CELEX: 31996D0240
Language: fr
Date: 1996-02-05 00:00:00
Title: 96/240/CE: Décision de la Commission, du 5 février 1996, modifiant la décision 92/532/CEE fixant les plans d'échantillonnage et les méthodes de diagnostic pour la détection et la confirmation de la présence de certaines maladies des poissons (Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)

Avis juridique important

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31996D0240

96/240/CE: Décision de la Commission, du 5 février 1996, modifiant la décision 92/532/CEE fixant les plans d'échantillonnage et les méthodes de diagnostic pour la détection et la confirmation de la présence de certaines maladies des poissons (Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)  

Journal officiel n° L 079 du 29/03/1996 p. 0019 - 0028

DÉCISION DE LA COMMISSION du 5 février 1996 modifiant la décision 92/532/CEE fixant les plans d'échantillonnage et les méthodes de diagnostic pour la détection et la confirmation de la présence de certaines maladies des poissons (Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE) (96/240/CE) LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,vu le traité instituant la Communauté européenne,vu la directive 91/67/CEE du Conseil, du 28 janvier 1991, relative aux conditions de police sanitaire régissant la mise sur le marché d'animaux et de produits d'aquaculture (1), modifiée en dernier lieu par la directive 95/22/CE (2), et notamment son article 15,considérant que les plans d'échantillonnage et les méthodes de diagnostic pour la détection et la confirmation de certaines maladies des poissons sont fixés dans la décision 92/532/CEE de la Commission (3);considérant que, depuis l'adoption de cette directive, l'évolution pratique et scientifique intervenue oblige à mettre à jour les plans d'échantillonnage et les méthodes de diagnostic;considérant que cette mise à jour concerne la taille de l'échantillon, les échantillons à prélever, le transport des échantillons et la méthode d'isolation des virus éventuellement présents dans l'échantillon;considérant que le comité scientifique vétérinaire, institué par la décision 81/651/CEE de la Commission (4), a été consulté;considérant que les mesures prévues par la présente décision sont conformes à l'avis du comité vétérinaire permanent,A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DÉCISION:Article premier L'annexe de la décision 92/532/CEE est remplacée par l'annexe de la présente décision.Article 2 Les États membres sont destinataires de la présente décision.Fait à Bruxelles, le 5 février 1996.Par la CommissionFranz FISCHLERMembre de la Commission(1) JO n° L 46 du 19. 2. 1991, p. 1.(2) JO n° L 243 du 11. 10. 1995, p. 1.(3) JO n° L 337 du 21. 11. 1992, p. 18.(4) JO n° L 233 du 19. 8. 1981, p. 32.ANNEXE PREMIÈRE PARTIE PROCÉDURES D'ÉCHANTILLONNAGE ET DE DIAGNOSTIC POUR LA SURVEILLANCE DE LA SHV ET DE LA NHI I. Échantillonnage 1. Période de l'échantillonnageLes exploitations font l'objet d'une inspection clinique au moins deux fois par an au cours de la période octobre-juin ou à n'importe quel moment où la température de l'eau est inférieure à 14 °C. Les intervalles entre les inspections doivent être d'au moins quatre mois. Toutes les unités de production (étangs, cuves, aquariums, cages, etc.) sont soumises à une inspection destinée à établir la présence de poissons morts, faibles ou au comportement anormal. Une attention particulière doit être accordée au point d'évacuation des eaux (si cela est faisable) où les poissons faibles ont tendance à s'accumuler en raison du courant.2. Sélection et collecte des échantillonsIl est collecté aux fins d'examen, en liaison avec les inspections visées au tableau 1 A, des échantillons composés de 30 à 150 poissons et/ou liquides ovariens. Si des truites arc-en-ciel sont présentes, les poissons de cette espèce devraient entrer dans la composition de l'échantillon. Si tel n'est pas le cas, l'échantillon doit contenir des poissons de toutes les autres espèces présentes dans la mesure où ces espèces sont sensibles à la SHV et/ou à la NHI (définies à l'annexe A de la directive 91/67/CEE concernant les conditions de santé animale régissant la mise sur le marché des animaux et des produits de l'aquaculture). Les espèces doivent être représentées proportionnellement dans