CELEX: 32017R0735
Language: mt
Date: 2017-02-14
Title: Regolament tal-Kummissjoni (UE) 2017/735 tal-14 ta' Frar 2017 li jemenda, għall-finijiet tal-adattament tiegħu għall-progress tekniku, l-Anness tar-Regolament (KE) Nru 440/2008 li jistabbilixxi metodi ta' ttestjar skont ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH) (Test b'rilevanza għaż-ŻEE. )

28.4.2017   
               
               
                  MT
               
               
                  Il-Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea
               
               
                  L 112/1
               
            REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (UE) 2017/735
      tal-14 ta' Frar 2017
      li jemenda, għall-finijiet tal-adattament tiegħu għall-progress tekniku, l-Anness tar-Regolament (KE) Nru 440/2008 li jistabbilixxi metodi ta' ttestjar skont ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH)
      (Test b'rilevanza għaż-ŻEE)
      IL-KUMMISSJONI EWROPEA,
      Wara li kkunsidrat it-Trattat dwar il-Funzjonament tal-Unjoni Ewropea,
      Wara li kkunsidrat ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-18 ta' Diċembru 2006 dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH), li jistabbilixxi Aġenzija Ewropea għas-Sustanzi Kimiċi, li jemenda d-Direttiva 1999/45/KE u li jħassar ir-Regolament (KEE) Nru 793/93 tal-Kunsill u r-Regolament (KE) Nru 1488/94 tal-Kummissjoni kif ukoll id-Direttiva 76/769/KEE tal-Kunsill u d-Direttivi tal-Kummissjoni 91/155/KEE, 93/67/KEE, 93/105/KE u 2000/21/KE (1), u b'mod partikolari l-Artikolu 13(2) tiegħu,
      Billi:
      
                  (1)
               
               
                  Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 440/2008 (2) isemmi l-metodi ta' ttestjar li jintużaw biex jiġu ddeterminati l-proprjetajiet fiżikokimiċi, it-tossiċità u l-ekotossiċità ta' sustanzi kimiċi li għandhom jiġu applikati għall-finijiet tar-Regolament (KE) Nru 1907/2006.
               
            
                  (2)
               
               
                  Huwa neċessarju li r-Regolament (KE) Nru 440/2008 jiġi aġġornat biex jinkludi metodi ta' ttestjar ġodda u aġġornati li ġew adottati reċentement mill-Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi (OECD) sabiex jitqies il-progress tekniku, u biex jiġi żgurat li jitnaqqas l-għadd ta' annimali li jintużaw għal skopijiet sperimentali, f'konformità mad-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill (3). Il-partijiet interessati ġew ikkonsultati dwar dan l-abbozz.
               
            
                  (3)
               
               
                  L-adattament għall-progress tekniku fih għoxrin metodi ta' ttestjar: metodu ġdid għad-determinazzjoni ta' proprjetà fiżikokimika, ħames metodi ta' ttestjar ġodda u wieħed aġġornat għall-valutazzjoni tal-ekotossiċità, żewġ metodi ta' ttestjar aġġornati sabiex jivvalutaw id-destin u l-imġiba ambjentali, u erba' metodi ta' ttestjar ġodda u seba' metodi ta' ttestjar aġġornati għad-determinazzjoni tal-effetti fuq is-saħħa tal-bniedem.
               
            
                  (4)
               
               
                  L-OECD regolarment tirrevedi l-linji gwida għall-ittestjar tagħha, sabiex tidentifika dawk li jkunu xjentifikament skaduti. Dan l-adattament għall-progress tekniku jħassar sitt metodi ta' ttestjar li l-linji gwida għall-ittestjar tal-OECD korrispondenti għalihom ġew ikkanċellati.
               
            
                  (5)
               
               
                  Ir-Regolament (KE) Nru 440/2008 għandu għalhekk jiġi emendat skont dan.
               
            
                  (6)
               
               
                  Il-miżuri previsti f'dan ir-Regolament huma skont l-opinjoni tal-Kumitat stabbilit bl-Artikolu 133 tar-Regolament (KE) Nru 1907/2006,
               
            ADOTTAT DAN IR-REGOLAMENT:
      Artikolu 1
      L-Anness tar-Regolament (KE) Nru 440/2008 huwa emendat skont l-Anness ta' dan ir-Regolament.
      Artikolu 2
      Dan ir-Regolament għandu jidħol fis-seħħ fl-għoxrin jum wara l-pubblikazzjoni tiegħu f' Il-Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea.
      
         Dan ir-Regolament għandu jorbot fl-intier tiegħu u japplika direttament fl-Istati Membri kollha.
         Magħmul fi Brussell, l-14 ta' Frar 2017.
         
            
               Għall-Kummissjoni
            
            
               Il-President
            
            Jean-Claude JUNCKER
         
      
      
         (1)  ĠU L 396, 30.12.2006, p. 1.
      
         (2)  Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 440/2008 tat-30 ta' Mejju 2008 li jistabbilixxi metodi ta' ttestjar skont ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH) (ĠU L 142, 31.5.2008, p. 1).
      
         (3)  Id-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta' Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintużaw għal skopijiet xjentifiċi (ĠU L 276, 20.10.2010, p. 33).
      
         ANNESS
         L-Anness għar-Regolament (KE) Nru 440/2008 huwa emendat kif ġej:
         
                     (1)
                  
                  
                     Fil-Parti A, jiżdied il-Kapitolu li ġej:
                     “A.25   KOSTANTI TA' DISSOĊJAZZJONI FL-ILMA (METODU TA' WINKLER — METODU SPETTROFOTOMETRIKU — METODU KONDUTTOMETRIKU)
                     
                     INTRODUZZJONI
                     Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test 112 (1981) tal-OECD
                     
                        Prerekwiżiti
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 Metodu analitiku xieraq
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Is-solubilità fl-ilma
                              
                           
                        Informazzjoni ta' gwida
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 Formula strutturali
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-konduttività elettrika għall-metodu konduttometriku
                              
                           
                        Dikjarazzjonijiet kwalifikati
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 Il-metodi ta' ttestjar jistgħu jsiru fuq sustanzi puri jew ta' grad kummerċjali. Għandhom jiġu kkunsidrati l-effetti possibbli tal-impuritajiet fuq ir-riżultati.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-metodu ta' Winkler mhuwiex adattat għal sustanzi b'solubilità baxxa (ara Soluzzjonijiet tat-test, iktar 'il quddiem).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-metodu spettrofotometriku huwa applikabbli biss għal sustanzi li għandhom spettri tal-assorbiment tal-UV/VIS effettivament differenti għall-forom dissoċjati u mhux dissoċjati. Dan il-metodu jista' jkun adattat ukoll għal sustanzi b'solubilità baxxa u għal dissoċjazzjonijiet mhux aċidi/bażi, eż. formazzjoni kumplessa.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Fil-każijiet li fihom tapplika l-ekwazzjoni ta' Onsager, jista' jintuża l-metodu konduttometriku, anki f'konċentrazzjonijiet moderatament baxxi u anki f'każijiet għal ekwilibriji mhux aċidi/bażi.
                              
                           
                        Dokumenti standard
                     
                     Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bbażat fuq metodi mogħtijin fir-referenzi elenkati fit-taqsima “Tagħrif” u fil-Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification EPA tat-18 ta' Awwissu, 1978.
                     METODU — INTRODUZZJONI, SKOP, KAMP TA' APPLIKAZZJONI, RILEVANZA, APPLIKAZZJONI U LIMITI TAT-TEST
                     Id-dissoċjazzjoni ta' sustanza fl-ilma hija ta' importanza fil-valutazzjoni tal-impatt tagħha fuq l-ambjent. Tirregola l-forma tas-sustanza li min-naħa tagħha tistabbilixxi l-imġiba u t-trasport tagħha. Tista' taffettwa l-adsorbiment tas-sustanza kimika fuq il-ħamriji u s-sedimenti u l-assorbiment fiċ-ċelloli bijoloġiċi.
                     
                        Definizzjonijiet u unitajiet
                     
                     Id-dissoċjazzjoni hija l-qsim irriversibbli f'żewġ speċijiet kimiċi jew iktar li jistgħu jkunu joniċi. Ġeneralment il-proċess ikun indikat bi
                     
                        RX ⇌ R
                        ++ X
                        –
                     
                     u l-kostant ta' ekwilibriju tal-konċentrazzjoni li jirregola r-reazzjoni huwa
                     
                        
                     Pereżempju, fil-każ partikolari li fih R huwa idroġenu (is-sustanza hija aċidu), il-kostant huwa
                     
                        
                     jew
                     
                        
                     
                        Sustanzi ta' referenza
                     
                     Is-sustanzi ta' referenza li ġejjin mhux bilfors jintużaw fil-każijiet kollha meta tiġi investigata sustanza ġdida. Primarjament jiġu pprovduti sabiex kultant ikun jista' jiġi kkalibrat il-metodu u sabiex tingħata l-possibbiltà li jitqabblu r-riżultati meta jiġi applikat metodu ieħor.
                     
                                  
                              
                              
                                 pKa
                                     (1)
                                 
                              
                              
                                 Temp. f'°C
                              
                           
                                 p-Nitrofenol
                              
                              
                                 7.15
                              
                              
                                 25 (1)
                                 
                              
                           
                                 Aċidu benżojku
                              
                              
                                 4.12
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                 p-Kloroanilina
                              
                              
                                 3.93
                              
                              
                                 20
                              
                           Tajjeb li wieħed ikollu sustanza b'bosta pKs kif indikat fil-Prinċipju tal-metodu, hawn taħt. Sustana bħal din tista' tkun:
                     
                                 Aċidu ċitriku
                              
                              
                                 pKa (8)
                              
                              
                                 Temp. f'°C
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 1) 3,14
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 2) 4,77
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 3) 6,39
                              
                              
                                 20
                              
                           
                        Il-prinċipju tal-metodu ta' ttestjar
                     
                     Il-proċess kimiku deskritt ġeneralment ftit ikun dipendenti mit-temperatura fil-medda ta' temperaturi rilevanti għall-ambjent. Id-determinazzjoni tal-kostant ta' dissoċjazzjoni teħtieġ kejl tal-konċentrazzjonijiet tal-forom dissoċjati u mhux dissoċjati tas-sustanza kimika. Bl-għarfien tal-istekjometrija tar-reazzjoni ta' dissoċjazzjoni indikata fid-Definizzjonijiet u unitajiet, iktar 'il fuq, jista' jiġi stabbilit il-kostant it-tajjeb. Fil-każ partikolari deskritt f'dan il-metodu ta' ttestjar, is-sustanza qiegħda ġġib ruħha bħala aċidu jew bażi, u d-determinazzjoni tista' ssir l-aħjar billi jiġu stabbiliti l-konċentrazzjonijiet rilevanti tal-forom jonizzati u mhux jonizzati tas-sustanza u l-pH tas-soluzzjoni. Ir-relazzjoni bejn dawn it-termini tingħata fl-ekwazzjoni għall-pKa f'Definizzjonijiet u unitajiet, iktar 'il fuq. Ċerti sustanzi jesibixxu iktar minn kostant ta' dissoċjazzjoni wieħed u jistgħu jiġu żviluppati ekwazzjonijiet simili. Uħud mill-metodi deskritti hawnhekk huma adattati wkoll għal dissoċjazzjoni mhux aċida/bażi.
                     
                        Kriterji tal-kwalità
                     
                     
                        Ripetibbiltà
                     
                     Il-kostant ta' dissoċjazzjoni għandu jiġi rreplikat (tal-inqas tliet determinazzjonijiet) għal unità fi ħdan ± 0.1 unità log.
                     DESKRIZZJONI TAL-PROĊEDURI TA' TEST
                     Hemm żewġ approċċi bażiċi għad-determinazzjoni tal-pKa. Wieħed jinvolvi titrazzjoni ta' ammont magħruf ta' sustanza b'aċidu jew bażi standard, kif xieraq; l-ieħor jinvolvi l-istabbiliment tal-konċentrazzjoni relattiva tal-forom jonizzati u mhux jonizzati u d-dipendenza tagħha mill-pH.
                     
                        Preparamenti
                     
                     Il-metodi bbażati fuq dawk il-prinċipji jistgħu jiġu kklassifikati bħala proċeduri ta' titrazzjoni, ta' spettrofotometrija u ta' konduttometrija.
                     
                        Soluzzjonijiet tat-test
                     
                     Għall-metodu ta' Winkler u l-metodu konduttometriku, is-sustanza kimika għandha tiġi dissolta f'ilma distillat. Għal metodi spettrofotometriċi u oħrajn, jintużaw soluzzjonijiet mewwieta. Il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test ma għandhiex taqbeż l-inqas wieħed bejn 0.01 M jew nofs il-konċentrazzjoni tas-saturazzjoni, u l-iktar forma pura disponibbli tas-sustanza għandha tintuża fit-tiswir tas-soluzzjonijiet. Jekk is-sustanza jkollha solubilità medja, tista' tiġi dissolta f'ammont żgħir ta' solvent li jitħallat mal-ilma qabel ma jiżdiedu l-konċentrazzjonijiet indikati hawn fuq.
                     Is-soluzzjonijiet għandhom jiġu vverifikati għall-preżenza ta' emulsjonijiet bl-użu ta' raġġ ta' Tyndall, speċjalment jekk jintuża kosolvent sabiex tissaħħaħ is-solubilità. Meta jintużaw soluzzjonijiet mewwieta, il-konċentrazzjoni tal-bafer ma għandhiex taqbeż iż-0.05 M.
                     
                        Kundizzjonijiet tat-test
                     
                     
                        Temperatura
                     
                     It-temperatura għandha tiġi kkontrollata sa tal-inqas ± 1 °C. Id-determinazzjoni idealment għandha ssir f'20 °C.
                     Jekk ikun hemm suspett ta' dipendenza sinifikanti fuq it-temperatura, id-determinazzjoni għandha ssir f'tal-inqas żewġ temperaturi oħrajn. L-intervalli tat-temperatura għandhom ikunu ta' 10 °C f'dan il-każ u l-kontroll tat-temperatura ± 0.1 °C.
                     
                        Analiżijiet
                     
                     Il-metodu sejjer jiġi stabbilit mill-għamla tas-sustanza li tkun qiegħda tiġi ttestjata. Irid ikun sensittiv biżżejjed sabiex ikunu jistgħu jiġu stabbiliti l-ispeċijiet differenti f'kull konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tat-test.
                     
                        It-twettiq tat-test
                     
                     
                        Il-metodu ta' Winkler
                     
                     Is-soluzzjoni tat-test tiġi stabbilita b'titrazzjoni bis-soluzzjoni bażi jew aċida standard kif xieraq, billi titkejjel il-pH wara kull żieda ta' soluzzjoni titrata. Għandhom isiru minimu ta' 10 żidiet addizzjonali qabel il-punt ta' ekwivalenza. Jekk l-ekwilibriju jintlaħaq malajr biżżejjed, jista' jintuża potentjometru tar-reġistrazzjoni. Għal dan il-metodu, kemm il-kwantità totali tas-sustanza kif ukoll il-konċentrazzjoni tagħha jridu jkunu magħrufin bl-eżatt. Iridu jittieħdu prekawzjonijiet sabiex jiġi eskluż id-diossidu tal-karbonju. Dettalji dwar il-proċedura, il-prekawzjonijiet, u l-kalkolu jingħataw f'testijiet standard, eż. referenzi (1), (2), (3), (4).
                     
                        Il-metodu spettrofotometriku
                     
                     Tul tal-mewġa jinstab meta l-forom jonizzati u mhux jonizzati tas-sustanzi jkollhom koeffiċjenti ta' estinzjoni konsiderevolment differenti. L-ispettru ta' assorbiment tal-UV/VIS jinkiseb minn soluzzjonijiet ta' konċentrazzjoni kostanti taħt kundizzjoni tal-pH li fiha s-sustanza essenzjalment ma tkunx jonizzata u kompletament jonizzata u f'bosta pHs intermedji. Dan jista' jsir, jew billi jiżdiedu inkrementi ta' aċidu kkonċentrat (bażi) ma' volum relattivament kbir ta' soluzzjoni tas-sustanza f'bafer b'bosta komponenti, inizjalment f'pH għolja (baxxa) (ref. 5), jew billi jiżdiedu volumi ndaqs ta' soluzzjoni ewlenija tas-sustanza, pereżempju fl-ilma, il-metanol, ma' volumi kostanti ta' bosta soluzzjonijiet mewwieta li jkopru l-medda ta' pH mixtieqa. Mill-valuri tal-pH u l-assorbiment fit-tul tal-mewġa magħżula, jiġi kkalkolat numru suffiċjenti ta' valuri għall-pKa billi tintuża dejta minn tal-inqas 5 pHs meta s-sustanza tkun tal-inqas 10 fil-mija u inqas minn 90 fil-mija jonizzata. Id-dettalji sperimentali ulterjuri u l-metodu ta' kalkolu jintgħataw fir-referenza (1).
                     
                        Il-metodu konduttometriku
                     
                     Bl-użu ta' ċellola ta' kostant żgħir u magħruf taċ-ċellola, titkejjel il-konduttività ta' soluzzjoni ta' madwar 0.1 M tas-sustanza f'ilma tal-konduttività. Jitkejlu wkoll il-konduttivitajiet ta' numru ta' dilwizzjonijiet li jsiru bi preċiżjoni ta' din is-soluzzjoni. Il-konċentrazzjoni titnaqqas bin-nofs kull darba, u s-serje għandha tkopri tal-inqas ordni ta' kobor fil-konċentrazzjoni. Il-konduttività ta' limitazzjoni f'dilwizzjoni infinita tinstab billi jsir esperiment simili b'melħ NA u bl-estrapolazzjoni. Imbagħad il-grad ta' dissoċjazzjoni jkun jista' jiġi kkalkolat mill-konduttività ta' kull soluzzjoni bl-użu tal-ekwazzjoni Onsager, u b'hekk bl-użu tal-Liġi ta' Dilwizzjoni Ostwald jista' jiġi kkalkolat il-kostant ta' dissoċjazzjoni bħala K = α2C/(1 – α) fejn C hija l-konċentrazzjoni f'moli kull litru u α hija l-frazzjoni dissoċjata. Iridu jittieħdu prekawzjonijiet sabiex jiġi eskluż is-CO2. Id-dettalji sperimentali ulterjuri u l-metodu ta' kalkolu jintgħataw fit-testi standard u fir-referenzi (1), (6) u (7).
                     DEJTA U RAPPORTAR
                     
                        Trattament tar-riżultati
                     
                     
                        Il-metodu ta' Winkler
                     
                     Il-pKa hija kkalkolata għal 10 punti mkejlin fuq il-kurva ta' titrazzjoni. Jiġu kkalkolati d-devjazzjoni medja u d-devjazzjoni standard tat-tali valuri pKa. Plott tal-pH kontra l-volum tal-bażi jew l-aċidu standard għandha tkun inkluża flimkien ma' preżentazzjoni f'tabelli.
                     
                        Il-metodu spettrofotometriku
                     
                     L-assorbiment u l-pH huma mqegħdin f'tabella minn kull spettru. Tal-inqas ħames valuri għall-pKa huma kkalkolati mill-punti ta' data tal-ispettri intermedji, u jiġu kkalkolati d-devjazzjoni medja u dik standard ta' dawn ir-riżultati wkoll.
                     
                        Il-metodu konduttometriku
                     
                     Il-konduttività ekwivalenti Λ hija kkalkolata għal kull konċentrazzjoni tal-aċidu u għal kull konċentrazzjoni ta' taħlita ta' ekwivalenti ta' aċidu, flimkien ma' 0.98 ekwivalenti ta' idrossidu tas-sodju mingħajr karbonat. L-aċidu huwa eċċessiv sabiex jiġi evitat OH– eċċessiv minħabba l-idroliżi. 1/Λ tiġi pplottjata kontra Λ _ tal-melħ tista' tinstab bl-estrapolazzjoni għal konċentrazzjoni żero.
                     Λo tal-aċidu tista' tiġi kkalkolata billi jintużaw il-valuri tat-tagħrif għal H+ u Na+. Il-pKa tista' tiġi kkalkolata minn α = Λi /Λo u Ka = α2C/(1 – α) għal kull konċentrazzjoni. Valuri aħjar għall-Ka jistgħu jinkisbu billi jsiru korrezzjonijiet għall-mobilità u l-attività. Għandhom jiġu kkalkolati d-devjazzjoni medja u d-devjazzjoni standard tal-valuri pKa.
                     
                        Rapport tat-test
                     
                     Id-dejta mhux ipproċessata u l-valuri pKa kkalkolati kollha għandhom jiġu sottomessi flimkien mal-metodu ta' kalkolu (idealment f'forma ta' tabelli, kif issuġġerit fir-ref. 1) u hekk ukoll il-parametri statistiċi deskritti iktar 'il fuq. Għall-metodi ta' Winkler, għandhom jingħataw id-dettalji tal-istandardizzazzjoni tas-soluzzjonijiet titrati.
                     Għall-metodu spettrofotometriku, għandhom jiġu sottomessi l-ispettri kollha. Għall-metodu konduttometriku, għandhom jiġu rrapportati d-dettalji tad-determinazzjoni tal-kostant taċ-ċelloli. Għandha tingħata informazzjoni dwar it-teknika użata, il-metodi analitiċi u l-għamla ta' kwalunkwe bafer użat.
                     Għandha tiġi rrapportata t-temperatura (jew temperaturi) tat-test.
                     TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Albert, A. & Sergeant, E.P.: Ionization Constants of Acids and Bases, Wiley, Inc., New York, 1962.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Nelson, N.H. & Faust, S.D.: Acidic dissociation constants of selected aquatic herbicides, Env. Sci. Tech. 3, II, pp. 1186-1188 (1969).
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 ASTM D 1293 — Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Standard Method 242. APHA/AWWA/WPCF, Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water, 14th Edition, American Public Health Association, Washington, D.C., 1976.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Clark, J. & Cunliffe, A.E.: Rapid spectrophotometric measurement of ionisation constants in aqueous solution. Chem. Ind. (London) 281, (March 1973).
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 ASTM D 1125 — Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Standard Method 205 — APHA/AWWA/NPCF (see above (4)).
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 
                                    Handbook of Chemistry and Physics, 60th ed. CRC-Press, Boca Raton, Florida, 33431 (1980).”
                              
                           
               
                     (2)
                  
                  
                     Fil-Parti B, il-Kapitolu B.5 huwa sostitwit b'dan li ġej:
                     “B.5   IRRITAZZJONI AKUTA TAL-GĦAJNEJN/KORRUŻJONI
                     
                     INTRODUZZJONI
                     Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 405 tal-OECD (2012). Il-linji gwida tat-test tal-OECD għall-Ittestjar tas-Sustanzi Kimiċi jiġu riveduti kull ċertu żmien sabiex jiġi żgurat li dawn jirriflettu l-aħjar xjenza disponibbli. Fir-reviżjonijiet preċedenti ta' din il-linja gwida tat-test, inxteħtet attenzjoni speċjali fuq it-titjib permezz tal-evalwazzjoni tal-informazzjoni eżistenti kollha dwar is-sustanza kimika tat-test sabiex ikunu evitati testijiet żejda fuq l-annimali tal-laboratorju u b'hekk jiġi indirizzat it-tħassib dwar it-trattament xieraq tal-annimali. TG 405 (adottata fl-1981 u aġġornata fl-1987, l-2002, u l-2012) tinkludi r-rakkomandazzjoni li qabel ma jitwettaq it-test in vivo deskritt għal irritazzjoni akuta tal-għajnejn/korrużjoni, għandha ssir analiżi tal-piż tal-evidenza (1) fuq id-dejta rilevanti eżistenti. Meta ma jkunx hemm biżżejjed dejta disponibbli, huwa rakkomandat li dawn jiġu żviluppati bl-applikazzjoni ta' testijiet sekwenzali (2) (3). L-istrateġija tat-testijiet tinkludi t-twettieq ta' testijiet in vitro vvalidati u aċċettabbli u hija pprovduta bħala suppliment għal dan il-metodu ta' ttestjar. Għall-fini tar-Regolament (KE) Nru 1907/2006 dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH) (2), strateġija ta' ttestjar integrata hija inkluża fil-Gwida tal-ECHA rilevanti wkoll (21). L-ittestjar fl-annimali għandu jsir biss jekk jiġi stabbilit li dan huwa neċessarju wara li jiġu kkunsidrati l-metodi alternattivi disponibbli, u l-użu ta' dan jitqies xieraq. F'dan iż-żmien li fih qiegħed jiġi abbozzat dan il-metodu ta' ttestjar aġġornat, hemm każijiet li fihom l-użu ta' dan il-metodu ta' ttestjar għadu neċessarju jew meħtieġ minn ċerti oqfsa regolatorji.
                     L-aħħar aġġornament iffoka l-iktar fuq l-użu ta' analġeżiċi u anestetiċi mingħajr ma jitħalla impatt fuq il-kunċett u l-istruttura bażiċi tal-linja gwida tat-test. ICCVAM (3) u bord xjentifiku internazzjonali indipendenti ta' evalwazzjoni bejn il-pari rrevedew l-utilità u l-limitazzjonijiet tal-użu spiss ta' anestetiċi topiċi, analġeżiċi sistemiċi u punti ta' tmiem umanitarji matul l-ittestjar in vivo tas-sikurezza tal-irritazzjoni okulari (12). Ir-reviżjoni kkonkludiet li l-użu ta' anestetiċi topiċi u analġeżiċi sistemiċi jista' jevita ħafna mill-uġigħ u t-tbatija jew kull uġigħ u tbatija bla ma jaffettwa l-eżitu tat-test, u rrakkomandat li dawn is-sustanzi jintużaw dejjem. Dan il-metodu ta' ttestjar jieħu f'kunsiderazzjoni din ir-reviżjoni. Anestetiċi topiċi, analġeżiċi sistemiċi, u punti ta' tmiem umanitarji għandhom jintużaw ta' spiss matul l-ittestjar in vivo tal-korrużjoni u l-irritazzjoni akuta tal-għajnejn. L-eċċezzjonijiet għall-użu tagħhom għandhom ikunu ġġustifikati. L-irfinamenti deskritti f'dan il-metodu sejrin inaqqsu b'mod sostanzjali jew jevitaw l-uġigħ u t-tbatija tal-annimali f'ħafna mis-sitwazzjonijiet ta' ttestjar fejn ikun għad hemm bżonn li jsir ittestjar in vivo tas-sikurezza okulari.
                     L-immaniġġjar preventiv ibbilanċjat tal-uġigħ għandu jinkludi (i) pretrattament ta' rutina b'anestetiku topiku (eż. proparacaine jew tetracaine) u analġeżiku sistemiku (eż. buprenorphine), (ii) skeda ta' rutina ta' wara t-trattament tal-analġeżija sistemika (eż. buprenorphine u meloxicam), (iii) osservazzjoni, monitoraġġ u reġistrazzjoni skedati tal-annimali għal sinjali kliniċi ta' uġigħ u/jew tbatija, u (iv) osservazzjoni, monitoraġġ u reġistrazzjoni skedati tal-għamla, is-severità u l-progressjoni ta' kull korriment marbut mal-għajnejn. Huma pprovduti iktar dettalji fil-proċeduri aġġornati deskritti iktar 'il quddiem. Wara l-għoti tas-sustanza kimika tat-test, ma għandu jiġi applikat l-ebda anestetiku jew analġeżiku topiku addizzjonali sabiex tiġi evitata interferenza mal-istudju. L-analġeżiċi b'attività antiinfjammatorja (eż. meloxicam) ma għandhomx jiġu applikati b'mod topiku, u d-dożi użati b'mod sistemiku ma għandhomx jinterferixxu ma' effetti okulari.
                     Id-definizzjonijiet huma stabbiliti fl-Appendiċi għall-metodu ta' ttestjar.
                     KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU
                     Fl-interess kemm ta' xjenza għaqlija kif ukoll tat-trattament xieraq tal-annimali, testijiet in vivo ma għandhomx jiġu kkunsidrati qabel ma tkun ġiet evalwata d-dejta disponibbli kollha rilevanti għall-potenzjal ta' korrużjoni/irritazzjoni tal-għajnejn mis-sustanza f'analiżi tal-piż tal-evidenza. Tali dejta għandha tinkludi evidenza minn studji eżistenti kemm fuq il-bnedmin u/jew l-annimali tal-laboratorju, l-evidenza ta' korrużjoni/irritazzjoni ta' sustanza jew taħlita waħda jew iktar strutturalment relatata, id-dejta li turi aċidità jew alkalinità qawwija tas-sustanza kimika (4) (5), u r-riżultati minn testijiet in vitro jew ex vivo vvalidati u aċċettati għall-korrużjoni tal-ġilda u l-korrużjoni/irritazzjoni tal-għajnejn (6) (13) (14) (15) (16) (17). L-istudji setgħu ġew konklużi qabel l-analiżi tal-piż tal-evidenza, jew bħala riżultat tagħha.
                     Għal ċerti sustanzi kimiċi, tali analiżi tista' tindika l-ħtieġa għal studji in vivo dwar il-potenzjal tas-sustanza kimika għal korrużjoni/irritazzjoni okulari. F'dawn il-każijiet kollha, qabel ma jiġi kkunsidrat l-użu tat-test in vivo tal-għajnejn, idealment l-ewwel għandu jsir u jiġi evalwat studju tal-effetti in vitro u/jew in vivo ta' korrużjoni tal-ġilda tas-sustanza kimika skont l-istrateġija ta' ttestjar sekwenzjali fil-metodu ta' ttestjar B.4 (7) jew l-istrateġija ta' ttestjar integrat deskritta fil-Gwida tal-ECHA (21).
                     Strateġija ta' ttestjar sekwenzjali, li tinkludi t-twettiq ta' testijiet validati in vitro jew ex vivo tal-korrużjoni/irritazzjoni tal-għajnejn, hija inkluża bħala Suppliment għal dan il-metodu ta' ttestjar u, għall-fini tar-REACH, fil-Gwida tal-ECHA (21). Huwa rakkomandat li din l-istrateġija ta' ttestjar tkun segwita qabel ma jinbdew it-testijiet in vivo. Għal sustanzi kimiċi ġodda, huwa rakkomandat approċċ gradwali ta' ttestjar għall-iżvilupp ta' dejta xjentifikament solida fuq il-korrużjoni/irritazzjoni tas-sustanza kimika. Għal sustanzi kimiċi eżistenti b'dejta mhux suffiċjenti dwar il-korrużjoni/irritazzjoni tal-ġilda u l-għajnejn, l-istrateġija tista' tintuża sabiex timla l-vojt fin-nuqqas ta' dejta. L-użu ta' strateġija jew proċedura ta' ttestjar differenti, jew id-deċiżjoni li ma jintużax approċċ gradwali ta' ttestjar, għandhom ikunu ġustifikati.
                     IL-PRINĊIPJU TAT-TEST IN VIVO
                     
                     Wara pretrattament b'analġeżiku sistemiku u l-induzzjoni ta' anesteżija topika xierqa, is-sustanza kimika li trid tiġi ttestjata hija applikata f'doża waħda għal waħda mill-għajnejn tal-annimal tal-esperiment; l-għajn mhux trattata isservi bħala l-kontroll. Il-grad tal-irritazzjoni/korrużjoni tal-għajn huwa evalwat billi jiġu kklassifikati l-leżjonijiet tal-konġuntiva, tal-kornea u tal-iris, f'intervalli speċifiċi. Effetti oħrajn fl-għajn u l-effetti sistemiċi avversi huma deskritti wkoll sabiex jipprovdu evalwazzjoni sħiħa tal-effetti. It-tul ta' żmien tal-istudju għandu jkun biżżejjed sabiex tkun evalwata r-reversibilità jew l-irreversibilità tal-effetti.
                     Annimali li juru sinjali ta' tbatija u/jew uġigħ severi fi kwalunkwe stadju tat-test jew leżjonijiet konsistenti mal-punti ta' tmiem umanitarji deskritti f'dan il-metodu ta' ttestjar (ara l-Paragrafu 26) għandhom jinqatlu b'mod umanitarju, u s-sustanza kimika għandha tiġi vvalutata kif xieraq. Il-kriterji għat-teħid tad-deċiżjoni sabiex jinqatlu b'mod umanitarju annimali fi stat ta' agunija jew tbatija severa huma spjegati f'dokument ta' Gwida tal-OECD (8).
                     IL-PREPARAMENTI GĦAT-TEST IN VIVO
                     
                     
                        L-għażla tal-ispeċijiet
                     
                     Il-fenek albino huwa l-annimal tal-laboratorju preferut, u jintużaw annimali adulti żgħażagħ b'saħħithom. Għandha tingħata raġuni għall-użu ta' razez jew speċijiet oħrajn.
                     
                        Preparazzjoni tal-annimali
                     
                     Iż-żewġ għajnejn ta' kull annimal sperimentali magħżul b'mod provviżorju għat-testijiet għandhom ikunu eżaminati fi żmien 24 siegħa qabel ma jibda t-test. Ma għandhomx jintużaw annimali li juru irritazzjoni fl-għajnejn, difetti okulari, jew li korriment korneali preeżistenti.
                     
                        Kundizzjonijiet tal-abitazzjoni u l-għalf
                     
                     L-annimali għandhom jinżammu f'gaġeġ individwali. It-temperatura tal-kamra tal-annimali sperimentali għandha tkun ta' 20 °C (± 3 °C) għall-fniek. Filwaqt li l-umdità relattiva għandha tkun tal-inqas ta' 30 % u idealment ma taqbiżx is-70 %, minbarra matul it-tindif tal-kamra, il-mira għandha tkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, b'sekwenza ta' 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Għandha tiġi evitata intensità eċċessiva tad-dawl. Għall-għalf, jistgħu jintużaw id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb.
                     PROĊEDURA TAT-TEST
                     
                        L-użu ta' anestetiċi topiċi u analġeżiċi sistemiċi
                     
                     Huma rakkomandati l-proċeduri li ġejjin sabiex jiġu evitati jew minimizzati l-uġigħ u t-tbatija fil-proċeduri ta' ttestjar tas-sikurezza okulari. Minflok, jistgħu jintużaw proċeduri alternattivi li ġew stabbiliti li jipprovdu evitar jew tnaqqis ekwivalenti jew aħjar tal-uġigħ u t-tbatija.
                     
                                 —
                              
                              
                                 Sittin minuta qabel l-applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test (TCA), tingħata buprenorfina 0.01 mg/kg permezz ta' injezzjoni taħt il-ġilda (SC) sabiex tipprovdi livell terapewtiku ta' analġeżija sistemika. Mhuwiex magħruf jew mistenni li buprenorfina u analġeżiċi opojdi simili oħrajn mogħtijin sistemikament jibdlu r-risponsi okulari (12).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Ħames minuti qabel it-TCA, tiġi applikata taqtira waħda jew tnejn ta' anestetiku okulari topiku (eż. 0.5 % kloridrat tal-proparacaine jew 0.5 % kloridrat tat-tetracaine) fuq kull għajn. Sabiex tiġi evitata l-interferenza possibbli mal-istudju, huwa rakkomandat anestetiku topiku li ma fihx preservattivi. L-għajn ta' kull annimal li mhijiex ittrattata b'sustanza kimika tat-test, iżda li hija ttrattata b'anestetiċi topiċi, isservi ta' kontroll. Jekk jiġi antiċipat li s-sustanza kimika tat-test tikkawża uġigħ u tbatija sinifikanti, normalment mhux suppost tiġi ttestjata in vivo. Madankollu, f'każ ta' dubju jew meta jkun hemm bżonn li jsir hekk, għandhom jiġu kkunsidrati l-applikazzjonijiet addizzjonali tal-anestetiku topiku f'intervalli ta' 5 minuti qabel it-TCA. L-utenti għandhom ikunu jafu li bosta applikazzjonijiet ta' anestetiċi topiċi jistgħu potenzjalment jikkaġunaw żieda ħafifa fis-severità u/jew iż-żmien meħtieġ sabiex jgħibu leżjonijiet indotti kimikament.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 sigħat wara t-TCA, jingħataw buprenorfina 0.01 mg/kg SC u meloxicam 0.5 mg/kg SC sabiex jipprovdu livell terapewtiku kontinwu ta' analġeżija sistemika. Filwaqt li ma hemm l-ebda dejta li tissuġġerixxi li meloxican għandu effetti antiinfjammatorji fuq l-għajn meta jingħata SC darba kuljum, meloxicam ma għandux jingħata sa tal-inqas 8 sigħat wara t-TCA sabiex tiġi evitata kwalunkwe interferenza possibbli mal-istudju (12).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Wara t-trattament inizjali ta' 8 sigħat wara t-TCA, buprenorfina 0.01 mg/kg SC għandha tingħata kull 12-il siegħa, flimkien ma' meloxicam 0.5 mg/kg SC kull 24 siegħa, sakemm jitilqu l-leżjonijiet okulari u ma jifdal ebda sinjal kliniku ta' uġigħ jew tbatija. Hemm disponibbli preparamenti għar-rilaxx sostnut ta' analġeżiċi li jistgħu jiġu kkunsidrati sabiex inaqqsu l-frekwenza tad-dożaġġ tal-analġeżiku.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Analġeżija “ta' salvataġġ” għandha tingħata minnufih wara t-TCA jekk l-analġeżija preventiva u l-anesteżija topika ma jkunux adegwati. Jekk annimal juri sinjali ta' uġigħ u tbatija matul l-istudju, tingħata minnufih doża “ta' salvataġġ” ta' buprenorfina 0.03 mg/kg SC u din tiġi ripetuta bi frekwenza massima ta' kull 8 sigħat, jekk ikun hemm bżonn, minflok iż-0.01 mg/kg SC kull 12-il siegħa. Imbagħad meloxicam 0.5 mg/kg SC jingħata kull 24 siegħa flimkien mad-doża “ta' salvataġġ” ta' buprenorfina, iżda mhux sa tal-inqas 8 sigħat wara t-TCA.
                              
                           
                        Applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test
                     
                     Is-sustanza kimika tat-test għandha titqiegħed fil-ħofra konġuntivali ta' waħda mill-għajnejn ta' kull annimal wara li l-kappell t'isfel tal-għajn jinġibed bil-galbu lil hinn mill-boċċa tal-għajn. Imbagħad il-kpiepel jinżammu bil-galbu magħluqin għal madwar sekonda sabiex jiġi evitat it-telf tal-materjal. L-għajn l-oħra, li tibqa' mingħajr trattament, isservi ta' kontroll.
                     
                        Irrigazzjoni
                     
                     L-għajnejn tal-annimali tat-test ma għandhomx jinħaslu għal tal-inqas 24 siegħa wara l-instillazzjoni tas-sustanza kimika tat-test, ħlief għas-solidi (ara l-paragrafu 18), u fil-każ ta' effetti korrużivi jew irritanti immedjati. Wara 24 siegħa, tista' ssir tlaħliħa sewwa jekk jitqies li din hija xierqa.
                     L-użu ta' grupp satellita ta' annimali għall-investigazzjoni tal-infuwenza tal-ħasil mhuwiex rakkommandat, sakemm ma jkunx xjetifikament ġustifikat. Jekk ikun meħtieġ grupp satellita, għandhom jintużaw żewġt ifniek. Il-kundizzjonijiet tal-ħasil għandhom ikunu dokumentati bir-reqqa, eż. il-ħin tal-ħasil; il-kompożizzjoni u t-temperatura tas-soluzzjoni tal-ħasil; id-durata, il-volum u l-veloċità tal-applikazzjoni.
                     
                        Livell tad-doża
                     
                     (1)   L-ittestjar tal-likwidi
                     
                     Għat-testijiet tal-likwidi, tintuża doża ta' 0.1 ml. Ma għandhomx jintużaw sprejs bil-pompa għall-instillazzjoni diretta tas-sustanza kimika fl-għajn. L-isprej tal-likwidu għandu jitneħħa u jinġabar f'kontenitur qabel l-instillazzjoni ta' 0,1 ml fl-għajn.
                     (2)   L-ittestjar tas-solidi
                     
                     Meta jsiru t-testijiet ta' solidi, pejsts, u sustanzi partikolati, l-ammont użat għandu jkollu volum ta' 0.1 ml jew piż ta' mhux aktar minn 100 mg. Is-sustanza kimika tat-test għandha tkun mitħuna fi trab fin. Il-volum tal-materjal solidu għandu jitkejjel wara li jkun kumpattat b'ġentilezza, eż. b'taptip fuq il-kontenitur tal-kejl. Jekk is-sustanza kimika solida tat-test ma tkunx tneħħiet mill-għajn tal-annimal tat-test b'mekkaniżmi fiżjoloġiċi fl-ewwel punt tal-ħin tal-osserazzjoni ta' siegħa wara t-trattament, l-għajn tista' titlaħlaħ b'ilma salin jew distillat.
                     (3)   L-ittestjar ta' aerosoli
                     
                     Huwa rakkommandat li l-isprejs bil-pompa u l-aerosoli kollha jinġabru qabel l-instillazzjoni fl-għajn. L-unika eċċezzjoni hija għas-sustanzi kimiċi f'kontenituri tal-aerosoli b'pressjoni għolja, li ma jistgħux jinġabru minħabba l-vaporizzazzjoni. F'dawn il-każijiet, l-għajn għandha tinżamm miftuħa, u s-sustanza kimika tat-test tingħata fl-għajn f'tagħfisa sempliċi ta' madwar sekonda, minn distanza ta' 10 cm direttament quddiem l-għajn. Din id-distanza tista' tvarja jiddependi mill-pressjoni tal-isprej u l-kontenuti tiegħu. Għandha tingħata attenzjoni sabiex ma ssirx ħsara lill-għajn mill-pressjoni tal-isprej. F'każijiet xierqa, jista' jkun hemm il-ħtieġa li jkun evalutat il-potenzjal ta' ħsara “mekkanika” tal-għajn mill-qawwa tal-isprej.
                     Tista' tinħareġ stima tad-doża minn aerosol billi t-test jiġi ssimulat kif ġej: is-sustanza kimika tiġi sprejjata fuq karta tal-użin minn fetħa d-daqs ta' għajn ta' fenek imqiegħda direttament quddiem il-karta. Iż-żieda fil-piż tal-karta tintuża sabiex jiġi kkalkolat l-ammont sprejjat fl-għajn. Għal sustanzi kimiċi volatili, id-doża tista' tkun ikkalkolata bl-użin ta' kontenitur riċevitur qabel u wara t-tneħħija tas-sustanza kimika tat-test.
                     
                        It-test inizjali (test in vivo tal-irritazzjoni/korrużjoni tal-għajn bl-użu ta' annimal wieħed)
                     
                     Huwa ferm rakkomandat li t-test in vivo jsir inizjalment bl-użu ta' annimal wieħed (ara s-Suppliment għal dan il-metodu ta' ttestjar: Strateġija ta' Ttestjar Sekwenzali għall-Irritazzjoni u l-Korrużjoni tal-Għajnejn). L-osservazzjonijiet għandhom jippermettu li jiġu stabbiliti s-severità u r-reversibilità qabel ma jsir it-test konfermatorju f'annimal ieħor.
                     Jekk ir-riżultati ta' dan it-test jindikaw li s-sustanza kimika tkun korrużiva jew severament irritanti għall-għajn bl-użu tal-proċedura deskritta, ma għandhomx isiru aktar testiet dwar l-irritazzjoni okulari.
                     
                        Test konfermatorju (test in vivo tal-irritazzjoni tal-għajn b'annimali addizzjonali)
                     
                     Jekk ma jkunx osservat effett korrużiv jew irritanti severament fit-test inizjali, ir-rispons irritanti jew negattiv għandu jiġi kkonfermat bl-użu ta' massimu ta' żewġ annimali addizzjonali. Jekk jiġi osservat effett irritanti fit-test inizjali, huwa rakkomandat li t-test konfermatorju jsir b'mod sekwenzjali f'annimal wieħed wara l-ieħor, minflok ma jiġu esposti żewġ annimali addizzjonali fl-istess ħin. Jekk it-tieni annimal juri effetti korrużivi jew irritanti severi, it-test m'għandux jitkompla. Jekk ir-riżultati mit-tieni annimal ikunu biżżejjed sabiex jippermettu li tiġi stabbilita klassifikazzjoni tal-periklu, ma għandu jsir ebda test ieħor.
                     
                        Perjodu ta' osservazzjoni
                     
                     Id-durata tal-perjodu ta' osservazzjoni għandha tkun biżżejjed sabiex ikunu evalwati l-kobor u r-reversibilità tal-effetti osservati. Madankollu, l-esperiment għandu jkun terminat fi kwalunkwe ħin jekk l-annimal juri sinjali kontinwi ta' uġigħ jew tbatija severi (8). Sabiex tkun stabbilita r-reversibilità tal-effetti, l-annimali għandhom ikunu osservati normalment għal 21 jum wara l-amministrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test. Jekk ir-reversibilità tidher qabel 21 jum, l-esperiment għandu jkun terminat f'dak il-waqt.
                     
