CELEX: 31979L1067
Language: pt
Date: 1979-11-13 00:00:00
Title: Primeira Directiva 79/1067/CEE da Comissão, de 13 de Novembro de 1979, que fixa os métodos de análise comunitários para o controlo de certos leites conservados total ou parcialmente desidratados destinados à alimentação humana

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31979L1067

Primeira Directiva 79/1067/CEE da Comissão, de 13 de Novembro de 1979, que fixa os métodos de análise comunitários para o controlo de certos leites conservados total ou parcialmente desidratados destinados à alimentação humana  

Jornal Oficial nº L 327 de 24/12/1979 p. 0029 - 0052 Edição especial finlandesa: Capítulo 13 Fascículo 10 p. 0150  Edição especial grega: Capítulo 13 Fascículo 9 p. 0056  Edição especial sueca: Capítulo 13 Fascículo 10 p. 0150  Edição especial espanhola: Capítulo 13 Fascículo 10 p. 0264  Edição especial portuguesa: Capítulo 13 Fascículo 10 p. 0264 

PRIMEIRA DIRECTIVA DA COMISSÃO de 13 de Novembro de 1979 que fixa os métodos de análise comunitários para o controlo de certos leites conservados total ou parcialmente desidratados destinados à alimentação humana(79/1067/CEE)  A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,  Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,  Tendo em conta a Directiva 76/118/CEE do Conselho, de 18 de Dezembro de 1975, relativa à aproximação das legislações dos Estados-membros respeitantes a certos leites conservados parcial ou totalmente desidratados destinados à alimentação humana (1) e,  nomeadamente, o seu artigo 11o,  Considerando que o artigo 11o da Directiva 76/118/CEE prevê que a composição de certos leites conservados parcial ou totalmente desidratados deve ser controlada por métodos de análise comunitários;  Considerando que é desejável que seja adoptada uma primeira série de métodos cujo estudo está terminado;  Considerando que as medidas previstas na presente directiva são conformes ao parecer emitido pelo Comité Permanente dos Géneros Alimentícios;  ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:   Artigo 1o  Os Estados-membros tomarão as medidas adequadas para que as análises necessárias ao controlo dos critérios que constam do Anexo I sejam efectuados em conformidade com os métodos descritos no Anexo II.   Artigo 2o  No caso em que são indicados métodos alternativos para a mesma determinação, a amostra pode ser analisada por qualquer desses métodos. O relatório do ensaio, referido no Anexo II, deve mencionar o método utilizado.   Artigo 3o  Os Estados-membros porão em vigor disposições legislativas, regulamentares e administrativas para darem cumprimento à presente directiva no prazo de dezoito meses a contar da sua notificação. Desse facto informarão imediatamente a Comissão.   Artigo 4o  Os Estados-membros são destinatários da presente directiva.  Feito em Bruxelas em 13 de Novembro de 1979.  Pela Comissão Etienne DAVIGNON Membro da Comissão   (1) JO no L 24 de 30. 1. 1976, p. 49.     ANEXO I   ÂMBITO DE APLICAÇÃO DOS PRIMEIROS MÉTODOS DE ANÁLISE COMUNITÁRIOS A APLICAR NA DIRECTIVA RELATIVA A CERTOS LEITES CONSERVADOS PARCIAL OU TOTALMENTE DESIDRATADOS I. Disposições gerais II. Determinação do teor de matéria seca:  - leite evaporado rico em matéria gorda« pelo método 1 (Anexo II)],  - leite evaporado ou leite evaporado gordo [pelo método 1 (Anexo II)],  - leite evaporado parcialmente desnatado [pelo método 1 (Anexo II)],  - leite evaporado desnatado [pelo método 1 (Anexo II)],  - leite condensado ou leite condensado gordo [pelo método 1 (Anexo II)],  - leite condensado parcialmente desnatado [pelo método 1 (Anexo II)],  - leite condensado desnatado [pelo método 1 (Anexo II)].  III. Determinação do teor de humidade:  - leite em pó rico em matéria gorda ou pó de leite rico em matéria gorda [pelo método 2 (Anexo II)],  - leite em pó, leite em pó gordo, pó de leite ou pó de leite gordo [pelo método 2 (Anexo II)],  - leite em pó parcialmente desnatado ou pó de leite parcialmente desnatado [pelo método 2 (Anexo II)],  - leite em pó desnatado ou pó de leite desnatado [pelo método 2 (Anexo II)].  IV. Determinação da matéria gorda:  - leite evaporado rico em matéria gorda [pelo método 3 (Anexo II)],  - leite evaporado ou leite evaporado gordo [pelo método 3 (Anexo II)],  - leite evaporado parcialmente desnatado [pelo método 3 (Anexo II)],  - leite desnatado [pelo método 3 (Anexo II)],  - leite condensado ou leite condensado gordo [pelo método 3 (Anexo II)],  - leite condensado parcialmente desnatado [pelo método 3 (Anexo II)],  - leite condensado desnatado [pelo método 3 (Anexo II)],  - leite em pó rico em matéria gorda, ou pó de leite rico em matéria gorda [pelo método 4 (Anexo II)],  - leite em pó, leite em pó gordo, pó de leite ou pó de leite gordo [pelo método 4 (Anexo II)],  - leite em pó parcialmente desnatado ou pó de leite parcialmente desnatado [pelo método 4 (Anexo II)],  - leite em pó desnatado ou pó de leite desnatado [pelo método 4 (Anexo II)].  V. Determinação da sacarose:  - leite condensado ou leite condensado gordo [pelo método 5 (Anexo II)],  - leite condensado parcialmente [desnatado pelo método 5 (Anexo II)],  - leite condensado desnatado [pelo método 5 (Anexo II)].  VI. Determinação do ácido láctico e dos lactatos:  - leite em pó rico em matéria gorda ou pó de leite rico em matéria gorda [pelo método 6 (Anexo II)],  - leite em pó, leite em pó gordo, pó de leite ou pó de leite gordo [pelo método 6 (Anexo II)],  - leite em pó parcialmente desnatado em pó ou pó de leite parcialmente desnatado [pelo método 6 (Anexo II)],  - leite em pó desnatado ou pó de leite desnatado [pelo método 6 (Anexo II)].  VII. Determinação da actividade fosfatásica:  - leite em pó rico em matéria gorda ou pó de leite rico em matéria gorda [pelo método 7 ou 8 (Anexo II)],  - leite em pó, leite em pó gordo, pó de leite ou pó de leite gordo [pelo método 7 ou 8 (Anexo II)],  - leite em pó parcialmente desnatado ou pó de leite parcialmente desnatado [pelo método 7 ou 8 (Anexo II)],  - leite em pó desnatado ou pó de leite desnatado [pelo método 7 ou 8 (Anexo II)].        ANEXO II   MÉTODOS DE ANÁLISE RELATIVOS A COMPOSIÇÃO DE CERTOS LEITES CONSERVADOS PARCIAL OU TOTALMENTE DESIDRATADOS DESTINADOS AO CONSUMO HUMANO DISPOSIÇÕES GERAIS 1. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA PARA ANÁLISE QUÍMICA 1.1. Leite evaporado rico em matéria gorda Leite evaporado ou leite evaporado gordo Leite evaporado parcialmente desnatado Leite evaporado desnatado Agitar a caixa fechada invertendo-a. Abrir a caixa e transferir lentamente o leite para um segundo recipiente que possa ser fechado hermeticamente, misturando-o por transferências sucessivas. Assegurar que todos os resíduos de gordura e de leite que  aderem às paredes e ao fundo da caixa sejam misturados na amostra. Fechar o recipiente. Se o conteúdo não estiver homogéneo, aquecer a caixa em banho-maria a 40 ° C. Agitar vigorosamente de 15 em 15 minutos. Após 2 horas, retirar o recipiente do  banho-maria e deixar arrefecer à temperatura ambiente. Retirar a tampa e misturar cuidadosamente o conteúdo com o auxílio de uma colher ou espátula (se a gordura estiver desemulsionada convém não proceder à análise da amostra). Conservar em local  fresco.  1.2. Leite condensado ou leite gordo condensado Leite condensado parcialmente desnatado Leite condensado desnatado Caixas:  Aquecer a caixa fechada em banho-maria a 30 - 40 ° C durante cerca de 30 minutos. Abrir a caixa e misturar cuidadosamente o conteúdo com uma espátula ou colher, efectuando movimentos ascendentes, descendentes e circulares a fim de obter uma mistura  inteira das camadas superiores e inferiores com todo o conteúdo. Procurar que os restos do leite que aderem às paredes e ao fundo da caixa sejam incorporados na amostra. Se possível, transferir o conteúdo para um segundo recipiente munido de fecho  estanque. Fechar o recipiente e conservar no frio.  Tubos: Cortar o fundo e transferir o conteúdo para um recipiente munido de fecho estanque. Cortar depois o tubo no sentido do comprimento, retirar todas as matérias que aderem às paredes e misturar cuidadosamente com o resto do conteúdo. Conservar o  recipiente no frio.  1.3. Leite em pó rico em matéria gorda ou pó de leite rico em matéria gorda Leite em pó, leite em pó gordo, pó de leite ou pó de leite gordo Leite em pó parcialmente desnatado ou pó de leite parcialmente desnatado Leite em pó desnatado ou pó de leite  desnatado Transferir o leite em pó para um recipiente limpo e seco (de fecho estanque) com uma capacidade correspondente ao dobro do volume do pó. Fechar o recipiente imediatamente e misturar inteiramente o leite em pó por agitações e inversões sucessivas.  