CELEX: 31991D0180
Language: fr
Date: 1991-02-14 00:00:00
Title: 91/180/CEE: Décision de la Commission, du 14 février 1991, arrêtant certaines méthodes d'analyse et de test du lait cru et du lait traité thermiquement

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31991D0180

91/180/CEE: Décision de la Commission, du 14 février 1991, arrêtant certaines méthodes d'analyse et de test du lait cru et du lait traité thermiquement  

Journal officiel n° L 093 du 13/04/1991 p. 0001 - 0048 édition spéciale finnoise: chapitre 3 tome 37 p. 0012  édition spéciale suédoise: chapitre 3 tome 37 p. 0012 

DÉCISION DE LA COMMISSION du 14 février 1991 arrêtant certaines méthodes d'analyse et de test du lait cru et du lait traité thermiquement (91/180/CEE) LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,  vu le traité instituant la Communauté économique européenne,  vu la directive 85/397/CEE du Conseil, du 5 août 1985, concernant les problèmes sanitaires et de police sanitaire lors d'échanges intracommunautaires de lait traité thermiquement (1), modifiée en dernier lieu par la directive 89/662/CEE (2), et  notamment son article 10 paragraphe 2,  considérant que, selon l'article 10 paragraphe 2 de la directive 85/397/CEE, la Commission arrête les méthodes d'analyse et de test à utiliser afin de contrôler le respect des normes relatives au lait cru et au lait traité thermiquement;  considérant que, pour le lait cru, il importe d'arrêter notamment des méthodes permettant de déterminer la teneur en germes, la teneur en cellules, le point de congélation et la présence d'antibiotiques;  considérant que, pour le lait pasteurisé, il importe d'arrêter notamment des méthodes permettant de déterminer l'absence de germes pathogènes, le nombre de coliformes, la teneur en germes, l'absence de phosphatase, la présence de péroxydase, l'absence  d'antibiotiques et le point de congélation;  considérant que, pour le lait stérilisé et le lait «à ultra haute température» (UHT), il importe d'arrêter notamment des méthodes permettant de déterminer la teneur en germes et l'absence d'antibiotiques;  considérant que, pour des raisons techniques, il convient dans une première étape d'arrêter des méthodes de référence d'analyse et de test visant à assurer le respect de certaines normes; qu'il importe en particulier de poursuivre l'examen des  conditions d'utilisation des méthodes de routine, d'analyse et de test; que, dans l'attente du résultat de cet examen, il incombe aux autorités compétentes de veiller à ce que soient utilisées des méthodes de routine appropriées aux fins du respect des  normes de la directive 85/397/CEE;   considérant que la détermination des méthodes de référence, d'analyse et de test comprend la détermination des procédés d'analyse et de critères de fidélité afin d'assurer une interprétation uniforme des résultats;  considérant que les mesures prévues à la présente décision sont conformes à l'avis du comité vétérinaire permanent,  A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DÉCISION:  Article premier Les procédés de référence, d'analyse et de test pour le lait cru sont les suivants:  - détermination du point de congélation,  - dénombrement des micro-organismes - teneur en germes à 30 oC,  - dénombrement des cellules somatiques,  - détection des antibiotiques et des sulfamides.  Article 2 Les procédés de référence, d'analyse et de test pour le lait pasteurisé sont les suivants:  - détermination du point de congélation,  - détermination de l'activité phosphatasique,  - détermination de l'activité peroxydasique,  - dénombrement des micro-organismes - teneur en germes à 30 oC,  - dénombrement des micro-organismes - teneur en germes à 21 oC,  - dénombrement des coliformes - comptage des colonies à 30 oC,  - détection des antibiotiques et des sulfamides,  - détection de micro-organismes pathogènes.  Article 3 Les procédés de référence, d'analyse et de test pour le lait UHT et le lait stérilisé sont les suivants:  - détermination du point de congélation,  - dénombrement des micro-organismes - teneur en germes à 30 oC,  - détection des antibiotiques et des sulfamides.  Article 4 La mise en oeuvre des procédés de référence d'analyse et de test, la détermination des critères de fidélité à retenir et la collecte des échantillons doivent s'effectuer selon les règles fixées à l'annexe I.  Article 5 Les procédés de référence d'analyse et de test mentionnés aux articles 1er, 2 et 3 sont décrits à l'annexe II.  Article 6 La présente décision est réexaminée avant le 31 décembre 1992 afin de tenir compte de l'évolution des connaissances scientifiques et techniques.  Article 7 Les États membres sont destinataires de la présente décision.  Fait à Bruxelles, le 14 février 1991. Par la Commission Ray MAC SHARRY Membre de la Commission (1) JO no L 226 du 24. 8. 1985, p. 13.(2)  JO no L 395 du 30. 12. 1989, p. 13.   ANNEXE I     TABLE DES MATIÈRES  Page II.  Dispositions générales .  4 II.  Échantillonnage du lait cru et du lait traité thermiquement  .  6 I. DISPOSITIONS GÉNÉRALES  1.  Introduction Les dispositions générales concernent les réactifs, le matériel, l'expression des résultats, les critères de fidélité et les rapports d'analyse. Les autorités compétentes des États membres et les laboratoires chargés des prélèvements et des analyses du  lait sont tenus de respecter ces dispositions.  2.  Réactifs 2.1.  Eau 2.1.1.  Sauf indication contraire, l'eau utilisée pour les opérations de solution, de dilution ou de rinçage doit obligatoirement être de l'eau distillée, de l'eau déionisée ou de l'eau déminéralisée de pureté au moins équivalente. Pour les analyses  microbiologiques, elle doit être exempte de substances susceptibles d'affecter ou d'influencer la croissance de micro-organismes dans les conditions opératoires décrites.  2.1.2.  Par «solution» ou «dilution» sans autre précision on entend «solution dans l'eau» ou «dilution avec de l'eau».  2.2.  Produits chimiques Sauf indication contraire, tous les produits chimiques utilisés doivent être de qualité analytique reconnue.  3.  Matériel 3.1.  Liste du matériel La liste du matériel donnée dans les différents procédés de référence concerne le matériel à usage spécifique et présentant des caractéristiques particulières.  3.2.  Balance analytique Par balance analytique, on entend une balance capable de peser à 0,1 mg près.  4.  Expression des résultats 4.1.  Résultats Sauf indication contraire, le résultat figurant dans le rapport d'analyse doit être la moyenne arithmétique de deux essais respectant le critère de répétabilité (5.1) fixé pour la méthode en question. Si le critère de répétabilité n'est pas rempli,  l'essai doit être répété dans la mesure du possible ou le résultat doit être invalidé.  4.2.  Calcul du pourcentage Sauf indication contraire, le résultat doit être calculé en pourcentage en masse de l'échantillon.  5.  Critères de fidélité: répétabilité et reproductibilité 5.1.  Les critères de fidélité figurant dans chaque procédé se définissent comme suit:  5.1.1.  La répétabilité (r) est la valeur au-dessous de laquelle se situe la valeur absolue de la différence entre deux résultats individuels obtenus avec le même procédé sur un produit identique dans les mêmes conditions (même analyste, même appareillage, même  laboratoire et court intervalle de temps).  5.1.2.  La reproductibilité (R) est la valeur au-dessous de laquelle se situe la valeur absolue de la différence entre deux résultats individuels obtenus avec le même procédé sur un produit identique dans des conditions différentes (analystes différents,  appareillages différents, laboratoires différents et/ou intervalles de temps différents).  5.1.3.  Sauf indication contraire, les valeurs de répétabilité et de reproductibilité figurant dans les paragraphes concernés de chaque procédé sont exprimées au niveau de probabilité de 95 % selon la norme ISO 5725: 2e édition 1986. Elles sont calculées sur la  base des résultats d'essais circulaires reconnus réalisés dans le but d'évaluer les méthodes. Certaines méthodes n'ont toutefois pas fait l'objet d'essais circulaires. Dans ce cas, les valeurs de répétabilité et de reproductibilité sont des valeurs  estimées.  5.1.4 Les essais circulaires et les études visés au point 5.1.3. devraient être planifiés et réalisés conformément aux orientations internationales.  6.  Rapport d'analyse Le rapport d'analyse doit préciser le procédé utilisé et les résultats obtenus. Il doit, en outre, mentionner tous les détails opératoires non spécifiés dans la méthode d'analyse ou facultatifs, ainsi que toutes les circonstances ayant pu influencer les  résultats. Le rapport d'analyse doit comporter toutes les informations permettant une identification complète de l'échantillon.  II. ÉCHANTILLONNAGE DU LAIT CRU ET DU LAIT TRAITÉ THERMIQUEMENT  1.  Objet et domaine d'application La présente norme décrit le procédé de référence d'échantillonnage du lait cru et du lait traité thermiquement. Cette dernière, tout comme les procédés de transport et de conservation des échantillons, s'applique au lait cru livré par les producteurs  ainsi qu'au lait cru et au lait traité thermiquement conservés dans les cuves de stockage et les citernes de transport.  Les procédés visés aux points 2, 4.4, 5 et 6 s'appliquent à l'échantillonnage du lait traité thermiquement destiné à la consommation directe.  2.  Considérations d'ordre général L'échantillonnage du lait cru et du lait traité thermiquement contenus dans des bidons, citernes, etc., doit être effectué par une personne autorisée ayant reçu une formation adéquate avant de procéder à l'échantillonnage.  S'ils le jugent nécessaire, les autorités compétentes ou le laboratoire d'analyse enseigneront les techniques d'échantillonnage au personnel chargé de l'échantillonnage afin d'être sûr que l'échantillon soit représentatif et conforme à l'ensemble du  lot.  S'ils le jugent nécessaire, les autorités compétentes ou le laboratoire d'analyse apprendront la façon de marquer l'échantillon au personnel chargé de l'échantillonnage afin que l'identification de l'échantillon soit incontestée.  3.  Équipement destiné à l'échantillonnage 3.1.  Généralités L'équipement pour l'échantillonnage doit non seulement être fabriqué en acier inoxydable ou en tout autre matériau approprié présentant la résistance voulue, mais être construit en fonction de l'utilisation prévue (mélange, échantillonnage, etc.). Les  plongeurs et les agitateurs destinés à mélanger les liquides dans les récipients doivent avoir une surface suffisante pour permettre un mélange approprié du produit sans entraîner le développement d'un goût de rance. Les louches doivent être pourvues  d'un manche solide d'une longueur suffisante pour prélever des échantillons à n'importe quelle profondeur dans le récipient. La capacité de la louche doit être d'au moins 50 ml.  Les récipients pour échantillons ainsi que leurs couvercles doivent être en verre, en métal ou en plastique approprié.  Les matériaux entrant dans la fabrication du matériel destiné à l'échantillonnage (récipients et couvercles y compris) ne doivent entraîner aucune modification de l'échantillon susceptible d'influencer les résultats des analyses. Le matériel lui-même et  les récipients destinés aux échantillons doivent présenter une surface propre, sèche, lisse et sans crevasses, ainsi que des angles arrondis.  3.2.  Matériel d'échantillonnage pour analyse microbiologique Le matériel d'échantillonnage (récipients y compris) doit respecter les dispositions du point 3.1 et être stérile.  Lorsque le même matériel sert à plusieurs échantillonnages, il doit être nettoyé et stérilisé après chaque échantillonnage conformément aux instructions ou exigences du laboratoire d'analyse ou de l'autorité compétente, de manière à ne pas influencer  les résultats des différentes analyses successives.  4.  Procédé d'échantillonnage 4.1.  Généralités Quelle que soit l'analyse à effectuer, avant le prélèvement, le lait doit être convenablement mélangé par un moyen manuel ou mécanique.  L'échantillon doit être prélevé immédiatement après le mélange alors que le lait est encore en mouvement.  Lorsque plusieurs échantillons de lait en citerne sont prélevés en même temps pour différents essais, l'échantillon destiné à l'analyse microbiologique doit être prélevé en premier.  Le volume de l'échantillon doit être en rapport avec les besoins de l'analyse. La capacité des récipients utilisés doit être telle que les récipients soient presque complètement remplis par l'échantillon, tout en permettant un bon mélange du contenu  avant l'analyse, mais en évitant le barattage durant le transport.  4.2 Échantillonnage manuel 4.2.1.  Prélèvement dans des seaux à lait et des bidons Pour obtenir rapidement l'agitation voulue, remuer le plongeur de haut en bas dans le seau ou le bidon en veillant à ce que le lait soit bien mélangé et à ce que la crème n'adhère pas au goulot du bidon. Prélever un échantillon représentatif de  l'ensemble du lot conformément au point 4.2.4.  4.2.2.  Prélèvement dans des cuves réfrigérées à la ferme Agiter mécaniquement ou manuellement le lait jusqu'à obtention d'une homogénéité suffisante.  Si le volume du lait ne permet pas l'emploi d'un agitateur mécanique, agiter manuellement.  4.2.3.  Prélèvement dans la cuve de mesure Il est essentiel que le lait soit bien mélangé lorsqu'on le verse dans la cuve de mesure. Il peut être nécessaire de compléter le mélange par une agitation manuelle ou mécanique, afin d'obtenir une répartition homogène de la matière grasse. Lorsque le  volume du lot à échantillonner dépasse la capacité de la cuve de mesure, prélever un échantillon représentatif de la totalité du lot conformément au point 4.2.4.  4.2.4.  Échantillonnage d'un lot divisé Lorsque la quantité de lait à échantillonner se trouve répartie dans plusieurs récipients, prélever une quantité représentative dans chaque récipient et noter la quantité de lait à laquelle chaque échantillon correspond. À moins que les échantillons  provenant de chaque récipient ne doivent être soumis à des analyses séparées, mélanger des portions de ces quantités représentatives, proportionellement à la quantité se trouvant dans le récipient dans lequel chaque échantillon a été prélevé. Après  avoir mélangé, prélever un (ou plusieurs) échantillon(s) de ces quantités proportionnelles.  4.2.5.  Prélèvement dans de grands récipients - cuves de stockage, camions-citernes et wagons-citernes 4.2.5.1.  Mélanger le lait selon un procédé approprié avant de procéder à l'échantillonnage.  Pour mélanger le contenu des grands récipients, des cuves de stockage, des camions-citernes ou des wagons-citernes, l'agitation mécanique est conseillée (4.2.5.2).  La durée du mélange dépend de la période pendant laquelle on a laissé reposer le lait. Il doit avoir été prouvé que le procédé de mélange appliqué dans chaque cas particulier est bien approprié aux besoins de l'analyse envisagée; l'efficacité du mélange  influence considérablement la similitude des résultats d'analyses effectuées sur des échantillons prélevés soit en différents endroits du lot, soit à la sortie de la cuve à intervalles réguliers pendant la vidange. Le mode de mélange du lait (lait cru  ou lait entier) est efficace si la différence de la teneur en matière grasse entre deux échantillons, prélevés dans ces conditions, est inférieure à 0,1 %.  Dans un grand récipient pourvu d'un trou de vidange à la partie inférieure, il peut y avoir, au point d'évacuation, une petite quantité de lait non représentative de l'ensemble du contenu même après mélange. C'est pourquoi il est préférable de prélever  les échantillons par un trou d'homme. En cas de prélèvement des échantillons au trou de vidange, laisser s'écouler une quantité de lait suffisante pour assurer la représentativité des échantillons.  4.2.5.2.  Le mélange du contenu des grands récipients ou des cuves de stockage, des camions-citernes et des wagons-citernes peut s'effectuer:  - au moyen d'un agitateur mécanique placé dans le réservoir et entraîné par un moteur électrique,  - au moyen d'une hélice ou d'un agitateur entraîné par un moteur électrique et placé dans le trou d'homme, l'agitateur étant suspendu dans le lait,  - dans le cas des camions ou wagons-citernes, par recyclage du lait dans le tuyau flexible de transfert relié à la pompe et introduit dans le trou d'homme,  - par de l'air comprimé filtré et propre. On utilisera une pression et un volume d'air minimaux, afin d'empêcher le développement d'un goût de rance.  4.3.  Échantillonnage automatique ou semi-automatique Pour prélever les échantillons de lait cru livré par les producteurs, on peut utiliser un équipement d'échantillonnage automatique ou semi-automatique conformément aux instructions données par le laboratoire chargé de l'analyse ou par une autre autorité  compétente.  Cet équipement doit être soumis aux contrôles prescrits par l'autorité responsable avant sa première utilisation et ensuite à intervalles réguliers. La conformité des techniques d'échantillonnage doit être vérifiée afin de pouvoir établir:  - le volume minimal de lait collecté qui peut être convenablement échantillonné,  - la proportion d'un entraînement quelconque (lequel est lié au volume minimal recueilli),  - la capacité de fournir un échantillon représentatif de l'ensemble après agitation convenable.  Pour l'emploi d'un équipement d'échantillonnage automatique ou semi-automatique, l'autorité nationale compétente peut prescrire:  - le volume minimal de lait à partir duquel les échantillons peuvent être prélevés,  - le volume minimal de l'échantillon,  - la quantité maximale pouvant être entraînée,  - les analyses qui peuvent être réalisées ou les précautions à prendre.  4.4.  Échantillonnage du lait traité thermiquement destiné à la consommation directe et conditionné pour la vente au détail En ce qui concerne le lait traité thermiquement destiné à la consommation directe et conditionné pour la vente au détail, les échantillons sont obligatoirement composés par des récipients intacts et non ouverts. Les échantillons doivent, si possible,  être prélevés lors du conditionnement ou dans la chambre froide de l'établissement de traitement dès que possible après la transformation (pour le lait pasteurisé, le jour même de cette dernière).  Il convient de prélever un nombre d'échantillons de chaque type de lait traité thermiquement [pasteurisé, «ultra haute température» (UHT) et stérilisé] correspondant au nombre d'analyses à effectuer en se conformant aux indications données par le  laboratoire chargé de l'analyse ou par toute autre autorité compétente.  5.  Identification de l'échantillon L'échantillon doit recevoir un code d'identification qui permette son identification rapide selon les indications données par le laboratoire d'analyse ou l'autorité compétente (voir point 2).  6.  Transport et stockage des échantillons En accord avec l'autorité nationale compétente, le laboratoire d'analyse prépare des instructions concernant le délai et les conditions de transport et de stockage à respecter entre le prélèvement des échantillons et leur analyse, en fonction du type de  lait et du procédé d'analyse à utiliser. Les instructions stipulent ce qui suit:  - lors du transport et du stockage, des précautions doivent être prises pour isoler l'échantillon de toute odeur indésirable et de la lumière directe du soleil. Si le récipient utilisé pour les échantillons est transparent, il doit être stocké à l'abri  de la lumière,  - les échantillons de lait cru destinés aux analyses microbiologiques doivent être transportés et conservés à une température se situant entre 0 et 4 oC. Le délai entre le prélèvement et l'analyse doit être aussi court que possible et ne peut en aucun  cas dépasser 36 h. L'autorité compétente peut accepter que la température de conservation soit comprise entre 0 et 6 oC si le délai précité n'excède pas 24 h,  - les échantillons de lait pasteurisé destinés aux analyses microbiologiques doivent être transportés et conservés à une température se situant entre 0 et 4 oC. Le délai entre le prélèvement et l'analyse doit être aussi court que possible et ne peut en  aucun cas dépasser 24 h,  - les échantillons de laits autres que les laits cru et pasteurisé, destinés aux analyses microbiologiques, doivent être conservés par réfrigération dans le laboratoire, et le délai entre le prélèvement et l'analyse doit être aussi court que possible.  Les précautions spéciales à prendre pour certaines analyses sont indiquées dans la description des diverses méthodes utilisables.   ANNEXE II     TABLE DES MATIÈRES  Page I.  Détermination du point de congélation .  10 II.  Détermination de l'activité phosphatasique .  16 III.  Détermination de l'activité peroxydasique .  19 IV.  Dénombrement des micro-organismes - Comptage sur plaque à 30 oC .  20 V.  Dénombrement des micro-organismes - Comptage sur plaque à 21 oC .  25 VI.  Dénombrement des coliformes - Comptage des colonies à 30 oC .  29 VII.  Dénombrement des cellules somatiques .  33 VIII.  Détection des antibiotiques et des sulfamides .  39 IX.  Détection des micro-organismes pathogènes .  48 I. DÉTERMINATION DU POINT DE CONGÉLATION  1.  Objet et domaine d'application Le présent chapitre décrit le procédé de référence de détermination du point de congélation du lait entier, partiellement écrémé ou écrémé, cru, pasteurisé, «ultra haute température» (UHT) ou stérilisé en utilisant un appareil (le cryoscope à  thermistance) dans lequel le bain contrôlé par thermostat est refroidi par réfrigération électrique et où une sonde à thermistance remplace le thermomètre en verre à mercure.  Il existe deux types d'instruments. Le premier recherche le point de congélation maximal sur le «palier» de la courbe de congélation, tandis que le deuxième est, pour des raisons commerciales, réglé de façon à effectuer la lecture à un moment déterminé  après le début de la congélation. Étant donné que les courbes de congélation peuvent varier non seulement d'un lait à l'autre mais aussi entre le lait et les solutions étalons utilisées pour l'étalonnage, ce procédé de référence nécessite l'emploi  d'instruments cherchant le palier. Les instruments à délai fixe peuvent être utilisés dans le cas d'analyses de routine pour le tri des laits.  Le point de congélation peut être utilisé pour estimer la proportion d'eau étrangère dans le lait, pour autant que l'acidité de l'échantillon ne dépasse pas 0,18 g d'acide lactique par 100 ml (voir point 7.4).  2.  Définition Point de congélation du lait: valeur mesurée selon la méthode décrite dans la présente norme et exprimée en degrés Celsius (oC).  3.  Principe Refroidissement d'une prise d'essai jusqu'à la température appropriée, en fonction de l'appareil, et amorce de la cristallisation par vibration mécanique entraînant une augmentation rapide de la température jusqu'à un palier correspondant au point de  congélation de la prise d'essai.  L'instrument est étalonné de manière à obtenir des lectures correctes pour deux solutions étalons en utilisant le même mode opératoire que pour les échantillons de lait. Dans ces conditions, le palier donne le point de congélation du lait en degrés  Celsius.  4.  Appareillage et verrerie Matériel courant de laboratoire, et notamment:  4.1.  Cryoscope Le cryoscope se compose d'un bain de réfrigération contrôlé par thermostat, d'une sonde à thermistance (thermomètre à résistance semi-conductrice) avec circuit associé, d'un galvanomètre, ou «lecteur», d'un agitateur à échantillons, d'un système pour  amorcer la congélation et de tubes à échantillon.  4.1.1.  Bain de réfrigération Deux types de bain de réfrigération peuvent être utilisés.  4.1.1.1.  Type à immersion Ce type consiste en un bain parfaitement isolé contenant un liquide de refroidissement approprié agité de manière que la différence de température entre deux points quelconques du liquide ne dépasse pas 0,2 oC. La température du liquide ne doit pas  varier de plus de p 0,5 oC de la valeur nominale établie par le fabricant.  Il est important que le liquide dans le bain soit maintenu à un niveau constant. Toute la surface du tube à échantillon au-dessous du trait repère de volume doit être recouverte par le liquide de refroidissement.  4.1.1.2.  Type à circulation Un courant continu de liquide de refroidissement approprié circule autour du tube à échantillon. La température du liquide ne doit pas varier de plus de p 0,5 oC de la valeur nominale déclarée par le fabricant.  Une solution aqueuse de 1,2 éthanediol (éthylèneglycol) à 33 % (v/v) constitue un liquide de refroidissement approprié.  4.1.2.  Thermistance et circuit connexe La thermistance doit être du type sonde en verre (diamètre maximal 1,80 p 0,2 mm et diamètre conducteur maximal de 0,31 mm). La constante de temps de la thermistance doit être inférieure à 2 secondes et la valeur de v (voir note) doit être élevée. La  tension de service, le courant et la constante de dissipation doivent être tels que la température de la thermistance ne s'élève pas de plus de 0,0005 oC autour de - 0,512 oC. La tolérance maximale de la résistance doit être de p 5 %.  Quand la sonde est en position de service dans le cryoscope, l'extrémité de la partie en verre doit se trouver dans l'axe du tube à échantillon et à 44,6 p 0,1 mm au-dessous du sommet du tube (voir figure à la page 15). Un centreur doit être fourni pour  permettre à l'utilisateur de placer la sonde dans cette position.  Note v définit les caractéristiques thermiques de la thermistance selon la formule:  -  d R  ×  R  =  T 2  ,  - d R d T × 1R = v T ²  où T représente la température en degrés Kelvin,  R représente la résistance en ohms à la température T,  -  d R  ×  R  représente le coefficient de température,  - d R d T × 1 R  représente le coefficient de température,  v est une constante qui dépend du matériau utilisé pour la fabrication de la thermistance. En pratique courante, une valeur supérieure à 3 000 est couramment recommandée.  4.1.3.  Appareil de mesure et de lecture 4.1.3.1.  Principe de mesure L'instrument utilisé doit opérer selon le principe de recherche du premier «palier» dans la courbe du point de congélation. Le palier correspond à la partie de la courbe dans laquelle la température reste constante à p 0,002 oC près pendant 20 secondes  au minimum.  4.1.3.2.  Opération manuelle La résistance de la thermistance doit être équilibrée au moyen d'un pont de Wheatstone ou d'un appareil similaire, en utilisant des résistances stables de qualité supérieure dont la tolérance maximale est de p 10 % et dont le coefficient de température  ne dépasse pas 2 × 10-&   oC.  La résistance de référence doit avoir une linéarité dans sa gamme d'utilisation meilleure que 0,3 % de sa valeur maximale.  Il doit être possible d'ajuster les résistances pour un étalonnage.  L'écart entre les graduations du cadran de mesure ne doit pas être supérieur à 0,001 oC.  4.1.3.3.  Opération automatique L'appareil de lecture doit permettre de distinguer au moins 0,001 oC dans la gamme de 0 à -1 oC.  La stabilité de l'appareil de lecture et de son circuit associé doit être telle que l'écart ne soit pas supérieur à 0,001 oC entre deux lectures successives d'une même température.  La linéarité du circuit doit être telle qu'aucune erreur supérieure à p 0,001 oC ne s'introduise en un point quelconque dans la gamme - 0,400 à - 0,600 oC quand l'appareil est utilisé correctement.  4.1.4.  Agitateur Pour agiter la prise d'essai, utiliser une tige en métal, inerte vis-à-vis du lait, ayant un diamètre compris entre 1 et 1,5 mm.  L'agitateur doit être réglé en amplitude et installé verticalement, son extrémité inférieure étant au même niveau que la pointe de la sonde à thermistance. Une tolérance d'environ 1,5 mm au-dessus ou au-dessous de cette position est admise.  L'agitateur doit vibrer latéralement avec une amplitude suffisante indiquée par le fabricant (au moins p 1,5 mm) pour assurer une température uniforme à la prise d'essai pendant la détermination. Au cours de son fonctionnement, l'agitateur ne doit, à  aucun moment, toucher la sonde à thermistance ou la paroi du tube.  4.1.5.  Dispositif permettant d'amorcer la congélation Ce dispositif peut être n'importe quel appareil qui, en fonctionnant, amorce instantanément la congélation de la prise d'essai, de telle sorte que la température de cette prise d'essai s'élève au voisinage du point de congélation. L'agitateur peut être  utilisé à cet effet; une des méthodes consiste à augmenter l'amplitude de vibration pendant 1 à 2 secondes, de façon que l'agitateur touche la paroi du tube à échantillon.  4.1.6.  Tubes à échantillon Les tubes à échantillon (voir figure 1) doivent être en verre de 50,8 p 0,1 mm de longueur, 16,0 p 0,1 mm de diamètre extérieur et 13,5 p 0,1 mm de diamètre intérieur. L'épaisseur du verre ne doit pas varier de plus de 0,1 mm sur l'ensemble de la paroi.   Les tubes doivent avoir un trait repère situé 29,8 mm au-dessous du bord (21 mm au-dessus de la base du tube) pour indiquer un volume d'échantillon de 2,5 p 0,1 ml.  4.1.7.  Alimentation électrique La tension d'alimentation doit être stabilisée, soit à l'intérieur ou à l'extérieur de l'appareil, de sorte que les fluctuations éventuelles ne dépassent pas p 1 % de la valeur nominale quand l'alimentation principale varie de p 6 %.  4.2.  Balance analytique 4.3.  Fioles jaugées à un trait de 1 000 ml de capacité, classe A.  4.4.  Étuve, bien ventilée, réglable à 130 p 1 oC ou four électrique, ventilé, réglable à 300 p 25 oC.  4.5.  Dessiccateur 5.  Réactifs 5.1.  Eau distillée dans un appareil en verre borosilicaté, bouillie et refroidie à 20 p 2 oC dans une fiole pourvue d'un tube absorbant l'anhydride carbonique.  5.2.  Chlorure de sodium, de qualité analytique, finement broyé, séché pendant cinq heures à 300 p 25 oC dans le four électrique (4.4) ou séché dans l'étuve (4.4) à 130 o p 1 oC pendant au moins 24 heures et refroidi à la température ambiante dans un  dessiccateur efficace.  5.3.  Solutions étalons Peser la quantité appropriée (voir tableau ci-dessous) de chlorure de sodium séché (5.2) dans un vase à peser. Dissoudre dans l'eau (5.1), transvaser quantitativement dans une fiole jaugée de 1 000 ml et compléter au trait repère avec l'eau à 20 p 2 oC.   Conserver cette solution pendant 2 mois au maximum à 5 oC environ dans des flacons en polyéthylène bien bouchés d'une capacité maximale de 250 ml.  Point de congélation de solutions de chlorure de sodium à 20 oC     g NaCl/l oC  6,859  7,818  8,149  8,314  8,480  8,646  8,811  8,977  9,143 10,155 - 0,408 - 0,464 - 0,483 - 0,492 - 0,502 - 0,512 - 0,521 - 0,531 - 0,541 - 0,600 Avant d'utiliser une solution étalon, la mélanger soigneusement par agitation et retournements successifs du flacon. Ne pas agiter violemment la solution étalon, afin d'éviter l'incorporation d'air.  