CELEX: 31992R0690
Language: pt
Date: 1992-03-19 00:00:00
Title: Regulamento (CEE) nº 690/92 da Comissão, de 19 de Março de 1992, que estabelece um método de referência para a detecção de caseína de leite de vaca no queijo de leite de ovelha

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31992R0690

Regulamento (CEE) nº 690/92 da Comissão, de 19 de Março de 1992, que estabelece um método de referência para a detecção de caseína de leite de vaca no queijo de leite de ovelha  

Jornal Oficial nº L 074 de 20/03/1992 p. 0023 - 0032 Edição especial finlandesa: Capítulo 3 Fascículo 41 p. 0123  Edição especial sueca: Capítulo 3 Fascículo 41 p. 0123 

REGULAMENTO (CEE) No 690/92 DA COMISSÃO  de 19 de Março de 1992  que estabelece um método de referência para a detecção de caseína de leite de vaca no queijo de leite de ovelhaA COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,  Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,  Tendo em conta o Tratado de Adesão de Espanha e de Portugal e, nomeadamente, os nos 1 e 2 do seu artigo 67o, o seu artigo 98o, o no 2 do seu artigo 234o e o seu artigo 310o,  Tendo em conta o Regulamento (CEE) no 1677/85 do Conselho, de 11 de Junho de 1985, relativo aos montantes compensatórios monetários no sector agrícola (1), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) no 2205/90 (2), e, nomeadamente, o  no 1 do seu artigo 1o,  Tendo em conta o Regulamento (CEE) no 804/68 do Conselho, de 27 de Junho de 1968, que estabelece a organização comum de mercado no sector do leite e dos produtos lácteos (3), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) no 374/92 da  Comissão (4), e, nomeadamente, o no 3 do seu artigo 9o, o no 7 do seu artigo 14o e o no 4 do seu artigo 17o,  Tendo em conta o Regulamento (CEE) no 876/68 do Conselho, de 28 de Junho de 1968, que estabelece, no sector do leite e dos produtos lácteos, as regras gerais relativas à concessão de restituições à exportação e aos critérios de fixação do seu montante  (5), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) no 1344/86 (6), e, nomeadamente, o no 3 do seu artigo 6o,  Considerando que os queijos produzidos exclusivamente com leite de ovelha devem obedecer a determinadas regras específicias, adoptadas no âmbito da regulamentação comunitária para o sector agrícola; que, antes da aplicação de tais regras, deve  assegurar-se que o produto em causa não contenha leite de vaca;  Considerando que, nos termos do Regulamento (CEE) no 508/71 do Conselho, de 8 de Março de 1971, que estabelece as regras gerais que regem a concessão de ajudas à armazenagem privada de queijos de cura prolongada (7), pode ser concedida uma ajuda à  armazenagem privada de queijo de leite de ovelha; que, nos termos do Regulamento (CEE) no 876/68, pode ser decidida uma restituição especial para os mesmos produtos; que, nos termos do Regulamento (CEE) no 1677/85, os montantes compensatórios não são  aplicáveis a estes produtos; que, em conformidade com o disposto no Regulamento (CEE) no 466/86 do Conselho, de 25 de Fevereiro de 1986, que determina, na sequência da adesão de Espanha, as regras gerais do regime dos montantes compensatórios de adesão  no sector do leite e dos produtos lácteos (8), e no Regulamento (CEE) no 3640/90 do Conselho, de 11 de Dezembro de 1990, que determina as regras gerais do regime dos montantes compensatórios de adesão no sector do leite e dos produtos lácteos na segunda  etapa da adesão de Portugal (9), os montantes compensatórios de adesão não são aplicáveis ao comércio de queijo de leite de ovelha;  Considerando que, dado que a Comissão já adoptou as disposições acima referidas, aplicáveis