CELEX: 32012R0640
Language: bg
Date: 2012-07-06 00:00:00
Title: Регламент (ЕС) № 640/2012 на Комисията от 6 юли 2012 година за изменение, с цел адаптиране към техническия прогрес, на Регламент (ЕО) № 440/2008 за определяне на методи за изпитване в съответствие с Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH)  текст от значение за ЕИП

20.7.2012   
            
            
               BG
            
            
               Официален вестник на Европейския съюз
            
            
               L 193/1
            
         РЕГЛАМЕНТ (ЕС) № 640/2012 НА КОМИСИЯТА
   от 6 юли 2012 година
   за изменение, с цел адаптиране към техническия прогрес, на Регламент (ЕО) № 440/2008 за определяне на методи за изпитване в съответствие с Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH)
   (текст от значение за ЕИП)
   ЕВРОПЕЙСКАТА КОМИСИЯ,
   като взе предвид Договора за функционирането на Европейския съюз,
   като взе предвид Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета от 18 декември 2006 г. относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH), за създаване на Европейска агенция по химикали, за изменение на Директива 1999/45/ЕО и за отмяна на Регламент (ЕИО) № 793/93 на Съвета и на Регламент (ЕО) № 1488/94 на Комисията, както и на Директива 76/769/ЕИО на Съвета и Директиви 91/155/ЕИО, 93/67/ЕИО, 93/105/ЕО и 2000/21/ЕО на Комисията (1), и по-специално член 13, параграф 3 от него,
   като има предвид, че:
   
               (1)
            
            
               Регламент (ЕО) № 440/2008 на Комисията (2) съдържа методите за изпитване с цел определяне на физикохимичните свойства, токсичността и екотоксичността на веществата, които методи за изпитване се използват за целите по Регламент (ЕО) № 1907/2006.
            
         
               (2)
            
            
               Необходимо е да се актуализира Регламент (ЕО) № 440/2008, за да се включат приоритетно нови и актуализирани алтернативни методи за изпитване, наскоро приети от Организацията за икономическо сътрудничество и развитие (ОИСР), с цел да се постигне намаление на броя на използваните за опитни цели животни в съответствие с Директива 2010/63/ЕС на Европейския парламент и на Съвета от 22 септември 2010 г. относно защитата на животните, използвани за научни цели (3) и Директива 86/609/ЕИО на Съвета от 24 ноември 1986 г. за сближаване на законовите, подзаконовите и административните разпоредби на държавите-членки относно защитата на животните, използвани за опитни и други научни цели (4). Проведени са консултации със заинтересованите страни по настоящия проектодокумент.
            
         
               (3)
            
            
               Следователно Регламент (ЕО) № 440/2008 следва да бъде съответно изменен.
            
         
               (4)
            
            
               Мерките, предвидени в настоящия регламент, са в съответствие със становището на комитета, създаден съгласно член 133 от Регламент (ЕО) № 1907/2006,
            
         ПРИЕ НАСТОЯЩИЯ РЕГЛАМЕНТ:
   Член 1
   Приложението към Регламент (ЕО) № 440/2008 се изменя в съответствие с приложението към настоящия регламент.
   Член 2
   Настоящият регламент влиза в сила на третия ден след публикуването му в Официален вестник на Европейския съюз.
   
   
      Настоящият регламент е задължителен в своята цялост и се прилага пряко във всички държави-членки.
      Съставено в Брюксел на 6 юли 2012 година.
      
         
            За Комисията
         
         
            Председател
         
         José MANUEL BARROSO
      
   
   
      (1)  ОВ L 396, 30.12.2006 г., стр. 1.
   
      (2)  ОВ L 142, 31.5.2008 г., стр. 1.
   
      (3)  ОВ L 276, 20.10.2010 г., стр. 33.
   
      (4)  ОВ L 358, 18.12.1986 г., стр. 1.
   
      ПРИЛОЖЕНИЕ
      Приложението към Регламент (ЕО) № 440/2008 се изменя, както следва:
      
                  1.
               
               
                  Глава Б.42 се заменя със следното:
                  „Б.42.   КОЖНА СЕНСИБИЛИЗАЦИЯ: ИЗСЛЕДВАНЕ НА ЛОКАЛНИТЕ ЛИМФНИ ВЪЗЛИ
                  
                  ВЪВЕДЕНИЕ
                  
                              1.
                           
                           
                              Указанията за изпитването на химикали на Организацията за икономическо сътрудничество и развитие (ОИСР) и основаните на тях методи на ЕС за изпитване периодично се преразглеждат във връзка с научния прогрес, промяната на регулаторните нужди и съображенията, свързани с хуманното отношение към животните. Първоначалният метод за изпитване (МИ) за определянето на кожна сенсибилизация при мишки — Изследването на локалните лимфни възли (LLNA; Указание за изпитване 429 на ОИСР; глава Б.42 от настоящото приложение) — беше приет по-рано (1). Публикувана е подробна информация за валидирането на LLNA и е направен преглед на съответните научни трудове (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Актуализираното LLNA се основава на оценката на опита и научните данни (12). Това е вторият МИ, предназначен за оценка на потенциала на химикалите (вещества и смеси) да предизвикват кожна сенсибилизация при животни. При другия МИ (т.е. Указание за изпитване 406 на ОИСР; глава Б.6 от настоящото приложение) се използват тестове върху морски свинчета, по-специално максимизиращ тест върху морски свинчета и тест на Buehler (13). LLNA има предимства в сравнение с Б.6 и Указание за изпитване 406 на ОИСР (13) по отношение на хуманното отношение към животните. Настоящият актуализиран метод за изпитване LLNA включва набор от стандарти за ефективност (СЕ) (допълнение 1), които могат да се използват за оценка на статуса на валидиране на нови и/или модифицирани методи за изпитване, които са функционално и по своя механизъм сходни с LLNA, в съответствие с принципите на Ръководство № 34 на ОИСР (14).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              При LLNA се проучва индукционната фаза на кожна сенсибилизация и се получават количествени данни, подходящи за оценяване на зависимостта доза—отговор. Следва да се отбележи, че слабите — умерени сенсибилизатори, които се препоръчват като подходящи положителни контролни химикали (ПК) при методите за изследване върху морски свинчета (т.е. Б.6 и Указание за изпитване 406 на ОИСР) (13), са подходящи за използване и при LLNA (6) (8) (15). Подходът на ограничено изследване на локалните лимфни възли (rLLNA), при който биха могли да се използват до 40 % по-малко животни, също е описан като възможност в настоящия МИ (16) (17) (18). Изследването rLLNA може да се използва, когато е налице регулаторна необходимост да се потвърди отрицателна прогноза за кожно-сенсибилизиращ потенциал, при условие че се спазват всички други протоколни спецификации за LLNA, описани в настоящия МИ. Прогнозата за отрицателен резултат следва да бъде направена въз основа на цялата налична информация, както е описано в точка 4. Преди прилагането на подхода rLLNA следва да се посочат ясни основания и научна обосновка за неговото използване. Ако въпреки очакванията при rLLNA се получи положителен или неясен резултат, може да е необходимо допълнително изпитване за тълкуване или изясняване на резултата. Изследването rLLNA не трябва да се използва за определянето на опасността от изпитвани вещества, предизвикващи кожна сенсибилизация, когато е необходима информация за зависимостта доза—отговор, като например при подкатегоризация за Регламент (ЕО) № 1272/2008 относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси и Глобалната хармонизирана система за класифициране и етикетиране на химикали (GHS) на Организацията на обединените нации (ООН).
                           
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                  
                              3.
                           
                           
                              Определенията са дадени в допълнение 2.
                           
                        ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ
                  
                              4.
                           
                           
                              LLNA осигурява алтернативен метод за определяне на химикали, които са потенциални кожни сенсибилизатори. Това не означава непременно, че при всички случаи следва да се използва LLNA вместо тестове върху морски свинчета, (т.е. глава Б.6, Указание за изпитване 406 на ОИСР) (13), а по-скоро че изпитването е равностойно и може да бъде използвано като алтернатива, при която обикновено положителните и отрицателните резултати не се нуждаят от допълнително потвърждаване. Лабораторията, провеждаща теста, следва да вземе предвид цялата налична информация за изпитваното вещество преди провеждането на теста. Тази информация следва да включва идентичността и химичната структура на изпитваното вещество; неговите физикохимични свойства; резултатите от всякакви други in vitro или in vivo токсикологични тестове на изпитваното вещество; и токсикологични данни за структурно подобни вещества. Тази информация следва да се вземе предвид, за да се определи дали LLNA е подходящо за веществото (с оглед на неприложимостта на LLNA по отношение на ограничен брой видове химикали — вж. точка 5) и като помощно средство при избора на доза.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              LLNA е in vivo метод и вследствие на това няма да доведе до преустановяване на използването на животни при оценяването на алергичната контактна сенсибилизираща активност. При все това този метод дава възможност да се намали броят на животните, изисквани за тази цел. Освен това LLNA предлага съществено подобрение (изразяващо се в намаление на болката и страданието) на начина, по който животните се използват за изпитване на алергичната контактна сенсибилизация. LLNA се основава на отчитането на имунологичните ефекти, стимулирани от химикалите по време на индукционната фаза на сенсибилизирането. За разлика от изследванията върху морски свинчета (т.е. глава Б.6, Указание за изпитване 406 на ОИСР) (13), LLNA не изисква да се разкрие кожна свръхчувствителност след предизвикване. Освен това LLNA не изисква употребата на адювант, както в случаите на максимизиращото изследване върху морски свинчета (13). По такъв начин при използване на LLNA се намаляват болката и страданието на животните. Въпреки предимствата на LLNA пред Б.6 и Указание за изпитване 406 на ОИСР, следва да се признае, че съществуват определени ограничения, които могат да доведат до необходимост от използване на Б.6 или на Указание за изпитване 406 на ОИСР (13) (напр. фалшиво отрицателни резултати при LLNA по отношение на някои метали, фалшиво положителни резултати при определени кожни дразнители) [например някои видове повърхностноактивни химикали] (19) (20) или разтворимост на изпитваното вещество). Освен това химичните класове или вещества, съдържащи функционални групи, за които е доказано че водят до възможно объркване (21), могат да породят необходимост от използване на изследванията върху морски свинчета (т.е. Б.6; Указание за изпитване 406 на ОИСР) (13). Също така, въз основа на ограничената валидационна база данни, която се състои предимно от пестицидни препарати, LLNA е по-вероятно да даде положителен резултат за тези видове изпитвани вещества в сравнение с изследването върху морски свинчета (22). При изпитването на препарати, обаче, следва да се обмисли включването на подобни вещества с известни резултати като еталонни вещества, за да се докаже правилното функциониране на LLNA (вж. точка 16). С изключение на тези установени ограничения, LLNA би следвало да е приложимо за изпитване на всички вещества, освен ако съществуват свързани с тези вещества свойства, които могат да повлияят на точността на LLNA.
                           
                        ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
                  
                              6.
                           
                           
                              Основният принцип, залегнал в LLNA, е, че сенсибилизаторите предизвикват пролиферация на лимфоцитите в лимфните възли, дрениращи мястото на прилагане на изпитваното вещество. Тази пролиферация е пропорционална на дозата и на потенциала на приложения алерген и осигурява лесен начин за получаване на количествено измерване на сенсибилизацията. Пролиферацията се измерва чрез сравняване на средната пролиферация във всяка изпитвана група със средната пролиферация в третираната само с носителя контролна група (КН). Определя се съотношението на средната пролиферация във всяка третирана група спрямо тази в паралелната третирана само с носителя контролна група, наречено стимулационен индекс (SI), който следва да е ≥ 3, за да може изпитваното вещество да бъде класифицирано като потенциален кожен сенсибилизатор. Описаните тук процедури се основават на използването на радиоактивно маркиране in vivo за измерване на увеличения брой на пролифериращите клетки в дрениращите аурикуларни (ушни) лимфни възли. От друга страна обаче, за оценка на броя на пролифериращите клетки могат да бъдат използвани други подходи, при условие че са спазени напълно изискванията за стандартите за ефективност (допълнение 1).
                           
                        ОПИСАНИЕ НА ИЗПИТВАНЕТО
                  
                     Избор на животински вид
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Биологичният вид, избран за това изследване, е мишката. Използват се млади възрастни мишки от женски пол от порода СВА/Са или CBA/J, които не са раждали и не са бременни. В началото на изследването животните следва да бъдат на възраст 8—12 седмици и отклоненията в теглото им следва да бъдат минимални и да не превишават 20 % от средното тегло. Алтернативно могат да бъдат използвани животни от други породи и от мъжки пол, когато има достатъчно събрани данни, които доказват, че не съществуват съществени различия при реакцията при LLNA, обусловени от пола и/или породата.
                           
                        
                     Условия на отглеждане и хранене
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Мишките следва да бъдат групово отглеждани (23), освен ако е дадена подходяща научна обосновка за индивидуално отглеждане на мишките. Температурата в стаята на опитните животни следва да бъде 22 ± 3 °C. При все че относителната влажност следва да бъде поне 30 % и е препоръчително тя да не надвишава 70 % освен по време на почистване на стаята, целта е относителната влажност да се поддържа в интервала 50—60 %. Осветлението следва да бъде изкуствено, с последователност 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. За храненето могат да се използват обичайните лабораторни диети с неограничен достъп до вода за пиене.
                           
                        
                     Подготовка на животните
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Животните се избират произволно, маркират се, за да е възможно индивидуалното им идентифициране (но не и чрез маркиране на ушите им) и се оставят в клетките им поне пет дни преди започване на дозирането, за да се аклиматизират към лабораторните условия. Всички животни се изследват преди да започне третирането, за да се потвърди отсъствието на видими кожни лезии.
                           
                        
                     Приготвяне на разтворите за дозиране
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Твърдите химикали следва да се разтворят или суспендират в разтворители/носители и ако е необходимо, да се разредят преди прилагането им върху ушите на мишките. Течните химикали могат да се прилагат в чист или разреден вид преди дозирането. Неразтворимите химикали като тези, които обикновено се наблюдават в медицинските изделия, следва да се подложат на засилена екстракция в подходящ разтворител, за да се проявят всички екстрахируеми съставки за изпитване преди прилагането им върху ушите на мишките. Изпитваните вещества следва да се приготвят ежедневно, освен ако данните за устойчивостта им показват, че те могат да се съхраняват.
                           
                        
                     Проверка на надеждността
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Използват се положителни контролни химикали (ПК) за доказване на подходящо провеждане на изследването чрез реагиране с достатъчна и възпроизводима чувствителност като сенсибилизиращо изпитвано вещество, за което степента на реакция е добре характеризирана. Препоръчва се включването на паралелна положителна контрола (ПК), защото тя доказва компетентността на лабораторията успешно да провежда всяко изследване и позволява оценка на вътрешно- и междулабораторната възпроизводимост и сравнимост. Освен това някои регулаторни органи изискват положителна контрола за всяко изпитване и поради това е препоръчително ползвателите на метода да се консултират със съответните органи преди провеждането на LLNA. В съответствие с това се насърчава рутинното използване на паралелна положителна контрола, за да се избегне необходимостта от допълнително изследване върху животни за спазване на изисквания, които биха могли да възникнат при използването на периодична положителна контрола (вж. точка 12). Положителната контрола следва да предизвиква положителна реакция при LLNA при ниво на експозиция, при което се очаква нарастване на стимулационния индекс SI > 3 спрямо отрицателната контролна група (ОК). Дозата за ПК следва да бъде избрана така, че да не причинява прекомерно кожно дразнене или системна токсичност и индукцията да е възпроизводима, но не прекомерна (напр. SI > 20 би било прекомерно). Предпочитаните положителни контроли са 25 % хексилканелен алдехид (№ 101-86-0 съгласно химичния регистър на Службата за химични индекси — Chemical Abstracts Service [CAS]) в ацетон: зехтин (4:1, об./об.) и 5 % меркаптобензотиазол (CAS № 149-30-4) в N,N-диметилформамид (вж. допълнение 1, таблица 1). Може да има обстоятелства, при които след подходяща обосновка могат да бъдат използвани и други положителни контроли, отговарящи на горепосочените критерии.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              При все че е препоръчително постоянното включване на паралелна положителна контролна (ПК) група, могат да съществуват ситуации, при които прилагането на периодично изпитване (т.е. на интервали ≤ 6 месеца) на ПК може да е подходящо за лаборатории, които редовно провеждат LLNA (т.е. провеждат LLNA не по-малко от веднъж месечно) и имат създадена база данни от предишни изпитвания с ПК, доказваща способността на лабораторията да получава възпроизводими и точни резултати с положителните контроли. Подходящата компетентност за провеждане на LLNA може да бъде успешно доказана чрез получаването на последователни положителни резултати с ПК при най-малко 10 независими изпитвания, проведени в рамките на разумно продължителен период от време (т.е. по-малко от една година).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Винаги следва да се включва паралелна ПК група, когато има процедурна промяна в LLNA (например промяна на обучения персонал, промяна на материалите и/или реагентите, с които се провежда методът за изпитване, промяна на оборудването, с което се провежда методът за изпитване, промяна в произхода на опитните животни), като тези промени следва да бъдат документирани в лабораторните доклади. Следва да се обърне внимание на въздействието на тези промени върху годността на предварително създадената база данни от предишни изпитвания с оглед да се определи необходимостта от създаване на нова база данни от предишни изпитвания за документиране на последователността на резултатите с ПК.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Изследователите следва да са наясно, че решението за периодично провеждане на изпитване с положителна контрола вместо паралелното му провеждане има последици върху адекватността и приемливостта на отрицателните резултати от изпитването, получени без паралелна положителна контрола по време на интервала между всяко периодично изпитване с положителна контрола. Например, ако се получи погрешен отрицателен резултат при периодичното изпитване с положителна контрола, отрицателните резултати за изпитваното вещество, получени по време на интервала между последното приемливо периодично изпитване с положителна контрола и неприемливото периодично изпитване с положителна контрола, могат да бъдат поставени под съмнение. Изводите относно тези резултати следва внимателно да се проучат, когато се взема решение дали да се включват паралелни ПК или само да се провеждат периодични ПК. Следва да се проучи и възможността за използване на по-малко животни в паралелната ПК група, когато това е научно обосновано и ако лабораторията докаже, въз основа на конкретните за лабораторията данни от предишни изпитвания, че могат да бъдат използвани по-малко мишки (12).
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Въпреки че положителната контрола следва да бъде изпитвана с носителя, за който е известно, че при прилагането му се получава постоянна реакция (напр. ацетон: зехтин; 4:1, об./об.), може да има определени регулаторни ситуации, при които да е необходимо също провеждането на изпитване с нестандартен носител (клинично/химично отговаряща формулация) (24). Ако паралелната положителна контрола се изпитва с различен носител от изпитваното вещество, тогава следва да се включи отделна третирана само с носителя контролна група за паралелната положителна контрола.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              В случаи, при които се оценяват изпитвани вещества от определен химичен клас или спектър от реакции, от полза могат да бъдат и еталонните вещества, за да се докаже, че методът за изпитване функционира правилно по отношение на откриването на потенциала за кожна сенсибилизация на тези видове изпитвани вещества. Подходящите еталонни вещества следва да притежават следните свойства:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          структурно и функционално сходство с класа на изпитваното вещество;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          известни физични/химични характеристики;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          подкрепящи данни от LLNA;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          подкрепящи данни от други животински модели и/или от хора.
                                       
                                    
                        ПРОЦЕДУРА НА ИЗПИТВАНЕ
                  
                     Брой на животните и нива на дозите
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Използват се минимум четири животни за подложена на дадена доза група, при минимум три концентрации на изпитваното вещество, плюс паралелна отрицателна контролна група (ОК), третирана само с носителя на изпитваното вещество, както и положителна контрола (паралелна или неотдавнашна въз основа на лабораторната политика като се вземат предвид точки 11—15). Следва да се разгледа възможността за изпитване на множество дози на положителната контрола, особено когато не се провеждат редовни изпитвания на ПК. Животните от контролните групи следва да бъдат отглеждани и третирани по начин, идентичен с този на животните от третираните групи, с изключение на това, че липсва третиране с изпитваното вещество.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Изборът на доза и носител следва да се базира на препоръките, посочени в литературните източници (3) и (5). Последователните дози обикновено се избират от подходяща поредица от концентрации като например 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % и т.н. Изборът на използваната поредица от концентрации следва да бъде придружен от подходяща научна обосновка. В случаите когато има съответна информация, при избора на трите последователни концентрации следва да бъде взета предвид цялата съществуваща токсикологична информация (напр. остра токсичност и кожно дразнене) и информацията за структурните и физикохимичните свойства на представляващото интерес изпитвано вещество (и/или структурно свързаните вещества), така че най-високата концентрация да увеличава в максимална степен експозицията, като същевременно се избягва систематична токсичност и/или прекомерно локално кожно дразнене (3) (25). При липсата на такава информация може да е необходимо първоначално предварително скринингово изпитване (вж. точки 21—24).
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Носителят не следва да пречи или да оказва влияние на резултата от изпитването и следва да бъде избран въз основа на способността си максимално да повишава разтворимостта, за да се получи най-високата постижима концентрация, като същевременно се приготвя подходящ разтвор/суспензия за прилагане на изпитваното вещество. Препоръчителните носители са ацетон: зехтин (4:1, об./об.), N,N-диметилформамид, метилетилкетон, пропилен гликол и диметилсулфоксид (19), но могат да бъдат използвани и други, при условие че се предостави достатъчна научна обосновка. При определени ситуации може да бъде необходимо да се използват в качеството на допълнителна контрола клинично използван разтворител или търговски препарат, в състава на който изпитваното вещество се предлага на пазара. Следва да се положи специална грижа за да се осигури, че хидрофилните изпитвани вещества се влагат в среда от носители, която навлажнява кожата и не се стича веднага, чрез инкорпорирането на подходящи солюбилизатори (напр. 1 % плуроник — Pluronic® L92). Поради тази причина трябва да се избягват носителите на изцяло водна основа.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Обработката на лимфни възли на отделни мишки дава възможност за оценка на вариабилността между животните и за статистическо сравнение на разликата между изпитваното вещество и измерванията в третираната с носителя контролна група (вж. точка 35). В допълнение към това е възможно оценяването на възможността за намаляване на броя на мишките в ПК група, когато са събрани индивидуални данни за отделните животни (12). Освен това някои регулаторни органи изискват събирането на индивидуални данни за отделните животни. Въпреки това сборните данни за животните могат да бъдат счетени за приемливи от някои регулаторни органи и в такива случаи ползвателите имат възможността да събират или индивидуални, или сборни данни за животните.
                           
                        
                     Предварително скринингово изпитване
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              При липса на информация за определянето на най-високата доза за изпитване (вж. точка 18) следва да се извърши предварително скринингово изпитване, за да се определи подходящото ниво на дозата за изпитване при LLNA. Целта на предварителното скринингово изпитване е да осигури данни за избор на максималното ниво на дозата, което да бъде използвано в основното изпитване LLNA в случаите, когато не е налична информация за концентрацията, причиняваща системна токсичност (вж. точка 24) и/или прекомерно локално кожно дразнене (вж. точка 23). Изпитваното максимално ниво на дозата следва да се състои от 100 % чисто изпитвано вещество (за течностите), или да е с максималната възможна концентрация (за твърдите вещества или суспензиите).
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Предварителното скринингово изпитване следва да се провежда при условия, идентични на тези в основното изпитване LLNA, с изключение на това, че не се оценява пролиферацията на лимфните възли и могат да се използват по-малко животни за подложена на определена доза група. Предлага се използването на едно или две животни за подложена на определена доза група. Всички мишки се наблюдават ежедневно за всякакви клинични признаци за системна токсичност или локално дразнене на мястото на прилагане. Телесните тегла се записват преди изпитването и преди завършването му (ден 6). И двете уши на всяка мишка се наблюдават за еритема и резултатите се отчитат, като се използва таблица 1 (25). Измерванията на дебелината на ушите се правят, като се използва измервателен уред за дебелина (напр. цифров микрометър или измервателен уред за дебелина Peacock Dial) в ден 1 (преди дозирането), ден 3 (приблизително 48 часа след първата доза) и ден 6. Освен това дебелината на ушите в ден 6 може да се определи чрез продупчване на ушите и определяне на теглото на взетите продупчени части, което следва да се извърши след като животните бъдат умъртвени по хуманен начин. Показател за прекомерното локално кожно дразнене е балова оценка на еритемата ≥ 3 и/или увеличаване на дебелината на ушите в размер на ≥ 25 % в който и да било от дните с измервания (26) (27). Най-високата доза, избрана за основното изпитване LLNA, ще бъде следващата по-ниска доза от поредицата от концентрации в предварителното скринингово изпитване (вж. точка 18), която не причинява системна токсичност и/или прекомерно локално кожно дразнене.
                              
                                 Таблица 1
                              
                              
                                 Оценки на еритемата
                              
                              
                                          Наблюдение
                                       
                                       
                                          Балова оценка
                                       
                                    
                                          Отсъствие на еритема
                                       
                                       
                                          0
                                       
                                    
                                          Много слаба еритема (едва забележима)
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                    
                                          Добре изразена еритема
                                       
                                       
                                          2
                                       
                                    
                                          Умерена до тежка еритема
                                       
                                       
                                          3
                                       
                                    
                                          Тежка еритема (силно зачервяване — с цвят на цвекло) до образуване на есхара, което не позволява да се отчете баловата оценка на еритемата
                                       
                                       
                                          4
                                       
                                    
                        
                              23.
                           
                           
                              В допълнение към увеличаването на дебелината на ушите с 25 % (26) (27), за идентифициране на дразнители при LLNA също така се използва статистически значимо увеличаване на дебелината на ушите при третираните мишки в сравнение с контролните мишки (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Въпреки това, макар че могат да възникнат статистически значими увеличения, когато дебелината на ушите е по-малка от 25 %, те не са конкретно свързани с прекомерното дразнене (30) (32) (33) (34).
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Следните клинични наблюдения могат да покажат наличие на системна токсичност (35) (36), когато се използват като част от интегрална оценка, и поради това могат да посочат какво следва да е максималното ниво на дозата, което да се използва в основното LLNA изпитване: промени във функционирането на нервната система (напр. пилоерекция, атаксия, тремори и конвулсии); промени в поведението (напр. агресивност, промяна в хигиената на тялото, изразена промяна в нивото на активност); промени в начина на дишане (т.е. промени в честотата и интензивността на дишането като диспнея, задъханост и хрипове) и промени в консумацията на храна и вода. Освен това в оценката следва да бъдат взети предвид признаци на летаргия и/или липса на реакция и всякакви клинични признаци на нещо повече от лека или момента болка и страдание или намаляване на телесното тегло > 5 % от ден 1 до ден 6, както и смъртността. Умиращите животни, както и животните, които очевидно изпитват болка или показват признаци на тежко и продължително страдание, следва да бъдат умъртвени по хуманен начин (37).
                           
                        
                     Експериментален график на основното изпитване
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Експерименталният график на изпитването е, както следва:
                              —   Ден 1: Индивидуално се идентифицира и записва теглото на всяко животно и всяко клинично наблюдение. Прилага се 25 μL подходящо разреден разтвор на изпитваното вещество, както и самостоятелно носителят или положителната контрола (паралелна или неотдавнашна въз основа на лабораторната политика, като се вземат предвид точки 11—15), в горната част на всяко ухо.
                              —   Дни 2 и 3: Повтаря се процедурата по прилагане, извършена в ден 1.
                              —   Дни 4 и 5: Няма третиране.
                              —   Ден 6: Записва се теглото на всяко животно. Инжектира се 250 μL стерилен буферен физиологичен разтвор с фосфат (PBS), съдържащ 20 μСi (7,4 × 105 Bq) тритиев (3H)-метил тимидин на всички изследвани и контролни мишки през опашната вена. Алтернативно се инжектира 250 μL стерилен PBS, съдържащ 2 μСi (7,4 × 104 Bq) 125I-йододеоксиуридин и 10–5Μ флуородеоксиуридин на всички мишки през опашната вена. Пет часа (5 h) по-късно животните се умъртвяват по хуманен начин. Дрениращите аурикуларни (ушни) лимфни възли от всяко ухо на мишката се отрязват и се обработват заедно в PBS за всяко животно (индивидуален подход към животните); алтернативно лимфните възли от всяко ухо се отрязват и събират в PBS за всяка третирана група (общ подход за третиране на групата). Подробности и диаграми за идентифицирането и дисекцията на лимфните възлите могат да бъдат намерени в позоваване (12). За допълнително наблюдение на локалната кожна реакция при основното изпитване в протокола от изпитването могат да бъдат включени допълнителни параметри като оценяване на ушната еритема или измервания на дебелината на ушите (получени или чрез използването на измервателен уред за дебелината, или чрез продупчване на ушите и определяне на теглото на взетите продупчени части при аутопсията).
                           
                        
                     Приготвяне на клетъчни суспензии
                  
                  
                              26.
                           
                           
                              Клетъчна суспензия от единични клетки се приготвя от клетки от лимфните възли (КЛВ), отрязани двустранно, като се използва индивидуалният подход към животните или алтернативно общият подход за третиране на групата, чрез леко механично раздробяване през 200-микронови отвори на мрежа от неръждаема стомана или чрез друга приемлива техника за получаване на клетъчна суспензия от единични клетки. Клетките от лимфните възли се измиват двукратно с голямо количество PBS и ДНК-то се преципитира с 5 % трихлороцетна киселина (ТСА) при 4 °C в продължение на 18 часа (3). Малките сферични топчета или повторно се суспендират в 1 ml ТСА и се прехвърлят в сцинтилационни стъкленици, съдържащи 10 mL сцинтилационна течност за 3H-преброяване, или се прехвърлят директно в гама броителни епруветки за 125I-преброяване.
                           
                        
                     Определяне на клетъчната пролиферация (инкорпорирана радиоактивност)
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Инкорпорирането на 3H-метил тимидин се измерва чрез β-сцинтилационен брояч като разпадане (дезинтегриране) за минута (DPM). Инкорпорирането на 125I-йододеоксиуридин се измерва чрез 125I-брояч и също се изразява като DPM. В зависимост от използвания подход инкорпорирането се изразява като DPM/мишка (индивидуален подход към животните) или DPM/третирана група (общ подход за третиране на групата).
                           
                        
                     Ограничено LLNA
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              В определени случаи, когато е налице регулаторна необходимост да се потвърди отрицателна прогноза за потенциален кожен сенсибилизатор, може да се използва незадължителен протокол за rLLNA (16) (17) (18), при който се използват по-малко животни, при условие че се спазват всички други протоколни спецификации за LLNA, описани в настоящия МИ. Преди прилагането на подхода rLLNA следва да се предоставят ясни основания и научна обосновка за неговото използване. Ако се получи положителен или неясен резултат, може да е необходимо допълнително изпитване за тълкуване или изясняване на резултата.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Намаляването на броя подложени на различни дози групи е единствената разлика между протоколите за методите на изпитване LLNA и rLLNA и поради тази причина rLLNA не предоставя информация за зависимостта доза—реакция. Следователно rLLNA не трябва да се използва, когато е необходима информация за зависимостта доза—реакция. Както при използващото множество дози LLNA, концентрацията на изпитваното вещество, оценявана при rLLNA, следва да бъде максималната концентрация, която не причинява явна систематична токсичност и/или прекомерно локално кожно дразнене на мишката (вж. точка 18).
                           
                        НАБЛЮДЕНИЯ
                  
                     Клинични наблюдения
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Всяка мишка следва да бъде внимателно наблюдавана поне веднъж дневно за всякакви клинични признаци за локално дразнене на мястото на прилагане или за систематична токсичност. Всички наблюдения следва систематично да се записват, като се водят дневници за всяка мишка. Плановете за наблюдение следва да включват критерии за бързото идентифициране на мишките, които показват признаци на систематична токсичност, прекомерно локално кожно дразнене или корозивност на кожата, за да бъдат подложени на евтаназия (37).
                           
                        
                     Телесни тегла
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Както е посочено в точка 25, индивидуалните телесни тегла на животните следва да бъдат измерени в началото на изпитването и при планираното умъртвяване на животните по хуманен начин.
                           
                        ИЗЧИСЛЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
                  
                              32.
                           