Les prises d'essai d'une solution étalon doivent être effectuées par écoulement dans un gobelet sec et propre. Ne pas utiliser de pipettes.  Ne pas utiliser de solutions contenues dans des flacons aux trois-quarts vides et ne pas utiliser de solutions ayant plus de deux mois si elles ne contiennent pas un fongicide (solution de thiomersal à 10 g/l par exemple).  6.  Étalonnage du cryoscope à thermistance Le cryoscope doit être réglé, de telle sorte que la température ambiante ne s'écarte pas de plus de 1 oC de la température d'étalonnage. Le cryoscope ne peut pas être exposé à la lumière du soleil, aux courants d'air ou à une température ambiante  dépassant 26-27 oC.  S'assurer que le cryoscope est en état de fonctionnement conformément aux indications du fabricant et qu'il a été mis en service 12 h au moins avant de procéder à l'étalonnage. Vérifier la position de la sonde, l'amplitude des vibrations de l'agitateur  et la température des fluides cryogéniques.  Choisir deux solutions étalons (voir tableau ci-dessus) qui encadrent de près la valeur supposée du point de congélation supposé du lait à analyser. La différence entre les points de congélation des deux solutions devrait, de préférence, ne pas dépasser  - 0,100 oC.  (Avec certains types de cryoscopes actuellement disponibles, le circuit associé à la thermistance est conçu de manière à se stabiliser sur une valeur spécifique du point de congélation dans la gamme des mesures de l'appareil. Dans ce cas, la sélection,  parmi les solutions étalons, d'une solution étalon ayant ce point de congélation facilite l'étalonnage; le fabricant doit indiquer cette valeur).  Introduire à l'aide d'une pipette 2,5 p 0,1 ml d'une solution étalon dans un tube à échantillon propre et sec, puis procéder à la mesure à l'aide du cryoscope.  Note Les tubes à échantillon utilisés pour l'étalonnage doivent être fabriqués et traités comme ceux utilisés pour les échantillons de lait (même type de verre, lavés et rincés avec de l'eau déminéralisée). Les températures des solutions étalons doivent être  identiques à celles des échantillons de lait.  Procéder aux contrôles d'étalonnage, en respectant les indications du fabricant, jusqu'à ce que la lecture du cryoscope soit identique au point de congélation de la solution étalon. Répéter cette opération avec l'autre solution étalon et continuer en  alternant de la sorte jusqu'à ce que les lectures successives donnent, pour chaque solution, la valeur correcte de leur point de congélation sans réglage supplémentaire. Le cryoscope est alors prêt à l'emploi et indique directement, sans correction, le  point de congélation de l'échantillon de lait.  7.  Préparation de l'échantillon à analyser 7.1.  Si nécessaire, conserver les échantillons à une température entre 0 et 5 oC.  7.2.  Éliminer de l'échantillon tout corps étranger visible ou toute matière grasse solide par filtrage, si nécessaire, dans un récipient sec et propre et mélanger doucement l'échantillon. Si un filtre est utilisé, il doit être inerte vis-à-vis du lait et  efficace à la température du laboratoire.  7.3.  Le lait peut être analysé à sa température de conservation (entre 0 et 5 oC) ou peut être amené à la température du laboratoire immédiatement avant de commencer l'analyse. Lors de leur utilisation, les solutions étalons et les échantillons de lait  doivent cependant être à la même température.  7.4.  Déterminer l'acidité titrable du lait, autant que possible, en même temps que la détermination du point de congélation. Les échantillons dont l'acidité dépasse 0,18 g d'acide lactique pour 100 ml de lait ne peuvent pas être analysés.  7.5.  Le lait UHT et le lait stérilisé doivent reposer au moins 20 minutes dans un récipient ouvert avant d'être analysés.  8.  Mode opératoire 8.1.  Vérifications préliminaires S'assurer que le niveau et la température du liquide de refroidissement sont conformes aux indications du fabricant et que la sonde à thermistance se trouve dans un tube à essai vide, à l'emplacement exact de l'échantillon. Mettre le cryoscope en  service et s'assurer que le liquide de refroidissement est convenablement agité ou circule correctement selon le cas. Si le cryoscope a fonctionné pendant 12 h au moins, vérifier la température du liquide de refroidissement de même que la position de  l'agitateur et l'amplitude de ses vibrations.  8.2.  Vérification de routine de l'étalonnage Avant chaque série d'essais, mesurer le point de congélation d'une solution étalon de chlorure de sodium (par exemple, une solution ayant un point de congélation de - 0,512 oC) jusqu'à ce que les valeurs obtenues à l'issue de deux déterminations  consécutives ne diffèrent pas de plus de 0,001 oC. Si la moyenne de ces valeurs diffère de plus de 0,002 oC du point de congélation de la solution étalon, étalonner à nouveau le cryoscope comme décrit au point 6.  Si le cryoscope est utilisé en continu, effectuer la vérification de routine de l'étalonnage au moins une fois par heure, en respectant les indications du fabricant.  8.3.  Détermination du point de congélation du lait Mélanger le récipient contenant l'échantillon de lait par agitations modérées et retournements successifs. Éviter d'agiter violemment l'échantillon afin d'éviter toute incorporation d'air.  Introduire à l'aide d'une pipette 2,5 p 0,1 ml de lait dans un tube à échantillon sec et propre. S'assurer que la sonde et l'agitateur sont propres et secs, les essuyer si nécessaire de bas en haut avec un tissu doux, propre et ne peluchant pas.  Placer le tube à échantillon dans le cryoscope étalonné en suivant les indications du fabricant. Le lait est refroidi et la congélation amorcée, à p 0,1 oC près de la température indiquée par le fabricant.  (Sur certains appareils automatiques, cette température peut être relevée sur le lecteur digital; sur les appareils manuels, la précision nécessaire est obtenue en s'assurant que la congélation débute lorsque l'aiguille ou le fil du galvanomètre  coïncide avec le repère approprié).  Si, pour une raison quelconque, la congélation débute avant ou après la plage de température indiquée, arrêter l'analyse et la recommencer avec une autre prise d'essai de lait. Si cette deuxième prise d'essai congèle aussi avant la température indiquée,  chauffer une fraction aliquote du lait à examiner à 45 oC et la maintenir à cette température pendant cinq minutes pour permettre la fusion de la matière grasse cristalline.  Refroidir ensuite à la température d'essai et procéder immédiatement à une nouvelle analyse. La température du lait après le début de la congélation augmente rapidement jusqu'à une valeur qui reste pratiquement constante pendant un certain temps avant  de redescendre. Le point de congélation correspond à la températeure la plus élevée atteinte durant cette période, valeur qu'il convient de relever.  Note Le temps pendant lequel la température reste constante et l'intervalle de temps entre le début de la congélation et l'obtention de la température la plus élevée diffèrent d'un échantillon à l'autre et sont considérablement plus courts pour l'eau et les  solutions étalons de chlorure de sodium que pour le lait. Il est essentiel de relever la température la plus élevée.  Lorsque la mesure est effectuée de façon satisfaisante, enlever le tube, le rincer à l'eau puis essuyer de bas en haut la sonde à thermistance et l'agitateur avec un tissu doux, propre et ne peluchant pas et procéder à une seconde détermination sur une  autre prise d'essai.  Si la différence entre les points de congélation obtenus est supérieure à la valeur de la répétabilité (0,004 oC), effectuer une seconde détermination sur une autre prise d'essai. Si les valeurs des deux déterminations concordent à 0,004 oC près, elles  devraient être retenues et utilisées pour le calcul du résultat final.  8.4.  Refroidissement de la sonde Après utilisation de l'appareil, placer un tube à échantillon vide à l'emplacement de l'échantillon et abaisser le mandrin de façon à garder la sonde au froid.  (Avec certains types de cryoscope, cela n'est pas possible; s'assurer dans ce cas que la sonde est bien refroidie avant d'effectuer les mesures en procédant par exemple à plusieurs déterminations factices jusqu'à obtention de lectures identiques).  9.  Expression des résultats 9.1.  Calcul Si l'étalonnage est confirmé après vérification de l'étalonnage en routine, prendre comme résultat la moyenne des deux valeurs acceptables obtenues pour le point de congélation arrondie à la troisième décimale.  Si la somme des deux valeurs acceptables de déterminations effectuées en double est un nombre impair, la moyenne doit être arrondie à la valeur paire la plus proche comme le montre l'exemple suivant:  Point de congélation (oC)    Valeurs des déterminations en double Moyenne - 0,544   - 0,545 - 0,545   - 0,546 - 0,544 - 0,546  9.2.  Fidélité 9.2.1.  Répétabilité (r): 0,004 oC.  9.2.2.  Reproductibilité (R): 0,006 oC. II. DÉTERMINATION DE L'ACTIVITÉ PHOSPHATASIQUE  1.  Objet et domaine d'application Le présent chapitre décrit le procédé de référence de détermination de l'activité phosphatasique du lait pasteurisé.  2.  Définition 2.1.  L'activité phosphatasique est la mesure de la quantité de phosphatase alcaline active présente dans le produit. Elle s'exprime par la quantité de phénol en mg par ml de lait pasteurisé dans les conditions décrites ci-après.  2.2.  L'activité phosphatasique d'un lait est négative si elle est inférieure à 4 mg de phénol par ml.  3.  Principe L'activité phosphatasique éventuellement présente dans l'échantillon libérera du phénol à partir du phénylphosphate disodique ajouté. Le phénol libéré réagit avec le dibromo-quinone chlorimide produisant du dibromo-indophénol (de couleur bleuâtre)  mesuré à 610 nm contre l'essai à blanc (échantillon dans lequel l'activité de l'enzyme est détruite).  4.  Réactifs 4.1.  Tampon de borate et d'hydroxyde de baryum 4.1.1.  Dissoudre 50,0 g d'hydroxyde de baryum [Ba(OH)2.8H2O] dans de l'eau et amener à 1 000 ml.  4.1.2.  Dissoudre 22,0 g d'acide borique (H3BO3) dans de l'eau et amener à 1 000 ml.  4.1.3.  Chauffer 500 ml de chaque solution à 50 oC, les mélanger, agiter, refroidir rapidement à 20 oC environ, ajuster le pH si nécessaire à 10,6 p 0,1 à l'aide de la solution 4.1.1 ou 4.1.2. Filtrer. Conserver la solution dans un récipient bouché  hermétiquement.  4.1.4.  Avant l'emploi, diluer la solution avec un volume d'eau équivalent.  4.2.  Tampon de développement de la coloration Dissoudre 6,0 g de métaborate de sodium (NaBO2) ou 12,6 g de NaBO2.4H2O et 20,0 g de chlorure de sodium (NaCl) dans de l'eau et amener à 1 000 ml.  4.3.  Tampon de coloration dilué Diluer 10 ml du tampon de développement de la coloration (4.2) dans de l'eau et porter à 100 ml.  4.4.  Substrat tamponné Dissoudre 0,1 g de phénylphosphate disodique déshydraté exempt de phénol dans 100 ml de tampon (4.1.3) ou dissoudre 0,5 g de phénylphosphate disodique dans 4,5 ml du tampon de développement de la coloration (4.2), ajouter deux gouttes de solution BQC  (4.6) et laisser reposer à la température ambiante pendant 30 minutes. Extraire la couleur ainsi formée à l'aide de 2,5 ml de butanol-1 et laisser reposer jusqu'à séparation du butanol-1. Décanter le butanol-1 et l'éliminer. Répéter l'extraction si  nécessaire.  La solution peut être conservée quelques jours au réfrigérateur; laisser la coloration se développer et procéder à une nouvelle extraction avant l'emploi. Préparer le substrat tamponné juste avant l'emploi en diluant 1 ml de cette solution à 100 ml à  l'aide du tampon de borate et d'hydroxyde de baryum (4.1.3).  4.5.  Défécant cuivre-zinc Dissoudre 3,0 g de sulfate de zinc (ZnSO4, 7H2O) et 0,6 g de sulfate de cuivre (II) (CuSO4, 5H2O) dans de l'eau et amener à 100 ml.  4.6.  Solution de dibromo-2,6 quinone-chlorimide (solution BQC) Dissoudre 40 p 1 mg de dibromo-2,6 quinone-chlorimide (BQC) (C6H2Br2CINO6) dans 10 ml d'alcool éthylique à 96 % (v/v).  Conserver au réfrigérateur dans une bouteille brune. Rejeter la solution si elle a changé de couleur ou si elle a plus d'un mois.  4.7.  Solution de sulfate de cuivre (II) Dissoudre 0,05 g de sulfate de cuivre (II) (CuSO4.5H2O) dans de l'eau et compléter à 100 ml.  4.8.  Solutions étalons de phénol 4.8.1.  Peser 200 p 2 mg de phénol anhydre pur, transvaser dans un ballon jaugé de 100 ml, ajouter de l'eau, mélanger et compléter jusqu'à 100 ml. Cette solution reste stable plusieurs mois au réfrigérateur.  4.8.2.  Diluer 10 ml de la solution concentrée dans de l'eau, compléter à 100 ml et mélanger. 1 ml contient 200 mg de phénol.  5.  Appareillage et verrerie Notes a)  Toute la verrerie ainsi que tous les bouchons et instruments d'échantillonnage doivent être soigneusement nettoyés. Il est recommandé de les rincer à l'eau distillée fraîchement bouillie ou de les passer à la vapeur.  b)  Certains types de bouchons en plastique peuvent entraîner une contamination phénolique; leur utilisation est à proscrire.  Matériel courant de laboratoire, et notamment:  5.1.  Balance analytique 5.2.  Bain d'eau réglable à 37 p 1 oC.  5.3.  Spectrophotomètre permettant d'effectuer des lectures à une longueur d'onde de 610 nm.  5.4.  Tubes à essai, 16 ou 18 mm × 150 mm, de préférence gradués tous les 5 et 10 ml.  5.5.  Pipettes 5.6.  Entonnoirs en verre, de dimensions appropriées, par exemple 5 cm de diamètre.  5.7.  Filtres plissés de 9 cm de diamètre convenant pour une vitesse de filtration moyenne.  5.8.  Fioles jaugées pour la préparation de solutions étalons.  6.  Mode opératoire Notes a)  Éviter la lumière solaire directe durant la détermination.  b)  Les traces de salive ou de transpiration peuvent donner des résultats faussement positifs et doivent dès lors être évitées. Prendre en conséquence des précautions particulières lors du pipettage.  6.1.  Préparation de l'échantillon pour l'essai 6.1.1.  Effectuer l'analyse immédiatement après l'échantillonnage. Dans le cas contraire, conserver l'échantillon au réfrigérateur, sans dépasser deux jours.  6.2.  Prise d'essai Pipetter dans chacun des deux tubes à essai (5.4) 1 ml de l'échantillon en utilisant un des tubes comme témoin ou essai à blanc. 6.3.  Détermination 6.3.1.  Chauffer l'essai à blanc pendant deux minutes dans de l'eau bouillante; recouvrir le tube et le becher contenant l'eau bouillante d'une feuille d'aluminium, pour que tout le tube chauffe. Refroidir rapidement à température ambiante.  6.3.2.  Traiter l'échantillon pour essai et l'essai à blanc de la même manière pendant le restant de l'opération. Ajouter 10 ml de substrat tamponné (4.4) et mélanger.  6.3.3.  Incuber immédiatement les essais au bain d'eau (5.2) pendant 60 minutes en mélangeant de temps en temps (au moins quatre fois).  6.3.4.  Chauffer dans de l'eau bouillante pendant deux minutes de la même manière qu'au point 6.3.1. Refroidir rapidement à température ambiante.  6.3.5.  Ajouter 1 ml de défécant cuivre-zinc (4.5) dans chaque tube et mélanger soigneusement.  6.3.6.  Filtrer sur papier filtre sec, jeter les deux premiers ml, refiltrer si nécessaire jusqu'à ce que le filtrat soit tout à fait limpide et recueillir 5 ml dans un tube à essai.  6.3.7.  Ajouter 5 ml de tampon de développement de la coloration (4.2).  6.3.8.  Ajouter 0,1 ml de solution BQC (4.6), mélanger et laisser la coloration se développer pendant 30 minutes à la température ambiante.  6.3.9.  Mesurer l'absorbance par rapport au témoin ou essai à blanc à une longueur d'onde de 610 nm (5.3).  6.3.10.  Si l'absorbance mesurée en 6.3.9 dépasse l'absorbance de la solution étalon contenant 20 g de phénol par tube mesurée conformément au point 6.4.4, répéter la détermination avec une dilution appropriée de l'échantillon. Préparer cette dilution en  mélangeant un volume de l'échantillon à un volume approprié d'une partie du même échantillon porté avec précaution à ébullition de façon à inactiver la phosphatase.  6.4.  Préparation de la courbe d'étalonnage 6.4.1.  Préparer à l'aide d'une solution étalon de phénol (4.8.2) une gamme de solutions étalons contenant 0 (témoin ou essai à blanc), 2, 5, 10 et 20 mg de phénol par millilitre. Pipetter respectivement 1 ml d'eau et 1 ml des quatre solutions étalons de phénol  dans chacun des cinq tubes à essai.  6.4.2.  Ajouter à chaque tube 1 ml de solution de sulfate de cuivre (II) (4.7), 5 ml du tampon de coloration dilué (4.3), 3 ml d'eau et 0,1 ml de solution BQC (4.6); mélanger.  6.4.3.  Laisser la coloration se développer pendant 30 minutes à température ambiante.  6.4.4.  Mesurer l'absorbance par rapport au témoin ou essai à blanc à une longueur d'onde de 610 nm (5.3).  6.4.5.  En partant des valeurs d'absorbance (6.4.4) obtenues pour chaque quantité de phénol ajoutée (6.4.1), calculer la droite de régression par la méthode des moindres carrés.  7.  Expression des résultats 7.1.  Calcul et formule 7.1.1.  En partant de la mesure d'absorbance (6.3.9), calculer la quantité de phénol à l'aide de la droite de régression (6.4.5).  7.1.2.  Calculer l'activité phosphatasique, exprimée en mg de phénol par millilitre de lait pasteurisé, à l'aide de la formule suivante:  Activité phosphatasique = 2,4 × A × D où A est la quantité de phénol en mg obtenue en 7.1.1;  D est le facteur de dilution de la dilution effectuée en 6.3.10 (en l'absence de dilution D =1),  2,4 est le facteur de dilution (5/12 de 1 ml de la prise d'essai) - Considérer 6.2 en liaison avec les points 6.3.2, 6.3.5 et 6.3.6.  7.2.  Fidélité 7.2.1 Répétabilité (r): 2 mg de phénol/ml.  7.2.2.  Reproductibilité (R): 3 (préliminaire) mg de phénol/ml.  7.2.3.  Si une dilution est effectuée conformément au point 6.3.10, les limites visées aux points 7.2.1 et 7.2.2 se réfèrent aux résultats obtenus avec l'échantillon dilué.  III. DÉTERMINATION DE L'ACTIVITÉ PEROXYDASIQUE  1.  Objet et domaine d'application Le présent chapitre décrit le procédé de référence de détermination de la présence ou de l'absence de l'enzyme de la peroxydase dans le lait, qui sert à contrôler la pasteurisation.  2.  Definitions Réaction positive au test de la peroxydase Si le lait est bien pasteurisé, une coloration bleue apparaît dans les 30 secondes qui suivent le mélange.  Réaction négative au test de la peroxydase Aucune coloration n'apparaît dans les 30 secondes qui suivent le mélange.  3.  Principe La peroxydase décompose le peroxyde d'hydrogène. L'oxygène atomique libéré transforme par oxydation la paraphénylènediamine incolore en indophénol pourpre (test de Storch). L'intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration de l'enzyme.   4.  Réactifs 4.1.  Solution de 1,4-phénylènediamine Dissoudre 2 g de 1,4-phênylènediamine (C6H8N2) dans de l'eau chaude (50 oC) et compléter à 100 ml. Conserver la solution dans un flacon brun avec un bouchon en verre et stocker à l'abri de la lumière et au frais. Un ou deux jours après sa préparation,  la solution de 1,4-phénylènediamine forme un dépôt qu'il convient d'éliminer.  4.2.  Solution de peroxyde d'hydrogène Diluer 9 ml de peroxyde d'hydrogène à 30 % dans de l'eau et compléter à 100 ml. Pour stabiliser, ajouter 1 ml d'acide sulfurique concentré par litre de solution.  La solution de peroxyde d'hydrogène est stable pendant un mois si on la conserve au frais et à l'abri de la lumière dans un flacon fermé par un bouchon en verre empêchant tout contact avec des composés organiques.  5.  Mode opératoire 5.1.  Introduire 5 ml de lait à analyser dans un tube à essai propre muni d'un couvercle approprié.  5.2.  Ajouter 5 ml de solution de 1,4-phénylènediamine (4.1).  5.3.  Ajouter 2 gouttes de solution de peroxyde d'hydrogène (4.2).  5.4.  Examiner la coloration dans les 30 secondes suivant le mélange. Si une coloration bleue apparaît plus de 30 secondes après l'adjonction des réactifs, la réaction n'est pas spécifique.  IV. DÉNOMBREMENT DES MICRO-ORGANISMES - COMPTAGE SUR PLAQUE À 30 oC  1.  Objet et domaine d'application Le présent chapitre décrit le procédé de référence de dénombrement des micro-organismes par la technique de comptage des colonies obtenues à 30 oC. La méthode est applicable au lait cru, au lait pasteurisé, au lait UHT et au lait stérilisé préincubé à  30 oC pendant 15 jours.  2.  Définition Par «micro-organismes», on entend tous les organismes formant des colonies comptables après une incubation en aérobiose dans les conditions opératoires décrites.  3.  Principe Mélanger un volume déterminé d'échantillon de lait au milieu de culture dans les boîtes de Petri et laisser incuber à 30 oC pendant 72 heures. Compter les colonies et calculer le nombre de micro-organismes par millilitre de lait cru ou pasteurisé ou par  0,1 millilitre de lait stérilisé ou UHT préincubé.  4.  Appareillage et verrerie Matériel courant de laboratoire, et notamment:  4.1.  Appareillage 4.1.1.  Four à air chaud, réglable à 170-175 oC.  4.1.2.  Autoclave, réglable à 121 oC.  4.1.3.  Étuve, réglable à 30 p 1 oC.  4.1.4.  pH-mètre, avec correction de température, sensible à 0,1 unité de pH près.  4.1.5.  Bain d'eau réglable à 45 p 1 oC.  4.1.6.  Loupe de grossissement 2-4 ×.  4.1.7.  Loupe de grossissement 8-10 ×.  4.1.8.  Compteur enregistreur 4.1.9.  Agitateur capable de mélanger 1 ml de l'échantillon de lait ou d'une dilution décimale avec 9 ml de diluant et dont le principe de fonctionnement est basé sur un mouvement de rotation excentré du contenu du tube à essai.  4.2.  Verrerie 4.2.1.  Tubes à essai avec bouchons appropriés et de capacité adéquate pour contenir, avec un espace suffisant permettant une agitation convenable, 10 ml de la première dilution ou des dilutions décimales suivantes.  4.2.2.  Fioles de 150 à 250 ml de capacité ou tubes de 20 ml de capacité environ pour contenir le milieu de culture.  4.2.3.  Pipettes (bouchées avec du coton) en verre ou en matériau synthétique stérile, non ébréchées, de 1 ml de capacité nominale, avec un orifice d'écoulement de 1,75 à 3 mm de diamètre.  4.2.4.  Boîtes de Petri en verre ou en matériau synthétique stérile transparent incolore, le fond des boîtes ayant un diamètre intérieur d'environ 90-100 mm. La profondeur intérieure doit être d'au moins 10 mm. Le fond ne doit présenter aucune irrégularité  susceptible de gêner le comptage des colonies.  4.2.5.  Stérilisation de la verrerie La verrerie doit être stérilisée par l'une des méthodes suivantes:  a)  au four à air chaud, à une température de 170 à 175 oC pendant 1 heure au moins (4.1.1);  b)  à l'autoclave, à une température de 121 p 1 oC pendant 20 minutes au moins (4.1.2).  Dans l'autoclave, toute précaution doit être prise pour assurer une pénétration adéquate de la vapeur: si le matériel est stérilisé dans des récipients, ceux-ci ne doivent pas être fermés hermétiquement, les bouchons ou les couvercles des fioles doivent  être desserrés.  Faire sécher la verrerie stérilisée à l'autoclave afin d'éliminer la vapeur.  Les pipettes doivent être stérilisées au four à air chaud (4.1.1).  5.  Milieu de culture - Comptage des germes du lait sur plaque de gélose 5.1.  Composition Extrait de levure 2,5 g Tryptone 5,0 g D(+) Glucose ou dextrose 1,0 g Poudre de lait écrémé 1,0 g Agar-agar 10 à 15 g suivant les propriétés gélifiantes de l'agar-agar Eau 1 000 ml La poudre de lait écrémé doit être exempte de substances inhibitrices, ce qui sera vérifié à l'aide de tests comparatifs réalisés en utilisant une poudre de lait écrémé reconnue exempte.  Préparation Mettre en suspension en dissolvant, dans l'ordre, l'extrait de levure, la tryptone, le glucose et, enfin, la poudre de lait écrémé, dans l'eau. Le chauffage de la suspension facilite l'opération. Ajouter ensuite l'agar-agar et porter à ébullition en  agitant fréquemment jusqu'à dissolution complète de l'agar-agar ou chauffer à la vapeur pendant 30 minutes environ.  Filtrer sur papier filtre, si nécessaire.  Vérifier le pH à l'aide d'un pH-mètre (4.1.4); si nécessaire, ajuster le pH en utilisant une solution (au moins 0,1 mol/l) d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique de sorte qu'il soit, après stérilisation, de 6,9 p 0,1 à 25 oC.  5.2.  Répartition, stérilisation et conservation du milieu de culture Répartir le milieu (5.1) par quantités de 100 à 150 ml dans les fioles ou de 12 à 15 ml dans les tubes (4.2.2). Boucher les fioles et les tubes.  Stériliser à l'autoclave (4.1.2) à 121 p 1 oC pendant 15 minutes.  Vérifier le pH du milieu.  Si le milieu de culture n'est pas utilisé immédiatement, le conserver à l'abri de la lumière entre 1 et 5 oC pendant un mois au maximum après sa préparation.  5.3.  Milieu de culture complet déshydraté vendu dans le commerce Le milieu de culture (5.1) peut être préparé avec un milieu de culture complet déshydraté vendu dans le commerce. Suivre les indications du fabricant, mais ajouter la poudre de lait écrémé avant la dissolution si elle n'entre pas dans la composition du  produit.  Ajuster le pH à 6,9 p 0,1 à 25 oC selon le mode décrit en 5.1 puis répartir, stériliser et stocker le milieu selon les indications données en 5.2.  6.  Diluants 6.1.  Solution peptone/sel Composition Peptone 1,0 g Chlorure de sodium (NaCl) 8,5 g Eau 1 000 ml Préparation Dissoudre les composants dans l'eau, en chauffant si nécessaire.  Vérifier le pH avec un pH-mètre (4.1.4); si nécessaire, ajuster le pH en utilisant une solution (au moins 0,1 mol/l) d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique, de sorte que, après stérilisation, il soit de 7,0 p 0,1 à 25 oC.  6.2.  Répartition, stérilisation et conservation du diluant Répartir le diluant (6.1) dans les tubes à essai (4.2.1) en quantité telle que, après stérilisation, chaque tube contienne 9,0 p 0,2 ml de diluant. Boucher les tubes.  Stériliser à l'autoclave (4.1.2) à 121 p 1 oC pendant 15 minutes.  Vérifier le pH du diluant.  Si le diluant n'est pas utilisé immédiatement, le conserver à l'abri de la lumière entre 1 et 5 oC pendant un mois au maximum après sa préparation.  6.3.  Diluants complets déshydratés du commerce Les poudres ou comprimés déshydratés vendus dans le commerce peuvent servir à la préparation du diluant (6.1). Suivre les instructions du fabricant. Ajuster le pH selon le mode décrit en 6.1 et répartir, stériliser et stocker les diluants selon les  indications données en 6.2.  7.  Mode opératoire 7.1.  Fusion du milieu Avant de procéder à l'examen microbiologique, faire fondre rapidement la quantité de milieu nécessaire et refroidir le milieu à 45 p 1 oC au bain d'eau (4.1.5).  7.2.  Préparation de l'échantillon de lait Mélanger convenablement l'échantillon afin d'obtenir une répartition des micro-organismes aussi homogène que possible, en retournant rapidement 25 fois le récipient contenant l'échantillon. Éviter la formation de mousse ou laisser la mousse se  disperser. Le délai entre le mélange et le prélèvement de la prise d'essai ne doit pas dépasser 3 minutes.  7.3.  Préparation de la première dilution (10-;) (lait cru et pasteurisé) Transférer à l'aide d'une pipette stérile (4.2.3) 1 ml de l'échantillon (7.2) de lait cru ou de lait pasteurisé dans 9 ml de diluant (6.1) en évitant tout contact entre la pipette et le diluant. La température du diluant doit être sensiblement la même  que celle de l'échantillon de lait. Mélanger soigneusement cette première dilution à l'aide de l'agitateur (4.1.9) pendant 5 à 10 secondes.  On obtient ainsi une première dilution 10-;.  7.4.  Préparation des dilutions décimales suivantes (lait cru et lait pasteurisé) Transférer, à l'aide d'une pipette stérile (4.2.3), 1 ml de la première dilution (7.3) dans 9 ml de diluant (6.1) en suivant les indications données en 7.3.  On obtient ainsi une dilution 10-$.  Répéter ces opérations pour obtenir les dilutions décimales suivantes jusqu'à obtention du nombre adéquat de micro-organismes (8.1.1).  7.5.  Inoculation des boîtes de Petri 7.5.1.  Lait cru: transférer, à l'aide d'une pipette stérile (4.2.3), 1 ml de l'échantillon et/ou de la dilution décimale appropriée dans une boîte (4.2.4). L'analyse doit porter sur l'examen d'au moins deux dilutions. Pour chaque dilution, préparer une boîte  sélectionnée comme il convient (8.1.1).  7.5.2.  Lait pasteurisé: transvaser, à l'aide d'une pipette stérile (4.2.3), 1 ml de l'échantillon et/ou de la dilution décimale appropriée dans une boîte (4.2.4). L'analyse doit au moins porter sur deux dilutions. Pour chaque dilution, préparer deux boîtes  sélectionnées comme il convient (8.1.1).  7.5.3.  Lait UHT et lait stérilisé (analyse, après incubation pendant 15 jours à 30 oC - Directive 85/397/CEE, annexe A chapitre VII point 5):  Transférer, à l'aide d'une pipette stérile (4.2.3), 0,1 ml de l'échantillon de lait (7.2) dans une boîte (4.2.4). Préparer deux boîtes.  7.6.  Coulage du milieu Verser environ 15 à 18 ml de milieu (7.1) dans chaque boîte ensemencée. Mélanger immédiatement par rotation de la boîte de Petri, afin d'obtenir une répartition régulière des colonies après incubation.  Le délai entre la fin de la préparation de l'échantillon et le mélange, selon le type de lait, de la prise d'essai ou de la dilution avec le milieu ne doit pas dépasser 15 minutes.  Laisser reposer sur une surface horizontale froide et propre jusqu'à solidification du milieu.  7.7.  Incubation des boîtes de Petri Placer les boîtes dans l'étuve (4.1.3). Incuber les boîtes retournées. Ne pas en empiler plus de six. Les piles de boîtes ne doivent pas se toucher, ni être en contact avec les parois et la partie supérieure de l'étuve.  Incuber à 30 p 1 oC pendant 72 p 2 heures.  7.8.  Comptage des colonies Effectuer le comptage des colonies dans les boîtes de Petri ne contenant pas plus de 300 colonies. Examiner les boîtes en lumière atténuée. Une loupe (4.1.6) et/ou un compteur enregistreur (4.1.8) peuvent être utilisés pour faciliter le comptage. Éviter de confondre des particules de matières précipitées avec des colonies de la taille d'une pointe  d'épingle. En cas de doute, procéder à un examen minutieux en utilisant si nécessaire une loupe de grossissement supérieur (4.1.7), afin de distinguer les colonies des matières étrangères.  Les colonies envahissantes sont considérées comme des colonies uniques. Si les colonies envahissantes recouvrent moins d'un quart de la boîte, compter les colonies sur la partie non touchée de la boîte et calculer le nombre correspondant pour la boîte  entière. Si les colonies envahissantes recouvrent plus d'un quart de la boîte, éliminer la boîte.  8.  Calcul et expression des résultats 8.1.  Lait cru et pasteurisé 8.1.1.  Utiliser les résultats des boîtes contenant entre 10 et 300 colonies (voir 8.1.3 et 8.1.4).  8.1.2.  