ao queijo de leite de ovelha, é, presentemente, necessário verificar, através do controlo adequado, que não houve qualquer incorporação de leite de vaca nos  produtos em causa; que, no âmbito desse controlo, é necessário estabelecer um método de referência comunitário para a detecção de caseína de leite de vaca, sem prejuízo da utilização de métodos de rotina que satisfaçam determinados critérios;  Considerando que o Comité de gestão do leite e dos produtos lácteos não emitiu um parecer no prazo fixado pelo seu presidente,  ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:  Artigo 1o  O método analítico de referência que consta do anexo será aplicado a fim de garantir que o queijo que deve ser produzido exclusivamente com leite de ovelha não contenha caseína de leite de vaca.  Considera-se que a caseína de leite de vaca está presente sempre que o teor aparente de caseína de leite de vaca da amostra analisada for igual ou superior ao teor da amostra de referência descrita no anexo.  Artigo 2o  Os métodos de rotina para a detecção de caseína de leite de vaca no queijo de leite de ovelha podem ser utilizados nas seguintes condições:  - o limite de detecção deve ser inferior ou igual a 0,5 %,  - não devem poder obter-se resultados falsamente positivos. Se esta possibilidade não puder ser excluída, todas as amostras que apresentarem resultados positivos terão de ser reanalisadas pelo método de referência,  - deve possível detectar, com o rigor adequado, a presença de caseína de leite de vaca mesmo após longos períodos de maturação, o que pode ocorrer nas condições comerciais correntes. Se esta condição não puder ser satisfeita em relação a um dado tipo de  queijo de leite de ovelha, esse tipo de queijo deve ser analisado pelo método de referência.  Artigo 3o  O presente regulamento entra em vigor no terceiro dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias.  É aplicável a partir de 16 de Setembro de 1992. O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-membros.  Feito em Bruxelas, em 19 de Março de 1992. Pela Comissão  Ray MAC SHARRY  Membro da Comissão   (1) JO no L 164 de 24. 6. 1985, p. 6. (2) JO no L 201 de 31. 7. 1990, p. 9. (3) JO no L 148 de 28. 6. 1968, p. 13. (4) JO no L 41 de 18. 2. 1992, p. 9. (5) JO no L 155 de 3. 7. 1968, p. 1. (6) JO no L 119 de 8. 5. 1986, p. 36. (7) JO no L 58  de 11. 3. 1971, p. 1. (8) JO no L 53 de 1. 3. 1986, p. 23. (9) JO no L 362 de 27. 12. 1990, p. 3.    g ANEXO  MÉTODO DE REFERÊNCIA PARA DETECÇÃO DE CASEÍNA DE LEITE DE VACA EM QUEIJO PRODUZIDO COM LEITE DE OVELHA   1.  Objectivo   Detecção de caseína de leite de vaca em queijo produzido com leite de ovelha através de focalização isoeléctrica das g-caseínas após plasmólise.  2.  Campo de aplicação   O método é adequado a uma detecção sensível e específica da  caseína de leite de vaca em queijos frescos e curados produzidos com leite de ovelha.  3.  Fundamento do método  3.1.  Isolamento das caseínas do queijo.  3.2.  Dissolução das caseínas isoladas e clivagem pela plasmina (EC.3.4.21.7).  3.3.  Focalização  isoeléctrica das caseínas tratadas com plasmina na presença de ureia e coloração das proteínas com azul brilhante de Comassie G 250.  3.4.  Avaliação da disposição de banda corada da g2-caseína (indício da presença de leite de vaca) através de  comparação entre a disposição relativa na amostra e a disposição relativa no mesmo gel a partir de padrões que contenham 0 % e 1 % de leite de vaca.  4.  Reagentes   Salvo outra indicação, devem ser utilizados reagentes de qualidade analítica. A água  deve ser bidestilada ou de pureza equivalente.   