CELEX: 32014R0260
Language: nl
Date: 2014-01-24 00:00:00
Title: Verordening (EU) nr. 260/2014 van de Commissie van 24 januari 2014 tot wijziging, in verband met de aanpassing ervan aan de technische vooruitgang, van Verordening (EG) nr. 440/2008 houdende vaststelling van testmethoden uit hoofde van Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH)  Voor de EER relevante tekst

19.3.2014   
            
            
               NL
            
            
               Publicatieblad van de Europese Unie
            
            
               L 81/1
            
         
      VERORDENING (EU) Nr. 260/2014 VAN DE COMMISSIE
   
   van 24 januari 2014
   tot wijziging, in verband met de aanpassing ervan aan de technische vooruitgang, van Verordening (EG) nr. 440/2008 houdende vaststelling van testmethoden uit hoofde van Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH)
   (Voor de EER relevante tekst)
   DE EUROPESE COMMISSIE,
   Gezien het Verdrag betreffende de werking van de Europese Unie,
   Gezien Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad van 18 december 2006 inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH), tot oprichting van een Europees Agentschap voor chemische stoffen, houdende wijziging van Richtlijn 1999/45/EG en houdende intrekking van Verordening (EEG) nr. 793/93 van de Raad en Verordening (EG) nr. 1488/94 van de Commissie alsmede Richtlijn 76/769/EEG van de Raad en de Richtlijnen 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG en 2000/21/EG van de Commissie (1), en met name artikel 13, lid 3,
   Overwegende hetgeen volgt:
   
               (1)
            
            
               Verordening (EG) nr. 440/2008 van de Commissie (2) bevat de testmethoden voor de bepaling van de fysisch-chemische eigenschappen, de toxiciteit en de ecotoxiciteit van stoffen die worden toegepast voor de uitvoering van Verordening (EG) nr. 1907/2006.
            
         
               (2)
            
            
               Verordening (EG) nr. 440/2008 moet worden bijgewerkt om daarin met prioriteit nieuwe en bijgewerkte, recentelijk door de OESO goedgekeurde alternatieve testmethoden op te nemen teneinde overeenkomstig Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (3) en Richtlijn 86/609/EEG van de Raad van 24 november 1986 inzake de onderlinge aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen van de lidstaten betreffende de bescherming van dieren die voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (4), tot een verlaging van het aantal proefdieren te komen.
            
         
               (3)
            
            
               De aanpassing betreft twee methoden voor de bepaling van fysisch-chemische eigenschappen, namelijk een aanpassing van de testmethode voor de oplosbaarheid in water en een nieuwe testmethode voor de verdelingscoëfficiënt, die van belang is voor de beoordeling van de persistentie, bioaccumulatie en toxiciteit (PBT-beoordeling); vier nieuwe en één aangepaste methode voor de bepaling van de ecotoxiciteit en het uiteindelijk lot en het gedrag in het milieu; en negen methoden voor de bepaling van de toxiciteit en andere gezondheidseffecten, waaronder vier testmethoden voor inhalatietoxiciteit (drie aangepaste methoden en één nieuwe methode om het aantal gebruikte dieren te verlagen en de beoordeling van de effecten te verbeteren), een aanpassing van de testmethode voor orale toxiciteit bij herhaalde toediening (28 dagen) om daar parameters voor de beoordeling van de endocriene werking in op te nemen, een aanpassing van de testmethode voor toxicokinetiek, die van belang is voor het ontwerp en de interpretatie van toxicologische studies en een aanpassing van de testmethoden voor chronische toxiciteit, carcinogeniteit en gecombineerde chronische toxiciteit/carcinogeniteit.
            
         
               (4)
            
            
               Verordening (EG) nr. 440/2008 moet dan ook dienovereenkomstig worden gewijzigd.
            
         
               (5)
            
            
               De in deze verordening vervatte maatregelen zijn in overeenstemming met het advies van het bij artikel 133 van Verordening (EG) nr. 1907/2006 ingestelde comité,
            
         HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD:
   Artikel 1
   De bijlage bij Verordening (EG) nr. 440/2008 wordt gewijzigd overeenkomstig de bijlage bij deze verordening.
   Artikel 2
   Deze verordening treedt in werking op de derde dag na die van de bekendmaking ervan in het Publicatieblad van de Europese Unie.
   
      Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselijk in elke lidstaat.
      Gedaan te Brussel, 24 januari 2014.
      
         
            Voor de Commissie
         
         
            De voorzitter
         
         José Manuel BARROSO
         
      
   
   
      (1)  PB L 396 van 30.12.2006, blz. 1.
   
      (2)  PB L 142 van 31.5.2008, blz. 1.
   
      (3)  PB L 276 van 20.10.2010, blz. 33.
   
      (4)  PB L 358 van 18.12.1986, blz. 1.
   
      BIJLAGE
      De bijlage bij Verordening (EG) nr. 440/2008 wordt als volgt gewijzigd:
      
                  1)
               
               
                  Hoofdstuk A.6 wordt vervangen door:
                  „A.6.   OPLOSBAARHEID IN WATER
                  
                  INLEIDING
                  
                              1.
                           
                           
                              Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 105 (1995) van de OESO (TG 105). Deze testmethode is een herziene versie van de oorspronkelijke TG 105, die in 1981 is vastgesteld. Er zijn geen inhoudelijke verschillen tussen de huidige versie en die uit 1981. De wijzigingen betreffen voornamelijk de vorm. De herziening is uitgevoerd op basis van EU-testmethode „Oplosbaarheid in water” (1).
                           
                        INLEIDENDE OVERWEGINGEN
                  
                              2.
                           
                           
                              De oplosbaarheid in water van een stof kan aanzienlijk worden beïnvloed door de aanwezigheid van verontreinigingen. Deze testmethode betreft de bepaling van de oplosbaarheid in water van niet-vluchtige, chemisch zuivere stoffen die stabiel zijn in water. Alvorens de oplosbaarheid in water te bepalen, is het nuttig om van tevoren te beschikken over gegevens inzake de te onderzoeken stof, zoals de structuurformule, de dampspanning, de dissociatieconstante en de hydrolyse (als functie van de pH).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              In deze testmethode worden twee methoden beschreven: de kolomelutiemethode en de methode met de kolf, die respectievelijk van toepassing zijn op stoffen waarvan de oplosbaarheid minder of meer bedraagt dan 10–2 g/l. Tevens wordt een eenvoudige inleidende test beschreven. Daarmee kan worden bepaald wat bij benadering de juiste hoeveelheid van het monster is om in de uiteindelijke test te gebruiken, alsmede hoeveel tijd er nodig is om de verzadigingswaarde te bereiken.
                           
                        DEFINITIES EN EENHEDEN
                  
                              4.
                           
                           
                              De oplosbaarheid van een stof in water is de massaconcentratie van de stof in een verzadigde oplossing in water bij een gegeven temperatuur.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              De oplosbaarheid in water wordt uitgedrukt als de massa van opgeloste stof per volume van de oplossing. De SI-eenheid is kg/m3 (g/l kan ook worden gebruikt).
                           
                        REFERENTIESTOFFEN
                  
                              6.
                           
                           
                              Het is niet nodig om bij het onderzoeken van een stof referentiestoffen te gebruiken.
                           
                        BESCHRIJVING VAN DE METHODEN
                  
                     Testomstandigheden
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              De test wordt bij voorkeur uitgevoerd bij 20 ± 0,5 °C. De gekozen temperatuur moet in alle betrokken delen van de apparatuur constant worden gehouden.
                           
                        
                     Inleidende test
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              In een maatcilinder van 10 ml, voorzien van een glazen stop, worden stapsgewijs toenemende volumes water op kamertemperatuur toegevoegd aan ongeveer 0,1 g monster (vaste stoffen moeten worden fijngemaakt). Nadat een hoeveelheid water is toegevoegd, wordt het mengsel telkens gedurende 10 minuten geschud en vervolgens visueel onderzocht op eventuele onopgeloste delen van het monster. Als het monster of delen ervan onopgelost zijn nadat nog 10 ml water is toegevoegd, wordt het experiment herhaald in een maatcilinder van 100 ml. De benaderde waarde van de oplosbaarheid is hieronder in tabel 1 vermeld onder de hoeveelheid water waarin het monster geheel wordt opgelost. Bij een lagere waarde van de oplosbaarheid kan het lang duren om een teststof op te lossen en moet minimaal 24 uur in acht worden genomen. Als de teststof na 24 uur nog steeds niet is opgelost, moet langer (maximaal 96 uur) worden gewacht of moet worden geprobeerd de stof verder te verdunnen om te bepalen of de kolomelutiemehode dan wel de methode met de kolf moet worden gebruikt.
                              
                                 Tabel 1
                              
                              
                                          ml water voor 0,1 g opgeloste stof
                                       
                                       
                                          0,1
                                       
                                       
                                          0,5
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          2
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                       
                                          100
                                       
                                       
                                          > 100
                                       
                                    
                                          benaderde waarde van de oplosbaarheid in g/l
                                       
                                       
                                          > 1 000
                                       
                                       
                                          1 000 tot en met 200
                                       
                                       
                                          200 tot en met 100
                                       
                                       
                                          100 tot en met 50
                                       
                                       
                                          50 tot en met 10
                                       
                                       
                                          10 tot en met 1
                                       
                                       
                                          < 1
                                       
                                    
                        
                     Kolomelutiemethode
                  
                  
                     Principe
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Deze methode is gebaseerd op de elutie van de te onderzoeken stof met water uit een microkolom welke is gevuld met een inert dragermateriaal dat van tevoren is gedekt met een overmaat aan de te onderzoeken stof (2). De oplosbaarheid in water is gelijk aan de massaconcentratie van het eluaat wanneer deze een plateau bereikt als functie van de tijd
                           
                        
                     Apparatuur
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              De apparatuur bestaat uit een microkolom (figuur 1) die op constante temperatuur wordt gehouden. Deze wordt aangesloten op een recirculatiepomp (figuur 2) of op een voorraadfles (figuur 3). De microkolom bevat een inerte drager die op zijn plaats wordt gehouden door een kleine prop glaswol, waarmee ook deeltjes worden weggefilterd. Bruikbare materialen voor de drager zijn bijvoorbeeld glasparels, diatomeeënaarde of andere inerte materialen.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              De microkolom in figuur 1 is geschikt voor de opstelling met recirculatiepomp. Zij is aan de bovenzijde voorzien van een hoofdruimte voor vijf kolomvolumina (die aan het begin van het experiment worden afgevoerd) en voor het volume van vijf monsters (die tijdens het experiment worden genomen om te worden geanalyseerd). Eventueel kunnen de afmetingen worden verminderd indien tijdens het experiment water aan het systeem kan worden toegevoegd ter vervanging van de eerste vijf kolomvolumina welke met verontreinigingen worden afgevoerd. De kolom is door middel van slangen, gemaakt van een inert materiaal, verbonden met de circulatiepomp, die een opbrengst van ongeveer 25 ml/h moet kunnen leveren. Als recirculatiepomp kan bijvoorbeeld een peristaltische pomp of een membraanpomp worden gebruikt. Er moet op worden toegezien dat geen verontreiniging en/of adsorptie plaatsvindt met het materiaal van de slangen.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              In figuur 3 is een schema van een opstelling met een voorraadfles afgebeeld. In deze opstelling is de microkolom voorzien van een eenwegkraan. De kolom en de voorraadfles zijn verbonden door middel van een glazen slijpstuk en slangen, gemaakt van een inert materiaal. Het debiet door de voorraadfles moet ongeveer 25 ml/h bedragen.
                              
                                 Figuur 1
                              
                              
                                 
                              Afmetingen in mm
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          Aansluiting voor glazen slijpstuk
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          Hoofdruimte
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          Inwendig 5
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          Uitwendig 19
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          Prop glaswol
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          Kraan
                                       
                                    
                                 Figuur 2
                              
                              
                                 
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          Evenwicht met atmosferische druk
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          Stromingsmeter
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          Microkolom
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          Circulatiepomp met thermostaatregeling
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          Recirculatiepomp
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          Tweewegkraan voor bemonstering
                                       
                                    
                                 Figuur 3
                              
                              
                                 
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          Voorraadfles (bijvoorbeeld een kolf van 2,5 liter)
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          Kolom
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          Fractieverzamelaar
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          Thermostaat
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          Teflonslang
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          Glazen slijpstuk
                                       
                                    
                                          G.
                                       
                                       
                                          Waterleiding (tussen thermostaat en kolom, inwendige diameter ongeveer 8 mm)
                                       
                                    
                        
                              13.
                           
                           
                              Ongeveer 600 mg dragermateriaal wordt overgebracht in een rondbodemkolf van 50 ml. Een geschikte hoeveelheid van de teststof wordt opgelost in een vluchtig en analytisch zuiver oplosmiddel en de juiste hoeveelheid van deze oplossing wordt bij het dragermateriaal gevoegd. Het oplosmiddel wordt, bijvoorbeeld met behulp van een roterende verdamper, volledig verdampt. Bij onvolledige verwijdering van het oplosmiddel kan het dragermateriaal, ten gevolge van verdelingseffecten aan het oppervlak, tijdens de elutiefase niet worden verzadigd met water. Het beladen dragermateriaal wordt gedurende twee uur bevochtigd in ongeveer 5 ml water en de suspensie wordt in de microkolom gebracht. Als alternatief kan men ook het droge, beladen dragermateriaal direct in de met water gevulde microkolom brengen, en daarna twee uur wachten totdat een evenwichtstoestand is ontstaan.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Het laden van het dragermateriaal kan aanleiding geven tot problemen en daarmee tot onjuiste resultaten, bijvoorbeeld als de teststof wordt afgezet als olie. Deze problemen moeten worden onderzocht en de bijzonderheden moeten worden gerapporteerd.
                           
                        
                     Werkwijze met circulatiepomp
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              De stroming door de kolom wordt op gang gebracht. Een debiet van ongeveer 25 ml/h (dit komt overeen met ongeveer 10 kolomvolumina/uur voor de beschreven kolom) wordt aanbevolen. Ten minste de eerste vijf kolomvolumina worden afgevoerd om wateroplosbare verontreinigingen te verwijderen. De apparatuur blijft in werking totdat een evenwichtstoestand is bereikt; hiervoor geldt dat de concentraties in vijf opeenvolgende monsters niet meer dan ± 30 % mogen verschillen op aselecte wijze. Tussen de tijdstippen, waarop deze monsters worden genomen, moeten ten minste tien kolomvolumina passeren. Afhankelijk van de toegepaste analysemethode kan het de voorkeur genieten een concentratie/tijdcurve op te stellen om aan te tonen dat het evenwicht is bereikt.
                           
                        
                     Werkwijze met voorraadfles
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Er wordt een aantal opeenvolgende monsters van het eluaat genomen voor analyse volgens de gekozen methode. In het middengebied van het eluaat, wanneer de concentraties constant zijn binnen ± 30 % in ten minste vijf opeenvolgende fracties, worden de fracties gebruikt om de oplosbaarheid te bepalen.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Als eluens wordt bij voorkeur dubbel gedestilleerd water gebruikt. Gedeïoniseerd water met een soortelijke weerstand van meer dan 10 megohm/cm en een totaal gehalte aan organische koolstof van minder dan 0,01 % kan ook worden gebruikt.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Bij beide werkwijzen wordt een tweede reeks metingen verricht waarbij het debiet de helft is van de aanvankelijke waarde. Als de resultaten van beide series metingen overeenstemmen, worden de testresultaten geaccepteerd. Als de gemeten oplosbaarheid bij het laagste debiet hoger blijkt, dan moet het halveren van het debiet worden voortgezet, totdat twee opeenvolgende series metingen dezelfde oplosbaarheid geven.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Bij beide werkwijzen moeten de fracties aan de hand van het Tyndall-effect worden gecontroleerd op aanwezigheid van deeltjes in colloïdale toestand. De aanwezigheid van deeltjes maakt de test ongeldig, zodat de test moet worden herhaald nadat de filterwerking van de kolom is verbeterd.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              De pH van elk monster moet worden gemeten, bij voorkeur met behulp van speciaal indicatorpapier.
                           
                        
                     Methode met de kolf
                  
                  
                     Principe
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              De teststof (vaste stoffen moeten worden fijngemaakt) wordt opgelost in water bij een temperatuur die iets hoger is dan de testtemperatuur. Zodra verzadiging is bereikt, wordt het mengsel afgekoeld en op de testtemperatuur gehouden. Als alternatief, en op voorwaarde dat men er, via geschikte monsternamen, zeker van is dat het verzadigingsevenwicht is bereikt, kan de meting rechtstreeks bij de testtemperatuur worden uitgevoerd. Vervolgens wordt de massaconcentratie van de teststof in de waterige oplossing, welke geen onopgeloste deeltjes mag bevatten, bepaald aan de hand van een geschikte analysemethode (3).
                           
                        
                     Apparatuur
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Het volgende materiaal is nodig:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          gangbaar laboratoriumglaswerk en -apparatuur;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          een apparaat om de oplossingen in beweging te brengen bij constante temperatuur;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          zo nodig voor emulsies een centrifuge (bij voorkeur met thermostaat), en
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analyseapparatuur.
                                       
                                    
                        
                     Werkwijze
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Aan de hand van de inleidende test wordt bepaald hoeveel van de teststof nodig is om de gewenste hoeveelheid water te verzadigen. In drie van een glazen stop voorziene glazen vaten (bijvoorbeeld centrifugebuizen, kolven) wordt telkens ongeveer vijfmaal die hoeveelheid materiaal afgewogen. De op grond van de analysemethode en het oplosbaarheidsbereik vastgestelde hoeveelheid water wordt in elk vat gegoten. De vaten worden goed afgesloten en vervolgens bij 30 °C geschud. Hiervoor moet een schud- of roermachine worden gebruikt waarmee bij constante temperatuur kan worden gewerkt, bijvoorbeeld een magneetroerder in een waterbak met thermostaatregeling. Na één dag wordt 24 uur gewacht totdat in één van de vaten onder af en toe roeren bij de testtemperatuur een evenwichtstoestand is ontstaan. Vervolgens wordt de inhoud van het vat gecentrifugeerd bij de testtemperatuur, waarna de concentratie van de teststof in de heldere waterige oplossing volgens een geschikte analysemethode wordt bepaald. De beide andere kolven ondergaan dezelfde behandeling nadat respectievelijk twee en drie dagen bij 30 °C is gewacht totdat een evenwichtstoestand is ontstaan. Als de gemeten concentraties in ten minste de twee laatstgenoemde vaten onderling niet meer dan 15 % verschillen, worden de testresultaten geaccepteerd. Als de resultaten van de vaten 1, 2 en 3 toenemende waarden geven, moet de hele test worden herhaald, waarbij langer wordt gewacht tot een evenwichtstoestand is ontstaan.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              De test kan ook worden uitgevoerd zonder voorverwarming bij 30 °C. Om de snelheid te kunnen schatten waarmee het verzadigingsevenwicht zich instelt, worden monsters genomen totdat blijkt dat verder roeren geen invloed meer heeft op de gemeten concentraties.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              De pH van elk monster moet worden gemeten, bij voorkeur met behulp van speciaal indicatorpapier.
                           
                        
                     Analytische bepalingen
                  
                  
                              26.
                           
                           
                              Bij voorkeur wordt een methode toegepast waarmee verschillende stoffen kunnen worden onderscheiden, aangezien kleine hoeveelheden opgeloste verontreinigingen kunnen leiden tot grote fouten in de gemeten oplosbaarheid. Voorbeelden van zulke methoden zijn: gas- of vloeistofchromatografie, titratie, fotometrie, voltametrie.
                           
                        GEGEVENS EN RAPPORTAGE
                  
                     Gegevens
                  
                  
                     Kolomelutiemethode
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Voor elke serie metingen moeten het gemiddelde en de standaardafwijking worden berekend van ten minste vijf opeenvolgende monsters, die op het verzadigingsniveau zijn genomen. De gemiddelde waarden uit twee tests met verschillend debiet mogen onderling niet meer dan 30 % verschillen.
                           
                        
                     Methode met de kolf
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Het gemiddelde van de aparte resultaten voor de drie kolven, die onderling niet meer dan 15 % mogen verschillen, wordt berekend.
                           
                        
                     Testverslag
                  
                  
                     Kolomelutiemethode
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          de resultaten van de inleidende test;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de chemische identiteit en verontreinigingen en indien van toepassing, de voorafgaande zuivering;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de concentraties, debieten en pH-waarden voor elk monster;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het gemiddelde en de standaardafwijking van ten minste vijf monsters uit elke serie die op het verzadigingsniveau zijn genomen;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het gemiddelde van ten minste twee opeenvolgende series;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de temperatuur van het water tijdens het verzadigingsproces;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de analysemethode;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de aard van het dragermateriaal;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het laden van het dragermateriaal;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het gebruikte oplosmiddel;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          elke gebleken chemische instabiliteit van de stof tijdens de test;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          alle gegevens en opmerkingen, die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de teststof.
                                       
                                    
                        
                     Methode met de kolf
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              In het verslag moet de volgende informatie worden opgenomen:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          de resultaten van de inleidende test;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de chemische identiteit en verontreinigingen en indien van toepassing, de voorafgaande zuivering;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de afzonderlijke analysen en het gemiddelde, indien meer dan één waarde werd bepaald, voor iedere kolf;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de pH van elk monster;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het gemiddelde van de waarden voor de verschillende kolven die onderling overeenstemden;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de testtemperatuur;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de analysemethode;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          elke gebleken chemische instabiliteit van de stof tijdens de test;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          alle gegevens en opmerkingen, die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de teststof.
                                       
                                    
                        
                     LITERATUUR:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              Richtlijn 92/69/EEG van de Commissie van 31 juli 1992 houdende zeventiende aanpassing aan de vooruitgang van de techniek van Richtlijn 67/548/EEG van de Raad betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke stoffen (PB L 383 van 29.12.1992, blz. 113).
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method.”.
                           
                        
            
                  2)
               
               
                  Hoofdstuk A.23 wordt toegevoegd:
                  „A.23   1-OCTANOL/WATER-VERDELINGSCOËFFICIËNT: LANGZAAM-ROERENMETHODE
                  
                  INLEIDING
                  
                              1.
                           
                           
                              Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 123 (2006) van de OESO (TG 123). De langzaam-roerenmethode („slow-stirring”-methode) heeft accurate waarden opgeleverd voor de 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënt (POW) tot een log POW van 8,2 (1). Het is dan ook een geschikte experimentele benadering voor de directe bepaling van de POW van zeer hydrofobe stoffen.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Andere methoden voor de bepaling van de 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënt (POW) zijn de „schudfles”-methode (2) en de bepaling van de POW aan de hand van het retentiegedrag bij omgekeerde-fase-HPLC (3). De „schudfles”-methode is gevoelig voor artefacten als gevolg van de overgang van microdruppeltjes octanol naar de waterfase. Hoe hoger de POW-waarde, hoe meer de aanwezigheid van deze druppeltjes in de waterfase leidt tot overschatting van de teststofconcentratie in het water. Daarom is het gebruik van deze methode beperkt tot stoffen met log POW < 4. De tweede methode berust op betrouwbare gegevens van rechtstreeks bepaalde POW-waarden voor de kalibratie van het verband tussen het HPLC-retentiegedrag en de gemeten POW-waarden. Er was een voorlopige OESO-testrichtlijn beschikbaar voor de bepaling van 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënten van ioniseerbare stoffen (4), maar deze wordt niet langer gebruikt.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Deze testmethode is ontwikkeld in Nederland. De nauwkeurigheid van de hier beschreven methoden is gevalideerd en geoptimaliseerd in een ringtest met medewerking van vijftien laboratoria (5).
                           
                        INLEIDENDE OVERWEGINGEN
                  
                     Significantie en gebruik
                  
                  
                              4.
                           
                           
                              Voor inerte organische stoffen zijn zeer significante verbanden gevonden tussen hun 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënt (POW) en hun bioaccumulatie in vissen. Bovendien is een verband aangetoond tussen de POW en de toxiciteit voor vissen en de sorptie van chemicaliën aan vaste stoffen zoals bodems en sedimenten. Referentie (6) biedt een uitvoerig overzicht van deze verbanden.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Er is een grote verscheidenheid aan verbanden vastgesteld tussen de 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënt en andere stofeigenschappen die van belang zijn voor milieutoxicologie en milieuchemie. Daardoor is de 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënt uitgegroeid tot een centrale parameter bij het beoordelen van het milieurisico van chemicaliën, alsmede bij het voorspellen van de levensloop van chemicaliën in het milieu.
                           
                        
                     Toepassingsgebied
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              De langzaam-roerenmethode wordt verondersteld de vorming van microdruppeltjes uit druppeltjes 1-octanol in de waterfase te beperken. Hierdoor wordt overschatting van de concentratie in het water als gevolg van teststofmoleculen in dergelijke druppeltjes vermeden. De langzaam-roerenmethode is dan ook bij uitstek geschikt voor de bepaling van de POW voor stoffen met een verwachte log POW-waarde van 5 of hoger, waarvoor de schudflesmethode (2) geneigd is foutieve resultaten te geven.
                           
                        DEFINITIE EN EENHEDEN
                  
                              7.
                           
                           
                              De verdelingscoëfficiënt van een stof tussen water en een lipofiel oplosmiddel (1-octanol) is een maat voor de evenwichtsverdeling van de stof tussen de twee fasen. De verdelingscoëfficiënt tussen water en 1-octanol (POW) wordt gedefinieerd als de verhouding tussen de evenwichtsconcentraties van de teststof in met water verzadigde 1-octanol (CO) en met 1-octanol verzadigd water (CW).
                              
                                 
                              Aangezien het om een verhouding van concentraties gaat, is de POW dimensieloos. Meestal wordt de 10-logaritme van POW gegeven (log POW). Vanwege de temperatuurafhankelijkheid van de POW moet bij gerapporteerde gegevens de meettemperatuur worden vermeld.
                           
                        PRINCIPE VAN DE METHODE
                  
                              8.
                           
                           
                              Om de verdelingscoëfficiënt vast te stellen worden water, 1-octanol en de teststof bij constante temperatuur met elkaar in evenwicht gebracht, waarna de concentraties van de teststof in de beide fasen worden bepaald.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              De problemen bij de schudflesmethode, in verband met de vorming van microdruppeltjes tijdens het experiment, kunnen met de hier voorgestelde langzaam-roerenmethode worden verminderd. In het langzaam-roerenexperiment worden water, 1-octanol en de teststof in een thermostatisch geregelde geroerde reactor gebracht. Het roeren versnelt de uitwisseling tussen de fasen. De turbulentie als gevolg van het roeren blijft beperkt, waardoor de uitwisseling tussen 1-octanol en water wordt bevorderd zonder dat daarbij microdruppeltjes worden gevormd.
                           
                        TOEPASBAARHEID VAN DE TEST
                  
                              10.
                           
                           
                              Omdat de aanwezigheid van andere stoffen dan de teststof van invloed zou kunnen zijn op de activiteitscoëfficiënt van de teststof, moet deze als zuivere stof worden onderzocht. Voor de 1-octanol/water-verdelingstest moet de hoogste in de handel verkrijgbare zuiverheid worden gebruikt.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Deze methode is van toepassing op zuivere stoffen die niet dissociëren of verbindingen vormen en die geen significante grensvlakactiviteit vertonen. Zij is toepasbaar voor het bepalen van de verdelingscoëfficiënt tussen 1-octanol en water van dergelijke stoffen en van mengsels. Indien de methode voor mengsels wordt gebruikt, zijn de vastgestelde verdelingscoëfficiënten tussen 1-octanol en water voorwaardelijk en afhankelijk van de chemische samenstelling van het onderzochte mengsel en de elektrolytsamenstelling van de gebruikte waterfase. Mits aanvullende stappen worden genomen, is de methode ook toepasbaar voor verbindingen die dissociëren of verbindingen vormen (punt 12).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Wegens het voorkomen van meervoudige evenwichtstoestanden in water en 1-octanol bij de 1-octanol/water-verdeling van dissociërende stoffen als organische zuren en fenolen, organische basen en organometaalverbindingen, is de verdelingscoëfficiënt een voorwaardelijke constante die sterk afhangt van de elektrolytsamenstelling (7)(8). Bij het bepalen van de 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënt moeten de pH en de elektrolytsamenstelling in het experiment dan ook worden gecontroleerd en gerapporteerd. De waardering van dergelijke verdelingscoëfficiënten vereist een deskundig oordeel. Op grond van de dissociatieconstanten moeten geschikte pH-waarden worden geselecteerd, zodat voor elke ionisatietoestand een verdelingscoëfficiënt wordt bepaald. Voor het onderzoeken van organometaalverbindingen zijn buffers nodig die geen complex vormen (8). Rekening houdend met bestaande kennis over het gedrag in water (complexconstanten, dissociatieconstanten), moeten de testomstandigheden zodanig worden gekozen dat een schatting kan worden gemaakt van de speciatie van de teststof in de waterfase. Ten behoeve van een gelijke ionsterkte in alle experimenten moet een achtergrondelektrolyt worden gebruikt.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Bij het uitvoeren van de test op stoffen met een lage oplosbaarheid in water of een hoge POW kunnen problemen optreden doordat de concentraties in water zo laag kunnen worden dat het moeilijk wordt deze nog nauwkeurig te bepalen. Deze testmethode biedt aanwijzingen om met dit probleem om te gaan.
                           
                        INFORMATIE OVER DE TESTSTOF
                  
                              14.
                           
                           
                              De zuiverheid van de chemische reagentia moet ten minste pro analysi zijn. Aanbevolen wordt om ongemerkte teststoffen te gebruiken met bekende chemische samenstelling en bij voorkeur een zuiverheid van 99 %, dan wel met radioactieve koolstof gemerkte teststoffen met bekende chemische samenstelling en radiochemische zuiverheid. Bij merkstoffen met een korte halfwaardetijd moet voor het radioactief verval worden gecorrigeerd. Bij radioactief gemerkte teststoffen moet een analytische methode worden toegepast die specifiek is voor de verbinding, opdat de gemeten radioactiviteit rechtstreeks verband houdt met de teststof.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Een schatting van log POW kan worden verkregen met behulp van speciaal hiervoor in de handel verkrijgbare software of aan de hand van de verhouding van de oplosbaarheidswaarden in beide oplosmiddelen.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Alvorens met een langzaam-roerenexperiment een POW-waarde te bepalen moet de volgende informatie over een teststof beschikbaar zijn:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          structuurformule;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          geschikte analytische methoden voor de bepaling van de concentratie van de stof in water en 1-octanol;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          dissociatieconstante(n) van ioniseerbare stoffen (OESO-richtlijn 112 (9));
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          oplosbaarheid in water (10);
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          niet-biologische hydrolyse (11);
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          gemakkelijke biologische afbreekbaarheid (12);
                                       
                                    
                                          g)
                                       
                                       
                                          dampspanning (13).
                                       
                                    
                        BESCHRIJVING VAN DE METHODE
                  
                     Uitrusting en apparatuur
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Een standaard-laboratoriumuitrusting is vereist, in het bijzonder:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          magneetroerders en teflongecoate roerstaafjes, gebruikt om de waterfase te roeren;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          geschikte analyse-instrumenten voor het bepalen van de teststofconcentratie bij de verwachte concentraties;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          een roervat met een kraan in de bodem. Afhankelijk van de schatting van log POW en de detectiegrens van de teststof moet worden overwogen een gelijkvormig reactievat van meer dan een liter te gebruiken, opdat een groot genoeg volume water kan worden gebruikt voor chemische extractie en analyse. Dit zal leiden tot hogere concentraties in het waterextract en daarmee een grotere betrouwbaarheid opleveren van de analytische bepaling. Een tabel met schattingen van het minimaal benodigde volume, de detectiegrens van de verbinding, de geschatte log POW en de oplosbaarheid in water is opgenomen in aanhangsel 1. De tabel is gebaseerd op het verband tussen POW en de verhouding tussen de oplosbaarheidswaarden in octanol en water, volgens Pinsuwan et al. (14):
                                          
                                             
                                          waarbij
                                          
                                              (in molariteit);
                                          en op het verband volgens Lyman (15) voor het voorspellen van de oplosbaarheid in water. Waarden voor de oplosbaarheid in water die zijn berekend met de vergelijking uit aanhangsel 1 moeten worden beschouwd als voorlopige schattingen. Er zij op gewezen dat het de gebruiker vrij staat een schatting te maken van de oplosbaarheid in water door middel van ieder ander verband waarvan hij of zij meent dat dit het verband tussen hydrofobiciteit en oplosbaarheid beter weergeeft. Voor vaste stoffen wordt hierbij aanbevolen het smeltpunt te betrekken bij het voorspellen van de oplosbaarheid. Bij gebruik van een gewijzigde vergelijking moet worden nagegaan of de vergelijking voor het berekenen van de oplosbaarheid in octanol nog opgaat. Een schematische weergave van een dubbelwandig glazen roervat met een volume van ongeveer een liter is opgenomen in aanhangsel 2. Van de verhoudingen van het reactievat in aanhangsel 2 is gebleken dat ze gunstig zijn; deze moeten dan ook worden gehandhaafd bij gebruik van een apparaat van een andere omvang;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          een voorziening om de temperatuur tijdens het langzaam-roerenexperiment constant te houden is essentieel.
                                       
                                    
                        
                              18.
                           
                           
                              Het reactievat moet zijn vervaardigd van inert materiaal, opdat de adsorptie aan het oppervlak van het reactievat verwaarloosbaar is.
                           
                        
                     Bereiding van de testoplossingen
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              De bepaling van de POW moet worden uitgevoerd met 1-octanol van de hoogste zuiverheid die in de handel verkrijgbaar is (ten minste + 99 %). Aanbevolen wordt de 1-octanol te zuiveren door extractie met zuur, base en water en vervolgens te drogen. Bovendien kan de 1-octanol worden gezuiverd door middel van destillatie. Bij de bereiding van de standaardoplossingen van de teststof moet gezuiverde 1-octanol worden gebruikt. Het water dat voor de POW-bepaling wordt gebruikt, moet zijn gedistilleerd in apparatuur van glas of kwarts, of verkregen uit een zuiveringssysteem. Ook kan HPLC-water worden gebruikt. Voor gedestilleerd water is filtratie door een 0,22 μm-filter vereist, en moeten blanco’s in het experiment worden opgenomen om na te gaan dat de geconcentreerde extracten geen onzuiverheden bevatten die kunnen interfereren met de teststof. Bij gebruik van een glasvezelfilter moet dit vooraf worden schoongemaakt door het ten minste drie uur bij 400 °C te verhitten.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Voorafgaand aan het experiment worden de beide oplosmiddelen met elkaar verzadigd door ze in een voldoende groot reactievat met elkaar in evenwicht te brengen. Hiertoe wordt het tweefasensysteem gedurende twee dagen geroerd.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Een geschikte teststofconcentratie wordt gekozen en opgelost in 1-octanol (verzadigd met water). De 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënt moet worden bepaald in verdunde oplossingen in 1-octanol en water. Daarom mag de teststofconcentratie niet hoger zijn dan 70 % van de oplosbaarheid van de stof, met een maximumconcentratie van 0,1 M in elk van beide fasen (1). De voor het experiment gebruikte 1-octanoloplossingen moeten vrij zijn van gesuspendeerde vaste teststofdeeltjes.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              De geschikte hoeveelheid teststof wordt opgelost in 1-octanol (verzadigd met water). Als de geschatte waarde voor log POW hoger is dan 5, moet men goed opletten dat de voor het experiment gebruikte 1-octanoloplossingen geen gesuspendeerde vaste teststofdeeltjes bevatten. Daartoe moet bij een geschatte waarde van log POW > 5 de volgende werkwijze worden gevolgd:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          de teststof wordt opgelost in 1-octanol (verzadigd met water);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de oplossing wordt lang genoeg weggezet om de gesuspendeerde vastestofdeeltjes te laten bezinken. Gedurende het bezinkingsproces wordt de teststofconcentratie gemonitord;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          nadat de gemeten concentraties in de 1-octanol-oplossing stabiele waarden hebben bereikt, wordt de stockoplossing verdund met een geschikt volume 1-octanol;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de concentratie van de verdunde stockoplossing wordt gemeten. Als de gemeten concentratie consistent is met de verdunning kan de verdunde stockoplossing worden gebruikt in het langzaam-roerenexperiment.
                                       
                                    
                        
                     Extractie en analyse van de monsters
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Voor de bepaling van de teststofconcentratie moet een gevalideerde analysemethode worden gebruikt. De onderzoekers moeten aantonen dat de concentraties in de met water verzadigde 1-octanolfase en in de met 1-octanol verzadigde waterfase tijdens het experiment boven de bepaalbaarheidsgrens liggen van de gebruikte analysemethode. In gevallen waarin extractiemethoden nodig zijn, moeten voorafgaand aan het experiment de recovery’s van de teststof uit de waterfase en uit de 1-octanolfase worden vastgesteld. Het analysesignaal moet worden gecorrigeerd voor blanco’s en er moet voor worden gezorgd dat geen carry-over van analyt van het ene monster naar het andere kan optreden.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Voorafgaand aan de analyse zijn waarschijnlijk extractie van de waterfase met een organisch oplosmiddel en preconcentratie van het extract noodzakelijk. Om dezelfde reden is het noodzakelijk eventuele blancoconcentraties te verlagen. Daartoe moeten oplosmiddelen van hoge zuiverheid worden gebruikt, bij voorkeur oplosmiddelen voor restanalyse. Bovendien kan het voor het vermijden van kruisverontreiniging bevorderlijk zijn om te werken met vooraf zorgvuldig gereinigd glaswerk(bv. door te wassen met een oplosmiddel of tot hoge temperatuur te verhitten).
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Een schatting van log POW kan worden verkregen met een schattingsprogramma of op basis van het oordeel van een deskundige. Indien de waarde hoger is dan 6 moeten blancocorrecties en analytcarry-over nauwlettend worden gemonitord. Evenzo is het bij een geschatte log POW > 6 geboden een surrogaatstandaard te gebruiken om te corrigeren voor de recovery. In de handel is een aantal softwareprogramma’s beschikbaar voor het schatten van log POW
                                  (1), bv. Clog P(16), KOWWIN (17), ProLogP (18) en ACD log P (19). Beschrijvingen van de schattingaanpak zijn te vinden in de referenties (20-22).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              De bepaalbaarheidsgrenzen voor de teststofconcentratie in 1-octanol en water worden vastgesteld met behulp van beproefde methoden. Als vuistregel geldt dat de bepaalbaarheidsgrens van de methode kan worden bepaald als zijnde de concentratie in water of 1-octanol die een signaal-ruisverhouding geeft van tien. Er moet een geschikte extractie- en preconcentratiemethode worden gekozen en analytische recovery’s moeten eveneens worden gespecificeerd. Een geschikte preconcentratiefactor wordt gekozen om bij analytische bepaling een signaal van de vereiste sterkte te verkrijgen.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Op basis van de parameters van de analysemethode en de verwachte concentraties wordt bepaald van welke orde van grootte de monsteromvang moet zijn voor een nauwkeurige bepaling van de stofconcentratie. Het gebruik van watermonsters die te klein zijn om voldoende analysesignaal te verkrijgen, moet worden vermeden. Het gebruik van buitensporig grote watermonsters moet eveneens worden vermeden, aangezien er anders te weinig water over is voor het minimaal vereiste aantal analysen (n = 5). In aanhangsel 1 wordt het minimale monstervolume aangegeven als functie van het volume van het reactievat, de detectiegrens van de teststof en de oplosbaarheid van de teststof.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              De kwantitatieve bepaling van de teststoffen geschiedt door de kalibratiecurven van de respectieve verbinding te vergelijken. De concentraties van de geanalyseerde monsters moeten vergezeld gaan van de concentraties van de standaarden.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Voor teststoffen met een geschatte log POW > 6 moet voorafgaand aan de extractie een surrogaatstandaard aan het watermonster worden gekoppeld om de tijdens extractie en preconcentratie van de watermonsters optredende verliezen te registeren. Voor een nauwkeurige recoverycorrectie moeten de eigenschappen van de surrogaten vrijwel of geheel overeenkomen met die van de teststof. Bij voorkeur worden voor dit doel stabiele, isotopisch gemerkte (bijvoorbeeld gedeutereerde of 13C-gemerkte) analogen van de betreffende stoffen gebruikt. Indien het gebruik van gemerkte stabiele isotopen (bijvoorbeeld 2H of 13C) niet mogelijk is, moet op basis van betrouwbare gegevens in de literatuur worden aangetoond dat de fysisch-chemische eigenschappen van het surrogaat nagenoeg overeenkomen met die van de teststof. Bij vloeistof-vloeistofextractie van de waterfase kunnen zich emulsies vormen. Dit kan worden beperkt door zout toe te voegen en de emulsie gedurende de nacht te laten bezinken. De voor de extractie en de preconcentratie van de monsters gebruikte methoden dienen te worden vermeld.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Monsters die uit de 1-octanolfase zijn onttrokken, kunnen zo nodig voorafgaand aan de analyse worden verdund met een geschikt oplosmiddel. Bovendien wordt het gebruik van surrogaatstandaarden aanbevolen voor stoffen waarvoor recoveryexperimenten een grote mate van variatie hebben aangetoond in de recoveryexperimenten (een relatieve standaarddeviatie > 10 %).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              De details van de analytische methode dienen te worden vermeld, waaronder de extractiemethode, de preconcentratie- en verdunningsfactoren, de instrumentparameters, de kalibratieprocedure, het kalibratiebereik, de analytische recovery van de teststof uit water, de toevoeging van surrogaatstandaarden voor recoverycorrectie, blancowaarden, detectiegrenzen en bepaalbaarheidsgrenzen.
                           
                        
                     Uitvoering van de test
                  
                  
                     Optimale volumeverhoudingen 1-octanol/water
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Bij het kiezen van de water- en 1-octanolvolumes moet rekening worden gehouden met de bepaalbaarheidsgrenzen in 1-octanol en water, de preconcentratiefactoren die zijn toegepast op de watermonsters, de monstervolumes in 1-octanol en water, en de verwachte concentraties. Om experimentele redenen moet het volume 1-octanol in het langzaam-roerensysteem zodanig worden gekozen dat de 1-octanollaag dik genoeg is (> 0,5 cm) om een monster te kunnen nemen uit de 1-octanolfase zonder deze te verstoren.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Typische faseverhoudingen die worden gebruikt bij bepalingen van verbindingen met een log POW van 4,5 en hoger zijn 20 tot 50 ml 1-octanol en 950 tot 980 ml water in een 1 litervat.
                           
                        
                     Testomstandigheden
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Tijdens de test wordt het reactievat thermostatisch geregeld om de temperatuur tot op 1 °C constant te houden. De bepaling dient te worden uitgevoerd bij 25 °C.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              De proefopstelling moet worden beschermd tegen daglicht, hetzij door het experiment in een donkere ruimte uit te voeren, hetzij door het reactievat met aluminiumfolie te bedekken.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Het experiment moet worden uitgevoerd in een (zo veel mogelijk) stofvrije omgeving.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Het 1-octanol-watersysteem wordt geroerd tot zich een evenwicht heeft ingesteld. In een pilotexperiment wordt de equilibratieperiode bepaald door een langzaam-roerenexperiment uit te voeren en op gezette tijden water- en 1-octanolmonsters te nemen. De monsters moeten worden genomen met een tussentijd van ten minste vijf uur.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Elke POW-bepaling moet worden uitgevoerd met ten minste drie onafhankelijke langzaam-roerenexperimenten.
                           
                        
                     Bepaling van de equilibratietijd
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Aangenomen wordt dat zich een evenwicht heeft ingesteld wanneer een regressie van de 1-octanol/water-concentratieverhouding tegen de tijd over een periode van vier meetpunten een helling oplevert die niet significant afwijkt van nul bij een p-waarde van 0,05. De equilibratietijd is minimaal één dag voordat met de monsterneming kan worden begonnen. Als vuistregel geldt dat de monsterneming van stoffen met een geschatte log POW < 5 op de dagen twee en drie kan plaatsvinden. Bij meer hydrofobe verbindingen kan het zijn dat de equilibratieperiode moet worden verlengd. Voor een verbinding met log POW = 8,23 (decachloorbifenyl) waren 144 uur voldoende voor het instellen van een evenwicht. Of zich een evenwicht heeft ingesteld, wordt nagegaan door herhaaldelijk een monster te nemen uit hetzelfde reactievat.
                           
                        
                     Het experiment opstarten
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Bij het opstarten van het experiment wordt het reactievat gevuld met 1-octanol verzadigd water. Vervolgens wordt gewacht totdat de thermostatisch ingestelde temperatuur is bereikt.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              De gewenste hoeveelheid teststof (opgelost in het vereiste volume met water verzadigde 1-octanol) wordt voorzichtig toegevoegd in het reactievat. Dit is een cruciale stap in het experiment, daar turbulente menging van de twee fasen vermeden moet worden. Daartoe kan de 1-octanolfase langzaam worden gepipetteerd tegen de wand van het proefvat, vlak boven het wateroppervlak. Het zal dan langs de glaswand stromen en een film vormen boven op de waterfase. Het rechtstreeks schenken van 1-octanol in het vat moet te allen tijde worden vermeden; er mogen geen 1-octanoldruppels rechtstreeks in het water vallen.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Nadat met roeren is begonnen, wordt de roersnelheid langzaam opgevoerd. Als de roermotoren niet op de vereiste manier kunnen worden ingesteld, moet worden overwogen een transformator te gebruiken. De roersnelheid moet zodanig worden ingesteld dat op het raakvlak van het water en de 1-octanol een vortex van 0,5 tot maximaal 2,5 cm diepte wordt gevormd. De roersnelheid moet worden verlaagd als de vortexdiepte van 2,5 cm wordt overschreden, aangezien anders microdruppeltjes kunnen worden gevormd uit druppeltjes 1-octanol in de waterfase, die leiden tot een overschatting van de teststofconcentratie in het water. De maximale roersnelheid van 2,5 cm vortexdiepte wordt aanbevolen op basis van de bevindingen uit het als ringtest uitgevoerde validatieonderzoek (5). Het is een compromis tussen een snelle evenwichtsinstelling en beperking van de vorming van microdruppeltjes 1-octanol.
                           
                        
                     Monsterneming en monsterbehandeling
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Voordat een monster wordt genomen, moet de roerder worden uitgezet en moeten de vloeistoffen tot stilstand komen. Nadat het monster is genomen, wordt de roerder weer langzaam aangezet en wordt de roersnelheid weer geleidelijk opgevoerd, zoals hierboven beschreven.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Monsters uit de waterfase worden genomen via een kraan in de bodem van het reactievat. Het dode volume aan water dat zich in de kranen bevindt (in het in aanhangsel 2 beschreven vat ongeveer 5 ml) moet altijd worden weggegooid. Het water in de kranen wordt namelijk niet geroerd en is dan ook niet in evenwicht met de bulk. Noteer het volume van de watermonsters en zorg dat rekening wordt gehouden met de hoeveelheid teststof in het weggegooide water wanneer een massabalans wordt opgesteld. Verlies door verdamping moet zo veel mogelijk worden beperkt door het water rustig in de scheitrechter te laten lopen, zodat de water-1-octanollaag niet wordt verstoord.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              1-octanolmonsters worden verkregen door afname van een klein aliquot (ca. 100 μl) uit de 1-octanollaag met een 100 microliterspuit van glas en metaal. Pas op dat het grensvlak niet wordt verstoord. Het volume van het vloeistofmonster wordt opgeschreven. Een klein aliquot is voldoende, daar het 1-octanolmonster nog wordt verdund.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Om onnodige overbrengingsstappen van het monster te vermijden moet het monstervolume gravimetrisch worden bepaald. Bij watermonsters kan dit worden gedaan door het watermonster in een scheitrechter op te vangen die al de vereiste hoeveelheid oplosmiddel bevat.
                           
                        GEGEVENS EN RAPPORTAGE
                  
                              47.
                           
                           
                              Volgens deze testmethode wordt de POW bepaald door drie langzaam-roerenexperimenten uit te voeren (drie proefnemingen) met de te onderzoeken verbinding, onder identieke omstandigheden. De regressie om aan te tonen dat evenwicht is bereikt, moet zijn gebaseerd op de resultaten van ten minste vier bepalingen van CO/CW op opeenvolgende tijdstippen. Op die manier kan de variantie worden berekend als maat voor de onzekerheid van de gemiddelde waarde die bij elke proefneming wordt verkregen.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              De POW kan worden gekarakteriseerd door de variantie in de gegevens die in elke proefneming zijn verkregen. Deze informatie wordt gebruikt om de POW te berekenen als gewogen gemiddelde van de resultaten van de individuele proefnemingen. Daartoe wordt de inverse variantie van de resultaten van de proefnemingen als gewicht gebruikt. Op die manier zullen gegevens met een grote spreiding (uitgedrukt in de variantie), en dus een lagere betrouwbaarheid, minder invloed hebben op de uitkomst dan gegevens met een lage variantie.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Op soortgelijke wijze wordt de gewogen standaarddeviatie berekend. Dit is een maat voor de herhaalbaarheid van de POW-meting. Een lage waarde voor de gewogen standaarddeviatie geeft aan dat de POW-bepaling binnen hetzelfde laboratorium een hoge herhaalbaarheid had. De formele statische behandeling van de gegevens wordt hieronder geschetst.
                           
                        
                     Verwerking van de resultaten
                  
                  
                     Het aantonen dat een evenwicht is bereikt
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Voor iedere monstertijd wordt de logaritme berekend van de verhouding van de teststofconcentratie in 1-octanol en water (log (CO/Cw)). Het bereiken van chemisch evenwicht wordt aangetoond door deze verhouding uit te zetten tegen de tijd. Als deze curve een plateau laat zien op basis van ten minste vier opeenvolgende tijdpunten toont dit aan dat een evenwicht is bereikt, en dat de verbinding daadwerkelijk in de 1-octanol is opgelost. Zo niet, dan moet de test worden voortgezet totdat vier opeenvolgende tijdpunten een helling opleveren die niet significant afwijkt van 0 bij een p-waarde van 0,05, hetgeen aangeeft dat log Co/Cw niet langer afhangt van de tijd.
                           
                        
                     Berekening van log POW
                     
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              De waarde van log POW van de proefneming wordt berekend als het gewogen gemiddelde van log Co/Cw voor het deel van de curve van log Co/Cw tegen de tijd waarvoor evenwicht is aangetoond. Het gewogen gemiddelde wordt berekend door de gegevens gewicht toe te kennen op basis van de inverse variantie, zodat de invloed van de gegevens op de einduitkomst omgekeerd evenredig is aan de onzekerheid van de gegevens.
                           
                        
                     Gemiddelde log POW
                     
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              De gemiddelde waarde van log POW van de verschillende proefnemingen wordt berekend als het gemiddelde van de uitkomsten van de individuele proefnemingen, gewogen naar hun respectieve varianties.
                              De berekening gaat als volgt:
                              
                                 
                              waarbij
                              
                                          log POW,i
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          de log POW-waarde van de individuele proefneming i;
                                       
                                    
                                          log POW,Av
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          de gewogen gemiddelde waarde van de individuele log POW-bepalingen;
                                       
                                    
                                          wi
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          het statistische gewicht dat aan de log POW-waarde van proefneming i wordt toegekend.
                                       
                                    Voor wi wordt de reciproque waarde van de variantie van log POW,i gebruikt ().
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              De fout in het gemiddelde van log POW, wordt geschat als de herhaalbaarheid van de log Co/Cw die is bepaald in de evenwichtsfase in de verschillende proefnemingen, en deze wordt uitgedrukt als de gewogen standaarddeviatie van log POW,Av (σlog Pow,Av), die op haar beurt een maat is voor de fout in log POW,Av. De gewogen standaarddeviatie kan als volgt worden berekend uit de gewogen variantie (varlog Pow,Av):
                              
                                 
                              
                                 
                              Het symbool n staat voor het aantal proefnemingen.
                           
                        
                     Testverslag
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Teststof:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de triviale naam, de chemische naam, het CAS-nummer, de structuurformule (waarin de plaats van het label wordt aangegeven bij gebruik van een radioactief gemerkte stof) en relevante fysisch-chemische eigenschappen (zie punt 17),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de zuiverheid (verontreinigingen) van de teststof,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de zuiverheid van het label van gemerkte chemicaliën en molaire activiteit (indien van toepassing),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de voorlopige schatting van log POW, alsmede de gebruikte methode om deze waarde af te leiden.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testomstandigheden:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de data waarop de onderzoeken zijn uitgevoerd,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de temperatuur tijdens het experiment,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de beginvolumes 1-octanol en water,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de volumes van de 1-octanol- en watermonsters,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de restvolumes 1-octanol en water in de testvaten,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een beschrijving van de testvaten en de gebruikte roeromstandigheden (vorm van het roerstaafje en het testvat, vortexdiepte in mm en, indien beschikbaar, de roersnelheid),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de gebruikte analysemethoden om de teststofconcentratie te bepalen en de bepaalbaarheidsgrens van de methode;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de monsternemingsintervallen,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de pH van de waterfase en de gebruikte buffers, wanneer de pH is bijgesteld voor ioniseerbare moleculen,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      het aantal replicaatbepalingen.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Resultaten:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de herhaalbaarheid en de gevoeligheid van de gebruikte analysemethoden,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de gemeten teststofconcentraties in 1-octanol en water in de tijd,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de massabalans,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de temperatuur en standaarddeviatie of het bereik van de temperatuur tijdens het experiment,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een regressie van de concentratieverhouding tegen de tijd,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de gemiddelde waarde voor log Pow,Av met standaardfout,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een bespreking en interpretatie van de resultaten;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      voorbeelden van onbewerkte gegevens van representatieve analysen (alle ruwe gegevens moeten worden opgeslagen overeenkomstig GLP-normen) inclusief recovery’s van surrogaten, het aantal kalibratieniveaus (samen met de criteria voor de correlatiecoëfficiënt van de kalibratiecurve), en de resultaten van de kwaliteitsgarantie/kwaliteitscontrole (QA/QC),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      indien beschikbaar: validatierapport van de bepalingsmethode (op te nemen als referentie).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATUUR:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the „slow-stirring” method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              Hoofdstuk A.8 van deze bijlage, Verdelingscoëfficiënt.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Hoofdstuk A.8 van deze bijlage, Verdelingscoëfficiënt.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596-2602.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paris.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Hoofdstuk A.6 van deze bijlage, Oplosbaarheid in water.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Hoofdstuk C.7 van deze bijlage, Afbraak — Niet-biologische afbraak: hydrolyse in afhankelijkheid van de pH.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Hoofdstuk C.4 — Delen II tot en met VII (methoden A tot en met F) van deze bijlage, Bepaling van de „gemakkelijke” biologische afbreekbaarheid.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Hoofdstuk A.4 van deze bijlage, Dampspanning.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623-626.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 tot en met 2-52.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001.
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, DC.
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479-488.
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386-390.
                           
                        
                     Aanhangsel 1
                     
                        Spreadsheet voor het berekenen van de minimaal benodigde volumes water voor de detectie van teststoffen met verschillende log POW-waarden in de waterfase
                     
                     Aannamen:
                     
                                 —
                              
                              
                                 het maximumvolume van de individuele aliquots = 10 % van het totaalvolume; 5 aliquots = 50 % van het totaalvolume,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 
                                    . Bij lagere concentraties zouden grotere volumes nodig zijn,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 het volume voor het bepalen van de detectiegrens = 100 ml,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 log Pow tegen log Sw en log Pow tegen SR (Soct/Sw) zijn goede manieren om de verbanden voor teststoffen weer te geven.
                              
                           
                        Geschatte Sw
                        
                     
                     
                                 Log Pow
                                 
                              
                              
                                 Vergelijking
                              
                              
                                 Log Sw
                                 
                              
                              
                                 Sw (mg/l)
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 0,496
                              
                              
                                 3,133E+00
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 0,035
                              
                              
                                 1,084E+00
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –0,426
                              
                              
                                 3,750E-01
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –0,887
                              
                              
                                 1,297E-01
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –1,348
                              
                              
                                 4,487E-02
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –1,809
                              
                              
                                 1,552E-02
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –2,270
                              
                              
                                 5,370E-03
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –2,731
                              
                              
                                 1,858E-03
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –3,192
                              
                              
                                 6,427E-04
                              
                           
                        Geschatte Soct
                        
                     
                     
                                 Log Pow
                                 
                              
                              
                                 Vergelijking
                              
                              
                                 Soct (mg/l)
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 3,763E+04
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 4,816E+04
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 6,165E+04
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 7,890E+04
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,010E+05
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,293E+05
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,654E+05
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 2,117E+05
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 2,710E+05
                              
                           
                        
                     
                                 Totale massa teststof
                                 (mg)
                              
                              
                                 Massaoct/Massawater
                                 
                              
                              
                                 MassaH2O
                                 
                                 (mg)
                              
                              
                                 ConcH2O
                                 
                                 (mg/l)
                              
                              
                                 Massaoct
                                 
                                 (mg)
                              
                              
                                 Concoct
                                 
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 1 319
                              
                              
                                 526
                              
                              
                                 2,5017
                              
                              
                                 2,6333
                              
                              
                                 1 317
                              
                              
                                 26 333
                              
                           
                                 1 686
                              
                              
                                 1 664
                              
                              
                                 1,0127
                              
                              
                                 1,0660
                              
                              
                                 1 685
                              
                              
                                 33 709
                              
                           
                                 2 158
                              
                              
                                 5 263
                              
                              
                                 0,4099
                              
                              
                                 0,4315
                              
                              
                                 2 157
                              
                              
                                 43 149
                              
                           
                                 2 762
                              
                              
                                 16 644
                              
                              
                                 0,1659
                              
                              
                                 0,1747
                              
                              
                                 2 762
                              
                              
                                 55 230
                              
                           
                                 3 535
                              
                              
                                 52 632
                              
                              
                                 0,0672
                              
                              
                                 0,0707
                              
                              
                                 3 535
                              
                              
                                 70 691
                              
                           
                                 4 524
                              
                              
                                 1664 36
                              
                              
                                 0,0272
                              
                              
                                 0,0286
                              
                              
                                 4 524
                              
                              
                                 90 480
                              
                           
                                 5 790
                              
                              
                                 5263 16
                              
                              
                                 0,0110
                              
                              
                                 0,0116
                              
                              
                                 5 790
                              
                              
                                 115 807
                              
                           
                                 7 411
                              
                              
                                 1 664 357
                              
                              
                                 0,0045
                              
                              
                                 0,0047
                              
                              
                                 7 411
                              
                              
                                 148 223
                              
                           
                                 9 486
                              
                              
                                 5 263 158
                              
                              
                                 0,0018
                              
                              
                                 0,0019
                              
                              
                                 9 486
                              
                              
                                 189 713
                              
                           
                        Berekening volumes
                     
                     
                        Minimaal benodigd volume voor de H2O-fase bij iedere detectiegrensconcentratie
                     
                     
                                 Log Kow
                                 
                              
                              
                                 Detectiegrens (mg/l)→
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,00
                              
                              
                                 10
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,04
                              
                              
                                 0,38
                              
                              
                                 3,80
                              
                              
                                 38
                              
                              
                                 380
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,09
                              
                              
                                 0,94
                              
                              
                                 9,38
                              
                              
                                 94
                              
                              
                                 938
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,23
                              
                              
                                 2,32
                              
                              
                                 23,18
                              
                              
                                 232
                              
                              
                                 2 318
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,57
                              
                              
                                 5,73
                              
                              
                                 57,26
                              
                              
                                 573
                              
                              
                                 5 726
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,41
                              
                              
                                 14,15
                              
                              
                                 141
                              
                              
                                 1 415
                              
                              
                                 14 146
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 3,50
                              
                              
                                 34,95
                              
                              
                                 350
                              
                              
                                 3 495
                              
                              
                                 34 950
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 8,64
                              
                              
                                 86,35
                              
                              
                                 864
                              
                              
                                 8 635
                              
                              
                                 86 351
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 21,33
                              
                              
                                 213
                              
                              
                                 2 133
                              
                              
                                 21 335
                              
                              
                                 213 346
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 52,71
                              
                              
                                 527
                              
                              
                                 5 271
                              
                              
                                 52 711
                              
                              
                                 527 111
                              
                           
                                 Gebruikt volume voor detectiegrens (l)
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                        Verklaring bij berekeningen
                     
                     Staat voor < 10 % van het totaalvolume van de waterfase in een equilibratievat van 1 liter.
                     Staat voor < 10 % van het totaalvolume van de waterfase in een equilibratievat van 2 liter.
                     Staat voor < 10 % van het totaalvolume van de waterfase in een equilibratievat van 5 liter.
                     Staat voor < 10 % van het totaalvolume van de waterfase in een equilibratievat van 10 liter.
                     Is zelfs meer dan 10 % in een equilibratievat van 10 liter.
                     
                        Overzicht van de benodigde volumes als functie van de oplosbaarheid in water en log Pow
                        
                     
                     Minimaal benodigd volume voor de H2O-fase bij elke detectiegrensconcentratie (ml)
                     
                                 Log Pow
                                 
                              
                              
                                 Sw (mg/l)
                              
                              
                                 Detectiegrens (mg/l)→
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,00
                              
                              
                                 10
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,12
                              
                              
                                 1,19
                              
                              
                                 11,90
                              
                              
                                 118,99
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,02
                              
                              
                                 0,24
                              
                              
                                 2,38
                              
                              
                                 23,80
                              
                              
                                 237,97
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 3
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,04
                              
                              
                                 0,40
                              
                              
                                 3,97
                              
                              
                                 39,66
                              
                              
                                 396,62
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,12
                              
                              
                                 1,19
                              
                              
                                 11,90
                              
                              
                                 118,99
                              
                              
                                 1 189,86
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,02
                              
                              
                                 0,20
                              
                              
                                 2,03
                              
                              
                                 20,34
                              
                              
                                 203,37
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                 0,51
                              
                              
                                 5,08
                              
                              
                                 50,84
                              
                              
                                 508,42
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,02
                              
                              
                                 10,17
                              
                              
                                 101,68
                              
                              
                                 1 016,83
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,20
                              
                              
                                 2,03
                              
                              
                                 20,34
                              
                              
                                 203,37
                              
                              
                                 2 033,67
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,09
                              
                              
                                 0,87
                              
                              
                                 8,69
                              
                              
                                 86,90
                              
                              
                                 869,01
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,17
                              
                              
                                 1,74
                              
                              
                                 17,38
                              
                              
                                 173,80
                              
                              
                                 1 738,02
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,375
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,23
                              
                              
                                 2,32
                              
                              
                                 23,18
                              
                              
                                 231,75
                              
                              
                                 2 317,53
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,43
                              
                              
                                 4,35
                              
                              
                                 43,45
                              
                              
                                 434,51
                              
                              
                                 4 345,05
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 0,4
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,19
                              
                              
                                 1,86
                              
                              
                                 18,57
                              
                              
                                 185,68
                              
                              
                                 1 856,79
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,37
                              
                              
                                 3,71
                              
                              
                                 37,14
                              
                              
                                 371,36
                              
                              
                                 3 713,59
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,74
                              
                              
                                 7,43
                              
                              
                                 74,27
                              
                              
                                 742,72
                              
                              
                                 7 427,17
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,49
                              
                              
                                 14,85
                              
                              
                                 148,54
                              
                              
                                 1 485,43
                              
                              
                                 14 854,35
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,63
                              
                              
                                 6,35
                              
                              
                                 63,48
                              
                              
                                 634,80
                              
                              
                                 6 347,95
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,27
                              
                              
                                 12,70
                              
                              
                                 126,96
                              
                              
                                 1 269,59
                              
                              
                                 12 695,91
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 2,54
                              
                              
                                 25,39
                              
                              
                                 253,92
                              
                              
                                 2 539,18
                              
                              
                                 25 391,82
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 5,08
                              
                              
                                 50,78
                              
                              
                                 507,84
                              
                              
                                 5 078,36
                              
                              
                                 50 783,64
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 0,025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 2,17
                              
                              
                                 21,70
                              
                              
                                 217,02
                              
                              
                                 2 170,25
                              
                              
                                 21 702,46
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 4,34
                              
                              
                                 43,40
                              
                              
                                 434,05
                              
                              
                                 4 340,49
                              
                              
                                 43 404,93
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,006
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 9,04
                              
                              
                                 90,43
                              
                              
                                 904,27
                              
                              
                                 9 042,69
                              
                              
                                 90 426,93
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,003
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 18,09
                              
                              
                                 180,85
                              
                              
                                 1 808,54
                              
                              
                                 18 085,39
                              
                              
                                 180 853,86
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 0,006
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 7,73
                              
                              
                                 77,29
                              
                              
                                 772,89
                              
                              
                                 7 728,85
                              
                              
                                 77 288,50
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,003
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 15,46
                              
                              
                                 154,58
                              
                              
                                 1 545,77
                              
                              
                                 15 457,70
                              
                              
                                 154 577,01
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0015
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 23,19
                              
                              
                                 231,87
                              
                              
                                 2 318,66
                              
                              
                                 23 186,55
                              
                              
                                 231 865,51
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 46,37
                              
                              
                                 463,73
                              
                              
                                 4 637,31
                              
                              
                                 46 373,10
                              
                              
                                 463 731,03
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 0,002
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 19,82
                              
                              
                                 198,18
                              
                              
                                 1 981,77
                              
                              
                                 19 817,73
                              
                              
                                 198 177,33
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 39,64
                              
                              
                                 396,35
                              
                              
                                 3 963,55
                              
                              
                                 39 635,47
                              
                              
                                 396 354,66
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0005
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 79,27
                              
                              
                                 792,71
                              
                              
                                 7 927,09
                              
                              
                                 79 270,93
                              
                              
                                 792 709,32
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,00025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 158,54
                              
                              
                                 1 585,42
                              
                              
                                 15 854,19
                              
                              
                                 158 541,86
                              
                              
                                 1 585 418,63
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 33,88
                              
                              
                                 338,77
                              
                              
                                 3 387,68
                              
                              
                                 33 876,77
                              
                              
                                 338 767,72
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0005
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 67,75
                              
                              
                                 677,54
                              
                              
                                 6 775,35
                              
                              
                                 67 753,54
                              
                              
                                 677 535,44
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,00025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 135,51
                              
                              
                                 1 355,07
                              
                              
                                 13 550,71
                              
                              
                                 135 507,09
                              
                              
                                 1 355 070,89
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,000125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 271,01
                              
                              
                                 2 710,14
                              
                              
                                 27 101,42
                              
                              
                                 271 014,18
                              
                              
                                 2 710 141,77
                              
                           
                                 Gebruikt volume voor detectiegrens (l)
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                  
                     Aanhangsel 2
                     
                        Voorbeeld van een dubbelwandig glazen testvat voor de bepaling van POW met de langzaam-roerenmethode
                     
                     
                        
                  ”
            
                  3)
               
               
                  Hoofdstuk B.2 wordt vervangen door:
                  „B.2.   ACUTE INHALATIETOXICITEIT
                  
                  INLEIDING
                  
                              1.
                           
                           
                              Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 403 (2009) van de OESO (1). Testrichtlijn 403 (TG 403), de oorspronkelijke testrichtlijn voor acute inhalatie, werd in 1981 vastgesteld. Deze herziene testmethode B.2 (die gelijkwaardig is aan de herziene versie van TG 403) is ontworpen om de flexibiliteit te vergroten, het gebruik van dieren terug te dringen en in regelgevingsbehoeften te voorzien. De herziene testmethode omvat twee soorten onderzoek: een traditioneel LC50-protocol en een concentratie × tijd-protocol (c × t-protocol). Deze testmethode heeft als belangrijkste kenmerken dat zij het mogelijk maakt om een verband tussen concentratie en respons vast te stellen dat loopt van een niet-dodelijke tot een dodelijke afloop, teneinde een mediaan letale concentratie (LC50), niet-dodelijke drempelconcentratie (bv. LC01), en helling af te leiden, en om mogelijke geslachtsgebonden gevoeligheid aan te tonen. Het c × t-protocol moet worden gebruikt wanneer specifieke behoeften op het gebied van regelgeving of wetenschap het nodig maken gedurende meerdere perioden van verschillende duur dierproeven uit te voeren, bijvoorbeeld met het oog op het opstellen van rampenbestrijdingsplannen (bv. om waarden voor de richtniveaus voor acute blootstelling (Acute Exposure Guideline Levels, AEGL’s), richtsnoeren voor rampenbestrijdingsplannen (Emergency Response Planning Guidelines (ERPG’s), of drempelniveaus voor acute blootstelling (Acute Exposure Threshold Levels, AETL’s) af te leiden) of ruimtelijkeordeningsplannen.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Aanwijzingen voor de uitvoering en interpretatie van onderzoek volgens deze testmethode zijn opgenomen in de leidraad betreffende tests op acute inhalatietoxiciteit (GD 39 (2)).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              De in de context van deze testmethode gebruikte definities zijn opgenomen in het laatste deel van dit hoofdstuk en in GD 39 (2).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Deze testmethode maakt het mogelijk teststoffen te karakteriseren, er een kwantitatieve risicobeoordeling voor uit te voeren, en ze te rangschikken en in te delen overeenkomstig Verordening (EG) nr. 1272/2008 (3). GD 39 (2) bevat een leidraad voor de keuze van de geschikte testmethode voor acute toxiciteitstests. Wanneer alleen informatie over indeling en etikettering nodig is, wordt over het algemeen hoofdstuk B.52 van deze bijlage (4) aanbevolen (zie GD 39 (2)). Deze testmethode B.2 is niet specifiek bedoeld voor het testen van speciale materialen, zoals slecht oplosbare isometrische materialen of vezelmaterialen of gefabriceerde nanomaterialen.
                           
                        INLEIDENDE OVERWEGINGEN
                  
                              5.
                           
                           
                              Alvorens te overwegen deze testmethode toe te passen, moet het testlaboratorium alle beschikbare informatie over de teststof, met inbegrip van bestaande studies (bv. hoofdstuk B.52 van deze bijlage (4)) waarvan de gegevens een argument vormen om geen aanvullende tests uit te voeren, in aanmerking nemen teneinde het gebruik van dieren tot een minimum te beperken. Voor de keuze van de geschiktste soorten, stam, geslacht, wijze van blootstelling en testconcentraties kan onder meer gebruik worden gemaakt van informatie over de identiteit, chemische structuur en fysisch-chemische eigenschappen van de teststof; de resultaten van eventuele in vitro of in vivo uitgevoerde toxiciteitstests; de voorgenomen toepassingen en de potentiële blootstelling van de mens; en de beschikbare (Q)SAR-gegevens en toxicologische gegevens over chemische stoffen met een verwante structuur (zie GD 39 (2)).
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Het testen van bijtende en/of irriterende teststoffen bij concentraties die naar verwachting hevige pijn en/of angst zullen veroorzaken, moeten zo veel mogelijk worden vermeden. Het bijtende/irriterende potentieel moet op basis van het oordeel van deskundigen worden geëvalueerd, met behulp van bijvoorbeeld ervaring bij mens en dier (bv. op grond van onderzoek met herhaalde toediening, uitgevoerd bij niet-bijtende/niet-irriterende concentraties), bestaande in-vitrogegevens (bv. op grond van de hoofdstukken B.40 (5) en B.40 bis (6) van deze bijlage of van OESO TG 435 (7)), pH-waarden, informatie over soortgelijke stoffen of andere relevante gegevens, teneinde uit te zoeken of van verdere tests kan worden afgezien. Bij specifieke regelgevingsbehoeften (bv. voor het opstellen van rampenplannen) kan deze testmethode worden gebruikt voor het blootstellen van dieren aan deze materialen, aangezien zij de onderzoeksleider of hoofdonderzoeker de controle geeft over de keuze van de doelconcentraties. De doelconcentraties mogen echter geen ernstige irriterende/bijtende effecten veroorzaken, maar moeten wel toereikend zijn om de concentratie/responscurve uit te breiden tot niveaus die stroken met de wetenschappelijke en regelgevingsdoelstellingen van de test. Deze concentraties moeten per geval worden gekozen en de keuze voor een bepaalde concentratie moet worden gemotiveerd (zie GD 39 (2)).
                           
                        PRINCIPE VAN DE TEST
                  
                              7.
                           
                           
                              Deze herziene testmethode B.2 is ontworpen om voldoende informatie te kunnen verzamelen over de acute toxiciteit van een teststof om deze in te kunnen delen, en om voor kwantitatieve risicobeoordelingen benodigde gegevens over de sterfte (bv. LC50, LC01 en helling) voor één of beide geslachten te verkrijgen. Deze testmethode omvat twee methoden. De eerste methode is een traditioneel protocol waarin groepen dieren gedurende een vaststaande periode, doorgaans vier uur, aan een limietconcentratie (limiettest) of een stapsgewijze reeks concentraties worden blootgesteld. Voor specifieke regelgevingsdoeleinden kan een andere blootstellingsduur vereist zijn. De tweede methode is een (c × t)-protocol waarin groepen dieren worden blootgesteld aan één concentratie (limietconcentratie) of een reeks van verschillende concentraties gedurende perioden van verschillende duur.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Stervende dieren of dieren die duidelijk pijn hebben of tekenen van hevige en voortdurende angst vertonen, worden op humane wijze gedood en worden bij de interpretatie van het testresultaat op dezelfde manier behandeld als dieren die tijdens de test gestorven zijn. OESO-leidraad nr. 19 inzake humane eindpunten (8) bevat criteria om te bepalen of stervende of hevig lijdende dieren moeten worden gedood en richtsnoeren om voorspelbare of ophanden zijnde sterfte te herkennen.
                           
                        BESCHRIJVING VAN DE METHODE
                  
                     Keuze van de diersoort
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Er worden gezonde jonge volwassen dieren van gangbare laboratoriumstammen gebruikt. Er wordt de voorkeur gegeven aan ratten; het gebruik van andere soorten moet worden gemotiveerd.
                           
                        
                     Voorbereiding van de dieren
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig zijn. Op de dag van blootstelling moeten de jonge volwassen dieren acht tot twaalf weken oud zijn en een lichaamsgewicht hebben dat niet meer dan 20 % afwijkt van het gemiddelde gewicht voor elk geslacht van eerder blootgestelde dieren van dezelfde leeftijd. De dieren worden willekeurig gekozen en gemerkt om elk dier afzonderlijk te kunnen identificeren. De dieren blijven voordat de test begint minimaal vijf dagen in hun kooi om in het laboratorium te acclimatiseren. Vlak voor de test acclimatiseren de dieren ook enige tijd in het testapparaat, aangezien hierdoor de stress als gevolg van de nieuwe omgeving zal afnemen.
                           
                        
                     Dierhouderij
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              De temperatuur van de ruimte waar de proefdieren verblijven, moet 22 ± 3 °C zijn. De relatieve vochtigheid wordt idealiter tussen 30 en 70 % gehouden, maar wanneer water als medium wordt gebruikt, zal dit niet altijd mogelijk zijn. Voor en na de blootstelling worden de dieren over het algemeen groepsgewijs in kooien ondergebracht, waarbij zij naar geslacht en concentratie worden gescheiden; het aantal dieren per kooi mag echter niet zo groot zijn dat een duidelijke observatie van elk dier wordt gestoord en moet zodanig worden gekozen dat er zo min mogelijk dieren verloren gaan als gevolg van kannibalisme en gevechten. Wanneer de dieren uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan acclimatisatie voor de fixeerbuizen noodzakelijk zijn. De fixeerbuizen mogen geen onnodige lichamelijke, thermische of immobilisatiestress voor de dieren opleveren. De immobilisatie kan van invloed zijn op fysiologische eindpunten zoals de lichaamstemperatuur (hyperthermie) en/of het ademminuutvolume. Als er generieke gegevens beschikbaar zijn waaruit blijkt dat geen significante veranderingen als gevolg van de immobilisatie optreden, is geen voorafgaande gewenning aan de fixeerbuizen noodzakelijk. Dieren die met hun hele lijf aan een aerosol worden blootgesteld, worden tijdens de blootstelling individueel gehuisvest om te voorkomen dat zij het testaerosol filteren door de vacht van hun kooigenoten. Er kan gebruik worden gemaakt van gebruikelijk en gecertificeerd laboratoriumvoeder, behalve tijdens de blootstelling, met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater uit de waterleiding. Er wordt kunstlicht gebruikt met een cyclus van 12 uur licht/12 uur donker.
                           
                        
                     Inhalatiekamers
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Bij de keuze van de inhalatiekamer wordt rekening gehouden met de aard van de teststof en het doel van de test. Blootstelling via de neus alleen heeft de voorkeur (hieronder vallen blootstelling via de kop alleen, blootstelling via de neus alleen en blootstelling via de snuit alleen). Blootstelling via de neus alleen heeft over het algemeen de voorkeur voor studies van vloeibare of vaste aerosolen en voor dampen die kunnen condenseren tot aerosolen. Speciale doelstellingen van de studie kunnen beter worden verwezenlijkt door blootstelling van het hele lijf, maar dit moet in het studieverslag worden gemotiveerd. Om bij gebruik van een kamer voor het hele lijf te zorgen voor een stabiele atmosfeer, mag het totale volume van de testdieren niet meer dan 5 % van het volume van de kamer innemen. De technische principes voor blootstelling via de neus alleen en blootstelling van het hele lijf, alsook de specifieke voor- en nadelen ervan, zijn uiteengezet in GD 39 (2).
                           
                        BLOOTSTELLINGSOMSTANDIGHEDEN
                  
                     Toediening van concentraties
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Voor de blootstelling via de neus alleen mag bij ratten elke tijdsduur worden gekozen, tot een maximum van zes uur. Bij muizen dient de blootstelling via de neus alleen in het algemeen niet langer dan vier uur te duren. Als er onderzoek met een langere tijdsduur nodig is, moet dit worden gemotiveerd (zie GD 39 (2)). Dieren die in een kamer voor het hele lijf aan aerosolen worden blootgesteld, worden afzonderlijk gehuisvest om ingestie van de teststof door het verzorgen van kooigenoten te voorkomen. Tijdens de blootstellingsperiode krijgen de dieren geen voeder. Tijdens een blootstelling van het hele lijf kan de dieren water worden gegeven.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              De dieren worden aan de teststof blootgesteld in de vorm van gas, damp, aerosol of een mengsel daarvan. De te testen fysische toestand hangt af van de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof, de gekozen concentratie en/of de meest waarschijnlijke fysische vorm waarin de teststof bij hantering en gebruik aanwezig is. Hygroscopische en chemisch reactieve teststoffen moeten worden getest in drogeluchtomstandigheden. Er dient op te worden gelet dat er geen explosieve concentraties optreden.
                           
                        
                     Deeltjesgrootteverdeling
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Voor alle aerosolen en voor dampen die tot aerosolen kunnen condenseren, wordt de deeltjesgrootte bepaald. Om blootstelling van alle relevante delen van de ademhalingswegen mogelijk te maken worden aerosolen met een massamediaan van de aerodynamische diameter (MMAD) tussen 1 en 4 μm en een geometrische standaardafwijking (σg) tussen 1,5 en 3,0 aanbevolen (2)(9)(10). Hoewel redelijkerwijs moet worden getracht deze normwaarden te halen, wordt het oordeel van een deskundige gegeven als dit niet mogelijk blijkt. Zo kunnen de deeltjes van metaaldampen kleiner zijn dan deze norm, terwijl geladen deeltjes, vezels en hygroscopische materialen (die in de vochtige omgeving van de ademhalingswegen opzwellen) de norm kunnen overschrijden.
                           
                        
                     Bereiding van de teststof in een medium
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Er kan een medium worden gebruikt om een passende concentratie en deeltjesgrootte van de teststof in de atmosfeer te verkrijgen. Als algemene regel wordt de voorkeur gegeven aan water. Deeltjesmateriaal kan aan mechanische processen worden onderworpen om de gewenste deeltjesgrootteverdeling te verkrijgen, waarbij er echter op moet worden gelet dat de teststof niet wordt ontbonden of gewijzigd. Als de samenstelling van de teststof mogelijk is gewijzigd door mechanische processen (bv. als er bij overvloedig malen door wrijving extreme temperaturen zijn ontstaan), wordt de samenstelling analytisch gecontroleerd. Er dient zorgvuldig op te worden gelet dat de teststof niet wordt verontreinigd. Niet-broze korrelige materialen die met opzet zo zijn samengesteld dat zij niet-inhaleerbaar zijn, hoeven niet te worden getest. Aan de hand van een slijtageproef moet worden aangetoond dat bij de hantering van het korrelige materiaal geen inhaleerbare deeltjes ontstaan. Als bij een slijtageproef inhaleerbare stoffen ontstaan, wordt een test op inhalatietoxiciteit verricht.
                           
                        
                     Controledieren
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Er is geen parallelle negatieve controlegroep (lucht) noodzakelijk. Wanneer voor het verkrijgen van de testatmosfeer een ander medium dan water wordt gebruikt, moet alleen een controlegroep voor dat medium worden gebruikt wanneer er geen historische gegevens over de inhalatietoxiciteit beschikbaar zijn. Indien een toxiciteitsstudie van een in een medium bereide teststof uitwijst dat er geen toxiciteit optreedt, volgt hieruit dat het medium bij de geteste concentratie niet toxisch is; in dat geval is er geen mediumcontrole noodzakelijk.
                           
                        CONTROLE VAN DE BLOOTSTELLINGSOMSTANDIGHEDEN
                  
                     Luchtdoorstroming in de kamer
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Tijdens elke blootstelling wordt de luchtdoorstroming in de kamer zorgvuldig geregeld, voortdurend gecontroleerd en ten minste elk uur geregistreerd. De controle van de concentratie (of stabiliteit) van de testatmosfeer is een integrale meting van alle dynamische parameters waarbij indirect alle relevante dynamische parameters voor het verkrijgen van de atmosfeer kunnen worden geregeld. Wanneer kamers voor blootstelling via de neus alleen worden gebruikt, moet er in het bijzonder op worden gelet dat de uitgeademde lucht niet opnieuw wordt ingeademd indien de luchtdoorstroming in het blootstellingssysteem ontoereikend is om een dynamische luchtdoorstroming van de teststofatmosfeer te verkrijgen. Er zijn voorgeschreven methoden die kunnen worden toegepast om aan te tonen dat de uitgeademde lucht bij de gekozen operationele omstandigheden niet opnieuw wordt ingeademd (2)(11). Het zuurstofgehalte moet ten minste 19 % bedragen en het kooldioxidegehalte niet meer dan 1 %. Als er redenen zijn om aan te nemen dat deze normwaarden niet kunnen worden gehaald, moet de zuurstof- en kooldioxideconcentratie worden gemeten.
                           
                        
                     Temperatuur en relatieve vochtigheid in de kamer
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              De temperatuur in de kamer moet op 22 ± 3 °C worden gehouden. Bij blootstelling via de neus alleen en bij blootstelling van het hele lijf wordt de relatieve vochtigheid in het ademhalingsgebied van de dieren gecontroleerd en bij een blootstellingsduur tot vier uur ten minste drie keer en bij een kortere blootstelling ieder uur geregistreerd. De relatieve vochtigheid wordt idealiter tussen 30 en 70 % gehouden, al zal dit niet altijd haalbaar (bv. wanneer mengsels op waterbasis worden getest) of meetbaar zijn vanwege interferentie tussen de teststof en de testmethode.
                           
                        
                     Teststof: nominale concentratie
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Waar mogelijk wordt de nominale concentratie in de blootstellingskamer berekend en geregistreerd. De nominale concentratie is de massa van de gegenereerde teststof gedeeld door het totale luchtvolume dat door het kamersysteem wordt geleid. De nominale concentratie wordt niet gebruikt om de blootstelling van de dieren te karakteriseren, maar een vergelijking tussen de nominale concentratie en de feitelijke concentratie vormt een aanwijzing voor het rendement van het testsysteem en kan bijgevolg worden gebruikt om problemen bij het genereren te ontdekken.
                           
                        
                     Teststof: feitelijke concentratie
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              De feitelijke concentratie is de concentratie van de teststof in het ademhalingsgebied van de dieren in een inhalatiekamer. De feitelijke concentraties kunnen worden verkregen door toepassing van specifieke methoden (bv. rechtstreekse bemonstering of op adsorptie of een chemische reactie gebaseerde methoden, gevolgd door analytische karakterisering) of niet-specifieke methoden, zoals gravimetrische filteranalyse. Gravimetrische analysen zijn alleen aanvaardbaar voor aerosolen van poeders met één component of aerosolen van vloeistoffen met een geringe vluchtigheid en moeten worden ondersteund met passende specifieke karakteriseringen van de teststof voorafgaand aan de studie. De concentratie van aerosolen van poeders met meerdere componenten kan ook door middel van gravimetrische analyse worden bepaald. In dat geval zijn echter analytische gegevens vereist die aantonen dat de samenstelling van het materiaal in de lucht vergelijkbaar is met die van het uitgangsmateriaal. Als deze informatie niet beschikbaar is, kan het nodig zijn in de loop van de studie op gezette tijden een nieuwe analyse van de teststof (idealiter in de toestand in de lucht) uit te voeren. Voor geaerosoliseerde stoffen die kunnen verdampen of sublimeren, moet worden aangetoond dat met de gekozen methoden alle fasen zijn verzameld. In het studieverslag worden de doelconcentratie, de nominale concentratie en de feitelijke concentratie vermeld, maar in statistische analysen voor de berekening van de letale concentratiewaarden wordt uitsluitend gebruikgemaakt van de feitelijke concentraties.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Er wordt zo mogelijk één partij van de teststof gebruikt en het testmonster wordt bewaard onder omstandigheden waarbij de zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit behouden blijven. Voor aanvang van de studie worden de teststof, met inbegrip van de zuiverheid, en indien technisch mogelijk de identiteit en de hoeveelheden van vastgestelde verontreinigingen en onzuiverheden gekarakteriseerd. Dit kan onder meer met de volgende gegevens worden aangetoond: retentietijd en relatief piekoppervlak, moleculair gewicht op basis van massaspectroscopie of gaschromatografie, of andere schattingen. Hoewel het testlaboratorium niet verantwoordelijk is voor de identiteit van het testmonster, kan het raadzaam zijn dat het testlaboratorium de karakterisering van de opdrachtgever ten minste in beperkte mate bevestigt (bv. kleur, fysische aard enz.).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              De blootstellingsatmosfeer wordt zo constant mogelijk gehouden en, afhankelijk van de analysemethode, voortdurend en/of met tussenpozen gecontroleerd. Wanneer met tussenpozen wordt bemonsterd, wordt in een studie van vier uur ten minste twee keer een monster van de kameratmosfeer genomen. Als dit vanwege de beperkte luchtdoorstroming of lage concentraties niet mogelijk is, kan één monster gedurende de volledige blootstellingsperiode worden verzameld. Indien significante fluctuaties tussen monsters optreden, worden bij de volgende geteste concentraties vier monsters per blootstelling genomen. Het verschil tussen individuele monsters van de kamerconcentratie en de gemiddelde concentratie mag bij gassen en dampen niet meer dan ± 10 % en bij vloeibare of vaste aerosolen niet meer dan ± 20 % bedragen. De equilibratietijd van de kamer (t95) wordt berekend en geregistreerd. De blootstellingsduur omvat de tijd waarin de teststof wordt gegenereerd en houdt rekening met de tijd die nodig is om t95 te bereiken. In GD 39 (2) zijn richtsnoeren voor het schatten van t95 opgenomen.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Voor zeer complexe mengsels bestaande uit gassen/dampen en aerosolen (bv. verbrandingsatmosferen en teststoffen die zijn ontleend aan doelgerichte eindproducten of apparaten), kan elke fase zich in een inhalatiekamer verschillend gedragen, zodat van elke fase (gas/damp en aerosol) ten minste één indicatorstof (analyt) moet worden gekozen, normaliter de voornaamste werkzame stof in het mengsel. Wanneer de teststof een mengsel is, wordt de analytische concentratie vermeld voor het mengsel, en niet slechts voor de werkzame stof of de component (analyt). Aanvullende informatie over feitelijke concentraties is opgenomen in GD 39 (2).
                           
                        
                     Teststof: deeltjesgrootteverdeling
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              De deeltjesgrootteverdeling van aerosolen wordt tijdens elke blootstelling van vier uur ten minste twee keer bepaald met behulp van een cascade-impactor of een alternatief instrument, zoals een aerodynamische deeltjesgroottemeter. Indien kan worden aangetoond dat de met een cascade-impactor of een alternatief instrument verkregen resultaten gelijkwaardig zijn, mag het alternatieve instrument gedurende de hele studie worden gebruikt. Parallel aan het primaire instrument wordt een tweede instrument, zoals een gravimetrisch filter of een impinger/gas bubbler gebruikt om de doeltreffendheid van de verzameling met het primaire instrument te bevestigen. De door middel van deeltjesgrootteanalyse en filteranalyse verkregen massaconcentraties moeten in redelijke mate overeenkomen (zie GD 39 (2)). Indien in een vroeg stadium van de studie de gelijkwaardigheid kan worden aangetoond, zijn verdere bevestigende metingen niet nodig. Met het oog op het dierenwelzijn moeten maatregelen worden genomen om zo veel mogelijk te voorkomen dat niet-overtuigende gegevens worden verkregen waardoor herhaling van de blootstelling noodzakelijk is. Voor dampen wordt de deeltjesgrootte bepaald indien de mogelijkheid bestaat dat de dampen condenseren waardoor aerosolvorming optreedt of indien in een dampatmosfeer deeltjes worden gedetecteerd waarbij gemengde fasen kunnen optreden (zie punt 15).
                           
                        PROCEDURE
                  
                              26.
                           
                           
                              Hieronder worden twee soorten onderzoek beschreven: het traditionele protocol en het c × t-protocol. Beide protocollen kunnen een verkennende test, een hoofdonderzoek, en/of een limiettest (traditioneel protocol) of tests bij een limietconcentratie (c × t) omvatten. Indien bekend is dat een van beide geslachten een grotere gevoeligheid heeft, kan de onderzoeksleider ervoor kiezen dit onderzoek alleen voor het gevoeligste geslacht uit te voeren. Als andere knaagdiersoorten dan ratten uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan de maximale blootstellingsduur worden aangepast om soortspecifieke symptomen van angst te minimaliseren. Alvorens met het onderzoek te beginnen moeten alle beschikbare gegevens worden bekeken om het gebruik van dieren tot een minimum te beperken. Zo kunnen gegevens die zijn verkregen op grond van hoofdstuk B.52 van deze bijlage (4) een verkennende test wellicht overbodig maken, en wellicht ook aantonen of het ene geslacht gevoeliger is dan het andere (zie GD 39 (2)).
                           
                        TRADITIONEEL PROTOCOL
                  
                     Algemene overwegingen: traditioneel protocol
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Bij een traditioneel onderzoek, worden groepen dieren aan een teststof blootgesteld gedurende een vaste periode (doorgaans vier uur) in een kamer voor blootstelling via de neus alleen of voor blootstelling van het hele lijf. Dieren worden blootgesteld aan hetzij een limietconcentratie (limiettest), of stapsgewijs aan ten minste drie concentraties (hoofdonderzoek). Het hoofdonderzoek kan worden voorafgegaan door een verkennende test, tenzij er al enige informatie over de teststof beschikbaar is, bijvoorbeeld uit een eerder uitgevoerd onderzoek volgens hoofdstuk B.52 (zie GD 39 (2)).
                           
                        
                     Verkennende test: traditioneel protocol
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Een verkennende test wordt gebruikt om de werkzaamheid van de teststof te schatten en geslachtsafhankelijke verschillen in gevoeligheid aan te tonen, en ter ondersteuning bij de keuze van de blootstellingsconcentratieniveaus voor het hoofdonderzoek of de limiettest. Bij de keuze van concentratieniveaus voor de verkennende test moet alle beschikbare informatie worden gebruikt, met inbegrip van de beschikbare (Q)SAR-gegevens en gegevens over soortgelijke chemische stoffen. Bij elke concentratie mogen ten hoogste drie mannetjes en drie vrouwtjes worden blootgesteld (om geslachtsafhankelijke verschillen vast te stellen kunnen drie dieren per geslacht nodig zijn). Een verkennende test kan betrekking hebben op één concentratie, maar indien nodig kunnen meerdere concentraties worden getest. In een verkennende test mogen niet zo veel dieren en concentraties worden getest dat deze test eerder op een hoofdonderzoek lijkt. Een eerder uitgevoerd onderzoek op grond van hoofdstuk B.52 (4) kan worden gebruikt in plaats van een verkennende test (zie GD 39 (2)).
                           
                        
                     Limiettest: traditioneel protocol
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Een limiettest wordt toegepast indien bekend is of verwacht wordt dat de teststof praktisch niet-toxisch is, d.w.z. dat een toxische reactie alleen optreedt boven de in de regelgeving bepaalde limietconcentratie. Bij een limiettest wordt één groep van drie mannetjes en drie vrouwtjes blootgesteld aan de teststof in een limietconcentratie. Informatie over de toxiciteit van de teststof kan afkomstig zijn van kennis omtrent vergelijkbare geteste stoffen, waarbij rekening wordt gehouden met de identiteit en het percentage van de bestanddelen waarvan bekend is dat zij in toxicologisch opzicht relevant zijn. Wanneer er weinig of geen informatie over de toxiciteit van het testmateriaal is of wordt verwacht dat de teststof toxisch is, moet het hoofdonderzoek worden uitgevoerd.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              De keuze van de limietconcentraties hangt gewoonlijk af van wettelijke voorschriften. Indien Verordening (EG) nr. 1272/2008 wordt toegepast, bedragen de limietconcentraties voor gassen, dampen en aerosolen respectievelijk 20 000 ppm, 20 mg/l en 5 mg/l (of de maximaal haalbare concentratie) (3). Het kan vanuit technisch oogpunt ingewikkeld zijn limietconcentraties van sommige teststoffen te bereiken, vooral als dampen en aerosolen. Wanneer aerosolen worden getest, is het primaire doel een in te ademen deeltjesgrootte te verkrijgen (MMAD van 1-4 μm). Voor de meeste teststoffen is dit mogelijk bij een concentratie van 2 mg/l. Aerosolen mogen alleen bij een hogere concentratie dan 2 mg/l worden getest indien een in te ademen deeltjesgrootte kan worden verkregen (zie GD 39 (2)). In Verordening (EG) nr. 1272/2008 worden tests boven een limietconcentratie met het oog op het dierenwelzijn afgeraden. De limietconcentratie moet alleen worden overwogen wanneer het zeer waarschijnlijk is dat de resultaten van een dergelijke test rechtstreeks van belang zijn om de gezondheid van mensen te beschermen (3), en dit moet in het studieverslag worden gemotiveerd. Als de teststof kan ontploffen, moet worden vermeden dat zich omstandigheden voordoen waarin een explosie kan optreden. Om onnodig gebruik van dieren te voorkomen wordt de limiettest van tevoren een keer zonder dieren uitgevoerd om te waarborgen dat de kameromstandigheden voor een limiettest kunnen worden bereikt.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Indien bij de limietconcentratie wordt geconstateerd dat er dieren gestorven of stervende zijn, kunnen de resultaten van de limiettest dienen als een verkennende test voor verdere tests bij andere concentraties (zie hoofdonderzoek). Indien de fysische of chemische eigenschappen van een teststof het onmogelijk maken een limietconcentratie te bereiken, moet bij de maximaal haalbare concentratie worden getest. Indien minder dan 50 % sterfte optreedt bij de maximaal haalbare concentratie, zijn geen verdere tests nodig. Als de limietconcentratie niet kon worden bereikt, moet dit in het studieverslag worden toegelicht en met ondersteunende gegevens worden gestaafd. Indien bij de maximaal haalbare concentratie van een damp geen toxiciteit optreedt, kan het nodig zijn de teststof in de vorm van een vloeibare aerosol te gebruiken.
                           
                        
                     Hoofdonderzoek: traditioneel protocol
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Een hoofdonderzoek wordt meestal uitgevoerd met vijf mannetjes en vijf vrouwtjes (of vijf dieren van het gevoeligste geslacht, indien dit bekend is) per concentratieniveau, en bij ten minste drie concentratieniveaus. Er moeten voldoende concentratieniveaus worden gebruikt om een robuuste statistische analyse mogelijk te maken. De tijdsduur tussen de blootstelling van de verschillende groepen wordt bepaald door de aanvang, de duur en de ernst van de toxiciteitsverschijnselen. De blootstelling van dieren bij het volgende concentratieniveau wordt uitgesteld totdat een redelijk vertrouwen bestaat dat de eerder geteste dieren zullen overleven. Dit stelt de onderzoeksleider in staat de doelconcentratie voor de volgende blootstellingsgroep aan te passen. Aangezien dit vanwege de afhankelijkheid van geavanceerde technologieën wellicht niet altijd praktisch is bij inhalatieonderzoek, moet de blootstelling van dieren bij het volgende concentratieniveau worden gebaseerd op eerdere ervaringen en wetenschappelijke afwegingen. Voor het testen van mengsels moet GD 39 (2) worden geraadpleegd.
                           
                        CONCENTRATIE × TIJD-PROTOCOL (C × T-PROTOCOL)
                  
                     Algemene overwegingen: c × t-protocol
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              Als alternatief voor het traditionele protocol kan een stapsgewijs c × t-onderzoek worden overwogen voor de beoordeling van de inhalatietoxiciteit (12)(13)(14). Bij deze aanpak kunnen de dieren bij verschillende concentratieniveaus en gedurende meerdere perioden van verschillende duur aan een teststof worden blootgesteld. Alle tests worden uitgevoerd in een kamer voor blootstelling via de neus alleen (kamers voor het hele lijf zijn voor dit protocol niet geschikt). Aanhangsel 1 bevat een stroomdiagram van dit protocol. Een simulatieanalyse heeft uitgewezen dat zowel met het traditionele protocol als met het c × t-protocol robuuste LC50-waarden kunnen worden verkregen, maar dat het c × t-protocol doorgaans beter geschikt is voor het verkrijgen van robuuste LC01- en LC10-waarden (15).
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Een simulatieanalyse heeft aangetoond dat het voor het testen bij vier concentraties en gedurende vijf blootstellingsperioden van verschillende duur in het kader van een hoofdonderzoek doorgaans volstaat om per c × t-interval twee dieren (één van elk geslacht als beide geslachten worden gebruikt, of twee van het gevoeligste geslacht) te gebruiken. Onder bepaalde omstandigheden kan de onderzoeksleider ervoor kiezen twee ratten per geslacht per c × t-interval te gebruiken (15). Door twee dieren per geslacht per concentratie en tijdstip te gebruiken kan de bias en de variabiliteit van de schattingen worden verkleind, het percentage succesvolle schattingen worden verhoogd, en het dekkingspercentage van het betrouwbaarheidsinterval worden verbeterd. Als er echter geen voldoende passende fitting met de gegevens mogelijk is om een schatting te kunnen maken (indien een dier per geslacht of twee dieren van het gevoeligste geslacht worden gebruikt), kan wellicht ook een vijfde blootstellingsconcentratie volstaan. Nadere richtsnoeren voor het bij een c × t-onderzoek te gebruiken aantal dieren en concentraties zijn opgenomen in GD 39 (2).
                           
                        
                     Verkennende test: c × t-protocol
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Een verkennende test wordt gebruikt om de werkzaamheid van de teststof te schatten, en ter ondersteuning bij de keuze van de blootstellingsconcentratieniveaus voor het hoofdonderzoek. Een verkennende test met ten hoogste drie dieren per geslacht per concentratie (zie aanhangsel III van GD 39 (2) voor nadere bijzonderheden) kan nodig zijn om een geschikte aanvangsconcentratie voor het hoofdonderzoek te kunnen kiezen en het aantal gebruikte dieren te kunnen minimaliseren. Soms is het nodig om drie dieren per geslacht te gebruiken om geslachtsafhankelijke verschillen vast te stellen. Deze dieren moeten gedurende één periode, doorgaans met een duur van 240 minuten, worden blootgesteld. Om te beoordelen of het mogelijk is geschikte testatmosferen tot stand te brengen, moeten voorafgaande tests zonder dieren worden uitgevoerd. Een verkennende test is doorgaans niet nodig als er gegevens over de sterfte beschikbaar zijn uit een onderzoek volgens hoofdstuk B.52 (4). Bij het kiezen van de aanvankelijke doelconcentratie in een onderzoek volgens hoofdstuk B.2 moet de onderzoeksleider rekening houden met de sterftepatronen die zijn waargenomen in al het beschikbare onderzoek volgens hoofdstuk B.52 (4), voor beide geslachten en voor alle geteste concentraties (zie GD 39 (2)).
                           
                        
                     Beginconcentratie: c × t-protocol
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              De beginconcentratie (blootstellingssessie I) (aanhangsel 1) is ofwel een limietconcentratie, ofwel een door de onderzoeksleider op basis van de verkennende test gekozen concentratie. Groepen van 1 dier per geslacht worden aan deze concentratie blootgesteld gedurende perioden van verschillende duur (bv. 15, 30, 60, 120, of 240 minuten), hetgeen betekent dat er in totaal 10 dieren worden gebruikt (dit wordt „blootstellingssessie I” genoemd) (aanhangsel 1).
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              De keuze van de limietconcentraties hangt gewoonlijk af van wettelijke voorschriften. Indien Verordening (EG) nr. 1272/2008 wordt toegepast, bedragen de limietconcentraties voor gassen, dampen en aerosolen respectievelijk 20 000 ppm, 20 mg/l en 5 mg/l (of de maximaal haalbare concentratie) (3). Het kan vanuit technisch oogpunt ingewikkeld zijn limietconcentraties van sommige teststoffen te bereiken, vooral als dampen en aerosolen. Wanneer aerosolen worden getest, is het doel een in te ademen deeltjesgrootte te verkrijgen (d.w.z. een MMAD van 1-4 μm) bij een limietconcentratie van 2 mg/l. Dat is met de meeste teststoffen mogelijk. Aerosolen mogen alleen bij een hogere concentratie dan 2 mg/l worden getest indien een in te ademen deeltjesgrootte kan worden verkregen (zie GD 39 (2)). In Verordening (EG) nr. 1272/2008 worden tests boven een limietconcentratie met het oog op het dierenwelzijn afgeraden. Tests boven de limietconcentratie moeten alleen worden overwogen wanneer het zeer waarschijnlijk is dat de resultaten van dergelijke tests rechtstreeks van belang zijn om de gezondheid van mensen te beschermen (3), en dit moet in het studieverslag worden gemotiveerd. Als de teststof kan ontploffen, moet worden vermeden dat zich omstandigheden voordoen waarin een explosie kan optreden. Om onnodig gebruik van dieren te voorkomen wordt de test bij de beginconcentratie van tevoren een keer zonder dieren uitgevoerd om te waarborgen dat de kameromstandigheden voor deze concentratie kunnen worden bereikt.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Indien bij de beginconcentratie wordt geconstateerd dat er dieren gestorven of stervende zijn, kunnen de resultaten bij deze concentratie als uitgangspunt dienen voor verdere tests bij andere concentraties (zie hoofdonderzoek). Indien de fysische of chemische eigenschappen van een teststof het onmogelijk maken een limietconcentratie te bereiken, moet bij de maximaal haalbare concentratie worden getest. Indien minder dan 50 % sterfte optreedt bij de maximaal haalbare concentratie, zijn geen verdere tests nodig. Als de limietconcentratie niet kon worden bereikt, moet dit in het studieverslag worden toegelicht en met ondersteunende gegevens worden gestaafd. Indien bij de maximaal haalbare concentratie van een damp geen toxiciteit optreedt, kan het nodig zijn de teststof in de vorm van een vloeibare aerosol te gebruiken.
                           
                        
                     Hoofdonderzoek: c × t-protocol
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              De beginconcentratie (blootstellingssessie I) (aanhangsel 1) die tijdens het hoofdonderzoek wordt getest, is ofwel een limietconcentratie, ofwel een door de onderzoeksleider op basis van de verkennende test gekozen concentratie. Indien tijdens of na blootstellingssessie I sterfte is geconstateerd, wordt de minimale blootstelling (c × t) die tot sterfte leidt als leidraad genomen voor het vaststellen van de concentratie en blootstellingsperioden voor blootstellingszitting II. Elke volgende blootstellingsessie hangt af van de sessie die eraan voorafgaat (zie aanhangsel 1).
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Voor veel teststoffen zullen de resultaten die worden verkregen bij de beginconcentratie, plus drie extra blootstellingssessies met een kleinere tijdraster (d.w.z. de geometrische afstand tussen de blootstellingsperioden, zoals aangegeven door de factor tussen opeenvolgende perioden, doorgaans √2), toereikend zijn om de c × t-sterfteverhouding vast te stellen (15), maar het gebruik van een vijfde blootstellingsconcentratie kan van enig nut zijn (zie aanhangsel 1 en GD 39 (2)). Voor de mathematische behandeling van de resultaten voor het c × t-protocol, zie aanhangsel 1.
                           
                        WAARNEMINGEN
                  
                              41.
                           
                           
                              De dieren worden tijdens de blootstellingsperiode veelvuldig klinisch geobserveerd. Na de blootstelling worden op dezelfde dag nog ten minste twee klinische observaties verricht, of meer als de respons van de dieren op de behandeling daartoe aanleiding geeft, en vervolgens gedurende veertien dagen ten minste één keer per dag. De duur van de observatieperiode staat niet vast, maar wordt bepaald op grond van de aard en het aanvangstijdstip van klinische symptomen en de duur van de herstelperiode. Het is belangrijk op welk tijdstip de toxiciteitsverschijnselen verschijnen en verdwijnen, vooral als er een neiging is tot vertraagde toxiciteitsverschijnselen. Alle observaties worden systematisch geregistreerd en van elk dier wordt een apart overzicht bijgehouden. Dieren die stervend worden aangetroffen en dieren die hevige pijn hebben en/of blijvende tekenen van hevige angst vertonen, worden met het oog op het dierenwelzijn op humane wijze gedood. Wanneer onderzoek wordt gedaan naar klinische toxiciteitsverschijnselen, moet erop worden gelet dat een aanvankelijk slecht uiterlijk aspect en voorbijgaande veranderingen in de ademhaling als gevolg van de blootstellingsprocedure, niet worden aangezien voor aan de teststof gerelateerde toxiciteit die het nodig zou maken de dieren voortijdig te doden. Er moet rekening worden gehouden met de beginselen en criteria in de leidraad voor humane eindpunten (GD 19) (7). Wanneer dieren om redenen van dierenwelzijn worden gedood of dood worden aangetroffen, wordt zo nauwkeurig mogelijk geregistreerd op welk tijdstip ze zijn gestorven.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Bij externe observaties van de dieren in de kooien wordt gekeken naar veranderingen in de huid en de vacht, de ogen en de slijmvliezen, de ademhalingsorganen, de bloedsomloop, het autonome en centrale zenuwstelsel, de somatomotorische activiteit en gedragspatronen. Waar mogelijk moet een onderscheid worden gemaakt tussen lokale en systemische effecten. Er moet worden gelet op de observatie van tremors, convulsies, speekselafscheiding, diarree, lethargie, slaap en coma. Een meting van de rectale temperatuur kan ondersteunende gegevens opleveren voor met de behandeling of opsluiting verband houdende reflectoire bradypneu of hypo-/hyperthermie.
                           
                        
                     Lichaamsgewicht
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Het gewicht van elk dier wordt tijdens de acclimatiseringsperiode één keer geregistreerd, op dag 0 (de dag van blootstelling) voorafgaand aan de blootstelling en ten minste op de dagen 1, 3 en 7 (en vervolgens iedere week), alsook op het moment waarop het dier sterft of wordt geëuthanaseerd als dit na dag 1 is. Het lichaamsgewicht is erkend als een kritische indicator van toxiciteit en dieren die een blijvende gewichtsafname van ≥ 20 % vertonen ten opzichte van de voor de studie geregistreerde waarde, moeten zorgvuldig worden gevolgd. Aan het einde van de periode na de blootstelling worden de dieren die nog leven, gewogen en op humane wijze gedood.
                           
                        
                     Pathologie
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Op alle proefdieren, met inbegrip van de dieren die tijdens de test sterven of met het oog op het dierenwelzijn worden geëuthanaseerd en uit het onderzoek worden genomen, wordt macroscopische obductie uitgevoerd. Als het niet mogelijk is onmiddellijk nadat een dood dier is aangetroffen een obductie te verrichten, wordt het dier gekoeld (niet bevroren) bij temperaturen die laag genoeg zijn om de autolyse tot een minimum te beperken. De obductie wordt zo spoedig mogelijk verricht, normaliter binnen één of twee dagen. Alle met het blote oog waarneembare pathologische veranderingen worden voor elk dier geregistreerd, met bijzondere aandacht voor veranderingen in de luchtwegen.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Om de interpretatieve waarde van de studie te vergroten kan worden overwogen aanvullend onderzoek te verrichten dat vooraf in de opzet is opgenomen, zoals bepaling van het longgewicht van overlevende ratten en/of microscopisch onderzoek van de luchtwegen om aanwijzingen voor irritatie te vinden. Ook kunnen de organen worden onderzocht die tekenen van macroscopische pathologische veranderingen vertonen bij dieren die na 24 uur of langer nog leven, alsmede organen waarvan bekend is of verwacht wordt dat zij zijn aangetast. Microscopisch onderzoek van de volledige luchtwegen kan nuttige informatie opleveren voor teststoffen die met water reageren, zoals zuren en hygroscopische teststoffen.
                           
                        GEGEVENS EN RAPPORTAGE
                  
                     Gegevens
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Voor elk dier worden de gegevens over het lichaamsgewicht en de obductiebevindingen vermeld. Daarnaast worden de gegevens van de klinische observatie in tabelvorm samengevat met voor alle testgroepen vermelding van het gebruikte aantal dieren, het aantal dieren dat specifieke toxiciteitsverschijnselen vertoonde, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of om redenen van dierenwelzijn is gedood, het tijdstip waarop elk dier is gestorven, een beschrijving van de toxische effecten met het verloop en de omkeerbaarheid en de obductiebevindingen.
                           
                        
                     Testverslag
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              In het testverslag wordt indien van toepassing de volgende informatie opgenomen:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Proefdieren en dierhouderij:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      beschrijving van de omstandigheden van de kooi, met inbegrip van: aantal (of verandering in het aantal) dieren per kooi, strooisel, omgevingstemperatuur en relatieve vochtigheid, lichtregime en identificatie van de voeding;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gebruikte soort/stam en motivering voor het gebruik van een ander soort dan ratten;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      randomiseringsmethode;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      details van de voeder- en waterkwaliteit (waaronder aard en herkomst van het voeder en herkomst van het water);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      beschrijving van de eventuele conditionering voorafgaand aan de test, met inbegrip van voeding, quarantaine en behandeling voor ziekte.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Teststof:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fysische aard, zuiverheid en, indien relevant, fysisch-chemische eigenschappen (met inbegrip van de isomeersamenstelling);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identificatiegegevens en, indien bekend, CAS-nummer (Chemical Abstracts Service).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Medium:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivatie voor het gebruik van het medium en voor de keuze ervan (indien een ander medium dan water wordt gebruikt);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      historische of parallelle gegevens waaruit blijkt dat het medium niet interfereert met de uitkomst van de studie.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhalatiekamer:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      beschrijving van de inhalatiekamer met inbegrip van afmetingen en volume;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      herkomst en beschrijving van de apparatuur die voor de blootstelling van dieren en het verkrijgen van de atmosfeer is gebruikt;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      apparatuur voor het meten van de temperatuur, de vochtigheid, de deeltjesgrootte en de feitelijke concentratie;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      herkomst van de lucht, behandeling van de aangevoerde/geëxtraheerde lucht en systeem dat voor de conditionering is gebruikt;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toegepaste methoden voor de kalibratie van de apparatuur voor het verkrijgen van een homogene testatmosfeer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      drukverschil (positief of negatief);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      blootstellingspoorten per kamer (blootstelling via de neus alleen); locatie van de dieren in het systeem (blootstelling van het hele lijf);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      homogeniteit/stabiliteit van de testatmosfeer in de tijd;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      locatie van temperatuur- en vochtigheidssensoren en bemonstering van de testatmosfeer in de kamer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      luchtdebiet, luchtdebiet per blootstellingspoort (blootstelling via de neus alleen) of dierbelasting per kamer (blootstelling van het hele lijf);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informatie over de apparatuur die voor de zuurstof- en kooldioxidemeting is gebruikt, indien van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      equilibratietijd van de kamer (t95);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aantal volumeveranderingen per uur;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      meetapparaten (indien van toepassing).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Blootstellingsgegevens:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivering van de keuze van de doelconcentratie in de hoofdstudie;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominale concentraties (totale massa van de in de inhalatiekamer geleide teststof, gedeeld door het door de kamer geleide luchtvolume);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      feitelijke concentraties van de in het ademhalingsgebied van de dieren verzamelde teststof; voor mengsels die heterogene fysische vormen produceren (gassen, dampen, aerosolen) kan elke vorm afzonderlijk worden geanalyseerd;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      alle luchtconcentraties worden in massa-eenheden vermeld (bv. mg/l, mg/m3 enz.); de volume-eenheden (bv. ppm, ppb enz.) kunnen tevens tussen haakjes worden vermeld;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      deeltjesgrootteverdeling, massamediaan van de aerodynamische diameter (MMAD) en geometrische standaardafwijking (σg), onder vermelding van de wijze waarop zij zijn berekend. De individuele deeltjesgrootteanalysen worden vermeld.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testomstandigheden:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      details van de bereiding van de teststof, met inbegrip van details van de procedures die zijn gevolgd om de deeltjesgrootte van vast materiaal te verlagen of oplossingen van de teststof te bereiden. Als de samenstelling van de teststof mogelijk is gewijzigd door mechanische processen, worden de resultaten opgenomen van de analysen die zijn verricht om de samenstelling van de teststof te controleren;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een beschrijving (bij voorkeur met een schematische voorstelling) van de apparatuur die voor het verkrijgen van de testatmosfeer en de blootstelling van de dieren aan de testatmosfeer is gebruikt;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      details van de toegepaste chemische analysemethode en de validering van die methode (met inbegrip van de efficiëntie van de recovery van de teststof uit het bemonsteringsmedium);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivering van de keuze van de testconcentraties.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Resultaten:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met de temperatuur, vochtigheid en luchtdoorstroming van de kamer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met de nominale en feitelijke concentratiegegevens van de kamer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met de deeltjesgroottegegevens met inbegrip van gegevens over de verzameling van het analytisch monster, de deeltjesgrootteverdeling en de berekening van de MMAD en σg;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met gegevens over de respons en het concentratieniveau voor elk dier (bv. dieren met toxiciteitsverschijnselen, met inbegrip van sterfte, en de aard, hevigheid, aanvangstijdstip en duur van de effecten);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      voor elk dier het tijdens de studie bepaalde gewicht; de datum en het tijdstip waarop zij zijn gestorven, indien vóór de geplande euthanasie; en voor elk dier het aanvangstijdstip en het verloop van de toxiciteitsverschijnselen en of ze reversibel waren;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      voor elk dier de obductiebevindingen en de histopathologische bevindingen, indien beschikbaar;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      schattingen van de mortaliteit (bv. LC50, LD01) met inbegrip van de 95 %-betrouwbaarheidsgrenzen en de helling (indien de evaluatiemethode daarin voorziet);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      statistisch verband, met inbegrip van de geschatte waarde van de exponent n (c × t-protocol). De naam van de gebruikte statistische software moet worden vermeld.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bespreking en interpretatie van de resultaten:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      speciale aandacht wordt besteed aan de beschrijving van de methoden die zijn toegepast om te voldoen aan de criteria van deze testmethode, bv. de limietconcentratie of de deeltjesgrootte;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      er wordt aandacht besteed aan de inhaleerbaarheid van deeltjes in het licht van de algemene bevindingen, in het bijzonder als niet aan de deeltjesgroottecriteria kan worden voldaan;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      er wordt een toelichting gegeven als dieren op humane wijze moesten worden gedood omdat zij pijn hadden of tekenen van hevige en voortdurende angst vertoonden, op basis van de criteria in de OESO-leidraad voor humane eindpunten (8);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      indien het testen volgens hoofdstuk B.52 van deze bijlage (4) is gestaakt om over te gaan op deze testmethode B.2, moet dit worden gemotiveerd;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      in de algehele beoordeling van de studie wordt aandacht besteed aan de consistentie van de methoden die voor de bepalingen van de nominale en feitelijke concentratie zijn toegepast, alsmede aan het verband tussen de feitelijke en de nominale concentratie;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      er wordt aandacht besteed aan de waarschijnlijke doodsoorzaak en overheersende werking (systemisch of plaatselijk).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATUUR:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/env/testguidelines
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/env/testguidelines
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Verordening (EG) nr. 1272/2008 van het Europees Parlement en de Raad van 16 december 2008 betreffende de indeling, etikettering en verpakking van stoffen en mengsels tot wijziging en intrekking van de Richtlijnen 67/548/EEG en 1999/45/EG en tot wijziging van Verordening (EG) nr. 1907/2006 (PB L 353 van 31.12.2008, blz. 1).
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.52 van deze bijlage, Acute inhalatietoxiciteit: methode ter bepaling van de acute-toxiciteitsklasse.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.40 van deze bijlage, In-vitrohuidcorrosie: test op basis van de transcutane elektrische weerstand (TEW).
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.40 bis van deze bijlage, In-vitrohuidcorrosie: test met humaan huidmodel.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/env/testguidelines
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/env/testguidelines
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/env/testguidelines
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, London/New York.
                           
                        DEFINITIE
                  Teststof: alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.
                  