Durante a preparação da amostra, é necessário evitar, tanto quanto possível, a exposição do leite em pó ao ar atmosférico, de modo a reduzir ao mínimo a absorção de água.  2. REAGENTES 2.1. Água 2.1.1. Sempre que se utilize água para soluções, diluições ou lavagens, é necessário utilizar água destilada, água desmineralizada ou água de pureza pelo menos equivalente.  2.1.2. Quando o termo «solução» ou «diluição» é utilizado sem outra indicação, trata-se de solução em água ou diluição em água.  2.2. Produtos químicos Todos os produtos químicos utilizados devem ser de qualidade analítica reconhecida, salvo especificações especiais.  3. APARELHOS E UTENSÍLIOS 3.1. Lista dos aparelhos As listas de aparelhos contêm apenas os artigos para utilização especializada ou com especificações especiais.  3.2. Balança analítica O termo «balança analítica» refere-se a uma balança capaz de pesar com uma precisão de pelo menos 0,1 mg.  4. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS 4.1. Cálculo da percentagem Salvo indicações em contrário, o resultado será calculado em percentagem de massa da amostra recebida no laboratório.  4.2. Número de algarismos significativos Os resultados não devem conter um número de algarismos significativos superior àquele que é justificado pela precisão do método de análise utilizado.  5. RELATÓRIO DO ENSAIO O relatório do ensaio especificará o método de análise utilizado bem como os resultados obtidos. Mencionará, por outro lado, todos os pormenores do procedimento não especificados no método de análise ou facultativos, bem como as condições susceptíveis  de terem influenciado o resultado obtido.  O relatório do ensaio fornecerá todas as informações necessárias à identificação completa da amostra.  MÉTODO 1: DETERMINAÇÃO DO TEOR DE MATÉRIA SECA (Estufa a 99 ° C) 1. ÂMBITO DE APLICAÇÃO Este método permite determinar o teor de matéria seca dos leites a seguir enumerados:  - leite evaporado rico em matéria gorda,  - leite evaporado ou leite gordo evaporado,  - leite evaporado parcialmente desnatado,  - leite evaporado desnatado concentrado,  - leite concentrado parcialmente desnatado,  - leite condensado desnatado.  2. DEFINIÇÃO Matéria seca do leite evaporado: matéria seca determinada pelo método especificado.  3. PRINCÍPIO DO MÉTODO Uma quantidade conhecida da amostra é diluída com água, misturada com areia e seca a uma temperatura de 99 ± 1 ° C. A massa após secagem constitui a massa de matéria seca. A matéria seca é expressa em percentagem da massa da amostra.  4. REAGENTES Areia de quarzo ou areia de mar (tamanho dos grãos: 0,18-0,5 mm, tratados com ácido clorídrico passado através de peneiro de 500 microns e retidos por peneiro de 180 microns). Deve corresponder ao teste de controlo a seguir descrito:  Aquecer cerca de 25 g de areia durante 2 horas na estufa (ponto 5.3) como se descreve nos pontos 6.1 a 6.3. Adicionar 5 ml de água, aquecer de novo na estufa durante 2 horas, arrefecer e pesar de novo. A diferença entre as duas pesagens não deve  ultrapassar 0,5 mg.  Se for caso disso, tratar a areia com ácido clorídrico a 25 % durante 3 dias; misturar de vez em quando. Lavar com água até eliminação da reacção ácida ou até que a água de lavagem esteja isenta de cloretos. Secar a 160 ° C e repetir o teste como acima  indicado.  5. APARELHOS E UTENSÍLIOS 5.1. Balança analítica.  5.2. Cápsulas metálicas, de preferência em níquel, alumínio ou aço inoxidável. As cápsulas devem estar munidas de tampas que se adaptem convenientemente mas que possam ser retiradas facilmente. As dimensões mais convenientes são: 60 a 80 mm de diâmetro  e 25 mm de profundidade, aproximadamente.  5.3. Estufa de secagem à pressão atmosférica, bem ventilada e controlada por termostato, regulada à temperatura de 99 ± 1 ° C. É importante que a temperatura seja uniforme no conjunto da estufa.  5.4. Exsicador provido de um indicador higrométrico, contendo gel de sílica recentemente activado ou em exsicante equivalente.  5.5. Varetas de vidro curtas, com uma das extremidades achatada e um comprimento correspondente às dimensões interiores das cápsulas metálicas (ponto 5.2).  5.6. Banho-maria em ebulição.  6. TÉCNICA 6.1. Colocar na cápsula (ponto 5.2), cerca de 25 g de areia (ponto 4) e uma vareta de vidro (ponto 5.5).  6.2. Aquecer a cápsula, a tampa e o conteúdo mantendo a tampa levantada, durante 2 horas na estufa (ponto 5.3).  6.3. Colocar a tampa na cápsula e transferir para o exsicador (ponto 5.4). Deixar arrefecer à temperatura ambiente e pesar com a aproximação de 0,1 mg (M0).  6.4. Inclinando a tampa, juntar a areia dum lado da cápsula. Introduzir no espaço livre disponível cerca de 1,5 g de amostra se for leite condensado e 3,0 se for leite evaporado. Ajustar a tampa e pesar com a aproximação de 0,1 mg (M1).  6.5. Retirar a tampa, adicionar 5 ml de água e, com a vareta de vidro (ponto 5.5), misturar os líquidos, depois a areia e a parte líquida. Deixar a vareta na mistura.  6.6. Colocar a cápsula sobre o banho-maria em ebulição (ponto 5.6) até que a água se tenha evaporado (em geral cerca de 20 minutos). Agitar a mistura de vez em quando com a vareta para que a massa fique bem arejada e não se aglutine após secagem.  Colocar a vareta no interior da cápsula.  6.7. Colocar a cápsula e a tampa na estufa, durante cerca de 1h e 30 min.  6.8. Colocar novamente a tampa, transferir a cápsula para o exsicador e deixar arrefecer até à temperatura ambiente; pesar com a aproximação de 0,1 mg.  6.9. Destapar a cápsula e aquecê-la, bem como a respectiva tampa, durante 1 hora na estufa.  6.10. Repetir a operação do ponto 6.8.  6.11. Repetir as operações descritas nos pontos 6.9 e 6.8 até que duas pesagens sucessivas não apresentem uma diferença superior a 0,5 mg ou que a massa aumente. Neste último caso, utilizar nos cálculos a pesagem com a massa mais baixa. Assegurar que o  peso final anotado seja M2g.  7. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS 7.1. Modo de cálculo O teor de matéria seca, expresso em percentagem da massa da amostra é dado pela fórmula:   × 100 onde:  M0 = massa, em gramas, da cápsula, sua tampa e areia após a operação do ponto 6.3,  M1 = massa, em gramas, da tampa, da cápsula da areia e da amostra após a operação do ponto 6.4,  M2 = massa, em gramas, da tampa, da cápsula da areia e da amostra seca após a operação do ponto 6.11.  7.2. Reprodutibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas, efectuadas simultaneamente ou rapidamente uma a seguir à outra, pelo mesmo analista na mesma amostra e nas mesmas condições não deve exceder 0,2 g de matéria seca para 100 g de produto.  8. CÁLCULO DO TEOR DE SUBSTÂNCIAS SÓLIDAS TOTAIS E DO TEOR DE SUBSTÂNCIAS SÓLIDAS NAO GORDAS NO LEITE 8.1. O teor de substâncias sólidas totais dos leites condensados é dado por:  - o teor de matéria seca total [obtido pelo método 1 (Anexo II)],  - o teor de sacarose [obtido pelo método 5 (Anexo II)].  8.2. O teor de substâncias sólidas não gordas dos leites evaporados é dado por:  - o teor de matéria seca total [obtido pelo método 1 (Anexo II)];  - o teor de sacarose [obtido pelo método 5 (Anexo II)],  - o teor de matéria gorda [obtido pelo método 3 (Anexo II)].  8.3. O teor de substâncias sólidas não gordas dos leites evaporados não açucarados é dado por:  - o teor de matéria seca total [obtido pelo método 1 (Anexo II)],  - o teor de matéria gorda [obtido pelo método 3 (Anexo II)].  MÉTODO 2: DETERMINAÇÃO DO TEOR DE HUMIDADE (Estufa a 102 ° C) 1. ÂMBITO DE APLICAÇÃO Este método permite determinar a perda de massa por secagem dos leites a seguir enumerados:  - leite em pó rico em matéria gorda ou pó de leite rico em matéria gorda,  - leite em pó, leite em pó gordo, pó de leite ou pó de leite gordo,  - leite em pó parcialmente desnatado ou pó de leite parcialmente desnatado,  - leite em pó desnatado ou pó de leite desnatado.  2. DEFINIÇÃO Teor de humidade: a perda de massa por secagem determinada pelo método especificado.  3. PRINCÍPIO DO MÉTODO A massa residual da porção de ensaio é determinada após secagem à pressão atmosférica em estufa a 102 ± 1 ° C até obtenção de massa constante. A perda de massa é calculada em percentagem da massa da amostra.  4. APARELHOS E UTENSÍLIOS 4.1. Balança analítica.  4.2. Cápsulas, de preferência de vidro, níquel, alumínio ou aço inoxidável. As cápsulas devem ser munidas de tampas convenientemente adaptadas mas que se possam retirar facilmente. As dimensões mais convenientes são: 60 a 80 mm de diâmetro e cerca de 25  mm de profundidade.  4.3. Estufa à pressão atmosférica, bem ventilada e controlada por termóstato, com temperatura regulada a 102 ± 1 ° C. É importante que a temperatura no conjunto da estufa seja uniforme.  