CELEX: 32004L0073
Language: et
Date: 2004-04-29 00:00:00
Title: Komisjoni direktiiv 2004/73/EÜ, 29. aprill 2004, millega kohandatakse kahekümne üheksandat korda tehnika arenguga nõukogu direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigusnormide ühtlustamise kohtaEMPs kohaldatav tekst.

Tähtis õiguslik teade

|

32004L0073

Komisjoni direktiiv 2004/73/EÜ, 29. aprill 2004, millega kohandatakse kahekümne üheksandat korda tehnika arenguga nõukogu direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigusnormide ühtlustamise kohtaEMPs kohaldatav tekst.  

CS.ES Peatükk 13 Köide 34 Lk 448  - 757 ET.ES Peatükk 13 Köide 34 Lk 448  - 757 HU.ES Peatükk 13 Köide 34 Lk 448  - 757 LT.ES Peatükk 13 Köide 34 Lk 448  - 757 LV.ES Peatükk 13 Köide 34 Lk 448  - 757 MT.ES Peatükk 13 Köide 34 Lk 448  - 757 PL.ES Peatükk 13 Köide 34 Lk 448  - 757 SK.ES Peatükk 13 Köide 34 Lk 448  - 757 SL.ES Peatükk 13 Köide 34 Lk 448  - 757

		Komisjoni direktiiv 2004/73/EÜ,29. aprill 2004,millega kohandatakse kahekümne üheksandat korda tehnika arenguga nõukogu direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigusnormide ühtlustamise kohta(EMPs kohaldatav tekst)EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut,võttes arvesse nõukogu 27. juuni 1967. aasta direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigusnormide ühtlustamise kohta, [1] eriti selle artiklit 28,ning arvestades järgmist:(1) Direktiivi 67/548/EMÜ I lisa sisaldab ohtlike ainete nimekirja koos iga aine liigitamise ja märgistamise üksikasjadega. Seda nimekirja on vaja ajakohastada, et see sisaldaks teatatud uusi aineid ja muid olemasolevaid aineid, ning kohandada olemasolevaid kirjeid tehnika arenguga, näiteks kehtestades teatavatele ainetele kontsentratsioonipiirid keskkonnas. Sellest tulenevalt on samuti vaja kustutada teatavaid aineid käsitlevad kirjed ja jagada osadeks mõned kirjed, kuna klassifikatsiooni ei kohaldata enam kõikide nendes kirjetes olevate ainete suhtes. Tuleks muuta 1,3-butadieeni sisaldavate ainete märgistamist, võtmaks arvesse seda, et nimetatud aine klassifitseeritakse käesoleva direktiivi kohaselt mutageenina.(2) Direktiivi 67/548/EMÜ V lisas on sätestatud ainete ja valmististe füüsikalis-keemiliste omaduste, mürgisuse ning ökotoksilisuse määramise meetodid. Vastavalt nõukogu 24. novembri 1986. aasta direktiivile 86/609/EMÜ (katseteks ja muudel teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitsega seotud liikmesriikide õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta) [2] on vaja muuta kõnealust lisa, et vähendada katsetes kasutatavate loomade arvu miinimumini. Peatükkides B.1, B.4, B.5, B.31 ja B.35 toodud subkroonilise suukaudse mürgisuse meetodid tuleks uuesti üle vaadata. Lisaks sellele tuleks lisada V lisasse peatükk B.42, et teha kättesaadavaks subkroonilist suukaudset mürgisust käsitlev täiustatud meetod. Lõpuks lisatakse füüsikalis-keemilisi omadusi käsitlev peatükk A.21, subkroonilist suukaudset mürgisust käsitlev peatükk B.43 ning keskkonnamürgisust käsitlevad peatükid C.21–C.24, et võimaldada kindlaks määrata omadused, mida ei ole juba piisavalt käsitletud V lisa meetodites.(3) Käesolevas direktiivis sätestatud meetmed on kooskõlas ohtlike ainete ja valmististe tehniliste kaubandustõkete kõrvaldamist käsitlevaid direktiive tehnika arenguga kohandava komitee arvamusega,ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI:Artikkel 1Direktiivi 67/548/EMÜ muudetakse järgmiselt:1. I lisa muudetakse järgmiselt:a) eessõna märkus K asendatakse lisa 1A tekstiga;b) käesoleva direktiivi lisa 1B kirjetele vastavad kirjed asendatakse nimetatud lisa tekstiga;c) käesoleva direktiivi lisa 1C kirjed lisatakse vastavalt direktiivi 67/548/EMÜ I lisa kirjete järjestusele;d) jäetakse välja kirjed, mille indeksi numbrid on 604-050-00-X, 607-050-00-8, 607-171-00-6 ja 613-130-00-3;e) asendatakse kirje, mille indeksi number on 048-002-00-0, käesoleva direktiivi lisa 1D kirjetega, mille indeksi numbrid 048-002-00-0 ja 048-011-00-X;f) asendatakse kirje, mille indeksi number on 609-006-00-3, käesoleva direktiivi lisa 1D kirjetega, mille indeksi numbrid 609-006-00-3 ja 609-065-00-5;g) asendatakse kirje, mille indeksi number on 612-039-00-6, lisa 1D kirjetega, mille indeksi numbrid 612-039-00-6 ja 612-207-00-9.2. V lisa muudetakse järgmiselt:a) lisatakse käesoleva direktiivi lisa 2A tekst peatükina A.21;b) peatükk B.1 bis asendatakse käesoleva direktiivi lisa 2B tekstiga;c) peatükk B.1 tris asendatakse käesoleva direktiivi lisa 2C tekstiga;d) peatükk B.4 asendatakse käesoleva direktiivi lisa 2D tekstiga;e) peatükk B.5 asendatakse käesoleva direktiivi lisa 2E tekstiga;f) peatükk B.31 asendatakse käesoleva direktiivi lisa 2F tekstiga;g) peatükk B.35 asendatakse käesoleva direktiivi lisa 2G tekstiga;h) lisatakse käesoleva direktiivi lisa 2H tekst peatükkidena B.42 ja B.43;i) lisatakse käesoleva direktiivi lisa 2I tekst peatükkidena C.21 ja C.24.Artikkel 21. Liikmesriigid jõustavad käesoleva direktiivi järgimiseks vajalikud õigusnormid hiljemalt 31. oktoobriks 2005. Nad edastavad kõnealuste sätete teksti ning kõnealuste sätete ja käesoleva direktiivi vahelise vastavustabeli viivitamata komisjonile. Kui liikmesriigid need normid vastu võtavad, lisavad nad nendesse või nende ametliku avaldamise korral nende juurde viite käesolevale direktiivile. Sellise viitamise viisi näevad ette liikmesriigid.2. Liikmesriigid edastavad komisjonile käesoleva direktiiviga reguleeritavas valdkonnas vastuvõetavate siseriiklike põhiliste õigusnormide teksti.Artikkel 3Käesolev direktiiv jõustub kahekümnendal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.Artikkel 4Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.Brüssel, 29. aprill 2004Komisjoni nimelkomisjoni liigeMargot Wallström[1] EÜT 196, 16.8.1967, lk 1. Direktiivi on viimati muudetud määrusega (EÜ) nr 807/2003 (ELT L 122, 16.5.2003, lk 36).[2] EÜT L 358, 18.12.1986, lk 1. Direktiivi on viimati muudetud Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiiviga 2003/65/EÜ (ELT L 230, 16.9.2003, lk 32).--------------------------------------------------LISA 1A"Märkus K:Ainet ei pea liigitama kantserogeenseks ega mutageenseks, kui saab tõendada, et aine sisaldab alla 0,1 massiprotsendi 1,3-butadieeni (EINECSi nr 203-450-8). Kui ainet ei liigitata kantserogeenseks ega mutageenseks, kohaldatakse selle suhtes vähemalt S-lauseid (2-)9-16. Käesolev märkus kehtib ainult teatavate I lisas esitatud komplekssete naftast saadud ainete puhul."--------------------------------------------------LISA 2AA.21. OKSÜDEERIMISVÕIME (VEDELIKUD)1. MEETOD1.1 SISSEJUHATUSKäesolev katsemeetod on välja töötatud selleks, et mõõta vedeliku võimet suurendada põleva materjali põlemiskiirust või põlemisintensiivsust või moodustada segu tuleohtliku ainega, mis süttib iseeneslikult juhul, kui need kaks ainet segatakse omavahel põhjalikult. See põhineb oksüdeerivate vedelike (1) ÜRO katsel ja on sellega samaväärne. Kuna käesolev meetod A.21 on algselt ette nähtud vastama direktiivi 67/548 nõuetele, on vaja läbi viia võrdlus üksnes ühe võrdlusainega. Katsete tegemine ja võrdlemine täiendava võrdlusainega võib olla vajalik juhul, kui eeldatakse, et katse tulemusi kasutatakse muudel eesmärkidel. [1]Käesolevat katset ei ole vaja läbi viia juhul, kui struktuurivalemi uurimine teeb kahtlusteta kindlaks, et aine ei reageeri tuleohtliku materjaliga eksotermiliselt.On kasulik teada enne katsetamist, kas aine võib plahvatada.Käesolev katse ei ole kasutatav tahkete ainete, gaaside, plahvatusohtlike või kergestisüttivate ainete ega orgaaniliste peroksiidide puhul.Käesolevat katset ei ole vaja teha juhul, kui oksüdeerivaid vedelikke (1) käsitlevas ÜRO katses on tulemused uuritava katseaine kohta juba olemas.1.2 MÕISTED JA ÜHIKUDKeskmine rõhutõusuaeg – katse käigus manomeeterrõhu suurenemiseks 690 kPa-lt 2070 kPa-le kulunud aegade keskmine.1.3 VÕRDLUSAINEVõrdlusainena kasutatakse 65 %-list (massiprotsent) lämmastikhappe vesilahust (analüütiliselt puhas). [2]Kui katse läbiviija näeb ette, et katse tulemusi võib lõpuks kasutada muudel eesmärkidel, [3] võib soovi korral samuti osutuda vajalikuks katse läbiviimine täiendavate võrdlusainetega. [4]1.4 KATSEMEETODI PÕHIMÕTEUuritav vedelik segatakse kiudtselluloosiga massisuhtes 1:1 ja pannakse surveanumasse. Kui segamisel või anuma täitmisel ilmneb isesüttimine, ei ole vaja katsete tegemist jätkata.Kui isesüttimist ei toimu, viiakse läbi kogu katse. Segu kuumutatakse surveanumas ja määratakse kindlaks keskmine aeg, mis kulub manomeeterrõhu suurenemiseks 690 kPa-lt 2070 kPa-le. Seda võrreldakse sellise keskmise ajaga, mis kulub võrdlusaine(te) ja tselluloosi 1:1-segu korral rõhu suurenemiseks.1.5 KVALITEEDINÕUDEDÜhe ainega tehtud viiest katsest koosnevas seerias ei tohi ükski tulemus erineda aritmeetilisest keskmisest rohkem kui 30 %. Tulemused, mis erinevad keskmisest rohkem kui 30 %, jäetakse kõrvale, täiustatakse segamis- ja täitmismenetlust ning korratakse katset.1.6 MEETODI KIRJELDUS1.6.1 Ettevalmistus1.6.1.1 Põlev ainePõleva ainena kasutatakse kuivatatud kiudtselluloosi, mille kiu pikkus on 50–250 μm ja keskmine läbimõõt on 25 μm. [5] Seda kuivatakse konstantse kaaluni kuni 25 mm paksuses kihis 105 °C juures neli tundi ja hoitakse eksikaatoris koos desikandiga kuni jahtumise ja kasutamiseni. Kuivatatud tselluloosi niiskusesisaldus peaks olema alla 0,5 % kuivmassist. [6] Vajadusel peaks selle tagamiseks kuivatamisaega pikendama. [7] Tselluloosi sama partiid kasutatakse kogu uuringu vältel.1.6.1.2 Seadmed1.6.1.2.1 SurveanumVaja läheb surveanumat. Anumaks on silindriline terasest anum, mille pikkus on 89 mm ja välisläbimõõt on 60 mm (vt joonis 1). Vastaskülgedel paikneb kaks tasapinnalist süvendit (millega on anuma sisemist vaba ruumi vähendatud 50 mm-ni) süüteküünla ja väljalaskeava korgi paigaldamise hõlbustamiseks. Anumas oleva 20 mm siseläbimõõduga kanali mõlemas otsas on 19 mm astmetaoline laiend, mis on keermestatud vastavalt Briti standardsele 1 "torukeermele (British Standard Pipe (BSP)) või samaväärsele meeterkeermele. Surveanuma kumerasse külgpinda on ühest otsast 35 mm kaugusele kruvitud külgharu, mis paikneb tasapinnaliste süvenditega 90o nurga all ning mis on ette nähtud ühendamiseks rõhuanduriga. Külgharu pesa moodustab 12 mm sügavune puuritud ava, mis on keermestatud vastavalt külgharu otsas oleva 1/2" BSP keermega (või samaväärse meeterkeermega). Vajaduse korral paigaldatakse inertne tihend, mis tagab hermeetilise ühenduskoha. Külgharu ulatub 55 mm surveanuma korpusest väljapoole ja selle on puuritud kanal siseläbimõõduga 6 mm. Külgharu otsas on astmetaoline keermestatud süvend, mis on ette nähtud ühendamiseks membraani tüüpi rõhuanduriga. Kasutada võib mis tahes rõhumõõturit tingimusel, et seda ei mõjuta kuumad gaasid või lagunemissaadused ning et see on võimeline reageerima rõhutõusudele 690-2070 kPA vähem kui 5 ms jooksul.Surveanuma külgharust kaugemal asuv ots on suletud süüteküünlaga, milles on kaks elektroodi – üks on isoleeritud küünla korpusest ja teine on sellega ühendatud (maandatud). Surveanuma teine ots on suletud puruneva membraaniga (purunemissurve ligikaudu 2200 kPa), mida hoiab paigal 20 mm läbimõõduga puuritud avaga kork. Vajaduse korral kasutatakse ühenduskoha hermeetilisuse tagamiseks inertset tihendit. Tugiraam (joonis 2) hoiab komplekti kasutamise ajal õiges asendis. Tugiraam koosneb tavaliselt pehmest rauast alusplaadist, mille mõõtmed on 235 mm x 184 mm x 6 mm, ja 185 mm pikkusest õõnsusega ruudukujulisest sektsioonist (S.H.S.) mõõtmetega 70 mm x 70 mm x 4 mm.Õõnsusega ruudukujulise sektsiooni ühe otsa kaks vastaskülge on maha lõigatud selliselt, et moodustub kahest tasapinnalise küljega jalast struktuur, mille otsas paikneb 86 mm pikkune terviklik karbikujuline osa. Nende tasapinnaliste külgedega jalgade otsad on lõigatud horisontaalsuuna suhtes 60o all ning on keevitatud alusplaadi külge. Põhisektsiooni ülaosa ühes küljes paikneb pilu laiusega 22 mm ja sügavusega 46 mm nii, et kui rõhuanuma komplekt lastakse allapoole süüteküünlaga ots ees, siis satub külgharu pilusse. Karbikujulise osa alumise sisepinna külge keevitatakse terasest 30 mm laiune ja 6 mm paksune detail, mis toimib eraldajana. Kaks vastasküljel olevat 7 mm pitskruvi hoiavad surveanumat kindlalt paigal. Kaks 12 mm laiust ja 6 mm paksusest terasriba, mis on keevitatud karbikujulise sektsiooni põhjale toetuvate külgmiste elementide külge, toetavad surveanumat altpoolt.1.6.1.2.2 SüütesüsteemSüütesüsteem koosneb 25 cm pikkusest Ni/Cr traadist, mille läbimõõt on 0,6 mm ja takistus on 3,85 oom/m. Traat on keritud spiraalina 5 mm läbimõõduga varda abil ja kinnitatud süüteküünla elektroodide külge. Spiraali kuju peaks vastama joonisel 3 toodule. Anuma põhja ja süütespiraali alakülje vaheline kaugus peaks olema 20 mm. Kui elektroode ei saa reguleerida, tuleks süütespiraali ja anuma põhja vahel olevad traadi otsad isoleerida keraamilise kestaga. Traati kuumutatakse püsivoolutoiteallikaga, mis suudab tagada vähemalt 10 A voolutugevuse.1.6.2 Katse sooritus [8]Seade, mis on komplekteeritud rõhuanduri ja kuumutussüsteemiga, kuid kuhu ei ole paigaldatud purunevat membraani, toetub altpoolt süüteküünlale. 2,5 g uuritavat vedelikku segatakse keeduklaasis 2,5 g kuivatatud tselluloosiga, kasutades klaasist segamispulka. [9] Ohutuse tagamiseks on tegija ja segu vahel segamise ajal kaitseekraan. Kui segu süttib segamise või anuma täitmise ajal, ei ole vaja katsetamist jätkata. Segu lisatakse tilkhaaval väikeste portsjonitena surveanumasse, tagades segu paiknemise ümber süütespiraali ja sellega hea kontakti. On oluline, et spiraal ei deformeeru anuma täitmise ajal, kuna see võib põhjustada väärasid tulemusi. [10] Purunev membraan asetatakse kohale ja lukustav kork keeratakse kõvasti kinni. Täidetud anum asetatakse tugiraamile nii, et purunev membraan jääb ülespoole. Tugiraam asetatakse sobivasse armeeritud tõmbekappi või põlemiskambrisse. Toiteallikas ühendatakse süüteküünla välimiste klemmidega ja lülitatakse sisse 10 A vool. Aeg segamise alustamisest kuni voolu sisselülitamiseni ei tohiks ületada 10 minutit.Rõhuanduri signaal registreeritakse sobiva süsteemi abil, mis võimaldab nii signaali hindamist kui ka rõhu ajalise sõltuvuse pidevat registreerimist (nt graafilise isekirjutiga ühendatud siirdeprotsesside registraator). Segu kuumutatakse kuni puruneva membraani rebestumiseni või vähemalt 60 s. Kui purunev membraan ei rebestu, tuleks lasta segul jahtuda enne seadme hoolikat lahtimonteerimist, vältides seejuures võimalikku hermeetilisuse kadumist. Uuritava aine ja võrdlusaine(te)ga viiakse läbi viis katset. Fikseeritakse aeg, mis kulub manomeeterrõhu tõusuks 690 kPa-lt 2070 kPa-le. Arvutatakse keskmine rõhutõusuaeg.Mõnedel juhtudel võivad ained tekitada rõhutõusu (liiga suurt või liiga väikest), mille põhjuseks on keemilised reaktsioonid, mis ei ole seotud aine oksüdeerimisvõimega. Neil juhtudel võib osutuda vajalikuks katse kordamine tselluloosi asemel inertse ainega, nt diatomiidiga (kobediatomiit), et selgitada reaktsiooni olemust.2. TULEMUSEDRõhutõusuajad nii uuritava aine kui ka võrdlusaine(te) puhul.Rõhutõusuajad inertse ainega katsete puhul (kui need on tehtud).2.1 TULEMUSTE TÖÖTLEMINEArvutatakse keskmised rõhutõusuajad nii uuritava aine kui ka võrdlusaine(te) kohta.Arvutatakse keskmine rõhutõusuaeg inertse ainega katsete puhul (kui need on tehtud ).Mõned näited tulemuste kohta on toodud tabelis 1.Tabel 1Näiteid tulemustest [14]Aine [13] | Keskmine rõhutõusuaeg (ms) 1:1 tselluloosisegu puhul |Ammooniumdikromaat, küllastunud vesilahus | 20800 |Kaltsiumnitraat, küllastunud vesilahus | 6700 |Raud(III)nitraat, küllastunud vesilahus | 4133 |Liitiumperkloraat, küllastunud vesilahus | 1686 |Magneesiumperkloraat, küllastunud vesilahus | 777 |Nikkelnitraat, küllastunud vesilahus | 6250 |Lämmastihape, 65 % | 4767 [11] |Perkloorhape, 50 % | 121 [11] |Perkloorhape, 55 % | 59 |Kaaliumnitraat, 30 % vesilahus | 26690 |Hõbenitraat, küllastunud vesilahus | — [12] |Naatriumkloraat, 40 % vesilahus | 2555 [11] |Naatriumkloraat, 45 % vesilahus | 4133 |Inertne aine | |Vesi: tselluloos | — [12] |3. PROTOKOLL3.1 KATSEPROTOKOLLKatseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet:- uuritud aine nimetus, koostis, puhtus jne,- uuritava aine kontsentratsioon,- tselluloosi kuivatusmenetlus,- tselluloosi niiskusesisaldus,- mõõtetulemused,- inertse ainega tehtud katsete tulemused, kui need on olemas,- arvutatud keskmised rõhutõusuajad,- võimalikud kõrvalekalded nimetatud meetodist ja nende põhjused,- kogu täiendav teave või märkused, mis on vajalikud tulemuste tõlgendamiseks.3.2 TULEMUSTE TÕLGENDAMINE [15]Katsetulemusi hinnatakse:a) selle põhjal, kas uuritava aine ja tselluloosi segu süttib ise; jab) rõhutõusule (690 kPa-lt 2070 kPa-le) kulunud keskmise aja võrdlemisel võrdlusaine(te) korral selleks kulunud ajaga.Vedelikku käsitatakse oksüdeerijana juhul, kui:a) uuritava aine ja tselluloosi 1:1 segu (massi järgi) süttib iseeneslikult; võib) uuritava aine ja tselluloosi 1:1 segu (massi järgi) korral on keskmine rõhutõusuaeg väiksem 65 massiprotsendilise lämmastikhappe (vesilahus) ja tselluloosi 1:1 segu (massi järgi) korral saadud keskmisest rõhutõusuajast või on sellega võrdne.Valepositiivse tulemuse vältimiseks tuleks tulemuste tõlgendamisel arvesse võtta ka tulemusi, mis on saadud aine katsetamisel koos inertse materjaliga.4. VIITED(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3. täiendatud väljaanne. ÜRO väljaanne nr: ST/SG/AC.10/ll/Rev. 3, 1999, lk 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids.+++++ TIFF +++++Surveanum(A) Surveanuma korpus(B) Purunevat membraani paigalhoidev kork(C) Süüteküünal(D) Pehme tinatihend(E) Purunev membraan(F) Külgharu(G) Rõhuanduri pea(H) Tihend(J) Isoleeritud elektrood(K) Maandatud elektrood(L) Isolatsioon(M) Teraskoonus(N) Tihendit deformeeriv soon+++++ TIFF ++++++++++ TIFF +++++(A) Süütespiraal(B) Isolatsioon(C) Elektroodid(D) SüüteküünalMärkus:toodud kujunditest võib kasutada emba-kumba.[1] Näiteks, ÜRO transpordieeskirjade raames.[2] Hapet tuleks kontsentratsiooni kindlaksmääramiseks enne katse läbiviimist tiitrida.[3] Näiteks, ÜRO transpordieeskirjade raames.[4] Nt 50 % (massiprotsent) perkloorhapet ja 40 % (massiprotsent) naatriumkloraati kasutatakse viites 1.[5] Nt Whatman Column Chromatographic Cellulose Powder CF 11, katalooginumber 4021 050.[6] Kinnitatakse (nt) tiitrimisega Karl-Fisheri järgi.[7] Nimetatud niiskusesisaldust on võimalik saavutada ka (nt) kuumutamisel 105 °C juures vaakumis 24 tunni jooksul.[8] Oksüdeerijate ja tselluloosi segusid tuleb käsitada plahvatusohtlikena ja käsitsema neid ettevaatlikult.[9] Praktikas saab seda teha, valmistades 1:1 segu uuritavast vedelikust ja tselluloosist suuremas koguses kui katseks vaja ning pannes 5 ± 0,1 g surveanumasse. Igaks katseks tuleb segu värskelt valmistada.[10] Eelkõige tuleb vältida spiraali naaberkeerdude vahelist kontakti.[11] Laboritevaheliste võrdluskatsete keskmine väärtus.[12] Suurimat rõhku 2070 kPa ei ole saavutatud.[13] Küllastunud lahused tuleks valmistada 20 °C juures.[14] Vt viide (1) ÜRO transpordieeskirjade kohase klassifitseerimise kohta.[15] Vt viide 1, tulemuste tõlgendamine ÜRO transpordieeskirjade kohaselt mitmeid võrdlusaineid kasutades.--------------------------------------------------LISA 2BB.1a. ÄGE SUUKAUDNE MÜRGISUS – KINDLA ANNUSE PROTSEDUUR1. MEETODKäesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 420-ga (2001).1.1 SISSEJUHATUSTraditsioonilised ägeda mürgisuse hindamise meetodid kasutavad loomade surma lõpetamiskriteeriumina. 1984. aastal soovitas British Toxicology Society uut lähenemist ägeda mürgisuse katsetamisele, mis põhineb aine manustamisel kindla annusemääraga seeriana (1). See lähenemine vältis loomade surma kasutamist lõpetamiskriteeriumina ja tugines selle asemel selgete mürgisuse nähtude vaatlemisele ühel seeriast valitud kindlal annusemääral. Protseduur kiideti katsemeetodina heaks 1992. aastal Ühendkuningriigi (2) ja rahvusvaheliste (3) in vivo valideerimiste põhjal. Seejärel hinnati kindla annuse protseduuri statistilisi omadusi matemaatiliste mudelite abil mitmetes uuringutes (4)(5)(6). In vivo ja mudeluuringud on tõestanud, et protseduur on korratav, et selles kasutatakse vähe loomi ja et see põhjustab vähem kannatusi kui traditsioonilised meetodid ning et selle abil saab klassifitseerida ained sarnaselt muude ägeda mürgisuse katsemeetoditega.Juhised antud eesmärgi saavutamiseks kõige sobivama katsemeetodi valimiseks võib leida ägeda suukaudse mürgisuse katsete juhisdokumendist ("Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing" (8)). Nimetatud juhisdokument sisaldab samuti täiendavat teavet B.1a katsemeetodi kasutamise ja tõlgendamise kohta.Meetodi põhimõte on, et põhiuuringus kasutatakse üksnes mõõdukalt mürgiseid annuseid ja et tõenäoliselt surmavate annuste manustamist tuleks vältida. Samuti ei tohiks manustada annuseid, mis teatavasti põhjustavad märkimisväärset valu või kannatusi sööbivate või tõsiselt ärritavate mõjude tõttu. Suremas loomad või loomad, kes ilmselt on valus või kellel on tugeva ja kestva kannatuse tunnused, surmatakse humaanselt ning need võetakse arvesse katsetulemuste tõlgendamisel samamoodi nagu loomi, kes surid katse käigus. Eraldi juhisdokumendis (8) on esitatud kriteeriumid, mille põhjal tehakse otsus suremas või raskelt kannatavate loomade surmamiseks, ja juhised prognoositava või ähvardava surma kindlakstegemiseks.Meetod annab teavet ohtlike omaduste kohta ning võimaldab reastada ja klassifitseerida ainet ägedat mürgisust põhjustavate kemikaalide klassifitseerimiseks vastavalt globaalselt harmoneeritud süsteemile (Globally Harmonised System (GHS) for the classification of chemicals which cause acute toxicity (9)).Katselaboratoorium võtab arvesse kogu katseaine kohta kättesaadava teabe enne uuringu tegemist. Selline teave sisaldab aine nimetust ja keemilist struktuuri; selle füüsikalis-keemilisi omadusi; muude ainega in vitro või in vivo tehtud mürgisuskatsete tulemusi; struktuurilt sarnaste ainete toksikoloogilisi andmeid ja aine eeldatavat otstarvet. Selline teave on vajalik kõikide asjaosaliste veenmiseks, et katse on tähtis inimeste tervise kaitsmiseks, ja aitab valida sobivat lähteannust.1.2 MÕISTEDÄge suukaudne mürgisus – viitab sellistele kahjulikele mõjudele, mis ilmnevad pärast aine suukaudselt manustamist ühekordse annuse või seeriaviisiliste annustena 24 tunni jooksul.Edasilükkunud surm – loom ei sure ega näi olevat suremas 48 tunni jooksul, kuid sureb hiljem, 14-päevase jälgimisperioodi jooksul.Annus – manustatava katseaine kogus. Annust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (nt mg/kg).Ilmne mürgisus – üldine mõiste, mis kirjeldab katseaine manustamise järel ilmnenud selgeid mürgisuse tunnuseid (vt näiteks (3)). Suuruselt järgmine kindel annus võib põhjustada enamikul loomadest tõenäoliselt kas tugevat valu ja kestva tugeva kannatuse tunnuseid, surmaeelset seisundit (kriteeriumid on toodud humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)) või tõenäoliselt surma.GHS – Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures (keemiliste ainete ja segude globaalselt harmoneeritud klassifitseerimissüsteem). Ühistegevus, milles osalevad OECD (inimeste tervis ja keskkond), ohtlike ainete vedu käsitlev ÜRO eksperdikomitee (füüsikalis-keemilised omadused) ja ILO (ohtudest teavitamine) ning mida koordineerib kemikaalide mõistlikku haldamist käsitlev organisatsioonidevaheline programm (IOMC).Ähvardav surm – loom on suremas või sureb tõenäoliselt enne järgmist kavandatud jälgimisperioodi. Närilistel võiksid sellisele seisundile viitavateks märkideks olla krambid, külili magamine, loidus ja värin. (Vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)).LD50 (surmava annuse mediaan) – aine statistiliselt määratletud ühekordne annus, mis tõenäoliselt põhjustab suukaudsel manustamisel surma 50 %-l loomadest. LD50 väärtust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (mg/kg).Piirannus – vastab katses kasutatavale maksimaalsele annusele (2000 või 5000 mg/kg).Surmaeelne seisund – loomad, kes on suremas või kes ei suuda ellu jääda ravist hoolimata (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)).Ennustatav surm – selliste kliiniliste tunnuste olemasolu, mis viitavad sellele, et surm saabub teatud aja möödumisel enne katse kavandatavat lõppu, näiteks: suutmatus tarbida vett või toitu. (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)).1.3 KATSEMEETODI PÕHIMÕTEÜhesooliste loomade rühmadele annustatakse katseainet järk-järgult 5, 50, 300 ja 2000 mg/kg kindlate annustena (erandkorras võidakse kasutada 5000 mg/kg kindlat lisaannust, vt punkt 1.6.2). Esialgne annusemäär valitakse eelkatse põhjal annusena, mis eeldatavasti põhjustab mõningaid mürgisuse nähte, kuid ei põhjusta tõsiseid toksilisi mõjusid või suremust. Valu, kannatuse ja ähvardava surmaga seotud kliinilisi tunnuseid ja tingimusi kirjeldatakse üksikasjalikult OECD juhisdokumendis (8). Järgnevatele loomarühmadele võib annustada kaitseaine suuremaid või väiksemaid kindlaid annuseid doose, sõltuvalt sellest, kas neil on olemas või puuduvad märgid mürgisuse või suremuse kohta. Käesolevat protseduuri jätkatakse seni, kuni on kindlaks tehtud tõenäoliselt mürgisust põhjustav annus või surmajuhtum, või kui suurim annus ei avalda mõju või kui väikseim annus põhjustab surma.1.4 KATSEMEETODI KIRJELDUS1.4.1 Loomaliikide valikEelistatud näriliste liik on rotid, kuigi võib kasutada ka näriliste teisi liike. Tavaliselt kasutatakse emasloomi (7). Selle põhjuseks on, et tavapäraseid LD50 katseid käsitlevad kirjandusülevaated näitavad, et sugupoolte tundlikkuses on vähe erinevusi, kuid neil juhtudel, kui erinevusi on täheldatud, on emasloomad üldiselt veidi tundlikumad (10). Kui struktuurselt sarnaste kemikaalide toksikoloogilisi või toksikokineetilisi omadusi käsitlevatest andmetest nähtub, et isasloomad on tõenäoliselt tundlikumad, siis kasutatakse neid. Kui katse sooritatakse isasloomadega, tuleks esitada piisav põhjendus.Kasutatakse noorte tervete täiskasvanud loomade enimkasutatavaid laboritüvesid. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Iga loom peaks annustamise alustamisel olema 8-12 nädalat vana ning tema mass ei tohiks erineda rohkem kui ± 20 % varem annuse saanud loomade keskmisest massist.1.4.2 Loomade pidamise ja toitmise tingimusedLoomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 °C (± 3 °C). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal, kui see peaks olema vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega. Loomad võib grupeerida puuridesse annuse põhjal, kuid puuris olevate loomade arv ei tohiks takistada iga looma selget jälgimist.1.4.3 Loomade ettevalmistamineLoomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identifitseerimise võimaldamiseks ning hoitakse oma puurides vähemalt 5 päeva enne annustamise alustamist, et võimaldada neil kohaneda laboritingimustega.1.4.4 Annuste valmistamineÜldiselt manustatakse katseaineid kasutatavate annuste vahemikus konstantses mahus nii, et muutub annustatava valmistise kontsentratsioon. Kui uuritakse vedelat lõppsaadust või segu, võib lahjendamata katseaine kasutamine, s.t konstantse kontsentratsiooni juures, olla siiski olulisem nimetatud aine hilisemal riskianalüüsil, ja see on mõnede reguleerivate asutuste nõue. Mõlemal juhul ei tohi manustamisel ületada annuse suurimat mahtu. Vedeliku suurim ühekordselt manustatav maht sõltub katselooma suurusest. Näriliste puhul ei tohiks maht tavaliselt ületada 1 ml 100 g kehamassi kohta: vesilahuste puhul võib siiski manustada 2 ml 100 g kehamassi kohta. Annuse valmistise koostamiseks on soovitav võimaluse korral kasutada vesilahust/suspensiooni/emulsiooni, tähtsuse järjekorras oleks järjestus lahus/suspensioon/emulsioon õlis (nt maisiõli) ja seejärel muudel kandeainetel põhinev lahus. Veest erinevate kandeainete puhul peaks kandeaine toksikoloogilised omadused olema teada. Annused tuleb valmistada ette natuke aega enne manustamist, välja arvatud juhul, kui valmistise stabiilsus sellel ajavahemikul, mil seda kasutatakse, on teada ja näib aktsepteeritav.1.5 PROTSEDUUR1.5.1 Annuste manustamineKatseainet manustatakse ühekordse annusena söögitoru kaudu või sobiva intubeerimise kanüüli abil. Erandkorras, kui ühekordne annus ei ole võimalik, võib annust manustada väiksemates osades kuni 24 tunni jooksul.Loomad peaksid enne doosi manustamist paastuma (nt rotte hoitakse söömata terve öö ja hiiri 3–4 tundi, üksnes vesi on saadaval). Paastumise järel loomi kaalutakse ja manustatakse katseaine. Pärast aine manustamist võib hoida rotte söömata veel 3–4 tundi ja hiiri 1–2 tundi. Kui annust manustatakse osadena ajavahemiku jooksul, võib sõltuvalt ajavahemiku pikkusest osutuda vajalikuks anda loomadele toitu ja vett.1.5.2 EelkatseEelkatse eesmärk on võimaldada valida põhiuuringu tarbeks sobiv lähteannus. Katseainet manustatakse üksikutele loomadele järk-järgult lisas 1 toodud vooskeemide kohaselt. Eelkatse on lõpetatud siis, kui saab langetada otsuse põhikatse lähteannuse kohta (või kui tuvastatakse surm madalaima kindla annuse puhul).Eelkatse lähteannus valitakse kindlate annusmäärade 5, 50, 300 ja 2000 mg/kg hulgast annusena, mis eeldatavasti põhjustab ilmset mürgisust, mis võimaluse korral põhineb sama kemikaali või struktuurselt sarnaste kemikaalidega sooritatud in vivo ja in vitro katsete andmetel. Sellise teabe puudumise korral on lähteannuseks 300 mg/kg.Iga looma korral on manustamiste vahel vähemalt 24-tunnine vahemik. Kõiki loomi jälgitakse vähemalt 14 päeva.Maksimaalset kindla annuse määra 5000 mg/kg võidakse kasutada erandkorras või siis, kui see on põhjendatud konkreetsete normatiivsete vajadustega (vt lisa 3). Loomade heaolu pärast ei ole soositud loomkatsete tegemisel GHS-kategooria 5 (2000–5000 mg/kg) annus ja seda tuleks kasutada üksnes siis, kui on eriti tõenäoline, et sellise katse tulemustel on otsene tähtsus inimeste ja loomade tervise või keskkonna kaitsmiseks.Juhul kui loom, kelle peal katsetati madalaimat kindla annuse määra (5 mg/kg), eelkatse käigus sureb, on tavapäraseks toiminguks uuringu peatamine ja aine klassifitseerimine GHS-kategooriasse 1 (nagu on näidatud lisas 1). Kui on siiski nõutav klassifitseerimise täiendav kinnitamine, võib teostada järgmise valikulise lisaprotseduuri. Teisele loomale manustatakse annus 5 mg/kg. Kui teine loom sureb, siis kinnitab see GHS- kategooriat 1 ja katse lõpetatakse kohe. Kui teine loom jääb ellu, siis manustatakse maksimaalselt kolmele täiendavale loomale annus 5 mg/kg. Kuna suremuse risk on kõrge, tuleb manustamist teha kõnealustele loomadele ükshaaval, et tagada nende heaolu. Ajavahemik igale loomale annuse manustamise vahel peab olema piisav selleks, et eelmine loom jääb tõenäoliselt ellu. Kui teine loom sureb, lõpetatakse viivitamata annustamine ja rohkematele loomadele doose ei manustata. Kuna teise surma juhtum (olenemata uuritud loomade arvust katse lõpetamise hetkel) kuulub tulemuse kategooriasse A (2 või enam surma), järgitakse 5 mg/kg fikseeritud annuse puhul lisas 2 toodud klassifitseerimisreeglit (kategooria 1, kui on 2 või enam surmajuhtumit, või kategooria 2, kui on vaid 1 surmajuhtum). Lisaks sellele antakse lisas 4 juhiseid EL süsteemi kohase klassifitseerimise kohta enne uue GHS-i kasutuselevõttu.1.5.3 Põhiuuring1.5.3.1 Loomade arv ja annusemääradLähteannuse tasemel katsete tegemise järel võetavad meetmed on esitatud lisas 2 toodud vooskeemides. Üks kolmest meetmest on nõutav; kas katse peatamine või sobiva ohuklassi määramine, katse sooritamine suurema kindla annusega või väiksema kindla annusega. Loomade kaitsmiseks ei kasutata põhiuuringus uuesti eelkatses surma põhjustanud annusemäära (vt lisa 2). Kogemused on näidanud, et kõige tõenäolisem tulemus läheannuse tasemel on see, et ainet on võimalik klassifitseerida ja täiendavaid katseid ei ole vaja teha.Igal uuritava annusemäära korral kasutatakse tavaliselt kokku viit ühest soost looma. Nende viie looma hulka kuulub üks loom eelkatsest, kellele manustati valitud annusemäärale vastav annus, ja veel neli looma (v.a harvaesineval juhul, kui põhiuuringus kasutatav annusemäär ei sisaldunud eelkatses).Annustamiste vaheline ajavahemik iga annusemäära korral määratakse kindlaks mürgisuse tunnuste ilmnemise, kestuse ja ägeduse abil. Järgmise annuse manustamist tuleb edasi lükata, kuni juba doosi saanud loomade ellujäämine on kindel. Vajaduse korral soovitatakse annustamiste vaheliseks ajaks jätta iga annusemäära puhul 3 või 4 päeva, et võimaldada jälgida viivitunud mürgisust. Ajavahemikku võib vajaduse korral korrigeerida, nt ebaselge vastuse puhul.Kui kasutatakse kõrgeimat kindlat annust 5000 mg/kg, tuleks järgida lisas 3 esitatud protseduuri (vt ka punkt 1.6.2).1.5.3.2 PiirkatsePiirkatset kasutatakse peamiselt olukordades, kuseksperimentaatoril on teavet selle kohta, et katsematerjal ei ole tõenäoliselt mürgine, s.t selle mürgisus ületab üksnes normatiivseid piirannuseid. Teavet katsematerjali mürgisuse kohta võib saada sarnaseid uuritud ühendeid või segusid või tooteid käsitlevatest teadmistest, võttes arvesse toksikoloogiliselt oluliste koostisosade olemust ja protsendimäära. Sellistel juhtudel, kui on vähe teavet mürgisuse kohta või see puudub üldse või mil katsematerjal on eeldatavasti mürgine, tuleks sooritada põhikatse.Käesoleva juhise kohase piirkatsena võidakse tavalist protseduuri kasutades kasutada eelkatset, mille lähteannus on 2000 mg/kg (või erandkorras 5000 mg/kg), mille järel manustatakse veel neljale loomale sama annus.1.6 VAATLUSEDLoomi jälgitakse individuaalselt pärast annustamist vähemalt esimese 30 minuti jooksul, perioodiliselt esimese 24 tunni jooksul, erilist tähelepanu pööratakse esimese 4 tunni jooksul ja seejärel iga päev, kokku 14 päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui need tuleb kõrvaldada uuringust ja surmata humaanselt loomade heaolu pärast või loomad leitakse surnuna. Vaatluse kestust ei tuleks siiski jäigalt määratleda. See tuleks kindlaks määrata toksiliste reaktsioonide, nende algushetke ja taastusperioodi pikkuse põhjal ja seda võib seega vajadusel pikendada. Mürgisuse nähtude ilmumise ja kadumise aeg on tähtis, eriti siis, kui on tendents, et mürgisusnähud võivad ilmneda hilistumisega (11). Kõik vaatlused registreeritakse süstemaatiliselt, säilitades iga looma kohta eraldi andmed.Täiendavad vaatlused on vajalikud siis, kui loomadel on jätkuvalt mürgisuse tunnused. Vaatlused peaksid hõlmama muutusi nahal ja karvkattes, silmades ja limaskestades ning samuti muutusi hingamissüsteemis, vereringes, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomotoorses tegevuses ja käitumises. Tähelepanu peaks olema suunatud värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, letargia, une ja kooma jälgimisele. Arvesse tuleks võtta humaansete lõpetamiskriteeriumide juhisdokumendis esitatud põhimõtteid ja kriteeriume (8). Suremas olevad loomad või loomad, kellel on tugev valu või tugeva kannatuse kestvad tunnused, tuleks surmata humaanselt. Kui loomad surmatakse humaansel viisil või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg võimalikult täpselt registreerida.1.6.1 KehamassIga looma mass tuleks määrata kindlaks veidi enne katseaine manustamist ja seejärel vähemalt kord nädalas. Massi muutused tuleks arvutada ja protokollida. Katse lõpus ellujäänud loomad kaalutakse ja siis surmatakse humaanselt.1.6.2 PatoloogiaKõik katseloomad (kaasa arvatud need, kes surid katse käigus või kõrvaldatakse uuringust loomade heaolu tagamiseks) lahatakse. Kõik üldpatoloogilised muutused tuleks iga looma puhul protokollida. Esialgse annustamise järel 24 või enam tundi elus püsinud loomade üldpatoloogiliste muutustega organeid võidakse samuti uurida mikroskoopiliselt, kuna see võib anda kasulikku teavet.2. TULEMUSEDTulemused esitatakse iga üksiku looma kohta. Lisaks sellele tuleb kõik andmed esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates ära iga katserühma puhul osalevate loomade arvu, mürgisusnähtudega loomade arvu, katse käigus surnud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahangul tehtud leiud.3. PROTOKOLL3.1 KATSEPROTOKOLLKatseprotokoll peab sisaldama vastavalt vajadusele järgmist teavet:Katseaine:- füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused (kaasa arvatud isomeerumine),- identifitseerimiseks vajalikud andmed, kaasa arvatud CASi number.Kandeaine (vajadusel):- kandeaine valiku põhjendus, kui see on veest erinev.Katseloomad:- kasutatud liigid/tüved,- loomade mikrobioloogiline seisund, kui see on teada,- loomade arv, vanus ja sugu (sh vajaduse korral põhjendus isasloomade kasutamise kohta emasloomade asemel),- päritolu, pidamistingimused, toitumine jne.Katsetingimused:- katseaine valmistamise üksikandmed, sh üksikandmed manustatava aine füüsilise oleku kohta,- katseaine manustamise üksikasjad, sh annuste mahud ja annustamise aeg,- üksikasjalikud andmed toidu ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas),- põhjendus lähteannuse valikuks.Tulemused:- tabelid iga looma (st loomad, kellel on mürgistustunnused, kaasa arvatud suremus, mõjude laad, ägedus ja kestus) reageerimise andmete ja annusemäärade kohta,- tabelid kehamassi ja kehamassi muutuste kohta,- iga looma mass annustamispäeval, seejärel nädalaste intervallidega ja surma- või surmamishetkel,- surma kuupäev ja kellaaeg juhul, kui loom sureb enne kavandatud surmamist,- iga looma korral mürgistusnähtude algusaeg ja nende võimalik taandumine,- iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on olemas.Tulemuste arutlus ja tõlgendamine.Järeldused.4. VIITED(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92.(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291.(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Felling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482.(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol.(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196.(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Pariis(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19.(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P, Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation . In: Principles and Methods of Toxicology. 3 rd Edition. A.W. Hayes , Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.--------------------------------------------------LISA 2C"B.Ib ÄGE SUUKAUDNE MÜRGISUS – ÄGEDA MÜRGISUSASTME MEETOD1. MEETODKäesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 423-ga (2001).1.1 SISSEJUHATUSKäesolevas katses sätestatud ägeda mürgisusastme meetod (1) on astmeline meetod, mille igal etapil kasutatakse 3 samast soost looma. Olenevalt loomade suremusest ja/või sellest, kas loomad on suremas, on katseaine ägeda mürgisuse hindamiseks vaja keskmiselt 2–4 etappi. Käesolev protseduur on korratav, selles kasutatakse väga vähe loomi. Selle abil võidakse järjestada ained sarnaselt muudele ägeda mürgisuse katsemeetoditele. Ägeda mürgisusastme meetod põhineb biomeetrilistel hindamistel (2)(3)(4)(5), kus kasutatakse kindlaid annuseid, mis on üksteisest piisavalt eraldatud aine klassifitseerimise eesmärgil ja ohu hindamiseks. 