l'échantillon. Au cours des deux premières années de la période de contrôle initiale de quatre ans qui précède l'agrément, l'échantillon est composé de 150 unités, de manière à garantir une détection ayant une fiabilité de 95 % des virus dont la prévalence est de 2 %, sauf pour les exploitations d'élevage de salmonidés ne comptant pas de géniteurs dans les zones côtières, où la taille de l'échantillon est de 30 unités.Au cours des deux dernières années de la période de contrôle, la taille de l'échantillon peut être réduite à 30 unités pour garantir une détection à une fiabilité de 95 % des virus dont la prévalence est de 10 %. Au cours des années ultérieures (maintien de l'agrément), la taille de l'échantillon peut aussi être ramenée à 30 unités.Dans les exploitations qui peuvent prouver qu'elles sont indemnes de SHV et de NHI depuis au moins quatre ans (sur la base d'un programme régulier d'inspections sanitaires officielles), l'échantillon à taille réduite peut être utilisé également pendant toute la période initiale de contrôle de quatre ans.Si on utilise, pour la production du poisson, plus d'une source d'eau, les poissons représentant toutes les sources d'eau doivent être inclus dans l'échantillon contenant 150 ou 30 poissons. Si des poissons faibles, au comportement anormal ou qui viennent de mourir (pas encore décomposés) sont présents, ils doivent être inclus en premier lieu dans l'échantillon. Si ces poissons ne sont pas présents, l'échantillon doit être composé de poissons en bonne santé, à l'aspect normal, collectés de telle manière que toutes les parties de l'exploitation ainsi que toutes les classes d'âge par année soient représentées proportionnellement dans l'échantillon.3. Préparation et envoi des échantillons de poissonsAvant d'être envoyés ou transférés vers le laboratoire, les morceaux d'organes à examiner sont prélevés sur le poisson à l'aide de ciseaux ou d'autres instruments stériles et placés dans des tubes en plastique contenant le milieu de transport, c'est-à-dire du milieu de culture cellulaire contenant 10 % de sérum de veau et d'antibiotiques. La combinaison de 200 UI de pénicilline, 200 µg de streptomycine et 200 µg de kanamycine par ml peut être recommandée, mais d'autres antibiotiques à l'efficacité éprouvée peuvent également être utilisés. Les tissus à examiner sont la rate, le rein antérieur et, en outre, soit le coeur, soit l'encéphale. Dans certains cas, le liquide ovarien doit être examiné (tableau 1).Du liquide ovarien ou des morceaux d'organes de 10 poissons (tableau 1) peuvent être réunis dans un tube en plastique de 10 ml, contenant 4 ml de milieu de transport et représentant un échantillon global. Les tissus de chaque échantillon doivent peser au moins 0,5 gramme (g).Les tubes sont placés dans des récipients isolés (par exemple des boîtes en polystyrène à parois épaisses) avec une quantité suffisante de glace ou de «blocs congelés» pour garantir une température des échantillons comprise entre 0 et 5 °C pendant le transport vers le laboratoire. Éviter le gel des échantillons. La température d'un échantillon pendant son transport ne doit jamais dépasser 10 °C et le récipient de transport doit encore contenir de la glace lors de sa réception.L'examen virologique doit commencer dès que possible, au plus tard 48 heures après la collecte des échantillons ou, dans des cas exceptionnels, au plus tard 72 heures après que le matériel collecté pour l'examen a été protégé par le milieu de transport et que les conditions de température pendant le transport ont été remplies (1.1.3. troisième alinéa).Des poissons entiers peuvent être envoyés au laboratoire si les conditions de température pendant le transport peuvent être respectées. Le poisson entier peut être enveloppé dans du papier absorbant et doit finalement être expédié dans un sac en plastique, réfrigéré comme indiqué ci-dessus. Des poissons vivants peuvent également être expédiés.4. Collecte de matériel diagnostic supplémentaireConformément à l'accord conclu avec le laboratoire de diagnostic considéré, d'autres tissus de poissons peuvent être collectés également et préparés en vue d'examens supplémentaires.II. Préparation des échantillons en vue de l'examen virologique 1. Homogénéisation des organesAu laboratoire, les tissus contenus dans les tubes doivent être