4.4. Exsicador com indicador higrométrico e contendo gel de sílica recentemente activado ou um exsicante equivalente.  5. TÉCNICA 5.1. Retirar a tampa da cápsula (ponto 4.2) e colocar a cápsula e tampa na estufa (ponto 4.3) durante cerca de 1 hora.  5.2. Voltar a colocar a tampa, transferir a cápsula para o exsicador (ponto 4.4) e deixar arrefecer até à temperatura ambiente; pesar com a aproximação de 0,1 mg (M0).  5.3. Colocar na cápsula cerca de 2 g de amostra de leite seco, pôr a tampa na cápsula e pesar rapidamente a cápsula com tampa com a aproximação de 0,1 mg (M1).  5.4. Retirar a tampa e colocar a cápsula e tampa na estufa durante 2 horas.  5.5. Tapar de novo. Transferir a cápsula tapada para o exsicador e deixar arrefecer até à temperatura ambiente; pesar rapidamente com a aproximação de 0,1 mg.  5.6. Destapar a cápsula e aquecer, assim como a tampa, durante 1 hora na estufa.  5.7. Repetir a operação do ponto 5.5.  5.8. Repetir as operações dos pontos 5.6 e 5.5 até que as pesagens sucessivas não apresentem uma diferença superior a 0,5 mg ou que a massa aumente. Neste último caso utilizar nos cálculos a pesagem com massa mais baixa (ponto 6.1). Assegurar que o peso  final anotado seja M2 g.  6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS 6.1. Modo de cálculo Calcular a perda de massa da amostra na secagem, expressa em percentagem de massa, utilizando a fórmula:   × 100 M0 = massa, em gramas, da cápsula e da tampa após a operação do ponto 5.2,  M1 = massa, em gramas, da cápsula, sua tampa e amostra após a operação do ponto 5.3,  M2 = massa, em gramas, da cápsula, sua tampa e amostra final após a operação do ponto 5.5.  6.2. Reprodutibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas simultaneamente ou rapidamente uma após a outra, pelo mesmo analista na mesma amostra e nas mesmas condições não deve exceder 0,1 g de água para 100 g de produto.  MÉTODO 3: DETERMINAÇÃO DO TEOR DE MATÉRIA GORDA (MÉTODO DE ROESE-GOTTLIEB) 1. ÂMBITO DE APLICAÇÃO Este método permite determinar o teor de matéria gorda dos leites a seguir enumerados:  - leite evaporado rico em matéria gorda,  - leite evaporado ou leite evaporado gordo,  - leite evaporado parcialmente desnatado,  - leite evaporado desnatado,  - leite condensado ou leite condensado gordo,  - leite condensado parcialmente desnatado,  - leite condensado desnatado.  2. DEFINIÇÃO Teor de matéria gorda dos leites evaporados: o teor de matéria gorda determinado pelo método descrito.  3. PRINCÍPIO DO MÉTODO O teor de matéria gorda é determinado por extracção de matéria gorda de uma solução amoníaco-alcoólica da amostra por meio de óxido dietílico e éter de petróleo, evaporação dos solventes e pesagem do resíduo, cálculo em percentagem da massa de amostra,  segundo o método de Roese-Gottlieb.  4. REAGENTES Todos os reagentes devem corresponder às condições estabelecidas no ensaio em branco (ponto 6.1). Se necessário, os reagentes poderão ser destilados novamente na presença de cerca de 1 g de gordura de manteiga para 100 ml de solvente.  4.1. Solução de amoníaco, aproximadamente a 25 % (m/m) de NH3 (densidade a 20 ° C, cerca de 0,91 g/ml) ou uma solução mais concentrada de concentração conhecida.  4.2. Etanol, a 96 ± 2 % (v/v) ou, na sua falta, etanol desnaturado com metanol, etilmetilcetona ou éter de petróleo.  4.3. Oxido dietílico isento de peróxidos Nota 1 Para confirmar se o óxido dietílico está isento de peróxidos, adicionar a 10 ml de óxido contidos numa pequena proveta de vidro rolhada, previamente lavada com um pouco de óxido, 1 ml de uma solução a 10 % iodeto de potássio preparada recentemente.  Agitar e deixar repousar durante 1 minuto. Não deve aparecer nenhuma coloração amarela em nenhuma das duas camadas.  Nota 2 O óxido dietílico pode ser mantido isento de peróxidos por adição de uma folha de zinco húmido, previamente mergulhada durante 1 minuto numa solução ácida diluída de sulfato de cobre, depois lavada com água. Para cada litro de óxido dietílico, utilizar  8.000 mm2 de zinco cortado em tiras suficientemente compridas para atingir pelo menos o meio do recipiente.  4.4. Éter de petróleo, que destile entre 30 et 60 ° C.  4.5. Mistura de solventes, preparada pouco tempo antes da utilização por mistura de volumes iguais de óxido dietílico (ponto 4.3) e éter de petróleo (ponto 4.4). (Pode-se substituir a mistura de solventes, nos casos em que a sua utilização é indicada,  pelo óxido dietílico ou éter de petróleo).  5. APARELHOS E UTENSÍLIOS 5.1. Balança analítica.  5.2. Tubos ou balões de extracção apropriados, com rolha de vidro esmerilada ou outras formas de vedação insensíveis à acção dos solventes utilizados.  5.3. Frascos de fundo plano e parede fina de 150 a 250 ml de capacidade.  5.4. Estufa de secagem à pressão atmosférica, bem ventilada, controlada por termostato (temperatura a 102 ± 1 ° C).  5.5. Grânulos destinados a facilitar a ebulição, isentos de matéria gorda, não porosos nem friáveis, por exemplo pérolas de vidro ou bocados de carboneto de silício (a utilização destes grânulos é facultativa; ver, sobre o assunto, o ponto 6.2.1).  5.6. Sifão correspondente aos tubos de extracção.  5.7. Centrifugadora.  6. TÉCNICA 6.1. Ensaio em branco Em simultâneo com a determinação da matéria gorda da amostra, efectuar um ensaio em branco com 10 ml de água utilizando o mesmo tipo de aparelho de extracção, os mesmos reagentes nas mesmas proporções e o mesmo modo operatório adiante descrito com  exclusão do ponto 6.2.2. Se o valor do ensaio em branco ultrapassar 0,5 mg convém verificar os reagentes, devendo os reagentes impuros ser purificados ou substituídos.  6.2. Determinação 6.2.1. Secar o balão (5.3.) (eventualmente depois de nele ter introduzido os materiais (ponto 5.5) que facilitam uma ebulição moderada durante a evaporação dos solventes) na estufa (ponto 5.4), durante meia hora a 1 hora. Deixar arrefecer o balão até à  temperatura da sala de balanças e pesá-lo depois de arrefecido, com a aproximação de 0,1 mg.  6.2.2. Agitar a amostra de 5 g preparada e pesar imediatamente com a aproximação de 1 mg, directamente ou por diferença, 4 g de leite evaporado ou 2 a 2,5 g de leite condensado no aparelho de extracção (ponto 5.2). Adicionar água até ao volume de 10,5  ml e agitar suavemente, aquecendo ligeiramente (40 a 50 ° C) até dispersão total do produto. A amostra deve estar completamente dispersa senão a determinação deve ser repetida.  6.2.3. Adicionar 1,5 ml da solução de amoníaco (25 %) (ponto 4.1) ou um volume correspondente de uma solução mais concentrada e misturar convenientemente.  6.2.4. Juntar 10 ml de etanol (ponto 4.2) e misturar os líquidos suave mas completamente no aparelho de extracção mantido aberto.  6.2.5. Juntar 25 ml de óxido dietílico (ponto 4.3). Em caso de necessidade arrefecer o aparelho sob água corrente. Fechar o aparelho, agitá-lo energicamente e invertê-lo várias vezes durante 1 minuto.  6.2.6. Retirar a tampa com precaução e juntar 25 ml de éter de petróleo (ponto 4.4) utilizando os primeiros mililitros para lavar o interior do colo do aparelho e deixando os líquidos de lavagem escorrer no aparelho. Fechar o aparelho introduzindo a  rolha, agitar e inverter o aparelho várias vezes durante 30 segundos. Se não se prevê centrifugação aquando da operação descrita no ponto 6.2.7 não agitar demasiado energicamente.  6.2.7. Deixar o aparelho em repouso até que a camada líquida superior se torne límpida e se separe nitidamente da fase aquosa. Pode igualmente efectuar-se a separação coma ajuda de uma centrifugadora adequada (ponto 5.7).  Observação Se se utilizar uma centrifugadora cujo motor não é trifásico podem produzir-se faíscas, tornando-se necessário vigiar para evitar uma explosão ou incêndio devido à presença de vapores de éter (em caso de ruptura de um tubo, por exemplo).  6.2.8. Retirar a tampa e lavar, assim como o interior do colo do aparelho, com alguns mililitros da mistura de solventes (ponto 4.5) deixar os líquidos de lavagem escorrer no aparelho. Transferir com cuidado, tão completamente quanto possível, a camada  superior para o frasco (ponto 6.2.1) por decantação ou com a ajuda de um sifão (ponto 5.6).  Observação Se a transferência não for feita com a ajuda de um sifão, pode ser necessário juntar um pouco de água para elevar a interface das duas camadas a fim de facilitar a decantação.  6.2.9. Lavar o interior e o exterior do colo do aparelho ou da ponta e parte inferior do sifão com alguns mililitros da mistura de solventes. Deixar os líquidos de lavagem do exterior e interior do aparelho escorrer para o balão bem como os do interior  do colo e do sifão do aparelho de extracção.  