1996. aastal vastuvõetud meetodit valideeriti ulatuslikult in vivo, võrreldes kirjandusest saadud LD50- väärtusi käsitlevaid andmeid nii riiklikul (6) kui ka rahvusvahelisel tasandil (7).Juhised antud eesmärgi saavutamiseks kõige sobivama katsemeetodi valimiseks võib leida ägeda suukaudse mürgisuse katseid käsitlevast (8) juhisdokumendist. Nimetatud juhisdokument sisaldab samuti täiendavat teavet B.lb katsemeetodi läbiviimise ja tõlgendamise kohta.Katseaineid ei ole vaja manustada annustes, mis teadaolevalt põhjustavad märkimisväärset valu ja kannatusi sööbiva või tugeva ärritava toimete tõttu. Suremas olevad loomad ja loomad, kes kannatavad ilmselgelt valu või kellel ilmnevad tõsiste või kestvate kannatuste tunnused, tuleks surmata humaanselt; need loomad võetakse arvesse katsetulemuste tõlgendamisel samamoodi nagu katse käigus surnud loomi. Eraldi juhisdokumendis (9) on esitatud kriteeriumid, mille alusel tehakse otsus suremas olevate või tõsiselt kannatavate loomade surmamise kohta, ning juhised prognoositava või ähvardava surma äratundmiseks.Meetod kasutab ettemääratletud annuseid ja tulemused võimaldavad aineid järjestada ja klassifitseerida vastavalt ägedat mürgisust põhjustavate kemikaalide klassifitseerimist käsitlevale globaalselt harmoneeritud süsteemile (10).Põhimõtteliselt ei ole meetod ette nähtud võimaldama arvutada täpset LD50-annust, kuid võimaldab kindlaks määrata määratletud kokkupuutevahemikku, kus suremus on eeldatav, kuna käesoleva katse põhipunkt on endiselt see, et osa loomi sureb. Meetod võimaldab kindlaks määrata LD50-väärtuse üksnes siis, kui vähemalt kaks annust põhjustavad suremuse, mis on 0 %-st suurem ja 100 %-st madalam . Tänu ettemääratletud annuste valikule sõltumata katseainest, ja klassifitseerimise selgelt väljendatud seosele erinevas seisundis täheldatud loomade arvuga on laborite aruanded järjepidevamad ja korratavamad.Katselaboratoorium võtab arvesse kogu katseaine kohta kättesaadava teabe enne uuringu tegemist. Selline teave sisaldab aine nimetust ja keemilist struktuuri; selle füüsikalis-keemilisi omadusi; muude ainetega in vitro või in vivo tehtud mürgisuskatsete tulemusi; struktuurilt sarnaste ainete toksikoloogilisi andmeid ja aine eeldatavat otstarvet. Selline teave on vajalik kõikide asjaosaliste veenmiseks, et katse on tähtis inimeste tervise kaitsmiseks, ja aitab valida sobivat lähteannust.1.2. MÕISTEDÄge suukaudne mürgisus – viitab sellistele kahjulikele mõjudele, mis ilmnevad pärast ainet on suukaudselt manustamist ühekordse annuse või seeriaviisiliste annustena 24 tunni jooksul.Edasilükkunud surm – loom ei sure ega näi olevat suremas 48 tunni jooksul, kuid sureb hiljem, 14-päevase jälgimisperioodi jooksul.Annus – manustatava katseaine kogus. Annust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (nt mg/kg).GHS – Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures (keemiliste ainete ja segude globaalselt harmoneeritud klassifitseerimissüsteem). Ühistegevus, milles osalevad OECD (inimeste tervis ja keskkond), ohtlike ainete vedu käsitlev ÜRO eksperdikomitee (füüsikalis-keemilised omadused) ja ILO (ohtudest teavitamine) ning mida koordineerib kemikaalide mõistlikku haldamist käsitlev organisatsioonidevaheline programm (IOMC).Ähvardav surm – loom on suremas või sureb tõenäoliselt enne järgmist kavandatud jälgimisperioodi. Närilistel võiksid sellisele seisundile viitavateks märkideks olla krambid, külili magamine, loidus ja värin (Vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9)).LD50 (surmava suukaudse annuse mediaan) – aine statistiliselt määratletud ühekordne annus, mis tõenäoliselt põhjustab suukaudsel manustamisel surma 50 %-l loomadest. LD50 väärtust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (mg/kg).Piirannus – vastab katses kasutatavale maksimaalsele annusele (2000 või 5000 mg/kg).Surmaeelne seisund – loomad, kes on suremas või kes ei suuda ellu jääda ravist hoolimata (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9)).Ennustatav surm – selliste kliiniliste tunnuste olemasolu, mis viitavad sellele, et surm saabub teatud aja möödumisel enne katse kavandatavat lõppu; näiteks suutmatus tarbida vett või toitu. (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9)).1.3 KATSE PÕHIMÕTETuginedes protseduurile, mille kohaselt kasutatakse igal etapil minimaalset arvu loomi, on katse põhimõtteks saada aine klassifitseerimiseks piisavalt teavet katseaine ägeda mürgisuse kohta. Ainet manustatakse katseloomade rühmale suukaudselt ühe kindlaksmääratud doosina. Ainet katsetatakse etapiviisiliselt, igal etapil kasutatakse kolme ühest soost looma (tavaliselt emaslooma). Ühendiga seotud suremuse puudumine või esinemine loomadel, kellele ühel etapil annustati ainet, määrab kindlaks järgmise etapi, s.t:- lisakatseid ei ole vaja,- aine sama annus manustatakse kolmele täiendavale loomale,- ainet manustatakse vastavalt vahetult järgmisele või eelmisele annusemäärale kolmele täiendavale loomale.Katseprotseduuri üksikasju on kirjeldatud lisas 1. Meetod võimaldab langetada otsuse seoses katseaine klassifitseerimisega ühte mürgisuse kategooriasse, mis on määratletud kindlaksmääratud LD50 piirväärtuse põhjal.1.4 MEETODI KIRJELDUS1.4.1 Loomaliikide valikEelistatud näriliste liik on rotid, kuigi võib kasutada ka näriliste teisi liike. Tavaliselt kasutatakse emasloomi (9). Selle põhjuseks on, et tavapäraseid LD50 katseid käsitlevad kirjandusülevaated näitavad, et sugupoolte tundlikkuses on vähe erinevusi, kuid neil juhtudel, kui on erinevusi täheldatud, on emasloomad üldiselt veidi tundlikumad (11). Kui struktuurselt sarnaste kemikaalide toksikoloogilisi või toksikokineetilisi omadusi käsitlevatest andmetest nähtub, et isasloomad on tõenäoliselt tundlikumad, siis kasutataks neid. Kui katse viiakse läbi isasloomadega, tuleks esitada piisav põhjendus.Kasutatakse noorte tervete täiskasvanud loomade enimkasutatavaid laboritüvesid. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Iga loom peaks annustamise alustamisel olema 8-12 nädalat vana ning tema mass ei tohiks erineda rohkem kui ± 20 % varem annuse saanud loomade keskmisest massist.1.4.2 Loomade pidamise ja toitmise tingimusedLoomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 °C (± 3 °C). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi koristamise aja, kui see peaks olema vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega. Loomad võib grupeerida puuridesse annuse põhjal, kuid puuris olevate loomade arv ei tohiks takistada iga looma selget jälgimist.1.4.3 Loomade ettevalmistamineLoomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identifitseerimise jaoks ning hoitakse oma puurides vähemalt 5 päeva enne annustamise alustamist, et võimaldada neil kohaneda laboritingimustega.1.4.4 Annuste valmistamineÜldiselt manustatakse katseaineid kasutatavate annuste vahemikus konstantses mahus nii, et muutub annustatava valmistise kontsentratsioon. Kui uuritakse vedelat lõppsaadust või segu, võib lahjendamata katseaine kasutamine, s.t konstantse kontsentratsiooni juures, olla siiski olulisem nimetatud aine hilisemal riskianalüüsil, ja see on mõnede reguleerivate asutuste nõue. Mõlemal juhul ei tohi ületada manustamisel annuste suurimat mahtu. Vedeliku suurim ühekordselt manustatav maht sõltub katselooma suurusest. Näriliste puhul ei tohiks maht tavaliselt ületada 1 ml 100 g kehamassi kohta: vesilahuste puhul võib siiski manustada 2 ml 100 g kehamassi kohta. Annuse valmistise koostamiseks on soovitav võimaluse korral kasutada vesilahust/suspensiooni/emulsiooni, tähtsuse järjekorras oleks järjestus järgmine lahus/suspensioon/emulsioon õlis (nt maisiõli) ja seejärel muudel kandeainetel põhinev lahus. Veest erinevate kandeainete puhul peaks kandeaine toksikoloogilised omadused olema teada. Annused tuleb valmistada ette natuke aega enne manustamist, välja arvatud juhul, kui valmistise stabiilsus sellel ajavahemikul, mil seda kasutatakse, on teada ja näib aktsepteeritav.1.5 PROTSEDUUR1.5.1 Annuste manustamineKatseainet manustatakse ühekordse annusena söögitoru kaudu või sobiva intubeerimise kanüüli abil. Erandkorras, kui ühekordne annus ei ole võimalik, annust manustada väiksemates osades kuni 24 tunni jooksul.Loomad peaksid enne doosi manustamist paastuma (nt rotte hoitakse söömata terve öö ja hiiri 3-4 tundi, üksnes vesi on saadaval). Paastumise järel loomi kaalutakse ja katseainet manustatakse. Pärast aine manustamist võib hoida rotte söömata veel 3–4 tundi ja hiiri 1–2 tundi. Kui annust manustatakse osadena ajavahemiku jooksul, võib sõltuvalt ajavahemiku pikkusest osutuda vajalikuks anda loomadele toitu ja vett.1.5.2 Loomade arv ja annusemääradIgal etapil kasutatakse kolme looma. Lähteannusena kasutatav annusemäär valitakse üks neljast kindlast suurusest – 5, 50, 300 ja 2000 mg/kehamassi kg. Lähteannuse määr peaks olema sellise väärtusega, mis kutsub suurima tõenäosusega esile suremust mõnede loomade hulgas, kellele ainet manustati. Lisas 1 toodud vooskeemid kirjeldavad protseduure, mida tuleks järgida iga lähteannuse puhul. Lisaks sellele antakse lisas 4 juhiseid EL süsteemi kohase klassifitseerimise kohta enne uue GHS-i kasutuselevõttu.Kui olemasolev teave kinnitab, et suremus on ebatõenäoline suurima algdoosi taseme juures (2000 mg/kg kehamassi kohta, tuleks läbi viia piirkatse. Kui puudub teave uuritava aine kohta, soovitatakse loomade heaolu tagamiseks kasutada algdoosina 300 mg/kg kehamassi kohta.Katserühmadele annustamiste ajavahemik määratakse kindlaks mürgisustunnuste algushetke, kestuse ja raskuse abil. Järgmise annuse manustamist loomadele tuleb edasi lükata hetkeni, kuni juba annuse saanud loomade ellujäämine on kindel.Maksimaalset kindla annuse määra 5000 mg/kg võidakse kasutada erandkorras ja ainult siis, kui see on põhjendatud konkreetsete normatiivsete vajadustega (vt lisa 2). Loomade heaolu pärast ei ole soositud loomkatsete tegemisel GHS-kategooria 5 (2000–5000 mg/kg) annus ja seda tuleks kasutada üksnes siis, kui on eriti tõenäoline, et sellise katse tulemustel on otsene tähtsus inimeste ja loomade tervise või keskkonna kaitsmisel.1.5.3 PiirkatsePiirkatset kasutatakse peamiselt olukordades, kus eksperimentaatoril on teavet selle kohta, et katsematerjal ei ole tõenäoliselt mürgine, s.t selle mürgisus ületab üksnes normatiivseid piirannuseid. Teavet katsematerjali mürgisuse kohta võib saada sarnaseid uuritud ühendeid, segusid või tooteid käsitlevatest teadmistest, võttes arvesse toksikoloogiliselt oluliste koostisosade olemust ja protsendimäära. Sellistel juhtudel, kui on vähe teavet mürgisuse kohta või see puudub üldse või mil katsematerjal on eeldatavasti mürgine, tuleks sooritada põhikatse.Piirkatse võidakse teha ühel annusemääral (2000 mg/kg kehamassi kohta) kuue loomaga (kolm looma igal etapil). Erandkorras võib piirkatse teha ühel annusemääral (5000 mg/kg) kolme loomaga (vt lisa 2). Kui esineb katseainega seotud suremust, võib sooritada lisakatseid aste võrra madalama annusemääraga.1.6 VAATLUSEDLoomi jälgitakse individuaalselt pärast annustamist vähemalt esimese 30 minuti jooksul, perioodiliselt esimese 24 tunni jooksul, erilist tähelepanu pööratakse esimese 4 tunni jooksul ja seejärel iga päev kokku 14 päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui loomad tuleb kõrvaldada uuringust ja surmata humaanselt loomade heaolu pärast või kui nad leitakse surnuna. Vaatluse kestust ei tuleks siiski jäigalt määratleda. See tuleks kindlaks määrata toksiliste reaktsioonide, nende algushetke ja taastusperioodi pikkuse põhjal ja seda võib seepärast vajadusel pikendada. Mürgisuse nähtude ilmumise ja kadumise aeg on tähtis, eriti siis, kui on tendents, et mürgisusnähud võivad ilmneda hilistumisega (12). Kõik vaatlused registreeritakse süstemaatiliselt, säilitades iga looma kohta eraldi andmed.Täiendavad vaatlused on vajalikud siis, kui loomadel on jätkuvalt mürgisuse tunnused. Vaatlused peaksid hõlmama muutusi nahal ja karvkattes, silmades ja limaskestades ning samuti muutusi hingamissüsteemis, vereringes, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomotoorses tegevuses ja käitumises. Tähelepanu peaks olema suunatud värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, letargia, une ja kooma jälgimisele. Arvesse tuleks võtta humaansete lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9) esitatud põhimõtteid ja kriteeriume. Suremas olevad loomad või loomad, kellel on tugev valu või tugeva kannatuse kestvad tunnused, tuleks surmata humaanselt. Kui loomad surmatakse humaansel viisil või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg võimalikult täpselt registreerida.1.6.1 KehamassIga looma mass tuleks määrata kindlaks veidi enne katseaine manustamist ja seejärel vähemalt kord nädalas. Massi muutused tuleks arvutada ja protokollida. Katse lõpus ellujäänud loomad kaalutakse ja siis surmatakse humaanselt.1.6.2 PatoloogiaKõik katseloomad (kaasa arvatud need, kes surid katse käigus või kõrvaldatakse uuringust loomade heaolu tagamiseks) lahatakse. Kõik üldpatoloogilised muutused tuleks iga looma puhul protokollida. Esialgse annustamise järel 24 või enam tundi elus püsinud loomade üldpatoloogiliste muutustega organeid võidakse samuti uurida mikroskoopiliselt, kuna see võib anda kasulikku teavet.2. TULEMUSEDTulemused esitatakse iga üksiku looma kohta. Lisaks sellele tuleb kõik andmed esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates ära iga katserühma puhul osalevate loomade arvu, mürgisusnähtudega loomade arvu, katse käigus surnud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahangul tehtud leiud.3. PROTOKOLL3.1 KatseprotokollKatseprotokoll peab sisaldama vastavalt vajadusele järgmist teavet:Katseaine:- füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused (kaasa arvatud isomeerumine);- identifitseerimiseks vajalikud andmed, kaasa arvatud CASi number.Kandeaine (vajadusel):- kandeaine valiku põhjendus, kui see on veest erinev.Katseloomad:- kasutatud liigid/tüved,- loomade mikrobioloogiline seisund, kui see on teada,- loomade arv, vanus ja sugu (sh vajaduse korral põhjendus isasloomade kasutamise kohta emasloomade asemel),- päritolu, pidamistingimused, toitumine jne.Katsetingimused:- katseaine valmistamise üksikasjad, sh üksikasjad manustatava aine füüsilise oleku kohta,- katseaine manustamise üksikasjad, sh annuste mahud ja annustamise aeg,- üksikasjalikud toidu ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas),- põhjendus lähteannuse valikuks.Tulemused:- tabelid iga looma (st loomad, kellel on mürgisustunnused, kaasa arvatud suremus, mõjude laad, ägedus ja kestus) reageerimise andmete ja annusemäärade kohta,- tabelid kehamassi ja kehamassi muutuste kohta,- iga looma mass annustamispäeval, seejärel nädalaste intervallidega ja surma- või surmamishetkel,- surma kuupäev ja kellaaeg juhul, kui loom sureb enne kavandatud surmamist,- iga looma korral mürgisusnähtude algusaeg ja nende võimalik taandumine,- iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on olemas.Tulemuste arutlus ja tõlgendamine.Järeldused.4. VIITED(1) Roll R., Hofer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86.(2) Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610.(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134.(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method - An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http:// webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].(11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231.(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994 ). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA."--------------------------------------------------LISA 2DΒ.4. ÄGE MÜRGISUS: NAHAÄRRITUS/-SÖÖVITUS1. MEETODKäesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 404-ga (2002).1.1 SISSEJUHATUSKäesoleva ajakohastatud meetodi ettevalmistamisel pööratakse eriliste tähelepanu võimalikele parandustele seoses loomade heaoluga ja kogu olemasoleva katseainet käsitleva teabe hindamisele, et vältida mittevajalikke katseid laboriloomadega. Käesoleva meetodi hulka kuulub soovitus, et enne kirjeldatud, aine söövitavust ja ärritavust uuriva in vivo katse tegemist analüüsitaks olemasolevate asjaomaste andmete osakaalu. Kui saadaolevad andmed on ebapiisavad, saab neid täiendada järjestikuste katsete tegemise abil (1). Katsete tegemise strateegia, mis on esitatud käesoleva meetodi lisas, hõlmab valideeritud ja heakskiidetud in vitro katsete sooritamist. Lisaks sellele soovitatakse vastavalt olukorrale, et in vivo algkatses kohaldatakse looma suhtes kolme katselappi järjestikku, mitte samaaegselt.Nii mõistlike teaduslike meetodite kui ka loomade heaolu huvides ei tehta in vivo katseid enne, kui on hinnatud kogu kättesaadava katseaine võimalikku naha söövitamist/ärritamist käsitleva teabe osakaalu. Sellisteks andmeteks on tõendid varasematest inimeste ja/või laboriloomadega tehtud uurimustest, tõendid ühe või mitme struktuuriliselt samalaadse aine või selliste ainete segude põhjustatud söövituse ja ärrituse kohta, aine tugevale happesusele või leelisusele viitavad andmed (2)(3) ning valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete tulemused (4)(5)(5a). Käesolev analüüs peaks vähendama vajadust teha in vivo katseid selliste ainete suhtes, mille nahasöövitavuse ja -ärritavuse kohta on muudest uurimustest juba piisavalt tõendeid saadud.Eelistatud järjestikuste katsete tegemise strateegia, mis hõlmab valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete sooritamist söövitavuse ja ärritavuse kohta, on esitatud käesoleva meetodi lisas. Strateegia töötati välja OECD seminaril (6), millest osavõtjad seda ühehäälselt soovitasid, ja see kiideti heaks soovitusliku katsestrateegiana keemiliste ainete klassifitseerimist käsitlevas globaalselt harmoneeritud süsteemis (GHS) (7). Soovitatakse, et nimetatud katsestrateegiat kasutataks enne in vivo katsete tegemist. Uute ainete katsetamisel on soovitav etapiviisiline katsete tegemine teaduslikult usaldatavate andmete tootmiseks aine söövitavuse ja ärritatavuse kohta. Olemasolevate ainete puhul, mille nahasöövitavuse ja -ärritavuse kohta ei ole piisavalt andmeid, tuleks strateegiat kasutada puuduvate andmete hankimiseks. Kui otsustatakse kasutada muud katsetamisstrateegiat või menetlust või mitte kasutada etapiviisilist katsete tegemist, siis tuleks seda otsust põhjendada.Kui söövitavust või ärritavust ei saa kindlaks määrata järjestikuste katsete tegemise strateegia kohaselt osakaalu analüüsimise abil, tuleks kaaluda in vivo katset (vt lisa).1.2 MÕISTEDNahaärritus – pöörduva nahakahjustuse tekkimine kuni neli tunni jooksul pärast katseaine manustamist.Nahasöövitus – pöördumatu nahakahjustuse, s.t nähtava marrasknahast pärisnahani ulatuva nekroosi tekkimine kuni nelja tunni jooksul pärast katseaine manustamist. Tüüpilised söövitusreaktsioonid on haavandid, verejooks, verised kärnad ning 14-päevase jälgimisperioodi lõpus naha heledaks muutumise tõttu värvimuutus, täielik karvakadu ja armid. Küsitavate kahjustuste hindamiseks tuleks kaaluda histopatoloogiat.1.3 KATSEMEETODI PÕHIMÕTEUuritavat ainet manustatakse ühekordse annusena katselooma nahale, katselooma töötlemata kehapinnad toimivad kontrollina. Ärritavuse/söövitavuse astet konstateeritakse ja märgitakse täpsustatud intervallid ning seda astet kirjeldatakse mõjude hindamise täiendamiseks. Uurimus kestab niikaua, et vaadeldud mõjude pöörduvust või pöördumatust saaks hinnata.Loomad, kellel on jätkuvalt tugeva stressi ja/või valu tunnused igal katseetapil, tuleks humaanselt tappa ja seda võetakse aine hindamisel arvesse. Suremas olevate ja tugevalt kannatavate loomade humaanse tapmise kriteeriumid on toodud viites (8).1.4 KATSEMEETODI KIRJELDUS1.4.1 In vivo katse ettevalmistamine1.4.1 Loomaliikide valikEelistatud laboriloom on albiinoküülik, kasutatakse terveid noori täiskasvanud küülikuid. Muude liikide kasutamist tuleks põhjendada.1.4.1.2 Loomade ettevalmistamineLigikaudu 24 tunni jooksul enne katset lõigatakse loomade seljaosa karvad lühikeseks. Tuleks vältida naha marrastamist ning kasutama peaks üksnes terveid, terve nahaga loomi.Mõnedel küüliku liinidel esineb tihedaid karvalaike, mis on silmatorkavamad teatavatel aastaaegadel. Selliseid tiheda karvastikuga kehapindasid ei tohiks kasutada katsetamise kohana.1.4.1.3 Loomade pidamise ja toitmise tingimusedLoomi hoitakse eraldi puurides. Loomade katseruumi temperatuur küülikutel peaks olema 20 °C (± 3 °C). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi puhastamise ajal, mil see on 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega.1.4.2 Katsemenetlus1.4.2.1 Katseaine manustamineKatseainet tuleks panna väikesele nahapinnale (ligikaudu 6 cm2) ja see kaetakse marlilapiga, mis kinnitatakse nahka mitteärritava teibiga. Kui ainet ei ole võimalik otse peale kanda (nt vedelikud või mõned pastad), kantakse katseaine esmalt marlilapile, mis seejärel asetatakse nahale. Lappi hoitakse õrnalt vastu nahka sobiva, pooltihke sideme abil kogu mõjuaja. Kui katseaine kantakse lapile, tuleks see lapp kinnitada nahale selliselt, et aine puutuks nahaga hästi kokku ja leviks nahal ühtlaselt. Tuleks tõkestada looma ligipääsu lapile ja katseaine allaneelamist või sissehingamist.Vedalaid katseaineid kasutatakse üldiselt lahjendamata kujul. Tehes katseid tahkete ainetega (mida võib vajadusel pulbristada), tuleks katseainet niisutada väikese koguse veega (või vajadusel muu sobiva kandeainega), et tagada hea kokkupuude nahaga. Kui kasutatakse muid kandeaineid kui vesi, on kandeaine võimalik mõju katseaine põhjustatud nahaärritusele minimaalne või olematu.Mõjuaja lõpus, mis kestab tavaliselt neli tundi, allesjäänud katseaine eemaldatakse võimaluse korral vee või sobiva lahustiga, muutmata marrasknaha olemasolevat reaktsiooni või puutumatust.1.4.2.2 AnnusmäärUuritavale pinnale kantakse 0,5 ml vedelat või 0,5 g tahket ainet või pastat.1.4.2.3 Algkatse (ühe loomaga in vivo nahaärrituvus/-söövitavuskatse)On eriti soovitav, et algselt tehtaks in vivo katse ühe loomaga, eriti juhul, kui aine võib tõenäoliselt olla söövitav. See on kooskõlas järjestikuste katsete tegemise strateegiaga (vt lisa 1).Kui osakaalu analüüsi põhjal on tõendatud, et aine on söövitav, ei ole vaja loomadega katseid jätkata. Enamike võimalike söövitavate ainete puhul ei ole tavaliselt täiendava in vivo katse tegemine vajalik. Juhul, kui lisateavet peetakse vajalikuks puudulike tõendite tõttu, võidakse sooritada piiratud loomkatse, kasutades järgmist lähenemist: Loomale pannakse üksteise järel kuni kolm katselappi. Esimene lapp eemaldatakse kolme minuti pärast. Kui ei täheldata tõsist nahareaktsiooni, asetatakse teine lapp ja eemaldatakse tunni aja pärast. Kui vaatlus antud etapil viitab sellele, et mõjutamist võib humaanselt pikendada nelja tunnini, pannakse peale kolmas lapp ja see eemaldatakse nelja tunni pärast, misjärel reaktsiooni hinnatakse.Kui sööbivat mõju vaadeldakse pärast kolme järjestikust mõjutamist, lõpetatakse katse kohe. Kui sööbivat mõju ei vaadelda pärast viimase lapi eemaldamist, jälgitakse looma 14 päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui söövitus ei teki varem.Kui katseaine ei tekita söövitust, kuid võib olla ärritav, asetatakse üks lapp ühele loomale neljaks tunniks.1.4.2.4 Kinnitav katse (in vivo nahaärritust käsitlev katse täiendavate loomadega)Kui söövitavat toimet ei ole algkatses jälgitud, tuleks ärritavat või negatiivset reaktsiooni kinnitada kahe muu looma kasutamise abil neljatunnisel mõjuperioodil. Kui algkatses on jälgitud ärritavat mõju, tuleks seejärel sooritada kinnitav katse või mõjutada kahte muud looma samaaegselt. Erandkorras, kui algkatset ei ole tehtud, võib kahele või kolmele loomale asetada ühe lapi, mis eemaldatakse nelja tunni pärast. Kui kasutatakse kahte looma, ei ole vaja lisakatset teha, kui mõlematel esineb sama reaktsioon. Muul juhul tehakse katse ka kolmanda loomaga. Ebaselgeid reaktsioone on vaja hinnata, tehes katseid muude loomadega.1.4.2.5 JälgimisperioodJälgitakse seni, kuni on võimalik täielikult hinnata vaadeldud mõjude pöörduvust. Katse tuleks lõpetada igal juhul siis, kui loomal on jätkuvalt tugeva valu või stressi tunnused. Mõjude pöörduvuse kindlaksmääramiseks tuleks jälgida loomi kuni 14 päeva pärast lapi eemaldamist. Kui pöörduvus ilmneb enne 14 päeva möödumist, tuleks katse lõpetada sel ajal.1.4.2.6 Kliinilised vaatlused ja naha reaktsioonide hindamineKõikidel loomadel uuritakse nahapunetuse ja turse nähte, reaktsioone hinnatakse 60 minuti pärast, seejärel 24, 48 ja 72 tundi pärast lapi eemaldamist. Ühe loomaga algkatses uuritakse uuritavat pinda samuti vahetult pärast lapi eemaldamist. Nahareaktsioone hinnatakse ja registreeritakse vastavalt allpool tabelis toodud hinnetele. Kui nahal on kahjustus, mida ei suudeta tuvastada ärrituse või söövitusena 72 tunni jooksul, võib vaja minna jälgida kuni 14. päevani, et kindlaks määrata mõjude pöörduvus. Lisaks ärrituse jälgimisele tuleks täielikult kirjeldada ja registreerida kõik paiksed toksilised mõjud nagu naha rasva lahustumine ja mis tahes organismi kahjulikud mõjud (nt mõjud mürgisuse kliinilistele tunnustele ja kehakaalule). Ebaselgete reaktsioonide selgitamiseks tuleks teha histopatoloogiline uurimine.Naha reaktsioonide hindamine on tingimata subjektiivne. Naha reaktsiooni hindamise ühtlustamiseks ning katselaboratooriumide ning jälgivate või tõlgendavate isikute abistamiseks on vaja vaatlusi tegevatel isikutel piisavalt tundma õppida kasutatavat hindamissüsteemi (vt tabel allpool). Illustreeritud juhis nahaärrituse või muude kahjustuste hindamiseks võib olla abiks (9).2. TULEMUSED2.1 TULEMUSTE ESITAMINEUurimuse tulemused esitatakse tabeli kujul lõplikus katsearuandes ja peaks hõlmama kõiki punktis 1.3 nimetatud asju.2.2 TULEMUSTE HINDAMINENahaärrituse määramisi tuleks hinnata vastavalt kahjustuse laadile ja raskusele ning nende pöörduvusele või pöördumatusele. Üksikud määramised ei esinda aine ärritavate omaduste absoluutset taset, kuna samuti hinnatakse katseaine muid mõjusid. Selle asemel tuleks vaadelda kontrollväärtustena üksikuid määramisi, mis vajavad hindamist koos kõikide muude uurimuses tehtud vaatlustega.Nahakahjustuste pöörduvust tuleb võtta arvesse ärritusreaktsioonide hindamisel. Kui sellised reaktsioonid nagu alopeetsia (piiratud pinnal), liigsarvestus, hüperplaasia ja kestendus jätkuvad 14-päevase jälgimisperioodi lõpus, tuleks käsitada katseainet naha ärritajana.3. PROTOKOLL3.1 KATSEPROTOKOLLKatsearuanne peab hõlmama järgmist teavet:Põhjendus in vivo katse tegemiseks: olemasolevate katseandmete, sh järjestikuste katsete tegemise strateegia põhjal saadud tulemuste osakaalu analüüs:- varasematest katsetest saadud asjaomaste andmete kirjeldus,- katsestrateegia igal etapil saadud andmed,- in vitro katsete kirjeldus, sh menetluste üksikasjad, katse-/võrdlusainetest saadud tulemused,- osakaalu analüüs in vivo uurimuse sooritamiseks.Katseaine:- tunnusandmed (nt CASi number; algupära; puhtus; tuntud lisandid; partii number),- füüsikaline laad ja füüsikalis-keemilised omadused (nt pH, lenduvus, lahustuvus, stabiilsus),- kui tegu on seguga, selle koostis ja koostisosade suhtelised protsendimäärad.Kandeaine:- nimetus, kontsentratsioon (vajaduse korral), kasutatud kogus,- kandeaine valiku põhjendamine.Katseloomad:- kasutatud liigid/liin, põhjendus muude loomade kui albiinoküülikute kasutamiseks,- igast soost loomade arv,- üksikute loomade kaalud katse alguses ja lõpus,- vanus katse alguses,- päritolu, elamistingimused, toitumine jne.Katsetingimused:- lapi asetuskoha ettevalmistamine,- üksikandmed lapi materjali kohta ning asetustehnika,- katseaine ettevalmistust, pealekandmist ja eemaldamist käsitlevad üksikasjad.Tulemused:- iga looma ärritus-/söövitusreaktsioonide määramised igal mõõtmiskorral tabeli kujul,- kõikide täheldatud kahjustuste kirjeldused,- täheldatud ärrituse või söövituse laadi ja astme jutustav kirjeldus ja võimalikud histopatoloogilised leiud,- muude kahjulike paiksete (nt naha rasva lahustumine) ning nahaärritusele ja -söövitusele lisaks kogu organismile suunatud mõjude kirjeldus.Tulemuste arutelu.4. VIITED(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429.(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19–26.(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709–720.(4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, "Skin Irritation", European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels.(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524.(5a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm).(7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ ehs/Class/HCL6.htm).(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/ monos.htm).(9) EPA (1990). Adas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Saadaval taotluse korral OECD sekretariaadist].TABEL 1: NAHA REAKTSIOONIDE MÄÄRAMINENahapunetuse ja kooriku tekkimineNahapunetust ei esine … | 0 |Väga kerge nahapunetus (vaevumärgatav) … | 1 |Selgesti nähtav nahapunetus … | 2 |Mõõdukas kuni tõsine nahapunetus … | 3 |Tõsine nahapunetus (tugev punetus) – kooriku tekkimine, mis takistab nahapunetusele punktide andmist … | 4 |Suurim võimalik punktide arv: 4 |Turse tekkimineTurset ei esine … | 0 |Väga kerge turse (vaevumärgatav) … | 1 |Kerge turse (nahapinna servad on kindlalt üleval) … | 2 |Mõõdukas turse (ligikaudu 1 mm üleval) … | 3 |Tugev turse (enam kui 1 mm üleval ja levinud ainega mõjutatud alast kaugemale) … | 4 |Suurim võimalik punktide arv: 4 |Ebaselgete reaktsioonide selgitamiseks tuleks teha histopatoloogiline uuring.--------------------------------------------------LISA 2EΒ. 5. AGE MURGISUS: SILMADE ÄRRITUS/SÖÖVITUS1. MEETODKäesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 405-ga (2002).1.1 SISSEJUHATUSKäesoleva ajakohastatud meetodi ettevalmistamisel pööratakse erilist tähelepanu võimalikele parandustele seoses loomade heaoluga ja kogu olemasoleva katseainet käsitleva teabe hindamisele, et vältida mittevajalikke katseid laboriloomadega. Käesoleva meetodi hulka kuulub soovitus, et enne kirjeldatud, silmade ägedat söövitust ja ärritust uuriva in vivo katse tegemist analüüsitaks olemasolevate asjaomaste andmete osakaalu (1). Kui saadaolevad andmed on puudulikud, saab neid täiendada järjestikuste katsete tegemise abil (2)(3). Katsete tegemise strateegia, mis on esitatud käesoleva meetodi lisas, hõlmab valideeritud ja heakskiidetud in vitro katsete sooritamist. Lisaks sellele on soovitav enne in vivo silmade katse tegemist teha silmade söövituse ennustamiseks in vivo nahaärrituse ja -söövituse katse.Nii mõistlike teaduslike meetodite kui ka loomade heaolu huvides ei tehta in vivo katseid enne, kui on hinnatud kogu kättesaadava, katseaine võimalikku silmade söövitamist/ärritamist käsitleva teabe osakaalu. Sellisteks andmeteks on tõendid varasematest inimeste ja/või laboriloomadega tehtud uuringutest, tõendid ühe või mitme struktuuriliselt samalaadse aine või selliste ainete segude põhjustatud söövituse ja ärrituse kohta, aine tugevale happesusele või leelisusele viitavad andmed (4)(5) ning valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo silmade söövitust ja ärritust uurivate katsete tulemused (6)(6a). Katsed võib teha enne osakaalu analüüsi või selle tulemusena.Teatavate ainete puhul võib selline analüüs viidata vajadusele teha in vivo katseid aine võimaliku silmade söövitavuse ja ärrituvuse väljaselgitamiseks. Kõikidel sellistel juhtudel on soovitav esmalt enne in vivo silmade katse tegemist teha katse in vivo aine nahakaudsete mõjude väljaselgitamiseks ja hinnata tulemusi vastavalt katsemeetodile B.4 (7). Osakaalu analüüsi tegemine ja järjestikuste katsete tegemise strateegia vähendaksid vajadust in vivo aine võimalikku silmade söövitavust/ärritavust uuriva katse tegemise järele, mille kohta on muudest katsetest saadud juba piisavalt tõendeid. Kui silmade söövitavust või ärritavust ei suudeta kindlaks määrata järjestikuste katsete tegemise strateegiat kasutades, isegi pärast in vivo nahasöövitust ja -ärritust uuriva katse tegemist, võib teha in vivo silmade söövitust/ärritust uuriva katse.Eelistatud järjestikuste katsete tegemise strateegia, mis hõlmab valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete sooritamist söövitavuse ja ärritavuse kohta, on esitatud käesoleva meetodi lisas. Strateegia töötati välja OECD seminaril (8), millest osavõtjad seda ühehäälselt soovitasid, ja see kiideti heaks soovitusliku katsete tegemise strateegiana keemiliste ainete klassifitseerimist käsitlevas globaalselt ühtlustatud süsteemis (GHS) (9). Soovitatakse, et nimetatud katsestrateegiat kasutataks enne in vivo katsete tegemist. Uute ainete katsetamisel on soovitav etapiviisiline katsete tegemine teaduslikult usaldatavate andmete tootmiseks aine söövitavuse ja ärritatavuse kohta. Olemasolevate ainete puhul, mille naha ja silmade söövitavuse ja -ärritavuse kohta ei ole piisavalt andmeid, tuleks strateegiat kasutada puuduvate andmete hankimiseks. Kui otsustatakse kasutada muud katsete tegemise strateegiat või menetlust või mitte kasutada etapiviisilist katsete tegemist, siis tuleks seda otsust põhjendada.1.2 MÕISTEDSilmade ärritus – selliste muutuste tekkimine silmas pärast seda, kui katseainet on manustatud silma eespinnale, mis täielikult pöörduvad 21 päeva jooksul pärast manustamist.Silmade söövitus – koekahjustuse tekkimine silmas või tugev füüsiline nägemislangus pärast seda, kui katseainet on manustatud silma eespinnale, mis on täielikult pöördumatud 21 päeva jooksul pärast aine manustamist.1.3 KATSEMEETODI PÕHIMÕTEUuritavat ainet manustatakse ühekordse annusena katselooma ühte silma, katselooma töötlemata silm toimib kontrollina. Silmade ärrituse/söövituse astet hinnatakse sidekesta, sarvkesta ja vikerkesta kahjustustele punkte andes teatavate intervallide tagant. Muid mõjusid silmas ja kahjulikke süsteemseid mõjusid kirjeldatakse samuti selleks, et hinnata täielikult mõjusid. Katse kestab niikaua, et vaadeldud mõjude pöörduvust või pöördumatust saaks hinnata.Loomade, kellel on jätkuvalt tugeva stressi ja/või valu tunnused igal katseetapil, tuleks humaanselt tappa ja seda võetakse aine hindamisel arvesse. Suremas olevate ja tugevalt kannatavate loomade humaanse tapmise kriteeriumid on toodud viites (10).1.4 KATSEMEETODI KIRJELDUS1.4.1 In vivokatse ettevalmistamine1.4.1 Loomaliikide valikEelistatud laboriloom on albiinoküülik, kasutatakse terveid noori täiskasvanud küülikuid. Muude liikide või liinide kasutamist tuleks põhjendada.1.4.1.2 Loomade ettevalmistamineKummagi katsesse valitud looma mõlemat silma uuritakse 24 tunni jooksul enne katse algust. Tuleks kasutada loomi, kellel esineb silmade ärritust, silmadefekte või varasemaid sarvkestakahjustusi.1.4.1.3 Loomade pidamise ja toitmise tingimusedLoomi hoitakse eraldi puurides. Loomade katseruumi temperatuur küülikutel peaks olema 20 °C (± 3 °C). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi puhastamise ajal, mil see on 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust.. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega.1.4.2 Katsemenetlus1.4.2.1 Katseaine manustamineKatseainet manustatakse iga looma ühe silma sidekestakotti, tõmmates alumist laugu õrnalt silmamunast eemale. Seejärel pigistatakse laud umbes üheks sekundiks õrnalt kinni, et vältida aine silmast väljavalgumist. Teine silm, mida ei töödelda, toimib kontrollina.1.4.2.2 LoputamineKatseloomade silmi ei tohiks pesta vähemalt 24 tundi pärast katseaine manustamist, välja arvatud tahked ained (vt punkt 1.4.2.3.2) ja koheste sööbivate või ärritavate mõjude korral. 24 tunni pärast võib loputada, kui seda peetakse vajalikuks.Pesemise mõju selgitamiseks ei soovitata kasutada loomade kontrollrühma, välja arvatud juhul, kui see on teaduslikult põhjendatud. Kui on vaja kontrollrühma, kasutatakse kahte küülikut. Pesemise tingimused tuleks hoolikalt dokumenteerida, nt pesemisaeg, pesemislahuse koostis ja temperatuur, pesemise kestus, vedeliku kogus ja voolukiirus.1.4.2.3 Annusmäär1.4.2.3.1 Vedelike uurimineVedelike uurimiseks kasutatakse 0,1 ml annust. Pumppihustist ei tohi ainet otse silma manustada. Vedelikujuga tuleks väljutada ja koguda mahutisse enne 0,1 ml silma manustamist.1.4.2.3.2 Tahkete ainete uurimineTahkete ainete, pastade ja osakeste uurimisel peaks kasutatav kogus olema 0,1 ml või kaaluga kuni 100 mg. Katseaine tuleks jahvatada peeneks tolmuks. Tahke aine kogust tuleks mõõta pärast selle õrnalt tihendamist, nt raputades mõõtemahutit. Kui tahket katseainet ei ole katselooma silmast eemaldatud füsioloogiliste mehhanismide abil esimese vaatluse ajal üks tund pärast käsitlemist, loputatakse silma füsioloogilise soolalahusega või destilleeritud veega.1.4.2.3.3 Aerosoolide uurimineSoovitatakse, et kogutakse kõik pumbatavad joad ja aerosoolid enne silma manustamist. Üheks erandiks on survestatud aerosoolmahutites ained, mida ei saa koguda aurustumise tõttu. Sellistel juhtudel tuleks silm hoida lahti ja katseaine panna silma ligikaudu üks sekund kestva lihtsa purskega 10 cm kauguselt otse silma ees. Nimetatud vahemaa võib muutuda sõltuvalt pihusti survest ja sisaldusest. Tuleks olla ettevaatlik, et pihusti surve ei teeks silmale liiga. Mõnel juhul võib osutuda vajalikuks hinnata pihusti tugevusest silmale põhjustatud võimalikke "mehaanilisi" kahjustusi.Aerosooliannuse suurust võib hinnata katset järgmiselt simuleerides: ainet pihustatakse kaalupaberile otse paberi ees oleva küüliku silma suuruses avausest. Paberi kaalu suurenemise abil hinnatakse silma pihustatud kogust. Lenduvate ainete puhul võib hinnata annust kogumismahuti kaalumise teel enne ja pärast katseaine eemaldamist.1.4.2.4 Algkatse (ühe loomaga in vivo nahaärrituvus-söövitavuskatse)Järjestikuste katsete tegemise strateegia kohaselt (vt lisa 1) on väga soovitav, et in vivo katse sooritataks algselt ühe loomaga.Kui nimetatud katse tulemused tõendavad, et aine on kirjeldatud menetlust kasutades silma söövitav või tugevalt ärritav, ei ole silma ärritavuse kindlakstegemiseks vaja teha täiendavaid katseid.1.4.2.5 LokaalanesteetikumidLokaalanesteetikume võib kasutada igal üksikjuhul. Kui osakaalu analüüs viitab sellele, et aine võib põhjustada valu, või kui algkatsega tõendatakse, et võib toimuda valulik reaktsioon, võib lokaalanesteetikume kasutada enne katseaine manustamist. Lokaalanesteetikumi liik, kontsentratsioon ja annus tuleks valida hoolikalt, et erinevused katseainele reageerides ei tuleneks selle kasutamisest. Kontrollsilma tuleb samamoodi tuimestada.1.4.2.6 Kinnitav katse (in vivo silmade ärritust käsitlev katse täiendavate loomadega)Kui söövitavat toimet ei ole algkatses täheldatud, tuleks ärritavat või negatiivset reaktsiooni kinnitada kahe muu looma kasutamise abil. Kui algkatses täheldatakse tugevat ärritavat mõju, mis viitab võimalikule tugevale (pöördumatule) mõjule kinnitava katse tegemisel, on soovitav, et kinnitav katse tehtaks järjestikuselt ühe loomaga korraga, mitte kahte lisalooma üheaegselt mõjutades. Kui teisel loomal esineb söövitavaid või tugevalt ärritavaid mõjusid, siis katset enam ei jätkata. Lisaloomasid võib vaja minna nõrkade või mõõdukate ärritavate reaktsioonide kinnitamiseks.1.4.2.7 JälgimisperioodJälgitakse seni, kuni on võimalik täielikult hinnata vaadeldud mõjude ulatust ja pöörduvust. Katse tuleks lõpetada igal juhul siis, kui loomal on jätkuvalt tugeva valu või stressi tunnused (9). Mõjude pöörduvuse kindlaksmääramiseks tuleks jälgida loomi tavaliselt 21 päeva pärast katseaine manustamist. Kui pöörduvus ilmneb enne 21 päeva möödumist, tuleks katse lõpetada sel ajal.1.4.2.7.1 Kliinilised vaatlused ja silma reaktsioonide hindamineSilmi tuleks jälgida 1, 24, 48 ja 72 tundi pärast katseaine manustamist. Loomi ei uurita pärast seda, kui on saadud lõplikud andmed. Loomad, kellel jätkuvalt esineb tugevat valu või stressi, tuleks viivitamata humaanselt tappa, ning ainet tuleks hinnata vastavalt sellele. Humaanselt tuleks tappa loomad, kellel aine manustamise järel esineb järgmisi silmakahjustusi: sarvkesta perforatsioon või märgatav sarvkesta haavand, kaasa arvatud silmasopislaiend; veri silma eeskambris; hinde 4 sarvkesta läbipaistmatus, mis püsib 48 tunni jooksul; valgusrefleksi puudumine (vikerkesta reaktsioon – hinne 2), mis püsib 72 tunni jooksul; sidekesta haavand; sidekesta või niktatsioonikesta nekroos või armistumine. Seda seetõttu, et sellised kahjustused üldiselt on pöördumatud.Loomad, kellel ei esine silmakahjustusi, võib tappa mitte varem kui kolm päeva pärast manustamist.Loomi, kellel esinevad kerged või mõõdukad kahjustused, tuleks jälgida seni, kuni kahjustused on selged, või 21 päeva, mil katse lõpetati. Jälgitakse 7, 14 ja 21 päeva, et kindlaks määrata kahjustuse seisund ning nende pöörduvus või pöördamatus.Silmade reaktsiooni (sidekest, sarvkest ja vikerkest) hinded tuleks registreerida iga kord, kui looma uuritakse (tabel 1). Kõikidest muudest silmakahjustustest (nt silma sarvkestakiht, värvumine) või kahjulikest süsteemsetest mõjudest tuleks samuti teada anda.Reaktsioonide uurimist võib hõlbustada binokulaarluubi, pilulambi, biomikroskoobi või muu sobiva seadme kasutamine. Pärast vaatluste registreerimist 24 tunni jooksul võib silmi edasi uurida fluorestseiini abil.Silma reaktsioonide hindamine on tingimata subjektiivne. Silma reaktsiooni hindamise ühtlustamiseks ning katselaboratooriumide ning jälgivate või tõlgendavate isikute abistamiseks on vaja vaatlusi tegevatel isikutel piisavalt tundma õppida kasutatavat hindamissüsteemi (vt tabel allpool).2. TULEMUSED2.2 TULEMUSTE HINDAMINESilmaärrituse punkte tuleks hinnata vastavalt kahjustuse laadile ja raskusele ning nende pöörduvusele või pöördumatusele. Üksikud määramised ei esinda aine ärritavate omaduste absoluutset taset, kuna samuti hinnatakse katseaine muid mõjusid. Selle asemel tuleks käsitleda üksikuid punkte kontrollväärtustena ja need on tähendusrikkad üksnes siis, kui neid on täielikult kirjeldatud ja kõiki vaatlusi on hinnatud.3. PROTOKOLL3.1 KATSEPROTOKOLLKatsearuanne peab hõlmama järgmist teavet:Põhjendus in vivo katse tegemiseks: varasemate katseandmete, sh järjestikuste katsete tegemise strateegia põhjal saadud tulemuste osakaalu analüüs:- varasematest katsetest saadud asjaomaste andmete kirjeldus,- katsestrateegia igal etapil saadud andmed,- in vitro testide kirjeldus, sh menetluste üksikasjad, katse-/võrdlusainetest saadud tulemused,- in vivo nahaärritust/-söövitust uuriva katse, sh saadud tulemuste kirjeldus,- osakaalu analüüs in vivo uurimuse sooritamiseks.Katseaine:- tunnusandmed (nt CASi number; algupära; puhtus; tuntud lisandid; partii number),- füüsikaline laad ja füüsikalis-keemilised omadused (nt pH, lenduvus, lahustuvus, stabiilsus, reaktiivsus veega),- kui tegu on seguga, selle koostis ja koostisosade suhtelised protsendimäärad,- kui kasutatakse lokaalanesteetikumi, selle nimetus, puhtus, liik, annus ja võimalik koostoime katseainega.Kandeaine:- nimetus, kontsentratsioon (vajaduse korral), kasutatud kogus,- kandeaine valiku põhjendamine.Katseloomad:- kasutatud liigid/liin, põhjendus muude loomade kui albiinoküülikute kasutamiseks,- iga looma vanus katse alguses,- mõlemast soost loomade arv katse- ja kontrollrühmas (vajaduse korral),- üksikute loomade kaalud katse alguses ja lõpus,- päritolu, elamistingimused, toitumine jne.Tulemused:- igal vaatlusel ärritusele punktide andmisel kasutatava meetodi kirjeldus (nt pilulamp, biomikroskoop, fluorestseiin),- tabeli kujul andmed iga looma ärritavate/söövitavate reaktsioonide kohta igal vaatlusel kuni katselooma kõrvaldamiseni katsest,- jälgitud ärrituse või söövituse astme ja laadi kirjeldus,- muude jälgitud silmakahjustuste kirjeldus (nt vaskularisatsioon, silma sarvkestakihi tekkimine, liited, värvumine),- mujal kui silmas tuvastatud paiksete või süsteemsete kahjulike mõjude ja histopatoloogiliste leidude kirjeldus.Tulemuste arutelu.3.2 TULEMUSTE TÕLGENDAMINEKatseloomadega tehtud silma ärritust uurivate katsete tulemuste ekstrapolatsioon inimestele on kehtiv üksnes piiratud ulatuses. Paljudel juhtudel on albiinoküülikud silmaärritajatele või – söövitavatele ainetele tundlikumad kui inimesed.Tuleks olla ettevaatlik andmete tõlgendamisel, et välistada sekundaarsest nakkusest tingitud ärritust.4. VIITED(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410- 429.