CELEX: 31995L0032
Language: pt
Date: 1995-07-07 00:00:00
Title: Sexta Directiva 95/32/CE da Comissão, de 7 de Julho de 1995, relativa à aproximação das legislações dos Estados-Membros respeitantes aos métodos de análise necessários para a fiscalização da composição dos produtos cosméticos

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31995L0032

Sexta Directiva 95/32/CE da Comissão, de 7 de Julho de 1995, relativa à aproximação das legislações dos Estados-Membros respeitantes aos métodos de análise necessários para a fiscalização da composição dos produtos cosméticos  

Jornal Oficial nº L 178 de 28/07/1995 p. 0020 - 0035

SEXTA  DIRECTIVA 95/32/CE DA COMISSÃOde 7 de Julho de 1995relativa à aproximação das legislações dos  Estados-membros respeitantes aos métodos de análise necessários para a fiscalização da composição  dos produtos cosméticos(Texto relevante para efeitos do EEE)A COMISSÃO DAS  COMUNIDADES EUROPEIAS, Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia, Tendo em conta a Directiva do Conselho 76/768/CEE, relativa à aproximação das legislações dos  Estados-membros respeitantes aos produtos cosméticos (1), com a última redacção que lhe foi dada  pela Directiva 94/32/CEE da Comissão (2), e, nomeadamente, o nº 1 do seu artigo 8º, Considerando que a Directiva 76/768/CEE prevê fiscalizações oficiais dos produtos cosméticos  destinadas a assegurar que sejam respeitadas as condições previstas nas disposições comunitárias  relativas à composição dos produtos cosméticos; Considerando que importa definir o mais rapidamente possível todos os métodos de análise  necessários e que alguns métodos já foram adoptados pela Directiva 80/1335/CEE da Comissão (3), com  a redacção que lhe foi dada pela Directiva 87/143/CEE (4), pela Directiva 82/434/CEE da Comissão  (5), com a redacção que lhe foi dada pela Directiva 90/207/CEE (6), e pelas Directivas da Comissão  83/514/CEE (7), 85/490/CEE (8) e 93/73/CEE (9); Considerando que a identificação e o doseamento do ácido benzóico, do ácido 4-hidroxibenzóico, do  ácido sórbico, do ácido salicílico e do ácido propiónico nos produtos cosméticos e a identificação  e o doseamento da hidroquinona, do éter monometílico da hidroquinona, do éter monoetílico da  hidroquinona e do éter monobenzílico da hidroquinona nos produtos cosméticos constituem a sexta  fase; Considerando que as medidas previstas na presente directiva estão conformes com o parecer do Comité  para a adaptação ao progresso técnico da Directiva 76/768/CEE, ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA: Artigo 1ºOs Estados-membros tomarão todas as medidas necessárias para que,  aquando das fiscalizações oficiais dos produtos cosméticos: - a identificação e o doseamento do ácido benzóico, do ácido 4-hidroxibenzóico, do ácido sórbico,  do ácido salicílico e do ácido propiónico, - a identificação e o doseamento da hidroquinona, do éter monometílico da hidroquinona, do éter  monoetílico da hidroquinona e do éter monobenzílico da hidroquinona, sejam efectuados segundo os métodos descritos no anexo. Artigo 2º1. Os Estados-membros porão em vigor as disposições legislativas, regulamentares e  administrativas necessárias para darem cumprimento às disposições da presente directiva até 30 de  Setembro de 1996. Desse facto informarão imediatamente a Comissão. As disposições adoptadas pelos Estados-membros farão referência à presente directiva ou serão  acompanhadas de tal menção aquando da sua publicação. Caberá aos Estados-membros determinar o  procedimento relativo à referência em questão. 2. Os Estados-membros comunicarão à Comissão o texto das disposições de direito nacional que  adoptarem no domínio regulado pela presente directiva. Artigo 3ºA presente directiva entra em vigor no vigésimo dia seguinte ao da sua publicação no  Jornal Oficial das Comunidades Europeias. Artigo 4ºOs Estados-membros são os destinatários da presente directiva. Feito em Bruxelas, em 7 de Julho de 1995. Pela ComissãoEmma BONINOMembro da Comissão(1) JO nº L 262 de 27. 9. 1976, p.  169. (2) JO nº L 181 de 15. 7. 1994, p. 31. (3) JO nº L 383 de 31. 12. 1980, p. 27. (4) JO nº L 57 de 27. 2. 1987, p. 56. (5) JO nº L 185 de 30. 6. 1982, p. 1. (6) JO nº L 108 de 28. 4. 1990, p. 92. (7) JO nº L 291 de 24. 10. 1983, p. 9. (8) JO nº L 295 de 7. 11. 1985, p. 30. (9) JO nº L 231 de 14. 9. 1993, p. 34.  ANEXO I. IDENTIFICAÇÃO E DETERMINAÇÃO DO ÁCIDO BENZÓICO, DO ÁCIDO 4-HIDROXIBENZÓICO, DO  ÁCIDO SÓRBICO, DO ÁCIDO SALICÍLICO E DO ÁCIDO PROPIÓNICO NOS PRODUTOS COSMÉTICOS1. Objectivo e  âmbito de aplicaçãoO método é utilizável para a identificação e determinação do ácido benzóico, do  ácido 4-hidroxibenzóico, do ácido sórbico, do ácido salicílico e do ácido propiónico nos produtos  cosméticos. Em procedimentos separados é descrita a identificação destes conservantes, a  determinação do ácido propiónico e a determinação do ácido 4-hidroxibenzóico, do ácido salicílico,  do ácido sórbico e do ácido benzóico. 