                     Aanhangsel 1
                     
                        C × t-protocol
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Als alternatief voor het traditionele protocol kan een stapsgewijs „concentratie × tijd”-onderzoek (c × t-onderzoek) worden overwogen voor de beoordeling van de inhalatietoxiciteit (12)(13)(14). Het wordt bij voorkeur uitgevoerd wanneer specifieke behoeften op het gebied van regelgeving of wetenschap het nodig maken gedurende meerdere perioden van verschillende duur dierproeven uit te voeren, bijvoorbeeld met het oog op het opstellen van rampenbestrijdings- of ruimtelijkeordeningsplannen. Deze aanpak begint meestal met het testen bij een limietconcentratie (blootstellingssessie I), waarbij de dieren worden blootgesteld aan een teststof gedurende vijf perioden van verschillende duur (bv. 15, 30, 60, 120 en 240 minuten), zodat binnen één blootstellingssessie gegevens over meerdere perioden van verschillende duur worden verkregen (zie figuur 1). Indien Verordening (EG) nr. 1272/2008 wordt toegepast, bedragen de limietconcentraties voor gassen, dampen en aerosolen respectievelijk 20 000 ppm, 20 mg/l en 5 mg/l. Deze niveaus mogen slechts worden overschreden wanneer er op grond van wetenschappelijke of regelgevingsoverwegingen behoefte bestaat aan het testen bij deze niveaus (zie punt 37 van de hoofdtekst van hoofdstuk B.2).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 In situaties waarin er weinig of geen informatie over de toxiciteit van een teststof beschikbaar is, moet een verkennende test worden uitgevoerd waarbij groepen van ten hoogste 3 dieren per geslacht worden blootgesteld aan door de onderzoeksleider gekozen doelconcentraties, doorgaans gedurende 240 minuten.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Indien een limietconcentratie is getest tijdens blootstellingssessie I en er minder dan 50 % sterfte is geconstateerd, zijn geen verdere tests nodig. Wanneer er op grond van wetenschappelijke of regelgevingsoverwegingen behoefte bestaat aan het vaststellen van de concentratie/tijdstip/responsverhouding bij hogere niveaus dan de aangegeven limietconcentratie, moet de volgende blootstelling bij een hoger niveau plaatsvinden, bijvoorbeeld bij twee keer de limietconcentratie (d.w.z. 2 L in figuur 1).
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Wanneer bij de limietconcentratie toxiciteit wordt waargenomen, zijn aanvullende tests (hoofdonderzoek) nodig. Deze aanvullende blootstellingen vinden ofwel bij lagere concentraties (in figuur 1: blootstellingssessies II, III of IV') ofwel bij hogere concentraties gedurende kortere perioden (in figuur 1: blootstellingssessie IV) plaats, waarbij de lengten van de perioden zijn aangepast en minder ver uit elkaar liggen.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 De test (beginconcentratie en aanvullende concentraties) wordt uitgevoerd met 1 dier/geslacht per concentratie/tijdstip, of 2 dieren van het gevoeligste geslacht per concentratie/tijdstip. Onder bepaalde omstandigheden kan de onderzoeksleider ervoor kiezen om 2 ratten per geslacht per concentratie/tijdstip (of 4 dieren van het gevoeligste geslacht per concentratie/tijdstip) te gebruiken (15). Door 2 dieren per geslacht per concentratie/tijdstip te gebruiken wordt doorgaans de bias en de variabiliteit van de schattingen verkleind, het percentage succesvolle schattingen verhoogd, en het dekkingspercentage van het betrouwbaarheidsinterval verbeterd. Nadere bijzonderheden zijn opgenomen in GD 39 (2).
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 In het ideale geval wordt elke blootstellingssessie binnen één dag uitgevoerd. Dit biedt de gelegenheid om de volgende blootstelling uit te stellen totdat een redelijk vertrouwen bestaat dat de eerder geteste dieren zullen overleven, en het stelt de onderzoeksleider in staat de doelconcentratie en de duur van de verschillende perioden voor de volgende blootstellingssessie aan te passen. Het is aan te raden elke blootstellingssessie te beginnen met de groep die het langst zal worden blootgesteld, bv. de 240 minuten-blootstellingsgroep, gevolgd door de 120 minuten-blootstellingsgroep enz. Indien bijvoorbeeld de dieren in de 240 minuten-groep na 90 minuten sterven of ernstige toxiciteitsverschijnselen vertonen (bv. extreme veranderingen van het ademhalingspatroon, zoals zware ademhaling), zou het niet zinvol zijn om een groep gedurende 120 minuten bloot te stellen, aangezien de sterfte waarschijnlijk 100 % zou bedragen. De onderzoeksleider moet dus kortere blootstellingsperioden kiezen voor die concentratie (bv. 90, 65, 45, 33 en 25 minuten).
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 De kamerconcentratie moet veelvuldig worden gemeten om de tijdgewogen gemiddelde concentratie voor elke blootstellingsduur te bepalen. Waar mogelijk moet het tijdstip waarop voor elk dier de dood intreedt (in plaats van de blootstellingsduur) worden gebruikt bij de statistische analyse.
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 De resultaten van de eerste vier blootstellingssessies moeten worden onderzocht om vast te stellen of er gegevens ontbreken in de concentratie-tijdcurve (zie figuur 1). Als er geen voldoende passende fitting mogelijk is, kan er een extra blootstelling (vijfde concentratie) worden uitgevoerd. De concentratie en lengten van de blootstellingsperioden voor de vijfde blootstelling moeten zodanig worden gekozen dat de ontbrekende gegevens kunnen worden ingevuld.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Alle blootstellingssessies (met inbegrip van de eerste blootstellingssessie) worden om de concentratie-tijd-responsverhouding te berekenen met behulp van statistische analyse (16). Indien mogelijk moeten voor elk c × t-interval de tijdgewogen gemiddelde concentratie en de blootstellingsduur tot het intreden van de dood (indien de dood intreedt tijdens de blootstelling) worden gebruikt.
                                 
                                    Figuur 1
                                 
                                 
                                    Hypothetisch voorbeeld van een concentratie-tijd-sterfteverhouding bij ratten
                                 
                                 
                                    
                                 Open symbolen = overlevende dieren; gesloten symbolen = dode dieren
                                 Driehoeken = vrouwtjes; cirkels = mannetjes
                                 Doorlopende lijn = LC50-waarden (bereik 7,5-240 min) voor mannetjes met n = 1
                                 Streeplijn = LC50-waarden (bereik 7,5-240 min) voor vrouwtjes met n = 1
                                 Punt-streeplijnen = lijn door hypothetische LC50-waarden voor mannetjes en vrouwtjes als n gelijk was geweest aan 2 (12).
                                 
                                    Legenda:
                                 
                                 Concentratie:
                                 Blootstellingstijd:
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Hieronder volgt een voorbeeld van de stapsgewijze procedure:
                                 
                                    Blootstellingssessie I —   tests bij de limietconcentratie (zie figuur 1)
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             1 dier/geslacht per concentratie/tijdstip; totaal 10 dieren (2)
                                             
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Doelconcentratie (3) = limietconcentratie
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Stel vijf groepen dieren bloot bij deze doelconcentratie gedurende respectievelijk 15, 30, 60, 120 en 240 minuten.
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    Blootstellingssessie II
                                     (4)
                                    —   Hoofdonderzoek
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             1 dier/geslacht per concentratie/tijdstip; totaal 10 dieren
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Stel vijf groepen dieren bloot bij een lagere concentratie (5) (1/2 L) gedurende iets langere perioden (een factor √2 uit elkaar gelegen; zie figuur 1).
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    Blootstellingssessie III —   Hoofdonderzoek
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             1 dier/geslacht per concentratie/tijdstip; totaal 10 dieren
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Stel vijf groepen dieren bloot bij een lagere concentratie (5) (1/4 L) gedurende iets langere perioden (een factor √2 uit elkaar gelegen; zie figuur 1).
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    Blootstellingssessie IV’—   Hoofdonderzoek
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             1 dier/geslacht per concentratie/tijdstip; totaal 10 dieren
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Stel vijf groepen dieren bloot bij een lagere concentratie (5) (1/8 L) gedurende iets langere perioden (een factor √2 uit elkaar gelegen; zie figuur 1).
                                          
                                       
                                    ↓ of
                                 
                                 
                                    Blootstellingssessie IV —   Hoofdonderzoek
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             1 dier/geslacht per concentratie/tijdstip; totaal 10 dieren
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Stel vijf groepen dieren bloot bij een hogere concentratied (6) (2 L) gedurende iets kortere perioden (een factor √2 uit elkaar gelegen; zie figuur 1).
                                          
                                       
                           
                        Mathematische behandeling van de resultaten voor het c × t-protocol
                     
                     
                                 12.
                              
                              
                                 Een c × t-procedure met 4 of 5 blootstellingsconcentraties en vijf perioden van verschillende duur levert respectievelijk 20 of 25 datapunten op. Met deze datapunten kan de c × t-verhouding worden berekend met behulp van statistische analyse (16):
                                 
                                    Vergelijking 1:
                                 
                                 
                                    
                                 waarbij C = concentratie; t = blootstellingsduur, of
                                 
                                    Vergelijking 2:
                                 
                                 
                                    
                                 waarbij 
                                 Met behulp van van vergelijking 1 kan de LC50-waarde worden berekend voor een periode van een bepaalde duur (bv. 4 uur, 1 uur, 30 minuten, of elke tijdsduur die binnen het geteste bereik valt) door P = 5 te gebruiken (50 % respons). Er zij op gewezen dat de Wet van Haber alleen van toepassing is bij n = 1. De LC01 kan worden berekend door P = 2,67 te gebruiken.
                              
                           ”.
            
                  4)
               
               
                  De hoofdstukken B.7 en B.8 worden vervangen door:
                  „B.7.   TOXICITEITSONDERZOEK (ORAAL) OP KNAAGDIEREN BIJ HERHAALDE TOEDIENING (28 DAGEN)
                  
                  INLEIDING
                  
                              1.
                           
                           
                              Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 407 (2008) van de OESO (TG 407). De oorspronkelijke testrichtlijn TG 407 werd in 1981 vastgesteld. In 1995 werd een herziene versie vastgesteld, met als doel aanvullende informatie te verkrijgen met behulp van de in het onderzoek gebruikte dieren, met name over neurotoxiciteit en immunotoxiciteit.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              In 1998 is de OESO een actie gestart om bestaande testrichtlijnen te herzien en nieuwe testrichtlijnen te ontwikkelen voor het screenen en testen op potentiële hormoonontregelaars (8), en heeft zij daaraan een hoge prioriteit toegekend. Een onderdeel van deze actie was het bijwerken van de bestaande OESO-richtlijn voor „toxiciteitsonderzoek (oraal) op knaagdieren bij herhaalde toediening (28 dagen)” (TG 407) door er geschikte parameters in op te nemen om de endocriene werking van teststoffen vast te kunnen stellen. Deze procedure ging gepaard met een uitgebreid internationaal programma voor het testen van de relevantie en praktische uitvoerbaarheid van de aanvullende parameters, de mate waarin met deze parameters de (anti)oestrogene, (anti)androgene, en (anti)thyreoïde werking van stoffen kan worden vastgesteld, de intra- en interlaboratoriumreproduceerbaarheid en de interferentie tussen de nieuwe parameters en die welke in de vroegere TG 407 waren voorgeschreven. De vele gegevens die daarbij zijn verkregen, zijn bijeengebracht en in detail geëvalueerd in een uitgebreid OESO-verslag (9). Deze bijgewerkte testmethode B.7 (gelijkwaardig met TG 407) is het resultaat van de ervaringen en resultaten van het internationale testprogramma. Met deze testmethode kunnen bepaalde met het endocrien systeem samenhangende effecten in de context van andere toxicologische effecten worden geplaatst.
                           
                        INLEIDENDE OVERWEGINGEN EN BEPERKINGEN
                  
                              3.
                           
                           
                              Bij de bepaling en evaluatie van de toxische eigenschappen van een chemische stof moet aan de hand van acute-toxiciteitstests eerst informatie over de toxiciteit worden verkregen. Daarna kan de orale toxiciteit door middel van herhaalde toediening worden bepaald. Deze testmethode heeft tot doel de effecten van toxiciteit op een zeer grote verscheidenheid aan potentiële doelwitten te onderzoeken. Zij levert informatie op over de mogelijke gevaren voor de gezondheid die kunnen voortvloeien uit herhaalde blootstelling gedurende een relatief beperkte periode, met inbegrip van effecten op het zenuwstelsel, het immuunsysteem en het endocrien systeem. Met betrekking tot deze specifieke eindpunten moet zij de identificatie mogelijk maken van potentieel neurotoxische stoffen, die in dit opzicht nader verdienen te worden onderzochtt, en stoffen die de fysiologie van de schildklier verstoren. Ook kan zij gegevens opleveren over stoffen die van invloed zijn op de mannelijke en/of vrouwelijke voortplantingsorganen van jonge volwassen dieren en een indicatie geven van de immunologische effecten.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              De resultaten van deze testmethode B.7 moeten worden gebruikt voor de identificatie van de gevaren en het beoordelen van risico’s. De resultaten die worden verkregen met de parameters die met het endocriene systeem te maken hebben, moeten worden gezien in samenhang met het conceptueel kader van de OESO voor het testen en beoordelen van hormoonontregelende stoffen (11). De methode omvat het basale toxiciteitsonderzoek bij herhaalde toediening dat kan worden gebruikt voor stoffen waarvoor een onderzoek van 90 dagen niet gerechtvaardigd is (bv. als het productievolume binnen bepaalde grenzen blijft), of ter voorbereiding op een langetermijnsonderzoek. De blootstellingstijd bedraagt 28 dagen.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Het internationale programma voor de validering van geschikte parameters om de mogelijke endocriene werking van een teststof vast te stellen, heeft aangetoond dat de kwaliteit van de met behulp van deze testmethode B.7 verkregen gegevens sterk zal afhangen van de ervaring waarover het testlaboratorium beschikt. Het gaat daarbij met name om de histopathologische bepaling van cyclische veranderingen in de vrouwelijke voortplantingsorganen en de bepaling van het gewicht van de kleine hormoonafhankelijke organen die moeilijk te ontleden zijn. Er zijn richtsnoeren ontwikkeld voor histopathologisch onderzoek (19). Deze zijn beschikbaar op de openbare website van de OESO over de testrichtsnoeren. Zij zijn bedoeld om de pathologen te helpen bij hun onderzoek en om de gevoeligheid van de bepalingen te helpen vergroten. Van diverse parameters werd vastgesteld dat zij als indicator kunnen dienen van met het endocrien systeem samenhangende toxiciteit; deze zijn in de testmethode opgenomen. Parameters waarvoor onvoldoende gegevens beschikbaar waren om het nut ervan te kunnen vaststellen of waarvan tijdens het valideringsprogramma slechts in geringe mate kon worden aangetoond dat zij zouden kunnen helpen bij de opsporing van hormoonontregelaars, worden voorgesteld als facultatieve eindpunten (zie aanhangsel 2).
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Op grond van de tijdens het valideringsproces verkregen gegevens moet worden benadrukt dat deze bepaling onvoldoende gevoelig is om alle stoffen met (anti)androgene of (anti)oestrogene werking te kunnen identificeren (9). De testmethode wordt niet uitgevoerd in het levensstadium dat het gevoeligst is voor hormoonontregeling. Met de testmethode zijn tijdens het valideringsproces desondanks stoffen geïdentificeerd die de schildklierfunctie in sterke of lichte mate beïnvloeden, alsmede sterk of matig endocrien werkzame stoffen die via de oestrogeen- of androgeenreceptoren werken, maar in de meeste gevallen konden endocrien werkzame stoffen die de oestrogeen- of androgeenreceptoren in lichte mate beïnvloeden niet worden geïdentificeerd. Daarom kan de methode niet als screeningtest voor endocriene activiteit worden omschreven.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Het ontbreken van effecten die verband houden met deze werkingswijzen kan derhalve niet als bewijs worden beschouwd voor het ontbreken van effecten op het endocrien systeem. Wat de met het endocrien systeem samenhangende effecten betreft, moet de karakterisering van stoffen derhalve niet worden gebaseerd op de resultaten van deze testmethode alleen, maar moeten deze resultaten gebruikt worden in een benadering met meervoudige bewijsvoering („weight of evidence”-benadering), waarin alle bestaande gegevens over een stof worden benut om de mogelijke endocriene werking ervan te karakteriseren. Voor de besluitvorming over regelgeving inzake endocriene werking (karakterisering van stoffen) moet daarom een brede benadering worden gevolgd, die niet slechts leunt op de resultaten van de toepassing van deze testmethode.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Erkend wordt dat alle procedures waarbij dieren worden gebruikt, aan de plaatselijke normen voor de verzorging van dieren moeten voldoen; bij de beschrijvingen van de verzorging en behandeling hieronder gaat het om minimale prestatienormen, die door de lokale regelgeving worden vervangen indien deze strikter is. De OESO heeft nadere richtsnoeren voor de humane behandeling van dieren opgesteld (14).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1.
                           
                        PRINCIPE VAN DE TEST
                  
                              10.
                           
                           
                              De teststof wordt gedurende een periode van 28 dagen dagelijks oraal toegediend aan verscheidene groepen proefdieren, in geleidelijk stijgende doses. Er wordt één dosis per groep gebruikt. Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks zorgvuldig geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven of worden geëuthanaseerd, wordt obductie verricht. Dieren die aan het eind van het onderzoek nog in leven zijn, worden geëuthanaseerd en ook hierop wordt obductie verricht. Een onderzoek van 28 dagen levert informatie op over de effecten van herhaalde orale blootstelling en kan erop wijzen dat verdere langetermijnonderzoeken nodig zijn. Ook kan het informatie opleveren over de te kiezen concentraties voor langetermijnonderzoek. Met de met behulp van deze testmethode verkregen gegevens kan de toxiciteit van de teststof worden gekarakteriseerd, een indicatie van de dosis-responsverhouding worden gegeven en het niveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld (No-Observed Adverse Effect Level, NOAEL) worden bepaald.
                           
                        BESCHRIJVING VAN DE METHODE
                  
                     Keuze van de diersoort
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              De voorkeur wordt gegeven aan ratten, hoewel andere knaagdiersoorten kunnen worden gebruikt. Indien de in deze testmethode B.7 gespecificeerde parameters worden onderzocht bij een andere knaagdiersoort moet dit uitvoerig worden gemotiveerd. Hoewel het vanuit biologisch oogpunt aannemelijk is dat andere soorten op vergelijkbare wijze op toxische stoffen reageren als de rat, kan het gebruik van kleinere soorten leiden tot een hogere variabiliteit als gevolg van technische moeilijkheden bij het ontleden van kleinere organen. In het internationale valideringsprogramma voor de detectie van hormoonontregelaars zijn alleen ratten gebruikt. Er worden gezonde jonge volwassen dieren van gangbare laboratoriumstammen gebruikt. De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig zijn. De toediening moet zo snel mogelijk na het spenen beginnen maar in ieder geval voordat de dieren negen weken oud zijn. Per geslacht mag bij het begin van het onderzoek het gewicht van de dieren die worden gebruikt, niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken. Als een herhaalde orale toediening wordt uitgevoerd als inleiding op een studie van langere duur, moeten de dieren in beide studies bij voorkeur tot dezelfde stam behoren en dezelfde oorsprong hebben.
                           
                        
                     Huisvesting en voeding
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Alle procedures moeten in overeenstemming zijn met de plaatselijke normen voor de verzorging van proefdieren. De temperatuur in de proefdierruimte moet 22 °C (± 3 °C) zijn. Hoewel de relatieve vochtigheid minimaal 30 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte) dient te zijn, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met een fotoperiode van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De keuze van het voer kan worden beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende mengbaarheid met de teststof te zorgen, wanneer de stof in het voer wordt toegediend. De dieren moeten in kleine groepen van hetzelfde geslacht worden gehuisvest; dieren kunnen individueel worden gehuisvest als dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is. Indien de dieren in groepen in kooien worden ondergebracht, mogen per kooi niet meer dan vijf dieren worden gehuisvest.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Het voeder moet regelmatig op verontreinigingen worden onderzocht. Een monster van het voedsel moet worden bewaard totdat het verslag is afgerond.
                           
                        
                     Voorbereiding van de dieren
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Gezonde jonge volwassen dieren worden willekeurig ingedeeld in de behandelde en controlegroepen. De kooien worden zodanig opgesteld dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooien tot een minimum worden beperkt. De dieren krijgen een unieke identificatie en blijven voordat de behandeling begint minimaal vijf dagen in hun kooi om in het laboratorium te acclimatiseren.
                           
                        
                     Voorbereiding van de doses
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              De teststof kan via een maagsonde, met de voeding of met het drinkwater worden toegediend. De wijze van de orale toediening hangt af van het doel van het onderzoek en van de fysische/chemische/toxicokinetische eigenschappen van de teststof.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Indien nodig wordt de teststof opgelost of gesuspendeerd in een geschikt medium. Aanbevolen wordt eerst te bezien of het mogelijk is een waterige oplossing/suspensie te gebruiken, als dit niet kan een oplossing/suspensie in olie (bv. maïsolie) te overwegen en daarna eventueel een ander medium. Van niet-waterige media moeten de toxische eigenschappen bekend zijn. De stabiliteit van de teststof in het medium moet worden bepaald.
                           
                        PROCEDURE
                  
                     Aantal en geslacht van de dieren
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Op ieder dosisniveau moeten ten minste tien dieren (vijf mannetjes en vijf vrouwtjes) worden gebruikt. Indien het de bedoeling is tussentijds dieren te euthanaseren, moet het aantal worden verhoogd met het aantal dieren dat volgens plan voor de voltooiing van de studie zal worden geëuthanaseerd. Er moet worden overwogen een aanvullende satellietgroep van tien dieren (vijf per geslacht) op te nemen in de controlegroep en de groep met het hoogste dosisniveau, voor observatie van reversibiliteit, persistentie of vertraagd tot uiting komen van toxische effecten gedurende ten minste 14 dagen na de behandeling.
                           
                        
                     Dosering
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              In het algemeen moeten er ten minste drie testgroepen en één controlegroep worden gebruikt, maar als er op grond van de beoordeling van andere gegevens bij toediening van 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag geen effecten worden verwacht, kan er een limiettest worden uitgevoerd. Als er geen bruikbare gegevens beschikbaar zijn, kan een bereikbepalingonderzoek worden uitgevoerd (bij dieren van dezelfde stam en dezelfde herkomst) om de orde van grootte van de te gebruiken doses te helpen bepalen. Afgezien van de toediening van de teststof worden de dieren in de controlegroep op identieke wijze behandeld als de dieren in de testgroepen. Indien bij de toediening van de teststof van een medium gebruik wordt gemaakt, dient dit aan de controlegroep in het hoogste gebruikte volume toegediend te worden.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              De dosisniveaus moeten worden gekozen in het licht van de bestaande gegevens over toxiciteit en (toxico)kinetica van de teststof en verwante stoffen. Het hoogste dosisniveau moet zo worden gekozen dat toxische effecten optreden, maar geen sterfte of ernstig lijden. Daarna moet een dalende reeks dosisniveaus worden gekozen teneinde een eventuele doseringsgerelateerde respons en het laagste dosisniveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld (No-Observed Adverse Effect Level, NOAEL) aan te tonen. Intervallen van een factor twee of vier zijn vaak optimaal om de dalende dosisniveaus vast te stellen en het is vaak beter een vierde testgroep toe te voegen dan zeer grote intervallen (bv. meer dan een factor tien) tussen de doseringen te gebruiken.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Bij algemene toxiciteit (bv. verminderd lichaamsgewicht, effecten op lever, hart, longen of nieren enz.) of andere veranderingen die mogelijk geen toxische reacties zijn (bv. verminderde voedselinname, leververgroting), moeten de waargenomen effecten op immunologische, neurologische of endocriene eindpunten met de nodige omzichtigheid worden geïnterpreteerd.
                           
                        
                     Limiettest
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Als volgens de hier beschreven procedures een test wordt uitgevoerd met één dosisniveau van ten minste 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag — of, in het geval van toediening via het voer of het drinkwater, het equivalente percentage in het voer of het drinkwater (berekend overeenkomstig het lichaamsgewicht) — en er geen waarneembare toxische effecten optreden, en deze ook niet kunnen worden verwacht op grond van gegevens betreffende chemische stoffen met verwante structuur, is het niet noodzakelijk een volledige test met drie dosisniveaus te doen. De limiettest is van toepassing, behalve wanneer vanwege de verwachte blootstelling van de mens een hoger dosisniveau nodig wordt geacht.
                           
                        
                     Toediening van de doses
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              De dieren krijgen gedurende een periode van 28 dagen, zeven dagen per week, een dosis van de teststof toegediend. Indien de teststof via een maagsonde aan het dier wordt toegediend, moet dit in één enkele dosis gebeuren met gebruikmaking van een maagbuisje of een geschikte intubatiecanule. Het maximale vloeistofvolume dat in één keer kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het dier. Het volume mag niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht, behalve wanneer het om een waterige oplossing gaat: in dat geval mag 2 ml/100 g lichaamsgewicht worden gebruikt. Behalve bij irriterende of bijtende stoffen, die normaal gesproken bij hogere concentraties hevigere effecten hebben, moeten volumeverschillen tot een minimum worden beperkt door de concentratie aan te passen, zodat er op alle dosisniveaus hetzelfde volume wordt toegediend.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Wanneer stoffen met de voeding of het drinkwater worden toegediend, moet erop worden toegezien dat de hoeveelheden van de teststof niet interfereren met de normale voedings- of waterbalans. Wanneer de teststof in het voer wordt toegediend, kan een constante concentratie in het voer (in ppm) of een constante dosis in verhouding tot het lichaamsgewicht van de dieren worden gebruikt; de gekozen methode moet worden gespecificeerd. Wanneer een stof met een sonde wordt toegediend, moet de dosis elke dag op een vergelijkbaar tijdstip worden toegediend en indien nodig worden aangepast om een constante dosis in verhouding tot het lichaamsgewicht van het dier te houden. Wanneer een onderzoek met herhaalde toediening als voorbereiding op een langdurig onderzoek wordt gebruikt, moet bij beide onderzoeken een vergelijkbare voeding worden gebruikt.
                           
                        
                     Waarnemingen
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              De dieren moeten 28 dagen worden geobserveerd. Dieren uit een satellietgroep die bestemd is voor vervolgwaarnemingen moeten ten minste 14 dagen zonder behandeling worden geobserveerd om de persistentie van de toxische effecten c.q. het herstel alsmede het eventuele optreden van vertraagde toxiciteit te kunnen waarnemen.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Algemene klinische waarnemingen moeten ten minste eenmaal per dag plaatsvinden, bij voorkeur steeds op hetzelfde tijdstip en met in achtneming van de piekperiode van de te verwachten effecten na toediening. De gezondheidstoestand van de dieren moet worden geregistreerd. De dieren moeten ten minste tweemaal per dag worden geobserveerd op ziekteverschijnselen en sterfte.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Alle dieren worden eenmaal voor de eerste blootstelling nauwkeurig klinisch onderzocht (om intra-individuele vergelijking mogelijk te maken) en vervolgens ten minste eenmaal per week. Dit onderzoek moet buiten de kooi op een vaste onderzoekplaats en bij voorkeur steeds op hetzelfde moment van de dag worden uitgevoerd. De gegevens moeten zorgvuldig worden opgetekend, bij voorkeur met behulp van scoringssystemen die door het testlaboratorium expliciet zijn gedefinieerd. Er moet zo veel mogelijk worden gezorgd dat variaties in de testomstandigheden minimaal zijn en dat de waarnemers niet weten welke behandeling een gegeven dier heeft ondergaan. Tekenen waarop moet worden gelet, zijn onder meer (maar niet alleen): veranderingen in huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van af- en uitscheiding, en onwillekeurige reacties zoals traanvorming, rechtopstaan van het haar, verandering van de pupilgrootte of een ongewoon ademhalingspatroon. Ook verandering in gang, houding en reactiviteit op vastpakken, alsmede de aanwezigheid van klonische of tonische bewegingen, stereotiep gedrag (bijvoorbeeld overmatige lichaamsverzorging, herhaaldelijk ronddraaien) of bizar gedrag (bijvoorbeeld zelfverminking, achteruitlopen) moeten worden opgetekend (2).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Gedurende de vierde week van de blootstelling moet de sensorische reactiviteit op stimuli van verschillende aard (2) (bv. auditief, visueel of proprioceptief) (3)(4)(5) worden bepaald en moet een bepaling van de grijpkracht (6) en de motorische activiteit (7) plaatsvinden. Meer informatie over de procedures die kunnen worden gevolgd, is te vinden in de desbetreffende literatuur. Er kunnen evenwel ook andere dan de genoemde procedures worden toegepast.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Als de studie wordt verricht bij wijze van inleidend onderzoek voor daaropvolgend subchronisch onderzoek van 90 dagen, kunnen functionele observaties in de vierde week achterwege worden gelaten. In dat geval moeten de functionele observaties in het bedoelde vervolgonderzoek plaatsvinden. Daar staat echter tegenover dat de beschikbaarheid van gegevens betreffende functionele observaties uit het onderzoek met herhaalde toediening, de keuze van de dosisniveaus voor het daaropvolgende subchronische onderzoek ten goede kan komen.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Bij wijze van uitzondering kunnen functionele waarnemingen ook achterwege worden gelaten bij groepen die anders tekenen van toxiciteit vertonen in een mate die aanzienlijk zou interfereren met de uitvoering van de functionele test.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Tijdens de necropsie kan de oestruscyclus van alle vrouwtjes worden vastgesteld (facultatief) door vaginale uitstrijkjes te nemen. Deze observaties leveren informatie op over de fase van de oestruscyclus op het moment waarop de dieren zijn gedood, en kunnen van pas komen bij de histologische evaluatie van oestrogeengevoelige weefsels (zie de richtsnoeren voor histopathologie (19)).
                           
                        
                     Lichaamsgewicht en consumptie van voer en water
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Alle dieren moeten ten minste eenmaal per week worden gewogen. Ook het voedselverbruik moet ten minste wekelijks worden gemeten. Indien de teststof met het drinkwater wordt toegediend, moet ook het waterverbruik ten minste wekelijks worden gemeten.
                           
                        
                     Hematologie
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Aan het eind van de testperiode moeten de volgende onderzoeken worden verricht: bepaling van hematocriet en hemoglobinegehalte, telling van de erytrocyten, totale en gedifferentieerde telling van de leukocyten, telling van de bloedplaatjes en meting van de stollingstijd en het stollingsvermogen. Indien de teststof of de vermeende metabolieten ervan oxiderende eigenschappen hebben, of hiervan een vermoeden bestaat, moeten andere bepalingen worden uitgevoerd, zoals van de methemoglobineconcentratie en de Heinz-lichaampjes.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              De bloedmonsters moeten worden genomen net vóór of tijdens het euthanaseren van de dieren; er moet worden genoteerd uit welk lichaamsdeel. De monsters moeten onder de juiste omstandigheden worden bewaard. Gedurende de nacht voordat zij geëuthanaseerd worden, mogen dieren geen voedsel krijgen (7).
                           
                        
                     Klinische biochemie
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Om belangrijke toxische effecten op de weefsels en met name op de nieren en de lever te onderzoeken moet klinisch-biochemisch onderzoek worden verricht op bloedmonsters van alle dieren, met uitzondering van de dieren die stervend zijn aangetroffen en/of zijn geëuthanaseerd vóór het beëindigen van het onderzoek. Deze monsters moeten juist vóór het euthanaseren of als onderdeel van de procedure hiervoor worden genomen. Onderzoek van plasma of serum moet omvatten: natrium, kalium, glucose, totaal cholesterol, ureum, creatinine, totaal proteïne en albumine, ten minste twee enzymen die een indicatie geven van hepatocellulaire effecten (zoals alanineaminotransferase, aspartaataminotransferase, alkalische fosfatase, gamma-glutamyltranspeptidase en glutamaatdehydrogenase), en galzuren. Bepaling van andere enzymen (van hepatische of andere oorsprong) en bilirubine kan onder bepaalde omstandigheden nuttige informatie geven.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Als optie kunnen tijdens de laatste week van het onderzoek de volgende urineonderzoeken worden verricht, waarbij op regelmatige tijdstippen urinemonsters moeten worden genomen: uitzien, volume, osmolaliteit of soortelijk gewicht, pH, eiwit, glucose en bloed/bloedcellen.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Bovendien moet worden overwogen plasma- of serummarkers van algemene weefselbeschadiging te onderzoeken. Andere onderzoeken die moeten worden uitgevoerd als van de teststof bekend is, of vermoed wordt, dat zij de desbetreffende metabolische profielen beïnvloedt, zijn: calcium, fosfaat, triglyceriden, specifieke hormonen, en cholesterinase. Deze moeten voor chemische stoffen in bepaalde klassen of per geval geïdentificeerd worden.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Hoewel bij de internationale evaluatie van de endocriene eindpunten geen duidelijke voordelen van de bepaling van schildklierhormonen (T3, T4) en TSH konden worden aangetoond, kan het nuttig zijn monsters van serum of plasma te bewaren voor het meten van T3, T4 en TSH (facultatief) als er aanwijzingen zijn voor een effect op de hypofyse-schildklieras. Deze monsters kunnen worden ingevroren bij – 20 °C voor opslag. De volgende factoren kunnen van invloed zijn op de variabiliteit en de absolute concentraties van de hormoonbepalingen:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          tijdstip waarop de dieren worden gedood, vanwege de schommelingen in de hormoonconcentraties gedurende de dag;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          wijze waarop de dieren worden gedood: onnodige stress bij de dieren, waardoor de hormoonconcentraties kunnen worden beïnvloed, moet worden voorkomen;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          testkits voor hormoonbepalingen, die verschillende standaardkrommen kunnen hebben.
                                       
                                    Histopathologisch onderzoek maakt een betrouwbaardere definitieve identificatie van stoffen met thyreoïde werking mogelijk dan bepaling van de hormoonniveaus.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Plasmamonsters die specifiek voor hormoonbepaling zijn bedoeld, moeten telkens op hetzelfde moment van de dag worden genomen. Het verdient aanbeveling speciale aandacht te schenken aan bepalingen van T3-, T4- en TSH-niveaus die het gevolg zijn van histopathologische veranderingen van de schildklier. De verschillende in de handel verkrijgbare „assay kits” kunnen verschillende numerieke waarden opleveren bij de analyse van hormoonconcentraties. Als gevolg daarvan kunnen wellicht geen prestatiecriteria op basis van uniforme historische gegevens worden gegeven. In plaats daarvan moeten de laboratoria zich inspannen om de variatiecoëfficiënten voor T3 en T4 lager dan 25, en voor TSH lager dan 35, te houden. Alle concentraties worden geregistreerd in ng/ml.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              In het geval van ontoereikende basisgegevens uit het verleden moet worden overwogen de hematologische en klinisch-biochemische variabelen te bepalen, bij voorkeur bij een groep dieren die niet in de testgroepen zijn opgenomen, of anders voordat met de toediening wordt begonnen.
                           
                        PATHOLOGIE
                  
                     Macroscopische obductie
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Bij alle dieren in de studie moet een volledige macroscopische obductie worden uitgevoerd, waaronder een zorgvuldig onderzoek van het huidoppervlak, alle lichaamsopeningen alsmede de schedelholte, de borstholte en de buikholte, en de inhoud daarvan. Lever, nieren, bijnieren, testes, epididymides, prostaat + zaadblaasjes met coagulans afscheidende klieren als geheel, thymus, milt, hersenen en hart van alle dieren (afgezien van de dieren die stervend zijn aangetroffen en/of zijn geëuthanaseerd vóór het beëindigen van het onderzoek) moeten zo nodig ontdaan worden van aanhechtend weefsel, en ze moeten zo spoedig mogelijk na de sectie nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. Het prostaatcomplex moet voorzichtig worden ontdaan van aanhechtend weefsel om te voorkomen dat de met vloeistof gevulde zaadblaasjes lek raken. Als alternatief kunnen zaadblaasjes en prostaat na de fixatie worden ontdaan van aanhechtend weefsel en gewogen.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Daarnaast kunnen facultatief twee andere weefsels worden gewogen, zo snel mogelijk na de sectie om uitdroging te voorkomen: gepaarde ovaria (nat gewicht) en uterus, inclusief cervix (richtsnoeren voor het verwijderen en prepareren van baarmoederweefsel voor gewichtsmeting zijn opgenomen in OESO TG 440 (18)).
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Het gewicht van de schildklier (facultatief) kan na de fixatie worden bepaald. Aanhechtend weefsel moet zeer voorzichtig en pas na fixatie worden verwijderd, om beschadiging van de weefsels te voorkomen. Weefselbeschadigingen kunnen de histopathologische analyse negatief beïnvloeden.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              De volgende weefsels moeten in een fixeermiddel worden bewaard dat zowel voor het type weefsel als voor het beoogde latere histopathologische onderzoek (zie punt 47) geschikt is: elk macroscopisch waarneembaar letsel, hersenen (representatieve delen waaronder cerebrum, cerebellum en pons), ruggenmerg, oog, maag, dunne en dikke darm (inclusief Peyerse platen), lever, nieren, bijnieren, milt, hart, thymus, schildklier, luchtpijp en longen (conserveren door opblazen met een fixatief en dan onderdompelen), geslachtsklieren (testes en ovaria), secundaire geslachtsorganen (uterus en cervix, epididymides, prostaat + zaadblaasjes met coagulans uitscheidende klieren), vagina, urineblaas, lymfeklieren [naast de meest proximale afvoerende lymfeklier moet ook een andere lymfeklier worden uitgenomen, afhankelijk van de ervaringen van het laboratorium (15)), perifere zenuwen (nervus ischiadicus of nervus tibialis), bij voorkeur dicht bij de spier, skeletspier en bot, met beenmerg (een coupe, of in plaats daarvan een direct op een objectglaasje aangebracht stukje beenmergaspiraat). Aanbevolen wordt de testes te fixeren door middel van onderdompeling in Bouin-oplossing of gemodificeerde Davidson-oplossing (16)(17). De tunica albuginea moet voorzichtig en ondiep met een naald worden ingeprikt op de beide polen van het orgaan, zodat het fixatief snel kan binnendringen. Uit de klinische en andere bevindingen kan de noodzaak blijken verder weefsel te onderzoeken. Ook organen waarvan op basis van de bekende eigenschappen van de teststof wordt verondersteld dat ze kunnen worden aangetast, moeten worden bewaard.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              De volgende weefsels kunnen nuttige aanwijzingen geven voor met het endocrien systeem samenhangende effecten: geslachtsklieren (ovaria en testes), secundaire geslachtsorganen (uterus inclusief cervix, epididymides, zaadblaasjes met coagulans afscheidende klieren, dorsolaterale en ventrale prostaat), vagina, hypofyse, mannelijke borstklier, schildklier en bijnier. Er bestaat onvoldoende documentatie over veranderingen in de mannelijke borstklieren, maar deze parameter zou kan erg gevoelig kunnen zijn voor stoffen met oestrogene werking. De observatie van niet in de lijst van punt 43 opgenomen organen/weefsels is facultatief (zie aanhangsel 2).
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              In de richtsnoeren voor histopathologisch onderzoek (19) zijn nadere gegevens opgenomen over de sectie, de fixatie, het snijden van coupes en de histopathologie van endocriene weefsels.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              In het kader van het internationale testprogramma zijn enkele aanwijzingen gevonden dat subtiele endocriene effecten van stoffen die de homeostase van geslachtshormonen in beperkte mate kunnen beïnvloeden, kunnen worden herkend aan verstoring van de synchronisatie van de oestruscyclus in verschillende weefsels, en niet zozeer door uitgesproken histopathologische veranderingen in de vrouwelijke geslachtsorganen. Hoewel dergelijke effecten niet eenduidig konden worden aangetoond, wordt aanbevolen rekening te houden met aanwijzingen voor mogelijke asynchronie van de oestruscyclus bij het interpreteren van de histopathologie van de ovaria (folliculaire, thecale en granulosacellen), uterus, cervix en vagina. Indien de door middel van vaginale uitstrijkjes vastgestelde fase van de cyclus wordt beoordeeld, kan deze ook in de vergelijking worden betrokken.
                           
                        
                     Histopathologie
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Bij alle dieren in de groep behandeld met het hoogste dosisniveau en bij de dieren in de controlegroep moet een volledig histopathologisch onderzoek worden verricht op de bewaarde organen en weefsels. Organen en weefsels die blijken te zijn beschadigd door de teststof op het hoogste dosisniveau, moeten in alle groepen met een lagere dosering worden onderzocht.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Elk macroscopisch waarneembaar letsel moet worden onderzocht.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Bij het histopathologisch onderzoek van de dieren in de satellietgroepen moet speciaal worden gelet op die organen en weefsels waarin effecten blijken te zijn opgetreden bij de andere behandelde groepen.
                           
                        GEGEVENS EN RAPPORTAGE
                  
                     Gegevens
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Voor elk dier worden apart gegevens verstrekt. Bovendien moeten alle gegevens worden samengevat in tabellen die voor iedere testgroep laten zien: het aantal dieren aan het begin van het onderzoek, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of om redenen van dierenwelzijn is geëuthanaseerd en het tijdstip waarop de dood bij de individuele dieren is ingetreden, het aantal dieren dat toxiciteitsverschijnselen vertoont, een beschrijving van de waargenomen toxische effecten, met inbegrip van de aanvang, de duur en de ernst van eventuele toxische effecten, het aantal dieren met letsel, het type letsel en de ernst ervan, en het percentage dieren waarbij ieder type letsel voorkomt.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Waar mogelijk moeten getalsmatige resultaten met behulp van een geschikte en algemeen erkende statistische methode worden geëvalueerd. Het gebruik van meerdere t-tests moet worden voorkomen door vergelijking van het effect over een dosisbereik. De statistische methoden moeten gedurende de opzet van het onderzoek worden gekozen.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Voor de kwaliteitscontrole wordt voorgesteld historische controlegegevens te verzamelen en variatiecoëfficiënten te berekenen voor numerieke gegevens, met name voor de parameters die verband houden met het opsporen van hormoonontregelaars. Deze gegevens kunnen voor vergelijkingsdoeleinden worden gebruikt wanneer daadwerkelijk uitgevoerd onderzoek wordt geëvalueerd.
                           
                        
                     Testverslag
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Teststof:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fysische aard, zuiverheid en fysisch-chemische eigenschappen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identificatiegegevens.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Medium (indien van toepassing):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivering voor de keuze van het medium, indien geen water wordt gebruikt.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Proefdieren:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gebruikte soort/stam;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      herkomst, huisvesting, voeding enz.;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gewicht van elk dier aan het begin van de test;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivering voor het gebruik van een ander soort dan ratten.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testomstandigheden:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivering voor de keuze van de dosisniveaus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof, de bereiding van het voer en de bereikte concentratie, stabiliteit en homogeniteit van het preparaat;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/drinkwater (in ppm) naar de feitelijke dosis (in mg/kg lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en het water.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Facultatieve onderzochte eindpunten
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      lijst van facultatieve onderzochte eindpunten.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Resultaten:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      lichaamsgewicht en veranderingen in het lichaamsgewicht;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      waar van toepassing, voedselverbruik en waterverbruik;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gegevens over de toxische reacties naar geslacht en dosisniveau, met inbegrip van toxiciteitsverschijnselen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aard, ernst en duur van (al dan niet reversibele) klinische waarnemingen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bepalingen van de sensorische activiteit, grijpkracht en motorische activiteit;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uitgevoerde hematologische onderzoeken en de relevante referentiewaarden;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uitgevoerde klinisch-biochemische onderzoeken en de relevante referentiewaarden;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      lichaamsgewicht ten tijde van het euthanaseren en gegevens over het gewicht van de organen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      obductiebevindingen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevindingen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      indien beschikbaar, absorptiegegevens;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      statistische behandeling van de resultaten, indien van toepassing.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bespreking van de resultaten
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Conclusies
                                          
                                       
                                    
                        
                     Aanhangsel 1
                     DEFINITIES
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Androgene werking: het vermogen van een stof om in een zoogdierorganisme als een natuurlijk androgeen hormoon (bv. testosteron) te werken.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Antiandrogene werking: het vermogen van een stof om in een zoogdierorganisme de werking van een natuurlijk androgeen hormoon (bv. testosteron) te onderdrukken.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Antioestrogene werking: het vermogen van een stof om in een zoogdierorganisme de werking van een natuurlijk oestrogeen hormoon (bv. 17ß-oestradiol) te onderdrukken.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Antithyreoïde werking: het vermogen van een stof om in een zoogdierorganisme de werking van een natuurlijk schildklierhormoon (bv. T3) te onderdrukken.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Dosering: een algemene term die de dosis en de frequentie en de duur van de toediening omvat.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Dosis: de toegediende hoeveelheid teststof. De dosis wordt uitgedrukt als gewicht van de teststof per eenheid lichaamsgewicht van het proefdier per dag (bv. mg/kg lichaamsgewicht/dag), of als constante voedingsconcentratie.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Manifeste toxiciteit: een algemene term die duidelijke toxiciteitsverschijnselen beschrijft die optreden na de toediening van de teststof. Deze verschijnselen moeten een beoordeling van de gevaren mogelijk maken en van een zodanige aard zijn dat verwacht mag worden dat bij een hogere toegediende dosis ernstige toxische verschijnselen en waarschijnlijk sterfte optreden.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    NOAEL: afkorting van „No-Observed Adverse Effect Level”, het niveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld. Dit is het hoogste dosisniveau waarbij nog geen aan de behandeling gebonden nadelige effecten worden vastgesteld.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Oestrogene werking is het vermogen van een stof om in een zoogdierorganisme als een natuurlijk oestrogeen hormoon (bv. 17ß-oestradiol) te werken.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Teststof: alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Thyreoïde werking: het vermogen van een stof om in een zoogdierorganisme als een natuurlijk schildklierhormoon (bv. T3) te werken.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Validatie: een wetenschappelijke procedure die is ontworpen om de operationele vereisten en beperkingen van een testmethode te beschrijven en de betrouwbaarheid en relevantie ervan voor een bepaald doel aan te tonen.
                              
                           
                  
                     Aanhangsel 2
                     
                        Aanbevolen eindpunten voor het opsporen van hormoonontregelaars met deze testmethode B.7
                     
                     
                                 Verplichte eindpunten
                              
                              
                                 Facultatieve eindpunten
                              
                           
                                 Gewicht
                              
                           
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Testes
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Epididymides
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Bijnieren
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Prostaat + zaadblaasjes met coagulans uitscheidende klieren
                                          
                                       
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Eierstokken
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Uterus inclusief cervix
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Schildklier
                                          
                                       
                           
                                 Histopathologie
                              
                           
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Geslachtsklieren:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Testes en
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Eierstokken
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Secundaire geslachtsorganen:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Epididymides,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Prostaat + zaadblaasje met coagulans uitscheidende klieren
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Uterus inclusief cervix
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Bijnieren
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Schildklier
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Vagina
                                          
                                       
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Vaginale uitstrijkjes
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Mannelijke borstklier
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Hypofyse
                                          
                                       
                           
                                 Hormoonmeting
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             T3-, T4-niveau in bloedsomloop
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             TSH-niveau in bloedsomloop
                                          
                                       
                           
                  
                     LITERATUUR:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404-407.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals N 440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.
                           
                        B.8.   SUBACUTE INHALATIETOXICITEIT: ONDERZOEK VAN 28 DAGEN
                  
                  SAMENVATTING
                  Deze herziene testmethode B.8 is ontworpen om de toxiciteit van een teststof via de inhalatieweg na herhaalde blootstelling gedurende een beperkte periode (28 dagen) volledig te karakteriseren, en gegevens op te leveren voor kwantitatieve beoordelingen van de inhalatierisico’s. Groepen van ten minste 5 mannelijke en 5 vrouwelijke knaagdieren worden gedurende 28 dagen 6 uur per dag blootgesteld aan a) de teststof bij drie of meer concentraties, b) gefilterde lucht (negatieve controle) en/of c) het medium (mediumcontrole). De dieren worden doorgaans vijf dagen per week blootgesteld, maar zeven dagen per week is ook toegestaan. Er worden altijd zowel mannetjes als vrouwtjes getest, maar zij kunnen bij verschillende concentratieniveaus worden blootgesteld indien bekend is dat een van beide geslachten gevoeliger is voor een bepaalde teststof. Deze methode geeft de onderzoeksleider de flexibiliteit om satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen), bronchoalveolaire lavage, neurologische tests en aanvullende klinisch-pathologische en histopathologische beoordelingen in het onderzoek op te nemen, om de toxiciteit van een teststof beter te kunnen karakteriseren.
                  INLEIDING
                  
                              1.
                           
                           
                              Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 412 (2009) van de OESO. Testrichtlijn 412 (TG 412), de oorspronkelijke testrichtlijn voor subacute inhalatie, werd in 1981 vastgesteld (1). Deze testmethode B.8 (die gelijkwaardig is aan de herziene versie van TG 412) is bijgewerkt om haar in overeenstemming te brengen met de stand van de wetenschap en om te voldoen aan de huidige en toekomstige regelgevingsbehoeften.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Met deze methode kunnen nadelige effecten na herhaalde dagelijkse blootstelling aan een teststof door inhalatie gedurende 28 dagen worden gekarakteriseerd. De gegevens uit het onderzoek van 28 dagen naar subacute inhalatietoxiciteit kunnen worden gebruikt voor kwantitatieve risicobeoordelingen (indien niet gevolgd door een onderzoek van 90 dagen naar subchronische inhalatietoxiciteit (hoofdstuk B.29 van deze bijlage)). De gegevens kunnen ook informatie opleveren over de te kiezen concentraties voor langetermijnonderzoek, zoals het onderzoek van 90 dagen naar subchronische inhalatietoxiciteit. Deze testmethode is niet specifiek bedoeld voor het testen van nanomaterialen. De in de context van deze testmethode gebruikte definities zijn opgenomen in het laatste deel van dit hoofdstuk en in leidraad GD 39 (2).
                           
                        INLEIDENDE OVERWEGINGEN
                  
                              3.
                           
                           
                              Het testlaboratorium moet alle beschikbare informatie over de teststof in overweging nemen voordat het onderzoek wordt uitgevoerd. Dit komt de kwaliteit van het onderzoek ten goede en zorgt ervoor dat het gebruik van dieren tot een minimum wordt beperkt. Voor de keuze van geschikte testconcentraties kan onder meer gebruik worden gemaakt van informatie over de identiteit, chemische structuur en fysisch-chemische eigenschappen van de teststof; de resultaten van eventuele in vitro of in vivo uitgevoerde toxiciteitstests; de voorgenomen toepassing(en) en de potentiële blootstelling van de mens; de beschikbare (Q)SAR-gegevens en toxicologische gegevens over chemische stoffen met een verwante structuur; en aan tests op acute inhalatietoxiciteit ontleende gegevens. In het geval van verwachte of in de loop van het onderzoek waargenomen neurotoxiciteit, kan de onderzoeksleider ervoor kiezen om geschikte evaluaties op te nemen, zoals een „functional observational battery” (FOB) en meting van de motorische activiteit. Hoewel de timing van de blootstellingen ten opzichte van specifiek onderzoek een kritieke factor kan vormen, mogen deze nieuwe activiteiten niet interfereren met de basisopzet van het onderzoek.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Verdunningen van bijtende of irriterende teststoffen kunnen worden getest bij concentraties die de gewenste mate van toxiciteit opleveren (zie GD 39 (2)). Bij blootstelling van dieren aan deze materialen, moeten de doelconcentraties laag genoeg zijn om geen hevige pijn en angst te veroorzaken, maar wel toereikend zijn om de concentratie/responscurve uit te breiden tot niveaus die stroken met de wetenschappelijke en regelgevingsdoelstellingen van de test. Deze concentraties moeten per geval worden gekozen, bij voorkeur op basis van een adequaat opgezet bereikbepalingonderzoek dat informatie oplevert over het kritische eindpunt, eventuele irritatiedrempelwaarden en het moment van optreden (zie de punten 11 tot en met 13). De keuze voor een bepaalde concentratie moet worden gemotiveerd.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Stervende dieren of dieren die duidelijk pijn hebben of tekenen van hevige en voortdurende angst vertonen, moeten op humane wijze worden gedood. Stervende dieren worden op dezelfde wijze beschouwd als dieren die tijdens de test sterven. De OESO-leidraad inzake humane eindpunten (3) bevat criteria om te bepalen of stervende of hevig lijdende dieren moeten worden gedood en richtsnoeren om voorspelbare of ophanden zijnde sterfte te herkennen.
                           
                        BESCHRIJVING VAN DE METHODE
                  
                     Keuze van de diersoort
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Er worden gezonde jonge volwassen knaagdieren van gangbare laboratoriumstammen gebruikt. Er wordt de voorkeur gegeven aan ratten. Als een andere soort wordt gebruikt, moet dit worden gemotiveerd.
                           
                        
                     Voorbereiding van de dieren
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig zijn. Op de dag waarop zij willekeurig worden ingedeeld, moeten de jonge volwassen dieren zeven tot negen weken oud zijn en een lichaamsgewicht hebben dat niet meer dan 20 % afwijkt van het gemiddelde gewicht voor elk geslacht. De dieren worden willekeurig gekozen, gemerkt om elk dier afzonderlijk te kunnen identificeren en vóór het begin van de test gedurende minimaal vijf dagen in hun kooi gehouden om ze aan de omstandigheden in het laboratorium te laten wennen.
                           
                        
                     Dierhouderij
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              De dieren moeten individueel worden onderscheiden, indien mogelijk met behulp van onderhuidse transponders, om de waarnemingen te vergemakkelijken en verwarring te voorkomen. De temperatuur van de ruimte waar de proefdieren verblijven, moet 22 ± 3 °C zijn. De relatieve vochtigheid wordt idealiter tussen 30 en 70 % gehouden, maar wanneer water als medium wordt gebruikt, zal dit niet altijd mogelijk zijn. Voor en na de blootstelling worden de dieren over het algemeen groepsgewijs in kooien ondergebracht, waarbij zij naar geslacht en concentratie worden gescheiden; het aantal dieren per kooi mag echter niet zo groot zijn dat een duidelijke observatie van elk dier wordt gestoord en moet zodanig worden gekozen dat er zo min mogelijk dieren verloren gaan als gevolg van kannibalisme en gevechten. Wanneer de dieren uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan acclimatisatie voor de fixeerbuizen noodzakelijk zijn. De fixeerbuizen mogen geen onnodige lichamelijke, thermische of immobilisatiestress voor de dieren opleveren. De immobilisatie kan van invloed zijn op fysiologische eindpunten zoals de lichaamstemperatuur (hyperthermie) en/of het ademminuutvolume. Als er generieke gegevens beschikbaar zijn waaruit blijkt dat geen significante veranderingen als gevolg van de immobilisatie optreden, is geen voorafgaande gewenning aan de fixeerbuizen noodzakelijk. Dieren die met hun hele lijf aan een aerosol worden blootgesteld, worden tijdens de blootstelling individueel gehuisvest om te voorkomen dat zij het testaerosol filteren door de vacht van hun kooigenoten. Er kan gebruik worden gemaakt van gebruikelijk en gecertificeerd laboratoriumvoeder, behalve tijdens de blootstelling, met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater uit de waterleiding. Er wordt kunstlicht gebruikt met een cyclus van 12 uur licht/12 uur donker.
                           
                        
                     Inhalatiekamers
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Bij de keuze van de inhalatiekamer wordt rekening gehouden met de aard van de teststof en het doel van de test. Blootstelling via de neus alleen heeft de voorkeur (hieronder vallen blootstelling via de kop alleen, blootstelling via de neus alleen en blootstelling via de snuit alleen). Blootstelling via de neus alleen heeft over het algemeen de voorkeur voor studies van vloeibare of vaste aerosolen en voor dampen die kunnen condenseren tot aerosolen. Speciale doelstellingen van de studie kunnen beter worden verwezenlijkt door blootstelling van het hele lijf, maar dit moet in het studieverslag worden gemotiveerd. Om bij gebruik van een kamer voor het hele lijf te zorgen voor een stabiele atmosfeer, mag het totale „volume” van de testdieren niet meer dan 5 % van het volume van de kamer innemen. De technische principes voor blootstelling via de neus alleen en blootstelling van het hele lijf, alsook de specifieke voor- en nadelen ervan, zijn uiteengezet in GD 39 (2).
                           
                        TOXICITEITSONDERZOEK
                  
                     Limietconcentraties
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Anders dan bij acuut onderzoek zijn er bij onderzoek van 28 dagen naar subacute inhalatietoxiciteit geen vastgestelde limietconcentraties. Bij het vaststellen van de maximale geteste concentratie moet rekening worden gehouden met: 1) de maximaal haalbare concentratie, 2) het niveau waaraan mensen in het ongunstigste geval zouden worden blootgesteld („worst case”), 3) de noodzaak een toereikende zuurstoftoevoer in stand te houden, en/of 4) overwegingen met het oog op dierenwelzijn. Indien geen op reële gegevens gebaseerde grenswaarden beschikbaar zijn, kunnen de limietwaarden voor acute-toxiciteitsonderzoek van Verordening (EG) nr. 1272/2008 (13) worden gebruikt (d.w.z. tot een maximale concentratie van 5 mg/l voor aerosolen, 20 mg/l voor dampen en 20 000 ppm voor gassen); zie GD 39 (2). Als het nodig is deze limietwaarden te overschrijden voor het testen van gassen of zeer vluchtige teststoffen (bv. koelmiddelen), moet dit worden gemotiveerd. De limietconcentratie moet tot onmiskenbare toxiciteit leiden zonder onnodige stress bij de dieren te veroorzaken of hun levensduur te beïnvloeden (3).
                           
                        
                     Bereikbepalingonderzoek
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Alvorens te beginnen met het hoofdonderzoek, kan het nodig zijn een bereikbepalingonderzoek uit te voeren. Een bereikbepalingonderzoek is uitgebreider dan een verkennende test, omdat het zicht niet beperkt tot de keuze van de concentratie. De tijdens een bereikbepalingonderzoek opgedane kennis kan ervoor helpen zorgen dat het hoofdonderzoek succesvol verloopt. Een bereikbepalingonderzoek kan bijvoorbeeld technische informatie opleveren met betrekking tot analysemethoden, deeltjesgroottebepaling, het herkennen van toxische mechanismen, klinisch-pathologische en histopathologische gegevens, en schattingen van mogelijke NOAEL- en MTC-concentraties in het hoofdonderzoek. De onderzoeksleider kan ervoor kiezen het bereikbepalingonderzoek te gebruiken om de drempelwaarde voor irritatie van de luchtwegen (bv. door middel van histopathologisch onderzoek van de luchtwegen, het testen van de longfunctie, of bronchoalveolaire lavage), de hoogste concentratie die zonder onnodige stress door de dieren wordt verdragen en de parameters waarmee de toxiciteit van een teststof het best kan worden gekarakteriseerd, te bepalen.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Een bereikbepalingonderzoek kan één of meer concentratieniveaus omvatten. Bij elk concentratieniveau worden ten hoogste drie mannetjes en drie vrouwtjes blootgesteld. Een bereikbepalingonderzoek duurt ten minste vijf dagen en doorgaans niet langer dan veertien dagen. In het testverslag moet de keuze van de concentraties voor het hoofdonderzoek worden gemotiveerd. Het hoofdonderzoek heeft tot doel een verband tussen concentratie en respons aan te tonen op basis van wat naar verwachting het gevoeligste eindpunt zal zijn. De lage concentratie is bij voorkeur de concentratie waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld („no-observed adverse effect”), de hoge concentratie moet tot onmiskenbare toxiciteit leiden zonder onnodige stress bij de dieren te veroorzaken of hun levensduur te beïnvloeden (3).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Bij het kiezen van de concentratieniveaus voor het bereikbepalingonderzoek moet met alle beschikbare informatie rekening worden gehouden, met inbegrip van structuur-activiteitrelaties en gegevens over vergelijkbare stoffen (zie punt 3). Een bereikbepalingonderzoek kan de vanuit mechanistisch oogpunt als meest gevoelig beschouwde eindpunten bevestigen of weerleggen, bv. cholinesteraseremming door organofosfaten, vorming van methemoglobine door voor erytrocyten toxische stoffen, schildklierhormonen (T3, T4) voor thyreotoxische stoffen, eiwit, LDH, of neutrofielen in bronchoalveolaire lavage voor onschadelijke, slecht oplosbare deeltjes of longirritatie veroorzakende aerosolen.
                           
                        
                     Hoofdonderzoek
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Het hoofdonderzoek naar subacute toxiciteit omvat doorgaans drie concentratieniveaus en, waar nodig, parallelle negatieve controles (luchtcontroles) en/of mediumcontroles (zie punt 17). Voor de keuze van geschikte blootstellingsniveaus moet gebruik worden gemaakt van alle beschikbare gegevens, met inbegrip van de resultaten van onderzoek naar systemische toxiciteit, metabolisme en kinetiek (er moet speciaal op worden gelet dat hoge concentratieniveaus waardoor kinetische processen worden verzadigd, worden vermeden). Elke testgroep bestaat uit ten minste tien knaagdieren (vijf mannetjes en vijf vrouwtjes) die over een periode van vier weken gedurende vijf dagen per week telkens zes uur per dag aan de teststof worden blootgesteld (de totale duur van het onderzoek is 28 dagen). De dieren mogen ook zeven dagen per week worden blootgesteld (bv. bij het testen van geneesmiddelen die worden geïnhaleerd). Indien bekend is dat een van beide geslachten gevoeliger is voor een bepaalde teststof, kunnen beide geslachten bij verschillende concentratieniveaus worden blootgesteld om het verband tussen concentratie en respons nauwkeuriger te kunnen bepalen, zoals beschreven in punt 15. Als andere knaagdiersoorten dan ratten uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan de maximale blootstellingsduur worden aangepast om soortspecifieke symptomen van angst te minimaliseren. Indien een blootstellingsduur van minder dan 6 uur/dag wordt gebruikt, of er onderzoek naar blootstelling van het hele lijf met een lange tijdsduur (bv. 22 uur/dag) moet worden verricht, moet dit worden gemotiveerd (zie GD 39 (2)). Tijdens de blootstellingsperiode krijgen de dieren geen voeder, tenzij de blootstelling langer duurt dan 6 uur. Tijdens een blootstelling van het hele lijf kan de dieren water worden gegeven.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              De gekozen doelconcentraties moeten het mogelijk maken de doelorganen te identificeren en een duidelijk verband tussen concentratie en respons aan te tonen:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          het hoge concentratieniveau moet toxische effecten veroorzaken, maar niet tot aanhoudende verschijnselen of sterfte leiden die een deugdelijke evaluatie belemmeren;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het (de) tussenliggende concentratieniveau(s) moet(en) zodanig zijn verdeeld dat een gradatie in toxische effecten tussen de lage en hoge concentratie wordt verkregen;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het lage concentratieniveau moet weinig of geen tekenen van toxiciteit opleveren.
                                       
                                    
                        
                     Satellietonderzoek (reversibiliteitsonderzoek)
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Een satellietonderzoek (reversibiliteitsonderzoek) kan worden gebruikt voor observatie van reversibiliteit, persistentie of vertraagd tot uiting komen van toxiciteit gedurende een geschikte periode van ten minste 14 dagen na de behandeling. Satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen) bestaan uit vijf mannetjes en vijf vrouwtjes die gelijktijdig met de proefdieren in het hoofdonderzoek worden blootgesteld. Satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen) moeten bij het hoogste concentratieniveau aan de teststof worden blootgesteld en waar nodig moeten er parallelle luchtcontroles en/of mediumcontroles zijn (zie punt 17).
                           
                        
                     Controledieren
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              De dieren voor de parallelle negatieve controle (luchtcontrole) worden op identieke wijze behandeld als de dieren in de testgroepen, behalve dat zij worden blootgesteld aan gefilterde lucht in plaats van aan de teststof. Wanneer voor het verkrijgen van de testatmosfeer water of een andere stof wordt gebruikt, moet in plaats van een negatieve controlegroep (luchtcontrolegroep) een mediumcontrolegroep in het onderzoek worden opgenomen. Waar mogelijk moet water worden gebruikt als het medium. Wanneer water wordt gebruikt als het medium moeten de controledieren worden blootgesteld aan lucht met dezelfde relatieve luchtvochtigheid als voor de blootgestelde groepen wordt gebruikt. De keuze van een geschikt medium vindt plaats op basis van een correct uitgevoerde voorstudie of van historische gegevens. Als de toxiciteit van een medium niet goed bekend is, kan de onderzoeksleider ervoor kiezen zowel een negatieve controle (luchcontrole) als een mediumcontrole te gebruiken, maar dit wordt sterk afgeraden. Indien uit historische gegevens blijkt dat een medium niet toxisch is, is een negatieve controlegroep (luchtcontrolegroep) niet nodig, en wordt alleen een mediumcontrole gebruikt. Indien een voorstudie van een in een medium bereide teststof uitwijst dat er geen toxiciteit optreedt, volgt hieruit dat het medium bij de geteste concentratie niet toxisch is en dat deze mediumcontrole moet worden gebruikt.
                           
                        BLOOTSTELLINGSOMSTANDIGHEDEN
                  
                     Toediening van concentraties
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              De dieren worden aan de teststof blootgesteld in de vorm van gas, damp, aerosol of een mengsel daarvan. De te testen fysische toestand hangt af van de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof, de gekozen concentratie en/of de meest waarschijnlijke fysische vorm waarin de teststof bij hantering en gebruik aanwezig is. Hygroscopische en chemisch reactieve teststoffen moeten worden getest in drogeluchtomstandigheden. Er dient op te worden gelet dat er geen explosieve concentraties optreden. Deeltjesmateriaal kan aan mechanische processen worden onderworpen om een kleinere deeltjesgrootte te verkrijgen. Nadere richtsnoeren zijn opgenomen in GD 39 (2).
                           
                        
                     Deeltjesgrootteverdeling
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Voor alle aerosolen en voor dampen die tot aerosolen kunnen condenseren, wordt de deeltjesgrootte bepaald. Om blootstelling van alle relevante delen van de ademhalingswegen mogelijk te maken, worden aerosolen met een massamediaan van de aerodynamische diameter (MMAD) tussen 1 en 3 μm en een geometrische standaardafwijking (σg) tussen 1,5 en 3,0 aanbevolen (4). Hoewel redelijkerwijs moet worden getracht deze normwaarden te halen, wordt het oordeel van een deskundige gegeven als dit niet mogelijk blijkt. Metaaldampdeeltjes kunnen bijvoorbeeld kleiner zijn dan deze normwaarde, en geladen deeltjes en vezels juist groter.
                           
                        
                     Bereiding van de teststof in een medium
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              In het ideale geval wordt de teststof zonder medium getest. Indien het noodzakelijk is een medium te gebruiken om een geschikte deeltjesgrootte en concentratie van de teststof te verkrijgen, wordt de voorkeur gegeven aan water. Wanneer een teststof wordt opgelost in een medium, moet de stabiliteit ervan worden aangetoond.
                           
                        CONTROLE VAN DE BLOOTSTELLINGSOMSTANDIGHEDEN
                  
                     Luchtdoorstroming in de kamer
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Tijdens elke blootstelling wordt de luchtdoorstroming in de blootstellingskamer zorgvuldig geregeld, voortdurend gecontroleerd en ten minste elk uur geregistreerd. De realtimecontrole van de concentratie (of stabiliteit in de tijd) van de testatmosfeer is een integrale meting van alle dynamische parameters waarbij indirect alle relevante dynamische parameters voor het verkrijgen van de atmosfeer kunnen worden geregeld. Indien de concentratie realtime wordt gecontroleerd, kan de frequentie waarmee de luchtdoorstroming wordt gemeten, worden teruggebracht tot één meting per blootstelling per dag. Wanneer kamers voor blootstelling via de neus alleen worden gebruikt, moet er in het bijzonder op worden gelet dat de uitgeademde lucht niet opnieuw wordt ingeademd. Het zuurstofgehalte moet ten minste 19 % bedragen en het kooldioxidegehalte niet meer dan 1 %. Als er redenen zijn om aan te nemen dat deze normwaarde niet kan worden gehaald, moet de zuurstof- en kooldioxideconcentratie worden gemeten. Wanneer uit de metingen op de eerste blootstellingsdag blijkt dat de waarden voor deze gassen op het juiste niveau liggen, zijn geen verdere metingen nodig.
                           
                        
                     Temperatuur en relatieve vochtigheid in de kamer
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              De temperatuur in de kamer moet op 22 ± 3 °C worden gehouden. Voor zover mogelijk wordt, zowel bij blootstelling via de neus alleen als bij blootstelling van het hele lijf, tijdens elke blootstelling de relatieve vochtigheid in het ademhalingsgebied van de dieren doorlopend gecontroleerd en ten minste elk uur geregistreerd. De relatieve vochtigheid wordt bij voorkeur tussen 30 en 70 % gehouden, al zal dit niet altijd haalbaar (bv. wanneer mengsels op waterbasis worden getest) of meetbaar zijn vanwege interferentie tussen de teststof en de testmethode.
                           
                        
                     Teststof: nominale concentratie
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Waar mogelijk wordt de nominale concentratie in de blootstellingskamer berekend en geregistreerd. De nominale concentratie is de massa van de gegenereerde teststof gedeeld door het totale luchtvolume dat door het inhalatiekamersysteem wordt geleid. De nominale concentratie wordt niet gebruikt om de blootstelling van de dieren te karakteriseren, maar een vergelijking tussen de nominale concentratie en de feitelijke concentratie vormt een aanwijzing voor het rendement van het testsysteem en kan bijgevolg worden gebruikt om problemen bij het genereren te ontdekken.
                           
                        
                     Teststof: feitelijke concentratie
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              De feitelijke concentratie is de concentratie van de teststof zoals bemonsterd in het ademhalingsgebied van de dieren in een inhalatiekamer. De feitelijke concentraties kunnen worden verkregen door toepassing van specifieke methoden (bv. rechtstreekse bemonstering of op adsorptie of een chemische reactie gebaseerde methoden, gevolgd door analytische karakterisering) of niet-specifieke methoden, zoals gravimetrische filteranalyse. Gravimetrische analysen zijn alleen aanvaardbaar voor aerosolen van poeders met één component of aerosolen van vloeistoffen met een geringe vluchtigheid en moeten worden ondersteund met passende specifieke karakteriseringen van de teststof voorafgaand aan de studie. De concentratie van aerosolen van poeders met meerdere componenten kan ook door middel van gravimetrische analyse worden bepaald. In dat geval zijn echter analytische gegevens vereist die aantonen dat de samenstelling van het materiaal in de lucht vergelijkbaar is met die van het uitgangsmateriaal. Als deze informatie niet beschikbaar is, kan het nodig zijn in de loop van de studie op gezette tijden een nieuwe analyse van de teststof (idealiter in de toestand in de lucht) uit te voeren. Voor geaerosoliseerde stoffen die kunnen verdampen of sublimeren, moet worden aangetoond dat met de gekozen methoden alle fasen zijn verzameld.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Er wordt zo mogelijk één partij van de teststof gebruikt gedurende het onderzoek, en het testmonster wordt bewaard onder omstandigheden waarbij de zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit behouden blijven. Voor aanvang van de studie worden de teststof, met inbegrip van de zuiverheid, en indien technisch mogelijk de identiteit en de hoeveelheden van vastgestelde verontreinigingen en onzuiverheden gekarakteriseerd. Dit kan onder meer met de volgende gegevens worden aangetoond: retentietijd en relatief piekoppervlak, moleculair gewicht op basis van massaspectroscopie of gaschromatografie, of andere schattingen. Hoewel het testlaboratorium niet verantwoordelijk is voor de identiteit van het testmonster, kan het raadzaam zijn dat het testlaboratorium de karakterisering van de opdrachtgever ten minste in beperkte mate bevestigt (bv. kleur, fysische aard enz.).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              De blootstellingsatmosfeer wordt zo constant mogelijk gehouden. Een voorziening voor realtimecontrole, zoals een aerosol-fotometer voor aerosolen, of een totaal-koolwaterstofanalysator voor dampen, kunnen worden gebruikt om de stabiliteit van de blootstellingsvoorwaarden aan te tonen. De feitelijke concentratie in de kamer moet gedurende elke blootstellingsdag voor elk blootstellingsniveau ten minste 3 keer worden gemeten. Als dit vanwege de beperkte luchtdoorstroming of lage concentraties niet mogelijk is, is één monster per blootstellingsperiode aanvaardbaar. In het ideale geval wordt dit monster in dat geval gedurende de volledige blootstellingsperiode verzameld. Het verschil tussen individuele monsters van de kamerconcentratie en de gemiddelde kamerconcentratie mag bij gassen en dampen niet meer dan ± 10 % en bij vloeibare of vaste aerosolen niet meer dan ± 20 % bedragen. De equilibratietijd van de kamer (t95) wordt berekend en gerapporteerd. De blootstellingsduur omvat de tijd waarin de teststof wordt gegenereerd. Hierbij wordt rekening gehouden met de equilibratietijd van de kamer (t95) en de vervaltijd. In GD 39 (2) zijn richtsnoeren voor het schatten van t95 opgenomen.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Voor zeer complexe mengsels bestaande uit dampen/gassen en aerosolen (bv. verbrandingsatmosferen en teststoffen die zijn ontleend aan doelgerichte eindproducten of apparaten), kan elke fase zich in een inhalatiekamer verschillend gedragen. Daarom moet van elke fase (damp/gas en aerosol) ten minste één indicatorstof (analyt) worden gekozen, normaliter de voornaamste werkzame stof in het mengsel. Wanneer de teststof een mengsel is, wordt de analytische concentratie vermeld voor het totale mengsel, en niet slechts voor het werkzame bestanddeel of de indicatorstof (analyt). Aanvullende informatie over feitelijke concentraties is opgenomen in GD 39 (2).
                           
                        
                     Teststof: deeltjesgrootteverdeling
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              De deeltjesgrootteverdeling van aerosolen wordt voor ieder concentratieniveau ten minste wekelijks bepaald met behulp van een cascade-impactor of een alternatief instrument, zoals een aerodynamische deeltjesgroottemeter. Indien kan worden aangetoond dat de met een cascade-impactor en het alternatieve instrument verkregen resultaten gelijkwaardig zijn, mag het alternatieve instrument gedurende de hele studie worden gebruikt.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Parallel aan het primaire instrument wordt een tweede instrument, zoals een gravimetrisch filter of een impinger/gas bubbler gebruikt om de doeltreffendheid van de verzameling met het primaire instrument te bevestigen. De door middel van deeltjesgrootteanalyse en filteranalyse verkregen massaconcentraties moeten in redelijke mate overeenkomen (zie GD 39 (2)). Indien in een vroeg stadium van de studie de gelijkwaardigheid bij alle geteste concentraties kan worden aangetoond, zijn verdere bevestigende metingen niet nodig. Met het oog op het dierenwelzijn moeten maatregelen worden genomen om zo veel mogelijk te voorkomen dat niet-overtuigende gegevens worden verkregen waardoor herhaling van het onderzoek noodzakelijk is.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Voor dampen wordt de deeltjesgrootte bepaald indien de mogelijkheid bestaat dat de dampen condenseren waardoor aerosolvorming optreedt of indien in een dampatmosfeer deeltjes worden gedetecteerd waarbij gemengde fasen kunnen optreden.
                           
                        WAARNEMINGEN
                  
                              31.
                           
                           
                              De dieren worden voor, tijdens en na de blootstellingsperiode klinisch geobserveerd. Afhankelijk van de reactie van de dieren tijdens de blootstelling kunnen frequentere observaties nodig zijn. Indien het observeren van de dieren wordt belemmerd door het gebruik van fixeerbuizen, slecht verlichte kamers voor het hele lijf, of ondoorzichtige atmosferen, moeten de dieren zorgvuldig worden geobserveerd na afloop van de blootstelling. Door de volgende dag vóór de blootstelling te observeren kan eventuele reversibiliteit of verergering van toxische effecten worden beoordeeld.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Alle observaties worden geregistreerd en van elk dier wordt een apart overzicht bijgehouden. Wanneer dieren om redenen van dierenwelzijn worden gedood of dood worden aangetroffen, wordt zo nauwkeurig mogelijk geregistreerd op welk tijdstip ze zijn gestorven.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Bij externe observaties van de dieren in de kooien wordt gekeken naar veranderingen in de huid en de vacht, de ogen en de slijmvliezen, de ademhalingsorganen, de bloedsomloop, het zenuwstelsel, de somatomotorische activiteit en gedragspatronen. Er moet worden gelet op de observatie van tremors, convulsies, speekselafscheiding, diarree, lethargie, slaap en coma. Een meting van de rectale temperatuur kan ondersteunende gegevens opleveren voor met de behandeling of opsluiting verband houdende reflectoire bradypneu of hypo-/hyperthermie. In het onderzoeksprotocol kunnen aanvullende beoordelingen worden opgenomen, zoals kinetiek, biomonitoring, longfunctie, retentie van slecht oplosbare stoffen die zich in longweefsel ophopen, en gedragsveranderingen.
                           
                        LICHAAMSGEWICHT
                  
                              34.
                           
                           
                              Het gewicht van elk dier wordt kort voor de eerste blootstelling geregistreerd, op dag 0 en vervolgens twee keer per week (bijvoorbeeld op vrijdag en maandag, om het herstel gedurende een weekend zonder blootstelling aan te tonen, of volgens een tijdsinterval om de systemische toxiciteit te kunnen beoordelen), alsook op het moment waarop het dier sterft of wordt geëuthanaseerd. Indien er gedurende de eerste twee weken geen effecten optreden, kan het lichaamsgewicht van de dieren gedurende het vervolg van de studie wekelijks worden gemeten. Indien satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen) worden gebruikt, moeten de dieren in deze groepen ook gedurende de hele herstelperiode wekelijks worden gewogen. Bij de beëindiging van het onderzoek moeten alle dieren kort voordat zij worden gedood, worden gewogen om een onvertekende berekening van de verhouding tussen orgaangewichten en lichaamsgewicht mogelijk te maken.
                           
                        VOEDSEL- EN WATERVERBRUIK
                  
                              35.
                           
                           
                              Het voedselverbruik wordt wekelijks gemeten. Het waterverbruik kan ook worden gemeten.
                           
                        KLINISCHE PATHOLOGIE
                  
                              36.
                           
                           
                              Voor alle dieren, met inbegrip van de dieren in de controlegroepen en satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen), worden klinisch-pathologische beoordelingen uitgevoerd wanneer zij worden gedood. Het tijdsinterval tussen het einde van de blootstelling en de aftapping van het bloed moet worden geregistreerd, met name wanneer het desbetreffende eindpunt snel naar de uitgangswaarde terugkeert. Voor parameters met een korte plasmahalfwaardetijd (bv. COHb, CHE, en MetHb) is het wenselijk om na het einde van de blootstelling monsters te nemen.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Tabel 1 bevat een lijst van de klinisch-pathologische parameters die doorgaans voor elk toxicologisch onderzoek vereist zijn. Urineonderzoek hoeft niet routinematig te worden uitgevoerd, maar kan worden verricht wanneer dit op grond van de verwachte of waargenomen toxiciteit nuttig wordt geacht. De onderzoeksleider kan ervoor kiezen aanvullende parameters te beoordelen om de toxiciteit van een teststof beter te kunnen karakteriseren (bijv. cholinesterase, lipiden, hormonen, zuur/base-evenwicht, methemoglobine of Heinz-lichaampjes, creatinekinase, verhouding myeloïde/erytroïde cellen, troponines, arteriële bloedgassen, lactaatdehydrogenase, sorbitoldehydrogenase, glutamaatdehydrogenase, en gamma- glutamyltranspeptidase).
                              
                                 Tabel 1
                              
                              
                                 Klinisch-pathologische standaardparameters
                              
                              
                                          Hematologisch
                                       
                                    
                                          Telling van de erytrocyten
                                          Hematocriet
                                          Hemoglobinegehalte
                                          Hemoglobinegehalte per erytrocyt
                                          Gemiddeld volume van de erytrocyten
                                          Hemoglobinegehalte per volume-eenheid erytrocyten
                                          Reticulocyten
                                       
                                       
                                          Totale telling van de leukocyten
                                          Gedifferentieerde telling van de leukocyten
                                          Telling van de bloedplaatjes
                                          Stollingsvermogen (een van de mogelijkheden kiezen):
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Prothrombinetijd
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Stollingstijd
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Partiële thromboplastinetijd
                                                   
                                                
                                    
                                          Klinisch-chemisch
                                       
                                    
                                          Glucose (8)
                                          
                                          Totaal cholesterol
                                          Triglyceriden
                                          Bloedureumstikstof
                                          Totaal bilirubine
                                          Creatinine
                                          Totaal eiwit
                                          Albumine
                                          Globuline
                                       
                                       
                                          Alanineaminotransferase
                                          Aspartaataminotransferase
                                          Alkalische
                                          fosfatase
                                          Kalium
                                          Natrium
                                          Calcium
                                          Fosfor
                                          Chloride
                                       
                                    
                                          Urineonderzoek (facultatief)
                                       
                                    
                                          Voorkomen (kleur en troebelheid)
                                          Volume
                                          Soortelijk gewicht of osmolaliteit
                                          pH
                                       
                                       
                                          Totaal eiwit
                                          Glucose
                                          Bloed/bloedcellen
                                       
                                    
                        
                              38.
                           
                           
                              Wanneer er aanwijzingen zijn dat afzetting en retentie primair in de onderste luchtwegen (d.w.z. de alveolen) plaatsvindt, kan bronchoalveolaire lavage de aangewezen techniek zijn voor kwantitatieve analyse van op hypothesen gebaseerde dosis-effectparameters, waarbij de nadruk ligt op alveolitis, longontsteking en fosfolipidose. Op deze manier kunnen veranderingen in de dosis-responsverhouding en het verloop in de tijd van alveolair letsel adequaat worden onderzocht. De bronchoalveolaire lavagevloeistof kan worden geanalyseerd met betrekking tot de totale en gedifferentieerde tellingen van de leukocyten, totaal eiwit, en lactaatdehydrogenase. Ook parameters die wijzen op lysosomale beschadigingen, fosfolipidose, fibrose en door irritatie of allergie veroorzaakte ontstekingen, kunnen worden overwogen; het kan hierbij onder meer gaan om de bepaling van pro-inflammatoire cytokinen/chemokinen. Bronchoalveolaire lavagemetingen vormen doorgaans een aanvulling op de resultaten van histopathologisch onderzoek, maar kunnen deze niet vervangen. In GD 39 (2) zijn richtsnoeren voor het uitvoeren van longlavage opgenomen.
                           
                        MACROPATHOLOGIE EN ORGAANGEWICHTEN
                  
                              39.
                           
                           
                              Op alle proefdieren, met inbegrip van de dieren die tijdens de test sterven of met het oog op het dierenwelzijn uit het onderzoek worden genomen, wordt macroscopische obductie uitgevoerd, indien mogelijk na volledig uitbloeden. Voor ieder dier moet worden geregistreerd hoeveel tijd er is verstreken tussen het einde van hun laatste blootstelling en het moment waarop zij zijn gedood. Als het niet mogelijk is onmiddellijk nadat een dood dier is aangetroffen een obductie te verrichten, wordt het dier gekoeld (niet bevroren) bij een temperatuur die laag genoeg is om de autolyse tot een minimum te beperken. De obductie wordt zo spoedig mogelijk verricht, normaliter binnen één of twee dagen. Alle met het blote oog waarneembare pathologische veranderingen worden voor elk dier geregistreerd, met bijzondere aandacht voor veranderingen in de luchtwegen.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Tabel 2 bevat een lijst van de organen en weefsels die tijdens de macroscopische obductie in een geschikt medium moeten worden bewaard voor histopathologisch onderzoek. Het is aan de onderzoeksleider om te beoordelen of de organen en weefsels tussen [vierkante haken] en alle andere organen en weefsels worden bewaard. De vet weergegeven organen moeten zo spoedig mogelijk na de sectie worden ontdaan van aanhechtend weefsel en nat worden gewogen om uitdroging te voorkomen. De schildklier en epididymides moeten alleen worden gewogen indien dit nodig is, omdat bij het ontdoen van aanhechtend weefsel artefacten kunnen ontstaan die het histopathologische onderzoek kunnen belemmeren. Weefsels en organen moeten worden gefixeerd in 10 % gebufferde formaldehyde of een ander geschikt fixeermiddel zodra de obductie is verricht, en ten minste 24 tot 48 uur vóór het ontdoen van aanhangend weefsel, afhankelijk van het gebruikte fixeermiddel.
                              
                                 Tabel 2
                              
                              
                                 Tijdens de macroscopische obductie bewaarde organen en weefsels
                              
                              
                                 Bijnieren
                              
                              Beenmerg (en/of vers aspiraat)
                              
                                 Hersenen (inclusief delen van cerebrum, cerebellum en medulla/pons)
                              [Ogen (netvlies, oogzenuw) en oogleden]
                              
                                 Hart
                              
                              
                                 Nieren
                              
                              Larynx (3 niveaus, 1 niveau moet de steel van de epiglottis bevatten)
                              
                                 Lever
                              
                              
                                 Long (alle lobben op één niveau, inclusief de hoofdbronchiën)
                              Lymfeklieren van de longhilus, met name bij slecht oplosbare teststoffen in deeltjesvorm. Voor grondiger onderzoek en/of studies met een immunologische focus kunnen aanvullende lymfeklieren worden overwogen, bv. uit de mediastinale, cervicale/submandibulaire en/of auriculaire streek.
                              Weefsels van de nasofarynx (ten minste 4 niveaus; 1 niveau moet het nasofaryngaal kanaal en het nasofarynx-geassocieerd lymfatisch weefsel (nasal associated lymphoid tissue, NALT) omvatten.
                              Slokdarm
                              [Reukkolf]
                              Ovaria
                              Zaadblaasjes
                              Ruggenmerg (cervicaal, middenthoracaal en lumbaal)
                              
                                 Milt
                              
                              Maag
                              
                                 Testes
                              
                              
                                 Thymus
                              
                              Schildklier
                              Luchtpijp (ten minste 2 niveaus, inclusief 1 lengtecoupe door de carina en 1 dwarscoupe)
                              [Urineblaas]
                              Uterus
                              Elk macroscopisch waarneembaar letsel
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              De longen worden in hun geheel verwijderd, gewogen en ingedruppeld met een geschikt fixeermiddel bij 20-30 cm waterdruk om ervoor te zorgen dat de longstructuur intact blijft (5). De coupes worden voor alle lobben op één niveau, inclusief de hoofdbronchiën, gemaakt, maar als longlavage wordt uitgevoerd, worden van de niet gespoelde lob op drie niveaus coupes gemaakt (geen seriële coupes).
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Ten minste 4 niveaus van de weefsels van de nasofarynx worden onderzocht, waarvan er één het nasofaryngaal kanaal moet omvatten (5)(6)(7)(8)(9), om adequaat onderzoek mogelijk te maken van het plaveiselcelepitheel, overgangsepitheel (respiratoir zonder trilharen), ademhalingsepitheel (respiratoir met trilharen) en reukepitheel, alsmede het drainerend lymfatisch weefsel (NALT; (10)(11)). Er worden drie niveaus van de larynx onderzocht; een van deze niveaus moet de steel van de epiglottis omvatten (12). Er worden ten minste twee niveaus van de luchtpijp onderzocht, inclusief één lengtecoupe door de carina van de splitsing van de extrapulmonale bronchiën, en één dwarscoupe.
                           
                        HISTOPATHOLOGIE
                  
                              43.
                           
                           
                              Alle in tabel 2 genoemde organen en weefsels wordt histopathologisch onderzocht bij de controle- en hogeconcentratiegroepen, en bij alle dieren die tijdens het onderzoek sterven of worden gedood. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de luchtwegen, doelorganen, en macroscopisch waarneembaar letsel. De organen en weefsels die in de hogeconcentratiegroep letsel vertonen, worden bij alle groepen onderzocht. De onderzoeksleider kan ervoor kiezen bij meer groepen histopathologisch onderzoek te verrichten, om een duidelijk verband tussen concentratie en respons aan te tonen. Indien van een satellietgroep (reversibiliteitsgroep) gebruik wordt gemaakt, dan wordt histopathologisch onderzoek verricht op alle weefsels en organen waar bij de behandelde groepen effecten blijken te zijn opgetreden. Indien er bij de hogeblootstellingsgroep buitensporig veel vroegtijdige sterfte of andere problemen optreden die afbreuk doen aan de significantie van de gegevens, wordt de groep die bij de op één na hoogste concentratie is blootgesteld, histopathologisch onderzocht. Getracht moet worden om de macroscopische waarnemingen te correleren aan microscopische bevindingen.
                           
                        GEGEVENS EN RAPPORTAGE
                  
                     Gegevens
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Voor elk dier apart worden gegevens over lichaamsgewicht, voedselverbruik, klinische pathologie, orgaangewichten en histopathologie vermeld. Daarnaast worden de gegevens van de klinische observatie in tabelvorm samengevat met voor alle testgroepen vermelding van het gebruikte aantal dieren, het aantal dieren dat specifieke toxiciteitsverschijnselen vertoonde, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of om redenen van dierenwelzijn is gedood, het tijdstip waarop elk dier is gestorven, een beschrijving van de toxische effecten met het verloop en de omkeerbaarheid en de obductiebevindingen. Alle resultaten, zowel numerieke als incidenteel, moeten met behulp van een geschikte statistische methode worden geëvalueerd. Iedere algemeen aanvaarde statistische methode mag worden gebruikt; de statistische methoden worden bij de opzet van het onderzoek gekozen.
                           
                        
                     Testverslag
                  
                  
                              45.
                           
                           
                              In het testverslag wordt indien van toepassing de volgende informatie opgenomen:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Proefdieren en dierhouderij:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      beschrijving van de omstandigheden van de kooi, met inbegrip van: aantal (of verandering in het aantal) dieren per kooi, strooisel, omgevingstemperatuur en relatieve vochtigheid, lichtregime en identificatie van de voeding;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gebruikte soort/stam en motivering voor het gebruik van een ander soort dan ratten; herkomst en historische gegevens kunnen worden vermeld, indien afkomstig van dieren die zijn blootgesteld onder vergelijkbare omstandigheden wat betreft blootstelling, huisvesting en vasten;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      randomiseringsmethode;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      beschrijving van de eventuele conditionering voorafgaand aan de test, met inbegrip van voeding, quarantaine en behandeling voor ziekte.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Teststof:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fysische aard, zuiverheid en, indien relevant, fysisch-chemische eigenschappen (met inbegrip van de isomeersamenstelling);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identificatiegegevens en, indien bekend, CAS-nummer (Chemical Abstracts Service).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Medium
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivatie voor het gebruik van het medium en voor de keuze ervan (indien een ander medium dan water wordt gebruikt);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      historische of parallelle gegevens waaruit blijkt dat het medium niet interfereert met de uitkomst van de studie.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhalatiekamer:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gedetailleerde beschrijving van de inhalatiekamer, met inbegrip van de afmetingen en een schematische weergave;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      herkomst en beschrijving van de apparatuur die voor de blootstelling van dieren en het verkrijgen van de atmosfeer is gebruikt;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      apparatuur voor het meten van de temperatuur, de vochtigheid, de deeltjesgrootte en de feitelijke concentratie;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      herkomst van de lucht en systeem dat voor de conditionering is gebruikt;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toegepaste methoden voor de kalibratie van de apparatuur voor het verkrijgen van een homogene testatmosfeer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      drukverschil (positief of negatief);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      blootstellingspoorten per kamer (blootstelling via de neus alleen); locatie van de dieren in de kamer (blootstelling van het hele lijf);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stabiliteit van de testatmosfeer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      locatie van temperatuur- en vochtigheidssensoren en bemonstering van de testatmosfeer in de kamer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      behandeling van de aangevoerde/geëxtraheerde lucht;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      luchtdebiet, luchtdebiet per blootstellingspoort (blootstelling via de neus alleen) of dierbelasting per kamer (blootstelling van het hele lijf);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      equilibratietijd van de kamer (t95);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aantal volumeveranderingen per uur;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      meetapparaten (indien van toepassing).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Blootstellingsgegevens:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivering van de keuze van de doelconcentratie in de hoofdstudie;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominale concentraties (totale massa van de in de inhalatiekamer geleide teststof, gedeeld door het door de kamer geleide luchtvolume);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      feitelijke concentraties van de in het ademhalingsgebied van de dieren verzamelde teststof; voor mengsels die heterogene fysische vormen produceren (gassen, dampen, aerosolen) kan elke vorm afzonderlijk worden geanalyseerd;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      alle luchtconcentraties worden in massa-eenheden vermeld (mg/l, mg/m3 enz.), in plaats van in volume-eenheden (ppm, ppb enz.);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      deeltjesgrootteverdeling, massamediaan van de aerodynamische diameter (MMAD) en geometrische standaardafwijking (σg), onder vermelding van de wijze waarop zij zijn berekend. De individuele deeltjesgrootteanalysen worden vermeld.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testomstandigheden:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      details van de bereiding van de teststof, met inbegrip van details van de procedures die zijn gevolgd om de deeltjesgrootte van vaste stoffen te verlagen of oplossingen van de teststof te bereiden;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een beschrijving (bij voorkeur met een schematische voorstelling) van de apparatuur die voor het verkrijgen van de testatmosfeer en de blootstelling van de dieren aan de testatmosfeer is gebruikt;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      details van de apparatuur die wordt gebruikt om de temperatuur in de kamer, de vochtigheid en de luchtdoorstroming in de kamer te controleren (d.w.z. ontwikkeling van een kalibratiecurve);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      details van de apparatuur die wordt gebruikt om monsters te verzamelen voor de bepaling van de kamerconcentratie en deeltjesgrootteverdeling;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      details van de toegepaste chemische analysemethode en de validering van die methode (met inbegrip van de efficiëntie van de recovery van de teststof uit het bemonsteringsmedium);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      randomiseringsmethode voor het indelen van de dieren in test- en controlegroepen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      details van de voeder- en waterkwaliteit (waaronder aard en herkomst van het voeder en herkomst van het water);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivering van de keuze van de testconcentraties.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Resultaten:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met de temperatuur, vochtigheid en luchtdoorstroming van de kamer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met de nominale en feitelijke concentratiegegevens van de kamer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met de deeltjesgroottegegevens met inbegrip van gegevens over de verzameling van het analytisch monster, de deeltjesgrootteverdeling en de berekening van de MMAD en σg;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met gegevens over de respons en het concentratieniveau voor elk dier (bv. dieren met toxiciteitsverschijnselen, met inbegrip van sterfte, en de aard, hevigheid, tijdstip van aanvang en duur van de effecten);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met het gewicht van elk dier;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met het voedselverbruik;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met klinisch-pathologische gegevens;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      voor elk dier de obductiebevindingen en de histopathologische bevindingen, indien beschikbaar;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met eventuele andere gemeten parameters.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bespreking en interpretatie van de resultaten:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      speciale aandacht wordt besteed aan de beschrijving van de methoden die zijn toegepast om te voldoen aan de criteria van deze testmethode, bv. de limietconcentratie of de deeltjesgrootte;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      er wordt aandacht besteed aan de inhaleerbaarheid van deeltjes in het licht van de algemene bevindingen, in het bijzonder als niet aan de deeltjesgroottecriteria kan worden voldaan;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      in de algehele beoordeling van de studie wordt aandacht besteed aan de consistentie van de methoden die voor de bepalingen van de nominale en feitelijke concentratie zijn toegepast, alsmede aan het verband tussen de feitelijke en de nominale concentratie;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      er wordt aandacht besteed aan de waarschijnlijke doodsoorzaak en overheersende werking (systemisch of plaatselijk);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      er wordt een toelichting gegeven als dieren op humane wijze moesten worden gedood omdat zij pijn hadden of tekenen van hevige en voortdurende angst vertoonden, op basis van de criteria in de OESO-leidraad voor humane eindpunten (3);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      het doelorgaan (de doelorganen) moet (moeten) worden aangegeven;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      het NOAEL en LOAEL moet worden bepaald.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATUUR:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 412, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419-428.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Verordening (EG) nr. 1272/2008 van het Europees Parlement en de Raad van 16 december 2008 betreffende de indeling, etikettering en verpakking van stoffen en mengsels tot wijziging en intrekking van de Richtlijnen 67/548/EEG en 1999/45/EG en tot wijziging van Verordening (EG) nr. 1907/2006 (PB L 353 van 31.12.2008, blz. 1).
                           
                        
                     Aanhangsel 1
                     DEFINITIE
                     Teststof: iedere stof of ieder mengsel die/dat met deze testmethode wordt getest.
                  ”.
            
                  5)
               
               
                  De hoofdstukken B.29 en B.30 worden vervangen door:
                  „B.29.   SUBCHRONISCHE INHALATIETOXICITEIT: ONDERZOEK VAN 90 DAGEN
                  
                  SAMENVATTING
                  Deze herziene testmethode B.29 is ontworpen om de toxiciteit van een teststof via de inhalatieweg gedurende een subchronische periode (90 dagen) volledig te karakteriseren, en robuuste gegevens op te leveren voor kwantitatieve beoordelingen van de inhalatierisico’s. Groepen van tien mannelijke en 10 vrouwelijke knaagdieren worden gedurende een periode van 90 dagen (13 weken) 6 uur per dag blootgesteld aan a) de teststof bij drie of meer concentraties, b) gefilterde lucht (negatieve controle) en/of c) het medium (mediumcontrole). De dieren worden doorgaans vijf dagen per week blootgesteld, maar zeven dagen per week is ook toegestaan. Er worden altijd zowel mannetjes als vrouwtjes getest, maar zij kunnen bij verschillende concentratieniveaus worden blootgesteld indien bekend is dat een van beide geslachten gevoeliger is voor een bepaalde teststof. Deze methode geeft de onderzoeksleider de flexibiliteit om satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen), het tussentijds doden van dieren, bronchoalveolaire lavage, neurologische tests en aanvullende klinisch-pathologische en histopathologische beoordelingen in het onderzoek op te nemen, om de toxiciteit van een teststof beter te kunnen karakteriseren.
                  INLEIDING
                  
                              1.
                           
                           
                              Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 413 (2009) van de OESO. Testrichtlijn 413 (TG 413), de oorspronkelijke testrichtlijn voor subchronische inhalatie, werd in 1981 vastgesteld (1). Deze testmethode B.29 (die gelijkwaardig is aan de herziene versie van TG 413 (2009)) is bijgewerkt om haar in overeenstemming te brengen met de stand van de wetenschap en om te voldoen aan de huidige en toekomstige regelgevingsbehoeften.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Onderzoek naar subchronische inhalatietoxiciteit wordt in de eerste plaats gebruikt om de concentraties waarmee de risico’s voor werknemers op de werkplek worden beoordeeld in regelgeving vast te leggen. Ook wordt het gebruikt om de risico’s voor mensen te beoordelen in de woonomgeving, het verkeer en het milieu. Met deze methode kunnen nadelige effecten na herhaalde dagelijkse blootstelling aan een teststof door inhalatie gedurende 90 dagen (ongeveer 10 % van de levensduur van een rat) worden gekarakteriseerd. De uit onderzoek naar subchronische inhalatietoxiciteit verkregen gegevens kunnen worden gebruikt voor kwantitatieve risicobeoordelingen en voor de keuze van de concentraties voor onderzoek naar chronische toxiciteit. Deze testmethode is niet specifiek bedoeld voor het testen van nanomaterialen. De in de context van deze testmethode gebruikte definities zijn opgenomen in het laatste deel van dit hoofdstuk en in GD 39 (2).
                           
                        INLEIDENDE OVERWEGINGEN
                  
                              3.
                           
                           
                              Het testlaboratorium moet alle beschikbare informatie over de teststof in overweging nemen voordat het onderzoek wordt uitgevoerd. Dit komt de kwaliteit van het onderzoek ten goede en zorgt ervoor dat het gebruik van dieren tot een minimum wordt beperkt. Voor de keuze van geschikte testconcentraties kan onder meer gebruik worden gemaakt van informatie over de identiteit, chemische structuur en fysisch-chemische eigenschappen van de teststof; de resultaten van eventuele in vitro of in vivo uitgevoerde toxiciteitstests; de voorgenomen toepassing(en) en de potentiële blootstelling van de mens; de beschikbare (Q)SAR-gegevens en toxicologische gegevens over chemische stoffen met een verwante structuur; en aan ander onderzoek met herhaalde blootstelling ontleende gegevens. In het geval van verwachte of in de loop van het onderzoek waargenomen neurotoxiciteit, kan de onderzoeksleider ervoor kiezen om geschikte evaluaties op te nemen, zoals een „functional observational battery” (FOB) en meting van de motorische activiteit. Hoewel de timing van de blootstellingen ten opzichte van specifiek onderzoek een kritieke factor kan vormen, mogen deze nieuwe activiteiten niet interfereren met de basisopzet van het onderzoek.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Verdunningen van bijtende of irriterende teststoffen kunnen worden getest bij concentraties die de gewenste mate van toxiciteit opleveren. Zie GD 39 (2) voor nadere informatie. Bij blootstelling van dieren aan deze materialen moeten de doelconcentraties laag genoeg zijn om geen hevige pijn en angst te veroorzaken, maar wel toereikend zijn om de concentratie/responscurve uit te breiden tot niveaus die stroken met de wetenschappelijke en regelgevingsdoelstellingen van de test. Deze concentraties moeten per geval worden gekozen, bij voorkeur op basis van een adequaat opgezet bereikbepalingonderzoek dat informatie oplevert over het kritische eindpunt, eventuele irritatiedrempels en het moment van optreden (zie de punten 11 tot en met 13). De keuze voor een bepaalde concentratie moet worden gemotiveerd.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Stervende dieren of dieren die duidelijk pijn hebben of tekenen van hevige en voortdurende angst vertonen, moeten op humane wijze worden gedood. Stervende dieren worden op dezelfde wijze beschouwd als dieren die tijdens de test sterven. De OESO-leidraad inzake humane eindpunten (3) bevat criteria om te bepalen of stervende of hevig lijdende dieren moeten worden gedood en richtsnoeren om voorspelbare of ophanden zijnde sterfte te herkennen.
                           
                        BESCHRIJVING VAN DE METHODE
                  
                     Keuze van de diersoort
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Er worden gezonde jonge volwassen knaagdieren van gangbare laboratoriumstammen gebruikt. Er wordt de voorkeur gegeven aan ratten. Als een andere soort wordt gebruikt, moet dit worden gemotiveerd.
                           
                        
                     Voorbereiding van de dieren
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig zijn. Op de dag waarop zij willekeurig worden ingedeeld, moeten de jonge volwassen dieren zeven tot negen weken oud zijn en een lichaamsgewicht hebben dat niet meer dan 20 % afwijkt van het gemiddelde gewicht voor elk geslacht. De dieren worden willekeurig gekozen, gemerkt om elk dier afzonderlijk te kunnen identificeren en vóór het begin van de test gedurende minimaal vijf dagen in hun kooi gehouden om ze aan de omstandigheden in het laboratorium te laten wennen.
                           
                        
                     Dierhouderij
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              De dieren moeten individueel worden gemerkt, bij voorkeur met onderhuidse transponders, om de waarnemingen te vergemakkelijken en verwarring te voorkomen. De temperatuur van de ruimte waar de proefdieren verblijven, moet 22 ± 3 °C zijn. De relatieve vochtigheid wordt idealiter tussen 30 en 70 % gehouden, maar wanneer water als medium wordt gebruikt zal dit niet altijd mogelijk zijn. Voor en na de blootstelling worden de dieren over het algemeen groepsgewijs in kooien ondergebracht, waarbij zij naar geslacht en concentratie worden gescheiden; het aantal dieren per kooi mag echter niet zo groot zijn dat een duidelijke observatie van elk dier wordt gestoord en moet zodanig worden gekozen dat er zo min mogelijk dieren verloren gaan als gevolg van kannibalisme en gevechten. Wanneer de dieren uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan acclimatisatie voor de fixeerbuizen noodzakelijk zijn. De fixeerbuizen mogen geen onnodige lichamelijke, thermische of immobilisatiestress voor de dieren opleveren. De immobilisatie kan van invloed zijn op fysiologische eindpunten zoals de lichaamstemperatuur (hyperthermie) en/of het ademminuutvolume. Als er generieke gegevens beschikbaar zijn waaruit blijkt dat geen significante veranderingen als gevolg van de immobilisatie optreden, is geen voorafgaande gewenning aan de fixeerbuizen noodzakelijk. Dieren die met hun hele lijf aan een aerosol worden blootgesteld, worden tijdens de blootstelling individueel gehuisvest om te voorkomen dat zij het testaerosol filteren door de vacht van hun kooigenoten. Er kan gebruik worden gemaakt van gebruikelijk en gecertificeerd laboratoriumvoeder, behalve tijdens de blootstelling, met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater uit de waterleiding. Er wordt kunstlicht gebruikt met een cyclus van 12 uur licht/12 uur donker.
                           
                        
                     Inhalatiekamers
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Bij de keuze van de inhalatiekamer wordt rekening gehouden met de aard van de teststof en het doel van de test. Blootstelling via de neus alleen heeft de voorkeur (hieronder vallen blootstelling via de kop alleen, blootstelling via de neus alleen en blootstelling via de snuit alleen). Blootstelling via de neus alleen heeft over het algemeen de voorkeur voor studies van vloeibare of vaste aerosolen en voor dampen die kunnen condenseren tot aerosolen. Speciale doelstellingen van de studie kunnen beter worden verwezenlijkt door blootstelling van het hele lijf, maar dit moet in het studieverslag worden gemotiveerd. Om bij gebruik van een kamer voor het hele lijf te zorgen voor een stabiele atmosfeer, mag het totale volume van de testdieren niet meer dan 5 % van het volume van de kamer innemen. De technische principes voor blootstelling via de neus alleen en blootstelling van het hele lijf, alsook de specifieke voor- en nadelen ervan, zijn uiteengezet in GD 39 (2).
                           
                        TOXICITEITSONDERZOEK
                  
                     Limietconcentraties
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Anders dan bij acuut onderzoek zijn er geen vastgestelde limietconcentraties bij onderzoek naar subchronische inhalatietoxiciteit. Bij het vaststellen van de maximale geteste concentratie moet rekening worden gehouden met: 1) de maximaal haalbare concentratie, 2) het niveau waaraan mensen in het ongunstigste geval zouden worden blootgesteld („worst case”), 3) de noodzaak een toereikende zuurstoftoevoer in stand te houden, en/of 4) overwegingen met het oog op dierenwelzijn. Indien geen op reële gegevens gebaseerde grenswaarden beschikbaar zijn, kunnen de limietwaarden voor acute-toxiciteitsonderzoek van Verordening (EG) nr. 1272/2008 (13) worden gebruikt (d.w.z. tot een maximale concentratie van 5 mg/l voor aerosolen, 20 mg/l voor dampen en 20 000 ppm voor gassen); zie GD 39 (2). Als het nodig is deze limietwaarden te overschrijden voor het testen van gassen of zeer vluchtige teststoffen (bv. koelmiddelen), moet dit worden gemotiveerd. De limietconcentratie moet tot onmiskenbare toxiciteit leiden zonder onnodige stress bij de dieren te veroorzaken of hun levensduur te beïnvloeden (3).
                           
                        
                     Bereikbepalingonderzoek
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Alvorens te beginnen met het hoofdonderzoek, is het doorgaans nodig een bereikbepalingonderzoek uit te voeren. Een bereikbepalingonderzoek is uitgebreider dan een verkennende test, omdat het zicht niet beperkt tot de keuze van de concentratie. De tijdens een bereikbepalingonderzoek opgedane kennis kan ervoor zorgen dat het hoofdonderzoek succesvol verloopt. Een bereikbepalingonderzoek kan bijvoorbeeld technische informatie opleveren met betrekking tot analysemethoden, deeltjesgroottebepaling, het herkennen van toxische mechanismen, klinisch-pathologische en histopathologische gegevens, en schattingen van mogelijke NOAEL- en MTC-concentraties in het hoofdonderzoek. De onderzoeksleider kan ervoor kiezen het bereikbepalingonderzoek te gebruiken om de drempelwaarde voor irritatie van de luchtwegen (bv. door middel van histopathologisch onderzoek van de luchtwegen, het testen van de longfunctie, of bronchoalveolaire lavage), de hoogste concentratie die zonder onnodige stress door de dieren wordt verdragen en de parameters waarmee de toxiciteit van een teststof het best kan worden gekarakteriseerd, te bepalen.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Een bereikbepalingonderzoek kan één of meer concentratieniveaus omvatten. Afhankelijk van de gekozen eindpunten worden bij elk concentratieniveau drie tot zes mannetjes en drie tot zes vrouwtjes blootgesteld. Een bereikbepalingonderzoek duurt ten minste vijf dagen en doorgaans niet langer dan 28 dagen. In het testverslag moet de keuze van de concentraties voor het hoofdonderzoek worden gemotiveerd. Het hoofdonderzoek heeft tot doel een verband tussen concentratie en respons aan te tonen op basis van wat naar verwachting het gevoeligste eindpunt zal zijn. De lage concentratie is bij voorkeur de concentratie waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld („no-observed adverse effect”), de hoge concentratie moet tot onmiskenbare toxiciteit leiden zonder onnodige stress bij de dieren te veroorzaken of hun levensduur te beïnvloeden (3).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Bij het kiezen van de concentratieniveaus voor het bereikbepalingonderzoek moet met alle beschikbare informatie rekening worden gehouden, met inbegrip van structuur-activiteitrelaties en gegevens over vergelijkbare stoffen (zie punt 3). Een bereikbepaling onderzoek kan de vanuit mechanistisch oogpunt als het meest gevoelig beschouwde eindpunten bevestigen of weerleggen, bv. cholinesteraseremming door organofosfaten, vorming van methemoglobine door voor erytrocyten toxische stoffen, schildklierhormonen (T3, T4) voor thyreotoxische stoffen, eiwit, LDH, of neutrofielen in bronchoalveolaire lavage voor onschadelijke, slecht oplosbare deeltjes of longirritatie veroorzakende aerosolen.
                           
                        
                     Hoofdonderzoek
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Het hoofdonderzoek naar subchronische toxiciteit omvat doorgaans drie concentratieniveaus en, waar nodig, parallelle negatieve controles (luchtcontroles) en/of mediumcontroles (zie punt 18). Voor de keuze van geschikte blootstellingsniveaus moet gebruik worden gemaakt van alle beschikbare gegevens, met inbegrip van de resultaten van onderzoek naar systemische toxiciteit, metabolisme en kinetiek (er moet speciaal op worden gelet dat hoge concentratieniveaus waardoor kinetische processen worden verzadigd, worden vermeden). Elke testgroep bestaat uit twintig knaagdieren (tien mannetjes en tien vrouwtjes) die over een periode van 13 weken gedurende vijf dagen per week telkens 6 uur per dag aan de teststof worden blootgesteld (de totale duur van het onderzoek is ten minste 90 dagen). De dieren mogen ook zeven dagen per week worden blootgesteld (bv. bij het testen van geneesmiddelen die worden geïnhaleerd). Indien bekend is dat een van beide geslachten gevoeliger is voor een bepaalde teststof, kunnen beide geslachten bij verschillende concentratieniveaus worden blootgesteld om het verband tussen concentratie en respons nauwkeuriger te kunnen bepalen, zoals beschreven in punt 15. Als andere knaagdiersoorten dan ratten uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan de maximale blootstellingsduur worden aangepast om soortspecifieke symptomen van angst te minimaliseren. Indien een blootstellingsduur van minder dan 6 uur/dag wordt gebruikt, of er onderzoek naar blootstelling van het hele lijf met een lange tijdsduur (bv. 22 uur/dag) moet worden verricht, moet dit worden gemotiveerd (zie GD 39 (2)). Tijdens de blootstellingsperiode krijgen de dieren geen voeder, tenzij de blootstelling langer duurt dan 6 uur. Tijdens een blootstelling van het hele lijf kan de dieren water worden gegeven.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              De gekozen doelconcentraties moeten het mogelijk maken de doelorganen te identificeren en een duidelijk verband tussen concentratie en respons aan te tonen:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          het hoge concentratieniveau moet toxische effecten veroorzaken, maar niet tot aanhoudende verschijnselen of sterfte leiden die een deugdelijke evaluatie belemmeren;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het (de) tussenliggende concentratieniveau(s) moeten zodanig zijn verdeeld dat een gradatie in toxische effecten tussen de lage en hoge concentratie wordt verkregen;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het lage concentratieniveau moet weinig of geen tekenen van toxiciteit opleveren.
                                       
                                    
                        
                     Tussentijds doden van dieren
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Indien het de bedoeling is tussentijds dieren te doden, moet het aantal dieren bij elk blootstellingsniveau worden verhoogd met het aantal dieren dat voor de voltooiing van het onderzoek zal worden gedood. Het tussentijds doden van dieren moet worden gemotiveerd, en er moet op adequate wijze rekening mee worden gehouden bij de statistische analysen.
                           
                        
                     Satellietonderzoek (reversibiliteitsonderzoek)
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Een satellietonderzoek (reversibiliteitsonderzoek) kan worden gebruikt voor observatie van reversibiliteit, persistentie of vertraagd tot uiting komen van toxiciteit gedurende een geschikte periode van ten minste 14 dagen na de behandeling. Satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen) bestaan uit tien mannetjes en tien vrouwtjes die gelijktijdig met de proefdieren in het hoofdonderzoek worden blootgesteld. Satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen) moeten bij het hoogste concentratieniveau aan de teststof worden blootgesteld en waar nodig moeten er parallelle luchtcontroles en/of mediumcontroles zijn (zie punt 18).
                           
                        
                     Controledieren
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              De dieren voor de parallelle negatieve controle (luchtcontrole) worden op identieke wijze behandeld als de dieren in de testgroepen, behalve dat zij worden blootgesteld aan gefilterde lucht in plaats van aan de teststof. Wanneer voor het verkrijgen van de testatmosfeer water of een andere stof wordt gebruikt, moet in plaats van een negatieve controlegroep (luchtcontrolegroep) een mediumcontrolegroep in het onderzoek worden opgenomen. Waar mogelijk moet water worden gebruikt als het medium. Wanneer water wordt gebruikt als het medium moeten de controledieren worden blootgesteld aan lucht met dezelfde relatieve luchtvochtigheid als voor de blootgestelde groepen wordt gebruikt. De keuze van een geschikt medium vindt plaats op basis van een correct uitgevoerde voorstudie of van historische gegevens. Als de toxiciteit van een medium niet goed bekend is, kan de onderzoeksleider ervoor kiezen zowel een negatieve controle (luchtcontrole) als een mediumcontrole te gebruiken, maar dit wordt sterk afgeraden. Indien uit historische gegevens blijkt dat een medium niet toxisch is, is een negatieve controlegroep (luchtcontrolegroep) niet nodig, en wordt alleen een mediumcontrole gebruikt. Indien een voorstudie van een in een medium bereide teststof uitwijst dat er geen toxiciteit optreedt, volgt hieruit dat het medium bij de geteste concentratie niet toxisch is en dat deze mediumcontrole moet worden gebruikt.
                           
                        BLOOTSTELLINGSOMSTANDIGHEDEN
                  
                     Toediening van concentraties
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              De dieren worden aan de teststof blootgesteld in de vorm van gas, damp, aerosol of een mengsel daarvan. De te testen fysische toestand hangt af van de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof, de gekozen concentraties en/of de meest waarschijnlijke fysische vorm waarin de teststof bij hantering en gebruik aanwezig is. Hygroscopische en chemisch reactieve teststoffen moeten worden getest in drogeluchtomstandigheden. Er dient op te worden gelet dat er geen explosieve concentraties optreden. Deeltjesmateriaal kan aan mechanische processen worden onderworpen om een kleinere deeltjesgrootte te verkrijgen. Nadere richtsnoeren zijn opgenomen in GD 39 (2).
                           
                        
                     Deeltjesgrootteverdeling
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Voor alle aerosolen en voor dampen die tot aerosolen kunnen condenseren, wordt de deeltjesgrootte bepaald. Om blootstelling van alle relevante delen van de ademhalingswegen mogelijk te maken, worden aerosolen met een massamediaan van de aerodynamische diameter (MMAD) tussen 1 en 3 μm en een geometrische standaardafwijking (σg) tussen 1,5 en 3,0 aanbevolen (4). Hoewel redelijkerwijs moet worden getracht deze normwaarden te halen, wordt het oordeel van een deskundige gegeven als dit niet mogelijk blijkt. Metaaldampdeeltjes kunnen bijvoorbeeld kleiner zijn dan deze normwaarde, en geladen deeltjes en vezels juist groter.
                           
                        
                     Bereiding van de teststof in een medium
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              In het ideale geval wordt de teststof zonder medium getest. Indien het noodzakelijk is een medium te gebruiken om een geschikte deeltjesgrootte en concentratie van de teststof te verkrijgen, wordt de voorkeur gegeven aan water. Wanneer een teststof wordt opgelost in een medium, moet de stabiliteit ervan worden aangetoond.
                           
                        CONTROLE VAN DE BLOOTSTELLINGSOMSTANDIGHEDEN
                  
                     Luchtdoorstroming in de kamer
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Tijdens elke blootstelling wordt de luchtdoorstroming in de blootstellingskamer zorgvuldig geregeld, voortdurend gecontroleerd en ten minste elk uur geregistreerd. De real-time controle van de concentratie (of stabiliteit in de tijd) van de testatmosfeer is een integrale meting van alle dynamische parameters waarbij indirect alle relevante dynamische parameters voor het verkrijgen van de atmosfeer kunnen worden geregeld. Indien de concentratie real-time wordt gecontroleerd, kan de frequentie waarmee de luchtdoorstroming wordt gemeten, worden teruggebracht tot één meting per blootstelling per dag. Wanneer kamers voor blootstelling via de neus alleen worden gebruikt, moet er in het bijzonder op worden gelet dat de uitgeademde lucht niet opnieuw wordt ingeademd. Het zuurstofgehalte moet ten minste 19 % bedragen en het kooldioxidegehalte niet meer dan 1 %. Als er redenen zijn om aan te nemen dat deze normwaarde niet kan worden gehaald, moet de zuurstof- en kooldioxideconcentratie worden gemeten. Wanneer uit de metingen op de eerste blootstellingsdag blijkt dat de waarden voor deze gassen op het juiste niveau liggen, zijn geen verdere metingen nodig.
                           