6.2.10. Proceder a uma segunda extracção repetindo as operações descritas nos pontos 6.2.5. a 6.2.9, inclusive, mas utilizando somente 15 ml de óxido dietílico e 15 ml de éter de petróleo.  6.2.11. Efectuar uma terceira extracção procedendo como se indica no ponto 6.2.10 mas omitindo a lavagem final, (ponto 6.2.9.).  ObservaçãoNo caso do leite desnatado evaporado e do leite desnatado condensado, esta extracção não é necessária.  6.2.12. Eliminar com cuidado, por evaporação ou destilição, o máximo de solvente (incluindo o etanol). Se o frasco for de capacidade reduzida será necessário eliminar um pouco do solvente, do modo acima referido, após cada extracção.  6.2.13. Quando já não houver nenhum cheiro a solvente aquecer o frasco deitado, durante 1 hora na estufa.  6.2.14. Retirar o frasco da estufa, deixá-lo arrefecer até à temperatura da sala das balanças e pesar com a aproximação de 0,1 mg.  6.2.15. Repetir as operações dos pontos 6.2.13 e 6.2.14 aquecendo por períodos de 30 a 60 minutos até que duas pesagens sucessivas não apresentem uma diferença superior a 0,5 mg ou que a massa aumente. Neste último caso utilizar nos cálculos (ponto  7.1), a pesagem mais baixa. Assegurar que o peso final anotado seja M1 g.  6.2.16. Juntar 15 a 25 ml de éter de petróleo para verificar se a matéria gorda é completamente solúvel. Aquecer ligeiramente e agitar o solvente com movimentos circulares até que toda a matéria gorda esteja em solução.  6.2.16.1. Se a matéria extraída for inteiramente solúvel no éter de petróleo, a massa da matéria gorda é a diferença entre a pesagem do ponto 6.2.12 e a do 6.2.15.  6.2.16.2. Se estiverem presentes matérias insolúveis ou sempre, em caso de dúvida, extrair completamente a matéria gorda lavando várias vezes com éter de petróleo quente, deixando depositar a matéria não dissolvida antes de cada decantação. Lavar três  vezes o exterior do colo do frasco. Aquecer o frasco, deitado, durante 1 hora na estufa e deixar arrefecer como acima indicado (ponto 6.2.1) até à temperatura da sala de balanças; pesar com a aproximação de 0,1 mg. A massa da matéria gorda é a diferença  entre a pesagem do ponto 6.2.15 e esta pesagem final.  7. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS 7.1. Modo de cálculo A massa expressa em gramas, da matéria gorda é dada pela fórmula:  (M1 - M2) - (B1 - B2) e o teor de matéria gorda da amostra, expresso em percentagem, pela fórmula:   × 100 em que:  M1 = massa, em gramas, do frasco M, que contém a matéria gorda, após a operação do ponto 6.2.15,  M2 = massa, em gramas, do frasco M após a operação do ponto 6.2.1 ou, no caso de existência de matérias insolúveis ou em caso de dúvida, após a operação do ponto 6.2.16.2,  B1 = massa, em gramas, do frasco B do ensaio em branco após a operação do ponto 6.2.15,  B2 = massa, em gramas, do frasco B, após a operação do ponto 6.2.1 ou, no caso de existência de matérias insolúveis ou em caso de dúvida, após a operação do ponto 6.2.16.2.  S = massa, em gramas, da toma de ensaio utilizada.  7.2. Reprodutibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas simultaneamente ou rapidamente uma após a outra pelo mesmo analista, na mesma amostra e nas mesmas condições não deve exceder 0,05 g de matéria gorda para 100 g de produto.  MÉTODO 4: DETERMINAÇÃO DO TEOR DE MATÉRIA GORDA (MÉTODO DE ROESE-GOTTLIEB) 1. ÂMBITO DE APLICAÇÃO Este método permite determinar o teor de matéria gorda dos leites a seguir enumerados:  - Leite em pó rico em matéria gorda ou pó de leite rico em matéria gorda,  - leite em pó, leite em pó gordo, pó de leite ou pó de leite gordo,  - leite em pó parcialmente desnatado ou pó de leite parcialmente desnatado,  - leite em pó desnatado ou pó de leite desnatado.  2. DEFINIÇÃO O teor de matéria gorda dos leites em pó é o teor de matéria gorda determinado pelo método especificado.  3. PRINCÍPIO DO MÉTODO O teor de matéria gorda é determinado por extracção de matéria gorda de uma solução amoníaco-alcóolica da amostra por meio de óxido dietílico e éter de petróleo, evaporação dos solventes, pesagem do resíduo e cálculo, em percentagem, da massa da  amostra, segundo o princípio do método de Roese-Gottlieb.  4. REAGENTES Todos os reagentes devem ser conformes às condições estabelecidas no ensaio em branco (ponto 6.1). Se necessário os reagentes podem ser redestilados na presença de cerca de 1 g de gordura de manteiga para 100 ml de solvente.  4.19. Solução de amoníaco, aproximadamente a 25 % (m/m) de NH3 (densidade a 20 ° C, cerca de 0,91 g/ml) ou solução mais concentrada de concentração conhecida.  4.2. Etanol, a 96 ± 2 % (v/v) ou, na sua falta, etanol desnaturado com metanol, etilmetilcetona ou éter de petróleo.  4.3. Óxido dietílico isento de peróxidos.  Nota 1 Para verificar se o óxido dietílico está isento de peróxidos, adicionar a 10 ml de óxido dietílico contidos numa pequena proveta de rolha de vidro, previamente lavada com um pouco de óxido dietílico, 1 ml de uma solução a 10 % de iodeto de potássio  recentemente preparada. Agitar e deixar repousar durante 1 minuto. Nenhuma coloração amarela deve aparecer em qualquer das camadas.  Nota 2 O óxido dietílico pode ser mantido isento de peróxidos por adição de uma folha de zinco húmida, previamente mergulhada durante 1 minuto numa solução ácida diluída de sulfato de cobre e depois lavada com água. Para um litro de óxido dietílico utilizar  cerca de 8 000 mm2 de folha de zinco cortada em tiras suficientemente compridas para atingir pelo menos o meio do recipiente.  4.4. Éter de petróleo que destile entre 30 e 60 ° C.  4.5. Mistura de solventes preparada pouco tempo antes da sua utilização, por mistura de volumes iguais de óxido dietílico (ponto 4.3) e éter de petróleo (ponto 4.4). (Poderá substituir-se a mistura de solventes nos casos em que a sua utilização é  prescrita, por óxido dietílico ou por éter de petróleo).  5. APARELHOS E UTENSÍLIOS 5.1. Balança analítica.  5.2. Tubos ou frascos de extracção adequados, com rolha de vidro esmerilado, ou outros fechos inertes em relação aos solventes utilizados.  5.3. Frascos de fundo plano e parede fina, de 150 a 250 ml de capacidade.  5.4. Estufa de secagem à pressão atmosférica bem ventilada e controlada por termostato (temperatura a 102 ± 1 ° C).  5.5. Grânulos destinados a facilitar a ebulição, isentos de matéria gorda, não porosos, não friáveis, por exemplo pérolas de vidro ou bocados de carboneto de silício (o uso destes grânulos é facultativo, ver a esse respeito o ponto 6.2.1).  5.6. Banho-maria de 60 a 70 ° C.  5.7. Sifão correspondente aos tubos de extracção.  5.8. Centrifugadora.  6. TÉCNICA 6.1. Ensaio em branco Ao mesmo tempo que a determinação do teor da matéria gorda da amostra efectuar um ensaio em branco com 10 ml de água utilizando o mesmo tipo de aparelho de extracção, os mesmos reagentes nas mesmas proporções e a mesma técnica que a seguir se descreve,  excluindo o ponto 6.2.2. Se o valor do ensaio em branco ultrapassar 0,5 mg é conveniente verificar os reagentes, devendo ser purificados ou substituídos o ou os reagentes impuros.  6.2. Determinação 6.2.1. Secar o frasco (ponto 5.3) [eventualmente depois de nele ter introduzido os materiais (ponto 5.5) que facilitam uma ebulição moderada durante a evaporação dos solventes] na estufa (ponto 5.4) durante meia hora a 1 hora. Deixar arrefecer o frasco  até à temperatura da sala de balanças e pesá-lo após arrefecimento, com a aproximação de 0,1 mg.  6.2.2. No aparelho de extracção (ponto 5.2) pesar com a aproximação de 1 mg, quer directamente quer por diferença, cerca de 1 g de leite gordo em pó ou cerca de 1,5 g de leite parcialmente desnatado em pó ou de leite desnatado em pó. Juntar 10 ml de  água e agitar até à dispersão total do pó de leite (pode ser necessário aquecer certas amostras).  6.2.3. Juntar 1,5 ml de solução de amoníaco (25 %) (ponto 4.1) ou um volume correspondente de uma solução mais concentrada e aquecer no banho-maria (ponto 5.6) durante 15 minutos de 60 a 70 ° C, agitando de vez em quando. Arrefecer depois por exemplo,  com água corrente.  6.2.4. Juntar 10 ml de etanol (ponto 4.2) e misturar os líquidos suave mas completamente no aparelho que se mantém aberto.  6.2.5. Juntar 25 ml de óxido dietílico (ponto 4.3). Arrefecer se necessário com água corrente. Fechar o aparelho, agitar energicamente várias vezes durante 1 minuto.  6.2.6. Retirar a rolha com precaução e juntar 25 ml de éter de petróleo (ponto 4.4) utilizando os primeiros mililitros para lavar a rolha e o interior do colo do aparelho e deixando os líquidos de lavagem escorrer no aparelho. Voltar a colocar a rolha,  agitar várias vezes invertendo o aparelho, durante 30 segundos. Se não se prevê a centrifugação aquando da operação descrita no ponto 6.2.7, não agitar demasiado energicamente.  