2. DefiniçãoOs teores em ácido benzóico, ácido 4-hidroxibenzóico, ácido salicílico, ácido sórbico  e ácido benzóico determinados segundo este método, são expressos em percentagem por massa dos  ácidos livres. A. IDENTIFICAÇÃO1. PrincípioApós a extracção ácido/base dos conservantes, o extracto é analisado  por cromatografia de camada fina utilizando uma placa de derivatização. Com base nos resultados  obtidos, a identificação é confirmada por cromatografia em fase líquida de elevada resolução ou, no  caso do ácido propiónico, por cromatografia em fase gasosa. 2. Reagentes2.1. GeralTodos os reagentes devem ser analiticamente puros. Deverá ser utilizada  água destilada ou de pureza equivalente. 2.2. Acetona2.3. Éter dietílico2.4. Acetonitrilo2.5. Tolueno2.6. Hexano-n2.7. Parafina  líquida2.8. Ácido clorídrico, 4M2.9. Hidróxido de potássio, aquoso, 4M2.10. Cloreto de cálcio,  Ca CI2  7 2H2O2.11. Carbonato de lítio, Li2CO32.12. 2-bromo-2&prime;-acetonaftona2.13. Ácido  4-hidroxibenzóico2.14. Ácido salicílico2.15. Ácido benzóico2.16. Ácido sórbico2.17. Ácido  propiónico2.18. Soluções de referência: Preparar soluções (100 mg/100 ml) a 0,1 % (m/v) de cada um dos cinco conservantes (2.13 a 2.17) em  éter dietílico. 2.19. Reagente de derivatização: Solução a 0,5 % (m/v) de 2-bromo-2&prime;-acetonaftona (2.12) em acetonitrilo (2.4) (50 mg/10 ml).  Esta solução deverá ser preparada todas as semanas e guardada no frigorífico. 2.20. Solução catalisadora: Solução a 0,3 % (m/v) de carbonato de lítio (2.11) em água (300 mg/100 ml). Esta solução deverá ser  preparada de novo. 2.21. Solvente para revelação: Tolueno (2.5)/acetona (2.2) (20:0,5, v/v)2.22. Parafina líquida (2.7)/hexano-n (2.6) (1:2, v/v)3.  MaterialEquipamento habitual de laboratório. 3.1. Banho-maria que se possa manter à temperatura de 60 °C3.2. Tina para revelação3.3. Fonte de  luz ultravioleta, 254 e 366 nm3.4. Placas de camada fina, Kieselgel 60, sem indicador de  fluorescência, 20 × 20 cm, camada de 0,25 mm de espessura com zona de concentração de 2,5 × 20  cm(Merck 11845 ou equivalente)3.5. Micro-seringa, 10 µl3.6. Micro-seringa, 25 µl3.7. Forno que  possa manter temperaturas até 105 °C3.8. Tubos de vidro de 50 ml com tampas de rosca3.9. Filtro  de papel, 90 mm de diâmetro, Schleider & Schull, Weissband nº 5892 ou equivalente3.10. Papel  indicador universal de ph 1-113.11. Frasco para amostras, em vidro, de 5 ml3.12. Evaporador com  camada rotativa (Rotavapor ou equivalente)3.13. Placa quente4. Metodologia4.1. Preparação da  amostraPesar aproximadamente 1 grama da amostra num tubo de vidro de 50 ml com a tampa de rosca  (3.8). Adicionar 4 gotas de ácido clorídrico 4M (2.8) e 40 ml de acetona (2.2). Para produtos  fortemente básicos, como o sabonete, adicionar 20 gotas de ácido clorídrico 4M (2.8). Verificar se  o pH é aproximadamente 2 utilizando papel indicador (3.10). Tapar o tubo e agitar vigorosamente  durante um minuto. Se necessário, para facilitar a extracção dos conservantes para a fase acetona, aquecer  progressivamente a mistura até cerca de 60 °C para derreter a fase lípida. Arrefecer a solução até atingir a temperatura ambiente e filtrar com um filtro de papel (3.9) para  um frasco cónico. Transferir 20 ml do filtrado para um frasco cónico de 200 ml, adicionar 20 ml de água e misturar.  Ajustar o pH da mistura com hidróxido de potássio 4M (2.9) até atingir cerca de 10. Utilizar o  papel indicador (3.10) para medir o pH. Adicionar 1 g de cloreto de cálcio (2.10) e agitar vigorosamente. Filtrar com um filtro de papel  (3.9) para uma ampola de decantação de 250 ml contendo 75 ml de éter dietílico (2.3) e agitar  vigorosamente durante um minuto. Deixar separar e escorrer a camada aquosa para um frasco cónico de  250 ml. Eliminar a camada de éter. Recorrendo a papel reagente (3.10), ajustar o pH da solução  aquosa até aproximadamente 2 com ácido clorídrico 4M (2.8). Adicionar 10 ml de éter dietílico  (2.3), rolhar o frasco e agitar vigorosamente durante um minuto. Deixar separar e transferir a  camada de éter para um evaporador rotativo (3.12). Eliminar a camada aquosa. Evaporar a camada de éter até ficar quase seca e dissolver novamente o resíduo em 1 ml de éter  dietílico (2.3). Transferir a solução obtida para um frasco de amostras (3.11). 