                        
                     Temperatuur en relatieve vochtigheid in de kamer
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              De temperatuur in de kamer moet op 22 ± 3 °C worden gehouden. Voor zover mogelijk wordt, zowel bij blootstelling via de neus alleen als bij blootstelling van het hele lijf, tijdens elke blootstelling de relatieve vochtigheid in het ademhalingsgebied van de dieren doorlopend gecontroleerd en ten minste elk uur geregistreerd. De relatieve vochtigheid wordt bij voorkeur tussen 30 en 70 % gehouden, al zal dit niet altijd haalbaar (bv. wanneer mengsels op waterbasis worden getest) of meetbaar zijn vanwege interferentie tussen de teststof en de testmethode.
                           
                        
                     Teststof: nominale concentratie
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Waar mogelijk wordt de nominale concentratie in de blootstellingskamer berekend en geregistreerd. De nominale concentratie is de massa van de gegenereerde teststof gedeeld door het totale luchtvolume dat door het inhalatiekamersysteem wordt geleid. De nominale concentratie wordt niet gebruikt om de blootstelling van de dieren te karakteriseren, maar een vergelijking tussen de nominale concentratie en de feitelijke concentratie vormt een aanwijzing voor het rendement van het testsysteem en kan bijgevolg worden gebruikt om problemen bij het genereren te ontdekken.
                           
                        
                     Teststof: feitelijke concentratie
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              De feitelijke concentratie is de concentratie van de teststof zoals bemonsterd in het ademhalingsgebied van de dieren in een inhalatiekamer. De feitelijke concentraties kunnen worden verkregen door toepassing van specifieke methoden (bv. rechtstreekse bemonstering of op adsorptie of een chemische reactie gebaseerde methoden, gevolgd door analytische karakterisering) of niet-specifieke methoden, zoals gravimetrische filteranalyse. Gravimetrische analysen zijn alleen aanvaardbaar voor aerosolen van poeders met één component of aerosolen van vloeistoffen met een geringe vluchtigheid en moeten worden ondersteund met passende specifieke karakteriseringen van de teststof voorafgaand aan de studie. De concentratie van aerosolen van poeders met meerdere componenten kan ook door middel van gravimetrische analyse worden bepaald. In dat geval zijn echter analytische gegevens vereist die aantonen dat de samenstelling van het materiaal in de lucht vergelijkbaar is met die van het uitgangsmateriaal. Als deze informatie niet beschikbaar is, kan het nodig zijn in de loop van de studie op gezette tijden een nieuwe analyse van de teststof (idealiter in de toestand in de lucht) uit te voeren. Voor geaerosoliseerde stoffen die kunnen verdampen of sublimeren, moet worden aangetoond dat met de gekozen methoden alle fasen zijn verzameld.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Er wordt zo mogelijk één partij van de teststof gebruikt gedurende het onderzoek en het testmonster wordt bewaard onder omstandigheden waarbij de zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit behouden blijven. Voor aanvang van de studie worden de teststof, met inbegrip van de zuiverheid, en indien technisch mogelijk de identiteit en de hoeveelheden van vastgestelde verontreinigingen en onzuiverheden gekarakteriseerd. Dit kan onder meer met de volgende gegevens worden aangetoond: retentietijd en relatief piekoppervlak, moleculair gewicht op basis van massaspectroscopie of gaschromatografie, of andere schattingen. Hoewel het testlaboratorium niet verantwoordelijk is voor de identiteit van het testmonster, kan het raadzaam zijn dat het testlaboratorium de karakterisering van de opdrachtgever ten minste in beperkte mate bevestigt (bv. kleur, fysische aard enz.).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              De blootstellingsatmosfeer wordt zo constant mogelijk gehouden. Een voorziening voor real-time controle, zoals een aerosol-fotometer voor aerosolen, of een totaal-koolwaterstofanalysator voor dampen, kunnen worden gebruikt om de stabiliteit van de blootstellingsvoorwaarden aan te tonen. De feitelijke concentratie in de kamer moet gedurende elke blootstellingsdag voor elk blootstellingsniveau ten minste 3 keer worden gemeten. Als dit vanwege de beperkte luchtdoorstroming of lage concentraties niet mogelijk is, is één monster per blootstellingsperiode aanvaardbaar. In het ideale geval wordt dit monster in dat geval gedurende de volledige blootstellingsperiode verzameld. Het verschil tussen individuele monsters van de kamerconcentratie en de gemiddelde kamerconcentratie mag bij gassen en dampen niet meer dan ± 10 % en bij vloeibare of vaste aerosolen niet meer dan ± 20 % bedragen. De equilibratietijd van de kamer (t95) wordt berekend en gerapporteerd. De blootstellingsduur omvat de tijd waarin de teststof wordt gegenereerd. Hierbij wordt rekening gehouden met de equilibratietijd van de kamer (t95) en de vervaltijd. In GD 39 (2) zijn richtsnoeren voor het schatten van t95 opgenomen.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Voor zeer complexe mengsels bestaande uit dampen/gassen en aerosolen (bv. verbrandingsatmosferen en teststoffen die zijn ontleend aan doelgerichte eindproducten of apparaten), kan elke fase zich in een inhalatiekamer verschillend gedragen. Daarom moet van elke fase (damp/gas en aerosol) ten minste één indicatorstof (analyt) worden gekozen, normaliter het voornaamste werkzame bestanddeel in het mengsel. Wanneer de teststof een mengsel is, wordt de analytische concentratie vermeld voor het totale mengsel, en niet slechts voor het werkzame bestanddeel of de indicatorstof (analyt). Aanvullende informatie over feitelijke concentraties is opgenomen in GD 39 (2).
                           
                        
                     Teststof: deeltjesgrootteverdeling
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              De deeltjesgrootteverdeling van aerosolen wordt voor ieder concentratieniveau ten minste wekelijks bepaald met behulp van een cascade-impactor of een alternatief instrument, zoals een aerodynamische deeltjesgroottemeter. Indien kan worden aangetoond dat de met een cascade-impactor en het alternatieve instrument verkregen resultaten gelijkwaardig zijn, mag het alternatieve instrument gedurende de hele studie worden gebruikt.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Parallel aan het primaire instrument wordt een tweede instrument, zoals een gravimetrisch filter of een impinger/gas bubbler gebruikt om de doeltreffendheid van de verzameling met het primaire instrument te bevestigen. De door middel van deeltjesgrootteanalyse en filteranalyse verkregen massaconcentraties moeten in redelijke mate overeenkomen (zie GD 39 (2)). Indien in een vroeg stadium van de studie de gelijkwaardigheid bij alle geteste concentraties kan worden aangetoond, zijn verdere bevestigende metingen niet nodig. Met het oog op het dierenwelzijn moeten maatregelen worden genomen om zo veel mogelijk te voorkomen dat niet-overtuigende gegevens worden verkregen waardoor herhaling van het onderzoek noodzakelijk is.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Voor dampen wordt de deeltjesgrootte bepaald indien de mogelijkheid bestaat dat de dampen condenseren waardoor aerosolvorming optreedt of indien in een dampatmosfeer deeltjes worden gedetecteerd waarbij gemengde fasen kunnen optreden.
                           
                        WAARNEMINGEN
                  
                              32.
                           
                           
                              De dieren worden voor, tijdens en na de blootstellingsperiode klinisch geobserveerd. Afhankelijk van de reactie van de dieren tijdens de blootstelling kunnen frequentere observaties nodig zijn. Indien het observeren van de dieren wordt belemmerd door het gebruik van fixeerbuizen, slecht verlichte kamers voor het hele lijf, of ondoorzichtige atmosferen, moeten de dieren zorgvuldig worden geobserveerd na afloop van de blootstelling. Door de volgende dag vóór de blootstelling te observeren kan eventuele reversibiliteit of verergering van toxische effecten worden beoordeeld.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Alle observaties worden geregistreerd en van elk dier wordt een apart overzicht bijgehouden. Wanneer dieren om redenen van dierenwelzijn worden gedood of dood worden aangetroffen, wordt zo nauwkeurig mogelijk geregistreerd op welk tijdstip ze zijn gestorven.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Bij externe observaties van de dieren in de kooien wordt gekeken naar veranderingen in de huid en de vacht, de ogen en de slijmvliezen, de ademhalingsorganen, de bloedsomloop, het zenuwstelsel, de somatomotorische activiteit en gedragspatronen. Er moet worden gelet op de observatie van tremors, convulsies, speekselafscheiding, diarree, lethargie, slaap en coma. Een meting van de rectale temperatuur kan ondersteunende gegevens opleveren voor met de behandeling of opsluiting verband houdende reflectoire bradypneu of hypo-/hyperthermie. In het onderzoeksprotocol kunnen aanvullende beoordelingen worden opgenomen, zoals kinetiek, biomonitoring, longfunctie, retentie van slecht oplosbare stoffen die zich in longweefsel ophopen, en gedragsveranderingen.
                           
                        LICHAAMSGEWICHT
                  
                              35.
                           
                           
                              Het gewicht van elk dier wordt kort voor de eerste blootstelling geregistreerd, op dag 0 en vervolgens twee keer per week (bijvoorbeeld op vrijdag en maandag, om het herstel gedurende een weekend zonder blootstelling aan te tonen, of volgens een tijdsinterval om de systemische toxiciteit te kunnen beoordelen), alsook op het moment waarop het dier sterft of wordt geëuthanaseerd. Indien er gedurende de eerste vier weken geen effecten optreden, kan het lichaamsgewicht van de dieren gedurende het vervolg van de studie wekelijks worden gemeten. Indien satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen) worden gebruikt, moeten de dieren in deze groepen ook gedurende de hele herstelperiode wekelijks gewogen worden. Bij de beëindiging van het onderzoek moeten alle dieren kort voordat zij worden gedood, worden gewogen om een onvertekende berekening van de verhouding tussen orgaangewichten en lichaamsgewicht mogelijk te maken.
                           
                        VOEDSEL- EN WATERVERBRUIK
                  
                              36.
                           
                           
                              Het voedselverbruik wordt wekelijks gemeten. Het waterverbruik kan ook worden gemeten.
                           
                        KLINISCHE PATHOLOGIE
                  
                              37.
                           
                           
                              Voor alle dieren, met inbegrip van de dieren in de controlegroepen en satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen), worden klinisch-pathologische beoordelingen uitgevoerd wanneer zij worden gedood. Het tijdsinterval tussen het einde van de blootstelling en de aftapping van het bloed moet worden geregistreerd, met name wanneer het desbetreffende eindpunt snel naar de uitgangswaarde terugkeert. Voor parameters met een korte plasmahalfwaardetijd (bv. COHb, CHE, en MetHb) is het wenselijk om na het einde van de blootstelling monsters te nemen.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Tabel 1 bevat een lijst van de klinisch-pathologische parameters die doorgaans voor elk toxicologisch onderzoek vereist zijn. Urineonderzoek hoeft niet routinematig te worden uitgevoerd, maar kan worden verricht wanneer dit op grond van de verwachte of waargenomen toxiciteit nuttig wordt geacht. De onderzoeksleider kan ervoor kiezen aanvullende parameters te beoordelen om de toxiciteit van een teststof beter te kunnen karakteriseren (bijv. cholinesterase, lipiden, hormonen, zuur/base-evenwicht, methemoglobine of Heinz-lichaampjes, creatinekinase, verhouding myeloïde/erytroïde cellen, troponines, arteriële bloedgassen, lactaatdehydrogenase, sorbitoldehydrogenase, glutamaatdehydrogenase, en gamma-glutamyltranspeptidase.
                              
                                 Tabel 1
                              
                              
                                 Klinisch-pathologische standaardparameters
                              
                              
                                          Hematologisch
                                       
                                    
                                          Telling van de erytrocyten
                                          Hematocriet
                                          Hemoglobinegehalte
                                          Hemoglobinegehalte per erytrocyt
                                          Gemiddeld volume van de erytrocyten
                                          Hemoglobinegehalte per volume-eenheid erytrocyten
                                          Reticulocyten
                                       
                                       
                                          Totale telling van de leukocyten
                                          Gedifferentieerde telling van de leukocyten
                                          Telling van de bloedplaatjes
                                          Stollingsvermogen (een van de mogelijkheden kiezen):
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Prothrombinetijd
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Stollingstijd
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Partiële thromboplastinetijd
                                                   
                                                
                                    
                                          Klinisch-chemisch
                                       
                                    
                                          Glucose (9)
                                          
                                          Totaal cholesterol
                                          Triglyceriden
                                          Bloedureumstikstof
                                          Totaal bilirubine
                                          Creatinine
                                          Totaal eiwit
                                          Albumine
                                          Globuline
                                       
                                       
                                          Alanineaminotransferase
                                          Aspartaataminotransferase
                                          Alkalische fosfatase
                                          Kalium
                                          Natrium
                                          Calcium
                                          Fosfor
                                          Chloride
                                       
                                    
                                          Urineonderzoek (facultatief)
                                       
                                    
                                          Voorkomen (kleur en troebelheid)
                                          Volume
                                          Soortelijk gewicht of osmolaliteit
                                          pH
                                       
                                       
                                          Totaal eiwit
                                          Glucose
                                          Bloed/bloedcellen
                                       
                                    
                        
                              39.
                           
                           
                              Wanneer er aanwijzingen zijn dat afzetting en retentie primair in de onderste luchtwegen (d.w.z. de alveolen) plaatsvindt, kan bronchoalveolaire lavage de aangewezen techniek zijn voor kwantitatieve analyse van op hypothesen gebaseerde dosis-effectparameters, waarbij de nadruk ligt op alveolitis, longontsteking en fosfolipidose. Op deze manier kunnen veranderingen in de dosis-responsverhouding en het verloop in de tijd van alveolair letsel adequaat worden onderzocht. De bronchoalveolaire lavagevloeistof kan worden geanalyseerd met betrekking tot de totale en gedifferentieerde tellingen van de leukocyten, totaal eiwit, en lactaatdehydrogenase. Ook parameters die wijzen op lysosomale beschadigingen, fosfolipidose, fibrose en door irritatie of allergie veroorzaakte ontstekingen, kunnen worden overwogen; het kan hierbij onder meer gaan om de bepaling van pro-inflammatoire cytokinen/chemokinen. Bronchoalveolaire lavagemetingen vormen doorgaans een aanvulling op de resultaten van histopathologisch onderzoek, maar kunnen deze niet vervangen. In GD 39 (2) zijn richtsnoeren voor het uitvoeren van longlavage opgenomen.
                           
                        OFTALMOLOGISCH ONDERZOEK
                  
                              40.
                           
                           
                              Met behulp van een oftalmoscoop of een ander geschikt apparaat wordt vóór de toediening van de teststof bij alle dieren, en bij de beëindiging van het onderzoek bij alle hogeconcentratie- en controlegroepen, een oftalmologisch onderzoek uitgevoerd van de fundus, refractieve media, iris en bindvliezen. Indien er veranderingen in de ogen worden vastgesteld, moeten alle dieren in de andere groepen worden onderzocht, met inbegrip van de satellietgroep (reversibiliteitsgroep).
                           
                        MACROPATHOLOGIE EN ORGAANGEWICHTEN
                  
                              41.
                           
                           
                              Op alle proefdieren, met inbegrip van de dieren die tijdens de test sterven of met het oog op het dierenwelzijn uit het onderzoek worden genomen, wordt macroscopische obductie uitgevoerd, indien mogelijk na volledig uitbloeden. Voor ieder dier moet worden geregistreerd hoeveel tijd er is verstreken tussen het einde van hun laatste blootstelling en het moment waarop zij zijn gedood. Als het niet mogelijk is onmiddellijk nadat een dood dier is aangetroffen een obductie te verrichten, wordt het dier gekoeld (niet bevroren) bij een temperatuur die laag genoeg is om de autolyse tot een minimum te beperken. De obductie wordt zo spoedig mogelijk verricht, normaliter binnen een of twee dagen. Alle met het blote oog waarneembare pathologische veranderingen worden voor elk dier geregistreerd, met bijzondere aandacht voor veranderingen in de luchtwegen.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Tabel 2 bevat een lijst van de organen en weefsels die tijdens de macroscopische obductie in een geschikt medium moeten worden bewaard voor histopathologisch onderzoek. Het is aan de onderzoeksleider om te beoordelen of de organen en weefsels tussen [vierkante haken] en alle andere organen en weefsels worden bewaard. De vet weergegeven organen moeten zo spoedig mogelijk na de sectie ontdaan worden van aanhechtend weefsel en nat worden gewogen om uitdroging te voorkomen. De schildklier en epididymides moeten alleen worden gewogen indien dit nodig is, omdat bij het ontdoen van aanhechtend weefsel artefacten kunnen ontstaan die het histopathologische onderzoek kunnen belemmeren. Weefsels en organen moeten worden gefixeerd in 10 % gebufferde formaldehyde of een ander geschikt fixeermiddel zodra de obductie is verricht, en ten minste 24 tot 48 uur vóór het ontdoen van aanhangend weefsel, afhankelijk van het gebruikte fixeermiddel.
                              
                                 Tabel 2
                              
                              
                                 Tijdens de macroscopische obductie bewaarde organen en weefsels
                              
                              
                                 Bijnieren
                              
                              Aorta
                              Beenmerg (en/of vers aspiraat)
                              
                                 Hersenen (inclusief coupes van cerebrum, cerebellum en medulla/pons)
                              Blindedarm
                              Colon
                              Duodenum
                              [Epididymides]
                              [Ogen (netvlies, oogzenuw) en oogleden]
                              Dijbeen en kniegewricht
                              Galblaas (indien aanwezig)
                              [Klieren van Harder]
                              
                                 Hart
                              
                              Ileum
                              Jejunum
                              
                                 Nieren
                              
                              [Traanklieren (extraorbitaal)]
                              Larynx (3 niveaus, inclusief de steel van de epiglottis)
                              
                                 Lever
                              
                              
                                 Long (alle lobben op één niveau, inclusief de hoofdbronchiën)
                              Lymfeklieren van de longhilus, met name bij slecht oplosbare teststoffen in deeltjesvorm. Voor grondiger onderzoek en/of studies met een immunologische focus kunnen aanvullende lymfeklieren worden overwogen, bv. uit de mediastinale, cervicale/submandibulaire en/of auriculaire streek.
                              Lymfeklieren (distaal van de porte d’entrée)
                              Borstklier (vrouwelijk)
                              Spieren (dij)
                              Weefsels van de nasofarynx (ten minste 4 niveaus; 1 niveau moet het nasofaryngaal kanaal en het nasofarynx-geassocieerd lymfatisch weefsel (nasal associated lymphoid tissue, NALT) omvatten.
                              Slokdarm
                              [Reukkolf]
                              
                                 Ovaria
                              
                              Alvleesklier
                              Bijschildklieren
                              Perifere zenuwen (nervus ischiadicus of nervus tibialis), bij voorkeur dicht bij de spier
                              Hypofyse
                              Prostaat
                              Rectum
                              Speekselklieren
                              Zaadblaasjes
                              Huid
                              Ruggenmerg (cervicaal, middenthoracaal en lumbaal)
                              
                                 Milt
                              
                              Borstbeen
                              Maag
                              Tanden
                              
                                 Testes
                              
                              
                                 Thymus
                              
                              
                                 Schildklieren
                              
                              [Tong]
                              Luchtpijp (ten minste 2 niveaus, inclusief 1 lengtecoupe door de carina en 1 dwarscoupe)
                              [Ureter]
                              [Urinebuis]
                              [Urineblaas]
                              
                                 Uterus
                              
                              Doelorganen
                              Alle macroscopisch waarneembare letsels en massa’s
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              De longen worden in hun geheel verwijderd, gewogen en ingedruppeld met een geschikt fixeermiddel bij 20-30 cm waterdruk om ervoor te zorgen dat de longstructuur intact blijft (5). De coupes worden voor alle lobben op één niveau, inclusief de hoofdbronchiën, gemaakt, maar als longlavage wordt uitgevoerd, worden van de niet gespoelde lob op drie niveaus coupes gemaakt (geen seriële coupes).
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Ten minste 4 niveaus van de weefsels van de nasofarynx worden onderzocht, waarvan er één het nasofaryngaal kanaal moet omvatten (5)(6)(7)(8)(9), om adequaat onderzoek mogelijk te maken van het plaveiselcelepitheel, overgangsepitheel (respiratoir zonder trilharen), ademhalingsepitheel (respiratoir met trilharen) en reukepitheel, alsmede het drainerend lymfatisch weefsel (NALT) (10)(11). Er worden drie niveaus van de larynx onderzocht; een van deze niveaus moet de steel van de epiglottis omvatten (12). Er worden ten minste twee niveaus van de luchtpijp onderzocht, inclusief één lengtecoupe door de carina van de splitsing van de extrapulmonale bronchiën, en één dwarscoupe.
                           
                        HISTOPATHOLOGIE
                  
                              45.
                           
                           
                              Alle in tabel 2 genoemde organen en weefsels worden histopathologisch onderzocht bij de controle- en hogeconcentratiegroepen, en bij alle dieren die tijdens het onderzoek sterven of worden gedood. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de luchtwegen, doelorganen, en macroscopisch waarneembaar letsel. De organen en weefsels die in de hogeconcentratiegroep letsel vertonen worden bij alle groepen onderzocht. De onderzoeksleider kan ervoor kiezen bij meer groepen histopathologisch onderzoek te verrichten, om een duidelijk verband tussen concentratie en respons aan te tonen. Indien van een satellietgroep (reversibiliteitsgroep) gebruik wordt gemaakt, dan wordt histopathologisch onderzoek verricht op alle weefsels en organen waar bij de behandelde groepen effecten blijken te zijn opgetreden. Indien er bij de hogeblootstellingsgroep buitensporig veel vroegtijdige sterfte of andere problemen optreden die afbreuk doen aan de significantie van de gegevens, wordt de groep die bij de op een na hoogste concentratie is blootgesteld, histopathologisch onderzocht. Getracht moet worden om de macroscopische waarnemingen te correleren aan microscopische bevindingen.
                           
                        GEGEVENS EN RAPPORTAGE
                  
                     Gegevens
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Voor elk dier apart worden gegevens over lichaamsgewicht, voedselverbruik, klinische pathologie, orgaangewichten en histopathologie vermeld. Daarnaast worden de gegevens van de klinische observatie in tabelvorm samengevat met voor alle testgroepen vermelding van het gebruikte aantal dieren, het aantal dieren dat specifieke toxiciteitsverschijnselen vertoonde, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of om redenen van dierenwelzijn is gedood, het tijdstip waarop elk dier is gestorven, een beschrijving van de toxische effecten met het verloop en de omkeerbaarheid en de obductiebevindingen. Alle resultaten, zowel numerieke als incidenteel, moeten met behulp van een geschikte statistische methode worden geëvalueerd. Iedere algemeen aanvaarde statistische methode mag worden gebruikt; de statistische methoden worden bij de opzet van het onderzoek gekozen.
                           
                        
                     Testverslag
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              In het testverslag wordt indien van toepassing de volgende informatie opgenomen:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Proefdieren en dierhouderij:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      beschrijving van de omstandigheden van de kooi, met inbegrip van: aantal (of verandering in het aantal) dieren per kooi, strooisel, omgevingstemperatuur en relatieve vochtigheid, lichtregime en identificatie van de voeding;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gebruikte soort/stam en motivering voor het gebruik van een ander soort dan ratten; herkomst en historische gegevens kunnen worden vermeld, indien zij betrekking hebben op dieren die zijn blootgesteld onder vergelijkbare omstandigheden wat betreft blootstelling, huisvesting en vasten;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      randomiseringsmethode;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      beschrijving van de eventuele conditionering voorafgaand aan de test, met inbegrip van voeding, quarantaine en behandeling voor ziekte.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Teststof:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fysische aard, zuiverheid en, indien relevant, fysisch-chemische eigenschappen (met inbegrip van de isomeersamenstelling);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identificatiegegevens en, indien bekend, CAS-nummer (Chemical Abstracts Service).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Medium:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivatie voor het gebruik van het medium en voor de keuze ervan (indien een ander medium dan water wordt gebruikt);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      historische of parallelle gegevens waaruit blijkt dat het medium niet interfereert met de uitkomst van de studie.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhalatiekamer:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gedetailleerde beschrijving van de inhalatiekamer, met inbegrip van de afmetingen en een schematische weergave;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      herkomst en beschrijving van de apparatuur die voor de blootstelling van dieren en het verkrijgen van de atmosfeer is gebruikt;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      apparatuur voor het meten van de temperatuur, de vochtigheid, de deeltjesgrootte en de feitelijke concentratie;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      herkomst van de lucht en systeem dat voor de conditionering is gebruikt;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toegepaste methoden voor de kalibratie van de apparatuur voor het verkrijgen van een homogene testatmosfeer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      drukverschil (positief of negatief);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      blootstellingspoorten per kamer (blootstelling via de neus alleen); locatie van de dieren in de kamer (blootstelling van het hele lijf);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stabiliteit van de testatmosfeer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      locatie van temperatuur- en vochtigheidssensoren en bemonstering van de testatmosfeer in de kamer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      behandeling van de aangevoerde/geëxtraheerde lucht;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      luchtdebiet, luchtdebiet per blootstellingspoort (blootstelling via de neus alleen) of dierbelasting per kamer (blootstelling van het hele lijf);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      equilibratietijd van de kamer (t95);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aantal volumeveranderingen per uur;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      meetapparaten (indien van toepassing).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Blootstellingsgegevens:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivering van de keuze van de doelconcentratie in de hoofdstudie;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominale concentraties (totale massa van de in de inhalatiekamer geleide teststof, gedeeld door het door de kamer geleide luchtvolume);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      feitelijke concentraties van de in het ademhalingsgebied van de dieren verzamelde teststof; voor mengsels die heterogene fysische vormen produceren (gassen, dampen, aerosolen) kan elke vorm afzonderlijk worden geanalyseerd;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      alle luchtconcentraties worden in massa-eenheden vermeld (mg/l, mg/m3 enz.), in plaats van in volume-eenheden (ppm, ppb enz.);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      deeltjesgrootteverdeling, massamediaan van de aerodynamische diameter (MMAD) en geometrische standaardafwijking (σg), onder vermelding van de wijze waarop zij zijn berekend. De individuele deeltjesgrootteanalysen worden vermeld.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testomstandigheden:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      details van de bereiding van de teststof, met inbegrip van details van de procedures die zijn gevolgd om de deeltjesgrootte van vast materiaal te verlagen of oplossingen van de teststof te bereiden;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een beschrijving (bij voorkeur met een schematische voorstelling) van de apparatuur die voor het verkrijgen van de testatmosfeer en de blootstelling van de dieren aan de testatmosfeer is gebruikt;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      details van de apparatuur die wordt gebruikt om de temperatuur in de kamer, de vochtigheid en de luchtdoorstroming in de kamer te controleren (d.w.z. ontwikkeling van een kalibratiecurve);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      details van de apparatuur die wordt gebruikt om monsters te verzamelen voor de bepaling van de kamerconcentratie en deeltjesgrootteverdeling;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      details van de toegepaste chemische analysemethode en de validering van die methode (met inbegrip van de efficiëntie van de recovery van de teststof uit het bemonsteringsmedium);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      randomiseringsmethode voor het indelen van de dieren in test- en controlegroepen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      details van de voeder- en waterkwaliteit (waaronder aard en herkomst van het voeder en herkomst van het water);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivering van de keuze van de testconcentraties.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Resultaten:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met de temperatuur, vochtigheid en luchtdoorstroming van de kamer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met de nominale en feitelijke concentratiegegevens van de kamer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met de deeltjesgroottegegevens met inbegrip van gegevens over de verzameling van het analytisch monster, de deeltjesgrootteverdeling en de berekening van de MMAD en σg;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met gegevens over de respons en het concentratieniveau voor elk dier (bv. dieren met toxiciteitsverschijnselen, met inbegrip van sterfte, en de aard, hevigheid, tijdstip van aanvang en duur van de effecten);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met het gewicht van elk dier;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met het voedselverbruik;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met klinisch-pathologische gegevens;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      voor elk dier de obductiebevindingen en de histopathologische bevindingen, indien beschikbaar.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bespreking en interpretatie van de resultaten:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      speciale aandacht wordt besteed aan de beschrijving van de methoden die zijn toegepast om te voldoen aan de criteria van deze testmethode, bv. de limietconcentratie of de deeltjesgrootte;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      er wordt aandacht besteed aan de inhaleerbaarheid van deeltjes in het licht van de algemene bevindingen, in het bijzonder als niet aan de deeltjesgroottecriteria kan worden voldaan;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      in de algehele beoordeling van de studie wordt aandacht besteed aan de consistentie van de methoden die voor de bepalingen van de nominale en feitelijke concentratie zijn toegepast, alsmede aan het verband tussen de feitelijke en de nominale concentratie;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      er wordt aandacht besteed aan de waarschijnlijke doodsoorzaak en overheersende werking (systemisch of plaatselijk);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      er wordt een toelichting gegeven als dieren op humane wijze moesten worden gedood omdat zij pijn hadden of tekenen van hevige en voortdurende angst vertoonden, op basis van de criteria in de OESO-leidraad voor humane eindpunten (3);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      het doelorganen (de doelorganen) moet (moeten) worden aangegeven;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      het NOAEL en LOAEL moet worden bepaald.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATUUR:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 413, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Whalan.E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419-428.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Verordening (EG) nr. 1272/2008 van het Europees Parlement en de Raad van 16 december 2008 betreffende de indeling, etikettering en verpakking van stoffen en mengsels tot wijziging en intrekking van de Richtlijnen 67/548/EEG en 1999/45/EG en tot wijziging van Verordening (EG) nr. 1907/2006 (PB L 353 van 31.12.2008, blz. 1).
                           
                        
                     Aanhangsel 1
                     DEFINITIE
                     Teststof: alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.
                  
                  B.30.   ONDERZOEK NAAR CHRONISCHE TOXICITEIT
                  
                  INLEIDING
                  
                              1.
                           
                           
                              Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 452 (2009) van de OESO. De oorspronkelijke TG 452 werd in 1981 vastgesteld. De ontwikkeling van deze herziene testmethode B.30 werd noodzakelijk geacht in het licht van recente ontwikkelingen op het gebied van dierenwelzijn en wettelijke voorschriften (1)(2)(3)(4). De actualisering van deze testmethode B.30 is gelijktijdig uitgevoerd met de herziening van hoofdstuk B.32 van deze bijlage, Carcinogeniteitsonderzoek, en hoofdstuk B.33 van deze bijlage, Gecombineerd onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit, en had tot doel aanvullende informatie te verkrijgen met behulp van de bij het onderzoek gebruikte dieren en nadere bijzonderheden over de keuze van de dosis te verschaffen. Deze testmethode is bedoeld voor gebruik bij het testen van een breed scala van stoffen, waaronder bestrijdingsmiddelen en industriële chemische stoffen.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Het meeste onderzoek naar chronische toxiciteit wordt uitgevoerd bij knaagdiersoorten en deze testmethode is daarom voornamelijk bedoeld voor onderzoek dat bij deze soorten wordt verricht. Als dergelijk onderzoek ook bij andere diersoorten dan knaagdieren moet worden uitgevoerd, kunnen de principes en procedures van deze testmethode, met de nodige aanpassingen, ook samen met die in hoofdstuk B.27 van deze bijlage, Toxiciteitsonderzoek (oraal) op dieren anders dan knaagdieren bij herhaalde toediening (90 dagen) (5), worden toegepast, zoals bedoeld in OESO-leidraad nr. 116 over het opzetten en uitvoeren van onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit (6).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              De drie belangrijkste toedieningswegen bij onderzoek naar chronische toxiciteit zijn de orale, de dermale en de inhalatieweg. De keuze van de toedieningsweg is afhankelijk van de fysische en chemische eigenschappen van de teststof en de voornaamste blootstellingsroute bij de mens. Nadere informatie over de keuze van de blootstellingsroute wordt verschaft in OESO-leidraad nr. 116 (6).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Deze testmethode spitst zich toe op blootstelling via de orale weg, de meest gebruikte route bij onderzoek naar chronische toxiciteit. Hoewel langetermijnonderzoek naar chronische toxiciteit met blootstelling via de dermale of de inhalatieweg ook noodzakelijk kan zijn om de risico’s voor de menselijke gezondheid te beoordelen, en/of vereist kan zijn op grond van bepaalde regelgevingskaders, zijn beide blootstellingsroutes technisch bijzonder complex. Dergelijk onderzoek dient per geval te worden opgezet, hoewel de hier beschreven testmethode voor het beoordelen en evalueren van chronische toxiciteit bij orale toediening kan worden gebruikt als basis voor een protocol voor dermaal en inhalatieonderzoek, rekening houdend met aanbevelingen ten aanzien van de behandelingsperiode, klinische en pathologische parameters enz. Er zijn OESO-richtsnoeren beschikbaar voor de toediening van teststoffen via de inhalatieweg (6)(7) en de dermale weg (6). Bij het opzetten van langetermijnonderzoek naar blootstelling via de inhalatieweg moet met name aandacht worden geschonken aan hoofdstuk B.8 van deze bijlage (8) en hoofdstuk B.29 van deze bijlage (9), samen met de OESO-leidraad voor acuut inhalatieonderzoek (7). In geval van tests die via de dermale weg worden uitgevoerd, dient hoofdstuk B.9 van deze bijlage (10) te worden geraadpleegd.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Het onderzoek naar chronische toxiciteit levert informatie op over de mogelijke gevaren voor de gezondheid die kunnen voortvloeien uit herhaalde blootstelling gedurende een aanzienlijk deel van de levensduur van de gebruikte diersoort. Het onderzoek zal informatie opleveren over de toxische effecten van de teststof, de doelorganen aanwijzen en de mogelijkheid van accumulatie aangeven. Daarnaast kan er een inschatting worden gemaakt van het niveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld. Aan de hand van deze inschatting kunnen vervolgens veiligheidscriteria voor de blootstelling van de mens worden vastgesteld. Bovendien wordt benadrukt dat het van groot belang is de dieren klinisch zorgvuldig te observeren, om zo veel mogelijk informatie te verkrijgen.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              De doelstellingen van het onder deze testmethode vallende onderzoek omvatten:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          het vaststellen van de chronische toxiciteit van een teststof;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het vaststellen van de doelorganen;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het karakteriseren van de dosis-responsverhouding;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het vaststellen van een niveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld (No-Observed Adverse Effect Level, NOAEL) of een uitgangspunt voor het bepalen van een benchmarkdosis (BMD);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het voorspellen van chronische toxische effecten bij niveaus waaraan mensen worden blootgesteld;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het verschaffen van gegevens om hypothesen over de werkingswijze te toetsen (6).
                                       
                                    
                        INLEIDENDE OVERWEGINGEN
                  
                              7.
                           
                           
                              Bij het beoordelen en evalueren van de toxicologische kenmerken van een teststof moet het testlaboratorium, alvorens het onderzoek uit te voeren, alle beschikbare informatie over de teststof in aanmerking nemen, zodat de opzet van het onderzoek zodanig kan worden afgestemd dat doelmatiger wordt getest op potentiële chronische toxiciteit en het gebruik van dieren wordt geminimaliseerd. Bij het opzetten van het onderzoek kan onder meer gebruik worden gemaakt van informatie over de identiteit, chemische structuur en fysisch-chemische eigenschappen van de teststof; de resultaten van eventuele in vitro of in vivo uitgevoerde toxiciteitstests; de voorgenomen toepassing(en) en de potentiële blootstelling van de mens; de beschikbare (Q)SAR-gegevens en toxicologische gegevens over chemische stoffen met een verwante structuur; de beschikbare toxicokinetische gegevens (kinetiek bij zowel eenmalige toediening als herhaalde toediening, indien beschikbaar), en aan ander onderzoek met herhaalde blootstelling ontleende gegevens. De chronische toxiciteit mag pas worden bepaald nadat eerst toxiciteitsgegevens zijn verkregen van toxiciteitsonderzoek met herhaalde toediening gedurende 28 dagen en/of 90 dagen. Als onderdeel van de algemene beoordeling van de potentiële schadelijke gezondheidseffecten van een bepaalde teststof (11)(12)(13)(14) moet een gefaseerde benadering van de chronische-toxiciteitstests worden overwogen.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Voordat met het onderzoek wordt begonnen, moet worden bepaald welke statistische methoden gezien de opzet van de proeven en de doelstellingen het best geschikt zijn voor de analyse van de uitkomsten. Zo moet onder meer worden overwogen of de statistische gegevens tevens een correctie voor overleving en een analyse in geval van voortijdige beëindiging van één of meer groepen moeten omvatten. Aanwijzingen voor de juiste statistische analysen en belangrijke verwijzingen naar internationaal erkende statistische methoden worden gegeven in richtsnoer nr. 116 (6) en richtsnoer nr. 35 over de analyse en evaluatie van onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit (15).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Bij het uitvoeren van onderzoek naar chronische toxiciteit moeten altijd de richtsnoeren en overwegingen worden gevolgd die worden beschreven in het OESO-leidraad nr. 19 betreffende het herkennen, beoordelen en gebruiken van klinische symptomen als humane eindpunten voor proefdiergebruik bij veiligheidsbeoordelingen (16), en met name punt 62 ervan. In dat punt wordt verklaard dat wanneer een dier bij onderzoek met herhaalde toediening klinische symptomen met een voortschrijdend karakter vertoont die leiden tot een verdere verslechtering van de toestand van het dier, op basis van de beschikbare informatie moet worden overwogen of het dier op humane wijze moet worden gedood. Hierbij moet tevens worden overwogen hoe de waarde van de informatie die kan worden gewonnen door het dier in kwestie te handhaven in het onderzoek zich verhoudt tot de algehele conditie van het dier. Als wordt besloten het dier in het onderzoek te handhaven, moet de frequentie van de waarnemingen zo nodig worden verhoogd. Het kan ook zijn dat het mogelijk is de pijn of angst te verlichten door de toediening van de dosis tijdelijk stop te zetten of de testdosis te verminderen, zonder dat dit het doel van het onderzoek nadelig beïnvloedt.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Nadere aanwijzingen en een bespreking van de principes voor de keuze van de dosis bij onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit zijn te vinden in leidraad nr. 116 (6) en twee publicaties van het International Life Sciences Institute (17)(18). Welke strategie voor dosiskeuze uiteindelijk wordt toegepast, is afhankelijk van de primaire doelstelling of doelstellingen van het onderzoek (punt 6). Bij het kiezen van de juiste dosisniveaus moet een evenwicht worden getroffen tussen enerzijds de gevarenscreening en anderzijds de karakterisering van de lagedosisrespons en de wisselwerking tussen de twee. Dit is met name relevant in situaties waarin gecombineerd onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit (hoofdstuk B.33 van deze bijlage) moet worden uitgevoerd (punt 11).
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Er moet worden nagegaan of gecombineerd onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit (hoofdstuk B.33 van deze bijlage) kan worden uitgevoerd in plaats van afzonderlijke studies naar chronische toxiciteit (deze testmethode B.30) en carcinogeniteit (hoofdstuk B.32 van deze bijlage). De gecombineerde test kost minder tijd en geld dan twee afzonderlijke studies, zonder dat dit ten koste gaat van de gegevenskwaliteit van de onderzoeksfasen. Bij uitvoering van gecombineerd onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit (hoofdstuk B.33 van deze bijlage) moet echter zorgvuldig rekening worden gehouden met de principes voor dosiskeuze (punt 9 en de punten 20 tot en met 25); bovendien kan de uitvoering van afzonderlijke studies verplicht zijn uit hoofde van bepaalde regelgevingskaders.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              De definities die in de context van deze testmethode worden gebruikt, zijn te vinden aan het eind van dit hoofdstuk en in leidraad nr. 116 (6).
                           
                        PRINCIPE VAN DE TEST
                  
                              13.
                           
                           
                              De teststof wordt dagelijks in trapsgewijs stijgende doses aan diverse groepen proefdieren toegediend, normaal gezien twaalf maanden achter elkaar, hoewel afhankelijk van de wettelijke voorschriften een kortere of langere duur kan worden gekozen (zie punt 33). De gekozen duur moet voldoende lang zijn zodat de eventuele effecten van cumulatieve toxiciteit tot uiting komen, zonder de storende effecten van geriatrische veranderingen. Afwijkingen van een blootstellingsduur van twaalf maanden moeten worden verantwoord, met name als voor een kortere duur wordt gekozen. De teststof wordt normaal gezien toegediend via de orale weg, hoewel ook de inhalatie- of de dermale weg geschikt kan zijn. Het onderzoek kan ook zo worden opgezet dat sommige dieren tussentijds worden gedood, bv. na drie en zes maanden, en dat met het oog hierop nieuwe groepen proefdieren kunnen worden toegevoegd (zie punt 19). Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven of worden gedood, wordt obductie verricht. Dieren die aan het eind van het onderzoek nog in leven zijn worden gedood en ook hierop wordt obductie verricht.
                           
                        BESCHRIJVING VAN DE METHODE
                  
                     Keuze van de diersoort
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Deze testmethode heeft hoofdzakelijk betrekking op de beoordeling en evaluatie van chronische toxiciteit bij knaagdieren (zie punt 2). Op grond van bepaalde regelgevingskaders kan echter vergelijkbaar onderzoek bij niet-knaagdieren vereist zijn. De keuze van de soort moet worden verantwoord. Bij het opzetten en uitvoeren van onderzoek naar chronische toxiciteit bij andere diersoorten dan knaagdieren moeten, zo nodig, de in deze testmethode beschreven principes als uitgangspunt worden genomen, in combinatie met de principes in hoofdstuk B.27 van deze bijlage, Toxiciteitsonderzoek (oraal) op dieren anders dan knaagdieren bij herhaalde toediening (90 dagen) (5). Nadere informatie over de keuze van de soort en de stam is te vinden in leidraad nr. 116 (6).
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              In deze testmethode wordt de voorkeur gegeven aan ratten, maar er kunnen ook andere knaagdiersoorten worden gebruikt, bijvoorbeeld muizen. Aan het gebruik van ratten en muizen als experimentele modellen wordt de voorkeur gegeven vanwege hun betrekkelijk korte levensduur, het grootschalige gebruik ervan bij farmacologisch en toxicologisch onderzoek, hun gevoeligheid voor tumorinductie en de beschikbaarheid van voldoende gekarakteriseerde stammen. Vanwege deze kenmerken is een grote hoeveelheid informatie over hun fysiologie en pathologie beschikbaar. Er worden jonge gezonde volwassen dieren van gangbare laboratoriumstammen gebruikt. Het onderzoek naar chronische toxiciteit uitgevoerd bij dieren van dezelfde stam en herkomst als die welke zijn gebruikt voor het inleidende toxiciteitsonderzoek van kortere duur. De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig zijn.
                           
                        
                     Huisvestings- en voedingsomstandigheden
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              De dieren kunnen individueel of in kleine groepjes van hetzelfde geslacht worden ondergebracht; individuele hokken moeten alleen worden overwogen als dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is (19)(20)(21). De kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. De temperatuur in de proefdierruimte dient 22 °C (± 3 °C) te zijn. Hoewel de relatieve luchtvochtigheid ten minste 30 % moet bedragen en, behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte, bij voorkeur niet hoger mag zijn dan 70 %, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. Het voer moet aan alle behoeften van de geteste soort voldoen en het gehalte aan onzuiverheden in het voer, met inbegrip van maar niet beperkt tot residuen van bestrijdingsmiddelen, persistente organische verontreinigende stoffen, fyto-oestrogenen, zware metalen en mycotoxinen, die van invloed kunnen zijn op de resultaten van het onderzoek, moet zo laag mogelijk zijn. Van tijd tot tijd moet er analytische informatie over het gehalte aan nutriënten en onzuiverheden in het voer worden samengesteld, ten minste aan het begin van het onderzoek en wanneer er veranderingen zijn in de gebruikte partij. Deze informatie moet in het eindverslag worden opgenomen. Ook over het bij het onderzoek gebruikte drinkwater moet analytische informatie worden verstrekt. De keuze van het voer kan worden beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende vermenging van de teststof te zorgen en te voldoen aan de voedingsbehoeften van de dieren wanneer die teststof via het voer wordt toegediend.
                           
                        
                     Voorbereiding van de dieren
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Er worden gezonde dieren gebruikt die gedurende ten minste zeven dagen aan de omstandigheden in het laboratorium hebben kunnen wennen en waarop geen eerdere proeven zijn uitgevoerd. Bij knaagdieren moet de toediening van de dosis zo snel mogelijk na het spenen en de acclimatisatie beginnen en bij voorkeur voordat de dieren acht weken oud zijn. Van de proefdieren worden de volgende kenmerken vastgelegd: soort, stam, herkomst, geslacht, gewicht en leeftijd. Aan het begin van het onderzoek moeten de gewichtsverschillen tussen de geslachten minimaal zijn en niet meer bedragen dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht van elk geslacht. De dieren worden willekeurig in de controle- en behandelingsgroepen ingedeeld. Na de willekeurige indeling mogen er binnen de geslachten geen significante verschillen in lichaamsgewicht zijn tussen de groepen. Als er statistisch significante verschillen zijn, moet de willekeurige indeling zo mogelijk opnieuw worden uitgevoerd. Aan elk dier moet een uniek identificatienummer worden toegekend in de vorm van een permanent merkteken dat met behulp van een tatoeage, een onder de huid ingebrachte microchip of via een andere geschikte methode wordt aangebracht.
                           
                        PROCEDURE
                  
                     Aantal en geslacht van de dieren
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Beide geslachten moeten worden gebruikt. Er moet een voldoende groot aantal dieren worden gebruikt om een grondige biologische en statistische evaluatie aan het einde van het onderzoek mogelijk te maken. Bij gebruik van knaagdieren moeten normaal gezien bij elk dosisniveau ten minste 20 dieren per geslacht per groep worden gebruikt. Bij gebruik van niet-knaagdieren wordt aanbevolen ten minste 4 dieren per geslacht per groep te gebruiken. Bij onderzoek waarbij muizen zijn betrokken, is het mogelijk dat per dosisgroep meer dieren nodig zijn om alle vereiste hematologische bepalingen uit te voeren.
                           
                        
                     Dieren tussentijds doden, satellietgroepen en verklikkerdieren
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Als onderdeel van het onderzoek kunnen sommige dieren (ten minste 10 dieren/geslacht/groep) tussentijds worden gedood, bijvoorbeeld na zes maanden voor de chronische-toxiciteitsfase, om informatie te verschaffen over de ontwikkeling van toxicologische veranderingen en mechanistische informatie, indien dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is. Als dergelijke informatie al beschikbaar is uit eerder toxiciteitsonderzoek met herhaalde toediening van de teststof, is het tussentijds doden van dieren mogelijk niet wetenschappelijk gerechtvaardigd. Ook satellietgroepen kunnen in het onderzoek worden opgenomen om de reversibiliteit van eventuele toxicologische effecten als gevolg van de onderzochte teststof te controleren. Hiervoor wordt doorgaans alleen het hoogste dosisniveau van het onderzoek met controlegroep gebruikt. Tijdens het onderzoek kan zo nodig ook een aanvullende groep verklikkerdieren (doorgaans vijf dieren per geslacht) worden opgenomen met het oog op de monitoring van de ziektestatus (22). Als dieren tussentijds zullen worden gedood, of satelliet- of verklikkergroepen in het onderzoek zullen worden opgenomen, moet het aantal dieren in de onderzoeksopzet worden vermeerderd met het aantal dieren dat voor afronding van het onderzoek zal worden gedood. Deze dieren moeten normaal gezien aan dezelfde waarnemingen worden onderworpen, met inbegrip van waarnemingen met betrekking tot het lichaamsgewicht, het voedsel- en waterverbruik, hematologische en klinisch-biochemische metingen en pathologisch onderzoek, als de dieren in de chronische-toxiciteitsfase van het hoofdonderzoek, hoewel de metingen (in de groepen met dieren die tussentijds worden gedood) ook kunnen worden beperkt tot specifieke, belangrijke parameters als neurotoxiciteit of immunotoxiciteit.
                           
                        
                     Dosisgroepen en dosering
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Aanwijzingen voor alle aspecten van de dosiskeuze en het interval tussen de dosisniveaus zijn te vinden in leidraad nr. 116 (6). Ten minste drie dosisniveaus en een bijbehorende controle zijn vereist, tenzij een limiettest wordt uitgevoerd (zie punt 27). De dosisniveaus worden doorgaans gebaseerd op de resultaten van korter onderzoek met herhaalde toediening of van bereikbepalingonderzoek, en er moet rekening worden gehouden met bestaande toxicologische en toxicokinetische gegevens die voor de teststof of aanverwante stoffen beschikbaar zijn.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Tenzij dit vanwege de fysisch-chemische aard of biologische kenmerken van de teststof onmogelijk is, moet de hoogste dosis normaliter zodanig worden gekozen dat de voornaamste doelorganen en toxische effecten worden vastgesteld zonder dat dit leed, ernstige toxiciteit, ziekteverschijnselen of sterfte veroorzaakt. Het hoogste dosisniveau moet, rekening houdend met de in punt 22 beschreven factoren, zodanig worden gekozen dat er tekenen van toxiciteit optreden, die bijvoorbeeld blijken uit een lichte achteruitgang van de gewichtstoename (ca. 10 %).
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Afhankelijk van het doel van het onderzoek (zie punt 6), kan echter een hoogste dosis worden gekozen die lager is dan de dosis waarbij tekenen van toxiciteit optreden, bv. als een dosis een zorgwekkend schadelijk effect heeft dat niettemin weinig invloed heeft op de levensduur of het lichaamsgewicht. De hoogste dosis mag niet hoger zijn dan 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag (limietdosis: zie punt 27).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              De dosisniveaus en het interval tussen de dosisniveaus kunnen zo worden gekozen dat een dosisrespons en een NOAEL of ander beoogd resultaat van het onderzoek, bv. een BMD (zie punt 25), bij het laagste dosisniveau worden vastgesteld. Factoren die moeten worden meegewogen bij de toediening van lagere doses omvatten de verwachte helling van de dosis-responscurve, de doses waarbij belangrijke veranderingen in het metabolisme of de toxische werking kunnen optreden, de verwachte locatie van een drempelwaarde of de verwachte locatie van een uitgangspunt voor extrapolatie naar lage doses.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Het gekozen interval tussen de dosisniveaus hangt van de kenmerken van de teststof af en kan niet in deze testmethode worden voorgeschreven, maar doorgaans leveren twee- tot viervoudige intervallen goede testresultaten op wanneer zij worden gebruikt voor de instelling van de afnemende dosisniveaus, en de toevoeging van een vierde testgroep is vaak te verkiezen boven het gebruik van zeer grote intervallen (bv. meer dan een factor van ongeveer 6 à 10) tussen twee doseringen. In het algemeen moet het gebruik van factoren boven de 10 worden vermeden en worden verantwoord als deze toch worden gebruikt.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Zoals nader wordt beschreven in leidraad nr. 6 (6), moet bij de keuze van de dosis rekening worden gehouden met het volgende:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          bekende of vermoedelijke niet-lineariteiten of buigpunten in de dosisrespons;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toxicokinetiek en dosisbereiken waarbij metabolische inductie, verzadiging of niet-lineariteit tussen externe en interne doses al dan niet optreden;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          precursorletsels en merkstoffen die het effect of indicatoren die de werking van de voornaamste fundamentele biologische processen aangeven;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de voornaamste (of vermoedelijke) aspecten van de werkingswijze, zoals doses waarbij de cytotoxiciteit begint toe te nemen, hormoonniveaus verstoord raken, homeostatische mechanismen het onderspit delven enz.;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          gebieden van de dosis-responscurve die een bijzonder robuuste schatting behoeven, bv. op het gebied van de verwachte BMD of een vermoedelijke drempelwaarde;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de verwachte blootstellingsniveaus bij de mens.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              De controlegroep wordt niet of, als bij de toediening van de teststof een medium wordt gebruikt, met medium behandeld. Afgezien van de behandeling met de teststof moeten de dieren in de controlegroep op dezelfde wijze worden behandeld als die in de testgroep. Als er een medium wordt gebruikt, wordt aan de controlegroep de hoogste gebruikte mediumdosis van de dosisgroepen toegediend. Indien een teststof wordt toegediend via de voeding en deze een geringere voedingsopname veroorzaakt omdat de voeding daardoor minder appetijtelijk is, kan een aanvullende paargevoede controlegroep dienen als een meer geschikte controle.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Indien op grond van tijdens inleidend onderzoek verkregen informatie kan worden verwacht dat een test op één dosisniveau dat overeenstemt met ten minste 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag, bij gebruikmaking van de beschreven procedures voor dit onderzoek waarschijnlijk geen schadelijke effecten geeft en als, op grond van gegevens van tests met structureel verwante stoffen, geen toxiciteit wordt verwacht, kan een volledig onderzoek waarbij van drie dosisniveaus gebruik wordt gemaakt mogelijk achterwege blijven. Een limiet van 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag kan van toepassing zijn, tenzij het blootstellingsniveau bij de mens duidt op de noodzaak een hoger dosisniveau te gebruiken.
                           
                        
                     Bereiding en toediening van doses van de teststof
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              De teststof wordt normaal gezien oraal, met de voeding of het drinkwater, of via een maagsonde toegediend. Nadere informatie over de toedieningswegen en -methoden is te vinden in leidraad nr. 116 (6). De toedieningsweg en de toedieningsmethode zijn afhankelijk van het doel van het onderzoek, de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof, de biologische beschikbaarheid ervan en de voornaamste blootstellingsroute en -methode bij de mens. De keuze van de toedieningsweg en de toedieningsmethode moet worden gemotiveerd. In het belang van het welzijn van de dieren moet de orale maagsonde normaal gesproken alleen worden gekozen in geval van agentia waarvoor de gekozen toedieningsweg- en methode redelijk overeenkomen met de mogelijke blootstelling van de mens (bijvoorbeeld bij geneesmiddelen). Bij in de voeding of het milieu voorkomende chemische stoffen zoals bestrijdingsmiddelen wordt de teststof doorgaans toegediend via de voeding of het drinkwater. In sommige scenario’s, bijvoorbeeld bij beroepsmatige blootstelling, kan toediening via andere wegen geschikter zijn.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Waar nodig wordt de teststof in een geschikt medium opgelost of gesuspendeerd. Er moet rekening worden gehouden met de volgende eigenschappen van het medium en andere additieven, naargelang hetgeen van toepassing is: effecten op de absorptie, de distributie, het metabolisme of de retentie van de teststof; effecten op de chemische eigenschappen van de teststof die de toxische kenmerken ervan kunnen veranderen; en effecten op het voedsel- of waterverbruik of de voedingsstatus van de dieren. Aanbevolen wordt eerst na te gaan of het mogelijk is een waterige oplossing/suspensie te gebruiken, als dit niet kan een oplossing/emulsie in olie (bv. maïsolie) te overwegen en daarna eventueel een ander medium. Wanneer een ander medium dan water wordt gebruikt, moeten de toxische kenmerken daarvan bekend zijn. Er moet informatie beschikbaar zijn over de stabiliteit van de teststof en de homogeniteit van de doseeroplossingen of het voer (naargelang hetgeen van toepassing is) onder de toedieningsomstandigheden (bv. dieet).
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Wanneer stoffen met de voeding of het drinkwater worden toegediend, moet erop worden toegezien dat de hoeveelheden van de teststof niet interfereren met de normale voedings- of waterbalans. Bij langetermijnonderzoek naar toxiciteit waarbij de teststof via het voer wordt toegediend, mag de concentratie van de teststof in de voeding de bovengrens van 5 % van de totale hoeveelheid voer normaal gesproken niet overschrijden om onevenwichtigheden in de voeding te vermijden. Indien de teststof met de voeding wordt toegediend, kan een constante voedingsconcentratie (mg/kg voer of ppm) of een constant dosisniveau als functie van het lichaamsgewicht van het dier (mg/kg lichaamsgewicht), berekend op weekbasis, worden gebruikt. Aangegeven moet worden welk alternatief is gebruikt.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Bij orale toediening wordt de teststof dagelijks (zeven dagen per week) aan de dieren toegediend, doorgaans gedurende twaalf maanden (zie ook punt 33), hoewel afhankelijk van de wettelijke voorschriften een langere duur nodig kan zijn. Elk ander doseringsschema, bv. vijf dagen per week, moet worden gemotiveerd. Bij toediening via de huid worden de dieren normaal gesproken ten minste 6 uur per dag, zeven dagen per week met de teststof behandeld, zoals wordt beschreven in hoofdstuk B.9 van deze bijlage (10), gedurende twaalf maanden. Blootstelling via inhalatie geschiedt 6 uur per dag, zeven dagen per week, maar ook blootstelling gedurende vijf dagen is mogelijk, indien dit wordt verantwoord. De blootstellingsperiode duurt doorgaans twaalf maanden. Als andere knaagdiersoorten dan ratten uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan de maximale blootstellingsduur worden aangepast om soortspecifieke symptomen van angst te minimaliseren. Een blootstellingsduur van minder dan 6 uur per dag moet worden gemotiveerd. Zie ook hoofdstuk B.8 van deze bijlage (8).
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Indien de teststof via een maagsonde aan de dieren wordt toegediend, moet dit iedere dag op hetzelfde tijdstip gebeuren met gebruikmaking van een maagbuisje of een geschikte intubatiecanule. Normaliter zal eenmaal per dag één dosis worden toegediend; als een stof lokale irritaties veroorzaakt, kan de dagelijkse doseersnelheid mogelijk worden gehandhaafd door de toe te dienen dosis te splitsen (tweemaal per dag). Het maximale vloeistofvolume dat in één keer kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het dier. Het volume moet zo laag mogelijk worden gehouden als praktisch uitvoerbaar is en mag bij knaagdieren normaliter niet meer dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht bedragen (22). Variaties in het testvolume moeten tot een minimum worden beperkt door de concentratie zodanig aan te passen dat bij alle dosisniveaus hetzelfde constante volume kan worden gebruikt. Een uitzondering vormen mogelijk bijtende of irriterende stoffen, die moeten worden verdund om ernstige lokale effecten te vermijden. Tests bij concentraties die waarschijnlijk een bijtende of irriterende werking hebben op het maag-darmkanaal, moeten worden vermeden.
                           
                        
                     Duur van het onderzoek
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              Hoewel deze testmethode in de eerste plaats is opgezet als een onderzoek van twaalf maanden naar de chronische toxiciteit, maakt de onderzoeksopzet ook een kortere (bv. 6 of negen maanden) of langere (bv. 18 of 24 maanden) onderzoeksduur mogelijk, afhankelijk van de eisen van de regelgeving of met het oog op specifieke mechanistische doeleinden. Afwijkingen van een blootstellingsduur van twaalf maanden moeten worden verantwoord, met name als voor een kortere duur wordt gekozen. Satellietgroepen die zijn opgenomen ter controle van de omkeerbaarheid van eventuele toxicologische veranderingen als gevolg van de onderzochte teststof moet dosering worden onthouden gedurende niet minder dan vier weken en niet meer dan een derde van de totale onderzoeksduur nadat de blootstelling is gestaakt. Nadere aanwijzingen, onder meer over de overleving tijdens het onderzoek, zijn te vinden in leidraad nr. 116 (6).
                           
                        WAARNEMINGEN
                  
                              34.
                           
                           
                              Alle dieren moeten worden onderzocht op ziekelijkheid of sterfte, gewoonlijk aan het begin en einde van elke dag, ook tijdens de weekends en de feestdagen. De proefdieren moeten ten minste eenmaal per dag worden geobserveerd, bij voorkeur op hetzelfde tijdstip, waarbij rekening moet worden gehouden met de piekperiode van verwachte effecten na toediening van de dosis via een maagsonde.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Alle dieren moeten ten minste eenmaal voor de eerste blootstelling aan een uitgebreid klinisch onderzoek worden onderworpen (om intra-individuele vergelijking mogelijk te maken), aan het einde van de eerste week van het onderzoek en vervolgens elke maand. Het waarnemingsprotocol moet zodanig worden opgezet dat verschillen tussen individuele waarnemers worden geminimaliseerd en onafhankelijk zijn van de testgroep. De dieren moeten buiten hun kooi worden geobserveerd, bij voorkeur telkens in een standaardgebied en op hetzelfde tijdstip. De gegevens moeten zorgvuldig worden opgetekend, bij voorkeur met behulp van scoringssystemen die door het testlaboratorium expliciet zijn gedefinieerd. Er moet worden getracht verschillen in de observatiecondities tot een minimum te beperken. Tekenen waarop moet worden gelet zijn onder meer (maar niet alleen): veranderingen in huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van af- en uitscheiding, en onwillekeurige reacties zoals traanvorming, rechtopstaan van het haar, verandering van de pupilgrootte en een ongewoon ademhalingspatroon. Ook verandering in gang, houding en reactiviteit op vastpakken, alsmede de aanwezigheid van klonische of tonische bewegingen, stereotiep gedrag (bijvoorbeeld overmatige lichaamsverzorging, herhaaldelijk ronddraaien) of bizar gedrag (bijvoorbeeld zelfverminking, achteruitlopen) moeten worden opgetekend (24).
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Vóór de eerste toediening van de teststof wordt bij alle dieren een oftalmologisch onderzoek uitgevoerd, waarbij gebruik wordt gemaakt van een oftalmoscoop of een ander geschikt apparaat. Bij beëindiging van het onderzoek wordt dit oftalmologisch onderzoek bij alle dieren verricht, maar ten minste bij die in de hogedosisgroep en in de controlegroep. Als met de behandeling samenhangende veranderingen in de ogen worden geconstateerd, moeten alle dieren worden onderzocht. Als de structurele analyse of andere informatie wijst op oculaire toxiciteit, moet de frequentie van het oogonderzoek worden verhoogd.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Voordat met het onderzoek wordt begonnen en met tussenpozen van drie maanden tot ten hoogste twaalf maanden na aanvang van het onderzoek, alsmede bij beëindiging van het onderzoek (als dit langer duurt dan twaalf maanden) kunnen, in geval van chemische stoffen waarvoor uit eerdere toxiciteitsonderzoek met herhaalde toediening gedurende 28 dagen en/of 90 dagen is gebleken dat deze kunnen leiden tot neurotoxische effecten, facultatief onderzoeken van de sensorische reacties op verschillende soorten stimuli (24) (bijvoorbeeld van auditieve, visuele en proprioceptieve aard) (25)(26)(27), alsmede een bepaling van de grijpkracht (28) en de motorische activiteit (29) worden verricht. Meer informatie over de procedures die kunnen worden gevolgd, is te vinden in de desbetreffende literatuur. Er kunnen evenwel ook andere dan de genoemde procedures worden toegepast.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              In geval van chemische stoffen waarvoor uit eerder toxiciteitsonderzoek met herhaalde toediening gedurende 28 dagen en/of 90 dagen is gebleken dat deze kunnen leiden tot immunotoxische effecten kan facultatief nader onderzoek van dit eindpunt worden verricht bij beëindiging van het onderzoek.
                           
                        
                     Lichaamsgewicht. voedsel-/waterverbruik en voedselefficiëntie
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Aan het begin van het onderzoek moeten alle dieren de eerste 13 weken ten minste één keer per week worden gewogen en daarna ten minste één keer per maand. Ook het voedselverbruik en de voedselefficiëntie moeten de eerste 13 weken ten minste één keer per week worden gemeten en daarna ten minste één keer per maand. Het waterverbruik moet de eerste 13 weken ten minste één keer per week worden gemeten en daarna ten minste één keer per maand als de stof met het drinkwater wordt toegediend. Meting van het waterverbruik moet ook worden overwogen bij onderzoek waarbij de drinkactiviteit verandert.
                           
                        
                     Hematologie en klinisch-biochemische bepalingen
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Bij onderzoek waarbij knaagdieren zijn betrokken, wordt na drie, zes en twaalf maanden, alsook bij beëindiging van het onderzoek (als dit langer duurt dan twaalf maanden) hematologisch onderzoek verricht op ten minste tien mannetjes en tien vrouwtjes per groep, waarbij telkens dezelfde dieren worden gebruikt. Bij muizen moeten mogelijk dieren in satellietgroepen worden gebruikt om alle vereiste hematologische bepalingen te verrichten (zie punt 18). Bij onderzoek met andere soorten dan knaagdieren worden monsters genomen bij een kleiner aantal dieren (bijvoorbeeld 4 dieren per geslacht en per groep bij onderzoek bij honden), op tussentijdse bemonsteringstijdstippen en bij beëindiging van het onderzoek, zoals beschreven voor knaagdieren. Er hoeven bij knaagdieren of andere soorten dan knaagdieren na drie maanden geen metingen te worden verricht als er geen effect is opgetreden op de hematologische parameters in een eerder onderzoek van 90 dagen met vergelijkbare dosisniveaus. Er moeten bloedmonsters worden genomen en daarbij dient te worden genoteerd uit welk lichaamsdeel en hoe de monsters zijn genomen, bijvoorbeeld door middel van een hartpunctie of uit de retro-orbitale sinus, onder verdoving.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              De volgende parameters worden onderzocht (30): totale en gedifferentieerde telling van de leukocyten, telling van de erytrocyten, telling van de bloedplaatjes, hemoglobinegehalte, hematocriet, gemiddeld volume van de erytrocyten (Mean Corpuscular Volume, MCV), hemoglobinegehalte per erytrocyt (Mean Corpuscular Haemoglobin, MCH), hemoglobinegehalte per volume-eenheid erytrocyten (Mean Corpuscular Haemoglobin Concentration, MCHC), prothrombinetijd en geactiveerde partiële thromboplastinetijd. Afhankelijk van de toxiciteit van de teststof kunnen ook andere hematologische parameters worden gemeten, zoals de Heinz-lichaampjes of andere morfologische afwijkingen van de erytrocyten of methemoglobine. In het algemeen moet een flexibele aanpak worden gehanteerd, afhankelijk van het waargenomen en/of verwachte effect van een bepaalde teststof. Als de teststof een effect heeft op het hematopoëtisch systeem, moeten mogelijk ook reticulocytentellingen en beenmergcytologie worden getest, hoewel deze niet routinematig hoeven te worden onderzocht.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Klinisch-biochemische bepalingen die bedoeld zijn om wezenlijke toxische effecten in weefsels en met name effecten op de nieren en lever te onderzoeken, moeten worden verricht op bloedmonsters die van ten minste tien mannetjes en 10 vrouwtjes per groep worden genomen, met dezelfde intervallen als wordt aangegeven voor hematologisch onderzoek, waarbij telkens dezelfde dieren worden gebruikt. Bij muizen moeten mogelijk dieren in satellietgroepen worden gebruikt om alle vereiste klinisch-biochemische bepalingen te verrichten. Bij onderzoek met andere soorten dan knaagdieren worden monsters genomen bij een kleiner aantal dieren (bijvoorbeeld 4 dieren per geslacht en per groep bij onderzoek bij honden), op tussentijdse bemonsteringstijdstippen en bij beëindiging van het onderzoek, zoals beschreven voor knaagdieren. Er hoeven na drie maanden geen metingen te worden verricht, noch bij knaagdieren noch bij andere diersoorten, als er in een eerder onderzoek van 90 dagen bij vergelijkbare dosisniveaus geen effect op klinisch-biochemische parameters is geconstateerd. Het verdient aanbeveling om de dieren (met uitzondering van muizen) vóór de bloedafname een nacht te laten vasten. De volgende parameters worden onderzocht (30): glucose, ureum (ureumstikstof), creatinine, totaal eiwit, albumine, calcium, natrium, kalium, totaal cholesterol, ten minste twee tests voor een hepatocellulaire evaluatie (alanineaminotransferase, aspartaataminotransferase, glutamaatdehydrogenase, totaal galzuren) (31), en ten minste twee tests voor hepatobiliaire evaluatie (alkalische fosfatase, gamma-glutamyltransferase, 5’-nucleotidase, totaal bilirubine, totaal galzuren) (31). Naargelang hetgeen van toepassing is, kunnen andere klinisch-chemische parameters als triglyceriden bij nuchtere toestand, specifieke hormonen en cholinesterase worden gemeten, afhankelijk van de toxiciteit van de teststof. In het algemeen is een flexibele aanpak nodig, afhankelijk van het waargenomen en/of verwachte effect van een bepaalde stof.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Bij ten minste tien mannetjes en tien vrouwtjes per groep moet de urine worden geanalyseerd, waarbij op dezelfde regelmatige tijdstippen urinemonsters moeten worden genomen als bij de hematologische en klinisch-chemische monsters. Metingen na drie maanden hoeven niet te worden verricht als bij het urineonderzoek in een eerder onderzoek van 90 dagen bij vergelijkbare dosisniveaus geen effect is geconstateerd. De volgende lijst van parameters is afkomstig uit een deskundige aanbeveling inzake klinisch-pathologisch onderzoek (30): uitzien, volume, osmolaliteit of soortelijk gewicht, pH, totaal eiwit, en glucose. Andere bepalingen omvatten keton, urobilinogeen, bilirubine en occult bloed. Indien nodig kunnen hieraan nog andere parameters worden toegevoegd om het onderzoek van de waargenomen effecten verder uit te breiden.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Er wordt in het algemeen van uitgegaan dat in geval van onderzoek bij honden basisgegevens voor hematologische en klinisch-biochemische variabelen vereist zijn vóór aanvang van de behandeling, maar dat die voor onderzoek bij knaagdieren niet hoeven te worden bepaald (30). Als de basisgegevens uit het verleden (zie paragraaf 50) ontoereikend zijn, moet worden overwogen om dergelijke gegevens alsnog te genereren.
                           
                        
                     Pathologie
                  
                  
                     Macroscopische obductie
                  
                  
                              45.
                           
                           
                              Bij alle dieren in het onderzoek moet normaal gesproken een volledige macroscopische obductie worden uitgevoerd, waaronder een zorgvuldig onderzoek van het huidoppervlak, alle lichaamsopeningen alsmede de schedelholte, de borstholte en de buikholte, en de inhoud daarvan. Het is echter mogelijk dat (bij de groepen met dieren die tussentijds moeten worden gedood of in de satellietgroepen) de metingen moeten worden beperkt tot specifieke, belangrijke parameters als neurotoxiciteit of immunotoxiciteit (zie punt 19). Bij deze dieren hoeft geen obductie te worden uitgevoerd en kunnen ook de in de volgende punten beschreven vervolgprocedures achterwege blijven. De onderzoeksleider bepaalt van geval tot geval of obductie op de verklikkerdieren noodzakelijk is.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Voor alle dieren, behalve die welke op grond van het tweede deel van punt 45 worden uitgesloten, moeten de orgaangewichten worden bepaald. De bijnieren, de hersenen, de epididymides, het hart, de nieren, de lever, de eierstokken, de milt, de testes, de schildklier (gewogen na fixatie, inclusief bijschildklieren) en de baarmoeder van alle dieren (afgezien van stervende en/of tussentijds gedode dieren) moeten worden ontdaan van aanhechtend weefsel, naargelang hetgeen van toepassing is, en moeten zo spoedig mogelijk na de sectie nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. In een onderzoek dat gebruikmaakt van muizen is weging van de bijnieren facultatief.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              De volgende weefsels moeten in een fixeermiddel worden bewaard dat zowel voor het type weefsel als voor het beoogde latere histopathologische onderzoek (32) geschikt is (de weefsels tussen rechte haken zijn facultatief):
                              
                                          elk macroscopisch waarneembaar letsel
                                       
                                       
                                          hart
                                       
                                       
                                          alvleesklier
                                       
                                       
                                          maag (voormaag, kliermaag)
                                       
                                    
                                          bijnier
                                       
                                       
                                          ileum
                                       
                                       
                                          bijschildklier
                                       
                                       
                                          [tanden]
                                       
                                    
                                          aorta
                                       
                                       
                                          jejunum
                                       
                                       
                                          perifere zenuw
                                       
                                       
                                          testis
                                       
                                    
                                          hersenen (inclusief coupes van cerebrum, cerebellum en medulla/pons)
                                       
                                       
                                          nier
                                       
                                       
                                          hypofyse
                                       
                                       
                                          thymus
                                       
                                    
                                          blindedarm
                                       
                                       
                                          traanklier (extraorbitaal)
                                       
                                       
                                          prostaat
                                       
                                       
                                          schildklier
                                       
                                    
                                          cervix
                                       
                                       
                                          lever
                                       
                                       
                                          rectum
                                       
                                       
                                          [tong]
                                       
                                    
                                          coagulans afscheidende klier
                                       
                                       
                                          long
                                       
                                       
                                          speekselklier
                                       
                                       
                                          luchtpijp
                                       
                                    
                                          colon
                                       
                                       
                                          lymfeklieren (zowel oppervlakkig als dieper gelegen)
                                       
                                       
                                          zaadblaasje
                                       
                                       
                                          urineblaas
                                       
                                    
                                          duodenum
                                       
                                       
                                          borstklier (verplicht bij vrouwtjes en facultatief bij mannetjes, indien zichtbaar ontleedbaar)
                                       
                                       
                                          skeletspier
                                       
                                       
                                          uterus (inclusief cervix)
                                       
                                    
                                          epididymis
                                       
                                       
                                          [bovenste luchtwegen, inclusief neus, neusschelpen en paranasale sinussen]
                                       
                                       
                                          huid
                                       
                                       
                                          [ureter]
                                       
                                    
                                          oog (inclusief netvlies)
                                       
                                       
                                          slokdarm
                                       
                                       
                                          ruggenmerg (drie niveaus: cervicaal, mediothoracaal en lumbaal)
                                       
                                       
                                          [urinebuis]
                                       
                                    
                                          [dijbeen met gewricht]
                                       
                                       
                                          [reukkolf]
                                       
                                       
                                          milt
                                       
                                       
                                          vagina
                                       
                                    
                                          galblaas (bij andere diersoorten dan ratten)
                                       
                                       
                                          ovarium
                                       
                                       
                                          [borstbeen]
                                       
                                       
                                          coupe van het beenmerg en/of vers beenmergaspiraat
                                       
                                    
                                          klier van Harder
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    Organen die paarsgewijs voorkomen, bv. nieren en bijnieren, moeten beide worden bewaard. Uit de klinische en andere bevindingen kan de noodzaak blijken verder weefsel te onderzoeken. Ook organen waarvan op basis van de bekende eigenschappen van de teststof verondersteld wordt dat ze kunnen worden aangetast, moeten worden bewaard. Bij onderzoek waarbij de dermale toedieningsweg wordt gebruikt, moeten de organen worden bewaard die voor de orale toedieningsweg zijn vastgesteld en is het van essentieel belang dat specifieke monsters van de huid op de toedieningslocatie worden genomen en bewaard. Bij inhalatieonderzoek moet de lijst van luchtwegweefsels die moeten worden bewaard en onderzocht, worden gebaseerd op de aanbevelingen in hoofdstuk B.8 van deze bijlage (8) en hoofdstuk B.29 van deze bijlage (9). In geval van andere organen/weefsels (en in aanvulling op de specifiek bewaarde weefsels van de luchtwegen) moeten de organen worden onderzocht die voor de orale toedieningsweg zijn vastgesteld.
                           
                        
                     Histopathologie
                  
                  
                              48.
                           
                           
                              Er zijn aanwijzingen beschikbaar voor beste praktijken voor de uitvoering van toxicologisch-pathologisch onderzoek (32). Ten minste het volgende histopathologische onderzoek dient te worden verricht:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          alle weefsels van de dieren in de hogedosisgroep en de controlegroep;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          alle weefsels van dieren die tijdens het onderzoek stierven of werden gedood;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          alle weefsels die macroscopische abnormaliteiten vertonen;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          doelweefsels of weefsels die met de behandeling samenhangende veranderingen vertonen in de hogedosisgroep en van alle dieren in alle andere dosisgroepen;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          organen die paarsgewijs voorkomen, bijvoorbeeld nieren en bijnieren, moeten beide worden onderzocht.
                                       
                                    
                        GEGEVENS EN RAPPORTAGE
                  
                     Gegevens
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Voor elk dier worden apart gegevens verstrekt over alle geëvalueerde parameters. Bovendien moeten alle gegevens worden samengevat in tabellen die voor iedere testgroep laten zien: het aantal dieren aan het begin van het onderzoek, het aantal dieren dat tijdens de test is gestorven of om redenen van dierenwelzijn moest worden gedood en het tijdstip waarop de dood bij de individuele dieren is ingetreden, het aantal dieren dat toxiciteitsverschijnselen vertoont, een beschrijving van de waargenomen toxische effecten, met inbegrip van de aanvang, de duur en de ernst van eventuele toxische effecten, het aantal dieren met letsel, de aard van het letsel en het percentage dieren waarbij ieder type letsel voorkomt. De gemiddelden en standaarddeviaties (voor continue testgegevens) van de dieren waarbij toxische effecten of letsels voorkomen, worden in tabelvorm samengevat, in aanvulling op de inschaling van de letsels.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Bij de interpretatie van de onderzoeksresultaten kunnen controlegegevens uit het verleden nuttig zijn, bv. wanneer er aanwijzingen zijn dat de gegevens van de parallelle controlegroepen aanzienlijk afwijken van de recente gegevens van de controledieren in dezelfde testfaciliteit/kolonie. Controlegegevens uit het verleden die ter evaluatie worden aangeboden, moeten afkomstig zijn uit hetzelfde laboratorium, verband houden met dieren van dezelfde leeftijd en stam, en zijn gegenereerd gedurende de vijf jaar die zijn voorafgegaan aan het onderzoek in kwestie.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Voor zover van toepassing moeten alle waargenomen resultaten met behulp van een geschikte en algemeen erkende statistische methode worden geëvalueerd. De statistische methoden en de te analyseren gegevens moeten tijdens het opzetten van het onderzoek worden gekozen (zie punt 8). Bij de selectie moet zo nodig worden gecorrigeerd voor overleving.
                           
                        
                     Testverslag
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Teststof:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fysische aard, zuiverheid en fysisch-chemische eigenschappen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identificatiegegevens;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      herkomst van de stof;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      partijnummer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      certificaat van chemische analyse.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Medium (indien van toepassing):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivering voor de keuze van het medium (wanneer dat geen water is).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Proefdieren:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gebruikte diersoort/stam en motivering van de keuze;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aantal, leeftijd en geslacht van de dieren bij aanvang van de test;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      herkomst, huisvesting, voeding enz.;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gewicht van elk dier aan het begin van de test.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testomstandigheden:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivering voor de gekozen toedieningsweg en de keuze van de dosis;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toegepaste statistische methoden voor analyse van de gegevens, indien van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bijzonderheden over de formulering van de teststof, respectievelijk de samenstelling van het voer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analytische gegevens over de bereikte concentratie, stabiliteit en homogeniteit van het preparaat;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de toedieningsweg en bijzonderheden over de toediening van de teststof;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bij inhalatieonderzoek, alleen via de neus of via het hele lichaam;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      werkelijke doses (mg/kg lichaamsgewicht/dag) en conversiefactor van de teststofconcentratie (mg/kg of ppm) in het voedsel/drinkwater naar de werkelijke dosis, voor zover van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en het water.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Resultaten (er moeten samengevatte gegevens in tabelvorm en gegevens voor elk dier apart worden verstrekt):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      overlevingsgegevens;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      lichaamsgewicht en veranderingen in het lichaamsgewicht;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      voedselverbruik, voedselefficiëntie, indien berekend, en waterverbruik, indien van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gegevens over de toxische reacties naar geslacht en dosisniveau, met inbegrip van toxiciteitsverschijnselen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aard, frequentie (en indien beoordeeld, ernst) en duur van de klinische waarnemingen (van voorbijgaande aard dan wel blijvend);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uitgevoerd oftalmologisch onderzoek;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematologische tests;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klinisch-biochemische tests;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      urinalysetests;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      resultaten van eventueel onderzoek naar neurotoxiciteit of immunotoxiciteit;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      lichaamsgewicht aan het einde van het onderzoek;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      orgaangewichten (en hun verhoudingen, indien van toepassing);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      obductiebevindingen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een gedetailleerde beschrijving van alle met de behandeling samenhangende histopathologische bevindingen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      indien beschikbaar, absorptiegegevens.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Statistische behandeling van de resultaten, indien van toepassing
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bespreking van de resultaten, waaronder:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dosis-responsverhoudingen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      beoordeling van eventuele informatie over de werkingswijze;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bespreking van eventuele modelleringsbenaderingen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bepaling van BMD, NOAEL of LOAEL;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      controlegegevens uit het verleden;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      relevantie voor de mens.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Conclusies
                                          
                                       
                                    
                        
                     LITERATUUR:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145-191.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.27 van deze bijlage, Subchronische orale toxiciteitstest: toxiciteitsonderzoek (oraal) op dieren anders dan knaagdieren bij herhaalde toediening (90 dagen).
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 — Second edition. Series on Testing and Assessment nr. 116, beschikbaar op de openbare website voor onderzoeksrichtlijnen van de OESO op www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment N°39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.8 van deze bijlage, Subacute inhalatietoxiciteit: onderzoek van 28 dagen.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.29 van deze bijlage, Subchronische inhalatietoxiciteit: onderzoek van 90 dagen.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.9 van deze bijlage, Toxiciteit (dermaal) bij herhaalde toediening (28 dagen).
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 - 837.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (PB L 276 van 20.10.2010, blz. 33).
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              (23)
                           
                           
                              Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.
                           
                        
                              (24)
                           
                           
                              IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
                           
                        
                              (25)
                           
                           
                              Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.
                           
                        
                              (26)
                           
                           
                              Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.
                           
                        
                              (27)
                           
                           
                              Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
                           
                        
                              (28)
                           
                           
                              Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
                           
                        
                              (29)
                           
                           
                              Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
                           
                        
                              (30)
                           
                           
                              Weingand K, Brown G, Hall R et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198-201.
                           
                        
                              (31)
                           
                           
                              EMEA (draft) document „Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity” (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).
                           
                        
                              (32)
                           
                           
                              Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131.
                           
                        
                     Aanhangsel 1
                     DEFINITIE
                     Teststof: iedere stof of ieder mengsel die/dat met deze testmethode wordt getest..
                  ”
            
                  6)
               
               
                  De hoofdstukken B.32 en B.33 worden vervangen door:
                  „B.32.   CARCINOGENITEITSONDERZOEK
                  
                  INLEIDING
                  
                              1.
                           
                           
                              Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 451 (2009) van de OESO (TG 451). De oorspronkelijke TG 451 betreffende carcinogeniteitsonderzoek is in 1981 vastgesteld. De actualisering van testmethode B.32 werd noodzakelijk geacht in het licht van recente ontwikkelingen op het gebied van dierenwelzijn en wettelijke voorschriften (2)(3)(4)(5)(6). De actualisering van deze testmethode B.32 is gelijktijdig uitgevoerd met de herziening van hoofdstuk B.30 van deze bijlage, Onderzoek naar chronische toxiciteit, en hoofdstuk B.33 van deze bijlage, Gecombineerd onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit, en had tot doel aanvullende informatie te verkrijgen met behulp van de bij het onderzoek gebruikte dieren en nadere bijzonderheden over de keuze van de dosis te verschaffen. Deze testmethode B.32 is bedoeld voor het testen van een breed scala van chemische stoffen, waaronder bestrijdingsmiddelen en industriële chemische stoffen. Hierbij zij evenwel opgemerkt dat bepaalde details en voorschriften voor geneesmiddelen kunnen verschillen (zie Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals van de Internationale Conferentie voor harmonisatie (ICH)).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Het meeste carcinogeniteitsonderzoek wordt uitgevoerd bij knaagdiersoorten en deze testmethode is daarom voornamelijk bedoeld voor onderzoek dat bij deze soorten wordt verricht. Als dergelijk onderzoek ook bij andere diersoorten dan knaagdieren moet worden uitgevoerd, kunnen de principes en procedures van deze testmethode, met de nodige aanpassingen, ook samen met die in hoofdstuk B.27 van deze bijlage, Toxiciteitsonderzoek (oraal) op dieren anders dan knaagdieren bij herhaalde toediening (90 dagen) (6), worden toegepast. Nadere aanwijzingen zijn te vinden in OESO-leidraad nr. 116 betreffende het opzetten en uitvoeren van onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit (7).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              De drie belangrijkste toedieningswegen bij carcinogeniteitsonderzoek zijn de orale, de dermale en de inhalatieweg. De keuze van de toedieningsweg is afhankelijk van de fysische en chemische eigenschappen van de teststof en de voornaamste blootstellingsroute bij de mens. Nadere informatie over de keuze van de blootstellingsroute wordt verschaft in leidraad nr. 116 (7).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Deze testmethode spitst zich toe op blootstelling via de orale weg, de meest gebruikte route bij carcinogeniteitsonderzoek. Hoewel carcinogeniteitsonderzoek met blootstelling via de dermale of de inhalatieweg ook noodzakelijk kan zijn om de risico’s voor de menselijke gezondheid te beoordelen en/of vereist kan zijn op grond van bepaalde regelgevingskaders, zijn beide blootstellingsroutes technisch bijzonder complex. Dergelijk onderzoek dient per geval te worden opgezet, hoewel de hier beschreven testmethode voor het beoordelen en evalueren van de carcinogeniteit bij orale toediening kan worden gebruikt als basis voor een protocol voor dermaal en inhalatieonderzoek, rekening houdend met aanbevelingen ten aanzien van de behandelingsperiode, klinische en pathologische parameters enz. Er zijn OESO-richtsnoeren beschikbaar voor de toediening van teststoffen via de dermale weg (7) en de inhalatieweg (7)(8). Bij het opzetten van langetermijnonderzoek naar blootstelling via de inhalatieweg moet met name aandacht worden geschonken aan hoofdstuk B.8 van deze bijlage (9) en hoofdstuk B.29 van deze bijlage (10), samen met de OESO-leidraad voor acuut inhalatieonderzoek (8). In geval van tests die via de dermale weg worden uitgevoerd, dient hoofdstuk B.9 van deze bijlage (11) te worden geraadpleegd.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Carcinogeniteitsonderzoek levert informatie op over de mogelijke gevaren voor de gezondheid die kunnen voortvloeien uit herhaalde blootstelling gedurende een periode die kan oplopen tot de gehele levensduur van de gebruikte diersoort. Het onderzoek zal informatie opleveren over de toxische effecten van de teststof, met inbegrip van potentiële carcinogeniteit, en kan de doelorganen aanwijzen en de mogelijkheid van accumulatie aangeven. Daarnaast kan er een inschatting worden gemaakt van het niveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld bij toxische effecten en, in het geval van niet-genotoxische carcinogene agentia, bij tumorreacties. Aan de hand van deze inschatting kunnen vervolgens veiligheidscriteria voor de blootstelling van de mens worden vastgesteld. Bovendien wordt benadrukt dat het van groot belang is de dieren klinisch zorgvuldig te observeren, om zo veel mogelijk informatie te verkrijgen.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              De doelstellingen van het onder deze testmethode vallende carcinogeniteitsonderzoek omvatten:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          het vaststellen van de carcinogene eigenschappen van een teststof die leiden tot een toegenomen incidentie van gezwellen, een toename van het aandeel kwaadaardige gezwellen of een vermindering van de tijd totdat gezwellen optreden, in vergelijking met parallelle controlegroepen;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het vaststellen van de organen die door carcinogeniteit kunnen worden aangetast;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het vaststellen van de tijd totdat gezwellen optreden;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het karakteriseren van de dosis-responsverhouding van de tumor;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het vaststellen van een niveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld (No-Observed Adverse Effect Level, NOAEL) of een uitgangspunt voor het bepalen van een benchmarkdosis (BMD);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het extrapoleren van de carcinogene effecten naar lage doses waaraan mensen worden blootgesteld;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het verschaffen van gegevens om hypothesen over de werkingswijze (2)(7)(12)(13)(14)(15) te toetsen.
                                       
                                    
                        INLEIDENDE OVERWEGINGEN
                  
                              7.
                           
                           
                              Bij het beoordelen en evalueren van de potentiële carcinogeniteit van een teststof moet het testlaboratorium, alvorens het onderzoek uit te voeren, alle beschikbare informatie over de teststof in aanmerking nemen, zodat de opzet van het onderzoek zodanig kan worden afgestemd dat doelmatiger wordt getest op potentiële carcinogeniteit en het gebruik van dieren wordt geminimaliseerd. Informatie over en aandacht voor de werkingswijze van een stof waarvan het vermoeden bestaat dat deze een carcinogene stof is (2)(7)(12)(13)(14)(15) is van groot belang, aangezien de optimale opzet van het onderzoek kan verschillen afhankelijk van het antwoord op de vraag of de teststof een stof is waarvan is gebleken of vermoed wordt dat deze een genotoxische carcinogene stof is. Raadpleeg leidraad nr. 116 (7) voor nadere aanwijzingen voor het beoordelen van de werkingswijze.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Informatie die behulpzaam kan zijn bij het opzetten van het onderzoek omvat de identiteit, de chemische structuur en de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof; de uitkomsten van eventuele in vitro of in vivo uitgevoerde toxiciteitstests, met inbegrip van genotoxiciteitstests; voorgenomen toepassing(en) en de kans op blootstelling van de mens; beschikbare (Q)SAR-gegevens, gegevens over de mutageniteit/genotoxiciteit en carcinogeniteit alsmede andere toxicologische gegevens van chemische stoffen met een verwante structuur; beschikbare toxicokinetische gegevens (kinetiek bij zowel eenmalige als herhaalde toediening, indien beschikbaar) en aan ander onderzoek met herhaalde blootstelling ontleende gegevens. De carcinogeniteit moet worden beoordeeld nadat initiële informatie over de toxiciteit is verkregen door middel van toxiciteitsonderzoek met herhaalde toediening gedurende 28 dagen en/of 90 dagen. Ook kortdurend onderzoek naar de initiatie/promotie van kanker kan nuttige informatie opleveren. Als onderdeel van de algemene beoordeling van de potentiële schadelijke gezondheidseffecten van een bepaalde teststof (16)(17)(18)(19) moet een gefaseerde benadering van de carcinogeniteitstesten worden overwogen.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Voordat met het onderzoek wordt begonnen, moet worden bepaald welke statistische methoden gezien de opzet van de proeven en de doelstellingen het best geschikt zijn voor de analyse van de uitkomsten. Zo moet onder meer worden overwogen of de statistische gegevens tevens een correctie voor overleving, een analyse van de cumulatieve risico’s op tumoren in verhouding tot de duur van overleving, een analyse van de tijd totdat tumoren optreden en een analyse in geval van voortijdige beëindiging van één of meer groepen moeten omvatten. Aanwijzingen voor de juiste statistische analysen en belangrijke verwijzingen naar internationaal erkende statistische methoden worden gegeven in leidraad nr. 116 (7) en leidraad nr. 35 over de analyse en evaluatie van onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit (20).
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Bij het uitvoeren van carcinogeniteitsonderzoek moeten altijd de richtsnoeren en overwegingen worden gevolgd die worden beschreven in het OESO-leidraad nr. 19 betreffende het herkennen, beoordelen en gebruiken van klinische symptomen als humane eindpunten voor proefdiergebruik bij veiligheidsbeoordelingen (21), en met name punt 62. In dat punt wordt verklaard dat wanneer een dier bij onderzoek met herhaalde toediening klinische symptomen met een voortschrijdend karakter vertoont die leiden tot een verdere verslechtering van de toestand van het dier, op basis van de beschikbare informatie moet worden overwogen of het dier op humane wijze moet worden gedood. Hierbij moet tevens worden overwogen hoe de waarde van de informatie die kan worden gewonnen door het dier in kwestie te handhaven in het onderzoek zich verhoudt tot de algehele conditie van het dier. Als wordt besloten het dier in het onderzoek te handhaven, moet de frequentie van de waarnemingen zo nodig worden verhoogd. Het kan ook zijn dat het mogelijk is de pijn of het ongerief te verlichten door de toediening van de dosis tijdelijk stop te zetten of de testdosis te verminderen, zonder dat dit het doel van het onderzoek nadelig beïnvloedt.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Nadere aanwijzingen en een bespreking van de principes voor de keuze van de dosis bij onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit zijn te vinden in leidraad nr. 116 (7) en twee publicaties van het International Life Sciences Institute (22)(23). Welke strategie voor dosiskeuze uiteindelijk wordt toegepast, is afhankelijk van de primaire doelstelling of doelstellingen van het onderzoek (punt 6). Bij het kiezen van de juiste dosisniveaus moet een evenwicht worden getroffen tussen enerzijds de gevarenscreening en anderzijds de karakterisering van de lagedosisrespons en de wisselwerking tussen de twee. Dit is met name relevant in situaties waarin gecombineerd onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit (hoofdstuk B.33 van deze bijlage) moet worden uitgevoerd (punt 12).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Er moet worden nagegaan of gecombineerd onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit (hoofdstuk B.33 van deze bijlage) kan worden uitgevoerd in plaats van afzonderlijke studies naar chronische toxiciteit (hoofdstuk B.30 van deze bijlage) en carcinogeniteit (deze testmethode B.32). De gecombineerde test kost minder tijd en geld dan twee afzonderlijke studies, zonder dat dit ten koste gaat van de gegevenskwaliteit van de onderzoeksfasen. Bij uitvoering van gecombineerd onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit (hoofdstuk B.33 van deze bijlage) moet echter zorgvuldig rekening worden gehouden met de principes voor dosiskeuze (punt 11 en de punten 22 tot en met 25); bovendien kan de uitvoering van afzonderlijke studies verplicht zijn uit hoofde van bepaalde regelgevingskaders.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              De definities die in de context van deze testmethode worden gebruikt, zijn te vinden aan het eind van dit hoofdstuk en in leidraad nr. 116 (7).
                           
                        PRINCIPE VAN DE TEST
                  
                              14.
                           
                           
                              De teststof wordt gedurende het grootste deel van de levensduur van de proefdieren dagelijks in trapsgewijs stijgende doses aan diverse groepen toegediend; gewoonlijk geschiedt dit oraal. Ook de inhalatie- of dermale weg kan geschikt zijn. De proefdieren worden zorgvuldig op tekenen van toxiciteit en zich ontwikkelend neoplastisch letsel onderzocht. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven of worden gedood, wordt obductie verricht. Dieren die aan het eind van het onderzoek nog in leven zijn, worden gedood en ook hierop wordt obductie verricht.
                           
                        BESCHRIJVING VAN DE METHODE
                  
                     Keuze van de diersoort
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Deze testmethode heeft hoofdzakelijk betrekking op de beoordeling en evaluatie van carcinogeniteit bij knaagdieren (punt 2). Het gebruik van andere diersoorten dan knaagdieren kan worden overwogen als het op grond van de beschikbare gegevens aannemelijk is dat deze relevanter zijn voor het voorspellen van gezondheidseffecten bij de mens. De keuze van de soort moet worden verantwoord. De voorkeur wordt gegeven aan ratten, maar er kunnen ook andere knaagdiersoorten worden gebruikt, bv. muizen. Hoewel het gebruik van muizen bij carcinogeniteitstest van beperkt nut kan zijn (24)(25)(26), zijn carcinogeniteitstests bij muizen op grond van bepaalde vigerende regelgevingsprogramma’s nog steeds vereist, tenzij wordt vastgesteld dat een dergelijk onderzoek vanuit wetenschappelijk oogpunt overbodig is. Aan het gebruik van ratten en muizen als experimentele modellen wordt de voorkeur gegeven vanwege hun betrekkelijk korte levensduur, het grootschalige gebruik ervan bij farmacologisch en toxicologisch onderzoek, hun gevoeligheid voor tumorinductie en de beschikbaarheid van voldoende gekarakteriseerde stammen. Vanwege deze kenmerken is een grote hoeveelheid informatie over hun fysiologie en pathologie beschikbaar. Nadere informatie over de keuze van de soort en de stam is te vinden in leidraad nr. 116 (7).
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Er worden jonge gezonde volwassen dieren van gangbare laboratoriumstammen gebruikt. Het carcinogeniteitsonderzoek wordt bij voorkeur uitgevoerd bij dieren van dezelfde stam en herkomst als die welke zijn gebruikt voor het inleidende toxiciteitsonderzoek van kortere duur. Als echter bekend is dat het moeilijk is om met dieren van deze stam en herkomst te voldoen aan de algemeen aanvaarde overlevingscriteria voor langetermijnonderzoek (zie leidraad nr. 116 (7)), moet worden overwogen voor het langetermijnonderzoek een stam met een hoger overlevingspercentage te gebruiken. De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig zijn.
                           
                        
                     Huisvesting en voeding
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              De dieren kunnen individueel of in kleine groepjes van hetzelfde geslacht worden ondergebracht; individuele hokken moeten alleen worden overwogen als dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is (27)(28)(29). De kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. De temperatuur in de proefdierruimte dient 22 °C (± 3 °C) te zijn. Hoewel de relatieve luchtvochtigheid ten minste 30 % moet bedragen en, behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte, bij voorkeur niet hoger mag zijn dan 70 %, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. Het voer moet aan alle voedingsbehoeften van de geteste soort voldoen en het gehalte aan onzuiverheden in het voer, met inbegrip van maar niet beperkt tot residuen van bestrijdingsmiddelen, persistente organische verontreinigende stoffen, fyto-oestrogenen, zware metalen en mycotoxinen, die van invloed kunnen zijn op de resultaten van de test, moet zo laag mogelijk zijn. Van tijd tot tijd moet er analytische informatie over het gehalte aan nutriënten en onzuiverheden in het voer worden samengesteld, ten minste aan het begin van het onderzoek en wanneer er veranderingen zijn in de gebruikte partij. Deze informatie moet in het eindverslag worden opgenomen. Ook over het bij het onderzoek gebruikte drinkwater moet analytische informatie worden verstrekt. De keuze van het voer kan worden beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende vermenging van de teststof te zorgen en te voldoen aan de voedingsbehoeften van de dieren wanneer die teststof via het voer wordt toegediend.
                           
                        
                     Voorbereiding van de dieren
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Er worden gezonde dieren gebruikt die gedurende ten minste zeven dagen aan de omstandigheden in het laboratorium hebben kunnen wennen en waarop geen eerdere proeven zijn uitgevoerd. Bij knaagdieren moet de toediening van de dosis zo snel mogelijk na het spenen en de acclimatisatie beginnen en bij voorkeur voordat de dieren acht weken oud zijn. Van de proefdieren worden de volgende kenmerken vastgelegd: soort, stam, herkomst, geslacht, gewicht en leeftijd. Aan het begin van het onderzoek moeten de gewichtsverschillen binnen elk geslacht minimaal zijn en niet meer bedragen dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht van alle in het onderzoek gebruikte dieren van dat geslacht. De dieren worden willekeurig in de controle- en behandelingsgroepen ingedeeld. Na de willekeurige indeling mogen er binnen de geslachten geen significante verschillen in lichaamsgewicht zijn tussen de groepen. Als er statistisch significante verschillen zijn, moet de willekeurige indeling zo mogelijk opnieuw worden uitgevoerd. Aan elk dier moet een uniek identificatienummer worden toegekend in de vorm van een permanent merkteken dat met behulp van een tatoeage, een onder de huid ingebrachte microchip of via een andere geschikte methode wordt aangebracht.
                           
                        PROCEDURE
                  
                     Aantal en geslacht van de dieren
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Beide geslachten moeten worden gebruikt. Er moet een voldoende groot aantal dieren worden gebruikt om een grondige biologische en statistische evaluatie mogelijk te maken. Daarom moet elke dosisgroep en elke gelijktijdige controlegroep ten minste 50 dieren van elk geslacht omvatten. Afhankelijk van het doel van het onderzoek, kan het statistisch onderscheidingsvermogen van de belangrijkste schattingen mogelijk worden vergroot door de dieren ongelijk over de diverse dosisgroepen te verdelen, met meer dan 50 dieren in de lagedosisgroepen, bv. om potentiële carcinogeniteit bij lage doses te schatten. Er moet echter worden onderkend dat een geringe verhoging van de groepsgrootte relatief weinig zal bijdragen tot het statistisch onderscheidingsvermogen van het onderzoek. Nadere informatie over de statistische opzet van het onderzoek en de keuze van de dosisniveaus voor een zo groot mogelijk statistisch onderscheidingsvermogen is te vinden in leidraad nr. 116 (7).
                           
                        
                     Dieren tussentijds doden en satellietgroepen (verklikkergroepen)
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Als onderdeel van het onderzoek kunnen sommige dieren tussentijds worden gedood, bv. na twaalf maanden, om informatie te verschaffen over de ontwikkeling van neoplastische veranderingen en mechanistische informatie, indien dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is. Als dergelijke informatie al beschikbaar is uit eerder toxiciteitsonderzoek met herhaalde toediening van de teststof, is het tussentijds doden van dieren mogelijk niet wetenschappelijk gerechtvaardigd. Als de onderzoeksopzet voorziet in het tussentijds doden van dieren, bedraagt het geplande aantal tussentijds te doden dieren in elke dosisgroep gewoonlijk 10 per geslacht en moet het totale aantal dieren in de onderzoeksopzet worden vermeerderd met het aantal dieren dat voor afronding van het onderzoek zal worden gedood. Tijdens het onderzoek kan zo nodig een aanvullende groep verklikkerdieren (doorgaans 5 dieren per geslacht) worden opgenomen met het oog op de monitoring van de ziektestatus (30). Nadere richtsnoeren zijn opgenomen in leidraad nr. 116 (7).
                           
                        
                     Dosisgroepen en dosering
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Aanwijzingen voor alle aspecten van de dosiskeuze en het interval tussen de dosisniveaus zijn te vinden in leidraad nr. 116 (7). Er worden ten minste drie dosisniveaus en een gelijktijdige controlegroep gebruikt. De dosisniveaus worden doorgaans gebaseerd op de resultaten van korter onderzoek met herhaalde toediening of van bereikbepalingonderzoek, en er moet rekening worden gehouden met bestaande toxicologische en toxicokinetische gegevens die voor de teststof of aanverwante stoffen beschikbaar zijn.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Tenzij dit vanwege de fysisch-chemische aard of biologische kenmerken van de teststof onmogelijk is, moet de hoogste dosis zodanig worden gekozen dat de voornaamste doelorganen en toxische effecten worden vastgesteld zonder dat dit leed, ernstige toxiciteit, ziekten of sterfte veroorzaakt. Het hoogste dosisniveau moet normaliter, rekening houdend met de in punt 23 beschreven factoren, zodanig worden gekozen dat er tekenen van toxiciteit optreden, die bijvoorbeeld blijken uit een lichte achteruitgang van de gewichtstoename (ca. 10 %). Afhankelijk van het doel van het onderzoek (zie punt 6), kan echter een hoogste dosis worden gekozen die lager is dan de dosis waarbij tekenen van toxiciteit optreden, bv. als een dosis een zorgwekkend schadelijk effect heeft dat niettemin weinig invloed heeft op de levensduur of het lichaamsgewicht.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              De dosisniveaus en het interval tussen de dosisniveaus kunnen zo worden gekozen dat een dosisrespons en, afhankelijk van de werkingswijze van de teststof, een NOAEL of ander beoogd resultaat van het onderzoek, bv. een BMD (zie punt 25), bij het laagste dosisniveau worden vastgesteld. Factoren die moeten worden meegewogen bij de toediening van lagere doses omvatten de verwachte helling van de dosis-responscurve, de doses waarbij belangrijke veranderingen in het metabolisme of de toxische werking kunnen optreden, de verwachte locatie van een drempelwaarde of de verwachte locatie van een uitgangspunt voor extrapolatie naar lage doses.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Het gekozen interval tussen de dosisniveaus hangt van de kenmerken van de teststof af en kan niet in deze testmethode worden voorgeschreven, maar doorgaans leveren twee- tot viervoudige intervallen goede testresultaten op voor de instelling van de afnemende dosisniveaus, en de toevoeging van een vierde testgroep is vaak te verkiezen boven het gebruik van zeer grote intervallen (bv. meer dan een factor van ongeveer 6 à 10) tussen twee doseringen. In het algemeen moet het gebruik van factoren boven de 10 worden vermeden en worden verantwoord als deze toch worden gebruikt.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Zoals nader wordt besproken in leidraad nr. 116 (7), moet bij de keuze van de dosis rekening worden gehouden met het volgende:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          bekende of vermoedelijke niet-lineariteiten of buigpunten in de dosisrespons;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toxicokinetiek en dosisbereiken waarbij metabolische inductie, verzadiging of niet-lineariteit tussen externe en interne doses al dan niet optreden;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          precursorletsels en merkstoffen die het effect of indicatoren die de werking van de voornaamste fundamentele biologische processen aangeven;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de voornaamste (of vermoedelijke) aspecten van de werkingswijze, zoals doses waarbij de cytotoxiciteit begint toe te nemen, hormoonniveaus verstoord raken, homeostatische mechanismen het onderspit delven enz.;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          gebieden van de dosis-responscurve die een bijzonder robuuste schatting behoeven, bv. op het gebied van de verwachte BMD of een vermoedelijke drempelwaarde;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de verwachte blootstellingsniveaus bij de mens.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              De controlegroep wordt niet of, als bij de toediening van de teststof een medium wordt gebruikt, met medium behandeld. Afgezien van de behandeling met de teststof moeten de dieren in de controlegroep op dezelfde wijze worden behandeld als die in de testgroep. Als er een medium wordt gebruikt, wordt aan de controlegroep de hoogste gebruikte mediumdosis van de dosisgroepen toegediend. Indien een teststof wordt toegediend via de voeding en deze een geringere voedingsopname veroorzaakt omdat de voeding daardoor minder appetijtelijk is, kan een aanvullende paargevoede controlegroep dienen als een meer geschikte controle.
                           
                        
                     Bereiding en toediening van doses van de teststof
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              De teststof wordt normaliter oraal, met de voeding of het drinkwater, of via een maagsonde toegediend. Nadere informatie over de toedieningswegen en -methoden is te vinden in leidraad nr. 116 (7). De toedieningsweg en de toedieningsmethode zijn afhankelijk van het doel van het onderzoek, de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof, de biologische beschikbaarheid ervan en de voornaamste blootstellingsroute en -methode bij de mens. De keuze van de toedieningsweg en de toedieningsmethode moet worden gemotiveerd. In het belang van het welzijn van de dieren moet de orale maagsonde normaliter alleen worden gekozen in geval van agentia waarvoor deze toedieningsweg- en methode redelijk overeenkomen met de mogelijke blootstelling van de mens (bv. bij geneesmiddelen). Bij in de voeding of het milieu voorkomende chemische stoffen zoals bestrijdingsmiddelen wordt de teststof doorgaans toegediend via de voeding of het drinkwater. In sommige scenario’s, bv. bij beroepsmatige blootstelling, kan toediening via andere wegen geschikter zijn.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Waar nodig wordt de teststof in een geschikt medium opgelost of gesuspendeerd. Er moet rekening worden gehouden met de volgende eigenschappen van het medium en andere additieven, naargelang hetgeen van toepassing is: effecten op de absorptie, de distributie, het metabolisme of de retentie van de teststof; effecten op de chemische eigenschappen van de teststof die de toxische kenmerken ervan kunnen veranderen; en effecten op het voedsel- of waterverbruik of de voedingsstatus van de dieren. Aanbevolen wordt eerst na te gaan of het mogelijk is een waterige oplossing/suspensie te gebruiken, als dit niet kan een oplossing/emulsie in olie (bv. maïsolie) te overwegen en daarna eventueel een ander medium. Wanneer een ander medium dan water wordt gebruikt, moeten de toxische kenmerken daarvan bekend zijn. Er moet informatie beschikbaar zijn over de stabiliteit van de teststof en de homogeniteit van de doseeroplossingen of het voer (naargelang hetgeen van toepassing is) onder de toedieningsomstandigheden (bv. dieet).
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Wanneer stoffen met de voeding of het drinkwater worden toegediend, moet erop worden toegezien dat de hoeveelheden van de teststof niet interfereren met de normale voedings- of waterbalans. Bij langetermijnonderzoek naar toxiciteit waarbij de teststof via het voer wordt toegediend, mag de concentratie van de teststof in de voeding de bovengrens van 5 % van de totale hoeveelheid voer normaliter niet overschrijden om onevenwichtigheden in de voeding te vermijden. Indien de teststof met de voeding wordt toegediend, kan een constante voedingsconcentratie (mg/kg voer of ppm) of een constant dosisniveau als functie van het lichaamsgewicht van het dier (mg/kg lichaamsgewicht), berekend op weekbasis, worden gebruikt. Aangegeven moet worden welk alternatief is gebruikt.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Bij orale toediening wordt de teststof dagelijks (zeven dagen per week) aan de dieren toegediend, bij knaagdieren normaliter gedurende 24 maanden (zie ook punt 32). Elk ander doseringsregime, bv. vijf dagen per week, moet worden gemotiveerd. Bij toediening via de huid worden de dieren gedurende 24 maanden normaliter ten minste 6 uur per dag, zeven dagen per week met de teststof behandeld, zoals beschreven is in hoofdstuk B.9 van deze bijlage (11). Blootstelling via inhalatie geschiedt 6 uur per dag, zeven dagen per week, maar ook blootstelling gedurende vijf dagen is mogelijk, indien dit wordt verantwoord. De blootstellingsduur bedraagt normaliter 24 maanden. Als andere knaagdiersoorten dan ratten uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan de maximale blootstellingsduur worden aangepast om soortspecifieke symptomen van leed te minimaliseren. Een blootstellingsduur van minder dan 6 uur per dag moet worden gemotiveerd. Zie ook hoofdstuk B.8 van deze bijlage (9).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Indien de teststof via een maagsonde aan de dieren wordt toegediend, moet dit iedere dag op hetzelfde tijdstip gebeuren met gebruikmaking van een maagbuisje of een geschikte intubatiecanule. Normaliter zal eenmaal per dag één dosis worden toegediend; als een stof lokale irritaties veroorzaakt, kan de dagelijkse doseersnelheid mogelijk worden gehandhaafd door de toe te dienen dosis te splitsen (tweemaal per dag). Het maximale vloeistofvolume dat in één keer kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het dier. Het volume moet zo laag mogelijk worden gehouden als praktisch uitvoerbaar is en mag bij knaagdieren normaliter niet meer dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht bedragen (31). Variaties in het testvolume moeten tot een minimum worden beperkt door de concentratie zodanig aan te passen dat bij alle dosisniveaus hetzelfde constante volume kan worden gebruikt. Een uitzondering vormen mogelijk bijtende of irriterende stoffen, die moeten worden verdund om ernstige lokale effecten te vermijden. Tests bij concentraties die waarschijnlijk een bijtende of irriterende werking hebben op het maag-darmkanaal, moeten worden vermeden.
                           
                        
                     Duur van het onderzoek
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              De duur van het onderzoek bedraagt normaliter 24 maanden bij knaagdieren, hetgeen overeenkomt met het grootste deel van de normale levensduur van de gebruikte dieren. Afhankelijk van de levensduur van de bij het onderzoek gebruikte stam van de diersoort kan een langere of kortere onderzoeksduur worden gehanteerd, maar deze moet wel worden verantwoord. Voor bepaalde muizenstammen, bv. AKR/J, C3H/J of C57BL/6J, kan een duur van 18 maanden geschikter zijn. Hier volgen enkele aanwijzingen met betrekking tot de duur, de beëindiging van het onderzoek en de overleving; nadere aanwijzingen, onder meer over de aanvaardbaarheid van negatieve carcinogeniteit ten opzichte van de overleving in het onderzoek, zijn te vinden in OESO-leidraad nr. 116 betreffende het opzetten en uitvoeren van onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit (7):
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          beëindiging van het onderzoek moet worden overwogen wanneer het aantal overlevenden in de groepen met lagere doses of de controlegroep onder de 25 % daalt;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          als alleen dieren in de groep met de hoogste dosis voortijdig sterven als gevolg van toxiciteit, hoeft dit niet tot beëindiging van het onderzoek te leiden;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de overleving moet voor elk geslacht afzonderlijk worden beschouwd;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het onderzoek mag niet dusdanig worden verlengd dat gegevens die uit het onderzoek zijn verkregen niet meer voldoende zijn voor een statistisch geldige evaluatie.
                                       
                                    
                        WAARNEMINGEN
                  
                              33.
                           
                           
                              Alle dieren moeten worden onderzocht op tekenen van ziekte of sterfte, gewoonlijk aan het begin en eind van elke dag, ook tijdens de weekends en op feestdagen. Daarnaast moeten de dieren eenmaal per dag worden onderzocht op specifieke tekenen van toxicologische relevantie, waarbij in het geval van toediening via een maagsonde rekening moet worden gehouden met de piekperiode van de verwachte effecten na toediening. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan zich ontwikkelende tumoren; van elke met het blote oog zichtbare of voelbare tumor moeten het tijdstip waarop deze voor het eerst is opgetreden, de plaats, de afmetingen, het uiterlijk en het verloop worden opgetekend.
                           
                        
                     Lichaamsgewicht. voedsel-/waterverbruik en voedselefficiëntie
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Bij het begin van de behandeling moeten alle dieren de eerste 13 weken ten minste één keer per week worden gewogen en daarna ten minste één keer per maand. Ook het voedselverbruik en de voedselefficiëntie moeten de eerste 13 weken ten minste één keer per week worden gemeten en daarna ten minste één keer per maand. Als de teststof met het drinkwater wordt toegediend, moet het waterverbruik de eerste 13 weken ten minste één keer per week worden gemeten en daarna ten minste één keer per maand. Meting van het waterverbruik moet ook worden overwogen bij onderzoek waarbij de drinkactiviteit verandert.
                           
                        
                     Hematologische, klinisch-biochemische en andere metingen
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Om te zorgen dat het onderzoek zo veel mogelijk informatie oplevert, met name voor het beoordelen van de werkingswijze, kunnen bloedmonsters worden genomen voor hematologie en klinisch-biochemische bepalingen indien de onderzoeksleider dit noodzakelijk acht. Ook urineonderzoek kan passend zijn. Nadere aanwijzingen over de waarde van dergelijke monsters in het kader van carcinogeniteitsonderzoek zijn te vinden in leidraad nr. 116 (7). Zo nodig kunnen bij de dieren die tussentijds worden gedood (punt 20), alsook bij beëindiging van het onderzoek op ten minste 10 dieren per geslacht per groep, bloedmonsters met het oog op hematologische en klinisch-chemische analyse worden genomen en urineonderzoek worden verricht. Genoteerd wordt uit welk lichaamsdeel de bloedmonsters worden genomen, bijvoorbeeld door middel van een hartpunctie of uit de retro-orbitale sinus, onder verdoving; deze worden in voorkomend geval onder passende omstandigheden bewaard. Er kunnen ook bloedpreparaten worden voorbereid voor onderzoek, met name als het beenmerg lijkt te zijn aangetast, hoewel er wordt getwijfeld aan de waarde die een dergelijk onderzoek heeft voor het beoordelen van het carcinogeen/oncogeen potentieel (32).
                           
                        PATHOLOGIE
                  
                     Macroscopische obductie
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Bij alle dieren in het onderzoek, behalve verklikkerdieren (zie punt 20) en andere dieren in satellietgroepen, moet een volledige macroscopische obductie worden verricht, waaronder een zorgvuldig onderzoek van het lichaamsoppervlak, alle lichaamsopeningen alsmede de schedelholte, de borstholte en de buikholte, en de inhoud ervan. De onderzoeksleider moet van geval tot geval beoordelen of obductie van verklikkerdieren en andere dieren in de satellietgroepen noodzakelijk is. Het gewicht van de organen maakt normaal gesproken geen deel uit van een carcinogeniteitsonderzoek, aangezien geriatrische veranderingen en, in latere stadia, zich ontwikkelende tumoren de bruikbaarheid van gegevens over de orgaangewichten verstoren. Deze gegevens kunnen echter van groot belang zijn voor het bepalen van de bewijskracht en in het bijzonder voor het beoordelen van de werkingswijze. Gegevens over het orgaangewicht van dieren die deel uitmaken van een satellietonderzoek dienen uiterlijk één jaar nadat het onderzoek is aangevat te worden verzameld.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              De volgende weefsels moeten in een fixeermiddel worden bewaard dat zowel voor het type weefsel als voor het beoogde latere histopathologische onderzoek (33) geschikt is (de weefsels tussen rechte haken zijn facultatief):
                              
                                          elk macroscopisch waarneembaar letsel
                                       
                                       
                                          hart
                                       
                                       
                                          alvleesklier
                                       
                                       
                                          maag (voormaag, kliermaag)
                                       
                                    
                                          bijnier
                                       
                                       
                                          ileum
                                       
                                       
                                          bijschildklier
                                       
                                       
                                          [tanden]
                                       
                                    
                                          aorta
                                       
                                       
                                          jejunum
                                       
                                       
                                          perifere zenuw
                                       
                                       
                                          testis
                                       
                                    
                                          hersenen (inclusief coupes van cerebrum, cerebellum en medulla/pons)
                                       
                                       
                                          nier
                                       
                                       
                                          hypofyse
                                       
                                       
                                          thymus
                                       
                                    
                                          blindedarm
                                       
                                       
                                          traanklier (extraorbitaal)
                                       
                                       
                                          prostaat
                                       
                                       
                                          schildklier
                                       
                                    
                                          cervix
                                       
                                       
                                          lever
                                       
                                       
                                          rectum
                                       
                                       
                                          [tong]
                                       
                                    
                                          coagulans afscheidende klier
                                       
                                       
                                          long
                                       
                                       
                                          speekselklier
                                       
                                       
                                          luchtpijp
                                       
                                    
                                          colon
                                       
                                       
                                          lymfeklieren (zowel oppervlakkig als dieper gelegen)
                                       
                                       
                                          zaadblaasje
                                       
                                       
                                          urineblaas
                                       
                                    
                                          duodenum
                                       
                                       
                                          borstklier (verplicht bij vrouwtjes en facultatief bij mannetjes, indien zichtbaar ontleedbaar)
                                       
                                       
                                          skeletspier
                                       
                                       
                                          uterus (inclusief cervix)
                                       
                                    
                                          epididymis
                                       
                                       
                                          [bovenste luchtwegen, inclusief neus, neusschelpen en paranasale sinussen]
                                       
                                       
                                          huid
                                       
                                       
                                          [ureter]
                                       
                                    
                                          oog (inclusief netvlies)
                                       
                                       
                                          slokdarm
                                       
                                       
                                          ruggenmerg (drie niveaus: cervicaal, mediothoracaal en lumbaal)
                                       
                                       
                                          [urinebuis]
                                       
                                    
                                          [dijbeen met gewricht]
                                       
                                       
                                          [reukkolf]
                                       
                                       
                                          milt
                                       
                                       
                                          vagina
                                       
                                    
                                          galblaas (bij andere diersoorten dan ratten)
                                       
                                       
                                          ovarium
                                       
                                       
                                          [borstbeen]
                                       
                                       
                                          coupe van het beenmerg en/of vers beenmergaspiraat
                                       
                                    
                                          klier van Harder
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    Organen die paarsgewijs voorkomen, bv. nieren en bijnieren, moeten beide worden bewaard. Uit de klinische en andere bevindingen kan de noodzaak blijken verder weefsel te onderzoeken. Ook organen waarvan op basis van de bekende eigenschappen van de teststof verondersteld wordt dat ze beschadigd kunnen worden, moeten worden bewaard. Bij onderzoek waarbij de dermale toedieningsweg wordt gebruikt, moeten de organen worden onderzocht die voor de orale toedieningsweg zijn vastgesteld en moeten specifieke monsters van de huid op de toedieningslocatie worden genomen en bewaard. Bij inhalatieonderzoek moet de lijst van luchtwegweefsels die moeten worden bewaard en onderzocht, worden gebaseerd op de aanbevelingen in de hoofdstukken B.8 en B.29 van deze bijlage. In geval van andere organen/weefsels (en in aanvulling op de specifiek bewaarde weefsels van de luchtwegen) moeten de organen worden onderzocht die voor de orale toedieningsweg zijn vastgesteld.
                           