                           
                              Резултатите за всяка третирана група се изразяват чрез стимулационния индекс (SI). Когато се използва индивидуалният подход към животните, SI се получава чрез разделяне на средната стойност на DPM/мишка във всяка група, изследвана с изпитваното вещество, както и в положителната контролна група, на средната стойност на DPM/мишка за контролната група, третирана само с разтворителя/носителя. Средната стойност на SI за контролите, третирани само с носителя, е единица. Когато се използва общият подход за третиране на групата, SI се получава чрез разделяне на общото радиоактивно инкорпориране за всяка третирана група на инкорпорирането на общата третирана само с носителя контролна група; така се получава средният SI.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              При процеса на вземане на решение, даден резултат се счита за положителен, когато SI ≥ 3. При гранични резултати, обаче, могат да бъдат взети предвид и силата на зависимостта доза—отговор, статистическата значимост и съответствието на реакциите при третиране с разтворител/носител и ПК реакциите (4) (5) (6).
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Ако е необходимо изясняване на получените резултати, следва да се обърне внимание на различните свойства на изпитваното вещество, включително дали то има структурна връзка с познати кожни сенсибилизатори, дали причинява прекомерно кожно дразнене при мишките, както и на естеството на наблюдаваната зависимост доза—отговор. Тези и други съображения подробно се обсъждат на друго място (7).
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Събирането на данни за радиоактивността на нивото на отделните мишки дава възможност за статистически анализ на наличието и степента на зависимостта доза—отговор в данните. Всяка статистическа оценка би могла да включва оценка на зависимостта доза—отговор, както и подходящо направени сравнения между изпитваните групи (напр. сравнения по двойки на третираните с определени дози групи съответно с паралелната третирана с носител контролна група). Статистическите анализи могат например да включват линейна регресия или изпитването на William за оценка на тенденциите в зависимостта доза—отговор и изпитването на Dunnett за сравнения по двойки. При избора на подходящ метод за статистически анализ изследователят следва да обърне внимание на възможни различия в дисперсиите и други свързани с тях проблеми, които могат да наложат трансформация на данните или провеждане на статистически анализ без параметри. Във всеки случай на изследователя може да му се наложи да извърши изчисления за SI и статистически анализи със и без определени точки с данни (понякога наричани „отклоняващи се стойности“).
                           
                        ДАННИ И ДОКЛАДВАНЕ
                  
                     Данни
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Данните следва да бъдат обобщени в табличен вид. Когато се използва индивидуалният подход към животните, се посочват индивидуалните DPM стойности за отделните животни, средната за групата стойност DPM/животно, съответните граници на отклонения (напр. SD, SEM) и средният SI за всяка подложена на дадена доза група в сравнение с паралелната третирана с носителя контролна група. Когато се използва общият подход за третиране на групата, се посочва средната/междинната DPM стойност и средният SI за всяка подложена на дадена доза група в сравнение с паралелната третирана с носителя контролна група.
                           
                        
                     Протокол от изпитването
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Протоколът от изпитването следва да включва следната информация:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Изпитвани и контролни вещества:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      идентификационни данни (напр. CAS и EC номера, ако са налични; източник, чистота, известни примеси, номер на партидата);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      физична форма и физикохимични свойства (напр. летливост, устойчивост, разтворимост);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ако е смес, състав и относително съотношение в проценти на елементите.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Разтворител/носител:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      идентификационни данни (чистота; концентрация, където е подходящо; използвано количество);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      обосновка за избора на носител.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Опитни животни:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      произход на мишките от порода CBA;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      микробиологичен статус на животните, ако е известен;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      брой и възраст на животните;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      произход на животните, условия на отглеждане, диета и т.н.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Условия на изпитване:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      подробна информация за приготвянето и прилагането на изпитваното вещество;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      обосновка за избора на доза (включително резултатите от предварителното скринингово изпитване, ако е проведено);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      използвани концентрации на изпитваното вещество и носителя и общо количество на приложеното изпитвано вещество;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      подробна информация за качеството на храната и водата (включително вид/източник на диетата, водоизточник);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      подробна информация за графиците на третиране и вземане на проби;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      методи за измерване на токсичността;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      критерии за считане на изпитванията за положителни или отрицателни;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      подробна информация за всякакви отклонения от протокола и обяснение за това как отклонението влияе на планирането на изпитването и на резултатите от него.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Проверка на надеждността:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      обобщение на резултатите от последната проверка на надеждността, включително информация за използваните изпитвано вещество, концентрация и носител;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      данни за паралелни и/или предишни положителни контроли и паралелни отрицателни контроли в лабораторията, провеждаща изпитването;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ако не е била включена паралелна положителна контрола, посочва се датата и лабораторният доклад на най-скорошното периодично изпитване с положителна контрола и доклад, в който подробно се представят данните от предишни изпитвания с положителни контроли на лабораторията, обосноваващ защо не се провежда паралелна положителна контрола.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Резултати:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      индивидуални тегла на мишките в началото на дозирането и при планираното им умъртвяване; както и средната стойност и границата на отклонение (напр. SD, SEM) за всяка третирана група;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      признаци на токсичност и време на настъпването им, включително кожно дразнене на мястото на прилагане, ако има такова, за всяко животно;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      таблица на DPM стойностите и стойностите на SI за всяка мишка (индивидуален подход към животните) или средните/медианните стойности (общ подход за третиране на групата) DPM стойности и стойности на SI за всяка третирана група;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      средната стойност и съответната граница на отклонение (напр. SD, SEM) за DPM/мишка за всяка третирана група и резултатите от анализа на отклоняващите се стойности за всяка третирана група, когато се използва индивидуалният подход към животните;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      изчисленият SI и подходяща мярка за вариабилността, при която се отчита вариабилността между животните както в групата с изпитваното вещество, така и в контролната група, когато се използва индивидуалният подход към животните;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      зависимостта доза—отговор;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      статистически анализи, където е подходящо.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Обсъждане на резултатите:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      кратък коментар на резултатите, анализ на зависимостта доза—отговор и статистически анализ, където е подходящо, със заключение дали изпитваното вещество следва да се счита за кожен сенсибилизатор.
                                                   
                                                
                                    
                        ЛИТЕРАТУРА
                  
                              (1)
                           
                           
                              OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Guideline for the Testing of Chemicals № 429, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary, Food Chem. Toxicol., 30, 165-169.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications, Toxicol., 93, 13-31.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise, J. Toxicol. Environ. Health, 53, 563-79.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation, Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 34, 985-997.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 36, 327-33.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins, Toxicol., 146, 49-59.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 258-273.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34, 274-286.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 249-257.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              OECD (1992), Skin Sensitisation. OECD Guideline for Testing of Chemicals № 406, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment № 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde, J. Appl. Toxicol., 18, 281-284.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal requirements? Contact Dermatitis, 54, 181-185.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay (rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research Centre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre for the Validation of Alternative Methods, April 2007. На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf]
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication № 99-4494, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96.
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, на разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]
                           
                        
                              (23)
                           
                           
                              ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
                           
                        
                              (24)
                           
                           
                              McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71-89.
                           
                        
                              (25)
                           
                           
                              OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals № 404, Paris, France. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/document/40/0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]
                           
                        
                              (26)
                           
                           
                              Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances, Toxicologist, 96, 235.
                           
                        
                              (27)
                           
                           
                              ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]
                           
                        
                              (28)
                           
                           
                              Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206.
                           
                        
                              (29)
                           
                           
                              Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions, Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94.
                           
                        
                              (30)
                           
                           
                              Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals, Toxicol. Meth., 8, 245-256.
                           
                        
                              (31)
                           
                           
                              Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods, Drug. Chem. Toxicol., 22, 491-506.
                           
                        
                              (32)
                           
                           
                              Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68.
                           
                        
                              (33)
                           
                           
                              Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728.
                           
                        
                              (34)
                           
                           
                              Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract, Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028.
                           
                        
                              (35)
                           
                           
                              OECD (1987), Acute Dermal Toxicity, OECD Guideline for Testing of Chemicals № 402, Paris, France. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (36)
                           
                           
                              ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, на разположение на адрес: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm]
                           
                        
                              (37)
                           
                           
                              OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment № 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                     Допълнение 1
                     
                        Стандарти за ефективност, предназначени за оценка на предложени сходни или модифицирани методи за изпитване LLNA за кожна сенсибилизация
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Предназначението на стандартите за ефективност (СЕ) е да се обявят основанията, въз основа на които новите методи за изпитване, както патентованите (т.е. защитените от авторско право, официално регистрираните с търговска марка, регистрираните), така и непатентованите, могат да бъдат определени като достатъчно точни и надеждни за целите на конкретни изпитвания. Тези СЕ, основани на валидирани и приети методи за изпитване, могат да бъдат използвани за оценяване на надеждността и точността на други сходни методи (разговорно наричани „вариантни методи“ за тестовете — „me-too“ tests), които се основават на сходни научни принципи и измерват или прогнозират същия биологичен или токсичен ефект (14).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Преди приемане на модифицираните методи (т.е. на предложени потенциални подобрения на одобрен метод за изпитване) трябва да се извърши оценка за определяне на ефекта на предложените изменения върху ефективността на изпитването и степента, до която тези изменения засягат наличната информация за другите елементи на процеса на валидиране. В зависимост от броя и естеството на предложените изменения, генерираните данни и придружаващата документация за тези изменения, те следва или да бъдат предмет на същия процес на валидиране, който е описан за ново изпитване, или, ако е приложимо, на ограничена оценка на надеждността и приложимостта чрез използване на приети СЕ (14).
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Сходните или модифицирани методи, предложени за използване съгласно настоящия метод за изпитване (МИ), следва да бъдат оценени, за да се определят надеждността и точността им, като се използват химикали, които са представителни за пълната скала на резултатите от LLNA. С оглед да се избегне своеволно използване върху животни, настойчиво се препоръчва лицата, които разработват модела, да се консултират със съответните органи преди да започнат изследвания за валидиране в съответствие със СЕ и указанията, формулирани в настоящия МИ.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Тези СЕ се основават на хармонизираните СЕ на Междуведомствения координационен комитет за валидиране на алтернативни методи на САЩ (US-ICCVAM), Европейския център за валидиране на алтернативни методи на ЕО EC-ECVAM) и Японския център за валидиране на алтернативни методи (JaCVAM) (12) за оценяване на валидността на сходни или модифицирани версии на LLNA. СЕ се състоят от съществени елементи на метода за изпитване, препоръчителни референтни химикали и стандарти за точност и надеждност, на които предложеният метод следва да отговаря или които той следва да надхвърля.
                              
                           I.   Съществени елементи на метода за изпитване
                     
                     
                                 5.
                              
                              
                                 Следните елементи следва да бъдат включени в протокола за метода за изпитване, за да се гарантира, че даден сходен или модифициран метод за LLNA е по своя механизъм и функционално аналогичен на LLNA и измерва същия биологичен ефект:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             изпитваното вещество следва да се прилага локално и на двете уши на мишката;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             пролиферацията на лимфоцитите следва да се измерва в лимфните възли, дрениращи мястото на прилагане на химикала за изпитване;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             пролиферацията на лимфоцитите следва да се измерва по време на индукционната фаза на кожната сенсибилизация;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             за изпитваните вещества, най-високата доза следва да бъде максималната концентрация, която не причинява системна токсичност и/или прекомерно локално кожно дразнене на мишката. За положителните референтни химикали, най-високата доза следва да бъде поне толкова висока, колкото стойностите на EC3 за LLNA на съответните референтни химикали (вж. таблица 1), без да причинява системна токсичност и/или прекомерно локално кожно дразнене на мишката;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             паралелна съдържаща само носител контрола следва да бъде включена във всяко изпитване и, където е подходящо, следва също да се използва паралелна положителна контрола;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             следва да се използват минимум четири животни за подложена на определена доза група;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             могат да се събират или индивидуални, или сборни данни за животните.
                                          
                                       Ако някой от тези критерии не е изпълнен, разглежданите тук стандарти за ефективност не могат да се използват за валидиране на сходния или модифициран метод.
                              
                           II.   Минимален списък на референтните химикали
                     
                     
                                 6.
                              
                              
                                 В хармонизираните СЕ на Междуведомствения координационен комитет за валидиране на алтернативни методи на САЩ (US-ICCVAM), Европейския център за валидиране на алтернативни методи на ЕО (EC-ECVAM) и Японския център за валидиране на алтернативни методи (JaCVAM) (12) е идентифициран минимален брой от 18 референтни химикала, които следва да се използват, и четири незадължителни референтни химикала (т.е. вещества, които предизвикват или фалшиво положителни, или фалшиво отрицателни резултати при LLNA в сравнение с резултатите, получени при изследвания върху човек или върху морски свинчета (Б.6 или Указание за изпитване 406 на ОИСР) (13) и следователно предоставят възможност за доказване на еднаква или по-добра ефективност, отколкото LLNA), които са включени в СЕ за LLNA. Критериите за подбор за идентифицирането на тези химикали бяха следните:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             списъкът на референтните химикали е представителен за видовете вещества, които обичайно се изпитват за откриване на потенциал за кожна сенсибилизация, както и спектъра от реакции, които LLNA е способно да измерва или прогнозира;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             тези вещества имат ясно определена химична структура;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             за всяко от веществата имаше налични данни за LLNA от тестове върху морски свинчета (т.е. глава Б.6, Указание за изпитване 406 на ОИСР) (13), и (където това е възможно) от изследвания върху хора; както и
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             тези вещества лесно могат да бъдат намерени от търговски източници.
                                          
                                       Препоръчителните референтни химикали са посочени в таблица 1. Изпитванията, при които се използват предлаганите референтни химикали, следва да бъдат оценявани с носителя, с който са посочени в таблица 1. В случаите, в които посоченото вещество не е налично, могат да бъдат използвани други вещества, които отговарят на критериите за избор, като се предостави подходяща обосновка.
                                 
                                    Таблица 1
                                 
                                 
                                    Препоръчителни референтни химикали за стандартите за ефективност за LLNA
                                 
                                 
                                             Номер
                                          
                                          
                                             Химикали (3)
                                             
                                          
                                          
                                             CAS №
                                          
                                          
                                             Форма
                                          
                                          
                                             Носител (4)
                                             
                                          
                                          
                                             EC3 % (5)
                                             
                                          
                                          
                                             N (6)
                                             
                                          
                                          
                                             0,5x – 2,0x EC3
                                          
                                          
                                             Действителен обхват на EC3
                                          
                                          
                                             LLNA спрямо МС
                                          
                                          
                                             LLNA спрямо рез. при хора
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             5-хлоро-2-метил-4-изотиазолин-3-он (CMI)/2-метил-4-изотиазолин-3-он (MI) (7)
                                             
                                          
                                          
                                             26172-55-4/2682-20-4
                                          
                                          
                                             Течна
                                          
                                          
                                             DMF
                                          
                                          
                                             0,009
                                          
                                          
                                             1
                                          
                                          
                                             0,0045—0,018
                                          
                                          
                                             НИ
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             DNCB
                                          
                                          
                                             97-00-7
                                          
                                          
                                             Твърда
                                          
                                          
                                             AOO
                                          
                                          
                                             0,049
                                          
                                          
                                             15
                                          
                                          
                                             0,025—0,099
                                          
                                          
                                             0,02—0,094
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             4-фенилендиамин
                                          
                                          
                                             106-50-3
                                          
                                          
                                             Твърда
                                          
                                          
                                             AOO
                                          
                                          
                                             0,11
                                          
                                          
                                             6
                                          
                                          
                                             0,055—0,22
                                          
                                          
                                             0,07—0,16
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             Кобалтов хлорид
                                          
                                          
                                             7646-79-9
                                          
                                          
                                             Твърда
                                          
                                          
                                             DMSO
                                          
                                          
                                             0,6
                                          
                                          
                                             2
                                          
                                          
                                             0,3—1,2
                                          
                                          
                                             0,4—0,8
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                       
                                             5
                                          
                                          
                                             Изоевгенол
                                          
                                          
                                             97-54-1
                                          
                                          
                                             Течна
                                          
                                          
                                             AOO
                                          
                                          
                                             1,5
                                          
                                          
                                             47
                                          
                                          
                                             0,77—3,1
                                          
                                          
                                             0,5—3,3
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                       
                                             6
                                          
                                          
                                             2-меркаптобензотиазол
                                          
                                          
                                             149-30-4
                                          
                                          
                                             Твърда
                                          
                                          
                                             DMF
                                          
                                          
                                             1,7
                                          
                                          
                                             1
                                          
                                          
                                             0,85—3,4
                                          
                                          
                                             НИ
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             Цитрал
                                          
                                          
                                             5392-40-5
                                          
                                          
                                             Течна
                                          
                                          
                                             AOO
                                          
                                          
                                             9,2
                                          
                                          
                                             6
                                          
                                          
                                             4,6—18,3
                                          
                                          
                                             5,1—13
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                       
                                             8
                                          
                                          
                                             Хидроксилимонена киселина (HCA)
                                          
                                          
                                             101-86-0
                                          
                                          
                                             Течна
                                          
                                          
                                             AOO
                                          
                                          
                                             9,7
                                          
                                          
                                             21
                                          
                                          
                                             4,8—19,5
                                          
                                          
                                             4,4—14,7
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                       
                                             9
                                          
                                          
                                             Евгенол
                                          
                                          
                                             97-53-0
                                          
                                          
                                             Течна
                                          
                                          
                                             AOO
                                          
                                          
                                             10,1
                                          
                                          
                                             11
                                          
                                          
                                             5,05—20,2
                                          
                                          
                                             4,9—15
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             Фенил бензоат
                                          
                                          
                                             93-99-2
                                          
                                          
                                             Твърда
                                          
                                          
                                             AOO
                                          
                                          
                                             13,6
                                          
                                          
                                             3
                                          
                                          
                                             6,8—27,2
                                          
                                          
                                             1,2—20
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                       
                                             11
                                          
                                          
                                             Канелен алкохол
                                          
                                          
                                             104-54-1
                                          
                                          
                                             Твърда
                                          
                                          
                                             AOO
                                          
                                          
                                             21
                                          
                                          
                                             1
                                          
                                          
                                             10,5—42
                                          
                                          
                                             НИ
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                       
                                             12
                                          
                                          
                                             Имидазолидинил уреа
                                          
                                          
                                             39236-46-9
                                          
                                          
                                             Твърда
                                          
                                          
                                             DMF
                                          
                                          
                                             24
                                          
                                          
                                             1
                                          
                                          
                                             12—48
                                          
                                          
                                             НИ
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                       
                                             13
                                          
                                          
                                             Метилметакрилат
                                          
                                          
                                             80-62-6
                                          
                                          
                                             Течна
                                          
                                          
                                             AOO
                                          
                                          
                                             90
                                          
                                          
                                             1
                                          
                                          
                                             45— 100
                                          
                                          
                                             НИ
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             Хлорбензен
                                          
                                          
                                             108-90-7
                                          
                                          
                                             Течна
                                          
                                          
                                             AOO
                                          
                                          
                                             25
                                          
                                          
                                             1
                                          
                                          
                                             Не е приложимо
                                          
                                          
                                             Не е приложимо
                                          
                                          
                                             –/–
                                          
                                          
                                             –/ (1)
                                             
                                          
                                       
                                             15
                                          
                                          
                                             Изопропанол
                                          
                                          
                                             67-63-0
                                          
                                          
                                             Течна
                                          
                                          
                                             AOO
                                          
                                          
                                             50
                                          
                                          
                                             1
                                          
                                          
                                             Не е приложимо
                                          
                                          
                                             Не е приложимо
                                          
                                          
                                             –/–
                                          
                                          
                                             –/+
                                          
                                       
                                             16
                                          
                                          
                                             Млечна киселина
                                          
                                          
                                             50-21-5
                                          
                                          
                                             Течна
                                          
                                          
                                             DMSO
                                          
                                          
                                             25
                                          
                                          
                                             1
                                          
                                          
                                             Не е приложимо
                                          
                                          
                                             Не е приложимо
                                          
                                          
                                             –/–
                                          
                                          
                                             –/ (1)
                                             
                                          
                                       
                                             17
                                          
                                          
                                             Метил салицилат
                                          
                                          
                                             119-36-8
                                          
                                          
                                             Течна
                                          
                                          
                                             AOO
                                          
                                          
                                             20
                                          
                                          
                                             9
                                          
                                          
                                             Не е приложимо
                                          
                                          
                                             Не е приложимо
                                          
                                          
                                             –/–
                                          
                                          
                                             –/–
                                          
                                       
                                             18
                                          
                                          
                                             Салицилова киселина
                                          
                                          
                                             69-72-7
                                          
                                          
                                             Твърда
                                          
                                          
                                             AOO
                                          
                                          
                                             25
                                          
                                          
                                             1
                                          
                                          
                                             Не е приложимо
                                          
                                          
                                             Не е приложимо
                                          
                                          
                                             –/–
                                          
                                          
                                             –/–
                                          
                                       
                                             Незадължителни вещества а доказване на подобрена ефективност, свързана с LLNA
                                          
                                       
                                             19
                                          
                                          
                                             Натриев лаурилсулфат
                                          
                                          
                                             151-21-3
                                          
                                          
                                             Твърда
                                          
                                          
                                             DMF
                                          
                                          
                                             8,1
                                          
                                          
                                             5
                                          
                                          
                                             4,05—16,2
                                          
                                          
                                             1,5—17,1
                                          
                                          
                                             +/–
                                          
                                          
                                             +/–
                                          
                                       
                                             20
                                          
                                          
                                             Етиленгликол диметакрилат
                                          
                                          
                                             97-90-5
                                          
                                          
                                             Течна
                                          
                                          
                                             MEK
                                          
                                          
                                             28
                                          
                                          
                                             1
                                          
                                          
                                             14—56
                                          
                                          
                                             НИ
                                          
                                          
                                             +/–
                                          
                                          
                                             +/+
                                          
                                       
                                             21
                                          
                                          
                                             Ксилол
                                          
                                          
                                             1330-20-7
                                          
                                          
                                             Течна
                                          
                                          
                                             AOO
                                          
                                          
                                             95,8
                                          
                                          
                                             1
                                          
                                          
                                             47,9—100
                                          
                                          
                                             НИ
                                          
                                          
                                             +/ (2)
                                             
                                          
                                          
                                             +/–
                                          
                                       
                                             22
                                          
                                          
                                             Никелов хлорид
                                          
                                          
                                             7718-54-9
                                          
                                          
                                             Твърда
                                          
                                          
                                             DMSO
                                          
                                          
                                             5
                                          
                                          
                                             2
                                          
                                          
                                             Не е приложимо
                                          
                                          
                                             Не е приложимо
                                          
                                          
                                             –/+
                                          
                                          
                                             –/+
                                          
                                       
                                             Съкращения: AOO = ацетон: зехтин (4:1, об./об.); CAS № = регистрационен номер съгласно химичния регистър на Службата за химични индекси; DMF = N,N-диметилформамид; DMSO = диметил сулфоксид; DNCB = 2,4-динитрохлорбензен; EC3 = оценена концентрация, необходима за постигането на стимулационен индекс със стойност 3; МС = резултат от изследването върху морски свинчета (т.е. глава Б.6 или Указание за изпитване 406 на ОИСР) (13); HCA = хексилканелен алдехид; течна = течна форма; LLNA = резултат от изследването на локалните лимфни възли върху мишки (т.е. глава Б.42, Указание за изпитване 429 на ОИСР) (1); MEK = метилетилкетон; NA = не е приложимо, тъй като стимулационният индекс е < 3; НИ = не е изчислено, тъй като данните са получени от едно изпитване; твърда = твърда форма; носител = носител на изпитваното вещество
                                          
                                       
                           III.   Определени стандарти за надеждност и точност
                     
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Точността на сходен или модифициран метод за LLNA следва да отговаря на или да надвишава точността на СЕ за LLNA, когато тя се оценява чрез използване на минимално необходимите 18 референтни химикала, които следва да бъдат използвани. Новият или модифицираният метод следва да доведе до правилно класифициране въз основа на решение „да/не“. При все това новият или модифициран метод може да не класифицира правилно всички химикали от минимално необходимите референтни химикали, които следва да бъдат използвани. Ако например един от слабите сенсибилизатори е класифициран неправилно, обосновката за неправилното класифициране и подходящите допълнителни данни (напр. резултати от изпитването, които осигуряват правилно класифициране на други вещества с физични, химични и сенсибилизиращи свойства, подобни на свойствата на неправилно класифицирания референтен материал) могат да бъдат счетени за показващи еквивалентна ефективност. При тези обстоятелства, статусът на валидирането на новия или модифициран метод за LLNA се оценява индивидуално за всеки отделен случай.
                              
                           
                        Вътрешнолабораторна възпроизводимост
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 За да бъде определена вътрешнолабораторната възпроизводимост, следва да бъде оценен нов или модифициран метод за LLNA, като се използва сенсибилизиращо вещество, което е добре характеризирано в LLNA. Поради това СЕ за LLNA се основават на вариабилността на резултатите от повторни изпитвания на хексилканелен алдехид (HCA). С цел оценяване на вътрешнолабораторната надеждност, стойностите на оценената прагова концентрация (ECt) за HCA следва да бъдат определени в четири различни случая с интервал от поне една седмица между отделните изпитвания. Признак за приемлива вътрешнолабораторна възпроизводимост е способността на дадена лаборатория във всяко едно изпитване на HCA да получава стойности на ECt от 5 % до 20 %, което представлява диапазон от 0,5—2,0 пъти средната EC3 стойност, посочена за HCA (10 %) в LLNA (вж. таблица 1).
                              
                           
                        Междулабораторна възпроизводимост
                     
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Междулабораторната възпроизводимост на нов или модифициран метод LLNA следва да бъде оценявана като се използват две сенсибилизиращи вещества, които са добре характеризирани в LLNA. СЕ за LLNA се основават на вариабилността на резултатите от изпитвания на хидроксилимонена киселина (HCA) и 2,4-динитрохлоробензен (DNCB) в различни лаборатории. Стойностите на ECt следва да бъдат определени независимо чрез едно изпитване, проведено в поне три отделни лаборатории. За да докаже приемлива междулабораторна възпроизводимост, всяка лаборатория следва да получи стойности на ECt от 5 % до 20 % за HCA и от 0,025 % до 0,1 % за DNCB, което представлява интервал от 0,5—2,0 пъти средната стойност на EC3 концентрация, посочена за HCA (10 %) и съответно, за DNCB (0,05 %) на база LLNA (вж. таблица 1).
                              
                           
                  
                     Допълнение 2
                     
                        Определения
                     
                     Точност: степента на близост на съвпадение на резултатите от метода за изпитване и приетите референтни стойности. Това е мярка за ефективността на метода за изпитване и един от аспектите на неговата приложимост. Терминът често се използва взаимозаменяемо с термина „съвпадение“, за да се обозначи делът на верните резултати при даден метод за изпитване (14).
                     Еталонно вещество: вещество, което предизвиква или не предизвиква сенсибилизация, използвано като норма за сравнение с изпитваното вещество. Едно еталонно вещество следва да притежава следните свойства: i) постоянен и надежден източник; ii) структурно и функционално сходство с класа на изпитваните вещества; iii) известни физикохимични характеристики; iv) потвърждаващи данни за известни въздействия; и v) известна ефективност за постигане на желаната реакция.
                     Оценена прагова концентрация (ECt): оценената концентрация на изпитвано вещество, която е необходима за постигането на стимулационен индекс, показващ положителна реакция.
                     Оценена концентрация, водеща до стимулационен индекс 3 (EC3): оценената концентрация на изпитвано вещество, която е необходима за постигането на стимулационен индекс със стойност три.
                     Вещество с фалшиво отрицателен резултат: изпитвано вещество, неправилно определено като даващо отрицателен резултат или неактивно посредством даден метод за изпитване, докато в действителност е веществото дава положителен резултат или е активно.
                     Вещество с фалшиво положителен резултат: изпитвано вещество, неправилно определено като даващо положителен резултат или активно при дадено изпитване, докато в действителност веществото дава отрицателен резултат или е неактивно.
                     Опасност: потенциалът за получаване на неблагоприятен за здравето или екологичен ефект. Неблагоприятният ефект се проявява само при достатъчно голяма степен на експозиция.
                     Междулабораторна възпроизводимост: мярка за степента, в която различни квалифицирани лаборатории, при използване на един и същи протокол и изпитване на едни и същи вещества, могат да получат качествено и количествено сходни резултати. Междулабораторната възпроизводимост се определя по време на процесите на предварително валидиране и валидиране и показва степента, в която изпитването може да бъде трансферирано успешно между лабораториите, също наричана възпроизводимост между лабораториите (14).
                     Вътрешнолабораторна възпроизводимост: определяне на степента, в която квалифицирани служители в рамките на една и съща лаборатория могат да възпроизведат успешно резултатите, като използват конкретен протокол в различни моменти. Също наричана възпроизводимост в рамките на лабораторията (14).
                     Вариантен метод за изпитване (me-too test): разговорен израз за метод за изпитване, който е структурно и функционално сходен с валидиран и приет референтен метод за изпитване. Такъв метод за изпитване би бил кандидат за последващо валидиране. Използва се взаимозаменяемо с термина „сходен метод за изпитване“ (14).
                     Отклоняваща се стойност: отклоняващата се стойност е наблюдение, което подчертано се различава от други стойности в произволно избрана извадка от популация.
                     Стандарти за ефективност (СЕ): стандарти въз основа на валидиран метод за изпитване, осигуряващи основа за оценка на сравнимостта на предложен метод за изпитване, който е по своя механизъм и функционално сходен с валидирания метод. Включват: i) съществени елементи на метода за изпитване; ii) минимален списък на референтните химикали, избрани измежду химикалите, които са били използвани за доказване на приемливата ефективност на валидирания метод за изпитване; и iii) сходните нива за точност и надеждност, въз основа на получените за валидирания метод за изпитване, които предложеният метод за изпитване следва да демонстрира при оценяването чрез използване на минималния списък на референтните химикали (14).
                     Патентован метод за изпитване: метод на изпитване, чието производство и дистрибуция са ограничени от патенти, авторски права, търговски марки и др.
                     Осигуряване на качеството: управленски процес, при който спазването на лабораторни стандарти за изпитване, изисквания и процедури за водене на дневници, както и точността на трансфера на данни се оценява от лица, които са независими от лицата, изпълняващи изпитването.
                     Референтни химикали: химикали, избрани за използване в процеса на валидиране, чиито реакции по отношение на системата за in vitro или in vivo референтни изпитвания или на представляващия интерес вид вече са известни. Тези химикали следва да бъдат представителни за класовете химикали, за които се очаква да бъде използван методът на изпитване, и следва да представляват пълният спектър от реакции, които може да се очакват от химикалите, за които може да бъде използван настоящият метод: силни, слаби и отрицателни реакции. Могат да се изискват различни набори от референтни химикали за отделните етапи на процеса на валидиране, както и за отделните методи за изпитване и приложения на изпитването (14).
                     Приложимост: описание на взаимовръзката между изпитването и ефекта, представляващ интерес, и дали тя е значима и полезна за определена цел. Това е степента, в която изпитването правилно измерва или прогнозира биологичния ефект, представляващ интерес. Приложимостта включва проучването на точността (съответствието) на метода за изпитване (14).
                     Надеждност: мярка за степента, в която даден метод за изпитване може да се извършва възпроизводимо в една и съща лаборатория и в различни лаборатории в течение на времето, при използване на един и същи протокол. Надеждността се оценява, като се изчислява вътрешно- и междулабораторната възпроизводимост (14).
                     Кожна сенсибилизация: имунологичен процес, който възниква, когато податлив индивид е локално изложен на химичен алерген с индуциращо действие, който предизвиква кожна имунна реакция, водеща до развиването на контактна сенсибилизация.
                     Стимулационен индекс (SI): стойност, изчислявана с цел оценка на потенциала на дадено изпитвано вещество да предизвиква кожна сенсибилизация, която представлява съотношението на пролиферацията в третираните групи спрямо тази в паралелната третирана с носителя контролна група.
                     Изпитвано вещество (също наричано „изпитван химикал“): всяко вещество или смес, изпитвано(а) чрез използването на настоящия метод за изпитване.
                     Валидиран метод за изпитване: метод за изпитване, за който са извършени изследвания за валидиране за определяне на приложимостта (включително на точността) и надеждността му за конкретна цел. Важно е да се отбележи, че един валидиран метод за изпитване може да не притежава достатъчно ефективност по отношение на точността и надеждността си, за да се счита за приложим за предлаганата цел (14).
                  “
            
                  2.
               
               
                  Глава Б.46 се заменя със следното:
                  „Б.46.   
                        IN VITRO КОЖНО ДРАЗНЕНЕ: МЕТОД ЗА ИЗПИТВАНЕ ВЪРХУ РЕКОНСТРУИРАН ЧОВЕШКИ ЕПИДЕРМИС
                  
                  ВЪВЕДЕНИЕ
                  
                              1.
                           
