CELEX: 31992L0069
Language: nl
Date: 1992-07-31 00:00:00
Title: Richtlijn 92/69/EEG van de Commissie van 31 juli 1992 houdende zeventiende aanpassing aan de vooruitgang van de techniek van Richtlijn 67/548/EEG van de Raad betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke stoffen

Avis juridique important

|

31992L0069

Richtlijn 92/69/EEG van de Commissie van 31 juli 1992 houdende zeventiende aanpassing aan de vooruitgang van de techniek van Richtlijn 67/548/EEG van de Raad betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke stoffen  

Publicatieblad Nr. L 383 van 29/12/1992 blz. 0113 - 0115 Bijzondere uitgave in het Fins: Hoofdstuk 6 Deel 6 blz. 0003  Bijzondere uitgave in het Zweeds: Hoofdstuk 6 Deel 6 blz. 0003  L 383A 29/12/1992 P. 0001 - 0235

RICHTLIJN 92/69/EEG VAN DE COMMISSIE  van 31 juli 1992  houdende zeventiende aanpassing aan de vooruitgang van de techniek van Richtlijn 67/548/EEG van de Raad betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke stoffenDE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische Gemeenschap,Gelet op Richtlijn 67/548/EEG van de Raad van 27 juni 1967 betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke stoffen (1), laatstelijk gewijzigd bij Richtlijn 92/32/EEG (2), inzonderheid op de artikelen 28 en 29,(1) PB nr. 196 van 16. 8. 1967, blz. 1.(2) PB nr. L 154 van 5. 6. 1992, blz. 1.Overwegende dat in artikel 3, lid 1, van Richtlijn 67/548/EEG en artikel 3 van Richtlijn 88/379/EEG van de Raad van 7 juni 1988 betreffende de onderlinge aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen van de Lid-Staten inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke preparaten (3), laatstelijk gewijzigd bij Richtlijn 90/492/EEG van de Commissie (4), is bepaald dat de fysisch-chemische eigenschappen, de toxiciteit en de ecotoxiciteit van stoffen en preparaten bepaald dienen te worden overeenkomstig de in bijlage V bij Richtlijn 67/548/EEG vastgelegde methoden;(3) PB nr. L 187 van 16. 7. 1988, blz. 14.(4) PB nr. L 275 van 5. 10. 1990, blz. 35.Overwegende dat de tekst van bijlage V bij Richtlijn 67/548/EEG in twee gedeelten is gepubliceerd, namelijk in de bijlage bij Richtlijn 84/449/EEG van de Commissie (5) en de bijlage bij Richtlijn 88/302/EEG van de Commissie (6);(5) PB nr. L 251 van 19. 9. 1984, blz. 1.(6) PB nr. L 133 van 30. 5. 1988, blz. 1, en rectificatie in PB nr. L 136 van 2. 6. 1988, blz. 20.Overwegende dat het, om rekening te houden met de technische ontwikkelingen, noodzakelijk is de testmethoden in de bijlage bij Richtlijn 84/449/EEG te herzien;Overwegende dat het, ten einde rekening te houden met de technische ontwikkelingen, tevens noodzakelijk is dat de methode wordt herzien die gebruikt wordt in verband met de remmingstest voor algen die thans in de bijlage bij Richtlijn 88/302/EEG is opgenomen en het bij deze gelegenheid noodzakelijk wordt geacht deze testmethode op te nemen in de bijlage bij Richtlijn 84/449/EEG;Overwegende dat het aantal dieren dat voor experimentele doeleinden wordt gebruikt overeenkomstig Richtlijn 86/609/EEG van de Raad van 24 november 1986 inzake de onderlinge aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen van de Lid-Staten betreffende de bescherming van dieren die voor experimentele doeleinden worden gebruikt (7), zoveel mogelijk wordt beperkt;(7) PB nr. L 358 van 18. 12. 1986, blz. 1.Overwegende dat de bepalingen van deze richtlijn in overeenstemming zijn met het advies van het Comité voor de aanpassing aan de vooruitgang van de techniek van de richtlijnen betreffende de opheffing van technische handelsbelemmeringen in de sector gevaarlijke stoffen en preparaten,HEEFT DE VOLGENDE RICHTLIJN VASTGESTELD: Artikel 1De bijlage bij Richtlijn 84/449/EEG wordt vervangen door de bijlage bij de onderhavige richtlijn.Artikel 2De in de bijlage bij Richtlijn 88/302/EEG opgenomen remmingstest voor algen wordt hierbij geschrapt.Artikel 3De Lid-Staten doen de nodige wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen in werking treden om uiterlijk op 30 oktober 1993 aan deze richtlijn te voldoen. Zij stellen de Commissie daarvan onmiddellijk in kennis.Wanneer de Lid-Staten deze bepalingen aannemen, wordt in die bepalingen naar de onderhavige richtlijn verwezen of wordt hiernaar verwezen bij de officiële bekendmaking van die bepalingen. De regels voor deze verwijzing worden vastgesteld door de Lid-Staten.Artikel 4Deze richtlijn is gericht tot de Lid-Staten.Gedaan te Brussel, 31 juli 1992.Voor de Commissie Karel VAN MIERT Lid van de CommissieBIJLAGEDeze bijlage wordt gepubliceerd in het Publikatieblad van de Europese Gemeenschappen nr. L 383 A. (zie de mededeling op bladzijde 3 van de omslag van dit Publikatieblad)Bijlage bij Richtlijn 92/69/EEG van de Commissie van 31 juli 1992 houdende zeventiende aanpassing aan de vooruitgang van de techniek van Richtlijn 67/548/EEG van de Raad betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke stoffen(1) INHOUDINLEIDINGDEEL A: METHODEN VOOR DE BEPALING VAN DE FYSISCH-CHEMISCHE EIGENSCHAPPEN //5A.1. Smelt-/vriestemperatuur //5A.2. Kooktemperatuur //15A.3. Relatieve dichtheid //21A.4. Dampspanning //26A.5. Oppervlaktespanning //47A.6. Oplosbaarheid in water //54A.8. Verdelingscoëfficiënt //63A.9. Vlampunt //74A.10. Ontvlambaarheid (vaste stoffen) //76A.11. Ontvlambaarheid (gassen) //79A.12. Ontvlambaarheid (contact met water) //81A.13. Pyrofore eigenschappen van vaste stoffen en vloeistoffen //85A.14. Explosiegevaar //87A.15. Zelfontbrandingstemperatuur (vloeistof en gassen) //98A.16. Relatieve zelfontbrandingstemperatuur van vaste stoffen //99A.17. Oxiderende eigenschappen (vaste stoffen) //102DEEL B: METHODEN VOOR DE BEPALING VAN DE TOXICITEIT //107Algemene inleiding //107B.1. Acute orale toxiciteit //110B.1 bis. Acute orale toxiciteit - vaste-dosismethode //113B.2. Acute inhalatietoxiciteit //117B.3. Acute dermale toxiciteit //121B.4. Acute toxiciteit (huidirritatie) //124B.5. Acute toxiciteit (irritatie van het oog) //127B.6. Sensibilisatie van de huid //131B.7. Toxiciteit (oraal) bij herhaalde toediening (28 dagen) //136B.8. Toxiciteit (inhalatie) bij herhaalde toediening (28 dagen) //140B.9. Toxiciteit (dermaal) bij herhaalde toediening (28 dagen) //144B.10. Mutageniteit (in vitro cytogenetische test op zoogdieren) //148B.11. Mutageniteit (in vivo cytogenetische test op beenmerg van zoogdieren, chromosoomanalyse) //151B.12. Mutageniteit (Micronucleustest) //154B.13. Mutageniteit (Escherichia coli - terugmutatietest) //157B.14. Mutageniteit (Salmonella typhimurium - terugmutatietest) //160DEEL C: METHODEN VOOR DE BEPALING VAN DE ECOTOXICITEIT //163C.1. Acute toxiciteit voor vissen //163C.2. Acute toxiciteit voor Daphnia //172C.3. Groeiremmingstest met algen //179C.4. Biologische afbraak: bepaling van de "gemakkelijke" biologische afbreekbaarheid //187C.4-A Opgelost organisch koolstof (DOC) afvlakkingstest //194C.4-B Gewijzigde OESO-screeningstest //197C.4-C Kooldioxide (CO2) ontwikkelingstest //202C.4-D Manometrische respirometrie //207C.4-E Gesloten-fles //211C.4-F MITI-test (Ministerie van Internationale Handel en Industrie van Japan) //216Bijlagen //221C.5. Afbraak - biochemisch zuurstofverbruik //226C.6. Afbraak - chemisch zuurstofverbruik //227C.7. Afbraak - niet biologische afbraak: hydrolyse in afhankelijkheid van de pH //229INLEIDINGIn deze bijlage worden de methoden uiteengezet voor de bepaling van de fysisch-chemische, toxicologische en ecotoxicologische eigenschappen die zijn opgesomd in bijlage VII en in bijlage VIII van Richtlijn 79/831/EEG. De methoden zijn gebaseerd op die welke zijn erkend en aanbevolen door bevoegde internationale organen (in het bijzonder de OESO).Indien dergelijke methoden niet beschikbaar waren, is gebruik gemaakt van nationale normen of wetenschappelijk overeengekomen methoden. Over het algemeen moeten de tests worden verricht met de stof, zoals die in de handel wordt gebracht. Aandacht moet worden besteed aan de mogelijke invloed van verontreinigingen op de testresultaten.Indien de methoden van deze bijlage niet geschikt zijn voor onderzoek van een bepaalde eigenschap, moet de gebruikte alternatieve methode worden gemotiveerd.Dierproeven dienen te worden uitgevoerd overeenkomstig de in elk land geldende voorschriften, waarbij men zich tevens moet laten leiden door de thans alom heersende opvattingen op het gebied van het dierlijk welzijn.Bij gelijkwaardige testmethoden moet die gebruikt worden, die de minste dierenoffers eist.DEEL A: METHODEN VOOR DE BEPALING VAN DE FYSISCH-CHEMISCHE EIGENSCHAPPENA.1. SMELT-/VRIESTEMPERATUUR1. METHODEDe meeste van de beschreven methoden berusten op de testrichtlijnen van de OESO (1). De fundamentele principes worden besproken in de referenties (2) en (3).1.1. INLEIDINGDe hier beschreven methoden en toestellen dienen te worden toegepast voor de bepaling van de smelttemperatuur van stoffen, ongeacht de mate van zuiverheid ervan.De keuze van de methode hangt af van de aard van de te onderzoeken stof. De beperkende factor zal dan ook worden bepaald door de vraag of de stof al dan niet gemakkelijk, moeilijk of helemaal niet kan worden verpulverd.Voor sommige stoffen is de bepaling van de vries- of stoltemperatuur zinvoller; ook de normen voor deze bepaling werden in de methode opgenomen.Indien, als gevolg van de specifieke eigenschappen van de stof, geen van de bovenstaande parameters eenvoudig kan worden gemeten, kan een vloeipunt geschikt zijn.1.2. DEFINITIES EN EENHEDENOnder smelttemperatuur wordt verstaan de temperatuur, waarbij de faseovergang van vaste naar vloeibare toestand optreedt bij normale atmosferische druk; deze temperatuur komt in het ideale geval overeen met de vriestemperatuur.Aangezien de faseovergang bij veel stoffen over een temperatuurbereik plaatsvindt, wordt deze vaak omschreven als het smelttraject.Smelttemperatuur en -traject worden steeds uitgedrukt in K.t = T   273,15t: Celsius-temperatuur, graden Celsius ( C)T: thermodynamische temperatuur, Kelvin (K)1.3. REFERENTIESTOFFENHet is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om van tijd tot tijd de werking van de methode te controleren en om vergelijkingen met resultaten van andere methoden mogelijk te maken.In de referenties worden enige ijkstoffen genoemd (4).1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODENDe temperatuur (het temperatuurbereik), waarbij fase-overgang van vaste naar vloeibare of van vloeibare naar vaste toestand plaatsvindt, wordt bepaald. In de praktijk betekent dit dat een monster van de te onderzoeken stof bij atmosferische druk wordt verwarmd/gekoeld en dat de temperatuur in het begin- en het eindstadium van het smelt-/vriesproces wordt bepaald. Vijf onderzoekmethoden worden beschreven, namelijk: de capillaire methode, de methode met de verhitte plaat, de methode voor bepaling van de vriestemperatuur, thermische-analysemethoden, alsmede de bepaling van het vloeipunt (zoals ontwikkeld voor minerale oliën).In sommige gevallen kan het gemakkelijker zijn de vriestemperatuur te bepalen in plaats van de smelttemperatuur.1.4.1. Capillaire methode1.4.1.1. Toestellen ter bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een vloeistofbadEen kleine hoeveelheid van de verpulverde stof wordt in een capillair gebracht en stevig aangedrukt. Het buisje wordt samen met een thermometer verwarmd, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de temperatuurstijging tijdens het eigenlijke smeltproces minder dan circa 1 K/min bedraagt. De temperatuur in het begin- en eindstadium van het smeltproces wordt bepaald.1.4.1.2. Toestellen ter bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een metalen blokAls omschreven in 1.4.1.1, met dit verschil dat het capillair en de thermometer in een verwarmd metalen blok zijn aangebracht en door openingen in het blok kunnen worden waargenomen.1.4.1.3. FotoceldetectieHet monster in het capillair wordt automatisch verhit in een metalen cilinder. Een lichtbundel wordt, via openingen in de cilinder, door de stof heen op een nauwkeurig geijkte fotocel gericht. De optische eigenschappen van de meeste stoffen veranderen van ondoorschijnend naar doorschijnend bij het smelten. Zodra de lichtintensiteit die de fotocel bereikt toeneemt, zendt deze een stopsignaal naar de digitale meter die de temperatuur afleest van een thermometer met platinaweerstand in de verwarmingskamer. Deze methode leent zich niet voor toepassing op sommige sterk gekleurde stoffen.1.4.2. Methode waarbij gebruik wordt gemaakt van een verhit oppervlak (hot stage)1.4.2.1. De verhitte staaf volgens KoflerDe verhitte staaf volgens Kofler bestaat uit twee stukken metaal die een verschillend warmtegeleidingsvermogen bezitten en elektrisch worden verwarmd. De staaf is zo ontworpen dat de temperatuur nagenoeg lineair langs de lengte ervan varieert. De temperatuur van de verhitte staaf kan variëren van 283 K tot 573 K; de temperatuur wordt met een voor elke staaf afzonderlijk geijkt ruitertje (met wijzer) afgelezen. Om een smelttemperatuur te bepalen, wordt de stof in een dunne laag direct op het oppervlak van de verhitte staaf gebracht. Binnen enkele seconden ontstaat er een scherpe scheidingslijn tussen de vloeibare en de vaste fase. De wijzer wordt ingesteld op de scheidingslijn, waarna de temperatuur kan worden afgelezen.1.4.2.2. SmeltpuntmicroscoopEr bestaan verschillende verhitte platen voor microscopische smelttemperatuurbepaling waarbij met zeer kleine hoeveelheden materiaal kan worden gewerkt. Bij de meeste verhitte platen wordt de temperatuur gemeten met een gevoelig thermokoppel, maar bij sommige met een kwikthermometer. Een toestel voor microscopische bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een verhitte plaat bestaat meestal uit een verwarmingskamer met een metalen plaat waarop het monster op een voorwerpglaasje wordt geplaatst. In het midden van de metalen plaat is een opening aangebracht zodat deze het licht van de microscoop doorlaat. Tijdens het gebruik wordt, om lucht uit de verwarmingskamer te weren, deze met een glazen plaat afgesloten.De verwarming van het monster wordt ingesteld met een regelweerstand. Voor zeer nauwkeurige metingen bij optisch anisotrope stoffen kan gebruik worden gemaakt van gepolariseerd licht.1.4.2.3. De meniscusmethodeDeze methode wordt speciaal toegepast voor polyamiden.Bepaling van de temperatuur, waarbij de verplaatsing van een meniscus van siliconenolie die tussen een verhit oppervlak (hot stage) en een dekglas, geplaatst op het te onderzoeken polyamidemonster, is ingesloten, visueel wordt waargenomen.1.4.3. Methode voor de bepaling van de vriestemperatuurHet monster wordt in een speciaal proefbuisje in een toestel geplaatst voor de bepaling van de vriestemperatuur. Tijdens de afkoeling wordt het monster voortdurend zachtjes geroerd en de temperatuur wordt regelmatig afgelezen en geregistreerd. Zodra de temperatuur gedurende enkele aflezingen constant blijft, wordt deze temperatuur (na correctie voor afwijking van de thermometer) geregistreerd als de vriestemperatuur.Onderkoeling moet worden voorkomen door een evenwicht te bewaren tussen de vaste en de vloeibare fase.1.4.4. Thermische analyse1.4.4.1. Differentiële thermische analyse (DTA)Met deze techniek wordt het verschil in temperatuur geregistreerd tussen de te onderzoeken stof en een referentiestof als functie van de temperatuur, wanneer beide stoffen aan hetzelfde gecontroleerde temperatuurprogramma worden blootgesteld. Als het monster een faseovergang doormaakt met verandering van enthalpie, zal deze verandering aangetoond worden door een endotherme (smelten) of exotherme (bevriezen) afwijking van de basislijn van de temperatuurregistratie.1.4.4.2. Differentiële scanningcalorimetrie (DSC)Deze techniek registreert het verschil tussen de energieopname van de te onderzoeken stof en een referentiestof als functie van de temperatuur, wanneer beide stoffen aan hetzelfde gecontroleerde temperatuurprogramma worden onderworpen. Deze energie is de energie die nodig is om dezelfde temperatuur voor beide stoffen te bereiken. Als het monster een faseovergang doormaakt met verandering van enthalpie, zal deze verandering aangetoond worden door een endotherme (smelten) of exotherme (bevriezen) afwijking van de basislijn van de warmtestroomregistratie.1.4.5. VloeipuntDeze methode werd ontwikkeld voor minerale oliën en is bruikbaar voor olieachtige stoffen met lage smelttemperaturen.Na voorafgaande verwarming wordt het monster afgekoeld met een specifieke snelheid en telkens, iedere 3 K, onderzocht op vloeikarakteristieken. De laagste temperatuur waarbij nog beweging van de vloeistof wordt gezien, wordt genoteerd als het vloeipunt.1.5. KWALITEITSCRITERIADe toepasbaarheid en nauwkeurigheid van de verschillende methoden voor de bepaling van smelttemperaturen/smelttrajecten staat vermeld in de tabel.TABEL: TOEPASBAARHEID VAN DE METHODEN>RUIMTE VOOR DE TABEL>>RUIMTE VOOR DE TABEL>>RUIMTE VOOR DE TABEL>>RUIMTE VOOR DE TABEL>1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODENDe aan te houden werkwijzen van bijna alle testmethoden staan beschreven in internationale en nationale normen (zie aanhangsel 1).1.6.1. Methoden waarbij gebruik wordt gemaakt van een capillairBij een trage temperatuurstijging zullen verpulverde stoffen doorgaans volgens de in figuur 1 weergegeven stadia verlopen.Figuur 1>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Stadium A (begin van het smeltproces): fijne druppeltjes hangen op uniforme wijze aan de binnenwand van het capillair.Stadium B er ontstaat ruimte tussen het monster en de binnenwand wegens krimpen van het monster.Stadium C het gekrompen monster begint in te storten en wordt vloeibaar.Stadium D op de oppervlakte wordt een volledige meniscus gevormd, maar een aanzienlijk gedeelte van het monster is nog vast.Stadium E (eindstadium van het smeltproces): er zijn geen vaste deeltjes meer.Tijdens de smelttemperatuurbepaling wordt de temperatuur in het begin- en eindstadium van het smeltproces geregistreerd.1.6.1.1. Toestellen ter bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een vloeistofbadIn figuur 2 is een genormaliseerd glazen apparaat voor smelttemperatuurbepaling (JIS K 0064) afgebeeld. Alle specificaties zijn opgegeven in mm.Figuur 2>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>A: MeetvatB: KurkC: OpeningD: ThermometerE: Hulpthermometer F: VloeistofbadG: Glazen capillair met een lengte van 80 tot 100 mm inwendige zijdelingse diameter: 1,0 ± 0,2 mm, wanddikte: 0,2 tot 0,3 mm H: ZijbuisBadvloeistofEr moet een geschikte badvloeistof bepaald worden. De keuze van de vloeistof is afhankelijk van de smelttemperatuur van de te onderzoeken stof, bij voorbeeld vloeibare paraffine voor stoffen met een smelttemperatuur van maximaal 473 K, siliconenolie voor stoffen met een smelttemperatuur van maximaal 573 K.Voor stoffen met een smelttemperatuur hoger dan 523 K kan een mengsel, bestaande uit drie delen zwavelzuur en twee delen kaliumsulfaat (naar massa), worden gebruikt. Passende voorzorgsmaatregelen dienen te worden genomen wanneer een dergelijk mengsel wordt gebruikt.ThermometerEr mag alleen gebruik worden gemaakt van thermometers die aan de eisen in de volgende of daarmee overeenkomende normen voldoen:ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.WerkwijzeDe droge stof wordt verpulverd in een mortier en in een aan één uiteinde dichtgesmolten capillair gebracht en wel zo dat het niveau van de vulling, nadat de stof stevig is aangedrukt, circa 3 mm bedraagt. Ten einde een gelijkvormig aangedrukt monster te verkrijgen, laat men het capillair vanaf een hoogte van circa 700 mm door een glazen buis verticaal op een horlogeglas vallen.Het gevulde capillaire buisje wordt in een bad geplaatst en wel zo dat het midden van de kwikbol van de thermometer het capillair ter hoogte van het monster aanraakt. Doorgaans wordt het capillair in het toestel gebracht bij ongeveer 10 K beneden de smelttemperatuur.De badvloeistof wordt zodanig verwarmd dat de temperatuurstijging circa 3 K/min bedraagt. De vloeistof moet worden geroerd. Bij ongeveer 10 K beneden de verwachte smelttemperatuur wordt de snelheid van de temperatuurstijging ingesteld op ten hoogste 1 K/min.BerekeningDe smelttemperatuur wordt als volgt berekend:T  =  TD + 0,00016 (TD   TE) nwaarin:T = de gecorrigeerde smelttemperatuur, uitgedrukt in KTD = de van thermometer D afgelezen temperatuur, in KTE = de van thermometer E afgelezen temperatuur, in Kn = het aantal schaalverdelingen van het kwikdraad op het uitstekende gedeelte van thermometer D.1.6.1.2. Toestellen ter bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een metalen blokApparatuurDe apparatuur bestaat uit:- een cilindervormig metalen blok, waarvan het bovenste gedeelte hol is en een kamer vormt (zie figuur 3);- een metalen stop met twee of meer openingen waarlangs buisjes in het metalen blok kunnen worden gebracht;- een verwarmingssysteem voor het metalen blok, bij voorbeeld een in het blok ingesloten elektrische weerstand;- een regelbare weerstand voor de stroomtoevoer, indien van elektrische verwarming gebruik wordt gemaakt;- in de zijwanden van de kamer, in rechte hoeken ten opzichte van elkaar, vier vensters van hittebestendig glas; voor één van deze vensters is een oculair aangebracht, waardoor het capillair kan worden waargenomen, de overige drie vensters worden gebruikt voor de verlichting van de kamer en inhoud daarvan;- een aan één uiteinde gesloten capillair van hittebestendig glas (zie 1.6.1.1).ThermometerZie de in 1.6.1.1 genoemde normen.Thermo-elektrische meetinstrumenten van vergelijkbare nauwkeurigheid kunnen ook worden gebruikt.Figuur 3>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>1.6.1.3. FotoceldetectieApparatuur en werkwijze:Het apparaat bestaat uit een metalen kamer met een geautomatiseerd verwarmingssysteem. Drie capillairen worden overeenkomstig 1.6.1.1 gevuld en in de oven geplaatst.Er zijn verscheidene lineaire temperatuurstijgingen beschikbaar voor het ijken van het apparaat; de gewenste temperatuurstijging wordt elektrisch ingesteld met een van tevoren gekozen constante snelheid en heeft een lineair verloop. Recorders geven de werkelijke oventemperatuur en de temperatuur van de stof in het capillair aan.1.6.2. Verwarmde oppervlakken (hot stages)1.6.2.1. De verhitte staaf volgens KoflerZie aanhangsel.1.6.2.2. SmeltpuntmicroscoopZie aanhangsel.1.6.2.3. Meniscusmethode (polyamiden)Zie aanhangsel.De opwarmsnelheid bij temperaturen in de buurt van de smelttemperatuur moet minder zijn dan 1 K/min.1.6.3. Methoden voor de vriestemperatuurbepalingZie aanhangsel.1.6.4. Thermische analyse1.6.4.1. Differentiële thermische analyseZie aanhangsel.1.6.4.2. Differentiële scanningcalorimetrieZie aanhangsel.1.6.5. Bepaling van het vloeipuntZie aanhangsel.2. GEGEVENSSoms is een thermometercorrectie noodzakelijk.3. RAPPORTAGEIn het eindverslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- de gebruikte methode;- de nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen) en, indien van toepassing, voorafgaande zuivering;- een schatting van de nauwkeurigheid.Het gemiddelde van ten minste twee metingen die binnen de geschatte nauwkeurigheidsgrenzen (zie tabellen) vallen, wordt gerapporteerd als smelttemperatuur.Als het temperatuurverschil tussen het beginpunt en het eindpunt van het smelten binnen de nauwkeurigheidsgrenzen van de methode valt, wordt de temperatuur van het eindstadium genomen als de smelttemperatuur; zo niet, dan moeten beide temperaturen worden gerapporteerd.Als ontleding of sublimatie van de onderzochte stof optreedt voordat de smelttemperatuur is bereikt, dient de temperatuur waarbij dit effect optreedt, te worden gerapporteerd.Alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof, dienen te worden gerapporteerd.4. LITERATUUR(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102 - Decision of the Council C(81) 30 Final.(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803-834.(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter VII.(4) IUPAC, Physicochemical Measurements: Catalogue of Reference Materials from National Laboratories, Pure and Applied Chemistry, 1976, Vol. 48, 505-515.AanhangselVoor aanvullende technische gegevens kunnen de volgende normen als voorbeeld worden geraadpleegd.1. Capillaire methoden1.1. Smelttemperatuurtoestellen met een vloeistofbadASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicalsBS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting rangeDIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach KapillarverfahrenJIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products1.2. Smelttemperatuurtoestellen met een metalen blokDIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen KunststoffenISO 1218 (E) Plastics - polyamides - determination of "melting point"2. Hete oppervlakken2.1. Verwarmde staaf volgens KoflerANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings2.2. SmeltpuntmicroscoopDIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen2.3. Meniscusmethode (polyamiden)ISO 1218 (E) Plastics - polyamides - determination of "melting point"ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materialsNF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination du "point de fusion". Méthode du ménisque.3. Methoden voor vriestemperatuurbepalingBS 4633 Method for the determination of crystallizing pointBS 4695 Method for determination of melting point of petroleum wax (cooling curve)DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und MotorenbenzolenISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la température de figeageDIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von FettsäurenNF T 60-114 Point de fusion des paraffinesNF T 20-051 Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation)ISO 1392 Method for the determination of the freezing point4. Thermische analyse4.1. Differentiële thermische analyseASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysisASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysisASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical dataDIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe4.2. Differentiële scanningcalorimetrie ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysisASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysisASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical dataDIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe5. Bepaling van het vloeipuntNBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite - Monsterneming en ontleding van aardolieprodukten: Troebelingspunt en vloeipuntASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oilsISO 3016 Petroleum oils - Determination of pour pointA.2. KOOKTEMPERATUUR1. METHODEDe meeste van de beschreven methoden berusten op de testrichtlijn van de OESO (1). De fundamentele principes worden besproken in de referenties (2) en (3).1.1. INLEIDINGDe hier beschreven methoden en toestellen kunnen worden toegepast op vloeistoffen en op bij lage temperatuur smeltende stoffen, welke beneden de kooktemperatuur geen chemische reactie ondergaan (bijvoorbeeld: auto-oxidatie, omlegging, ontleding, enz.). De methoden zijn van toepassing op zuivere en onzuivere vloeistoffen.De meeste aandacht wordt gegeven aan de fotoceldetectiemethode en thermische analysemethode, omdat hiermee zowel smelt- als kooktemperaturen kunnen worden bepaald. Bovendien kunnen deze metingen worden geautomatiseerd.Het voordeel van de dynamische methode is, dat deze ook kan worden toegepast voor de bepaling van de dampspanning en dat het niet nodig is de kooktemperatuur te corrigeren tot normale druk (101,325 kPa) omdat de normale druk tijdens de meting kan worden ingesteld met behulp van een manostaat.Opmerkingen:De invloed van verontreinigingen op de bepaling van de kooktemperatuur is sterk afhankelijk van de aard van de verontreiniging. Indien in het monster vluchtige verontreinigingen aanwezig zijn, die de resultaten zouden kunnen be¨ unvloeden, kan de stof worden gezuiverd.1.2. DEFINITIES EN EENHEDENDe normale kooktemperatuur wordt gedefinieerd als de temperatuur waarbij de dampdruk van een vloeistof gelijk is aan 101,325 kPa.Als de kooktemperatuur niet wordt gemeten bij normale atmosferische druk, kan de temperatuur-afhankelijkheid van de dampdruk worden beschreven met de vergelijking van Clausius-Clapeyron:log p = 2,3 RTD Hv + constantewaarin:p = de dampspanning van de stof in pascal (Pa)Ä Hv = de verdampingswarmte in J mol 1R = de universele molaire gasconstante = 8,314 J mol 1 K 1T = de thermodynamische temperatuur in K.Bij vermelding van de kooktemperatuur moet de druk tijdens de meting worden opgegeven.HerleidingenDruk (eenheid: kPa)100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa("bar" is nog toegestaan, doch het gebruik hiervan wordt niet aanbevolen).133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr(de eenheden mm Hg en Torr zijn niet meer toegestaan).1 atm = standaardatmosfeer = 101 325 Pa(de eenheid "atm" is niet toegestaan)Temperatuur (eenheid: K)t = T   273,15t: Celsiustemperatuur, graden Celsius ( C)T: thermodynamische temperatuur, kelvin (K)1.3. REFERENTIESTOFFENHet is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Referentiestoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om zo nu en dan de werking van de methode te controleren en om vergelijking met de resultaten van andere methoden mogelijk te maken.Een aantal ijkstoffen is te vinden in de methoden die zijn opgenomen in het aanhangsel.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODENVijf methoden voor de bepaling van de kooktemperatuur (of kooktraject) berusten op de meting van de kooktemperatuur, twee andere op thermische analyse.1.4.1. Bepaling met behulp van een ebullioscoopDe ebullioscoop is oorspronkelijk ontwikkeld voor de bepaling van het molecuulgewicht via de kooktemperatuurverhoging, doch leent zich ook voor nauwkeurige metingen van de kooktemperatuur. Een zeer eenvoudig toestel is beschreven in ASTM D 1120-72 (zie aanhangsel). De vloeistof wordt in dit toestel onder evenwichtscondities bij atmosferische druk verwarmd totdat zij kookt.1.4.2. Dynamische methodeBij deze methode meet men de condensatietemperatuur van de damp met behulp van een geschikte thermometer in de reflux tijdens het koken. De druk kan bij deze methode worden gevarieerd.1.4.3. Destillatiemethode voor kooktemperatuurBij deze methode destilleert men de vloeistof en meet men de condensatietemperatuur van de damp, alsmede de hoeveelheid destillaat.1.4.4. Methode volgens SiwoloboffBij deze methode verwarmt men het monster in een monsterbuisje, dat in een verwarmd vloeistofbad wordt gehouden. Een dichtgesmolten capillair met een luchtbel onderin wordt in het monsterbuisje gebracht.1.4.5. FotoceldetectieNaar het beginsel volgens Siwoloboff worden de opstijgende bellen automatisch gemeten met een fotocel.1.4.6. Differentiële thermische analyseMet deze techniek wordt het verschil in temperatuur geregistreerd tussen de te onderzoeken stof en een referentiestof als functie van de temperatuur, wanneer beide stoffen aan hetzelfde gecontroleerde temperatuurprogramma worden blootgesteld. Als het monster een faseovergang doormaakt met verandering van enthalpie, zal deze verandering aangetoond worden door een endotherme afwijking (koken) van de basislijn van de temperatuurregistratie.1.4.7. Differentiële scanningcalorimetrieDeze techniek registreert het verschil tussen de energieopname van de te onderzoeken stof en een een referentiestof als functie van de temperatuur, wanneer beide stoffen aan hetzelfde gecontroleerde temperatuurprogramma worden onderworpen. Deze energie is de energie die nodig is om dezelfde temperatuur voor beide stoffen te bereiken. Als het monster een faseovergang doormaakt met verandering van enthalpie zal deze verandering aangetoond worden door een endotherme afwijking (koken) van de basislijn van de warmtestroomregistratie.1.5. KWALITEITSCRITERIADe toepasbaarheid en nauwkeurigheid van de verschillende methoden voor de bepaling van de kooktemperatuur/kooktraject staan vermeld in tabel 1.>RUIMTE VOOR DE TABEL>1.6. BESCHRIJVING VAN DE METHODENDe werkwijzen van een aantal testmethoden zijn beschreven in internationale en nationale normen (zie aanhangsel).1.6.1. EbullioscoopZie aanhangsel.1.6.2. Dynamische methodeZie testmethode A.4 voor de bepaling van de dampspanning.De waargenomen kooktemperatuur bij een druk van 101,325 kPa wordt geregistreerd.1.6.3. Destillatiemethode (kooktraject)Zie aanhangsel.1.6.4. Methode volgens SiwoloboffHet monster wordt verwarmd in een smelttemperatuurtoestel in een monsterbuisje met een diameter van ongeveer 5 mm (figuur 1).In figuur 1 staat een standaardapparaat voor de bepaling van de smelt- en kooktemperatuur (JIS K 0064) afgebeeld (glas, alle afmetingen in mm).Figuur 1>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>A: MeetvatB: KurkC: OpeningD: ThermometerE: HulpthermometerF: VloeistofbadG: Monsterbuisje: buitendiameter maximaal 5 mm; met daarin een capillair met een lengte van ongeveer 100 mm en een binnendiameter van circa 1 mm en een wanddikte van circa 0,2 tot 0,3 mmH: Zijbuis Een capillair (kookcapillair) dat op ongeveer 1 cm boven het ondereind is dichtgesmolten, wordt in het monsterbuisje gebracht. Het monsterbuisje wordt met de te onderzoeken stof gevuld, totdat het dichtgesmolten deel van het capillair zich onder het vloeistofoppervlak bevindt. Het monsterbuisje met het kookcapillair wordt met een elastiekje aan de thermometer bevestigd of met een zijstuk vastgezet (zie figuur 2).Figuur 2>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Beginsel volgens SiwoloboffFiguur 3>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Gewijzigd beginselDe badvloeistof wordt gekozen aan de hand van de kooktemperatuur. Bij temperaturen tot 573 K kan siliconenolie worden gebruikt. Vloeibare paraffine mag slechts worden gebruikt bij temperaturen tot 473 K. De verwarming van het vloeistofbad moet zo geregeld zijn, dat de temperatuur aanvankelijk 3 K/min stijgt. Het vloeistofbad moet worden geroerd. Bij ongeveer 10 K beneden de verwachte kooktemperatuur moet de verwarming zo worden ingesteld dat de temperatuur met minder dan 1 K/min stijgt. Zodra de kooktemperatuur wordt bereikt, beginnen er snel belletjes uit het kookcapillair te komen.De kooktemperatuur wordt bereikt wanneer, bij tijdelijke afkoeling, de bellenvorming stopt en de vloeistof plotseling in het capillair omhoog komt. De bijbehorende stand van de thermometer is de kooktemperatuur van de te onderzoeken stof.Bij het gewijzigd beginsel (figuur 3) wordt de kooktemperatuur bepaald in een smelttemperatuurcapillair. Deze wordt uitgetrokken tot een fijne punt van ongeveer 2 cm lengte, waarin een geringe hoeveelheid van het monster wordt opgezogen. Het open einde van de fijne punt wordt dicht gesmolten, zodat er zich onderin een kleine luchtbel bevindt (a). Bij verwarming in het smelttemperatuur toestel (b) zet de luchtbel uit. De kooktemperatuur komt overeen met de temperatuur waarbij de prop van de te onderzoeken stof op het niveau van het vloeistofoppervlak komt (c).1.6.5. FotoceldetectieHet monster wordt verwarmd in een capillair in een verwarmd metaalblok.Via geschikte openingen in het blok wordt een lichtbundel door de stof heen op een zorgvuldig geijkte fotocel gericht.Terwijl de temperatuur van het monster oploopt, komen er luchtbellen uit het kookcapillair. Wanneer de kooktemperatuur wordt bereikt, neemt het aantal bellen flink toe. Hierbij verandert de intensiteit van het licht dat op de cel valt, waardoor het apparaat wordt stilgezet dat de temperatuur afleest van een thermometer met platina weerstand die in het blok is gemonteerd.Deze methode is bijzonder nuttig omdat hiermee ook bepalingen mogelijk zijn beneden kamertemperatuur tot 253,15 K (  20  C) zonder enige veranderingen in de apparatuur. Het instrument moet alleen in een koelbad worden geplaatst.1.6.6. Thermische analyse1.6.6.1. Differentiële thermische analyseZie aanhangsel.1.6.6.2. Differentiële scanningcalorimetrieZie aanhangsel.2. GEGEVENSBij kleine afwijkingen van de normale druk (max. ± 5 kPa) worden de kooktemperaturen genormaliseerd tot Tn met behulp van de volgende numerieke vergelijking van Sidney Young:Tn = T + (fT × D p)waarin:Ä p = (101,325   p), [let op het teken]p = barometerstand in kPa,fT = tempo waarin de kooktemperatuur verandert met de druk in K/kPa,T = gemeten kooktemperatuur in K,Tn = kooktemperatuur gecorrigeerd tot normale druk in K.De temperatuurcorrectiefactoren fT en de vergelijkingen voor de benadering daarvan zijn opgenomen in de internationale en nationale normen die hierboven voor een groot aantal stoffen zijn genoemd.Zo worden bijvoorbeeld in de methode DIN 53171 de volgende (bij benadering) correcties vermeld voor oplosmiddelen in verf (zie tabel 2).>RUIMTE VOOR DE TABEL>3. RAPPORTAGEIn het eindverslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- de gebruikte methode;- een nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen) en, indien van toepassing, voorafgaande zuivering;- een schatting van de nauwkeurigheid;Het gemiddelde van ten minste twee metingen die binnen de geschatte nauwkeurigheidsgrenzen (zie tabel 1) vallen, wordt genoteerd als kooktemperatuur.De gemeten kooktemperaturen en hun gemiddelde moeten worden opgegeven, alsmede de druk(ken), waarbij de metingen zijn uitgevoerd, in kPa. De druk dient bij voorkeur dicht bij de normale atmosferische druk te liggen.Alle gegevens en opmerkingen, die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof, dienen te worden gerapporteerd.4. LITERATUUR(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103 - Decision of the Council C(81)30 Final.(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II.(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol.I, Part I, Chapter VIII.AanhangselVoor aanvullende technische gegevens kunnen de volgende normen als voorbeeld worden geraadpleegd:1. EbullioscoopASTM D 1120-72 Standard Test Method for Boiling Point of Engine Anti-freezes2. Destillatieprocess (kooktraject)ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range)BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum productsBS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristicsDIN 53171 Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des SiedeverlaufesNF T 20-608 Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation3. Differentiële thermische analyse en differentiële scanningcalorimetrieASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysisASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysisASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical dataDIN 51005 Thermische Analyse: BegriffeA.3. RELATIEVE DICHTHEID1. METHODEDe beschreven methoden berusten op de testrichtlijn van de OESO (1). De fundamentele principes worden besproken in referentie (2).1.1. INLEIDINGDe hieronder beschreven methoden voor het bepalen van de relatieve dichtheid zijn van toepassing op vaste stoffen en op vloeistoffen, ongeacht de zuiverheid van deze stoffen. De verschillende methoden zijn vermeld in tabel 1.1.2. DEFINITIES EN EENHEDENDe relatieve dichtheid, D420, van vaste stoffen of vloeistoffen is de verhouding tussen de massa van een volume te onderzoeken stof bij 20  C en de massa van hetzelfde volume water bij 4  C. De relatieve dichtheid heeft geen dimensie.De dichtheid, ñ, van een stof is het quotiënt van de massa m en het volume v van deze stof.De dichtheid, ñ, wordt uitgedrukt in kg/m3 (SI-eenheden).1.3. REFERENTIESTOFFEN (1) (3)Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om zo nu en dan de werking van de methode te controleren en om vergelijkingen met resultaten van andere methodes mogelijk te maken.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODENEr worden vier soorten methoden gebruikt.1.4.1. Methoden gebaseerd op de opwaartse kracht1.4.1.1. Areometer (hydrometer voor vloeistoffen)Voldoende nauwkeurige en snelle dichtheidsbepalingen kunnen worden uitgevoerd met drijvende areometers; het gedeelte van de areometer dat in de vloeistof zakt, is bepalend voor de dichtheid van de vloeistof en kan van een schaalverdeling worden afgelezen.1.4.1.2. Hydrostatische balans (voor vloeistoffen en vaste stoffen)Het gewichtsverschil van een monster, gemeten in lucht en in een geschikte vloeistof (bij voorbeeld water), kan worden gebruikt om de dichtheid ervan te bepalen.Voor vaste stoffen geldt de gemeten dichtheid slechts voor het bewuste monster. Voor het bepalen van de dichtheid van vloeistoffen wordt een voorwerp met volume v eerst in lucht en vervolgens in de testvloeistof gewogen.1.4.1.3. Methode met ondergedompeld voorwerp (voor vloeistoffen) (4)Bij deze methode wordt de dichtheid van een vloeistof bepaald aan de hand van het verschil tussen de resultaten van een weging van de vloeistof voor en na het onderdompelen van een voorwerp met bekend volume in de te onderzoeken vloeistof.1.4.2. Methoden met de pyknometerVoor vaste stoffen en vloeistoffen kunnen pyknometers van uiteenlopende vorm en met bekend volume worden gebruikt. De dichtheid wordt berekend uit het verschil in gewicht tussen de volle en de lege pyknometer en het bekende volume daarvan.1.4.3. Vergelijkingspyknometer met lucht (voor vaste stoffen)De dichtheid van een vaste stof in willekeurige vorm kan bij kamertemperatuur worden gemeten met behulp van een gasvergelijkingspyknometer. Het volume van een stof wordt in lucht of in een inert gas gemeten in een cilinder waarvan het variabele volume gekalibreerd is. Voor de berekening van de dichtheid wordt na meting van het volume een massameting verricht.1.4.4. Oscillerende dichtheidsmeter (5) (6) (7)De dichtheid van een vloeistof kan worden gemeten met behulp van een oscillerende dichtheidsmeter. Een mechanische oscillator in de vorm van een U-buis wordt in trilling gebracht bij de resonantiefrequentie van de oscillator die afhankelijk is van zijn massa. Bij het inbrengen van een monster verandert de resonantiefrequentie van de oscillator. Het apparaat moet worden geijkt met twee vloeistoffen van bekende dichtheid. Deze ijkstoffen moeten bij voorkeur zo worden gekozen dat de dichtheden ervan zich aan de uiteinden van het meetbereik bevinden.1.5. KWALITEITSCRITERIADe toepasbaarheid van de verschillende methoden voor bepaling van de relatieve dichtheid staat vermeld in de tabel.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODENNormen, die als voorbeeld kunnen worden geraadpleegd voor aanvullende technische gegevens, zijn bijgevoegd in het aanhangsel.De proeven moeten worden uitgevoerd bij 20  C en ten minste in tweevoud.2. GEGEVENSZie normen.3. RAPPORTAGEIn het eindverslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- de gebruikte methode;- een nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen) en, indien van toepassing, voorafgaande zuivering.De relatieve dichtheid D420 dient te worden gerapporteerd zoals gedefinieerd onder 1.2, alsmede de fysische toestand van de onderzochte stof.Alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof, dienen te worden gerapporteerd.>RUIMTE VOOR DE TABEL>4. LITERATUUR(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final.(2) R. Weissberger ed., Technique of organic chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I.(3) IUPAC, Recommended reference materials for realisation of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508.(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm; 1979, Vol. 11, 427-430.(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297-302.(6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen - Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717-726.(7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253-255.AanhangselVoor aanvullende technische gegevens kunnen de volgende normen als voorbeeld worden geraadpleegd:1. METHODEN GEBASEERD OP DE OPWAARTSE KRACHT1.1. AreometerDIN 12790, ISO 387 Areometer; algemene aanwijzingenDIN 12791 Deel I: Dichtheidsareometers: constructie, instelling en gebruikDeel II: Dichtheidsareometers: genormaliseerde maten, benaming.Deel III: Gebruik en testISO 649-2 Laboratoriumglaswerk: Dichtheidsareometers voor algemeen gebruikNF T 20-050 Chemische produkten voor industrieel gebruik - Bepaling van dichtheid van vloeistoffen - AreometermethodeDIN 12793 Laboratoriumglaswerk: areometers voor bepaling van het meetbereik1.2. Hydrostatische balansVoor vaste stoffenISO 1183 Methode A: Methoden voor het bepalen van de dichtheid en relatieve dichtheid van kunststoffen met uitzondering van schuimplasticsNF T 20-049 Chemische produkten voor industrieel gebruik - Bepaling van dichtheid van vaste stoffen uitgezonderd poeders en schuimprodukten - Hydrostatische balansmethodeASTM D 792 Soortelijk gewicht en dichtheid van kunststoffen door verplaatsing.DIN 53479 Proeven voor kunststoffen en elastomeren: bepaling van de dichtheid.Voor vloeistoffenISO 901 ISO 758DIN 51757 Proeven voor minerale oliën en verwante materialen: bepaling van de dichtheidASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 en ASTM D 1481-62ASTM D 1298 Dichtheid, soortelijk gewicht of API-gewicht van ruwe aardolie en vloeibare aardolieprodukten met de areometermethodeBS 4714 Dichtheid, soortelijk gewicht of API-gewicht van ruwe aardolie en vloeibare aardolieprodukten met de areometermethode1.3. Methode met ondergedompeld voorwerpDIN 53217 Proeven voor verf, vernis en soortgelijke produkten; dichtheidsbepaling met de methode met ondergedompeld voorwerp2. PYKNOMETERMETHODEN2.1. Voor vloeistoffenISO 3507 PyknometersISO 758 Vloeibare chemische produkten; bepaling van de dichtheid bij 20  CDIN 12797 Gay-Lussac pyknometer (voor niet-vluchtige vloeistoffen die niet al te visceus zijn)DIN 12798 Lipkin pyknometer (voor vloeistoffen met een kinematische viscositeit van minder dan 100,10 6 m2 s 1 bij 15  C)DIN 12800 Sprengel pyknometer (voor vloeistoffen zoals in DIN 12798)DIN 12801 Reischauer pyknometer (voor vloeistoffen met een kinematische viscositeit van minder dan 100,10 6 m2s 1 bij 20  C, vooral ook toepasbaar op koolwaterstoffen en oplossingen in water, alsmede op vloeistoffen met een hogere dampdruk, ongeveer 1 bar bij 90  C)DIN 12806 Hubbard pyknometer (voor alle soorten visceuze vloeistoffen met een niet al te hoge dampdruk, in het bijzonder voor verven, vernissen en bitumen)DIN 12807 Bingham pyknometer (voor vloeistoffen zoals in DIN 12801)DIN 12808 Jaulmes pyknometer (in het bijzonder voor mengsels van ethanol en water)DIN 12809 Pyknometer met ingeslepen thermometer en capillaire zijbuis (voor vloeistoffen die niet al te visceus zijn)DIN 53217 Proeven voor verven, vernissen en soortgelijke produkten; bepaling van de dichtheid met behulp van een pyknometerDIN 51757 Punt 7: Proeven voor minerale oliën en verwante materialen; bepaling van de dichtheidASTM D 297 Hoofdstuk 15: Rubberprodukten - chemische analyseASTM D 2111 Methode C: Organische halogeenverbindingenBS 4699 Methode voor het bepalen van soortelijk gewicht en dichtheid van aardolieprodukten (met behulp van een bicapillaire pyknometer met schaalverdeling)BS 5903 Methode voor het bepalen van de relatieve dichtheid en dichtheid van aardolieprodukten met behulp van een pyknometer met capillaire stopNF T 20-053 Chemische produkten voor industrieel gebruik - Bepaling van dichtheid van vaste stoffen in poeders en vloeistoffen - Pyknometermethode2.2. Voor vaste stoffenISO 1183 Methode B: Methode voor het bepalen van de dichtheid en relatieve dichtheid van kunststoffen, met uitzondering van schuimplasticsNF T 20-053 Chemische produkten voor industrieel gebruik - Bepaling van dichtheid van vaste stoffen in poeder en vloeistoffen - PyknometermethodeDIN 19683 Bepaling van de bodemdichtheid3. VERGELIJKINGSPYKNOMETER MET LUCHTDIN 55990 Deel 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der DichteDIN 53243 Anstrichstoffe; chlorhaltige Polymere; PrüfungA.4. DAMPSPANNING1. METHODEDe meeste van de beschreven methoden berusten op de testrichtlijn van de OESO (1). De fundamentele principes worden besproken in referenties (2) en (3).1.1. INLEIDINGVoor het uitvoeren van deze test is het nuttig om van tevoren te beschikken over gegevens inzake de structuur, de smelttemperatuur en de kooktemperatuur van de stof.Er bestaat geen meetmethode die voor alle mogelijke waarden van de dampspanning van toepassing is. Er worden daarom verschillende methoden aanbevolen voor het meten van de dampspanning van RUIMTE VOOR DE TABEL>1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN1.6.1. Dynamische meting1.6.1.1. ApparatuurDe meetapparatuur bestaat uit een kookvat met glazen of metalen koeler en voorzieningen voor het meten van temperatuur en het regelen en meten van druk. De meetapparatuur die in figuur 1 is afgebeeld, is van hittebestendig glas en bestaat uit vijf delen:De grote, gedeeltelijk dubbelwandige buis bestaat uit een glazen slijpstuk, een koeler, een koelvat en een inlaatbuis.De glazen cilinder met een Cottrell-pomp is gemonteerd in het kookgedeelte van de buis en heeft een ruw oppervlak van gebroken glas om "stoten" tijdens het kookproces te voorkomen.De temperatuur wordt gemeten met behulp van een geschikte temperatuursensor (bij voorbeeld een weerstandsthermometer of een thermokoppel), doorgevoerd in het apparaat tot op de plaats van het meetpunt (nr. 5, figuur 1) via een goed passende opening (bij voorbeeld geslepen insteekverbinding).De noodzakelijke aansluitingen met de apparatuur voor het regelen en meten van de druk worden gemaakt.De bol, die als buffervolume werkt, is verbonden met de meetapparatuur door middel van een capillaire buis.Het kookvat wordt verwarmd met een verwarmingselement (bij voorbeeld een verwarmingspatroon) dat onderin de glazen apparatuur is aangebracht. De gewenste verwarmingsstroom wordt ingesteld en geregeld door middel van een thermokoppel.Het vereiste vacuüm tussen 102 Pa en ongeveer 105 Pa wordt aangelegd met een vacuümpomp.Voor het regelen van druk (meetbereik van ongeveer 102 Pa tot 105 Pa) en ventilatie wordt een passende kraan voor lucht of stikstoftoevoer gebruikt.Voor het meten van de druk wordt een manometer gebruikt.1.6.1.2. MeetprocedureDe dampspanning wordt gemeten door de kooktemperatuur van het monster bij verschillende ingestelde waarden van de druk tussen ongeveer 103 Pa en 105 Pa te bepalen. Als de temperatuur bij constante druk constant blijft, betekent dit dat de kooktemperatuur is bereikt. Schuimende stoffen kunnen met deze methode niet worden onderzocht.De te onderzoeken stof wordt in een schoon en droog monstervat gebracht. Indien vaste stoffen niet als poeder beschikbaar zijn, kunnen er problemen ontstaan; deze kunnen echter worden opgelost door de koelwatermantel te verwarmen. Na het vullen wordt de apparatuur bij de flens gasdicht afgesloten en worden de stof en de apparatuur ontgast. Vervolgens wordt de laagst gewenste druk ingesteld en wordt het verwarmingssysteem aangezet. Tegelijkertijd wordt de temperatuurvoeler verbonden met een recorder.Het evenwicht is bereikt, wanneer bij een constante druk een constante kooktemperatuur kan worden afgelezen. Wees voorzichtig om "stoten" tijdens het koken te voorkomen. Voorts moet volledige condensatie plaatsvinden op de koeler. Bij het bepalen van de dampspanning van bij lage temperatuur smeltende stoffen moet men voorkomen dat de condensor verstopt raakt.Nadat dit evenwichtspunt is geregistreerd, wordt een hogere druk ingesteld. Dit proces wordt herhaald totdat een druk van 105 Pa is bereikt (ongeveer 5 tot 10 meetpunten in totaal). Ter controle moeten de evenwichtspunten nogmaals worden bepaald bij afnemende druk.1.6.2. Statische methode1.6.2.1. ApparatuurDe apparatuur omvat een vat voor het monster en een verwarmings- en koelsysteem om de monstertemperatuur in te stellen en te meten. De apparatuur bevat bovendien instrumenten om de druk in te stellen en te meten. Figuren 2a en 2b illustreren de basisbeginselen die hier van toepassing zijn.De monsterruimte (figuur 2a) is aan één zijde afgesloten door een geschikte hoogvacuümkraan. Aan de andere zijde is een U-vormige buis bevestigd die een geschikte manometervloeistof bevat. Eén uiteinde van de U-vormige buis vertakt naar de vacuümpomp, de stikstofcilinder of de ventilatiekraan, en een manometer.Een drukventiel met drukaanwijzing kan gebruikt worden in plaats van een U-buis (figuur 2b).Om de stof op een ingestelde temperatuur te brengen, wordt de monsterruimte met de kraan en de U-vormige buis of drukventiel in een bad gebracht, dat op een constante temperatuur van ± 0,2 K gehouden wordt. De temperatuur wordt aan de buitenkant van de monsterruimte of in het vat zelf gemeten.Een vacuümpomp met een tegenstroomkoelbuis wordt gebruikt om het apparaat vacuüm te zuigen.Bij methode 2a wordt de dampspanning van de stof indirect gemeten met een nulaanwijzer. Deze methode berust op het feit dat de dichtheid van de vloeistof in de U-buis verandert als de temperatuur sterk wisselt.Voor de nulpuntsinstelling kunnen in de U-vormige buis, afhankelijk van het drukbereik en het chemisch gedrag van de stof, verschillende vloeistoffen worden gebruikt: siliconenoliüen, ftalaten. De teststof mag niet merkbaar oplossen in of reageren met de vloeistof in de U-buis.Voor de manometer kan kwik worden gebruikt in het bereik van normale luchtdrukken tot 102 Pa; siliconenvloeistoffen en ftalaten zijn geschikt voor drukken van 10 tot 102 Pa. De verwarmbare membraancapaciteitmanometers kunnen zelfs worden gebruikt bij drukken beneden 10 1 Pa. Er bestaan ook andere drukmeters die gebruikt kunnen worden tot 102 Pa.1.6.2.2. MeetprocedureVóór de meting moeten alle onderdelen van de apparatuur in figuur 2 grondig gereinigd en gedroogd worden.Vul voor methode 2a de U-buis met de gewenste vloeistof die moet zijn ontgast bij verhoogde temperatuur voordat tot aflezen wordt overgegaan.De te onderzoeken stof wordt in het apparaat geplaatst waarna dit wordt gesloten en vervolgens de temperatuur voldoende wordt verlaagd voor ontgassing. De temperatuur moet laag genoeg zijn om te verzekeren dat alle lucht afgepompt is, maar mag - in geval van een meercomponentensysteem - de samenstelling van het materiaal niet veranderen. Indien gewenst kan een evenwichtstoestand sneller bereikt worden door te roeren.Het monster kan onderkoeld worden met bij voorbeeld vloeibare stikstof (opgelet: vermijd condensatie van lucht of pompvloeistof) of een mengsel van ethanol en droog ijs. Voor metingen bij lage temperatuur gebruikt men een bad met regelbare temperatuur, dat is aangesloten op een ultrastaat.Met de kraan boven de monsterruimte in geopende stand wordt vervolgens de ingesloten lucht gedurende een aantal minuten uit de apparatuur gepompt. Daarna wordt de kraan gesloten en de temperatuur van het monster op het laagst gewenste niveau gebracht. Zo nodig moet de ontgassing verschillende keren herhaald worden.Als het monster verhit wordt, stijgt de dampspanning. Dit verandert het evenwicht van de vloeistof in de U-buis. Om hiervoor te compenseren, wordt stikstof of lucht via de kraan in het apparaat binnengelaten tot de vloeistof in de drukmeter weer bij nul staat. De hiervoor vereiste druk kan afgelezen worden bij kamertemperatuur op een precisiemanometer. Deze druk komt overeen met de dampspanning van de te onderzoeken stof bij die specifieke meettemperatuur.Methode 2b is gelijkaardig, maar de dampspanning wordt direct afgelezen.De temperatuurafhankelijkheid van de dampspanning wordt bepaald met voldoende kleine temperatuurintervallen (ongeveer 5 tot 10 meetpunten in totaal) tot aan het gewenste maximum. Ter controle moeten de metingen bij lage temperaturen herhaald worden.Als de waarden die verkregen worden bij de herhaalde metingen niet overeenkomen met de curve verkregen bij stijgende temperatuur, kan dit te wijten zijn aan een van de volgende factoren:1. Het monster bevat nog altijd lucht (bij voorbeeld stoffen met hoge viscositeit) of bij lage temperatuur kokende stoffen die vrijkomt/vryçkomen bij verwarming en verwijderd kan/kunnen worden door afpompen na verdere onderkoeling.2. De koeltemperatuur is niet laag genoeg. In dit geval wordt vloeibaar stikstof gebruikt als koelmiddel.Als 1 of 2 van toepassing is dienen de metingen herhaald te worden.3. De stof ondergaat een chemische reactie in het onderzochte temperatuurbereik (bij voorbeeld afbraak, polymerisatie).1.6.3. IsoteniscoopZie referentie 7 voor een volledige beschrijving van deze methode. Het principe van het meetinstrument is afgebeeld in figuur 3. Evenals de statische methode, die is beschreven in 1.6.2, is de isoteniscoop geschikt voor onderzoek van vaste stoffen en vloeistoffen.Voor vloeistoffen dient de stof zelf als vulvloeistof in de hulpmanometer. Een hoeveelheid vloeistof die voldoende is voor het vullen van de bol en de korte arm van het manometergedeelte, wordt in de isoteniscoop gebracht. De isoteniscoop wordt met het vacuümsysteem verbonden, leeggepompt en daarna gevuld met stikstof. Het leegmaken en doorspoelen van het systeem wordt tweemaal herhaald om de resterende zuurstof te verwijderen. De gevulde isoteniscoop wordt horizontaal gehouden zodat het monster zich in een dunne laag verspreidt over de bol en het manometergedeelte (U-deel). De druk in het systeem wordt gereduceerd tot 133 Pa en het monster wordt zachtjes verwarmd tot het juist kookt (verwijdering van opgeloste gefixeerde gassen). De isoteniscoop wordt dan zo gedraaid dat het monster terugloopt naar de bol en de korte arm van de manometer, zo dat beide volledig gevuld zijn met vloeistof. De druk wordt aangehouden zoals bij het ontgassen en de uitgetrokken punt van de monsterbol wordt verwarmd met een kleine vlam, totdat de damp die uit het monster vrijkomt voldoende expandeert om een deel van het monster uit het bovenste gedeelte van de bol en de manometerarm te verplaatsen naar het manometergedeelte van de isoteniscoop en zo een met damp gevulde, stikstofvrije ruimte te creüeren.Vervolgens wordt de isoteniscoop in een thermostatisch bad geplaatst, en de druk van de stikstof aangepast tot deze druk gelijk is aan de druk van het monster. Het drukevenwicht wordt aangeduid door het manometergedeelte van de isoteniscoop. Bij het evenwichtspunt is de dampspanning van de stikstof gelijk aan de dampspanning van de te onderzoeken stof.Voor vaste stoffen worden de in 1.6.2.1 genoemde manometervloeistoffen gebruikt, afhankelijk van het druk- en temperatuurbereik. De ontgaste manometervloeistof wordt in de ronding van de lange arm van de isoteniscoop gebracht. Daarna wordt de te onderzoeken vaste stof in de bol gebracht en bij hogere temperatuur ontgast. Vervolgens wordt de isoteniscoop gekanteld zodat de manometervloeistof in de U-buis kan stromen. Het meten van de dampspanning als functie van de temperatuur vindt plaats volgens 1.6.2.1.6.4. Effusiemethode: Dampspanningsbalans1.6.4.1. ApparatuurIn de literatuur worden verschillende versies van het apparaat beschreven (1). Het hier beschreven apparaat illustreert de algemene basisprincipes (figuur 4). De belangrijkste onderdelen zijn afgebeeld in figuur 4; deze bestaan uit een hoogvacuüm roestvrijstalen of glazen houder, apparatuur om een vacuüm te creëren en te meten, alsmede ingebouwde onderdelen voor het meten van de dampspanning door middel van een balans. De volgende onderdelen zijn in het apparaat gemonteerd:- Een verdampingsoven met een flens en een draaiende inlaat. De verdampingsoven is een cilindervormig vat, vervaardigd uit bij voorbeeld koper of een chemisch inerte, thermische goed geleidende legering. Een glazen vat omgeven door een koperen wand kan ook gebruikt worden. De oven heeft een diameter van ongeveer 3 tot 5 cm en is 2 tot 5 cm hoog. Er zijn één tot drie openingen van verschillende grootte voor de dampstroom. De oven wordt verwarmd met behulp van of wel een verwarmingsplaat onder de oven, of wel een verwarmingsspiraal rond de buitenkant van de oven. Om te voorkomen dat de warmte zich verspreidt over de grondplaat wordt de verwarming verbonden met de grondplaat via een metalen stuk met lage thermische geleiding (nikkel-zilver- of chroom-nikkelstaal), bij voorbeeld een nikkel-zilverbuis verbonden met de draaibare inlaat in het geval van een oven met verschillende openingen. Deze opstelling heeft als voordeel dat er een koperen staaf ingebracht kan worden. Zo kan er van buitenuit gekoeld worden met behulp van een koelbad.- Als het ovendeksel drie openingen van verschillende doorsnede heeft, welke 90  ten opzichte van elkaar zijn geplaatst, kunnen verschillende dampspanningen in het totale te meten bereik worden gemeten (openingen tussen ongeveer 0,30 en 4,50 mm doorsnede). Grote openingen dienen voor lage dampdrukken en vice versa. Door de oven te draaien kan de gewenste opening of een tussenstand voor de dampstroom (ovenopening - schild - balansschaal) worden ingesteld waardoor de molecuulstroom door de ovenopening op of naast de balansschaal wordt gericht. Om de temperatuur van de stof te meten, is een thermokoppel of weerstandsthermometer op een geschikte plaats gemonteerd.- Boven het schild hangt de balansschaal van een zeer gevoelige microbalans (zie verder). De balansschaal heeft een diameter van ongeveer 30 mm. Verguld aluminium is een geschikt materiaal.- De balansschaal wordt omgeven door een cilindervormige koelpot van messing of koper. Afhankelijk van het type heeft de balans een opening voor de balansarm en een schildopening voor de molecuulstroom, zodat totale condensatie van de damp op de balansschaal wordt verzekerd. De warmteafvoer naar buiten vindt plaats door een koperen staaf naar de koeling. Deze wordt door de grondplaat geleid en is daarvan thermisch geüisoleerd, bij voorbeeld met een chroom-nikkelstalen buis. De staaf wordt onder de grondplaat in een dewarvat met vloeibare stikstof gedompeld of men laat vloeibare stikstof door de staaf stromen. De koelpot wordt zo op een temperatuur van ongeveer 120  C gehouden. De balansschaal wordt uitsluitend door straling gekoeld, voldoende voor het onderzochte drukbereik (koeling ongeveer een uur vóór het begin van de meting).- De balans wordt boven de koelpot geplaatst. Geschikte balansen zijn bij voorbeeld een zeer gevoelige 2-armige elektronische microbalans (8) of een zeer gevoelig instrument met bewegende spiraal (zie OESO Test Guideline 104, uitgave 12.05.81).