                        
                     Histopathologie
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Er zijn richtsnoeren beschikbaar voor beste praktijken voor de uitvoering van toxicologisch pathologisch onderzoek (33). Ten minste de volgende weefsel moeten worden onderzocht:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          alle weefsels van de dieren in de hogedosisgroep en de controlegroep;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          alle weefsels van dieren die tijdens het onderzoek stierven of werden gedood;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          alle weefsels die macroscopische abnormaliteiten vertonen, met inbegrip van tumoren;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          bij waarneming van met de behandeling samenhangende histopathologische veranderingen bij dieren in de hogedosisgroep, dezelfde weefsels van alle dieren in alle andere dosisgroepen;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          alle organen die paarsgewijs voorkomen, bv. nieren en bijnieren, moeten beide worden onderzocht.
                                       
                                    
                        GEGEVENS EN RAPPORTAGE
                  
                     Gegevens
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Voor elk dier worden apart gegevens verstrekt over alle geëvalueerde parameters. Bovendien moeten alle gegevens worden samengevat in tabellen die voor iedere testgroep laten zien: het aantal dieren aan het begin van het onderzoek, het aantal dieren dat tijdens de test is gestorven of om redenen van dierenwelzijn moest worden gedood en het tijdstip waarop de dood bij de individuele dieren is ingetreden, het aantal dieren dat toxiciteitsverschijnselen vertoont, een beschrijving van de waargenomen toxiciteitsverschijnselen, met inbegrip van de aanvang, de duur en de ernst van eventuele toxische effecten, het aantal dieren met letsel, de aard van het letsel en het percentage dieren waarbij ieder type letsel voorkomt. De gemiddelden en standaarddeviaties (voor continue testgegevens) van de dieren waarbij toxische effecten of letsels voorkomen, worden in tabelvorm samengevat, in aanvulling op de inschaling van de letsels.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Bij de interpretatie van de onderzoeksresultaten kunnen controlegegevens uit het verleden nuttig zijn, bv. wanneer er aanwijzingen zijn dat de gegevens van de parallelle controlegroepen aanzienlijk afwijken van de recente gegevens van de controledieren in dezelfde testfaciliteit/kolonie. Controlegegevens uit het verleden die ter evaluatie worden aangeboden, moeten afkomstig zijn uit hetzelfde laboratorium, verband houden met dieren van dezelfde leeftijd en stam, en zijn gegenereerd gedurende de vijf jaar die zijn voorafgegaan aan het onderzoek in kwestie.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Voor zover van toepassing moeten alle waargenomen resultaten met behulp van een geschikte en algemeen erkende statistische methode worden geëvalueerd. De statistische methoden en de te analyseren gegevens moeten tijdens het opzetten van het onderzoek worden gekozen (zie punt 9). Bij de selectie moet zo nodig worden gecorrigeerd voor overleving.
                           
                        
                     Testverslag
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Teststof:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fysische aard, zuiverheid en fysisch-chemische eigenschappen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identificatiegegevens;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      herkomst van de stof;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      partijnummer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      certificaat van chemische analyse.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Medium (indien van toepassing):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivering voor de keuze van het medium (wanneer dat geen water is);
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Proefdieren:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gebruikte diersoort/stam en motivering van de keuze;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aantal, leeftijd en geslacht van de dieren bij aanvang van de test;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      herkomst, huisvesting, voeding enz.;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gewicht van elk dier aan het begin van de test.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testomstandigheden:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivering voor de gekozen toedieningsweg en de keuze van de dosis;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toegepaste statistische methoden voor analyse van de gegevens, indien van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bijzonderheden over de formulering van de teststof, respectievelijk de samenstelling van het voer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analytische gegevens over de bereikte concentratie, stabiliteit en homogeniteit van het preparaat;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de toedieningsweg en bijzonderheden over de toediening van de teststof;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bij inhalatieonderzoek, alleen via de neus of via het hele lichaam;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      werkelijke doses (mg/kg lichaamsgewicht/dag) en conversiefactor van de teststofconcentratie (mg/kg of ppm) in het voedsel/drinkwater naar de werkelijke dosis, voor zover van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gegevens over de kwaliteit van het voer en het drinkwater.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Resultaten (er moeten samengevatte gegevens in tabelvorm en gegevens voor elk dier apart worden verstrekt)
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Algemeen:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      overlevingsgegevens;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      lichaamsgewicht en veranderingen in het lichaamsgewicht;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      voedselverbruik, voedselefficiëntie, indien berekend, en waterverbruik, indien van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toxicokinetische gegevens (indien beschikbaar);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oftalmoscopie (indien beschikbaar);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematologie (indien beschikbaar);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klinische chemie (indien beschikbaar).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Klinische bevindingen:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tekenen van toxiciteit;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      incidentie (en indien beoordeeld, ernst) van eventuele abnormaliteiten;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aard, ernst en duur van de klinische waarnemingen (van voorbijgaande aard dan wel blijvend).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Obductiegegevens:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      lichaamsgewicht aan het eind van het onderzoek;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      orgaangewichten en verhoudingen ervan, indien van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      obductiebevindingen; incidentie en ernst van abnormaliteiten.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Histopathologie:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      niet-neoplastische histopathologische bevindingen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      neoplastische histopathologische bevindingen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      correlatie van macroscopische en microscopische bevindingen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gedetailleerde beschrijving van alle met de behandeling samenhangende histopathologische bevindingen, met inbegrip van een inschaling van de ernst;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een verslag van eventuele intercollegiale toetsing van objectglaasjes.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Statistische behandeling van de resultaten, indien van toepassing
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bespreking van de resultaten, waaronder:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bespreking van eventuele modelleringsbenaderingen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dosis-responsverhoudingen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      controlegegevens uit het verleden;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      beoordeling van eventuele informatie over de werkingswijze;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bepaling van BMD, NOAEL of LOAEL;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      relevantie voor de mens.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Conclusies
                                          
                                       
                                    
                        
                     LITERATUUR:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.27 van deze bijlage, Subchronische orale toxiciteitstest: toxiciteitsonderzoek (oraal) op dieren anders dan knaagdieren bij herhaalde toediening (90 dagen).
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment nr. 116, beschikbaar op de openbare website voor onderzoeksrichtlijnen van de OESO op www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.8 van deze bijlage, Subacute inhalatietoxiciteit: onderzoek van 28 dagen.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.29 van deze bijlage, Subchronische inhalatietoxiciteit: onderzoek van 90 dagen.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.9 van deze bijlage, Toxiciteit (dermaal) bij herhaalde toediening (28 dagen).
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793-801.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98.
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West, W, Olin S(2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729-837.
                           
                        
                              (23)
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              (24)
                           
                           
                              Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1):214.
                           
                        
                              (25)
                           
                           
                              Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284.
                           
                        
                              (26)
                           
                           
                              Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196-1203.
                           
                        
                              (27)
                           
                           
                              Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (PB L 276 van 20.10.2010, blz. 33).
                           
                        
                              (28)
                           
                           
                              National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington, DC, US Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              (29)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
                           
                        
                              (30)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              (31)
                           
                           
                              Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.
                           
                        
                              (32)
                           
                           
                              Weingand K, et al. (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198-201.
                           
                        
                              (33)
                           
                           
                              Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P, et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131.
                           
                        
                     Aanhangsel 1
                     DEFINITIE
                     Teststof: alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.
                  
                  B.33.   GECOMBINEERD ONDERZOEK NAAR CHRONISCHE TOXICITEIT EN CARCINOGENITEIT
                  
                  INLEIDING
                  
                              1.
                           
                           
                              Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 453 (2009) van de OESO (TG 453). De oorspronkelijke TG 453 werd in 1981 vastgesteld. De actualisering van testmethode B.33 werd noodzakelijk geacht in het licht van recente ontwikkelingen op het gebied van dierenwelzijn en wettelijke voorschriften (1)(2)(3)(4)(5). De actualisering van deze testmethode B.33 is gelijktijdig uitgevoerd met de herziening van hoofdstuk B.32 van deze bijlage, Carcinogeniteitsonderzoek, en hoofdstuk B.30 van deze bijlage, Onderzoek naar chronische toxiciteit, en had tot doel aanvullende informatie te verkrijgen met behulp van de bij het onderzoek gebruikte dieren en nadere bijzonderheden over de keuze van de dosis te verschaffen. Deze testmethode is bedoeld voor gebruik bij het testen van een breed scala van stoffen, waaronder bestrijdingsmiddelen en industriële chemische stoffen. Hierbij zij evenwel opgemerkt dat bepaalde details en voorschriften voor geneesmiddelen kunnen verschillen (zie Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals van de Internationale Conferentie voor harmonisatie (ICH)).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Het meeste onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit wordt uitgevoerd bij knaagdiersoorten en deze testmethode is daarom voornamelijk bedoeld voor onderzoek dat bij deze soorten wordt verricht. Als dergelijk onderzoek ook bij andere diersoorten dan knaagdieren moet worden uitgevoerd, kunnen de beschreven principes en procedures, met de nodige aanpassingen, ook samen met die in hoofdstuk B.27 van deze bijlage, Toxiciteitsonderzoek (oraal) op dieren anders dan knaagdieren bij herhaalde toediening (90 dagen) (6), worden toegepast, zoals bedoeld in OESO-leidraad nr. 116 over het opzetten en uitvoeren van onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit (7).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              De drie belangrijkste toedieningswegen bij onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit zijn de orale, de dermale en de inhalatieweg. De keuze van de toedieningsweg is afhankelijk van de fysische en chemische eigenschappen van de teststof en de voornaamste blootstellingsroute bij de mens. Nadere informatie over de keuze van de blootstellingsroute wordt verschaft in leidraad nr. 116 (7).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Deze testmethode spitst zich toe op blootstelling via de orale weg, de meest gebruikte route bij onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit. Hoewel langetermijnonderzoek met blootstelling via de dermale of de inhalatieweg ook noodzakelijk kan zijn om de risico’s voor de menselijke gezondheid te beoordelen, en/of vereist kan zijn op grond van bepaalde regelgevingskaders, zijn beide blootstellingsroutes technisch bijzonder complex. Dergelijk onderzoek dient per geval te worden opgezet, hoewel de hier beschreven testmethode voor het beoordelen en evalueren van chronische toxiciteit en carcinogeniteit bij orale toediening kan worden gebruikt als basis voor een protocol voor dermaal en inhalatieonderzoek, rekening houdend met aanbevelingen ten aanzien van de behandelingsperiode, klinische en pathologische parameters enz. Er zijn OESO-richtsnoeren beschikbaar voor de toediening van teststoffen via de inhalatieweg (7)(8) en de dermale weg (7). Bij het opzetten van langetermijnonderzoek naar blootstelling via de inhalatieweg moet met name aandacht worden geschonken aan hoofdstuk B.8 van deze bijlage (9) en hoofdstuk B.29 van deze bijlage (10), samen met de OESO-leidraad voor acuut inhalatieonderzoek (8). In geval van tests die via de dermale weg worden uitgevoerd, dient hoofdstuk B.9 van deze bijlage (11) te worden geraadpleegd.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Gecombineerd onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit levert informatie op over de mogelijke gevaren voor de gezondheid die kunnen voortvloeien uit herhaalde blootstelling gedurende een periode die kan oplopen tot de gehele levensduur van de gebruikte diersoort. Het onderzoek zal informatie opleveren over de toxische effecten van de teststof, met inbegrip van potentiële carcinogeniteit, de doelorganen aanwijzen en de mogelijkheid van accumulatie aangeven. Daarnaast kan er een inschatting worden gemaakt van het niveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld bij toxische effecten en, in het geval van niet-genotoxische carcinogene agentia, bij tumorreacties. Aan de hand van deze inschatting kunnen vervolgens veiligheidscriteria voor de blootstelling van de mens worden vastgesteld. Bovendien wordt benadrukt dat het van groot belang is de dieren klinisch zorgvuldig te observeren, om zo veel mogelijk informatie te verkrijgen.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              De doelstellingen van het onder deze testmethode vallende onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit omvatten:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          het vaststellen van de carcinogene eigenschappen van een teststof die leiden tot een toengenomen incidentie van gezwellen, een toename van het aandeel kwaadaardige gezwellen of een vermindering van de tijd totdat gezwellen optreden, in vergelijking met parallelle controlegroepen;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het vaststellen van de tijd todat gezwellen optreden;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het vaststellen van de chronische toxiciteit van de teststof;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het vaststellen van de organen die kunnen worden aangetast door chronische toxiciteit en carcinogeniteit;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het karakteriseren van de dosis-responsverhouding;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het vaststellen van een niveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld (No-Observed Adverse Effect Level, NOAEL) of een uitgangspunt voor het bepalen van een benchmarkdosis (BMD);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het extrapoleren van de carcinogene effecten naar lage doses waaraan mensen worden blootgesteld;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het voorspellen van chronische toxische effecten bij niveaus waaraan mensen worden blootgesteld;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het verschaffen van gegevens om hypothesen over de werkingswijze (2)(7)(12)(13)(14)(15) te toetsen.
                                       
                                    
                        INLEIDENDE OVERWEGINGEN
                  
                              7.
                           
                           
                              Bij het beoordelen en evalueren van de potentiële carcinogeniteit en chronische toxiciteit van een teststof moet het testlaboratorium, alvorens het onderzoek uit te voeren, alle beschikbare informatie over de teststof in aanmerking nemen, zodat de opzet van het onderzoek zodanig kan worden afgestemd dat doelmatiger wordt getest op de toxicologische eigenschappen en het gebruik van dieren wordt geminimaliseerd. Informatie over en aandacht voor de werkingswijze van een stof waarvan het vermoeden bestaat dat deze een carcinogene stof is (2)(7)(12)(13)(14)(15), is van groot belang, aangezien de optimale opzet van het onderzoek kan verschillen afhankelijk van het antwoord op de vraag of de teststof een stof is waarvan is gebleken of vermoed wordt dat deze een genotoxische carcinogene stof is. Raadpleeg leidraad nr. 116 (7) voor nadere aanwijzingen voor het beoordelen van de werkingswijze.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Bij het opzetten van het onderzoek kan onder meer gebruik worden gemaakt van informatie over de identiteit, chemische structuur en fysisch-chemische eigenschappen van de teststof; de resultaten van eventuele in vitro of in vivo uitgevoerde toxiciteitstests, met inbegrip van genotoxiciteitstests; de voorgenomen toepassing(en) en de potentiële blootstelling van de mens; de beschikbare (Q)SAR-gegevens, gegevens over de mutageniteit/genotoxiciteit en carcinogeniteit, en andere toxicologische gegevens over chemische stoffen met een verwante structuur; de beschikbare toxicokinetische gegevens (kinetiek bij zowel eenmalige toediening als herhaalde toediening, indien beschikbaar), en aan ander onderzoek met herhaalde blootstelling ontleende gegevens. De chronische toxiciteit/carcinogeniteit mag pas worden bepaald nadat eerst toxiciteitsgegevens zijn verkregen van toxiciteitsonderzoek met herhaalde toediening gedurende 28 dagen en/of 90 dagen. Ook kortdurend onderzoek naar de initiatie/promotie van kanker kan nuttige informatie opleveren. Als onderdeel van de algemene beoordeling van de potentiële schadelijke gezondheidseffecten van een bepaalde teststof (16)(17)(18)(19) moet een gefaseerde benadering van de carcinogeniteitstests worden overwogen.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Voordat met het onderzoek wordt begonnen, moet worden bepaald welke statistische methoden gezien de opzet van de proeven en de doelstellingen het best geschikt zijn voor de analyse van de uitkomsten. Zo moet onder meer worden overwogen of de statistische gegevens tevens een correctie voor overleving, een analyse van de cumulatieve risico’s op tumoren in verhouding tot de duur van overleving, een analyse van de tijd totdat tumoren optreden en een analyse in geval van voortijdige beëindiging van één of meer groepen moeten omvatten. Aanwijzingen voor de juiste statistische analysen en belangrijke verwijzingen naar internationaal erkende statistische methoden worden gegeven in leidraad nr. 116 (7) en leidraad nr. 35 over de analyse en evaluatie van onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit (20).
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Bij het uitvoeren van carcinogeniteitsonderzoek moeten altijd de richtsnoeren en overwegingen worden gevolgd die worden beschreven in de OESO-leidraad voor het herkennen, beoordelen en gebruiken van klinische symptomen als humane eindpunten voor proefdiergebruik bij veiligheidsbeoordelingen (21), en met name punt 62 ervan. In dat punt wordt verklaard dat wanneer een dier bij onderzoek met herhaalde toediening klinische symptomen met een voortschrijdend karakter vertoont die leiden tot een verdere verslechtering van de toestand van het dier, op basis van de beschikbare informatie moet worden overwogen of het dier op humane wijze moet worden gedood. Hierbij moet tevens worden overwogen hoe de waarde van de informatie die kan worden gewonnen door het dier in kwestie te handhaven in het onderzoek zich verhoudt tot de algehele conditie van het dier. Als wordt besloten het dier in het onderzoek te handhaven, moet de frequentie van de waarnemingen zo nodig worden verhoogd. Het kan ook zijn dat het mogelijk is de pijn of het leed te verlichten door de toediening van de dosis tijdelijk stop te zetten of de testdosis te verminderen, zonder dat dit het doel van het onderzoek nadelig beïnvloedt.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Nadere aanwijzingen en een bespreking van de principes voor de keuze van de dosis bij onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit zijn te vinden in leidraad nr. 116 (7) en twee publicaties van het International Life Sciences Institute (22)(23). Welke strategie voor dosiskeuze uiteindelijk wordt toegepast, is afhankelijk van de primaire doelstelling of doelstellingen van het onderzoek (punt 6). Bij het kiezen van de juiste dosisniveaus moet een evenwicht worden getroffen tussen enerzijds de risicoscreening en anderzijds de karakterisering van de lage-dosisrespons en de wisselwerking tussen de twee. Dit is met name relevant voor dit gecombineerde onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Er moet worden nagegaan of dit gecombineerde onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit moet worden uitgevoerd in plaats van afzonderlijk onderzoek naar chronische toxiciteit (hoofdstuk B.30 van deze bijlage), respectievelijk naar carcinogeniteit (hoofdstuk B.32 van deze bijlage). Het gecombineerde onderzoek biedt als voordeel dat het minder tijd en kosten vergt en dat er minder gebruik wordt gemaakt van proefdieren dan bij twee afzonderlijke studies, zonder dat dit ten koste gaat van de gegevenskwaliteit van de onderzoeksfasen. Bij het uitvoeren van een gecombineerd onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit moet echter zorgvuldig rekening worden gehouden met de principes voor dosiskeuze (punt 11 en de punten 22 tot en met 26); bovendien kan de uitvoering van afzonderlijke studies verplicht zijn uit hoofde van bepaalde regelgevingskaders. Nadere aanwijzingen voor het opzetten van een zo efficiënt mogelijk gecombineerd onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit, zowel wat betreft het aantal gebruikte proefdieren als het stroomlijnen van de diverse experimentele procedures, zijn te vinden in leidraad nr. 116 (7).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              De definities die in de context van deze testmethode worden gebruikt, zijn te vinden aan het einde van dit hoofdstuk en in leidraad nr. 116 (7).
                           
                        PRINCIPE VAN HET ONDERZOEK
                  
                              14.
                           
                           
                              Het onderzoek is opgebouwd uit twee fasen die tegelijkertijd lopen: de ene fase heeft betrekking op de chronische toxiciteit en de andere op de carcinogeniteit (zie de punten 34 en 35 voor de duur van de fasen). De teststof wordt normaal gezien toegediend via de orale weg, hoewel ook de inhalatie- of de dermale weg geschikt kan zijn. Tijdens de chronische-toxiciteitsfase wordt de teststof dagelijks in trapsgewijs stijgende doses aan diverse groepen proefdieren toegediend. Daarbij wordt één dosis per groep gebruikt, normaal gezien twaalf maanden achter elkaar, hoewel afhankelijk van de wettelijke voorschriften een kortere of langere duur kan worden gekozen (zie punt 34). De gekozen duur moet voldoende lang zijn zodat de eventuele effecten van cumulatieve toxiciteit tot uiting komen, zonder de storende effecten van geriatrische veranderingen. Het onderzoek kan ook zo worden opgezet dat sommige dieren tussentijds worden gedood, bv. na drie en zes maanden, en dat met het oog hierop nieuwe groepen proefdieren kunnen worden toegevoegd (zie punt 20). In de carcinogeniteitsfase wordt de teststof dagelijks aan diverse groepen proefdieren toegediend, gedurende een groot deel van hun levensduur. Tijdens beide fasen worden de proefdieren zorgvuldig op tekenen van toxiciteit en zich ontwikkelend neoplastisch letsel onderzocht. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven of worden gedood, wordt obductie verricht. Dieren die aan het eind van het onderzoek nog in leven zijn, worden gedood en ook hierop wordt obductie verricht.
                           
                        BESCHRIJVING VAN DE METHODE
                  
                     Keuze van de diersoort
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Deze testmethode heeft hoofdzakelijk betrekking op de beoordeling en evaluatie van chronische toxiciteit en carcinogeniteit bij knaagdieren (punt 2). Het gebruik van andere diersoorten dan knaagdieren kan worden overwogen als het op grond van de beschikbare gegevens aannemelijk is dat deze relevanter zijn voor het voorspellen van gezondheidseffecten bij de mens. De keuze van de soort moet worden verantwoord. De voorkeur wordt gegeven aan ratten, maar er kunnen ook andere knaagdiersoorten worden gebruikt, bv. muizen. Hoewel het gebruik van muizen bij carcinogeniteitstest van beperkt nut kan zijn (24)(25)(26), is testen op carcinogeniteit op grond van bepaalde vigerende regelgevingsprogramma’s nog steeds vereist, tenzij wordt vastgesteld dat een dergelijk onderzoek vanuit wetenschappelijk oogpunt overbodig is. Aan het gebruik van ratten en muizen als experimentele modellen wordt de voorkeur gegeven vanwege hun betrekkelijk korte levensduur, het grootschalige gebruik ervan bij farmacologisch en toxicologisch onderzoek, hun gevoeligheid voor tumorinductie en de beschikbaarheid van voldoende gekarakteriseerde stammen. Vanwege deze kenmerken is een grote hoeveelheid informatie over hun fysiologie en pathologie beschikbaar. Bij het opzetten en uitvoeren van onderzoek naar chronische toxiciteit of carcinogeniteit bij andere diersoorten dan knaagdieren moeten, zo nodig, de in deze testmethode beschreven principes als uitgangspunt worden genomen, in combinatie met de principes in hoofdstuk B.27 van deze bijlage, Toxiciteitsonderzoek (oraal) op dieren anders dan knaagdieren bij herhaalde toediening (90 dagen) (6). Nadere informatie over de keuze van de soort en de stam is te vinden in leidraad nr. 116 (7).
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Er worden jonge gezonde volwassen dieren van gangbare laboratoriumstammen gebruikt. Het gecombineerde onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit moet worden uitgevoerd bij dieren van dezelfde stam en herkomst als die welke zijn gebruikt voor het inleidend toxiciteitsonderzoek van kortere duur. Als echter bekend is dat het moeilijk is om met dieren van deze stam en herkomst te voldoen aan de algemeen aanvaarde overlevingscriteria voor langetermijnonderzoek (zie leidraad nr. 116 (7)), moet worden overwogen een stam met een aanvaardbaar overlevingspercentage voor het langetermijnonderzoek te gebruiken. De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig zijn.
                           
                        
                     Huisvesting en voeding
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              De dieren kunnen elk apart of in kleine groepjes met hetzelfde geslacht worden ondergebracht; aparte hokken moeten alleen worden overwogen als dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is (27)(28)(29). De kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. De temperatuur in de proefdierruimte dient 22 °C (± 3 °C) te zijn. Hoewel de relatieve luchtvochtigheid ten minste 30 % moet bedragen en, behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte, bij voorkeur niet hoger mag zijn dan 70 %, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. Het voer moet aan alle behoeften van de geteste soort voldoen en het gehalte aan onzuiverheden in het voer, met inbegrip van maar niet beperkt tot residuen van bestrijdingsmiddelen, persistente organische verontreinigende stoffen, fyto-oestrogenen, zware metalen en mycotoxinen, die van invloed kunnen zijn op de resultaten van het onderzoek, moet zo laag mogelijk zijn. Van tijd tot tijd moet er analytische informatie over het gehalte aan nutriënten en onzuiverheden in het voer worden samengesteld, ten minste aan het begin van het onderzoek en wanneer er veranderingen zijn in de gebruikte partij. Deze informatie moet in het eindverslag worden opgenomen. Ook over het bij het onderzoek gebruikte drinkwater moet analytische informatie worden verstrekt. De keuze van het voer kan worden beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende vermenging van de teststof te zorgen en te voldoen aan de voedingsbehoeften van de dieren wanneer die teststof via het voer wordt toegediend.
                           
                        
                     Voorbereiding van de dieren
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Er worden gezonde dieren gebruikt die gedurende ten minste zeven dagen aan de omstandigheden in het laboratorium hebben kunnen wennen en waarop geen eerdere proeven zijn uitgevoerd. Bij knaagdieren moet de toediening van de dosis zo snel mogelijk na het spenen en de acclimatisatie beginnen en bij voorkeur voordat de dieren acht weken oud zijn. De kenmerken van de proefdieren qua soort, stam, herkomst, geslacht, gewicht en leeftijd worden vastgelegd. Aan het begin van het onderzoek moeten de gewichtsverschillen tussen de geslachten minimaal zijn en niet meer bedragen dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht van elk geslacht. De dieren worden willekeurig in de controle- en behandelingsgroepen ingedeeld. Na de willekeurige indeling mogen er binnen de geslachten geen significante verschillen in lichaamsgewicht zijn tussen de groepen. Als er statistisch significante verschillen zijn, moet de willekeurige indeling zo mogelijk opnieuw worden uitgevoerd. Aan elk dier moet een uniek identificatienummer worden toegekend in de vorm van een permanent merkteken dat met behulp van een tatoeage, een onder de huid ingebrachte microchip of via een andere geschikte methode wordt aangebracht.
                           
                        PROCEDURE
                  
                     Aantal en geslacht van de dieren
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Beide geslachten moeten worden gebruikt. Er moet een voldoende groot aantal dieren worden gebruikt zodat een grondige biologische en statistische evaluatie mogelijk is. Bij knaagdieren moeten alle dosisgroepen (zoals beschreven in punt 22) en parallelle controlegroepen die in de carcinogeniteitsfase worden gebruikt daarom ten minste 50 dieren van elk geslacht omvatten. Afhankelijk van het doel van het onderzoek kan het statistisch onderscheidingsvermogen van de belangrijkste schattingen mogelijk worden vergroot door de dieren ongelijk over de diverse dosisgroepen te verdelen, met meer dan 50 dieren in de lage-dosisgroepen, bv. om potentiële carcinogeniteit bij lage doses te schatten. Er moet echter worden onderkend dat een gematigde verhoging van de groepsgrootte relatief weinig zal bijdragen tot het statistisch onderscheidingsvermogen van het onderzoek. Bij knaagdieren moeten alle dosisgroepen (zoals beschreven in punt 22) en parallelle controlegroepen die in de chronische-toxiciteitsfase worden gebruikt, ten minste 10 dieren per geslacht omvatten. Hierbij zij opgemerkt dat dit aantal lager is dan bij het onderzoek naar chronische toxiciteit (hoofdstuk B.30 van deze bijlage). Bij de interpretatie van de gegevens over het kleinere aantal dieren per groep in de chronische-toxiciteitsfase van dit gecombineerde onderzoek kan echter ook gebruik worden gemaakt van de gegevens over de grotere groep dieren in de carcinogeniteitsfase van het onderzoek. Bij onderzoek waarbij muizen zijn betrokken, is het mogelijk dat in de chronische-toxiciteitsfase per dosisgroep meer dieren nodig zijn om alle vereiste hematologische bepalingen uit te voeren. Nadere informatie over de statistische opzet van het onderzoek en de keuze van de dosisniveaus voor een zo groot mogelijk statistisch onderscheidingsvermogen is te vinden in leidraad nr. 116 (7).
                           
                        
                     Dieren tussentijds doden, satellietgroepen en verklikkerdieren
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Als onderdeel van het onderzoek kunnen sommige dieren tussentijds worden gedood, bv. na zes maanden voor de chronische-toxiciteitsfase, om informatie te verschaffen over de ontwikkeling van niet-neoplastische veranderingen en mechanistische informatie, indien dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is. Als dergelijke informatie al beschikbaar is uit eerder toxiciteitsonderzoek met herhaalde toediening van de teststof, is het tussentijds doden van dieren mogelijk niet wetenschappelijk gerechtvaardigd. Het tussentijds doden van de dieren die worden gebruikt in de chronische-toxiciteitsfase van het onderzoek, die normaal twaalf maanden duurt (zie punt 34), levert gegevens voor de carcinogeniciteitsfase van het onderzoek, waardoor het totale aantal gebruikte dieren kan worden verminderd. Ook satellietgroepen kunnen in de chronische-toxiciteitsfase van het onderzoek worden opgenomen om de reversibiliteit van eventuele toxicologische effecten als gevolg van de onderzochte teststof te controleren. Hiervoor kan het hoogste dosisniveau van het onderzoek met controlegroep worden gebruikt. Tijdens het onderzoek kan zo nodig een aanvullende groep verklikkerdieren (doorgaans 5 dieren per geslacht) worden opgenomen met het oog op de monitoring van de ziektestatus (30). Nadere aanwijzingen voor het opzetten van het onderzoek in verband met het tussentijds doden van dieren, satellietgroepen en verklikkerdieren, alsmede het minimaliseren van het aantal gebruikte dieren is te vinden in leidraad nr. 116 (7).
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Als de onderzoeksopzet het gebruik van satellietgroepen en/of het tussentijds doden van dieren omvat, bevat elke opgenomen dosisgroep gewoonlijk 10 dieren per geslacht en moet het totaal aantal dieren in de onderzoeksopzet wordt vermeerderd met het aantal dieren dat tussentijds zal worden gedood. Dieren die tussentijds worden gedood en dieren die deel uitmaken van satellietgroepen moeten normaal gezien aan dezelfde waarnemingen worden onderworpen, met inbegrip van waarnemingen met betrekking tot het lichaamsgewicht, het voedsel- en waterverbruik, hematologische en klinisch-biochemische metingen en pathologisch onderzoek, als de dieren in de chronische-toxiciteitsfase van het hoofdonderzoek, hoewel de metingen (in de groepen met dieren die tussentijds worden gedood) ook kunnen worden beperkt tot specifieke, belangrijke parameters als neurotoxiciteit of immunotoxiciteit.
                           
                        
                     Dosisgroepen en dosering
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Aanwijzingen voor alle aspecten van de dosiskeuze en het interval tussen de dosisniveaus zijn te vinden in leidraad nr. 116 (7). Er moeten ten minste drie dosisniveaus en een gelijktijdige controle worden gebruikt, voor zowel de chronische-toxiciteitsfase als de carcinogeniteitsfase. De dosisniveaus worden doorgaans gebaseerd op de resultaten van korter onderzoek met herhaalde toediening of van bereikbepalingonderzoek, en er moet rekening worden gehouden met bestaande toxicologische en toxicokinetische gegevens die voor de teststof of aanverwante stoffen beschikbaar zijn.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Voor de chronische-toxiciteitsfase van het onderzoek is een volledig onderzoek met drie dosisniveaus mogelijk niet noodzakelijk, als kan worden verwacht dat een test met een bepaald dosisniveau, dat gelijkwaardig is aan ten minste 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag, geen schadelijke effecten zal hebben. Hierbij moet men zich baseren op informatie die afkomstig is van inleidend onderzoek en de overweging dat toxiciteit niet is te verwachten op grond van gegevens betreffende stoffen met een verwante structuur. Een limiet van 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag kan van toepassing zijn, tenzij het blootstellingsniveau bij de mens duidt op de noodzaak een hoger dosisniveau te gebruiken.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Tenzij dit vanwege de fysisch-chemische aard of biologische kenmerken van de teststof onmogelijk is, moet de hoogste dosis zodanig worden gekozen dat de voornaamste doelorganen en toxische effecten worden vastgesteld zonder dat dit leed, ernstige toxiciteit, ziekteverschijnselen of sterfte veroorzaakt. Het hoogste dosisniveau moet zodanig worden gekozen dat er tekenen van toxiciteit optreden, die bijvoorbeeld blijken uit een lichte achteruitgang van de gewichtstoename (ca. 10 %). Afhankelijk van het doel van het onderzoek (zie punt 6), kan een hoogste dosis worden gekozen die lager is dan de dosis waarbij tekenen van toxiciteit optreden, bv. als een dosis een zorgwekkend schadelijk effect heeft dat niettemin weinig invloed heeft op de levensduur of het lichaamsgewicht.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              De dosisniveaus en het interval tussen de dosisniveaus kunnen zo worden gekozen dat een dosisrespons en, afhankelijk van de werkingswijze van de teststof, een NOAEL of ander beoogd resultaat van het onderzoek, bv. een BMD (zie punt 27), worden vastgesteld. Factoren die moeten worden meegewogen bij de toediening van lagere doses omvatten de verwachte helling van de dosis-responscurve, de doses waarbij belangrijke veranderingen in het metabolisme of de toxische werking kunnen optreden, de verwachte locatie van een drempelwaarde of de verwachte locatie van een uitgangspunt voor extrapolatie naar lage doses. Bij het uitvoeren van een gecombineerd onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit bestaat het hoofddoel eruit informatie te verkrijgen met het oog op het beoordelen van het carcinogeniteitsrisico, en zal informatie over de chronische toxiciteit normaal gezien een secundair doel zijn. Hierbij dient rekening te worden gehouden bij de keuze van de doses en het interval tussen de dosisniveaus voor het onderzoek.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Het gekozen interval tussen de dosisniveaus is afhankelijk van de onderzoeksdoelen en de kenmerken van de teststof en kan in deze testmethode niet gedetailleerd worden voorgeschreven, maar doorgaans leveren twee- tot viervoudige intervallen goede testrestultaten op bij gebruik voor de instelling van de afnemende dosisniveaus, en de toevoeging van een vierde testgroep is vaak te verkiezen boven het gebruik van zeer grote intervallen (bv. meer dan een factor van ongeveer 6 à 10) tussen twee doseringen. In het algemeen moet het gebruik van factoren boven de 10 worden vermeden en worden verantwoord als deze toch worden gebruikt.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Zoals nader wordt beschreven in leidraad nr. 116 (7), moet bij de keuze van de dosis rekening worden gehouden met het volgende:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          bekende of vermoedelijke niet-lineariteiten of buigpunten in de dosisrespons;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toxicokinetiek en dosisbereiken waarbij metabolische inductie, verzadiging of niet-lineariteit tussen externe en interne doses al dan niet optreden;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          precursorletsels en merkstoffen die het effect of indicatoren die de werking van de voornaamste fundamentele biologische processen aangeven;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de voornaamste (of vermoedelijke) aspecten van de werkingswijze, zoals doses waarbij de cytotoxiciteit begint toe te nemen, hormoonniveaus verstoord raken, homeostatische mechanismen het onderspit delven enz.;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          gebieden van de dosis-responscurve die een bijzonder robuuste schatting behoeven, bv. op het gebied van de verwachte BMD of een vermoedelijke drempelwaarde;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de verwachte blootstellingniveaus bij de mens, met name met betrekking tot de keuze van middelhoge en lage doses.
                                       
                                    
                        
                              28.
                           
                           
                              De controlegroep wordt niet of, als bij de toediening van de teststof een medium wordt gebruikt, met medium behandeld. Afgezien van de behandeling met de teststof moeten de dieren in de controlegroep op dezelfde wijze worden behandeld als die in de testgroep. Als er een medium wordt gebruikt, wordt aan de controlegroep de hoogste gebruikte mediumdosis van de dosisgroepen toegediend. Indien een teststof wordt toegediend via de voeding en deze een geringere voedingsopname veroorzaakt omdat de voeding daardoor minder appetijtelijk is, kan een paargevoede controlegroep dienen als een meer geschikte controle.
                           
                        
                     Bereiding en toediening van doses van de teststof
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              De teststof wordt normaal gezien oraal, met de voeding of het drinkwater, of via een maagsonde toegediend. Nadere informatie over de toedieningswegen en -methoden is te vinden in leidraad nr. 116 (7). De toedieningsweg en de toedieningsmethode zijn afhankelijk van het doel van het onderzoek, de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof, de biologische beschikbaarheid ervan en de voornaamste blootstellingsroute en -methode bij de mens. De keuze van de toedieningsweg en de toedieningsmethode moet worden gemotiveerd. In het belang van het welzijn van de dieren moet de orale maagsonde normaal gesproken alleen worden gekozen in geval van agentia waarvoor de gekozen toedieningsweg en -methode redelijk overeenkomen met de mogelijke blootstelling van de mens (bv. bij geneesmiddelen). Bij in de voeding of het milieu voorkomende chemische stoffen zoals bestrijdingsmiddelen wordt de teststof doorgaans toegediend via de voeding of het drinkwater. In sommige scenario’s, bv. bij beroepsmatige blootstelling, kan toediening via andere wegen beter geschikt zijn.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Waar nodig wordt de teststof in een geschikt medium opgelost of gesuspendeerd. Er moet rekening worden gehouden met de navolgende eigenschappen van het medium en andere additieven, naargelang hetgeen van toepassing is: effecten op de absorptie, de distributie, het metabolisme of de retentie van de teststof; effecten op de chemische eigenschappen van de teststof die de toxische kenmerken daarvan kunnen veranderen; en effecten op het voedsel- of waterverbruik of de voedingsstatus van de dieren. Aanbevolen wordt eerst te bezien of het mogelijk is een waterige oplossing/suspensie te gebruiken, als dit niet kan een oplossing/emulsie in olie (bv. maïsolie) te overwegen en daarna eventueel oplossing in een ander medium. Wanneer een ander medium dan water wordt gebruikt, moeten de toxische kenmerken daarvan bekend zijn. Er moet informatie beschikbaar zijn over de stabiliteit van de teststof en de homogeniteit van de doseeroplossingen of het voer (naargelang hetgeen van toepassing is) onder de toedieningsomstandigheden (bv. dieet).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Wanneer stoffen met de voeding of het drinkwater worden toegediend, moet erop worden toegezien dat de hoeveelheden van de teststof niet interfereren met de normale voedings- of waterbalans. Bij langetermijnonderzoek naar toxiciteit waarbij de teststof via het voer wordt toegediend, mag de concentratie van de teststof in de voeding de bovengrens van 5 % van de totale hoeveelheid voer normaal gesproken niet overschrijden om onevenwichtigheden in de voeding te vermijden. Indien de teststof met de voeding wordt toegediend, kan een constante voedingsconcentratie (mg/kg voer of ppm) of een constant dosisniveau als functie van het lichaamsgewicht van het dier (mg/kg lichaamsgewicht), berekend op weekbasis, worden gebruikt. Aangegeven moet worden welk alternatief is gebruikt.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Bij orale toediening wordt de teststof dagelijks (zeven dagen per week) aan de dieren toegediend gedurende 12 maanden (chronische-toxiciteitsfase) of 24 maanden (carcinogeniteitsfase). Zie in dat verband ook de punten 33 en 34. Gebruik van een ander toedieningsschema, bv. vijf dagen per week, moet worden verantwoord. Bij toediening via de huid worden de dieren normaal gesproken ten minste 6 uur per dag, zeven dagen per week met de teststof behandeld, zoals wordt beschreven in hoofdstuk B.9 van deze bijlage (11), gedurende 12 maanden (chronische-toxiciteitsfase) of 24 maanden (carcinogeniteitsfase). Blootstelling via inhalatie geschiedt 6 uur per dag, zeven dagen per week, maar ook blootstelling gedurende vijf dagen is mogelijk, indien dit wordt verantwoord. De blootstellingsduur bedraagt normaal gezien 12 maanden (chronische-toxiciteitsfase) of 24 maanden (carcinogeniteitsfase). Als andere knaagdiersoorten dan ratten uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan de maximale blootstellingsduur worden aangepast om soortspecifieke symptomen van leed te minimaliseren. Gebruik van een blootstellingsduur van minder dan 6 uur per dag moet worden gemotiveerd. Zie ook hoofdstuk B.8 van deze bijlage (9).
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Indien de teststof via een maagsonde aan de dieren wordt toegediend, moet dit iedere dag op hetzelfde tijdstip gebeuren met gebruikmaking van een maagbuisje of een geschikte intubatiecanule. Normaliter zal eenmaal per dag één dosis worden toegediend; als een stof lokale irritaties veroorzaakt, kan de dagelijkse doseersnelheid mogelijk worden gehandhaafd door de toe te dienen dosis te splitsen (tweemaal per dag). Het maximale volume dat in één keer kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het dier. Het volume moet zo laag mogelijk worden gehouden als praktisch uitvoerbaar is en mag bij knaagdieren normaal gezien niet meer dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht bedragen (31). Variaties in het testvolume moeten geminimaliseerd worden door het aanpassen van de concentratie zodat op alle dosisniveaus hetzelfde constante volume kan worden gebruikt. Een uitzondering vormen mogelijk bijtende of irriterende stoffen, die moeten worden verdund om ernstige lokale effecten te vermijden. Tests bij concentraties die waarschijnlijk een bijtende of irriterende werking hebben op het maag-darmkanaal, moeten worden vermeden.
                           
                        
                     Duur van het onderzoek
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              De toedieningsperiode en de duur van de chronische-toxiciteitsfase van dit onderzoek bedraagt normaal gezien 12 maanden, hoewel gegeven de onderzoeksopzet ook een kortere (bv. 6 of 9 maanden) of langere (bv. 18 of 24 maanden) onderzoeksduur mogelijk is, afhankelijk van de eisen van de regelgeving of met het oog op specifieke mechanistische doeleinden. Afwijkingen van een blootstellingsduur van twaalf maanden moeten worden verantwoord, met name als voor een kortere duur wordt gekozen. Alle dosisgroepen die in deze fase worden gebruikt, moeten op de aangegeven tijd worden beëindigd met het oog op de evaluatie van chronische toxiciteit en niet-neoplastische pathologie. Satellietgroepen die zijn opgenomen ter controle van de reversibiliteit van eventuele toxicologische veranderingen als gevolg van de onderzochte teststof moet dosering worden onthouden gedurende niet minder dan vier weken en niet meer dan een derde van de totale onderzoeksduur nadat de blootstelling is gestaakt.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              De duur van de carcinogeniteitsfase van dit onderzoek bedraagt normaal gezien 24 maanden bij knaagdieren, hetgeen overeenkomt met het grootste deel van de normale levensduur van de gebruikte dieren. Afhankelijk van de levensduur van de bij het onderzoek gebruikte stam van de diersoort kan een langere of kortere onderzoeksduur worden gehanteerd, maar deze moet wel worden verantwoord. Voor bepaalde muizenstammen, bv. AKR/J, C3H/J of C57BL/6J, kan een duur van 18 maanden beter geschikt zijn. Hier volgen enkele aanwijzingen met betrekking tot de duur, de beëindiging van het onderzoek en de overleving; nadere aanwijzingen, onder meer over het verband tussen de aanvaardbaarheid van negatief carcinogeniteitsonderzoek en de overleving tijdens het onderzoek, zijn te vinden in leidraad nr. 116 (7):
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          beëindiging van het onderzoek moet worden overwogen wanneer het aantal overlevenden in de groepen met lagere doses of de controlegroep onder de 25 % daalt;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          als alleen dieren in de groep met de hoogste dosis voortijdig sterven als gevolg van toxiciteit, hoeft dit niet tot beëindiging van het onderzoek te leiden;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          als blijkt dat de geslachten qua overleving verschillen, moeten de geslachten afzonderlijk worden beschouwd;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het onderzoek mag niet dusdanig worden verlengd dat gegevens die uit het onderzoek zijn verkregen niet meer voldoende zijn voor een statistisch geldige evaluatie.
                                       
                                    
                        WAARNEMINGEN (CHRONISCHE-TOXICITEITSFASE)
                  
                              36.
                           
                           
                              Alle dieren moeten worden onderzocht op ziekelijkheid of sterfte, gewoonlijk aan het begin en einde van elke dag, ook tijdens de weekends en de feestdagen. De proefdieren moeten ten minste eenmaal per dag worden geobserveerd, bij voorkeur op hetzelfde tijdstip, waarbij rekening moet worden gehouden met de piekperiode van verwachte effecten na toediening van de dosis via een maagsonde.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Alle dieren moeten ten minste eenmaal voor de eerste blootstelling aan een uitgebreid klinisch onderzoek worden onderworpen (om intra-individuele vergelijking mogelijk te maken), aan het einde van de eerste week van het onderzoek en vervolgens elke maand. Het waarnemingsprotocol moet zodanig worden opgezet dat verschillen tussen individuele waarnemers worden geminimaliseerd en onafhankelijk zijn van de testgroep. De dieren moeten buiten hun kooi worden geobserveerd, bij voorkeur telkens in een standaardgebied en op hetzelfde tijdstip. De gegevens moeten zorgvuldig worden opgetekend, bij voorkeur met behulp van scoringssystemen die door het testlaboratorium expliciet zijn gedefinieerd. Er moet worden getracht verschillen in de observatiecondities tot een minimum te beperken. Tekenen waarop moet worden gelet zijn onder meer (maar niet alleen): veranderingen in huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van af- en uitscheiding, en onwillekeurige reacties zoals traanvorming, rechtopstaan van het haar, verandering van de pupilgrootte of een ongewoon ademhalingspatroon. Ook verandering in gang, houding en reactiviteit op vastpakken, alsmede de aanwezigheid van klonische of tonische bewegingen, stereotiep gedrag (bv. overmatige lichaamsverzorging, herhaaldelijk ronddraaien) of bizar gedrag (bv. zelfverminking, achteruitlopen) moeten worden opgetekend (32).
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Vóór de eerste toediening van de teststof wordt bij alle dieren een oftalmologisch onderzoek uitgevoerd, waarbij gebruik wordt gemaakt van een oftalmoscoop of een ander geschikt apparaat. Bij beëindiging van het onderzoek wordt dit oftalmologisch onderzoek bij alle dieren verricht, maar ten minste bij die in de hogedosisgroep en in de controlegroep. Als met de behandeling samenhangende veranderingen in de ogen worden geconstateerd, moeten alle dieren worden onderzocht. Als de structurele analyse of andere informatie wijst op oculaire toxiciteit, moet de frequentie van het oogonderzoek worden verhoogd.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Voordat met het onderzoek wordt begonnen en met tussenpozen van drie maanden tot ten hoogste twaalf maanden na aanvang van het onderzoek, alsmede bij beëindiging van het onderzoek (als dit langer duurt dan twaalf maanden) kunnen, in geval van chemische stoffen waarvoor uit eerdere toxiciteitsonderzoek met herhaalde toediening gedurende 28 dagen en/of 90 dagen is gebleken dat deze kunnen leiden tot neurotoxische effecten, facultatief onderzoeken van de sensorische reacties op verschillende soorten stimuli (32) (bv. van auditieve, visuele en proprioceptieve aard) (33)(34)(35), alsmede een bepaling van de grijpkracht (36) en de motorische activiteit (37) worden verricht. Meer informatie over de procedures die kunnen worden gevolgd, is te vinden in de desbetreffende literatuur. Er kunnen evenwel ook andere dan de genoemde procedures worden toegepast.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              In geval van chemische stoffen waarvoor uit eerder toxiciteitsonderzoek met herhaalde toediening gedurende 28 dagen en/of 90 dagen is gebleken dat deze kunnen leiden tot immunotoxische effecten, kan facultatief nader onderzoek van dit eindpunt worden verricht bij beëindiging van het onderzoek.
                           
                        
                     Lichaamsgewicht. voedsel-/waterverbruik en voedselefficiëntie
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Aan het begin van het onderzoek moeten alle dieren de eerste 13 weken ten minste één keer per week worden gewogen en daarna ten minste één keer per maand. Ook het voedselverbruik en de voedselefficiëntie moeten de eerste 13 weken ten minste één keer per week worden gemeten en daarna ten minste één keer per maand. Het waterverbruik moet de eerste 13 weken ten minste één keer per week worden gemeten en daarna ten minste één keer per maand als de teststof met het drinkwater wordt toegediend. Het meten van het waterverbruik moet ook worden overwogen bij onderzoek waarbij de drinkactiviteit verandert.
                           
                        
                     Hematologie en klinisch-biochemische bepalingen
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Bij onderzoek waarbij knaagdieren zijn betrokken, wordt na drie, zes en twaalf maanden, alsook bij beëindiging van het onderzoek (als dit langer duurt dan twaalf maanden) hematologisch onderzoek verricht op alle proefdieren (tien mannetjes en tien vrouwtjes per groep). Bij muizen moeten mogelijk dieren in satellietgroepen worden gebruikt om alle vereiste hematologische bepalingen te verrichten (zie punt 19). Bij onderzoek met andere soorten dan knaagdieren worden monsters genomen bij een kleiner aantal dieren (bv. 4 dieren per geslacht en per groep bij onderzoek bij honden), op tussentijdse bemonsteringstijdstippen en bij beëindiging van het onderzoek, zoals beschreven voor knaagdieren. Er hoeven bij knaagdieren of andere soorten dan knaagdieren na drie maanden geen metingen te worden verricht als er geen effect is opgetreden op de hematologische parameters in een eerder onderzoek van 90 dagen met vergelijkbare dosisniveaus. Er moeten bloedmonsters worden genomen en daarbij dient te worden genoteerd uit welk lichaamsdeel en hoe de monsters zijn genomen, bijvoorbeeld door middel van een hartpunctie of uit de retro-orbitale sinus, onder verdoving.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              De volgende parameters worden onderzocht (38): totale en gedifferentieerde telling van de leukocyten, telling van de erytrocyten, telling van de bloedplaatjes, hemoglobinegehalte, hematocriet, gemiddeld volume van de erytrocyten (Mean Corpuscular Volume, MCV), hemoglobinegehalte per erytrocyt (Mean Corpuscular Haemoglobin, MCH), hemoglobinegehalte per volume-eenheid erytrocyten (Mean Corpuscular Haemoglobin Concentration, MCHC), prothrombinetijd en geactiveerde partiële thromboplastinetijd. Afhankelijk van de toxiciteit van de teststof kunnen ook andere hematologische parameters worden gemeten, zoals de Heinz-lichaampjes of andere morfologische afwijkingen van de erytrocyten of methemoglobine. In het algemeen moet een flexibele aanpak worden gehanteerd, afhankelijk van het waargenomen en/of verwachte effect van een bepaalde teststof. Als de teststof een effect heeft op het hematopoëtisch systeem, moeten mogelijk ook reticulocytentellingen en beenmergcytologie worden getest, hoewel deze niet routinematig hoeven te worden onderzocht.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Klinisch-biochemische bepalingen die bedoeld zijn om wezenlijke toxische effecten in weefsels en met name effecten op de nieren en lever te onderzoeken, moeten worden verricht op bloedmonsters die van elk dier worden genomen (tien mannetjes en tien vrouwtjes per groep), met dezelfde intervallen als wordt aangegeven voor hematologisch onderzoek. Bij muizen moeten mogelijk dieren in satellietgroepen worden gebruikt om alle vereiste klinisch-biochemische bepalingen te verrichten. Bij onderzoek met andere soorten dan knaagdieren worden monsters genomen bij een kleiner aantal dieren (bv. 4 dieren per geslacht en per groep bij onderzoek bij honden), op tussentijdse bemonsteringstijdstippen en bij beëindiging van het onderzoek, zoals beschreven voor knaagdieren. Er hoeven na drie maanden geen metingen te worden verricht, noch bij knaagdieren noch bij andere diersoorten, als er in een eerder onderzoek van 90 dagen bij vergelijkbare dosisniveaus geen effect op klinisch-biochemische parameters is geconstateerd. Het verdient aanbeveling om de dieren (met uitzondering van muizen) vóór de bloedafname een nacht te laten vasten (10). De volgende parameters worden onderzocht (38): glucose, ureum (ureumstikstof), creatinine, totaal eiwit, albumine, calcium, natrium, kalium, totaal cholesterol, ten minste twee tests voor een hepatocellulaire evaluatie (alanineaminotransferase, aspartaataminotransferase, glutamaatdehydrogenase, totaal galzuren) (39), en ten minste twee tests voor hepatobiliaire evaluatie (alkalische fosfatase, gamma-glutamyltransferase, 5’-nucleotidase, totaal bilirubine, totaal galzuren) (39). Naargelang hetgeen van toepassing is, kunnen andere klinisch-chemische parameters als triglyceriden bij nuchtere toestand, specifieke hormonen en cholinesterase worden gemeten, afhankelijk van de toxiciteit van de teststof. In het algemeen is een flexibele aanpak nodig, afhankelijk van het waargenomen en/of verwachte effect van een bepaalde stof.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Bij alle proefdieren (tien mannetjes en 10 vrouwtjes per groep) moet de urine worden geanalyseerd, waarbij op dezelfde regelmatige tijdstippen urinemonsters moeten worden genomen als bij de hematologische en klinisch-chemische monsters. Metingen na drie maanden hoeven niet te worden verricht als bij het urineonderzoek in een eerder onderzoek van 90 dagen bij vergelijkbare dosisniveaus geen effect is geconstateerd. De volgende lijst van parameters is afkomstig uit een deskundige aanbeveling inzake klinisch-pathologisch onderzoek (38): uitzien, volume, osmolaliteit of soortelijk gewicht, pH, totaal eiwit, en glucose. Andere bepalingen omvatten keton, urobilinogeen, bilirubine en occult bloed. Indien nodig kunnen hieraan nog andere parameters worden toegevoegd om het onderzoek van het(de) waargenomen effect(en) verder uit te breiden.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Er wordt in het algemeen van uitgegaan dat in geval van onderzoek bij honden basisgegevens voor hematologische en klinisch-biochemische variabelen dienen te worden bepaald vóór aanvang van de behandeling, maar dat dit voor onderzoek bij knaagdieren niet nodig is (38). Als de basisgegevens uit het verleden (zie punt 58) ontoereikend zijn, moet worden overwogen om dergelijke gegevens alsnog te genereren.
                           
                        PATHOLOGIE
                  
                     Macroscopische obductie
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Bij alle dieren in het onderzoek moet normaal gesproken een volledige macroscopische obductie worden uitgevoerd, waaronder een zorgvuldig onderzoek van het huidoppervlak, alle lichaamsopeningen alsmede de schedelholte, de borstholte en de buikholte, en de inhoud daarvan. Het is echter mogelijk dat (bij de groepen met dieren die tussentijds moeten worden gedood of in de satellietgroepen) de metingen moeten worden beperkt tot specifieke, belangrijke parameters als neurotoxiciteit of immunotoxiciteit (zie punt 21). Bij deze dieren hoeft geen obductie te worden uitgevoerd en kunnen ook de in de volgende punten beschreven vervolgprocedures achterwege blijven. De onderzoeksleider bepaalt van geval tot geval of obductie op de verklikkerdieren noodzakelijk is.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Voor alle dieren, behalve die welke op grond van het tweede deel van punt 47 worden uitgesloten, moeten de orgaangewichten worden bepaald. De bijnieren, de hersenen, de epididymides, het hart, de nieren, de lever, de ovaria, de milt, de testes, de schildklier (gewogen na fixatie, inclusief bijschildklieren) en de uterus van alle dieren (afgezien van stervende en/of tussentijds gedode dieren) moeten worden ontdaan van aanhechtend weefsel, naargelang hetgeen van toepassing is, en moeten zo spoedig mogelijk na de sectie nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              De volgende weefsels moeten in een fixeermiddel worden bewaard dat zowel voor het type weefsel als voor het beoogde latere histopathologische onderzoek (40) het meest geschikt is (de weefsels tussen rechte haken zijn facultatief):
                              
                                          elk macroscopisch waarneembaar letsel
                                       
                                       
                                          hart
                                       
                                       
                                          alvleesklier
                                       
                                       
                                          maag (voormaag, kliermaag)
                                       
                                    
                                          bijnier
                                       
                                       
                                          ileum
                                       
                                       
                                          bijschildklier
                                       
                                       
                                          [tanden]
                                       
                                    
                                          aorta
                                       
                                       
                                          jejunum
                                       
                                       
                                          perifere zenuw
                                       
                                       
                                          testis
                                       
                                    
                                          hersenen (inclusief coupes van cerebrum, cerebellum en medulla/pons)
                                       
                                       
                                          nier
                                       
                                       
                                          hypofyse
                                       
                                       
                                          thymus
                                       
                                    
                                          blindedarm
                                       
                                       
                                          traanklier (extraorbitaal)
                                       
                                       
                                          prostaat
                                       
                                       
                                          schildklier
                                       
                                    
                                          cervix
                                       
                                       
                                          lever
                                       
                                       
                                          rectum
                                       
                                       
                                          [tong]
                                       
                                    
                                          coagulans afscheidende klier
                                       
                                       
                                          long
                                       
                                       
                                          speekselklier
                                       
                                       
                                          luchtpijp
                                       
                                    
                                          colon
                                       
                                       
                                          lymfeklieren (zowel oppervlakkig als dieper gelegen)
                                       
                                       
                                          zaadblaasje
                                       
                                       
                                          urineblaas
                                       
                                    
                                          duodenum
                                       
                                       
                                          borstklier (verplicht bij vrouwtjes en facultatief bij mannetjes, indien zichtbaar ontleedbaar)
                                       
                                       
                                          skeletspier
                                       
                                       
                                          uterus (inclusief cervix)
                                       
                                    
                                          epididymis
                                       
                                       
                                          [bovenste luchtwegen, inclusief neus, neusschelpen en paranasale sinussen]
                                       
                                       
                                          huid
                                       
                                       
                                          [ureter]
                                       
                                    
                                          oog (inclusief netvlies)
                                       
                                       
                                          slokdarm
                                       
                                       
                                          ruggenmerg (drie niveaus: cervicaal, mediothoracaal en lumbaal)
                                       
                                       
                                          [urinebuis]
                                       
                                    
                                          [dijbeen met gewricht]
                                       
                                       
                                          [reukkolf]
                                       
                                       
                                          milt
                                       
                                       
                                          vagina
                                       
                                    
                                          galblaas (bij andere diersoorten dan ratten)
                                       
                                       
                                          ovarium
                                       
                                       
                                          [borstbeen]
                                       
                                       
                                          coupe van het beenmerg en/of vers beenmergaspiraat
                                       
                                    
                                          klier van Harder
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    Organen die paarsgewijs voorkomen, bv. nieren en bijnieren, moeten beide worden bewaard. Uit de klinische en andere bevindingen kan de noodzaak blijken verder weefsel te onderzoeken. Ook organen waarvan op basis van de bekende eigenschappen van de teststof verondersteld wordt dat ze kunnen worden aangetast, moeten worden bewaard. Bij onderzoek waarbij de dermale toedieningsweg wordt gebruikt, moeten de organen worden onderzocht die voor de orale toedieningsweg zijn vastgesteld en moeten specifieke monsters van de huid op de toedieningslocatie worden genomen en bewaard. Bij inhalatieonderzoek moet de lijst van luchtwegweefsels die moeten worden bewaard en onderzocht, worden gebaseerd op de aanbevelingen in hoofdstuk B.8 van deze bijlage (9) en hoofdstuk B.29 van deze bijlage (10). In geval van andere organen/weefsels (en in aanvulling op de specifiek bewaarde weefsels van de luchtwegen) moeten de organen worden onderzocht die voor de orale toedieningsweg zijn vastgesteld.
                           
                        
                     Histopathologie
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Er zijn aanwijzingen beschikbaar voor beste praktijken voor de uitvoering van toxicologisch pathologisch onderzoek (40). Ten minste het volgende histopathologische onderzoek dient te worden verricht:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          alle weefsels van de dieren in de hogedosisgroep en de controlegroep;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          alle weefsels van dieren die tijdens het onderzoek stierven of werden gedood;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          alle weefsels die macroscopische abnormaliteiten vertonen;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          doelweefsels of weefsels die met de behandeling samenhangende veranderingen vertonen in de hogedosisgroep en van alle dieren in alle andere dosisgroepen;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          organen die paarsgewijs voorkomen, bv. nieren en bijnieren, moeten beide worden onderzocht.
                                       
                                    
                        WAARNEMINGEN (CARCINOGENITEITSFASE)
                  
                              51.
                           
                           
                              Alle dieren moeten worden onderzocht op tekenen van ziekelijkheid of sterfte, gewoonlijk aan het begin en einde van elke dag, ook tijdens de weekends en op feestdagen. Daarnaast moeten de dieren eenmaal per dag worden onderzocht op specifieke tekenen van toxicologische relevantie. Bij maagsondeonderzoek moeten de dieren worden onderzocht in de periode die onmiddellijk volgt op de toediening van de dosis. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan zich ontwikkelende tumoren; van elke met het blote oog zichtbare of voelbare tumor moeten het tijdstip waarop deze voor het eerst is opgetreden, de plaats, de afmetingen, het uiterlijk en het verloop worden opgetekend.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Aan het begin van het onderzoek moeten alle dieren de eerste 13 weken ten minste één keer per week worden gewogen en daarna ten minste één keer per maand. Ook het voedselverbruik en de voedselefficiëntie moeten de eerste 13 weken ten minste één keer per week worden gemeten en daarna ten minste één keer per maand. Het waterverbruik moet de eerste 13 weken ten minste één keer per week worden gemeten en daarna ten minste één keer per maand als de teststof met het drinkwater wordt toegediend. Het meten van het waterverbruik moet ook worden overwogen bij onderzoek waarbij de drinkactiviteit verandert.
                           
                        
                     Hematologische, klinisch-biochemische en andere metingen
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Om de hoeveelheid uit het onderzoek verkregen informatie te maximaliseren, met name voor het beoordelen van de werkingswijze, kunnen bloedmonsters worden genomen voor hematologie en klinisch-biochemische bepalingen, indien de onderzoeksleider dit noodzakelijk acht. Ook urineonderzoek kan aangewezen zijn. De gegevens over de dieren die zijn gebruikt in de chronische-toxiciteitsfase van het onderzoek, die doorgaans twaalf maanden duurt (zie punt 34), zullen informatie over deze parameters verschaffen. Nadere aanwijzingen over de waarde van dergelijke monsters in het kader van carcinogeniteitsonderzoek zijn te vinden in leidraad nr. 116 (7). Als bloedmonsters worden genomen, moeten deze aan het einde van de testperiode worden genomen, net vóór of tijdens het doden van de dieren. Daarbij dient te worden genoteerd uit welk lichaamsdeel en hoe de monsters zijn genomen, bijvoorbeeld door middel van een hartpunctie of uit de retro-orbitale sinus, onder verdoving. Er kunnen ook bloedpreparaten worden voorbereid voor onderzoek, met name als het beenmerg lijkt te zijn aangetast, hoewel er wordt getwijfeld aan de waarde die een dergelijk onderzoek in de carcinogeniteitsfase heeft voor het beoordelen van het carcinogeen/oncogeen potentieel (38).
                           
                        PATHOLOGIE
                  
                     Macroscopische obductie
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              Bij alle dieren in het onderzoek, behalve verklikkerdieren en andere dieren in satellietgroepen (zie punt 20), moet een volledige macroscopische obductie worden verricht, waaronder een zorgvuldig onderzoek van het huidoppervlak, alle lichaamsopeningen alsmede de schedelholte, de borstholte en de buikholte, en de inhoud daarvan. De onderzoeksleider moet van geval tot geval beoordelen of obductie van verklikkerdieren en andere dieren in de satellietgroepen noodzakelijk is. Het gewicht van de organen maakt normaal gesproken geen deel uit van carcinogeniteitsonderzoek, aangezien geriatrische veranderingen en, in latere stadia, zich ontwikkelende tumoren de bruikbaarheid van gegevens over de orgaangewichten verstoren. Deze gegevens kunnen echter van groot belang zijn voor het bepalen van de bewijskracht van deze gegevens en voor het beoordelen van de werkingswijze. Gegevens over het orgaangewicht van dieren die deel uitmaken van een satellietonderzoek dienen uiterlijk één jaar nadat het onderzoek is aangevat te worden verzameld.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              De volgende weefsels moeten in een fixeermiddel worden bewaard dat zowel voor het type weefsel als voor het beoogde latere histopathologische onderzoek (40) geschikt is (de weefsels tussen rechte haken zijn facultatief):
                              
                                          elk macroscopisch waarneembaar letsel
                                       
                                       
                                          hart
                                       
                                       
                                          alvleesklier
                                       
                                       
                                          maag (voormaag, kliermaag)
                                       
                                    
                                          bijnier
                                       
                                       
                                          ileum
                                       
                                       
                                          bijschildklier
                                       
                                       
                                          [tanden]
                                       
                                    
                                          aorta
                                       
                                       
                                          jejunum
                                       
                                       
                                          perifere zenuw
                                       
                                       
                                          testis
                                       
                                    
                                          hersenen (inclusief coupes van cerebrum, cerebellum en medulla/pons)
                                       
                                       
                                          nier
                                       
                                       
                                          hypofyse
                                       
                                       
                                          thymus
                                       
                                    
                                          blindedarm
                                       
                                       
                                          traanklier (extraorbitaal)
                                       
                                       
                                          prostaat
                                       
                                       
                                          schildklier
                                       
                                    
                                          cervix
                                       
                                       
                                          lever
                                       
                                       
                                          rectum
                                       
                                       
                                          [tong]
                                       
                                    
                                          coagulans afscheidende klier
                                       
                                       
                                          long
                                       
                                       
                                          speekselklier
                                       
                                       
                                          luchtpijp
                                       
                                    
                                          colon
                                       
                                       
                                          lymfeklieren (zowel oppervlakkig als dieper gelegen)
                                       
                                       
                                          zaadblaasje
                                       
                                       
                                          urineblaas
                                       
                                    
                                          duodenum
                                       
                                       
                                          borstklier (verplicht bij vrouwtjes en facultatief bij mannetjes, indien zichtbaar ontleedbaar)
                                       
                                       
                                          skeletspier
                                       
                                       
                                          uterus (inclusief cervix)
                                       
                                    
                                          epididymis
                                       
                                       
                                          [bovenste luchtwegen, inclusief neus, neusschelpen en paranasale sinussen]
                                       
                                       
                                          huid
                                       
                                       
                                          [ureter]
                                       
                                    
                                          oog (inclusief netvlies)
                                       
                                       
                                          slokdarm
                                       
                                       
                                          ruggenmerg (drie niveaus: cervicaal, mediothoracaal en lumbaal)
                                       
                                       
                                          [urinebuis]
                                       
                                    
                                          [dijbeen met gewricht]
                                       
                                       
                                          [reukkolf]
                                       
                                       
                                          milt
                                       
                                       
                                          vagina
                                       
                                    
                                          galblaas (bij andere diersoorten dan ratten)
                                       
                                       
                                          ovarium
                                       
                                       
                                          [borstbeen]
                                       
                                       
                                          coupe van het beenmerg en/of vers beenmergaspiraat
                                       
                                    
                                          klier van Harder
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    Organen die paarsgewijs voorkomen, bv. nieren en bijnieren, moeten beide worden bewaard. Uit de klinische en andere bevindingen kan de noodzaak blijken verder weefsel te onderzoeken. Ook organen waarvan op basis van de bekende eigenschappen van de teststof verondersteld wordt dat ze beschadigd kunnen worden, moeten worden bewaard. Bij onderzoek waarbij de dermale toedieningsweg wordt gebruikt, moeten de organen worden onderzocht die voor de orale toedieningsweg zijn vastgesteld en moeten specifieke monsters van de huid op de toedieningslocatie worden genomen en bewaard. Bij inhalatieonderzoek moet de lijst van luchtwegweefsels die moeten worden bewaard en onderzocht, worden gebaseerd op de aanbevelingen in hoofdstuk B.8 van deze bijlage (8) en hoofdstuk B.29 van deze bijlage (9). In geval van andere organen/weefsels (en in aanvulling op de specifiek bewaarde weefsels van de luchtwegen) moeten de organen worden onderzocht die voor de orale toedieningsweg zijn vastgesteld.
                           
                        
                     Histopathologie
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Er zijn aanwijzingen beschikbaar voor beste praktijken voor de uitvoering van toxicologisch pathologisch onderzoek (40). Ten minste de volgende weefsel moeten worden onderzocht:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          alle weefsels van de dieren in de hogedosisgroep en de controlegroep;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          alle weefsels van dieren die tijdens het onderzoek stierven of werden gedood;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          alle weefsels die macroscopische abnormaliteiten vertonen, met inbegrip van tumoren;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          bij waarneming van met de behandeling samenhangende histopathologische veranderingen bij dieren in de hogedosisgroep, dezelfde weefsels van alle dieren in alle andere dosisgroepen;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          alle organen die paarsgewijs voorkomen, bv. nieren en bijnieren, moeten beide worden onderzocht.
                                       
                                    
                        GEGEVENS EN RAPPORTAGE (CARCINOGENITEIT EN CHRONISCHE TOXICITEIT)
                  
                     Gegevens
                  
                  
                              57.
                           
                           
                              Voor elk dier worden apart gegevens verstrekt over alle geëvalueerde parameters. Bovendien moeten alle gegevens worden samengevat in tabellen die voor iedere testgroep laten zien: het aantal dieren aan het begin van het onderzoek, het aantal dieren dat tijdens de test is gestorven of om redenen van dierenwelzijn moest worden gedood en het tijdstip waarop de dood bij de individuele dieren is ingetreden, het aantal dieren dat toxiciteitsverschijnselen vertoont, een beschrijving van de waargenomen toxische effecten, met inbegrip van de aanvang, de duur en de ernst van eventuele toxische effecten, het aantal dieren met letsel, de aard van het letsel en het percentage dieren waarbij ieder type letsel voorkomt. Samengevatte gegevens in tabelvorm moeten de gemiddelde en standaarddeviatie (voor continue testgegevens) verschaffen van dieren waarbij toxische effecten of letsels voorkomen, in aanvulling op de inschaling van de letsels.
                           
                        
                              58.
                           
                           
                              Bij de interpretatie van de onderzoeksresultaten kunnen controlegegevens uit het verleden nuttig zijn, bv. wanneer er aanwijzingen zijn dat de gegevens van de parallelle controlegroepen aanzienlijk afwijken van de recente gegevens van de controledieren in dezelfde testfaciliteit/kolonie. Controlegegevens uit het verleden die ter evaluatie worden aangeboden, moeten afkomstig zijn uit hetzelfde laboratorium, verband houden met dieren van dezelfde leeftijd en stam, en zijn gegenereerd gedurende de vijf jaar die zijn voorafgegaan aan het onderzoek in kwestie.
                           
                        
                              59.
                           
                           
                              Voor zover van toepassing moeten alle waargenomen resultaten met behulp van een geschikte en algemeen erkende statistische methode worden geëvalueerd. De statistische methoden en de te analyseren gegevens moeten tijdens het opzetten van het onderzoek worden gekozen (zie punt 9). Bij de selectie moet zo nodig worden gecorrigeerd voor overleving.
                           
                        
                              60.
                           
                           
                              In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Teststof:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fysische aard, zuiverheid en fysisch-chemische eigenschappen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identificatiegegevens;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      herkomst van de stof;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      partijnummer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      certificaat van chemische analyse.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Medium (indien van toepassing):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivering voor de keuze van het medium (wanneer dat geen water is).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Proefdieren:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gebruikte diersoort/stam en motivering van de keuze;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aantal, leeftijd en geslacht van de dieren bij aanvang van de test;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      herkomst, huisvesting, voeding enz.;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gewicht van elk dier aan het begin van de test.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testomstandigheden:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivering voor de gekozen toedieningsweg en de keuze van de dosis;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toegepaste statistische methoden voor analyse van de gegevens, indien van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bijzonderheden over de formulering van de teststof, respectievelijk de samenstelling van het voer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analytische gegevens over de bereikte concentratie, stabiliteit en homogeniteit van het preparaat;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de toedieningsweg en bijzonderheden over de toediening van de teststof;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bij inhalatieonderzoek, alleen via de neus of via het hele lichaam;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      werkelijke doses (mg/kg lichaamsgewicht/dag) en conversiefactor van de teststofconcentratie (mg/kg of ppm) in het voedsel/drinkwater naar de werkelijke dosis, voor zover van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en het water.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Resultaten (er moeten samengevatte gegevens in tabelvorm en gegevens voor elk dier apart worden verstrekt)
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Algemeen:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      overlevingsgegevens;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      lichaamsgewicht/veranderingen hierin;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      voedselverbruik, voedselefficiëntie, indien berekend, en waterverbruik, indien van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toxicokinetische gegevens, indien beschikbaar;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oftalmoscopie (indien beschikbaar);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematologie (indien beschikbaar);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klinische chemie (indien beschikbaar).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Klinische bevindingen:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tekenen van toxiciteit;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      incidentie (en indien gescoord, ernst) van eventuele abnormaliteiten;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aard, ernst en duur van de klinische waarnemingen (van voorbijgaande aard dan wel blijvend).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Obductiegegevens:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      lichaamsgewicht aan het einde van het onderzoek;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      orgaangewichten en hun verhoudingen, indien van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      obductieverslagen, incidentie en ernst van abnormaliteiten.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Histopathologie:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      niet-neoplastische histopathologische bevindingen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      neoplastische histopathologische bevindingen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      correlatie van macroscopische en microscopische bevindingen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gedetailleerde beschrijving van alle met de behandeling samenhangende histopathologische bevindingen, met inbegrip van een inschaling van de ernst;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een verslag van eventuele intercollegiale toetsing van objectglaasjes.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Statistische behandeling van de resultaten, naargelang hetgeen van toepassing is
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bespreking van de resultaten, waaronder:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bespreking van eventuele modelleringsbenaderingen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dosis-responsverhoudingen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      controlegegevens uit het verleden;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      beoordeling van eventuele informatie over de werkingswijze;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bepaling van BMD, NOAEL of LOAEL;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      relevantie voor de mens.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Conclusies
                                          
                                       
                                    
                        
                     LITERATUUR:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum, U.S. Environmental Protection Agency, Washington, DC.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Barlow S.M., Greig J.B., Bridges J.W. et al. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food and Chemical Toxicology 40: 145-191.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Chhabra R.S., Bucher J.R., Wolfe M., Portier C. (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health, nr. 206, 437-445.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.27 van deze bijlage, Subchronische orale toxiciteitstest: toxiciteitsonderzoek (oraal) op dieren anders dan knaagdieren bij herhaalde toediening (90 dagen).
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 — Second edition. Series on Testing and Assessment nr. 116, beschikbaar op de openbare website voor onderzoeksrichtlijnen van de OESO op www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.8 van deze bijlage, Subacute inhalatietoxiciteit: onderzoek van 28 dagen.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.29 van deze bijlage, Subchronische inhalatietoxiciteit: onderzoek van 90 dagen.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.9 van deze bijlage, Toxiciteit (dermaal) bij herhaalde toediening (28 dagen).
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Boobis A.R., Cohen S.M., Dellarco V., McGregor D., Meek M.E., Vickers C., Willcocks D., Farland W. (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans, Crit. Rev. in Toxicol, 36:793-801.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Cohen S.M., Meek M.E., Klaunig J.E., Patton D.E., Fenner-Crisp P.A. (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Holsapple M.P., Pitot H.C., Cohen S.N., Boobis A.R., Klaunig J.E., Pastoor T., Dellarco V.L., Dragan Y.P. (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Meek E.M., Bucher J.R., Cohen S.M., Dellarco V., Hill R.N., Lehman-McKemmon L.D., Longfellow D.G., Pastoor T., Seed J., Patton D.E. (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Carmichael N.G., Barton H.A., Boobis A.R. et al. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1-7.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Barton H.A., Pastoor T.P., Baetcke T. et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Crit. Rev. Toxicol. 36: 9-35.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              Doe J.E., Boobis A.R., Blacker A. et al. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 37-68.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              Cooper R.L., Lamb J.S., Barlow S.M. et al. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69-98.
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              Rhomberg L.R., Baetcke K., Blancato J., Bus J., Cohen S., Conolly R., Dixit R., Doe J., Ekelman K., Fenner-Crisp P., Harvey P., Hattis D., Jacobs A., Jacobson-Kram D., Lewandowski T., Liteplo R., Pelkonen O., Rice J., Somers D., Turturro A., West W., Olin S. (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729-837.
                           
                        
                              (23)
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran J.A. (Ed.), ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              (24)
                           
                           
                              Griffiths SA, Parkinson C., McAuslane J.A.N. en Lumley C.E. (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1):214.
                           
                        
                              (25)
                           
                           
                              Usui T., Griffiths SA and Lumley C.E. (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284.
                           
                        
                              (26)
                           
                           
                              Carmichael N.G., Enzmann H., Pate I., Waechter F. (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect 105:1196-1203.
                           
                        
                              (27)
                           
                           
                              Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (PB L 276 van 20.10.2010, blz. 33).
                           
                        
                              (28)
                           
                           
                              National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington, DC, US Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              (29)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments, ISBN 3-906255-06-9.
                           
                        
                              (30)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              (31)
                           
                           
                              Diehl K.-H., Hull R., Morton D., Pfister R., Rabemampianina Y., Smith D., Vidal J.-M., van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology, 21:15-23.
                           
                        
                              (32)
                           
                           
                              IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
                           
                        
                              (33)
                           
                           
                              Tupper D.E., Wallace R.B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.
                           
                        
                              (34)
                           
                           
                              Gad S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.
                           
                        
                              (35)
                           
                           
                              Moser V.C., McDaniel K.M., Phillips P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
                           
                        
                              (36)
                           
                           
                              Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
                           
                        
                              (37)
                           
                           
                              Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
                           
                        
                              (38)
                           
                           
                              Weingand K., Brown G., Hall R. et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198-201.
                           
                        
                              (39)
                           
                           
                              EMEA (concept)document „Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity” (doc. ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).
                           
                        
                              (40)
                           
                           
                              Crissman J.W., Goodman D.G., Hildebrandt P.K. et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131.
                           
                        
                     Aanhangsel 1
                     DEFINITIE
                     Teststof: iedere stof of ieder mengsel die/dat met deze testmethode wordt getest..
                  ”
            
                  7)
               
               
                  Hoofdstuk B.36 wordt vervangen door:
                  „B.36.   TOXICOKINETIEK
                  
                  INLEIDING
                  
                              1.
                           
                           
                              Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 417 (2010) van de OESO (TG 417). De toxicokinetiek van een teststof wordt onderzocht om afdoende informatie te verkrijgen over de absorptie, de distributie, de biotransformatie (d.w.z. metabolisme) en de uitscheiding. Met behulp van deze informatie kan de concentratie of dosering aan de waargenomen toxiciteit worden gerelateerd en het toxiciteitsmechanisme worden doorgrond. Door aan te tonen dat de proefdieren stelselmatig aan de teststof worden blootgesteld en de circulerende bestanddelen te onthullen (oorspronkelijke stof/metabolieten) kan de toxicokinetiek bijdragen tot een beter begrip van toxicologisch onderzoek. De voornaamste voor dit onderzoek te bepalen toxicokinetische parameters verschaffen tevens informatie over de mogelijkheid van accumulatie van de teststof in weefsels en/of organen en de mogelijkheid van inductie van biotransformatie als gevolg van de blootstelling aan de teststof.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Toxicokinetische gegevens kunnen helpen te beoordelen in hoeverre de gegevens over de toxiciteit bij dieren geschikt en relevant zijn om te worden geëxtrapoleerd voor gebruik bij de afweging van de gevaren/risico’s voor de mens. Daarnaast bewijst toxicokinetisch onderzoek goede diensten bij het bepalen van de dosisniveaus voor toxiciteitsonderzoek (lineaire tegenover niet-lineaire kinetiek), de effecten van de toedieningsweg, de biologische beschikbaarheid en de onderzoeksopzet. Bepaalde soorten toxicokinetische gegevens kunnen worden gebruikt bij het opstellen van fysiologische toxicokinetische modellen (PBTK).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Daarnaast kunnen gegevens over metabolieten/toxicokinetiek worden gebruikt voor het voorspellen van mogelijke toxische effecten en werkingswijzen, en het verband met dosisniveaus en blootstellingsroute. Verder kunnen gegevens over het metabolisme nuttige informatie verschaffen met het oog op de beoordeling van het toxicologisch belang van blootstellingen aan exogeen gevormde metabolieten van de teststof.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Adequate toxicokinetische gegevens kunnen worden gebruikt om de aanvaardbaarheid en toepasselijkheid van kwantitatieve structuur-activiteitsrelaties en „read-across”- of groeperingsbenaderingen voor de beoordeling van de veiligheid van chemische stoffen te versterken. Kinetische gegevens kunnen ook worden gebruikt om de toxicologische relevantie van ander onderzoek (bv. in vivo/in vitro) te beoordelen.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Tenzij een andere toedieningsweg wordt vermeld (zie met name de punten 74-78), is deze testmethode toepasbaar op de orale toediening van de teststof.
                           
                        INLEIDENDE OVERWEGINGEN
                  
                              6.
                           
                           
                              Afhankelijk van het regelgevingssysteem gelden er verschillende voorschriften en eisen met betrekking tot het meten van eindpunten en parameters die verband houden met de toxicokinetiek voor verschillende categorieën chemische stoffen (bv. bestrijdingsmiddelen, biociden, industriële chemische stoffen). Anders dan bij de meeste andere testmethoden worden in deze testmethode toxicokinetische tests beschreven, waarbij van meerdere metingen en eindpunten gebruik wordt gemaakt. Het is mogelijk dat er in de toekomst nieuwe testmethoden en/of leidraden worden ontwikkeld om de afzonderlijke eindpunten nader te beschrijven. Welke tests of beoordelingen in het kader van deze testmethode worden uitgevoerd, is afhankelijk van de voorschriften en/of eisen van het desbetreffende regelgevingssysteem.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Er kunnen tal van studies worden uitgevoerd om het toxicokinetische gedrag van een bepaalde teststof voor regelgevingsdoeleinden te evalueren. Het is echter mogelijk dat, afhankelijk van de specifieke regelgevingsbehoeften of -situaties, niet al deze mogelijke studies noodzakelijk zijn om een teststof te evalueren. Bij het opzetten van toxicokinetisch onderzoek moet op flexibele wijze rekening worden gehouden met de kenmerken van de onderzochte teststof. In sommige gevallen is het mogelijk dat slechts een bepaalde reeks vragen hoeft te worden onderzocht in verband met de gevaren en risico’s van de teststof. In andere gevallen kunnen toxicokinetische gegevens worden verzameld als onderdeel van de evaluatie in het kader van ander toxicologisch onderzoek. In weer andere gevallen kunnen aanvullend en/of uitgebreider toxicologisch onderzoek noodzakelijk zijn, afhankelijk van de regelgevingsbehoeften en/of eventuele nieuwe vragen die rijzen tijdens de evaluatie van de chemische stof.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Het testlaboratorium moet alle beschikbare informatie over de teststof, relevante metabolieten en analogen in overweging nemen voordat het onderzoek wordt uitgevoerd. Dit komt de kwaliteit van het onderzoek ten goede en zorgt ervoor dat het onnodig gebruik van dieren wordt vermeden. Deze informatie omvat ook gegevens van andere relevante testmethoden (onderzoek in vivo of in vitro en/of evaluaties in silico). Fysisch-chemische eigenschappen, zoals de partitiecoëfficiënt octanol/water (uitgedrukt als log POW), pKa, de oplosbaarheid in water, de dampdruk en het molecuulgewicht van een chemische stof, kunnen goede diensten bewijzen bij het plannen van het onderzoek en het interpreteren van de resultaten. Deze eigenschappen kunnen worden bepaald aan de hand van de methoden die in de relevante testmethoden worden beschreven.
                           
                        BEPERKINGEN
                  
                              9.
                           
                           
                              Deze testmethode is niet bedoeld voor bijzondere gevallen, zoals drachtige of zogende dieren en hun nakomelingen, of ter evaluatie van mogelijke residuen in voedselproducerende dieren die aan de teststof worden blootgesteld. De gegevens die met een onderzoek volgens B.36 zijn verkregen, kunnen echter achtergrondinformatie verschaffen die van pas komt bij het opzetten van specifiek onderzoek op dit terrein. Deze testmethode is niet bedoeld voor het testen van nanomaterialen. Uit een verslag van de voorlopige evaluatie van de toepasbaarheid van de OESO-richtlijnen voor onderzoek op nanomaterialen blijkt dat TG 417 (gelijkwaardig aan deze testmethode B.36) mogelijk niet op nanomaterialen van toepassing is (1).
                           
                        DEFINITIES
                  
                              10.
                           
                           
                              De in deze testmethode gebruikte definities worden gegeven in het aanhangsel.
                           
                        OVERWEGINGEN INZAKE DIERENWELZIJN
                  
                              11.
                           
                           
                              Aanwijzingen voor de humane behandeling van dieren zijn opgenomen in OESO-leidraad nr. 19 (2). Het verdient aanbeveling OESO-richtsnoer nr. 19 te raadplegen bij alle studies in vivo en in vitro dat in deze testmethode wordt beschreven.
                           
                        BESCHRIJVING VAN DE METHODEN
                  
                     Verkennend onderzoek
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Het gebruik van verkennend onderzoek voor het kiezen van de onderzoeksparameters voor toxicokinetisch onderzoek (bv. metabolisme, massabalans, analytische procedures, bepalen van de dosering, uitademing van CO2 enz.) wordt aanbevolen en aangemoedigd. Het is mogelijk dat het voor de karakterisering van sommige van deze parameters niet noodzakelijk is radioactief gemerkte stoffen te gebruiken.
                           
                        
                     Keuze van de dieren
                  
                  
                     Soort
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              De diersoort (en de stam) die voor toxicokinetische tests wordt gebruikt, moet bij voorkeur gelijk zijn aan de diersoort die is gebruikt bij ander toxicologisch onderzoek van de onderzochte teststof. Normaal gesproken moeten ratten worden gebruikt, aangezien deze op grote schaal worden ingezet bij toxicologisch onderzoek. Het gebruik van andere of aanvullende soorten kan gerechtvaardigd zijn als fundamenteel toxicologisch onderzoek significante toxiciteit bij deze soorten aantoont of als wordt aangetoond dat de toxiciteit/toxicokinetiek voor de mens relevanter is. Als een andere soort wordt gekozen, dient hiervoor een motivering te worden gegeven.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Tenzij anders vermeld, worden bij deze testmethode ratten gebruikt als proefdiersoort. Het is mogelijk dat de testmethode op bepaalde punten moet worden aangepast als er andere proefdiersoorten worden gebruikt.
                           
                        
                     Leeftijd en stam
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Er moeten gezonde, jong-volwassen dieren (normaal gesproken zes-twaalf weken oud ten tijde van de toediening van de doses) worden gebruikt (zie ook de punten 13 en 14). Als er dieren uit een andere leeftijdscategorie worden gebruikt, moet hiervoor een motivering worden gegeven. Alle dieren moeten bij aanvang van het onderzoek ongeveer even oud zijn. Het gewicht van de afzonderlijke dieren mag niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht van de testgroep afwijken. In het ideale geval moet de gebruikte stam gelijk zijn aan die welke is gebruikt voor het samenstellen van de toxicologische databank voor de teststof.
                           
                        
                     Aantal en geslacht van de dieren
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Per geteste dosis moeten minimaal vier dieren van hetzelfde geslacht worden gebruikt. Het gebruikte geslacht dient te worden gemotiveerd. Als er voldoende aanwijzingen zijn om aan te nemen dat er significante verschillen in toxiciteit zijn die samenhangen met het geslacht, moet het gebruik van beide geslachten (vier mannetjes en vier vrouwtjes) worden overwogen.
                           
                        
                     Huisvestings- en voedingsomstandigheden
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              In het algemeen moeten de dieren tijdens de onderzoeksperiode in aparte kooien worden gehuisvest. In bijzondere omstandigheden kan huisvesting in groepen gerechtvaardigd zijn. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. De temperatuur van de proefdierruimte moet 22 °C (± 3 °C) en de relatieve vochtigheid 30-70 % bedragen. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater.
                           
                        
                     Teststof
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Een met 14C radioactief gemerkte teststof moet worden gebruikt bij het bepalen van de massabalans en het identificeren van metabolieten, tenzij kan worden aangetoond dat:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          de massabalans en de metabolieten afdoende kunnen worden geëvalueerd met de niet-radioactief gemerkte teststof;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de analytische specificiteit en gevoeligheid van de methode waarbij gebruikgemaakt wordt van de niet-radioactief gemerkte teststof gelijk zijn aan of groter zijn dan die welke kunnen worden verkregen met de radioactief gemerkte teststof.
                                       
                                    In dat geval hoeft er geen radioactief gemerkte teststof te worden gebruikt. Daarnaast kunnen andere radioactieve en stabiele isotopen worden gebruikt, met name als het element verantwoordelijk is voor of onderdeel is van het toxische bestanddeel van de teststof. Indien mogelijk moet het radioactief gemerkte materiaal zich in een metabolisch stabiel gedeelte van het hoofdmolecuul (het neemt niet deel aan het metabolisme, wordt niet via de stofwisseling uitgescheiden als CO2 en wordt geen onderdeel van het koolstofreservoir van het organisme) bevinden. Markering van meerdere locaties of gebieden van het molecuul kan noodzakelijk zijn om de rol van de teststof in de stofwisseling te volgen.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              De zuiverheid en de identiteit van de al dan niet radioactief gemerkte teststoffen moeten met geschikte methoden worden geanalyseerd. De radiologische zuiverheid van de radioactieve teststof moet van het hoogst bereikbare niveau zijn voor de specifieke teststof (in het ideale geval hoger dan 95 %) en er moeten redelijke inspanningen worden gedaan om onzuiverheden groter dan of gelijk aan 2 % op te sporen. De zuiverheid, de identiteit en het aandeel van eventuele geconstateerde onzuiverheden moeten worden vermeld. Het is mogelijk dat specifieke regelgevingsprogramma’s aanvullende aanwijzingen verstrekken met betrekking tot de definitie en specificaties van uit mengsels bestaande teststoffen en methoden om de zuiverheid ervan te bepalen.
                           
                        
                     Keuze van de dosis
                  
                  
                     Verkennend onderzoek
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Voor het verkennend onderzoek volstaat gewoonlijk één orale dosis. Deze dosis moet niet-toxisch zijn, maar hoog genoeg opdat de metabolieten in excreta (en plasma, indien van toepassing) kunnen worden geïdentificeerd en voldoen aan de aangegeven doelstelling van het verkennend onderzoek, zoals wordt vermeld in punt 12 van deze testmethode.
                           
                        
                     Hoofdonderzoek
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Voor het hoofdonderzoek wordt de voorkeur gegeven aan minimaal twee doses aangezien de informatie van ten minste twee dosisgroepen kan helpen bij het bepalen van de dosering voor ander toxiciteitsonderzoek en bij de dosis-responsbepaling van bestaand toxiciteitsonderzoek.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Als twee doses worden toegediend, moeten beide doses hoog genoeg zijn opdat de metabolieten in excreta (en plasma, indien van toepassing) kunnen worden geïdentificeerd. Bij de keuze van de dosis moet rekening worden gehouden met informatie op basis van beschikbare toxiciteitsgegevens. Als dergelijke informatie niet beschikbaar is (bv. op basis van onderzoek naar acute orale toxiciteit waarbij klinische toxiciteitsverschijnselen zijn opgetekend, of op basis van toxiciteitsonderzoek met herhaalde toediening), kan voor de hoogste dosis een waarde worden overwogen die lager is dan de geschatte LD50-waarde (oraal en dermaal) of LC50-waarde (inhalatie), of die lager is dan de laagste waarde van het geschatte acute toxiciteitsbereik. De laagste dosis moet een fractie van de hoogste dosis zijn.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Als een bepaald dosisniveau wordt onderzocht, dient de dosis idealiter hoog genoeg te zijn zodat de metabolieten in excreta (en plasma, indien van toepassing) kunnen worden geïdentificeerd, zonder dat dit tot klaarblijkelijke toxiciteit leidt. Als er geen tweede dosisniveau is opgenomen, moet dat worden gemotiveerd.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Het is mogelijk dat twee doses niet voldoende zijn voor het bepalen van het effect van de dosis op kinetische processen. Ten minste een van de doses moet voldoende hoog zijn om deze processen te verzadigen. Als de oppervlakte onder de plasmaconcentratie-tijdcurve (area under the curve, AUC) tussen de twee in het hoofdonderzoek gebruikte dosisniveaus niet lineair is, vormt dit een duidelijke aanwijzing dat ergens tussen de twee dosisniveaus verzadiging optreedt van één of meer kinetische processen.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Voor teststoffen met lage toxiciteit moet een maximale dosis van 1 000 mg/kg lichaamsgewicht (oraal en dermaal) worden toegediend (zie hoofdstuk B.2 van deze bijlage voor aanwijzingen betreffende toediening door middel van inhalatie; deze dosis is doorgaans niet hoger dan 2 mg/l). Afhankelijk van de chemische stof en de regelgevingsbehoeften kan het noodzakelijk zijn een hogere dosis te gebruiken. De keuze van de dosis moet altijd worden gemotiveerd.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Toxicokinetische gegevens over de eenmalige toediening en gegevens over de weefseldistributie afkomstig van onderzoek met eenmalige toediening kunnen volstaan voor het bepalen van de mogelijkheid van accumulatie en/of persistentie. In bepaalde gevallen kan herhaalde toediening van de dosis echter noodzakelijk zijn i) om een vollediger beeld te krijgen van de mogelijkheid van accumulatie en/of persistentie of veranderingen in de toxicokinetiek (zoals bijvoorbeeld inductie en inhibitie van enzymen), of ii) om te voldoen aan de voorschriften van het desbetreffende regelgevingssysteem. Bij onderzoek met herhaalde toediening zal herhaalde toediening van een lage dosis meestal volstaan, maar in bepaalde omstandigheden kan eveneens herhaalde toediening van een hoge dosis noodzakelijk zijn (zie ook punt 57).
                           
                        
                     Toediening van de teststof
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              De teststof moet zijn opgelost of homogeen zijn gesuspendeerd in hetzelfde medium dat is gebruikt voor het andere toxiciteitsonderzoek met maagsonde dat met de teststof is verricht, als informatie daarover beschikbaar is. De keuze van het medium moet worden gemotiveerd. Bij de opzet van het onderzoek moet aandacht worden besteed aan de keuze van het medium en het doseringsvolume. Gewoonlijk wordt de teststof toegediend via een maagsonde; toediening via gelatinecapsules of vermengd met het voer kan in bepaalde gevallen de voorkeur verdienen (in beide gevallen moet een motivering worden gegeven). De aan elk dier werkelijk toegediende dosis dient te worden geverifieerd.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Het maximale vloeistofvolume dat tegelijkertijd via een orale maagsonde moet worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van de proefdieren, het soort toedieningsmedium en de vraag of de proefdieren nuchter zijn voordat de teststof wordt toegediend. Het verstrekken of beperken van het voedsel voor toediening van de dosis moet worden gemotiveerd. Normaal gesproken moet het volume van zowel waterige als niet-waterige media zo laag mogelijk worden gehouden. De dosisvolumes bij knaagdieren mogen 10 ml/kg lichaamsgewicht normaal gezien niet overschrijden. Voor meer lipofiele teststoffen worden mediavolumes vanaf 4 ml/kg lichaamsgewicht gebruikt. Voor herhaalde dosering, waarbij dagelijks vasten is gecontra-indiceerd, moeten lagere dosisvolumes (bijvoorbeeld 2-4 ml/kg lichaamsgewicht) worden overwogen. Indien mogelijk kan het gebruik van een dosisvolume worden overwogen dat consistent is met het volume dat is toegediend bij ander onderzoek met orale maagsonde dat voor een teststof is verricht.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Aan de hand van intraveneuze toediening van de teststof en meting van de teststof in het bloed en/of de excreta kan de biologische beschikbaarheid of de relatieve orale absorptie worden vastgesteld. Bij intraveneus onderzoek wordt een eenmalige dosis (gewoonlijk gelijkwaardig aan maar niet hoger dan de laagste orale dosis; zie de informatie over de keuze van de dosis) van de teststof toegediend met een geschikt medium. Dit materiaal moet in een passende hoeveelheid (bijvoorbeeld 1 ml/kg lichaamsgewicht) via de gekozen locatie worden toegediend aan ten minste vier dieren van het juiste geslacht (mits gerechtvaardigd mogen beide geslachten worden gebruikt; zie punt 16). Bij intraveneuze toediening van de teststof moet een volledig opgelost of gesuspendeerd dosispreparaat worden gebruikt. Het medium voor intraveneuze toediening mag de integriteit of de doorstroming van het bloed niet verstoren. Als de teststof via een infuus wordt toegediend, moet de infusiesnelheid worden vermeld en tussen de dieren worden gestandaardiseerd, mits een infuuspomp wordt gebruikt. Er moet een verdovingsmiddel worden gebruikt als de halsader wordt gecanuleerd (voor toediening van de teststof en/of aftapping van bloed) of als de dijbeenslagader wordt gebruikt voor de toediening. Er moet bijzondere aandacht worden besteed aan het soort verdoving dat wordt toegepast, aangezien dit de toxicokinetiek kan beïnvloeden. De dieren moeten in de gelegenheid worden gesteld zich voldoende te herstellen voordat de teststof en het medium worden toegediend.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Ook andere toedieningswegen, zoals de dermale of de inhalatieweg (zie de punten 74-78), kunnen worden toegepast bij bepaalde teststoffen, afhankelijk van hun fysisch-chemische eigenschappen en het verwachte gebruik of de verwachte blootstelling bij de mens.
                           
                        
                     Metingen
                  
                  
                     Massabalans
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              De massabalans wordt bepaald door het percentage toegediende (radioactieve) dosis dat via de urine, de feces en de uitgeademde lucht is uitgescheiden op te tellen bij het percentage dat in de weefsels, het resterende karkas en de wasvloeistof van de kooi aanwezig is (zie punt 46). In het algemeen wordt een totale recovery van de toegediende teststof (radioactiviteit) van ca. > 90 % als afdoende beschouwd.
                           
                        
                     Absorptie
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Een eerste schatting van de absorptie kan worden verkregen door het percentage van de dosis in het maag-darmkanaal en/of de feces uit te sluiten bij het bepalen van de massabalans. Zie punt 33 voor informatie over het berekenen van het absorptiepercentage. Zie de punten 44-49 voor informatie over het onderzoeken van de excreta. Als de exacte mate van absorptie na orale toediening van de dosis niet kan worden vastgesteld op basis van massabalansonderzoek (bv. wanneer meer dan 20 % van de toegediende dosis aanwezig is in de feces), kan nader onderzoek noodzakelijk zijn. Dit onderzoek moet hetzij 1) de orale toediening van de teststof en de meting van de teststof in de gal, hetzij 2) de orale en intraveneuze toediening van de teststof en de meting van de nettohoeveelheid teststof die aanwezig is in de urine plus de uitgeademde lucht plus het karkas voor elk van beide toedieningswegen, omvatten. Welke van beide onderzoeksopzetten ook wordt gekozen, de meting van de radioactiviteit wordt verricht als surrogaatmethode voor de stofspecifieke analyse van de teststof plus metabolieten.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Als de galexcretie wordt onderzocht, wordt gewoonlijk de orale toedieningsweg gebruikt. Bij dit onderzoek worden de galwegen van ten minste vier dieren van het juiste geslacht (of beide geslachten, indien gerechtvaardigd) gecanuleerd en wordt een eenmalige dosis van de teststof toegediend. Na toediening van de teststof wordt de galexcretie gecontroleerd op radioactiviteit/teststof zolang dit noodzakelijk is om een schatting te kunnen maken van het percentage toegediende dosis dat via deze weg wordt uitgescheiden. Op basis hiervan kan rechtstreeks de mate van orale absorptie worden berekend:
                              
                                 
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Bij sommige categorieën chemische stoffen kan rechtstreekse uitscheiding van de geabsorbeerde dosis plaatsvinden via de intestinale membranen. In dergelijke gevallen wordt meting van het percentage dosis in de feces na orale toediening aan ratten met gecanuleerde galwegen niet geacht representatief te zijn voor de niet-geabsorbeerde dosis. Als intestinale secretie wordt vermoed, is het raadzaam om het percentage geabsorbeerde dosis te baseren op de absorptie die is berekend op basis van een vergelijking van de uitscheiding na de orale toediening en de intraveneuze toediening (intacte ratten of ratten met gecanuleerde galwegen) (zie punt 35). Als kwantificering van de intestinale secretie noodzakelijk wordt geacht, is het daarnaast raadzaam om de uitscheiding bij ratten met gecanuleerde galwegen te meten na intraveneuze toediening van de dosis.
                           
                        
                     Biologische beschikbaarheid
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              De biologische beschikbaarheid kan worden bepaald op basis van de kinetiek in het plasma/bloed van de orale en intraveneuze groepen, zoals beschreven in de punten 50-52, door middel van een specifieke chemische analyse van de teststof en/of relevante metabolieten; hiervoor is derhalve geen radioactief gemerkte teststof vereist. De biologische beschikbaarheid (F) van de teststof of relevante metabolieten kan dan als volgt worden berekend:
                              
                                 
                           
                        Hierbij is AUC de oppervlakte onder de plasmaconcentratie-tijdcurve en exp de toedieningsweg (oraal, dermaal of via inhalatie).
                  
                              36.
                           
                           
                              Met het oog op de risicobeoordeling van systemische effecten wordt in het algemeen de voorkeur gegeven aan de biologische beschikbaarheid van het toxische bestanddeel boven het absorptiepercentage voor het vergelijken van systemische concentraties die zijn vastgesteld in het kader van onderzoek bij dieren met gelijkwaardige biomonitoringgegevens die afkomstig zijn van blootstellingsonderzoek onder werknemers. De complexiteit kan toenemen als de doses in het niet-lineaire bereik liggen. Het is daarom belangrijk dat bij de toxicokinetische screening de doses in het lineaire bereik worden bepaald.
                           
                        
                     Weefseldistributie
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Kennis van de weefseldistributie van een teststof en/of de metabolieten ervan is van belang voor de identificatie van doelweefsels en een beter begrip van het onderliggende toxiciteitsmechanisme, alsook voor het verkrijgen van informatie over de mogelijkheid van accumulatie en persistentie van teststof en metabolieten. Het percentage totale (radioactieve) dosis in de weefsels en het resterende karkas moet ten minste worden gemeten bij beëindiging van het uitscheidingsexperiment (gewoonlijk zeven dagen of minder na toediening van de dosis, afhankelijk van het gedrag van de specifieke teststof). Als er bij beëindiging van het onderzoek geen teststof wordt gevonden in weefsels (bv. omdat de teststof vanwege zijn korte halveringstijd vóór de beëindiging van het onderzoek is verdwenen), moet erop worden gelet dat de gegevens niet verkeerd worden geïnterpreteerd. In dergelijke gevallen moet de weefseldistributie worden onderzocht ten tijde van de piekconcentratie van de teststof (en/of metabolieten) in het plasma/bloed (Tmax) of de hoogste uitscheiding via de urine, naargelang hetgeen van toepassing is (zie punt 38). Daarnaast kan het noodzakelijk zijn vaker weefsels te verzamelen om de weefseldistributie van de teststof en/of de metabolieten ervan te bepalen, zodat de tijdafhankelijkheid kan worden geëvalueerd (indien van toepassing) en de massabalans kan worden bepaald, indien een bevoegde autoriteit dat verlangt. De weefsels die moeten worden verzameld, omvatten lever, vet, maag-darmkanaal, nier, milt, volledig bloed, resterend karkas, weefsels van doelorganen en andere weefsels, bijvoorbeeld schildklier, erytrocyten, voortplantingsorganen, huid, oog (met name bij gepigmenteerde dieren) die mogelijk van belang zijn voor de toxicologische evaluatie van de teststof. Er moet worden overwogen aanvullende weefsels op dezelfde tijdstippen te analyseren om de dieren zo doelmatig mogelijk te gebruiken en indien bij onderzoek naar de subchronische en/of chronische toxiciteit doelorgaantoxiciteit wordt waargenomen. Ook de concentratie van (radioactieve) residuen en de verhouding weefsel/plasma (bloed) moeten worden vermeld.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Het is mogelijk dat ook de weefseldistributie op aanvullende tijdstippen, zoals ten tijde van de piekconcentratie in het plasma/bloed (bijvoorbeeld Tmax) of de hoogste uitscheiding via de urine, die zijn verkregen op basis van het desbetreffende onderzoek naar de kinetiek in het plasma/bloed of de uitscheiding, moet worden geëvalueerd of dat dit door een bevoegde autoriteit wordt verlangd. Deze informatie kan nuttig zijn om een beter begrip te krijgen van de toxiciteit en de mogelijkheid van accumulatie en persistentie van de teststof en metabolieten. De keuze van de monsters moet worden gemotiveerd; de monsters voor de analyse moeten in het algemeen gelijk zijn aan die welke hierboven worden vermeld (zie punt 37).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Bij onderzoek naar de weefseldistributie kan radioactiviteit worden gekwantificeerd door middel van sectie op de organen, homogenisering, verbranding en/of solubilisatie, gevolgd door een vloeistofscintillatietelling van de ingesloten residuen. Bepaalde technieken die momenteel worden ontwikkeld, zoals Quantitative whole-body autoradiography en receptor microscopic autoradiography, kunnen nuttig zijn bij het bepalen van de verdeling van een teststof over de organen en/of weefsels (3)(4).
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Voor andere blootstellingsroutes dan de orale moeten specifieke weefsels worden verzameld en geanalyseerd, zoals de longen bij inhalatieonderzoek en de huid bij dermaal onderzoek. Zie hiervoor de punten 74-78.
                           
                        
                     Metabolisme
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Excreta (en plasma, indien van toepassing) moeten worden verzameld ter identificatie en kwantificering van de onveranderde teststof en metabolieten, zoals beschreven in de punten 44-49. Samenvoeging van de excreta is aanvaardbaar ter vereenvoudiging van de identificatie van metabolieten binnen een specifieke dosisgroep. Profilering van de metabolieten uit elke periode wordt aanbevolen. Als dit vanwege een gebrek aan monsters en/of radioactiviteit niet mogelijk is, is het samenvoegen van op diverse tijdstippen verzamelde urine en feces aanvaardbaar, maar het samenvoegen daarvan voor de geslachten of doses is niet aanvaardbaar. Er moeten passende kwalitatieve en kwantitatieve methoden worden toegepast om urine, feces, door de behandelde dieren uitgeademde radioactiviteit en gal, indien van toepassing, te analyseren.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Er moeten redelijke inspanningen worden gedaan om alle metabolieten te identificeren die 5 % of meer van de toegediende dosis uitmaken en een metabolismeschema op te stellen voor de teststof. Teststoffen waarvan de aanwezigheid in de excreta in concentraties van 5 % of hoger van de toegediende dosis is vastgesteld, moeten worden geïdentificeerd. Hiermee wordt bedoeld dat de exacte structuur van de bestanddelen moet worden bepaald. Doorgaans wordt de identiteit van de stoffen bepaald door middel van co-chromatografie van de metaboliet aan de hand van bekende normen met behulp van twee ongelijke systemen of technieken die een positieve identificatie van de structuur mogelijk maken, zoals massaspectrometrie, kernspinresonantie (nuclear magnetic resonance, NMR) enz. In geval van co-chromatografie worden chromatografische technieken waarbij dezelfde stationaire fase wordt gebruikt met twee verschillende oplossingssystemen niet geacht een adequate verificatie van de identiteit van de metaboliet met behulp van twee methoden op te leveren, aangezien de toegepaste methoden niet onafhankelijk van elkaar zijn. Voor de identificatie met behulp van co-chromatografie moeten twee ongelijke, onafhankelijke analysesystemen worden gebruikt, zoals dunnelaagchromatografie (thin layer chromatography, TLC) met omgekeerde en normale fase en hogedrukvloeistofchromatografie (high performance liquid chromatography, HPLC). Mits de chromatografische scheiding van voldoende hoge kwaliteit is, is aanvullende bevestiging door middel van spectroscopie niet noodzakelijk. Als alternatief kan ondubbelzinnige identificatie worden verkregen met behulp van methoden die informatie over de structuur bieden zoals: vloeistofchromatografie/massaspectrometrie (LC-MS), of vloeistofchromatografie/tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS), gaschromatografie/massaspectrometrie (GC-MS) en NMR-spectrometrie.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Als het niet mogelijk is metabolieten met 5 % of hoger van de toegediende dosis te identificeren, moet een rechtvaardiging/toelichting in het eindverslag worden opgenomen. Het kan passend zijn om metabolieten die minder dan 5 % van de toegediende dosis vertegenwoordigen te identificeren om een beter begrip te verwerven van de metabole route met het oog op de beoordeling van de gevaren en/of risico’s die aan de teststof kleven. Zo mogelijk moet de structuur worden bevestigd. Hiertoe kan een metabool profiel in het plasma, bloed of andere weefsels worden opgesteld.
                           
                        
                     Uitscheiding
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              De snelheid en omvang van de uitscheiding van de toegediende dosis moeten worden bepaald door het percentage (radioactieve) dosis te meten dat is teruggevonden in urine, feces en uitgeademde lucht. Aan de hand van deze gegevens kan tevens de massabalans worden bepaald. De in de urine, feces en uitgeademde lucht verwijderde hoeveelheden van de teststof (radioactiviteit) moeten met de juiste tussenpozen worden bepaald (zie de punten 47-49). Experimenten met herhaalde toediening moeten zodanig worden opgezet dat het mogelijk is uitscheidingsgevens te verzamelen overeenkomstig de doelstellingen die in punt 26 worden beschreven. Op die manier kunnen experimenten met eenmalige toediening met elkaar worden vergeleken.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Als uit verkennend onderzoek is gebleken dat er geen significante hoeveelheid van de teststof (radioactiviteit) (overeenkomstig punt 49) in de uitgeademde lucht wordt uitgescheiden, hoeft de uitgeademde lucht in het definitieve onderzoek niet te worden verzameld.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Elk dier wordt in een aparte behuizing geplaatst zodat de excreta (urine, feces en uitgeademde lucht) kunnen worden verzameld. Aan het einde van elke verzamelperiode (zie de punten 47-49) worden deze metabole eenheden gereinigd met een geschikt oplosmiddel (het „uitwassen”) om ervoor te zorgen dat zo veel mogelijk teststof (radioactiviteit) wordt teruggevonden. Het verzamelen van excreta moet worden beëindigd na zeven dagen of, indien dit eerder plaatsvindt, nadat 90 % van de toegediende dosis is teruggevonden.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              De totale hoeveelheden van de teststof (radioactiviteit) in de urine dienen op ten minste twee tijdstippen op dag 1 van de verzameling te worden bepaald, eenmaal 24 uur na toediening van de dosis en daarna dagelijks totdat het onderzoek wordt beëindigd. Het wordt aangeraden op dag 1 meer dan twee bemonsteringstijdstippen (bv. om 6, 12 en 24 uur) te kiezen. De resultaten van verkenned onderzoek moeten worden geanalyseerd om informatie te verkrijgen over alternatieve of aanvullende bemonsteringstijdstippen. Wanneer een ander bemonsteringsschema wordt gebruikt, moet hiervoor een motivering worden gegeven.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              De totale hoeveelheden van de teststof (radioactiviteit) in feces dienen dagelijks te worden bepaald, vanaf 24 uur na toediening van de dosis totdat het onderzoek wordt beëindigd, tenzij op grond van modelonderzoek alternatieve of aanvullende bemonsteringstijdstippen worden aangeraden. Wanneer een ander bemonsteringsschema wordt toegepast, moet dit worden gemotiveerd.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Het verzamelen van uitgeademd CO2 en andere vluchtige stoffen tijdens een onderzoeksexperiment kan worden gestaakt wanneer in de uitgeademde lucht minder dan 1 % van de toegediende dosis wordt gevonden in de loop van een bemonsteringsperiode van 24 uur.
                           
                        
                     Onderzoek naar het tijdsverloop
                  
                  
                     Kinetiek in plasma/bloed
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Dit onderzoek heeft tot doel schattingen te verkrijgen van toxicokinetische basisparameters (bijvoorbeeld Cmax, Tmax, halveringstijd (t1/2), AUC) voor de teststof. Dergelijk onderzoek kan worden verricht met één dosis of, bij voorkeur, met twee of meer doses. De dosering wordt bepaald door de aard van het experiment en/of het onderzochte vraagstuk. Om antwoord te geven op vraagstukken over bijvoorbeeld de biologische beschikbaarheid van de teststof en/of het effect van de dosis op de zuivering door de nieren (bv. om te verduidelijken of afhankelijk van de dosering verzadiging van de zuivering optreedt) kunnen kinetische gegevens noodzakelijk zijn.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Voor dergelijk onderzoek moeten per dosisgroep ten minste vier dieren van hetzelfde geslacht worden gebruikt. Het gebruikte geslacht dient te worden gemotiveerd. Als er voldoende aanwijzingen zijn om aan te nemen dat er significante verschillen in toxiciteit zijn die samenhangen met het geslacht, moet het gebruik van beide geslachten (vier mannetjes en vier vrouwtjes) worden overwogen.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Na toediening van de teststof (radioactief gemerkt) moeten op geschikte bemonsteringstijdstippen van elk dier bloedmonsters worden genomen volgens de passende bemonsteringsmethode. De hoeveelheid en het aantal bloedmonsters die per dier kunnen worden afgenomen kunnen worden beperkt door de mogelijke effecten van de herhaalde bemonstering op de gezondheid/fysiologie van het dier en/of de gevoeligheid van de analysemethode. De monsters moeten voor elk dier afzonderlijk worden geanalyseerd. In bepaalde gevallen (bijvoorbeeld met het oog op de karakterisering van metabolieten) kan het noodzakelijk zijn monsters van meerdere dieren samen te voegen. Samengevoegde monsters moeten duidelijk als zodanig worden gemarkeerd en er moet een motivering worden gegeven voor het samenvoegen. Als een radioactief gemerkte teststof wordt gebruikt, kan een analyse van de totaal aanwezige radioactiviteit toereikend zijn. In dat geval wordt de totale radioactiviteit geanalyseerd in volledig bloed en plasma of plasma en rode bloedcellen om berekening van de verhouding bloed/plasma mogelijk te maken. In andere gevallen kan nader onderzoek noodzakelijk zijn waarvoor identificatie van de oorspronkelijke verbinding en/of metabolieten vereist is of ter beoordeling van de eiwitbinding.
                           
                        
                     Kinetiek in andere weefsels
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Dit onderzoek heeft tot doel tijdgebonden informatie te verkrijgen met betrekking tot vraagstukken die verband houden met de toxische werkingswijze, bioaccumulatie en biopersistentie door de niveaus van de teststof in uiteenlopende weefsels te bepalen. Welke weefsels worden gekozen en hoeveel tijdstippen worden geëvalueerd is afhankelijk van het te onderzoeken weefsel en de toxicologische databank voor de teststof. Bij het opzetten van aanvullend onderzoek naar de kinetiek in weefsels moet rekening worden gehouden met de informatie die overeenkomstig de punten 37-40 is verzameld. Dit onderzoek kan worden verricht met eenmalige of herhaalde toediening. De gekozen aanpak moet nader worden gemotiveerd.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Er kan onderzoek naar kinetiek in andere weefsels worden verricht:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          als er aanwijzingen zijn voor een verlengde halveringstijd in bloed, wat zou kunnen wijzen op de mogelijke accumulatie van de teststof in diverse weefsels, of
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          om te zien of een stabiele waarde is bereikt voor bepaalde weefsels (bij onderzoek met herhaalde toediening kan het bv. interessant zijn te bepalen of er ook een stabiele waarde is bereikt in de doelweefsels, ook al is er in het bloed blijkbaar een stabiele waarde voor de teststof bereikt).
                                       
                                    
                        
                              55.
                           
                           
                              Voor dergelijk onderzoek naar het tijdsverloop dient een passende orale dosis van de teststof te worden toegediend aan ten minste vier dieren per dosis per tijdstip en het tijdsverloop van de distributie in geselecteerde weefsels te worden gevolgd. Hierbij mogen dieren van één geslacht worden gebruikt, tenzij geslachtsspecifieke toxiciteit wordt waargenomen. Of de totale radioactiviteit of de oorspronkelijke chemische stof en/of metabolieten worden geanalyseerd, is mede afhankelijk van het onderzochte vraagstuk. De beoordeling van de weefseldistributie dient te worden verricht met gebruikmaking van passende technieken.
                           