                           
                              Кожно дразнене означава предизвикване на обратимо увреждане на кожата вследствие на прилагането на изпитвано вещество за период от време до 4 часа [както е определено в Глобалната хармонизирана система за класифициране и етикетиране на химикали (GHS) на Организацията на обединените нации (ООН) и Регламент (ЕО) № 1272/2008 на Европейския парламент и на Съвета от 16 декември 2008 г. относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси (Регламент CLP) (1) (3)]. Настоящият метод за изпитване (МИ) съдържа in vitro процедура, която може да се използва за определянето на опасността от дразнещи химикали (вещества и смеси) в съответствие с категория 2 по GHS на ООН и Регламент CLP на ЕС (1) (2) (3). В ЕС и други региони, които не са приели незадължителната категория 3 по GHS на ООН (слаби дразнители), настоящият МИ може също така да се използва за определяне на некласифицирани химикали, т.е. без категория по GHS на ООН и Регламент CLP на ЕС (1) (3). Настоящият МИ може да се използва за определяне на дразнещия ефект на химикали върху кожата като напълно самостоятелно заместващо изпитване на in vivo изпитването за кожно дразнене в рамките на стратегия за поетапно изпитване (4) и глава Б.4 от настоящото приложение).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Оценката на кожното дразнене обикновено включва използването на опитни животни [Указание за изпитване 404 на ОИСР; глава Б.4 от настоящото приложение] (4). Метод Б.4 бе преработен през 2004 г. във връзка със съображенията за хуманно отношение към животните, което позволи определянето на корозивността/дразненето на кожата с прилагането на стратегия за поетапно изпитване, като се използват валидирани in vitro и ex vivo методи и по този начин се избягват болката и страданието на животните. Три валидирани метода за in vitro изпитване бяха приети като указания за изпитване 430, 431 и 435 на ОИСР (5) (6) (7) и два от тях като глави Б.40 и Б.40 bis от настоящото приложение, които следва да се използват за свързаната с корозивността част на стратегията за поетапно изпитване от метод Б.4 или Указание за изпитване 404 на ОИСР (4).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Предмет на настоящия МИ е кожното дразнене като опасност за човешкото здраве. Той се основава на реконструиран човешки епидермис (RhE), който поради цялостното си устройство (използването на човешки нетрансформирани епидермални кератиноцити като източник на клетки, както и на използването на представителна тъканна и клетъчна структура) силно наподобява биохимичните и физиологичните свойства на горните слоеве на човешката кожа, т.е. на епидермиса. Настоящият МИ също така включва набор от стандарти за ефективност (СЕ) (допълнение 2) за оценката на сходни и модифицирани методи за изпитване, основани на RhE и разработени от EC-ECVAM (8), в съответствие с принципите на Ръководство № 34 на ОИСР (9).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Съществуват три валидирани метода, които съответстват на разглеждания тук МИ. Бяха проведени изследвания преди валидирането, както и изследвания за оптимизирането и за валидирането на метод за in vitro изпитване (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20), предлаган на пазара като EpiSkinTM и използващ модел на реконструиран човешки епидермис (RhE) (определен като валидирания референтен метод — ВРМ). Други два предлагани на пазара методи RhE за in vitro изпитване за кожно дразнене са показали подобни резултати като ВРМ съгласно валидиране, основано на стандартите за ефективност (21), и това са методите EpiDermTM SIT (EPI-200) и SkinEthicTM RHE (22).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Преди предлаган сходен или модифициран метод RhE за in vitro изпитване, различен от ВРМ и методите EpiDermTM SIT (EPI-200) или SkinEthicTM RHE, да може да бъде използван за регулаторни цели, следва да се определят неговата надеждност, приложимост (точност) и ограничения за предложеното му използване, за да се гарантира, че той може да се счита за сходен с ВРМ, в съответствие със стандартите за ефективност, определени в настоящия МИ (допълнение 2). Освен това е препоръчително да се направи справка в Обяснителния справочен документ на ОИСР относно in vitro изпитването за кожно дразнене, преди разработването и валидирането на сходен или модифициран метод RhE за in vitro изпитване и представянето му за регулаторно приемане (23).
                           
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                  
                              6.
                           
                           
                              Използваните определения са дадени в допълнение 1.
                           
                        ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ
                  
                              7.
                           
                           
                              Едно ограничение на МИ, както бе демонстрирано чрез изследването за валидиране (16), се състои в това, че той не позволява класифицирането на химикали в незадължителната категория 3 по GHS на ООН (леки дразнители) (1). Когато се използва като частично заместващо изпитване, може да се изиска последващо in vivo изпитване, за да се характеризира напълно потенциалът за кожно дразнене (4 и глава Б.4 от настоящото приложение). Признава се, че използването на човешка кожа е предмет на национални и международни етични съображения и условия.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Предмет на настоящия МИ е in vitro изпитването за кожно дразнене като елемент от стратегията за поетапно изпитване на Б.4 (Указание за изпитване 404 на ОИСР) относно корозивност/дразнене на кожата (4). Докато настоящият МИ не предоставя адекватна информация за корозивността на кожата, следва да се отбележи, че методът за изпитване Б.40 bis (Указание за изпитване 431 на ОИСР) относно корозивността на кожата се основа на една и съща система за изпитване RhE, макар че се използва друг протокол (глава Б.40 bis). Настоящият метод се основава на моделите RhE, използващи човешки кератиноцити, като по този начин представя in vitro целевия орган на вида, представляващ интерес. Освен това той обхваща пряко първоначалния етап от каскадата на възпалението/механизмът на действие на възпалението (увреждане на клетки и тъкани, водещо до локализирана травма), която/който се появява по време на in vivo дразнене. По време на валидирането, което е залегнало в основата на настоящия МИ, беше изпитан широк кръг от химикали, като емпиричната база данни на изследването за валидиране наброяваше общо 58 химикала (16) (18) (23). Методът е приложим за твърди вещества, течности, полутвърди вещества и восъци. Течностите може да са на водна или друга основа; твърдите вещества може да са разтворими или неразтворими във вода. Където е възможно, твърдите вещества преди използването им следва да бъдат стрити на фин прах, като не се изисква никаква друга предварителна обработка на пробата. Газовете и аерозолите все още не са оценени с валидационно проучване (24). Въпреки че е възможно те да бъдат изпитвани чрез използване на технология RhE, настоящият МИ не дава възможност за изпитване на газове и аерозоли. Освен това следва да се отбележи, че силно оцветените химикали могат да окажат влияние на измерванията за жизнеспособността на клетките и е необходимо използването на адаптирани контроли за корекции (вж. точки 24—26).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Едно изпитване, включващо три тъканни репликата, би следвало да е достатъчно за изпитването на даден химикал, когато класификацията е недвусмислена. При все това при наличие на гранични резултати, каквито са несъответстващите измервания на репликати и/или средната жизнеспособност, изразена процентно като 50 ± 5 %, следва да се разгледа възможността за провеждане на второ изпитване, както и на трето изпитване в случай на наличие на несъответстващи резултати между първите две изпитвания.
                           
                        ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
                  
                              10.
                           
                           
                              Изпитваният химикал се прилага локално на триизмерен модел на реконструиран човешки епидермис (RhE), състоящ се от нетрансформирани човешки епидермални кератиноцити, които са култивирани да образуват многослоен, силно диференциран модел на човешкия епидермис. Той се състои от организиран базален, спинозен и грануларен слой, и от многослоенстратум корнеум, съдържащ междуклетъчни ламелни липидни слоеве, представляващи основните липидни класове, аналогични на тези, които се наблюдават in vivo.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Кожното дразнене, предизвикано от химикали, което се проявява с еритема и оток, е резултат от поредица от събития, започваща с проникване в роговия слой и увреждане на по-долните слоеве кератиноцити. Умиращите кератиноцити освобождават медиатори, които дават начало на каскадата на възпалението, действаща върху клетките в дермиса, по-специално върху стромалните и ендотелиалните клетки. Разширяването и повишената пропускливост на ендотелиалните клетки водят до получаването на наблюдаваните еритема и оток (24). Основаните на RhE методи измерват началните събития, настъпващи в рамките в каскадата.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Клетъчната жизнеспособност в моделите RhE се измерва чрез ензимно превръщане на виталния оцветител MTT [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиев бромид, тиазолил синьо; CAS номер 298-93-1] в синя формазанова сол, която се измерва количествено след екстракция от тъканите (25). Дразнещите химикали се определят по способността им да намаляват клетъчната жизнеспособност под определени прагови нива (т.е. ≤ 50 % за дразнители от категория 2 по GHS на ООН/Регламент CLP на ЕС). В зависимост от регулаторната рамка, в която се използват резултатите от настоящия МИ, химикалите, при които клетъчната жизнеспособност е над определеното прагово ниво, могат да се считат за химикали, които не са дразнители (т.е. > 50 %, „Без категория“).
                           
                        ДОКАЗВАНЕ НА КОМПЕТЕНТНОСТ
                  
                              13.
                           
                           
                              Преди рутинното използване на който и да било от трите валидирани метода, които се придържат към настоящия МИ, лабораториите следва да докажат техническа компетентност, като използват десетте референтни химикала, посочени в таблица 1. По отношение на сходни методи, разработени съгласно настоящия МИ, или изменения на някой от трите валидирани метода, следва да бъдат спазени изискванията на стандартите за ефективност, описани в допълнение 2 от настоящия МИ, преди методът да бъде използван за регулаторно изпитване.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Като част от процедурата за доказване на компетентност, е препоръчително след получаването на тъканите ползвателят да провери бариерните им свойства, както е посочено от производителя на модела на RhE. Това е особено важно, ако тъканите са били превозвани на дълго разстояние или в продължение на дълги периоди от време. След като един метод е успешно установен и е доказана компетентност по отношение на неговото използване, такава проверка няма да бъде рутинно необходима. Когато обаче методът се използва рутинно, се препоръчва да се продължи оценяването на бариерните свойства на редовни интервали.
                              
                                 Таблица 1
                              
                              
                                 Референтни химикали
                                  (8)
                              
                              
                                          Химикал
                                       
                                       
                                          CAS №
                                       
                                       
                                          Балова оценка in vivo
                                              (9)
                                          
                                       
                                       
                                          Агрегатно състояние
                                       
                                       
                                          Категория по GHS на ООН/ Регламент CLP на ЕС
                                       
                                    
                                          Нафтилоцетна киселина
                                       
                                       
                                          86-87-3
                                       
                                       
                                          0
                                       
                                       
                                          Твърдо
                                       
                                       
                                          Без категория
                                       
                                    
                                          Изопропанол
                                       
                                       
                                          67-63-0
                                       
                                       
                                          0,3
                                       
                                       
                                          Течно
                                       
                                       
                                          Без категория
                                       
                                    
                                          Метилов стеарат
                                       
                                       
                                          112-61-8
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          Твърдо
                                       
                                       
                                          Без категория
                                       
                                    
                                          Хептил бутират
                                       
                                       
                                          5870-93-9
                                       
                                       
                                          1,7
                                       
                                       
                                          Течно
                                       
                                       
                                          Без категория
                                          (Незадължителна категория 3) (10)
                                              (11)
                                          
                                       
                                    
                                          Хексил салицилат
                                       
                                       
                                          6259-76-3
                                       
                                       
                                          2
                                       
                                       
                                          Течно
                                       
                                       
                                          Без категория
                                          (Незадължителна категория 3) (10)
                                              (11)
                                          
                                       
                                    
                                          Цикламен алдехид
                                       
                                       
                                          103-95-7
                                       
                                       
                                          2,3
                                       
                                       
                                          Течно
                                       
                                       
                                          Категория 2
                                       
                                    
                                          1-бромхексан
                                       
                                       
                                          111-25-1
                                       
                                       
                                          2,7
                                       
                                       
                                          Течно
                                       
                                       
                                          Категория 2
                                       
                                    
                                          Калиев хидроксид (5 % воден разтвор)
                                       
                                       
                                          1310-58-3
                                       
                                       
                                          3
                                       
                                       
                                          Течно
                                       
                                       
                                          Категория 2
                                       
                                    
                                          1-метил-3-фенил-1-пиперазин
                                       
                                       
                                          5271-27-2
                                       
                                       
                                          3,3
                                       
                                       
                                          Твърдо
                                       
                                       
                                          Категория 2
                                       
                                    
                                          Хептанал
                                       
                                       
                                          111-71-7
                                       
                                       
                                          3,4
                                       
                                       
                                          Течно
                                       
                                       
                                          Категория 2
                                       
                                    
                        ПРОЦЕДУРА
                  
                              15.
                           
                           
                              По-долу са описани елементите и процедурите на метод RhE за оценка на кожно дразнене. Следва да бъде реконструиран модел на RhE, като той може да бъде изготвен на място или закупен от търговски източник. Налични са стандартни работни процедури (СРП) за методите EpiSkinTM, EpiDermTM SIT (EPI-200) и SkinEthicTM RHE (26) (27) (28). Изпитването следва да се провежда съгласно следните изисквания:
                           
                        
                     Елементи на метода за изпитване RhE
                  
                  
                     Общи условия
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              За реконструирането на епитела следва да се използват нетрансформирани човешки кератиноцити. Под функционалния рогов слой следва да има множество слоеве от жизнеспособни епителни клетки (базален, спинозен и грануларен слой). Роговият слой следва да бъде многослоен и да съдържа основния липиден профил, за да създаде функционална бариера, която е достатъчно здрава, за да устои на бързото проникване на цитотоксични химични маркери, например натриев додецил сулфат (SDS) или Triton X-100. Бариерната функция следва да бъде доказана и може да бъде оценена или чрез определяне на концентрацията, при която химичен маркер намалява жизнеспособността на тъканите с 50 % (IC50) след определено време на експозиция, или чрез определяне на времето на експозиция, необходимо за намаляване на жизнеспособността с 50 % (ET50) при прилагане на химичния маркер с определена фиксирана концентрация. Задържащите свойства на модела на RhE следва да предотвратяват преминаването на материал около роговия слой към жизнеспособната тъкан, което би довело до неадекватно моделиране на експозицията на кожата. Моделът на RhE следва да не е заразен с бактерии, вируси, микоплазма или гъбички.
                           
                        
                     Функционални условия
                  
                  Жизнеспособност
                  
                              17.
                           
                           
                              Използваното изпитване за определяне на величината на жизнеспособността е изпитването с MTT (25). Ползвателите на модела на RhE следва да гарантират, че всяка използвана партида от модела на RhE отговаря на определените критерии за отрицателната контрола (ОК). Оптичната плътност (ОП) на разтворителя, който се използва за екстракцията, сама по себе си следва да бъде достатъчно малка, т.е. ОП < 0.1. Разработчикът/доставчикът на модела на RhE определя интервал на приемливост (горна и долна граница) за стойностите на ОП на отрицателната контрола (при условията на метода за изпитване за кожно дразнене), като интервалите на приемливост за трите валидирани метода са дадени в таблица 2. Следва да се документира, че тъканите, третирани с ОК, са стабилни като култура (дават сходни измервания на жизнеспособността) за периода на продължителност на експозицията при изпитването.
                              
                                 Таблица 2
                              
                              
                                 Интервали на приемливост за стойностите на ОП на отрицателната контрола
                              
                              
                                           
                                       
                                       
                                          Долна граница на приемливост
                                       
                                       
                                          Горна граница на приемливост
                                       
                                    
                                          EpiSkinTM (SM)
                                       
                                       
                                          ≥ 0,6
                                       
                                       
                                          ≤ 1,5
                                       
                                    
                                          EpiDermTM SIT (EPI-200)
                                       
                                       
                                          ≥ 1,0
                                       
                                       
                                          ≤ 2,5
                                       
                                    
                                          SkinEthicTM RHE
                                       
                                       
                                          ≥ 1,2
                                       
                                       
                                          ≤ 2,5
                                       
                                    
                        Бариерна функция
                  
                              18.
                           
                           
                              
                                 Роговият слой и липидният му състав следва да бъдат достатъчни, за да устоят на бързото проникване на цитотоксични химични маркери, например SDS или Triton X-100, оценено с IC50 или ET50 (таблица 3).
                           
                        Морфология
                  
                              19.
                           
                           
                              Следва да бъде проведено хистологично изследване на модела на RhE, за да се докаже структура, подобна на човешки епидермис (включително на многослойния рогов слой).
                           
                        Възпроизводимост
                  
                              20.
                           
                           
                              Резултатите от положителните контролни химикали (ПК) и отрицателните контроли (ОК) на метода за изпитване следва да доказват възпроизводимост с течение на времето.
                           
                        Контрол на качеството (КК)
                  
                              21.
                           
                           
                              Разработчикът/доставчикът на модела на RhE следва да гарантира и докаже, че всяка използвана партида от модела на RhE отговаря на определени критерии за пускане в обращение на продукцията, сред които най-значими са тези за жизнеспособността (точка 17), бариерната функция (точка 18) и морфологията (точка 19). Тези данни следва да бъдат предоставени на ползвателите на метода, така че те да могат да включат тази информация в протокола от изпитването. Разработчикът/доставчикът на модела на RhE (или изследователят, ако се използва собствен модел) следва да определи интервал на приемливост (горна и долна граница) за IC50 или ET50. За надеждно прогнозиране на класификацията на дразненето могат да се приемат само резултати, получени с отговарящи на изискванията тъкани. Интервалите на приемливост за трите валидирани метода са дадени като пример в таблица 3.
                              
                                 Таблица 3
                              
                              
                                 Примери за критерии на контрол на качеството на партида за пускане в обращение
                              
                              
                                           
                                       
                                       
                                          Долна граница на приемливост
                                       
                                       
                                          Горна граница на приемливост
                                       
                                    
                                          EpiSkinTM (SM)
                                          (18-часово третиране с SDS) (26)
                                       
                                       
                                          IC50 = 1,0 mg/ml
                                       
                                       
                                          IC50 = 3,0 mg/ml
                                       
                                    
                                          EpiDermTM SIT (EPI-200)
                                          (1 % Triton X-100) (27)
                                       
                                       
                                          ET50 = 4,8 h
                                       
                                       
                                          ET50 = 8,7 h
                                       
                                    
                                          SkinEthicTM RHE
                                          (1 % Triton X-100) (28)
                                       
                                       
                                          ET50 = 4,0 h
                                       
                                       
                                          ET50 = 9,0 h
                                       
                                    
                        
                     Прилагане на изпитваните и контролните химикали
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              За всеки изпитван химикал и за контролите във всяко изпитване следва да се използват най-малко три репликата. За течни, както и за твърди вещества следва да се прилага достатъчно количество от изпитвания химикал за равномерното покриване на повърхността на епидермиса, като същевременно се избягва прилагането на изобилна доза, т.е. следва да се използват най-малко 25 μL/cm2 или 25 mg/cm2. Преди прилагането на твърдите вещества повърхността на епидермиса следва да се овлажни с дейонизирана или дестилирана вода, за да се подобри контакта между изпитвания химикал и повърхността на епидермиса. Когато е възможно, твърдите вещества следва да се изпитват под формата на фин прах. В края на периода на експозиция изпитваният химикал следва внимателно да се измие от повърхността на епидермиса с буферен воден разтвор или 0,9 % NaCl. В зависимост от това кой от трите валидирани метода на RhE се използва, периодът на експозиция варира между 15 и 60 минути, а температурата на инкубация — между 20 и 37 °C. Тези периоди на експозиция и температури са оптимизирани за всеки метод на RhE и представляват различните присъщи свойства на методите, за подробности вж. стандартните работни процедури (СРП) за методите (26) (27) (28).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              За да се докаже, че жизнеспособността (с ОК), бариерната функция и получената в резултат тъканна чувствителност (с ПК) на тъканите са в границите на определен от предишни изследвания интервал на приемливост, при всяко изпитване следва да се използват паралелни отрицателни (ОК) и положителни контроли (ПК). За положителна контрола е предложен 5 % воден разтвор на SDS. Като химикали за отрицателни контроли са предложени вода или буферен физиологичен разтвор с фосфат (PBS).
                           
                        
                     Измервания на клетъчната жизнеспособност
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Най-важният елемент на процедурата за изпитване е измерванията на жизнеспособността да не се провеждат веднага след експозицията на изпитваните химикали, а в чиста среда след достатъчно дълъг инкубационен период след третирането на промитите тъкани. Този период позволява както възстановяването от леките цитотоксични ефекти, така и появата на ясно изразени цитотоксични ефекти. По време на фазата на оптимизиране на изпитването (11) (12) (13) (14) (15) беше доказано, че оптималният период на инкубация след третирането е 42 часа.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Изпитването с MTT е валидиран количествен метод, който следва да се използва за измерване на клетъчната жизнеспособност съгласно настоящия МИ. Той е съвместим с използване в триизмерни тъканни модели. Кожната проба се поставя в разтвор на MTT с подходяща концентрация (например 0,3—1 mg/mL) за 3 часа. След това утаеният син формазанов продукт се извлича от тъканта с помощта на разтворител (например изопропанол, киселинен изопропанол), а концентрацията на формазан се измерва, като се определи ОП при 570 nm, използвайки ширина на филтърната дължина на вълната най-много ± 30 nm.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Оптичните свойства на изпитвания химикал или химичното му въздействие върху MTT могат да повлияят на изпитването, като доведат до погрешна оценка на жизнеспособността (защото изпитваният химикал може да предотврати, да предизвика или да промени оцветяването). Това може да се случи, ако определен изпитван химикал не бъде напълно отстранен от тъканта чрез промиване или когато проникне през епидермиса. Ако изпитваният химикал действа пряко върху MTT (редуктор на МТТ), ако е естествено оцветен или се оцветява по време на третиране на тъканта, следва да се използват допълнителни контроли, за да се открие и коригира въздействието на изпитвания химикал върху техниката за измерване на жизнеспособността. Подробно описание на това как да се коригира пряката редукция на MTT и въздействията на оцветителите е налично в СРП за трите валидирани метода (26) (27) (28).
                           
                        
                     Критерии за приемливост
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              За всеки модел, използващ валидни партиди на модели на RhE (вж. точка 21), тъканите, третирани с отрицателната контрола, следва да показват оптична плътност, отразяваща състоянието на тъканите, които са преминали през етапите по транспортиране и приемане, както и през всички процедури по протокола. Стойностите на оптичната плътност на контролите не трябва да са по-ниски от установените граници от предишни изпитвания. По подобен начин тъканите, третирани с положителната контрола, т.е. 5 % воден разтвор на SDS, следва да отразяват способността им да реагират на дразнещ химикал при условията на МИ (26) (27) (28). Следва да се определят съответни и подходящи критерии за оценка на вариабилността между тъканните репликати (например ако се използват стандартните отклонения (СО), те следва да бъдат в рамките на 1-странен интервал на толерантност от 95 %, изчислен на базата на данни от предишни изследвания; за СО на ВРМ < 18 %).
                           
                        
                     Интерпретация на резултатите и модел за прогнозиране
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Получените стойности за оптична плътност за всеки изпитван химикал могат да се използват за изчисляването на процентната жизнеспособност, нормализирана спрямо ОК, която е определена на 100 %. Граничната стойност за процента на клетъчната жизнеспособност, която разграничава дразнещите от некласифицираните изпитвани химикали, и статистическата(ите) процедура(и), използвана(и) за оценка на резултатите и определяне на дразнещите химикали, следва да бъдат ясно определени и документирани, както и доказано целесъобразни. Граничните стойности за прогнозиране на дразненето са дадени по-долу:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Изпитваният химикал се счита за дразнещ кожата в съответствие с категория 2 по GHS на ООН/Регламент CLP на ЕС, ако жизнеспособността на тъканта след експозиция и инкубация след третирането е по-малка или равна (≤) на 50 %.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          В зависимост от регулаторната рамка, в която се използват резултатите от настоящия МИ, изпитваният химикал може да се счита за недразнещ кожата в съответствие с категорията „Без категория“ по GHS на ООН/Регламент CLP на ЕС, ако жизнеспособността на тъканта след експозиция и инкубация след третирането е по-голяма (>) от 50 %.
                                       
                                    
                        ДАННИ И ДОКЛАДВАНЕ
                  
                     Данни
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              За всяко изпитване следва да се докладват в табличен вид данни от отделните тъканни репликати (например данни за стойностите на оптична плътност и изчисления процент на клетъчната жизнеспособност за всеки изпитван химикал, включително класифициране), включително данни от повторните опити, ако е целесъобразно. В допълнение следва да се докладват средните стойности ± стандартното отклонение за всяко изпитване. Наблюдаваните взаимодействия с реагента MTT и оцветените изпитвани химикали следва да се докладват за всеки изпитван химикал.
                           
                        
                     Протокол от изпитването
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Протоколът от изпитването следва да включва следната информация:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Изпитвани и контролни химикали:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      химично(и) наименование(я) като CAS наименование и номер и ЕС наименование и номер, ако са известни;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      чистота и състав на химикала (в тегловни проценти);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      физични/химични свойства, които имат отношение към провеждането на изпитването (напр. агрегатно състояние, устойчивост, летливост, pH и разтворимост във вода, ако са известни);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      обработка на изпитваните/контролните химикали преди изпитването, ако е приложимо (напр. нагряване, стриване);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      условия за съхранение.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Обосновка на използвания модел на RhE и протокол
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Условия на изпитване:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      използвана клетъчна система;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      пълна придружаваща информация за конкретния използван модел на RhE, включително качествените му показатели; това следва да включва, но не се ограничава до:
                                                      
                                                                  i)
                                                               
                                                               
                                                                  жизнеспособност;
                                                               
                                                            
                                                                  ii)
                                                               
                                                               
                                                                  бариерна функция;
                                                               
                                                            
                                                                  iii)
                                                               
                                                               
                                                                  морфология;
                                                               
                                                            
                                                                  iv)
                                                               
                                                               
                                                                  възпроизводимост и предсказуемост;
                                                               
                                                            
                                                                  v)
                                                               
                                                               
                                                                  контрол на качеството (КК) на модела;
                                                               
                                                            
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      подробна информация за използваната процедура на изпитване;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      използвани дози при изпитването, продължителност на експозицията и инкубационен период след третирането;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      описание на всякакви изменения на процедурата за изпитване;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      препратка към данни за модела от предишни изпитвания; това следва да включва, но не се ограничава до:
                                                      
                                                                  i)
                                                               
                                                               
                                                                  приемливост на данните за КК по отношение на партидни данни от предишни изпитвания;
                                                               
                                                            
                                                                  ii)
                                                               
                                                               
                                                                  приемливост на стойностите от положителните и отрицателните контроли по отношение на средните стойности и интервалите на положителните и отрицателните контроли;
                                                               
                                                            
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      описание на използваните критериите за оценка, включително обосновката за избора на граничната(ите) точка(и) за модела за прогнозиране;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      препратка към контролни данни от предишни изпитвания.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Резултати:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      таблично представяне на данните за отделните изпитвани химикали за всяко изпитване и всяко измерване на репликати;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      посочване на използваните контроли за преките редуктори на MTT и/или оцветяващите изпитвани химикали;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      описание на други наблюдавани ефекти.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Обсъждане на резултатите
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Заключение
                                          
                                       
                                    
                        ЛИТЕРАТУРА
                  
                              (1)
                           
                           
                              UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, UN New York and Geneva. На разположение на адрес: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html]
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              EC-ECVAM (2009), Statement on the „Performance under UN GHS of three in vitro assays for skin irritation testing and the adaptation of the Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards“, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 9 април 2009 г. На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Регламент (ЕО) № 1272/2008 на Европейския парламент и на Съвета от 16 декември 2008 г. относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси, за изменение и за отмяна на директиви 67/548/ЕИО и 1999/45/ЕО и за изменение на Регламент (ЕО) № 1907/2006. ОВ L 353, 31.12.2008 г., стр. 1.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals № 404, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              OECD (2004), In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals № 430, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              OECD (2004), In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD Guideline for the Testing of Chemicals № 431, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              OECD (2006), In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals № 435, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              EC-ECVAM (2009), Performance Standards for in vitro skin irritation test methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment № 34, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001), A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, Results and evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57-93.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in Vitro 16, 765–770.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests, ALTEX 21, 107–114.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests – An assessment of the performance of the optimised test, ATLA 33, 351-367.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. (2005), The in vitro acute skin irritation of chemicals: optimisation of the EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process, ATLA 33, 329-349.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irritation Task Force report 2, ATLA 30, 109-129.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test, ATLA 35, 559-601.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1-α. На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 603-619.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007), In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy - Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 351-358.
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of in vitro tests for skin irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 април 2007 г. На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation testing. На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of in vitro tests for skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC29), 5 ноември 2008 г. На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
                           
                        
                              (23)
                           
                           
                              OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test Guideline on in vitro skin irritation testing. OECD Series on Testing and Assessment, № 137, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/document/24/0,3746,en_2649_34377_47858904_1_1_1_1,00.html]
                           
                        
                              (24)
                           
                           
                              Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004), In vitro skin irritation: fact and future. State of the art review of mechanisms and models, Toxicol. in Vitro 18, 231-243.
                           
                        
                              (25)
                           
                           
                              Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods 65, 55-63.
                           
                        
                              (26)
                           
                           
                              EpiSkinTM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation Validation Study: Validation of the EpiSkinTM test method 15 min - 42 hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
                           
                        
                              (27)
                           
                           
                              EpiDermTM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for: In vitro EpiDermTM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corporation’s reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
                           
                        
                              (28)
                           
                           
                              SkinEthicTM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irritation test-42а test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
                           
                        
                              (29)
                           
                           
                              Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, стр. 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc Graw-Hill, New York.
                           
                        
                              (30)
                           
                           
                              Директива 2001/59/ЕО на Комисията от 6 август 2001 г. относно двадесет и осмо адаптиране към техническия прогрес на Директива 67/548/ЕИО на Съвета за сближаването на законовите, подзаконовите и административните разпоредби относно класификацията, опаковането и етикетирането на опасни вещества, ОВ L 225, 21.8.2001 г., стр. 1.
                           
                        
                              (31)
                           
                           
                              Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Contact Dermatitis 51, 1-4.
                           
                        
                              (32)
                           
                           
                              Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irritation and photo-irritation patch test data with cellular in vitro assays and animal in vivo data, ALTEX, 14, 359-365.
                           
                        
                              (33)
                           
                           
                              Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch test data with in vitro skin irritation assays and animal data, Contact Dermatitis, 62, 109-116.
                           