- De grondplaat bevat bovendien elektrische aansluitingen voor thermokoppels (of weerstandsthermometers) en verwarmingsspiralen.- In het vat wordt een vacuüm geproduceerd met behulp van een partiüele vacuümpomp of een hoogvacuümpomp (vereist vacuüm van ongeveer 1 tot 2 × 10 3 Pa, verkregen na 2 uur pompen). De druk wordt geregeld met een geschikte ionisatiemanometer.1.6.4.2. MeetprocedureHet vat wordt gevuld met de te onderzoeken stof en het deksel wordt gesloten. Het schild en de koelpot worden boven de oven geschoven. Het apparaat wordt gesloten en de vacuümpompen worden ingeschakeld. De einddruk vóór het begin van de meting is ongeveer 10 4 Pa. Vanaf 10 2 Pa wordt de koelpot aangezet.Wanneer het benodigde vacuüm is bereikt, kan de ijkserie bij de laagst gewenste temperatuur worden gestart. De overeenkomstige opening in het deksel wordt ingesteld, de damp stroomt door het schild recht boven de opening en raakt de gekoelde balansschaal. De balansschaal moet groot genoeg zijn om te verzekeren dat hij wordt geraakt door de volledige dampstroom die door de opening in het schild geleid wordt. De impuls van de dampstroom werkt als kracht op de balansschaal en de moleculen condenseren op het gekoelde oppervlak.De impuls en gelijktijdige condensatie veroorzaken een signaal op de recorder. Dit signaal kan op twee manieren worden beoordeeld:1. Voor het hier beschreven apparaat wordt de dampspanning direct bepaald uit de impuls op de schaal (hiervoor hoeft de molecuulmassa niet bekend te zijn (2)). Er dient wel rekening gehouden te worden met geometrische factoren zoals de ovenopening en de hoek van de molecuulstroom bij het verwerken van de metingen.2. Tegelijkertijd kan de massa van het condensaat worden gemeten zodat de verdampingssnelheid hieruit kan worden berekend. De dampspanning kan ook worden berekend uit de verdampingssnelheid en de molecuulmassa door gebruik te maken van de vergelijking van Herz (2):p = G2 p RT × 103Mwaarin:G = verdampingssnelheid (kg s 1 m 2)M = molaire massa (g mol 1)T = temperatuur (K)R = universele molaire gasconstante (J mol 1 K 1)p = dampspanning (Pa).Als het vereiste vacuüm is bereikt, wordt begonnen met de serie metingen bij de laagst gewenste meettemperatuur.Voor verdere metingen wordt de temperatuur met kleine stappen verhoogd, totdat de hoogste gewenste temperatuur bereikt wordt. Vervolgens wordt het monster weer afgekoeld en eventueel wordt een tweede kromme van de dampspanning gemeten. Als de tweede reeks de resultaten van de eerste niet bevestigt, dan is het mogelijk dat de stof in het gemeten temperatuurbereik ontleedt.1.6.5. Effusiemethode: Door middel van gewichtsafname1.6.5.1. ApparatuurHet uitstroomapparaat bestaat uit de volgende basisonderdelen:- een tank die van een thermostaatregeling voorzien kan worden en waarin de effusiecellen zijn geplaatst;/- een hoogvacuümpomp (bij voorbeeld een diffusiepomp of een turbomoleculaire pomp) met vacuümmeter;- een val met gebruik van vloeibaar stikstof of droog ijs.In figuur 5 wordt een elektrisch verwarmde aluminium vacuümtank met 4 roestvrijstalen uitstroomcellen als voorbeeld afgebeeld. De roestvrijstalen folie van ongeveer 0,3 mm dikte heeft een uitstroomopening van 0,2 tot 1,0 mm doorsnede en is verbonden met de uitstroomcel via een van schroefdraad voorzien deksel.1.6.5.2. MeetprocedureDe ijk- en teststoffen worden in elke uitstroomcel gebracht, het metalen diafragma met de opening wordt vastgeschroefd met behulp van het deksel, elke cel wordt gewogen met een nauwkeurigheid van 0,1 mg. De cel wordt in het van een thermostaat voorziene apparaat geplaatst, dat vervolgens wordt afgepompt tot beneden een tiende van de te verwachten druk. Met vaste tussenpozen van 5 tot 30 uur wordt lucht in het apparaat gelaten en de afname van de massa van de uitstroomcel wordt bepaald door een nieuwe weging.Om zeker te zijn dat de resultaten niet beüinvloed worden door vluchtige verontreinigingen, wordt de cel opnieuw gewogen met vaste tussenpozen om te controleren of de verdampingssnelheid constant blijft over ten minste twee zulke perioden.De dampspanning p in de uitstroomcel wordt gegeven door:p =mKAtE2 p R TMwaarin:p = dampspanning (Pa)m = massa van de stof die de cel verlaat tijdens tijd t (kg)t = tijd (s)A = oppervlakte van de opening (m2)K = correctiefactorR = universele gasconstante (J mol 1 K 1)T = temperatuur (K)M= molecuulmassa (kg mol 1).De correctiefactor K is afhankelijk van de verhouding van de lengte tot de straal van de cilindrische opening:verhouding:0,10,20,61,02,0K:0,9520,9090,7710,6720,514De bovenstaande vergelijking kan ook geschreven worden als:p = EmtTMwaarin E =1KA2 p R de uitstroomcelconstante is.Deze effusiecelconstante E kan bepaald worden met behulp van ijkstoffen (2,9) via de volgende vergelijking:E =p(r) tmM(r)Twaarin:p(r) = dampspanning van de ijkstof (Pa)M(r) = molecuulmassa van de ijkstof (kg mol 1).1.6.6. Gasverzadigingsmethode1.6.6.1. ApparatuurDe apparatuur voor deze test bestaat uit de onderdelen zoals afgebeeld in figuur 6a en zoals hieronder beschreven (1).Inert gas:Het dragergas mag niet chemisch met de te onderzoeken stof reageren. Stikstof voldoet meestal, maar in een enkel geval kan een ander gas nodig zijn (10). Het gebruikte gas moet droog en schoon zijn (zie figuur 6a, onderdeel 4: relatieve vochtigheidsmeter).Regeling van de gasstroom:Voor het instellen van een constante gasstroom door de verzadigingskolom is een gasregelingssysteem nodig.Dampvallen:De keuze van het type dampval hangt af van de eigenschappen van het monster en de gekozen analysemethode. De damp moet kwantitatief worden opgevangen in een vorm waarin vervolgens analyse mogelijk is. Voor sommige stoffen zullen dampvallen met een vloeistof zoals hexaan of ethyleenglycol geschikt zijn. Voor andere stoffen zijn vaste adsorbentia meer geschikt.Als een alternatief voor dampvallen met daarop volgende analyse kunnen in serie gezette analytische technieken zoals chromatografie gebruikt worden om de hoeveelheid stof, die door een bekende hoeveelheid dragergas wordt verplaatst, te meten. Verder kan ook het massaverlies van het monster gemeten worden.Warmtewisselaar:Voor metingen bij verschillende temperaturen kan het noodzakelijk zijn om een warmtewisselaar in de opstelling aan te brengen.Verzadigingskolom:De te onderzoeken stof wordt, vanuit een oplossing, op een geschikte inerte drager gebracht. De aldus beladen drager wordt in een verzadigingskolom gebracht; de afmetingen van de kolom en de stroomsnelheid van het dragergas moeten een volledige verzadiging van het dragergas verzekeren. De verzadigingskolom moet zijn voorzien van een thermostaatregeling. Voor metingen boven kamertemperatuur moet het gedeelte tussen de verzadigingskolom en de dampvallen worden verwarmd om te voorkomen dat de te onderzoeken stof daar condenseert.Om het verplaatsen van de stofmassa door diffusie te verminderen, kan een capillair achter de verzadigingskolom geplaatst worden (figuur 6b).1.6.6.2. MeetprocedureBereiding van de verzadigingskolom:Een oplossing van de te onderzoeken stof in een zeer vluchtig oplosmiddel wordt toegevoegd aan een geschikte hoeveelheid dragermateriaal. Er moet voldoende te onderzoeken stof worden toegevoegd om gedurende de gehele proef verzadiging te verzekeren. Het oplosmiddel wordt volledig afgedampt aan de lucht of in een roterende verdamper, waarna het grondig gemengde materiaal in de verzadigingskolom wordt gebracht. Nadat het monster op de gewenste temperatuur is gebracht, wordt droge stikstof door de apparatuur geleid.Meting:De dampvallen of in serie geplaatste detectors worden verbonden met de uitstroomleiding van de kolom en de tijd wordt geregistreerd. De stroomsnelheid wordt aan het begin en op gezette tijden gedurende het experiment gecontroleerd met behulp van een bellenteller (of continu met een massastroommeter).De druk bij de uitgang van de verzadigingskolom moet worden gemeten:(a) of wel door een manometer tussen de verzadigingskolom en de dampvallen te plaatsen (dit kan onbevredigend zijn vanwege de vergroting van de dode ruimte en het adsorberende oppervlak),(b) of wel door in een afzonderlijk experiment de drukvervallen over het gebruikte opvangsysteem te bepalen als functie van de stroomsnelheid (dit kan onbevredigend zijn bij gebruik van vloeistofvallen).De tijd die nodig is om de voor de verschillende analysemethoden vereiste hoeveelheid stof op te vangen, wordt bepaald aan de hand van inleidende proeven of schattingen. Als alternatief voor het opvangen van de stof voor verdere analyse kan een in serie gekoppelde kwantitatieve analytische techniek gebruikt worden (bij voorbeeld chromatografie). Voordat de dampdruk bij een bepaalde temperatuur wordt berekend, moeten inleidende proeven worden uitgevoerd om de maximale stroomsnelheid te bepalen waarbij het dragergas volledig verzadigd zal worden met de damp van de te onderzoeken stof. Dit is het geval als het dragergas zo langzaam door de verzadiger wordt geleid, dat een nog geringere snelheid geen grotere berekende dampdruk geeft.De te gebruiken analysemethode (bij voorbeeld gaschromatografie of gravimetrie) hangt af van de aard van de te onderzoeken stof.De hoeveelheid stof, die door een bekend volume dragergas wordt getransporteerd, wordt bepaald.1.6.6.3. Berekening van de dampspanningDe dampspanning wordt berekend uit de dampdichtheid, W/V, met behulp van de vergelijking:p =WV×RTMwaarin:p = dampspanning (Pa)W = massa van de verdampte teststof (kg)V = volume verzadigd gas (m3)R = universele molaire gasconstante (J mol 1 K 1)T = temperatuur (K)M = molaire massa van de teststof (kg mol 1).De gemeten volumes moeten worden gecorrigeerd voor druk- en temperatuurverschillen tussen de stroomsnelheidsmeter en de verzadigingskolom die met een thermostaat op constante temperatuur gehouden wordt. Als de stroomsnelheidsmeter zich achter de dampval bevindt, kan het nodig zijn te corrigeren voor bestanddelen die uit de val verdampt zijn (1).1.6.7. Draaiende rotor (8, 11, 13)1.6.7.1. ApparatuurDe draaiende rotortechniek kan worden uitgevoerd met behulp van een draaiende-rotor-viscositeitsmeter zoals afgebeeld in figuur 8. Een schematische tekening van de experimentele opstelling wordt getoond in figuur 7.De meetapparatuur bestaat meestal uit een meetkop met draaiende rotor, geplaatst in een van thermostaatregeling voorziene ruimte (geregeld op 0,1  C). De monsterhouder wordt in een van een thermostaatregeling voorziene ruimte (geregeld op 0,01  C) gebracht, en om condensatie te voorkomen, worden alle andere onderdelen van de opstelling op een hogere temperatuur gehouden. Een hoogvacuümpomp wordt aan het toestel verbonden door middel van hoogvacuümkranen.De meetkop met draaiende rotor bestaat uit een stalen kogel (4 tot 5 mm doorsnede) in een buis. De kogel zweeft stabiel in een magnetisch veld, opgewekt met een combinatie van permanente magneten en controlespoelen.De kogel wordt aan het draaien gebracht door rotatie van de velden. De rotatiesnelheid kan worden bepaald met meetspoelen, die de altijd aanwezige geringe zijdelingse magnetisatie van de kogel meten.1.6.7.2. MeetprocedureAls de kogel een bepaalde draaisnelheid v(o) (gewoonlijk ongeveer 400 toeren per seconde) heeft bereikt, wordt de energietoevoer gestopt waardoor een vertraging van de draaisnelheid optreedt, die het gevolg is van de gaswrijving.De afname van de rotatiesnelheid wordt gemeten als functie van de tijd. Als de wrijving door de magnetische ophanging verwaarloosd kan worden ten opzichte van de wrijving van het gas, wordt de gasdruk p gegeven door:p =pcrrs 10 t× lnv (t)v (o)waarin:c  = gemiddelde snelheid van de gasmoleculenr = straal van de kogelñ = soortelijke massa van de kogeló = coëfficiënt van de overdracht van het tangentieel moment (ó = 1 voor een ideaal boloppervlak van de kogel)t = tijd v(t) = rotatiesnelheid na tijd tv(o) = beginrotatiesnelheid.Deze vergelijking kan ook geschreven worden als:p =pcrr10s×tn tn-1tn × tn-1waarin tn, tn 1 de tijd voorstelt die nodig is voor een gegeven aantal omwentelingen N. Deze tijdsintervallen tn en tn 1 volgen elkaar op waarbij tn > tn 1.De gemiddelde snelheid van het gasmolecuul c  wordt gegeven door:c  =(8 RTp M)12waarin:T = temperatuurR = universele molaire gasconstanteM = molaire massa.2. GEGEVENSIn elk van de voorafgaande methoden moet de dampspanning ten minste bij twee temperaturen worden bepaald. Bepaling van de dampspanning bij drie of meer temperaturen in het bereik van 0 tot 50  C verdient de voorkeur, aangezien men dan kan controleren of de dampspanningskromme lineair is.3. RAPPORTAGEIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- de gebruikte methode;- de nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen) en indien van toepassing, voorafgaande zuivering;- ten minste twee waarden voor de dampspanning en de bijbehorende temperaturen, bij voorkeur in het bereik van 0 tot 50  C;- alle ruwe gegevens;- grafiek van log p tegen 1/T;- geschatte waarde van de dampspanning bij 20 of 25  C.Indien een verandering (faseovergang, ontleding) in de onderzochte stof werd waargenomen, dient het testrapport in het bijzonder de volgende gegevens te bevatten:- aard van de verandering;- temperatuur waarbij de verandering optreedt bij atmosferische druk;- dampspanning bij 10  C respectievelijk 20  C beneden de overgangstemperatuur en bij 10  C respectievelijk 20  C boven de overgangstemperatuur (tenzij het een overgang is van vaste fase naar gasfase).Alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof, dienen te worden gerapporteerd.4. LITERATUUR(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104. Decision of the Council C(81) 30 Final.(2) Ambrose, D., in B. Le Neindre, B. Vodar (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol. II.(3) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry. Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I.(4) Knudsen, M.: Ann. Phys. Lpz., 1909, Vol. 29, 1979; 1911, Vol. 34, 593.(5) NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10 1 to 10 PA5 - Static method.(6) NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10 3 to 1 Pa - Vapour pressure balance method.(7) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure/temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.(8) G. Messer, P. Rüohl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol., (A), 1987, Vol. 5 (4), 2440.(9) Ambrose, D., Lawrenson, I. J., Sprake, C. H. S. J. Chem. Thermodynamics 1975, Vol. 7, 1173.(10) B. F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, Vol. 85, 435.(11) G. Comsa, J. K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, Vol. 17 (2), 642.(12) G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, Vol. 20 (4), 1148.(13) J. K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol., (A), 1985, Vol. 3 (3), 1715.Aanhangsel 1SchattingsmethodeINLEIDINGDe berekende waarden van de dampspanning kunnen als volgt worden gebruikt:- om te bepalen welke van de experimentele methoden geschikt is;- om een schatting of grenswaarde te verkrijgen, in geval de experimentele methode om technische redenen niet toegepast kan worden (ook als de dampspanning zeer laag is);- om die gevallen op te kunnen sporen, waar de experimentele meting kan worden weggelaten omdat de dampspanning waarschijnlijk BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Apparaat voor bepaling van de dampspanningskromme volgens de dynamische methode1  =  Thermokoppel2  =  Vacuümbuffervolume3  =  Precisiemanometer4  =  Vacuüm5  =  Meetpunt6  =  Verwarmingselement (circa 150 W)Figuur 2a>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Apparaat voor bepaling van de dampspanningskromme volgens de statische methode (gebruik makend van de U-buis manometer)1 = Te onderzoeken stof6 = Temperatuurbad2 = Dampfase7 = Temperatuurmeetapparaat3 = Hoogvacuümkraan8 = Naar de vacuümpomp4 = U-buis (hulpmanometer)9 = Ventilatie5 = ManometerFiguur 2b>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Apparaat voor bepaling van de dampspanningskromme volgens de statische methode (gebruik makend van een drukaanwijzing)1 = Te onderzoeken stof5 = Drukaanwijzer2 = Dampfase6 = Temperatuurbad3 = Hoogvacuümkraan7 = Temperatuur-meetapparaat4 = DrukventielFiguur 3>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Isoteniscoop (referentie 2)1  =  Naar meet- en regelsysteem voor druk2  =  8 mm uitwendige buis3  =  Droge stikstof in druksysteem4  =  Damp van het monster5  =  Kleine punt6  =  Vloeibaar monsterFiguur 4>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Apparatuur voor bepaling van de dampspanningskromme met behulp van de dampspanningsbalansmethode1  = Te onderzoeken stof6 = Koelsysteem2  = Dampfase met dampstroom7 = Schild3  = Verdampingsoven met draaibare openingen8 = Koelstaaf voor koelsysteem9 = Balansschaal3a = Ovendeksel met opening10 = Microbalans4  = Ovenverwarming (koelpot)11 = Naar de recorder5  = Meting van de temperatuur van het monster12 = Naar de hoogvacuümpompFiguur 5>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Voorbeeld van een apparaat voor verdamping bij lage druk met behulp van de uitstroommethode, met een uitstroomcelvolume van 8 cm31  = Verbinding naar vacuüm2  = Uitsparingen voor platina weerstandsthermometer of temperatuurmeting en -regeling (2)3  = Deksel voor vacuümvat4  = O-ring5  = Aluminium vacuümvat6  = Onderdeel voor het plaatsen en verwijderen van de cellen7  = Deksel met schroefdraad8  = Vleugelmoeren (6)9  = Bouten (6)10  = Roestvrijstalen uitstroomsel11  = Verwarmingspatronen (6)Figuur 6a>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Voorbeeld van een gasstroomsysteem voor bepaling van de dampspanning volgens de gasverzadigingsmethode1  =  Gasstroomregelaar6 = PTFE-verbindingsstukken2  =  Warmtewisselaars7 = Gasstroommeter3  =  Naaldventielen8 = Dampval (absorptie)4  =  Sensor (%) relatieve vochtigheid9 = Olieval5  =  Verzadigingskolommen10 = Bellenteller met glasfilterFiguur 6b>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Een voorbeeld van een systeem voor de bepaling van de dampspanning met de gasverzadigingsmethode, met een capillair geplaatst achter de verzadigingskamer1  =  Thermische massastroommeter6 = Gasverzadigingskamer2  =  Manometer7 = Capillair3  =  Thermostatisch geregelde ruimte8 = Absorptievaten4  =  Thermostatische spiraal voor dragergas9 = Gasmeter5  =  Thermometer (Pt 100)10 = KoudevalFiguur 7>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Voorbeeld van experimentele opstelling voor de draaiende-rotormethode DampspanningsapparaatA. Draaiende-rotormeetkopB. MonstercelC. ThermostaatD. Vacuümleiding (turbopomp)E. LuchtthermostaatFiguur 8>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Voorbeeld van een draaiende-rotormeetkop1 = Kogel2 = Vacuümbuis bevestigd aan 63 = Permanente magneten (2)4 = Magneetspoelen (2) voor verticale stabilisatie5 = Magneetspoelen voor aandrijving (4)6 = VerbindingsflensA. 5. OPPERVLAKTESPANNING1. METHODEDe beschreven methoden berusten op de testrichtlijn van de OESO (1). De fundamentele principes worden besproken in referentie (2).1.1. INLEIDINGDe hier beschreven methoden zijn geschikt voor de bepaling van de oppervlaktespanning van waterige oplossingen.Voor het uitvoeren van deze test is het nuttig om van tevoren te beschikken over gegevens inzake de oplosbaarheid in water, de structuur, de hydrolyseerbaarheid en de kritische concentraties voor de vorming van micellen.De hieronder beschreven methoden zijn geschikt voor de meeste chemische stoffen, ongeacht de zuiverheid ervan.Bepaling van de oppervlaktespanning met behulp van de ringspanningsmeter is alleen mogelijk voor waterige oplossingen met een dynamische viscositeit van minder dan ongeveer 200 mPa 7s.1.2. DEFINITIES EN EENHEDENDe vrije-oppervlakte-enthalpie per oppervlakte-eenheid heet de oppervlaktespanning. De oppervlaktespanning wordt uitgedrukt in N/m (SI-eenheid) of in mN/m (SI-subeenheid).1 N/m = 103 dyne/cm1 mN/m = 1 dyne/cm in het verouderde cgs-systeem.1.3. REFERENTIESTOFFENHet is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om zo nu en dan de werking van de methode te controleren en om vergelijkingen met resultaten van andere methoden mogelijk te maken.Een aantal referentiestoffen met zeer uiteenlopende oppervlaktespanningen staan vermeld in referenties (1) en (3).1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODENDe methoden berusten op de meting van de maximale kracht die verticaal moet worden uitgeoefend op een beugel of een ring die het oppervlak van de te onderzoeken vloeistof in een meetbak raakt, om deze beugel of ring van dit oppervlak te scheiden, of op een plaat waarvan een rand het oppervlak raakt, om de vloeistoflaag die zich heeft gevormd op te trekken.Stoffen die oplosbaar zijn in water met een concentratie van ten minste 1 mg/l worden getest in waterige oplossingen bij één concentratie.1.5. KWALITEITSCRITERIADeze methoden zijn nauwkeuriger dan waarschijnlijk voor milieubeoordelingsdoeleinden noodzakelijk is.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODENDe stof wordt opgelost in gedestilleerd water. De concentratie van deze oplossing moet 90 % van die van een verzadigde oplossing in water bedragen. Indien deze concentratie de 1 g/l overschrijdt, wordt een oplossing van 1 g/l gebruikt voor de bepaling. Stoffen met een oplosbaarheid in water van minder dan 1 mg/l hoeven niet te worden onderzocht.1.6.1. PlaatmethodeZie ISO 304 en NF T 73-060 ("Surface Active Agents - Determination of Surface Tension by Drawing up Liquid Films").1.6.2. BeugelmethodeZie ISO 304 en NF T 73-060 ("Surface Active Agents - Determination of Surface Tension by Drawing up Liquid Films").1.6.3. RingmethodeZie ISO 304 en NF T 73-060 ("Surface Active Agents - Determination of Surface Tension by Drawing up Liquid Films").1.6.4. Geharmoniseerde ringmethode (OESO)1.6.4.1. ApparatuurIn de handel verkrijgbare spanningsmeters kunnen voor deze metingen worden gebruikt. Zij bestaan uit:- draaitafeltje;- systeem voor het meten van de kracht;- meetlichaam (ring);- meetvat.1.6.4.1.1. DraaitafeltjeHet draaitafeltje wordt gebruikt als draagvlak voor het meetvat met temperatuurregeling, waarin de te onderzoeken stof zich bevindt. Te samen met het systeem voor het meten van de kracht is het draaitafeltje aan een rek gemonteerd.1.6.4.1.2. Systeem voor het meten van de krachtHet systeem voor het meten van de kracht (zie figuur) bevindt zich boven het draaitafeltje. De fout bij het meten van de kracht mag niet meer bedragen dan ± 10 6 N, hetgeen overeenkomt met een foutgrens van ± 0,1 mg in een massameting. De meetschaal van de in de handel verkrijgbare tensiometers is meestal geijkt in mN/m zodat de oppervlaktespanning met een nauwkeurigheid van 0,1 mN/m rechtstreeks in mN/m kan worden afgelezen.1.6.4.1.3. Meetlichaam (ring)De ring bestaat meestal uit een draad van platina-iridium met een dikte van ongeveer 0,4 mm en een gemiddelde omtrek van 60 mm. De ring wordt horizontaal opgehangen aan een metalen stift en een ophangsysteem om de verbinding met het krachtmeetsysteem tot stand te brengen (zie figuur).Figuur>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Meetlichaam (alle maten in mm)1.6.4.1.4. MeetvatVoor de te onderzoeken oplossing wordt een glazen meetvat met temperatuurregeling gebruikt. Het meetvat dient zo te zijn ontworpen dat tijdens de meting de temperatuur van de testvloeistof en de gasfase daarboven constant is en dat het monster niet kan verdampen. Ronde glazen bekers met een inwendige doorsnede van ten minste 45 mm zijn aanvaardbaar.1.6.4.2. Voorbereiding van het apparaat1.6.4.2.1. SchoonmakenGlazen vaten dienen zorgvuldig te worden schoongemaakt. Zo nodig moeten zij worden gespoeld met heet chroomzuur en vervolgens met stroperig fosforzuur (83 tot 98 gewichtsprocent H3PO4), dan grondig gespoeld met leidingwater, uitgewassen met tweemaal gedestilleerd water tot een neutrale pH, en vervolgens gedroogd of omgespoeld met een gedeelte van de te onderzoeken vloeistof.De ring wordt eerst zorgvuldig in water gespoeld ten einde water-oplosbare stoffen te verwijderen, daarna kort in chroomzuur gedompeld, in tweemaal gedestilleerd water gewassen tot een neutrale pH is bereikt en ten slotte kort verhit boven een methanolvlam.NB:Verontreinigende stoffen zoals siliconen die niet in chroomzuur of fosforzuur oplossen, dienen met een geschikt organisch oplosmiddel te worden verwijderd.1.6.4.2.2. IJking van het apparaatBij de validering van het apparaat wordt het nulpunt gecontroleerd en zodanig ingesteld dat met de uitslag van de wijzer een nauwkeurige bepaling in mN/m mogelijk is.Opstellen:Het apparaat wordt, bij voorbeeld met behulp van een waterpas aan de onderzijde van de tensiometer, horizontaal opgesteld; hiertoe wordt gebruik gemaakt van de schroeven aan de onderzijde van het apparaat.Instelling van het nulpunt:Na het aanbrengen van de ring aan het apparaat en alvorens deze in de vloeistof te dompelen wordt de wijzer van de tensiometer op nul gezet en wordt nagegaan of de ring evenwijdig aan het vloeistofoppervlak loopt. Hierbij kan het vloeistofoppervlak als spiegel worden gebruikt.IJking:Het ijken kan op twee manieren geschieden:(a) Met behulp van een massa; hierbij worden ruiters met een bekende massa van 0,1 tot 1,0 g op de ring aangebracht; de ijkfactor Öa, waarmee alle afgelezen waarden moeten worden vermenigvuldigd, wordt bepaald met behulp van de volgende vergelijking (1):fa =  srsa(1)waarin:sr = mg2b (mN/m)m = massa van de ruiter (g)g = versnelling door de zwaartekracht (981 cm 7 s 2 op zeeniveau) b = gemiddelde omtrek van de ring (in cm)óa = uitslag van de tensiometer na het plaatsen van de ruiter op de ring (mN/m).(b) Met behulp van water; hierbij wordt gebruik gemaakt van zuiver water met een oppervlaktespanning van bij voorbeeld 72,3 mN/m bij 23  C; deze procedure verloopt weliswaar vlotter dan die met de ruiters, maar houdt steeds het gevaar in dat de oppervlaktespanning van het water onjuist is door de aanwezigheid van sporen oppervlakteactieve stoffen.De ijkfactor, Öb, waarmee alle meetresultaten moeten worden vermenigvuldigd, wordt bepaald met behulp van de volgende vergelijking (2):fb =  sosg(2)waarin:óo = literatuurwaarde voor de oppervlaktespanning van water (mN/m),óg = gemeten waarde voor de oppervlaktespanning van het water (mN/m),beide bij dezelfde temperatuur.1.6.4.3. Bereiding van de monstersDe te onderzoeken stoffen worden tot de gewenste concentraties in water opgelost; er mogen geen onoplosbare stoffen in het water voorkomen.De oplossing moet op constante temperatuur worden gehouden (± 0,5  C). Aangezien de oppervlaktespanning van een oplossing in het meetvat met de tijd verandert, moeten er op verschillende tijdstippen metingen worden verricht en moet van de resultaten een kromme worden uitgezet waaruit het verloop van de oppervlaktespanning als functie van de tijd blijkt. Zodra geen verdere wijzigingen meer worden waargenomen, is er een evenwichtstoestand bereikt.Stof en gasvormige verontreinigingen be¨ unvloeden het resultaat van de meting. De meting dient derhalve te worden verricht onder een scherm.1.6.5. TestomstandighedenDe metingen dienen plaats te vinden bij ongeveer 20  C en de temperatuur dient op ± 0,5  C na constant te zijn.1.6.6. Uitvoering van de proefDe te-meten oplossingen dienen in het zorgvuldig schoongemaakte meetvat te worden overgebracht waarbij schuimvorming wordt vermeden; vervolgens wordt het meetvat op de tafel van het testapparaat geplaatst. Het tafelblad met het meetvat wordt omhoog gebracht tot de ring is gedompeld onder het oppervlak van de te onderzoeken oplossing. Vervolgens laat men het tafelblad geleidelijk en regelmatig (met een snelheid van ongeveer 0,5 cm/min) zakken om de ring van het oppervlak vrij te maken, tot de maximale kracht is bereikt. De vloeistoflaag die aan de ring hangt, mag de ring niet loslaten. Na de meting wordt de ring weer onder het oppervlak gedompeld en wordt de meting herhaald tot een constante waarde voor de oppervlaktespanning is bereikt. Bij iedere bepaling dient de tijd, die verlopen is sinds het overbrengen van de vloeistof naar het meetvat, te worden genoteerd. De meter wordt afgelezen op het moment van de maximale kracht die vereist is om de ring van het oppervlak van de vloeistof los te trekken.2. GEGEVENSTer berekening van de oppervlaktespanning wordt de van het apparaat afgelezen waarde in mN/m eerst vermenigvuldigd met de ijkfactor Öa of Öb (afhankelijk van de toegepaste ijkprocedure). Dit leidt tot een waarde die slechts bij benadering juist is en daarom nog verder moet worden gecorrigeerd.Harkins en Jordan (4) hebben langs empirische weg correctiefactoren bepaald voor oppervlaktespanningen die met de ringmethode zijn gemeten; deze correctiefactoren zijn afhankelijk van de afmetingen van de ring, de dichtheid van de vloeistof en de oppervlaktespanning.Het is tamelijk omslachtig om de correctiefactor voor iedere meting afzonderlijk met behulp van de tabellen van Harkins en Jordan te bepalen voor de berekening van de oppervlaktespanning; daarom kan voor waterige oplossingen gebruik worden gemaakt van een vereenvoudigde procedure waarbij de gecorrigeerde waarden voor de oppervlaktespanning rechtstreeks uit de volgende tabel worden afgelezen (tussenliggende waarden worden via interpolatie verkregen).>RUIMTE VOOR DE TABEL>Deze tabel werd opgesteld aan de hand van de correctie volgens Harkins en Jordan en overeenkomstig de DIN-normen (DIN 53914) voor water en waterige oplossingen (met een dichtheid van ñ = 1 g/cm3) en voor in de handel verkrijgbare ringen met afmetingen R = 9,55 mm (gemiddelde straal van de ring) en r = 0,185 mm (straal van de draad van de ring). De tabel geeft de gecorrigeerde waarden voor oppervlaktespanningsmetingen die werden uitgevoerd na ijking met massa of met water.Volgens een alternatieve methode zonder voorafgaande ijking kan de oppervlaktespanning als volgt worden berekend:s = 4 p Rf × Fwaarin:F = de kracht die op de dynamometer wordt afgelezen bij het breken van de filmR = de straal van de ringf = de correctiefactor (1).3. RAPPORTAGE3.1. VERSLAG VAN DE PROEFENEMINGENIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- gebruikte testmethode;- gebruikt type water of oplossing;- nauwkeurige specificatie van de stoffen (beschrijving en verontreinigingen);- meetresultaten: afgelezen oppervlaktespanning waarbij zowel de afzonderlijke resultaten als het rekenkundig gemiddelde daarvan moet worden vermeld, alsmede het gecorrigeerde gemiddelde (waarbij rekening is gehouden met de correctiefactor voor het apparaat en de correctietabel);- concentratie van de oplossing;- temperatuur bij de meting;- ouderdom van de gebruikte oplossing, en met name de tijd tussen de bereiding en de meting van de oplossing;- beschrijving van de tijdafhankelijkheid van de oppervlaktespanning, na het overbrengen van de oplossing in het meetvat;- alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, en met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de stof.3.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATENMet het oog op het feit dat gedestilleerd water een oppervlaktespanning heeft van 72,75 mN/m bij 20  C, dienen stoffen met een oppervlaktespanning van minder dan 60 mN/m, zoals gemeten met deze methode, beschouwd te worden als oppervlakteactieve stoffen.4. LITERATUUR(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115 - Decision of the Council C(81) 30 Final.(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ. New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV.(3) Pure Appl. Chem., 1976, Vol. 48, 511.(4) Harkins, W. D., Jordan, H. F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, Vol. 52, 1751.A.6. OPLOSBAARHEID IN WATER1. METHODEDe beschreven methoden berusten op de testrichtlijn van de OESO (1).1.1. INLEIDINGVoor het uitvoeren van deze test is het nuttig om van tevoren te beschikken over gegevens inzake de structuurformule, de dampspanning, de dissociatieconstanten en de hydrolyse (als functie van de pH) van de stof.Er bestaat niet één methode waarmee alle mogelijke waarden van de oplosbaarheid in water kunnen worden onderzocht.De twee hieronder beschreven meetmethoden beslaan alle mogelijke waarden van de oplosbaarheid maar zijn niet van toepassing op vluchtige stoffen:- de eerste methode wordt aangeduid als de "kolom-elutie"-methode en is van toepassing op chemisch zuivere stoffen met een geringe oplosbaarheid ( 10 2 g/l), welke stabiel zijn in water;De oplosbaarheid in water van de te onderzoeken stof kan aanzienlijk worden be¨ unvloed door de aanwezigheid van verontreinigingen.1.2. DEFINITIES EN EENHEDENDe oplosbaarheid van een stof in water wordt opgegeven als de massaconcentratie van de stof in een verzadigde oplossing in water bij een gegeven temperatuur. De oplosbaarheid in water wordt uitgedrukt in eenheden massa per volume oplossing. De SI-eenheid is kg/m3 (g/l kan ook worden gebruikt).1.3. REFERENTIESTOFFENHet is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om zo nu en dan de werking van de methode te controleren en om vergelijkingen met resultaten van andere methodes mogelijk te maken.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODENDe hoeveelheid van het monster en de tijd die nodig zijn om de verzadigingswaarde van de massaconcentratie te bereiken, moeten bij benadering worden bepaald in een eenvoudige inleidende test.1.4.1. Kolom-elutie-methodeDeze methode is gebaseerd op de elutie van de te onderzoeken stof met water uit een microkolom welke is gevuld met een inert dragermateriaal zoals glasparels of zand, gedekt met een overmaat aan de te onderzoeken stof. De oplosbaarheid in water is bepaald zodra de massaconcentratie van het eluaat constant is. Dit blijkt uit een constante concentratiewaarde als functie van de tijd.1.4.2. Methode met de kolfBij deze methode wordt de stof (vaste stoffen moeten worden fijngemaakt) opgelost in water bij een temperatuur die iets hoger is dan de testtemperatuur. Zodra verzadiging is bereikt wordt het mengsel afgekoeld en op de testtemperatuur gehouden, terwijl net zo lang wordt geroerd totdat er een evenwichtstoestand is bereikt. Als alternatief kan de meting rechtstreeks bij de testtemperatuur uitgevoerd worden, op voorwaarde dat men er, via geschikte monsternames, zeker van is dat het verzadigingsevenwicht bereikt is. Vervolgens wordt de massaconcentratie van de stof in de waterige oplossing, welke geen onopgeloste deeltjes mag bevatten, bepaald aan de hand van een geschikte analysemethode.1.5. KWALITEITSCRITERIA1.5.1. HerhaalbaarheidVoor de kolom-elutie-methode kan  3 % per  C), dan wordt nog bij twee andere temperaturen gemeten, die tenminste 10  C boven, respectievelijk 10  C onder de eerste temperatuur liggen. In dit geval dient de temperatuurregeling op ± 0,1  C nauwkeurig te zijn. De gekozen temperatuur moet in alle betrokken delen van de apparatuur constant worden gehouden.1.6.2. Inleidende testIn een maatcylinder van 10 ml, voorzien van een glazen stop, wordt gedestilleerd water op kamertemperatuur toegevoegd aan ongeveer 0,1 g monster (vaste stoffen moeten worden fijngemaakt). Toenemende volumes gedestilleerd water worden stapsgewijze toegevoegd, volgens onderstaande tabel.>RUIMTE VOOR DE TABEL>Nadat de aangegeven hoeveelheid water is toegevoegd, wordt het mengsel telkens gedurende tien minuten hard geschud en vervolgens visueel onderzocht op eventuele onopgeloste delen van het monster. Als het monster of delen ervan onopgelost zijn nadat nog 10 ml water is toegevoegd, dient het experiment te worden herhaald in een maatcilinder van 100 ml met grotere volumes water. De tijd die nodig is om een stof op te lossen kan bij lagere waarden van de oplosbaarheid aanzienlijk langer zijn (minimaal 24 uur dient in acht te worden genomen). De benaderde waarde van de oplosbaarheid is in de tabel vermeld onder de hoeveelheid water waarin het monster geheel wordt opgelost. Als de stof nog steeds onoplosbaar blijkt moet meer dan 24 uur gewacht worden (maximaal 96 uur), of dient verdere verdunning plaats te vinden om te bepalen of de kolom-elutie-methode dan wel de methode met de kolf moet worden gebruikt.1.6.3. Kolom-elutie-methode1.6.3.1. Dragermateriaal, oplosmiddel en eluensHet dragermateriaal voor de kolom-elutie-methode moet inert zijn. Bruikbare materialen zijn bij voorbeeld glasparel en zand. Voor het aanbrengen van de te onderzoeken stof op het dragermateriaal dient gebruik te worden gemaakt van een geschikt vluchtig en analytisch zuiver oplosmiddel. Als eluens dient water, dat tweemaal gedestilleerd is in glas- of kwartsapparatuur, te worden gebruikt.Opmerking:Er mag geen gebruik worden gemaakt van water dat rechtstreeks uit een organische ionenwisselaar komt.1.6.3.2. Laden van het dragermateriaalOngeveer 600 mg dragermateriaal wordt afgewogen en overgebracht in een rondbodemkolf van 50 ml.Een afgewogen hoeveelheid van de te onderzoeken stof wordt opgelost in het gekozen oplosmiddel. De juiste hoeveelheid van deze oplossing wordt bij het dragermateriaal gevoegd. Het oplosmiddel moet, bij voorbeeld in een roterende verdamper, volledig worden verdampt. Bij onvolledige verwijdering van het oplosmiddel kan het dragermateriaal, ten gevolge van verdelingseffecten aan het oppervlak, later niet worden verzadigd met water.Het laden van het dragermateriaal kan aanleiding geven tot problemen (onjuiste resultaten) als de te onderzoeken stof wordt afgezet als olie of in een andere kristalvorm. Dit probleem moet experimenteel worden onderzocht en de bijzonderheden moeten worden gerapporteerd.Het beladen dragermateriaal wordt gedurende ongeveer twee uur bevochtigd in ongeveer 5 ml water, waarna de suspensie wordt aangebracht op de microkolom. Anderzijds kan men ook het droge, beladen dragermateriaal direct in de met water gevulde microkolom brengen, en daarna ongeveer twee uur wachten totdat een evenwichtstoestand is ontstaan.Testprocedure:De stof kan op twee verschillende manieren van het dragermateriaal worden geëlueerd:- recirculatiepomp (zie figuur 1);- voorraadfles (zie figuur 4).1.6.3.3. Kolom-elutie-methode met recirculatiepompApparatuurEen schema van het systeem is afgebeeld in figuur 1. In figuur 2 is een geschikte microkolom afgebeeld: elke maat is echter aanvaardbaar mits deze voldoet aan de criteria voor reproduceerbaarheid en gevoeligheid. De kolom moet aan de bovenzijde zijn voorzien van een reservoir voor ten minste vijf kolomvolumina water, en moet minimaal vijf monsters kunnen bevatten. Eventueel kunnen de afmetingen worden verminderd indien extra oplosmiddel wordt gebruikt ter vervanging van de eerste vijf kolomvolumina welke met verontreinigingen worden afgevoerd.De kolom moet worden aangesloten op een recirculatiepomp waarmee een debiet van ongeveer 25 ml/uur kan worden ingesteld. De pomp wordt aangesloten door middel van polytetrafluorethyleen (PTFE) en/of glazen verbindingsstukken. De kolom en de pomp moeten zo worden opgesteld dat het mogelijk is om monsters te nemen van de uitstromende vloeistof en om het reservoir in evenwicht te houden met de atmosferische druk. Het kolommateriaal wordt ondersteund door een kleine (5 mm) prop glaswol waarmee ook deeltjes worden weggefilterd. Als recirculatiepomp kan bij voorbeeld een peristaltische pomp of een membraanpomp worden gebruikt (er moet op worden toegezien dat aan de slangwand geen verontreiniging en/of adsorptie plaatsvindt).MeetprocedureDe stroming door de kolom wordt op gang gebracht. Een debiet van ongeveer 25 ml/uur (dit komt overeen met ongeveer 10 kolomvolumina/uur voor de beschreven kolom) wordt aanbevolen. De eerste vijf kolomvolumina (minimaal) worden afgevoerd om wateroplosbare verontreinigingen te verwijderen. Vervolgens wordt de recirculatiepomp aan de onderzijde van de kolom aangesloten. De apparatuur blijft in werking totdat een evenwichtstoestand is bereikt; hiervoor geldt dat de concentraties in vijf opeenvolgende monsters niet meer dan ± 30 % mogen verschillen op aselecte wijze. Tussen de tijdstippen, waarop deze monsters worden genomen, moeten ten minste 10 kolomvolumina van het eluens passeren.1.6.3.4. Kolom-elutie-methode met voorraadflesApparatuur (zie figuren 3 en 4)Voorraadfles: voor aansluiting van de voorraadfles wordt gebruik gemaakt van een rond glazen slijpstuk en polytetrafluorethyleenslangen. Een debiet van ongeveer 25 ml/uur wordt aanbevolen. Er wordt een aantal opeenvolgende monsters van het eluaat genomen voor analyse volgens de gekozen methode.MeetprocedureIn het middengebied van het eluaat, wanneer de concentraties constant zijn (± 30 %) in tenminste vijf opeenvolgende fracties, worden deze fracties gebruikt om de oplosbaarheid in water te bepalen.In beide gevallen (circulatiepomp of voorraadfles) moet een tweede reeks metingen worden verricht waarbij het debiet de helft is van de aanvankelijke waarde. Als de resultaten van beide series metingen overeenstemmen, worden de testresultaten geaccepteerd. Als de oplosbaarheid bij het laagste debiet hoger blijkt, dan moet het halveren van het debiet worden voortgezet, totdat twee opeenvolgende series metingen dezelfde oplosbaarheid geven.In beide gevallen (circulatiepomp of voorraadfles) moeten de monsters aan de hand van het Tyndall-effect (verstrooiing van licht) worden gecontroleerd op aanwezigheid van deeltjes in collo udale toestand. De aanwezigheid van dergelijke deeltjes maakt de resultaten ongeldig, zodat de test moet worden herhaald nadat de filterwerking van de kolom is verbeterd.De pH van elk monster moet worden geregistreerd. Er moet een tweede serie metingen worden uitgevoerd bij dezelfde temperatuur.1.6.4. Methode met de kolf1.6.4.1. ApparatuurVoor de methode met de kolf is het volgende materiaal nodig:- gangbaar laboratoriumglaswerk en -apparatuur;- een apparaat om de oplossingen in beweging te brengen bij constante temperatuur;- zo nodig voor emulsies een centrifuge (bij voorkeur met thermostaat);- apparatuur voor analytische bepaling.1.6.4.2. MeetprocedureAan de hand van de inleidende test wordt bepaald hoeveel materiaal nodig is om de gewenste hoeveelheid water te verzadigen. De benodigde hoeveelheid water hangt af van de analysemethode en van de oplosbaarheid. In drie van een glazen stop voorziene glazen vaten (bij voorbeeld centrifugebuizen, kolven) wordt telkens ongeveer vijfmaal de aldus bepaalde hoeveelheid materiaal afgewogen. De gewenste hoeveelheid water wordt in elk vat gegoten, waarna de vaten goed worden afgesloten. De afgesloten vaten worden vervolgens bij een temperatuur van 30  C in beweging gebracht. (Hiervoor wordt een schud- of roermachine gebruikt waarmee bij constante temperatuur kan worden gewerkt, bij voorbeeld een magneetroerder in een waterbak met thermostaatregeling.) Na één dag wordt één van de vaten verwijderd, waarna onder af en toe roeren 24 uur wordt gewacht totdat bij de testtemperatuur een nieuwe evenwichtstoestand is ontstaan. Vervolgens wordt de inhoud van het vat gecentrifugeerd bij de testtemperatuur, waarna de concentratie van de teststof in de heldere waterige oplossing analytisch wordt bepaald. De beide andere kolven ondergaan dezelfde behandeling nadat zij gedurende twee respectievelijk drie dagen bij 30  C zijn geëquilibreerd. Als de waarden voor de concentratie in tenminste de laatste twee vaten voldoen aan de vereiste reproduceerbaarheid, worden de testresultaten geaccepteerd. Als de resultaten van de vaten 1, 2 en 3 toenemende waarden geven, moet de hele test worden herhaald, waarbij langer wordt gewacht tot een evenwichtstoestand is ontstaan.De meetprocedure kan ook worden uitgevoerd zonder voorverwarming bij 30  C. Om de snelheid te kunnen schatten waarmee het verzadigingsevenwicht zich instelt, worden monsters genomen totdat blijkt dat verder roeren geen invloed meer heeft op de concentratie van de testoplossing.De pH van elk monster moet worden geregistreerd.1.6.5. AnalyseHiervoor dient bij voorkeur een methode te worden toegepast waarmee verschillende stoffen kunnen worden onderscheiden, aangezien kleine hoeveelheden opgeloste verontreinigingen kunnen leiden tot grote fouten in de gemeten oplosbaarheid. Voorbeelden van zulke methoden zijn: gas- of vloeistofchromatografie, titratie, fotometrie, voltametrie.2. GEGEVENS2.1. KOLOM-ELUTIE-METHODEVoor elke serie metingen moeten het gemiddelde en de standaardafwijking worden berekend van tenminste vijf opeenvolgende monsters, die op het verzadigingsniveau zijn genomen. De resultaten moeten worden opgegeven in eenheden massa per volume oplossing.De gemiddelden van twee metingen met verschillend debiet moeten worden vergeleken en moeten een herhaalbaarheid beter dan 30 % hebben.2.2. METHODE MET DE KOLFVoor de drie kolven moeten de afzonderlijke resultaten worden vermeld en het gemiddelde van de als constant beschouwde resultaten (herhaalbaarheid beter dan 15 %) moet worden bepaald en opgegeven in eenheden massa per volume oplossing. Hiervoor kan het nodig zijn massa-eenheden om te rekenen naar volume-eenheden, waarbij rekening wordt gehouden met de dichtheid indien de oplosbaarheid zeer hoog is (> 100 g/l).3. RAPPORTAGE3.1. KOLOM-ELUTIE-METHODEHet rapport dient zo mogelijk de volgende gegevens te bevatten:- de resultaten van de inleidende test;- nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen);- de afzonderlijke concentraties, debieten en pH-waarden van elk monster;- het gemiddelde en de standaardafwijking van ten minste vijf monsters uit elke serie die zijn genomen op het verzadigingsniveau;- het gemiddelde van de twee opeenvolgende acceptabele series;- de temperatuur van het water tijdens het verzadigingsproces;- de toegepaste analysemethode;- de aard van het toegepaste dragermateriaal;- het laden van het dragermateriaal;- het gebruikte oplosmiddel;- elke gebleken chemische instabiliteit van de stof tijdens de test en de gebruikte methode;- alle gegevens en opmerkingen, die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof.3.2. METHODE MET DE KOLFHet rapport dient zo mogelijk de volgende gegevens te bevatten:- de resultaten van de inleidende test;- nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen);- de afzonderlijke analyses en het gemiddelde, indien meer dan één waarde werd bepaald, voor iedere kolf;- de pH van elk monster;- het gemiddelde van de waarden voor de verschillende kolven die onderling overeenstemden;- de testtemperatuur;- de toegepaste analysemethode;- elke gebleken chemische instabiliteit van de stof tijdens de test en de gebruikte methode;- alle gegevens en opmerkingen, die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof.4. LITERATUUR(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105 - Decision of the Council C(81) 30 Final.(2) NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility - Column elution method.(3) NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility - Flask method.AanhangselFiguur 1>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Kolom-elutie-methode met recirculatiepompFiguur 2>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Een voorbeeld van een microkolom (alle afmetingen in mm)Figuur 3>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Een voorbeeld van een microkolom (alle afmetingen in mm)Figuur 4>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Kolom-elutie-methode met voorraadfles1 = voorraadfles (bij voorbeeld een glazen fles van 2,5 liter)2 = kolom (zie figuur 3)3 = monsterverzamelaar4 = thermostaat5 = teflonslang6 = glazen slijpstuk7 = waterleiding (tussen thermostaat en kolom, inwendige diameter ongeveer 8 mm)A.8. VERDELINGSCOËFFICIËNT1. METHODEDe "schudfles"-methode berust op de testrichtlijn van de OESO (1).1.1. INLEIDINGVoor het uitvoeren van deze test is het nuttig om van tevoren te beschikken over gegevens inzake de structuurformule, dissociatieconstante, oplosbaarheid in water, hydrolyse, oplosbaarheid in n-octanol en oppervlaktespanning van de stof.Metingen van ioniseerbare stoffen dienen alleen te worden uitgevoerd met de niet-ge¨ uoniseerde vorm van de stof (vrij zuur of vrije base) verkregen met behulp van een geschikte buffer met een pH van minstens één pH-eenheid onder (vrij zuur) of boven (vrije base) de pK.Deze testmethode omvat twee verschillende procedures: de schudflesmethode en de hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC). De eerste methode is toepasbaar wanneer de log Pow-waarde (zie verder voor definities) in het bereik van  2 tot 4 valt, de tweede methode in het bereik van 0 tot 6. Alvorens een van beide experimentele procedures uit te voeren, dient eerst een voorlopige schatting van de verdelingscoëfficiënt te worden gemaakt.De schudflesmethode is alleen van toepassing op chemisch zuivere stoffen die oplosbaar zijn in water en n-octanol. De methode is niet van toepassing op oppervlakteactieve stoffen (waarvoor een berekende waarde of een raming, gebaseerd op de individuele oplosbaarheid in n-octanol en water, moet worden gerapporteerd).De HPLC-methode is niet toepasbaar op sterke zuren en basen, metaalcomplexen en oppervlakte-actieve stoffen die met het eluent kunnen reageren. Voor deze stoffen dient een berekende waarde of een raming, gebaseerd op de individuele oplosbaarheid in n -octanol en water, te worden gerapporteerd.De HPLC-methode is minder gevoelig voor de aanwezigheid van verontreinigingen in de teststof dan de schudflesmethode. Desondanks kunnen verontreinigingen soms de interpretatie van de resultaten bemoeilijken omdat moeilijk kan worden bepaald welke piek bij welke stof hoort. Voor mengsels die een band zonder resolutie geven, moeten de boven- en ondergrens van log P worden gerapporteerd.1.2. DEFINITIES EN EENHEDENDe verdelingscoëfficiënt (P) is gedefinieerd als de verhouding van de concentraties in evenwichtstoestand (ci) van een opgeloste stof in een twee-fasensysteem bestaande uit twee niet-mengbare oplosmiddelen. Voor n-octanol en water:Pow = cn-octanolcwaterDe verdelingscoëfficiënt (P) is daarom het quotiënt van twee concentraties; gewoonlijk wordt deze waarde opgegeven als een logaritme met grondtal tien (log P).1.3. REFERENTIESTOFFENSchudflesmethodeHet is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om zo nu en dan de werking van de methode te controleren en om vergelijkingen met resultaten van andere methoden mogelijk te maken.HPLC-methodeOm de gemeten HPLC-gegevens van een stof te kunnen correleren met de P-waarde, moet een ijklijn worden gemaakt van log P tegen de chromatografische gegevens, met behulp van minstens 6 referentiepunten. De gebruiker dient de geschikte referentiestoffen te kiezen. Zo mogelijk dient de Pow-waarde van minstens één referentiestof boven, en die van minstens één referentiestof onder de Pow van de teststof te liggen. Voor log P-waarden kleiner dan 4 kan bij de ijking worden uitgegaan van met de schudflesmethode verkregen gegevens. Voor log P-waarden groter dan 4 kan de ijking worden uitgevoerd met behulp van gevalideerde waarden uit de literatuur, op voorwaarde dat deze overeenkomen met de berekende waarden. Voor een grotere nauwkeurigheid verdient het de voorkeur om referentiestoffen te kiezen die qua structuur verwant zijn aan de te onderzoeken stof.Er zijn uitgebreide lijsten beschikbaar met log Pow-waarden voor verschillende categorieën chemicaliën (2)(3). Als er geen gegevens over de verdelingscoëfficiënt van structureel verwante stoffen beschikbaar zijn, mag een meer algemene ijking worden toegepast met andere ijkstoffen.In aanhangsel 2 wordt een lijst van aanbevolen ijkstoffen en hun Pow-waarden gegeven.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE1.4.1. SchudflesmethodeOm een verdelingscoëfficiënt te kunnen bepalen, moet een evenwichtstoestand zijn bereikt tussen alle componenten van het systeem; de concentraties van de opgeloste stoffen moeten vervolgens in beide fasen worden bepaald. Uit de literatuur blijkt dat er voor dit probleem, dat wil zeggen het grondig mengen van beide fasen gevolgd door fasescheiding ten einde de evenwichtsconcentraties van de te onderzoeken stof te bepalen, verschillende technische oplossingen bestaan.1.4.2. HPLC-methodeHPLC wordt uitgevoerd met analytische kolommen, gepakt met een in de handel verkrijgbare vaste fase, bestaande uit chemisch aan silica gebonden lange koolwaterstofketens (bij voorbeeld C8, C18). Chemische stoffen die in deze kolommen ge¨ unjecteerd worden, bewegen met verschillende snelheden door deze kolommen, wat een gevolg is van het verschil in verdeling tussen de mobiele fase en de stationaire koolwaterstoffase. Mengsels van stoffen worden geëlueerd in volgorde van waterafstotendheid, wateroplosbare stoffen het eerst en olieoplosbare stoffen het laatst, afhankelijk van hun koolwaterstof/water-verdelingscoëfficiënt. Op deze wijze kan de verhouding tussen de retentietijd in de (omgekeerde fase) kolom en de n-octanol/water-verdelingscoëfficiënt worden bepaald. De verdelingscoëfficiënt wordt afgeleid uit de capaciteitsfactor k, met de volgende formule:k = tR   t0t0waarintR = retentietijd van de te onderzoeken stof, en t0 = gemiddelde tijd die een molecuul van het oplosmiddel nodig heeft om de kolom te passeren (dode tijd).Kwantitatieve analysemethoden zijn niet vereist, alleen de elutietijd moet worden bepaald.1.5. KWALITEITSCRITERIA1.5.1. HerhaalbaarheidSchudflesmethodeOm de nauwkeurigheid van de verdelingscoëfficiënt te garanderen moeten duplo-metingen worden verricht onder drie uiteenlopende testomstandigheden; hierbij kan zowel de hoeveelheid stof als de verhouding van de hoeveelheden oplosmiddel worden gevarieerd. De gevonden waarden van de verdelingscoëfficiënt moeten, uitgedrukt in gewone logaritmen, binnen een interval van ± 0,3 log-eenheden vallen.HPLC-methodeOm de betrouwbaarheid van de meting te vergroten moeten duplo-metingen worden verricht. De log P-waarden, afgeleid uit de individuele metingen, moeten binnen een bereik van ± 0,1 log-eenheid liggen.1.5.2. GevoeligheidSchudflesmethodeHet meetbereik van de methode wordt bepaald door de detectiegrens van de analysemethode. Deze moet voldoende laag zijn om log Pow-waarden in het bereik van  2 tot 4 te kunnen bepalen (onder speciale voorwaarden kan dit bereik uitgebreid worden tot een log Pow van 5), wanneer de concentratie van de opgeloste stof in geen van beide fasen hoger is dan 0,01 mol per liter.HPLC-methodeMet de HPLC-methode kunnen verdelingscoëfficiënten worden bepaald in het log Pow-bereik van 0 tot 6.Normaal gezien kan de verdelingscoëfficiënt van een mengsel worden geschat tot op ± 1 log-eenheid van de schudfleswaarde. Voorbeelden van correlaties kunnen worden teruggevonden in de literatuur (4, 5, 6, 7, 8). Grotere nauwkeurigheid kan meestal worden bereikt met behulp van correlatiekrommen gebaseerd op referentiemengsels met verwante structuur (9).1.5.3. SpecificiteitSchudflesmethodeDe verdelingswet van Nernst geldt alleen voor verdunde oplossingen bij constante temperatuur, druk en pH. De wet geldt bovendien voor een zuivere stof die wordt verdeeld tussen twee zuivere oplosmiddelen. Indien in één of beide fasen tegelijkertijd verschillende opgeloste stoffen voorkomen, dan kan dit van invloed zijn op de resultaten.Dissociatie of associatie van de opgeloste moleculen leidt tot afwijkingen van de verdelingswet van Nernst. Dergelijke afwijkingen blijken uit de concentratieafhankelijkheid van de verdelingscoëfficiënt.Wegens het voorkomen van meervoudige evenwichtstoestanden mag deze test niet zonder correcties worden toegepast op ioniseerbare stoffen. Voor dergelijke stoffen dient het gebruik van bufferoplossingen in plaats van water te worden overwogen; de pH van de buffer dient tenminste 1 pH-eenheid te verschillen van de pKa van de stof en men dient rekening te houden met het belang van deze pH met betrekking tot het milieu.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. Inleidende schatting van de verdelingscoëfficiëntDe verdelingscoëfficiënt wordt bij voorkeur geschat aan de hand van een berekeningsmethode (zie aanhangsel 1) of, indien van toepassing, op basis van de oplosbaarheidsverhouding van de te onderzoeken stof in de zuivere oplosmiddelen (10).1.6.2. Schudfles-methode1.6.2.1. Voorbereidingn-Octanol: de verdelingscoëfficiënt moet worden bepaald met analytisch zuiver oplosmiddel.Water: er moet gebruik worden gemaakt van gedestilleerd of dubbel gedestilleerd water uit apparatuur van glas of kwarts. Voor ioniseerbare verbindingen dienen zo nodig bufferoplossingen in plaats van water te worden gebruikt.Opmerking:Er mag geen gebruik worden gemaakt van water dat rechtstreeks uit een ionenwisselaar komt.1.6.2.1.1. Voorverzadiging van de oplosmiddelenAlvorens een verdelingscoëfficiënt te bepalen, worden de fasen van het oplosmiddelsysteem onderling verzadigd door uitschudden bij de temperatuur van het experiment. Hiertoe is het handig om gedurende 24 uur twee grote voorraadflessen met analytisch zeer zuiver n-octanol, respectievelijk water, waaraan voldoende water respectievelijk n-octanol is toegevoegd, mechanisch te schudden en daarna te laten staan totdat de fasen zich afscheiden en een verzadigingstoestand is ontstaan.1.6.2.1.2. Voorbereiding van de testHet twee-fasensysteem moet het testvat bijna vullen. Aldus wordt vervluchtiging van de vloeistof voorkomen. De volumeverhouding en de benodigde hoeveelheid van de te onderzoeken stof worden bepaald door:- de inleidende bepaling van de verdelingscoëfficiënt (zie 1.6.1);- de minimale hoeveelheid van de te onderzoeken stof vereist voor de analyse;- de beperking van de maximale concentratie in beide fasen tot 0,01 mol/l.Er worden drie tests uitgevoerd: in de eerste test wordt gewerkt met de berekende volumeverhouding n-octanol/water; in de tweede test wordt deze verhouding gedeeld door twee, in de derde test wordt deze verhouding vermenigvuldigd met twee (bij voorbeeld 1:1, 1:2, 2:1).1.6.2.1.3. De te onderzoeken stofEr wordt een voorraadoplossing bereid uit n-octanol voorverzadigd met water. De concentratie van deze voorraadoplossing moet nauwkeurig worden bepaald voor gebruik bij de bepaling van de verdelingscoëfficiënt. Deze oplossing moet onder stabiele omstandigheden bewaard worden.1.6.2.2. TestomstandighedenDe testtemperatuur moet constant (± 1  C) worden gehouden binnen een bereik van 20-25  C.1.6.2.3. Meetprocedure1.6.2.3.1. Instelling van het verdelingsevenwichtVoor de verschillende testomstandigheden moeten steeds twee testvaten worden gevuld met de vereiste, nauwkeurig bekende hoeveelheden van beide oplosmiddelen en de gewenste hoeveelheid voorraadoplossing.Het volume van de n-octanol-fasen moet worden gemeten. De testvaten moeten in een schudmachine worden geplaatst of met de hand worden geschud. Aanbevolen wordt om, bij gebruik van een centrifugebuis, deze snel 180  te draaien om de transversale as, zodat de ingesloten lucht door de beide fasen omhoog beweegt. De ervaring heeft geleerd dat 50 van dergelijke bewegingen gewoonlijk voldoende zijn om het verdelingsevenwicht te bereiken. Om zeker te zijn wordt aangeraden om 100 bewegingen uit te voeren in 5 minuten.1.6.2.3.2. Scheiding van de fasenIndien noodzakelijk, moet het mengsel worden gecentrifugeerd om de fasen te scheiden. Dit moet worden gedaan in een laboratoriumcentrifuge bij kamertemperatuur; indien een centrifuge zonder temperatuurregeling wordt gebruikt, moeten de centrifugebuizen ten minste gedurende één uur op de testtemperatuur worden gehouden, zodat de evenwichtstoestand zich kan instellen voordat de analyse wordt uitgevoerd.1.6.2.4. AnalyseVoor bepaling van de verdelingscoëfficiënt moet de concentratie van de te onderzoeken stof in beide fasen worden bepaald. Dit kan worden gedaan door onder de verschillende testomstandigheden uit alle buizen een monster van iedere fase te nemen en dit volgens de gekozen procedure te analyseren. De totale hoeveelheid van de te onderzoeken stof in beide fasen wordt berekend en vergeleken met de oorspronkelijke hoeveelheid toegevoegde stof.Van de water-fase moet een monster worden genomen volgens een procedure waardoor zo min mogelijk sporen n-octanol worden meegenomen: voor de bemonstering van de water-fase kan een glazen injectiespuit met verwisselbare naald worden gebruikt. De injectiespuit moet van tevoren gedeeltelijk worden gevuld met lucht. De lucht moet zachtjes worden uitgedreven terwijl de naald door de n-octanol-fase wordt gestoken. De benodigde hoeveelheid van de water-fase wordt in de injectiespuit gezogen. De spuit wordt snel uit de oplossing gehaald, waarna de naald wordt losgemaakt. De inhoud van de injectiespuit kan nu worden gebruikt als monster van de water-fase. De concentratie in de twee afzonderlijke fasen dient bij voorkeur te worden bepaald met behulp van een analysemethode waarmee verschillende stoffen kunnen worden onderscheiden. Enkele voorbeelden van geschikte analysenmethoden zijn:- fotometrische methoden;- gaschromatografie;- hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC).1.6.3. HPLC-METHODE1.6.3.1. VoorbereidingApparatuurBenodigd is een vloeistofchromatograaf, uitgerust met een niet-pulserende pomp en een geschikte detectie-inrichting. Het gebruik van een injectieventiel met injectielussen wordt aangeraden. Aangezien de aanwezigheid van polaire groepen in de stationaire fase het juiste gedrag van de HPLC-kolom ernstig kan be¨ unvloeden, dient deze een zo klein mogelijk percentage polaire groepen te bevatten (11). Men kan gebruik maken van in de handel verkrijgbare, met microdeeltjes gevulde, omgekeerde fasepakkingen of van voorgepakte kolommen. Tussen het injectiesysteem en de analytische kolom kan een voorkolom worden ge¨ unstalleerd.Mobiele faseMethanol en water, beide van HPLC-kwaliteit, worden gebruikt als elutiemiddel, dat voor gebruik wordt ontgast. Isokratische elutie dient te worden toegepast. Men moet methanol/water-verhoudingen met minimaal 25 % watergehalte gebruiken, normaliter neemt men een 3:1 (v/v) methanol/watermengsel om verbindingen met een log P van 6 binnen het uur te elueren, bij een stroomsnelheid van 1 ml/minuut. Voor verbindingen met een hoge log P kan het noodzakelijk zijn om de elutietijd te verkorten (evenals voor de referentiestoffen) door de polariteit van de mobiele fase of de kolomlengte te verminderen.Stoffen met een zeer lage oplosbaarheid in n-octanol geven met de HPLC-methode veelal abnormaal lage log Pow-waarden; de pieken van dergelijke stoffen vallen soms samen met het oplosmiddelfront. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat het verdelingsproces te traag verloopt om het evenwicht te bereiken binnen de tijdsduur die normaal voor een HPLC-scheiding nodig is. Het kan dan nuttig zijn om de stroomsnelheid en/of de methanol/water-verhouding te verlagen ten einde een betrouwbare waarde te verkrijgen.Test- en referentiestoffen moeten in voldoende concentratie oplosbaar zijn in de mobiele fase om detectie mogelijk te maken. Alleen in uitzonderingsgevallen mogen additieven in het methanol/water-mengsel worden gebruikt, daar toevoegingen de eigenschappen van de kolom veranderen. Voor chromatogrammen met additieven is het verplicht een aparte kolom van hetzelfde type te gebruiken. Als methanol/water niet voldoet, mogen andere organisch-oplosmiddel/water-mengsels worden gebruikt, bij voorbeeld ethanol/water of acetonitril/water.De pH van het eluent is kritisch voor ioniseerbare stoffen. Hij moet in het juiste pH-bereik van de kolom liggen, gewoonlijk tussen 2 en 8. Bufferen wordt aangeraden. Voorzichtigheid dient in acht te worden genomen om neerslag van zout en achteruitgang van de kolom te voorkomen, hetgeen optreedt met sommige organische fase/buffer-mengsels. HPLC-metingen met stationaire fasen op basis van silica boven pH 8 worden afgeraden omdat het gebruik van een alkalische mobiele fase kan leiden tot een snelle achteruitgang van de kolomeigenschappen.Opgeloste stoffenDe referentiestoffen dienen zo zuiver mogelijk te zijn. Verbindingen voor test- of ijkdoeleinden worden, indien mogelijk, opgelost in de mobiele fase.TestomstandighedenDe temperatuur gedurende de metingen mag niet meer variëren dan ± 2 K.1.6.3.2. MetingBerekening van de dode tijd t0De dode tijd t0 kan bepaald worden met of wel een homologe serie (bij voorbeeld n-alkylmethylketonen) of wel organische stoffen die niet worden tegengehouden (bij voorbeeld thioureum of formamide). Ter berekening van de dode tijd t0 met een homologe serie moet een set van ten minste 7 stoffen uit dezelfde serie worden ge¨ unjecteerd en moeten de respectieve retentietijden worden bepaald. De ruwe retentietijden tr(nc+1) worden uitgezet als functie van tr(nc + 1) = a + b tr(nc) , en het snijpunt a en de helling b van de regressievergelijking:t0 = a / (1   b)worden bepaald (nc = aantal koolstofatomen). De dode tijd t0 wordt dan gegeven door:t0  =  a / (1   b)IJklijnDe volgende stap bestaat uit het construeren van een correlatiekromme van log k-waarden tegen log P voor geschikte referentiestoffen. In de praktijk wordt een set van 5 tot 10 standaard-referentiestoffen, met een log P-waarde rond het te verwachten bereik, tegelijkertijd ge unjecteerd en worden de retentietijden bepaald, bij voorkeur met een recorder/integrator die is verbonden met het detectiesysteem. De corresponderende logaritmen van de capaciteitsfactoren, log k, worden berekend en uitgezet als functie van log P, bepaald met de schudflesmethode. De ijking wordt uitgevoerd met regelmatige tussenpozen, minstens eenmaal per dag, zodat rekening kan worden gehouden met mogelijke veranderingen in het gedrag van de kolom.Bepaling van de capaciteitsfactor van de te onderzoeken stofDe teststof wordt in een zo klein mogelijke hoeveelheid van de mobiele fase ge¨ unjecteerd. De retentietijd wordt bepaald (in duplo), om zo de capaciteitsfactor k te kunnen berekenen. Uit de correlatiegrafiek van de ijkstoffen kan de verdelingscoëfficiënt van de teststof worden ge unterpoleerd. Voor zeer lage en zeer hoge verdelingscoëfficiënten is extrapolatie noodzakelijk. In deze gevallen dient men extra aandacht te besteden aan de betrouwbaarheidsgrenzen van de regressielijn.2. GEGEVENSSchudflesmethodeDe betrouwbaarheid van de gevonden waarden voor P kan worden onderzocht door de gemiddelden van de duplo-bepalingen te vergelijken met het totale gemiddelde.3. RAPPORTAGEIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen);- indien de methoden niet toepasbaar zijn (bij voorbeeld oppervlakteactieve stoffen), dient een berekende waarde of een schatting gebaseerd op de individuele oplosbaarheid in n-octanol en water te worden opgegeven;- alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof.Voor de schudflesmethode- het resultaat van de inleidende schatting, indien van toepassing;- testtemperatuur;- gegevens over de analytische procedures voor bepaling van de concentraties;- tijd en snelheid van centrifugeren, indien van toepassing;- de gemeten concentraties in beide fasen voor elke bepaling (dit betekent dat in totaal 12 concentraties worden vermeld);- het gewicht van de onderzochte stof, het volume van elke fase in elk testvat en de berekende totale hoeveelheid van de onderzochte stof in elke fase bij evenwicht;- de berekende waarden van de verdelingscoëfficiënt (P) en het gemiddelde voor iedere groep testomstandigheden, evenals het gemiddelde van alle metingen; indien er aanwijzingen zijn dat de verdelingscoëfficiënt afhankelijk is van de concentratie, dient dit te worden vermeld in het testrapport;- de standaardafwijking van de afzonderlijke P-waarden ten opzichte van het gemiddelde;- de logaritme (grondtal 10) van de P-waarde gemiddeld over alle metingen;- de theoretisch berekende waarde van Pow, wanneer deze is bepaald of wanneer de gemeten waarde groter is dan 104;- pH van het gebruikte water en van de waterfase tijdens het experiment;- indien bufferoplossingen worden gebruikt, de redenen voor het gebruik van bufferoplossingen in plaats van water, samenstelling, concentratie en pH van de bufferoplossingen, pH van de waterige fase vóór en na het experiment.Voor de HPLC-methode- het resultaat van de inleidende schatting, indien van toepassing;- test- en referentiestoffen, en de zuiverheid;- testtemperatuur;- de pH waarbij de bepaling wordt uitgevoerd;- details van de analytische en de voorkolom, de mobiele fase en de detectiemethode;- retentiegegevens en log P-waarden uit de literatuur voor de bij de ijking gebruikte referentiestoffen;- details van de gevonden regressielijn (log k tegen log P);- gemiddelde retentiegegevens en de ge¨ unterpoleerde log P-waarde voor de teststof;- beschrijving van de apparatuur en de werkomstandigheden;- elutieprofielen;- de hoeveelheden test- en referentiestoffen die in de kolom zijn gebracht;- dode tijd en hoe hij gemeten werd.4. LITERATUUR(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107 - Decision of the Council C(81) 30 Final.(2) C. Hansch en A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction od bioactivity (C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir.) - Available from Pomona College Medicinal Chemistry Project, 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.(4) L. Renberg, G. Sundström en K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683.(5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt en R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219.(6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.(7) W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1.(8) J.E. Haky en A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675.(9) S. Fujisawa en E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol.  15, 787.(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumspraxis (edited by E. Müller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1958), Band I/1, 223-339.(11) R.F. Rekker en H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479.(12) A. Leo, C. Hansch en D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.(13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977.(14) NF T 20-043 (AFNOR) (Sept.1985). Chemical products for industrial use - Determination of partition coefficient - Flask shaking method.(15) C.V. Eadsforth en P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.(16) A. Leo, C. Hansch en D. Elkins, Chem. Rev, 1971, vol. 71, 525.(17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani en E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207.(18) W.B. Neely, D.R. Branson en G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1113.(19) D.S. Brown en E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382.(20) J.K. Seydel en K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1979.(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam, 1984.(22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel, 1978.(23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy en P.J. Taylor, J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.Aanhangsel 1Berekenings-/SchattingsmethodenINLEIDINGEen algemene inleiding tot berekeningsmethoden, gegevens en voorbeelden worden gegeven in het "Handbook of Chemical Property Estimation Methods" (a).Berekende waarden voor Pow kunnen worden gebruikt:- om te beslissen welke van de experimentele methoden het meest geschikt is (schudflesbereik: log Pow:  2 tot 4, HPLC-bereik: log Pow: 0 tot 6);- om de geschikte testvoorwaarden te kunnen kiezen (bij voorbeeld referentiestoffen voor de HPLC-methode, n-octanol/water-volumeverhoudingen voor de schudflesmethode);- ter controle voor het laboratorium zelf van eventuele fouten in het experiment;- om een Pow-schatting te leveren in die gevallen waar de experimentele methoden om technische redenen niet kunnen worden toegepast.SCHATTINGSMETHODEInleidende schatting van de verdelingscoëfficiëntDe waarde van de verdelingscoëfficiënt kan geschat worden met behulp van de oplosbaarheid van de teststof in zuivere oplosmiddelen.Hiervoor geldt:Pgeschat = cn-Oktanol verzadigdcwater verzadigdBEREKENINGSMETHODENPrincipe van de berekeningsmethodenAlle berekeningsmethoden zijn gebaseerd op de formele fragmentatie van het molecuul in geschikte substructuren, waarvoor betrouwbare log Pow-fragmentconstanten bekend zijn. De log Pow van het volledige molecuul wordt dan berekend als de som van de afzonderlijke waarden van de overeenkomstige fragmenten, plus de som van de correctietermen voor intramoleculaire wisselwerkingen.Lijsten van fragmentconstanten en correctietermen zijn te vinden in de literatuur (b)(c)(d)(e). Sommige hiervan worden regelmatig bijgewerkt (b).KwaliteitscriteriaOver het algemeen vermindert de betrouwbaarheid van een berekeningsmethode met het toenemen van de complexiteit van de onderzochte stof. Voor eenvoudige moleculen met laag molecuulgewicht en slechts één of twee functionele groepen kan een afwijking van 0,1 tot 0,3 log Pow-eenheden worden verwacht tussen de resultaten van de verschillende fragmentatiemethoden en de gemeten waarde. Voor meer complexe moleculen kan de fout groter zijn. Dit is afhankelijk van de betrouwbaarheid en beschikbaarheid van fragmentconstanten, alsmede van het vermogen om intramoleculaire wisselwerkingen (bij voorbeeld waterstofbruggen) te herkennen en het juiste gebruik van de correctietermen (minder problematisch met de computersoftware CLOGP-3) (b). In geval van ioniserende verbindingen is het belangrijk de lading of de mate van ionisatie juist in te schatten.BerekeningsproceduresHansch ð-methodeDe oorspronkelijke hydrofobesubstitutieconstante ð, ge¨ untroduceerd door Fujita et al. (f), wordt gedefinieerd als:px = log Pow (PhX)   log Pow (PhH)waarin Pow (PhX) de verdelingscoëfficiënt van een aromatisch derivaat is, en Pow (PhH) die van de oorspronkelijke verbinding,(bij voorbeeld pCl= log Pow (C6H5Cl) log Pow (C6H6) = 2,84   2,13 = 0,71).Volgens zijn definitie is de Ð-methode voornamelijk toepasbaar op aromatische substitutie. De Ð-waarden van een groot aantal substitutiegroepen zijn in tabellen terug te vinden (b)(c)(d). Deze worden gebruikt voor de berekening van log Pow van aromatische moleculen of substructuren.Rekker-MethodeVolgens Rekker (g) wordt de log Pow-waarde als volgt berekend:log Pow = Siai fi + Sj (wisselwerkingstermen)waarin fi de moleculaire fragmentconstante voorstelt en ai de frequentie van het voorkomen ervan in het onderzochte molecuul. De correctietermen kunnen worden uitgedrukt als een integraal veelvoud van één enkele constante cm (de zogenaamde "magische" constante). De fragmentconstanten fi en cm werden bepaald uit een lijst van 1 054 experimentele Pow waarden (825 stoffen) met behulp van meervoudige regressieanalyse (c)(h). De bepaling van de interactietermen wordt uitgevoerd volgens vaste regels beschreven in de literatuur (e)(h)(i).Hansch-Leo-methodeVolgens Hansch en Leo (c) wordt de log Pow-waarde berekend uit:log Pow = Siai fi + Sj bj Fjwaarin fi de moleculaire fragmentconstante voorstelt, Fj de correctietermen en ai en bj het overeenkomstige aantal keren dat ze voorkomen. Afgeleid uit experimentele Pow-waarden werd door "trial and error" een lijst gemaakt van atoom- en groeps-fragmentwaarden evenals een lijst van correctietermen Fj (de zogenaamde "factoren"). De correctietermen zijn geclassificeerd in verschillende categorieën (a)(c). Omdat het vrij ingewikkeld en tijdrovend is rekening te houden met alle regels en correctietermen, werden softwarepakketten ontwikkeld (b).Gecombineerde methodeDe berekening van log Pow van complexe moleculen kan aanzienlijk verbeterd worden, indien het molecuul wordt opgesplitst in grotere substructuren waarvoor betrouwbare log Pow-waarden beschikbaar zijn, hetzij uit tabellen (b)(c) of uit eigen metingen. Zulke fragmenten (bij voorbeeld heterocyclische structuren, antrachinon, azobenzeen) kunnen dan worden gecombineerd met de Ð-waarden volgens Hansch of met de fragmentconstanten volgens Rekker of Leo.Opmerkingeni) De berekeningsmethoden kunnen slechts worden toegepast op gedeeltelijk of volledig geioniseerde stoffen wanneer de mogelijkheid bestaat om de nodige correctiefactoren in de berekening te verwerken.ii) Als het bestaan van intramoleculaire waterstofbruggen kan worden aangenomen, moeten de overeenkomstige correctietermen (ongeveer + 0,6 tot +1,0 log Pow-eenheden) bij het resultaat worden opgeteld (a). Aanwijzingen voor de aanwezigheid van waterstofbruggen kunnen worden verkregen uit ruimtelijke modellen of spectroscopische gegevens over het molecuul.iii) Als verschillende tautomere vormen mogelijk zijn, dient de meest waarschijnlijke vorm gebruikt te worden voor de berekening.iv) De herzieningen van lijsten met fragmentconstanten dienen zorgvuldig gevolgd te worden.RapportBij het gebruik van berekenings-/schattingsmethoden dient het testrapport zo mogelijk de volgende gegevens te bevatten:- beschrijving van de stof (mengsel, verontreinigingen, enz.);- aanwijzingen over mogelijke intramoleculaire waterstofbruggen, dissociatie, lading en alle andere ongewone effecten (bij voorbeeld tautomerie);- beschrijving van de berekeningsmethode;- identificatie of leverancier van de database;- bijzonderheden in de keuze van de fragmenten;- uitgebreide documentatie van de berekening.LITERATUUR(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl en D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).(c) C. Hansch en A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.(d) A. Leo, C. Hansch en D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.(e) R.F. Rekker en H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. - Chim. Ther. , 1979, vol. 14, 479.(f) T. Fujita, J. Iwasa en C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, vol. 1, Elsevier, New York, 1977.(h) C.V. Eadsforth en P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.(i) R.A. Scherrer, ACS - American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, 225.Aanhangsel 2>RUIMTE VOOR DE TABEL>A.9. VLAMPUNT1. METHODE1.1. INLEIDINGAlvorens de test uit te voeren is het nuttig te beschikken over oriënterende gegevens inzake de brandbaarheid van de stof. De testprocedure is van toepassing op vloeistoffen waarvan de dampen door een ontstekingsbron tot ontbranding kunnen worden gebracht. De hier beschreven testmethoden zijn alleen betrouwbaar indien de gemeten waarde van het vlampunt binnen een bereik ligt zoals in de afzonderlijke methoden is aangegeven.Bij het selecteren van de te gebruiken methode dient rekening te worden gehouden met mogelijke chemische reacties tussen de teststof en het monstervat.1.2. DEFINITIES EN EENHEDENHet vlampunt is de laagste temperatuur, gecorrigeerd tot een druk van 101,325 kPa, waarbij een vloeistof onder de beschreven omstandigheden zodanig verdampt, dat in het testvat een brandbaar mengsel van lucht en damp wordt gevormd.Eenheden:  Ct = T   273,15(t in  C en T in K).1.3. REFERENTIESTOFFENHet is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Referentiestoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om regelmatig de werking van de methode te controleren en om vergelijkingen met resultaten van andere methoden mogelijk te maken.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEDe stof wordt in een testvat gebracht en verwarmd of gekoeld tot de testtemperatuur volgens de procedure beschreven bij de afzonderlijke testmethode. Ontstekingspogingen worden uitgevoerd om te zien of het monster al dan niet tot ontbranding kan worden gebracht bij de testtemperatuur.1.5. KWALITEITSCRITERIA1.5.1. ReproduceerbaarheidDe reproduceerbaarheid varieert met de gemeten waarde van het vlampunt en met de gebruikte testmethode; maximaal 2  C.1.5.2. GevoeligheidDe gevoeligheid is afhankelijk van de gebruikte testmethode.1.5.3. ToepasbaarheidDe toepasbaarheid van een aantal testmethoden blijft beperkt tot bepaalde vlampuntsbereiken en afhankelijk van stofeigenschappen (bij voorbeeld hoge viscositeit).1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. VoorbereidingenEen monster van de te onderzoeken stof wordt in een testapparaat overeenkomstig 1.6.3.1, respectievelijk 1.6.3.2, gebracht.Uit veiligheidsoverwegingen wordt aangeraden voor energetische of giftige stoffen een methode waarbij slechts een klein monstervolume (circa 2 cm3) nodig is, toe te passen.1.6.2. TestomstandighedenHet apparaat dient, voor zover de veiligheid dit toelaat, op een tochtvrije plaats te worden opgesteld.1.6.3. Uitvoering van de test1.6.3.1. EvenwichtsmethodeZie ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523 en ISO 3679.1.6.3.2. Niet-evenwichtsmethodeApparatuur van Abel:Zie BS 2000-170, NF M 07-011 en NF T 66-009.Apparatuur van Abel-Pensky:Zie EN 57, DIN 51755, deel 1 (voor temperaturen van 5 tot 65  C) DIN 51755, deel 2 (voor temperaturen lager dan 5  C), NF M 07-036.Apparatuur van Tag:Zie ASTM D 56.Apparatuur van Pensky-Martens:Zie ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34 en NF M 07-019.Opmerkingen:Indien het vlampunt, bepaald volgens een van de niet-evenwichtsmethoden onder 1.6.3.2, de volgende waarden blijkt te hebben: 0 ± 2  C, 21 ± 2  C, 55 ± 2  C, dient dit te worden bevestigd volgens een evenwichtsmethode met gebruik van dezelfde apparatuur.Alleen de methoden waarmee de temperatuur van het vlampunt kan worden bepaald, komen in aanmerking voor gebruik ten behoeve van een kennisgeving.Voor de bepaling van het vlampunt van viseuze vloeistoffen (verven, lijmen, e.d.) die oplosmiddelen bevatten, mag uitsluitend gebruik worden gemaakt van apparatuur en testmethoden die geschikt zijn voor bepaling van het vlampunt van viseuze vloeistoffen.Zie ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523 en DIN 53213, deel 1.2. GEGEVENS3. RAPPORTAGEIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- nauwkeurige beschrijving van de stof (beschrijving en verontreinigingen);- de gebruikte testmethode alsmede eventuele wijzigingen;- de resultaten en alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten.4. LITERATUURGeen.A.10. ONTVLAMBAARHEID (VASTE STOFFEN)1. METHODE1.1. INLEIDINGAlvorens de test uit te voeren is het nuttig te beschikken over oriënterende gegevens inzake potentieel explosieve eigenschappen van de stof.Deze test dient alleen te worden toegepast op stoffen in poeder-, korrel- of pastavorm.Alleen stoffen waarvan de brandsnelheid hoger is dan een bepaalde drempelwaarde, worden als licht ontvlambaar beschouwd. Daarom worden niet alle stoffen die kunnen worden ontstoken, maar alleen die stoffen die snel branden of waarvan het brandgedrag buitengewoon gevaarlijk is, inbegrepen.Het is buitengewoon gevaarlijk indien een smeulproces zich voortplant door een metaalpoeder, vanwege de moeilijkheid om het vuur te doven. Daarom dienen metaalpoeders als licht ontvlambaar te worden beschouwd, als de smeulhaard zich binnen een zekere tijd door de gehele massa kan voortplanten.1.2. DEFINITIES EN EENHEDENBrandtijd in seconden.1.3. REFERENTIESTOFFENNiet gekozen.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEVan de stof wordt een ononderbroken rups of poederlijn met een lengte van ongeveer 250 mm gevormd waarop een oriënterende proef wordt uitgevoerd om te bepalen of, na ontsteken van het monster met behulp van een gasvlam, de vlam of het smeulproces zich voortplant. Als het vlamfront/smeulproces zich binnen een bepaalde tijdsduur over 200 mm van de sliert voortplant, dient een volledig testprogramma te worden uitgevoerd om de brandsnelheid vast te stellen.1.5. KWALITEITSCRITERIANiet gegeven.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. Oriënterende proefVan de stof wordt een ononderbroken rups of poederlijn van ongeveer 250 mm lengte, 20 mm breedte en 10 mm hoogte gevormd op een onbrandbare, niet-poreuze en slecht warmtegeleidende grondplaat.Een hete vlam van een gasbrander (minimale diameter 5 mm) wordt gedurende maximaal 2 minuten bij één uiteinde van de rups gehouden totdat het poeder ontbrandt (5 minuten voor metaalpoeders of metaallegeringen). Men dient er op te letten of de ontbranding zich binnen 4 minuten (of 40 minuten bij metaalpoeders) voortplant over 200 mm van de poederrups. Indien de stof niet ontbrandt of indien de vlam of het smeulproces zich niet binnen 4 minuten (of 40 minuten bij metaalpoeders) voortplant over 200 mm poederrups dient de stof niet als licht ontvlambaar te worden beschouwd en behoeft geen verder onderzoek te worden uitgevoerd. Als het brandproces zich in minder dan 4 minuten, of minder dan 40 minuten bij metaalpoeders, voortplant over 200 mm van de poederrups dient de procedure zoals hieronder beschreven (punt 1.6.2. en volgende) te worden uitgevoerd.1.6.2. Brandsnelheidstest1.6.2.1. VoorbereidingenPoeder of korrelvormige stoffen worden ingebracht (niet aandrukken) in een mal met een lengte van 250 mm en een driehoekige doorsnede met een inwendige hoogte van 10 mm en een inwendige breedte van 20 mm. Om de zijkanten te begrenzen zijn aan beide kanten van de mal in de lengterichting twee metalen platen gemonteerd die 2 mm uitsteken boven de rand van de driehoekige doorsnede (zie figuur). Vervolgens laat men de mal driemaal van een hoogte van 2 cm op een massief oppervlak vallen. Indien nodig wordt de mal bijgevuld.Vervolgens worden de zijplaten verwijderd en wordt de overtollige stof met een stevig blad weggeveegd. Een onbrandbare, niet-poreuze en slecht warmtegeleidende plaat wordt bovenop de mal gelegd, het apparaat wordt omgekeerd, waarna de mal wordt verwijderd.Pastavormige stoffen worden op een onbrandbare, niet-poreuze en slecht warmtegeleidende plaat aangebracht in de vorm van een rups met een lengte van 250 mm en een doorsnede van ongeveer 1 cm2.1.6.2.2. TestomstandighedenBij een vochtgevoelige stof dient de test zo snel als mogelijk na het verwijderen van de verpakking te worden uitgevoerd.1.6.2.3. Uitvoering van de testDe rups wordt in een zuurkast geplaatst in een richting loodrecht op de richting van de trek.De luchtsnelheid moet voldoende zijn om te verhinderen dat verbrandingsgassen naar de laboratoriumruimte ontsnappen; de luchtsnelheid mag gedurende de test niet veranderd worden. De apparatuur moet worden omgeven door een tochtscherm.Met de hete vlam van een gasbrander (minimale diameter 5 mm) wordt de rups aan één kant ontstoken. Nadat de rups over een lengte van 80 mm heeft gebrand, wordt de brandsnelheid over de volgende 100 mm gemeten. De test, waarbij steeds een schone koude plaat wordt gebruikt, wordt zesmaal uitgevoerd, tenzij eerder een positief resultaat wordt verkregen.2. GEGEVENSVoor de beoordeling zijn de brandduur in de oriënterende proef (1.6.1) en de kortste brandduur uit de hoogstens zes testen (1.6.2.3) van belang.3. RAPPORTAGE3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGENIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- een nauwkeurige specificatie van de stof (beschrijving en verontreinigingen);- een beschrijving van de fysische toestand en het vochtgehalte van de onderzochte stof;- de resultaten van de oriënterende test en, indien uitgevoerd, de brandsnelheidstest;- alle verdere opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten.3.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATENPoedervormige, korrelvormige of pastavormige stoffen worden als licht ontvlambaar beschouwd indien in één van de tests uitgevoerd volgens 1.6.2 de brandduur minder dan 45 seconden bedraagt. Poeders van metalen of metaallegeringen worden als licht ontvlambaar beschouwd, indien zij kunnen worden ontstoken en indien de vlam of reactiezone zich binnen 10 minuten over het gehele monster uitbreidt.4. LITERATUUR(1) NF T 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.AanhangselFiguur>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Mal en toebehoren om een rups van de te onderzoeken stof te vormen (Afmetingen in mm)A.11. ONTVLAMBAARHEID (GASSEN)1. METHODE1.1. INLEIDINGMet deze methode kan worden vastgesteld of mengsels van gassen en lucht bij kamertemperatuur (ongeveer 20  C) en atmosferische druk brandbaar zijn, en zo ja, binnen welk concentratiebereik. Mengsels met toenemende concentraties van het te onderzoeken gas in lucht worden blootgesteld aan een elektrische vonk, waarna wordt vastgesteld of ontbranding plaatsvindt.1.2. DEFINITIE EN EENHEDENDe maat voor de brandbaarheid is het bereik van de concentratiewaarden tussen de onderste en bovenste ontploffingsgrens. De onder- en bovenexplosiegrenzen worden gevormd door de uiterste concentraties van het brandbare gas in lucht waarbij een vlam zich niet voortplant.1.3. REFERENTIESTOFNiet gegeven.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEDe concentratie van het gas in de lucht wordt stap voor stap opgevoerd, waarbij het mengsel in iedere stap wordt blootgesteld aan een elektrische vonk.1.5. KWALITEITSCRITERIANiet gegeven.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. ApparatuurHet testvat is een staande glazen cilinder met een inwendige diameter van minimaal 50 mm en een hoogte van minimaal 300 mm. De ontstekingselektroden bevinden zich op een onderlinge afstand van 3 tot 5 mm en worden 60 mm boven de cilinderbodem geplaatst. De cilinder is voorzien van een overdrukventiel. Het apparaat moet worden afgeschermd om schade bij een eventuele ontploffing te beperken.Als ontstekingsbron wordt gebruik gemaakt van een staande inductievonk met een duur van 0,5 sec, opgewekt door een hoogspanningstransformator met een uitgangsspanning van 10 tot 15 kV (maximaal ingangsvermogen 300 W). Een voorbeeld van een geschikt apparaat wordt gegeven in referentie (2).1.6.2. TestomstandighedenDe test moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 20  C).1.6.3. Uitvoering van de testMet behulp van doseerpompen wordt een bekende concentratie van het gas in lucht naar de glazen cilinder geleid. Het mengsel wordt blootgesteld aan een vonk en er wordt vastgesteld of er zich vanaf de ontstekingsbron al dan niet een vlam ontwikkelt die zich zelfstandig voortplant. De gasconcentratie wordt in stappen van 1 % vol opgevoerd, totdat ontbranding zoals boven bedoeld, plaatsvindt.Als de chemische structuur van het gas erop wijst dat het niet ontvlambaar is en de samenstelling van het sto¨ uchiometrische mengsel met lucht berekend kan worden, dienen alleen de mengsels in het bereik van 10 % beneden tot 10 % boven de sto¨ uchiometrische samenstelling getest te worden in stappen van 1 %.2. GEGEVENSHet enige gegeven van belang voor bepaling van deze eigenschap is het optreden van een vlam, die zich zelfstandig voortplant.3. RAPPORTAGEIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- een nauwkeurige specificatie van de stof (beschrijving en verontreinigingen);- een beschrijving van de gebruikte apparatuur inclusief de afmetingen;- de temperatuur waarbij de test werd uitgevoerd;- de onderzochte concentraties en de verkregen resultaten;- het resultaat van de test: niet ontvlambaar of licht ontvlambaar gas. Indien geconcludeerd wordt dat het gas niet ontvlambaar is, moet het concentratiebereik waarover het gas in stappen van 1 % onderzocht werd, vermeld worden;- alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten.4. LITERATUUR(1) NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases.(2) W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. Redeker en H. Schacke. Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech., 1984, vol. 56, 2, 126-127.A.12. ONTVLAMBAARHEID (CONTACT MET WATER)1. METHODE1.1. INLEIDINGDeze testmethode kan worden gebruikt om vast te stellen of de reactie van een stof met water of vochtige lucht leidt tot het vrijkomen van een gevaarlijke hoeveelheid van één of meer eventueel licht ontvlambare gassen.De testmethode kan zowel op vaste als op vloeibare stoffen worden toegepast. Deze methode is niet van toepassing op stoffen die in aanraking met lucht spontaan ontbranden.1.2. DEFINITIES EN EENHEDENLicht ontvlambaar: Stoffen die bij aanraking met water of vochtige lucht licht ontvlambare gassen produceren met een minimum ontwikkelingshoeveelheid van 1 liter per kg stof per uur.1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEDe stof wordt volgens de hieronder beschreven getrapte volgorde getest; als bij één van de stappen ontbranding optreedt, is verder onderzoek overbodig. Als bekend is dat de te onderzoeken stof niet heftig reageert met water kan worden verdergegaan met stap 4 (1.3.4).1.3.1. Stap 1De te onderzoeken stof wordt in een buis met gedistilleerd water op 20  C gebracht en er wordt nagegaan of het vrijgekomen gas ontbrandt.1.3.2. Stap 2De te onderzoeken stof wordt gebracht op een filtreerpapier dat in een schotel met gedistilleerd water van 20  C drijft, en er wordt nagegaan of het vrijkomende gas ontbrandt. Het filtreerpapier dient alleen om de stof op één plaats te houden, waardoor de kans op ontbranding toeneemt.1.3.3. Stap 3Van de te onderzoeken stof wordt een hoopje van ongeveer 2 cm hoog en 3 cm doorsnede gemaakt. Hierop worden een paar druppels water gebracht en er wordt nagegaan of het vrijkomende gas ontbrandt.1.3.4. Stap 4De te onderzoeken stof wordt met gedistilleerd water van 20  C gemengd en de snelheid van gasontwikkeling wordt ieder uur gemeten gedurende een periode van 7 uur. Als de snelheid van de gasontwikkeling onregelmatig is of toeneemt tegen het eind van de periode van 7 uur, moet de duur van de meting tot maximaal 5 dagen worden verlengd. De test kan worden gestaakt zodra een snelheid hoger dan 1 liter/kg per uur wordt gemeten.1.4. REFERENTIESTOFNiet gegeven.1.5. KWALITEITSCRITERIANiet gegeven.1.6. BESCHRIJVING VAN DE METHODEN1.6.1. Stap 11.6.1.1. TestomstandighedenDe proef wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 20  C).1.6.1.2. Uitvoering van de testEen kleine hoeveelheid (ongeveer 2 mm doorsnede) van de te onderzoeken stof wordt in een bak met gedistilleerd water gebracht. Genoteerd wordt (i) of er gas ontwijkt en (ii) of het gas spontaan ontbrandt. Indien ontbranding van het gas plaatsvindt, is verder onderzoek van de stof niet nodig, omdat de stof dan als gevaarlijk wordt beschouwd.1.6.2. Stap 21.6.2.1. ApparatuurEen filtreerpapier laat men plat op het oppervlak van een hoeveelheid gedistilleerd water drijven in een geschikt vat, bij voorbeeld een verdampingsschotel met een doorsnede van 100 mm.1.6.2.2. TestomstandighedenDe proef wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 20  C).1.6.2.3. Uitvoering van de testEen kleine hoeveelheid van de te onderzoeken stof (ongeveer 2 mm doorsnede) wordt midden op het filtreerpapier gebracht. Genoteerd wordt (i) of er gas ontwijkt en (ii) of het gas spontaan ontbrandt. Indien ontbranding van het gas plaatsvindt, is verder onderzoek van de stof niet nodig, omdat de stof dan als gevaarlijk wordt beschouwd.1.6.3. Stap 31.6.3.1. TestomstandighedenDe proef wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 20  C).1.6.3.2. Uitvoering van de testVan de te onderzoeken stof wordt een hoopje van ongeveer 2 cm hoogte en 3 cm doorsnede gemaakt met een kuiltje bovenin. In het kuiltje worden een paar druppels water gebracht en genoteerd wordt (i) of er gas ontwijkt en (ii) of het gas spontaan ontbrandt. Indien ontbranding van het gas plaatsvindt, is verder onderzoek van de stof niet nodig, omdat de stof dan als gevaarlijk wordt beschouwd.1.6.4. Stap 41.6.4.1. ApparatuurDe apparatuur wordt opgesteld als in de figuur.1.6.4.2. TestomstandighedenKijk of het vat van de te onderzoeken stof poeder bevat bestaande uit deeltjes van minder dan 500 ìm diameter. Indien meer dan 1 gewichtsprocent van de stof poedervormig is of indien het monster brokkelig is, wordt de stof in zijn geheel vóór de test tot poeder gemalen; op deze manier wordt rekening gehouden met mogelijk verkleining van de deeltjesgrootte tijdens opslag en verwerking van de stof. In alle andere gevallen wordt de stof onderzocht zoals ze werd verkregen. De test moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 20  C) en atmosferische druk.1.6.4.3. Uitvoering van de test10 tot 20 ml water wordt in de druppeltrechter van het apparaat gebracht en 10 g van de te onderzoeken stof wordt afgewogen in de erlenmeyerkolf. Het volume van het vrijkomende gas kan op elke geschikte wijze worden gemeten. De kraan van de druppeltrechter wordt geopend zodat het water in de erlenmeyerkolf komt, en een chronometer gestart. De hoeveelheid vrijkomend gas wordt ieder uur gemeten gedurende een periode van 7 uur. Als tijdens deze periode het vrijkomen van gas onregelmatig verloopt, of als aan het eind van de periode de hoeveelheid vrijkomend gas toeneemt moeten de metingen voortgezet worden tot maximaal 5 dagen. Indien de gasontwikkelingssnelheid, tijdens de metingen, op welk ogenblik dan ook, meer dan 1 liter per kg stof en per uur bedraagt, kan het onderzoek gestaakt worden. De test moet in triplo worden uitgevoerd.Indien de chemische identiteit van het gas niet bekend is, dient het te worden geanalyseerd. Indien het gas licht ontvlambare componenten bevat en niet bekend is of het totale mengsel licht ontvlambaar is, moet een mengsel van dezelfde samenstelling worden bereid en getest volgens methode A.11.2. GEGEVENSDe onderzochte stof wordt als gevaarlijk beschouwd indien:- spontane ontbranding plaatsvindt bij één van de stappen tijdens de testprocedure;- een ontvlambaar gas vrijkomt met een grotere snelheid groter dan 1 liter per kg van de te onderzoeken stof per uur.3. RAPPORTAGEIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- een nauwkeurige specificatie van de stof (beschrijving en verontreinigingen);- gegevens over eventuele voorbehandeling van de onderzochte stof;- de resultaten van de tests (stappen 1, 2, 3 en 4);- de chemische identiteit van het vrijgekomen gas;- de snelheid waarmee het gas vrijkomt als stap 4 (1.6.4) wordt uitgevoerd;- alle verdere opmerkingen die van belang zijn voor interpretatie van de resultaten.4. LITERATUUR(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, tests and criteria, 1990, United Nations, New York.(2) NF T 20-040 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.AanhangselFiguur>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>ApparatuurA.13. PYROFORE EIGENSCHAPPEN VAN VASTE STOFFEN EN VLOEISTOFFEN1. METHODE1.1. InleidingDe testprocedure is van toepassing op vaste en vloeibare stoffen, die spontaan kunnen ontbranden kort nadat ze bij kamertemperatuur (ongeveer 20  C) in aanraking zijn gekomen met lucht.Deze testprocedure is niet van toepassing op stoffen die bij kamertemperatuur eerst na uren- of dagenlange blootstelling aan lucht spontaan ontbranden of die op hogere temperatuur moeten worden gebracht om tot zelfontbranding te komen.1.2. DEFINITIES EN EENHEDENStoffen worden als pyrofoor beschouwd als ze ontbranden of verkoling veroorzaken onder de omstandigheden zoals beschreven onder 1.6.Voor de zelfontvlambaarheid van vloeistoffen kan ook een test nodig zijn volgens methode A.15: Zelfontbrandingstemperatuur (vloeistoffen en gassen).1.3. REFERENTIESTOFFENNiet gegeven.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEDe stof, vast of vloeibaar, wordt op een inerte drager gebracht en gedurende 5 minuten bij omgevingstemperatuur in aanraking gebracht met lucht. Indien vloeistoffen niet ontbranden moeten ze geabsorbeerd worden op filterpapier en gedurende 5 minuten bij omgevingstemperatuur (ongeveer 20  C) worden blootgesteld aan lucht. Als een vaste of vloeibare stof ontbrandt, of een vloeistof het filterpapier doet ontbranden of verkolen, wordt de stof beschouwd als pyrofoor.1.5. KWALITEITSCRITERIAReproduceerbaarheid: gezien het belang met betrekking tot veiligheid is één enkel positief resultaat voldoende om de stof als pyrofoor te beschouwen.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. ApparatuurEen porseleinen bakje van ongeveer 10 cm doorsnede wordt bij kamertemperatuur (ongeveer 20  C) tot een hoogte van ongeveer 5 mm gevuld met diatomeeënaarde.Opmerking:Diatomeeënaarde of een vergelijkbare en gangbare inerte stof wordt representatief geacht voor aarde waarmee gemorste stoffen in geval van een ongeluk in aanraking kunnen komen.Droog filterpapier is vereist om vloeistoffen te onderzoeken die niet ontbranden na aanraking met lucht wanneer ze in aanraking zijn met een inerte drager.1.6.2. Uitvoering van de testa) Poedervormige vaste stoffen1 tot 2 cm3 van de te onderzoeken, poedervormige stof wordt vanaf ongeveer 1 m hoogte op een niet-brandbaar oppervlak gestrooid; nagegaan wordt of de stof tijdens het vallen, of binnen 5 minuten na het neerkomen, ontbrandt.De proef wordt 6 keer uitgevoerd tenzij ontbranding optreedt.b) Vloeistoffen ongeveer 5 cm3 van van de te onderzoeken vloeistof wordt in het porseleinen bakje gegoten en nagegaan wordt of de stof binnen 5 minuten ontbrandt.Als geen ontbranding optreedt tijdens de zes proeven, voer dan de volgende tests uit:Een hoeveelheid van 0,5 ml van de te onderzoeken stof wordt met behulp van een injectiespuit op een gekarteld filterpapiertje gebracht en er wordt nagegaan of ontbranding of verkoling van het filterpapier optreedt binnen vijf minuten nadat de vloeistof werd aangebracht. De test wordt driemaal uitgevoerd, tenzij ontbranding of verkoling optreedt.2. GEGEVENS2.1. BEWERKING VAN DE RESULTATENHet onderzoek mag worden gestaakt zodra een positief resultaat optreedt in één van de tests.2.2. BEOORDELINGIndien de stof ontbrandt binnen vijf minuten na opbrengen op een inerte drager en blootstelling aan de lucht, of indien een vloeistof een filterpapiertje verkoolt of doet ontbranden binnen vijf minuten na opbrengen en blootstelling aan de lucht, wordt de stof beschouwd als zijnde pyrofoor.3. RAPPORTAGEIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- een nauwkeurige specificatie van de stof (beschrijving en verontreinigingen);- de resultaten van de tests;- iedere bijkomende opmerking betreffende de interpretatie van de resultaten.4. LITERATUUR(1) NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.A.14. EXPLOSIEGEVAAR1. METHODE1.1. INLEIDINGDe methode omvat een testschema om vast te stellen of een pasta explosiegevaar oplevert wanneer de stof aan een vlam (thermische gevoeligheid) of aan een schok of wrijving (mechanische gevoeligheid) wordt blootgesteld, alsmede of een vloeistof explosiegevaar oplevert wanneer de stof aan een vlam of aan een schok wordt blootgesteld.De methode bestaat uit drie delen:a) een test voor de thermische gevoeligheid (1);b) een test voor de mechanische gevoeligheid bij schokken (1);c) een test voor de mechanische gevoeligheid bij wrijving (1).De methode levert gegevens op waarmee de kans op ontstaan van een explosie door bepaalde veel voorkomende stimuli kan worden beoordeeld. De methode is niet bedoeld om vast te stellen of een stof onder om het even welke omstandigheden kan exploderen.De methode is geschikt om te bepalen of een stof explosiegevaar oplevert (thermische en mechanische gevoeligheid) onder omstandigheden zoals beschreven in de richtlijn. De methode is gebaseerd op een aantal soorten apparaten die internationaal op grote schaal worden gebruikt (1) en die doorgaans zinvolle resultaten geven. Erkend wordt dat de methode geen definitief uitsluitsel geeft. Andere apparatuur dan beschreven, mag worden gebruikt op voorwaarde dat deze internationaal erkend is en dat de resultaten afdoende getoetst kunnen worden aan de resultaten met de beschreven apparatuur.De proeven hoeven niet te worden uitgevoerd indien uit de beschikbare thermodynamische gegevens  (vormingswarmte, ontledingswarmte) en/of afwezigheid van bepaalde reactieve groepen (2) in de struktuurformule met afdoende zekerheid kan worden vastgesteld dat de stof niet snel kan ontleden onder produktie van gassen of warmte (dat wil zeggen: het materiaal vertegenwoordigt geen enkel explosiegevaar). Een test op mechanische gevoeligheid voor wrijving is niet vereist voor vloeistoffen.1.2. DEFINITIES EN EENHEDENAls explosief worden gedefinieerd: stoffen die door de werking van een vlam kunnen ontploffen of die gevoelig zijn voor schokken en wrijving in de beschreven apparatuur (of die mechanisch gevoeliger zijn dan 1,3-dinitrobenzeen in andere apparatuur).1.3. REFERENTIESTOFFENTechnisch, kristallijn 1,3-dinitrobenzeen gezeefd door 0,5 mm maaswijdte, voor de wrijvings- en schokmethode.Perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine (RDX, hexogeen, cycloniet - CAS 121-82-4), geherkristalliseerd uit waterig cyclohexanon, nat gezeefd door een 250 ìm zeef en op een 150 ìm zeef en gedroogd bij 103 ± 2  C (gedurende 4 uur) voor de tweede reeks wrijvings- en schoktests.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODETot vaststelling van veilige omstandigheden voor het uitvoeren van de drie gevoeligheidstests zijn oriënterende proeven noodzakelijk.1.4.1. Oriënterende proef (3)Om veiligheidsredenen worden voor het uitvoeren van de gevoeligheidsbeproevingen zeer kleine monsters (ongeveer 10 mg) van de stof zonder afsluiting verwarmd in een gasvlam, blootgesteld aan schokken in een geschikt apparaat, en aan wrijving door middel van een hamer tegen een aambeeld of door middel van elk ander wrijvingstoestel. Het doel is vast te stellen of de stof zo gevoelig en explosiegevaarlijk is dat de voorgeschreven gevoeligheidstests, vooral die van thermische gevoeligheid, moeten worden uitgevoerd met speciale voorzorgen om aldus te voorkomen dat de onderzoeker gewond kan raken.1.4.2. Thermische gevoeligheidBij deze methode wordt de stof verwarmd in een stalen buis, afgesloten door afsluitplaten met openingen van verschillende doorsnede, om vast te stellen of de stof bij thermische belasting en goed gedefinieerde opsluiting kan ontploffen.1.4.3. Mechanische gevoeligheid (schok)Bij deze methode wordt de stof aan een schok, veroorzaakt door een bepaalde massa vallend vanaf een bepaalde hoogte, onderworpen.1.4.4. Mechanische gevoeligheid (wrijving)Bij deze methode wordt de vaste stof of pasta onder bepaalde omstandigheden van belasting en relatieve beweging onderworpen aan wrijving tussen standaardoppervlakken.1.5. KWALITEITSCRITERIANiet gegeven.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN1.6.1. Thermische gevoeligheid (werking van een vlam)1.6.1.1. ApparatuurHet apparaat bestaat uit een stalen buis, bestemd voor éénmalig gebruik, voorzien van een herbruikbare afsluitinrichting (figuur 1), die in een verwarmings- en beschermingstoestel wordt geplaatst. Elke buis is diep getrokken uit plaatstaal (zie aanhangsel) en heeft een inwendige doorsnede van 24 mm, een lengte van 75 mm en een wanddikte van 0,5 mm. Aan het open einde is de buis van een flens voorzien om afsluiting met de afsluitinrichting mogelijk te maken. De afsluitinrichting bestaat uit een drukbestendige ronde afsluitplaat met een gat in het midden, die met behulp van een tweedelige schroefverbinding (moer en kraag met schroefdraad) stevig op de buis wordt bevestigd. De moer en de kraag zijn gemaakt van chroommangaanstaal (zie aanhangsel) dat tot 800  C vonkvrij is. De afsluitplaten zijn 6 mm dik en gemaakt van hittebestendig staal (zie aanhangsel), en zijn verkrijgbaar in een reeks verschillende openingsmaten.1.6.1.2. TestomstandighedenNormaal wordt de stof getest zoals hij verkregen werd, alhoewel het in sommige gevallen noodzakelijk kan zijn om de stof te testen na verpulvering, bij voorbeeld indien hij geperst, gegoten of op andere wijze verdicht is.Voor vaste stoffen wordt de hoeveelheid voor elke test te gebruiken materiaal bepaald met behulp van een twee-staps vulprocedure. Een gewogen buis wordt gevuld met 9 cm3 van de stof, waarna deze wordt aangedrukt met een kracht van 80 N verdeeld over de hele doorsnede van de buis. Om veiligheidsredenen of in gevallen waar de fysische vorm van het monster kan veranderen onder druk, mogen andere vulmethoden worden gebruikt; aandrukken is bij voorbeeld niet geschikt als de stof zeer wrijvingsgevoelig is. Als de stof samendrukbaar is wordt meer materiaal bijgevoegd en aangeperst met 80 N totdat de buis gevuld is tot op 55 mm van de bovenkant. De massa van de stof die gebruikt wordt om de buis te vullen tot op het niveau van 55 mm wordt bepaald, vervolgens worden nog twee porties met deze massa, en elk aangedrukt met een kracht van 80 N, ingebracht. Daarna wordt het materiaal of wel bijgevuld of wel verwijderd en aangedrukt totdat de buis gevuld is tot op een hoogte van 15 mm van de bovenkant. Een tweede stap in de vulprocedure wordt uitgevoerd met een aangedrukte massa die een derde bedraagt van de totale hoeveelheid die in de eerste poging werd bepaald. Er worden nog twee van deze hoeveelheden toegevoegd en elk onder 80 N aangedrukt, waarna het niveau van de stof wordt aangepast tot op 15 mm van de bovenkant door materiaal naar behoefte toe te voegen of weg te halen. Voor elke beproeving wordt nu de hoeveelheid vaste stof gebruikt, die in de tweede vulprocedure is vastgesteld, waarbij het vullen wordt uitgevoerd met drie gelijke porties die achtereenvolgens worden samengeperst tot 9 cm3 met de daartoe benodigde kracht (het samenpersen kan worden vereenvoudigd met behulp van tussenringen).Vloeistoffen en gels worden in de buis gebracht tot op een hoogte van 60 mm, waarbij zorg dient te worden gedragen dat bij het vullen met gel geen luchtbellen ontstaan. De buis wordt in de kraag geschoven, de juiste afsluitplaat wordt opgelegd en de moer wordt op de kraag geschroefd na het aanbrengen van een beetje smeermiddel op basis van molybdeendisulfide. Het is van essentieel belang te controleren dat er geen materiaal achterblijft tussen de moer, de plaat, en de schroefdraad.De verwarming geschiedt met behulp van propaan uit een industriële cilinder voorzien van een drukregelaar (60 tot 70 mbar), dat via een meter door een verdeelstuk evenredig verdeeld wordt over vier branders (hetgeen visueel te controleren is aan de vlammen uit de branders). De branders worden rond de beproevingsruimte geplaatst zoals aangegeven in figuur 1. De vier branders hebben een gezamenlijk verbruik van ongeveer 3,2 liter propaan per minuut. Andere stookgassen of branders mogen gebruikt worden, maar de opwarmsnelheid moet verlopen zoals in figuur 3 aangegeven. Voor alle apparatuur dient de opwarmsnelheid periodiek gecontroleerd te worden met behulp van met dibutylftalaat gevulde buizen zoals in figuur 3 is aangeduid.1.6.1.3. Uitvoering van de proevenElke test wordt uitgevoerd totdat ofwel de buis gefragmenteerd is of de buis gedurende vijf minuten is verhit. Als de test resulteert in fragmentatie van de buis in drie of meer stukken, die soms nog aan elkaar zijn verbonden door smalle metaalstrookjes zoals ge¨ ullustreerd in figuur 2, wordt het resultaat beoordeeld als een opgetreden explosie. Een testresultaat, waarbij minder of geen fragmenten ontstaan, wordt beschouwd als niet explosief.Een reeks van drie proeven met een afsluitplaat met een opening van 6,0 mm doorsnede wordt uitgevoerd en, als geen explosies optreden, een tweede reeks van drie proeven met een afsluitplaat met een opening van 2,0 mm. Indien een explosie plaatsvindt in een van de twee proefreeksen, kunnen verdere tests achterwege blijven.1.6.1.4. BeoordelingHet testresultaat wordt als positief beschouwd als er een explosie plaatsvindt in een van bovenstaande testreeksen.1.6.2. Mechanische gevoeligheid (schok)1.6.2.1. Apparatuur (figuur 4)De belangrijkste onderdelen van een doorsnee valhamerapparaat zijn een gietstalen blok met voet, aambeeld, kolom, geleiders, valgewichten, een ontkoppelinrichting en een monsterhouder. Op het stalen blok van 230 mm lengte × 250 mm breedte × 200 mm hoogte met een gegoten voet van 450 mm lengte × 450 mm breedte × 60 mm hoogte, zit het stalen aambeeld van 100 mm doorsnede × 70 mm hoogte vastgeschroefd. Aan de achterkant van het stalen blok is de houder geschroefd waarin de kolom, bestaande uit een naadloze getrokken stalen buis, is bevestigd. Vier schroeven verankeren het apparaat aan een massief betonnen blok van 60 × 60 × 60 cm in een zodanige positie dat de geleiderbalken volkomen verticaal staan en het valgewicht vrij kan vallen. Gewichten van 5 en 10 kg massief staal kunnen worden gebruikt. Het slagoppervlak van de gewichten bestaat uit getemperd staal, HRC 60 tot 63, met een minimumdoorsnede van 25 mm.Het te onderzoeken monster wordt gevat in een schokbeproevingsvat dat bestaat uit twee massieve, in het verlengde boven elkaar liggende stalen cilinders omhuld door een holle stalen geleidecilinder. De massief stalen cilinders hebben een doorsnede van 10 ( 0,003;  0,005) mm en een hoogte van 10 mm, gepolijste oppervlakken, afgeronde zijvlakken (rondingsstraal 0,5 mm) en een hardheid van HRC 58 tot 65. De holle cilinder heeft een uitwendige diameter van 16 mm, een gepolijste binnenkant met een doorsnede van 10 (+0,005; +0,010) mm en een hoogte van 13 mm. Het beproevingsvat wordt vastgezet op een stalen tussenaambeeld (26 mm doorsnede en 26 mm hoogte) en wordt gecentreerd door een ring met perforaties via welke de explosiegassen kunnen worden afgevoerd.1.6.2.2. TestomstandighedenHet monstervolume dient 40 mm3 te bedragen of overeen te komen met het vulvolume in een alternatief apparaat. Vaste stoffen dienen in droge toestand te worden onderzocht en worden als volgt voorbewerkt:a) poedervormige stoffen worden gezeefd (maaswijdte 0,5 mm); alles wat de zeef doorlaat, wordt voor de test gebruikt;b) samengeperste, gegoten of op andere wijze verdichte stoffen worden in stukken gebroken en gezeefd; de zeeffractie van 0,5 tot 1 mm doorsnede wordt gebruikt voor de test en dient representatief te zijn voor de oorspronkelijke stof.Stoffen die normaal gezien geleverd worden als pasta's zouden, in de mate van het mogelijke, moeten worden getest in droge staat of, in ieder geval, na het zoveel mogelijk verwijderd hebben van vloeistof. Vloeistoffen worden onderzocht met een spleet van 1 mm tussen de bovenste en de onderste stalen cilinder.1.6.2.3. Uitvoering van de proevenEen reeks van zes proeven wordt uitgevoerd waarbij men het gewicht van 10 kg van een hoogte van 0,40 m (40 J) laat vallen. Indien een explosie wordt verkregen in de reeks met 40 J moet een extra reeks van zes proeven worden uitgevoerd waarbij men 5 kg van 0,15 m (7,5 J) laat vallen. In andere apparaten wordt het monster vergeleken met de gekozen referentiestof via een vastgestelde procedure (bij voorbeeld op-en-neer techniek, enz.).1.6.2.4. BeoordelingHet testresultaat wordt als positief beschouwd als ten minste éénmaal in een van de proeven een explosie (ontbranden en/of een knal staan hiermee gelijk) plaatsvindt met het beschreven slagapparaat of als het monster in een alternatieve slagproef gevoeliger is dan 1,3-dinitrobenzeen of RDX.1.6.3. Mechanische gevoeligheid (wrijving)1.6.3.1. Apparatuur (figuur 5)Het wrijvingsapparaat bestaat uit een gietstalen grondplaat waarop het eigenlijke wrijvingstoestel gemonteerd is. Het wrijvingstoestel bestaat uit een vaste porseleinen pen en een bewegende porseleinen plaat. De porseleinen plaat zit vast in een slede welke tussen twee geleiders beweegt. De slede wordt via een aandrijfstang, een excentrische nok en een geschikt drijfwerk op zodanige wijze met een elektromotor verbonden, dat de porseleinen plaat slechts éénmaal onder de porseleinen pen heen en weer wordt bewogen over een afstand van 10 mm. De porseleinen pen kan belast worden met bij voorbeeld 120 of 360 newton.De vlakke porseleinen platen worden van wit technisch porselein (oppervlakteruwheid tussen 9 en 32 ìm) gemaakt en zijn 25 mm lang, 25 mm breed en 5 mm hoog. De cylindrische porseleinen pen wordt eveneens van wit technisch porselein gemaakt, is 15 mm lang, heeft een doorsnede van 10 mm en bolvormige uiteinden met een rondingsstraal van 10 mm, en geruwd oppervlak.1.6.3.2. TestomstandighedenHet monstervolume dient 10 mm3 te bedragen of overeen te komen met het vulvolume in een alternatief apparaat.Vaste stoffen dienen in droge toestand te worden onderzocht en worden als volgt voorbewerkt:a) poedervormige stoffen worden gezeefd (maaswijdte 0,5 mm); alles wat de zeef doorlaat, wordt voor de test gebruikt;b) samengeperste, gegoten of op andere wijze verdichte stoffen worden in stukken gebroken en gezeefd; de zeeffractie kleiner dan 0,5 mm wordt gebruikt voor de test.Stoffen die gewoonlijk als pasta's geleverd zouden worden, moeten, in de mate van het mogelijke, in droge staat worden getest. Wanneer de stoffen niet in droge staat kunnen worden bereid, wordt de pasta (na het zoveel mogelijk verwijderen van vloeistof) getest als een 0,5 mm dikke, 2 mm brede en 10 mm lange plak, bereid met behulp van een mal.1.6.3.3. Uitvoering van de proevenDe porseleinen pen wordt op het te onderzoeken monster geplaatst en de belasting wordt aangebracht. Tijdens de test moeten de groeven van de porseleinen plaat loodrecht op de bewegingsrichting liggen. Er moet goed op worden gelet dat de pen op het monster rust, dat voldoende van de te onderzoeken stof onder de pen ligt en dat de plaat op de juiste wijze onder de pen doorbeweegt. Voor pasta's wordt een 0,5 mm dikke mal met een gleuf van 2 bij 10 mm gebruikt om de pasta op de plaat aan te brengen. De porseleinen plaat moet in 0,44 seconden onder de porseleinen pen heen en weer bewegen over een afstand van 10 mm. De pen en elk gedeelte van het oppervlak mogen slechts voor één test worden gebruikt; de twee uiteinden van de pen kunnen dus dienen voor twee proeven en de twee opppervlakken van de plaat elk voor drie proeven.Een reeks van zes proeven wordt uitgevoerd met 360 N belasting. Als een positief resultaat wordt verkregen tijdens deze zes proeven, moet een tweede reeks van zes proeven worden uitgevoerd met 120 N belasting.Bij gebruik van andere apparatuur wordt het monster vergeleken met de gekozen referentiestof via een vastgestelde procedure (bij voorbeeld op-en-neer-techniek, enz.)1.6.3.4. BeoordelingHet testresultaat wordt als positief beschouwd als ten minste in één van de proeven een explosie (knetteren en/of een knal of ontbranden staan hiermee gelijk) plaatsvindt met het beschreven wrijvingsapparaat of als aan gelijkwaardige eisen voldaan wordt in andere wrijvingsapparatuur.2. GEGEVENSIn beginsel wordt in de zin van deze richtlijn aan een stof of preparaat explosiegevaar toegeschreven indien een positief resultaat wordt verkregen in de thermische-, schok- of wrijvingsgevoeligheidstest.3. RAPPORTAGE3.1. TESTRAPPORTIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- de identiteit, samenstelling, zuiverheid, vochtgehalte, enz. van de onderzochte stof;- de fysische vorm van het monster, en of het al dan niet werd verpulverd, gebroken en/of gezeefd;- waarnemingen tijdens de thermische-gevoeligheidstests (bij voorbeeld de monstermassa, aantal fragmenten, enz.);- waarnemingen tijdens de mechanische-gevoeligheidstests (bij voorbeeld de vorming van grote hoeveelheden rook of complete ontleding zonder knal, vlammen, vonken, knallen, knetteren, enz.);- de resultaten van elke soort test;- indien afwijkende apparatuur is gebruikt, moet dit op wetenschappelijke gronden worden gerechtvaardigd; bovendien moet de correlatie tussen meetresultaten met de afwijkende apparatuur en de hierboven beschreven apparatuur bewezen worden;- eventueel nuttige opmerkingen, zoals verwijzing naar proeven met soortgelijke produkten, die van belang kunnen zijn voor een correcte interpretatie van de resultaten;- alle aanvullende opmerkingen die van belang kunnen zijn voor een goede interpretatie van de resultaten.3.2. INTERPRETATIE EN BEOORDELING VAN DE RESULTATENIn het testrapport moet worden vermeld welke resultaten als onjuist, afwijkend of niet-representatief worden beschouwd. Indien een van de resultaten moet worden verworpen, dient een toelichting en de resultaten van alle alternatieve of aanvullende proeven te worden gegeven. Indien een afwijkend resultaat niet kan worden verklaard, moet het worden aanvaard en gebruikt om de stof overeenkomstig in te delen.4. LITERATUUR(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Tests and criteria, 1990, United Nations, New York(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990(3) Koenen, H., Ide, K.H., en Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6-13 en 30-42(4) NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of explosive riskAanhangselVoorbeeld van materiaalspecificatie voor thermische-gevoeligheidstest (zie DIN 1623)(1) Buis: Materiaalspecificatie nr. 1.0336.505 g(2) Afsluitplaat: Materiaalspecificatie nr. 1.4873(3) Getapte kraag en moer: Materiaalspecificatie nr. 1.3817Figuur 1>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Apparatuur voor de thermische gevoeligheidstest Alle afmetingen in mmFig. 1a Stalen buis en toebehorenFig. 1b Verwarmings- en beschermingstoestel>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Figuur 2>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Thermische-gevoeligheidstestVoorbeelden van fragmentatieFiguur 3>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>IJking voor opwarmsnelheid in de thermische gevoeligheidstestTemperatuur/tijd-curve verkregen door verhitting van dibutylftalaat (27 cm3) in een gesloten (1,5 mm afsluitplaat) buis met behulp van een propaandebiet van circa 3,2 liter/minuut. De temperatuur wordt gemeten met een chromel/alumel thermokoppel, roestvrijstalen omhulsel van 1 mm doorsnede, in het midden van de buis geplaatst op 43 mm onder de rand. De opwarmsnelheid in het bereik van 135  C tot 285  C moet tussen 185 en 215 K/minuut liggen.Figuur 4>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Schokgevoeligheidstest (Afmetingen in mm)>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Figuur 4>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>VervolgFig. 4c Schoktoestel voor stoffen in poeder- of pasta-achtige vorm(1) stalen cilinders(2) geleidingsring voor stalen cilinders(3) centreerring met openingen(a) verticale snede(b) bovenaanzicht(4) rubber ring(5) vloeistof (40 mm3)(6) vloeistofloze ruimte>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Fig. 4d Schoktoestel voor vloeistoffen>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Fig. 4e Hamer (valgewicht van 5 kg)(1) insteekeinde(2) wijzertje voor de hoogte(3) positioneergroef(4) cilindrische slagkop(5) terugslaghaakFiguur 5>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>WrijvingsgevoeligheidstestFig. 5a Wrijvingstoestel;Fig. 5b Beginpositie van de pen  verticaal- en bovenaanzichtop het monster>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>A.15. ZELFONTBRANDINGSTEMPERATUUR (VLOEISTOFFEN EN GASSEN)1. METHODE1.1. INLEIDINGExplosieve stoffen en stoffen die spontaan ontbranden in aanraking met lucht bij kamertemperatuur moeten niet onderworpen worden aan dit onderzoek. De testprocedure is van toepassing op gassen, vloeistoffen en dampen die in aanwezigheid van lucht door een heet oppervlak tot ontbranding kunnen worden gebracht.De temperatuur waarbij zelfontbranding optreedt, kan aanzienlijk worden verlaagd door de aanwezigheid van katalytische verontreinigingen, door het oppervlakmateriaal, of door een groter volume van het proefvat.1.2. DEFINITIES EN EENHEDENDe mate van zelfontbranding wordt uitgedrukt in de zelfontbrandingstemperatuur. De zelfontbrandingstemperatuur is de laagste temperatuur waarbij de te onderzoeken stof gemengd met lucht tot ontbranding komt onder omstandigheden zoals beschreven in deze testmethode.1.3. REFERENTIESTOFFENDe referentiestoffen worden beschreven in de normen (zie 1.6.3). Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om de werking van de methode regelmatig te controleren en om vergelijking met resultaten van andere methoden mogelijk te maken.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEDe methode bepaalt de laagste temperatuur van het binnenoppervlak van een vat, die leidt tot ontbranding van een in het vat geinjecteerd(e) gas, damp, of vloeistof.1.5. KWALITEITSCRITERIADe reproduceerbaarheid is afhankelijk van het temperatuurgebied waarin de zelfontbranding optreedt, en van de gebruikte testmethode.De gevoeligheid en specificiteit zijn afhankelijk van de gebruikte testmethode.