4.2. Cromatografia de camada finaPara cada referência ou amostra a cromatografar, aplicar cerca de  3 µl de solução de carbonato de lítio (2.20) com uma seringa (3.5) a distâncias regulares na linha  de partida da zona de concentração da placa de cromatografia de camada fina (3.4) e secar numa  corrente de ar frio. Colocar essa placa sobre uma placa quente (3.13), a 40 °C para manter as manchas tão pequenas  quanto possível. Com uma micro-seringa (3.5) aplicar 10 µl de cada solução de referência (2.18) e  da solução de amostra (4.1) na linha de partida da placa, nos pontos exactos em que a solução de  carbonato de lítio foi aplicada. Finalmente, aplicar cerca de 15 µl de reagente de derivatização (2.19) (solução de  2-bromo-2&prime;-acetonaftona), mais uma vez nos pontos em que foram aplicadas as soluções de  referência/amostra e a solução de carbonato de lítio. Aquecer a placa de cromatografia de camada fina num forno (3.7) a 80 °C durante 45 minutos. Deixar arrefecer a revelar a placa numa tina (3.2) equilibrada durante 15 minutos (sem utilizar  filtro), recorrendo a solvente de revelação 2.21 (tolueno/acetona), até a frente do solvente  atingir uma distância de 15 cm (pode demorar aproximadamente 80 minutos). Secar a placa numa corrente de ar frio e examinar as manchas obtidas sob luz ultra-violeta (UV)  (3.3). Para permitir a fluorescência das manchas fracas, mergulhar a placa de cromatografia fina em  parafina/hexano-n (2.22). 5. IdentificaçãoCalcular o Rf para cada mancha: Comparar o Rf e o comportamento sob raios UV obtido para a amostra com os valores obtidos para as  soluções de referência. Tirar conclusões preliminares relativamente à presença e identidade dos conservantes presentes.  Proceder à cromatografia líquida de elevada resolução descrita na parte B ou, se se verificar a  presença de ácido propiónico, à cromatografia em fase gasosa descrita na parte C. Comparar os  tempos de retenção obtidos para a amostra com os das soluções de referência. Combinar os resultados da cromatografia de camada fina com os da cromatografia líquida de elevada  resolução ou da cromatografia em fase gasosa. Basear na análise dos resultados combinados a  identificação dos conservantes presentes na amostra. B. DETERMINAÇÃO DO ÁCIDO BENZÓICO, DO ÁCIDO 4-HIDROXIBENZÓICO, DO ÁCIDO SÓRBICO E DO ÁCIDO  SALICÍLICO1. PrincípioApós a acidificação, a amostra é extraída com uma mistura de etanol e água.  Depois da filtração, os conservantes são determinados através da cromatografia líquida de elevada  resolução. 2. Reagentes2.1. Todos os reagentes devem ser analiticamente puros e apropriados para  cromatografia líquida de elevada resolução quando necessário. Deverá ser utilizada água destilada  ou de pureza equivalente. 2.2. Etanol, absoluto2.3. Ácido 4-hidroxibenzóico2.4. Ácido salicílico2.5. Ácido benzóico2.6.  Ácido sórbico2.7. Acetato de sódio, (CH3COONa  7 3H2O)2.8. Ácido acético, d204 = 1,05 g/ml2.9.  Acetonitrilo2.10. Ácido sulfúrico, 2M2.11. Hidróxido de potássio, aquoso, 0,2M2.12. Ácido  2-metoxibenzóico2.13. Mistura etanol/água: misturar 9 volumes de etanol (2.2) e 1 volume de água (2.1). 2.14. Solução de referência interna: preparar uma solução contendo cerca de 1 g de ácido 2-metoxibenzóico (2.12) em 500 ml de mistura de  etanol/água (2.13). 2.15. Fase móvel para cromatografia líquida de elevada resolução. 2.15.1. Acetato tampão: acresentar 6,35 g de acetato de sódio (2.7) e 20,0 ml de ácido acético  (2.8) a 1 litro de água e misturar. 2.15.2. Preparar a fase móvel, misturando 9 volumes de acetato tampão (2.15.1) com 1 volume de  acetonitrilo (2.9). 2.16. Solução-base de conservantes -Pesar com exactidão cerca de 0,05 g de ácido 4-hidroxibenzóico  (2.3), 0,2 g de ácido salicílico (2.4), 0,2 g de ácido benzóico (2.5) e 0,05 g de ácido sórbico  (2.6) num frasco graduado de 50 ml; perfazer este volume, com mistura de água/etanol (2.13).  Guardar a solução num frigorífico. A solução permanecerá estável durante uma semana. 2.17. Soluções de referência de conservantesTransferir da solução-base (2.16), respectivamente,  8,00, 4,00, 2,00, 1,00 e 0,50 ml para um conjunto de frascos graduados de 20 ml. Em cada frasco,  adicionar 10,00 ml de solução de referência interna (2.14) e 0,5 ml de ácido sulfúrico 2M (2.10).  Encher, até perfazer os 20 ml, com mistura etanol/água (2.13). Estas soluções deverão ser  preparadas na altura da utilização. 3. MaterialEquipamento habitual de laboratório, não discriminado, e: 3.1. Banho-maria, regulado a 60 °C3.2. Equipamento de cromatografia líquida, de alta resolução com  detector de UV de comprimento de onda variável e dispositivo de injecção de 10 µl3.3. Coluna de  análise: aço inoxidável, comprimento de 12,5-25 cm, diâmetro interno de 4,6 mm, cheia com Nucleosil 5C18 ou  equivalente3.4. Papel de filtro, diâmetro: 90 mm, Schleicher e Schull, Weissband nº 5892 ou  equivalente3.5. Tubos de vidro de 50 ml com tampa de rosca3.6. Frascos de vidro para amostras, 5  ml3.7. Granulados para facilitar a ebulição, carborundo, 2-4 mm, ou equivalente4.  Metodologia4.1. Preparação da amostra4.1.1. Preparação da amostra sem adição interna de  referência. Pesar 1 g da amostra num tubo de vidro de 50 ml com tampa de rosca (3.5). Adicionar com uma pipeta  1,00 ml de ácido sulfúrico 2M (2.10), 40,0 ml de mistura etanol/água (2.13). Juntar aproximadamente  1 g de granulados para facilitar a ebulição (3.7), fechar o tubo e agitar vigorosamente durante um  minuto, pelo menos, até obter uma suspensão homogénea. Colocar o tubo durante 5 minutos exactos em  água a 60 °C (3.1) para facilitar a extracção dos conservantes para a fase etanol. Arrefecer  imediatamente o tubo num fluxo de água fria e manter o extracto à temperatura de 5 °C durante uma  hora. Filtrar o extracto com papel de filtro (3.4). Transferir aproximadamente 2 ml do extracto para um  frasco de amostras (3.6). Conservar o extracto a 5 °C e proceder à determinação por cromatografia  líquida de elevada resolução nas 24 horas subsequentes à preparação. 