Calculer le nombre de micro-organismes par millilitre de lait cru ou pasteurisé à l'aide de la formule suivante:   (n1 + 0,1 n2) d   S C (n1 + 0,1 n2) d  où S C est la somme totale des colonies comptées selon 8.1.1,  (n1 + 0,1 n2) dest égal au volume de l'échantillon ensemencé où:  n1 est le nombre de boîtes comptées dans la première dilution,  n2 est le nombre de boîtes comptées dans la deuxième dilution,  d est le facteur de dilution à partir duquel les premiers comptages ont été obtenus.  Le nombre est arrondi à deux chiffres significatifs. Quand le chiffre à arrondir est 5, arrondir de manière que le chiffre placé immédiatement à gauche soit pair.  Exemple (lait pasteurisé):  Dilution 10-2: 278 et 290 colonies Dilution 10-3:  33 et  28 colonies Nombre/ml =  278 + 290 + 33 + 28   Nombre/ml = 278 + 290 +33 + 28 (2 + 0,1 × 2) 10-2 Nombre/ml =  0,022   = 629 0,022 = 28 590 = 29 000 = 2,9 × 10%.  8.1.3.  Si tous les dénombrements sont inférieurs à 10, indiquer que le nombre de micro-organismes par millilitre est «inférieur à 10 ×  d», «d» étant l'inverse du facteur de dilution de plus faible.  8.1.4.  Lorsque tous les dénombrements sont supérieurs à 300 et que le comptage est possible, procéder à une estimation et la multiplier par l'inverse du facteur de dilution. Exprimer le résultat avec l'indication «nombre estimé de micro-organismes par  millilitre».  8.2.  Lait UHT et lait stérilisé Les teneurs en germes supérieures à 10 colonies par 0,1 ml sont considérées comme ne répondant plus aux exigences de la directive 85/397/CEE.  9.  Fidélité On ne dispose encore d'aucun résultat d'essais circulaires internationalement reconnus.  V. DÉNOMBREMENT DES MICRO-ORGANISMES - COMPTAGE SUR PLAQUE À 21 oC  1.  Objet et domaine d'application Le présent chapitre décrit le procédé de référence de dénombrement des micro-organismes, par la technique de comptage des colonies à 21 oC, dans le lait pasteurisé préincubé pendant cinq jours à 6 oC, essentiellement en vue de déterminer le degré de  contamination du lait pasteurisé par des micro-organismes psychotrophes capables de se multiplier dans le lait à 6 oC.  2.  Définition Par «micro-organismes», on entend tous les organismes formant des colonies comptables après une incubation en aérobiose dans les conditions opératoires décrites.  3.  Principe Incubation du lait pasteurisé à 6 oC pendant cinq jours. Mélange d'un volume déterminé de l'échantillon de lait préincubé au milieu de culture dans des boîtes de Petri à 21 oC pendant 25 heures. Comptage des colonies et calcul du nombre de  micro-organismes par millilitre de lait pasteurisé.  4.  Appareillage et verrerie Matériel courant de laboratoire, et notamment:  4.1.  Appareillage 4.1.1.  Four à air chaud réglable à 170-175 oC.  4.1.2.  Autoclave réglable à 121 p 1 oC.  4.1.3.  Étuves réglables à une température uniforme de:  a)  6 p 0,2 oC;  b) 21 p 1 oC.  4.1.4.  pH-mètre, avec correction de température, sensible à p 0,1 unité de pH près.  4.1.5.  Bain d'eau réglable à 45 p 1 oC.  4.1.6.  Loupe de grossissement 2-4 ×.  4.1.7.  Loupe de grossissement 8-10 ×.  4.1.8.  Compteur enregistreur.  4.1.9.  Agitateur capable de mélanger 1 ml de l'échantillon de lait ou d'une dilution décimale à 9 ml de diluant et dont le principe de fonctionnement est basé sur un mouvement de rotation excentré du contenu du tube à essai.  4.2.  Verrerie 4.2.1.  Tubes à essai, avec bouchons appropriés, de capacité adéquate pour contenir, avec un espace suffisant permettant une agitation convenable, 10 ml de la première dilution ou des dilutions décimales suivantes.  4.2.2.  Fioles de 150 à 250 ml de capacité ou tubes d'environ 20 ml de capacité, pour contenir le milieu de culture.  4.2.3.  Pipettes (bouchées avec du coton) en verre ou en matériau synthétique stérile, non ébréchées, d'une capacité nominale de 1 ml, avec un orifice d'écoulement de 1,75 à 3 mm de diamètre.  4.2.4.  Boîtes de Petri en verre ou en matériau synthétique stérile transparent incolore, le fond des boîtes ayant un diamètre intérieur d'environ 90-100 mm. La profondeur intérieure doit être d'au moins 10 mm. Le fond ne doit présenter aucune irrégularité  susceptible de gêner le comptage des colonies.  4.2.5.  Stérilisation de la verrerie La verrerie doit être stérilisée par l'une des méthodes suivantes:  a)  au four à air chaud (4.1.1) à une température de 170 à 175 oC pendant une heure au moins;  b)  à l'autoclave (4.1.2) à une température de 121 p 1 oC pendant vingt minutes au moins.  Dans l'autoclave, toute précaution doit être prise pour assurer une pénétration adéquate de la vapeur: si le matériel est stérilisé dans des récipients, ceux-ci ne doivent pas être fermés hermétiquement, les bouchons ou les couvercles des fioles doivent  être desserrés.  Faire sécher la verrerie stérilisée à l'autoclave afin d'éliminer la vapeur.  Les pipettes doivent être stérilisées au four à air chaud (4.1.1).  5.  Milieu de culture - Comptage des germes du lait sur plaque de gélose 5.1.  Composition Extrait de levure 2,5 g Tryptone 5,0 g D(+) Glucose ou dextrose 1,0 g Poudre de lait écrémé 1,0 g Agar-agar 10 à 15 g, suivant les propriétés gélifiantes de l'agar-agar Eau 1 000 ml La poudre de lait écrémé doit être exempte de substances inhibitrices, ce qui sera vérifié par des tests comparatifs réalisés en utilisant une poudre de lait écrémé reconnue exempte.  Préparation Mettre en suspension en dissolvant, dans l'ordre, l'extrait de levure, la tryptone, le glucose et enfin la poudre de lait écrémé dans l'eau. L'opération est plus facile si la suspension est chauffée. Ajouter ensuite l'agar-agar et porter à ébullition en  agitant fréquemment jusqu'à dissolution complète de l'agar-agar ou chauffer à la vapeur pendant 30 minutes environ.  Filtrer sur papier filtre, si nécessaire.  Vérifier le pH à l'aide d'un pH-mètre (4.1.4). Si nécessaire, ajuster le pH en utilisant une solution (au moins 0,1 mol/l) d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique de sorte qu'il soit, après stérilisation, de 6,9 p 0,1 à 25 oC.  5.2.  Répartition, stérilisation et conservation du milieu de culture Répartir le milieu de culture (5.1) par quantités de 100 à 150 ml dans les fioles ou de 12 à 15 ml dans les tubes (4.2.2). Boucher les fioles et les tubes.  Stériliser à l'autoclave (4.1.2) à 121 p 1 oC pendant 15 minutes.  Vérifier le pH du milieu.  Si le milieu de culture n'est pas utilisé immédiatement, le conserver à l'abri de la lumière entre 1 et 5 oC pendant un mois au maximum après sa préparation.  5.3.  Milieu de culture complet déshydraté du commerce Le milieu de culture (5.1) peut être préparé avec un milieu de culture complet déshydraté vendu dans le commerce. Suivre les instructions du fabricant, mais ajouter de la poudre de lait écrémé avant la dissolution si elle n'entre pas dans la composition  du produit.  Ajuster le pH à 6,9 p 0,1 à 25 o C selon le mode décrit en 5.1, puis répartir, stériliser et stocker le milieu selon les indications données en 5.2.  6.  Diluants 6.1.  Solution peptone/sel Composition Peptone 1,0 g Chlorure de sodium (NaCl) 8,5 g Eau 1 000 ml Préparation Dissoudre les composants dans l'eau, en chauffant si nécessaire.  Vérifier le pH à l'aide d'un pH-mètre (4.1.4); si nécessaire, ajuster le pH en utilisant une solution (au moins 0,1 mol/l) d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique de sorte qu'après stérilisation, il soit de 7,0 p 0,1 à 25 oC.  6.2.  Répartition, stérilisation et conservation du diluant Répartir le diluant (6.1) dans les tubes à essai (4.2.1) en quantité telle que chaque tube contienne, après stérilisation, 9,0 p 0,2 ml de diluant. Boucher les tubes.  Stériliser à l'autoclave (4.1.2) à 121 p 1 oC pendant 15 minutes.  Vérifier le pH du diluant.  Si le diluant n'est pas utilisé immédiatement, le conserver à l'abri de la lumière entre 1 et 5 oC pendant un mois au maximum après sa préparation.  6.3.  Diluants complets déshydratés du commerce La préparation du diluant (6.1) peut s'effectuer avec des poudres ou comprimés déshydratés vendus dans le commerce. Suivre les instructions du fabricant. Ajuster le pH selon le mode décrit en 6.1 puis répartir, stériliser et stocker les diluants selon  les instructions donnés en 6.2.  7.  Mode opératoire 7.1.  Fusion du milieu Avant de procéder à l'examen microbiologique, faire fondre rapidement la quantité de milieu nécessaire et refroidir le milieu à 45 p 1 oC dans un bain d'eau (4.1.5).  7.2.  Préparation de l'échantillon de lait 7.2.1.  Incuber le lait pasteurisé en emballage fermé ou si ce n'est pas possible, l'échantillon représentatif d'au moins 100 ml, pendant 120 p 2 heures à 6 p 0,5 oC dans une étuve [4.1.3.a)].  7.2.2.  Après incubation, mélanger convenablement l'échantillon de lait afin d'obtenir une répartition des micro-organismes aussi homogène que possible, en retournant rapidement 25 fois le récipient contenant l'échantillon. Éviter la formation de mousse ou  laisser la mousse se disperser. Le délai entre le mélange et le prélèvement de la prise d'essai ne doit pas dépasser 3 minutes.  7.3.  Préparation de la première dilution (10-;) Transférer, à l'aide d'une pipette stérile (4.2.3), 1 ml de l'échantillon (7.2.2) dans 9 ml de diluant (6.1) en évitant tout contact entre la pipette et le diluant. La température du diluant doit être sensiblement la même que celle de l'échantillon.  Mélanger soigneusement cette première dilution à l'aide d'un agitateur (4.1.9) pendant 5 à 10 secondes.  On obtient ainsi une première dilution 10-;.  7.4.  Préparation des dilutions décimales suivantes Transférer, à l'aide d'une pipette stérile (4.2.3), 1 ml de la première dilution (7.3) dans 9 ml de diluant (6.1) en suivant les indications données en 7.3.  On obtient ainsi la dilution 10-$.  Répéter ces opérations pour obtenir les dilutions décimales suivantes jusqu'à obtention du nombre adéquat de micro-organismes (8.1).  7.5.  Inoculation des boîtes de Petri Transférer, à l'aide d'une pipette stérile (4.2.3), 1 ml de l'échantillon ou de la dilution décimale appropriée dans une boîte (4.2.4). L'analyse doit porter sur l'examen d'au moins deux dilutions. Préparer, pour chaque dilution, deux boîtes  sélectionnées comme il convient (8.1).  7.6.  Coulage du milieu Verser environ 15 à 18 ml de milieu (7.1) dans chaque boîte ensemencée.  Mélanger immédiatement par rotation de la boîte de Petri afin d'obtenir une répartition régulière des colonies après incubation.  Le délai entre la fin de la préparation de l'échantillon et le mélange de la dilution avec le milieu ne doit pas dépasser 15 minutes.  Laisser reposer sur une surface horizontale froide et propre.  7.7.  Incubation des boîtes de Petri Placer les boîtes dans l'étuve [4.1.3.b)]. Incuber les boîtes retournées. Ne pas en empiler plus de six. Les piles de boîtes ne doivent pas se toucher ni être en contact avec les parois et la partie supérieure de l'étuve.  Incuber à 21 p 1 oC pendant 25 heures.  7.8.  Comptage des colonies Effectuer le comptage des colonies dans les boîtes de Petri ne contenant pas plus de 300 colonies.  Examiner les boîtes en lumière atténuée. Une loupe (4.1.6) et/ou un compteur enregistreur (4.1.8) peuvent être utilisés pour faciliter le comptage. Éviter de confondre des particules de matières précipitées avec des colonies de la taille d'une pointe  d'épingle. En cas de doute, procéder à un examen minutieux en utilisant si nécessaire une loupe de grossissement supérieur (4.1.7), afin de distinguer les colonies des matières étrangères.  Les colonies envahissantes sont considérées comme des colonies uniques. Si les colonies envahissantes recouvrent moins d'un quart de la boîte, compter les colonies sur la partie non touchée de la boîte et calculer le nombre correspondant pour la boîte  entière. Si les colonies envahissantes recouvrent plus d'un part de la boîte, éliminer la boîte.  8.  Calcul et expression des résultats 8.1.  Utiliser les résultats des boîtes contenant entre 10 et 300 colonies (voir 8.3 et 8.4).  8.2.  Calculer le nombre de micro-organismes par millilitre de lait pasteurisé à l'aide de la formule suivante:   (n1 + 0,1 n2) d   S C (n1 + 0,1 n2) d  où S C est la somme totale des colonies comptées selon le point 8.1,  (n1 + 0,1 n2) d est égal au volume de l'échantillon ensemencé où:  n1 est le nombre de boîtes comptées dans la première dilution,  n2 est le nombre de boîtes comptées dans la deuxième dilution,  d est le facteur de dilution à partir duquel les premiers comptages ont été obtenus.  Le nombre est arrondi à deux chiffres significatifs. Quand le chiffre à arrondir est 5, arrondir de manière que le chiffre placé immédiatement à gauche soit pair.  Exemple:  Dilution 10-2: 278 et 290 colonies Dilution 10-3:  33 et  28 colonies Nombre/ml =  278 + 290 + 33 + 28   Nombre/ml = 278 + 290 +33 + 28 (2 + 0,1 × 2) 10-2 Nombre/ml =  0,022   = 629 0,022 = 28 590 = 29 000 = 2,9 × 10%.   8.3.  Si tous les dénombrements sont inférieurs à 10, indiquer que le nombre de micro-organismes par millilitre est «inférieur à 10 × d», «d» étant l'inverse du facteur de dilution le plus faible.  8.4.  Lorsque tous les dénombrements sont supérieurs à 300 et que le comptage est possible, procéder à une estimation et la multiplier par l'inverse du facteur de dilution. Exprimer le résultat avec l'indication «nombre estimé de micro-organismes par  millilitre».  9.  Fidélité On ne dispose d'aucun résultat d'essais circulaires internationalement reconnus.  VI. DÉNOMBREMENT DES COLIFORMES - MÉTHODE PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES À 30 oC  1.  Objet et domaine d'application Le présent chapitre décrit le procédé de référence de dénombrement des coliformes dans le lait pasteurisé par la technique de comptage des colonies à 30 oC.  2.  Définition Par «coliformes», on entend les bactéries qui, à 30 oC, forment des colonies caractéristiques ou des colonies non caractéristiques qui fermentent le lactose avec production de gaz dans les conditions opératoires décrites.  3.  Principe Mélange d'un volume déterminé de l'échantillon de lait au milieu de culture dans des boîtes de Petri mis à incuber à 30 oC pendant 24 heures. Comptage des colonies caractéristiques et, si nécessaire, confirmation de l'identité des colonies non  caractéristiques en vérifiant leur aptitude à fermenter le lactose. Ensuite, calcul du nombre de coliformes par millilitre de lait pasteurisé.  4.  Appareillage et verrerie Matériel courant de laboratoire, et notamment:  4.1.  Appareillage 4.1.1.  Four à air chaud, réglable à 170-175 oC.  4.1.2.  Autoclave, réglable à 121 p 1 oC.  4.1.3.  Étuve, réglable à 30 p 1 oC.  4.1.4. pH-mètre, avec correction de température, sensible à p 0,1 unité de pH.  4.1.5.  Bain d'eau, réglable à 45 p 1 oC.  4.1.6.  Anse en platine iridié ou en nickel-chrome.  4.2.  Verrerie 4.2.1.  Tubes à essai, avec bouchons appropriés, de 20 ml de capacité environ, pour contenir le milieu de confirmation (5.2) et cloches de Durham de dimensions appropriées en vue de leur utilisation dans ces tubes.  4.2.2.  Fioles de 150 à 250 ml de capacité pour contenir le milieu sélectif solide (5.1).  4.2.3.  Pipettes en verre ou en matèriau synthétique stérile, non ébréchées, ayant une capacité nominale de 1-10 ml avec un orifice d'écoulement de 1,75 à 3 mm de diamètre.  4.2.4.  Boîtes de Petri en verre ou en matériau synthétique stérile transparent et incolore, le fond de la boîte ayant un diamètre intérieur d'environ 90-100 mm. La hauteur intérieure de la boîte doit être d'au moins 10 mm. Le fond de la boîte ne doit présenter  aucune irrégularité susceptible de gêner le comptage des colonies.  4.2.5.  Stérilisation de la verrerie La verrerie doit être stérilisée par l'une des méthodes suivantes:  a)  au four à air chaud (4.1.1) à une température de 170 à 175 oC pendant 1 h au moins;  b)  à l'autoclave (4.1.2) à une température de 121 p 1 oC pendant 20 minutes au moins.  Dans un autoclave, toute précaution doit être prise pour assurer une pénétration adéquate de la vapeur: si le matériel est stérilisé dans des récipients, les récipients ne doivent pas être fermés hermétiquement, les bouchons ou les couvercles des fioles  ou des flacons doivent être desserrés.  Faire sécher la verrerie stérilisée à l'autoclave afin d'éliminer la vapeur.  Stériliser les pipettes au four à air caud (4.1.1).  5.  Milieux de culture 5.1.  Gélose lactosée biliée au cristal violet et au rouge neutre (VRBL). Milieu sélectif solide.  Composition Peptone 7 g Extrait de levure 3 g Lactose (C12H22O11.H2O) 10 g Chlorure de sodium (NaCl) 5 g Sels biliaires 1,5 g Rouge neutre 0,03 g Cristal violet 0,002 g Agar-agar 10-15 g (selon les propriétés gélifiantes de l'agar-agar) Eau 1 000 ml Préparation Mettre en suspension, en dissolvant les composants dans l'eau et laisser reposer quelques minutes. Mélanger ensuite énergiquement.  Vérifier le pH à l'aide d'un pH-mètre (4.1.4); si nécessaire, ajuster le pH en utilisant une solution (au moins 0,1 mol/l) d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique, de sorte que, après ébullition, il soit de 7,4 p 0,1 à 25o C.  Porter rapidement à ébullition en agitant de temps en temps et répartir immédiatement le milieu par quantités de 100 à 150 ml dans des fioles stériles (4.2.2). Refroidir le milieu à 45 p 1 oC dans un bain d'eau (4.1.5).  Contrôler la stérilité du milieu au moment de l'emploi (voir 6.4) Utiliser le milieu dans les 3 heures qui suivent sa préparation.  5.2.  Bouillon lactosé bilié au vert brillant. Milieu de confirmation.  Composition Peptone 10 g Lactose (C12H22O11.H2O) 10 g Bile de boeuf déshydratée 20 g Vert brillant 0,0133 g Eau 1 000 ml Préparation Dissoudre les composants dans l'eau en portant à ébullition.  Vérifier le pH à l'aide d'un pH-mètre (4.1.4) et ajuster, si nécessaire, le pH à l'aide d'une solution (au moins 0,1 mol/l) d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique de sorte que, après stérilisation, il soit de 7,2 p 0,1 à 25 oC.  Répartir le milieu, par quantités de 10 ml, dans des tubes à essai (4.2.1) contenant les cloches de Durham (4.2.1). Boucher les tubes.  Stériliser à l'autoclave (4.1.2) à 121 p 1 oC pendant 15 minutes.  Les cloches de Durham ne doivent pas contenir de bulles d'air après stérilisation.  Vérifier le pH du milieu.  Si le milieu n'est pas utilisé immédiatement, le conserver à l'abri de la lumière entre 0 et 5 oC pendant un mois au maximum après sa préparation.  5.3 Milieux de culture complets déshydratés du commerce Les milieux de culture (5.1, 5.2) peuvent être préparés à l'aide de milieux complets déshydratés vendus dans le commerce. Suivre les instructions du fabricant. Ajuster le pH, répartir, porter à ébullition ou stériliser et stocker les milieux selon les  indications données en 5.1 et 5.2.  6.  Mode opératoire 6.1 Le milieu Utiliser le milieu (gélose (VRBL) décrit en 5.1.  6.2.  Préparation de l'échantillon de lait Agiter vigoureusement l'échantillon de lait afin d'obtenir une répartition des micro-organismes aussi homogène que possible, en retournant rapidement 25 fois le récipient contenant l'échantillon. Éviter la formation de mousse ou laisser la mousse se  disperser. Le délai entre le mélange et le prélèvement de la prise d'essai ne doit pas dépasser 3 minutes.  6.3.  Ensemencement des boîtes de Petri Ensemencer 3 ml de l'échantillon de lait (6.2) en transférant, à l'aide d'une pipette stérile (4.2.3), 1 ml de l'échantillon dans chacune des trois boîtes (4.2.4).  6.4.  Coulage du milieu Couler de la gélose VRBL (6.1) dans chaque boîte ensemencée à raison d'environ 12 ml.  Mélanger immédiatement la gélose, par rotation de la boîte de Petri, afin d'obtenir une répartition régulière des colonies après incubation.  Le délai entre la fin de la préparation de l'échantillon et le mélange de la prise d'essai et du milieu ne doit pas dépasser 15 minutes.  Pour contrôler la stérilité, préparer une boîte témoin avec 12 ml de gélose VRBL utilisée pour les boîtes ensemencées.  Laisser reposer sur une surface horizontale froide et propre jusqu'à solidification du milieu.  Après solidification complète du milieu, couler 4 ml au moins de gélose VRBL (6.1) à la surface du milieu ensemencé.  Laisser solidifier.  6.5.  Incubation des boîtes Petri Placer les boîtes dans l'étuve (4.1.3). Incuber les boîtes retournées. Ne pas en empiler plus de six. Les piles de boîtes ne doivent ni se toucher ni être en contact avec les parois ou la partie supérieure de l'étuve.  Incuber à 30 p 1 oC pendant 24 p 2 heures.  6.6.  Comptage des colonies 6.6.1.  Compter les colonies dans les boîtes de Petri ne contenant pas plus de 150 colonies. Compter les colonies rouges foncées ayant un diamètre d'au moins 0,5 mm avec ou sans précipité autour, caractéristiques des coliformes.  6.6.2.  Si toutes ou quelques colonies ont un aspect non caractéristique (divergence de couleur, de taille ou de formation du précipité par rapport aux colonies typiques), appliquer l'épreuve de confirmation (6.7).  6.7.  Épreuve de confirmation Selon les indications données en 6.6.2, appliquer l'épreuve de confirmation sur un nombre approprié de colonies (par exemple de 3 à 5) non caractéristiques en les ensemençant dans des tubes de bouillon lactosé bilié au vert brillant (5.2) à l'aide d'une  anse bouclée (4.1.6). Incuber les tubes à 30 p 1 oC pendant 24 p 2 h.  Considérer les colonies qui produisent du gaz dans les cloches de Durham comme étant des coliformes.  7.  Calcul et expression des résultats 7.1.  Retenir pour le comptage (voir 7.4) les boîtes contenant au maximum 150 colonies.  7.2.  S'il est procédé à l'épreuve de confirmation, calculer le nombre de colonies de coliformes à partir du pourcentage de colonies de coliformes confirmées.  7.3.  Calculer le nombre de coliformes par ml de lait pasteurisé à l'aide de la formule suivante:   S C  ,  S C n   où S C est la somme totale des colonies de coliformes (7.1 en relation avec 7.3) trouvées par l'analyse de l'échantillon de lait (3 ml).  n est le nombre de ml de l'échantillon analysé (6.3.1) (3 ml).  Le nombre est arrondi à deux chiffres significatifs s'il y a plus de 100 colonies. Quand le chiffre à arrondir est 5, arrondir de manière que le chiffre placé immédiatement à gauche soit pair.   Si tous les dénombrements sont supérieurs à 150 colonies, exprimer le résultat obtenu avec l'indication «nombre estimé de coliformes par ml».  8.  Fidélité On ne dispose d'aucun résultat d'essais circulaires internationalement reconnus.  VII. DÉNOMBREMENT DES CELLULES SOMATIQUES  Le présent chapitre décrit deux procédures de référence de dénombrement des cellules somatiques:  A.  Le procédé microscopique B.  Le procédé fluoro-opto-électronique.   A.  Procédé microscopique 1.  Objet et domaine d'application La présente norme décrit le procédé de référence de dénombrement des cellules somatiques dans le lait cru.  La présente norme décrit le procédé de dénombrement du nombre «véritable» de cellules dans un échantillon de lait pour étalonner et vérifier la précision du procédé fluoro-opto-électronique (voir B.1).  2.  Définition Dans le présent procédé, on entend par cellules somatiques les cellules, par exemple leucocytes et cellules épithéliales, dont le noyau peut être coloré distinctement au bleu de méthylène.  3.  Principe Étalement de 0,01 ml de lait sur une surface de 1 cm$ d'une lame porte-objet. Le film de lait est séché et coloré. Le comptage s'effectue à l'aide d'un microscope. Le nombre de cellules somatiques dénombrées pour une surface déterminée est multiplié par  un facteur de multiplication afin d'obtenir le nombre de cellules par ml.  4.  Réactifs Les produits chimiques doivent être de qualité analytique.  Solution colorante Composition Bleu de méthylène  0,6 g Éthanol - 99 % 54,6 ml 1,1,1-trichloro-éthane ou tétrachloro-éthane 40,6 ml Acide acétique glacial  6,6 ml Attention Le tétrachloro-éthane étant toxique, les manipulations doivent être réalisées sous une hotte aspirante.  Préparation Mélanger l'éthanol et le 1,1,1-trichloro-éthane ou tétrachloro-éthane dans un flacon et chauffer dans un bain d'eau à 60-70 oC. Ajouter le bleu de méthylène, mélanger soigneusement, refroidir au réfrigérateur à 4 oC pendant 12 à 24 heures puis ajouter  l'acide acétique glacial. Filtrer sur filtre d'une porosité de 10 à 12 microns au maximum et conserver la solution colorante dans un flacon étanche. En cas de formation de particules de sédiments, filtrer à nouveau avant usage.  5 Appareillage et verrerie 5.1.  Microscope permettant un grossissement de × 500 à × 1 000.  5.2.  Microseringue permettant de répartir des quantités de 0,01 ml avec une précision de 2 % ou meilleure.  5.3.  Lame porte-objet pour l'étalonnement du film comportant un rectangle gravé de 20 mm × 5 mm ou lame standard et gabarit de 20 mm × 5 mm.  5.4.  Plaque chauffante horizontale (30-50 oC) pour sécher les lames.  5.5.  Ventilateur (type sèche-cheveux) pour sécher le film.  5.6.  Bain d'eau, réglable à 30-40 oC pour chaffer l'échantillon de lait.  5.7.  Micromètre objectif gradué au 1/100 de mm.  6.  Mode opératoire 6.1.  Échantillon de lait L'échantillon de lait doit être analysé dans les six heures qui suivent le prélèvement. Pendant le stockage, la température de l'échantillon ne doit pas dépasser 6 oC. La congélation doit être évitée.  6.2.  Préparation de l'échantillon dans le laboratoire Chauffer l'échantillon dans un bain d'eau (5.6) à 30-40 oC, puis mélanger soigneusement. Refroidir à la température à laquelle la microseringue (5.2) a été étalonnée, par exemple 20 oC.  6.3.  Prétraitement des lames Nettoyer les lames (5.3) à l'éthanol par exemple, essuyer à l'aide d'un papier ne laissant pas de particules, flamber et laisser refroidir. Conserver dans une boîte à l'abri des poussières.  6.4.  Préparation du film À l'aide de la microseringue (5.2) prélever 0,01 ml de l'échantillon de lait préparé comme indiqué ci-dessus. Nettoyer soigneusement la partie externe de la seringue entrée en contact avec le lait. Déposer le contenu de la seringue sur la lame (5.3)  après avoir pris soin de délimiter les contours du rectangle (20 mm × 5 mm). Répartir ensuite le prélèvement aussi régulièrement que possible sur cette surface. Laisser sécher le film sur une plaque chauffante horizontale (5.4) jusqu'à ce qu'il soit  complètement sec.  Préparer et examiner au moins deux films pour chaque échantillon.  6.5.  Coloration des films Immerger dans une solution colorante (4) pendant 10 minutes. Sécher et, si nécessaire, compléter le séchage à l'aide du ventilateur (5.5). Plonger les films dans de l'eau jusqu'à élimination complète du surplus de colorant. Sécher à nouveau et conserver  à l'abri des poussières.  6.6.  Étalonnage du champ microscopique À partir du grossissement choisi (× 500 - × 1 000), mesurer à l'aide du micromètre objectif (5.7) le diamètre du champ microscopique.  7.  Comptage et calcul 7.1.  Dénombrement des cellules Utiliser le microscope (5.1). Au lieu de dénombrer les cellules, dénombrer uniquement les noyaux de cellules, clairement reconnaissables et dont au moins la moitié est visible dans le champ microscopique. Compter les bandes ou les champs situés dans le  tiers central du film en évitant de compter les bandes ou les champs sélectionnés exclusivement dans les zones périphériques du film. Le soin apporté à la préparation des films et, par conséquent, la fiabilité des résultats doivent être vérifiés au  moins une fois par mois en comptant différentes parties du film. Il est également possible de procéder au dénombrement en comptant les champs microscopiques répartis de telle façon que toutes les parties du film seront représentées de manière  équivalente.  7.2.  Détermination du nombre minimal de cellules à compter Étant donné que le dénombrement microscopique des cellules somatiques peut également être utilisé pour l'étalonnage des techniques de comptage mécaniques et automatiques, le coefficient de variation des comptages sur des échantillons identiques ne doit  pas être plus élevé que celui obtenu avec les appareils électroniques. Le coefficient de variation pour un échantillon de lait contenant de 400 000 à 600 000 cellules par ml ne doit pas dépasser 5 %.  D'après la loi de distribution de Poisson, afin d'obtenir cette répétabilité, le nombre de cellules somatiques à dénombrer dans chaque échantillon ne doit pas être inférieur à 400.  Selon la loi de distribution de Poisson,  M = V = s$,  où M est la valeur moyenne arithmétique,  V est la variance et s est l'écart-type.  Le coefficient de variation est:  CV =  s × 100 %  ou CV =  100 %  ou CV =  100 %   CV = s × 100 % M ou CV = 100 % s ou CV = 100 % wM- M (moyenne) représente le nombre de particules (cellules) qui ont été dénombrées (par exemple, 400 pour CV = 5 %).  7.3.  Calcul du facteur de multiplication En utilisant 0,01 ml de lait, le facteur de multiplication se calcule conformément aux points 7.3.1 ou 7.3.2.  7.3.1.  Comptage des bandes dans le film La longueur des bandes à dénombrer est de 5 mm, soit la largeur du film. La largeur de la bande correspond par contre au diamètre du champ microscopique déterminé par le micromètre objectif (5.7).  Facteur de multiplication =  20× 100   Facteur de multiplication = 20 × 100 d × b où d est le diamètre en millimètres du champ microscopique, déterminé par le micromètre objectif (5.7),  b est le nombre de bandes entièrement comptées.  7.3.2.  Comptage des champs microscopiques dans le tiers central du film ou à l'aide d'une grille Facteur de multiplication: =  20 × 5 × 100  =  12 732   Facteur de multiplication =20 × 5 × 100 P × d² × s 4 = 12 732 d² × s où d représente le diamètre en millimètres du champ microscopique déterminé par le micromètre objectif (5.7),  s représente le nombre de champs comptés.  7.4.  Calcul de la teneur en cellules Le nombre de cellules somatiques dénombrées (7.1 et 7.2) est multiplié par le facteur de multiplication (7.3), afin d'obtenir le nombre de cellules par ml de lait.  7.5.  Précision Le coefficient de variation de répétabilité (voir 7.2) ne doit pas excéder 5 %.  On ne dispose d'aucun résultat d'essais circulaires internationalement reconnus en matière de précision.   B.  Procédé fluoro-opto-électronique 1.  Objet et domaine d'application La présente norme décrit le procédé officiel qui, après un étalonnage adéquat (voir A.1), peut être utilisé pour le dénombrement des cellules somatiques dans le lait cru - avec ou sans addition de conservateurs chimiques.  2.  Définition Pour ce procédé, les cellules somatiques sont des particules qui ont une intensité de fluorescence minimale due à la coloration de l'ADN cellulaire.  3.  Principe Un volume de l'échantillon (par exemple 0,2 ml) est mélangé convenablement avec la solution tampon et la solution fluorescente. Une partie de ce mélange est ensuite transférée sous la forme d'un mince film dans un disque rotatif faisant fonction de  porte-objet.  Chaque cellule produit une impulsion électrique qui est amplifiée et enregistrée. Le nombre de cellules somatiques est imprimé en milliers par ml.  4.  