                        Osservazzjonijiet kliniċi u l-iggradar tar-reazzjonijiet tal-għajn
                     
                     L-għajnejn għandhom jiġu evalwati b'mod komprensiv għall-preżenza jew l-assenza ta' leżjonijiet okulari siegħa wara t-TCA, segwita minn evalwazzjonijiet li tal-inqas isiru ta' kuljum. L-annimali għandhom jiġu evalwati bosta drabi kuljum għall-ewwel 3 ijiem sabiex jiġi żgurat li d-deċiżjonijiet dwar it-terminazzjoni jittieħdu fil-ħin. L-annimali tat-test għandhom jiġu evalwati b'rutina għad-durata sħiħa tal-istudju għal sinjali kliniċi ta' uġigħ u/jew tbatija (eż. mess jew ħakk ripetut tal-għajn, teptip eċċessiv tal-għajnejn, dmugħ eċċessiv) (9) (10) (11) tal-inqas darbtejn kuljum, b'tal-inqas 6 sigħat bejn l-osservazzjonijiet, jew iktar spiss jekk ikun hemm bżonn. Dan huwa neċessarju sabiex (i) l-annimali jiġu vvalutati b'mod adegwat għal evidenza ta' uġigħ u tbatija sabiex jittieħdu deċiżjonijiet informati fuq il-ħtieġa li jiżdied id-dożaġġ tal-analġeżiċi u (ii) l-annimali jiġu vvalutati għal evidenza ta' punti ta' tmiem umanitarji stabbiliti sabiex jittieħdu deċiżjonijiet informati dwar jekk huwiex xieraq li l-annimali jingħataw ewtanażija umanitarja, u sabiex jiġi żgurat li t-tali deċiżjonijiet jittieħdu fil-ħin. It-tilwin bil-fluworexxeina għandu jintuża ta' spiss u għandu jintuża bijomikroskopju korneali meta jitqies li dan huwa xiearq (eż. għall-valutazzjoni tal-fond tal-korriment meta jkun hemm ulċerazzjoni korneali) bħala għajnuna fid-detezzjoni u l-kejl tal-ħsara okulari, u sabiex jiġi evalwat jekk intlaħqux il-kriterji tal-punt ta' tmiem stabbiliti għall-ewtanażja umanitarja. Jistgħu jinġabru ritratti diġitali tal-leżjonijiet osservati għal referenza u sabiex jiġi pprovdut rekord permanenti tal-firxa ta' ħsara okulari. L-annimali għandhom jinżammu fit-test mhux aktar milli meħtieġ ladarba tinkiseb l-informazzjoni definita. L-annimali li juru uġigħ jew tbatija severi għandhom jinqatlu b'mod umanitarju mingħajr dewmien, u s-sustanza kimika għandha tiġi vvalutata kif xieraq.
                     L-annimali bil-leżjonijiet tal-għajnejn li ġejjin wara l-instillazzjoni għandhom jinqatlu b'mod umanitarju (irreferi għat-Tabella 1 għal deskrizzjoni tal-gradi tal-leżjonijiet): perforazzjoni korneali jew ulċerazzjoni korneali sinifikanti inkluża stafiloma; demm fil-kompartiment anterjuri tal-għajn; opaċità korneali tal-grad 4; assenza ta' rifless tad-dawl (grad 2 tar-rispons iridjali) li tippersisti għal 72 siegħa; ulċerazzjoni tal-membrana konġuntivali; nekrożi tal-membrana konġuntivali jew nittitanti; jew tqaxxir. Dan għaliex, ġeneralment, tali leżjonijiet ma jkunux reversibbli. Barra minn hekk, huwa rakkomandat li l-leżjonijiet okulari li ġejjin jistgħu jintużaw bħala punti ta' tmiem umanitarji sabiex jiġu terminati l-istudji qabel tmiem il-perjodu ta' osservazzjoni skedat ta' 21 jum. Dawn il-leżjonijiet jitqiesu bħala prekursuri ta' korrimenti irritanti jew korrużivi u korrimenti li mhumiex mistennijin li jitilqu sa tmiem il-perjodu ta' osservazzjoni ta' 21 jum: fond sever tal-korriment (eż. ulċerazzjoni korneali li testendi lil hinn mis-saffi superfiċjali tal-istroma), qerda tal-limbus > 50 % (kif evidenzjata minn tibjid tat-tessut konġuntivali), u infezzjoni severa tal-għajn (nixxija purulenti). Taħlita ta': vaskularizzazzjoni tal-wiċċ tal-kornea (jiġifieri pannu korneali); żona ta' tilwin bil-fluworexxeina li ma tonqosx maż-żmien skont valutazzjoni li ssir kuljum; u/jew nuqqas ta' riefiteljalizzazzjoni 5 ijiem wara l-applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test jistgħu jitqiesu wkoll bħala kriterji potenzjalment siewja li jinfluwenzaw id-deċiżjoni klinika dwar it-terminazzjoni bikrija tal-istudju. Madankollu, dawn is-sejbiet waħedhom mhumiex biżżejjed sabiex jiġġustifikaw terminazzjoni bikrija tal-istudju. Ladarba jkunu ġew identifikati effetti okulari severi, għandu jiġi kkonsultat veterinarju tal-annimali tal-laboratorju inkarigat jew ikkwalifikat jew persunal imħarreġ sabiex jidentifika l-leżjonijiet kliniċi għal eżami kliniku sabiex jistabbilixxi jekk it-taħlita ta' dawn l-effetti jiġġustifikax terminazzjoni bikrija tal-istudju. Il-gradi ta' reazzjoni okulari (konġuntivi, kornea u iris) għandhom jinkisbu u jiġu rreġistrati wara siegħa, 24, 48 u 72 siegħa wara l-applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test (Tabella 1). L-annimali li ma jiżviluppawx leżjonijiet okulari jistgħu jiġu terminati mhux aktar qabel 3 ijiem wara l-instillazzjoni. L-annimali b'leżjonijiet okulari li mhumiex severi għandhom ikunu osservati sakemm ifiqu l-leżjonijiet, jew għal 21 jum, f'liema waqt l-istudju jkun terminat. L-osservazzjonijiet għandhom isiru u jiġu rreġistrati f'tal-inqas siegħa, 24 siegħa, 48 siegħa, 72 siegħa, 7 ijiem, 14-il jum, u 21 jum sabiex jiġi stabbilit l-istatus tal-leżjonijiet, u r-reversibilità jew l-irreversibilità tagħhom. Għandhom isiru osservazzjonijiet iktar frekwenti jekk ikun hemm bżonn sabiex jiġi stabbilit jekk l-annimal tat-test għandux jiġi ewtanizzat minħabba kunsiderazzjonijiet umanitarji jew jitneħħiex mill-istudju minħabba riżultati negattivi
                     Il-gradi tal-leżjonijiet okulari (Tabella 1) għandhom jiġu rreġistrati f'kull eżami. Kwalunkwe leżjoni oħra fl-għajn (eż. pannu korneali, tilwin, bidliet fil-kompatiment anterjuri) jew effett sistemiku avvers għandhom jiġu rrapportati wkoll.
                     L-eżami tar-reazzjonijiet jista' jkun iffaċilitat bl-użu tal-loupe binokulari, lampa tal-ferq tal-id, bijomikroskopju, jew xi apparat xieraq ieħor. Wara r-reġistrazzjoni tal-osservazzjonijiet wara 24 siegħa, l-għajnejn jistgħu jerġgħu jiġu eżaminati bl-għajnuna tal-fluworexxeina.
                     L-iggradar tar-risponsi okulari huwa neċċessarjament suġġettiv. Sabiex tkun imħeġġa l-armonizzazzjoni fl-iggradar tar-rispons okulari u sabiex ikunu megħjuna l-laboratorji tat-testijiet u dawk involuti fit-twettiq tall-osservazzjonijiet u tal-interpretazzjoni tagħhom, il-persunal li jwettaq l-osservazzjonijiet irid ikun imħarreġ b'mod adegwat fis-sistema tal-punteġġ użata.
                     DEJTA U RAPPORTAR
                     
                        Evalwazzjoni tar-riżultati
                     
                     Il-klassifikazzjonijiet tal-irritazzjoni okulari għandhom jiġu evalwati b'konnessjoni man-natura u s-severità tal-leżjonijiet, u r-reversibilità jew in-nuqqas ta' reversibilità tagħhom. Il-klassifikazzjonijiet individwali ma jirrapreżentawx standard assolut għall-proprjetajiet irritanti ta' sustanza kimika, minħabba li jiġu evalwati effetti oħrajn tas-sustanza kimika tat-test ukoll. Minflok, il-klassifikazzjonijiet individwali għandhom jitqiesu bħala valuri ta' referenza u jagħmlu sens biss meta jkunu sostnuti b'deskrizzjoni sħiħa u evalwazzjoni tal-osservazzjonijiet kollha.
                     
                        Rapport tat-test
                     
                     Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Il-ħsieb wara l-ittestjar in vivo: il-piż tal-evidenza ta' dejta preeżistenti tat-testijiet, inklużi r-riżultati minn strateġija ta' ttestjar sekwenzali:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             deskrizzjoni tad-dejta rilevanti disponibbli minn testijiet preċedenti;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dejta miksuba f'kull stadju tal-istrateġija ta' ttestjar;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             deskrizzjoni tat-testijiet in vitro mwettqin, inklużi d-dettalji tal-proċeduri, ir-riżultati miksubin bis-sustanzi kimiċi ta' referenza/tat-test;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             deskrizzjoni tal-istudju in vivo dwar l-irritazzjoni/korrużjoni dermali li jkun sar, inklużi r-riżultati miksubin;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             analiżi tal-piż tal-evidenza għat-twettieq tal-istudju in vivo.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanza kimika tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             dejta ta' identifikazzjoni (eż. isem is-sustanza u, jekk disponibbli, in-numru CAS, il-purità, l-impuritajiet magħrufin, is-sors, in-numru tal-lott);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             in-natura fiżika u l-propjetajiet fiżikokimiċi (eż. il-pH, il-volatilità, is-solubilità, l-istabilità, ir-reattività mal-ilma);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             fil-każ ta' taħlita, il-komponenti għandhom jiġu identifikati inkluża d-dejta ta' identifikazzjoni tas-sustanzi kostitwenti (eż. l-ismijiet tas-sustanzi kimiċi u, jekk disponibbli, in-numri tas-CAS) u l-konċentrazzjonijiet tagħhom;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-doża applikata.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Il-veikolu:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             l-identifikazzjoni, il-konċentrazzjoni (meta xieraq), il-volum użat;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-ġustifikazzjoni għall-għażla tal-veikolu.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    L-annimali tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             l-ispeċijiet/ir-razza użati, ir-raġuni wara l-użu ta' annimali oħrajn u mhux fniek albino;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             l-età ta' kull annimal fil-bidu tal-istudju;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             in-numru ta' annimali ta' kull sess użati fit-test u fil-gruppi ta' kontroll (jekk meħtieġ);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-piżijiet tal-annimali individwali, kemm fil-bidu kif ukoll fil-konklużjoni tat-test;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             is-sors, il-kundizzjonijiet tal-gaġeg, id-dieta, eċċ.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    L-anestetiċi u l-analġeżiċi
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             id-dożi u l-ħinijiet ta' meta ngħataw l-anestetiċi topiċi u l-analġeżiċi sistemiċi;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             jekk jintuża anestetiku lokali, l-identifikazzjoni, il-purità, it-tip, id-doża, u l-interazzjoni potenzjali mas-sustanza kimika tat-test.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ir-riżultati:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             id-deskrizzjoni tal-metodu użat sabiex jingħata punteġġ lill-irritazzjoni f'kull ħin tal-osservazzjoni (eż. lampa tal-ferq tal-id, bijomikroskopju, fluworexxeina);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             it-tqegħid f'tabella tad-dejta dwar ir-rispons irritanti/korrużiv għal kull annimali f'kull ħin ta' osservazzjoni jew sat-tneħħija ta' kull animal mit-test;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-deskrizzjoni narrattiva tal-grad u n-natura tal-irritazzjoni jew tal-korrożjoni osservata;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-deskrizzjoni ta' kwalunkwe leżjoni oħra osservata fl-għajn (eż. vaskularizzazzjoni, formazzjoni tal-pannu korneali, aderenzi, tilwin);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-deskrizzjoni tal-effetti avversi sistemiċi u lokali mhux okulari, reġistrazzjoni tas-sinjali kliniċi tal-uġigħ u t-tbatija, ritratti diġitali, u sejbiet istopatoloġiċi, jekk ikun hemm.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Diskussjoni dwar ir-riżultati
                                 
                              
                           
                        Interpretazzjoni tar-riżultati
                     
                     L-estrapolazzjoni tar-riżultati tal-istudji dwar l-irritazzjoni tal-għajn fl-annimali tal-laboratorju għall-bnedmin hija valida biss sa ċertu punt limitat. F'ħafna każijiet, il-fenek albino huwa iktar sensittiv mill-bnedmin għal irritanti jew korrużivi okulari.
                     Għandha tingħata attenzjoni għall-interpretazzjoni tad-dejta sabiex tkun eskluża irritazzjoni li tirriżulta minn infezzjoni sekondarja.
                     TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Barratt, M.D., et al. (1995), The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard, ECVAM Workshop Report 8, ATLA 23, 410 — 429.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 de Silva, O., et al. (1997), Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies, Food Chem. Toxicol 35, 159 — 164.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Worth A.P. and Fentem J.H. (1999), A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Young, J.R., et al. (1988), Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals, Toxicol. In Vitro, 2, 19 — 26.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Neun, D.J. (1993), Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH, J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 — 231.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Fentem, J.H., et al. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in vitro 12, pp.483 — 524.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Kapitolu B.4 ta' dan l-Anness, Kapitolu B.4 ta' dan l-Anness.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19. (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Wright EM, Marcella KL, Woodson JF. (1985), Animal pain: evaluation and control, Lab Animal, May/June, 20-36.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 National Research Council (NRC) (2008), Recognition and Alleviation of Distress in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 National Research Council (NRC) (2009), Recognition and Alleviation of Pain in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report: Recommendations for Routine Use of Topical Anesthetics, Systemic Analgesics, and Humane Endpoints to Avoid or Minimize Pain and Distress in Ocular Safety Testing, NIH Publication No. 10-7514, Research Triangle Park, NC, USA: National Institute of Environmental Health Sciences.
                                 http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/OcuAnest- TMER.htm
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu B.40 ta' dan l-Anness, Korrużjoni tal-Ġilda In Vitro: Test tar-Reżistenza Elettrika Transkutanja (TER).
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu B.40bis ta' dan l-Anness, Korrużjoni tal-Ġilda In Vitro: Test Mudell tal-Ġilda tal-Bniedem.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu B.47 ta' dan l-Anness, Metodu ta' Ttestjar tal-Opaċità u l-Permeabilità tal-Kornea fil-Bovini għall-Identifikazzjoni ta' i) Sustanzi Kimiċi li Jinduċu Ħsara Serja lill-Għajnejn u ii) Sustanzi Kimiċi li ma Jeħtiġux Klassifikazzjoni għal Irritazzjoni tal-Għajnejn jew Ħsara Serja lill-Għajnejn..
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 B.48 Metodu ta' Ttestjar tal-Għajnejn tat-Tiġieġ Iżolati għall-Identifikazzjoni ta' i) Sustanzi Kimiċi li Jinduċu Ħsara Serja lill-Għajnejn u ii) Sustanzi Kimiċi li ma Jeħtiġux Klassifikazzjoni għal Irritazzjoni tal-Għajnejn jew Ħsara Serja lill-Għajnejn.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 U.S. EPA (2003), Label Review Manual: 3rd Edition, EPA737-B-96-001, Washington, DC: U.S., Environmental Protection Agency.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 UN (2011), Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fourth revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 KE (2008), ir-Regolament (KE) Nru Ir-Regolament (KE) Nru 1272/2008 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tas-16 ta' Diċembru 2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballaġġ tas-sustanzi u t-taħlitiet, li jemenda u jħassar id-Direttivi 67/548/KEE u 1999/45/KE, u li jemenda r-Regolament (KE) Nru 1907/2006. Il-ĠU L 353, 31.12.2008, p. 1.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 ECHA Guidance on information requirements and chemical safety assessment, Chapter R.7a: Endpoint specific guidance.
                                 http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf
                              
                           
                        Tabella 1
                     
                     
                        L-iggradar tal-leżjonijiet okulari
                     
                     
                                 Il-kornea
                              
                              
                                 Grad
                              
                           
                                 Opaċità: il-grad ta' densità (il-qari għandu jittieħed mill-iktar żona densa) (*1)
                                 
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Ebda ulċerazzjoni jew opaċità
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Partijiet mifruxin jew imxerrdin tal-opaċità (għajr skurar ħafif ta' tleqqija normali); dettalji tal-iris viżibbli biċ-ċar
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Parti trasluċida li tintlemaħ faċilment; dettalji tal-iris ftit oskurata
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Parti nakruża; ebda dettalji tal-iris viżibbli; daqs tal-ħabba ftit li xejn jingħaraf
                              
                              
                                 3
                              
                           
                                 Kornea opaka; iris ma tistax tingħaraf mill-opaċità
                              
                              
                                 4
                              
                           
                                 Il-massimu possibbli: 4
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 L-iris
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Normali
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Tikmix fond ħafna, konġestjoni, nefħiet, iperemija ċirkumkorneali moderata; jew injezzjoni; iris reattiva għad-dawl (reazzjoni batuta titqies li hija effett
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Emorraġija, qerda sinifikanti, jew ebda reazzjoni għad-dawl
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Il-massimu possibbli: 2
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Il-konġuntivi
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Ħmura (tirreferi għal konġuntivi palpebrali u bulbari; esklużi l-kornea u l-iris)
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Normali
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Xi vini iperemiċi (injettati)
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Kulur diffuż, krimżi; vini individwali ma jingħarfux faċilment
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Aħmar mitfi diffuż
                              
                              
                                 3
                              
                           
                                 Il-massimu possibbli: 3
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Il-kemożi
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Nefħiet (tirreferi għall-kpiepel u/jew il-membrani nittitanti)
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Normali
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Xi nefħiet iktar min-normal
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Nefħiet evidenti, b'everżjoni palpebrali parzjali
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Nefħiet, bil-kpiepel kważi nofshom magħluqin
                              
                              
                                 3
                              
                           
                                 Nefħiet, bil-kpiepel iktar minn nofshom magħluqin
                              
                              
                                 4
                              
                           
                                 Il-massimu possibbli: 4
                              
                              
                                  
                              
                           
                        Appendiċi
                        DEFINIZZJONIJIET
                        
                           
                              Riserva tal-aċidi/alkali
                           : Għal preparati aċidiċi, dan huwa l-ammont (g) ta' idrossidu tas-sodju/100 g tal-preparat meħtieġ għall-produzzjoni ta' pH speċifika. Għal preparati alkalini, dan huwa l-ammont (g) ta' idrossidu tas-sodju ekwivalenti għall-aċidu sulfuriku g/100 g tal-preparat meħtieġ għall-produzzjoni ta' pH speċifika (Young et al. 1988).
                        
                           
                              Sustanza Kimika
                           : Sustanza jew taħlita.
                        
                           
                              Mhux irritanti
                           : Is-sustanzi li mhumiex ikklassifikati bħala irritanti okulari tal-Kategorija I, II jew III tal-EPA; jew irritanti tal-għajnejn tal-GHS tal-Kategorija 1, 2, 2A, jew 2B; jew il-Kategorija 1 jew 2 tal-UE (17) (18) (19).
                        
                           
                              Korrużiva okulari
                           : (a) Sustanza kimika li tikkawża ħsara irreversibbli fit-tessut għall-għajn; (b) Sustanzi kimiċi li huma klassifikati bħala irritanti tal-għajnejn tal-GHS tal-Kategorija 1, jew irritanti okulari tal-Kategorija I tal-EPA, jew il-Kategorija 1 tal-UE (17) (18) (19).
                        
                           
                              Irritanti okulari
                           : (a) Sustanza kimika li tipproduċi bidla reversibbli fl-għajn; (b) Sustanzi kimiċi li huma kklassifikati bħala irritanti okulari tal-Kategorija II jew III tal-EPA; jew irritanti tal-għajnejn tal-GHS tal-Kategorija 2, 2A jew 2B; jew il-Kategorija 2 tal-UE (17) (18) (19).
                        
                           
                              Irranti okulari severa
                           : (a) Sustanza kimika li tikkawża ħsara fit-tessut fl-għajn li ma tfiqx fi żmien 21 mill-applikazzjoni jew tikkaġuna tnaqqis fiżiku sever tal-vista; (b) Sustanzi kimiċi li huma klassifikati bħala irritanti tal-għajnejn tal-GHS tal-Kategorija 1, jew irritanti okulari tal-Kategorija I tal-EPA, jew il-Kategorija 1 tal-UE (17) (18)
                        
                           
                              Sustanza kimika tat-test
                           : Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta' dan il-metodu ta' ttestjar.
                        
                           
                              Approċċ sekwenzjali
                           : Strateġija ta' ttestjar gradwali li biha l-informazzjoni eżistenti kollha dwar sustanza kimika tat-test tiġi riveduta, f'ordni speċifiku, permezz ta' proċess tal-piż tal-evidenza f'kull livell sabiex jiġi ddeterminat jekk hemmx biżżejjed informazzjoni disponibbli għal deċiżjoni dwar il-klassifikazzjoni tal-periklu, qabel ma wieħed jgħaddi għal-livell li jmiss. Jekk il-potenzjal ta' irritazzjoni ta' sustanza kimika tat-test jista' jiġi assenjat fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, ma jkun meħtieġ l-ebda ttestjar ieħor. Jekk il-potenzjal ta' irritazzjoni ta' sustanza kimika tat-test ma jkunx jista' jiġi assenjat fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, għandha ssir proċedura ta' ttestjar sekwenzjali fuq l-annimali sakemm tkun tista' ssir klassifikazzjoni mhux ekwivoka.
                        
                           
                              Piż tal-evidenza (proċess)
                           : Il-vantaġġi u l-iżvantaġġi ta' ġabra ta' informazzjoni jintużaw bħala l-bażi għal konklużjoni li jaf ma tkunx evidenti mid-dejta individwali.
                     
                     
                        SUPPLIMENT GĦALL-METODU TA' TTESTJAR B.5
                         (4)
                     
                     STRATEĠIJA TA' TTESTJAR SEKWENZALI GĦALL-IRRITAZZJONI U L-KORRUŻJONI TAL-GĦAJNEJN).
                     
                        Kunsiderazzjonijiet ġenerali
                     
                     Fl-interessi ta' xjenza valida u t-trattament xieraq tal-annimali, huwa importanti li jkun evitat l-użu bla bżonn tal-annimali, u li jitnaqqas l-ittestjar li aktarx li jipproduċi risponsi severi fl-annimali. L-informazzjoni kollha dwar sustanza kimika relatata mal-potenzal tagħha ta' irritazzjoni/korrużjoni okulari għandha tkun evalwata qabel ma jiġi kkunsidrat l-ittestjar in vivo. Jaf diġà jkun hemm biżżejjed evidenza sabiex sustanza kimika tat-test tkun tista' tiġi kklassifikata fir-rigward tal-potenzjal tagħha ta' irritazzjoni jew korrużjoni tal-għajnejn mingħajr il-ħtieġa li jsiru testijiet fuq annimali tal-laboratorju. Għalhekk, l-użu ta' analiżi tal-piż tal-evidenza u strateġija ta' ttestjar sekwenzjali sejjer inaqqas il-ħtieġa ta' testijiet in vivo, speċjalment jekk is-sustanza kimika aktarx li tipproduċi risponsi severi.
                     Huwa rakkommandat li tintuża analiżi tal-piż tal-evidenza għall-evalwazzjoni tal-informazzjoni eżistenti li tappartjeni għas-sustanzi ta' irritazzjoni u korrużjoni tal-għajnejn u sabiex jiġi stabbilit jekk għandhomx isiru studji addizzjonali, apparti minn studji in vivo fuq l-għajnejn, sabiex jgħinu fil-karatterizzazzjoni tat-tali potenzjal. Meta jkunu meħtieġa aktar studji, huwa rakkommandat li tintuża l-istrateġija ta' ttestjar sekwenzali sabiex tiġi żviluppata d-dejta sperimentali rilevanti. Għal sustanzi li ma jkollhom l-ebda storja ta' ttestjar, għandha tintuża l-istrateġija ta' ttestjar sekwenzali sabiex tiġi żviluppata d-dejta meħtieġa għall-evalwazzjoni tal-korrużjoni/irritazzjoni tagħhom għall-għajnejn. L-istrateġija ta' ttestjar inizjali deskritta f'dan is-Suppliment ġiet żviluppata f'sessjoni ta' ħidma tal-OECD (1). Imbagħad kompliet tiġi kkonfermata u elaborata fis-Sistema ta' Klassifikazzjoni Integrata Armonizzata għall-Effetti fuq is-Saħħa tal-Bniedem u l-Ambjent tas-Sustanzi Kimiċi, kif approvata mit-28 Laqgħa Konġunta tal-Kumitat dwar is-Sustanzi Kimiċi u l-Grupp ta' Ħidma dwar is-Sustanzi Kimiċi, f'Novembru 1998 (2), u aġġornata minn grupp ta' esperti tal-OECD fl-2011.
                     Għad li din l-istrateġija ta' ttestjar mhijiex parti integrata mill-metodu ta' ttestjar B.5, tesprimi l-approċċ rakkomandat għad-determinazzjoni tal-proprjetajiet ta' irritazzjoni/korrużjoni tal-għajnejn. Dan l-approċċ jirrappreżenta kemm l-aħjar prattika kif ukoll il-parametru referenzjarju etiku għall-ittestjar in vivo għall-irritazzjoni/korrużjoni tal-għajn. Il-metodu ta' ttestjar jipprovdi gwida għat-twettieq tat-test in vivo u jiġbor fih il-fatturi li għandhom ikunu indirizzati qabel ma jkun ikkunsidrat tali test. L-istrateġija ta' ttestjar sekwenzali tipprovdi approċċ tal-piż tal-evidenza għall-evalwazzjoni ta' dejta eżistenti dwar il-proprjetajiet ta' irritazzjoni/korrużjoni tal-għajnejn tas-sustanzi kimiċi u approċċ sekwenzjali għall-ġenerazzjoni tad-dejta rilevanti dwar sustanzi li dwarhom hemm bżonn li jsiru studji addizzjonali jew li dwarhom ma sar l-ebda studju. L-istrateġija l-ewwel tinkludi t-twettiq ta' testijiet in vitro jew ex vivo vvalidati u aċċettati u mbagħad ta' studji TM B.4 f'ċirkustanzi speċifiċi (3) (4).
                     
                        Deskrizzjoni tal-istrateġija ta' ttestjar gradwali
                     
                     Qabel ma jitwettqu t-testijiet bħala parti mill-istrateġija ta' ttestjar sekwenżjali (Figura), l-informazzjoni kollha disponibbli għandha tkun evalwata sabiex jiġi stabbilit hemmx bżonn li jsir ittestjar in vivo fuq l-għajnejn. Għalkemm tista' tinkiseb informazzjoni sinifikanti mill-evalwazzjoni ta' parametri singoli (eż. pH estrema), għandha tiġi vvalutata l-informazzjoni kollha eżistenti. Id-dejta rilevanti kollha dwar l-effetti tas-sustanza kimika inkwistjoni, u tal-analogi strutturali tagħha, għandha tiġi evalutata fit-teħid tad-deċiżjoni tal-piż tal-evidenza, u għandu jiġi ppreżentat ir-raġunar wara d-deċiżjoni. L-enfasi ewlenija għandha tinxteħet fuq dejta eżistenti dwar il-bniedem u l-annimali rigward is-sustanza kimika, segwita mill-eżitu tal-ittestjar in vitro jew ex vivo. Studji in vivo ta' sustanzi kimiċi korrużivi għandhom ikunu evitati, kull meta dan ikun possibbli. Il-fatturi meqjusa għall-istrateġija tat-testijiet jinkludu:
                     
                                  
                              
                              
                                 Evalwazzjoni tad-dejta eżistenti dwar il-bniedem u/jew l-annimali u/jew dejta in vitro minn metodi aċċettati internazzjonalment u vvalidati (Stadju 1).
                                 L-ewwel għandha tiġi kkunsidrata dejta eżistenti dwar il-biedem, eż. studji kliniċi u okkupazzjonali, u rapporti ta' każijiet, u/jew dejta dwar testijiet fuq l-animali minn studji okulari u/jew dejta in vitro minn metodi aċċettati internazzjonalment u vvalidati għall-irritazzjoni/korrużjoni tal-għajnejn, għaliex din tipprovdi informazzjoni marbuta b'mod dirett mal-effetti fuq l-għajnejn. Wara, għandha tiġi evalwata d-dejta disponibbli minn studji fuq il-bniedem u/jew l-annimali li fihom tiġi investigata l-korrużjoni/irritazzjoni dermali, u/jew studji in vitro minn metodi aċċettati internazzjonalment u vvalidati għall-korrużjoni tal-ġilda. Sustanzi kimiċi b'korrużjoni jew irritazzjoni severa magħrufa, fuq l-għajnejn, m'għandhomx ikunu instillati fuq l-għajnejn tal-annimali, u l-anqas sustanzi kimiċi li juru effetti irritanti korrużivi jew severi fuq il-ġilda; dawn is-sustanzi kimiċi għandhom jitqiesu li huma korrużivi u/jew irritanti għall-għajnejn ukoll. Sustanzi kimiċi b'biżżejjed evidenza ta' nuqqas ta' korrużjoni u irritazzjoni minn studji okulari mwettqin fl-imgħoddi ma għandhomx jiġu ttestjati fi studji in vivo fuq l-għajnejn ukoll.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Analiżi tar-relazzjonijiet struttura-attività (SAR) (Stadju 2).
                                 Ir-riżultati tat-testijiet fuq sustanzi kimiċi strutturalment relatati għandhom ikunu ikkunsidrati, jekk disponibbli. Meta jkun hemm biżżejjed dejta dwar il-bniedem u/jew l-annimali fuq sustanzi relatati strutturalment jew taħlitiet tat-tali sustanzi li tindika l-potenzjal ta' korrużjoni/irritazzjoni tagħhom għall-għajnejn, jista' jiġi supponut li s-sustanza kimika tat-test sejra tipproduċi l-istess risponsi. F'dawk il-każijiet, is-sustanza kimika jaf ma jkollhiex bżonn tiġi ttestjata. Dejta negattiva mill-istudji fuq sustanzi strutturalment relatati jew taħlitiet ta' tali sustanzi ma tkunx tikkostitwixxi evidenża suffiċjenti ta' nuqqas ta' korrużjoni/irritazzjoni ta' sustanza kimika permezz tal-istrateġija ta' ttestjar sekwenzjali. Għandhom jintużaw approċċi SAR vvalidati u aċċettati sabiex jiġi identifikat il-potenzjal ta' korrużjoni u irritazzjoni għal effetti dermali u dawk okulari.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Propjetajiet fiżikokimiċi u r-reattività kimika (Stadju 3).
                                 Sustanzi kimiċi li jesibixxu pH estremi bħal ≤ 2.0 jew ≥ 11.5 jista' jkollhom effetti lokali qawwija. Jekk il-pH estrema hija l-bażi għall-identifikazzjoni ta' sustanza kimika bħala korrużiva jew irritanti għall-għajnejn, allura r-riserva aċida/alkalina tagħha (il-kapaċità mewwieta) tista' tkun ikkunsidrata wkoll (5)(6)(7). Jekk il-kapaċità mewwieta tissuġġerixxi li sustanza kimika jaf ma tkunx korrużiva għall-għajnejn (jiġifieri sustanzi kimiċi b'pH estrema u riserva aċida/alkalina baxxa), għandhom isiru iktar testijiet sabiex dan jiġi kkonfermat, idealment billi jintuża test in vitro jew ex vivo vvalidat u aċċettat (ara l-paragrafu 10).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Kunsiderazzjoni ta' informazzjoni eżistenti oħra (Stadju 4).
                                 L-informazzjoni disponibbli kollha dwar it-tossiċità sistemika permezz tar-rotta dermali għandha tkun evalutata f'dan l-istadju. It-tossiċità dermali akuta tas-sustanza kimika tat-test għandha tkun ikkunsidrata wkoll. Jekk ikun intwera li s-sustanza kimika tat-test hija ferm tossika bir-rotta dermali, jaf ma jkunx hemm bżonn li tkun ittestjata fl-għajnejn. Għalkemm mhux bilfors li jkun hemm relazzjoni bejn it-tossiċità akuta dermali u l-irritazzjoni/korrużjoni tal-għajnejn, jista' jkun supponut li jekk aġent ikun ferm tossiku permezz tar-rotta dermali, dan ikun jesibixxi wkoll tossiċità għolja meta jkun instillat fl-għajnejn. Tali dejta tista' tkun ikkunsidrata wkoll bejn l-Istadji 2 u 3.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Valutazzjoni tal-korrużjoni dermali tas-sustanza kimika jekk tkun meħtieġa għal finijiet regolatorji wkoll (Stadju 5).
                                 Il-potenzjal ta' korrużjoni u irritazzjoni severa tal-ġilda għandu jiġi evalwat l-ewwel skont il-metodu ta' ttestjar B.4 (4) u s-Suppliment li jakkumpanjah (8), inkluż l-użu ta' metodi ta' ttestjar dwar il-korrużjoni tal-ġilda in vitro aċċettati internazzjonalment u vvalidati (9) (10) (11). Jekk jintwera li s-sustanza kimika tipproduċi korrużjoni jew irritazzjoni serja tal-ġilda, tista' tiġi kkunsidrata wkoll li hija korrużiva jew irritanti b'mod sever għall-għajnejn. B'hekk, ma jkun meħtieġ li jsir ebda test ulterjuri. Jekk is-sustanza kimika ma tkunx korrużiva jew severament irritanti għall-ġilda, għandu jsir test in vitro jew ex vivo fuq l-għajnejn.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Ir-riżultati mit-testijiet in vitro jew ex vivo (Stadju 6).
                                 Is-sustanzi kimiċi li jkunu wrew proprjetajiet korrużivi jew irritanti severi f'test in vitro jew ex vivo (12) (13) li jkun ġie vvalidat u aċċettat internazzjonalment għall-valutazzjoni speċifika tal-korrużjoni/irritazzjoni tal-għajnejn, ma għandhomx bżonn jiġu ttestjati fl-annimali. Jista' jkun supponut li tali sustanzi kimiċi jipproduċu l-istess effetti severi in vivo. Jekk ma jkunx hemm testijiet in vitro/ex vivo vvalidati u aċċettati disponibbli, wieħed għandu jaqbeż l-Istadju 6 u jmur direttament għall-Istadju 7.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Test in vivo fuq il-fniek (Stadji 7 u 8):
                                 L-ittestjar okulari in vivo għandu jibda b'test inizjali li juża annimal wieħed. Jekk ir-riżultati ta' dan it-test jindikaw li s-sustanza kimika tkun severament irritanti jew korrużiva għall-għajnejn, ma għandux isir iktar ittestjar. Jekk dak it-test ma jiżvelax effetti korrużivi jew irritanti severi, isir test konfermatorju b'żewġ annimali oħrajn. Skont ir-riżultati tat-test konfermatorju, jaf ikun hemm bżonn ta' iktar testijiet. [ara l-metodu ta' ttestjar B.5]
                              
                           
                        STRATEĠIJA GĦALL-ITTESTJAR U L-EVELWAZZJONI TA' IRRITAZZJONI/KORRUŻJONI TAL-GĦAJNEJN
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Attività
                                 
                              
                              
                                 
                                    Sejba
                                 
                              
                              
                                 
                                    Konklużjoni
                                 
                              
                           
                                 
                                    1
                                 
                              
                              
                                 Dejta eżistenti dwar il-bniedem u/jew l-annimali, u/jew dejta in vitro minn metodi aċċettati internazzjonalment u vvalidati li juru l-effetti fuq l-għajnejn
                              
                              
                                 Ħsara severa għall-għajnejn
                              
                              
                                 Punt finali apikali; ikkunsidra korrużjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn tal-ebda test.
                              
                           
                                 Irritazzjoni għall-għajnejn
                              
                              
                                 Punt finali apikali; ikkunsidra irritazzjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn tal-ebda test.
                              
                           
                                 Ma hemmx korrużjoni/ma hemmx irritazzjoni għall-għajnejn
                              
                              
                                 Punt finali apikali; ikkunsidra li ma hemmx korrużjoni u ma hemmx irritazzjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn tal-ebda test.
                              
                           
                                 Dejta eżistenti dwar il-bniedem u/jew l-annimali, u/jew dejta in vitro minn metodi aċċettati internazzjonalment u vvalidati li juru l-effetti korrużivi fuq il-ġilda
                              
                              
                                 Korrużjoni għall-ġilda
                              
                              
                                 Assumi korrużjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn tal-ebda test.
                              
                           
                                 Dejta eżistenti dwar il-bniedem u/jew l-annimali, u/jew dejta in vitro minn metodi aċċettati internazzjonalment u vvalidati li juru l-effetti irritanti severi fuq il-ġilda
                              
                              
                                 Irritazzjoni severa għall-ġilda
                              
                              
                                 Assumi irritazzjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn tal-ebda test
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    ebda informazzjoni disponibbli, jew l-informazzjoni disponibbli mhijiex konklużiva
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    2
                                 
                              
                              
                                 Agħmel SAR għall-korrużjoni/irritazzjoni tal-għajnejn
                              
                              
                                 Hija mbassra ħsara severa għall-għajnejn
                              
                              
                                 Assumi korrużjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn tal-ebda test.
                              
                           
                                 Hija mbassra irritazzjoni għall-għajnejn
                              
                              
                                 Assumi irritazzjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn tal-ebda test.
                              
                           
                                 Ikkunsidra SAR għall-korrużjoni tal-ġilda
                              
                              
                                 Hija mbassra korrużjoni għall-ġilda
                              
                              
                                 Assumi korrużjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn tal-ebda test.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Ma tista' ssir ebda previżjoni, jew il-previżjonijlet mhumiex konklużivi jew huma negattivi
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    3
                                 
                              
                              
                                 Kejjel il-pH (kapaċità mewwieta, jekk rilevanti)
                              
                              
                                 pH ≤ jew ≥ 11,5 (b'kapaċità mewwieta għolja, jekk rilevanti)
                              
                              
                                 Assumi korrużjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn tal-ebda test.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    2 < H < 11,5, jew pH ≤ 2,0 jew ≥11,5 b'kapaċità mewwieta baxxa/b'ebda kapaċità mewwieta, jekk rilevanti
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    4
                                 
                              
                              
                                 Ikkunsidra d-dejta eżistenti dwar it-tossiċità sistemika permezz tar-rotta dermali
                              
                              
                                 Tossiċità għolja f'konċentrazzjonijiet li jkunu ttestjati fuq l-għajn.
                              
                              
                                 Is-sustanza kimika tkun tossika wisq sabiex tiġi ttestjata. Ma hemm bżonn tal-ebda test.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Tali informazzjoni mhijiex disponibbli, jew is-sustanza kimika mhijiex tossika ħafna
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    5
                                 
                              
                              
                                 Ivvaluta l-potenzjal ta' korrużjoni tal-ġilda b'esperimenti skont l-istrateġija ta' ttestjar fil-kapitolu B.4 ta' dan l-Anness jekk ikun hemm bżonn li jsir hekk għal finijiet regolatorji wkoll
                              
                              
                                 Rispons korrużiv jew irritanti severament
                              
                              
                                 Assumi korrużjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn li jsir ebda test ieħor.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Is-sustanza kimika mhijiex korrużiva jew severament irritanti għall-ġilda
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    6
                                 
                              
                              
                                 Agħmel test(ijiet) okulari in vitro jew ex vivo vvalidat(i) u aċċettat(i)
                              
                              
                                 Rispons korrużiv jew irritanti severament
                              
                              
                                 Assumi korrużjoni jew irritazzjoni severa għall-għajnejn, diment li t-test imwettaq jista' jintuża sabiex jidentifika korrużivi/irritanti severi u s-sustanza kimika tkun fi ħdan id-dominju tal-applikabilità tat-test. Ma hemm bżonn li jsir ebda test ieħor.
                              
                           
                                 Rispons irritanti
                              
                              
                                 Assumi irritazzjoni għall-għajnejn, diment li t-test(ijiet) imwettaq jista' jintuża sabiex jidentifika kif suppost korrużivi/irritanti severi u irritanti, u s-sustanza kimika hija fi ħdan id-dominju tal-applikabilità tat-test(ijiet). Ma hemm bżonn li jsir ebda test ieħor.
                              
                           
                                 Rispons mhux irritanti
                              
                              
                                 Assumi li ma hemmx irritazzjoni għall-għajnejn, diment li t-test(ijiet) imwettaq jista' jintuża sabiex jidentifika kif suppost mhux irritanti, jagħmel distinzjoni kif suppost ta' dawn minn sustanzi kimiċi li huma irritanti, irritanti severi, jew korrużivi okulari, u s-sustanza kimika hija fi ħdan id-dominju tal-applikabilità tat-test. Ma hemm bżonn li jsir ebda test ieħor.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Test(ijiet) in vitro jew ex vivo vvalidat(i) u aċċettat(i) ma jistgħux jintużaw sabiex tintlaħaq konklużjoni
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    7
                                 
                              
                              
                                 Agħmel test inizjali tal-għajnejn in vivo fuq il-fniek billi tuża annimal wieħed
                              
                              
                                 Ħsara severa għall-għajnejn
                              
                              
                                 Ikkunsidra korrużjoni lill-għajnejn. Ma hemm bżonn li jsir ebda test ieħor.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    L-ebda ħsara severa, jew l-ebda rispons
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    8
                                 
                              
                              
                                 Agħmel test konfermatorju billi tuża annimal addizzjonali wieħed jew tnejn
                              
                              
                                 Korrużjoni jew irritazzjoni
                              
                              
                                 Ikkunsidra korrużjoni jew irritazzjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn li jsir ebda test ieħor.
                              
                           
                                 Ma hemmx korrużjoni jew irritazzjoni
                              
                              
                                 Ikkunsidra li ma hemmx irritazzjoni u ma hemmx korrużjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn li jsir ebda test ieħor.
                              
                           TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Li sar f'Solna, l-Iżvezja, 22 — 24 ta' Jannar 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Kapitolu B.4 ta' dan l-Anness, Irritazzjoni/Korrużjoni Dermali Akuta.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 — 26.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in vitro 12, pp.483 — 524.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Neun, D.J. (1993), Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH, J. Toxicol. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 — 231.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Suppliment għall-Kapitolu B.4 ta' dan l-Anness, Strateġija ta' Ttestjar Sekwenzjali għall-Irritazzjoni u l-Korrużjoni tal-Ġilda.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu B.40 ta' dan l-Anness, Korrużjoni tal-Ġilda In Vitro: Test tar-Reżistenza Elettrika Transkutanja (TER).
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Kapitolu B.40bis of this Annex, Korrużjoni tal-Ġilda In Vitro: Test Mudell tal-Ġilda tal-Bniedem.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu B.47 ta' dan l-Anness, Metodu ta' Ttestjar tal-Opaċità u l-Permeabilità tal-Kornea fil-Bovini għall-Identifikazzjoni ta' i) Sustanzi Kimiċi li Jinduċu Ħsara Serja lill-Għajnejn u ii) Sustanzi Kimiċi li ma Jeħtiġux Klassifikazzjoni għal Irritazzjoni tal-Għajnejn jew Ħsara Serja lill-Għajnejn.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Kapitolu B.48 ta' dan l-Anness, Metodu ta' Ttestjar tal-Għajnejn tat-Tiġieġ Iżolati għall-Identifikazzjoni ta' i) Sustanzi Kimiċi li Jinduċu Ħsara Serja lill-Għajnejn u ii) Sustanzi Kimiċi li ma Jeħtiġux Klassifikazzjoni għal Irritazzjoni tal-Għajnejn jew Ħsara Serja lill-Għajnejn.”
                              