4.1.2. Preparação da amostra com adição de referência interna. Pesar com precisão de três décimos 1 g ± 0,1 g (gramas a) da amostra num tubo de vidro de 50 ml com  tampa de rosca (3.5). Com uma pipeta, adicionar 1,00 ml de ácido sulfúrico 2M (2.10) e 30,0 ml de  mistura de etanol/água (2.13). Juntar cerca de 1 g de granulados para facilitar a ebulição (3.7) e  10,00 ml da solução de referência interna (2.14). Fechar o tubo e agitar vigorosamente durante um  minuto, pelo menos, até obter uma suspensão homogénea. Colocar o tubo durante exactamente 5 minutos  em água à temperatura de 60 °C (3.1) para facilitar a extracção dos conservantes para a fase  etanol. Arrefecer imediatamente o tubo num fluxo de água fria e manter o extracto à temperatura de 5 °C  durante uma hora. Filtrar o extracto com papel de filtro (3.4). Transferir aproximadamente 2 ml do filtrado para um  frasco de amostras (3.6). Manter o filtrado à temperatura de 5 °C e realizar a determinação por  cromatografia líquida de elevada resolução nas 24 horas subsequentes à preparação. 4.2. Cromatografia líquida de elevada resoluçãoFase móvel: acetonitrilo/acetato tampão (2.15). Ajustar o fluxo da fase móvel na coluna a 2,0 ml/minuto ± 0,5 ml/minuto. Fixar o detector de comprimento de onda em 240 nm. 4.2.1. CalibragemInjectar quantidades de 10 µl de cada uma das soluções de conservantes de  referência (2.17) no cromatógrafo líquido (3.2). Relativamente a cada solução determinar as razões  entre as alturas dos picos dos conservantes analisados e a altura do pico da referência interna dos  cromatogramas obtidos. Elaborar um gráfico para cada conservante, relacionando a razão da altura de  pico com a concentração de cada solução de referência. Verificar se se obtém uma resposta linear para as soluções de referência no processo de  calibragem. 4.2.2. DeterminaçãoInjectar 10 µl da amostra de extracto (4.1.1) no cromatógrafo líquido (3.2) e  registar o cromatograma. Injectar 10 µl de uma solução de referência de conservante (2.17) e  registar o cromatograma. Comparar os cromatogramas obtidos. Se no cromatograma da amostra de  extracto (4.1.1) não ocorrerem picos com, aproxidamente, o mesmo tempo de retenção do ácido  2-metoxibenzóico (referência interna recomendada), injectar 10 µl de amostra de extracto com  referência interna (4.1.2) no cromatógrafo líquido e registar o cromatograma. Se se verificar a interferência de um pico no cromatograma da amostra de extracto (4.1.1) com o  mesmo tempo de retenção do ácido 2-metoxibenzóico, seleccionar outra referência interna adequada  (se um dos conservantes em estudo não aparecer no cromatograma, esse conservante poderá ser  utilizado como referência interna). Verificar se os cromatogramas obtidos para uma solução de referência e a solução amostra preenchem  os seguintes requisitos: - o pico de separação do par menos separado deverá ser de 0,90, pelo menos (para uma definição de  pico de separação, observar a figura 1). >REFERÊNCIA A UMA IMAGEN>Figura 1: pico de separaçãoJO n- Se não se obtiver a separação  necessária, haverá que utilizar uma coluna mais eficaz ou adaptar a composição da fase móvel até  serem alcançadas as condições pretendidas, - o factor de assimetria As de todos os picos obtidos deverá estar compreendido entre 0,9 e 1,5  (para uma definição de factor de assimetria do pico, ver figura 2). Para registar o cromatograma  com vista à determinação do facto de assimetria, recomenda-se uma velocidade da banda de registo  não inferior a 2 cm/minuto, >REFERÊNCIA A UMA IMAGEN>Figura 2: Factor de assimetria do pico- deverá obter-se uma linha de  base estável. 5. CálculoUtilizar a razão entre as alturas dos picos dos conservantes analisados para a altura do  pico do ácido 2-metoxibenzóico (referência interna) e o gráfico de calibragem para calcular a  concentração dos conservantes ácidos na solução de amostra. Calcular o teor da amostra em ácido  benzóico, ácido 4-hidroxibenzóico, ácido sórbico ou ácido salicílico, em percentagem por massa  (xi), utilizando a fórmula: xi % (m/m) = 100  7 20  7 b 106  7 a = b 500  7 aem que: a = massa (g) da quantidade analisada (4.1.2). b = concentração (µg/ml) do conservante no extracto de amostra (4.1.2) obtido no gráfico de  calibragem; 6. Repetibilidade (1)Para um teor em ácido 4-hidroxibenzóico de 0,40 %, a diferença entre os  resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve ultrapassar um  valor absoluto de 0,035 %. Para um teor em ácido benzóico de 0,50 %, a diferença entre os resultados de duas determinações  paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve ultrapassar um valor absoluto de 0,050 %. Para um teor em ácido salicílico de 0,50 %, a diferença entre os resultados de duas determinações  paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve ultrapassar um valor absoluto de 0,045 %. Para um teor em ácido sórbico de 0,60 %, a diferença entre os resultados de duas determinações  paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve ultrapassar um valor absoluto de 0,035 %. 