Nota: As especificações seguintes aplicam-se a géis de poliacrilamina que contenham ureia, de dimensões 265 × 125 × 0,25 mm, preparados em laboratório. Em caso de utilização de outras dimensões e tipos de  gel, as condições de separação devem ser ajustadas.   Focalização isoeléctrica  4.1.  Reagentes para produção de géis de poliacrilamida que contenham ureia  4.1.1.  Solução de base de gel   Dissolver:   4,85 g de acrilamida   0,15 g de  N,N-metileno-bis-acrilamida (BIS)   48,05 g de ureia   12,22 g de glicerol (87 % m/m)   em água e perfazer até 100 ml. Armazenar em recipiente de vidro de cor âmbar no frigorífico.   Nota: Pode ser usada, de preferência, uma solução disponível no  comércio, de acrilamida/BIS previamente misturada em vez das acrilamidas neurotóxicas com as massas referidas. Caso essa solução contenha 30 % p/v de acrilamida e 0,8 % p/v de BIS, deve ser utilizado na formulação um volume de 16,2 ml, em vez de massas  fixadas. A solução pode ser armazenada durante um período máximo de 10 dias. Se a sua condutividade for superior a 5 mS, proceder a uma desionização por agitação com 2 g de Amberlite MB-3 durante 30 minutos, seguida de filtração através de membrana de  0,45 mm.  4.1.2.  Solução de gel   Preparar uma solução de gel misturando aditivos e anfólitos com a solução-mae de gel (ver 4.1.1).   9,0 ml de solução-mae   24 mg de v-alanina   500 ml de amfólita pH 3,5-9,5 (1)   500 ml de amfólita pH 6-7(1).    Misturar a solução de gel e desgaseificar durante 2 a 3 minutos num banho ultra-sons ou no vácuo.   Nota: Preparar a solução de gel imediatamente antes da sua utilização (ver 6.2).  4.1.3.  Soluções catalizadoras   40 % p/v de persulfato de amónio  (PER): dissolver 800 mg de PER em água e levar até 2 ml.   N,N,NN-tetrametiletilenodiamina (TEMED).   Nota: Utilisar sempre solução de PER recentemente preparada.  4.2.  Fluido de contacto   Querosene ou parafina líquida.  4.3.  Solução anódica   Juntar  água a 5,77 g de ácido fosfórico (85 % p/p) em água e diluir para 100 ml.  4.4.  Solução catódica   Dissolver 2,00 g de hidróxido de sódio em água e perfazer o volume de 100 ml.   Preparação das amostras  4.5.  Reagentes para o isolamento das proteínas    Diclorometano.   Ácido acético diluído (25,0 ml de ácido acético glacial diluído para 100 ml de água).   Acetona.  4.6.  Solução-tampão para dissolução das proteínas   Dissolver:   5,75 g de glicerol (87 % m/m)   24,03 g de ureia   250 mg de  ditiotreitol   em água destilada até perfazer 50 ml.   Nota: Conservar no frigorífico durante um período máximo de uma semana.  4.7.  Reagentes para a clivagem da caseína pela plasmina  4.7.1.  Solução-tampão de carbonato de amónio   Titular uma solução  de 0,2 mol/l de hidrogenacarbonato de amónio (1,58 g/100 ml de água) com uma solução de 0,2 mol/l de carbonato de amónio (1,92 g/100 ml de água) até pH 8.  4.7.2.  Plasmina de bovino (EC.3.4.21.7), com uma actividade de pelo menos 5 U/ml.  4.7.3.   Solução de inibição de enzima   Dissolver 2,624 g de ácido e-aminocapróico (ácido 6-amino-n-hexanóico) em 100 ml de etanol a 40 % (v/v).  4.8.  Preparação de padrões de leite desnatado de ovelha coagulado que contenham 0 % e 1 % de leite de vaca.   O  leite desnatado é preparado por centrifugação de leite cru de ovelha a 37 °C a 2 500 g durante 20 minutos. Após rápido arrefecimento do tubo e do seu conteúdo a 6-8 °C, a camada superior de gordura é totalmente retirada. Para a preparação do padrão a 1  %, adicionar 5,00 ml de leite desnatado de vaca a 495 ml de leite desnatado de ovelha num copo de 1 litro e ajustar o pH a 6,4 através da adição de ácido láctico diluído (10 % p/v). Ajustar a temperatura a 35 °C e adicionar 100 ml de coalho de vitelo  (actividade do coalho: 1 : 10 000 3 000 U/ml), agitar durante 1 minuto e deixar o copo coberto com uma folha de alumínio a 35 °C durante 1 hora, a fim de permitir a formação de requeijão. Após a coagulação, todo o leite coalhado é liofilizado sem  homogeneização prévia ou escorrimento do soro de leite. Após liofilizada, a amostra é moída finamente a fim de produzir um pó homogéneo.   