                           
               
                     (3)
                  
                  
                     Fil-Parti B, il-Kapitolu B.10 huwa sostitwit b'dan li ġej:
                     “B.10   Test In Vitro Ta' Aberrazzjoni Kromożomika Fil-Mammiferi
                     
                     INTRODUZZJONI
                     Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test 473 (2016) tal-OECD Huwa parti minn sensiela ta' metodi ta' ttestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika. Ġie żviluppat dokument tal-OECD li jipprovdi informazzjoni sintetika dwar l-ittestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika u ħarsa ġenerali dwar it-tibdil reċenti la sar f'dawk il-Linji Gwida tat-Test (1).
                     L-iskop tat-test in vitro ta' aberrazzjoni kromożomika huwa li jidentifika s-sustanzi kimiċi li jikkawżaw aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali f'kulturi ta' ċelloli tal-mammiferi (2) (3) (4). L-aberrazzjonijiet strutturali jistgħu jkunu ta' żewġ tipi, kromożomiċi jew kromatidi. Tista' sseħħ piloplojdija (inkluża endoreduplikazzjoni) f'assaġġi tal-aberrazzjoni kromożomika in vitro. Filwaqt li l-anewġeni jistgħu jinduċu l-poliplojdija, il-poliplojdija waħedha ma tindikax potenzjal anewġeniku u tista' tindika sempliċi perturbazzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelloli jew ċitotossiċità (5). It-test mhuwiex imfassal sabiex ikejjel l-anewplojdija. Sabiex jiġi verifikat hemmx anewplojdija, ikun rakkomandat test in vitro tal-mikronukleu (6).
                     It-test in vitro ta' aberrazzjoni kromożomika jista' juża kulturi ta' linji ta' ċelloli stabbiliti jew kulturi ta' ċelloli primarji ta' oriġini mill-bniedem jew minn rodituri. Iċ-ċelloli użati għandhom jintgħażlu fuq il-bażi tal-abilità ta' tkabbir fil-kultura, l-istabilità tal-karjotip (inkluż in-numru ta' kromożomi) u l-frekwenza spontanja tal-aberrazzjonijiet kromożomiċi (7). Bħalissa, id-dejta disponibbli ma tippermettix li jinħarġu rakkomandazzjonijiet assoluti iżda tissuġġerixxi li, meta jiġu evalwati l-perikli kimiċi, huwa importanti li jiġu kkunsidrati l-istatus p53, l-istabilità ġenetika (karjotip), il-kapaċità ta' tiswija tad-DNA u l-oriġini (minn rodituri jew mill-bniedem) taċ-ċelloli magħżulin għall-ittestjar. Għalhekk, dawk li jużaw dan il-metodu ta' ttestjar huma mħeġġin jikkunsidraw l-influwenza ta' dawn il-karatteristiċi u karatteristiċi oħrajn taċ-ċelloli fuq il-prestazzjoni ta' linja ta' ċelloli fis-sejbien tal-induzzjoni ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi, peress li l-għarfien dejjem qiegħed jiżdied f'dan il-qasam.
                     Id-definizzjonijiet użati huma pprovduti fl-Appendiċi 1.
                     KUNSIDERAZZJONIJIET U LIMITAZZJONIJIET INIZJALI
                     It-testijiet li jsiru in vitro ġeneralment jirrekjedu l-użu ta' sors eżoġeniku ta' attivazzjoni metabolika sakemm iċ-ċelloli ma jkunux metabolikament kompetenti fir-rigward tas-sustanzi kimiċi tat-test. Is-sistema eżoġena ta' attivazzjoni metabolika ma timitax għalkollox il-kundizzjonijiet in vivo. Wieħed għandu joqgħod attent li jevita kundizzjonijiet li jistgħu jwasslu għal riżultati pożittivi artifiċjali, jiġifieri ħsara fil-kromożomi mhux ikkaġunata minn interazzjoni diretta bejn is-sustanzi kimiċi tat-test u l-kromożomi; tali kundizzjonijiet jinkludu bidliet fil-pH jew l-ożmolalità (8) (9) (10), interazzjoni ma' komponenti medji (11) (12) jew livelli eċċessivi ta' ċitotossiċità (13) (14) (15) (16).
                     Dan it-test jintuża sabiex jaqbad aberrazzjonijiet kromożomiċi li jistgħu jirriżultaw minn avvenimenti klastoġeniċi. L-analiżi ta' induzzjoni ta' aberrazzjoni kromożomika għandha ssir bl-użu ta' ċelloli fil-metafażi. Għalhekk, huwa essenzjali li ċ-ċelloli għandhom jiksbu l-mitożi kemm f'kulturi ttrattati kif ukoll f'dawk mhux ittrattati. Għal nanomaterjali manifatturati, jaf ikun hemm bżonn li jsiru adattamenti speċifiċi ta' dan il-metodu ta' ttestjar li ma jkunux deskritti fih.
                     Qabel ma jintuża dan il-metodu ta' ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta' dejta għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet ma jkunux meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita.
                     IL-PRINĊIPJU TAT-TEST
                     Il-kulturi ta' ċelloli ta' oriġini umana jew minn mammiferi oħrajn huma esposti għas-sustanza kimika tat-test kemm b'sors eżoġenu ta' attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajr dan is-sors sakemm ma jintużawx ċelloli b'kapaċità metabolizzanti adegwata (ara l-paragrafu 13). F'intervalli prestabbiliti kif xieraq wara li l-kulturi ta' ċelloli jibdew jiġu esposti għas-sustanza kimika tat-test, dawn jiġu ttrattati b'inibitur tal-metafażi (eż. kolċemid jew kolċisina), miġbur u mlewwen, u ċ-ċelloli tal-metafażi jiġu analizzati bil-mikroskopju għall-preżenza ta' aberrazzjonijiet tat-tip kromatid u tat-tip kromożomiku
                     DESKRIZZJONI TAL-METODU
                     
                        Preparamenti
                     
                     
                        Ċelloli
                     
                     Tista' tintuża firxa ta' linji ta' ċelloli (eż. Ovarji tal-Hamster Ċiniż (CHO), pulmun tal-Hamster Ċiniż V79, Pulmun tal-Hamster Ċiniż (CHL)/IU, TK6) jew kulturi ta' ċelloli primarji, inklużi linfoċiti periferiċi tad-demm tal-bniedem jew ta' mammiferi oħrajn (7). L-għażla tal-linji ta' ċelloli għandha tkun iġġustifikata xjentifikament. Meta jintużaw ċelloli prmiarji, għal raġunijiet ta' trattament xieraq tal-annimali, għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' ċelloli primarji ta' oriġini umana meta dan ikun fattibbli u dawn għandhom jiġu kampjunati skont il-prinċipji u r-regolamenti etiċi umani. Il-linfoċiti periferiċi tad-demm tal-bniedem għandhom jinkisbu mingħand individwi żgħażagħ (madwar 18-35 sena) li ma jpejpux u li ma għandhom ebda marda magħrufa jew li ma kinux esposti riċentement għal aġenti ġenotossiċi (eż. sustanzi kimiċi, radjazzjonijiet jonizzanti) f'livelli li jżidu l-inċidenza ta' sfond ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi. Dan jiżgura li l-inċidenza ta' sfond ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi tibqa' baxxa u konsistenti. L-inċidenza bażi tal-aberrazzjonijiet kromożomiċi tiżdied mal-età, u din it-tendenza hija iktar evidenti fin-nisa milli fl-irġiel (17) (18). Jekk jinġabru flimkien ċelloli mingħand iktar minn donatur wieħed, għandu jiġi speċifikat l-għadd ta' donaturi. Hemm bżonn li jintwera li ċ-ċelloli nqasmu sa mill-bidu nett tat-trattament bis-sustanza kimika tat-test sal-kampjunar taċ-ċelloli. Il-kulturi taċ-ċelloli jinżammu f'fażi ta' tkabbir taċ-ċelloli esponenzjali (linji ta' ċelloli) jew jiġu stimolati sabiex jinqasmu (kulturi primarji ta' linfoċiti), sabiex jesponu ċ-ċelloli fi stadji differenti taċ-ċiklu taċ-ċelloli, peress li jaf ma tkunx magħrufa s-sensittività tal-istadji taċ-ċelloli għas-sustanzi kimiċi. Iċ-ċelloli primarji li jeħtieġu stimolazzjoni b'aġenti mitoġeniċi sabiex jinqasmu ġeneralment ma jibqgħux sinkronizzati matul l-esponiment għas-sustanza kimika tat-test (eż. linfoċiti umani wara stimolazzjoni mitoġenika ta' 48 siegħa). L-użu ta' ċelloli sinkronizzati matul it-trattament mhuwiex rakkomandat, iżda jista' jkun aċċettabbli jekk ikun iġġustifikat.
                     
                        Il-kundizzjonijiet tal-media tal-kultura
                     
                     Għandhom jintużaw kundizzjonijiet xierqa tal-media tal-kultura u tal-inkubazzjoni (reċipjenti tal-kultura, atmosfera umidifikata ta' 5 % CO2 jekk xieraq, temperatura ta' inkubazzjoni ta' 37 °C) għaż-żamma tal-kulturi. Il-linji ta' ċelloli għandhom jiġu verifikati b'mod regolari għall-istabilità tal-għadd ta' kromożomi modali u l-assenza ta' kontaminazzjoni tal-Mikoplażma (7) (19), u ċ-ċelloli ma għandhomx jintużaw jekk ikunu kontaminati jew jekk jinbidel l-għadd ta' kromożomi modali. It-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli tal-linji ta' ċelloli jew il-kulturi prmiarji użati fil-laboratorju tat-testijiet għandu jkun stabbilit u konsistenti mal-karatteristiċi taċ-ċelloli ppubblikati (20).
                     
                        Preparazzjoni tal-kulturi
                     
                     Linji ta' ċelloli: iċ-ċelloli huma propagati minn kulturi omm, imqegħdin fil-medium tal-kultura f'densità b'tali mod li ċ-ċelloli f'sospensjonijiet jew f'monosaffi jibqgħu jikbru b'mod esponenzjali sal-ħin tal-ġbir (eż. għandha tiġi evitata konfluwenza għal ċelloli li jikbru f'monosaffi).
                     Linfoċiti: demm sħiħ ittrattat b'antikoagulant (eż. eparina) jew linfoċiti separati jiġu kulturati (eż. għal 48 siegħa għal linfoċiti umani) fil-preżenza ta' mitoġenu [eż. fitoemagglutinina (PHA) għal linfoċiti umani] sabiex tiġi indotta diviżjoni taċ-ċelloli qabel l-esponiment għas-sustanza kimika tat-test.
                     
                        Attivazzjoni metabolika
                     
                     Għandhom jintużaw sistemi metabolizzanti eżoġeni meta jintużaw ċelloli b'kapaċità metabolika endoġena inadegwata. L-iktar sistema użata spiss li hija l-ewwel rakkomandata, sakemm ma jkunx stipulat b'mod ieħor, hija frazzjoni postmitokondrijali ssupplimentata minn kofatturi (S9) imħejjija mill-fwied ta' rodituri (ġeneralment firien) ittrattati b'indutturi enzimatiċi bħal Aroclor 1254 (21) (22) (23) jew taħlita ta' fenobarbital u β-naftoflavon (24) (25) (26) (27) (28) (29). Din it-taħlita msemmija l-aħħar ma tmurx kontra l-Konvenzjoni ta' Stokkolma dwar Materjal Organiku Persistenti li Jniġġes (30) u ntwera li hija effettiva daqs Aroclor 1254 għall-induzzjoni ta' ossidażijiet b'funzjoni mħallta (24) (25) (26) (28). Il-frazzjoni S9 normalment tintuża f'konċentrazzjonijiet li jvarjaw minn 1 sa 2 % (v/v) iżda tista' tiżdied sa 10 % (v/v) fil-medium tat-test finali. L-użu ta' prodotti li jnaqqsu l-indiċi mitotiku, speċjalment prodotti ta' kumplessazzjoni tal-kalċju (31) għandu jiġi evitat matul it-trattament. L-għażla tat-tip u l-konċentrazzjoni ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika eżoġena jew induttur metaboliku użati tista' tkun influwenzata mill-klassi tas-sustanzi kimiċi li jiġu ttestjati.
                     
                        Preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test
                     
                     Is-sustanzi kimiċi solidi tat-test għandhom jiġu ppreparati f'solventi xierqa u jiġu dilwiti, jekk dan ikun xieraq, qabel it-trattament taċ-ċelloli (ara l-paragrafu 23). Is-sustanzi kimiċi likwidi tat-test jistgħu jiżdiedu direttament mas-sistema tat-test u/jew jiġu dilwiti qabel it-trattament tas-sistema tat-test. Is-sustanzi kimiċi gassużi jew volatili tat-test għandhom jiġu ttestjati b'modifiki xierqa fil-protokolli standard, bħat-trattament f'reċipjenti tal-kultura ssiġillati (32) (33) (34). Il-preparamenti tas-sustanza kimika tat-test għandhom isiru eżatt qabel it-trattament, sakemm id-dejta dwar l-istabilità ma turix l-aċċettabilità tal-ħżin.
                     
                        Kundizzjonijiet tat-test
                     
                     
                        Solventi
                     
                     Is-solvent għandu jingħażel sabiex tiġi ottimizzata s-solubilità tas-sustanza kimika tat-test mingħajr ma jitħalla impatt avvers fuq it-twettiq tal-assaġġ, eż. bidla fit-tkabbir taċ-ċelloli, effett fuq l-integrità tas-sustanza kimika tat-test, reazzjoni ma' reċipjenti tal-kultura, indeboliment tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika. Huwa rakkomandat li, kull meta dan ikun possibbli, l-ewwel għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent milwiem (jew medium tal-kultura). Pereżempju, fost is-solventi ferm stabbiliti hemm l-ilma jew is-sulfossidu tad-dimetil. Ġeneralment, is-solventi organiċi ma għandhomx jaqbżu l-1 % (v/v) u s-solventi milwiema (salina jew ilma) ma għandhomx jaqbżu l-10 % (v/v) fil-medium tat-trattament finali. Jekk jintużaw solventi mhux ferm stabbiliti (eż. etanol jew aċeton), l-użu tagħhom għandu jkun sostnut minn dejta li tindika l-kompatibilità tagħhom mas-sustanzi kimiċi tat-test, is-sistema tat-test u n-nuqqas tagħhom ta' tossiċità ġenetika fil-konċentrazzjoni użata. Fin-nuqqas ta' dik id-dejta ta' sostenn, importanti li jiġu inklużi kontrolli mhux ittrattati (ara l-Appendiċi 1) sabiex jintwera li s-solvent magħżul ma jinduċi ebda effett dannuż jew klastoġeniku.
                     
                        Il-kejl tal-proliferazzjoni taċ-ċelloli u ċ-ċitotossiċità u l-għażla tal-konċentrazzjonijiet tat-trattament
                     
                     Meta wieħed jistabbilixxi l-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test, għandhom jiġu evitati konċentrazzjonijiet li għandhom il-kapaċità li jipproduċu rispons pożittiv artefattwali, bħal dawk li jipproduċu ċitotossiċità eċċessiva (ara l-paragrafu 22), il-preċipitazzjoni fil-medium tal-kultura (ara l-paragrafu 23), jew bidliet ċari fil-pH jew ożmolalità (ara l-paragrafu 5). Jekk is-sustanza kimika tat-test tikkaġuna bidla ċara fil-pH tal-medium fi żmien iż-żieda, il-pH tista' tiġi aġġustata bl-ibbaferjar tal-medium tat-trattament finali sabiex jiġu evitati riżultati pożittivi artifattwali u sabiex jinżammu l-kundizzjonijiet xierqa tal-kultura.
                     Il-kejliet tal-proliferazzjoni taċ-ċelloli jsiru sabiex ikun żgurat li biżżejjed ċelloli ttrattati jkunu jilħqu l-fażi tal-mitożi waqt it-test u li t-trattamenti jsiru fil-livelli xierqa ta' ċitotossiċità (ara l-paragrafi 18 u 22). Iċ-ċitotossiċità għandha tiġi stabbilita b'attivazzjoni metabolika u mingħajr fl-esperiment ewlieni bl-użu ta' indikazzjoni xierqa ta' mewt u tkabbir taċ-ċelloli. Filwaqt li l-evalwazzjoni taċ-ċitotossiċità f'test inizjali tista' tkun siewja sabiex jiġu definiti aħjar il-konċentrazzjonijiet li sejrin jintużaw fl-esperiment ewlieni, test inizjali mhuwiex obbligatorju. Jekk isir, ma għandux isir minflok il-kejl taċ-ċitotossiċità fl-esperiment ewlieni.
                     L-Irduppjar Relattiv tal-Popolazzjoni (RPD) jew iż-Żieda Relattiva fl-Għadd taċ-Ċelloli (RICC) huma metodi xierqa għall-valutazzjoni taċ-ċitotossiċità f'testijiet ċitoġenetiċi (13) (15) (35) (36) (55) (ara l-Appendiċi 2 għall-formuli). Fil-każ ta' trattament fit-tul u ħinijiet tal-kampjunar wara l-bidu tat-trattament li jkunu itwal minn darba u nofs it-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli normali (jiġifieri itwal minn 3 darbiet it-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli b'kollox), l-RPD jista' jissottovaluta ċ-ċitotossiċità (37). F'dawn iċ-ċirkustanzi, l-RICC tista' tipprovdi kejl aħjar jew inkella l-evalwazzjoni taċ-ċitotossiċità wara darba u nofs it-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli normali tkun stima siewja bl-użu tal-RPD.
                     Għal linfoċiti f'kulturi primarji, filwaqt li l-indiċi mitotiku (MI) huwa kejl tal-effetti ċitotossiċi/ċitostatiċi, huwa influwenzat mill-ħin li jitkejjel fih wara t-trattament, il-mitoġenu użat u t-tkissir taċ-ċiklu ċellulari possibbli. Madankollu, l-MI huwa aċċettabbli għaliex kejliet oħrajn taċ-ċitotossiċità jistgħu jkunu diffiċli u imprattiċi u jaf ma jkunux japplikaw għall-popolazzjoni fil-mira ta' linfoċiti li jikbru bħala tweġiba għall-istimolazzjoni tal-PHA.
                     Filwaqt li l-RICC u l-RPD għal-linji ta' ċelloli u l-MI għall-kultura primarja ta' linfoċiti huma l-parametri rakkomandati taċ-ċitotossiċità, indikaturi oħrajn (eż. l-integrità taċ-ċelloli, l-apoptożi, in-nekrożi, iċ-ċiklu taċ-ċelloli) jistgħu jipprovdu informazzjoni addizzjonali siewja.
                     Għandhom jiġu evalwati tal-inqas tliet konċentrazzjonijiet tat-test (mhux inklużi l-kontroll tas-solvent u pożittivi) li jissodisfaw il-kriterji ta' aċċettabilità (iċ-ċitotossiċità xierqa, in-numru ta' ċelloli, eċċ.). Ikun xi jkun it-tip taċ-ċelloli (linji ta' ċelloli jew kulturi primarji ta' linfoċiti), jistgħu jintużaw kulturi rreplikati jew kulturi uniċi ttrattati f'kull konċentrazzjoni ttestjata. Filwaqt li l-użu ta' kulturi duplikati huwa rakkomandat, kulturi uniċi huma aċċettabbli wkoll diment li jingħata punteġġ lill-istess numru totali ta' ċelloli għal kulturi uniċi jew kulturi duplikati. L-użu ta' kulturi waħedhom huwa ta' rilevanza partikolari meta jiġu vvalutati iktar minn 3 konċentrazzjonijiet (ara l-paragrafu 31). Ir-riżultati miksubin fil-kulturi rreplikati indipendenti f'konċentrazzjoni partikolari jistgħu jinġabru flimkien għall-analiżi tad-dejta (38). Għal sustanzi kimiċi tat-test li juru tossiċità baxxa jew ebda tossiċità, intervalli tal-konċentrazzjoni ta' madwar id-doppju jew it-tripplu normalment ikunu xierqa. Meta sseħħ ċitotossiċità, il-konċentrazzjonijiet tat-test magħżulin għandhom ikopru firxa minn dik iċ-ċitotossiċità produttiva kif spjegat fil-paragrafu 22 u jinkludu konċentrazzjonijiet li fihom ikun hemm ċitotossiċità moderata u baxxa jew ebda ċitotossiċità. Ħafna sustanzi kimiċi tat-test juru kurvi konċentrazzjoni rispons wiqfin u, sabiex tinkiseb dejta f'ċitotossiċità baxxa u moderata jew sabiex tiġi studjata r-relazzjoni bejn id-doża u r-rispons f'dettall, sejjer ikun hemm bżonn li jintużaw konċentrazzjoni spazjati iktar qrib xulxin u/jew iktar minn tliet konċentrazzjonijiet (kulturi waħedhom jew repliki), speċjalment f'sitwazzjonijiet li fihom ikun hemm bżonn li jsir esperiment ripetut (ara l-paragrafu 47).
                     Jekk il-konċentrazzjoni massima tkun ibbażata fuq iċ-ċitotossiċità, l-ogħla konċentrazzjoni għandu jkollha l-għan li tikseb ċitotossiċità ta' 55 ± 5 % bl-użu tal-parametri rakkomandati dwar iċ-ċitotossiċità (jiġifieri tnaqqis fl-RICC u l-RPD għal linji ta' ċelloli u tnaqqis fl-MI għal kulturi primarji ta' linfoċiti għal 45± 5 % tal-kontroll negattiv parallel). Wieħed għandu joqgħod attent meta jinterpreta riżultati pożittivi li mbagħad jistgħu jinstabu li huma fil-parti superjuri ta' din il-firxa ta' ċitotossiċità ta' 55 ± 5 % (13).
                     Għal sustanzi kimiċi tat-test ftit li xejn solubbli li mhumiex ċitotossiċi f'konċentrazzjonijiet inqas mill-inqas konċentrazzjoni insolubbli, l-ogħla konċentrazzjoni analizzata għandha tipproduċi turbidità jew preċipitat viżibbli bl-għajnejn jew bl-għajnuna ta' mikroskopju invertit fi tmiem it-test bis-sustanza kimika tat-test. Anki jekk iċ-ċitotossiċità sseħħ f'livelli inqas mill-inqas konċentrazzjoni insolubbli, huwa rakkomandat li l-ittestjar isir f'konċentrazzjoni waħda biss li tipproduċi turbidità jew bi preċipitat viżibbli għaliex jistgħu jirriżultaw effetti artifattwali mill-preċipitat. Fil-konċentrazzjoni li tipproduċi preċipitat, għandha tingħata attenzjoni sabiex jiġi żgurat li l-preċipitat ma jxekkilx it-twettiq tat-test (eż. tilwin jew punteġġar). Id-determinazzjoni tas-solubilità fil-medium tal-kultura qabel l-esperiment tista' tkun utli.
                     Jekk ma jiġu osservati ebda preċipitat jew ċitotossiċità li tillimita, l-ogħla konċentrazzjoni tat-test għandha tkun tikkorrispondi għal 10 mM, 2 mg/ml jew 2 μl/ml, liema minnhom tkun l-inqas (39) (40) (41). Meta s-sustanza kimika tat-test ma jkollhiex kompożizzjoni definita, eż. sustanza b'kompożizzjoni mhux magħrufa jew varjabbli, il-prodotti ta' reazzjoni kumplessa jew il-materjal bijoloġiku (UVCB) (42), estratt ambjentali eċċ, il-konċentrazzjoni massima jaf trid tkun ogħla (eż. 5 mg/ml), fin-nuqqas ta' ċitotossiċità suffiċjenti, sabiex tiżdied il-konċentrazzjoni ta' kull wieħed mill-komponenti. Madankollu, ta' min jinnota li dawn ir-rekwiżiti jistgħu jvarjaw għall-prodotti farmaċewtiċi għall-bniedem (43).
                     
                        Kontrolli
                     
                     Għal kull ħin tal-ġbir għandhom ikunu inklużi kontrolli negattivi paralleli (ara l-paragrafu 15), li jikkonsistu f'solvent waħdu fil-medium tat-trattament u ttrattat bl-istess mod bħall-kulturi tat-trattament.
                     Kontrolli pożittivi paralleli huma meħtieġa sabiex juru l-ħila tal-laboratorju fl-identifikazzjoni ta' klastoġeni fil-kundizzjonijiet tal-protokoll tat-test użat u l-effikaċja tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika eżoġena, meta applikabbli. Fit-Tabella 1 ta' hawn taħt jingħataw xi eżempji ta' kontrolli pożittivi. Jistgħu jintużaw sustanzi kimiċi ta' kontroll pożittiv oħrajn, jekk ikunu ġġustifikati. Peress li t-testijiet in vitro taċ-ċelloli tal-mammiferi huma standardizzati biżżejjed, l-użu tal-kontrolli pożittivi jista' jkun limitat għal klastoġenu li jeħtieġ attivazzjoni metabolika. Diment li dan isir fl-istess ħin mat-test mhux attivat bl-użu tal-istess durata tat-trattament, ir-rispons tal-kontroll pożittiv uniku sejjer juri kemm l-attività tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika u kemm hija risponsiva s-sistema tat-test. Madankollu, trattament fit-tul (mingħajr S9) għandu jkollu l-kontroll pożittiv tiegħu stess peress li d-durata tat-trattament sejra tvarja mit-test bl-użu tal-attivazzjoni metabolika. Kull kontroll pożittiv għandu jintuża f'konċentrazzjoni waħda jew iktar mistennija li toffri żidiet riproduċibbli u identifikabbli fuq l-isfond sabiex tintwera s-sensittività tas-sistema tat-test (jiġifieri l-effetti huma ċari iżda ma jikxfux minnufih l-identità tal-lametti kodifikati lill-qarrej), u r-rispons ma għandux ikun f'riskju minħabba ċitotossiċità li taqbeż il-limiti speċifikati fil-metodu ta' ttestjar.
                     
                        Tabella 1.
                     
                     
                        Sustanzi kimiċi ta' referenza rakkomandati għall-valutazzjoni tal-għarfien tal-laboratorju u għall-għażla tal-kontrolli pożittivi.
                     
                     
                                 Kategorija
                              
                              
                                 Sustanza Kimika
                              
                              
                                 CASRN
                              
                           1.   Klastoġeni attivi mingħajr attivazzjoni metabolika
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Metansulfonat tal-metil
                              
                              
                                 66-27-3
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Mitomiċina C
                              
                              
                                 50-07-7
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 4-Nitrokinolina-N-Ossida
                              
                              
                                 56-57-5
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Ċitożina arabinosida
                              
                              
                                 147-94-4
                              
                           2.   Klastoġeni li jeħtieġu attivazzjoni metabolika
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Benżo(a)piren
                              
                              
                                 50-32-8
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Ċiklofosfammid
                              
                              
                                 50-18-0
                              
                           PROĊEDURA
                     
                        Trattament bis-sustanza kimika tat-test
                     
                     Ċelloli li jipproliferaw huma ttrattati bis-sustanza tat-test fil-preżenza u fin-nuqqas ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika.
                     
                        Żmien il-ġbir tal-kulturi
                     
                     Għal evalwazzjoni dettaljata, li tkun meħtieġa sabiex jiġi konkluż eżitu negattiv, għandhom isiru t-tliet kundizzjonijiet sperimentali kollha kemm huma li ġejjin bl-użu ta' trattament fuq terminu qasir b'attivazzjoni metabolika u mingħajrha u trattament fit-tul mingħajr attivazzjoni metabolika (ara l-paragrafi 43, 44 u 45):
                     
                                 —
                              
                              
                                 Iċ-ċelloli għandhom ikunu esposti għas-sustanza kimika tat-test mingħajr attivazzjoni metabolika għal 3-6 sigħat, u jiġu kampjunati f'ħin ekwivalenti għal madwar kull darba u nofs it-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli normali mindu jinbeda t-trattament (18),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Iċ-ċelloli għandhom ikunu esposti għas-sustanza kimika tat-test mingħajr attivazzjoni metabolika għal 3-6 sigħat, u jiġu kampjunati f'ħin ekwivalenti għal madwar kull darba u nofs it-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli normali mindu jinbeda t-trattament (18),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Iċ-ċelloli għandhom ikunu esposti bla heda għas-sustanza kimika tat-test mingħajr attivazzjoni metabolika sal-kampjunar f'ħin għal madwar kull darba u nofs iċ-ċiklu taċ-ċelloli normali. Ċerti sustanzi kimiċi (eż. analogi nukleosidiċi) jistgħu jinqabdu iktar malajr minn ħinijiet ta' trattament/kampjunar ta' itwal minn darba u nofs it-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli normali (24).
                              
                           F'każ li xi waħda mill-kundizzjonijiet sperimentali ta' hawn fuq twassa għal rispons pożittiv, jaf ma jkunx hemm bżonn li jiġi investigat xi wieħed mir-reġimi tat-trattament l-oħrajn.
                     
                        Preparazzjoni tal-kromożomi
                     
                     Il-kulturi taċ-ċelloli jiġu ttrattati b'kolċemid jew kolċisina normalment għal siegħa sa tliet sigħat qabel il-ġbir. Kull kultura ta' ċelloli tinġabar u tiġi proċessata separatament għall-preparazzjoni tal-kromożomi. Il-preparazzjoni tal-kromożomi tinvolvi t-trattament ipotoniku taċ-ċelloli, il-fissazzjoni u t-tilwin. Fil-monosaffi, iċ-ċelloli mitotiċi (identifikabbli għaliex huma tondi u maqlugħin mill-wiċċ) jistgħu jkunu preżenti fl-aħħar tat-trattament ta' bejn 3 u 6 sigħat. Minħabba li dawn iċ-ċelloli mitotiċi jistgħu jinqalgħu faċilment, jistgħu jintilfu meta jitneħħa l-medium li jkun fih is-sustanza kimika tat-test. Jekk hemm evidenza ta' żieda sostanzjali fin-numru ta' ċelloli mitotiċi meta mqabbla mal-kontrolli, xi ħaġa li tindika inibizzjoni mitotika, iċ-ċelloli għandhom jinġabru b'ċentrifugazzjoni u jiżdiedu lura mal-kulturi, sabiex jiġi evitat milli jintilfu ċelloli li huma f'mitożi, u f'riskju ta' aberrazzjoni kromożomika, f'ħin il-ġbir.
                     
                        Analiżi
                     
                     Il-lametti kollha, inklużi dawk tal-kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati b'mod indipendenti qabel ma ssir analiżi mikroskopika għal aberrazzjonijiet kromożomiċi. Billi l-proċeduri ta' fissazzjoni spiss jirriżultaw fi proporzjon ta' ċelloli fil-metafażi li tilfu kromożomi, iċ-ċelloli li jingħaddu għandu għalhekk ikun fihom numru ta' ċentromeri ugwali għan-numru modali +/– 2.
                     Tal-inqas 300 metafażi mifruxin sew għandhom jingħaddu għal kull konċentrazzjoni u kontroll sabiex jiġi konkluż li sustanza kimika tat-test hija negattiva biċ-ċar (ara l-paragrafu 45). It-300 ċellola għandhom ikunu maqsumin indaqs bejn ir-repliki, meta jintużaw kulturi rreplikati. Meta jintużaw kulturi waħedhom għal kull konċentrazzjoni (ara l-paragafu 21), għandhom jingħaddu tal-inqas 300 metafażi mifruxin sew f'din il-kultura waħedha. L-għadd ta' 300 ċellola għandu l-vantaġġ li jżid is-saħħa statistika tat-test u, barra minn hekk, rari jiġu osservati valuri żero (mistennijin li jkunu 5 % biss) (44). In-numru ta' metafażijiet magħdudin jista' jitnaqqas meta jiġu osservati numri kbar ta' ċelloli b'aberrazzjonijiet kromożomiċi u s-sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva b'mod ċar.
                     Għandhom jingħaddu ċelloli b'aberrazzjoni(jiet) kromożomiċi strutturali, li jinkludu u jeskludu distakki. Il-ksur u d-distakki huma definiti fl-Appendiċi 1 skont (45) (46). Aberrazzjonijiet tat-tip kromatid u kromożomiku għandhom jiġu rreġistrati għalihom u jiġu kklassifikati skont is-sottotipi (ksur, skambji). Il-proċeduri li jintużaw fil-laboratorju għandhom jiżguraw li l-analiżi tal-aberrazzjonijiet kromożomiċi ssir minn persuni mħarrġin sew fl-għoti ta' punteġġi u huma evalwati bejn il-pari, jekk xieraq.
                     Għalkemm l-għan tat-test huwa li jinkixfu aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali, huwa importanti li wieħed jirreġistra l-frekwenzi tal-poliplojdija u l-endoreduplikazzjoni meta jseħħu dawn l-avvenimenti. (Ara l-paragrafu 2).
                     
                        Il-profiċjenza tal-laboratorju
                     
                     Sabiex tiġi stabbilita biżżejjed esperjenza bit-test qabel ma jintuża għall-ittestjar ta' rutina, il-laboratorju għandu jkun għamel sensiela ta' esperimenti b'sustanzi kimiċi pożittivi ta' referenza li jaġixxu permezz ta' mekkaniżmi differenti u bosta kontrolli negattivi (bl-użu ta' bosta solventi/veikoli). Dawn ir-risponsi tal-kontroll pożittiv u negattiv reazzjonijiet għandhom ikunu konsistenti mat-tagħrif. Dan mhuwiex applikabbli għal laboratorju li għandhom esperjernza, jiġifieri li għandhom database storika disponibbli kif definita fil-paragrafu 37.
                     Għandha tiġi investigata firxa ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv (ara t-Tabella 1 fil-paragrafu 26) bi trattamenti qosra u twal fin-nuqqas ta' attivazzjoni metabolika, u anki bi trattament qasir fil-preżenza ta' attivazzjoni metabolika, sabiex tintwera l-ħila li jinqabdu sustanzi kimiċi klastoġeniċi u tiġi stabbilita l-effikaċja tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika. Għandha tingħażel medda ta' konċentrazzjonijiet tas-sustanzi kimiċi magħżulin sabiex jingħataw żidiet riproduċibbli u marbutin mal-konċentrazzjoni fuq l-isfond sabiex jintwerew is-sensittività u l-firxa dinamika tas-sistema tat-test.
                     
                        Dejta storika tal-kontroll
                     
                     Il-laboratorju għandu jistabbilixxi:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Medda u distribuzzjoni storiċi tal-kontroll pożittiv,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Medda u distribuzzjoni storiċi tal-kontroll negattiv (mhux ittrattat, solvent).
                              
                           Meta għall-ewwel tinkiseb id-dejta għal distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu konsistenti mad-dejta tal-kontroll ippubblikata, meta tkun teżisti. Peress li tiżdied iktar dejta sperimentali mad-distribuzzjoni tal-kontroll, idealment il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % ta' dik id-distribuzzjoni (44) (47). Id-database storika tal-kontrolli negattivi tal-laboratorju għall-ewwel għandha tinbena b'minimu ta' 10 esperimenti iżda idealment tkun tikkonsisti f'tal-inqas 20 esperiment imwettqin f'kundizzjonijiet sperimentali paragunabbli. Il-laboratorji għandhom jużaw metodi ta' kontroll tal-kwalità, bħal karti tal-kontroll (eż. C-charts jew X-bar charts (48)), sabiex jidentifikaw kemm hija varjabbli d-dejta tal-kontroll pożittiv u negattiv tagħhom, u sabiex juru li l-metodoloġija hija “taħt kontroll” fil-laboratorju tagħhom (44). Rakkomandazzjonijiet ulterjuri dwar kif jibnu u jużaw id-dejta storika (jiġifieri kriterji għall-inklużjoni u l-esklużjoni ta' dejta fid-dejta storika u l-kriterji ta' aċċettabilità għal esperiment partikolari) jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (47).
                     Kwalunkwe bidla fil-protokoll tal-esperimenti għandha tiġi kkunsidrata fid-dawl tal-konsistenza tagħha mad-databases tal-kontroll storiċi eżistenti tal-laboratorju. Kwalunkwe inkonsistenza kbira għandha tirriżulta fl-istabbiliment ta' database storika ġdida tal-kontroll.
                     Id-dejta tal-kontroll negattiv għandha tikkonsisti fl-inċidenza taċ-ċelloli b'aberrazzjonijiet kromożomiċi minn kultura waħedha jew is-somma tal-kulturi rreplikati kif deskritti fil-paragrafu 21. Idealment, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % tad-distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju (44) (47). Meta d-dejta tal-kontroll negattiv parallel toħroġ mil-limiti ta' kontroll ta' 95 %, din tista' titqies aċċettabbli li tiddaħħal fid-distribuzzjoni storika tal-kontroll diment li din id-dejta ma tkunx eċċezzjoni estrema u jkun hemm evidenza li s-sistema tat-test tkun “taħt kontroll” (ara l-paragrafu 37) u evidenza ta' nuqqas ta' żball tekniku jew uman.
                     DEJTA U RAPPORTAR
                     
                        Preżentazzjoni tar-riżultati
                     
                     Il-perċentwal ta' ċelloli b'aberrazzjoni(jiet) kromożomika strutturali għandu jiġi evalwat. L-aberrazzjonijiet tat-tip kromatid u kromożomiku kklassifikat skont is-sottotipi (ksur, skambji) għandhom jiġu elenkati b'mod separat bin-numri u l-frekwenzi tagħhom għall-kulturi ta' esperimenti u ta' kontroll. Id-distakki jiġu rreġistrati u rrapportati separatament u ma jiddaħħlux fil-frekwenza ta' aberrazzjonijiet totali. Il-perċentwal ta' poliplojdija u/jew ċelloli endoreduplikati jiġi rrapportat meta jiġi osservat.
                     Għandhom jiġu rreġistrati l-miżuri paralleli ta' ċitotossiċità għall-kulturi tal-kontroll ittrattat, negattiv u pożittiv kollha fl-esperiment(i) tal-aberrazzjonijiet ewlenin.
                     Għandha tiġi pprovduta dejta dwar il-kultura individwali. Barra minn hekk, id-dejta kollha għandha tinġabar taħt forma ta' tabella.
                     
                        Kriterji ta' Aċċettabilità
                     
                     L-aċċettazzjoni ta' test hija bbażata fuq il-kriterji li ġejjin:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Il-kontroll negattiv parallel jitqies aċċettabbli għaż-żieda fid-database storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju kif deskritt fil-paragrafu 39.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-kontrolli negattivi paralleli (ara l-paragrafu 26) għandhom jinduċu risponsi li huma kompatibbli ma' dawk iġġenerati fid-database storika tal-kontroll pożittiv u jipproduċu żieda statistikament sinifikanti meta mqabblin mal-kontroll negattiv parallel.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-kriterji ta' proliferazzjoni taċ-ċelloli fil-kontroll tas-solventi għandhom ikunu ssodisfati (paragrafi 17 u 18).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 It-tliet kundizzjonijiet sperimentali kollha kemm huma ġew ittestjati sakemm wieħed ma rriżultax f'riżultati pożittivi (ara l-paragrafu 28).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Hemm numru adegwat ta' ċelloli u konċentrazzjonijiet li huma analizzabbli (paragrafi 31 u 21).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-kriterji għall-għażla tal-ogħla konċentrazzjoni huma konsistenti ma' dawk deskritti fil-paragrafi 22, 23 u
                              
                           
                        Evalwazzjoni u interpretazzjoni tar-riżultati
                     
                     Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva biċ-ċar jekk, fi kwalunkwe waħda mill-kundizzjonijiet sperimentali analizzati (ara l-paragrafu 28):
                     
                                 a)
                              
                              
                                 tal-inqas waħda mill-konċentrazzjonijiet tat-test turi żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv parallel,
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 iż-żieda hija marbuta mad-doża meta tiġi evalwata b'test xieraq tat-tendenzi,
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 kwalunkwe wieħed mir-riżultati jaqa' barra mid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson; ara l-paragrafu 39).
                              
                           Meta jiġu ssodisfati dawn il-kriterji kollha, is-sustanza kimika tat-test imbagħad tiġi kkunsidrata kapaċi tinduċi aberrazzjonijiet kromożomiċi f'ċelloli kulturati tal-mammiferi f'din is-sistema tat-test. Ir-rakkomandazzjonijiet għall-iktar metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (49) (50) (51).
                     Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija negattiva biċ-ċar jekk, fil-kundizzjonijiet sperimentali analizzati kollha (ara l-paragrafu 28):
                     
                                 a)
                              
                              
                                 l-ebda waħda mill-konċentrazzjonijiet tat-test ma turi żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv parallel,
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 ma hemm l-ebda żieda marbuta mal-konċentrazzjoni meta tiġi evalwata b'test xieraq tat-tendenzi,
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 ir-riżultati kollha jaqgħu fid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson; ara l-paragrafu 39).
                              
                           Imbagħad, is-sustanza kimika tat-test tiġi kkunsidrata li mhijiex kapaċi tinduċi aberrazzjonijiet kromożomiċi f'ċelloli kulturati tal-mammiferi f'din is-sistema tat-test.
                     Ma hemm l-ebda ħtieġa għall-verifika ta' rispons posittiv jew negattiv ċar.
                     F'każ li r-rispons la jkun negattiv ċar u lanqas pożittiv ċar kif spjegat hawn fuq jew sabiex tgħin fl-istabbiliment tar-rilevanza bijoloġika ta' riżultat, id-dejta għandha tiġi evalwata b'ġudizzju espert u/jew b'investigazzjonijiet ulterjuri. L-ikklassifikar ta' ċelloli addizzjonali (fejn xieraq) jew it-twettiq ta' esperiment ripetut possibilment bl-użu ta' kundizzjonijiet modifikati tal-esperiment (eż. spazjar tal-konċentrazzjonijiet, kundizzjonijiet ta' attivazzjoni metabolika oħrajn (jiġifieri konċentrazzjoni S9 jew oriġini S9)) jista' jkun siewi.
                     F'każijiet rari, anki wara investigazzjonijiet ulterjuri, is-sett ta' dejta sejjer jipprekludi l-ħruġ ta' konklużjoni ta' riżultati pożittivi jew negattivi u, għalhekk, ir-rispons tas-sustanza kimika tat-test sejjer jiġi konkluż bħala ekwivoku.
                     Żieda fin-numru ta' ċelloli poliplojdi tista' tindika li s-sustanzi kimiċi tat-test għandhom il-potenzjal li jinibixxu l-proċessi mitotiċi u jwasslu aberrazzjonijiet kromożomiċi numeriċi (52). Żieda fin-numru ta' ċelloli bi kromożżomi endoreduplikati tista' tindika li s-sustanzi kimiċi tat-test għandhom il-potenzjal li jinibixxu l-progress taċ-ċiklu taċ-ċelloli (53) (54) (ara l-paragrafu 2). Għaldaqstant, l-inċidenza ta' ċelloli poliplojdi u ċelloli bi kromożomi endoreduplikati għandha tiġi rreġistrata b'mod separat.
                     
                        Rapport tat-test
                     
                     Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanza kimika tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             is-sors, in-numru tal-lott, id-data ta' limitu għall-użu, jekk disponibbli
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test stess, jekk magħrufa;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             is-solubilità u l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent, jekk magħrufin;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kejl tal-pH, l-ożmolalità u l-preċipitat fil-medium tal-kultura li miegħu żdiedet is-sustanza kimika tat-test, kif xieraq.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanza monokostitwenti:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             id-dehra fiżika, is-solubilità fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanzi multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             ikkaratterizzati safejn possibbli mill-identità kimika (ara iktar 'il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Solventi:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-perċentwal ta' solvent fil-medium tal-kultura finali għandu jiġi indikat ukoll.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ċelloli:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             tip u sors taċ-ċelloli
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             karatteristiċi karjotipiċi u l-adegwatezza tat-tip ta' ċellola użat;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             in-nuqqas ta' mikoplażma, għal-linji ta' ċelloli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             għal-linji ta' ċelloli, informazzjoni dwar it-tul taċ-ċiklu taċ-ċellola, il-ħin għall-irduppjar jew l-indiċi tal-proliferazzjoni;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             is-sess tad-donaturi tad-demm, l-età u kwalunkwe informazzjoni rilevanti dwar id-donatur, id-demm sħiħ jew il-linfoċiti separati, il-mitoġenu użat;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             in-numru ta' passaġġi, jekk disponibbli, għal-linji ta' ċelloli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodi għall-manutenzjoni tal-kulturi taċ-ċelloli, għal-linji ta' ċelloli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             in-numru modali ta' kromożomi, għal-linji ta' ċelloli.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kundizzjonijiet tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             l-identità tal-inibitur tal-metafażi, il-konċentrazzjoni tiegħu u d-durata tal-esponiment taċ-ċelloli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test espressa bħala konċentrazzjoni finali fil-medium tal-kultura (eż. μg jew mg/mL jew mM tal-medium tal-kultura).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ir-raġuni prinċipali għall-għażla tal-konċentrazzjonijiet u l-għadd ta' kulturi inklużi, eż. dejta dwar iċ-ċitotossiċità u limitazzjonijiet tas-solubilità;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kompożizzjoni tal-media, il-konċentrazzjoni tas-CO2 jekk applikabbli, il-livell ta' umdità;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-konċentrazzjoni (u/jew il-volum) ta' solvent u s-sustanza kimika tat-test miżjuda fil-medium tal-kultura;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             it-temperatura ta' inkubazzjoni;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-ħin ta' inkubazzjoni;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-durata tat-trattament;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-ħin tal-ġbir wara t-trattament;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-densità taċ-ċelloli fiż-żriegħ, jekk xieraq;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             it-tip u l-kompożizzjoni tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika (is-sors ta' S9, il-metodu ta' preparazzjoni tat-taħlita ta' S9, il-konċentrazzjoni jew il-volum ta' taħlita ta' S9 u l-S9 fil-medium tal-kultura finali, il-kontrolli tal-kwalità tal-S9);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             is-sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv u negattiv, il-konċentrazzjonijiet finali għal kull kundizzjoni tat-trattament;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodi tal-preparazzjoni tal-lametti u t-teknika użata għat-tilwin;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kriterji għall-aċċettabilità tal-assaġġi;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kriterji għall-ikklassifikar tal-aberrazzjonijiet;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             in-numru ta' metafażijiet analizzati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodi għall-kejl taċ-ċitotossiċità;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kwalunkwe informazzjoni supplimentari rilevanti għaċ-ċitotossiċità u l-metodu użat;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kriterji biex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodi użati sabiex jiġu stabbiliti l-pH, l-ożmolalità u l-preċipitazzjoni.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ir-riżultati:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             l-għadd ta' ċelloli ttrattati u l-għadd ta' ċelloli miġburin għal kull kultura meta jintużaw il-linji ta' ċelloli
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kejliet taċ-ċitotossiċità, eż. RPD, RICC, MI, osservazzjonijiet oħrajn, jekk ikun hemm;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             informazzjoni dwar it-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli, il-ħin għall-irduppjar jew l-indiċi tal-proliferazzjoni fil-każ tal-linji ta' ċelloli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             is-sinjali ta' preċipitazzjoni u l-ħin tad-determinazzjoni;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-definizzjoni għall-aberrazzjonijiet, inklużi d-distakki;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             In-numru ta' ċelloli kklassifikati, in-numru ta' ċelloli b'aberrazzjonijiet kromożomiċi u t-tip ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi mogħtijin b'mod separat għal kull kultura ttrattata u tal-kontroll, inklużi u esklużi d-distakki;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bidliet fil-plojdija (ċelloli poliplojdi u ċelloli bi kromożomi endoreduplikati, mogħtijin b'mod separat), jekk jiġu osservati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ir-relazzjoni konċentrazzjoni rispons, fejn possibbli,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-dejta tal-kontroll negattiv (solvent) u pożittiv (konċentrazzjonijiet u solventI) parallel;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-dejta tal-kontroll negattiv (solvent) u pożittiv, b'meded, medji u devjazzjonijiet standard u limiti ta' kontroll ta' 95 % għad-distribuzzjoni, kif ukoll in-numru ta' dejta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             analiżijiet statistiċi, il-valuri p, jekk ikun hemm.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Diskussjoni tar-riżultati.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Konklużjonijiet.
                                 
                              
                           TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 (1976), “Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens”, in Chemical Mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed.), Plenum Press, New York and London, pp. 1-29
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Ishidate, M. Jr., T. Sofuni (1985), “The in vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture” fi Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al. (eds.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York- Oxford, pp. 427-432.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosomal aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Muehlbauer, P.A. et al. (2008), “Improving dose selection and identification of aneugens in the in vitro chromosome aberration test by integration of flow cytometry-based methods”, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/4, pp. 318-327.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu B.49 ta' dan l-Anness: Test In Vitro tal-Mikronukleu taċ-Ċelloli tal-Mammiferi.
                                 