Réactifs Sauf indication contraire, n'utiliser que des produits chimiques de qualité analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou déionisée, ou de l'eau d'une pureté équivalente.  4.1.  Solution tampon Composition Hydrogénophtalate de potassium 51,0 g Hydroxyde de potassium 13,75 g Polyéthylèneglycol-mono-p-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl)-phényl-éther (par exemple Triton X-100), à 1 % en volume 10,0 ml pH 5,7 - 5,9. Compléter à 10 000 ml avec de l'eau distillée.  Préparation Mélanger les différents composants. La conservation sous fermeture hermétique ne doit pas dépasser 7 jours.  4.2 Solution fluorescente (solution mère) Composition Bromure d'éthidium 1,0 g Compléter à 1 000 ml avec de l'eau.  Préparation Dissoudre le bromure d'éthidium dans l'eau. La conservation dans un flacon hermétique à l'abri de la lumière ne doit pas dépasser 2 mois.  4.3 Solution fluorescente (solution pour l'analyse) Mélanger 20 ml de la solution mère (4.2) à la solution tampon (4.1) de manière à obtenir 1 000 ml. La solution pour l'analyse ne doit pas être utilisée au-delà de 7 jours.  4.4 Solution de lavage Composition Solution tampon (4.1) 10,0 ml Polyéthylèneglycol-mono-p-(1,1,3,3-tétraméthylbutyle)-phényle-éther (par exemple Triton X-100), à 1 % en volume 10,0 ml Ammoniac, à 25 % en volume 25,0 ml Compléter à 10 000 ml avec de l'eau.  Préparation Mélanger les différents composants. Ne pas conserver au-delà de 30 jours.  5.  Appareillage et verrerie 5.1 Compteur fonctionnant selon le principe de la fluorescence optique.  Note Avant l'emploi, étalonner l'instrument. La relation entre le volume des particules à dénombrer et le seuil limite à partir duquel les dénombrements sont appliqués est déterminée de la sorte. L'étalonnage de l'appareil s'effectue suivant les instructions  du fabricant en utilisant des échantillons dont la teneur en cellules a été déterminée par la méthode microscopique (A).  5.2.  Bain d'eau, à circulation, réglable à 40 p 1 oC.  5.3.  Tube à essai, avec fermeture appropriée, d'environ 15 ml.  6.  Échantillon de lait 6.1.  L'échantillon doit être stocké à basse température dans un tube à essai (5.3). Si l'échantillon ne contient pas de conservateur chimique, le dénombrement ne doit pas s'effectuer dans les 24 heures qui suivent la traite, étant donné que la teneur en  germes serait trop faible. La température de conservation ne doit pas dépasser 6 oC.  6.2.  Addition de conservateurs La conservation chimique doit être réalisée dans les 24 heures. L'addition de conservateurs doit s'effectuer dès que possible après le prélèvement de l'échantillon.  6.2.1.  La conservation chimique de l'échantillon est réalisée par l'addition de l'un des conservateurs suivants:  - acide orthoborique:  la concentration finale de l'acide orthoborique dans l'échantillon ne doit pas dépasser 0,6 g/100 ml. L'échantillon conservé de la sorte peut être stocké pendant 24 heures supplémentaires à 6-12 oC,  - dichromate de potassium:  la concentration finale de dichromate de potassium ne doit pas dépasser 0,2 g/100 ml. L'échantillon conservé de la sorte peut être stocké durant 72 heures supplémentaires à 6-12 oC,  - azide de sodium:  l'échantillon peut être conservé avec de l'azide de sodium à une concentration finale de 0,024 g/100 ml, à condition qu'il soit refroidi à une température de 6-12 oC immédiatement après le prélèvement et compté dans les 48 heures qui suivent le  prélèvement,  - bronopol:  l'échantillon peut être conservé avec du bronopol à une concentration finale de 0,05 g/100 ml, à condition d'être refroidi à 6-12 oC immédiatement après le prélèvement et compté dans les 72 heures qui suivent le prélèvement.  6.2.2.  Un échantillon déjà conservé à l'aide d'acide orthoborique peut être conservé 48 heures de plus par addition de dichromate de potassium.  Note Pour les échantillons conservés à l'aide de dichromate de potassium, les normes locales relatives au rejet des effluents doivent être respectées.  7.  Mode opératoire 7.1.  Prétraitement de l'échantillon Le lait à analyser doit être conservé après la traite pendant au moins 24 heures à 2-6 oC environ. Le comptage des échantillons le jour de la traite n'est pas conseillé sans prétraitement, car les résultats risquent d'être trop faibles. S'il faut malgré  tout procéder au comptage, l'échantillon doit alors être prétraité pendant trois heures au moins à l'aide de dichromate de potassium (voir 6.2.1).  7.2.  Préparation Chauffer l'échantillon prétraité (7.1) ou l'échantillon non traité ayant au moins un jour dans un bain d'eau (5.2) à 40 oC environ. Conserver ensuite l'échantillon à température ambiante jusqu'au moment du comptage.  7.3.  Comptage des cellules Procéder au comptage à l'aide du compteur (5.1) dans les quinze minutes qui suivent la fin du chauffage (voir 7.2). Immédiatement avant le comptage, mélanger convenablement les échantillons afin d'obtenir une répartition des cellules somatiques aussi  homogène que possible.  La dilution et la préparation ultérieures de l'échantillon doivent s'effectuer automatiquement dans le compteur.  8.  Fidélité On ne dispose pas de chiffres de répétabilité (r) et de reproductibilité (R) provenant d'essais circulaires internationalement reconnus.  À l'avenir, des critères de fidélité seront fixés par un laboratoire de référence de comptage des cellules, chargé d'organiser et d'évaluer régulièrement des essais circulaires.  Les données disponibles à l'échelle nationale permettent de procéder aux estimations suivantes:  nombre de cellules compris entre 400 000 et 500 000 ml - écart type relatif à la répétabilité:  sr = 20 000 cellules/ml (soit un coefficient de variation de 5 %-4 %),  - écart type relatif à la reproductibilité:  sR = 40 000 cellules/ml (soit un coefficient de variation de 10 %-8 %).  9.  Contrôle de précision Le contrôle de précision s'effectue à l'aide d'échantillons d'une teneur en cellules connue, déterminée par un comptage microscopique des cellules dans un laboratoire national de référence.  VIII. DÉTECTION DES ANTIBIOTIQUES ET DES SULFAMIDES  OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION Le présent chapitre décrit le procédé de référence de détection des antibiotiques et des sulfamides dans le lait cru et le lait traité thermiquement.  Le procédé de référence comporte:  A.  Un procédé qualitatif Ce procédé est le procédé initial qui permet de sélectionner les échantillons de lait contenant des antibiotiques et des sulfamides. Le procédé décrit est l'un des procédés basés sur l'emploi d'une souche de Bacillus stearothermophilus, variété  calidolactis, ATCC 10149 comme organisme test. Ce procédé a été choisi comme étant représentatif pour ces épreuves de détection.  B.  Un procédé de confirmation et d'identification de la pénicilline Ce procédé doit être utilisé pour confirmer les résultats de la «méthode A», identifier la pénicilline et en déterminer la concentration.   A.  Procédé qualitatif 1.  Objet et domaine d'application La présente norme décrit la technique de la détection qualitative des antibiotiques et des sulfamides dans le lait cru et le lait traité thermiquement en concentration supérieure aux limites mentionnées dans le tableau ci-après:   Concentrations décelables de différents antibiotiques et sulfamides (¹)  Limite de détection Négative Positive Benzylpénicilline 0,002  0,006 Ampicilline 0,002  0,005 Cloxacilline 0,015  0,035 Nafcilline 0,006  0,011 Tétracycline HCL 0,10   0,40  Oxytétracycline 0,20   0,45  Chlortétracycline 0,15   0,50  Chloramphénicol 7,  15,  Dihydrostreptomycine 4,  13,  Néomycine 1,  22,  Kanamycine 9,  28,  Bacitracine 0,06   0,14  Érythromycine 1,   2,25  Rifamycine 0,01   0,14  Diaphénylsulfone 0,01   0,1   Sulfaméthazine (sulfadimidine) 0,5    1,  (¹) La benzylpénicilline et la bacitracine sont exprimées en Ul/ml, tous les autres antibiotiques en mg/ml.  2.  Définition Le lait contient des antibiotiques ou des sulfamides lorsque la couleur du milieu est inchangée (voir 7.1).  3.  Principe Addition de l'échantillon de lait et du mélange nutritif dans une gélose contenant un indicateur de pH et des spores de Bacillus stearothermophilus, variété calidolactis, ATCC 10149 (voir 5.4.1), souche représentant, d'une manière générale, une très  bonne sensibilité et plus particulièrement pour la pénicilline. Une croissance normale et la production d'acide par cet organisme après incubation provoquent un changement de couleur de l'indicateur de pH qui vire du pourpre au jaune. Lorsque le lait  contient des substances inhibitrices pour la croissance de l'organisme test, la couleur de l'indicateur de pH reste pourpre.  4.  Appareillage et verrerie Matériel courant de laboratoire, et notamment:  4.1.  Appareillage 4.1.1.  Étuve réglable à 64 p 1 oC.  4.1.2.  Bain d'eau réglable à 64 p 1 oC.  4.1.3.  Portoir pour tubes ou ampoules.  4.1.4.  Seringue à usage unique avec embout jetable permettant de prélever et de répartir 0,1 ml.  4.1.5.  Pince.  4.1.6.  Four à air chaud, réglable de 170 à 175 oC.  4.1.7.  Autoclave, réglable à 121 p 1 oC.  4.1.8.  pH-mètre.  4.2.  Verrerie 4.2.1.  Flacons à échantillon avec fermeture adéquate.  Note Certains bouchons en caoutchouc peuvent déposer des substances inhibitrices au niveau de l'encolure du flacon.  4.2.2.  Boîtes de Petri en matière synthétique stérile ou en verre incolore transparent, d'un diamètre intérieur minimal d'environ 140 mm, à fond parfaitement plat.  4.2.3.  Flacons d'une capacité de 250 ml.  4.2.4.  Pipettes (bouchées avec du coton) en verre ou en matière synthétique stérile d'une capacité nominale de 1 ml et 10 ml.  4.2.5.  Spatules en verre 4.2.6.  Tubes ou ampoules avec couvercle ou bouchon, d'un diamètre intérieur de 8 mm environ.  4.2.7.  Stérilisation de la verrerie La verrerie doit être stérilisée par l'une des méthodes suivantes:  a)  au four à air chaud à une température de 170 à 175 oC pendant une heure au moins (4.1.6);  b)  à l'autoclave à une température de 121 oC pendant 20 minutes au moins (4.1.7).  Dans l'autoclave, toute précaution doit être prise pour assurer une pénétration adéquate de la vapeur: si le matériel est stérilisé dans des récipients, ceux-ci ne doivent pas être fermés hermétiquement, les bouchons ou les couvercles des fioles ou des  flacons doivent être desserrés.  Faire sécher la verrerie stérilisée en autoclave afin d'éliminer la vapeur.  Stériliser les pipettes au four à air chaud.  5.  Milieux, solutions, organisme test Les composants de base des milieux doivent convenir aux analyses bactériologiques. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée sur verre ou de l'eau déminéralisée de pureté équivalente. Elle doit être exempte de substances pouvant inhiber la croissance  de l'organisme test. 5.1.  Milieux 5.1.1.  Gélose nutritive Composition Extrait de levure 2 g Peptone 5 g Extrait de viande 1 g Chlorure de sodium 5 g Gélose 10-15 g Eau distillée 1 000 ml Préparation Dissoudre les composants dans l'eau. Amener à ébullition en remuant de temps à autre. Ajuster le pH de manière à être, après stérilisation, de 7,4 p 0,1 à 25 oC.  Répartir à raison de 10 ml dans des tubes à essai ou à raison de 100 ml dans des flacons et incliner pour obtenir une pente.  Stériliser à 121 oC pendant 15 minutes.  5.1.2.  Milieu gélosé Composition Chlorure de sodium 2 g Gélose 15 g Eau 1 000 ml Solution de triméthroprime ou de tetroxoprim (voir 5.1.3) (1) 10 ml Préparation Dissoudre les composants, exception faite du triméthoprime ou du tetroxoprim, dans l'eau. Amener à ébullition en remunant de temps à autre. Ajouter du triméthoprime ou du tetroxoporim et stériliser à 121 p 1 oC pendant 15 minutes. Ajuster le pH de  manière à être, après stérilisation, de 7,0 p 0,1 à 25 oC.  5.1.3.  Solution de triméthoprime ou de tetroxoprim Composition Triméthoprime 5 mg ou tetroxoprim 30 mg Éthanol à 96o 5 ml ou 30 ml Eau à raison de 1 000 ml Préparation Dissoudre le triméthoprime ou le tetroxoprim (5 ou 30 ml) dans l'éthanol et compléter avec l'eau.  5.1.4.  Mélange nutritif Composition Extrait de levure 0,75 mg Glucose 5,0  mg Amidon soluble 8,0  mg Pourpre de bromocrésol 0,025 g Eau à raison de 50 ml Préparation Dissoudre le mélange nutritif et l'indicateur dans l'eau en chauffant si nécessaire et stériliser par filtrage. Le mélange nutritif est vendu dans le commerce sous forme de comprimés.  5.2.  Solutions étalons de pénicilline 5.2.1.  Préparer, dans un flacon stérile à fermeture adéquate, une solution de pénicilline à 60 mg/ml = (100 UL/ml) en dissolvant du benzylpénicillinate de sodium ou de potassium dans de l'eau distillée stérile.  5.2.2.  Préparer une solution diluée de pénicilline en introduisant 1,25 ml de solution de pénicilline (5.2.1) dans de l'eau distillée stérile et compléter à 1 000 ml. Cette solution diluée contient 0,075 mg de pénicilline/ml (= 0,125 UL de pénicilline/ml).  5.2.3.  Préparer 75 ml de solution étalon de pénicilline contenant 0,004 mg de pénicilline/ml (= 0,0067 UL de pénicilline/ml) en ajoutant 4 ml de solution diluée de pénicilline (5.2.2) à 71 ml de lait exempt de substances inhibitrices (5.3) et mélanger.   13. 4. 91 Journal officiel des Communautés européennes 5.2.4.  Les solutions de pénicilline décrites de 5.2.1 à 5.2.3 doivent être préparées extemporanément.  5.3.  Lait exempt de substances inhibitrices Préparer un lait témoin exempt de substances inhibitrices en dissolvant, dans de l'eau distillée stérile, du lait écrémé en poudre (10 % m/v) dans lequel on aura préalablement vérifié l'absence de substances inhibitrices. On peut également utiliser une  quantité appropriée de lait frais de mélange dans lequel on aura vérifié l'absence de substances inhibitrices; ce lait sera réparti dans des flacons, chauffé pendant une heure à 100 oC puis conservé au réfrigérateur à 0-6 oC pendant une semaine au  maximum.  5.4.  Organisme test 5.4.1.  Le Bacillus stearothermophilus, variété calidolactis, souche ATCC 10149 est utilisé comme organisme test. La souche ATCC 10149 est identique à la souche C 953.  5.4.2.  Préparer une culture de réserve depuis la culture d'épreuve pour conserver la souche. La conservation est effectuée sur gélose nutritive inclinée (5.1.1). La gélose inclinée est ensemencée en stries à l'aide d'une anse imprégnée de la culture d'épreuve  puis incubée en aérobiose pendant 48 heures à 63 p 1 oC. Après incubation, boucher hermétiquement le tube à l'aide d'un bouchon stérile en caoutchouc. La culture de réserve ainsi obtenue peut être conservée plusieurs mois au réfrigérateur à 5 oC.  5.5.  Culture d'épreuve (suspension de spores) 5.5.1.  Verser aseptiquement 20 ml de gélose nutritive fondue (5.1.1) dans une boîte de Petri stérile (4.2.2) et laisser refroidir à température ambiante.  5.5.2.  À l'aide d'une pipette stérile (4.2.4), transférer 5 ml d'eau distillée stérile dans un tube contenant la culture de réserve (5.4.2) et reprendre par lavage les spores se trouvant sur la gélose inclinée en s'aidant d'une anse stérile. Conserver la  suspension de spores à 5 oC et l'utiliser dans les 36 heures qui suivent.  5.5.3.  À l'aide d'une pipette stérile (4.2.4), transférer 0,5 ml de la suspension de spores (5.5.2) dans une boîte contenant le milieu (5.5.1) et étaler soigneusement l'inoculum sur toute la surface avec un étaleur en verre. Incuber à 63 p 1 oC (4.1.1) pendant  16-18 heures.  Depuis une culture de réserve (5.4.2) ou une culture ayant plus de 36 heures, la technique de repiquage devra être effectuée au moins deux fois avec un intervalle maximum de 36 heures entre chaque subculture.  5.5.4.  Transférer à l'aide d'une pipette stérile (4.2.4), 10 ml d'eau distillée dans la boîte contenant la culture (5.5.3) et éliminer les spores en suspension de la surface en s'aidant d'une baguette de verre.  Transférer la suspension de spores (4.2.3) dans un flacon (5.2.3) contenant 250 ml d'eau distillée stérile. Fermer le flacon et agiter vigoureusement. Les cultures qui ne sont pas repiquées immédiatement doivent être conservées au réfrigérateur à 0-6  oC.  5.5.5.  La suspension de spores ensemencée sur le milieu gélosé (5.1.2) exempt de triméthoprime doit présenter un nombre de germes viables compris entre 5 et 10 millions par ml après incubation à 63 p 1 oC pendant 16-18 heures. La suspension de spores doit être  uniformément trouble et, si elle contient des flocons ou un sédiment, la remplacer par une nouvelle suspension préparée à partir de la culture de réserve (5.4.2).  5.6.  Préparation des tubes à essai/ampoules 5.6.1.  Faire fondre le milieu gélosé (5.1.2) puis refroidir à 55 oC.  5.6.2.  Ajouter une partie de la suspension de spores fraîches (5.5.4) à cinq parties de milieu gélosé (5.6.1) dans un tube ou un flacon; mélanger soigneusement.  5.6.3.  Transférer, dans un tube ou une ampoule stérile (5.6.2) 0,3 ml du milieu ensemencé (4.2.6) calculé pour obtenir une couche uniforme de 5 mm d'épaisseur puis fermer le tube avec un bouchon ou un couvercle et, pour l'ampoule, sceller l'extrémité à la  flamme. Laisser solidifier le milieu gélosé puis maintenir les tubes/ampoules en position verticale pendant au moins 12 heures.  5.6.4.  Le tubes à essai/ampoules peuvent être utilisés le jour même mais également être conservés pendant plusieurs mois à 0-6 oC à condition d'être refroidis immédiatement après leur préparation.  6.  Mode opératoire 6.1.  Les échantillons doivent être analysés le plus tôt possible et de préférence dans les 24 heures qui suivent le prélèvement; entre-temps, ils doivent être conservés à 0-5 oC. S'il n'est pas possible d'analyser les échantillons durant ces 24 heures, les  conserver au congélateur (- 30 oC à - 15 oC) pour réduire au minimum l'inactivation de la pénicilline.  6.2.  Identifier chaque tube/ampoule (5.6) de façon lisible et indélébile. Enlever le couvercle ou le bouchon. Placer sur un portoir (4.1.3) le nombre requis pour l'examen des échantillons et des témoins (5.2 et 5.3).  6.3.  Ajouter 50 microlitres du mélange nutritif (5.1.4) dans chaque tube/ampoule.  6.4.  Mélanger soigneusement l'échantillon de lait à analyser et transférer, à l'aide de la seringue (4.1.4), 0,1 ml dans le tube/ampoule étiqueté(e). Utiliser un embout neuf et jetable pour transférer chaque échantillon.  6.5.  Selon le mode décrit en 6.4, préparter 2 témoins depuis la solution étalon de pénicilline contenant 0,004 g/ml (= 0,0067 UL/ml) de pénicilline.  6.6.  Selon le mode décrit en 6.4, préparer 2 témoins depuis le lait témoin exempt de substances inhibitrices (5.3).  6.7.  Boucher les tubes/ampoules et placer le portoir contenant les tubes/ampoules dans un bain d'eau à 63 p 1 oC (4.1.2) pendant au moins 2 ;/2-2 =/4 heures.  6.8.  Retirer le portoir contenant les tubes/ampoules du bain d'eau.  6.9.  Observer la couleur du milieu gélosé (voir 7).  7.  Interprétation des résultats 7.1.  Une coloration pourpre du milieu gélosé dans les tubes/ampoules qui contiennent la solution étalon de pénicilline ou l'échantillon de lait révèle la présence d'antibiotiques ou de sulfamides (à peu près) au niveau «positif» visé dans le tableau de la  page 39. La sensibilité du milieu est satisfaisante si la coloration des tubes/ampoules contenant la solution étalon de pénicilline (6.5) reste pourpre.  7.2.  Une coloration pourpre partielle du milieu gélosé ou une coloration irrégulière dans les tubes/ampoules contenant l'échantillon de lait révèle la présence de substances inhibitrices entre les niveaux visés dans le tableau de la page 39.  7.3.  Une coloration jaune du milieu gélosé dans les tubes/ampoules contenant le lait témoin exempt de substances inhibitrices ou l'échantillon de lait révèle l'absence de substances inhibitrices de l'organisme test.  7.4.  Si tous les tubes/ampoules soumis à l'épreuve, y compris le témoin négatif, présentent une coloration pourpre, les tubes/ampoules ne contiennent pas de spores viables et les échantillons doivent faire l'objet d'une nouvelle analyse utilisant pour  l'ensemble de la technique des préparations fraîchement préparées.  8.  Confirmation des résultats 8.1.  Confirmer les résultats de tous les échantillons présentant les réactions décrites en 7.1 et 7.2 à l'aide de la «méthode B». Si les échantillons de lait doivent être conservés avant la confirmation, il convient de les surgeler pour empêcher la  dégradation des antiobiotiques.   B.  Procédé de confirmation de la présence de pénicilline et détermination de sa concentration 1.  Objet et domaine d'application La présente norme décrit le procédé de confirmation des pénicillines ou autres antibiotiques ainsi que le procédé de détermination de la concentration en pénicilline des échantillons de lait présentant une réaction positive (A.7.1) ou douteuse (A.7.2).   Sensibilité du procédé à différents antibiotiques Voir A.1.  2.  Définition 2.1.  L'échantillon de lait contient des antibiotiques, y compris des sulfamides, lorsque l'échantillon analysé par la méthode décrite produit une zone claire d'inhibition d'au moins 2 mm autour du disque.  2.2.  Si un échantillon contenant des antibiotiques y compris des sulfamides (2.1) et additionné de pénicillinase (betalactamase) ne produit pas de zone claire ou donne une zone claire d'un diamètre plus petit que celui en l'absence de pénicillinase, la  substance inhibitrice est soit de la pénicilline, soit de la pénicilline associée à un autre antibiotique, sulfamide compris.  2.3.  Si la zone n'est pas inactivée par la pénicillinase (2.2) la substance inhibitrice présente dans l'échantillon de lait n'est pas de la pénicilline mais peut être un autre résidu [se reporter à la directive 85/397/CEE, annexe A chapitre VI A.1.f) et 2  b)].  Certaines pénicillines semi-synthétiques, par exemple le cloxacilline sodique, ne sont pas ou ne sont qu'en partie inactivées par la pénicillinase ou sont résistantes et ne peuvent être identifiées comme étant des pénicillines (voir 7.3).  3.  Principe Une disque de papier absorbant imprégné de lait à analyser est placé sur la surface d'un milieu gélosé ensemencé avec la souche de Bacillus stearothermophilus, variété calidolactis. Une croissance normale du micro-organisme après incubation trouble le  milieu gélosé. Une zone claire autour du disque révèle la présence dans le lait de substances inhibitrices pour la croissance. La dimension de la zone claire dépend, entre autres, de la concentration et du type de substance inhibitrice présente dans le  lait.  4.  Appareillage, verrerie et matériel 4.1.  Appareillage 4.1.1.  Voir A.4.1.  4.1.2.  Bain d'eau réglable à 80o p 1 oC.  4.2.  Verrerie Voir A.4.2.  4.3.  Disques en papier, exempts de substances inhibitrices, de 9 à 13 mm de diamètre, capables d'absorber environ 130 mg de lait (conserver de préférence dans un dessiccateur).  5.  Milieux, solutions étalons, solution de pénicillinase, réactifs, organisme test, etc.  Les composants des milieux doivent convenir aux analyses bactériologiques. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée sur verre ou de l'eau déminéralisée de pureté équivalente, exempte de substances pouvant inhiber la croissance des micro-organismes.  5.1.  Milieux 5.1.1.  Gélose nutritive (A.5.1.1) 5.1.2.  Milieu pour l'épreuve de détection des substances inhibitrices Composition Extrait de levure 2,5 g Tryptone 5 g Glucose 1 g Solution de triméthoprime (ou de tetroxoprim) (A.5.1.3.) 10 ml Agar-agar 10-15 g (selon les propriétés gélifiantes) Eau 1 000 ml Préparation Dissoudre complètement les composants solides dans l'eau en chauffant et en agitant avant d'ajouter la solution de triméthoprime ou de tetroxoprim. Après avoir ajouté la solution de triméthoprime ou de tetroxoprim, ajuster la valeur du pH de manière à  ce que, après stérilisation, elle atteigne 8,0 p 0,1 à 25 oC. Stériliser le milieu pendant 15 minutes à 121 p 1 oC.  5.2.  Solutions étalons de pénicilline dans le lait Se reporter à A.5.2.  Pour la quantification des substances inhibitrices (8) préparer des solutions étalons de pénicilline dans du lait exempt de substances inhibitrices (A.5.3) aux concentrations suivantes:  a)  0,004 g/ml (0,0067 UL/ml);  b) 0,006 g/ml (0,01 UL/ml);  c) 0,03 g/ml (0,05 UL/ml);  d) 0,06 g/ml (0,1 UL/ml).  5.3.  Solution de pénicillinase 5.3.1.  Dissoudre une quantité suffisante de pénicillinase (bétalactamase) dans de l'eau distillée stérile pour obtenir une concentration de 1 000 U/ml. Cette solution, de préférence répartie en petites portions, peut être stockée à 0-5 oC pendant quatre  semaines au maximum.  Note La pénicillinase n'a pas fait l'objet d'une normalisation internationale. Dans la présente méthode, il est supposé que dix unités de pénicillinase suffisent à inactiver 0,6 mg (= 1 UL) de pénicilline. Si l'on ne connaît pas la concentration d'une  pénicillinase donnée, il conviendra de vérifier si la supposition énoncée ci-dessus est correcte. Si nécessaire, ajuster la concentration de la solution de pénicillinase en conséquence.  5.3.2.  Au lieu d'une solution de pénicillinase, il est possible d'utiliser des disques imprégnés de pénicillinase vendus dans le commerce; vérifier alors que ces disques contiennent la quantité requise de pénicillinase.  5.4.  Organisme test Se reporter à A.5.4.  5.5.  Culture test (suspension de spores) Se reporter à A.5.5.  5.6.  Préparation des boîtes de Petri 5.6.1.  Faire fondre le milieu pour l'épreuve de détection des substances inhibitrices (5.1.2) puis faire refroidir à 55 oC.  5.6.2.  Ajouter, dans un flacon, une partie de suspension de spores fraîches (5.5) au nombre nécessaire de parties du milieu pour l'épreuve de détection des substances inhibitrices (5.1.2) pour obtenir la densité appropriée de colonies dans le milieu ensemencé  et mélanger convenablement.  5.6.3.  Couler, dans une boîte de Petri stérile (A.4.2.2) préalablement chauffée à 55 oC, le milieu ensemencé (5.6.2), de façon à obtenir une couche de 0,6 à 0,8 mm d'épaisseur. Pour une boîte de Petri d'un diamètre intérieur de 140 mm, il faut environ 15 ml de  milieu pour obtenir une épaisseur de 0,8 mm.  5.6.4.  Placer les boîtes de Petri sur une surface horizontale froide dont l'horizontalité aura été vérifiée à l'aide d'un niveau, enlever les couvercles et laisser le milieu gélosé se solidifier. Après solidification du milieu, replacer les couvercles sur les  boîtes, les retourner afin d'éviter une condensation de l'eau à la surface du milieu gélosé.  5.6.5.  Les boîtes de Petri ainsi préparées doivent être utilisées de préférence le jour même, mais elles peuvent être utilisées pendant deux semaines au maximum à condition d'être conservées à 5 oC dans un sachet en polyéthylène scellé, immédiatement après  leur préparation.  5.6.6.  Afin d'identifier les échantillons, marquer le fond des boîtes de Petri.  6.  Mode opératoire 6.1.  Préparation de l'échantillon 6.1.1.  Les échantillons donnant des résultats positifs ou douteux à la «méthode A» (A.7.1 et A.7.2) doivent être soumis à une nouvelle analyse pour identification et quantification de la pénicilline.  6.1.2.  Au préalable, chauffer les échantillons de lait à 80 p 1 oC pendant 10 minutes, pour éviter l'influence de substances inhibitrices thermolabiles non spécifiques.  6.1.3.  Mélanger soigneusement puis transférer environ 10 ml de l'échantillon de lait chauffé dans un flacon stérile à large goulot. Ajouter environ 0,4 mlDÉCISION DE LA COMMISSION du 14 février 1991 arrêtant certaines méthodes d'analyse et de test du lait cru et du lait traité thermiquement (91/180/CEE)  LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,  vu le traité instituant la Communauté économique européenne,  vu la directive 85/397/CEE du Conseil, du 5 août 1985, concernant les problèmes sanitaires et de police sanitaire lors d'échanges intracommunautaires de lait traité thermiquement (1), modifiée en dernier lieu par la directive 89/662/CEE (2), et  notamment son article 10 paragraphe 2, considérant que, selon l'article 10 paragraphe 2 de la directive 85/397/CEE, la Commission arrête les méthodes d'analyse et de test à utiliser afin de contrôler le respect des normes relatives au lait cru et au lait traité thermiquement; considérant que, pour le lait cru, il importe d'arrêter notamment des méthodes permettant de déterminer la teneur en germes, la teneur en cellules, le point de congélation et la présence d'antibiotiques;  considérant que, pour le lait pasteurisé, il importe d'arrêter notamment des méthodes permettant de déterminer l'absence de germes pathogènes, le nombre de coliformes, la teneur en germes, l'absence de phosphatase, la présence de péroxydase, l'absence  d'antibiotiques et le point de congélation;  considérant que, pour le lait stérilisé et le lait «à ultra haute température» (UHT), il importe d'arrêter notamment des méthodes permettant de déterminer la teneur en germes et l'absence d'antibiotiques;  considérant que, pour des raisons techniques, il convient dans une première étape d'arrêter des méthodes de référence d'analyse et de test visant à assurer le respect de certaines normes; qu'il importe en particulier de poursuivre l'examen des  conditions d'utilisation des méthodes de routine, d'analyse et de test; que, dans l'attente du résultat de cet examen, il incombe aux autorités compétentes de veiller à ce que soient utilisées des méthodes de routine appropriées aux fins du respect des  normes de la directive 85/397/CEE;   considérant que la détermination des méthodes de référence, d'analyse et de test comprend la détermination des procédés d'analyse et de critères de fidélité afin d'assurer une interprétation uniforme des résultats;  considérant que les mesures prévues à la présente décision sont conformes à l'avis du comité vétérinaire permanent,  A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DÉCISION:  Article premier Les procédés de référence, d'analyse et de test pour le lait cru sont les suivants:  - détermination du point de congélation,  - dénombrement des micro-organismes - teneur en germes à 30 oC,  - dénombrement des cellules somatiques,  - détection des antibiotiques et des sulfamides.  Article 2 Les procédés de référence, d'analyse et de test pour le lait pasteurisé sont les suivants:  - détermination du point de congélation,  - détermination de l'activité phosphatasique,  - détermination de l'activité peroxydasique,  - dénombrement des micro-organismes - teneur en germes à 30 oC,  - dénombrement des micro-organismes - teneur en germes à 21 oC,  - dénombrement des coliformes - comptage des colonies à 30 oC,  - détection des antibiotiques et des sulfamides,  - détection de micro-organismes pathogènes.  Article 3 Les procédés de référence, d'analyse et de test pour le lait UHT et le lait stérilisé sont les suivants:  - détermination du point de congélation,  - dénombrement des micro-organismes - teneur en germes à 30 oC,  - détection des antibiotiques et des sulfamides.  