7. Observações7.1. Os resultados do teste de robustez realizado segundo o método descrito  revelaram que a quantidade de ácido sulfúrico adicionada para extrair os ácidos da amostra é  crítica, devendo a quantidade de amostra utilizada manter-se dentro dos limites prescritos. 7.2. Se se desejar, poderá ser utilizada uma coluna de protecção adequada. C. DETERMINAÇÃO DO ÁCIDO PROPIÓNICO1. Objectivo e âmbito de aplicaçãoEste método é aplicável para  a determinação do ácido propiónico em todos os produtos cosméticos, sendo a concentração máxima de  2 % (m/m). 2. DefiniçãoA concentração de ácido propiónico, determinada segundo este método, é expressa em  percentagem por massa (% m/m) do produto. 3. PrincípioApós o ácido propiónico ser extraído do produto, a determinação é feita através de  cromatografia em fase gasosa, utilizando o ácido 2-metilpropiónico como referência interna. 4. ReagentesTodos os reagentes devem ser analiticamente puros; deverá ser utilizada água destilada  ou de pureza equivalente. 4.1. Etanol 96 % (v/v)4.2. Ácido propiónico4.3. Ácido 2-metilpropiónico4.4. Ácido ortofosfórico,  10 % (m/v)4.5. Solução de ácido propiónicoPesar com precisão aproximadamente 1,00 g (gramas p) de  ácido propiónico num frasco de 50 ml e acrescentar etanol até perfazer aquele volume (4.1). 4.6. Solução de referência interna: Pesar aproximadamente 1,00 g (gramas e) de ácido 2-metilpropiónico num frasco de 50 ml e adicionar  etanol até perfazer aquele volume (4.1). 5. Material5.1. Equipamento habitual de laboratório e: 5.2. Equipamento para cromatografia em fase gasosa com detector de ionização por chama5.3. Tubo de  vidro (20 × 150 mm) com tampa de rosca5.4. Banho-maria à temperatura de 60 °C5.5. Seringa de  vidro de 10 ml com filtro de membrana (diâmetro dos poros: 0,45 µm)6. Metodologia6.1. Preparação  da amostra6.1.1. Preparação da amostra sem a referência internaPesar cuidadosamente 1 g da  amostra num tubo de vidro (5.3). Adicionar 0,5 ml de ácido fosfórico (4.4) e 9,5 ml de etanol  (4.1). Tapar o tubo e agitar vigorosamente. Se necessário, colocar o tubo em água à temperatura de 60 °C  (5.4) durante 5 minutos para dissolver abundantemente a fase lipídica. Arrefecer rapidamente sob  água corrente. Filtrar uma parte da solução com um filtro de membrana (5.5). Proceder à  cromatografia do filtrado do próprio dia. 6.1.2. Preparação da amostra com referência internaPesar com precisão de três décimos 1 g ± 0,1 g  (gramas a) de amostra num tubo de vidro (5.3). Adicionar 0,5 ml de ácido fosfório (4.4), 0,50 ml de  solução de referência interna (4.6) e 9 ml de etanol (4.1). Tapar o tubo e agitar vigorosamente. Se necessário, colocar o tubo em água à temperatura de 60 °C  (5.4) durante 5 minutos para dissolver a fase lipídica. Arrefecer rapidamente sob água corrente.  Filtrar parte da solução com um filtro de membrana (5.5). Proceder à cromatografia do filtrado no  próprio dia. 6.2. Condições para cromatografia em fase gasosaRecomendam-se as seguintes condições para proceder  à cromatografia em fase gasosa: ColunaTipo Aço-inoxidávelComprimento 2 mDiâmetro 1/8&Prime; Enchimento 10 % SPTM 1 000 (ou equivalente) + 1 % H3PO4 emChromosorb WAW 100-120  meshTemperaturaInjector 200 °CColuna 120 °CDetector 200 °CGás de arraste:NitrogénioFluxo: 25 ml/minuto6.3. Cromatografia6.3.1. CalibraçãoVerter com uma pipeta  respectivamente 0,25, 0,50, 1,00, 2,00 e 4,00 ml de solução de ácido propiónico (4.5) para um  conjunto de frascos de 20 ml de volume. A cada um acrescentar com uma pipeta 1,00 ml de solução de  referência interna (4.6); perfazer o volume de 20 ml com etanol (4.1) e misturar. As soluções assim  preparadas contêm e mg/ml de ácido 2-metilpropiónico como referência interna (ou seja, 1 mg/ml se  e=1,000) e p/4, p/2, p, 2p, 4p mg/ml de ácido propiónico (ou seja, 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 4,00  mg/ml se p=1,000). Injectar 1 µl de cada uma destas soluções e obter a curva de calibração inscrevendo no eixo «x» a  relação entre as massas do ácido propiónico e do ácido 2-metilpropiónico e no eixo «y» a relação  entre as áreas de pico correspondentes. Proceder a 3 injecções de cada solução e calcular a relação média entre as áreas de pico. 6.3.2. DeterminaçãoInjectar 1 µl do filtro da amostra 6.1.1. Comparar o cromatograma com uma das  soluções de referência (6.3.1). Se o pico apresenta um tempo de retenção sensivelmente análogo ao  do ácido 2-metilpropiónico, mudar a referência interna. Se não se observar interferência, injectar  1 µl do filtrado da amostra 6.1.2 e medir as áreas do pico do ácido propiónico e do pico da  referência interna. Fazer três injecções de cada solução e calcular a relação média entre as áreas de pico. 7. Cálculos7.1. A partir da curva de calibração obtida em 6.3.1, determinar a razão da massa (K),  correspondente à razão da área do pico calculada em 6.3.2. 