6.2.7. Deixar o aparelho em repouso até que a camada líquida superior se apresente límpida e se separe nitidamente da fase aquosa. Pode igualmente efectuar-se a separação com uma centrifugadora adequada (ponto 5.8).  Observação Se for utilizada uma centrifugadora cujo motor não é trifásico podem produzir-se faíscas e é portanto necessário vigiar para evitar uma explosão ou incêndio devidos à presença de vapores de éter (em caso de ruptura de um tubo, por exemplo).  6.2.8. Retirar a rolha e lavá-la, assim como o interior do colo do aparelho. Transferir com cuidado, tão completamente quanto possível, a camada superior para o frasco (ponto 6.2.1) por decantação ou com um sifão (ponto 5.7).  Observação Se a transferência não for feita com um sifão pode ser necessário juntar um pouco de água para elevar a interface das duas camadas a fim de facilitar a decantação.  6.2.9. Lavar o exterior e interior do colo do aparelho ou a ponta e a parte inferior do sifão, com alguns mililitros da mistura de solventes. Deixar os líquidos de lavagem do exterior do aparelho escorrer para o frasco e os do interior e do sifão para o  aparelho de extracção.  6.2.10. Proceder a uma segunda extracção repetindo as operações descritas nos pontos 6.2.5 a 6.2.9 inclusive, mas utilizando somente 15 ml de óxido dietílico e 15 ml de éter de petróleo.  6.2.11. Efectuar uma terceira extracção procedendo como se indica no ponto 6.2.10, mas omitindo a lavagem final (ponto 6.2.9).  Observação Tratando-se de leite em pó desnatado, a terceira extracção não é necessária.  6.2.12. Eliminar com cuidado, por evaporação ou destilação, o máximo de solvente (incluindo o etanol). Se o frasco for de capacidade reduzida será necessário eliminar um pouco de solvente, do modo referido, após cada extracção.  6.2.13. Quando já não houver nenhum cheiro a solvente, aquecer o frasco, deitado, durante 1 hora na estufa.  6.2.14. Retirar o frasco da estufa e deixar arrefecer até à temperatura da sala de balanças como acima indicado (ponto 6.2.1) e pesar com a aproximação de 0,1 mg.  6.2.15. Repetir as operações dos pontos 6.2.13 e 6.2.14 aquecendo por períodos de 30 a 60 minutos até que a diferença entre duas pesagens sucessivas seja, em massa, inferior a 0,5 mg ou até que a massa aumente. Se houver aumento de massa utilizar nos  cálculos (ponto 7.1) a massa mais baixa. M1 é a massa obtida em g.  6.2.16. Juntar 15 a 25 ml de éter de petróleo para verificar se a matéria extraída é inteiramente solúvel. Aquecer ligeiramente e agitar o solvente com movimentos circulares até que toda a matéria gorda esteja em solução.  6.2.16.1. Se a matéria extraída for inteiramente solúvel no éter de petróleo, a massa da matéria gorda é a diferença entre as pesagens do ponto 6.2.1 e a do ponto 6.2.15.  6.2.16.2. Se existir matéria insolúvel e sempre, em caso de dúvida, extrair completamente a matéria gorda contida no frasco por lavagens repetidas com éter de petróleo quente, deixando depositar a matéria não dissolvida antes de cada decantação. Lavar  por três vezes o exterior do colo do frasco. Aquecer o frasco deitado durante 1 hora na estufa e deixar arrefecer até à temperatura da sala de balanças como se indica acima (ponto 6.2.1) e pesar com a aproximação de 0,1 mg. A massa de matéria gorda é a  diferença entre a pesagem do ponto 6.2.15 e a pesagem final.  7. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS 7.1. Modo de cálculo A massa, expressa em gramas, da matéria gorda extraída é dada pela fórmula:  (M1 - M2) - (B1 - B2) e o teor de matéria gorda da amostra, expresso em percentagem, pela fórmula:   × 100 em que:  M1 = massa, em gramas, do frasco M com a matéria gorda após a operação do ponto 6.2.15,  M2 = massa, em gramas, do frasco M após a operação do ponto 6.2.1, ou no caso de existência de matérias insolúveis ou em caso de dúvida, após a operação do ponto 6.2.16.2,  B1 = massa, em gramas, do frasco B do ensaio em branco após a operação do ponto 6.2.15,  B2 = massa, em gramas, do frasco B após a operação do ponto 6.2.1, ou no caso de existência de matérias insolúveis ou em caso de dúvida após a operação do ponto 6.2.16.2,  S = massa, em gramas, da toma de ensaio utilizada.  7.2. Reprodutibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas simultaneamente ou rapidamente uma após a outra, pelo mesmo analista, na mesma amostra, nas mesmas condições, não deve exceder 0,2 g de matéria gorda para 100 g de produto, com excepção do  leite desnatado em pó para o qual a diferença não deve exceder 0,1 mg de matéria gorda para 100 g de produto.  MÉTODO 5: DETERMINAÇÃO DO TEOR DE SACAROSE (MÉTODO POLARIMÉTRICO) 1. ÂMBITO DE APLICAÇÃO Este método permite determinar o teor de sacarose dos leites a seguir enumerados:  - leite condensado ou leite condensado gordo,  - leite condensado parcialmente desnatado,  - leite condensado desnatado.  As amostras não devem conter açúcar invertido. Y¤¤2. DEFINIÇÃO O teor de sacarose dos leites condensados é o teor de sacarose determinado pelo método especificado.  3. PRINCÍPIO DO MÉTODO O método é baseado no princípio da inversão de Clerget: um tratamento suave com um ácido hidroliza completamente a sacarose. A lactose e os outros açúcares não são praticamente hidrolizados. O teor de sacarose é deduzido da alteração poder rotatório da  solução.  Um filtrado límpido da amostra, sem mutarotação devida à lactose, é preparado por tratamento da solução por amoníaco, neutralização e clarificação por adições sucessivas de soluções de acetato de zinco e hexaferrocianeto de potássio.  Sobre uma parte do filtrado, a sacarose é hidrolizada nas condições descritas.  Partindo dos poderes rotatórios antes e após a inversão, calcula-se o teor de sacarose por meio das fórmulas.  4. REAGENTES 4.1. Solução de acetato de zinco, M: dissolver 21,9 g de acetato de zinco cristalizado Zn (C2H3O2)2 · 2H2O e 3 ml de ácido acético glacial em água e perfazer 100 ml.  4.2. Solução de hexaferrocianeto de potássio (II), 0,25 M: dissolver 10,6 g de hexaferrocianeto (II) de potássio K4[Fe(CN)6] · 3H2O em água e perfazer 100 ml.  4.3. Solução de ácido clorídrico 6,35 ± 0,20 M (20 a 22 %) ou 5,0 ± 0,2 M (16 a 18 %).  4.4. Solução diluída de amoníaco 2,0 ± 0,2 M (3,5 %).  4.5. Solução diluída de ácido acético 2,0 ± 0,2 M (12 %).  4.6. Indicador azul de bromotimol, solução a 1 % (m/v) em etanol.  5. APARELHOS E UTENSÍLIOS 5.1. Balança analítica, com sensibilidade de 10 mg.  5.2. Tubo de polarímetro de 2 dm de comprimento rigorosamente calibrado.  5.3. Polarímetro ou sacarímetro:  a) Polarímetro com luz de sódio ou luz verde de mercúrio (lâmpada de vapor de mercúrio com prisma ou écran Wratten especial no 77 A), que permita uma leitura com a precisão de, pelo menos, 0,05 graus de ângulo.  b) Sacarímetro com escala internacional, utilizando a luz branca que passa através de um filtro de 15 mm de solução a 6 % de dicromato de potássio ou da luz de sódio e que permita uma leitura com uma precisão pelo menos igual a 0,1 graus da escala  sacarimétrica internacional.  5.4. Banho-maria regulado a 60 ± 1 ° C.  6. TÉCNICA 6.1. Controlo do método A fim de normalizar o método, os reagentes e os aparelhos, proceder-se-á a um controlo do método como seguidamente se descreve, por análise, em duplicado, de uma mistura de 100 g de leite e 18 g de sacarose pura ou de 110 g de leite desnatado e 18 g de  sacarose pura, correspondendo a 40 g de leite evaporado que contenha 45 % de sacarose. Calcular o teor de sacarose por meio das fórmulas indicadas no ponto 7 utilizando na fórmula 1, para M, F e P, a quantidade de leite pesado e os teores de matéria  gorda e de proteínas desse leite e, na fórmula 2, para M o algarismo de 40 g. A média dos valores encontrados não deve diferir deste valor (45 %) mais de 0,2 %.  6.2. Determinação 6.2.1. Numa cápsula de vidro de 100 ml, pesar com precisão de 10 mg, cerca de 40 g de amostra convenientemente misturada. Juntar 50 ml de água quente (80 a 90 ° C) e misturar cuidadosamente.  6.2.2. Transferir quantitativamente a mistura para um balão aferido de 200 ml, lavar a cápsula com quantidades sucessivas de água a 60 ° C, até que o volume total seja de 120 a 150 ml. Misturar e arrefecer à temperatura ambiente.  6.2.3. Juntar 5 ml da solução de amoníaco diluída (ponto 4.4). Misturar de novo e deixar repousar durante 15 minutos.  6.2.4. Neutralizar o amoníaco adicionando uma quantidade equivalente da solução diluída de ácido acético (ponto 4.5). Determinar previamente a quantidade exacta de ml por titulação da solução de amoníaco diluída utilizando como indicador o azul de  bromotimol (ponto 4.6). Misturar.  