complètement homogénéisés (soit à l'aide d'un broyeur stomacher, d'un mixeur ou d'un ensemble pilon-mortier) et placés ensuite en suspension dans le milieu de transport original. Si un échantillon est constitué de poissons entiers de moins de 6 cm de longueur, ceux-ci sont réduits en fines particules à l'aide de ciseaux stériles après élimination de la partie du corps se situant à l'arrière de l'ouverture ventrale, homogénéisés conformément à la méthode décrite ci-dessus et mis en suspension dans le milieu de transport. Le rapport final entre le matériel tissulaire et le milieu de transport doit être ajusté à >NUM>1>DEN>10.2. Centrifugation de l'homogénatL'homogénat est centrifugé dans une centrifugeuse réfrigérée à 2-5 °C à 2 000-4 000 × g pendant 15 minutes, et le liquide surnageant est collecté et traité soit pendant 4 heures à 15 °C, soit pendant une nuit à 4 °C avec des antibiotiques, c'est-à-dire que de la gentamicine à 1 mg/ml peut être employée à ce stade.Si l'échantillon a été expédié dans un milieu de transport (c'est-à-dire sous antibiotiques), le liquide surnageant ne doit plus être traité aux antibiotiques.Le traitement aux antibiotiques vise à maîtriser la contamination bactérienne des échantillons et rend superflue toute filtration à travers des filtres à membranes.Si le liquide surnageant collecté est conservé à - 80 °C pendant 48 heures après l'échantillonnage, il peut être décongelé et réutilisé une seule fois pour un examen virologique.S'il se présente des difficultés pratiques (panne d'incubateur, problèmes de cultures cellulaires, etc.) qui empêchent d'inoculer des cellules dans les 48 heures suivant la collecte des échantillons de tissus, il est admis que le liquide surnageant soit congelé à - 80 °C et qu'un examen virologique soit pratiqué dans les quatorze jours.Avant d'inoculer les cellules, mélanger le liquide surnageant avec des parts égales d'un groupe d'antisérums contre les sérotypes indigènes du virus NPI, dilués de façon appropriée, et incuber ainsi pendant au minimum une heure à 15 °C ou au maximum pendant 18 heures à 4 °C. Le titre de l'antisérum doit être d'au moins >NUM>1>DEN>2 000 dans un test de neutralisation sur plaque à 50 %.Le traitement de tous les inocula à l'antisérum contre le virus NPI (virus qui, dans certaines régions d'Europe, est présent dans 50 % des échantillons de poissons) vise à empêcher l'apparition, dans des cultures cellulaires inoculées, d'un ECP résultant du virus NPI. Cela réduira la durée des examens virologiques ainsi que le nombre des cas dans lesquels l'apparition d'un ECP devrait être considérée comme une indication potentielle de SHV ou de NHI.Lorsque des échantillons proviennent d'unités de production considérées comme indemnes de NPI, le traitement des inocula à l'antisérum contre le virus NPI peut être omis.III. Examen virologique 1. Cultures cellulaires et milieuxDes cellules soit BF-2, soit RTG-2 et soit EPC, soit FHM, sont cultivées à des températures de 20 à 30 °C dans un milieu approprié, c'est-à-dire un milieu Eagle's MEM (ou des versions modifiées), additionné de 10 % de sérum de foetus de bovin et d'antibiotiques à des concentrations standard.Lorsque les cellules sont cultivées dans des fioles fermées, il est recommandé de tamponner le milieu à l'aide de bicarbonate. Le milieu utilisé pour la culture cellulaire en unités ouvertes peut être tamponné à l'aide de Tris-HCl (23 mM) et de bicarbonate de soude (6 mM). Le pH doit être aussi proche que possible de 7,6.Les cultures cellulaires à utiliser pour l'inoculation avec du matériel tissulaire devraient être jeunes (de 4 à 48 heures) et en phase de croissance active (non confluentes) au moment de l'inoculation.2. Inoculation des cultures cellulairesInoculer une suspension d'organes traitée aux antibiotiques dans des cultures cellulaires en deux dilutions: la première et, en outre, une dilution de celle-ci à >NUM>1 >DEN>10, donnant respectivement des dilutions finales du matériel tissulaire dans un milieu de culture cellulaires à >NUM>1 >DEN>100 et >NUM>1 >DEN>1 000 (de manière à éviter des interférences par homologie). Deux lignées cellulaires au moins doivent être inoculées (cf. III. 1). Le rapport entre la taille de l'inoculum et le volume du milieu de culture cellulaire devrait être d'environ >NUM>1 >DEN>10.Pour chaque dilution