Para a preparação do padrão a 0 %, proceder do mesmo modo com 500 ml de leite de ovelha desnatado puro de ovino.    Nota: É aconselhável verificar a pureza do leite de ovelha através da focalização isoeléctrica das caseínas tratadas com plasmina antes da preparação dos padrões.   Reagentes para coloração das proteínas  4.9.  Fixador   Dissolver 150 ml de ácido  tricloroacético em água e perfazer até 1 000 ml.  4.10.  Solução de descoloração   Misturar 500 ml de metanol e 200 ml de ácido acético glacial e perfazer até 2 000 ml com água destilada.   Nota: Preparar a solução de descoloração todos os dias; esta  pode ser facilmente preparada misturando volumes iguais de soluções de metanol a 50 % (v/v) e de ácido acético glacial a 20 % (v/v).  4.11.  Soluções de coloração  4.11.1.  Solução de coloração (solução-mae 1)   Dissolver 3,0 g de azul brilhante de  Comassie of G 250 (Color Index 42655) em 1 000 ml de metanol a 90 % (v/v), utilizando um agitador magnético (aproximadamente 45 minutos) e filtrar através de dois filtros de pregas de velocidade média.  4.11.2.  Solução de coloração (solução-mae 2)    Dissolver 5,0 g de sulfato de cobre pentahidratado em 1 000 ml de ácido acético a 20 % (v/v).  4.11.3.  Solução de coloração (solução de trabalho)   Misturar 125 ml de cada uma das soluções-mae (4.11.1, 4.11.2) imediatamente antes da coloração.    Nota: A solução de coloração não deve ser utilizada de novo para além do dia da sua preparação.  5.  Aparelhos e utensílios  5.1.  Placas de vidro (265 × 125 × 4 mm); rolos de borracha (espessura 15 cm); mesa de nivelamento  5.2.  Folha de suporte do  gel (265 × 125 mm)  5.3.  Folha de cobertura (280 × 125 mm). Colar uma faixa de fita adesiva (280 × 6 × 0,25 mm) a cada uma das margens mais longas (ver figura 1)  5.4.  Câmara de electrofocalização com placa de arrefecimento (por exemplo 265 × 125 mm)  com um gerador de voltagem adequada ( 2,5 kV) ou aparelho automático de electroforese  5.5.  Crióstato de circulação, controlado termostaticamente a 12 ± 0,5 °C  5.6.  Centrifugadora ajustável a 3 000 g  5.7.  Eléctrodos em placa ( 265 mm de  comprimento)  5.8.  Frascos conta-gotas de plástico para as soluções anódica e catódica  5.9.  Aplicadores de amostra (10 × 5 mm, viscose ou papel de filtro com baixa absorção de proteínas)  5.10.  Tesouras, bisturis e pinças de aço inoxidável  5.11.   Tinas de aço inoxidável ou de vidro para coloração e descoloração (por exemplo, tabuleiros de 265 × 150 mm)  5.12.  Homogeneizador de vareta ajustável (vareta com 10 mm de diâmetro), de 8 000 a 20 000 rotações por minuto  5.13.  Agitador magnético   5.14.  Banho de ultra-sons  5.15.  Soldador de folhas  5.16.  Micropipetas de 5 a 25 ml  5.17.  Concentrador de vácuo ou liofilizador  5.18.  Banho-maria controlado termostaticamente, ajustável a 35 e 40 ± 1 °C, com agitador  5.19.  Densitómetro, com  leitura a l = 634 nm  6.  Técnica  6.1.  Preparação das amostras  6.1.1.  