7.2. A partir da razão da massa obtida desta forma, calcular o teor da amostra (x) em ácido  propiónico, em percentagem por massa recorrendo à fórmula: x % (m/m) = K 0,5  7 100  7 e 50  7 a = K e aem que: K = razão calculada em 7.1; e = massa, em gramas, da referência interna pesada em 4.6; a = massa, em gramas, da amostra pesada em 6.1.2. Arredondar os resultados à décima. 8. Repetibilidade (1)Para um teor em ácido propiónico de 2 % (m/m), a diferença entre os  resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve ultrapassar 0,12  %. II. IDENTIFICAÇÃO E DETERMINAÇÃO DA HIDROQUINONA, DO ÉTER MONOMETÍLICO DE QUINOL, DO ÉTER  MONOETÍLICO DE QUINOL E DO ÉTER MONOBENZÍLICO DE QUINOL EM PRODUTOS COSMÉTICOSA. IDENTIFICAÇÃO1.  Objectivo e âmbito de aplicaçãoEste método descreve a detecção e a identificação da hidroquinona,  do éter monometílico de quinol, do éter monoetílico de quinol e do éter monobenzílico de quinol  (monobenzona) em produtos cosméticos para branqueamento da pele. 2. PrincípioA hidroquinona e os respectivos éteres são identificados por cromatografia de camada  fina (CCF). 3. ReagentesOs reagentes devem ser todos de pureza analítica. 3.1. Etanol, 96 % (v/v)3.2. Clorofórmio3.3. Éter dietílico3.4. Solvente de revelação: Clorofórmio/éter dietílico, 66:33 (v/v)3.5. Amónia, 25 % (m/m) (d204 = 0,91 g/ml)3.6. Ácido  ascórbico3.7. Hidroquinona3.8. Éter monometílico de quinol3.9. Éter monoetílico de quinol3.10.  Éter monobenzílico de quinol (Monobenzona)3.11. Solutos de referência: Os seguintes solutos de referência devem ser preparados de fresco e mantêm-se estáveis durante 1  dia. 3.11.1. Introduzir 0,05 g de hidroquinona (3.7.) num tubo de ensaio graduado de 10 ml. Acrescentar  0,250 g de ácido ascórbico (3.6.) e 5 ml de etanol a 96 % (3.1.). Acrescentar amónia (3.5.) até se  atingir um pH de 10. Perfazer um volume de 10 ml com etanol (3.1.). 3.11.2. Introduzir 0,05 g de éter monometílico de quinol (3.8.) num tubo de ensaio graduado de 10  ml. Acrescentar 0,250 g de ácido ascórbico (3.6.) e 5 ml de etanol (3.1.). Acrescentar amónia  (3.5.) até se atingir um pH de 10. Perfazer um volume de 10 ml com etanol (3.1.). 3.11.3. Introduzir 0,05 g de éter monoetílico de quinol (3.9.) num tubo de ensaio graduado de 10  ml. Acrescentar 0,250 g de ácido ascórbico (3.6.) e 5 ml de etanol (3.1.). Acrescentar amónia  (3.5.) até se atingir um pH de 10. Perfazer um volume de 10 ml com etanol (3.1.). 3.11.4. Introduzir 0,05 g de éter monobenzílico de quinol (3.10.) num tubo de ensaio graduado de 10  ml. Acrescentar 0,250 g de ácido ascórbico (3.6.) e 5 ml de etanol (3.1.). Acrescentar amónia  (3.5.) até se atingir um pH de 10. Perfazer um volume de 10 ml com etanol (3.1.). 3.12. Nitrato de prata3.13. Ácido 12-molibdofosfórico3.14. Ferricianeto de potássio  hexahidrato3.15. Cloreto férrico, hexahidrato3.16. Reagentes para nebulização: 3.16.1. A um soluto aquoso de nitrato de prata (3.12.) a 5 % (m/v) acrescentar amónia (3.5.) até  dissolução do precipitado formado. Aviso: o soluto torna-se explosivamente instável em repouso e deve ser eliminado após utilização. 3.16.2. Soluto a 10 % (m/v) de ácido 12-molibdofosfórico (3.13.) em etanol (3.1.). 3.16.3. Preparar um soluto aquoso de ferricianeto de potássio (3.14.) a 1 % (m/v) e um soluto  aquoso de cloreto férrico (3.15.) a 2 % (m/v). Misturar partes iguais de ambos os solutos  imediatamente antes da utilização. 4. MaterialEquipamento normal de laboratório, e: 4.1. Equipamento convencional de CCF4.2. Placas CCF, prontas para utilização: silicagel GHR/UV254;  20 cm × 20 cm (Machery, Nagel ou equivalente); espessura da camada: 0,25 mm. 4.3. Banho ultra-sónico4.4. Centrifugadora4.5. Lâmpada UV, 254 nm5. Procedimento5.1. Preparação  da amostra: Introduzir 3,0 g da amostra num tubo de ensaio graduado de 10 ml. Acrescentar 0,250 g de ácido  ascórbico (3.6.) e 5 ml de etanol (3.1.). Fazer o soluto atingir o pH 10 com amónia (3.5.).  Perfazer um volume de 10 ml com etanol (3.1.). Rolhar o tubo e homogeneizar num banho ultra-sónico  durante dez minutos. Filtrar através de papel de filtro ou centrifugar a 3 000 rpm. 5.2. CCF5.2.1. Saturar um tanque cromatográfico com solvente de revelação (3.4.). 5.2.2. Depositar numa placa 2 µl de soluto de referência (3.11.) e 2 µl de soluto amostra (5.1.).  Revelar à temperatura ambiente em situação de obscuridade até que a frente de solvente tenha  migrado 15 cm desde o ponto de partida. 5.2.3. Retirar a placa e deixar secar à temperatura ambiente. 5.3. Detecção5.3.1. Observar a placa com luz UV de 254 nm e assinalar a posição das manchas. 