                        
                     Inductie/remming van enzymen
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Het is mogelijk dat onderzoek moet worden verricht naar de mogelijke effecten van inductie/remming van enzymen of biotransformatie van de onderzochte teststof als aan één of meer van de volgende voorwaarden wordt voldaan:
                              
                                          1.
                                       
                                       
                                          de beschikbare gegevens wijzen op een verband tussen de biotransformatie van de teststof en een verhoogde toxiciteit;
                                       
                                    
                                          2.
                                       
                                       
                                          de beschikbare toxiciteitsgegevens wijzen op een niet-lineair verband tussen dosis en metabolisme;
                                       
                                    
                                          3.
                                       
                                       
                                          de resultaten van onderzoek dat was gericht op de identificatie van metabolieten wijzen op een mogelijk toxische metaboliet die het resultaat kan zijn van een enzympad dat door de teststof wordt geïnduceerd;
                                       
                                    
                                          4.
                                       
                                       
                                          effecten waarvan men vermoed dat ze verband houden met enzyminductie zouden door dergelijk onderzoek kunnen worden verklaard;
                                       
                                    
                                          5.
                                       
                                       
                                          als er vanuit toxicologisch opzicht significante veranderingen in het metabole profiel van de teststof worden waargenomen tijdens proeven in vitro of in vivo met verschillende diersoorten of onder verschillende omstandigheden, kan karakterisering van de betrokken enzymen noodzakelijk zijn (bijvoorbeeld fase I-enzymen zoals de iso-enzymen van het cytochroom P450-afhankelijk mono-oxygenasesysteem, fase II-enzymen zoals de iso-enzymen van sulfotransferase of UDP-glucuronyltransferase of andere relevante enzymen). Deze informatie kan worden gebruikt om het belang van bepaalde soorten voor extrapolatie naar andere soorten te evalueren.
                                       
                                    
                        
                              57.
                           
                           
                              Er moeten passende onderzoeksprotocollen worden gebruikt om veranderingen in de toxicokinetiek die verband houden met de teststof te evalueren, mits deze gevalideerd en voorzien zijn van een passende motivering. Voorbeelden van onderzoeksopzetten zijn onderzoek met herhaalde toediening van een niet-gemerkte teststof, gevolgd door een eenmalige radioactief gemerkte dosis op dag 14, of met herhaalde toediening van een radioactief gemerkte teststof en bemonstering op dag 1, 7 en 14 om de metabole profielen te bepalen. Herhaalde toediening van een radioactief gemerkte teststof kan ook informatie opleveren over bioaccumulatie (zie punt 26).
                           
                        AANVULLENDE BENADERINGEN
                  
                              58.
                           
                           
                              Benaderingen in aanvulling op de proeven in vivo die in deze testmethode worden beschreven, kunnen nuttige informatie verschaffen over de absorptie, de distributie, het metabolisme of de verwijdering van een teststof bij bepaalde diersoorten.
                           
                        
                     Gebruik van in-vitro-informatie
                  
                  
                              59.
                           
                           
                              Met behulp van de juiste testsystemen kunnen bij onderzoek in vitro vraagstukken in verband met het metabolisme van de teststof worden onderzocht. Pas geïsoleerde of gekweekte hepatocyten en subcellulaire fracties (bv. microsomen en cytosol of S9-fractie) uit de lever kunnen worden gebruikt om mogelijke metabolieten te onderzoeken. Het lokaal metabolisme van het doelorgaan, bv. de long, kan van belang zijn voor de risicobeoordeling. Hiertoe kunnen microsomiale fracties van doelweefsels van nut zijn. Onderzoek op het gebied van microsomen kan dienen om mogelijke, van het geslacht en het levensstadium afhankelijke verschillen te onderzoeken en enzymparameters (Km en Vmax) te karakteriseren die kunnen helpen bij het beoordelen van de mate waarin de dosisafhankelijkheid van het metabolisme reageert op verschillende blootstellingsniveaus. Daarnaast kunnen met behulp van microsomen de specifieke bij het metabolisme van de teststof betrokken microsomiale enzymen worden geïdentificeerd die relevant kunnen zijn voor de extrapolatie naar andere soorten (zie ook punt 56). De mogelijkheid van inductie van biotransformatie kan ook worden onderzocht met behulp van subcellulaire fracties uit de lever (bv. microsomen en cytosol) van dieren die vooraf zijn behandeld met de onderzochte teststof, in vitro via onderzoek naar de inductie van hepatocyten of op basis van specifieke cellijnen waarin specifieke enzymen tot expressie komen. In bepaalde gevallen en onder de juiste omstandigheden kan worden overwogen subcellulaire fracties van menselijke weefsels te gebruiken bij het bepalen van mogelijke soortafhankelijke verschillen op het gebied van biotransformatie. De resultaten van onderzoek in vitro kunnen ook nuttig zijn bij het ontwikkelen van PBTK-modellen (5).
                           
                        
                              60.
                           
                           
                              Onderzoek in vitro naar dermale absorptie kan aanvullende informatie opleveren voor het karakteriseren van de absorptie (6).
                           
                        
                              61.
                           
                           
                              Met primaire celculturen van levercellen en verse weefselcoupes kunnen vergelijkbare vraagstukken worden onderzocht als met levermicrosomen. In bepaalde gevallen kunnen cellijnen waarin het relevante enzym tot specifieke expressie komt of genetisch aangepaste cellijnen antwoord verschaffen op specifieke vragen. In andere gevallen kan het nuttig zijn de inductie en de remming van specifieke cytochrome P450-iso-enzymen (bv. CYP1A1, 2E1, 1A2 e.a.) en/of van fase II-enzymen door de oorspronkelijke verbinding door middel van onderzoek in vitro te bestuderen. De verkregen informatie kan nut hebben voor verbindingen met een verwante structuur.
                           
                        
                     Het gebruik van toxicokinetische gegevens uit toxiciteitsonderzoek als aanvullende informatie
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Aan de analyse van bloed-, weefsel- en/of excretamonsters die zijn verkregen tijdens ander toxiciteitsonderzoek kunnen gegevens worden ontleend over de biologische beschikbaarheid, veranderingen in de plasmaconcentratie in de tijd (AUC, Cmax), de mogelijkheid van bioaccumulatie, de zuiveringssnelheid en van het geslacht of het levensstadium afhankelijke veranderingen in metabolisme en kinetiek.
                           
                        
                              63.
                           
                           
                              Aan de hand van de onderzoeksopzet kunnen vraagstukken worden onderzocht in verband met: de verzadiging van de absorptie-, biotransformatie- of uitscheidingsroutes bij hogere doseringen; de werking van nieuwe metabole routes bij hogere doseringen en de beperking van toxische metabolieten tot hogere doseringen.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              In verband met de beoordeling van de gevaren kunnen ook de volgende vraagstukken worden onderzocht:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          leeftijdsafhankelijke gevoeligheid vanwege verschillen in status van de bloed-hersenbarrière, de nieren en/of het detoxificatievermogen;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de gevoeligheid van subpopulaties voor verschillen in biotransformatievermogen of andere toxicokinetische verschillen;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de mate van blootstelling van de foetus als gevolg van de transplacentale overdracht van chemische stoffen of van het pasgeboren jong als gevolg van de lactatie.
                                       
                                    
                        
                     Het gebruik van toxicokinetische modellering
                  
                  
                              65.
                           
                           
                              Toxicokinetische modellen kunnen van nut zijn voor diverse aspecten van de gevaar- en risicobeoordeling, zoals het voorspellen van de systemische blootstelling en de interne dosis in weefsels. Daarnaast kunnen specifieke vragen over de werkingswijze worden onderzocht en deze modellen kunnen de basis vormen voor de extrapolatie naar andere soorten, blootstellingsroutes, doseringspatronen en de risicobeoordeling bij de mens. Gegevens die nuttig zijn voor het ontwikkelen van PBTK-modellen voor een teststof bij een willekeurige soort omvatten 1) partitiecoëfficiënten, 2) biochemische constanten en fysiologische parameters, 3) routespecifieke absorptieparameters en 4) kinetische in-vivogegevens voor de evaluatie van modellen (bijvoorbeeld zuiveringsparameters voor relevante (> 10 %) uitscheidingsroutes, Km en Vmax voor het metabolisme]. De experimentele gegevens die worden gebruikt bij het ontwikkelen van modellen moeten met wetenschappelijk verantwoorde methoden worden gegenereerd en de modelresultaten moeten worden gevalideerd. Vaak worden aan de hand van voor de teststof en diersoort specifieke parameters als de absorptiesnelheid, de partitionering van bloed en weefsel en de metabole constanten niet-gecompartimenteerde of op de fysiologie gebaseerde modellen ontwikkeld (7).
                           
                        GEGEVENS EN RAPPORTAGE
                  
                              66.
                           
                           
                              Het verdient aanbeveling een inhoudsopgave op te nemen in het onderzoeksverslag.
                           
                        
                     Hoofdtekst van het verslag
                  
                  
                              67.
                           
                           
                              De hoofdtekst van het verslag moet de in deze testmethode behandelde informatie bevatten, die als volgt is onderverdeeld in afdelingen en punten:
                           
                        
                     Samenvatting
                  
                  
                              68.
                           
                           
                              In deze afdeling van het onderzoeksverslag moeten een samenvatting van de onderzoeksopzet en een beschrijving van de gebruikte methoden worden opgenomen. Daarnaast moet aandacht worden besteed aan de voornaamste bevindingen op het gebied van de massabalans, de aard en omvang van de metabolieten, weefselresiduen, de zuiveringssnelheid, de mogelijkheid van bioaccumulatie, geslachtsafhankelijke verschillen enz. De samenvatting moet voldoende gedetailleerd zijn om evaluatie van de bevindingen mogelijk te maken.
                           
                        
                     Inleiding
                  
                  
                              69.
                           
                           
                              In deze afdeling van het verslag moeten de doelstellingen, de motivering en de opzet van het onderzoek worden beschreven, alsmede passende referenties en eventuele achtergrondinformatie worden verschaft.
                           
                        
                     Materialen en methoden
                  
                  
                              70.
                           
                           
                              In deze afdeling van het verslag moet een gedetailleerde beschrijving van alle ter zake doende informatie worden opgenomen:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          Teststof
                                          In deze onderafdeling moet de aard van de teststof worden beschreven: de chemische naam, de moleculaire structuur, de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de chemische samenstelling, de chemische zuiverheid en zo mogelijk de aard en de hoeveelheden van eventuele onzuiverheden. Daarnaast moet informatie over de fysisch-chemische eigenschappen worden opgenomen, met inbegrip van de fysische toestand, de kleur, de algemene oplosbaarheid en/of de partitiecoëfficiënt, de stabiliteit, en, indien van toepassing, de corrosiviteit. Daarnaast moet informatie over eventuele isomeren worden verstrekt, indien van toepassing. Als de teststof radioactief gemerkt is, moet ook de volgende informatie worden opgenomen: het soort radio-isotoop, de positie van het radioactief merkteken, de specifieke activiteit en de radiochemische zuiverheid.
                                          Verder dient te worden beschreven wat voor soort media, verdunningsmiddelen, suspenderingsmiddelen en emulgatoren of andere materialen bij het toedienen van de teststof zijn gebruikt;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          Proefdieren
                                          Deze onderafdeling moet informatie bevatten over de proefdieren, alsook over de keuze van de diersoort, de stam en de leeftijd bij aanvang van het onderzoek, het geslacht, het lichaamsgewicht, de gezondheidstoestand en de verzorging van de dieren, samen met een motivering;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          Methoden
                                          Deze onderafdeling bevat bijzonderheden van de onderzoeksopzet en de gebruikte methodologie, met inbegrip van:
                                          
                                                      1)
                                                   
                                                   
                                                      een motivering voor eventuele aanpassingen van de blootstellingsroute en de blootstellingsomstandigheden, indien van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      2)
                                                   
                                                   
                                                      een motivering voor de keuze van de dosisniveaus;
                                                   
                                                
                                                      3)
                                                   
                                                   
                                                      een beschrijving van verkennend onderzoek dat is gebruikt bij het opzetten van de proeven van het vervolgonderzoek, indien van toepassing. Er moeten ondersteunende gegevens van verkennend onderzoek worden verstrekt;
                                                   
                                                
                                                      4)
                                                   
                                                   
                                                      de manier waarop de doseeroplossing is bereid en het soort oplosmiddel of medium dat is gebruikt, indien van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      5)
                                                   
                                                   
                                                      het aantal behandelingsgroepen en het aantal dieren in elke groep;
                                                   
                                                
                                                      6)
                                                   
                                                   
                                                      de doseringsniveaus en -hoeveelheden (en de specifieke activiteit van de dosis bij gebruik van radioactiviteit);
                                                   
                                                
                                                      7)
                                                   
                                                   
                                                      de toedieningsweg(en) en -methoden;
                                                   
                                                
                                                      8)
                                                   
                                                   
                                                      de doseerfrequenties;
                                                   
                                                
                                                      9)
                                                   
                                                   
                                                      de vastperiode (indien van toepassing);
                                                   
                                                
                                                      10)
                                                   
                                                   
                                                      de totale radioactiviteit per dier;
                                                   
                                                
                                                      11)
                                                   
                                                   
                                                      de behandeling van dieren;
                                                   
                                                
                                                      12)
                                                   
                                                   
                                                      de bemonstering en de behandeling van de monsters;
                                                   
                                                
                                                      13)
                                                   
                                                   
                                                      de analysemethoden die zijn gebruikt voor het scheiden, kwantificeren en identificeren van de metabolieten;
                                                   
                                                
                                                      14)
                                                   
                                                   
                                                      de detectiegrens voor de toegepaste methoden;
                                                   
                                                
                                                      15)
                                                   
                                                   
                                                      andere metingen en procedures die tijdens het onderzoek zijn uitgevoerd (met inbegrip van de validatie van de methoden voor de analyse van metabolieten).
                                                   
                                                
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          Statistische analyse
                                          Als gebruik wordt gemaakt van statistische analyse om de bevindingen van het onderzoek te analyseren, moet het verslag voldoende informatie over de analysemethode en het gebruikte computerprogramma bevatten, zodat een onafhankelijke evaluator/statisticus de analyse kan beoordelen en reconstrueren.
                                          Ingeval van onderzoek aan de hand van systeemmodellen zoals PBTK moeten de gepresenteerde modellen een volledige modelomschrijving omvatten om onafhankelijke reconstructie en validatie van het model mogelijk te maken (zie punt 65 en het aanhangsel: Definities).
                                       
                                    
                        
                     Resultaten
                  
                  
                              71.
                           
                           
                              Alle gegevens in deze afdeling moeten worden samengevat en in tabelvorm worden gepresenteerd, voorzien van een passende statistische evaluatie en een beschrijving. De gegevens van de radioactiviteitsbepaling moeten op passende wijze worden samengevat en gepresenteerd, gewoonlijk als microgram- of milligramequivalent per monstermassa, hoewel ook andere eenheden mogen worden gebruikt. Neem in deze afdeling grafische illustraties van de bevindingen, reproducties van representatieve chromatografische en spectrometrische gegevens, gekwantificeerde/geïdentificeerde metabolieten en de voorgestelde metabole routes, inclusief de moleculaire structuur van de metabolieten, op. Neem daarnaast ook de volgende informatie op, indien van toepassing:
                              
                                          1)
                                       
                                       
                                          de hoeveelheid en het percentage teruggevonden radioactiviteit in de urine, de feces, de uitgeademde lucht alsmede de wasvloeistof uit de kooien.
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Neem in geval van huidonderzoek ook gegevens op over de recovery van de teststof van de behandelde huid, de wasvloeistof na het wassen van de huid en de resterende radioactiviteit in het toestel dat de huid bedekt en de metabole eenheid, alsmede de resultaten van het onderzoek waarbij de huid wordt gewassen. Zie de punten 74-77 voor nadere informatie.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Neem in geval van inhalatieonderzoek ook gegevens op over de recovery van de teststof uit de longen en weefsels uit de neus (8). Zie punt 78 voor nadere informatie.
                                                   
                                                
                                    
                                          2)
                                       
                                       
                                          de weefseldistributie uitgedrukt als percentage van de toegediende dosis en de concentratie (microgramequivalenten per gram weefsel), alsmede de verhouding weefsel-bloed of weefsel-plasma;
                                       
                                    
                                          3)
                                       
                                       
                                          de materiaalbalans die is opgemaakt op basis van de verschillende studies aan de hand van de analyse van lichaamsweefsels en excreta;
                                       
                                    
                                          4)
                                       
                                       
                                          plasmaconcentraties en toxicokinetische parameters (biologische beschikbaarheid, AUC, Cmax, Tmax, zuivering, halveringstijd) na toediening via de relevante blootstellingsroute(s);
                                       
                                    
                                          5)
                                       
                                       
                                          de snelheid en omvang van de absorptie van de teststof na toediening via de relevante blootstellingsroute(s);
                                       
                                    
                                          6)
                                       
                                       
                                          de hoeveelheden van de teststof en metabolieten (uitgedrukt als een percentage van de toegediende dosis) die in de excreta zijn verzameld;
                                       
                                    
                                          7)
                                       
                                       
                                          verwijzingen naar gegevens in de bijlage over alle gemeten eindpunten voor alle afzonderlijke dieren (bv. toediening van de dosis, percentage recovery, concentraties, toxicokinetische parameters enz.);
                                       
                                    
                                          8)
                                       
                                       
                                          een illustratie van de veronderstelde metabole routes en de moleculaire structuren van de metabolieten.
                                       
                                    
                        
                     Bespreking en conclusies
                  
                  
                              72.
                           
                           
                              In deze afdeling moet de auteur:
                              
                                          1)
                                       
                                       
                                          een veronderstelde metabole route voorstellen die is gebaseerd op de resultaten van het metabolisme en de dispositie van de teststof;
                                       
                                    
                                          2)
                                       
                                       
                                          mogelijke soort- en geslachtsafhankelijke verschillen bespreken met betrekking tot de dispositie en/of de biotransformatie van de teststof;
                                       
                                    
                                          3)
                                       
                                       
                                          de identificatie en omvang van metabolieten, zuiveringssnelheden, mogelijkheid van bioaccumulatie, en niveau van weefselresiduen van oorspronkelijke verbindingen en/of metaboliet(en), alsmede mogelijke dosisafhankelijke veranderingen in toxicokinetische parameters, naargelang hetgeen van toepassing is, in tabellen zetten en bespreken;
                                       
                                    
                                          4)
                                       
                                       
                                          eventuele relevante toxicokinetische gegevens opnemen die zijn verkregen tijdens het verrichte toxiciteitsonderzoek;
                                       
                                    
                                          5)
                                       
                                       
                                          een beknopte conclusie formuleren die door de bevindingen van het onderzoek wordt gestaafd;
                                       
                                    
                                          6)
                                       
                                       
                                          afdelingen toevoegen (voor zover noodzakelijk of van toepassing).
                                       
                                    
                        
                              73.
                           
                           
                              Er moeten afdelingen worden toegevoegd voor ondersteunende bibliografische gegevens, tabellen, illustraties, aanhangsels enz.
                           
                        ALTERNATIEVE BLOOTSTELLINGSROUTES
                  
                     Dermaal
                  
                  
                     Dermale behandeling
                  
                  
                              74.
                           
                           
                              In deze afdeling wordt specifieke informatie verschaft over het onderzoek naar de toxicokinetiek van de teststof via de dermale route. Raadpleeg voor dermale absorptie hoofdstuk B.44 van deze bijlage (Absorptie door de huid: in-vivomethode (9)). Voor andere eindpunten, zoals distributie en metabolisme, kan deze testmethode B.36, worden gebruikt. Bij de dermale behandeling moeten één of meer dosisniveaus worden gebruikt voor de teststof. De teststof (bijvoorbeeld puur, verdund of geformuleerd materiaal met de teststof dat op de huid wordt aangebracht) moet hetzelfde zijn (of een realistisch surrogaat) als die waaraan mensen of andere potentiële doelsoorten kunnen worden blootgesteld. De dosisniveaus moeten overeenkomstig de punten 20-26 van deze testmethode worden gekozen. Bij het kiezen van de dermale dosis kan rekening worden gehouden met factoren als de verwachte blootstelling bij de mens en/of doses waarbij toxiciteit is waargenomen bij ander onderzoek naar de huidtoxiciteit. Indien nodig moet/moeten de dermale dosis/doses worden opgelost in een geschikt medium en worden aangebracht in een hoeveelheid die toereikend is voor toediening van de dosis/doses. Kort voor de proef wordt het haar op het ruggedeelte van de romp van de proefdieren geknipt. Het dier kan ook worden geschoren, maar dit moet dan ongeveer 24 uur voor de proef geschieden. Bij het knippen of scheren moet erop worden gelet dat de huid niet wordt bekrast, omdat daardoor de doorlaatbaarheid van de huid zou kunnen veranderen. Ca. 10 % van de lichaamsoppervlakte moet voor het aanbrengen van de teststof worden onthaard. Bij zeer toxische stoffen mag de te bedekken oppervlakte kleiner zijn dan ca. 10 %, maar een zo groot mogelijke oppervlakte moet met een dunne en gelijkmatig aangebrachte laag worden bedekt. Van alle bij dermaal onderzoek gebruikte testgroepen moet dezelfde oppervlakte worden behandeld. De toedieningsgebieden moeten worden beschermd met een geschikte afdekking die niet kan verschuiven. De dieren worden in aparte kooien gehuisvest.
                           
                        
                              75.
                           
                           
                              Er moet onderzoek worden verricht om te beoordelen hoeveel van de opgebrachte dosis van de teststof van de huid kan worden verwijderd door de behandelde huid te wassen met een milde oplossing van zeep en water. Dit onderzoek kan ook nuttig zijn bij het bepalen van de massabalans wanneer de teststof via de huid wordt toegediend. Bij onderzoek waarbij de huid wordt gewassen moet een eenmalige dosis van de teststof bij twee dieren worden opgebracht. Het dosisniveau wordt gekozen overeenkomstig punt 23 van deze testmethode (zie ook punt 76 voor een bespreking van de duur van het huidcontact). De hoeveelheid in de wasvloeistof teruggevonden teststof moet worden bepaald om te beoordelen hoe effectief de teststof door middel van wassen wordt verwijderd.
                           
                        
                              76.
                           
                           
                              Tenzij de corrosiviteit dit onmogelijk maakt, moet de opgebrachte teststof ten minste 6 uur op de huid aanwezig blijven. Wanneer de afdekking wordt verwijderd, moet het behandelde gebied worden gewassen nadat de procedure is toegepast die wordt beschreven in punt 75. Zowel de afdekking als de wasvloeistof moeten worden geanalyseerd op resterende teststof. Bij beëindiging van het onderzoek moet elk dier overeenkomstig (2) op humane wijze worden gedood en moet de behandelde huid worden verwijderd. Een geschikt gedeelte van de behandelde huid moet worden geanalyseerd om de resterende teststof (radioactiviteit) te bepalen.
                           
                        
                              77.
                           
                           
                              Het is mogelijk dat voor de toxicokinetische beoordeling van geneesmiddelen andere procedures moeten worden toegepast, afhankelijk van het desbetreffende regelgevingssysteem.
                           
                        
                     Inhalatie
                  
                  
                              78.
                           
                           
                              Er dient één concentratie (of meer, indien noodzakelijk) van de teststof te worden gebruikt. De concentraties moeten worden gekozen overeenkomstig de punten 20-26 van deze testmethode. Inhalatiebehandelingen moeten worden uitgevoerd met behulp van een „neuskegel” of een apparaat dat de toediening beperkt tot het hoofd ter voorkoming van absorptie via andere blootstellingsroutes (8). Als andere blootstellingsvormen dan inhalatie worden gebruikt, moet worden gedocumenteerd waarom. De duur van de blootstelling via inhalatie moet worden vastgesteld; de inhalatieduur bedraagt doorgaans 4-6 uur.
                           
                        
                     LITERATUUR:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment N°19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Solon E.G., Kraus L. (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73-81.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Stumpf W.E. (2005). Drug localization and targeting with receptor microscopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25-40.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Loizou G., Spendiff M., Barton H.A., Bessems J., Bois F.Y., d’Yvoire M.B., Buist H., Clewell H.J. 3rd, Meek B., Gundert-Remy U., Goerlitz G., Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400-411.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.45 van deze bijlage, Absorptie door de huid: in-vitromethode.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              IPCS (2010). Characterization and application of Physiologically-Based Pharmacokinetic Models in Risk Assessment, IPCS Harmonization Project Document No. 9. Geneva, World Health Organization, International Programme on Chemical Safety.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.44 van deze bijlage, Absorptie door de huid: in-vivomethode.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Barton H.A., et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Gibaldi M. en Perrier D., (1982). Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel Dekker, Inc., New York.
                           
                        
                     Aanhangsel
                     DEFINITIES
                     
                        Absorptie: de processen die verband houden met de opname van chemische stoffen in of door weefsels. De term absorptie heeft betrekking op de oorspronkelijke verbinding en alle metabolieten ervan en mag niet worden verward met „biologische beschikbaarheid”.
                     
                        Accumulatie (bioaccumulatie): de toename in de tijd van de hoeveelheid van een teststof in weefsels (doorgaans vetweefsels, na herhaalde blootstelling); als de hoeveelheid toegevoegde teststof in het lichaam groter is dan de snelheid waarmee deze verdwijnt, stapelt de teststof zich op in het organisme en kunnen er toxische concentraties van de teststof worden bereikt.
                     
                        ADME: een acroniem voor „absorptie, distributie, metabolisme en excretie”.
                     
                        AUC: (area under the curve, oppervlakte onder de plasmaconcentratie-tijdcurve): de oppervlakte onder de curve in een grafiek van de ontwikkeling in de tijd van de concentratie van een teststof in plasma. Deze oppervlakte is een maat voor de totale hoeveelheid van de teststof die gedurende een vooraf bepaalde tijd door het lichaam is geabsorbeerd. Onder lineaire omstandigheden is de AUC (vanaf tijdstip nul tot oneindig) evenredig aan de totale hoeveelheid van een teststof die door het lichaam wordt geabsorbeerd, ongeacht de absorptiesnelheid.
                     
                        Autoradiografie: (autoradiografie van het gehele lichaam): een kwalitatieve of kwantitatieve techniek die wordt gebruikt om de ligging in het weefsel van een radioactieve teststof te bepalen. Hiertoe worden met behulp van röntgenopnamen of meer recentelijk met behulp van Digital Phosphor Imaging radioactief gemerkte moleculen of fragmenten van moleculen in beeld gebracht door de straling vast te leggen die door het onderzochte voorwerp wordt uitgezonden. Ten opzichte van sectie op de organen kan kwantitatieve autoradiografie van het gehele lichaam voordelen bieden bij de evaluatie van de distributie van de teststof en de beoordeling van de algemene recovery en resolutie van radioactief materiaal in weefsels. Zo heeft deze techniek bijvoorbeeld als voordeel dat deze kan worden toegepast bij een gepigmenteerd diermodel om een mogelijke binding van de teststof aan melanine, dat zich aan bepaalde moleculen kan binden, te beoordelen. Hoewel op deze manier voor het hele lichaam een overzicht kan worden verkregen van de bindingsplaatsen met een grote capaciteit en een geringe affiniteit, is het nut van deze techniek beperkt als het erom gaat specifieke doelgebieden te herkennen zoals receptorbindende gebieden waar voor detectie een betrekkelijk hoge resolutie en hoge gevoeligheid vereist is. Wanneer autoradiografie wordt toegepast, moeten proeven die zijn bedoeld om de massabalans van de toegediende verbinding te bepalen in een andere groep of in een ander onderzoek worden uitgevoerd dan in de proef waarmee de weefseldistributie wordt onderzocht, waarbij alle excreta (eventueel met inbegrip van de uitgeademde lucht) en hele karkassen worden gehomogeniseerd en door middel van vloeistofscintillatietelling worden geanalyseerd.
                     
                        Galexcretie: uitscheiding via de galwegen.
                     
                        Bioaccumulatie: zie „accumulatie”.
                     
                        Biologische beschikbaarheid: de fractie van de toegediende dosis die in de systemische circulatie terechtkomt of beschikbaar wordt gemaakt op de plaats waar de fysiologische activiteit zich voordoet. De biologische beschikbaarheid van een teststof heeft gewoonlijk betrekking op de oorspronkelijke verbinding, maar kan ook betrekking hebben op de metaboliet(en) ervan. Slechts één chemische vorm wordt onderzocht. NB: biologische beschikbaarheid en absorptie zijn niet hetzelfde. Het verschil tussen bijvoorbeeld orale absorptie (d.w.z. aanwezigheid in de darmwand en de portaalcirculatie) en biologische beschikbaarheid (d.w.z. aanwezigheid in systemisch bloed en in weefsels) kan onder meer worden toegeschreven aan chemische afbraak als gevolg van het metabolisme in de darmwand of het transport van efflux naar het darmlumen of het presystemisch metabolisme in de lever (10). De biologische beschikbaarheid van een toxisch bestanddeel (oorspronkelijke verbinding of een metaboliet) is een essentiële parameter voor de risicobeoordeling bij de mens (extrapolatie van hoge naar lage dosis, extrapolatie van de ene route naar de andere), aan de hand waarvan een interne waarde kan worden afgeleid van de externe NOAEL of BMD (toegepaste dosis). Voor het bepalen van levereffecten bij orale toediening volstaat de orale absorptie. Voor alle andere effecten die niet met de toedieningsplaats samenhangen, levert de biologische beschikbaarheid in het algemeen betrouwbaarder resultaten op als parameter voor gebruik bij de risicobeoordeling dan de absorptie.
                     
                        Biopersistentie: zie „persistentie”.
                     
                        Biotransformatie: (gewoonlijk een enzymatische) chemische omzetting van de onderzochte teststof in een andere chemische stof in het lichaam. Synoniem met „metabolisme”.
                     
                        Cmax
                        : hetzij de piekconcentratie in het bloed (plasma/serum) na toediening hetzij de hoogste uitscheiding (in urine of feces) na toediening.
                     
                        Zuiveringssnelheid: een kwantitatieve maat voor de snelheid per tijdseenheid waarmee de teststof uit het bloed, het plasma of een bepaald weefsel wordt verwijderd.
                     
                        Compartiment: een structureel of biochemisch onderdeel (of eenheid) van een lichaam, weefsel of cel, dat is gescheiden van de rest.
                     
                        Detoxificatiewegen: een reeks stappen die leidt tot de verwijdering van toxische stoffen uit het lichaam, hetzij via metabole verandering, hetzij via uitscheiding.
                     
                        Distributie: de verspreiding van de teststof en de daarvan afgeleide stoffen door een organisme.
                     
                        Enzymen/iso-enzymen: eiwitten die optreden als katalysator van chemische reacties. Iso-enzymen zijn enzymen die vergelijkbare chemische reacties katalyseren, maar een andere aminozuurvolgorde hebben.
                     
                        Enzymatische parameters: Km: constante van Michaelis en Vmax: maximale snelheid.
                     
                        Uitscheiding: één of meer processen waardoor de toegediende teststof en/of de metabolieten ervan door het lichaam worden uitgescheiden.
                     
                        Exogeen: afkomstig van of het gevolg van invloed van buiten het organisme of systeem.
                     
                        Extrapolatie: op basis van wat bekend is of wat waargenomen is uitspraken doen over één of meer onbekende waarden.
                     
                        Halveringstijd (t1/2): de tijd waarin de concentratie van de teststof in een compartiment met de helft afneemt. Doorgaans verwijst deze term naar de plasmaconcentratie of de hoeveelheid van de teststof in het hele lichaam.
                     
                        Inductie (van enzymen): de aanmaak van één of meer enzymen als reactie op een prikkel vanuit de omgeving of een inducerend molecuul.
                     
                        Lineariteit/lineaire kinetiek: volgens de kinetiek is een proces lineair als de snelheid van alle overdrachten tussen de compartimenten evenredig is aan de aanwezige hoeveelheden of concentraties, d.w.z. van de eerste orde is. Bijgevolg zijn de zuiverings- en de distributievolumes constant, evenals de halveringstijden. De bereikte concentraties zijn evenredig aan de toedieningssnelheid (blootstelling) en accumulatie kan eenvoudiger worden voorspeld. De lineariteit/niet-lineariteit kan worden bepaald door de relevante parameters, bijvoorbeeld de AUC, met elkaar te vergelijken na verschillende doses of na eenmalige en herhaalde blootstelling. Het achterwege blijven van dosisafhankelijkheid kan wijzen op verzadiging van de enzymen die betrokken zijn bij het metabolisme van de verbinding, terwijl een toename van de AUC na herhaalde blootstelling in vergelijking met eenmalige blootstelling kan wijzen op remming van het metabolisme en een afname van de AUC kan wijzen op inductie van het metabolisme (zie ook (11)).
                     
                        Massabalans: het bijhouden van de hoeveelheid teststof die het systeem binnenkomt en verlaat.
                     
                        Materiaalbalans: zie „massabalans”.
                     
                        Toxisch werkingsmechanisme/werkingswijze: het werkingsmechanisme heeft betrekking op de specifieke biochemische wisselwerkingen waaraan de teststof zijn effect ontleent. De werkingswijze heeft betrekking op algemenere wegen die leiden tot de toxiciteit van de teststof.
                     
                        Metabolisme: synoniem met „biotransformatie”.
                     
                        Metabolieten: producten van het metabolisme of metabole processen.
                     
                        Orale absorptie: het percentage van de dosis van de teststof dat wordt geabsorbeerd op de toedieningsplaats (bijvoorbeeld het spijsverteringskanaal). Aan de hand van deze kritische parameter kan de fractie van de toegediende teststof worden onderzocht die de poortader en vervolgens de lever bereikt.
                     
                        Partitiecoëfficiënt: ook verdelingscoëfficiënt genoemd. Een maat voor de differentiële oplosbaarheid van een chemische stof in twee oplosmiddelen.
                     
                        Piekconcentraties in het bloed (plasma/serum): de hoogste concentratie in het bloed (plasma/serum) na toediening (zie ook „Cmax”).
                     
                        Persistentie (biopersistentie): de langdurige aanwezigheid van een chemische stof (in een biologisch systeem) die bestand is tegen afbraak/verwijdering.
                     
                        Read-across: aan de hand van de informatie over het eindpunt van één of meer chemische stoffen kan het eindpunt van de onderzochte stof worden voorspeld.
                     
                        Receptor Microscopic Autoradiography (of Receptor Micro-Autoradiography): deze techniek kan worden gebruikt om de wisselwerking tussen lichaamsvreemde stoffen en specifieke weefsellocaties of celpopulaties te onderzoeken in het kader van bijvoorbeeld onderzoek naar receptorbinding of specifieke werkingswijzen waarvoor een hoge resolutie en een hoge gevoeligheid vereist zijn en die met andere technieken, zoals autoradiografie van het gehele lichaam, niet mogelijk zijn.
                     
                        Toedieningsweg (oraal, intraveneus, dermaal, inhalatie enz): heeft betrekking op de manier waarop chemische stoffen aan het lichaam worden toegediend (bijvoorbeeld via een orale maagsonde, via de voeding, via de huid, door inademing, intraveneus enz.).
                     
                        Verzadiging: de toestand waarbij één of meer kinetische processen (bijvoorbeeld absorptie, metabolisme of zuivering) hun hoogste punt hebben bereikt (verzadigd zijn).
                     
                        Gevoeligheid: het vermogen van een methode of instrument om onderscheid te maken tussen gemeten reacties die overeenstemmen met verschillende niveaus van de onderzochte variabele.
                     
                        Concentratie in het bloed (plasma) in stationaire toestand: een niet-evenwichtstoestand van een open systeem waarbij alle krachten die op het systeem inwerken exact worden opgeheven door tegengestelde krachten, zodanig dat de concentratie van alle elementen in het systeem stabiel is hoewel er materiaal door het systeem stroomt.
                     
                        Systeemmodellering (op fysiologie gebaseerde toxicokinetische, op farmacokinetiek gebaseerde, op fysiologie gebaseerde farmacokinetische, op biologie gebaseerde enz.): het opstellen van een abstract model waarin het gedrag van een systeem wiskundig wordt beschreven.
                     
                        Doelweefsel: het weefsel waarin een belangrijk schadelijk effect van een toxische stof optreedt.
                     
                        Teststof: iedere chemische stof of ieder mengsel die/dat met deze testmethode wordt getest.
                     
                        Weefseldistributie: de omkeerbare beweging van een teststof tussen verschillende plaatsen in het lichaam. De weefseldistributie kan worden onderzocht door middel van sectie op de organen, homogenisering, verbranding en vloeistofscintillatietelling of met behulp van kwalitatieve en/of kwantitatieve autoradiografie van het gehele lichaam. De eerste techniek is nuttig voor het bepalen van de concentratie en het recoverypercentage bij weefsels en het resterende karkas van dezelfde dieren, maar biedt mogelijk niet voldoende onderscheidingsvermogen voor alle weefsels en biedt mogelijk een minder gunstige algemene recovery (< 90 %). Zie hierboven voor een definitie van de laatste techniek.
                     
                        Tmax
                        : de tijd die nodig is om Cmax te bereiken.
                     
                        Toxicokinetiek: (farmacokinetiek): de bestudering van de absorptie, de distributie, het metabolisme en de uitscheiding van teststoffen in de loop van de tijd.
                     
                        Validatie van modellen: het beoordelen van de mate waarin een model in staat is de beschikbare toxicokinetische gegevens toereikend te beschrijven. Modellen kunnen worden geëvalueerd door een statistische en visuele vergelijking van de voorspellingen met de experimentele waarden aan de hand van een gemeenschappelijke onafhankelijke variabele (bijvoorbeeld de tijd). De omvang van de evaluatie moet in verhouding staan tot het beoogde gebruik van het model..
                  ”
            
                  8)
               
               
                  Hoofdstuk B.52 wordt toegevoegd:
                  „B.52.   ACUTE INHALATIETOXICITEIT: METHODE TER BEPALING VAN DE ACUTE-TOXICITEITSKLASSE
                  
                  INLEIDING
                  
                              1.
                           
                           
                              Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 436 (2009) van de OESO (TG 436). TG 403, de eerste testrichtlijn voor acute inhalatie, werd in 1981 vastgesteld en is sindsdien aangepast (zie hoofdstuk B.2 van deze bijlage (1)). De ontwikkeling van een methode ter bepaling van de acute-toxiciteitsklasse (ATC) voor inhalatie (2)(3)(4) werd opportuun geacht na de vaststelling van de herziene ATC-methode voor orale toxiciteit (hoofdstuk B.1 ter van deze bijlage) (5). Een retrospectieve prestatiebeoordeling van de ATC-testmethode voor acute inhalatietoxiciteit wees uit dat de methode geschikt is voor toepassing voor indelings- en etiketteringsdoeleinden (6). De ATC-testmethode voor inhalatie zal het mogelijk maken seriële stappen van vaste doelconcentraties toe te passen om te komen tot een toxiciteitsrangschikking van teststoffen. Sterfte wordt gebruikt als belangrijkste eindpunt, maar als er sprake is van hevige pijn of angst of ophanden zijnde sterfte van dieren, worden deze dieren op humane wijze gedood om het lijden te beperken. OESO-leidraad nr. 19 (7) bevat richtsnoeren voor humane eindpunten.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Richtsnoeren voor de uitvoering en interpretatie van deze testmethode zijn opgenomen in leidraad nr. 39 betreffende tests op acute inhalatietoxiciteit (GD 39(8)).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              De in de context van deze testmethode gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1 en in GD 39 (8).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              De testmethode levert informatie over de gevaarlijke eigenschappen op en maakt het mogelijk de teststof te rangschikken en in te delen overeenkomstig Verordening (EG) nr. 1272/2008 voor de indeling van chemische stoffen die acute toxiciteit veroorzaken (9). Als puntschattingen van de LC50-waarden of concentratie-responsanalysen vereist zijn, is de methode in hoofdstuk B.2 van deze bijlage (1) de aangewezen testmethode. Nadere richtsnoeren voor de keuze van testmethoden zijn opgenomen in GD 39 (8). Deze testmethode is niet specifiek bedoeld voor het testen van speciale materialen, zoals slecht oplosbare isometrische materialen of vezelmaterialen of gefabriceerde nanomaterialen.
                           
                        INLEIDENDE OVERWEGINGEN
                  
                              5.
                           
                           
                              Alvorens te overwegen deze testmethode toe te passen, moet het testlaboratorium alle beschikbare informatie over de teststof, met inbegrip van bestaande studies waarvan de gegevens een argument vormen om geen aanvullende tests uit te voeren, in aanmerking nemen teneinde het gebruik van dieren tot een minimum te beperken. Voor de keuze van de geschiktste soorten, stam, geslacht, wijze van blootstelling en testconcentraties kan onder meer gebruik worden gemaakt van informatie over de identiteit, chemische structuur en fysisch-chemische eigenschappen van de teststof; de resultaten van eventuele in vitro of in vivo uitgevoerde toxiciteitstests; de voorgenomen toepassing(en) en de potentiële blootstelling van de mens; en de beschikbare (Q)SAR-gegevens en toxicologische gegevens over chemische stoffen met een verwante structuur. Bij deze testmethode mogen geen concentraties worden gebruikt waarvan verwacht wordt dat zij door een bijtende (11) of sterk irriterende werking hevige pijn en angst opleveren (zie GD 39 (8)).
                           
                        PRINCIPE VAN DE TEST
                  
                              6.
                           
                           
                              Het principe van de test is dat tijdens een vier uur durende blootstelling stapsgewijs voldoende informatie over de acute inhalatietoxiciteit van de teststof wordt verkregen om indeling van de stof mogelijk te maken. Voor specifieke regelgevingsdoeleinden kan een andere blootstellingsduur vereist zijn. Bij elk van de gedefinieerde concentratiestappen worden drie dieren van elk geslacht getest. Afhankelijk van het aantal dode en/of stervende dieren kunnen twee stappen volstaan om een uitspraak over de acute toxiciteit van de teststof te kunnen doen. Als er aanwijzingen zijn dat het ene geslacht mogelijk gevoeliger is dan het andere, kan de test uitsluitend met dieren van het gevoeligste geslacht worden voortgezet. De uitkomst van de voorgaande stap is bepalend voor de volgende stap, waarbij er de volgende mogelijkheden zijn:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          er zijn geen verdere tests nodig;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          er worden drie dieren per geslacht getest, of
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          er worden uitsluitend zes dieren van het gevoeligste geslacht getest, d.w.z. dat de geschatte ondergrens van de toxiciteitsklasse wordt gebaseerd op zes dieren per testconcentratiegroep, ongeacht het geslacht.
                                       
                                    
                        
                              7.
                           
                           
                              Stervende dieren of dieren die duidelijk pijn hebben of tekenen van hevige en voortdurende angst vertonen, worden op humane wijze gedood en worden bij de interpretatie van de testresultaten op dezelfde manier behandeld als dieren die tijdens de test gestorven zijn. Leidraad nr. 19 inzake humane eindpunten (7) bevat criteria om te bepalen of stervende of hevig lijdende dieren moeten worden gedood en richtsnoeren om voorspelbare of ophanden zijnde sterfte te herkennen.
                           
                        BESCHRIJVING VAN DE METHODE
                  
                     Keuze van de diersoort
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Er worden gezonde jonge volwassen dieren van gangbare laboratoriumstammen gebruikt. Er wordt de voorkeur gegeven aan ratten; het gebruik van andere soorten moet worden gemotiveerd.
                           
                        
                     Voorbereiding van de dieren
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig zijn. Op de dag van blootstelling moeten de jonge volwassen dieren acht tot twaalf weken oud zijn en een lichaamsgewicht hebben dat niet meer dan 20 % afwijkt van het gemiddelde gewicht voor elk geslacht van eerder blootgestelde dieren van dezelfde leeftijd. De dieren worden willekeurig gekozen en gemerkt om elk dier afzonderlijk te kunnen identificeren. De dieren blijven voordat de test begint minimaal vijf dagen in hun kooi om in het laboratorium te acclimatiseren. Vlak voor de test acclimatiseren de dieren ook enige tijd in het testapparaat, aangezien hierdoor de stress als gevolg van de nieuwe omgeving zal afnemen.
                           
                        
                     Dierhouderij
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              De temperatuur van de ruimte waar de proefdieren verblijven, moet 22 ± 3 °C zijn. De relatieve vochtigheid wordt idealiter tussen 30 en 70 % gehouden, maar wanneer water als medium wordt gebruikt, zal dit niet altijd mogelijk zijn. Voor en na de blootstelling worden de dieren over het algemeen groepsgewijs in kooien ondergebracht, waarbij zij naar geslacht en concentratie worden gescheiden; het aantal dieren per kooi mag echter niet zo groot zijn dat een duidelijke observatie van elk dier wordt gestoord en moet zodanig worden gekozen dat er zo min mogelijk dieren verloren gaan als gevolg van kannibalisme en gevechten. Wanneer de dieren uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan acclimatisatie voor de fixeerbuizen noodzakelijk zijn. De fixeerbuizen mogen geen onnodige lichamelijke, thermische of immobilisatiestress voor de dieren opleveren. De immobilisatie kan van invloed zijn op fysiologische eindpunten zoals de lichaamstemperatuur (hyperthermie) en/of het ademminuutvolume. Als er generieke gegevens beschikbaar zijn waaruit blijkt dat geen significante veranderingen als gevolg van de immobilisatie optreden, is geen voorafgaande gewenning aan de fixeerbuizen noodzakelijk. Dieren die met hun hele lijf aan een aerosol worden blootgesteld, worden tijdens de blootstelling individueel gehuisvest om te voorkomen dat zij het testaerosol filteren door de vacht van hun kooigenoten. Er kan gebruik worden gemaakt van gebruikelijk en gecertificeerd laboratoriumvoeder, behalve tijdens de blootstelling, met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater uit de waterleiding. Er wordt kunstlicht gebruikt met een cyclus van 12 uur licht/12 uur donker.
                           
                        
                     Inhalatiekamers
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Bij de keuze van de inhalatiekamer wordt rekening gehouden met de aard van de teststof en het doel van de test. Blootstelling via de neus alleen heeft de voorkeur (hieronder vallen blootstelling via de kop alleen, blootstelling via de neus alleen en blootstelling via de snuit alleen). Blootstelling via de neus alleen heeft over het algemeen de voorkeur voor studies van vloeibare of vaste aerosolen en voor dampen die kunnen condenseren tot aerosolen. Speciale doelstellingen van de studie kunnen beter worden verwezenlijkt door blootstelling van het hele lijf, maar dit moet in het studieverslag worden gemotiveerd. Om bij gebruik van een kamer voor het hele lijf te zorgen voor een stabiele atmosfeer, mag het totale volume van de testdieren niet meer dan 5 % van het volume van de kamer innemen. De technische principes voor blootstelling via de neus alleen en blootstelling van het hele lijf, alsook de specifieke voor- en nadelen ervan, zijn uiteengezet in GD 39 (8).
                           
                        BLOOTSTELLINGSOMSTANDIGHEDEN
                  
                     Toediening van concentraties
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Er wordt een vaste blootstellingsduur van vier uur, exclusief equilibratietijd, aanbevolen. In verband met specifieke eisen kan een andere duur noodzakelijk zijn, maar dit moet in het studieverslag worden gemotiveerd (zie GD 39 (8)). Dieren die in een kamer voor het hele lijf worden blootgesteld, worden afzonderlijk gehuisvest om ingestie van de teststof door het verzorgen van kooigenoten te voorkomen. Tijdens de blootstellingsperiode krijgen de dieren geen voeder. Tijdens een blootstelling van het hele lijf kan de dieren water worden gegeven.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              De dieren worden aan de teststof blootgesteld in de vorm van gas, damp, aerosol of een mengsel daarvan. De te testen fysische toestand hangt af van de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof, de gekozen concentratie en/of de meest waarschijnlijke fysische vorm waarin de teststof bij hantering en gebruik aanwezig is. Hygroscopische en chemisch reactieve teststoffen moeten worden getest in drogeluchtomstandigheden. Er dient op te worden gelet dat er geen explosieve concentraties optreden.
                           
                        
                     Deeltjesgrootteverdeling
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Voor alle aerosolen en voor dampen die tot aerosolen kunnen condenseren, wordt de deeltjesgrootte bepaald. Om blootstelling van alle relevante delen van de ademhalingswegen mogelijk te maken, worden aerosolen met een massamediaan van de aerodynamische diameter (MMAD) tussen 1 en 4 μm en een geometrische standaardafwijking (σg) tussen 1,5 en 3,0 aanbevolen (8)(13)(14). Hoewel redelijkerwijs moet worden getracht deze normwaarden te halen, wordt het oordeel van een deskundige gegeven als dit niet mogelijk blijkt. Zo kunnen de deeltjes van metaaldampen kleiner zijn dan deze norm, terwijl geladen deeltjes, vezels en hygroscopische materialen (die in de vochtige omgeving van de ademhalingswegen opzwellen) de norm kunnen overschrijden.
                           
                        
                     Bereiding van de teststof in een medium
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Er kan een medium worden gebruikt om een passende concentratie en deeltjesgrootte van de teststof in de atmosfeer te verkrijgen. Als algemene regel wordt de voorkeur gegeven aan water. Deeltjesmateriaal kan aan mechanische processen worden onderworpen om de gewenste deeltjesgrootteverdeling te verkrijgen, waarbij er echter op moet worden gelet dat de teststof niet wordt ontbonden of gewijzigd. Als de samenstelling van de teststof mogelijk is gewijzigd door mechanische processen (bv. als er bij overvloedig malen door wrijving een extreme temperatuur is ontstaan), wordt de samenstelling analytisch gecontroleerd. Er dient zorgvuldig op te worden gelet dat de teststof niet wordt verontreinigd. Niet-broze korrelige materialen die met opzet zo zijn samengesteld dat zij niet-inhaleerbaar zijn, hoeven niet te worden getest. Aan de hand van een slijtageproef moet worden aangetoond dat bij de hantering van het korrelige materiaal geen inhaleerbare deeltjes ontstaan. Als bij een slijtageproef inhaleerbare deeltjes ontstaan, wordt een test op inhalatietoxiciteit verricht.
                           
                        
                     Controledieren
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Er is geen parallelle negatieve controlegroep (lucht) noodzakelijk. Wanneer voor het verkrijgen van de testatmosfeer een ander medium dan water wordt gebruikt, moet alleen een controlegroep voor dat medium worden gebruikt wanneer er geen historische gegevens over de inhalatietoxiciteit beschikbaar zijn. Indien een toxiciteitsstudie van een in een medium bereide teststof uitwijst dat er geen toxiciteit optreedt, volgt hieruit dat het medium bij de geteste concentratie niet toxisch is; in dat geval is er geen mediumcontrole noodzakelijk.
                           
                        CONTROLE VAN DE BLOOTSTELLINGSOMSTANDIGHEDEN
                  
                     Luchtdoorstroming in de kamer
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Tijdens elke blootstelling wordt de luchtdoorstroming in de kamer zorgvuldig geregeld, voortdurend gecontroleerd en ten minste elk uur geregistreerd. De controle van de concentratie (of stabiliteit) van de testatmosfeer is een integrale meting van alle dynamische parameters waarbij indirect alle relevante dynamische parameters voor het verkrijgen van de atmosfeer kunnen worden geregeld. Wanneer kamers voor blootstelling via de neus alleen worden gebruikt, moet er in het bijzonder op worden gelet dat de uitgeademde lucht niet opnieuw wordt ingeademd indien de luchtdoorstroming in het blootstellingssysteem ontoereikend is om een dynamische luchtdoorstroming van de teststofatmosfeer te verkrijgen. Er zijn voorgeschreven methoden die kunnen worden toegepast om aan te tonen dat de uitgeademde lucht bij de gekozen operationele omstandigheden niet opnieuw wordt ingeademd (8)(15). Het zuurstofgehalte moet ten minste 19 % bedragen en het kooldioxidegehalte niet meer dan 1 %. Als er redenen zijn om aan te nemen dat deze normwaarden niet kunnen worden gehaald, moet de zuurstof- en kooldioxideconcentratie worden gemeten.
                           
                        
                     Temperatuur en relatieve vochtigheid in de kamer
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              De temperatuur in de kamer moet op 22 ± 3 °C worden gehouden. Bij blootstelling via de neus alleen en bij blootstelling van het hele lijf wordt de relatieve vochtigheid in het ademhalingsgebied van de dieren gecontroleerd en bij een blootstellingsduur tot vier uur ten minste drie keer en bij een kortere blootstelling ieder uur geregistreerd. De relatieve vochtigheid wordt idealiter tussen 30 en 70 % gehouden, al zal dit niet altijd haalbaar (bv. wanneer mengsels op waterbasis worden getest) of meetbaar zijn vanwege interferentie tussen de teststof en de testmethode.
                           
                        
                     Teststof: nominale concentratie
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Waar mogelijk wordt de nominale concentratie in de blootstellingskamer berekend en geregistreerd. De nominale concentratie is de massa van de gegenereerde teststof gedeeld door het totale luchtvolume dat door het kamersysteem wordt geleid. De nominale concentratie wordt niet gebruikt om de blootstelling van de dieren te karakteriseren, maar een vergelijking tussen de nominale en de feitelijke concentratie vormt een aanwijzing voor het rendement van het testsysteem en kan bijgevolg worden gebruikt om problemen bij het genereren te ontdekken.
                           
                        
                     Teststof: feitelijke concentratie
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              De feitelijke concentratie is de concentratie van de teststof in het ademhalingsgebied van de dieren in een inhalatiekamer. De feitelijke concentraties kunnen worden verkregen door toepassing van specifieke methoden (bv. rechtstreekse bemonstering of op adsorptie of een chemische reactie gebaseerde methoden, gevolgd door analytische karakterisering) of niet-specifieke methoden, zoals gravimetrische filteranalyse. Gravimetrische analysen zijn alleen aanvaardbaar voor aerosolen van poeders met één component of aerosolen van vloeistoffen met een geringe vluchtigheid en moeten worden ondersteund met passende specifieke karakteriseringen van de teststof voorafgaand aan de studie. De concentratie van aerosolen van poeders met meerdere componenten kan ook door middel van gravimetrische analyse worden bepaald. In dat geval zijn echter analytische gegevens vereist die aantonen dat de samenstelling van het materiaal in de lucht vergelijkbaar is met die van het uitgangsmateriaal. Als deze informatie niet beschikbaar is, kan het nodig zijn in de loop van de studie op gezette tijden een nieuwe analyse van de teststof (idealiter in de toestand in de lucht) uit te voeren. Voor geaerosoliseerde stoffen die kunnen verdampen of sublimeren, moet worden aangetoond dat met de gekozen methoden alle fasen zijn verzameld. In het studieverslag worden de doelconcentratie, de nominale concentratie en de feitelijke concentratie vermeld, maar in statistische analysen voor de berekening van de letale concentratiewaarden wordt uitsluitend gebruikgemaakt van de feitelijke concentraties.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Er wordt zo mogelijk één partij van de teststof gebruikt en het testmonster wordt bewaard onder omstandigheden waarbij de zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit behouden blijven. Voor aanvang van de studie worden de teststof, met inbegrip van de zuiverheid, en indien technisch mogelijk de identiteit en de hoeveelheden van vastgestelde verontreinigingen en onzuiverheden gekarakteriseerd. Dit kan onder meer met de volgende gegevens worden aangetoond: retentietijd en relatief piekoppervlak, moleculair gewicht op basis van massaspectroscopie of gaschromatografie, of andere schattingen. Hoewel het testlaboratorium niet verantwoordelijk is voor de identiteit van het testmonster, kan het raadzaam zijn dat het testlaboratorium de karakterisering van de opdrachtgever ten minste in beperkte mate bevestigt (bv. kleur, fysische aard enz.).
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              De blootstellingsatmosfeer wordt zo constant mogelijk gehouden en, afhankelijk van de analysemethode, voortdurend en/of met tussenpozen gecontroleerd. Wanneer met tussenpozen wordt bemonsterd, wordt in een studie van vier uur ten minste twee keer een monster van de kameratmosfeer genomen. Als dit vanwege de beperkte luchtdoorstroming of lage concentraties niet mogelijk is, kan één monster gedurende de volledige blootstellingsperiode worden verzameld. Indien significante fluctuaties tussen monsters optreden, worden bij de volgende geteste concentraties vier monsters per blootstelling genomen. Het verschil tussen individuele monsters van de kamerconcentratie en de gemiddelde kamerconcentratie mag bij gassen en dampen niet meer dan ± 10 % en bij vloeibare of vaste aerosolen niet meer dan ± 20 % bedragen. De equilibratietijd van de kamer (t95) wordt berekend en geregistreerd. De blootstellingsduur omvat de tijd waarin de teststof wordt gegenereerd en houdt rekening met de tijd die nodig is om t95 te bereiken. In GD 39 (8) zijn richtsnoeren voor het schatten van t95 opgenomen.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Voor zeer complexe mengsels bestaande uit dampen/gassen en aerosolen (bv. verbrandingsatmosferen en teststoffen die zijn ontleend aan doelgerichte eindproducten of apparaten), kan elke fase zich in een inhalatiekamer verschillend gedragen, zodat van elke fase (damp/gas en aerosol) ten minste één indicatorstof (analyt) moet worden gekozen, normaliter de voornaamste werkzame stof in het mengsel. Wanneer de teststof een mengsel is, wordt de analytische concentratie vermeld voor het totale mengsel, en niet slechts voor het werkzame bestanddeel of de component (analyt). Aanvullende informatie over feitelijke concentraties is opgenomen in GD 39 (8).
                           
                        
                     Teststof: deeltjesgrootteverdeling
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              De deeltjesgrootteverdeling van aerosolen wordt tijdens elke blootstelling van vier uur ten minste twee keer bepaald met behulp van een cascade-impactor of een alternatief instrument, zoals een aerodynamische deeltjesgroottemeter. Indien kan worden aangetoond dat de met een cascade-impactor of een alternatief instrument verkregen resultaten gelijkwaardig zijn, mag het alternatieve instrument gedurende de hele studie worden gebruikt. Parallel aan het primaire instrument wordt een tweede instrument, zoals een gravimetrisch filter of een impinger/gas bubbler gebruikt om de doeltreffendheid van de verzameling met het primaire instrument te bevestigen. De door middel van deeltjesgrootteanalyse en filteranalyse verkregen massaconcentraties moeten in redelijke mate overeenkomen (zie GD 39 (8)). Indien in een vroeg stadium van de studie de gelijkwaardigheid kan worden aangetoond, zijn verdere bevestigende metingen niet nodig. Met het oog op het dierenwelzijn moeten maatregelen worden genomen om zo veel mogelijk te voorkomen dat niet-overtuigende gegevens worden verkregen waardoor herhaling van de blootstelling noodzakelijk is. Voor dampen wordt de deeltjesgrootte bepaald indien de mogelijkheid bestaat dat de dampen condenseren waardoor aerosolvorming optreedt of indien in een dampatmosfeer deeltjes worden gedetecteerd waarbij gemengde fasen kunnen optreden (zie punt 14).
                           
                        PROCEDURE
                  
                     Hoofdtest
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Voor elke stap wordt gebruikgemaakt van drie dieren van elk geslacht of zes dieren van het gevoeligste geslacht. Wanneer andere knaagdieren dat ratten uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan de maximale blootstellingsduur worden aangepast om soortspecifieke symptomen van angst te voorkomen. Van de vier vaste doses wordt er één als aanvangsconcentratie gekozen, namelijk die waarbij naar alle waarschijnlijkheid toxiciteit bij enkele dieren zal optreden. De testschema’s voor gassen, dampen en aerosolen (opgenomen in de aanhangsels 2-4) vertegenwoordigen tests met de drempelwaarden van de CLP-categorieën 1-4 (9) voor gassen (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4h) (aanhangsel 2), voor dampen (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4h) (aanhangsel 3) en voor aerosolen (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4h) (aanhangsel 4). Categorie 5, die niet bij Verordening (EG) nr. 1272/2008 (9) ten uitvoer wordt gelegd, betreft concentraties boven de desbetreffende limietconcentraties. Voor elke aanvangsconcentratie is het desbetreffende testschema van toepassing. De pijlen geven, afhankelijk van het aantal gestorven of op humane wijze gedode dieren, de procedure aan die moet worden gevolgd totdat indeling mogelijk is.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              De tijdsduur tussen de blootstelling van de verschillende groepen wordt bepaald door de aanvang, de duur en de ernst van de toxiciteitsverschijnselen. De blootstelling van dieren bij het volgende concentratieniveau wordt uitgesteld totdat een redelijk vertrouwen bestaat dat de eerder geteste dieren zullen overleven. Er wordt aanbevolen tussen de blootstellingen op elk concentratieniveau een periode van drie of vier dagen in te lassen om observatie van vertraagde toxiciteit mogelijk te maken. Dit interval kan zo nodig worden aangepast, bijvoorbeeld bij onduidelijke reacties.
                           
                        
                     Limiettest
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              De limiettest wordt toegepast indien bekend is of verwacht wordt dat de teststof praktisch niet-toxisch is, d.w.z. dat een toxische reactie alleen optreedt boven de in de regelgeving bepaalde limietconcentratie. Informatie over de toxiciteit van de teststof kan afkomstig zijn van kennis omtrent vergelijkbare geteste stoffen of vergelijkbare mengsels, waarbij rekening wordt gehouden met de identiteit en het percentage van de bestanddelen waarvan bekend is dat zij in toxicologisch opzicht relevant zijn. Wanneer er weinig of geen informatie over de toxiciteit van de teststof is of wordt verwacht dat de teststof toxisch is, moet de hoofdtest worden uitgevoerd (verdere richtsnoeren staan in GD 39 (8)).
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Als limiettest voor deze testmethode worden volgens de normale procedure drie dieren van elk geslacht of zes dieren van het gevoeligste geslacht blootgesteld aan concentraties van 20 000 ppm voor gassen, 20 mg/l voor dampen en 5 mg/l voor stof/nevels (indien haalbaar). Wanneer aerosolen worden getest, is het primaire doel een in te ademen deeltjesgrootte te verkrijgen (d.w.z. een MMAD van 1-4 μm). Voor de meeste teststoffen is dit mogelijk bij een concentratie van 2 mg/l. Aerosolen mogen alleen bij een hogere concentratie dan 2 mg/l worden getest indien een in te ademen deeltjesgrootte kan worden verkregen (zie GD 39 (8)). Overeenkomstig het GHS (16) worden tests boven een limietconcentratie met het oog op het dierenwelzijn afgeraden. Tests in GHS-categorie 5 (16), die niet bij Verordening (EG) nr. 1272/2008 (9) ten uitvoer wordt gelegd, moeten alleen worden overwogen wanneer het zeer waarschijnlijk is dat de resultaten van een dergelijke test rechtstreeks van belang zijn om de gezondheid van mensen te beschermen, en moeten in het studieverslag worden gemotiveerd. Als de teststof kan ontploffen, moet worden vermeden dat zich omstandigheden voordoen waarin een explosie kan optreden. Om onnodig gebruik van dieren te voorkomen wordt de limiettest van tevoren één keer zonder dieren uitgevoerd om te waarborgen dat de kameromstandigheden voor een limiettest kunnen worden bereikt.
                           
                        OBSERVATIES
                  
                              29.
                           
                           
                              De dieren worden tijdens de blootstellingsperiode veelvuldig klinisch geobserveerd. Na de blootstelling worden op dezelfde dag nog ten minste twee klinische observaties verricht, of meer als de respons van de dieren op de behandeling daartoe aanleiding geeft, en vervolgens gedurende veertien dagen ten minste één keer per dag. De duur van de observatieperiode staat niet vast, maar wordt bepaald op grond van de aard en het aanvangstijdstip van klinische symptomen en de duur van de herstelperiode. Het is belangrijk op welk tijdstip de toxiciteitsverschijnselen verschijnen en verdwijnen, vooral als er een neiging is tot vertraagde toxiciteitsverschijnselen. Alle observaties worden systematisch geregistreerd en van elk dier wordt een apart overzicht bijgehouden. Dieren die stervend worden aangetroffen en dieren die hevige pijn hebben en/of blijvende tekenen van hevige angst vertonen, worden met het oog op het dierenwelzijn op humane wijze gedood. Wanneer onderzoek wordt gedaan naar klinische toxiciteitsverschijnselen, moet erop worden gelet dat een aanvankelijk slecht uiterlijk aspect en voorbijgaande veranderingen in de ademhaling als gevolg van de blootstellingsprocedure, niet worden aangezien voor aan de behandeling gerelateerde effecten. Er moet rekening worden gehouden met de beginselen en criteria in de leidraad voor humane eindpunten (7). Wanneer dieren om redenen van dierenwelzijn worden gedood of dood worden aangetroffen, wordt zo nauwkeurig mogelijk geregistreerd op welk tijdstip ze zijn gestorven.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Bij externe observaties van de dieren in de kooien wordt gekeken naar veranderingen in de huid en de vacht, de ogen en de slijmvliezen, de ademhalingsorganen, de bloedsomloop, het autonome en centrale zenuwstelsel, de somatomotorische activiteit en gedragspatronen. Waar mogelijk moet een onderscheid worden gemaakt tussen lokale en systemische effecten. Er moet worden gelet op de observatie van tremors, convulsies, speekselafscheiding, diarree, lethargie, slaap en coma. Een meting van de rectale temperatuur kan ondersteunende gegevens opleveren voor met de behandeling of opsluiting verband houdende reflectoire bradypneu of hypo-/hyperthermie.
                           
                        
                     Lichaamsgewicht
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Het gewicht van elk dier wordt tijdens de acclimatiseringsperiode één keer geregistreerd, op dag 0 (de dag van blootstelling) voorafgaand aan de blootstelling en ten minste op de dagen 1, 3 en 7 (en vervolgens iedere week), alsook op het moment waarop het dier sterft of wordt geëuthanaseerd als dit na dag 1 is. Het lichaamsgewicht is erkend als een kritische indicator van toxiciteit en dieren die een blijvende gewichtsafname van ≥ 20 % vertonen ten opzichte van de voor de studie geregistreerde waarde, moeten zorgvuldig worden gevolgd. Aan het einde van de periode na de blootstelling worden de dieren die nog leven, gewogen en op humane wijze gedood.
                           
                        
                     Pathologie
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Op alle proefdieren, met inbegrip van de dieren die tijdens de test sterven of met het oog op het dierenwelzijn worden geëuthanaseerd en uit het onderzoek worden genomen, wordt macroscopische obductie uitgevoerd. Als het niet mogelijk is onmiddellijk nadat een dood dier is aangetroffen een obductie te verrichten, wordt het dier gekoeld (niet bevroren) bij temperaturen die laag genoeg zijn om de autolyse tot een minimum te beperken. De obductie wordt zo spoedig mogelijk verricht, normaliter binnen één of twee dagen. Alle met het blote oog waarneembare pathologische veranderingen worden voor elk dier geregistreerd, met bijzondere aandacht voor veranderingen in de luchtwegen.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Om de interpretatieve waarde van de studie te vergroten, kan worden overwogen aanvullend onderzoek te verrichten dat vooraf in de opzet is opgenomen, zoals bepaling van het longgewicht van overlevende ratten en/of microscopisch onderzoek van de luchtwegen om aanwijzingen voor irritatie te vinden. Ook kunnen de organen worden onderzocht die tekenen van macroscopische pathologische veranderingen vertonen bij dieren die na 24 uur of langer nog leven, alsmede organen waarvan bekend is of verwacht wordt dat zij zijn aangetast. Microscopisch onderzoek van de volledige luchtwegen kan nuttige informatie opleveren voor teststoffen die met water reageren, zoals zuren en hygroscopische teststoffen.
                           
                        GEGEVENS EN RAPPORTAGE
                  
                     Gegevens
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Voor elk dier worden de gegevens over het lichaamsgewicht en de obductiebevindingen vermeld. Daarnaast worden de gegevens van de klinische observatie in tabelvorm samengevat met voor alle testgroepen vermelding van het gebruikte aantal dieren, het aantal dieren dat specifieke toxiciteitsverschijnselen vertoonde, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of om redenen van dierenwelzijn is gedood, het tijdstip waarop elk dier is gestorven, een beschrijving van de toxische effecten met het verloop en de omkeerbaarheid en de obductiebevindingen.
                           
                        
                     Testverslag
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              In het testverslag wordt indien van toepassing de volgende informatie opgenomen:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Proefdieren en dierhouderij:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      beschrijving van de omstandigheden van de kooi, met inbegrip van: aantal (of verandering in het aantal) dieren per kooi, strooisel, omgevingstemperatuur en relatieve vochtigheid, lichtregime en identificatie van de voeding;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gebruikte soort/stam en motivering voor het gebruik van een ander soort dan ratten;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      randomiseringsmethode;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      details van de voeder- en waterkwaliteit (waaronder aard en herkomst van het voeder en herkomst van het water);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      beschrijving van de eventuele conditionering voorafgaand aan de test, met inbegrip van voeding, quarantaine en behandeling voor ziekte.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Teststof:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fysische aard, zuiverheid en, indien relevant, fysisch-chemische eigenschappen (met inbegrip van de isomeersamenstelling);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identificatiegegevens en, indien bekend, CAS-nummer (Chemical Abstracts Service).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Medium:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivatie voor het gebruik van het medium en voor de keuze ervan (indien een ander medium dan water wordt gebruikt);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      historische of parallelle gegevens waaruit blijkt dat het medium niet interfereert met de uitkomst van de studie.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhalatiekamer:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      beschrijving van de inhalatiekamer met inbegrip van afmetingen en volume;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      herkomst en beschrijving van de apparatuur die voor de blootstelling van dieren en het verkrijgen van de atmosfeer is gebruikt;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      apparatuur voor het meten van de temperatuur, de vochtigheid, de deeltjesgrootte en de feitelijke concentratie;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      herkomst van de lucht, behandeling van de aangevoerde/geëxtraheerde lucht en systeem dat voor de conditionering is gebruikt;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toegepaste methoden voor de kalibratie van de apparatuur voor het verkrijgen van een homogene testatmosfeer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      drukverschil (positief of negatief);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      blootstellingspoorten per kamer (blootstelling via de neus alleen); locatie van de dieren in het systeem (blootstelling van het hele lijf);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      homogeniteit/stabiliteit van de testatmosfeer in de tijd;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      locatie van temperatuur- en vochtigheidssensoren en bemonstering van de testatmosfeer in de kamer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      luchtdebiet, luchtdebiet per blootstellingspoort (blootstelling via de neus alleen) of dierbelasting per kamer (blootstelling van het hele lijf);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informatie over de apparatuur die voor de zuurstof- en kooldioxidemeting is gebruikt, indien van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      equilibratietijd van de kamer (t95);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aantal volumeveranderingen per uur;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      meetapparaten (indien van toepassing).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Blootstellingsgegevens:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivering van de keuze van de doelconcentratie in de hoofdstudie;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominale concentraties (totale massa van de in de inhalatiekamer geleide teststof, gedeeld door het door de kamer geleide luchtvolume);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      feitelijke concentraties van de in het ademhalingsgebied van de dieren verzamelde teststof; voor testmengsels die heterogene fysische vormen produceren (gassen, dampen, aerosolen) kan elke vorm afzonderlijk worden geanalyseerd;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      alle luchtconcentraties worden in massa-eenheden vermeld (bv. mg/l, mg/m3 enz.); de volume-eenheden (bv. ppm, ppb) kunnen tevens tussen haakjes worden vermeld;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      deeltjesgrootteverdeling, massamediaan van de aerodynamische diameter (MMAD) en geometrische standaardafwijking (σg), onder vermelding van de wijze waarop zij zijn berekend. De individuele deeltjesgrootteanalysen worden vermeld.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testomstandigheden:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      details van de bereiding van de teststof, met inbegrip van details van de procedures die zijn gevolgd om de deeltjesgrootte van vaste stoffen te verlagen of oplossingen van de teststof te bereiden. Als de samenstelling van de teststof mogelijk is gewijzigd door mechanische processen, worden de resultaten opgenomen van de analysen die zijn verricht om de samenstelling van de teststof te controleren;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een beschrijving (bij voorkeur met een schematische voorstelling) van de apparatuur die voor het verkrijgen van de testatmosfeer en de blootstelling van de dieren aan de testatmosfeer is gebruikt;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      details van de toegepaste chemische analysemethode en de validering van die methode (met inbegrip van de efficiëntie van de recovery van de teststof uit het bemonsteringsmedium);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivering van de keuze van de testconcentraties.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Resultaten:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met de temperatuur, vochtigheid en luchtdoorstroming van de kamer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met de nominale en feitelijke concentratiegegevens van de kamer;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met de deeltjesgroottegegevens met inbegrip van gegevens over de verzameling van het analytisch monster, de deeltjesgrootteverdeling en de berekening van de MMAD en σg;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een tabel met gegevens over de respons en het concentratieniveau voor elk dier (bv. dieren met toxiciteitsverschijnselen, met inbegrip van sterfte, en de aard, hevigheid en duur van de effecten);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      voor elk dier het op de dagen van de studie bepaalde gewicht en de datum en het tijdstip waarop zij zijn gestorven, indien vóór de geplande euthanasie; voor elk dier het aanvangstijdstip van de toxiciteitsverschijnselen en of deze reversibel waren;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      voor elk dier de obductiebevindingen en de histopathologische bevindingen, indien beschikbaar;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de indeling in CLP-categorie en de LC50-drempelwaarde.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bespreking en interpretatie van de resultaten:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      speciale aandacht wordt besteed aan de beschrijving van de methoden die zijn toegepast om te voldoen aan de criteria van deze testmethode, bv. de limietconcentratie of de deeltjesgrootte;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      er wordt aandacht besteed aan de inhaleerbaarheid van deeltjes in het licht van de algemene bevindingen, in het bijzonder als niet aan de deeltjesgroottecriteria kan worden voldaan;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      in de algehele beoordeling van de studie wordt aandacht besteed aan de consistentie van de methoden die voor de bepalingen van de nominale en feitelijke concentratie zijn toegepast, alsmede aan het verband tussen de feitelijke en de nominale concentratie;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      er wordt aandacht besteed aan de waarschijnlijke doodsoorzaak en overheersende werking (systemisch of plaatselijk);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      er wordt een toelichting gegeven als dieren op humane wijze moesten worden gedood omdat zij pijn hadden of tekenen van hevige en voortdurende angst vertoonden, op basis van de criteria in de OESO-leidraad voor humane eindpunten (7).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATUUR:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.2 van deze bijlage, Acute inhalatietoxiciteit.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System. Arch. Toxicol. 77: 243-254.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic-Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations. Arch. Toxicol. 71: 537-549.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives to LD/LC50 Tests. ALTEX 1: 129-134.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.1 ter van deze bijlage, Acute orale toxiciteit: methode ter bepaling van de acute-toxiciteitsklasse.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 105, OECD, Paris. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Verordening (EG) nr. 1272/2008 van het Europees Parlement en de Raad van 16 december 2008 betreffende de indeling, etikettering en verpakking van stoffen en mengsels tot wijziging en intrekking van de Richtlijnen 67/548/EEG en 1999/45/EG en tot wijziging van Verordening (EG) nr. 1907/2006 (PB L 353 van 31.12.2008, blz. 1).
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.40 van deze bijlage, In-vitrohuidcorrosie: test op basis van de transcutane elektrische weerstand (TEW).
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Hoofdstuk B.40 bis van deze bijlage, In-vitrohuidcorrosie: test met humaan huidmodel.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and Geneva. Beschikbaar op: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_welcome_e.html.
                           
                        
                     Aanhangsel 1
                     DEFINITIE
                     Teststof: alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.
                  
                  
                     Aanhangsel 2
                     
                        Procedure voor elke aanvangsconcentratie voor gassen (ppm/4h)
                     
                     Algemene opmerkingen (12)
                     
                     In de stroomschema’s in dit aanhangsel wordt voor elke aanvangsconcentratie de te volgen procedure geschetst.
                     Aanhangsel 2a: aanvangsconcentratie 100 ppm
                     Aanhangsel 2b: aanvangsconcentratie 500 ppm
                     Aanhangsel 2c: aanvangsconcentratie 2 500 ppm
                     Aanhangsel 2d: aanvangsconcentratie 20 000 ppm
                     De pijlen geven, afhankelijk van het aantal gestorven of op humane wijze gedode dieren, de te volgen procedure aan.
                  
                  
                     Aanhangsel 2a
                     
                        Acute inhalatietoxiciteit:
                     
                     
                        Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 100 ppm/4h voor gassen
                     
                     
                        
                  
                  
                     Aanhangsel 2b
                     
                        Acute inhalatietoxiciteit:
                     
                     
                        Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 500 ppm/4h voor gassen
                     
                     
                        
                  
                  
                     Aanhangsel 2c
                     
                        Acute inhalatietoxiciteit:
                     
                     
                        Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 2 500 ppm/4h voor gassen
                     
                     
                        
                  
                  
                     Aanhangsel 2d
                     
                        Acute inhalatietoxiciteit:
                     
                     
                        Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 20 000 ppm/4h voor gassen
                     
                     
                        
                  
                  
                     Aanhangsel 3
                     
                        Procedure voor elke aanvangsconcentratie voor dampen (mg/l/4h)
                     
                     Algemene opmerkingen (13)
                     
                     In de stroomschema’s in dit aanhangsel wordt voor elke aanvangsconcentratie de te volgen procedure geschetst.
                     Aanhangsel 3a: aanvangsconcentratie 0,5 mg/l
                     Aanhangsel 3b: aanvangsconcentratie 2,0 mg/l
                     Aanhangsel 3c: aanvangsconcentratie 10 mg/l
                     Aanhangsel 3d: aanvangsconcentratie 20 mg/l
                     De pijlen geven, afhankelijk van het aantal gestorven of op humane wijze gedode dieren, de te volgen procedure aan.
                  
                  
                     Aanhangsel 3a
                     
                        Acute inhalatietoxiciteit:
                     
                     
                        Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 0,5 mg/l/4h voor dampen
                     
                     
                        
                  
                  
                     Aanhangsel 3b
                     
                        Acute Inhalatietoxiciteit:
                     
                     
                        Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 2 mg/l/4h voor dampen
                     
                     
                        
                  
                  
                     Aanhangsel 3c
                     
                        Acute Inhalatietoxiciteit:
                     
                     
                        Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 10 mg/l/4h voor dampen
                     
                     
                        
                  
                  
                     Aanhangsel 3d
                     
                        Acute Inhalatietoxiciteit:
                     
                     
                        Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 20 mg/l/4h voor dampen
                     
                     
                        
                  
                  
                     Aanhangsel 4
                     
                        Procedure voor elke aanvangsconcentratie voor aerosolen (mg/l/4h)
                     
                     Algemene opmerkingen (14)
                     
                     In de stroomschema’s in dit aanhangsel wordt voor elke aanvangsconcentratie de te volgen procedure geschetst.
                     Aanhangsel 4a: aanvangsconcentratie 0,05 mg/l
                     Aanhangsel 4b: aanvangsconcentratie 0,5 mg/l
                     Aanhangsel 4c: aanvangsconcentratie 1 mg/l
                     Aanhangsel 4d: aanvangsconcentratie 5 mg/l
                     De pijlen geven, afhankelijk van het aantal gestorven of op humane wijze gedode dieren, de te volgen procedure aan.
                  
                  
                     Aanhangsel 4a
                     
                        Acute Inhalatietoxiciteit:
                     
                     
                        Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 0.05 mg/l/4h voor dampen
                     
                     
                        
                  
                  
                     Aanhangsel 4b
                     
                        Acute inhalatietoxiciteit:
                     
                     
                        Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 0,5 mg/l/4h voor aerosolen
                     
                     
                        
                  
                  
                     Aanhangsel 4c
                     
                        Acute inhalatietoxiciteit:
                     
                     
                        Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 1 mg/l/4h voor aerosolen
                     
                     
                        
                  
                  
                     Aanhangsel 4d
                     
                        Acute inhalatietoxiciteit:
                     
                     
                        Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 500 ppm/4h voor gassen
                     
                     
                        
                  ”
            
                  9)
               
               
                  Hoofdstuk C.10 wordt vervangen door:
                  „C.10.   SIMULATIETEST AEROBE RIOOLWATERZUIVERING: C.10-A: ACTIEFSLIBINSTALLATIES — C.10-B: BIOFILMS
                  
                  
                     C.10-A:   Actiefslibinstallaties
                  
                  INLEIDING
                  
                              1.
                           
                           
                              Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 303 (2001) van de OESO (TG 303). In de jaren 1950 bleek dat de nieuwe oppervlakteactieve stoffen die in het milieu werden gebracht, leidden tot overmatige schuimvorming in rioolwaterzuiveringsinstallaties en rivieren. Bij de aerobe zuivering werden deze stoffen niet volledig verwijderd en in sommige gevallen verhinderden zij de verwijdering van ander organisch materiaal. Daarom werd veel onderzoek gedaan naar de mogelijkheden om oppervlakteactieve stoffen uit rioolwater te verwijderen en naar de vraag of nieuwe stoffen die door de chemische industrie werden geproduceerd, geschikt waren voor rioolwaterzuivering. Hierbij werd gebruikgemaakt van modelinstallaties voor de twee voornaamste soorten aerobe biologische rioolwaterbehandeling (actief slib en filtering door percolatie of druppelfilters). Verspreiding en monitoring van elke nieuwe chemische stof in grootschalige rioolwaterzuiveringen zou, zelfs op plaatselijk niveau, onpraktisch en zeer kostbaar zijn geweest.
                           
                        INLEIDENDE OVERWEGINGEN
                  
                     Actiefslibinstallaties
                  
                  
                              2.
                           
                           
                              Er zijn modellen van actiefslibinstallaties beschreven met een omvang tussen 300 ml en ongeveer 2 000 ml. Sommige waren een realistische imitatie van installaties op ware grootte, met bezinkingsvijvers waaruit het bezonken slib werd teruggepompt in de beluchtingstank, terwijl andere, zoals die van Swisher (1), geen bezinkingsvoorziening hadden. De omvang van de apparatuur is een compromis: enerzijds moet de apparatuur groot genoeg zijn om de mechanische bewerking met succes te kunnen uitvoeren en een toereikende hoeveelheid monsters te kunnen leveren zonder de bewerking te verstoren, terwijl de apparatuur anderzijds niet te veel plaats mag innemen en niet te veel materialen mag vergen.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Twee soorten apparatuur die veelvuldig en naar tevredenheid zijn gebruikt, zijn de installatie van Husmann (2) en de „poreuze pot” (3)(4), voor het eerst gebruikt bij de bestudering van oppervlakteactieve stoffen; zij worden in deze testmethode beschreven. Ook andere apparaten zijn naar tevredenheid gebruikt, bv. de installatie van Eckenfelder (5). Omdat de uitvoering van die simulatietest relatief hoge kosten en grote inspanningen vergt, werd tegelijkertijd onderzoek gedaan naar eenvoudigere en goedkopere screeningtests, die inmiddels zijn opgenomen in hoofdstuk C.4 A-F van deze bijlage (6). De ervaring met vele oppervlakteactieve en andere stoffen heeft uitgewezen dat stoffen die de screeningtests doorstonden (en dus gemakkelijk biologisch afbreekbaar waren) ook afbreekbaar bleken bij de simulatietest. Sommige stoffen die de screeningtests niet doorstonden, doorstonden wel de tests op inherente biologische afbreekbaarheid (hoofdstukken C.12 (7) en C.19 (8) van deze bijlage), maar van deze laatste groep bleken er slechts enkele afbreekbaar in de simulatietest, terwijl de stoffen die de test op inherente biologische afbreekbaarheid niet doorstonden, ook niet afbreekbaar bleken in de simulatietests (9)(10)(11).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Voor sommige doeleinden volstaan simulatietests die onder één reeks bedrijfsomstandigheden worden uitgevoerd; de resultaten worden uitgedrukt als het percentage verwijderde teststof of opgeloste organische koolstof (DOC). In deze testmethode wordt een beschrijving van een dergelijke test gegeven. In tegenstelling tot de eerdere versie van dit hoofdstuk, waarin slechts één soort apparatuur werd beschreven die kunstmatig afvalwater behandelde met gekoppelde eenheden volgens een vrij grove slibafvoermethode, biedt deze tekst echter een aantal varianten. Er worden alternatieven beschreven voor het soort apparatuur, de werkwijze, het afvalwater en de slibafvoer. De tekst sluit nauw aan bij die van ISO 11733 (12), die tijdens de voorbereiding zorgvuldig is onderzocht, hoewel de methode niet aan een ringonderzoek is onderworpen.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Voor andere doeleinden moet de concentratie van de teststof in het effluent nauwkeuriger bekend zijn en is een uitgebreidere methode vereist. Daarbij moet bijvoorbeeld gedurende de testperiode elke dag het percentage afgevoerd slib preciezer worden gecontroleerd en moeten de installaties bij een aantal afvoerpercentages functioneren. Bij de meest uitgebreide methode moeten tests bij twee of drie verschillende temperaturen worden verricht: een dergelijke methode is beschreven door Birch (13)(14) en samengevat in aanhangsel 6. De huidige kennis is echter ontoereikend om te kunnen beslissen welke van de kinetische modellen van toepassing zijn op de biologische afbreekbaarheid van stoffen in een rioolwaterzuiveringsinstallatie en in het aquatisch milieu in het algemeen. Het model van Monod, dat bij wijze van voorbeeld in aanhangsel 6 wordt gegeven, is alleen geldig voor stoffen die in een concentratie van 1 mg/l of meer aanwezig zijn, maar volgens sommigen moet ook dit nog worden onderbouwd. In aanhangsel 7 worden tests vermeld die kunnen worden uitgevoerd bij concentraties die meer overeenstemmen met de in de praktijk in rioolwater aangetroffen niveaus, maar zij zijn, evenals die in aanhangsel 6, opgenomen in aanhangsels en worden niet als afzonderlijke testmethoden verstrekt.
                           
                        
                     Filters
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Modellen met percolatiefilters hebben veel minder aandacht gekregen, mogelijk omdat zij omslachtiger en minder compact zijn dan modellen van actiefslibinstallaties. Gerike et al. hebben druppelfilterinstallaties ontwikkeld en toegepast met gekoppelde eenheden (15). Die filters waren relatief groot (2 m hoog; volume 60 l) en elk filter had een zuiveringscapaciteit van slechts 2 l/h. Baumann et al. (16) hebben druppelfilters gesimuleerd door strips van polyester („fleece”) in 1 m lange buizen (binnendiameter 14 mm) te plaatsen nadat zij gedurende 30 minuten in geconcentreerd actief slib waren ondergedompeld. De teststof werd, als enige koolstofbron in een oplossing van minerale zouten, van de bovenzijde door de verticale buis geleid en de biologische afbreekbaarheid werd beoordeeld door in het effluent de DOC te meten en in het ontsnappende gas de CO2.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Biofilters zijn op een andere manier gesimuleerd (15): naar het binnenoppervlak van roterende buizen, die een kleine hoek met het horizontale vlak maakten, werd afvalwater (ongeveer 250 ml/h) met en zonder teststof geleid; de verzamelde effluenten werden op DOC en/of de specifieke teststof geanalyseerd.
                           
                        PRINCIPE VAN DE TEST
                  
                              8.
                           
                           
                              Deze methode is ontworpen om in een continu werkend testsysteem dat het actiefslibproces nabootst de eliminatie en de primaire en/of totale biologische afbraak van in water oplosbare organische stoffen door aerobe micro-organismen te bepalen. Als koolstof- en energiebronnen voor de micro-organismen worden een gemakkelijk biologisch afbreekbaar organisch medium en de organische teststof gebruikt.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Er vinden parallelle bepalingen, onder identieke omstandigheden, plaats met twee continu werkende testinstallaties (actiefslibinstallaties of poreuze potten) die geschikt worden geacht voor de doeleinden van de test. Normaliter bedraagt de gemiddelde hydraulische retentietijd zes uur en de gemiddelde slibleeftijd (slibretentietijd) zes tot tien dagen. Het slib wordt afgevoerd met een van beide methoden; de teststof wordt normaliter in een concentratie tussen 10 mg/l opgeloste organische koolstof (DOC) en 20 mg/l DOC toegevoegd aan het influent (organisch medium) van slechts een van de installaties. De tweede installatie wordt gebruikt als controle-installatie om de biologische afbreekbaarheid van het organische medium te bepalen.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              In frequent genomen monsters van beide effluenten wordt bij voorkeur de DOC bepaald, of anders het chemisch zuurstofverbruik (CZV), en in het effluent van de installatie waarin de teststof is geleid, wordt de concentratie van de teststof (indien vereist) door middel van een specifieke analyse bepaald. Het verschil tussen de DOC- of CZV-concentraties in het effluent van de testinstallatie en de controle-installatie wordt toegeschreven aan de teststof of de organische metabolieten ervan. Dit verschil wordt met de aan de toegevoegde teststof toegeschreven DOC- of CZV-concentratie van het influent vergeleken om de eliminatie van de teststof te bepalen.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              De biologische afbraak kan normaliter van de biologische adsorptie worden onderscheiden door zorgvuldige bestudering van de eliminatie-tijdcurve en kan doorgaans worden bevestigd door de uitvoering van een test op gemakkelijke biologische afbreekbaarheid met behulp van een geacclimatiseerd entmateriaal uit de installatie waarin de teststof is geleid.
                           
                        INFORMATIE OVER DE TESTSTOF
                  
                              12.
                           
                           
                              De zuiverheid, oplosbaarheid in water, vluchtigheid en adsorptie-eigenschappen van de teststof moeten bekend zijn om de resultaten goed te kunnen interpreteren. Normaliter kunnen vluchtige en onoplosbare stoffen niet worden getest, tenzij er speciale voorzorgsmaatregelen worden genomen (zie aanhangsel 5). Ook de chemische structuur, of ten minste de molecuulformule, moet bekend zijn om theoretische waarden te kunnen berekenen en/of de gemeten waarden van parameters te kunnen controleren (bv. theoretisch zuurstofverbruik (ThOD), opgeloste organische koolstof (DOC) en chemisch zuurstofverbruik (CZV)).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Informatie over de giftigheid van de teststof voor micro-organismen (zie aanhangsel 4) kan nuttig zijn voor het kiezen van de juiste testconcentraties en kan essentieel zijn voor een juiste interpretatie van lage waarden voor de biologische afbraak.
                           
                        NIVEAUS WAARBIJ DE TEST WORDT DOORSTAAN
                  
                              14.
                           
                           
                              Bij de eerste uitvoering van deze (bevestigende) simulatietest ter bepaling van de primaire biologische afbreekbaarheid van oppervlakteactieve stoffen, moet meer dan 80 % van de specifieke stof worden verwijderd om de oppervlakteactieve stof te mogen verhandelen. Als de waarde van 80 % niet wordt gehaald, kan deze (bevestigende) simulatietest worden uitgevoerd en mag de oppervlakteactieve stof alleen worden verhandeld als meer dan 90 % van de specifieke stof wordt verwijderd. Voor stoffen in het algemeen is er geen sprake van dat de test al dan niet kan worden doorstaan en kan het verkregen verwijderingspercentage worden gebruikt in berekeningen voor de schatting van de waarschijnlijke milieuconcentratie die voor de beoordeling van de gevaren van stoffen wordt gebruikt. Bij de resultaten is het vaak „alles of niets”. In een aantal studies van zuivere stoffen die een significante mate van biologische afbreekbaarheid vertoonden, bedroeg het gevonden DOC-verwijderingspercentage voor meer dan drie kwart van de stoffen > 90 % en voor meer dan 90 % van de stoffen > 80 %.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Relatief weinig stoffen (bv. oppervlakteactieve stoffen) zijn in de bij deze test gebruikte concentraties (ongeveer 10 mg C/l) in het afvalwater aanwezig. Sommige stoffen kunnen bij deze concentraties een inhibitoire werking hebben, terwijl de kinetiek van de verwijdering van andere stoffen bij lage concentraties anders kan zijn. Een nauwkeurigere beoordeling van de afbraak kan worden verkregen door gewijzigde methoden toe te passen, waarbij realistische lage concentraties van de teststof worden gebruikt, en de verzamelde gegevens kunnen worden gebruikt om kinetische constanten te berekenen. De benodigde experimentele technieken zijn echter nog niet volledig gevalideerd en de kinetische modellen die de reacties van de biologische afbraak beschrijven, zijn nog niet vastgesteld (zie aanhangsel 7).
                           
                        REFERENTIESTOFFEN
                  
                              16.
                           
                           
                              Om te waarborgen dat de experimentele procedure correct wordt uitgevoerd, kan het soms nuttig zijn gelijktijdig met de onderzochte teststof andere stoffen te testen waarvan het gedrag bekend is. Daarbij kan het gaan om stoffen als adipinezuur, 2-fenylfenol, 1-naftol, difenylzuur en 1-naftoëzuur (9)(10)(11).
                           
                        REPRODUCEERBAARHEID VAN TESTRESULTATEN
                  
                              17.
                           
                           
                              Er zijn veel minder studieverslagen over simulatietests dan over tests op gemakkelijke biologische afbreekbaarheid. De reproduceerbaarheid tussen (gelijktijdige) duplo’s is goed (binnen 10-15 %) voor teststoffen die voor ten minste 80 % afbraken, maar voor minder goed afgebroken stoffen is de variabiliteit groter. Ook voor sommige stoffen die een grensgeval zijn, werden tijdens de negen weken dat de test mag duren, bij verschillende gelegenheden zeer uiteenlopende resultaten (bv. 10 % en 90 %) geregistreerd.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              De resultaten met de twee soorten apparatuur ontliepen elkaar niet veel, maar sommige stoffen braken in huishoudelijk afvalwater beter en consistenter af dan in kunstmatig OESO-afvalwater.
                           
                        BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE
                  
                     Apparatuur
                  
                  
                     Testsysteem
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Het testsysteem voor één teststof bestaat uit een testinstallatie en een controle-installatie; wanneer echter uitsluitend specifieke analysen worden verricht (primaire biologische afbreekbaarheid), volstaat een testinstallatie. Een controle-installatie kan worden gebruikt voor verscheidene testinstallaties met dezelfde of verschillende teststoffen. Als testeenheden worden gekoppeld (aanhangsel 3), moet elke testinstallatie haar eigen controle-installatie hebben. Het testsysteem kan hetzij een actiefslibmodel volgens Husmann (aanhangsel 1, figuur 1), hetzij een poreuze pot (aanhangsel 1, figuur 2) zijn. In beide gevallen zijn opslagtanks van voldoende omvang voor het influent en het effluent vereist, evenals pompen voor de dosering van het influent (al dan niet gemengd met de oplossing van de teststof).
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Elke actiefslibinstallatie bestaat uit een beluchtingsvat met een bekende capaciteit van ongeveer 3 liter actief slib en een nabezinkvat (secundaire zuivering) met een inhoud van ongeveer 1,5 liter; de volumes kunnen enigszins worden gewijzigd door de hoogte van het nabezinkvat aan te passen. Vaten van een andere omvang zijn toegestaan als deze onder een vergelijkbare hydraulische belasting worden gebruikt. Als de temperatuur in de testkamer niet binnen het gewenste bereik kan worden gehouden, wordt aanbevolen watermantelvaten met regelbare watertemperatuur te gebruiken. Om het actief slib uit het nabezinkvat terug te leiden naar het beluchtingsvat, wordt een continu of niet-continu functionerende persluchtpomp of doseerpomp gebruikt.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Het poreuzepotsysteem bestaat uit een poreuze binnencilinder met een kegelvormige bodem, geplaatst in een iets groter vat met dezelfde vorm, dat echter uit ondoordringbare kunststof bestaat. Een geschikt materiaal voor het poreuze vat is poreus polyethyleen met een maximale poriegrootte van 90 μm en een dikte van 2 mm. Het slib wordt van het behandelde organische medium gescheiden door differentiële passage door de poreuze wand. Het effluent wordt verzameld in de ringvormige ruimte, waaruit het overloopt in het opvangvat. Aangezien er geen bezinking plaatsvindt, wordt het slib niet teruggeleid. Het hele systeem kan worden gemonteerd in een waterbad met temperatuurregeling. In het begin kunnen poreuze potten verstopt raken en overstromen. In dat geval wordt de poreuze voering door een schone voering vervangen, waarbij eerst het slib uit de pot in een schone emmer wordt overgeheveld. Na de ondoordringbare buitencilinder te hebben schoongeveegd, wordt een schone voering aangebracht en wordt het slib weer in de pot overgebracht. Ook slib dat aan de verstopte voering is blijven plakken, wordt zorgvuldig afgeschraapt en overgebracht. Reinig verstopte potten eerst door met een fijne waterstraal het achterblijvende slib te verwijderen en de pot te dompelen in een verdunde oplossing van natriumhypochloriet en vervolgens in water, gevolgd door grondig spoelen met water.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Voor het beluchten van het slib in de beluchtingsvaten van beide systemen moeten geschikte technieken worden toegepast, bijvoorbeeld poreus materiaal (beluchtingsstenen) en perslucht. De lucht moet zo nodig door een geschikt filter worden gezuiverd en gereinigd. Er moet voldoende lucht door het systeem gaan om op ieder moment van de test aerobe omstandigheden te behouden en slibvlokken in suspensie te houden.
                           
                        
                     Filtreerapparaat of centrifuge
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Apparaat voor het filtreren van monsters over membraanfilters met een geschikte porositeit (nominale openingsdiameter 0,45 μm) die oplosbare organische stoffen adsorberen en zo min mogelijk organische koolstof vrij laten komen. Als filters worden gebruikt die organische koolstof vrij laten komen, worden de filters zorgvuldig met warm water gewassen om uitloogbare organische koolstof te verwijderen. Bij wijze van alternatief kan een centrifuge worden gebruikt die een versnelling van 40 000 m/s2 kan produceren.
                           
                        
                     Analyseapparatuur
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Apparatuur die nodig is voor de bepaling van:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          DOC (opgeloste organische koolstof) en TOC (totale hoeveelheid organische koolstof) of CZV (chemisch zuurstofverbruik);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de specifieke stof, indien nodig;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          gesuspendeerde vaste stoffen, pH, zuurstofconcentratie in water;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          temperatuur, zuurgraad en alkaliteit;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          ammonium, nitriet en nitraat, als de test wordt uitgevoerd onder omstandigheden waarin nitrificatie mogelijk is.
                                       
                                    
                        
                     Water
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Kraanwater met een DOC-gehalte van minder dan 3 mg/l. Bepaal de alkaliteit, tenzij deze al bekend is.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Gedeïoniseerd water met een DOC-gehalte van minder dan 2 mg/l.
                           
                        
                     Organisch medium
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Als organisch medium is kunstmatig afvalwater, huishoudelijk afvalwater of een mengsel van beide soorten afvalwater toegestaan. Gebleken is (11)(14) dat het gebruik van huishoudelijk afvalwater alleen veelal een hoger percentage DOC-verwijdering oplevert en dat daarin zelfs bepaalde stoffen verwijderd en biologisch afgebroken kunnen worden die bij gebruik van kunstmatig OESO-afvalwater niet afbreken. Bovendien wordt het actief slib vaak gestabiliseerd wanneer continu of met tussenpozen huishoudelijk afvalwater wordt toegevoegd, waardoor de cruciale goede bezinking kan plaatsvinden. Daarom wordt het gebruik van huishoudelijk afvalwater aanbevolen. Meet de DOC- of CZV-concentratie van elke nieuwe partij van het organische medium. De zuurgraad of alkaliteit van het organische medium moet bekend zijn. Als het organische medium een lage zuurgraad of alkaliteit heeft, kan het nodig zijn een geschikte bufferoplossing (natriumwaterstofcarbonaat of kaliumdiwaterstoffosfaat) toe te voegen om tijdens de test in het beluchtingsvat een pH-waarde van ongeveer 7,5 ± 0,5 te behouden. In elk afzonderlijk geval moet worden besloten hoeveel en op welk moment een bufferoplossing wordt toegevoegd. Wanneer voortdurend en/of met tussenpozen mengsels worden gebruikt, moet de DOC- (of CZV-)waarde van het mengsel ongeveer constant worden gehouden, bijvoorbeeld door verdunning met water.
                           
                        
                     Kunstmatig afvalwater
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Per liter leidingwater worden opgelost: pepton, 160 mg; vleesextract, 110 mg; ureum, 30 mg; watervrij dikaliumwaterstoffosfaat (K2HPO4), 28 mg; natriumchloride (NaCl), 7 mg; calciumchloridedihydraat (CaCl2.2H2O), 4 mg; magnesiumsulfaatheptahydraat (Mg2SO4.7H2O), 2 mg. Dit kunstmatig OESO-afvalwater is een voorbeeld en geeft een gemiddelde DOC-concentratie in het influent van ongeveer 100 mg/l. Bij wijze van alternatief mogen ook andere samenstellingen worden gebruikt die ongeveer dezelfde DOC-concentratie opleveren en het feitelijke afvalwater beter benaderen. Als een minder geconcentreerd influent vereist is, wordt het kunstmatige afvalwater met kraanwater verdund, bijvoorbeeld in een verhouding van 1:1 om een concentratie van ongeveer 50 mg/l te bereiken. Een dergelijk minder geconcentreerd influent bevordert de groei van nitrificerende organismen en moet worden gebruikt wanneer nitrificerende rioolwaterzuiveringsinstallaties moeten worden gesimuleerd. Dit kunstmatige afvalwater mag in geconcentreerde vorm van gedistilleerd water worden bereid en ten hoogste één week worden bewaard bij ongeveer 1 °C. Zo nodig wordt het met kraanwater verdund. (Dit medium is onbevredigend, bijvoorbeeld omdat het stikstofgehalte zeer hoog is en het koolstofgehalte relatief laag, maar er is nog geen beter voorstel gedaan, afgezien van de toevoeging van meer fosfaat als buffer en extra pepton).
                           
                        
                     Huishoudelijk afvalwater
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Gebruik vers bezonken rioolwater dat dagelijks wordt verzameld uit een rioolwaterzuiveringsinstallatie die hoofdzakelijk huishoudelijk afvalwater ontvangt. Het wordt voorafgaand aan de primaire bezinking verzameld uit het overloopkanaal van de primaire bezinkingstank of uit de inlaat van de actiefslibinstallatie en moet grotendeels vrij zijn van grove deeltjes. Het rioolwater kan worden gebruikt na enige dagen (gewoonlijk niet meer dan zeven) bij ongeveer 4 °C te zijn bewaard, mits aangetoond wordt dat tijdens de opslag de DOC- (of CZV-)waarde niet significant (met minder dan 20 %) is gedaald. Om verstoringen van het systeem te voorkomen, moet de DOC (of het CZV) van elke nieuwe partij voor gebruik op een passende constante waarde worden gebracht, bijvoorbeeld door verdunning met kraanwater.
                           
                        
                     Actief slib
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Verzamel actief slib voor het enten uit de beluchtingstank van een goed functionerende rioolwaterzuiveringsinstallatie of uit een actiefslibinstallatie op laboratoriumschaal, die hoofdzakelijk huishoudelijk afvalwater verwerkt.
                           
                        
                     Stamoplossingen van de teststof
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Bereid voor stoffen die voldoende oplosbaar zijn, stamoplossingen in een geschikte concentratie (bv. 1 tot 5 g/l) in gedeïoniseerd water of in de minerale fractie van het kunstmatig afvalwater (zie aanhangsel 5 voor onoplosbare en vluchtige stoffen). Bepaal de DOC en de totale hoeveelheid organische koolstof (TOC) van de stamoplossing en herhaal de metingen voor elke nieuwe partij. Controleer, als het verschil tussen de DOC en de TOC groter is dan 20 %, de oplosbaarheid in water van de teststof. Vergelijk de DOC of de met een specifieke analyse van de stamoplossing bepaalde concentratie van de teststof met de nominale waarde om vast te stellen of de recovery toereikend is (normaliter kan een waarde van > 90 % worden verwacht). Bepaal, in het bijzonder voor dispersies, of al dan niet gebruik kan worden gemaakt van de DOC als analytische parameter, dan wel of alleen een specifieke analysetechniek voor de teststof kan worden gebruikt. Monsters van dispersies moeten worden gecentrifugeerd. Voor elke nieuwe partij wordt de DOC of het CZV gemeten, dan wel de teststof met een specifieke analyse.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Bepaal de pH van de stamoplossing. Extreme waarden wijzen erop dat de toevoeging van de stof van invloed kan zijn op de pH van het actief slib in het testsysteem. Neutraliseer in dat geval de stamoplossing met kleine hoeveelheden van een anorganisch zuur of een anorganische base om een pH van 7 ± 0,5 te verkrijgen, maar let erop dat de teststof niet neerslaat.
                           
                        PROCEDURE
                  
                              33.
                           
                           
                              De procedure wordt beschreven voor de actiefslibinstallaties; voor het poreuzepotsysteem zijn enige aanpassingen nodig.
                           
                        
                     Bereiding van het entmateriaal
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Aan het begin van de test wordt het testsysteem geënt met actief slib of een entmateriaal met een lage concentratie micro-organismen. Bewaar het entmateriaal voorafgaand aan het gebruik in beluchte toestand bij kamertemperatuur en gebruik het binnen 24 uur. Neem in het eerste geval een monster van het actief slib uit de beluchtingstank van een goed functionerende biologische rioolwaterzuiveringsinstallatie of een laboratoriumzuiveringsinstallatie, die hoofdzakelijk huishoudelijk afvalwater ontvangt. Als omstandigheden moeten worden gesimuleerd waarin nitrificatie mogelijk is, wordt slib genomen van een nitrificerende rioolwaterzuiveringsinstallatie. Bepaal de concentratie gesuspendeerde vaste stoffen en concentreer het slib zo nodig door middel van bezinking, zodat zo min mogelijk volume aan het testsysteem wordt toegevoegd. Zorg voor een aanvangsconcentratie droge stof van ongeveer 2,5 g/l.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Gebruik in het tweede geval 2 tot 10 ml/l van het effluent van een biologische zuiveringsinstallatie voor huishoudelijk rioolwater als entmateriaal. Om zo veel mogelijk verschillende soorten bacteriën te krijgen, kan het nuttig zijn entmateriaal uit diverse andere bronnen toe te voegen, bijvoorbeeld uit het oppervlaktewater. In dat geval zal het actief slib zich in het testsysteem ontwikkelen en groeien.
                           
                        
                     Dosering van het organische medium
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Zorg ervoor dat de houders voor het influent en het effluent en de slangen vanuit de influentvaten en naar de effluentvaten grondig zijn gereinigd om microbiële groei voorafgaand en gedurende de test te voorkomen. Monteer de testsystemen in een kamer met temperatuurregeling (normaliter tussen 20 en 25 °C) of gebruik testeenheden met watermantel. Bereid een toereikende hoeveelheid van het vereiste organisch medium (punten 27-29). Vul eerst het beluchtingsvat en het nabezinkvat met het organische medium en voeg daaraan het entmateriaal (punten 34 en 35) toe. Start de beluchting op zodanige wijze dat het slib in suspensie en in aerobe toestand wordt gehouden en begin met de dosering van het influent en de terugvoer van het bezonken slib. Pomp het organische medium uit opslagvaten in de beluchtingsvaten (punten 20 en 21) van de test- en controle-installatie en verzamel de respectieve effluenten in soortgelijke opslagvaten. Om de normale hydraulische retentietijd van 6 uur te verkrijgen, wordt het organische medium met 0,5 l/h in de vaten gepompt. Meet, om deze snelheid te controleren, de dagelijks ingebrachte hoeveelheid organisch medium door de afname van de hoeveelheid van het medium in de opslagvaten te noteren. Om de effecten van onderbroken afgifte van en schoksgewijze belasting met chemische stoffen te kunnen bepalen, zijn andere wijzen van dosering vereist.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Als het organische medium bereid wordt om gedurende meer dan één dag te worden gebruikt, moet het bij ongeveer 4 °C worden gekoeld of moet een andere conserveermethode worden toegepast om microbiële groei en biologische afbraak buiten de testinstallaties tegen te gaan (punt 29). Als kunstmatig afvalwater wordt gebruikt, kan een geconcentreerde stamoplossing (bv. tien keer de normale concentratie, punt 28) worden bereid en bij ongeveer 4 °C worden bewaard. Deze stamoplossing kan voor gebruik goed worden vermengd met een passende hoeveelheid kraanwater; een andere mogelijkheid is om de stamoplossing rechtstreeks in de vaten te pompen en afzonderlijk de juiste hoeveelheid kraanwater toe te voegen.
                           
                        
                     Dosering van de teststof
                  
                  
                              38
                           
                           
                              Voeg een passende hoeveelheid van de stamoplossing van de teststof (punt 31) toe aan het opslagvat van het influent of pomp deze hoeveelheid met een afzonderlijke pomp rechtstreeks in het beluchtingsvat. De normale gemiddelde testconcentratie in het influent bedraagt 10 tot 20 mg/l DOC, met een hoogste concentratie van 50 mg/l. Als de teststof slecht oplosbaar is in water of toxische effecten worden verwacht, wordt de concentratie verlaagd naar 5 mg/l DOC of nog lager, maar alleen als er een geschikte specifieke analysemethode beschikbaar is en wordt toegepast (gedispergeerde teststoffen die slecht oplosbaar zijn in water, kunnen met speciale doseertechnieken worden toegevoegd; zie aanhangsel 5).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Begin, nadat het systeem is gestabiliseerd en efficiënt DOC uit het organische medium verwijderd (ongeveer 80 %), met het toevoegen van de teststof. Het is belangrijk dat vóór het toevoegen van de teststof wordt gecontroleerd of alle installaties even efficiënt functioneren; als dit niet het geval is, helpt het gewoonlijk om het afzonderlijke slib te mengen en gelijke hoeveelheden over de afzonderlijke installaties te herverdelen. Wanneer gebruik wordt gemaakt van een entmateriaal van (ongeveer) 2,5 g/l actief slib (drooggewicht), kan de teststof vanaf het begin van de test worden toegevoegd, aangezien de directe toevoeging vanaf het begin van toenemende hoeveelheden als voordeel heeft dat het actief slib zich beter aan de teststof kan aanpassen. Ongeacht de wijze waarop de teststof wordt toegevoegd, wordt aanbevolen met regelmatige intervallen de relevante stroomsnelheid en/of de volumes in het opslagvat of de opslagvaten te meten.
                           
                        
                     Behandeling van actief slib
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Ongeacht het gebruikte entmateriaal stabiliseert de concentratie van het actief slib gewoonlijk tijdens de test op een waarde tussen 1 en 3 g/l (drooggewicht), afhankelijk van de kwaliteit en de concentratie van het organische medium, de bedrijfsomstandigheden, de aard van de aanwezige micro-organismen en de invloed van de teststof.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Bepaal hetzij ten minste wekelijks de gesuspendeerde vaste stoffen in de beluchtingsvaten en voer de overmaat slib af om de concentratie tussen 1 en 3 g/l (drooggewicht) te houden, of houd de gemiddelde slibleeftijd op een constante waarde, gewoonlijk tussen zes en tien dagen. Als bijvoorbeeld een slibretentietijd van acht dagen wordt gekozen, wordt dagelijks 1/8 van het volume van het actief slib in het beluchtingsvat verwijderd en afgevoerd. Herhaal dit dagelijks of laat dit, bij voorkeur, uitvoeren door een automatische niet-continu functionerende pomp. Door de concentratie van de gesuspendeerde vaste stoffen constant, of binnen strikte grenswaarden, te houden, wordt niet gezorgd voor een constante slibretentietijd (SRT); dit is echter de operationele variabele die de waarde van de concentratie van de teststof in het effluent bepaalt.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Verwijder gedurende de test ten minste dagelijks het slib dat aan de wanden van het beluchtingsvat en het nabezinkvat plakt, zodat dit weer in suspensie wordt gebracht. Controleer en reinig regelmatig alle buizen en slangen om biofilmgroei te voorkomen. Voer het bezonken slib uit het nabezinkvat terug naar het beluchtingsvat, bij voorkeur door met onderbrekingen te pompen. In het poreuzepotsysteem vindt geen terugvoer plaats; zorg ervoor dat er schone binnenpotten zijn geplaatst voordat het volume in het vat significant toeneemt (punt 21).
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              In installaties van Husmann kan een slechte bezinking en verlies van slib optreden. Dit kan worden gecorrigeerd door in de test- en controle-installatie tegelijkertijd één of meer van de onderstaande acties te verrichten:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          met regelmatige intervallen, bijvoorbeeld wekelijks, kan vers slib of flocculant (bv. per vat 2 ml FeCl3 van 50 g/l) worden toegevoegd, waarbij erop moet worden gelet dat de toevoeging van FeCl3 geen reactie of neerslag van de teststof induceert;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de persluchtpomp kan worden vervangen door een peristaltische pomp, waardoor een slibrecirculatiestroom op gang kan worden gebracht die ongeveer gelijk is aan de vereiste influentstroom en de ontwikkeling van een anaerobe zone in het bezonken slib kan ontstaan (door de configuratie van de persluchtpomp kan de stroomsnelheid van het teruggevoerde slib niet lager zijn dan 12 keer de stroomsnelheid van het influent);
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      er kan met onderbrekingen slib uit het nabezinkvat in het beluchtingsvat worden gepompt (bv. 5 minuten inschakeltijd per 2,5 uur om 1 tot 1,5 l/h terug te voeren);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      om verlies door schuimvorming te voorkomen, kan een minimale concentratie niet-toxisch antischuimmiddel worden gebruikt (bv. siliconenolie);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      het slib kan in het nabezinkvat kortstondig schoksgewijs worden belucht (bv. gedurende 10 s per uur);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      het organische medium kan met intervallen in het beluchtingsvat worden ingebracht (bv. gedurende 3 tot 10 minuten per uur).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     Bemonstering en analyse
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Meet met regelmatige tussenpozen het gehalte aan opgeloste zuurstof, de temperatuur en de pH-waarde van het actief slib in de beluchtingsvaten. Zorg ervoor dat er steeds voldoende zuurstof beschikbaar is (> 2 mg/l) en dat de temperatuur binnen het voorgeschreven bereik blijft (normaliter 20 tot 25 °C). Houd de pH-waarde op 7,5 ± 0,5 door kleine hoeveelheden van een anorganische base of een anorganisch zuur aan het beluchtingsvat of het influent toe te voegen of door de buffercapaciteit van het organische medium te vergroten (zie punt 27). Indien nitrificatie optreedt, wordt zuur geproduceerd, waarbij de oxidatie van 1 mg N het equivalent van ongeveer 7 mg CO3– oplevert. De meetfrequentie hangt af van de te meten parameter en de stabiliteit van het systeem, en kan variëren van één keer per dag tot één keer per week.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Meet de DOC of het CZV in de influenten van de controle- en testvaten. Meet de concentratie van de teststof in het testinfluent door een specifieke analyse te verrichten of schat deze aan de hand van de concentratie in de stamoplossing (punt 31), het gebruikte volume en de in de testinstallatie ingebrachte hoeveelheid afvalwater. Om de variabiliteit van de concentratiegegevens te beperken, wordt aanbevolen de concentratie van de teststof te berekenen.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Neem passende monsters van het verzamelde effluent (bv. composietmonsters voor 24 uur) en filtreer de monsters over een membraan met poriegrootte 0,45 μm of centrifugeer ze gedurende ongeveer 15 minuten bij ongeveer 40 000 m/s2. Als filtratie moeilijk is, moet worden gecentrifugeerd. Bepaal de DOC of het CZV ten minste in duplo om de totale biologische afbraak te meten en bepaal zo nodig de primaire biologische afbraak door een specifieke analyse voor de teststof uit te voeren.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Het gebruik van de COD kan bij lage concentraties analytische problemen opleveren en wordt daarom alleen aangeraden bij een voldoende hoge testconcentratie (ongeveer 30 mg/l). Voor sterk adsorberende stoffen wordt bovendien aanbevolen de in het slib geadsorbeerde hoeveelheid te meten met een op de teststof afgestemde specifieke analysetechniek.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              De bemonsteringsfrequentie hangt af van de verwachte duur van de test. Een frequentie van drie keer per week wordt aanbevolen. Wacht nadat de installaties efficiënt functioneren, na inbrenging van de teststof één tot maximaal zes weken om het actief slib zich te laten aanpassen en een stationaire toestand te bereiken. Er moeten bij voorkeur ten minste 15 geldige waarden worden verkregen in de plateaufase (punt 59), die normaliter 3 weken duurt, om het testresultaat te evalueren. De test kan worden beëindigd als een toereikend eliminatiepercentage (bv. > 90 %) is bereikt en deze 15 waarden beschikbaar zijn, die afkomstig zijn van analysen die gedurende drie weken elke werkdag zijn verricht. De test mag normaliter na toevoeging van de teststof niet langer dan twaalf weken duren.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Als in het slib nitrificatie plaatsvindt en bestudeerd moet worden welke invloed de teststof daarop heeft, worden ten minste één keer per week monsters van het effluent van de test- en controle-installatie geanalyseerd op ammonium en/of nitriet plus nitraat.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Alle analysen, en met name de stikstofbepalingen, worden zo spoedig mogelijk verricht. Als analysen moeten worden uitgesteld, worden de monsters in het donker bij ongeveer 4 °C bewaard in volle, goed afgesloten flessen. Als de monsters langer dan 48 uur moeten worden bewaard, worden zij geconserveerd door invriezen, zuurbehandeling (bv. 10 ml/l van een zwavelzuuroplossing van 400 g/l) of toevoeging van een geschikte toxische stof (bv. 20 ml/l van een kwik(II)chloride-oplossing van 10 g/l). De conserveertechniek mag de resultaten van de analyse niet beïnvloeden.
                           
                        
                     Koppeling van testinstallaties
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Als gebruik moet worden gemaakt van gekoppelde installaties (aanhangsel 3), wordt dagelijks dezelfde hoeveelheid actief slib (150 tot 1 500 ml voor beluchtingsvaten die 3 liter vloeistof bevatten) uitgewisseld tussen de beluchtingsvaten van de testinstallatie en de controle-installatie daarvan. Als de teststof sterk aan het slib adsorbeert, wordt alleen het supernatans van de nabezinkvaten uitgewisseld. Gebruik in beide gevallen een correctiefactor om de testresultaten te berekenen (punt 55).
                           
                        GEGEVENS EN RAPPORTAGE
                  
                     Verwerking van de resultaten
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Bereken met de volgende vergelijking de procentuele DOC- of CZV-eliminatie van de teststof voor elk beoordelingsmoment:
                              
                                 
                              waarbij
                              
                                          Dt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          % DOC- of CZV-eliminatie op tijdstip t;
                                       
                                    
                                          Cs
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          aan de teststof toegeschreven DOC of CZV in het influent, bij voorkeur geschat aan de hand van de stamoplossing (mg/l);
                                       
                                    
                                          E
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          gemeten DOC- of CZV-waarde in het testeffluent op tijdstip t (mg/l);
                                       
                                    
                                          Eo
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          gemeten DOC- of CZV-waarde in het controle-effluent op tijdstip t (mg/l).
                                       
                                    
                        
                              53.
                           