                        
                     Допълнение 1
                     
                        Определения
                     
                     Точност: степента на близост на съвпадение на резултатите от метода за изпитване и приетите референтни стойности. Това е мярка за ефективността на метода за изпитване и един от аспектите на неговата приложимост. Терминът често се използва взаимозаменяемо с термина „съвпадение“, за да се обозначи делът на верните резултати на даден метод за изпитване (9).
                     Клетъчна жизнеспособност: параметър, измерващ общата активност на клетъчната популация, например като способност на клетъчните митохондриални дехидрогенази да намаляват постъпването на виталния оцветител MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиев бромид, тиазолил синьо) в клетките, което, в зависимост от измерената крайна точка и използваната процедура на изпитване, корелира с общия брой и/или с виталността на живите клетки.
                     Съответствие: това е мярка за ефективността на метод за изпитване, използвана за методи за изпитване, които предоставят категоричен резултат, и е един от аспектите на приложимостта. Терминът често се използва взаимозаменяемо с термина „точност“ и се определя като делът на всички изпитвани химикали, които са правилно класифицирани като положителни или отрицателни (9).
                     ET50: може да се оцени чрез определяне на времето на експозиция, необходимо за намаляване на клетъчната жизнеспособността с 50 % при прилагане на химичния маркер с определена фиксирана концентрация, вж. също IC50.
                     Регламент CLP на ЕС (Регламент (ЕО) № 1272/2008 на Европейския парламент и на Съвета от 16 декември 2008 г. относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси): въвежда в законодателството на Европейския съюз (ЕС) системата GHS на ООН за класифицирането и етикетирането на химикали (вещества и смеси) (3).
                     GHS (Глобална хармонизирана система за класифициране и етикетиране на химикали на Организацията на обединените нации (ООН): система, предлагаща класифициране на химикали (вещества и смеси) според стандартизирани видове и степени на физическа, здравна и екологична опасност и разглеждаща съответни съобщителни елементи, като например пиктограми, сигнални думи, предупреждения за опасност, препоръки за безопасност и информационни листове за безопасност, така че те да съобщават информация за тяхното неблагоприятно въздействие с оглед защита на хората (включително работодатели, работещи, служители в транспорта, потребители и аварийни служители) и на околната среда (1).
                     IC50: може да се оцени чрез определяне на концентрацията на химичния маркер, при която жизнеспособността на тъканите се намалява с 50 % (IC50) след фиксирано време на експозиция, вж. също ET50.
                     Изобилна доза: количество от изпитвания химикал, приложено върху епидермиса, което надхвърля количеството, необходимо за пълно и равномерно покриване на повърхността на епидермиса.
                     Вариантен метод за изпитване (me-too test): разговорен израз за метод за изпитване, който е структурно и функционално сходен с валидиран и приет референтен метод за изпитване. Такъв метод за изпитване би могъл да подлежи на последващо валидиране. Използва се взаимозаменяемо с термина „сходен метод за изпитване“ (9).
                     Стандарти за ефективност (СЕ): стандарти въз основа на валидиран метод за изпитване, осигуряващи основата за оценка на сравнимостта на предложен метод за изпитване, който е по своя механизъм и функционално сходен с валидирания метод. Включени са: i) съществени елементи на метода за изпитване; ii) минимален списък на референтните химикали, избрани измежду химикалите, които са били използвани за доказване на приемливата ефективност на валидирания метод за изпитване; и iii) сходните нива за точност и надеждност въз основа на получените за валидирания метод за изпитване, които предложеният метод за изпитване следва да демонстрира при оценяването чрез използване на минималния списък на референтните химикали (9).
                     Референтни химикали: химикали, избрани за използване в процеса на валидиране, чиито реакции по отношение на системата за in vitro или in vivo референтни изпитвания или на представляващия интерес вид вече са известни. Тези химикали следва да бъдат представителни на класовете химикали, за които се очаква да бъде използван методът на изпитване, и следва да представляват пълния спектър от реакции, които може да се очакват от химикалите, за които може да бъде използван настоящият метод: силни, слаби и отрицателни реакции. Могат да се изискват различни набори от референтни химикали за отделните етапи на процеса на валидиране, както и за отделните методи за изпитване и отделните приложения на изпитването (9).
                     Приложимост: описание на взаимовръзката между изпитването и ефекта, представляващ интерес, и дали тя е значима и полезна за определена цел. Това е степента, в която изпитването правилно измерва или прогнозира биологичния ефект, представляващ интерес. Приложимостта включва разглеждането на точността (съответствието) на метода за изпитване (9).
                     Надеждност: мярка за степента, в която даден метод за изпитване може да се извърши възпроизводимо в една и съща лаборатория и между различни лаборатории в течение на времето, когато се използва един и същи протокол. Надеждността се оценява, като се изчислява вътрешно- и междулабораторната възпроизводимост (9).
                     Заместващо изпитване: изпитване, предназначено да замести изпитване, което се използва рутинно и е прието за определяне на опасността и/или оценка на риска, и за което е установено, че предоставя равностойна или по-добра защита на здравето на хората или животните или на околната среда, според приложимото, в сравнение с приетото изпитване за всички възможни изпитвани ситуации и химикали (9).
                     Чувствителност: делът на всички положителни/активни изпитвани химикали, които са класифицирани правилно чрез изпитването. Това е мярка за точността на метода за изпитване, която предоставя категорични резултати и е важен фактор при оценката на приложимостта на метода за изпитване (9).
                     Кожно дразнене: предизвикването на обратимо увреждане на кожата вследствие на прилагането на изпитван химикал за период от време до 4 часа. Кожното дразнене е локално възникваща, неимуногенна реакция, която се появява скоро след третирането (29). Главната му характеристика е обратимият му характер, който включва възпалителни реакции и повечето от характерните клинични признаци на дразнене (еритема, оток, сърбеж и болка), свързани с възпалителен процес.
                     Специфичност: делът на всички негативни/неактивни изпитвани химикали, които са класифицирани правилно чрез изпитването. Това е мярка за точността на метода за изпитване, която предоставя категорични резултати и е важен фактор при оценката на приложимостта на метода за изпитване (9).
                     Стратегия за поетапно изпитване: изпитване, при което методите за изпитване се използват поетапно; избраните методи за изпитване във всеки следващ етап се определят въз основа на резултатите от предходния етап на изпитване (9).
                     Изпитван химикал (също наричан изпитвано вещество): всяко вещество или смес, изпитвано(а) чрез използването на настоящия метод за изпитване.
                  
                  
                     Допълнение 2
                     
                        Стандарти за ефективност за оценка на предложени сходни или модифицирани методи за in vitro изпитване за кожно дразнене върху реконструиран човешки епидермис (RhE)
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Целта на стандартите за ефективност (СЕ) е да се съобщят основанията, въз основа на които новите методи, както патентованите (т.е. защитените от авторско право, официално регистрираните с търговска марка, регистрираните), така и непатентованите, могат да бъдат определени като достатъчно точни и надеждни за целите на конкретни изпитвания. Тези СЕ, основани на валидирани и приети методи, могат да бъдат използвани за оценяване на надеждността и точността на други аналогични методи (разговорно наричани „варианти аз също“ на тестовете), които се основават на сходни научни принципи и които измерват или прогнозират същия биологичен или токсичен ефект (9).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Преди приемане на модифицираните методи, т.е. предложени потенциални подобрения на одобрен метод, следва да бъде извършена оценка за определяне на ефекта на предложените изменения върху ефективността на изпитването и степента, до която тези изменения засягат наличната информация за другите елементи на процеса на валидиране. В зависимост от броя и естеството на предложените изменения, генерираните данни и придружаващата документация за тези изменения, те следва или да бъдат предмет на същия процес на валидиране, който е описан за ново изпитване, или, ако е приложимо, на ограничена оценка на надеждността и приложимостта чрез използване на приети СЕ (9).
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Следва да бъдат оценени сходните (вариантни) методи или модификации на всеки от трите валидирани метода [EpiSkinTM (валидирания референтен метод — ВРМ), EpiDermTM SIT (EPI-200) и SkinEthicTM RHE], предложени за използване съгласно настоящия метод за изпитване (МИ), за да се определят надеждността и точността им, като се използват химикали, които са представителни за пълната скала на Draize за силата на дразнене. Когато оценката се извършва с използването на 20-те препоръчителни референтни химикала на СЕ (таблица 1), предложените сходни или модифицирани методи следва да имат стойности на надеждност и точност, сравними с тези, получени при валидирания референтен метод (таблица 2) (2) (16). Стойностите на надеждност и точност, които следва да бъдат достигнати, са представени в точки 8—12 от настоящото допълнение. Включени са некласифицирани (без категория по GHS на ООН/Регламент CLP на ЕС) и класифицирани (категория 2 по GHS на ООН/Регламент CLP на ЕС) химикали (1), представляващи различни химични класове, така че надеждността и точността (чувствителността, специфичността и цялостната точност) на предложения метод да могат да бъдат сравнени с тези на валидирания референтен метод. Надеждността на метода, както и неговата способност правилно да идентифицира дразнещи химикали от категория 2 по GHS на ООН/Регламент CLP на ЕС и в зависимост от регулаторната рамка, за която се генерират данните, също и способността му правилно да идентифицира химикали, които са без категория по GHS на ООН/Регламент CLP на ЕС, следва да бъдат определени преди използването му за изпитване на нови изпитвани химикали.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Тези СЕ са основани на СЕ на EC-ECVAM (8) и са актуализирани в съответствие със системите за класифициране и етикетиране GHS на ООН и Регламент CLP на ЕС (1) (3). Първоначалните СЕ бяха определени след завършването на изследването за валидиране (21) и бяха основани на системата за класификация на ЕС, определена в Директива 2001/59/ЕО на Комисията от 6 август 2001 г. относно двадесет и осмо адаптиране към техническия прогрес на Директива 67/548/ЕИО на Съвета за сближаването на законовите, подзаконовите и административните разпоредби относно класификацията, опаковането и етикетирането на опасни вещества (12). СЕ бяха актуализирани поради приемането на системата за класифициране и етикетиране GHS на ООН в законодателството на ЕС (Регламент CLP на ЕС) (3), което бе осъществено в периода между приключването на изследването за валидиране и завършването на настоящия МИ (8). Това актуализиране се отнася предимно до промени: i) в набора от референтните химикали на СЕ; и ii) определените стойности на надеждност и точност (2) (23).
                              
                           СТАНДАРТИ ЗА ЕФЕКТИВНОСТ ЗА МЕТОДИ ЗА IN VITRO ИЗПИТВАНЕ ЗА КОЖНО ДРАЗНЕНЕ ВЪРХУ РЕКОНСТРУИРАН ЧОВЕШКИ ЕПИДЕРМИС (RHE)
                     
                                 5.
                              
                              
                                 СЕ се състоят от следните три елемента (9):
                                 
                                             I)
                                          
                                          
                                             Съществени елементи на метода за изпитване;
                                          
                                       
                                             II)
                                          
                                          
                                             Минимален списък на референтните химикали;
                                          
                                       
                                             III)
                                          
                                          
                                             Определени стойности на надеждност и точност.
                                          
                                       
                           I)   Съществени елементи на метода за изпитване
                     
                     
                                 6.
                              
                              
                                 Те се състоят от съществени структурни, функционални и процедурни елементи на валидиран метод, които следва да бъдат включени в протокола на предложен сходен по своя механизъм и функционално сходен или модифициран метод. Тези елементи включват уникални характеристики на метода, процедурни подробности от решаващо значение и мерки за контрол на качеството. Придържането към съществените елементи на метода за изпитване ще спомогне да се гарантира, че предложен сходен или модифициран метод се основава на същите концепции като съответния валидиран референтен метод — ВРМ (9). Съществените елементи на метода за изпитване са подробно описани в точки 16—21 на МИ и изпитването следва да бъде проведено съгласно следните условия:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             общите условия (точка 16);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             функционалните условия, които включват:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         жизнеспособност (точка 17);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         бариерна функция (точка 18);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         морфология (точка 19);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         възпроизводимост (точка 20); както и
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         контрол на качеството (точка 21).
                                                      
                                                   
                                       
                           II)   Минимален списък на референтните химикали
                     
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Референтните химикали се използват, за да се определи дали надеждността и точността на предложен сходен или модифициран метод, за който е доказано, че е достатъчно структурно и функционално сходен с валидирания референтен метод (ВРМ), или който представлява незначително изменение на някой от трите валидирани метода, са сравними със или по-добри от тези на ВРМ (2) (8) (16) (23). 20-те препоръчителни референтни химикала, посочени в таблица 1, включват химикали, представляващи различни химични класове (т.е. химични категории, основани на функционалните групи), и са представителни за пълната скала на Draize за силата на дразнене (от недразнител до силен дразнител). Включените в този списък химикали включват 10 химикала от категория 2 по GHS на ООН/Регламент CLP на ЕС и 10 некатегоризирани химикала, от които 3 химикала са от незадължителната категория 3 по GHS на ООН. Съгласно разглеждания тук метод за изпитване класифицирането в незадължителната категория 3 се счита за класифициране без категория. Химикалите, посочени в таблица 1, са избрани измежду химикалите, използвани във фазата на оптимизиране, следваща фазата преди валидирането, и в изследването за валидиране на ВРМ, по отношение на химичната функционалност и агрегатното състояние (14) (18). Тези референтни химикали представляват минималния брой химикали, които следва да бъдат използвани за оценка на точността и надеждността на предложен сходен или модифициран метод, но не са предназначени да бъдат използвани при разработването на нови методи. Когато даден химикал от списъка не е на разположение, биха могли да се използват други химикали, за които са налице подходящи in vivo референтни данни, предимно химикали измежду тези, използвани във фазата на оптимизиране, следваща фазата преди валидирането, и в изследването за валидиране на ВРМ. При желание към минималния списък на референтните химикали могат да бъдат прибавени допълнителни химикали, които представляват други химични класове и за които са налице подходящи in vivo референтни данни, с цел допълнителна оценка на точността на предложения метод.
                                 
                                    Таблица 1
                                 
                                 
                                    Минимален списък на референтните химикали за определяне на стойностите на точност и надеждност за сходни или модифицирани методи на RhE за кожно дразнене
                                     (13)
                                 
                                 
                                             Химикал
                                          
                                          
                                             CAS номер
                                          
                                          
                                             Агрегатно състояние
                                          
                                          
                                             Балова оценка in vivo
                                             
                                          
                                          
                                             ВРМ in vitro категория
                                          
                                          
                                             
                                                In vivo категория по GHS на ООН/Регламент CLP на ЕС
                                          
                                       
                                             1-бромо-4-хлорбутан
                                          
                                          
                                             6940-78-9
                                          
                                          
                                             Течно
                                          
                                          
                                             0
                                          
                                          
                                             Категория 2
                                          
                                          
                                             Без категория
                                          
                                       
                                             Диетил фталат
                                          
                                          
                                             84-66-2
                                          
                                          
                                             Течно
                                          
                                          
                                             0
                                          
                                          
                                             Без категория
                                          
                                          
                                             Без категория
                                          
                                       
                                             Нафтилоцетна киселина
                                          
                                          
                                             86-87-3
                                          
                                          
                                             Твърдо
                                          
                                          
                                             0
                                          
                                          
                                             Без категория
                                          
                                          
                                             Без категория
                                          
                                       
                                             Алил феноксиацетат
                                          
                                          
                                             7493-74-5
                                          
                                          
                                             Течно
                                          
                                          
                                             0,3
                                          
                                          
                                             Без категория
                                          
                                          
                                             Без категория
                                          
                                       
                                             Изопропанол
                                          
                                          
                                             67-63-0
                                          
                                          
                                             Течно
                                          
                                          
                                             0,3
                                          
                                          
                                             Без категория
                                          
                                          
                                             Без категория
                                          
                                       
                                             4-метил-тио-бензалдехид
                                          
                                          
                                             3446-89-7
                                          
                                          
                                             Течно
                                          
                                          
                                             1
                                          
                                          
                                             Категория 2
                                          
                                          
                                             Без категория
                                          
                                       
                                             Метилов стеарат
                                          
                                          
                                             112-61-8
                                          
                                          
                                             Твърдо
                                          
                                          
                                             1
                                          
                                          
                                             Без категория
                                          
                                          
                                             Без категория
                                          
                                       
                                             Хептил бутират
                                          
                                          
                                             5870-93-9
                                          
                                          
                                             Течно
                                          
                                          
                                             1,7
                                          
                                          
                                             Без категория
                                          
                                          
                                             Без категория
                                          
                                       
                                             Хексил салицилат
                                          
                                          
                                             6259-76-3
                                          
                                          
                                             Течно
                                          
                                          
                                             2
                                          
                                          
                                             Без категория
                                          
                                          
                                             Без категория
                                          
                                       
                                             Канелен алдехид
                                          
                                          
                                             104-55-2
                                          
                                          
                                             Течно
                                          
                                          
                                             2
                                          
                                          
                                             Категория 2
                                          
                                          
                                             Без категория
                                             
                                                (Незадължителна категория 3)
                                                 (15)
                                             
                                          
                                       
                                             
                                                1-деканол
                                                 (14)
                                             
                                          
                                          
                                             
                                                112-30-1
                                             
                                          
                                          
                                             
                                                Течно
                                             
                                          
                                          
                                             
                                                2,3
                                             
                                          
                                          
                                             
                                                Категория 2
                                             
                                          
                                          
                                             
                                                Категория 2
                                             
                                          
                                       
                                             Цикламен алдехид
                                          
                                          
                                             103-95-7
                                          
                                          
                                             Течно
                                          
                                          
                                             2,3
                                          
                                          
                                             Категория 2
                                          
                                          
                                             Категория 2
                                          
                                       
                                             1-бромхексан
                                          
                                          
                                             111-25-1
                                          
                                          
                                             Течно
                                          
                                          
                                             2,7
                                          
                                          
                                             Категория 2
                                          
                                          
                                             Категория 2
                                          
                                       
                                             2-хлорометил-3,5-диметил-4-метоксипиридин хидрохлорид
                                          
                                          
                                             86604-75-3
                                          
                                          
                                             Твърдо
                                          
                                          
                                             2,7
                                          
                                          
                                             Категория 2
                                          
                                          
                                             Категория 2
                                          
                                       
                                             
                                                Ди-н-пропил дисулфид
                                                 (14)
                                             
                                          
                                          
                                             
                                                629-19-6
                                             
                                          
                                          
                                             
                                                Течно
                                             
                                          
                                          
                                             
                                                3
                                             
                                          
                                          
                                             
                                                Без категория
                                             
                                          
                                          
                                             
                                                Категория 2
                                             
                                          
                                       
                                             Калиев хидроксид (5 % воден разтвор)
                                          
                                          
                                             1310-58-3
                                          
                                          
                                             Течно
                                          
                                          
                                             3
                                          
                                          
                                             Категория 2
                                          
                                          
                                             Категория 2
                                          
                                       
                                             Бензенетиол, 5-(1,1-диметилетил)-2-метил
                                          
                                          
                                             7340-90-1
                                          
                                          
                                             Течно
                                          
                                          
                                             3,3
                                          
                                          
                                             Категория 2
                                          
                                          
                                             Категория 2
                                          
                                       
                                             1-метил-3-фенил-1-пиперазин
                                          
                                          
                                             5271-27-2
                                          
                                          
                                             Твърдо
                                          
                                          
                                             3,3
                                          
                                          
                                             Категория 2
                                          
                                          
                                             Категория 2
                                          
                                       
                                             Хептанал
                                          
                                          
                                             111-71-7
                                          
                                          
                                             Течно
                                          
                                          
                                             3,4
                                          
                                          
                                             Категория 2
                                          
                                          
                                             Категория 2
                                          
                                       
                                             Тетрахлоретилен
                                          
                                          
                                             127-18-4
                                          
                                          
                                             Течно
                                          
                                          
                                             4
                                          
                                          
                                             Категория 2
                                          
                                          
                                             Категория 2
                                          
                                       
                           III)   Определени стойности на надеждност и точност
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 За целите на определяне на надеждността и приложимостта на предложените сходни или модифицирани методи, които подлежат на трансфериране между лабораториите, съответни тестове с използването на всичките 20 референтни химикала, посочени в таблица 1, следва да бъдат проведени в поне три лаборатории. При все това, ако предложеният метод ще бъде използван само в една лаборатория, за целите на валидирането няма да бъде изисквано изпитване в много лаборатории. От съществено значение е обаче тези изследвания за валидиране да бъдат независимо оценявани от международно признати валидационни органи съгласно международните указания (9). Всички 20 референтни химикала следва да бъдат изпитвани в рамките на три независими изпитвания във всяка лаборатория, извършвани с различни партиди на тъкани и на достатъчни големи интервали от време. Всяко изпитване следва да се състои от минимум три едновременно изпитвани тъканни репликата за всеки включен изпитван химикал, отрицателни контроли (ОК) и положителни контроли (ПК).
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Изчисляването на стойностите на надеждността и точността на предложения метод следва да се извърши при едновременно отчитане на всички четири критерия, посочени по-долу, като се гарантира, че стойностите за надеждност и приложимост са изчислени по предварително определен и последователен начин.
                                 
                                             1.
                                          
                                          
                                             Само данните от провеждането на пълни цикли на изпитвания отговарят на критериите за изчисляване на вътрешно- и междулабораторната вариабилност и прогнозния капацитет (точността) на метода.
                                          
                                       
                                             2.
                                          
                                          
                                             Окончателната класификация на всеки референтен химикал във всяка участваща лаборатория следва да бъде получена, като се използва средната стойност на жизнеспособността по време на отделно проведените изпитвания от един пълен цикъл от изпитвания.
                                          
                                       
                                             3.
                                          
                                          
                                             Само данните, получени за химикали, с които са проведени пълни цикли от изпитвания във всички участващи лаборатории, отговарят на критериите за изчисляване на междулабораторната вариабилност на метода.
                                          
                                       
                                             4.
                                          
                                          
                                             Изчисляването на стойностите на точност следва да бъде извършено въз основа на прогнозите на отделни лаборатории, получени за 20-те референтни химикала от различните участващи лаборатории.
                                          
                                       В този контекст един цикъл от изпитвания се състои от три независими изпитвания, извършени от една лаборатория за един изпитван химикал. Пълен цикъл от изпитвания представлява цикъл от изпитвания, извършвани от една лаборатория за един изпитван химикал, когато всички три изпитвания са валидни. Това означава, че всяко отделно невалидно изпитване прави невалиден целия цикъл от изпитвания, състоящ се от три изпитвания.
                              
                           
                        Вътрешнолабораторна възпроизводимост
                     
                     
                                 10.
                              
                              
                                 Оценката на вътрешнолабораторната възпроизводимост следва да показва съответствие на класификациите (категория 2 и без категория по GHS на ООН/Регламент CLP на ЕС), получени при различни, независимо проведени изпитвания на 20-те референтни химикала в рамките на една лаборатория, равно на или по-голямо (≥) от 90 %.
                              
                           
                        Междулабораторна възпроизводимост
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Оценката на междулабораторната възпроизводимост не е от съществено значение, ако предложеният метод за изпитване се използва единствено в една лаборатория. За методи, които подлежат на трансфериране между лаборатории, съответствието на класификациите (категория 2 и без категория по GHS на ООН/Регламент CLP на ЕС), получени при различни, независимо проведени изпитвания на 20-те референтни химикала препоръчително между най-малко три лаборатории, следва да бъде равно на или по-голямо (≥) от 80 %.
                              
                           
                        Прогнозен капацитет (точност)
                     
                     
                                 12.
                              
                              
                                 Точността (чувствителността, специфичността и цялостната точност) на предложения сходен или модифициран метод следва да бъде сравнима с или по-добра от тази на ВРМ, като се взима предвид допълнителната информация, свързана с приложимостта при видовете, представляващи интерес (таблица 2). Чувствителността следва да бъде равна на или по-голяма (≥) от 80 % (2) (8) (23). При все това по отношение на чувствителността на предложения метод in vitro е валидно допълнително ограничение на специфичността, съгласно което само два химикала от категория 2 по класификация in vivo, 1-деканол и ди-н-пропил дисулфид, могат да бъдат класифицирани неправилно като химикали без категория от повече от една участваща лаборатория. Специфичността следва да бъде равна на или по-голяма (≥) от 70 % (2) (8) (23). Не е налице последващо ограничение по отношение на специфичността на предложения метод in vitro, т.е. всяка една участваща лаборатория може да класифицира неправилно който и да било химикал без категория по класификация in vivo, при условие че окончателната специфичност на метода за изпитване попада в рамките на приемливия интервал. Цялостната точност следва да бъде равна на или по-голяма (≥) от 75 % (2) (8) (23). Въпреки че чувствителността на ВРМ, изчислена за 20-те референтни химикала, посочени в таблица 1, е равна на 90 %, определената минимална стойност на чувствителността, изисквана за всеки сходен или модифициран метод, за да бъде счетен за валиден, е определена на 80 %, тъй като както 1-деканол (химикал с гранични резултати), така и ди-н-пропил дисулфид (химикал с погрешно отрицателни резултати при ВРМ) са известни като непредизвикващи дразнене при хората (31) (32) (33), въпреки че се идентифицират като дразнители при изпитването върху зайци. Тъй като моделите на RhE се основават на клетки от човешки произход, те могат да предвидят, че тези химикали не предизвикат дразнене (без категория по GHS на ООН/Регламент CLP на ЕС).
                                 
                                    Таблица 2
                                 
                                 
                                    Изисквани прогнозни стойности за чувствителност, специфичност и цялостна точност за всеки сходен или модифициран метод, за да бъде счетен за валиден
                                 
                                 
                                             Чувствителност
                                          
                                          
                                             Специфичност
                                          
                                          
                                             Цялостна точност
                                          
                                       
                                             ≥ 80 %
                                          
                                          
                                             ≥ 70 %
                                          
                                          
                                             ≥ 75 %
                                          
                                       
                           
                        Критерии за приемане на изпитването
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Възможно е едно или няколко изпитвания, свързани с един или повече изпитвани химикала, да не отговаря(т) на критериите за приемане на изпитването за изпитваните и контролните химикали или да не е/са приемливо(и) по други причини. За допълване на липсващите данни е допустимо извършването на максимум две допълнителни изпитвания за всеки изпитван химикал („повторно изпитване“). По-точно, тъй като в случая на повторно изпитване трябва да бъдат едновременно изпитвани и ПК, и ОК, за всеки изпитван химикал могат да бъдат извършени максимум две допълнителни изпитвания.
                              
                           
                                 14.
                              
                              
                                 Възможно е дори след повторно изпитване минималният брой от три валидни изпитвания, изискван за всеки изпитван химикал, да не бъде получен за всеки референтен химикал във всяка участваща лаборатория, което води до матрица с непълни данни. В такива случаи следва да бъдат изпълнени едновременно следните три критерия, за да бъдат счетени наборите от данни за приемливи:
                                 
                                             1.
                                          
                                          
                                             Всички 20 референтни химикала следва да преминат през поне един пълен цикъл от изпитвания.
                                          
                                       
                                             2.
                                          
                                          
                                             Във всяка от поне три участващи лаборатории е необходимо минимум 85 % от циклите от изпитвания да бъдат пълни (за 20 химикала; т.е. позволени са 3 невалидни цикъла от изпитвания в една лаборатория).
                                          
                                       
                                             3.
                                          
                                          
                                             Минимум 90 % от всички възможни цикли от изпитвания от поне три лаборатории е необходимо да бъдат пълни (за 20 химикала, изпитвани в три лаборатории; т.е. позволени са общо 6 невалидни цикъла от изпитвания).
                                          
                                       
                           “
            
                  3.
               
               
                  Добавят се следните глави:
                  „Б.49.   ИЗПИТВАНЕ IN VITRO ЗА МИКРОЯДРА НА КЛЕТКИ ОТ БОЗАЙНИЦИ
                  
                  ВЪВЕДЕНИЕ
                  
                              1.
                           
                           
                              Изпитването in vitro за микроядра (MNvit) представлява изпитване за генотоксичност за откриване на микроядра (МЯ) в цитоплазмата на интерфазни клетки. Микроядрата могат да произлизат от ацентрични хромозомни фрагменти (т.е. с липсващ центромер) или от цели хромозоми, които не са в състояние да се придвижат към полюсите по време на анафазния стадий на клетъчно делене. Изпитването открива активността на кластогенните и анеугенните химикали (вещества и смеси) (1) (2) в клетки, които са преминали през клетъчно делене по време на и след експозиция на изпитваното вещество. Настоящият метод за изпитване (МИ) позволява използването на протоколи със и без инхибитор на полимеризацията на актина — цитохалазин Б (цитоБ). Добавянето на цитоБ преди целевата митоза дава възможност за идентификация и селективен анализ на честотата на микроядра в клетките, които са преминали през една митоза, тъй като тези клетки са двуядрени (3) (4). Настоящият МИ позволява използването на протоколи без блокиране на цитокинезата, при условие че са налице доказателства за това, че анализираната популация на клетки е преминала през митоза.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              В допълнение към използването на изпитването MNvit за идентифициране на химикали (вещества и смеси), които индуцират микроядра, използването на блокиране на цитокинезата, имунохимично маркиране на кинетохорите или хибридизация с центромерни/теломерни проби (флуоресцентна in situ хибридизация (FISH) също може да предостави информация относно механизмите на увреждане на хромозомите и образуване на микроядра (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Процедурите на маркиране и хибридизация могат да бъдат използвани, когато е налице увеличено образуване на микроядра и изследователят пожелае да определи дали увеличението е резултат от кластогенни и/или анеугенни ефекти.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Микроядрата представляват увреждане, което е било предадено на дъщерните клетки, докато хромозомните аберации, отчетени в метафазните клетки, могат да не бъдат предадени. Тъй като микроядрата в интерфазните клетки могат да бъдат оценени относително обективно, лабораторният персонал трябва единствено да определи дали клетките са преминали през делене и колко клетки съдържат микроядро. В резултат на това препаратите могат да бъдат оценени относително бързо, а анализът може да бъде автоматизиран. Поради това е практично да се оценят хиляди вместо стотици клетки в рамките на едно третиране, с което се увеличава статистическата достоверност на изпитването. Накрая, тъй като микроядрата могат да се породят от изоставащи хромозоми, налице е потенциал за откриване на агенти, индуциращи анеуплоидия, които се изследват трудно в рамките на конвенционални изпитвания за хромозомни аберации, напр. Указание за изпитване 473 на ОИСР (глава Б.10 от настоящото приложение) (17). При все това изпитването MNvit не дава възможност за разграничаване на химикалите, индуциращи полиплоидия, от химикалите, индуциращи кластогенност, без специални техники, каквато е техниката FISH, описана в точка 2.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Изпитването MNvit представлява метод in vitro, при който обичайно се използват култивирани човешки клетки или клетки на гризачи. Той осигурява изчерпателна основа за изследване на възможността за увреждане на хромозомите in vitro, тъй като могат да бъдат открити както анеугени, така и кластогени.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Изпитването MNvit е устойчиво и ефективно при разнообразни типове клетки и при наличието или липсата на цитоБ. Налице са изчерпателни данни в подкрепа на валидността на изпитването MNvit, за което се използват клетъчни линии на гризачи (CHO, V79, CHL/IU и L5178Y) и човешки лимфоцити (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Те включват по-конкретно данни от международните изпитвания за валидиране, координирани от Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) и от докладите от Международния семинар относно изпитването за генотоксичност (4) (16). Наличните данни също така бяха повторно оценени в рамките на ретроспективно изследване за валидиране, основано на тежестта на доказателствата и извършено от Европейския център за валидиране на алтернативните методи (ECVAM) към Европейската комисия, и методът за изпитване беше одобрен като научно валиден от Научния консултативен комитет (НКК) на ECVAM (32) (33) (34). Беше описано използването на човешката лимфобластоидна клетъчна линия TK6 (35), клетките HepG2 (36) (37) и първичната култура на клетки от ембрион на сирийски хамстер (38), въпреки че те не са били използвани в изследвания за валидиране.
                           
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                  
                              6.
                           
                           
                              Използваните определения са дадени в допълнение 1.
                           
                        ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ
                  
                              7.
                           
                           
                              Изпитванията, провеждани in vitro, по принцип изискват използването на екзогенен източник на метаболитно активиране, освен когато клетките са с адекватен метаболизиращ капацитет по отношение на изпитваните вещества. Екзогенната система на метаболитно активиране не възпроизвежда изцяло in vivo условия. Също така следва внимателно да се избягват условия, които биха довели до изкуствено предизвикани положителни резултати, които не отразяват присъща мутагенност и които биха могли да се породят от фактори като подчертани промени на рН или осмотичното налягане или от високи нива на цитотоксичност (39) (40) (41). Ако изпитваният химикал причини промяна в pH на средата към момента на добавянето, pH следва да бъде коригирано, за предпочитане чрез буфериране на изходния разтвор по такъв начин, че общият обем във всички изпитвани концентрации и за всички контроли да остане същият.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              За целите на анализиране на индуцирането на микроядра от съществено значение е митозата да е настъпила както при третирани, така и при нетретирани култури. Най-информативният стадий за отчитане на наличието на микроядра е в клетки, които са завършили една митоза по време на или след третиране с изпитваното вещество.
                           
                        ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
                  
                              9.
                           
                           
                              Клетъчните култури с произход от хора или бозайници се подлагат на въздействието на изпитваното вещество със и без екзогенен източник на метаболитно активиране, освен когато се използват клетки с адекватен метаболизиращ капацитет. Във всички изпитвания се включват паралелни контроли с разтворителя/носителя (КН) и положителни контролни химикали (ПК).
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              По време на и след експозицията на изпитваното вещество клетките се отглеждат за период, който е достатъчен, за да позволи увреждането на хромозомите или делителното вретено да доведе до образуването на микроядра в интерфазните клетки. За индуциране на анеуплоидия изпитваното вещество обикновено следва да бъде налично по време на митозата. Събраните и оцветените интерфазни клетки се анализират за наличието на микроядра. В идеалния случай микроядрата следва да бъдат отчетени само в онези клетки, които са преминали през митоза по време на експозиция на изпитваното вещество или по време на периода след експозиция, ако се използва такъв. При култури, които са били третирани с блокер на цитокинезата, това се постига с отчитане само на двуядрените клетки. При липсата на блокер на цитокинезата е важно да се докаже, че е вероятно анализираните клетки да са преминали през клетъчно делене по време на или след експозиция на изпитваното вещество. За всички протоколи е важно да се докаже, че пролиферацията на клетки е настъпила както в контролните, така и в третираните култури, и степента на цитотоксичност или цитостаза, индуцирана от изпитваното вещество, следва да бъде оценена в културите (или в паралелните култури), които се оценяват за наличието на микроядра.
                           
                        ОПИСАНИЕ НА ИЗПИТВАНЕТО
                  
                     Препарати
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Могат да бъдат използвани култивирани първични човешки лимфоцити от периферна кръв (5) (19) (42) (43) и редица клетъчни линии на гризачи, например клетките CHO, V79, CHL/IU и L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Използването на други клетъчни линии и типове следва да бъде обосновано въз основа на тяхната доказана ефективност в рамките на изпитването, както е описано в раздела „Критерии за приемливост“. Тъй като фоновата честота на микроядрата ще окаже влияние върху чувствителността на изпитването, препоръчва се използването на типове клетки с ниска, стабилна фонова честота на образуване на микроядра.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Човешките лимфоцити от периферна кръв следва да бъдат получени от млади (на приблизителна възраст 18—35 години), здрави индивиди, които не са пушачи и за които не е известно скорошно излагане на генотоксични химикали или радиация. Броят на донорите следва да бъде посочен, ако се обединят клетките от повече от един донор в обща група за използване. Честотата на микроядрата нараства с възрастта и тази тенденция е по-изразена при индивидите от женски пол, отколкото при индивидите от мъжки пол (44), като това следва да бъде взето предвид при подбора на донорни клетки за обединяване в обща група.
                           