Isolamento das caseínas   Pesar a quantidade correspondente a 5 g de matéria seca de queijo ou padrões - no caso do queijo branco com bolor utilizar quando possível a parte  central não curado - para um tubo de centrifugação de 100 ml, adicionar 60 ml de água destilada e homogeneizar com um homogeneizador de vareta (8 000 a 10 000 rpm). Ajustar o pH a 4,6 com ácido acético diluído (4.5) e centrifugar durante 5 minutos a 3  000 g. Decantar a gordura e o soro de leite, homogeneizar o resíduo a 20 000 rpm em 40 ml de água destilada [ajustar o pH a 4-5 com ácido diluído (4.5)] (20 000 rpm), adicionar 20 ml de diclorometano (4.5), homogeneizar e centrifugar durante 5 minutos a  3 000 g. Retirar a camada de caseína que se encontra entre as fases aquosa e orgânica (ver figura 2) com uma espátula e decantar ambas as fases. Homogeneizar de novo a caseína em 40 ml de água destilada (ver supra) e 20 ml de diclorometano e  centrifugar. Repetir este processo até que ambas as fases extraídas sejam incolores (duas a três vezes). Homogeneizar o resíduo proteico com 50 ml de acetona isenta de água (4.5) e filtrar através filtro de papel de pregas de velocidade média. Lavar o  resíduo do filtra com duas porções diferentes de 25 ml de acetona e secar ao ar ou numa corrente de azoto; em seguida pulverizar finamente em almofariz.    Nota: Os isolados secos proteicos podem manter-se indefinidamente à temperatura ambiente. Com vista a um isolamento rápido das proteínas, homogeneizar a quantidade equivalente a 5 g de massa seca de queijo duas vezes com 100 ml de acetona (4.5) a  20 000 rpm, deixar em repouso durante 5 minutos e filtrar em seguida num filtro de pregas. Secar o resíduo proteico por meio da acetona, como acima descrito, a fim de ober pó seco. O método rápido não é aplicável ao queijo do tipo roquefort.  6.1.2.   Clivagem pela plasmina das v-caseínas a fim de intensificar as g-caseínas.   Suspender 25 mg de caseína isolada ou 50 mg de padrões liofilizados (4.8) ou isolado seco de porteínas obtido pelo processo rápido em 0,5 ml de tampão de carbonato de amónio  (4.7.1) e homogeneizar durante 20 minutos usando, por exemplo, um banho de ultra-sons. Aquecer a 40 °C e adicionar 10ml de plasmina (4.7.2), misturar e incubar durante uma hora a 40 °C com agitação contínua. A fim de inibir as enzimas, adicionar 20ml de  solução de ácido e-aminocapróico (4.7.3), e adicionar em seguida 200 mg de ureia sólida e 2 mg de ditiotreitol.   Nota: A fim de obter mais simetria nas bandas de caseína é aconselhável liofilizar a solução depois de adicionar o ácido e-aminocapróico e  dissolver em seguida os resíduos em 0,5 ml de tampão de ureia (4.6).  6.2.  Preparação de géis de acrilamida contendo ureia   Com a ajuda de algumas gotas de água, enrolar a folha de suporte do gel (5.2) para uma placa de vidro (5.1) e retirar toda a  água remanescente com um toalhete de papel ou tecido. Enrolar a folha de cobertura (5.3) com separadores (0,25 mm) para outra placa de vidro da mesma forma. Deixar a placa horizontalmente numa mesa de nivelamento.   Adicionar 10 ml de cada uma das  soluções de catálise TEMED e PER (4.1.3) à solução de gel preparada e à qual foi retirado o ar (4.1.2), misturar rapidamente e deitar uniformemente para o centro da folha de cobertura. Colocar uma extremidade da placa de suporte do gel (folha virada  para baixo) sobre a placa da folha de cobertura e baixá-la devagar de modo a formar um filme de gel entre as folhas e espalhar regularmente e sem bolhas de ar (ver figura 3). Com cuidado, deixar a placa com o suporte de gel cair completamente,  utilizando uma espátula fina e colocar mais três placas de vidro no cimo a fim de actuarem como pesos. Depois de terminada a polimerização (cerca de 60 minutos), retirar o gel polimerizado para a folha de suporte do gel juntamente com a folha de  cobertura inclinando as placas de vidro. Limpar cuidadosamente o reverso da folha de suporte a fim de remover os resíduos do gel e ureia. Colocar a « sanduíche » de gel numa folha enrolada, soldar as extremidades e guardar em frigorífico (durante, no  máximo, 6 semanas).   