5.3.2. Aspergir a placa com: - reagente de nitrato de prata (3.16.1.), ou- reagente de ácido 12-molibdofosfórico (3.16.2.);  aquecer aproximadamente até aos 120 °C, ou- soluto de ferricianeto de potássio e soluto de cloreto  férrico (3.16.3.)6. IdentificaçãoCalcular o valor Rf para cada mancha. Comparar as manchas obtidas a partir do soluto amostra com as obtidas a partir dos solutos de  referência relativament a: valores Rf; cor das manchas sob radiação UV; cor das manchas após  visualização com reagente de nebulização. Executar a técnica CLER (Cromatografia Líquida de Elevada Resolução) descrita na secção seguinte  (B), e comparar os tempos de retenção obtidos para o(s) pico(s) da amostra com os dos solutos de  referência. Combinar os resultados obtidos com as técnicas CCF e CLER para identificar a presença de  hidroquinona e/ou dos respectivos éteres. 7. ObservaçõesNas condições descritas, observaram-se os seguintes valores Rf: hidroquinona 0,32éter monometílico de quinol 0,53éter monoetílico de quinol 0,55éter  monobenzílico de quinol 0,58B. DETERMINAÇÃO1. Objectivo e âmbito de aplicaçãoEste método  especifica a natureza de um procedimento para determinação da hidroquinona, de éter monometílico de  quinol, do éter monoetílico de quinol e do éter monobenzílico de quinol em produtos cosméticos para  branqueamento da pele. 2. PrincípioA amostra é extraída com uma mistura água/metanol sob o efeito de um ligeiro  aquecimento para fundir quaisquer lípidos presentes. A determinação das substâncias a analisar no  soluto obtido é executada por cromotografia líquida de fase invertida com detecção UV. 3. Reagentes3.1. Os reagentes têm todos que ser de qualidade analítica. A água utilizada tem que  ser destilada ou de pureza pelo menos equivalente. 3.2. Metanol3.3. Hidroquinona3.4. Éter monometílico de quinol3.5. Éter monoetílico de  quinol3.6. Éter monobenzílico de quinol (Monobenzona)3.7. Tetrahidrofurano de grau CLER3.8.  Mistura água/metanol 1:1 (v/v). Misturar 1 volume de água e 1 volume de metanol (3.2.). 3.9. Fase móvel: mistura de tetrahidrofurano/água 45:55 (v/v). Misturar 45 volumes de  tetrahidrofurano (3.7.) e 55 volumes de água. 3.10. Soluto de referência: Verter 0,06 g de hidroquinona (3.3.), 0,08 g de éter monometílico de quinol (3.4.), 0,10 g de éter  monoetílico de quinol (3.5.) e 0,12 g de éter monobenzílico de quinol (3.6.) para um frasco de 50  ml. Dissolver e perfazer este volume com metanol (3.2.). Preparar o soluto de referência diluindo  10,00 ml deste soluto em 50,00 ml de mistura água/metanol (3.8.). Estes solutos têm que ser preparados de fresco. 4. MaterialEquipamento normal de laboratório e: 4.1. Banho-maria, susceptível de manter a temperatura a 60 °C4.2. Cromatógrafo de fase líquida de  elevada redução com um detector de UV de comprimento de onda variável e um dispositivo de injecção  de 10 µl4.3. Coluna analítica: Coluna cromatográfica de aço inoxidável, de 250 mm de comprimento, diâmetro interno de 4,6 mm,  cheia com fenil Zorbax (fenetilsilano ligado quimicamente em Zorbax SIL, tamponado com  trimetilclorosilano) partículas de 6 µm, ou equivalente. Não utilizar uma coluna de guarda, com  excepção de guarda de fenil ou equivalente4.4. Papel de filtro, diâmetro 90 mm, Schleicher e  Schull, Weissband nº 5892 ou equivalente5. Procedimento5.1. Preparação da amostraPesar com  precisão de três décimos 1 g ± 0,1 g (gramas a) de amostra num recipiente graduado de 50 ml.  Dispersar a amostra em 25 ml de mistura água/metanol (3.8.). Fechar o recipiente e agitar  vigorosamente até obter uma suspensão homogénea. Agitar durante pelo menos um minuto. Colocar o  recipiente em banho-maria (4.1.) mantido a 60 °C a fim de aumentar a extracção. Arrefecer o  recipiente e perfazer o volume de 50 ml com água/metanol (3.8.). Filtrar o extracto com um papel de  filtro (4.4.). Executar a determinação CLER nas 24 horas subsequentes à preparação do extracto. 5.2. Cromatografia líquida de elevada resolução. 5.2.1. Ajustar o fluxo da fase móvel (3.9.) a 1,0 ml/minuto e fixar o detector de comprimento de  onda em 295 nm. 5.2.2. Injectar 10 µl do soluto amostra, obtido conforme descrito na secção 5.1. e registar o  cromatograma. Medir as áreas de pico. Executar uma calibração conforme descrito em 5.2.3. Comparar os cromatogramas obtidos com os  solutos amostra e padrão. Utilizar as áreas de pico e os factores resposta (FR) calculados na  secção (5.2.3.) para determinar a concentração das substâncias a analisar no soluto amostra. 5.2.3. CalibraçãoInjectar 10 µl do soluto de referência (3.10.) e registar o cromatograma.  