et chaque lignée cellulaire, il y a lieu d'utiliser un minimum d'environ 2 cm² de cellules, ce qui correspond à une cupule dans un plateau de culture cellulaire à 24 cupules. L'utilisation de plateaux de culture cellulaire est recommandée mais d'autres supports présentant une surface de croissance similaire ou supérieure peuvent également convenir.3. Incubation des cultures cellulairesIncuber les cultures cellulaires inoculées à 15 °C pendant sept à dix jours. Si la couleur du milieu de culture cellulaire vire du rouge au jaune, indiquant une acidification du milieu, ajuster le pH à l'aide d'une solution stérile de bicarbonate ou à l'aide de substances équivalentes pour garantir la sensibilité de la cellule à l'infection virale.Effectuer tous les six mois le titrage des stocks congelés de virus SHV et NHI afin de vérifier la sensibilité des cultures cellulaires à l'infection.4. MicroscopieInspecter chaque jour les cultures cellulaires inoculées afin de déceler l'apparition d'un ECP à un grossissement d'environ 40 fois. Si un ECP se produit nettement, engager immédiatement les procédures d'identification du virus conformément à la section IV.5. Sous-cultureS'il ne s'est pas produit de ECP après l'incubation primaire de sept à dix jours, procéder à une sous-culture portant sur des cultures cellulaires fraîches en utilisant une superficie cellulaire similaire à celle de la culture primaire.Des parties aliquotes du milieu (liquide surnageant) provenant de toutes les cultures/cupules constituant la culture primaire sont groupées selon la souche cellulaire pendant sept à dix jours après inoculation. Les groupes sont ensuite inoculés dans des cultures cellulaires homologues non diluées et diluées à >NUM>1 >DEN>10 (donnant respectivement des dilutions finales du liquide surnageant à >NUM>1 >DEN>10 et >NUM>1 >DEN>100), comme décrit à la section I.III.2. L'inoculation peut être précédée d'une préincubation des dilutions avec l'antisérum contre le virus NPI à une dilution appropriée, comme décrit à la section I.II.2.Incuber ensuite les cultures inoculées pendant sept à dix jours à 15 °C, compte tenu des dispositions de la section III.4.S'il se produit un ECP toxique au cours des trois premiers jours suivant l'incubation, une sous-culture peut être réalisée à ce stade, mais les cellules doivent alors être incubées pendant sept jours et soumises à une nouvelle sous-culture suivie de sept autres jours d'incubation. Lorsqu'un ECP se produit au bout de trois jours, les cellules peuvent être passées une fois et incubées pour parvenir au nombre total de quatorze jours à partir de l'inoculation primaire. Il ne doit pas y avoir de signe de toxicité au cours des sept derniers jours d'incubation.IV. Identification du virus 1. Tests d'identification du virusSi, dans une culture cellulaire, un ECP s'est produit, le milieu (liquide surnageant) est collecté et examiné selon une ou plusieurs des techniques suivantes: neutralisation, immunofluorescence (IF), méthode immuno-enzymatique (ELISA).Si les tests n'ont pas permis d'identifier le virus de façon sûre en une semaine, celui-ci doit être transféré à un laboratoire communautaire de référence national pour maladies des poissons ou au laboratoire communautaire de référence pour certaines maladies des poissons pour être immédiatement identifié.Les immunoréactifs utilisés pour identifier le virus doivent être de qualité de référence et agréés, en ce qui concerne le titre et la spécificité, par le laboratoire de référence national pour les maladies des poissons.2. NeutralisationÉliminer les cellules du milieu collecté par centrifugation (2 000-4 000×g) ou par filtration sur membrane (0,45 µm), puis diluer le milieu à >NUM>1 >DEN>100 et >NUM>1 >DEN>10 000 dans un milieu de culture cellulaire.Mélanger des parties aliquotes des dilutions et les incuber séparément pendant 60 minutes à 15 °C avec des parties égales des réactifs suivants:>TABLE>Inoculer au moins deux cultures cellulaires avec 50 µl chacune de mélange de virus et de sérum et incuber à 15 °C. Contrôler l'apparition d'un ECP conformément à la section III.4.D'autres tests de neutralisation peuvent être appliqués si leur efficacité est prouvée.3. Immunofluorescence (IF)Pour chaque isolat de virus à identifier, ensemencer au moins huit couvre-objets ou l'équivalent à