Nota: A folha de cobertura com os separadores pode ser reutilizada. O gel de poliacrilamida pode ser cortado em pequenas dimensões, cuja utilização é recomendada quando se disponha de poucas amostras ou se for empregue um aparelho  automático de electroforese (2 géis, dimensão 4,5 × 5 cm).  6.3.  Focalização isoeléctrica   Ligar o termóstato de arrefecimento a 12 °C. Limpar o reverso da folha de suporte de gel com querosene e, em seguida, deitar algumas gotas de querosene (4.2)  para o centro do bloco de arrefecimento. Enrolar a sanduíche de gel, com o lado de suporte para baixo e para dentro, tendo o cuidado de evitar bolhas de ar. Limpar qualquer excesso de querosene e retirar a folha de cobertura. Impregnar os eléctrodos com  as soluções de electrólise (4.3, 4.4), cortar segundo o comprimento do gel e colocar nas posições previstas (a distância dos eléctrodos deve ser de 9,5 cm).   Condições de focalização isoeléctrica:  6.3.1.  Formato do gel 265 × 125 × 0,25 mm          Fase  Tempo (min)  Voltagem (V)  Corrente (mA)  Potência (W)  Volt-hora (Vh)         1. Pré-focalização  30  máx. 2 500  máx. 15  const. 4  ca. 300  2. Focalização da amostra (*)  60  máx. 2 500  máx. 15  const. 4  ca. 1 000  3. Focalização final   60  máx. 2 500  máx. 5  máx. 20  ca. 3 000   40  máx. 2 500  máx. 6  máx. 20  ca. 3 000   30  máx. 2 500  máx. 7  máx. 25  ca. 2 500          (*) Aplicação da amostra: Após pré-focalizar (fase 1), pipetar 18 ml de cada uma das soluções de amostra para  os aplicadores de amostras (10 × 5 mm), colocá-los com intervalos de 1 mm e de 5 mm longitudinalmente a partir do ânodo e pressionar ligeiramente. Efectuar a focalização nas condições supra e remover cuidadosamente os aplicadores de amostras, após 60  minutos de focalização da amostra.      Nota: Se a espessura ou largura dos géis forem alteradas, os valores da corrente e da potência têm de ser devidamente adaptados (por exemplo, duplicar os valores da corrente eléctrica e da potência se for  utilizado um gel de 265 × 125 × 0,5 mm).  6.3.2.  Exemplo de um programa de voltagem para um aparelho automático de electroforese (2 géis de 5,0 × 4,5 cm e eléctrodos sem placas aplicados directamente no gel)         Fase  Voltagem  Corrente  Potência   Temperatura  Volt-hora         1. Pré-focalização  1 000 V  10,0 mA  3,5 W  8 °C  85 Vh  2. Focalização da amostra  250 V  5,0 mA  2,5 W  8 °C  30 Vh  3. Focalização  1 200 V  10,0 mA  3,5 W  8 °C  80 Vh  4. Focalização  1 500 V  5,0 mA  7,0 W  8 °C   570 Vh          Colocar o aplicador de amostras na fase 2 a 0 Vh.   Retirar o aplicador de amostras na fase 2 a 30 Vh.  6.4.  Coloração das proteínas  6.4.1.  Fixação das proteínas   Retirar os eléctrodos de placas imediatamente após desligar a  corrente e colocar imediatamente o gel numa placa de coloração/descoloração cheia com 200 ml de fixador (4.9); deixar durante 15 minutos agitando ocasionalmente.  6.4.2.  Lavagem e coloração da placa de gel   Escorrer a totalidade do fixador e lavar a  placa de gel duas vezes durante 30 segundos de cada vez com 100 ml de solução de descoloração (4.10). Decantar a solução de descoloração e encher a placa com 250 ml de solução de coloração (4.11.3); deixar corar durante 45 minutos agitando suavemente.   6.4.3.  Descoloração da placa de gel   Decantar a solução de coloração, lavar a placa de gel duas vezes com 100 ml de solução de descoloração de cada vez e, em seguida, agitar durante pelo menos 2 × 15 minutos com 200 ml de solução de descoloração até  que o fundo se apresente claro e incolor. Lavar a placa de gel com água destilada (2 × 2 minutos) e secar ao ar (2 a 3 horas) ou com secador de cabelo (10 a 15 minutos).   