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. ApparatuurDe apparatuur wordt beschreven in de onder 1.6.3 genoemde methode.1.6.2. TestomstandighedenDe te onderzoeken stof wordt onderzocht volgens de methode beschreven onder 1.6.3.1.6.3. Uitvoering van de testZie: IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.2. GEGEVENSRegistreer de testtemperatuur, de atmosferische druk, de gebruikte hoeveelheid stof en de tijdsduur tot ontbranding.3. RAPPORTAGEIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen);- de gebruikte hoeveelheid stof en de atmosferische druk;- de gebruikte apparatuur;- de resultaten van metingen (testtemperaturen, resultaten met betrekking tot ontbranding en bijbehorende tijdsduur);- alle verdere opmerkingen die van belang zijn voor interpretatie van de resultaten.4. LITERATUURGeen.A.16. RELATIEVE ZELFONTBRANDINGSTEMPERATUUR VAN VASTE STOFFEN1. METHODE1.1. INLEIDINGExplosiegevaarlijke stoffen en stoffen die in contact met lucht bij kamertemperatuur spontaan ontbranden, moeten niet aan deze test worden onderworpen.Deze test geeft oriënterende informatie over de zelfontbrandbaarheid van vaste stoffen bij verhoogde temperatuur.Indien de warmte, die vrijkomt bij reactie van de stof met zuurstof of bij exotherme ontleding, niet snel genoeg aan de omgeving wordt afgegeven, vindt zelfopwarming en uiteindelijk zelfontbranding plaats. Zelfontbranding kan dus slechts optreden als de snelheid van de warmteproduktie groter is dan die van het warmteverlies.De testprocedure is bruikbaar als een oriënterende proef voor vaste stoffen. Omdat de ontsteking en verbranding van vaste stoffen ingewikkelde processen zijn, mag de volgens deze testmethode bepaalde zelfontbrandingstemperatuur alleen voor vergelijkingsdoeleinden worden gebruikt.1.2. DEFINITIES EN EENHEDENDe zelfontbrandingstemperatuur, die met deze methode verkregen wordt, is de laagste omgevingstemperatuur in  C waarbij een bepaald volume van een stof onder welbepaalde omstandigheden ontbrandt.1.3. REFERENTIESTOFFENNiet gegeven.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEEen bepaald volume van de te onderzoeken stof wordt bij kamertemperatuur in een oven geplaatst; het temperatuurverloop in het midden van het monster wordt als functie van de tijd geregistreerd, terwijl de temperatuur van de oven met een snelheid van 0,5  C/minuut wordt opgevoerd tot 400  C of tot de smelttemperatuur indien deze lager is. Voor het doel van deze test wordt de temperatuur van de oven, waarbij de temperatuur van het monster door zelfopwarming 400  C bereikt, de zelfontbrandingstemperatuur genoemd.1.5. KWALITEITSCRITERIANiet gegeven.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. Apparatuur1.6.1.1. OvenEen laboratoriumoven van ongeveer 2 liter, waarvan het temperatuurverloop lineair geregeld kan worden, en voorzien van natuurlijke luchtcirculatie en explosieontlasting. Ten einde eventueel explosiegevaar te vermijden, moet voorkomen worden dat ontledingsgassen in contact kunnen komen met de elektrische verwarmingselementen.1.6.1.2. Gazen kubusEen stuk roestvrij staalgaas met openingen van 0,045 mm moet worden uitgeknipt volgens het patroon van figuur 1. Het gaas wordt gevouwen en met draad vastgemaakt in de vorm van een kubus met open bovenkant.1.6.1.3. ThermokoppelsGeschikte thermokoppels.1.6.1.4. RecorderTweekanaalsrecorder, gecalibreerd van 0 tot 600  C of hiermee overeenkomstige spanning.1.6.2. TestomstandighedenDe stoffen worden getest zoals ontvangen.1.6.3. Uitvoering van de testDe kubus wordt gevuld met de te onderzoeken stof waarbij onder zachtjes tikken zoveel stof toegevoegd wordt dat de kubus volledig gevuld is. Vervolgens wordt de kubus bij kamertemperatuur midden in de oven gehangen. Het ene thermokoppel wordt in het middelpunt van de kubus gebracht en het tweede tussen de kubus en de ovenwand om de oventemperatuur te registreren.De temperaturen van de oven en van het monster worden continu geregistreerd terwijl de temperatuur van de oven met een snelheid van 0,5  C/min wordt opgevoerd tot 400  C of tot de smelttemperatuur indien deze lager is dan 400  C.Wanneer de stof reageert, zal het thermokoppel in het monster een scherpe temperatuursstijging boven de oventemperatuur te zien geven.2. GEGEVENSDe oventemperatuur, waarbij de temperatuur van het monster door zelfopwarming 400  C bereikt, is van belang voor de beoordeling (zie figuur 2).3. RAPPORTAGEIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- een beschrijving van de onderzochte stof;- de meetresultaten inclusief de temperatuur/tijd-grafiek;- alle verdere opmerkingen die van belang zijn voor interpretatie van de resultaten.4. LITERATUUR(1) NF T 20-036 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.Figuur 1>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Patroon van de testkubus met ribben van 20 mmFiguur 2>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Karakteristieke temperatuur/tijd-kurveA.17. OXIDERENDE EIGENSCHAPPEN (VASTE STOFFEN)1. METHODE1.1. INLEIDINGHet is nuttig om, voordat deze test wordt uitgevoerd, te beschikken over gegevens over de mogelijke explosieve eigenschappen van de te onderzoeken stof.Deze test is niet toepasbaar op vloeistoffen en gassen, explosieve of licht ontvlambare vaste stoffen of organische peroxiden.Deze test hoeft niet uitgevoerd te worden als op grond van de structuurformule met afdoende zekerheid kan worden vastgesteld dat de stof niet exotherm kan reageren met een brandbare stof.Ten einde vast te stellen of voor deze test speciale voorzorgsmaatregelen nodig zijn, moet een oriënterende proef worden uitgevoerd.1.2. DEFINITIES EN EENHEDENBrandduur: de tijd in seconden die de reactiezone nodig heeft om zich langs een rups stof te verplaatsen, volgens de werkwijze van 1.6.Brandsnelheid: de bijbehorende snelheid in mm/s.Maximale brandsnelheid: de hoogste waarde van de brandsnelheden van mengsels die 10 tot 90 gewichtsprocent oxiderende stof bevatten.1.3. REFERENTIESTOFAls referentiestof voor de test en de oriënterende proef wordt bariumnitraat (analytisch zuiver) gebruikt.Het referentiemengsel is het volgens 1.6 bereide mengsel van bariumnitraat en poedervormige cellulose, dat de grootst mogelijke brandsnelheid heeft (doorgaans een mengsel met 60 gewichtsprocent bariumnitraat).1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEMet het oog op de veiligheid wordt een oriënterende proef uitgevoerd. Verdere onderzoeken zijn onnodig wanneer uit de oriënterende proef overduidelijk blijkt dat de te onderzoeken stof oxiderende eigenschappen heeft. In andere gevallen wordt de stof aan het volledige onderzoek onderworpen.In het volledige onderzoek wordt de te onderzoeken stof in verschillende verhoudingen gemengd met een bepaalde brandbare stof. Van ieder mengsel wordt een rups gevormd en deze wordt aan één uiteinde aangestoken. De maximale brandsnelheid wordt bepaald en vergeleken met de maximale brandsnelheid van het referentiemengsel.1.5. KWALITEITSCRITERIAIndien nodig kunnen de stoffen op willekeurige wijze worden gemalen en gemengd, mits de maximale brandsnelheden uit de zes verschillende bepalingen niet meer dan 10 % verschillen van hun rekenkundige gemiddelde.1.6. BESCHRIJVING VAN DE METHODE1.6.1. Voorbereiding1.6.1.1. TeststofDe deeltjesgrootte van het te onderzoeken monster wordt als volgt tot minder dan 0,125 mm verkleind: de stof wordt gezeefd en de overblijvende fractie gemalen; deze handelingen worden herhaald totdat de gehele portie door de zeef is gegaan.Iedere methode voor malen en zeven kan worden gebruikt, zolang aan de kwaliteitscriteria is voldaan.Vóór het bereiden van het mengsel wordt de stof eerst tot constant gewicht gedroogd bij 105  C. Indien de ontledingstemperatuur van de te onderzoeken stof beneden 105  C ligt, wordt de stof bij een lagere temperatuur gedroogd.1.6.1.2. Brandbare stofPoedervormige cellulose wordt gebruikt als brandbare stof. De cellulose moet het soort zijn dat wordt gebruikt bij dunne-laagchromatografie of kolomchromatografie. Een type waarbij meer dan 85 % van de vezels een lengte hebben tussen 0,020 en 0,075 mm is geschikt gebleken. Het cellulosepoeder wordt gezeefd door een zeef met openingen van 0,125 mm. Eén en dezelfde voorbewerkte batch cellulose wordt gebruikt gedurende de hele proef.Vóór het bereiden van het mengsel wordt de poedervormige cellulose bij 105  C tot constant gewicht gedroogd.Indien in de oriënterende proef houtmeel wordt gebruikt, wordt het houtmeel van naaldhout gebruikt dat door een zeef met openingen van 1,6 mm valt; het gezeefde houtmeel wordt grondig gemengd en vervolgens vier uur bij 105  C gedroogd in een laag van maximaal 25 mm dikte. Na afkoelen wordt het houtmeel in een luchtdicht vat dat zover mogelijk gevuld is, bewaard tot het ogenblik waarop het wordt gebruikt, zo mogelijk binnen 24 uur na het drogen.1.6.1.3. OntstekingsbronAls ontstekingsbron dient de hete vlam van een gasbrander (minimale diameter 5 mm). Indien een andere ontstekingsbron wordt gebruikt (bij voorbeeld bij proeven in een inerte atmosfeer), moeten beschrijving, redenen en geschiktheid worden gerapporteerd.1.6.2. Uitvoering van de testOpmerking:In verband met mogelijk explosiegevaar moeten mengsels van oxiderende stoffen en cellulose of houtmeel met de nodige voorzichtigheid worden behandeld.1.6.2.1. Oriënterende proefTwee gewichtsdelen gedroogde stof worden grondig gemengd met één gewichtsdeel cellulose of houtmeel. Van het mengsel wordt, bij voorbeeld met behulp van een glazen trechter waarvan de steel is dichtgestopt, zonder aandrukken een kegelvormig hoopje gemaakt met een basisdiameter van 3,5 cm en een hoogte van 2,5 cm.Het hoopje wordt op een koude, onbrandbare, niet poreuze en slecht warmtegeleidende grondplaat geplaatst. De oriënterende proef moet worden uitgevoerd in een zuurkast zoals beschreven in 1.6.2.2.De ontstekingsbron wordt in contact gebracht met het hoopje stof. De heftigheid en de duur van de reactie worden geobserveerd en geregistreerd.De stof kan worden aangemerkt als oxiderend als de reactie heftig verloopt.Zodra het resultaat aanleiding geeft tot enige twijfel, dient de hieronder beschreven volledige test te worden uitgevoerd.1.6.2.2. Volledig onderzoekEr worden mengsels van de oxiderende stof en de brandbare stof gemaakt, waarbij het gehalte oxiderende stof in stappen van 10 gewichtsprocenten oploopt van 10 tot 90 gewichtsprocenten. In grensgevallen moeten tussenliggende mengverhoudingen worden bereid, zodat de maximale brandsnelheid nauwkeuriger kan worden bepaald.Er wordt een rupsstof gevormd met behulp van een mal. Deze mal is van metaal, heeft een lengte van 250 mm en een driehoekige doorsnede met een hoogte van 10 mm en een basis van 20 mm. Aan weerszijden van de mal worden in de lengterichting twee metalen platen aangebracht die 2 mm boven de driehoekige doorsnede uitsteken (zie figuur). De mal wordt zonder aandrukken gevuld met een kleine overmaat van het mengsel. Na de mal eenmaal van een hoogte van 2 cm op een vast oppervlak te hebben laten vallen, wordt de overmaat mengsel met een schuingehouden blad weggeveegd. De zijstroken worden verwijderd en het overblijvende poeder wordt met een rol glad gestreken. Ten slotte wordt bovenop de mal een vuurvaste, niet poreuze en slecht warmtegeleidende plaat gelegd, het geheel wordt omgekeerd en de mal verwijderd.De rups wordt in de zuurkast geplaatst in een richting loodrecht op de richting van de trek.De luchtsnelheid moet voldoende zijn om te verhinderen dat verbrandingsgassen naar de laboratoriumruimte ontsnappen; de luchtsnelheid mag gedurende de test niet veranderd worden. De apparatuur moet worden omgeven door een tochtscherm.In verband met de hygroscopische eigenschappen van cellulose en sommige te onderzoeken stoffen moet de test zo snel mogelijk worden uitgevoerd.Eén uiteinde van de rups wordt aangestoken door aanraking met de vlam.De brandduur wordt gemeten over een lengte van 200 mm, nadat de reactiezone reeds een beginafstand van 30 mm heeft afgelegd.De test wordt uitgevoerd met de referentiestof en vervolgens ten minste éénmaal met elk mengsel uit de reeks van de te onderzoeken stof en cellulose.Indien een maximale brandsnelheid wordt waargenomen die aanzienlijk hoger is dan de maximale brandsnelheid van het referentiemengsel, kan de test worden gestaakt; zo niet, dan moet de test vijfmaal worden herhaald met de drie mengsels die de hoogste brandsnelheid opleverden.Indien men vermoedt dat het resultaat vals positief is, moet de test herhaald worden met een inerte stof met een zelfde deeltjesgrootte, zoals kiezelgoer, in plaats van cellulose. Ook kan het mengsel te onderzoeken stof/cellulose, dat de grootste verbrandingssnelheid heeft, opnieuw getest worden in een inerte atmosfeer (BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Mal en toebehoren voor de bereiding van de rups (Afmetingen in mm)DEEL B: METHODEN VOOR DE BEPALING VAN DE TOXICITEIT ALGEMENE INLEIDING DEEL B A. INLEIDINGZie algemene inleiding.B. DEFINITIES(i) Acute toxiciteit omvat de schadelijke effecten die binnen een gegeven tijd (meestal 14 dagen) na de toediening van een enkelvoudige dosis van een stof optreden.(ii) LD50 (mediaan letale dosis) is de statistisch vastgestelde enkelvoudige dosis van een stof, waarvan kan worden verwacht dat bij 50 % van de dieren die de dosis hebben ontvangen de dood intreedt. De LD50-waarde wordt uitgedrukt in het gewicht van de teststof per gewichtseenheid proefdier (mg/kg).(iii) LC50 (mediaan letale concentratie) is de statistisch vastgestelde concentratie van een stof, waarvan kan worden verwacht dat bij 50 % van de gedurende een bepaalde tijd blootgestelde dieren, tijdens de blootstelling of binnen een bepaalde tijd na de blootstelling, de dood intreedt. De LC50-waarde wordt uitgedrukt in het gewicht van de teststof per standaardvolume lucht (mg/l).(iv) Het niveau zonder schadelijk effect is de hoogste dosis of het hoogste niveau van blootstelling tijdens een proef, waarbij nog geen waarneembare toxiciteitsverschijnselen optreden.(v) Subacute/subchronische toxiciteit omvat de schadelijke effecten die bij proefdieren optreden als gevolg van de dagelijks herhaalde toediening van of blootstelling aan een chemische stof gedurende een klein gedeelte van hun verwachte levensduur.(vi) De maximaal verdraagbare dosis (MTD) is het hoogste dosisniveau dat tekenen van toxiciteit bij proefdieren tot gevolg heeft zonder dat dit belangrijke gevolgen heeft voor de overleving in de test waarin ze wordt gebruikt.(vii) Huidirritatie is het ontstaan van een reversibele ontstekingsreactie in de huid als gevolg van het toedienen van een teststof op de huid.(viii) Oogirritatie is het ontstaan van reversibele veranderingen in het oog als gevolg van de toediening van een teststof op het oppervlak aan de voorzijde van het oog.(ix) Sensibilisering van de huid (allergische contactdermatitis) is een via het immuunsysteem veroorzaakte reactie van de huid op een stof.Specifieke definities voor inhalatietoxiciteit- een aërosol wordt gedefinieerd als deeltjes (vast en/of vloeibaar) homogeen verdeeld in lucht.- de aërodynamische diameter is de doorsnede van een bol met dichtheid van 1 g/cm 3 met dezelfde eind-val-snelheid als het bewuste deeltje.- de massa-mediaan van de aërodynamische diameter (MMAD) is de berekende aërodynamische diameter die de grootteverdeling van het aërosol, gemeten naar de massa, in tweeën verdeelt.- de geometrische standaarddeviatie (GSD) is de verhouding van het geschatte 84 percentiel tot het 50 percentiel, en duidt de helling aan van de verdelingscurve van de cumulatieve deeltjesgrootte, aangenomen dat de grootteverdeling log-normaal is.Specifieke definities voor de vastgestelde dosisprocedure bij de bepaling van acute orale toxiciteit- onder evidente intoxicatie worden verstaan de intoxicatieverschijnselen die worden waargenomen na toediening van een teststof en die zo ernstig zijn dat de toediening van het naast hogere dosisniveau sterfte zou kunnen veroorzaken.- onderdiscriminerende dosis wordt verstaan het hoogste van de vier vastgestelde dosisniveaus die kunnen worden toegediend zonder dat met de teststof verband houdende sterfte wordt veroorzaakt (met inbegrip van dieren die moesten worden afgemaakt).C. MUTAGENITEIT (inclusief pre-screeningtest voor carcinogeniteit)Voor de voorlopige bepaling van de mutagene werking van een stof is het noodzakelijk gegevens te verkrijgen over twee categorieën van eindpunten, namelijk genmutaties en chromosoomafwijkingen.Deze twee eindpunten worden geëvalueerd aan de hand van de volgende proeven:(i) tests voor genmutaties in prokaryotische cellen zoals Salmonella typhimurium; tests die gebruik maken van Escherichia coli zijn ook aanvaardbaar. Welke van deze twee testorganismen gekozen wordt, kan afhangen van de aard van de chemische stof die getest wordt;(ii) tests voor chromosoomafwijkingen in de in vitro gekweekte cellen van zoogdieren; een in vivo test (de micronucleustest of het metafaseonderzoek van beenmergcellen) is eveneens aanvaardbaar. De in vitro methoden zijn echter sterk te verkiezen in de afwezigheid van contra-indicaties.D. EVALUATIE EN INTERPRETATIEBij de evaluatie en interpretatie van de testresultaten moet rekening worden gehouden met de beperkingen ten aanzien van de mate waarin de resultaten van dierproeven en in vitro tests kunnen worden geëxtrapoleerd naar de mens.Voor zover beschikbaar kan het bewijs van ongunstige effecten op de mens van belang zijn voor de bepaling van de potentiële effecten van chemische stoffen op de menselijke bevolking.E. LITERATUURToxicologie is een zich snel ontwikkelende experimentele wetenschap waarover overvloedig literatuurgegevens ter beschikking zijn. Relevante informatie kan worden gevonden in de "Test Guidelines" van de OESO.Nadere opmerkingenVerzorging van de dierenBij toxiciteitstests zijn een stringente bewaking van de leefomstandigheden en een goede verzorging van de dieren een eerste vereiste.(i) HuisvestingsomstandighedenDe leefomstandigheden in de kamers of ruimten waar de proefdieren zijn ondergebracht, moeten geschikt zijn voor het soort proefdier. Voor ratten, muizen en cavia's is een kamertemperatuur van 22  C (± 3  C) en een relatieve vochtigheidsgraad van 30-70 % passend; voor konijnen moet de temperatuur 20  C (± 3  C) en de relatieve vochtigheidsgraad 30-70 % bedragen.Sommige experimentele technieken zijn bijzonder gevoelig voor temperatuureffecten; in dergelijke gevallen wordt in de beschrijving van de onderzoekmethode uitvoerig ingegaan op de in dat geval juiste omstandigheden. Bij ieder onderzoek naar toxische effecten moeten de temperatuur en de vochtigheidsgraad worden gecontroleerd, opgetekend en in het eindverslag over de studie worden opgenomen.Bij gebruik van kunstlicht moet in normale gevallen een schema van twaalf uur licht - twaalf uur duisternis worden aangehouden. Nadere gegevens over de verlichting moeten worden opgetekend en in het eindverslag worden opgenomen.Het is belangrijk om in verslagen over dierproeven steeds aan te geven welk soort kooien is gebruikt en hoeveel dieren tijdens de blootstelling aan de chemische stof en tijdens latere waarnemingsperioden in iedere kooi waren gehuisvest.(ii) VoedingBij de samenstelling van het voedsel moet rekening worden gehouden met alle eisen die de aan de proef onderworpen diersoorten aan hun voeding stellen. Indien chemische stoffen worden toegediend aan de dieren via de voeding, kan de voedingswaarde door interactie tussen de stof en een bestanddeel van de voeding verminderd worden.Bij het interpreteren van de resultaten dient rekening te worden gehouden met de mogelijkheid van dergelijke reacties.Onzuiverheden in de voeding waarvan bekend is dat ze de toxiciteit be¨ unvloeden, mogen niet in interfererende concentraties voorkomen.Welzijn van de dierenBij het uitwerken van de testmethoden werd extra aandacht besteed aan dierenwelzijn. Enkele voorbeelden worden hieronder kort samengevat, maar deze lijst is niet volledig. De exacte bewoording en/of voorwaarden dienen nagelezen te worden in de tekst van de methoden:- voor de bepaling van de acute orale toxiciteit wordt een alternatieve methode, de "vastgestelde dosismethode" ingevoerd. Bij deze test wordt niet uitgegaan van de dood als specifiek eindpunt. Bij deze methode worden minder dieren gebruikt en zij veroorzaakt minder ongerief en pijn dan de klassieke bepaling van de acute orale toxiciteit;- het aantal dieren is teruggebracht tot het wetenschappelijk aanvaardbaar minimum: slechts vijf dieren van hetzelfde geslacht worden per dosisniveau getest voor de methoden B.1 en B.3; slechts tien dieren (en maar vijf voor de negatieve referentiegroep) worden gebruikt voor de bepaling van de sensibilisering van de huid door de Guinea Maximisation Test (methode B.6); het aantal dieren dat benodigd is voor de positieve controle bij het testen van de mutageniteit in vivo wordt ook verminderd (methoden B.11 en B.12);- ongerief en pijn van de dieren worden tot een minimum teruggebracht; het kan nodig zijn dieren die ernstige, blijvende verschijnselen van ongerief en pijn vertonen, af te maken; het doseren van teststoffen volgens een methode waarvan bekend is dat zij corrosieve of irriterende eigenschappen bezitten, behoeft niet te worden uitgevoerd (methoden B.1, B.2 en B.3);- het testen met irrelevant hoge doses wordt vermeden door de invoering van limietproeven, niet alleen bij de tests op acute toxiciteit (methoden B.1, B.2 en B.3) maar ook bij de in vivo tests op mutageniteit (methoden B.11 en B.12);- een strategie voor tests op irritatie maakt het thans mogelijk een test niet uit te voeren of de studie te beperken tot een enkel dier wanneer voldoende wetenschappelijk bewijs kan worden geleverd.Deze wetenschappelijke gegevens kunnen gebaseerd worden op de fysisch-chemische eigenschappen van de stof, de resultaten van andere reeds uitgevoerde proeven of de resultaten van goed gevalideerde in vitro proeven. Indien bij voorbeeld bij het uitvoeren van een onderzoek naar acute toxiciteit bij toediening op de huid geen huidirritatie werd waargenomen bij de limiettestdosis van de te onderzoeken stof (methode B.3), kan verder testen voor huidirritatie (methode B.4) overbodig zijn; stoffen die duidelijk bijtende of ernstige huidirriterende eigenschappen vertonen bij het onderzoek naar huidirritatie (methode B.4), dienen niet verder te worden getest op oogirritatie (methode B.5).B.1. ACUTE ORALE TOXICITEIT1. METHODE1.1. INLEIDINGZie algemene inleiding deel B (punt A).1.2. DEFINITIESZie algemene inleiding deel B (punt B).1.3. REFERENTIESTOFFENGeen.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEDe teststof wordt oraal via een maagsonde in geleidelijk stijgende doseringen aan verscheidene groepen proefdieren toegediend. Er wordt één dosis per groep gebruikt. De gekozen doses kunnen gebaseerd worden op de resultaten van een voorexperiment. Vervolgens worden de symptomen en sterfte waargenomen. Bij de dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij de dieren die aan het eind van het onderzoek nog leven, wordt necropsie verricht. Deze methode is in de eerste plaats gericht op studies met knaagdieren.Dieren die hevige en aanhoudende tekenen van ongemak of nood en pijn vertonen, zouden op humane wijze moeten worden gedood. Het doseren van teststoffen op een manier waarvan bekend is dat deze als gevolg van bijtende of irriterende eigenschappen pijn en ongemak veroorzaakt, behoeft niet te worden uitgevoerd.1.5. KWALITEITSCRITERIAGeen.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. VoorbereidingenVóór het onderzoek worden de dieren ten minste 5 dagen onder dezelfde huisvestings- en voedingsomstandigheden gehouden als tijdens de proef. Gezonde, jong volwassen dieren worden vóór de behandeling in ad random groepen ingedeeld. Zo nodig wordt de teststof in een geschikt medium opgelost of gesuspendeerd. Het verdient aanbeveling om eerst gebruik te maken van een oplossing in water. Als dit niet mogelijk is, kan oplossen of suspenderen in achtereenvolgens plantaardige olie of een ander medium worden overwogen. Van niet-waterige media moeten de toxische eigenschappen bekend zijn; als dit niet het geval is, moeten deze eigenschappen vóór of gedurende het onderzoek worden bepaald. Bij knaagdieren mag het maximale volume dat voor de proef gebruikt wordt normaliter niet groter zijn dan 10 ml/kg lichaamsgewicht, behalve bij oplossingen in water waarvan het volume maximaal 20 ml/kg mag bedragen. De variabiliteit in het voor de proef gebruikte volume moet zo klein mogelijk worden gehouden door de concentratie zodanig aan te passen dat bij alle dosisniveaus een constant volume wordt gewaarborgd.1.6.2. Proefomstandigheden1.6.2.1. ProefdierenTenzij er contra-indicaties zijn, wordt de voorkeur gegeven aan ratten.De proef dient te worden uitgevoerd met een rattenstam die gewoonlijk in laboratoria wordt gebruikt. Per geslacht mag bij het begin van de studie het gewicht van de dieren die worden gebruikt, niet meer dan 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken.1.6.2.2. Aantal en geslachtVoor ieder dosisniveau moeten ten minste 5 knaagdieren worden gebruikt. Zij dienen van hetzelfde geslacht te zijn. Indien wijfjes worden gebruikt, moeten deze nullipaar zijn en niet zwanger. Indien informatie beschikbaar is die aantoont dat één van beide geslachten duidelijk gevoeliger is, dienen dieren van dit geslacht gebruikt te worden.Opmerking: In onderzoeken naar acute toxiciteit met dieren van een hogere orde dan ratten, dienen kleinere aantallen in overweging te worden genomen.De doses dienen zorgvuldig te worden uitgekozen, en alle moeite dient te worden gedaan om matig toxische doses niet te boven te gaan. In dergelijke tests dient toediening van letale doses van de teststof te worden vermeden.1.6.2.3. DosisniveausBij de proeven moeten voldoende (ten minste drie) dosisniveaus worden toegepast die zodanig onderling verschillen dat proefgroepen worden verkregen met duidelijke verschillen in toxische effecten en sterftecijfers. De gegevens moeten voldoende zijn om een dosis/respons-curve te maken en om, waar mogelijk, op aanvaardbare wijze een LD50 te bepalen.1.6.2.4. LimiettestWanneer knaagdieren worden gebruikt, kan een limiettest worden uitgevoerd met één dosis van ten minste 2 000 mg/kg lichaamsgewicht in een groep van 5 mannetjes en 5 wijfjes, met behulp van de hierboven beschreven testmethode. Indien sterfte wordt vastgesteld die met de teststof verband houdt, moet het uitvoeren van een volledige studie overwogen worden.1.6.2.5. ObservatieperiodeDe observatieperiode moet ten minste 14 dagen bedragen. Deze duur van de observatie moet echter niet als een streng vastgelegde periode beschouwd worden, maar moet door de toxische reacties, het tijdstip waarop deze voor het eerst worden waargenomen en de duur van het herstel worden bepaald; de observatieperiode kan dus, indien noodzakelijk, worden verlengd. Van belang zijn het tijdstip waarop de intoxicatieverschijnselen voor het eerst zijn waargenomen, het tijdstip waarop zij weer verdwijnen en het tijdstip waarop de dood intreedt, in het bijzonder wanneer er aanwijzingen zijn voor vertraagde sterfte.1.6.3. UitvoeringVóór de toediening van de teststof moet de dieren voedsel worden onthouden. Aan ratten wordt in de nacht vóór de dosering geen voedsel verstrekt; voor dieren met een snellere stofwisseling kan die periode worden verkort; de consumptie van water is niet aan beperkingen onderworpen. De volgende dag moeten de dieren gewogen worden en vervolgens wordt de teststof in één enkele dosis via een maagsonde toegediend. Als het niet mogelijk is de teststof in één enkele dosis te geven, kan deze in kleinere porties worden verdeeld, waarbij niet meer dan 24 uur tussen de eerste en laatste toediening mag liggen. Na toediening van de teststof kunnen de dieren nog 3 tot 4 uur zonder voedsel worden gelaten. Als één dosis bij gedeelten over een bepaalde periode wordt toegediend, kan het nodig zijn om de dieren gedurende de doseringsperiode van voedsel en water te voorzien.Na de toediening worden systematisch waarnemingen gedaan en geregistreerd. Dit moet voor ieder dier individueel worden gedaan. Tijdens de eerste dag moeten regelmatig waarnemingen worden verricht.Ten minste één keer per werkdag moet een zorgvuldig klinisch onderzoek worden verricht. Andere waarnemingen moeten iedere dag worden gedaan waarbij ervoor gezorgd moet worden dat er zo weinig mogelijk dieren voor het onderzoek verloren gaan, bij voorbeeld door necropsie of koeling van dood aangetroffen dieren en afzondering of opoffering van zwakke of stervende dieren. Bij het observeren van de dieren moet in ieder geval aandacht besteed worden aan veranderingen van huid en vacht, ogen en slijmvliezen, ademhaling, bloedsomloop, autonoom en centraal zenuwstelsel, somatomotorische activiteit en gedrag. Er moet bijzondere aandacht worden besteed aan de waarneming van tremoren, convulsies, speekselvloed, diarree, lethargie, slaap en coma. Het tijdstip waarop de dood intreedt, moet zo nauwkeurig mogelijk worden geregistreerd.Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die op het einde van de test nog leven, wordt necropsie verricht. Alle macroscopisch waarneembare pathologische veranderingen worden geregistreerd. Als hiertoe aanleiding bestaat, worden weefselmonsters genomen voor histopathologisch onderzoek.Bepaling van de toxiciteit bij het andere geslachtNa het voltooien van de studie met het ene geslacht, moet ten minste één groep van 5 dieren van het andere geslacht worden blootgesteld aan de stof om te verzekeren dat dieren van dit geslacht niet duidelijk gevoeliger zijn voor de teststof. In bepaalde gevallen kan een motivering worden gegeven voor het gebruik van minder dieren. Wanneer voldoende informatie beschikbaar is om aan te tonen dat dieren van het geteste geslacht duidelijk gevoeliger zijn, kan het testen van het andere geslacht achterwege worden gelaten.2. GEGEVENSDe volgende gegevens moeten voor iedere proefgroep in tabellen worden samengevat: het aantal dieren bij het begin van het onderzoek, het tijdstip waarop de dood bij de individuele dieren intrad, het aantal dieren dat andere intoxicatieverschijnselen vertoont, een beschrijving van de toxische effecten en de bevindingen bij de necropsie. Het gewicht van ieder individueel dier wordt bepaald en genoteerd kort voordat teststof wordt toegediend, vervolgens één keer iedere week en ten slotte bij hun dood. Veranderingen in het gewicht worden berekend en geregistreerd, indien de dieren langer dan één dag in leven blijven. Dieren die op humane wijze gedood worden omwille van proefstof gerelateerde ongemak of nood en pijn, worden geregistreerd als gestorven als gevolg van toediening van de stof. Door middel van een erkende methode kan de LD50 worden bepaald. Bij de evaluatie van de gegevens moet ook aandacht worden besteed aan het eventuele verband dat bestaat tussen de blootstelling van de dieren aan de teststof en indien waargenomen het aantal en de ernst van alle voorkomende afwijkingen, waaronder gedrags- en klinische afwijkingen, macroscopisch waarneembare beschadigingen, veranderingen in het lichaamsgewicht, sterfte en eventuele andere toxicologische effecten.3. RAPPORTAGE3.1. Verslag van de proefnemingenIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, voeding, enz.;- proefomstandigheden;- dosisniveau (met het eventuele medium en de concentraties);- het geslacht van de blootgestelde dieren;- tabellarische gegevens betreffende de effecten per geslacht en dosisniveau (dat wil zeggen het aantal dieren dat tijdens de proef sterft of wordt gedood, het aantal dat intoxicatieverschijnselen vertoont; het aantal blootgestelde dieren);- het tijdstip na de blootstelling waarop de dood intreedt, redenen en criteria voor het op humane wijze doden van dieren;- alle waarnemingen;- de LD50 van het geslacht dat het volledige onderzoek onderging, bepaald na 14 dagen (waarbij de berekeningsmethode dient te worden omschreven);- het 95 %-betrouwbaarheidsinterval voor de LD50 (waar dit gegeven kan worden);- dosis/sterfte-curve met helling (indien dit bij de gebruikte bepalingsmethode mogelijk is);- bevindingen bij de necropsie;- eventuele histopathologische bevindingen;- resultaten van de test die eventueel op het andere geslacht werd uitgevoerd;- bespreking van de resultaten (speciale aandacht dient gegeven te worden aan het effect dat het op humane wijze doden van dieren tijdens de test zou kunnen hebben op de berekende LD50-waarde);- interpretatie van de resultaten.3.2. Evaluatie en interpretatieZie algemene inleiding deel B (punt D).4. LITERATUURZie algemene inleiding deel B (punt E).B.1 bis. ACUTE ORALE TOXICITEIT - VASTE-DOSISMETHODE1. METHODE1.1. INLEIDINGZie algemene inleiding deel B (punt A).1.2. DEFINITIESZie algemene inleiding deel B (punt B).1.3. REFERENTIESTOFFENGeen.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEDe acute orale toxiciteitstest verstrekt gegevens over de nadelige effecten die, binnen korte tijd, op het innemen van een enkele dosis van de teststof kunnen volgen.De vaste-dosismethode wordt in twee fasen uitgevoerd.In een voorstudie worden de effecten van verschillende oraal, met een maagsonde, toegediende doses op dieren van één geslacht sequentiëel onderzocht. Deze voorstudie verstrekt informatie over de relatie tussen dosis en toxiciteit, alsmede een schatting van de minimale letale dosis. Gewoonlijk worden in deze fase niet meer dan 5 dieren onderzocht.Gedurende het hoofdonderzoek wordt de stof op één van de vooraf bepaalde dosisniveaus (5, 50, 500 of 2 000 mg/kg) oraal, met behulp van een maagsonde, aan groepen van 5 mannetjes en 5 wijfjes toegediend. De gebruikte dosis wordt in de voorstudie bepaald en is de dosis waarvan verwacht wordt dat die "evidente intoxicatie" veroorzaakt (zie 1.2. Definities), maar geen sterfte.Na de toediening worden waarnemingen van de effecten gedaan.Wanneer het eerst gekozen dosisniveau duidelijke intoxicatie veroorzaakt, maar geen met de teststof verband houdende mortaliteit, is het niet nodig de proef voort te zetten.Wanneer op het gekozen dosisniveau geen evidente intoxicatie wordt waargenomen, dient de stof op het volgende hogere dosisniveau te worden getest. Wanneer dieren sterven of wanneer een ernstige toxische reactie het noodzakelijk maakt dieren op een humane wijze te doden, dient de stof bij het naast gelegen lagere dosisniveau te worden getest.Deze procedure maakt de identificatie mogelijk van de "discriminerende dosis" (zie 1.2. Definities), dat wil zeggen het hoogste van de vooraf vastgestelde niveaus van de doses die kunnen worden toegediend zonder sterfte te veroorzaken (inclusief het pijnloos doden van proefdieren).Dieren die verschijnselen van ernstige en aanhoudende angst en pijn vertonen, mogen op een humane wijze gedood worden. Het doseren van teststoffen op een wijze waarvan bekend is dat het als gevolg van corrosieve of irriterende eigenschappen duidelijke ernstige nood en pijn veroorzaakt, behoeft niet te worden uitgevoerd.1.5. KWALITEITSCRITERIAGeen.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. Voorbereidingen1.6.1.1. ProefdierenTenzij er contra-indicaties zijn, wordt de voorkeur gegeven aan ratten.De proef dient te worden uitgevoerd met een rattenstam die gewoonlijk in laboratoria wordt gebruikt. Voor ieder geslacht mag het gewicht van de dieren die bij de test worden gebruikt, niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken.Vóór de test worden de dieren ten minste vijf dagen onder dezelfde huisvestings- en voedingsomstandigheden als van de proef gehouden. Voor de test worden gezonde, jonge volwassen dieren steekproefsgewijs geselecteerd en in de behandelingsgroepen van de voorstudie en het hoofdonderzoek ingedeeld. In de praktijk zal voor het hoofdonderzoek, slechts één groep van elk geslacht nodig zijn.1.6.1.2. Dosisbereiding en -toedieningZo nodig wordt de teststof in een geschikt medium opgelost of gesuspendeerd. Het verdient aanbeveling om eerst gebruik te maken van een oplossing in water. Als dat niet mogelijk is kan achtereenvolgens plantaardige olie of een ander middel worden overwogen als oplosmiddel of om de stof in te suspenderen. Van niet-waterige media moeten de toxische eigenschappen bekend zijn; als dit niet het geval is moeten deze eigenschappen vóór of tijdens de test worden vastgesteld. Bij knaagdieren mag het maximale volume dat voor de proef wordt gebruikt normaliter niet groter zijn dan 10 ml/kg lichaamsgewicht, behalve bij oplossingen in water waarvan het voor de proef gebruikte volume maximaal 20 ml/kg mag bedragen. De spreiding in het volume moet zo klein mogelijk worden gehouden door de concentratie zodanig aan te passen dat bij alle dosisniveaus een constant volume wordt gewaarborgd.Vóór de toediening van de teststof dient aan de dieren voeding te worden onthouden. Aan ratten wordt in de nacht vóór de test geen voedsel verstrekt; water is niet aan beperkingen onderworpen. De volgende dag dienen de dieren te worden gewogen. Vervolgens wordt de teststof in één enkele dosis per maagsonde toegediend. Als het niet mogelijk is de teststof in één enkele dosis toe te dienen, kan deze in kleinere porties, verdeeld gedurende een periode van ten hoogste 24 uur, worden gegeven. Nadat de teststof is toegediend, kunnen de dieren nog drie of vier uur zonder voedsel worden gelaten. Als een dosis in kleinere porties verdeeld over een bepaalde periode wordt toegediend, kan het nodig zijn de dieren, afhankelijk van de lengte van die periode, van voedsel en water te voorzien.1.6.2. Uitvoering1.6.2.1. VoorstudieDe effecten van verschillende doses worden op individuele dieren onderzocht. Hiervoor gebruikt men normaliter wijfjes, tenzij er aanduidingen zijn dat mannetjes gevoeliger zijn. De doses worden sequentiëel toegediend, dat wil zeggen de tijd tussen toediening van de dosis aan een volgend dier dient ten minste 24 uur te zijn. Bij alle dieren wordt zorgvuldig gelet op tekenen van toxiciteit, gedurende een periode van ten minste zeven dagen. Wanneer tekenen van matige toxiciteit na zeven dagen aanwezig blijven, dient het dier gedurende een verdere periode van zeven dagen te worden geobserveerd. De volgende dosisniveaus kunnen worden toegepast: 5, 50, 500 en 2 000 mg/kg. Wanneer de eerste gekozen dosis geen ernstige toxiciteit veroorzaakt, en de volgende hogere dosis sterfte veroorzaakt, kan het nodig zijn één of meer tussen gelegen dosisniveaus te onderzoeken. Hiermee moet het mogelijk zijn informatie te verzamelen over het (de) dosisniveau(s) die tekenen van toxiciteit veroorzaakt (veroorzaken) evenals over het laagste dosisniveau dat mortaliteit veroorzaakt.Gestreefd dient te worden naar het selecteren van het eerste dosisniveau aan de hand van kennis over verwante chemische stoffen. Wanneer deze informatie ontbreekt, wordt aanbevolen 500 mg/kg als eerste dosis te gebruiken. Wanneer geen tekenen van toxiciteit bij het eerste dosisniveau waargenomen worden, kan het volgende hogere dosisniveau onderzocht worden. Wanneer geen mortaliteit bij 2 000 mg/kg optreedt, is het vooronderzoek beëindigd en zal het hoofdonderzoek bij dat dosisniveau moeten worden gestart. Wanneer de dieren op humane wijze gedood moeten worden, als gevolg van ernstige effecten die door het eerste dosisniveau (b¨y voorbeeld 500 mg/kg) veroorzaakt worden, dient het naast gelegen lagere dosisniveau (b¨y voorbeeld 50 mg/kg) aan een ander dier te worden toegediend. Wanneer dit dier blijft leven, kunnen tussenliggende dosisniveaus aan andere dieren worden toegediend. Gewoonlijk worden niet meer dan v¨yf dieren in deze procedure gebruikt.1.6.2.2. HoofdonderzoekVoor ieder te onderzoeken dosisniveau dienen tien dieren (vijf wijfjes en vijf mannetjes) te worden gebruikt. De wijfjes moeten nullipaar zijn en niet zwanger.Een principieel onderdeel van de vaste-dosismethode is dat alleen matig toxische doses worden gebruikt. Het toedienen van dodelijke doses van de teststof moet worden vermeden.Het bij de proef te gebruiken dosisniveau dient te worden geselecteerd uit vier vaste-dosisniveaus, te weten 5, 50, 500 of 2 000 mg/kg lichaamsgewicht. Het eerste dosisniveau dat gekozen wordt, is het niveau waarvan verwacht wordt dat het evidente intoxicatie veroorzaakt, maar geen met de teststof verband houdende mortaliteit (inclusief het noodzakelijk geworden humane doden; toevallige sterfgevallen tellen niet mee maar dienen wel te worden geregistreerd). Wanneer dit dosisniveau evidente intoxicatie veroorzaakt, maar geen met de teststof verband houdende mortaliteit, is verder testen niet nodig.Wanneer als gevolg van de toediening van het geselecteerde dosisniveau geen evidente intoxicatie optreedt, dient de stof opnieuw te worden getest op het volgende hogere dosisniveau. De dieren moeten echter onder observatie worden gehouden tot de observatieperiode is afgelopen. Wanneer dieren humaan moeten worden gedood in verband met een ernstige toxische reactie, of bij mortaliteit, die verband houdt met de teststof, dient de stof op het naast gelegen lagere dosisniveau te worden getest. Ook nu dienen dieren, die niet behoeven te worden gedood, de volledige observatieperiode onder observatie te worden gehouden.Na de toediening worden waarnemingen gedaan. Deze worden systematisch geregistreerd. Dit dient voor ieder dier afzonderlijk te geschieden.De observatieperiode moet minstens 14 dagen duren. De duur van de observatie kan echter niet dwingend worden voorgeschreven. Zij is afhankelijk van de toxische reacties, de snelheid waarmee deze ontstaan en de duur van het herstel; de periode kan dus zo nodig worden verlengd. Van belang is het tijdstip waarop de intoxicatieverschijnselen voor het eerst worden waargenomen en weer verdwijnen, alsmede het tijdstip waarop de dood intreedt, vooral wanneer de mogelijkheid bestaat dat de intoxicatieverschijnselen pas laat zichtbaar worden.Er dient een zorgvuldig klinisch onderzoek plaats te vinden en wel twee keer op de dag van het toedienen van de dosis en minstens één keer per dag daarna. Dieren die duidelijk pijn lijden of ernstige tekenen van angst vertonen dienen humaan te worden gedood. De eerste dagen na het toedienen van de testdosis zijn aanvullende waarnemingen noodzakelijk indien de dieren tekenen van intoxicatie blijven vertonen. De proef kan worden beëindigd indien het duidelijk wordt dat het gekozen dosisniveau te hoog was.Er dient gelet te worden op veranderingen van huid en vacht, ogen en slijmvliezen, ademhaling, bloedsomloop, autonoom en centraal zenuwstelsel, somatomotorische activiteit en gedragspatroon. Bijzondere aandacht dient te worden besteed aan de waarneming van tremoren, convulsies, speekselvloed, diarree, lethargie, slaap en coma.Het gewicht van elk individueel dier dient te worden vastgesteld kort voordat de teststof wordt toegediend, vervolgens dagelijks de daarop volgende drie dagen en daarna wekelijks. De dieren die tijdens de proef sterven en zij die tot het einde van de proef in leven blijven worden gewogen. Vervolgens wordt op hen necropsie verricht. Alle macroscopische waarneembare pathologische veranderingen dienen te worden geregistreerd. Als hiertoe aanleiding bestaat, dient weefsel verzameld te worden voor histopathologisch onderzoek.Het onderzoek van een tweede of, in uitzonderlijke gevallen, van een derde dosisniveau kan, afhankelijk van de resultaten van het voorafgaande dosisniveau, noodzakelijk zijn.Wanneer een stof mortaliteit veroorzaakt bij 5 mg/kg lichaamsgewicht (of wanneer de voorstudie aangeeft dat bij dat dosisniveau mortaliteit op zal treden), kan nader onderzoek naar de acute toxiciteit van de stof plaatsvinden.2. GEGEVENSGegevens uit zowel de voorstudie als het hoofdonderzoek dienen voor elk getest dosisniveau in tabellen te worden samengevat, waarin is weergegeven : het aantal dieren aan het begin van de test, het aantal dieren dat intoxicatieverschijnselen vertoont, het aantal dieren dat tijdens de test is gestorven of humaan moest worden gedood, een beschrijving van de toxische effecten en, voor het hoofdonderzoek, vermelding of evidente intoxicatie welke verband houdt met de teststof is waargenomen, het verloop in de tijd van eventuele toxische effecten en de bevindingen bij de necropsie. Veranderingen in het gewicht van de dieren die langer dan één dag in leven blijven, worden berekend en genoteerd.Dieren die humaan moeten worden gedood vanwege ernstige angst en pijn, welke verband houdt met de teststof, worden geregistreerd als dieren die door de teststof zijn gestorven.3. RAPPORTAGE3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGENIn dit verslag dienen, voor zover mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen voor zowel de voorstudie als het hoofdonderzoek :- diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, voeding, enz.;- proefomstandigheden;- dosisniveaus (met het eventuele medium en de concentratie);- volledige resultaten van alle onderzochte dosisniveaus;- tabellarische gegevens betreffende de effecten naar geslacht en dosisniveau (dat wil zeggen aantal gebruikte dieren, veranderingen in lichaamsgewicht, eventueel aantal dieren dat tijdens de proef is gestorven of moest worden gedood, aantal dieren dat intoxicatieverschijnselen vertoont, aard, ernst en duur van de effecten); - tijdverloop van de eerste tekenen van intoxicatie en eventuele reversibiliteit van deze effecten; - wanneer dieren gestorven of gedood zijn, het tijdstip van sterven na de toediening van de stof, alsmede redenen en criteria voor het humaan doden van dieren; - necropsiebevindingen; - eventuele histopathologische bevindingen; - bespreking van de resultaten; - interpretatie van de resultaten, met inbegrip van de verschijnselen van evidente intoxicatie en het bij de proef vastgestelde discriminerende dosisniveau.3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE>RUIMTE VOOR DE TABEL>Zie ook algemene inleiding deel B (D).4. LITERATUURZie algemene inleiding deel B (E).B.2. ACUTE INHALATIETOXICITEIT1. METHODE1.1. INLEIDINGHet is nuttig om over oriënterende informatie te beschikken ten aanzien van de deeltjesgrootte, de dampspanning, het smeltpunt, het kookpunt, het vlampunt en het ontploffingsgevaar (indien van toepassing) van de te onderzoeken stof.Zie ook algemene inleiding deel B (punt A).1.2. DEFINITIESZie algemene inleiding deel B (punt B).1.3. REFERENTIESTOFFENGeen.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEVerscheidene groepen proefdieren worden gedurende een vastgestelde periode aan geleidelijk stijgende concentraties van de teststof blootgesteld. Er wordt één concentratie per groep gebruikt. Vervolgens worden de symptomen en sterfte waargenomen. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die aan het einde van de studie leven, wordt necropsie verricht.Dieren die hevige en aanhoudende tekenen van angst en pijn vertonen, zouden op humane wijze moeten worden gedood. Het doseren van teststoffen op een manier waarvan bekend is dat deze als gevolg van corrosieve of ernstig irriterende eigenschappen pijn en ongemak veroorzaakt, behoeft niet te worden uitgevoerd.1.5. KWALITEITSCRITERIAGeen.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. VoorbereidingenVóór het onderzoek worden de dieren ten minste 5 dagen onder dezelfde huisvestings- en voedingsomstandigheden gehouden als tijdens de proef. Gezonde jonge dieren worden op een willekeurige manier vóór de behandeling in het vereiste aantal groepen ingedeeld. Het is niet nodig de dieren aan een gesimuleerde blootstelling te onderwerpen, tenzij dit wenselijk is bij het type expositieapparatuur dat wordt gebruikt.Vaste teststoffen moeten eventueel worden gemicroniseerd om deeltjes van geschikte grootte te verkrijgen.Waar nodig wordt een passend medium aan de teststof toegevoegd, ten einde de juiste concentratie van de proefstof in de atmosfeer te bereiken; in dat geval moet ook een mediumcontrolegroep worden toegevoegd. Indien een medium of andere additieven worden gebruikt om de dosering te vergemakkelijken, moet bekend zijn dat deze geen toxische effecten veroorzaken. In voorkomend geval kunnen bestaande gegevens worden gebruikt.1.6.2. Proefomstandigheden1.6.2.1. ProefdierenTenzij er contra-indicaties bestaan, wordt de voorkeur gegeven aan ratten. De proef dient te worden uitgevoerd met een rattenstam die gewoonlijk in laboratoria wordt gebruikt. Per geslacht mag bij het begin van de studie het gewicht van de dieren die worden gebruikt, niet meer dan 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken.1.6.2.2. Aantal en geslachtVoor ieder concentratieniveau moeten ten minste tien knaagdieren (vijf wijfjes en vijf mannetjes) worden gebruikt. De wijfjes moeten nullipaar zijn en mogen niet zwanger zijn.Opmerking: In acute-toxiciteittesten met dieren van een hogere orde dan knaagdieren, dienen kleinere aantallen in overweging te worden genomen. De doses dienen zorgvuldig te worden gekozen, en alle moeite dient te worden gedaan om matig toxische doses niet te boven te gaan. In dergelijke testen dient toediening van letale doses van de teststof te worden vermeden.1.6.2.3. BlootstellingsconcentratiesBij de proeven moeten voldoende (ten minste drie) expositieconcentraties worden gebruikt die zodanig onderling verschillen dat proefgroepen worden verkregen met duidelijke verschillen in toxische effecten en sterftecijfers. De gegevens moeten voldoende zijn om een concentratie/respons-curve te verkrijgen en om, indien mogelijk, op aanvaardbare wijze een LC50 te bepalen.1.6.2.4. LimiettestIndien een 4-uur durende expositie van 5 mannelijke en 5 vrouwelijke proefdieren aan 5 mg/l in de  vorm van een gas of een vloeistof- of vaststofaërosol geen expositie gerelateerde sterfte veroorzaakt binnen 14 dagen, is het wellicht niet noodzakelijk verdere proeven te nemen. Indien als gevolg van fysische of chemische eigenschappen van de teststof - waaronder ook de explosieve eigenschappen worden gerekend - de voornoemde concentratie niet gehaald kan worden, dient de maximaal haalbare concentratie te worden gebruikt.1.6.2.5. BlootstellingstijdDe blootstellingstijd bedraagt 4 uur.1.6.2.6. ApparatuurDe dieren worden aan de teststoffen blootgesteld met behulp van inhalatieapparatuur die zodanig gebouwd is dat kan worden gezorgd voor een dynamische luchtdoorstroming van ten minste 12 luchtverversingen per uur, een toereikend zuurstofgehalte en een gelijkmatige verdeling van de teststoffen in de atmosfeer. Als van een expositiekamer gebruik wordt gemaakt, moet deze op een zodanige wijze zijn ontworpen dat de dieren zo min mogelijk bij elkaar kunnen kruipen en zoveel mogelijk door inhalatie aan de teststof worden blootgesteld. Als algemene regel voor het verzekeren van een stabiele atmosfeer in de expositiekamer geldt, dat het totale "volume" van de proefdieren niet méér mag bedragen dan 5 % van het volume van de blootstellingskamer. Naar keuze kunnen de dieren oronasaal, alleen met hun kop of individueel met hun hele lijf aan de testlucht worden blootgesteld; de eerste twee methoden zullen ertoe bijdragen dat zo min mogelijk teststof via andere wegen in het lichaam wordt opgenomen.1.6.2.7. ObservatieperiodeDe observatieperiode moet ten minste 14 dagen bedragen. Deze duur van de observatie moet echter niet als een streng vastgelegde periode worden beschouwd, maar moet door de toxische reacties, het tijdstip waarop deze voor het eerst worden waargenomen en de duur van het herstel worden bepaald; de observatieperiode kan dus, indien noodzakelijk, worden verlengd. Van belang zijn het tijdstip waarop toxische verschijnselen voor het eerst zijn waargenomen, het tijdstip waarop zij weer verdwijnen en het tijdstip waarop de dood intreedt, in het bijzonder wanneer de kans bestaat op een uitgestelde dood.1.6.3. UitvoeringKort vóór de blootstelling worden de dieren gewogen en vervolgens 4 uur lang aan de testconcentratie blootgesteld in het daarvoor bestemde apparaat, na evenwichtsinstelling van de concentratie in de blootstellingskamer. De evenwichtsinstelling mag niet veel tijd in beslag nemen. Tijdens de proef dient de temperatuur op 22  C ± 3  C te worden gehouden. In het ideale geval moet de relatieve vochtigheid tussen 30 % en 70 % worden gehouden, behalve waar dit niet goed uitvoerbaar is (bijvoorbeeld bij het testen van sommige aërosolen). Het onderhouden van een lichte onderdruk (&le; 5 mm water) voorkomt het weglekken van de teststof naar de omgeving. Gedurende de blootstelling worden de dieren voedsel en water onthouden. Om de testatmosfeer te genereren en concentratiemetingen uit te voeren dienen geschikte systemen gebruikt te worden. Het systeem moet de waarborg bieden dat de expositieomstandigheden bij de proef zo spoedig mogelijk stabiel zijn. De kamer moet zo ontworpen en bediend kunnen worden dat een homogene verdeling van de testatmosfeer binnen de kamer wordt gehandhaafd.De volgende parameters moeten worden gemeten of gemonitored:(a) de luchtdoorstromingssnelheid (continu) (luchtdebiet);(b) de feitelijke concentratie van de teststof in het ademhalingsgebied van de dieren, ten minste driemaal gemeten tijdens de blootstelling (sommige atmosferen, bijvoorbeeld aërosolen met hoge concentratie moeten eventueel vaker worden gecontroleerd). Tijdens de blootstelling mag de concentratie niet meer dan ± 15 % van het gemiddelde afwijken. Bij sommige aërosolen is het mogelijk dat de concentratie niet binnen deze grenzen gehouden kan worden; in dat geval kan een grotere afwijking worden aanvaard. Voor aërosolen moet zo dikwijls als noodzakelijk is (ten minste éénmaal per testgroep) een analyse worden uitgevoerd om de verdeling van de deeltjesgrootte te bepalen;(c) de temperatuur en de vochtigheid; indien mogelijk continu.Tijdens en na de blootstelling worden waarnemingen gedaan die voor ieder individueel dier worden geregistreerd. Tijdens de eerste dag moeten frequent waarnemingen worden verricht. Ten minste één keer per werkdag moet een zorgvuldig klinisch onderzoek worden verricht; overige waarnemingen moeten iedere dag worden gedaan waarbij erop moet worden toegezien dat er zo weinig mogelijk dieren voor het onderzoek verloren gaan, bijvoorbeeld door necropsie of koeling van dood aangetroffen dieren en afzondering of opoffering van zwakke of stervende dieren.Bij het observeren moet in ieder geval aandacht worden besteed aan veranderingen van huid, vacht, ogen, slijmvliezen, ademhalingsorganen, bloedsomloop, autonoom en centraal zenuwstelsel, somatomotorische activiteit en gedrag. Er moet bijzondere aandacht worden besteed aan de waarneming van het ademhalingsgedrag, tremoren, convulsies, speekselvloed, diarree, lethargie, slaap en coma. Het tijdstip waarop de dood intreedt, moet zo nauwkeurig mogelijk worden geregistreerd. Het gewicht van ieder dier wordt na de expositie éénmaal per week en bij de dood van de dieren bepaald.Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die aan het eind van de proefnemingen leven, wordt necropsie verricht, waarbij vooral aandacht wordt besteed aan veranderingen in het bovenste en onderste gedeelte van de ademhalingswegen. Alle macroscopisch waarneembare pathologische veranderingen worden geregistreerd. Als hiertoe aanleiding bestaat, worden weefselmonsters genomen voor histopathologisch onderzoek.2. GEGEVENSDe volgende gegevens moeten voor iedere proefgroep in tabellen worden samengevat: aantal dieren bij het begin van het onderzoek, tijdstip waarop de dood intreedt bij de individuele dieren, het aantal dieren dat andere toxiciteitsverschijnselen vertoont, een beschrijving van de toxische effecten en de bevindingen bij de necropsie. Veranderingen in het gewicht moeten worden berekend en geregistreerd indien de dieren langer dan één dag in leven blijven. Dieren die op humane wijze gedood worden omwille van angst en pijn in verband met de stofblootstelling worden geregistreerd als gestorven in verband met de stofblootstelling. Met behulp van een erkende methode wordt de LC50 bepaald. Bij de evaluatie van de gegevens moet ook aandacht worden besteed aan het eventuele verband dat bestaat tussen de blootstelling van de dieren aan de teststof en het aantal en de ernst van alle voorkomende afwijkingen, waaronder gedrags- en klinische afwijkingen, macroscopisch waarneembare beschadigingen, veranderingen in het lichaamsgewicht, sterfte en eventuele andere toxische effecten.3. RAPPORTAGE3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGENIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, voeding, enzovoort;- proefomstandigheden: Beschrijving van de expositieapparatuur met inbegrip van ontwerp, type, afmetingen, luchtbron, systeem voor het genereren van aërosolen, methode van luchtconditionering en de wijze waarop de dieren tijdens de proeven in een blootstellingskamer zijn ondergebracht (als deze gebruikt is). Er moet een beschrijving worden gegeven van de apparatuur voor het meten van de temperatuur, de vochtigheid, de concentraties en de verdeling van de deeltjesgrootte van het aërosol;Gegevens betreffende de expositie:Deze moeten tabellarisch worden gerangschikt en worden voorzien van gemiddelde waarden en een maat voor de variabiliteit (bijvoorbeeld standaardafwijking). Zij dienen, indien mogelijk, te omvatten:(a) de luchtdoorstromingssnelheid (luchtdebiet) door de inhalatieapparatuur;(b) temperatuur en vochtigheid van de lucht;(c) nominale concentraties (de totale hoeveelheid teststof die de inhalatieapparatuur wordt binnengeleid, gedeeld door het luchtvolume);(d) aard van het eventuele medium;(e) feitelijke concentraties van de teststof in het ademhalingsgebied van de dieren;(f) massa-mediaan van de aërodynamische diameter (MMAD) en de geometrische standaard afwijking (GSD);(g) duur van de evenwichtsinstelling;(h) duur van de expositie;- tabellarische gegevens betreffende de effecten per geslacht en concentratieniveau (dat wil zeggen het aantal dieren dat tijdens de proef stierf of gedood werd, het aantal dieren dat toxische verschijnselen vertoonde, het aantal blootgestelde dieren);- het tijdstip gedurende of na de blootstelling waarop de dood intreedt, redenen en criteria voor het op humane wijze doden van dieren;- alle waarnemingen;- de LC50 voor beide geslachten bepaald aan het eind van de observatieperiode (waarbij de berekeningsmethode dient te worden omschreven);- 95 %-betrouwbaarheidsinterval voor de LC50 (waar dit gegeven kan worden);- dosis/sterfte-curve met helling (indien dit bij de gebruikte bepalingsmethode mogelijk is);- bevindingen bij de necropsie;- eventuele histopathologische bevindingen;- bespreking van de resultaten (speciale aandacht dient te worden besteed aan het effect van het op humane wijze doden van dieren tijdens de proeven op de berekende LC50);- interpretatie van de resultaten.3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIEZie algemene inleiding deel B (punt D).4. LITERATUURZie algemene inleiding deel B (punt E).B.3. ACUTE DERMALE TOXICITEIT1. METHODE1.1. INLEIDINGZie algemene inleiding deel B (punt A).1.2. DEFINITIESZie algemene inleiding deel B (punt B).1.3. REFERENTIESTOFFENGeen.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEDe teststof wordt in geleidelijk stijgende doseringen op de huid van verscheidene groepen proefdieren aangebracht. Er wordt één dosis per groep gebruikt. Vervolgens worden de symptomen en sterfte waargenomen. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die aan het eind van de proefnemingen leven, wordt necropsie verricht.Dieren die hevige en aanhoudende tekenen van nood en pijn vertonen, moeten eventueel op humane wijze worden gedood. Het doseren van teststoffen op een manier waarvan bekend is dat deze als gevolg van bijtende of irriterende eigenschappen pijn en nood veroorzaakt, behoeft niet te worden uitgevoerd.1.5. KWALITEITSCRITERIAGeen.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. VoorbereidingenVóór het onderzoek worden de dieren in hun proefkooien ten minste 5 dagen onder dezelfde huisvestings- en voedingsomstandigheden gehouden als tijdens de proef. Gezonde, jong volwassen dieren worden op een willekeurige manier vóór de behandeling in groepen ingedeeld. Ongeveer 24 uur vóór de proef wordt het haar op het ruggedeelte van de romp van de proefdieren door knippen of scheren verwijderd; bij het knippen of scheren moet erop worden gelet dat de huid niet wordt bekrast, omdat daardoor de doorlaatbaarheid van de huid zou kunnen veranderen. Ten minste 10 % van de lichaamsoppervlakte moet voor het aanbrengen van de teststof worden onthaard. Bij een proef met vaste stoffen, die eventueel tot een poeder kunnen worden fijngemaakt, moet de teststof voldoende met water of, zo nodig, met een passend medium worden bevochtigd, zodat de stof goed in contact met de huid komt. Als van een medium gebruik wordt gemaakt, moet rekening worden gehouden met de invloed hiervan op de mate waarin de huid de teststof doorlaat. Vloeibare teststoffen worden in het algemeen onverdund gebruikt.1.6.2. Proefomstandigheden1.6.2.1. ProefdierenEr kan gebruik worden gemaakt van volwassen ratten of konijnen. Ook andere diersoorten kunnen worden gebruikt, maar de noodzakelijkheid hiervan moet worden gerechtvaardigd. De proef dient te worden uitgevoerd met een stam die gewoonlijk in laboratoria wordt gebruikt. Per geslacht mag bij het begin van de studie het gewicht van de dieren die worden gebruikt, niet meer dan 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken.1.6.2.2. Aantal en geslachtVoor ieder dosisniveau moeten ten minste 5 knaagdieren worden gebruikt. Zij dienen van hetzelfde geslacht te zijn. Indien wijfjes worden gebruikt, moeten deze nullipaar zijn en niet zwanger. Indien informatie beschikbaar is die aantoont dat één van beide geslachten duidelijk gevoeliger is, dienen dieren van dit geslacht gebruikt te worden.Opmerking: In onderzoeken naar acute toxiciteit met dieren van een hogere orde dan knaagdieren, dienen kleinere aantallen in overweging te worden genomen. De doses dienen zorgvuldig te worden uitgekozen, en alle moeite dient te worden gedaan om matig toxische doses niet te boven te gaan. In dergelijke testen dient toediening van letale doses van de teststof te worden vermeden.1.6.2.3. DosisniveausBij de proeven moeten voldoende (ten minste drie) dosisniveaus worden toegepast die zodanig onderling verschillen dat proefgroepen worden verkregen met duidelijke verschillen in toxische effecten en sterftecijfers. Bij de vaststelling van de dosisniveaus moet rekening worden gehouden met alle mogelijke irriterende of corrosieve effecten. De gegevens moeten voldoende zijn om een dosis/respons-curve te maken en om, indien mogelijk, op aanvaardbare wijze een LD50 te bepalen.1.6.2.4. LimiettestEen limiettest met één dosis van ten minste 2 000 mg/kg lichaamsgewicht wordt uitgevoerd op een groep van 5 mannetjes en 5 wijfjes, met behulp van de hierboven beschreven testmethode. Indien sterfte wordt vastgesteld die met de teststof verband houdt, moet het uitvoeren van een volledig testprogramma overwogen worden.1.6.2.5. ObservatieperiodeDe observatieperiode moet ten minste 14 dagen bedragen. Deze duur van de observatie moet echter niet als een streng vastgelegde periode beschouwd worden, maar moet door de toxische reacties, het tijdstip waarop deze voor het eerst worden waargenomen en de duur van het herstel worden bepaald; de observatieperiode kan dus, indien noodzakelijk, worden verlengd. Van belang zijn het tijdstip waarop intoxicatieverschijnselen voor het eerst zijn waargenomen en het tijdstip waarop zij weer verdwijnen, hun duur en het tijdstip waarop de dood intreedt, in het bijzonder wanneer de kans bestaat voor een vertraagde sterfte.1.6.3. UitvoeringIeder dier moet individueel in een kooi worden gehuisvest. De teststof wordt gelijkmatig verdeeld over een oppervlak van ongeveer 10 % van de totale lichaamsoppervlakte. Bij zeer toxische stoffen mag het te behandelen oppervlak kleiner zijn, maar een zo groot mogelijke oppervlakte moet worden bedekt met een zo dun en zo gelijkmatig mogelijk aangebrachte laag.De teststof moet gedurende de expositietijd van 24 uur door middel van poreus verbandgaas en niet-irriterend plakband in contact met de huid blijven. Het behandelde gedeelte van de huid moet op een geschikte wijze verder worden bedekt om het verbandgaas en de teststof op hun plaats te houden en om te verhinderen dat de dieren de teststof langs orale weg opnemen. Hulpmiddelen om de dieren te fixeren, kunnen worden gebruikt om te voorkomen dat de dieren de teststof via de mond opnemen, maar het wordt niet aangeraden de dieren volledig te immobiliseren.Aan het eind van de expositieperiode wordt de resterende teststof - zo mogelijk met water - van de huid verwijderd of anders door middel van een andere geschikte reinigingstechniek.De gedane waarnemingen moeten systematisch worden geregistreerd voor ieder individueel dier. Tijdens de eerste dag worden de dieren regelmatig geobserveerd. Ten minste één keer per werkdag moet een zorgvuldig klinisch onderzoek worden verricht. De andere waarnemingen moeten iedere dag worden verricht, waarbij erop moet worden toegezien dat er zo weinig mogelijk dieren voor het onderzoek verloren gaan, bijvoorbeeld door necropsie of koeling van dood aangetroffen dieren en door afzondering of opoffering van zwakke of stervende dieren.Bij het observeren wordt aandacht besteed aan veranderingen van vacht, behandelde huid, ogen, slijmvliezen, ademhaling, bloedsomloop, autonoom en centraal zenuwstelsel, somatomotorische activiteit en gedrag. Er moet bijzondere aandacht worden besteed aan de waarneming van tremoren, speekselvloed, diarree, lethargie, slaap en coma. Het tijdstip waarop de dood intreedt moet zo nauwkeurig mogelijk worden geregistreerd. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die aan het einde van de proefnemingen leven, wordt necropsie verricht. Alle macroscopisch waarneembare pathologische veranderingen worden geregistreerd. Als hiertoe aanleiding bestaat, worden weefselmonsters genomen voor histopathologisch onderzoek.Bepaling van de toxiciteit bij het andere geslachtNa het voltooien van de studie voor het ene geslacht, moet ten minste een groep van 5 dieren van het andere geslacht worden blootgesteld aan de stof om te verzekeren dat dit geslacht niet duidelijk gevoeliger is voor de teststof. In bepaalde gevallen kunnen redenen bestaan voor het gebruik van minder dieren. Indien voldoende informatie beschikbaar is om aan te tonen dat dieren van het geteste geslacht duidelijk gevoeliger zijn, mag het testen van het andere geslacht achterwege worden gelaten.2. GEGEVENSDe volgende gegevens moeten voor iedere proefgroep in tabellen worden samengevat: het aantal dieren bij het begin van het onderzoek, het tijdstip waarop de dood intreedt bij de individuele dieren, het aantal dieren dat andere intoxicatieverschijnselen vertoont, een beschrijving van de toxische effecten en de bevindingen bij de necropsie. Het gewicht van ieder individueel dier wordt bepaald kort voordat de teststof wordt aangebracht, en vervolgens één keer iedere week en ten slotte bij zijn dood; veranderingen in het gewicht worden berekend en geregistreerd, indien de dieren langer dan één dag in leven blijven. Dieren die op humane wijze gedood worden omwille van nood of ongemak en pijn in verband met de stof, worden geregistreerd als gestorven in verband met de stof. De LD50 moet door middel van een erkende methode worden bepaald.Bij de evaluatie van de gegevens moet ook aandacht worden besteed aan het eventuele verband dat bestaat tussen de blootstelling van de dieren aan de teststof en het aantal en de ernst van alle voorkomende afwijkingen, waaronder gedrags- en klinische afwijkingen, macroscopisch waarneembare beschadigingen, veranderingen in het lichaamsgewicht, sterfte en eventuele andere toxicologische effecten.3. RAPPORTAGE3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGENIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, voeding, enzovoort;- proefomstandigheden (met vermelding van de wijze waarop de huid is schoongemaakt en het soort verband: occlusief of niet occlusief);- dosisniveaus (met het eventuele medium en de concentraties);- het geslacht van de blootgestelde dieren;- tabellarische gegevens betreffende de effecten per geslacht en dosisniveau (dat wil zeggen het aantal dieren dat tijdens de proef stierf of gedood werd, het aantal dieren dat intoxicatieverschijnselen vertoont, het aantal blootgestelde dieren);- het tijdstip na de blootstelling waarop de dood intreedt, redenen en criteria voor het op humane wijze doden van dieren;- alle waarnemingen;- de LD50 van het geslacht dat het volledige onderzoek onderging, bepaald na 14 dagen (waarbij de berekeningsmethode dient te worden omschreven);- 95 %-betrouwbaarheidsinterval voor de LD50 (waar dit gegeven kan worden);- dosis/sterfte-curve met helling (indien dit bij de gebruikte bepalingsmethode mogelijk is);- bevindingen bij de necropsie;- eventuele histopathologische bevindingen;- resultaten van de test die eventueel op het andere geslacht werd uitgevoerd;- bespreking van de resultaten (speciale aandacht dient besteed te worden aan het effect dat het op humane wijze doden van dieren tijdens de proeven zou kunnen hebben op de berekende LD50);- interpretatie van de resultaten.3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIEZie algemene inleiding deel B (punt D).4. LITERATUURZie algemene inleiding deel B (punt E).B.4. ACUTE TOXICITEIT (HUIDIRRITATIE)1. METHODE1.1. INLEIDINGZie algemene inleiding deel B (punt A).1.2. DEFINITIESZie algemene inleiding deel B (punt B).1.3. REFERENTIESTOFFENGeen.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEInleidende overwegingenVoldoende aandacht dient gegeven te worden aan alle beschikbare gegevens over de te onderzoeken stof teneinde het testen van stoffen onder omstandigheden die ernstige reacties teweeg kunnen brengen te minimaliseren. De volgende informatie kan van nut zijn om te bepalen of een volledige test, een studie met één enkel dier, of geen verdere test moet worden uitgevoerd.i) Fysisch-chemische eigenschappen en chemische reactiviteit. Voor sterk zure of basische stoffen (bijvoorbeeld met een pH van kleiner of gelijk aan 2 of groter of gelijk aan 11,5) behoeven wellicht geen onderzoeken te worden uitgevoerd op primaire huidirritatie als bijtende eigenschappen verwacht kunnen worden. Ook dient rekening gehouden te worden met de basische of zure reserve.ii) Indien overtuigende gegevens voor ernstige effecten uit goedgevalideerde in vitro testen beschikbaar zijn, is een volledige test eventueel niet vereist.iii) Resultaten van acute toxiciteitsstudies. Indien een test op de acute toxiciteit langs dermale weg is uitgevoerd met de limietdosis van de stof (2 000 mg/kg lichaamsgewicht), en hierbij geen huidirritatie werd waargenomen, kan verder testen op huidirritatie onnodig zijn. Voorts is het testen van stoffen, waarvan werd aangetoond dat zij uiterst toxisch zijn langs dermale weg, onnodig.De teststof wordt in één enkele dosis op de huid van verschillende proefdieren aangebracht. Ieder dier wordt als zijn eigen controle gebruikt. De graad van irritatie wordt na een bepaald tijdsverloop afgelezen en geregistreerd en wordt uitvoerig beschreven om een volledige evaluatie van de effecten mogelijk te maken. De duur van de waarnemingen moet voldoende zijn om het reversibele of irreversibele karakter van de waargenomen effecten ten volle te kunnen beoordelen.Dieren die hevige en voortdurende tekenen van nood of ongemak en pijn vertonen, moeten eventueel op humane wijze worden gedood.1.5. KWALITEITSCRITERIAGeen.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. VoorbereidingenOngeveer 24 uur vóór de proef wordt het haar op het ruggedeelte van de romp van de proefdieren door knippen of scheren verwijderd.Bij het knippen of scheren moet erop worden gelet dat de huid niet wordt bekrast. Alleen dieren met een gezonde en gave huid mogen worden gebruikt.Sommige konijnestammen hebben plekken met dichte haargroei, die in bepaalde perioden van het jaar meer op de voorgrond treden. De teststoffen mogen niet op deze zones met dichte haargroei worden aangebracht.Bij een proef met vaste stoffen (die eventueel tot poeder kunnen worden fijngemaakt) moet de teststof voldoende met water of, zo nodig, met een passend medium worden bevochtigd, zodat de stof goed in contact met de huid komt. Als van een medium gebruik wordt gemaakt, moet rekening worden gehouden met de invloed hiervan op de irritatie van de huid door de teststof. Vloeibare teststoffen worden in het algemeen onverdund gebruikt.1.6.2. Proefomstandigheden1.6.2.1. ProefdierenHoewel er verschillende soorten zoogdieren gebruikt kunnen worden, is het albino konijn de soort die de voorkeur heeft.1.6.2.2. Aantal dierenIndien op grond van in vitro-screeningsresultaten of andere overwegingen wordt vermoed dat de teststof necrose zou kunnen veroorzaken (d.w.z. bijtend zou kunnen zijn), moet een test met één enkel dier worden overwogen. Als de resultaten van deze test niet wijzen op bijtende eigenschappen, moet het onderzoek vervolledigd worden met behulp van ten minste twee extra dieren.Voor het volledige onderzoek worden ten minste drie gezonde volwassen dieren gebruikt. Er behoeven geen afzonderlijke dieren te worden gebruikt voor een onbehandelde controlegroep. Extra proefdieren kunnen vereist zijn ter opheldering van moeilijk te interpreteren resultaten.1.6.2.3. DosisniveauTenzij er contra-indicaties bestaan, wordt een dosis van 0,5 ml vloeistof of 0,5 g vaste of semi-vaste stof op het testgedeelte van de huid aangebracht. De onbehandelde huid dient als controle voor de test.1.6.2.4. ObservatieperiodeDe duur van de waarneming moet niet als een streng vastgelegde periode worden beschouwd, maar moet lang genoeg zijn om het reversibele of irreversibele karakter van de geobserveerde effecten ten volle te kunnen beoordelen. De observatieperiode hoeft in de regel echter niet langer te duren dan 14 dagen vanaf de datum van de applicatie.1.6.3. UitvoeringDe dieren moeten individueel in kooien worden gehuisvest. De teststof wordt aangebracht op een klein huidoppervlak (circa 6 cm2) en de plek wordt met gaas bedekt dat met behulp van niet-irriterend plakband op zijn plaats wordt gehouden. Bij gebruik van vloeistof of vloeibare pasta kan het nodig zijn de vloeistof eerst op het gaas aan te brengen en het gaas daarna op de huid te leggen. Het gaas moet voor de duur van de expositie in aanraking met de huid blijven door middel van een geschikt occlusief- of semi-occlusief verband. Er moet tevens voor worden gezorgd dat het dier niet in contact komt met het verband om opname van de teststoffen via de mond of door inhalatie te voorkomen.Aan het einde van de blootstellingsperiode moet de resterende teststof zo mogelijk worden verwijderd met water of met een geschikt oplosmiddel zonder het bestaande effect of de toestand van de opperhuid te wijzigen.De expositie duurt gewoonlijk 4 uur.Indien vermoed wordt dat de stof necrose kan veroorzaken (bijvoorbeeld als deze een bijtende werking heeft) moet de expositieduur beperkt worden (bijvoorbeeld tot 1 uur of 3 minuten). Dergelijke testen kunnen ook in eerste instantie met één dier worden uitgevoerd, indien dit niet uitgesloten is door de acute dermale toxiciteit van de teststof, drie patches (gasjes) tegelijkertijd aan te brengen bij dit dier. Het eerste gaasje wordt verwijderd na drie minuten. Indien geen ernstige huidreactie wordt waargenomen, wordt na één uur het tweede gaasje verwijderd. Indien de observaties in dit stadium aantonen dat een vier uur durende blootstelling noodzakelijk is en op humane wijze kan worden uitgevoerd, wordt het derde gaasje verwijderd na vier uur en worden daarna de resultaten beoordeeld. In dit geval (d.w.z. wanneer een vier uur durende blootstelling mogelijk was), dient de test te worden vervolledigd met ten minste twee extra dieren, tenzij dit niet humaan geacht wordt (bijvoorbeeld als necrose wordt waargenomen na de vier uur durende blootstelling).Indien na 3 minuten of één uur een ernstige reactie van de huid (bijvoorbeeld necrose) wordt waargenomen, wordt het onderzoek onmiddellijk beëindigd.Onder bepaalde omstandigheden, bijvoorbeeld gezien het verwachte toepassings- en blootstellingspatroon van de mens, kan het nodig zijn de blootstelling te verlengen.1.6.3.1. Observatie en scoringDe dieren moeten worden onderzocht op tekenen van erytheem en oedeem en de reacties moeten 60 minuten en vervolgens 24, 48 en 72 uur na de verwijdering van de patch (het gaasje) worden beoordeeld. De huidirritatie moet worden ingedeeld en geregistreerd volgens de in de tabel opgenomen schaal. Mogelijk moeten nog nadere waarnemingen worden verricht indien volledig herstel niet binnen de 72 uur is opgetreden. Behalve de waarneming van irritatie moeten eventuele ernstige beschadigingen zoals een bijtende werking (onomkeerbare vernietiging van huidweefsel) en andere toxische effecten volledig worden beschreven.Technieken zoals histopathologisch onderzoek of meting van de dikte van de huidplooi kunnen worden gebruikt om twijfelachtige reacties of effecten die worden verhuld door verkleuring van de huid door de teststof, op te helderen.2. GEGEVENSDe volgende gegevens moeten voor ieder dier afzonderlijk in tabellen worden samengevat: irritatiescores voor erytheem en oedeem gedurende de observatieperiode, ernstige beschadigingen, graad en aard van de irritatie, het reversibele of irreversibele karakter van de letsels, bijtende werking en alle andere waargenomen toxische effecten moeten worden beschreven.3. RAPPORTAGE3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGENIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, voeding, enzovoort;- proefomstandigheden (inclusief de belangrijkste fysisch-chemische eigenschappen van de gebruikte stof en de toegepaste techniek voor de ontharing en reiniging van de huid, alsmede het soort verband: occlusief of semi-occlusief);- tabellarische rangschikking van de gegevens betreffende de irritatiereactie voor ieder afzonderlijk dier en voor iedere observatietijd (1, 24, 48, 72 uur, enzovoort, na verwijdering van het gaas);- beschrijving van eventueel waargenomen ernstige letsels waaronder bijtende werking;- beschrijving van de graad en de aard van de waargenomen irritatie en van histopathologische bevindingen indien van toepassing;- beschrijving van eventuele toxische effecten, andere dan huidirritatie;- bespreking van de resultaten;- interpretatie van de resultaten.3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIEZie algemene inleiding deel B (punt D).4. LITERATUURZie algemene inleiding deel B (punt E).Aanhangsel>RUIMTE VOOR DE TABEL>B.5. ACUTE TOXICITEIT (IRRITATIE VAN HET OOG)1. METHODE1.1. INLEIDINGZie algemene inleiding deel B (punt A).1.2. DEFINITIESZie algemene inleiding deel B (punt B).1.3. REFERENTIESTOFFENGeen.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEInleidende overwegingenVoldoende aandacht dient gegeven te worden aan alle beschikbare gegevens over de te onderzoeken stof teneinde het testen van stoffen onder omstandigheden die ernstige reacties teweeg kunnen brengen te minimaliseren. De volgende informatie kan hiervoor van nut zijn.i) Fysisch-chemische eigenschappen en chemische reactiviteit. Sterk zure of basische stoffen die, bijvoorbeeld in het oog een pH van kleiner of gelijk aan 2, of groter of gelijk aan 11,5 geven, behoeven wellicht niet te worden onderzocht als ernstig letsel verwacht kan worden. Tevens dient rekening gehouden te worden met de basische of zure reserve.ii) Resultaten van goed gevalideerde alternatieve studies; stoffen waarvan is aangetoond dat zij potentieel bijtende of ernstig irriterende eigenschappen bezitten, dienen niet verder te worden getest op oogirritatie, daar kan worden aangenomen dat zulke stoffen ernstige effecten op de ogen zullen hebben in een test volgens deze methode.iii) Resultaten uit huidirritatiestudies. Stoffen waarvan is aangetoond dat zij duidelijk bijtende of ernstige huidirriterende eigenschappen bezitten tijdens een huidirritatiestudie, dienen niet verder te worden getest op oogirritatie, daar kan worden verondersteld dat zulke stoffen ernstige effecten op de ogen zouden kunnen hebben.De teststof wordt in één enkele dosis op één van de ogen van ieder van de verschillende proefdieren aangebracht; het onbehandelde oog dient als controle. De graad van irritatie wordt op bepaalde tijdstippen beoordeeld en genoteerd en wordt uitvoeriger beschreven om een volledige evaluatie van de effecten mogelijk te maken. De duur van de waarnemingen moet voldoende lang zijn om het reversibele of irreversibele karakter van de waargenomen effecten ten volle te kunnen beoordelen.Dieren die hevige en aanhoudende tekenen van nood/ongemak en pijn vertonen, moeten eventueel op humane wijze worden gedood.1.5. KWALITEITSCRITERIAGeen.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. VoorbereidingenBeide ogen van ieder voorlopig voor de test geselecteerd proefdier moeten in de loop van de 24 uur voor het begin van de test worden onderzocht. Dieren die lijden aan oogirritatie, oogaandoeningen of een reeds bestaand hoornvliesletsel, mogen niet worden gebruikt.1.6.2. Proefomstandigheden1.6.2.1. ProefdierenHoewel er diverse soorten proefdieren voor deze test gebruikt worden, wordt aanbevolen om bij de tests gebruik te maken van gezonde volwassen albino konijnen.1.6.2.2. Aantal proefdierenEen onderzoek met slechts één proefdier dient te worden overwogen indien duidelijke effecten kunnen worden voorzien. Indien de resultaten van deze test met één konijn suggereren dat de stof ernstig irriterend (reversibel effect) of bijtend (irreversibel effect) is voor het oog bij gebruik van de beschreven procedure, behoeven mogelijk geen verdere testen op oogirritatie op de volgende dieren te worden uitgevoerd. In bepaalde gevallen kan het verder testen met extra dieren nuttig zijn om specifieke aspecten te onderzoeken.In andere gevallen dan een onderzoek met slechts één dier moeten ten minste drie dieren worden gebruikt. Het aantal proefdieren mag worden opgevoerd in geval van moeilijk te interpreteren resultaten.1.6.2.3. DosisniveauBij vloeistoffen wordt een dosis van 0,1 ml gebruikt. Bij vaste stoffen, pasta's en uit deeltjes samengestelde stoffen moet een volume van 0,1 ml of een gewicht van circa 0,1 g worden gebruikt (het gewicht moet altijd worden geregistreerd). Indien de teststof bestaat uit een vaste of korrelige stof, moet deze worden fijngemalen. Het volume van de deeltjes moet worden gemeten na deze eerst zacht te hebben samengepakt, bijvoorbeeld door het tikken met de maathouder.Bij vloeistoffen in pomp-sprays of spuitbussen onder druk moet de vloeistof worden versproeid en 0,1 ml worden opgevangen en in het oog worden gedruppeld, zoals beschreven voor vloeistoffen.1.6.2.4. ObservatieperiodeDe duur van de waarneming moet niet als een streng vastgelegde periode worden beschouwd. Ze moet echter voldoende lang zijn om het reversibele of irreversibele karakter van de waargenomen effecten te kunnen beoordelen, maar in de regel niet langer dan 21 dagen vanaf de toediening van de teststof.1.6.3. UITVOERINGDe dieren moeten individueel worden gehuisvest. Bij elk van de dieren wordt de teststof aangebracht in de bindvlieszak van één oog, waarbij het onderste ooglid voorzichtig van de oogbol wordt weggetrokken. De oogleden worden dan ongeveer één seconde zachtjes dichtgehouden om verlies van de teststof te voorkomen. Het andere oog, dat onbehandeld blijft, dient als controle.Indien verwacht wordt dat de stof onredelijke pijn zou kunnen veroorzaken, mag een lokaal anesteticum worden gebruikt alvorens de te onderzoeken stof in te druppelen. Het soort, de concentratie en het tijdstip van toediening dienen zorgvuldig te worden gekozen om te verzekeren dat geen significante verschillen in reactie op de teststof optreden als gevolg van het gebruik van het lokale anesteticum. Het controle-oog dient op identieke wijze te worden verdoofd.De ogen van de proefdieren mogen gedurende 24 uur na de toediening van de teststof niet worden uitgewassen. Na verloop van 24 uur kan dit zo nodig wel gebeuren.Als uit de test blijkt dat een stof irriterend is, kunnen extra tests nodig zijn met gebruikmaking van konijnen waarvan de ogen kort na het indruppelen van de stof worden uitgespoeld. In deze gevallen wordt het gebruik van drie konijnen aanbevolen. Een halve minuut na de toediening worden de ogen van de konijnen een halve minuut lang uitgespoeld, waarbij het volume en de stroomsnelheid geen letsels mogen veroorzaken.1.6.3.1. Observatie en scoringDe ogen moeten worden onderzocht na 1, 24, 48 en 72 uur. Als er na 72 uur geen oogletsels zijn, kan het onderzoek worden beëindigd.Verlenging van de observatieperiode kan nodig zijn in geval van een blijvende aandoening van het hoornvlies of andere oogirritaties, ten einde te bepalen of deze beschadigingen erger worden en reversibel of irreversibel van aard zijn. Behalve de observatie van het hoornvlies, de iris en de bindvliezen, moeten eventuele andere letsels die worden opgemerkt ook worden opgetekend en in het verslag worden vermeld. Bij ieder onderzoek moeten de oogreacties (tabel) worden beoordeeld en opgetekend. (De scoring van de oogreacties is voor verschillende interpretaties vatbaar. Ten behoeve van de testlaboratoria waar de proeven worden uitgevoerd en van degenen die de waarnemingen doen en interpreteren, kan een ge¨ ullustreerde handleiding over oogirritaties gebruikt worden.)Het onderzoek van de reacties kan worden vergemakkelijkt met behulp van een binoculaire loep, een hand-spleetlamp, een biomicroscoop of andere geschikte instrumenten. Nadat de waarnemingen na 24 uur zijn geregistreerd, kunnen de ogen van sommige of alle konijnen verder worden onderzocht met behulp van fluoresce¨ une.2. GEGEVENSVoor ieder dier afzonderlijk moeten de irritatie-scores op de vastgestelde observatietijdstippen in tabellen worden samengevat. Een beschrijving van de graad en aard van de irritatie, aanwezigheid van ernstige beschadigingen en optreden van effecten anders dan aan de ogen moeten in het rapport worden vermeld.3. RAPPORTAGE3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGENIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, voeding, enzovoort;- proefomstandigheden (inclusief de van belang zijnde fysisch-chemische eigenschappen van de teststof);- tabel van irritatiereactie/bijtende werking van elk afzonderlijk dier op de verschillende observatietijdstippen (d.w.z. 1, 24, 48 en 72 uur);- beschrijving van eventueel waargenomen ernstige beschadigingen;- uitvoerige beschrijving van de graad en aard van de waargenomen irritatie of bijtende werking, met inbegrip van het betrokken gebied van de cornea, en het al dan niet reversibele karakter;- beschrijving van de toegepaste methode voor het vaststellen van de irritatie na 1, 24, 48 en 72 uur (door hand-spleetlamp, biomicroscoop, fluoresce¨ une);- omschrijving van eventueel geconstateerde topicale effecten anders dan aan de ogen;- bespreking van de resultaten;- interpretatie van de resultaten.3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIEZie algemene inleiding deel B (punt D).4. LITERATUURZie algemene inleiding deel B (punt E).Aanhangsel>RUIMTE VOOR DE TABEL>B.6. SENSIBILISATIE VAN DE HUID1. METHODE1.1. INLEIDINGOpmerkingen:De gevoeligheid en het vermogen van een test om stoffen op te sporen met potentieel huidsensibiliserende eigenschappen bij de mens worden belangrijk geacht in een systeem voor de classificatie van toxische stoffen ten behoeve van de volksgezondheid.Er bestaat géén enkele testmethode waarmee alle stoffen die de menselijke huid kunnen sensibiliseren, adequaat kunnen worden ge¨ udentificeerd en die voor alle stoffen toepasselijk is.Factoren zoals de fysische kenmerken van een stof, met inbegrip van het vermogen om in de huid binnen te dringen, moeten overwogen worden bij de keuze van een test.Testen die gebruik maken van cavia's kunnen worden onderverdeeld in testen waarin gebruik wordt gemaakt van een adjuvans, waarbij een allergie wordt versterkt door het oplossen of suspenderen van de teststof in Freunds Compleet Adjuvans (FCA), en tests waarin geen adjuvans wordt gebruikt.Proeven met adjuvans voorspellen een waarschijnlijk huidsensibiliserend effect van een stof bij mensen wellicht nauwkeuriger dan de methoden die geen gebruik maken van Freunds Compleet Adjuvans; deze methoden verdienen dan ook de voorkeur.De Maximalisatietest met cavia's is een algemeen toegepaste test waarbij een adjuvans gebruikt wordt. Alhoewel verschillende andere methoden gebruikt kunnen worden om het sensibiliserend vermogen van een stof aan te tonen, wordt de Maximalisatietest beschouwd als de adjuvanstechniek, die de voorkeur heeft.Voor veel soorten chemicaliën worden niet-adjuvanstesten (de Buehlertest heeft de voorkeur) als minder gevoelig beschouwd.In bepaalde gevallen kunnen er goede redenen zijn om de Buehlertest te verkiezen, met lokale applicatie in plaats van intradermale injectie zoals in de Maximalisatietest met cavia's. Voor het gebruik van de Buehlertest dient een wetenschappelijke verantwoording te worden gegeven.De Maximalisatietest met cavia's en de Buehlertest worden beschreven in de onderhavige methode. Andere methoden mogen gebruikt worden op voorwaarde dat zij goed zijn gevalideerd en wetenschappelijk verantwoord zijn.Ongeacht de gebruikte methoden moet de gevoeligheid van de voor de huidsensibilisatietest gebruikte caviastam met regelmatige tussenpozen (zes maanden) worden gecontroleerd met behulp van een bekende, licht tot matig sensibiliserende stof, en hierbij dient een voldoende aantal positieve resultaten te worden verkregen.Zie tevens algemene inleiding deel B (punt A).1.2. DEFINITIESZie algemene inleiding deel B (punt B).1.3. REFERENTIESTOFFENDe volgende stoffen, zonodig verdund, worden aanbevolen, alsmede iedere andere sensibiliserende stof, die ofwel uit de literatuur bekend is, ofwel tot de groep van de te onderzoeken stof behoort.- p-fenyleendiamineCAS nr. 106-50-3- 1-chloor-2,4-dinitrobenzeenCAS nr. 97-00-7- kaliumdichromaatCAS nr. 7778-50-9- neomycinesulfaatCAS nr. 1405-10-3- nikkelsulfaatCAS nr. 7786-81-41.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODENa de eerste blootstelling aan een teststof (de "inductieperiode") ondergaan de dieren ongeveer twee weken na de laatste inductie een "challenge blootstelling" aan de teststof om vast te stellen of een overgevoeligheid is ge¨ unduceerd. De overgevoeligheid wordt bepaald door het onderzoeken van de reactie van de huid op de challenge blootstelling.1.5. KWALITEITSCRITERIAGeen.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. Maximalisatietest met cavia's1.6.1.1. VoorbereidingenVoor het onderzoek worden gezonde, jonge albino cavia's op willekeurige wijze bij de test en de controlegroepen ingedeeld. Voor de dosering wordt de schouder door knippen en/of scheren onthaard. Hierbij moet erop worden gelet dat de huid niet wordt beschadigd.1.6.1.2. Proefomstandigheden1.6.1.2.1. ProefdierenDe proef dient te worden uitgevoerd met stammen albino cavia's die gewoonlijk in laboratoria worden gebruikt, waarbij de dieren niet meer dan 500 g mogen wegen.1.6.1.2.2. Aantal en geslachtEr kan gebruik worden gemaakt van mannelijke en/of vrouwelijke dieren. Vrouwelijke dieren moeten nullipaar zijn en mogen niet zwanger zijn. Minimaal tien dieren worden gebruikt voor de behandelde groep en ten minste vijf voor de controlegroep. Het gebruik van een kleiner aantal dieren moet worden gerechtvaardigd. In geval van onduidelijke resultaten kan histopathologisch onderzoek helpen om te beslissen of de test herhaald dient te worden met een andere groep dieren. Als het niet mogelijk is tot de definitieve conclusie te komen dat een teststof wel of niet huidsensibiliserend is, is het aanbevolen, meerdere dieren bij te voegen, om er in totaal ten minste 20 test- en 10 controledieren te hebben.1.6.1.2.3. DosisniveausDe concentratie van de teststof wordt aangepast tot op een niveau dat enige huidirritatie geeft, maar in ieder stadium van inductie goed door de proefdieren wordt verdragen.De provocatieconcentratie moet gelijk zijn aan de hoogste concentratie die bij niet-gesensibiliseerde dieren niet zal leiden tot huidirritatie.Deze concentraties kunnen worden vastgesteld door een verkennende proef uit te voeren op kleine schaal (twee of drie dieren).1.6.1.2.4. ObservatieperiodeGedurende de inductieperiode wordt de huid geobserveerd om eventuele irritatie-effecten te ontdekken. Na de challenge-expositie wordt de reactie van de huid 24 en 48 uur na verwijdering van het gaas geregistreerd.1.6.1.3. UitvoeringDe dieren worden gewogen aan het begin en het einde van de test. Het schoudergebied wordt onthaard. De procedure bestaat uit twee fasen:1.6.1.3.1. InductieDag 0 - TestgroepIn de schouderstreek worden de volgende intradermale injecties, elk van 0,1 ml, in tweevoud en steeds één aan iedere zijde, gegeven:Injectie 1:0,1 ml Freunds Compleet Adjuvans (FCA) gemengd met water of fysiologische zoutoplossing (1:1);Injectie 2:0,1 ml teststof, zo nodig in een geschikt medium;Injectie 3:0,1 ml teststof in FCA.In injectie 3 worden de in water oplosbare te onderzoeken stoffen opgelost in 0,05 ml water en 0,05 ml onverdund FCA. Indien in vet oplosbare of onoplosbare stoffen dienen te worden onderzocht, moeten deze worden vermengd met onverdund FCA.In injectie 3 dient de eindconcentratie van de teststof gelijk te zijn aan deze van injectie 2.De injecties 1 en 2 worden dicht bij elkaar en het dichtst bij het hoofd gegeven en 3 aan de staartzijde van het testgebied.Dag 0 - ControlegroepEr worden steeds twee intradermale injecties gegeven op dezelfde plaatsen als hierboven beschreven.Injectie 1:0,1 ml Freunds Compleet Adjuvans (FCA) gemengd met water of fysiologische zoutoplossing (1:1);Injectie 2:0,1 ml medium;Injectie 3:0,1 ml medium in FCA.Dag 6 - Test- en controlegroepenIndien de te onderzoeken stof geen huidirritatie geeft, wordt het testgebied, na het knippen en/of scheren, ingesmeerd met 0,5 ml 10 % natriumlaurylsulfaat in vaseline, om aldus een lokale irritatie te veroorzaken.Dag 7 - TestgroepHet testgebied wordt opnieuw onthaard. De teststof wordt in een geschikt medium (de keuze van het medium dient te worden verantwoord; vaste stoffen worden fijngemaakt en in een geschikt vehiculum opgenomen; vloeistoffen kunnen eventueel direct worden aangebracht) over een filtreerpapier verspreid (2 × 4 cm) en op het testgebied aangebracht waarmee het, met behulp van een occlusief verband, 48 uur in contact moet blijven.Dag 7 - ControlegroepHet testgebied wordt opnieuw onthaard. Slechts het medium alleen wordt op soortgelijke wijze op het testgebied aangebracht waarmee het met een dekkend verband 48 uur in contact moet blijven.1.6.1.3.2. ChallengeDag 21Beide flanken van de dieren in de test en in de controlegroep worden onthaard. Op één flank van de behandelde dieren wordt een gaasje of een cupje met de teststof aangebracht en op de andere flank een gaasje of een cupje met alleen het medium.Door middel van een dekkend verband wordt ervoor gezorgd dat de pleister 24 uur met de huid in contact blijft.De controlegroep wordt op identieke wijze blootgesteld.Dag 23 en 24- 21 uur na het verwijderen van de pleister wordt het gebied waar de provocatie plaatsvond, schoongemaakt en zonodig onthaard;- 3 uur later (48 uur na het begin van de provocatie) wordt de reactie van de huid geobserveerd en geregistreerd;- 24 uur later (72 uur na het begin) wordt de huid voor de tweede maal geobserveerd en worden de resultaten geregistreerd.Om de tijdens de eerste provocatie verkregen resultaten te bevestigen kan overwogen worden om ongeveer een week later een tweede provocatie, zo nodig met een nieuwe controlegroep voor het medium, uit te voeren.1.6.1.3.3. Observatie en scoringAlle reacties van de huid en alle ongewone bevindingen als gevolg van de inductie en provocatiebehandelingen moeten worden geregistreerd en gerapporteerd.Technieken zoals histopathologisch onderzoek of meting van de dikte van de huidplooi kunnen gebruikt worden ter opheldering van onduidelijke reacties of resultaten die door het verkleuren van de huid door de teststof worden gemaskeerd.1.6.2. Buehlertest1.6.2.1. VoorbereidingenVoor het onderzoek worden gezonde, jonge albino cavia's op willekeurige wijze bij de test en de controlegroepen ingedeeld. Voor de toediening wordt één flank door knippen en/of scheren onthaard. Hierbij moet erop worden gelet dat de huid niet wordt beschadigd.1.6.2.2. Proefomstandigheden1.6.2.2.1. ProefdierenDe proef dient te worden uitgevoerd met stammen albino cavia's die gewoonlijk in laboratoria worden gebruikt, waarbij de dieren niet meer dan 500 g mogen wegen.1.6.2.2.2. Aantal en geslachtEr kan gebruik worden gemaakt van mannelijke en/of vrouwelijke dieren. Vrouwelijke dieren moeten nullipaar zijn en mogen niet zwanger zijn. Ten minste twintig dieren worden gebruikt voor de testgroep en ten minste tien voor de controlegroep. Het gebruik van een kleiner aantal dieren moet worden gerechtvaardigd. In geval van onduidelijke resultaten kan histopathologisch onderzoek helpen om te beslissen of de test herhaald dient te worden met een andere groep dieren.1.6.2.2.3. DosisniveausDe concentratie van de teststof wordt aangepast aan het hoogste niveau dat in iedere fase van de inductie goed systemisch kan worden verdragen en dat, bij irriterende stoffen, een milde tot matige irritatie veroorzaakt bij de meerderheid van de proefdieren. De provocatieconcentratie moet gelijk zijn aan de hoogste concentratie die bij niet-gesensibiliseerde dieren niet zal leiden tot huidirritatie. Deze concentraties kunnen worden vastgesteld door een verkennende proef uit te voeren op kleine schaal (twee of drie dieren).1.6.2.2.4. ObservatieperiodeGedurende de inductieperiode wordt de huid geobserveerd om eventuele irritatie-effecten te ontdekken. Na de provocatie-expositie wordt de reactie van de huid 24 en 48 uur na verwijdering van de pleister geregistreerd, d.w.z. 30 en 54 uur na het begin van de blootstelling.1.6.2.3. UitvoeringDe dieren worden gewogen aan het begin en het einde van de test.De procedure bestaat uit twee fasen:1.6.2.3.1. InductieDag 0 - TestgroepEén flank wordt onthaard. 0,5 ml van de te onderzoeken stof wordt in een geschikt medium (de keuze van het medium dient te worden verantwoord; vloeistoffen kunnen eventueel direct worden aangebracht) over een katoenen gaasje verspreid. Het gaasje wordt op het testgebied aangebracht waarmee het, met behulp van een occlusieve pleister of een cupje met een geschikt verband, 6 uur in contact moet blijven.Dag 0 - ControlegroepEén flank wordt onthaard. Alleen het medium wordt op soortgelijke wijze op het testgebied aangebracht. Het wordt met een occlusieve pleister of een cupje en een geschikt verband gedurende 6 uur in contact gehouden met de huid.Dag 7 en 14Dezelfde blootstelling als op Dag 0 wordt op Dag 7 en Dag 14 uitgevoerd op hetzelfde testgebied (zonodig onthaard).1.6.2.3.2. ProvocatieDag 28De andere flank van de dieren in de behandelde en in de controlegroep worden onthaard. Een occlusieve pleister of een cupje met 0,5 ml teststof wordt aangebracht, met de maximale niet-irriterende concentratie, op het achterste deel van de flank van de behandelde dieren. Een occlusieve pleister of cupje met enkel het medium wordt op het voorste deel van de flank aangebracht.De occlusieve pleisters of cupjes worden gedurende 6 uur met behulp van een geschikt verband met de huid in contact gehouden.De controlegroep wordt op identieke wijze blootgesteld.Dag 29 en 30- 21 uur na het verwijderen van de pleister wordt het gebied waar de provocatie plaatsvond, schoongemaakt en zonodig onthaard;- 3 uur later (30 uur na het begin van de provocatie) wordt de reactie van de huid geobserveerd en geregistreerd;- 24 uur later (54 uur na het begin) wordt de huid voor de tweede maal geobserveerd en worden de resultaten geregistreerd.1.6.2.3.3. Observatie en scoringAlle reacties van de huid en alle ongewone bevindingen als gevolg van de inductie en provocatie moeten worden geregistreerd en gerapporteerd.Technieken zoals histopathologisch onderzoek of meting van de dikte van de huidplooi kunnen gebruikt worden ter opheldering van onduidelijke reacties of resultaten die door het verkleuren van de huid worden gemaskeerd.2. GEGEVENS (Maximalisatietest en Buehlertest)De gegevens moeten, indien mogelijk, in tabelvorm worden samengevat met voor ieder dier de reacties van de huid bij iedere waarneming.3. RAPPORTAGE (Maximalisatietest en Buehlertest)3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN (MAXIMALISATIETEST EN BUEHLERTEST)In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- gebruikte caviastam;- proefomstandigheden, de voor de inductie en provocatie gebruikte medium en concentraties van de te onderzoeken stof;- aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;- gewicht van ieder dier afzonderlijk bij het begin en aan het eind van het onderzoek;- iedere waarneming op ieder dier afzonderlijk, en indien hiervan gebruik is gemaakt, ook het score-systeem;- bespreking van de resultaten;- interpretatie van de resultaten.3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE (MAXIMALISATIETEST EN BUEHLERTEST)Zie algemene inleiding deel B (punt D).4. LITERATUURZie algemene inleiding deel B (punt E).B.7. TOXICITEIT (ORAAL) BIJ HERHAALDE TOEDIENING (28 DAGEN)1. METHODE1.1. INLEIDING Zie algemene inleiding deel B (punt A).1.2. DEFINITIESZie algemene inleiding deel B (punt B).1.3. REFERENTIESTOFFENGeen.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEDe teststof wordt gedurende een periode van 28 dagen dagelijks oraal toegediend aan verscheidene groepen proefdieren, in geleidelijk stijgende doses. Er wordt één dosis per groep gebruikt. Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die aan het eind van het onderzoek leven, wordt necropsie verricht.1.5. KWALITEITSCRITERIAGeen.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. VoorbereidingenVoor het onderzoek worden de dieren ten minste 5 dagen onder gelijke huisvestings- en voedingsomstandigheden gehouden als gedurende de proef. Gezonde jonge dieren worden op willekeurige wijze voor de start van de behandeling in groepen ingedeeld. De teststof kan met de voeding, via een maagsonde, in capsules of met het drinkwater worden toegediend. De teststof moet bij alle dieren gedurende de volledige proefperiode op dezelfde manier worden toegediend. Indien een medium of andere additieven worden gebruikt om de toediening te vergemakkelijken, moet bekend zijn dat deze geen toxische effecten veroorzaken. In voorkomend geval kunnen bestaande gegevens worden gebruikt.1.6.2. Proefomstandigheden1.6.2.1. ProefdierenTenzij er contra-indicaties bestaan, wordt de voorkeur gegeven aan ratten. Er dient gebruik te worden gemaakt van jonge gezonde dieren van rattenstammen die gewoonlijk in laboratoria worden gebruikt. In het ideale geval moet met de dosering worden begonnen voor de ratten 6 weken oud zijn. Zij mogen in ieder geval niet ouder zijn dan 8 weken.Bij het begin van de studie mag het gewicht van de dieren die bij de test worden gebruikt, niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken.1.6.2.2. Aantal en geslachtTen minste tien dieren (vijf wijfjes en vijf mannetjes) per groep moeten worden gebruikt. De wijfjes moeten nullipaar zijn en niet zwanger. Indien het de bedoeling is tussentijds dieren te doden, moet het aantal dieren worden verhoogd met het aantal dat tussentijds zal worden gedood. Daarnaast kan een satellietgroep van tien dieren (vijf dieren per geslacht) gedurende 28 dagen worden behandeld met het hoge dosisniveau en vervolgens gedurende 14 dagen na de behandeling worden geobserveerd om na te gaan of toxische effecten verdwijnen, voortduren of pas later tot uiting komen. Tevens wordt een satellietgroep van tien controledieren (vijf per geslacht) gebruikt.1.6.2.3. DosisniveausTen minste drie dosisniveaus en een controle zijn vereist. Afgezien van de toediening van de teststof moeten de dieren van de controlegroep op dezelfde wijze als de dieren van de testgroepen worden behandeld. Indien een medium wordt gebruikt om de dosering te vergemakkelijken, moet het medium aan de dieren van de controlegroep op dezelfde wijze worden toegediend als aan die van de testgroepen en moet de dosis die van het medium wordt toegediend even groot zijn als de dosis die de dieren in de groep met het hoogste dosisniveau ontvangen. Het hoogste dosisniveau van de teststof moet leiden tot toxische effecten, maar er mogen geen of weinig sterfgevallen voorkomen. Bij het laagste dosisniveau mogen geen tekenen van toxiciteit optreden. Indien het blootstellingsniveau van de mens kan worden geschat, moet het laagste niveau dit overschrijden. In het ideale geval treden bij het middelste dosisniveau minimaal waarneembare toxische effecten op. Bij meer dan één tussendosis moet het verschil tussen de dosisniveaus zo groot zijn dat een gradatie in toxische effecten wordt verkregen. In de groep met de laagste dosis, in de tussengroepen en in de controlegroep mogen niet veel sterfgevallen voorkomen, omdat anders een zinvolle evaluatie van de resultaten niet mogelijk is.Indien de teststof met de voeding wordt toegediend, kan een constante voedingsconcentratie (ppm of mg/kg) of een constant dosisniveau als functie van het lichaamsgewicht van de dieren worden gebruikt; de gekozen methode moet worden gespecificeerd. Indien de stof via een maagsonde wordt toegediend, moeten de doses op vaste tijdstippen worden gegeven. De doses moeten geregeld worden aangepast (wekelijks of twee keer per week) om een constant dosisniveau als functie van het lichaamsgewicht van het dier te verkrijgen.1.6.2.4. LimiettestIndien bij een onderzoek van 28 dagen, verricht volgens onderstaande methode bij een dosisniveau van 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag, of een hoger niveau dat verband houdt met het niveau waaraan de mens, voor zover bekend, kan worden blootgesteld, geen toxische effecten optreden, is het wellicht niet noodzakelijk om verdere proeven te ondernemen. Wanneer stoffen met lage toxiciteit met de voeding worden toegediend moet erop worden toegezien dat de hoeveelheden en andere eigenschappen van de teststof niet interfereren met de normale voedingsbehoeften.1.6.2.5. ObservatieperiodeDe proefdieren moeten dagelijks worden geobserveerd. Tekenen van toxiciteit moeten met het tijdstip waarop deze voor het eerst zijn opgetreden en de mate en duur ervan worden genoteerd. Het tijdstip waarop de dood intreedt, het tijdstip waarop de intoxicatieverschijnselen zich voor het eerst voordoen en het tijdstip waarop zij weer verdwijnen, moeten eveneens worden genoteerd.1.6.3. UitvoeringDe dieren krijgen in het ideale geval gedurende een periode van 28 dagen, 7 dagen per week, een dosis van de teststof toegediend. Dieren in satellietgroepen voor latere waarnemingen moeten nog 14 dagen zonder behandeling worden gehouden om herstel of voortduren van de toxische effecten te kunnen vaststellen.Bij het observeren moet aandacht worden besteed aan veranderingen van huid en vacht, ogen en slijmvliezen, ademhaling, bloedsomloop, autonoom en centraal zenuwstelsel, somatomotorische activiteit en gedrag. Wekelijks moet het voerverbruik (en het waterverbruik indien de teststof met het drinkwater wordt toegediend) worden gemeten en moeten de dieren worden gewogen.De dieren moeten regelmatig worden geobserveerd om te voorkomen dat zij voor de studie verloren gaan als gevolg van bijvoorbeeld kannibalisme of autolyse van weefsels of omdat de dieren in verkeerde kooien zijn geplaatst. Na afloop van de behandelingsperiode wordt bij alle overlevende dieren van de behandelde groepen (afgezien van de dieren in de satellietgroepen) necropsie verricht. Wanneer stervende dieren of dieren met hevige angst of pijn worden aangetroffen, moeten deze worden verwijderd en op een humane manier worden gedood; bij hen wordt eveneens necropsie verricht.Aan het einde van de behandelingsperiode moeten bij alle dieren met inbegrip van die uit de controlegroepen de volgende onderzoekingen worden verricht:1) hematologie, waarbij ten minste bepaling van het hematocriet en het hemoglobinegehalte, erythrocytentelling, totale- en gedifferentieerde telling van de leucocyten en meting van een maat voor het stollingsvermogen;2) klinisch-biochemische bepalingen in het bloed waarbij ten minste één parameter van de leverfunctie en nierfunctie: serum alanineaminotransferase (vroegere benaming: serum glutaminezuur-pyrodruivenzuur-transaminase (SGPT)), serum aspartaataminotransferase (vroegere benaming: serum glutaminezuur-oxaalazijnzuur-transaminase (SGOT)), ureum, albumine, bloedcreatinine, totaal bilirubine en totaal serumeiwit.Voor een goede toxicologische evaluatie kan het nodig zijn het onderzoek uit te breiden met: calcium, fosfor, chloride, natrium, kalium, glucosegehalte bij nuchtere toestand, analyse van de lipiden, hormonen, zuur/base-evenwicht, methemoglobine, en cholinesterase-activiteit.Zo nodig kan verder klinisch-biochemisch onderzoek worden verricht om het onderzoek van waargenomen effecten uit te breiden.1.6.3.1. Macroscopische necropsieBij alle dieren in de studie moet een volledige macroscopische necropsie worden uitgevoerd. Zo spoedig mogelijk na sectie moeten ten minste lever, nieren, bijnieren en testes nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. Organen en weefsels (lever, nieren, milt, testes, bijnieren, hart en alle organen die macroscopisch waarneembaar letsel of veranderingen in omvang vertonen) moeten in een geschikt medium worden bewaard voor eventueel later histopathologisch onderzoek.1.6.3.2. Histopathologisch onderzoekBij de dieren in de groep behandeld met het hoogste dosisniveau en bij de dieren in de controlegroep moet histopathologisch onderzoek worden verricht op de bewaarde organen en weefsels. Organen en weefsels die blijken te zijn beschadigd door de teststof op het hoogste dosisniveau, moeten in alle groepen met een lagere dosering worden onderzocht. Bij het histopathologisch onderzoek van de dieren in de satellietgroepen moet speciaal worden gelet op die organen en weefsels waarin effecten blijken te zijn opgetreden bij de andere behandelde groepen.2. GEGEVENSDe gegevens moeten worden samengevat in tabellen die voor iedere proefgroep laten zien: het aantal dieren aan het begin van het onderzoek en het aantal dieren dat ieder type beschadiging vertoont.Alle waargenomen resultaten moeten met behulp van een geschikte statistische methode worden geëvalueerd. Iedere erkende statistische methode mag hiervoor worden gebruikt.3. RAPPORTAGE3.1. VERSLAG VAN HET ONDERZOEKIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, voeding, enzovoort;- proefomstandigheden;- dosisniveaus (met het eventuele medium) en concentraties;- gegevens over de toxische reacties naar geslacht en dosis;- waar mogelijk het hoogste dosisniveau waarbij geen effect optreedt;- tijdstip gedurende studie waarop dieren tussentijds sterven of aangeven of dieren tot het eind van de proef in leven bleven;- toxische of andere effecten;- tijdstip waarop een abnormaal verschijnsel werd waargenomen en het verloop hiervan;- gegevens over voedsel en lichaamsgewicht;- uitgevoerde hematologische onderzoekingen en alle resultaten;- uitgevoerde klinisch-biochemische onderzoekingen en alle resultaten;- bevindingen bij de necropsie;- een gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevindingen;- waar van toepassing statistische behandeling van de resultaten;- bespreking van de resultaten;- interpretatie van de resultaten.3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIEZie algemene inleiding deel B (punt D).4. LITERATUURZie algemene inleiding deel B (punt E).B.8. TOXICITEIT (INHALATIE) BIJ HERHAALDE TOEDIENING (28 DAGEN)1. METHODE1.1. INLEIDINGHet is nuttig om over oriënterende informatie te beschikken ten aanzien van de deeltjesgrootteverdeling, de dampspanning, het smeltpunt, het kookpunt, het vlampunt en het ontploffingsgevaar (indien van toepassing) van de te onderzoeken stof.Zie verder algemene inleiding deel B (punt A).1.2. DEFINITIESZie algemene inleiding deel B (punt B).1.3. REFERENTIESTOFFENGeen.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEVerscheidene groepen proefdieren worden gedurende een periode van 28 dagen dagelijks een bepaalde tijd aan geleidelijk stijgende concentraties van de teststof blootgesteld. Er wordt een concentratie per groep gebruikt. Indien een medium wordt gebruikt om de juiste concentratie van de teststof in de atmosfeer te bereiken, moet een mediumcontrolegroep worden toegevoegd. Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die aan het eind van de proefnemingen leven, wordt necropsie verricht.1.5. KWALITEITSCRITERIAGeen.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. VoorbereidingenVóór het onderzoek worden de dieren ten minste 5 dagen onder gelijke huisvestings- en voedingsomstandigheden gehouden als gedurende de proef. Gezonde jonge dieren worden op willekeurige wijze voor het onderzoek in het vereiste aantal groepen ingedeeld. Waar nodig wordt een passend medium aan de teststof toegevoegd ten einde de juiste concentratie van de teststof in de atmosfeer te bereiken. Indien een medium of andere additieven worden gebruikt om de dosering te vergemakkelijken, moet bekend zijn dat deze geen toxische effecten veroorzaken. In voorkomend geval kunnen bestaande gegevens worden gebruikt.1.6.2. Proefomstandigheden1.6.2.1. ProefdierenTenzij er contra-indicaties zijn, wordt de voorkeur gegeven aan ratten. Er dient gebruik te worden gemaakt van jonge gezonde dieren van rattenstammen die gewoonlijk in laboratoria worden gebruikt.Bij het begin van de studie mag het gewicht van de dieren die bij de test worden gebruikt niet meer dan ± 20 % van het betreffende gemiddelde gewicht afwijken.1.6.2.2. Aantal en geslachtVoor iedere testgroep moeten ten minste tien dieren (vijf wijfjes en vijf mannetjes) worden gebruikt. De wijfjes moeten nullipaar zijn en niet zwanger. Indien het de bedoeling is tussentijds dieren te doden, moet het aantal worden verhoogd met het aantal dieren dat volgens plan voor de voltooiing van de studie zal worden gedood. Daarnaast kan een satellietgroep van tien dieren (vijf per geslacht) gedurende 28 dagen worden behandeld met het hoogste concentratieniveau, waarna zij nog gedurende 14 dagen na de behandeling worden geobserveerd om na te gaan of de toxische effecten eventueel verdwijnen, voortduren of pas later tot uiting komen. Tevens wordt een satellietgroep van tien controledieren (vijf per geslacht) gebruikt.1.6.2.3. BlootstellingsconcentratiesTen minste drie concentraties met een controle of een mediumcontrole (overeenkomend met de concentratie van het medium bij het hoogste expositieniveau), indien een medium wordt gebruikt, zijn vereist. Afgezien van de toediening van de teststof moeten de dieren in de controlegroep op dezelfde wijze als de dieren in de testgroepen worden behandeld. De hoogste concentratie moet leiden tot toxische effecten, maar er mogen geen of weinig sterfgevallen voorkomen. Bij de laagste concentratie mogen geen tekenen van toxiciteit optreden. Indien het blootstellingsniveau van de mens kan worden geschat, moet de laagste concentratie deze overschrijden. In het ideale geval treden bij de middelste concentratie minimaal waarneembare toxische effecten op. Bij meer dan één tussenconcentratie moet het verschil tussen de concentraties zo groot zijn dat een gradatie in toxische effecten wordt verkregen. In de groep met de laagste concentratie, in de tussengroepen en in de controlegroepen mogen niet veel sterfgevallen voorkomen, omdat anders een zinvolle evaluatie van de resultaten niet mogelijk is.1.6.2.4. BlootstellingstijdDe dagelijkse blootstellingstijd bedraagt 6 uur, maar een afwijkende duur kan in verband met specifieke vereisten nodig zijn.1.6.2.5. ApparatuurDe dieren worden aan de teststoffen blootgesteld met behulp van inhalatieapparatuur die zodanig is gebouwd dat kan worden gezorgd voor een dynamische luchtdoorstroming van ten minste 12 luchtverversingen per uur, een toereikend zuurstofgehalte en een gelijkmatige verdeling van de teststof in de atmosfeer. Als van een expositiekamer gebruik wordt gemaakt, moet deze op zodanige wijze zijn ontworpen dat de dieren zo min mogelijk bij elkaar kunnen kruipen en zoveel mogelijk door inhalatie aan de teststof worden blootgesteld. Als algemene regel voor het verzekeren van een stabiele atmosfeer in de expositiekamer geldt dat het totale "volume" van de proefdieren niet méér mag bedragen dan 5 % van het volume van de blootstellingskamer. Naar keuze kunnen de dieren oronasaal, alleen met hun kop of individueel met hun hele lijf aan de testlucht worden blootgesteld; de eerste twee methoden zullen ertoe bijdragen dat zo min mogelijk teststof via andere wegen in het lichaam wordt opgenomen.1.6.2.6. ObservatieperiodeDe proefdieren moeten tijdens de gehele periode van behandeling en herstel dagelijks op tekenen van toxiciteit worden onderzocht. Het tijdstip waarop de dood intreedt, het tijdstip waarop toxische verschijnselen voor het eerst zijn waargenomen en het tijdstip waarop zij weer verdwijnen, moeten worden genoteerd.1.6.3. UitvoeringDe dieren worden gedurende een periode van 28 dagen, 5 tot 7 dagen per week aan de teststof blootgesteld. Dieren in satellietgroepen voor latere waarnemingen moeten nog 14 dagen zonder behandeling worden gehouden om herstel of voortduren van de toxische effecten te kunnen vaststellen. Tijdens de proefnemingen dient de temperatuur op 22  C ± 3  C te worden gehouden.In het ideale geval moet de relatieve vochtigheid tussen 30 % en 70 % worden gehouden, behalve waar dit niet goed uitvoerbaar is (bijvoorbeeld bij het testen van sommige aërosolen). Het onderhouden van een lichte onderdruk (&le; 5 mm water) voorkomt het weglekken van de teststof naar de omgeving. Gedurende de blootstelling worden de dieren voedsel en water onthouden.Er moet gebruik worden gemaakt van een dynamisch inhalatiesysteem met een geschikt systeem voor de analytische controle van de concentratie. Aanbevolen wordt in een verkennende proef vast te stellen welke blootstellingsconcentraties voor de proeven het meest geschikt zijn. De doorstromingssnelheid moet zodanig worden aangepast dat de condities in de expositiekamer homogeen zijn. Het systeem moet waarborgen dat de omstandigheden bij de proef zo spoedig mogelijk stabiel zijn.De volgende parameters moeten worden gemeten of gemonitored:a) de luchtdoorstromingssnelheid (luchtdebiet) (continu);b) de feitelijke concentratie van de teststof in het ademhalingsgebied. Tijdens de dagelijkse blootstelling mag de concentratie met niet méér dan ± 15 % van het gemiddelde afwijken. Bij sommige aërosolen is het mogelijk dat de concentratie niet binnen deze grenzen gehouden kan worden; in dat geval kan een grotere afwijking worden aanvaard. Tijdens de gehele duur van de studie moeten de dagelijkse concentraties zo constant mogelijk worden gehouden. Voor aërosolen moet ten minste éénmaal per week bij elke testgroep de deeltjesgrootteverdeling worden geanalyseerd;c) de temperatuur en de vochtigheid (continu, indien mogelijk);Tijdens en na de blootstelling worden waarnemingen gedaan die voor elk individueel dier systematisch worden geregistreerd. Alle dieren moeten dagelijks worden geobserveerd; tekenen van toxiciteit moeten worden genoteerd met het tijdstip waarop deze voor het eerst optreden en de mate en de duur ervan. Bij het observeren wordt in ieder geval aandacht besteed aan veranderingen van huid en vacht, ogen, slijmvliezen, ademhalingsorganen, bloedsomloop, autonoom en centraal zenuwstelsel, somatomotorische activiteit en gedrag. Wekelijks moeten de dieren worden gewogen. Het wordt eveneens aanbevolen het voerverbruik wekelijks te meten. De dieren moeten regelmatig worden geobserveerd, om te voorkomen dat ze voor de studie verloren gaan als gevolg van oorzaken als kannibalisme, autolyse van weefsels of omdat de dieren in verkeerde kooien zijn geplaatst. Na afloop van de onderzoekperiode wordt bij alle overlevende dieren in de behandelde groepen (afgezien van de dieren in de satellietgroep) necropsie verricht. Stervende dieren of dieren met hevige angst of pijn, moeten meteen na ontdekking worden verwijderd en op een humane manier worden gedood; bij hen wordt eveneens necropsie verricht.Na afloop van de proeven moet bij alle dieren, met inbegrip van die uit de controlegroep, het volgende worden onderzocht:i) hematologie, waarbij ten minste bepaling van hematocriet en hemoglobinegehalte, erythrocytentelling, totale en gedifferentieerde telling van de leucocyten en meting van stollingseigenschappen moeten worden uitgevoerd.ii) klinisch-biochemische bepalingen in het bloed waarbij ten minste één parameter van de leverfunctie en nierfunctie wordt bekeken: serum alanineaminotransferase (vroegere benaming: serum glutaminezuur-pyrodruivenzuur-transaminase (SGPT)), serum aspartaataminotransferase (vroegere benaming: serum glutaminezuur-oxaalazijnzuur-transaminase (SGOT)), ureum, albumine, bloedcreatinine, totaal bilirubine en totaal serumeiwit.Voor een goede toxicologische evaluatie kan het nodig zijn het onderzoek uit te breiden met: calcium, fosfor, chloride, natrium, kalium, glucosegehalte in nuchtere toestand, analyse van de lipiden, hormonen, zuur/base-evenwicht, methemoglobine en cholinesterase-activiteit.Zo nodig kan verder klinisch-biochemisch onderzoek worden verricht om het onderzoek van de waargenomen effecten uit te breiden.1.6.3.1. Macroscopische necropsieBij alle dieren in de studie moet een volledige macroscopische necropsie worden uitgevoerd. Zo spoedig mogelijk na sectie moeten ten minste lever, nieren, bijnieren, longen en testes nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. Organen en weefsels (de ademhalingswegen, lever, nieren, milt, testes, bijnieren, hart en alle organen die macroscopisch waarneembare afwijkingen of veranderingen in omvang vertonen) moeten in een geschikt medium worden bewaard voor eventueel histopathologisch onderzoek. De longen moeten in hun geheel worden verwijderd, gewogen en behandeld worden met een geschikt fixatief om ervoor te zorgen dat de longstructuur intact blijft.1.6.3.2. Histopathologisch onderzoekBij de dieren in de hoge concentratiegroep en bij de dieren in de controlegroep(en) moet histopathologisch onderzoek op de bewaarde organen en weefsels worden verricht. Organen en weefsels die bij het hoogste concentratieniveau door de teststof blijken te zijn beschadigd, moeten in alle groepen met een lagere dosering worden onderzocht. Bij het histopathologisch onderzoek van dieren in satellietgroepen moet speciaal worden gelet op organen en weefsels waar, bij de andere behandelde groepen, effecten blijken te zijn opgetreden.2. GEGEVENSDe volgende gegevens moeten voor iedere proefgroep in tabellen worden samengevat: het aantal dieren bij het begin van het onderzoek en het aantal dieren waarbij ieder type beschadiging voorkomt.Alle waargenomen resultaten moeten met behulp van een geschikte statistische methode worden geëvalueerd. Iedere erkende statistische methode kan hiervoor worden gebruikt.3. RAPPORTAGE3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGENIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, voeding, enzovoort;- proefomstandigheden:Beschrijving van de blootstellingsapparatuur met inbegrip van ontwerp, type, afmetingen, luchtbron, systeem voor het genereren van aërosolen, methode van luchtconditionering, behandeling van de afgevoerde lucht en de wijze waarop de dieren tijdens de proeven in een blootstellingskamer zijn ondergebracht als deze is gebruikt. Er moet een beschrijving worden gegeven van de apparatuur voor het meten van de temperatuur, de vochtigheid en, in voorkomend geval, de stabiliteit van de concentratie of de deeltjesgrootteverdeling van de aërosolen.Gegevens betreffende de blootstelling:Deze moeten tabellarisch worden gerangschikt en worden voorzien van gemiddelde waarden en een maat voor de variabiliteit (bijvoorbeeld standaardafwijking). Zij dienen zo mogelijk te omvatten:a) de luchtdoorstromingssnelheid (luchtdebiet) door de inhalatieapparatuur;b) temperatuur en vochtigheid van de lucht;c) nominale concentraties (de totale hoeveelheid teststof die de inhalatieapparatuur wordt binnengeleid, gedeeld door het luchtvolume);d) aard van het eventuele medium;e) feitelijke concentraties van de teststof in het ademhalingsgebied van de dieren;f) massa-mediaan van de aërodynamische diameter (MMAD) en de geometrische standaardafwijking (GSD);- gegevens over de toxische reactie per geslacht en concentratie;- tijdstip gedurende de studie waarop de dood intreedt, of aangeven of de dieren tot het einde van de proef in leven bleven;- beschrijving van toxische of andere effecten; hoogste niveau waarbij geen effect wordt waargenomen;- tijdstip waarop een abnormaal verschijnsel wordt waargenomen en het verloop hiervan;- gegevens over voedselconsumptie en lichaamsgewicht;- uitgevoerde hematologische proeven en alle resultaten;- uitgevoerde klinisch-biochemische proeven en alle resultaten;- bevindingen bij de necropsie;- een gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevindingen;- waar mogelijk statistische behandeling van de resultaten;- bespreking van de resultaten;- interpretatie van de resultaten.3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIEZie algemene inleiding deel B (punt D).4. LITERATUURZie algemene inleiding deel B (punt E).B.9. TOXICITEIT (DERMAAL) BIJ HERHAALDE TOEDIENING (28 DAGEN)1. METHODE1.1. INLEIDINGZie algemene inleiding deel B (punt A).1.2. DEFINITIESZie algemene inleiding deel B (punt B).1.3. REFERENTIESTOFFENGeen.