l'aide de cellules EPC à une densité engendrant une confluence d'environ 60 à 90 % après 24 heures de culture. Choisir les cellules EPC à cette fin à cause de leur forte adhérence aux surfaces de verre.Lorsque les cellules sont déposées sur la surface du verre (environ 1 heure après l'ensemencement) ou lorsque les cultures ont été incubées pendant 24 heures de maximum, inoculer le virus à identifier. Inoculer quatre cultures suivant le rapport de volume à volume de >NUM>1 >DEN>10 et quatre cultures suivant le rapport de >NUM>1 >DEN>100.Entre 20 et 30 heures après l'inoculation, rincer les cultures deux fois à l'aide du produit Eagle's MEM sans sérum, fixer à l'acétone et teinter par IF à deux couches. La première couche de réactif se compose d'anticorps poly- ou monoclonaux de qualité de référence. La seconde est un antisérum conjugué avec FITC contre l'immunoglobuline utilisée dans la première couche. Pour chacun des antisérums testés, teinter au moins une culture inoculée à dose élevée et une culture inoculée à faible dose. Inclure dans le test des témoins négatifs et positifs appropriés.Monter les cultures teintées en utilisant une solution glycérol-eau salée. Examiner aux ultraviolets incidents. Utiliser des oculaires 10 × ou 12 × et des lentilles d'objectif × 25 ou × 40, dont les ouvertures numériques sont respectivement &gt; 0,7 et &gt; 1,3.Certaines souches du virus Egtved réagissent fortement avec l'antisérum contre la souche de référence F1 à l'IF, bien qu'elles ne réagissent pas dans des tests de neutralisation.La technique d'IF décrite ci-dessus est indiquée à titre d'exemple. D'autres techniques d'IF (concernant les cultures cellulaires, la fixation et les anticorps de qualité de référence) peuvent être appliquées si leur efficacité est prouvée.4. Test ELISARecouvrir les cupules des plaques microtitres (par exemple, immunoplaques Nunc, Maxisorp, Nunc, Danemark) pendant une nuit avec les dilutions recommandées de fractions d'immunoglobuline purifiée à la protéine A des anticorps de qualité de référence.Après rinçage des cupules à l'aide d'un tampon PBS-Tween-20, introduire le virus à identifier dans les cupules en deux ou quatre dilutions et laisser opérer la réaction avec l'anticorps de couverture pendant 60 minutes à 37 °C. Après rinçage à l'aide du tampon PBS-Tween-20, ajouter les anticorps traités au biotinyle, d'une spécificité correspondant à celle des anticorps de couverture et laisser agir pendant 60 minutes à une température de 20 °C. Après un nouveau rinçage comme ci-dessus, ajouter de la streptavidine conjuguée avec HRP et laisser réagir pendant 1 heure à 20 °C. Après un dernier rinçage, l'enzyme liée est visualisée à l'aide de substrats ELISA appropriés (OPD ou autres).La variante ELISA ci-dessus, basée sur la biotine et l'avidine, est donnée à titre d'exemple. D'autres variantes ELISA d'une efficacité éprouvée peuvent être utilisées à la place.Tableau 1 A Obtention de l'agrément >TABLE>>TABLE>>TABLE>DEUXIÈME PARTIE PROCÉDURES DE DIAGNOSTIC PERMETTANT DE CONFIRMER LA NHI ET LA SHV EN CAS DE SUSPICION Le diagnostic de la NHI et de la SHV peut être réalisé par l'une des techniques suivantes:- A. Isolation conventionnelle du virus suivie d'une identification séroligique du virus,- B. Isolation du virus avec identification sérologique simultanée du virus,- C. Autres techniques de diagnostic (IF, ELISA).Le premier diagnostic de la NHI et de la SHV dans les exploitations situées dans les zones agréées ne peut reposer uniquement sur la méthode C. Il faut également appliquer soit la méthode A, soit la méthode B.Le matériel tissulaire destiné à l'examen virologique peut dans certains cas devoir être accompagné de matériel supplémentaire en vue d'un examen bactériologique, parasitologique, histologique ou autre, afin de permettre un diagnostic différentiel. Ce matériel devrait être collecté conformément aux procédures définies par l'OIE.II.A. Isolation conventionnelle du virus suivie d'une identification sérologique du virus II.A.I.1. Sélection des échantillonsIl y a lieu de sélectionner aux fins d'examen au moins 10 poissons présentant des signes typiques de NHI ou de SHV.II.A.I.2. Préparation et expédition des échantillons de poissonsVoir I.I.3.II.A.I.3. Collecte de matériel diagnostic supplémentaireVoir I.I.4.II.A.II Préparation