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 ILSI paper (draft), Lorge, E., M. Moore, J. Clements, M. O Donovan, F. Darroudi, M. Honma, A. Czich, J van Benthem, S. Galloway, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Kim, D.J. Kirkland, Recommendations for good cell culture practices in genotoxicity testing.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Scott, D. et al. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol.257/2, pp. 147-204.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Morita, T. et al. (1992), Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 268/2, pp. 297-305.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 789-886.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Long, L.H. et al. (2007), Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 634/1-2, pp. 177-183.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Nesslany, F. et al. (2008), Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/6, pp. 439-452.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 191-201.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Kirkland, D. et al. (2005), Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens. I: Sensitivity, specificity and relative predictivity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 584/1-2, pp. 1–256.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Greenwood, S. et al. (2004), Population doubling: a simple and more accurate estimation of cell growth suppression in the in vitro assay for chromosomal aberrations that reduces irrelevant positive results, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 43/1, pp. 36–44.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Hilliard, C.A. et al. (1998), Chromosome aberrations in vitro related to cytotoxicity of nonmutagenic chemicals and metabolic poisons, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 31/4, pp. 316–326.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Hedner K. et al. (1982), Sister chromatid exchanges and structural chromosomal aberrations in relation to age and sex, Human Genetics, Vol. 62, pp. 305-309.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Ramsey M.J. et al. (1995), The effects of age and lifestyle factors on the accumulation of cytogenetic damage as measured by chromosome painting, Mutation Research, Vol. 338, pp. 95-106.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Coecke S. et al. (2005), Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, Vol. 33/3, pp. 261-287.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Henderson, L. et al. (1997), Industrial Genotoxicology Group collaborative trial to investigate cell cycle parameters in human lymphocyte cytogenetics studies, Mutagenesis, Vol.12/3, pp.163-167.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Ames, B.N., J. McCann, E. Yamasaki (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 31/6, pp. 347-363.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Maron, D.M., B.N. Ames (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 113/3-4, pp. 173-215.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Natarajan, A.T. et al. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Research, Vol. 37/1, pp. 83-90.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Matsuoka, A., M. Hayashi, M. Jr. Ishidate (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix in vitro, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 66/3, pp. 277-290.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Ong, T.-m. et al. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, Journal of Environmental Pathology and Toxicology, Vol. 4/1, pp. 55-65.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Elliot, B.M. et al. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, Vol. 7/3, pp. 175-177.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Matsushima, T. et al. (1976), “A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems” in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J. et al. (eds.), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1994). Report from Working Group on in vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 241-261.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 Johnson, T.E., D.R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 28/1, pp. 51-59.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Disponibbli fuq: http://www.pops.int/.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987), Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes, Mutation Research, Vol. 190/3, pp. 225-8.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982), “CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids” in Genotoxic Effects of Airborne Agents, Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (eds.), Plenum, New York, pp. 91-103.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Zamora, P.O. et al. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 5/6, pp. 795-801.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Asakura, M. et al. (2008), An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay, Mutation Research, Vol. 652/2, pp. 122-130.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Lorge, E. et al. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 655/1-2, pp. 1-3.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Galloway, S. et al. (2011), Workshop summary: Top concentration for in vitro mammalian cell genotoxicity assays; and Report from working group on toxicity measures and top concentration for in vitro cytogenetics assays (chromosome aberrations and micronucleus), Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 77-83.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Honma, M. (2011), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 724/1-2, pp. 86-87.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 Richardson, C. et al. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. Fi: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 OECD (2014), Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487) ENV/JM/TG(2014)17. Disponibbli fuq talba.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Morita, T., M. Honma, K. Morikawa (2012), Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 741/1-2, pp. 32-56.
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Brookmire, L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013), Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environmental and Molecular Muagenesis, Vol. 54/1, pp. 36-43.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011), Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances, http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 USFDA (2012), International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use. Disponibbli fuq: https://federalregister.gov/a/2012-13774.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 OECD (2014), Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 ISCN (2013), An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Schaffer, L.G., J. MacGowan-Gordon, M. Schmid (eds.), Karger Publishers Inc., Connecticut.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Scott, D. et al. (1990), “Metaphase chromosome aberration assays in vitro”, in Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Recommended Procedures, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 62-86.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control Data, Mutation Research, Vol. 723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 (48)
                              
                              
                                 Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd Edition, John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 (49)
                              
                              
                                 Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003), Statistical Methods for Rates and Proportions, 3rd ed., John Wiley & Sons, New York.
                              
                           
                                 (50)
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175.
                              
                           
                                 (51)
                              
                              
                                 Richardson, C. et al. (1989), “Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays”, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.
                              
                           
                                 (52)
                              
                              
                                 Warr, T.J., E.M. Parry, J.M. Parry (1993), A comparison of two in vitro mammalian cell cytogenetic assays for the detection of mitotic aneuploidy using 10 known or suspected aneugens, Mutation Research, Vol. 287/1, pp. 29-46.
                              
                           
                                 (53)
                              
                              
                                 Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Research, Vol. 119/3, pp. 403-413.
                              
                           
                                 (54)
                              
                              
                                 Huang, Y., C. Change, J.E. Trosko (1983), Aphidicolin — induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Research, Vol. 43/3, pp. 1362-1364.
                              
                           
                                 (55)
                              
                              
                                 Soper, K.A., S.M. Galloway (1994), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research, Vol. 312, pp. 139-149.
                              
                           
                        Appendiċi 1
                        DEFINIZZJONIJIET
                        
                           
                              Anewplojdija
                           : kwalunkwe devjazzjoni mill-għadd ta' diplojdi (jew aplojdi) normali ta' kromożomi minn kromożomu wieħed jew aktar, iżda mhux mis-sett(ijiet) kollu/kollha ta' kromożomi (poliplojdija).
                        
                           
                              Apoptożi
                           : mewta programmata taċ-ċelloli kkaratterizzata minn sensiela ta' passi li jwasslu għal diżintegrazzjoni taċ-ċelloli fil-partikoli mwaħħlin mal-membrana li mbagħad jiġu eliminati permezz ta' fagoċitożi jew permezz ta' tixrid.
                        
                           
                              Proliferazzjoni taċ-ċelloli
                           : żieda fl-għadd ta' ċelloli bħala riżultat ta' diviżjoni mitotika taċ-ċelloli.
                        
                           
                              Sustanza kimika
                           : sustanza jew taħlita.
                        
                           
                              Ksur tal-kromatid
                           : diskontinwità ta' kromatid wieħed fejn ikun hemm nuqqas ta' allinjament ċar ta' wieħed mill-kromatidi.
                        
                           
                              Distakk kromatidu
                           : reġjun mingħajr tilwin (leżjoni akromatika) ta' kromatid wieħed fejn ikun hemm nuqqas minimu ta' allinjament tal-kromatid.
                        
                           
                              Aberrazzjoni tat-tip tal-kromatidi
                           : ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur ta' kromatidi singoli jew ksur u għaqda mill-ġdid bejn kromatidi.
                        
                           
                              Aberrazzjoni tat-tip tal-kromożomi
                           : ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur, jew ksur u għaqda mill-ġdid, taż-żewġ kromatidi f'sit identiku.
                        
                           
                              Klastoġenu
                           : kwalunkwe sustanza kimika li tikkawża aberrazzjonijiet kromożomiċi f'popolazzjonijiet ta' ċelloli jew organiżmi ewkarjotiċi.
                        
                           
                              Konċentrazzjonijiet
                           : irreferi għal konċentrazzjonijiet finali tas-sustanza kimika tat-test fil-medium tal-kultura.
                        
                           
                              Ċitotossiċità
                           : Għall-assaġġi koperti f'dan il-metodu ta' ttestjar li jużaw linji ta' ċelloli, iċ-ċitotossiċità hija identifikata bħala tnaqqis fl-irduppjar relattiv tal-popolazzjoni (RPD) jew iż-żieda relattiva fl-għadd taċ-ċelloli (RICC) taċ-ċelloli ttrattati meta mqabblin mal-kontroll negattiv (ara l-paragrafu 17 u l-Appendiċi 2). Għall-assaġġi koperti f'dan il-metodu ta' ttestjar li jużaw kulturi primarji ta' linfoċiti, iċ-ċitotossiċità hija identifikata bħala tnaqqis fl-indiċi mitotiku (MI) taċ-ċelloli ttrattati meta mqabblin mal-kontroll negattiv (ara l-paragrafu 18 u l-Appendiċi 2).
                        
                           
                              Endoreduplikazzjoni
                           : proċess li bih wara perjodu S tar-replikazzjoni tad-DNA, in-nukleu ma jidħolx f'mitożi iżda jibda perjodu S ieħor. Ir-riżultat huwa kromożomi b'4, 8, 16,… il-kromatid.
                        
                           
                              Ġenotossiċi
                           : terminu ġenerali li jkopri t-tipi kollha ħsara lid-DNA jew lill-kromożomi, inklużi ksur, tħassiriet, addotti, modifiki u konnessjonijiet tan-nukleotidi, riarranġamenti, mutazzjonijiet tal-ġeni, aberrazzjonijiet kromożomiċi, u anewplojdija. Mhux it-tipi kollha ta' effetti ġenotossiċi jirriżultaw f'mutazzjonijiet jew ħsara fil-kromożomi stabbli.
                        
                           
                              Indiċi mitotiku (MI)
                           : il-proporzjon ta' ċelloli fil-metafażi diviż bin-numru totali ta' ċelloli osservati f'popolazzjoni ta' ċelloli; indikazzjoni tal-livell ta' profilerazzjoni ta' dik il-popolazzjoni.
                        
                           
                              Mitożi
                           : diviżjoni tan-nukleu taċ-ċelloli li normalment jinqasam fi profażi, prometafażi, metafażi, anafażi u telofażi.
                        
                           
                              Mutaġeniku
                           : jipproduċi bidla ereditarja ta' sekwenza(i) tal-koppja ta' bażijiet tad-DNA f'ġeni jew tal-istruttura tal-kromożomi (aberrazzjonijiet kromożomiċi).
                        
                           
                              Aberrazzjoni numerika
                           : bidla fin-numru ta' kromożomi min-numru karatteristku normali ta' ċelloli użati.
                        
                           
                              Poliplojdija
                           : aberrazzjonijiet kromożomiċi numeriċi f'ċelloli jew organiżmi li jinvolvu sett(ijiet) sħiħ(sħaħ) ta' kromożomi, għall-kuntrarju ta' kromożomu jew kromożomi individwali (anewplojdija).
                        
                           
                              Status p53
                           : il-proteina p53 hija involuta fir-regolamentazzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelloli, l-apoptożi u t-tiswija tad-DNA. Ċelloli b'defiċjenza fil-proteina p53 funzjonali, li mhux kapaċi jinibixxu ċ-ċiklu taċ-ċelloli jew jelimintaw iċ-ċelloli bil-ħsara b'apoptożi jew mekkaniżmi oħrajn (eż. induzzjoni tat-tiswija tad-DNA) marbutin mal-funzjonijiet p53 f'rispons għall-ħsara fid-DNA, teoretikament għandhom ikunu iktar suxxettibbli għal mutazzjonijiet tal-ġeni jew aberrazzjonijiet kromożomiċi.
                        
                           
                              Żieda Relattiva fl-Għadd taċ-Ċelloli (RICC)
                           : iż-żieda fin-numru ta' ċelloli f'kulturi esposti għas-sustanza kimika kontra żieda f'kulturi mhux ittrattati, proporzjon espress bħala perċentwal.
                        
                           
                              Irduppjar Relattiv tal-Popolazzjoni (RPD)
                           : iż-żieda fin-numru ta' raddoppji tal-popolazzjoni f'kulturi esposti għas-sustanza kimika kontra żieda f'kulturi mhux ittrattati, proporzjon espress bħala perċentwal.
                        
                           
                              Frazzjoni tal-fwied S9
                           : supernatant ta' omoġenat tal-fwied wara ċentrifugazzjoni ta' 9 000 g, jiġifieri estratt minn fwied mhux ipproċessat.
                        
                           
                              Taħlita ta' F9
                           : taħlita tal-frazzjoni tal-fwied S9 u l-kofatturi neċessarji għall-attività tal-enzimi metaboliċi.
                        
                           
                              Kontrolli tas-solvent
                           : Terminu ġenerali li jiddefinixxi l-kulturi tal-kontroll li jirċievu s-solvent waħdu użat sabiex jiddisolvi s-sustanza kimika tat-test.
                        
                           
                              Aberrazzjoni strutturali
                           : bidla fl-istruttura tal-kromożomi li wieħed jinduna biha bl-eżami mikroskopiku tal-istadju metafażiku tad-diviżjoni taċ-ċelluoli, osservati bħala tħassir u biċċiet, bidliet minn ġewwa u bidliet bejniethom.
                        
                           
                              Sustanza kimika tat-test
                           : Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta' dan il-metodu ta' ttestjar.
                        
                           
                              Kontrolli mhux ittrattati
                           : kulturi li ma jirċievu ebda trattament (jiġifieri ebda sustanza kimika tat-test u lanqas solvent) iżda jiġu pproċessati fl-istess ħin bl-istess mod bħall-kulturi li jirċievu s-sustanza kimika tat-test.
                     
                     
                        Appendiċi 2
                        
                           FORMOLI GĦALL-VALUTAZZJONI TAĊ-ĊITOTOSSIĊITÀ
                        
                        
                           Indiċi mitotiku (MI):
                        
                        
                           
                        
                           Iż-Żieda Relattiva fl-Għadd taċ-Ċelloli (RICC) jew l-Irduppjar Relattiv tal-Popolazzjoni (RPD), minħabba li t-tnejn iqisu l-proporzjon tal-popolazzjoni taċ-ċelloli li tkun iddividiet ruħha.
                        
                           
                        
                           
                        fejn:
                        
                           Irduppjar tal-Popolazzjoni = [log (Numru ta' ċelloli wara t-trattament ÷ Numru ta' ċelloli inizjali)] ÷ log 2
                        Pereżempju, RICC, jew RPD ta' 53 % jindikaw ċitotossiċità/ċitostażi ta' 47 % u ċitotossiċità/ċitostażi ta' 55 % imkejla bl-MI tfisser li l-MI attwali huwa 45 % tal-kontroll.
                        
                        Fi kwalunkwe każ, l-għadd ta' ċelloli qabel it-trattament għandu jitkejjel u l-istess għal kulturi ttrattati u tal-kontroll negattiv.
                        Filwaqt li l-RCC (jiġifieri n-Numru ta' ċelloli f'kulturi tat-trattament/ Numru ta' ċelloli f'kulturi tal-kontroll) intuża bħala parametru taċ-ċitotossiċità fl-imgħoddi, illum ma għadux rakkomandat għaliex jista' jissottovaluta ċ-ċitotossiċità
                        Fil-kulturi tal-kontroll negattiv, l-irduppjar tal-popolazzjoni għandu jkun kompatibbli mar-rekwiżit li jittieħed kampjun taċ-ċelloli wara t-trattament fi żmien ekwivalenti għal madwar darba u nofs it-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli u l-indiċi mitotiku għandu jkun għoli biżżejjed sabiex jinkiseb numru suffiċjenti ta' ċelloli fil-mitożi u sabiex jiġi kkalkolat b'mod affidabbli tnaqqis ta' 50 %.
                     ”
               
                     (4)
                  
                  
                     Fil-Parti B, il-Kapitolu B.11 huwa sostitwit b'dan li ġej:
                     “B.11   Test Tal-Aberrazzjoni Fil-Kromożomi Tal-Mudullun Tal-Mammiferi
                     
                     INTRODUZZJONI
                     Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test 475 (2016) tal-OECD Huwa parti minn sensiela ta' metodi ta' ttestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika. Ġie żviluppat dokument tal-OECD li jipprovdi informazzjoni sintetika dwar l-ittestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika u ħarsa ġenerali dwar it-tibdil reċenti la sar f'dawk il-Linji Gwida tat-Test (1).
                     It-test in vivo tal-aberrazzjoni fil-kromożomi tal-mudullun tal-mammiferi huwa ta' rilevanza partikolari għall-valutazzjoni tal-ġenotossiċità għaliex, għad li jvarja bejn l-ispeċijiet, il-fatturi tal-metaboliżmu in vivo, il-farmakokinetiċi u l-proċessi ta' tiswija tad-DNA huma attivi u jikkontribwixxu għar-risponsi. Assaġġ in vivo huwa siewi wkoll sabiex tkun tista' ssir investigazzjoni ulterjuri tal-ġenotossiċità żvelata minn sistema in vitro.
                     It-test in vivo ta' aberrazzjoni kromożomika fil-mammiferi jintuża sabiex jinstabu aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali indotti mis-sustanzi kimiċi tat-test fiċ-ċelloli tal-mudullun tal-annimali, normalment rodituri (2) (3) (4) (5). L-aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali jistgħu jkunu ta' żewġ tipi, kromożomiċi jew kromatidi. Filwaqt li l-maġġoranza ta' aberrazzjonijiet ġenotossiċi indotti bis-sustanzi kimiċi huma tat-tip kromatid, jistgħu jseħħu aberrazzjonijiet tat-tip kromożomiku wkoll. Il-ħsara kromożomika u l-avvenimenti relatati huma l-kawża ta' ħafna mard ġenetiku fil-bniedem u hemm evidenza sostanzjali li, meta dawn il-leżjonijiet u l-avvenimenti relatati jikkaġunaw alterazzjonijiet f'onkoġeni u f'ġeni li jrażżnu t-tumuri, dawn ikunu involuti fil-ħolqien tal-kanċer fil-bniedem u sistemi sperimentali. Tista' sseħħ piloplojdija (inkluża endoreduplikazzjoni) f'assaġġi tal-aberrazzjoni kromożomika in vivo. Madankollu, żieda fil-poliplojdija waħedha ma tindikax potenzjal anewġeniku u tista' tindika sempliċi perturbazzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelloli jew ċitotossiċità. It-test mhuwiex imfassal sabiex ikejjel l-anewplojdija. Test in vivo tal-mikronukleu fl-eritroċiti mammiferi (Kapitolu B.12 ta' dan l-Anness) jew it-test in vitro tal-mikronukleu taċ-ċelloli tal-mammiferi (Kapitolu B.49 ta' dan l-Anness) ikunu t-testijiet in vivo u in vitro, rispettivament, rakkomandati għas-sejbien ta' anewplojdija.
                     Id-definizzjonijiet tat-terminoloġija użata huma stabbiliti fl-Appendiċi 1.
                     KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU
                     F'dan it-test spiss jintużaw rodituri, iżda f'ċerti każijiet jista' jkun hemm speċijiet oħrajn li jkunu xierqa, jekk ikunu ġġustifikati xjentifikament. Il-mudullun huwa t-tessut fil-mira ta' dan it-test, peress li huwa tessut ferm vaskularizzat u fih popolazzjoni ta' ċelluli b'ċiklu rapidu li jistgħu jkunu faċilment iżolati u pproċessati. Fir-rapport għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xjentifika meta jintużaw speċijiet oħrajn li mhumiex firien u ġrieden. Jekk jintużaw speċijiet oħrajn li mhumiex rodituri, huwa rakkomandat li l-kejl tal-aberrazzjoni kromożomika tal-mudullun jiġi integrat f'test xieraq ieħor tat-tossiċità.
                     Jekk ikun hemm evidenza li s-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test, jew il-metabolit(i) tagħha, mhumiex sejrin jilħqu t-tessut fil-mira, jaf ma jkunx xieraq li jintuża dan it-test.
                     Qabel ma jintuża dan il-metodu ta' ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta' dejta għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet ma jkunux meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita.
                     IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TA' TTESTJAR
                     L-annimali huma esposti għas-sustanza kimika tat-test permezz ta' rotta xierqa ta' esponiment u jiġu ewtanazzati b'mod umanitarju fi żmien xieraq wara t-trattament. Qabel l-ewtanażija, l-annimali jiġu ttrattati b'inibitur tal-metafażi (eż. kolċisina jew kolċemid). Imbagħad isiru preparazzjonijiet tal-kromożomi miċ-ċelloli tal-mudullun u dawn jitlewnu, u ċ-ċelluli fil-metafażi jiġu analizzati għal aberrazzjonijiet kromożomiċi.
                     VERIFIKA TAL-PROFIĊJENZA TAL-LABORATORJU
                     
                        Investigazzjonijiet tal-Profiċjenza
                     
                     Sabiex tiġi stabbilita biżżejjed esperjenza fit-twettiq tal-assaġġ qabel ma jintuża għal testijiet ta' rutina, il-laboratorju għandu jkun wera li għandu l-ħila li jirriproduċi r-riżultati mistennijin mid-dejta ppubblikata (eż. (6)) għal frekwenzi ta' aberrazzjonijiet kromożomatiċi b'tal-inqas żewġ sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv (inklużi risponsi dgħajfin indotti minn dożi baxxi ta' kontrolli pożittivi), bħal dawk elenkati fit-Tabella 1 u b'kontrolli tal-veikolu/solvent kompatibbli (ara l-paragrafu 22). Dawn l-esperimenti għandhom jużaw dożi li jagħtu żidiet riproduċibbli u relatati mad-dożi u juru s-sensittività u l-medda dinamika tas-sistema tat-test fit-tessut ta' interess (il-mudullun) u jużaw il-metodu tal-punteġġ li sejjer jitħaddem fil-laboratorju. Dan ir-rekwiżit mhuwiex applikabbli għal laboratorji li għandhom esperjenza, jiġifieri li għandhom database storika disponibbli kif definita fil-paragrafi 10-14.
                     
                        Dejta Storika tal-Kontroll
                     
                     Matul l-investigazzjonijiet tal-profiċjenza, il-laboratorju għandu jistabbilixxi:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Medda u distribuzzjoni storiċi tal-kontroll pożittiv, u
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Medda u distribuzzjoni storiċi tal-kontroll negattiv.
                              
                           Meta għall-ewwel tinkiseb id-dejta għal distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu konsistenti mad-dejta tal-kontroll ippubblikata, meta tkun teżisti. Peress li tiżdied iktar dejta sperimentali mad-distribuzzjoni storika tal-kontroll, idealment il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % ta' dik id-distribuzzjoni. Id-database storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju għandha tkun statistikament robusta sabiex tiġi żgurata l-ħila tal-laboratorju sabiex jivvaluta d-distribuzzjoni tad-dejta tal-kontroll negattiv tiegħu. It-tagħrif jissuġġerixxi li jista' jkun hemm bżonn ta' minimu ta' 10 esperimenti iżda idealment ikun hemm tal-inqas 20 esperiment imwettqin f'kundizzjonijiet sperimentali paragunabbli. Il-laboratorji għandhom jużaw metodi ta' kontroll tal-kwalità, bħal karti tal-kontroll (eż. C-charts jew X-bar charts (7)), sabiex jidentifikaw kemm hija varjabbli d-dejta tagħhom, u sabiex juru li l-metodoloġija hija “taħt kontroll” fil-laboratorju tagħhom. Rakkomandazzjonijiet ulterjuri dwar kif jibnu u jużaw id-dejta storika (jiġifieri kriterji għall-inklużjoni u l-esklużjoni ta' dejta fid-dejta storika u l-kriterji ta' aċċettabilità għal esperiment partikolari) jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (8).
                     Meta l-laboratorju ma jagħmilx numru kbir biżżejjed ta' esperimenti sabiex jistabbilixxi distribuzzjoni statistikament robusta tal-kontroll negattiv (ara l-paragrafu 11) matul l-investigazzjonijiet tal-profiċjenza (deskritti fil-paragrafu 9), jista' jiġi aċċettat li d-distribuzzjoni tinbena matul l-ewwel testijiet ta' rutina. Dan l-approċċ għandu jsegwi r-rakkomandazzjonijiet stipulati fit-tagħrif (8) u r-riżultati tal-kontroll negattiv miksubin f'dawn l-esperimenti għandhom jibqgħu konsistenti mad-dejta ppubblikata tal-kontroll negattiv.
                     Kwalunkwe bidla fil-protokoll tal-esperimenti għandha tiġi kkunsidrata fid-dawl tal-impatt tagħha fuq kemm id-dejta li tirriżulta tibqa' konsistenti mad-database storika eżistenti tal-kontroll tal-laboratorju. Inkonsistenzi kbar biss għandhom jirriżultaw fl-istabbiliment ta' database storika ġdida tal-kontroll, fejn il-ġudizzju tal-esperti jistabbilixxi li tvarja mid-distribuzzjoni ta' qabel (ara l-paragrafu 11). Matul l-istabbiliment mill-ġdid, jaf ma jkunx hemm bżonn ta' database sħiħa tal-kontroll negattiv sabiex ikun jista' jsir test propju, diment li l-laboratorju jkun jista' juri li l-valuri tal-kontroll negattiv parallel tiegħu jibqgħu konsistenti mad-database ta' qabel jew mad-dejta ppubblikata korrispondenti.
                     Id-dejta tal-kontroll negattiv għandha tikkonsisti fl-inċidenza tal-aberrazzjoni kromożomika strutturali (esklużi d-distakki) f'kull annimal. Idealment, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % tad-distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju. Meta d-dejta tal-kontroll negattiv parallel toħroġ mil-limiti ta' kontroll ta' 95 %, din tista' titqies aċċettabbli li tiddaħħal fid-distribuzzjoni storika tal-kontroll diment li din id-dejta ma tkunx eċċezzjoni estrema u jkun hemm evidenza li s-sistema tat-test tkun “taħt kontroll” (ara l-paragrafu 11) u ebda evidenza ta' żball tekniku jew uman.
                     DESKRIZZJONI TAL-METODU
                     
                        Preparamenti
                     
                     
                        Għażla ta' speċi tal-annimali
                     
                     Għandhom jintużaw razez użati spiss fil-laboratorju ta' annimali żgħar b'saħħithom. Il-firien jintużaw l-iktar spiss, għad li l-ġrieden jistgħu jkunu adattati wkoll. Tista' tintuża kwalunkwe speċi ta' mammiferi xierqa oħra, jekk tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xjentifika fir-rapport.
                     
                        Kundizzjonijiet tal-abitazzjoni u l-għalf tal-annimali
                     
                     Għar-rodituri, it-temperatura fil-kamra tal-annimali għandha tkun ta' 22 °C (± 3 °C). Għad li, idealment, l-umdità relattiva għandha tkun ta' 50-60 %, għandha tkun tal-inqas 40 % u, idealment, ma taqbiżx is-70 % ħlief matul it-tindif tal-kamra. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, b'sekwenza ta' 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Dwar l-għalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta' ilma tax-xorb. L-għażla tad-dieta tista' tkun influwenzata mill-bżonn li tiġi żgurata taħlita xierqa ta' sustanza kimika tat-test meta tingħata minn din ir-rotta. Ir-rodituri għandhom jitrabbew fi gruppi żgħar (mhux iktar minn ħamsa f'gaġġa) tal-istess sess u grupp tat-trattament jekk ma tkun mistennija ebda mġiba aggressiva, idealment f'gaġeġ solidi mal-art bl-arrikkiment ambjentali xieraq. L-annimali jistgħu jitrabbew waħedhom biss jekk dan ikollu ġustifikazzjoni xjentifika.
                     
                        Preparazzjoni tal-annimali
                     
                     Normalment jintużaw annimali adulti żgħar b'saħħithom (għal rodituri, idealment 6-10 ġimgħat fil-bidu tat-trattament, għad li jistgħu jiġu aċċettati annimali ftit ixjaħ ukoll), u dawn jiġu assenjati b'mod aleatorju għall-gruppi tal-kontroll u tat-trattament. L-annimali individwali jiġu identifikati b'mod uniku bl-użu ta' metodu umanitarju u l-inqas invasiv possibbli (eż. b'ċirku madwarhom, tikketti, mikroċipep jew identifikazzjoni bijometrika, iżda mhux b'titqib fil-widnejn jew fis-swaba') u jitħallew iderru fil-kundizzjonijiet tal-laboratorju għal tal-inqas ħamest ijiem. Il-gaġeġ għandhom ikunu rranġati b'mod li jkunu mminimizzati l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid tal-gaġeġ. Għandha tiġi evitata kontaminazzjoni kroċjata mill-kontroll pożittiv u s-sustanza kimika tat-test. Fil-bidu tal-istudju, il-varjazzjoni fil-piż tal-annimali għandha tkun minima u ma taqbiżx ± 20 % tal-piż medju ta' kull sess.
                     
                        Preparazzjoni tad-dożi
                     
                     Is-sustanzi kimiċi solidi tat-test għandhom jinħallu jew jiġu sospiżi f'solventi jew veikoli xierqa jew jitħalltu f'dieta jew ilma tajjeb għax-xorb qabel id-dożaġġ tal-annimali. Is-sustanzi kimiċi likwidi tat-test jistgħu jiġu dożati direttament jew jiġu dilwiti qabel id-dożaġġ. Għal esponimenti bit-teħid man-nifs, is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jingħataw bħala gass, fwar jew aerosol solidu/likwidu, skont il-proprjetajiet fiżikokimiċi tagħhom. Għandhom jintużaw preparati ġodda tas-sustanza kimika tat-test sakemm id-dejta dwar l-istabilità ma turix l-aċċettabilità tal-ħżin u tiddefinixxi l-kundizzjonijiet tal-ħżin xierqa.
                     
                        Solvent/veikolu
                     
                     Is-solvent/veikolu ma għandux jipproduċi effetti tossiċi fil-livelli ta' doża użati, u ma għandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni kimika mas-sustanzi kimiċi tat-test. Jekk jintużaw solventi/veikoli oħrajn li mhumiex magħrufin sew, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun sostnuta permezz ta' dejta ta' referenza li tindika l-kompatibbiltà tagħhom. Huwa rakkomandat li, fejn jista' jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/veikolu milwiem. Eżempji ta' solventi/veikoli kompatibbli użati spiss jinkludu ilma, salina fiżjoloġika, soluzzjoni tal-metilċelluloża, soluzzjoni tal-melħ tas-sodju taċ-ċelluloża tal-karbossimetilċelluloża, żejt taż-żebbuġa u żejt tal-qamħirrum. Fin-nuqqas ta' dejta storika jew ippubblikata tal-kontroll li turi li ma huma indotti ebda aberrazzjoni strutturali jew effett dannuż ieħor minn solvent/veikolu atipiku magħżul, għandu jsir studju inizjali sabiex tiġi stabbilita l-aċċettabbiltà tal-kontroll tas-solvent/veikolu.
                     
                        Kontrolli
                     
                     
                        Kontrolli pożittivi
                     
                     Normalment għandu jkun inkluż grupp ta' annimali ttrattati b'sustanza kimika tal-kontroll pożittiv ma' kull test. Dan jista' jiġi rrinunzjat meta l-laboratorju tal-ittestjar ikollu profiċjenza murija fit-twettiq tat-test u jkun stabbilixxa medda storika tal-kontroll pożittiv. Meta ma jkunx hemm grupp tal-kontroll pożittiv parallel inkluż, il-kontrolli tal-punteġġ (lametti fissi u mhux imlewnin) għandhom ikunu inklużi f'kull esperiment. Dawn jistgħu jinkisbu billi fl-ikklassifikar tal-istudju jiddaħħlu kampjuni ta' referenza xierqa li nkisbu u nħażnu minn esperiment tal-kontroll pożittiv separat imwettaq b'mod perjodiku (eż. kull 6-18-il xahar) fil-laboratorju fejn isir it-test; pereżempju, matul l-ittestjar tal-profiċjenza u fuq bażi regolari wara, fejn ikun hemm bżonn.
                     Is-sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv għandhom jipproduċu b'mod affidabbli żieda identifikabbli fil-frekwenza taċ-ċelloli b'aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali fuq il-livell spontanju. Id-dożi tal-kontroll pożittiv għandhom jingħażlu sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx immedjatament l-identità tal-kampjuni kodifikati lil min jaqrahom. Huwa aċċettabbli li l-kontroll pożittiv jingħata b'rotta differenti mis-sustanza kimika tat-test, bl-użu ta' skeda tat-trattament differenti, u li l-kampjunar iseħħ biss f'waqt partikolari biss. Barra minn dan, jista' jiġi kkunsidrat l-użu ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv relatati mal-klassi tas-sustanzi kimiċi, meta xieraq. Fit-Tabella 1 hemm inklużi eżempji ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv.
                     
                        Tabella 1
                     
                     
                        Eżempji ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv
                     
                     
                                 Sustanza Kimika
                              
                              
                                 CASRN
                              
                           
                                 Metansulfonat tal-etil
                              
                              
                                 62-50-0
                              
                           
                                 Metansulfonat tal-metil
                              
                              
                                 66-27-3
                              
                           
                                 Nitrosurea tal-etil
                              
                              
                                 759-73-9
                              
                           
                                 Mitomiċina C
                              
                              
                                 50-07-7
                              
                           
                                 Ċiklofosfamida (monoidrat)
                              
                              
                                 50-18-0 (6055-19-2)
                              
                           
                                 Trietilenmelamina
                              
                              
                                 51-18-3
                              
                           
                        Kontrolli negattivi
                     
                     L-annimali tal-grupp tal-kontroll negattiv għandhom ikunu inklużi f'kull ħin tal-kampjunar u l-bqija jiġu mmaniġġjati bl-istess mod bħall-gruppi tat-trattament, ħlief li ma jirċivux trattament bis-sustanza kimika tat-test. Jekk jintuża solvent/veikolu fl-għoti tas-sustanza kimika tat-test, il-grupp tal-kontroll għandu jirċievi dan is-solvent/il-veikolu. Madankollu, jekk jintwera li hemm varjabbiltà konsistenti bejn l-annimali u frekwenzi ta' ċelloli b'aberrazzjonijiet strutturali permezz ta' dejta storika tal-kontroll negattiv f'kull waqt tal-kampjunar għal-laboratorju tal-ittestjar, jaf ikun hemm bżonn ta' kampjunar wieħed biss għall-kontroll negattiv. Meta jintuża kampjunar wieħed għall-kontrolli negattivi, għandu jkun l-ewwel waqt tal-kampjun użat fl-istudju.
                     PROĊEDURA
                     
                        In-numru u s-sess tal-annimali
                     
                     B'mod ġenerali, ir-rispons tal-mikronukleu huwa simili bejn l-annimali rġiel u nisa (9) u mhuwiex mistenni li dan sejjer iseħħ ukoll għal aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali; għalhekk, ħafna mill-istudji jistgħu jsiru f'kull sess. Dejta li turi d-differenzi rilevanti bejn l-irġiel u n-nisa (eż. differenzi fit-tossiċità sistemika, il-metaboliżmu, il-bijodisponibilità, it-tossiċità tal-mudullun, eċċ. inkluż, eż. studju għat-tiftix tal-medda) tħeġġeġ l-użu taż-żewġ sessi. F'dan il-każ, jaf ikun xieraq li jsir studju fiż-żewġ sessi, eż. bħala parti minn studju ripetut tat-tossiċità tad-doża. Jaf ikun xieraq li jintuża d-disinn fattorjali f'każ li jintużaw iż-żewġ sessi. Dettalji dwar kif tiġi analizzata d-dejta bl-użu ta' dan id-disinn huma mogħtijin fl-Appendiċi 2.
                     Id-daqsijiet tal-grupp fil-bidu tal-istudju għandhom jiġu stabbiliti bil-għan li jiġu pprovduti tal-inqas 5 annimali analizzabbli ta' sess wieħed, jew ta' kull sess jekk jintużaw it-tnejn, għal kull grupp. Fejn l-esponiment umana għas-sustanzi kimiċi tista' tkun speċifika għas-sess, bħal ma jseħħ pereżempju għal ċerti prodotti farmaċewtiċi, it-test għandu jsir b'annimali tas-sess xieraq. Bħala gwida għal rekwiżiti tipiċi massimi tal-annimali, studju fil-mudullun f'żewġ waqtiet tal-kampjunar bi tliet gruppi tad-doża u grupp tal-kontroll negattiv parallel, flimkien ma' grupp tal-kontroll pożittiv (kull grupp imsawwar minn ħames annimali ta' sess uniku), ikun jeħtieġ 45 annimal.
                     
                        Livelli tad-doża
                     
                     Jekk isir studju preliminari għat-tiftix tal-medda għaliex ma jkun hemm ebda dejta xierqa diġà disponibbli sabiex tgħin fl-għażla tad-doża, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, bl-użu tal-istess speċijiet, razza, sess u reġim tat-trattament li jrid jintuża fl-istudju ewlieni (10). L-istudju għandu jkollu l-għan li jidentifika d-doża massima tollerata (MTD), definita bħala l-ogħla doża li sejra tiġi tollerata mingħajr evidenza ta' tossiċità li tillimita l-istudju, b'rabta mad-durata tal-perjodu tal-istudju (pereżempju, billi tiġi indotta dipressjoni tal-piż tal-ġisem jew ċitotossiċità tas-sistema ematopoetika), iżda mhux mewt jew evidenza ta' uġigħ, tbatija jew diffikultà li jeħtieġu ewtanażja umanitarja (11).
                     L-ogħla doża tista' tiġi definita wkoll bħala doża li tipproduċi xi indikazzjoni ta' tossiċità għall-mudullun.
                     Sustanzi kimiċi li jesibixxu saturazzjoni tal-proprjetajiet tossikokinetiċi, jew jinduċu proċessi ta' ditossifikazzjoni li jistgħu jwasslu għal tnaqqis fl-esponiment wara trattament fit-tul jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta' ssettar tad-dożi u għandhom jiġu evalwati fuq bażi ta' każ b'każ.
                     Sabiex tinkiseb informazzjoni dwar ir-rispons għad-doża, studju sħiħ għandu jinkludi grupp tal-kontroll negattiv u tal-inqas tliet livelli ta' dożi ġeneralment separati b'fattur ta' 2, iżda mhux ikbar minn 4. Jekk is-sustanza kimika tat-test ma tipproduċix tossiċità fi studju għat-tiftix tal-medda jew fuq il-bażi tad-dejta eżistenti, l-ogħla doża għal amministrazzjoni waħda għandha tkun ta' 2 000 mg/kg tal-piż tal-ġisem. Madankollu, jekk is-sustanza kimika tat-test tikkaġuna tossiċità, l-MTD għandha tkun l-ogħla doża mogħtija u l-livelli tad-doża użati idealment għandhom ikopru medda mill-massimu sa doża li tipproduċi ftit tossiċità jew ebda tossiċità. Meta tiġi osservata tossiċità tat-tessut fil-mira (il-mudullun) fil-livelli tad-doża kollha ttestjati, huwa rakkomandat li jsir studju ulterjuri f'dożi mhux tossiċi. Studji li jkollhom l-għan li jikkaratterizzaw iktar bis-sħiħ l-informazzjoni kwantitattiva dwar ir-rispons għad-doża jistgħu jeħtieġu gruppi tad-doża addizzjonali. Għal ċerti tipi ta' sustanzi kimiċi tat-test (eż. prodotti farmaċewtiċi għall-bniedem) koperti minn rekwiżiti speċifiċi, dawn il-limiti jistgħu jvarjaw.
                     
                        Test tal-limitu
                     
                     Jekk l-esperimenti għat-tiftix tal-medda, jew dejta eżistenti minn razez ta' annimali relatati, jindikaw li reġim tat-trattament ta' tal-inqas id-doża limitu (deskritta hawn taħt) ma jipproduċi ebda effett tossiku osservabbli (inkluż ebda dipressjoni tal-proliferazzjoni tal-mudullun jew evidenza oħra ta' ċitotossiċità tat-tessut fil-mira), u jekk ma tkunx mistennija ġenotossiċità fuq il-bażi ta' studji in vitro tal-ġenotossiċità jew dejta minn sustanzi kimiċi relatati strutturalment, f'dak il-każ jaf ma jitqiesx neċessarju li jsir studju sħiħ li juża tliet livelli tad-doża, diment li jkun intwera li s-sustanza (jew sustanzi) kimika tilħaq it-tessut fil-mira (il-mudullun). F'dawn il-każijiet, livell tad-doża wieħed, fid-doża limitu, jista' jkun biżżejjed. Għal perjodu ta' amministrazzjoni ta' > 14-il jum, id-doża limitu hija ta' 1 000 mg/kg piż tal-ġisem/jum. Għal perjodi ta' amministrazzjoni ta' 14-il jum jew inqas, id-doża limitu hija 2 000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum.
                     
                        Amministrazzjoni tad-dożi
                     
                     Ir-rotta antiċipata tal-esponiment tal-bniedem għandha tiġi kkunsidrata meta jitfassal assaġġ. Għaldaqstant, jistgħu jingħażlu rotot tal-esponiment bħal rotta djetetika, mal-ilma tax-xorb, subkuntanja topika, fil-vini, orali (gavage), mat-teħid man-nifs, intratrakeali, jew b'impjant, kif iġġustifikati. Fi kwalunke każ, ir-rotta għandha tingħażel sabiex jiġi żgurat esponiment adegwat tat-tessut(i) fil-mira. Ġeneralment ma tkunx rakkomandata injezzjoni intraperitoneali peress li mhijiex rotta intiża ta' esponiment tal-bniedem, u għandha tintuża biss b'ġustifikazzjoni xjentifika speċifika. Jekk is-sustanza kimika tat-test tiġi mħallta fid-dieta jew l-ilma tax-xorb, speċjalment fil-każ ta' dożaġġ wieħed, wieħed għandu joqgħod attent li l-ħin bejn il-konsum tal-ikel u l-ilma u l-kampjunar ikun biżżejjed sabiex ikunu jistgħu jiġu identifikati l-effetti (ara l-paragrafi 33-34). Il-volum massimu ta' likwidu li jista' jingħata b'gavage jew injezzjoni f'darba jiddependi mid-daqs tal-annimal tat-test. Normalment il-volum ma għandux ikun aktar minn 1 ml/100 g tal-piż tal-ġisem ħlief fil-każ ta' soluzzjonijiet milwiema fejn jistgħu jintużaw massimu ta' 2 ml/100 g tal-piż tal-ġisem. L-użu ta' volumi ikbar minn dan għandu jkun iġġustifikat. Ħlief għal sustanzi kimiċi tat-test irritanti jew korrużivi, li normalment jipproduċu effetti aggravati f'konċentrazzjonijiet ikbar, il-varjabbiltà fil-volum tat-test għandu jitnaqqas kemm jista' jkun billi tiġi aġġustata l-konċentrazzjoni sabiex tiġi żgurata amministrazzjoni ta' volum kostanti b'rabta mal-piż tal-ġisem fil-livelli kollha tad-doża.
                     
                        Skeda tat-trattament
                     
                     Normalment is-sustanzi kimiċi tat-test jingħataw bħala trattament wieħed, iżda jistgħu jingħataw bħala doża maqsuma (jiġifieri żewġ trattamenti jew iktar fl-istess ġurnata separati b'mhux iktar minn sagħtejn jew tlieta) sabiex jiġi ffaċilitat l-għoti ta' volum kbir. F'dawn iċ-ċirkustanzi, jew meta s-sustanza kimika tat-test tingħata bit-teħid man-nifs, il-ħin tal-kampjunar għandu jiġi skedat fuq il-bażi tal-ħin tal-aħħar dożaġġ jew tmiem l-esponiment.
                     Ftit li xejn hemm dejta disponibbli dwar l-adegwatezza ta' protokoll ta' doża ripetuta għal dan it-test. Madankollu, fiċ-ċirkustanzi li fihom ikun xieraq li jiġi integrat dan it-test b'test dwar it-tossiċità b'doża ripetuta, wieħed għandu joqgħod attent li jevita milli jintilfu ċelloli mitotiċi bi ħsara fil-kromożomi, xi ħaġa li tista' sseħħ b'dożi tossiċi. Integrazzjoni bħal din tkun aċċettabbli meta l-ogħla doża tkun ikbar jew daqs id-doża limitu (ara l-paragrafu 29) u grupp tad-doża jingħata d-doża limitu għad-durata tal-perjodu tat-trattament. It-test tal-mikronukleu (il-metodu ta' ttestjar B.12) għandu jitqies bħala t-test in vivo tal-għażla għal aberrazzjonijiet kromożomiċi meta tkun mixtieqa integrazzjoni ma' studji oħrajn.
                     Għandhom jittieħdu kampjuni tal-mudullun f'żewġ ħinijiet separati wara trattamenti uniċi. Għal rodituri, l-ewwel intervall ta' kampjunar għandu jkun il-ħin neċessarju sabiex jgħaddu darba u nofs it-tul taċ-ċiklu normali taċ-ċelloli (b'dan tal-aħħar li normalment ikun 12-18-il siegħa wara l-perjodu tat-trattament). Ladarba l-ħin meħtieġ għall-bidu u l-metaboliżmu tas-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test kif ukoll l-effetti tagħha fuq il-kinetika taċ-ċikli taċ-ċelloli jistgħu jaffettwaw il-ħin ottimali sabiex wieħed jintebaħ bl-aberrazzjoni kromożomika, huwa rakkomandat li jittieħed kampjun ieħor 24 siegħa wara li jkun ittieħed l-ewwel kampjun. Fl-ewwel ħin tal-kampjunar, il-gruppi kollha tad-doża għandhom jiġu ttrattati u jinġabru kampjuni għall-analiżi; madankollu, fil-ħin(ijiet) tal-kampjunar iktar tard, l-ogħla doża biss trid tingħata. Jekk jintużaw reġimi tad-dożi ta' iktar minn ġurnata fuq il-bażi ta' ġustifikazzjoni xjentifika, ġeneralment għandu jintuża ħin tal-kampjunar wieħed sa madwar darba u nofs it-tul taċ-ċiklu normali taċ-ċelloli wara t-trattament finali.
                     Wara t-trattament u qabel il-ġbir tal-kampjun, l-annimali jingħataw injezzjoni intraperitoneali b'doża xierqa ta' inibitur tal-metafażi (eż. kolċemid jew kolċisina), u l-kampjuni jinġabru f'intervall xieraq wara. Għall-ġrieden, dan l-intervall huwa ta' madwar 3-5 qabel il-ġbir u, għall-firien, huwa sagħtejn sa 5 sigħat. Iċ-ċelloli jinġabru mill-mudullun u jitkabbru, jiġu ffissati u mlewna, u analizzati għal aberrazzjonijiet kromożomiċi (12).
                     