(2) de Suva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol .35., 159-164.(3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P, Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 - 26.(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 - 231.(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524.(6a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.(7) Testing method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion.(8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).(9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ ehs/Class/HCL6.htm).(10) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).TABEL 1: SILMAKAHJUSTUSTE HINDAMINESarvkestHägusus: tihedusaste (mõõtmised tuleks teha kõige tihedamas kohas) [1] |Ei esine haavandeid või hägusust … | 0 |Hajutatud või hajusad hägususalad (välja arvatud tavapärase läike kerge tuhmumine); vikerkesta selgelt nähtavad detailid … | 1 |Kergesti märgatav poolläbipaistev ala; vikerkesta kergelt varjatud detailid … | 2 |Pärlmutrine ala; vikerkesta detailid ei ole nähtavad; pupilli suurus on vaevunähtav … | 3 |Läbipaistmatu sarvkest; vikerkest ei eristu läbi hägususe … | 4 |Suurim võimalik punktide arv: 4 |VikerkestTavaline … | 0 |Selgesti süvenenud kurrud, verepais, turse, mõõdukas liigveresus sarvkesta ümber; või injektsioon; vikerkest reageerib valgusele (pikaldast reaktsiooni peetakse katseaine mõjuks) … | 1 |Verejooks, täielikult hävinud vikerkest või ei reageeri valgusele … | 2 |Suurim võimalik punktide arv: 2 |SidekestPunasus (viitab laugude ja silmamuna sidekestale, v.a sarv- ja vikerkest) |Tavaline … | 0 |Mõned hüpereemilised veresooned (injekteeritud) … | 1 |Hajunud sügavpunane värvus; üksikuid veresooni ei ole kerge eristada … | 2 |Hajunud tumepunane … | 3 |Suurim võimalik punktide arv: 3 |SidekestaturseTurse (viitab laugudele ja/või niktatsioonikestale) |Tavaline … | 0 |Mõningane tavapärasest suurem turse … | 1 |Selge turse, laud osaliselt ümberpöördunud … | 2 |Turse, laud poolsuletud … | 3 |Turse, laud rohkem kui poolsuletud … | 4 |Suurim võimalik punktide arv: 4 |[1] Sarvkesta hägususala tuleks mainida.--------------------------------------------------LISA 2FB.31 SÜNNIEELSE ARENGU MÜRGISUSE UURIMUS1. MEETODKäesolev meetod lähtub juhendist (2001).1.1 SISSEJUHATUSKäesolev arenguaegse mürgisuse uurimise meetod on välja töötatud selleks, et pakkuda üldist teavet sünnieelse kokkupuute mõjude kohta tiinetel katseloomadel ja emakas areneval organismil; see võib hõlmata nii emalt pärinevat mõjude kui ka surma, strukturaalsete kõrvalekallete või loote muundunud arengu hindamist. Funktsionaalsed puudujäägid, mis on arengu tähtis osa, ei ole käesoleva testi lahutamatu osa. Neid võib uurida eraldi uurimuses või käesoleva uurimuse täiendusena, kasutades neurotoksilisuse uuringutele suunatud katsemeetodit. Funktsionaalsete puudujääkide ja muude sünnijärgsete mõjude uurimist käsitleva teabe puhul tuleks vajadusel pidada nõu kahe põlvkonna reproduktiivse mürgisuse uuringut ja arengulise neurotoksilisuse uuringut käsitleva katsemeetodi üle.Käesolev katsemeetod võib eeldada konkreetset kohandamist üksikjuhtudel spetsiaalsete, nt katseaine füüsikalis-keemilisi või toksikoloogilisi omadusi puudutavate teadmiste põhjal. Selline kohandamine on aktsepteeritav, kui on olemas veenvad teaduslikud tõendid, et kohandamise tõttu on katse informatiivsem. Sellisel juhul tuleks hoolikalt dokumenteerida uurimisprotokollis nimetatud teaduslikud tõendid.1.2 MÕISTEDArengutoksikoloogia – selliste areneva organismi kahjulike mõjude uuring, mis võivad tuleneda kokkupuutest enne viljastumist, sünnieelse arengu ajal või sünnijärgselt kuni seksuaalse küpsuse eani. Arengutoksikoloogia peamised ilmingud on: 1) organismi surm, 2) strukturaalsed kõrvalekalded, 3) muundunud kasv ja 4) funktsionaalsed puudujäägid. Arengutoksikoloogiale viidati varem sageli kui teratoloogiale.Kahjulik mõju – selline töötlemisega seotud muutus algtasemest, mis vähendab organismi võimet ellu jääda, sigida või kohaneda keskkonnaga. Võttes arvesse arengutoksikoloogiat, oma kõige laiemas tähenduses sisaldab see mis tahes mõju, mis segab viljastamise tulemuse normaalset arengut nii enne kui pärast sündi.Muundunud areng – järglase organi või keha kaalu või suuruse muutumine.Muundumised (anomaaliad) – strukturaalsed muundumised, mis hõlmavad nii väärarenguid kui ka muutusi (28).Väärareng/suur kõrvalekalle – strukturaalne muutus, mida peetakse loomale kahjulikuks (võib olla samuti surmav) ja mida juhtub tavaliselt harva.Muutus/väike kõrvalekalle – strukturaalne muutus, millel on vähe või ei ole üldse kahjulikku mõju loomadele; võib olla ajutine ja võib esineda suhteliselt sagedasti kontrollpopulatsioonis.Viljastumise tulemus (conceptus) – viljastunud munaraku derivaatide summa arengu igal etapil viljastumisest kuni sünnini, kaasa arvatud lootevälised kestad ning embrüo või loode.Implantatsioon (nidatsioon) – lootepõiekese kinnitumine emaka epiteelkoele, kaasa arvatud selle tungimine läbi emakaepiteeli, ning selle kinnitumine emakalimaskestale.Embrüo – organismi varane või arengustaadium, eelkõige munaraku viljastumise tulemus pärast pikitelje ilmumist ja seni, kuni kõik suuremad struktuurid on olemas.Embrüotoksilisus – embrüo tavalist struktuuri, arengut, kasvu ja/või elujõulisust kahjustav.Loode – sündimata järglane embrüojärgsel perioodil.Lootetoksilisus – loote tavalist struktuuri, arengut, kasvu ja/või elujõulisust kahjustav.Abort – viljastumise tulemuse (embrüo või mitteelujõulise loote) enneaegne väljumine emakast.Resorptsioon – viljastumise tulemus (conceptus), kes pärast emakasse istutamist sureb või on või resorbeerub või on resorbeerunud.Varajane resorptsioon – tõendid implantatsiooni kohta ilma äratuntava embrüo/lootetaHiline resorptsioon – surnud embrüo või väliste degeneratiivsete muutustega loodeNOAEL – lühend täheldamata-kahjuliku-mõju taseme kohta ja see on kõrgeim annus- või kokkupuutetase, kus ei ole täheldatud kahjulikke, töötlemisega seotud leide.1.3 VÕRDLUSAINEPuudub.1.4 KATSEMEETODI PÕHIMÕTETavaliselt manustatakse katseainet tiinetele loomadele vähemalt alates implantatsioonist kuni ühe päevani enne ettemääratud tapmist, mis peaks olema niipalju kui võimalik tavalise sünnitustähtaja lähedal, et ei läheks andmed kaduma varase sünnituse tõttu. Katsemeetod ei ole mõeldud vaid uurima organogeneesi perioodi (nt närilistel 5.–15. päev ja küülikutel 6.–18. päev), vaid samuti kogu tiinusperioodi aegseid mõjusid alates enne implantatsiooni ja lõppedes päev enne keisrilõiget. Natuke enne keisrilõiget emasloomad tapetakse, emakasisu uuritakse ning loodetele antakse hinnang väliselt nähtavate anomaaliate kohta ning pehme koe ja skeletimuutuste kohta.1.5 KATSEMEETODI KIRJELDUS1.5.1 Loomaliikide valikOn soovitav, et katse tehtaks kõige sobivamate liikidega ja et kasutataks laboriliike ja -liine, mida tavaliselt kasutatakse sünnieelse arengutoksilisuse uurimiseks. Eelistatud näriliste liik on rott ja eelistatud muude kui näriliste liik on küülik. Tuleks põhjendada seda, kui kasutatakse muid liike.1.5.2 Loomade pidamise ja toitmise tingimusedLoomade katseruumi temperatuur peaks närilistel olema 22 °C (± 3o) ja küülikutel 18 °C (± 3o). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt ei ületa 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal peaks see olema 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega.Paaritumine peab toimuma selleks ettenähtud puurides. Kuna paaritunud loomade puhul eelistatakse eraldi hoidmist, on samuti lubatud väikesearvulistes rühmades hoidmine.1.5.3 Loomade ettevalmistamineTuleks kasutada terveid loomi, kes on harjutatud laboritingimustega vähemalt 5 päeva ja keda ei ole varem katsetes kasutatud. Katseloomade liik, liin, päritolu, sugu, kaal ja/või vanus on äratuntavad. Kõikide katserühmade loomad peaksid niipalju kui võimalik olema ühesuguse kaalu ja vanusega. Noori täiskasvanud ja sünnitamata emasloomi tuleks kasutada iga annusmäära juures. Emasloomad tuleks paaritada sama liigi ja liini isasloomadega ning õdede-vendade paaritamist tuleks vältida. Näriliste puhul on tiinuse 0. päev päev, mil tupekorki ja/või spermat jälgiti; küülikute puhul on 0. päev tavaliselt suguühte või kunstliku viljastamise päev, kui kasutatakse sellist tehnikat. Paaritunud loomad määratakse erapooletult kontroll- või töödeldavatesse rühmadesse. Puurid asetatakse nii, et puuri asetamisest tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Igale loomale tuleks anda ainulaadne tunnusnumber. Paaritunud emasloomad tuleks erapooletult jagada kontroll- või töödeldavatesse rühmadesse ning kui emasloomi paaritatakse partiides, tuleks iga partii loomad jaotada ühtlaselt rühmade vahel. Samamoodi tuleks sama isaslooma poolt viljastatud emasloomad jagada ühtlaselt rühmadesse.1.6 MENETLUS1.6.1 Loomade arv ja suguIgas katse- ja kontrollrühmas peaks olema piisaval hulgal emasloomi, et lahanguks saadakse ligikaudu 20 emaslooma, kellel täheldatakse implantatsiooni. Rühmad, kus on alla 16 sellise looma, ei ole sobivad. Emade suremus ei pruugi tunnistada kehtetuks uurimist, tingimusel et see ei ületa 10 %.1.6.2 Annuste valmistamineKui kandeainet või lisandit kasutatakse manustamise lihtsustamiseks, arvesse tuleks võtta järgmisi omadusi: katseaine absorbtsiooni, jaotamist, metabolismi ja peetumist või eritumist käsitlevad mõjud; katseaine keemilisi omadusi käsitlevad mõjud, mis võivad muuta toksilisi omadusi; ning toidu- või veetarbimist või toitumust käsitlevad mõjud. Kandeaine ei tohiks olla arengust lähtuvalt mürgine ega mõjutada reproduktsiooni.1.6.3 AnnustamineTavaliselt katseainet manustatakse iga päev alates implantatsioonist (nt 5. päev pärast paaritumist) kuni päevani enne kavandatud keisrilõiget. Kui esialgsed uurimused vajadusel ei viita preimplanatatsiooni kaotuse kõrgele riskile, võib ravi pikendada kuni kogu tiinusperioodini paaritumiste ja ettekavandatud tapmiseni. On hästi teada, et ebasobiv käsitamine või tiinusaegne stress võivad viia loote kaotuseni. Et vältida lootekaotust muude kui katsega seotud tegurite poolt, tiinete loomade tarbetu käsitamine ning stress välistest teguritest nagu näiteks müra, tuleks vältida.Tuleks kasutada vähemalt kolme annusmäära ja teha samaaegselt kontrolli. Paaritunud loomad jagatakse erapooletult kontroll- või töödeldavatesse rühmadesse. Annusmäärade vahemikud määratakse nii, et saaks hinnata toksilisi mõjusid. Kui katseaine füüsikalis-keemiline laad või bioloogilised omadused ei sea piiranguid, valitakse kõrgeim annus eesmärgiga põhjustada mõningat arengu- ja/või emale suunatud mürgisust (kliinilised nähud või kehakaalu vähenemine), kuid mitte surma või tõsiseid kannatusi. Vähemalt üks vahepealne annusmäär tekitab minimaalseid täheldatavaid toksilisi mõjusid. Väikseima annusmäära puhul ei tohiks emale suunatud või arengutoksilisust ilmneda. Tuleks valida annusmäärade alanev järjestus, et näidata annusega seotud reaktsiooni ja mittetäheldatud kahjuliku mõju taset (NOAEL): Kahe- või neljakordsed vahemikud on sageli optimaalsed alanevate annusmäärade kehtestamisel ja sageli on eelistatav neljanda katserühma lisamine väga suurte vahemike (nt üle 10-kordne tegur) annuste vahel. Kuigi eesmärgiks on määrata ema täheldamata kahjulikud mõjud, kiideti samuti heaks uuringud, kus sellist vahemikku ei kasuta. (1)Annusmäärad tuleks valida, võttes arvesse olemasolevaid andmeid mürgisuse kohta ning ka lisateavet katseaine või samalaadse aine metabolismi ja toksikokineetika kohta. Käesolev teave aitab samuti viidata sellele, et annustamisrežiim on adekvaatne.Tuleks kasutada samaaegset kontrollrühma. Nimetatud rühmaks on võltskontrollrühm (platseebot saav kontrollrühm) või kandeainet saav kontrollrühm, kui kandeainet kasutatakse katseaine manustamisel. Kõikidele rühmadele tuleks manustada sama kogus kas katseainet või kandeainet. Kontrollrühma(de) loomi tuleks käsitada sarnsaelt katserühma loomadele. Kandeainet saavatele kontrollrühmadele tuleks anda suurim kogus kasutatud kandeaineid (madalaim katserühm):1.6.4 PiirkatseKui suukaudne annusmäär on vähemalt 1000 mg kg kehakaalu kohta päevas, kasutades käesolevas uurimuses kirjeldatud menetlusi, täheldatavat mürgisust põhjustamata, kas tiinetel loomadel ja/või nende järglastel ning kui mõju eeldatavasti ei põhine olemasolevatel andmetel (nt struktuuriliselt ja/või metaboolselt samalaadsed ühendid), siis ei peeta vajalikuks kolme annusmäära kasutavat täielikku uurimust. Inimeste ootuspärane vastuvõtlikkus võib viidata piirkatses kasutavatest annustest suuremate suukaudsete annuste kasutamise vajadusele. Muude manustamisviiside puhul nagu, näiteks, sissehingamine või nahakaudne kasutamine, võivad katseaine füüsikalis-keemilised omadused tihti viidata ja piirata suurimat saavutatava kokkupuutumise ulatusega (nt nahakaudne kasutamine ei põhjusta rasket paikset mürgisust).1.6.5 Annuste manustamineKatseainet või kandeained manustatakse tavaliselt suu kaudu intubeerimise teel. Kui kasutatakse muud manustamisviisi, peaks katse tegija põhjendama selle valikut ja asjakohased muutused võivad olla vajalikud (2)(3)(4). Katseainet tuleks manustada ligikaudu samal ajal iga päev.Üksikute loomade annus peab tavaliselt põhinema kõige viimasel ühe looma kehakaalu kindlaksmääramisel. Annuse määramisel tuleks siiski olla ettevaatlik tiinuse viimasel trimestril. Varasemaid andmeid tuleks kasutada annuse valimisel, et vältida liigset emale suunatud mürgisust. Kui liigset mürgisust on täheldatud käsitletud emasloomadel, tuleks need loomad humaanselt tappa. Kui mitmetel tiinetel loomadel on liigse mürgisuse nähud, tuleks kaaluda nimetatud annusrühma lõpetamist. Kui aineid manustatakse sundsöötmise teel, peaks see olema eelistatult ühekordne annus loomadele söögitoru kaudu või sobiva intubeerimise kanüüli abil. Vedeliku suurim kogus, mida saab ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Maht ei tohiks ületada 1 ml 100 g kehakaalu kohta, välja arvatud vesilahuste puhul, kui võib kasutada mahtu 2 ml 100 g kehakaalu kohta. Kui kandeainena kasutatakse maisiõli, ei tohiks selle maht ületada 0,4 ml 100 g kehakaalu kohta. Katsekoguse muutlikkust tuleks vähendada, kohandades kontsentratsioone konstantse koguse tagamiseks kõikidel annusmääradel.1.6.6 Emasloomade jälgimineKliinilised vaatlused tuleks teha ja registreerida vähemalt üks kord päevas, soovitavalt sama ajal iga päev, võttes arvesse pärast annustamist oodatavate mõjude kõrgperioodi. Loomade seisund tuleks registreerida, kaasa arvatud suremus, haigestumus, asjassepuutuvad käitumismuutused ning kõik selge mürgisuse nähud.1.6.7 Kehakaal ja toidu tarbimineLoomi tuleks kaaluda tiinuse 0. päeval ja mitte hiljem kui tiinuse 3. päeval, kui kasutatakse välise aretaja tarnitud aegpaaritunud loomi, annustamise esimesel päeval, vähemalt iga kolme päeva tagant annustamisperioodil ja ettemääratud tapmise päeval.Toidu tarbimist tuleks registreerida kolmepäevaste ajavahemike tagant ja see peaks kokku langema kehakaalu kindlaksmääramisega.1.6.8 Tapajärgne uurimineEmasloomad tuleks tappa päev enne oodatavat sünnitustähtpäeva. Emasloomad, kellel ilmnevad abordi või enneaegse sünnituse nähud enne ettemääratud tapmiskuupäeva, tuleks tappa ja neile tehakse põhjalik makroskoopiline uuring.Lõpetamise ajal või uurimuse käigus asetleidnud surma korral tuleks uurida emaslooma makroskoopiliselt igasuguste strukturaalsete kõrvalekallete või patoloogiliste muutuste osas. Emasloomade hindamine keisrilõike ajal ja sellele järgnevad looteanalüüsid tuleks teha soovitavalt teadmata, millisesse rühma emasloom kuulub, et vähendada süstemaatilist viga.1.6.9 Emakasisu uurimineVahetult pärast lõpetamist või nii kiiresti kui võimalik pärast surma tuleks emakas eemaldada ja kinnitada loomade tiinust. Emakat, mis ei ole tiine, tuleks edasi uurida (nt näriliste puhul ammooniumsulfiidiga värvimisega ja Salewski värvimisega või muu sobiva meetodiga küülikute puhul), et kinnitada tiinuse puudumist (5).Tiine emakas, kaasa arvatud emakakael, tuleks ära kaaluda. Tiine emaka kaalu ei tohiks saada loomadelt, kes surid katse käigus.Kollakehade arv tuleks kindlaks määrata tiinete loomade puhul.Emakasisu tuleks uurida mitmete embrüo- või lootesurmade suhtes ja elujõuliste loodete suhtes. Resorptsiooni ulatust tuleks kirjeldada, et hinnata conceptus’e surma suhtelist aega (vt punkt 1.2).1.6.10 Loodete uurimineIga loote sugu ja kehakaal tuleks kindlaks määrata.Iga loodet uuritakse väliste muundumiste suhtes (6).Looteid uuritakse skeleti- ja pehmekoe muundamiste osas (nt muutused ja väärarengud või anomaaliad) (7) (8) (9) (10) (11) (12 ) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24). Loote muunduste liigitamine on soovitav, kuid mitte nõutav. Kui liigitamine on tehtud, tuleks selgesti sõnastada iga kategooria kindlaks määramise kriteeriumid. Erilist tähelepanu tuleks pöörata reproduktiivorganile, mida tuleks uurida muundunud arengu tunnuste suhtes.Närilistel ligikaudu pool pesakonnast valmistataks ette skeletimuundumiste uurimiseks. Ülejäänud pesakond valmistatakse ette pehmekoe muundumiste uurimiseks, kasutades heakskiidetud või sobivat mikrotoommenetlust või hoolsat dissekteerimistehnikat.Muude kui näriliste puhul, nt küülikud, tuleks uurida kõiki looteid nii pehmekoe- kui ka skeletimuutuste suhtes. Nende loodete kehasid hinnatakse hoolsa dissekteerimise abil pehmekoemuutuste osas, mis võivad hõlmata jätkumenetlusi südame sisestruktuuri (25) hindamiseks. Pooltel, selliselt uuritud loodetel eemaldatakse pead, mille pehmekoemuutusi (sh silmad, aju, ninaõõned ja keel) uuritakse tavalise mikrotoommenetluse abil (26) või võrdselt tundliku meetodi abil. Nende loodete kehad ja ülejäänud looted, keda ei ole uuritud, prepareeritakse skeletimuutuste uurimise tarbeks, kasutades samu meetodeid nagu näriliste puhul.2. TULEMUSED2.1 TULEMUSTE TÖÖTLEMINEAndmed edastatakse iga emaslooma ja nende järglase kohta tabeli kujul, näidates iga katserühma ja põlvkonna kohta loomade arvu katse alguses, katse käigus surnud või humaansetel kaalutlustel tapetud loomade arvu, surma ja humaanse tapmise ajad, tiinete emasloomade arvu, mürgisuse nähtudega loomade aru, mürgisuse nähtude kirjelduse, sh toksiliste mõjude algusaja, kestuse ja raskuse, embrüot/loodet käsitlevate vaatluste liigid ja kogu asjaomane teave pesakonna kohta.Numbrilisi tulemusi hinnatakse asjaomase statistilise meetodi abil, kasutades andmeanalüüsi üksusena pesakonda. Kasutatakse üldiselt heakskiidetud statistilist meetodit; statistilised meetodid tuleks valida uurimuse kavandamisel ja neid tuleks põhjendada. Andmed loomadest, kes ei ela ettemääratud tapmiseni, tuleks samuti edastada. Nimetatud andmed võivad sisalduda rühmakeskmiste hulgas vajaduse korral. Sellistelt loomadelt saadud andmete olulisus ja seetõttu nende sisaldumist rühmakeskmis(t)e hulgas või sealt väljajätmist tuleks põhjendada ja hinnata ükshaaval.2.2 TULEMUSTE HINDAMINESünnieelse arengutoksilisust käsitleva uurimuse avastusi hinnatakse vaadeldud mõjude tähenduses. Hindamine peab hõlmama järgmist teavet:- ema ja embrüot/loodet uuriva katse tulemused, sh loomade katseainega kokkupuute ning kõikide avastuste esinemise ja raskuse vahelise seose või selle puudumise hindamine,- loote väliste muutuste, pehmekoe- ja skeletimuutuste liigitamisel kasutatavad kriteeriumid, kui liigitamist on kasutatud,- vajadusel ajaloolised kontrollandmed katsetulemuste tõlgendamise tõhustamiseks,- kõikide protsendimäärade või indeksite arvutamisel kasutatud arvud,- vajadusel katseavastuste piisav statistiline analüüs, mis peaks sisaldama piisavalt teavet analüüsimeetodi kohta, nii et sõltumatu arvustaja/statistik saaks uuesti hinnata ja rekonstrueerida analüüsi.Igas katses, mis tõendab toksiliste mõjude puudumist, tuleks kaaluda jätkuuurimisi katseaine absorbtsiooni ja biosaadavuse kindlaksmääramiseks.2.3 TULEMUSTE TÕLGENDAMINESünnieelset arengutoksilisust käsitlev katse annab teavet emasloomade korduva ainega kokkupuute kohta tiinuse ajal ja nende järglase üsasisese arengu kohta. Katse tulemusi tõlgendatakse koostoimes subkroonilisel, reproduktsiooni, toksikokineetilisel ja muudel katsetel saadud avastustega. Kuna rõhutatakse nii üldist mürgisust emale mõjuva mürgisuse tähenduses kui ka arengutoksilisuse lõpp-punkte, võimaldavad katsetulemused mingis teatud ulatuses vahetegemist üldise toksilisuse puudumisel asetleidvate arengumõjude ja nende arengumõjude vahel, mis on tekkinud tasemetel, mis on samuti emasloomale (27) mürgised.3. PROTOKOLL3.1 KATSEPROTOKOLLKatseprotokoll peab hõlmama järgmist teavet:Katseaine:- füüsiline laad ja vajadusel füüsikalis-keemilised omadused,- tunnusandmed, kaasa arvatud CASi number, kui see on teada/kasutusel,- puhtus.Kandeaine (vajadusel):- kandeaine valiku põhjendus, kui see on muu kui vesi.Katseloomad:- kasutatud liigid ja liinid,- loomade arv ja vanus,- päritolu, elamistingimused, toitumine jne,- iga looma kaal katse alguses.Katsetingimused:- annuste valiku põhjendus,- katseaine valmistamise/toiduvalmistise üksikandmed, saavutatud kontsentratsioon, valmistise stabiilsus ja homogeensus,- katseaine manustamise üksikasjad,- toidu/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni (ppm) muutmine tegelikuks annuseks (mg/kg kehakaalu kohta päevas) vajaduse korral,- keskkonnatingimused,- üksikasjad toidu- ja veekvaliteedi kohta.Tulemused:Andmed emaslooma mürgisele annusele reaktsioonide kohta, sealhulgas, kuid mitte ainult:- loomade arv katse alguses, ellujäänud loomade arv, tiinete loomade arv ja katkenud tiinusega loomade arv, enneaegselt sünnitanud loomade arv,- surmapäev katse ajal või andmed loomade ellujäämise kohta kuni lõpetamiseni,- andmed loomade kohta, kes ei elanud kuni ettemääratud tapmiseni, edastatakse, kuid ei sisaldu rühmadevahelistes statistilistes võrdlustes,- iga ebatavalise kliinilise tunnuse jälgimise päev ja selle edasiarenemine,- kehakaal, kehakaalu muutus ja tiine emaka kaal, sh valikuliselt kehakaalu muutus, mida on korrigeeritud tiine emaka kaalu võrra,- toidu tarbimine ja, kui seda on mõõdetud, vee tarbimine,- lahangu leiud, sh emaka kaal,- edastatakse NOAEL-väärtused ema ja areneva loote kohta.Arenguga seotud lõpp-punktid annuse järgi pesakonna kohta, kellel on implantaadid, kaasa arvatud:- kollakehade arv,- implantatsioonide arv, elus ja surnud loodete ning resorptsioonide arv ja protsent,- implantatasioonieelsete või -järgsete tiinuste katkemise arv ja protsent.Arenguga seotud lõpp-punktid annuse järgi pesakonna kohta, kus on elus looted, kaasa arvatud:- elus järglaste arv ja protsent,- sooline jagunemine,- loote kehakaal, soovitavalt soo järgi ja kombineeritud mõlema sooga,- väliste, pehmekoe- ja skeletiväärarengud ning muud asjaomased muutused,- liigitamise kriteeriumid vajadusel,- loodete ja selliste pesakondade koguarv ja protsent, kellel on välised, pehmekoe- või skeletimuutused ning individuaalsete anomaaliate ja muude asjaomaste muutuste liigid ja esinemine.Tulemuste arutelu.Järeldused.4. VIITED(1) Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for Developmental Toxicity. Risk Analysis 16; 399-410.(2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies. Fundamental and Applied Toxicology 14; 386-398.(3) Wong, B.A., et al. (1997) Developing Specialized Inhalation Exposure Systems to Address Toxicological Problems. CIIT Activities 17; 1-8.(4) US Environmental Protection Agency (1985) Subpart Ε-Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation Developmental Toxicity Study.(5) Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte. Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experimentelle Pathologic 247:367.(6) Edwards, J.A. (1968) The external Development of the Rabbit and Rat Embryo. In Advances in Teratology. D.H.M. Woolam (ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.(7) Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S. Congenital Anomalies 16; 171-173.(8) Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial Skeletal Variations Detected by the Double Staining Techniquefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses. Congenital Anomalies 32;:381-391.(9) Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following Heat Exposure in the Rat. Teratology 47:229-242.(10) Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats. Teratology 37; 476.(11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Foetuses. Journal of Morphology 127:291-306.(12) Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative of Foetal Maturity. Teratology 11; 313-320.(13) Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity Studies. Toxicology and Applied Pharmacology 9; :398-408.(14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in Rats: Malformations or Variations? Teratology 8; 309-316.(15) Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD (Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to Ethylene Glycol. Teratology 46; 169-181.(16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and Histological Study of Viscera. Supplement to Teratology Workshop Manual, pp. 163-173.(17) Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Possible Influence of the Sex Factor. American Journal of Anatomy 41; 411-445.(18) Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for Fetal Bone. Stain Technology 39; 61-63.(19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton. American Journal of Anatomy 36; 313-355.(20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Examination of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Testing. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis 4; 181-188.(21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957) The Genesis of the Rat Skeleton. Thomas, Springfield, IL.(22) Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Teratology. In Teratology: Principles and Techniques, Wilson J.G. and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, pp 251-277.(23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977) Handbook of Teratology, Vol. 4. Plenum, NY.(24) Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Techniques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity. Acta Vet. Acad. Sci. Hung. 28; 233-239.(25) Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in Mammalian Foetuses. Teratology 9; 37-38.(26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In: Methods in Prenatal Toxicology Neubert, D., Merker, H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of Chicago, Chicago, IL, pp. 126-144.(27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for Developmental Toxicity Risk Assessment. Federal Register 56; 63798-63826.(28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental Abnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) Teratology 55; 249-292.--------------------------------------------------LISA 2GB.35 KAHE PÕLVKONNA REPRODUKTSIOONI TOKSILISUSE UURING1. MEETODKäesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 416 (2001).1.1 SISSEJUHATUSKäesolev kahe põlvkonna reproduktsiooni uurimise meetod on välja töötatud selleks, et pakkuda üldist teavet katseaine mõjude kohta isas- ja emasloomade reproduktiivsüsteemide rikkumatusele ja toimimisele, kaasa arvatud sugunäärmete funktsioonile, innatsüklile, paaritumiskäitumisele, viljastumisele, tiinusele, poegimisele, imetamisele ja võõrutamisele, ning teavet järglase kasvu ja arengu kohta. Uurimus võib pakkuda teavet ka katseaine mõjude kohta vastsündinu haigestumisele, suremusele ning anda esialgseid andmeid sünnieelse ja sünnijärgse arengutoksilisuse kohta ja võib juhendada järgmiste katsete tegemist. Lisaks F1-põlvkonna kasvu ja arengu uurimisele on käesolev katsemeetod samuti mõeldud nii F2-põlvkonna isas- ja emasloomade reproduktiivsüsteemide rikkumatuse ja toimimise kui ka kasvu ja arengu hindamiseks. Arengutoksilisust ja funktsionaalseid puudujääke käsitleva täiendava teabe puhul saab käesolevasse protokolli lisada kas täiendavaid osauurimusi, vajadusel pidada nõu arengutoksilisust ja/või arenguga seotud neurotoksilisust käsitlevate meetodite üle või saab neid lõpp-punkte uurida eraldi uurimustes, kasutades sobivaid katsemeetodeid.1.2 KATSEMEETODI PÕHIMÕTEKatseainet manustatakse gradueeritud annustena mitmetele isas- ja emasloomade rühmadele. P-põlvkonna isasloomadele tuleks annustada kasvu ajal ja vähemalt ühe täieliku spermatogeneesi tsükli jooksul (hiirtel ligikaudu 56 päeva ja rottidel 70 päeva), et tekitada spermatogeneesile kahjulikke mõjusid. Mõju spermale määratakse kindlaks mitmete spermaparameetrite (nt sperma morfoloogia ja liikuvus) ning koepreparaatide ja üksikasjalike histopatoloogiliste uurimuste abil. Kui spermatogeneesi käsitlevad andmed on olemas varasemast, korduvaid annuseid kasutavast uurimusest, mille kestus on piisav, nt 90-päevane uurimus, ei ole vaja lisada hindamisse P-põlvkonna isasloomi. On siiski soovitav, et P-põlvkonna spermaproove või digitaalseid salvestusi säilitatakse hilisema hindamise tarbeks. P-põlvkonna emasloomadele tuleks annustada katseainet kasvu ajal ja mitme täieliku innatsükli käigus, et tuvastada katseaine võimalikud kahjulikud mõjud tavapärasele innatsüklile. Katseainet manustatakse järglaste vanematele (P) nende paaritumise ajal, tiinuste ajal ja kuni F1-järglase võõrutamiseni. Võõrutamise ajal jätkatakse aine manustamist F1-järglastele ajal, mil nad arenevad täiskasvanuteks, paaritumise ajal ja F2-põlvkonna poegimise järel kuni võõrutamiseni.Kliinilisi vaatlusi ja patoloogilisi uuringuid viiakse läbi kõikidel loomadel mürgisuse sümptomite tuvastamiseks, eriline tähelepanu on mõjudel isas- ja emasloomade reproduktiivsüsteemide rikkumatusele ja toimimisele ning järglase kasvule ja arengule.1.3 KATSEMEETODI KIRJELDUS1.3.1 Loomaliikide valikEelistatud loomaliik on rott. Kui kasutatakse muid liike, tuleks seda põhjendada ja asjaomased mugandused on vajalikud. Liine, kellel on madal sigivus või kellel teatakse olevat arenguhäireid, ei tohiks kasutada. Uuringut alustades peaks loomade massi muutus olema minimaalne ja ei tohiks ületada 20 % kummagi soo keskmisest massist.1.3.2 Loomade pidamise ja toitmise tingimusedLoomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 °C (± 3o). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt ei ületa 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal peaks see olema vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust.. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega. Toiduvalikut võib mõjutada vajadus tagada katseaine sobiv lisamine, kui katseainet manustatakse käesoleva meetodi abil.Loomi võib hoida eraldi või väikestes, samast soost loomade rühmades. Paaritumine peab toimuma selleks ettenähtud puurides. Kui võib tõdeda, et suguühe on toimunud, pannakse paaritunud emasloomad oma poegimis- või poegimispuuridesse. Paaritunud rotte võib samuti pidada väikestes rühmades ja eraldatakse üksteisest üheks või kaheks päevaks enne sünnitamist. Paaritunud loomadele antakse sünnituse lähenedes sobivad ja kindlaksmääratud pesapunumismaterjalid.1.3.3 Loomade ettevalmistamineTuleks kasutada terveid täiskasvanud loomi, keda on harjutatud laboritingimustega vähemalt 5 päeva ja keda ei ole varem katsetes kasutatud. Katseloomade liik, liin, päritolu, sugu, kaal ja/või vanus on äratuntavad. Teadma peaks õe-venna suhteid loomade vahel, et vältida õdede-vendade paaritamist. Loomad määratakse juhuvaliku teel kontroll- ja katserühmadesse (kihistamine kehamassi järgi on soovitav). Puurid asetatakse nii, et puuri asetamisest tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Igale loomale tuleks anda ainulaadne tunnusnumber. P-põlvkonna puhul tuleks seda teha enne annustamise algust. F1-põlvkonna puhul tuleks seda teha paaritumiseks valitud loomade võõrutamisel. F1-sugupõlve kõikide valitud loomade puhul säilitatakse andmed pesakonna kohta, millest nad pärit on. Lisaks sellele soovitatakse identifitseerida pojad individuaalselt nii ruttu pärast sündi kui võimalik, kui poegi kaalutakse või tehakse muid funktsionaalseid katseid.P-põlvkonna vanemad on ligikaudu 5–9 nädalat vanad annustamise alguses. Kõikide katserühmade loomad peaksid niipalju kui võimalik olema ühesuguse kaalu ja vanusega.1.4 MENETLUS1.4.1 Loomade arv ja suguIgas katse- ja kontrollrühmas on piisav arv loomi, et katsesse saadakse eelistatult mitte vähem kui 20 tiinet emaslooma, kes on poegimas või hakkavad varsti poegima. Ainete puhul, mis põhjustavad käsitlemisega seotud soovimatuid mõjusid (nt steriilsus, liigne mürgisus suure annuse juures), ei ole see võimalik. Eesmärgiks on luua piisavalt tiinuse juhtumeid, et kindlustada sellise aine tähendusrikas hindamine, millel on võime mõjutada viljakust, tiinust ja ema käitumist ning imetamist, F1-järglase kasvu ja arengut viljastumisest kuni suguküpseks saamiseni ning nende järglaste (F2) arengut kuni võõrutamiseni. Seetõttu, kui ei saada soovitud arvu tiineid loomi (s.t 20 looma), ei tähenda see, et katse on ilmtingimata invaliidne. Katse valiidsust hinnatakse iga üksikjuhtumi puhul eraldi.1.4.2 Dooside valmistamineOn soovitav, et katseainet manustatakse suu kaudu (toidu ja joogivee kaudu või sondi abil), välja arvatud juhul, kui muud manustamisviisi (nt naha kaudu või sissehingamine) peetakse sobivamaks.Vajadusel lahustatakse või suspendeeritakse katseaine sobivas kandeaines. On soovitav, et võimaluse korral kaalutakse esmalt vesilahuse/-suspensiooni kasutamist, seejärel õlilahuse/-emulsiooni (nt maisiõli) kasutamist ja siis võimalikku muude kandealuste lahust. Veest erinevate kandeainete puhul peaks kandeaine toksikoloogilised omadused teada olema. Katseaine stabiilsus kandeaines määratakse kindlaks.1.4.3 AnnustamineTuleks kasutada vähemalt kolme annusemäära ja samaaegset kontrolli. Kui katseaine füüsikalis-keemiline laad või bioloogilised mõjud ei sea piiranguid, valitakse suurim annusemäär selliselt, et põhjustab mürgisust, kuid ei põhjusta surma ega raskeid kannatusi. Ootamatu suremuse korral on tavaliselt siiski aktsepteeritavad sellised uuringud, milles P-sugupõlve vanemate suremus on ligikaudu alla 10 protsendi. Tuleks valida annusemäärade alanev järjestus, et näidata annusega seotud reaktsiooni ja täheldamata kahjuliku mõju taset (NOAEL). Kahe- või neljakordsed vahemikud on sageli optimaalsed alanevate annusemäärade kehtestamisel ja sageli on eelistatud neljanda katserühma lisamine väga suurte vahemike (nt üle 10-kordne tegur) annuste vahel. Toitumisuuringute puhul ei tohiks annuste vahemik olla mitte suurem kui kolmekordne. Annusemäärad tuleks valida varasemaid mürgisust käsitlevaid andmeid, eriti annuseid käsitlevate kordusuuringute tulemusi arvesse võttes. Mis tahes kättesaadavat teavet metabolismi ja katseühendi või sellega seotud ainete kineetika kohta tuleks samuti arvesse võtta. Selline teave aitab samuti viidata sellele, et annustamisrežiim on adekvaatne.Kontrollrühmaks on rühm, kellega katseid ei tehta, või kandeainet saav kontrollrühm, kui kandeainet kasutatakse katseaine manustamisel. Kontrollrühma loomi käsitletakse sarnaselt katserühma loomadega, kuid neile ei anta uuritavat ainet. Kui kasutatakse kandeainet, saab kontrollrühm kandeainet suuremas mahus. Kui katseainet manustatakse toidu kaudu ja seetõttu väheneb toidu võtmine või ärakasutamine, siis võib pidada vajalikuks paariskontrollrühma kasutamist. Teise võimalusena võib kasutada samaaegsete paariskontrollrühmade asemel andmeid, mis on saadud sellistest kontrollitud uuringutest, mis on välja töötatud selliste mõjude hindamiseks, mille on vähenenud toidutarbimine põhjustanud reproduktiivsetele parameetritele.Arvesse võetakse kandeaine ja muude lisandite järgmiseid omadusi: katseaine absorbtsiooni, jaotamist, metabolismi või peetumist käsitlevad mõjud; katseaine keemilisi omadusi käsitlevad mõjud, mis võivad muuta toksilisi omadusi; ning toidu- või veetarbimist või toitumust käsitlevad mõjud.1.4.4 PiirkatseKui suukaudne uuring ühe annusemääraga, mis on vähemalt 1000 mg kg kehamassi kohta päevas või vastav protsendimäär toidus või joogivees, kui manustatakse toidu või joogivee kaudu, kasutades käesolevas uuringus kirjeldatud protseduure, ei tekita täheldatavaid toksilisi mõjusid vanematele või nende järglastele ja kui mürgisus eeldatavasti ei põhine struktuurselt ja/või metaboolselt sarnaste ühendite kohta käivatel andmetel, siis ei peeta vajalikuks täieliku uuringu tegemist, kus kasutatakse mitmeid annusemäärasid. Piirkatset kohaldatakse, välja arvatud siis, kui inimese kokkupuude viitab vajadusele kasutada suuremat suukaudset annusemäära. Muude manustamisviiside korral, nagu näiteks sissehingamine või naha kaudu manustamine, võivad katseaine füüsikalis-keemilised omadused nagu lahustuvus tihti viidata suurimale kokkupuutetasemele ja seada sellele piiranguid.1.4.5 Annuste manustamineLoomadele annustatakse katseainet 7 päeva nädalas. Eelistatakse suukaudset manustamist (toit, joogivesi või sond). Kui kasutatakse muud manustamisviisi, tuleks seda põhjendada ning asjaomased muudatused võivad osutuda vajalikuks. Kõikidele loomadele annustatakse ainet sama meetodi järgi asjaomase katseperioodi jooksul. Kui katseainet manustatakse sondi abil, tehakse seda läbi söögitoru. Korraga manustatava vedeliku maht ei ületa 1 ml 100 g kehamassi kohta (0,4 ml 100 g kehamassi koha on maksimum maisiõli puhul), välja arvatud vesilahuste puhul, kui võib kasutada 2 ml 100 g kehamassi kohta. Välja arvatud ärritavad või söövitavad ained, mille mõjud tavaliselt teravnevad suuremate kontsentratsioonide korral, tuleks vähendada katses kasutatavate mahtude varieeruvust, reguleerides kontsentratsioone nii, et kogumaht kõikide annuste korral jääks samaks. Sundsöötmisega seotud uuringutes saavad pojad tavaliselt katseainet üksnes kaudselt piimast, vahetu annustamine algab nende jaoks võõrutuse ajal. Toidu või joogiveega seotud uuringutes saavad pojad täiendavalt katseainet vahetult, kui nad hakkavad ise sööma imetamisperioodi viimasel nädalal.Toidu või joogivee kaudu manustatud ainete puhul on oluline tagada, et hõlmatud katseaine kogused ei häiriks tavapärast toitumist või veetasakaalu. Kui katseainet manustatakse toidus kas püsiva toidukontsentratsioonina (ppm) või võidakse kasutada püsivat annusemäära looma kehamassi suhtes, siis tuleb täpsustada kasutatud alternatiivi. Sondi kaudu manustatud aine puhul tuleks annus anda samal kellaajal iga päev ja kohandada vähemalt igal nädalal, et säilitada konstantset annusemäära looma kehamassi suhtes. Sondiannuse kohandamisel kaalu järgi tuleks arvesse võtta teavet katseaine platsenta kaudu levimise kohta.1.4.6 Katsete ajakavaP-põlvkonna isas- ja emasloomade puhul algab igapäevane annustamine siis, kui nad on 5-9 nädalat vanad. F1-isas- ja emasloomade puhul algab igapäevane annustamine võõrutamise ajal, tuleb meeles pidada, et katseaine toidu või joogivee kaudu manustamise korral võib toimuda F1-põlvkonna poegade vahetu kokkupuude katseainega juba imetamise ajal. Mõlema soo puhul (P ja F1) jätkatakse annustamist vähemalt 10 nädalat enne paaritamist. Annustamist jätkatakse mõlemast soost loomade puhul kahenädalase paaritumisperioodi jooksul. Isasloomad surmatakse humaanselt ja uuritakse neid siis, kui neid ei ole enam vaja reproduktiivsuse mõjude hindamiseks. P-põlvkonna emasloomade puhul jätkatakse annustamist kogu tiinuse aja ja kuni F1-järglaste võõrutamiseni. Arvesse tuleks võtta muudatusi annustamise ajakavas, mis põhinevad katseaine, sh varasematel mürgisuse, metabolismi või bioakumulatsiooni tekke kohta käivatel kättesaadavatel andmetel. Iga looma annus peab tavaliselt põhinema looma kõige viimase individuaalse kehamassi kindlaksmääramisel. Annuse määramisel tuleks siiski olla ettevaatlik tiinuse viimasel trimestril.P- ja F1-põlvkonna isas- ja emasloomade käsitlemist jätkatakse kuni surmamiseni. Kõik P- ja F1-põlvkonna täiskasvanud isas- ja emasloomad surmatakse humaanselt, kui neid enam ei vajada reproduktiivsuse mõjude hindamiseks. F1- järglased, keda ei ole valitud paaritumiseks, ning kõik F2- järglased surmatakse humaanselt pärast võõrutamist.1.4.7 Paaritumisprotseduur1.4.7.1 P-põlvkonna paaritumineIga paaritumise korral pannakse emasloom ühte puuri ühe sama annusemääraga isasloomaga (1:1 paaritumine) kuni suguühte toimumiseni või 2 nädalaks. Iga päev uuritakse emasloomadel sperma või tupekorgi olemasolu. Tiinuse 0. päevaks peetakse päeva, mil leitakse tupekork või sperma. Kui paaritumine ei õnnestunud, saab kaaluda emaslooma uuesti paaritamist sama rühma viljakaks peetava isasloomaga. Paarituvad paarid tuleks selgesti andmetes ära näidata. Õdede-vendade paaritumist tuleks vältida.1.4.7.2 F1-põlvkonna paaritumineF1-järglaste paaritumise korral valitakse vähemalt üks isasloom ja üks emasloom võõrutamise ajal igast pesakonnast paaritumiseks muude sama annusemääraga, kuid erinevast pesakonnast poegadega, et sünniks F2-põlvkond. Poegade valimine igast pesakonnast peaks olema juhuslik, kui poegade kehamassis või välimuses olulisi erinevusi ei ole täheldatud. Juhul kui on täheldatud nimetatud erinevusi, valitakse iga pesakonna parimad esindajad. Pragmaatiliselt on seda kõige parem teha kehamassi põhjal, kuid seda võib teha ka välimuse põhjal. F1-järglasi ei paaritata enne, kuni nad on saanud täiesti suguküpseks.Poegimata paare tuleks hinnata, et kindlaks määrata viljatuse näiv põhjus. See võib hõlmata selliseid protseduure nagu lisavõimalused paaritumiseks muude viljakaks peetavate isade või emadega, suguelundite mikroskoopiline uurimine ning innatsüklite või spermatogeneesi uurimine.1.4.7.3 Teine paaritumineTeatavatel juhtudel nagu käsitlemisega seotud muutused pesakonna suuruses või ebaselge mõju täheldamine esimesel paaritumisel, on soovitav, et P- või F1-sugupõlve täiskasvanud loomad paarituksid uuesti teise pesakonna saamiseks. On soovitav uuesti paaritada emas- ja isasloomi, kellel ei ole varem pesakonda olnud, viljakaks peetavate erinevast soost loomadega. Kui teise pesakonna saamist peetakse mõlemas põlvkonnas vajalikuks, tuleks loomad uuesti paaritada ligikaudu nädal pärast eelmise pesakonna võõrutamist.1.4.7.4 Pesakonna suurusLoomadel lubatakse poegida tavaliselt ja kasvatada järglased üles kuni võõrutamiseni. Pesakonna suuruse ühtlustamine ei ole kohustuslik. Kui seda on ühtlustatud, tuleks üksikasjalikult kirjeldada kasutatud meetodit.1.5 VAATLUSED1.5.1 Kliinilised vaatlusedIga päev tuleks teha üldine kliiniline vaatlus ja sondi kaudu annustamise korral peaks selle ajastamisel arvesse võtma mõjude oodatavat kõrghetke pärast annustamist. Käitumise muutused, raske või pikaleveninud poegimise märgid ja kõik mürgisuse tunnused tuleks registreerida. Üksikasjalikum lisauuring iga looma kohta tuleks teostada vähemalt iga nädal ja kõige parem oleks seda teha siis, kui looma kaalutakse. Kõiki loomi tuleks jälgida haigestumise ja suremuse osas kaks korda päevas ja vajadusel nädalavahetusel kord päevas.1.5.2 Poeginud loomade kehamass ja toidu/vee tarbimineP- ja F1-põlvkonna poeginud loomi kaalutakse annustamise esimesel päeval ja seejärel vähemalt kord nädalas. Poeginud emasloomi (P- ja F1-põlvkond) kaalutakse vähemalt tiinuse 0., 7., 14. ja 20. või 21. päeval ning imetamise ajal samadel päevadel poegade kaalumisel ja loomade surmamispäeval. Nimetatud vaatlustest tuleks teatada ükshaaval iga täiskasvanud looma kohta. Paaritumisele eelneval ajal ja tiinusperioodil mõõdetakse toidu tarbimist vähemalt iga nädal. Vee tarbimist mõõdetakse vähemalt iga nädal, kui katseainet manustatakse vees.1.5.3 InnatsükkelInnatsükli pikkuse ja normaalsust hinnatakse P- ja F1-põlvkonna emasloomadel tupeäiete abil enne paaritumist ja valikuliselt paaritumise ajal, kuni leitakse tõendeid paaritumise toimumise kohta. Tupe-/emakakaelarakke võttes tuleks olla ettevaatlik, et vältida limaskesta kahjustamist ja seejärel pseudotiinuse teket (1).1.5.4 SpermaparameetridKõikide P- ja F1-põlvkonna isasloomade surmamisel registreeritakse munandite ja munandimanuse mass ning üks kummastki elundist säilitatakse histopatoloogiliseks uurimiseks (vt punkt 1.5.7, 1.5.8.1). P- ja F1-põlvkonna igast rühmast eraldatakse vähemalt kümne isaslooma suurune osarühm, allesjäänud munanditest ja munandimanustest loendatakse homogeenimisele resistentsed spermatiidid ja munandimanuse sabas säilinud sperma hulk. Sama osarühma isasloomade puhul tuleks koguda munandimanuse sabas või seemnejuhas olev sperma liikuvuse ja sperma morfoloogia hindamiseks. Kui täheldatakse käsitlemisega seotud mõjusid või kui on tõendeid muude uuringute võimalike mõjude kohta spermatogeneesile, tuleks hinnata iga annusrühma kõikide isasloomade spermat; vastasel juhul võib loendamine piirduda kontrollrühma ning suure annusega rühma P- ja F1-põlvkonna isasloomadega.Homogeenimisele resistentsete munandites olevate spermatiidide ja munandimanuse sabas oleva sperma koguhulk tuleks arvutada (2)(3). Munandimanuse sabas säilinud seemnerakkude arv võib lähtuda kvalitatiivseteks hindamisteks kasutatud suspensioonis olevate seemnerakkude kontsentratsioonist ja mahust ning järelejäänud munandimanuse sabakoe jahvatamisel ja/või homogeenimisel saadud seemnerakkude arvust. Arvutamised tuleks teha kõikide valitud isasloomade osarühmade kõikides annuserühmades pärast loomade surmamist, välja arvatud juhul, kui tehakse video- või digitaalsalvestusi või kui proovid külmutatakse ja analüüsitakse hiljem. Sellistel juhtudel võib esmalt analüüsida kontrollrühma ja suure annusega rühma. Kui käsitlemisega ei kaasne mõjusid (nt mõjud seemnerakkude arvule, sperma liikuvusele ja morfoloogiale), ei ole vaja analüüsida muid annuserühmasid. Kui on täheldatud käsitlemisega kaasnevaid mõjusid, siis tuleks samuti hinnata väiksema annusega rühmasid.Munandimanuse (või seemnejuha) sperma liikuvust tuleks hinnata või videosalvestada kohe pärast surmamist. Sperma tuleks koguda, minimiseerides kahju, ning lahjendada liikuvusanalüüsi jaoks vastuvõetavaid meetodeid kasutades (4). Progressiivselt liikuva sperma protsendimäär tuleks kindlaks määrata kas subjektiivselt või objektiivselt. Kui arvutipõhine liikuvusanalüüs sooritatakse (5)(6)(7)(8)(9)(10), sõltub progressiivne liikumine kasutaja määratud keskmise liikumiskiiruse ja otsesuse künnisest või lineaarsest indeksist. Kui proove filmitakse (11) või kujundid salvestatakse muul moel lahangu ajal, võib jätkuanalüüsi teha üksnes kontrollrühma ja suure annusega rühma P- ja F1-põlvkonna meesloomadega, välja arvatud juhul, kui täheldatakse käsitlemisega kaasnevaid mõjusid; sellisel juhul tuleks samuti hinnata väikese annusega rühmasid. Video- või digitaalpildi puudumisel tuleks analüüsida kõikide katserühmade kõiki proove lahangu ajal.Munandimanuse (või seemnejuhade) spermaproovi tuleks morfoloogiliselt hinnata. Spermat (vähemalt 200 seemnerakku proovi kohta) tuleks uurida fiksatiiviga käsitletud märgpreparaatidena (12) ja liigitada kas tavaliseks või ebatavaliseks. Morfoloogiliste sperma kõrvalekallete näidete hulka kuuluvad kokkusulamine, isoleeritud pead ning peade ja/või sabade ebamoodustised. Hinnata tuleks kõikidest annuserühmadest valitud isasloomade osarühma kas vahetult pärast loomade surmamist või video- ja digitaalsete salvestuste põhjal hiljem. Äigeid, mis on juba fikseeritud, võib uurida hiljem. Sellistel juhtudel võib esmalt analüüsida kontrollrühma ja suure annusega rühma. Kui käsitlemisega ei kaasne mõjusid (nt mõjud sperma morfoloogiale), ei ole vaja analüüsida muid annuserühmasid. Kui on täheldatud käsitlemisega kaasnevaid mõjusid, siis tuleks samuti hinnata väiksema annusega rühmasid.Kui mõnda eespool nimetatud sperma hindamisparameetritest on juba uuritud süsteemse toksilisuse uuringu osana vähemalt 90 päeva, ei ole neid vaja tingimata korrata kahe põlvkonna uuringus. On siiski soovitav, et P-põlvkonna spermaproovid või digitaalsed salvestused säilitatakse hilisema hindamise tarbeks.1.5.5 JärglaneIga pesakonda uuritakse nii ruttu kui võimalik pärast poegimist (imetamise 0. päev), et kindlaks määrata poegade arv ja sugu, surnult sünnid, elussünnid ja kõikide anomaaliate olemasolu. 0. päeval surnult leitud poegi (kui nende laibad on leotamata) tuleks soovitavalt uurida võimalike defektide ja surmapõhjuse osas ning laibad tuleks säilitada. Elusad pojad tuleks kokku lugeda ja ükshaaval kaaluda sünni hetkel (imetamise 0. päev) või 1. päeval, ning seejärel regulaarsetel kaalumispäevadel, nt imetamise 4., 7., 14. ja 21. päeval. Füüsilised või käitumuslikud kõrvalekalded, mida on täheldatud emadel või järglastel, tuleks registreerida.Järglase füüsiline areng tuleks registreerida peamiselt kehamassi lisandumise teel. Muud füüsilised parameetrid (nt kõrva ja silma avanemine, hammaste teke, karvakasv) võivad anda täiendavat teavet, kuid nimetatud andmeid peaks soovitavalt hindama seksuaalset küpsust käsitlevate andmete kontekstis (nt vanus ja kehamass tupe avanemisel või suguti ja eesnaha eraldumisel) (13). Soovitatakse F1-põlvkonna järglaste funktsionaalseid uuringuid (nt motoorne tegevus, sensoorne funktsioon, reflekside ontogenees) enne ja/või pärast võõrutamist, eelkõige neid uuringuid, mis on seotud seksuaalse küpsusega, juhul kui selliseid uuringuid ei käsitleta eraldi katsetes. Tupe avanemise ja eesnaha eraldumise iga määratakse kindlaks paaritumiseks valitud F1-põlvkonna võõrutatud poegade puhul. Anogenitaalset vahemaad mõõdetakse sünnijärgsel 0. päeval F2-põlvkonna poegade puhul, kui F1-põlvkonna sooline jagunemine või seksuaalse küpsuse saavutamise ajastus selleks põhjust annavad.Funktsionaalsed vaatlused võib ära jätta rühmades, millel vastasel juhul ilmneksid negatiivsete mõjude selged tunnused (nt oluline massi vähenemine jne). Kui funktsionaalseid uuringuid tehakse, ei peaks neid tegema paaritumiseks valitud poegadega.1.5.6 ÜldlahangSurmamise või uuringu käigus suremise korral uuritakse makroskoopiliselt kõiki poeginud loomi (P- ja F1-põlvkond), kõiki väliste kõrvalekalletega või kliiniliste tunnustega poegi ja juhuslikult valitud F1- ja F2-põlvkonna mõlemast soost ja igast pesakonnast poegi mis tahes strukturaalsete kõrvalekallete või patoloogiliste muutuste suhtes. Erilist tähelepanu tuleks pöörata reproduktiivsüsteemi elunditele. Tuleks uurida humaanselt surmatud suremisseisundis poegade või surnud poegade (kui nende laibad on leotamata) võimalikke defekte ja/või surmapõhjust ning nende laibad tuleks säilitada.Kõikide esimest korda poegivate emasloomade emakat tuleks uurida implantatsiooni kohtade olemasolu ja arvu suhtes viisil, mis ei sisalda histopatoloogilist hindamist.1.5.7 Elundite massidSurmamise ajal määratakse kindlaks kõikide P- ja F1- põlvkonna poeginud loomade kehamass ja järgmiste elundite mass (paariselundid peaks kaaluma ükshaaval):- emakas, munasarjad,- munandid, munandimanused (kogumass ja sabaosa mass),- eesnääre,- seemnepõiekesed koos näärmete ja nendes olevate vedelikega ning eesnäärmega (tervikuna),- aju, maks, neerud, põrn, ajuripats, kilpnäärmed ja neerupealised ning määratud sihtelundid.Lahanguks valitud F1- ja F2-põlvkonna poegade kehamassid tuleks määrata kindlaks surmamisel. Kaalutakse järgmiseid elundeid, mis on juhuslikult valitud ühest pojast/soost/pesakonnast (vt punkt 1.5.6): aju, põrn ja harknääre.Üldlahangu ja elundite kaalumise tulemusi tuleks hinnata muudes, korduvate annustega uuringutes tehtud vaatluste kontekstis, kui see on teostatav.1.5.8 Histopatoloogia1.5.8.1 Poeginud loomadP- ja F1-põlvkonna poeginud loomadelt eemaldatakse järgmised elundid ja koed või nende representatiivsed proovid ja neid säilitatakse sobivas kasvukeskkonnas histopatoloogilise uuringu tarbeks:- tupp, emakas koos emakakaelaga ning munasarjad (säilitatakse sobivas kinnitis),- üks munand (säilitatakse Bouini või võrreldavas kinnitis), üks munandimanus, seemnepõiekesed, eesnääre ja selle eesosa,- eelnevalt identifitseeritud sihtelund(id) kõikidelt paaritumiseks valitud P- ja F1-põlvkonna loomadelt.Eespool loetletud säilitatud elundite ja kudede täielik histopatoloogiline uuring tehakse kõikide paaritumiseks valitud ning suure annusega ja kontrollrühma kuuluvate P- ja F1-põlvkonna loomade kohta. P-põlvkonna loomade munasarjade uurimine ei ole kohustuslik. Käsitlemisega seotud muutustega elundeid tuleks samuti uurida väikese ja keskmise annusega rühmades, et aidata NOAEL-i välja selgitada. Lisaks sellele tuleks selliste väikese ja keskmise annusega loomade, kellel kahtlustatakse vähenenud viljakust, nt need, kellel ei õnnestunud paarituda, viljastuda, sigitada või sünnitada terveid järglasi, või need, kelle innatsüklit või sperma hulka, liikuvust või morfoloogiat mõjutati, suguelundeid hinnata histopatoloogiliselt. Kõiki üldkahjustusi nagu atroofia või kasvajad tuleks uurida.Munandeid tuleks üksikasjalikult histopatoloogiliselt uurida (nt kasutades Bouini kinnitit, parafiinilõike või 4–5 μm paksuseid läbilõikeid), et kindlaks teha käsitlemisega seotud mõjud nagu paigale jäänud spermatiidid, puuduvad sugurakukihid või -liigid, hulktuumsed hiidrakud või spermatogeensete rakkude irdumine luumenisse (14). Puutumatu munandimanuse puhul tuleb uurida pead, keha ja saba, mida saab teha pikilõigete hindamise teel. Munandimanuse puhul tuleks hinnata leukotsüüdi infiltratsiooni, rakutüüpide esinemissageduse muutusi, hälbivaid rakutüüpe ja sperma fagotsütoosi. PAS- ja hematoksüliiniga värvimist võib kasutada isasloomade suguelundite uurimisel.Imetamisjärgne munasari peaks sisaldama alg- ja kasvavaid munarakke ning imetamisaegseid suuri kollakehasid. Histopatoloogiline uurimine peaks tuvastama algmunarakkude populatsiooni kvalitatiivse vähenemise. Algmunarakkude kvantitatiivne hindamine tuleks teha F1-põlvkonna emasloomadele; loomade arv, munasarjalõigete valik ja lõikeproovi suurus peaksid statistiliselt sobima kasutatava hindamisprotseduuriga. Uurimisel peaks arvutama algmunarakkude arvu, mida saab kombineerida väikeste kasvavate munarakkudega, katse- ja kontrollrühma kuuluvate munasarjade võrdlemiseks (15) (16) (17) (18) (19).1.5.8.2 Võõrutatud pojadKõikide väliste kõrvalekalletega või kliiniliste tunnustega poegade, samuti paaritumiseks mittevalitud F1- ja F2- põlvkonnast juhuslikult valitud ühe poja/soo/pesakonna selgete kõrvalekalletega kude ja sihtelundid fikseeritakse ja säilitatakse sobivas kasvukeskkonnas histopatoloogilise uurimise tarbeks. Säilitatud kudedele tehakse täielik histopatoloogiline määramine, milles pearõhk on reproduktiivsüsteemi elunditel.2. TULEMUSED2.1 TULEMUSTE TÖÖTLEMINEAndmed edastatakse kokkuvõtlikult iga emaslooma ja nende järglase kohta tabeli kujul, näidates iga katserühma ja põlvkonna kohta loomade arvu katse alguses, katse käigus surnud või humaansetel kaalutlustel surmatud loomade arvu, surma ja humaanse surmamise ajad, viljakate emasloomade arvu, tiinete emasloomade arvu, mürgisusnähtudega loomade aru, mürgisusnähtude kirjelduse, sh toksiliste mõjude algusaja, kestuse ja raskuse, embrüot/loodet käsitlevate vaatluste liigid ja kogu asjaomane teave pesakonna kohta.Numbrilisi tulemusi tuleks hinnata sobiva, üldiselt heakskiidetud statistilise meetodi abil; statistilised meetodid tuleks valida uurimuse kavandamisel ja neid tuleks põhjendada. Annuse ja sellele reageerimise statistilised mudelid võivad olla andmete analüüsimisel vajalikud. Protokoll peaks hõlmama piisavalt teavet analüüsimeetodi kohta ja kasutatava arvutiprogrammi kohta, nii et sõltumatu arvestaja/statistik võib uuesti hinnata ja rekonstrueerida analüüsi.2.2 TULEMUSTE HINDAMINEKahe põlvkonna reproduktsiooni toksilisuse uuringu avastusi tuleks hinnata täheldatud mõjude, kaasa arvatud lahangu- ja mikroskoopilised leiud, suhtes. Hindamine hõlmab katseaine annuse ja kõrvalekallete – sh üldkahjustused, identifitseeritud sihtelundid, mõjutatud viljakus, kliinilised kõrvalekalded, mõjutatud paljunemisvõime ja pesakonna suurus/laad, kehamassi muutused, mõjud suremusele ja mis tahes muud toksilised mõjud – olemasolu või puudumise, esinemissageduse ja raskusastme vahelist seost või selle puudumist. Katseaine füüsikalis-keemilisi omadusi ja vajadusel toksikokineetilisi andmeid tuleks võtta arvesse katsetulemuste hindamisel.Nõuetekohaselt tehtud reproduktsiooni toksilisuse uuring hindab rahuldavalt mõjuta määrasid ja mõistab reproduktsioonile, poegimisele, imetamisele, sünnijärgsele arengule, kaasa arvatud kasv ja seksuaalne areng, kahjulikke mõjusid.2.3 TULEMUSTE TÕLGENDAMINEKahe põlvkonna reproduktsiooni toksilisuse uuring annab teavet korduvate ainega kokkupuudete mõjude kohta reproduktiivtsükli kõikidel etappidel. Eelkõige annab uuring teavet reproduktiivparameetrite kohta ning järglaste arengu, kasvu, suguküpseks saamise ja ellujäämise kohta. Uuringu tulemusi tõlgendatakse koostoimes subkroonilisel, sünnieelse arengu ja toksikokineetilisel ning muudel uuringutel tehtud avastustega. Käesoleva uuringu tulemusi võib kasutada kemikaali täiendava uurimise vajaduse hindamisel. Uuringu tulemuste ekstrapoleerimine on kehtiv piiratud ulatuses. Neid saab kõige paremini kasutada teabe andmiseks mõjuta määrade ja inimeste lubatud kokkupuudete kohta (20) (21) (22) (23).3. PROTOKOLL3.1 KATSEPROTOKOLLKatsearuanne peab hõlmama järgmist teavet:Katseaine:- füüsiline laad ja vajadusel füüsikalis-keemilised omadused,- tunnusandmed,- puhtus.Kandeaine (vajadusel):- kandeaine valiku põhjendus, kui see on veest erinev.Katseloomad:- kasutatud liigid/tüved,- loomade arv, vanus ja sugu,- päritolu, pidamistingimused, toitumine, pesamaterjalid jne,- iga looma kaal katse alguses.Katsetingimused:- annuste valiku põhjendus,- katseaine valmistise/toidupreparaadi üksikasjad, saadud kontsentratsioonid,- preparaadi stabiilsus ja homogeensus,- katseaine manustamise üksikasjad,- toidu/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni (ppm) muutmine tegelikuks annuseks (mg kg kehamassi kohta päevas), vajaduse korral,- üksikasjad toidu- ja veekvaliteedi kohta.Tulemused:- toidu tarbimine ja vajadusel vee tarbimine, toidu tõhusus (kehamassi lisandumine tarbitud toidu grammi kohta) ning katseaine tarbimine P- ja F1-põlvkonna loomadel, välja arvatud perioodil, mil loomi hoitakse koos, ja vähemalt imetamise viimasel kolmandikul,- andmed absorbtsiooni kohta (kui seda on mõõdetud),- paaritumiseks valitud P- ja F1-põlvkonna loomade kehamassi andmed,- pesakonna ja poegade massi andmed,- andmed poeginud loomade kehamassi kohta surmamisel ning elundite täieliku ja suhtelise massi kohta,- kliiniliste vaatluste laad, raskus ja kestus (sõltuvalt sellest, kas kahjud on pöörduvad või mitte),- surmaaeg katse ajal või andmed loomade ellujäämise kohta kuni surmamiseni,- andmed toksilise reaktsiooni kohta sooti ja annuste kaupa, kaasaarvatud paaritumis-, viljakus-, tiinus-, sünni-, elujõulisus- ja imetamisindeksid; protokoll peaks viitama nende indeksite arvutamisel kasutatud arvudele,- toksilised või muud mõjud reproduktsioonile, järglastele, sünnijärgsele kasvule jne,- lahangu leiud,- kõikide histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus,- tavalise innatsükliga P- ja F1-põlvkonna emasloomade arv ning tsükli pikkus,- munandimanuse sabaosas oleva sperma koguarv, progressiivselt liikuva sperma protsendimäär, morfoloogiliselt normaalse sperma protsendimäär ning tuvastatud kõrvalekaldega sperma protsendimäär,- aega paaritumiseni, sh päevade arv paaritumiseni,- tiinuse pikkus,- implantatsioonide arv, kollakehad, pesakonna suurus,- elussündide arv ja implantatsioonide järel toimunud abordid,- selgelt nähtavate arenguhälvetega poegade arv, kui see on kindlaks määratud, tuleks teatada kängujäänud loomade arv,- andmed poegade füüsilise arengu järkude kohta ja andmed muude sünnijärgsete arengute kohta; hinnatud füüsilise arengu järke tuleks põhjendada,- andmed poegade ja täiskasvanud loomade funktsionaalsete vaatluste kohta,- vajadusel tulemuste statistiline töötlemine.Tulemuste arutelu.Järeldused, sh NOAEL-väärtused mõjude kohta emadele ja järglastele.4. VIITED(1) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In: Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.(2) Gray, L.E. et al., (1989). A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat. Fundamental and Applied Toxicology 12:92-108.(3) Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats. Journal of Reproduction and Fertility 54:103-107.(4) Klinefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat. Reproductive Toxicology 5:39-44.(5) Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report. Reproductive Toxicology 10(3):237-244.(6) Chapin, R.E. et al., (1992).Methods for Assessing Rat Sperm Motility. Reproductive Toxicology 6:267-273.(7) Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration. Journal of Andrology 13:409-421.(8) Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations. Reproductive Toxicology 5:449-458.(9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In: Methods in Toxicology, Part A., Academic, Orlando, Florida, pp. 319-333.(10) Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology 10: 401-415.(11) Working, P.K. and M. Hurtt (1987). Computerized Videomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andrology 8:330-337.(12) Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6:491-505.(13) Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biological Reproduction 17:298303.(14) Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.(15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Orlando, Florida.(16) Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York, pp. 421-426.(17) Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989). Test Methods for Assessing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven, New York.(18) Smith, B.J. et al,. (1991). Comparison of Random and Serial Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive Toxicology 5:379-383.(19) Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histology. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston,. and C.A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.(20) Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive System. In: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, J. Doull, and C.D. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.(21) Zenick, H. and E.D. Clegg, (1989). Assessment of Male Reproductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, New York.(22) Palmer, A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York.(23) Palmer, A.K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.--------------------------------------------------LISA 2HB.42 NAHATUNDLIKKUS: PAIKNE LÜMFISÕLMEDE UURING1. MEETODKäesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 429-ga (2002).1.1 SISSEJUHATUSPaikne lümfisõlmede uuring (Local Lymph Node Assay, LLNA) on piisavalt valideeritud ja heaks kiidetud, et selle võiks põhjendatult võtta vastu uue meetodina (1)(2)(3). See on teine meetod kemikaalide nahatundlikkusvõime hindamiseks loomadel. Teises meetodis (B.6) kasutatakse katseid merisigadega, nimelt merisigadega tehtav maksimiseerimiskatse ja Buehleri katse (4).LLNA on alternatiivne meetod, mille abil võidakse kindlaks teha nahka sensibiliseerivad kemikaalid ja kinnitada, et kemikaalidel puudub oluline naha sensibiliseerimisvõime. See ei tähenda tingimata seda, et kõikidel juhtudel tuleks kasutada LLNA merisigadega tehtavate katsete asemel, kuid pigem seda, et uuring on ühtmoodi hea ja seda võib kasutada alternatiivina, milles positiivsed ja negatiivsed tulemused üldiselt ei vaja enam kinnitamist.LLNA näeb ette teatavad soodustused seoses nii teadusliku arengu kui ka loomade heaoluga. See uurib nahatundlikkuse esilekutsumise etappi ja esitab kvantitatiivsed andmed, mis sobivad annusele reageerimise hindamiseks. LLNA valideerimise üksikasjad ja sellega seotud töö ülevaade avaldatakse (5)(6)(7)(8). Lisaks sellele tuleks märkida, et kerged/mõõdukad sensibilisaatorid, mida soovitatakse sobivaks positiivseks kontrollaineks merisigadega tehtavate katsemeetodite puhul, on samuti sobivad kasutamiseks LLNA-ga (6)(8)(9).LLNA on in vivo meetod ja seetõttu ei lõpetata loomade kasutamist puutetundlikkuse hindamisel. Selles võidakse siiski vähendada selleks ettenähtud loomade arvu vähendamist. Lisaks sellele LLNA-s kasutatud viis loomade puutetundlikkuse uurimiseks on tunduvalt täiustatum. LLNA põhineb kemikaalide põhjustatud immunoloogiliste juhtumite kontrollil tundlikkuse esilekutsumisel. Erinevalt merisigadega tehtavatest katsetest ei eelda LLNA, et tekiksid esilekutsutud naha ülitundlikkusreaktsioonid. Samuti ei eelda LLNA adjuvandi kasutamist, nagu seda tehakse merisigadega tehtava maksimiseerimiskatse puhul. Seetõttu vähendab LLNA loomade kannatusi. Hoolimata LLNA hüvedest traditsiooniliste meriseakatsetega võrreldes, tuleks tunnistada, et on teatud piirangud, mis võivad tingida traditsiooniliste meriseakatsete kasutamise (nt valenegatiivsed LLNA leiud teatavate metallide puhul, valepositiivsed leiud teatavate nahka ärritavate ainete puhul)(10).Vt ka Sissejuhatust B osas.1.2 KATSEMEETODI PÕHIMÕTELLNA põhimõte on selline, et sensibilisaatorid kutsuvad esile primaarse lümfotsüütide vohamise lümfisõlmes, mis tühjendab keemilise aine ala. Nimetatud vohamine on võrdeline manustatud annusega (ja allergeeni tõhususega) ning pakub lihtsaid vahendeid tundlikkuse objektiivseks ja kvantitatiivseks mõõtmiseks. LLNA hindab nimetatud vohamist annuse ja sellele reageerimise suhtena, milles vohamist katserühmades võrreldakse vohamisega kandeainet manustatud kontrollrühmades. Katserühmade ja kandeainet saanud kontrollrühmade vohamise suhe (stimulatsiooniindeks) määratakse kindlaks ja see peab olema vähemalt 3 enne, kui katseainet saab edasi hinnata võimaliku nahasensibilisaatorina. Siin kirjeldatud meetodid põhinevad radioaktiivse märgistuse kasutamisel, et mõõta raku vohamist. Vohamise hindamise muid lõpp-punkte võib siiski kasutada, tingimusel et on olemas põhjendus ja piisav teaduslik toetus, kaasa arvatud täielikud viited ja meetodite kirjeldus.1.3 KATSEMEETODI KIRJELDUS1.3.1 Ettevalmistused1.3.1.1 Loomade pidamise ja toitmise tingimusedLoomi hoitakse eraldi puurides. Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 °C (±3 °C). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt ei ületa 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal peaks see olema 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust.. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega.1.3.1.2 Loomade ettevalmistamineLoomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identifitseerimise võimaldamiseks (kuid mitte kõrvamärkide kujul) ning hoitakse oma puurides vähemalt 5 päeva enne annustamise alustamist, et võimaldada neil kohaneda laboritingimustega. Enne katse alustamist uuritakse kõiki loomi, tagamaks, et neid ei ole nähtavaid nahakahjustusi.1.3.2 Katsetingimused1.3.2.1 KatseloomadKäesoleva katse jaoks valitud liik on hiir. Kasutatakse CBA/Ca või CBA/J liini noori täiskasvanud emashiiri, kes ei ole poeginud ega ei ole tiined. Katse alguses peaksid loomad olema 8–12 nädalat vanad ning loomade massimuutus peaks olema minimaalne ja mitte ületama 20 % keskmisest massist. Muid liine ja isasloomi võib kasutada, kui on loodud piisavalt andmeid, tõendamaks, et LLNA reaktsioonis ei ole olulisi liini ja/või soospetsiifilisi erinevusi.1.3.2.2 Usaldusväärsuse kontrollPositiivseid kontrolle kasutatakse selleks, et tõendada katse sobivat sooritamist ja labori pädevust katse edukaks sooritamiseks. Positiivne kontroll peaks andma positiivse LLNA reaktsiooni kokkupuutetasemel, mis eeldatavasti suurendab stimulatsiooniindeksit (SI) > 3 negatiivse kontrollrühma suhtes. Positiivne kontrollannus tuleks valida selline, et esilekutsumine on selge, kuid mitte liigne. Eelistatud ained on heksüülkanüülaldehüüd (CASi nr 101-86-0, EINECSi nr 202-983-3) ja merkaptobensotiasool (CASi nr 149-30-4, EINECSi nr 205-736-8). Võib olla olukordi, kus piisavalt põhjendatult võib kasutada muid kontrollaineid, mis vastavad eespool toodud kriteeriumidele. Kuigi tavaliselt võidakse eeldada positiivset kontrollrühma igas katses, võib olla olukordi, kus katselaboritel on olemas varasemad positiivse kontrolli andmed, mis näitavad rahuldava reaktsiooni järjepidevust kuue kuu või pikema perioodi jooksul. Sellistel juhtudel võib osutuda vajalikuks katsete tegemine harvem positiivsete kontrollrühmadega mitte pikemate kui kuuekuuliste intervallidega. Kuigi tuleks uurida positiivset kontrollainet kandeaines, mis teatavasti annab samasuguse reaktsiooni (nt atsetoon: oliiviõli), võib esineda teatavaid normatiivseid olukordi, kus mittestandardse kandeainega (kliiniliselt/keemiliselt asjaomane preparaat) katsete tegemine võib samuti olla vajalik. Sellises olukorras tuleks uurida võimalikku positiivse kontrollaine ja nimetatud ebatavalise kandeaine vahelist koostoimet.1.3.2.3 Loomade arv, annusemäärad ja kandeaine valikÜhes annuserühmas kasutatakse minimaalselt nelja looma, minimaalselt kolme katseaine kontsentratsiooni ja negatiivset kontrollrühma, kelle puhul kasutatakse kandeainet katseaine puhul, ning vajadusel positiivset kontrollrühma. Sellistel juhtudel, kus kogutakse kokku andmed iga looma kohta, kasutatakse minimaalselt viit looma ühes annuserühmas. Kontrollrühma loomi käsitletakse sarnaselt katserühma loomadega, kuid neile ei anta uuritavat ainet.Annuse ja kandeaine valik peaks põhinema viites (1) antud soovitusel. Annused valitakse kontsentratsioonide seeriatest 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %. Varasemaid andmeid ägeda mürgisuse ja nahaärrituse kohta tuleks arvesse võtta vajadusel kolme järjestikuse kontsentratsiooni valimisel selliselt, et kõrgeim kontsentratsioon suurendab kokkupuudet, kuid väldib süsteemset mürgisust ja liigselt paikset nahaärritust (2)(11).Kandeaine tuleks valida katsekontsentratsioonide ja lahustuvuse suurendamisel, samal ajal valmistades katseaine kohaldamiseks sobiva lahuse/suspensiooni. Eelistuse järjekorras on soovitud kandeained atsetoon/oliiviõli (4:1 v/v), dimetüülformamiid, metüületüülketoon, propüleenglükool ja dimetüülsulfoksiid (2)(10), kuid võib kasutada ka muid kandeaineid, kui esitada selleks piisav teaduslik põhjendus. Teatud olukordades võib osutuda vajalikuks kasutada täiendavaks kontrolliks kliiniliselt põhjendatud lahustit või kaubanduslikku valmistist, milles katseainet turustatakse. Tuleks olla eriliselt ettevaatlik, tagamaks, et hüdrofiilsed ained lisatakse kandeaine süsteemi, mis niisutab nahka ja ei voola kohe maha. Seetõttu tuleks täielikke vesilahuseid vältida.1.3.3 Katsemenetlus1.3.3.1 Katsete ajakavaKatse ajakava on järgmine:päev:Tehakse ükshaaval kindlaks iga looma mass ja see registreeritakse. Katselooma kummagi kõrva tagaossa annustatakse lähteannusena 25 μl katseaine, kandeaine või positiivse kontrollaine (vajadusel) sobivat lahjendust.2. ja 3. päev:Korratakse 1. päeval tehtud annustamisprotseduuri.4. ja 5. päev:Katseid ei tehta.6. päev:Registreeritakse iga looma mass. Süstitakse 250μl fosfaatpuhvri lisandiga soolalahust (PBS), mis sisaldab 20 μCi (7,4e + 8 Bq) 3H-metüültümidiini, igale katse- ja kontrollrühma hiirele sabaveeni kaudu. Alternatiivselt süstitakse 250 μL fosfaatpuhvrilisandiga soolalahust, mis sisaldab 2 μCi (7,4e + 7 Bq) 125I-jododeoksüuridiini ja 10-5 Μ-fluorodeoksüuridiini, kõikidele hiirtele sabaveeni kaudu.Viis tundi hiljem loomad surmatakse. Iga katserühma puhul lõigatakse kummastki kõrvast lahti vedelikku ärajuhtivad kõrvalesta lümfisõlmed ning uputatakse fosfaatpuhvrilisandiga soolalahusesse (katserühma proovid pannakse kokku); alternatiivselt iga üksiku looma lümfisõlmepaarid võidakse lahti lõigata ja uputada fosfaatpuhvrilisandiga soolalahusesse (ühe looma proov). Sõlme identifitseerimise ja dissekteerimise üksikasjad ja diagrammid võib leida viite 10 I lisast.1.3.3.2 Rakususpensioonide ettevalmistamineKatserühmade kokkupandud lümfisõlmerakkudest või üksikute loomade lümfisõlmepaari rakkudest valmistatakse suspensioon, kus kõik rakud õrnalt mehaaniliselt hajutatakse läbi 200 μm avaga roostevabast terasest võrgu. Lümfisõlmerakud pestakse kaks korda ohtralt fosfaatpuhvrilisandiga soolalahusega ja sadestatakse 5 % triklooräädikhappega (TCA) 4 °C juures 18 tundi (2). Graanulid kas suspendeeritakse uuesti 1 ml TCA-s ja pannakse stsintsillatsioonipudelisse, mis sisaldab 10 ml stsintsillatsioonivedelikku 3H-loendamiseks, või pannakse otse gammaloenduri torru 125I-loendamiseks.1.3.3.3 Raku vohamise (inkorporeeritud radioaktiivsuse) määramine3H-metüültümidiini inkorporeerumist mõõdetakse ß-stsintsillatsiooni loendamise teel eraldumistena minutis (DPM). 125I-jododeoksüuridiini inkorporeerumist mõõdetakse 125I-loendamise teel ning samuti väljendatakse DPM-na. Sõltuvalt kasutatud lähenemisest väljendatakse inkorporeerumist DPM-na katserühma kohta (kokkupandud proovid) või DPM-na looma kohta (üksikproovid).1.3.3.4 Vaatlused1.3.3.4.1 Kliinilised vaatlusedLoomadel tuleks hoolikalt jälgida kord päevas kliinilisi tunnuseid- kas annustamiskoha paikne ärritus või süsteemne mürgisus. Kõik vaatlused registreeritakse süstemaatiliselt, säilitades iga looma kohta eraldi andmed.1.3.3.4.2 KehamassidVastavalt punktile 1.3.3.1 tuleks mõõta iga looma kehamass katse alguses ja loomade ettemääratud surmamise hetkel.1.3.4 Tulemuste arvutamineTulemusi väljendatakse stimulatsiooniindeksina (SI). Kokkupandud proove kasutades saadakse SI, jagades iga katserühma kokkupandud radioaktiivne inkorporeerumine kandeaine-kontrollrühma kokkupandud inkorporeerumisega; selle tulemuseks on keskmine SI: Individuaalset lähenemist kasutades tuletatakse SI, jagades iga katseainerühma ja positiivse kontrollrühma keskmise DPM-i looma kohta lahusti-/kandeaine-kontrollrühma keskmise DPM-iga looma kohta. Keskmine SI kandeaine-kontrollrühmade puhul on seega 1.Individuaalse lähenemise kasutamine SI arvutamiseks võimaldab sooritada andmete statistilise analüüsi. Sobiva statistilise analüüsi meetodi valimisel peaks uurija säilitama teadlikkuse dispersioonide võimalike ebavõrdsuste kohta ja muude seotud probleemide kohta, mis võivad tingida andmete muutmise või mitteparameetrilise statistilise analüüsi. Andmete tõlgendamise piisav lähenemine on hinnata kõiki katse- ja kandeaine-kontrollrühma üksikandmeid ja saada neist kõige paremini sobiv annuse ja sellele reageerimise kõver, võttes arvesse usalduspiire (8)(12)(13). Uurija peaks jälgima rühmas esinevaid üksikute loomade võimalikke "lubatud veaga" reaktsioone, mis võivad tingida reaktsiooni alternatiivse mõõtmise (nt keskmise asemel mediaan) või lubatud vea kõrvaldamise.Otsustusprotsess seoses positiivse reaktsiooniga hõlmab stimulatsiooniindeksit >=3, kui annust ja sellele reageerimist ning vajadusel statistilist olulisust arvesse võetakse (3)(6)(8)(12)(14).Kui on vaja selgitada saadud tulemusi, tuleks arvesse võtta katseaine erinevaid omadusi, kaasa arvatud võimalik struktuuriline sarnasus tuntud naha sensibilisaatoritega, võimalik liigne nahaärritus ning annuse ja sellele reageerimise olemus. Neid ja muid kaalutlusi on arutatud üksikasjalikult viites (7).2. TULEMUSEDAndmed esitatakse kokkuvõtlikult tabeli kujul, kus on näidatud keskmised ja individuaalsed DPM-väärtused ning stimulatsiooniindeksid iga annuserühma, kaasa arvatud kandeainet saanud rühma puhul.3. PROTOKOLL3.1 KATSEPROTOKOLLKatseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet:Katseaine:- tunnusandmed (nt CASi number, kui see on olemas; algupära; puhtus; tuntud lisandid; partii number),- füüsikaline laad ja füüsikalis-keemilised omadused (nt lenduvus, stabiilsus, lahustuvus),- kui tegu on seguga, selle koostis ja koostisosade suhtelised protsendimäärad.Kandeaine:- tunnusandmed [puhtus; kontsentratsioon (vajaduse korral), kasutatud kogus],- kandeaine valiku põhjendamine.Katseloomad:- kasutatav hiirte liin,- loomade mikrobioloogiline seisund, kui see on teada,- päritolu, elamistingimused, toitumine jne,- loomade arv, vanus ja sugu.Katsetingimused:- katseaine ettevalmistamise ja kasutamise üksikasjad,- annuse valiku põhjendus, kaasa arvatud annusepiirkonna määramise katse tulemused, kui see on sooritatud; kandeaine ja katseaine kontsentratsioonid ning manustatud aine koguhulk,- üksikandmed toidu ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas).Usaldusväärsuse kontroll:- kokkuvõte viimase usaldusväärsuse kontrolli tulemustest, mis sisaldavad teavet kasutatud aine, kontsentratsiooni ja kandeaine kohta,- katselaborite praegused ja/või varasemad positiivsed ja negatiivsed kontrollandmed.Tulemused:- iga looma mass annustamise alguses ja ettemääratud surmamise hetkel,- tabel keskmiste DPM-väärtuste kohta (kokkupandud proovid) ja üksikute DPM-väärtuste kohta (üksikproovid) ning iga annuserühma (kaasa arvatud kandeaine-kontrollrühm) stimulatsiooniindeksid,- vajadusel statistilised analüüsid,- mürgisuse ilmnemise algus ja nähud, kaasa arvatud võimalik nahaärritus annustamiskohas igal loomal.Tulemuste arutelu:- lühikommentaar tulemuste, annuse ja sellele reageerimise analüüsi ning vajadusel statistiliste analüüside kohta ja järeldused selle kohta, kas katseainet tuleks pidada naha sensibilisaatoriks.4. VIITED(1) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992). The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary. Food and Chemical Toxicology 30, 165-169.