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEDe teststof wordt gedurende een periode van 28 dagen dagelijks in geleidelijk stijgende doseringen op de huid van verscheidene groepen proefdieren aangebracht. Er wordt één dosis per groep gebruikt. Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die aan het eind van de proef leven, wordt necropsie verricht.1.5. KWALITEITSCRITERIAGeen.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. VoorbereidingenVoor het onderzoek worden de dieren ten minste 5 dagen onder gelijke huisvestings- en voedingsomstandigheden gehouden als tijdens de proef voorkomen. Gezonde jonge dieren worden op willekeurige wijze voor de behandeling ingedeeld bij testgroepen en controlegroepen. Kort voor de proef wordt het haar op het ruggedeelte van de romp van de proefdieren geknipt; het haar kan ook worden geschoren, maar dit moet dan ongeveer 24 uur voor de proef worden gedaan. Gewoonlijk zal het dier ongeveer om de week opnieuw moeten worden geknipt of geschoren. Bij het knippen of scheren moet erop worden gelet dat de huid niet wordt bekrast. Ten minste 10 % van de lichaamsoppervlakte moet voor het aanbrengen van de teststof worden onthaard. Bij het bepalen van de oppervlakte die moet worden onthaard en de afmetingen van de aan te brengen bedekking moet rekening worden gehouden met het gewicht van het dier. Bij een proef met vaste stoffen, die eventueel tot poeder kunnen worden fijngemaakt, moet de teststof voldoende met water of, zo nodig, met een passend medium worden bevochtigd, zodat de stof goed in contact met de huid komt. Vloeibare teststoffen worden in het algemeen onverdund gebruikt. De teststof wordt gedurende 5 tot 7 dagen per week dagelijks aangebracht.1.6.2. Proefomstandigheden1.6.2.1. ProefdierenEr kan gebruik worden gemaakt van volwassen ratten, konijnen of cavia's. Ook andere diersoorten kunnen worden gebruikt, maar de noodzaak hiervoor moet worden aangetoond.Bij het begin van de studie mag het gewicht van de dieren die bij de test worden gebruikt niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken.1.6.2.2. Aantal en geslachtVoor ieder dosisniveau moeten ten minste tien dieren (vijf wijfjes en vijf mannetjes) met een gezonde huid worden gebruikt. De wijfjes moeten nullipaar zijn en niet zwanger. Indien het de bedoeling is tussentijds dieren te doden, moet het aantal worden verhoogd met het aantal dieren dat volgens plan voor de voltoo¨ ung van de studie zal worden gedood. Daarnaast kan een satellietgroep van tien dieren (vijf per geslacht) gedurende 28 dagen worden behandeld met het hoge dosisniveau waarna zij nog gedurende 14 dagen na de behandeling worden geobserveerd om na te gaan of de toxische effecten eventueel verdwijnen, voortduren of pas later tot uiting komen. Tevens wordt een satellietgroep van tien controledieren (vijf per geslacht) gebruikt.1.6.2.3. DosisniveauTen minste drie dosisniveaus, met een controlegroep of een mediumcontrolegroep, indien een medium wordt gebruikt, zijn vereist. De expositieduur moet ten minste 6 uur per dag bedragen. De teststof moet iedere dag op ongeveer dezelfde tijd worden aangebracht; op vastgestelde tijden (iedere week of twee keer per week) is een correctie vereist om ervoor te zorgen dat het dosisniveau in verhouding tot het lichaamsgewicht van het dier constant blijft. Afgezien van de toediening van de teststof moeten de dieren in de controlegroep op dezelfde wijze als de dieren in de proefgroep worden behandeld. Indien een medium is gebruikt om het doseren te vergemakkelijken moet aan de mediumcontrolegroep op dezelfde wijze als aan de testgroep een dosis van het medium worden toegediend en deze dosis moet even groot zijn als die van de dieren in de groep met het hoogste dosisniveau. Het hoogste dosisniveau van de teststof moet leiden tot toxische effecten, maar er mogen geen of weinig sterfgevallen voorkomen. Bij het laagste dosisniveau mogen geen tekenen van toxiciteit optreden. Indien het blootstellingsniveau van de mens kan worden geschat, moet het laagste niveau deze overschrijden. In het ideale geval treden bij het middelste dosisniveau minimaal waarneembare toxische effecten op. Bij meer dan één tussendosis moet het verschil tussen de dosisniveaus zo groot zijn dat een gradatie in toxische effecten wordt verkregen. In de groep met de laagste dosis en in de tussengroepen, alsmede in de controlegroepen, mogen niet veel sterfgevallen voorkomen, omdat anders een zinvolle evaluatie van de resultaten niet mogelijk is.Indien toediening van de teststof tot ernstige huidirritatie leidt, moeten de concentraties worden verlaagd, wat vermindering of ontbreken van andere toxische effecten bij het hoge dosisniveau tot gevolg kan hebben. Indien de huid ernstig is beschadigd, kan het zelfs noodzakelijk zijn de studie te beëindigen en een nieuwe studie met lagere concentraties te beginnen.1.6.2.4. LimiettestIndien bij een verkennende proef geen toxische effecten optreden bij een dosisniveau van 1 000 mg/kg, of een hoger niveau dat verband houdt met het niveau waaraan de mens, voor zover bekend, kan worden blootgesteld, is het wellicht niet noodzakelijk om verdere proeven te nemen.1.6.2.5. ObservatieperiodeDe proefdieren moeten dagelijks worden onderzocht op tekenen van toxiciteit. Het tijdstip waarop de dood intreedt, het tijdstip waarop toxiciteitsverschijnselen voor het eerst zijn waargenomen en het tijdstip waarop zij weer verdwijnen, moeten worden opgetekend.1.6.3. UitvoeringDe dieren moeten afzonderlijk in kooien worden gehuisvest. De dieren worden gedurende een periode van 28 dagen, zo mogelijk 7 dagen per week, met de teststof behandeld. Dieren in eventuele satellietgroepen voor latere waarnemingen moeten nog 14 dagen zonder behandeling worden gehouden om herstel of voortduren van de toxische effecten te kunnen vaststellen. De blootstellingstijd moet 6 uur per dag bedragen.De teststof moet gelijkmatig worden aangebracht over een oppervlakte van ongeveer 10 % van de totale lichaamsoppervlakte. Bij zeer toxische stoffen kan de te bedekken oppervlakte kleiner zijn, maar een zo groot mogelijke oppervlakte moet worden bedekt met een zo dun en gelijkmatig mogelijk aangebrachte laag.De teststof moet gedurende de blootstellingstijd door middel van poreus gaasverband en niet-irriterend plakband in contact met de huid worden gehouden. Het testgedeelte van de huid moet op geschikte wijze verder worden bedekt om het verbandgaas en de teststof op hun plaats te houden en om te verhinderen dat de dieren de teststof via de mond opnemen. Hulpmiddelen om de dieren te fixeren kunnen worden gebruikt om te voorkomen dat de dieren de teststof via de mond opnemen, maar het wordt niet aangeraden de dieren volledig te immobiliseren. Als alternatief kan een "beschermende halskraag" worden gebruikt.Aan het einde van de blootstellingsperiode wordt de resterende teststof zo mogelijk met water van de huid verwijderd of anders door middel van een andere geschikte reinigingstechniek.Alle dieren moeten dagelijks worden geobserveerd; tekenen van toxiciteit moeten worden genoteerd met inbegrip van het tijdstip waarop deze voor het eerst optraden en de mate en de duur ervan. Bij het observeren moet aandacht worden besteed aan veranderingen van de huid, de vacht, de ogen en de slijmvliezen, de ademhalingsorganen, de bloedsomloop, het autonome en het centrale zenuwstelsel, de somatomotorische activiteit en het gedrag. Wekelijks moeten de dieren worden gewogen. Het is eveneens aanbevolen het voerverbruik wekelijks te meten. De dieren moeten regelmatig worden geobserveerd om te voorkomen dat zij voor de studie verloren gaan als gevolg van oorzaken als kannibalisme, autolyse van weefsels of omdat de dieren in verkeerde kooien zijn geplaatst. Na afloop van de onderzoekperiode wordt bij alle overlevende dieren in de behandelde groepen (afgezien van de dieren in de satellietgroep), necropsie verricht. Indien stervende dieren of dieren met hevige nood/ongemak of pijn worden aangetroffen, moeten deze worden verwijderd en op een humane manier worden gedood; bij hen wordt eveneens necropsie verricht.Na afloop van de studie moeten bij alle dieren, met inbegrip van die uit de controlegroepen, de volgende onderzoekingen worden uitgevoerd:1) Hematologie waarbij ten minste bepaling van hematocriet en hemoglobinegehalte, erythrocytentelling, totale en gedifferentieerde telling van de leucocyten en meting van stollingsvermogen.2) Klinisch-biochemische bepalingen in het bloed waarbij ten minste één parameter van de lever- en nierfunctie: serum alanineaminotransferase (vroegere benaming: serum glutaminezuur-pyrodruivenzuur-transaminase (SGPT)), serum aspartaataminotransferase (vroegere benaming: serum glutaminezuur-oxaalazijnzuur-transaminase (SGOT)), ureum, albumine, bloedcreatinine, totaal bilirubine en totaal serumeiwit.Voor een goede toxicologische evaluatie kan het nodig zijn het onderzoek uit te breiden met: calcium, fosfor, chloride, natrium, kalium, glucosegehalte bij nuchtere toestand, analyse van de lipiden, hormonen, zuur/base-evenwicht, methemoglobine en cholinesterase-activiteit.Zo nodig kan verder klinisch-biochemisch onderzoek worden verricht om het onderzoek van de waargenomen effecten uit te breiden.1.6.4. Macroscopische necropsieBij alle dieren in de studie moet een volledige macroscopische necropsie worden uitgevoerd. Zo spoedig mogelijk na sectie moeten ten minste lever, nieren, bijnieren en testes nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. Organen en weefsels (de normale en de behandelde huid, lever, nieren, milt, testes, bijnieren, hart en alle organen die macroscopisch waarneembare beschadigingen of veranderingen in omvang vertonen) moeten in een geschikt medium worden bewaard voor eventueel later histopathologisch onderzoek.1.6.5. Histopathologisch onderzoekBij de dieren in de groep die een hoge dosis heeft ontvangen en bij die in de controlegroep moet histopathologisch onderzoek op de bewaarde organen en weefsels worden verricht. Organen en weefsels die bij het hoogste doseringsniveau door de teststof blijken te zijn beschadigd, moeten in alle groepen met een lagere dosering worden onderzocht. Bij het histopathologisch onderzoek van de dieren in de satellietgroep moet speciaal worden gelet op de organen en weefsels waar, bij de andere behandelde groepen, effecten blijken te zijn opgetreden.2. GEGEVENSDe volgende gegevens moeten voor iedere proefgroep in tabellen worden samengevat: het aantal dieren bij het begin van het onderzoek en het aantal dieren waarbij ieder type beschadiging voorkomt.Alle waargenomen resultaten moeten met behulp van een geschikte statistische methode worden geëvalueerd. Iedere erkende statistische methode kan hiervoor worden gebruikt.3. RAPPORTAGE3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGENIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, dieet, enzovoort;- proefomstandigheden (met inbegrip van het soort verband: occlusief of niet-occlusief);- dosisniveaus (met het eventueel medium) en concentraties;- waar mogelijk het hoogste dosisniveau waarbij geen effect optreedt;- gegevens over de toxische reactie naar geslacht en dosis;- tijdstip gedurende de studie waarop de dood intreedt, of aangeven of dieren tot het eind van de proef bleven leven;- toxische of andere effecten;- tijdstip waarop een abnormaal verschijnsel werd waargenomen en het verloop hiervan;- gegevens over voedsel en lichaamsgewicht;- uitgevoerde hematologische proeven en alle resultaten;- uitgevoerde klinisch-biochemische proeven en alle resultaten;- bevindingen bij de necropsie;- een gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevindingen;- waar mogelijk statistische behandeling van de resultaten;- bespreking van de resultaten;- interpretatie van de resultaten.3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIEZie algemene inleiding deel B (punt D).4. LITERATUURZie algemene inleiding deel B (punt E).B.10. MUTAGENITEIT ("IN VITRO" CYTOGENETISCHE TEST OP ZOOGDIEREN)1. METHODE1.1. INLEIDINGZie algemene inleiding deel B (punt A).1.2. DEFINITIESZie algemene inleiding deel B (punt C).1.3. REFERENTIESTOFFENGeen.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEDeze cytogenetische test (in vitro) is een kortdurende mutageniteitstest voor de opsporing van structurele chromosoomafwijkingen in gekweekte zoogdiercellen. Culturen van zowel bestaande cellijnen als van primaire celculturen kunnen worden gebruikt. Na blootstelling aan de teststoffen mét en zonder een geschikt metabool activeringssysteem worden celculturen behandeld met spindle-remmers, zoals colchicine, om cellen te accumuleren in een metafaseachtig stadium van de mitose (c-metafase). Op vastgestelde tijden worden de cellen geoogst en worden chromosoompreparaten gemaakt. De preparaten worden gekleurd en de metafasecellen worden geanalyseerd op chromosoomafwijkingen.1.5. KWALITEITSCRITERIAGeen.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. Voorbereidingen1.6.1.1. CellenBestaande cellijnen of culturen van primaire cellen worden gebruikt, zoals Chinese-hamstercellen en menselijke lymfocyten. De teststoffen worden in een kweekmedium of in andere geschikte oplosmiddelen opgelost alvorens de cellen worden behandeld.1.6.1.2. Metabool activeringssysteemDe cellen dienen te worden blootgesteld aan de teststof zowel met als zonder een geschikt metabool activeringssysteem. Het meest algemeen gebruikte systeem is een post-mitochondriale fractie verrijkt met een cofactor, verkregen uit de lever van knaagdieren die behandeld werden met enzym-inducerende stoffen.1.6.2. ProefomstandighedenAantal culturenVoor elk experimenteel punt worden ten minste twee culturen gebruikt.Gebruik van negatieve en positieve controlesHet oplosmiddel (wanneer het oplosmiddel niet bestaat uit voedingsbodem of water), het leverenzymactiveringsmengsel, het leverenzymactiveringsmengsel met oplosmiddel en onbehandelde controles worden als negatieve controles gebruikt.Bij elke proef behoort een positieve controle; bij het experiment waarbij een leverenzymactiveringsmengsel wordt gebruikt om de teststoffen te activeren, moet als positieve controle een stof worden gebruikt waarvan bekend is dat deze metabole activering nodig heeft.DosisniveauTe minste drie doses van de teststof, met een spreiding van tenminste een factor 10 in de dosis, worden toegepast. De hoogste dosis moet de mitotische activiteit met circa 50 % remmen of een ander teken van cytotoxiciteit vertonen. Indien de teststof niet toxisch is, dient ze te worden onderzocht tot aan de oplosbaarheidsgrens of tot een maximale concentratie van 5 mg/ml.Omstandigheden voor de cultuurDe kweekomstandigheden: kweekmedium en incubatieomstandigheden zoals temperatuur, gebruikte kweekvaten, CO2-concentraties en vochtigheid dienen geschikt te zijn.1.6.3. Procedure1.6.3.1. Bereiding van culturenBestaande cellijnen: de cellen worden gekweekt uit voorraadculturen (bijvoorbeeld door trypsinebehandeling of door afschudden), met de juiste dichtheid geënt in kweekvaten en ge¨ uncubeerd bij 37  C.Menselijke lymfocyten: bloed waaraan heparine is toegevoegd, wordt gebracht in een voedingsbodem die fytohemagglutinine, foetaal kalfsserum en antibiotica bevat en wordt bij 37  C ge¨ uncubeerd.1.6.3.2. Behandeling van de culturen met de te testen stofi) Behandeling zonder leverenzymactiveringsmengselAlle behandelingen beslaan zo mogelijk ten minste één volledige celcyclus en de fixatieschema's worden zodanig gekozen dat van cellen die tijdens verschillende stadia van de cyclus zijn behandeld, de eerste mitose na de behandeling wordt geanalyseerd. Wanneer de behandeling niet de gehele lengte van een celcyclus beslaat, worden de fixatietijden zodanig gekozen dat cellen worden bemonsterd die tijdens de behandeling in verschillende stadia van de celcyclus verkeren, dat wil zeggen G1, S en G2.De teststof wordt toegevoegd aan culturen van erkende cellijnen wanneer deze in het exponentiële groeistadium verkeren. Culturen van menselijke lymfocyten worden behandeld terwijl zij nog in een halfsynchrone toestand zijn.ii) Behandeling met leverenzymactiveringsmengselVoor de behandeling dient de teststof in combinatie met het activeringssysteem zo lang mogelijk aanwezig te zijn, zonder een toxisch effect op de cellen uit te oefenen. Indien deze behandeling vanwege de toxiciteit niet de gehele duur van een celcyclus beslaat, worden de fixatietijden zodanig gekozen dat cellen worden bemonsterd die tijdens de behandeling in verschillende stadia van de celcyclus verkeren, dat wil zeggen G1, S en G2.Oogsten van cellenCelculturen worden gedurende een afdoende periode vóór het oogsten behandeld met een spindle-remmer. Elke cultuur wordt afzonderlijk geoogst en verwerkt voor chromosoompreparaten.Ten minste twee oogsttijden zijn nodig. Het is aan te bevelen om de eerste na ongeveer één celcyclus uit te voeren en de tweede later, om er zeker van te zijn dat alle stadia van de celcyclus meegenomen worden en om rekening te houden met vertraging in de celcyclus.1.6.3.3. ChromosoompreparatenVoor chromosoompreparaten zijn nodig: hypotonische behandeling van de cellen, fixatie, spreiding op objectglaasjes en kleuring.AnalysePer cultuur worden ten minste 100 goed gespreide metafasen geanalyseerd op chromosoomafwijkingen. Voor de analyse worden de objectglaasjes gecodeerd. Bij menselijke lymfocyten worden alleen metafasen met 46 centromeren geanalyseerd.Bij erkende cellijnen worden alleen metafasen geanalyseerd die het modale aantal ± 2 centromeren bevatten.Voorts dient voor elk dosisniveau de mitotische index of een andere geschikte indicatie van cytotoxiciteit te worden bepaald.2. GEGEVENSDe gegevens worden in een tabel opgenomen. Chromatideafwijkingen ('gaps', breuken, uitwisselingen), chromosoomafwijkingen (bijvoorbeeld gaps, breuken, minutes, ringen, dicentrische en polycentrische structuren) en het aantal afwijkende metafasen (met en zonder 'gaps') worden voor alle behandelde en controleculturen afzonderlijk vermeld.De gegevens dienen aan de hand van passende statistische methoden te worden geëvalueerd.De testresultaten dienen te worden vergeleken met de gelijktijdig uitgevoerde negatieve controles.Ten minste twee onafhankelijke onderzoeken dienen te worden uitgevoerd. Eén enkel onderzoek kan echter voldoende zijn, indien dit wetenschappelijk verantwoord kan worden. Het is niet noodzakelijk het tweede onderzoek op identieke wijze als het eerste uit te voeren. Het kan zelfs wenselijk zijn om bepaalde testomstandigheden te veranderen om aldus meer bruikbare gegevens te verkrijgen.3. RAPPORTAGE3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGENIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- gebruikte cellen;- proefomstandigheden: samenstelling van het kweekmedium, C02-concentratie, incubatietemperatuur, incubatieduur, dosisniveaus, duur van de behandeling, duur van de behandeling met en concentratie van de gebruikte spindle-remmer, het gebruikte soort leverenzymactiveringsmengsel, positieve en negatieve controles;- aantal celculturen;- aantal geanalyseerde metafasen (voor elke cultuur worden de gegevens afzonderlijk vermeld);- mitotische index of een andere indicatie van cytotoxiciteit;- type en aantal afwijkingen, afzonderlijk vermeld voor elke behandelde en controlecultuur, modaal aantal chromosomen in de gevestigde cellijnen die men heeft gebruikt;- statistische evaluatie;- bespreking van de resultaten;- interpretatie van de resultaten.3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIEZie algemene inleiding deel B (punt D).4. LITERATUURZie algemene inleiding deel B (punt E).B.11. MUTAGENITEIT (IN VIVO CYTOGENETISCHE TEST OP BEENMERG VAN ZOOGDIEREN, CHROMOSOOMANALYSE)1. METHODE1.1. INLEIDINGZie algemene inleiding deel B (punt A).1.2. DEFINITIESZie algemene inleiding deel B (punt C).1.3. REFERENTIESTOFFENGeen.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEDeze cytogenetische in vivo test is een kortdurende mutageniteitsproef voor het vaststellen van structurele chromosoomafwijkingen. Chromosoomafwijkingen worden in het algemeen geëvalueerd in de eerste mitoses na de behandeling. Bij chemische mutagenen zijn de meeste ge¨ unduceerde afwijkingen van het chromatide-type.Bij deze methode worden beenmergcellen van zoogdieren gebruikt, die op geschikte wijze aan teststoffen worden blootgesteld en met opeenvolgende tussenperioden worden gedood. Alvorens zij gedood worden, worden de dieren behandeld met een spindle-remmer, zoals colchicine, ten einde cellen in een metafaseachtig stadium van de mitose (c-metafase) te accumuleren. Er worden aan de lucht gedroogde chromosoompreparaten van de cellen vervaardigd en gekleurd, en de metafasen worden onder de microscoop op chromosoomafwijkingen geanalyseerd.1.5. KWALITEITSCRITERIAGeen.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. VoorbereidingenDe teststoffen worden in een fysiologische zoutoplossing opgelost. Indien zij onoplosbaar zijn, worden zij in geschikte oplosmiddelen opgelost of gesuspendeerd.Vers bereide oplossingen van de teststof worden gebruikt. Indien men een oplosmiddel gebruikt om de toediening te vergemakkelijken, mag dit de teststof niet be¨ unvloeden of toxische effecten veroorzaken.1.6.2. Proefomstandigheden1.6.2.1. ProefdierenEr worden knaagdieren zoals ratten, muizen of Chinese hamsters gebruikt. Gezonde, jonge volwassen dieren worden aselect gekozen en vervolgens in behandelings- en controlegroepen ingedeeld.1.6.2.2. Aantal en geslachtVoor elke behandelings- en controlegroep worden ten minste vijf wijfjes en vijf mannetjes gebruikt. Er worden aldus per periode tien dieren per groep gedood indien verscheidene intervalle testtijden-na-de-behandeling in het testschema zijn opgenomen. Bij de positieve controlegroep is een enkele bemonsteringstijd voldoende.1.6.2.3. Wijze van toedieningDe teststoffen worden in de meeste gevallen slechts eenmaal toegediend. Op basis van toxicologische gegevens kan een schema voor een herhaalde behandeling worden toegepast. Een herhaalde behandeling kan echter alleen worden toegepast indien de teststof geen cytotoxische effecten in het beenmerg vertoont. De gebruikelijke methoden voor toediening zijn: oraal of via intraperitoneale injectie. Ook andere wijzen van toediening kunnen in aanmerking komen.1.6.2.4. Gebruik van negatieve en positieve controlesAls positieve controle wordt een stof gebruikt, waarvan men weet dat deze in vivo chromosoomafwijkingen veroorzaakt terwijl een negatieve controlegroep (oplosmiddel) ook tot de opzet van iedere proef behoort.1.6.2.5. DosisniveauVoor het basisdossier wordt één dosis van de teststof gebruikt; deze dosis is de maximaal te verdragen dosis (MTD) of de dosis die een indicatie van cytotoxiciteit, bijvoorbeeld gedeeltelijke mitoseremming, geeft.Voor "niet-toxische" stoffen is 2 000 mg/kg lichaamsgewicht de maximale (limiet)dosis die onderzocht moet worden na één toediening.Indien het schema met herhaalde toediening wordt gebruikt, is de limietdosis 1 000 mg/kg lichaamsgewicht per dag.Om wetenschappelijke reden kunnen aanvullende dosisniveaus gebruikt worden.Wanneer de test ter verificatie gebruikt wordt, dienen ten minste twee aanvullende dosisniveaus te worden gebruikt.1.6.3. UitvoeringDe proef kan op twee manieren worden uitgevoerd:i) De dieren worden eenmaal met de maximaal te verdragen dosis (MTD) van de teststof behandeld. In eerste instantie worden 24 uur na de behandeling monsters genomen. Wanneer de resultaten duidelijk positief zijn, kan verder bemonsteren onnodig zijn. Indien de resultaten echter negatief of onduidelijk zijn - de kinetiek van de celcyclus kan immers door de teststof worden be¨ unvloed - wordt een eerdere en een latere bemonsteringsperiode, voldoende gespreid in de tijd tussen 6 en 48 uur, na behandeling toegepast.Wanneer aanvullende dosisniveaus worden gebruikt, dienen de monsters in de meest gevoelige perioden te worden genomen of, als die niet bekend zijn, 24 uur na de behandeling.ii) Als op grond van farmacokinetische en metabole gegevens een schema voor herhaalde behandeling nodig is, kan een herhaalde dosering plaatsvinden en dienen de monsters tussen 6 en 24 uur na de laatste behandeling te worden genomen.BeenmergpreparaatAlvorens de dieren worden gedood, worden zij intraperitoneaal ge¨ unjecteerd met een passende dosis spindle-remmer om een voldoende aantal cellen in de C-metafase te verkrijgen. Het beenmerg wordt uit de beide dijbenen van pas gedode dieren verkregen door spoelen met een isotone oplossing. Na een passende hypotonische behandeling worden de cellen gefixeerd en vervolgens op objectglaasjes gespreid. Na droging aan de lucht worden de glaasjes gekleurd.AnalyseDe glaasjes worden voor de microscopische analyse gecodeerd. Ten minste 50 goedgespreide metafasen met het volledige aantal centromeren worden geanalyseerd op chromosoomafwijkingen. Bovendien kunnen voor elk dier de mitotische indexen worden vastgesteld.2. GEGEVENSDe gegevens worden gepresenteerd in de vorm van tabellen. De afwijkingen van chromatide of isochromatide aard ('gaps', breuken, uitwisselingen), en de mitotische indexen, indien ze werden vastgesteld, worden voor alle behandelde en controledieren afzonderlijk genoteerd. Tevens worden gemiddelde aantallen en standaardafwijkingen voor elk van de proef- en controlegroepen genoteerd. De gegevens worden met behulp van passende statistische methoden geëvalueerd.3. RAPPORTAGE3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGENIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- soort, stam en leeftijd van de gebruikte dieren;- aantal dieren per geslacht in de proef- en controlegroepen;- proefomstandigheden: gedetailleerde beschrijving van het schema voor de behandeling en bemonstering, dosisniveaus, duur van de behandeling met en concentratie van de spindle-remmer;- aantal per dier geanalyseerde metafasen;- mitotische indexen, indien ze werden vastgesteld;- soort en aantal afwijkingen, voor elk behandeld en controledier afzonderlijk;- tekens van toxiciteit tijdens het verloop van de studie;- statistische evaluatie;- bespreking van de resultaten;- interpretatie van de resultaten.3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIEZie algemene inleiding deel B (punt D).4. LITERATUURZie algemene inleiding deel B (punt E).B.12. MUTAGENITEIT (MICRONUCLEUSTEST)1. METHODE1.1. INLEIDINGZie algemene inleiding deel B (punt A).1.2. DEFINITIESZie algemene inleiding deel B (punt C).1.3. REFERENTIESTOFFENGeen.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEDe micronucleustest is een kortdurende test, die in vivo op zoogdieren wordt toegepast voor het vaststellen van chromosoombeschadiging of beschadiging van het mitotisch apparaat door de inwerking van chemische stoffen. Basis voor deze proef is de toename van het aantal micronuclei in de polychromatische erythrocyten van behandelde dieren vergeleken met de controledieren.De micronuclei worden gevormd uit chromosoomfragmenten of gehele chromosomen die achterblijven in de mitose. Wanneer erythroblasten zich ontwikkelen tot erythrocyten, wordt de hoofdkern uitgestoten terwijl de micronucleus in het cytoplasma bewaard kan blijven. Bij deze proef worden jonge polychromatische erythrocyten in het beenmerg van laboratoriumzoogdieren, die op geschikte wijze aan de teststoffen zijn blootgesteld, gebruikt. Het beenmerg wordt uit een dijbeen gehaald, er worden uitstrijkjes vervaardigd en vervolgens gekleurd. Polychromatische erythrocyten worden onder de microscoop op micronuclei onderzocht, en vervolgens wordt de verhouding tussen polychromatische en normochromatische erythrocyten vastgesteld.1.5. KWALITEITSCRITERIAGeen.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. VoorbereidingenDe chemische teststoffen worden in een isotone oplossing opgelost; indien zij onoplosbaar zijn, worden zij in andere, passende media opgelost of gesuspendeerd. Wanneer men een medium gebruikt, mag dit de teststof niet be¨ unvloeden of toxische effecten veroorzaken. Gewoonlijk worden vers bereide oplossingen van de teststof gebruikt.1.6.2. Proefomstandigheden1.6.2.1. ProefdierenMuizen verdienen de voorkeur, maar ook andere zoogdieren kunnen worden gebruikt. Gezonde, jonge volwassen dieren worden aselect gekozen en vervolgens in behandelings- en controlegroepen ingedeeld.1.6.2.2. Aantal en geslachtVoor elke behandelings- en controlegroep worden ten minste vijf wijfjes en vijf mannetjes gebruikt. Er worden per blootstellingstijd tien dieren per groep gedood indien verscheidene testtijden-na-de-behandeling in het testschema zijn opgenomen. Bij de positieve controlegroep is een enkele blootstellingstijd voldoende.1.6.2.3. Wijze van toedieningDe teststoffen worden meestal slechts éénmaal toegediend. Op basis van toxicologische gegevens kan een schema voor een herhaalde behandeling worden toegepast. Een herhaalde behandeling kan echter alleen worden toegepast indien de teststof geen cytotoxische effecten in beenmerg teweeg brengt. De gebruikelijke methoden voor toediening zijn: oraal of via intraperitoneale injectie. Ook andere wijzen van toediening kunnen in aanmerking komen.1.6.2.4. Gebruik van negatieve en positieve controlesBij elke proef dienen zowel positieve als negatieve (oplosmiddel) controles te worden gebruikt.1.6.2.5. DosisniveauVoor het basisdossier wordt één dosis van de teststof gebruikt; de dosis is de maximaal te verdragen dosis of de dosis die een indicatie van cytotoxiciteit geeft, bijvoorbeeld door verandering in de verhouding tussen polychromatische en normochromatische erythrocyten.Voor "niet-toxische" stoffen is 2 000 mg/kg lichaamsgewicht de maximale (limiet)dosis die onderzocht moet worden na één toediening.Indien het schema met herhaalde toediening wordt gebruikt, is de limietdosis 1 000 mg/kg lichaamsgewicht per dag.Om wetenschappelijke redenen kunnen aanvullende doseringen gebruikt worden.Wanneer de test ter verificatie gebruikt wordt, dienen ten minste twee aanvullende doseringen te worden gebruikt.1.6.3. ProcedureDe proef kan op twee manieren worden uitgevoerd:i) De dieren worden éénmaal met de teststof behandeld. De bemonsteringstijden dienen samen te vallen met de maximale reactie van de test, die varieert met de teststof. Daarom worden ten minste tweemaal beenmergmonsters genomen, de eerste niet eerder dan 12 uur na de behandeling en de laatste niet later dan 48 uur.Wanneer aanvullende doseringen worden gebruikt, dienen de beenmergmonsters in de meest gevoelige periode genomen te worden of, als die niet bekend is, 24 uur na de behandeling.ii) Als op grond van de farmacokinetische en metabole gegevens een schema voor herhaalde behandeling nodig is, kan een herhaalde dosering plaatsvinden en dienen de beenmergmonsters ten minste één maal te worden genomen en niet eerder dan 12 uur na de laatste behandeling.BeenmergbehandelingHet beenmerg wordt verkregen uit de twee dijbenen van pas gedode dieren door uitspoelen met foetaal kalfsserum. De cellen worden gecentrifugeerd en het supernatans verwijderd. Druppels van de gehomogeniseerde celsuspensie worden op objectglaasjes gebracht en uitgestreken. Na droging aan de lucht worden de glaasjes gekleurd.AnalyseDe objectglaasjes worden voor de microscopische analyse gecodeerd. Per dier worden ten minste 1 000 polychromatische erythrocyten onderzocht op de aanwezigheid van micronuclei.De verhouding tussen normochromatische en polychromatische erythrocyten wordt voor elk dier bepaald door een totaal van 1 000 erythrocyten te tellen.2. GEGEVENSDe gegevens worden in de vorm van tabellen gepresenteerd. Het aantal aldus gevonden polychromatische erythrocyten, het aantal polychromatische erythrocyten met micronuclei, en het percentage cellen met micronuclei worden afzonderlijk vermeld voor alle behandelde en controledieren en dat geldt ook voor de verhouding tussen normochromatische en polychromatische erythrocyten. Tevens worden voor elk van de proef- en controlegroepen gemiddelde aantallen en standaardafwijkingen vermeld. De gegevens worden met behulp van geschikte statistische methoden geëvalueerd.3. RAPPORTAGE3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGENIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- soort, stam en leeftijd van de gebruikte dieren;- aantal dieren per geslacht in de proef- en controlegroepen;- proefomstandigheden: gedetailleerde beschrijving van de behandeling en beenmergafname, dosisniveaus, toxiciteitsgegevens, negatieve en positieve controles;- criteria voor het scoren van micronuclei;- indien mogelijk, dosis/effect-relatie;- tekens van toxiciteit tijdens het verloop van de studie;- statistische evaluatie;- bespreking van de resultaten;- interpretatie van de resultaten.3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIEZie algemene inleiding deel B (punt D).4. LITERATUURZie algemene inleiding deel B (punt E).B.13. MUTAGENITEIT (ESCHERICHIA COLI) - TERUGMUTATIETEST1. METHODE1.1. INLEIDINGZie algemene inleiding deel B (punt A).1.2. DEFINITIESZie algemene inleiding deel B (punt C).1.3. REFERENTIESTOFFENGeen.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEHet tryptofaan-terugmutatiesysteem van Escherichia coli (trp) is een microbiologische test waarbij de terugmutatie trp   . trp+ onder invloed van chemische stoffen, die baseveranderingen in het genetisch materiaal van het organisme veroorzaken, wordt gemeten.De bacteriën worden met en zonder metabole activering blootgesteld aan de teststof. Na een geschikte incubatietijd op een minimale voedingsbodem worden de terugmutantkolonies geteld en vergeleken met het aantal spontane terugmutanten in een onbehandelde cultuur en/of in een cultuur behandeld met oplosmiddel.1.5. KWALITEITSCRITERIAGeen.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEVoor het verrichten van de bepaling kunnen de volgende methoden worden toegepast:(1) de pre-incubatiemethode; en(2) de directe methode, waarbij de bacteriën en de te testen stof met de agar worden gemengd en over het oppervlak van een selectieve agarplaat worden uitgegoten.1.6.1. Voorbereidingen1.6.1.1. BacteriënDe bacteriën worden gekweekt bij 37  C tot de laat-exponentiële of de vroeg-stationaire groeifase. De celdichtheid dient circa 108-109 cellen per milliliter te zijn.1.6.1.2. Metabole activeringDe bacteriën dienen aan de teststof te worden blootgesteld zowel met als zonder een geschikt metabool activeringssysteem. Het meest algemeen gebruikte systeem is een post-mitochondriale fractie verrijkt met een cofactor, verkregen uit de lever van knaagdieren die behandeld werden met enzyminducerende stoffen.1.6.2. Proefomstandigheden1.6.2.1. TeststammenDrie stammen, te weten WP2, WP2 uvr A en WP2 uvr A pKM 101, dienen te worden gebruikt. Er moeten erkende methoden voor bereiding van voorraadculturen en opslag worden gebruikt. De eisen inzake de groei en de genetische identiteit van de stammen, hun gevoeligheid voor UV-straling of mitomycine C en de resistentie tegen ampicilline in stam WP2 uvr A pKM 101 dienen te worden gecontroleerd. De frequentie van spontane terugmutanten van de verschillende bacteriënstammen dient te liggen binnen de verwachte grenzen.1.6.2.2. VoedingsbodemsEen voor de uitdrukking en selectie van mutanten geschikte voedingsbodem wordt gebruikt met een toereikende topagar.1.6.2.3. Gebruik van negatieve en positieve controlesTesten met onbehandelde controles en controles met oplosmiddel dienen gelijktijdig te worden uitgevoerd. Positieve controles moeten tevens worden uitgevoerd om twee redenen:i) Om de gevoeligheid van de bacteriestammen te bevestigen.Methylmethaansulfonaat, 4-nitrochinolineoxide of ethylnitrosoureum kunnen als positieve controles voor testen zonder metabole activering worden gebruikt.ii) Om de activiteit van het geschikte metaboliseringssysteem te controleren.Een positieve controle voor de activiteit van één metaboliseringssysteem voor alle bacteriestammen is 2-aminoanthraceen. Als een positieve controlestof van dezelfde chemische klasse als de teststof voorhanden is dient deze te worden gebruikt.1.6.2.4. Hoeveelheid teststof per plaatTen minste vijf verschillende hoeveelheden van de teststof worden getest met half-log-intervallen tussen de platen. De stoffen worden getest tot de grens van oplosbaarheid of toxiciteit is bereikt. De toxiciteit blijkt uit de vermindering van het aantal spontane terugmutanten, de opheldering van de achtergrond of uit de mate van overleving van behandelde culturen. Niet-toxische stoffen dient men te testen tot 5 mg per plaat alvorens de te testen stof als negatief te evalueren.1.6.2.5. IncubatieomstandighedenDe platen worden 48 à 72 uur ge¨ uncubeerd bij 37  C.1.6.3. UitvoeringVoor de methode waarbij de te testen stof direct aan de plaat wordt toegevoegd zonder enzymactivering worden de teststof en 0,1 ml van een verse bacteriecultuur toegevoegd aan 2,0 ml topagar. Voor proeven met metabole activering wordt 0,5 ml leverenzymactiveringsmengsel met een voldoende hoeveelheid post-mitochondriale fractie toegevoegd aan de topagar nadat de te testen stof en de bacteriën zijn toegevoegd. De inhoud van elk van de buisjes wordt gemengd en uitgegoten over het oppervlak van een selectieve agarplaat. De topagar krijgt de gelegenheid te stollen, en vervolgens worden de platen 48 à 72 uur bij 37  C ge¨ uncubeerd. Aan het einde van de incubatietijd telt men de terugmutantkolonies per plaat.Voor de pre¨ uncubatiemethode wordt een mengsel van de te testen stof, 0,1 ml van een verse bacteriecultuur en een voldoende hoeveelheid leverenzymactiveringsmengsel of dezelfde hoeveelheid buffer gepre¨ uncubeerd alvorens 2,0 ml topagar wordt toegevoegd. Alle overige procedures verlopen zoals hierboven voor de directe methode is aangegeven.Bij beide methoden dient het uitplaten ten minste in drievoud te geschieden.2. GEGEVENSDe aantallen terugmutantkolonies per plaat worden zowel voor de controleculturen als voor de behandelde culturen gerapporteerd.Individuele plaattellingen, het gemiddelde aantal terugmutantkolonies per plaat en standaardafwijkingen dienen voor de teststof en voor de controles te worden opgegeven.De gegevens dienen aan de hand van geschikte statistische methoden te worden geëvalueerd.Ten minste twee onafhankelijke onderzoeken dienen te worden uitgevoerd. Het is niet noodzakelijk het tweede onderzoek op identieke wijze als het eerste uit te voeren. Het kan zelfs wenselijk zijn om bepaalde testvoorwaarden te veranderen om aldus meer bruikbare gegevens te verkrijgen.3. RAPPORTAGE3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGENIn het verslag van de proefnemingen moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- gebruikte bacteriestam;- proefomstandigheden: dosisniveaus, toxiciteit, samenstelling van de voedingsbodem, behandelingsprocedures (pre¨ uncubatie, incubatie), metabool activeringssysteem, referentiestoffen, negatieve controles;- individuele plaattelling, gemiddeld aantal terugmutantkolonies per plaat, standaardafwijking; dosis/effect-relatie als dat mogelijk is;- bespreking van de resultaten;- interpretatie van de resultaten.3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIEZie algemene inleiding deel B (punt D).4. LITERATUURZie algemene inleiding deel B (punt E).B.14. MUTAGENITEIT (SALMONELLA TYPHIMURIUM - TERUGMUTATIETEST)1. METHODE1.1. INLEIDINGZie algemene inleiding deel B (punt A).1.2. DEFINITIESZie algemene inleiding deel B (punt C).1.3. REFERENTIESTOFFENGeen.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEHet histidineterugmutatiesysteem van Salmonella typhimurium (his) is een microbiologische test, waarbij de terugmutatie his   . his+ wordt gemeten onder invloed van chemische stoffen die basesubstituties of "Frameshift"-mutaties in het genetisch materiaal van het organisme veroorzaken.De bacteriën worden met en zonder metabole activering blootgesteld aan de teststof, en op een minimale voedingsbodem uitgeplaat. Na een geschikte incubatietijd worden de terugmutantkolonies geteld en vergeleken met het aantal spontane terugmutanten in een onbehandelde cultuur en/of in een cultuur met oplosmiddel.1.5. KWALITEITSCRITERIAGeen.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. Voorbereidingen1.6.1.1. BacteriënVerse culturen van bacteriën worden bij 37  C gekweekt tot de laat-exponentiële of vroeg-stationaire groeifase. De celdichtheid dient bij benadering 108 tot 109 cellen per milliliter te zijn.1.6.1.2. Metabole activeringDe bacteriën dienen aan de teststof te worden blootgesteld zowel met als zonder een geschikt metabool activeringssysteem. Het meest algemeen gebruikte systeem is een post-mitochondriale fractie verrijkt met een cofactor, verkregen uit de lever van knaagdieren die behandeld werden met enzyminducerende stoffen.1.6.2. Proefomstandigheden1.6.2.1. TeststammenOp zijn minst moeten vier bacteriestammen: TA 1535, TA  1537 of TA 97, TA 98 en TA 100 worden gebruikt; daarnaast mogen ook nog andere stammen, zoals TA 1538 en TA 102, worden gebruikt. Er moeten erkende methoden voor de bereiding en de opslag van de voorraadculturen worden gebruikt. De groeicondities en de genetische identiteit van de stammen, hun gevoeligheid voor UV- straling en kristalviolet en de resistentie tegen ampicilline dienen te worden gecontroleerd. De frequentie van spontane terugmutanten dient te liggen binnen de te verwachten grenzen.1.6.2.2. VoedingsbodemsEen geschikte selectieve voedingsbodem wordt gebruikt, met een toereikende topagar.1.6.2.3. Gebruik van negatieve en positieve controlesTesten met onbehandelde controles en controles met oplosmiddel, dienen gelijktijdig te worden uitgevoerd. Positieve controles moeten tevens worden uitgevoerd om twee redenen:i)Om de gevoeligheid van de bacteriestammen te bevestigen.De volgende verbindingen kan men gebruiken voor tests zonder metabole activering:BacteriestamMuteert terug metTA 1535, TA 100 natriumazideTA 1538, TA 98, TA 972-nitrofluoreenTA 15379-aminoacridineTA 102cumeenhydroperoxideii) om de activiteit van het geschikte metaboliseringssysteem te controleren.Een positieve controle voor de activiteit van één metaboliseringssysteem voor alle bacteriestammen is 2-aminoanthraceen. Als een positieve controlestof van dezelfde chemische klasse als de teststof voorhanden is dient deze te worden gebruikt.1.6.2.4. Hoeveelheid teststof per plaatTen minste vijf verschillende hoeveelheden teststof worden getest met halflogintervallen tussen de platen. De stoffen worden getest tot de grens van oplosbaarheid of toxiciteit is bereikt. De toxiciteit blijkt uit de vermindering van het aantal spontane terugmutanten, de opheldering van de achtergrond of uit de mate van overleving van de behandelde culturen. Niet-toxische chemicaliën dient men te testen tot 5 mg per plaat, alvorens de te testen stof als negatief te beschouwen.1.6.2.5. IncubatieomstandighedenDe platen worden 48 à 72 uur ge¨ uncubeerd bij 37  C.1.6.3. ProcedureVoor de methode waarbij de te testen stof direct aan de plaat wordt toegevoegd zonder enzymactivering, worden de teststof en 0,1 ml van de verse bacteriecultuur toegevoegd aan 2,0 ml topagar. Voor proeven met metabole activering wordt 0,5 ml van het leverenzymactiveringsmengsel, dat een voldoende hoeveelheid post-mitochondriale fractie bevat, toegevoegd aan de topagar nadat de te testen stof en de bacteriën zijn toegevoegd. De inhoud van ieder buisje wordt gemengd en uitgegoten over de oppervlakte van een selectieve agarplaat. De topagar krijgt de gelegenheid om te stollen, en vervolgens worden de platen 48 à 72 uur ge¨ uncubeerd bij 37  C. Aan het einde van de incubatieperiode worden de terugmutantkolonies per plaat geteld. Voor de pre¨ uncubatie wordt een mengsel van de teststof, 0,1 ml verse bacteriecultuur en een toereikende hoeveelheid leverenzymactiveringsmengsel of dezelfde hoeveelheid buffer gepre¨ uncubeerd, alvorens 2,0 ml topagar wordt toegevoegd. Alle overige procedures verlopen zoals hierboven voor de directe methode is aangegeven.Bij beide methoden dient het uitplaten ten minste in drievoud te geschieden.2. GEGEVENSHet aantal terugmutantkolonies per plaat wordt zowel voor de controlereeks als voor de behandelde reeks gemeld.Voor de teststof en de controles dienen individuele plaattellingen, het gemiddelde aantal terugmutantkolonies per plaat en standaardafwijkingen te worden opgegeven.De gegevens dienen aan de hand van een geschikte statistische methode te worden geëvalueerd.Ten minste twee onafhankelijke onderzoeken dienen te worden uitgevoerd. Het is niet noodzakelijk een tweede onderzoek identiek aan het eerste uit te voeren. Het kan dan wenselijk zijn om bepaalde testvoorwaarden te veranderen om aldus meer bruikbare gegevens te verkrijgen.3. RAPPORTAGE3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGENIn het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:- gebruikte bacteriestam;- proefomstandigheden: dosisniveaus, toxiciteit, samenstelling van de voedingsbodem, behandelingsprocedures (pre¨ uncubatie, incubatie), metabool activeringssysteem, referentiestoffen, negatieve controles;- individuele plaattelling, gemiddeld aantal terugmutantkolonies per plaat, standaardafwijking; dosis/effect-relatie als dat mogelijk is;- bespreking van de resultaten;- interpretatie van de resultaten.3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIEZie algemene inleiding deel B (punt D).4. LITERATUURZie algemene inleiding deel B (punt E).DEEL C: METHODEN VOOR DE BEPALING VAN DE ECOTOXICITEIT C.1. ACUTE TOXICITEIT VOOR VISSEN1. METHODE1.1. INLEIDINGHet doel van deze test is het bepalen van de acute letale toxiciteit van een stof voor vissen in zoet water. Met het oog op de keuze van de testmethode (statisch, semi-statisch of doorstroming) die het meest geschikt is om concentraties van de teststof gedurende de testperiode voldoende constant te houden, is het wenselijk om, voor zover mogelijk, te beschikken over gegevens over de oplosbaarheid in water, dampspanning, chemische stabiliteit, dissociatieconstanten en biologische afbreekbaarheid van de teststof.Zowel bij de voorbereiding van de test als bij de interpretatie van de resultaten moet rekening worden gehouden met aanvullende gegevens (bijvoorbeeld structuurformule, zuiverheidsgraad, aard en percentage van van belang zijnde verontreinigingen, aanwezigheid en hoeveelheden van additieven en de n-octanol/water-verdelingscoëfficiënt).1.2. DEFINITIES EN EENHEDENAcute toxiciteit is het waarneembare schadelijke effect dat in een organisme wordt teweeggebracht binnen een korte tijd (dagen) van blootstelling aan een stof. In deze test wordt de acute toxiciteit uitgedrukt als de mediaan letale concentratie (LC50), dat wil zeggen de concentratie in water waardoor 50 % van een groep vissen in de proef wordt gedood binnen een continue blootstellingsperiode, die moet worden vermeld.Alle concentraties van de teststof worden opgegeven in gewicht per volume (mg/l). Ze kunnen ook worden uitgedrukt als gewicht per gewicht (mg/kg 1).1.3. REFERENTIESTOFFENEen referentiestof kan worden getest om aan te tonen dat de respons van geteste diersoorten onder laboratoriumomstandigheden niet in belangrijke mate is veranderd.Voor deze test worden geen referentiestoffen gespecificeerd.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEEr kan een limiettest met 100 mg per liter worden uitgevoerd, om aan te tonen dat de LC50 groter is dan deze concentratie.De vissen worden gedurende 96 uur blootgesteld aan de teststof die in een reeks concentraties aan het water is toegevoegd. De sterfte wordt ten minste elke 24 uur genoteerd en de concentraties waarbij 50 % van de vissen sterft (LC50) wordt indien mogelijk berekend voor elke waarnemingstijd.1.5. KWALITEITSCRITERIADe kwaliteitscriteria zijn zowel op de limiettest als op de volledige test van toepassing.De sterfte in de controlegroepen mag aan het einde van de test niet hoger zijn dan 10 % (of één vis indien minder dan tien worden gebruikt).Het zuurstofgehalte moet gedurende de gehele test meer dan 60 % van de verzadigingswaarde voor lucht zijn geweest.De concentraties van de geteste stof dienen gedurende de gehele test binnen 80 % van de oorspronkelijke concentraties gehouden te worden.Bij stoffen die gemakkelijk oplossen in het testmedium en stabiele oplossingen geven en bijvoorbeeld niet in belangrijke mate vervluchtigen of worden afgebroken, gehydrolyseerd of geadsorbeerd, mag de beginconcentratie als gelijk aan de nominale concentraties beschouwd worden. Evenwel dient aangetoond te worden dat de concentratie gedurende de gehele test gehandhaafd werden en dat aan de kwaliteitscriteria is voldaan.Voor stoffen die:(i) moeilijk oplosbaar zijn in het testmediumof(ii) in staat zijn stabiele emulsies of dispersies te vormenof(iii) niet stabiel zijn in waterige oplossingen,dient de bij het begin van de proef in de oplossing (of, indien dit technisch onmogelijk is, in de waterkolom) gemeten concentratie als de beginconcentratie te worden beschouwd. De concentratie moet na een equilibratieperiode maar voordat de proefvissen worden ingebracht, worden bepaald.In al deze gevallen dienen gedurende de test verdere metingen te worden uitgevoerd om de actuele blootstellingsconcentraties te bevestigen of om te bevestigen dat aan de kwaliteitscriteria is voldaan.De pH mag niet meer dan 1 eenheid variëren.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEEr kunnen drie verschillende procedures worden toegepast:Statische test:Toxiciteitstest waarbij de te onderzoeken oplossing niet stroomt. (Oplossingen blijven ongewijzigd gedurende de test.)Semi-statische test:Test waarbij de oplossing niet stroomt, maar de testoplossing periodiek per bak wordt ververst na een langere periode (bijvoorbeeld 24 uur).Doorstroomtest:Toxiciteitstest waarin het water voortdurend wordt ververst in de testbakken waarbij de te onderzoeken stof wordt meegevoerd met het water ten einde het testmedium te verversen.1.6.1. Reagentia1.6.1.1. Oplossingen van de teststoffenStamoplossingen van de gewenste sterkte worden bereid door de stof op te lossen in gede¨ uoniseerd water of water volgens 1.6.1.2.De gekozen testconcentraties worden bereid door verdunning van de stamoplossing. Indien hoge concentraties worden getest, kan de te onderzoeken stof rechtstreeks worden opgelost in het verdunningswater.De stoffen moeten normaal gezien slechts worden getest tot aan de oplosbaarheidsgrens. Bij sommige stoffen (bijvoorbeeld stoffen met lage oplosbaarheid in water of een hoge Pow, of stoffen die een stabiele dispersie vormen in plaats van een echte oplossing in water) is het aanvaardbaar een testconcentratie te onderzoeken boven de oplosbaarheidslimiet van de stof, om te verzekeren dat de maximaal oplosbare/stabiele concentratie werd bereikt. Het is echter belangrijk dat deze concentratie niet op andere wijze het testsysteem verstoort (bijvoorbeeld een vlies van de stof op het water waardoor de zuurstofvoorziening van het water verhinderd wordt).Ultrasone dispersie, organische oplosmiddelen, emulgatoren of dispergeermiddelen kunnen worden gebruikt als hulpmiddel bij het bereiden van stamoplossingen van stoffen met een lage oplosbaarheid in water, of bij het dispergeren van deze stoffen in het testmedium. Indien dergelijke hulpstoffen worden gebruikt, moeten alle testconcentraties dezelfde hoeveelheid hulpstof bevatten en moeten extra controlevissen worden blootgesteld aan dezelfde concentratie van de hulpstof als die welke is gebruikt in de testreeks. De concentratie van dergelijke hulpstoffen dient zo laag mogelijk gehouden te worden en mag in géén geval groter zijn dan 100 mg per liter testmedium.De test dient te worden uitgevoerd zonder correctie van de pH. Indien er aanwijzingen zijn voor een duidelijke verandering van de pH, wordt geadviseerd om de test te herhalen met gecorrigeerde pH en de resultaten te vermelden. In dat geval dient de pH-waarde van de stamoplossing te worden aangepast aan de pH-waarde van het verdunningswater, tenzij er speciale redenen zijn om dit niet te doen. Voor dit doel verdienen HCl en NaOH de voorkeur. Deze pH-correctie dient zodanig te geschieden dat de concentratie van de teststof in de stamoplossing niet in belangrijke mate wordt gewijzigd. Indien ten gevolge van de correctie een chemische reactie of fysische neerslagvorming van de teststof mocht optreden, dan dient dit te worden vermeld in het rapport.1.6.1.2. Voorraad en verdunningswaterLeidingwater (waarin geen chloor, zware metalen of andere stoffen in mogelijk schadelijke concentraties mogen voorkomen), goede kwaliteit natuurlijk water of synthetisch water (zie aanhangsel 1) kunnen worden gebruikt. Water met een totale hardheid van 10 tot 250 mg per liter (als CaCO3) en met een pH van 6,0 tot 8,5 verdient de voorkeur.1.6.2. ApparatuurAlle apparatuur dient te zijn vervaardigd van chemisch inert materiaal.- Automatisch verdunningssysteem (voor doorstroomtest).- Zuurstofmeter.- Apparatuur voor de bepaling van de hardheid van water.- Apparatuur voor de temperatuurbeheersing.- pH-meter.1.6.3. TestvissenDe vissen dienen gezond te zijn en vrij van elke waarneembare misvorming.Het verdient aanbeveling de te gebruiken soorten te selecteren op basis van relevante praktische overwegingen, zoals goede beschikbaarheid gedurende het gehele jaar, goede houdbaarheid, geschiktheid voor testdoeleinden, relatieve gevoeligheid voor chemische stoffen, alsmede alle economische, biologische of ecologische factoren die van belang zijn. Tevens dient bij de keuze van de vissoort rekening gehouden te worden met de behoefte aan vergelijkbaarheid van de verkregen gegevens en met de bestaande internationale harmonisering (referentie 1).Een lijst met voor de uitvoering van de onderhavige test aanbevolen vissoorten staat vermeld in aanhangsel 2; de zebravis en de regenboogforel hebben de voorkeur.1.6.3.1. Het houden van voorraadTestvissen dienen bij voorkeur afkomstig te zijn van één partij, met ongeveer dezelfde lengte en leeftijd. De vissen moeten ten minste 12 dagen onder de volgende omstandigheden worden bewaard:Hoeveelheid vis per liter: aangepast aan het systeem (recirculatie of doorstroming) en de vissoort,Water: zie 1.6.1.2,Licht: per dag een belichtingsperiode van 12 à 16 uur,Zuurstofgehalte: ten minste 80 % van de verzadigingswaarde voor lucht,Voeren: drie keer per week of dagelijks; dit wordt 24 uur voor het begin van de test stopgezet.1.6.3.2. SterfteNa een gewenningsperiode van 48 uur wordt de sterfte geregistreerd, waarbij de volgende criteria worden gehanteerd:- in 7 dagen meer dan 10 % van de populatie:de gehele partij wordt afgekeurd;- 5 tot 10 % van de populatie:de periode van het in voorraad houden wordt met nog 7 dagen verlengd. Indien geen nieuwe sterfgevallen optreden, wordt de partij goedgekeurd. Anders dient deze te worden afgekeurd;- minder dan 5 % van de populatie:de partij wordt goedgekeurd.1.6.4. AanpassingAlle vissen moeten gedurende ten minste 7 dagen voor het gebruik worden blootgesteld aan water van de kwaliteit en de temperatuur zoals dat in de test zal worden gebruikt.1.6.5. TestprocedureEen definitieve test kan worden voorafgegaan door een test om het meetgebied vast te stellen. Deze verschaft gegevens over de voor de eigenlijke test te gebruiken reeks concentraties.Naast de testreeks wordt een controlegroep zonder de teststof uitgevoerd en, indien van toepassing, ook een controlegroep met de hulpstof.Afhankelijk van de fysische en chemische eigenschappen van de teststof kan gekozen worden voor een statische, semi-statische of doorstroomtest om aan de kwaliteitscriteria te voldoen.Vissen worden als volgt aan de stof blootgesteld:- Tijdsduur: 96 uur,- Aantal dieren: ten minste 7 per concentratie,- Bakken: van een capaciteit die in overeenstemming is met de aanbevolen hoeveelheid vis per liter,- Hoeveelheid vis per liter: een maximale bezettingsgraad van 1,0 g per liter voor statische en semi-statische tests wordt aanbevolen; voor doorstroomsystemen kan een grotere hoeveelheid vis per liter aanvaardbaar zijn,- Testconcentratie: ten minste vijf concentraties die verschillen met een constante welke niet groter is dan 2,2 en die zo mogelijk het gebied met een sterfte van 0 % tot 100 % bestrijken,- Water: zie 1.6.1.2,- Licht: dagelijks een belichtingsperiode van 12 à 16 uur,- Temperatuur: aangepast aan de soort (Aanhangsel 2); voor iedere afzonderlijke test moet de temperatuur evenwel constant blijven binnen ± 1  C.- Zuurstofgehalte: ten minste 60 % van de verzadigingswaarde voor lucht bij de gekozen temperatuur,- Voeren: achterwege laten.De vissen worden gecontroleerd na de eerste 2 tot 4 uur en ten minste elke 24 uur. Vissen worden geacht dood te zijn indien aanraking van de staartwortel geen reactie teweeg brengt en geen ademhalingsbewegingen zichtbaar zijn. Dode vissen worden, zodra zij zijn opgemerkt, verwijderd en de sterfte wordt geregistreerd.Er wordt aantekening gemaakt van zichtbare afwijkingen (bijvoorbeeld evenwichtsverlies, veranderingen in zwemgedrag, ademhalingsfunctie, pigmentatie enzovoort).De pH, zuurstofconcentratie en temperatuur moeten dagelijks worden gemeten.LimiettestGebruik makend van de procedure zoals beschreven in deze methode, kan een limiettest worden uitgevoerd met 100 mg per liter om aan te tonen dat de LC50 groter is dan deze concentratie.Indien de aard van de stof zodanig is dat een concentratie van 100 mg per liter in het testwater niet bereikt kan worden, dient de proef te worden uitgevoerd met een concentratie die gelijk is aan de oplosbaarheid van de te onderzoeken stof (of de maximale concentratie die een stabiele dispersie vormt) in het gebruikte medium (zie ook punt 1.6.1.1).De limiettest dient te worden uitgevoerd met 7 à 10 vissen en eenzelfde aantal in de controlegroepen. (De binomiale theorie schrijft voor dat als bij gebruik van 10 vissen geen sterfte optreedt, de LC50 met een betrouwbaarheid van 99,9 % groter is dan de in de limiettest gebruikte concentratie. Met 7, 8 of 9 vissen geeft de afwezigheid van sterfte een betrouwbaarheid van ten minste 99 % dat de LC50 groter is dan de gebruikte concentratie.)Indien sterfte optreedt, dient een volledige test te worden uitgevoerd. Indien subletale effecten worden waargenomen, dienen deze te worden vermeld.2. GEGEVENS EN EVALUATIE Zet voor elke aanbevolen blootstellingsperiode op logaritmisch-waarschijnlijkheidspapier voor elk tijdstip waarop waarnemingen werden geregistreerd (24, 48, 72 en 96 uur) het sterftepercentage uit tegen de concentratie.De LC50 en de betrouwbaarheidsintervallen (p = 0,05) dienen zo mogelijk voor iedere waarnemingsperiode geschat te worden met behulp van standaardprocedures; deze waarden moeten worden afgerond tot op één, of ten hoogste twee significante cijfers (voorbeelden voor afronding op twee cijfers: 170 voor 173,5; 0,13 voor 0,127; 1,2 voor 1,21).In die gevallen waarin de helling van de concentratie/respons-percentage-kromme te steil is voor een berekening van de LC50-waarde, is een grafische schatting van deze waarde voldoende.Indien twee opeenvolgende concentraties met een onderlinge verhouding van 2,2 slechts een sterfte van 0 respectievelijk 100 % geven, dan zijn deze waarden voldoende om aan te geven in welk gebied de LC50 ligt.Indien blijkt dat de stabiliteit of homogeniteit van de teststof niet kan worden gehandhaafd, dient dit te worden vermeld en dient voorzichtigheid betracht te worden bij de interpretatie van de resultaten.3. RAPPORTAGEIn het verslag moeten indien mogelijk de volgende gegevens worden opgenomen:- gegevens over de testvis (wetenschappelijke naam; stam; leverancier; eventuele voorbehandeling; afmeting en aantal dat voor elke testconcentratie gebruikt is;- herkomst van het verdunningswater alsmede belangrijkste chemische kenmerken (pH, hardheid, temperatuur);- voor stoffen met een geringe oplosbaarheid in water, de methode voor de bereiding van de stam- en testoplossingen;- concentratie van eventuele hulpstoffen;- lijst van de gebruikte concentraties en alle beschikbare gegevens over de stabiliteit bij de concentraties van de teststof in de gebruikte oplossing;- als chemische analyses zijn uitgevoerd, dienen de toegepaste methoden en de verkregen resultaten te worden vermeld;- de resultaten van de limiettest, indien van toepassing;- redenen voor de keuze van de testprocedure alsmede verdere details (bijvoorbeeld statisch, semi-statisch, doseersnelheid, doorstroomsnelheid, of er belucht is, hoeveelheid vis per liter, enzovoort);- beschrijving van de testuitrusting;- lichtregime;- voor iedere 24 uur het zuurstofgehalte, de pH-waarde en de temperatuur van de testoplossingen;- gegevens om aan te tonen dat aan de kwaliteitscriteria is voldaan;- een tabel met de cumulatieve mortaliteit voor elke concentratie en voor de controlegroepen (en, zo nodig, voor de controlegroep met hulpstof) op elke aanbevolen waarnemingstijd;- grafiek van de concentratie/responspercentage-kromme aan het einde van de test;- zo mogelijk, de LC50-waarden op elk van de aanbevolen waarnemingstijden (met de 95 % betrouwbaarheidsgrenzen);- statistische procedures voor de bepaling van de LC50-waarden;- als een referentiestof wordt gebruikt moeten ook hiervan de resultaten worden vermeld;- hoogste testconcentratie die binnen de testperiode geen sterfte veroorzaakte;- laagste testconcentratie die binnen de testperiode 100 % sterfte veroorzaakte.4. LITERATUUR(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C(81) 30 Final and updates.(2) AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio - Static and Flow Through methods - NFT 90-303 June 1985.(3) AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri - Static and Flow Through methods - NFT 90-305 June 1985.(4) ISO 7346/1, /2 en /3 - Water Quality - Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan - Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.(5) Eidgenössisches Departement des Innern, Schweiz: Richtlinien für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden - Part II 1974.(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 L(1) und L(15).(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.