                        Среди и условия за отглеждане на културата
                  
                              13.
                           
                           
                              При отглеждането на културата следва да се използват подходяща хранителна среда и инкубационни условия (съдове за културата, концентрация на СО2, температура и влажност). Установените клетъчни линии и щамове следва да се проверяват рутинно за стабилност на модалния брой на хромозомите и отсъствие на микоплазмено замърсяване и не следва да се използват, ако са замърсени или има промени в модалния брой на хромозомите. Следва да се знае нормалното време на клетъчен цикъл при използваните условия за отглеждане на културата в лабораторията, провеждаща изпитването. Ако се използва методът на блокиране на цитокинезата, тогава концентрацията на инхибитора на цитокинезата следва да бъде оптимизирана за конкретния тип клетки и следва да се докаже, че тя произвежда добра реколта от двуядрени клетки за отчитане.
                           
                        Приготвяне на културите
                  
                              14.
                           
                           
                              Установени клетъчни линии и щамове: размножават се клетки от изходни култури, посяват се в хранителна среда с такава гъстота, че културите да не достигат точката на сливане в монослоеве и суспензионните култури да не достигнат прекомерна гъстота преди времето на събиране, и се инкубират при 37 °C.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Лимфоцити: цялостна кръв, третирана с антикоагулант (напр. хепарин), или изолирани лимфоцити се култивират в присъствието на митоген, напр. фитохемаглутинин (ФХА), преди експозиция на изпитваното вещество и на цитоБ.
                           
                        Метаболитно активиране
                  
                              16.
                           
                           
                              Следва да се използват екзогенни метаболизиращи системи при използването на клетки с недостатъчен ендогенен метаболичен капацитет. Най-често използваната система е постмитохондрична фракция (S9) с добавка на ко-фактор, приготвена от черните дробове на гризачи, третирани с ензимно индуциращи агенти като Ароклор 1254 (45) (46) или смес от фенобарбитон и β-нафтофлавон (46) (47) (48) (49). Последната комбинация не противоречи на Стокхолмската конвенция за устойчивите органични замърсители (50) и Регламент (ЕО) № 850/2004 относно устойчивите органични замърсители (66) и е доказано, че е също толкова ефективна, колкото Ароклор 1254 за индуцирането на оксидазите със смесени функции (46) (47) (48) (49). Фракцията S9 обикновено се използва в концентрации, вариращи от 1 до 10 % (об./об.) в последната среда на изпитване. Състоянието на системата за метаболитно активиране може да зависи от класа на изпитвания химикал и в някои случаи може да е подходящо да се използва повече от една концентрация на S9.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Създадените чрез генно инженерство клетъчни линии, експресиращи специфични човешки активиращи ензими или активиращи ензими на гризачи, могат да премахнат необходимостта от екзогенна система за метаболитно активиране и могат да се използват като тестклетки. В такива случаи изборът на използваните клетъчни линии следва да е научно обоснован, например чрез приложимостта на оксидази със смесени функции за метаболизма на изпитваното вещество (51) и реагирането им на известни кластогени и анеугени (вж. отделния раздел „Критерии за приемливост“). Следва да се отбележи, че изпитваното вещество може да не бъде метаболизирано от оксидазата(ите) с изразени смесени функции; в такъв случай отрицателните резултати няма да покажат, че изпитваното вещество не може да индуцира микроядра.
                           
                        Приготвяне на изпитваното вещество
                  
                              18.
                           
                           
                              Твърдите химикали следва да се разтворят в подходящи разтворители или носители и ако е необходимо, да се разредят преди третиране на клетките. Течните химикали могат да се добавят директно в системите за изпитване и/или да се разредят преди третирането. Газовете или летливите химикали следва да бъдат изпитвани чрез подходящи изменения на стандартните протоколи, като например обработване в запечатани съдове (52) (53). Следва да се използват пресни препарати на изпитваното вещество, освен ако данните за устойчивостта му показват, че то може да се съхранява.
                           
                        
                     Условия на изпитване
                  
                  Разтворители/носители
                  
                              19.
                           
                           
                              Разтворителят/носителят не следва да реагира с изпитваното вещество или да е несъвместим с оцеляването на клетките или с поддържането на активността на S9 при използваната концентрация. Ако се използват различни от добре утвърдените разтворители/носители, (напр. вода, среда за клетъчни култури, диметил сулфоксид), използването им следва да бъде подкрепено от данни за съвместимостта им с изпитваното вещество и липсата им на генетична токсичност. Препоръчва се винаги когато е възможно първо да се обмисля възможността за използването на воден разтворител/носител.
                           
                        Използване на цитоБ като блокер на цитокинезата
                  
                              20.
                           
                           
                              Едно от най-важните съображения при извършването на изпитването MNvit е да се осигури, че оценяваните клетки са преминали през митоза по време на третирането или инкубационния период след третирането, ако се използва такъв. ЦитоБ е агентът, който е бил най-широко използван за блокиране на цитокинезата, тъй като той инхибира събирането на актин и по този начин предотвратява отделянето на дъщерни клетки след митоза, което води до образуването на двуядрени клетки (5) (54) (55). Поради това отчитането на микроядра може да се ограничи до клетки, които са преминали през митоза по време на или след третиране. Въздействието, което изпитваното вещество оказва върху кинетиката на клетъчната пролиферация, може да бъде измерено едновременно. ЦитоБ следва да бъде използван като блокер на цитокинезата, когато се използват човешки лимфоцити, тъй като периодите на клетъчен цикъл ще варират при различните култури и донори и тъй като не всички лимфоцити ще реагират на ФХА (фитохемаглутинин). При изпитване на клетъчните линии са били използвани други методи, за да се прецени дали оценяваните клетки са претърпели делене; тези методи са разгледани по-долу (вж. точка 26).
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Лабораторията следва да определи подходящата концентрация на цитоБ за всеки тип клетки за постигане на оптималната честота на двуядрени клетки в контролните култури, третирани с разтворителя/носителя. Подходящата концентрация на цитоБ обикновено е между 3 и 6 μg/ml.
                           
                        Измерване на пролиферацията на клетки и цитотоксичността и избиране на концентрации на експозиция
                  
                              22.
                           
                           
                              При определяне на най-високата концентрация на изпитваното вещество, която да бъде изпитана, следва да се избягват концентрациите, които могат да доведат до изкуствено предизвикани положителни реакции, например които предизвикват прекомерна цитотоксичност, преципитиране в хранителната среда и явни промени в pH или осмотичното налягане (39) (40) (41).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Извършват се измервания на пролиферацията на клетките, за да се гарантира, че третираните клетки са преминали през митоза по време на изпитването, както и че третиранията са извършени при подходящи нива на цитотоксичност (вж. точка 29). Цитотоксичността следва да се определи със и без метаболитно активиране в клетки, които изискват метаболитно активиране, като се използва относителният ръст в количеството клетки (RICC) или относителното удвояване на популации (RPD) (вж. допълнение 2 за формули), освен когато се употребява цитоБ. Когато се употребява цитоБ, цитотоксичността може да бъде определена, като се използва индексът на репликация (RI) (вж. допълнение 2 за формула).
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Третирането на култури с цитоБ и измерването на относителните честоти на едноядрени, двуядрени и многоядрени клетки в културата осигурява точен метод за количествено определяне на ефекта върху пролиферацията на клетките и цитотоксичната или цитостатичната активност на дадено третиране (5) и гарантира, че се отчитат само клетки, които са преминали през делене по време на или след третирането.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              При изследвания с цитоБ, цитостазата/цитотоксичността може да бъде определена количествено чрез индекса на пролиферация при блокиране на цитокинезата (CBPI) (5) (26) (56) или да бъде получена чрез RI от поне 500 клетки на култура (вж. допълнение 2 за формули). Когато се използва цитоБ за оценка на пролиферацията на клетки, CBPI или RI следва да бъдат определени от поне 500 клетки на култура. Тези измервания, наред с другите измервания, могат да бъдат използвани за оценяване на цитотоксичността чрез сравняване на стойностите в третираните и контролните култури. Оценката на другите маркери за цитотоксичност (напр. сливане, клетъчен брой, апоптоза, некроза, преброяване на метафази) може да предостави полезна информация.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              При изследвания без цитоБ е необходимо да се докаже, че клетките, отчетени в културата, са преминали през делене по време на или след третирането с изпитваното вещество, в противен случай могат да се получат погрешно отрицателни реакции. Методите, които са използвани, за да се гарантира, че преминалите през делене клетки, които се отчитат, включват инкорпориране и последващо откриване на бромодеоксиуридин (BrdU) за идентифициране на клетки, които са се репликирали (57), образуването на клонинги, когато клетките от постоянни клетъчни линии се третират и отчитат in situ върху микроскопско предметно стъкло (индекс на пролиферация (PI)) (25) (26) (27) (28), или измерването на относително удвояване на популации (RPD), относителен ръст в количеството клетки (RICC) или други доказани методи (16) (56) (58) (59) (вж. допълнение 2 за формули). Оценката на другите маркери за цитотоксичност или цитостаза (напр. сливане, клетъчен брой, апоптоза, некроза, преброяване на метафази) може да предостави полезна информация.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Следва да се оценят най-малко три концентрации, които могат да бъдат подложени на анализ. За да се постигне това, може да бъде необходимо да се извърши опит, като се използва голям брой близки по стойност концентрации и да се анализира образуването на микроядра в тези концентрации, като се предостави подходящият диапазон от цитотоксичности. Алтернативна стратегия е да се извърши предварителен тест за цитотоксичност с цел стесняване на диапазона за окончателното изпитване.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Най-високата концентрация следва да има за цел постигане на цитотоксичност в размер на 55 ± 5 %. По-високите равнища могат да индуцират увреждане на хромозомите като вторичен ефект от цитотоксичността (60). Когато се прояви цитотоксичност, избраните изпитвани концентрации следва да обхващат диапазон от цитотоксичност в размер на 55 ± 5 % до малка или нулева токсичност.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Ако не се наблюдава никаква цитотоксичност или преципитат, най-високата изпитвана концентрация следва да съответства на 0,01 M, 5 mg/mL или 5 μl/mL, в зависимост коя от стойностите е най-ниска. В общия случай концентрациите, избрани за анализ, следва да бъдат разграничени една от друга със стойност, непревишаваща 10. За изпитвани вещества, които показват стръмна крива „концентрация — отговор“, може да бъде необходимо сближаване на концентрациите на изпитваните вещества по стойност, така че културите в диапазоните на средна и ниска токсичност също да бъдат оценени.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Когато разтворимостта е ограничаващ фактор, максималната концентрация, ако не е ограничена от цитотоксичност, следва да бъде най-ниската концентрация, при която минималният преципитат е видим при култури, при условие че липсва каквото и да било въздействие върху оценяването. Оценяването на преципитацията следва да бъде извършвано чрез методи като оптическа микроскопия, като се отбелязва преципитатът, който се задържа или се появява по време на култивирането (към края на третирането).
                           
                        Контроли
                  
                              31.
                           
                           
                              Във всеки опит следва да бъдат включени паралелни положителни контроли и контроли с разтворителя/носителя, както със, така и без метаболитно активиране.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              ПК са необходими за показване на способността на използваните клетки и протокола от изпитването с цел идентифициране на кластогените и анеугените, както и за потвърждаване на метаболитния капацитет на препарата S9. За извършване на ПК следва да се използват известни индуктори на образуване на микроядра при концентрации, които се очаква да породят малки, но възпроизводими увеличения над фоновите равнища, както и да се демонстрира чувствителността на системата за изпитване. Концентрациите на положителната контрола следва да са избрани така, че ефектите да са ясни, но да не разкриват непосредствено на четящото устройство идентичността на кодираните предметни стъкла.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Следва да бъде използван кластоген, който изисква метаболитно активиране (напр. циклофосфамид; бензо[а]пирен), за да се демонстрира както метаболитното активиране, така и способността на системата за изпитване за откриване на кластогени. Ако са обосновани, могат да се използват и други ПК. Тъй като някои ПК, които имат нужда от метаболитно активиране, могат да бъдат активни без екзогенно метаболитно активиране при определени условия на третиране или в определени клетъчни линии, необходимостта от метаболитно активиране, както и активността на препарата S9 следва да бъдат изпитани в избраната клетъчна линия и при избраните концентрации.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Понастоящем не са известни анеугени, които изискват метаболитно активиране на тяхната генотоксична активност (16). Възприетите към настоящия момент ПК за анеугенна активност са например колхицин и винбластин. Могат да бъдат използвани и други химикали, ако те индуцират микроядра единствено или основно чрез анеугенна активност. С цел избягване на необходимостта от две ПК (за кластогенност и анеугенност) без метаболитно активиране, контролата на анеугенността може да служи за ПК без S9, а контролата на кластогенността може да бъде използвана за изпитване на адекватността на използваната система за метаболитно активиране. За клетките, които не изискват S9, следва да се използват ПК както за кластогенността, така и за анеугенността. Предложените ПК са включени в допълнение 3.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Може да се обмисли използването на положителни контролни химикали, принадлежащи към даден химичен клас, когато са налични подходящи химикали. Всички използвани ПК следва да бъдат подходящи за клетъчния тип и условията на активиране.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Контролите, третирани с разтворителя/носителя, следва да бъдат включвани за всеки период на събиране. В допълнение към това следва също да се използват нетретирани ОК (които не се третират с разтворителя/носителя), освен когато са налице публикувани или лабораторни контролни данни от предишни изследвания, показващи, че от избрания разтворител при използваната концентрация не се предизвикват генотоксични или други делеционни ефекти.
                           
                        ПРОЦЕДУРА НА ИЗПИТВАНЕ
                  
                     График на третиране
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              За да се увеличи в максимална степен вероятността за откриване на анеуген или кластоген, действащ на конкретен стадий от клетъчния цикъл, е важно достатъчен брой клетки да бъдат третирани с изпитваното вещество по време на всички стадии на техните клетъчни цикли. Поради това графикът на третиране за клетъчните линии и първичните клетъчни култури може да се различава в известна степен от графика за лимфоцитите, които изискват митогенна стимулация, за да започнат своя клетъчен цикъл, и тези въпроси са разгледани в точки 41—43 (16).
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Теоретичните съображения, заедно с публикуваните данни (18), показват, че повечето анеугени и кластогени ще бъдат открити в рамките на кратък период на третиране от не повече от 3 до 6 часа при наличието и липсата на S9, последван от премахване на изпитваното вещество и период на растеж от 1,5—2,0 клетъчни цикъла (6). Събират се проби от клетките в период, равняващ се на около 1,5—2,0 пъти обичайната (т.е. при липса на третиране) продължителност на клетъчния цикъл или след началото, или в края на третирането (вж. таблица 1). Периодите на вземане на проби или възстановяване могат да бъдат удължени, ако е известно или се допуска, че изпитваното вещество засяга продължителността на клетъчния цикъл (напр. при изпитване на нуклеозидни аналози).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Поради потенциалната цитотоксичност на препаратите S9 за култивирани клетки от бозайници, третиране с удължен период на експозиция с продължителност 1,5—2,0 обичайни клетъчни цикъла се прилага само при липсата на S9. При удължения период на третиране се предлагат варианти, които позволяват третиране на клетките с изпитвания химикал при наличието или липсата на цитоБ. Тези варианти са насочени към ситуации, при които е възможно да има опасения, свързани с възможните взаимодействия между изпитваното вещество и цитоБ.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Предложените графици на третиране на клетките са представени в таблица 1. Тези общи графици на третиране могат да бъдат изменяни в зависимост от стабилността или реактивността на изпитваното вещество или конкретните характеристики, свързани с растежа на използваните клетки. Всички третирания следва да започват и приключват, докато клетките растат експоненциално. Тези графици са представени по-подробно в точки 41—47 по-долу.
                              
                                 Таблица 1
                              
                              
                                 Третиране на клетки и време за събиране за изпитването MNvit
                              
                              
                                          Лимфоцити, първични клетки и клетъчни линии, третирани с цитоБ
                                       
                                       
                                          + S9
                                       
                                       
                                          Извършва се третиране за 3—6 часа при наличието на S9;
                                          премахват се S9 и средата, в която се извършва третирането;
                                          добавят се чиста среда и цитоБ;
                                          събиране след период с продължителността на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла.
                                       
                                    
                                          – S9
                                          Кратка експозиция
                                       
                                       
                                          Извършва се третиране за 3—6 часа;
                                          премахва се средата, в която се извършва третирането;
                                          добавят се чиста среда и цитоБ;
                                          събиране след период с продължителността на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла.
                                       
                                    
                                          – S9
                                          Удължена експозиция
                                       
                                       
                                          
                                             Вариант А: извършва се третиране в продължение на 1,5—2 нормални цикъла при наличието на цитоБ;
                                          в края на периода на експозиция се събира клетъчната реколта.
                                          
                                             Вариант Б: извършва се третиране в продължение на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла;
                                          премахва се изпитваното вещество;
                                          добавят се чиста среда и цитоБ;
                                          събиране след период с продължителността на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла.
                                       
                                    
                                          Клетъчни линии третирани без цитоБ.
                                          (Идентични на графиците на третиране, описани по-горе, с изключение на това, че не се добавя никакъв агент цитоБ.)
                                       
                                    
                        
                     Лимфоцити, първични клетки и клетъчни линии, третирани с цитоБ
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              За лимфоцитите най-ефикасният подход е започване на експозицията на изпитваното вещество 44—48 часа след стимулация с ФХА, когато синхронизацията на циклите ще е изчезнала (5). При първоначалното изпитване клетките се третират за период от 3 до 6 часа с изпитваното вещество при липсата и наличието на S9. Средата, в която се извършва третирането, се премахва и се заменя с чиста среда, която съдържа цитоБ, а клетките се събират след период с продължителността на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Ако и двете първоначални изпитвания на краткосрочното (3—6 часа) третиране са отрицателни или неясни, се използва последващо третиране с удължен период на експозиция без S9. Налични са два варианта на третиране, като и двата са приемливи в еднаква степен. При все това може да е по-уместно да се използва вариант А за стимулирани лимфоцити, когато е вероятно продължителността на експоненциалния растеж да намалее до 96 часа след стимулацията. Освен това клетъчните култури следва да не са достигнали до сливане към момента на окончателното взимане на проби, както е описано във вариант Б.
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Вариант А: клетките се третират с изпитваното вещество за период от време с продължителността на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла и се събират в края на периода на третиране.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Вариант Б: клетките се третират с изпитваното вещество за период от време с продължителността на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла. Средата, в която се извършва третирането, се премахва и се за заменя с чиста среда, а клетките се събират след допълнителен период с продължителността на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла.
                                       
                                    
                        
                              43.
                           
                           
                              Първичните клетки и клетъчните линии следва да бъдат третирани по начин, подобен на начина на третиране на лимфоцитите, с изключение на това, че не е необходимо да бъдат стимулирани с ФХА за период от 44—48 часа. Клетките, различни от лимфоцити, следва да бъдат изложени на въздействие по такъв начин, че към момента на прекратяване на изследването те все още да се намират в логаритмична фаза на растеж.
                           
                        
                     Клетъчни линии, третирани без цитоБ
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Клетките следва да бъдат третирани за 3—6 часа при наличие и при липса на S9. Средата, в която се извършва третирането, се премахва и се заменя с чиста среда, а клетките се събират след период с продължителността на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Ако и двете първоначални изпитвания на краткосрочното (3—6 часа) третиране са отрицателни или неясни, се използва последващо третиране с удължен период на експозиция (без S9). Налични са два варианта на третиране, като и двата са приемливи в еднаква степен:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Вариант А: клетките се третират с изпитваното вещество за период от време с продължителността на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла и се събират в края на периода на третиране.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Вариант Б: клетките се третират с изпитваното вещество за период от време с продължителността на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла. Средата, в която се извършва третирането, се премахва и се заменя с чиста среда, а клетките се събират след допълнителен период с продължителността на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла.
                                       
                                    
                        
                              46.
                           
                           
                              При еднослойните култури е възможно към края на третирането с продължителност 3—6 часа да присъстват митотични клетки (които се идентифицират като кръгли и отделящи се от повърхността). Тъй като тези митотични клетки се отделят лесно, те могат да се загубят при премахване на средата, съдържаща изпитваното вещество. Следва да се положат грижи те да бъдат събрани при измиване на културите и да бъдат върнати в културите, за да се избегне загубата на клетки, намиращи се в стадий на митоза, и на такива, за които е налице риск от образуване на микроядра, към момента на събиране на клетъчната реколта.
                           
                        
                     Брой на културите
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Следва да се използват дубликатни култури за всяка концентрация на изпитвано вещество и за културите, третирани с носителя/разтворителя и отрицателните контролни култури. Когато чрез лабораторната база данни от предишни изследвания може да се докаже минимално вариране между дубликатните култури, използването на единични култури може да бъде приемлив вариант. Ако се използват единични култури, се препоръчва анализирането на увеличен брой концентрации.
                           
                        
                     Събиране на клетки и подготовка на предметно стъкло
                  
                  
                              48.
                           
                           
                              Всяка култура се събира и обработва отделно. Подготовката на клетките може да включва хипотонично третиране, но тази мярка не е необходима, ако по друг начин е постигнато адекватно разстилане на клетките. В подготовката на предметното стъкло могат да бъдат използвани различни техники, при условие че е постигната висококачествена подготовка на клетките за оценяване. Цитоплазмата на клетките следва да бъде запазена, за да се даде възможност за откриването на микроядра и (в метода на блокиране на цитокинезата) надеждното идентифициране на двуядрени клетки.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Предметните стъкла могат да бъдат оцветявани чрез използване на различни методи, като Giemsa или флуоресцентни специфични оцветители за ДНК (59). Използването на специфичен оцветител за ДНК (напр. акридин оранжево (61) или Хьохст 33258 плюс пиронин-Y (62) може да елиминира някои от артефактите, свързани с използването на оцветител, който не е специфичен за ДНК. Антикинетохорните антитела, FISH с панцентромерни ДНК проби или праймирано маркиране in situ с праймери, специфични за панцентромера, заедно с подходящо контрастно оцветяване на ДНК, могат да бъдат използвани за идентифициране на съдържанието (хромозоми/хромозомни фрагменти) на микроядрата, ако механистичната информация за тяхното образуване представлява интерес (15) (16). Могат да бъдат използвани и други методи за разграничаване на кластогените от анеугените, ако те са се доказали като ефективни.
                           
                        
                     Анализ
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Всички предметни стъкла, включително тези на разтворителя/носителя и на контролите, следва да се кодират независимо едно от друго преди микроскопския анализ. Алтернативно, кодираните проби могат да бъдат анализирани чрез използване на валидирана, автоматизирана система за поточна цитометрия или анализ на изображения.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              При култури, третирани с цитоБ, честотата на микроядрата следва да бъде анализирана при поне 2 000 двуядрени клетки на концентрация (поне 1 000 двуядрени клетки на култура; две култури на концентрация). Ако се използват единични култури, от тази култура следва да бъдат отчетени поне 2 000 двуядрени клетки на концентрация. Ако за оценяване при всяка концентрация са налични значително по-малко от 1 000 двуядрени клетки на култура или по-малко от 2 000 при единична култура и ако не е открито значително увеличение на микроядрата, изпитването следва да бъде повторено с използване на повече клетки или при по-малко токсични концентрации, което от двете е уместно. Следва да се внимава да не се отчитат двуядрени клетки с неправилни форми или, когато двете ядра се различават в голяма степен по размер, двуядрените клетки не следва да се бъркат със слаборазстлани многоядрени клетки. Клетките, които съдържат повече от две основни ядра, не следва да бъдат анализирани за наличието на микроядра, тъй като базовата честота на микроядрата може да бъде по-висока при тези клетки (63) (64). Отчитането на едноядрените клетки е приемливо, ако е доказано, че изпитваното вещество оказва влияние върху активността на цитоБ.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              При клетъчни линии, изпитвани без третиране с цитоБ, микроядрата следва да бъдат отчетени при поне 2 000 клетки на концентрация (поне 1 000 клетки на култура; две култури на концентрация). Когато се използва само една култура на концентрация, от тази култура следва да бъдат отчетени поне 2 000 клетки.
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Когато се употребява цитоБ, CBPI или RI следва да бъдат определени за оценка на пролиферацията на клетките (вж. допълнение 2), като се използват поне 500 клетки на култура. Когато третиранията се извършват при липсата на цитоБ, от съществено значение е да бъдат предоставени доказателства, че оценяваните клетки са пролиферирали, както е обсъдено в точки 24—27.
                           
                        
                     Критерии за приемливост
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              Лаборатория, която предлага да използва изпитването MNvit, описано в този МИ, следва да докаже своята способност надеждно и точно да открива химикали с известна анеугенна и кластогенна активност, със и без метаболитно активиране, както и известни отрицателни химикали чрез използване на референтните химикали, изброени в допълнение 3. Като доказателство за своята способност да извърши този МИ правилно, лабораторията следва да предостави доказателства, че клетките, които се оценяват за образуване на микроядра, са преминали през едно клетъчно делене, ако изпитването е проведено без използване на цитоБ.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Химикалите, изброени в допълнение 3, се препоръчват за използване като референтни химикали. Могат да бъдат включени химикали заместители или допълнителни химикали, ако тяхната активност е известна, ако те индуцират микроядра посредством същите механизми за действие и ако за тях е доказано, че са приложими към химикалите чрез използване на процедурата MNvit. Обосновката може да включва изследване за валидиране, използващо голямо разнообразие от вещества или фокусирано върху по-тесен спектър въз основа на химичния клас на изпитваното вещество или изследвания механизъм на увреждане.
                           
                        
                              56.
                           
                           
                              Контролните култури, третирани с разтворителя/носителя, и нетретираните култури следва да имат възпроизводимо ниски и съгласувани честоти на микроядра (обикновено 5—25 микроядра/1 000 клетки за клетъчните типове, идентифицирани в точка 11). Другите типове клетки могат да имат различни спектри от реакции, които следва да бъдат определени, когато те се валидират за използване в изпитването MNvit. Данните от отрицателните контроли, контролите на разтворителя и ПК следва да се използват за установяване на диапазоните от контроли от предишни изследвания. Тези стойности следва да се използват при определяне на адекватността на едновременните НК/ПК за даден експеримент.
                           
                        
                              57.
                           
                           
                              Ако за изпитването са предложени незначителни промени на протокола (напр. използване на автоматизирани вместо ръчни техники на оценяване; използване на нов тип клетки), ефективността на промяната следва да бъде показана преди измененият протокол да може да бъде счетен за приемлив за използване. Показването на ефективност включва демонстриране, че могат да се открият основните механизми на разкъсване и придобиване или загуба на хромозоми, както и че могат да бъдат постигнати подходящи положителни и отрицателни резултати за класа на отделните вещества или широкия спектър от вещества, които ще бъдат изпитвани.
                           
                        ДАННИ И ДОКЛАДВАНЕ
                  
                     Обработка на резултатите
                  
                  
                              58.
                           
                           
                              Ако се използва техниката на блокиране на цитокинезата, в оценката на индуцирането на микроядра се използват само честотите на двуядрените клетки с микроядра (независимо от броя на микроядрата в една клетка). Отчитането на броя на клетките с едно, две или повече ядра може да предостави полезна информация, но не е задължително.
                           
                        
                              59.
                           
                           
                              Следва да се определят съпътстващите измервания на цитотоксичността и/или цитостазата за всички третирани и контролни култури, третирани с разтворителя/носителя (58). Следва да бъдат изчислени CBPI или RI за всички третирани и контролни култури като измервания на забавяне на клетъчния цикъл, когато се използва методът на блокиране на цитокинезата. При липса на цитоБ следва да бъдат използвани RPD, RICC или PI (вж. допълнение 2).
                           
                        
                              60.
                           
                           
                              Следва да се предоставят данни за отделните култури. В допълнение към това всички данни следва да бъдат обобщени в табличен вид.
                           
                        
                              61.
                           
                           
                              Химикалите, които индуцират микроядра в изпитването Mnvit, постигат това, като индуцират разкъсване на хромозоми, загуба на хромозоми или комбинация от двете. Последващият анализ, при който се използват антикинетохорни антитела, специфични за центромера проби in situ или други методи, може да бъде използван за определяне дали механизмът за индуциране на микроядра се дължи на кластогенна и/или анеугенна активност.
                           
                        
                     Оценка и тълкуване на резултатите
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Няма изискване за потвърждаване на ясна положителна или отрицателна реакция чрез допълнително изпитване. Двузначните резултати могат да бъдат изяснени чрез анализ на още 1 000 клетки от всички култури с цел избягване на маскиране. Ако резултатът не бъде изяснен при този подход, следва да бъде извършено допълнително изпитване. Изменението на параметрите на изследването с цел разширяване или стесняване на обхвата на условията, ако е целесъобразно, следва да се вземе предвид при последващите експерименти. Параметрите на изследването, които могат да се изменят, включват границите на изпитваната концентрация, подбиране на подходящия момент на третиране и събирането на клетки и/или условията на метаболитно активиране.
                           
                        
                              63.
                           
                           
                              Има няколко критерия за определяне на положителен резултат, като например свързано с концентрацията увеличение, или статистически значимо увеличение в броя на клетките, съдържащи микроядра. Първо следва да се разгледа биологичната значимост на резултатите. Проучването дали наблюдаваните стойности са в рамките на или извън границите на историческата контрола може да осигури насоки при оценката на биологичната значимост на реакцията. Може да бъдат използвани подходящи статистически методи като помощно средство за оценка на резултатите от изпитването (65). Резултатите от статистическото изпитване обаче следва да се оценяват във връзка със зависимостта доза—отговор. Възпроизводимостта и данните от предишни изпитвания също следва да бъдат взети предвид.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Въпреки че повечето опити дават ясни положителни или отрицателни резултати, в някои случаи наборът от данни изключва категоричната преценка за активността на изпитваното вещество. Тези неясни или съмнителни реакции могат да продължат да се получават, независимо колко пъти е повторен опитът.
                           
                        
                              65.
                           
                           
                              Положителните резултати от изпитването MNvit показват, че изпитваното вещество индуцира разкъсване на хромозоми или загуба на хромозоми в култивирани клетки от бозайници. Отрицателните резултати показват, че при използваните условия на изпитване изпитваното вещество не индуцира разкъсване на хромозоми и/или придобиване или загуба на хромозоми в култивирани клетки от бозайници.
                           
                        
                     Протокол от изпитването
                  
                  
                              66.
                           