(2) Kimber, I, Derman, R.J., Scholes E.W, and Basketter, D.A. (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicology, 93, 13-31.(3) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E., Hastings, K.L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. Journal of Toxicology and Environmental Health, 53, 563-79.(4) Testing Method B.6.(5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996). The local lymph node assay: status of validation. Food and Chemical Toxicology, 34, 999-1002.(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E (1996). The local lymph node assay- A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology, 34, 985-997.(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998). Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology. 36, 327-33.(8) Van Och, F.M.M, Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J., Van Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employement of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicology, 146, 49-59.(9) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998). Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde. Journal of Applied Toxicology, 18, 281-4.(10) National Institute of Environmental Health Sciences (1999). The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds: The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494, Research Triangle Park, N.C. (http://iccvam.niehs.nih.gov).(11) Testing method B.4.(12) Basketter, D.A., Selbie, E., Scholes, E.W. Lees, D. Kimber, I. and Botham, PA. (1993) Results with OECD recommended positive control sensitisers in the maximisation, Buehler and local lymph node assays. Food and Chemical Toxicology, 31, 63-67.(13) Basketter D.A., Lea L.J., Dickens A., Briggs D., Pate I., Dearman R.J., Kimber I. (1999). A comparison of statistical approaches to the derivation of EC3 values from local lymph node assay dose responses. J. Appl. Toxicology, 19, 261-266.(14) Basketter DA, Blaikie L, Derman RJ, Kimber I, Ryan CA, Gerberick GF, Harvey P, Evans P, White IR and Rycroft RTG (2000). Use of local lymph node assay for the estimation of relative contact allergenic potency. Contact Dermatitis 42, 344-48.B.43 NÄRILISTE NEUROTOKSILISUSE UURING1. MEETODKäesolev meetod on samaväärne OECD TG 424-ga (1997).Käesolev katsemeetod on välja töötatud sellise teabe saamiseks, mis on vajalik kemikaalide võimaliku neurotoksilisuse kinnitamiseks või täiendavaks iseloomustamiseks täiskasvanud loomadel. Seda saab kombineerida olemasolevate, korduva annusega toksilisuse uuringute katsemeetoditega või sooritatakse eraldi uuringuna. On soovitav, et OECD neurotoksilisuse uurimise strateegiaid ja meetodeid käsitleva juhisdokumendi (1) osas peetaks nõu, et aidata välja töötada käesoleval katsemeetodil põhinevaid uuringuid. See on eriti tähtis siis, kui võetakse arvesse käesoleva meetodi rutiinseks kasutamiseks soovitatud vaatluste ja katsemenetluste muudatusi. Juhisdokument on koostatud, et hõlbustada muude, teatavates olukordades kasutatavate katsemenetluste valikut. Käesoleva meetodi abil ei hinnata arenguga seotud neurotoksilisust.1.1 SISSEJUHATUSKemikaalide toksiliste omaduste hindamisel on oluline arvesse võtta võimalikke neurotoksilisi mõjusid. Juba korduvate annustega süsteemset toksilisust uuriv katsemeetod hõlmab vaatlusi, mis skriinivad võimalikku neurotoksilisust. Käesolevat katsemeetodit võib kasutada sellise uuringu väljatöötamiseks, mille abil saadakse lisateavet või kinnitust täheldatud neurotoksiliste mõjude kohta korduva annusega süsteemse toksilisuse uuringutes. Kemikaalide teatavate klasside võimaliku neurotoksilisuse arvessevõtmine võib viidata sellele, et neid võib sobivamalt hinnata, kasutades meetodid ilma eelnevalt korduva annusega neurotoksilisuse uuringutest saadud võimalike neurotoksilisuse märkideta. Selliste kaalutluste hulka kuuluvad nt:neuroloogiliste märkide või neuropatoloogiliste kahjustuste jälgimine muudes toksilisuse uuringutes kui korduva annusega süsteemse toksilisuse uuringud, võistruktuuriline samalaadsus või muu teave, mis seob kemikaalid tuntud neurotoksiliste ainetega.Lisaks sellele võib olla muid näiteid, kui käesoleva katsemeetodi kasutamine on vajalik, vt täiendavad üksikasjad viites (1).Käesolev meetod on välja töötatud selliselt, et seda saab kohandada vastavalt erilistele vajadustele, mis kinnitavad kemikaalide teatavat histopatoloogilist ja käitumusega seotud neurotoksilisust ning iseloomustavad ja kvantifitseerivad neurotoksilisi reaktsioone.Varem võrdsustati neurotoksilisust neuropaatiaga, millega kaasnevad neuropatoloogilised kahjustused või neuroloogilised väärtalitlused nagu atakk, halvatus või värin. Kuigi neuropaatia on neurotoksilisuse tähtis ilming, on nüüd selge, et on palju muid närvisüsteemi mürgisusnähte (nt motoorse koordinatsiooni kadumine, sensoorsed puudujäägid, õppimis- ja mäluhäired), mida ei pruugita kajastada neuropaatias või muud liiki uuringutes.Käesolev neurotoksilisust uuriv katsemeetod on välja töötatud närvi-käitumis- ja neuropatoloogiliste häirete tuvastamiseks täiskasvanud närilistel. Kuigi käitumishäired, isegi juhul, kui morfoloogilised muutused puuduvad, võivad peegeldada negatiivset mõju organismile, ei ole mitte kõik käitumismuutused närvisüsteemile omased. Seetõttu tuleks täheldatud muutusi hinnata koostoimes nii korrelatiivsete histopatoloogiliste, hematoloogiliste või biokeemiliste andmetega kui ka muud süsteemse toksilisuse liiki käsitlevate andmetega. Käesoleva meetodiga ettenähtud neurotoksiliste reaktsioonide iseloomustamiseks ja kvantifitseerimiseks tehtav uurimine hõlmab histopatoloogilisi ja käitumisega seotud menetlusi, mida võivad toetada elektrofüsioloogilised ja/või biokeemilised uuringud (1)(2)(3)(4).Neurotoksilised ained võivad toimida närvisüsteemi mitmetele osadele ja paljude mehhanismide kaudu. Kuna ükski katsesari ei ole võimeline põhjalikult hindama kõikide ainete neurotoksilist võimet, võib osutuda vajalikuks kasutada muid in vivo või in vitro katseid, mis on omased täheldatud või ootuspärase neurotoksilisuse liigile.Käesolevat katsemeetodit võib samuti kasutada koostoimes OECD neurotoksilisuse uurimise strateegiat ja meetodeid käsitlevas juhisdokumendis (1) sätestatud juhistega, et töötada välja uuringud, mis on ette nähtud täiendavaks kirjeldamiseks või annus-reaktsiooni kvantifikatsiooni tundlikkuse suurendamiseks, et paremini hinnata täheldamata negatiivse mõju määra või kinnitaksid kemikaali teadaolevaid või kahtlustatavaid ohte. Näiteks võib välja töötada uuringud, millega neurotoksilisi mehhanisme identifitseeritakse ja hinnatakse või täiendatakse andmeid, mis on saadud juba põhiliste närvi-käitumis- ja neuropatoloogiliste vaatlusprotseduuride kasutamisel. Sellistes uuringutes ei ole vaja hankida andmeid, mis on saadud juba käesoleva meetodi poolt soovitatud standardmenetluste kasutamisel, kui sellised andmed on juba olemas ja neid ei peeta vajalikuks uuringu tulemuste tõlgendamisel.Käesolev neurotoksilisuse uuring, kas eraldi või millegagi koos kasutades, annab sellist teavet, mida saab:kindlaks teha, kas närvisüsteem on alaliselt või pöörduvalt uuritud kemikaali tõttu kahjustatud;aidata kaasa selliste närvisüsteemi muutuste iseloomustamisele, mis on seotud kemikaalidega kokkupuutega ja aluseks oleva mehhanismi mõistmisele;kindlaks määrata annuse ja selle reaktsiooni ning aja ja reaktsiooni suhted, et hinnata täheldamata negatiivse mõju määra (mida saab kasutada kemikaalide ohutuskriteeriumide loomisel).Käesolevas katsemeetodis manustatakse katseainet suu kaudu. Võib kasutada ka muid manustamisteid (nt naha kaudu või sisse hingates), kuid see võib eeldada soovitatud protseduuride muutmist. Manustamistee valiku kaalutlused sõltuvad inimeste kokkupuute profiilist ja olemasolevast toksikoloogilisest või kineetilisest teabest.1.2. MÕISTEDKahjulik mõju – selline töötlemisega seotud muutus algtasemest, mis vähendab organismi võimet ellu jääda, sigida või kohaneda keskkonnaga.Annus – manustatava katseaine kogus. Annust väljendatakse massina (g, mg) või katseaine massina katselooma massiühiku kohta (nt mg kg kohta) või konstantsete toidukontsentratsioonidega (ppm).Annustamine – üldmõiste, mis hõlmab annust, annustamise sagedust ja kestust.Neurotoksilisus – negatiivne muutus närvisüsteemi struktuuris ja funktsioonis, mis tuleneb kemikaali, bioloogilise või füüsilise mõjuritega kokkupuutest.Neurotoksiline aine – kemikaal, bioloogiline või füüsiline mõjur, mis võib põhjustada neurotoksilisust.NOAEL – lühend täheldamata-kahjuliku-mõju määra kohta ja see on kõrgeim annusmäär, kus ei ole täheldatud kahjulikke, katse tegemisega seotud leide.1.3 KATSEMEETODI PÕHIMÕTEKatsekemikaali manustatakse suu kaudu erinevat annustena laborinäriliste mitmele rühmale. Korduvad annused on tavaliselt eeldatud, ning annustamisrežiim võib olla 28 päeva, subkrooniline 90 päeva või krooniline 1 aasta või kauemgi. Käesolevas katsemeetodis sätestatud menetlusi võib samuti kasutada ägeda neurotoksilisuse uuringuks. Loomi uuritakse, et tuvastata või iseloomustada käitumise ja/või neuroloogilisi kõrvalekaldeid. Igal vaatlusperioodil hinnatakse neurotoksiliste ainete mõjutatud hulka käitumisi. Katse lõpus osale loomadest (igas katserühmast, mõlemast soost) tehakse in situ perfusioon ning ajust, seljaajust ja perifeersetest närvidest prepareeritakse lõiked ja neid uuritakse.Kui uuring tehakse eraldi uuringuga neurotoksilisuse skriinimiseks või neurotoksiliste mõjude iseloomustamiseks, võib kasutada igast rühmast loomi, keda ei kasutatud perfusioonil ja hiljem histopatoloogilisel uuringul (vt tabel 1), teatavate närvi-käitumis-, neuropatoloogilistel, neurokeemilistel või elektrofüsioloogilistel protseduuridel käesoleva meetodi (1) poolt nõutavatest standarduuringutest saadud andmete täiendamiseks. Need täiendavad protseduurid võivad olla eriti kasulikud, kui empiirilised vaatlused või oodatavad mõjud viitavad kemikaali neurotoksilisuse teatavale liigile või sihtmärgile. Alternatiivselt võib kasutada allesjäänud loomi sellistel hindamistel, mis on ette nähtud närilistega tehtavate korduva annusega toksilisuse uuringute katsemeetodites.Kui käesoleva katsemeetodi protseduure kombineeritakse muude katsemeetodite protseduuridega, on vaja piisavalt loomi mõlemate uuringute vaatluste nõuete rahuldamiseks.1.4 KATSEMEETODI KIRJELDUS1.4.1 Loomaliikide valikEelistatud näriliste liik on rotid, kuigi võib põhjenduse korral kasutada ka näriliste teisi liike. Rakendatakse noorte täiskasvanute ja tervete loomade enimkasutatavaid laboritüvesid. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Annustamist tuleks alustada tavaliselt nii kiiresti kui võimalik pärast võõrutamist, soovitavalt mitte enne, kui loomad on kuuenädalased, ja igal juhul enne, kui loomad on üheksanädalased. Kui käesolevat uuringut siiski kombineeritakse muude uuringutega, on vaja kohandada vanusenõuet. Uuringut alustades peaks loomade massi muutus olema minimaalne ja ei tohiks ületada ± 20 % iga soo keskmisest massist. Kui tehakse korduva annusega lühiajaline uuring pikaajalise uuringu alguuringuna, tuleks kasutada mõlemas uuringus samast liinist ja sama päritolu loomi.1.4.2 Loomade pidamise ja toitmise tingimusedLoomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 °C (± 3 °C). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt ei ületa 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal peaks see olema 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Valju katkendlikku heli tuleks vältida. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega. Toiduvalikut võib mõjutada vajadus tagada katseaine sobiv lisamine, kui katseainet manustatakse käesoleva meetodi abil. Loomi võib hoida eraldi või väikestes samast soost loomade rühmades.1.4.3 Loomade ettevalmistamineTerved noored loomad määratakse juhuvaliku alusel kontroll- ja katserühma. Puurid asetatakse nii, et puuri asetamisest tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Loomad identifitseeritakse individuaalselt ja hoitakse oma puurides vähemalt viis päeva enne uurimuse alustamist, et võimaldada laboritingimustega kohanemist.1.4.4 Manustamisviis ja annuste ettevalmistamineKäesolevas katsemeetodis manustatakse katseainet suu kaudu. Suu kaudu saab manustada sondi abil, toiduga, joogiveega või kapslitena. Võib kasutada ka muid manustamisviise (nt naha kaudu või sisse hingates), kuid see võib eeldada soovitatud protseduuride muutmist. Manustamisviisi valiku kaalutlused sõltuvad inimeste kokkupuute omadustest ja olemasolevast toksikoloogilisest või kineetilisest teabest. Tuleks ära märkida põhjendus manustamisviisi valimiseks ning käesoleva meetodi protseduuride muudatuste tegemiseks.Vajadusel lahustatakse või suspendeeritakse katseaine sobivas kandeaines. On soovitav, et võimaluse korral kaalutakse esmalt vesilahuse/-suspensiooni kasutamist, seejärel õlilahuse/-emulsiooni (nt maisiõli) kasutamist ja siis võimalikku muude kandealuste lahust/suspensiooni. Kandeaine toksilised omadused peaksid olema teada. Lisaks sellele tuleks arvesse võtta järgmisi kandeaine omadusi: katseaine absorbtsiooni, jaotamist, metabolismi või peetumist käsitlevad mõjud; katseaine keemilisi omadusi käsitlevad mõjud, mis võivad muuta toksilisi omadusi; ning loomade toidu- või veetarbimist või toitumust käsitlevad mõjud.1.5 PROTSEDUURID1.5.1 Loomade arv ja suguKui uuring tehakse eraldi uuringuga, tuleks kasutada vähemalt 20 looma (10 emaslooma ja 10 isaslooma) igas annus- ja kontrollrühmas üksikasjalike kliiiniliste ja funktsionaalsete vaatluste hindamiseks. Vähemalt viiele isasloomale ja viiele emasloomale, kes on valitud nimetatud 10 isaslooma ja 10 emaslooma hulgast, teha perfusioon in situ ja kasutada neid üksikasjalikus neurohistopatoloogilises uuringus katse lõpus. Juhul, kui vaadeldakse üksnes piiratud arvu antud annusrühmas olevaid loomi neurotoksiliste mõjude tunnuste osas, tuleks arvesse võtta nimetatud loomade lisamist nende hulka, kes valitakse perfusiooniks. Kui uuring tehakse koos korduva annusega toksilisuse uuringuga, tuleks kasutada piisavalt loomi mõlema uuringu eesmärkide täitmiseks. Loomade minimaalne arv iga rühma kohta erinevate uuringute kombinatsioonides on toodud tabelis 1. Kui osa loomades surmatakse uuringu kestel või suunatakse toibuvatest loomadest koosnevasse rühma toksiliste mõjude pöörduvuse, püsivuse või hilisema esinemise vaatlemiseks katse järel või kui kaalutakse täiendavaid vaatlusi, siis tuleks suurendada loomade arvu, tagamaks, et vaatluseks ja histopatoloogilisteks uuringuteks oleks kättesaadav nõutav arv loomi.1.5.2 Katse- ja kontrollrühmTuleks kasutada vähemalt kolme katse- ja kontrollrühma, kuid kui muude andmete hindamisel ei eeldata ühtegi mõju korduva annusega 1000 mg kg kehamassi kohta päevas, võib teha piirkatse. Kui puuduvad sobivad andmed, tuleks teha annuse piirkonna määramise katse, et aidata kindlaks määrata kasutatavaid annuseid. Kontrollrühma loomi käsitletakse sarnaselt katserühma loomadega, kuid neile ei anta uuritavat ainet. Kui kandeainet kasutatakse katseaine manustamisel, peaks kontrollrühm saama kandeainet suurima kasutatud kogusena.1.5.3. Usaldusväärsuse kontrollUuringut teostav labor peaks esitama andmed oma võime kohta teostada uuringut ja kasutatud protseduuride tundlikkuse kohta. Sellised andmed peaksid tõendama võimet tuvastada ja kvantifitseerida muutusi lõpp-punktides, mille vaatlemist soovitatakse. Nendeks on autonoomsed sümptomid, sensoorne reaktiivsus, jäseme haardejõud ja motoorne aktiivsus. Teave kemikaalide kohta, mis põhjustavad erinevat liiki neurotoksilisi reaktsioone ja mida võib kasutada positiivsete kontrollainetena, võib leida viidetes 2–9. Varasemaid andmeid võib kasutada, kui katsemenetluste olulised aspektid jäävad samaks. Varasemate andmete perioodiline ajakohastamine on soovitav. Protseduuride jätkuvat tundlikkust tõendavad uued andmed tuleks luua, kui katset sooritav labor on muutnud katse tegemise mõningaid olulisi osasid või menetlusi.1.5.4. Annuse valikAnnusemäärade valimisel tuleks võtta arvesse kõiki katseühendi või sellega seotud ainete saadaolevaid varem saadud toksilisuse ja kineetilisi andmeid. Kõrgeim annusemäär tuleks valida eesmärgiga põhjustada neurotoksilisi mõjusid või selgeid süsteemseid toksilisi mõjusid. Tuleks valida annusmäärade alanev järjestus, eesmärgiga näidata annusega seotud reaktsiooni ja mittetäheldatud kahjulikku mõju (NOAEL) väikseima annusemäära puhul. Põhimõtteliselt tuleks annusemäärad kehtestada nii, et saaks eristada algseid toksilisi mõjusid närvisüsteemile süsteemse toksilisusega seotud mõjudest. Kahe- või kolmekordsed vahemikud on sageli optimaalsed ning sageli on eelistatud neljanda katserühma lisamine väga suurte vahemike (nt üle 10-kordne tegur) annuste vahel. Kui inimese vastuvõtlikkuse kohta on olemas mõistlik hinnang, tuleks seda arvesse võtta.1.5.5 PiirkatseKui katse ühe annusega, milleks on vähemalt 1000 mg kg kehamassi kohta, kasutades kirjeldatud protseduure, ei põhjusta täheldatavaid neurotoksilisi mõjusid ja kui toksilisus ootuspäraselt põhineb struktuurselt lähedaste ainete andmetel, siis ei peeta kolme annuse taset käsitlevat täielikku uuringut vajalikuks. Inimeste ootuspärane kokkupuude võib viidata piirkatses kasutavatest suukaudsetest annustest suuremate annuste kasutamise vajadusele. Muude manustamisviiside korral, nagu näiteks sissehingamine või naha kaudu manustamine, võivad katseaine füüsikalis-keemilised omadused tihti viidata suurimale kokkupuutetasemele. Ägeda suukaudse uuringu tegemiseks peaks piirkatse annus olema vähemalt 2000 mg/kg.1.5.6 Annuste manustamineLoomadele annustatakse katseainet kord päevas, seitse päeva nädalas, vähemalt 28 päeva; viiepäevase annustamisrežiimi või lühema kokkupuute perioodi kasutamist on vaja põhjendada. Katseainet manustatakse ühekordse annusena sondi abil söögitoru kaudu või sobiva intubeerimise kanüüli abil. Vedeliku suurim kogus, mida saab ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Kogus ei tohiks ületada 1 ml/100 g kehamassi kohta. Vesilahuste puhul võib siiski manustada 2 ml/100 g kehamassi kohta. Arvesse võtmata ärritavaid või söövitavaid aineid, mille mõjud tavaliselt halvenevad suuremate kontsentratsioonide korral, tuleks vähendada katsekoguse varieeruvust, reguleerides kontsentratsioone nii, et kogumaht kõikide annuste korral jääks samaks.Toidu või joogivee kaudu manustatud ainete puhul on oluline tagada, et hõlmatud katseaine kogused ei häiriks tavapärast toitumist või veetasakaalu. Kui katseainet manustatakse toiduga kas püsiva toidukontsentratsioonina (ppm) või võidakse kasutada püsivat annusemäära looma kehamassi suhtes, siis tuleb täpsustada kasutatud alternatiivi. Sondi kaudu manustatud aine puhul tuleks annus anda samal kellaajal iga päev ja kohandada vähemalt igal nädalal, et säilitada konstantne annusemäär looma kehamassi suhtes. Kui korduva annusega uuringut tehakse pikaajalise uuringu alguuringuga, tuleks kasutada mõlemas uuringus sama toitu. Erandkorras, kui ühekordne annus ei ole võimalik, manustatakse annust väiksemates osades kuni 24 tunni jooksul.1.6 VAATLUSED1.6.1 Vaatluste ja katsete sagedusKorduva annusega uuringutes peaks vaatlusperiood hõlmama annustamisperioodi. Akuutsetes uuringutes tehakse vaatlusi katse järel 14 päeva. Satelliitrühma kuuluvate loomade puhul, keda hoitakse kokkupuutumise eest katsejärgsel perioodil, peaks vaatlused hõlmama sama perioodi.Vaatlusi tuleks teha piisavalt sageli, et suurendada mis tahes käitumisega seotud ja/või neuroloogiliste kõrvalekallete tuvastamise tõenäosust. Vaatlusi peaks tegema soovitavalt sama ajal iga päev, võttes arvesse oodatavate mõjude kõrghetke pärast annustamist. Kliiniliste vaatluste ja funktsionaalsete katsete sagedus on esitatud kokkuvõtlikult tabelis 2. Kui varasematest uuringutest saadud kineetilised või muud andmed viitavad vajadusele kasutada erinevaid vaatlus-, katse- või vaatlusjärgseid aja hetki, tuleks vastu võtta alternatiivne ajakava maksimaalse teabe saamiseks. Ajakava muudatuste kohta tuleks esitada põhjendus.1.6.1.1 Üldise tervisliku seisundi ja suremuse/haigestumuse vaatlusedKõiki loomi tuleks hoolikalt vaadelda vähemal kord päevas nende tervisliku seisundit arvesse võttes ning vähemalt kaks korda päevas haigestumuse ja suremuse osas.1.6.1.2 Üksikasjalikud kliinilised vaatlusedÜksikasjalikud kliinilised vaatlused tuleks teha kõikide loomade kohta, kes on valitud sel eesmärgil (vt tabel 1), üks kord enne esimest kokkupuudet (et võimaldada sama katselooma käsitlevaid võrdlusi) ja seejärel erinevate ajavahemike tagant, sõltuvalt uuringu kestusest (vt tabel 2). Üksikasjalikud kliinilised vaatlused toibuvate loomade satelliitrühmade kohta tuleks teha toibumisperioodi lõpus. Üksikasjalikud kliinilised vaatlused tuleks teha looma oma puurist väljaspool standardalal. Neid peaks hoolikalt registreerima, kasutades punktisüsteeme, mis hõlmavad kriteeriume või punktiskaalasid iga vaatluse käigus tehtava mõõtmise kohta. Kasutatavad kriteeriumid või skaalad tuleks selgesõnaliselt määratleda katselabori poolt. Tuleb püüda tagada, et muutused katsetingimustes oleksid minimaalsed (mitte süsteemselt seotud katsega) ning et vaatlusi teeks koolitatud vaatlejad, kes ei ole teadlikud tegelikust käsitlemisest.On soovitav, et vaatlusi tehtaks struktuurselt, et täpselt määratletud kriteeriume (kaasa arvatud määratlus - normaalne "vahemik") kohaldatakse süsteemselt iga looma suhtes igal vaatlusel. "Normaalne vahemik" tuleks adekvaatselt dokumenteerida. Kõik täheldatud sümptomid tuleks registreerida. Kui see on teostatav, tuleks registreerida ka täheldatud sümptomite suurus. Kliinilised vaatlused peaksid hõlmama, kuid mitte ainult, naha, karvkatte, silmade, limaskestade, eritiste esinemise ja autonoomse aktiivsuse (nt pisaravool, piloerektsioon, pupilli suurus, ebatavaline hingamismudel ja/või suu kaudu hingamine (lõõtsutamine), kõik urineerimise või roojamisega seotud ebatavalised sümptomid ning uriini värvumine) muutusi.Kõik ebatavalised reaktsioonid seoses kehaasendi, aktiivsuse astme (nt standardala vähenenud või suurenenud uurimine) ning liigutuste koordinatsiooniga tuleks samuti üles märkida. Muutused kõnnakus (nt taarumine, ataksia), kehaasendis (nt küürus selg) ning käsitlemise, asetamise või muude keskkonnaga stiimulitega seotud reaktiivsuses ning klooniliste või tooniliste liigutuste, krampide või värinate esinemine, stereotüübid (nt ülemäärane sugemine, ebatavalised pea liigutused, korduv tiirutamine) või veider käitumine (nt hammustamine või ülemäärane lakkumine, enesesandistamine, tagurpidi kõndimine, häälitsemine) või agressiivsus tuleks registreerida.1.6.1.3 Funktsionaalsed katsedSarnaselt üksikasjalikele kliinilistele vaatlustele, tuleks funktsionaalsed katsed samuti teostada üks kord enne kokkupuudet ja seejärel sageli kõiki loomadega, kes on sel eesmärgil välja valitud (vt tabel 1). Funktsionaalsete katsete tegemise sagedus on samuti sõltuv uuringu kestuses (vt tabel 2). Lisaks tabelis 2 sätestatud vaatlusperioodidele tuleks funktsionaalsed vaatlused toibuvate loomade satelliitrühmade suhtes samuti teha võimalikult lähedal lõplikule surmamisele. Funktsionaalsetes katsetes peaks käsitlema sensoorset reaktiivsust erinevatele stiimulitele [nt kuulmis-, nägemis- ja propriotseptoorsed stiimulid (5)(6)(7)], jäseme haardejõu hindamine (8) ja motoorse tegevuse hindamine (9). Motoorset tegevust tuleks mõõta automaatseadme abil, mis on võimeline avastama nii tegevuse vähenemise kui suurenemise. Kui kasutatakse muud kindlaksmääratud süsteemi, peaks see olema kvantitatiivne ning selle tundlikkus ja usaldusväärsus peaksid olema tõendatud. Iga seadet tuleb testida selle usaldusväärsuse tagamiseks aja jooksul ja seadmete vastavuse tagamiseks. Järgitavate protseduuride täiendavad üksikasjad on toodud vastavates viidetes. Kui puuduvad andmed (nt struktuuraktiivsus, epidemioloogilised andmed, muud toksikoloogilised uuringud), mis viitaksid võimalikele neurotoksiliste mõjudele, tuleks kaaluda sensoorseid ja motoorseid funktsioone või õppimist ja mälu uurivate täpsemate katsete lisamist nimetatud võimalike mõjude uurimiseks üksikasjalikumalt. Viites (1) on esitatud rohkem teavet täpsemate katsete ja nende kasutamise kohta.Erandkorras, loomad, kel ilmnevad mürgisusnähud sellises ulatuses, et see oluliselt häiriks funktsionaalse katse sooritamist, võib katsest välja jätta. Tuleks esitada loomade funktsionaalsest katsest väljajätmise põhjendus.1.6.2 Kehamass ja toidu/vee tarbimineKuni 90-päevaste uuringute puhul tuleks loomi kaaluda vähemalt kord nädalas ja mõõtmisi tuleks teha toidu tarbimise kohta (vee tarbimine, kui katseainet manustatakse nimetatud keskkonnas) vähemalt kord nädalas. Pikaajaliste uuringute puhul tuleks kaaluda kõiki loomi vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala jooksul ja seejärel vähemalt kord iga 4 nädala tagant. Mõõtmisi toidu tarbimise kohta (vee tarbimine, kui katseainet manustatakse nimetatud keskkonnas) tuleks teha vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala jooksul ja seejärel ligikaudu kolmekuuliste intervallide tagant, välja arvatud juhul, kui tervislik seisundi või kehamassi muutumine näeb ette teisiti.1.6.3 OftalmoloogiaPikemate kui 28-päevaste uuringute puhul tuleks teha oftalmoloogiline uuring, kasutades oftalmoskoopi või samalaadset sobivat instrumenti, enne katseaine manustamist ja katse lõpetamisel, eelistatavalt kõikide loomadega, kuid vähemalt loomadega, kes on suure annusemääraga või kontrollrühmades. Kui avastatakse muutused silmades või kui kliinilised tunnused viitavad selle vajadusele, tuleks uurida kõiki loomi. Pikaajaliste uuringute puhul tuleks teha oftalmoloogiline uuring 13 nädala jooksul. Oftalmoloogilisi uuringuid ei ole vaja teha, kui selle kohta on juba olemas andmed, mis on saadud muudest, sarnase kestusega ja samalaadse annusemääraga uuringutest.1.6.4 Hematoloogia ja kliiniline biokeemiaKui neurotoksilisuse uuring tehakse koos korduva annusega süsteemse toksilisuse uuringuga, tuleks teha hematoloogilised uuringud ja kliinilise biokeemia määramised vastavalt süsteemse toksilisuse uuringu asjaomasele meetodile. Proove tuleks koguda selliselt, et vähendatakse kõiki võimalikke mõjusid neuroloogilisele käitumisele.1.6.5 HistopatoloogiaNeuropatoloogiline uuring tuleks välja töötada uuringu in vivo etapis tehtud vaatluste täiendamiseks ja laiendamiseks. Proovid vähemalt viie looma kudedest soo ja rühma kohta (vt tabel 1 ja järgmine lõige) fikseeritakse in situ, kasutades üldtunnustatud perfusiooni- ja fiksatsioonitehnikat (vt viite 3 5. peatükk ja viite 4 50. peatükk). Kõik täheldatavad suured muutused tuleks registreerida. Kui uuringut teostatakse eraldi uuringuga neurotoksilisuse skriinimiseks või neurotoksiliste mõjude iseloomustamiseks, võib kasutada ülejäänud loomi kas teatavate neuroloogilise käitumisega seotud (10)(11), neuropatoloogilistes (10)(11)(12)(13), neurokeemilistes (10)(11)(14)(15) või elektrofüsioloogilistes (10)(11)(16)(17) protseduurides, mis võivad täiendada siin kirjeldatud protseduure ja uuringuid, või kasutada histopatoloogias uuritavate subjektide arvu suurendamiseks. Need täiendavad protseduurid võivad olla eriti kasulikud, kui empiirilised vaatlused või oodatavad mõjud viitavad kemikaali neurotoksilisuse (2)(3) teatavale liigile või sihtmärgile. Alternatiivselt võib ülejäänud loomi samuti kasutada rutiinsetes patoloogilistes hindamistes, nagu on kirjeldatud korduvate annustega uuringute meetodis.Kõik parafiini valatud koeproovid värvitakse üldise värvimisprotseduuri abil, nt hematoksüliin ja eosiin (H&E), ning neid uuritakse mikroskoopiliselt. Kui täheldatakse või kahtlustatakse perifeerse neuropaatia sümptomeid, tuleks uurida plastikusse valatud perifeerse närvikoe proove. Kliinilised tunnused võivad anda põhjust uute kohtade uurimisele või eriliste värvimismenetluste kasutamisele. Viidetes (3) ja (4) on antud juhised täiendavate uuringukohtade kohta. Samuti võivad sobivad erivärvid olla abiks teatud liiki patoloogilistele muutustele viitamisel (18).Kesk- ja perifeerse närvisüsteemi representatiivsed lõike tuleks uurida histoloogiliselt (vt viite 3 5. peatükk ja viite 4 50. peatükk). Uuritavad alad peaksid tavaliselt sisaldama järgmist: eesaju, suuraju keskosa, sh hipokampi läbiv lõige, keskaju, väikeaju, ajusild, piklikaju, silm koos nägemisnärviga ja võrkkestaga, seljaaju kaela- ja nimmetüve kohal, spinaalganglion, spinaal- ja ventraalnärvikiud, proksimaalne istmikunärv, proksimaalne säärenärv (põlves) ja säärenärvipoolsed sääremarjalihase harud. Seljaajust ja perifeersest närvist tehtavate lõigete hulka kuuluvad nii rist- kui pikilõiked. Tähelepanu tuleks pöörata närvisüsteemi veresoonestikule. Samuti tuleks uurida skeletilihasest, eelkõige sääremarjalihasest võetud proovi. Erilist tähelepanu tuleks pöörata kesk- ja perifeerse närvisüsteemi kohtadele, mille raku- ja kiustruktuur ja –tüüp on teatavasti eriti mõjutatud neurotoksiliste ainete poolt.Viidetes (3)(4) on toodud selliseid neuropatoloogilisi muutusi käsitlev juhend, mida põhjustab kokkupuude toksiliste ainetega. Etapiviisiline koeproovide uuring on soovitav, milles võrreldakse esmalt suure annusega rühma lõikeid kontrollrühma lõigetega. Kui ei ole täheldatud neuropatoloogilisi muutusi nimetatud rühmade proovides, ei ole vaja teha hilisemaid analüüse. Kui neuropatoloogilisi muutusi on täheldatud suure annusega rühmas, tuleks seejärel keskmiste ja väikese annusega rühma igast võimalikust mõjutatud koest võetud proovid kodeerida ja hiljem neid uurida.Kui leitakse tõendeid neuropatoloogiliste muutuste kohta kvalitatiivses uuringus, siis tuleks teha teine uuring kõikides närvisüsteemi piirkondades, kus nimetatud muutused esinevad. Kõikide annuserühmade igast võimalikust mõjutatud piirkonnased võetud lõiked tuleks kodeerida ja neid tuleks uurida juhuslikult ilma koodi teadmata. Iga kahjustuse sagedus ja raskusaste tuleks registreerida. Pärast seda, kui kõikide annuserühmade kõiki piirkondi on hinnatud, saab koodi murda ja teha statistilise analüüsi annuse ja sellele reageerimise suhte hindamiseks. Erineva raskusastmega kahjustuse näiteid tuleks kirjeldada.Neuropatoloogilisi leide tuleks hinnata käitumisega seotud vaatluste ja mõõtmiste kontekstis ning katseaine varasematest ja praegustest süsteemse toksilisuse uuringutest saadud muude andmete põhjal.2. TULEMUSED2.1 TULEMUSTE TÖÖTLEMINETulemused esitatakse iga üksiku looma kohta. Lisaks sellele tuleks esitada kõik andmed kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates iga katse- või kontrollrühma puhul ära loomade arvu katse alguses, katse käigus surnud või humaanselt surmatud loomade arvu ning kõikide surmade või humaansete tapmiste aja, mürgisusnähtude arvu, täheldatud mürgisusnähtude kirjelduse, sh toksiliste mõjude algusaja, kestuse, liigi ja raskuse, kahjustustega loomade arvu, sh kahjustus(t)e liik ja raskus.2.2 TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINEUuringu avastusi peaks hindama neuroloogiliste käitumisega seotud ja neuropatoloogiliste mõjude (neurokeemilised või eletkrofüsioloogilised mõjud ning kui lisatakse täiendavad uuringud) esinemissageduse, raskuse ja korrelatsiooni osas ning kõikide muude negatiivsete mõjude osas. Võimaluse korral tuleks hinnata numbrilisi tulemuse sobiva ja üldiselt heakskiidetud statistilise meetodi abil Statistilised meetodid tuleks valida uuringu väljatöötamise ajal.3. PROTOKOLL3.1 KATSEPROTOKOLLKatseprotokoll peab hõlmama järgmist teavet:Katseaine:- füüsiline laad (sh isomeersus, puhtus ja füüsikalis-keemilised omadused),- tunnusandmed.Kandeaine (vajadusel):- kandeaine valiku põhjendamine.Katseloomad:- kasutatud liigid/liinid,- loomade arv, vanus ja sugu,- päritolu, pidamistingimused, kohanemine, toitumine jne,- iga looma kaal katse alguses.Katsetingimused:- katseaine valmistise/toiduvalmistise üksikandmed, saavutatud kontsentratsioon, valmistise stabiilsus ja homogeensus,- manustatavate annuste täpsustamine, sh kandeaine, mahu ja manustatava aine füüsilise vormi üksikasjad,- katseaine manustamise üksikasjad,- annusemäärade valiku põhjendus,- põhjendus kokkupuute viise ja kestuse kohta,- toidu/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni (ppm) muutmine tegelikuks annuseks (mg/kg kehamassi kohta päevas), vajaduse korral,- üksikasjad toidu- ja veekvaliteedi kohta.Vaatlus ja katsemenetlused:- üksikasjad igast rühmast loomade määramise kohta perfusiooni alamrühmadesse,- punktisüsteeme käsitlevad üksikasjad, sh üksikasjalike kliiniliste vaatluste iga mõõtmise kriteeriumid ja punktiskaalad,- üksikasjad funktsionaalsete katsete kohta, milles uuritakse sensoorset reaktiivsust erinevatele stiimulitele (nt kuulmis-, nägemis- ja propriotseptoorsed stiimulid); hinnatakse jäseme haardejõudu; hinnatakse motoorset tegevust (sh üksikasjad automaatseadmete kohta, mis avastavad tegevust); ja muude kasutatavate menetluste kohta,- üksikasjad oftalmoloogiliste uuringute kohta ja vajadusel hematoloogiliste uuringute ning kliinilise biokeemia katsete kohta ning asjaomase lähtetaseme väärtuste kohta,- üksikasjad teatavate neuroloogiliste käitumisega seotud, neuropatoloogiliste, neurokeemiliste või elektrofüsioloogiliste menetluste kohta.Tulemused:- kehamass/kehamassi muutused, sh kehamass surmamise hetkel,- toidu ja vee tarbimine vajadusel,- toksilist reaktsiooni käsitlevad andmed ja annusemäär, sh toksilisuse või suremuse sümptomid,- üksikasjalike kliiniliste vaatluste (pöörduvad või pöördumatud) olemuse, raskuse ja kestuse kohta (algusaeg ja edasine käik),- funktsionaalsete katsete tulemuste üksikasjalik kirjeldus,- lahangu leiud,- vajadusel kõikide neuroloogiliste käitumisega seotud, neuropatoloogiliste ja neurokeemiliste või elektrofüsioloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus,- andmed absorbtsiooni ja metabolismi kohta (kui seda on mõõdetud),- vajadusel tulemuste statistiline töötlemine.Tulemuste arutelu:- teave annuse ja sellele reageerimise kohta,- muude toksiliste mõjude seos uuritud kemikaali võimaliku neurotoksilisuse kohta tehtud järeldusega,- täheldamata negatiivse mõju tase.Järeldused:- uuritava kemikaali üldist neurotoksilisust käsitlevat erimärget soositakse.4. VIITED(1) OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.(2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.(3) World Health Organization (WHO) (1986). Environmental Health Criteria document 60: Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemicals.(4) Spencer, PS. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, PS. and Schaumburg, H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/ London.(5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurological Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999-1003.(6) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704.(7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. Pharmacol., 108, 267-283.(8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233-236.(9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599-609.(10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.(11) Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. Marcel Dekker, New York.(12) Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxicity Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689-695.(13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. (1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydroxyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18, 343-352.(14) O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445-452.(15) O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368-378.(16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Electrophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, pp. 299-335.(17) Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neurotoxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicology. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wilkins Co., Baltimore/London, pp. 726-742.