(8) NEN 6506 - Water - Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980.(9) Environmental Protection Agency, Methods for the Acute Toxicity Tests with Fish, Macroinvertebrates and Amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.(10) Environmental Protection Agency, Environmental Monitoring and Support Laboratory, Office of Research and Development. EPA-600/4-78-012, January 1978.(11) Environmental Protection Agency: Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979.(12) Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 14th edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.(13) Commission of the European Communities.Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. CEE Study D.8368, 22 March 1979.(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die Ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.(15) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method for evaluating dose effects experiments, J. Pharm. Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99.(16) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.(17) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.(18) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, vol. 4, 3-32.(19) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials. ASTM STP 634, 1977, 65-84.(20) Stephan, C.E., Bush, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R.W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.Aanhangsel 1Synthetisch waterVoorbeeld van een geschikt verdunningswaterAlle chemicaliën moeten van pro-analyse kwaliteit zijn.Het water moet gedistilleerd of gede¨ uoniseerd water van goede kwaliteit zijn met een geleidingsvermogen van minder dan 5 ìScm 1.Het toestel voor de distillatie van water mag geen koperen onderdelen bevatten.StamoplossingenCaCl2. 2H20 (calciumchloridedihydraat) 11,76 g Oplossen in water en aanvullen met water tot 1 liter.MgSO4. 7H20 (magnesiumsulfaatheptahydraat) 4,93 g Oplossen in water en aanvullen met water tot 1 liter.NaHCO3 (natriumwaterstofcarbonaat) 2,59 g Oplossen in water en aanvullen met water tot 1 liter.KCl (kaliumchloride) 0,23 g Oplossen in water en aanvullen met water tot 1 liter.Synthetisch verdunningswaterMeng 25 ml van elk van de vier stamoplossingen en vul met water aan tot 1 liter.Belucht tot het zuurstofgehalte overeenkomt met de verzadigingswaarde voor lucht.De pH moet 7,8 ± 0,2 bedragen.De pH zo nodig bijstellen met NaOH (natriumhydroxide) of HCl (zoutzuur).Het aldus verkregen verdunningswater wordt gedurende ongeveer 12 uur weggezet en behoeft niet verder te worden belucht.De som van de Ca- en Mg-ionen in deze oplossing bedraagt 2,5 mmol per liter. De verhouding van de Ca- en Mg-ionen is 4:1 en die van de Na- en K-ionen 10:1. De totale alkaliteit van deze oplossing is 0,8 mmol per liter.Eventuele afwijkingen van de bereidingswijze van het verdunningswater mogen niet leiden tot een andere samenstelling of andere eigenschappen van het water.Aanhangsel 2>RUIMTE VOOR DE TABEL>HerkomstBovengenoemde vissen laten zich gemakkelijk kweken en/of zijn het gehele jaar ruim verkrijgbaar. Zij kunnen worden geteeld en gekweekt in viskwekerijen of in het laboratorium onder omstandigheden waarbij ziektekiemen en parasieten onder controle gehouden worden, zodat de proefdieren gezond zijn en hun afkomst bekend is. Deze vissen zijn in veel delen van de wereld beschikbaar.Aanhangsel 3Voorbeeld van een concentratie / sterftepercentage - kromme Voorbeeld van de bepaling van de LC50-waarde met logaritmisch-waarschijnlijkheidspapier>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>C.2. ACUTE TOXICITEIT VOOR DAPHNIA1. METHODE1.1. INLEIDINGHet doel van deze test is het bepalen van de mediaan van de effectieve concentratie van een stof (EC50) waarbij immobilisatie van Daphnia in zoet water optreedt. Alvorens de test te beginnen is het wenselijk om, voor zover mogelijk, te beschikken over gegevens over de oplosbaarheid in water, dampspanning, chemische stabiliteit, dissociatieconstanten en biologische afbreekbaarheid van de stof.Zowel bij de voorbereiding van de test als bij de interpretatie van de resultaten moet rekening worden gehouden met verdere gegevens (bijvoorbeeld structuurformule, zuiverheidsgraad, aard en percentage van van belang zijnde verontreinigingen, aanwezigheid en hoeveelheden van additieven en de n-octanol/water-verdelingscoëfficiënt).1.2. DEFINITIES EN EENHEDENAan de eis van de richtlijn met betrekking tot de LC50 voor Daphnia wordt beschouwd te zijn voldaan door de bepaling van de EC50 zoals beschreven in deze testmethode.In deze test wordt de acute toxiciteit uitgedrukt als de mediaan van de effectieve concentratie (EC50) voor immobilisatie. Dit is de concentratie (uitgaande van de beginwaarden) waarbij 50 % van de Daphnia's in een testgroep wordt ge¨ ummobiliseerd binnen een ononderbroken blootstellingsperiode die moet worden aangegeven.ImmobilisatieDieren die niet tot zwemmen in staat zijn binnen 15 seconden na zachtjes bewegen van het testvat, worden geacht immobiel te zijn.Alle concentraties van de teststof worden opgegeven in gewicht per volume (mg/l). Ze kunnen ook worden uitgedrukt als gewicht per gewicht (mg.kg 1).1.3. REFERENTIESTOFFENEen referentiestof kan worden getest om aan te tonen dat de gevoeligheid van geteste soorten onder laboratoriumomstandigheden niet in belangrijke mate is veranderd.De samenvatting van de resultaten van een EEG-ringtest, waarbij gebruik gemaakt werd van vier verschillende stoffen, wordt gegeven in aanhangsel 2.1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEEr kan een limiettest met 100 mg per liter worden uitgevoerd om aan te tonen dat de EC50 hoger is dan deze concentratie.De Daphnia worden gedurende 48 uur blootgesteld aan de teststof die aan het water is toegevoegd in een aantal uiteenlopende concentraties; indien een kortere test wordt gebruikt moet een verantwoording hiervoor gegeven worden in het testrapport.Als de concentraties van de teststof een geschikt gebied beslaan, zal onder overigens gelijke testomstandigheden het zwemvermogen van de Daphnia door verschillende concentraties van de teststof gemiddeld in verschillende mate worden be¨ unvloed. Verschillende concentraties hebben tot gevolg dat verschillende percentages Daphnia niet meer kunnen zwemmen aan het einde van de test. De concentraties die 0 of 100 % immobilisatie veroorzaken, worden rechtstreeks afgeleid uit de waarnemingen; de 48-uur EC50 wordt daarentegen zo mogelijk door berekening bepaald.Voor deze methode wordt een statisch systeem gebruikt. Testoplossingen worden dan ook niet vernieuwd tijdens de blootstellingsperiode.1.5. KWALITEITSCRITERIADe kwaliteitscriteria zijn zowel op de limiettest als op de volledige test van toepassing.De immobilisatie in de controlegroepen mag aan het einde van de test niet hoger zijn dan 10 %.De proef-Daphnia in de controlegroepen mogen niet vastzitten aan het wateroppervlak.Het is wenselijk dat gedurende het hele testverloop de opgeloste zuurstofconcentratie in de proefvaten boven 3 mg l 1 blijft. Onder geen enkele voorwaarde mag de opgeloste zuurstofconcentratie echter lager worden dan 2 mg l 1.De concentratie van de teststof dient gedurende de gehele test binnen 80 % van de oorspronkelijke concentratie gehouden te worden.Bij stoffen die gemakkelijk oplossen in het testmedium en stabiele oplossingen vormen en bijvoorbeeld niet in belangrijke mate vervluchtigen of worden afgebroken, gehydrolyseerd of geadsorbeerd, mag de beginconcentratie als gelijk aan de nominale concentratie beschouwd worden. Evenwel dient aangetoond te worden dat de concentraties gedurende de gehele test gehandhaafd zijn en dat aan de kwaliteitscriteria is voldaan.Bij stoffen die:(i) slecht oplosbaar zijn in het testmediumof(ii) in staat zijn stabiele emulsies of dispersies te vormenof(iii) niet stabiel zijn in waterige oplossingen,dient de bij het begin van de proef in de oplossing (of, indien dit technisch onmogelijk is, in de waterkolom) gemeten concentratie als de beginconcentratie te worden beschouwd. De concentratie dient te worden bepaald na een periode van evenwichtsinstelling, maar voor het uitzetten van de proeforganisme.In al deze gevallen dienen gedurende de test verdere metingen te worden uitgevoerd om de actuele blootstellingsconcentraties te bevestigen of om te bevestigen dat aan de kwaliteitscriteria is voldaan.De pH mag met niet meer dan 1 eenheid variëren.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. Reagentia1.6.1.1. Oplossingen van de teststoffenStamoplossingen van de gewenste sterkte worden bereid door de stof op te lossen in gede¨ uoniseerd water of water volgens 1.6.1.2.De gekozen testconcentraties worden bereid door verdunning van de stamoplossingen. Indien hoge concentraties worden getest, kan de te onderzoeken stof rechtstreeks worden opgelost in het verdunningswater.De stoffen moeten normaal gezien slechts worden getest tot aan de oplosbaarheidsgrens. Bij sommige stoffen (bijvoorbeeld stoffen met lage oplosbaarheid in water of een hoge Pow, of stoffen die een stabiele dispersie vormen in plaats van een ware oplossing in water) is het aanvaardbaar een testconcentratie te onderzoeken boven de oplosbaarheidsgrens van de stof, om te verzekeren dat de maximaal oplosbare/stabiele concentratie werd bereikt. Het is echter belangrijk dat deze concentratie niet op andere wijze het testsysteem verstoort (bijvoorbeeld een vlies van de stof op het water waardoor de zuurstofvoorziening van het water wordt verhinderd, enzovoorts).Ultrasone dispersie, organische oplosmiddelen, emulgatoren of dispergeermiddelen kunnen worden gebruikt als hulpmiddel bij het bereiden van stamoplossingen van stoffen met een lage oplosbaarheid in water of bij het dispergeren van deze stoffen in het testmedium. Indien dergelijke hulpstoffen worden gebruikt, moeten alle testconcentraties dezelfde hoeveelheid hulpstof bevatten en moeten extra controle-Daphnia worden blootgesteld aan dezelfde concentratie van de hulpstof als die welke is gebruikt in de testreeks. De concentratie van dergelijke hulpstoffen dient zo laag mogelijk gehouden te worden en mag in géén geval groter zijn dan 100 mg per liter testmedium.De test dient te worden uitgevoerd zonder correctie van de pH. Indien er aanwijzingen zijn voor een duidelijke verandering van de pH, wordt aangeraden om de test te herhalen na correctie van de pH en de resultaten te vermelden. In dat geval dient de pH-waarde van de stamoplossing te worden aangepast aan de pH-waarde van het verdunningswater, tenzij er speciale redenen zijn om dit niet te doen. Voor dit doel verdienen HCl en NaOH de voorkeur. Deze pH-correctie dient zodanig te geschieden dat de concentratie van de teststof in de stamoplossing niet in belangrijke mate wordt gewijzigd. Indien tengevolge van de correctie een chemische reactie of fysische neerslagvorming van de teststof mocht optreden, dan dient dit te worden vermeld in het rapport.1.6.1.2. TestwaterIn deze test wordt synthetisch water gebruikt (zie aanhangsel 1 en referentie (2): ISO 6341). Om de noodzaak van acclimatisering vóór de test te vermijden wordt aanbevolen om voor de kweek water van dezelfde kwaliteit (pH, hardheid) te gebruiken als voor de test.1.6.2. ApparatuurEr moet gebruik worden gemaakt van gangbare laboratoriumapparatuur en uitrusting. Materiaal dat rechtstreeks in contact komt met de testoplossingen moet bij voorkeur volledig van glas zijn.- Zuurstofmeter (met micro-elektrode of andere geschikte voorzieningen voor de meting van opgeloste zuurstof in monsters met een klein volume);- Adequate apparatuur voor de temperatuurbeheersing;- pH-meter;- Uitrusting voor de bepaling van de hardheid van water.1.6.3. TestorganismeDe testsoort is bij voorkeur Daphnia magna, alhoewel Daphnia pulex ook is toegestaan. De testdieren moeten bij het begin van de test minder dan 24 uur oud, in het laboratorium gekweekt en vrij van zichtbare ziekten zijn, en een bekende voorgeschiedenis hebben (bijvoorbeeld kweek, eventuele voorbehandelingen enzovoort).1.6.4. TestprocedureEen definitieve test kan worden voorafgegaan door een test om het meetgebied vast te stellen. Deze verschaft gegevens over de voor de eigenlijke test te gebruiken reeks concentraties.Naast de testreeks wordt één controlegroep zonder de teststof getest en, indien van toepassing, ook één controlegroep met de hulpstof.Daphnia worden als volgt aan de stof blootgesteld:- Tijdsduur: bij voorkeur 48 uur.- Aantal dieren: ten minste 20 dieren bij iedere testconcentratie, bij voorkeur ingedeeld in vier groepen van vijf dieren of in twee groepen van tien.- Benodigd volume: ten minste 2 ml testoplossing dient per dier te worden gerekend.- Testconcentratie: de testoplossing moet onmiddellijk voor het toevoegen van de Daphnia worden bereid, bij voorkeur zonder gebruik te maken van andere oplosmiddelen dan water. De concentraties worden zo bereid dat ze een meetkundige reeks vormen, met een concentratie-verhouding die 2,2 niet overschrijdt. Concentraties voldoende voor 0 % en 100 % immobilisatie na 48 uur dienen te worden getest, alsmede een reeks tussenliggende graden van immobilisatie, aan de hand waarvan de EC50-waarde na 48 uur kan worden berekend. Daarnaast dienen controlegroepen te worden getest.- Water: zie 1.6.1.2.- Licht: een licht-donker cyclus naar keuze.- Temperatuur: de testtemperatuur moet tussen 18 en 22  C liggen, maar voor iedere afzonderlijke test moet de temperatuur evenwel constant blijven binnen ± 0,1  C.- Beluchting: de testoplossing mag niet met luchtbellen worden belucht.- Voeren: achterwege laten.De pH en de zuurstofconcentratie van de controles en alle testconcentraties moeten na afloop van de test gemeten worden; de pH van de testoplossingen mag niet worden gewijzigd.Vluchtige stoffen moeten worden getest in volledig gevulde, afgesloten vaten, die groot genoeg zijn om zuurstofgebrek te voorkomen.De Daphnia worden in ieder geval ge¨ unspecteerd na een blootstelling van 24 uur en nogmaals na 48 uur.LimiettestsMet de in deze methode beschreven procedures kan een limiettest worden uitgevoerd met 100 mg per liter om aan te tonen dat de EC50 hoger is dan deze concentratie.Indien de aard van de stof zodanig is dat een concentratie van 100 mg per liter in het testwater niet bereikt kan worden, dient de proef te worden uitgevoerd bij een concentratie die gelijk is aan de oplosbaarheid van de te onderzoeken stof (of de maximale concentratie die een stabiele dispersie vormt) in het gebruikte medium (zie ook punt 1.6.1.1).De limiettest dient te worden uitgevoerd met 20 Daphnia, ingedeeld in twee of vier groepen, en hetzelfde aantal in de controlegroep(en). Indien immobilisatie optreedt, dient een volledige studie te worden uitgevoerd.2. GEGEVENS EN EVALUATIEZet voor elk tijdstip waarop waarnemingen werden geregistreerd (24 en 48 uur) het sterftepercentage uit tegen de concentratie op logaritmisch-waarschijnlijkheidspapier.De EC50 en de betrouwbaarheidsintervallen (p = 0,05) dienen zo mogelijk voor iedere waarnemingsperiode geschat te worden met behulp van standaardprocedures; deze waarden moeten worden afgerond tot op één, of ten hoogste twee significante cijfers (voorbeelden voor afronding op twee cijfers: 170 voor 173,5; 0,13 voor 0,127; 1,2 voor 1,21).In die gevallen waarin de helling van de concentratie/responspercentage-kromme te steil is voor een berekening van de EC50-waarde, is een grafische schatting van deze waarde voldoende.Indien twee opeenvolgende concentraties met een onderlinge verhouding van 2,2 slechts 0 respectievelijk 100 % immobilisatie geven, dan zijn deze waarden voldoende om aan te geven in welk gebied de EC50 ligt.Indien blijkt dat de stabiliteit of homogeniteit van de teststof niet kan worden gehandhaafd, dient dit te worden vermeld en dient voorzichtigheid betracht te worden bij de interpretatie van de resultaten.3. RAPPORTAGEIn het verslag moeten, indien mogelijk de volgende gegevens worden opgenomen:- gegevens over het testorganisme (wetenschappelijke naam; stam; leverancier of herkomst; eventuele voorbehandeling; kweekmethode - met inbegrip van de herkomst van het voer, de soort en hoeveelheid voer en de frequentie waarmee gevoerd is);- herkomst van het verdunningswater alsmede de belangrijkste chemische kenmerken (bijvoorbeeld pH, temperatuur, hardheid);- in geval van stoffen met een lage oplosbaarheid in water, de methode voor de bereiding van de stam- en testoplossingen;- concentraties van eventuele hulpstoffen;- lijst van de gebruikte concentraties en alle beschikbare gegevens over de stabiliteit bij de concentraties van de teststof in de gebruikte oplossingen;- in geval van chemische analyses: toegepaste methoden en behaalde resultaten;- de resultaten van de limiettest, indien van toepassing;- beschrijving van de testuitrusting;- lichtregime;- de zuurstofgehaltes, de pH-waarden en de temperaturen van de testoplossingen;- gegevens om aan te tonen dat aan de kwaliteitscriteria is voldaan;- een tabel met de cumulatieve immobilisatie voor elke concentratie en voor de controlegroep (en, zo nodig, voor de controlegroep met hulpstof) op elke aanbevolen waarnemingstijd (24 en 48 uur);- grafiek van de concentratie/responspercentage-kromme aan het einde van de test;- zo mogelijk, de EC50-waarden op elk van de aanbevolen waarnemingstijden (met de 95 % betrouwbaarheidsgrenzen);- statistische procedures voor de bepaling van de EC50-waarden;- als een referentiestof wordt gebruikt moeten ook hiervan de resultaten worden vermeld;- hoogste testconcentratie die binnen de testperiode geen immobilisatie veroorzaakte;- laagste testconcentratie die binnen de testperiode 100é% immobilisatie veroorzaakte.4. LITERATUUR(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 202. Decision of the Council C(81) 30 Final and updates.(2) International Standard ISO, Water Quality - Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341 1989.(3) AFNOR. Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera - crustacea) NFT 90 301 (January 1983).(4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die Ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.(5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (L11).(6) Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U. K.(7) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. A simplified method for evaluating dose effects experiments, J. Pharmacol. Exper. Therap., 1949, vol. 96, 99-113.(8) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.(9) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, vol. 4, 3-32.(10) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM 1977, STP 634, 65-84.(11) Stephan, C. E., Bush, K. A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.Aanhangsel 1Synthetisch waterVoorbeeld van een geschikt verdunningswater (volgens ISO 6341)Alle chemicaliën moeten van pro-analyse kwaliteit zijn.Het water moet gedistilleerd of gede¨ uoniseerd water van goede kwaliteit zijn met een geleidingsvermogen van minder dan 5 ìScm 1.Het toestel voor de distillatie van water mag geen koperen onderdelen bevatten.StamoplossingenCaCl2  7 2 H2O calciumchloridedihydraat) 11,76 g Oplossen in water en aanvullen met water tot 1 liter.MgSO4  7 7 H2O (magnesiumsulfaatheptahydraat) 4,93 g Oplossen in water en aanvullen met water tot 1 liter.NaHCO3 (natriumwaterstofcarbonaat) 2,59 g Oplossen in water en aanvullen met water tot 1 liter.KCl (kaliumchloride) 0,23 g Oplossen in water en aanvullen met water tot 1 liter.Synthetisch verdunningswaterMeng 25 ml van elk van de vier stamoplossingen en vul met water aan tot 1 l.Belucht tot het zuurstofgehalte overeenkomt met de verzadigingswaarde voor lucht.De pH moet 7,8 ± 0,2 bedragen.De pH zo nodig bijstellen met NaOH (natriumhydroxide) of HCl (zoutzuur).Het aldus verkregen verdunningswater wordt gedurende ongeveer 12 uur weggezet en behoeft niet verder te worden belucht.De som van de Ca- en Mg-ionen in deze oplossing bedraagt 2,5 mmol per liter. De verhouding van de Ca- en Mg-ionen is 4:1 en die van de Na- en K-ionen 10:1. De totale alkaliteit van deze oplossing is 0,8 mmol per liter.Eventuele afwijkingen van de bereidingswijze van het verdunningswater mogen niet leiden tot een andere samenstelling of andere eigenschappen van het water.Aanhangsel 2Samenvatting van de resultaten van een EEG-ringtest, uitgevoerd in 1978 (ook aangehaald in referentie 2)Let op: het doel van deze ringtest was de bepaling van de EC50 na 24 uur.Gebruikte stoffen:1) Kaliumdichromaat2) Tetrapropylbenzeensulfonzuur3) Tetrapropylbenzeensulfonzuur, natriumzout4) 2,4,5-Trichloorfenoxyazijnzuur, kaliumzout>RUIMTE VOOR DE TABEL>Aanhangsel 3Voorbeeld van concentratie/immobilisatiepercentage-curve>BEGIN VAN DE GRAFIEK>>EIND VAN DE GRAFIEK>Voorbeeld van de bepaling van de EC50-waarde met logaritmisch-waarschijnlijkheidspapierC.3. GROEIREMMINGSTEST MET ALGEN1. METHODE1.1. INLEIDINGHet doel van deze test is het bepalen van de effecten van een stof op de groei van een eencellige groene algensoort. Met relatief korte onderzoeken (72 uur) kunnen de effecten op verschillende generaties bepaald worden. Deze methode kan worden aangepast voor het gebruik met verschillende eencellige algensoorten; dan dient evenwel een beschrijving van de gebruikte methode bij het testrapport gevoegd te worden.Deze test is eenvoudig toe te passen op in water oplosbare stoffen die, onder de testomstandigheden, waarschijnlijk in oplossing blijven.De methode kan gebruikt worden voor stoffen die de meting van de algengroei niet direct storen.Alvorens met de test te beginnen is het wenselijk om, voor zover mogelijk, te beschikken over gegevens over de oplosbaarheid in water, dampspanning, chemische stabiliteit, dissociatieconstanten en biologische afbreekbaarheid van de stof.Zowel bij de voorbereiding van de test als bij de interpretatie van de resultaten moet rekening worden gehouden met nadere gegevens (bijvoorbeeld structuurformule, zuiverheidsgraad, aard en percentage van belangrijke verontreinigingen, aanwezigheid en hoeveelheid van additieven en de n-octanol/water-verdelingscoëfficiënt).1.2. DEFINITIES EN EENHEDENCeldichtheid: het aantal cellen per milliliter;Groei: de toename van de celdichtheid gedurende de onderzoeksperiode;Groeisnelheid: de toename van de celdichtheid per tijdseenheid;EC50: in deze methode de concentratie van een teststof waarbij ten opzichte van de controle een 50 % vermindering van de groei (EbC50) of de groeisnelheid (ErC50) optreedt;NOEC (no observed effect concentration, concentratie waarbij geen effect wordt waargenomen): in deze methode de hoogste geteste concentratie waarbij geen significante groeiremming wordt waargenomen ten opzichte van de controle;Alle concentraties van de teststof worden opgegeven in gewicht per volume (mg/l). Ze kunnen ook worden uitgedrukt als gewicht per gewicht (mg  7 kg 1).1.3. REFERENTIESTOFFENEen referentiestof kan worden getest om aan te tonen dat de gevoeligheid van de geteste soort onder de testomstandigheden in het laboratorium niet in belangrijke mate is veranderd.Als een referentiestof wordt gebruikt, moeten de resultaten worden weergegeven in het testrapport. Kaliumdichromaat mag als referentiestof gebruikt worden, maar de kleur zou van invloed kunnen zijn op de kwaliteit en intensiteit van het voor de cellen beschikbare licht, alsmede op de spectrometrische bepalingen indien deze gebruikt worden. Kaliumdichromaat is gebruikt tijdens een internationale inter-laboratoriumtest (zie referentie (3) en Aanhangsel 2).1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEEr kan een limiettest met 100 mg per liter worden uitgevoerd om aan te tonen dat de EC50 hoger is dan deze concentratie.Onder bepaalde omstandigheden worden exponentieel groeiende culturen van geselecteerde groene algen gedurende verschillende generaties blootgesteld aan verschillende concentraties van de teststof.De testoplossingen worden ge¨ uncubeerd gedurende 72 uur en de celdichtheid wordt in iedere oplossing ten minste éénmaal per 24 uur gemeten. De remming van de groei wordt bepaald in verhouding tot een controlecultuur.1.5. KWALITEITSCRITERIADe kwaliteitscriteria zijn zowel op de limiettest als op de volle studie toepasselijk.De celdichtheid in de controleculturen moet binnen drie dagen ten minste met een factor 16 zijn toegenomen.De concentratie van de teststof dient gedurende de gehele test binnen 80 % van de oorspronkelijke concentratie gehouden te worden.Bij stoffen die gemakkelijk oplossen in het testmedium en stabiele oplossingen vormen en bijvoorbeeld niet in belangrijke mate vervluchtigen of worden afgebroken, gehydrolyseerd of geadsorbeerd, mag de beginconcentratie als gelijk aan de nominale concentratie beschouwd worden. Evenwel dient aangetoond te worden dat de concentraties gedurende de gehele test gehandhaafd werden en dat aan de kwaliteitscriteria is voldaan.Bij stoffen die:(i)  slecht oplosbaar zijn in het testmedium of(ii) in staat zijn stabiele emulsies of dispersies te vormen of(iii) niet stabiel zijn in waterige oplossingendient de bij het begin van de proef gemeten concentratie als de beginconcentratie te worden beschouwd. De concentratie dient te worden bepaald na een periode van evenwichtsinstelling.In al deze gevallen dienen gedurende de test verdere metingen te worden uitgevoerd om de actuele blootstellingsconcentraties te bevestigen of om te bevestigen dat aan de kwaliteitscriteria werd voldaan.Zoals bekend kunnen significante hoeveelheden van de te onderzoeken stof tijdens de testperiode opgenomen in de biomassa van de algen. Om aan de bovengenoemde kwaliteitscriteria te voldoen dient daarom rekening gehouden te worden met zowel de hoeveelheid van de stof die is opgenomen in de algenbiomassa, als met de hoeveelheid stof in de oplossing (of, indien dit technisch onmogelijk is, gemeten in de waterkolom). Daar de bepaling van de concentratie van de stof in de biomassa van de algen aanzienlijke technische problemen kan stellen, kan aangetoond worden dat aan de kwaliteitscriteria is voldaan door de proef bij de hoogste concentratie uit te voeren, maar dan zonder algen, en de concentraties aan het begin en het einde van de proef in de oplossing (of, indien dit technisch onmogelijk is, in de waterkolom) te meten.1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE1.6.1. Reagentia1.6.1.1. Oplossingen van de teststoffenStamoplossingen van de gewenste sterkte worden bereid door de stof op te lossen in gede¨ uoniseerd water of water volgens 1.6.1.2.De gekozen testconcentraties worden bereid door geschikte hoeveelheden aan de algen-voorcultuur toe te voegen (zie Aanhangsel 1). Stoffen moeten normaal gezien enkel worden getest tot aan de oplosbaarheidsgrens. Bij sommige stoffen (bijvoorbeeld stoffen met lage oplosbaarheid in water of een hoge Pow, of stoffen die een stabiele dispersie vormen in plaats van een echte oplossing in water), is het aanvaardbaar een testconcentratie te onderzoeken boven de oplosbaarheidsgrens van de stof, om te verzekeren dat de maximaal oplosbare/stabiele concentratie werd bereikt. Het is echter belangrijk dat deze concentratie niet op andere wijze het testsysteem verstoort (bijvoorbeeld een vlies van de stof op het water waardoor de zuurstofvoorziening van het water wordt verhinderd, enz.).Ultrasone dispersie, organische oplosmiddelen, emulgatoren of dispergeermiddelen kunnen worden gebruikt als hulpmiddel bij het bereiden van stamoplossingen van stoffen met een lage oplosbaarheid in water of bij het dispergeren van deze stoffen in het testmedium. Indien dergelijke hulpstoffen worden gebruikt, moeten alle testconcentraties dezelfde hoeveelheid hulpstof bevatten en moeten extra controles worden blootgesteld aan dezelfde concentratie van de hulpstof als die welke is gebruikt in de testreeks. De concentratie van dergelijke hulpstoffen dient zo laag mogelijk gehouden te worden en mag in géén geval groter zijn dan 100 mg per liter testmedium.De test dient te worden uitgevoerd zonder correctie van de pH. Indien er aanwijzingen zijn voor een duidelijke verandering van de pH, wordt aangeraden om de test te herhalen na correctie van de pH en de resultaten te vermelden. In dat geval dient de pH-waarde van de stamoplossing te worden aangepast aan de pH-waarde van het verdunningswater, tenzij er speciale redenen zijn om dit niet te doen. Voor dit doel verdienen HCl en NaOH de voorkeur. Deze pH-correctie dient zodanig te geschieden dat de concentratie van de teststof in de stamoplossing niet in belangrijke mate wordt gewijzigd. Indien tengevolge van de correctie een chemische reactie of fysische neerslagvorming van de teststof mocht optreden, dan dient dit te worden vermeld.1.6.1.2. TestmediumHet water dient gedistilleerd water van goede kwaliteit te zijn, of gede¨ uoniseerd water met een soortelijke geleiding van minder dan 5 ìS  7 cm 1. Het toestel voor de distillatie van het water mag geen koperen onderdelen bevatten.Het volgende medium wordt aangeraden.Vier stamoplossingen worden bereid volgens de volgende tabel. De stamoplossingen worden gesteriliseerd met behulp van membraanfiltratie of een autoclaaf en opgeslagen in het donker bij 4  C. Stamoplossing nr. 4 mag alleen met membraanfiltratie gesteriliseerd worden. Deze stamoplossingen worden verdund om de eindconcentraties van voedingsstoffen in de testoplossingen te bereiken.>RUIMTE VOOR DE TABEL>De pH van het medium na bereiken van een evenwichtstoestand met lucht is ongeveer 8.1.6.2. Apparatuur- Gangbare laboratoriumuitrusting,- Testkolven met een geschikt volume (erlenmeyers van 250 ml zijn bijvoorbeeld geschikt indien het volume van de testoplossing 100 ml bedraagt). Alle testkolven dienen identiek te zijn wat betreft materiaal en dimensies.- Kweekapparaat: kast of kamer waarin de temperatuur binnen het bereik van 21 tot 25  C, binnen ± 2  C gehouden kan worden, en een continue uniforme verlichting in het spectraal bereik van 400 tot 700 nm. Indien de algen in de controleculturen de vereiste groeisnelheid hebben bereikt, mag aangenomen worden dat de groeivoorwaarden, inclusief de lichtintensiteit, voldoende waren.Het verdient aanbeveling op het gemiddelde niveau van de testoplossingen een lichtintensiteit tussen 60 en 120 ìE  7 m 2  7 s 1 (35 tot 70 × 1018 fotonen  7 m 2  7 s 1) te gebruiken, gemeten in het bereik van 400 tot 700 nm met behulp van een geschikte receptor. Voor lichtmeters die geijkt zijn in lux is een gelijkwaardig bereik van 6 000 tot 10 000 lx aanvaardbaar.Deze lichtintensiteit kan verkregen worden met behulp van vier tot zeven 30 W TL-lampen van het universele witte type (kleurtemperatuur ongeveer 4 000 K) op 0,35 m afstand van de algencultuur.- Celdichtheidsmetingen moeten uitgevoerd worden met een rechtstreekse telling voor levende cellen, bijvoorbeeld een microscoop met telkamers. Andere methoden (fotometrie, turbidimetrie ...) kunnen gebruikt worden indien zij voldoende gevoelig zijn en indien is aangetoond dat zij voldoende goed gecorreleerd zijn met de celdichtheid.1.6.3. TestorganismenHet verdient aanbeveling om als groene algensoort een snelgroeiend soort te nemen dat geschikt is voor kweken en testen. De volgende soorten hebben de voorkeur:- Selenastrum capricornutum, bijvoorbeeld ATCC 22662 of CCAP 278/4,- Scenedesmus subspicatus, bijvoorbeeld 86.81 SAG.Opmerking:ATCC = American Type Culture Collection (V.S.)CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (G.B.)SAG = Algencultuur-verzameling (Göttingen, B.R.D.)Indien andere soorten worden gebruikt, dient de stam te worden vermeld.1.6.4. TestprocedureHet concentratiebereik waarin het optreden van de effecten wordt verwacht, kan bepaald worden met behulp van proeven voor afbakening van het testbereik.De twee meeteenheden voor groei (biomassa en groeisnelheid) kunnen resulteren in zeer uiteenlopende maten van groeiremming; beide dienen gebruikt te worden in de afbakeningsproef om er zeker van te zijn dat de meetkundige concentratiereeks een schatting van de EbC50 en de ErC50 mogelijk maakt.Oorspronkelijke celdichtheidHet verdient aanbeveling dat de celdichtheid in de testculturen voor Selenastrum capricornutum en Scenedesmus subspicatus in het begin ongeveer 104 cellen/ml bedraagt. Indien andere soorten worden gebruikt dient de biomassa vergelijkbaar te zijn.Concentraties van de teststofTen minste vijf testconcentraties worden zo bereid dat ze een meetkundige reeks vormen, met een concentratie-verhouding die niet groter is dan 2,2. De laagste geteste concentratie mag geen waarneembaar effect op de algengroei vertonen. De hoogste geteste concentratie dient de groei ten opzichte van de controle met ten minste 50 % te remmen en bij voorkeur de groei volledig te stoppen.Duplo's en controlesElke testconcentratie dient in triplo getest te worden. Drie controles zonder teststof dienen te worden uitgevoerd en indien van toepassing tevens drie controles met hulpstof. Indien gemotiveerd mag het testschema veranderd worden om het aantal concentraties op te voeren en het aantal duplo's per concentratie te verminderen.Uitvoering van de testTestculturen met de gewenste concentraties teststof en de gewenste hoeveelheid algen-inoculum worden bereid door toevoeging van hoeveelheden van de stamoplossing van de teststof aan de vereiste hoeveelheden preculturen van de algen (zie Aanhangsel 1).De testkolven worden geschud en in het kweekapparaat geplaatst. De algen worden in suspensie gehouden door schudden, roeren of doorborrelen met lucht om aldus de gasuitwisseling te verbeteren en de pH-variatie in de testoplossing te verminderen. De culturen moeten op een temperatuur van 21 tot 25  C worden gehouden, afgeregeld tot op ± 2  C.De celdichtheid in iedere kolf wordt ten minste 24, 48, en 72 uur na de start van de test bepaald. Gefilterd algen-medium met de juiste concentratie van de teststof wordt gebruikt als achtergrondbepaling, indien gebruik wordt gemaakt van andere methoden voor meting van de celdichtheid dan rechtstreekse telling.De pH wordt aan het begin van de test en na 72 uur gemeten.De pH van de controles mag tijdens de test niet meer dan 1,5 eenheid variëren.Testen van vluchtige stoffenTot op heden bestaat er geen algemeen aanvaarde methode voor het testen van vluchtige stoffen. Indien van een stof bekend is dat ze neiging heeft tot verdampen, kunnen gesloten kolven met een vergrote vrije ruimte boven de vloeistof gebruikt worden. Er dient evenwel bij het berekenen van de vrije ruimte in de gesloten kolven rekening gehouden te worden met een mogelijk CO2-gebrek. Variaties op deze methode zijn voorgesteld (zie referentie (4)).Getracht moet worden om de hoeveelheid stof te bepalen die in de oplossing blijft en aanbevolen wordt om extra voorzichtig te zijn bij het interpreteren van resultaten van tests met vluchtige chemicaliën met behulp van gesloten systemen.LimiettestMet de procedure beschreven in deze methode kan een limiettest worden uitgevoerd met 100 mg per liter om aan te tonen dat de EC50 hoger is dan deze concentratie.Indien de aard van de stof zodanig is dat een concentratie van 100 mg per liter in het testwater niet bereikt kan worden, dient de proef te worden uitgevoerd bij een concentratie die gelijk is aan de oplosbaarheid van de te onderzoeken stof (of de maximale concentratie die een stabiele dispersie vormt) in het gebruikte medium (zie ook punt 1.6.1.1).De limiettest dient ten minste in drievoud te worden uitgevoerd met hetzelfde aantal controles. De twee groei-eenheden (biomassa en groeisnelheid) dienen bij de limiettest gebruikt te worden.Indien in een limiettest een gemiddelde afname van de biomassa of de groeisnelheid ten opzichte van de controle van 25 % of meer wordt gevonden, dient een volledige studie te worden uitgevoerd.2. GEGEVENS EN EVALUATIEDe in de testculturen en controles gemeten celdichtheid wordt in tabellen genoteerd met de concentraties van de teststof en de tijdstippen van de meting. De gemiddelde waarde van de celdichtheid voor iedere concentratie van de teststof en de controles wordt uitgezet als functie van de tijd (0-72 uur) om aldus groeikrommes te verkrijgen.Om de concentratie/effect verhouding te bepalen dienen de twee volgende benaderingen te worden gevolgd. Bepaalde stoffen kunnen de groei stimuleren bij lage concentraties. Alleen met gegevens die op een remming tussen 0 en 100 % wijzen, moet rekening gehouden worden.2.1. VERGELIJKING VAN DE OPPERVLAKTEN ONDER DE GROEIKROMMESDe oppervlakte tussen de groeikrommes en de horizontale lijn N = N0 kan berekend worden volgens de formule:A =N1 N02 × t1 +N1 + N2 2N02 × (t2t1) + +Nn 1 + Nn 2N02× (tn tn 1)waarinA = de oppervlakte,N0 = het aantal cellen/ml op tijd t0 (begin van de test),N1 = het gemeten aantal cellen/ml op tijd t1,N2 = het gemeten aantal cellen/ml op tijd tn,t1 = het tijdstip van de eerste meting na het begin van de test,tn = het tijdstip van de nde meting na het begin van de test,n = het aantal uitgevoerde metingen sinds het begin van de test.Het percentage celgroeiremming bij iedere teststofconcentratie (IA) wordt berekend volgens de formule:IA = Ac   AtAc × 100waarinAc = de oppervlakte tussen de groeikromme voor de controle en de horizontale lijn N = N0,At = de oppervlakte tussen de groeikromme bij concentratie t en de horizontale lijn N = N0.IA-waarden worden uitgezet tegen de bijbehorende concentraties op semilogaritmisch papier of op semilogaritmisch waarschijnlijkheidspapier. Indien uitgezet op waarschijnlijkheidspapier, dienen de punten op het oog, of met behulp van een berekende regressie te worden verbonden door een rechte lijn.De EC50 wordt geschat op grond van de regressielijn door de concentratie af te lezen die overeenkomt met 50 % remming (IA = 50 %). Om de met deze methode verkregen waarde ondubbelzinnig te onderscheiden, wordt voorgesteld om het symbool EbC50 te gebruiken. Het is van wezenlijk belang om de EbC50 aan te geven met de betrokken blootstellingsperiode, bijvoorbeeld EbC50 (0-72 uur).2.2. VERGELIJKING VAN DE GROEISNELHEIDDe gemiddelde specifieke groeisnelheid (ì) voor exponentieel groeiende culturen kan als volgt berekend worden:m = ln Nn   ln N0tn   t0waarin t0 de tijd aan het begin van de test is.De gemiddelde specifieke groeisnelheid kan anderszins worden afgeleid uit de helling van de regressielijn, verkregen door ln N uit te zetten tegen de tijd.Het percentage remming van de specifieke groeisnelheid bij iedere teststofconcentratie (Iìt) wordt berekend volgens de formule:Imt = mc   mtmc × 100waarinìc = de gemiddelde specifieke groeisnelheidìt = de gemiddelde specifieke groeisnelheid voor de testconcentratie tDe percentuele afname van de gemiddelde specifieke groeisnelheid bij iedere teststofconcentratie ten opzichte van de controlewaarde wordt uitgezet tegen de logaritme van de concentratie. De EC50 kan vervolgens afgelezen worden uit de verkregen grafiek. Om de met deze methode verkregen EC50-waarde ondubbelzinnig te onderscheiden, wordt voorgesteld om het symbool ErC50 te gebruiken. Het tijdstip van de meting dient te worden aangegeven; als de waarde bij de tijdstippen 0 en 72 uur behoort, wordt bijvoorbeeld het symbool als ErC50(0-72 uur) aangegeven.Opmerking: De specifieke groeisnelheid is een logaritmische term, zodat kleine veranderingen in de groeisnelheid kunnen leiden tot grote veranderingen in de biomassa. De EbC- en ErC-waarden zijn daarom niet numeriek vergelijkbaar.2.3. BEREKENING VAN DE NOECDe concentratie waarbij geen effect wordt waargenomen (NOEC) wordt bepaald volgens een geschikte statistische procedure voor meervoudige monstervergelijking (bijvoorbeeld variantie-analyse en Dunnett-test), met behulp van de uit de triplo-tests verkregen afzonderlijke waarden van de oppervlakten onder de groeikrommes  A (zie punt 2.1), of de specifieke groeisnelheden ì (zie 2.2).3. RAPPORTAGEIn het verslag moeten indien mogelijk de volgende gegevens worden opgenomen:- teststof: gegevens voor chemische identificatie;- gegevens over het testorganisme: oorsprong, laboratoriumcultuur, stamnummer, kweekmethode;- testomstandigheden:- datum van het begin en het einde van de test, alsmede de duur;- temperatuur;- samenstelling van het medium;- kweekapparatuur;- pH van de oplossingen aan het begin en het einde van de test (een verklaring dient gegeven te worden als pH-veranderingen van meer dan 1,5 eenheid werden waargenomen);- medium en de gebruikte methode voor het oplossen van de teststof en de concentratie van het medium in de testoplossing;- lichtintensiteit en -kwaliteit;- geteste concentraties (gemeten of nominaal);- resultaten:- celdichtheid in iedere kolf op ieder meetpunt en de methode voor het bepalen van de celdichtheid;- gemiddelde waarden van de celdichtheid;- groeikrommes;- grafische presentatie van de concentratie/effect relatie;- EC-waarden en de berekeningsmethode;- NOEC;- andere waargenomen effecten.4. LITERATUUR(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201. Decision of the Council C(81) 30 Final.(2) Umweltbundesamt, Berlijn, 1984, Verfahrensvorschlag "Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subspicatus", in: Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg 1986.(3) ISO 8692 - Water Quality - Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.(4) S. Galassi en M. Vighi - Chemosphere, 1981, vol. 10, 1123-1126.Aanhangsel 1Voorbeeld van een procedure voor het kweken van algenAlgemene observatiesHet doel van het kweken op basis van de volgende procedure is het verkrijgen van algenculturen voor toxiciteitstesten.Geschikte methoden moeten gebruikt worden om te verzekeren dat de algenculturen niet besmet worden met bacteriën (ISO 4833). Axenische culturen zijn gewenst, maar eensoortige algenculturen zijn verplicht.Alle behandelingen dienen te worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden ter vermijding van besmetting met bacteriën of andere algen. Besmette culturen dienen te worden afgekeurd.Procedure voor het verkrijgen van algenculturenBereiding van de voedingsstoffenoplossingen (media):Het medium kan bereid worden door verdunnen van de geconcentreerde stamoplossingen van voedingsstoffen. Voor vast medium wordt 0,8 % agar toegevoegd. Het medium moet steriel zijn. Sterilisatie met een autoclaaf kan leiden tot verlies van NH3.Stamculturen:De stamculturen bestaan uit kleine algenculturen die regelmatig op vers medium worden overgezet om aldus als nieuw uitgangsmateriaal voor tests te dienen. Indien de culturen niet regelmatig worden gebruikt, worden zij uitgestreken in schuine agarbuizen. Deze worden ten minste éénmaal per twee maanden overgebracht op vers medium.De stamculturen worden gekweekt in erlenmeyers met het geschikte medium (volume ongeveer 100 ml). Wanneer de algen ge¨ uncubeerd worden bij 20  C met continue verlichting, is wekelijks overzetten vereist.Gedurende het overzetten wordt een hoeveelheid "oud" medium met steriele pipetten zodanig overgebracht naar de kolf met het verse medium, dat de beginconcentratie van de snelgroeiende soort ongeveer 100 maal kleiner is dan in de oude cultuur.De groeisnelheid kan bepaald worden uit de groeikromme. Indien bekend, is het mogelijk de dichtheid te schatten waarbij de cultuur moet worden overgezet naar het nieuwe medium. Dit dient te geschieden voordat de cultuur de afstervingsfase bereikt.Voorcultuur:De voorcultuur dient om een aantal algen te geven dat geschikt is voor inoculatie van de testculturen. De voorculturen worden ge¨ uncubeerd onder testomstandigheden en worden gebruikt terwijl zij nog exponentieel groeien, normaal gezien na een incubatieperiode van drie dagen. Wanneer de algenculturen misvormde of abnormale cellen bevatten, moeten ze worden afgekeurd.Aanhangsel 2In ISO 8692 ("Water Quality - Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum") worden de volgende resultaten vermeld voor een interlaboratoriumtest, uitgevoerd door 16 laboratoria, met kaliumdichromaat als teststof:>RUIMTE VOOR DE TABEL>C.4. BEPALING VAN DE GEMAKKELIJKE BIOLOGISCHE AFBREEKBAARHEIDDEEL I. ALGEMEENI.1. INLEIDINGVoor het testen van de gemakkelijke biologische afbreekbaarheid van chemische stoffen in een aëroob watermedium worden zes testmethoden beschreven:(a) DOC (opgeloste organische koolstof) Afvlakkingstest (Methode C.4-A)(b) Gewijzigde OESO-Screening test - Afvlakking DOC (Methode C.4-B)(c) Kooldioxyde (CO2) Ontwikkelingstest (Gewijzigde Sturm-test) (Methode C.4-C)(d) Manometrische respirometrie (Methode C.4-D)(e) Gesloten-flestest (Methode C.4-E)(f) MITI (Ministerie voor Internationale Handel en Industrie - Japan) (Methode C.4-F)In deel I van de methode worden zowel de algemene aanwijzingen als de op alle zes tests betrekking hebbende aanwijzingen gegeven. In de Delen II tot en met VII worden bijzonderheden over de afzonderlijke methoden vermeld. De bijlagen bevatten definities, formules en nadere toelichting.Bij een vergelijkend onderzoek tussen laboratoria in OESO-verband in 1988 bleek dat de methoden overeenstemmende resultaten geven. Afhankelijk van de fysische kenmerken van de te onderzoeken stof kan echter de voorkeur naar de ene of de andere methode gaan.I.2. KEUZE VAN DE GESCHIKTE METHODEVoor een keuze van de meest in aanmerking komende methode is informatie over de oplosbaarheid, de dampdruk en de adsorptie-eigenschappen van de stof van wezenlijk belang. Voor het berekenen van theoretische waarden en/of het controleren van gemeten waarden voor parameters, b.v. ThOD, ThCO2, DOC, TOC, COD (zie Bijlagen I en II) moet de scheikundige structuur of de brutoformule bekend zijn.Teststoffen die tot ten minste 100 mg/l in water oplosbaar zijn kunnen met alle methoden worden bepaald, mits ze niet-vluchtig en niet-adsorberend zijn. Voor stoffen die slecht in water oplosbaar, vluchtig of adsorberend zijn, worden in Tabel 1 geschikte methoden aangegeven. De wijze waarop slecht in water oplosbare stoffen en vluchtige stoffen kunnen worden behandeld wordt beschreven in Bijlage III. Matig vluchtige stoffen kunnen worden onderzocht met behulp van de DOC-afvlakkingsmethode, indien er voldoende gasruimte in de proefvaten is (deze zouden goed afgesloten moeten worden). In dat geval dient een niet-biologische controle te worden toegepast voor het verdisconteren van een eventueel fysisch verlies.>RUIMTE VOOR DE TABEL>Informatie over de zuiverheid of de relatieve hoeveelheden van belangrijke componenten van het testmateriaal is nodig voor een interpretatie van de verkregen resultaten, vooral wanneer de uitkomsten gering of marginaal zijn.Informatie over de giftigheid van de teststof voor bacteriën (Bijlage IV) kan zeer nuttig zijn voor het kiezen van de juiste testconcentraties en kan essentieel zijn voor een juiste interpretatie van een geringe waarde voor de biologische afbraak.I.3. REFERENTIESTOFFENVoor een controle op de procedure worden referentiestoffen die aan de criteria voor gemakkelijke biologische afbreekbaarheid voldoen onderzocht door een geschikte proefvolume referentiestof parallel met de gewone testuitvoeringen te behandelen.Geschikte chemische stoffen zijn aniline (vers gedistilleerd), natriumacetaat en natriumbenzoaat. Deze referentiestoffen worden bij de onderhavige me thoden alle afgebroken, zelfs wanneer niet bewust entmateriaal wordt toegevoegd.Voorgesteld is een referentiestof te zoeken die wel gemakkelijk biologisch afbreekbaar is maar de toevoeging van een entmateriaal vereist. Daartoe is kaliumwaterstoftalaat voorgesteld, maar de geschiktheid moet nog worden aangetoond voordat deze stof als referentiestof aangenomen kan worden.In de respirometrische testen kunnen stikstof bevattende verbindingen als gevolg van nitrificatie van invloed zijn op de opgenomen hoeveelheid zuurstof (zie Bijlagen II en V).I.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODENEen oplossing of suspensie van de teststof in een anorganisch medium wordt geënt en onder aërobe omstandigheden in het donker of in gedempt licht bebroed. De hoeveelheid DOC in de testoplossing die het gevolg is van het entmateriaal dient zo laag mogelijk te zijn in vergelijking met de hoeveelheid DOC tengevolge van de teststof.Voor de endogene activiteit van het entmateriaal wordt een correctie aangebracht door middel van parallelle blanco proeven met entmateriaal maar zonder teststof, ofschoon de endogene activiteit van cellen in aanwezigheid van een teststof niet volledig overeenstemt met die van de endogene controle. De werking van de procedures wordt gecontroleerd door een parallelle test met een referentiestof uit te voeren.In het algemeen wordt de afbraak gevolgd door de bepaling van parameters, zoals DOC, CO2-produktie en opgenomen zuurstof en worden op voldoende frequente tijdstippen metingen gedaan om het begin en het einde van de biologische afbraak vast te stellen. Bij automatische respirometers is de meting continu. Soms wordt de DOC gemeten naast een andere parameter, maar gewoonlijk wordt dit slechts bij het begin en bij de afloop van de test gedaan. Voor het bepalen van de primaire afbraak van de teststof en voor het bepalen van de concentratie van eventuele gevormde tussenprodukten (verplicht bij de MITI-test) kan ook een specifieke chemische analyse worden uitgevoerd.Gewoonlijk duurt de test 28 dagen. De proeven kunnen echter ook eerder dan na 28 dagen, en wel zodra de kromme voor de biologische afbraak gedurende ten minste 3 bepalingen een plateau vertoont, worden beëindigd. De proeven kunnen ook langer dan 28 dagen worden voortgezet, wanneer uit de kromme blijkt dat de biologische afbraak wel begonnen is, maar dat op dag 28 nog geen plateau is bereikt.I.5. KWALITEITSCRITERIAI.5.1. ReproduceerbaarheidIn verband met de aard van de biologische afbraak en van de als entmateriaal gebruikte gemengde bacterie-populaties dienen bepalingen ten minste in tweevoud te worden uitgevoerd.De ervaring leert in het algemeen dat hoe hoger de aanvankelijk aan het testmedium toegevoegde concentratie micro-organismen is, hoe geringer de afwijking tussen herhaalde bepalingen is. Uit ringtests is ook gebleken dat er tussen de resultaten van verschillende laboratoria grote verschillen kunnen zijn, maar gewoonlijk wordt met gemakkelijk biologische afbreekbare stoffen een goede overeenstemming verkregen.I.5.2. Geldigheid van de testEen test wordt geldig beschouwd indien het verschil tussen de uiterste waarden van de in de test meermalen uitgevoerde metingen van de verwijdering van teststof op het plateauniveau, aan het einde van de test of aan het einde van het venster van 10 dagen, minder is dan 20 % en indien het percentage afbraak van de referentiestof na 14 dagen het niveau voor gemakkelijke biologische afbreekbaarheid heeft bereikt. Indien aan een van deze voorwaarden niet is voldaan, dient de test te worden herhaald. Wegens de strengheid van de methoden behoeven lage waarden nog niet te betekenen dat de teststof onder milieu-omstandigheden niet biologisch afbreekbaar is, maar wel dat meer onderzoek nodig is om de biologische afbreekbaarheid vast te stellen.Indien in een toxiciteitstest waarbij zowel de teststof als een referentiestof aanwezig is, in 14 dagen minder dan 35 % afbraak (gebaseerd op DOC) of minder dan 25 % afbraak (gebaseerd op ThOD of ThCO2) is opgetreden, kan worden aangenomen dat de teststoffen remmend werken (zie ook Bijlage IV). De testreeks dient dan te worden herhaald, zo mogelijk met een lagere concentratie teststof en/of een hogere concentratie entmateriaal, maar niet meer dan 30 mg vaste stof per liter.I.6. ALGEMENE WERKWIJZEN EN BEREIDINGENAlgemene omstandigheden die van toepassing zijn op de test zijn in Tabel 2 samengevat. Apparatuur en overige experimentele omstandigheden die op afzonderlijke tests betrekking hebben worden verderop in het hoofdstuk voor die test beschreven.>RUIMTE VOOR DE TABEL>I.6.1. VerdunningswaterGede¨ uoniseerd of gedistilleerd water, dat vrij is van remmende concentraties giftige stoffen (b.v. Cu++-20ionen) wordt gebruikt. Het mag niet meer dan 10 % van de hoeveelheid organische koolstof die met het testmateriaal wordt ge¨ untroduceerd bevatten. De grote zuiverheid van het testwater is nodig om hoge waarden van de blanco-proeven te vermijden. Besmetting kan het gevolg zijn van aanwezige verontreinigingen en ook van de ionenuitwisselende harsen en van de lysis van bacteriën en algen. Voor elke reeks tests dient slechts gebruik te worden gemaakt van een enkele voorraad water, die vooraf door middel van DOC-analyse is gecontroleerd. Zo'n controle is niet nodig voor de gesloten fles-test, maar het zuurstofverbruik van het water moet laag blijven.I.6.2. Voorraadoplossingen van anorganische componentenVoor het bereiden van testoplossingen worden voorraadoplossingen met geschikte concentraties van anorganische componenten aangemaakt. Voor de methoden DOC-afvlakking, gewijzigde OESO-test, CO2-ontwikkeling, manometrische respirometrie en gesloten fles kunnen de onderstaande voorraadoplossingen worden gebruikt (met verschillende verdunningsfactoren).De verdunningsfactoren en, voor de MITI-test, de specifieke bereiding van het anorganische medium, worden in de hoofdstukken van de afzonderlijke tests beschreven.Voorraadoplossingen:De onderstaande voorraadoplossingen worden bereid met gebruikmaking van reagentia van analytische kwaliteit.(a) Monokaliumdiwaterstoforthosfaat, KH2PO4 8,50 gDikaliummonowaterstoforthofosfaat, K2HPO4 21,75 gDinatriummonowaterstoforthofosfaat-dihydraat, Na2HPO4 . 2 H2O 33,40 gAmmoniumchloride, NH4Cl 0,50 gOplossen in water en tot 1 liter aanvullen. De pH van de oplossing moet 7,4 zijn.(b) Calciumchloride, watervrij, CaCl2 27,50 gof calciumchloride-dihydraat, CaCl2 . 2 H2O 36,40 gIn water oplossen en tot 1 liter aanvullen(c) Magnesiumsulfaat-heptahydraat, MgSO4 . 7 H2O 22,50 gIn water oplossen en tot 1 liter aanvullen(d) IJzer(III)chloride-hexahydraat, FeCl3 . 6 H2O 0,25 gIn water oplossen en tot 1 liter aanvullenOpmerking: Teneinde deze oplossing (d) niet onmiddellijk voor gebruik te behoeven te bereiden wordt één druppel geconcentreerde HCl of 0,4 g ethyleendiaminetetra-azijnzuur-dinatriumzout (EDTA) per liter toegevoegd.I.6.3. Voorraadoplossingen van chemicaliënIndien de oplosbaarheid meer dan 1 g/l bedraagt, wordt bijvoorbeeld 1-10 g, zoals toepasselijk is, aan teststof of referentiestof in gede¨ uoniseerd water opgelost en tot 1 liter aangevuld. In andere gevallen worden voorraadoplossingen in het anorganische medium bereid of wordt de stof rechtstreeks aan het anorganische medium toegevoegd. Voor het bewerken van minder goed oplosbare stoffen wordt verwezen naar Bijlage III, maar in de MITI-test (Methode C.4-F) dienen noch oplosmiddelen noch emulgatoren te worden gebruikt.I.6.4. EntmateriaalHet entmateriaal kan van diverse bronnen afkomstig zijn: actief slib, (chloorvrij) behandeld water, oppervlaktewater en grond of een mengsel daarvan. Indien bij de DOC-afvlakking, de CO2-ontwikkeling en de manometrische respirometrie actief slib wordt gebruikt, dient dit te worden onttrokken aan een behandelingsinstallatie of installatie op laboratoriumschaal die hoofdzakelijk huishoudelijk afvalwater verwerkt. Gebleken is dat entmateriaal van andere bronnen een grotere spreiding van resultaten geeft. Voor de gewijzigde OESO-test en de gesloten-flestest is een meer verdund entmateriaal zonder slibvlokken nodig en bij voorkeur wordt dan als bron een secundair effluent van een rioolwaterzuiveringsinstallatie of van een laboratoriuminstallatie met huishoudelijk afvalwater genomen. Voor de MITI-test is het entmateriaal afkomstig van een mengsel van bronnen. Het wordt in het hoofdstuk van die test beschreven.I.6.4.1. Entmateriaal uit actief slibUit de beluchtingstank van een rioolwaterzuiveringsinstallatie of een laboratoriuminstallatie die hoofdzakelijk huishoudelijk afval verwerkt, wordt een vers monster actief slib verzameld. Grove deeltjes worden zonodig door filtratie door een fijne zeef verwijderd; daarna wordt het slib aëroob gehouden.In plaats daarvan kan na verwijdering van eventuele grove deeltjes worden bezonken of gecentrifugeerd (b.v. 10 min. bij 1 100 g). De bovenstaande vloeistof wordt weggeworpen. Het geconcentreerde slib kan in het mineraal medium gewassen worden; daarna wordt het in anorganisch medium gesuspendeerd tot een concentratie van 3-5 g gesuspendeerde vaste stof/l en belucht tot het tijdstip van gebruik.Slib moet afkomstig zijn van een correct werkend zuiveringsstation. Als slib afkomstig is van een installatie met hoge omloopsnelheid, of geacht wordt remmers te bevatten, dient het te worden gewassen. Het opnieuw gesuspendeerde slib wordt na grondig mengen bezonken of gecentrifugeerd, de bovenstaande vloeistof wordt weggeworpen en het gewassen slib wordt in een volgend volume anorganisch medium opnieuw gesuspendeerd. Deze procedure wordt herhaald totdat het slib geacht wordt vrij te zijn van overmaat substraat of remmer.Nadat het slib volledig opnieuw is gesuspendeerd, of bij niet behandeld slib direct, wordt vlak voor gebruik een monster getrokken voor de bepaling van het droog gewicht aan gesuspendeerde vaste stoffen.Een andere mogelijkheid is het homogeniseren van actief slib (3-5 g gesuspendeerde vaste stof per l). Het slib wordt 2 min. bij matige snelheid in een mechanische menger behandeld. Het gemengde slib wordt gedurende 30 min. of zoveel langer als nodig bezonken en de vloeistof wordt afgeschonken en gebruikt als entmateriaal in een hoeveelheid van 10 ml/l anorganisch medium.I.6.4.2. Andere bronnen van entmateriaalDit kan worden betrokken van het secundaire effluent van een zuiveringsinstallatie of een laboratoriuminstallatie die hoofdzakelijk huishoudelijk afvalwater ontvangt. Er wordt een vers monster verzameld en dit wordt tijdens transport aëroob gehouden. Na 1 uur bezinken of filtreren door een grof filterpapier wordt het afgeschonken effluent of het filtraat aëroob gehouden zolang als nodig is. Tot 100 ml van dit soort entmateriaal per liter mineraal medium kan gebruikt worden.Een verdere bron van entmateriaal is oppervlaktewater. In dit geval wordt een monster van een geschikt oppervlaktewater, b.v. rivieren, plassen, verzameld en aëroob gehouden tot het nodig is. Zonodig wordt het entmateriaal door filtreren of centrifugeren geconcentreerd.I.6.5. Preconditionering van entmateriaalEntmateriaal kan op de proefomstandigheden worden gepreconditioneerd, maar mag niet vooraf aan de teststof worden aangepast. Preconditionering bestaat uit het beluchten van actief slib gedurende 5-7 dagen in anorganisch medium of secundaire effluent bij de testtemperatuur. Door preconditionering wordt de nauwkeurigheid van de testmethode soms verbeterd doordat de blanco-waarden worden verlaagd. Het wordt niet nodig geacht het entmateriaal voor de MITI-test te preconditioneren.I.6.6. Niet-biologische controlesZonodig wordt gecontroleerd op mogelijke niet-biologische afbraak van de teststof door het bepalen van de verwijdering van DOC, de zuurstofopname of de kooldioxyde-ontwikkeling in steriele controles die geen entmateriaal bevatten. Het testmateriaal wordt gesteriliseerd door filtratie door een membraan (0,2-0,45 micrometer) of door toevoeging van een geschikte giftige stof met een geschikte concentratie. Indien gebruik gemaakt wordt van membraanfiltratie, moeten de monsters aseptisch verzameld worden, om de steriliteit ervan te behouden. De adsorptie van de teststof moet op voorhand uitgesloten worden. Is dit niet het geval, en is het entmateriaal uit actief slib afkomstig, moeten tests waarbij de biologische afbreekbaarheid als DOC-verwijdering bepaald wordt, een abiotische controle bevatten, die geënt en vergiftigd wordt.I.6.7. Aantal kolvenHet aantal kolven in een doorsnee proef wordt in de betreffende hoofdstukken voor elke test beschreven.Kolven van het volgende soort kunnen gebruikt worden: testsuspensie:met teststof en entmateriaalentmateriaalblanco:met entmateriaal alleenprocedurecontrole:met referentiestof en entmateriaalabiotische steriele controle:met teststof - steriel (zie I.6.6.)adsorptiecontrole:met teststof, entmateriaal en steriliserend middeltoxiciteitscontrole:met teststof, referentiestof en entmateriaal.Het is beslist nodig de bepalingen in de testsuspensie en entmateriaalblanco parallel uit te voeren. Het is raadzaam de bepalingen in de andere kolf parallel te volgen.Dit is echter wellicht niet altijd mogelijk. Men dient zich er van te vergewissen dat er voldoende monsters worden genomen of afgelezen om een bepaling van het percentage verwijdering in het venster van 10 dagen mogelijk te maken.I.7. GEGEVENS EN EVALUATIEBij de berekening van Dt, percentage afbraak, worden de gemiddelde waarden van duplo-metingen van de parameter zowel in de testvaten als van de entmateriaalblanco gebruikt. De formules daarvoor zijn vermeld in de onderstaande hoofdstukken die op de afzonderlijke tests betrekking hebben. Het verloop van de afbraak wordt grafisch weergegeven en het 10-dagen venster wordt aangegeven. Het percentage verwijdering dat na afloop van het 10-dagen venster is bereikt en de waarde van het plateau of, indien van toepassing, aan het eind van de test, worden berekend en gerapporteerd.Bij de respirometrische tests kunnen stikstof bevattende verbindingen door nitrificatie van invloed zijn op de opgenomen hoeveelheid zuurstof (zie Bijlagen II en V).I.7.1. Afbraak gemeten door middel van DOC-bepalingOp elk tijdstip van monsterneming moet het percentage afbraak (Dt) voor de kolven met teststof apart, aan de hand van gemiddelden van in duplo gemeten DOC-waarden, berekend worden; het doel hiervan is, de validiteit van de test te bevestigen (zie I.5.2). Het percentage afbraak wordt met de volgende formule berekend :Dt = (1 Ct Cbt Co Cbo) × 100waarin:Dt = % afbraak op tijdstip t,Co = gemiddelde beginconcentratie van DOC in het geënte kweekmedium dat de teststof bevat (mg DOC/l),Ct = gemiddelde concentratie DOC in het geënte kweekmedium dat de teststof bevat op tijdstip t (mg DOC/l),Cbo = gemiddelde beginconcentratie van DOC in het blanco geënte anorganische medium (mg DOC/l),Cbt = gemiddelde concentratie van DOC in het blanco geënte anorganische medium op tijdstip t (mg DOC/l).Alle concentraties worden experimenteel gemeten.I.7.2. Afbraak gemeten door middel van specifieke analyseWanneer de specifieke analytische gegevens beschikbaar zijn, wordt de primaire biologische afbraak berekend:Dt = Sb SaSb × 100waarin:Dt = % afbraak op tijdstip t, gewoonlijk 28 dagen,Sa = overblijvende hoeveelheid teststof in het entmedium aan het eind van de test (mg),Sb = overblijvende hoeveelheid teststof in de blanco test met water/medium waaraan alleen de teststof was toegevoegd (mg).I.7.3. Niet-biologische afbraakIndien gebruik wordt gemaakt van een abiotische steriele controle, wordt het percentage niet-biologische afbraak berekend :% niet-biologische afbraak = Cs(o)   Cs(t)Cs(o) × 100waarin:Cs(o) = DOC concentratie in de steriele controle op dag 0Cs(t) = DOC concentratie in de steriele controle op dag tI.8. RAPPORTAGEHet testrapport bevat, voorzover mogelijk, de volgende gegevens:- teststof en referentiestof en zuiverheid daarvan;- testomstandigheden;- entmateriaal: aard en plaats(en) van bemonstering, concentratie en eventuele pre-conditionering;- indien bekend, hoeveelheid en aard van industrieel afval dat in rioolwater aanwezig is;- testduur en testtemperatuur;- in geval van slecht oplosbare teststoffen, de uitgevoerde behandeling;- toegepaste testmethode; voor elke wijziging van de procedure dienen wetenschappelijke gronden en een toelichting te worden gegeven;- gegevensformulier;- alle eventueel waargenomen remmingsverschijnselen;- eventueel waargenomen niet-biologische afbraak;- specifieke analytisch-chemische gegevens, indien beschikbaar;- analytische gegevens over tussenproducten, indien beschikbaar;- de grafiek van het percentage afbraak tegen de tijd voor de teststof en de referentiestof; de aanloopfase, de afbraakfase, het 10-dagen venster en de helling dienen duidelijk te zijn aangegeven (Bijlage I); indien de test aan de validiteitscriteria heeft voldaan, kan het gemiddelde van de percentages afbraak van de teststof bevattende kolven voor de grafiek gebruikt worden.