6.2.5. Juntar, misturando suavemente por rotação do balão inclinado, 12,5 ml de solução de acetato de zinco (ponto 4.1).  6.2.6. Do mesmo modo que para a solução de acetato, juntar 12,5 ml de solução de hexaferrocianeto (II) de potássio (ponto 4.2).  6.2.7. Levar o conteúdo do frasco a 20 ° C e juntar água (a 20 ° C) até ao traço marcado de 200 ml.  Observação Até esta fase todas as adições de água ou de reagentes serão efectuadas de modo a evitar a formação de bolhas de ar e, por esta mesma razão todas as misturas serão efectuadas por rotação do frasco e não por agitação violenta. Se se verificar a presença  de bolhas de ar antes de ajustar o volume ao traço (200 ml), podem eliminar-se ligando bala uma bomba de vácuo e imprimindo-lhe um movimento de rotação.  6.2.8. Tapar o balão com uma rolha seca e misturar completamente sacudindo energicamente.  6.2.9. Deixar repousar durante alguns minutos e filtrar seguidamente por papel de filtro seco. Rejeitar os 25 primeiros ml do filtrado.  6.2.10. Polarização directa: determinar a rotação óptica do filtrado a 20 ° ± 1 ° C.  6.2.11. Inversão: pipetar para um balão marcado de 50 ml, 40 ml do filtrado obtido do modo anteriormente indicado. Juntar 6,0 ml de ácido clorídrico 6,35 M ou 7,6 ml de ácido clorídrico 5,00 M (ponto 4.3).  Colocar o balão num banho-maria a 60 ° C durante 15 minutos, devendo o balão estar imergido até à base do colo. Misturar por rotação durante os 5 primeiros minutos durante os quais o conteúdo deve ter atingido a temperatura do banho. Arrefecer a 20 ° C  e perfazer o volume com água a 20 ° C; misturar e deixar repousar 1 hora a esta temperatura.  6.2.12. Polarização após inversão Determinar o poder rotatório da solução invertida a 20 ± 0,2 ° C (quando a temperatura T do líquido no tubo de polarização diferir mais de 0,2 ° C durante a medição, deve ser aplicada a correcção de temperatura indicada no ponto 7.2).  7. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS 7.1. Modo de cálculo Calcular o teor de sacarose por meio das seguintes fórmulas:  1. V =  (1,08 F + 1,55 P) 2. S =  ×  ×  % S = teor de sacarose,  M = massa da amostra pesada, expressa em g,  F = percentagem da matéria gorda da amostra,  P = percentagem de proteínas (N × 6,38) da amostra,  V = volume, en ml, em que é diluída a amostra antes da filtração,  V = correcção, expressa en ml, para o volume de precipitado formado durante a clarificação,  D = leitura polarimétrica directa (polarização antes da inversão),  I = leitura polarimétrica após inversão,  L = comprimento em dm do tubo do polarímetro,  Q = factor de inversão cujos valores são a seguir indicados.  Observações a) Pesando exactamente 40 g de leite condensado e utilizando um polarímetro com luz de sódio, graduado em graus de ângulo e um tubo de polarímetro de 2 dm de comprimento a 20,0 ± 0,1 ° C, o teor de sacarose dos leites condensados normais (C = 9) pode  ser calculado pela fórmula seguinte:  S = (D - 1,25 I) (2,833 - 0,00612F - 0,00878 P) b) Se medição da polarização após inversão for efectuada a temperatura diferente de 20 ° C, os números obtidos devem ser multiplicados por:  [1 + 0,0037 (T - 20)] 7.2. Valores do factor de inversão Q As fórmulas seguintes dão os valores exactos de Q para diversas fontes de luz, com correcções, se for caso disso, para a concentração e a temperatura:  Luz de sódio e polarímetro com escala em graus de ângulo:  Q = 0,8825 + 0,0006 (C - 9) - 0,0033 (T - 20).  Luz verde de mercúrio e polarímetro com escala em graus de ângulo:  Q = 1,0392 + 0,0007 (C - 9) - 0,0039 (T - 20).  Luz branca com écran de dicromato e sacarímetro com escala sacarimétrica internacional:  Q = 2,549 + 0,0017 (C - 9) - 0,0095 (TT - 20).  Nas fórmulas anteriores:  C = percentagem de açúcares totais na solução invertida após a leitura polarimétrica.  T = temperatura da solução invertida aquando da leitura no polarímetro.  Observação I A percentagem de açúcares totais C na solução invertida pode ser calculada a partir da leitura directa e da variação após inversão segundo o método habitual, utilizando os valores normais de rotação específica da sacarose, da lactose e do açúcar  invertido.  A correcção 0,0006 (C - 9) etc., só é exacta quando C for igual a cerca de 9; para o leite condensado normal esta correcção pode ser desprezada, sendo então C próximo de 9.  Observação 2 Os desvios de temperatura de 1 ° C em relação a 20 ° C influenciam pouco a leitura directa. Os desvios de mais de 0,2 ° C aquando da leitura, pelo contrário, exigem uma correcção. A correcção - 0,0033 (T - 20), etc., só é exacta para temperaturas  compreendidas entre 18 e 22 ° C.  7.3. Reprodutibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas simultaneamente ou rapidamente uma após a outra pelo mesmo analista sobre a mesma amostra e nas mesmas condições não deve exceder 0,3 g de sacarose para 100 g de leite condensado.  MÉTODO 6: DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ÁCIDO LÁCTICO E LACTATOS 1. OBJECTIVO E ÂMBITO DE APLICAÇÃO Este método permite obter o teor de ácido láctico e lactatos dos leites a seguir enumerados:  - Leite em pó rico em matéria gorda ou pó de leite rico em matéria gorda,  - leite em pó, leite em pó gordo, pó de leite ou pó de leite gordo,  - leite em pó parcialmente desnatado ou pó de leite parcialmente desnatado,  - leite em pó desnatado ou pó de leite desnatado.  2. DEFINIÇÃO Teor de ácido láctico e de lactatos dos leites em pó: o teor de ácido láctico de lactatos determinado pelo método especificado.  3. PRINCÍPIO DO MÉTODO A matéria gorda, as proteínas e a lactose são eliminadas simultaneamente de uma solução de amostra por adição de sulfato de cobre e hidróxido de cálcio, seguidos de filtração.  O ácido láctico e os lactatos do filtrado são transformados em acetaldeído pelo ácido sulfúrico concentrado na presença de sulfato de cobre (II).  O teor de ácido láctico é determinado por colorimetria utilizando o p-hidroxidifenilo.  O teor de ácido láctico e lactatos é expresso em mg de ácido láctico por 100 g de matérias sólidas não lipídicas.  4. REAGENTES 4.1. Solução de sulfato de cobre (II): dissolver 250 g de sulfato de cobre (II) (CuSO4 · 5H2O) em água e diluir à 1000 ml.  4.2. Suspensão de hidróxido de cálcio.  4.2.1. Pulverizar 300 g de hidróxido de cálcio [Ca(OH) 2] num almofariz com água, utilizando no total 900 ml. A suspensão deve ser preparada pouco tempo antes de ser utilizada.  4.2.2. Pulverizar 300 g de hidróxido de cálcio [Ca(OH) 2] num almofariz com água, utilizando no total 1 400 ml. A suspensão deve estar preparada pouco tempo antes de ser utilizada.  4.3. Solução ácido sulfúrico - sulfato de (II) cobre: adicionar a 300 ml de ácido sulfúrico 95,5 = 97,0 % (m/m) de H2SO4, 0,5 ml de solução de sulfato de cobre (II) (ponto 4.1).  4.4. Solução de p-hidroxidifenilo (C6H5C6H4OH): Dissolver agitando e aquecendo ligeiramente 0,75 g de p-hidroxidifenilo em 5 ml de uma solução aquosa de hidróxido de sódio contendo 5 g de NaOH por 100 ml. Diluir até 50 ml com água num balão marcado.  Conservar a solução em frasco de vidro castanho ao abrigo da luz e em local fresco. Não utilizar a solução se a cor mudar ou se produzir turvação. A duração máxima de conservação da solução é de 72 horas.  4.5. Solução padrão de ácido láctico: dissolver pouco antes da sua utilização, 0,1067 g de lactato de lítio (CH3CHOHCOOLi) em água e perfazer 1 000 ml em balão marcado. Um ml desta solução corresponde a 0,1 mg de ácido láctico.  4.6. Leite reconstituído padrão: analisar previamente várias amostras de leite em pó de alta qualidade. Para a preparação da curva de calibragem tomar a amostra cujo teor de ácido láctico seja mais baixo, não superior a 30 mg de ácido láctico por 100 g  de matérias sólidas não lipídicas. Seguir a técnica descrita nos pontos 6.2.1 e 6.2.2.  5. APARELHOS E UTENSÍLIOS 5.1. Balança analítica.  5.2. Espectrofotómetro que permita leitura no comprimento de onda de 570 nm.  5.3. Banho-maria a 30 ± 2 ° C.  5.4. Almofariz e pilão 5.5. Papel de filtro (Schleicher et Schull 595, Whatman 1 ou similar).  5.6. Tubos de ensaio de pirex ou similares (dimensões 25 × 150 mm).  Nota Todos os aparelhos devem estar perfeitamente limpos e serem utilizados somente para esta determinação. Antes da lavagem passar os aparelhos de vidro que contêm o precipitado com ácido clorídrico concentrado.  6. TÉCNICA 6.1. Ensaio em branco Efectuar um ensaio em branco vertendo 30 ml de água num tubo graduado de 50 ml e proceder a um tratamento como é descrito nos pontos 6.2.4 a 6.2.11, inclusive. Se os resultados do ensaio em branco em relação à água ultrapassarem o equivalente a 20 mg de  ácido láctico por 100 g de matérias sólidas não lipídicas, os reagentes devem ser verificados e o (ou os) reagente(s) impuro(s) deve(m) ser substituído(s). Tratar o ensaio em branco simultaneamente com as amostras.  