(18) Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Techniques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livingstone.Tabel 1Minimaalne loomade arv rühmas, kui neurotoksilisuse uuringut tehakse eraldi või koos muude uuringutega| NEUROTOKSILISUSE UURING, MIS ON TEHTUD: |eraldi uuringuna | kombineeritud 28-päevase uuringuga | kombineeritud 90-päevase uuringuga | kombineeritud kroonilise toksilisuse uuringuga |Loomade koguarv rühma kohta | 10 isaslooma ja 10 emaslooma | 10 isaslooma ja 10 emaslooma | 15 isaslooma ja 15 emaslooma | 25 isaslooma ja 25 emaslooma |Funktsionaalsete katsete, sh üksikasjalike kliiniliste vaatluste jaoks välja valitud loomade arv | 10 isaslooma ja 10 emaslooma | 10 isaslooma ja 10 emaslooma | 10 isaslooma ja 10 emaslooma | 10 isaslooma ja 10 emaslooma |Perfusiooniks in situ ja neurohistopatoloogiaks valitud loomade arv | 5 isaslooma ja 5 emaslooma | 5 isaslooma ja 5 emaslooma | 5 isaslooma ja 5 emaslooma | 5 isaslooma ja 5 emaslooma |Loomade arv, kes on välja valitud korduva annusega/subkroonilise/kroonilise mürgisuse vaatlustes, hematoloogias, kliinilises biokeemias, histopatoloogias jne, nagu on märgitud vastavates juhendites | | 5 isaslooma ja 5 emaslooma | 10 isaslooma [1] ja 10 emaslooma [1] | 20 isaslooma [1] ja 20 emaslooma [1] |Vajadusel täiendavad vaatlused | 5 isaslooma ja 5 emaslooma | | | |Tabel 2Kliiniliste vaatluste ja funktsionaalsete katsete sagedusVaatluste liik | Uuringu kestus || | Äge | 28-päevane | 90-päevane | Krooniline |Kõikidel loomadel | üldine tervislik seisund | kord päevas | kord päevas | kord päevas | kord päevas |suremus/haigestumus | kaks korda päevas | kaks korda päevas | kaks korda päevas | kaks korda päevas |Funktsionaalseteks vaatlusteks valitud loomadel | üksikasjalikud kliinilised vaatlused | enne esimest kokkupuudet8 tunni jooksul pärast annustamist ajal, mil mõju on hinnanguliselt suurim7. ja 14. päeval pärast annustamist | enne esimest kokkupuudetseejärel kord nädalas | enne esimest kokkupuudetkord esimese ja teise kokkupuutenädala jooksulseejärel kord kuus | enne esimest kokkupuudetkord esimese kokkupuutekuu lõpusseejärel iga kolme kuu tagant |Funktsionaalsed katsed | enne esimest kokkupuudet8 tunni jooksul pärast annustamist ajal, mil mõju on hinnanguliselt suurim7. ja 14. päeval pärast annustamist | enne esimest kokkupuudetneljandal annustamisnädalal võimalikult lähedal kokkupuuteperioodi lõpule | enne esimest kokkupuudetkord esimese ja teise kokkupuutenädala jooksulseejärel kord kuus | enne esimest kokkupuudetkord esimese kokkupuutekuu lõpusseejärel iga kolme kuu tagant |--------------------------------------------------LISA 2IC.21. MULLAMIKROOBID: LÄMMASTIKU TRANSFORMATSIOONI KATSE1. MEETODKäesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 216 (2000).1.1 SISSEJUHATUSKäesolev katsemeetod kirjeldab laborimeetodit, mis on välja töötatud kemikaalide pikaajaliste mõjude uurimiseks mullamikroobide lämmastiku transformatsiooni suhtes pärast ühekordset kokkupuudet Katse põhineb peamiselt Euroopa ja Vahemeremaade taimekaitseorganisatsiooni soovitustel (1). Samuti võetakse arvesse muid juhised, sh Saksa Biologische Bundesanstalti (2), USA Keskkonnakaitseagentuuri (3), SETACi (4) ja Rahvusvahelise Standardiorganisatsiooni (5) juhiseid. Käesolevas katses kasutatavate mullaproovide arvu ja tüüpide osas lepiti kokku mulla ja sedimentide valikut käsitlevas OECD töörühmas, mis tuli kokku Belgirates Itaalias 1995. aastal (6). Mullaproovide kogumist, käsitlemist ja säilitamist käsitlevad soovitused põhinevad ISO juhisdokumendil (7) ja Belgirate töörühma soovitustel. Katseainete toksiliste omaduste hindamisel võib osutuda vajalikuks määrata kindlaks mõjud mulla mikroobsele aktiivsusele, nt kui vajatakse andmeid põllukultuuride kaitsevahendite võimalike kõrvalmõjude kohta mulla mikrofloora suhtes või kui eeldatakse mullamikroobide kokkupuudet muude kemikaalidega kui põllukultuuride kaitsevahendid. Lämmastiku transformatsiooni katse tehakse selleks, et kindlaks määrata selliste kemikaalide mõju mulla mikrofloorale. Kui uuritakse agrokemikaale (nt põllukultuuride kaitsevahendid, väetised, metsanduskemikaalid), sooritatakse nii lämmastiku transformatsiooni kui ka süsiniku transformatsiooni katse. Kui uuritakse muid kui agrokemikaale, piisab lämmastiku transformatsiooni katsest. Kui selliste kemikaalide lämmastiku transformatsiooni katses saadud EC50-väärtused on kaubanduslike nitrifikatsiooniinhibiitorite (nt nitrapüriin) esindavas vahemikus, saab täiendava teabe kogumiseks teha süsiniku transformatsiooni katse.Muld koosneb elusatest ja elututes koostisosadest, mis eksisteerivad keerukates ja heterogeensetes segudes. Mikroobid mängivad tähtsat rolli viljaka mulla orgaanilise aine hajutamisel ja muutmisel, ning mõned liigid mõjutavad mulla viljakuse erinevaid aspekte. Kõik nimetatud biokeemiliste protsesside pikaajalised häired võivad häirida toitaineringlust ja see võib muuta mulla viljakust. Süsiniku ja lämmastiku transformatsioon toimub kõikides viljakates muldades. Kuigi nimetatud protsesse põhjustavad mikroobikogumid on mullati erinev, on transformatsioonirajad oma olemuselt samad.Käesolev katsemeetod on välja töötatud selleks, et avastada aine pikaajalisi negatiivseid mõjusid aeroobsete pinnamuldade lämmastikutransformatsiooni protsessile. Katsemeetod võimaldab samuti hinnata ainete mõjusid mulla mikrofloora süsiniku transformatsioonile. Nitraat tekib pärast süsinik-lämmastiksidemete lagunemist. Seetõttu kui nitraadi teke leitakse olevat samal tasemel katse- ja kontrollmuldades, on väga tõenäoline, et peamised süsinikusidemete lagunemisteed on puutumata ja toimivad hästi. Katses kasutatava substraadi (peenestatud lutsernijahu) süsiniku-lämmastiku suhe on soodne (tavaliselt 12/1 ja 16/1). Seetõttu ei vähendata süsiniku puudust katse käigus ja kui mikroobikogumeid kahjustab kemikaal, siis taastuvad need 100 päeva jooksul.Käesoleva katsemeetodi aluseks olevad katsed töötati välja peamiselt ainete jaoks, mille pinnasesse jõudvat kogust saab ennustada. Sellised ained on näiteks põllukultuuride kaitsevahendid, mille annustamine põllule on teada. Agrokemikaalide puhul piisab sellest, kui uuritakse kahte annust oletatava annustamissageduse osas. Agrokemikaalide puhul saab uurida toimeaineid (a.i.) või preparaate. Katse ei piirdu siiski vaid agrokemikaalidega. Muutes nii pinnasesse annustavaid katseaine koguseid kui ka seda, kuidas andmeid hinnatakse, saab kasutada katset kemikaalide puhul, mille pinnasesse jõudev kogus ei ole teada. Seega määratakse kindlaks muude kemikaalide kui agrokemikaalid puhul kontsentratsiooni ridade mõjud lämmastiku transformatsioonile. Nimetatud katsetest saadud andmeid kasutatakse annuse-reaktsiooni kõvera koostamiseks ja ECX väärtuste arvutamiseks, milles χ on mõju protsendina.1.2. MÕISTEDLämmastiku transformatsioon – mikroobide tegevuse tulemusena ammonifikatsiooni- ja nitrifikatsiooniprotsessi kaudu toimuv, lämmastikku sisaldava orgaanilise aine lõplik lagunemine vastavaks anorgaaniliseks lõppsaaduseks, nitraadiks.ECX (efektiivkontsentratsioon) – mullas esineva katseaine kontsentratsioon, mis tõkestab lämmastiku transformatsiooni nitraadiks x protsenti.EC50 (efektiivkontsentratsiooni mediaan) – mullas esineva katseaine kontsentratsioon, mis tõkestab lämmastiku transformatsiooni nitraadiks 50 protsenti (50 %).1.3 VÕRDLUSAINEDPuuduvad.1.4 KATSEMEETODI PÕHIMÕTESõelutud mulda parandatakse peenestatud taimejahuga ning seda kas töödeldakse seejärel katseainega või jäetakse töötlemata (kontrollproov). Kui uuritakse agrokemikaale, on soovitav kasutada vähemalt kahte katsekontsentratsiooni ja need tuleks valida suurima kontsentratsiooni suhtes, mis eeldatavasti esineb põllul. Pärast inkubeerimise 0., 7., 14. ja 28. päeva ekstraheeritakse katse- ja kontrollmullaproove sobiva lahustiga ning määratakse kindlaks ekstraktides esinevad nitraadikogused. Nitraaditekke kiirust katseproovides võrreldakse kiirusega kontrollproovides ning arvutatakse katse- ja kontrollproovide protsentuaalne hälve. Kõik katsed kestavad vähemalt 28 päeva. Kui 28. päeval on katse- ja kontrollmullaproovide vahelised erinevused võrdsed või suuremad kui 25 %, jätkatakse mõõtmisi kuni 100 päeva. Kui ei uurita agrokemikaale, lisatakse mullaproovidele katseaine kontsentratsiooni ridu ning katse- ja kontrollproovides tekkinud nitraadikoguseid mõõdetakse pärast 28 inkubeerimispäeva. Mitmekordseid kontsentratsioone käsitlevate katsete tulemusi analüüsitakse regressioonmudelit kasutades, ning arvutatakse väärtused (s.t EC50, EC25 ja/või EC10). Vt mõisted.1.5 KATSE VALIIDSUSAgrokemikaalidega tehtud katsete tulemuste hindamine põhineb suhtelistelt väikestel erinevustel (s.t keskmine väärtus on ± 25 %) kontroll- ja katsemullaproovide nitraadi kontsentratsioonide vahel, et kontrollproovide suured muutused võib viia väärate tulemusteni. Seetõttu peaksid paralleelsete kontrollproovide vahelised muutused olema väiksemad kui ± 15 %.1.6 KATSEMEETODI KIRJELDUS1.6.1 SeadmedKatsetes kasutatakse mahuteid, mis on valmistatud keemiliselt inertsest materjalist. Mahutite mahutavus peaks vastama mullaproovide inkubeerimisprotseduurile, s.t üksikute mullaproovide massina või sarjana inkubeerimine (vt punkt 1.7.1.2). Tuleks tagada, et veekadu oleks katse käigus minimaalne ja gaasivahetus oleks võimalik (nt võib katsemahutid katta perforeeritud polüetüleenkilega). Kui uuritakse lenduvaid aineid, tuleks kasutada mastabeeritavaid ja gaasikindlaid mahuteid. Need peaksid olema sellise suurusega, et ligikaudu üks neljandik nende mahust täidetakse mullaprooviga.Katses kasutatakse järgmiseid standardseid laboriseadmeid:- segamisseade: mehaaniline segur või vastav seade;- tsentrifuug (3000 g) või filtreerimisseade (kasutades nitraadivaba filterpaberit);- nitraadi analüüsi jaoks piisava tundlikkuse mõõteseade, mille mõõtmistulemus on korduvteostatav.1.6.2 Mullaliikide valik ja arvKasutatakse ühte mullaliiki. Soovitavad mullaomadused on järgmised:- liivasisaldus: vähemalt 50 % ja kuni 75 %;- pH: 5,5–7,5,- orgaanilise süsiniku sisaldus: 0,5–1,5 %;- mikroobi biomassi tuleks mõõta (8)(9) ja selle süsinikusisaldus peaks olema vähemalt 1 % mulla orgaanilise süsiniku koguhulgast.Enamikel juhtudel nimetatud omadustega muld esindab halvimat juhtu, kuna uuritava kemikaali absorbtsioon on minimaalne ja selle kättesaadavus mikrofloorale on suurim. Sellest tulenevalt ei ole katsed muude mullaliikidega üldiselt vajalikud. Teatud juhtudel, nt kui katseainet eeldatavasti kasutatakse peamiselt muldades, nt happelised metsamullad, või kui kemikaalid on elektrostaatiliselt laetud, võib osutuda vajalikuks kasutada ka muud mullaliiki.1.6.3 Mullaproovide kogumine ja säilitamine1.6.3.1 KogumineÜksikasjalik teave proovikogumiskoha ajaloo kohta peaks olema kättesaadav. Üksikasjade hulka kuuluvad täpne asukoht, taimkate, põllukultuuride kaitsevahenditega töötlemise kuupäevad, orgaaniliste ja anorgaaniliste väetistega töötlemine, bioloogiliste materjalide lisamine või juhuslik saastumine. Mullaproovide kogumiseks valitud kohta peaks saama kasutada pikka aega. Sobivad on püsikarjamaad, üheaastaste teraviljakultuuridega (v.a mais) põllud või tihedalt külvatud haljaskesa. Valitud proovivõtukohta ei tohiks töödelda põllukultuuride kaitsevahenditega vähemalt ühe aasta jooksul enne proovide võtmist. Samuti ei tohiks kasutada orgaanilisi väetisi vähemalt kuus kuud. Mineraalväetiste kasutamine on lubatud üksnes siis, kui see vastab põllukultuuride nõuetele ja mullaproove ei tohiks võtta vähemalt kolm kuud pärast väetise kasutamist. Biotsiidi mõjuga (nt kaltsiumtsüaanamiid) väetistega töödeldud mulla kasutamist tuleks vältida.Proovide võtmist tuleks vältida pikkade (rohkem kui 30 päeva) põua- või vettimisperioodide ajal või vahetult pärast seda. Küntud muldade puhul tuleks proovid võtta 0–20 cm sügavuselt. Rohumaade (karjamaade) või muude muldade puhul, kui ei ole pikka aega küntud (vähemalt ühe kasvuperioodi vältel), peaks proovivõtu suurim sügavus olema veidi rohkem kui 20 cm (nt kuni 25 cm).Mullaproovid tuleks transportida mahutites ja temperatuuridel, mis tagavad, et algseid mullaomadusi ei muudeta oluliselt.1.6.3.2 SäilitamineVärskelt põllult kogutud mulla kasutamine on eelistatud. Kui ei säilitamine laboris on vältimatu, võib mullaproovid lahustada pimedas temperatuuril 4 ± 2 °C maksimaalselt kolmeks kuuks. Mullaproovide säilitamise ajal tuleb tagada aeroobsed tingimused. Kui mullaproovid kogutakse piirkondadest, kus maapind on vähemalt kolm kuud aastas külmunud, saab kaaluda nende säilitamist kuueks kuuks miinus 18 °C kuni miinus 22 °C juures. Säilitatud mullaproovide mikroobi biomassi mõõdetakse enne igat katset ja biomassis peaks olema süsinikku vähemalt 1 % mulla orgaanilise süsiniku kogusisaldusest (vt punkt 1.6.2).1.6.4 Mullaproovide käsitlemine ja katseks ettevalmistamine1.6.4.1 EelinkubeerimineKui mullaproovid säilitati (vt punkt 1.6.3.2), on soovitav preinkubeerida 2–28 päeva. Mulla temperatuur ja niiskusesisaldus preinkubeerimise ajal peaksid olema samasugused kui need, mida kasutati katses (vt punktid 1.6.4.2 ja 1.7.1.3).1.6.4.2 Füüsikalis-keemilised omadusedMuld puhastatakse käsitsi suurtest objektidest (nt kivid, taimeosad jne) ning seejärel märgsõelutakse ilma liigselt kuivatamata 2 mm või sellest väiksemateks osakeste suuruseks. Mullaproovi niiskusesisaldust peaks reguleerima destilleeritud või deioniseeritud veega 40-60 % maksimaalse veemahutavuseni.1.6.4.3 Parandamine orgaanilise substraadigaMulda tuleks parandada sobiva orgaanilise substraadiga, nt peenestatud lutserni-rohujahu seguga (põhiline koostisosa on Medicago sativa), mille süsiniku-lämmastiku suhe on 12/1 ja 16/1. Soovitav lutserni-mulla suhe on 5 g lutserni ühe kilogrammi mulla kohta (kuivmass).1.6.5 Katseaine ettevalmistamine mulda annustamiseksKatseainet annustatakse tavaliselt kandeaine abil. Kandeaine võib olla vesi (veeslahustuvate ainete puhul) või inertne tahke aine, nt peen kvartsliiv (mille osakeste suurus on 0,1–0,5 mm). Vedelaid, veest erinevaid kandeaineid (nt orgaanilisi lahusteid nagu atsetoon, kloroform) tuleks vältida, kuna nad võivad kahjustada mikrofloorat. Kui kasutatakse kandeainena liiva, saab selle katta katseainega, mis on sobivas lahustis lahustatud või suspendeeritud. Sellisel juhul tuleks lahusti eemaldada aurustumise teel enne mullaga segamist. Katseaine optimaalseks jaotumiseks mullas on soovitav suhe 10 g liiva ühe kilogrammi mulla kohta (kuivmass). Kontrollproove töödeldakse sarnase veehulgaga ja/või üksnes kvartsliivaga.Kui uuritakse lenduvaid kemikaale, tuleks vältida kadusid töötlemise ajal niipalju kui võimalik ja tuleks püüda tagada homogeenne jaotus mullas (nt katseainet tuleks injekteerida mulda mitmes kohas).1.6.6 Uuritavad kontsentratsioonidKui uuritakse agrokemikaale, tuleks kasutada vähemalt kahte kontsentratsiooni. Väiksem kontsentratsioon peaks kajastama vähemalt katseaine kasutamisel mulda jõudvat suurimat eeldatavat kogust ning suurem kontsentratsioon peaks olema väiksema kontsentratsiooni kordne. Mulda lisatavate katseainete kontsentratsioonid arvutatakse eeldusel, et aine imendub ühtlaselt 5 cm sügavusele ja mulla lasuvustihedus on 1,5. Agrokemikaalide puhul, mida annustatakse otse mulda, või kemikaalide puhul, mille mulda jõudvat kogust saab ennustada, on soovitavad katsekontsentratsioonid suurimad arvutuskontsentratsioonid (PEC) ja neist viis korda suuremad kontsentratsioonid. Uurides aineid, mida eeldatavasti annustatakse mulda mitmel korral ühel aastaajal, peaks katsekontsentratsioon olema saadud PEC korrutamisel suurima eeldatava annustamiste arvuga. Kõrgeim uuritav kontsentratsioon ei tohiks siiski olla suurem kui kümnekordne suurim üksikannus. Kui uuritakse muid kui agrokemikaale, tuleks kasutada vähemalt viie kontsentratsiooni geomeetrilist sarja. Uuritavad kontsentratsioonid peaksid hõlmama EC, väärtuste kindlaksmääramiseks vajalikku vahemikku.1.7 KATSE SOORITAMINE1.7.1 Kokkupuute tingimused1.7.1.1 Katse- ja kontrollproovidKui uuritakse agrokemikaale, tuleks mullaproovid jagada kolmeks võrdse massiga osaks. Kaks osa segatakse kandeainega, mis sisaldab katseainet, ning kolmas osa segatakse kandeainega, mis ei sisalda katseainet (kontrollproov). On soovitav kasutada vähemalt kolme paralleelset proovi nii katse- kui kontrollproovide korral. Kui uuritakse muid kui agrokemikaale, tuleks mullaproovid jagada kuueks võrdse massiga osaks. Viis proovi segatakse katseainet sisaldava kandeainega ja kuues proov segatakse kandeainega, mis ei sisalda kemikaali. On soovitav kasutada kolme paralleelset proovi nii katse- kui kontrollproovide korral. Tuleks tagada katseaine ühtlane jaotus katseproovide hulka kuuluvates mullaproovides. Segamise ajal tuleks vältida mulla pallideks vormimist.1.7.1.2 Mullaproovide inkubeerimineMullaproove inkubeeritakse kahel moel: katse- ja kontrollmullaproovide koondproovina või katse ja kontrollmullaproovide üksikute ja võrdse suurusega osaproovide sarjana. Kui uuritakse lenduvaid aineid, tuleks katse sooritada vaid üksikute osaproovide sarjana. Kui mullaproovid inkubeeritakse koondproovina, valmistatakse ette katse- ja kontrollmullaproovide suured kogused ning vastavalt vajadusele analüüsitavad osaproovid katse käigus. Algselt iga katse- või kontrollproovi kohta ettevalmistatud kogus sõltub osaproovide suurusest, kasutatud paralleelsete proovide arvust ja suurimatest eeldatavatest proovide võtmise aegadest. Koondproovina inkubeeritavad mullaproovid tuleks enne osaproovide võtmist hoolega segada. Kui mullaproovid inkubeeritakse üksikute mullaproovide sarjana, jagatakse iga katse- ja kontrollmullaproovide koondproov soovitud arvuks osaproovideks, ning neid kasutatakse vastavalt vajadusele. Katsetest, kus eeldatakse rohkem kui kahte proovide võtmise aega, tuleks ette valmistada piisavalt osaproove kõikide paralleelproovide ja proovivõtuaegade jaoks. Vähemalt kolme uuritava mullaproovi paralleelproovi tuleks inkubeerida aeroobsetes tingimustes (vt punkt 1.7.1.1). Kõikide katsete käigus tuleks kasutada sobivaid mahuteid, milles on piisavalt õhuruumi, et vältida anaeroobsete tingimuste tekkimist. Kui uuritakse lenduvaid aineid, tuleks katse sooritada vaid üksikute osaproovide sarjana.1.7.1.3 Katsetingimused ja katse kestusKatset tehakse pimedas toatemperatuuril 20 ± 2 °C. Mullaproovide niiskusesisaldust tuleks säilitada katse käigus 40 %–60 % mulla suurimast veemahutavusest (vt punkt 1.6.4.2) vahemikus ± 5 %. Vajadusel võib lisada destilleeritud, deioniseeritud vett.Katsete minimaalne kestus on 28 päeva. Kui uuritakse agrokemikaale, võrreldakse katse- ja kontrollproovides nitraaditekke kiirust. Kui need erinevad 28. päeval rohkem kui 25 %, jätkatakse katset seni, kuni erinevus võrdub või on väiksem kui 25 %, või maksimaalselt 100 päeva, olenevalt sellest, kummaks kulub vähem aega. Muude kui agrokemikaalide puhul lõpetatakse katse pärast 28 päeva. Arvutatakse ECX-väärtused.1.7.2 Mullaproovide võtmine ja analüüs1.7.2.1 Mullaproovide võtmise ajakavaKui uuritakse agrokemikaale, analüüsitakse mullaproovides nitraati 0., 7., 14. ja 28. päeval. Kui on vaja katset pikendada, tuleks teha täiendavad mõõtmised 14-päevaste intervallide tagant pärast 28. päeva.Kui uuritakse muid kui agrokemikaale, kasutatakse vähemalt viit katsekontsentratsiooni ja analüüsitakse mullaproovides nitraati kokkupuute perioodi alguses (0. päev) ja lõpus (28. päev). Võib lisada vajadusel vahepealse mõõtmise, nt 7. päeval. 28. päeval saadud teavet kasutatakse kemikaali ECx-väärtuse kindlaksmääramiseks. Soovi korral võib kasutada 0. päeval kontrollproovidest saadud andmeid mullas nitraadi algkogusest teatamiseks.1.7.2.2 Mullaproovide analüüsIgas katse- ja kontrollproovi paralleelproovis tekkinud nitraadi kogus määratakse kindlaks igal proovivõtuajal. Nitraat ekstraheeritakse mullast proovide raputamise teel sobiva ekstrahendiga, nt kaaliumkloriidilahus (0,1 M). Soovitav suhe on 5 ml KCl lahust mullaproovi ühe kuivmassi grammi kohta. Ekstraheerimise optimeerimiseks ei tohiks mulla ja ekstrahendi mahutid olla rohkem kui pooltäis. Segu raputatakse 150 rpm 60 minutit. Segusid tsentrifuugitakse või filtreeritakse ning analüüsitakse vedelfaasist nitraat. Osakestevabad vedelikuekstraktid võib säilitada enne analüüsi miinus 20 ± 5 °C juures kuni kuus kuud.2. TULEMUSED2.1 TULEMUSTE TÖÖTLEMINEKui katseid tehakse agrokemikaalidega, tuleks registreerida igas mullaproovi paralleelproovis tekkinud nitraadikogus ja tuleks esitada kõikide paralleelproovide keskmised väärtused tabeli kujul. Lämmastiku transformatsiooni kiirusi tuleks hinnata sobivate ja üldiselt heakskiidetud statistiliste meetodite abil (nt F-katse, 5 % olulisusaste). Tekkinud nitraadi koguseid väljendatakse mg nitraadina mulla kuivmassi kg kohta päevas. Nitraadi tekke kiirusi igas katseproovis võrreldakse kiirustega kontrollproovis ning arvutatakse kontrollproovide protsentuaalne hälve.Kui katseid tehakse muude kui agrokemikaalidega, määratakse kindlaks igas paralleelproovis tekkinud nitraadi kogused ning koostatakse annuse-reaktsiooni kõver ECX-väärtuste hindamiseks. Nitraadikoguseid (s.t mg nitraati mulla kuivmassi kg kohta) katseproovides pärast 28 päeva võrreldakse kontrollproovis olevate nitraadikogustega. Nimetatud andmete põhjal arvutatakse protsentuaalsed inhibitsiooniväärtused iga katsekontsentratsiooni kohta.Need protsendimäärad registreeritakse kontsentratsioonina ning seejärel kasutatakse statistilisi protseduure ECx-väärtuste arvutamiseks. Usalduspiirid (p = 0,95) arvutatud ECx puhul määratakse samuti kindlaks standardprotseduuride abil (10)(11)(12).Katseained, mis sisaldavad lämmastiku suuri koguseid võivad mõjutada katse käigus tekkivaid nitraadikoguseid. Kui nimetatud aineid uuritakse suurte kontsentratsioonidena (nt kemikaalid, mida eeldatavasti annustatakse korduvalt), peaks katse sisaldama sobivaid kontrolle (s.t mullaproov ja katseaine ilma taimejahuta). Nimetatud kontrollidest saadud andmeid peab võtma arvesse ECx-väärtuste arvutamisel.2.2 TULEMUSTE TÕLGENDAMINEKui hinnatakse agrokemikaalidega tehtud katsete tulemusi ning nitraaditekke kiiruste erinevus madalamate katseaineannuste (mis vastab suurimale eeldatavale kontsentratsioonile) ja kontrollproovide vahel on võrdne või väiksem kui 25 % mis tahes proovivõtuajal pärast 28 päeva möödumist, saab hinnata, et katseainel ei oma pikaajalist toimet lämmastiku tekkele muldades. Kui muude kemikaalide kui agrokemikaalidega tehtud katsete tulemusi hinnatakse, kasutatakse EC50, EC25 ja/või EC10 väärtusi.3. PROTOKOLLKatseprotokoll peab hõlmama järgmist teavet:Kasutatava mulla täielik identifitseerimine, kaasa arvatud:- geograafiline viide kohale (laiuskraad, pikkuskraad),- teave koha ajaloo kohta (s.t taimkate, põllukultuuride kaitsevahenditega töötlemine, väetistega töötlemine, juhuslik saastamine jne),- kasutusviis (nt põllumaa, mets jne),- proovivõtu sügavus (cm),- liiva-/aleuriidi-/savisisaldus (protsenti kuivmassist),- pH (vees),- orgaanilise süsiniku sisaldus (protsenti kuivmassist),- lämmastiku sisaldus (protsenti kuivmassist),- algne lämmastiku sisaldus (mg nitraati kg kuivmassi kohta),- katioonvahetusvõime (mmol/kg),- mikroobi biomass protsendina orgaanilise süsiniku koguhulgast,- viide iga parameetri määramismeetodi kohta,- kogu teave mullaproovide kogumise ja säilitamise kohta,- vajadusel üksikandmed mulla eelinkubeerimise kohta.Katseaine:- füüsiline laad ja vajadusel füüsikalis-keemilised omadused,- vajadusel keemilised tunnusandmed, sh struktuurivalem, puhtus (s.t põllukultuuride kaitsevahendite toimeaine protsendimäär), lämmastikusisaldus.Substraat:- substraadi allikas,- koostis (lutsernijahu, lutserni-rohujahu),- süsiniku, lämmastiku sisaldus (protsenti kuivmassist),- sõelaava suurus (mm).Katsetingimused:- üksikandmed mulla parandamise kohta orgaanilise substraadiga,- uuritava kemikaali kontsentratsioonide arv ja vajadusel valitud kontsentratsioonide põhjendus,- üksikandmed katseaine mulda annustamise kohta,- inkubatsioonitemperatuur,- mulla niiskusesisaldus katse alguses ja kestel,- kasutatav mulla inkubeerimismeetod (koondproovina või üksikute osaproovide sarjana),- paralleelsete proovide arv,- proovivõtuajad,- nitraadi mullast ekstraheerimise meetod.Tulemused:- analüüsimeetod ja -seade, mida kasutatakse nitraadi analüüsimiseks,- andmed tabeli kujul, sh nitraadi mõõtmiste üksikud ja keskväärtused,- katse- ja kontrollproovide paralleelproovide vaheline muutus,- arvutustega tehtud paranduste selgitused, kui vaja,- nitraadi tekke kiiruse protsentuaalne muutus igal proovivõtukorral või vajadusel EC50 väärtus 95 % usaldusvahemikus, muud ECx-väärtused (s.t EC25 või EC10) usaldusvahemikes ning annuse-reaktsiooni kõver,- tulemuste statistiline töötlemine,- kogu teave ja vaatlused, mis aitaksid tõlgendada tulemusi.4. VIITED(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Bruxelles.(5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality - Determination of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical Committee ISO/TC 190/SC 4: Sou Quality - Biological Methods.(6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italie, 18-20 Janvier 1995.(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality - Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.(8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method.(9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method.(10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.(11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.(12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.C.22 MULLAMIKROOBID: SÜSINIKU TRANSFORMATSIOONI KATSE1. MEETODKäesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 217 (2000).1.1 SISSEJUHATUSKäesolev katsemeetod kirjeldab laborimeetodit, mis on välja töötatud selleks, et uurida põllukultuuride kaitsevahendite ja muude võimalike kemikaalide pikaajalisi mõjusid mullamikroobide süsiniku transformatsioonile ühekordse kokkupuute järel. Katse põhineb peamiselt Euroopa ja Vahemere taimekaitseorganisatsiooni soovitustel (1). Samuti võetakse arvesse muid juhised, sh Saksa Biologische Bundesanstalti (2), USA Keskkonnakaitseagentuuri (3) ja SETACi (4) juhiseid . Käesolevas katses kasutatavate mullaproovide arvu ja tüüpide osas lepiti kokku mulla ja sedimentide valikut käsitlevas OECD töörühmas, mis tuli kokku Belgirates Itaalias 1995. aastal (5). Mullaproovide kogumist, käsitlemist ja säilitamist käsitlevad soovitused põhinevad ISO juhisdokumendil (6) ja Belgirate töörühma soovitustel.Katseainete toksiliste omaduste hindamisel võib osutuda vajalikuks määrata kindlaks mõjud mulla mikroobsele aktiivsusele, nt kui vajatakse andmeid põllukultuuride kaitsevahendite võimalike kõrvalmõjude kohta mulla mikrofloora suhtes või kui eeldatakse mullamikroobide kokkupuudet muude kemikaalidega kui põllukultuuride kaitsevahendid. Süsiniku transformatsiooni katse tehakse selleks, et kindlaks määrata selliste kemikaalide mõju mulla mikrofloorale. Kui uuritakse agrokemikaale (nt põllukultuuride kaitsevahendid, väetised, metsanduskemikaalid), sooritatakse nii süsiniku transformatsiooni kui ka lämmastiku transformatsiooni katse. Kui uuritakse muid kui agrokemikaale, piisab lämmastiku transformatsiooni katsest. Kui selliste kemikaalide lämmastiku transformatsiooni katses saadud EC50-väärtused on kaubanduslike nitrifikatsiooniinhibiitorite (nt nitrapüriin) esindavas vahemikus, saab täiendava teabe kogumiseks teha süsiniku transformatsiooni katse.Muld koosneb elusatest ja elututest koostisosadest, mis eksisteerivad keerukates ja heterogeensetes segudes. Mikroobid mängivad tähtsat rolli viljaka mulla orgaanilise aine hajutamisel ja muutmisel, ning mõned liigid mõjutavad mulla viljakuse erinevaid aspekte. Kõik nimetatud biokeemiliste protsesside pikaajalised häired võivad häirida toitaineringlust ja see võib muuta mulla viljakust. Süsiniku ja lämmastiku transformatsioon toimub kõikides viljakates muldades. Kuigi nimetatud protsesse põhjustav mikroobikogum on mullati erinev, on transformatsioonirajad oma olemuselt samad.Käesolev katsemeetod on välja töötatud selleks, et avastada aine pikaajalisi negatiivseid mõjusid aeroobsete pinnamuldade süsiniku transformatsiooni protsessile. Katse on tundlik süsiniku transformatsioonis osaleva mikroobikogumi suuruse ja tegevuse muutuste suhtes, kuna katses lastakse neil mikroobikogumitel osa saada nii keemilisest stressist kui ka süsiniku puudusest. Kasutatakse liivast mulda, mille orgaanilise aine sisaldus on madal. Seda mulda töödeldakse katseainega ja inkubeeritakse tingimustes, mis võimaldavad kiiret mikroobide ainevahetust. Nimetatud tingimustes on kiirelt vähenenud kergesti kättesaadava süsiniku allikad mullas. See põhjustab süsiniku puudust, mis tapab mikroobirakud ning kutsub esile puhkeperioodi ja/või sporulatsiooni. Kui katset teostatakse kauem kui 28 päeva, saab mõõta nimetatud reaktsiooni summat (töötlemata mulla) kontrollproovides metaboolselt aktiivse mikroobi biomassi järkjärgulise vähenemisena (7). Kui süsinikupuuduses vaevlevas mullas olevat biomassi mõjutab katsetingimustes kemikaali esinemine, ei saa see pöörduda tagasi samale tasemele nagu kontrollproovis olev biomass. Seetõttu katseaine põhjustatud häireid mis tahes ajal katse käigus kestavad tihti kuni katse lõpuni.Käesoleva katsemeetodi aluseks olevad katsed töötati välja peamiselt ainete jaoks, mille pinnasesse jõudvat kogust saab ennustada. Sellised ained on näiteks põllukultuuride kaitsevahendid, mille annustamine põllule on teada. Agrokemikaalide puhul piisab sellest, kui uuritakse kahte annust oletatava annustamissageduse osas. Agrokemikaalide puhul saab uurida toimeaineid (a.i.) või preparaate. Katse ei piirdu siiski vaid prognoositavaid arvestuskontsentratsioone omavate kemikaalidega. Muutes nii pinnasesse annustatavaid katseaine koguseid kui ka seda, kuidas andmeid hinnatakse, saab kasutada katset kemikaalide puhul, mille pinnasesse jõudev kogus ei ole teada. Seega määratakse kindlaks muude kemikaalide kui agrokemikaalid puhul kontsentratsiooni ridade mõjud süsiniku transformatsioonile. Nimetatud katsetest saadud andmeid kasutatakse annuse-reaktsiooni kõvera koostamiseks ja ECX väärtuste arvutamiseks, milles x on mõju protsendina.1.2. MÕISTEDSüsiniku transformatsioon – orgaanilise aine lagundamine mikroorganismide poolt anorgaaniliseks lõppsaaduseks, süsinikdioksiidiks.ECX (efektiivkontsentratsioon) – mullas esineva katseaine kontsentratsioon, mis tõkestab süsiniku transformatsiooni süsinikdioksiidiks x protsendiga.EC50 (efektiivkontsentratsiooni mediaan) – mullas esineva katseaine kontsentratsioon, mis tõkestab süsiniku transformatsiooni süsinikdioksiidiks 50 protsendiga.1.3 VÕRDLUSAINEDPuuduvad.1.4 KATSEMEETODI PÕHIMÕTESõelutud mulda töödeldakse kas katseainega või jäetakse töötlemata (kontroll). Kui uuritakse agrokemikaale, on soovitav kasutada vähemalt kahte katsekontsentratsiooni ja need tuleks valida suurima kontsentratsiooni suhtes, mis eeldatavasti esineb põllul. Pärast 0., 7., 14. ja 28. inkubeerimispäeva segatakse katse- ja kontrollmullaproovid glükoosiga ning glükoosi põhjustatud hingamiskiirust mõõdetakse järjestikusel 12 tunnil. Hingamiskiirusi väljendatakse vabanenud süsinikdioksiidina (mg süsinikdioksiidi mulla kuivmassi kg kohta tunnis) või tarbitud hapnikuna (mg hapnikku kg mulla kohta tunnis). Keskmist hingamiskiirust katseproovides võrreldakse sama hingamiskiirusega kontrollproovides ning arvutatakse katseproovi ja kontrollproovi vaheline protsentuaalne hälve. Kõik katsed kestavad vähemalt 28 päeva. Kui 28. päeval on katse- ja kontrollproovide vahelised erinevused võrdsed või suuremad kui 25 %, jätkatakse mõõtmisi 14-päevaste intervallidega kuni maksimaalselt 100 päeva. Kui uuritakse muid kemikaale kui agrokemikaalid, lisatakse mullaproovidele katseaine kontsentratsioonide sari ning mõõdetakse glükoosi põhjustatud hingamiskiirusi (s.t tekkinud süsinikdioksiidi või tarbitud hapniku koguste keskmine) pärast 28 päeva möödumist. Kontsentratsioonide sarja käsitlevate katsete tulemusi analüüsitakse regressioonmudelit kasutades, ning arvutatakse ECx väärtused (s.t EC50, EC25 ja/või EC10). Vt mõisted.1.5 KATSE VALIIDSUSAgrokemikaalidega tehtud katsete tulemuste hindamine põhineb suhtelistelt väikestel erinevustel (s.t keskmine väärtus on ± 25 %) kontroll- ja katsemullaproovides vabanenud süsinikdioksiidi või tarbitud hapniku vahel, et kontrollproovide suured muutused võivad viia väärate tulemusteni. Seetõttu peaksid paralleelsete kontrollproovide vahelised muutused olema väiksemad kui ± 15 %.1.6 KATSEMEETODI KIRJELDUS1.6.1 SeadmedKatsetes kasutatakse mahuteid, mis on valmistatud keemiliselt inertsest materjalist. Mahutite mahutavus peaks vastama mullaproovide inkubeerimisprotseduurile, s.t üksikute mullaproovide massina või sarjana inkubeerimine (vt punkt 1.7.1.2). Tuleks tagada, et veekadu oleks katse käigus minimaalne ja gaasivahetus oleks võimalik (nt võib katsemahutid katta perforeeritud polüetüleenkilega). Kui uuritakse lenduvaid aineid, tuleks kasutada mastabeeritavaid ja gaasikindlaid mahuteid. Need peaksid olema sellise suurusega, et ligikaudu üks neljandik nende mahust täidetakse mullaprooviga.Glükoosi põhjustatud hingamise kindlaksmääramisel on nõutavad inkubeerimissüsteemid ja süsinikdioksiidi tootmise või hapniku tarbimise mõõtmisseadmed. Selliste süsteemide ja seadmete kohta käivad näiteid võib leida kirjandusviidetest (8) (9) (10) (11).1.6.2 Mullaliikide valik ja arvKasutatakse ühte mullaliiki. Soovitavad mullaomadused on järgmised:- liivasisaldus: vähemalt 50 % ja kuni 75 %,- pH: 5,5–7,5,- orgaanilise süsiniku sisaldus: 0,5–1,5 %,- mikroobi biomassi tuleks mõõta (12)(13) ja selle süsinikusisaldus peaks olema vähemalt 1 % mulla orgaanilise süsiniku koguhulgast.Enamikel juhtudel nimetatud omadustega muld esindab halvimat juhtu, kuna uuritava kemikaali absorbtsioon on minimaalne ja selle kättesaadavus mikrofloorale on suurim. Sellest tulenevalt ei ole katsed muude mullaliikidega üldiselt vajalikud. Teatud juhtudel, nt kui katseainet eeldatavasti kasutatakse peamiselt muldades, nt happelised metsamullad, või kui kemikaalid on elektrostaatiliselt laetud, võib osutuda vajalikuks kasutada ka muud mullaliiki.1.6.3 Mullaproovide kogumine ja säilitamine1.6.3.1 KogumineÜksikasjalik teave proovikogumiskoha ajaloo kohta peaks olema kättesaadav. Üksikasjade hulka kuuluvad täpne asukoht, taimkate, põllukultuuride kaitsevahenditega töötlemise kuupäevad, orgaaniliste ja anorgaaniliste väetistega töötlemine, bioloogiliste materjalide lisamine või juhuslik saastumine. Mullaproovide kogumiseks valitud kohta peaks saama kasutada pikka aega. Sobivad on püsikarjamaad, üheaastaste teraviljakultuuridega (v.a mais) põllud või tihedalt külvatud haljaskesa. Valitud proovivõtukohta ei tohiks töödelda põllukultuuride kaitsevahenditega vähemalt ühe aasta jooksul enne proovide võtmist. Samuti ei tohiks kasutada orgaanilisi väetisi vähemalt kuus kuud. Mineraalväetiste kasutamine on lubatud üksnes siis, kui see vastab põllukultuuride nõuetele ja mullaproove ei tohiks võtta vähemalt kolm kuud pärast väetise kasutamist. Biotsiidi mõjuga (nt kaltsiumtsüaanamiid) väetistega töödeldud mulla kasutamist tuleks vältida.Proovide võtmist tuleks vältida pikkade (rohkem kui 30 päeva) põua- või vettimisperioodide ajal või vahetult pärast seda. Küntud muldade puhul tuleks proovid võtta 0-20 cm sügavuselt. Rohumaade (karjamaade) või muude muldade puhul, kui ei ole pikka aega küntud (vähemalt ühe kasvuperioodi vältel), peaks proovivõtu suurim sügavus olema veidi rohkem kui 20 cm (nt kuni 25 cm). Mullaproovid tuleks transportida mahutites ja temperatuuridel, mis tagavad, et algseid mullaomadusi ei muudeta oluliselt.1.6.3.2 SäilitamineVärskelt põllult kogutud mulla kasutamine on eelistatud. Kui ei säilitamine laboris on vältimatu, võib mullaproove säilitada pimedas temperatuuril 4 ± 2 °C maksimaalselt kolm kuud. Mullaproovide säilitamise ajal tuleb tagada aeroobsed tingimused. Kui mullaproovid kogutakse piirkondadest, kus maapind on vähemalt kolm kuud aastas külmunud, saab kaaluda nende säilitamist kuueks kuuks miinus 18 °C juures. Säilitatud mullaproovide mikroobi biomassi mõõdetakse enne igat katset ja biomassis peaks olema süsinikku vähemalt 1 % mulla orgaanilise süsiniku kogusisaldusest (vt punkt 1.6.2).1.6.4 Mullaproovide käsitlemine ja katseks ettevalmistamine1.6.4.1 EelinkubeerimineKui mullaproove säilitati (vt punkt 1.6.4.2 ja1.7.1.3), on soovitav preinkubeerida 2–28 päeva. Mulla temperatuur ja niiskusesisaldus preinkubeerimise ajal peaksid olema samasugused kui need, mida kasutati katses (vt punktid 1.6.4.2 ja 1.7.1.3).1.6.4.2 Füüsikalis-keemilised omadusedMuld puhastatakse käsitsi suurtest objektidest (nt kivid, taimeosad jne) ning seejärel märgsõelutakse ilma liigselt kuivatamata 2 mm või sellest väiksemateks osakeste suuruseks. Mullaproovi niiskusesisaldust peaks reguleerima destilleeritud või deioniseeritud veega 40–60 % maksimaalse veemahutavuseni.1.6.5 Katseaine ettevalmistamine mulda annustamiseksKatseainet annustatakse tavaliselt kandeaine abil. Kandeaine võib olla vesi (veeslahustuvate ainete puhul) või inertne tahke aine, nt peen kvartsliiv (mille osakeste suurus on 0,1–0,5 mm). Vedelaid, veest erinevaid kandeaineid (nt orgaanilisi lahusteid nagu atsetoon, kloroform) tuleks vältida, kuna nad võivad kahjustada mikrofloorat. Kui kasutatakse kandeainena liiva, saab selle katta katseainega, mis on sobivas lahustis lahustatud või suspendeeritud. Sellisel juhul tuleks lahusti eemaldada aurustumise teel enne mullaga segamist. Katseaine optimaalseks jaotumiseks mullas on soovitav suhe 10 g liiva ühe kilogrammi mulla kohta (kuivmass). Kontrollproove töödeldakse sarnase veehulgaga ja/või üksnes kvartsliivaga.Kui uuritakse lenduvaid kemikaale, tuleks vältida kadusid töötlemise ajal niipalju kui võimalik ja tuleks püüda tagada ühtlane jaotus mullas (nt katseainet tuleks injekteerida mulda mitmes kohas).1.6.6 Uuritavad kontsentratsioonidKui uuritakse põllukultuuride kaitsevahendeid või muid prognoositavaid arvestuskontsentratsioone omavaid kemikaale, tuleks kasutada vähemalt kahte kontsentratsiooni. Väiksem kontsentratsioon peaks kajastama vähemalt katseaine kasutamisel mulda jõudvat suurimat eeldatavat kogust ning suurem kontsentratsioon peaks olema väiksema kontsentratsiooni kordne. Mulda lisatavate katseainete kontsentratsioonid arvutatakse eeldusel, et aine imendub ühtlaselt 5 cm sügavusele ja mulla lasuvustihedus on 1,5. Agrokemikaalide puhul, mida annustatakse otse mulda, või kemikaalide puhul, mille mulda jõudvat kogust saab ennustada, on soovitavad katsekontsentratsioonid suurimad arvutuskontsentratsioonid (PEC) ja neist viis korda suuremad kontsentratsioonid. Uurides aineid, mida eeldatavasti annustatakse mulda mitmel korral ühel aastaajal, peaks katsekontsentratsioon olema saadud PEC korrutamisel suurima eeldatava annustamiste arvuga. Kõrgeim uuritav kontsentratsioon ei tohiks siiski olla suurem kui kümnekordne suurim üksikannus.Kui uuritakse muid kui agrokemikaale, tuleks kasutada vähemalt viie kontsentratsiooni geomeetrilist sarja. Uuritavad kontsentratsioonid peaksid hõlmama ECx väärtuste kindlaksmääramiseks vajalikku vahemikku.1.7 KATSE SOORITAMINE1.7.1 Kokkupuute tingimused1.7.1.1 Katse- ja kontrollproovidKui uuritakse agrokemikaale, tuleks mullaproovid jagada kolmeks võrdse massiga osaks. Kaks osa segatakse kandeainega, mis sisaldab katseainet, ning kolmas osa segatakse kandeainega, mis ei sisalda katseainet (kontrollproov). On soovitav kasutada vähemalt kolme paralleelset proovi nii katse- kui kontrollproovide puhul. Kui uuritakse muid kui agrokemikaale, tuleks mullaproovid jagada kuueks võrdse massiga osaks. Viis proovi segatakse katseainet sisaldava kandeainega ja kuues proov segatakse kandeainega, mis ei sisalda kemikaali. On soovitav kasutada kolme paralleelset proovi nii katse- kui kontrollproovide korral. Tuleks tagada katseaine ühtlane jaotus katseproovide hulka kuuluvates mullaproovides. Segamise ajal tuleks vältida mulla pallideks vormimist.1.7.1.2 Mullaproovide inkubeerimineMullaproove inkubeeritakse kahel moel: katse- ja kontrollmullaproovide koondproovina või katse ja kontrollmullaproovide üksikute ja võrdse suurusega osaproovide sarjana. Kui uuritakse lenduvaid aineid, tuleks katse sooritada vaid üksikute osaproovide sarjana. Kui mullaproovid inkubeeritakse koondproovina, valmistatakse ette katse- ja kontrollmullaproovide suured kogused ning vastavalt vajadusele analüüsitavad osaproovid katse käigus. Algselt iga katse- või kontrollproovi kohta ettevalmistatud kogus sõltub osaproovide suurusest, kasutatud paralleelsete proovide arvust ja suurimatest eeldatavatest proovide võtmise aegadest. Koondproovina inkubeeritavad mullaproovid tuleks enne osaproovide võtmist hoolega segada. Kui mullaproovid inkubeeritakse üksikute mullaproovide sarjana, jagatakse iga katse- ja kontrollmullaproovide koondproov soovitud arvuks osaproovideks, ning neid kasutatakse vastavalt vajadusele. Katsetest, kus eeldatakse rohkem kui kahte proovide võtmise aega, tuleks ette valmistada piisavalt osaproove kõikide paralleelproovide ja proovivõtuaegade jaoks. Vähemalt kolme uuritava mullaproovi paralleelproovi tuleks inkubeerida aeroobsetes tingimustes (vt punkt 1.7.1.1). Kõikide katsete käigus tuleks kasutada sobivaid mahuteid, milles on piisavalt õhuruumi, et vältida anaeroobsete tingimuste tekkimist. Kui uuritakse lenduvaid aineid, tuleks katse sooritada vaid üksikute osaproovide sarjana.1.7.1.3 Katsetingimused ja katse kestusKatset tehakse pimedas toatemperatuuril 20 ± 2 °C. Mullaproovide niiskusesisaldust tuleks säilitada katse käigus 40 %–60 % mulla suurimast veemahutavusest (vt punkt 1.6.4.2) vahemikus ± 5 %. Vajadusel võib lisada destilleeritud, deioniseeritud vett.Katsete minimaalne kestus on 28 päeva. Kui uuritakse agrokemikaale, võrreldakse katse- ja kontrollproovides vabanenud süsinikdioksiidi või tarbitud hapniku koguseid. Kui need erinevad 28. päeval rohkem kui 25 %, jätkatakse katset seni, kuni erinevus võrdub või on väiksem kui 25 %, või maksimaalselt 100 päeva, olenevalt sellest, kummaks kulub vähem aega. Muude kui agrokemikaalide puhul lõpetatakse katse pärast 28 päeva. 