d'échantillons pour examen virologiqueVoir I.II.II.A.III Examen virologiqueVoir I.III, si ce n'est que des cellules soit BF-2, soit RTG-2 et soit des cellules EPC, soit FHM peuvent être utilisées pour l'inoculation avec du matériel tissulaire.II.A.IV Identification du virusVoir I.IV.II.B. Isolation du virus avec isolation sérologique concomitante du virus II.B.I.1. Sélection des échantillonsVoir II.A.I.1.II.B.I.2. Préparation et expédition des échantillons de poissonsVoir I.I.3.II.B.I.3. Collecte de matériel diagnostic supplémentaireVoir I.I.4.II.B.II.1. Homogénéisation des organesVoir I.II.1.II.B.II.2. Centrifugation de l'homogénatVoir I.II.2.II.B.II.3. Traitement du liquide surnageant à l'aide des antisérums de diagnosticLa suspension comportant l'organe traité contre la NPI et l'antibiotique est diluée à >NUM>1>DEN>10 et à >NUM>1>DEN>10 000 dans un milieu de culture cellulaire et des parties aliquotes sont mélangées et incubées pendant 60 minutes à 15 °C avec des parties égales des réactifs énumérés à la section I.IV.2.II.B.III.1. Cultures cellulaires et milieuxDes cellules soit BF-2, soit RTG-2 et soit EPC, soit FHM sont cultivées à des températures de 20 à 30 °C dans un milieu approprié, c'est-à-dire un milieu Eagle's MEM (ou des versions modifiées), additionné de 10 % de sérum de foetus de bovin et d'antibiotiques à des concentrations standard.Lorsque les cellules sont cultivées dans des fioles fermées, il est recommandé de tamponner le milieu à l'aide de bicarbonate. Le milieu utilisé pour la culture des cellules en unités ouvertes peut être tamponné à l'aide de Tris-HCl (23 mM) et de bicarbonate de soude (6 mM). Le pH doit être aussi proche que possible de 7,6.Les cultures cellulaires à utiliser pour l'inoculation avec du matériel tissulaire devraient être jeunes (de 4 à 48 heures) et en phase de croissance active (non confluentes) au moment de l'inoculation.II.B.III.2. Inoculation des cultures cellulairesÀ partir de chaque mélange virus-sérum (préparé conformément à II.B.II.3), inoculer au moins deux cultures cellulaires par ligne cellulaire avec 50 µl chacune.II.B.III.3. Incubation des cultures cellulairesVoir I.III.3.II.B.III.4. MicroscopieInspecter quotidiennement les cultures cellulaires inoculées afin de déceler l'apparition d'un EPC à un grossissement de 40 fois. Si la formation d'un EPC est empêchée par l'un des sérums utilisés, le virus peut être considéré comme ayant été identifié en conséquence.Si l'apparition d'un ECP n'est pas empêchée par un des antisérums, il y a lieu de mettre en oeuvre les procédures d'identification du virus conformément à I.IV.II.B.III.5. Sous-cultureS'il ne s'est pas formé de EPC après sept jours, une sous-culture doit être mise en oeuvre à partir de cultures inoculées avec le liquide surnageant plus le milieu (II.B.II.3) conformément à I.III.5.II.C. Autres techniques de diagnostic Le liquide surnageant préparé comme indiqué sous II.A.II.2 peut être soumis à IF ou à ELISA, respectivement conformément à II.A.IV.3 ou II.A.IV.4. Ces techniques rapides doivent être complétées par un examen virologique conformément à A ou B moins de 48 heures après l'échantillonnage si:a) un résultat négatif a été obtenuoub) un résultat positif a été obtenu avec des échantillons représentant le premier cas de NHI ou SHV dans une zone agréée.Du matériel tissulaire peut être soumis à d'autres techniques de diagnostic telles que l'IF sur des éléments congelés ou l'immunohistochimie sur du matériel tissulaire fixé à la formaline. Ces techniques doivent toujours être accompagnées d'une inoculation de matériel tissulaire non fixé sur des cultures cellulaires.ABRÉVIATIONS BF-2 fibroblast de bluegill (lignée cellulaire)ECP effet cytopathogèneELISA méthode immuno-enzymatiqueEPC Epithelioma papulosum cyprinii (lignée cellulaire)FHM tête de boule (lignée cellulaire)FITC isothiocyanate de fluorescéineHRP peroxydase de raifortIF immunofluorescenceIFAT immunofluorescence des titres d'anticorpsMEM milieu essentiel minimalNHI(V) nécrose hématopoïétique infectieuse (virus)NPI(V) nécrose pancréatique infectieuse (virus)OPD ortho-phénolène diaminePBS solution tamponnée au phosphateRTG-2 gonade de truite arc-en-ciel (lignée cellulaire)SHV(V) septicémie hémorragique virale (virus)Tris-HCl tris(hydroxyméthyl) aminométhane - HCl(1*) Inspections cliniques.