                        Osservazzjonijiet
                     
                     Għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi ġenerali fuq l-annimali tat-test u s-sinjali kliniċi għandhom jiġu rreġistrati tal-inqas darba kuljum, idealment fl-istess ħin(ijiet) kuljum u filwaqt li jiġi kkunsidrat il-perjodu ta' wara d-dożaġġ li fih sejrin jidhru l-iktar l-effetti antiċipati. Tal-inqas darbtejn kuljum matul il-perjodu ta' dożaġġ, l-annimali kollha għandhom ikunu osservati għal morbidità u mortalità. L-annimali kollha għandhom jintiżnu fil-bidu tal-istudju, tal-inqas darba fil-ġimgħa matul l-istudji b'doża ripetuta, u fil-fażi tal-ewtanażja. Fi studji twal tal-inqas ġimgħa, il-kejliet tal-konsum tal-ikel għandhom isiru tal-inqas kull ġimgħa. Jekk is-sustanza kimika tat-test tingħata mal-ilma tax-xorb, il-konsum tal-ilma għandu jitkejjel f'kull bidla tal-ilma u tal-inqas darba fil-ġimgħa. L-annimali li jesibixxu indikaturi mhux letali ta' tossiċità eċċessiva għandhom jiġu ewtanazzati b'mod umanitarju qabel jintemm il-perjodu ta' ttestjar (11).
                     
                        Esponiment tat-tessut fil-mira
                     
                     Għandu jittieħed kampjun tad-demm f'ħin(ijiet) xieraq sabiex ikunu jistgħu jiġu mixtarra l-livelli ta' plażma tas-sustanzi kimiċi tat-test bil-għan li jintwera li seħħet l-esponiment tal-mudullun, meta dan ikun iġġustifikat u meta ma jkunx hemm dejta oħra dwar l-esponiment (ara l-paragrafu 44).
                     
                        Preparazzjoni tal-mudullun u tal-kromożomi
                     
                     Eżatt wara l-ewtanażja umanitarja, jittieħdu ċelloli tal-mudullun mill-femori jew mit-tibji tal-annimali, imbagħad dawn jiġu esposti għal soluzzjoni ipotonika u jiġu ffissati. Imbagħad iċ-ċelloli fil-metafażi jitferrxu fuq lametti u jiġu mlewnin billi jintużaw metodi stabbiliti (ara (3) (12)).
                     
                        Analiżi
                     
                     Il-lametti kollha, inklużi dawk tal-kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati b'mod indipendenti qabel l-analiżi u għandhom jitqassmu b'mod aleatorju sabiex min jaqrahom ma jkunx jaf x'inhi l-kundizzjoni tat-trattament.
                     L-indiċi mitotiku għandu jiġi stabbilit bħala miżura ta' ċitotossiċita f'għall-inqas 1 000 ċellula għal kull annimal għal kull annimal trattat għall-annimali ttrattati (inklużi kontrolli pożittivi), mhux ittrattati jew l-annimali tal-kontroll negattiv tal-veikolu/solvent kollha.
                     Għandhom jiġu analizzati tal-inqas 200 metafażi għal kull annimal għal aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali, inklużi u esklużi distakki (6). Madankollu, jekk id-database storika tal-kontroll negattiv tindika li l-frekwenza medja ta' sfond ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali hija <1 % fil-laboratorju tal-ittestjar, għandu jiġi kkunsidrat l-ikklassifiar ta' ċelloli addizzjonali. Aberrazzjonijiet tat-tip kromatid u kromożomiku għandhom jiġu rreġistrati għalihom u jiġu kklassifikati skont is-sottotipi (ksur, skambji). Il-proċeduri li jintużaw fil-laboratorju għandhom jiżguraw li l-analiżi tal-aberrazzjonijiet kromożomiċi ssir minn persuni mħarrġin sew fl-għoti ta' punteġġi u huma evalwati bejn il-pari, jekk xieraq. Fid-dawl tal-fatt li l-proċeduri ta' preparazzjoni tal-lametti spiss jirriżultaw fil-ksur ta' sehem mill-metafażijiet li jirriżulta fit-telf ta' kromożomi, iċ-ċelloli li jingħataw punteġġ għandu jkun fihom għadd ta' ċentromeri ta' mhux inqas minn 2n±2, fejn n hija n-numru aplojdi ta' kromożomi għal dik l-ispeċi.
                     DEJTA U RAPPORTAR
                     
                        Trattament tar-riżultati
                     
                     Dejta dwar l-annimali individwali għandha tiġi ppreżentata f'forma ta' tabelli. L-indiċi mitotiku, l-għadd ta' ċelloli tal-metafażi li ngħataw punteġġ, in-numru ta' aberrazzjonijiet għal kull ċellola fil-metafażi u l-perċentwal ta' ċelloli b'aberrazzjoni(jiet) kromożomika strutturali għandhom jiġu evalwati għal kull annimal. Għandhom jiġu elenkati t-tipi differenti ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali bl-għadd u l-frekwenzi tagħhom għal gruppi tat-trattament u tal-kontroll. Id-distakki, kif ukoll iċ-ċelloli poliplojdi u ċ-ċelloli bi kromożomi endoreduplikati għandhom jiġu rreġistrati b'mod separat. Il-frekwenza tad-distakki tiġi rrapportata iżda, ġeneralment, ma tkunx inkluża fl-analiżi tal-frekwenza totali ta' aberrazzjonijiet strutturali. Jekk ma hemmx evidenza ta' differenza fir-rispons bejn is-sessi, id-dejta tista' tingħaqad f'daqqa għall-analiżi statistika. Għandha tiġi rrapportata dejta dwar it-tossiċità tal-annimali u s-sinjali kliniċi wkoll.
                     
                        Kriterji ta' Aċċettabilità
                     
                     Il-kriterji li ġejjin jistabbilixxu l-aċċettabilità tat-test:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Huwa aċċettat li d-dejta tal-kontroll negattiv parallel tiżdied fid-database storika tal-kontroll tal-laboratorju (ara l-paragrafi 11-14);
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 Il-kontrolli pożittivi paralleli jew il-kontrolli tal-punteġġ għandhom jinduċu risponsi li huma kompatibbli ma' dawk iġġenerati fid-database storika tal-kontroll pożittiv u jipproduċu żieda statistikament sinifikanti meta mqabblin mal-kontroll negattiv (ara l-paragrafi 20-21);
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 Ġie analizzat in-numru xieraq ta' dożi u ċelloli;
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 Il-kriterji għall-għażla tal-ogħla doża huma konsistenti ma' dawk deskritti fil-paragrafi 25-28.
                              
                           
                        Evalwazzjoni u Interpretazzjoni tar-Riżultati
                     
                     Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva biċ-ċar jekk:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Tal-inqas wieħed mill-gruppi tat-trattament jesibixxi żieda statistikament sinifikanti fil-frekwenza taċ-ċelloli b'aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali (esklużi distakki) meta mqabbel mal-kontroll negattiv parallel,
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 Din iż-żieda hija marbuta mad-doża tal-inqas f'mument tal-kampjunar wieħed meta tiġi evalwata b'test tat-tendenza xieraq, u
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 Kwalunkwe wieħed mir-riżultati jaqa' barra mid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson).
                              
                           Jekk l-ogħla doża biss tiġi eżaminata f'mument tal-kampjunar partikolari, sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva biċ-ċar jekk ikun hemm żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv parallel u r-riżultati jaqgħu barra mid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson). Ir-rakkomandazzjonijiet għall-metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (13). Meta ssir analiżi tar-rispons għad-doża, għandhom jiġu analizzati tal-inqas tliet gruppi tad-doża. It-testijiet statistiċi għandhom jużaw l-annimal bħala l-unità sperimentali. Ir-riżultati pożittivi fit-test għall-aberrazzjonijiet kromożomiċi jindikaw li s-sustanza kimika tat-test tinduċi aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali fil-mudullun tal-ispeċi ttestjata.
                     Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija negattiva biċ-ċar jekk, fil-kundizzjonijiet sperimentali kollha eżaminati:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 L-ebda wieħed mill-gruppi tat-trattament ma jesibixxi żieda statistikament sinifikanti fil-frekwenza taċ-ċelloli b'aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali (esklużi distakki) meta mqabbel mal-kontroll negattiv parallel,
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 Ma hemm l-ebda żieda marbuta mad-doża fi kwalunkwe ħin tal-kampjunar meta tiġi evalwata b'test xieraq tat-tendenzi,
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 Ir-riżultati kollha jaqgħu fid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson), u
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 Seħħ esponiment tal-mudullun għas-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test.
                              
                           Ir-rakkomandazzjonijiet għall-iktar metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (13). Evidenza ta' esponiment tal-mudullun għal sustanza kimika tat-test tista' tinkludi dipressjoni tal-indiċi mitotiku jew kejl tal-livelli ta' plażma jew tad-demm tas-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test. Fil-każ ta' amministrazzjoni fil-vina, ma hemmx bżonn ta' evidenza ta' esponiment. Inkella, tista' tintuża dejta ADME, miksuba fi studju indipendenti bl-użu tal-istess rotta u l-istess speċi, sabiex jintwera li seħħ esponiment tal-mudullun. Ir-riżultati negattivi jindikaw li, fil-kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza kimika tat-test ma tinduċix aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali fil-mudullun tal-ispeċi ttestjata.
                     Ma hemm l-ebda ħtieġa għal verifika ta' rispons posittiv jew negattiv ċar.
                     F'każijiet li fihom ir-rispons la jkun negattiv ċar u lanqas pożittiv ċar u sabiex tgħin fl-istabbiliment tar-rilevanza bijoloġika ta' riżultat (eż. żieda batuta jew limitata), id-dejta għandha tiġi evalwata b'ġudizzju espert u/jew b'investigazzjonijiet ulterjuri tal-esperimenti eżistenti mwettqin. F'ċerti każijiet, l-analiżi ta' iktar ċelloli jew it-twettiq ta' esperiment ripetut bl-użu ta' kundizzjonijiet modifikati tal-esperiment jistgħu jkunu siewja.
                     F'każijiet rari, anki wara investigazzjonijiet ulterjuri, id-dejta sejra tipprekludi konklużjoni li s-sustanza kimika tat-test tipproduċi riżultati pożittivi jew negattivi u, għalhekk, l-istudju jiġi konkluż bħala ekwivoku.
                     Il-frekwenzi ta' metafażijiet endoreduplikati u poliplojdi fost il-metafażijiet totali għandhom jiġu rreġistrati b'mod separat. Żieda fin-numru ta' ċelloli poliplojdi/endoreduplikati tista' tindika li s-sustanza kimika tat-test għandha l-potenzjal li tinibixxi l-proċessi mitotiċi jew il-progressjoni taċ-ċiklu taċ-ċelloli (ara l-paragrafu 3).
                     
                        Rapport tat-test
                     
                     Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
                     
                        Sommarju
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanza kimika tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             is-sors, in-numru tal-lott, id-data ta' limitu għall-użu, jekk disponibbli
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test, jekk magħrufa.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanza monokostitwenti:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             id-dehra fiżika, is-solubilità fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanzi multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             ikkaratterizzati safejn possibbli mill-identità kimika (ara iktar 'il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             il-ġustifikazzjoni għall-għażla tal-veikolu.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             is-solubilità u l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent/veikolu, jekk magħrufin;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-preparazzjoni tal-formulazzjonijiet djetetiċi, tal-ilma tajjeb għax-xorb jew tat-teħid man-nifs;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-determinazzjonijiet analitiċi dwar il-formulazzjonijiet (eż., l-istabilità, l-omoġenità, il-konċentrazzjonijiet nominali), meta jsiru.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    L-annimali tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             l-ispeċi/ir-razza użata u ġustifikazzjoni għall-għażla;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             l-għadd, l-età u s-sess tal-annimali;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             is-sors, il-kundizzjonijiet tal-gaġeg, id-dieta, eċċ.;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodu għall-identifikazzjoni unika tal-annimali;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             għal studji fuq terminu qasir: il-piż individwali tal-annimali fil-bidu u fi tmiem it-test; għal studji itwal minn ġimgħa: il-piżijiet tal-ġisem individwali matul l-istudju u l-konsum ta' ikel. Il-medda tal-piż individwali, id-devjazzjoni medja u standard għal kull grupp għandhom ikunu inklużi.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kundizzjonijiet tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kontroll pożittiv u dak negattiv (veikolu/solvent);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dejta minn studju għat-tiftix tal-medda, jekk ikun sar;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ir-raġuni għall-għażla tal-livell tad-doża;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dettalji dwar l-għoti tas-sustanza kimika tat-test;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ir-raġuni għar-rotta u d-durata tal-għoti;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metodi għall-verifika li s-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test laħqet iċ-ċirkulazzjoni ġenerali jew il-mudullun;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-doża propja (mg/kg piż tal-ġisem/jum) ikkalkolata mill-konċentrazzjoni (ppm) u l-konsum tas-sustanza kimika tat-test fid-dieta/ilma tax-xorb, jekk applikabbli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dettalji dwar il-kwalità tal-ikel u tal-ilma;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodu tal-ewtanażja;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodu tal-analġeżija (meta tintuża);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             deskrizzjoni dettaljata tat-trattament u l-iskedi tal-kampjunar u ġustifikazzjonijiet għall-għażliet;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodi tal-preparazzjoni tal-lametti;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodi ta' kejl tat-tossiċità;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             l-identità tal-inibitur tal-metafażi, il-konċentrazzjoni, id-doża u l-ħin tal-għoti tiegħu qabel il-kampjunar;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-proċeduri għall-iżolament u l-preservazzjoni tat-tessuti;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kriterji għall-ikklassifikar tal-aberrazzjonijiet;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             in-numru ta' ċelloli fil-metafażi analizzati għal kull annimal u n-numru ta' ċelloli analizzati għad-determinazzjoni tal-indiċi mitotiku;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kriterji għall-aċċettabilità tal-istudju;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kriterji sabiex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew inkonklużivi.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ir-riżultati:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kundizzjoni tal-annimali qabel u matul il-perjodu tat-test, inklużi sinjali tat-tossiċità;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             l-indiċi mitotiku, mogħti b'mod separat għal kull annimal;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             it-tip u n-numru ta' aberrazzjonijiet u ta' ċelloli aberranti, mogħti b'mod separat għal kull annimal;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             in-numru totali ta' aberrazzjonijiet għal kull grupp bil-medji u d-devjazzjonijiet standard;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             in-numru ta' ċelloli b'aberrazzjonijiet għal kull grupp bil-medji u d-devjazzjonijiet standard;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bidliet fil-plojdija, inklużi l-frekwenzi ta' ċelloli poliplojdi u/jew endoreduplikati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ir-relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn possibbli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             l-analiżijiet statistiċi u l-metodu applikat;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dejta li ssostni l-fatt li seħħ l-esponiment tal-mudullun;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dejta tal-kontroll negattiv parallel u tal-kontroll pożittiv bil-meded, il-medji u d-devjazzjonijiet standard;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-dejta storika tal-kontroll negattiv u pożittiv b'meded, medji u devjazzjonijiet standard, u limiti ta' kontroll ta' 95 % għad-distribuzzjoni, kif ukoll il-perjodu ta' żmien u n-numru ta' osservazzjonijiet;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kriterji ssodisfati għal rispons pożittiv jew negattiv.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Diskussjoni tar-riżultati.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Konklużjoni.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Referenzi.
                                 
                              
                           TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Adler, I.D. (1984), “Cytogenetic Tests in Mammals”, in Mutagenicity Testing: A Practical Approach, Venittand, S., J.M. Parry (eds.), IRL Press, Washington, DC, pp. 275-306.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Preston, R.J. et al. (1987), Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells, Mutation Research, Vol. 189/2, pp. 157-165.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Richold, M. et al. (1990), “In Vivo Cytogenetics Assays”, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 115-141.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Tice, R.R. et al. (1994), Report from the working group on the in vivo mammalian bone marrow chromosomal aberration test, Mutation Research, Vol. 312/3, pp. 305-312.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Adler, I.D. et al. (1998), Recommendations for statistical designs of in vivo mutagenicity tests with regard to subsequent statistical analysis, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 417/1, pp. 19-30.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 293-304.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, Vol. 7/5, pp. 313-319.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 OECD (2000), “Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No19, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Pacchierotti, F., V. Stocchi (2013), Analysis of chromosome aberrations in somatic and germ cells of the mouse, Methods in Molecular Biology, Vol. 1044, pp. 147-163.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Lovell, D.P. et al. (1989), “Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays”, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.
                              
                           
                        Appendiċi 1
                        DEFINIZZJONIJIET
                        
                           
                              Anewplojdija
                           : Kwalunkwe devjazzjoni mill-għadd ta' diplojdi (jew aplojdi) normali ta' kromożomi minn kromożomu wieħed jew aktar, iżda mhux minn multipli tas-sett (jew settijiet) kollu ta' kromożomi (ara poliplojdija).
                        
                           
                              Ċentromeru
                           : Reġjun(i) ta' kromożomu li miegħu huma assoċjati fibri rqaq waqt id-diviżjoni taċ-ċellola, li jippermettu l-moviment b'ċertu ordni ta' kromożomi sekondarji għall-poli ta' ċelloli sekondarji.
                        
                           
                              Sustanza kimika
                           : sustanza jew taħlita.
                        
                           
                              Aberrazzjoni tat-tip tal-kromatidi
                           : ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur ta' kromatidi singoli jew ksur u għaqda mill-ġdid bejn kromatidi.
                        
                           
                              Aberrazzjoni tat-tip tal-kromożomi
                           : Ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur, jew ksur u għaqda mill-ġdid, taż-żewġ kromatidi f'sit identiku.
                        
                           
                              Endoreduplikazzjoni
                           : Proċess li bih wara perjodu S tar-replikazzjoni tad-DNA, in-nukleu ma jidħolx f'mitożi iżda jibda perjodu S ieħor. Ir-riżultat huwa kromożomi b'4, 8, 16… il-kromatid.
                        
                           
                              Distakk
                           : Leżjoni akromatika iżgħar mill-wisgħa ta' kromatid wieħed, u b'misallinjament minimu tal-kromatidi.
                        
                           
                              Indiċi mitotiku
                           : Il-proporzjon bejn in-numru ta' ċelloli f'mitożi u n-numru totali ta' ċelloli f'popolazzjoni, li huwa kejl tal-istatus tal-proliferazzjoni ta' dik il-popolazzjoni taċ-ċelloli.
                        
                           
                              Aberrazzjoni numerika
                           : Bidla fin-numru ta' kromożomi min-numru karatteristku normali ta' annimali użati (anewplojdija).
                        
                           
                              Poliplojdija
                           : Aberrazzjoni kromożomika numerika li tinvolvi bidla fin-numru tas-sett sħiħ ta' kromożomi, għall-kuntrarju ta' bidla numerika fil-parti tas-sett ta' kromożomi (ara anewplojdija).
                        
                           
                              Aberrazzjoni kromożomika strutturali
                           : Bidla fl-istruttura tal-kromożomi li wieħed jinduna biha bl-eżami mikroskopiku tal-istadju metafażiku tad-diviżjoni taċ-ċelluoli, osservati bħala tħassir u biċċiet, bidliet minn ġewwa u bidliet bejniethom.
                        
                           
                              Sustanza kimika tat-test
                           : Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta' dan il-metodu ta' ttestjar.
                     
                     
                        Appendiċi 2
                        
                           ID-DISINN FATTORJALI GĦALL-IDENTIFIKAZZJONI TAD-DIFFERENZI FIS-SESSI FL-ASSAĠĠ IN VIVO TAL-ABERRAZZJONI KROMOŻOMIKA
                        
                        
                           Id-disinn fattorjali u l-analiżi tiegħu
                        
                        F'dan id-disinn, jiġu ttestjati tal-inqas 5 irġiel u 5 nisa f'kull livell tal-konċentrazzjoni li jirriżultaw f'disinn li juża tal-inqas 40 annimal (20 raġel u 20 mara, flimkien ma' kontrolli pożittivi rilevanti).
                        Id-disinn, li huwa wieħed mill-iktar disinni fattorjali sempliċi, huwa ekwivalenti għal analiżi bidirezzjonali tal-varjanza bis-sess u l-livell ta' konċentrazzjoni li huma l-effetti ewlenin. Id-dejta tista' tiġi analizzata billi jintużaw pakketti ta' softwer statistiku standard bħal SPSS, SAS, STATA, Genstat kif ukoll bl-użu ta' R.
                        L-analiżi tagħmel partizzjoni tal-varjabbiltà fis-sett ta' dejta bejn is-sessi, bejn il-konċentrazzjonijiet u b'rabta mal-interazzjoni bejn is-sessi u l-konċentrazzjonijiet. Kull wieħed mit-termini jiġi ttestjat kontra stima tal-varjabbiltà bejn l-annimali rreplikati fi ħdan il-gruppi ta' annimali tal-istess sess bl-istess konċentrazzjoni. Id-dettalji sħaħ dwar il-metodoloġija sottostanti huma disponibbli f'ħafna kotba standard dwar l-istatistika (ara r-referenzi) u fil-faċilitajiet tal-għajnuna pprovduti mal-pakketti statistiċi.
                        L-analiżi tkompli billi ssir spezzjoni tat-terminu ta' interazzjoni sess x konċentrazzjoni fit-tabella ANOVA (5). Fin-nuqqas ta' terminu ta' interazzjoni sinifikanti, il-valuri kombinati bejn is-sessi jew fost il-livelli ta' konċentrazzjoni jipprovdu testijiet statistiċi validi bejn il-livelli bbażati fuq it-terminu tal-varjabbiltà tar-raggruppati fi ħdan il-grupp tal-ANOVA.
                        L-analiżi tkompli billi tagħmel partizzjoni bejn l-istima tal-varjabbiltà bejn il-konċentrazzjonijiet f'kuntrasti li jipprovdu għal test għal kuntrasti lineari u kwadratiċi tar-risponsi bejn il-livelli tal-konċentrazzjonijiet. Meta jkun hemm interazzjoni sinifikanti sess x konċentrazzjoni, tista' ssir partizzjoni ta' dan it-terminu f'kuntrasti ta' interazzjoni lineari x sess u kwadradiku x sess ukoll. Dawn it-termini jipprovdu testijiet ta' jekk ir-risponsi għall-konċentrazzjoni humiex paralleli għaż-żewġ sessi jew jekk hemmx rispons differenzjali bejn iż-żewġ sessi.
                        L-istima tal-varjabbiltà tal-miġburin fi ħdan il-grupp tista' tintuża sabiex tipprovdi testijiet bejn il-pari tad-differenza bejn il-medji. Dawn il-paraguni jistgħu jsiru bejn il-medji għaż-żewġ sessi u bejn il-medji għal-livell ta' konċentrazzjoni differenti bħal fil-każ tal-paraguni mal-livelli tal-kontroll negattiv. F'dawk il-każijiet li fihom ikun hemm interazzjoni sinifikanti, jistgħu jsiru paraguni bejn il-medji ta' konċentrazzjonijiet differenti fi ħdan sess jew bejn il-medji tas-sessi fl-istess konċentrazzjoni.
                        
                           Referenzi
                        
                        Hemm ħafna kotba dwar l-istatistika li jiddiskutu t-teorija, id-disinn, il-metodoloġija, l-analiżi u l-interpretazzjoni tad-disinni fattorjali li jvarjaw mill-iktar analiżijiet b'żewġ fatturi sempliċi sal-iktar forom kumplessi użati fil-metodoloġija dwar id-Disinn tal-Esperiment. Din li ġejja mhijiex lista eżawrjenti. Uħud mill-kotba jipprovdu eżempji maħdumin ta' disinni komparabbli, f'ċerti każijiet b'kodiċi għat-twettiq tal-analiżijiet bl-użu ta' diversi pakketti ta' softwer.
                        
                                     
                                 
                                 
                                    Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              ”
               
                     (5)
                  
                  
                     Fil-Parti B, il-Kapitolu B.12 huwa sostitwit b'dan li ġej:
                     “B.12   Test Tal-Mikronukleu Fl-Eritroċiti Mammiferi
                     
                     INTRODUZZJONI
                     Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test 474 (2016) tal-OECD Huwa parti minn sensiela ta' metodi ta' ttestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika. Ġie żviluppat dokument tal-OECD li jipprovdi informazzjoni sintetika dwar l-ittestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika u ħarsa ġenerali dwar it-tibdil reċenti la sar f'dawk il-Linji Gwida tat-Test (1).
                     It-test in vivo tal-mikronukleu tal-mammiferi huwa ta' rilevanza partikolari għall-valutazzjoni tal-ġenotossiċità għaliex, għad li jvarja bejn l-ispeċijiet, il-fatturi tal-metaboliżmu in vivo, il-farmakokinetiċi u l-proċessi ta' tiswija tad-DNA huma attivi u jikkontribwixxu għar-risponsi. Assaġġ in vivo huwa siewi wkoll sabiex tkun tista' ssir investigazzjoni ulterjuri tal-ġenotossiċità żvelata minn sistema in vitro.
                     It-test in vivo tal-mikronukleu tal-mammiferi jintuża għall-qbid ta' ħsara indotta mis-sustanza kimika tat-test fil-kromożomi jew l-apparat mitotiku tal-eritroblasti. It-test jevalwa l-formulazzjoni tal-mikronukleu fl-eritroċiti tal-kampjun jew fil-mudullun jew fiċ-ċelloli tad-demm periferali tal-annimali, normalment rodituri.
                     L-għan tat-test tal-mikronukleu huwa li jidentifika sustanzi kimiċi li jikkawżaw ħsara ċitoġenetika li tirriżulta fil-formazzjoni ta' mikronukleji li jkun fihom biċċiet ta' residwi ta' kromożomi jew kromożomi sħaħ.
                     Meta eritroblast tal-mudullun jiżviluppa f'eritroċita immatura (kultant imsejħa wkoll retikuloċita jew eritroċita polikromatika), in-nukleu ewlieni jiġi estruż; kwalunkwe mikronukleu li ġie fformat jista' jitħalla fiċ-ċitoplażma. Il-viżwalizzazzjoni jew id-detezzjoni tal-mikronukleji hija ffaċilitata f'dawn iċ-ċelloli għax ma għandhomx nukleu ewlieni. Żieda fil-frekwenza ta' eritroċiti immaturi mikronukleati f'annimali ttrattati hija indikazzjoni ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali jew numeriċi indotti.
                     Eritroċiti mikronukleati fformati ġodda jiġu identifikati u kkwantifikati bit-tilwin segwit minn punteġġar viżwali bl-użu ta' mikroskopju, jew b'analiżi awtomatizzata. L-għadd ta' biżżejjed eritroċiti immaturi fid-demm periferali jew fil-mudullun ta' annimali adulti huwa ffaċilitat ħafna bl-użu ta' pjattaforma tal-punteġġar awtomatizzata. Dawn il-pjattaformi huma alternattivi aċċettabbli għall-evalwazzjoni manwali (2). Studji komparattivi wrew li t-tali metodi, li jużaw standards tal-kalibraġġ xierqa, jistgħu jipprovdu riproduċibbilità u sensittività aħjar bejn il-laboratorji u fi ħdan il-laboratorji mill-ikklassifikar manwali bil-mikroskopju (3) (4). Sistemi awtomatizzati li jistgħu jkejlu l-frekwenzi tal-eritroċiti mikronukleati jinkludu, iżda mhumiex limitati għal, ċitometri tal-fluss (5), pjattaformi tal-analiżi tal-immaġnijiet (6) (7), u ċitometri ta' skennjar bil-laser (8).
                     Għad li dan normalment ma jsirx bħala parti mit-test, il-frammenti tal-kromożomi jistgħu jiġu distinti minn kromożomi sħaħ permezz ta' għadd ta' kriterji. Dawn jinkludu l-identifikazzjoni tal-preżenza jew l-assenza ta' kinetoċoru jew DNA ċentometriku, li t-tnejn li huma huma karatteristiċi ta' kromożomi intatti. L-assenza ta' kinetoċoru jew DNA ċentometriku tindika li l-mikronukleu fih biss frammenti ta' kromożomi, filwaqt li l-preżenza tindika telf ta' kromożomi.
                     Id-definizzjonijiet tat-terminoloġija użata huma stabbiliti fl-Appendiċi 1.
                     KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU
                     Il-mudullun ta' rodituri adulti żgħar huwa t-tessut fil-mira għal ħsara ġenetika fit-test peress li l-eritroċiti huma prodotti f'dan it-tessut. Il-kejl tal-mikronukleji f'eritroċiti immaturi fid-demm periferali huwa aċċettabbli fi speċijiet mammiferi oħrajn li għalihom intweriet sensittività adegwata għall-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi li jikkaġunaw aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali jew numeriċi f'dawn iċ-ċelloli (b'induzzjoni tal-mikronukleji f'eritroċiti immaturi) u ġiet ipprovduta ġustifikazzjoni xjentifika. Il-frekwenza ta' eritroċiti immaturi mikronukleati hija l-punt ta' tmiem ewlieni. Il-frekwenza tal-eritroċiti maturi li fihom mikronukleji fid-demm periferali tista' tintuża wkoll bħala punt ta' tmiem fi speċijiet mingħajr selezzjoni splenika b'saħħitha kontra ċelloli mikronukleati u meta l-annimali jiġu ttrattati kontinwament għal perjodu li jaqbeż it-tul tal-ħajja tal-eritroċita fl-ispeċijiet użati (eż. 4 ġimgħat jew iktar fil-ġurdien).
                     Jekk ikun hemm evidenza li s-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test, jew il-metabolit(i) tagħha, mhumiex sejrin jilħqu t-tessut fil-mira, jaf ma jkunx xieraq li jintuża dan it-test.
                     Qabel ma jintuża dan il-metodu ta' ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta' dejta għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet ma jkunux meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita.
                     IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TA' TTESTJAR
                     L-annimali huma esposti għas-sustanza kimika tat-test permezz ta' rotta xierqa. Jekk jintuża l-mudullun, l-annimali jiġu ewtanazzati b'mod umanitarju f'ħin(ijiet) xieraq wara t-trattament, il-mudullun jiġi estratt, u jsiru l-preparazzjonijiet u t-tilwin (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Meta jintuża demm periferali, id-demm jinġabar f'ħinijiet xierqa wara t-trattament u jsiru l-preparazzjonijiet u t-tilwin (12) (16) (17) (18). Meta t-trattament jingħata b'mod akut, importanti li jingħażlu l-ħinijiet tal-ġbir tal-mudullun jew tad-demm li fihom tista' tiġi identifikata l-induzzjoni relatata mat-trattament ta' eritroċiti immaturi mikronukleati. Fil-każ ta' kampjunar tad-demm periferali, irid ikun għadda wkoll biżżejjed żmien sabiex dawn l-avvenimenti jidhru fid-demm li jiċċirkola. Il-preparati jiġu analizzati għall-preżenza ta' mikronukleji, jew b'viżwalizzazzjoni bl-użu ta' mikroskopju, analiżi tal-immaġnijiet, iċ-ċitometrija tal-fluss, jew b'ċitometrija ta' skennjar bil-laser.
                     VERIFIKA TAL-PROFIĊJENZA TAL-LABORATORJU
                     
                        Investigazzjonijiet tal-Profiċjenza
                     
                     Sabiex jiġi stabbilit li hemm biżżejjed esperjenza fit-twettiq tal-assaġġ qabel ma jintuża għall-ittestjar ta' rutina, il-laboratorju għandu jkun wera li għandu l-ħila li jirriproduċi r-riżultati mistennijin mid-dejta ppubblikata (17) (19) (20) (21) (22) għall-frekwenzi tal-mikronukleu b'tal-inqas żewġ sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv (inklużi risponsi dgħajfin indotti minn dożi baxxi ta' kontrolli pożittivi), bħal dawk elenkati fit-Tabella 1 u b'kontrolli tal-veikolu/solvent kompatibbli (ara l-paragrafu 26). Dawn l-esperimenti għandhom jużaw dożi li jagħtu żidiet riproduċibbli u relatati mad-dożi u juru s-sensittività u l-medda dinamika tas-sistema tat-test fit-tessut ta' interess (il-mudullun jew id-demm periferali) u jużaw il-metodu tal-punteġġ li sejjer jitħaddem fil-laboratorju. Dan ir-rekwiżit mhuwiex applikabbli għal laboratorji li għandhom esperjenza, jiġifieri li għandhom database storika disponibbli kif definita fil-paragrafi 14-18.
                     
                        Dejta Storika tal-Kontroll
                     
                     Matul l-investigazzjonijiet tal-profiċjenza, il-laboratorju għandu jistabbilixxi:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Medda u distribuzzjoni storiċi tal-kontroll pożittiv, u
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Medda u distribuzzjoni storiċi tal-kontroll negattiv.
                              
                           Meta għall-ewwel tinkiseb id-dejta għal distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu konsistenti mad-dejta tal-kontroll ippubblikata, meta tkun teżisti. Peress li tiżdied iktar dejta sperimentali mad-distribuzzjoni storika tal-kontroll, idealment il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % ta' dik id-distribuzzjoni. Id-database storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju għandha tkun statistikament robusta sabiex tiġi żgurata l-ħila tal-laboratorju sabiex jivvaluta d-distribuzzjoni tad-dejta tal-kontroll negattiv tiegħu. It-tagħrif jissuġġerixxi li jista' jkun hemm bżonn ta' minimu ta' 10 esperimenti iżda idealment ikun hemm tal-inqas 20 esperiment imwettqin f'kundizzjonijiet sperimentali paragunabbli. Il-laboratorji għandhom jużaw metodi ta' kontroll tal-kwalità, bħal karti tal-kontroll (eż. C-charts jew X-bar charts (23)), sabiex jidentifikaw kemm hija varjabbli d-dejta tagħhom, u sabiex juru li l-metodoloġija hija “taħt kontroll” fil-laboratorju tagħhom. Rakkomandazzjonijiet ulterjuri dwar kif jibnu u jużaw id-dejta storika (jiġifieri kriterji għall-inklużjoni u l-esklużjoni ta' dejta fid-dejta storika u l-kriterji ta' aċċettabilità għal esperiment partikolari) jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (24).
                     Meta l-laboratorju ma jagħmilx numru kbir biżżejjed ta' esperimenti sabiex jistabbilixxi distribuzzjoni statistikament robusta tal-kontroll negattiv (ara l-paragrafu 15) matul l-investigazzjonijiet tal-profiċjenza (deskritti fil-paragrafu 13), jista' jiġi aċċettat li d-distribuzzjoni tinbena matul l-ewwel testijiet ta' rutina. Dan l-approċċ għandu jsegwi r-rakkomandazzjonijiet stipulati fit-tagħrif (24) u r-riżultati tal-kontroll negattiv miksubin f'dawn l-esperimenti għandhom jibqgħu konsistenti mad-dejta ppubblikata tal-kontroll negattiv.
                     Kwalunkwe bidla fil-protokoll tal-esperimenti għandha tiġi kkunsidrata fid-dawl tal-impatt tagħha fuq kemm id-dejta li tirriżulta tibqa' konsistenti mad-database storika eżistenti tal-kontroll tal-laboratorju. Inkonsistenzi kbar biss għandhom jirriżultaw fl-istabbiliment ta' database storika ġdida tal-kontroll, fejn il-ġudizzju tal-esperti jistabbilixxi li tvarja mid-distribuzzjoni ta' qabel (ara l-paragrafu 15). Matul l-istabbiliment mill-ġdid, jaf ma jkunx hemm bżonn ta' database sħiħa tal-kontroll negattiv sabiex ikun jista' jsir test propju, diment li l-laboratorju jkun jista' juri li l-valuri tal-kontroll negattiv parallel tiegħu jibqgħu konsistenti mad-database ta' qabel jew mad-dejta ppubblikata korrispondenti.
                     Id-dejta tal-kontroll negattiv għandha tikkonsisti fl-inċidenza eritroċiti immaturi mikronukleati f'kull annimal. Idealment, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % tad-distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju. Meta d-dejta tal-kontroll negattiv parallel toħroġ mil-limiti ta' kontroll ta' 95 %, din tista' titqies aċċettabbli li tiddaħħal fid-distribuzzjoni storika tal-kontroll diment li din id-dejta ma tkunx eċċezzjoni estrema u jkun hemm evidenza li s-sistema tat-test tkun “taħt kontroll” (ara l-paragrafu 15) u ebda evidenza ta' żball tekniku jew uman.
                     DESKRIZZJONI TAL-METODU
                     
                        Preparamenti
                     
                     
                        Għażla ta' speċi tal-annimali
                     
                     Għandhom jintużaw razez użati spiss fil-laboratorju ta' annimali żgħar b'saħħithom. Jistgħu jintużaw ġrieden, firien jew speċijiet mammiferi xierqa oħrajn. Meta jintuża demm periferali, irid jiġi stabbilit li t-tneħħija splenika ta' ċelloli mikronukleati miċ-ċirkulazzjoni ma tqegħidx f'riskju d-detezzjoni ta' mikronukleji indotti fl-ispeċi magħżula. Dan intwera biċ-ċar għad-demm periferali tal-ġrieden u l-firien (2). Fir-rapport għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xjentifika meta jintużaw speċijiet oħrajn li mhumiex firien u ġrieden. Jekk jintużaw speċijiet oħrajn li mhumiex rodituri, huwa rakkomandat li l-kejl tal-mikronukleji indotti jiġi integrat f'test xieraq ieħor tat-tossiċità.
                     
                        Kundizzjonijiet tal-abitazzjoni u l-għalf tal-annimali
                     
                     Għar-rodituri, it-temperatura fil-kamra tal-annimali għandha tkun ta' 22 °C (± 3 °C). Għad li, idealment, l-umdità relattiva għandha tkun ta' 50-60 %, għandha tkun tal-inqas 40 % u, idealment, ma taqbiżx is-70 % ħlief matul it-tindif tal-kamra. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, b'sekwenza ta' 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Dwar l-għalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta' ilma tax-xorb. L-għażla tad-dieta tista' tkun influwenzata mill-bżonn li tiġi żgurata taħlita xierqa ta' sustanza kimika tat-test meta tingħata minn din ir-rotta. Ir-rodituri għandhom jitrabbew fi gruppi żgħar (mhux iktar minn ħamsa f'gaġġa) tal-istess sess u grupp tat-trattament jekk ma tkun mistennija ebda mġiba aggressiva, idealment f'gaġeġ solidi mal-art bl-arrikkiment ambjentali xieraq. L-annimali jistgħu jitrabbew waħedhom biss jekk dan ikollu ġustifikazzjoni xjentifika.
                     
                        Preparazzjoni tal-annimali
                     
                     Normalment jintużaw annimali adulti żgħar b'saħħithom (għal rodituri, idealment 6-10 ġimgħat fil-bidu tat-trattament, għad li jistgħu jiġu aċċettati annimali ftit ixjaħ ukoll), u dawn jiġu assenjati b'mod aleatorju għall-gruppi tal-kontroll u tat-trattament. L-annimali individwali jiġu identifikati b'mod uniku bl-użu ta' metodu umanitarju u l-inqas invasiv possibbli (eż. b'ċirku madwarhom, tikketti, mikroċipep jew identifikazzjoni bijometrika, iżda mhux b'titqib fil-widnejn jew fis-swaba') u jitħallew iderru fil-kundizzjonijiet tal-laboratorju għal tal-inqas ħamest ijiem. Il-gaġeġ għandhom ikunu rranġati b'mod li jkunu mminimizzati l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid tal-gaġeġ. Għandha tiġi evitata kontaminazzjoni kroċjata mill-kontroll pożittiv u s-sustanza kimika tat-test. Fil-bidu tal-istudju, il-varjazzjoni fil-piż tal-annimali għandha tkun minima u ma taqbiżx ± 20 % tal-piż medju ta' kull sess.
                     
                        Preparazzjoni tad-dożi
                     
                     Is-sustanzi kimiċi solidi tat-test għandhom jinħallu jew jiġu sospiżi f'solventi jew veikoli xierqa jew jitħalltu f'dieta jew ilma tajjeb għax-xorb qabel id-dożaġġ tal-annimali. Is-sustanzi kimiċi likwidi tat-test jistgħu jiġu dożati direttament jew jiġu dilwiti qabel id-dożaġġ. Għal esponimenti bit-teħid man-nifs, is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jingħataw bħala gass, fwar jew aerosol solidu/likwidu, skont il-proprjetajiet fiżikokimiċi tagħhom. Għandhom jintużaw preparati ġodda tas-sustanza kimika tat-test sakemm id-dejta dwar l-istabilità ma turix l-aċċettabilità tal-ħżin u tiddefinixxi l-kundizzjonijiet tal-ħżin xierqa.
                     
                        Kundizzjonijiet tat-test
                     
                     
                        Solvent/veikolu
                     
                     Is-solvent/veikolu ma għandux jipproduċi effetti tossiċi fil-livelli tad-doża użati, u ma għandux ikun kapaċi li joħloq reazzjoni kimika mas-sustanzi kimiċi tat-test. Jekk jintużaw solventi/veikoli oħrajn li mhumiex magħrufin sew, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun sostnuta permezz ta' dejta ta' referenza li tindika l-kompatibbiltà tagħhom. Huwa rakkomandat li, fejn jista' jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/veikolu milwiem. Eżempji ta' solventi/veikoli kompatibbli użati spiss jinkludu ilma, salina fiżjoloġika, soluzzjoni tal-metilċelluloża, soluzzjoni tal-melħ tas-sodju taċ-ċelluloża tal-karbossimetilċelluloża, żejt taż-żebbuġa u żejt tal-qamħirrum. Fin-nuqqas ta' dejta storika jew ippubblikata tal-kontroll li turi li ma huma indotti ebda mikronukleu u effett dannuż ieħor minn solvent/veikolu atipiku magħżul, għandu jsir studju inizjali sabiex tiġi stabbilita l-aċċettabbiltà tal-kontroll tas-solvent/veikolu.
                     
                        Kontrolli
                     
                     
                        Kontrolli pożittivi
                     
                     Normalment għandu jkun inkluż grupp ta' annimali ttrattati b'sustanza kimika tal-kontroll pożittiv ma' kull test. Dan jista' jiġi rrinunzjat meta l-laboratorju tal-ittestjar ikollu profiċjenza murija fit-twettiq tat-test u jkun stabbilixxa medda storika tal-kontroll pożittiv. Meta ma jkunx hemm grupp tal-kontroll pożittiv parallel inkluż, il-kontrolli tal-punteġġ (lametti fissi u mhux imlewnin jew kampjuni ta' sospensjoni taċ-ċelloli, kif ikun xieraq għall-metodu tal-punteġġar) għandhom ikunu inklużi f'kull esperiment. Dawn jistgħu jinkisbu billi fil-punteġġar tal-istudju jiddaħħlu kampjuni ta' referenza xierqa li nkisbu u nħażnu minn esperiment tal-kontroll pożittiv separat imwettaq b'mod perjodiku (eż. kull 6-18-il xahar); pereżempju, matul l-ittestjar tal-profiċjenza u fuq bażi regolari wara, fejn ikun hemm bżonn.
                     Is-sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv għandhom jipproduċu b'mod affidabbli żieda identifikabbli fil-frekwenza tal-mikronukleji fuq il-livell spontanju. Meta ssir klassifikazzjoni manwali bil-mikroskopju, id-dożi tal-kontroll pożittiv għandhom jingħażlu sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx immedjatament l-identità tal-kampjuni kodifikati lil min jaqrahom. Huwa aċċettabbli li l-kontroll pożittiv jingħata b'rotta differenti mis-sustanza kimika tat-test, bl-użu ta' skeda tat-trattament differenti, u li l-kampjunar iseħħ biss f'waqt partikolari biss. Barra minn dan, jista' jiġi kkunsidrat l-użu ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv relatati mal-klassi tas-sustanzi kimiċi, meta xieraq. Fit-Tabella 1 hemm inklużi eżempji ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv.
                     
                        Tabella 1
                     
                     
                        Eżempji ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv.
                     
                     Sustanzi Kimiċi u CASRN
                     Metansulfonat tal-etil [CASRN 62-50-0]
                     Metansulfonat tal-metil [CASRN 66-27-3]
                     Nitrosurea tal-etil [CASRN 759-73-9]
                     Mitomiċina C [CASRN 50-07-7]
                     Ċiklofosfamida (monoidrat) [CASRN 50-18-0 (CASRN 6055-19-2)]
                     Trietilenmelamina [CASRN 51-18-3]
                     Kolċisina [CASRN 64-86-8] jew Vinblastina [CASRN 865-21-4] — bħal anewġeni
                     
                        Kontrolli negattivi
                     
                     L-annimali tal-grupp tal-kontroll negattiv għandhom ikunu inklużi f'kull ħin tal-kampjunar u l-bqija jiġu mmaniġġjati bl-istess mod bħall-gruppi tat-trattament, ħlief li ma jirċivux trattament bis-sustanza kimika tat-test. Jekk jintuża solvent/veikolu fl-għoti tas-sustanza kimika tat-test, il-grupp tal-kontroll għandu jirċievi dan is-solvent/il-veikolu. Madankollu, jekk jintwera li hemm varjabbiltà konsistenti bejn l-annimali u frekwenzi ta' ċelloli b'mikronukleji permezz ta' dejta storika tal-kontroll negattiv f'kull waqt tal-kampjunar għal-laboratorju tal-ittestjar, jaf ikun hemm bżonn ta' kampjunar wieħed biss għall-kontroll negattiv. Meta jintuża kampjunar wieħed għall-kontrolli negattivi, għandu jkun l-ewwel waqt tal-kampjun użat fl-istudju.
                     Jekk jintuża demm periferali, kampjun ta' qabel it-trattament jista' jiġi aċċettat minflok kontroll negattiv parallel għal studji fuq terminu qasir meta d-dejta li tirriżulta tkun konsistenti mad-database storika tal-kontroll għal-laboratorju tal-ittestjar. Intwera li għall-firien, il-kampjunar ta' volumi żgħar (eż. taħt il-100 μl/jum) qabel it-trattament għandu impatt minimu fuq il-frekwenza tal-isfond tal-mikronukleji (25).
                     PROĊEDURA
                     
                        In-numru u s-sess tal-annimali
                     
                     B'mod ġenerali, ir-rispons tal-mikronukleu huwa simili bejn l-annimali rġiel u, għalhekk, ħafna mill-istudji jistgħu jsiru f'kull sess (26). Dejta li turi d-differenzi rilevanti bejn l-irġiel u n-nisa (eż. differenzi fit-tossiċità sistemika, il-metaboliżmu, il-bijodisponibilità, it-tossiċità tal-mudullun, eċċ. inkluż, eż. fi studju għat-tiftix tal-medda) tħeġġeġ l-użu taż-żewġ sessi. F'dan il-każ, jaf ikun xieraq li jsir studju fiż-żewġ sessi, eż. bħala parti minn studju ripetut tat-tossiċità tad-doża. Jaf ikun xieraq li jintuża d-disinn fattorjali f'każ li jintużaw iż-żewġ sessi. Dettalji dwar kif tiġi analizzata d-dejta bl-użu ta' dan id-disinn huma mogħtijin fl-Appendiċi 2.
                     Id-daqsijiet tal-grupp fil-bidu tal-istudju għandhom jiġu stabbiliti bil-għan li jiġu pprovduti tal-inqas 5 annimali analizzabbli ta' sess wieħed, jew ta' kull sess jekk jintużaw it-tnejn, għal kull grupp. Fejn l-esponiment uman għas-sustanzi kimiċi jista' jkun speċifiku għas-sess, bħal ma jseħħ pereżempju għal ċerti prodotti farmaċewtiċi, it-test għandu jsir b'annimali tas-sess xieraq. Bħala gwida għal rekwiżiti tipiċi massimi tal-annimali, studju fil-mudullun imwettaq skont il-parametri stabbiliti fil-paragrafu 37 bi tliet gruppi tad-doża u kontrolli negattivi u pożittivi paralleli (kull grupp imsawwar minn ħames annimali ta' sess uniku), ikun jeħtieġ bejn 25 u 35 annimal.
                     