28. päeval määratakse kindlaks katse- ja kontrollmullaproovides vabanenud süsinikdioksiidi või tarbitud hapniku kogused ja arvutatakse ECX-väärtused.1.7.2 Mullaproovide võtmine ja analüüs1.7.2.1 Mullaproovide võtmise ajakavaKui uuritakse agrokemikaale, analüüsitakse mullaproovides glükoosi põhjustatud hingamiskiirusi 0., 7., 14. ja 28. päeval. Kui on vaja katset pikendada, tuleks teha täiendavad mõõtmised 14-päevaste intervallide tagant pärast 28. päeva.Kui uuritakse muid kui agrokemikaale, kasutatakse vähemalt viit katsekontsentratsiooni ja analüüsitakse mullaproovides glükoosi põhjustatud hingamist kokkupuute perioodi alguses (0. päev) ja lõpus (28. päev). Võib lisada vajadusel vahepealse mõõtmise, nt 7. päeval. 28. päeval saadud teavet kasutatakse kemikaali ECx-väärtuse kindlaksmääramiseks. Soovi korral võib kasutada 0. päeval kontrollproovidest saadud andmeid mullas metaboolselt aktiivse mikroobi biomassi algkogustest teatamiseks (12).1.7.2.2 Glükoosi põhjustatud hingamiskiiruste mõõtmineIga katseproovi ja kontrollproovi paralleelse proovi glükoosi põhjustatud hingamiskiirus määratakse kindlaks igal proovivõtukorral. Mullaproovidesse segatakse selline glükoosihulk, millest piisab vahetu suurima hingamisreaktsiooni põhjustamiseks. Nimetatud mullaproovis suurima hingamisreaktsiooni põhjustamiseks vajaliku glükoosi hulga saab kindlaks määrata eelkatses, kasutades glükoosi kontsentratsioonide sarja (14). Liivaste muldade puhul, mille orgaanilise süsiniku sisaldus on 0,5–1,5 %, piisab tavaliselt 2000–4000 mg glükoosist mulla kuivmassi kg kohta. Glükoosi võib jahvatada pulbriks koos puhta kvartsliivaga (10 g liiva mulla kuivmassi kg kohta) ja segada ühtlaselt mullaga.Glükoosiga parandatud mullaproove inkubeeritakse sobivas hingamiskiiruste mõõtmisseadmes kas pidevalt, kord tunnis või kord kahe tunni jooksul (vt punkt 1.6.1) 20 ± 2 °C juures. Vabanenud süsinikdioksiidi või tarbitud hapnikku mõõdetakse 12 järjestikusel tunnil ning mõõtmisi tuleks alustada nii ruttu kui võimalik, s.t üks tund pärast glükoosiga täiendamist. Mõõdetakse vabanenud süsinikdioksiidi või tarbitud hapniku üldkoguseid 12 tunni jooksul ja määratakse keskmised hingamiskiirused.2. TULEMUSED2.1 TULEMUSTE TÖÖTLEMINEKui katseid tehakse agrokemikaalidega, tuleks registreerida igas mullaproovi paralleelproovis vabanenud süsinikdioksiidi või tarbitud hapniku kogus ja tuleks esitada kõikide paralleelproovide keskmised väärtused tabeli kujul. Süsiniku transformatsiooni kiirusi tuleks hinnata sobivate ja üldiselt heakskiidetud statistiliste meetodite abil (nt F-katse, 5 % olulisusaste). Glükoosi põhjustatud hingamiskiirusi väljendatakse mg süsinikdioksiidina mulla kuivmassi kg kohta tunnis või mg hapnikuna mulla kuivmassi kg kohta tunnis. Keskmist süsinikdioksiidi tekkekiirust või keskmist hapniku tarbimiskiirust igas katseproovis võrreldakse samade kiirustega kontrollproovis ning arvutatakse katse- ja kontrollproovi vaheline protsentuaalne hälve.Kui katseid tehakse muude kui agrokemikaalidega, määratakse kindlaks igas paralleelproovis vabanenud süsinikdioksiidi või tarbitud hapniku kogused ning koostatakse annuse-reaktsiooni kõver ECX-väärtuste hindamiseks. Katseproovi glükoosi põhjustatud hingamiskiirusi (s.t mg süsinikdioksiidi mulla kuivmassi kg kohta tunnis või mg hapnikku mulla kuivmassi kg kohta tunnis) pärast 28 päeva möödumist võrreldakse samade kiirustega kontrollproovis. Nimetatud andmete põhjal arvutatakse protsentuaalsed inhibitsiooniväärtused iga katsekontsentratsiooni kohta. Need protsendimäärad registreeritakse kontsentratsioonina ning seejärel kasutatakse statistilisi protseduure ECx-väärtuste arvutamiseks. Usalduspiirid (p = 0,95) arvutatud ECx puhul määratakse samuti kindlaks standardprotseduuride abil (15)(16)(17).2.2 TULEMUSTE TÕLGENDAMINEKui hinnatakse agrokemikaalidega tehtud katsete tulemusi ning hingamiskiiruste erinevus madalamate katseaineannuste (mis vastab suurimale eeldatavale kontsentratsioonile) ja kontrollproovide vahel on võrdne või väiksem kui 25 % mis tahes proovivõtuajal pärast 28 päeva möödumist, saab hinnata, et katseaine ei oma pikaajalist toimet süsinikdioksiidi tekkele muldades. Kui muude kemikaalide kui agrokemikaalidega tehtud katsete tulemusi hinnatakse, kasutatakse EC50, EC25 ja/või EC10 väärtusi.3. PROTOKOLL3.1 KATSEPROTOKOLLKatseprotokoll peab hõlmama järgmist teavet:Kasutatava mulla täielik identifitseerimine, kaasa arvatud:- geograafiline viide kohale (laiuskraad, pikkuskraad),- teave koha ajaloo kohta (s.t taimkate, põllukultuuride kaitsevahenditega töötlemine, väetistega töötlemine, juhuslik saastamine jne),- kasutusviis (nt põllumaa, mets jne),- proovivõtu sügavus (cm),- liiva-/aleuriidi-/savisisaldus (protsenti kuivmassist),- pH (vees),- orgaanilise süsiniku sisaldus (protsenti kuivmassist),- lämmastiku sisaldus (protsenti kuivmassist),- katioonvahetusvõime (mmol/kg),- algne mikroobi biomass protsendina orgaanilise süsiniku koguhulgast,- viide iga parameetri määramismeetodi kohta,- kogu teave mullaproovide kogumise ja säilitamise kohta,- vajadusel üksikandmed mulla eelinkubeerimise kohta.Katseaine:- füüsiline laad ja vajadusel füüsikalis-keemilised omadused,- vajadusel keemilised tunnusandmed, sh struktuurivalem, puhtus (s.t põllukultuuride kaitsevahendite toimeaine protsendimäär), lämmastikusisaldus.Katsetingimused:- üksikandmed mulla parandamise kohta orgaanilise substraadiga,- uuritava kemikaali kontsentratsioonide arv ja vajadusel valitud kontsentratsioonide põhjendus,- üksikandmed katseaine mulda annustamise kohta,- inkubatsioonitemperatuur,- mulla niiskusesisaldus katse alguses ja kestel,- kasutatav mulla inkubeerimismeetod (koondproovina või üksikute osaproovide sarjana),- paralleelsete proovide arv,- proovivõtuajad.Tulemused:- hingamiskiiruste mõõtmismeetod ja -seade,- andmed tabeli kujul, sh süsinikdioksiidi või hapniku üksikud ja keskmised väärtused,- katse- ja kontrollproovide paralleelproovide vaheline muutus,- arvutustega tehtud paranduste selgitused, kui vaja,- glükoosi põhjustatud hingamiskiiruse protsentuaalne muutus igal proovivõtukorral või vajadusel EC50 väärtus 95 % usaldusvahemikus, muud ECx-väärtused (s.t EC25 või EC10) usaldusvahemikes ning annuse-reaktsiooni kõver,- vajadusel tulemuste statistiline töötlemine,- kogu teave ja vaatlused, mis aitaksid tõlgendada tulemusi.4. VIITED(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels.(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality - Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.(7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for Pesticide Experiments, in "Pesticide Effects on Soil Microflora". Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60.(8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in "Methods of Soil Analysis - Part 2: Chemical and Microbiological Properties". Agronomy Monograph № 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Keeney. 41: 831- 871.(9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality - Guidance on Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality - Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.(11) Heinemeye,r Ο., Insam, Η., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81.(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method.(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method.(14) Malkomes, H.-P. (1986). EinfluE von Glukosemenge auf die Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenuber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113-120.(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.(16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.(17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.C.23 AEROOBNE JA ANAEROOBNE TRANSFORMATSIOON MULLAS1. MEETODKäesolev katsemeetod lähtub juhendist OECD TG 307 (2002).1.1 SISSEJUHATUSKäesolev katsemeetod põhineb olemasolevatel juhenditel (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9). Käesolevas katsemeetodis kirjeldatud meetod töötati välja kemikaalide aeroobse ja anaeroobse transformatsiooni hindamiseks mullas. Katsete abil määratakse (i) katseaine transformatsioonikiirus, ja (ii) selliste transformatsioonisaaduse laad, mida taimed ja mullaorganismid saavad mõjutada, ning nende moodustumis- ja hävimiskiirus. Sellised uuringud tehakse kemikaalidega, mida levitatakse otse maapinda või mis tõenäoliselt jõuavad mullakeskkonda. Selliste laboriuuringute tulemusi võib samuti kasutada vastavates väliuuringutes kasutatud proovivõtu- ja analüüsiprotokollide koostamisel.Transformatsiooniteede hindamiseks piisab üldjuhul aeroobsest ja anaeroobsest uuringust ühe pinnasetüübiga (8)(10)(11). Transformatsioonikiirused tuleks kindlaks määrata veel lisaks vähemalt kolmes pinnasetüübis (8)(10).Käesolevas katses kasutatavate pinnaste arvu ja tüüpide osas lepiti kokku pinnase ja sedimentide valikut käsitlevas OECD töörühmas, mis tuli kokku Belgirates Itaalias 1995. aastal (10). Uuritavad pinnasetüübid peaksid esindama keskkonnatingimusi, kus katseainet kasutatakse või kus vabastamised toimuvad. Näiteks, kemikaale, mis võidakse vabastada subtroopilises kuni troopilises kliimas, tuleks uurida Ferrasoli või Nitosoliga (FAO-süsteem). Töörühm tegi samuti soovitusi seoses mullaproovide kogumise, käsitlemise ja säilitamisega, vastavalt ISO juhendile (15). Käesolevas meetodis võetakse samuti arvesse riisi kasvatamisel kasutatavaid pinnaseid.1.2 MÕISTEDKatseaine – mis tahes aine, kas lähteühend või vastav transformatsioonisaadus.Transformatsioonisaadused – kõik katseaine biootilistes või abiootilistes transformatsioonireaktsioonides saadud ained, kaasa arvatud CO2 ja tooted, mis on seotud jääkides.Seotud jäägid – pinnases, taimedes või loomades olevad ühendid, mis ekstraheerimise järel säilivad matriitsis lähteainena või selle metaboliidi(metaboliitide)/transformatsioonisaadustena. Ekstraheerimismeetod ei tohiks oluliselt muuta ühendit ennast või matriitsi struktuuri. Sideme olemust saab selgitada osaliselt matriitsi muutva ekstraheerimismeetodi ja täiustatud analüüsitehnikate abil. Tänaseni, näiteks, on sel viisil kindlaks tehtud kovalentsed ioonsidemed ja sorptsioonsidemed ning "lõksud". Üldiselt vähendab seotud jääkide teke oluliselt bioloogilist kättesaadavust ja bioloogilist omastatavust (12) [1984. aasta IUPACi muudatus (13)].Aeroobne transformatsioon – reaktsioonid, milles osaleb molekulaarne hapnik (14).Anaeroobne transformatsioon – reaktsioonid, milles ei osale molekulaarne hapnik (14).Pinnas – väikeste (peamiselt mikro-) organismide poolt orgaaniliseks muudetav segu mineraalsetest ja orgaanilistest keemilistest koostisainetest, mis hiljem sisaldab kõrge süsiniku- ja lämmastikusisaldusega ning suure molekulmassiga ühendeid. Pinnast võib töödelda kahes eri seisundis:a) looduspärane, nagu see on aja jooksul arenenud pinnasetüüpide erinevateks iseloomulikeks kihtideks;b) häiritud, nagu see on tavaliselt esineb viljeluspõldudel või käesolevas meetodis kasutamiseks kaevatud proovides (14).Mineralisatsioon – orgaanilise ühendi täielik lagunemine CO2-ks ja H2O-ks aeroobsetes tingimustes ning CH4-ks, CO2-ks ja H2O-ks anaeroobsetes tingimustes. Käesoleva katsemeetodi kontekstis, kui kasutatakse 14C-märgistatud ühendit, tähendab mineralisatsioon ulatuslikku lagundamist, mille käigus märgistatud süsinikuaatom oksüdeerub ning vabaneb sobiv kogus 14CO2 (14).Poolestusaeg – t0.5 on aeg, mis kulub katseaine 50 %-liseks transformatsiooniks, kui transformatsiooni saab kirjeldada esimese astme kineetika abil; poolestusaeg ei sõltu kontsentratsioonist.DT50 (hävimisaeg 50) – aeg, mille jooksul katseaine kontsentratsiooni vähendatakse 50 % võrra; see on erinev poolestusajast t0.5, mil transformatsioon ei järgi esimese astme kineetikat.DT75 (hävimisaeg 75) – aeg, mille jooksul katseaine kontsentratsiooni vähendatakse 75 % võrra.DT90 (hävimisaeg 90) – aeg, mille jooksul katseaine kontsentratsiooni vähendatakse 90 % võrra.1.3 VÕRDLUSAINEDVõrdlusaineid tuleks kasutada transformatsioonisaaduste iseloomustamiseks ja/või identifitseerimiseks spektroskoopiliste ja kromatograafiliste meetodite abil.1.4 KATSE KOHALDAMISALAMeetodit kohaldatakse kõikide keemiliste ainete suhtes (märgistamata või radiomärgistatud, mille kohta on olemas piisavalt täpne ja tundlik analüüsimeetod. See on kohaldatav kergelt lenduvate, mittelenduvate, veeslahustuvate või vees mittelahustuvate ühendite suhtes. Katset ei kohaldata kemikaalide suhtes, mis kergesti lenduvad pinnasest (nt fumigandid, orgaanilised lahustid) ja seega ei saa seda hoida pinnases käesolevates katsemeetodites.1.5 TEAVE KATSEAINE KOHTAMärgistamata või märgistatud katseainet saab kasutada transformatsioonikiiruse mõõtmiseks. Märgistatud materjal on nõutav transformatsioonitee uurimiseks ja ainetaseme määramiseks. 14C-märgistust soovitatakse, kuid muude isotoopide (näiteks 13C, 15N, 3H, 32P) kasutamine võib olla samuti kasulik. Niipalju kui võimalik tuleks märgistus asetada molekuli kõige stabiilsema(te) osa(de) külge. [1] Katseaine puhtus peaks olema vähemalt 95 %.Enne pinnases aeroobset ja anaeroobset transformatsiooni käsitleva katse tegemist peaks olema katseaine kohta kättesaadaval järgmine teave:a) lahustuvus vees (meetod A.6);b) lahustuvus orgaanilistes lahustites;c) aururõhk (meetod A.4) ja Henry konstant;d) n-oktanooli/vee jaotustegur (meetod A.8);e) keemiline stabiilsus pimedas (hüdrolüüs) (meetod C.7);f) pKa, kui molekulil on kalduvus protoneerumisele või deprotoneerumisele [OECD juhend 112] (16).Muu vajalik teave võib sisaldada andmeid katseaine mürgisuse kohta mullamikroobide suhtes [Katsemeetodid C.21 ja C.22] (16).Katseaine ja selle transformatsioonisaaduste kvantifitseerimise ja identifitseerimise analüüsimeetodid (sh ekstraheerimis- ja puhastamismeetodid) peaksid olema kättesaadavad.1.6 KATSEMEETODI PÕHIMÕTEMullaproove töödeldakse katseainega ja inkubeeritakse pimedas Erlenmeyer kolbides või möödavoolusüsteemides kontrollitud laboritingimustes (konstantse temperatuuri ning pinnaseniiskuse juures). Pärast sobivaid ajavahemikku ekstraheeritakse mullaproovid ja neid analüüsitakse lähteaine ja transformatsioonisaaduste suhtes. Lenduvad saadused kogutakse samuti analüüsiks sobivate absorbtsiooniseadmete abil. Kasutades 14C-märgistusega materjali, saab mõõta katseaine erinevaid mineralisatsioonikiiruseid eraldunud 14CO2 kinni püüdes, ning saab määrata ainetaseme, sh pinnases seotud jäägid.1.7 KVALITEEDINÕUDED1.7.1 SaagisVähemalt kahe mullaproovi ekstraheerimine ja analüüs kohe katseaine lisamise järel annab esimesi märke analüüsimeetodi korratavuse kohta ning katseaine manustamise ühtsuse kohta Saagised katse hilisematelt etappidelt on saadud vastavatelt ainetasemetelt. Saagised peaksid jääma vahemikku 90–110 % märgistatud kemikaalide puhul (8) ja 70–110 % märgistamata kemikaalide puhul (3).1.7.2 Analüüsimeetodi korratavus ja tundlikkusAnalüüsimeetodi korratavust (v.a alguses tehtud ektsaheerimise tõhusus) katseaine ja transformatsiooni saaduste kvantifitseerimiseks saab kontrollida, korduvanalüüsides samast pinnasest tehtud ekstrakti, mida on inkubeeritud seni, kuni tekivad transformatsioonisaadused.Katseaine ja transformatsioonisaaduste puhul on analüüsimeetodi avastamislävi (LOD) peaks olema vähemalt 0,01 mg-kg-1 mullaproovi (katseainena) või 1 % kasutatud annusest, olenevalt sellest, kumb on väiksem. Kvantifikatsioonilävi (LOQ) tuleks samuti määrata.1.7.3 Transformatsioonist saadud andmete täpsusKatseaine kontsentratsioonide regressioonanalüüs ajafunktsioonina annab vajalikku teavet transformatsioonikõvera usaldusväärsuse kohta ning võimaldab arvutada poolestusaegade usalduspiire (näilise esimese astme kineetika puhul) või DT50 väärtused ja vajadusel DT75 ja DT90 väärtused.1.8 KATSEMEETODI KIRJELDUS1.8.1 Seadmed ja keemilised reaktiividInkubatsioonisüsteemid võivad olla staatiliselt suletud süsteemid või sobivad möödavoolusüsteemid (7)(17). Näited mullaproovide inkubatsioonil kasutatava möödavooluseadme ja Erlenmeyeri kolvi kohta on esitatud vastavalt joonistel 1 ja 2. Mõlemat tüüpi inkubatsioonisüsteemidel on eelised ja puudused (7)(17).Nõutavad on standardsed laboriseadmed, eriti järgmised:- analüütilised seadmed, näiteks GLC, HPLC, TLC-seadmed, kaasa arvatud radiomärgistatud või märgistamata ainete analüüsimisel kohaldatavad avastamissüsteemid või pööratud isotoopide lahjendusmeetod,- identifitseerimisel kasutatavad seadmed (nt MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR jne),- vedelikstsintsillaatsioonloendur,- oksüdeerija radioaktiivsete ainete põletamiseks,- tsentrifuug,- ekstraheerimisseade (nt tsentrifuugiküvetid külmekstraheerimiseks ja Soxhlet’ seade pidevekstraheerimiseks püstjahuti all),- lahuste ja ekstraktide kontsentreerimise seadmed (nt pöördaurusti),- veevann,- mehaaniline segamisseade (nt sõtkumismasin, pöörlev segisti).Kasutatud keemilised reaktiivid, näiteks:- NaOH, analüütiliselt puhas, 2 mol . dm-3, või muu sobiv alus (nt KOH, etanoolamiin),- H2SO4, analüütiliselt puhas, 0,05 mol . dm-3,- etüleenglükool, analüütiliselt puhas,- tahked absorbtsioonimaterjalid, nt naatronlubi ja polüuretaanküünlad,- orgaanilised lahustid, analüütiliselt puhtad, nt atsetoon, metanool jt,- stsintsillatsioonvedelik.1.8.2 Katseaine annustamineMullaproovi lisamiseks või levitamiseks võib katseainet lahustada vees (deioniseeritud või destilleeritud) või vajadusel väheses koguses atsetoonis või muudes orgaanilistes lahustites (6), milles katseaine on piisavalt lahustuv ja stabiilne. Valitud lahusti kogusel ei peaks siiski olema olulist mõju mulla mikroobsele aktiivsusele (vt punktid 1.5 ja 1.9.2-1.9.3 Selliste mikrobioloogilist aktiivsust inhibeerivate lahustite nagu kloroform, diklorometaan ja muud halogeenitud lahustid kasutamist tuleks vältida.Katseainet võib samuti lisada tahkel kujul, nt segatud kvartsliivaga (6) või mullaproovide väikeste osaproovidena, mida on õhkkuivatatud ja steriliseeritud. Kui katseainet lisatakse lahusti abil, tuleks lasta lahustil aurustuda enne katseainet sisaldava osaproovi lisamist algupärasesse ebasteriilsesse mullaproovi.Üldkemikaalide puhul, mis sisenevad mulda üldiselt reoveesetete kaudu või põllumajanduslikul kasutamisel, tuleks katseainet esmalt lisada reovette, mida seejärel annustatakse mullaproovi (vt punktid 1.9.2 ja 1.9.3).Preparaatide kasutamist tavaliselt ei soovitata. Nt nõrgalt lahustuva katseaine puhul võib siiski kasutada preparaati sobiva alternatiivina.1.8.3 Pinnased1.8.3.1 Pinnase valikTransformatsioonitee kindlaksmääramisel võib kasutada representatiivset pinnast; soovitav pinnasetüüp on saviliiv või liivsavi või savi või savine liiv [vastavalt FAO ja USDA klassifikatsioonile (18)], mille pH on 5,5–8,0, orgaanilise süsiniku sisaldus on of 0,5–2,5 % ja mikroobi biomass on vähemalt 1 % orgaanilise süsiniku koguhulgast (10).Transformatsioonitee määramisel tuleks uurida vähemalt kolme representatiivset pinnast. Pinnaste orgaanilise süsiniku sisaldus, pH, savi sisaldus ja mikroobi biomass on erinevad (10).Kõiki pinnaseid tuleks iseloomustada vähemalt nende tekstuuri (liiva, alueriidi, savi (protsentides)) [vastavalt FAO ja USDA klassifikatsioonile (18)], pH, katioonvahetusvõime, orgaanilise süsiniku, lasuvustiheduse, veeläbilaskvusvõime [2] ja mikroobi biomassi poolest (üksnes aeroobsetes uuringutes). Tulemuste tõlgendamisel võib osutuda kasulikuks lisateave pinnaseomaduste kohta. Pinnaseomaduste kindlaksmääramiseks saab kasutada viidetes (19)(20)(21)(22)(23) soovitatud meetodeid. Mikroobi biomass tuleks määrata substraadi indutseeritud hingamise (SIR) meetodi (25)(26) või alternatiivsete meetodite abil (20).1.8.3.2 Mullaproovide kogumine, käsitlemine ja säilitamineÜksikasjalik teave proovikogumiskoha ajaloo kohta peaks olema kättesaadav. Üksikasjade hulka kuuluvad täpne asukoht, taimkate, põllukultuuride kaitsevahenditega töötlemise kuupäevad, orgaaniliste ja anorgaaniliste väetistega töötlemine, bioloogiliste materjalide lisamine või juhuslik saastumine. Kui pinnaseid on juba töödeldud katseainega või selle struktuursete analoogidega viimase nelja aasta jooksul, ei tuleks neid kasutada transformatsiooni uuringutel (10)(15).Muld peaks olema värskelt kogutud põllult (A-horisondilt või ülemisest 20 cm kihist), ning selle veesisaldus peaks olema selline, et hõlbustaks sõelumist. Muude muldade kui riisipõldude muldade puhul tuleks vältida proovide võtmist pikkade (> 30 päeva) põua-, külmumis- või üleujutusperioodide jooksul või vahetult pärast neid (14). Proove tuleks transportida nii, et muutused mulla veesisalduses oleksid minimaalsed ja neid tuleks hoida pimedas võimalikult vaba õhujuurdepääsuga. Nõrgalt seotud polüetüleenkott on üldiselt selleks piisav.Mulda tuleks töödelda nii ruttu kui võimalik pärast proovivõtmist. Taimed, suurem mullafauna ja kivid tuleks eemaldada enne mulla sõelumist läbi 2 mm sõela, mis eemaldab väikesed kivid, fauna ja taimejäätmed. Tuleks vältida mulla ulatuslikku kuivatamiste ja purustamist enne sõelumist (15).Kui põllult proovide võtmine on raske talvel (pinnas on külmunud või kaetud lumekihtidega), võib proove võtta mullapartiist, mida säilitatakse kasvuhoones taimkatte all (nt rohu või rohu-ristikheina segu all). Väga on eelistatud uuringud värskelt põllult kogutud muldadega, kuid kui kogutud ja töödeldud mulda tuleb säilitada enne uuringu algust, peavad säilitamistingimused olema piisavad ja ük snes piiratud aja jooksul (4 ± 2 °C maksimaalselt kolm kuud), et säiliks mikroobne aktiivsus. [3] Üksikasjalikud juhendid selliste mullaproovide kogumiseks, käsitlemiseks ja säilitamiseks, mida kasutatakse biotransformatsioonikatsetes, on toodud viidetes (8)(10)(15)(26)(27).Enne töödeldud pinnase kasutamist katses, tuleks seda eelinkubeerida, et lasta seemnetel idaneda ja saaks need eemaldada ning taastada mikroobide ainevahetuse tasakaal pärast proovivõtu- ja säilitamistingimuste muutumist inkubatsioonitingimusteks. 2–28 päeva vahel toimuv eelinkubeerimine ligikaudu samadel temperatuuri ja niiskuse tingimustel nagu tegelikus katseski on üldiselt piisav (15). Säilitamis- ja eelinkubeerimisperioodid kokku ei tohiks ületada kolme kuud.1.9 KATSE SOORITAMINE1.9.1 Katsetingimused1.9.1.1 KatsetemperatuurKogu katseperioodi jooksul tuleks mullaproovid inkubeerida pimedas konstantsel temperatuuril, mis vastab kliimatingimustele, kus katseainet kasutati või kus toimus vabastamine. Kõikide parasvöötmes pinnasesse jõudvate katseainete puhul on soovitav temperatuur 20 ± 2 °C. Temperatuuri tuleks jälgida.Kemikaalide puhul, mida kasutatakse või mis vabanevad külmemas kliimas (nt põhjamaades, sügis/talveperioodil), tuleks inkubeerida lisaproove, kuid madalamal temperatuuril (nt 10 ± 2 °C).1.9.1.2 NiiskusesisaldusAeroobsetes tingimustes transformatsioonikatsete puhul tuleks mulla niiskusesisaldust [4] reguleerida ja säilitada pF vahemikus 2,0–2,5 (3). Mulla niiskusesisaldust väljendatakse veemassina kuiva mulla massi kohta ja seda tuleks korrapäraselt kontrollida (nt kahenädalaste intervallide tagant), kaaludes inkubatsioonikolbe ja veekadusid, mida täiendatakse vee lisamise teel (eelistatavalt steriilne filtreeritud kraanivesi). Tuleks püüda vältida või vähendada katseaine ja/või transformatsioonisaaduste kadu lendumise ja/või fotolagundamise (kui see juhtub) kaudu vedeliku lisamise käigus.Anaeroobsetes tingimustes transformatsioonikatsete käigus küllastatakse pinnast veega üleujutamise teel.1.9.1.3 Aeroobsed inkubatsioonitingimusedMöödavoolusüsteemides säilitatakse aeroobsed tingimused vahelduva loputamise või pidevalt niisutatud õhuga ventileerimise teel. Erlenmeyeri kolbides tagatakse õhuvahetus difusiooni abil.1.9.1.4 Steriilsed aeroobsed tingimusedKatseaine abiootilise transformatsiooni olulisuse kohta käiva teabe saamiseks võib mullaproovid steriliseerida (steriliseerimismeetodid on viidetes 16 ja 29), töödelda steriilse katseainega (nt lahuse lisamine läbi steriilse filtri) ja tuulutada niisutatud steriilse õhuga, nagu on kirjeldatud punktis 1.9.1.3. Riisipõldude mullaproovide puhul tuleks pinnast ja vett steriliseerida ja inkubeerida tuleks vastavalt punktile 1.9.1.6.1.9.1.5 Aneroobsed inkubatsioonitingimusedAnaeroobsete tingimuste loomiseks ja säilitamiseks katseainega töödeldud ja aeroobsetes tingimustes 30 päeva või ühe poolestusaja jooksul või DT50 ajal (olenevalt sellest, milleks kulub vähem aega) inkubeeritud pinnast küllastatakse seejärel veega (1–3 cm veekiht) ja inkubatsioonisüsteemi loputatakse inertse gaasiga (nt lämmastik või argoon). [5] Katsesüsteem peab võimaldama järgmiseid mõõtmisi: pH, hapniku kontsentratsiooni ja redokspotentsiaali mõõtmised, ja sisaldama lenduvate saaduste püüdmise seadmeid. Erlenmeyeri kolbidest koosnev süsteem tuleb sulgeda, et vältida õhu sisenemist difusiooni teel.1.9.1.6 Niiske põllu mullaproovide inkubatsioonitingimusedRiisipõllu mullaproovide transformatsiooni uurimisel ujutataks pinnas üle ligikaudu 1-5 cm veekihiga ja katseainet annustatakse veefaasi (9). Soovitav pinnasesügavus on vähemalt 5 cm. Süsteemi õhutatakse samamoodi nagu aeroobsetel tingimustel. Veekihi pH, hapniku kontsentratsiooni ja redokspotentsiaali tuleks jälgida ja sellest teatada. Vähemalt kahenädalane eelinkubatsiooniperiood on vajalik enne transformatsiooniuuringutega alustamist (vt punkt 1.8.3.2).1.9.1.7 Katse kestusKiirust ja transformatsiooniteed käsitlevad uuringud ei tohiks tavaliselt ületada 120 päeva [6] (3)(6)(8), kuna seejärel eeldatakse, et väheneb mulla mikroobne aktiivsus tehislaborisüsteemis, kus ei täiene looduslikult toitainetagavarad. Kui katseaine vähenemist ja peamiste transformatsioonisaaduste teket ja vähenemist on vaja kirjeldada, tuleks uuringuid jätkata pikema aja jooksul (nt 6 või 12 kuud) (8). Pikemaid inkubatsiooniperioode tuleks põhjendada katseprotokollis ja sellele tuleks lisada biomassi mõõtmised nimetatud perioodide kestel ja lõpus.1.9.2 Katse sooritusLigikaudu 50–200 g mulda (kuivmassina) asetatakse iga inkubatsioonikolvi põhja (vt lisas 3 joonised 1 ja 2) ning mulda töödeldakse katseainega ühe punktis 1.8.2 kirjeldatud meetodi abil. Kui orgaanilisi lahusteid kasutatakse katseaine annustamiseks, tuleks need eemaldada mullast aurustamise teel. Seejärel segatakse muld hoolikalt spaatliga ja/või kolvi raputamise teel. Kui uuring tehakse niiskete põldude tingimustes, tuleks mulda ja vett hoolikalt segada pärast katseaine lisamist. Väikeseid töödeldud muldade alikvoote (nt 1 g) tuleks analüüsida katseaine ühtlase jaotuse kontrollimiseks. Alternatiivne meetod on toodud allpool.Annustatav kogus peaks vastama põllukultuuride kaitsevahendite kasutusjuhendites soovitatud suurimale annusele ja ühtset levimist sobivasse sügavusse (nt ülemisse 10 cm mullakihti. [7] Näiteks, kemikaalide puhul, mis levivad taimede lehtedesse või pinnasesse ilma, et need tungiksid taimedesse, sobiv sügavus selle arvutamiseks, kui palju kemikaali tuleks igasse kolbi lisada, on 2,5 cm. Pinnasesse tunginud kemikaalide puhul on sobiv sügavus kasutusjuhendis täpsustatud tungimissügavus. Üldkemikaalide puhul tuleks hinnata annustamist kõige sobivama pinnasesse tungimise tee põhjal, näiteks, kui peamine pinnasesse tungimise tee on läbi reoveesetete, tuleks kemikaali annustada reovette kontsentratsioonis, mis vastab oodatud reovee kontsentratsioonile, ja pinnasesse lisatud reovee hulk peaks vastama tavalisele põllumajanduses kasutatavate pinnaste reovee määrale. Kui see kontsentratsioon ei ole piisavalt suur peamiste transformatsioonisaaduste identifitseerimiseks, võib olla abiks erinevate suuremaid kontsentratsioone sisaldavate mullaproovide inkubeerimine, kuid tuleks vältida liiga suuri annusmäärasid, mis võivad mõjutada mulla mikroobide funktsioone (vt punktid 1.5 ja 1.8.2).Alternatiivselt saab katseainega töödelda suuremat mullakogust (s.t 1–2 kg), seda hoolikalt segades sobiva segamisseadme abil ja seejärel asetades need väikeste, 50–200 g osadena inkubatsioonikolbidesse (nt proovijaoturite abil) Väikeseid töödeldud muldade alikvoote (nt 1 g) tuleks analüüsida katseaine ühtlase jaotuse kontrollimiseks. Sellist protseduuri eelistatakse, kuna see võimaldab ühtlasemalt katseainet pinnasesse jagada.Samuti inkubeeritakse töötlemata mullaproove samadel tingimustel (aeroobsed) nagu katseainega töödeldud proove. Nimetatud proove kasutatakse biomassi mõõtmistel uuringu käigus ja lõpus.Kui katseainet lisatakse pinnasesse lahjendatuna orgaanilis(t)es lahusti(te)s, inkubeeritakse sama koguse lahusti(te)ga töödeldud mullaproove samadel tingimustel (aeroobsed) kui katseainega töödeldud mullaproove. Nimetatud proove kasutatakse biomassi mõõtmistel uuringute alguses, kestel ja lõpus lahusti(te) mõjude kontrollimiseks mikroobi biomassi suhtes.Töödeldud mullaproove sisaldavad kolvid kas kinnitatakse möödavoolusüsteemi, mida on kirjeldatud joonisel 1, või suletakse absorbtsioonikolonni, mis on toodud joonisel 2 (vt lisa 3).1.9.3 Proovide võtmine ja mõõtmineParalleelsed inkubatsioonikolvid eemaldatakse sobiva ajavahemiku tagant ja mullaproovid ekstraheeritakse erineva polaarsusega lahustitega ning analüüsitakse katseaine ja/või transformatsioonisaaduste osas. Hästi väljatöötatud uuringus on piisavalt kolbe, et igal proovivõtukorral kasutatakse kahte kolbi. Samamoodi eemaldatakse absorbtsioonilahused või tahked absorbtsioonimaterjalid erinevate ajavahemike tagant (seitsmepäevane intervallid esimese kuu jooksul ja pärast ühe kuu möödumist 17-päevased intervallid) iga mullaproovi inkubatsiooni kestel ja lõpus ning analüüsitakse lenduvate saaduste osas. Kohe katseaine manustamise järel (0-päevane proov) võetud mullaproovile lisaks tuleks katsetesse lisada vähemalt viis erinevat proovivõtukohta. Ajavahemikud tuleks valida nii, et katseaine vähenemisaegu ning transformatsioonisaaduste tekke- ja vähenemisaegu saaks määrata (nt 0, 1, 3, 7 päeva; 2, 3 nädalat; 1, 2, 3 kuud jne).Kasutades 14C-märgistusega katseainet, ekstraheerimata radioaktiivsete ainete määr määratakse põlemise teel ja ainetase arvutatakse iga proovivõtuaja kohta.Anaeroobsete ja niiske põllu proovide korral mulla- ja veefaase ning katseaine ja transformatsioonisaaduseid analüüsitakse või eraldatakse filtreerimise või tsentrifuugimise teel enne ekstraheerimist ja analüüsi.1.9.4 ValikkatsedAeroobsetes, mittesteriilsetes uuringutes, milles kasutatakse muid temperatuure ja mullaniiskust, võib hinnata pinnase temperatuuri ja niiskuse mõju katseaine ja/või selle transformatsioonisaaduste transformatsioonikiirust pinnases.Ekstraheerimata radioaktiivseid aineid võib lisaks proovida kirjeldada näiteks ülikriitilisel vedeliku ekstraheerimisel.2. TULEMUSED2.1 TULEMUSTE TÖÖTLEMINEKatseaine, transformatsioonisaaduste, lenduvate ainete (vaid protsendina) ja ekstraheerimata ainete kogused tuleks esitada protsendina lähtekontsentratsioonist ja vajadusel mg-kg-1 mullaproove (tahke kuivmass) igas proovivõtuvahemikus. Ainetase tuleks esitada protsendina lisatud lähtekontsentratsioonist igas proovivõtuvahemikus. Katseaine graafiline esitamine aja funktsioonina aitab hinnata transformatsiooni poolestusaega või DT50. Peamised transformatsioonisaadused tuleks identifitseerida ja nende kontsentratsioonid tuleks esitada aja funktsioonina, et näidata nende tekke- ja vähenemiskiirust. Peamised transformatsioonisaadused on mis tahes saadused, mida esineb igal ajahetkel uuringu käigus ≥10 % katseaine annusest.Kinnipüütud lenduvad ained annavad märke selle kohta, et katseaine ja selle transformatsioonisaaduste võimest pinnasest lenduda.Sobivate kineetilise mudeli kohaste arvutuste põhjal peaks saama täpsemalt määrata poolestusajad või DT50 väärtused ja vajadusel DT75 ja DT90 väärtused. Poolestusajad ja DT50 väärtused tuleks teatada koos kasutatava mudeli, kineetika astme ja määramiskoefitsiendi (r2) kirjeldusega. Esimese astme kineetika on soositud, välja arvatud juhul, kui r2 < 0,7. Vajadusel tuleks arvutused teha peamiste transformatsioonisaaduste kohta. Sobivate mudelite näiteid kirjeldatakse viidetes 31–35.Uurides erinevatel temperatuuridel kiiruseid, tuleks kirjeldada transformatsioonikiirust temperatuuri funktsioonina katsetemperatuuri vahemikus, kasutades Arrheniuse võrrandit kujul:k =võilnA –,kus ln A ja Β on kõige sobivama joone lõikepunktist ja tõusust saadavad regressioonkonstandid, mis saadakse ln k ja 1/T lineaarse regressioonanalüüsi tulemusena, k on kiirusekonstant temperatuuril T ja T on temperatuur Kelvini järgi. Kui transformatsiooni reguleerib mikroobide tegevus, tuleks võtta arvesse piiratud temperatuurivahemikku, milles Arrheniuse võrrand kehtib.2.2 TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINEKuigi uuringuid tehakse tehislaboritingimustes, saab tulemuste põhjal hinnata katseaine transformatsioonikiirust ja samuti transformatsioonisaaduste tekke- ja vähenemiskiirust välitingimustes (36)(37).Katseaine transformatsioonitee uuring annab teavet selle kohta, kuidas lisatud ainet struktuur pinnases muutub keemiliste ja mikroobsete reaktsioonide abil.3. PROTOKOLL3.1 KATSEPROTOKOLLKatseprotokoll peab sisaldama:Katseaine:- üldnimetus, keemiline nimetus, CASi number, struktuurivalem (tuues ära märgi(märkide) asukoha, kui kasutatakse radiomärgistatud ainet) ja asjaomased füüsikalis-keemilised omadused (vt punkt 1.5),- katseaine puhtus (lisandid),- märgistatud kemikaali radiokeemiline puhtus ja spetsiifiline aktiivsus (vajadusel).Võrdlusained:- selliste võrdlusainete keemiline nimetus ja struktuur, mida kasutatakse transformatsioonisaaduste kirjeldamiseks ja/või identifitseerimiseks.Katsepinnased:- üksikandmed kogumiskoha koha,- mullaproovide võtmise päev ja protseduur,- pinnase omadused, nt pH, orgaanilise süsiniku sisaldus, tekstuur (liiva-, aleuriidi-, saviprotsent), katioonvahetusvõime, lasuvustihedus, veeläbilaskvusvõime ja mikroobi biomass,- mullaproovide säilitamise pikkus ja tingimused (kui need säilitatakse).Katsetingimused:- uuringute tegemise kuupäevad,- lisatud katseaine kogus,- kasutatud lahustid ja katseaine lisamise meetod,- töödeldud mullaproovide lähtemass ja nende mass analüüsi igal proovivõtukorral,- kasutatud inkubatsioonisüsteemi kirjeldus,- õhu voolukiirus (üksnes möödavoolussüsteemides),- katsesüsteemi temperatuur,- mullaproovide niiskusesisaldus inkubatsiooni ajal,- mikroobi biomass aeroobse uuringu alguses, kestel ja lõpus,- pH, hapniku kontsentratsioon ja redokspotentsiaal anaeroobsete ja niiske põllumaa uuringute alguses, kestel ja lõpus,- ekstraheerimismeetod,- katseaine ja peamiste transformatsioonisaaduste kvantifitseerimis- ja identifitseerimismeetodid mullaproovides ning ja absorbtsioonimaterjalides,- paralleelproovide arv ja kontrollproovide arv.Tulemused:- mikroobide tegevuse määramistulemus,- kasutatud analüüsimeetodite korratavus ja tundlikkus,- saagisemäärad (valiidse katse protsendimäärad on toodud punktis 1.7.1),- tulemused tabeli kujul, väljendatuna protsendina lähteannusest ja vajadusel mg-kg-1 mullaproovi (kuivmass),- ainetase uuringute kestel ja lõpus,- pinnase ekstraheerimata (seotud) radioaktiivsuse või jääkide iseloomustamine,- vabanenud CO2 ja muude lenduvate ühendite kvantifitseerimine,- katseaine ja vajadusel transformatsioonisaaduste kontsentratsioonid mullaproovis esitatud aja funktsioonina,- katseaine ja vajadusel transformatsioonisaaduste poolestusaeg või DT50, DT75 ja DT90 väärtused usaldusvahemikes,- hinnang abiootilise lagunemise kiirusele steriilsetes tingimustes,- hinnang katseaine ja vajadusel peamiste transformatsioonisaaduste transformatsioonikineetika kohta,- vajadusel eeldatavad transformatsiooniteed,- tulemuste arutlus ja tõlgendamine,- töötlemata tulemused (s.t proovide kromatogrammid, transformatsioonikiirust käsitlevad arvutused ja transformatsioonisaaduste identifitseerimiseks kasutatavad vahendid).4. VIITED(1) US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.(2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada.(3) European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC of 14 July 1995 amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. Annex II, Part A and Annex HI, Part A: Fate and Behaviour in the Environment.(4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in sou, water and air.(5) BBA (1986). Richtlinie fur die amtliche Prufung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden - Abbau, Umwandlung und Metabolismus.(6) ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality - Guidance on laboratory tests for biodegradation of organic chemicals in soil - Part 1: Aerobic conditions.(7) ISO 14239 (1997). Soil Quality - Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.(8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.(9) MAFF - Japan 2000 - Draft Guidelines for transformation studies of pesticides in soil - Aerobic metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded).(10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.(11) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.(12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley - VCH (1998).(13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).(14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).(15) ISO 10381-6 (1993). Soil Quality - Sampling - Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.(16) Annex V to Dir. 67/548/EEC.(17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.(18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).(19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mineralogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.(20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Microbiological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.(21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality - General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.(22) Muckenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.(23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.(24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215-221.(25) ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality - Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: fumigation-extraction method.(26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45-60.(27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation in the environment: Aerobic and bio-transformation of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16th Symposium on Environmental Science of Pesticide, 105-120.(28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59-63 (SETAC-Europe).(29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjodahl-Svensson K., Stenstrom J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Europe).(30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethylene oxide on soil microbial content and some chemical characteristics. Plant and Soil 102, 197-200.(31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Fesdegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.(32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical modelling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181-199.(33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In "Environmental Dynamics of Pesticides". R. Haque and V.H. Freed, Eds., 135-172.