Article 4 La mise en oeuvre des procédés de référence d'analyse et de test, la détermination des critères de fidélité à retenir et la collecte des échantillons doivent s'effectuer selon les règles fixées à l'annexe I.  Article 5 Les procédés de référence d'analyse et de test mentionnés aux articles 1er, 2 et 3 sont décrits à l'annexe II.  Article 6 La présente décision est réexaminée avant le 31 décembre 1992 afin de tenir compte de l'évolution des connaissances scientifiques et techniques.  Article 7 Les États membres sont destinataires de la présente décision.  Fait à Bruxelles, le 14 février 1991. Par la Commission Ray MAC SHARRY Membre de la Commission (1) JO no L 226 du 24. 8. 1985, p. 13.(2)  JO no L 395 du 30. 12. 1989, p. 13.   ANNEXE I     TABLE DES MATIÈRES  Page II.  Dispositions générales .  4 II.  Échantillonnage du lait cru et du lait traité thermiquement  .  6 I. DISPOSITIONS GÉNÉRALES  1.  Introduction Les dispositions générales concernent les réactifs, le matériel, l'expression des résultats, les critères de fidélité et les rapports d'analyse. Les autorités compétentes des États membres et les laboratoires chargés des prélèvements et des analyses du  lait sont tenus de respecter ces dispositions.  2.  Réactifs 2.1.  Eau 2.1.1.  Sauf indication contraire, l'eau utilisée pour les opérations de solution, de dilution ou de rinçage doit obligatoirement être de l'eau distillée, de l'eau déionisée ou de l'eau déminéralisée de pureté au moins équivalente. Pour les analyses  microbiologiques, elle doit être exempte de substances susceptibles d'affecter ou d'influencer la croissance de micro-organismes dans les conditions opératoires décrites.  2.1.2.  Par «solution» ou «dilution» sans autre précision on entend «solution dans l'eau» ou «dilution avec de l'eau».  2.2.  Produits chimiques Sauf indication contraire, tous les produits chimiques utilisés doivent être de qualité analytique reconnue.  3.  Matériel 3.1.  Liste du matériel La liste du matériel donnée dans les différents procédés de référence concerne le matériel à usage spécifique et présentant des caractéristiques particulières.  3.2.  Balance analytique Par balance analytique, on entend une balance capable de peser à 0,1 mg près.  4.  Expression des résultats 4.1.  Résultats Sauf indication contraire, le résultat figurant dans le rapport d'analyse doit être la moyenne arithmétique de deux essais respectant le critère de répétabilité (5.1) fixé pour la méthode en question. Si le critère de répétabilité n'est pas rempli,  l'essai doit être répété dans la mesure du possible ou le résultat doit être invalidé.  4.2.  Calcul du pourcentage Sauf indication contraire, le résultat doit être calculé en pourcentage en masse de l'échantillon.  5.  Critères de fidélité: répétabilité et reproductibilité 5.1.  Les critères de fidélité figurant dans chaque procédé se définissent comme suit:  5.1.1.  La répétabilité (r) est la valeur au-dessous de laquelle se situe la valeur absolue de la différence entre deux résultats individuels obtenus avec le même procédé sur un produit identique dans les mêmes conditions (même analyste, même appareillage, même  laboratoire et court intervalle de temps).  5.1.2.  La reproductibilité (R) est la valeur au-dessous de laquelle se situe la valeur absolue de la différence entre deux résultats individuels obtenus avec le même procédé sur un produit identique dans des conditions différentes (analystes différents,  appareillages différents, laboratoires différents et/ou intervalles de temps différents).  5.1.3.  Sauf indication contraire, les valeurs de répétabilité et de reproductibilité figurant dans les paragraphes concernés de chaque procédé sont exprimées au niveau de probabilité de 95 % selon la norme ISO 5725: 2e édition 1986. Elles sont calculées sur la  base des résultats d'essais circulaires reconnus réalisés dans le but d'évaluer les méthodes. Certaines méthodes n'ont toutefois pas fait l'objet d'essais circulaires. Dans ce cas, les valeurs de répétabilité et de reproductibilité sont des valeurs  estimées.  5.1.4 Les essais circulaires et les études visés au point 5.1.3. devraient être planifiés et réalisés conformément aux orientations internationales.  6.  Rapport d'analyse Le rapport d'analyse doit préciser le procédé utilisé et les résultats obtenus. Il doit, en outre, mentionner tous les détails opératoires non spécifiés dans la méthode d'analyse ou facultatifs, ainsi que toutes les circonstances ayant pu influencer les  résultats. Le rapport d'analyse doit comporter toutes les informations permettant une identification complète de l'échantillon.  II. ÉCHANTILLONNAGE DU LAIT CRU ET DU LAIT TRAITÉ THERMIQUEMENT  1.  Objet et domaine d'application La présente norme décrit le procédé de référence d'échantillonnage du lait cru et du lait traité thermiquement. Cette dernière, tout comme les procédés de transport et de conservation des échantillons, s'applique au lait cru livré par les producteurs  ainsi qu'au lait cru et au lait traité thermiquement conservés dans les cuves de stockage et les citernes de transport.  Les procédés visés aux points 2, 4.4, 5 et 6 s'appliquent à l'échantillonnage du lait traité thermiquement destiné à la consommation directe.  2.  Considérations d'ordre général L'échantillonnage du lait cru et du lait traité thermiquement contenus dans des bidons, citernes, etc., doit être effectué par une personne autorisée ayant reçu une formation adéquate avant de procéder à l'échantillonnage.  S'ils le jugent nécessaire, les autorités compétentes ou le laboratoire d'analyse enseigneront les techniques d'échantillonnage au personnel chargé de l'échantillonnage afin d'être sûr que l'échantillon soit représentatif et conforme à l'ensemble du  lot.  S'ils le jugent nécessaire, les autorités compétentes ou le laboratoire d'analyse apprendront la façon de marquer l'échantillon au personnel chargé de l'échantillonnage afin que l'identification de l'échantillon soit incontestée.  3.  Équipement destiné à l'échantillonnage 3.1.  Généralités L'équipement pour l'échantillonnage doit non seulement être fabriqué en acier inoxydable ou en tout autre matériau approprié présentant la résistance voulue, mais être construit en fonction de l'utilisation prévue (mélange, échantillonnage, etc.). Les  plongeurs et les agitateurs destinés à mélanger les liquides dans les récipients doivent avoir une surface suffisante pour permettre un mélange approprié du produit sans entraîner le développement d'un goût de rance. Les louches doivent être pourvues  d'un manche solide d'une longueur suffisante pour prélever des échantillons à n'importe quelle profondeur dans le récipient. La capacité de la louche doit être d'au moins 50 ml.  Les récipients pour échantillons ainsi que leurs couvercles doivent être en verre, en métal ou en plastique approprié.  Les matériaux entrant dans la fabrication du matériel destiné à l'échantillonnage (récipients et couvercles y compris) ne doivent entraîner aucune modification de l'échantillon susceptible d'influencer les résultats des analyses. Le matériel lui-même et  les récipients destinés aux échantillons doivent présenter une surface propre, sèche, lisse et sans crevasses, ainsi que des angles arrondis.  3.2.  Matériel d'échantillonnage pour analyse microbiologique Le matériel d'échantillonnage (récipients y compris) doit respecter les dispositions du point 3.1 et être stérile.  Lorsque le même matériel sert à plusieurs échantillonnages, il doit être nettoyé et stérilisé après chaque échantillonnage conformément aux instructions ou exigences du laboratoire d'analyse ou de l'autorité compétente, de manière à ne pas influencer  les résultats des différentes analyses successives.  4.  Procédé d'échantillonnage 4.1.  Généralités Quelle que soit l'analyse à effectuer, avant le prélèvement, le lait doit être convenablement mélangé par un moyen manuel ou mécanique.  L'échantillon doit être prélevé immédiatement après le mélange alors que le lait est encore en mouvement.  Lorsque plusieurs échantillons de lait en citerne sont prélevés en même temps pour différents essais, l'échantillon destiné à l'analyse microbiologique doit être prélevé en premier.  Le volume de l'échantillon doit être en rapport avec les besoins de l'analyse. La capacité des récipients utilisés doit être telle que les récipients soient presque complètement remplis par l'échantillon, tout en permettant un bon mélange du contenu  avant l'analyse, mais en évitant le barattage durant le transport.  4.2 Échantillonnage manuel 4.2.1.  Prélèvement dans des seaux à lait et des bidons Pour obtenir rapidement l'agitation voulue, remuer le plongeur de haut en bas dans le seau ou le bidon en veillant à ce que le lait soit bien mélangé et à ce que la crème n'adhère pas au goulot du bidon. Prélever un échantillon représentatif de  l'ensemble du lot conformément au point 4.2.4.  4.2.2.  Prélèvement dans des cuves réfrigérées à la ferme Agiter mécaniquement ou manuellement le lait jusqu'à obtention d'une homogénéité suffisante.  Si le volume du lait ne permet pas l'emploi d'un agitateur mécanique, agiter manuellement.  4.2.3.  Prélèvement dans la cuve de mesure Il est essentiel que le lait soit bien mélangé lorsqu'on le verse dans la cuve de mesure. Il peut être nécessaire de compléter le mélange par une agitation manuelle ou mécanique, afin d'obtenir une répartition homogène de la matière grasse. Lorsque le  volume du lot à échantillonner dépasse la capacité de la cuve de mesure, prélever un échantillon représentatif de la totalité du lot conformément au point 4.2.4.  4.2.4.  Échantillonnage d'un lot divisé Lorsque la quantité de lait à échantillonner se trouve répartie dans plusieurs récipients, prélever une quantité représentative dans chaque récipient et noter la quantité de lait à laquelle chaque échantillon correspond. À moins que les échantillons  provenant de chaque récipient ne doivent être soumis à des analyses séparées, mélanger des portions de ces quantités représentatives, proportionellement à la quantité se trouvant dans le récipient dans lequel chaque échantillon a été prélevé. Après  avoir mélangé, prélever un (ou plusieurs) échantillon(s) de ces quantités proportionnelles.  4.2.5.  Prélèvement dans de grands récipients - cuves de stockage, camions-citernes et wagons-citernes 4.2.5.1.  Mélanger le lait selon un procédé approprié avant de procéder à l'échantillonnage.  Pour mélanger le contenu des grands récipients, des cuves de stockage, des camions-citernes ou des wagons-citernes, l'agitation mécanique est conseillée (4.2.5.2).  La durée du mélange dépend de la période pendant laquelle on a laissé reposer le lait. Il doit avoir été prouvé que le procédé de mélange appliqué dans chaque cas particulier est bien approprié aux besoins de l'analyse envisagée; l'efficacité du mélange  influence considérablement la similitude des résultats d'analyses effectuées sur des échantillons prélevés soit en différents endroits du lot, soit à la sortie de la cuve à intervalles réguliers pendant la vidange. Le mode de mélange du lait (lait cru  ou lait entier) est efficace si la différence de la teneur en matière grasse entre deux échantillons, prélevés dans ces conditions, est inférieure à 0,1 %.  Dans un grand récipient pourvu d'un trou de vidange à la partie inférieure, il peut y avoir, au point d'évacuation, une petite quantité de lait non représentative de l'ensemble du contenu même après mélange. C'est pourquoi il est préférable de prélever  les échantillons par un trou d'homme. En cas de prélèvement des échantillons au trou de vidange, laisser s'écouler une quantité de lait suffisante pour assurer la représentativité des échantillons.  4.2.5.2.  Le mélange du contenu des grands récipients ou des cuves de stockage, des camions-citernes et des wagons-citernes peut s'effectuer:  - au moyen d'un agitateur mécanique placé dans le réservoir et entraîné par un moteur électrique,  - au moyen d'une hélice ou d'un agitateur entraîné par un moteur électrique et placé dans le trou d'homme, l'agitateur étant suspendu dans le lait,  - dans le cas des camions ou wagons-citernes, par recyclage du lait dans le tuyau flexible de transfert relié à la pompe et introduit dans le trou d'homme,  - par de l'air comprimé filtré et propre. On utilisera une pression et un volume d'air minimaux, afin d'empêcher le développement d'un goût de rance.  4.3.  Échantillonnage automatique ou semi-automatique Pour prélever les échantillons de lait cru livré par les producteurs, on peut utiliser un équipement d'échantillonnage automatique ou semi-automatique conformément aux instructions données par le laboratoire chargé de l'analyse ou par une autre autorité  compétente.  Cet équipement doit être soumis aux contrôles prescrits par l'autorité responsable avant sa première utilisation et ensuite à intervalles réguliers. La conformité des techniques d'échantillonnage doit être vérifiée afin de pouvoir établir:  - le volume minimal de lait collecté qui peut être convenablement échantillonné,  - la proportion d'un entraînement quelconque (lequel est lié au volume minimal recueilli),  - la capacité de fournir un échantillon représentatif de l'ensemble après agitation convenable.  Pour l'emploi d'un équipement d'échantillonnage automatique ou semi-automatique, l'autorité nationale compétente peut prescrire:  - le volume minimal de lait à partir duquel les échantillons peuvent être prélevés,  - le volume minimal de l'échantillon,  - la quantité maximale pouvant être entraînée,  - les analyses qui peuvent être réalisées ou les précautions à prendre.  4.4.  Échantillonnage du lait traité thermiquement destiné à la consommation directe et conditionné pour la vente au détail En ce qui concerne le lait traité thermiquement destiné à la consommation directe et conditionné pour la vente au détail, les échantillons sont obligatoirement composés par des récipients intacts et non ouverts. Les échantillons doivent, si possible,  être prélevés lors du conditionnement ou dans la chambre froide de l'établissement de traitement dès que possible après la transformation (pour le lait pasteurisé, le jour même de cette dernière).  Il convient de prélever un nombre d'échantillons de chaque type de lait traité thermiquement [pasteurisé, «ultra haute température» (UHT) et stérilisé] correspondant au nombre d'analyses à effectuer en se conformant aux indications données par le  laboratoire chargé de l'analyse ou par toute autre autorité compétente.  5.  Identification de l'échantillon L'échantillon doit recevoir un code d'identification qui permette son identification rapide selon les indications données par le laboratoire d'analyse ou l'autorité compétente (voir point 2).  6.  Transport et stockage des échantillons En accord avec l'autorité nationale compétente, le laboratoire d'analyse prépare des instructions concernant le délai et les conditions de transport et de stockage à respecter entre le prélèvement des échantillons et leur analyse, en fonction du type de  lait et du procédé d'analyse à utiliser. Les instructions stipulent ce qui suit:  - lors du transport et du stockage, des précautions doivent être prises pour isoler l'échantillon de toute odeur indésirable et de la lumière directe du soleil. Si le récipient utilisé pour les échantillons est transparent, il doit être stocké à l'abri  de la lumière,  - les échantillons de lait cru destinés aux analyses microbiologiques doivent être transportés et conservés à une température se situant entre 0 et 4 oC. Le délai entre le prélèvement et l'analyse doit être aussi court que possible et ne peut en aucun  cas dépasser 36 h. L'autorité compétente peut accepter que la température de conservation soit comprise entre 0 et 6 oC si le délai précité n'excède pas 24 h,  - les échantillons de lait pasteurisé destinés aux analyses microbiologiques doivent être transportés et conservés à une température se situant entre 0 et 4 oC. Le délai entre le prélèvement et l'analyse doit être aussi court que possible et ne peut en  aucun cas dépasser 24 h,  - les échantillons de laits autres que les laits cru et pasteurisé, destinés aux analyses microbiologiques, doivent être conservés par réfrigération dans le laboratoire, et le délai entre le prélèvement et l'analyse doit être aussi court que possible.  Les précautions spéciales à prendre pour certaines analyses sont indiquées dans la description des diverses méthodes utilisables.   ANNEXE II     TABLE DES MATIÈRES  Page I.  Détermination du point de congélation .  10 II.  Détermination de l'activité phosphatasique .  16 III.  Détermination de l'activité peroxydasique .  19 IV.  Dénombrement des micro-organismes - Comptage sur plaque à 30 oC .  20 V.  Dénombrement des micro-organismes - Comptage sur plaque à 21 oC .  25 VI.  Dénombrement des coliformes - Comptage des colonies à 30 oC .  29 VII.  Dénombrement des cellules somatiques .  33 VIII.  Détection des antibiotiques et des sulfamides .  39 IX.  Détection des micro-organismes pathogènes .  48 I. DÉTERMINATION DU POINT DE CONGÉLATION  1.  Objet et domaine d'application Le présent chapitre décrit le procédé de référence de détermination du point de congélation du lait entier, partiellement écrémé ou écrémé, cru, pasteurisé, «ultra haute température» (UHT) ou stérilisé en utilisant un appareil (le cryoscope à  thermistance) dans lequel le bain contrôlé par thermostat est refroidi par réfrigération électrique et où une sonde à thermistance remplace le thermomètre en verre à mercure.  Il existe deux types d'instruments. Le premier recherche le point de congélation maximal sur le «palier» de la courbe de congélation, tandis que le deuxième est, pour des raisons commerciales, réglé de façon à effectuer la lecture à un moment déterminé  après le début de la congélation. Étant donné que les courbes de congélation peuvent varier non seulement d'un lait à l'autre mais aussi entre le lait et les solutions étalons utilisées pour l'étalonnage, ce procédé de référence nécessite l'emploi  d'instruments cherchant le palier. Les instruments à délai fixe peuvent être utilisés dans le cas d'analyses de routine pour le tri des laits.  Le point de congélation peut être utilisé pour estimer la proportion d'eau étrangère dans le lait, pour autant que l'acidité de l'échantillon ne dépasse pas 0,18 g d'acide lactique par 100 ml (voir point 7.4).  2.  Définition Point de congélation du lait: valeur mesurée selon la méthode décrite dans la présente norme et exprimée en degrés Celsius (oC).  3.  Principe Refroidissement d'une prise d'essai jusqu'à la température appropriée, en fonction de l'appareil, et amorce de la cristallisation par vibration mécanique entraînant une augmentation rapide de la température jusqu'à un palier correspondant au point de  congélation de la prise d'essai.  L'instrument est étalonné de manière à obtenir des lectures correctes pour deux solutions étalons en utilisant le même mode opératoire que pour les échantillons de lait. Dans ces conditions, le palier donne le point de congélation du lait en degrés  Celsius.  4.  Appareillage et verrerie Matériel courant de laboratoire, et notamment:  4.1.  Cryoscope Le cryoscope se compose d'un bain de réfrigération contrôlé par thermostat, d'une sonde à thermistance (thermomètre à résistance semi-conductrice) avec circuit associé, d'un galvanomètre, ou «lecteur», d'un agitateur à échantillons, d'un système pour  amorcer la congélation et de tubes à échantillon.  4.1.1.  Bain de réfrigération Deux types de bain de réfrigération peuvent être utilisés.  4.1.1.1.  Type à immersion Ce type consiste en un bain parfaitement isolé contenant un liquide de refroidissement approprié agité de manière que la différence de température entre deux points quelconques du liquide ne dépasse pas 0,2 oC. La température du liquide ne doit pas  varier de plus de p 0,5 oC de la valeur nominale établie par le fabricant.  Il est important que le liquide dans le bain soit maintenu à un niveau constant. Toute la surface du tube à échantillon au-dessous du trait repère de volume doit être recouverte par le liquide de refroidissement.  4.1.1.2.  Type à circulation Un courant continu de liquide de refroidissement approprié circule autour du tube à échantillon. La température du liquide ne doit pas varier de plus de p 0,5 oC de la valeur nominale déclarée par le fabricant.  Une solution aqueuse de 1,2 éthanediol (éthylèneglycol) à 33 % (v/v) constitue un liquide de refroidissement approprié.  4.1.2.  Thermistance et circuit connexe La thermistance doit être du type sonde en verre (diamètre maximal 1,80 p 0,2 mm et diamètre conducteur maximal de 0,31 mm). La constante de temps de la thermistance doit être inférieure à 2 secondes et la valeur de v (voir note) doit être élevée. La  tension de service, le courant et la constante de dissipation doivent être tels que la température de la thermistance ne s'élève pas de plus de 0,0005 oC autour de - 0,512 oC. La tolérance maximale de la résistance doit être de p 5 %.  Quand la sonde est en position de service dans le cryoscope, l'extrémité de la partie en verre doit se trouver dans l'axe du tube à échantillon et à 44,6 p 0,1 mm au-dessous du sommet du tube (voir figure à la page 15). Un centreur doit être fourni pour  permettre à l'utilisateur de placer la sonde dans cette position.  Note v définit les caractéristiques thermiques de la thermistance selon la formule:  -  d R  ×  R  =  T 2  ,  - d R d T × 1 R = v T ²  oùT représente la température en degrés Kelvin,  R représente la résistance en ohms à la température T,  -  d R  ×  R  représente le coefficient de température,  - d R d T × 1 R  représente le coefficient de température,  v est une constante qui dépend du matériau utilisé pour la fabrication de la thermistance. En pratique courante, une valeur supérieure à 3 000 est couramment recommandée.  4.1.3.  Appareil de mesure et de lecture 4.1.3.1.  Principe de mesure L'instrument utilisé doit opérer selon le principe de recherche du premier «palier» dans la courbe du point de congélation. Le palier correspond à la partie de la courbe dans laquelle la température reste constante à p 0,002 oC près pendant 20 secondes  au minimum.  4.1.3.2.  Opération manuelle La résistance de la thermistance doit être équilibrée au moyen d'un pont de Wheatstone ou d'un appareil similaire, en utilisant des résistances stables de qualité supérieure dont la tolérance maximale est de p 10 % et dont le coefficient de température  ne dépasse pas 2 × 10-&   oC.  La résistance de référence doit avoir une linéarité dans sa gamme d'utilisation meilleure que 0,3 % de sa valeur maximale.  Il doit être possible d'ajuster les résistances pour un étalonnage.  L'écart entre les graduations du cadran de mesure ne doit pas être supérieur à 0,001 oC.  4.1.3.3.  Opération automatique L'appareil de lecture doit permettre de distinguer au moins 0,001 oC dans la gamme de 0 à -1 oC.  La stabilité de l'appareil de lecture et de son circuit associé doit être telle que l'écart ne soit pas supérieur à 0,001 oC entre deux lectures successives d'une même température.  La linéarité du circuit doit être telle qu'aucune erreur supérieure à p 0,001 oC ne s'introduise en un point quelconque dans la gamme - 0,400 à - 0,600 oC quand l'appareil est utilisé correctement.  4.1.4.  Agitateur Pour agiter la prise d'essai, utiliser une tige en métal, inerte vis-à-vis du lait, ayant un diamètre compris entre 1 et 1,5 mm.  L'agitateur doit être réglé en amplitude et installé verticalement, son extrémité inférieure étant au même niveau que la pointe de la sonde à thermistance. Une tolérance d'environ 1,5 mm au-dessus ou au-dessous de cette position est admise.  L'agitateur doit vibrer latéralement avec une amplitude suffisante indiquée par le fabricant (au moins p 1,5 mm) pour assurer une température uniforme à la prise d'essai pendant la détermination. Au cours de son fonctionnement, l'agitateur ne doit, à  aucun moment, toucher la sonde à thermistance ou la paroi du tube.  4.1.5.  Dispositif permettant d'amorcer la congélation Ce dispositif peut être n'importe quel appareil qui, en fonctionnant, amorce instantanément la congélation de la prise d'essai, de telle sorte que la température de cette prise d'essai s'élève au voisinage du point de congélation. L'agitateur peut être  utilisé à cet effet; une des méthodes consiste à augmenter l'amplitude de vibration pendant 1 à 2 secondes, de façon que l'agitateur touche la paroi du tube à échantillon.  4.1.6.  Tubes à échantillon Les tubes à échantillon (voir figure 1) doivent être en verre de 50,8 p 0,1 mm de longueur, 16,0 p 0,1 mm de diamètre extérieur et 13,5 p 0,1 mm de diamètre intérieur. L'épaisseur du verre ne doit pas varier de plus de 0,1 mm sur l'ensemble de la paroi.   Les tubes doivent avoir un trait repère situé 29,8 mm au-dessous du bord (21 mm au-dessus de la base du tube) pour indiquer un volume d'échantillon de 2,5 p 0,1 ml.  4.1.7.  Alimentation électrique La tension d'alimentation doit être stabilisée, soit à l'intérieur ou à l'extérieur de l'appareil, de sorte que les fluctuations éventuelles ne dépassent pas p 1 % de la valeur nominale quand l'alimentation principale varie de p 6 %.  4.2.  Balance analytique 4.3.  Fioles jaugées à un trait de 1 000 ml de capacité, classe A.  4.4.  Étuve, bien ventilée, réglable à 130 p 1 oC ou four électrique, ventilé, réglable à 300 p 25 oC.  4.5.  Dessiccateur 5.  Réactifs 5.1.  Eau distillée dans un appareil en verre borosilicaté, bouillie et refroidie à 20 p 2 oC dans une fiole pourvue d'un tube absorbant l'anhydride carbonique.  5.2.  Chlorure de sodium, de qualité analytique, finement broyé, séché pendant cinq heures à 300 p 25 oC dans le four électrique (4.4) ou séché dans l'étuve (4.4) à 130 o p 1 oC pendant au moins 24 heures et refroidi à la température ambiante dans un  dessiccateur efficace.  5.3.  Solutions étalons Peser la quantité appropriée (voir tableau ci-dessous) de chlorure de sodium séché (5.2) dans un vase à peser. Dissoudre dans l'eau (5.1), transvaser quantitativement dans une fiole jaugée de 1 000 ml et compléter au trait repère avec l'eau à 20 p 2 oC.   Conserver cette solution pendant 2 mois au maximum à 5 oC environ dans des flacons en polyéthylène bien bouchés d'une capacité maximale de 250 ml.  Point de congélation de solutions de chlorure de sodium à 20 oC     g NaCl/l oC  6,859  7,818  8,149  8,314  8,480  8,646  8,811  8,977  9,143 10,155 - 0,408 - 0,464 - 0,483 - 0,492 - 0,502 - 0,512 - 0,521 - 0,531 - 0,541 - 0,600 Avant d'utiliser une solution étalon, la mélanger soigneusement par agitation et retournements successifs du flacon. Ne pas agiter violemment la solution étalon, afin d'éviter l'incorporation d'air.  Les prises d'essai d'une solution étalon doivent être effectuées par écoulement dans un gobelet sec et propre. Ne pas utiliser de pipettes.  Ne pas utiliser de solutions contenues dans des flacons aux trois-quarts vides et ne pas utiliser de solutions ayant plus de deux mois si elles ne contiennent pas un fongicide (solution de thiomersal à 10 g/l par exemple).  6.  Étalonnage du cryoscope à thermistance Le cryoscope doit être réglé, de telle sorte que la température ambiante ne s'écarte pas de plus de 1 oC de la température d'étalonnage. Le cryoscope ne peut pas être exposé à la lumière du soleil, aux courants d'air ou à une température ambiante  dépassant 26-27 oC.  S'assurer que le cryoscope est en état de fonctionnement conformément aux indications du fabricant et qu'il a été mis en service 12 h au moins avant de procéder à l'étalonnage. Vérifier la position de la sonde, l'amplitude des vibrations de l'agitateur  et la température des fluides cryogéniques.  Choisir deux solutions étalons (voir tableau ci-dessus) qui encadrent de près la valeur supposée du point de congélation supposé du lait à analyser. La différence entre les points de congélation des deux solutions devrait, de préférence, ne pas dépasser  - 0,100 oC.  (Avec certains types de cryoscopes actuellement disponibles, le circuit associé à la thermistance est conçu de manière à se stabiliser sur une valeur spécifique du point de congélation dans la gamme des mesures de l'appareil. Dans ce cas, la sélection,  parmi les solutions étalons, d'une solution étalon ayant ce point de congélation facilite l'étalonnage; le fabricant doit indiquer cette valeur).  Introduire à l'aide d'une pipette 2,5 p 0,1 ml d'une solution étalon dans un tube à échantillon propre et sec, puis procéder à la mesure à l'aide du cryoscope.  Note Les tubes à échantillon utilisés pour l'étalonnage doivent être fabriqués et traités comme ceux utilisés pour les échantillons de lait (même type de verre, lavés et rincés avec de l'eau déminéralisée). Les températures des solutions étalons doivent être  identiques à celles des échantillons de lait.  Procéder aux contrôles d'étalonnage, en respectant les indications du fabricant, jusqu'à ce que la lecture du cryoscope soit identique au point de congélation de la solution étalon. Répéter cette opération avec l'autre solution étalon et continuer en  alternant de la sorte jusqu'à ce que les lectures successives donnent, pour chaque solution, la valeur correcte de leur point de congélation sans réglage supplémentaire. Le cryoscope est alors prêt à l'emploi et indique directement, sans correction, le  point de congélation de l'échantillon de lait.  7.  Préparation de l'échantillon à analyser 7.1.  Si nécessaire, conserver les échantillons à une température entre 0 et 5 oC.  7.2.  Éliminer de l'échantillon tout corps étranger visible ou toute matière grasse solide par filtrage, si nécessaire, dans un récipient sec et propre et mélanger doucement l'échantillon. Si un filtre est utilisé, il doit être inerte vis-à-vis du lait et  efficace à la température du laboratoire.  7.3.  Le lait peut être analysé à sa température de conservation (entre 0 et 5 oC) ou peut être amené à la température du laboratoire immédiatement avant de commencer l'analyse. Lors de leur utilisation, les solutions étalons et les échantillons de lait  doivent cependant être à la même température.  7.4.  Déterminer l'acidité titrable du lait, autant que possible, en même temps que la détermination du point de congélation. Les échantillons dont l'acidité dépasse 0,18 g d'acide lactique pour 100 ml de lait ne peuvent pas être analysés.  7.5.  Le lait UHT et le lait stérilisé doivent reposer au moins 20 minutes dans un récipient ouvert avant d'être analysés.  8.  Mode opératoire 8.1.  