                           
                              Протоколът от изпитването следва да включва поне следната информация, когато тя има отношение към провеждането на изпитването:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Изпитван химикал:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      идентификационни данни и номер съгласно химичния регистър на Службата за химични индекси (CAS номер) и ЕС номер;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      физическа природа и чистота;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      физикохимични свойства, които имат отношение към провеждането на изпитването;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      реактивоспособност на изпитвания химикал с разтворителя/носителя или средата за клетъчните култури.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Разтворител/носител:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      обосновка за избора на разтворител/носител;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      разтворимост и устойчивост на изпитваното вещество в разтворителя/носителя.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Клетки:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      тип и източник на използваните клетки;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      дали използваният тип клетки е подходящ;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      отсъствие на микоплазма, ако е приложимо;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      информация за продължителността на клетъчния цикъл, времето за удвояване или индекса на пролиферация;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      когато се използват лимфоцити, пол, възраст и брой на кръвните донори, ако е приложимо;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      когато се използват лимфоцити, дали на експозиция са изложени цялостната кръв или изолирани лимфоцити;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      брой на пасажи, ако е приложимо;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      методи за поддържане на клетъчните култури, ако е приложимо;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      модален брой на хромозомите;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      нормално (отрицателна контрола) време на клетъчен цикъл.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Условия на изпитване:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      идентичност на блокера на цитокинезата (напр. цитоБ), ако се използва такъв, неговата концентрация и времетраене на експозицията на клетките;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      обосновка за избора на концентрации и броя на култури, включително данни за цитотоксичността и граници на разтворимост, ако са налични;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      състав на средите, концентрация на CO2, ако е приложимо;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      концентрации на изпитваното вещество;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      концентрация (и/или обем) на носителя и добавеното изпитвано вещество;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      температура и време на инкубация;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      времетраене на третирането;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      време на събиране след третирането;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      гъстота на клетките при посяване, ако е приложимо;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      тип и състав на системата за метаболитно активиране, включително критерии за приемливост;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      положителни контролни химикали и отрицателни контроли;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      методи на подготовка на предметното стъкло и използвана техника на оцветяване;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      критерии за идентификация на микроядрата;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      брой на анализираните клетки;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      методи за измерване на цитотоксичността;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      всякаква допълнителна информация, свързана с цитотоксичността;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      критерии за считане на изследванията за положителни, отрицателни или неясни;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      използван(и) метод(и) за статистически анализ;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      методи като използването на кинетохорно антитяло за определяне дали микроядрата съдържат цели хромозоми или хромозомни фрагменти, ако е приложимо.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Резултати:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      използвано измерване на цитотоксичността, напр. CBPI или RI в случай че се използва метод на блокиране на цитокинезата; RICC, RPD или PI, когато не се използват методи на блокиране на цитокинезата; други приложими наблюдения, напр. клетъчно сливане, апоптоза, некроза, преброяване на метафази, честота на двуядрените клетки;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      признаци на преципитация;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      данни за рН и осмотичното налягане на средата на третиране, ако са определени;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      определяне на приемливи клетки за анализ;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      разпределянето на едноядрените, двуядрените и многоядрените клетки, ако се използва метод на блокиране на цитокинезата;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      брой на клетките с микроядра, даден отделно за всяка третирана и контролна култура, като по целесъобразност се посочва дали са от двуядрени или едноядрени клетки;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      зависимостта концентрация—отговор, където е възможно;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      данни за паралелни отрицателни контроли (с разтворителя/носителя) и положителни контролни химикали (концентрации и разтворители);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      данни от предишни изпитвания за паралелни отрицателни контроли (с разтворителя/носителя) и положителни контролни химикали, с интервали, средни стойности, стандартно отклонение и доверителен интервал (напр. 95 %);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      статистически анализ; p-стойности, ако има такива.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Обсъждане на резултатите
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Заключения
                                          
                                       
                                    
                        ЛИТЕРАТУРА
                  
                              (1)
                           
                           
                              Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res., 392, 1-4.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project, Mutation Res., 287, 3-15.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay, Cytobios., 43, 233-246.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group, Environ. Mol. Mutagen., 35, 167-172.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay, Nature Protocols, 2(5), 1084-1104.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation, Mutation Res., 161, 193-198.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody, Environ. Mol. Mutagen., 13, 34-43.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes, Mutation Res., 234, 9-20.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, 6, 297-302.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes, Mutagenesis, 8, 329-334.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe, Mutation Res., 319, 205-213.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization, Mutagenesis, 8, 519-525.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes, Mutation Res., 322, 9-20.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy, Mutation Res., 372, 233-245.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes, Mutation Res., 372, 211-219.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res., 540, 153-163.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              OECD (1997), In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, Test Guideline № 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. На разположение на адрес: [[www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study, Mutation Res., 607, 13-36.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes, Mutation Res., 607, 37-60.
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells, Mutation Res., 607, 61-87.
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells, Mutation Res., 607, 88-124.
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells, Mutation Res., 607, 125-152.
                           
                        
                              (23)
                           
                           
                              Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience, Mutation Res., 392, 187-208.
                           
                        
                              (24)
                           
                           
                              Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience, Mutation Res., 392, 45-59.
                           
                        
                              (25)
                           
                           
                              Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and Madle, S. (1998), Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Res., 410, 81-116.
                           
                        
                              (26)
                           
                           
                              Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different test approaches, Mutation Res. 439, 183-190.
                           
                        
                              (27)
                           
                           
                              Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. (1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity, Mutation Res. 445, 55-71.
                           
                        
                              (28)
                           
                           
                              von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000), In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells - results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances, Mutation Res., 468, 137-163.
                           
                        
                              (29)
                           
                           
                              Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 517, 123-134.
                           
                        
                              (30)
                           
                           
                              Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and Sofuni, T. (1999), Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU), Mutagenesis, 14, 569-580.
                           
                        
                              (31)
                           
                           
                              Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test, Mutation Res., 607, 1-152.
                           
                        
                              (32)
                           
                           
                              ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25th meeting, 16-17 ноември 2006 г., На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.it/index.htm]
                           
                        
                              (33)
                           
                           
                              ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.it/index.htm]
                           
                        
                              (34)
                           
                           
                              Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT), Mutagenesis, 23, 271-283.
                           
                        
                              (35)
                           
                           
                              Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test, Mutation Res., 347, 105-115.
                           
                        
                              (36)
                           
                           
                              Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells, Mutagenesis, 17, 257-260.
                           
                        
                              (37)
                           
                           
                              Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge, Toxicol., 198, 315-328.
                           
                        
                              (38)
                           
                           
                              Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals, Mutation Res., 392, 61-70.
                           
                        
                              (39)
                           
                           
                              Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, 147-205.
                           
                        
                              (40)
                           
                           
                              Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells, Mutation Res., 268, 297-305.
                           
                        
                              (41)
                           
                           
                              Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886.
                           
                        
                              (42)
                           
                           
                              Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymphocytes, Mutation Res., 147, 29-36.
                           
                        
                              (43)
                           
                           
                              Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method, Mutation Res., 392, 11-18.
                           
                        
                              (44)
                           
                           
                              Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei, Environ. Mol. Mutagen.
                                 37, 31-45.
                           
                        
                              (45)
                           
                           
                              Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutation Res., 113, 173-215.
                           
                        
                              (46)
                           
                           
                              Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65.
                           
                        
                              (47)
                           
                           
                              Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, 7, 175-177.
                           
                        
                              (48)
                           
                           
                              Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, стр. 85-88.
                           
                        
                              (49)
                           
                           
                              Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59.
                           
                        
                              (50)
                           
                           
                              UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). На разположение на адрес: [http://www.pops.int/]
                           
                        
                              (51)
                           
                           
                              Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells, Mutagenesis, 11, 247-274.
                           
                        
                              (52)
                           
                           
                              Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R.R., Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, стр. 91-103.
                           
                        
                              (53)
                           
                           
                              Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay, Environ. Mutagenesis 5, 795-801.
                           
                        
                              (54)
                           
                           
                              Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations, Mutation Res., 285, 35-44.
                           
                        
                              (55)
                           
                           
                              Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 521, 103-112.
                           
                        
                              (56)
                           
                           
                              Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to „Report from the in vitro micronucleus assay working group“, Mutation Res., 564, 97-100.
                           
                        
                              (57)
                           
                           
                              Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear assay in lymphocytes, Mutation Res., 139, 61-65.
                           
                        
                              (58)
                           
                           
                              Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Res., 655, 1-3.
                           
                        
                              (59)
                           
                           
                              Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. (1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 341, 169-184.
                           
                        
                              (60)
                           
                           
                              Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environ. Molec. Mutagenesis 35, 191-201.
                           
                        
                              (61)
                           
                           
                              Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, 241-247.
                           
                        
                              (62)
                           
                           
                              MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, 269-275.
                           
                        
                              (63)
                           
                           
                              Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Res., 120, 241-247.
                           
                        
                              (64)
                           
                           
                              Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 534, 65-75.
                           
                        
                              (65)
                           
                           
                              Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003), In vitro micronucleus test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, стр. 463-467.
                           
                        
                              (66)
                           
                           
                              Регламент (ЕО) № 850/2004 на Европейския парламент и на Съвета от 29 април 2004 г. относно устойчивите органични замърсители и за изменение на Директива 79/117/ЕИО, ОВ L 229, 30.4.2004 г., стр. 5.
                           
                        
                     Допълнение 1
                     
                        Определения
                     
                     Анеуген: всяко вещество или процес, което/който води до анеуплоидия в клетките или организмите чрез взаимодействие с компонентите на митотичния и мейотичния цикъл на клетъчно делене.
                     Анеуплоидия: всяко отклонение от обичайния диплоиден (или хаплоиден) брой на хромозомите на една или повече от една хромозома, но не и на пълния(те) набор(и) от хромозоми (полиплоидия).
                     Апоптоза: програмирана клетъчна смърт, характеризираща се с редица етапи, водещи до разпадане на клетките на мембраносвързани частици, които впоследствие се премахват чрез фагоцитоза или разпространение.
                     Клетъчна пролиферация: увеличение на броя на клетките в резултат на митотично клетъчно делене.
                     Центромера: ДНК регион от хромозома, в който се свързват двете хроматиди и върху който двете кинетохори са прикрепени една до друга.
                     Кластоген: всяко вещество или процес, което/който причинява структурни хромозомни аберации в популации на клетки или организми.
                     Цитокинеза: процесът на клетъчно делене, който следва непосредствено след митозата и в резултат на който се образуват две дъщерни клетки, всяка от които съдържа едно ядро.
                     Индекс на пролиферация при блокиране на цитокинезата (CBPI): съотношението на клетки от второто делене в третираната популация, което има отношение към нетретираната контролна проба (вж. допълнение 2 за формула).
                     Цитостаза: потискане на растежа на клетките (вж. допълнение 2 за формула).
                     Цитотоксичност: вредни въздействия върху клетъчната структура или функция, които в крайна сметка причиняват клетъчна смърт.
                     Генотоксичен: общ термин, обхващащ всички видове увреждане на ДНК или хромозоми, включително разкъсвания, пренареждания на адукти, мутации, хромозомни аберации и анеуплоидия. Не всички видове генотоксични ефекти водят до мутации или трайно увреждане на хромозомите.
                     Интерфазни клетки: клетки, които не са във фаза на митоза.
                     Кинетохора: белтъчна структура, разположена около центромерата на хромозомата, с която нишките на делителното вретено се свързват по време на клетъчното делене, като така позволяват методично придвижване на дъщерните хромозоми към полюсите на дъщерните клетки.
                     Микроядра: малки ядра, отделни от главното ядро и в допълнение към него, на клетките, произведени по време на телофазата на митоза или мейоза чрез изоставащи хромозомни фрагменти или цели хромозоми.
                     Митоза: делене на клетъчното ядро, обикновено разделено на профаза, прометафаза, метафаза, анафаза и телофаза.
                     Митотичен индекс: съотношението на клетките в метафаза, разделени на броя клетки, наблюдавани в клетъчната популация; показател за степента на пролиферация на тази популация.
                     Мутагенен: води до наследствена промяна на ДНК последователност(и) на базовите двойки в гени или на структура от хромозоми (хромозомни аберации).
                     Неспособност за отделяне: неспособност на двойката хроматиди да се отделят една от друга и правилно да се разделят, за да се обособят като хромозоми за развиващите се дъщерни клетки, в резултат на което се получават дъщерни клетки с анормален брой хромозоми.
                     Полиплоидия: числови хромозомни аберации в клетки или организми, включващи цял набор(и) от хромозоми в противовес на отделна хромозома или хромозоми (анеуплоидия).
                     Индекс на пролиферация (PI): метод за измерване на цитотоксичността, когато не се използва цитоB (вж. допълнение 2 за формула).
                     Относителен ръст в количеството клетки (RICC): метод за измерване на цитотоксичността, когато не се използва цитоB (вж. допълнение 2 за формула).
                     Относително удвояване на популации (RPD): метод за измерване на цитотоксичността, когато не се използва цитоB (вж. допълнение 2 за формула).
                     Индекс на репликация (RI): съотношението на циклите на клетъчно делене, през които е преминала третирана култура, в сравнение с нетретирана контрола по време на периода на експозиция и възстановяване (вж. допълнение 2 за формула).
                     Изпитван химикал (също наричан изпитвано вещество): всяко вещество или смес, изпитвано(а) чрез използването на настоящия метод за изпитване.
                  
                  
                     Допълнение 2
                     
                        Формули за оценка на цитотоксичността
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 
                                    Когато се използва цитоБ, оценката на цитотоксичността следва да бъде основавана на индекса на пролиферация при блокиране на цитокинезата (CBPI) или на индекса на репликация (RI) (16) (58). CBPI посочва средния брой на клетъчните цикли на клетка по време на периода на експозиция на цитоБ и може да бъде използван за изчисляване на пролиферацията на клетките. RI посочва относителния брой на ядрата в третирани култури в сравнение с контролните култури и може да бъде използван за изчисляване на процента на цитостаза:
                                 Процент на цитостаза = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)}
                                 както и
                                 
                                             T
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             култура за изпитване с третирания химикал
                                          
                                       
                                             C
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             контролни култури, третирани с носителя
                                          
                                       където:
                                 
                                    
                                 Поради това CBPI на стойност 1 (всички клетки са едноядрени) е еквивалентен на 100 % цитостаза.
                                 Цитостаза = 100 – RI
                                 
                                    
                                 
                                             T
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             третирани култури
                                          
                                       
                                             C
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             контролни култури
                                          
                                       
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Поради това RI на стойност 53 % означава, че в сравнение с броя на клетките, които са претърпели делене, за да образуват двуядрени и многоядрени клетки в контролната култура, само 53 % от този брой са претърпели делене в третираната култура, т.е. 47 % цитостаза.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 
                                    Когато не се използва цитоБ, се препоръчва оценяване на цитотоксичността въз основа на относителния ръст в количеството клетки (RICC) или на относителното удвояване на популации (RPD) (58), тъй като и при двете се отчита съотношението на популацията на клетки, които са претърпели делене.
                                 
                                    
                                 
                                    
                                 където:
                                 Удвояване на популации = [логаритъм (брой на клетките след третиране ÷ първоначален брой на клетките)] ÷ логаритъм 2
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Поради това RICC или RPD на стойност 53 % показва 47 % цитотоксичност/цитостаза.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Чрез използване на индекса на пролиферация (PI) цитотоксичността може да бъде оценена чрез преброяване на броя на клонингите, които се състоят от 1 клетка (cl1), 2 клетки (cl2), 3 до 4 клетки (cl4) и 5 до 8 клетки (cl8)
                                 
                                    
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 PI е използван като ценен и надежден параметър за цитотоксичност и за клетъчни линии, култивирани in situ при липсата на цитоБ (25) (26) (27) (28).
                              
                           
                  
                     Допълнение 3
                     
                        Препоръчителни референтни химикали за оценка на ефективността
                         (16)
                     
                     
                                 Категория
                              
                              
                                 Химикал
                              
                              
                                 CAS №
                              
                              
                                 ЕС №
                              
                           1.   Кластогени, активни без метаболитно активиране
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Цитозин арабинозид
                              
                              
                                 147-94-4
                              
                              
                                 205-705-9
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Митомицин С
                              
                              
                                 50-07-7
                              
                              
                                 200-008-6
                              
                           2.   Кластогени, изискващи метаболитно активиране
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Бензо[a]пирен
                              
                              
                                 50-32-8
                              
                              
                                 200-028-5
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Циклофосфамид
                              
                              
                                 50-18-0
                              
                              
                                 200-015-4
                              
                           3.   Анеугени
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Колхицин
                              
                              
                                 64-86-8
                              
                              
                                 200-598-5
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Винбластин
                              
                              
                                 143-67-9
                              
                              
                                 205-606-0
                              
                           4.   Вещества, даващи отрицателен резултат
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Ди(2-етил-хексил)фталат
                              
                              
                                 117-81-7
                              
                              
                                 204-211-0
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Налидиксова киселина
                              
                              
                                 389-08-2
                              
                              
                                 206-864-7
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Пирен
                              
                              
                                 129-00-0
                              
                              
                                 204-927-3
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Натриев хлорид
                              
                              
                                 7647-14-5
                              
                              
                                 231-598-3
                              
                           
                  
                     Б.50.   КОЖНА СЕНСИБИЛИЗАЦИЯ: ИЗСЛЕДВАНЕ НА ЛОКАЛНИТЕ ЛИМФНИ ВЪЗЛИ: DA
                  
                  ВЪВЕДЕНИЕ
                  
                              1.
                           
                           
                              Указанията за изпитването на химикали на ОИСР и методите за изпитване на ЕС периодично се преразглеждат с оглед на научния прогрес, промяната на регулаторните нужди и съображенията, свързани с хуманното отношение към животните. Първият метод за изпитване (МИ) (Б.42) за определянето на кожна сенсибилизация при мишки — изследването на локалните лимфни възли (LLNA, Указание за изпитване 429 на ОИСР) — бе преработен (1). Публикувана е подробна информация за валидирането на LLNA и е направен преглед на съответните научни трудове (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). При LLNA се използва радиоизотопен тимидин или йод за измерване на пролиферацията на лимфоцитите и поради това изследването има ограничена употреба, когато придобиването, използването или обезвреждането на радиоактивни вещества е проблематично. LLNA: DA (разработено от Daicel Chemical Industries, Ltd.) е нерадиоактивно изменение на LLNA, което определя количествено съдържанието на аденозин трифосфат (АТР) чрез биолуминесценция като индикатор за пролиферацията на лимфоцитите. Методът за изпитване LLNA: DA е валидиран, преработен и препоръчван от международна група за партньорска оценка, тъй като се счита за полезен за идентифициране на химикалите, които са кожни сенсибилизатори, както и на химикалите, които не предизвикват кожна сенсибилизация (10) (11) (12) (13). Този МИ е предназначен за оценка на потенциала на химикалите (вещества и смеси) да предизвикват кожна сенсибилизация при животни. В глава Б.6 от настоящото приложение и в Указание за изпитване 406 на ОИСР се използват изследвания върху морски свинчета, по-специално максимизиращ тест върху морски свинчета и тест на Buehler (14). LLNA (глава Б.42 от настоящото приложение; Указание за изпитване 429 на ОИСР) и двете му нерадиоактивни изменения: LLNA: DA (глава Б.50 от настоящото приложение; Указание за изпитване 442 А на ОИСР) и LLNA: BrdU-ELISA (глава Б.51 от настоящото приложение; Указание за изпитване 442 Б на ОИСР) — всички те предоставят предимство спрямо изследванията върху морски свинчета в Б.6 и Указание за изпитване 406 на ОИСР (14), що се отнася до намаляването на и усъвършенстването при използването на животни.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Подобно на LLNA, LLNA: DA проучва индукционната фаза при кожна сенсибилизация и осигурява количествени данни, подходящи за оценяване на зависимостта доза—отговор. Освен това способността за откриване на кожни сенсибилизатори без да е необходимо използването на радиомаркер за ДНК елиминира потенциалната възможност за професионална експозиция на радиоактивност, както и проблемите, свързани с обезвреждането на отпадъци. Това от своя страна може да даде възможност за повишаване на използването на мишки за откриване на кожни сенсибилизатори, което още повече би могло да намали използването на морски свинчета за изпитване на потенциала за кожна сенсибилизация (т.е. Б.6; Указание за изпитване 406 на ОИСР) (14).
                           
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                  
                              3.
                           
                           
                              Използваните определения са дадени в допълнение 1.
                           
                        ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ
                  
                              4.
                           
                           
                              LLNA: DA е модифициран метод LLNA за определяне на химикалите, които са потенциални кожни сенсибилизатори, с известни ограничения. Това не означава непременно, че при всички случаи следва да се използва LLNA: DA вместо LLNA или изследванията върху морски свинчета (т.е. Б.6, Указание за изпитване 406 на ОИСР) (14), а по-скоро че изпитването е равностойно и може да бъде използвано като алтернатива, при която обикновено положителните и отрицателните резултати вече не изискват допълнително потвърждаване (10) (11). Лабораторията, провеждаща изпитването, следва да вземе предвид цялата налична информация за изпитваното вещество преди провеждането на изпитването. Тази информация ще включва идентичността и химичната структура на изпитваното вещество; неговите физикохимични свойства; резултатите от всякакви други in vitro или in vivo токсикологични изпитвания на изпитваното вещество; и токсикологични данни за структурно свързани вещества. Тази информация следва да се вземе предвид, за да се определи дали LLNA: DA е подходящо за изпитваното веществото (с оглед на несъвместимостта на ограничен брой видове химикали с LLNA: DA [вж. точка 5] и като помощно средство при избора на доза.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              LLNA: DA е in vivo метод и вследствие на това няма да доведе до преустановяване на използването на животни при оценяването на алергичната контактна сенсибилизираща активност. Той обаче има потенциала да намали използването на животни за тази цел в сравнение с изследванията върху морски свинчета (Б.6; Указание за изпитване 406 на ОИСР) (14). Освен това LLNA: DA предлага съществено усъвършенстване (по-малко болка и страдание) на начина, по който животните се използват за изпитване на алергичната контактна сенсибилизация, тъй като за разлика от Б.6 и Указание за изпитване 406 на ОИСР LLNA: DA не изисква да се разкрие кожна свръхчувствителност след предизвикване. Въпреки предимствата на LLNA: DA пред Б.6 и Указание за изпитване 406 на ОИСР (14), съществуват определени ограничения, които могат да доведат до необходимост от използване на Б.6 или на Указание за изпитване 406 на ОИСР (напр. изпитването на определени метали, фалшиво положителни резултати при определени кожни дразнители) [например някои видове повърхностноактивни вещества] (6) (1 и глава Б.42 от настоящото приложение) или разтворимостта на изпитваното вещество). Освен това химичните класове или вещества, съдържащи функционални групи, за които е доказано, че водят до възможно объркване (16), могат да доведат до необходимост от използване на изследванията върху морски свинчета (т.е. Б.6; Указание за изпитване 406 на ОИСР (14)). В допълнение се препоръчва установените за LLNA ограничения (1 и глава Б.42 от настоящото приложение) да бъдат прилагани и по отношение на LLNA: DA (10). Освен това използването на LLNA: DA може да не е подходящо за изпитвани вещества, които влияят на нивата на аденозин трифосфат (АТР) (напр. вещества, които действат като инхибитори на АТР), или такива, които влияят на точното измерване на вътреклетъчния ATP (напр. наличието на ATP-разграждащи ензими, наличието на извънклетъчен ATP в лимфния възел). С изключение на тези установени ограничения LLNA: DA следва да се прилага за изпитване на всички вещества, освен ако съществуват свързани с тези вещества свойства, които могат да повлияят на точността на LLNA: DA. Освен това следва да бъде обърнато внимание на възможността за гранични положителни резултати, когато са получени стойности на стимулационния индекс (SI) между 1,8 и 2,5 (вж. точка 31—32). Това се основава на базата данни от валидирането, състояща се от 44 вещества, които използват SI ≥ 1,8 (вж. точка 6), за които изследването LLNA: DA: правилно е определило всички 32 сенсибилизатора при LLNA, но неправилно е определило три от 12-те вещества, които не са сенсибилизатори при LLNA със стойности на SI между 1,8 и 2,5 (т.е гранични положителни) (10). При все това, тъй като същият набор от данни беше използван за определяне на стойностите на SI и изчисляване на прогнозните способности на изпитването, посочените резултати могат да представляват надценяване на реалните прогнозни способности.
                           
                        ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
                  
                              6.
                           
                           
                              Основният принцип, залегнал в LLNA: DA, е, че сенсибилизаторите предизвикват пролиферация на лимфоцитите в лимфните възли, дрениращи мястото на прилагане на изпитваното вещество. Тази пролиферация е пропорционална на дозата и на действието на приложения алерген и осигурява лесен начин за получаване на количествено измерване на сенсибилизацията. Пролиферацията се измерва чрез сравняване на средната пролиферация във всяка изпитвана група със средната пролиферация в третираната с носителя контролна група (КН). Съотношението на средната пролиферация във всяка третирана група спрямо тази в паралелната третирана с носителя контролна група, наречено SI, е предварително определено и следва да бъде ≥ 1,8, за да може изпитваното вещество да бъде оценено по-нататък като потенциален кожен сенсибилизатор. Описаните тук процедури се основават на измерването на съдържанието на ATP чрез използването на биолуминесценция (за която е известно, че корелира с броя на живите клетки) (17) за показване на увеличения брой на пролифериращите клетки в дрениращите аурикуларни (ушни) лимфни възли (18) (19). Биолуминесцентният метод използва ензима луцифераза за катализиране на образуването на светлина от ATP и луциферин съгласно следната реакция:
                              
                                 ATP + Луциферин + O
                                 2
                                 Оксилуцифеpuн + AMP + PPi
                                  + CO
                                 2 + светлина
                              
                              Интензитетът на излъчваната светлина е в линейна зависимост от концентрацията на ATP и се измерва чрез използването на луминометър. Изпитването луциферин—луцифераза е чувствителен метод за количествено определяне на ATP и се използва в широк кръг от приложения (20).
                           
                        ОПИСАНИЕ НА ИЗПИТВАНЕТО
                  
                     Избор на животински вид
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Видът животно, избран за това изследване, е мишката. Изследванията за валидиране на LLNA: DA бяха проведени изключително с мишки от порода CBA/J, която поради това се счита за предпочитаната порода (12) (13). Използват се млади възрастни мишки от женски пол, които не са раждали и не са бременни. В началото на изследването животните следва да бъдат на възраст между 8—12 седмици и отклоненията в теглото им следва да бъдат минимални и да не превишават 20 % от средното тегло. Алтернативно могат да бъдат използвани животни от други породи и от мъжки пол, когато има достатъчно събрани данни, които доказват, че не съществува реакция при LLNA: DA, която да показва съществени различия, обусловени от пола и/или породата.
                           
                        
                     Условия на отглеждане и хранене
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Мишките следва да бъдат групово отглеждани (21), освен ако е направена подходяща научна обосновка за индивидуално отглеждане на мишките. Температурата в стаята на опитните животни следва да бъде 22 ± 3 °C. Въпреки че относителната влажност следва да бъде поне 30 % и е препоръчително тя да не надвишава 70 % освен по време на почистване на стаята, целта е относителната влажност да се поддържа в интервала 50—60 %. Осветлението следва да бъде изкуствено, като последователността е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. За храненето могат да се използват обичайните лабораторни диети с неограничен достъп до вода за пиене.
                           
                        
                     Подготовка на животните
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Животните се избират произволно, маркират се, за да е възможно индивидуалното им идентифициране (но не и чрез маркиране на ушите им) и се оставят в клетките си поне пет дни преди започване на дозирането, за да се аклиматизират към лабораторните условия. Преди да започне третирането, всички животни се изследват, за да се потвърди отсъствието на видими кожни лезии.
                           
                        
                     Приготвяне на разтворите за дозиране
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Твърдите химикали следва да се разтворят или суспендират в разтворители/носители и ако е необходимо, да се разредят преди прилагането им върху ушите на мишките. Течните химикали могат да се прилагат в чист или разреден вид преди дозирането. Неразтворимите химикали като тези, които обикновено се наблюдават в медицинските изделия, следва да се подложат на засилена екстракция в подходящ разтворител, за да се проявят всички екстрахируеми съставки за изпитване преди прилагането им върху ушите на мишките. Изпитваните вещества следва да се приготвят ежедневно, освен ако данните за устойчивостта им показват, че те могат да се съхраняват.
                           
                        
                     Проверка на надеждността
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Положителните контролни химикали (ПК) се използват за доказване на подходящо провеждане на изпитването чрез реагиране с достатъчна и възпроизводима чувствителност на сенсибилизиращо изпитвано вещество, за което степента на реакция е добре характеризирана. Препоръчва се включването на паралелна положителна контрола (ПК), защото така се доказва компетентността на лабораторията успешно да провежда всяко изследване и позволява оценка на вътрешно- и междулабораторната възпроизводимост и сравнимост. Някои регулаторни органи също изискват ПК за всяко изпитване и поради това е препоръчително потребителите да се консултират със съответните органи преди провеждането на LLNA: DA. Следователно се насърчава рутинното използване на паралелна ПК, за да се избегне необходимостта от изследване на допълнителни животни за изпълняването на тези изисквания, които биха могли да възникнат в резултат на използването на периодична ПК (вж. точка 12). ПК следва да предизвика положителна LLNA: DA реакция при ниво на експозиция, при което се очаква нарастване на стимулационния индекс SI ≥ 1,8 спрямо отрицателната контролна група (ОК). Дозата за ПК следва да бъде избрана така, че да не причинява прекомерно кожно дразнене или системна токсичност и индукцията да е възпроизводима, но не прекомерна (например SI > 10 би се считало за прекомерно). Предпочитаните ПК са 25 % хексилканелен алдехид (№ 101-86-0 съгласно химичния регистър на Службата за химични индекси [CAS]) и 25 % евгенол (CAS номер 97-53-0) в ацетон: зехтин (4:1, об./об.). Може да има обстоятелства, при които след направено подходящо обосноваване могат да бъдат използвани други положителни контроли, отговарящи на горепосочените критерии.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              При все че е препоръчително постоянното включване на паралелна положителна контролна (ПК) група, могат да съществуват ситуации, при които периодичното изпитване (т.е. на интервали ≤ 6 месеца) на ПК може да бъде подходящо за лаборатории, които редовно провеждат LLNA: DA (т.е. провеждат LLNA: DA с честота не по-малко от веднъж месечно) и имат създадена база данни от предишни изпитвания с ПК, доказваща способността на лабораторията да получава възпроизводими и точни резултати с положителните контроли. Подходяща компетентност за провеждане на LLNA: DA може да бъде успешно доказана чрез получаването на последователни положителни резултати с ПК при най-малко 10 независими изпитвания, проведени в рамките на разумен период от време (т.е. по-малко от една година).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Паралелна ПК група следва да се включва винаги, когато има процедурна промяна в LLNA: DA (например промяна на обучения персонал, промяна на материалите и/или реагентите, с които се провежда методът за изпитване, промяна на оборудването, с което се провежда методът за изпитване, промяна в произхода на опитните животни), като тези промени следва да бъдат документирани в лабораторни доклади. Следва да бъде обърнато внимание на въздействието на тези промени върху годността на предварително създадената база данни от предишни изпитвания с оглед да се определи необходимостта от създаване на нова база данни от предишни изпитвания за документиране на последователността на резултатите с ПК.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Изследователите следва да са наясно, че решението за периодично провеждане на изпитване с ПК вместо паралелното му провеждане има последици върху годността и приемливостта на отрицателните резултати от изпитването, получени без паралелна ПК по време на интервала между всяко периодично изпитване с ПК. Например, ако се получи фалшиво отрицателен резултат при периодичното изпитване с ПК, отрицателните резултати за изпитваното вещество, получени по време на интервала между последното приемливо периодично изпитване с ПК и неприемливото периодично изпитване с ПК, могат да бъдат поставени под съмнение. Изводите относно тези резултати следва внимателно да бъдат взети предвид при определяне дали да се включват паралелни ПК или само да се провеждат периодични ПК. Следва да се обърне внимание и на използването на по-малко животни в паралелната ПК група, когато това е научно обосновано и ако лабораторията докаже, въз основа на конкретните за лабораторията данни от предишни изпитвания, че могат да бъдат използвани по-малко мишки (22).
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Въпреки че ПК следва да бъде изпитвана в носител, за който е известно, че при прилагането му се получава постоянна реакция (напр. ацетон: зехтин; 4:1, об./об.), може да има определени регулаторни ситуации, при които ще бъде необходимо провеждането на изпитване и в нестандартен носител (клинично/химично отговаряща формулация) (23). Ако паралелната ПК се изпитва в различен носител от изпитваното вещество, тогава следва да бъде включена отделна третирана с носителя контролна група за паралелната ПК.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              В случаи, при които се оценяват вещества от определен химичен клас или спектър от реакции, еталонните вещества също могат да бъдат от полза, за да се докаже, че методът за изпитване функционира правилно по отношение на откриването на потенциала за кожна сенсибилизация на тези видове вещества. Подходящите еталонни вещества следва да притежават следните свойства:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          структурно и функционално сходство с класа на изпитваното вещество;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          известни физични/химични характеристики;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          подкрепящи данни от LLNA: DA;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          подкрепящи данни от други животински модели и/или от хора.
                                       
                                    
                        ПРОЦЕДУРА НА ИЗПИТВАНЕ
                  
                     Брой на животните и нива на дозите
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Използват се минимум четири животни за подложена на дадена доза група, при минимум три концентрации на изпитваното вещество, плюс паралелна отрицателна контролна група (ОК), третирана само с носителя на изпитваното вещество, както и ПК (паралелна или скорошна въз основа на лабораторната политика, като се вземат предвид точки 11—15). Следва да се обмисли изпитването на множество дози на ПК, особено когато не се провеждат редовни изпитвания на ПК. Животните от контролните групи следва да бъдат отглеждани и третирани по начин, идентичен с този, на животните от третираните групи, с изключение на това, че липсва третиране с изпитваното вещество.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Изборът на доза и носител следва да бъде основан на препоръките, посочени в библиографски бележки 2 и 24. Последователните дози обикновено се избират от подходяща поредица от концентрации като например 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % и т.н. Изборът на използваната поредица от концентрации следва да бъде придружен от подходяща научна обосновка. Цялата съществуваща токсикологична информация (напр. остра токсичност и кожно дразнене) и информацията за структурните и физикохимичните свойства на представляващото интерес изпитвано вещество (и/или структурно свързаните вещества) следва да бъде взета предвид в случай на наличност при избора на трите последователни концентрации, така че най-високата концентрация да увеличава в максимална степен експозицията, като същевременно се избягва системната токсичност и/или прекомерното локално кожно дразнене (24) (25). При липсата на такава информация може да е необходимо първоначално предварително скринингово изпитване (вж. точки 21—24).
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Носителят не следва да пречи или да оказва влияние на резултата от изпитването и следва да бъде избран въз основа на способността си максимално да повишава разтворимостта, за да се получи най-високата постижима концентрация, като същевременно се приготвя подходящ разтвор/суспензия за прилагане на изпитваното вещество. Препоръчителните носители са ацетон: зехтин (4:1, об./об.), N,N-диметилформамид, метилетилкетон, пропилен гликол и диметилсулфоксид (6), но могат да бъдат използвани и други, при условие че се предостави достатъчна научна обосновка. При определени ситуации може да бъде необходимо да се използват клинично обусловени разтворители или търговска формулация, в която изпитваното вещество се маркира като допълнителна контрола. Особено внимание следва да бъде обърнато, за да се гарантира, че хидрофилните изпитвани вещества се инкорпорират в среда от носители, която навлажнява кожата и не се изпарява веднага чрез инкорпорирането на подходящи солюбилизатори (напр. 1 % плуроник — Pluronic® L92). Поради тази причина носителите на изцяло водна основа трябва да бъдат избягвани.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Обработката на лимфни възли от отделни мишки дава възможност за оценка на вариабилността между животните и за статистическо сравнение на разликата между изпитваното вещество и измерванията в третираната с носителя контролна група (вж. точка 33). В допълнение на това е възможно оценяване на възможността за намаляване на броя на мишките в ПК група, когато са събрани индивидуални данни за отделните животни (22). Освен това някои регулаторни органи изискват събирането на индивидуални данни за отделните животни. Редовното събиране на индивидуални данни за отделните животни предоставя предимство по отношение на хуманното отношение към животните, като се избягва дублирането на изпитвания, което би било необходимо, ако резултатите за изпитваното вещество, които първоначално са събрани по един начин (напр. чрез сборни данни за животните), по-късно бъдат разглеждани от регулаторни органи с други изисквания (напр. за събиране на индивидуални данни за отделните животни).
                           