                           
                              De mate van DOC- of CZV-eliminatie van het organische medium in de controle-installatie is informatie die nuttig is voor de beoordeling van de biologische afbraakactiviteit van het actief slib tijdens de test. Bereken de procentuele eliminatie met de volgende vergelijking:
                              
                                 
                              waarbij
                              
                                          DB
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          % DOC- of CZV-eliminatie van het organische medium in de controle-installatie op tijdstip t;
                                       
                                    
                                          CM
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          DOC of CZV van het organische medium in het controle-influent (mg/l).
                                       
                                    Desgewenst kan de procentuele DOC- of CZV-eliminatie als gevolg van het organische medium plus de teststof in de testinstallatie worden berekend met de volgende vergelijking:
                              
                                 
                              waarbij
                              
                                          DT
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          % DOC- of CZV-eliminatie van het totale testinfluent;
                                       
                                    
                                          CT
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          DOC of CZV van het totale testinfluent of berekend aan de hand van de stamoplossingen (mg/l);
                                       
                                    
                        
                              54.
                           
                           
                              Bereken, als met een specifieke analysemethode de teststof wordt gemeten, voor elk meettijdstip de verwijdering van de teststof met de volgende vergelijking:
                              
                                 
                              waarbij
                              
                                          DST
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          % primaire eliminatie van teststof op tijdstip t;
                                       
                                    
                                          Si
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          gemeten of geschatte concentratie van de teststof in het testinfluent (mg/l);
                                       
                                    
                                          Se
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          gemeten concentratie van de teststof in het testeffluent op tijdstip t (mg/l).
                                       
                                    
                        
                              55.
                           
                           
                              Als gewerkt is met gekoppelde eenheden, wordt de verdunning van de teststof in het beluchtingsvat als gevolg van de uitwisseling van het slib gecompenseerd door een correctiefactor toe te passen (zie aanhangsel 3). Als de gemiddelde hydraulische retentietijd 6 uur bedraagt en de helft van het volume van het actief slib in het beluchtingsvat is uitgewisseld, moeten de bepaalde dagelijkse eliminatiewaarden (Dt, punt 52) met de volgende vergelijking worden gecorrigeerd om de feitelijke mate van eliminatie van de teststof Dtc te verkrijgen:
                              
                                 
                           
                        
                     Uitdrukking van de testresultaten
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Zet de procentuele eliminatie Dt (of Dtc) en Dst, indien beschikbaar, uit tegen de tijd (zie aanhangsel 2). Uit de vorm van de eliminatiecurve van de teststof (als zodanig of als DOC) kunnen enkele conclusies over het verwijderingsproces worden afgeleid.
                           
                        
                     Adsorptie
                  
                  
                              57.
                           
                           
                              Als vanaf het begin van de test een grote mate van DOC-eliminatie van de teststof wordt waargenomen, wordt de teststof waarschijnlijk geëlimineerd door adsorptie aan de vaste stoffen van het actief slib. Dit kan worden aangetoond door met een specifieke analyse de geadsorbeerde teststof te bepalen. Het is niet gebruikelijk dat gedurende de hele test een hoge mate van DOC-eliminatie van adsorbeerbare stoffen plaatsvindt; normaliter is de mate van verwijdering in eerste instantie groot, waarna geleidelijk een evenwichtswaarde wordt bereikt. Als de adsorbeerbare teststof echter op de een of andere manier kan zorgen voor acclimatisering van de microbiële populatie, neemt de DOC-eliminatie van de teststof vervolgens toe en wordt een hoge plateauwaarde bereikt.
                           
                        
                     Aanloopfase
                  
                  
                              58.
                           
                           
                              Net als in statische screeningtests hebben veel teststoffen een aanloopfase nodig voordat volledige biologische afbraak plaatsvindt. In de aanloopfase vindt acclimatisering of aanpassing van de afbraakbacteriën plaats en wordt de teststof nagenoeg niet verwijderd; vervolgens gaan deze bacteriën groeien. Deze fase duurt totdat ongeveer 10 % van de initiële hoeveelheid teststof is verwijderd (nadat eventuele adsorptie heeft kunnen plaatsvinden); op dat moment begint de afbraakfase. De aanloopfase is vaak zeer variabel en slecht reproduceerbaar.
                           
                        
                     Plateaufase
                  
                  
                              59.
                           
                           
                              In een continue test is de plateaufase van een eliminatiecurve de fase waarin de maximale afbraak plaatsvindt. De plateaufase moet ten minste drie weken duren en omvat ongeveer 15 geldige gemeten waarden.
                           
                        
                     Gemiddeld eliminatiepercentage van de teststof
                  
                  
                              60.
                           
                           
                              Bereken het gemiddelde van de eliminatiewaarden (Dt) van de teststof in de plateaufase. Rond de gevonden waarde af op het dichtstbijzijnde gehele getal (1 %); dit is het eliminatiepercentage van de teststof. Aanbevolen wordt tevens het 95 %-betrouwbaarheidsinterval van de gemiddelde waarde te berekenen.
                           
                        
                     Eliminatie van het organische medium
                  
                  
                              61.
                           
                           
                              Zet de procentuele eliminatie van de DOC of het CZV van het organische medium in de controle-installatie (DB) uit tegen de tijd. Geef het gemiddelde eliminatiepercentage op dezelfde wijze aan als voor de teststof (punt 60).
                           
                        
                     Aanduiding van biologische afbraak
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Als de teststof niet significant aan het actief slib adsorbeert en de eliminatiecurve een vorm heeft die typerend is voor biologische afbraak met aanloopfase, afbraakfase en plateaufase (punten 58 en 59), kan de gemeten eliminatie zonder meer aan biologische afbraak worden toegeschreven. Als een grote mate van initiële verwijdering heeft plaatsgevonden, kan in de simulatietest geen onderscheid worden gemaakt tussen biologische en niet-biologische eliminatieprocessen. In dergelijke gevallen, alsook in andere gevallen waarin getwijfeld wordt over de biologische afbraak (bv. als wordt gestript), moeten de geadsorbeerde teststoffen worden geanalyseerd of aanvullende statische biologischeafbraaktests worden verricht voor parameters die duidelijk op biologische processen wijzen. Dergelijke tests zijn de methoden voor zuurstofopname (hoofdstukken C.4 D, E en F van deze bijlage (6)), een test waarbij de productie van kooldioxide wordt gemeten (hoofdstuk C.4 C van deze bijlage (6)) en de ISO-gasruimteproef (18), waarvoor van tevoren blootgesteld entmateriaal uit de simulatietest wordt gebruikt. Als de verwijdering van zowel de DOC als de specifieke stof is gemeten, wijzen significante verschillen tussen beide verwijderingspercentages (waarbij het eerste lager is dan het tweede) op de aanwezigheid van organische tussenproducten in de effluenten, die moeilijker afbreekbaar kunnen zijn dan de oorspronkelijke stof.
                           
                        
                     Geldigheid van testresultaten
                  
                  
                              63.
                           
                           
                              Als het eliminatiepercentage van het organische medium (punt 53) in de controle-installatie is bepaald, is er informatie over het normale biologische afbraakgedrag van het entmateriaal. De test wordt geldig geacht als de mate van DOC- of CZV-eliminatie in de controle-installatie(s) na twee weken > 80 % is en geen ongebruikelijke waarnemingen zijn gedaan.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Als een gemakkelijk biologisch afbreekbare (referentie)stof is gebruikt, moet de mate van biologische afbraak (Dt, punt 52) > 90 % zijn.
                           
                        
                              65.
                           
                           
                              Als de test is uitgevoerd onder omstandigheden waarin nitrificatie mogelijk is, moeten de gemiddelde concentraties aan ammoniumstikstof en nitrietstikstof in de effluenten respectievelijk < 1 mg/l en < 2 mg/l zijn.
                           
                        
                              66.
                           
                           
                              Als niet aan deze criteria (punten 63-65) wordt voldaan, wordt de test herhaald met een entmateriaal uit een andere bron, wordt een referentiestof getest en worden alle procedures van de proef opnieuw bekeken.
                           
                        
                     Testverslag
                  
                  
                              67.
                           
                           
                              In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden opgenomen:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Teststof:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identificatiegegevens;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fysische toestand en, indien relevant, fysisch-chemische kenmerken.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testomstandigheden:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      soort testsysteem; eventuele aanpassingen voor het testen van onoplosbare en vluchtige stoffen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      soort organisch medium;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      indien bekend, percentage en aard van industrieel afvalwater dat in het rioolwater aanwezig is;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      entmateriaal, aard en plaats(en) van bemonstering, concentratie en eventuele prebehandeling;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stamoplossing van de teststof: DOC- en TOC-gehalte; bij suspensies: wijze van bereiding; gebruikte testconcentratie; indien afwijkend van het bereik van 10 tot 20 mg/l DOC, motivering; toevoegingsmethode; datum van eerste toevoeging; eventuele wijzigingen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gemiddelde slibleeftijd en gemiddelde hydraulische retentietijd; methode van slibafvoer; methoden om bulking, verlies van slib enz. tegen te gaan;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toegepaste analysetechnieken;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      testtemperatuur;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kwaliteit van de slibbulking, slibvolume-index (SVI), concentratie gesuspendeerde vaste stoffen in het mengsel (MLSS);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      eventuele afwijkingen van de standaardprocedures en omstandigheden die de resultaten kunnen hebben beïnvloed.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testresultaten:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      alle gemeten gegevens van DOC, CZV, specifieke analysen, pH, temperatuur, zuurstofgehalte, gesuspendeerde vaste stoffen, stikstofverbindingen, indien relevant;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      alle berekende waarden van Dt (of Dtc), DB en DSt in de vorm van tabellen en eliminatiecurven;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informatie over de aanloop- en plateaufase, de duur van de test, het eliminatiepercentage van de teststof en van het organische medium in de controle-installatie, met statistische informatie en verklaringen betreffende de biologische afbraak en de geldigheid van de test;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een bespreking van de resultaten.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATUUR:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              Swisher RD (1987). „Surfactant Biodegradation”, 2nd Edn. Marcel Dekker Inc. New York, 1085 pp.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              Duitse Bondsregering (1962). Verordnung über die Abbaubarkeit von Detergenzien in Wasch- und Reinigungsmitteln. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No.49: 698-706.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Painter HA and King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing biodegradability. Technical Report No.70, Water Research Centre, Medmenham, UK.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Painter HA and King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. Res. 12: 909-915.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Eckenfelder, W.W (19) US EPA.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Hoofdstuk C.4 van deze bijlage, Bepaling van de „gemakkelijke” biologische afbreekbaarheid.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              Hoofdstuk C.12 van deze bijlage, Biologische afbraak — gewijzigde SCAS-test.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Hoofdstuk C.19 van deze bijlage, Raming van de adsorptiecoëfficiënt (KOC
                                 ) aan de bodem en aan rioolslib met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC).
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Gerike P and Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3:157-173.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and conclusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45-55.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Painter HA and Bealing D (1989). Experience and data from the OECD activated sludge simulation test. pp 113-138, In: Laboratory tests for simulation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              ISO 11733 (1995; revised 2004). Evaluation of the elimination and biodegradability of organic substances in an aqueous medium — Activated sludge simulation test.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol. Deterg.: 33-48.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 (2): 340-343.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Gerike P, Fischer WK and Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753-758.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF — Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214-220.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. Methods for the examination of waters and associated materials. pp. 91-98 ISBN 011 751661 9.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              ISO 14593 (1998). Water Quality — Evaluation in an aqueous medium of the ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the analysis of inorganic carbon in sealed vessels.
                           
                        
                     Aanhangsel 1
                     
                        Figuur 1
                     
                     
                        Apparatuur voor de beoordeling van biologische afbreekbaarheid
                     
                     Installatie van Husmann
                     
                        
                     
                                 A.
                              
                              
                                 Opslagvat
                              
                           
                                 B.
                              
                              
                                 Doseerpomp
                              
                           
                                 C.
                              
                              
                                 Beluchtingsvat (inhoud 3 l)
                              
                           
                                 D.
                              
                              
                                 Nabezinkvat
                              
                           
                                 E.
                              
                              
                                 Persluchtpomp
                              
                           
                                 F.
                              
                              
                                 Verzamelvat
                              
                           
                                 G.
                              
                              
                                 Beluchter
                              
                           
                                 H.
                              
                              
                                 Luchtstroommeter
                              
                           
                        Figuur 2
                     
                     
                        Apparatuur voor de beoordeling van biologische afbreekbaarheid
                     
                     Poreuze pot
                     
                        
                     
                                 A.
                              
                              
                                 Opslagvat
                              
                           
                                 B.
                              
                              
                                 Doseerpomp
                              
                           
                                 C.
                              
                              
                                 Poreus beluchtingsvat
                              
                           
                                 D.
                              
                              
                                 Ondoordringbaar buitenvat
                              
                           
                                 E.
                              
                              
                                 Verzamelvat
                              
                           
                                 F.
                              
                              
                                 Diffusor
                              
                           
                                 G.
                              
                              
                                 Luchtstroommeter
                              
                           
                        Figuur 3
                     
                     
                        Maten van poreus beluchtingsvat van 3 liter
                     
                     
                        
                  
                  
                     Aanhangsel 2
                     
                        Voorbeeld van een eliminatiecurve
                     
                     
                        
                  
                  
                     Aanhangsel 3
                     [TER INFORMATIE]
                     KOPPELING VAN TESTINSTALLATIES
                     Om een evenwicht tot stand te trachten te brengen tussen de microbiële populaties in het slib van een testinstallatie, die zowel afvalwater als teststof ontvangt, en een controle-installatie, die uitsluitend afvalwater ontvangt, is overgegaan tot een dagelijkse slibuitwisseling (1). Deze procedure werd „koppeling” genoemd en de methode staat bekend als „gekoppelde eenheden”. Aanvankelijk werd koppeling toegepast bij actiefslibinstallaties volgens Husmann, maar later ook bij poreuzepotinstallaties (2)(3). Aangezien noch bij installaties van het Husmanntype, noch bij poreuzepotinstallaties significante verschillen tussen de resultaten van niet-gekoppelde en gekoppelde installaties werden gevonden, levert de investering van extra tijd en energie in het koppelen van de eenheden geen voordelen op.
                     Omdat bij de slibuitwisseling een deel van de teststof wordt overgeheveld en de teststofconcentraties in het test- en controle-effluent nagenoeg gelijk kunnen zijn, kan het lijken alsof er een aanzienlijke verwijdering plaatsvindt. Daarom moeten correctiefactoren worden toegepast, die afhangen van het uitgewisselde deel van het slib en de gemiddelde hydraulische retentietijd. De berekening is uitvoerig beschreven in de literatuur (1).
                     Bereken de gecorrigeerde DOC- of CZV-eliminatie met de algemene formule:
                     
                        
                     waarbij
                     
                                 Dtc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 gecorrigeerd % DOC- of CZV-eliminatie;
                              
                           
                                 Dt
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 bepaald % DOC- of CZV-eliminatie;
                              
                           
                                 a
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 uitgewisseld deel van het volume van de actiefslibinstallaties;
                              
                           
                                 r
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 gemiddelde hydraulische retentietijd (h).
                              
                           Als bijvoorbeeld de helft van het volume van de beluchtingstank wordt uitgewisseld (a = 0,5) en de gemiddelde hydraulische retentietijd 6 uur bedraagt, is de correctieformule:
                     
                        
                     
                        LITERATUUR:
                     
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Painter HA, Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD Activated Sludge Simulation Test. pp. 113-138. In: Laboratory Tests for Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK.
                              
                           
                  
                     Aanhangsel 4
                     EVALUATIE VAN DE INHIBITIE VAN HET ACTIEF SLIB
                     
                        Inhibitie door teststoffen
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Het is mogelijk dat een stof (of afvalwater) in de simulatietest niet wordt afgebroken of verwijderd en zelfs een inhibitoir effect heeft op de micro-organismen in het slib. Andere stoffen zijn bij lage concentraties biologisch afbreekbaar, maar bij hogere concentraties inhibitoir (hormese). Inhibitoire effecten kunnen in een eerder stadium zijn vastgesteld of kunnen zijn vastgesteld door de uitvoering van een toxiciteitstest waarvoor hetzelfde of soortgelijk entmateriaal is gebruikt als in de simulatietest (1). Dergelijke methoden zijn de inhibitie van de zuurstofopname (hoofdstuk C.11 van deze bijlage (2) en ISO 8192 (3)) en de inhibitie van de groei van sliborganismen (ISO 15522 (4)).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Bij de simulatietest manifesteert inhibitie zich doordat het verschil in opgeloste organische koolstof (DOC) of chemisch zuurstofverbruik (CZV) tussen het effluent van het testvat en dat van het controlevat groter is dan de als teststof toegevoegde DOC. Met andere woorden, het percentage verwijderde DOC (en biochemisch zuurstofverbruik (BZV), chemisch zuurstofverbruik (CZV) en/of NH+
                                    4) van het organische medium neemt af door de aanwezigheid van de teststof. Als dit het geval is, moet de test worden herhaald waarbij de concentratie van de teststof wordt verlaagd totdat een niveau wordt bereikt waarbij geen inhibitie optreedt; de concentratie kan mogelijk nog verder worden verlaagd totdat de teststof biologisch wordt afgebroken. Als de teststof (of het afvalwater) echter bij alle geteste concentraties nadelige effecten op het proces heeft, zijn er aanwijzingen dat het moeilijk, zo niet onmogelijk, is om de stof biologisch te behandelen; het kan evenwel zinvol zijn de test te herhalen met actief slib uit een andere bron en/of het slib geleidelijker te laten acclimatiseren.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Als de teststof daarentegen bij de eerste uitvoering van de simulatietest biologisch wordt geëlimineerd, moet de concentratie worden verhoogd als er behoefte is aan kennis over de mogelijke inhibitoire werking van de stof.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Bij de bepaling van de inhibitiegraad dient men zich te realiseren dat de populatie van het actief slib kan veranderen en dat de micro-organismen na verloop van tijd een tolerantie kunnen ontwikkelen voor een inhibitoire stof.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Berekening van de inhibitiegraad:
                                 Het totale percentage verwijdering van BZV, DOC, CZV enz. (Ro) voor de test- en controle-installatie kan als volgt worden berekend:
                                 
                                    
                                 waarbij:
                                 
                                             I
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             concentratie van BZV, DOC, CZV enz. in het influent van het test- of controlevat (mg/l);
                                          
                                       
                                             E
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             desbetreffende concentratie in het effluent (mg/l).
                                          
                                       Voor de testinstallaties moeten I en E worden gecorrigeerd voor de DOC als gevolg van de teststof, omdat anders de berekening van de procentuele inhibitie onjuist is.
                                 De inhibitiegraad als gevolg van de aanwezigheid van de teststof kan als volgt worden berekend:
                                 
                                    
                                 waarbij:
                                 
                                             Rc
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             procentuele verwijdering in de controlevaten;
                                          
                                       
                                             Rt
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             procentuele verwijdering in de testvaten.
                                          
                                       
                           
                        LITERATUUR:
                     
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Reynolds L et al. (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Hoofdstuk C.11 van deze bijlage, Biologische afbraak — Actief slib: remming ademhaling.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 ISO 8192 (2007) Water quality — Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 ISO 15522 (1999) Water Quality — Determination of the inhibitory effect of water constituents on activated sludge microorganisms.
                              
                           
                  
                     Aanhangsel 5
                     
                        Slecht in water oplosbare teststoffen — Vluchtige stoffen
                     
                     
                        Slecht in water oplosbare stoffen
                     
                     Er lijken weinig rapporten te zijn gepubliceerd over de uitvoering van simulatietests voor rioolwaterzuivering op slecht in water oplosbare en onoplosbare stoffen (1)(2)(3).
                     Er is geen enkele dispergeermethode die bruikbaar is voor alle onoplosbare teststoffen. Van de vier soorten methoden die in ISO 10634 (4) zijn beschreven, lijken er twee geschikt te zijn om te proberen teststoffen te dispergeren met het oog op de uitvoering van een simulatietest, namelijk het gebruik van emulgeermiddelen en/of ultrasone energie. De stabiliteit van de dispersie moet gedurende een periode van ten minste 24 uur worden onderzocht. Dispersies die op geschikte wijze zijn gestabiliseerd en onder constant roeren in een reservoir zijn bewaard (punt 38), worden vervolgens, gescheiden van het huishoudelijke (of kunstmatige) afvalwater, in de beluchtingstank ingebracht.
                     Onderzoek, als de dispersies stabiel zijn, hoe de teststof in gedispergeerde vorm kan worden bepaald. Het is onwaarschijnlijk dat DOC geschikt is, zodat een specifieke analysemethode voor de teststof moet worden vastgesteld die kan worden toegepast op de effluenten, de vaste deeltjes in de effluenten en het actief slib. Vervolgens worden de lotgevallen van de teststof in de simulatie van het actiefslibproces bepaald in de vloeibare en de vaste fase. Aldus wordt een „massabalans” vastgesteld om te bepalen of de teststof biologisch is afgebroken. Hieruit blijkt echter alleen de primaire biologische afbreekbaarheid. Om te trachten de totale biologische afbreekbaarheid aan te tonen, moet een respirometrische test op gemakkelijke biologische afbreekbaarheid (hoofdstuk C.4 van deze bijlage (5) C, F of D) worden uitgevoerd waarbij als entmateriaal slib wordt gebruikt dat in de simulatietest aan de teststof is blootgesteld.
                     
                        Vluchtige stoffen
                     
                     De uitvoering van rioolwaterzuiveringssimulaties op vluchtige stoffen is zowel controversieel als problematisch. Net als over slecht in water oplosbare teststoffen lijken er zeer weinig rapporten over simulatietests met vluchtige stoffen te zijn gepubliceerd. Een gebruikelijk type apparaat met volledige menging wordt aangepast door de beluchtings- en nabezinktanks af te sluiten, de luchtdoorstroming met debietmeters te meten en te regelen en het uitgaande gas door vallen te leiden om vluchtig organisch materiaal te verzamelen. In sommige gevallen wordt een vacuümpomp gebruikt om het uitgaande gas naar een „koude” val of een purgeand-trap-systeem met Tenax- en silicagelfilters te zuigen om gaschromatografische analysen te verrichten. De in de val aanwezige teststof kan analytisch worden bepaald.
                     De test wordt in twee delen uitgevoerd. Eerst functioneren de installaties zonder slib, terwijl het kunstmatige afvalwater en de teststof in de beluchtingstank worden gepompt. Gedurende enkele dagen worden monsters van het influent, het effluent en het uitgaande gas verzameld en geanalyseerd. Op basis van de verzamelde gegevens kan het uit het systeem gestripte percentage (Rvs) van de teststof worden berekend.
                     Vervolgens wordt de normale biologische test (met slib) uitgevoerd onder bedrijfsomstandigheden die identiek zijn aan die van de strippingstudie. Er worden ook DOC- en CZV-metingen verricht om te controleren of de installaties efficiënt functioneren. Incidenteel worden analysen verricht om in het eerste deel van de test de teststof in het influent, het effluent en het uitgaande gas te bepalen; na acclimatisering worden frequenter analysen verricht. Opnieuw kan, op basis van de gegevens in de stationaire toestand, het percentage van de teststof worden berekend dat door alle processen (fysisch en biologisch) uit de vloeibare fase is verwijderd (RT), alsook het uit het systeem gestripte deel (RV).
                     Berekening:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 in de niet-biologische test kan het uit het systeem gestripte percentage (RVP) van de teststof als volgt worden berekend:
                                 waarbij
                                 
                                             RVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             verwijdering van de teststof door vervluchtiging (%);
                                          
                                       
                                             SVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             in de val verzamelde teststof, uitgedrukt als equivalente concentratie in de vloeibare fase (mg/l);
                                          
                                       
                                             SIP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             concentratie van de teststof in het influent (mg/l);
                                          
                                       
                           
                                 b)
                              
                              
                                 in de biologische test kan het uit het systeem gestripte percentage (RV) van de teststof als volgt worden berekend:
                                 waarbij
                                 
                                             RV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             verwijdering van de teststof door vervluchtiging in de biologische test (%);
                                          
                                       
                                             SV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             in de biologische test in de val verzamelde teststof, uitgedrukt als equivalente concentratie in het vloeibare influent (mg/l);
                                          
                                       
                                             SI
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             concentratie van de teststof in het influent (mg/l);
                                          
                                       
                           
                                 c)
                              
                              
                                 in de biologische test wordt het percentage (RT) van de teststof dat door alle processen is verwijderd als volgt berekend:
                                 waarbij
                                 SE= concentratie van de teststof in het (vloeibare) effluent (mg/l);
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 vervolgens kan het door biologische afbraak en adsorptie verwijderde percentage (RBA) als volgt worden berekend:
                                 Er moeten afzonderlijke tests worden verricht om te bepalen of de teststof is geadsorbeerd; als dit het geval is, kan een nadere correctie worden toegepast;
                              
                           
                                 e)
                              
                              
                                 een vergelijking tussen het gestripte deel van de teststof in de biologische test (RV) en de niet-biologische test (RVP) geeft een aanwijzing voor het totale effect dat de biologische behandeling heeft op de emissie van de teststof in de atmosfeer.
                                 
                                             
                                                Voorbeeld:
                                             
                                          
                                          
                                             Benzeen
                                          
                                       Slibretentietijd = vier dagen
                                 Een kunstmatig afvalwater; retentietijd = 8 uur
                                 
                                             SIP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             SI = 150 mg/l
                                          
                                       
                                             SVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             150 mg/l (SEP = 0)
                                          
                                       
                                             SV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             22,5 mg/l
                                          
                                       
                                             SE
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             50 μg/l
                                          
                                       Hieruit volgt:
                                 
                                             RVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             100 %, RV = 15 %
                                          
                                       
                                             RT
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             100 % en RBA = 85 %.
                                          
                                       Benzeen werd geacht niet aan het slib te adsorberen.
                              
                           
                        LITERATUUR:
                     
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939-854.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control Fed. 55: 97.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 ISO 10634 (1995) Water Quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Hoofdstuk C.4 van deze bijlage, Bepaling van de „gemakkelijke” biologische afbreekbaarheid.
                              
                           
                  
                     Aanhangsel 6
                     
                        Effecten van de slibretentietijd (SRT) op de behandelbaarheid van stoffen
                     
                     INLEIDING
                     
                                 1.
                              
                              
                                 De in de hoofdtekst beschreven methode is ontworpen om te bepalen of de teststoffen (waarvan gewoonlijk bekend is dat zij inherent, maar niet gemakkelijk, biologisch afbreekbaar zijn) biologisch afbreekbaar zijn binnen de grenzen die door rioolwaterzuiveringsinstallaties worden gesteld. De resultaten worden uitgedrukt als procentuele verwijdering en procentuele biologische afbraak. De bedrijfsomstandigheden van de actiefslibinstallaties en de keuze van het influent maken een vrij uiteenlopende variatie in de concentratie van de teststof in het effluent mogelijk. Er worden tests verricht bij slechts één nominale concentratie van vaste stoffen van het actief slib of één nominale slibretentietijd (SRT) en de beschreven slibafvoerregelingen kunnen ertoe leiden dat de SRT-waarde tijdens de test aanzienlijk varieert, zowel van dag tot dag als in de loop van een dag.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Bij deze variant (1)(2) wordt de SRT gedurende elke periode van 24 uur binnen veel nauwere grenzen geregeld (zoals ook op de grote schaal gebeurt), waardoor de concentratie in de effluenten constanter is. Huishoudelijk afvalwater wordt aanbevolen, omdat dit een consistenter en hoger verwijderingpercentage oplevert. Bovendien worden de effecten van een aantal SRT-waarden onderzocht en in een gedetailleerdere studie kunnen de effecten van een reeks van temperaturen op de effluentconcentratie worden bepaald.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Er bestaat nog geen algemene overeenstemming over de vraag welke kinetische modellen van toepassing zijn op de biologische afbraak van stoffen onder rioolwaterzuiveringsomstandigheden. Het model van Monod voor bacteriële groei en substraatgebruik werd gekozen (1)(2) voor toepassing op de verzamelde gegevens, aangezien de methode uitsluitend bedoeld was voor stoffen die in grote hoeveelheden worden geproduceerd, waardoor concentraties van meer dan 1 mg/l in het rioolwater optreden. De geldigheid van het vereenvoudigde model en de gemaakte aannamen is vastgesteld aan de hand van een reeks alcoholethoxylaten met een uiteenlopende mate van primaire biologische afbreekbaarheid (2)(3).
                                 
                                             
                                                Opmerking:
                                             
                                          
                                          
                                             Deze variant van de methode volgt grotendeels de tekst van testmethode C.10-A; hierna worden alleen de details vermeld die afwijken.
                                          
                                       
                           PRINCIPE VAN DE TEST
                     
                                 4.
                              
                              
                                 De poreuzepotinstallaties voor actief slib, die zijn ontworpen om te zorgen voor (bijna) continue afvoer van gemengde vloeistof waarbij de slibretentietijd (SRT of θs) zeer nauwkeurig kan worden geregeld, worden in niet-gekoppelde modus gebruikt bij een reeks SRT’s, en facultatief ook bij een reeks temperaturen. De retentietijd bedraagt gewoonlijk twee tot tien dagen en de temperatuur ligt tussen 5 en 20 °C. Het (bij voorkeur huishoudelijke) afvalwater en de oplossing van de teststof worden afzonderlijk in de installaties gebracht in een dosering die de gewenste slibretentietijd (3 tot 6 uur) en concentratie van de teststof in het influent oplevert. De controle-installaties die geen teststof ontvangen, worden ter vergelijking parallel gebruikt.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Er kan gebruik worden gemaakt van andere soorten apparatuur, waarbij er echter zorgvuldig op dient te worden gelet dat de SRT goed wordt geregeld. Als bijvoorbeeld installaties met een bezinker worden gebruikt, kan het nodig zijn een correctie toe te passen voor het verlies van vaste stoffen via het effluent van de installatie. Bovendien moeten bijzondere voorzorgsmaatregelen worden genomen om fouten als gevolg van de variatie van de hoeveelheid slib in de bezinker te voorkomen.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 De installaties worden bij een geselecteerde reeks omstandigheden gebruikt; nadat een evenwichtstoestand is bereikt, worden in de effluenten in stationaire toestand gedurende een periode van ongeveer drie weken de gemiddelde concentraties van de teststof, en eventueel de DOC, bepaald. Naast de beoordeling van de procentuele verwijdering van de teststof, en eventueel DOC, wordt het verband tussen de bedrijfsomstandigheden van de installatie en de concentratie in het effluent grafisch weergegeven. Op grond hiervan kunnen tentatieve kinetische constanten worden berekend en kan een voorspelling worden gedaan over de omstandigheden waaronder de teststof kan worden behandeld.
                              
                           INFORMATIE OVER DE TESTSTOF
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Hoofdstuk C.10-A, punten 12 en 13, is van toepassing.
                              
                           NIVEAUS WAARBIJ DE TEST WORDT DOORSTAAN
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Hoofdstuk C.10-A, punten 14 en 15, is van toepassing.
                              
                           REFERENTIETESTSTOF
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Hoofdstuk C.10-A, punt 16, is van toepassing.
                              
                           REPRODUCEERBAARHEID VAN TESTRESULTATEN
                     
                                 10.
                              
                              
                                 Hoofdstuk C.10-A, punten 17 en 18, is van toepassing.
                              
                           BESCHRIJVING VAN DE METHODE
                     
                        Apparatuur
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Het gewijzigde poreuzepotsysteem (aanhangsel 6.1) is een geschikte installatie. Dit bestaat uit een binnenvat (voering) van poreus polypropyleen met een dikte van 3,2 mm, een poriegrootte van ongeveer 90 μm en stompgelaste naden (hierdoor is de installatie steviger dan die welke beschreven is in punt 21 van dit hoofdstuk C.10-A). De voering wordt bevestigd in een ondoordringbaar buitenvat van polyethyleen, dat uit twee delen bestaat: een ronde bodem waarin gaten voor twee luchtleidingen en een slibafvoerleiding zijn geboord, waarop met schroeven een cilinder met een uitlaat is bevestigd, zodat het poreuzepotvat een bekende inhoud (3 l) heeft. Op een van de luchtleidingen wordt een beluchtingssteen gemonteerd en de andere heeft een open uiteinde en wordt loodrecht op de steen in de pot geplaatst. Dit systeem produceert voldoende werveling om de inhoud van de pot volledig te mengen en te zorgen voor een concentratie opgeloste zuurstof die hoger is dan 2 mg/l.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Het vereiste aantal installaties wordt, in waterbaden of kamers met constante temperatuur, op een geregelde temperatuur gehouden binnen het bereik 5 tot 20 °C (± 1 °C). Er zijn pompen nodig om de oplossing van de teststof en het bezonken rioolwater met het vereiste debiet (respectievelijk 0-1,0 ml/min en 0-25 ml/min) in de beluchtingsvaten te leiden en er is een derde pomp nodig om het afvoerslib uit de beluchtingsvaten te verwijderen. Het zeer lage debiet waarmee het slib moet worden afgevoerd, wordt verkregen door gebruik te maken van een op een hoger debiet afgestelde pomp die op een tijdschakelaar is aangesloten, zodat de pomp met tussenpozen functioneert; zo levert bijvoorbeeld 10 s inschakeltijd per minuut bij een pompdebiet van 3 ml/min een afvoerdebiet van 0,5 ml/min op.
                              
                           
                        Filtreerapparaat of centrifuge
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Hoofdstuk C.10-A, punt 23, is van toepassing.
                              
                           
                        Analyseapparatuur
                     
                     
                                 14.
                              
                              
                                 Hoofdstuk C.10-A, punt 24, is van toepassing.
                              
                           
                        Water
                     
                     
                                 15.
                              
                              
                                 Hoofdstuk C.10-A, punten 25 en 26, is van toepassing.
                              
                           
                        Organisch medium
                     
                     
                                 16.
                              
                              
                                 Hoofdstuk C.10-A, punt 27, is van toepassing.
                              
                           
                        Kunstmatig afvalwater
                     
                     
                                 17.
                              
                              
                                 Hoofdstuk C.10-A, punt 28, is van toepassing.
                              
                           
                        Huishoudelijk afvalwater
                     
                     
                                 18.
                              
                              
                                 Hoofdstuk C.10-A, punt 29, is van toepassing.
                              
                           
                        Actief slib
                     
                     
                                 19.
                              
                              
                                 Hoofdstuk C.10-A, punt 30, is van toepassing.
                              
                           
                        Stamoplossingen van de teststof
                     
                     
                                 20.
                              
                              
                                 Hoofdstuk C.10-A, punten 31 en 32, is van toepassing.
                              
                           PROCEDURE
                     
                        Bereiding van het entmateriaal
                     
                     
                                 21.
                              
                              
                                 Alleen punt 34 van hoofdstuk C.10-A is van toepassing — gebruik actief slib (ongeveer 2,5 g/l).
                              
                           
                        Aantal testinstallaties
                     
                     
                                 22.
                              
                              
                                 Voor een eenvoudige test, waarbij alleen de procentuele verwijdering wordt gemeten, is slechts één SRT vereist; om de voor de berekening van tentatieve kinetische constanten benodigde gegevens te verkrijgen, zijn daarentegen 4 of 5 SRT’s vereist. Gewoonlijk worden waarden tussen twee en tien dagen gekozen. In de praktijk is het handig om bij één temperatuur gelijktijdig een test uit te voeren met 4 of 5 SRT’s; bij uitgebreide studies worden dezelfde SRT-waarden, of misschien een andere reeks waarden, gebruikt bij andere temperaturen binnen het bereik 5-20 °C. Voor primaire biologische afbreekbaarheid (het belangrijkste gebruik) is normaliter slechts één installatie per reeks omstandigheden vereist. Voor totale biologische afbreekbaarheid is echter, voor elke reeks omstandigheden, een controle-installatie nodig, die wel afvalwater maar geen teststof ontvangt. Als vermoed wordt dat de teststof in het gebruikte afvalwater aanwezig is, moeten bij de beoordeling van primaire biologische afbreekbaarheid controle-installaties worden gebruikt en moet op de berekeningen een correctiefactor worden toegepast.
                              
                           
                        Dosering van het organische medium en de teststof
                     
                     
                                 23.
                              
                              
                                 Hoofdstuk C.10-A, punten 36 tot en met 39, is van toepassing, met dien verstande dat de teststofoplossing apart wordt ingebracht en dat verschillende slibafvoerdebieten worden toegepast. Bovendien moeten de debieten van de influenten, effluenten en de slibafvoer frequent, bijvoorbeeld twee keer per dag, worden gecontroleerd en zo nodig worden aangepast. Als het gebruik van huishoudelijk afvalwater moeilijkheden voor de analysemethoden oplevert, wordt de test uitgevoerd met kunstmatig afvalwater, waarbij echter moet worden gewaarborgd dat de verschillende media vergelijkbare kinetische gegevens opleveren.
                              
                           
                        Behandeling van actiefslibinstallaties
                     
                     
                                 24.
                              
                              
                                 Hoofdstuk C.10-A, punten 40 tot en met 43, is van toepassing, maar de SRT moet uitsluitend worden geregeld door „constante” slibafvoer.
                              
                           
                        Bemonstering en analyse
                     
                     
                                 25.
                              
                              
                                 Hoofdstuk C.10-A, punten 44 tot en met 50, is van toepassing, maar de concentratie van de teststof moet worden bepaald en de DOC wordt facultatief bepaald; er mag geen gebruik worden gemaakt van het CZV.
                              
                           GEGEVENS EN RAPPORTAGE
                     
                        Verwerking van de resultaten
                     
                     
                                 26.
                              
                              
                                 Hoofdstuk C.10-A, punten 52 tot en met 54, is van toepassing.
                              
                           
                        Uitdrukking van de testresultaten
                     
                     
                                 27.
                              
                              
                                 Hoofdstuk C.10-A, punten 56 tot en met 62, is van toepassing.
                              
                           
                        Berekening van kinetische constanten
                     
                     
                                 28.
                              
                              
                                 Het is realistischer om de gemiddelde concentratie van de teststof in het effluent in stationaire toestand te vermelden en te beschrijven hoe deze varieert afhankelijk van de bedrijfsomstandigheden van de installatie, dan om de procentuele primaire biologische afbreekbaarheid te vermelden. Dit kan worden gedaan met behulp van vergelijking (6) in aanhangsel 6.2, die waarden kan geven voor KS, μm en θSC, de kritische slibretentietijd.
                                 (Bij wijze van alternatief kunnen benaderingen voor KS en μm worden verkregen met een eenvoudig computerprogramma waarmee de met vergelijking [2] (aanhangsel 6.2) berekende theoretische curve wordt aangepast aan de experimenteel verkregen waarden. Hoewel een bepaalde oplossing niet uniek zal zijn, kan een redelijke benadering van KS en μm worden verkregen.)
                              
                           
                        Variabiliteit van de resultaten
                     
                     
                                 29.
                              
                              
                                 De ervaring leert dat variabele waarden worden verkregen voor de kinetische parameters van individuele stoffen. Verondersteld wordt dat de omstandigheden waaronder het slib is gegroeid en de omstandigheden waaronder de test is verricht (zoals in punt 5 en in andere tests) grote invloed hebben op de uitkomsten. Een aspect van deze variabiliteit is besproken door Grady e.a. (4), die hebben geopperd dat de begrippen „extant” en „intrinsic” moeten worden gebruikt voor de twee extreme omstandigheden die de grenzen vormen van de fysiologische toestand die een kweek tijdens een kinetisch experiment kan bereiken. Als de toestand tijdens de test niet mag veranderen, geven de waarden van de kinetische parameter de omstandigheden weer van het milieu waaruit de micro-organismen afkomstig zijn; deze waarden worden „extant” of momenteel bestaand genoemd. Als de omstandigheden in de test zodanig zijn dat het eiwitsynthesesysteem zich optimaal ontwikkelt en een zo groot mogelijke groeisnelheid wordt gehaald, worden de verkregen kinetische parameters „intrinsiek” genoemd en hangen zij uitsluitend af van de aard van het substraat en het type bacteriën in de kweek. Als richtsnoer worden de extante waarden verkregen wanneer een lage verhouding tussen de concentratie substraat en werkzame micro-organismen (So/Xo) wordt aangehouden, bv. 0,025, en de intrinsieke waarden wanneer deze verhouding hoog is, bv. ten minste 20. In beide gevallen moet So ten minste gelijk zijn aan de overeenkomstige waarde van KS, de halfverzadigingsconstante.
                              
                           
                                 30.
                              
                              
                                 De variabiliteit en andere facetten van de biologischeafbraakkinetiek zijn besproken tijdens een recente SETAC-workshop (5). Dergelijke, gerapporteerde en geplande, studies moeten een duidelijker beeld opleveren van de kinetische processen in rioolwaterzuiveringsinstallaties, zodat bestaande gegevens beter kunnen worden geïnterpreteerd en de opzet van toekomstige testmethoden kan worden geoptimaliseerd.
                              
                           
                        LITERATUUR:
                     
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol Deterg.: 33-48.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Birch RR (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 340-343.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411-422.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic parameter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. Wat. Res., 30 (3): 742-748.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4-6th Sept. 1996. SETAC — Europe, Brussels.
                              
                           
                  
                     Aanhangsel 6.1
                     
                        Poreuze pot met SRT-regeling
                     
                     
                        
                  
                  
                     Aanhangsel 6.2
                     
                        Berekening van kinetische constanten
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Aannemende dat het kinetische model van Monod van toepassing is, en uitgaande van een massabalans van actieve vaste stoffen en substraat in het hele actiefslibsysteem (1), gelden de volgende expressies voor de stationaire toestand:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [1]
                                          
                                       of
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [2]
                                          
                                       waarbij
                                 
                                             S1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             concentratie van het substraat in het effluent (mg/l);
                                          
                                       
                                             KS
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             halfverzadigingsconstante, de concentratie waarbij geldt: μ = μm/2 (mg/l);
                                          
                                       
                                             μ
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             specifieke groeisnelheid (d–1);
                                          
                                       
                                             μm
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             maximumwaarde van μ (d–1);
                                          
                                       
                                             Kd
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             specifieke afnamesnelheid van vaste stoffen (d–1);
                                          
                                       
                                             θS
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             gemiddelde slibretentietijd, SRT (d).
                                          
                                       Bestudering van deze vergelijking leidt tot de volgende conclusies:
                                 
                                             i)
                                          
                                          
                                             de concentratie in het effluent is onafhankelijk van de concentratie in het influent (S0); dit betekent dat de procentuele biologische afbraak varieert naargelang van de concentratie in het influent (S0);
                                          
                                       
                                             ii)
                                          
                                          
                                             de enige regelparameter van de installatie die van invloed is op S1, is de slibretentietijd (θS);
                                          
                                       
                                             iii)
                                          
                                          
                                             voor een gegeven concentratie in het influent S0 zal er een kritische slibretentietijd zijn, zodanig dat:
                                             
                                                         
                                                            
                                                      
                                                      
                                                         [3]
                                                      
                                                   waarbij
                                             θSC= kritische slibretentietijd; bij een kortere SRT worden de werkzame micro-organismen uit de installatie gespoeld;
                                          
                                       
                                             iv)
                                          
                                          
                                             aangezien de andere parameters in vergelijking [2] verband houden met groeikinetiek, zal de temperatuur waarschijnlijk het substraatniveau in het effluent en de kritische slibleeftijd beïnvloeden, d.w.z. dat de slibretentietijd die nodig is om een bepaalde zuiveringsgraad te verkrijgen toeneemt naarmate de temperatuur daalt.
                                          
                                       
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Uitgaande van een massabalans van vaste stoffen in het poreuzepotsysteem, en aannemende dat de concentratie van vaste stoffen in het effluent van de installatie (X2) laag is in vergelijking met de concentratie in het beluchtingsvat (X1), geldt voor de slibretentietijd:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [4]
                                          
                                       en
                                 
                                    
                                 waarbij
                                 
                                             V
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             volume van het beluchtingsvat (l);
                                          
                                       
                                             X1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             concentratie van vaste stoffen in het beluchtingsvat (mg/l);
                                          
                                       
                                             X2
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             concentratie van vaste stoffen in het effluent (mg/l);
                                          
                                       
                                             Q0
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             influentdebiet (l/d);
                                          
                                       
                                             Q1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             slibafvoerdebiet (l/d).
                                          
                                       Dit betekent dat de slibretentietijd op elke vooraf gekozen waarde kan worden geregeld door aanpassing van het slibafvoerdebiet (Q1).
                                 
                                    Conclusies:
                                 
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Hoofddoel van de test is de effluentconcentratie, en dus de niveaus van de teststof in de ontvangende wateren, te voorspellen.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 In sommige gevallen kan de kritische slibretentietijd (θSC) gemakkelijk worden bepaald door S1 uit te zetten tegen θS, bijvoorbeeld bij curve 3 in figuur 1. Wanneer dit niet mogelijk is, kan θSC, met benaderingen voor μm en KS, worden berekend door S1 uit te zetten tegen S1•θS.
                                 Een herschikking van vergelijking [1] geeft:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [5]
                                          
                                       Als Kd klein is, geldt: 1 + θs • Kd ~ 1 en wordt [5]:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [6]
                                          
                                       Dit levert een rechte lijn op (zie figuur 2) waarvan de richtingscoëfficiënt 1/μm is en het snijpunt met de y-as KS/μm; bovendien geldt: θS ~1/μm.
                                 
                                    Figuur 1
                                 
                                 
                                    Drie temperaturen; vijf SRT’s
                                 
                                 
                                    
                                 
                                    Figuur 2
                                 
                                 
                                    Regressielijn van SRT · S1 versus S1 bij T = 5 °C
                                 
                                 
                                    
                                 
                                    Legenda:
                                 
                                 effluentconcentratie
                                 curve.
                              
                           
                  
                     Aanhangsel 7
                     TEST BIJ LAAG CONCENTRATIEBEREIK (μg/l)
                     
                                 1.
                              
                              
                                 In het aquatisch milieu, en zelfs in afvalwater, zijn veel stoffen normaliter in zeer lage concentraties (μg/l) aanwezig. Bij die concentraties fungeren zij waarschijnlijk niet als primaire substraten die in groei resulteren, maar is het waarschijnlijker dat zij afbreken tot geen groei veroorzakende secundaire substraten, samen met uiteenlopende koolstoffen die van nature voorkomen. Daarom is het model van aanhangsel 6 niet geschikt voor de afbreekbaarheid van dergelijke stoffen. Er zijn vele modellen die zouden kunnen worden toegepast en onder de omstandigheden die in rioolwaterzuiveringssystemen heersen, kunnen verscheidene modellen tegelijkertijd werkzaam zijn. Om dit probleem te kunnen oplossen is veel meer onderzoek noodzakelijk.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Tot die tijd kan, uitsluitend voor primaire biologische afbreekbaarheid, de procedure in de hoofdtekst (hoofdstuk C.10-A) worden gevolgd, waarbij gebruik moet worden gemaakt van passende lage concentraties (< 100 μg/l) en een gevalideerde analyseprocedure. De procentuele biologische afbraak kan worden berekend (zie punt 54 van de testmethode), mits rekening wordt gehouden met niet-biologische processen (adsorptie, vluchtigheid enz.). Een voorbeeld is de studie van Nyholm e.a. (1)(2), waarbij in een vul-en-aftapsysteem een cyclus van 4 uur is toegepast. Zij rapporteerden pseudo-eersteordeconstanten voor vijf stoffen die in een concentratie van 5 tot 100 μg/l aan kunstmatig afvalwater werden toegevoegd. (Voor totale biologische afbreekbaarheid kunnen 14C-gemerkte teststoffen worden gebruikt. Een beschrijving daarvan valt buiten het bestek van deze testmethode, omdat er vooralsnog geen overeengekomen procedures bestaan, al bevat een voorgestelde methode voor ISO 14592 (3) richtsnoeren voor het gebruik van 14C-gemerkte stoffen.)
                              
                           
                        SCAS-test
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Later is een eenvoudigere tweefasentest voorgesteld (4)(5)(6), waarbij de semicontinue actiefslibmethode (SCAS) wordt gevolgd door kortstondige kinetische tests op monsters uit de SCAS-installaties. Bij het SCAS-systeem worden (anders dan bij de oorspronkelijke testmethode C.12) bekende slibafvoerdebieten toegepast en wordt gemodificeerd kunstmatig OESO-afvalwater of huishoudelijk afvalwater gebruikt. Het kunstmatige afvalwater werd gemodificeerd (om de pH-waarde en de slechte bezinkingseigenschappen te wijzigen) door toevoeging van fosfaat als buffer, gistextract, ijzer(III)chloride en zouten van spoorelementen, en het CZV werd tot ongeveer 750 mg/l verhoogd door verhoging van de concentratie pepton en vleesextract. De installaties werkten met een cyclus van 24 uur: 23 uur beluchten, afvoer van slib, bezinking, verwijdering van het supernatans (effluent) gevolgd door toevoeging van kunstmatig afvalwater plus teststof in een concentratie tot 100 μg/l (d.w.z. ongeveer dezelfde concentratie als in de kortetermijntest). Eén keer per week werd 10 % van het totale slib vervangen door vers slib, om een evenwichtige microbiële populatie te behouden.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 De concentraties van de teststof worden van tevoren en aan het eind van de beluchting gemeten en de test wordt voortgezet totdat een constante verwijdering van de teststof is bereikt; dit kan variëren van één week tot verscheidene maanden.
                              
                           
                        Kortetermijntest
                     
                     
                                 5.
                              
                              
                                 Er wordt een korte test (van bv. 8 uur) verricht om de (pseudo-)eersteordeconstante van de kinetische snelheid te bepalen voor de afname van de teststof in actief slib met bekende, maar uiteenlopende oorsprongen en achtergronden. In het bijzonder worden tijdens een acclimatisatieproef, aan het eind van een beluchtingsperiode wanneer de concentratie organisch substraat laag is, slibmonsters uit de SCAS-reactoren genomen (punten 3 en 4). Ter vergelijking kan ook slib worden afgenomen uit een parallelle SCAS-installatie waarin de teststof niet is toegevoegd. Mengsels van het slib en de daaraan in twee of meer concentraties tussen 1 en 50 μg/l toegevoegde teststof worden belucht, zonder toevoeging van kunstmatig afvalwater of ander organisch substraat. Gedurende maximaal 24 uur wordt met regelmatige intervallen, afhankelijk van de afbreekbaarheid van de stof, de in de oplossing achterblijvende teststof bepaald (bijvoorbeeld ieder uur). De monsters worden gecentrifugeerd en vervolgens op geschikte wijze geanalyseerd.
                              
                           
                        Berekeningen
                     
                     
                                 6.
                              
                              
                                 De gegevens over de SCAS-installaties worden gebruikt voor de berekening van de procentuele verwijdering van de teststof (punt 54). Bovendien kan met de volgende formule een gemiddelde snelheidsconstante K1 worden berekend (genormaliseerd voor de concentratie gesuspendeerde vaste stoffen):
                                 
                                    
                                 waarbij
                                 
                                             t
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             beluchtingstijd (23 uur);
                                          
                                       
                                             Ce
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             concentratie aan eind van beluchtingsperiode (μg/l);
                                          
                                       
                                             Ci
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             concentratie bij begin beluchting (μg/l);
                                          
                                       
                                             SS
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             concentratie van vaste stoffen in het actief slib (g/l).
                                          
                                       
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Bij de kortetermijntest wordt de resterende procentuele concentratie op logaritmische schaal uitgezet tegen de tijd en komt de richtingscoëfficiënt van het begindeel (10-50 % afbraak) van de curve overeen met K1, de (pseudo-)eersteordeconstante. De constante wordt voor de concentratie vaste stoffen van het slib genormaliseerd door de richtingscoëfficiënt te delen door die concentratie. Het verslag over de resultaten moet ook gegevens bevatten over de initiële concentraties van de teststof en de gesuspendeerde vaste stoffen, de slibretentietijd, de slibbelasting en de bron, alsook over de eventuele voorafgaande blootstelling aan de teststof.
                              
                           
                        Variabiliteit van de resultaten
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 De variabiliteit en andere facetten van de biologischeafbraakkinetiek zijn besproken tijdens een recente SETAC-workshop (7). Dergelijke, gerapporteerde en geplande, studies moeten een duidelijker beeld opleveren van de kinetische processen in rioolwaterzuiveringsinstallaties, zodat bestaande gegevens beter kunnen worden geïnterpreteerd en de opzet van toekomstige testmethoden kan worden geoptimaliseerd.
                              
                           
                        LITERATUUR:
                     
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and Schultz B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339-353.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993). Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505-1510.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Water Quality — Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations in water.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996). Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851-864.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Berg UT and Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in semi-continuous activated sludge reactors with low (μg/l range) and standard (ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711-735.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegradability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, SG. Feitjel, T. King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4-6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
                              
                           
                  
                     C.10-B:   Biofilms
                  
                  INLEIDING
                  
                              1.
                           
                           
                              Simulatietests worden normaliter gebruikt voor stoffen die een screeningtest op gemakkelijke biologische afbreekbaarheid (hoofdstukken C.4 A tot en met F van deze bijlage (9)) niet doorstonden, maar wel een test op inherente biologische afbreekbaarheid. In uitzonderlijke gevallen worden simulatietests ook gebruikt voor stoffen waarover meer informatie nodig is, in het bijzonder stoffen die in grote hoeveelheden worden geproduceerd; doorgaans wordt de actiefslibtest (C.10-A) uitgevoerd. In bepaalde omstandigheden is echter specifieke informatie vereist over het gedrag van een stof bij rioolwaterzuiveringsmethoden waarbij gebruik wordt gemaakt van biofilms, namelijk percolatie- of druppelfilters, roterende biologische contactoren en wervelbedden. Er zijn verschillende installaties ontwikkeld om in deze behoefte te voorzien.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Gerike et al. (1) hebben gebruikgemaakt van grote druppelfilters op schaal, met gekoppelde eenheden. Die filters vergden veel ruimte en relatief grote hoeveelheden afvalwater of kunstmatig afvalwater. Truesdale et al. (2) beschreven kleinere filters (6 ft, diameter 6 inch), waarover surfactantvrij natuurlijk afvalwater werd geleid, maar ook daarvoor waren nog vrij grote volumes nodig. Het duurde maar liefst 14 weken voordat een „rijpe” biofilm was ontstaan en nadat de testsurfactant voor het eerst was toegevoegd, duurde het nog eens vier-acht weken voordat de acclimatisering was voltooid.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Baumann et al. (3) ontwikkelden een veel kleiner filter met strips van polyester („fleece”) die vooraf in actief slib waren ondergedompeld als inert medium dat de biofilm ondersteunde. De teststof werd als enige koolstofbron gebruikt en de biologische afbraak werd beoordeeld door meting van de opgeloste organische koolstof (DOC) in het influent en het effluent en op grond van de hoeveelheid CO2 in het uitgaande gas.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Een tamelijk verschillende aanpak volgden Gloyna et al. (4), die de roterende buisreactor uitvonden. Op het bekende binnenoppervlak van de roterende buis liet men een biofilm ontstaan door het influent van de bovenzijde in de buis te leiden, die een kleine hoek met het horizontale vlak maakte. De reactor is gebruikt om de biologische afbreekbaarheid van oppervlakteactieve stoffen te bestuderen (5) en om de optimale dikte van de biofilm en de diffusie door de film te onderzoeken (6). De auteurs hebben de reactor verder ontwikkeld en onder meer geschikt gemaakt voor de bepaling van CO2 in het uitgaande gas.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              De roterende buisreactor is door het Standing Committee of Analysts (Verenigd Koninkrijk) als standaardmethode overgenomen voor de beoordeling van zowel de biologische afbreekbaarheid van stoffen (7) als de behandelbaarheid en toxiciteit van afvalwater (8). De voordelen van de hier beschreven methode zijn gelegen in de eenvoud, compactheid, reproduceerbaarheid en het relatief kleine volume organisch medium dat nodig is.
                           
                        PRINCIPE VAN DE TEST
                  
                              6.
                           
                           
                              Op het binnenoppervlak van een traag roterende hellende buis wordt, vermengd of afzonderlijk, kunstmatig of huishoudelijk afvalwater en teststof aangebracht. Op het binnenoppervlak groeit een laag micro-organismen die lijkt op de laag die aanwezig is op biofiltermedia. De bedrijfsomstandigheden van de reactor worden zodanig gekozen dat voldoende eliminatie van organisch materiaal en, zo nodig, oxidatie van ammonium plaatsvinden.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Het effluent uit de buis wordt verzameld en bezonken en/of gefiltreerd alvorens te worden geanalyseerd op opgeloste organische koolstof (DOC) en/of de teststof met een specifieke methode. De controle-installaties die geen teststof ontvangen, worden ter vergelijking parallel gebruikt onder dezelfde omstandigheden. Het verschil tussen de DOC-concentraties in het effluent van de testinstallatie en de controle-installatie wordt toegeschreven aan de teststof en de organische metabolieten ervan. Dit verschil wordt met de concentratie van de toegevoegde teststof (als DOC) vergeleken om de eliminatie van de teststof te berekenen.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              De biologische afbraak kan normaliter van de biologische adsorptie worden onderscheiden door zorgvuldige bestudering van de eliminatie-tijdcurve. Bevestiging kan gewoonlijk worden verkregen door een test op gemakkelijke afbreekbaarheid (zuurstofopname of kooldioxideproductie) te verrichten op geacclimatiseerd entmateriaal dat aan het eind van de test wordt genomen uit de reactoren waarin de teststof is ingebracht.
                           
                        INFORMATIE OVER DE TESTSTOF
                  
                              9.
                           
                           
                              De zuiverheid, oplosbaarheid in water, vluchtigheid en adsorptie-eigenschappen van de teststof moeten bekend zijn om de resultaten goed te kunnen interpreteren.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Normaliter kunnen vluchtige en slecht oplosbare stoffen niet worden getest, tenzij er speciale voorzorgsmaatregelen worden genomen (zie aanhangsel 5 van hoofdstuk C.10-A). Ook de chemische structuur, of ten minste de molecuulformule, moet bekend zijn om theoretische waarden te kunnen berekenen en/of de gemeten waarden van parameters te kunnen controleren (bv. theoretisch zuurstofverbruik (ThOD) en DOC).
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Informatie over de giftigheid van de teststof voor micro-organismen (zie aanhangsel 4 van hoofdstuk C.10-A) kan nuttig zijn voor het kiezen van de juiste testconcentraties en kan essentieel zijn voor een juiste interpretatie van lage waarden voor de biologische afbraak.
                           
                        NIVEAUS WAARBIJ DE TEST WORDT DOORSTAAN
                  
                              12.
                           
                           
                              Aanvankelijk moest de primaire biologische afbraak van oppervlakteactieve stoffen ten minste 80 % bedragen om de stof in de handel te mogen brengen. Als de waarde van 80 % niet wordt gehaald, kan deze (bevestigende) simulatietest worden uitgevoerd en mag de oppervlakteactieve stof alleen worden verhandeld als meer dan 90 % van de specifieke stof wordt verwijderd. Voor stoffen in het algemeen is er geen sprake van een niveau waarbij de test al dan wordt doorstaan en kan het verwijderingspercentage worden gebruikt in berekeningen voor de schatting van de waarschijnlijke milieuconcentratie die voor de beoordeling van de gevaren van stoffen wordt gebruikt. In een aantal studies van zuivere stoffen die een significante mate van biologische afbreekbaarheid vertoonden, bedroeg het gevonden DOC-verwijderingspercentage voor meer dan drie kwart van de stoffen > 90 % en voor meer dan 90 % van de stoffen > 80 %.
                           
                        REFERENTIESTOFFEN
                  
                              13.
                           
                           
                              Om te waarborgen dat de experimentele procedure correct wordt uitgevoerd, kan het soms nuttig zijn referentiestoffen te testen waarvan het gedrag bekend is. Daarbij kan het gaan om stoffen als adipinezuur, 2-fenylfenol, 1-naftol, difenylzuur en 1-naftoëzuur.
                           
                        REPRODUCEERBAARHEID VAN TESTRESULTATEN
                  
                              14.
                           
                           
                              Door een laboratorium in het Verenigd Koninkrijk is de relatieve standaardafwijking binnen tests vastgesteld op 3,5 % en die tussen tests op 5 % (7).
                           
                        BESCHRIJVING VAN DE METHODE
                  
                     Apparatuur
                  
                  
                     Roterende buisreactoren
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              De apparatuur bestaat uit een metalen draagconstructie met een rij buizen van acryl met een lengte van 30,5 cm en een binnendiameter van 5 cm, rustend op met rubber beklede wieltjes (zie de figuren 1 en 2 in aanhangsel 8). Elke buis heeft aan de buitenzijde een ongeveer 0,5 cm diepe inkeping om haar op de wieltjes te houden en een met grove staalwol geruwd binnenoppervlak waarin aan de bovenzijde (inlaat) een 0,5 cm diepe flens is aangebracht om de ingebrachte vloeistof tegen te houden. De buizen maken een hoek van ongeveer 1 graad met het horizontale vlak teneinde de vereiste contacttijd te verkrijgen bij aanbrenging van het testmedium in een schone buis. De met rubber beklede wieltjes worden aangedreven door een langzaam draaiende motor met variabel toerental. De temperatuur van de buizen wordt geregeld door de apparatuur in een kamer met constante temperatuur te plaatsen.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Het uitgaande CO2-gas kan, om later te worden gemeten, in een alkalische oplossing worden opgevangen door elke buisreactor in een iets grotere, afgesloten buis te plaatsen en te zorgen voor gasdichte verbindingen (6).
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Voor elke buis wordt in een opslagvat (A) van 20 l voldoende organisch medium, waaraan zo nodig teststof is toegevoegd, voor 24 uur aangebracht (zie figuur 2). Zo nodig kan de teststofoplossing afzonderlijk worden ingebracht. Nabij de bodem van elk opslagvat bevindt zich een uitlaat die met geschikte leidingen (bv. van siliconenrubber) via een peristaltische pomp (B) verbonden is met een toevoerbuis van glas of acryl, die 2-4 cm in de bovenzijde (inlaat) van de hellende buis (C) steekt. Het effluent druppelt uit de onderzijde van de hellende buis en wordt opgevangen in een ander opslagvat (D). Het effluent wordt vóór analyse bezonken of gefiltreerd.
                           
                        
                     Filtreerapparaat of centrifuge
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Apparaat voor het filtreren van monsters over membraanfilters met een geschikte porositeit (nominale openingsdiameter 0,45 μm) die organische stoffen adsorberen of zo min mogelijk organische koolstof vrij laten komen. Als filters worden gebruikt die organische koolstof vrij laten komen, worden zij zorgvuldig met warm water gewassen om uitloogbare organische koolstof te verwijderen. Bij wijze van alternatief kan een centrifuge worden gebruikt die een versnelling van 40 000 m/s2 kan produceren.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Analyseapparatuur voor het bepalen van:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          DOC/totale organische koolstof (TOC), of chemisch zuurstofverbruik (CZV);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de specifieke stof, zo nodig (HPLC, GC enz.);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pH, temperatuur, zuurgraad en alkaliteit;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          ammonium, nitriet en nitraat, als de tests worden uitgevoerd onder omstandigheden waarin nitrificatie mogelijk is.
                                       
                                    
                        
                     Water
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Kraanwater met een DOC-gehalte van minder dan 3 mg/l.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Gedestilleerd of gedeïoniseerd water met een DOC-gehalte van minder dan 2 mg/l.
                           
                        
                     Organisch medium
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Als organisch medium mag kunstmatig afvalwater, huishoudelijk afvalwater of een mengsel van beide soorten afvalwater worden gebruikt. Gebleken is dat het gebruik van huishoudelijk afvalwater alleen veelal een hoger percentage DOC-verwijdering oplevert (in actiefslibinstallaties) en dat daarin zelfs bepaalde stoffen biologisch afgebroken kunnen worden die bij gebruik van kunstmatig OESO-afvalwater niet afbreken. Daarom wordt het gebruik van huishoudelijk afvalwater aanbevolen. Meet de DOC- (of CZV-)concentratie in elke nieuwe partij van het organische medium. De zuurgraad of alkaliteit van het organische medium moet bekend zijn. Als het medium een lage zuurgraad of alkaliteit heeft, kan het nodig zijn een geschikte bufferoplossing (natriumwaterstofcarbonaat of kaliumwaterstoffosfaat) toe te voegen om tijdens de test in de reactor een pH-waarde van ongeveer 7,5 ± 0,5 te behouden. In elk afzonderlijk geval moet worden besloten hoeveel en op welk moment een bufferoplossing wordt toegevoegd.
                           
                        
                     Kunstmatig afvalwater
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Per liter leidingwater worden opgelost: pepton, 160 mg; vleesextract, 110 mg; ureum, 30 mg; watervrij dikaliumwaterstoffosfaat (K2HPO4), 28 mg; natriumchloride (NaCl), 7 mg; calciumchloridedihydraat (CaCl2.2H2O), 4 mg; magnesiumsulfaatheptahydraat (MgSO4.7H2O), 2 mg. Dit kunstmatig OESO-afvalwater is een voorbeeld en geeft een gemiddelde DOC-concentratie in het influent van ongeveer 100 mg/l. Bij wijze van alternatief mogen ook andere samenstellingen worden gebruikt die ongeveer dezelfde DOC-concentraties opleveren en het feitelijke afvalwater beter benaderen. Dit kunstmatige afvalwater mag in geconcentreerde vorm van gedistilleerd water worden bereid en ten hoogste één week worden bewaard bij ongeveer 1 °C. Zo nodig wordt het met kraanwater verdund. (Dit medium is onbevredigend, bijvoorbeeld omdat het stikstofgehalte zeer hoog is en het koolstofgehalte relatief laag, maar er is nog geen beter voorstel gedaan, afgezien van de toevoeging van meer fosfaat als buffer en extra pepton).
                           
                        
                     Huishoudelijk afvalwater
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Gebruik vers bezonken rioolwater dat dagelijks wordt verzameld uit een rioolwaterzuiveringsinstallatie die hoofdzakelijk huishoudelijk afvalwater ontvangt. Het wordt verzameld uit het overloopkanaal van de primaire bezinkingstank of uit de inlaat van de actiefslibinstallatie en moet grotendeels vrij zijn van grove deeltjes. Het rioolwater kan worden gebruikt na enige dagen bij ongeveer 4 °C te zijn bewaard, mits aangetoond wordt dat tijdens de opslag de DOC- (of CZV-)waarde niet significant (met minder dan 20 %) is gedaald. Om verstoringen van het systeem te voorkomen, moet de DOC (of het CZV) van elke nieuwe partij voor gebruik op een passende constante waarde worden gebracht, bijvoorbeeld door verdunning met kraanwater.
                           
                        
                     Smeermiddel
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              De rollen van de peristaltische pomp kunnen worden gesmeerd met glycerol of olijfolie: beide smeermiddelen zijn geschikt voor gebruik bij leidingen van siliconenrubber.
                           
                        
                     Stamoplossingen van de teststof
                  
                  
                              26.
                           
                           
                              Bereid voor stoffen die voldoende oplosbaar zijn, stamoplossingen in een geschikte concentratie (bv. 1 tot 5 g/l) in gedeïoniseerd water of in de minerale fractie van het kunstmatig afvalwater. Zie aanhangsel 5 van hoofdstuk C.10-A voor onoplosbare stoffen. Zonder modificatie van de buisreactoren (punt 16) is deze methode niet geschikt voor vluchtige stoffen. Bepaal de DOC en TOC van de stamoplossing en herhaal de metingen voor elke nieuwe partij. Controleer, als het verschil tussen de DOC en de TOC groter is dan 20 %, de oplosbaarheid in water van de teststof. Vergelijk de DOC of de met een specifieke analyse van de stamoplossing bepaalde concentratie van de teststof met de nominale waarde om vast te stellen of de recovery toereikend is (normaliter kan een waarde van > 90 % worden verwacht). Bepaal, in het bijzonder voor dispersies, of al dan niet gebruik kan worden gemaakt van de DOC als analytische parameter, dan wel of alleen een specifieke analysetechniek voor de teststof kan worden gebruikt. Monsters van dispersies moeten worden gecentrifugeerd. Voor elke nieuwe partij wordt de DOC of het CZV gemeten, dan wel de teststof met een specifieke analyse.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Bepaal de pH van de stamoplossing. Extreme waarden wijzen erop dat de toevoeging van de stof van invloed kan zijn op de pH van het actief slib in het testsysteem. Neutraliseer in dat geval de stamoplossing met kleine hoeveelheden van een anorganisch zuur of een anorganische base om een pH van 7 ± 0,5 te verkrijgen, maar let erop dat de teststof niet neerslaat.
                           
                        PROCEDURE
                  
                     Bereiding van het organische medium voor dosering
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Zorg ervoor dat alle houders voor het influent en het effluent en de slangen vanuit de influentvaten en naar de effluentvaten grondig zijn gereinigd om microbiële groei voorafgaand en gedurende de test te voorkomen.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Bereid het kunstmatige afvalwater (punt 23) elke dag vers uit de vaste stoffen of uit de geconcentreerde stamoplossing door voldoende verdunning met kraanwater. Meet in een cilinder de vereiste hoeveelheid af en voeg deze toe aan een schoon influentvat. Voeg zo nodig vóór verdunning tevens de vereiste hoeveelheid stamoplossing van de teststof of referentiestof aan het kunstmatige afvalwater toe. Bereid, als dit praktischer is of noodzakelijk is om verlies van de teststof te vermijden, een afzonderlijke verdunde oplossing van de teststof in een afzonderlijk reservoir en leid deze via een andere doseerpomp in de hellende buizen.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Als alternatief (en bij voorkeur) kan ook bezonken huishoudelijk afvalwater (punt 24) worden gebruikt, dat zo mogelijk elke dag vers wordt verzameld.
                           
                        
                     Werking van roterende buisreactoren
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Voor de beoordeling van één teststof zijn twee identieke buisreactoren nodig, die in een kamer met constante temperatuur (gewoonlijk 22 ± 2 °C) zijn geplaatst.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Stel de peristaltische pompen zo in dat per uur 250 ± 25 ml organisch medium (zonder teststof) wordt ingebracht in de hellende buizen, die met 18 ± 2 tpm ronddraaien. Breng het smeermiddel (punt 25) van tevoren en tijdens de test periodiek op de leidingen van de pomp aan om de pomp goed te laten werken en de levensduur van de leidingen te verlengen.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Stel de hellingshoek van de buizen zo in dat de verblijfsduur van de ingebrachte vloeistof in een schone buis 125 ± 12,5 s bedraagt. Schat de retentietijd door een niet-biologische markerstof (bv. NaCl, inerte kleurstof) aan de ingebrachte vloeistof toe te voegen; de tijd die nodig is voor het bereiken van de piekconcentratie in het effluent geldt als de gemiddelde retentietijd (wanneer de maximale film aanwezig is, kan de retentietijd tot ongeveer 30 minuten toenemen).
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Gebleken is dat bij deze snelheden, toerentallen en tijdsduren voldoende DOC- (of CZV-)eliminatie plaatsvindt en genitrificeerde effluenten worden geproduceerd. Als onvoldoende eliminatie plaatsvindt of als de prestaties van een bepaalde zuiveringsinstallatie moeten worden nagebootst, moet het debiet worden aangepast. In het laatste geval wordt de doseersnelheid van het organische medium aangepast totdat de prestaties van de reactor overeenkomen met die van de zuiveringsinstallatie.
                           
                        
                     Enten
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Wanneer kunstmatig afvalwater wordt gebruikt, kan beënting via de lucht volstaan om de groei van micro-organismen op gang te brengen; zo niet, voeg dan gedurende drie dagen per liter 1 ml bezonken slib toe aan de ingebrachte vloeistof.
                           
                        
                     Metingen
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Controleer met regelmatige intervallen of de doseer- en omwentelingssnelheden binnen het voorgeschreven bereik liggen. Meet ook de pH van het effluent, zeker wanneer nitrificatie wordt verwacht.
                           
                        
                     Bemonstering en analyse
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              De methode, het patroon en de frequentie van de bemonstering worden op het doel van de test afgestemd. Neem bijvoorbeeld steek- of grijpmonsters van het influent en het effluent, of verzamel monsters over een langere periode, bv. 3-6 uur. Neem in de eerste periode, zonder teststof, twee keer per week monsters. Filtreer de monsters over membranen of centrifugeer de monsters gedurende circa 15 minuten bij 40 000 m/s2 (punt 18). Het kan noodzakelijk zijn de monsters vóór membraanfiltratie te laten bezinken en/of over een grof filter te leiden. Bepaal de DOC (of het CZV) ten minste in duplo en zo nodig het BZV, ammonium en nitriet/nitraat.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Alle analysen moeten zo spoedig mogelijk na verzameling en bereiding van de monsters worden verricht. Als analysen moeten worden uitgesteld, worden de monsters in het donker bij ongeveer 4 °C bewaard in volle, goed afgesloten flessen. Als de monsters langer dan 48 uur moeten worden bewaard, worden zij geconserveerd door invriezen, zuurbehandeling of toevoeging van een geschikte toxische stof (bv. 20 ml/l van een kwik(II)chloride-oplossing van 10 g/l). De conserveertechniek mag de resultaten van de analyse niet beïnvloeden.
                           
                        
                     Aanloopperiode
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              In deze periode groeit de biofilm aan het oppervlak tot een optimale dikte; dit duurt doorgaans ongeveer twee weken en mag niet langer dan zes weken duren. De DOC- (of CZV-)verwijdering (punt 44) neemt toe en bereikt een plateauwaarde. Wanneer in beide buizen het plateau is bereikt bij een vergelijkbare waarde, wordt een van de buizen gekozen om als controlereactor te fungeren gedurende de rest van de test, waarbij de prestaties van beide buizen consistent moeten blijven.
                           
                        
                     Inbrengen van de teststof
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Voeg in dit stadium de teststof in de vereiste concentratie (gewoonlijk 10-20 mg C/l) toe aan de andere reactor. De controlereactor ontvangt alleen het organische medium.
                           
                        
                     Acclimatiseringsperiode
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Zet de DOC- (of CZV-)analysen twee keer per week voort en meet als de primaire biologische afbreekbaarheid moet worden beoordeeld tevens de concentratie van de teststof met een specifieke analyse. Laat nadat de teststof voor het eerst is ingebracht acclimatisatie optreden in één tot zes weken (of in bijzondere omstandigheden langer). Wanneer de procentuele verwijdering (punten 43-45) een maximale waarde heeft bereikt, moeten in de plateaufase binnen ongeveer drie weken 12-15 geldige waarden worden verkregen om de gemiddelde procentuele verwijdering te bepalen. De test wordt geacht te zijn voltooid als een voldoende hoog eliminatiepercentage is bereikt. De test mag normaliter na de eerste toevoeging van de teststof niet langer dan twaalf weken duren.
                           
                        
                     Loslatende film
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Met betrekkelijk regelmatige intervallen laten plotseling grote hoeveelheden overtollige film los in de buizen. Om te zorgen voor vergelijkbare resultaten, moeten de tests ten minste twee volledige cycli omvatten waarbij de film groeit en loslaat.
                           
                        GEGEVENS EN RAPPORTAGE
                  
                     Verwerking van de resultaten
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Bereken met de volgende vergelijking de procentuele DOC- of (CZV-)eliminatie van de teststof voor elk beoordelingsmoment:
                              
                                 
                              waarbij
                              
                                          Dt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          procentuele DOC- (of CZV)-eliminatie op tijdstip t;
                                       
                                    
                                          Cs
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          aan de teststof toegeschreven concentratie DOC (of CZV) in het influent, bij voorkeur geschat aan de hand van de concentratie in en het toegevoegde volume van de stamoplossing (mg/l);
                                       
                                    
                                          E
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          gemeten DOC of (CZV) in het testeffluent op tijdstip t (mg/l);
                                       
                                    
                                          Eo
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          gemeten DOC of (CZV) in het controle-effluent op tijdstip t (mg/l).
                                       
                                    Herhaal de berekening voor de referentiestof, indien getest.
                           
                        
                     Prestaties van de controlereactor
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              De mate van DOC- (of CZV-)eliminatie (DB) van het organische medium in de controlereactoren is informatie die nuttig is voor de beoordeling van de biologische afbraakactiviteit van de biofilm tijdens de test. Bereken de procentuele eliminatie met de volgende vergelijking:
                              
                                 
                              waarbij
                              Cm= DOC (of CZV) van het organische medium in het controle-influent (mg/l).
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Bereken, als de teststof met een specifieke analysemethode wordt gemeten, voor elk meettijdstip de verwijdering (DST) van de teststof met de volgende vergelijking:
                              
                                 
                              waarbij
                              
                                          Si
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          gemeten of, bij voorkeur, geschatte concentratie van de teststof in het testinfluent (mg/l);
                                       
                                    
                                          Se
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          gemeten concentratie van de teststof in het testeffluent op tijdstip t (mg/l).
                                       
                                    Bereken, als de analysemethode een positieve waarde in ongewijzigd afvalwater oplevert die overeenkomt met S
                                    c
                                  mg/l, de procentuele verwijdering (DSC) als volgt:
                              
                                 
                           
                        
                     Uitdrukking van de testresultaten
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Zet de procentuele eliminatie Dt en DST (of DSC), indien beschikbaar, uit tegen de tijd (zie aanhangsel 2 van hoofdstuk C.10-A). Neem het gemiddelde (afgerond op het dichtstbijzijnde gehele getal) en de standaardafwijking van de in de plateaufase verkregen 12-15 waarden voor DT (en DST, indien beschikbaar) als de procentuele verwijdering van de teststof. Uit de vorm van de eliminatiecurve kunnen enkele conclusies over het eliminatieproces worden afgeleid.
                           
                        
                     Adsorptie
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Als aan het begin van de test een grote mate van DOC-eliminatie van de teststof wordt waargenomen, wordt de teststof waarschijnlijk geëlimineerd door adsorptie aan de biofilm. Dit kan worden aangetoond door de geadsorbeerde teststof te bepalen in de vaste stoffen die van de film zijn losgekomen. Het is niet gebruikelijk dat gedurende de hele test een hoge mate van DOC-eliminatie van adsorbeerbare stoffen plaatsvindt; normaliter is de mate van verwijdering in eerste instantie groot, waarna geleidelijk een evenwichtswaarde wordt bereikt. Als de geadsorbeerde teststof echter kan zorgen voor acclimatisering van de microbiële populatie, neemt de DOC-eliminatie van de teststof vervolgens toe en wordt een hoge plateauwaarde bereikt.
                           
                        
                     Aanloopfase
                  
                  
                              48.
                           
                           
                              Net als in statische screeningtests hebben veel teststoffen een aanloopfase nodig voordat volledige biologische afbraak plaatsvindt. In de aanloopfase vindt acclimatisering (of aanpassing) van de werkzame bacteriën plaats en wordt de teststof nagenoeg niet verwijderd; vervolgens gaan deze bacteriën groeien. Het einde van deze fase is arbitrair vastgesteld op het moment waarop ongeveer 10 % van de initiële hoeveelheid teststof is verwijderd (nadat eventuele adsorptie heeft kunnen plaatsvinden); op dat moment begint de afbraakfase. De aanloopfase is vaak zeer variabel en slecht reproduceerbaar.
                           
                        
                     Plateaufase
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              In een continue test is de plateaufase van een eliminatiecurve de fase waarin de maximale afbraak plaatsvindt. Deze fase moet ten minste drie weken duren en omvat ongeveer 12-15 geldige gemeten waarden.
                           
                        
                     Gemiddeld eliminatiepercentage van de teststof
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Bereken het gemiddelde van de eliminatiewaarden Dt (en DST, indien beschikbaar) van de teststof in de plateaufase. Rond de gevonden waarde af op het dichtstbijzijnde gehele getal (1 %); dit is het eliminatiepercentage van de teststof. Aanbevolen wordt tevens het 95 %-betrouwbaarheidsinterval van de gemiddelde waarde te berekenen. Bereken op soortgelijke wijze het gemiddelde eliminatiepercentage (DB) van het organische medium in het controlevat.
                           
                        
                     Aanduiding van biologische afbraak
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Als de teststof niet significant aan de biofilm adsorbeert en de eliminatiecurve een vorm heeft die typerend is voor biologische afbraak met aanloopfase, afbraakfase en plateaufase (punten 48 en 49), kan de gemeten eliminatie zonder meer aan biologische afbraak worden toegeschreven. Als een grote mate van initiële verwijdering heeft plaatsgevonden, kan in de simulatietest geen onderscheid worden gemaakt tussen biologische en niet-biologische eliminatieprocessen. In dergelijke gevallen, alsook in andere gevallen waarin getwijfeld wordt over de biologische afbraak (bv. als wordt gestript), moeten monsters van de film op de geadsorbeerde teststof worden geanalyseerd of aanvullende statische (screening)tests op biologische afbreekbaarheid worden verricht voor parameters die duidelijk op biologische processen wijzen. Dergelijke tests zijn de methoden voor zuurstofopname (hoofdstuk C.4 van deze bijlage D, E en F) (9) en een test die de CO2-productie meet (hoofdstuk C.4-C van deze bijlage of de gasruimteproef) (10); gebruik als entmateriaal van tevoren blootgestelde biofilm uit de juiste reactor.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Als de verwijdering van zowel de DOC als de specifieke stof is gemeten, wijzen significante verschillen tussen beide verwijderingspercentages (waarbij het eerste lager is dan het tweede) op de aanwezigheid van organische tussenproducten in de effluenten, die moeilijker afbreekbaar kunnen zijn; deze moeten worden onderzocht.
                           
                        
                     Geldigheid van testresultaten
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              De test wordt geldig geacht als de mate van DOC- (of CZV-)eliminatie (DB) in de controle-installaties na twee weken bedrijfstijd > 80 % is en geen ongebruikelijke waarnemingen zijn gedaan.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Als een gemakkelijk afbreekbare (referentie)stof is getest, moet de mate van biologische afbraak > 90 % zijn en mag het verschil tussen duplowaarden niet meer dan 5 % bedragen. Als niet aan deze twee criteria wordt voldaan, moeten de procedures van de proef opnieuw worden bekeken en/of moet huishoudelijk afvalwater uit een andere bron worden verkregen.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Indien een teststof in duplo-installaties wordt behandeld, mag ook het verschil tussen de waarden voor biologische afbraak van die installaties niet meer dan 5 % bedragen. Als niet aan dit criterium wordt voldaan, maar de verwijdering hoog is, wordt de analyse gedurende nog eens drie weken voortgezet. Als de verwijdering laag is, worden de inhibitoire effecten van de teststof onderzocht (indien niet bekend) en wordt de test indien mogelijk herhaald met een lagere concentratie teststof.
                           
                        
                     Testverslag
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden opgenomen:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Teststof:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identificatiegegevens;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fysische toestand en, indien relevant, fysisch-chemische kenmerken.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testomstandigheden:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      eventuele wijzigingen van het testsysteem, in het bijzonder indien onoplosbare of vluchtige stoffen worden getest;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      soort organisch medium;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      indien gebruikt en indien bekend, percentage en aard van industrieel afvalwater dat in het rioolwater aanwezig is;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      beëntingsmethode;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stamoplossing van de teststof — gehalte aan DOC (opgeloste organische koolstof) en TOC (totale organische koolstof); bij suspensies: wijze van bereiding; gebruikte testconcentratie(s), met motivering indien afwijkend van het bereik 10-20 mg/l DOC; toevoegingsmethode; datum van eerste toevoeging; eventuele wijzigingen van de concentratie;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gemiddelde hydraulische retentietijd (zonder groei); omwentelingssnelheid van de buis; benadering van de hellingshoek, indien mogelijk;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gegevens over loslaten film; tijd en intensiteit;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      testtemperatuur en bereik;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toegepaste analysetechnieken.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testresultaten:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      alle gemeten gegevens van DOC, CZV, specifieke analysen, pH, temperatuur, stikstofverbindingen, indien relevant;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      alle berekende gegevens van Dt (of Dtc), DB en Ds in de vorm van tabellen en eliminatiecurven;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informatie over de aanloop- en plateaufase, de duur van de test, het eliminatiepercentage van de teststof en de referentiestof (indien getest) en van het organische medium (in de controle-installatie), met statistische informatie en verklaringen betreffende de biologische afbraak en de geldigheid van de test;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een bespreking van de resultaten.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATUUR:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. Res. 14: 753-758.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material. Wat. Waste Tr. J. 7: 441-444.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF — Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214-220.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355-1357.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional trickling filter. JAOCS 43: 92-94.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865-881.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, London.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Hoofdstuk C.4 van deze bijlage, Bepaling van de „gemakkelijke” biologische afbreekbaarheid A-F.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              ISO 14593 (1998). Water Quality-Evaluation in an aqueous medium of the ultimate biodegradability of organic substances. Method by analysis of released inorganic carbon in sealed vessels.
                           
                        
                     Aanhangsel 8
                     
                        Figuur 1
                     
                     
                        Roterende buizen
                     
                     
                        
                     
                        Legenda:
                     
                     Bovenaanzicht
                     Aanzicht A/B
                     Aangedreven wieltjes
                     Niet-aangedreven wieltjes
                     Aandrijfmotor
                     Vertragingsmechanisme
                     Binnenflens
                     Hellingsmechanisme
                     Kegelwielendrijfwerk
                     
                        Figuur 2
                     
                     
                        Stroomdiagram
                     
                     
                        
                     A: Opslagvat
                     B: Peristaltische pomp
                     C: Roterende buis
                     D: Opslagvat effluent
                     
                        DEFINITIES:
                     
                     Teststof: alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.
                     (Chemische) stof: „Er zij op gewezen dat het begrip „(chemische) stof” in de UNCED-overeenkomsten en nadere documenten een ruime betekenis heeft en betrekking heeft op zowel stoffen, producten, mengsels, preparaten als andere begrippen waarmee de betrokken stoffen in de bestaande systemen kunnen worden aangeduid.”..
                  ”
            
                  10)
               
               
                  De volgende hoofdstukken C.27, C.28, C.29 en C.30 worden toegevoegd:
                  „C.27   TEST TER BEPALING VAN DE TOXICITEIT VOOR CHIRONOMIDEA IN SEDIMENT EN WATER M.B.V. VERRIJKT SEDIMENT
                  
                  INLEIDING
                  
                              1.
                           
                           
                              Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 218 (2004) van de OESO (TG 218). Deze testmethode is bedoeld om de effecten te bepalen van langdurige blootstelling van in het sediment levende larven van tweevleugelige zoetwaterinsecten van Chironomus sp. aan stoffen. De methode is gebaseerd op bestaande toxiciteitstestprotocollen voor Chironomus riparius en Chironomus tentans die in Europa (1)(2)(3) en Noord-Amerika (4)(5)(6)(7)(8) zijn ontwikkeld en aan een ringonderzoek zijn onderworpen (1)(6)(9). Er kunnen ook andere goed gedocumenteerde Chironomidae worden gebruikt, bijvoorbeeld Chironomus yoshimatsui (10)(11).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Bij het in deze testmethode gebruikte blootstellingsscenario wordt het sediment met de teststof verrijkt. De selectie van het juiste blootstellingsscenario hangt af van het beoogde doel van de test. Het scenario waarbij sediment wordt verrijkt, dient om accumulatie van persistente stoffen in het sediment na te bootsen. Bij dit blootstellingssysteem wordt het sediment van een testsysteem van sediment en water verrijkt.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              De stoffen die moeten worden getest voor in het sediment levende organismen zijn gewoonlijk gedurende lange tijd persistent in dit compartiment. De in het sediment levende organismen kunnen via een aantal routes worden blootgesteld. Het relatieve belang van elke blootstellingsroute en de tijd die voor de bijdrage aan de algehele toxische effecten via elke route wordt genomen, hangen af van de fysisch-chemische eigenschappen van de betrokken stof. Voor sterk adsorberende stoffen (bijvoorbeeld met log Kow > 5) of voor stoffen die een covalente binding met het sediment aangaan, kan ingestie van besmet voedsel een belangrijke blootstellingsroute zijn. Om de toxiciteit van zeer lipofiele stoffen niet te onderschatten, kan worden overwogen vóór aanbrenging van de teststof voedsel aan het sediment toe te voegen. Om rekening te houden met alle mogelijke blootstellingsroutes, ligt de nadruk bij deze testmethode op langdurige blootstelling. De testduur bedraagt 20-28 dagen voor C. riparius en C. yoshimatsui, en 28-65 dagen voor C. tentans. Als voor een specifiek doel, bijvoorbeeld om de effecten van een onstabiele stof te onderzoeken, kortetermijngegevens vereist zijn, kunnen na een periode van tien dagen aanvullende duplo’s worden verwijderd.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              De gemeten eindpunten zijn het totale aantal tot adult ontwikkelde dieren en de hiervoor benodigde tijd. Als aanvullende kortetermijngegevens vereist zijn, wordt aanbevolen de overleving en de groei van de larven pas te meten na een periode van tien dagen en zo nodig aanvullende duplo’s te gebruiken.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Het gebruik van kunstmatig sediment wordt aanbevolen. Kunstmatig sediment heeft verschillende voordelen ten opzichte van natuurlijke sedimenten:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          de experimentele variabiliteit wordt beperkt omdat het een reproduceerbare „genormaliseerde matrix” vormt en niet gezocht hoeft te worden naar niet-besmette schone sedimentbronnen;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het testsediment kent geen seizoensveranderingen en op ieder moment kunnen tests worden gestart; het sediment hoeft niet te worden voorbehandeld om inheemse fauna te verwijderen; het gebruik van kunstmatig sediment beperkt ook de kosten aangezien geen sediment in het veld hoeft te worden verzameld voor routinetests;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          door het gebruik van kunstmatig sediment is de toxiciteit van stoffen vergelijkbaar en kunnen stoffen dienovereenkomstig worden gerangschikt.
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1.
                           
                        PRINCIPE VAN DE TEST
                  
                              7.
                           
                           
                              Larven in het eerste stadium van Chironomidae worden in sediment-watersystemen aan een concentratiebereik van de teststof blootgesteld. Het sediment wordt met de teststof verrijkt, waarna larven in het eerste stadium aan de gestabiliseerde concentraties sediment en water in de testglazen worden toegevoegd. Aan het eind van de test worden het uitkomstquotiënt en het ontwikkelingstempo van Chironomidae gemeten. Zo nodig kunnen tevens na tien dagen de overleving en het gewicht van de larven worden bepaald (hiervoor kunnen zo nodig aanvullende duplo’s worden gebruikt). Deze gegevens worden geanalyseerd door hetzij met een regressiemodel een schatting te maken van de concentratie die zou leiden tot een afname van het uitkomen, de overleving of de groei van larven met × % (bv. EC15, EC50 enz.), hetzij een statistische hypothese te toetsen om een NOEC/LOEC te bepalen. In het laatste geval worden de effectwaarden door middel van statistische toetsen met controlewaarden vergeleken.
                           
                        GEGEVENS OVER DE TESTSTOF
                  
                              8.
                           
                           
                              De oplosbaarheid in water van de teststof, de dampspanning ervan, de gemeten of berekende verdeling in sediment en de stabiliteit in water en sediment moeten bekend zijn. Er moet een betrouwbare analysemethode, met een bekende en gerapporteerde nauwkeurigheid en detectiegrens, beschikbaar zijn voor de kwantitatieve bepaling van de teststof in bovenliggend water, poriewater en sediment. Andere nuttige informatie zijn de structuurformule en de zuiverheid van de teststof. Ook het uiteindelijke chemische lot van de teststof (bv. dissipatie, niet-biologische en biologische afbraak enz.) is nuttige informatie. Nadere richtsnoeren voor het testen van stoffen met zodanige fysisch-chemische eigenschappen dat de uitvoering van de test problematisch is, zijn in (12) opgenomen.
                           
                        REFERENTIESTOFFEN
                  
                              9.
                           
                           
                              Er kunnen regelmatig tests met referentiestoffen worden uitgevoerd om de betrouwbaarheid van het testprotocol en de testomstandigheden te waarborgen. Voorbeelden van toxische referentiestoffen die met succes in ringonderzoek en valideringsstudies zijn gebruikt, zijn: lindaan, trifluralin, pentachloorfenol, cadmiumchloride en kaliumchloride (1)(2)(5)(6)(13).
                           
                        GELDIGHEID VAN DE TEST
                  
                              10.
                           
                           
                              De test is alleen geldig als aan de onderstaande voorwaarden wordt voldaan:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          het uitkomstpercentage in de controlegroepen moet aan het eind van de test ten minste 70 % zijn (1)(6);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de ontwikkeling tot adult van de in de controlevaten gestopte C. riparius en C. yoshimatsui moet binnen 12 tot 23 dagen plaatsvinden; voor C. tentans is een periode van 20 tot 65 dagen nodig;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          aan het eind van de test worden de pH en het gehalte aan opgeloste zuurstof in elk vat gemeten. Het zuurstofgehalte moet ten minste 60 % bedragen van de verzadigingswaarde van lucht (ASV) bij de heersende temperatuur en het bovenliggende water moet in alle testvaten een pH-waarde tussen 6 en 9 hebben;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de watertemperatuur mag niet met meer dan ± 1,0 °C afwijken. De watertemperatuur kan worden geregeld door een isotherme kamer te gebruiken; in dat geval wordt de kamertemperatuur met passende tussenpozen bevestigd.
                                       
                                    
                        BESCHRIJVING VAN DE METHODE
                  
                     Testvaten
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              De studie wordt uitgevoerd in bekerglazen met een inhoud van 600 ml en een diameter van 8 cm. Ook andere vaten kunnen geschikt zijn, mits zij voldoende diep zijn voor het bovenliggende water en het sediment. Het sedimentoppervlak moet ten minste 2 tot 3 cm2 per larve bedragen. De verhouding tussen de dikte van de sedimentlaag en de diepte van het bovenliggende water moet 1:4 zijn. Testvaten en andere apparatuur die in contact met het testsysteem komt, moeten volledig van glas of een ander chemisch inert materiaal zijn gemaakt (bv. teflon).
                           
                        
                     Keuze van de soorten
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Als testsoort heeft Chironomus riparius de voorkeur. Chironomus tentans is ook geschikt, maar is lastiger in het gebruik en vergt een lagere testperiode. Chironomus yoshimatsui mag ook worden gebruikt. Aanhangsel 2 bevat bijzonderheden over de kweekmethoden van Chironomus riparius. Er is ook informatie beschikbaar over de kweekomstandigheden van andere soorten, namelijk Chironomus tentans (4) en Chironomus yoshimatsui (11). Vóór de test moet de identificatie van de soorten worden bevestigd; als de organismen uit eigen kweek afkomstig zijn, is geen bevestiging voorafgaand aan iedere test nodig.
                           
                        
                     Sediment
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Er wordt bij voorkeur kunstmatig sediment gebruikt (ook wel bereid, gereconstitueerd of synthetisch sediment genoemd). Als echter natuurlijk sediment wordt gebruikt, moet dit worden gekarakteriseerd (ten minste pH en gehalte aan organische koolstof; bepaling van parameters als C/N-verhouding en korrelgrootteverdeling worden eveneens aanbevolen) en moet het vrij zijn van verontreinigingen en andere organismen die de Chironomidae zouden kunnen beconcurreren of consumeren. Ook wordt aanbevolen het natuurlijke sediment, voordat het in een test ter bepaling van de toxiciteit voor Chironomidae wordt gebruikt, zeven dagen te laten rusten onder dezelfde omstandigheden die ook in de test zullen heersen. Voor deze test wordt sediment aanbevolen dat op basis van de in testmethode C.8 (14) gebruikte kunstmatige grond als volgt is samengesteld (1)(15)(16):
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          4-5 % (drooggewicht) turf: de pH moet zo dicht mogelijk bij 5,5 tot 6,0 liggen; het is belangrijk dat fijngemalen turf in poedervorm (deeltjesgrootte ≤ 1 mm) wordt gebruikt dat alleen aan de lucht is gedroogd;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          20 % (drooggewicht) kaolienklei (met bij voorkeur meer dan 30 % kaoliniet);
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          75-76 % (drooggewicht) kwartszand (overwegend bestaande uit fijn zand; meer dan 50 % van de deeltjes moet een grootte tussen 50 en 200 μm hebben);
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          er wordt gedeïoniseerd water toegevoegd om het uiteindelijke mengsel een vochtgehalte van 30-50 % te geven;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          er wordt chemisch zuiver calciumcarbonaat (CaCO3) toegevoegd om het uiteindelijke sedimentmengsel een pH van 7,0 ± 0,5 te geven. Het gehalte aan organische koolstof van het uiteindelijke mengsel moet 2 % (± 0,5 %) bedragen en moet worden aangepast door toevoeging van extra turf en zand overeenkomstig a) en c).
                                       
                                    
                        
                              14.
                           
                           
                              De bron van de turf, de kaolienklei en het zand moet bekend zijn. De bestanddelen van het sediment moeten worden gecontroleerd op verontreiniging met chemische stoffen (bv. zware metalen, organische chloor- en fosforverbindingen enz.). In aanhangsel 3 wordt een voorbeeld gegeven van de bereiding van kunstmatig sediment. Menging van droge bestanddelen is ook aanvaardbaar, mits wordt aangetoond dat na toevoeging van het bovenliggende water geen scheiding van de bestanddelen van het sediment plaatsvindt (bv. door drijvende turfdeeltjes) en dat de turf of het sediment voldoende geconditioneerd is.
                           
                        
                     Water
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Elk water dat aan de in de aanhangsels 2 en 4 vermelde chemische eigenschappen van aanvaardbaar verdunningswater voldoet, is geschikt als testwater. Als kweek- en testwater is elk geschikt water, natuurlijk water (oppervlakte- of grondwater), synthetisch water (zie aanhangsel 2) of ontchloord kraanwater aanvaardbaar, mits de Chironomidae daarin gedurende het kweken en testen overleven zonder tekenen van stress te vertonen. Aan het begin van de test moet het testwater een pH-waarde tussen 6 en 9 hebben en mag de totale hardheid, uitgedrukt als CaCO3, niet hoger zijn dan 400 mg/l. Als echter een interactie tussen de hardheidsionen en de teststof wordt vermoed, moet water met een lagere hardheid worden gebruikt (en is Elendt-medium M4 dus ongeschikt). Voor de hele studie moet één soort water worden gebruikt. De in aanhangsel 4 vermelde kwaliteitskenmerken voor water moeten ten minste twee keer per jaar worden gemeten, of wanneer vermoed wordt dat een significante verandering heeft plaatsgevonden.
                           
                        
                     Stamoplossingen — Verrijkte sedimenten
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Verrijkte sedimenten worden gewoonlijk in de gekozen concentratie bereid door rechtstreeks een oplossing van de teststof aan het sediment toe te voegen. Een stamoplossing van de in gedeïoniseerd water opgeloste teststof wordt met het kunstmatige sediment gemengd met behulp van een wals of een voedermixer of door handmatig mengen. Indien de teststof slecht in water oplosbaar is, kan deze worden opgelost in een zo klein mogelijk volume van een geschikt organisch oplosmiddel (bv. hexaan, aceton of chloroform). Deze oplossing wordt vervolgens gemengd met 10 g fijn kwartszand per testvat. Laat het oplosmiddel verdampen, zodat het volledig uit het zand wordt verwijderd; vervolgens wordt het zand gemengd met een geschikte hoeveelheid sediment per testglas. Voor het oplossen, dispergeren of emulgeren van de teststof mogen alleen gemakkelijk verdampende oplosmiddelen worden gebruikt. Bij de bereiding van het sediment moet rekening worden gehouden met het zand dat in het mengsel van teststof en zand aanwezig is (het sediment wordt dus met minder zand bereid). De aan het sediment toegevoegde teststof moet zorgvuldig en gelijkmatig over het sediment worden verdeeld. Zo nodig kunnen deelmonsters worden geanalyseerd om de homogeniteit te bepalen.
                           
                        TESTOPZET
                  
                              17.
                           
                           
                              De testopzet heeft betrekking op het aantal testconcentraties en de factor waarmee ze van elkaar verschillen, het aantal vaten per concentratieniveau en het aantal larven per vat. Er wordt een beschrijving gegeven van testopzetten voor de puntschatting van de EC, de schatting van de NOEC en de uitvoering van een limiettest.
                           
                        
                     Opzet voor regressieanalyse
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              De in de test gebruikte concentraties moeten de effectconcentratie (bv. EC15 en EC50) en het concentratiebereik waarbinnen het effect van de teststof van belang is, omvatten. In het algemeen nemen de nauwkeurigheid en in het bijzonder de geldigheid van schattingen van de effectconcentraties (ECx) toe als de effectconcentratie binnen het geteste concentratiebereik ligt. Extrapolaties ver onder de laagste positieve concentratie of boven de hoogste concentraties moeten worden vermeden. Om het concentratiebereik te kiezen, kan een preliminaire bereikbepalingstest worden uitgevoerd (zie punt 27).
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Als een ECx-schatting moet worden gemaakt, worden ten minste vijf concentraties in triplo getest. In alle gevallen is het raadzaam bij voldoende concentraties te testen om een goede modelschatting mogelijk te maken. Het verschil tussen de concentraties mag niet meer dan factor 2 bedragen (als de dosis-responscurve een geringe helling vertoont, kan hiervan worden afgeweken). Het aantal duplo’s voor elke testgroep kan worden verlaagd wanneer het aantal testconcentraties met een verschillende respons wordt verhoogd. Als het aantal duplo’s wordt verhoogd of de intervallen tussen de testconcentraties worden verkleind, worden de betrouwbaarheidsintervallen van de test gewoonlijk kleiner. Als een schatting van de overleving en de groei van larven na tien dagen moet worden gemaakt, zijn aanvullende duplo’s vereist.
                           
                        
                     Opzet voor de schatting van een NOEC/LOEC
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Als een LOEC- of NOEC-schatting moet worden gemaakt, worden vijf concentraties getest met ten minste vier duplo’s en mag het verschil tussen de concentraties niet meer dan factor 2 bedragen. Het aantal duplo’s moet toereikend zijn om voldoende onderscheidend vermogen te waarborgen om een verschil van 20 % met de controlegroep te kunnen vaststellen bij een significantieniveau van 5 % (p = 0,05). Het ontwikkelingstempo kan gewoonlijk worden bepaald met een variantieanalyse (ANOVA), zoals de toets van Dunnett of Williams (17)(18)(19)(20). Voor het uitkomstquotiënt kan de toets van Cochran-Armitage, de exacte toets van Fisher (met correctie van Bonferroni) of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt.
                           
                        
                     Limiettest
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Als in de preliminaire bereikbepalingstest geen effecten zijn waargenomen, kan een limiettest worden uitgevoerd (één testconcentratie en controlegroep). Deze limiettest wordt uitgevoerd bij een concentratie die voldoende hoog is om de besluitvormers in staat te stellen mogelijke toxische effecten van de teststof uit te sluiten; deze concentratie wordt vastgesteld op een niveau dat zich naar verwachting in geen enkele situatie zal voordoen. Een concentratie van 1 000 mg/kg (drooggewicht) wordt aanbevolen. Gewoonlijk zijn zes duplo’s voor zowel de testgroep als de controlegroep nodig. Aangetoond moet worden dat het onderscheidend vermogen groot genoeg is om een verschil van 20 % met de controlegroep te kunnen vaststellen bij een significantieniveau van 5 % (p = 0,05). Voor de meetrespons (ontwikkelingstempo en gewicht) is de T-toets een geschikte statistische methode, mits de gegevens aan de voorwaarden van deze toets voldoen (normale verdeling, homogene variantie). Als niet aan die voorwaarden wordt voldaan, kan de T-toets voor ongelijke variantie of een verdelingsvrije toets, zoals de Wilcoxon-Mann-Whitney-toets, worden gebruikt. Voor het uitkomstquotiënt is de exacte toets van Fisher geschikt.
                           
                        PROCEDURE
                  
                     Blootstellingsomstandigheden
                  
                  
                     Voorbereiding van het verrijkt sediment-watersysteem
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Voor het aanbrengen van de teststof wordt de in testmethode C.8, Toxiciteit voor regenwormen, beschreven verrijkingsprocedure aanbevolen (14). De verrijkte sedimenten worden in de vaten aangebracht, waaraan voldoende bovenliggend water wordt toegevoegd om te zorgen voor een volumeverhouding van 1:4 tussen het sediment en het water (zie punten 11 en 15). De sedimentlaag moet een dikte van 1,5 tot 3 cm hebben. Om te voorkomen dat tijdens de toevoeging van testwater aan de waterkolom bestanddelen zich van het sediment afscheiden en fijn materiaal in suspensie wordt gebracht, kan het sediment tijdens het gieten worden afgedekt met een kunststof schijf, die onmiddellijk daarna wordt verwijderd. Ook andere middelen kunnen geschikt zijn.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              De testvaten worden (bijvoorbeeld met glasplaten) bedekt. Om verdampingsverliezen te compenseren, kan het waterniveau tijdens de studie worden aangevuld tot het oorspronkelijke volume. Om te voorkomen dat zouten ontstaan, moet hiervoor gedestilleerd of gedeïoniseerd water worden gebruikt.
                           
                        
                     Stabilisatie
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Nadat het verrijkte sediment met bovenliggend water is voorbereid, is het wenselijk de teststof zich te laten verdelen uit de waterfase naar het sediment (3)(4)(6)(13). Dit moet bij voorkeur gebeuren onder de in de test heersende temperatuur- en beluchtingsomstandigheden. De tijd die nodig is voor equilibratie hangt af van het sediment en de stof en kan variëren van enkele uren tot verscheidene dagen en soms zelfs weken (vier-vijf weken). Aangezien veel stoffen ondertussen zouden kunnen afbreken, wordt niet gewacht tot een evenwicht is ontstaan, maar wordt een equilibratieperiode van 48 uur aanbevolen. Aan het eind van deze nadere equilibratieperiode wordt in het bovenliggende water, het poriewater en het sediment, bij ten minste de hoogste en een lagere concentratie, de concentratie van de teststof gemeten (zie punt 38). Op basis van deze analysen van de teststof kan de massabalans worden berekend en kunnen de resultaten als gemeten concentraties worden uitgedrukt.
                           
                        
                     Toevoeging van testorganismen
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Vier tot vijf dagen voordat de testorganismen aan de testvaten worden toegevoegd, worden eipakketten uit de kweken genomen en in kleine vaten in een kweekmedium geplaatst. Er kan ouder medium uit de voorraadcultuur of vers bereid medium worden gebruikt. In het laatste geval wordt aan het kweekmedium een kleine hoeveelheid voedsel, zoals groene algen en/of enkele druppels filtraat uit een fijngemalen suspensie van visvoervlokken, toegevoegd (zie aanhangsel 2). Er worden alleen vers afgezette eipakketten gebruikt. Normaliter beginnen de larven enkele dagen nadat de eieren zijn gelegd (twee tot drie dagen voor Chironomus riparius bij 20 °C en één tot vier dagen voor Chironomus tentans bij 23 °C en Chironomus yoshimatsui bij 25 °C) uit te komen en vindt de groei van de larven plaats in vier stadia die elk vier-acht dagen duren. Voor de test worden larven in het eerste stadium (2-3 of 1-4 dagen na uitkomen) gebruikt. Het stadium van muggen kan mogelijk worden gecontroleerd aan de hand van de breedte van het epicranium (6).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Twintig larven in het eerste stadium worden met een stompe pipet willekeurig verdeeld over de testvaten met verrijkt sediment en water. Tijdens het inbrengen van de larven in de testvaten en de eerste 24 uur daarna wordt de beluchting van het water uitgezet (zie de punten 25 en 32). Afhankelijk van de testopzet (zie de punten 19 en 20) bedraagt het aantal larven dat per concentratie wordt gebruikt ten minste 60 voor de EC-puntschatting en 80 voor de NOEC-bepaling.
                           
                        
                     Testconcentraties
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Om het concentratiebereik van de test te bepalen kan een bereikbepalingstest worden uitgevoerd. Daarvoor wordt een reeks sterk gespreide concentraties van de teststof gebruikt. Om te zorgen voor dezelfde oppervlaktedichtheid per Chironomus als in de eigenlijke test, worden de Chironomidae aan elke concentratie van de teststof blootgesteld gedurende een periode die een schatting van de wenselijke testconcentraties mogelijk maakt, en zijn geen duplo’s vereist.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              De testconcentraties voor de eigenlijke test worden gebaseerd op de uitkomsten van de bereikbepalingstest. Er moeten ten minste vijf concentraties worden gebruikt en geselecteerd, zoals beschreven in de punten 18 tot en met 20.
                           
                        
                     Controlegroep
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              De test omvat controlevaten zonder teststof maar met sediment, met het vereiste aantal duplo’s (zie de punten 19 en 20). Indien voor het aanbrengen van de teststof een oplosmiddel is gebruikt (zie punt 16), wordt een controlegroep voor het oplosmiddel in het sediment toegevoegd.
                           
                        
                     Testsysteem
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Er worden statische systemen gebruikt. In uitzonderlijke gevallen kunnen semistatische of doorstroomsystemen met onderbroken of continue verversing van het bovenliggende water worden gebruikt, bijvoorbeeld als de kwaliteitsspecificaties voor het water niet geschikt zijn voor het testorganisme of het chemische evenwicht wordt aangetast (te laag gehalte opgeloste zuurstof, te hoge concentratie excretieproducten, uit het sediment vrijkomende mineralen, gewijzigde pH en/of waterhardheid enz.). Gewoonlijk kan de kwaliteit van het bovenliggende water echter met andere methoden, zoals beluchting, worden verbeterd; deze verdienen de voorkeur.
                           
                        
                     Voedsel
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              De larven moeten, bij voorkeur dagelijks of ten minste drie keer per week, worden gevoerd. Voor jonge larven lijkt in de eerste tien dagen 0,25-0,5 mg visvoer (een suspensie in water of fijngemalen voedsel, bv. TetraMin of TetraPhyll; zie details in aanhangsel 2) per larve per dag voldoende te zijn (0,35-0,5 mg voor C. yoshimatsui). Oudere larven kunnen iets meer voedsel nodig hebben: tijdens de rest van de test zou 0,5-1 mg per larve per dag moeten volstaan. Als schimmelgroei wordt waargenomen of sterfte in de controlegroepen wordt geconstateerd, moet het voedselrantsoen in alle test- en controlegroepen worden verlaagd. Als de schimmelontwikkeling niet kan worden gestopt, moet de test worden herhaald. Voor sterk adsorberende stoffen (bijvoorbeeld met log Kow > 5) of voor stoffen die een covalente binding met het sediment aangaan, kan de voor de overleving en natuurlijke groei van de organismen vereiste hoeveelheid voedsel vóór de stabilisatieperiode aan het kunstmatige sediment worden toegevoegd. In dat geval wordt in plaats van visvoer plantaardig materiaal gebruikt, bv. 0,5 % (drooggewicht) fijngemalen bladeren van bv. brandnetel (Urtica dioica), witte moerbei (Morus alba), witte klaver (Trifolium repens), spinazie (Spinacia oleracea) of ander plantaardig materiaal (Cerophyl of alfacellulose).
                           
                        
                     Incubatieomstandigheden
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              In het bovenliggende water in de testvaten wordt bij voorkeur 24 uur na toevoeging van de larven voorzichtige beluchting toegepast en gedurende de test voortgezet (waarbij erop moet worden gelet dat het gehalte aan opgeloste zuurstof niet lager wordt dan 60 % van de ASV). De beluchting vindt plaats via een glazen pasteurpipet die 2-3 cm boven de sedimentlaag wordt bevestigd (bv. één of enkele luchtbellen/s). Als vluchtige stoffen worden getest, kan worden overgewogen het sediment-watersysteem niet te beluchten.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              De test wordt verricht bij een constante temperatuur van 20 °C (± 2 °C). Voor C. tentans en C. yoshimatsui bedraagt de aanbevolen temperatuur respectievelijk 23 °C en 25 °C (± 2 °C). Er wordt een fotoperiode van 16 uur gebruikt bij een lichtintensiteit van 500 tot 1 000 lux.
                           
                        
                     Blootstellingsduur
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              De blootstelling begint bij toevoeging van larven aan de verrijkte vaten en de controlevaten. De maximale blootstellingsduur bedraagt 28 dagen voor C. riparius en C. yoshimatsui, en 65 dagen voor C. tentans. Als eerder muggen uitkomen, kan de test worden beëindigd nadat minimaal vijf dagen zijn verstreken na verschijning van de laatste volwassen mug in de controlegroep.
                           
                        
                     Waarnemingen
                  
                  
                     Uitkomst van muggen
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              De ontwikkelingstijd en het totale aantal volledig uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen worden bepaald. Mannetjes zijn gemakkelijk te herkennen aan hun veerachtige antennes.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              De testvaten worden ten minste drie keer per week geobserveerd om een visuele beoordeling van eventueel afwijkend gedrag te verrichten (bv. verlating van het sediment, ongewoon zwemgedrag), waarbij met de controlegroep wordt vergeleken. In de periode waarin verwacht wordt dat de muggen uitkomen, moet dagelijks een telling van de uitgekomen muggen worden verricht. Dagelijks worden het aantal volledig uitgekomen muggen en hun geslacht geregistreerd. Na identificatie worden de muggen uit de vaten verwijderd. Als er voor het eind van de test eipakketten zijn afgezet, worden deze geregistreerd en vervolgens verwijderd om te voorkomen dat opnieuw larven in het sediment terechtkomen. Ook wordt geregistreerd hoeveel zichtbare poppen niet zijn uitgekomen. Aanhangsel 5 bevat aanwijzingen voor de meting van het uitkomen.
                           
                        
                     Groei en overleving
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Als gegevens over de overleving en groei van larven na tien dagen vereist zijn, wordt bij het begin gezorgd voor extra testvaten, die voor de voortzetting worden gebruikt. Het sediment van deze aanvullende vaten wordt door een 250 μm-zeef gevoerd, zodat de larven overblijven. De criteria voor „dood” zijn immobiliteit of geen reactie op een mechanische prikkel. Niet meer aangetroffen larven moeten als dode larven worden geteld (aan het begin van de test gestorven larven kunnen door microben zijn afgebroken). Het (asvrije) drooggewicht van de overlevende larven per testvat wordt bepaald en op grond daarvan wordt het gemiddelde individuele drooggewicht per vat berekend. Het is nuttig om te bepalen in welk stadium de overlevende larven zich bevinden; dit kan door de breedte van het epicranium van elk individu te meten.
                           
                        
                     Analytische bepalingen
                  
                  
                     Concentratie van de teststof
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Voor aanvang van de test (d.w.z. voordat de larven worden toegevoegd) worden uit ten minste één vat per behandeling monsters van het bulksediment genomen om de concentratie van de teststof in het sediment analytisch te bepalen. Aanbevolen wordt ten minste bij de hoogste en een lagere concentratie monsters van het bovenliggende water, het poriewater en het sediment te analyseren bij het begin (zie punt 24) en eind van de test. Deze bepalingen van de concentratie van de teststof leveren informatie op over het gedrag en de verdeling van de teststof in het water-sedimentsysteem.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Wanneer tussenliggende metingen worden verricht (bv. op dag 7) en voor de analyse grotere monsters nodig zijn die niet uit de testvaten kunnen worden genomen zonder het testsysteem te beïnvloeden, worden analytische bepalingen verricht op monsters uit aanvullende testvaten die op dezelfde wijze zijn behandeld (inclusief toevoeging van testorganismen), maar niet voor biologische waarnemingen zijn gebruikt.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Om het poriewater te isoleren, wordt aanbevolen te centrifugeren, bijvoorbeeld 30 minuten bij 10 000 g en een temperatuur van 4 °C. Filtratie kan ook aanvaardbaar zijn, mits aangetoond is dat de teststof niet aan filters adsorbeert. In sommige gevallen kan analyse van de concentraties in het poriewater onmogelijk zijn doordat het monster te klein is.
                           
                        
                     Fysisch-chemische eigenschappen
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              De pH en temperatuur van de testvaten moeten op een geschikte wijze worden gemeten (zie punt 10). De hardheid en het ammoniagehalte moeten bij het begin en het eind van de test in de controlevaten en in één testvat worden gemeten bij de hoogste concentratie.
                           
                        GEGEVENS EN RAPPORTAGE
                  
                     Verwerking van de resultaten
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Doel van deze test is het bepalen van het effect van de teststof op het ontwikkelingstempo en het totale aantal volledig uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen, of bij de tiendaagse test de effecten op de overleving en het gewicht van de larven. Als er geen aanwijzingen zijn voor een statistisch verschil in gevoeligheid tussen de geslachten, kunnen de resultaten voor mannetjes en vrouwtjes worden samengevoegd voor statistische analysen. Het verschil in gevoeligheid tussen de geslachten kan statistisch worden beoordeeld met bv. een χ2-r × 2-toets. Zo nodig worden na tien dagen de overleving en het gemiddelde individuele drooggewicht per vat van de larven bepaald.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Bij voorkeur aan de hand van de bij het begin van de test gemeten sedimentconcentraties (zie punt 38) worden effectconcentraties berekend, die gebaseerd zijn op en uitgedrukt worden als drooggewicht.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Voor de berekening van een puntschatting voor de EC50 of enige andere ECx kunnen de gegevens per vat als echte replicaties worden gebruikt. Bij de berekening van een betrouwbaarheidsinterval voor elke ECx moet rekening worden gehouden met de variabiliteit tussen vaten, tenzij wordt aangetoond dat deze verwaarloosbaar is. Wanneer voor het model de kleinstekwadratenmethode wordt toegepast, worden de gegevens per vat getransformeerd om de homogeniteit van de variantie te vergroten. Voordat de ECx-waarden worden berekend, moet de respons echter zijn teruggetransformeerd naar de oorspronkelijke waarde.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Wanneer de statistische analyse dient om de NOEC/LOEC te bepalen door toetsing van een hypothese, moet rekening worden gehouden met de variabiliteit tussen vaten, bv. met een geneste ANOVA. Als de gebruikelijke ANOVA-aannamen niet opgaan, kunnen robuustere tests (21) wenselijk zijn.
                           