                        Livelli tad-doża
                     
                     Jekk isir studju preliminari għat-tiftix tal-medda għaliex ma jkun hemm ebda dejta xierqa diġà disponibbli sabiex tgħin fl-għażla tad-doża, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, bl-użu tal-istess speċijiet, razza, sess u reġim tat-trattament li jrid jintuża fl-istudju ewlieni (27). L-istudju għandu jkollu l-għan li jidentifika d-doża massima tollerata (MTD), definita bħala l-ogħla doża li sejra tiġi tollerata mingħajr evidenza ta' tossiċità li tillimita l-istudju, b'rabta mad-durata tal-perjodu tal-istudju (pereżempju, billi tiġi indotta dipressjoni tal-piż tal-ġisem jew ċitotossiċità tas-sistema ematopoetika, iżda mhux mewt jew evidenza ta' uġigħ, tbatija jew diffikultà li jeħtieġu ewtanażja umanitarja (28)).
                     L-ogħla doża tista' tiġi identifikata wkoll bħala doża li tipproduċi tossiċità fil-mudullun (eż. tnaqqis fil-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali fil-mudullun jew id-demm periferali ta' iktar minn 50 %, iżda mhux għal inqas minn 20 % tal-valur tal-kontroll). Madankollu, meta jiġu analizzati ċ-ċelloli pożittivi għas-CD71 fiċ-ċirkulazzjoni tad-demm periferali (jiġifieri biċ-ċitometrija tal-fluss), din il-frazzjoni bikrija ħafna ta' eritroċiti immaturi twieġeb għall-isfidi tossiċi iktar malajr mill-koorti ikbar pożittiva għall-RNA ta' eritroċiti immaturi. Għaldaqstant, it-tossiċità ikbar tista' ssir evidenti f'disinni tal-esponiment akut li jeżaminaw il-frazzjoni ta' eritroċiti immaturi pożittivi għas-CD71 meta mqabbla ma' dawk li jidentifikaw eritroċiti immaturi fuq il-bażi tal-kontenut tal-RNA. Għal din ir-raġuni, meta l-esperimenti jużaw ħamest ijiem tat-trattament jew inqas, l-ogħla livell tad-doża għas-sustanzi kimiċi tat-test li jikkaġunaw tossiċità jista' jiġi definit bħala d-doża li tikkaġuna tnaqqis statistikament sinifikanti fil-proporzjon ta' eritroċiti immaturi pożittivi għas-D71 fost l-eritroċiti totali iżda mhux inqas minn 5 % tal-valur tal-kontroll (29).
                     Sustanzi kimiċi li jesibixxu saturazzjoni tal-proprjetajiet tossikokinetiċi, jew jinduċu proċessi ta' ditossifikazzjoni li jistgħu jwasslu għal tnaqqis fl-esponiment wara għoti fit-tul jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta' ssettar tad-dożi u għandhom jiġu evalwati fuq bażi ta' każ b'każ.
                     Sabiex tinkiseb informazzjoni dwar ir-rispons għad-doża, studju sħiħ għandu jinkludi grupp tal-kontroll negattiv u tal-inqas tliet livelli ta' dożi ġeneralment separati b'fattur ta' 2, iżda mhux ikbar minn 4. Jekk is-sustanza kimika tat-test ma tipproduċix tossiċità fi studju għat-tiftix tal-medda jew fuq il-bażi tad-dejta eżistenti, l-ogħla doża għal perjodu ta' amministrazzjoni ta' 14-il jum jew iktar għandha tkun ta' 1 000 mg/kg tal-piż tal-ġisem/jum, jew għal perjodi ta' amministrazzjoni ta' inqas minn 14-il jum, 2 000 mg/kg tal-piż tal-ġisem/jum. Madankollu, jekk is-sustanza kimika tat-test tikkaġuna tossiċità, l-MTD għandha tkun l-ogħla doża mogħtija u l-livelli tad-doża użati idealment għandhom ikopru medda mill-massimu sa doża li tipproduċi ftit tossiċità jew ebda tossiċità. Meta tiġi osservata tossiċità tat-tessut fil-mira (il-mudullun) fil-livelli tad-doża kollha ttestjati, huwa rakkomandat li jsir studju ulterjuri f'dożi mhux tossiċi. Studji li jkollhom l-għan li jikkaratterizzaw iktar bis-sħiħ l-informazzjoni kwantitattiva dwar ir-rispons għad-doża jistgħu jeħtieġu gruppi tad-doża addizzjonali. Għal ċerti tipi ta' sustanzi kimiċi tat-test (eż. prodotti farmaċewtiċi għall-bniedem) koperti minn rekwiżiti speċifiċi, dawn il-limiti jistgħu jvarjaw.
                     
                        Test tal-limitu
                     
                     Jekk l-esperimenti għat-tiftix tal-medda, jew dejta eżistenti minn razez ta' annimali relatati, jindikaw li reġim tat-trattament ta' tal-inqas id-doża limitu (deskritta hawn taħt) ma jipproduċi ebda effett tossiku osservabbli (inkluż ebda dipressjoni tal-proliferazzjoni tal-mudullun jew evidenza oħra ta' ċitotossiċità tat-tessut fil-mira), u jekk ma tkunx mistennija ġenotossiċità fuq il-bażi ta' studji in vitro tal-ġenotossiċità jew dejta minn sustanzi kimiċi relatati strutturalment, f'dak il-każ jaf ma jitqiesx neċessarju li jsir studju sħiħ li juża tliet livelli tad-doża, diment li jkun intwera li s-sustanza (jew sustanzi) kimika tilħaq it-tessut fil-mira (il-mudullun). F'dawn il-każijiet, livell tad-doża wieħed, fid-doża limitu, jista' jkun biżżejjed. Meta l-għoti jsir għal 14-il jum jew iktar, id-doża limitu hija ta' 1 000 mg/kg piż tal-ġisem/jum. Għal perjodi ta' għoti ta' 14-il jum jew inqas, id-doża limitu hija ta' 2 000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum.
                     
                        Amministrazzjoni tad-dożi
                     
                     Ir-rotta antiċipata tal-esponiment tal-bniedem għandha tiġi kkunsidrata meta jitfassal assaġġ. Għaldaqstant, jistgħu jingħażlu rotot tal-esponiment bħal rotta djetetika, mal-ilma tax-xorb, subkuntanja topika, fil-vini, orali (gavage), mat-teħid man-nifs, intratrakeali, jew b'impjant, kif iġġustifikati. Fi kwalunke każ, ir-rotta għandha tingħażel sabiex jiġi żgurat esponiment adegwat tat-tessut(i) fil-mira. Ġeneralment ma tkunx rakkomandata injezzjoni intraperitoneali peress li mhijiex rotta intiża ta' esponiment tal-bniedem, u għandha tintuża biss b'ġustifikazzjoni xjentifika speċifika. Jekk is-sustanza kimika tat-test tiġi mħallta fid-dieta jew l-ilma tax-xorb, speċjalment fil-każ ta' dożaġġ wieħed, wieħed għandu joqgħod attent li l-ħin bejn il-konsum tal-ikel u l-ilma u l-kampjunar ikun biżżejjed sabiex ikunu jistgħu jiġu identifikati l-effetti (ara l-paragrafi 37). Il-volum massimu ta' likwidu li jista' jingħata b'gavage jew injezzjoni f'darba jiddependi mid-daqs tal-annimal tat-test. Normalment il-volum ma għandux ikun aktar minn 1 ml/100 g tal-piż tal-ġisem ħlief fil-każ ta' soluzzjonijiet milwiema fejn jistgħu jintużaw massimu ta' 2 ml/100 g tal-piż tal-ġisem. L-użu ta' volumi ikbar minn dan għandu jkun iġġustifikat. Ħlief għal sustanzi kimiċi tat-test irritanti jew korrużivi, li normalment jipproduċu effetti aggravati f'konċentrazzjonijiet ikbar, il-varjabbiltà fil-volum tat-test għandu jitnaqqas kemm jista' jkun billi tiġi aġġustata l-konċentrazzjoni sabiex tiġi żgurata amministrazzjoni ta' volum kostanti b'rabta mal-piż tal-ġisem fil-livelli kollha tad-doża.
                     
                        Skeda tat-trattament
                     
                     Idealment, isiru 2 trattamenti jew iktar, mogħtijin f'intervalli ta' 24 siegħa, speċjalment meta dan it-test jiġi integrat fi studji oħrajn dwar it-tossiċità. Inkella, jistgħu jingħataw trattamenti waħedhom, jekk ikunu ġġustifikati xjentifikament (eż. sustanzi kimiċi tat-test li jkunu magħrufin li jimblokkaw iċ-ċiklu taċ-ċelloli). Is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jingħataw ukoll bħala doża maqsuma, jiġifieri żewġ trattamenti jew iktar fl-istess ġurnata separati b'mhux iktar minn sagħtejn jew tlieta) sabiex jiġi ffaċilitat l-għoti ta' volum kbir. F'dawn iċ-ċirkustanzi, jew meta s-sustanza kimika tat-test tingħata bit-teħid man-nifs, il-ħin tal-kampjunar għandu jiġi skedat fuq il-bażi tal-ħin tal-aħħar dożaġġ jew tmiem l-esponiment.
                     It-test jista' jsir fi ġrieden jew firien b'wieħed minn dawn it-tliet modi:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 L-annimali jiġu ttrattati bis-sustanza kimika tat-test darba. Il-kampjuni tal-mudullun jittieħdu tal-inqas darbtejn (minn gruppi indipendenti ta' annimali), l-ewwel wieħed mhux qabel 24 siegħa wara t-trattament, iżda mhux wara 48 siegħa wara t-trattament b'intervall(i) xieraq bejn il-kampjuni, sakemm sustanza kimika tat-test ma tkunx magħrufa li għandha nofs ħajja partikolarment twila. L-użu ta' ħinijiet tat-teħid ta' kampjuni qabel 24 siegħa wara t-trattament għandu jkun iġġustifikat. Il-kampjuni ta' demm periferali jittieħdu għall-inqas darbtejn (mill-istess grupp ta' annimali), l-ewwel wieħed mhux qabel 36 siegħa wara t-trattament, b'intervall(i) xierqa wara t-teħid ta' l-ewwel kampjun, iżda mhux aktar minn 72 siegħa. Fl-ewwel ħin tal-kampjunar, il-gruppi kollha tad-doża għandhom jiġu ttrattati u jinġabru kampjuni għall-analiżi; madankollu, fil-ħin(ijiet) tal-kampjunar iktar tard, l-ogħla doża biss trid tingħata. Meta jiġi identifikat rispons pożittiv f'ħin tal-kampjun wieħed, ma jkunx hemm bżonn li jittieħdu iktar kampjuni sakemm ma jkunx hemm bżonn ta' informazzjoni kwantitattiva dwar ir-rispons għad-doża. Il-ħinijiet tal-ġbir deskritti huma konsegwenza tal-kinetika tal-feġġa u l-għibien tal-mikronukleji f'dawn iż-2 kompartimenti tat-tessut.
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 Jekk jintużaw 2 trattament kuljum (eż. żewġ trattamenti f'intervalli ta' 24 siegħa), għandhom jinġabru kampjuni darba bejn 18 u 24 siegħa wara l-aħħar trattament riward il-mudullun jew darba bejn 36 u 48 siegħa wara l-aħħar trattament rigward demm periferali (30). Il-ħinijiet tal-ġbir deskritti huma konsegwenza tal-kinetika tal-feġġa u l-għibien tal-mikronukleji f'dawn iż-2 kompartimenti tat-tessut.
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 Jekk jintużaw tliet trattamenti kuljum jew iktar (eż. tliet trattamenti jew iktar f'intervalli ta' madwar 24 siegħa), il-kampjuni tal-mudullun għandhom jinġabru mhux iktar minn 24 siegħa wara l-aħħar trattament u d-demm periferali għandu jinġabar mhux iktar tard minn 40 siegħa wara l-aħħar trattament (31). Din il-possibbiltà ta' trattament tħaddem taħlita tal-assaġġ kometa (eż. kampjunar 2-6 sigħat mill-aħħar trattament) mat-test tal-mikronukleji, u l-integrazzjoni tat-test tal-mikronukleji ma' studji tat-tossiċità b'doża ripetuta. Id-dejta akkumulata tissuġġerixxi li l-induzzjoni tal-mikronukleji tista' tiġi osservata matul dawn il-perjodi itwal ta' żmien meta jingħataw 3 dożi jew iktar (15).
                              
                           Jistgħu jintużaw reġimi oħrajn tad-dożaġġ jew tal-kampjunar meta dawn ikunu rilevanti u xjentifikament iġġustifikati, u sabiex tiġi ffaċilitata l-integrazzjoni ma' testijiet oħrajn tat-tossiċità.
                     
                        Osservazzjonijiet
                     
                     Għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi ġenerali fuq l-annimali tat-test u s-sinjali kliniċi għandhom jiġu rreġistrati tal-inqas darba kuljum, idealment fl-istess ħin(ijiet) kuljum u filwaqt li jiġi kkunsidrat il-perjodu ta' wara d-dożaġġ li fih sejrin jidhru l-iktar l-effetti antiċipati. Tal-inqas darbtejn kuljum matul il-perjodu ta' dożaġġ, l-annimali kollha għandhom ikunu osservati għal morbidità u mortalità. L-annimali kollha għandhom jintiżnu fil-bidu tal-istudju, tal-inqas darba fil-ġimgħa matul l-istudji b'doża ripetuta, u fil-fażi tal-ewtanażja. Fi studji twal tal-inqas ġimgħa, il-kejliet tal-konsum tal-ikel għandhom isiru tal-inqas kull ġimgħa. Jekk is-sustanza kimika tat-test tingħata mal-ilma tax-xorb, il-konsum tal-ilma għandu jitkejjel f'kull bidla tal-ilma u tal-inqas darba fil-ġimgħa. L-annimali li jesibixxu indikaturi mhux letali ta' tossiċità eċċessiva għandhom jiġu ewtanazzati b'mod umanitarju qabel jintemm il-perjodu ta' ttestjar (28). F'ċerti ċirkustanzi, it-temperatura tal-ġisem tal-annimali tista' tiġi ssorveljata, peress li ipertermja u ipotermja indotti mit-trattament ġew implikati fil-produzzjoni ta' riżultati spurji (32) (33) (34).
                     
                        Esponiment tat-tessut fil-mira
                     
                     Għandu jittieħed kampjun tad-demm f'ħin(ijiet) xieraq sabiex ikunu jistgħu jiġu mixtarra l-livelli ta' plażma tas-sustanzi kimiċi tat-test bil-għan li jintwera li seħħet l-esponiment tal-mudullun, meta dan ikun iġġustifikat u meta ma jkunx hemm dejta oħra dwar l-esponiment (ara l-paragrafu 48).
                     
                        Preparazzjoni tal-mudullun / tad-demm
                     
                     Normalment iċ-ċelloli tal-mudullun jinkisbu mill-femori jew mit-tibji tal-annimali, eżatt wara l-ewtanażja umanitarja. Spiss, iċ-ċelloli jitneħħew, jitħejjew u jitlewnu bl-użu tal-metodi stabbiliti. Jistgħu jinkisbu volumi żgħar ta' demm periferali, skont l-istandards adegwati dwar it-trattament xieraq tal-annimali, jew bl-użu ta' metodu li jippermetti li l-annimal tat-test jibqa' ħaj, bħall-fsad mill-vina tad-denb jew vina xierqa oħra, jew b'titqiba kardijaka jew kampjunar minn vina kbira fil-fażi tal-ewtanażja tal-annimal. Kemm għal eritroċiti miksubin mill-mudullun kif ukoll dawk mid-demm periferali, skont il-metodu ta' analiżi, iċ-ċelloli jista' jsirilhom tilwin sopravitali minnufih (16) (17) (18), isiru l-preparazzjonijiet tal-istrixxi li mbagħad jitlewnu għall-mikroskopju, jew inkella jiġu ffissati u jitlewnu kif xieraq għall-analiżi biċ-ċitometrija tal-fluss. L-użu ta' tilwin speċifiku tad-DNA [eż. oranġjo tal-akridina (35) jew Hoechst 33258 plus pyronin-Y (36)] jista' jelimina xi wħud mill-artifatti assoċjati mal-użu ta' tilwin mhux speċifiku għad-DNA. Dan il-vantaġġ ma jipprekludix l-użu ta' tilwin konvenzjonali (eż. Giemsa għall-analiżi bil-mikroskopju). Jistgħu jintużaw ukoll sistemi addizzjonali [eż. kolonni taċ-ċelluloża li jneħħu ċelloli nukleati (37) (38)] diment li jkun intwera li dawn is-sistemi huma kompatibbli mal-preparazzjoni tal-kampjun fil-laboratorju.
                     Meta dawn il-metodi jkunu applikabbli, jistgħu jintużaw antikorpi antikinetoċori (39), FISH b'sondi tad-DNA panċentromeriċi (40) jew tikkettar in situ mogħti primer bi primers speċifiċi għall-panċetromeri, flimkien mal-kontrotilwin xieraq tad-DNA (41), sabiex tiġi identifikata n-natura tal-mikronukleji (kromożoma/framment kromożomika) sabiex jiġi stabbilit jekk il-mekkaniżmu tal-induzzjoni tal-mikronukleu huwiex dovut għal attività klastoġenika u/jew anewġenika. Jistgħu jintużaw metodi oħrajn għal divrenzjar bejn il-klastoġeni u l-anewġeni jekk ikun intwera li dawn huma effettivi.
                     
                        Analiżi (manwali u awtomatizzata)
                     
                     Il-lametti jew il-kampjuni għall-analiżi kollha, inklużi dawk tal-kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati b'mod indipendenti qabel kull xorta ta' analiżi u għandhom jitqassmu b'mod aleatorju sabiex min jaqrahom manwalment ma jkunx jaf x'inhi l-kundizzjoni tat-trattament; it-tali kodifikazzjoni mhijiex neċessarja meta jintużaw sistemi ta' klassifikazzjoni awtomatizzati li ma jeħtiġux spezzjoni viżwali u li ma jistgħux jiġu affettwati minn preġudizzju tal-operatur. Il-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali (immaturi + maturi) tiġi stabbilita għal kull annimal billi jingħaddu għall-inqas 500 eritroċiti għall-mudullun u 2 000 eritroċiti għad-demm periferali (42). Għandu jingħata punteġġ lil mill-inqas 4 000 eritroċiti immaturi għall-inċidenza ta' eritroċiti immaturi mikronukleati (43). Jekk id-database storika tal-kontroll negattiv tindika li l-frekwenza medja ta' sfond ta' eritroċiti immaturi mikronukleati hija ta' < 0.1 % fil-laboratorju tal-ittestjar, għandu jiġi kkunsidrat l-għoti ta' punteġġ lil ċelloli addizzjonali. Meta jiġu analizzati l-kampjuni, il-proporzjon ta' eritroċiti immaturi għall-eritroċiti totali fl-annimali tat-trattament ma għandux ikun inqas minn 20 % tal-proporzjon tal-kontroll tal-veikolu/solvent meta l-punteġġar isir bil-mikroskopju u mhux inqas minn madwar 5 % tal-proporzjon tal-kontroll tal-veikolu/solvent meta l-punteġġar tal-eritroċiti immaturi tas-CD71+ isir b'metodi ċitometriċi (ara l-paragrafu 31) (29). Pereżempju, għal assaġġ tal-mudullun mogħti punteġġ bil-mikroskopju, jekk il-proporzjon tal-kontroll tal-eritroċiti immaturi fil-mudullun ikun ta' 50 %, il-limitu superjuri tat-tossiċità jkun 10 % eritroċiti immaturi.
                     Peress li l-milsa tal-firien taħtaf u teqred l-eritroċiti mikronukleati, sabiex tinżamm sensittività għolja tal-assaġġ meta jiġi analizzat id-demm periferali tal-firien, idealment l-analiżi tal-eritroċiti immaturi mikronukleati tiġi ristretta għall-iżgħar frazzjoni. Meta jintużaw metodi tal-analiżi awtomatizzati, dawn l-iktar eritroċiti immaturi jistgħu jiġu identifikati fuq il-bażi tal-kontenut għoli ta' RNA tagħhom, jew il-livell għoli ta' riċetturi tat-transferrina (CD71+) espress fuq il-wiċċ tagħhom (31). Madankollu, paragun dirett tal-metodi ta' tilwin differenti wera li jistgħu jinkisbu riżultati sodisfaċenti b'bosta metodi, inkluż it-tilwin konvenzjonali bl-oranġjo tal-akridina (3) (4).
                     DEJTA U RAPPORTAR
                     
                        Trattament tar-riżultati
                     
                     Dejta dwar l-annimali individwali għandha tiġi ppreżentata f'forma ta' tabelli. Għal kull annimal li jiġi analizzat għandhom jiġu elenkati separatament in-numru ta' eritroċiti immaturi li jingħaddu, il-proporzjon ta' eritroċiti immaturi mikronukleati, u n-numru ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali. Meta l-ġrieden jiġu ttrattati kontinwament għal 4 ġimgħat jew iktar, id-dejta dwar in-numru u l-proporzjon ta' eritroċiti maturi mikronukleati għandha tingħata wkoll jekk tinġabar. Għandha tiġi rrapportata dejta dwar it-tossiċità tal-annimali u s-sinjali kliniċi wkoll.
                     
                        Kriterji ta' Aċċettabilità
                     
                     Il-kriterji li ġejjin jistabbilixxu l-aċċettabilità tat-test:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 Huwa aċċettat li d-dejta tal-kontroll negattiv parallel tiżdied fid-database storika tal-kontroll tal-laboratorju (ara l-paragrafi 15-18).
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 Il-kontrolli pożittivi paralleli jew il-kontrolli tal-punteġġ għandhom jinduċu risponsi li huma kompatibbli ma' dawk iġġenerati fid-database storika tal-kontroll pożittiv u jipproduċu żieda statistikament sinifikanti meta mqabblin mal-kontroll negattiv parallel (ara l-paragrafi 24-25).
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 Ġie analizzat in-numru xieraq ta' dożi u ċelloli;
                              
                           
                                 d.
                              
                              
                                 Il-kriterji għall-għażla tal-ogħla doża huma konsistenti ma' dawk deskritti fil-paragrafi 30-33.
                              
                           
                        Evalwazzjoni u Interpretazzjoni tar-Riżultati
                     
                     Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva biċ-ċar jekk:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 Tal-inqas wieħed mill-gruppi tat-trattament jesibixxi żieda statistikament sinifikanti fil-frekwenza eritroċiti immaturi mikronukleati meta mqabbel mal-kontroll negattiv parallel,
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 Din iż-żieda hija marbuta mad-doża tal-inqas f'mument tal-kampjunar wieħed meta tiġi evalwata b'test tat-tendenza xieraq, u
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 Kwalunkwe wieħed mir-riżultati jaqa' barra mid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson).
                              
                           Jekk l-ogħla doża biss tiġi eżaminata f'mument tal-kampjunar partikolari, sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva biċ-ċar jekk ikun hemm żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv parallel u r-riżultati jaqgħu barra mid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson). Ir-rakkomandazzjonijiet għall-iktar metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (44) (45) (46) (47). Meta ssir analiżi tar-rispons għad-doża, għandhom jiġu analizzati tal-inqas tliet gruppi tad-doża. It-testijiet statistiċi għandhom jużaw l-annimal bħala l-unità sperimentali. Ir-riżultati pożittivi minn test mikronukleu jindikaw li sustanza kimika tat-test tinduċi mikronukleji li huma r-riżultat ta' ħsara fil-kromożomi jew ħsara fl-apparat mitotiku fl-eritroblasti tal-ispeċi tat-test. F'każ li fih ikun sar test sabiex jinqabdu ċentromeri fi ħdan mikronukleji, sustanza kimika tat-test li tipproduċi mikronukleji li fihom ċentromeri (DNA ċentromeriku jew kinetoċoru, li jindika telf ta' kromożoma sħiħa) hija evidenza li s-sustanza kimika tat-test hija anewġen.
                     Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija negattiva biċ-ċar jekk, fil-kundizzjonijiet sperimentali kollha eżaminati:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 L-ebda wieħed mill-gruppi tat-trattament ma jesibixxi żieda statistikament sinifikanti fil-frekwenza eritroċiti immaturi mikronukleati meta mqabbel mal-kontroll negattiv parallel,
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 Ma hemm l-ebda żieda marbuta mad-doża fi kwalunkwe ħin tal-kampjunar meta tiġi evalwata b'test xieraq tat-tendenzi,
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 Ir-riżultati kollha jaqgħu fid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson), u
                              
                           
                                 d.
                              
                              
                                 Seħħ esponiment tal-mudullun għas-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test.
                              
                           Ir-rakkomandazzjonijiet għall-iktar metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (44) (45) (46) (47). Evidenza ta' esponiment tal-mudullun għal sustanza kimika tat-test tista' tinkludi dipressjoni tal-proporzjon ta' eritroċiti immaturi għal maturi jew kejl tal-livelli ta' plażma jew tad-demm tas-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test. Fil-każ ta' għoti fil-vina, ma hemmx bżonn ta' evidenza tal-esponiment. Inkella, tista' tintuża dejta ADME, miksuba fi studju indipendenti bl-użu tal-istess rotta u l-istess speċi, sabiex jintwera li seħħ esponiment tal-mudullun. Ir-riżultati negattivi jindikaw li, fil-kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza kimika tat-test ma tipproduċix mikronukleji fl-eritroċiti immaturi tal-ispeċi tat-test.
                     Ma hemm l-ebda ħtieġa għal verifika ta' rispons posittiv jew negattiv ċar.
                     F'każijiet li fihom ir-rispons la jkun negattiv ċar u lanqas pożittiv ċar u sabiex tgħin fl-istabbiliment tar-rilevanza bijoloġika ta' riżultat (eż. żieda batuta jew limitata), id-dejta għandha tiġi evalwata b'ġudizzju espert u/jew b'investigazzjonijiet ulterjuri tal-esperimenti eżistenti mwettqin. F'ċerti każijiet, l-analiżi ta' iktar ċelloli jew it-twettiq ta' esperiment ripetut bl-użu ta' kundizzjonijiet modifikati tal-esperiment jistgħu jkunu siewja.
                     F'każijiet rari, anki wara investigazzjonijiet ulterjuri, id-dejta sejra tipprekludi konklużjoni li s-sustanza kimika tat-test tipproduċi riżultati pożittivi jew negattivi u, għalhekk, l-istudju jiġi konkluż bħala ekwivoku.
                     
                        Rapport tat-test
                     
                     Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sommarju
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanza kimika tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             is-sors, in-numru tal-lott, id-data ta' limitu għall-użu, jekk disponibbli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test, jekk magħrufa.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanza monokostitwenti:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             id-dehra fiżika, is-solubilità fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanzi multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             ikkaratterizzati safejn possibbli mill-identità kimika (ara iktar 'il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             il-ġustifikazzjoni għall-għażla tal-veikolu.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             is-solubilità u l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent/veikolu, jekk magħrufin;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-preparazzjoni tal-formulazzjonijiet djetetiċi, tal-ilma tajjeb għax-xorb jew tat-teħid man-nifs;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-determinazzjonijiet analitiċi dwar il-formulazzjonijiet (eż. l-istabilità, l-omoġenità, il-konċentrazzjonijiet nominali), meta jsiru.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    L-annimali tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             l-ispeċi/ir-razza użata u ġustifikazzjoni għall-għażla;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             l-għadd, l-età u s-sess tal-annimali;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             is-sors, il-kundizzjonijiet tal-gaġeg, id-dieta, eċċ.;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodu għall-identifikazzjoni unika tal-annimali;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             studji fuq terminu qasir: il-piż individwali tal-annimali fil-bidu u fi tmiem it-test; għal studji itwal minn ġimgħa: il-piżijiet tal-ġisem individwali matul l-istudju u l-konsum ta' ikel. Il-medda tal-piż individwali, id-devjazzjoni medja u standard għal kull grupp għandhom ikunu inklużi.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kundizzjonijiet tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             dejta tal-kontroll pożittiv u negattiv (veikolu/solvent);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dejta minn studju għat-tiftix tal-medda, jekk ikun sar;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ir-raġuni għall-għażla tal-livell tad-doża;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dettalji dwar l-għoti tas-sustanza kimika tat-test;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ir-raġuni għar-rotta u d-durata tal-għoti;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metodi għall-verifika li s-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test laħqet iċ-ċirkulazzjoni ġenerali jew it-tessut fil-mira;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-doża propja (mg/kg piż tal-ġisem/jum) ikkalkolata mill-konċentrazzjoni (ppm) u l-konsum tas-sustanza kimika tat-test fid-dieta/ilma tax-xorb, jekk applikabbli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dettalji dwar il-kwalità tal-ikel u tal-ilma;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodu tal-ewtanażja;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodu tal-analġeżija (meta tintuża);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             deskrizzjoni dettaljata tat-trattament u l-iskedi tal-kampjunar u ġustifikazzjonijiet għall- għażliet;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodi tal-preparazzjoni tal-lametti;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-proċeduri għall-iżolament u l-preservazzjoni tat-tessuti;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodi ta' kejl tat-tossiċità;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kriterji għall-ikklassifikar tal-eritroċiti immaturi mikronukleati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             in-numru ta' ċelloli analizzati għal kull annimal fid-determinazzjoni tal-frekwenza ta' eritroċiti immaturi mikronukleati u għad-determinazzjoni tal-proporzjon ta' eritroċiti immaturi għal maturi;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kriterji għall-aċċettabilità tal-istudju;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodi, bħall-użu ta' antikorpi antikinetoċori jew sondi tad-DNA speċifiċi għaċ-ċentromeri, sabiex jiġi kkaratterizat jekk mikronukleu fihx kromożomi sħaħ jew frammentati, jekk applikabbli.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ir-riżultati:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kundizzjoni tal-annimali qabel u matul il-perjodu tat-test, inklużi sinjali tat-tossiċità;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             in-numru ta' eritroċiti immaturi mikronukleati, mogħti separatament għal kull annimal;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-devjazzjoni standard medja ± ta' eritroċiti immaturi mikronukleati għal kull grupp;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ir-relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn possibbli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             l-analiżijiet statistiċi u l-metodi applikati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dejta tal-kontroll negattiv u tal-kontroll pożittiv paralleli bil-meded, il-medji u d-devjazzjonijiet standard;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-dejta storika tal-kontroll negattiv u pożittiv b'meded, medji u devjazzjonijiet standard, u limiti ta' kontroll ta' 95 % għad-distribuzzjoni, kif ukoll il-perjodu ta' żmien u n-numru ta' punti ta' dejta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dejta li ssostni l-fatt li seħħ l-esponiment tal-mudullun;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dejta ta' karatterizzazzjoni li tindika jekk mikronukleu fihx kromożomi sħaħ jew frammentati, jekk applikabbli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kriterji ssodisfati għal rispons pożittiv jew negattiv.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Diskussjoni tar-riżultati.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Konklużjoni.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Referenzi.
                                 
                              
                           TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2007), in vivo erythrocyte micronucleus assay III. Validation and regulatory acceptance of automated scoring and the use of rat peripheral blood reticulocytes, with discussion of non-hematopoietic target cells and a single dose-level limit test, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 627/1, pp. 10-30.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: II. An efficient method of monitoring chromosomal damage in the rat, Toxicology Sciences, Vol. 94/1, pp. 92-107.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Dertinger, S.D. et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: I. Intra- and interlaboratory comparison with microscopic scoring, Toxicological Sciences, Vol. 94/1, pp. 83-91.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Dertinger, S.D. et al. (2011), Flow cytometric scoring of micronucleated erythrocytes: an efficient platform for assessing in vivo cytogenetic damage, Mutagenesis, Vol. 26/1, pp. 139-145.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Parton, J.W., W.P. Hoffman, M.L. Garriott (1996), Validation of an automated image analysis micronucleus scoring system, Mutation Research, Vol. 370/1, pp. 65-73.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Asano, N. et al. (1998), An automated new technique for scoring the rodent micronucleus assay: computerized image analysis of acridine orange supravitally stained peripheral blood cells, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 404/1-2, pp. 149-154.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Styles, J.A. et al. (2001), Automation of mouse micronucleus genotoxicity assay by laser scanning cytometry, Cytometry, Vol. 44/2, pp. 153-155.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Heddle, J.A. (1973), A rapid in vivo test for chromosomal damage, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 18/2, pp. 187-190.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Schmid, W. (1975), The micronucleus test, Mutation Research, Vol. 31/1, pp. 9-15.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Heddle, J.A. et al. (1983), The induction of micronuclei as a measure of genotoxicity. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 123/1, pp. 61-118.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Mavournin, K.H. et al. (1990), The in vivo micronucleus assay in mammalian bone marrow and peripheral blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 239/1, pp. 29-80.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (1983), Micronuclei in circulating erythrocytes: a rapid screen for chromosomal damage during routine toxicity testing in mice, Developments in Toxicology Environmental Science, Vol. 11, pp. 555-558.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (1987), Guidelines for the conduct of micronucleus assays in mammalian bone marrow erythrocytes, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 189/2, pp. 103-112.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (1990), The in vivo erythrocyte micronucleus test: measurement at steady state increases assay efficiency and permits integration with toxicity studies, Fundamental and Applied Toxicology, Vol. 14/3, pp. 513-522.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1990), The micronucleus assay with mouse peripheral blood reticulocytes using acridine orange-coated slides, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 245/4, pp. 245-249.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 CSGMT/JEMS.MMS — The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992), Micronucleus test with mouse peripheral blood erythrocytes by acridine orange supravital staining: the summary report of the 5th collaborative study, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 278/2-3, pp. 83-98.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 CSGMT/JEMS.MMS — The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan (1995), Protocol recommended by the CSGMT/JEMS.MMS for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT) (CSGMT/JEMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan), Mutagenesis, Vol. 10/3, pp. 153-159.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Salamone, M.F., K.H. Mavournin (1994), Bone marrow micronucleus assay: a review of the mouse stocks used and their published mean spontaneous micronucleus frequencies, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 23/4, pp. 239-273.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Krishna, G., G. Urda, J. Paulissen (2000), Historical vehicle and positive control micronucleus data in mice and rats, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 453/1, pp. 45-50.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Hayes, J. et al. (2009), The rat bone marrow micronucleus test--study design and statistical power, Mutagenesis, Vol. 24/5, pp. 419-424.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Wakata, A. et al. (1998), Evaluation of the rat micronucleus test with bone marrow and peripheral blood: summary of the 9th collaborative study by CSGMT/JEMS. MMS. Collaborative Study Group for the Micronucleus Test. Environmental Mutagen Society of Japan. Mammalian Mutagenicity Study Group, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 32/1, pp. 84-100.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Rothfuss, A. et al. (2011), Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 108-120.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 293-304.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, Vol. 7/5, pp. 313-319.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 OECD (2000), “Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 19, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 LeBaron, M.J. et al. (2013), Influence of counting methodology on erythrocyte ratios in the mouse micronucleus test, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 54/3, pp. 222-228.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Higashikuni, N., S. Sutou (1995), An optimal, generalized sampling time of 30 +/- 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, Vol. 10/4, pp. 313-319.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2000), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay. II. Some aspects of protocol design including repeated treatments, integration with toxicity testing, and automated scoring, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 234-252.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Asanami, S., K. Shimono (1997), High body temperature induces micronuclei in mouse bone marrow, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 390/1-2, pp. 79-83.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Asanami, S., K. Shimono, S. Kaneda (1998), Transient hypothermia induces micronuclei in mice, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 413/1, pp. 7-14.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Spencer, P.J. et al. (2007), Induction of micronuclei by phenol in the mouse bone marrow: I. Association with chemically induced hypothermia, Toxicological Sciences, Vol. 97/1, pp. 120-127.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Hayashi, M., T. Sofuni, M. Jr. Ishidate (1983), An application of Acridine Orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Research Letters, Vol. 120/4, pp. 241-247.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T., C.M. Wehr, R.G. Langlois (1983), A simple fluorescent staining procedure for micronuclei and RNA in erythrocytes using Hoechst 33258 and pyronin Y, Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 269-275.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Romagna, F., C.D. Staniforth (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 213/1, pp. 91-104.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 Sun, J.T., M.J. Armstrong, S.M. Galloway (1999), Rapid method for improving slide quality in the bone marrow micronucleus assay; an adapted cellulose column procedure, Mutation Research, Vol. 439/1, pp. 121-126.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 Miller, B.M., I.D. Adler (1990), Application of antikinetochore antibody staining (CREST staining) to micronuclei in erythrocytes induced in vivo, Mutagenesis, Vol. 5/4, pp. 411-415.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Miller, B.M. et al. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, Vol. 6/4, pp. 297-302.
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Russo, A. (2002), PRINS tandem labeling of satellite DNA in the study of chromosome damage, American Journal of Medical Genetics, Vol. 107/2, pp. 99-104.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 Gollapudi, B.B., L.G. McFadden (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Research, Vol. 347/2, pp. 97-99.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 OECD (2014), “Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 Richold, M. et al. (1990), “In Vivo Cytogenetics Assays”, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 115-141.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 Lovell, D.P. et al. (1989), “Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays”, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1994), Statistical analysis of data in mutagenicity assays: rodent micronucleus assay, Environmental Health Perspectives, Vol. 102/Suppl 1, pp. 49-52.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Kim, B.S., M. Cho, H.J. Kim (2000), Statistical analysis of in vivo rodent micronucleus assay, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 469/2, pp. 233-241.
                              
                           
                        Appendiċi 1
                        DEFINIZZJONIJIET
                        
                           
                              Ċentromeru
                           : Reġjun(i) ta' kromożomu li miegħu huma assoċjati fibri rqaq waqt id-diviżjoni taċ-ċellola, li jippermettu l-moviment b'ċertu ordni ta' kromożomi sekondarji għall-poli ta' ċelloli sekondarji.
                        
                           
                              Sustanza kimika
                           : sustanza jew taħlita.
                        
                           
                              Eritroblast
                           : Stadju bikri fl-iżvilupp tal-eritroċita, li jiġi eżatt qabel l-eritroċita immatura, fejn iċ-ċellola jkun għad fiha nukleu.
                        
                           
                              Kinetoċoru
                           : L-istruttura tal-proteini li tifforma fiċ-ċentromeru taċ-ċelloli ewkarjotiċi, li torbot il-kromożoma mal-polimeri mikrotubuli mill-magħżel mitotiku matul il-mitożi u mejożi u l-funzjonijiet matul id-diviżjoni taċ-ċelloli sabiex tissepara l-kromatidi aħwa.
                        
                           
                              Mikronukleji
                           : Nukleji żgħar, separati minn u addizzjonali għan-nukleji prinċipali taċ-ċelloli, prodotti waqt it-telofażi ta' mitożi (mejożi) permezz ta' biċċiet ta' residwi ta' kromożomi jew kromożomi sħaħ.
                        
                           
                              Eritroċita normokromatika jew matura
                           : Eritroċita matura għalkollox li tilfet l-RNA residwu li jifdal wara l-enukleazzjoni u/jew li tilfet markaturi taċ-ċelloli oħrajn b'ħajja qasira li normalment jgħibu wara l-enukleazzjoni malli sseħħ id-diviżjoni tal-eritroblast finali.
                        
                           
                              Eritroċita polikromatika jew immatura
                           : Eritroċita fformata ġdida fi stadju intermedju tal-iżvilupp, li tlewwen kemm bil-komponenti blu kif ukoll ħomor tat-tilwin klassiku tad-demm bħall-Giemsa ta' Wright minħabba l-preżenza ta' RNA residwu fiċ-ċellola fformata ġdida. Ċelloli fformati ġodda bħal dawn huma bejn wieħed u ieħor l-istess bħal retikuloċiti, li huma viżwalizzati bl-użu ta' kulurant vitali li jikkaġuna l-RNA residwu sabiex jagħqad f'retikulu. Metodi oħrajn, inkluż it-tilwin monokromatiku tal-RNA b'kuluranti fluworexxenti jew tikkettar ta' markaturi tal-wiċċ b'ħajja qasira bħas-CD71 b'antikorpi fluworexxenti, saru jintużaw ta' spiss sabiex tiġi identifikata ċ-ċellola ħamra tad-demm ifformata ġdida. Eritroċiti polikromatiċi, retikuloċiti, u eritroċiti pożittivi għas-CD71 ilkoll huma eritroċiti immaturi, għad li kull waħda minnhom għandha distribuzzjoni tal-età kemxejn differenti.
                        
                           
                              Retikuloċita
                           : Eritroċita fformata ġdida mlewna b'kulurant vitali li twassal sabiex l-RNA ċellolari residu jagħqad f'retikulu karatteristiku. Ir-retikuloċiti u l-eritroċiti polikromatiċi għandhom distribuzzjoni tal-età ċellolari simili.
                        
                           
                              Sustanza kimika tat-test
                           : Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta' dan il-metodu ta' ttestjar.
                     
                     
                        Appendiċi 2
                        
                           ID-DISINN FATTORJALI GĦALL-IDENTIFIKAZZJONI TAD-DIFFERENZI FIS-SESSI FL-ASSAĠĠ IN VIVO TAL-MIKRONUKLEU
                        
                        
                           Id-disinn fattorjali u l-analiżi tiegħu
                        
                        F'dan id-disinn, jiġu ttestjati tal-inqas 5 irġiel u 5 nisa f'kull livell tal-konċentrazzjoni li jirriżultaw f'disinn li juża tal-inqas 40 annimal (20 raġel u 20 mara, flimkien ma' kontrolli pożittivi rilevanti).
                        Id-disinn, li huwa wieħed mill-iktar disinni fattorjali sempliċi, huwa ekwivalenti għal analiżi bidirezzjonali tal-varjanza bis-sess u l-livell ta' konċentrazzjoni li huma l-effetti ewlenin. Id-dejta tista' tiġi analizzata billi jintużaw pakketti ta' softwer statistiku standard bħal SPSS, SAS, STATA, Genstat kif ukoll bl-użu ta' R.
                        L-analiżi tagħmel partizzjoni tal-varjabbiltà fis-sett ta' dejta bejn is-sessi, bejn il-konċentrazzjonijiet u b'rabta mal-interazzjoni bejn is-sessi u l-konċentrazzjonijiet. Kull wieħed mit-termini jiġi ttestjat kontra stima tal-varjabbiltà bejn l-annimali rreplikati fi ħdan il-gruppi ta' annimali tal-istess sess bl-istess konċentrazzjoni. Id-dettalji sħaħ dwar il-metodoloġija sottostanti huma disponibbli f'ħafna kotba standard dwar l-istatistika (ara r-referenzi) u fil-faċilitajiet tal-għajnuna pprovduti mal-pakketti statistiċi.
                        L-analiżi tkompli billi ssir spezzjoni tat-terminu ta' interazzjoni sess x konċentrazzjoni fit-tabella ANOVA (6). Fin-nuqqas ta' terminu ta' interazzjoni sinifikanti, il-valuri kombinati bejn is-sessi jew fost il-livelli ta' konċentrazzjoni jipprovdu testijiet statistiċi validi bejn il-livelli bbażati fuq it-terminu tal-varjabbiltà tar-raggruppati fi ħdan il-grupp tal-ANOVA.
                        L-analiżi tkompli billi tagħmel partizzjoni bejn l-istima tal-varjabbiltà bejn il-konċentrazzjonijiet f'kuntrasti li jipprovdu għal test għal kuntrasti lineari u kwadratiċi tar-risponsi bejn il-livelli tal-konċentrazzjonijiet. Meta jkun hemm interazzjoni sinifikanti sess x konċentrazzjoni, tista' ssir partizzjoni ta' dan it-terminu f'kuntrasti ta' interazzjoni lineari x sess u kwadradiku x sess ukoll. Dawn it-termini jipprovdu testijiet ta' jekk ir-risponsi għall-konċentrazzjoni humiex paralleli għaż-żewġ sessi jew jekk hemmx rispons differenzjali bejn iż-żewġ sessi.
                        L-istima tal-varjabbiltà tal-miġburin fi ħdan il-grupp tista' tintuża sabiex tipprovdi testijiet bejn il-pari tad-differenza bejn il-medji. Dawn il-paraguni jistgħu jsiru bejn il-medji għaż-żewġ sessi u bejn il-medji għal-livelli ta' konċentrazzjoni differenti bħal fil-każ tal-paraguni mal-livelli tal-kontroll negattiv. F'dawk il-każijiet li fihom ikun hemm interazzjoni sinifikanti, jistgħu jsiru paraguni bejn il-medji ta' konċentrazzjonijiet differenti fi ħdan sess jew bejn il-medji tas-sessi fl-istess konċentrazzjoni.
                        