                        
                     Предварителното скринингово изпитване
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              При липсата на информация за определянето на най-високата доза за изпитване (вж. точка 18) следва да се извърши предварително скринингово изпитване, за да се определи подходящото ниво на дозата за изпитване при LLNA: DA. Целта на предварителното скринингово изпитване е да предостави насоки за избора на максималното ниво на дозата, което да бъде използвано в основното изпитване LLNA: DA, в случаите, когато не е налична информация за концентрацията, която причинява системна токсичност (вж. точка 24) и/или прекомерно локално кожно дразнене (вж. точка 23). Изпитваното максимално ниво на дозата следва да бъде 100 % от изпитваното вещество за течности или максималната възможна концентрация за твърди вещества или суспензии.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Предварителното скринингово изпитване се провежда при условия, идентични на тези в основното изпитване LLNA: DA, с изключение на това, че не се оценява пролиферацията на лимфните възли и могат да бъдат използвани по-малко животни за подложена на дадена доза група. Предлага се използването на едно или две животни за подложена на дадена доза група. Всички мишки се наблюдават ежедневно за всякакви клинични признаци за системна токсичност или локално дразнене на мястото на прилагане. Телесните тегла се записват преди изпитването и преди завършването му (ден 8). И двете уши на всяка мишка се наблюдават за еритема и резултатите се отчитат, като се използва таблица 1 (25). Измерванията на дебелината на ушите се правят, като се използва измервателен уред за дебелината (напр. цифров микрометър или измервателен уред за дебелина Peacock Dial) в ден 1 (преди дозирането), ден 3 (приблизително 48 часа след първата доза), ден 7 (24 часа преди приключването) и ден 8. Освен това дебелината на ушите в ден 8 би могла да бъде определена чрез продупчване на ушите и определяне на теглото на взетите продупчени части, което следва да се извърши след като животните бъдат умъртвени по хуманен начин. Показател за прекомерно локално дразнене е балова оценка на еритемата ≥ 3 и/или дебелина на ушите в размер на ≥ 25 % в който и било от дните с измервания (26) (27). Най-високата доза, избрана за основното изпитване LLNA: DA, ще бъде следващата по-ниска доза от поредицата от концентрации в предварителното скринингово изпитване (вж. точка 18), която не причинява системна токсичност и/или прекомерно локално кожно дразнене.
                              
                                 Таблица 1
                              
                              
                                 Оценки на еритемата
                              
                              
                                          Наблюдение
                                       
                                       
                                          Балова оценка
                                       
                                    
                                          Отсъствие на еритема
                                       
                                       
                                          0
                                       
                                    
                                          Много слаба еритема (едва забележима)
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                    
                                          Добре изразена еритема
                                       
                                       
                                          2
                                       
                                    
                                          Умерена до тежка еритема
                                       
                                       
                                          3
                                       
                                    
                                          Тежка еритема (силно зачервяване — с цвят на цвекло) до образуване на есхара, което не позволява да се отчете баловата оценка на еритемата
                                       
                                       
                                          4
                                       
                                    
                        
                              23.
                           
                           
                              В допълнение към увеличаване на дебелината на ушите с 25 % (26) (27), за идентифициране на дразнители при LLNA също така се използва статистически значимо увеличаване на дебелината на ушите при третираните мишки в сравнение с контролните мишки (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Въпреки това, макар че могат да възникнат статистически значими увеличения, когато дебелината на ушите е по-малка от 25 %, те не са конкретно свързани с прекомерното дразнене (30) (31) (32) (33) (34).
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Следните клинични наблюдения могат да показват системна токсичност (35), когато се използват като част от интегрална оценка, и поради това могат да показват максималното ниво на дозата, което да се използва в основното LLNA: DA: промени във функционирането на нервната система (напр. пилоерекция, атаксия, тремори и конвулсии); промени в поведението (напр. агресивност, промяна в хигиената на тялото, изразена промяна в нивото на активност); промени в начина на дишане (т.е. промени в честотата и интензивността на дишането като диспнея, задъханост и хрипове) и промени в консумацията на храна и вода. Освен това в оценката следва да бъдат взети предвид признаци на летаргия и/или липса на реакция и всякакви клинични признаци на нещо повече от лека или моментна болка и страдание или намаляване на телесното тегло > 5 % от ден 1 до ден 8, както и смъртността. Умиращите животни, както и животните, които показват признаци на силна болка или страдание, следва да бъдат умъртвени по хуманен начин (36).
                           
                        
                     Експериментален график на основното изпитване
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Експерименталният график на изпитването е, както следва:
                              —   Ден 1: индивидуално се идентифицира и записва теглото на всяко животно и всяко клинично наблюдение. Прилага се 1 % воден разтвор на натриев лаурил сулфат (SLS) в горната част на всяко ухо, като се използва четка, потопена в разтвора на SLS, за да се покрие цялата горна част на всяко ухо с четири-пет движения. Един час след третирането със SLS се прилага се 25 μ1 подходящо разреден разтвор на изпитваното вещество, както и самостоятелно носителят или положителната контрола (паралелна или скорошна въз основа на лабораторната политика, като се вземат предвид точки 11—15), в горната част на всяко ухо.
                              —   Дни 2, 3 и 7: повтаря се процедурата по предварително третиране и прилагане на изпитваното вещество с 1 % воден разтвор на SLS, извършена в ден 1.
                              —   Дни 4, 5, и 6: няма третиране.
                              —   Ден 8: записва се теглото на всяко животно и всяко клинично наблюдение. Приблизително 24—30 часа след началото на прилагането в ден 7, животните се умъртвяват по хуманен начин. Дрениращите аурикуларни (ушни) лимфни възли от всяко ухо на мишката се отрязват и обработват отделно в буферен физиологичен разтвор с фосфат (PBS) за всяко животно. Подробности и диаграми за идентифицирането и дисекцията на лимфните възлите могат да бъдат намерени в позоваване (22). За допълнително наблюдение на локалната кожна реакция при основното изпитване в протокола от изпитването могат да бъдат включени допълнителни параметри като оценяване на ушната еритема или измервания на дебелината на ушите (получени или чрез използването на измервателен уред за дебелината, или чрез продупчване на ушите и определяне на теглото на взетите продупчени части при аутопсията).
                           
                        
                     Приготвяне на клетъчни суспензии
                  
                  
                              26.
                           
                           
                              От всяка мишка се приготвя клетъчна суспензия от единични клетки, която се приготвя от клетки от лимфни възли (КЛВ), отрязани двустранно чрез поставяне на лимфните възли между две предметни стъкла и упражняване на лек натиск за раздробяване на възлите. След потвърждаване, че тъканта се е разстлала тънко, двете предметни стъкла се разделят. Тъканта се суспендира на двете предметни стъкла в PBS чрез задържане на всяко стъкло на ъгъла на лабораторната чаша и промиване с PBS, като едновременно с това тъканта се остъргва от стъклото с прибор за остъргване на клетки. Освен това лимфните възли на животните в отрицателната контролна група са малки, поради което е важно да се действа внимателно, за да избегнат каквито и да било изкуствени ефекти върху стойностите на SI. Следва да бъде използван общ обем от 1 mL PBS за промиване на двете предметни стъкла. Суспензията, приготвена от КЛВ в лабораторна чаша, следва да бъде хомогенизирана леко с прибор за остъргване на клетки. След това с микропипета се събира аликвотна част от 20 μL от суспензията, приготвена от КЛВ, като се внимава да не се отнеме от мембраната, която е видима с просто око, и впоследствие се смесва с 1,98 mL PBS за създаване на проба с обем 2 mL. След това се приготвя втора проба с обем 2 mL, като се използва същата процедура, така че да бъдат приготвени две проби за всяко животно.
                           
                        
                     Определяне на клетъчната пролиферация (измерване на съдържанието на аденозинтрифосфат (АТП) в лимфоцитите)
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Увеличенията в съдържанието на ATP в лимфните възли се измерват чрез метода луциферин/луцифераза, като се използва комплект за измерване на ATP, с който се измерва биолуминесценцията в относителни единици луминесценция (RLU). Времетраенето на изпитването от момента на умъртвяване на животното до измерване на съдържанието на ATP за всяко отделно животно следва да е еднакво, в рамките на приблизително 30 минути, тъй като се счита, че съдържанието на ATP постепенно намалява с времето след умъртвяване на животното (12). Поради това сериите от процедури от отрязването на аурикуларните (ушни) лимфни възли до измерването на ATP следва да бъдат завършени в рамките на 20 минути съгласно предварително определения времеви график, който е един и същ за всяко животно. Луминесценцията на ATP следва да бъде измерена във всяка проба с обем 2 mL, така че да бъдат събрани общо две измервания на ATP за всяко животно. След това се определя средната луминесценция на ATP и тя се използва в последващи изчисления (вж. точка 30).
                           
                        НАБЛЮДЕНИЯ
                  
                     Клинични наблюдения
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Всяка мишка следва да бъде внимателно наблюдавана поне веднъж дневно за всякакви клинични признаци за локално дразнене на мястото на прилагане или за системна токсичност. Всички наблюдения систематично се записват, като се водят дневници за всяка мишка. Плановете за наблюдение следва да включват критерии за бързото идентифициране на мишките, които показват признаци на системна токсичност, прекомерно локално кожно дразнене или корозивност на кожата, за да бъдат подложени на евтаназия (36).
                           
                        
                     Телесни тегла
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Както е посочено в точка 25, индивидуалните телесни тегла на животните следва да бъдат измерени в началото на изпитването и при планираното им умъртвяване по хуманен начин.
                           
                        ИЗЧИСЛЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
                  
                              30.
                           
                           
                              Резултатите за всяка третирана група се изразяват като средния SI. SI се получава чрез разделяне на средната стойност на RLU/мишка във всяка група, изследвана с изпитваното вещество, и в положителната контролна група, на средната стойност на RLU/мишка за контролната група, третирана с разтворителя/носителя. Средната стойност на SI за контролите, третирани с носителя, е единица.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              При процеса на вземане на решение даден резултат се счита за положителен, когато SI ≥ 1,8 (10). Силата на зависимостта доза—отговор, статистическата значимост и постоянството на разтворителя/носителя и ПК реакциите обаче също могат да бъдат използвани при определянето дали даден граничен резултат (т.е. стойност на SI между 1,8 и 2,5) да бъде обявен за положителен (2) (3) (37).
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              При гранична положителна реакция със стойност на SI между 1,8 и 2,5 ползвателите могат да вземат предвид допълнителна информация като например зависимостта доза—отговор, доказателство за системна токсичност или прекомерно дразнене и, където е подходящо, статистическата значимост заедно със стойностите на SI, с цел потвърждаване, че тези резултати са положителни (10). Следва да бъде обърнато внимание на различните свойства на изпитваното вещество, включително дали то има структурна връзка с познати кожни сенсибилизатори, дали причинява прекомерно кожно дразнене при мишките, както и какво е естеството на наблюдаваната зависимост доза—отговор. Тези и други съображения подробно се обсъждат на друго място (41).
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Събирането на данни на нивото на отделните мишки ще даде възможност за статистически анализ на наличието и степента на зависимостта доза—отговор в данните. Всяка статистическа оценка би могла да включва оценка на зависимостта доза—отговор, както и подходящо направени сравнения между изпитваните групи (напр. сравнения по двойки на дозираните групи с паралелната третирана с разтворителя/носителя контролна група). Статистическите анализи могат да включват например линейна регресия или изпитването на William за оценка на тенденциите в зависимостта доза—отговор и изпитването на Dunnett за сравнения по двойки. При избора на подходящ метод за статистически анализ, изследователят следва да обърне внимание на възможни различия в дисперсиите и други свързани с тях проблеми, които могат да наложат трансформация на данните или провеждане на непараметричен статистически анализ. Във всеки случай на изследователя може да му се наложи да извърши изчисления за SI и статистически анализи със и без определени точки с данни (понякога наричани „отклоняващи се стойности“).
                           
                        ДАННИ И ДОКЛАДВАНЕ
                  
                     Данни
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Данните следва да бъдат обобщени в табличен вид, като се посочват индивидуалните RLU стойности за отделните животни, средната стойност RLU/животно за групата, свързаните с тях граници на отклонение (напр. SD, SEM) и средният SI за всяка подложена на дадена доза група, сравнени с паралелната третирана с разтворителя/носителя контролна група.
                           
                        
                     Протокол от изпитването
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Протоколът от изпитването следва да включва следната информация:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Изпитвани и контролни химикали:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      идентификационни данни (напр. CAS и EC номера, ако са налични; източник, чистота, известни примеси, номер на партидата);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      физична форма и физикохимични свойства (напр. летливост, устойчивост, разтворимост);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ако е смес, състав и относително съотношение в проценти на елементите.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Разтворител/носител:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      идентификационни данни (чистота; концентрация, където е подходящо; използвано количество);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      обосновка за избора на носител.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Опитни животни:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      произход на мишките от порода CBA;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      микробиологичен статус на животните, ако е известен;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      брой и възраст на животните;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      произход на животните, условия на отглеждане, диета и т.н.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Условия на изпитване:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      източник, номер на партидата и данни, свързани с осигуряването на качеството/контрола на качеството на производителя за комплекта за ATP;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      подробна информация за приготвянето и прилагането на изпитваното вещество;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      обосновка за избора на доза (включително резултатите от предварителното скринингово изпитване, ако е проведено);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      използвани концентрации на изпитваното вещество и носителя и общо количество на приложеното изпитвано вещество;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      подробна информация за качеството на храната и водата (включително вид/източник на диетата, водоизточник);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      подробна информация за графиците на третиране и вземане на проби;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      методи за измерване на токсичността;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      критерии за считане на изпитванията за положителни или отрицателни;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      подробна информация за всякакви отклонения от протокола и обяснение как отклонението влияе на планирането на изпитването и на резултатите от него.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Проверка на надеждността:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      обобщение на резултатите от последната проверка на надеждността, включително информация за използваните изпитвано вещество, концентрация и носител;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      данни за паралелни и/или предишни положителни контроли и паралелни отрицателни контроли (разтворител/носител) за лабораторията, провеждаща изпитването;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ако не е била включена паралелна положителна контрола, се посочва датата и лабораторният доклад на най-скорошното периодично изпитване с положителна контрола и доклад, в който подробно се представят данните от предишни изпитвания с положителни контроли на лабораторията и който обосновава защо не се провежда паралелна положителна контрола.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Резултати:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      индивидуални тегла на мишките в началото на дозирането и при планираното им умъртвяване; както и средният и граница на отклонение (напр. SD, SEM) за всяка третирана група;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      признаци на токсичност и време на настъпването им, включително кожно дразнене на мястото на прилагане, ако има такова, за всяко животно;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      време на умъртвяване на животното и време на измерване на ATP за всяко животно;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      таблица на RLU стойностите и стойностите на SI за отделните мишки за всяка третирана с доза група;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      средната стойност и съответна граница на отклонение (напр. SD, SEM) за RLU/мишка за всяка третирана група и резултатите от анализа на отклоняващите се стойности за всяка третирана група;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      изчисленият SI и подходяща мярка за вариабилността, която отчита вариабилността между животните както в групата с изпитваното вещество, така и в контролната група;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      зависимостта доза—отговор;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      статистически анализи, където е подходящо;
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Обсъждане на резултатите:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      кратък коментар на резултатите, анализ на зависимостта доза—отговор и статистически анализ, където е подходящо, със заключение дали изпитваното вещество следва да се счита за кожен сенсибилизатор.
                                                   
                                                
                                    
                        ЛИТЕРАТУРА
                  
                              (1)
                           
                           
                              OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline № 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation. Food Chem, Toxicol., 34, 999-1002.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem, Toxicol., 34, 985-997.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327-333.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, 49-59.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 258-273.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 274-286.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process.Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 249-257.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication № 10-7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm]
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf].
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Characterization and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint.J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 1-10.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph node assay based on adenosine triphosphate measurement. J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 11-26.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline № 406, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Meth., 160, 81-88.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP. J. Immunol. Meth., 72, 127-132.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Development of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacterial cell number from a mixed population. Biomat., 24, 27-34.
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, enzymes, and metabolites. Meth. Enzymol., 305, 346-370.
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]
                           
                        
                              (23)
                           
                           
                              McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71-89.
                           
                        
                              (24)
                           
                           
                              Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13-31.
                           
                        
                              (25)
                           
                           
                              OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline № 404, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (26)
                           
                           
                              Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235.
                           
                        
                              (27)
                           
                           
                              ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]
                           
                        
                              (28)
                           
                           
                              Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206.
                           
                        
                              (29)
                           
                           
                              Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94.
                           
                        
                              (30)
                           
                           
                              Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245-256.
                           
                        
                              (31)
                           
                           
                              Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug Chem. Toxicol., 22, 491-506.
                           
                        
                              (32)
                           
                           
                              Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68.
                           
                        
                              (33)
                           
                           
                              Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728.
                           
                        
                              (34)
                           
                           
                              Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028.
                           
                        
                              (35)
                           
                           
                              ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm]
                           
                        
                              (36)
                           
                           
                              OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment № 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (37)
                           
                           
                              Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ. Health, 53 563-79.
                           
                        
                              (38)
                           
                           
                              OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment № 34, ENV/JM/MONO_(2005)14, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                     Допълнение 1
                     ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                     Точност: степента на близост на съвпадение на резултатите от метода за изпитване и приетите референтни стойности. Това е мярка за ефективността на метода за изпитване и един от аспектите на неговата приложимост. Терминът често се използва взаимозаменяемо с термина „съвпадение“, за да се обозначи делът на верните резултати на даден метод за изпитване (38).
                     Еталонно вещество: вещество, което предизвиква или не предизвиква сенсибилизация, използвано като норма за сравнение с изпитваното вещество. Едно еталонно вещество следва да притежава следните свойства: i) постоянен и надежден източник; ii) структурно и функционално сходство с класа на изпитваните вещества; iii) известни физикохимични характеристики; iv) потвърждаващи данни за известни въздействия; и v) известна ефективност за постигане на желаната реакция.
                     Вещество с фалшиво отрицателен резултат: изпитвано вещество, неправилно определено като даващо отрицателен резултат или неактивно при даден метод за изпитване, докато в действителност то дава положителен резултат или е активно.
                     Вещество с фалшиво положителен резултат: изпитвано вещество, неправилно определено като даващо положителен резултат или активно от дадено изпитване, докато в действителност то дава отрицателен резултат или е неактивно.
                     Опасност: потенциалът за получаване на неблагоприятен за здравето или екологичен ефект. Неблагоприятният ефект се проявява само при достатъчно голяма степен на експозиция.
                     Междулабораторна възпроизводимост: мярка за степента, в която различните квалифицирани лаборатории, които използват един и същи протокол и изпитват едни и същи изпитвани вещества, могат да получат качествено и количествено сходни резултати. Междулабораторната възпроизводимост се определя по време на процесите на предварително валидиране и на валидиране и показва степента, в която изпитването може да бъде трансферирано успешно между лабораториите, също наричана възпроизводимост между лабораториите (38).
                     Вътрешнолабораторна възпроизводимост: определяне на степента, в която квалифицирани служители в рамките на една и съща лаборатория могат да възпроизведат успешно резултатите, като използват конкретен протокол в различни моменти. Също наричана възпроизводимост в рамките на лабораторията (38).
                     Отклоняваща се стойност: отклоняващата се стойност е наблюдение, което е маркирано като различно от други стойности в произволно избрана извадка от популация.
                     Осигуряване на качеството: управленски процес, при който спазването на лабораторни стандарти за изпитване, изисквания и процедури за водене на дневници, както и точността на трансфера на данни, се оценява от лица, които са независими от лицата, изпълняващи изпитването.
                     Надеждност: мярка за степента, в която даден метод за изпитване може да се извърши възпроизводимо в една и съща лаборатория и между различни лаборатории в течение на времето, когато се използва един и същи протокол. Надеждността се оценява, като се изчислява вътрешно- и междулабораторната възпроизводимост (38).
                     Кожна сенсибилизация: имунологичен процес, който възниква, когато податлив индивид е локално изложен на химичен алерген с предизвикващо действие, който предизвиква кожна имунна реакция, водеща до развиването на контактна сенсибилизация.
                     Стимулационен индекс (SI): стойност, изчислявана за оценка на потенциала на дадено изпитвано вещество да предизвиква кожна сенсибилизация, която представлява съотношението на пролиферацията в третираните групи спрямо тази в паралелната третирана с носителя контролна група.
                     Изпитвано вещество (също наричано изпитван химикал): всяко вещество или смес, изпитвано(а) чрез използването на настоящия метод за изпитване.
                  
                  
                     Б.51.   КОЖНА СЕНСИБИЛИЗАЦИЯ: ИЗСЛЕДВАНЕ НА ЛОКАЛНИТЕ ЛИМФНИ ВЪЗЛИ: BRDU-ELISA
                  
                  ВЪВЕДЕНИЕ
                  
                              1.
                           
                           
                              Указанията за изпитването на химикали на ОИСР и методите за изпитване на ЕС периодично се преразглеждат с оглед на научния прогрес, промяната на регулаторните нужди и съображенията, свързани с хуманното отношение към животните. Първият метод за изпитване (МИ) (Б.42) за определянето на кожна сенсибилизация при мишки — Изследването на локалните лимфни възли (LLNA, Указание за изпитване 429 на ОИСР) — беше преработен (1 и глава Б.42 от настоящото приложение). Публикувана е подробна информация за валидирането на LLNA и е направен преглед на съответните научни трудове (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). При изследването LLNA се използва радиоизотопен тимидин или йод за измерване на пролиферацията на лимфоцитите и поради това изследването има ограничена употреба, когато придобиването, използването или обезвреждането на радиоактивни вещества е проблематично. LLNA: BrdU-ELISA [Ензимно свързан имуносорбентен анализ ELIЅА] е нерадиоактивно изменение на МИ LLNA, при което се използва 5-бромо-2-деоксиуридин (BrdU) (№ 59-14-3 съгласно химичния регистър на Службата за химични индекси [CAS]), който не е радиомаркиран, в базирана на ELISA система за изпитване с цел измерване на пролиферацията на лимфоцитите. LLNA: BrdU-ELISA е валидиран, преработен и препоръчан от независима научна международна група за партньорска оценка, тъй като се счита за полезен за идентифициране на химикалите, които са кожни сенсибилизатори, както и на химикалите, които не предизвикват кожна сенсибилизация, с известни ограничения (10) (11) (12). Този МИ е предназначен за оценка на потенциала на химикалите (вещества и смеси) да предизвикват кожна сенсибилизация при животни. Глава Б.6 от настоящото приложение и Указание за изпитване 406 на ОИСР използват изследвания върху морски свинчета, по-специално максимизиращ тест върху морски свинчета и тест на Buehler (13). LLNA (глава Б.42 от настоящото приложение; Указание за изпитване 429 на ОИСР) и двете му нерадиоактивни изменения: LLNA: BrdU-ELISA (глава Б.51 от настоящото приложение; Указание за изпитване 442 Б на ОИСР) и LLNA: DA (глава Б.50 от настоящото приложение; Указание за изпитване 442 А на ОИСР) — всички те предоставят предимство спрямо изследванията върху морски свинчета в Б.6 и Указание за изпитване 406 на ОИСР (13), що се отнася до намаляването и усъвършенстването на използването на животни.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Подобно на LLNA, методът LLNA: BrdU-ELISA проучва индукционната фаза при кожна сенсибилизация и осигурява количествени данни, подходящи за оценяване на зависимостта доза—отговор. Освен това способността за откриване на кожни сенсибилизатори без да е необходимо използването на радиомаркер за ДНК елиминира потенциалната възможност за професионална експозиция на радиоактивност, както и проблемите, свързани с обезвреждането на отпадъци. Това от своя страна може да даде възможност за повишаване на използването на мишки за откриване на кожни сенсибилизатори, което още повече би могло да намали използването на морски свинчета за изпитване на потенциала за кожна сенсибилизация (т.е. Б.6; Указание за изпитване 406 на ОИСР) (13).
                           
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                  
                              3.
                           
                           
                              Използваните определения са дадени в допълнение 1.
                           
                        ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ
                  
                              4.
                           
                           
                              LLNA: BrdU-ELISA е модифициран метод LLNA за определяне на химикалите, които са потенциални кожни сенсибилизатори, с известни ограничения. Това не означава непременно, че при всички случаи следва да се използва LLNA: BrdU-ELISA вместо LLNA или изследванията върху морски свинчета (т.е. глава Б.6, Указание за изпитване 406 на ОИСР) (13), а по-скоро че изпитването е равностойно и може да бъде използвано като алтернатива, при която обикновено положителните и отрицателните резултати вече не изискват допълнително потвърждаване (10) (11). Лабораторията, провеждаща изпитването, следва да вземе предвид цялата налична информация за изпитваното вещество преди провеждането на изпитването. Тази информация ще включва идентичността и химичната структура на изпитваното вещество; неговите физикохимични свойства; резултатите от всякакви други in vitro или in vivo токсикологични изпитвания на изпитваното вещество; и токсикологични данни за структурно свързани вещества. Тази информация следва да се вземе предвид, за да се определи дали LLNA: BrdU-ELISA е подходящо за изпитваното веществото (с оглед на несъвместимостта на ограничен брой видове химикали с LLNA: BrdU-ELISA [вж. точка 5]) и като помощно средство при избора на доза.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              LLNA: BrdU-ELISA е in vivo метод и вследствие на това няма да доведе до преустановяване на използването на животни при оценяването на алергичната контактна сенсибилизираща активност. Той обаче има потенциала да намали използването на животни за тази цел в сравнение с изследванията върху морски свинчета (Б.6; Указание за изпитване 406 на ОИСР) (13). Освен това LLNA: BrdU-ELISA предлага съществено усъвършенстване на начина, по който животните се използват за изпитване на алергичната контактна сенсибилизация, тъй като за разлика от глава Б.6 и Указание за изпитване 406 на ОИСР, LLNA: BrdU-ELISA не изисква да се разкрие кожна свръхчувствителност след предизвикване. Освен това LLNA: BrdU-ELISA не изисква употребата на адювант, както в случаите на максимизиращ тест върху морски свинчета (глава Б.6 от настоящото приложение, 13). По такъв начин LLNA: BrdU-ELISA намалява страданието на животните. Въпреки предимствата на LLNA: BrdU-ELISA пред Б.6 и Указание за изпитване 406 на ОИСР (13), съществуват определени ограничения, които могат да доведат до необходимост от използване на Б.6 или на Указание за изпитване 406 на ОИСР (напр. изпитването на определени метали, погрешно положителни резултати при определени кожни дразнители) [например някои видове повърхностноактивни вещества] (6) (1 и глава Б.42 от настоящото приложение) или разтворимостта на изпитваното вещество). Освен това химичните класове или вещества, съдържащи функционални групи, за които е доказано, че водят до възможно объркване (15), могат да доведат до необходимост от използване на изследванията върху морски свинчета (т.е. Б.6; Указание за изпитване 406 на ОИСР (13). Установените за LLNA ограничения (1 и глава Б.42 от настоящото приложение) се препоръчва да бъдат прилагани и по отношение на LLNA: BrdU-ELISA (10). С изключение на тези установени ограничения, LLNA: BrdU-ELISA следва да се прилага за изпитване на всички химикали, освен ако съществуват свързани с тези химикали свойства, които могат да повлияят на точността на LLNA: BrdU-ELISA. Освен това следва да бъде обърнато внимание на възможността за гранични положителни резултати, когато са получени стойности на стимулационния индекс (SI) между 1,6 и 1,9 (вж. точки 31—32). Това се основава на базата данни от валидирането, състояща се от 43 вещества, използващи SI ≥ 1,6 (вж. точка 6), за които изследването LLNA: BrdU-ELISA правилно е определило всички 32 сенсибилизатора при LLNA, но неправилно е определило две от 11-те вещества, които не са сенсибилизатори при LLNA със стойности на SI между 1,6 и 1,9 (т.е гранично положителни) (10). При все това, тъй като същият набор от данни беше използван за определяне на стойностите на SI и изчисляване на прогнозните способности на изпитването, посочените резултати могат да представляват надценяване на реалните прогнозни способности.
                           
                        ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
                  
                              6.
                           
                           
                              Основният принцип, залегнал в LLNA: BrdU-ELISA, е, че сенсибилизаторите предизвикват пролиферация на лимфоцитите в лимфните възли, дрениращи мястото на прилагане на изпитваното вещество. Тази пролиферация е пропорционална на дозата и на действието на приложения алерген и осигурява лесен начин за получаване на количествено измерване на сенсибилизацията. Пролиферацията се измерва чрез сравняване на средната пролиферация във всяка изпитвана група със средната пролиферация в третираната с носителя контролна група (КН). Съотношението на средната пролиферация във всяка третирана група спрямо тази в паралелната третирана с носителя контролна група, наречено SI, е определено и следва да бъде ≥ 1,6, преди да се гарантира по-нататъшната оценка на тест-субстанцията като потенциален кожен сенсибилизатор. Описаните тук процедури се основават на измерването на съдържанието на BrdU за показване на увеличения брой на пролифериращите клетки в дрениращите аурикуларни (ушни) лимфни възли. BrdU е аналогичен на тимидина и по подобен начин е инкорпориран в ДНК-то на пролифериращите клетки. Инкорпорирането на BrdU се измерва чрез ELISA, при който се използва специфично за BrdU антитяло, което също е маркирано с пероксидаза. Когато се добави субстратът, пероксидазата реагира със субстрата и произвежда цветен продукт, който количествено се определя при специфична абсорбция, като се използва ридер за микротитърна плака.
                           
                        ОПИСАНИЕ НА ИЗПИТВАНЕТО
                  
                     Избор на животински вид
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Видът животни, избран за това изследване, е мишка. Изследванията за валидиране на LLNA: BrdU-ELISA бяха проведени изключително с мишки от порода CBA/JN, която поради това се счита за предпочитаната порода (10) (12). Използват се млади възрастни мишки от женски пол, които не са раждали и не са бременни. В началото на изследването животните следва да бъдат на възраст 8—12 седмици и отклоненията в теглото им следва да бъдат минимални и да не превишават 20 % от средното тегло. Алтернативно могат да бъдат използвани животни от други породи и от мъжки пол, когато има достатъчно събрани данни, които доказват, че не съществува реакция при LLNA: BrdU-ELISA, която да показва съществени различия, обусловени от пола и/или породата.
                           
                        
                     Условия на отглеждане и хранене
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Мишките следва да бъдат групово отглеждани (16), освен ако е предоставена подходяща научна обосновка за индивидуално отглеждане на мишките. Температурата в стаята на опитните животни следва да бъде 22 ± 3 °C. Въпреки че относителната влажност следва да бъде поне 30 % и е препоръчително тя да не надвишава 70 % освен по време на почистване на стаята, целта е относителната влажност да се поддържа в интервала 50—60 %. Осветлението следва да бъде изкуствено, като последователността е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. За храненето могат да се използват обичайните лабораторни диети с неограничен достъп до вода за пиене.
                           