                        
                     Uitkomstquotiënt
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Het uitkomstquotiënt betreft een binaire respons en kan, wanneer een monotone dosisrespons wordt verwacht en de gegevens consistent zijn met die verwachting, worden geanalyseerd met de toets van Cochran-Armitage, toegepast met stapjes omlaag. Als dit niet het geval is, kan de exacte toets van Fisher of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt, met volgens Bonferroni-Holm gecorrigeerde p-waarden. Als er aanwijzingen zijn dat de variabiliteit tussen duplo’s met dezelfde concentratie groter is dan een binomiale verdeling zou uitwijzen (zogeheten „extrabinomiale” variantie), moet een robuuste toets van Cochran-Armitage of een exacte toets van Fisher, zoals voorgesteld in punt 21, worden gebruikt.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Het aantal uitgekomen muggen per vat, ne, wordt bepaald en gedeeld door het aantal in het vat gestopte larven, na:
                              
                                 
                              waarbij:
                              
                                          ER
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          uitkomstquotiënt (emergence ratio);
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          aantal uitgekomen muggen per vat;
                                       
                                    
                                          na
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          aantal larven dat in één vat is gestopt.
                                       
                                    
                        
                              48.
                           
                           
                              Bij wijze van alternatief, dat vooral voor grote monsters geschikt is, kan, wanneer een monotone dosisrespons wordt verwacht en de gegevens over het uitkomstquotiënt consistent zijn met die verwachting, het uitkomstquotiënt in geval van extrabinomiale variantie als een continue respons worden behandeld en kunnen procedures als de toets van Williams worden gebruikt. Wanneer er geen sprake is van een monotone dosisrespons, kan de toets van Dunnett geschikt zijn. Als „grote” monsters worden hier beschouwd monsters waarvan per duplo (vat) zowel het aantal uitgekomen als het aantal niet-uitgekomen muggen groter is dan vijf.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Voordat ANOVA-methoden worden toegepast, moeten de waarden van het uitkomstquotiënt eerst een hoektransformatie of een Freeman-Tukey-transformatie ondergaan om een approximatieve normale verdeling te verkrijgen en de variantie te egaliseren. Wanneer de absolute frequenties worden gebruikt, kan de toets van Cochran-Armitage, de exacte toets van Fisher (Bonferroni) of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt. De hoektransformatie wordt uitgevoerd door de arcsinus (sin–1) van de vierkantswortel van het uitkomstquotiënt te nemen.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Voor uitkomstquotiënten worden de ECx-waarden berekend door middel van regressieanalyse (of bv. probit (22), logit, Weibull, geschikte commerciële software enz.). Als geen regressieanalyse mogelijk is (bv. als er minder dan twee partiële responsen zijn), worden andere niet-parametrische methoden, zoals voortschrijdend gemiddelde of eenvoudige interpolatie, gebruikt.
                           
                        
                     Ontwikkelingstempo
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Met de gemiddelde ontwikkelingstijd wordt bedoeld de gemiddelde tijd tussen het moment waarop de larven in het vat worden gestopt (dag 0 van de test) en het moment waarop de experimentele cohort muggen uitkomt (voor de berekening van de werkelijke ontwikkelingstijd moet rekening worden gehouden met de leeftijd van de larven op het moment van inbrengen). Het ontwikkelingstempo is de reciproke waarde van de ontwikkelingstijd (eenheid: dag–1) en staat voor het deel van de larvenontwikkeling dat per dag plaatsvindt. Het ontwikkelingstempo heeft de voorkeur voor de evaluatie van deze sedimenttoxiciteitsstudies, omdat deze in vergelijking met de ontwikkelingstijd een kleinere variantie en een grotere homogeniteit heeft en de normale verdeling beter benadert. Daarom kunnen sterke parametrische testprocedures beter op het ontwikkelingstempo dan op de ontwikkelingstijd worden toegepast. Voor het ontwikkelingstempo als continue respons kunnen ECx = waarden worden geschat door middel van regressieanalyse (bv. (23)(24)).
                           
                        
                              52.
                           
                           Bij de volgende statistische tests wordt aangenomen dat het op inspectiedag x waargenomen aantal muggen is uitgekomen in het midden van het tijdsinterval tussen dag x en dag x-l (l = lengte van het inspectie-interval, doorgaans één dag). Het gemiddelde ontwikkelingstempo per vat (
                                 ) wordt als volgt berekend:
                                 
                              waarbij:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          gemiddeld ontwikkelingstempo per vat;
                                       
                                    
                                          i
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          index van het inspectie-interval;
                                       
                                    
                                          m
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          maximumaantal inspectie-intervallen;
                                       
                                    
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          in inspectie-interval i uitgekomen aantal muggen;
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          totaal aantal uitgekomen muggen aan het eind van de proef (= )
                                       
                                    
                                          xi
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          ontwikkelingstempo van de in interval i uitgekomen muggen;
                                       
                                    
                                 
                              waarbij
                              
                                          dayi
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          inspectiedag (dagen na aanbrengen);
                                       
                                    
                                          li
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          lengte van inspectie-interval i (dagen, gewoonlijk één dag).
                                       
                                    
                        
                     Testverslag
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden opgenomen:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Teststof:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fysische toestand en, indien relevant, fysisch-chemische kenmerken (oplosbaarheid in water, dampspanning, verdelingscoëfficiënt in de bodem (of in sediment, indien beschikbaar), stabiliteit in water enz.);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identificatiegegevens van de stof (triviale naam, chemische naam, structuurformule, CAS-nummer enz.) met inbegrip van de zuiverheid en de analysemethode voor de kwantitatieve bepaling van de teststof.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Diersoort:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gebruikte proefdieren: soort, wetenschappelijke naam, bron van de organismen en kweekomstandigheden;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informatie over de hantering van eipakketten en larven;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      leeftijd van de proefdieren op het moment waarop zij in de testvaten werden gestopt.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testomstandigheden:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gebruikt sediment, d.w.z. natuurlijk of kunstmatig sediment;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      voor natuurlijk sediment: de locatie en beschrijving van de sedimentmonsternemingsplaats inclusief, indien mogelijk, vervuilingsgeschiedenis; eigenschappen: pH, gehalte aan organische koolstof, C/N-verhouding en korrelgrootteverdeling (indien van toepassing);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bereiding van het kunstmatige sediment: ingrediënten en eigenschappen (gehalte aan organische koolstof, pH, vocht enz. bij het begin van de test);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bereiding van het testwater (bij gebruik van synthetisch water) en eigenschappen (zuurstofgehalte, pH, geleidbaarheid, hardheid enz. bij het begin van de test);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dikte van de sedimentlaag en diepte van het bovenliggende water;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      volume van het bovenliggende en poriewater; gewicht van het natte sediment met en zonder poriewater;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      testvaten (materiaal en afmetingen);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sedimentverrijkingsmethode: toegepaste testconcentraties, aantal duplo’s en eventueel gebruik van oplosmiddel;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      evenwichtsstabiliseringsfase van het verrijkte sediment-watersysteem: duur en omstandigheden;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      incubatieomstandigheden: temperatuur, lichtcyclus en -intensiteit, beluchting (frequentie en intensiteit);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      details over het voedsel, met inbegrip van soort voedsel, bereiding, hoeveelheid en voederregime.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Resultaten:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de nominale testconcentraties, de gemeten testconcentraties en de resultaten van alle analysen die zijn verricht om de concentratie van de teststof in het testvat te bepalen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kwaliteit van het water in de testvaten, d.w.z. pH, temperatuur, opgeloste zuurstof, hardheid en ammonia;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vervanging van verdampt testwater, indien van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aantal uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen per vat en per dag;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aantal niet tot mug ontwikkelde larven per vat;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gemiddeld individueel drooggewicht van de larven per vat, en per stadium, indien van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      percentage uitgekomen muggen per vat en testconcentratie (mannelijke en vrouwelijke muggen gecombineerd);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gemiddeld ontwikkelingstempo van volledig uitgekomen muggen per duplo en behandeling (mannelijke en vrouwelijke muggen gecombineerd);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      schattingen van toxische eindpunten, bv. ECx (met bijbehorende betrouwbaarheidsintervallen), NOEC en/of LOEC, en de statistische methoden waarmee zij zijn bepaald;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bespreking van de resultaten, met inbegrip van een eventuele beïnvloeding van de resultaten van de test die een gevolg is van afwijkingen van deze testmethode.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATUUR:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Testmethode C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482-491.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117.
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531.
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585.
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.
                           
                        
                              (23)
                           
                           
                              Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494.
                           
                        
                              (24)
                           
                           
                              Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312.
                           
                        
                     Aanhangsel 1
                     DEFINITIES
                     Voor de toepassing van deze testmethode wordt verstaan onder:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    kunstmatig sediment (ook wel bereid, gereconstitueerd of synthetisch sediment genoemd): een mengsel van materialen waarmee de fysische bestanddelen van natuurlijk sediment worden nagebootst;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 „bovenliggend water”: het water dat in het testvat op het sediment wordt gegoten;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 „poriewater” (ook wel interstitieel water genoemd): het water in de ruimten tussen de sediment- en bodemdeeltjes;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 „verrijkt sediment”: sediment waaraan teststof is toegevoegd;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 „teststof”: alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.
                              
                           
                  
                     Aanhangsel 2
                     
                        Aanbevelingen voor de kweek van Chironomus riparius
                        
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Larven van Chironomus kunnen worden gekweekt in kristalliseerschalen of grotere houders. Op de bodem van de houder wordt een 5 tot 10 mm dikke laag fijn kwartszand gestrooid. Ook kiezelgoer (bv. Merck, Art 8117) is geschikt gebleken als substraat (in dat geval volstaat een dunnere laag van slechts enkele mm). Vervolgens wordt een enkele cm diepe laag geschikt water toegevoegd. Om verdampingsverliezen te compenseren en uitdroging te voorkomen, worden de waterniveaus zo nodig aangevuld. Indien nodig kan het water worden vervangen. Er wordt voorzichtige beluchting toegepast. De larvenkweekvaten worden in een geschikte kooi geplaatst, zodat de volwassen muggen niet kunnen ontsnappen. De kooi moet groot genoeg zijn om de uitgekomen volwassen muggen te laten zwermen, omdat anders mogelijk niet wordt gecopuleerd (ten minste ca. 30 x 30 x 30 cm).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 De kooien worden op kamertemperatuur of in een kamer met een constant klimaat bij 20 ± 2 °C gehouden, met een lichtregime van 16 uur licht (intensiteit ca. 1 000 lux), 8 uur donker. Gerapporteerd is dat een relatieve luchtvochtigheid van minder dan 60 % de voortplanting kan belemmeren.
                              
                           
                        Verdunningswater
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Elk geschikt natuurlijk of synthetisch water kan worden gebruikt. Gebruikelijk zijn bronwater, ontchloord kraanwater en kunstmatige media (bv. Elendt-media M4 en M7, zie hieronder). Voor gebruik moet het water worden belucht. Indien nodig kan het kweekwater worden ververst door voorzichtig het gebruikte water uit de kweekvaten te gieten of hevelen zonder de larvenhulzen te beschadigen.
                              
                           
                        Toediening van voedsel aan larven
                     
                     
                                 4.
                              
                              
                                 De larven van Chironomus worden dagelijks gevoerd met ongeveer 250 mg visvoervlokken (TetraMin®, TetraPhyll® of een soortgelijk merk visvoer) per vat. Dit voer kan worden gegeven als droog gemalen poeder of als suspensie in water: aan 20 ml verdunningswater wordt 1,0 g voedervlokken toegevoegd en gemengd, zodat een homogeen mengsel ontstaat. Van dit mengsel kan ongeveer 5 ml per vat per dag worden gebruikt (schudden voor gebruik). Aan oudere larven kan meer voer worden gegeven.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Het voedsel wordt aangepast op basis van de waterkwaliteit. Als het kweekmedium troebel wordt, wordt de hoeveelheid voedsel verminderd. De toediening van voedsel moet zorgvuldig worden geobserveerd. Als te weinig voer wordt gegeven, zullen de larven naar de waterkolom uitwijken; als te veel voer wordt gegeven, neemt de microbiële activiteit toe en daalt het zuurstofgehalte. Beide condities kunnen tot lagere groeisnelheden leiden.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Wanneer nieuwe kweekvaten worden ingericht, kunnen ook enige cellen van groene algen (bv. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) worden toegevoegd.
                              
                           
                        Toediening van voedsel aan uitgekomen volwassen muggen
                     
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Enkele onderzoekers hebben erop gewezen dat een in een sacharoseoplossing gedrenkt wattenschijfje als voedsel kan dienen voor uitgekomen volwassen muggen.
                              
                           
                        Uitkomst van muggen
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 In de larvenkweekvaten zullen zich bij 20 ± 2 °C na ongeveer 13-15 dagen volwassen muggen ontwikkelen. Mannetjes zijn gemakkelijk te herkennen aan hun veerachtige antennes.
                              
                           
                        Eipakketten
                     
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Zodra in de kweekkooi volwassen muggen aanwezig zijn, worden alle larvenkweekvaten drie keer per week gecontroleerd op afgezette geleiachtige eipakketten. Als eipakketten aanwezig zijn, worden zij voorzichtig verwijderd. Zij worden overgebracht naar een klein schaaltje met een monster van het kweekwater. De eipakketten worden gebruikt om een nieuw kweekvat te beginnen (bv. 2-4 eipakketten per vat) of worden voor toxiciteitstests gebruikt.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Larven in het eerste stadium moeten na twee-drie dagen uitkomen.
                              
                           
                        Inrichting van nieuwe kweekvaten
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Zodra kweken zijn opgezet, moet het mogelijk zijn een keer per week, of minder vaak naargelang de testvoorschriften, een vers larvenkweekvat in te richten, waarbij de oudere vaten worden verwijderd nadat zich volwassen muggen hebben ontwikkeld. Dit systeem zorgt voor een regelmatige aanvoer van volwassen muggen met een minimum aan beheer.
                              
                           
                        Bereiding van de testoplossingen M4 en M7
                     
                     
                                 12.
                              
                              
                                 Elendt (1990) heeft het medium M4 beschreven. Het medium M7 wordt op dezelfde wijze als M4 bereid, maar met een vier keer zo lage concentratie van de in tabel 1 vermelde stoffen. Er is een publicatie over het medium M7 in voorbereiding (persoonlijk medegedeeld door Elendt). De testoplossing mag niet volgens Elendt en Bias (1990) worden bereid, omdat de voor de stamoplossingen vermelde concentraties van NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 en K2HPO4 niet geschikt zijn.
                              
                           
                        Bereiding van het medium M7
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Elke stamoplossing (I) wordt apart bereid en met deze stamoplossingen (I) wordt een gecombineerde stamoplossing (II) bereid (zie tabel 1). Het medium M7 wordt bereid uit 50 ml gecombineerde stamoplossing (II) en de in tabel 2 vermelde hoeveelheden van elke stamoplossing van macronutriënten en tot 1 liter gedeïoniseerd water aangevuld. Een vitaminestamoplossing wordt bereid door overeenkomstig tabel 3 drie vitaminen toe te voegen aan gedeïoniseerd water; kort voor gebruik wordt 0,1 ml van de gecombineerde vitaminestamoplossing aan het definitieve medium M7 toegevoegd (de vitaminestamoplossing wordt in bevroren toestand in kleine porties bewaard.) Het medium wordt belucht en gestabiliseerd.
                              
                           
                        LITERATUUR:
                     
                     BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
                     
                        Tabel 1
                     
                     
                        Stamoplossingen van spoorelementen voor de media M4 en M7
                     
                     
                                 Stamoplossingen (I)
                              
                              
                                 Hoeveelheid (mg) aangevuld tot 1 liter gedeïoniseerd water
                              
                              
                                 Gecombineerde stamoplossing (II) bereiden door de volgende hoeveelheden (ml) van de stamoplossingen (I) te mengen en tot 1 liter gedeïoniseerd water aan te vullen
                              
                              
                                 Uiteindelijke concentraties in testoplossingen (mg/l)
                              
                           
                                 M4
                              
                              
                                 M7
                              
                              
                                 M4
                              
                              
                                 M7
                              
                           
                                 H3BO3
                                     (15)
                                 
                              
                              
                                 57 190
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 2,86
                              
                              
                                 0,715
                              
                           
                                 MnCl2 · 4 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 7 210
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,361
                              
                              
                                 0,090
                              
                           
                                 LiCl (15)
                                 
                              
                              
                                 6 120
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,306
                              
                              
                                 0,077
                              
                           
                                 RbCl (15)
                                 
                              
                              
                                 1 420
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,071
                              
                              
                                 0,018
                              
                           
                                 SrCl2 · 6 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 3 040
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,152
                              
                              
                                 0,038
                              
                           
                                 NaBr (15)
                                 
                              
                              
                                 320
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,016
                              
                              
                                 0,004
                              
                           
                                 Na2MoO4 · 2 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 1 260
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,063
                              
                              
                                 0,016
                              
                           
                                 CuCl2 · 2 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 335
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,017
                              
                              
                                 0,004
                              
                           
                                 ZnCl2
                                 
                              
                              
                                 260
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,013
                              
                              
                                 0,013
                              
                           
                                 CaCl2 · 6 H2O
                              
                              
                                 200
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,010
                              
                              
                                 0,010
                              
                           
                                 KI
                              
                              
                                 65
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,0033
                              
                              
                                 0,0033
                              
                           
                                 Na2SeO3
                                 
                              
                              
                                 43,8
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,0022
                              
                              
                                 0,0022
                              
                           
                                 NH4VO3
                                 
                              
                              
                                 11,5
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,00058
                              
                              
                                 0,00058
                              
                           
                                 Na2EDTA · 2 H2O (15)
                                     (16)
                                 
                              
                              
                                 5 000
                              
                              
                                 20,0
                              
                              
                                 5,0
                              
                              
                                 2,5
                              
                              
                                 0,625
                              
                           
                                 FeSO4 · 7 H2O (15)
                                     (16)
                                 
                              
                              
                                 1 991
                              
                              
                                 20,0
                              
                              
                                 5,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,249
                              
                           
                        
                     
                        Tabel 2
                     
                     
                        Stamoplossingen van macronutriënten voor de media M4 en M7
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 Hoeveelheid aangevuld tot 1 liter gedeïoniseerd water
                                 (mg)
                              
                              
                                 Hoeveelheid stamoplossing van macronutriënten die wordt toegevoegd om de media M4 en M7 te bereiden
                                 (ml/l)
                              
                              
                                 Uiteindelijke concentraties in de testoplossingen M4 en M7
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 CaCl2 · 2 H2O
                              
                              
                                 293 800
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 293,8
                              
                           
                                 MgSO4 · 7 H2O
                              
                              
                                 246 600
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                 123,3
                              
                           
                                 KCl
                              
                              
                                 58 000
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 5,8
                              
                           
                                 NaHCO3
                                 
                              
                              
                                 64 800
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 64,8
                              
                           
                                 NaSiO3 · 9 H2O
                              
                              
                                 50 000
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                 10,0
                              
                           
                                 NaNO3
                                 
                              
                              
                                 2 740
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,274
                              
                           
                                 KH2PO4
                                 
                              
                              
                                 1 430
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,143
                              
                           
                                 K2HPO4
                                 
                              
                              
                                 1 840
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,184
                              
                           
                        
                     
                        Tabel 3
                     
                     
                        Vitaminestamoplossing voor de media M4 en M7. De drie vitamineoplossingen worden tot één vitaminestamoplossing samengevoegd
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 Hoeveelheid aangevuld tot 1 liter gedeïoniseerd water
                                 (mg)
                              
                              
                                 Hoeveelheid vitaminestamoplossing die wordt toegevoegd om de media M4 en M7 te bereiden
                                 (ml/l)
                              
                              
                                 Uiteindelijke concentraties in de testoplossingen M4 en M7
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 Thiaminehydrochloride
                              
                              
                                 750
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,075
                              
                           
                                 Cyanocobalamine (B12)
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,0010
                              
                           
                                 Biotine
                              
                              
                                 7,5
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,00075
                              
                           
                        LITERATUUR:
                     
                     Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33.
                     Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167.
                  
                  
                     Aanhangsel 3
                     BEREIDING VAN KUNSTMATIG SEDIMENT
                     
                        Samenstelling van het sediment
                     
                     Het kunstmatige sediment wordt als volgt samengesteld:
                     
                                 Bestanddeel
                              
                              
                                 Eigenschappen
                              
                              
                                 % van het
                                 sediment (drooggewicht)
                              
                           
                                 Turf
                              
                              
                                 Veenmosturf, zo dicht mogelijk bij pH 5,5-6,0, zonder zichtbare plantenresten, fijngemalen (deeltjesgrootte ≤ 1 mm) en aan de lucht gedroogd
                              
                              
                                 4-5
                              
                           
                                 Kwartszand
                              
                              
                                 Korrelgrootte: > 50 % van de deeltjes moet binnen het bereik 50-200 μm liggen
                              
                              
                                 75-76
                              
                           
                                 Kaolienklei
                              
                              
                                 Met ≥ 30 % kaoliniet
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                 Organische koolstof
                              
                              
                                 Aangepast door toevoeging van turf en zand
                              
                              
                                 2 (± 0,5)
                              
                           
                                 Calciumcarbonaat
                              
                              
                                 CaCO3, poedervormig, chemisch zuiver
                              
                              
                                 0,05-0,1
                              
                           
                                 Water
                              
                              
                                 Geleidbaarheid ≤ 10 μS/cm
                              
                              
                                 30-50
                              
                           
                        Bereiding
                     
                     De turf wordt aan de lucht gedroogd en tot een fijn poeder vermalen. Er wordt een suspensie van de vereiste hoeveelheid turfpoeder in gedeïoniseerd water bereid met een kwalitatief hoogwaardig homogeniseerapparaat. De pH van deze suspensie wordt met CaCO3 aangepast tot 5,5 ± 0,5. De suspensie wordt ten minste twee dagen lang onder zachtjes roeren bij 20 ± 2 °C geconditioneerd om de pH te stabiliseren en een stabiele microbiële component te verkrijgen. De pH wordt opnieuw gemeten en moet nu 6,0 ± 0,5 bedragen. Vervolgens wordt de turfsuspensie met de andere bestanddelen (zand en kaolienklei) en gedeïoniseerd water vermengd om een homogeen sediment te verkrijgen met een watergehalte van 30-50 % van het drooggewicht van het sediment. De pH van het uiteindelijke mengsel wordt nogmaals gemeten en zo nodig met CaCO3 tot 6,5-7,5 aangepast. Er worden monsters van het sediment genomen om het drooggewicht en het gehalte aan organische koolstof te bepalen. Aanbevolen wordt het kunstmatige sediment, voordat het in een test ter bepaling van de toxiciteit voor Chironomidae wordt gebruikt, zeven dagen te laten rusten onder dezelfde omstandigheden die ook in de test zullen heersen.
                     
                        Opslag
                     
                     De droge bestanddelen voor de bereiding van het kunstmatige sediment kunnen op een droge en koele plaats bij kamertemperatuur worden bewaard. Het kunstmatige (natte) sediment mag niet worden opgeslagen voordat het in de test wordt gebruikt. Het moet onmiddellijk na afloop van de zevendaagse conditioneringsperiode die de bereiding afsluit, worden gebruikt.
                     
                        LITERATUUR:
                     
                     Hoofdstuk C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen.
                     Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20.
                  
                  
                     Aanhangsel 4
                     
                        Chemische eigenschappen van aanvaardbaar verdunningswater
                     
                     
                                 Stof
                              
                              
                                 Concentraties
                              
                           
                                 Vaste deeltjes
                              
                              
                                 < 20 mg/l
                              
                           
                                 Totaalgehalte aan organische koolstof
                              
                              
                                 < 2 mg/l
                              
                           
                                 Niet-geïoniseerde ammonia
                              
                              
                                 < 1 μg/l
                              
                           
                                 Hardheid uitgedrukt als CaCO3
                                 
                              
                              
                                 < 400 mg/l (17)
                                 
                              
                           
                                 Restchloorgehalte
                              
                              
                                 < 10 μg/l
                              
                           
                                 Totaalgehalte aan organofosfor-pesticiden
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Totaalgehalte aan organochloor-pesticiden en polychloorbifenylen
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Totaalgehalte aan organisch chloor
                              
                              
                                 < 25 ng/l
                              
                           
                  
                     Aanhangsel 5
                     
                        Richtsnoeren voor de monitoring van het uitkomen van larven van chiromidae
                     
                     Op de testglazen worden „emergence traps” geplaatst. Deze vallen zijn vanaf dag 20 tot het eind van de test nodig. Onderstaande tekening toont een voorbeeld van een gebruikte val:
                     
                        
                     A: nylon hor
                     B: omgekeerde kunststofbekers
                     C: bekerglas zonder tuit
                     D: openingen met hor voor wateruitwisseling
                     E: water
                     F: sediment
                  
                  C.28.   TEST TER BEPALING VAN DE TOXICITEIT VOOR CHIRONOMIDEA IN SEDIMENT EN WATER M.BV VERRIJKT WATER
                  
                  INLEIDING
                  
                              1.
                           
                           
                              Deze methode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 219 (2004) van de OESO. De testmethode is bedoeld om de effecten te bepalen van langdurige blootstelling van in het sediment levende larven van tweevleugelige zoetwaterinsecten van Chironomus spp. aan stoffen. Zij berust hoofdzakelijk op de BBA-richtsnoeren en maakt gebruik van een testsysteem van sediment en water met kunstmatige grond en een blootstellingsscenario voor de waterkolom (1). De methode houdt ook rekening met de bestaande toxiciteitstestprotocollen voor Chironomus riparius en Chironomus tentans die in Europa en Noord-Amerika zijn ontwikkeld (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) en aan een ringonderzoek zijn onderworpen (1)(6)(9). Er kunnen ook andere goed gedocumenteerde Chironomidae worden gebruikt, bijvoorbeeld Chironomus yoshimatsui (10)(11).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Bij het in deze testmethode gebruikte blootstellingsscenario wordt gebruikgemaakt van verrijkt water. De selectie van het juiste blootstellingsscenario hangt af van het beoogde doel van de test. Het waterblootstellingsscenario, waarbij de waterkolom wordt verrijkt, is bedoeld om een gebeurtenis na te bootsen waarbij een gespoten bestrijdingsmiddel overwaait; het scenario heeft betrekking op de initiële concentratiepiek in het poriewater. Dit scenario is ook bruikbaar voor andersoortige blootstelling (waaronder weglekkende chemische stoffen), maar niet voor accumulatieprocessen die langer duren dan de testperiode.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              De stoffen die moeten worden getest voor in het sediment levende organismen, zijn gewoonlijk gedurende lange tijd persistent in dit compartiment. De in het sediment levende organismen kunnen via een aantal routes worden blootgesteld. Het relatieve belang van elke blootstellingsroute en de tijd die voor de bijdrage aan de algehele toxische effecten via elke route wordt genomen, hangen af van de fysisch-chemische eigenschappen van de betrokken stof. Voor sterk adsorberende stoffen (bijvoorbeeld met log Kow > 5) of voor stoffen die een covalente binding met het sediment aangaan, kan ingestie van besmet voedsel een belangrijke blootstellingsroute zijn. Om de toxiciteit van zeer lipofiele stoffen niet te onderschatten, kan worden overwogen vóór aanbrenging van de teststof voedsel aan het sediment toe te voegen. Om rekening te houden met alle mogelijke blootstellingsroutes, ligt de nadruk bij deze testmethode op langdurige blootstelling. De testduur bedraagt 20-28 dagen voor C. riparius en C. yoshimatsui, en 28-65 dagen voor C. tentans. Als voor een specifiek doel, bijvoorbeeld om de effecten van onstabiele stoffen te onderzoeken, kortetermijngegevens vereist zijn, kunnen na een periode van tien dagen aanvullende duplo’s worden verwijderd.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              De gemeten eindpunten zijn het totale aantal tot adult ontwikkelde dieren en de hiervoor benodigde tijd. Als aanvullende kortetermijngegevens vereist zijn, wordt aanbevolen de overleving en de groei van de larven pas te meten na een periode van tien dagen en zo nodig aanvullende duplo’s te gebruiken.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Het gebruik van kunstmatig sediment wordt aanbevolen. Kunstmatig sediment heeft verschillende voordelen ten opzichte van natuurlijke sedimenten:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          de experimentele variabiliteit wordt beperkt omdat het een reproduceerbare „genormaliseerde matrix” vormt en niet gezocht hoeft te worden naar niet-besmette schone sedimentbronnen;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          het testsediment kent geen seizoensveranderingen en op ieder moment kunnen tests worden gestart; het sediment hoeft niet te worden voorbehandeld om inheemse fauna te verwijderen; het gebruik van kunstmatig sediment beperkt ook de kosten aangezien geen sediment in het veld hoeft te worden verzameld voor routinetests;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          door het gebruik van kunstmatig sediment is de toxiciteit van stoffen vergelijkbaar en kunnen stoffen dienovereenkomstig worden gerangschikt: voor verscheidene stoffen zijn de toxiciteitsgegevens uit tests met natuurlijk en kunstmatig sediment vergelijkbaar gebleken (2).
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1.
                           
                        PRINCIPE VAN DE TEST
                  
                              7.
                           
                           
                              Larven in het eerste stadium van Chironomidae worden in sediment-watersystemen aan een concentratiebereik van de teststof blootgesteld. De test begint op het moment waarop de larven in het eerste stadium in de testbekers met het sediment-watersysteem worden gestopt, waarna het water met de teststof wordt verrijkt. Aan het eind van de test worden het uitkomstquotiënt en het ontwikkelingstempo van Chironomidae gemeten. Zo nodig kunnen tevens na tien dagen de overleving en het gewicht van de larven worden bepaald (hiervoor kunnen zo nodig aanvullende duplo’s worden gebruikt). Deze gegevens worden geanalyseerd door hetzij met een regressiemodel een schatting te maken van de concentratie die zou leiden tot een afname van het uitkomen, de overleving of de groei van larven met x % (bv. EC15, EC50 enz.), hetzij een statistische hypothese te toetsen om een NOEC/LOEC te bepalen. In het laatste geval worden de effectwaarden door middel van statistische toetsen met controlewaarden vergeleken.
                           
                        GEGEVENS OVER DE TESTSTOF
                  
                              8.
                           
                           
                              De oplosbaarheid in water van de teststof, de dampspanning ervan, de gemeten of berekende verdeling in sediment en de stabiliteit in water en sediment moeten bekend zijn. Er moet een betrouwbare analysemethode, met een bekende en gerapporteerde nauwkeurigheid en detectiegrens, beschikbaar zijn voor de kwantitatieve bepaling van de teststof in bovenliggend water, poriewater en sediment. Andere nuttige informatie zijn de structuurformule en de zuiverheid van de teststof. Ook het uiteindelijke chemische lot van de teststof (bv. dissipatie, niet-biologische en biologische afbraak enz.) is nuttige informatie. Nadere richtsnoeren voor het testen van stoffen met zodanige fysisch-chemische eigenschappen dat de uitvoering van de test problematisch is, zijn in (12) opgenomen.
                           
                        REFERENTIESTOFFEN
                  
                              9.
                           
                           
                              Er kunnen regelmatig tests met referentiestoffen worden uitgevoerd om de betrouwbaarheid van het testprotocol en de testomstandigheden te waarborgen. Voorbeelden van toxische referentiestoffen die met succes in ringonderzoek en valideringsstudies zijn gebruikt, zijn: lindaan, trifluralin, pentachloorfenol, cadmiumchloride en kaliumchloride (1)(2)(5)(6)(13).
                           
                        GELDIGHEID VAN DE TEST
                  
                              10.
                           
                           
                              De test is alleen geldig als aan de onderstaande voorwaarden wordt voldaan:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          het uitkomstpercentage in de controlegroepen moet aan het eind van de test ten minste 70 % zijn (1)(6);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de ontwikkeling tot adult van de in de controlevaten gestopte C. riparius en C. yoshimatsui moet binnen 12 tot 23 dagen plaatsvinden; voor C. tentans is een periode van 20 tot 65 dagen nodig;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          aan het eind van de test worden de pH en het gehalte aan opgeloste zuurstof in elk vat gemeten. Het zuurstofgehalte moet ten minste 60 % bedragen van de verzadigingswaarde van lucht (ASV) bij de heersende temperatuur en het bovenliggende water moet in alle testvaten een pH-waarde tussen 6 en 9 hebben;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de watertemperatuur mag niet met meer dan ± 1,0 °C afwijken. De watertemperatuur kan worden geregeld door een isotherme kamer te gebruiken; in dat geval wordt de kamertemperatuur met passende tussenpozen bevestigd.
                                       
                                    
                        BESCHRIJVING VAN DE METHODE
                  
                     Testvaten
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              De studie wordt uitgevoerd in bekerglazen met een inhoud van 600 ml en een diameter van 8 cm. Ook andere vaten kunnen geschikt zijn, mits zij voldoende diep zijn voor het bovenliggende water en het sediment. Het sedimentoppervlak moet ten minste 2 tot 3 cm2 per larve bedragen. De verhouding tussen de dikte van de sedimentlaag en de diepte van het bovenliggende water moet 1:4 zijn. Testvaten en andere apparatuur die in contact met het testsysteem komt, moeten volledig van glas of een ander chemisch inert materiaal zijn gemaakt (bv. teflon).
                           
                        
                     Keuze van de soorten
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Als testsoort heeft Chironomus riparius de voorkeur. Chironomus tentans is ook geschikt maar is lastiger in het gebruik en vergt een lagere testperiode. Chironomus yoshimatsui mag ook worden gebruikt. Aanhangsel 2 bevat bijzonderheden over de kweekmethoden van Chironomus riparius. Er is ook informatie beschikbaar over de kweekomstandigheden van andere soorten, namelijk Chironomus tentans (4) en Chironomus yoshimatsui (11). Vóór de test moet de identificatie van de soorten worden bevestigd; als de organismen uit eigen kweek afkomstig zijn, is geen bevestiging voorafgaand aan iedere test nodig.
                           
                        
                     Sediment
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Er wordt bij voorkeur kunstmatig sediment gebruikt (ook wel bereid, gereconstitueerd of synthetisch sediment genoemd). Als echter natuurlijk sediment wordt gebruikt, moet dit worden gekarakteriseerd (ten minste pH en gehalte aan organische koolstof; bepaling van parameters als C/N-verhouding en korrelgrootteverdeling worden eveneens aanbevolen) en moet het vrij zijn van verontreinigingen en andere organismen die de Chironomidae zouden kunnen beconcurreren of consumeren. Ook wordt aanbevolen het natuurlijke sediment, voordat het in een test ter bepaling van de toxiciteit voor Chironomidae wordt gebruikt, zeven dagen te laten rusten onder dezelfde omstandigheden die ook in de test zullen heersen. Voor deze test wordt sediment aanbevolen dat op basis van de in testmethode C.8 (14) gebruikte kunstmatige grond als volgt is samengesteld (1)(15)(16):
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          4-5 % (drooggewicht) turf: de pH moet zo dicht mogelijk bij 5,5 tot 6,0 liggen; het is belangrijk dat fijngemalen turf in poedervorm (deeltjesgrootte ≤ 1 mm) wordt gebruikt dat alleen aan de lucht is gedroogd;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          20 % (drooggewicht) kaolienklei (met bij voorkeur meer dan 30 % kaoliniet);
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          75-76 % (drooggewicht) kwartszand (overwegend bestaande uit fijn zand; meer dan 50 % van de deeltjes moet een grootte tussen 50 en 200 μm hebben);
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          er wordt gedeïoniseerd water toegevoegd om het uiteindelijke mengsel een vochtgehalte van 30-50 % te geven;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          er wordt chemisch zuiver calciumcarbonaat (CaCO3) toegevoegd om het uiteindelijke sedimentmengsel een pH van 7,0 ± 0,5 te geven.
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          Het gehalte aan organische koolstof van het uiteindelijke mengsel moet 2 % (± 0,5 %) bedragen en moet worden aangepast door toevoeging van extra turf en zand overeenkomstig a) en c).
                                       
                                    
                        
                              14.
                           
                           
                              De bron van de turf, de kaolienklei en het zand moet bekend zijn. De bestanddelen van het sediment moeten worden gecontroleerd op verontreiniging met chemische stoffen (bv. zware metalen, organische chloor- en fosforverbindingen enz.). In aanhangsel 3 wordt een voorbeeld gegeven van de bereiding van kunstmatig sediment. Menging van droge bestanddelen is ook aanvaardbaar, mits wordt aangetoond dat na toevoeging van het bovenliggende water geen scheiding van de bestanddelen van het sediment plaatsvindt (bv. door drijvende turfdeeltjes) en dat de turf of het sediment voldoende geconditioneerd is.
                           
                        
                     Water
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Elk water dat aan de in de aanhangsels 2 en 4 vermelde chemische eigenschappen van aanvaardbaar verdunningswater voldoet, is geschikt als testwater. Als kweek- en testwater is elk geschikt water, natuurlijk water (oppervlakte- of grondwater), synthetisch water (zie aanhangsel 2) of ontchloord kraanwater aanvaardbaar, mits de Chironomidae daarin gedurende het kweken en testen overleven zonder tekenen van stress te vertonen. Aan het begin van de test moet het testwater een pH-waarde tussen 6 en 9 hebben en mag de totale hardheid, uitgedrukt als CaCO3, niet hoger zijn dan 400 mg/l. Als echter een interactie tussen de hardheidsionen en de teststof wordt vermoed, moet water met een lagere hardheid worden gebruikt (en is Elendt-medium M4 dus ongeschikt). Voor de hele studie moet één soort water worden gebruikt. De in aanhangsel 4 vermelde kwaliteitskenmerken voor water moeten ten minste twee keer per jaar worden gemeten, of wanneer vermoed wordt dat een significante verandering heeft plaatsgevonden.
                           
                        
                     Stamoplossingen — verrijkt water
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              De testconcentraties worden berekend op basis van de concentraties in de waterkolom, d.w.z. het boven het sediment liggende water. Testoplossingen van de gekozen concentraties worden gewoonlijk bereid door verdunning van een stamoplossing. De stamoplossingen worden bij voorkeur bereid door oplossing van de teststof in het testmedium. Het gebruik van oplosmiddelen of dispergeermiddelen kan in bepaalde gevallen nodig zijn om een stamoplossing van een passende concentratie te verkrijgen. Voorbeelden van geschikte oplosmiddelen zijn aceton, ethanol, methanol, ethyleenglycolmonoëthylether, ethyleenglycoldimethylether, dimethylformamide en triëthyleenglycol. Als dispergeermiddelen mogen Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % methylcellulose en HCO-40 worden gebruikt. De concentratie van de solubilisator in het uiteindelijke testmedium moet minimaal zijn (d.w.z. ≤ 0,1 ml/l) en moet in elke testgroep gelijk zijn. Indien een solubilisator wordt gebruikt, mag dit geen significante effecten op de overleving hebben, noch een zichtbaar negatief effect op de Chironomidae-larven hebben, hetgeen blijkt uit de controlegroep met uitsluitend oplosmiddel. Het gebruik van deze stoffen moet echter zo veel mogelijk worden vermeden.
                           
                        TESTOPZET
                  
                              17.
                           
                           
                              De testopzet heeft betrekking op het aantal testconcentraties en de factor waarmee ze van elkaar verschillen, het aantal vaten per concentratieniveau en het aantal larven per vat. Er wordt een beschrijving gegeven van testopzetten voor de puntschatting van de EC, de schatting van de NOEC en de uitvoering van een limiettest. Regressieanalyse heeft de voorkeur boven toetsing van een hypothese.
                           
                        
                     Opzet voor regressieanalyse
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              De in de test gebruikte concentraties moeten de effectconcentratie (bv. EC15 en EC50) en het concentratiebereik waarbinnen het effect van de teststof van belang is omvatten. In het algemeen nemen de nauwkeurigheid en in het bijzonder de geldigheid van schattingen van de effectconcentraties (ECx) toe als de effectconcentratie binnen het geteste concentratiebereik ligt. Extrapolaties ver onder de laagste positieve concentratie of boven de hoogste concentraties moeten worden vermeden. Om het concentratiebereik te kiezen, kan een preliminaire bereikbepalingstest worden uitgevoerd (zie punt 27).
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Als een ECx-schatting moet worden gemaakt, worden ten minste vijf concentraties in triplo getest. In alle gevallen is het raadzaam bij voldoende concentraties te testen om een goede modelschatting mogelijk te maken. Het verschil tussen de concentraties mag niet meer dan factor 2 bedragen (als de dosis-responscurve een geringe helling vertoont, kan hiervan worden afgeweken). Het aantal duplo’s voor elke testgroep kan worden verlaagd wanneer het aantal testconcentraties met een verschillende respons wordt verhoogd. Als het aantal duplo’s wordt verhoogd of de intervallen tussen de testconcentraties worden verkleind, worden de betrouwbaarheidsintervallen van de test gewoonlijk kleiner. Als een schatting van de overleving en de groei van larven na tien dagen moet worden gemaakt, zijn aanvullende duplo’s vereist.
                           
                        
                     Opzet voor de schatting van een NOEC/LOEC
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Als een LOEC- of NOEC-schatting moet worden gemaakt, worden vijf concentraties getest met ten minste vier duplo’s en mag het verschil tussen de concentraties niet meer dan factor 2 bedragen. Het aantal duplo’s moet toereikend zijn om voldoende onderscheidend vermogen te waarborgen om een verschil van 20 % met de controlegroep te kunnen vaststellen bij een significantieniveau van 5 % (p = 0,05). Het ontwikkelingstempo kan gewoonlijk worden bepaald met een variantieanalyse (ANOVA), zoals de toets van Dunnett of Williams (17)(18)(19)(20). Voor het uitkomstquotiënt kan de toets van Cochran-Armitage, de exacte toets van Fisher (met correctie van Bonferroni) of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt.
                           
                        
                     Limiettest
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Als in de preliminaire bereikbepalingstest geen effecten zijn waargenomen, kan een limiettest worden uitgevoerd (één testconcentratie en controlegroep). De limiettest dient om aanwijzingen te verzamelen dat de toxische waarde van de teststof groter is dan de geteste limietconcentratie. Er kan geen concentratie voor deze testmethode worden aanbevolen; die wordt aan het oordeel van de regelgever overgelaten. Gewoonlijk zijn zes duplo’s voor zowel de testgroep als de controlegroep nodig. Aangetoond moet worden dat het onderscheidend vermogen groot genoeg is om een verschil van 20 % met de controlegroep te kunnen vaststellen bij een significantieniveau van 5 % (p = 0,05). Voor de meetrespons (ontwikkelingstempo en gewicht) is de T-toets een geschikte statistische methode, mits de gegevens aan de voorwaarden van deze toets voldoen (normale verdeling, homogene variantie). Als niet aan die voorwaarden wordt voldaan, kan de T-toets voor ongelijke variantie of een verdelingsvrije toets, zoals de Wilcoxon-Mann-Whitney-toets, worden gebruikt. Voor het uitkomstquotiënt is de exacte toets van Fisher geschikt.
                           
                        PROCEDURE
                  
                     Blootstellingsomstandigheden
                  
                  
                     Voorbereiding van het verrijkt water-sedimentsysteem
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              In de testvaten wordt voldoende kunstmatig sediment (zie de punten 13-14 en aanhangsel 3) aangebracht om een laag van ten minste 1,5 cm te vormen. Vervolgens wordt een 6 cm diepe laag water toegevoegd (zie punt 15). De verhouding tussen de dikte van de sedimentlaag en de diepte van het water mag niet groter zijn dan 1:4 en de sedimentlaag mag niet dikker zijn dan 3 cm. Laat het sediment-watersysteem onder voorzichtige beluchting zeven dagen rusten voordat de testorganismen worden toegevoegd (zie punt 14 en aanhangsel 3). Om te voorkomen dat tijdens de toevoeging van testwater aan de waterkolom bestanddelen zich van het sediment afscheiden en fijn materiaal in suspensie wordt gebracht, kan het sediment tijdens het gieten worden afgedekt met een kunststof schijf, die onmiddellijk daarna wordt verwijderd. Ook andere middelen kunnen geschikt zijn.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              De testvaten worden (bijvoorbeeld met glasplaten) bedekt. Om verdampingsverliezen te compenseren, kan het waterniveau tijdens de studie worden aangevuld tot het oorspronkelijke volume. Om te voorkomen dat zouten ontstaan, moet hiervoor gedestilleerd of gedeïoniseerd water worden gebruikt.
                           
                        
                     Toevoeging van testorganismen
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Vier tot vijf dagen voordat de testorganismen aan de testvaten worden toegevoegd, worden eipakketten uit de kweken genomen en in kleine vaten in een kweekmedium geplaatst. Er kan ouder medium uit de voorraadcultuur of vers bereid medium worden gebruikt. In het laatste geval wordt aan het kweekmedium een kleine hoeveelheid voedsel, zoals groene algen en/of enkele druppels filtraat uit een fijngemalen suspensie van visvoervlokken, toegevoegd (zie aanhangsel 2). Er worden alleen vers afgezette eipakketten gebruikt. Normaliter beginnen de larven enkele dagen nadat de eieren zijn gelegd (twee tot drie dagen voor Chironomus riparius bij 20 °C en één tot vier dagen voor Chironomus tentans bij 23 °C en Chironomus yoshimatsui bij 25 °C) uit te komen en vindt de groei van de larven plaats in vier stadia die elk vier-acht dagen duren. Voor de test worden larven in het eerste stadium (twee-drie of één-vier dagen na uitkomen) gebruikt. Het stadium van muggen kan mogelijk worden gecontroleerd aan de hand van de breedte van het epicranium (6).
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Twintig larven in het eerste stadium worden met een stompe pipet willekeurig verdeeld over de testvaten met verrijkt sediment en water. Tijdens het inbrengen van de larven in de testvaten en de eerste 24 uur daarna wordt de beluchting van het water uitgezet (zie de punten 24 en 32). Afhankelijk van de testopzet (zie de punten 19 en 20) bedraagt het aantal larven dat per concentratie wordt gebruikt ten minste 60 voor de EC-puntschatting en 80 voor de NOEC-bepaling.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              24 uur na toevoeging van de larven wordt de bovenliggende waterkolom met de teststof verrijkt, waarna weer lichte beluchting wordt toegepast. Onder het wateroppervlak worden met een pipet kleine hoeveelheden van de teststofoplossing ingebracht. Vervolgens wordt het bovenliggende water voorzichtig gemengd, zonder het sediment te verstoren.
                           
                        
                     Testconcentraties
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Om het concentratiebereik van de test te bepalen, kan een bereikbepalingstest worden uitgevoerd. Daarvoor wordt een reeks sterk gespreide concentraties van de teststof gebruikt. Om te zorgen voor dezelfde oppervlaktedichtheid per Chironomus als in de eigenlijke test, worden de Chironomidae aan elke concentratie van de teststof blootgesteld gedurende een periode die een schatting van de wenselijke testconcentraties mogelijk maakt, en zijn geen duplo’s vereist.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              De testconcentraties voor de eigenlijke test worden gebaseerd op de uitkomsten van de bereikbepalingstest. Er moeten ten minste vijf concentraties worden gebruikt en geselecteerd, zoals beschreven in de punten 18 tot en met 20.
                           
                        
                     Controlegroep
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              De test omvat controlevaten zonder teststof maar met sediment, met het vereiste aantal duplo’s (zie de punten 19-20). Indien voor het aanbrengen van de teststof een oplosmiddel is gebruikt (zie punt 16), wordt een controlegroep voor het oplosmiddel in het sediment toegevoegd.
                           
                        
                     Testsysteem
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Er worden statische systemen gebruikt. In uitzonderlijke gevallen kunnen semistatische of doorstroomsystemen met onderbroken of continue verversing van het bovenliggende water worden gebruikt, bijvoorbeeld als de kwaliteitsspecificaties voor het water niet geschikt zijn voor het testorganisme of het chemische evenwicht wordt aangetast (te laag gehalte opgeloste zuurstof, te hoge concentratie excretieproducten, uit het sediment vrijkomende mineralen, gewijzigde pH en/of waterhardheid enz.). Gewoonlijk kan de kwaliteit van het bovenliggende water echter met andere methoden, zoals beluchting, worden verbeterd; deze verdienen de voorkeur.
                           
                        
                     Voedsel
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              De larven moeten, bij voorkeur dagelijks of ten minste drie keer per week, worden gevoerd. Voor jonge larven lijkt in de eerste tien dagen 0,25-0,5 mg visvoer (een suspensie in water of fijngemalen voedsel, bv. TetraMin of TetraPhyll; zie details in aanhangsel 2) per larve per dag voldoende te zijn (0,35-0,5 mg voor C. yoshimatsui). Oudere larven kunnen iets meer voedsel nodig hebben: tijdens de rest van de test zou 0,5-1 mg per larve per dag moeten volstaan. Als schimmelgroei wordt waargenomen of sterfte in de controlegroepen wordt geconstateerd, moet het voedselrantsoen in alle test- en controlegroepen worden verlaagd. Als de schimmelontwikkeling niet kan worden gestopt, moet de test worden herhaald. Voor sterk adsorberende stoffen (bijvoorbeeld met log Kow > 5) of voor stoffen die een covalente binding met het sediment aangaan kan de voor de overleving en natuurlijke groei van de organismen vereiste hoeveelheid voedsel vóór de stabilisatieperiode aan het kunstmatige sediment worden toegevoegd. In dat geval wordt in plaats van visvoer plantaardig materiaal gebruikt, bv. 0,5 % (drooggewicht) fijngemalen bladeren van bv. brandnetel (Urtica dioica), witte moerbei (Morus alba), witte klaver (Trifolium repens), spinazie (Spinacia oleracea) of ander plantaardig materiaal (Cerophyl of alfacellulose).
                           
                        
                     Incubatieomstandigheden
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              In het bovenliggende water in de testvaten wordt bij voorkeur 24 uur na toevoeging van de larven voorzichtige beluchting toegepast en gedurende de test voortgezet (waarbij erop moet worden gelet dat het gehalte aan opgeloste zuurstof niet lager wordt dan 60 % van de ASV). De beluchting vindt plaats via een glazen pasteurpipet die 2-3 cm boven de sedimentlaag wordt bevestigd (bv. één of enkele luchtbellen/s). Als vluchtige stoffen worden getest, kan worden overgewogen het sediment-watersysteem niet te beluchten.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              De test wordt verricht bij een constante temperatuur van 20 °C (± 2 °C). Voor C. tentans en C. yoshimatsui bedraagt de aanbevolen temperatuur respectievelijk 23 °C en 25 °C (± 2 °C). Er wordt een fotoperiode van 16 uur gebruikt bij een lichtintensiteit van 500 tot 1 000 lux.
                           
                        
                     Blootstellingsduur
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              De blootstelling begint bij toevoeging van larven aan de verrijkte vaten en de controlevaten. De maximale blootstellingsduur bedraagt 28 dagen voor C. riparius en C. yoshimatsui, en 65 dagen voor C. tentans. Als eerder muggen uitkomen, kan de test worden beëindigd nadat minimaal vijf dagen zijn verstreken na verschijning van de laatste volwassen mug in de controlegroep.
                           
                        WAARNEMINGEN
                  
                     Uitkomst van muggen
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              De ontwikkelingstijd en het totale aantal volledig uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen worden bepaald. Mannetjes zijn gemakkelijk te herkennen aan hun veerachtige antennes.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              De testvaten worden ten minste drie keer per week geobserveerd om een visuele beoordeling van eventueel afwijkend gedrag te verrichten (bv. verlating van het sediment, ongewoon zwemgedrag), waarbij met de controlegroep wordt vergeleken. In de periode waarin verwacht wordt dat de muggen uitkomen, moet dagelijks een telling van de uitgekomen muggen worden verricht. Dagelijks worden het aantal volledig uitgekomen muggen en hun geslacht geregistreerd. Na identificatie worden de muggen uit de vaten verwijderd. Als er voor het eind van de test eipakketten zijn afgezet, worden deze geregistreerd en vervolgens verwijderd om te voorkomen dat opnieuw larven in het sediment terechtkomen. Ook wordt geregistreerd hoeveel zichtbare poppen niet zijn uitgekomen. Aanhangsel 5 bevat aanwijzingen voor de meting van het uitkomen.
                           
                        
                     Groei en overleving
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Als gegevens over de overleving en groei van larven na tien dagen vereist zijn, wordt bij het begin gezorgd voor extra testvaten, die voor de voortzetting worden gebruikt. Het sediment van deze aanvullende vaten wordt door een 250 μm-zeef gevoerd, zodat de larven overblijven. De criteria voor „dood” zijn immobiliteit of geen reactie op een mechanische prikkel. Niet meer aangetroffen larven moeten als dode larven worden geteld (aan het begin van de test gestorven larven kunnen door microben zijn afgebroken). Het (asvrije) drooggewicht van de overlevende larven per testvat wordt bepaald en op grond daarvan wordt het gemiddelde individuele drooggewicht per vat berekend. Het is nuttig om te bepalen in welk stadium de overlevende larven zich bevinden; dit kan door de breedte van het epicranium van elk individu te meten.
                           
                        
                     Analytische bepalingen
                  
                  
                     Concentratie van de teststof
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Er moeten ten minste bij de hoogste en een lagere concentratie monsters van het bovenliggende water, het poriewater en het sediment worden geanalyseerd bij het begin (bij voorkeur een uur na inbrenging van de teststof) en eind van de test. Deze bepalingen van de concentratie van de teststof leveren informatie op over het gedrag en de verdeling van de teststof in het water-sedimentsysteem. Aangezien bemonstering van het sediment bij het begin van de test van invloed kan zijn op het testsysteem (bv. doordat de testlarven worden verwijderd), moeten voor de analytische bepalingen bij het begin van de test en tijdens de test zo nodig aanvullende testvaten worden gebruikt (zie punt 39). Als in een water/sedimentstudie onder vergelijkbare omstandigheden (bv. verhouding sediment/water, soort toepassing, organischekoolstofgehalte van het sediment) de verdeling van de teststof tussen het water en het sediment duidelijk is bepaald, kunnen metingen in het sediment niet noodzakelijk zijn.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Wanneer tussenliggende metingen worden verricht (bv. op dag 7) en voor de analyse grotere monsters nodig zijn die niet uit de testvaten kunnen worden genomen zonder het testsysteem te beïnvloeden, worden analytische bepalingen verricht op monsters uit aanvullende testvaten die op dezelfde wijze zijn behandeld (inclusief toevoeging van testorganismen), maar niet voor biologische waarnemingen zijn gebruikt.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Om het poriewater te isoleren, wordt aanbevolen te centrifugeren, bijvoorbeeld 30 min bij 10 000 g en een temperatuur van 4 °C. Filtratie kan ook aanvaardbaar zijn, mits aangetoond is dat de teststof niet aan filters adsorbeert. In sommige gevallen kan analyse van de concentraties in het poriewater onmogelijk zijn doordat het monster te klein is.
                           
                        
                     Fysisch-chemische eigenschappen
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              De pH, het gehalte aan opgeloste zuurstof in het testwater en de temperatuur van de testvaten moeten op een geschikte wijze worden gemeten (zie punt 10). De hardheid en het ammoniagehalte moeten bij het begin en het eind van de test in de controlevaten en in één testvat worden gemeten bij de hoogste concentratie.
                           
                        GEGEVENS EN RAPPORTAGE
                  
                     Verwerking van de resultaten
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Doel van deze test is het bepalen van het effect van de teststof op het ontwikkelingstempo en het totale aantal volledig uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen, of bij de tiendaagse test de effecten op de overleving en het gewicht van de larven. Als er geen aanwijzingen zijn voor een statistisch verschil in gevoeligheid tussen de geslachten, kunnen de resultaten voor mannetjes en vrouwtjes worden samengevoegd voor statistische analysen. Het verschil in gevoeligheid tussen de geslachten kan statistisch worden beoordeeld met bv. een χ2-r × 2 -toets. Zo nodig worden na tien dagen de overleving en het gemiddelde individuele drooggewicht per vat van de larven bepaald.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Bij voorkeur aan de hand van de bij het begin van de test gemeten concentraties (zie punt 38) worden effectconcentraties berekend, die als concentratie in het bovenliggende water worden uitgedrukt.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Voor de berekening van een puntschatting voor de EC50 of enige andere ECx kunnen de gegevens per vat als echte replicaties worden gebruikt. Bij de berekening van een betrouwbaarheidsinterval voor elke ECx moet rekening worden gehouden met de variabiliteit tussen vaten, tenzij wordt aangetoond dat deze verwaarloosbaar is. Wanneer voor het model de kleinstekwadratenmethode wordt toegepast, worden de gegevens per vat getransformeerd om de homogeniteit van de variantie te vergroten. Voordat de ECx-waarden worden berekend, moet de respons echter zijn teruggetransformeerd naar de oorspronkelijke waarde.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Wanneer de statistische analyse dient om de NOEC/LOEC te bepalen door toetsing van een hypothese, moet rekening worden gehouden met de variabiliteit tussen vaten, bv. met een geneste ANOVA. Als de gebruikelijke ANOVA-aannamen niet opgaan, kunnen robuustere tests (21) wenselijk zijn.
                           
                        
                     Uitkomstquotiënt
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Het uitkomstquotiënt betreft een binaire respons en kan, wanneer een monotone dosisrespons wordt verwacht en de gegevens consistent zijn met die verwachting, worden geanalyseerd met de toets van Cochran-Armitage, toegepast met stapjes omlaag. Als dit niet het geval is, kan de exacte toets van Fisher of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt, met volgens Bonferroni-Holm gecorrigeerde p-waarden. Als er aanwijzingen zijn dat de variabiliteit tussen duplo’s met dezelfde concentratie groter is dan een binomiale verdeling zou uitwijzen (zogeheten „extrabinomiale” variantie), moet een robuuste toets van Cochran-Armitage of een exacte toets van Fisher, zoals voorgesteld in punt 21, worden gebruikt.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Het aantal uitgekomen muggen per vat, ne, wordt bepaald en gedeeld door het aantal in het vat gestopte larven, na:
                              
                                 
                              waarbij:
                              
                                          ER
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          uitkomstquotiënt (emergence ratio);
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          aantal uitgekomen muggen per vat;
                                       
                                    
                                          na
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          aantal larven dat in één vat is gestopt.
                                       
                                    
                        
                              48.
                           
                           
                              Bij wijze van alternatief, dat vooral voor grote monsters geschikt is, kan, wanneer een monotone dosisrespons wordt verwacht en de gegevens over het uitkomstquotiënt consistent zijn met die verwachting, het uitkomstquotiënt in geval van extrabinomiale variantie als een continue respons worden behandeld en kunnen procedures als de toets van Williams worden gebruikt. Wanneer er geen sprake is van een monotone dosisrespons, kan de toets van Dunnett geschikt zijn. Als „grote” monsters worden hier beschouwd monsters waarvan per duplo (vat) zowel het aantal uitgekomen als het aantal niet-uitgekomen muggen groter is dan vijf.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Voordat ANOVA-methoden worden toegepast, moeten de waarden van het uitkomstquotiënt eerst een hoektransformatie of een freeman-tukeytransformatie ondergaan om een approximatieve normale verdeling te verkrijgen en de variantie te egaliseren. Wanneer de absolute frequenties worden gebruikt, kan de toets van Cochran-Armitage, de exacte toets van Fisher (Bonferroni) of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt. De hoektransformatie wordt uitgevoerd door de arcsinus (sin–1) van de vierkantswortel van het uitkomstquotiënt te nemen.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Voor uitkomstquotiënten worden de ECx-waarden berekend door middel van regressieanalyse (of bv. probit (22), logit, Weibull, geschikte commerciële software enz.). Als geen regressieanalyse mogelijk is (bv. als er minder dan twee partiële responsen zijn), worden andere niet-parametrische methoden, zoals voortschrijdend gemiddelde of eenvoudige interpolatie, gebruikt.
                           
                        
                     Ontwikkelingstempo
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Met de gemiddelde ontwikkelingstijd wordt bedoeld de gemiddelde tijd tussen het moment waarop de larven in het vat worden gestopt (dag 0 van de test) en het moment waarop de experimentele cohort muggen uitkomt (voor de berekening van de werkelijke ontwikkelingstijd moet rekening worden gehouden met de leeftijd van de larven op het moment van inbrengen). Het ontwikkelingstempo is de reciproke waarde van de ontwikkelingstijd (eenheid: dag–1) en staat voor het deel van de larvenontwikkeling dat per dag plaatsvindt. Het ontwikkelingstempo heeft de voorkeur voor de evaluatie van deze sedimenttoxiciteitsstudies, omdat deze in vergelijking met de ontwikkelingstijd een kleinere variantie en een grotere homogeniteit heeft en de normale verdeling beter benadert. Daarom kunnen sterke parametrische testprocedures beter op het ontwikkelingstempo dan op de ontwikkelingstijd worden toegepast. Voor het ontwikkelingstempo als continue respons kunnen ECx = waarden worden geschat door middel van regressieanalyse (bv. (23)(24)).
                           
                        
                              52.
                           
                           Bij de volgende statistische tests wordt aangenomen dat het op inspectiedag x waargenomen aantal muggen is uitgekomen in het midden van het tijdsinterval tussen dag x en dag x-l (l = lengte van het inspectie-interval, doorgaans één dag). Het gemiddelde ontwikkelingstempo per vat (
                                 ) wordt als volgt berekend:
                                 
                              waarbij:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          gemiddeld ontwikkelingstempo per vat;
                                       
                                    
                                          i
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          index van het inspectie-interval;
                                       
                                    
                                          m
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          maximumaantal inspectie-intervallen;
                                       
                                    
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          in inspectie-interval i uitgekomen aantal muggen;
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          totaal aantal uitgekomen muggen aan het eind van de proef ()
                                       
                                    
                                          xi
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          ontwikkelingstempo van de in interval i uitgekomen muggen;
                                       
                                    
                                 
                              waarbij:
                              
                                          dayi
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          inspectiedag (dagen na aanbrengen);
                                       
                                    
                                          li
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          lengte van inspectie-interval i (dagen, gewoonlijk één dag).
                                       
                                    
                        
                     Testverslag
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden opgenomen:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Teststof:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fysische toestand en, indien relevant, fysisch-chemische kenmerken (oplosbaarheid in water, dampspanning, verdelingscoëfficiënt in de bodem (of in sediment, indien beschikbaar), stabiliteit in water enz.);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identificatiegegevens van de stof (triviale naam, chemische naam, structuurformule, CAS-nummer enz.) met inbegrip van de zuiverheid en de analysemethode voor de kwantitatieve bepaling van de teststof.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Diersoort:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gebruikte proefdieren: soort, wetenschappelijke naam, bron van de organismen en kweekomstandigheden;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informatie over de hantering van eipakketten en larven;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      leeftijd van de proefdieren op het moment waarop zij in de testvaten werden gestopt.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testomstandigheden:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gebruikt sediment, d.w.z. natuurlijk of kunstmatig sediment;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      voor natuurlijk sediment: de locatie en beschrijving van de sedimentmonsternemingsplaats inclusief, indien mogelijk, vervuilingsgeschiedenis; eigenschappen: pH, gehalte aan organische koolstof, C/N-verhouding en korrelgrootteverdeling (indien van toepassing);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bereiding van het kunstmatige sediment: ingrediënten en eigenschappen (gehalte aan organische koolstof, pH, vocht enz. bij het begin van de test);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bereiding van het testwater (bij gebruik van synthetisch water) en eigenschappen (zuurstofgehalte, pH, geleidbaarheid, hardheid enz. bij het begin van de test);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dikte van de sedimentlaag en diepte van het bovenliggende water;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      volume van het bovenliggende en poriewater; gewicht van het natte sediment met en zonder poriewater;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      testvaten (materiaal en afmetingen);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bereidingswijze van stamoplossingen en testconcentraties;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aanbrenging van de teststof: toegepaste testconcentraties, aantal duplo’s en eventueel gebruik van oplosmiddel;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      incubatieomstandigheden: temperatuur, lichtcyclus en -intensiteit, beluchting (frequentie en intensiteit);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      details over het voedsel, met inbegrip van soort voedsel, bereiding, hoeveelheid en voederregime.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Resultaten:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de nominale testconcentraties, de gemeten testconcentraties en de resultaten van alle analysen die zijn verricht om de concentratie van de teststof in het testvat te bepalen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kwaliteit van het water in de testvaten, d.w.z. pH, temperatuur, opgeloste zuurstof, hardheid en ammonia;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vervanging van verdampt testwater, indien van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aantal uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen per vat en per dag;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aantal niet tot mug ontwikkelde larven per vat;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gemiddeld individueel drooggewicht van de larven per vat, en per stadium, indien van toepassing;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      percentage uitgekomen muggen per vat en testconcentratie (mannelijke en vrouwelijke muggen gecombineerd);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gemiddeld ontwikkelingstempo van volledig uitgekomen muggen per duplo en behandeling (mannelijke en vrouwelijke muggen gecombineerd);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      schattingen van toxische eindpunten, bv. ECx (met bijbehorende betrouwbaarheidsintervallen), NOEC en/of LOEC, en de statistische methoden waarmee zij zijn bepaald;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bespreking van de resultaten, met inbegrip van een eventuele beïnvloeding van de resultaten van de test die een gevolg is van afwijkingen van deze testmethode.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATUUR:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Hoofdstuk C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531.
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48:577-585.
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.
                           
                        
                              (23)
                           
                           
                              Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494.
                           
                        
                              (24)
                           
                           
                              Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312.
                           
                        
                     Aanhangsel 1
                     DEFINITIES
                     Voor de toepassing van deze methode wordt verstaan onder:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kunstmatig sediment (ook wel bereid, gereconstitueerd of synthetisch sediment genoemd): een mengsel van materialen waarmee de fysische bestanddelen van natuurlijk sediment worden nagebootst.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bovenliggend water: het water dat in het testvat op het sediment wordt gegoten.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Poriewater (ook wel interstitieel water genoemd): het water in de ruimten tussen de sediment- en bodemdeeltjes.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Verrijkt water: testwater waaraan teststof is toegevoegd.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Teststof: alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.
                              
                           
                  
                     Aanhangsel 2
                     
                        Aanbevelingen voor de kweek van Chironomus riparius
                        
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Larven van Chironomus kunnen worden gekweekt in kristalliseerschalen of grotere houders. Op de bodem van de houder wordt een 5 tot 10 mm dikke laag fijn kwartszand gestrooid. Ook kiezelgoer (bv. Merck, Art 8117) is geschikt gebleken als substraat (in dat geval volstaat een dunnere laag van slechts enkele mm). Vervolgens wordt een enkele cm diepe laag geschikt water toegevoegd. Om verdampingsverliezen te compenseren en uitdroging te voorkomen, worden de waterniveaus zo nodig aangevuld. Indien nodig kan het water worden vervangen. Er wordt voorzichtige beluchting toegepast. De larvenkweekvaten worden in een geschikte kooi geplaatst, zodat de volwassen muggen niet kunnen ontsnappen. De kooi moet groot genoeg zijn om de uitgekomen volwassen muggen te laten zwermen, omdat anders mogelijk niet wordt gecopuleerd (ten minste ca. 30 × 30 × 30 cm).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 De kooien worden op kamertemperatuur of in een kamer met een constant klimaat bij 20 ± 2 °C gehouden, met een lichtregime van 16 uur licht (intensiteit ca. 1 000 lux), 8 uur donker. Gerapporteerd is dat een relatieve luchtvochtigheid van minder dan 60 % de voortplanting kan belemmeren.
                              
                           
                        Verdunningswater
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Elk geschikt natuurlijk of synthetisch water kan worden gebruikt. Gebruikelijk zijn bronwater, ontchloord kraanwater en kunstmatige media (bv. Elendt-media M4 en M7, zie hieronder). Voor gebruik moet het water worden belucht. Indien nodig kan het kweekwater worden ververst door voorzichtig het gebruikte water uit de kweekvaten te gieten of hevelen zonder de larvenhulzen te beschadigen.
                              
                           
                        Toediening van voedsel aan larven
                     
                     
                                 4.
                              
                              
                                 De larven van Chironomus worden dagelijks gevoerd met ongeveer 250 mg visvoervlokken (TetraMin®, TetraPhyll® of een soortgelijk merk visvoer) per vat. Dit voer kan worden gegeven als droog gemalen poeder of als suspensie in water: aan 20 ml verdunningswater wordt 1,0 g voedervlokken toegevoegd en gemengd, zodat een homogeen mengsel ontstaat. Van dit mengsel kan ongeveer 5 ml per vat per dag worden gebruikt (schudden voor gebruik). Aan oudere larven kan meer voer worden gegeven.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Het voedsel wordt aangepast op basis van de waterkwaliteit. Als het kweekmedium troebel wordt, wordt de hoeveelheid voedsel verminderd. De toediening van voedsel moet zorgvuldig worden geobserveerd. Als te weinig voer wordt gegeven, zullen de larven naar de waterkolom uitwijken; als te veel voer wordt gegeven, neemt de microbiële activiteit toe en daalt het zuurstofgehalte. Beide condities kunnen tot lagere groeisnelheden leiden.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Wanneer nieuwe kweekvaten worden ingericht, kunnen ook enige cellen van groene algen (bv. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) worden toegevoegd.
                              
                           
                        Toediening van voedsel aan uitgekomen volwassen muggen
                     
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Enkele onderzoekers hebben erop gewezen dat een in een sacharoseoplossing gedrenkt wattenschijfje als voedsel kan dienen voor uitgekomen volwassen muggen.
                              
                           
                        Uitkomst van muggen
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 In de larvenkweekvaten zullen zich bij 20 ± 2 °C na ongeveer 13-15 dagen volwassen muggen ontwikkelen. Mannetjes zijn gemakkelijk te herkennen aan hun veerachtige antennes.
                              
                           
                        Eipakketten
                     
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Zodra in de kweekkooi volwassen muggen aanwezig zijn, worden alle larvenkweekvaten drie keer per week gecontroleerd op afgezette geleiachtige eipakketten. Als eipakketten aanwezig zijn, worden zij voorzichtig verwijderd. Zij worden overgebracht naar een klein schaaltje met een monster van het kweekwater. De eipakketten worden gebruikt om een nieuw kweekvat te beginnen (bv. 2-4 eipakketten per vat) of worden voor toxiciteitstests gebruikt.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Larven in het eerste stadium moeten na twee-drie dagen uitkomen.
                              
                           
                        Inrichting van nieuwe kweekvaten
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Zodra kweken zijn opgezet, moet het mogelijk zijn één keer per week, of minder vaak naargelang de testvoorschriften, een vers larvenkweekvat in te richten, waarbij de oudere vaten worden verwijderd nadat zich volwassen muggen hebben ontwikkeld. Dit systeem zorgt voor een regelmatige aanvoer van volwassen muggen met een minimum aan beheer.
                              
                           
                        Bereiding van de testoplossingen M4 en M7
                     
                     
                                 12.
                              
                              
                                 Elendt (1990) heeft het medium M4 beschreven. Het medium M7 wordt op dezelfde wijze als M4 bereid, maar met een vier keer zo lage concentratie van de in tabel 1 vermelde stoffen. Er is een publicatie over het medium M7 in voorbereiding (persoonlijk medegedeeld door Elendt). De testoplossing mag niet volgens Elendt en Bias (1990) worden bereid, omdat de voor de stamoplossingen vermelde concentraties van NaSiO3 5H2O, NaNO3, KH2PO4 en K2HPO4 niet geschikt zijn.
                              
                           
                        Bereiding van het medium M7
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Elke stamoplossing (I) wordt apart bereid en met deze stamoplossingen (I) wordt een gecombineerde stamoplossing (II) bereid (zie tabel 1). Het medium M7 wordt bereid uit 50 ml gecombineerde stamoplossing (II) en de in tabel 2 vermelde hoeveelheden van elke stamoplossing van macronutriënten en tot 1 liter gedeïoniseerd water aangevuld. Een vitaminestamoplossing wordt bereid door overeenkomstig tabel 3 drie vitaminen toe te voegen aan gedeïoniseerd water; kort voor gebruik wordt 0,1 ml van de gecombineerde vitaminestamoplossing aan het definitieve medium M7 toegevoegd (de vitaminestamoplossing wordt in bevroren toestand in kleine porties bewaard.) Het medium wordt belucht en gestabiliseerd.
                                 
                                    Tabel 1
                                 
                                 
                                    Stamoplossingen van spoorelementen voor de media M4 en M7
                                 
                                 
                                             Stamoplossingen (I)
                                          
                                          
                                             Hoeveelheid (mg) aangevuld tot 1 liter gedeïoniseerd water
                                          
                                          
                                             Gecombineerde stamoplossing (II) bereiden door de volgende hoeveelheden (ml) van de stamoplossingen (I) te mengen en tot 1 liter gedeïoniseerd water aan te vullen
                                          
                                          
                                             Uiteindelijke concentraties in testoplossingen (mg/l)
                                          
                                       
                                             M4
                                          
                                          
                                             M7
                                          
                                          
                                             M4
                                          
                                          
                                             M7
                                          
                                       
                                             H3BO3
                                                 (18)
                                             
                                          
                                          
                                             57 190
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             2,86
                                          
                                          
                                             0,715
                                          
                                       
                                             MnCl2 • 4 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             7 210
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,361
                                          
                                          
                                             0,090
                                          
                                       
                                             LiCl (18)
                                             
                                          
                                          
                                             6 120
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,306
                                          
                                          
                                             0,077
                                          
                                       
                                             RbCl (18)
                                             
                                          
                                          
                                             1 420
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,071
                                          
                                          
                                             0,018
                                          
                                       
                                             SrCl2 • 6 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             3 040
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,152
                                          
                                          
                                             0,038
                                          
                                       
                                             NaBr (18)
                                             
                                          
                                          
                                             320
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,016
                                          
                                          
                                             0,004
                                          
                                       
                                             Na2MoO4 • 2 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             1 260
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,063
                                          
                                          
                                             0,016
                                          
                                       
                                             CuCl2 • 2 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             335
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,017
                                          
                                          
                                             0,004
                                          
                                       
                                             ZnCl2
                                             
                                          
                                          
                                             260
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,013
                                          
                                          
                                             0,013
                                          
                                       
                                             CaCl2 • 6 H2O
                                          
                                          
                                             200
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,010
                                          
                                          
                                             0,010
                                          
                                       
                                             KI
                                          
                                          
                                             65
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,0033
                                          
                                          
                                             0,0033
                                          
                                       
                                             Na2SeO3
                                             
                                          
                                          
                                             43,8
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,0022
                                          
                                          
                                             0,0022
                                          
                                       
                                             NH4VO3
                                             
                                          
                                          
                                             11,5
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,00058
                                          
                                          
                                             0,00058
                                          
                                       
                                             Na2EDTA • 2 H2O (18)
                                                 (19)
                                             
                                          
                                          
                                             5 000
                                          
                                          
                                             20,0
                                          
                                          
                                             5,0
                                          
                                          
                                             2,5
                                          
                                          
                                             0,625
                                          
                                       
                                             FeSO4 • 7 H2O (18)
                                                 (19)
                                             
                                          
                                          
                                             1 991
                                          
                                          
                                             20,0
                                          
                                          
                                             5,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,249
                                          
                                       
                                    Tabel 2
                                 
                                 
                                    Stamoplossingen van macronutriënten voor de media M4 en M7
                                 
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Hoeveelheid aangevuld tot 1 liter gedeïoniseerd water
                                             (mg)
                                          
                                          
                                             Hoeveelheid stamoplossing van macronutriënten die wordt toegevoegd om de media M4 en M7 te bereiden
                                             (ml/l)
                                          
                                          
                                             Uiteindelijke concentraties in de testoplossingen M4 en M7
                                             (mg/l)
                                          
                                       
                                             CaCl2 • 2 H2O
                                          
                                          
                                             293 800
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             293,8
                                          
                                       
                                             MgSO4 • 7 H2O
                                          
                                          
                                             246 600
                                          
                                          
                                             0,5
                                          
                                          
                                             123,3
                                          
                                       
                                             KCl
                                          
                                          
                                             58 000
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             5,8
                                          
                                       
                                             NaHCO3
                                             
                                          
                                          
                                             64 800
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             64,8
                                          
                                       
                                             NaSiO3 • 9 H2O
                                          
                                          
                                             50 000
                                          
                                          
                                             0,2
                                          
                                          
                                             10,0
                                          
                                       
                                             NaNO3
                                             
                                          
                                          
                                             2 740
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,274
                                          
                                       
                                             KH2PO4
                                             
                                          
                                          
                                             1 430
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,143
                                          
                                       
                                             K2HPO4
                                             
                                          
                                          
                                             1 840
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,184
                                          
                                       
                                    Tabel 3
                                 
                                 
                                    Vitaminestamoplossing voor de media M4 en M7
                                 
                                 De drie vitamineoplossingen worden tot één vitaminestamoplossing samengevoegd.
                                 
                                    
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Hoeveelheid aangevuld tot 1 liter gedeïoniseerd water
                                             (mg)
                                          
                                          
                                             Hoeveelheid vitaminestamoplossing die wordt toegevoegd om de media M4 en M7 te bereiden
                                             (ml/l)
                                          
                                          
                                             Uiteindelijke concentraties in de testoplossingen M4 en M7
                                             (mg/l)
                                          
                                       
                                             Thiaminehydrochloride
                                          
                                          
                                             750
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,075
                                          
                                       
                                             Cyanocobalamine (B12)
                                          
                                          
                                             10
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,0010
                                          
                                       
                                             Biotine
                                          
                                          
                                             7,5
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,00075
                                          
                                       
                           
                        LITERATUUR:
                     
                     BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
                     Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33.
                     Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167.
                  
                  
                     Aanhangsel 3
                     BEREIDING VAN KUNSTMATIG SEDIMENT
                     
                        Samenstelling van het sediment
                     
                     Het kunstmatige sediment wordt als volgt samengesteld:
                     
                                 Bestanddeel
                              
                              
                                 Eigenschappen
                              
                              
                                 % van het sediment
                                 (drooggewicht)
                              
                           
                                 Turf
                              
                              
                                 Veenmosturf, zo dicht mogelijk bij pH 5,5-6,0, zonder zichtbare plantenresten, fijngemalen (deeltjesgrootte ≤ 1 mm) en aan de lucht gedroogd
                              
                              
                                 4-5
                              
                           
                                 Kwartszand
                              
                              
                                 Korrelgrootte: > 50 % van de deeltjes moet binnen het bereik 50-200 μm liggen
                              
                              
                                 75-76
                              
                           
                                 Kaolienklei
                              
                              
                                 Met ≥ 30 % kaoliniet
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                 Organische koolstof
                              
                              
                                 Aangepast door toevoeging van turf en zand
                              
                              
                                 2 (± 0,5)
                              
                           
                                 Calciumcarbonaat
                              
                              
                                 CaCO3, poedervormig, chemisch zuiver
                              
                              
                                 0,05-0,1
                              
                           
                                 Water
                              
                              
                                 Geleidbaarheid ≤ 10 μS/cm
                              
                              
                                 30-50
                              
                           
                        Bereiding
                     
                     De turf wordt aan de lucht gedroogd en tot een fijn poeder vermalen. Er wordt een suspensie van de vereiste hoeveelheid turfpoeder in gedeïoniseerd water bereid met een kwalitatief hoogwaardig homogeniseerapparaat. De pH van deze suspensie wordt met CaCO3 aangepast tot 5,5 ± 0,5. De suspensie wordt ten minste twee dagen lang onder zachtjes roeren bij 20 ± 2 °C geconditioneerd om de pH te stabiliseren en een stabiele microbiële component te verkrijgen. De pH wordt opnieuw gemeten en moet nu 6,0 ± 0,5 bedragen. Vervolgens wordt de turfsuspensie met de andere bestanddelen (zand en kaolienklei) en gedeïoniseerd water vermengd om een homogeen sediment te verkrijgen met een watergehalte van 30-50 % van het drooggewicht van het sediment. De pH van het uiteindelijke mengsel wordt nogmaals gemeten en zo nodig met CaCO3 tot 6,5-7,5 aangepast. Er worden monsters van het sediment genomen om het drooggewicht en het gehalte aan organische koolstof te bepalen. Aanbevolen wordt het kunstmatige sediment, voordat het in een test ter bepaling van de toxiciteit voor Chironomidae wordt gebruikt, zeven dagen te laten rusten onder dezelfde omstandigheden die ook in de test zullen heersen.
                     
                        Opslag
                     
                     De droge bestanddelen voor de bereiding van het kunstmatige sediment kunnen op een droge en koele plaats bij kamertemperatuur worden bewaard. Het kunstmatige (natte) sediment mag niet worden opgeslagen voordat het in de test wordt gebruikt. Het moet onmiddellijk na afloop van de zevendaagse conditioneringsperiode die de bereiding afsluit, worden gebruikt.
                     
                        LITERATUUR:
                     
                     Hoofdstuk C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen.
                     Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20.
                  
                  
                     Aanhangsel 4
                     
                        Chemische eigenschappen van aanvaardbaar verdunningswater
                     
                     
                                 Stof
                              
                              
                                 Concentraties
                              
                           
                                 Vaste deeltjes
                              
                              
                                 < 20 mg/l
                              
                           
                                 Totaalgehalte aan organische koolstof
                              
                              
                                 < 2 mg/l
                              
                           
                                 Niet-geïoniseerde ammonia
                              
                              
                                 < 1 μg/l
                              
                           
                                 Hardheid uitgedrukt als CaCO3
                                 
                              
                              
                                 < 400 mg/l (20)
                                 
                              
                           
                                 Restchloorgehalte
                              
                              
                                 < 10 μg/l
                              
                           
                                 Totaalgehalte aan organofosfor-pesticiden
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Totaalgehalte aan organochloor-pesticiden en polychloorbifenylen
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Totaalgehalte aan organisch chloor
                              
                              
                                 < 25 ng/l
                              
                           
                  
                     Aanhangsel 5
                     
                        Richtsnoeren voor de monitoring van het uitkomen van larven van Chiromidae
                        
                     
                     Op de testglazen worden „emergence traps” geplaatst. Deze vallen zijn vanaf dag 20 tot het eind van de test nodig. Onderstaande tekening toont een voorbeeld van een gebruikte val:
                     
                        
                     
                                 A
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 nylon hor
                              
                           
                                 B
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 omgekeerde kunststofbekers
                              
                           
                                 C
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 bekerglas zonder tuit
                              
                           
                                 D
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 openingen met hor voor wateruitwisseling
                              
                           
                                 E
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 water
                              
                           
                                 F
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 sediment
                              
                           
                  C.29.   GEMAKKELIJKE BIOLOGISCHE AFBREEKBAARHEID — CO2 IN GESLOTEN VATEN (GASRUIMTETEST)
                  
                  INLEIDING
                  
                              1.
                           
                           
                              Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 310 (2006) van de OESO (TG 310). Deze testmethode is een schiftingsproef voor de beoordeling van de gemakkelijke biologische afbreekbaarheid van chemische stoffen en biedt soortgelijke informatie als de zes testmethoden die in hoofdstuk C.4 A tot en met F van deze bijlage worden beschreven. Derhalve kan een chemische stof waarvoor bij deze testmethode positieve resultaten worden geregistreerd, worden beschouwd als gemakkelijk biologisch afbreekbaar en daarom ook als snel afbreekbaar in het milieu.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              De erkende koolstofdioxidemethode (CO2-methode) (1), op basis van de oorspronkelijke Sturm-test (2) voor het beoordelen van de biologische afbreekbaarheid van organische chemische stoffen, waarbij het door microbiële activiteit geproduceerde koolstofdioxide wordt gemeten, is gewoonlijk de eerste keuze voor het testen van slecht oplosbare chemische stoffen en sterk adsorberende stoffen. Deze test wordt ook gekozen voor oplosbare (maar niet vluchtige) chemische stoffen, aangezien de ontwikkeling van koolstofdioxide door velen wordt beschouwd als het enige ondubbelzinnige bewijs van microbiële activiteit. De verwijdering van opgeloste organische koolstof kan worden bereikt door fysisch-chemische processen — adsorptie, vervluchtiging, neerslaan, hydrolyse — evenals door microbiële activiteit. Ook vele niet-biologische reacties verbruiken zuurstof; slechts zelden wordt CO2 op een abiotische manier geproduceerd uit organische chemische stoffen. In de oorspronkelijke en gewijzigde Sturm-test (1)(2) wordt CO2 verwijderd uit de vloeibare fase naar de absorptievaten door middel van uitwassen (d.w.z. met luchtbellen die behandeld zijn om CO2 uit het vloeibare medium te verwijderen), terwijl CO2 in de versie van Larson (3)(4) wordt overgebracht van het reactievat naar de absorptievaten door CO2-vrije lucht door de gasruimte te blazen en daarbij het testvat continu te schudden. Enkel in de gewijzigde versie van Larson wordt het reactievat geschud, terwijl roeren uitsluitend wordt gespecificeerd voor onoplosbare stoffen in ISO 9439 (5) en in de oorspronkelijke Amerikaanse versie (6), waarbij beide versies uitwassen in plaats van gasruimtevervanging specificeren. In een andere officiële Amerikaanse EPA-methode (7) op basis van de methode van Gledhill (8) wordt het reactievat geschud en afgesloten voor de atmosfeer. Het geproduceerde CO2 wordt rechtstreeks uit de gasvormige fase verzameld in een interne alkalische afscheider, zoals in de klassieke respirometerkolven van Warburg/Barcroft.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Echter, aangetoond is dat anorganische koolstof (IC) zich ophoopt in het medium tijdens de toepassing van de standaard-, gewijzigde Sturm-test bij een aantal chemische stoffen (9). Een IC-concentratie van niet minder dan 8 mg/l werd aangetroffen tijdens de afbraak van 20 mg C/l aniline. Dit betekent dat de verzameling van CO2 in de alkalische afscheiders geen waarheidsgetrouwe weerspiegeling was van de hoeveelheid CO2 die op microbiologische wijze werd geproduceerd op tussentijdse momenten tijdens de afbraak. Bijgevolg zal de specificatie dat > 60 % van de theoretische maximale CO2-productie (ThCO2) moet worden verzameld binnen een „tiendagenvenster” (de tien dagen die onmiddellijk volgen op het bereiken van de biologische afbreekbaarheid van 10 %) om een teststof in te delen als gemakkelijk biologisch afbreekbaar, niet bereikt worden voor bepaalde chemische stoffen die die indeling wel zouden krijgen bij toepassing van de verwijderingsmethode met opgeloste organische koolstof (DOC).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Als het percentage afbraak lager is dan verwacht, is mogelijk sprake van opeenhoping van anorganische koolstof in de testoplossing. In dergelijke gevallen kan gebruik worden gemaakt van de andere tests op gemakkelijke biologische afbreekbaarheid.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Andere nadelen van de Sturm-methodologie (omslachtig, tijdrovend, grotere kans op toevallige fouten en niet toepasbaar op vluchtige chemische stoffen) waren eerder aanleiding om te zoeken naar een techniek voor gesloten vaten, anders dan die van Gledhill, in plaats van doorblazen met gas (10)(11). Boatman et al. (12) hebben de vroegere methoden beoordeeld en gekozen voor een systeem met een gesloten gasruimte, waarin het CO2 aan het eind van de incubatie door middel van aanzuren van het medium vrijkwam in de gasruimte. CO2 werd gemeten door middel van gaschromatografie (GC)/IC-analyse in automatisch genomen monsters van de gasruimte, maar er werd geen rekening gehouden met opgeloste anorganische koolstof (DIC) in de vloeibare fase. Ook waren de gebruikte vaten zeer klein (20 ml) en bevatten ze slechts 10 ml medium, wat tot problemen leidde, bv. bij het toevoegen van de noodzakelijkerwijs zeer kleine hoeveelheden onoplosbare teststoffen. Ook is het mogelijk dat in het geënte medium onvoldoende of geen micro-organismen aanwezig waren die in staat waren om te zorgen voor de afbraak van de teststoffen.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Deze moeilijkheden zijn overwonnen door de onafhankelijke onderzoeken van Struijs en Stoltenkamp (13) en van Birch en Fletcher (14), waarbij laatstgenoemden geïnspireerd werden door hun ervaringen met apparatuur die was gebruikt in de test op anaerobe biologische afbreekbaarheid (15). In de eerstgenoemde methode (13) werd CO2 gemeten in de gasruimte na aanzuren en equlibratie, terwijl in de laatstgenoemde methode (14) DIC werd gemeten in zowel de gas- als de vloeibare fase, zonder behandeling met teststof; meer dan 90 % van het geproduceerde IC was aanwezig in de vloeibare fase. Beide methoden hebben voordelen ten opzichte van de Sturm-test in de zin dat het testsysteem compacter en beter hanteerbaar is, ook vluchtige chemische stoffen getest kunnen worden en de mogelijkheid van vertraging in het meten van het geproduceerde CO2 wordt voorkomen.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              De twee methoden werden gecombineerd in de ISO-norm voor CO2 in gasruimten (16), die werd onderworpen aan een ringtest (17), en dit is de norm die de basis vormt van de onderhavige testmethode. Zo ook zijn de twee methoden in de Amerikaanse EPA-methode (18) toegepast. Twee methoden voor het meten van CO2 zijn aanbevolen, namelijk CO2 in de gasruimte na aanzuren (13) en IC in de vloeibare fase na toevoeging van een overmaat alkali. De laatstgenoemde methode werd geïntroduceerd door Peterson tijdens de CONCAWE-ringtest (19) van deze gasruimtemethode, in een gewijzigde vorm om inherente biologische afbreekbaarheid te meten. De wijzigingen die zijn doorgevoerd in de herziening van 1992 (20) van de in hoofdstuk C.4 van deze bijlage over gemakkelijke biologische afbreekbaarheid beschreven methoden zijn in de onderhavige testmethode geïntegreerd, zodat de omstandigheden (medium, duur enz.) voor het overige dezelfde zijn als in de herziene Sturm-test (20). Birch en Fletcher (14) hebben aangetoond dat met deze gasruimtetest testresultaten werden bereikt die zeer vergelijkbaar waren met de resultaten die werden behaald met dezelfde chemische stoffen in de OESO-ringtest (21) van de herziene testmethoden.
                           
                        PRINCIPE VAN DE TEST
                  
                              8.
                           
                           
                              De teststof, doorgaans 20 mg C/l, zijnde de enige bron van koolstof en energie, wordt geïncubeerd in een uit anorganische bufferzouten bestaand medium, dat geënt is met een gemengde populatie micro-organismen. De test wordt uitgevoerd in gesloten flessen met bovenin een gasruimte met lucht, die een reservoir van zuurstof voor aerobe biologische afbraak vormt. De CO2-ontwikkeling die het gevolg is van de totale aerobe biologische afbraak van de teststof wordt bepaald door de overmaat aan IC te meten die wordt geproduceerd in de testflessen in vergelijking met de hoeveelheid IC die wordt geproduceerd in blanco vaten die uitsluitend geënt medium bevatten. De mate van afbraak wordt uitgedrukt als een percentage van de theoretische maximale productie van anorganische koolstof (ThIC), op basis van de hoeveelheid teststof (als organische koolstof) die in eerste instantie werd toegevoegd.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              De verwijdering van DOC en/of de mate van primaire biologische afbraak van de teststof kan eveneens worden gemeten (20).
                           
                        INFORMATIE OVER DE TESTSTOF
                  
                              10.
                           
                           
                              Het gehalte aan organische koolstof (gewichtspercent) van de teststof moet bekend zijn, hetzij op basis van de chemische structuur ervan hetzij door het te meten, zodat de procentuele afbraak kan worden berekend. Voor vluchtige teststoffen is een gemeten of berekende constante van de wet van Henry nuttig voor het bepalen van een geschikte verhouding van de gasruimte tot het vloeistofvolume. Informatie over de toxiciteit van de teststof voor micro-organismen is nuttig voor het kiezen van de juiste testconcentratie en voor het interpreteren van resultaten die op slechte biologische afbreekbaarheid duiden: aanbevolen wordt om de inhibitietest uit te voeren, tenzij bekend is dat de teststof geen inhibitoir effect heeft op microbiële activiteiten (zie punt 24).
                           
                        TOEPASBAARHEID VAN DE METHODE
                  
                              11.
                           
                           
                              De test is toepasbaar op in water oplosbare en onoplosbare teststoffen, hoewel een goede dispersie van de teststof moet worden gewaarborgd. Met gebruikmaking van de aanbevolen verhouding tussen gasruimte en vloeistofvolume van 1:2 kunnen vluchtige chemische stoffen met een constante van de wet van Henry van maximaal 50 Pa.m3.mol–1 worden getest, aangezien het aandeel van de teststof in de gasruimte niet meer zal zijn dan 1 % (13). Een kleinere gasruimte kan worden gebruikt voor het testen van chemische stoffen met een hogere vluchtigheid, maar hun biobeschikbaarheid kan beperkend zijn, met name indien ze slecht oplosbaar zijn in water. Echter, gebruikers moeten waarborgen dat de verhouding tussen de gasruimte en het vloeistofvolume en de teststofconcentratie dusdanig zijn dat voldoende zuurstof beschikbaar is om volledige aerobe biologische afbraak te kunnen doen plaatsvinden (d.w.z. vermijd het gebruik van een hoge substraatconcentratie en een klein gasruimtevolume). Richtsnoeren hiervoor zijn te vinden in (13)(23).
                           
                        REFERENTIESTOFFEN
                  
                              12.
                           
                           
                              Ter controle van de testprocedure moet een referentiestof met een bekende biologische afbreekbaarheid tegelijkertijd worden getest. Hiervoor kunnen aniline, natriumbenzoaat of ethyleenglycol worden gebruikt bij het testen van in water oplosbare teststoffen en 1-octanol bij het testen van slecht oplosbare teststoffen (13). De biologische afbraak van deze stoffen moet binnen 14 dagen > 60 % ThIC bereiken.
                           
                        REPRODUCEERBAARHEID
                  
                              13.
                           
                           
                              In de ISO-ringtest van de methode (17) werden de volgende resultaten behaald met gebruikmaking van de aanbevolen omstandigheden, met inbegrip van 20 mg C teststof/l.
                              
                                          Teststof
                                       
                                       
                                          Gemiddelde procentuele biologische afbraak
                                          (28d)
                                       
                                       
                                          Variatiecoëfficiënt
                                          (%)
                                       
                                       
                                          Aantal laboratoria
                                       
                                    
                                          Aniline
                                       
                                       
                                          90
                                       
                                       
                                          16
                                       
                                       
                                          17
                                       
                                    
                                          1-octanol
                                       
                                       
                                          85
                                       
                                       
                                          12
                                       
                                       
                                          14
                                       
                                    De intertestvariabiliteit (repliceerbaarheid), met gebruikmaking van aniline, was laag met variabiliteitscoëfficiënten van maximaal 5 % in bijna iedere uitvoering van de test. In de twee gevallen waarin de repliceerbaarheid slechter was, was de grotere variabiliteit waarschijnlijk te wijten aan een hoge IC-productie in de blanco vaten. De repliceerbaarheid was slechter met 1-octanol, maar was nog steeds minder dan 10 % voor 79 % van de test-uitvoeringen. Deze grotere intertestvariabiliteit kan veroorzaakt zijn door doseerfouten, aangezien een klein volume (3 tot 4 μl) 1-octanol in afgesloten testflessen moest worden gespoten. Het gebruik van lagere concentraties teststof zou hebben geresulteerd in hogere variantiecoëfficiënten, in het bijzonder bij concentraties van minder dan 10 mg C/l. Dit kon gedeeltelijk worden verholpen door de concentratie van de totale hoeveelheid anorganische koolstof (TIC) in het entmateriaal te verminderen.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              In een EU-ringtest (24) van vijf oppervlakteactieve stoffen die werden toegevoegd in een concentratie van 10 mg C/l werden de volgende resultaten behaald:
                              
                                          Teststof
                                       
                                       
                                          Gemiddelde procentuele biologische afbraak
                                          (28d)
                                       
                                       
                                          Variatiecoëfficiënt
                                          (%)
                                       
                                       
                                          Aantal laboratoria
                                       
                                    
                                          Tetrapropyleen
                                          Benzeensulfonaat
                                       
                                       
                                          17
                                       
                                       
                                          45
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Di-iso-octylsulfo-succinaat
                                          (anionisch)
                                       
                                       
                                          72
                                       
                                       
                                          22
                                       
                                       
                                          9
                                       
                                    
                                          Hexadecyl-trimethyl (21)
                                          
                                          Ammoniumchloride
                                          (kationisch)
                                       
                                       
                                          75
                                       
                                       
                                          13
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Isononylfenol-(ethoxylaat)9
                                          
                                          (niet-ionisch)
                                       
                                       
                                          41
                                       
                                       
                                          32
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Cocoamidepropyl
                                          Dimethylhydroxy
                                          Sulfobetaïne
                                          (amfoteer)
                                       
                                       
                                          60
                                       
                                       
                                          23
                                       
                                       
                                          11
                                       
                                    Uit de resultaten blijkt in het algemeen dat de variabiliteit hoger was voor de minder goed afgebroken oppervlakteactieve stoffen. De intertestvariabiliteit was minder dan 15 % voor meer dan 90 % van de gevallen, met als hoogste 30-40 %.
                              
                                          NOOT:
                                       
                                       
                                          De meeste oppervlakteactieve stoffen zijn geen soorten die uit één molecuul bestaan, maar zijn mengsels van isomeren, homologen enz., die na verschillende vertragingsperioden worden afgebroken en met verschillende kinetische snelheden, wat resulteert in „vage”, uitgerekte curven, zodat de waarde van 60 % die nodig is om de test te doorstaan mogelijk niet gehaald wordt binnen „het tiendagenvenster”, ondanks het feit dat iedere individuele moleculaire soort binnen tien dagen > 60 % zou behalen, indien afzonderlijk getest. Dit kan ook worden waargenomen bij andere complexe mengsels.
                                       
                                    
                        BESCHRIJVING VAN DE METHODE
                  
                     Apparatuur
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Gewone laboratoriumapparatuur en:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          glazen serumflessen, afgesloten met stoppen van butylrubber en aluminium krimpsluitingen. De aanbevolen maat is „125 ml” met een totaal volume van ongeveer 160 ml (in dit geval moet het bekende volume van elke fles 160 ± 1 ml zijn). Een kleinere maat fles mag worden gebruikt, indien de resultaten voldoen aan de in de punten 66 en 67 omschreven voorwaarden;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          koolstofanalyseapparaat of ander instrument (bv. gaschromatograaf) voor het meten van anorganische koolstof;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          hoogprecisie-injectienaalden voor gasvormige en vloeibare monsters;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          rondschudapparaat in een omgeving met temperatuurregeling;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          een voorraad CO2-vrije lucht — deze kan worden verkregen door lucht door natriumkalkkorrels te leiden of door gebruik te maken van een gasmengsel bestaande uit 80 % N2/20 % O2 (facultatief) (zie punt 28);
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          membraanfiltratieapparaat met een porositeit van 0,20-0,45 μm (facultatief);
                                       
                                    
                                          g)
                                       
                                       
                                          analyseapparaat voor organische koolstof (facultatief).
                                       
                                    
                        
                     Reagentia
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Er wordt steeds gebruikgemaakt van reagentia pro analysi.
                           
                        
                     Water
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Gedestilleerd of gedeïoniseerd water moet worden gebruikt met daarin een concentratie van ≤ 1 mg/l als totale organische koolstof. Dit vertegenwoordigt ≤ 5 % van het initiële gehalte aan organische koolstof dat werd geïntroduceerd door de aanbevolen dosis van de teststof.
                           
                        
                     Stamoplossingen voor het uit anorganische zouten bestaande medium
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              De stamoplossingen en het uit anorganische zouten bestaande medium zijn vergelijkbaar met die in ISO 14593 (16) en de in C.4 beschreven tests op de „gemakkelijke biologische afbreekbaarheid” (20). Het gebruik van een hogere concentratie ammoniumchloride (2,0 g/l in plaats van 0,5 g/l) zou enkel in zeer uitzonderlijke gevallen nodig moeten zijn, bv. als de teststofconcentratie > 40 mg C/l is. Stamoplossingen moeten gekoeld worden bewaard en na zes maanden als afval worden verwijderd, tenzij bewijs van neerslaan of microbiële groei bestaat. De volgende stamoplossingen worden bereid:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4) 8,50 g
                                          dikaliumwaterstoffosfaat (K2HPO4) 21,75 g
                                          dinatriumwaterstoffosfaatdihydraat (Na2HPO4.2H2O) 33,40 g
                                          ammoniumchloride (NH4Cl) 0,50 g
                                          In water oplossen en tot 1 liter aanvullen. De pH van deze oplossing moet 7,4 (± 0,2) zijn. Als dit niet het geval is, moet een nieuwe oplossing worden bereid;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          calciumchloridedihydraat (CaCl2.2H2O) 36,40 g
                                          In water oplossen en tot 1 liter aanvullen;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          magnesiumsulfaatheptahydraat (MgSO4.7H2O) 22,50 g
                                          In water oplossen en tot 1 liter aanvullen;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          ijzer(III)chloridehexahydraat (FeCl3.6H20) 0,25 g
                                          In water oplossen en tot 1 liter aanvullen en één druppel geconcentreerde HCl toevoegen.
                                       
                                    
                        
                     Bereiding van anorganisch medium
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              10 ml van oplossing a) wordt gemengd met ongeveer 800 ml water (punt 17), daaraan wordt vervolgens 1 ml van de oplossingen b), c) en d) toegevoegd en het geheel wordt met water aangevuld tot 1 liter (punt 17).
                           
                        
                     Andere reagentia
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Geconcentreerd orthofosforzuur (H3PO4) (> 85 % massa per volume).
                           
                        
                     Natriumhydroxideoplossing 7M
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              280 g natriumhydroxide (NaOH) wordt opgelost in 1 liter water (punt 17). De concentratie DIC van deze oplossing wordt bepaald en deze waarde wordt in acht genomen bij het berekenen van het testresultaat (zie de punten 55 en 61), met name in het licht van het geldigheidscriterium in punt 66, onder b). Indien de concentratie DIC te hoog is, wordt een verse oplossing bereid.
                           
                        
                     Teststof
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Er wordt een stamoplossing van een voldoende in water oplosbare teststof in water (punt 17) of in het testmedium (punt 19) bereid, in een concentratie die bij voorkeur 100 maal groter is dan de uiteindelijke concentratie die in de test zal worden gebruikt; het kan nodig zijn de pH van de stamoplossing aan te passen. De stamoplossing moet worden toegevoegd aan het anorganische medium om een definitieve concentratie organische koolstof tussen 2 en 40 mg C/l te bereiken, bij voorkeur 20 mg C/l. Als lagere concentraties worden gebruikt, kan de verkregen precisie onvoldoende zijn. Oplosbare en onoplosbare vloeibare chemische stoffen kunnen rechtstreeks aan de vaten worden toegevoegd met behulp van hoogprecisie-injectienaalden. Voor slecht oplosbare en onoplosbare teststoffen is mogelijk een speciale behandeling nodig (25). De keuzes zijn:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          rechtstreeks toevoegen van bekende gewogen hoeveelheden;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          ultrasone dispersie vóór toevoeging;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          dispersie met behulp van emulgeermiddelen, waarvan vóór toevoeging vastgesteld moet worden of ze inhibitoire of stimulerende effecten hebben op microbiële activiteit;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          adsorptie van vloeibare teststoffen of van een oplossing in een geschikt vluchtig oplosmiddel aan een inert medium of hulpmiddel (bv. glasvezelfilter), gevolgd door verdamping van het oplosmiddel, indien gebruikt, en rechtstreekse toevoeging van bekende hoeveelheden;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          toevoeging van een bekend volume van een oplossing van de teststof in een zeer vluchtig oplosmiddel aan een leeg testvat, gevolgd door verdamping van het oplosmiddel.
                                       
                                    Agentia of oplosmiddelen die in c), d) en e) worden gebruikt, moeten worden getest op een eventueel stimulerend of inhibitoir effect op microbiële activiteit (zie punt 42, onder b)).
                           
                        
                     Referentiestof
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Een stamoplossing van de (oplosbare) referentiestof wordt bereid in water (punt 17) in een concentratie van bij voorkeur 100 maal de definitieve concentratie die zal worden gebruikt (20 mg C/l) in de test.
                           
                        
                     Inhibitiecontrole
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Teststoffen vertonen vaak geen significante afbraak onder de omstandigheden die heersen bij beoordelingen van de gemakkelijke biologische afbreekbaarheid. Een mogelijke oorzaak is dat de teststof in de in de test gebruikte concentratie een inhibitoir effect op het entmateriaal heeft. Een inhibitiecontrole kan in de testopzet worden opgenomen om de identificatie (achteraf) van inhibitie als een mogelijke oorzaak of bijdragende factor te vergemakkelijken. De inhibitiecontrole kan ook worden gebruikt om dergelijke interferenties uit te sluiten en aan te tonen dat de ontbrekende of geringe afbraak uitsluitend moet worden toegeschreven aan niet-vatbaarheid voor microbiële aanvallen onder de testomstandigheden. Om informatie te verkrijgen over de toxiciteit van de teststof voor (aerobe) micro-organismen wordt een oplossing bereid in het testmedium die de teststof en de referentiestof bevat (punt 19), elk in dezelfde respectieve concentraties als de toegevoegde concentraties (zie de punten 22 en 23).
                           
                        
                     Entmateriaal
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Het entmateriaal kan van diverse bronnen afkomstig zijn: actief slib; (chloorvrij) behandeld water; oppervlaktewater en grond; of een mengsel daarvan (20). De afbraakactiviteit van de bron moet worden gecontroleerd door gebruik te maken van een referentiestof. Ongeacht de bron mogen micro-organismen die eerder aan de teststof zijn blootgesteld niet worden gebruikt, indien de procedure gebruikt wordt als een test op de gemakkelijke biologische afbreekbaarheid.
                              
                                          
                                             Waarschuwing:
                                       
                                       
                                          Actief slib, rioolwater en behandeld water bevatten ziekteverwekkende organismen en moeten voorzichtig worden gehanteerd.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              De ervaring leert dat het optimale volume voor het entmateriaal het volume is dat:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          voldoende is om te zorgen voor toereikende biologische afbraakactiviteit;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de referentiestof afbreekt met het voorgeschreven percentage (zie punt 66);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          resulteert in 102 tot 105 kolonievormende eenheden per milliliter in het uiteindelijke mengsel;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          normaal resulteert in een concentratie van 4 mg/l gesuspendeerde vaste stoffen in het uiteindelijke mengsel bij het gebruik van actief slib; concentraties van maximaal 30 mg/l kunnen worden gebruikt, maar deze kunnen leiden tot een significant hogere productie van CO2 in de blanco vaten (26);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          minder bijdraagt dan 10 % van de initiële concentratie van organische koolstof die door de teststof werd geïntroduceerd;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          in het algemeen 1-10 ml entmateriaal is voor 1 liter testoplossing.
                                       
                                    
                        
                     Actief slib
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Uit de beluchtingstank van een rioolwaterzuiveringsinstallatie of een laboratoriuminstallatie die hoofdzakelijk huishoudelijk afval verwerkt, wordt vers actief slib verzameld. Indien nodig kunnen grove deeltjes door te zeven worden verwijderd (bv. door gebruik te maken van een zeef met mazen van 1 mm2) en het slib moet aeroob worden gehouden, totdat het wordt gebruikt.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Ook kan het slib, na verwijdering van eventuele grove deeltjes, worden bezonken of gecentrifugeerd (bv. 1 100 × g gedurende 10 minuten). De bovendrijvende vloeistof wordt als afval verwijderd. Het slib kan worden gewassen in de oplossing van mineralen. Het geconcentreerde slib wordt in anorganisch medium gesuspendeerd tot een concentratie van 3-5 g gesuspendeerde vaste stof/l en vervolgens belucht tot het tijdstip van gebruik.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Slib moet afkomstig zijn van een correct werkende conventionele zuiveringsinstallatie. Als slib afkomstig is van een installatie met hoge omloopsnelheid, of geacht wordt remmers te bevatten, dient het te worden gewassen. Het opnieuw gesuspendeerde slib wordt na grondig mengen bezonken of gecentrifugeerd, de bovendrijvende vloeistof wordt als afval verwijderd en het gewassen slib wordt in een volgend volume anorganisch medium opnieuw gesuspendeerd. Deze procedure wordt herhaald totdat het slib geacht wordt vrij te zijn van overmaat substraat of remmer.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Nadat het slib volledig opnieuw is gesuspendeerd, of bij niet-behandeld slib direct, wordt vlak voor gebruik een monster genomen voor de bepaling van het drooggewicht aan gesuspendeerde vaste stoffen.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Een andere mogelijkheid is het homogeniseren van actief slib (3-5 g gesuspendeerde vaste stof per l). Het slib wordt twee minuten bij matige snelheid in een Waring-menger behandeld. Het gemengde slib wordt gedurende 30 minuten of zoveel langer als nodig bezonken en de vloeistof wordt gedecanteerd en gebruikt als entmateriaal in een hoeveelheid van 10 mg/l anorganisch medium.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Een nog verdere vermindering van de blanco CO2-ontwikkeling kan worden bereikt door het slib een nacht te beluchten met CO2-vrije lucht. 4 mg/l vaste stof in het actief slib wordt gebruikt als de concentratie van het entmateriaal in deze test (13).
                           
                        
                     Secundair effluent van zuiveringsinstallaties
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              Het entmateriaal kan ook worden betrokken van het secundaire effluent van een zuiveringsinstallatie of een laboratoriuminstallatie die hoofdzakelijk huishoudelijk afvalwater ontvangt. Het monster moet onder aerobe omstandigheden worden bewaard en moet worden gebruikt op de dag van verzameling of, indien nodig, worden gepreconditioneerd. Het effluent moet worden gefilterd met een grove filter om grove deeltjes te verwijderen en de pH-waarde wordt gemeten.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Om het gehalte aan IC te verminderen, wordt het filtraat gedurende één uur uitgewassen met CO2-vrije lucht (punt 15, onder e)), waarbij de pH wordt gehandhaafd op 6,5 met gebruikmaking van orthofosforzuur (punt 20). De pH-waarde wordt met natriumhydroxide (punt 21) teruggebracht op de oorspronkelijke waarde en na ongeveer één uur bezinken wordt een geschikt volume van de bovendrijvende vloeistof genomen voor het enten. Deze uitwasprocedure vermindert het gehalte aan IC van het entmateriaal. Indien bijvoorbeeld het aanbevolen maximale volume van gefilterd, uitgewassen effluent (100 ml) per liter als entmateriaal werd gebruikt, bedroeg de hoeveelheid IC in de blanco controlevaten tussen 0,4 en 1,3 mg/l (14), wat overeenkomt met 2-6,5 % van teststof C in een concentratie van 20 mg C/l en 4-13 % in een concentratie van 10 mg C/l.
                           
                        
                     Oppervlaktewater
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Uit daarvoor geschikt oppervlaktewater wordt een monster genomen. Dit moet onder aerobe omstandigheden worden bewaard en worden gebruikt op de dag waarop het verzameld is. Indien nodig wordt het monster geconcentreerd door het te filteren of centrifugeren. Het volume van het in elk testvat te gebruiken entmateriaal moet voldoen aan de in punt 26 vermelde criteria.
                           
                        
                     Grond
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Op een diepte van maximaal 20 cm onder het grondoppervlak wordt een geschikt grondmonster genomen. Stenen, plantresten en ongewervelde dieren moeten worden verwijderd uit het grondmonster, waarna het wordt gezeefd door zeefmazen van 2 mm (als het monster te nat is om onmiddellijk te zeven, eerst gedeeltelijk aan de lucht laten drogen om het zeven te vergemakkelijken). Het monster moet onder aerobe omstandigheden worden bewaard en worden gebruikt op de dag waarop het werd genomen (als het monster wordt vervoerd in een niet helemaal dichtgeknoopte zwarte zak van polyethyleen, kan het bij 2 tot 4 °C maximaal een maand in de zak worden bewaard).
                           
                        
                     Preconditionering van het entmateriaal
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Entmateriaal kan op de proefomstandigheden worden gepreconditioneerd, maar mag niet vooraf aan de teststof worden aangepast. Preconditionering kan de blanco CO2-ontwikkeling verminderen. Preconditionering bestaat in het beluchten van actief slib na verdunning in testmedium tot 30 mg/l met vochtige CO2-vrije lucht gedurende vijf-zeven dagen bij testtemperatuur.
                           
                        TESTPROCEDURE
                  
                     Aantal flessen
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Het aantal flessen (punt 15, onder a)) dat nodig is voor een test, is afhankelijk van de analysefrequentie en de duur van de test.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Aanbevolen wordt om flessen in drievoud te analyseren met een voldoende aantal tussenpozen, zodat het tiendagenvenster herkend kan worden. Ook moeten ten minste vijf testflessen (punt 15, onder a)) uit de sets a), b) en c) (zie punt 42) aan het eind van de test worden geanalyseerd om betrouwbaarheidsintervallen van 95 % te kunnen berekenen voor de gemiddelde procentuele biologische afbraak.
                           
                        
                     Geënt medium
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Het entmateriaal wordt gebruikt in een concentratie van 4 mg/l droge vaste stoffen in actief slib. Onmiddellijk voor het gebruik wordt voldoende geënt medium bereid door, bijvoorbeeld, 2 ml op passende wijze behandeld actief slib (punten 27 tot en met 32) in een concentratie van 2 000 mg/l toe te voegen aan 1 liter uit anorganische zouten bestaand medium (punt 19). Bij het gebruik van secundair effluent wordt maximaal 100 ml effluent (punt 33) toegevoegd aan 900 ml uit anorganische zouten bestaand medium (punt 19) en tot 1 liter verdund met medium.
                           
                        
                     Flessen prepareren
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Bekende hoeveelheden van het geënte medium worden verdeeld over duploflessen om een verhouding tussen gasruimte en vloeistof te bereiken van 1:2 (bv. 107 ml toevoegen aan flessen met een inhoud van 160 ml). Andere verhoudingen kunnen ook worden gebruikt, maar houd hierbij rekening met de waarschuwing in punt 11. Ongeacht het type entmateriaal dat wordt gebruikt, moet het geënte medium voldoende worden gemengd om te waarborgen dat het gelijk over de testflessen wordt verdeeld.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Er worden flessensets (punt 15, onder a)) met de volgende inhoud voorbereid:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          testvaten (aangeduid als FT) met daarin de teststof;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          blanco controlevaten (aangeduid als FB) met daarin uitsluitend het testmedium plus het entmateriaal; eventuele chemische stoffen, oplosmiddelen, agentia of glasvezelfilters die nodig zijn om de teststof in de testvaten te brengen, moeten ook worden toegevoegd;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          vaten (aangeduid als FC) met de referentiestof voor het controleren van de procedure;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          indien nodig, vaten (aangeduid als FI) met daarin zowel de teststof als de referentiestof in dezelfde concentraties (punt 24) als in respectievelijk de flessen FT en FC, voor het controleren van een eventueel inhibitoir effect van de teststof;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          vaten (aangeduid als FS) voor het controleren van mogelijke abiotische afbraak, als a) plus 50 mg/l HgCl2 of op enige andere manier gesteriliseerd (bv. in een autoclaaf).
                                       
                                    
                        
                              43.
                           
                           
                              In water oplosbare teststoffen en referentiestoffen worden toegevoegd als waterige stamoplossingen (punten 22, 23 en 24) om een concentratie van 10 tot 20 mg C/l te bereiken.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Onoplosbare teststoffen en onoplosbare referentiestoffen worden op verschillende manieren (zie punt 22, onder a)-e)) aan flessen toegevoegd in overeenstemming met de aard van de teststof, hetzij voor hetzij na toevoeging van het geënte medium, afhankelijk van de behandelingsmethode van de teststof. Indien een van de in punt 22, onder a)-e), beschreven procedures wordt toegepast, moeten de blanco flessen FB (punt 42, onder b)) op een soortgelijke manier worden behandeld, maar zonder de teststof en de referentiestof.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Vluchtige teststoffen moeten worden geïnjecteerd in gesloten flessen (punt 47) met behulp van een micro-injectienaald. De dosis wordt berekend op basis van het geïnjecteerde volume en de dichtheid van de teststof.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Indien nodig moet water aan de vaten worden toegevoegd om in ieder vat hetzelfde vloeistofvolume te hebben. Er moet worden gewaarborgd dat de verhouding tussen gasruimte en vloeistof (gewoonlijk 1:2) en de concentratie van de teststof zodanig zijn dat voldoende zuurstof in de gasruimte aanwezig is om volledige biologische afbraak mogelijk te maken.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Alle flessen worden vervolgens afgesloten, bijvoorbeeld met septa van butylrubber en aluminium doppen. Vluchtige teststoffen moeten in deze fase worden toegevoegd (punt 45). Voor het monitoren van de vermindering van de concentratie DOC in de testoplossing en voor het uitvoeren van tijdstip-nulanalysen voor de initiële concentratie IC (steriele controles, punt 42, onder e)) of andere determinanten wordt een daarvoor geschikt monster uit het testvat genomen. Het testvat en de inhoud ervan worden als afval verwijderd.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              De gesloten flessen worden op een rondschudapparaat geplaatst (punt 15, onder d)), met een schudsnelheid die voldoende is om de inhoud van de flessen goed te mengen en gesuspendeerd te houden (bv. 150 tot 200 tpm), en worden vervolgens in het donker geïncubeerd bij een temperatuur van 20 °C, die niet meer mag afwijken dan ± 1 °C.
                           
                        
                     Monstername
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Het patroon van de monstername is afhankelijk van de vertragingstijd en de kinetische snelheid van de biologische afbraak van de teststof. Flessen worden op de dag van de monstername weggenomen voor de analyse, die ten minste wekelijks of frequenter (bv. tweemaal per week) moet worden uitgevoerd indien een volledige afbraakcurve vereist is. Het vereiste aantal duploflessen wordt uit het schudapparaat genomen, overeenkomend met FT, FB en FC en, indien ze gebruikt worden, FI en FS (zie punt 42). De test duurt gewoonlijk 28 dagen. Indien de curve voor de biologische afbraak aangeeft dat een plateau is bereikt voordat de 28 dagen voorbij zijn, moet de test eerder dan na 28 dagen worden afgerond. De vijf flessen die voor de 28e dag van de test zijn gereserveerd, worden bemonsterd en de resultaten worden gebruikt om de betrouwbaarheidslimieten of de variatiecoëfficiënt van de procentuele biologische afbreekbaarheid te berekenen. De flessen die zijn bedoeld voor de controles op inhibitie en voor abiotische afbraak hoeven niet zo frequent te worden bemonsterd als de andere flessen; bemonstering op dag 1 en dag 28 is voldoende.
                           