- percentage verwijdering na het 10-dagen venster, alsmede op het plateau of aan het eind van de test.DEEL II. DOC-AFVLAKKINGSTEST (Methode C.4-A)II.1. PRINCIPE VAN DE METHODEEen gemeten volume aan geënt anorganisch medium dat een bekende concentratie van de teststof (10-40 mg DOC/l) als de enige nominale bron van organische koolstof bevat wordt bij 22 ± 2  C in het donker of in gedempt licht belucht.De afbraak wordt door middel van DOC-analyse met regelmatige tussenpozen gedurende 28 dagen gevolgd. De mate van biologische afbraak wordt berekend doordat de concentratie aan verwijderde DOC (gecorrigeerd voor de DOC in de blanco-entmateriaalcontrole) als percentage van de aanvankelijk aanwezige concentratie wordt uitgedrukt. De mate van primaire biologische afbraak kan ook worden berekend uit een aanvullende chemische analyse die bij het begin en het eind van de incubatie wordt uitgevoerd.II.2. BESCHRIJVING VAN DE METHODEII.2.1. Apparatuur(a) Erlenmeyerkolven, b. v. 250 ml tot 2 l, afhankelijk van het voor DOC-analyse benodigde volume;(b) Schudmachine geschikt voor de erlenmeyers, hetzij met automatische temperatuurregeling, hetzij gebruikt in een kamer met constante temperatuur, en met een voldoende vermogen voor het in stand houden van aërobe omstandigheden in alle kolven;(c) Filtratie-apparatuur met geschikte membranen;(d) DOC-analyse-apparaat;(e) Apparatuur voor het bepalen van opgeloste zuurstof;(f) Centrifuge.II.2.2. Bereiding van anorganisch mediumZie voor de bereiding van de voorraadoplossing I.6.2.10 ml oplossing (a) wordt gemengd met 800 ml verdunningswater, daaraan wordt 1 ml van de oplossingen (b) t/m (d) toegevoegd en het geheel wordt met verdunningswater tot 1 l aangevuld.II.2.3. Bereiding en pre-conditionering van entmateriaalHet entmateriaal kan van diverse bronnen afkomstig zijn: actief slib, behandeld water, oppervlaktewater en grond of een mengsel daarvan.Zie I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. en I.6.5.II.2.4. Bereiding van de proefoplossingenBij wijze van voorbeeld worden porties van 800 ml anorganisch medium in erlenmeyers van 2 liter gebracht en wordt in afzonderlijke kolven telkens een zodanig volume aan voorraadoplossingen van teststof en referentiestof gebracht dat een concentratie met een chemisch equivalent aan 10-40 mg DOC/l wordt verkregen. De pH wordt gecontroleerd en, zonodig, op 7,4 bijgesteld. De kolven worden geënt met actief slib of een andere bron van entmateriaal (zie I.6.4.) tot een uiteindelijke concentratie van niet meer dan 30 mg gesuspendeerde vaste stof per liter wordt verkregen. Tevens worden controles van entmateriaal in anorganisch medium, maar zonder test- of referentiestof, bereid.Zonodig wordt één kolf gebruikt om de eventuele remmende werking van een teststof te controleren door het enten van een oplossing die in het anorganische medium vergelijkbare concentraties van zowel de teststof als de referentiestof bevat.Tevens wordt, indien nodig, een volgende steriele kolf ingericht voor de controle op de eventuele niet-biologische afbraak van de teststof door toepassing van een niet-geënte oplossing van de stof (zie I.6,6.).Indien het vermoeden bestaat dat de teststof in belangrijke mate op glas, slib o.i.d. wordt geadsorbeerd, wordt bovendien in een voorafgaand onderzoek de waarschijnlijke mate van adsorptie en daarmee de geschiktheid van de test voor de desbetreffende stof bepaald (zie Tabel 1). Hiertoe wordt een kolf met de teststof, het entmateriaal en het steriliserend middel bereid.In alle kolven wordt het volume met anorganisch medium tot 1 l aangevuld en na mengen wordt uit elke kolf een monster genomen ter bepaling van de beginconcentratie aan DOC (zie Bijlage  II.4). De openingen van de kolven worden afgedekt, bij voorbeeld met aluminiumfolie, zodanig dat er een ongehinderde uitwisseling van lucht tussen de kolf en de omgevende atmosfeer kan plaatsvinden. Vervolgens worden de kolven op de schudmachine geplaatst en kan de test beginnen.II.2.5. Aantal kolven in een doorsnee-proef Kolven 1 en 2: testsuspensie Kolven 3 en 4: entmateriaalblanco Kolf 5: procedurecontrole bij voorkeur en zo nodig: Kolf 6: abiotische steriele controle Kolf 7: adsorptiecontrole Kolf 8: toxiciteitscontroleZie ook I.6.7.II.2.6. Uitvoering van de testGedurende de test worden met bepaalde tussenpozen de concentraties aan DOC in elke kolf in duplo bepaald, en wel zo vaak dat het begin van het 10-dagen venster en het percentage verwijdering aan het eind van het 10-dagen venster kunnen worden bepaald. Er wordt geen groter volume aan testsuspensie genomen dan voor elke bepaling nodig is.Voordat een monster wordt genomen worden zonodig verliezen door verdamping uit de kolven aangevuld door toevoeging van verdunningswater (I.6.1.) in de vereiste hoeveelheid. Voordat een monster wordt onttrokken, wordt het kweekmedium grondig vermengd en wordt er zorg voor gedragen dat aan de wanden van de kolf hechtend materiaal wordt opgelost of gesuspendeerd.Onmiddellijk nadat het monster is genomen wordt het met een membraan gefiltreerd of gecentrifugeerd (zie Bijlage II.4). De afgefiltreerde of gecentrifugeerde monsters worden op dezelfde dag geanalyseerd danwel gedurende maximaal 48 uur bij 2-4  C of langere tijd beneden -18  C bewaard.II.3. GEGEVENS EN RAPPORTAGEII.3.1. Verwerking van resultatenHet percentage afbraak op tijdstipt wordt berekend zoals aangegeven bij I.7.1. (DOC-bepaling) en, eventueel, bij I.7.2. (specifieke analyse).Alle resultaten worden op de daartoe bestemde gegevensformulieren ingevuld.II.3.2. Geldigheid van de resultatenZie I.5.2.II.3.3. RapportageZie I.8.II.4. GEGEVENSFORMULIERHieronder volgt een voorbeeld van een gegevensformulier.DOC-AFVLAKKINGSTEST1. LABORATORIUM2. DATUM AAN HET BEGIN VAN DE TEST3. TESTSTOFNaam:Concentratie voorraadoplossing: mg/l als teststofBeginconcentratie in het milieu, t0: mg/l als teststof4. ENTMATERIAALHerkomst:Uitgevoerde behandeling:Pre-conditionering, indien van toepassing:Concentratie van gesuspendeerde vaste stof in reactiemengsel: mg/l.5. KOOLSTOFBEPALINGENKoolstofanalyse-apparaat: . .>RUIMTE VOOR DE TABEL>6. EVALUATIE VAN VERKREGEN GEGEVENS>RUIMTE VOOR DE TABEL>7. NIET-BIOLOGISCHE CONTROLE (facultatief)>RUIMTE VOOR DE TABEL>% niet-biologische afbraak = Cs(o)   Cs(t)Cs(o) × 1008. SPECIFIEKE SCHEIKUNDIGE ANALYSE (facultatief)>RUIMTE VOOR DE TABEL>DEEL III. GEWIJZIGDE OESO-SCREENING TEST (Methode C.4-B)III.1. PRINCIPE VAN DE METHODEEen gemeten volume anorganisch medium dat een bekende concentratie teststof (10-40 mg DOC/l) als enige nominale bron van organische koolstof bevat wordt geënt met 0,5 ml effluent per liter medium. Het mengsel wordt in het donker of in gedempt licht bij 22 ± 2  C belucht.De afbraak wordt gedurende 28 dagen met regelmatige tussenpozen gevolgd door middel van DOC-analyse. De mate van biologische afbraak wordt berekend doordat de concentratie verwijderde DOC (gecorrigeerd voor de waarde in de blanco-entmateriaalcontrole) wordt uitgedrukt als percentage van de aanvankelijk aanwezige concentratie. De mate van primaire biologische afbraak kan ook worden berekend aan de hand van een aanvullende chemische analyse die aan het begin en aan het eind van de incubatie wordt uitgevoerd.III.2. BESCHRIJVING VAN DE METHODEIII.2.1. Apparatuur(a) Erlenmeyerkolven, b.v. 250 ml tot 2 l, afhankelijk van het voor DOC-analyse benodigde volume;(b) Schudmachine - geschikt voor de erlenmeyers, hetzij met een automatische temperatuurregeling, hetzij gebruikt in een kamer met constante temperatuur, en met een zodanig vermogen dat in alle kolven aërobe omstandigheden kunnen worden gehandhaafd;(c) Filtratie-apparatuur met geschikte membranen;(d) DOC-analyse-apparaat;(e) Apparatuur voor het bepalen van opgeloste zuurstof;(f) CentrifugeIII.2.2. Bereiding van anorganisch mediumZie voor de bereiding van de voorraadoplossing I.6.2.10 ml van oplossing (a) wordt gemengd met 800 ml verdunningswater, daaraan wordt 1 ml van de oplossingen (b) t/m (d) toegevoegd en het geheel wordt met verdunningswater tot 1 l aangevuld.Bij deze methode wordt slechts 0,5 ml effluent/liter als entmateriaal gebruikt en daarom kan het nodig zijn het medium te versterken met spoorelementen en groeifactoren. Dit geschiedt door toevoeging van 1 ml van elk van de onderstaande oplossingen per liter uiteindelijk medium:Spoorelementoplossing:Mangaansulfaat-tetrahydraat, MnSO4. 4H2O 39,9 mgBoorzuur, H3BO3 57,2 mgZinksulfaat-heptahydraat, ZnSO4. 7H2O 42,8 mgAmmoniumheptamolybdaat, (NH4)6Mo7O24 34,7 mgFe-chelaat (FeCl3-ethyleendiaminetetraazijnzuur) 100,0 mgDeze stoffen worden opgelost in verdunningswater en de oplossing wordt tot 1 000 ml met verdunningswater aangevuld.Vitamine-oplossing:Gistextract 15,0 mgHet gistextract wordt opgelost in 100 ml verdunningswater De oplossing wordt gesteriliseerd door filtratie door een membraan van 0,2 micron of vers bereid.III.2.3. Bereiding en pre-conditionering van entmateriaalHet entmateriaal is afkomstig van het secundaire effluent van een zuiveringsinstallatie of een laboratoriuminstallatie die hoofdzakelijk huishoudelijk afvalwater ontvangt. Zie I.6.4.2. en I.6.5.Hiervan wordt 0,5 ml per liter mineraal medium gebruikt.III.2.4. Bereiding van de proefoplossingenBij wijze van voorbeeld worden porties van 800 ml anorganisch medium in erlenmeyers van 2 liter gebracht en wordt in de afzonderlijke kolven telkens een zodanig volume aan voorraadoplossingen van teststof en referentiestof toegevoegd dat een concentratie met een chemisch equivalent van 10-40 mg DOC/l wordt verkregen. De pH-waarden worden gecontroleerd en, zonodig, op 7,4 bijgesteld. De kolven worden geënt met rioolwaterzuiveringseffluent in een hoeveelheid van 0,5 ml/liter (zie I.6.4.2.). Tevens worden controles voor entmateriaal in het anorganische medium bereid zonder test- of referentiestof.Zonodig wordt één kolf gebruikt om de eventuele remmende werking van een teststof te controleren door het enten van een oplossing die in het anorganische medium vergelijkbare concentraties van zowel de teststof als de referentiestof bevat.Tevens wordt, indien nodig, een volgende steriele kolf ingericht voor de controle op de eventuele niet-biologische afbraak van de teststof door toepassing van een niet-geënte oplossing van de stof (zie I.6.6.).Indien het vermoeden bestaat dat de teststof in belangrijke mate op glas, slib o.i.d. wordt geadsorbeerd, wordt bovendien in een voorafgaand onderzoek de waarschijnlijke mate van adsorptie en daarmee de geschiktheid van de test voor de desbetreffende stof bepaald (zie Tabel 1). Hiertoe wordt een kolf met de teststof, het entmateriaal en het steriliserend middel bereid.In alle kolven wordt het volume met anorganisch medium tot 1 l aangevuld en na mengen wordt uit elke kolf een monster genomen ter bepaling van de beginconcentratie aan DOC (zie Bijlage II.4). De openingen van de kolven worden afgedekt, bij voorbeeld met aluminiumfolie, zodanig dat er een ongehiderde uitwisseling van lucht tussen de kolf en de omgevende atmosfeer kan plaatsvinden. Vervolgens worden de kolven op de schudmachine geplaatst en kan de test beginnen.III.2.5. Aantal kolven in een doorsnee-proefKolven 1 en 2: testsuspensieKolven 3 en 4: entmateriaalblancoKolf 5: procedurecontrole en bij voorkeur en zo nodig:Kolf 6: abiotische steriele controleKolf 7: adsorptiecontroleKolf 8: toxiciteitscontroleZie ook I.6.7.III.2.6. Uitvoering van de testGedurende de test worden met bepaalde tussenpozen de concentraties aan DOC in elke kolf in duplo bepaald, en wel zo vaak dat het begin van het 10-dagen venster en het percentage verwijdering aan het eind van het 10-dagen venster kunnen worden bepaald. Er wordt geen groter volume aan testsuspensie genomen dan voor elke bepaling nodig is.Voordat een monster wordt genomen worden zonodig verliezen door verdamping uit de kolven aangevuld door toevoeging van verdunningswater (I.6.1.) in de vereiste hoeveelheid. Voordat een monster wordt onttrokken wordt het kweekmedium grondig vermengd en wordt er zorg voor gedragen dat aan de wanden van de kolf hechtend materiaal wordt opgelost of gesuspendeerd. Onmiddellijk nadat het monster is genomen wordt het met een membraan gefiltreerd of gecentrifugeerd (zie Bijlage II.4). De afgefiltreerde of gecentrifugeerde monsters worden op dezelfde dag geanalyseerd danwel gedurende maximaal 48 uur bij 2-4  C of langere tijd beneden  18  C bewaard.III.3. GEGEVENS EN RAPPORTAGEIII.3.1. Verwerking van de resultatenHet percentage afbraak op tijdstip t wordt berekend zoals aangegeven bij I.7.1. (DOC-bepaling) en, eventueel, bij I.7.2. (specifieke analyse).Alle resultaten worden op de daartoe bestemde gegevensformulieren ingevuld.III.3.2. Geldigheid van de resultatenZie I.5.2.III.3.3. RapportageZie I.8.III.4. GEGEVENSFORMULIERHieronder wordt een voorbeeld van een gegevensformulier gegeven.GEWIJZIGDE OESO-SCREENING TEST1. LABORATORIUM2. DATUM AAN HET BEGIN VAN DE TEST3. TESTSTOFNaam:Concentratie voorraadoplossing: mg/l als teststofBeginconcentratie in het milieu, t0: mg/l als teststof4. ENTMATERIAALHerkomst:Uitgevoerde behandeling:Pre-conditionering, indien van toepassing:Concentratie van gesuspendeerde vaste stof in reactiemengsel: mg/l5. KOOLSTOFBEPALINGENKoolstofanalyse-apparaat:>RUIMTE VOOR DE TABEL>6. EVALUATIE VAN VERKREGEN GEGEVENS>RUIMTE VOOR DE TABEL>7. NIET-BIOLOGISCHE CONTROLE (facultatief)>RUIMTE VOOR DE TABEL>% niet-biologische afbraak = Cs(o)   Cs(t)Cs(o) × 1008. SPECIFIEKE SCHEIKUNDIGE ANALYSE (facultatief)>RUIMTE VOOR DE TABEL>DEEL IV. KOOLDIOXYDE CO2-ONTWIKKELINGTEST (Methode C.4-C)IV.1. PRINCIPE VAN DE METHODEEen gemeten volume geënt anorganisch medium dat een bekende concentratie teststof (10-20 mg DOC of TOC/l) als enige nominale bron van organische koolstof bevat wordt belucht door doorleiden van kooldioxyde-vrije lucht met een geregelde snelheid, in het donker of in gedempt licht. De afbraak wordt gedurende 28 dagen gevolgd door bepaling van het geproduceerde kooldioxyde dat in barium- of natriumhydroxyde wordt afgevangen en door titratie van het resterende hydroxyde of als anorganische koolstof wordt gemeten. De hoeveelheid geproduceerd kooldioxyde uit de teststof (gecorrigeerd voor datgene dat afkomstig is van het blanco entmateriaal) wordt uitgedrukt als een percentage van ThCO2. De mate van biologische afbraak kan ook worden berekend aan de hand van een aanvullende DOC-analyse die aan het begin en aan het eind van de incubatie wordt uitgevoerd.IV.2. BESCHRIJVING VAN DE METHODEIV.2.1. Apparatuura) Kolven, inhoud 2-5 liter, elk voorzien van een beluchtingsbuis die tot onder in de kolf reikt en een uitgang;b) Magneetroerders, indien slecht oplosbare stoffen worden bepaald;c) Gas-absorptieflessen;d) Inrichting voor het regelen en meten van de luchtstroom;e) Apparatuur voor het uitwassen van kooldioxyde, voor het bereiden van lucht die vrij is van kooldioxyde; in plaats daarvan kan een mengsel van CO2-vrije zuurstof en CO2-vrije stikstof uit gascilinders in de juiste verhouding (20 % O2: 80 % N2) worden gebruikt;f) Inrichting voor het bepalen van kooldioxyde, hetzij titrimetrisch hetzij met behulp van een of ander analyse-apparaat voor anorganische koolstof;g) Inrichting voor membraanfiltratie (facultatief);h) DOC-analyse-apparaat (facultatief).IV.2.2. Bereiding van anorganisch mediumZie voor de bereiding van de voorraadoplossingen, I.6.2.10 ml van oplossing (a) wordt gemengd met 800 ml verdunningswater, daaraan wordt 1 ml van de oplossingen (b) t/m (d) toegevoegd en het geheel wordt met verdunningswater tot 1 l aangevuld.IV.2.3. Bereiding en pre-conditionering van entmateriaalHet entmateriaal kan van diverse bronnen afkomstig zijn: actief slib, behandeld water, oppervlaktewater en grond of een mengsel daarvan.Zie I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. en I.6.5.IV.2.4. Bereiding van de proefoplossingenBij wijze van voorbeeld geven de onderstaande volumes en gewichten de waarden aan voor 5-literkolven die 3 l suspensie bevatten. Indien kleinere volumes worden gebruikt, worden de waarden dienovereenkomstig aangepast, maar er dient op te worden toegezien dat het gevormde kooldioxyde nauwkeurig kan worden gemeten.In elke 5-literkolf wordt 2 400 ml anorganisch medium gebracht. Daaraan wordt een zodanig volume van het bereide actieve slib (zie I.6.4.1. en I.6.5.) toegevoegd dat een concentratie aan gesuspendeerde deeltjes van niet meer dan 30 mg/l in het uiteindelijke 3 l geënt mengsel wordt verkregen. In plaats daarvan kan eerst het bereide slib worden verdund tot een suspensie van 500-1 000 mg/l in het anorganische medium voordat een berekende hoeveelheid daarvan aan de 2 400 ml anorganisch medium in de 5-literkolf wordt toegevoegd om een concentratie van 30 mg/l in het uiteindelijke 3 l proefvolume te verkrijgen. Dit gaat gepaard met een grotere nauwkeurigheid. Ook andere bronnen van entmateriaal kunnen worden gebruikt (zie I.6.4.2.).De geënte mengsels worden gedurende een nacht belucht met CO2-vrije lucht zodat kooldioxyde uit het systeem wordt verwijderd.In telkens een aantal gelijke kolven worden afzonderlijk testmateriaal en referentiestof als gekende volumes voorraadoplossingen toegevoegd tot concentraties als gevolg van de toegevoegde stoffen van 10 tot 20 mg DOC of TOC/l; enkele kolven blijven zonder toevoeging van chemicaliën en dienen als controle op het entmateriaal. Slecht oplosbare teststoffen worden rechtstreeks in de kolven gebracht op basis van gewicht of volume of worden behandeld als beschreven in Bijlage III.Zonodig wordt één kolf gebruikt voor de controle op het eventuele remmende effect van de teststof waarbij zowel de teststof als de referentiestof in dezelfde concentraties als in de andere kolven worden toegevoegd.Tevens wordt indien nodig een steriele kolf gebruikt voor de controle op de eventuele niet-biologische afbraak van de teststof, waarbij een niet-geënte oplossing van de stof wordt gebruikt (zie I.6.6.). Steriliseren door toevoeging van een giftige stof met de geschikte concentratie.Het volume van de suspensies wordt in alle kolven aangevuld tot 3 l door toevoeging van anorganisch medium dat vooraf met CO2-vrije lucht is belucht. Eventueel kunnen monsters worden getrokken voor analyse van DOC (zie Bijlage II.4) en/of specifieke analyse. De absorptieflessen worden aangesloten op de luchtuitgangen van de kolven.Indien bariumhydroxyde wordt gebruikt, worden drie absorptiekolven, die elk 100 ml 0,0125 M bariumhydroxyde-oplossing bevatten, in serie op elke 5-literkolf aangesloten. De oplossing moet vrij van neergeslagen sulfaat en carbonaat zijn en de concentratie moet vlak voor gebruik worden bepaald. Indien natriumhydroxyde wordt gebruikt, worden twee vallen aangesloten, waarbij de tweede dient als controle om aan te tonen dat alle kooldioxyde in de eerste is geabsorbeerd. Bruikbaar zijn absorptiekolven die zijn voorzien van sluitingen voor serumflessen. In elke kolf wordt 200 ml 0,05 M natriumhydroxyde gebracht, welke hoeveelheid voldoende is voor het absorberen van de totale hoeveelheid kooldioxyde die bij volledige afbraak van de teststof wordt ontwikkeld. De natriumhydroxyde-oplossing zal echter, zelfs indien deze vers is bereid, sporen carbonaten bevatten; dit wordt gecorrigeerd door aftrek van het carbonaat in de blanco.IV.2.5. Aantal kolven in een doorsnee-proefKolven 1 en 2: testsuspensieKolven 3 en 4: entmateriaalblancoKolf 5: procedurecontroleen bij voorkeur en zo nodig:Kolf 6: abiotische steriele controleKolf 7: toxiciteitscontroleZie ook I.6.7.IV.2.6. Uitvoering van de testDe test wordt gestart doordat CO2-vrije lucht met een snelheid van 30-100 ml/min. door de suspensies wordt geborreld. Van tijd tot tijd worden monsters van het kooldioxyde absorberende materiaal genomen voor analyse van het CO2-gehalte. Tijdens de eerste tien dagen verdient het aanbeveling elke tweede of derde dag analyses uit te voeren en vervolgens elke vijfde dag tot de 28ste dag zodat het 10-dagen venster kan worden vastgesteld.Op de 28ste dag worden (indien van toepassing) monsters getrokken voor DOC-analyse en/of specifieke analyse, wordt de pH van de suspensies gemeten en wordt aan elke kolf 1 ml geconcentreerd zoutzuur toegevoegd; de kolven worden gedurende een nacht belucht teneinde het in de testsuspensies aanwezige kooldioxyde te verdrijven. Op dag 29 wordt de laatste analyse van vrijgekomen kooldioxyde gemaakt.Op de dagen van CO2-meting wordt de absorptiefles voor bariumhydroxyde die het dichtst bij de kolf staat, losgekoppeld en wordt de hydroxyde-oplossing getitreerd met 0,05 M HCl met fenolftale¨ une als indicator. De overige absorptieflessen worden een plaats dichter bij de kolf gebracht en er wordt een nieuwe absorptiefles met daarin 100 ml vers 0,0125 M bariumhydroxyde aan het eind van de reeks geplaatst. De titraties worden uitgevoerd wanneer dat nodig is, bij voorbeeld wanneer in de eerste val een aanzienlijke hoeveelheid neerslag wordt waargenomen en voordat er in de tweede val een duidelijke neerslag is, of ten minste wekelijks. In het andere geval wordt, wanneer NaOH absorptiemiddel is, met een spuit een klein monster (afhankelijk van de kenmerken van de gebruikte koolstof-analysator) van de natriumhydroxyde-oplossing in de absorptiefles die het dichtst bij de kolf staat, getrokken. Het monster wordt in het IC-gedeelte van het koolstofanalyse-apparaat gespoten en rechtstreeks geanalyseerd op ontwikkelde kooldioxyde.De inhoud van de tweede val wordt alleen aan het eind van de test geanalyseerd ter correctie van eventuele overdracht van kooldioxyde.IV.3. GEGEVENS EN RAPPORTAGEIV.3.1. Verwerking van de resultatenDe hoeveelheid in een absorptiefles afgevangen CO2 die wordt getitreerd komt overeen met:mg CO2 = (100 × CB  0,5 × V × CA) × 44waarin:V = volume HCl dat is gebruikt voor het titreren van de 100 ml in de absorptiefles (ml),CB = concentratie bariumhydroxyde-oplossing (M),CA = concentratie zoutzuuroplossing (M),en, indien CB 0,0125 M en CA 0,05 M is, is de getitreerde hoeveelheid voor 100 ml bariumhydroxyde 50 ml en wordt het gewicht aan CO2 gegeven door:0,052 × 44 × ml getitreerd HCl = 1,1 × ml HClIn dit geval bedraagt dus de factor voor het herleiden van het getitreerde volume HCl tot geproduceerde mg CO2 1,1.Het CO2-gewicht dat afkomstig is uit alleen het entmateriaal en dat wat afkomstig is van het entmateriaal plus de teststof worden berekend met de desbetreffende titratiewaarden en het verschil is het gewicht aan CO2 dat alleen door de teststof is geproduceerd.Indien bij voorbeeld het entmateriaal alleen een titratie van 48 ml en het entmateriaal plus teststof 45 ml geeft, dan geldt:CO2 uit entmateriaal  = 1,1 × (50-48) = 2,2 mgCO2 uit entmateriaal plus teststof  = 1,1 × (50-45) = 5,5 mgen derhalve bedraagt het gewicht aan CO2 dat door teststof is produceerd 3,3 mg.Het percentage biologische afbraak wordt berekend uit:% afbraak = ThCO2 × mg toegevoegde teststofmg CO2 geproduceerd × 100of,% afbraak = mg TOC toegevoegd in test × 3,67mg CO2 geproduceerd × 100waarbij 3,67 de omrekeningsfactor (44/12) van koolstof naar kooldioxyde is.Het percentage afbraak na elk tijdsinterval wordt verkregen door optellen van het percentage van ThCO2-waarden dat voor elk van de dagen, tot het tijdstip waarop het is gemeten, is berekend.Voor natriumhydroxyde-absorptieflessen wordt de hoeveelheid geproduceerd kooldioxyde berekend en uitgedrukt als IC (mg) door vermenigvuldiging van de concentratie IC in het absorptiemiddel met het volume van het absorptiemiddel.Het percentage afbraak wordt berekend uit:% ThCO2 = mg IC uit testkolf   mg IC uit blancomg TOC toegevoegd als teststof × 100De verwijdering van DOC (indien van toepassing) wordt berekend zoals beschreven onder 1.7. Deze en alle andere resultaten worden op het beschikbare gegevensformulier vermeld.IV.3.2. Geldigheid van de resultatenHet IC-gehalte van de suspensie van teststof in het anorganische medium aan het begin van de test moet minder dan 5 % bedragen van de TC en de totale CO2-ontwikkeling in de entmateriaal-blanco aan het eind van de test mag doorgaans niet meer dan 40 mg/l medium bedragen. Indien waarden van meer dan 70 mg CO2/l worden verkregen, dienen de gegevens en de proefopzet kritisch te worden onderzocht.Zie ook I.5.2.IV.3.3. RapportageZie I.8.IV.4. GEGEVENSFORMULIERHieronder volgt een voorbeeld van een gegevensformulier.KOOLDIOXYDE (CO2) -ONTWIKKELINGTEST1. LABORATORIUM2. DATUM AAN HET BEGIN VAN DE TEST3. TESTSTOFNaam:Concentratie voorraadoplossing: mg/l als teststofBeginconcentratie in het milieu: mg/l als teststofTotale C aan kolf toegevoegd: mg CThCO2: mg  CO24. ENTMATERIAALHerkomst:Uitgevoerde behandeling:Pre-conditionering, indien van toepassing:Concentratie van gesuspendeerde vaste stof in reactiemengsel: mg/l5. KOOLDIOXYDEPRODUKTIE EN AFBREEKBAARHEID:Methode: Ba(OH)2/NaOH/andere>RUIMTE VOOR DE TABEL>6. KOOLSTOFANALYSE (facultatief)Koolstofanalyse-apparaat: ...>RUIMTE VOOR DE TABEL>% DOC verwijderd = 1 Ct Cb(t) CoCb(o) × 1007. NIET-BIOLOGISCHE AFBRAAK (facultatief)% niet-biologische afbraak = CO2-vorming in steriele kolf na 28 dagen (mg)ThCO2 (mg) × 100DEEL V. MANOMETRISCHE RESPIROMETRIE TEST (Methode C.4-D)V.1. PRINCIPE VAN DE METHODEEen gemeten volume geënt anorganisch medium dat een bekende concentratie teststof (100 mg/l teststof die ten minste 50-100 mg ThOD/l geeft) als enige nominale bron van organische koolstof bevat, wordt gedurende ten hoogste 28 dagen in een gesloten kolf bij een constante temperatuur (± 1  C of minder) geroerd. Het gebruik aan zuurstof wordt bepaald hetzij door meten van hoeveelheid zuurstof (elektrolytisch geproduceerd) die nodig is om in de respirometerkolf een constant gasvolume te behouden, hetzij op grond van de verandering van het volume of van de druk (of een combinatie daarvan) in de apparatuur. Ontwikkelde kooldioxyde wordt geabsorbeerd in een oplossing van kaliumhydroxyde of een ander geschikt absorptiemiddel. De hoeveelheid door de teststof opgenomen zuurstof (gecorrigeerd voor opneming door de parallel behandelde blanco-entstof) wordt uitgedrukt als percentage ThOD of COD. Facultatief kunnen de primaire biologische afbraak worden berekend uit de aanvullende specifieke analyse die aan het begin en aan het einde van de incubatie wordt uitgevoerd, en de totale afbraak door DOC-analyse.V.2. BESCHRIJVING VAN DE METHODEV.2.1. Apparatuur(a) geschikte respirometer;(b) temperatuurregeling, constant op ± 1  C of beter;(c) membraan-filtratie-inrichting (facultatief);(d) koolstof analyse-apparaat (facultatief).V.2.2. Bereiding van anorganisch mediumZie voor de bereiding van de voorraadoplossingen I.6.2.10 ml van oplossing (a) wordt gemengd met 800 ml verdunningswater, daaraan wordt 1 ml van de oplossingen (b) t/m (d) toegevoegd en het geheel wordt met verdunningswater tot 1 l aangevuld.V.2.3. Bereiding en pre-conditionering van entmateriaalHet entmateriaal kan van diverse bronnen afkomstig zijn: actief slib, behandeld water, oppervlaktewater en grond of een mengsel daarvan.Zie I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. en I.6.5.V.2.4. Bereiding van de proefoplossingenOplossingen van de teststof en referentiestof worden afzonderlijk in anorganisch medium, uitgaande van voorraadoplossingen, bereid in een hoeveelheid die doorgaans overeenkomt met een concentratie van 100 mg chemische stof/l (overeenkomend met ten minste 50-100 mg ThOD/l).Het ThOD wordt berekend op basis van de vorming van ammoniumzouten, tenzij nitrificatie moet worden verwacht, in welk geval de berekening moeten worden gebaseerd op nitraatvorming (zie Bijlage II.2.).De pH-waarden worden bepaald en zonodig bijgesteld op 7,4 ± 0,2.Slecht oplosbare stoffen dienen pas in een later stadium te worden toegevoegd (zie hieronder).Indien de giftigheid van de teststof moet worden bepaald, wordt nog een oplossing in anorganisch medium bereid welke zowel de teststof als de referentiestof in dezelfde concentraties als in de afzonderlijke oplossingen bevat.Indien meting van de fysisch-chemische zuurstofopname nodig is, wordt een oplossing van de teststof die door toevoeging van een geschikte giftige stof gesteriliseerd is (zie I.6,6.) in een hoeveelheid van gewoonlijk 100 mg ThOD/l bereid.Het benodigde volume van oplossingen van de teststof en de referentiestof wordt ten minste in duplo in kolven gebracht. In volgende kolven wordt alleen anorganisch medium gebracht (voor entstof controles) en, zonodig, de gemengde oplossing van teststof en referentiestof en de steriele oplossing.Indien de teststof slecht oplosbaar is wordt deze in dit stadium rechtstreeks toegevoegd op basis van gewicht of volume of wordt deze behandeld als beschreven in Bijlage III. Aan de compartimenten van het CO2-absorptie-apparaat worden kaliumhydroxyde, natronkalkpillen of een ander absorptiemiddel toegevoegd.V.2.5. Aantal kolven in een doorsnee-proefKolven 1 en 2: testsuspensieKolven 3 en 4: entmateriaalblancoKolf 5: procedurecontrolebij voorkeur en zo nodig:Kolf 6: steriele controleKolf 7: toxiciteitscontroleZie I.6.7.V.2.6. Uitvoering van de testDe kolven worden op de gewenste temperatuur gebracht en de daartoe bestemde kolven worden geënt met bereid actief slib of een andere bron van entmateriaal tot een concentratie aan gesuspendeerde vaste stof van niet meer dan 30 mg/l. De apparatuur wordt in gereedheid gebracht, de roerder wordt aangezet, het geheel wordt gecontroleerd op luchtdichtheid en de meting van de zuurstofopname wordt gestart. Gewoonlijk is dan geen verdere aandacht nodig behalve voor de nodige aflezingen en voor de dagelijkse controle op de juiste temperatuur en het juiste roeren.De zuurstofopname wordt met behulp van de door de fabrikant van de apparatuur verstrekte methoden berekend uit de met regelmatige tussenpozen verrichte aflezingen. Aan het eind van de incubatie, gewoonlijk na 28 dagen, wordt de pH van de inhoud van de kolven gemeten, in het bijzonder indien de opgenomen hoeveelheid zuurstof lager is danwel hoger is dan ThODNH4 (voor stikstof bevattende verbindingen).Indien nodig worden aan het begin en aan het eind monsters uit de respirometerkolven genomen voor analyse van DOC of specifieke chemische stof (zie Bijlage II.4). Bij monsterneming aan het begin dient er voor te worden gezorgd dat het volume van de in de kolf achterblijvende testsuspensie bekend is. Wanneer door een N-bevattende teststof zuurstof wordt opgenomen, wordt de toename van de concentratie nitriet en nitraat in 28 dagen bepaald en wordt de correctie voor de door nitrificatie verbruikte zuurstof berekend (Bijlage V).V.3. GEGEVENS EN RAPPORTAGEV.3.1. Verwerking van de resultatenDe opgenomen hoeveelheid zuurstof (mg) van de teststof na een bepaalde tijd (die is gecorrigeerd voor de blanco entstofcontrole na dezelfde tijd) wordt gedeeld door het gewicht van de onderzochte teststof. Dit geeft het BOD die is uitgedrukt als mg zuurstof/mg teststof, d.w.z.BOD = mg O2-opname door teststof   mg O2-opname door blancomg teststof in kolf= mg O2 per mg teststof.Het percentage biologische afbraak wordt berekend hetzij uit:% biologische afbraak = % ThOD =   BOD (mg O2/mg stof)  ThOD (mg O2/mg stof) × 100,hetzij uit% COD =  BOD (mg O2/mg stof) COD (mg O2/mg stof) × 100Opgemerkt dient te worden dat deze twee methoden niet noodzakelijk dezelfde waarde geven; bij voorkeur wordt de eerstgenoemde methode gebruikt.Voor teststoffen die stikstof bevatten wordt het geschikte ThOD (NH4 of NO3) gebruikt, afhankelijk van hetgeen bekend is of verwacht wordt omtrent het optreden van nitrificatie (Bijlage II.2). Indien nitrificatie optreedt maar niet volledig is, wordt uit de verandering in concentraties nitriet en nitraat een correctie berekend voor de door de nitrificatie verbruikte zuurstof (Bijlage V).Wanneer facultatieve bepalingen van organische koolstof en/of specifieke chemische stof worden uitgevoerd, wordt het percentage afbraak berekend zoals beschreven is onder I.7.Alle resultaten worden op de bijgevoegde gegevensformulieren vermeld.V.3.2. Geldigheid van de resultatenDe hoeveelheid opgenomen zuurstof van de entmateriaalblanco bedraagt normaal 20-30 mg O2/l en mag in 28 dagen niet groter zijn dan 60 mg/l. Waarden hoger dan 60 mg/l nopen tot een kritisch onderzoek van de gegevens en de experimentele technieken. Indien de pH-waarde buiten het gebied 6-8,5 ligt en het zuurstofverbruik door de teststof minder dan 60 % bedraagt, dient de test te worden herhaald met een lagere concentratie teststof.Zie ook I.5.2.V.3.3. RapportageZie I.8.V.4. GEGEVENSFORMULIERHieronder volgt een voorbeeld van een gegevensformulier.MANOMETRISCHE RESPIROMETRIE TEST1. LABORATORIUM2. DATUM AAN HET BEGIN VAN DE TEST3. TESTSTOFNaam:Concentratie voorraadoplossing: mg/lBeginconcentratie in het milieu, Co: mg/lVolume in de testkolf (V): mlThOD stof/COD stof: mg O2/mg (NH4, NO3)4. ENTMATERIAALHerkomst:Uitgevoerde behandeling:Pre-conditionering, indien van toepassing:Concentratie van gesuspendeerde vaste stof in reactiemengsel: mg/l5. ZUURSTOFOPNAME: BIOLOGISCHE AFBREEKBAARHEID>RUIMTE VOOR DE TABEL>6. CORRECTIE VOOR NITRIFICATIE (zie Bijlage V)>RUIMTE VOOR DE TABEL>7. KOOLSTOF ANALYSE (facultatief)Koolstof analyse-apparaat: ...>RUIMTE VOOR DE TABEL>8. SPECIFIEKE CHEMISCHE ANALYSE (facultatief)Sb = concentratie in fysisch-chemische (steriele) controle na 28 dagen.Sa = concentratie in de geënte kolf na 28 dagen.% biologische afbraak = Sb   SaSb × 1009. NIET-BIOLOGISCHE AFBRAAK (facultatief)a = zuurstofverbruik in steriele kolven na 28 dagen, (mg).Zuurstofverbruik per mg teststof = CoVa (zie afdelingen 1 en 3)% niet-biologische afbraak = CoV × ThODa × 100DEEL VI. GESLOTEN-FLESTEST (Methode C.4-E)VI.1. PRINCIPE VAN DE METHODEDe oplossing van de teststof in anorganisch medium, doorgaans met een concentratie van 2-5 mg/l, wordt geënt met een betrekkelijk gering aantal micro-organismen uit een gemengde populatie en wordt bij constante temperatuur in het donker in volledig gevulde, afgesloten flessen gehouden. De afbraak wordt gevolgd door analyse van opgeloste zuurstof gedurende 28 dagen. De door de teststof opgenomen hoeveelheid zuurstof, die wordt gecorrigeerd voor de opname door de parallel onderzochte blanco voor het entmateriaal, wordt uitgedrukt als percentage ThOD of COD.VI.2. BESCHRIJVING VAN DE METHODEVI.2.1. Apparatuura) BOD-flessen met glazen stoppen, b.v. 250-350 ml;b) Waterbad of broedapparaat, voor het op constante temperatuur (± 1  C of beter) houden van de flessen, met uitsluiting van licht;c) Grote glazen flessen (2-5 l) voor de bereiding van medium en voor het aanvullen van de BOD-flessen;d) Zuurstofelektrode en meter, of apparatuur en reagentia voor Winkler-titratie.VI.2.2. Bereiding van anorganisch mediumZie voor de bereiding van de voorraadoplossing I.6.2.1 (een) ml van oplossingen (a) t/m (d) wordt gemengd en het mengsel wordt met verdunningswater tot 1 l aangevuld.VI.2.3. Bereiding van het entmateriaalHet entmateriaal is normaal afkomstig van het secundaire effluent van een zuiveringsinstallatie of een laboratoriuminstallatie die hoofdzakelijk huishoudelijk afvalwater ontvangt. Een alternatieve bron van entmateriaal is oppervlaktewater. Gewoonlijk wordt één druppel (0,05 ml) tot 5 ml filtraat per liter medium gebruikt; voorafgaandelijke proeven kunnen nodig zijn om het optimaal volume voor een gegeven effluent te bepalen (zie I.6.4.2. en I.6.5.).VI.2.4. Bereiding van de proefoplossingenAnorganisch medium wordt gedurende ten minste 20 min. krachtig belucht. Elke testreeks wordt met uit dezelfde voorraad afkomstig mineraal medium uitgevoerd. In het algemeen is het medium na 20 uur staan bij de testtemperatuur voor gebruik gereed. Ter controle wordt de concentratie opgeloste zuurstof bepaald; de waarde dient bij 20  C ongeveer 9 mg/l te zijn. Alle overbreng- en aanvulhandelingen van het met lucht verzadigde medium dienen zonder bellen, bijvoorbeeld door gebruik van hevels, te worden uitgevoerd.Voor de bepaling van de teststof en referentiestof in gelijktijdige proefseries worden parallelle groepen van BOD-flessen bereid. Een voldoende aantal BOD-flessen, waaronder entmateriaalblanco's worden gereed gemaakt zodat op de gewenste tijdstippen, bijvoorbeeld na 0, 7, 14, 21 en 28 dagen, ten minste duplo-metingen van het zuurstofgebruik kunnen worden gedaan. Om het 10-dagen venster met zekerheid te kunnen vaststellen kunnen meer flessen nodig zijn.In grote flessen wordt volledig belucht anorganisch medium gebracht, zodanig dat de flessen voor ongeveer een-derde gevuld zijn. Vervolgens wordt in afzonderlijke grote flessen zoveel van de voorraadoplossingen van de teststof en referentiestof gebracht dat de uiteindelijke concentratie van de stoffen niet meer dan ongeveer 10 mg/l is. Aan het blanco-controlemedium dat in een andere grote fles aanwezig is, wordt geen chemische stof toegevoegd.Teneinde zekerheid te geven dat de activiteit van het entmateriaal niet beperkend is, mag de concentratie opgeloste zuurstof in de BOD-flessen niet lager dan 0,5 mg/l zijn. Dit beperkt de concentratie van de teststof tot ongeveer 2 mg/l. Van slecht afbreekbare teststoffen en van teststoffen met een lage ThOD kan echter 5-10 mg/l worden gebruikt. In sommige gevallen kan het raadzaam zijn twee parallelle reeksen van de teststof bij twee verschillende concentraties, bijvoorbeeld 2 en 5 mg/l uit te voeren. Als regel wordt de ThOD op grond van de vorming van ammoniumzouten berekend, maar indien verwacht wordt of bekend is dat nitrificatie optreedt, wordt de berekening uitgevoerd op basis van de vorming van nitraat (ThODNO3: zie Bijlage II.2). Indien nitrificatie evenwel niet volledig is of niet optreedt, wordt gecorrigeerd voor de veranderingen in concentratie nitriet en nitraat, zoals door analyse is vastgesteld (zie Bijlage V).Indien de toxiciteit van de teststof moet worden onderzocht (bijvoorbeeld in het geval dat eerder een lage waarde voor de biologische afbreekbaarheid is gevonden) is een volgende reeks flessen nodig.Een volgende grote fles wordt gevuld met belucht anorganisch medium (tot ongeveer een-derde van het volume) plus teststof en referentiestof met uiteindelijke concentraties die als regel dezelfde zijn als die in de andere grote flessen.De oplossingen in de grote flessen worden met secundair effluent (een druppel of ongeveer 0,05 ml, tot 5 ml/l) of met een andere bron, zoals rivierwater geënt (zie I.6.4.2.). Tenslotte worden de oplossingen met belucht anorganisch medium tot het eindvolume aangevuld met behulp van een hevel die met het oog op een voldoende menging tot op de bodem van de fles reikt.VI.2.5. Aantal kolven in een doorsnee-proefIn een doorsneebepaling worden de volgende flessen gebruikt:ten minste 10 die teststof en entmateriaal bevatten (testsuspensie),ten minste 10 met alleen entmateriaal (entmateriaalblanco),ten minste 10 met referentiestof en entmateriaal (procedurecontrole),en, zonodig 6 flessen met teststof, referentiestof en entmateriaal (toxiciteitscontrole). Om zekerheid te geven dat het 10-dagen venster kan worden vastgesteld zal ongeveer het dubbele aantal flessen nodig zijn.VI.2.6. Uitvoering van de testElke bereide oplossing wordt met behulp van een hevel uit het onderste kwart (niet de bodem) van de desbetreffende grote fles onmiddellijk in de bijbehorende groep BOD-flessen overgebracht, zodat alle BOD-flessen volledig gevuld zijn. Er wordt zachtjes op de kolven geklopt om eventuele luchtbellen te verwijderen. De flessen van het tijdstip nul worden onmiddellijk op opgeloste zuurstof onderzocht met behulp van de Winkler-methode of met elektrodemethoden. De inhoud van de flessen kan met het oog op latere analyse via de Winkler-methode worden bewaard door toevoeging van mangaan(II)sulfaat en natriumhydroxyde (het eerste Winkler-reagens). De zorgvuldig afgesloten flessen die de zuurstof als bruin gehydrateerd mangaan(III)oxyde gefixeerd bevatten, worden gedurende niet langer dan 24 uur bij 10-20  C in het donker bewaard, voordat de overige stappen van de Winkler-methode worden uitgevoerd. De overige herhalingsflessen worden afgesloten zodanig dat er geen luchtbellen worden opgesloten en worden in het donker bij 20  C ge¨ uncubeerd. Elke reeks moet vergezeld gaan van een volledige parallelreeks voor de bepaling van het geënte blanco-medium. Voor analyse van opgelost zuurstof op gezette tijden (ten minste wekelijks) gedurende de bebroeding van 28 dagen wordt van elke reeks ten minste één duplofles genomen.Wekelijkse monsterneming is voldoende voor de bepaling van het percentage verwijdering in een 14-dagen venster, terwijl een bemonstering om de 3-4 dagen het vaststellen van een 10-dagen venster mogelijk maakt, waarbij ongeveer tweemaal zoveel flessen nodig zijn.Voor stikstof bevattende teststoffen moeten correcties voor de door eventueel optredende nitrificatie veroorzaakte zuurstofopname worden uitgevoerd. Hiertoe wordt de methode met de O2-elektrode toegepast voor de bepaling van de concentratie opgeloste zuurstof, waarna uit de BOD-fles een monster wordt genomen voor analyse van nitriet en nitraat. Uit de toename van de concentratie nitriet en nitraat wordt de gebruikte hoeveelheid zuurstof berekend (zie Bijlage V).VI.3. GEGEVENS EN RAPPORTAGEVI.3.1. Verwerking van de resultatenAllereerst wordt het BOD dat na elk tijdstip is opgetreden berekend door aftrekken van de zuurstofafname (mg O2/l) van de entmateriaal-blanco van de afname als gevolg van de teststof. Deze gecorrigeerde afname wordt gedeeld door de concentratie (mg/l) van de teststof waarbij het specifieke BOD als mg zuurstof per mg teststof wordt verkregen. Het percentage biologische afbreekbaarheid wordt berekend door het specifieke BOD door het specifieke ThOD (dat is berekend volgens Bijlage II.2) of COD (door analyse bepaald, zie Bijlage II.3) te delen, dus:BOD = mg O2 opname door teststof   mg O2 opname door blancomg teststof in de kolf= mg O2 per mg teststof.% afbraak =  BOD (mg O2/mg teststof) ThOD (mg O2/mg teststof) × 100ofwel% afbraak =  BOD (mg O2/mg teststof) COD (mg O2/mg teststof) × 100Opgemerkt dient te worden dat deze twee methoden niet dezelfde uitkomst behoeven te geven; het gebruik van de eerste methode heeft de voorkeur.Voor teststoffen die stikstof bevatten wordt het geschikte ThOD (NH4 of NO3) gebruikt, afhankelijk van hetgeen bekend is of verwacht wordt omtrent het optreden van nitrificatie (Bijlage II.2). Indien nitrificatie optreedt maar niet volledig is, wordt uit de verandering in concentraties nitriet en nitraat een correctie berekend voor de door nitrificatie verbruikte zuurstof (zie Bijlage V).VI.3.2. Geldigheid van de resultatenDe afname van de hoeveelheid zuurstof in de entmateriaal-blanco mag na 28 dagen niet meer dan 1,5 mg opgeloste zuurstof/l bedragen. Bij hogere waarden dan deze moeten de experimentele technieken worden doorgelicht. De restconcentratie zuurstof in de testflessen mag nooit minder dan 0,5 mg/l worden. Dergelijke lage zuurstofconcentraties zijn slechts geldig, indien met de methode waarmee opgeloste zuurstof wordt bepaald dergelijke concentraties nauwkeurig kunnen worden gemeten.Zie ook I.5.2.VI.3.3. RapportageZie I.8.VI.4. GEGEVENSFORMULIERHieronder volgt een voorbeeld van een gegevensformulierGESLOTEN-FLESTEST1. LABORATORIUM2. DATUM AAN HET BEGIN VAN DE TEST3. TESTSTOFNaam:Concentratie voorraadoplossing: mg/lBeginconcentratie in de fles: mg/lThOD/COD: mg O2/mg teststof4. ENTMATERIAALHerkomst:Uitgevoerde behandeling:Pre-conditionering, indien van toepassing:Concentratie in reactiemengsel: ml/l5. DO-BEPALINGMethode: Winkler/elektrode>RUIMTE VOOR DE TABEL>6. CORRECTIE VOOR NITRIFICATIE (zie Bijlage V)>RUIMTE VOOR DE TABEL>7. DO-AFNAME: % AFBRAAK>RUIMTE VOOR DE TABEL>mto = waarde in de testkolf op tijdstip 0mtx = waarde in de testkolf op tijdstip xmbo = gem. blanco waarde op tijdstip 0mbx = gem. blanco waarde op tijdstip xOok de correctie voor nitrificatie uit iii+vi in afdeling 6 dient te worden toegepast.8. BLANCO DO AFNAMEZuurstofverbruik door blanco: (mbo   mb28) mg/l. Dit verbruik is van belang voor de geldigheid van de test. Het dient minder dan 1,5 mg/l te zijn.DEEL VII. M.I.T.I.-TEST (Methode C.4-F)VII.1. PRINCIPE VAN DE METHODEDe zuurstofopname door een geroerde oplossing of suspensie van de teststof in een anorganisch medium dat met speciaal gekweekte, niet-aangepaste micro-organismen is geënt, wordt automatisch gedurende 28 dagen bij 25 ± 1  C in een verduisterde, afgesloten respirometer automatisch gemeten. Het vrijkomende kooldioxyde wordt door natronkalk geabsorbeerd. De biologische afbreekbaarheid wordt uitgedrukt als het percentage zuurstofopname (gecorrigeerd voor opname door de blanco) van de theoretische opname (ThOD). Het percentage primaire biologische afbreekbaarheid wordt ook berekend uit een aanvullende specifieke chemische analyse die aan het begin en aan het eind van de incubatie wordt uitgevoerd en verder, naar keuze, door middel van DOC-analyse.VII.2. BESCHRIJVING VAN DE METHODEVII.2.1. Apparatuura) Automatische elektrolytische BOD-meter of respirometer, doorgaans uitgerust met 6 flessen, met elk 300 ml en voorzien van kommetjes die het absorptiemiddel voor CO2 bevatten;b) Kamer met constante temperatuur en/of waterbad van 25  C ± 1  C of beter;c) Membraanfiltratie-eenheid (facultatief);d) Koolstof-analysator (facultatief).VII.2.2. Bereiding van anorganisch mediumDe volgende voorraadoplossingen worden uitgaande van reagentia van analytische kwaliteit en water (I.6.1.) bereid:(a) Monokaliumdiwaterstoforthofosfaat, KH2PO4 8,50 gDikaliummonowaterstoforthofosfaat, K2HPO4 21,75 gDinatriummonowaterstoforthofosfaat-dodecahydraat Na2HPO412 H2O 44,60 gAmmoniumchloride, NH4Cl 1,70 gDeze stoffen worden in water opgelost en de oplossingwordt tot 1 liter aangevuld.De pH-waarde van de oplossing dient 7,2 te zijn.(b) Magnesiumsulfaat-heptahydraat, MgSO47 H2O 22,50 gwordt in water opgelost en tot 1 liter aangevuld.(c) Calciumchloride, watervrij, CaCl2 27,50 gwordt in water opgelost en tot 1 liter aangevuld(d) IJzer(III)chloride-hexahydraat, FeCl3. 6 H2O 0,25 gwordt in water opgelost en tot 1 liter aangevuldVan elke oplossing (a), (b), (c) en (d) wordt 3 ml genomen en er wordt tot 1 liter aangevuld.VII.2.3. Bereiding van entmateriaalVerse monsters worden verzameld op niet minder dan 10 lokaties, voornamelijk in gebieden waar uiteenlopende chemicaliën worden gebruikt en geloosd. Van plaatsen zoals rioolwaterzuiveringsinstallaties, behandelingsinstallaties voor industrieel afvalwater, rivieren, plassen en zeeën worden monsters van 1 liter slib, oppervlaktebodem, water e.d. verzameld en grondig dooreen gemengd. Na verwijdering van drijvend materiaal en bezinking wordt de bovenstaande vloeistof met natriumhydroxyde of fosforzuur op pH 7 ± 1 gebracht.Van de gefiltreerde bovenstaande vloeistof wordt een voldoende volume genomen voor het vullen van een actief-slib-tank van het vul-en-loop-type en de vloeistof wordt ongeveer 23,5 uur belucht. Dertig minuten na beëindigen van de beluchting wordt ongeveer eenderde van het gehele volume van de bovenstaande vloeistof verwijderd en wordt een gelijk volume van een oplossing (pH 7) die telkens 0,1 % glucose, pepton en monokaliumorthofosfaat bevat aan het bezonken materiaal toegevoegd waarna de beluchting wordt hervat. Deze procedure wordt eenmaal per dag herhaald. De slibeenheid dient volgens een verantwoorde praktijk te worden gebruikt: effluenten moeten helder zijn, de temperatuur bedraagt 25 ± 2  C , de pH 7 ± 1, slib bezinkt goed, er is voldoende beluchting om het mengsel te allen tijde aëroob te houden, er zijn protozoën aanwezig en de activiteit van het slib wordt ten minste elke drie maanden ten opzichte van een referentiestof getest. Het slib wordt niet eerder als entmateriaal gebruikt dan na een werking van ten minste één maand, maar ook niet meer dan na vier maanden. Daarna wordt op gezette tijden, elke drie maanden, een monster van ten minste 10 lokaties genomen.Teneinde vers en oud slib op dezelfde activiteit te houden wordt de gefiltreerde bovenstaande vloeistof van een in gebruik zijnd actief slib gemengd met een gelijk volume van de gefiltreerde bovenstaande vloeistof van een vers uit tien bronnen verzameld mengsel en wordt de verenigde vloeistof als boven gekweekt. 18-24 uur nadat de eenheid is gevoed wordt slib als entmateriaal genomen.VII.2.4. Bereiding van de proefoplossingenDe volgende zes kolven worden bereid:Nr. 1: teststof in verdunningswater, 100 mg/lNr. 2, 3 en 4: teststof in anorganisch medium, 100 mg/lNr. 5: referentiestof (b.v. aniline) in anorganische medium, 100 mg/lNr. 6: alleen anorganisch mediumSlecht oplosbare teststoffen worden rechtstreeks op basis van gewicht of volume toegevoegd of behandeld als beschreven in Bijlage III, met dien verstande dat er geen oplosmiddelen of emulgeermiddelen worden gebruikt. In alle kolven wordt in daarvoor bestemde kommetjes absorptiemiddel voor CO2 gebracht. De pH in de kolven nrs. 2, 3 en 4 wordt op 7,0 ingesteld.VII.2.5. Uitvoering van de testDe kolven nrs. 2, 3 en 4 (testsuspensies), nr. 5 (activiteitscontrole) en nr. 6 (entmateriaal-blanco) worden geënt met een klein volume entmateriaal tot een concentratie van 30 mg/l gesuspendeerde vaste stof. Aan de kolf 1, die dient als niet-biologische controle, wordt geen entmateriaal toegevoegd. De apparatuur wordt gemonteerd, de luchtdichtheid wordt gecontroleerd, de roerders worden aangezet en de meting van de zuurstofopname in het donker wordt begonnen. De temperatuur, de roerder en het coulometrische registratie-apparaat voor zuurstofopname worden dagelijks gecontroleerd en eventuele kleurverandering van de inhoud van de kolven wordt genoteerd. De opgenomen hoeveelheid zuurstof voor de zes kolven wordt rechtstreeks, met een geschikte methode afgelezen, b.v. van het zes-punts papierregistratie-apparaat, waaruit een BOD-kromme voortkomt. Aan het eind van de incubatie, gewoonlijk 28 dagen, wordt de pH van de inhoud van de kolven gemeten en worden de concentraties van de resterende teststof en van eventueel tussenprodukt en, in geval van wateroplosbare teststof, de concentratie DOC bepaald (Bijlage II.4). In geval van vluchtige stoffen wordt bijzondere zorgvuldigheid betracht. Indien nitrificatie wordt verwacht, worden zo mogelijk de nitraat- en nitrietconcentratie bepaald.VII.3. GEGEVENS EN RAPPORTAGEVII.3.1. Verwerking van de resultatenDe door de teststof na een gegeven tijdsduur opgenomen hoeveelheid zuurstof (mg), die is gecorrigeerd voor de door de blanco-controle van het entmateriaal in dezelfde tijd opgenomen hoeveelheid, wordt gedeeld door het gewicht van de gebruikte teststof. Dit geeft het BOD, uitgedrukt als mg zuurstof/mg teststof, d.w.z.:BOD = mg O2 opname door teststof   mg O2 opname door blancomg teststof in kolf = mg O2/mg teststof.Het percentage biologische afbraak wordt dan verkregen uit:% biologische afbraak = % ThOD =   BOD (mg O2/mg stof)  ThOD (mg O2/mg stof) × 100Voor mengsels wordt het ThOD berekend uit elementairanalyse, net als voor een eenvoudige verbinding. Al naar gelang nitrificatie afwezig danwel volledig is (Bijlage II.2) wordt het bijbehorende ThOD (ThODNH4 of ThODNO3) gebruikt. Indien echter nitrificatie optreedt maar niet volledig is, wordt een correctie aangebracht voor de door nitrificatie verbruikte hoeveelheid zuurstof die is berekend uit de veranderingen in concentraties nitriet en nitraat (Bijlage V).Het percentage primaire biologische afbraak wordt berekend uit het verlies aan specifieke (moeder)stof (zie I.7,2).Dt = Sb   SaSb × 100 %Indien er in kolf nr. 1, waar fysisch-chemische verwijdering wordt gemeten, een verlies aan teststof is geweest, wordt dit gerapporteerd en wordt de concentratie teststof (Sb) na 28 dagen in deze kolf gebruikt voor het berekenen van het percentage biologische afbraak.Wanneer bepalingen van de DOC worden uitgevoerd (naar keuze), wordt het percentage uiteindelijke biologische afbraak berekend uit:Dt = 1 Ct Cbt Co Cbo × 100zoals beschreven onder punt I.7.1. Als er verlies aan DOC in kolf nr. 1, waarin fysisch-chemische verwijdering wordt gemeten, is geweest, wordt de DOC-concentratie in deze kolf gebruikt voor het berekenen van het percentage biologische afbraak.Alle resultaten worden op de bijgaande gegevensformulieren geregistreerd.VII.3.2. Geldigheid van de resultatenDe zuurstofopname door de entmateriaal-blanco bedraagt normaal 20-30 mg O2/l en mag over 28 dagen niet meer zijn dan 60 mg/l. Hogere waarden dan 60 mg/l betekenen dat de gegevens en experimentele technieken moeten worden getoetst. Indien de pH-waarde buiten het gebied van een 6-8,5 ligt en het zuurstofverbruik door de teststof minder dan 60 % bedraagt, dient de test met een lagere concentratie teststof te worden herhaald.Zie ook I.5.2.Indien het percentage afbraak van aniline dat is berekend uit het zuurstofgebruik na 7 dagen niet meer dan 40 % en na 14 dagen niet meer dan 65 % bedraagt, wordt de test als ongeldig beschouwd.VII.3.3. RapportageZie I.8.VII.4. GEGEVENSFORMULIERHieronder volgt een voorbeeld van een gegevensformulierMITI (I) TEST1. LABORATORIUM2. DATUM AAN HET BEGIN VAN DE TEST3. TESTSTOFNaam:Concentratie voorraadoplossing: mg/l als teststofBeginconcentratie in het milieu, Co: mg/l als teststofVolume reactiemengsel, V: mlThOD: ... mg O2/l4. ENTMATERIAALVerzamelingsplaatsen van slib:1) ...2) ...3) ...4) ...5) ...6) ...7) ...8) ...9) ...10) ...Concentratie gesuspendeerde vaste stof in actief slib na acclimatisering met synthetisch rioolwater = ...mg/lVolume actief slib per liter eindmedium  = ...mlConcentratie slib in eindmedium = ... mg/l5. ZUURSTOFOPNAME: BIOLOGISCHE AFBREEKBAARHEIDGebruikt type respirometer:>RUIMTE VOOR DE TABEL>6. KOOLSTOFANALYSE (facultatief)Koolstofanalyse-apparaat:>RUIMTE VOOR DE TABEL>% DOC verwijderd: a   (b   c)a × 1007. GEGEVENS UIT DE SPECIFIEKE CHEMISCHE ANALYSE>RUIMTE VOOR DE TABEL>% afbraak = Sb   SaSb × 100Berekend wordt het % afbraak, respectievelijk voor kolven a1, a2 en a3.8. OPMERKINGDe kromme van het BOD tegen de tijd wordt, indien beschikbaar, bijgevoegd.BIJLAGE IAFKORTINGEN EN DEFINITIESDO: Opgeloste zuurstof (mg/l) is de concentratie zuurstof die is opgelost in een waterig medium.BOD: (BZV), biochemisch zuurstofverbruik (g) is de hoeveelheid zuurstof die door micro-organismen wordt verbruikt bij het metaboliseren van een test- verbinding; wordt ook uitgedrukt als g zuurstofopname per g testverbinding (zie methode C.5).COD: (CZV), chemisch zuurstofverbruik (g) is de hoeveelheid zuurstof die tijdens oxydatie van een testverbinding met warm, zuur dichromaat wordt verbruikt; het biedt een maat van de aanwezige hoeveelheid oxydeerbaar materiaal; wordt ook uitgedrukt als g zuurstof verbruikt per g testverbinding (zie methode C.6).DOC: Opgeloste organische koolstof is de organische koolstof die in de oplossing aanwezig is of die of door een filter van 0,45 micrometer gaat of na centrifugeren bij 40 000 m.s 2 (± 4 000 g) gedurende 15 min., in de vloeistof blijft.ThOD: Theoretisch zuurstofverbruik (mg) is de totale hoeveelheid zuurstof die nodig is om een chemische stof volledig te oxyderen; het wordt berekend op basis van de molecuulformule (zie Bijlage II.2) en wordt ook uitgedrukt als mg zuurstof die nodig is per mg testverbinding.ThCO2: Theoretische hoeveelheid kooldioxyde (mg) is de hoeveelheid kooldioxyde die volgens berekening uit het bekende of gemeten koolstof gehalte van de testverbinding wordt geproduceerd, wanneer deze volledig wordt gemineraliseerd; wordt ook uitgedrukt als mg kooldioxyde ontwikkeld per mg testverbinding.TOC: Totale organische koolstof van een monster is de som van de hoeveelheid organische koolstof in oplossing en in suspensie.IC: Anorganische koolstoff.TC: Totale koolstof is de som van de in een monster aanwezige organische en anorganische koolstof.Primaire biologische afbraak:is de wijziging in de chemische structuur van een stof als gevolg van een biologisch proces, hetgeen leidt tot verlies van een bepaalde eigenschap van de stof.Uiteindelijke biologische afbraak (aëroob):is de mate van afbraak die wordt verkregen wanneer de testverbinding volledig door micro-organismen wordt omgezet tot kooldioxyde, water, anorganische zouten en nieuwe microbiële celbestanddelen (biomassa).Gemakkelijk biologisch afbreekbaar:een arbitraire indeling van chemische stoffen die bepaalde schiftingsproeven op uiteindelijke biologische afbreekbaarheid hebben doorstaan; deze proeven zijn zo streng dat geacht wordt dat dergelijke verbindingen in aquatisch milieu onder aërobe omstandigheden snel en volledig biologisch worden afgebroken.Inherent biologisch afbreekbaar:een indeling van chemische stoffen waarvoor welke erkende proef op biologische afbreekbaarheid dan ook een ondubbelzinnig bewijs van biologische afbraak (primair of uiteindelijk) levert.Behandelbaarheid:is de geschiktheid van verbindingen tot verwijdering gedurende biologische afvalwaterbehandeling zonder nadelige invloed op de normale werking van de behandelingsprocessen. In het algemeen zijn gemakkelijk biologische afbreekbare verbindingen behandelbaar, maar geldt dat niet voor alle inherent biologisch afbreekbare verbindingen. Niet-biologische processen kunnen ook optreden.Aanlooptijdis de duur vanaf de enting in een afvlakkingstest, totdat het percentage afbraak tot ten minste 10 % is gestegen. De aanlooptijd is vaak sterk variabel en slecht reproduceerbaar.Afbraaktijdis de tijd van het eind van de aanlooptijd tot het tijdstip dat 90 % van de maximale afbraak is bereikt.10-dagen vensteris de periode van 10 dagen onmiddellijk na het bereiken van 10 % afbraak.BIJLAGE IIBEREKENING EN BEPALING VAN GESCHIKTE TOTAAL PARAMETERSAfhankelijk van de gekozen methode zijn bepaalde totaalparameters nodig. In dit gedeelte wordt de herleiding van deze waarden beschreven. Het gebruik van deze parameters wordt bij de afzonderlijke methoden beschreven.1. Koolstof gehalteHet koolstof gehalte wordt berekend uit de bekende elementaire samenstelling of bepaald aan de hand van elementair analyse van de teststof.2. Theoretisch zuurstofverbruik (ThOD)Het theoretische zuurstofverbruik (ThOD) kan worden berekend indien de elementaire samenstelling bekend is of door elementair analyse is bepaald. Voor de verbinding met samenstelling:CcHhClclNnNanaOoPpSsis dit zonder nitrificatie,ThODNH4 = 16 (2 c + 1/2 (h cl 3 n) + 3 s + 5/2 p + 1/2 na o)MW mg/mgof net nitrificatie,ThODNO3 = 16 (2 c + 1/2 (h cl) + 5/2 n + 3 s + 5/2 p + 1/2 na o)MW mg/mg3. Chemisch zuurstofverbruik (COD)Het chemisch zuurstofverbruik (COD) wordt bepaald volgens methode C.6.4. Opgeloste organische koolstof (DOC)Opgeloste organische koolstof (DOC) is per definitie de organische koolstof van een chemische stof of een mengsel in water dat door een filter van 0,45 micrometer gaat.Uit de testvaten worden monsters getrokken en deze worden onmiddellijk met een geschikt membraanfilter in het filtreerapparaat gefiltreerd. De eerste 20 ml (bij gebruik van kleine filters kan deze hoeveelheid worden verminderd) van het filtraat wordt verwijderd. Hoeveelheden van 10-20 ml, of minder in geval van injectie (volume afhankelijk van de voor de koolstof analysator benodigde hoeveelheid), worden apart gehouden voor koolstof analyse. De DOC-concentratie wordt bepaald met behulp van een analyse-apparaat voor organische koolstof, waarmee een koolstofconcentratie die overeenkomt met of kleiner is dan 10 % van de oorspronkelijke, in de test gebruikte DOC-concentratie nauwkeurig kan worden gemeten.Gefiltreerde monsters die niet op dezelfde werkdag kunnen worden geanalyseerd kunnen worden bewaard, gedurende 48 uur in een koelkast bij 2-4  C, of gedurende langere tijden beneden  18 C.Opmerkingen:Menbraanfilters zijn met het oog op hydrofilisering vaak ge¨ umpregneerd met oppervlakte-actieve stoffen. Een dergelijk filter kan derhalve enkele mg oplosbare organische koolstof bevatten die kunnen storen bij de bepalingen van de biologische afbreekbaarheid. Oppervlakte-actieve stoffen en andere oplosbare organische verbindingen worden uit de filters verwijderd doordat deze driemaal telkens een uur in gede¨ uoniseerd water worden uitgekookt. De filters kunnen dan gedurende een week in water worden bewaard. Indien er eenmalige filterpatronen worden gebruikt, moet elke partij worden gecontroleerd op het niet-afgeven van oplosbare organische koolstof.Afhankelijk van het type membraanfilter kan de teststof door adsorptie worden vastgehouden. Het kan daarom raadzaam zijn na te gaan dat de teststof niet door het filter wordt vastgehouden.Centrifugeren bij 40 000 m.sec 2 (4 000 g) gedurende 15 min. kan worden toegepast in plaats van filtratie, voor het onderscheid tussen TOC en DOC. Bij een beginconcentratie van RUIMTE VOOR DE TABEL>Borax (0,05 mol.l 1) + NaOH (0,1 mol.l 1)>RUIMTE VOOR DE TABEL>