6.2. Determinação Nota: Evitar a contaminação com impurezas, nomeadamente pela saliva e a transpiração.  6.2.1. Determinar o teor de matérias sólidas não lipídicas (a) da amostra, deduzindo de 100 o teor de matéria gorda (segundo o método 4) e o teor de humidade (segundo o método 2).  6.2.2. Pesar g da amostra com a aproximação de 0,1 g. Juntar esta quantidade de amostra a 100 ml de água e misturar cuidadosamente.  6.2.3. Medir por pipeta 5 ml da solução obtida para um tubo graduado de 50 ml e diluir com água até 30 ml.  6.2.4. Juntar lentamente e agitando 5 ml da solução de sulfato de cobre (ponto 4.1) e deixar repousar 10 minutos.  6.2.5. Juntar lentamente e agitando, 5 ml da suspensão de hidróxido de cálcio (ponto 4.2.1) ou 10 ml da suspensão de hidróxido (ponto 4.2.2).  6.2.6. Diluir até 50 ml com água, agitar vigorosamente, deixar repousar 10 minutos e filtrar. Rejeitar as primeiras gotas do filtrado.  6.2.7. Pipetar 1 ml do filtrado para um tubo de ensaio (ponto 5.6).  6.2.8. Adicionar ao conteúdo do tubo, por meio de uma bureta ou de uma pipeta graduada, 6 ml da solução de ácido sulfúrico e de sulfato de cobre (ponto 4.3). Misturar.  6.2.9. Aquecer em banho-maria em ebulição, durante 5 minutos. Arrefecer à temperatura ambiente sob água corrente.  6.2.10. Juntar 2 gotas de reagente de p-hidroxidifenilo (ponto 4.4) e agitar vigorosamente para repartir uniformemente o reagente em todo o líquido. Mergulhar o tubo no banho-maria a 30 ± 2 ° C e manter durante 15 minutos. Agitar de vez em quando.  6.2.11. Mergulhar o tubo no banho-maria em ebulição durante 90 segundos. Arrefecer à temperatura ambiente debaixo de água corrente.  6.2.12. Medir a densidade óptica em relação ao ensaio em branco (6.1) nas 3 horas que se seguem, no comprimento de onda indicado no ponto 5.2.  6.2.13. Se a densidade ultrapassar o ponto mais alto da curva de calibragem, repetir o ensaio utilizando uma diluição conveniente do filtrado obtido no ponto 6.2.6.  6.3. Traçado da curva de calibragem 6.3.1. Pipetar 5 ml do leite reconstituído (ponto 4.6) para cinco cilindros graduados de 50 ml. Pipetar para estes tubos 0, 1, 2, 3 e 4 ml da solução padrão (ponto 4.5), de modo a obter uma gama de amostragem que corresponda a 0, 20, 40, 60 e 80 mg de  ácido láctico adicionado por 100 g de matérias sólidas não lipídicas de pós de leite.  6.3.2. Diluir com água até cerca de 30 ml e proceder ao tratamento descrito nos pontos 6.2.4 a 6.2.11, inclusive.  6.3.3. Medir as densidades ópticas de elementos da gama de amostragem (ponto 6.3.1) em relação ao ensaio em branco (ponto 6.1) com o comprimento de onda indicado no ponto 5.2. Registar estas densidades ópticas num diagrama em função das quantidades de  ácido láctico mencionadas no ponto 6.3.1, isto é, 0 mg, 20 mg, 40 mg, 60 mg, 80 mg por 100 g de matérias sólidas não lipídicas. Traçar a recta mais satisfatória, passando pelos pontos e preparar a curva de calibragem, deslocando esta linha paralelamente  a si mesma, de modo a fazê-la passar pela origem.  7. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS 7.1. Modo de cálculo Converter a densidade óptica medida segundo o ponto 6.2.12 ou 6.2.13 em mg de ácido láctico por 100 g de matérias sólidas não lipídicas da amostra, reportando-se à curva de calibragem. Multiplicar este resultado pelo factor de diluição no caso em que o  filtrado foi diluído segundo o ponto 6.2.13.  7.2. Reprodutibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas simultaneamente ou rapidamente uma após outra, pelo mesmo analista e nas mesmas condições sobre a mesma amostra, não deve ultrapassar 8 mg de ácido láctico por 100 g de matérias sólidas  não lipídicas para os teores que atingem 80 mg. Para valores mais elevados esta diferença não deve ultrapassar 10 % do valor mais baixo.  MÉTODO 7: DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE FOSFATÁSICA (MÉTODO DE SANDERS E SAGER, ALTERADO) 1. ÂMBITO DE APLICAÇÃO Este método permite determinar a actividade da fosfatase nos leites a seguir enumerados:  - leite em pó rico em matéria gorda ou pó de leite rico em matéria gorda,  - leite em pó, leite em pó gordo, pó de leite ou pó de leite gordo,  - leite em pó parcialmente desnatado ou pó de leite parcialmente desnatado,  - leite em pó desnatado ou pó de leite desnatado.  2. DEFINIÇÃO A actividade da fosfotase do leite em pó é medida pela quantidade da fosfatase alcalina activa presente. É expressa pela quantidade de fenol libertada em µg por ml de leite reconstituído, determinado pelo processo a seguir descrito.  3. PRINCÍPIO DO MÉTODO A actividade da fosfatase do leite em pó é determinada pela capacidade da fosfatase em libertar fenol do fenilfosfato dissódico. A quantidade de fenol libertado nas condições estabelecidas é determinada por medição espectrofotométrica da coloração  desenvolvida graças ao reagente de Gibbs. 4. REAGENTES 4.1. Solução A Tampão de borato e hidróxido de bário: pH 10,6 ± 0,1, a 20 ° C. Dissolver 25,0 g de hidróxido de bário [BA(OH)2 · 8H2O] em água e diluir até 500 ml. Dissolver 11,0 g de ácido bórico (H3BO3) em água e diluir até 500 ml.  Aquecer as duas soluções a uma temperatura de 50 ° C e misturar. Agitar e arrefecer a mistura à temperatura ambiente. Ajustar o pH a 10,6 ± 0,1 com a solução de hidróxido de bário e filtrar.  Conservar a solução num recipiente bem fechado. Antes de utilizar diluir o tampão com a mesma quantidade de água.  4.2. Solução B Tampão para o desenvolvimento da cor. Dissolver 6 g de metaborato de sódio (NaBO2) (ou 12,6 g de NaBO2 · 4H2O) e 20 g de cloreto de sódio (NaCl) em água e diluir até 1000 ml.  4.3. Solução C Substrato tamponado.  4.3.1. Dissolver 0,5 g de fenilfosfato dissódico (Na2C6H3PO4 - 2H2O) em 4,5 ml de solução B (ponto 4.2). Juntar 2 gotas de solução E (ponto 4.5) e deixar repousar durante 30 minutos. Extrair a cor formada com 2,5 ml de álcool butílico (ponto 4.10). Se  necessário, repetir a extracção da cor. Após separação rejeitar o álcool butílico. Esta solução pode ser conservada durante alguns dias num frigorífico. Desenvolver e extrair a cor mais uma vez antes da utilização.  4.3.2. Pipetar 1 ml desta solução para um balão marcado de 100 ml e adicionar solução A até à marca. Preparar o substrato imediatamente antes da utilização.  4.4. Solução D Precipitante.  Dissolver 3,0 g de sulfato de zinco (ZnS1O4 · 7H2O) e 0,6 g de sulfato de cobre II (CuSO4 · 5H2O) em água e perfazer 100 ml.  4.5. Solução E Reagente de Gibbs.  Dissolver 0,040 g de 2,6-dibromoquinona-1,4-cloroimida (O · C6H2Br2 · NCl) em 10 ml de etanol a 96 %. Conservar a solução num frasco de vidro escuro, no frigorífico. Rejeitar este reagente logo que tiver mudado de cor.  4.6. Tampão de diluição da coloração Diluir 10 ml da solução tampão B para o desenvolvimento da cor (ponto 4.2) com água e perfazer 100 ml.  4.7. Solução de sulfato de cobre Dissolver 0,05 g de sulfato de cobre II (CuSO4 · 5H2O) em água e perfazer 100 ml.  4.8. Solução padrão de fenol Dissolver 0,200 ± 0,001 g de fenol puro em água e perfazer 100 ml em balão aferido. Esta solução pode ser conservada durante alguns meses em frigorífico. Diluir 10 ml desta solução com água até 100 ml. Esta solução diluída contém 200 µg de fenol por ml  e pode ser utilizada para preparar soluções mais diluídas.  4.9. Água destilada fervida.  4.10. Álcool n-butílico.  5. APARELHOS E UTENSÍLIOS 5.1. Balança analítica.  5.2. Banho-maria mantido por termostato a 37 ± 1 ° C.  5.3. Espectrofotómetro que permita leitura num comprimento de onda de 610 nm.  5.4. Papel de filtro (Schleicher e Schull 597, Whatman 42 ou similares).  5.5. Banho-maria em ebulição.  5.6. Folha de alumínio.  6. TÉCNICA Precauções a tomar 1. Evitar a exposição directa à luz solar.  2. Limpar perfeitamente todos os aparelhos de vidro, as rolhas e materiais de transfazamento. Recomenda-se que sejam lavados e fervidos em água ou tratados por vapor.  3. Evitar o uso de materiais plásticos (rolhas, por exemplo) que possam conter fenol.  4. A saliva contém fosfatase, evitar cuidadosamente qualquer vestígio de saliva.  6.1. Preparação da amostra 6.1.1. Dissolver 10 g de amostra, pesadas com a aproximação de 0,1 g, em 90 ml de água. A temperatura de dissolução do pó não deve ultrapassar os 35 ° C.  6.2. Determinação 6.2.1. Introduzir em dois tubos de ensaio 1 ml de leite reconstituído, em cada, preparado como se indica no ponto 6.1.1.  