                        
                     Analyse van anorganische koolstof (IC)
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              De CO2-productie in de flessen wordt bepaald door de toename in de concentratie van anorganische koolstof (IC) tijdens incubatie te meten. Er zijn twee aanbevolen methoden beschikbaar voor het meten van de hoeveelheid in de test geproduceerde IC en deze worden hieronder beschreven. Aangezien de methoden enigszins verschillende resultaten kunnen opleveren, dient slechts één ervan in een testuitvoering te worden gebruikt.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Methode a) wordt aanbevolen in gevallen waarin de kans bestaat dat het medium overblijfselen bevat van bijvoorbeeld glasvezelpapier en/of onoplosbare teststof. Indien een koolstofanalyseapparaat niet beschikbaar is, kan deze analyse worden uitgevoerd met een gaschromatograaf. Het is belangrijk dat de flessen (bijna) de testtemperatuur hebben, wanneer het gas in de gasruimte wordt geanalyseerd. Methode b) is mogelijk gemakkelijker voor laboratoria die koolstofanalyseapparaten gebruiken om IC te meten. Het is belangrijk dat de natriumhydroxideoplossing (punt 21) die wordt gebruikt om CO2 om te zetten in carbonaat vers bereid is of dat het IC-gehalte ervan bekend is, zodat hiermee rekening kan worden gehouden bij het berekenen van de testresultaten (zie punt 66, onder b)).
                           
                        
                     Methode a):   aanzuren tot pH < 3
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Vóór iedere reeks analysen wordt het IC-analyseapparaat gekalibreerd met behulp van een geschikte IC-standaard (bv. 1 gewichtspercent CO2 in N2). Geconcentreerd fosforzuur (punt 20) wordt geïnjecteerd door het septum van iedere bemonsterde fles om de pH van het medium te verlagen tot < 3 (bv. 1 ml toevoegen aan 107 ml testmedium). De flessen worden teruggeplaatst op het schudapparaat. Nadat de flessen gedurende één uur bij testtemperatuur zijn geschud, worden ze van het schudapparaat genomen, waarna bekende hoeveelheden (bv. 1 ml) gas aan de gasruimte worden onttrokken en geïnjecteerd in het IC-analyseapparaat. De gemeten IC-concentraties worden geregistreerd als mg C/l.
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Het principe van deze methode is dat na aanzuring tot pH < 3 en equilibratie bij 20 °C, de evenwichtsconstante voor de verdeling van CO2 over de vloeibare en gasvormige fasen in de testflessen 1,0 is, indien gemeten als een concentratie (13). Dit moet voor het testsysteem minimaal eenmaal worden aangetoond, en wel als volgt:
                              Flessen met daarin 5 en 10 mg/l als IC, met gebruikmaking van een oplossing van watervrij natriumcarbonaat (Na2CO3) in CO2-vrij water dat is bereid door water aan te zuren tot pH 6,5 met geconcentreerd orthofosforzuur (punt 20), worden gedurende een nacht uitgewassen met CO2-vrije lucht en de pH wordt met alkali verhoogd tot neutraal. Er moet worden gewaarborgd dat de verhouding tussen het gasruimtevolume en het vloeistofvolume dezelfde is als in de tests (bv. 1:2). Vervolgens worden het aanzuren en de equilibratie uitgevoerd als beschreven in punt 52 en wordt de IC-concentratie van zowel de gasruimte als de vloeibare fasen gemeten. Er wordt gecontroleerd of de twee concentraties dezelfde zijn binnen de marge voor toevallige fouten. Zo niet, moet de gebruiker de procedures herzien. Deze controle op de verdeling van IC over de vloeibare en gasvormige fasen hoeft niet bij iedere uitvoering van de test te worden verricht, maar kan indien mogelijk tijdens het kalibreren worden verricht.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Indien de verwijdering van DOC moet worden gemeten (uitsluitend teststoffen die in water oplosbaar zijn), moeten monsters worden genomen van de vloeibare fase uit afzonderlijke (niet aangezuurde) flessen, met een membraan worden gefilterd en worden geïnjecteerd in het DOC-analyseapparaat. Indien nodig kunnen deze flessen voor andere analysen worden gebruikt om de primaire biologische afbreekbaarheid te meten.
                           
                        
                     Methode b):   omzetting van CO2 in carbonaat
                  
                  
                              55.
                           
                           
                              Voor iedere reeks analysen wordt het IC-analyseapparaat gekalibreerd met behulp van een geschikte standaard, bijvoorbeeld een oplossing van natriumbicarbonaat (NaHCO3) in CO2-vrij water (zie punt 53) binnen het bereik van 0 tot 20 mg/l, als IC. Een oplossing van natriumhydroxide (7M, punt 21) (bv. 1 ml op 107 ml medium) wordt geïnjecteerd door het septum van iedere bemonsterde fles en de flessen worden gedurende één uur bij testtemperatuur geschud. Gebruik dezelfde NaOH-oplossing voor alle flessen die op een bepaalde dag worden geanalyseerd, maar niet noodzakelijkerwijs bij alle monsternamen tijdens een test. Indien absolute blanco IC-waarden benodigd zijn bij alle monsternamen, moet het IC-gehalte van de NaOH-oplossing iedere keer wanneer deze wordt gebruikt, worden bepaald. De flessen worden van het schudapparaat genomen en men laat de inhoud bezinken. Geschikte volumes (bv. 50 tot 1 000 μl) worden met een injectienaald onttrokken aan de vloeibare fase in ieder vat. De monsters worden in het IC-analyseapparaat geïnjecteerd en de concentraties IC worden geregistreerd. Er moet worden gewaarborgd dat het gebruikte analyseapparaat geschikt is om de alkalinemonsters die bij deze methode geproduceerd worden, te verwerken.
                           
                        
                              56.
                           
                           
                              Het principe van deze methode is dat de concentratie IC na de toevoeging van alkali en het schudden verwaarloosbaar is. Dit moet voor het testsysteem ten minste eenmaal worden gecontroleerd door met gebruikmaking van IC-standaarden alkali toe te voegen en te laten equilibreren en vervolgens de concentratie IC in zowel de gasruimte als de vloeibare fasen te meten (zie punt 53). De concentratie in de gasruimte moet in de buurt van nul liggen. Deze controle op de nagenoeg volledige absorptie van CO2 hoeft niet bij iedere uitvoering van de test te worden verricht.
                           
                        
                              57.
                           
                           
                              Indien de verwijdering van DOC moet worden gemeten (uitsluitend teststoffen die in water oplosbaar zijn), moeten monsters worden genomen van de vloeibare fase uit afzonderlijke flessen (zonder toegevoegd alkali), waarna ze met een membraan worden gefilterd en worden geïnjecteerd in het DOC-analyseapparaat. Indien nodig kunnen deze flessen voor andere analysen worden gebruikt om de primaire biologische afbreekbaarheid te meten.
                           
                        GEGEVENS EN RAPPORTAGE
                  
                     Berekening van de resultaten
                  
                  
                              58.
                           
                           
                              Uitgaande van een mineralisatie van de teststof in CO2 van 100 %, is de overmaat aan ThIC die is geproduceerd in vergelijking met de ThIC die in de blanco controlevaten is geproduceerd gelijk aan de TOC die is toegevoegd aan iedere testfles aan het begin van de test, dat wil zeggen:
                              
                                 
                              De totale massa (mg) anorganische koolstof (TIC) in elke fles is:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          Vergelijking [1]
                                       
                                    waarbij
                              
                                          VL
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          volume van vloeistof in de fles (liter);
                                       
                                    
                                          CL
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          concentratie van IC in de vloeistof (mg/l als koolstof);
                                       
                                    
                                          VH
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          volume van de gasruimte (liter);
                                       
                                    
                                          CL
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          concentratie van IC in de gasruimte (mg/l als koolstof).
                                       
                                    De berekeningen van TIC voor de twee analysemethoden die worden gebruikt voor het meten van IC in deze test, worden in de onderstaande punten 60 en 61 beschreven. De procentuele biologische afbraak (% D) is in alle gevallen het resultaat van:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          Vergelijking [2]
                                       
                                    waarbij
                              
                                          TICt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          mg TIC in testfles op moment t;
                                       
                                    
                                          TICb
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          gemiddelde mg TIC in blanco flessen op moment t;
                                       
                                    
                                          TOC
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          mg TOC in eerste instantie toegevoegd aan het testvat.
                                       
                                    De procentuele biologische afbraak % D wordt berekend voor de test (FT), referentie (FC) en, indien van toepassing, de controleflessen voor de inhibitiemonitoring (FI) op basis van de respectieve hoeveelheden TIC die zijn geproduceerd tot aan het moment van iedere monstername.
                           
                        
                              59.
                           
                           
                              Indien het TIC-gehalte van de steriele controles (FS) tijdens de testperiode significant is gestegen, kan worden geconcludeerd dat abiotische afbraak van de teststof opgetreden is en moet hiermee rekening worden gehouden bij de berekening van D in vergelijking [2].
                           
                        
                     Aanzuren tot pH < 3
                  
                  
                              60.
                           
                           Aangezien het aanzuren tot pH < 3 en de equilibratie resulteert in een gelijke verdeling van de concentratie TIC in de vloeibare en gasvormige fasen, hoeft alleen de concentratie IC in de gasvormige fase te worden gemeten. Derhalve geldt op basis van vergelijking [1]: 
                                 , waarbij VB = volume van de serumfles.
                        
                     Omzetting van CO2 in carbonaat
                  
                  
                              61.
                           
                           In deze methode worden de berekeningen verricht als in vergelijking [1], maar de verwaarloosbare hoeveelheid IC in de gasvormige fase wordt genegeerd, dat wil zeggen.
                                  en 
                                 .
                        
                     Uitdrukking van de resultaten
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Een curve voor biologische afbraak wordt verkregen door de procentuele biologische afbraak, D, uit te zetten tegen de incubatietijd en indien mogelijk worden de aanloopfase, de biologischeafbraakfase, het tiendagenvenster en de plateaufase, dat wil zeggen de fase waarin de maximale afbraak bereikt is en de curve voor biologische afbraak afgevlakt is, aangegeven. Indien vergelijkbare resultaten worden behaald voor tegelijkertijd geteste testvaten FT (< 20 % afwijking), wordt een curve voor het gemiddelde getekend (zie aanhangsel 2, figuur 1); zo niet, wordt voor ieder vat een curve getekend. De gemiddelde waarde van de procentuele biologische afbraak in de plateaufase wordt bepaald of de hoogste waarde wordt genomen (bv. indien de curve in de plateaufase afneemt), maar in het laatste geval is het belangrijk om na te gaan of de waarde geen uitbijter is. Dit maximale niveau van biologische afbreekbaarheid moet in het testverslag als „mate van biologische afbraak van de teststof” worden vermeld. Indien het aantal testvaten onvoldoende was om een plateaufase aan te geven, worden de meetgegevens van de laatste dag van de test gebruikt om een gemiddelde waarde te berekenen. Deze laatste waarde, het gemiddelde van vijf duplovaten, dient als indicatie van de precisie waarmee de procentuele biologische afbreekbaarheid is bepaald. Ook moet de waarde die gemeten wordt aan het eind van het tiendagenvenster, worden gerapporteerd.
                           
                        
                              63.
                           
                           
                              Op dezelfde manier wordt een curve voor de referentiestof, FC, uitgezet en, indien van toepassing, voor de abiotische eliminatiecontrole, FS, en de inhibitiecontrole, FI.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              De hoeveelheden TIC die in de blanco controlevaten (FB) aanwezig zijn, worden vastgelegd evenals de hoeveelheden in de kolven FS (abiotische controle), voor zover deze vaten in de test werden opgenomen.
                           
                        
                              65.
                           
                           
                              Voor de vaten FI wordt D berekend, op basis van de theoretische IC-opbrengst die wordt verwacht van alleen het referentiebestanddeel van het mengsel. Indien op dag 28 [(DFC
                                  (22) – DFI
                                  (23))/DFC] × 100 > 25 %, kan worden aangenomen dat de teststof een inhibitoir effect op de activiteit van het entmateriaal heeft gehad en dit kan een verklaring zijn voor de lage waarden van DFT die zijn verkregen onder de testomstandigheden. In dit geval kan de test worden herhaald met een lagere testconcentratie en met bij voorkeur een vermindering van de DIC in het entmateriaal en de in de blanco controlevaten gevormde TIC, aangezien de lagere concentratie anders de nauwkeurigheid van de methode nadelig beïnvloedt. Als alternatief kan ander entmateriaal worden gebruikt. Indien in fles FS (abiotisch) een significante stijging (> 10 %) in de hoeveelheid TIC wordt waargenomen, zijn er mogelijk abiotische afbraakprocessen opgetreden.
                           
                        
                     Geldigheid van de resultaten
                  
                  
                              66.
                           
                           
                              Een test wordt geacht geldig te zijn, indien:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          de gemiddelde procentuele afbraak in de vaten FC met daarin de referentiestof > 60 % is op de 14e dag van de incubatie, en
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          de gemiddelde hoeveelheid TIC die aanwezig is in de blanco controlevaten FB aan het eind van de test > 3 mg C/l is.
                                       
                                    Als deze grenswaarden niet worden gehaald, moet de test worden herhaald met een uit een andere bron afkomstig entmateriaal en/of moeten de procedures worden herzien. Indien bijvoorbeeld hoge IC-productie in de blanco vaten een probleem is, moet de in de punten 27 tot en met 32 beschreven procedure worden gevolgd.
                           
                        
                              67.
                           
                           
                              Indien de teststof 60 % ThIC niet haalt en aangetoond is dat de teststof geen inhibitoir effect heeft (punt 65), kan de test worden herhaald met een hogere concentratie van het entmateriaal (maximaal 30 mg/l actief slib en 100 ml effluent/l) of entmaterialen uit andere bronnen, in het bijzonder indien de afbraak binnen het bereik van 20 tot 60 % lag.
                           
                        
                     Interpretatie van de resultaten
                  
                  
                              68.
                           
                           
                              Biologische afbraak > 60 % ThIC binnen het tiendagenvenster in deze test toont aan dat de teststof gemakkelijk biologisch afbreekbaar is onder aerobe omstandigheden.
                           
                        
                              69.
                           
                           
                              Als de waarde voor het doorstaan van de test van 60 % ThIC niet wordt gehaald, moet de pH-waarde worden bepaald in media in flessen waaraan geen zuur of alkaline is toegevoegd; een waarde lager dan 6,5 zou duiden op het optreden van nitrificatie. In een dergelijk geval moet de test worden herhaald met een bufferoplossing met een hogere concentratie.
                           
                        
                     Testverslag
                  
                  
                              70.
                           
                           
                              Een tabel wordt opgesteld met % D voor iedere testfles (FT), referentiefles (FC) en, indien van toepassing, inhibitiecontrolefles (FI) voor iedere monsternamedag. Indien vergelijkbare resultaten worden verkregen voor duploflessen, wordt een curve van gemiddelde % D uitgezet tegen de tijd. De hoeveelheid TIC in de blanco vaten (FB) wordt vastgelegd, alsmede de hoeveelheid DOC in de steriele controlevaten (FS) en/of andere determinanten en hun procentuele verwijdering.
                           
                        
                              71.
                           
                           
                              De gemiddelde waarde van % D in de plateaufase wordt bepaald of de hoogste waarde wordt gebruikt als de curve voor biologische afbraak in de plateaufase afneemt; deze waarde wordt gerapporteerd als de „mate van biologische afbraak van de teststof”. Het is belangrijk om in het laatstgenoemde geval te waarborgen dat de hoogste waarde geen uitbijter is.
                           
                        
                              72.
                           
                           
                              In het tesverslag worden de volgende gegevens opgenomen:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Teststof:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de triviale naam, de chemische naam, het CAS-nummer, de structuurformule en relevante fysisch-chemische eigenschappen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de zuiverheid (verontreinigingen) van de teststof.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testomstandigheden:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      verwijzing naar deze testmethode;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een beschrijving van het gebruikte testsysteem (bv. volume van het vat, verhouding tussen gasruimte en vloeistof, roermethode enz.);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de manier waarop de teststof en de referentiestof aan het testsysteem zijn toegevoegd: de gebruikte testconcentratie en de hoeveelheid koolstof die als dosis aan elke testfles is toegevoegd, eventueel gebruik van oplosmiddelen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nadere gegevens van het gebruikte entmateriaal, eventuele voorbehandeling en preconditionering;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      incubatietemperatuur;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      validering van de principes van IC-analyse;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      belangrijkste kenmerken van het gebruikte IC-analyseapparaat (en eventuele andere toegepaste analysemethoden);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aantal duplobepalingen.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Resultaten:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ruwe gegevens en berekende waarden van de biologische afbraak in tabelvorm;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de grafiek van de procentuele afbraak uitgezet tegen de tijd voor de test- en referentiestof, de aanloopfase, de afbreekfase, het tiendagenvenster en de richtingscoëfficiënt;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de procentuele verwijdering in de plateaufase, aan het eind van de test en na het tiendagenvenster;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      eventuele redenen om de testresultaten te verwerpen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      eventuele andere omstandigheden die relevant zijn voor de gevolgde procedure;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      een bespreking van de resultaten.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATUUR:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              Hoofdstuk C.4 van deze bijlage, Bepaling van de „gemakkelijke” biologische afbreekbaarheid — CO2-ontwikkelingstest (methode C.4-C).
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 159-167.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153-1161.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195-1210.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              ISO 9439 (1990; revised 1999). Water Quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium — Carbon dioxide evolution Test (Sturm).
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922-929.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801-812.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181-185.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). Appl. Env. Microbiol. 35: 51-53.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233-243.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204-211.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 23: 507-524.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust H, and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19: 1527-1550.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              ISO 14593, (1999) Water Quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in an aerobic medium-method by analysis of inorganic carbon in sealed vessels (C02 headspace test).
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Battersby NS (1997). The ISO headspace C02 biodegradation test, Chemosphere 34: 1813-1822.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance, Washington, DC.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR and Starkey M (1999). An „inherent” biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219-3235.
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              Hoofdstuk C.4 van deze bijlage, Bepaling van de „gemakkelijke” biologische afbreekbaarheid.
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris.
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              Hoofdstuk C.11 van deze bijlage, Test op de remming van de ademhaling van actief slib.
                           
                        
                              (23)
                           
                           
                              Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319-327.
                           
                        
                              (24)
                           
                           
                              EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO2 method: application to surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.
                           
                        
                              (25)
                           
                           
                              ISO 10634 (1996) Water Quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
                           
                        
                     Aanhangsel 1
                     AFKORTINGEN EN DEFINITIES
                     IC: anorganische koolstof.
                     ThCO2: theoretische hoeveelheid kooldioxide (mg) is de hoeveelheid kooldioxide die volgens berekening uit het bekende of gemeten koolstofgehalte van de teststof wordt geproduceerd, wanneer deze volledig wordt gemineraliseerd; wordt ook uitgedrukt als mg ontwikkelde kooldioxide per mg teststof.
                     DOC: opgeloste organische koolstof is de organische koolstof die in de oplossing aanwezig is of die of door een filter van 0,45 μm gaat of na centrifugeren bij ongeveer 4 000 g (ongeveer 40 000 m s-2) gedurende 15 minuten in de bovenstaande vloeistof overblijft.
                     DIC: opgeloste anorganische koolstof.
                     ThIC: theoretische hoeveelheid anorganische koolstof.
                     TIC: totale hoeveelheid anorganische koolstof.
                     Gemakkelijk biologisch afbreekbaar: een arbitraire indeling van chemische stoffen die bepaalde schiftingsproeven op totale biologische afbreekbaarheid hebben doorstaan; deze proeven zijn zo streng dat geacht wordt dat dergelijke chemische stoffen in aquatisch milieu onder aerobe omstandigheden snel en volledig biologisch worden afgebroken.
                     Tiendagenvenster: de periode van tien dagen onmiddellijk na het bereiken van 10 % biologische afbraak.
                     Inherente biologische afbreekbaarheid: een indeling van chemische stoffen waarvoor elke test op biologische afbreekbaarheid een ondubbelzinnig bewijs van (primaire of totale) biologische afbraak levert.
                     Totale aerobe biologische afbraak: de mate van afbraak die wordt verkregen wanneer de teststof volledig door micro-organismen wordt omgezet tot kooldioxide, water, anorganische zouten en nieuwe microbiële celbestanddelen (biomassa).
                     Mineralisatie: mineralisatie is de volledige ontleding van een organische chemische stof in CO2 en H2O onder aerobe omstandigheden en in CH4, CO2 en H2O onder anaerobe omstandigheden.
                     Aanloopfase: de tijdsduur vanaf de aanvang van de test totdat acclimatisering en/of adaptatie van de afbrekende micro-organismen heeft plaatsgevonden en de biologische afbraak van een teststof of organisch materiaal tot een detecteerbaar niveau is gestegen (bv. 10 % van de theoretische maximale biologische afbraak, of lager, afhankelijk van de nauwkeurigheid van de meettechniek).
                     Afbreekfase: de tijd van het eind van de aanloopperiode tot het tijdstip waarop 90 % van de maximale afbraak is bereikt.
                     Plateaufase: de plateaufase is de fase waarin de maximale afbraak is bereikt en de curve voor de biologische afbreekbaarheid afgevlakt is.
                     Teststof: alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.
                  
                  
                     Aanhangsel 2
                     
                        Voorbeeld van een curve voor biologische afbreekbaarheid
                     
                     
                        Figuur 1
                     
                     
                        Biologische afbraak van 1-octanol in de CO2-gasruimtetest
                     
                     
                        
                     
                        Legenda:
                     
                     biologische afbraak
                     afbreekfase
                     maximale biologische afbraak
                     plateaufase
                     tiendagenvenster
                     testperiode (dagen)
                  
                  C.30.   BIOACCUMULATIE IN TERRESTRISCHE OLIGOCHAETAE
                     
                  
                  INLEIDING
                  
                              1.
                           
                           
                              Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 317 (2010) van de OESO (TG 317). Testmethoden met betrekking tot het uiteindelijke lot in het milieu zijn onder meer Bioconcentratie: doorstroomtest met vissen (hoofdstuk C.13 van deze bijlage (49)) en de test voor „bioaccumulatie in in het sediment levende bentische Oligochaetae” (53), die in respectievelijk 1996 en 2008 werden gepubliceerd. Het is moeilijk, zo niet onmogelijk, om gegevens inzake aquatische bioaccumulatie te extrapoleren naar terrestrische organismen zoals regenwormen. Modelberekeningen op basis van de lipofiliciteit van een teststof, bv. (14)(37), worden op dit moment gebruikt voor de beoordeling van bioaccumulatie van chemische stoffen in de bodem, zoals bv. in de technische leidraad van de EU (19). Er is al ingegaan op de noodzaak van een compartimentspecifieke testmethode, zie bv. (55). Een dergelijke methode is met name belangrijk voor de evaluatie van secundaire vergiftiging in terrestrische voedselketens (4). Er zijn diverse nationale testmethoden voor bioaccumulatie in andere organismen dan vissen, bv. (2) en (72). Een methode voor het meten van bioaccumulatie uit verontreinigde grond in regenwormen (Eisenia fetida, Savigny) en potwormen is ontwikkeld door de American Society for Testing and Materials (3). Een internationaal erkende methode voor de bepaling van bioaccumulatie in verrijkte grond zal de risicoanalyse voor chemische stoffen in terrestrische ecosystemen verbeteren, bv. (25)(29).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Ongewervelde dieren die grond opnemen, worden blootgesteld aan de chemische stoffen die zich in de grond bevinden. Onder deze dieren spelen terrestrische Oligochaetae (regenwormen) een belangrijke rol in de structuur en functie van grond (15)(20). Terrestrische Oligochaetae leven in de bodem en hoofdzakelijk aan het bodemoppervlak (met name in de strooisellaag); in biomassa uitgedrukt zijn ze vaak de meest voorkomende soort (54). Door bioturbatie van de bodem en door als prooi te dienen kunnen deze dieren een grote invloed hebben op de biobeschikbaarheid van chemische stoffen voor andere organismen zoals ongewervelde dieren (bv. roofmijten en kevers; bv. (64)) of gewervelde roofdieren (bv. vossen en meeuwen) (18)(62). In aanhangsel 5 zijn een aantal van de momenteel in ecotoxicologische tests gebruikte soorten terrestrische Oligochaetae beschreven.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              De ASTM Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity or Bioaccumulation Tests with the Lumbricid Earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid Potworm Enchytraeus albidus (3) bevat vele essentiële en nuttige nadere gegevens met betrekking tot de uitvoering van de onderhavige testmethode ter bepaling van de bioaccumulatie in de bodem. Andere documenten waarnaar in deze testmethode wordt verwezen, zijn hoofdstuk C.13 van deze bijlage, Bioconcentratie: doorstroomtest met vissen (49) en TG 315 van de OESO: Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates (53). Praktijkervaring met onderzoek naar bioaccumulatie in de bodem en publicaties uit de literatuur, bv. (1)(5)(11)(12)(28)(40)(43)(45)(57)(59)(76)(78)(79), zijn eveneens belangrijke bronnen van informatie voor deze testmethode.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Deze testmethode is voornamelijk van toepassing op stabiele, neutrale organische stoffen, die neigen naar adsorptie aan de grond. Deze testmethode kan worden gebruikt om te testen op bioaccumulatie van stabiele metallo-organische verbindingen die zich aan grond hechten. De methode kan tevens worden toegepast op metalen en andere spoorelementen.
                           
                        VOORWAARDE
                  
                              5.
                           
                           
                              Tests voor het meten van de bioaccumulatie van een chemische stof in terrestrische Oligochaetae zijn uitgevoerd met zware metalen (zie bv. (63)) en persistente, organische stoffen met bekende log Kow-waarden tussen 3,0 en 6,0, bv. (40). Dergelijke tests kunnen ook worden toegepast op:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          chemische stoffen met een log Kow van meer dan 6,0 (superhydrofobe chemische stoffen);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          chemische stoffen die behoren tot een klasse van organische stoffen waarvan bekend is dat ze kunnen bioaccumuleren in levende organismen, bv. oppervlakteactieve stoffen of stoffen met een hoog adsorptievermogen;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          chemische stoffen met structuurkenmerken die wijzen op bioaccumulatiepotentieel, bv. analogen van stoffen waarvan het bioaccumulatiepotentieel bekend is, en
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          metalen.
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              Vóór het begin van de studie moet informatie over de teststof worden verzameld, zoals de triviale naam, de chemische naam (bij voorkeur de IUPAC-naam), de structuurformule, het CAS-registratienummer, de zuiverheid, voorzorgsmaatregelen, passende opslagomstandigheden en de analysemethoden. Daarnaast moet de volgende informatie bekend zijn:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          oplosbaarheid in water;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          verdelingscoëfficiënt octanol/water, Kow;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          verdelingscoëfficiënt grond/water, uitgedrukt als Koc;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          dampspanning;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          afbreekbaarheid (bv. in grond, water);
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          bekende metabolieten.
                                       
                                    
                        
                              7.
                           
                           
                              Er kan gebruik worden gemaakt van radioactief gelabelde of niet radioactief gelabelde teststoffen. Om de analyse te vergemakkelijken wordt echter het gebruik van een radioactief gelabelde teststof aanbevolen. Deze keuze wordt gemaakt op basis van de aantoonbaarheidsgrenswaarden of een vereiste om de oorspronkelijke teststof en metabolieten te meten. Indien een radioactief gelabelde teststof wordt gebruikt en de totale hoeveelheid radioactieve residuen wordt gemeten, is het belangrijk dat de radioactief gelabelde residuen in zowel de grond als de testorganismen worden gekenmerkt op basis van de percentages van de oorspronkelijke teststof en de gelabelde niet-oorspronkelijke stof, bv. in monsters die zijn genomen in stationaire toestand of aan het eind van de opnamefase, zodat een bioaccumulatiefactor (BAF) kan worden berekend voor de oorspronkelijke teststof en voor de desbetreffende grondmetabolieten (zie punt 50). Mogelijk moet de hier beschreven methode worden aangepast, bv. om voor voldoende biomassa te zorgen, voor het meten van niet-radioactief gelabelde organische teststoffen of metalen. Indien de totale hoeveelheid radioactieve residuen wordt gemeten (door vloeistofscintillatietelling na extractie, verbranding of weefselsolubilisatie), wordt de bioaccumulatiefactor gebaseerd op de oorspronkelijke teststof en metabolieten. De berekening van de BAF moet bij voorkeur worden gebaseerd op de concentratie van de oorspronkelijke teststof in de organismen en de totale hoeveelheid radioactieve residuen. Vervolgens moet de voor het vetgehalte van de worm en het gehalte aan organische koolstof (OC) in de bodem genormaliseerde biota-grondaccumulatiefactor (BSAF) worden berekend op basis van de BAF, zodat de resultaten van verschillende bioaccumulatietests met elkaar kunnen worden vergeleken.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              De toxiciteit van de teststof voor de in de test gebruikte soort moet bekend zijn, bv. een effectconcentratie (ECx) of letale concentratie (LCx) voor de tijd van de opnamefase (bv. (19)). De geselecteerde concentratie van de teststof moet bij voorkeur ongeveer 1 % bedragen van de acute asymptotische LC50 en ten minste tien keer zo hoog zijn als de aantoonbaarheidsgrens van de stof in grond voor de gebruikte analysemethode. De voorkeur moet worden gegeven aan toxiciteitswaarden die zijn afgeleid uit langetermijnonderzoek naar subletale eindpunten (51)(52), voor zover beschikbaar. Indien dergelijke gegevens niet beschikbaar zijn, geeft een test op acute toxiciteit nuttige informatie (zie bv. (23)).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Er moet een geschikte analysemethode met een bekende juistheid, precisie en gevoeligheid voor de kwantificering van de chemische stof in de testoplossingen, in de bodem en in het biologische materiaal beschikbaar zijn, alsook nadere gegevens met betrekking tot monsterbereiding en -opslag en veiligheidsinformatiebladen voor materialen. De analytische aantoonbaarheidsgrenzen van de teststof in de bodem en het wormweefsel moeten eveneens bekend zijn. Indien een met 14C gelabelde teststof wordt gebruikt, moeten de specifieke radioactiviteit (d.w.z. Bq mol–1) en het percentage van de met onzuiverheden verbonden radioactiviteit bekend zijn. De specifieke radioactiviteit van de teststof moet hoog genoeg zijn om analyse mogelijk te maken en de gebruikte testconcentraties mogen geen toxische effecten veroorzaken.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              De test kan worden uitgevoerd met kunstmatige grond of met natuurlijke grond. Informatie over kenmerken van de gebruikte natuurlijke grond, bv. de oorsprong van de grond of de bestanddelen ervan, de pH-waarde, het gehalte aan organische koolstof, de deeltjesgrootteverdeling (percentage zand, silt en klei) en het waterhoudend vermogen (WHC), moet bekend zijn vóór de start van de test (3)(48).
                           
                        PRINCIPE VAN DE TEST
                  
                              11.
                           
                           
                              De parameters die kenmerkend zijn voor de bioaccumulatie van een teststof zijn onder meer de bioaccumulatiefactor (BAF), de opnamesnelheidsconstante (ks) en de eliminatiesnelheidsconstante (ke). Definities worden gegeven in aanhangsel 1.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              De test bestaat uit twee fasen: de opnamefase (blootstelling) en de eliminatiefase (na blootstelling). Tijdens de opnamefase worden duplogroepen wormen blootgesteld aan grond die verrijkt is met de teststof. Naast deze testdieren worden groepen controlewormen onder identieke omstandigheden zonder de teststof gehouden. Het drooggewicht en het vetgehalte van de testorganismen worden gemeten. Dit kan worden gedaan met behulp van de wormen van de controlegroep. Analytische nuleffectmetingen (blanco) kunnen worden uitgevoerd door monsters van de controlewormen en -grond te analyseren. Voor de eliminatiefase worden de wormen overgebracht naar grond die vrij is van de teststof. Een eliminatiefase is altijd vereist, tenzij de opname van de teststof tijdens de blootstellingsfase niet significant was. Een eliminatiefase levert informatie op over de snelheid waarmee de teststof door de testorganismen wordt uitgescheiden (bv. (27)). Indien tijdens de opnamefase geen stationaire toestand is bereikt, moet de bepaling van de kinetische parameters — kinetische bioaccumulatiefactor BAFk, opname- en eliminatiesnelheidsconstante(n) — bij voorkeur gebaseerd zijn op simultane fitting van de resultaten van de opname- en de eliminatiefasen. De concentratie van de teststof in/op de wormen wordt gedurende beide fasen gemonitord.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Tijdens de opnamefase worden metingen verricht op bemonsteringstijdstippen tot 14 dagen („Enchytraeidae”) of 21 dagen (regenwormen) totdat de stationaire toestand is bereikt (11)(12)(67). De stationaire toestand treedt op wanneer de tegen de tijd uitgezette concentratie in wormen evenwijdig loopt aan de tijdas en drie opeenvolgende concentratieanalysen van monsters die genomen zijn met intervallen van ten minste twee dagen, niet meer dan ± 20 % van elkaar variëren op basis van statistische vergelijkingen (bv. analyse van variantie, regressieanalyse).
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              De eliminatiefase bestaat uit het overbrengen van de testorganismen naar vaten met hetzelfde substraat zonder de teststof. Tijdens de eliminatiefase worden metingen verricht op bemonsteringstijdstippen gedurende 14 dagen („Enchytraeidae”) of 21 dagen (regenwormen), tenzij uit eerdere analytische bepaling een vermindering van 90 % van de teststofresiduen in wormen is gebleken. De concentratie van de teststof in de wormen aan het eind van de eliminatiefase wordt gerapporteerd als niet-geëlimineerde residuen. De bioaccumulatiefactor in stationaire toestand (BAFSS) wordt bij voorkeur berekend op twee manieren: als de verhouding tussen de concentratie in wormen (Ca) en in de bodem (Cs) bij een kennelijke stationaire toestand, en als een kinetische bioaccumulatiefactor, BAFK, zijnde de verhouding tussen de snelheidsconstante van opname uit de bodem (ks) en de eliminatiesnelheidsconstante (ke) (zie aanhangsel 1 voor definities), uitgaande van een eersteordekinetiek (zie aanhangsel 2 voor berekeningen). Indien eersteordekinetiek duidelijk niet van toepassing is, moeten andere modellen worden gebruikt.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              De opnamesnelheidsconstante, de eliminatiesnelheidsconstante (of -constanten, indien andere modellen gebruikt worden), de kinetische bioaccumulatiefactor (BAFK) en, indien mogelijk, de betrouwbaarheidsgrenzen van elk van deze parameters worden berekend met behulp van gecomputeriseerde modelvergelijkingen (zie aanhangsel 2 voor richtsnoeren). De kwaliteit van de fitting van ieder model dat wordt gebruikt, kan worden bepaald aan de hand van bijvoorbeeld de correlatiecoëfficiënt of de determinatiecoëfficiënt (coëfficiënten die in de buurt van één liggen, duiden op een goede fitting) of chi-kwadraattest. Ook kan de grootte van de standaardfout of betrouwbaarheidsgrens rond de geschatte parameters een indicatie zijn van de kwaliteit van de fitting van het model.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Ter vermindering van de variabiliteit in de testresultaten voor teststoffen met een hoge lipofiliciteit moeten de bioaccumulatiefactoren worden uitgedrukt in verhouding tot het vetgehalte en het gehalte aan organische koolstof (kg organische koolstof in de bodem (OC) kg–1 vetgehalte van worm). Deze aanpak is gebaseerd op het feit dat voor bepaalde chemische klassen een duidelijk verband bestaat tussen het bioaccumulatiepotentieel en de lipofiliciteit; dit is duidelijk vastgesteld voor vissen (47). Er is een verband tussen het vetgehalte van vissen en de bioaccumulatie van dergelijke stoffen. Voor bentische organismen zijn soortgelijke correlaties gevonden, bv. (30)(44). Ook voor terrestrische Oligochaetae is deze correlatie aangetoond, bv. (5)(6)(7)(14). Indien voldoende wormweefsel beschikbaar is, kan het vetgehalte van de testdieren op hetzelfde biologische materiaal worden bepaald als het materiaal dat gebruikt is om de concentratie van de teststof te bepalen. Als alternatief kunnen controledieren worden gebruikt om het vetgehalte te meten.
                           
                        GELDIGHEID VAN DE TEST
                  
                              17.
                           
                           
                              Voor een geldige test moeten zowel de controle- als de testgroepen aan de volgende criteria voldoen:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          aan het eind van de test mag de totale sterfte tijdens de opname- en eliminatiefase niet hoger zijn dan 10 % (regenwormen) of 20 % („Enchytraeidae”) van het totale aantal ingebrachte wormen;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          voor Eisenia fetida en Eisenia andrei mag het gemiddelde massaverlies, gemeten aan het eind van de opnamefase en aan het eind van de eliminatiefase, niet hoger zijn dan 20 % in vergelijking met het versgewicht aan het begin van iedere fase.
                                       
                                    
                        BESCHRIJVING VAN DE METHODE
                  
                     Diersoort
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Diverse soorten terrestrische Oligochaetae worden aanbevolen voor tests op bioaccumulatie. In aanhangsel 5 zijn de meest gebruikte soorten beschreven, namelijk Eisenia fetida of Eisenia andrei („Lumbricidae”), of Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus of Enchytraeus luxuriosus („Enchytraeidae”).
                           
                        
                     Apparatuur
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Voor alle onderdelen van de apparatuur moet het gebruik van materialen die de teststof kunnen oplossen of adsorberen of andere stoffen kunnen logen en die een schadelijk effect op de testdieren hebben, worden vermeden. Er kunnen rechthoekige of cilindervormige standaardvaten met een passend volume van een chemisch inert materiaal worden gebruikt, die geschikt zijn voor de densiteit, d.w.z. het aantal testwormen. Roestvrij staal, kunststof of glas kan worden gebruikt voor apparatuur die in contact komt met de testmedia. De testvaten moeten dusdanig zijn afgedekt dat de wormen niet kunnen ontsnappen, terwijl ze van voldoende lucht worden voorzien. Voor stoffen met een hoge adsorptiecoëfficiënt, zoals synthetische pyretroïden, kan het noodzakelijk zijn gesilaniseerd glas te gebruiken. In deze situaties moet de apparatuur na gebruik als afval worden verwijderd (49). Voorkomen moet worden dat radioactief gelabelde teststoffen en vluchtige chemische stoffen ontsnappen. Er moeten afscheiders (bv. gaswasflessen van glas) met geschikte absorptiemiddelen worden gebruikt om eventuele residuen die uit de testvaten verdampen, op te vangen.
                           
                        
                     Grond
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              De testgrond moet van een dusdanige kwaliteit zijn dat de testorganismen kunnen overleven en, bij voorkeur, zich kunnen voortplanten gedurende de acclimatiserings- en testperioden, zonder een abnormaal uiterlijk te hebben of abnormaal gedrag te vertonen. De wormen moeten boortunnels in de grond maken.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              De kunstmatige grond die in hoofdstuk C.8 van deze bijlage (48) wordt beschreven, is het aanbevolen substraat in de tests. Aanhangsel 4 beschrijft de voorbereiding van de kunstmatige grond voor gebruik in de bioaccumulatietests en geeft aanbevelingen voor de opslag van kunstmatige grond. Luchtgedroogde kunstmatige grond kan bij kamertemperatuur tot gebruik worden bewaard.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Natuurlijke grond van niet-verontreinigde terreinen kan echter ook als test- en/of kweeksubstraat dienen. Natuurlijke grond moet worden gekarakteriseerd met ten minste de oorsprong (plaats van verzameling), pH, gehalte aan organische koolstof, deeltjesgrootteverdeling (percentage zand, silt en klei), het maximale waterhoudende vermogen (WHCmax) en het procentuele watergehalte (3). Analyse van de grond of de bestanddelen ervan op microverontreinigingen vóór gebruik levert in dit verband nuttige informatie op. Indien grond van landbouwvelden wordt gebruikt, mag de grond gedurende ten minste één jaar niet met gewasbeschermingsproducten of met mest van behandelde dieren en gedurende ten minste zes maanden vóór de monstername niet met organische meststoffen behandeld zijn (50). Manipulatieprocedures voor natuurlijke grond vóór het gebruik ervan in ecotoxicologische tests met Oligochaetae in het laboratorium zijn beschreven in (3). Voor natuurlijke grond moet de opslagtijd in het laboratorium zo kort mogelijk worden gehouden.
                           
                        
                     Het aanbrengen van de teststof
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              De teststof wordt in de grond gebracht. De fysisch-chemische eigenschappen van de teststof moeten in aanmerking worden genomen. Een in water oplosbare teststof moet volledig in water opgelost zijn voordat de stof met de grond wordt vermengd. Als verrijkingsprocedure voor moeilijk in water oplosbare teststoffen wordt aanbevolen een laag teststof aan te brengen op één of meer bestanddelen van de (kunstmatige) grond. Zo kan (een deel van) het kwartszand worden doordrenkt met een oplossing van de teststof in een geschikt organisch oplosmiddel, dat vervolgens langzaam wordt ingedampt. Vervolgens kan het met een laag van de teststof bedekte deel met de vochtige grond worden gemengd. Het grote voordeel van deze procedure is dat geen oplosmiddel in de grond terechtkomt. Bij gebruik van natuurlijke grond kan de teststof op de hierboven voor kunstmatige grond beschreven wijze worden toegevoegd aan een luchtgedroogd deel van de grond of door de vochtige grond worden geroerd, met vervolgens verdamping indien een solubilisator wordt gebruikt. In het algemeen moet zo veel mogelijk worden vermeden dat de vochtige grond in contact komt met oplosmiddelen. Er moet rekening worden gehouden met de volgende overwegingen (3):
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          indien een ander oplosmiddel dan water wordt gebruikt, moet dit een middel zijn dat mengbaar is met water en/of kan worden afgedreven (bijvoorbeeld verdampt), waardoor alleen de teststof op de grond achterblijft;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          indien een oplosmiddelcontrolegroep wordt gebruikt, is een negatieve controle niet nodig. De oplosmiddelcontrolegroep moet de hoogste concentratie oplosmiddel bevatten die aan de grond is toegevoegd en het gebruikte oplosmiddel moet afkomstig zijn van dezelfde partij die voor het bereiden van de stamoplossing is gebruikt. De toxiciteit en vluchtigheid van het oplosmiddel alsmede de oplosbaarheid van de teststof in het gekozen oplosmiddel moeten de voornaamste criteria zijn op basis waarvan een geschikte solubilisator wordt gekozen.
                                       
                                    
                        
                              24.
                           
                           
                              Voor chemische stoffen die slecht in water en in organische oplosmiddelen oplosbaar zijn, kan, bijvoorbeeld met behulp van een vijzel en stamper, 2,0-2,5 g fijn gemalen kwartszand per testvat worden gemengd met de hoeveelheid teststof die nodig is om de gewenste testconcentratie te verkrijgen. Het mengsel van kwartszand en teststof wordt toegevoegd aan de vooraf bevochtigde grond en grondig gemengd met een passende hoeveelheid gedeïoniseerd water om het vereiste vochtgehalte te verkrijgen. Het uiteindelijke mengsel wordt over de testvaten verdeeld. De procedure wordt voor iedere testconcentratie herhaald en tevens wordt een passende controlegroep met 2,0-2,5 g fijn gemalen kwartszand per testvat bereid.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              De concentratie van de teststof in de grond moet na verrijking worden bepaald. De homogene verdeling van de teststof in de grond moet worden gecontroleerd voordat de testorganismen worden toegevoegd. De verrijkingsmethode en de redenen voor het kiezen van een specifieke verrijkingsprocedure moeten worden gerapporteerd (24).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Idealiter moet een evenwicht tussen de grond- en de poriënwaterfase zijn bereikt voordat de organismen worden toegevoegd; een periode van vier dagen bij 20 °C wordt aanbevolen. Voor vele slecht in water oplosbare organische stoffen kan de tijd die nodig is om een echt evenwicht tussen geadsorbeerde en opgeloste fracties te bereiken, worden geteld in dagen of maanden. Afhankelijk van het doel van de studie, bijvoorbeeld wanneer de milieuomstandigheden moeten worden nagebootst, kan de verrijkte grond gedurende een langere periode „gerijpt” worden, bv. voor metalen drie weken bij 20 °C (22).
                           
                        
                     Kweken van de testorganismen
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Wormen moeten bij voorkeur in een permanente laboratoriumcultuur worden gehouden. Richtsnoeren voor de laboratoriumkweekmethoden voor Eisenia fetida en Eisenia andrei en voor soorten „Enchytraeidae” zijn opgenomen in aanhangsel 5 (zie ook (48)(51)(52)).
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              De in de tests gebruikte wormen moeten vrij zijn van waarneembare ziekten, abnormaliteiten en parasieten.
                           
                        UITVOERING VAN DE TEST
                  
                              29.
                           
                           
                              De testorganismen worden tijdens de opnamefase aan de teststof blootgesteld. De opnamefase duurt 14 dagen („Enchytraeidae”) of 21 dagen (regenwormen), tenzij aangetoond is dat een stationaire toestand is bereikt.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Voor de eliminatiefase worden de wormen overgebracht naar grond die vrij is van teststof. Het eerste monster moet 4 tot 24 uur na het begin van de eliminatiefase worden genomen. Voorbeelden van bemonsteringsschema’s voor een opnamefase van 21 dagen en een eliminatiefase van 21 dagen zijn opgenomen in aanhangsel 3.
                           
                        
                     Testorganismen
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Voor vele soorten terrestrische „Enchytraeidae” is het individuele gewicht zeer laag (bv. 5-10 mg natgewicht voor Enchytraeus albidus en minder voor Enchytraeus crypticus of Enchytraeus luxuriosus); om de gewichtsmetingen en chemische analyse uit te voeren, kan het nodig zijn om de wormen van de duplotestvaten in een gezamenlijke groep te bundelen (d.w.z. alle wormen in een duplovat worden gebruikt om één analytisch meetresultaat voor het weefsel te verkrijgen). 20 individuele „Enchytraeidae” worden aan ieder duplovat toegevoegd en ten minste drie duplovaten moeten worden gebruikt. Als de analytische aantoonbaarheidsgrens van de teststof hoog is, zijn mogelijk meer wormen nodig. Voor testsoorten met een hoger individueel gewicht (Eisenia fetida en Eisenia andrei) kunnen duplovaten met één individu worden gebruikt.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              De regenwormen die in een test worden gebruikt, moeten een vergelijkbaar gewicht hebben (bv. Eisenia fetida en Eisenia andrei moeten een individueel gewicht hebben van 250-600 mg). „Enchytraeidae” (bv. Enchytraeus albidus) moeten een lengte hebben van ongeveer 1 cm. Alle wormen die in een bepaalde test worden gebruikt, moeten van dezelfde bron afkomstig zijn en moeten volwassen dieren met een clitellum zijn (zie aanhangsel 5). Aangezien het gewicht en de leeftijd van een dier een effect kunnen hebben op de BAF-waarden (bv. vanwege een variërend vetgehalte en/of de aanwezigheid van eieren), moeten deze parameters nauwkeurig geregistreerd worden en in aanmerking worden genomen bij het interpreteren van de resultaten. Daarnaast kunnen tijdens de blootstellingsperiode cocons worden gevormd, die eveneens van invloed zullen zijn op de BAF-waarden. Het verdient aanbeveling vóór de test een deelsteekproef van de testwormen te wegen om een schatting van het gemiddelde nat- en drooggewicht te verkrijgen.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Om de afname van de teststofconcentratie in de grond tijdens de opnamefase te beperken, moet een grote grond-wormverhouding worden toegepast. Voor Eisenia fetida en Eisenia andrei wordt een minimale hoeveelheid van 50 g drooggewicht aan grond per worm aanbevolen en voor „Enchytraeidae” minimaal 10-20 g drooggewicht per testvat. De vaten moeten een grondlaag van 2-3 cm („Enchytraeidae”) of 4-5 cm (regenwormen) bevatten.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              De in een test gebruikte wormen worden uit de cultuur verwijderd („Enchytraeidae” bijvoorbeeld met behulp van een juwelierspincet). Volwassen dieren worden overgebracht naar onbehandelde testgrond om te acclimatiseren en worden gevoed (zie punt 36). Als de testomstandigheden verschillen van de cultuuromstandigheden, moet een acclimatiseringsfase van 24-72 uur volstaan om de wormen aan de testomstandigheden te laten wennen. Na acclimatisering worden de regenwormen gespoeld door ze naar glazen schalen (bv. petrischalen) met schoon water over te brengen, waarna ze worden gewogen en aan de testgrond worden toegevoegd. Voordat ze worden gewogen, moet overtollig water van de wormen worden verwijderd door ze voorzichtig tegen de rand van het schaaltje te houden of door ze voorzichtig droog te deppen met een licht bevochtigd papieren doekje.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Het graafgedrag van de testorganismen moet worden geobserveerd en geregistreerd. In tests met regenwormen beginnen de dieren (controle- en testgroep) gewoonlijk binnen enkele uren tunnels te graven; dit moet binnen 24 uur na inbrenging van de wormen in de testvaten worden gecontroleerd. Indien de regenwormen geen tunnels in de grond graven (bv. meer dan 10 % gedurende meer dan de helft van de opnamefase), duidt dit erop dat de testomstandigheden niet passend zijn of dat de testorganismen niet gezond zijn. In een dergelijk geval moet de test worden stopgezet en herhaald. „Enchytraeidae” leven voornamelijk in de interstitiële poriën van de grond en vaak komt hun integument slechts gedeeltelijk in aanraking met het omringende substraat; de blootstelling van gravende en niet gravende „Enchytraeidae” wordt verondersteld equivalent te zijn en indien de „Enchytraeidae” niet graven, wil dat niet noodzakelijkerwijs zeggen dat de test moet worden herhaald.
                           
                        
                     Voeding
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Als grond met een laag totaal gehalte aan organische koolstof wordt gebruikt, moet worden overwogen voeding toe te dienen. Bij gebruik van kunstmatige grond wordt een wekelijks rantsoen (d.w.z. de wormen moeten eenmaal per week worden gevoed) van 7 mg gedroogde mest per g grond (drooggewicht) voor regenwormen en een wekelijks rantsoen van 2-2,5 mg gemalen havervlokken per g grond (drooggewicht) voor „Enchytraeidae” aanbevolen (11). Het eerste rantsoen moet net voordat de testorganismen worden toegevoegd, met de grond worden vermengd. Bij voorkeur moet dezelfde soort voeding worden gebruikt als de voeding die in de culturen wordt gebruikt (zie aanhangsel 5).
                           
                        
                     Licht en temperatuur
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              De tests moeten worden uitgevoerd bij een gecontroleerde cyclus van 16 uur licht en 8 uur donker, met bij voorkeur 400 tot 800 lux in het gebied van de testvaten (3). De testtemperatuur moet gedurende de gehele test 20 ± 2 °C zijn.
                           
                        
                     Testconcentraties
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Er wordt gebruikgemaakt van één concentratie. Situaties waarin één of meer aanvullende concentraties nodig zijn, moeten worden gemotiveerd. Indien de toxiciteit (ECx) van de teststof dicht bij de analytische aantoonbaarheidsgrens ligt, verdient het aanbeveling om een radioactief gelabelde teststof met een hoge specifieke radioactiviteit te gebruiken. Voor metalen moet de concentratie hoger zijn dan het achtergrondniveau in weefsel en grond.
                           
                        
                     Duplo’s
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Voor de kinetische metingen (opname- en eliminatiefase) moeten er per bemonsteringspunt minimaal drie behandelde duplovaten zijn. Het totale aantal bereide duplo’s moet voldoende zijn voor alle bemonsteringstijdstippen tijdens de opname- en eliminatiefase.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Voor de biologische waarnemingen en metingen (bv. de verhouding tussen nat- en drooggewicht, het vetgehalte) en voor de analyse van achtergrondconcentraties in wormen en grond moeten ten minste twaalf duplovaten van een negatieve controlegroep (vier monsternamen aan het begin, vier aan het eind van de opnamefase en vier aan het eind van de eliminatiefase) beschikbaar zijn, indien geen ander oplosmiddel dan water wordt gebruikt. Indien een solubilisator wordt gebruikt om de teststof aan te brengen, moet in aanvulling op de met teststof behandelde duplo’s een oplosmiddelcontrole worden uitgevoerd (vier duplovaten moeten aan het begin worden bemonsterd, vier aan het eind aan de opnamefase en vier aan het eind van de eliminatiefase) waarbij alle bestanddelen behalve de teststof worden gebruikt. In dat geval kan ook worden gezorgd voor vier aanvullende duplovaten van een negatieve controlegroep (geen oplosmiddel) voor facultatieve monstername aan het eind van de opnamefase. Deze duplo’s kunnen biologisch worden vergeleken met de oplosmiddelcontrolegroep om informatie te verkrijgen over een mogelijk effect van het oplosmiddel op de testorganismen. Het verdient aanbeveling te zorgen voor een voldoende aantal aanvullende reserveduplovaten (bv. acht) voor zowel de testgroep als de controlegroep(en).
                           
                        
                     Frequentie van de metingen van de grondkwaliteit
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Aan het begin en aan het eind van de opname- en eliminatiefase worden de pH van de grond, het vochtgehalte van de grond en de temperatuur (continu) in de testruimte gemeten. Eenmaal per week wordt het vochtgehalte van de grond gecontroleerd door de testvaten te wegen en de meetwaarden met het initiële gewicht aan het begin van de test te vergelijken. Waterverliezen moeten worden gecompenseerd door gedeïoniseerd water toe te voegen.
                           
                        
                     Bemonstering en analyse van de wormen en de grond
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Een voorbeeld van een schema voor de opname- en eliminatiefasen van bioaccumulatietests met regenwormen en „Enchytraeidae” is opgenomen in aanhangsel 3.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              De grond in de testvaten wordt bemonsterd om de concentratie teststof vóór toevoeging van de wormen en tijdens de opname- en eliminatiefasen te bepalen. Tijdens de test worden de concentraties teststof in de wormen en de grond bepaald. In het algemeen worden totale grondconcentraties gemeten. Facultatief kunnen concentraties in poriënwater worden gemeten; in dat geval moeten voor aanvang van het onderzoek een motivering en passende methoden worden opgegeven, die tevens in het verslag worden opgenomen.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              De wormen en grond worden tijdens de opname- en eliminatiefasen op minimaal zes momenten bemonsterd. Indien de stabiliteit van een teststof is aangetoond, kan het aantal grondanalysen worden verminderd. Het verdient aanbeveling om ten minste drie duplo’s aan het begin en aan het eind van de opnamefase te analyseren. Als de concentratie in de grond die aan het eind van de opnamefase wordt gemeten, meer dan 30 % afwijkt van de initiële concentratie, moeten de grondmonsters die op andere dagen zijn genomen ook worden geanalyseerd.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              De wormen van een duplo moeten bij iedere monstername uit de grond worden verwijderd (bv. door de grond van een duplovat over een ondiepe schaal te verspreiden en de wormen met een zacht juwelierspincet op te pakken) en vervolgens snel met water worden gespoeld in een ondiepe glazen of stalen schaal. Overtollig water moet worden verwijderd (zie punt 34). De wormen worden vervolgens voorzichtig overgebracht naar een van tevoren gewogen vat en onmiddellijk gewogen, inclusief darminhoud.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              De regenwormen (Eisenia spp.) ontlasten vervolgens 's nachts hun darmen, bv. op een vochtig stuk filterpapier in een afgedekte petrischaal (zie punt 34). Nadat de wormen hun darmen hebben ontlast, wordt het gewicht van de wormen bepaald om een eventuele vermindering van biomassa tijdens de test te beoordelen (zie geldigheidscriteria in punt 17). Het wegen en de weefselanalyse van „Enchytraeidae” wordt uitgevoerd zonder dat de dieren hun darmen hebben ontlast, aangezien dit in technisch opzicht moeilijk is vanwege de geringe omvang van deze wormen. Nadat het uiteindelijke gewicht is bepaald, moeten de wormen onverwijld worden gedood door middel van de meest passende methode (bv. met gebruikmaking van vloeibare stikstof of door bevriezen bij temperaturen onder – 18 °C).
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Tijdens de eliminatiefase vervangen de wormen verontreinigde darminhoud met schone grond. Dit betekent dat onmiddellijk vóór de eliminatiefase genomen monsters van wormen die zich niet hebben ontlast („Enchytraeidae” in dit geval) verontreinigde darminhoud bevatten. Voor aquatische Oligochaetae wordt aangenomen dat het merendeel van de verontreinigde darminhoud na de eerste 4 tot 24 uur van de eliminatiefase door schoon sediment is vervangen, zie bv. (46). In studies naar de accumulatie van radioactief gelabeld cadmium en zink zijn vergelijkbare bevindingen voor regenwormen gerapporteerd (78). In de „Enchytraeidae” die zich niet hebben ontlast, kan de concentratie van dit eerste monster van de eliminatiefase worden beschouwd als de weefselconcentratie na ontlasting van de darm. Om rekening te houden met de verdunning van de teststofconcentratie door opname van niet-verontreinigde grond tijdens de eliminatiefase, kan het gewicht van de darminhoud worden geschat op basis van de verhouding natgewicht/asgewicht van de worm of de verhouding drooggewicht/asgewicht van de worm.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              De grond- en wormmonsters moeten bij voorkeur onmiddellijk na verwijdering (d.w.z. binnen één-twee dagen) worden geanalyseerd om ontbinding of andere verliezen te voorkomen en het verdient aanbeveling om de opname- en eliminatiesnelheden bij benadering te berekenen naarmate de test vordert. Als de analyse met vertraging plaatsvindt, moeten de monsters op passende wijze worden bewaard, bv. diepgevroren (≤ – 18 °C).
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Gecontroleerd moet worden of de precisie en reproduceerbaarheid van de chemische analyse alsmede de recovery van de teststof uit de grond- en wormmonsters toereikend zijn voor de gebruikte methode; de extractie-efficiëntie, de aantoonbaarheidsgrens (LOD) en de bepaalbaarheidsgrens (LOQ) moeten worden gerapporteerd. Ook moet worden gecontroleerd of de teststof in de controlevaten niet detecteerbaar is in hogere concentraties dan de achtergrondconcentratie. Indien bij de controlewormen de concentratie van de teststof in het testorganisme Ca > 0, moet hiermee rekening worden gehouden bij de berekening van de kinetische parameters (zie aanhangsel 2). Alle monsters moeten tijdens de gehele test dusdanig worden gehanteerd dat verontreiniging en verlies (bv. ten gevolge van adsorptie van de teststof aan het bemonsteringshulpmiddel) tot een minimum worden beperkt.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Bij gebruik van radioactief gelabelde teststoffen is het mogelijk om de oorspronkelijke stof en de metabolieten te analyseren. Kwantificering van de oorspronkelijke teststof en de metabolieten in stationaire toestand of aan het eind van de opnamefase levert belangrijke informatie op. De monsters worden vervolgens „opgeschoond”, zodat de oorspronkelijke teststof afzonderlijk kan worden gekwantificeerd. Indien individuele metabolieten een radioactiviteit van meer dan 10 % van de totale radioactiviteit hebben, wordt aanbevolen deze metabolieten te identificeren.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              De totale recovery en de teststofrecovery in wormen, grond en, indien gebruikt, in afscheiders met absorptiemiddelen om verdampte teststof op te vangen, moeten worden geregistreerd en gerapporteerd.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Bundeling van de bemonsterde individuen uit een bepaald testvat is aanvaardbaar voor „Enchytraeidae” die kleiner zijn dan regenwormen. Indien door de bundeling het aantal duplo’s afneemt, beperkt dit de statistische procedures die op de gegevens kunnen worden toegepast. Indien het nodig is een specifieke statistische procedure toe te passen of een bepaald statistisch onderscheidingsvermogen te bereiken, moet de test, rekening houdend met die bundeling, die procedure en dat onderscheidingsvermogen, met een voldoende aantal duplotestvaten worden uitgevoerd.
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Het verdient aanbeveling om de BAF uit te drukken als functie van het totale drooggewicht en, indien nodig (d.w.z. voor zeer hydrofobe chemische stoffen), als functie van het vetgehalte. Er moeten geschikte methoden worden toegepast om het vetgehalte te bepalen (sommige bestaande methoden — bv. (31)(58) — moeten hiervoor worden aangepast). Bij deze methoden wordt gebruikgemaakt van een chloroform/methanol-extractietechniek. Om het gebruik van gechloreerde oplosmiddelen te vermijden, moet echter een aangepaste versie van de methode van Bligh en Dyer (9), als beschreven in (17), worden gebruikt. Aangezien de verschillende methoden verschillende resultaten kunnen opleveren, is het van belang dat bijzonderheden over de gebruikte methode worden verstrekt. De vetanalyse moet, indien mogelijk, d.w.z. als voldoende wormweefsel voorhanden is, worden uitgevoerd op hetzelfde monster of extract als voor de analyse van de teststof wordt gebruikt — de vetten moeten immers meestal toch worden verwijderd alvorens het extract chromatografisch kan worden geanalyseerd (49). Als alternatief kunnen controledieren worden gebruikt om het vetgehalte te meten, dat vervolgens gebruikt kan worden om de BAF-waarden te normaliseren. Deze laatstgenoemde aanpak vermindert de verontreiniging van apparatuur met de teststof.
                           
                        GEGEVENS EN RAPPORTAGE
                  
                     Verwerking van de resultaten
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              De opnamecurve van de teststof wordt verkregen door de concentratie in/op de wormen tijdens de opnamefase uit te zetten tegen de tijd in een lineair coördinatenstelsel. Wanneer de curve een plateau, of stationaire toestand, heeft bereikt (zie definities in aanhangsel 1), wordt de bioaccumulatiefactor in stationaire toestand, BAFss, berekend op basis van:
                              
                                 
                              Ca is de concentratie van teststof in het testorganisme
                              Cs is de concentratie van teststof in de grond
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Indien geen stationaire toestand wordt bereikt, moet in plaats van de BAFss de BAFK op basis van de snelheidsconstanten worden bepaald, en wel als volgt:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          de accumulatiefactor (BAFK) wordt bepaald als de verhouding ks/ke;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de opname- en eliminatiesnelheden worden bij voorkeur tegelijkertijd bepaald (zie vergelijking [11] in aanhangsel 2);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          de eliminatiesnelheidsconstante (ke) wordt gewoonlijk bepaald op basis van de eliminatiecurve (d.w.z. de uitgezette concentratie van de teststof in de wormen tijdens de eliminatiefase). De opnamesnelheidsconstante ks wordt vervolgens berekend met de bekende ke en een waarde van Ca die wordt afgeleid van de opnamecurve — zie aanhangsel 2 voor een beschrijving van deze methoden. Het verdient de voorkeur BAFK en de snelheidsconstanten ks en ke te berekenen met behulp van een gecomputeriseerde niet-lineaire parameterschattingstechniek. Als de eliminatie duidelijk niet van de eerste orde is, moeten complexere modellen worden toegepast.
                                       
                                    
                        
                     Testverslag
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Teststof:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      alle beschikbare informatie met betrekking tot acute toxiciteit of toxiciteit op lange termijn (bv. ECx, LCx, NOEC) van de teststof voor in de bodem levende Oligochaetae;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zuiverheid, fysische aard en fysisch-chemische eigenschappen, bv. log Kow, oplosbaarheid in water;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      chemische identificatiegegevens, bron van de teststof, identiteit en concentratie van eventueel gebruikte oplosmiddelen;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      indien radioactief gelabelde teststof wordt gebruikt, de precieze positie van de gelabelde atomen, de specifieke radioactiviteit en de radiochemische zuiverheid.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Diersoort:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      wetenschappelijke naam, stam, oorsprong, eventuele voorafgaande behandeling, acclimatisatie, leeftijd, grootte-interval enz.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testomstandigheden:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gebruikte testprocedure;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aard en kenmerken van de gebruikte verlichting en de fotoperiode(s);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      testopzet (bv. aantal en grootte van de testvaten, grondmassa en hoogte van de grondlaag, aantal duplo’s, aantal wormen per duplo, aantal testconcentraties, duur van de opname- en de eliminatiefase, frequentie van de bemonstering);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivering van de keuze van het testvatmateriaal;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      methode voor het bereiden en aanbrengen van de teststof en de redenen voor het kiezen van een specifieke methode;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de nominale testconcentraties, de gemiddelden en standaardafwijkingen van de in de testvaten gemeten waarden en de methode waarmee deze waarden zijn bepaald;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bron van de bestanddelen van de kunstmatige grond of — bij gebruik van natuurlijke media — oorsprong van de grond, beschrijving van eventuele voorbehandeling, resultaten van de controles (overleven, biomassaontwikkeling, voortplanting), grondkenmerken (pH, totale gehalte aan organische koolstof, deeltjesgrootteverdeling (percentage zand, silt en klei), het maximale waterhoudende vermogen (WHCmax), het procentuele watergehalte aan het begin en aan het eind van de test en eventuele andere verrichte metingen);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gedetailleerde informatie over de verwerking van grond- en wormmonsters, met inbegrip van details van de bereiding, opslag, verrijkingsprocedures, extractie en analyseprocedures (en -precisie) voor de teststof in wormen en grond alsmede het vetgehalte (indien gemeten) en de recovery van de teststof.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Resultaten:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sterfte van de controlewormen en de wormen in elk testvat alsmede ieder waargenomen abnormaal gedrag (bv. vermijding van de grond, uitblijven van voortplanting in een bioaccumulatietest met „Enchytraeidae”);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      de verhouding tussen drooggewicht en natgewicht van de grond en de testorganismen (nuttig voor normalisatie);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      het natgewicht van de wormen op ieder bemonsteringstijdstip; voor regenwormen, het natgewicht bij het begin van de test en op ieder bemonsteringstijdstip voor en na het ontlasten van de darm;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      het vetgehalte van de testorganismen (indien bepaald);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      grafieken van de opname- en eliminatiekinetiek van de teststof in de wormen en van de tijd tot de stationaire toestand;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Ca en Cs (met standaardafwijking en bereik, indien van toepassing) voor alle bemonsteringstijdstippen (Ca uitgedrukt in g kg–1 nat- en drooggewicht van het hele lichaam, Cs uitgedrukt in g kg–1 nat- en drooggewicht van de grond). Indien een biota-grondaccumulatiefactor (BSAF) nodig is (bv. om de resultaten van twee of meer tests die met dieren met een ander vetgehalte zijn uitgevoerd, te kunnen vergelijken), kan Ca aanvullend worden uitgedrukt in g kg–1 vetgehalte van het organisme en kan Cs worden uitgedrukt in g kg–1 organische koolstof (OC) van de grond;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      BAF (uitgedrukt in kg grond·kg–1 worm), de grondopnamesnelheidsconstante ks (uitgedrukt in g grond kg–1 van worm dag–1) en de eliminatiesnelheidsconstante ke (uitgedrukt in dag–1); BSAF (uitgedrukt in kg OC in de grond kg–1 vetgehalte van de worm) kan aanvullend worden gerapporteerd;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      indien gemeten: percentages van de oorspronkelijke stof, metabolieten en gebonden residuen (d.w.z. het percentage van de teststof dat niet geëxtraheerd kan worden met normale extractiemethoden) die in grond en testdieren zijn aangetoond;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      methoden die zijn gebruikt voor de statistische analyse van gegevens.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Evaluatie van de resultaten:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      overeenstemming van de resultaten met de in punt 17 vermelde geldigheidscriteria;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      onverwachte of ongewone resultaten, bv. onvolledige eliminatie van de teststof uit de testdieren.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATUUR:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane (γ-HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1688-00a.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid potworm Enchytraeus albidus. ASTM International, E1676-04: 26 pp.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger G (2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): Bioaccumulation — New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlijn Heidelberg: 235-276.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93-99.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & Hermens J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 154-165.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel C (1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei). Ecotox. Environ. Safety 31: 185-191.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Bell AW (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902: 1-13.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Bligh EG and Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911-917.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Parijs, 671 p.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P (2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes Enchytraeus luxuriosus and Enchytraeus albidus (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). Hydrobiologia 463: 185-196.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Conder JM and Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm Eisenia fetida. J. Soils Sediments 3: 13-20.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Connell DW and Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to Earthworm System. Chemosphere 20: 91-100.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37: 2-29.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Didden W (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd, Nederland, pp. 555-576.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing Programme.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, Bachmann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 140-145.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad van 18 december 2006 inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH), tot oprichting van een Europees Agentschap voor chemische stoffen, houdende wijziging van Richtlijn 1999/45/EG en houdende intrekking van Verordening (EEG) nr. 793/93 van de Raad en Verordening (EG) nr. 1488/94 van de Commissie alsmede Richtlijn 76/769/EEG van de Raad en de Richtlijnen 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG en 2000/21/EG van de Commissie (PB L 396 van 30.12.2006, blz. 1).
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              Edwards CA and Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. Third Edition, Chapman & Hall, London, 426 pp.
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th and Römbke J (2009). Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: 149 pp. Kan worden gedownload op: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
                           
                        
                              (23)
                           
                           
                              Elmegaard N and Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: 57 pp.
                           
                        
                              (24)
                           
                           
                              Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.
                           
                        
                              (25)
                           
                           
                              EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195-208.
                           
                        
                              (26)
                           
                           
                              Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk assessment? Chemosphere 32: 1897-1905.
                           
                        
                              (27)
                           
                           
                              Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumulation. Chemosphere 29: 1501-1514.
                           
                        
                              (28)
                           
                           
                              Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Dichlorprop) beim Regenwurm Lumbricus rubellus (Oligochaeta, Lumbricidae). Dissertation University Mainz, 156 pp.
                           
                        
                              (29)
                           
                           
                              Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF — Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 78-84.
                           
                        
                              (30)
                           
                           
                              Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225-1231.
                           
                        
                              (31)
                           
                           
                              Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099-1105.
                           
                        
                              (32)
                           
                           
                              Hawker DW and Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701-707.
                           
                        
                              (33)
                           
                           
                              Hund-Rinke K and Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sediments 1: 15-20.
                           
                        
                              (34)
                           
                           
                              Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59-81.
                           
                        
                              (35)
                           
                           
                              ISO 11268-2 (1998) Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction.
                           
                        
                              (36)
                           
                           
                              Jaenike J (1982). „Eisenia foetida” is two biological species. Megadrilogica 4: 6-8.
                           
                        
                              (37)
                           
                           
                              Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080-2090.
                           
                        
                              (38)
                           
                           
                              Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in Eisenia andrei (Oligochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953-961.
                           
                        
                              (39)
                           
                           
                              Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, DeJong A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms (Eisenia andrei, Oligochaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 767-775.
                           
                        
                              (40)
                           
                           
                              Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm, Eisenia andrei (Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399-3404.
                           
                        
                              (41)
                           
                           
                              Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305-312.
                           
                        
                              (42)
                           
                           
                              Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217-232.
                           
                        
                              (43)
                           
                           
                              Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von 14C-Hexachlorbenzol und 14C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University München, 137 pp.
                           
                        
                              (44)
                           
                           
                              Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23: 588-595.
                           
                        
                              (45)
                           
                           
                              Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accumulation in Lumbricus rubellus under laboratory conditions compared with accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17-26.
                           
                        
                              (46)
                           
                           
                              Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegates. Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244-1249.
                           
                        
                              (47)
                           
                           
                              Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumulation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berliin 1990, VCH, Weinheim.
                           
                        
                              (48)
                           
                           
                              Hoofdstuk C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen.
                           
                        
                              (49)
                           
                           
                              Hoofdstuk C.13 van deze bijlage, Bioconcentratie: doorstroomtest met vissen.
                           
                        
                              (50)
                           
                           
                              Hoofdstuk C.21 van deze bijlage, Micro-organismen in de bodem: bepaling van de omzetting van stikstof.
                           
                        
                              (51)
                           
                           
                              OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
                              
                           
                        
                              (52)
                           
                           
                              OECD (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia Andrei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
                           
                        
                              (53)
                           
                           
                              OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
                           
                        
                              (54)
                           
                           
                              Petersen H and Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287-388.
                           
                        
                              (55)
                           
                           
                              Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology Vol. 1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378-396.
                           
                        
                              (56)
                           
                           
                              Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser-Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77-81.
                           
                        
                              (57)
                           
                           
                              Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm Eisenia fetida. RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.
                           
                        
                              (58)
                           
                           
                              Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ.Toxicol. Chem. 10: 1431-1436.
                           
                        
                              (59)
                           
                           
                              Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S.
                           
                        
                              (60)
                           
                           
                              Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 pp.
                           
                        
                              (61)
                           
                           
                              Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105-129.
                           
                        
                              (62)
                           
                           
                              Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107-127.
                           
                        
                              (63)
                           
                           
                              Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110-2120.
                           
                        
                              (64)
                           
                           
                              Schlosser H-J and Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 413-433.
                           
                        
                              (65)
                           
                           
                              Schmelz R and Collado R (1999). Enchytraeus luxuriosus sp. nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 57: 93-100.
                           
                        
                              (66)
                           
                           
                              Sims R W and Gerard BM (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.
                           
                        
                              (67)
                           
                           
                              Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557-2563.
                           
                        
                              (68)
                           
                           
                              Spacie A and Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309-320.
                           
                        
                              (69)
                           
                           
                              Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scroggins RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxicology. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac Press, Pensacola, 67-81.
                           
                        
                              (70)
                           
                           
                              Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM (2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta. Environ. Toxicol. Chemistry 22: 1167-1171.
                           
                        
                              (71)
                           
                           
                              UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation — Bewertungskonzept und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.
                           
                        
                              (72)
                           
                           
                              US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, MN, maart 2000.
                           
                        
                              (73)
                           
                           
                              Van Brummelen TC and Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: 277-285.
                           
                        
                              (74)
                           
                           
                              Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the toxicity of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earthworms (Ed. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB).
                           
                        
                              (75)
                           
                           
                              Van Gestel CA and Ma W-C (1990). An approach to quantitative structureactivity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. Chemosphere 21: 1023-1033.
                           
                        
                              (76)
                           
                           
                              Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil invertebrates. Environmental Pollution 136: 409-417.
                           
                        
                              (77)
                           
                           
                              Venter JM and Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm Eisenia fetida (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161-165.
                           
                        
                              (78)
                           
                           
                              Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm Lumbricus rubellus exposed to contaminated floodplain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843-1851.
                           
                        
                              (79)
                           
                           
                              Widianarko B and Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402-406.
                           
                        
                     Aanhangsel 1
                     DEFINITIES
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bioaccumulatie is de toename van de concentratie van de teststof in of op een organisme ten opzichte van de concentratie van de teststof in het omringende medium. Bioaccumulatie is het gevolg van zowel bioconcentratie- als biomagnificatieprocessen (zie hieronder).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bioconcentratie is de toename van de concentratie van de teststof in of op een organisme ten gevolge van de opname van de chemische stof uit uitsluitend het omringende medium (d.w.z. via het lichaamsoppervlak en ingenomen grond) ten opzichte van de concentratie van de teststof in het omringende medium.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Biomagnificatie is de toename van de concentratie van de teststof in of op een organisme ten gevolge van voornamelijk de opname van verontreinigde voeding of prooi ten opzichte van de concentratie van de teststof in de voeding of prooi. Biomagnificatie kan leiden tot een overdracht of accumulatie van de teststof binnen voedselketens.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 De eliminatie van een teststof is het verlies van die stof uit het weefsel van het testorganisme door actieve of passieve processen die optreden ongeacht of de teststof in het omringende medium aanwezig is.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 De bioaccumulatiefactor (BAF) op enig moment van de opnamefase van deze bioaccumulatietest, is de verhouding tussen de concentratie van de teststof in of op het testorganisme (Ca in g kg–1 drooggewicht van worm) en de concentratie van die stof in het omringende medium (Cs in g kg–1 drooggewicht van grond); de BAF heeft als eenheden kg grond·kg–1 worm.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 De bioaccumulatiefactor in stationaire toestand (BAFss) is de BAF in stationaire toestand en ondergaat gedurende langere tijd geen significante wijzigingen als de concentratie van de teststof in het omringende medium (Cs in g kg–1 drooggewicht van grond) constant blijft tijdens deze periode.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bioaccumulatiefactoren die rechtstreeks op basis van de verhouding tussen de grondopnamesnelheidsconstante en de eliminatiesnelheidsconstante (ks en ke, zie hieronder) worden berekend, worden aangeduid met de term kinetische bioaccumulatiefactor (BAFK).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 De biota-grondaccumulatiefactor (BSAF) is de verhouding tussen de voor vetgehalte genormaliseerde concentratie van de teststof in of op het testorganisme en de voor organische koolstof genormaliseerde concentratie van de teststof in de grond in stationaire toestand. Ca wordt vervolgens uitgedrukt als g kg–1 vetgehalte van het organisme en Cs als g kg–1 organisch materiaal in de grond; de BSAF heeft als eenheden kg OC·kg–1 vet.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Een plateau of stationaire toestand wordt gedefinieerd als het evenwicht tussen de opname- en eliminatieprocessen die gelijktijdig optreden tijdens de blootstellingsfase. De stationaire toestand wordt bereikt wanneer in een grafiek van de BAF als functie van de tijd de curve evenwijdig gaat lopen met de tijdas en drie opeenvolgende bepalingen van BAF op monsters die met tussenpozen van ten minste twee dagen worden genomen, niet meer dan 20 % van elkaar verschillen en er bovendien geen statistisch significant verschil bestaat tussen de waarden verkregen op de drie bemonsteringstijdstippen. Voor teststoffen die langzaam worden opgenomen, verdient het de voorkeur om intervallen van zeven dagen te gebruiken (49).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 De organischekoolstof-water-verdelingscoëfficiënt (Koc) is de verhouding tussen de concentratie van een stof in of op de fractie organische koolstof van een substraat en de concentratie van die stof in water in een toestand van evenwicht.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 De octanol-water-verdelingscoëfficiënt (Kow) is de verhouding tussen de oplosbaarheid van een stof in n-octanol en water bij evenwicht; deze verhouding wordt soms ook uitgedrukt als Pow. Het logaritme van Kow (log Kow) wordt gebruikt als een indicatie van het bioaccumulatiepotentieel van een chemische stof door in het water levende organismen.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 De blootstellings- of opnamefase is de periode gedurende welke de testorganismen aan de teststof worden blootgesteld.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 De grondopnamesnelheidsconstante (ks) is de numerieke waarde die aangeeft hoe snel de concentratie van de teststof in of op de testorganismen toeneemt ten gevolge van de opname uit de grondfase. ks wordt uitgedrukt in g grond kg–1 van worm d–1.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 De eliminatiefase is de periode die begint op het moment waarop de testorganismen van een medium dat de teststof bevat worden overgebracht naar een medium dat die stof niet bevat, en gedurende welke de eliminatie (of het nettoverlies) van de teststof uit het testorganisme wordt bestudeerd.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 De eliminatiesnelheidsconstante (ke) is de numerieke waarde die de snelheid aangeeft waarmee de concentratie van de teststof in of op het testorganisme afneemt na overbrenging van de testorganismen uit een medium dat de teststof bevat naar een medium dat de teststof niet bevat; ke wordt uitgedrukt in d–1.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Teststof: alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.
                              
                           
                  
                     Aanhangsel 2
                     
                        Berekening van opname- en eliminatieparameters
                     
                     Het belangrijkste eindpunt van een bioaccumulatietest is de bioaccumulatiefactor, BAF. De gemeten BAF kan worden berekend door de concentratie in het testorganisme, Ca, te delen door de concentratie in de grond, Cs, in stationaire toestand. Indien de stationaire toestand tijdens de opnamefase niet wordt bereikt, wordt de BAFK berekend op basis van de snelheidsconstanten in plaats van BAFSS. Er dient echter opgetekend te worden of de BAF al dan niet gebaseerd is op concentraties in stationaire toestand.
                     De gangbare manier voor het verkrijgen van de kinetische bioaccumulatiefactor (BAFK), de grondopnamesnelheidsconstante (ks) en de eliminatiesnelheidsconstante (ke) is om gebruik te maken van gecomputeriseerde niet-lineaire parameterschattingstechnieken, bv. op basis van de in (68) beschreven modellen. Op basis van de aan de tijd gerelateerde concentratiegegevens en modelvergelijkingen:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 (Vergelijking [1])
                              
                           of
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 (Vergelijking [2])
                              
                           waarbij
                     
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 concentratie van de chemische stof in wormen [g kg–1 nat- of drooggewicht];
                              
                           
                                 ks
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 opnamesnelheidsconstante in weefsel [g grond kg–1 worm d–1];
                              
                           
                                 Cs
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 concentratie van de chemische stof in grond [g kg–1 nat- of drooggewicht];
                              
                           
                                 ke
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 eliminatiesnelheidsconstante [d–1];
                              
                           
                                 tc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 tijd aan het eind van de opnamefase,
                              
                           berekenen deze computerprogramma’s waarden voor BAFK, ks en ke.
                     Indien de achtergrondconcentratie in de niet-blootgestelde wormen bijvoorbeeld op dag 0 significant afwijkt van nul (dit kan bv. het geval zijn voor metalen), moet met deze achtergrondconcentratie (Ca,0) rekening worden gehouden in deze vergelijkingen, zodat ze aldus luiden:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 (Vergelijking [3])
                              
                           en
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 (Vergelijking [4])
                              
                           In gevallen waarin een significante afname van concentratie van de teststof in de grond wordt waargenomen gedurende het verloop van de opnamefase, kunnen de volgende modellen worden gebruikt, bv. (67)(79):
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (Vergelijking [5])
                              
                           waarbij
                     
                                 Cs
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 concentratie van de chemische stof in grond [g kg–1 nat- of drooggewicht];
                              
                           
                                 k0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 afbraaksnelheidsconstante in grond [d–1];
                              
                           
                                 C0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 initiële concentratie van de chemische stof in grond [g kg–1 nat- of drooggewicht];
                              
                           
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 (Vergelijking [6])
                              
                           
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 (Vergelijking [7])
                              
                           waarbij
                     
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 concentratie van de chemische stof in wormen [g kg–1 nat- of drooggewicht];
                              
                           
                                 ks
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 opnamesnelheidsconstante in weefsel [g grond kg–1 worm d–1];
                              
                           
                                 k0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 afbraaksnelheidsconstante in grond [d–1];
                              
                           
                                 ke
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 eliminatiesnelheidsconstante [d–1];
                              
                           
                                 tc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 tijd aan het eind van de opnamefase.
                              
                           Indien de stationaire toestand wordt bereikt tijdens de opnamefase (d.w.z. t = ∞), kan vergelijking [1]
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 (Vergelijking [1])
                              
                           worden gereduceerd tot:
                     
                        
                     of
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (Vergelijking [8])
                              
                           Hierbij benadert ks/ke × Cs de concentratie van de teststof in het wormweefsel in stationaire toestand (Ca,ss).
                     De biota-grondaccumulatiefactor (BSAF) kan als volgt worden berekend:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (Vergelijking [9])
                              
                           waarbij foc de fractie organische koolstof in de grond is en flip de fractie wormvet, beide bij voorkeur bepaald op monsternamen tijdens de test en op basis van respectievelijk droog- of natgewicht.
                     De eliminatiekinetiek kan worden gemodelleerd met gebruikmaking van de gegevens uit de eliminatiefase en door de volgende modelvergelijking en een gecomputeriseerde niet-lineaire parameterschattingsmethode toe te passen. Als de tegen de tijd uitgezette gegevens wijzen op een constante exponentiële afname van de concentratie van de teststof in de dieren, kan een een-compartimentmodel (vergelijking [9]) worden gebruikt om het tijdverloop van de eliminatie te beschrijven.
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (Vergelijking [10])
                              
                           Eliminatieprocessen lijken soms uit twee fasen te bestaan in de zin dat ze tijdens de eerste fasen een snelle afname van Ca vertonen, waarna dit verandert in een langzamer verlies van teststoffen in de latere fasen van de eliminatie, bv. (27)(68). De twee fasen kunnen worden verklaard aan de hand van de aanname dat er twee verschillende compartimenten in het organisme zijn, waaruit de teststof met verschillende snelheden verloren gaat. In deze gevallen moet specifieke literatuur worden bestudeerd, bv. (38)(39)(40)(78).
                     Met gebruikmaking van de bovenstaande modelvergelijkingen kunnen de kinetische parameters (ks en ke) ook worden berekend in één uitvoering van de test door het eersteordekinetiekmodel op alle gegevens van zowel de opname- als de eliminatiefase tegelijk toe te passen. Voor een beschrijving van een methode die een dergelijke gecombineerde berekening van opname- en eliminatiesnelheidsconstanten mogelijk maakt, kunnen (41), (73) en (70) worden geraadpleegd.
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (Vergelijking [11])
                              
                           
                                 
                                    Noot:
                                 
                              
                              
                                 Bij gelijktijdige schatting van de opname- en eliminatieparameters op basis van de gecombineerde opname- en eliminatiegegevens is „m” in vergelijking [11] een descriptor waarmee het computerprogramma de deeltermen van de vergelijking kan toewijzen aan de datasets van de desbetreffende fase en de vergelijking correct kan uitvoeren (m = 1 voor opnamefase; m = 2 voor eliminatiefase).
                              
                           Deze modelvergelijkingen moeten echter met voorzichtigheid worden gebruikt, in het bijzonder indien tijdens de test de biobeschikbaarheid van de teststof verandert of (biologische) afbraak optreedt (zie bv. (79)).
                  
                  
                     Aanhangsel 3
                     VOORBEELDEN VAN SCHEMA’S VOOR TESTS OP BIOACCUMULATIE IN DE BODEM
                     
                        Regenwormtest
                     
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Opnamefase met 8 bemonsteringsdata die voor de berekening van de kinetiek worden gebruikt
                                 
                                             Dag
                                          
                                          
                                             Activiteit
                                          
                                       
                                             – 6
                                          
                                          
                                             Voorbereide grond gedurende 48 uur conditioneren.
                                          
                                       
                                             – 4
                                          
                                          
                                             De grondfractie verrijken met de oplossing met de teststof; eventueel oplosmiddel verdampen; grondbestanddelen vermengen; grond over de testvaten verdelen; equilibratie bij testomstandigheden gedurende vier dagen (drie weken voor met metaal verrijkte grond).
                                          
                                       
                                             – 3 tot – 1
                                          
                                          
                                             Testorganismen uit de cultuur nemen voor acclimatisering; grondbestanddelen bereiden en bevochtigen.
                                          
                                       
                                             0
                                          
                                          
                                             Temperatuur en pH van de grond meten; grondmonsters uit testvaten en oplosmiddelcontrolevaten nemen om de concentratie van de teststof te bepalen; voedingsrantsoen toevoegen; wormen wegen en gerandomiseerd over de testvaten verdelen; voldoende deelmonsters van wormen achterhouden voor de bepaling van analytische achtergrondwaarden, nat- en drooggewicht en vetgehalte; alle testvaten wegen om het vochtgehalte in de grond te controleren; luchttoevoer regelen indien een gesloten testsysteem wordt gebruikt.
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             Luchttoevoer regelen, wormgedrag en temperatuur registreren, grond- en wormmonsters nemen om de concentratie van de teststof te bepalen.
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1.
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             Luchttoevoer regelen, wormgedrag en temperatuur registreren.
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1.
                                          
                                       
                                             5-6
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 3.
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1; voedingsrantsoen toevoegen, vochtgehalte van de grond regelen door de testvaten opnieuw te wegen en verdampt water te compenseren.
                                          
                                       
                                             8-9
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 3.
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1.
                                          
                                       
                                             11-13
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 3.
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1; voedingsrantsoen toevoegen, vochtgehalte van de grond regelen door de testvaten opnieuw te wegen en verdampt water te compenseren.
                                          
                                       
                                             15-16
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 3.
                                          
                                       
                                             17
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1.
                                          
                                       
                                             18-20
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 3.
                                          
                                       
                                             21
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1; temperatuur en pH van de grond meten; vochtgehalte regelen door de testvaten opnieuw te wegen; opnamefase beëindigen; wormen van resterende blootgestelde duplo’s overbrengen naar vaten met schone grond voor de eliminatiefase (geen ontlasting van de darm); grond- en wormmonsters uit de oplosmiddelcontrolevaten nemen.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Bij de planning van activiteiten die aan de blootstelling voorafgaan (equilibratiefase), moet rekening worden gehouden met de eigenschappen van de teststof.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             De voor dag 3 beschreven activiteiten moeten dagelijks worden uitgevoerd (althans op werkdagen).
                                          
                                       
                           
                                 b)
                              
                              
                                 Eliminatiefase
                                 
                                             Dag
                                          
                                          
                                             Activiteit
                                          
                                       
                                             – 6
                                          
                                          
                                             Grondbestanddelen bereiden en bevochtigen; bereide grond gedurende 48 uur conditioneren.
                                          
                                       
                                             – 4
                                          
                                          
                                             Grondbestanddelen mengen; grond over de testvaten verdelen; incubatie bij testomstandigheden gedurende vier dagen.
                                          
                                       
                                             0 (eind van de opnamefase)
                                          
                                          
                                             Temperatuur en pH van de grond meten; wormen wegen en gerandomiseerd over de testvaten verdelen; voedingsrantsoen toevoegen; wormen uit resterende blootgestelde duplo’s overbrengen naar vaten met schone grond; na 4-6 uur grond- en wormmonsters nemen om de concentratie van de teststof te bepalen.
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             Luchttoevoer regelen, wormgedrag en temperatuur registreren, grond- en wormmonsters nemen om de concentratie van de teststof te bepalen.
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1.
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             Luchttoevoer regelen, wormgedrag en temperatuur registreren.
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1.
                                          
                                       
                                             5-6
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 3.
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1; voedingsrantsoen toevoegen, vochtgehalte van de grond regelen door de testvaten opnieuw te wegen en verdampt water te compenseren.
                                          
                                       
                                             8-9
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 3.
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1.
                                          
                                       
                                             11-13
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 3.
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1; voedingsrantsoen toevoegen, vochtgehalte van de grond regelen door de testvaten opnieuw te wegen en verdampt water te compenseren.
                                          
                                       
                                             15-16
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 3.
                                          
                                       
                                             17
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1.
                                          
                                       
                                             18-20
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 3.
                                          
                                       
                                             21
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1; temperatuur en pH van de grond meten, vochtgehalte van de grond regelen door de testvaten opnieuw te wegen; grond- en wormmonsters uit oplosmiddelcontrolevaten nemen.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             De grond wordt voor aanvang van de eliminatiefase op dezelfde manier voorbereid als voor de opnamefase.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             De voor dag 3 beschreven activiteiten moeten dagelijks worden uitgevoerd (althans op werkdagen).
                                          
                                       
                           
                        „Enchytraeidae”-test
                     
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Opnamefase met 8 bemonsteringsdata die voor de berekening van de kinetiek worden gebruikt
                                 
                                             Dag
                                          
                                          
                                             Activiteit
                                          
                                       
                                             – 6
                                          
                                          
                                             Voorbereide grond gedurende 48 uur conditioneren.
                                          
                                       
                                             – 4
                                          
                                          
                                             De grondfractie verrijken met de oplossing met de teststof; eventueel oplosmiddel verdampen; grondbestanddelen vermengen; grond over de testvaten verdelen; equilibratie bij testomstandigheden gedurende vier dagen (drie weken voor met metaal verrijkte grond).
                                          
                                       
                                             – 3 tot – 1
                                          
                                          
                                             Testorganismen uit de cultuur nemen voor acclimatisering; grondbestanddelen bereiden en bevochtigen.
                                          
                                       
                                             0
                                          
                                          
                                             Temperatuur en pH van de grond meten; grondmonsters uit testvaten en oplosmiddelcontrolevaten nemen om de concentratie van de teststof te bepalen; voedingsrantsoen aan de grond toevoegen; wormen wegen en gerandomiseerd over de testvaten verdelen; voldoende deelmonsters van wormen achterhouden voor de bepaling van analytische achtergrondwaarden, nat- en drooggewicht en vetgehalte; alle testvaten wegen om het vochtgehalte in de grond te controleren; luchttoevoer regelen indien een gesloten testsysteem wordt gebruikt.
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             Luchttoevoer regelen, wormgedrag en temperatuur registreren, grond- en wormmonsters nemen om de concentratie van de teststof te bepalen.
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1.
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             Luchttoevoer regelen, wormgedrag en temperatuur registreren.
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1.
                                          
                                       
                                             5-6
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 3.
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1; voedingsrantsoen aan de grond toevoegen, vochtgehalte van de grond regelen door de testvaten opnieuw te wegen en verdampt water te compenseren.
                                          
                                       
                                             9
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1.
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 3.
                                          
                                       
                                             11
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1.
                                          
                                       
                                             12-13
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 3.
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             Zelfde als dag 1; voedingsrantsoen aan de grond toevoegen; temperatuur en pH van de grond meten; vochtgehalte van de grond regelen door de testvaten opnieuw te wegen; opnamefase beëindigen; wormen van resterende blootgestelde duplo’s overbrengen naar vaten met schone grond voor de eliminatiefase (geen ontlasting van de darm); grond- en wormmonsters uit de oplosmiddelcontrolevaten nemen.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Bij de planning van activiteiten die aan de blootstelling voorafgaan (equilibratiefase), moet rekening worden gehouden met de eigenschappen van de teststof.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             De voor dag 3 beschreven activiteiten moeten dagelijks worden uitgevoerd (althans op werkdagen).
                                          
                                       
                           
                  
                     Aanhangsel 4
                     
                        Kunstmatige grond — Aanbevelingen voor de voorbereiding en opslag
                     
                     Aangezien natuurlijke grond uit een bepaalde bron mogelijk niet het hele jaar beschikbaar is en inheemse organismen alsook de aanwezigheid van microverontreinigingen de test kunnen beïnvloeden, wordt de in hoofdstuk C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen (48), beschreven kunstmatige grond aanbevolen voor gebruik in deze test. In deze grond kunnen meerdere testsoorten overleven, groeien en zich voortplanten en er wordt gezorgd voor maximale standaardisatie en intra- en interlaboratoriumvergelijkbaarheid van test- en cultuuromstandigheden.
                     Grondbestanddelen:
                     
                                 Turf:
                              
                              
                                 10 %
                              
                              
                                 veenmosturf, overeenkomstig OESO-richtlijn 207 (48);
                              
                           
                                 Kwartszand:
                              
                              
                                 70 %
                              
                              
                                 industrieel kwartszand (luchtgedroogd); korrelgrootte: meer dan 50 % van de deeltjes moet in het bereik 50-200 μm zijn, maar alle deeltjes moeten ≤ 2 mm zijn;
                              
                           
                                 Kaolienklei:
                              
                              
                                 20 %
                              
                              
                                 met kaoliengehalte ≥ 30 %;
                              
                           
                                 Calciumcarbonaat:
                              
                              
                                 ≤ 1 %
                              
                              
                                 CaCO3, verpulverd, chemisch zuiver.
                              
                           Desgewenst kan het gehalte organische koolstof van de kunstmatige grond worden verlaagd, bv. door het turfgehalte te verminderen tot 4-5 % van de droge grond en de hoeveelheid zand dienovereenkomstig te verhogen. Door een dergelijke verlaging van het gehalte organische koolstof kan de hechting van de teststof aan de grond (organische koolstof) afnemen en kan de beschikbaarheid van de teststof voor de wormen toenemen (74). Aangetoond is dat Enchytraeus albidus en Eisenia fetida kunnen voldoen aan de geldigheidscriteria voor de voortplanting bij tests in veldgrond met een lager gehalte organische koolstof, bv. 2,7 % (33)(61), en de ervaring leert dat dit ook bereikt kan worden in kunstmatige grond met 5 % turf.
                     
                        Voorbereiding
                     
                     De droge bestanddelen van de grond worden grondig gemengd (bv. in een grote laboratoriummenger). Dit moet ongeveer één week voor aanvang van de test worden gedaan. De gemengde droge grondbestanddelen moeten ten minste 48 uur voordat de teststof wordt aangebracht, worden bevochtigd met gedeïoniseerd water om de zuurgraad te equilibreren/stabiliseren. Voor de bepaling van de pH moet een mengsel van grond en een oplossing van 1 M KCl in een verhouding van 1:5 worden gebruikt. Indien de pH-waarde niet binnen het vereiste bereik (6,0 ± 0,5) valt, wordt een voldoende hoeveelheid CaCO3 aan de grond toegevoegd of wordt een nieuwe partij grond voorbereid.
                     Het maximale waterhoudende vermogen (WHC) van de kunstmatige grond wordt bepaald overeenkomstig ISO 11268-2 (35). Minimaal twee dagen voor aanvang van de test wordt de droge kunstmatige grond bevochtigd door genoeg gedeïoniseerd of synthetisch water toe te voegen om ongeveer de helft van het uiteindelijke watergehalte te verkrijgen. Het uiteindelijke watergehalte moet tussen 40 % en 60 % van het maximale waterhoudende vermogen (WHC) liggen. Bij aanvang van de test wordt de voorbevochtigde grond verdeeld in zoveel porties als het aantal testconcentraties en controles die voor de test gebruikt worden en wordt het vochtgehalte aangepast tot 40-60 % van WHCmax door de oplossing van de teststof te gebruiken en/of gedeïoniseerd of synthetisch water toe te voegen. Het vochtgehalte wordt aan het begin en aan het eind van de test (bij 105 °C) bepaald. Het moet optimaal zijn voor de behoeften van de diersoort (het vochtgehalte kan ook als volgt worden gecontroleerd: wanneer men de grond lichtjes in de hand knijpt, moeten kleine druppels water tussen de vingers verschijnen).
                     
                        Opslag
                     
                     De droge bestanddelen van de kunstmatige grond kunnen tot gebruik bij kamertemperatuur worden bewaard. De voorbereide, voorbevochtigde grond kan voorafgaand aan de verrijking maximaal drie dagen op een koele plaats worden bewaard; hierbij moet de verdamping van water tot een minimum worden beperkt. Grond die met de teststof verrijkt is, moet onverwijld worden gebruikt, tenzij informatie beschikbaar is die erop duidt dat de grond in kwestie bewaard kan worden zonder dat dit van invloed is op de toxiciteit en biobeschikbaarheid van de teststof. Monsters van verrijkte grond kunnen vervolgens tot de analyse onder de voor de desbetreffende teststof aanbevolen omstandigheden worden bewaard.
                  
                  
                     Aanhangsel 5
                     
                        Aanbevolen soorten terrestrische Oligochaetae voor tests op bioaccumulatie in de bodem
                     
                     
                        Regenwormen
                     
                     De aanbevolen testsoort is Eisenia fetida (Savigny 1826), die behoort tot de familie „Lumbricidae”. Deze soort wordt sinds 1972 onderverdeeld in twee ondersoorten (Eisenia fetida and Eisenia andrei (10)). Volgens Jaenicke (36) gaat het om twee echte, afzonderlijke soorten. Eisenia fetida is gemakkelijk herkenbaar dankzij zijn felgele strepen tussen de segmenten, terwijl Eisenia andrei een egale, donkerrode kleur heeft. Oorspronkelijk zijn ze waarschijnlijk afkomstig uit het gebied rond de Zwarte Zee, maar tegenwoordig zijn ze wereldwijd verspreid, in het bijzonder in door de mens aangepaste habitats zoals composthopen. Beide soorten kunnen voor zowel ecotoxicologische als bioaccumulatietests worden gebruikt.
                     
                        Eisenia fetida en Eisenia andrei zijn in de handel verkrijgbaar, bv. als visaas. In vergelijking met andere lumbricidenregenwormen hebben ze een korte levenscyclus en bereiken ze volwassenheid binnen ca. twee-drie maanden (bij kamertemperatuur). Hun optimale temperatuur is ongeveer 20-24 °C. Ze geven de voorkeur aan relatief vochtige substraten met een nagenoeg neutrale pH en een hoog gehalte aan organisch materiaal. Aangezien deze soorten al 25 jaar veelvuldig worden gebruikt in gestandaardiseerde ecotoxicologische tests, zijn hun kweekmethoden uitvoerig beschreven (48)(77).
                     Beide soorten kunnen worden gekweekt in een grote diversiteit aan dierlijke afvalstoffen. Het door de ISO (35) aanbevolen kweekmedium is een 50:50-mengsel van paarden- of rundermest en turf. Het medium moet een pH-waarde van ongeveer 6 tot 7 hebben (gereguleerd met calciumcarbonaat), een lage ionische geleidbaarheid (minder dan 6 mS/cm of minder dan 0,5 % zoutconcentratie) en mag niet overmatig verontreinigd zijn met ammonia of dierlijke urine. Tevens kan in de handel verkrijgbare tuinaarde die vrij is van additieven of kunstmatige grond overeenkomstig OESO (48) of een mengsel van beide in een verhouding van 50:50 worden gebruikt. Het substraat dient vochtig maar niet te nat te zijn. Kweekbakken met een volume van 10 tot 50 liter zijn geschikt.
                     Om wormen met een standaardleeftijd en -massa te verkrijgen kan de kweek het beste worden begonnen met cocons. Daartoe worden volwassen wormen in een kweekbak met vers substraat gestopt om cocons te produceren. De praktijk wijst uit dat een populatiedichtheid van ongeveer 100 volwassen wormen per kg substraat (natgewicht) tot goede voortplantingssnelheden leidt. Na 28 dagen worden de volwassen wormen verwijderd. De uit de cocons gekomen regenwormen worden na minimaal twee maanden, maar minder dan twaalf maanden, wanneer ze volwassen zijn, voor de tests gebruikt.
                     Wormen van de hierboven beschreven soorten kunnen als gezond worden beschouwd als ze zich door het substraat voortbewegen, niet proberen om het substraat te verlaten en zich voortdurend voortplanten. Zeer traag voortbewegen of een geel uiteinde aan de achterkant van de worm (in het geval van Eisenia fetida) duidt op uitputting van het substraat. In dat geval wordt vers substraat en/of een kleiner aantal dieren per bak aanbevolen.
                     
                        Selectie van aanvullende literatuur
                     
                     Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean Soc. London, 6: 1-58.
                     Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1-81.
                     Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
                     Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. Oikos 28: 49-55.
                     Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 180-201.
                     Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. London 31: 1-171.
                     Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm Ecology — from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331-338 pp.
                     
                        „Enchytraeidae”
                     
                     De aanbevolen testsoort is Enchytraeus albidus Henle 1837 (witte potworm). Enchytraeus albidus is een van de grootste soorten (tot 15 mm) van de tot de gelede wormen behorende Oligochaetae-familie van de „Enchytraeidae” en is wereldwijd verspreid, bv. (8). Enchytraeus albidus wordt aangetroffen in mariene, limnische en terrestrische habitats, hoofdzakelijk in ontbindend organisch materiaal (zeewier, compost) en zelden in weiden (42). Deze brede ecologische tolerantie en een aantal morfologische variaties duiden erop dat er mogelijk verschillende rassen voor deze soort bestaan.
                     
                        Enchytraeus albidus is in de handel verkrijgbaar als voeding voor vissen. Gecontroleerd dient te worden of de cultuur verontreinigd is door andere, gewoonlijk kleinere soorten (60). Indien verontreiniging optreedt, moeten alle wormen met water worden gewassen in een petrischaal. Grote volwassen exemplaren van Enchytraeus albidus worden vervolgens geselecteerd (met behulp van een stereomicroscoop) om een nieuwe cultuur te beginnen. Alle andere wormen worden verwijderd. De levenscyclus van de worm is kort, aangezien volwassenheid wordt bereikt tussen 33 dagen (bij 18 °C) en 74 dagen (bij 12 °C). Enkel culturen die zonder problemen gedurende ten minste vijf weken (één generatie) in het laboratorium zijn gehouden, mogen voor een test worden gebruikt.
                     Andere soorten van het geslacht Enchytraeus zijn ook geschikt, in het bijzonder Enchytraeus luxuriosus. Deze soort is een echte bodembewoner, zoals recentelijk is beschreven in (65). Indien andere soorten van het geslacht Enchytraeus worden gebruikt, moeten ze duidelijk worden geïdentificeerd en moet de motivering van de keuze van de soort worden gerapporteerd.
                     
                        Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe 1992) is een soort die tot dezelfde groep behoort als Enchytraeus luxuriosus. Het staat niet vast dat deze soort in het veld voorkomt, aangezien de soort alleen in regenwormculturen en composthopen is beschreven (Römbke 2003). De oorspronkelijk ecologische behoeften van de soort zijn derhalve onbekend. Recent laboratoriumonderzoek met diverse veldsubstraten heeft echter bevestigd dat deze soort een ruime tolerantie heeft voor grondeigenschappen als pH en textuur (Jänsch et al. 2005). In de afgelopen jaren is deze soort vaak gebruikt in ecotoxicologische studies vanwege de eenvoud van kweken en testen, bv. Kuperman et al. 2003. De soort is echter klein (3-12 mm; gemiddeld 7 mm (Westheide & Müller 1996)) en dit maakt de hantering moeilijker in vergelijking met Enchytraeus albidus. Bij gebruik van deze soort in plaats van Enchytraeus albidus kan de omvang van het testvat kleiner zijn, maar dat hoeft niet. Daarnaast moet in overweging worden genomen dat deze soort zich zeer snel voortplant met een generatietijd van minder dan 20 dagen bij 20 ± 2 °C (Achazi et al. 1999) en zelfs sneller bij hogere temperaturen.
                     „Enchytraeidae” van de soort Enchytraeus albidus (alsmede andere Enchytraeus-soorten) kunnen worden gekweekt in grote plastic bakken (bv. 30 × 60 × 10 cm of voor een cultuur van kleine wormen 20 × 12 × 8 cm) die gevuld zijn met een mengsel van kunstmatige grond en in de handel verkrijgbare, niet verontreinigde tuinaarde zonder additieven. Compostmateriaal moet worden vermeden, aangezien dat toxische stoffen zoals zware metalen zou kunnen bevatten. Voordat de kweekgrond wordt gebruikt, moet fauna eruit worden verwijderd door driemaal diepvriezen. Zuiver kunstmatige grond kan ook worden gebruikt, maar de voortplantingssnelheid zou langzamer kunnen zijn in vergelijking met gemengde substraten. Het substraat moet een pH van 6,0 ± 0,5 hebben. De cultuur wordt bij een temperatuur van 15 °C ± 2 °C bewaard in een kweekbak zonder licht. In ieder geval moet een hogere temperatuur dan 23 °C worden vermeden. De kunstmatige/natuurlijke grond moet vochtig zijn, maar niet nat. Wanneer zachtjes met de hand in de grond wordt geknepen, zouden slechts kleine waterdruppels moeten verschijnen. In ieder geval moeten anoxische omstandigheden worden vermeden (als bijvoorbeeld een deksel wordt gebruikt, moet het aantal gaten in het deksel groot genoeg zijn om voldoende luchtverversing te waarborgen). De kweekgrond moet worden belucht door de grond eenmaal per week zorgvuldig te mengen.
                     De wormen moeten minimaal eenmaal per week ad libitum worden gevoederd met havervlokken die in een holte in het grondoppervlak worden geplaatst en met grond worden bedekt. Indien voedsel van het laatste voedertijdstip in de bak achterblijft, moet de hoeveelheid voedsel dienovereenkomstig worden aangepast. Als er schimmels op het achtergebleven voedsel groeien, moet het worden vervangen door een nieuwe hoeveelheid havervlokken. Om de voortplanting te stimuleren kunnen de havervlokken om de twee weken worden verrijkt met in de handel verkrijgbaar proteïnepoeder met toegevoegde vitaminen. Na drie maanden worden de dieren overgebracht naar een vers voorbereide cultuur of kweeksubstraat. De havervlokken, die in een afgesloten verpakking moeten worden bewaard, moeten voor gebruik in een autoclaaf worden gesteriliseerd of verhit om infecties door meelmijten (bv. Glycyphagus sp., Astigmata, Acarina) of roofmijten (bv. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina) te voorkomen. Na desinfectie wordt het voedsel vermalen, zodat het gemakkelijk op het grondoppervlak kan worden verspreid. Andere mogelijke voedingsbronnen zijn bakkersgist of het visvoer TetraMin®.
                     In het algemeen zijn de cultuuromstandigheden toereikend als de wormen niet proberen het substraat te verlaten, zich snel door de grond voortbewegen, een glanzend buitenoppervlak hebben waaraan geen gronddeeltjes kleven en een min of meer wittige kleur hebben en als wormen van verschillende leeftijden zichtbaar zijn. In feite kunnen wormen als gezond worden beschouwd als ze zich voortdurend voortplanten.
                     
                        Selectie van aanvullende literatuur
                     
                     Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117-126.
                     Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51-83.
                     Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651-656.
                     Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. Pedobiologia 47: 607-616.
                     Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479 – 488.
                     Westheide W and Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263-267.”.
                  ”
            
         (1)  Deze informatie wordt slechts gegeven om de gebruikers van dienst te zijn. Andere, equivalente computerprogramma’s kunnen worden gebruikt als kan worden aangetoond dat deze dezelfde resultaten geven.
      
         (2)  Indien er geen informatie beschikbaar is over mogelijke geslachtsgebonden gevoeligheid, worden ratten van beide geslachten gebruikt, d.w.z. 1 dier/geslacht per concentratie. Op basis van bestaande informatie, of als tijdens deze blootstellingssessie blijkt dat een van beide geslachten gevoeliger is, worden voor de volgende tests 10 dieren van het gevoeligste geslacht gebruikt (2 dieren per concentratie/tijdstip) bij elk concentratieniveau.
      
         (3)  Indien Verordening (EG) nr. 1272/2008 wordt toegepast, bedragen de limietconcentraties voor gassen, dampen en aerosolen respectievelijk 20 000 ppm, 20 mg/l en 5 mg/l. In geval van verwachte toxiciteit of op basis van de resultaten van de verkennende test moeten lagere aanvangsconcentraties worden gekozen. Wanneer daar op grond van wetenschappelijke of regelgevingsoverwegingen behoefte aan bestaat, kunnen hogere concentraties worden gebruikt.
      
         (4)  In het ideale geval wordt de blootstelling van dieren bij het volgende concentratieniveau uitgesteld totdat een redelijk vertrouwen bestaat dat de eerder behandelde dieren zullen overleven. Dit stelt de onderzoeksleider in staat de doelconcentratie en de duur van de verschillende perioden voor de volgende blootstellingssessie aan te passen.
      
         (5)  De minimale dosis (concentratie × tijd) die tot sterfte heeft geleid tijdens het testen bij de beginconcentratie (eerste blootstellingssessie) wordt als leidraad genomen voor het vaststellen van de volgende combinatie van concentratie en blootstellingsperioden. Doorgaans wordt de concentratie gehalveerd (1/2 L) en wordt een nieuwe tijdspanne voor de blootstelling van de dieren vastgesteld met een nog fijner raster, waarbij de blootstellingsperioden een geometrische reeks met factor 1,4 (√2, zie referentie 11) vormen, met in het midden daarvan de tijdsduur die overeenkomt met het tijdens de eerste blootstelling waargenomen minimale letale concentratieniveau (tijd × concentratie). In de figuur (figuur 1) werd in blootstellingssessie I bij 15 minuten voor het eerst sterfte geconstateerd; de in sessie II gebruikte perioden liggen daarom rond de 30 minuten en duren 15, 21, 30, 42 en 60 minuten. Het wordt sterk aanbevolen na de eerste twee blootstellingen de gegevens in een grafiek op te nemen die lijkt op de bovenstaande, en te controleren of de verhouding tussen concentratie en tijd een hoek van 45 graden vertoont (n = 1), of dat deze minder steil (bv. n = 2) of juist steiler (bv. n = 0,8) verloopt. In de laatstgenoemde gevallen wordt sterk aangeraden de volgende concentraties en perioden dienovereenkomstig aan te passen.
      
         (6)  In bepaalde gevallen kan het nodig zijn om de concentratie te verhogen (2 L) en een nieuwe tijdspanne met een nog fijner raster vast te stellen, waarbij de blootstellingsperioden een geometrische reeks met factor 1,4 (√2) vormen, met in het midden daarvan de tijdsduur die overeenkomt met het tijdens de eerste blootstelling waargenomen minimale letale concentratieniveau. De minimale blootstellingsduur moet bij voorkeur meer bedragen dan 5 minuten; de maximale blootstellingsduur mag niet meer bedragen dan uur.”.
      
         (7)  Voor een aantal metingen in serum en plasma, met name voor glucose, is het aan te bevelen de nacht ervoor de dieren voedsel te onthouden. De voornaamste reden is dat de toegenomen variabiliteit die onvermijdelijk het gevolg is van niet-vasten, subtiele effecten maskeert en de interpretatie bemoeilijkt. Aan de andere kant kan het 's nachts onthouden van voedsel echter interfereren met het algemene metabolisme van de dieren en, met name in voedingsonderzoeken, de dagelijkse blootstelling aan de teststof verstoren. Als men de dieren een nacht laat vasten, moeten de klinisch-biochemische bepalingen verricht worden na de functionele observaties in week 4 van de studie.
      
         (8)  Omdat een lange vastperiode tot systematische fouten in de glucosemetingen voor de behandelde versus de controledieren kan leiden, moet de onderzoeksleider bepalen of het passend is om de dieren te laten vasten. Indien een vastperiode wordt gebruikt, moet deze zijn afgestemd op de gebruikte diersoort; voor de rat kan dit 16 uur zijn (een nacht vasten). De bepaling van het glucosegehalte in nuchtere toestand kan plaatsvinden na een nacht vasten tijdens de laatste week van de blootstelling, of na een nacht vasten voorafgaand aan de obductie (in het laatste geval gelijktijdig met de bepaling van alle andere klinisch-pathologische parameters).
      
         (9)  omdat een lange vastperiode tot systematische fouten in de glucosemetingen voor de behandelde versus de controledieren kan leiden, moet de onderzoeksleider bepalen of het passend is om de dieren te laten vasten. Indien een vastperiode wordt gebruikt, moet deze zijn afgestemd op de gebruikte diersoort; voor de rat kan dit 16 uur zijn (een nacht vasten). De bepaling van het glucosegehalte in nuchtere toestand kan plaatsvinden na een nacht vasten tijdens de laatste week van de blootstelling, of na een nacht vasten voorafgaand aan de obductie (in het laatste geval gelijktijdig met de bepaling van alle andere klinisch-pathologische parameters).
      
         (10)  Voor een aantal metingen van serum en plasma, met name voor glucose, verdient het aanbeveling om de dieren een nacht te laten vasten. De voornaamste reden is dat de toegenomen variabiliteit die onvermijdelijk het gevolg is van niet-vasten, subtiele effecten maskeert en de interpretatie bemoeilijkt. Daarbij moet echter worden opgemerkt dat een nacht vasten van invloed kan zijn op het algemene metabolisme van de dieren en dat dit in het bijzonder bij voedingsonderzoek de dagelijkse blootstelling aan de teststof kan verstoren. Alle beoordeelde dieren moeten in dezelfde fysiologische toestand verkeren en daarom moeten gedetailleerde of neurologische beoordelingen bij voorkeur worden gepland op een andere dag dan die waarop klinische biochemische monsters worden genomen.
      
         (11)  De bijtende werking kan worden gebaseerd op het oordeel van deskundigen, met behulp van gegevens als: ervaring bij mens en dier, bestaande (in-vitro)gegevens, bv. de hoofdstukken B.40 (10) en B.40 bis (11) van deze bijlage of TG 435 van de OESO (12), pH-waarden, informatie over soortgelijke chemische stoffen of andere relevante gegevens.
      
         (12)  In de volgende tabellen wordt verwezen naar het GHS (Globally Harmonised System for Classification and Labelling of Chemicals, mondiaal geharmoniseerd classificatie- en etiketteringssysteem voor chemische stoffen). Het EU-equivalent hiervan is Verordening (EG) nr. 1272/2008. Categorie 5 voor acute inhalatietoxiciteit wordt niet bij Verordening (EG) nr. 1272/2008 (9) ten uitvoer gelegd.
      
         (13)  In de volgende tabellen wordt verwezen naar het GHS (Globally Harmonised System for Classification and Labelling of Chemicals, mondiaal geharmoniseerd classificatie- en etiketteringssysteem voor chemische stoffen). Het EU-equivalent hiervan is Verordening (EG) nr. 1272/2008. Categorie 5 voor acute inhalatietoxiciteit wordt niet bij Verordening (EG) nr. 1272/2008 (9) ten uitvoer gelegd.
      
         (14)  In de volgende tabellen wordt verwezen naar het GHS (Globally Harmonised System for Classification and Labelling of Chemicals, mondiaal geharmoniseerd classificatie- en etiketteringssysteem voor chemische stoffen). Het EU-equivalent hiervan is Verordening (EG) nr. 1272/2008. Categorie 5 voor acute inhalatietoxiciteit wordt niet bij Verordening (EG) nr. 1272/2008 (9) ten uitvoer gelegd.
      
         (15)  Deze stoffen zijn verschillend voor M4 en M7, zoals hierboven is aangegeven.
      
         (16)  Deze oplossingen worden apart bereid, vervolgens samengevoegd en onmiddellijk in een autoclaaf behandeld.
      
         (17)  Opgemerkt zij echter dat als er een interactie tussen de hardheidsionen en de teststof wordt vermoed, water met een lagere hardheid moet worden gebruikt (dan is Elendt-medium M4 dus ongeschikt).
      
         (18)  Deze stoffen zijn verschillend voor M4 en M7, zoals hierboven is aangegeven.
      
         (19)  Deze oplossingen worden apart bereid, vervolgens samengevoegd en onmiddellijk in een autoclaaf behandeld.
      
         (20)  Opgemerkt zij echter dat als er een interactie tussen de hardheidsionen en de teststof wordt vermoed, water met een lagere hardheid moet worden gebruikt (dan is Elendt-medium M4 dus ongeschikt).
      
         (21)  SiO2 werd toegevoegd om de toxiciteit te neutraliseren.
      
         (22)  De procentuele afbraak in vaten FC met daarin de referentiestof.
      
         (23)  De procentuele afbraak in vaten FI.