                        
                     Подготовка на животните
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Животните се избират произволно, маркират се, за да е възможно индивидуалното им идентифициране (но не и чрез маркиране на ушите им) и се оставят в клетките си поне пет дни преди започване на дозирането, за да се аклиматизират към лабораторните условия. Преди да започне третирането, всички животни се изследват, за да се потвърди отсъствието на видими кожни лезии.
                           
                        
                     Приготвяне на разтворите за дозиране
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Твърдите химикали следва да се разтворят или суспендират в разтворители/носители и, ако е необходимо, да се разредят преди прилагането им върху ушите на мишките. Течните химикали могат да се прилагат в чист или разреден вид преди дозирането. Неразтворимите химикали като тези, които обикновено се наблюдават в медицинските изделия, следва да се подложат на засилена екстракция в подходящ разтворител, за да се проявят всички екстрахируеми съставки за изпитване преди прилагането им върху ушите на мишките. Изпитваните вещества следва да се приготвят ежедневно, освен ако данните за устойчивостта им показват, че те могат да се съхраняват.
                           
                        
                     Проверка на надеждността
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Положителните контролни химикали (ПК) се използват за доказване на подходящо провеждане на изпитването чрез реагиране с достатъчна и възпроизводима чувствителност като сенсибилизиращо изпитвано вещество, за което степента на реакция е добре характеризирана. Препоръчва се включването на паралелна положителна контрола (ПК), защото тя доказва компетентността на лабораторията успешно да провежда всяко изследване и позволява оценка на вътрешно- и междулабораторната възпроизводимост и сравнимост. Някои регулаторни органи също изискват ПК за всяко изпитване и поради това е препоръчително потребителите да се консултират със съответните органи преди провеждането на LLNA: BrdU-ELISA. В съответствие с това се насърчава рутинното използване на паралелна положителна контрола, за да се избегне необходимостта от изследване на допълнителни животни за изпълняването на тези изисквания, които биха могли да възникнат в резултат на използването на периодична положителна контрола (вж. точка 12). ПК следва да предизвика положителна LLNA: BrdU-ELISA реакция при ниво на експозиция, при което се очаква нарастване на стимулационния индекс SI ≥ 1,6 спрямо отрицателната контролна група (ОК). Дозата за ПК следва да бъде избрана така, че да не причинява прекомерно кожно дразнене или системна токсичност и индукцията да е възпроизводима, но не прекомерна (например SI > 14 би се считало за прекомерно). Предпочитаните ПК са 25 % хексилканелен алдехид (CAS № 101-86-0) и 25 % евгенол (CAS № 97-53-0) в ацетон: зехтин (4:1, об./об.). Може да има обстоятелства, при които след направено подходящо обосноваване, могат да бъдат използвани други положителни контроли, отговарящи на горепосочените критерии.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              При все че е препоръчително постоянното включване на паралелна положителна контролна (ПК) група, могат да съществуват ситуации, при които периодичното изпитване (т.е. на интервали ≤ 6 месеца) на ПК може да бъде подходящо за лаборатории, които редовно провеждат LLNA: BrdU-ELISA (т.е. провеждат LLNA: BrdU-ELISA с честота не по-малко от веднъж месечно) и които имат създадена база данни от предишни изпитвания с ПК, доказваща способността на лабораторията да получава възпроизводими и точни резултати с положителните контроли. Подходяща компетентност за провеждане на LLNA: BrdU-ELISA може да бъде успешно доказана чрез получаването на последователни положителни резултати с ПК при най-малко 10 независими изпитвания, проведени в рамките на разумен период от време (т.е. по-малко от една година).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Винаги следва да се включва паралелна ПК група, когато има процедурна промяна в LLNA: BrdU-ELISA (например промяна на обучения персонал, промяна на материалите и/или реагентите, с които се провежда методът за изпитване, промяна на оборудването, с което се провежда методът за изпитване, промяна в произхода на опитните животни), като тези промени следва да бъдат документирани в лабораторни доклади. Следва да бъде обърнато внимание на въздействието на тези промени върху годността на предварително създадената база данни от предишни изпитвания с оглед да се определи необходимостта от създаване на нова база данни от предишни изпитвания за документиране на последователността на резултатите с ПК.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Изследователите следва да са наясно, че решението за периодично провеждане на изпитване с положителна контрола вместо паралелното му провеждане има последици върху годността и приемливостта на отрицателните резултати от изпитването, получени без паралелна положителна контрола по време на интервала между всяко периодично изпитване с положителна контрола. Например, ако се получи фалшиво отрицателен резултат при периодичното изпитване с положителна контрола, отрицателните резултати за изпитваното вещество, получени по време на интервала между последното приемливо периодично изпитване с положителна контрола и неприемливото периодично изпитване с положителна контрола, могат да бъдат поставени под съмнение. Изводите относно тези резултати следва да бъдат внимателно взети предвид при определяне дали да се включват паралелни ПК или само да се провеждат периодични ПК. Следва да се обърне внимание и на използването на по-малко животни в паралелната ПК група, когато това е научно обосновано и ако лабораторията докаже, въз основа на конкретните за лабораторията данни от предишни изпитвания, че могат да бъдат използвани по-малко мишки (17).
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Въпреки че положителната контрола следва да бъде изпитвана в носителя, за който е известно, че при прилагането му се получава постоянна реакция (напр. ацетон: зехтин; 4:1, об./об.), може да има определени регулаторни ситуации, при които също така ще бъде необходимо провеждането на изпитване в нестандартен носител (клинично/химично отговаряща формулация) (18). Ако паралелната положителна контрола се изпитва в различен носител от изпитваното вещество, тогава следва да бъде включена отделна третирана с носителя контролна група за паралелната положителна контрола.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              В случаи, при които се оценяват изпитвани вещества от определен химичен клас или спектър от реакции, еталонните вещества също могат да бъдат от полза, за да се докаже, че методът за изпитване функционира правилно по отношение на откриването на потенциала за кожна сенсибилизация на тези видове изпитвани вещества. Подходящите еталонни вещества следва да притежават следните свойства:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          структурно и функционално сходство с класа на изпитваното вещество;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          известни физични/химични характеристики;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          подкрепящи данни от LLNA: BrdU-ELISA;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          подкрепящи данни от други животински модели и/или от хора.
                                       
                                    
                        ПРОЦЕДУРА НА ИЗПИТВАНЕ
                  
                     Брой на животните и нива на дозите
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Използват се минимум четири животни за подложена на дадена доза група, при минимум три концентрации на изпитваното вещество, плюс паралелна отрицателна контролна група (ОК), третирана само с носителя на изпитваното вещество, както и ПК група (паралелна или скорошна въз основа на лабораторната политика, като се вземат предвид точки 11—15). Следва да се обмисли изпитването на множество дози на положителната контрола, особено когато не се провеждат редовни изпитвания на ПК. Животните от контролните групи следва да бъдат отглеждани и третирани по начин, идентичен с този, на животните от третираните групи, с изключение на това, че липсва третиране с изпитваното вещество.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Изборът на доза и носител следва да бъде основан на препоръките, посочени в библиографски бележки 2 и 19. Последователните дози обикновено се избират от подходяща поредица от концентрации като например 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % и т.н. Изборът на използваната поредица от концентрации следва да бъде придружен от подходяща научна обосновка. Цялата съществуваща токсикологична информация (напр. остра токсичност и кожно дразнене) и информацията за структурните и физикохимичните свойства на представляващото интерес изпитвано вещество (и/или структурно свързаните вещества) следва да бъде взета предвид в случай на наличност при избора на трите последователни концентрации, така че най-високата концентрация да увеличава в максимална степен експозицията, като същевременно се избягва системната токсичност и/или прекомерното локално кожно дразнене (19) (20) и глава Б.4 от настоящото приложение). При липсата на такава информация може да е необходимо първоначално предварително скринингово изпитване (вж. точки 21—24).
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Носителят не следва да пречи или да оказва влияние на резултата от изпитването и следва да бъде избран въз основа на способността му максимално да повишава разтворимостта, за да се получи най-високата постижима концентрация, като същевременно се приготвя подходящ разтвор/суспензия за прилагане на изпитваното вещество. Препоръчителните носители са ацетон: зехтин (4:1, об./об.), N,N-диметилформамид, метилетилкетон, пропилен гликол и диметилсулфоксид (6), но могат да бъдат използвани и други, при условие че се предостави достатъчна научна обосновка. При определени ситуации може да бъде необходимо да се използват клинично обусловени разтворители или търговска формулация, в която изпитваното вещество се маркира като допълнителна контрола. Следва да се обърне особено внимание, за да се гарантира, че хидрофилните изпитвани вещества се инкорпорират в среда от носители, която навлажнява кожата и не се изпарява веднага чрез инкорпорирането на подходящи солюбилизатори (напр. 1 % плуроник — Pluronic® L92). Поради тази причина носителите на изцяло водна основа трябва да бъдат избягвани.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Обработката на лимфни възли от отделни мишки дава възможност за оценка на вариабилността между животните и за статистическо сравнение на разликата между изпитваното вещество и измерванията в третираната с носителя контролна група (вж. точка 33). В допълнение към това оценяването на възможността за намаляване на броя на мишките в ПК група е възможно единствено когато се събират индивидуални данни за отделните животни (17). Освен това някои регулаторни органи изискват събирането на индивидуални данни за отделните животни. Редовното събиране на индивидуални данни за отделните животни предоставя предимство по отношение на хуманното отношение към животните, като се избягва дублирането на изпитвания, което би било необходимо, ако резултатите за изпитваното вещество, които първоначално са събрани по един начин (напр. чрез сборни данни за животните), по-късно бъдат разгледани от регулаторни органи с други изисквания (напр. за събиране на индивидуални данни за отделните животни).
                           
                        
                     Предварително скринингово изпитване
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              При липсата на информация за определянето на най-високата доза за изпитване (вж. точка 18) следва да се извърши предварително скринингово изпитване, за да се определи подходящото ниво на дозата за изпитване при LLNA: BrdU-ELISA. Целта на предварителното скринингово изпитване е да предостави насоки за избора на максималното ниво на дозата, което да бъде използвано в основното изпитване LLNA: BrdU-ELISA, когато не е налична информация за концентрацията, причиняваща системна токсичност (вж. точка 24) и/или прекомерно локално кожно дразнене (вж. точка 23). Изпитваното максимално ниво на дозата следва да бъде 100 % от изпитваното вещество за течности или максималната възможна концентрация за твърди вещества или суспензии.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Предварителното скринингово изпитване се провежда при условия, идентични на тези в основното изпитване LLNA: BrdU-ELISA, с изключение на това, че не се оценява пролиферацията на лимфните възли и могат да бъдат използвани по-малко животни за подложена на дадена доза група. Предлага се използването на едно или две животни за подложена на дадена доза група. Всички мишки се наблюдават ежедневно за всякакви клинични признаци за систематична токсичност или локално дразнене на мястото на прилагане. Телесните тегла се записват преди изпитването и преди завършването му (ден 6). И двете уши на всяка мишка се наблюдават за еритема и резултатите се отчитат, като се използва таблица 1 (20) и глава Б.4 от настоящото приложение). Измерванията на дебелината на ушите се правят, като се използва измервателен уред за дебелината (напр. цифров микрометър или измервателен уред за дебелината Peacock Dial) в ден 1 (преди дозирането), ден 3 (приблизително 48 часа след първата доза) и ден 6. Освен това в ден 6 дебелината на ушите би могла да бъде определена чрез продупчване на ушите и определяне на теглото на взетите продупчени части, което следва да се извърши след като животните бъдат умъртвени по хуманен начин. Показател за прекомерното локално дразнене е балова оценка на еритемата ≥ 3 и/или дебелина на ушите в размер на ≥ 25 % в който и било от дните с измервания (21) (22). Най-високата доза, избрана за основното изпитване LLNA: BrdU-ELISA, ще бъде следващата по-ниска доза от поредицата от концентрации в предварителния скрининг (вж. точка 18), която не причинява системна токсичност и/или прекомерно локално кожно дразнене.
                              
                                 Таблица 1
                              
                              
                                 Оценки на еритемата
                              
                              
                                          Наблюдение
                                       
                                       
                                          Балова оценка
                                       
                                    
                                          Отсъствие на еритема
                                       
                                       
                                          0
                                       
                                    
                                          Много слаба еритема (едва забележима)
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                    
                                          Добре изразена еритема
                                       
                                       
                                          2
                                       
                                    
                                          Умерена до тежка еритема
                                       
                                       
                                          3
                                       
                                    
                                          Тежка еритема (силно зачервяване — с цвят на цвекло) до образуване на есхара, което не позволява да се отчете баловата оценка на еритемата
                                       
                                       
                                          4
                                       
                                    
                        
                              23.
                           
                           
                              В допълнение към увеличаване на дебелината на ушите с 25 % (21) (22), за идентифициране на дразнители при LLNA също така се използва статистически значимо увеличаване на дебелината на ушите при третираните мишки в сравнение с контролните мишки (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). Въпреки това, макар че могат да възникнат статистически значими увеличения, когато дебелината на ушите е по-малка от 25 %, те не са конкретно свързани с прекомерното дразнене (25) (26) (27) (28) (29).
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Следните клинични наблюдения могат да показват систематична токсичност (30), когато се използват като част от интегрирана оценка, и поради това могат да показват максималното ниво на дозата, което да се използва в основното LLNA: BrdU-ELISA: промени във функционирането на нервната система (напр. пилоерекция, атаксия, тремори и конвулсии); промени в поведението (напр. агресивност, промяна в хигиената на тялото, изразена промяна в нивото на активност); промени в начина на дишане (т.е. промени в честотата и интензивността на дишането като диспнея, задъханост и хрипове) и промени в консумацията на храна и вода. Освен това в оценката следва да бъдат взети предвид признаци на летаргия и/или липса на реакция и всякакви клинични признаци на нещо повече от лека или момента болка и страдание или намаляване на телесното тегло > 5 % от ден 1 до ден 6, както и смъртността. Умиращите животни, както и животните, които показват признаци на силна болка или страдание, следва да бъдат умъртвени по хуманен начин (31).
                           
                        
                     Експериментален график на основното изпитване
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Експерименталният график на изпитването е, както следва:
                              —   Ден 1: индивидуално се идентифицира и записва теглото на всяко животно и всяко клинично наблюдение. Прилага се 25 μL подходящо разреден разтвор на изпитваното вещество, както и самостоятелно носителят или положителната контрола (паралелна или скорошна въз основа на лабораторната политика, като се вземат предвид точки 11—15), в горната част на всяко ухо.
                              —   Дни 2 и 3: повтаря се процедурата по прилагане, извършена в ден 1.
                              —   Ден 4: няма третиране.
                              —   Ден 5: инжектира се 0,5 mL (5 mg/мишка) разтвор на BrdU (10 mg/mL) вътрешно перитонеално.
                              —   Ден 6: записва се теглото на всяко животно и всяко клинично наблюдение. Приблизително 24 часа (24 h) след инжектирането на BrdU животните се умъртвяват по хуманен начин. Дрениращите аурикуларни (ушни) лимфни възли от всяко ухо на мишката се отрязват и обработват отделно в буферен физиологичен разтвор с фосфат (PBS) за всяко животно. Подробности и диаграми за идентифицирането и дисекцията на лимфните възлите могат да бъдат намерени в позоваване (17). За допълнително наблюдение на локалната кожна реакция при основното изпитване в протокола от изпитването могат да бъдат включени допълнителни параметри като оценяване на ушната еритема или измервания на дебелината на ушите (получени или чрез използването на измервателен уред за дебелината, или чрез продупчване на ушите и определяне на теглото на взетите продупчени части при аутопсията).
                           
                        
                     Приготвяне на клетъчни суспензии
                  
                  
                              26.
                           
                           
                              Клетъчна суспензия от единични клетки се приготвя от клетки от лимфните възли (КЛВ), отрязани двустранно от всяка мишка, чрез леко механично разпръсване през 200-микронови отвори на мрежа от неръждаема стомана или чрез друга приемлива техника за получаване на клетъчна суспензия от единични клетки (напр. използване на пластмасово чукало за еднократна употреба за раздробяване на лимфните възли с последващото им преминаване през найлонова мрежа със 70-микронови отвори). Процедурата за приготвяне на суспензията от КЛВ е от критична важност в това изпитване и поради това всеки оператор следва да усвои предварително уменията за това. Освен това лимфните възли на животните в отрицателната контролна група са малки, поради което е важно да действате внимателно, за да избегнете каквито и да било изкуствени ефекти върху стойностите на SI. Във всеки случай, целевият обем на суспензията, приготвена от КЛВ, следва да бъде приспособен към определен оптимизиран обем (прибл. 15 mL). Оптимизираният обем се основава на постигане на средната абсорбция на отрицателната контролна група в интервала 0,1—0,2.
                           
                        
                     Определяне на клетъчната пролиферация (измерване на съдържанието на BrdU в ДНК на лимфоцитите)
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              BrdU се измерва с метода ELISA чрез използване на промишлен комплект (напр. Roche Applied Science, Mannheim, Germany, каталожен номер 11 647 229 001). Накратко, 100 μL от суспензията, приготвена от клетки от лимфните възли (КЛВ), се добавя трикратно в резервоарите на микроплата с плоско дъно. След фиксиране и денатурация на КЛВ, във всеки резервоар се добавя антитяло анти-BrdU и се дава възможност за реакция. Впоследствие антитялото анти-BrdU се премахва чрез промиване и след това се добавя разтвор субстрат и се позволява образуване на хромоген. След това се измерва абсорбция на 370 nm с референтна дължина на вълната от 492 nm. Във всички случаи условията за провеждане на изпитването следва да бъдат оптимизирани (вж. точка 26).
                           
                        НАБЛЮДЕНИЯ
                  
                     Клинични наблюдения
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Всяка мишка следва да бъде внимателно наблюдавана поне веднъж дневно за всякакви клинични признаци за локално дразнене на мястото на прилагане или за систематична токсичност. Всички наблюдения систематично се записват, като се водят дневници за всяка мишка. Плановете за наблюдение следва да включват критерии за бързото идентифициране на мишките, които показват признаци на системна токсичност, прекомерно локално кожно дразнене или корозивност на кожата, за да бъдат подложени на евтаназия (31).
                           
                        
                     Телесни тегла
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Както е посочено в точка 25, индивидуалните телесни тегла на животните следва да бъдат измерени в началото на изпитването и при планираното умъртвяване на животните по хуманен начин.
                           
                        ИЗЧИСЛЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
                  
                              30.
                           
                           
                              Резултатите за всяка третирана група се изразяват като среден SI. SI се получава чрез разделяне на средната стойност на индекса на маркиране на BrdU/мишка във всяка група, изследвана с изпитваното вещество, и в положителната контролна група, на средната стойност на индекса на маркиране на BrdU за третираната с разтворителя/носителя контролна група. Средната стойност на SI за контролите, третирани с носителя, е единица.
                              Индексът на маркиране на BrdU се определя като:
                              Индекс на маркиране на BrdU = (ABSem – ABS празна пробаem) – (ABSref – ABS празна пробаref)
                              където em = дължина на вълната на емисията; и ref = референтна дължина на вълната.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              При процеса на вземане на решение даден резултат се счита за положителен, когато SI ≥ 1,6 (10). При все това силата на зависимостта доза—отговор статистическата значимост и съгласуваността на разтворителя/носителя и ПК реакциите също могат да бъдат използвани при определянето дали даден граничен резултат (т.е. стойност на SI между 1,6 и 1,9) да бъде обявен за положителен (3) (6) (32).
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              При гранична положителна реакция със стойност на SI между 1,6 и 1,9 ползвателите могат да вземат предвид допълнителна информация като например зависимостта доза—отговор, доказателство за систематична токсичност или прекомерно дразнене и, където е подходящо, статистическата значимост заедно със стойностите на SI, с цел потвърждаване, че тези резултати са положителни (10). Следва да бъде обърнато внимание на различните свойства на изпитваното вещество, включително дали то има структурна връзка с познати кожни сенсибилизатори, дали причинява прекомерно кожно дразнене при мишките, както и какво е естеството на наблюдаваната зависимост доза—отговор. Тези и други съображения подробно се обсъждат на друго място (4).
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Събирането на данни на нивото на отделните мишки ще даде възможност за статистически анализ на наличието и степента на зависимостта доза—отговор в данните. Всяка статистическа оценка би могла да включва оценка на зависимостта доза—отговор, както и подходящо направени сравнения между изпитваните групи (напр. сравнения по двойки на дозираните групи с паралелната третирана с разтворителя/носителя контролна група). Статистическите анализи могат да включват например линейна регресия или изпитването на William за оценка на тенденциите в зависимостта доза—отговор и изпитването на Dunnett за сравнения по двойки. При избора на подходящ метод за статистически анализ, изследователят следва да обърне внимание на възможни различия в дисперсиите и други свързани с тях проблеми, които могат да наложат трансформация на данните или провеждане на статистически анализ без параметри. Във всеки случай на изследователя може да му се наложи да извърши изчисления за SI и статистически анализи със и без определени точки с данни (понякога наричани „отклоняващи се стойности“).
                           
                        ДАННИ И ДОКЛАДВАНЕ
                  
                     Данни
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Данните следва да бъдат обобщени в табличен вид, като се посочват индивидуалните стойности на индекса на маркиране на BrdU за отделните животни, средната за групата стойност на индекса на маркиране на BrdU/животно, свързаният с нея граница на отклонение (напр. SD, SEM) и средният SI за всяка подложена на дадена доза група в сравнение с паралелната третирана с разтворителя/носителя контролна група.
                           
                        
                     Протокол от изпитването
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Протоколът от изпитването следва да включва следната информация:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Изпитвани и контролни химикали:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      идентификационни данни (напр. CAS и EC номера, ако са налични; източник, чистота, известни примеси, номер на партидата);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      физична форма и физикохимични свойства (напр. летливост, устойчивост, разтворимост);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ако е смес, състав и относително съотношение в проценти на елементите.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Разтворител/носител:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      идентификационни данни (чистота; концентрация, където е подходящо; използвано количество);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      обосновка за изборa на носител.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Опитни животни:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      произход на мишките от порода CBA;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      микробиологичен статус на животните, ако е известен;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      брой и възраст на животните;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      произход на животните, условия на отглеждане, диета и т.н.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Условия на изпитване:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      източник, номер на партидата и данни, свързани с осигуряването на качеството/контрола на качеството на производителя (чувствителност и специфичност на антитялото и границата на откриваемост) за комплекта за ELISA;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      подробна информация за приготвянето и прилагането на изпитваното вещество;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      обосновка за избора на доза (включително резултатите от предварителното скринингово изпитване, ако е проведено);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      използвани концентрации на изпитваното вещество и носителя и общо количество на приложеното изпитвано вещество;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      подробна информация за качеството на храната и водата (включително вид/източник на диетата, водоизточник);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      подробна информация за графиците на третиране и вземане на проби;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      методи за измерване на токсичността;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      критерии за считане на изпитванията за положителни или отрицателни;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      подробна информация за всякакви отклонения от протокола и обяснение за това как отклонението влияе на планирането на изпитването и на резултатите от него.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Проверка на надеждността:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      обобщение на резултатите от последната проверка на надеждността, включително информация за използваните изпитвано вещество, концентрация и носител;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      данни за паралелни и/или предишни положителни контроли и паралелни отрицателни контроли (разтворител/носител) за лабораторията, провеждаща изпитването;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ако не е била включена паралелна положителна контрола, се посочва датата и лабораторният доклад на най-скорошното периодично изпитване с положителна контрола и доклад, в който подробно се представят данните от предишни изпитвания с положителни контроли на лабораторията и който обосновава защо не се провежда паралелна положителна контрола.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Резултати:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      индивидуални тегла на мишките в началото на дозирането и при планираното им умъртвяване по хуманен начин; както и средната стойност на границата на отклонение (напр. SD, SEM) за всяка третирана група;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      признаци на токсичност и време на настъпването им, включително кожно дразнене на мястото на прилагане, ако има такова, за всяко животно;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      таблица на индексите на маркиране на BrdU и стойностите на SI за отделните мишки за всяка третирана група;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      средната стойност и съответната граница на отклонение (напр. SD, SEM) за индекса на маркиране на BrdU/мишка за всяка третирана група и резултатите от анализа на отклоняващите се стойности за всяка третирана група;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      изчисленият SI и подходяща мярка за вариабилността, която отчита вариабилността между животните както в групата с изпитваното вещество, така и в контролната група;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      зависимостта доза—отговор;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      статистически анализи, където е подходящо.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Обсъждане на резултатите:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      кратък коментар на резултатите, анализ на зависимостта доза—отговор и статистически анализ, където е подходящо, със заключение дали изпитваното вещество следва да се счита за кожен сенсибилизатор.
                                                   
                                                
                                    
                        ЛИТЕРАТУРА
                  
                              (1)
                           
                           
                              OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline № 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, 985-997.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327-33.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, 49-59.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258-273.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 274-286.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249-257.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication № 10-7552A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm]
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf]
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005), Novel approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129-134.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline № 406, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. На разположение на адрес:[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71-89.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13-31.
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline № 404, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235.
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf
                           
                        
                              (23)
                           
                           
                              Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, 195-206.
                           
                        
                              (24)
                           
                           
                              Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94.
                           
                        
                              (25)
                           
                           
                              Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245-256.
                           
                        
                              (26)
                           
                           
                              Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, 491-506.
                           
                        
                              (27)
                           
                           
                              Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter- laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68.
                           
                        
                              (28)
                           
                           
                              Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728.
                           
                        
                              (29)
                           
                           
                              Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028.
                           
                        
                              (30)
                           
                           
                              ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm].
                           
                        
                              (31)
                           
                           
                              OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment № 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (32)
                           
                           
                              Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563-79.
                           
                        
                              (33)
                           
                           
                              OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment № 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                     Допълнение 1
                     ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                     Точност: степента на близост на съвпадение на резултатите от метода за изпитване и приетите референтни стойности. Това е мярка за ефективността на метода за изпитване и един от аспектите на неговата приложимост. Терминът често се използва взаимозаменяемо с термина „съвпадение“, за да се обозначи делът на верните резултати на даден метод за изпитване (33).
                     Еталонно вещество: вещество, което предизвиква или не предизвиква сенсибилизация, използвано като норма за сравнение с изпитваното вещество. Едно еталонно вещество следва да притежава следните свойства: i) постоянен и надежден източник; ii) структурно и функционално сходство с класа на изпитваните вещества; iii) известни физикохимични характеристики; iv) потвърждаващи данни за известни въздействия; и v) известна ефективност за постигане на желаната реакция.
                     Вещество с фалшиво отрицателен резултат: изпитвано вещество, неправилно определено като даващо отрицателен резултат или неактивно при даден метод за изпитване, докато в действителност то дава положителен резултат или е активно (33).
                     Вещество с фалшиво положителен резултат: изпитвано вещество, неправилно определено като даващо положителен резултат или активно при дадено изпитване, докато в действителност то дава отрицателен резултат или е неактивно (33).
                     Опасност: потенциалът за получаване на неблагоприятен за здравето или екологичен ефект. Неблагоприятният ефект се проявява само при достатъчно голяма степен на експозиция.
                     Междулабораторна възпроизводимост: мярка за степента, в която различните квалифицирани лаборатории, които използват един и същи протокол и изпитват едни и същи изпитвани вещества, могат да получат качествено и количествено сходни резултати. Междулабораторната възпроизводимост се определя по време на процесите на предварително валидиране и на валидиране и показва степента, в която изпитването може да бъде трансферирано успешно между лабораториите, също наричана възпроизводимост между лабораториите (38).
                     Вътрешнолабораторна възпроизводимост: определяне на степента, в която квалифицирани служители в рамките на една и съща лаборатория могат да възпроизведат успешно резултатите, като използват конкретен протокол в различни моменти. Също наричана възпроизводимост в рамките на лабораторията (38).
                     Отклоняваща се стойност: отклоняващата се стойност е наблюдение, което е маркирано като различно от други стойности в произволно избрана извадка от популация.
                     Осигуряване на качеството: управленски процес, при който спазването на лабораторни стандарти за изпитване, изисквания и процедури за водене на дневници, както и точността на трансфера на данни, се оценява от лица, които са независими от лицата, изпълняващи изпитването.
                     Надеждност: мярка за степента, в която даден метод за изпитване може да се извърши възпроизводимо в една и съща лаборатория и между различни лаборатории в течение на времето, когато се използва един и същи протокол. Надеждността се оценява, като се изчислява вътрешно- и междулабораторната възпроизводимост (38).
                     Кожна сенсибилизация: имунологичен процес, който възниква, когато податлив индивид е локално изложен на химичен алерген с предизвикващо действие, който предизвиква кожна имунна реакция, водеща до развиването на контактна сенсибилизация.
                     Стимулационен индекс (SI): стойност, изчислявана за оценка на потенциала на дадено изпитвано вещество да предизвиква кожна сенсибилизация, която представлява съотношението на пролиферацията в третираните групи спрямо тази в паралелната третирана с носителя контролна група.
                     Изпитвано вещество (също наричано изпитван химикал): всяко вещество или смес, изпитвано(а) чрез използването на настоящия метод за изпитване.
                  “
            
         (1)  Химикал, за който се счита, че не предизвиква кожна сенсибилизация при хората въз основа на факта, че не са констатирани клинични резултати от кожно-алергични проби, не е включен като алерген в наборите за кожно-алергични проби и не са установени докладвани случаи за сенсибилизация при хора.
      
         (2)  Няма налични данни за резултата от изследване върху морски свинчета.
      
         (3)  Химикалите следва да се приготвят ежедневно, освен ако данните за устойчивостта им показват, че те могат да се съхраняват.
      
         (4)  Поради потенциалното въздействие на различните носители върху ефективността на LLNA, следва да се използва препоръчителният носител за всеки референтен химикал (24) (32).
      
         (5)  Средна стойност, когато са налични повече от една стойности на EC3. За веществата даващи отрицателен резултат (т.е. със стимулационен индекс < 3 се предоставя най-високата изпитана концентрация).
      
         (6)  Брой на изпитванията LLNA, от които са получени данните.
      
         (7)  Предлаган на пазара като Kathon CG (CAS № 55965-84-9), който представлява смес в съотношение 3:1 от CMI и MI. Относителните концентрации на всеки елемент варират от 1,1 % до 1,25 % (CMI) и 0,3 % до 0,45 % (MI). Неактивните елементи са магнезиеви соли (21,5 % до 24 %) и меден нитрат (0,15 % до 0,17 %), като останалата част на състава е вода в процентно съотношение от 74 % до 77 %. Kathon CG може лесно да бъде намерен от Sigma-Aldrich и Rohm and Haas (понастоящем Dow Chemical Corporation).
      
         (8)  Тези референтни химикали са подгрупа на референтните химикали, използвани при изследването за валидиране.
      
         (9)  Балова оценка in vivo в съответствие с Б.4 и Указание за изпитване 404 на ОИСР (4).
      
         (10)  Съгласно настоящия метод за изпитване, незадължителната категория 3 по GHS на ООН (слаби дразнители) се счита за „Без категория“.
      
         (11)  Незадължителната категория 3 по GHS на ООН не е приложима съгласно Регламент CLP на ЕС.
      
         (12)  ОВ L 225, 21.8.2001 г., стр. 1.
      
         (13)  Изборът на химикалите се основава на следните критерии: i) химикалите се предлагат на пазара; ii) представителни са за пълната скала на Draize за силата на дразнене (от недразнител до силен дразнител); iii) имат ясно определена химична структура; iv) представителни са за химичната функционалност, използвана в процеса на валидиране; и v) нямат прекомерно токсичен профил (например канцерогенен или токсичен по отношение на репродуктивната система) и разходите за обезвреждането им не са прекалено високи.
      
         (14)  Химикали, които са дразнители при зайците, но за които има надеждни доказателства, че не предизвикват дразнене при хората (31) (32) (33).
      
         (15)  По GHS на ООН, не присъства в Регламент CLP на ЕС.
      
         (16)  Референтните химикали са препоръчителните за използване химикали. Заместване или добавяне на химикали към списъка на референтните химикали може да бъде направено, ако е известна тяхната активност и ако те индуцират микроядра чрез същите механизми за действие, както и ако е доказано, че имат отношение към химикалите, които ще бъдат изпитвани чрез използването на процедурата MNvit. В зависимост от целта обосновката би могла също така да включва изследване за валидиране, използващо голямо разнообразие от вещества или насочено към по-тесен спектър въз основа на химичния клас на изпитваното вещество или изпитвания механизъм на увреждане.