Vérifications préliminaires S'assurer que le niveau et la température du liquide de refroidissement sont conformes aux indications du fabricant et que la sonde à thermistance se trouve dans un tube à essai vide, à l'emplacement exact de l'échantillon. Mettre le cryoscope en  service et s'assurer que le liquide de refroidissement est convenablement agité ou circule correctement selon le cas. Si le cryoscope a fonctionné pendant 12 h au moins, vérifier la température du liquide de refroidissement de même que la position de  l'agitateur et l'amplitude de ses vibrations.  8.2.  Vérification de routine de l'étalonnage Avant chaque série d'essais, mesurer le point de congélation d'une solution étalon de chlorure de sodium (par exemple, une solution ayant un point de congélation de - 0,512 oC) jusqu'à ce que les valeurs obtenues à l'issue de deux déterminations  consécutives ne diffèrent pas de plus de 0,001 oC. Si la moyenne de ces valeurs diffère de plus de 0,002 oC du point de congélation de la solution étalon, étalonner à nouveau le cryoscope comme décrit au point 6.  Si le cryoscope est utilisé en continu, effectuer la vérification de routine de l'étalonnage au moins une fois par heure, en respectant les indications du fabricant.  8.3.  Détermination du point de congélation du lait Mélanger le récipient contenant l'échantillon de lait par agitations modérées et retournements successifs. Éviter d'agiter violemment l'échantillon afin d'éviter toute incorporation d'air.  Introduire à l'aide d'une pipette 2,5 p 0,1 ml de lait dans un tube à échantillon sec et propre. S'assurer que la sonde et l'agitateur sont propres et secs, les essuyer si nécessaire de bas en haut avec un tissu doux, propre et ne peluchant pas.  Placer le tube à échantillon dans le cryoscope étalonné en suivant les indications du fabricant. Le lait est refroidi et la congélation amorcée, à p 0,1 oC près de la température indiquée par le fabricant.  (Sur certains appareils automatiques, cette température peut être relevée sur le lecteur digital; sur les appareils manuels, la précision nécessaire est obtenue en s'assurant que la congélation débute lorsque l'aiguille ou le fil du galvanomètre  coïncide avec le repère approprié).  Si, pour une raison quelconque, la congélation débute avant ou après la plage de température indiquée, arrêter l'analyse et la recommencer avec une autre prise d'essai de lait. Si cette deuxième prise d'essai congèle aussi avant la température indiquée,  chauffer une fraction aliquote du lait à examiner à 45 oC et la maintenir à cette température pendant cinq minutes pour permettre la fusion de la matière grasse cristalline.  Refroidir ensuite à la température d'essai et procéder immédiatement à une nouvelle analyse. La température du lait après le début de la congélation augmente rapidement jusqu'à une valeur qui reste pratiquement constante pendant un certain temps avant  de redescendre. Le point de congélation correspond à la températeure la plus élevée atteinte durant cette période, valeur qu'il convient de relever.  Note Le temps pendant lequel la température reste constante et l'intervalle de temps entre le début de la congélation et l'obtention de la température la plus élevée diffèrent d'un échantillon à l'autre et sont considérablement plus courts pour l'eau et les  solutions étalons de chlorure de sodium que pour le lait. Il est essentiel de relever la température la plus élevée.  Lorsque la mesure est effectuée de façon satisfaisante, enlever le tube, le rincer à l'eau puis essuyer de bas en haut la sonde à thermistance et l'agitateur avec un tissu doux, propre et ne peluchant pas et procéder à une seconde détermination sur une  autre prise d'essai.  Si la différence entre les points de congélation obtenus est supérieure à la valeur de la répétabilité (0,004 oC), effectuer une seconde détermination sur une autre prise d'essai. Si les valeurs des deux déterminations concordent à 0,004 oC près, elles  devraient être retenues et utilisées pour le calcul du résultat final.  8.4.  Refroidissement de la sonde Après utilisation de l'appareil, placer un tube à échantillon vide à l'emplacement de l'échantillon et abaisser le mandrin de façon à garder la sonde au froid.  (Avec certains types de cryoscope, cela n'est pas possible; s'assurer dans ce cas que la sonde est bien refroidie avant d'effectuer les mesures en procédant par exemple à plusieurs déterminations factices jusqu'à obtention de lectures identiques).  9.  Expression des résultats 9.1.  Calcul Si l'étalonnage est confirmé après vérification de l'étalonnage en routine, prendre comme résultat la moyenne des deux valeurs acceptables obtenues pour le point de congélation arrondie à la troisième décimale.  Si la somme des deux valeurs acceptables de déterminations effectuées en double est un nombre impair, la moyenne doit être arrondie à la valeur paire la plus proche comme le montre l'exemple suivant:  Point de congélation (oC)    Valeurs des déterminations en double Moyenne - 0,544   - 0,545 - 0,545   - 0,546 - 0,544 - 0,546  9.2.  Fidélité 9.2.1.  Répétabilité (r): 0,004 oC.  9.2.2.  Reproductibilité (R): 0,006 oC. II. DÉTERMINATION DE L'ACTIVITÉ PHOSPHATASIQUE  1.  Objet et domaine d'application Le présent chapitre décrit le procédé de référence de détermination de l'activité phosphatasique du lait pasteurisé.  2.  Définition 2.1.  L'activité phosphatasique est la mesure de la quantité de phosphatase alcaline active présente dans le produit. Elle s'exprime par la quantité de phénol en mg par ml de lait pasteurisé dans les conditions décrites ci-après.  2.2.  L'activité phosphatasique d'un lait est négative si elle est inférieure à 4 mg de phénol par ml.  3.  Principe L'activité phosphatasique éventuellement présente dans l'échantillon libérera du phénol à partir du phénylphosphate disodique ajouté. Le phénol libéré réagit avec le dibromo-quinone chlorimide produisant du dibromo-indophénol (de couleur bleuâtre)  mesuré à 610 nm contre l'essai à blanc (échantillon dans lequel l'activité de l'enzyme est détruite).  4.  Réactifs 4.1.  Tampon de borate et d'hydroxyde de baryum 4.1.1.  Dissoudre 50,0 g d'hydroxyde de baryum [Ba(OH)2.8H2O] dans de l'eau et amener à 1 000 ml.  4.1.2.  Dissoudre 22,0 g d'acide borique (H3BO3) dans de l'eau et amener à 1 000 ml.  4.1.3.  Chauffer 500 ml de chaque solution à 50 oC, les mélanger, agiter, refroidir rapidement à 20 oC environ, ajuster le pH si nécessaire à 10,6 p 0,1 à l'aide de la solution 4.1.1 ou 4.1.2. Filtrer. Conserver la solution dans un récipient bouché  hermétiquement.  4.1.4.  Avant l'emploi, diluer la solution avec un volume d'eau équivalent.  4.2.  Tampon de développement de la coloration Dissoudre 6,0 g de métaborate de sodium (NaBO2) ou 12,6 g de NaBO2.4H2O et 20,0 g de chlorure de sodium (NaCl) dans de l'eau et amener à 1 000 ml.  4.3.  Tampon de coloration dilué Diluer 10 ml du tampon de développement de la coloration (4.2) dans de l'eau et porter à 100 ml.  4.4.  Substrat tamponné Dissoudre 0,1 g de phénylphosphate disodique déshydraté exempt de phénol dans 100 ml de tampon (4.1.3) ou dissoudre 0,5 g de phénylphosphate disodique dans 4,5 ml du tampon de développement de la coloration (4.2), ajouter deux gouttes de solution BQC  (4.6) et laisser reposer à la température ambiante pendant 30 minutes. Extraire la couleur ainsi formée à l'aide de 2,5 ml de butanol-1 et laisser reposer jusqu'à séparation du butanol-1. Décanter le butanol-1 et l'éliminer. Répéter l'extraction si  nécessaire.  La solution peut être conservée quelques jours au réfrigérateur; laisser la coloration se développer et procéder à une nouvelle extraction avant l'emploi. Préparer le substrat tamponné juste avant l'emploi en diluant 1 ml de cette solution à 100 ml à  l'aide du tampon de borate et d'hydroxyde de baryum (4.1.3).  4.5.  Défécant cuivre-zinc Dissoudre 3,0 g de sulfate de zinc (ZnSO4, 7H2O) et 0,6 g de sulfate de cuivre (II) (CuSO4, 5H2O) dans de l'eau et amener à 100 ml.  4.6.  Solution de dibromo-2,6 quinone-chlorimide (solution BQC) Dissoudre 40 p 1 mg de dibromo-2,6 quinone-chlorimide (BQC) (C6H2Br2CINO6) dans 10 ml d'alcool éthylique à 96 % (v/v).  Conserver au réfrigérateur dans une bouteille brune. Rejeter la solution si elle a changé de couleur ou si elle a plus d'un mois.  4.7.  Solution de sulfate de cuivre (II) Dissoudre 0,05 g de sulfate de cuivre (II) (CuSO4.5H2O) dans de l'eau et compléter à 100 ml.  4.8.  Solutions étalons de phénol 4.8.1.  Peser 200 p 2 mg de phénol anhydre pur, transvaser dans un ballon jaugé de 100 ml, ajouter de l'eau, mélanger et compléter jusqu'à 100 ml. Cette solution reste stable plusieurs mois au réfrigérateur.  4.8.2.  Diluer 10 ml de la solution concentrée dans de l'eau, compléter à 100 ml et mélanger. 1 ml contient 200 mg de phénol.  5.  Appareillage et verrerie Notes a)  Toute la verrerie ainsi que tous les bouchons et instruments d'échantillonnage doivent être soigneusement nettoyés. Il est recommandé de les rincer à l'eau distillée fraîchement bouillie ou de les passer à la vapeur.  b)  Certains types de bouchons en plastique peuvent entraîner une contamination phénolique; leur utilisation est à proscrire.  Matériel courant de laboratoire, et notamment:  5.1.  Balance analytique 5.2.  Bain d'eau réglable à 37 p 1 oC.  5.3.  Spectrophotomètre permettant d'effectuer des lectures à une longueur d'onde de 610 nm.  5.4.  Tubes à essai, 16 ou 18 mm × 150 mm, de préférence gradués tous les 5 et 10 ml.  5.5.  Pipettes 5.6.  Entonnoirs en verre, de dimensions appropriées, par exemple 5 cm de diamètre.  5.7.  Filtres plissés de 9 cm de diamètre convenant pour une vitesse de filtration moyenne.  5.8.  Fioles jaugées pour la préparation de solutions étalons.  6.  Mode opératoire Notes a)  Éviter la lumière solaire directe durant la détermination.  b)  Les traces de salive ou de transpiration peuvent donner des résultats faussement positifs et doivent dès lors être évitées. Prendre en conséquence des précautions particulières lors du pipettage.  6.1.  Préparation de l'échantillon pour l'essai 6.1.1.  Effectuer l'analyse immédiatement après l'échantillonnage. Dans le cas contraire, conserver l'échantillon au réfrigérateur, sans dépasser deux jours.  6.2.  Prise d'essai Pipetter dans chacun des deux tubes à essai (5.4) 1 ml de l'échantillon en utilisant un des tubes comme témoin ou essai à blanc.  6.3.  Détermination 6.3.1.  Chauffer l'essai à blanc pendant deux minutes dans de l'eau bouillante; recouvrir le tube et le becher contenant l'eau bouillante d'une feuille d'aluminium, pour que tout le tube chauffe. Refroidir rapidement à température ambiante.  6.3.2.  Traiter l'échantillon pour essai et l'essai à blanc de la même manière pendant le restant de l'opération. Ajouter 10 ml de substrat tamponné (4.4) et mélanger. 6.3.3.  Incuber immédiatement les essais au bain d'eau (5.2) pendant 60 minutes en mélangeant de temps en temps (au moins quatre fois).  6.3.4.  Chauffer dans de l'eau bouillante pendant deux minutes de la même manière qu'au point 6.3.1. Refroidir rapidement à température ambiante.  6.3.5.  Ajouter 1 ml de défécant cuivre-zinc (4.5) dans chaque tube et mélanger soigneusement.  6.3.6.  Filtrer sur papier filtre sec, jeter les deux premiers ml, refiltrer si nécessaire jusqu'à ce que le filtrat soit tout à fait limpide et recueillir 5 ml dans un tube à essai.  6.3.7.  Ajouter 5 ml de tampon de développement de la coloration (4.2).  6.3.8.  Ajouter 0,1 ml de solution BQC (4.6), mélanger et laisser la coloration se développer pendant 30 minutes à la température ambiante.  6.3.9.  Mesurer l'absorbance par rapport au témoin ou essai à blanc à une longueur d'onde de 610 nm (5.3).  6.3.10.  Si l'absorbance mesurée en 6.3.9 dépasse l'absorbance de la solution étalon contenant 20 g de phénol par tube mesurée conformément au point 6.4.4, répéter la détermination avec une dilution appropriée de l'échantillon. Préparer cette dilution en  mélangeant un volume de l'échantillon à un volume approprié d'une partie du même échantillon porté avec précaution à ébullition de façon à inactiver la phosphatase.  6.4.  Préparation de la courbe d'étalonnage 6.4.1.  Préparer à l'aide d'une solution étalon de phénol (4.8.2) une gamme de solutions étalons contenant 0 (témoin ou essai à blanc), 2, 5, 10 et 20 mg de phénol par millilitre. Pipetter respectivement 1 ml d'eau et 1 ml des quatre solutions étalons de phénol  dans chacun des cinq tubes à essai.  6.4.2.  Ajouter à chaque tube 1 ml de solution de sulfate de cuivre (II) (4.7), 5 ml du tampon de coloration dilué (4.3), 3 ml d'eau et 0,1 ml de solution BQC (4.6); mélanger.  6.4.3.  Laisser la coloration se développer pendant 30 minutes à température ambiante.  6.4.4.  Mesurer l'absorbance par rapport au témoin ou essai à blanc à une longueur d'onde de 610 nm (5.3).  6.4.5.  En partant des valeurs d'absorbance (6.4.4) obtenues pour chaque quantité de phénol ajoutée (6.4.1), calculer la droite de régression par la méthode des moindres carrés.  7.  Expression des résultats 7.1.  Calcul et formule 7.1.1.  En partant de la mesure d'absorbance (6.3.9), calculer la quantité de phénol à l'aide de la droite de régression (6.4.5).  7.1.2.  Calculer l'activité phosphatasique, exprimée en mg de phénol par millilitre de lait pasteurisé, à l'aide de la formule suivante:  Activité phosphatasique = 2,4 × A × D où A est la quantité de phénol en mg obtenue en 7.1.1;  D est le facteur de dilution de la dilution effectuée en 6.3.10 (en l'absence de dilution D =1),  2,4 est le facteur de dilution (5/12 de 1 ml de la prise d'essai) - Considérer 6.2 en liaison avec les points 6.3.2, 6.3.5 et 6.3.6.  7.2.  Fidélité 7.2.1 Répétabilité (r): 2 mg de phénol/ml.  7.2.2.  Reproductibilité (R): 3 (préliminaire) mg de phénol/ml.  7.2.3.  Si une dilution est effectuée conformément au point 6.3.10, les limites visées aux points 7.2.1 et 7.2.2 se réfèrent aux résultats obtenus avec l'échantillon dilué.  III. DÉTERMINATION DE L'ACTIVITÉ PEROXYDASIQUE  1.  Objet et domaine d'application Le présent chapitre décrit le procédé de référence de détermination de la présence ou de l'absence de l'enzyme de la peroxydase dans le lait, qui sert à contrôler la pasteurisation.  2.  Definitions Réaction positive au test de la peroxydase Si le lait est bien pasteurisé, une coloration bleue apparaît dans les 30 secondes qui suivent le mélange.  Réaction négative au test de la peroxydase Aucune coloration n'apparaît dans les 30 secondes qui suivent le mélange.  3.  Principe La peroxydase décompose le peroxyde d'hydrogène. L'oxygène atomique libéré transforme par oxydation la paraphénylènediamine incolore en indophénol pourpre (test de Storch). L'intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration de l'enzyme.   4.  Réactifs 4.1.  Solution de 1,4-phénylènediamine Dissoudre 2 g de 1,4-phênylènediamine (C6H8N2) dans de l'eau chaude (50 oC) et compléter à 100 ml. Conserver la solution dans un flacon brun avec un bouchon en verre et stocker à l'abri de la lumière et au frais. Un ou deux jours après sa préparation,  la solution de 1,4-phénylènediamine forme un dépôt qu'il convient d'éliminer.  4.2.  Solution de peroxyde d'hydrogène Diluer 9 ml de peroxyde d'hydrogène à 30 % dans de l'eau et compléter à 100 ml. Pour stabiliser, ajouter 1 ml d'acide sulfurique concentré par litre de solution.  La solution de peroxyde d'hydrogène est stable pendant un mois si on la conserve au frais et à l'abri de la lumière dans un flacon fermé par un bouchon en verre empêchant tout contact avec des composés organiques.  5.  Mode opératoire 5.1.  Introduire 5 ml de lait à analyser dans un tube à essai propre muni d'un couvercle approprié.  5.2.  Ajouter 5 ml de solution de 1,4-phénylènediamine (4.1).  5.3.  Ajouter 2 gouttes de solution de peroxyde d'hydrogène (4.2).  5.4.  Examiner la coloration dans les 30 secondes suivant le mélange. Si une coloration bleue apparaît plus de 30 secondes après l'adjonction des réactifs, la réaction n'est pas spécifique.  IV. DÉNOMBREMENT DES MICRO-ORGANISMES - COMPTAGE SUR PLAQUE À 30 oC  1.  Objet et domaine d'application Le présent chapitre décrit le procédé de référence de dénombrement des micro-organismes par la technique de comptage des colonies obtenues à 30 oC. La méthode est applicable au lait cru, au lait pasteurisé, au lait UHT et au lait stérilisé préincubé à  30 oC pendant 15 jours.  2.  Définition Par «micro-organismes», on entend tous les organismes formant des colonies comptables après une incubation en aérobiose dans les conditions opératoires décrites.  3.  Principe Mélanger un volume déterminé d'échantillon de lait au milieu de culture dans les boîtes de Petri et laisser incuber à 30 oC pendant 72 heures. Compter les colonies et calculer le nombre de micro-organismes par millilitre de lait cru ou pasteurisé ou par  0,1 millilitre de lait stérilisé ou UHT préincubé.  4.  Appareillage et verrerie Matériel courant de laboratoire, et notamment:  4.1.  Appareillage 4.1.1.  Four à air chaud, réglable à 170-175 oC.  4.1.2.  Autoclave, réglable à 121 oC.  4.1.3.  Étuve, réglable à 30 p 1 oC.  4.1.4.  pH-mètre, avec correction de température, sensible à 0,1 unité de pH près.  4.1.5.  Bain d'eau réglable à 45 p 1 oC.  4.1.6.  Loupe de grossissement 2-4 ×.  4.1.7.  Loupe de grossissement 8-10 ×.  4.1.8.  Compteur enregistreur 4.1.9.  Agitateur capable de mélanger 1 ml de l'échantillon de lait ou d'une dilution décimale avec 9 ml de diluant et dont le principe de fonctionnement est basé sur un mouvement de rotation excentré du contenu du tube à essai.  4.2.  Verrerie 4.2.1.  Tubes à essai avec bouchons appropriés et de capacité adéquate pour contenir, avec un espace suffisant permettant une agitation convenable, 10 ml de la première dilution ou des dilutions décimales suivantes.  4.2.2.  Fioles de 150 à 250 ml de capacité ou tubes de 20 ml de capacité environ pour contenir le milieu de culture.  4.2.3.  Pipettes (bouchées avec du coton) en verre ou en matériau synthétique stérile, non ébréchées, de 1 ml de capacité nominale, avec un orifice d'écoulement de 1,75 à 3 mm de diamètre.  4.2.4.  Boîtes de Petri en verre ou en matériau synthétique stérile transparent incolore, le fond des boîtes ayant un diamètre intérieur d'environ 90-100 mm. La profondeur intérieure doit être d'au moins 10 mm. Le fond ne doit présenter aucune irrégularité  susceptible de gêner le comptage des colonies.  4.2.5.  Stérilisation de la verrerie La verrerie doit être stérilisée par l'une des méthodes suivantes:  a)  au four à air chaud, à une température de 170 à 175 oC pendant 1 heure au moins (4.1.1);  b)  à l'autoclave, à une température de 121 p 1 oC pendant 20 minutes au moins (4.1.2).  Dans l'autoclave, toute précaution doit être prise pour assurer une pénétration adéquate de la vapeur: si le matériel est stérilisé dans des récipients, ceux-ci ne doivent pas être fermés hermétiquement, les bouchons ou les couvercles des fioles doivent  être desserrés.  Faire sécher la verrerie stérilisée à l'autoclave afin d'éliminer la vapeur.  Les pipettes doivent être stérilisées au four à air chaud (4.1.1).  5.  Milieu de culture - Comptage des germes du lait sur plaque de gélose 5.1.  Composition Extrait de levure 2,5 g Tryptone 5,0 g D(+) Glucose ou dextrose 1,0 g Poudre de lait écrémé 1,0 g Agar-agar 10 à 15 g suivant les propriétés gélifiantes de l'agar-agar Eau 1 000 ml La poudre de lait écrémé doit être exempte de substances inhibitrices, ce qui sera vérifié à l'aide de tests comparatifs réalisés en utilisant une poudre de lait écrémé reconnue exempte.  Préparation Mettre en suspension en dissolvant, dans l'ordre, l'extrait de levure, la tryptone, le glucose et, enfin, la poudre de lait écrémé, dans l'eau. Le chauffage de la suspension facilite l'opération. Ajouter ensuite l'agar-agar et porter à ébullition en  agitant fréquemment jusqu'à dissolution complète de l'agar-agar ou chauffer à la vapeur pendant 30 minutes environ.  Filtrer sur papier filtre, si nécessaire.  Vérifier le pH à l'aide d'un pH-mètre (4.1.4); si nécessaire, ajuster le pH en utilisant une solution (au moins 0,1 mol/l) d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique de sorte qu'il soit, après stérilisation, de 6,9 p 0,1 à 25 oC.  5.2.  Répartition, stérilisation et conservation du milieu de culture Répartir le milieu (5.1) par quantités de 100 à 150 ml dans les fioles ou de 12 à 15 ml dans les tubes (4.2.2). Boucher les fioles et les tubes.  Stériliser à l'autoclave (4.1.2) à 121 p 1 oC pendant 15 minutes.  Vérifier le pH du milieu.  Si le milieu de culture n'est pas utilisé immédiatement, le conserver à l'abri de la lumière entre 1 et 5 oC pendant un mois au maximum après sa préparation.  5.3.  Milieu de culture complet déshydraté vendu dans le commerce Le milieu de culture (5.1) peut être préparé avec un milieu de culture complet déshydraté vendu dans le commerce. Suivre les indications du fabricant, mais ajouter la poudre de lait écrémé avant la dissolution si elle n'entre pas dans la composition du  produit.  Ajuster le pH à 6,9 p 0,1 à 25 oC selon le mode décrit en 5.1 puis répartir, stériliser et stocker le milieu selon les indications données en 5.2.  6.  Diluants 6.1.  Solution peptone/sel Composition Peptone 1,0 g Chlorure de sodium (NaCl) 8,5 g Eau 1 000 ml Préparation Dissoudre les composants dans l'eau, en chauffant si nécessaire.  Vérifier le pH avec un pH-mètre (4.1.4); si nécessaire, ajuster le pH en utilisant une solution (au moins 0,1 mol/l) d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique, de sorte que, après stérilisation, il soit de 7,0 p 0,1 à 25 oC.  6.2.  Répartition, stérilisation et conservation du diluant Répartir le diluant (6.1) dans les tubes à essai (4.2.1) en quantité telle que, après stérilisation, chaque tube contienne 9,0 p 0,2 ml de diluant. Boucher les tubes.  Stériliser à l'autoclave (4.1.2) à 121 p 1 oC pendant 15 minutes.  Vérifier le pH du diluant.  Si le diluant n'est pas utilisé immédiatement, le conserver à l'abri de la lumière entre 1 et 5 oC pendant un mois au maximum après sa préparation.  6.3.  Diluants complets déshydratés du commerce Les poudres ou comprimés déshydratés vendus dans le commerce peuvent servir à la préparation du diluant (6.1). Suivre les instructions du fabricant. Ajuster le pH selon le mode décrit en 6.1 et répartir, stériliser et stocker les diluants selon les  indications données en 6.2.  7.  Mode opératoire 7.1.  Fusion du milieu Avant de procéder à l'examen microbiologique, faire fondre rapidement la quantité de milieu nécessaire et refroidir le milieu à 45 p 1 oC au bain d'eau (4.1.5).  7.2.  Préparation de l'échantillon de lait Mélanger convenablement l'échantillon afin d'obtenir une répartition des micro-organismes aussi homogène que possible, en retournant rapidement 25 fois le récipient contenant l'échantillon. Éviter la formation de mousse ou laisser la mousse se  disperser. Le délai entre le mélange et le prélèvement de la prise d'essai ne doit pas dépasser 3 minutes.  7.3.  Préparation de la première dilution (10-;) (lait cru et pasteurisé) Transférer à l'aide d'une pipette stérile (4.2.3) 1 ml de l'échantillon (7.2) de lait cru ou de lait pasteurisé dans 9 ml de diluant (6.1) en évitant tout contact entre la pipette et le diluant. La température du diluant doit être sensiblement la même  que celle de l'échantillon de lait. Mélanger soigneusement cette première dilution à l'aide de l'agitateur (4.1.9) pendant 5 à 10 secondes.  On obtient ainsi une première dilution 10-;.  7.4.  Préparation des dilutions décimales suivantes (lait cru et lait pasteurisé) Transférer, à l'aide d'une pipette stérile (4.2.3), 1 ml de la première dilution (7.3) dans 9 ml de diluant (6.1) en suivant les indications données en 7.3.  On obtient ainsi une dilution 10-$.  Répéter ces opérations pour obtenir les dilutions décimales suivantes jusqu'à obtention du nombre adéquat de micro-organismes (8.1.1).  7.5.  Inoculation des boîtes de Petri 7.5.1.  Lait cru: transférer, à l'aide d'une pipette stérile (4.2.3), 1 ml de l'échantillon et/ou de la dilution décimale appropriée dans une boîte (4.2.4). L'analyse doit porter sur l'examen d'au moins deux dilutions. Pour chaque dilution, préparer une boîte  sélectionnée comme il convient (8.1.1).  7.5.2.  Lait pasteurisé: transvaser, à l'aide d'une pipette stérile (4.2.3), 1 ml de l'échantillon et/ou de la dilution décimale appropriée dans une boîte (4.2.4). L'analyse doit au moins porter sur deux dilutions. Pour chaque dilution, préparer deux boîtes  sélectionnées comme il convient (8.1.1).  7.5.3.  Lait UHT et lait stérilisé (analyse, après incubation pendant 15 jours à 30 oC - Directive 85/397/CEE, annexe A chapitre VII point 5):  Transférer, à l'aide d'une pipette stérile (4.2.3), 0,1 ml de l'échantillon de lait (7.2) dans une boîte (4.2.4). Préparer deux boîtes.  7.6.  Coulage du milieu Verser environ 15 à 18 ml de milieu (7.1) dans chaque boîte ensemencée. Mélanger immédiatement par rotation de la boîte de Petri, afin d'obtenir une répartition régulière des colonies après incubation.  Le délai entre la fin de la préparation de l'échantillon et le mélange, selon le type de lait, de la prise d'essai ou de la dilution avec le milieu ne doit pas dépasser 15 minutes.  Laisser reposer sur une surface horizontale froide et propre jusqu'à solidification du milieu.  7.7.  Incubation des boîtes de Petri Placer les boîtes dans l'étuve (4.1.3). Incuber les boîtes retournées. Ne pas en empiler plus de six. Les piles de boîtes ne doivent pas se toucher, ni être en contact avec les parois et la partie supérieure de l'étuve.  Incuber à 30 p 1 oC pendant 72 p 2 heures.  7.8.  Comptage des colonies Effectuer le comptage des colonies dans les boîtes de Petri ne contenant pas plus de 300 colonies.  Examiner les boîtes en lumière atténuée. Une loupe (4.1.6) et/ou un compteur enregistreur (4.1.8) peuvent être utilisés pour faciliter le comptage. Éviter de confondre des particules de matières précipitées avec des colonies de la taille d'une pointe  d'épingle. En cas de doute, procéder à un examen minutieux en utilisant si nécessaire une loupe de grossissement supérieur (4.1.7), afin de distinguer les colonies des matières étrangères.  Les colonies envahissantes sont considérées comme des colonies uniques. Si les colonies envahissantes recouvrent moins d'un quart de la boîte, compter les colonies sur la partie non touchée de la boîte et calculer le nombre correspondant pour la boîte  entière. Si les colonies envahissantes recouvrent plus d'un quart de la boîte, éliminer la boîte.  8.  Calcul et expression des résultats 8.1.  Lait cru et pasteurisé 8.1.1. Utiliser les résultats des boîtes contenant entre 10 et 300 colonies (voir 8.1.3 et 8.1.4).  8.1.2.  Calculer le nombre de micro-organismes par millilitre de lait cru ou pasteurisé à l'aide de la formule suivante:   (n1 + 0,1 n2) d   S C (n1 + 0,1 n2) d  où S C est la somme totale des colonies comptées selon 8.1.1,  (n1 + 0,1 n2) d est égal au volume de l'échantillon ensemencé où:  n1 est le nombre de boîtes comptées dans la première dilution,  n2 est le nombre de boîtes comptées dans la deuxième dilution,  dest le facteur de dilution à partir duquel les premiers comptages ont été obtenus.  Le nombre est arrondi à deux chiffres significatifs. Quand le chiffre à arrondir est 5, arrondir de manière que le chiffre placé immédiatement à gauche soit pair.  Exemple (lait pasteurisé):  Dilution 10-2: 278 et 290 colonies Dilution 10-3:  33 et  28 colonies Nombre/ml =  278 + 290 + 33 + 28   Nombre/ml = 278 + 290 +33 + 28 (2 + 0,1 × 2) 10-2 Nombre/ml =  0,022   = 629 0,022 = 28 590 = 29 000 = 2,9 × 10%.  8.1.3.  Si tous les dénombrements sont inférieurs à 10, indiquer que le nombre de micro-organismes par millilitre est «inférieur à 10 ×  d», «d» étant l'inverse du facteur de dilution de plus faible.  8.1.4.  Lorsque tous les dénombrements sont supérieurs à 300 et que le comptage est possible, procéder à une estimation et la multiplier par l'inverse du facteur de dilution. Exprimer le résultat avec l'indication «nombre estimé de micro-organismes par  millilitre».  8.2.  Lait UHT et lait stérilisé Les teneurs en germes supérieures à 10 colonies par 0,1 ml sont considérées comme ne répondant plus aux exigences de la directive 85/397/CEE.  9.  Fidélité On ne dispose encore d'aucun résultat d'essais circulaires internationalement reconnus.  V. DÉNOMBREMENT DES MICRO-ORGANISMES - COMPTAGE SUR PLAQUE À 21 oC  1.  Objet et domaine d'application Le présent chapitre décrit le procédé de référence de dénombrement des micro-organismes, par la technique de comptage des colonies à 21 oC, dans le lait pasteurisé préincubé pendant cinq jours à 6 oC, essentiellement en vue de déterminer le degré de  contamination du lait pasteurisé par des micro-organismes psychotrophes capables de se multiplier dans le lait à 6 oC.  2.  Définition Par «micro-organismes», on entend tous les organismes formant des colonies comptables après une incubation en aérobiose dans les conditions opératoires décrites.  3.  Principe Incubation du lait pasteurisé à 6 oC pendant cinq jours. Mélange d'un volume déterminé de l'échantillon de lait préincubé au milieu de culture dans des boîtes de Petri à 21 oC pendant 25 heures. Comptage des colonies et calcul du nombre de  micro-organismes par millilitre de lait pasteurisé.  4.  Appareillage et verrerie Matériel courant de laboratoire, et notamment:  4.1.  Appareillage 4.1.1.  Four à air chaud réglable à 170-175 oC.  4.1.2.  Autoclave réglable à 121 p 1 oC.  4.1.3.  Étuves réglables à une température uniforme de:  a)  6 p 0,2 oC;  b) 21 p 1 oC.  4.1.4.  pH-mètre, avec correction de température, sensible à p 0,1 unité de pH près.  4.1.5.  Bain d'eau réglable à 45 p 1 oC.  4.1.6.  Loupe de grossissement 2-4 ×.  4.1.7.  Loupe de grossissement 8-10 ×.  4.1.8.  Compteur enregistreur.  4.1.9.  Agitateur capable de mélanger 1 ml de l'échantillon de lait ou d'une dilution décimale à 9 ml de diluant et dont le principe de fonctionnement est basé sur un mouvement de rotation excentré du contenu du tube à essai.  4.2.  Verrerie 4.2.1.  Tubes à essai, avec bouchons appropriés, de capacité adéquate pour contenir, avec un espace suffisant permettant une agitation convenable, 10 ml de la première dilution ou des dilutions décimales suivantes.  4.2.2.  Fioles de 150 à 250 ml de capacité ou tubes d'environ 20 ml de capacité, pour contenir le milieu de culture.  4.2.3.  Pipettes (bouchées avec du coton) en verre ou en matériau synthétique stérile, non ébréchées, d'une capacité nominale de 1 ml, avec un orifice d'écoulement de 1,75 à 3 mm de diamètre.  4.2.4.  Boîtes de Petri en verre ou en matériau synthétique stérile transparent incolore, le fond des boîtes ayant un diamètre intérieur d'environ 90-100 mm. La profondeur intérieure doit être d'au moins 10 mm. Le fond ne doit présenter aucune irrégularité  susceptible de gêner le comptage des colonies.  4.2.5.  