Injectar várias vezes até obter um área de pico constante. Determinar o factor resposta RFi: RFi = pi ciem que, pi = área de pico de: hidroquinona, éter monometílico de quinol, éter monoetílico de quinol ou éter  monobenzílico de quinol; eci = concentração (g/50 ml) no soluto de referência (3.10.) de:  hidroquinona, éter monometílico de quinol, éter monoetílico de quinol ou éter monobenzílico de  quinol. Verificar se os cromatogramas obtidos relativos aos solutos padrão e amostra obedecem aos seguintes  requisitos: - a separação de picos do par de picos mais mal separados deve ser, no mínimo, de 0,90. (Para  definição da separação de picos, ver figura 1). >REFERÊNCIA A UMA IMAGEN>Figura 1: Separação de picosSe não se obtiver a separação necessária,  haverá que utilizar uma coluna mais eficaz ou adaptar a composição da fase móvel até serem  alcançadas as condições pretendidas, - o factor As de assimetria de todos os picos obtidos deve situar-se na gama de valores  compreendidos entre 0,9 e 1,5 (para definição do factor de assimetria de picos, ver figura 2). Para  registar o cromatograma com vista à determinação do factor de assimetria, recomenda-se uma  velocidade de registo de pelo menos 2 cm/min, >REFERÊNCIA A UMA IMAGEN>Figura 2: factor de assimetria de picos- deverá obter-se uma linha de  base estável. 6. CálculoUtilizar as áreas dos picos das substâncias a analisar para calcular as respectivas  concentrações na amostra. Calcular a concentração da substância a analisar na amostra, em  percentagem por massa, (xi) por meio da seguinte fórmula: xi % (m/m) = bi  7 100 RFi  7 aem que: a= massa da amostra em gramas; bi = área de pico da substância a analisar i na amostraRFi = factor resposta7. Repetibilidade  (1)7.1. Para um teor de hidroquinona de 2,0 % a diferença entre os resultados de duas  determinações efectuadas em paralelo na mesma amostra não deve exceder um valor absoluto de 0,13  %. 7.2. Para um teor de éter monometílico de quinol de 1,0 % a diferença entre os resultados de duas  determinações efectuadas em paralelo na mesma amostra não deve exceder um valor absoluto de 0,1 %. 7.3. Para um teor de éter monoetílico de quinol de 1,0 % a diferença entre os resultados de duas  determinações efectuadas em paralelo na mesma amostra não deve exceder uma valor absoluto de 0,11  %. 7.4. Para um teor de éter monobenzílico de quinol de 1,0 % a diferença entre os resultados de duas  determinações efectuadas em paralelo na mesma amostra não deve exceder um valor absoluto de 0,11  %. 8. Reprodutibilidade (1)8.1. Para um teor de hidroquinona de 2,0 % a diferença entre os resultados  de duas determinações efectuadas na mesma amostra em condições diferentes (laboratórios,  operadores, material e/ou tempo de execução diferentes) não deve exceder um valor absoluto de 0,37  %. 8.2. Para um teor de éter monometílico de quinol de 1,0 % a diferença entre os resultados de duas  determinações efectuadas na mesma amostra em condições diferentes (laboratórios, operadores,  material e/ou tempo de execução diferentes) não deve exceder um valor absoluto de 0,21 %. 8.3. Para um teor de éter de monoetílico de quinol de 1,0 % a diferença entre os resultados de duas  determinações efectuadas na mesma amostra em condições diferentes (laboratórios, operadores,  material e/ou tempo de execução diferentes) não deve exceder um valor absoluto de 0,19 %. 8.4. Para um teor de éter monobenzílico de quinol de 1,0 % a diferença entre os resultados de duas  determinações efectuadas na mesma amostra em condições diferentes (laboratórios, operadores,  material e/ou tempo de execução diferentes) não deve exceder um valor absoluto de 0,11 %. 9. Observações9.1. Quando se determinar um teor de hidroquinona consideravelmente superior a 2 % e  for necessário um cálculo exacto, o extracto da amostra (5.1.) deve ser diluído até atingir uma  concentração idêntica à que seria obtida com uma amostra com um teor de hidroquinona de 2 % e a  determinação repetida (com alguns equipamentos a absorvência pode situar-se fora da gama linear do  detector para concentrações elevadas de hidroquinona). 9.2. InterferênciasO método acima descrito permite a determinação da hidroquinona e dos  respectivos éteres com um único ciclo isocrático. A utilização da coluna de fenil garante uma  retenção suficiente de hidroquinona, retenção essa que não pode ser garantida quando é utilizada  uma coluna C18 durante a fase móvel descrita. No entanto, este método está sujeito às interferências de um determinado número de parabenos. Em  tal caso a determinação deve ser repetida recorrendo a um sistema diferente de fase móvel/fase  estacionária. Nas notas (1) e (2) estão descritos métodos adequados: Coluna: Zorbax ODS, 4,6 mm × 25 cm, ou equivalenteTemperatura: 36 °CDébito: 1,5 ml/minFase  móvel: para a hidroquinona: metanol/água 5/95 (V/V)para o éter monometílico de quinol:  metanol/água 30/70 (V/V)para o éter monobenzílico de quinol: metanol/água 80/20 (V/V) (1)Coluna:  Spherisorb S5-ODS, ou equivalentefase móvel: água/metanol 90/10 (V/V)débito: 1,5 ml/minEstas  condições são adequadas para a hidroquinona (2). (1) ISO 5725. (1) ISO 5725. (1) ISO 5725. (1) M. Herpol-Borremans and M.O. Masse, Identification et dosage de l'hydroquinone et ses éthers  méthylique et benzylique dans les produits cosmétiques pour blanchir la peau. Int. J. Cosmet. Sci  8-203-214 (1986). (2) J. Firth and I. Rix, Determination of Hydroquinone in skintoning creams, Analyst (1986), 111,  p. 129.