(34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer 39, 188-204.(35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. I. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer 33, 47-60.(36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, 1032-1041.(37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 83-122.LISA 1VEEPINEVUS, VÄLIVEEMAHUTAVUS (FC) JA VEEMAHUTAVUS (WHC) [1]Veesamba kõrgus [cm] | pF [2] | baar [3] | Märkused |107 | 7 | 104 | Kuiv pinnas |1,6 · 104 | 4,2 | 16 | Närbumispiir |104 | 4 | 10 |103 | 3 | 1 |6-102 | 2,8 | 0,6 |3,3 · 102 | 2,5 | 0,33 [4] | Väliveemahutavuse ala [5] WHC (hinnang) Veega küllastatud pinnas |102 | 2 | 0,1 |60 | 1,8 | 0,06 |33 | 1,5 | 0,033 |10 | 1 | 0,01 |1 | 0 | 0,001 |Veepinevust mõõdetakse veesamba kõrgusena (cm) või baarides. Imirõhu laia ulatuse tõttu väljendatakse seda üksnes pF väärtusena, mis vastab veesamba logaritmile.Väliveemahutavus on määratletud veehulgana, mida võib säilitada atmosfäärirõhus looduspinnases 2 päeva pärast pikemat vihmaperioodi või pärast piisavat kastmist. See määratakse looduspärases pinnases in situ põllul. Mõõtmist seega ei kohaldata pinnase häiritud laboriproovides. Häiritud mullaproovides määratud FC väärtused võivad esindada suuri süsteemseid muutusi.Veemahutavus (WHC) määratakse kindlaks laboris looduspärases või häiritud mullas, küllastades mullasammast veega kapillaartranspordi teel. See on eriti kasulik häiritud mullaproovide teel ja võib olla kuni 30 % suurem kui väliveemahutavus.1 Samuti võib olla seda katseliselt kergem määrata kui usaldusväärseid FC-väärtusi.LISA 2ERINEVATEST RIIKIDEST ERINEVATEST MULLATÜÜPIDEST VÕETUD MULLAPROOVIDE NIISKUSE SISALDUS (g vett 100 g kuiva pinnase kohta)Niiskusesisaldus | Sisaldus järgmistes riikides: | Mullatüübi riik || | WHC [1] | pF = 1,8 | pF = 2,5 |Liiv | Saksamaa | 28,7 | 8,8 | 3,9 |Mudane liiv | Saksamaa | 50,4 | 17,9 | 12,1 |Mudane liiv | Šveits | 44,0 | 35,3 | 9,2 |Aleuriitne muda | Šveits | 72,8 | 56,6 | 28,4 |Savimuda | Brasiilia | 69,7 | 38,4 | 27,3 |Savimuda | Jaapan | 74,4 | 57,8 | 31,4 |Liivane muda | Jaapan | 82,4 | 59,2 | 36,0 |Aleuriitne muda | Ameerika Ühendriigid | 47,2 | 33,2 | 18,8 |Liivane muda | Ameerika Ühendriigid | 40,4 | 25,2 | 13,3 |LISA 31: | nõelventiil |2: | vett sisaldavad gaasipesupudelid |3: | ultramembraan (üksnes steriilsed tingimused), poori suurus 0.2 μm |4: | pinnase ainevahetuse kolb (veega küllastatud üksnes anaeroobsetes ja niiske põllumaa tingimuses) |5: | etüleenglükoollõks orgaaniliste lenduvate ühendite jaoks |6: | väävelhappelõks leeliseliste lenduvate ühendite jaoks |7, 8: | naatriumhüdroksiidilõks CO2 & muude happeliste lenduvate ainete jaoks |9: | voolumõõtur. |+++++ TIFF ++++++++++ TIFF +++++(1) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.(2) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.(3) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.C.24 AEROOBNE JA ANAEROOBNE TRANSFORMATSIOON PÕHJASETTES1. MEETODKäesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 308 (2002).1.1 SISSEJUHATUSKemikaalid võivad pääseda madalasse või sügavasse pinnavette näiteks otse annustatuna, õhku pihustatuna, äravoolu või kuivendamise kaudu, jäätmete kõrvaldamisel, tööstusliku, kodumajapidamise või põllumajandusliku heitveena ja atmosfäärist väljasadenemisel. Käesolev katsemeetod kirjeldab laborimeetodit, mida kasutatakse orgaaniliste kemikaalide aeroobse ja anaeroobse transformatsiooni hindamiseks põhjasettes. See põhineb olemasolevatel juhenditel (1)(2)(3)(4)(5)(6). Käesolevas katses kasutatavate pinnaste arvu ja tüüpide osas lepiti kokku pinnase ja sedimentide valikut käsitlevas OECD töörühmas, mis tuli kokku Belgirates Itaalias 1995. aastal (7). Töörühm tegi samuti soovitusi seoses mullaproovide kogumise, käsitlemise ja säilitamisega, vastavalt ISO juhendile (8). Sellised uuringud tehakse kemikaalidega, mida levitatakse otse vette või mis tõenäoliselt jõuavad veekeskkonda eespool kirjeldatud viisil.Loodusliku põhjasette tingimused on tihti aeroobsed ülemises veefaasis. Sette pinnakiht võib olla kas aeroobne või anaeroobne, kuigi sügavam sete on tavaliselt anaeroobne. Kõikide nende võimaluste hõlmamiseks kirjeldatakse käesolevas dokumendis nii aeroobseid kui ka anaeroobseid katseid. Aeroobne katse simuleerib aeroobset veesammast, mille all on aeroobne settekiht ja mille all omakorda anaeroobne gradient. Anaeroobne katse simuleerib täielikult anaeroobset põhjasetet. Kui asjaolud viitavad sellele, et on vaja oluliselt kõrvale kalduda neist soovitustest, nt kasutades puutumata sette tuuma või setteid, mis võivad olla kokku puutunud katseainetega, on selleks kättesaadavad muud meetodid (9).1.2. MÕISTEDSI-ühikuid tuleks kasutada igal juhul.Katseaine – mis tahes aine, kas lähteühend või vastav transformatsioonisaadus.Transformatsioonisaadused – kõik katseaine biootilistes või abiootilistes transformatsioonireaktsioonides saadud ained, kaasa arvatud CO2 ja tooted, mis on seotud jääkides.Seotud jäägid – pinnases, taimedes või loomades olevad ühendid, mis ekstraheerimise järel säilivad matriitsis lähteainena või selle metaboliidi(metaboliitide)/transformatsioonisaadustena. Ekstraheerimismeetod ei tohiks oluliselt muuta ühendit ennast või matriitsi struktuuri. Seose olemust saab selgitada osaliselt matriitsi muutva ekstraheerimismeetodi ja täiustatud analüüsitehnikate abil. Tänaseni, näiteks, on sel viisil kindlaks tehtud kovalentsed ioonsidemed ja sorptsioonsidemed ning "lõksud". Üldiselt vähendab seotud jääkide teke oluliselt bioloogilist kättesaadavust ja bioloogilist omastatavust (10) [1984. aasta IUPACi muudatus (11)].Aeroobne transformatsioon – (oksüdeeriv): reaktsioonid, milles osaleb molekulaarne hapnik (12).Anaeroobne transformatsioon – (redutseeriv): reaktsioonid, milles ei osale molekulaarne hapnik (12).Looduslikud veed – pinnaveed, mis on saadud tiikides, jõgedes, ojadest jm.Sete – segu mineraalsetest ja orgaanilistest keemilistest koostisainetest, millest viimased sisaldavad kõrge süsiniku- ja lämmastikusisaldusega ning suure molekulmassiga ühendeid. See sadestub looduslikku vette, millega ta moodustab piirkihi.Mineralisatsioon – orgaanilise ühendi täielik lagunemine CO2-ks ja H2O-ks aeroobsetes tingimustes ning CH4-ks, CO2-ks ja H2O-ks anaeroobsetes tingimustes. Käesoleva katsemeetodi kontekstis, kui kasutatakse radiomärgistatud ühendit, tähendab mineralisatsioon ulatuslikku lagundamist, mille käigus märgistatud süsinikuaatom oksüdeeritakse ning vabaneb sobiv kogus 14CO2 või 14CH4.Poolestusaeg, t0.5 – aeg, mis kulub katseaine 50 %-liseks transformatsiooniks, kui transformatsiooni saab kirjeldada esimese astme kineetika abil; poolestusaeg ei sõltu lähtekontsentratsioonist.DT50 (hävimisaeg 50) – aeg, mille jooksul katseaine lähtekontsentratsiooni vähendatakse 50 % võrra.DT75 (hävimisaeg 75) – aeg, mille jooksul katseaine lähtekontsentratsiooni vähendatakse 75 % võrra.DT90 (hävimisaeg 90) – aeg, mille jooksul katseaine lähtekontsentratsiooni vähendatakse 90 % võrra.1.3 VÕRDLUSAINEDVõrdlusaineid tuleks kasutada transformatsioonisaaduste identifitseerimiseks ja/või kvantifitseerimiseks spektroskoopiliste ja kromatograafiliste meetodite abil.1.4 TEAVE KATSEAINE KOHTAMärgistamata või isotoopmärgistatud katseainet saab kasutada transformatsioonikiiruse mõõtmiseks, kuigi eelistatakse märgistatud materjali. Märgistatud materjal on nõutav transformatsioonitee uurimiseks ja ainetaseme määramiseks. 14C-märgistust soovitatakse, kuid muude isotoopide (näiteks 13C, 15N, 3H, 32P) kasutamine võib olla samuti kasulik. Niipalju kui võimalik tuleks märgistus asetada molekuli kõige stabiilsema(te) osa(de) külge. [8] Katseaine keemiline ja/või radiokeemiline puhtus peaks olema vähemalt 95 %.Enne katse sooritamist peaks katseaine kohta olemas olema järgmine teave:a) lahustuvus vees (meetod A.6);b) lahustuvus orgaanilistes lahustites;c) aururõhk (meetod A.4) ja Henry konstant;d) n-oktanool/vee jaotustegur (meetod A.8);e) adsorptsioonikoefitsient (Kd, Kf or Koc, vajadusel) (meetod C.18);f) hüdrolüüs (meetod C.7);g) dissotsiatsioonikonstant (pKa) [OECD juhend 112] (13);h) katseaine keemiline struktuur ja isotoopmärgistus(t)e asukoht, kui need esinevad.Märkus:Tuleks teatada temperatuur, mille juures mõõtmisi tehakse.Muu kasulik teabe hulka võivad kuuluda andmed katseaine mikroorganismidele mõjuva mürgisuse kohta, andmed kiire ja/või inherentse biolagundatavuse kohta ning andmed aeroobse ja anaeroobse transformatsiooni kohta pinnases.Katseaine ja selle vees ja settes olevate transformatsioonisaaduste kvantifitseerimise ja identifitseerimise analüüsimeetodid (sh ekstraheerimis- ja puhastamismeetodid) peaksid olema kättesaadavad (vt punkt 1.7.2).1.5 KATSEMEETODI PÕHIMÕTEKäesolevas katses kirjeldatud meetod kasutab aeroobseid ja anaeroobseid põhjasetteid (vt lisa 1), mis võimaldavad:i) katseaine transformatsioonikiiruse mõõtmist põhjasettes,ii) katseaine transformatsioonikiiruse mõõtmist settes,iii) katseaine ja/või transformatsioonisaaduste mineralisatsioonikiiruse mõõtmist (kui kasutatakse 14C-märgistusega katseainet),iv) transformatsioonisaaduste identifitseerimine ja kvantifitseerimine vee- ja settefaasides, sh ainetase (kui kasutatakse märgistatud katseainet),v) katseaine ja selle transformatsioonisaaduste jaotamise mõõtmine kahe faasi vahel inkubatsiooni ajal pimedas (et vältida, näiteks, vetikavohangut) konstantsel temperatuuril. Poolestusajad, DT50, DT75 ja DT90 väärtused määratakse, kui andmed seda lubavad, kuid neid ei tohiks ekstrapoleerida pikalt üle katseperioodi (vt punkt 1.2).Vähemalt kaks setet ja nendega seotud veed on nõutavad nii aeroobseks kui anaeroobseks katseks (7). Siiski võib esineda olukordi, kui tuleks kasutada rohkem kui kahte põhjasetet, näiteks, kemikaalide puhul, mis võivad esineda magevees ja/või merekeskkonnas.1.6 KATSE KOHALDAMISALAMeetodit kohaldatakse kõikide keemiliste ainete suhtes (märgistamata või märgistatud, mille kohta on olemas piisavalt täpne ja tundlik analüüsimeetod. See on kohaldatav kergelt lenduvate, mittelenduvate, veeslahustuvate või vees halvasti lahustuvate ühendite suhtes. Katset ei kohaldata kemikaalide suhtes, mis kergesti lenduvad pinnasest (nt fumigandid, orgaanilised lahustid) ja seega ei saa seda hoida vees ja/või settes käesolevates katsemeetodites.Meetodit on kohaldatud nii palju, et uurida kemikaalide transformatsiooni magevees ja setetes, kuid põhimõtteliselt võib seda kohaldada ka suudmealas ja merekeskkonnas. See ei sobi voolava vee (nt jõed) või avamere tingimuste simuleerimiseks.1.7 KVALITEEDINÕUDED1.7.1 SaagisVähemalt kahe vee- ja setteproovi ekstraheerimine ja analüüs kohe katseaine lisamise järel annab esimesi märke analüüsimeetodi korratavuse kohta ning katseaine manustamise ühtsuse kohta Saagised katse hilisematelt etappidelt on saadud vastavatelt ainetasemetelt (kui kasutatakse märgistatud materjali). Saagised peaksid jääma vahemikku 90–110 % märgistatud kemikaalide puhul (6) ja 70–110 % märgistamata kemikaalide puhul.1.7.2 Analüüsimeetodi korratavus ja tundlikkusAnalüüsimeetodi korratavust (v.a alguses tehtud ekstraheerimise tõhusus) katseaine ja transformatsiooni saaduste kvantifitseerimiseks saab kontrollida, korduvanalüüsides samast veest või settest tehtud ekstrakti, mida on inkubeeritud seni, kuni tekivad transformatsioonisaadused.Katseaine ja transformatsioonisaaduste puhul peaks analüüsimeetodi avastamislävi (LOD) olema vähemalt 0,01 mg-kg-1 vee- või setteproovina (katseainena) või 1 % kasutatud lähteannusest, olenevalt sellest, kumb on väiksem. Kvantifikatsioonilävi (LOQ) tuleks samuti määrata.1.7.3 Transformatsioonist saadud andmete täpsusKatseaine kontsentratsioonide regressioonanalüüs ajafunktsioonina annab vajalikku teavet transformatsioonikõvera täpsuse kohta ning võimaldab arvutada poolestusaegade usalduspiire (näilise esimese astme kineetika puhul) või DT50 väärtused ja vajadusel DT75 ja DT90 väärtused.1.8 MEETODI KIRJELDUS1.8.1 Katsesüsteem ja -seadmedKatse tuleks teha klaasmahutites (nt pudelid, tsentrifuugiküvetid), välja arvatud juhul, kui esialgne teave (nt n-oktanooli-vee jaotustegur, sorbtsiooniandmed jne) viitab sellele, et katseaine võib kinnituda klaasile, mistõttu võiks kaaluda alternatiivse materjali kasutamist (nt teflon). Kui on teada, et katseaine kinnitub klaasile, võib olla võimalik leevendada seda probleemi, kasutades ühte või mitut järgmistest meetoditest:- määrata klaasile kinnitunud katseaine ja transformatsioonisaaduste mass,- pesta kõik klaasnõud lahustiga katse lõpus,- kasutada preparaate (vt ka punkt 1.9.2),- kasutada katseaine süsteemi lisamisel kaaslahusti suurenenud kogust; kui kasutatakse kaaslahustit, peaks see olema selline, mis ei solvolüüsi katseainet.Tüüpilise katseseadme näited, s.t gaasimöödavoolu- ja biomeetersüsteemid, on toodud vastavalt lisades 2 ja 3 (14). Muid kasulikke inkubatsioonisüsteeme on kirjeldatud viites 15. Katseseadme ülesehitus peaks olema selline, et see võimaldab õhu või lämmastiku vahetust ning lenduvate ainete püüdmist. Seadme mõõdud peaksid vastama katsetingimustele (vt 1.9.1). Ventilatsioon tagatakse kas kerge mullitamise või viies õhu või lämmastiku veepinnale. Viimasel juhul on soovitav segada vett kergelt ülevalpool, et hapnik või lämmastik vees paremini leviks. CO2-vaba õhku ei tohiks kasutada, kuna see võib põhjustada vee pH taseme tõusu. Igal juhul sette häirimine on ebasoovitav ja seda peaks vältima niipalju kui võimalik. Kergelt lenduvaid aineid tuleks uurida biomeetersüsteemis, veepinda kergelt segades. Samuti võib kasutada suletud anumaid, milles on kas atmosfääriõhuga või lämmastikuga õhuruum, ja sisemisi pudeleid lenduvate ainete püüdmiseks (16). Õhuruumi gaasi regulaarne vahetumine on nõutav aeroobses katses, et kompenseerida hapniku tarbimist biomassi poolt.Lenduvate transformatsioonisaaduste kogumiseks sobivad lõksud sisaldavad, kuid mitte ainult 1 mol-dm-3 kaaliumhüdroksiidi või naatriumhüdroksiidi lahuseid süsinikdioksiidi puhul [9] ja etüleenglükooli, etanoolamiini või 2 % parafiini ksüleenis orgaaniliste ühendite puhul. Anaeroobsetes tingimustes tekkinud lenduvad ained, näiteks metaan, saab koguda, näiteks, molekulaarsõelade abil. Sellised lenduvad ained saab põletada, näiteks, CO2-ks, viies gaasi CuO-ga täidetud kvartstorusse temperatuuril 900 °C ja püüdes absorberis tekkinud CO2 leelisesse (17).Nõutavad on katseainete ja transformatsioonisaaduste keemilise analüüsi laboriseadmed (nt gaasvedelikkromatograafia (GLC), kõrgefektiivne vedelikkromatograafia (HPLC), planaarkromatograafia (TLC), mass-spektroskoopia (MS), gaaskromatograaifa – mass-spektroskoopia (GS-MS), vedelik-kromatograafia – mass-spektromeetria (LC-MS), tuumamagnetresonants (NMR) jne), sh vajadusel radiomärgistatud või märgistamata kemikaalide avastamissüsteemid. Kui kasutatakse radiomärgistatud materjali, soovitatakse samuti vedelikstsintsillatsioonloendurit ja oksüdeerijat põletamiseks (setteproovide põletamiseks enne radioaktiivsuse analüüsi).Muud standardlaboriseadmed füüsikalis-keemiliste ja bioloogiliste määramiste joaks (vt tabel 1, punkt 1.8.2.2), klaasnõud, kemikaalid ja reaktiivid on nõutavad vastavalt vajadusele.1.8.2 Põhjasetete valik ja arvProovivõtukohad tuleks valida vastavalt katse eesmärgile igas nimetatud olukorras. Proovivõtukohtade valikul tuleks kaaluda valgla ja vee ülesvoolu võimalikke põllumajanduslikke, tööstuslikke või kodumajapidamise sisendeid. Setteid ei tohiks kasutada, kui need on saastatud katseainega või selle struktuurse analoogiga viimase 4 aasta jooksul.1.8.2.1 Sette valikTavaliselt kasutatakse aeroobsetes katsetes kahte setet (7). Need kaks setet peaksid erinema orgaanilise süsiniku sisalduse ja tekstuuri poolest. Ühel settel on kõrge orgaanilise süsiniku sisaldus (2,5–7,5 %) ja peen tekstuur, teisel on madal orgaanilise aine sisaldus (0,5–2,5 %) ja jäme tekstuur. Orgaanilise süsiniku sisaldused peaksid tavaliselt erinema vähemalt 2 %. "Peen tekstuur" tähendab määratluse järgi > 50 % [savi + aleuriidi] [10] sisaldust ja "jäme tekstuur" < 50 % [savi + aleuriidi] sisaldust. Kahe sette [savi + aleuriidi] sisaldus peaks tavaliselt erinema vähemalt 20 %. Juhul, kui kemikaal võib samuti jõuda merevette, peaks vähemalt üks põhjasete olema pärit merest.Rangelt anaeroobses katses tuleks valida prooviks kaks setet (sh nendega seotud vesi) pinnaveemassist anaeroobselt alalt (7). Sette- ja veefaase tuleks käsitleda ja transportida ettevaatlikult hapnikuta tingimustes.Muud parameetrid võivad olla tähtsad setete valikul ja neid tuleks arvesse võtta iga üksikjuhtumi puhul eraldi. Näiteks, setete pH-vahemik on tähtis selliste kemikaalide uurimisel, mille transformatsioon ja/või sorbtsioon sõltub pH-st. Sorbtsiooni pH-sõltuvust saab peegeldada katseaine pKaväärtuses.1.8.2.2 Põhjasetteproovide kirjeldamineNii vee kui sette puhul peamised parameetrid, mida tuleb mõõta ja millest tuleb teatada (viidates katsemeetodile), ning katseetapp, milles need parameetrid määratakse, on esitatud kokkuvõtlikult siin toodud tabelis. Nende parameetrite määramismeetodid on toodud viidetes (18)(19)(20)(21).Lisaks sellele võib osutuda vajalikuks mõõta ja teatada ka muudest parameetritest iga juhtumi puhul eraldi (nt magevee puhul: osakesed, aluselisus, kõvadus, elektrijuhtivus, NO3/PO4 (suhe ja üksikud väärtused); setete puhul: katioonvahetusvõime, veemahutavus, karbonaat, kogulämmastik ja -fosfor, ning merede puhul: soolsus). Setete või vee analüüs nitraadi, sulfaadi, biokättesaadava raua ja muude võimalike elektronaktseptorite kohta võib olla kasulik redokstingimuste hindamisel, eriti seoses anaeroobse transformatsiooniga.Vee-setteproovide iseloomustamiseks kasutatavate parameetrite mõõtmine (7)(22)(23)Parameeter | Katseprotseduuri etapp |väliproovide võtmine | järelkäsitlemine | kohanemise algus | katse algus | katse käigus | katse lõpp |VesiPäritolu/allikas | X | | | | | |Temperatuur (°C) | X | | | | | |pH | X | | X | X | X | X |Kogu orgaaniline süsinik | | | X | X | | X |O2 kontsentratsioon [11] | X | | X | X | X | X |Redokspotentsiaal [11] | | | X | X | X | X |SettedPäritolu/allikas | X | | | | | |Kihi sügavus | X | | | | | |pH | | X | X | X | X | X |Osakeste jaotus | | X | | | | |Kogu orgaaniline süsinik | | X | X | X | | X |Mikroobi biomass [12] | | X | | X | | X |Redokspotentsiaal [11] | Vaatlused (värv/lõhn) | | X | X | X | X |1.8.3 Kogumine, käsitlemine ja säilitamine1.8.3.1 KogumineISO põhjasetteproovide võtmist käsitleva juhendi (8) eelnõud tuleks kasutada setteproovide võtmisel. Setteproovid tuleks võtta sette 5-10 cm ülemisest kihist. Settega seotud vesi tuleks koguda samast kohast ja samal ajal kui sete. Anaeroobse katse puhul tuleks sette- ja sellega seotud vee proove võtta ja transportida hapnikuta (28) (vt punkt 1.8.2.1). Mõningaid proovivõtuseadmeid on kirjeldatud kirjanduses (8)(23).1.8.3.2 KäsitlemineSete eraldatakse veest filtreerimise teel ja sete märgsõelutakse läbi 2 mm sõelaava, kasutades liigsed proovivõtukohast võetud vett, mis seejärel visatakse minema. Seejärel segatakse soovitud suhtes (vt punkt 1.9.1) sette ja vee teadaolevad kogused inkubatsioonikolbides ja valmistataks ette kohanemiseks (vt punkt 1.8.4). Anaeroobse katse puhul tuleb sooritada kõik käsitlemisetapid hapniku puudumisel (29)(30)(31)(32)(33).1.8.3.3 SäilitamineVärskelt võetud sette- ja veeproovide kasutamist soovitatakse väga, kuid kuna säilitamine on vajalik, tuleks sete ja vesi sõeluda selliselt, nagu on kirjeldatud eespool, ja säilitada koos, veega küllastatult (6–10 cm veekiht), pimedas, temperatuuril 4 ± 2 °C [13] maksimaalselt 4 nädalat (7)(8)(23). Aeroobsetes katsetes kasutatud proovid tuleks säilitada vaba õhu juurdepääsuga (nt avatud mahutites), samas anaeroobsete katsete proovid tuleks säilitada ilma hapnikuta. Transportimisel ja säilitamisel ei tohi sette- või veeproove külmutada või setteproove kuivatada.1.8.4 Sette-/veeproovide katseks ettevalmistamineKohanemisperiood peaks aset leidma enne katseaine lisamist, asetades iga sette-/veeproovi inkubatsiooninõusse, mida kasutatakse põhikatses, ja kohanemine toimub täpselt samades tingimustes nagu katseinkubatsioon (vt punkt 1.9.1). Kohanemisperiood on aeg, mis kulub süsteemi mõistliku stabiilsuse saavutamiseks, mida peegeldavad pH, hapniku kontsentratsioon vees, sette- ja veeproovi redokspotentsiaal ning faaside makroskoopiline eraldamine. Kohanemisperiood peaks tavaliselt kestma üks kuni kaks nädalat ja ei tohiks ületada nelja nädalat. Nimetatud perioodil tehtud määramiste tulemused tuleks teha teatavaks.1.9 KATSE SOORITAMINE1.9.1 KatsetingimusedKatse tehakse inkubatsiooniseadmes (vt punkt 1.8.1), milles vee ja sette mahusuhe on 3:1 ja 4:1 ning settekiht on 2,5 cm (±0,5 cm). [14] Vähemalt 50 g setet (kuivmass) inkubatsioonianuma kohta on soovitav.Katse tuleks sooritada pimedas konstantsel temperatuuril vahemikus 10–30 °C. Temperatuur (20 ± 2) °C on sobiv. Vajadusel võib kasutada täiendavaid madalamaid temperatuure (nt 10 °C) iga juhtumi puhul eraldi, sõltuvalt katse kohta nõutavast teabest. Inkubatsioonitemperatuuri tuleks jälgida ja sellest teatada.1.9.2 Katseaine töötlemine ja lisamineKasutatakse kemikaali ühte katsekontsentratsiooni. [15] Põllukultuuride kemikaalide puhul, mida lisatakse otse veemassi, tuleks tõlgendada suurima annusena märgistusel suurimat lisamiskiirust, mis on arvutatud katseanuma vee pindala põhjal. Kõikidel muudel juhtudel peaks kasutatav kontsentratsioon põhinema keskkonnaemissioonidest tehtud ennustuste põhjal. Tuleks püüda tagada seda, et katseainet lisatakse piisavas kontsentratsioonis selleks, et iseloomustada transformatsiooniteed ning transformatsioonisaaduste teke ja vähenemist. Võib osutuda vajalikuks lisada suuremaid annuseid (nt 10-kordsed) olukordades, kus katseaine kontsentratsioonid on lähedal avastamispiiridele katse alguses ja/või kui peamisi transformatsioonisaaduseid ei suudeta kohe avastada, kuna nende kontsentratsioon on 10 % katseaine annusemäärast. Kui kasutatakse suuremaid kontsentratsioone, ei tohiks neil olla olulist negatiivset mõju vee-settesüsteemi mikroobide tegevusele. Katseaine konstantse kontsentratsiooni saamiseks erinevate mõõtmetega anumates võib pidada vajalikuks lisatava aine koguse kohandamist, mis põhineb veesamba sügavusel anumas seoses vee sügavusega uuritavas keskkonnas (mis eeldatavasti on 100 cm, kuid võib kasutada ka muid sügavusi). Vt lisa 4 näidisarvutamise kohta.Ideaalselt tuleks lisada katseainet vesilahusena katsesüsteemi veefaasi. Kui see on vältimatu, on lubatud kasutada veega segunevate lahustite (nt atsetoon, etanool) väikeseid koguseid katseaine lisamiseks ja jaotamiseks, kuid see ei tohiks ületada 1 % v/v ja sellel ei tohiks olla kahjulikke mõjusid katsesüsteemi mikroobide tegevusele. Katseaine vesilahus tuleks teha hoolikalt – täieliku homogeensuse tagamiseks võib vaja minna generaatorkolonne ja eelsegamist. Katsesüsteemi vesilahuse lisamise järel on soovitav veefaasi õrnalt segada, häirides setet nii vähe kui võimalik.Preparaatide kasutamist tavaliselt ei soovitata, kuna preparaatide koostisosad võivad mõjutada katseaine ja/või transformatsioonisaaduste jaotumist vee- ja settefaaside vahel. Nt nõrgalt veeslahustuva katseaine puhul võib siiski kasutada preparaati sobiva alternatiivina.Inkubatsioonianumate arv sõltub proovivõtukordade arvust (vt punkt 1.9.3). Katsesüsteeme peaks olema piisavalt, et igal proovivõtukorral võib kasutada kahte süsteemi. Kui iga põhjasettesüsteemi kohta tehakse kontrollproovid, ei tohiks neid töödelda katseainega. Kontrollproove saab kasutada sette mikroobi biomassi ning vee- ja setteproovide orgaanilise süsiniku koguarvu määramiseks katse lõpus. Kahte kontrollproovi (s.t üks kontrollproov iga põhjasette kohta) saab kasutada nõutud parameetrite jälgimiseks settes ja vees kohanemise ajal (vt tabelit punktis 1.8.2.2). Tuleks teha kaks täiendavat kontrollproovi juhul, kui katseainet lisatakse lahusti abil, et mõõta kahjulikke mõjusid katsesüsteemi mikroobide tegevusele.1.9.3 Katse kestus ja proovide võtmineKatse ei tohiks tavaliselt kesta kauem kui 100 päeva (6) ning peaks jätkuma seni, kuni lagunemise ja vee/sette jaotamise kohta esitatakse selgitus või kui 90 % katseainest on hävinud transformatsiooni ja/või lendumise tõttu. Proovivõtukordade arv peaks olema vähemalt kuus (sealhulgas proovivõtu 0 kord), ja enne katset võib kasutada valikulist eelkatset (vt punkt 1.9.4), mille käigus määratakse asjaomased proovivõturežiimid ja katse kestus, välja arvatud juhul, kui katseaine kohta on olemas piisavalt andmeid eelnevatest uuringutest. Hüdrofoobsete katseainete puhul võib vaja minna täiendavaid proovivõtuhetki katse algperioodil, et määrata vee- ja settefaaside jaotamise kiirus.Asjaomastel proovivõtuaegadel eemaldatakse analüüsis kõik inkubatsioonianumad (paralleelproovides). Setet ja selle peal olevat vett analüüsitakse eraldi. [16] Pinnavesi tuleks hoolikalt eemaldada setet minimaalselt häirides. Katseaine ja transformatsioonisaaduste ekstraheerimine ja karakteriseerimine peaksid järgima asjaomaseid analüütilisi protseduure. Tuleks hoolikalt eemaldada aine, mis võib olla adsorbeerunud inkubatsioonianumasse või lenduvate ainete püüdmistorusse.1.9.4 Valikulised eelkatsedKui proovivõtu kestust ja režiimi ei saa hinnata muude, katseainet käsitlevate asjaomaste uuringute põhjal, võib pidada vajalikuks teha valikuline eelkatse, mis tuleks sooritada, kasutades samu katsetingimusi, mis on välja pakutud lõppuuringuks. Asjaomased katsetingimuste ja eelkatse tulemuste kohta, kui see on sooritatud) tuleks esitada lühiprotokoll.1.9.5 Mõõtmised ja analüüsKatseaine a transformatsioonisaaduste kontsentratsiooni igal proovivõtu korral vees ja settes tuleks mõõta ja neist teatada (lisatud kontsentratsiooni ja protsendimäärana). Üldiselt tuleks identifitseerida transformatsoonisaadused, mis on avastatud ≥ 10 %-na radioaktiivsest ainest vee-sette koguproovis igal proovivõtuajal, kui seda ei ole mõistlikult teisiti põhjendatud. Transformatsioonisaaduseid, mille kontsentratsioonid katse käigus pidevalt kasvavad, tuleks samuti identifitseerimisel arvesse võtta, isegi siis, kui nende kontsentratsioonid ei ületa eespool toodud piirnorme, kuna see võib viidata aine püsivusele. Viimast tuleks arvesse võtta iga juhtumi puhul eraldi, tuues põhjendused protokollis.Gaaside/lenduvate ainete püüdmissüsteemide (CO2 ja muud, s.t. lenduvad orgaanilised ühendid) tulemustest tuleks teatada igal proovivõtuajal. Tuleks teatada ka mineralisatsioonikiirus. Ekstraheerimata (seotud) jääkidest settes tuleks teatada igal proovivõtuhetkel.2. TULEMUSED2.1 TULEMUSTE TÖÖTLEMINELisatud radioaktiivse aine kogu ainetase või saagis (vt punkt 1.7.1) arvutatakse igal proovivõtukorral. Tulemustest tuleks teada anda lisatud radioaktiivse aine protsendimäärana. Radioaktiivse aine jaotamisest vee ja sette vahel tuleks teatada kontsentratsioonide ja protsendimääradena igal proovivõtukorral.Katseaine poolestusaeg, DT50 ja vajadusel DT75 ja DT90 tuleks arvutada koos usalduspiiridega (vt punkt 1.7.3). Teavet katseaine hävimiskiiruse kohta vees ja settes võib saada sobivate hindamisprotseduuride abil. Nende hulka kuuluvad näiline esimese astme kineetika, graafilisi või numbrilisi lahendeid kasutavad empiirilised kõvera moodustamise tehnika ning keerukamad hindamised, näiteks ühe või mitme lahtriga näidised. Täiendavaid üksikasju võib leida asjaomasest avaldatud kirjandusest (35)(36)(37).Kõikidel lähenemistel on oma tugevad ja nõrgad küljed ning need erinevad märkimisväärselt oma keerukuse poolest. Esimese astme kineetika võib lagundamis- ja jaotamisprotsesse liiga lihtsustada, kuid võimaluse korral lisab suuruse (kiirusekonstant või poolestusaeg), mis on hõlpsasti mõistetav ja mis on väärtuslik simulatsioonimudelite koostamisel ja prognoositavate arvutuskontsentratsioonide arvutamisel. Empiiriliste lähenemiste või lineaarsete transformatsioonide käigus võidakse saada andmete jaoks paremini sobivaid kõveraid ja seetõttu hinnata paremini poolestusaegasid, DT50 ja vajadusel DT75 ja DT90-väärtusi. Tuletatud konstantide kasutamine on siiski piiratud. Lahternäidiste abil võib luua riski hindamise jaoks kasulikke, väärtuslikke konstante, mis kirjeldavad lagunemiskiirust erinevates sektorites ja kemikaali jaotust. Neid tuleks samuti kasutada kiiruskonstantide hindamiseks peamiste transformatsioonisaaduse tekkel ja lagunemisel. Kõikidel juhtudel tuleb valitud meetodit põhjendada ja eksperimenteerija peaks graafiliselt ja/või statistiliselt esitama sobivuse headuse.3. PROTOKOLL3.1 KATSEPROTOKOLLProtokoll peab hõlmama järgmist teavet:Katseaine:- üldnimetus, keemiline nimetus, CASi number, struktuurivalem (tuues ära märgi(märkide) asukoha, kui kasutatakse radiomärgistatud ainet) ja asjaomased füüsikalis-keemilised omadused,- katseaine puhtus (lisandid),- märgistatud kemikaali radiokeemiline puhtus ja molaarne aktiivsus (vajadusel).Võrdlusained:- selliste võrdlusainete keemiline nimetus ja struktuur, mida kasutatakse transformatsioonisaaduste kirjeldamiseks ja/või identifitseerimiseks.Uuritavad setted ja veed:- põhjasettest proovide võtmise koha (kohtade) asukoht ja kirjeldus, sh võimaluse korral saastumise ajalugu,- kogu teave vee-settesüsteemide kogumise, säilitamise (kui säilitatakse) ja kohanemise kohta,- vee-setteproovide tunnused, mis on loetletud punkti 1.8.2.2 tabelis.Katsetingimused:- kasutatud katsesüsteem (nt möödavool, biomeeter, õhutamisviis, segamismeetod, veemaht, settemass, nii vee- kui settekihi paksus, katseanumate mõõdud jne),- katseaine lisamine katsesüsteemi: kasutatud katsekontsentratsioon, paralleelproovide ja kontrollproovide arv, katseaine lisamisviis (nt lahusti abil, kui seda kasutatakse) jne,- inkubatsioonitemperatuur,- proovivõtuajad,- ekstraheerimismeetodid ja -tõhusused ning analüüsimeetodid ja avastamispiirid,- transformatsioonisaaduste kirjeldamise/identifitseerimise meetodid,- kõrvalekalded katseprotokollist või katsetingimustest katse käigus.Tulemused:- representatiivsete analüüside töötlemata andmed (kõik töötlemata andmed tuleb säilitada labori arhiivis),- kasutatud analüüsimeetodite korratavus ja tundlikkus,- saagisemäärad (valiidse katse protsendimäärad on toodud punktis 1.7.1),- tulemused tabeli kujul, väljendatuna katseaine ja vajadusel transformatsioonisaaduste ning ekstraheerimata radioaktiivsete ainete protsendimäärana lähteannusest ja vajadusel mg-kg-1 vees, settes ja kogu süsteemis (vaid protsendina),- ainetase uuringute kestel ja lõpus,- vee- ja settefraktsioonides ning kogu süsteemis toimunud transformatsiooni (sh mineralisatsiooni) graafiline esitamine,- mineralisatsioonikiirused,- katseaine ja vajadusel peamiste transformatsioonisaaduste poolestusaeg, DT50 ja vajadusel DT75 ja DT90 väärtused, kaasa arvatud usalduspiirid vees, settes ja kogu süsteemis,- hinnang katseaine ja vajadusel peamiste transformatsioonisaaduste transformatsioonikineetika kohta,- vajadusel eeldatavad transformatsiooniteed,- tulemuste arutelu.4. VIITED(1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany.(2) Commission for registration of pesticides: Application for registration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The Netherlands.(3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United-Kingdom.(4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) - Anaerobic and aerobic. Canada, pp. 35-37.(5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, Anaerobic aquatic metabolism.(6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.(7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.(8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality - Sampling - Part 12: Guidance on sampling of bottom sediments.(9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 712-C-98-080.(10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).(11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).(12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.(14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. BCPC - Pests and Diseases, 3B-4, 149-158.(15) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry (D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114. J. Wiley & Sons.(16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inoculation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631-637.(17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with 14C-labelled model surfactants. Water Research 21, 661-667.(18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.(19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (17th edition). American Public Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.(20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. Longman.(21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential measurements. Anal. Chemistry 44, 1038-1039.(22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests', 3-4 July 1991.(23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach.(24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, 2858-2868.(25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329-338.(26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon requirements of actively-metabolising microbial populations under in-situ conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197-203.(27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method.(28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sediment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13-21.(29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850-857.(30) Birch, R.R., Biver, C, Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, U., Steber, ]., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527-1550.(31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegradation tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499-1509.(32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A batch test for assessing the mineralisation of 14C-radiolabelled compounds under realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597-3603.(33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 712-C-98-090.(34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sediment characteristics and drying sediment on sorption coefficients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, 961-968.(35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer, 39, 187-203.(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues I. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer, 33, 47-60.(37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water systems. Brighton Crop Protection Conference - Pest and Diseases, pp. 1349-1354.[1] Näiteks, kui katseaine sisaldab ühte rõngast, on nõutav see märgistada; kui katseaine sisaldab kahte või enamat rõngast, võib vaja minna eraldi uuringuid kummagi märgistatud rõnga säilimise hindamiseks ja sobiva teabe saamiseks transformatsioonisaaduste tekke kohta.[2] Pinnase veeläbilaskvusvõimet saab mõõta väliveemahutavusena, veemahutavuse või imirõhuna (pF). Selgitused on lisas 1. Katseprotokollis tuleks edastada, kas pinnase veeläbilaskvusvõime ja lasuvustihedus määrati kindlaks looduspärastes väliproovides või häiritud (töödeldud) proovides.[3] Viimased uurimistulemused viitavad sellele, et parasvöötmes kogutud mullaproove saab samuti säilitada -20 °C juures üle kolme kuu (28)(29) mikroobide aktiivsust oluliselt häirimata.[4] Mullaproov ei tohiks kunagi olla liiga märg või liiga kuiv, et säiliks mulla mikrofloora piisav õhutus ja toitumine. Soovituslikud niiskusesisaldused optimaalseks mikroobi kasvuks on 40–60 % veemahutavusest (WHC) ja 0.1-0.33 baari (6). Viimane vahemik on sama, mis 2,0–2,5 pF-vahemik. Erinevatele mullatüüpidele omased niiskusesisaldused on toodud lisas 2.[5] Aeroobsed tingimused domineerivad pindmises mullakihis ja isegi aluspõhjas, nagu on näidatud EÜ rahastatud uurimusprojektis: [K. Takagi et al. (1992). Microbial diversity and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal variation in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internal. Symp. Environm. Aspects Pesticides Microbiol., 270–277, 17–21 August 1992, Sigtuna, Sweden]. Anaeroobsed tingimused võivad esineda vaid juhuslikult pinnaste üleujutuste käigus pärast tugevaid sademeid või siis, kui on loodud niiske põllumajanduse tingimused riisipõldudel.[6] Aeroobsed uuringud tuleks lõpetada palju varem kui 120 päeva, tingimusel et selgelt on selleks ajaks jõutud lõpliku transformatsiooniteeni ja lõpliku mineralisatsioonini. Katse lõpetamine on võimalik pärast 120 päeva või siis, kui vähemalt 90 % katseainest transformeeritakse, kuid tekkis ainult 5 % CO2.[7] Järgmise võrrandi abil arvutatakse lähtekontsentratsioon pindala põhjal:Csoilmg/kgsoil = Akg/ha·106mg/kg1m·104m2/ha·dkgsoil/m3Csoil = lähtekontsentratsioon mullaproovis [mg-kg-1]A = annustamine [kg-ha-1]; l = mullakihi paksus uuritavas keskkonnas [m]; d = kuivlasuvustihedus [kg-m-3].Rusikareegel on, et annustamisel 1 kg-ha-1 saadakse pinnase kontsentratsiooniks ligikaudu 1 mg-kg-1 10 cm kihis (oletades, et lasuvustihedus on 1 g . cm-3).[1] Mückenhausen, Ε. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.[2] pF = veesamba kõrguse (cm) logaritm.[3] 1 baari = 10s Pa.[4] Vastab ligikaudsele 10 %-lisele veesisaldusele liivas, 3,5 %-lisele mudas ja 45 %-lisele savis.[5] Väliveemahutavus ei ole konstantne, vaid see varieerub vastavalt mulla tüübile pF 1,5ja 2, vahel.[1] Veemahutavus.[8] Näiteks, kui aine sisaldab ühte rõngast, tuleb see rõngas märgistada. Kui katseaine sisaldab kahte või enamat rõngast, on vaja eraldi katseid teha, et hinnata iga märgistatud rõnga säilimise hindamiseks ning sobiva teabe saamiseks transformatsioonisaaduste tekke kohta.[9] Kuna nimetatud leeliselised absorbtsioonilahused absorbeerivad ka õhutamisel süsinikdioksiidi ning aeroobsetes katsetes hingamisel tekkinud süsinikdioksiidi, tuleb neid regulaarselt vahetada, et vältida nende küllastumist ja seega nende absorbtsioonivõime hävimist.[10] [Savi + aleuriit] on sette mineraalfraktsioon, mille osakeste suurus on < 50 μm.[11] Viimased uurimustulemused on näidanud, et vee hapniku kontsentratsioonide ja redokspotentsiaalide mõõtmistel ei ole mehhanistlikku ega ennustatavat väärtust, kui käsitletakse mikroobipopulatsioonide kasvu ja arengut pinnavetes (24)(25). Biokeemilise hapnikutarbe (BOD) määramine väliproovide võtmisel, katse alguses või lõpus) ja mikro/makrotoitainete Ca, Mg ja Mn kontsentratsioonide määramine (katse alguses ja lõpus) vees ning kogulämmastiku ja kogukaaliumi mõõtmine setetes (väliproovide võtmise ajal ja katse lõpus) sobivad paremini aeroobse biotransformatsiooni kiiruste ja teede tõlgendamiseks ja hindamiseks.[12] Aeroobsetes uuringutes mikroobide hingamiskiiruse meetod (26), suitsutusmeetod (27) või bakterite arvu määramine (nt bakterid, kiirikbakterid, seened ja kolooniate koguarv), anaeroobsetes uuringutes metanogeneesi kiirus.[13] Viimased uuringud on näidanud, et säilitamine temperatuuril 4 °C võib põhjustada sette orgaanilise süsiniku sisalduse vähenemist, mille võimalikuks tulemuseks on mikroobide tegevuse vähenemine (34).[14] Viimased uuringud on näidanud, et säilitamine temperatuuril 4 °C võib põhjustada sette orgaanilise süsiniku sisalduse vähenemist, mille võimalikuks tulemuseks on mikroobide tegevuse vähenemine (34).[15] Katse tegemine teise kontsentratsiooniga võib olla kasulik kemikaalide puhul, mis jõuavad pinnavette erinevaid teid pidi oluliselt erinevate kontsentratsioonide tõttu, kuni saab analüüsida väiksemat kontsentratsiooni piisavalt täpselt.[16] Kui võib toimuda kiire anaeroobsete transformatsioonisaaduste reoksüdeerumine, tuleks säilitada anaeroobsed tingimused proovivõtu ja analüüsimise ajal.--------------------------------------------------