                           Referenzi
                        
                        Hemm ħafna kotba dwar l-istatistika li jiddiskutu t-teorija, id-disinn, il-metodoloġija, l-analiżi u l-interpretazzjoni tad-disinni fattorjali li jvarjaw mill-iktar analiżijiet b'żewġ fatturi sempliċi sal-iktar forom kumplessi użati fil-metodoloġija dwar id-“Disinn tal-Esperiment”. Din li ġejja mhijiex lista eżawrjenti. Uħud mill-kotba jipprovdu eżempji maħdumin ta' disinni komparabbli, f'ċerti każijiet b'kodiċi għat-twettiq tal-analiżijiet bl-użu ta' diversi pakketti ta' softwer.
                        
                                     
                                 
                                 
                                    Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              ”
               
                     (6)
                  
                  
                     Fil-Parti B, jitħassar il-Kapitolu B.15.
                  
               
                     (7)
                  
                  
                     Fil-Parti B, jitħassar il-Kapitolu B.16.
                  
               
                     (8)
                  
                  
                     Fil-Parti B, jitħassar il-Kapitolu B.18.
                  
               
                     (9)
                  
                  
                     Fil-Parti B, jitħassar il-Kapitolu B.19.
                  
               
                     (10)
                  
                  
                     Fil-Parti B, jitħassar il-Kapitolu B.20.
                  
               
                     (11)
                  
                  
                     Fil-Parti B, jitħassar il-Kapitolu B.24.
                  
               
                     (12)
                  
                  
                     Fil-Parti B, il-Kapitolu B.47 huwa sostitwit b'dan li ġej:
                     “B.47   Metodu tat-Test tal-Opaċità u l-Permeabilità tal-Kornea fil-Bovini għall-Identifikazzjoni ta' i) Sustanzi Kimiċi li Jinduċu Ħsara Serja lill-Għajnejn u ii) Sustanzi Kimiċi li ma Jeħtiġux Klassifikazzjoni għal Irritazzjoni tal-Għajnejn jew Ħsara Serja lill-Għajnejn
                     
                     INTRODUZZJONI
                     Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 437 tal-OECD (2013). Il-metodu tat-test tal-Opaċità u l-Permeabilità tal-Kornea fil-Bovini ġie evalwat mill-Kumitat ta' Koordinazzjoni Interaġenzjali dwar il-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ICCVAM), flimkien maċ-Ċentru Ewropew għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ECVAM) u ċ-Ċentru Ġappuniż għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (JaCVAM), fl-2006 u l-2010 (1)(2). Fl-ewwel evalwazzjoni, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP ġie evalwat għall-utilità tiegħu sabiex jidentifika sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (1). Fit-tieni evalwazzjoni, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP ġie evalwat għall-utilità tiegħu sabiex jidentifika sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) mhux klassifikati għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn (2). Id-database tal-validazzjoni tal-BCOP kien fiha 113-il sustanza u 100 taħlita b'kollox (2)(3). Minn dawn l-evalwazzjonijiet u r-reviżjoni bejn il-pari tagħhom, ġie konkluż li l-metodu ta' ttestjar jista' jidentifika kif suppost sustanzi kimiċi (kemm sustanzi kif ukoll taħlitiet) li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1) kif ukoll dawk li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, kif definiti mis-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta' Sustanzi Kimiċi (GHS) (4) u r-Regolament (KE) Nru 1272/2008 dwar il-Klassifikazzjoni, l-Ittikkettar u l-Imballaġġ tas-Sustanzi u t-Taħlitiet (CLP) (7) u, għaldaqstant, ġie approvat bħala xjentifikament validu għal dawn iż-żewġ skopijiet. Ħsara serja lill-għajnejn hija l-produzzjoni ta' tibdiliet fl-għajnejn, jew tnaqqis fiżiku serju tal-vista, wara li tiġi applikata sustanza kimika fuq il-wiċċ quddiemi tal-għajn, li ma jkunux riversibbli fi żmien 21 jum mill-applikazzjoni. Is-sustanzi kimiċi tat-test li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn huma klassifikati fil-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU. Is-sustanzi kimiċi mhux ikklassifikati għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn huma definiti bħala dawk li ma jissodisfawx ir-rekwiżiti għall-klassifikazzjoni fil-Kategorija 1 jew 2 (2A jew 2B) tal-GHS tan-NU, jiġifieri huma msejħin bħala Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU. Dan il-metodu ta' ttestjar jinkludi l-użu rakkomandat u l-limitazzjonijiet tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP fuq il-bażi tal-evalwazzjonijiet tiegħu. Id-differenzi ewlenin bejn il-verżjoni oriġinali tal-2009 u l-verżjoni aġġornata tal-2013 tal-linja gwida tat-test tal-OECD jikkonċernaw, iżda mhumiex limitati għal: l-użu tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni skont il-GHS tan-NU (paragrafi 2 u 7); kjarifiki fuq l-applikabilità tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP għall-ittestjar ta' alkoħols, ketoni u solidi (paragrafi 6 u 7) u ta' sustanzi u taħlitiet (paragrafu 8); kjarifiki fuq kif għandhom jiġu testjati sustanzi tensjoattivi u taħlitiet li fihom tensjoattivi (paragrafu 28); aġġornamenti u kjarifiki dwar il-kontrolli pożittivi (paragrafi 39 u 40); aġġornament tal-kriterji dwar id-deċiżjoni tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP (paragrafu 47); aġġornament tal-kriterji ta' aċċettazzjoni tal-istudju (paragrafu 48); aġġornament fl-elementi tar-rapport tat-test (paragrafu 49); aġġornament tal-Appendiċi 1 dwar id-definizzjonijiet; iż-żieda tal-Appendiċi 2 tal-kapaċità ta' previżjoni tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP skont id-diversi sistemi ta' klassifikazzjoni; aġġornament tal-Appendiċi 3 fuq il-lista ta' sustanzi kimiċi tal-profiċjenza; u aġġornament tal-Appendiċi 4 dwar l-apparat fejn titqiegħed il-kornea tal-BCOP (paragrafu 1) u dwar l-opaċitometru (paragrafi 2 u 3).
                     Ġeneralment huwa aċċettat li, fil-futur qarib, ebda test in vitro tal-irritazzjoni tal-għajnejn waħdu ma huwa sejjer ikun kapaċi jieħu post it-test Draize in vivo tal-għajnejn sabiex ibassar il-medda sħiħa ta' irritazzjonijiet għal klassijiet ta' sustanzi kimiċi differenti. Madankollu, taħlitiet strateġiċi ta' diversi metodi ta' ttestjar alternattivi fi ħdan strateġija ta' ttestjar (sekwenzjali) jaf ikunu kapaċi jieħdu post it-test Draize tal-għajnejn (5). L-approċċ minn Fuq għal Isfel (5) huwa mfassal sabiex jintuża meta, fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, sustanza kimika tkun mistennija li jkollha potenzjal għoli ta' irritazzjoni, filwaqt li l-approċċ minn Isfel għal Fuq (5) huwa mfassal sabiex jintuża meta, fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, sustanza kimika ma tkunx mistennija tikkaġuna biżżejjed irritazzjoni tal-għajnejn sabiex tkun teħtieġ li tiġi kklassifikata. Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP huwa metodu ta' ttestjar in vitro li jista' jintuża f'ċerti ċirkustanzi u fi ħdan limitazzjonijiet speċifiċi għall-klassifikazzjoni tal-periklu għall-għajnejn u t-tikkettar ta' sustanzi kimiċi. Filwaqt li ma jitqiesx li huwa validu bħala sostitut awtonomu għat-test in vivo tal-għajnejn fuq il-fniek, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP huwa rakkomandat bħala pass inizjali fi ħdan strateġija ta' ttestjar, bħall-approċċ minn Fuq għal Isfel issuġġerit minn Scott et al. (5) sabiex jiġu identifikati sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn, jiġifieri sustanzi kimiċi li jiġu klassifikati fil-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU, mingħajr ma jsiru iktar testijiet (4). Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP huwa rakkomandat ukoll sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, kif definiti mill-GHS tan-NU (Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU) (4) fi ħdan strateġija ta' ttestjar bħall-approċċ minn Isfel għal Fuq (5). Madankollu, sustanza kimika li mhijiex prevista li tikkaġuna ħsara serja lill-għajnejn jew bħala mhux klassifikata għal irritazzjoni tal-għajnejn/ħsara serja lill-għajnejn bil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP tkun teħtieġ iktar testijiet (in vitro u/jew in vivo) sabiex tistabbilixxi klassifikazzjoni definittiva.
                     L-għan ta' dan il-metodu ta' ttestjar huwa li jiddeskrivi l-proċeduri użati għall-evalwazzjoni tal-potenzjal li sustanza kimika tat-test tikkawża periklu għall-għajen kif imkejjel mill-ħila tagħha li tinduċi opaċità jew żieda fil-permeabilità f'kornea bovina iżolata. L-effetti tossiċi għall-kornea jitkejlu bi: (i) trażmissjoni mnaqqsa tad-dawl (opaċità), u (ii) żieda fil-passaġġ tal-kulurant fluworexxein tas-sodju (permeabilità). Il-valutazzjonijiet tal-opaċità u l-permeabilità tal-kornea wara esponiment għas-sustanza kimika tat-test jingħaqdu għall-kisba ta' Punteġġ tal-Irritazzjoni In Vitro (IVIS), li jintuża sabiex jiġi kklassifikat il-livell ta' irritazzjoni tas-sustanza kimika tat-test.
                     Id-definizzjonijiet huma pprovduti fl-Appendiċi 1.
                     KUNSIDERAZZJONIJIET U LIMITAZZJONIJIET INIZJALI
                     Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bbażat fuq il-protokoll tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP tal-ICCVAM (6)(7), li oriġinarjament kien żviluppat minn informazzjoni miksuba mill-Istitut għall-protokoll tax-Xjenzi in vitro (IIVS) u l-Protokoll 124 tal-INVITTOX (8). Dan tal-aħħar jirrappreżenta l-protokoll użat għall-istudju ta' prevalidazzjoni sponsorjat mill-Komunità Ewropea li sar fl-1997-1998. Dawn iż-żewġ protokolli kienu bbażati fuq il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP irrapportat għall-ewwel darba minn Gautheron et al. (9).
                     Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP jista' jintuża sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn kif definiti mill-GHS tan-NU, jiġifieri sustanzi kimiċi li jiġu klassifikati taħt il-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU (4). Meta jintuża għal dan il-għan, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP għandu preċiżjoni kumplessiva ta' 79 % (150/191), rata ta' foloz pożittivi ta' 25 % (32/126), rata ta' foloz negattivi ta' 14 % (9/65), meta mqabbel mad-dejta tal-metodu ta' ttestjar in vivo tal-għajnejn tal-fniek ikklassifikat skont is-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (3) (ara l-Appendiċi 2, Tabella 1). Meta s-sustanzi kimiċi tat-test fi ħdan ċerti klassijiet ta' sustanzi kimiċi (jiġifieri alkoħols, ketoni) jew fiżiċi (jiġifieri solidi) jiġu esklużi mid-database, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP għandu preċiżjoni kumplessiva ta' 85 % (111/131), rata ta' foloz pożittivi ta' 20 % (16/81), rata ta' foloz negattivi ta' 8 % (4/50) għas-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (3). In-nuqqasijiet potenzjali tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP meta jintuża sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU) huma bbażati fuq ir-rati għoljin ta' foloz pożittivi għal alkoħols u ketoni u r-rata għolja ta' foloz negattivi għal solidi osservati fid-database dwar il-validazzjoni (1)(2)(3). Madankollu, peress li mhux l-alkoħols u l-ketoni kollha huma mbassra b'mod eċċessiv mill-metodu ta' ttestjar tal-BCOP u wħud huma mbassrin kif suppost bħala Kategorija 1 tal-GHS tan-NU, dawn iż-żewġ gruppi funzjonali organiċi ma jitqisux li jaqgħu barra mid-dominju ta' applikabilità tal-metodu ta' ttestjar. Huwa f'idejn l-utent ta' dan il-metodu ta' ttestjar li jiddeċiedi jekk previżjoni eċċessiva possibbli ta' alkoħol jew keton tistax tiġi aċċettat jew jekk għandhomx isiru iktar testijiet f'approċċ tal-piż tal-evidenza. Rigward ir-rati ta' foloz negattivi għas-solidi, ta' min jinnota li s-solidi jistgħu jwasslu għal kundizzjonijiet varjabbli u ta' esponiment estrem fit-test Draize in vivo tal-irritazzjoni tal-għajnejn, li jitsgħu jirriżultaw fi previżjonijiet irrilevanti tal-potenzjal ta' irritazzjoni veru tagħhom (10). Ta' min jinnota wkoll li l-ebda wieħed mill-foloz negattivi identifikati fid-database tal-validazzjoni tal-ICCVAM (2)(3), fil-kuntest ta' identifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU), ma rriżulta f'IVIS ≤ 3, li huwa l-kriterju użat sabiex sustanza kimika tat-test tiġi identiifkata bħala Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU. Barra minn hekk, f'dan il-kuntest il-foloz negattivi tal-BCOP mhumiex kritiċi peress li s-sustanzi kimiċi kollha tat-test li jipproduċu 3 < IVIS ≤ 55 imbagħad jiġu ttestjati b'testijiet in vitro validati adegwatament oħrajn, jew bħala l-aħħar alternattiva fil-fniek, skont ir-rekwiżiti regolatorji, bl-użu ta' strateġija ta' ttestjar sekwenzjali f'approċċ tal-piż tal-evidenza. Peress li ċerti sustanzi kimiċi solidi huma previsti kif suppost mill-metodu ta' ttestjar tal-BCOP bħala Kategorija 1 tal-GHS tan-NU, dan l-istat fiżiku lanqas ma jitqies li ma jaqax taħt id-dominju tal-applikabilità tal-metodu ta' ttestjar. L-investigaturi għandhom jikkunsidraw jużaw dan il-metodu ta' ttestjar għat-tipi kollha ta' sustanzi kimiċi, f'liema każ IVIS > 55 għandu jiġi aċċettat bħala indikatur ta' rispons inkluża ħsara serja lill-għajnejn li għandu jiġi klassifikat bħala Kategorija 1 tal-GHS tan-NU mingħajr ma jsiru iktar testijiet. Madankollu, kif diġà ntqal, riżultati pożittivi miksuba bl-alkoħols jew il-ketoni għandhom jiġu interpretati b'ċerta kawtela minħabba potenzjal ta' tbassir żejjed.
                     Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP jista' jintuża wkoll sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, skont is-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (4). Meta jintuża għal dan il-għan, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP għandu preċiżjoni kumplessiva ta' 69 % (135/196), rata ta' foloz pożittivi ta' 69 % (61/89), rata ta' foloz negattivi ta' 0 % (0/107), meta mqabbel mad-dejta tal-metodu ta' ttestjar in vivo tal-għajnejn tal-fniek ikklassifikat skont is-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (3) (ara l-Appendiċi 2, Tabella 2). Ir-rata ta' foloz pożittivi miksuba (sustanzi kimiċi ta' Ebda Kategorija tal-GNS tan-NU li in vivo jipproduċi IVIS > 3, ara l-paragrafu 47) hija konsiderevolment għolja, iżda mhijiex kritika f'dan il-kuntest peress li s-sustanzi kimiċi kollha tat-test li jipproduċu 3 < IVIS ≤ 55 imbagħad jiġu ttestjati b'testijiet in vitro validati adegwatament oħrajn, jew bħala l-aħħar alternattiva fil-fniek, skont ir-rekwiżiti regolatorji, bl-użu ta' strateġija ta' ttestjar sekwenzjali f'approċċ tal-piż tal-evidenza. Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP ma juri ebda nuqqas speċifiku għall-ittestjar ta' alkoħols, ketoni u solidi meta l-iskop ikun li jiġu identifikati sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn (Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU) (3). L-investigaturi għandhom jikkunsidraw jużaw dan il-metodu ta' ttestjar għat-tipi kollha ta' sustanzi kimiċi, f'liema każ riżultat negattiv (IVIS ≤ 3) għandu jiġi aċċettat bħala indikatur li ma hemm bżonn ta' ebda klassifikazzjoni (Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU). Peress li l-metodu ta' ttestjar tal-BCOP jista' jidentifika korrettament 31 % biss mis-sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, dan il-metodu ta' ttestjar ma għandux ikun l-ewwel għażla sabiex jinbeda approċċ minn Isfel għal Fuq (5), jekk ikun hemm metodi in vitro validati u aċċettati oħrajn b'sensittività għolja simili iżda speċifiċità għolja għad-dispożizzjoni.
                     Id-database tal-validazzjoni tal-BCOP kien fiha 113-il sustanza u 100 taħlita b'kollox (2)(3). Għaldaqstant, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP jitqies applikabbli għall-ittestjar taż-żewġ sustanzi u taħlitiet.
                     Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP mhuwiex rakkomandat għall-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi tat-test li għandhom jiġu klassifikati bħala irritanti għall-għajnejn (Kategorija 2 jew Kategorija 2A tal-GHS tan-NU) jew sustanzi kimiċi tat-test li għandhom jiġu klassifikati bħala ftit irritanti għall-għajnejn (Kategorija 2B tal-GHS tan-NU) minħabba n-numru konsiderevoli ta' sustanzi kimiċi tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU bħala sustanzi kimiċi tal-Kategorija 2, 2A jew 2B tal-GHS tan-NU u ta' Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU sovraklassifikati bħala Kategorija 2, 2A jew 2B tal-GHS tan-NU(2)(3). Għal dan il-għan, jista' jkun hemm bżonn li jsiru iktar testijiet b'metodu xieraq ieħor.
                     Il-proċeduri kollha li jinvolvu għajnejn bovini u korneji bovini għandhom isegwu r-regolamenti u l-proċeduri applikabbli tal-istallazzjoni tal-ittestjar f'dak li għandu x'jaqsam mal-manipulazzjoni ta' materjali dderivati mill-annimali, li jinkludu, iżda li mhumiex limitati għal, tessuti u fluwidi tat-tessuti. Huwa rakkomandat li jittieħdu l-prekawzjonijiet universali tal-laboratorju (11).
                     Filwaqt li l-metodu ta' ttestjar tal-BCOP ma jqisx feriti konġuntivali u iridali, jindirizza l-effetti korneali, li huma kawża primarja tal-klassifikazzjoni in vivo meta titqies il-klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU. Ir-reversibilità tal-feriti korneali ma tistax tiġi evalwata per se fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP. Ġie propost, abbażi ta' studji fuq għajnejn il-fniek, li valutazzjoni tal-fond inizjali tal-ferita fil-kornea tista' tintuża sabiex jiġu identifikati xi tipi ta' effetti riversibbli (12). Madankollu, hemm bżonn ta' iktar għarfien xjentifiku sabiex nifhmu kif iseħħu effetti irreversibbli mhux marbtin ma' ferita inizjali ta' livell għoli. Fl-aħħar nett, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP ma jippermettix li ssir valutazzjoni tal-potenzjal għal tossiċità sistemika assoċjata ma' esponiment okulari.
                     Dan il-metodu ta' ttestjar sejjer jiġi aġġornat kull ċertu żmien iktar ma jkun hemm informazzjoni u dejta ġodda kkunsidrati. Pereżempju, l-istopatoloġija tista' tkun potenzjalment siewja meta jkun hemm bżonn ta' karatterizzazzjoni iktar kompluta tal-ħsara fil-kornea. Ki spjegat fid-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 160 (13), dawk li jużawh huma mħeġġin jippreservaw il-kornei u jħejju kampjuni għall-istopatoloġija li jistgħu jintużaw sabiex jiġu żviluppati database u kriterji dwar id-deċiżjonijiet li jistgħu jkomplu jtejbu l-preċiżjoni ta' dan il-metodu ta' ttestjar.
                     Għal kwalunkwe laboratorju li inizjalment jistabbilixxi dan il-metodu ta' ttestjar, għandhom jintużaw is-sustanzi kimiċi tal-profiċjenza pprovduti fl-Appendiċi 3. Laboratorju jista' juża dawn is-sustanzi kimiċi sabiex juri l-kompetenza teknika tiegħu fit-twettiq tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP qabel ma jissottometti dejta tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP għall-finijiet tal-klassifikazzjoni regolatorja tal-perikli.
                     IL-PRINĊIPJU TAT-TEST
                     Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP huwa mudell organotipiku li jipprovdi manutenzjoni fuq perjodu qasir tal-funzjoni fiżjoloġika u bijokimika normali tal-kornea tal-bovini in vitro. F'dan il-metodu ta' ttestjar, il-ħsara mis-sustanza kimika tat-test tiġi vvalutata minn kejl kwantitattiv ta' bidliet fl-opaċità u l-permeabilità tal-kornea permezz ta' opaċitometru u spettrofotometru ta' dawl viżibbli, rispettivament. Iż-żewġ tipi ta' kejl jintużaw sabiex jiġi kkalkolat IVIS, li jintuża sabiex tiġi assenjata kategorija ta' klassifikazzjoni tal-periklu ta' irritazzjoni in vitro għat-tbassir tal-potenzjal ta' irritazzjoni okulari tas-sustanza kimika tat-test in vivo (ara l-Kriterji tad-Deċiżjoni fil-paragrafu 48).
                     Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP juża kornei iżolati mill-għajnejn ta' bhejjem li jkunu għadhom kemm inqatlu. L-opaċità tal-kornea titkejjel b'mod kwantitattiv bħala l-ammont ta' trażmissjoni ta' dawl minn ġol-kornea. Il-permeabilità titkejjel b'mod kwantitattiv bħala l-ammont ta' żebgħa fluworexxeina tas-sodju li jgħaddi min-naħa għall-oħra tal-ħxuna kollha tal-kornea, kif individwat fil-medium fil-kavità posterjuri. Is-sustanzi kimiċi tat-test, li jiġu introdotti fil-kavità anterjuri tal-apparat fejn titqiegħed il-kornea, jiġu applikati fis-superfiċje tal-epitelju tal-kornea. L-Appendiċi 4 tipprovdi deskrizzjoni u dijagramma tal-apparat fejn titqiegħed il-kornea użat fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP. L-apparat fejn titqiegħed il-kornea jista' jinxtara minn sorsi differenti jew jista' jinbena.
                     
                        Is-Sors u l-Età tal-Għajnejn tal-Bovini u l-Għażla tal-Ispeċijiet tal-Annimali
                     
                     Bhejjem mibgħuta l-biċċeriji tipikament jinqatlu jew għall-konsum mill-bniedem jew inkella għal użi kummerċjali oħrajn. Bħala sors ta' korneji għall-użu fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP jintużaw biss l-annimali b'saħħithom li jitqiesu xierqa sabiex jidħlu fil-katina alimentari tal-bniedem. Minħabba li l-bhejjem għandhom skala wiesgħa ta' piżijiet, skont ir-razza, l-età u s-sess, mhemmx piż irrakkomandat għall-annimal meta jiġi biex jinqatel.
                     Meta jintużaw għajnejn minn annimali ta' età differenti jistgħu jirriżultaw varjazzjonijiet fid-dimensjonijiet tal-kornea. Korneji b'dijametru orizzontali > 30.5 mm u valuri tal-ħxuna ċentrali tal-kornea (CCT) ≥ 1 100 μm ġeneralment jinkisbu minn bhejjem li jkollhom aktar minn tmien snin, filwaqt li dawk b'dijametru orizzontali < 28.5 mm u CCT < 900 μm ġeneralment jinkisbu minn bhejjem li jkollhom anqas minn ħames snin (14). Minħabba f'hekk, tipikament ma jintużawx għajnejn minn bhejjem li jkollhom aktar minn 60 xahar. Għajnejn minn bhejjem li jkollhom anqas minn 12-il xahar tradizzjonalment ma ntużawx għaliex l-għajnejn ikunu għadhom qegħdin jiżviluppaw u l-ħxuna tal-kornea u d-dijametru tal-kornea jkunu iżgħar b'mod konsiderevoli minn dawk irrapportati għall-għajnejn mill-bhejjem adulti. Madankollu, l-użu ta' kornei minn annimali żgħar (jiġifieri ta' età minn 6 xhur sa 12-il xahar) huwa permess minħabba li hemm xi vantaġġi, bħal pereżempju disponibilità akbar, skala dejqa ta' etajiet, u inqas perikli marbuta ma' esponiment potenzjali tal-ħaddiema għall-Enċefalopatija Sponġiforma Bovina (15). Minħabba li aktar evalwazzjoni tal-effett tad-daqs jew il-ħxuna tal-kornea fuq is-sensibilità għal sustanzi kimiċi korrużivi u irritanti tkun utli, l-utenti huma mħeġġin jirrapportaw stima tal-età u/jew il-piż tal-annimali li jipprovdu l-korneji użati fi studju.
                     
                        Ġbir u Trasport tal-Għajnejn lejn il-Laboratorju
                     
                     L-għajnejn jinġabru mill-impjegati tal-biċċerija. Sabiex jiġu minimizzati l-ħsara mekkanika u tipi oħrajn ta' ħsara lill-għajnejn, l-għajnejn għandhom jiġu enukleati mill-iktar fis wara l-mewt u jitkessħu minnufih wara l-enukleazzjoni u matul it-trasport. Sabiex jiġi evitat l-esponiment tal-għajnejn għal sustanzi kimiċi potenzjalment irritanti, il-ħaddiema tal-biċċerija ma għandhomx jużaw deterġent meta jlaħalħu ras l-annimal.
                     L-għajnejn għandhom jingħaddsu kompletament f'Soluzzjoni tal-Melħ Ekwilibrata mkessħa ta' Hanks, (Hanks' Balanced Salt Solution, HBSS) f'reċipjent ta' daqs adattat, u ttrasportati lejn il-laboratorju b'mod li kemm jista' jkun inaqqas id-deterjorament u/jew il-kontaminazzjoni mill-batterji. Minħabba li l-għajnejn jinġabru waqt il-proċess tal-qatla, dawn jistgħu jiġu esposti għad-demm u għal materjali bijoloġiċi oħrajn, inklużi batterji u mikroorganiżmi oħrajn. Għalhekk huwa importanti li jiġi żgurat li r-riskju ta' kontaminazzjoni jitnaqqas kemm jista' jkun (eż. billi r-reċipjent li jkun fih l-għajnejn jinżamm fuq silġ imxarrab, billi jiżdiedu antibijotiċi fl-HBSS li tintuża għall-ħżin tal-għajnejn waqt it-trasport [eż. 100 IU/mL ta' peniċillina u 100 μg/ml ta' streptomiċina]).
                     L-intervall tal-ħin li jgħaddi minn meta jinġabru l-għajnejn u l-użu tal-kornei fil-BCOP għandu jitnaqqas kemm jista' jkun (tipikament għandhom jinġabru u jintużaw fl-istess ġurnata) u għandu jintwera li dan ma jikkompromettix ir-riżultati tal-assaġġ. Dawn ir-riżultati huma bbażati fuq il-kriterji tal-għażla għall-għajnejn, kif ukoll ir-risponsi tal-kontrolli pożittivi u negattivi. L-għajnejn kollha użati fl-assaġġ għandhom ikunu mill-istess grupp ta' għajnejn miġbura f'ġurnata speċifika.
                     
                        Il-Kriterji tal-Għażla għall-Għajnejn Użati fil-Metodu ta' Ttestjar tal-BCOP
                     
                     Malli jaslu fil-laboratorju, l-għajnejn jiġu eżaminati bir-reqqa għad-difetti inklużi żieda fl-opaċità, grif u neovaskularizzazzjoni. Għandhom jintużaw biss il-korneji minn għajnejn li ma jkollhom l-ebda difett ta' dan it-tip.
                     Il-kwalità ta' kull kornea tiġi evalwata wkoll fi stadji li jiġu aktar 'il quddiem fl-assaġġ. Korneji li għandhom opaċità ikbar minn seba' unitajiet tal-opaċità jew ekwivalenti għall-opaċitometru u apparati fejn titqiegħed il-kornea wara perjodu ta' ekwilibrazzjoni inizjali ta' siegħa għandhom jintremew (NOTA: l-opaċitometru għandu jiġi kkalibrat bi standards tal-opaċità li jintużaw sabiex jiġu stabbiliti l-unitajiet tal-opaċità, ara l-Appendiċi 4).
                     Kull grupp tat-trattament (sustanza kimika tat-test, kontrolli negattivi u pożittivi paralleli) jikkonsisti minn minimu ta' tliet għajnejn. Fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP għandhom jintużaw tliet korneji għall-kontroll negattiv. Minħabba li l-korneji kollha jinqatgħu barra mill-globu sħiħ, u jitqiegħdu fil-kavitajiet tal-korneji, il-manipulazzjoni tagħhom tista' tirriżulta f'artefatti fil-valuri tal-opaċità u l-permeabilità tal-korneji individwali (inkluż il-kontroll negattiv). Barra minn hekk, il-valuri tal-opaċità u l-permeabilità mill-korneji tal-kontroll negattiv jintużaw biex jikkoreġu l-valuri tal-opaċità u l-permeabilità tal-kornei ttrattati bis-sustanza kimika tat-test u l-kornei ttrattati bil-kontroll pożittiv fil-kalkoli tal-IVIS.
                     PROĊEDURA
                     
                        Preparazzjoni tal-Għajnejn
                     
                     Korneji li ma jkollhom l-ebda difett jiġu dissezzjonati b'tali mod li jibqa' minn 2 sa 3 mm ta' xifer tal-isklerotika sabiex jgħin il-manipulazzjoni sussegwenti, u dan isir b'attenzjoni sabiex tiġi evitata kwalunkwe ħsara fl-epitelju u l-endotelju. Korneji iżolati jitqiegħdu f'apparat fejn titqiegħed il-kornea ddisinjat speċjalment għal dan il-għan li jikkonsisti f'kavitajiet anterjuri u posterjuri, li jkunu f'kuntatt mal-ġenb epiteljali u l-ġenb endoteljali tal-kornea, rispettivament. Iż-żewġ kavitajiet jimtlew sax-xifer bil-Medium Essenzjali Minimu ta' Eagle (Eagle's Minimum Essential Medium, EMEM) mingħajr fenol aħmar (l-ewwel il-kavità posterjuri), filwaqt li jiġi żgurat li ma jifformawx bżieżaq. L-apparat imbagħad jiġi kkalibrat għal tal-anqas siegħa f'temperatura ta' 32 ± 1 °C sabiex il-korneji jekwilibraw mal-medium u jiksbu kemm jista' jkun possibbli attività metabolika normali (it-temperatura approssimattiva tas-superfiċje tal-kornea in vivo hija 32 °C).
                     Wara l-perjodu ta' ekwilibrazzjoni, EMEM frisk, mingħajr fenol aħmar u msaħħan minn qabel jiżdied fiż-żewġ kavitajiet u jittieħed l-ewwel qari tal-valuri tal-opaċità għal kull kornea. Kwalunkwe kornea li turi ħsara makroskopika fit-tessut (eż. grif, pigmentazzjoni, neovaskularizzazzjoni) jew opaċità ikbar minn seba' unitajiet tal-opaċità jew ekwivalenti għall-opaċitometru u l-apparati fejn titqiegħed il-kornea użati jintremew. Tal-inqas tliet korneji jintgħażlu bħala korneji tal-kontroll negattiv (jew solvent). Imbagħad, il-korneji li jifdal jiġu ddistribwiti fi grupp tat-trattament u tal-kontroll pożittiv.
                     Minħabba li l-kapaċità tas-sħana tal-ilma hija ogħla minn dik tal-arja, l-ilma jipprovdi kundizzjonijiet ta' temperatura aktar stabbli għall-inkubazzjoni. Għalhekk, huwa rrakkomandat l-użu ta' banju tal-ilma sabiex l-apparat fejn titqiegħed il-kornea u l-kontenut tiegħu jinżammu f'temperatura ta' 32 ± 1 °C. Madankollu, jistgħu jintużaw ukoll inkubaturi tal-arja, filwaqt li jittieħdu prekawzjonijiet sabiex tinżamm l-istabilità tat-temperatura (eż., billi l-apparat u l-media jissaħħnu minn qabel).
                     
                        Applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test
                     
                     Jintużaw żewġ protokolli ta' trattament, wieħed għal-likwidi u l-aġenti tensjoattivi (solidi jew likwidi), u ieħor għal solidi li mhumiex aġenti tensjoattivi.
                     Il-likwidi jiġu ttestjati meta ma jkunux dilwiti. Semisolidi, kremi u x-xema' tipikament jiġu ttestjati bħala likwidi. Sustanzi tensjoattivi puri jiġu ttestjati f'konċentrazzjoni ta' 10 % w/v f'soluzzjoni tal-klorur tas-sodju ta' 0.9 %, ilma distillat, jew solvent ieħor li jkun intwera li ma għandu l-ebda effetti avversi fuq is-sistema tat-test. Għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xierqa għal konċentrazzjonijiet ta' dilwizzjoni alternattivi. Taħlitiet li fihom aġenti tensjoattivi jistgħu jiġu ttestjati mhux dilwiti jew dilwiti f'konċentrazzjoni xierqa skont ix-xenarju tal-esponiment rilevanti in vivo. Għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xierqa għall-konċentrazzjoni ttestjata. Il-kornei jiġu esposti għal-likwidi u l-aġenti tensjoattivi għal 10 minuti. L-użu ta' ħinijiet oħrajn ta' esponiment għandu jkun ibbażat fuq raġuni xjentifika xierqa. Jekk jogħġbok ara l-Appendiċi 1 għal definizzjoni ta' taħlita tensjoattiva u taħlita li fiha aġent tensjoattiv.
                     Solidi li mhumiex aġenti tensjoattivi tipikament jiġu ttestjati bħala soluzzjonijiet jew sospensjonijiet f'konċentrazzjoni ta' 20 % w/v f'soluzzjoni tal-klorur tas-sodju ta' 0.9 %, ilma distillat, jew solvent ieħor li jkun intwera li ma għandu l-ebda effetti avversi fuq is-sistema tat-test. F'ċerti ċirkostanzi u b'ġustifikazzjoni xjentifika xierqa, is-solidi jistgħu jiġu ttestjati puri b'applikazzjoni diretta fuq is-superfiċje tal-kornea permezz tal-metodu tal-kavità miftuħa (ara l-paragrafu 32). Il-korneji jiġu esposti għas-solidi għal erba' sigħat, iżda bħalma jsir għal-likwidi u l-aġenti tensjoattivi, jistgħu jintużaw ħinijiet ta' esponiment alternattivi fuq il-bażi ta' raġuni xjentifika xierqa.
                     Jistgħu jintużaw metodi ta' trattament differenti, skont in-natura fiżika u l-karatteristiċi kimiċi (eż. solidi, likwidi, likwidi viskużi jew mhux viskużi) tas-sustanza kimika tat-test. Il-fattur kritiku huwa li jiġi żgurat li s-sustanza kimika tat-test tkopri b'mod xieraq is-superfiċje tal-epitelju u li titneħħa b'mod xieraq waqt l-istadji tat-tlaħliħ. Metodu tal-kavità magħluqa tipikament jintuża għal sustanz kimiċi tat-test li jvarjaw minn likwidi mhux viskużi għal likwidi viskużi ftit, filwaqt li metodu tal-kavità miftuħa tipikament jintuża għal sustanzi tat-test li jvarjaw minn likwidi semiviskużi għal likwidi viskużi u għal solidi puri.
                     Fil-metodu tal-kavità magħluqa, ammont tas-sustanza kimika tat-test (750 μl) li jkun biżżejjed biex ikopri l-kavità anterjuri jiġi introdott minn ġot-toqob tad-dożaġġ fuq is-superfiċje ta' fuq tal-kavità, u t-toqob sussegwentement jiġu ssiġillati bit-tappieri tal-kavità waqt l-esponiment. Huwa importanti li jiġi żgurat li kull kornea tiġi esposta għas-sustanza kimika tat-test għall-intervall tal-ħin xieraq.
                     Fil-metodu tal-kavità miftuħa, iċ-ċirku li jsakkar it-tieqa u t-tieqa tal-ħġieġ jitneħħew mill-kavità anterjuri qabel ma jibda t-trattament. Il-kontroll jew is-sustanza kimika tat-test (750 μl, jew biżżejjed sustanza kimika tat-test biex tiksi l-kornea għalkollox) jiġu applikati direttament fuq is-superfiċje tal-epitelju tal-kornea permezz ta' mikropipetta. Jekk ikun diffiċli li tuża l-pipetta għas-sustanza kimika tat-test, is-sustanza kimika tat-test tista' tiġi kkargata bil-pressa f'pipetta bi spostament pożittiv sabiex tgħin fid-dożaġġ. Il-ponta tal-pipetta bi spostament pożittiv, tiddaħħal fil-ponta tad-distribuzzjoni tas-siringa sabiex il-materjal ikun jista' jinġibed fil-ponta tal-pipetta taħt pressjoni. Imbagħad jeħtieġ li l-pistun tal-pipetta jinġibed 'il fuq fl-istess waqt li l-pistun tas-siringa jingħafas 'l isfel. Jekk fil-ponta tal-pipetta jiffurmaw xi bżieżaq tal-arja, is-sustanza kimika tat-test għandha titneħħa (tinħareġ 'il barra) u l-proċess jiġi ripetut sa mal-ponta timtela mingħajr ma jkun hemm bżieżaq tal-arja. Jekk ikun meħtieġ, tista' tintuża siringa normali (mingħajr labra) minħabba li din tippermetti l-kejl ta' volum akkurat tas-sustanza kimika tat-test u applikazzjoni eħfef fuq is-superfiċje tal-epitelju tal-kornea. Wara d-dożaġġ, it-tieqa tal-ħġieġ terġa' titqiegħed fuq il-kavità anterjuri biex terġa' tinħoloq sistema magħluqa.
                     
                        Inkubazzjoni ta' Wara l-Esponiment
                     
                     Wara l-perjodu ta' esponiment, is-sustanza kimika tat-test, is-sustanza kimika tal-kontroll negattiv, jew tal-kontroll pożittiv jitneħħew mill-kavità anterjuri u l-epitelju jinħaslu tal-inqas tliet darbiet (jew sakemm ma tkun tista' tiġi osservata l-ebda evidenza viżiva tas-sustanza kimika tat-test) bl-EMEM (li jkun fih il-fenol aħmar). Medium li jkun fih il-fenol aħmar jintuża għat-tlaħliħ minħabba li bidla fil-kulur tal-fenol aħmar tista' tiġi mmonitorjata sabiex tiġi ddeterminata l-effikaċja tat-tlaħliħ ta' sustanzi kimiċi tat-test aċidużi jew alkalini. Il-korneji jinħaslu aktar minn tliet darbiet jekk il-fenol aħmar jibqa' jibdel il-kulur (isfar jew vjola), jew is-sustanza kimika tat-test tkun għadha viżibbli. Ladarba l-medium ma jibqagħlux sustanza kimika tat-test, il-kornei jitlaħalħu għall-aħħar darba bl-EMEM (mingħar fenol aħmar). L-EMEM (mingħajr fenol aħmar) jintuża għall-aħħar tlaħliħa sabiex jiġi żgurat li l-fenol aħmar jitneħħa kompletament mill-kavità anterjuri qabel ma titkejjel l-opaċità. Imbagħad il-kavità anterjuri terġa' timtela b'EMEM frisk mingħajr fenol aħmar.
                     Għal-likwidi jew l-aġenti tensjoattivi, wara t-tlaħliħ, il-korneji jiġu inkubati għal sagħtejn oħra f'temperatura ta' 32 ± 1 °C. F'ċerti ċirkostanzi ħin itwal ta' inkubazzjoni wara l-esponiment jista' jkun utli u jista' jiġi kkunsidrati fuq bażi ta' każ b'każ. Korneji ttrattati b'solidi jitlaħalħu kompletament fi tmiem il-perjodu tal-esponiment li jdum erba' sigħat, iżda ma jeħtiġux aktar inkubazzjoni.
                     Fi tmiem il-perjodu ta' inkubazzjoni wara l-esponiment għal-likwidi u l-aġenti tensjoattivi u fi tmiem il-perjodu tal-esponiment ta' erba' sigħat għas-solidi li mhumiex aġenti tensjoattivi, jiġu rreġistrati l-opaċità u l-permeabilità ta' kull kornea. Barra minn hekk, kull kornea tiġi osservata b'mod viżiv u l-osservazzjonijiet pertinenti jiġu rreġistrati (eż. tqaxxir tat-tessuti, sustanza kimika tat-test residwa, opaċità mhux uniformi). Dawn l-osservazzjonijiet jistgħu jkunu importanti għaliex jistgħu jiġu riflessi minn varjazzjonijiet fil-qari tal-valuri tal-opaċitometru.
                     
                        Sustanzi Kimiċi tal-Kontroll
                     
                     Kontrolli negattivi jew tas-solvent/tal-veikolu u kontrolli pożittivi paralleli jiġu inklużi f'kull esperiment.
                     Meta sustanza likwida tiġi ttestjata f'100 %, kontroll negattiv (eż., soluzzjoni tal-klorur tas-sodju ta' 0.9 % jew ilma distillat) jiġi inkluż fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP sabiex ikunu jistgħu jiġu individwati bidliet mhux speċifiċi fis-sistema tat-test u sabiex tiġi pprovduta linja ta' bażi għall-punti ta' tmiem tal-assaġġ. Dan jiżgura wkoll li l-kundizzjonijiet tal-assaġġ ma jirriżultawx b'mod li mhux xieraq f'rispons irritanti.
                     Meta jiġi ttestjat likwidu dilwit, aġent tensjoattiv jew solidu fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP, jiġi inkluż grupp tal-kontroll tas-solvent/tal-veikolu parallel sabiex ikunu jistgħu jiġu individwati bidliet mhux speċifiċi fis-sistema tat-test u sabiex tiġi pprovduta linja ta' bażi għall-punti ta' tmiem tal-assaġġ. Jista' jintuża biss solvent/veikolu li jkun intwera li ma għandu l-ebda effett avvers fuq is-sistema tat-test.
                     Sustanza kimika magħrufa li tinduċi rispons pożittiv hija inkluża bħala kontroll pożittiv parallel f'kull esperiment sabiex tiġi verifikata l-integrità tas-sistema tat-test u t-twettiq korrett ta' dan. Madankollu, sabiex jiġi żgurat li l-varjabilità fir-reazzjoni tal-kontroll pożittiv tista' tiġi vvalutata, id-daqs tar-reazzjoni irritanti ma għandux ikun eċċessiv.
                     Eżempji ta' kontrolli pożittivi għal sustanzi kimiċi tat-test likwidi huma 100 % etanol jew 100 % dimetilformamid. Eżempju ta' kontroll pożittiv għal sustanzi kimiċi tat-test huwa 20 % w/v imidażol f'0.9 % soluzzjoni tal-klorur tas-sodju.
                     Is-sustanzi kimiċi ta' riferiment huma utli għall-evalwazzjoni tal-potenzjal li sustanzi kimiċi mhux magħrufa ta' klassi speċifika ta' kimiċi jew tal-prodotti jikkawżaw irritazzjoni okulari, jew għall-evalwazzjoni tal-potenzjal relattiv li sustanza irritanti għall-għajnejn tikkawża irritazzjoni okulari fi ħdan skala speċifika ta' risponsi ta' sustanzi irritanti.
                     
                        Punti ta' Tmiem Imkejlin
                     
                     L-opaċità tiġi stabbilita mill-ammont ta' trażmissjoni ta' dawl minn ġol-kornea. L-opaċità tal-kornea titkejjel b'mod kwantitattiv permezz ta' opaċitometru, li jagħti valuri ta' opaċità fuq skala kontinwa.
                     Il-permeabilità tiġi stabbilita mill-ammont taż-żebgħa fluworexxeina tas-sodju li tippenetra s-saffi kollha taċ-ċelloli tal-kornea (jiġifieri l-epitelju fuq is-superfiċje esterna tal-kornea għal ġol-endotelju fuq is-superfċije interna tal-kornea). Millilitru ta' soluzzjoni ta' fluworexxeina tas-sodju (4 jew 5 mg/ml meta jiġu ttestjati likwidi jew aġenti tensjoattivi jew solidi li mhumiex aġenti tensjoattivi, rispettivament) jiżdied fil-kavità anterjuri tal-apparat fejn titqiegħed il-kornea, li tkun f'kuntatt mal-ġenb epiteljali tal-kornea, filwaqt li l-kavità posterjuri, li tkun f'kuntatt mal-ġenb endoteljali tal-kornea, timtela b'EMEM frisk. Imbagħad l-apparat jiġi inkubat f'pożizzjoni orizzontali għal 90 ± 5 min fi 32 ± 1 °C. L-ammont ta' fluworexxeina tas-sodju li jgħaddi għal ġol-kavità posterjuri jitkejjel b'mod kwantitattiv permezz ta' spettrofotometru UV/VIS. Kejl spettrofotometriku evalwat f'490 nm jiġi rreġistrat bħala densità ottika (OD490) jew valuri ta' assorbità li jitkejlu fuq skala kontinwa. Il-valuri ta' permeabilità tal-fluworexxeina jiġu stabbiliti bl-użu ta' valuri ta' OD490 fuq il-bażi ta' spettrofotometru viżibbli li juża traġitt ottiku standard ta' 1 cm.
                     Inkella jista' jintuża qarrej tal-folja tal-mikrotitrazzjoni b'96 bwejra diment li; (i) tkun tista' tiġi stabbilita l-iskala ta' valuri lineari tal-qarrej tal-folja għad-determinazzjoni tal-valuri tal-fluworexxeina OD490; u (ii), jintuża l-volum it-tajjeb ta' kampjuni ta' fluworexxeina fil-folja b'96 bir sabiex jinkisbu valuri OD490 ekwivalenti għat-traġitt okulari standard ta' 1 cm (dan jista' jkun jeħtieġ bir sħiħ [normalment 360μl]).
                     DEJTA U RAPPORTAR
                     
                        Evalwazzjoni tad-Dejta
                     
                     Ladarba l-valuri (OD490) tal-opaċità u l-permeabilità medja jkunu ġew ikkoreġuti għall-opaċità tal-isfond u l-valuri OD490 tal-permeabilità tal-kontroll negattiv, il-valuri medji OD490 tal-opaċità u l-permeabilità għal kull grupp ta' trattament għandhom jiġu kkombinati f'formula dderivata empirikament sabiex jiġi kkalkulat punteġġ tal-irritanza in vitro (IVIS) għal kull grupp tat-trattament kif ġej:
                     IVIS = valur medju tal-opaċità + (15 × valur OD490 medju tal-permeabilità)
                     Sina et al. (16) irrapportaw li din il-formula ġiet idderivata matul studji interni u bejn laboratorji. Id-dejta ġġenerata għal sensiela ta' 36 kompost fi studju fost bosta laboratorji ġiet soġġetta għal analiżi b'varjabbli mutlipli sabiex tiġi ddeterminata l-ekwazzjoni tal-aqwa adattament bejn id-dejta in vivo u dik in vitro. Ix-xjentisti f'żewġ kumpaniji separati għamlu din l-analiżi u waslu għal ekwazzjonijiet kważi identiċi.
                     Il-valuri tal-opaċità u tal-permeabilità għandhom jiġu evalwati wkoll b'mod indipendenti sabiex jiġi ddeterminat jekk sustanza kimika tat-test tkunx ipprovokat korrużività jew irritazzjoni severa permezz ta' wieħed biss miż-żewġ punti ta' tmiem (ara l-Kriterji tad-Deċiżjoni).
                     