Nota: Proceder à fixação, lavagem, coloração e descoloração a 20 °C. Não utilizar  temperaturas elevadas.  7.  Avaliação   A avaliação é efectuada por comparação da disposição das bandas da amostra com as das amostras de referência no mesmo gel. A detecção de leite de vaca em leite de ovelha ou produtos feitos a partir deste é  realizada através das g2-e g3-caseínas intensificadas com o tratamento da plasmina (ver 6.1.2), cujos pontos isoeléctricos variam entre pH 6,5 e pH 7,5; (ver figuras 4 e 5). O limite de detecção é inferior a 0,5 %.   Para a avaliação visual da  quantidade de leite de bovino, é aconselhável ajustar as concentrações das amostras e dos padrões a fim de obter o mesmo nível de intensidade das g2-caseínas de ovino (ver « g2 0 » nas figuras 4 e 5). Em seguida, a quantidade de leite de bovino  (inferior, igual ou superior a 1 %) na amostra desconhecida poderá ser directamente avaliada por comparação da intensidade das g2-caseínas bovinas (ver « g2V » nas figuras 4 e 5).   Se possível, aplicar densitometria (5.19) para determinação da razão  das áreas dos picos das g2-caseínas ovinas e bovinas (ver figura 5). Comparar este valor com a razão das g2-caseínas no padrão a 1 % analisado no mesmo gel.   Nota: O método funciona satisfatoriamente, caso exista um sinal positivo claro das g2-caseínas  bovinas no padrão a 1 %, mas não no padrão a 0 %. Caso contrário, optimizar o método seguindo os pormenores do método com exactidão.  8.  Referências   Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.:  Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine cheese by gel isoelectric focusing of g2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).   Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe  and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholyte/immobilized pH gradient - isoelectric focusing of g2-caseins using plasmin as signal amplifier. En: Electrophoresis-Forum '89 (B.J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, Munique  (1989).   Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -kaese durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaligen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).   Krause I., Berner  I., Klostermeyer H.: Z. Lebensm. Unters. Forsch. (em preparação).   Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 mm polyacrylamide gels on silanized glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).  Fig. 1. Esquema da folha de cobertura  Separador  Folha de poliéster  Fig. 2. Camada de caseína a flutuar entre as fases aquosa e orgânica após centrifugação  H2O-Fase  Caseína  Fase de CH2Cl2  Fig. 3. Técnica de flapping para distribuição de géis ultrafinos de poliacrilamida  a = separador (0,25 mm); b = folha de cobertura (5.3); c, e = placas de vidro (5.1); d = solução de gel (4.1.2); f = folha de suporte do gel (5.2)                   Fig. 4. Focalização isoelétrica das caseínas tratadas com plasmina de queijo do tipo pecorino com diferentes quantidades de leite de vaca. % LV = percentagem de leite da vaca, V = vaca, O = ovelha  Queijo do tipo pecorino que contém  Fig. 5. Sobreposição de densitogramas de amostras de queijo de tipo pecorino que contêm 0, 1, 2, 3 e 7 % de leite de vaca após focalização isoeléctrica. Mais de metade do gel de IEF foi examinado a l = 634 mm. STD = padrões com 0 e 1 % de leite de vaca   (1) Os produtos Ampholine pH 3,5-9,5 (Pharmacia-LKB) e Servalyt pH 6-7 (Serva) mostraram-se especialment adequados para a obtenção da necessária separação das -caseínas.