Stérilisation de la verrerie La verrerie doit être stérilisée par l'une des méthodes suivantes:  a)  au four à air chaud (4.1.1) à une température de 170 à 175 oC pendant une heure au moins;  b)  à l'autoclave (4.1.2) à une température de 121 p 1 oC pendant vingt minutes au moins.  Dans l'autoclave, toute précaution doit être prise pour assurer une pénétration adéquate de la vapeur: si le matériel est stérilisé dans des récipients, ceux-ci ne doivent pas être fermés hermétiquement, les bouchons ou les couvercles des fioles doivent  être desserrés.  Faire sécher la verrerie stérilisée à l'autoclave afin d'éliminer la vapeur.  Les pipettes doivent être stérilisées au four à air chaud (4.1.1).  5.  Milieu de culture - Comptage des germes du lait sur plaque de gélose 5.1.  Composition Extrait de levure 2,5 g Tryptone 5,0 g D(+) Glucose ou dextrose 1,0 g Poudre de lait écrémé 1,0 g Agar-agar 10 à 15 g, suivant les propriétés gélifiantes de l'agar-agar Eau 1 000 ml La poudre de lait écrémé doit être exempte de substances inhibitrices, ce qui sera vérifié par des tests comparatifs réalisés en utilisant une poudre de lait écrémé reconnue exempte.  Préparation Mettre en suspension en dissolvant, dans l'ordre, l'extrait de levure, la tryptone, le glucose et enfin la poudre de lait écrémé dans l'eau. L'opération est plus facile si la suspension est chauffée. Ajouter ensuite l'agar-agar et porter à ébullition en  agitant fréquemment jusqu'à dissolution complète de l'agar-agar ou chauffer à la vapeur pendant 30 minutes environ.  Filtrer sur papier filtre, si nécessaire.  Vérifier le pH à l'aide d'un pH-mètre (4.1.4). Si nécessaire, ajuster le pH en utilisant une solution (au moins 0,1 mol/l) d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique de sorte qu'il soit, après stérilisation, de 6,9 p 0,1 à 25 oC.  5.2.  Répartition, stérilisation et conservation du milieu de culture Répartir le milieu de culture (5.1) par quantités de 100 à 150 ml dans les fioles ou de 12 à 15 ml dans les tubes (4.2.2). Boucher les fioles et les tubes.  Stériliser à l'autoclave (4.1.2) à 121 p 1 oC pendant 15 minutes.  Vérifier le pH du milieu.  Si le milieu de culture n'est pas utilisé immédiatement, le conserver à l'abri de la lumière entre 1 et 5 oC pendant un mois au maximum après sa préparation.  5.3.  Milieu de culture complet déshydraté du commerce Le milieu de culture (5.1) peut être préparé avec un milieu de culture complet déshydraté vendu dans le commerce. Suivre les instructions du fabricant, mais ajouter de la poudre de lait écrémé avant la dissolution si elle n'entre pas dans la composition  du produit.  Ajuster le pH à 6,9 p 0,1 à 25 o C selon le mode décrit en 5.1, puis répartir, stériliser et stocker le milieu selon les indications données en 5.2.  6.  Diluants 6.1.  Solution peptone/sel Composition Peptone 1,0 g Chlorure de sodium (NaCl) 8,5 g Eau 1 000 ml Préparation Dissoudre les composants dans l'eau, en chauffant si nécessaire.  Vérifier le pH à l'aide d'un pH-mètre (4.1.4); si nécessaire, ajuster le pH en utilisant une solution (au moins 0,1 mol/l) d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique de sorte qu'après stérilisation, il soit de 7,0 p 0,1 à 25 oC.  6.2.  Répartition, stérilisation et conservation du diluant Répartir le diluant (6.1) dans les tubes à essai (4.2.1) en quantité telle que chaque tube contienne, après stérilisation, 9,0 p 0,2 ml de diluant. Boucher les tubes.  Stériliser à l'autoclave (4.1.2) à 121 p 1 oC pendant 15 minutes.  Vérifier le pH du diluant.  Si le diluant n'est pas utilisé immédiatement, le conserver à l'abri de la lumière entre 1 et 5 oC pendant un mois au maximum après sa préparation.  6.3.  Diluants complets déshydratés du commerce La préparation du diluant (6.1) peut s'effectuer avec des poudres ou comprimés déshydratés vendus dans le commerce. Suivre les instructions du fabricant. Ajuster le pH selon le mode décrit en 6.1 puis répartir, stériliser et stocker les diluants selon  les instructions donnés en 6.2.  7.  Mode opératoire 7.1.  Fusion du milieu Avant de procéder à l'examen microbiologique, faire fondre rapidement la quantité de milieu nécessaire et refroidir le milieu à 45 p 1 oC dans un bain d'eau (4.1.5).  7.2.  Préparation de l'échantillon de lait 7.2.1.  Incuber le lait pasteurisé en emballage fermé ou si ce n'est pas possible, l'échantillon représentatif d'au moins 100 ml, pendant 120 p 2 heures à 6 p 0,5 oC dans une étuve [4.1.3.a)].  7.2.2.  Après incubation, mélanger convenablement l'échantillon de lait afin d'obtenir une répartition des micro-organismes aussi homogène que possible, en retournant rapidement 25 fois le récipient contenant l'échantillon. Éviter la formation de mousse ou  laisser la mousse se disperser. Le délai entre le mélange et le prélèvement de la prise d'essai ne doit pas dépasser 3 minutes.  7.3.  Préparation de la première dilution (10-;) Transférer, à l'aide d'une pipette stérile (4.2.3), 1 ml de l'échantillon (7.2.2) dans 9 ml de diluant (6.1) en évitant tout contact entre la pipette et le diluant. La température du diluant doit être sensiblement la même que celle de l'échantillon.  Mélanger soigneusement cette première dilution à l'aide d'un agitateur (4.1.9) pendant 5 à 10 secondes.  On obtient ainsi une première dilution 10-;.  7.4.  Préparation des dilutions décimales suivantes Transférer, à l'aide d'une pipette stérile (4.2.3), 1 ml de la première dilution (7.3) dans 9 ml de diluant (6.1) en suivant les indications données en 7.3.  On obtient ainsi la dilution 10-$.  Répéter ces opérations pour obtenir les dilutions décimales suivantes jusqu'à obtention du nombre adéquat de micro-organismes (8.1).  7.5.  Inoculation des boîtes de Petri Transférer, à l'aide d'une pipette stérile (4.2.3), 1 ml de l'échantillon ou de la dilution décimale appropriée dans une boîte (4.2.4). L'analyse doit porter sur l'examen d'au moins deux dilutions. Préparer, pour chaque dilution, deux boîtes  sélectionnées comme il convient (8.1).  7.6.  Coulage du milieu Verser environ 15 à 18 ml de milieu (7.1) dans chaque boîte ensemencée.  Mélanger immédiatement par rotation de la boîte de Petri afin d'obtenir une répartition régulière des colonies après incubation.  Le délai entre la fin de la préparation de l'échantillon et le mélange de la dilution avec le milieu ne doit pas dépasser 15 minutes.  Laisser reposer sur une surface horizontale froide et propre.  7.7.  Incubation des boîtes de Petri Placer les boîtes dans l'étuve [4.1.3.b)]. Incuber les boîtes retournées. Ne pas en empiler plus de six. Les piles de boîtes ne doivent pas se toucher ni être en contact avec les parois et la partie supérieure de l'étuve.  Incuber à 21 p 1 oC pendant 25 heures.  7.8.  Comptage des colonies Effectuer le comptage des colonies dans les boîtes de Petri ne contenant pas plus de 300 colonies.  Examiner les boîtes en lumière atténuée. Une loupe (4.1.6) et/ou un compteur enregistreur (4.1.8) peuvent être utilisés pour faciliter le comptage. Éviter de confondre des particules de matières précipitées avec des colonies de la taille d'une pointe  d'épingle. En cas de doute, procéder à un examen minutieux en utilisant si nécessaire une loupe de grossissement supérieur (4.1.7), afin de distinguer les colonies des matières étrangères.  Les colonies envahissantes sont considérées comme des colonies uniques. Si les colonies envahissantes recouvrent moins d'un quart de la boîte, compter les colonies sur la partie non touchée de la boîte et calculer le nombre correspondant pour la boîte  entière. Si les colonies envahissantes recouvrent plus d'un part de la boîte, éliminer la boîte.  8.  Calcul et expression des résultats 8.1.  Utiliser les résultats des boîtes contenant entre 10 et 300 colonies (voir 8.3 et 8.4).  8.2.  Calculer le nombre de micro-organismes par millilitre de lait pasteurisé à l'aide de la formule suivante:   (n1 + 0,1 n2) d   S C (n1 + 0,1 n2) d  où S C est la somme totale des colonies comptées selon le point 8.1,  (n1 + 0,1 n2) d est égal au volume de l'échantillon ensemencé où:  n1 est le nombre de boîtes comptées dans la première dilution,  n2 est le nombre de boîtes comptées dans la deuxième dilution,  d est le facteur de dilution à partir duquel les premiers comptages ont été obtenus.  Le nombre est arrondi à deux chiffres significatifs. Quand le chiffre à arrondir est 5, arrondir de manière que le chiffre placé immédiatement à gauche soit pair.  Exemple:  Dilution 10-2: 278 et 290 colonies Dilution 10-3:  33 et  28 colonies Nombre/ml =  278 + 290 + 33 + 28   Nombre/ml = 278 + 290 +33 + 28 (2 + 0,1 × 2) 10-2 Nombre/ml =  0,022   = 629 0,022 = 28 590 = 29 000 = 2,9 × 10%.   8.3.  Si tous les dénombrements sont inférieurs à 10, indiquer que le nombre de micro-organismes par millilitre est «inférieur à 10 × d», «d» étant l'inverse du facteur de dilution le plus faible.  8.4.  Lorsque tous les dénombrements sont supérieurs à 300 et que le comptage est possible, procéder à une estimation et la multiplier par l'inverse du facteur de dilution. Exprimer le résultat avec l'indication «nombre estimé de micro-organismes par  millilitre».  9.  Fidélité On ne dispose d'aucun résultat d'essais circulaires internationalement reconnus.  VI. DÉNOMBREMENT DES COLIFORMES - MÉTHODE PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES À 30 oC  1.  Objet et domaine d'application Le présent chapitre décrit le procédé de référence de dénombrement des coliformes dans le lait pasteurisé par la technique de comptage des colonies à 30 oC.  2.  Définition Par «coliformes», on entend les bactéries qui, à 30 oC, forment des colonies caractéristiques ou des colonies non caractéristiques qui fermentent le lactose avec production de gaz dans les conditions opératoires décrites.  3.  Principe Mélange d'un volume déterminé de l'échantillon de lait au milieu de culture dans des boîtes de Petri mis à incuber à 30 oC pendant 24 heures. Comptage des colonies caractéristiques et, si nécessaire, confirmation de l'identité des colonies non  caractéristiques en vérifiant leur aptitude à fermenter le lactose. Ensuite, calcul du nombre de coliformes par millilitre de lait pasteurisé.  4.  Appareillage et verrerie Matériel courant de laboratoire, et notamment:  4.1.  Appareillage 4.1.1.  Four à air chaud, réglable à 170-175 oC.  4.1.2.  Autoclave, réglable à 121 p 1 oC.  4.1.3.  Étuve, réglable à 30 p 1 oC.  4.1.4.  pH-mètre, avec correction de température, sensible à p 0,1 unité de pH.  4.1.5.  Bain d'eau, réglable à 45 p 1 oC.  4.1.6.  Anse en platine iridié ou en nickel-chrome.  4.2. Verrerie 4.2.1.  Tubes à essai, avec bouchons appropriés, de 20 ml de capacité environ, pour contenir le milieu de confirmation (5.2) et cloches de Durham de dimensions appropriées en vue de leur utilisation dans ces tubes.  4.2.2.  Fioles de 150 à 250 ml de capacité pour contenir le milieu sélectif solide (5.1).  4.2.3.  Pipettes en verre ou en matèriau synthétique stérile, non ébréchées, ayant une capacité nominale de 1-10 ml avec un orifice d'écoulement de 1,75 à 3 mm de diamètre.  4.2.4.  Boîtes de Petri en verre ou en matériau synthétique stérile transparent et incolore, le fond de la boîte ayant un diamètre intérieur d'environ 90-100 mm. La hauteur intérieure de la boîte doit être d'au moins 10 mm. Le fond de la boîte ne doit présenter  aucune irrégularité susceptible de gêner le comptage des colonies.  4.2.5.  Stérilisation de la verrerie La verrerie doit être stérilisée par l'une des méthodes suivantes:  a)  au four à air chaud (4.1.1) à une température de 170 à 175 oC pendant 1 h au moins;  b)  à l'autoclave (4.1.2) à une température de 121 p 1 oC pendant 20 minutes au moins.  Dans un autoclave, toute précaution doit être prise pour assurer une pénétration adéquate de la vapeur: si le matériel est stérilisé dans des récipients, les récipients ne doivent pas être fermés hermétiquement, les bouchons ou les couvercles des fioles  ou des flacons doivent être desserrés.  Faire sécher la verrerie stérilisée à l'autoclave afin d'éliminer la vapeur.  Stériliser les pipettes au four à air caud (4.1.1).  5.  Milieux de culture 5.1.  Gélose lactosée biliée au cristal violet et au rouge neutre (VRBL). Milieu sélectif solide.  Composition Peptone 7 g Extrait de levure 3 g Lactose (C12H22O11.H2O) 10 g Chlorure de sodium (NaCl) 5 g Sels biliaires 1,5 g Rouge neutre 0,03 g Cristal violet 0,002 g Agar-agar 10-15 g (selon les propriétés gélifiantes de l'agar-agar) Eau 1 000 ml Préparation Mettre en suspension, en dissolvant les composants dans l'eau et laisser reposer quelques minutes. Mélanger ensuite énergiquement.  Vérifier le pH à l'aide d'un pH-mètre (4.1.4); si nécessaire, ajuster le pH en utilisant une solution (au moins 0,1 mol/l) d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique, de sorte que, après ébullition, il soit de 7,4 p 0,1 à 25o C.  Porter rapidement à ébullition en agitant de temps en temps et répartir immédiatement le milieu par quantités de 100 à 150 ml dans des fioles stériles (4.2.2). Refroidir le milieu à 45 p 1 oC dans un bain d'eau (4.1.5).  Contrôler la stérilité du milieu au moment de l'emploi (voir 6.4) Utiliser le milieu dans les 3 heures qui suivent sa préparation.  5.2.  Bouillon lactosé bilié au vert brillant. Milieu de confirmation.  Composition Peptone 10 g Lactose (C12H22O11.H2O) 10 g Bile de boeuf déshydratée 20 g Vert brillant 0,0133 g Eau 1 000 ml Préparation Dissoudre les composants dans l'eau en portant à ébullition.  Vérifier le pH à l'aide d'un pH-mètre (4.1.4) et ajuster, si nécessaire, le pH à l'aide d'une solution (au moins 0,1 mol/l) d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique de sorte que, après stérilisation, il soit de 7,2 p 0,1 à 25 oC.  Répartir le milieu, par quantités de 10 ml, dans des tubes à essai (4.2.1) contenant les cloches de Durham (4.2.1). Boucher les tubes.  Stériliser à l'autoclave (4.1.2) à 121 p 1 oC pendant 15 minutes.  Les cloches de Durham ne doivent pas contenir de bulles d'air après stérilisation.  Vérifier le pH du milieu.  Si le milieu n'est pas utilisé immédiatement, le conserver à l'abri de la lumière entre 0 et 5 oC pendant un mois au maximum après sa préparation.  5.3 Milieux de culture complets déshydratés du commerce Les milieux de culture (5.1, 5.2) peuvent être préparés à l'aide de milieux complets déshydratés vendus dans le commerce. Suivre les instructions du fabricant. Ajuster le pH, répartir, porter à ébullition ou stériliser et stocker les milieux selon les  indications données en 5.1 et 5.2.  6.  Mode opératoire 6.1 Le milieu Utiliser le milieu (gélose (VRBL) décrit en 5.1.  6.2.  Préparation de l'échantillon de lait Agiter vigoureusement l'échantillon de lait afin d'obtenir une répartition des micro-organismes aussi homogène que possible, en retournant rapidement 25 fois le récipient contenant l'échantillon. Éviter la formation de mousse ou laisser la mousse se  disperser. Le délai entre le mélange et le prélèvement de la prise d'essai ne doit pas dépasser 3 minutes.  6.3.  Ensemencement des boîtes de Petri Ensemencer 3 ml de l'échantillon de lait (6.2) en transférant, à l'aide d'une pipette stérile (4.2.3), 1 ml de l'échantillon dans chacune des trois boîtes (4.2.4).  6.4.  Coulage du milieu Couler de la gélose VRBL (6.1) dans chaque boîte ensemencée à raison d'environ 12 ml.  Mélanger immédiatement la gélose, par rotation de la boîte de Petri, afin d'obtenir une répartition régulière des colonies après incubation.  Le délai entre la fin de la préparation de l'échantillon et le mélange de la prise d'essai et du milieu ne doit pas dépasser 15 minutes.  Pour contrôler la stérilité, préparer une boîte témoin avec 12 ml de gélose VRBL utilisée pour les boîtes ensemencées.  Laisser reposer sur une surface horizontale froide et propre jusqu'à solidification du milieu.  Après solidification complète du milieu, couler 4 ml au moins de gélose VRBL (6.1) à la surface du milieu ensemencé.  Laisser solidifier.  6.5.  Incubation des boîtes Petri Placer les boîtes dans l'étuve (4.1.3). Incuber les boîtes retournées. Ne pas en empiler plus de six. Les piles de boîtes ne doivent ni se toucher ni être en contact avec les parois ou la partie supérieure de l'étuve.  Incuber à 30 p 1 oC pendant 24 p 2 heures.  6.6.  Comptage des colonies 6.6.1.  Compter les colonies dans les boîtes de Petri ne contenant pas plus de 150 colonies. Compter les colonies rouges foncées ayant un diamètre d'au moins 0,5 mm avec ou sans précipité autour, caractéristiques des coliformes.  6.6.2.  Si toutes ou quelques colonies ont un aspect non caractéristique (divergence de couleur, de taille ou de formation du précipité par rapport aux colonies typiques), appliquer l'épreuve de confirmation (6.7).  6.7.  Épreuve de confirmation Selon les indications données en 6.6.2, appliquer l'épreuve de confirmation sur un nombre approprié de colonies (par exemple de 3 à 5) non caractéristiques en les ensemençant dans des tubes de bouillon lactosé bilié au vert brillant (5.2) à l'aide d'une  anse bouclée (4.1.6). Incuber les tubes à 30 p 1 oC pendant 24 p 2 h.  Considérer les colonies qui produisent du gaz dans les cloches de Durham comme étant des coliformes.  7.  Calcul et expression des résultats 7.1.  Retenir pour le comptage (voir 7.4) les boîtes contenant au maximum 150 colonies.  7.2.  S'il est procédé à l'épreuve de confirmation, calculer le nombre de colonies de coliformes à partir du pourcentage de colonies de coliformes confirmées.  7.3.  Calculer le nombre de coliformes par ml de lait pasteurisé à l'aide de la formule suivante:   S C  ,  S C n   où S C est la somme totale des colonies de coliformes (7.1 en relation avec 7.3) trouvées par l'analyse de l'échantillon de lait (3 ml).  n est le nombre de ml de l'échantillon analysé (6.3.1) (3 ml).  Le nombre est arrondi à deux chiffres significatifs s'il y a plus de 100 colonies. Quand le chiffre à arrondir est 5, arrondir de manière que le chiffre placé immédiatement à gauche soit pair.   Si tous les dénombrements sont supérieurs à 150 colonies, exprimer le résultat obtenu avec l'indication «nombre estimé de coliformes par ml».  8.  Fidélité On ne dispose d'aucun résultat d'essais circulaires internationalement reconnus.  VII. DÉNOMBREMENT DES CELLULES SOMATIQUES  Le présent chapitre décrit deux procédures de référence de dénombrement des cellules somatiques:  A.  Le procédé microscopique B.  Le procédé fluoro-opto-électronique.   A.  Procédé microscopique 1.  Objet et domaine d'application La présente norme décrit le procédé de référence de dénombrement des cellules somatiques dans le lait cru.  La présente norme décrit le procédé de dénombrement du nombre «véritable» de cellules dans un échantillon de lait pour étalonner et vérifier la précision du procédé fluoro-opto-électronique (voir B.1).  2.  Définition Dans le présent procédé, on entend par cellules somatiques les cellules, par exemple leucocytes et cellules épithéliales, dont le noyau peut être coloré distinctement au bleu de méthylène.  3.  Principe Étalement de 0,01 ml de lait sur une surface de 1 cm$ d'une lame porte-objet. Le film de lait est séché et coloré. Le comptage s'effectue à l'aide d'un microscope. Le nombre de cellules somatiques dénombrées pour une surface déterminée est multiplié par  un facteur de multiplication afin d'obtenir le nombre de cellules par ml.  4.  Réactifs Les produits chimiques doivent être de qualité analytique.  Solution colorante Composition Bleu de méthylène  0,6 g Éthanol - 99 % 54,6 ml 1,1,1-trichloro-éthane ou tétrachloro-éthane 40,6 ml Acide acétique glacial  6,6 ml Attention Le tétrachloro-éthane étant toxique, les manipulations doivent être réalisées sous une hotte aspirante.  Préparation Mélanger l'éthanol et le 1,1,1-trichloro-éthane ou tétrachloro-éthane dans un flacon et chauffer dans un bain d'eau à 60-70 oC. Ajouter le bleu de méthylène, mélanger soigneusement, refroidir au réfrigérateur à 4 oC pendant 12 à 24 heures puis ajouter  l'acide acétique glacial. Filtrer sur filtre d'une porosité de 10 à 12 microns au maximum et conserver la solution colorante dans un flacon étanche. En cas de formation de particules de sédiments, filtrer à nouveau avant usage.  5 Appareillage et verrerie 5.1.  Microscope permettant un grossissement de × 500 à × 1 000.  5.2.  Microseringue permettant de répartir des quantités de 0,01 ml avec une précision de 2 % ou meilleure.  5.3.  Lame porte-objet pour l'étalonnement du film comportant un rectangle gravé de 20 mm × 5 mm ou lame standard et gabarit de 20 mm × 5 mm.  5.4.  Plaque chauffante horizontale (30-50 oC) pour sécher les lames.  5.5.  Ventilateur (type sèche-cheveux) pour sécher le film.  5.6.  Bain d'eau, réglable à 30-40 oC pour chaffer l'échantillon de lait.  5.7.  Micromètre objectif gradué au 1/100 de mm.  6.  Mode opératoire 6.1.  Échantillon de lait L'échantillon de lait doit être analysé dans les six heures qui suivent le prélèvement. Pendant le stockage, la température de l'échantillon ne doit pas dépasser 6 oC. La congélation doit être évitée.  6.2.  Préparation de l'échantillon dans le laboratoire Chauffer l'échantillon dans un bain d'eau (5.6) à 30-40 oC, puis mélanger soigneusement. Refroidir à la température à laquelle la microseringue (5.2) a été étalonnée, par exemple 20 oC.  6.3.  Prétraitement des lames Nettoyer les lames (5.3) à l'éthanol par exemple, essuyer à l'aide d'un papier ne laissant pas de particules, flamber et laisser refroidir. Conserver dans une boîte à l'abri des poussières.  6.4.  Préparation du film À l'aide de la microseringue (5.2) prélever 0,01 ml de l'échantillon de lait préparé comme indiqué ci-dessus. Nettoyer soigneusement la partie externe de la seringue entrée en contact avec le lait. Déposer le contenu de la seringue sur la lame (5.3)  après avoir pris soin de délimiter les contours du rectangle (20 mm × 5 mm). Répartir ensuite le prélèvement aussi régulièrement que possible sur cette surface. Laisser sécher le film sur une plaque chauffante horizontale (5.4) jusqu'à ce qu'il soit  complètement sec.  Préparer et examiner au moins deux films pour chaque échantillon.  6.5.  Coloration des films Immerger dans une solution colorante (4) pendant 10 minutes. Sécher et, si nécessaire, compléter le séchage à l'aide du ventilateur (5.5). Plonger les films dans de l'eau jusqu'à élimination complète du surplus de colorant. Sécher à nouveau et conserver  à l'abri des poussières.  6.6.  Étalonnage du champ microscopique À partir du grossissement choisi (× 500 - × 1 000), mesurer à l'aide du micromètre objectif (5.7) le diamètre du champ microscopique.  7.  Comptage et calcul 7.1.  Dénombrement des cellules Utiliser le microscope (5.1). Au lieu de dénombrer les cellules, dénombrer uniquement les noyaux de cellules, clairement reconnaissables et dont au moins la moitié est visible dans le champ microscopique. Compter les bandes ou les champs situés dans le  tiers central du film en évitant de compter les bandes ou les champs sélectionnés exclusivement dans les zones périphériques du film. Le soin apporté à la préparation des films et, par conséquent, la fiabilité des résultats doivent être vérifiés au  moins une fois par mois en comptant différentes parties du film. Il est également possible de procéder au dénombrement en comptant les champs microscopiques répartis de telle façon que toutes les parties du film seront représentées de manière  équivalente.  7.2.  Détermination du nombre minimal de cellules à compter Étant donné que le dénombrement microscopique des cellules somatiques peut également être utilisé pour l'étalonnage des techniques de comptage mécaniques et automatiques, le coefficient de variation des comptages sur des échantillons identiques ne doit  pas être plus élevé que celui obtenu avec les appareils électroniques. Le coefficient de variation pour un échantillon de lait contenant de 400 000 à 600 000 cellules par ml ne doit pas dépasser 5 %.  D'après la loi de distribution de Poisson, afin d'obtenir cette répétabilité, le nombre de cellules somatiques à dénombrer dans chaque échantillon ne doit pas être inférieur à 400.  Selon la loi de distribution de Poisson,  M = V = s$,  où M est la valeur moyenne arithmétique,  V est la variance et s est l'écart-type.  Le coefficient de variation est:  CV =  s × 100 %  ou CV =  100 %  ou CV =  100 %   CV = s × 100 % M ou CV = 100 % s ou CV = 100 % wM- M (moyenne) représente le nombre de particules (cellules) qui ont été dénombrées (par exemple, 400 pour CV = 5 %).  7.3.  Calcul du facteur de multiplication En utilisant 0,01 ml de lait, le facteur de multiplication se calcule conformément aux points 7.3.1 ou 7.3.2.  7.3.1.  Comptage des bandes dans le film La longueur des bandes à dénombrer est de 5 mm, soit la largeur du film. La largeur de la bande correspond par contre au diamètre du champ microscopique déterminé par le micromètre objectif (5.7).  Facteur de multiplication =  20× 100   Facteur de multiplication = 20 × 100 d × b où d est le diamètre en millimètres du champ microscopique, déterminé par le micromètre objectif (5.7),  b est le nombre de bandes entièrement comptées.  7.3.2.  Comptage des champs microscopiques dans le tiers central du film ou à l'aide d'une grille Facteur de multiplication: =  20 × 5 × 100  =  12 732   Facteur de multiplication = 20 × 5 × 100 P × d² × s 4 = 12 732 d² × soù d représente le diamètre en millimètres du champ microscopique déterminé par le micromètre objectif (5.7),  s représente le nombre de champs comptés.  7.4.  Calcul de la teneur en cellules Le nombre de cellules somatiques dénombrées (7.1 et 7.2) est multiplié par le facteur de multiplication (7.3), afin d'obtenir le nombre de cellules par ml de lait.  7.5.  Précision Le coefficient de variation de répétabilité (voir 7.2) ne doit pas excéder 5 %.  On ne dispose d'aucun résultat d'essais circulaires internationalement reconnus en matière de précision.   B.  Procédé fluoro-opto-électronique 1.  Objet et domaine d'application La présente norme décrit le procédé officiel qui, après un étalonnage adéquat (voir A.1), peut être utilisé pour le dénombrement des cellules somatiques dans le lait cru - avec ou sans addition de conservateurs chimiques.  2.  Définition Pour ce procédé, les cellules somatiques sont des particules qui ont une intensité de fluorescence minimale due à la coloration de l'ADN cellulaire.  3.  Principe Un volume de l'échantillon (par exemple 0,2 ml) est mélangé convenablement avec la solution tampon et la solution fluorescente. Une partie de ce mélange est ensuite transférée sous la forme d'un mince film dans un disque rotatif faisant fonction de  porte-objet.  Chaque cellule produit une impulsion électrique qui est amplifiée et enregistrée. Le nombre de cellules somatiques est imprimé en milliers par ml.  4.  Réactifs Sauf indication contraire, n'utiliser que des produits chimiques de qualité analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou déionisée, ou de l'eau d'une pureté équivalente.  4.1.  Solution tampon Composition Hydrogénophtalate de potassium 51,0 g Hydroxyde de potassium 13,75 g Polyéthylèneglycol-mono-p-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl)-phényl-éther (par exemple Triton X-100), à 1 % en volume 10,0 ml pH 5,7 - 5,9. Compléter à 10 000 ml avec de l'eau distillée.  Préparation Mélanger les différents composants. La conservation sous fermeture hermétique ne doit pas dépasser 7 jours.  4.2 Solution fluorescente (solution mère) Composition Bromure d'éthidium 1,0 g Compléter à 1 000 ml avec de l'eau.  Préparation Dissoudre le bromure d'éthidium dans l'eau. La conservation dans un flacon hermétique à l'abri de la lumière ne doit pas dépasser 2 mois.  4.3 Solution fluorescente (solution pour l'analyse) Mélanger 20 ml de la solution mère (4.2) à la solution tampon (4.1) de manière à obtenir 1 000 ml. La solution pour l'analyse ne doit pas être utilisée au-delà de 7 jours.  4.4 Solution de lavage Composition Solution tampon (4.1) 10,0 ml Polyéthylèneglycol-mono-p-(1,1,3,3-tétraméthylbutyle)-phényle-éther (par exemple Triton X-100), à 1 % en volume 10,0 ml Ammoniac, à 25 % en volume 25,0 ml Compléter à 10 000 ml avec de l'eau.  Préparation Mélanger les différents composants. Ne pas conserver au-delà de 30 jours.  5.  Appareillage et verrerie 5.1 Compteur fonctionnant selon le principe de la fluorescence optique.  Note Avant l'emploi, étalonner l'instrument. La relation entre le volume des particules à dénombrer et le seuil limite à partir duquel les dénombrements sont appliqués est déterminée de la sorte. L'étalonnage de l'appareil s'effectue suivant les instructions  du fabricant en utilisant des échantillons dont la teneur en cellules a été déterminée par la méthode microscopique (A).  5.2.  Bain d'eau, à circulation, réglable à 40 p 1 oC.  5.3.  Tube à essai, avec fermeture appropriée, d'environ 15 ml.  6.  Échantillon de lait 6.1.  L'échantillon doit être stocké à basse température dans un tube à essai (5.3). Si l'échantillon ne contient pas de conservateur chimique, le dénombrement ne doit pas s'effectuer dans les 24 heures qui suivent la traite, étant donné que la teneur en  germes serait trop faible. La température de conservation ne doit pas dépasser 6 oC.  6.2.  Addition de conservateurs La conservation chimique doit être réalisée dans les 24 heures. L'addition de conservateurs doit s'effectuer dès que possible après le prélèvement de l'échantillon.  6.2.1.  La conservation chimique de l'échantillon est réalisée par l'addition de l'un des conservateurs suivants:  - acide orthoborique:  la concentration finale de l'acide orthoborique dans l'échantillon ne doit pas dépasser 0,6 g/100 ml. L'échantillon conservé de la sorte peut être stocké pendant 24 heures supplémentaires à 6-12 oC,  - dichromate de potassium:  la concentration finale de dichromate de potassium ne doit pas dépasser 0,2 g/100 ml. L'échantillon conservé de la sorte peut être stocké durant 72 heures supplémentaires à 6-12 oC,  - azide de sodium:  l'échantillon peut être conservé avec de l'azide de sodium à une concentration finale de 0,024 g/100 ml, à condition qu'il soit refroidi à une température de 6-12 oC immédiatement après le prélèvement et compté dans les 48 heures qui suivent le  prélèvement,  - bronopol:  l'échantillon peut être conservé avec du bronopol à une concentration finale de 0,05 g/100 ml, à condition d'être refroidi à 6-12 oC immédiatement après le prélèvement et compté dans les 72 heures qui suivent le prélèvement.  6.2.2.  Un échantillon déjà conservé à l'aide d'acide orthoborique peut être conservé 48 heures de plus par addition de dichromate de potassium.  Note Pour les échantillons conservés à l'aide de dichromate de potassium, les normes locales relatives au rejet des effluents doivent être respectées.  7.  Mode opératoire 7.1.  