6.2.2. Aquecer um dos tubos de ensaio em água em ebulição durante 2 minutos. Cobrir o tubo e o banho-maria (ponto 5.5) ou, por exemplo, um copo com uma folha de alumínio (ponto 5.6), de modo a que o tubo seja todo aquecido. Arrefecer na água fria à  temperatura ambiente. Este tubo servirá para o ensaio em branco. A partir deste ponto tratar os dois tubos de forma idêntica. 6.2.3. Juntar 10 ml da solução C (ponto 4.3.2). Misturar e colocar os tubos no banho-maria a 37 ° C (ponto 5.2).  6.2.4. Incubar durante 60 minutos no banho-maria, agitando de vez em quando.  6.2.5. Transferir imediatamente os tubos para um banho-maria em ebulição e aquecer durante 2 minutos; arrefecer à temperatura ambiente em água fria.  6.2.6. Juntar 1 ml da solução D (ponto 4.4) misturar e filtrar por papel de filtro seco; rejeitar os primeiros filtrados até obtenção de um líquido límpido.  6.2.7. Introduzir 5 ml de cada filtrado em tubos de ensaio, juntar 5 ml da solução B (ponto 4.2) e 0,1 ml da solução E (ponto 4.5). Misturar.  6.2.8. Deixar formar a cor à temperatura ambiente e ao abrigo da luz durante 30 minutos.  6.2.9. Medir a densidade óptica da solução da amostra em relação ao ensaio em branco, no comprimento de onda indicado no ponto 5.3.  6.2.10. Repetir a determinação se a densidade óptica da solução ultrapassar a do padrão de 20 µg de fenol preparado segundo o ponto 7.  Se este limite for ultrapassado, diluir um volume conveniente de leite reconstituído de acordo com o ponto.  6.1.1, com um volume adequado de leite cuidadosamente fervido, como se indica no ponto 6.2.2, para inactivar a fosfatose presente.  7. PREPARAÇÃO DA CURVA PADRAO 7.1. Pipetar para quatro balões de 100 ml, respectivamente 1,3,5 e 10 ml da solução padrão diluída de acordo com o ponto 4.8 e completar com água até ao traço; estas soluções contêm respectivamente 2,6,10 e 12 µg de fenol por ml.  7.2. Pipetar 1 ml de cada solução testemunha (ponto 7.1) para tubos de ensaio a fim de obter uma série de amostras contendo 0 (valor zero) 2,6,10 e 20 µg de fenol. O branco é obtido pipetando 1 ml de água.  7.3. Pipetar sucessivamente para cada tubo de ensaio 1 ml da solução de sulfato de cobre (ponto 4.7), 5 ml de solução tampão corada (ponto 4.6), 3 ml de água e 0,1 ml da solução E (ponto 4.5); misturar.  7.4. Deixar repousar os tubos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz solar directa, durante 30 minutos.  7.5. Medir a densidade óptica do conteúdo dos tubos em relação ao valor zero, no comprimento de onda indicado no ponto 5.3.  7.6. Estabelecer a curva padrão registando os valores das densidades ópticas em função das quantidades de fenol em µg, tal como são indicadas no ponto 7.2.  8. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS 8.1. Modo de cálculo 8.1.1. Converter o número obtido no ponto 6.2.9 em µg de fenol por referência à curva padrão.  8.1.2. Calcular a actividade da fosfatose, expressa em µg de fenol por ml de leite reconstituído segundo a fórmula seguinte:  actividade das fosfatase = 2,4 × P em que P = quantidade de fenol em µg segundo o ponto 8.1.1.  8.1.3. Se tiver sido necessário diluir como se indicou em 6.2.10, multiplicar o resultado obtido em 8.1.2 pelo factor de diluição.  8.2. Reprodutibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas simultaneamente ou rapidamente uma após outra, pelo mesmo analista, sobre a mesma amostra e nas mesmas condições, não deve exceder 2 µg de fenol libertado por mil de leite reconstítuido.  MÉTODO 8: DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE DA FOSFATASE (MÉTODO ASCHAFFENBURG E MULLEN) 1. ÂMBITO DE APLICAÇÃO O presente método permite determinar a actividade da fosfatase nos leites a seguir enumerados:  - leite em pó rico em matéria gorda ou pó de leite rico em matéria gorda,  - leite em pó, leite em pó gordo, pó de leite ou pó de leite gordo,  - leite em pó parcialmente desnatado ou pó de leite parcialmente desnatado,  - leite em pó desnatado ou pó de leite desnatado.  2. DEFINIÇÃO A actividade da fosfatase do leite desidratado é medida pela quantidade de fosfatase alcalina activa presente no produto. É expressa em quantidade de p-nitrofenol libertado em g por ml, de leite reconstituído, determinada pelo processo a seguir  descrito.  3. PRINCÍPIO DO MÉTODO A amostra de leite reconstituído é diluída num substrato tamponado (pH 10,2) e incubada durante 2 horas a uma temperatura de 37 ° C. Qualquer quantidade de fosfatase alcalina presente na amostra, libertará nestas condições p-nitrofenol proveniente do  p-nitrofenilfosfato dissódico. O p-nitrofenol libertado é medido por comparação directa com padrões de vidro colorido num colorímetro simples de luz reflectida.  4. REAGENTES 4.1. Tampão de carbonato de sódio e de bicarbonato de sódio.  Dissolver 3,5 g de carbonato de sódio anidro e 1,5 g de bicarbonato de sódio em água e diluir até 1 000 ml num balão aferido.  4.2. Substrato tamponado.  Dissolver 1,5 g de p-nitrofenilfosfato dissódico na solução tampão de carbonato de sódio e bicarbonato de sódio (ponto 4.1) e diluir até 1 000 ml em balão aferido.  Esta solução é estável durante um mês no frigorífico (& le; 4 ° C) mas é necessário efectuar um teste de controlo da cor nas soluções assim conservadas (ver ponto 6, nota 3).  4.3. Precipitantes.  4.3.1. Sulfato de zinco.  Dissolver 30,0 g de sulfato de zinco (ZnSO4) em água e perfazer 100 ml em balão aferido.  4.3.2. Hexaferrocianeto (II) de potássio em solução.  Dissolver 17,2 g de hexaferrocianeto (II) de potássio triidratado [K4Fe(CN)6 · 3H2O] em água e perfazer 100 ml em balão aferido.  5. APARELHOS E UTENSÍLIOS 5.1. Balança analítica.  5.2. Banho-maria a 37 ± 1 ° C, controlado por termóstato.  5.3. Comparador colorimétrico com disco especial contendo padrões de vidro colorido calibrados em ug de p-nitrofenol por ml de leite e duas células de 25 mm cada.  6. TÉCNICA Precauções a ter 1. Após utilização esvaziar os tubos, mergulhá-los em água, lavá-los com água quente adicionada de um detergente alcalino, passar em seguida cuidadosamente pela água da torneira aquecida e límpida. Lavá-los em água para terminar; secar antes da  utilização.  As pipetas devem ser lavadas cuidadosamente com água da torneira clara e fria, imediatamente após a utilização; lavá-los com água e secá-los antes de utilizar.  2. As rolhas dos tubos de ensaio devem ser lavadas cuidadosamente com água da torneira quente imediatamente após a utilização; fervê-las em seguida em água durante 2 minutos.  3. O substrato tamponado (ponto 4.2) deve permanecer estável durante pelo menos 1 mês no frigorífico, a uma temperatura de & le; 4 ° C. Qualquer instabilidade traduz-se pela formação de uma cor amarela. Embora o ensaio seja sempre lido em relação a um  controlo do produto fervido contendo o mesmo substrato tamponado, recomenda-se que não seja utilizado o substrato quando a cor indicar um excesso de 10 g, sendo a leitura efectuada numa célula de 25 mm do colorímetro e utilizando água destilada na outra  célula de 25 mm.  4. Utilizar uma pipeta por amostra e evitar a contaminação com saliva.   5. Evitar sempre a exposição directa à luz do sol.  6.1. Preparação da amostra Dissolver 10 g de pó em 90 ml de água. A temperatura de dissolução do pó não deve ultrapassar 35 ° C.  6.2. Determinação 6.2.1. Pipetar 15 ml de substrato tamponado (ponto 4.2) para um tubo de ensaio limpo e seco, depois 2 ml de amostra de leite reconstituído (ponto 6.1) a testar. Fechar o tubo por meio de uma rolha, misturar invertendo o tubo e colocar no banho-maria a  37 ° C (ponto 5.2).  6.2.2. Colocar simultaneamente no banho-maria um tubo de controlo contendo 15 ml de substrato tamponado e 2 ml de amostra de leite reconstituído fervido do mesmo tipo do teste.  6.2.3. Retirar os dois tubos do banho-maria passadas 2 horas, juntar 0,5 ml do precipitante de sulfato de zinco (ponto 4.3.1), rolhar, agitar vigorosamente e deixar repousar durante 3 minutos. Juntar 0,5 ml do precipitante com hexaferrocianeto (II) de  potássio (ponto 4.3.2); misturar completamente e filtrar por papel plissado (ponto 5.4); recolher o filtrado límpido em tubo de ensaio limpo.  6.2.4. Transferir o filtrado para uma célula de 25 mm e comparar por referência com o filtrado da amostra de controlo fervida no colorímetro, utilizando o disco especial (ponto 5.3).  7. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS 7.1. Modo de cálculo A leitura directa obtida segundo o ponto 6.2.4 é expressa em µg de p-nitrofenol por ml de amostra ou por ml de amostra de leite reconstituído.  7.2. Reprodutibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas simultaneamente ou rapidamente uma após outra pelo mesmo analista, na mesma amostra e nas mesmas condições não deve exceder 2 µg de p-nitrofenol libertado por ml de leite reconstituído.