Prétraitement de l'échantillon Le lait à analyser doit être conservé après la traite pendant au moins 24 heures à 2-6 oC environ. Le comptage des échantillons le jour de la traite n'est pas conseillé sans prétraitement, car les résultats risquent d'être trop faibles. S'il faut malgré  tout procéder au comptage, l'échantillon doit alors être prétraité pendant trois heures au moins à l'aide de dichromate de potassium (voir 6.2.1).  7.2.  Préparation Chauffer l'échantillon prétraité (7.1) ou l'échantillon non traité ayant au moins un jour dans un bain d'eau (5.2) à 40 oC environ. Conserver ensuite l'échantillon à température ambiante jusqu'au moment du comptage.  7.3.  Comptage des cellules Procéder au comptage à l'aide du compteur (5.1) dans les quinze minutes qui suivent la fin du chauffage (voir 7.2). Immédiatement avant le comptage, mélanger convenablement les échantillons afin d'obtenir une répartition des cellules somatiques aussi  homogène que possible.  La dilution et la préparation ultérieures de l'échantillon doivent s'effectuer automatiquement dans le compteur.  8.  Fidélité On ne dispose pas de chiffres de répétabilité (r) et de reproductibilité (R) provenant d'essais circulaires internationalement reconnus.  À l'avenir, des critères de fidélité seront fixés par un laboratoire de référence de comptage des cellules, chargé d'organiser et d'évaluer régulièrement des essais circulaires.  Les données disponibles à l'échelle nationale permettent de procéder aux estimations suivantes:  nombre de cellules compris entre 400 000 et 500 000 ml - écart type relatif à la répétabilité:  sr = 20 000 cellules/ml (soit un coefficient de variation de 5 %-4 %),  - écart type relatif à la reproductibilité:  sR = 40 000 cellules/ml (soit un coefficient de variation de 10 %-8 %).  9.  Contrôle de précision Le contrôle de précision s'effectue à l'aide d'échantillons d'une teneur en cellules connue, déterminée par un comptage microscopique des cellules dans un laboratoire national de référence.  VIII. DÉTECTION DES ANTIBIOTIQUES ET DES SULFAMIDES  OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION Le présent chapitre décrit le procédé de référence de détection des antibiotiques et des sulfamides dans le lait cru et le lait traité thermiquement.  Le procédé de référence comporte:  A.  Un procédé qualitatif Ce procédé est le procédé initial qui permet de sélectionner les échantillons de lait contenant des antibiotiques et des sulfamides. Le procédé décrit est l'un des procédés basés sur l'emploi d'une souche de Bacillus stearothermophilus, variété  calidolactis, ATCC 10149 comme organisme test. Ce procédé a été choisi comme étant représentatif pour ces épreuves de détection.  B.  Un procédé de confirmation et d'identification de la pénicilline Ce procédé doit être utilisé pour confirmer les résultats de la «méthode A», identifier la pénicilline et en déterminer la concentration.   A.  Procédé qualitatif 1.  Objet et domaine d'application La présente norme décrit la technique de la détection qualitative des antibiotiques et des sulfamides dans le lait cru et le lait traité thermiquement en concentration supérieure aux limites mentionnées dans le tableau ci-après:   Concentrations décelables de différents antibiotiques et sulfamides (¹)  Limite de détection Négative Positive Benzylpénicilline 0,002  0,006 Ampicilline 0,002  0,005 Cloxacilline 0,015  0,035 Nafcilline 0,006  0,011 Tétracycline HCL 0,10   0,40  Oxytétracycline 0,20   0,45  Chlortétracycline 0,15   0,50  Chloramphénicol 7,  15,  Dihydrostreptomycine 4,  13,  Néomycine 1,  22,  Kanamycine 9,  28,  Bacitracine 0,06   0,14  Érythromycine 1,   2,25  Rifamycine 0,01   0,14  Diaphénylsulfone 0,01   0,1   Sulfaméthazine (sulfadimidine) 0,5    1,  (¹) La benzylpénicilline et la bacitracine sont exprimées en Ul/ml, tous les autres antibiotiques en mg/ml.  2.  Définition Le lait contient des antibiotiques ou des sulfamides lorsque la couleur du milieu est inchangée (voir 7.1).  3.  Principe Addition de l'échantillon de lait et du mélange nutritif dans une gélose contenant un indicateur de pH et des spores de Bacillus stearothermophilus, variété calidolactis, ATCC 10149 (voir 5.4.1), souche représentant, d'une manière générale, une très  bonne sensibilité et plus particulièrement pour la pénicilline. Une croissance normale et la production d'acide par cet organisme après incubation provoquent un changement de couleur de l'indicateur de pH qui vire du pourpre au jaune. Lorsque le lait  contient des substances inhibitrices pour la croissance de l'organisme test, la couleur de l'indicateur de pH reste pourpre.  4.  Appareillage et verrerie Matériel courant de laboratoire, et notamment:  4.1.  Appareillage 4.1.1.  Étuve réglable à 64 p 1 oC.  4.1.2.  Bain d'eau réglable à 64 p 1 oC.  4.1.3.  Portoir pour tubes ou ampoules.  4.1.4.  Seringue à usage unique avec embout jetable permettant de prélever et de répartir 0,1 ml.  4.1.5.  Pince.  4.1.6.  Four à air chaud, réglable de 170 à 175 oC.  4.1.7.  Autoclave, réglable à 121 p 1 oC.  4.1.8.  pH-mètre.  4.2.  Verrerie 4.2.1.  Flacons à échantillon avec fermeture adéquate.  Note Certains bouchons en caoutchouc peuvent déposer des substances inhibitrices au niveau de l'encolure du flacon.  4.2.2.  Boîtes de Petri en matière synthétique stérile ou en verre incolore transparent, d'un diamètre intérieur minimal d'environ 140 mm, à fond parfaitement plat.  4.2.3.  Flacons d'une capacité de 250 ml.  4.2.4.  Pipettes (bouchées avec du coton) en verre ou en matière synthétique stérile d'une capacité nominale de 1 ml et 10 ml.  4.2.5.  Spatules en verre 4.2.6.  Tubes ou ampoules avec couvercle ou bouchon, d'un diamètre intérieur de 8 mm environ.  4.2.7.  Stérilisation de la verrerie La verrerie doit être stérilisée par l'une des méthodes suivantes:  a)  au four à air chaud à une température de 170 à 175 oC pendant une heure au moins (4.1.6);  b)  à l'autoclave à une température de 121 oC pendant 20 minutes au moins (4.1.7).  Dans l'autoclave, toute précaution doit être prise pour assurer une pénétration adéquate de la vapeur: si le matériel est stérilisé dans des récipients, ceux-ci ne doivent pas être fermés hermétiquement, les bouchons ou les couvercles des fioles ou des  flacons doivent être desserrés.  Faire sécher la verrerie stérilisée en autoclave afin d'éliminer la vapeur.  Stériliser les pipettes au four à air chaud.  5.  Milieux, solutions, organisme test Les composants de base des milieux doivent convenir aux analyses bactériologiques. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée sur verre ou de l'eau déminéralisée de pureté équivalente. Elle doit être exempte de substances pouvant inhiber la croissance  de l'organisme test.  5.1.  Milieux 5.1.1.  Gélose nutritive Composition Extrait de levure2 g Peptone 5 g Extrait de viande 1 g Chlorure de sodium 5 g Gélose 10-15 g Eau distillée 1 000 ml Préparation Dissoudre les composants dans l'eau. Amener à ébullition en remuant de temps à autre. Ajuster le pH de manière à être, après stérilisation, de 7,4 p 0,1 à 25 oC.  Répartir à raison de 10 ml dans des tubes à essai ou à raison de 100 ml dans des flacons et incliner pour obtenir une pente.  Stériliser à 121 oC pendant 15 minutes.  5.1.2.  Milieu gélosé Composition Chlorure de sodium 2 g Gélose 15 g Eau 1 000 ml Solution de triméthroprime ou de tetroxoprim (voir 5.1.3) (1) 10 ml Préparation Dissoudre les composants, exception faite du triméthoprime ou du tetroxoprim, dans l'eau. Amener à ébullition en remunant de temps à autre. Ajouter du triméthoprime ou du tetroxoporim et stériliser à 121 p 1 oC pendant 15 minutes. Ajuster le pH de  manière à être, après stérilisation, de 7,0 p 0,1 à 25 oC.  5.1.3.  Solution de triméthoprime ou de tetroxoprim Composition Triméthoprime 5 mg ou tetroxoprim 30 mg Éthanol à 96o 5 ml ou 30 ml Eau à raison de 1 000 ml Préparation Dissoudre le triméthoprime ou le tetroxoprim (5 ou 30 ml) dans l'éthanol et compléter avec l'eau.  5.1.4.  Mélange nutritif Composition Extrait de levure 0,75 mg Glucose 5,0  mg Amidon soluble 8,0  mg Pourpre de bromocrésol 0,025 g Eau à raison de 50 ml Préparation Dissoudre le mélange nutritif et l'indicateur dans l'eau en chauffant si nécessaire et stériliser par filtrage. Le mélange nutritif est vendu dans le commerce sous forme de comprimés.  5.2.  Solutions étalons de pénicilline 5.2.1.  Préparer, dans un flacon stérile à fermeture adéquate, une solution de pénicilline à 60 mg/ml = (100 UL/ml) en dissolvant du benzylpénicillinate de sodium ou de potassium dans de l'eau distillée stérile.  5.2.2.  Préparer une solution diluée de pénicilline en introduisant 1,25 ml de solution de pénicilline (5.2.1) dans de l'eau distillée stérile et compléter à 1 000 ml. Cette solution diluée contient 0,075 mg de pénicilline/ml (= 0,125 UL de pénicilline/ml).  5.2.3.  Préparer 75 ml de solution étalon de pénicilline contenant 0,004 mg de pénicilline/ml (= 0,0067 UL de pénicilline/ml) en ajoutant 4 ml de solution diluée de pénicilline (5.2.2) à 71 ml de lait exempt de substances inhibitrices (5.3) et mélanger.   13. 4. 91 Journal officiel des Communautés européennes 5.2.4.  Les solutions de pénicilline décrites de 5.2.1 à 5.2.3 doivent être préparées extemporanément.  5.3.  Lait exempt de substances inhibitrices Préparer un lait témoin exempt de substances inhibitrices en dissolvant, dans de l'eau distillée stérile, du lait écrémé en poudre (10 % m/v) dans lequel on aura préalablement vérifié l'absence de substances inhibitrices. On peut également utiliser une  quantité appropriée de lait frais de mélange dans lequel on aura vérifié l'absence de substances inhibitrices; ce lait sera réparti dans des flacons, chauffé pendant une heure à 100 oC puis conservé au réfrigérateur à 0-6 oC pendant une semaine au  maximum.  5.4.  Organisme test 5.4.1.  Le Bacillus stearothermophilus, variété calidolactis, souche ATCC 10149 est utilisé comme organisme test. La souche ATCC 10149 est identique à la souche C 953.  5.4.2.  Préparer une culture de réserve depuis la culture d'épreuve pour conserver la souche. La conservation est effectuée sur gélose nutritive inclinée (5.1.1). La gélose inclinée est ensemencée en stries à l'aide d'une anse imprégnée de la culture d'épreuve  puis incubée en aérobiose pendant 48 heures à 63 p 1 oC. Après incubation, boucher hermétiquement le tube à l'aide d'un bouchon stérile en caoutchouc. La culture de réserve ainsi obtenue peut être conservée plusieurs mois au réfrigérateur à 5 oC.  5.5.  Culture d'épreuve (suspension de spores) 5.5.1.  Verser aseptiquement 20 ml de gélose nutritive fondue (5.1.1) dans une boîte de Petri stérile (4.2.2) et laisser refroidir à température ambiante.  5.5.2.  À l'aide d'une pipette stérile (4.2.4), transférer 5 ml d'eau distillée stérile dans un tube contenant la culture de réserve (5.4.2) et reprendre par lavage les spores se trouvant sur la gélose inclinée en s'aidant d'une anse stérile. Conserver la  suspension de spores à 5 oC et l'utiliser dans les 36 heures qui suivent.  5.5.3.  À l'aide d'une pipette stérile (4.2.4), transférer 0,5 ml de la suspension de spores (5.5.2) dans une boîte contenant le milieu (5.5.1) et étaler soigneusement l'inoculum sur toute la surface avec un étaleur en verre. Incuber à 63 p 1 oC (4.1.1) pendant  16-18 heures.  Depuis une culture de réserve (5.4.2) ou une culture ayant plus de 36 heures, la technique de repiquage devra être effectuée au moins deux fois avec un intervalle maximum de 36 heures entre chaque subculture.  5.5.4.  Transférer à l'aide d'une pipette stérile (4.2.4), 10 ml d'eau distillée dans la boîte contenant la culture (5.5.3) et éliminer les spores en suspension de la surface en s'aidant d'une baguette de verre.  Transférer la suspension de spores (4.2.3) dans un flacon (5.2.3) contenant 250 ml d'eau distillée stérile. Fermer le flacon et agiter vigoureusement. Les cultures qui ne sont pas repiquées immédiatement doivent être conservées au réfrigérateur à 0-6  oC.  5.5.5.  La suspension de spores ensemencée sur le milieu gélosé (5.1.2) exempt de triméthoprime doit présenter un nombre de germes viables compris entre 5 et 10 millions par ml après incubation à 63 p 1 oC pendant 16-18 heures. La suspension de spores doit être  uniformément trouble et, si elle contient des flocons ou un sédiment, la remplacer par une nouvelle suspension préparée à partir de la culture de réserve (5.4.2).  5.6.  Préparation des tubes à essai/ampoules 5.6.1.  Faire fondre le milieu gélosé (5.1.2) puis refroidir à 55 oC.  5.6.2.  Ajouter une partie de la suspension de spores fraîches (5.5.4) à cinq parties de milieu gélosé (5.6.1) dans un tube ou un flacon; mélanger soigneusement.  5.6.3.  Transférer, dans un tube ou une ampoule stérile (5.6.2) 0,3 ml du milieu ensemencé (4.2.6) calculé pour obtenir une couche uniforme de 5 mm d'épaisseur puis fermer le tube avec un bouchon ou un couvercle et, pour l'ampoule, sceller l'extrémité à la  flamme. Laisser solidifier le milieu gélosé puis maintenir les tubes/ampoules en position verticale pendant au moins 12 heures.  5.6.4.  Le tubes à essai/ampoules peuvent être utilisés le jour même mais également être conservés pendant plusieurs mois à 0-6 oC à condition d'être refroidis immédiatement après leur préparation.  6.  Mode opératoire 6.1.  Les échantillons doivent être analysés le plus tôt possible et de préférence dans les 24 heures qui suivent le prélèvement; entre-temps, ils doivent être conservés à 0-5 oC. S'il n'est pas possible d'analyser les échantillons durant ces 24 heures, les  conserver au congélateur (- 30 oC à - 15 oC) pour réduire au minimum l'inactivation de la pénicilline.  6.2.  Identifier chaque tube/ampoule (5.6) de façon lisible et indélébile. Enlever le couvercle ou le bouchon. Placer sur un portoir (4.1.3) le nombre requis pour l'examen des échantillons et des témoins (5.2 et 5.3).  6.3.  Ajouter 50 microlitres du mélange nutritif (5.1.4) dans chaque tube/ampoule.  6.4.  Mélanger soigneusement l'échantillon de lait à analyser et transférer, à l'aide de la seringue (4.1.4), 0,1 ml dans le tube/ampoule étiqueté(e). Utiliser un embout neuf et jetable pour transférer chaque échantillon.  6.5.  Selon le mode décrit en 6.4, préparter 2 témoins depuis la solution étalon de pénicilline contenant 0,004 g/ml (= 0,0067 UL/ml) de pénicilline.  6.6.  Selon le mode décrit en 6.4, préparer 2 témoins depuis le lait témoin exempt de substances inhibitrices (5.3).  6.7.  Boucher les tubes/ampoules et placer le portoir contenant les tubes/ampoules dans un bain d'eau à 63 p 1 oC (4.1.2) pendant au moins 2 ;/2-2 =/4 heures.  6.8.  Retirer le portoir contenant les tubes/ampoules du bain d'eau.  6.9.  Observer la couleur du milieu gélosé (voir 7).  7.  Interprétation des résultats 7.1.  Une coloration pourpre du milieu gélosé dans les tubes/ampoules qui contiennent la solution étalon de pénicilline ou l'échantillon de lait révèle la présence d'antibiotiques ou de sulfamides (à peu près) au niveau «positif» visé dans le tableau de la  page 39. La sensibilité du milieu est satisfaisante si la coloration des tubes/ampoules contenant la solution étalon de pénicilline (6.5) reste pourpre.  7.2.  Une coloration pourpre partielle du milieu gélosé ou une coloration irrégulière dans les tubes/ampoules contenant l'échantillon de lait révèle la présence de substances inhibitrices entre les niveaux visés dans le tableau de la page 39.  7.3.  Une coloration jaune du milieu gélosé dans les tubes/ampoules contenant le lait témoin exempt de substances inhibitrices ou l'échantillon de lait révèle l'absence de substances inhibitrices de l'organisme test.  7.4.  Si tous les tubes/ampoules soumis à l'épreuve, y compris le témoin négatif, présentent une coloration pourpre, les tubes/ampoules ne contiennent pas de spores viables et les échantillons doivent faire l'objet d'une nouvelle analyse utilisant pour  l'ensemble de la technique des préparations fraîchement préparées.  8.  Confirmation des résultats 8.1.  Confirmer les résultats de tous les échantillons présentant les réactions décrites en 7.1 et 7.2 à l'aide de la «méthode B». Si les échantillons de lait doivent être conservés avant la confirmation, il convient de les surgeler pour empêcher la  dégradation des antiobiotiques.   B.  Procédé de confirmation de la présence de pénicilline et détermination de sa concentration 1.  Objet et domaine d'application La présente norme décrit le procédé de confirmation des pénicillines ou autres antibiotiques ainsi que le procédé de détermination de la concentration en pénicilline des échantillons de lait présentant une réaction positive (A.7.1) ou douteuse (A.7.2).   Sensibilité du procédé à différents antibiotiques Voir A.1.  2.  Définition 2.1.  L'échantillon de lait contient des antibiotiques, y compris des sulfamides, lorsque l'échantillon analysé par la méthode décrite produit une zone claire d'inhibition d'au moins 2 mm autour du disque.  2.2.  Si un échantillon contenant des antibiotiques y compris des sulfamides (2.1) et additionné de pénicillinase (betalactamase) ne produit pas de zone claire ou donne une zone claire d'un diamètre plus petit que celui en l'absence de pénicillinase, la  substance inhibitrice est soit de la pénicilline, soit de la pénicilline associée à un autre antibiotique, sulfamide compris.  2.3.  Si la zone n'est pas inactivée par la pénicillinase (2.2) la substance inhibitrice présente dans l'échantillon de lait n'est pas de la pénicilline mais peut être un autre résidu [se reporter à la directive 85/397/CEE, annexe A chapitre VI A.1.f) et 2  b)].  Certaines pénicillines semi-synthétiques, par exemple le cloxacilline sodique, ne sont pas ou ne sont qu'en partie inactivées par la pénicillinase ou sont résistantes et ne peuvent être identifiées comme étant des pénicillines (voir 7.3).  3.  Principe Une disque de papier absorbant imprégné de lait à analyser est placé sur la surface d'un milieu gélosé ensemencé avec la souche de Bacillus stearothermophilus, variété calidolactis. Une croissance normale du micro-organisme après incubation trouble le  milieu gélosé. Une zone claire autour du disque révèle la présence dans le lait de substances inhibitrices pour la croissance. La dimension de la zone claire dépend, entre autres, de la concentration et du type de substance inhibitrice présente dans le  lait.  4.  Appareillage, verrerie et matériel 4.1.  Appareillage 4.1.1.  Voir A.4.1.  4.1.2.  Bain d'eau réglable à 80o p 1 oC.  4.2.  Verrerie Voir A.4.2.  4.3.  Disques en papier, exempts de substances inhibitrices, de 9 à 13 mm de diamètre, capables d'absorber environ 130 mg de lait (conserver de préférence dans un dessiccateur).  5.  Milieux, solutions étalons, solution de pénicillinase, réactifs, organisme test, etc.  Les composants des milieux doivent convenir aux analyses bactériologiques. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée sur verre ou de l'eau déminéralisée de pureté équivalente, exempte de substances pouvant inhiber la croissance des micro-organismes.  5.1.  Milieux 5.1.1.  Gélose nutritive (A.5.1.1) 5.1.2.  Milieu pour l'épreuve de détection des substances inhibitrices Composition Extrait de levure 2,5 g Tryptone 5 g Glucose 1 g Solution de triméthoprime (ou de tetroxoprim) (A.5.1.3.) 10 ml Agar-agar 10-15 g (selon les propriétés gélifiantes) Eau 1 000 ml Préparation Dissoudre complètement les composants solides dans l'eau en chauffant et en agitant avant d'ajouter la solution de triméthoprime ou de tetroxoprim. Après avoir ajouté la solution de triméthoprime ou de tetroxoprim, ajuster la valeur du pH de manière à  ce que, après stérilisation, elle atteigne 8,0 p 0,1 à 25 oC. Stériliser le milieu pendant 15 minutes à 121 p 1 oC.  5.2.  Solutions étalons de pénicilline dans le lait Se reporter à A.5.2.  Pour la quantification des substances inhibitrices (8) préparer des solutions étalons de pénicilline dans du lait exempt de substances inhibitrices (A.5.3) aux concentrations suivantes:  a)  0,004 g/ml (0,0067 UL/ml);  b) 0,006 g/ml (0,01 UL/ml);  c) 0,03 g/ml (0,05 UL/ml);  d) 0,06 g/ml (0,1 UL/ml).  5.3.  Solution de pénicillinase 5.3.1.  Dissoudre une quantité suffisante de pénicillinase (bétalactamase) dans de l'eau distillée stérile pour obtenir une concentration de 1 000 U/ml. Cette solution, de préférence répartie en petites portions, peut être stockée à 0-5 oC pendant quatre  semaines au maximum.  Note La pénicillinase n'a pas fait l'objet d'une normalisation internationale. Dans la présente méthode, il est supposé que dix unités de pénicillinase suffisent à inactiver 0,6 mg (= 1 UL) de pénicilline. Si l'on ne connaît pas la concentration d'une  pénicillinase donnée, il conviendra de vérifier si la supposition énoncée ci-dessus est correcte. Si nécessaire, ajuster la concentration de la solution de pénicillinase en conséquence.  5.3.2.  Au lieu d'une solution de pénicillinase, il est possible d'utiliser des disques imprégnés de pénicillinase vendus dans le commerce; vérifier alors que ces disques contiennent la quantité requise de pénicillinase.  5.4.  Organisme test Se reporter à A.5.4.  5.5.  Culture test (suspension de spores) Se reporter à A.5.5.  5.6.  Préparation des boîtes de Petri 5.6.1.  Faire fondre le milieu pour l'épreuve de détection des substances inhibitrices (5.1.2) puis faire refroidir à 55 oC.  5.6.2.  Ajouter, dans un flacon, une partie de suspension de spores fraîches (5.5) au nombre nécessaire de parties du milieu pour l'épreuve de détection des substances inhibitrices (5.1.2) pour obtenir la densité appropriée de colonies dans le milieu ensemencé  et mélanger convenablement.  5.6.3.  Couler, dans une boîte de Petri stérile (A.4.2.2) préalablement chauffée à 55 oC, le milieu ensemencé (5.6.2), de façon à obtenir une couche de 0,6 à 0,8 mm d'épaisseur. Pour une boîte de Petri d'un diamètre intérieur de 140 mm, il faut environ 15 ml de  milieu pour obtenir une épaisseur de 0,8 mm.  5.6.4.  Placer les boîtes de Petri sur une surface horizontale froide dont l'horizontalité aura été vérifiée à l'aide d'un niveau, enlever les couvercles et laisser le milieu gélosé se solidifier. Après solidification du milieu, replacer les couvercles sur les  boîtes, les retourner afin d'éviter une condensation de l'eau à la surface du milieu gélosé.  5.6.5.  Les boîtes de Petri ainsi préparées doivent être utilisées de préférence le jour même, mais elles peuvent être utilisées pendant deux semaines au maximum à condition d'être conservées à 5 oC dans un sachet en polyéthylène scellé, immédiatement après  leur préparation.  5.6.6.  Afin d'identifier les échantillons, marquer le fond des boîtes de Petri.  6.  Mode opératoire 6.1.  Préparation de l'échantillon 6.1.1.  Les échantillons donnant des résultats positifs ou douteux à la «méthode A» (A.7.1 et A.7.2) doivent être soumis à une nouvelle analyse pour identification et quantification de la pénicilline.  6.1.2.  Au préalable, chauffer les échantillons de lait à 80 p 1 oC pendant 10 minutes, pour éviter l'influence de substances inhibitrices thermolabiles non spécifiques.  6.1.3.  Mélanger soigneusement puis transférer environ 10 ml de l'échantillon de lait chauffé dans un flacon stérile à large goulot. Ajouter environ 0,4 ml de la solution de pénicillinase (5.3) au lait et mélanger convenablement.  6.2.  Détection des substances inhibitrices 6.2.1.  Plonger un disque en papier (4.3) dans l'échantillon de lait (6.1.2) à l'aide d'une pince propre et sèche. Éliminer le surplus de lait en égouttant le disque de papier contre l'encolure du flacon. Placer le disque à plat sur la surface de la boîte de  Petri (5.6) et presser légèrement à l'aide de la pince.  6.2.2.  Les disques imprégnés par les différents échantillons de lait doivent se situer à 20 mm au moins les uns des autres et à au moins 10 mm de la périphérie.  6.2.3.  Afin de vérifier la sensibilité de la méthode, des disques (4.3) imprégnés d'une solution étalon de pénicilline [5.2.a)] doivent être déposés au hasard entre les disques imprégnés de l'échantillon de lait à raison d'au moins 2 % du nombre de disques  imprégnés par l'échantillon de lait; cinq disques étalons au moins doivent être utilisés lors de chaque test.  6.2.4.  Après avoir placé tous les disques au hasard sur le milieu gélosé et porté leur identité, retourner les boîtes et faire incuber à 63 p 1 oC pendant 2 ;/2 à 5 heures. 6.2.5.  Après incubation, examiner les boîtes de Petri devant une source lumineuse adéquate pour observer les zones claires d'inhibition autour des disques de papier. Mesurer les zones claires.  6.2.6.  La solution étalon de pénicilline (6.2.3) doit présenter des zones d'au moins 2 mm autour des disques.  6.2.7.  La présence des zones claires autour des disques imprégnés par l'échantillon de lait d'une dimension équivalente ou supérieure à celle décrite en 6.2.6 révèle la présence de substances inhibitrices de l'organisme test.  6.3. Identification et quantification de la substance inhibitrice 6.3.1.  L'opération 6.2.1 est effectuée en double sur l'échantillon de lait chauffé (6.1.2) et sur l'échantillon traité à la pénicillinase (6.1.3). Au lieu d'ajouter de la pénicillinase à 10 ml d'échantillon de lait, il est possible de plonger un disque imbibé  de pénicillinase (5.3.2) dans l'échantillon de lait et de le placer dans la boîte d'essai.  6.3.2.  Effectuer l'opération 6.2.1 en double pour chacune des solutions étalons de pénicilline décrites en 5.2.a)-d).  6.3.3.  Calculer la moyenne des diamètres des zones claires d'inhibition correspondant à l'échantillon de lait, à l'échantillon de lait additionné de pénicillinase et aux solutions étalons de pénicilline.  7.  Interprétation des résultats (voir 2) 7.1.  Si aucune zone claire n'apparaît autour du disque imprégné par le lait additionné de pénicillinase, mais qu'une zone claire apparaît autour du disque imprégné de lait, zone égale ou supérieure à la zone autour du disque imprégné par la solution de  pénicilline étalon [5.2.a)], la substance inhibitrice présente dans l'échantillon de lait correspond à une concentration en benzylpénicillinate de sodium (de potassium) égale ou supérieure à 0,004 g/ml.  7.2.  Si le diamètre moyen de la zone claire autour du disque imprégné par le lait additionné de pénicillinase est égal au diamètre moyen de la zone claire autour du disque contenant l'échantillon de lait, le lait contient des substances inhibitrices qu'il  est impossible d'inactiver à la concentration de pénicillinase utilisée dans la présente méthode.  7.3.  Si le diamètre moyen de la zone claire autour du disque imprégné par le lait additionné de pénicillinase est inférieur au diamètre moyen de la zone claire autour du disque contenant l'échantillon de lait, chauffé selon 6.1.2, l'échantillon de lait  contient à la fois de la pénicilline et des antibiotiques, sulfamides compris, et la pénicilline ou la pénicilline semi-synthétique, qui ne peut être identifiée par la concentration de pénicillinase employée dans la présente méthode. Les pénicillines  synthétiques, telles que la cloxacilline sodique, peuvent ne pas être inactivées par la pénicillinase dans les conditions décrites et peuvent alors être classées comme substances inhibitrices autres que la pénicilline.  Note Les substances inhibitrices autres que la pénicilline peuvent, si nécessaire, être identifiées par des procédés appropriés.  8.  Détermination de la concentration en pénicilline 8.1.  La détermination de la concentration en pénicilline peut s'effectuer soit après avoir établi une courbe d'étalonnage, soit depuis des calculs basés sur les dimensions des zones obtenues avec les solutions de pénicilline étalons dans le lait [5.2.a)-d)].   8.2.  Tracé de la courbe d'étalonnage Étant donné qu'il existe une corrélation linéaire entre le log10 de la concentration de pénicilline et le diamètre des zones d'inhibition, la courbe d'étalonnage peut être tracée sur du papier semi-logarithmique en posant les concentrations de  pénicilline en ordonnée et le diamètre des zones d'inhibition en abscisse. Le calcul du diamètre des zones d'inhibition s'obtient depuis la moyenne des épreuves effectuées en double. Les diamètres des zones d'inhibition sont portées sur un graphique en  fonction des concentrations des solutions étalons de pénicilline et la courbe d'étalonnage est tracée.  8.3.  Calcul Les concentrations en pénicilline d'un échantillon de lait peuvent se calculer d'après le diamètre des zones à l'aide de l'équation de régression ou de la courbe d'étalonnage. Pour un dosage précis, le rayon des zones d'inhibition doit être au moins  deux fois, et au plus et cinq fois, égal à celui des disques.  9.  Expression des résultats 9.1.  Exprimer les résultats en concentration de pénicilline égale ou supérieure à 0,004 g/ml (ou en indiquant la concentration déterminée) et, pour les substances inhibitrices autres que la pénicilline, en concentration équivalente en pénicilline.  9.2.  Répétabilité (r) et reproductibilité (R) Les chiffres ne sont ni disponibles ni significatifs, en raison de l'emploi d'un étalon pour la comparaison.  IX. DÉTECTION DES MICRO-ORGANISMES PATHOGÈNES  1.  Objet et domaine d'application Conformément aux prescriptions de l'annexe A chapitre VII point 2 de la directive 85/397/CEE, le présent chapitre donne les instructions à suivre pour la détection des micro-organismes pathogènes dans le lait pasteurisé.  2.  Définition L'analyse doit porter sur les bactéries le plus fréquement mises en cause dans les maladies d'origine alimentaire.  La pasteurisation est un traitement de protection contre la présence de germes pathogènes non thermorésistants dans le lait. Si les normes fixées à l'annexe A chapitre VII point 2 de la directive sont respectées en ce qui concerne le comptage des  colonies à 30 oC et à 21 oC, les coliformes et la phosphatase, une analyse spécifique en vue de la détection des germes pathogènes n'est nécessaire que si l'on soupçonne le lait d'être lié à des intoxications alimentaires.  3.  Mode opératoire Les méthodes et les fréquences d'analyse doivent être fixées par l'autorité nationale, de façon à permettre la délivrance de certificats de salubrité pour le lait traité thermiquement destiné aux échanges intracommunautaires. Pour la détection des  micro-organismes pathogènes, appliquer les critères et procédés admis au plan international s'il en existe.  4.  Procès-verbal Pour chaque micro-organisme pathogène recherché, le résultat doit être exprimé de la manière suivante:  Nombre par millilitre de lait ou par «présence» ou «absence» dans le volume de lait pasteurisé requis par le procédé utilisé.  Le procès-verbal doit indiquer clairement le procédé utilisé.  (1) L'utilisation de milieux de culture contenant des substances antifolates doit se faire en respectant les règles relatives aux brevets qui les protègent.  No L 93/42