                        Kriterji tad-Deċiżjoni
                     
                     Il-valuri limitu tal-IVIS għall-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi tat-test li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU) u sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn (Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU) jingħataw hawnhekk:
                     
                                 IVIS
                              
                              
                                 GHS tan-NU
                              
                           
                                 ≤ 3
                              
                              
                                 Ebda Kategorija
                              
                           
                                 > 3; ≤ 55
                              
                              
                                 Ma tista' ssir ebda previżjoni
                              
                           
                                 > 55
                              
                              
                                 Kategorija 1
                              
                           
                        Kriterji ta' Aċċettazzjoni tal-Istudju
                     
                     Test jitqies aċċettabbli jekk il-kontroll pożittiv jagħti IVIS li jkun fi ħdan żewġ devjazzjonijiet standard tal-medja storika attwali, li tiġi aġġornata tal-anqas kull tliet xhur, jew kull darba li jitwettaq test aċċettabbli f'laboratorji fejn it-testijiet ma jitwettqux b'mod frekwenti (jiġifieri anqas minn darba fix-xahar). Ir-reazzjonijiet mill-kontroll negattiv jew tas-solvent/tal-medium għandhom jirriżultaw f'valuri ta' opaċità u permeabilità li jkunu anqas mill-ogħla limiti stabbiliti għall-valuri tal-opaċità u l-permeabilità tal-isfond għall-korneji bovini ttrattati bil-kontroll negattiv jew tas-solvent/tal-veikolu rispettiv. Sessjoni waħda ta' ttestjar magħmula minn tal-inqas tliet korneji għandha tkun biżżejjed għal sustanza kimika tat-test meta l-klassifikazzjoni li tirriżulta tkun inekwivokabbli. Madankollu, f'każijiet ta' riżultati mhux ċari fl-ewwel sensiela ta' testijiet, għandha tiġi kkunsidrata t-tieni sensiela ta' testijiet (iżda mhux bilfors), kif ukoll it-tielet waħda fil-każ ta' riżultati tal-IVIS medju li ma jaqblux bejn l-ewwel żewġ sensiliet ta' testijiet. F'dan il-kuntest, riżultat fl-ewwel sensiela ta' testijet jitqies li mhuwiex ċar jekk il-previżjonijiet mit-3 korneji ma jkunux jaqblu, b'tali mod li:
                     
                                 —
                              
                              
                                 2 mit-3 korneji taw previżjonijiet li ma jaqblux mill-medja tat-3 korneji kollha kemm huma, JEW,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 1 mit-3 korneji tat previżjoni li ma taqbilx mill-medja tat-3 korneji kollha kemm huma, U r-riżultat li ma jaqbiżx kien > 10 unitajiet tal-IVIS mil-limitu ta' 55.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Jekk is-sensiela ripetuta ta' testijiet tikkonferma l-previżjoni tal-ewwel sensiela ta' testijiet (fuq il-bażi tal-valur medju tal-IVIS), tkun tista' tittieħed deċiżjoni finali mingħajr ma jsiru testijiet oħrajn. Jekk is-sensiela ripetuta ta' testijiet fi previżjoni mhux konkordanti mill-ewwel sensiela ta' testijiet (fuq il-bażi tal-valur medju tal-IVIS), issir it-tielet u l-aħħar sensiela ta' testijiet sabiex jiġu solvuti l-previżjonijiet li ma jaqblux, u sabiex tiġi kklassifikata s-sustanza kimika tat-test. Jista' jkun awtorizzat li jiġu rinunzjati iktar testijiet għall-klassifikazzjoni u t-tikkettar f'każ li xi sensiela ta' testijiet tirriżulta fi previżjoni tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU.
                              
                           
                        Rapport tat-test
                     
                     Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja, jekk tkun rilevanti għat-twettiq tal-istudju:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanzi Kimiċi tat-Test u tal-Kontroll
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Isem tas-sustanza kimika (jew sustanzi kimiċi) pereżempju l-isem strutturali użat mill-Chemical Abstracts Service (CAS), segwit minn ismijiet oħrajn, jekk ikunu magħrufin; in-Numru tar-Reġistru (RN) tas-CAS, jekk ikun magħruf;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-purità u l-kompożizzjoni tas-sustanza kimika tat-test/tal-kontroll (f'perċentwal(i) skont il-piż), sakemm din l-informazzjoni tkun disponibbli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Proprjetajiet fiżikokimiċi bħall-istat fiżiku, il-volatilità, il-pH, l-istabilità, il-klassi kimika, is-solubilità fl-ilma rilevanti għat-twettiq tal-istudju;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Trattament tas-sustanzi kimiċi tat-test/ta' kontroll qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             L-istabilità, jekk tkun magħrufa.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Informazzjoni dwar l-Isponser u l-Faċilità tat-Test
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             L-isem u l-indirizz tal-isponser, tal-faċilità tat-test u tad-direttur tal-istudju.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Il-Kundizzjonijiet tal-Metodu ta' Ttestjar
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             L-opaċitometru użat (eż. mudell u speċifikazzjonijiet) u l-issettjar tal-istrumenti;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             L-informazzjoni dwar il-kalibraġġ għal apparati użati għall-kejl tal-opaċità u l-permeabilità (eż. opaċitometru u spettrofotometru) sabiex tiġi żgurata linearità tal-kejliet;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             It-tip ta' apparati fejn titqiegħed il-kornea użati (eż. mudell u speċifikazzjonijiet);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni ta' tagħmir ieħor użat;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-proċedura użata sabiex tiġi żgurata l-integrità (jiġifieri l-preċiżjoni u l-affidabilità) tal-metodu ta' ttestjar maż-żmien (eż. ittestjar perjodiku tas-sustanzi kimiċi tal-profiċjenza).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kriterji għal Test Aċċettabbli
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-meded aċċettabbli tal-kontrolli pożittivi u negattivi paralleli bbażati fuq dejta storika;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Jekk applikabbli, il-meded aċċettabbli tal-kontrolli paralleli ta' riferiment bbażati fuq dejta storika.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Il-Ġbir u l-Preparazzjoni tal-Għajnejn
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Identifikazzjoni tas-sors tal-għajnejn (jiġifieri l-faċilità minn fejn inġabru);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Id-dijametru tal-kornea bħala kejl tal-età u l-annimal sors u l-idoneità għall-assaġġ;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-kundizzjonijiet tat-trasport u l-ħżin tal-għajnejn (eż., id-data u l-ħin meta nġabru l-għajnejn, l-intervall tal-ħin qabel ma nbeda t-test, il-media tat-trasport u l-kundizzjonijiet tat-temperatura, kwalunkwe antibijotiku li ntuża);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-preparazzjoni u l-immuntar tal-korneji tal-bovini, inklużi dikjarazzjonijiet fuq il-kwalità tagħhom, it-temperatura tal-apparati fejn titqiegħed il-kornea, u l-kriterji għall-għażla tal-korneji użati għall-ittestjar.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Proċedura tat-test
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             In-numru ta' repliki użati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             L-identità tal-kontrolli negattivi u pożittivi użati (jekk applikabbli, anki s-solvent u l-kontrolli ta' riferiment);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-konċentrazzjoni(jiet) tas-sustanza kimika, l-applikazzjoni, il-ħin tal-esponiment u l-ħin ta' inkubazzjoni wara l-esponiment użati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni tal-kriterji ta' evalwazzjoni u deċiżjoni użati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni tal-kriterji ta' aċċettazzjoni tal-istudju użati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni ta' kwalunkwe modifika tal-proċedura tat-test;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni tal-kriterji ta' deċiżjoni użati.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ir-riżultati
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Tabulazzjoni ta' dejta minn kampjuni individwali tat-test (eż. valuri ta' opaċità u OD490 u IVIS ikkalkolat għas-sustanza lkimika tat-test u l-kontrolli pożittivi, negattivi u ta' riferiment [jekk inklużi], irrapportati f'forma ta' tabella, inkluża dejta minn esperimenti ripetuti ta' replika kif ikun xieraq, u l-medji ± tad-devjazzjoni standard għal kull esperiment);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni ta' effetti osservati oħrajn;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU in vitro derivata, jekk applikabbli.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Diskussjoni tar-Riżultati
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Konklużjoni
                                 
                              
                           TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 ICCVAM (2006). Test Method Evaluation Report — In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Disponibbli fuq: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report: Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. NIH Publication No.10-7553. Research Triangle Park, NC:National Institute of Environmental Health Sciences. Disponibbli fuq: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 OECD (2013). Streamlined Summary Document supporting the Test Guideline 437 for eye irritation/corrosion. Series on Testing and Assessment, No.189, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 UN (2011). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30 Rev 4, New York and Geneva: United Nations. Disponibbli fuq: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Scott, L., Eskes, C., Hoffmann, S., Adriaens, E., Alépée, N., Bufo, M., Clothier, R., Facchini, D., Faller, C., Guest, R., Harbell, J., Hartung, T., Kamp, H., Le Varlet, B., Meloni, M., McNamee, P., Osborne, R., Pape, W., Pfannenbecker, U., Prinsen, M., Seaman, C., Spielman, H., Stokes, W., Trouba, K., Van den Berghe, C., Van Goethem, F., Vassallo, M., Vinardell, P., and Zuang, V. (2010). A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using Bottom-Up and Top-Down approaches. Toxicol. in Vitro 24:1-9.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 ICCVAM (2006). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. Fi: ICCVAM Test Method Evaluation Report — in vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Disponibbli fuq: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 ICCVAM (2010). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. Fi: ICCVAM Test Method Evaluation Report — Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 10-7553A. Disponibbli fuq: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay — SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442-449.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicol. in Vitro 20:78-81.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Disponibbli fuq: [http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 OECD (2011). Guidance Document on The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-severe Irritants. Series on Testing and Assessment, No. 160. Adopted October 25, 2011. Paris: Organisation for Economic Co-operation and Development.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159-2165.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on — Part I. The Lancet 349: 636-641.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam. Appl. Toxicol. 26:20-31.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu B.5 ta' dan l-Anness, Irritazzjoni/korrużjoni akuta tal-għajnejn.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 ICCVAM (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Disponibbli fuq: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm].
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 OECD (1998). Series on Good Laboratory Practice and Compliance Monitoring. No. 1: OECD Principles on Good Laboratory Practice (revised in 1997).
                                 Disponibbli fuq: http://www.oecd.org/document/63/0,3343,en_2649_34381_2346175_1_1_1_1,00.html
                              
                           
                        Appendiċi 1
                        DEFINIZZJONIJIET
                        
                           
                              Preċiżjoni
                           : Il-qrubija fil-livell ta' qbil bejn ir-riżultati tal-metodu ta' ttestjar u l-valuri ta' referenza aċċettati. Hija kejl tal-prestazzjoni tal-metodu ta' ttestjar u wieħed mill-aspetti ta'“rilevanza”. It-terminu jintuża spiss minflok “konkordanza” sabiex ifisser il-proporzjon ta' riżultati tajbin tal-metodu ta' ttestjar.
                        
                           
                              Sustanza kimika ta' riferiment
                           : Sustanza kimika użata bħala standard għall-paragun ma' sustanza kimika tat-test. Sustanza kimika ta' riferiment għandu jkollha l-proprjetajiet li ġejjin; (i) sors(i) konsistenti u affidabbli; (ii) similarità strutturali u funzjonali mal-klassi ta' sustanzi kimiċi ttestjati; (iii) karatteristiċi fiżiċi/kimiċi magħrufin; (iv) dejta ta' appoġġ dwar effetti magħrufin, u (v) potenza magħrufa fl-iskala tar-rispons mixtieq.
                        
                           
                              Approċċ Minn Isfel Għal Fuq
                           : approċċ sekwenzjali użat għal sustanza kimika ssuspettata li ma teħtieġx klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, li jibda bid-determinazzjoni ta' sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni (eżitu negattiv) minn sustanzi kimiċi oħrajn (eżitu pożittiv).
                        
                           
                              Sustanza kimika
                           : Sustanza jew taħlita.
                        
                           
                              Kornea
                           : Il-parti trasparenti tal-parti ta' quddiem tal-boċċa tal-għajn li tiksi l-iris u l-pupilla u tħalli d-dawl jgħaddi għal ġol-parti interna tal-għajn.
                        
                           
                              Opaċità tal-kornea
                           : Kejl tal-estensjoni tal-opaċità tal-kornea wara esponiment għal sustanza kimika tat-test. Żieda fl-opaċità tal-kornea hija indikattiva ta' ħsara fil-kornea. L-opaċità tista' tiġi evalwata b'mod suġġettiv kif isir fit-test Draize li jsir fuq għajnejn il-fniek, jew b'mod oġġettiv bi strument bħal pereżempju “opaċitometru”.
                        
                           
                              Permeabilità tal-kornea
                           : Kejl kwantitattiv tal-ħsara fl-epitelju tal-kornea billi jiġi ddeterminat l-ammont ta' żebgħa fluworexxeina tas-sodju li tgħaddi minn ġos-saffi kollha taċ-ċelluli tal-kornea.
                        
                           
                              Irritazzjoni għall-għajnejn
                           : Il-produzzjoni ta' tibdiliet fl-għajnejn wara l-applikazzjoni ta' sustanza kimika tat-test fil-wiċċ ta' wara tal-għajn, li huma kompletament reversibbli fi żmien 21 jum mill-applikazzjoni. Interkambjabbli ma' “Effetti reversibbli fuq l-għajnejn” u mal-“Kategorija 2 tal-GHS tan-NU” (4).
                        
                           
                              Rata ta' negattivi foloz
                           : Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi pożittivi kollha identifikati b'mod falz bħala negattivi permezz ta' metodu ta' ttestjar. Dan huwa wieħed mill-indikaturi tal-prestazzjoni tal-metodu ta' ttestjar.
                        
                           
                              Rata ta' foloz pożittivi
                           : Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi negattivi kollha identifikati b'mod falz bħala pożittivi permezz ta' metodu ta' ttestjar. Dan huwa wieħed mill-indikaturi tal-prestazzjoni tal-metodu ta' ttestjar.
                        
                           
                              Periklu
                           : Proprjetà inerenti ta' aġent jew sitwazzjoni li għandhom il-potenzjal li jikkawżaw effetti avversi meta organiżmu, sistema jew (sub)popolazzjoni jiġu esposti għal dak l-aġent.
                        
                           
                              Punteġġ tal-Irritazzjoni In Vitro (IVIS)
                           : Formula dderivata empirikament użata fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP li biha l-valuri medji tal-opaċità u tal-permeabilità għal kull grupp tat-trattament jiġu kkombinati f'punteġġ in vitro wieħed għal kull grupp tat-trattament. L-IVIS = valur medju tal-opaċità + (15 x valur medju tal-permeabilità).
                        
                           
                              Effetti irreversibbli fuq l-għajnejn
                           : Ara “Ħsara serja lill-għajnejn”.
                        
                           
                              Taħlita
                           : Taħlita jew soluzzjoni msawra minn żewġ sustanzi jew iktar li fiha ma jirreaġixxux (4)
                        
                           
                              Kontroll negattiv
                           : Replika mhux ittrattata li fiha l-komponenti kollha ta' sistema tat-test. Dan il-kampjun jiġi proċessat b'kampjuni ttrattati bis-sustanza kimika tat-test u kampjuni tal-kontroll oħrajn sabiex jiġi ddeterminat jekk is-solvent ikollux interazzjoni mas-sistema tat-test.
                        
                           
                              Mhux ikklassifikati
                           : Sustanzi kimiċi li mhumiex ikklassifikati għal Irritazzjoni tal-għajnejn (Kategorija 2, 2A jew 2B tal-GHS tan-NU) jew Ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU). Interkambjabbli ma' “Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU”.
                        
                           
                              Opaċitometru
                           : Strument li jintuża sabiex ikejjel “l-opaċità tal-kornea” billi jevalwa b'mod kwantitattiv it-trażmissjoni tad-dawl minn ġol-kornea. L-istrument tipiku jkollu żewġ kompartimenti, kull wieħed minnhom b'sors ta' dawl u fotoċellola tiegħu stess. Kompartiment minnhom jintuża għall-kornea trattata, filwaqt li l-ieħor jintuża biex jikkalibra u jiżżera l-istrument. Dawl minn lampa aloġena jintbagħat minn ġo kompartiment ta' kontroll (kavità vojta mingħajr twieqi jew likwidu) għal ġo fotoċellola u jitqabbel mad-dawl mingħut minn ġol-kompartiment sperimentali, fejn tinsab il-kavità li fiha l-kornea, għal ġo fotoċellola. Id-differenza fit-trażmissjoni tad-dawl mill-fotoċelloli titqabbel u valur numeriku ta' opaċità jidher fuq displej diġitali.
                        
                           
                              Kontroll pożittiv
                           : Replika li jkun fiha l-komponenti kollha ta' sistema tat-test u ttrattata b'sustanza li jkun magħruf li tikkawża rispons pożittiv. Sabiex jiġi żgurat li l-varjabilità fir-rispons tal-kontroll pożittiv tkun tista' tiġi vvalutata tul iż-żmien, id-daqs tar-rispons pożittiv ma għandux ikun eċċessiv.
                        
                           
                              Effetti irreversibbli fuq l-għajnejn
                           : Ara “Irritazzjoni għall-għajnejn”.
                        
                           
                              Affidabilità
                           : Kejliet ta' kemm metodu ta' ttestjar jista' jitwettaq b'mod riproduċibbli fil-laboratorji u bejn il-laboratorji tul iż-żmien, meta jitwettaq billi jintuża l-istess protokoll. Tiġi vvalutatata bil-kalkolu tar-riproduċibilità fil-laboratorju u bejn laboratorju u ieħor u r-ripetibilità fil-laboratorju.
                        
                           
                              Ħsara serja lill-għajnejn
                           : Il-produzzjoni ta' ħsara fit-tessut fl-għajnejn, jew tnaqqis fiżiku serju tal-vista, wara li tiġi applikata sustanza kimika fuq il-wiċċ quddiemi tal-għajn, li ma jkunux riversibbli fi żmien 21 jum mill-applikazzjoni. Interkambjabbli ma' “Effetti irreversibbli fuq l-għajnejn” u mal-“Kategorija 1 tal-GHS tan-NU” (4).
                        
                           
                              Kontroll tas-solvent/veikolu
                           : Kampjun mhux ittrattat li fih il-komponenti kollha ta' sistema tat-test, inkluż is-solvent jew il-veikolu li jiġi pproċessat mal-kampjuni ttrattati bis-sustanza kimika tat-test u kampjuni tal-kontroll oħrajn sabiex jiġi stabbilit ir-rispons bażi għall-kampjuni ttrattati bis-sustanza kimika tat-test dissolta fl-istess solvent jew veikolu. Meta jiġi ttestjat ma' kontroll negattiv parallel, dan il-kampjun juri wkoll jekk is-solvent jew il-veikolu jkollux interazzjoni mas-sistema tat-test.
                        
                           
                              Sustanza
                           : Elementi kimiċi u l-komposti tagħhom fl-istat naturali jew miksubin bi kwalunkwe proċess ta' produzzjoni, inkluż kwalunkwe addittiv meħtieġ għall-preservazzjoni tal-istabilità tal-prodott u ta' kwalunkwe impurità li toriġina mill-proċess użat, imma eskluż kwalunkwe solvent li jista' jkun separat mingħajr ma jaffetwa l-istabilità tas-sustanza jew ibiddel il-kompożizzjoni tagħha (4).
                        
                           
                              Tensjoattiv
                           : Imsejjaħ ukoll aġent tensjoattiv, dan huwa sustanza, bħal deterġent, li tista' tnaqqas it-tensjoni fil-wiċċ ta' likwidu u b'hekk tippermettilu jtella' r-ragħwa jew jippenetra solidi; huwa magħruf ukoll bħala aġent li jxarrab.
                        
                           
                              Taħlita li fiha aġent tensjoattiv
                           : Fil-kuntest ta' dan il-metodu ta' ttestjar, din hija taħlita li fiha aġent tensjoattiv wieħed jew iktar f'konċentrazzjoni finali ta' > 5 %.
                        
                           
                              Approċċ Minn Fuq Għal Isfel
                           : approċċ sekwenzjali użat għal sustanza kimika ssuspettata li tikkawża ħsara serja lill-għajnejn, li jibda bid-determinazzjoni ta' sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (eżitu pożittiv) minn sustanzi kimiċi oħrajn (eżitu negattiv).
                        
                           
                              Sustanza kimika tat-test
                           : Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta' dan il-metodu ta' ttestjar.
                        
                           
                              Strateġija ta' ttestjar sekwenzjali
                           : Strateġija ta' ttestjar gradwali li biha l-informazzjoni eżistenti kollha dwar sustanza kimika tat-test tiġi riveduta, f'ordni speċifiku, permezz ta' proċess tal-piż tal-evidenza f'kull livell sabiex jiġi ddeterminat jekk hemmx biżżejjed informazzjoni disponibbli għal deċiżjoni dwar il-klassifikazzjoni tal-periklu, qabel ma wieħed jgħaddi għal-livell li jmiss. Jekk il-potenzjal ta' irritazzjoni ta' sustanza kimika tat-test jista' jiġi assenjat fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, ma jkun meħtieġ l-ebda ttestjar ieħor. Jekk il-potenzjal ta' irritazzjoni ta' sustanza kimika tat-test ma jkunx jista' jiġi assenjat fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, għandha ssir proċedura ta' ttestjar sekwenzjali fuq l-annimali sakemm tkun tista' ssir klassifikazzjoni mhux ekwivoka.
                        
                           
                              Is-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta' Sustanzi Kimiċi tan-Nazzjonijiet Uniti (GHS tan-NU)
                           : Sistema li tipproponi l-klassifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) skont it-tipi u l-livelli standardizzati ta' perikli fiżiċi, sanitarji u ambjentali, u tindirizza l-elementi ta' komunikazzjoni korrispondenti, bħal pittogrammi, kliem ta' twissija, dikjarazzjonijiet ta' periklu, dikjarazzjonijiet ta' prekawzjoni u skedi ta' tagħrif dwar is-sikurezza, sabiex jitwassal tagħrif dwar l-effetti avversi bil-għan li n-nies ikunu protetti (inklużi min iħaddem, il-ħaddiema, it-trasportaturi, il-konsumaturi u l-ħaddiema tal-emerġenza) u l-ambjent (4).
                        
                           
                              Kategorija 1 tal-GHS tan-NU
                           : Ara “Ħsara serja lill-għajnejn”.
                        
                           
                              Kategorija 2 tal-GHS tan-NU
                           : Ara “Irritazzjoni għall-għajnejn”.
                        
                           
                              Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU
                           : Sustanzi kimiċi li ma jissodisfawx ir-rekwiżiti għall-klassifikazzjoni fil-Kategorija 1 jew 2 (2A jew 2B) tal-GHS tan-NU. Interkambjabbli ma' “Mhux Ikklassifikati”.
                        
                           
                              Metodu ta' ttestjar ivvalidat
                           : Metodu ta' ttestjar li għalih ikunu tlestew studji ta' validazzjoni sabiex tiġi ddeterminata r-rilevanza (inkluża l-preċiżjoni) u l-affidabilità għal għan speċifiku. Ta' min jinnota li jista' jkun li metodu ta' ttestjar ivvalidat ma jkollux prestazzjoni tajba biżżejjed f'termini ta' preċiżjoni u affidabilità sabiex jitqies aċċettabli għall-għan propost.
                        
                           
                              Piż tal-evidenza
                           : Il-proċess li fih jitqiesu l-qawwiet u d-dgħufijiet ta' diversi biċċiet ta' informazzjoni sabiex tintlaħaq u tiġi appoġġata konklużjoni rigward il-potenzjal ta' sustanza kimika li tkun ta' periklu.
                     
                     
                        Appendiċi 2
                        
                           IL-KAPAĊITÀ TA' PREVIŻJONI TAL-METODU TA' TTESTJAR TAL-BCOP
                        
                        
                           Tabella 1
                        
                        
                           Il-Kapaċità ta' Previżjoni tal-BCOP għall-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn [Kat 1 vs Mhux Kat 1 (Kat 2 + Ebda Kat) tas-CLP tal-UE/ tal-GHS tan-NU; Kat I vs Mhux Kat I (Kat II + KAT III + KAT IV) tal-EPA tal-Istati Uniti]
                        
                        
                                    Klassifikazzjoni Sistema
                                 
                                 
                                    Nru
                                 
                                 
                                    Preċiżjoni
                                 
                                 
                                    Sensittività
                                 
                                 
                                    Foloz Negattivi
                                 
                                 
                                    Speċifiċità
                                 
                                 
                                    Foloz pożittivi
                                 
                              
                                    %
                                 
                                 
                                    Nru
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Nru
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Nru
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Nru
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Nru
                                 
                              
                                    GHS tan-NU
                                    CLP tal-UE
                                 
                                 
                                    191
                                 
                                 
                                    78,53
                                 
                                 
                                    150/191
                                 
                                 
                                    86,15
                                 
                                 
                                    56/65
                                 
                                 
                                    13,85
                                 
                                 
                                    9/65
                                 
                                 
                                    74,60
                                 
                                 
                                    94/126
                                 
                                 
                                    25,40
                                 
                                 
                                    32/126
                                 
                              
                                    EPA tal-Istati Uniti
                                 
                                 
                                    190
                                 
                                 
                                    78,95
                                 
                                 
                                    150/190
                                 
                                 
                                    85,71
                                 
                                 
                                    54/63
                                 
                                 
                                    14,29
                                 
                                 
                                    9/63
                                 
                                 
                                    75,59
                                 
                                 
                                    96/127
                                 
                                 
                                    24,41
                                 
                                 
                                    31/127
                                 
                              
                           
                        
                           Tabella 2
                        
                        
                           Il-Kapaċità ta' Previżjoni tal-BCOP għall-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn [“mhux irritanti”) [Ebda Kat vs Mhux Ebda Kat (Kat 1 + Kat 2) tas-CLP tal-UE/ tal-GHS tan-NU; Kat IV vs Mhux Kat IV (Kat I + Kat II + Kat III) tal-EPA tal-Istati Uniti]
                        
                        
                                    Klassifikazzjoni Sistema
                                 
                                 
                                    Nru
                                 
                                 
                                    Preċiżjoni
                                 
                                 
                                    Sensittività
                                 
                                 
                                    Foloz Negattivi
                                 
                                 
                                    Speċifiċità
                                 
                                 
                                    Foloz pożittivi
                                 
                              
                                    %
                                 
                                 
                                    Nru
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Nru
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Nru
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Nru
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Nru
                                 
                              
                                    GHS tan-NU
                                    CLP tal-UE
                                 
                                 
                                    196
                                 
                                 
                                    68,88
                                 
                                 
                                    135/196
                                 
                                 
                                    100
                                 
                                 
                                    107/107
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    0/107
                                 
                                 
                                    31,46
                                 
                                 
                                    28/89
                                 
                                 
                                    68,54
                                 
                                 
                                    61/89
                                 
                              
                                    EPA tal-Istati Uniti
                                 
                                 
                                    190
                                 
                                 
                                    82,11
                                 
                                 
                                    156/190
                                 
                                 
                                    93,15
                                 
                                 
                                    136/146
                                 
                                 
                                    6,85
                                 
                                 
                                    10/146
                                 
                                 
                                    45,45
                                 
                                 
                                    20/44
                                 
                                 
                                    54,55
                                 
                                 
                                    24/44
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 3
                        
                           SUSTANZI KIMIĊI TA' PROFIĊJENZA GĦALL-METODU TA' TTESTJAR TAL-BCOP
                        
                        Qabel l-użu ta' rutina ta' dan il-metodu ta' ttestjar, il-laboratorji għandhom juru l-profiċjenza teknika billi jidentifikaw b'mod korrett il-klassifikazzjoni tal-ħsara lill-għajnejn ta' 13-il sustanza kimika rrakkomandati fit-Tabella 1. Dawn is-sustanzi kimiċi ntgħażlu sabiex jirrappreżentaw il-firxa ta' risponsi għal perikli tal-għajnejn fuq il-bażi tar-riżultati fit-test in vivo fuq l-għajnejn tal-fniek (TG 405) (17) u s-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (jiġifieri l-Kategoriji 1, 2A, 2B jew Mhux Ikklassifikati) (4). Kriterji tal-għażla oħrajn kienu li s-sustanzi kimiċi huma disponibbli fis-suq, li hemm dejta ta' referenza in vivo ta' kwalità għolja għad-dispożizzjoni, u li hemm dejta in vitro ta' kwalità għolja għad-dispożizzjoni mill-metodu ta' ttestjar tal-BCOP. Hemm dejta ta' referenza disponibbli fid-Dokument Sommarju Simplifikat (3) u fid-Dokument ta' Reviżjoni ta' Sfond tal-ICCVAM għall-metodu ta' ttestjar tal-BCOP (2)(18).
                        
                           Tabella 1
                        
                        
                           Is-sustanzi kimiċi rakkomandati għall-wiri tal-profiċjenza teknika bil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP
                        
                        
                                    Sustanza Kimika
                                 
                                 
                                    CASRN
                                 
                                 
                                    Sustanza Kimika tal-Klassi (8)
                                    
                                 
                                 
                                    Forma Fiżika
                                 
                                 
                                    Klassifikazzjoni (9)
                                       In Vivo
                                    
                                 
                                 
                                    Klassifikazzjoni tal-BCOP
                                 
                              
                                    Klorur tal-benżalkonju (5 %)
                                 
                                 
                                    8001-54-5
                                 
                                 
                                    Kompost tal-onju
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                              
                                    Kloressidin
                                 
                                 
                                    55-56-1
                                 
                                 
                                    Ammin, Ammidin
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                              
                                    Dibenzojl-L- aċidu tartariku
                                 
                                 
                                    2743-38-6
                                 
                                 
                                    Aċidu karbossiliku, Ester
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                              
                                    Imidażol
                                 
                                 
                                    288-32-4
                                 
                                 
                                    Eteroċikliku
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                              
                                    Aċidu trikloroaċetiku (30 %)
                                 
                                 
                                    76-03-9
                                 
                                 
                                    Aċidu karbossiliku
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                              
                                    Klorur ta' 2,6-diklorobenżojl
                                 
                                 
                                    4659-45-4
                                 
                                 
                                    Aloġenur tal-aċil
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 2A
                                 
                                 
                                    Ma tista' ssir ebda previżjoni preċiża/affidabbli
                                 
                              
                                    Etil-2-metilaċetoaċetat
                                 
                                 
                                    609-14-3
                                 
                                 
                                    Keton, Ester
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 2 B
                                 
                                 
                                    Ma tista' ssir ebda previżjoni preċiża/affidabbli
                                 
                              
                                    Nitrat tal-ammonju
                                 
                                 
                                    6484-52-2
                                 
                                 
                                    Melħ inorganiku
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 2 (10)
                                    
                                 
                                 
                                    Ma tista' ssir ebda previżjoni preċiża/affidabbli
                                 
                              
                                    EDTA, melħ di-potassju
                                 
                                 
                                    25102-12-9
                                 
                                 
                                    Ammin, Aċidu karbossiliku (melħ)
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Mhux ikklassifikat
                                 
                                 
                                    Mhux ikklassifikat
                                 
                              
                                    Tween 20
                                 
                                 
                                    9005-64-5
                                 
                                 
                                    Ester, Polietere
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Mhux ikklassifikat
                                 
                                 
                                    Mhux ikklassifikat
                                 
                              
                                    2-Merkaptopirimidina
                                 
                                 
                                    1450-85-7
                                 
                                 
                                    Aloġenur tal-aċil
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Mhux ikklassifikat
                                 
                                 
                                    Mhux ikklassifikat
                                 
                              
                                    Fenilbutażon
                                 
                                 
                                    50-33-9
                                 
                                 
                                    Eteroċikliku
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Mhux ikklassifikat
                                 
                                 
                                    Mhux ikklassifikat
                                 
                              
                                    Poliossietilen 23 lauril eter (BRIJ-35) (10 %)
                                 
                                 
                                    9002-92-0
                                 
                                 
                                    Alkoħol
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Mhux ikklassifikat
                                 
                                 
                                    Mhux ikklassifikat
                                 
                              
                                    Taqsiriet: CASRN = Numru tar-Reġistru tal-Chemical Abstracts Service
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 4
                        L-APPARAT TAL-BCOP FEJN TITQIEGĦED IL-KORNEA
                        L-apparat tal-BCOP fejn titqiegħed il-kornea huwa magħmul minn materjal inerti (eż. polipropilen). L-apparat huwa magħmul minn żewġ nofsijiet (kavità anterjuri u oħra posterjuri), u għandu żewġ kavitajiet interni ċilindriċi simili. Kull kavità hija mfassal sabiex tiflaħ volum ta' madwar 5 ml u tintemm f'tieqa tal-ħġieġ, li minnha jiġu rreġistrati l-kejliet tal-opaċità. Kull waħda mill-kavitajiet interni għandha dijametru ta' 1,7 cm u fond ta' 2,2 cm (11). Iċ-ċirku-o jitqiegħed fil-kavità posterjuri biex jipprevjeni kwalunkwe tnixxija. Il-korneji jitqiegħdu bil-parti tal-endotelju tħares 'l isfel fuq iċ-ċirku-o tal-kavitajiet posterjuri u l-kavitajiet anterjuri jitqiegħdu fuq il-parti tal-epitelju tal-korneji. Il-kavitajiet jinżammu f'posthom permezz ta' tliet viti tal-azzar inossidabbli li jinsabu fuq it-truf esterni tal-kavità. Fl-aħħar parti ta' kull kavità nsibu tieqa tal-ħġieġ li tista' titneħħa sabiex ikun hemm aċċess faċli għall-kornea. Ċirku-o jitqiegħed ukoll bejn it-tieqa tal-ħġieġ u l-kavità biex jipprevjeni kwalunkwe tnixxija. Żewġ toqbiet fil-parti ta' fuq ta' kull kavità jippermettu l-introduzzjoni u t-tneħħija tal-medium u s-sustanzi kimiċi tat-test. Dawn jingħalqu b'tappijiet tal-lastku waqt il-perjodi ta' trattament u ta' inkubazzjoni. It-trażmissjoni tad-dawl minn ġol-apparati fejn titqiegħed il-kornea għandha l-potenzjal li tinbidel peress li l-effetti ta' xedd u kedd jew il-ġmigħ ta' residwi kimiċi speċifiċi fit-toqob tal-kavità interna jew fuq it-twieqi tal-ħġieġ jistgħu jaffettwaw it-tifrix jew ir-riflettanza tad-dawl. Il-konsegwenza tista' tkun żidiet jew tnaqqisiet fit-trażmissjoni tad-dawl bażi (u, b'mod kuntrarju, il-valuri tal-opaċità bażi) minn ġol-apparati fejn titqiegħed il-kornea, u tista' tkun evidenti peress li bidliet sinifikanti fil-kejliet inizjali bażi mistennijin tal-opaċità tal-kornea fil-kavitajiet individwali (jiġifieri l-valuri tal-opaċità tal-kornea inizjali f'apparati speċifiċi individwali tal-kornea jistgħu jvarjaw spiss b'iktar minn 2 jew 3 unitajiet tal-opaċità mill-valuri bażi mistennijin). Kull laboratorju għandu jikkunsidra jistabbilixxix programm għall-evalwazzjoni ta' tibdiliet fit-trażmissjoni tad-dawl minn ġol-apparati fejn titqiegħed il-kornea, skont in-natura tal-kimiki ttestjati u l-frekwenza tal-użu tal-kavitajiet. Sabiex jiġu stabbiliti l-valuri bażi, l-apparati fejn titqiegħed il-kornea jistgħu jiġu vverifikati qabel ma jsir użu ta' rutina billi jitkejlu l-valuri tal-opaċità bażi (jew it-trażmissjoni tad-dawl) tal-kompartimenti b'medium komplut, mingħajr kornei. Imbagħad, l-apparati li jżommu l-korneji jiġu verifikati b'mod perjodiku għal tibdiliet fit-trażmissjoni tad-dawl matul il-perjodi tal-użu. Kull laboratorju jista' jistabbilixxi l-frekwenza għall-verifika tal-apparati fejn titqiegħed il-kornea, fuq il-bażi tas-sustanzi kimiċi ttestjati, il-frekwenza tal-użu, u l-osservazzjonijiet tat-tibdiliet fil-valuri bażi tal-opaċità tal-kornea. Jekk jiġu osservati tibdiliet notevoli fit-trażmissjoni tad-dawl minn ġol-apparati fejn titqiegħed il-kornea, iridu jiġu kkunsidrati proċeduri xierqa ta' tindif u/jew illostrar tal-wiċċ ta' ġewwa tal-apparati fejn titqiegħed il-kornea jew is-sostituzzjoni ta' dawn.
                        
                           Apparat fejn titqiegħed il-kornea: dijagramma bi spjega tal-installazzjoni
                        
                        
                     
                        Appendiċi 5
                        L-OPAĊITOMETRU
                        L-opaċitometru huwa apparat li jkejjel it-trażmissjoni tad-dawl. Pereżempju, għal tagħmir OP-KIT minn Electro Design (Riom, Franza) użat fil-validazzjoni tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP, id-dawl minn lampa aloġena jintbagħat minn ġo kompartiment ta' kontroll (kavità vojta mingħajr twieqi jew likwidu) għal ġo fotoċellola u jitqabbel mad-dawl mingħut minn ġol-kompartiment sperimentali, fejn tinsab il-kavità li fiha l-kornea, għal ġo fotoċellola. Id-differenza fit-trażmissjoni tad-dawl mill-fotoċelloli titqabbel u valur numeriku ta' opaċità jidher fuq displej diġitali. L-unitajiet tal-opaċità huma stabbiliti. Jistgħu jintużaw tipi oħrajn ta' opaċitometri b'issettjar differenti (eż. li ma jeħtiġux il-kejliet paralleli tal-kompartimenti tal-kontroll u tal-esperiment) jekk jintwera bil-provi li dawn jagħtu riżultati simili għat-tagħmir ivvalidat.
                        L-opaċitometru għandu jipprovdi rispons lineari minn skala ta' qari ta' valuri ta' opaċità li jkopru l-valuri tal-limiti użati għal klassifiki differenti deskritti mill-Mudell ta' Tbassir (jiġifieri sal-valur tal-limitu li jindika korrużjoni/irritazzjoni severa). Sabiex jiġi żgurat qari ta' valuri lineari u akkurat sa 75-80 unità ta' opaċità, jeħtieġ li l-opaċitometru jiġi kkalibrat bl-użu ta' sensiela ta' kalibraturi. Il-kalibraturi jitqiegħdu fil-kavità tal-kalibraġġ (kavità tal-kornea mfassla sabiex iżżomm fiha l-kalibraturi) u jinqraw fuq l-opaċitometru. Il-kavità tal-kalibraġġ hija ddisinjata b'tali mod li l-kalibraturi jinżammu bejn wieħed u ieħor fl-istess distanza bejn id-dawl u l-fotoċellola fejn ikunu sejrin jitqiegħdu l-korneji waqt il-kejl tal-opaċità. Il-valuri ta' referenza u l-valur programmat inizjali skont it-tip ta' tagħmir użat. Il-linearità tal-kejliet tal-opaċità għandha tiġi żgurata permezz ta' proċeduri xierqa (speċifiċi għall-istrument). Pereżempju, għat-tagħmir OP-KIT minn Electro Design (Riom, Franza), l-opaċitometru l-ewwel jiġi kkalibrat għal 0 unitajiet tal-opaċità bl-użu tal-kavità tal-kalibraġġ mingħajr kalibratur. Imbagħad tliet kalibraturi differenti jitqiegħdu fil-kavità tal-kalibraġġ wieħed wieħed u jitkejlu l-opaċitajiet. Il-kalibraturi 1, 2 u 3 għandhom jirriżultaw f'qari ta' valuri tal-opaċità daqs il-valuri stabbiliti tagħhom ta' 75, 150, u 225 unità ta' opaċità, rispettivament, ±5 %.
                     ”
               
                     (13)
                  
                  
                     Fil-Parti B, il-Kapitolu B.48 huwa sostitwit b'dan li ġej:
                     “B.48   Metodu ta' Ttestjar tal-Għajnejn tat-Tiġieġ Iżolati għall-Identifikazzjoni ta' i) Sustanzi Kimiċi li Jinduċu Ħsara Serja lill-Għajnejn u ii) Sustanzi Kimiċi li ma Jeħtiġux Klassifikazzjoni għal Irritazzjoni tal-Għajnejn jew Ħsara Serja lill-Għajnejn
                     
                     INTRODUZZJONI
                     Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 438 tal-OECD (2013). Il-metodu ta' ttestjar tal-Għajnejn tat-Tiġieġ Iżolati (ICE) ġie evalwat mill-Kumitat ta' Koordinazzjoni Interaġenzjali dwar il-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ICCVAM), flimkien maċ-Ċentru Ewropew għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ECVAM) u ċ-Ċentru Ġappuniż għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (JaCVAM), fl-2006 u l-2010 (1) (2) (3). Fl-ewwel evalwazzjoni, l-ICE ġie approvat bħala metodu ta' ttestjar xjentifikament validu għall-użu bħala test ta' skrinjar sabiex jidentifika sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1), kif definiti mis-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta' Sustanzi Kimiċi (GHS) tan-Nazzjonijiet Uniti (NU) (1) (2) (4) u r-Regolament (KE) Nru 1272/2008 dwar il-Klassifikazzjoni, l-Ittikkettar u l-Imballaġġ tas-Sustanzi u t-Taħlitiet (CLP) (12). Fit-tieni evalwazzjoni, il-metodu ta' ttestjar tal-ICE ġie evalwat għall-utilità tiegħu sabiex jidentifika sustanzi kimiċi mhux ikklassifikati għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn kif definita mill-GHS tan-NU (3) (4). Ir-riżultati mill-istudju ta' validazzjoni u r-rakkomandazzjonijiet tal-bord ta' evalwazzjoni bejn il-pari żammew ir-rakkomandazzjoni oriġinali għall-użu tal-ICE għall-klassifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU), peress li d-database disponibbli baqgħet l-istess mill-validazzjoni tal-ICCVAM oriġinali. F'dak l-istadju, ma ġiet issuġġerita ebda rakkomandazzjoni ulterjuri għal espansjoni tad-dominju ta' applikabilità tal-ICE sabiex ikunu inklużi kategoriji oħrajn. Saret rievalwazzjoni tas-sett ta' dejta in vitro u in vivo użat fl-istudju ta' validazzjoni b'enfasi fuq l-evalwazzjoni tal-utilità tal-ICE sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn (5). Din ir-rievalwazzjoni kkonkludiet li l-metodu ta' ttestjar tal-ICE jista' jintuża wkoll sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn u ħsara serja lill-għajnejn kif definita mill-GHS tan-NU (4) (5). Dan il-metodu ta' ttestjar jinkludi l-użi rakkomandat u l-limitazzjonijiet tal-metodu ta' ttestjar tal-ICE fuq il-bażi ta' dawn l-evalwazzjonijiet. Id-differenzi ewlenin bejn il-verżjoni oriġinali tal-2009 u l-verżjoni aġġornata tal-2013 tal-linja gwida tat-test tal-OECD jinkludu, iżda mhumiex limitati għal: l-użu tal-metodu ta' ttestjar tal-ICE sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni skont is-Sistema ta' Klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU, aġġornament fl-elementi tar-rapport tat-test, aġġornament tal-Appendiċi 1 dwar id-definizzjonijiet, u aġġornament tal-Appendiċi 2 dwar is-sustanzi kimiċi ta' profiċjenza.
                     Ġeneralment huwa aċċettat li, fil-futur qarib, ebda test in vitro tal-irritazzjoni tal-għajnejn waħdu ma huwa sejjer ikun kapaċi jieħu post it-test Draize in vivo tal-għajnejn sabiex ibassar il-medda sħiħa ta' irritazzjonijiet għal klassijiet ta' sustanzi kimiċi differenti. Madankollu, taħlitiet strateġiċi ta' diversi metodi ta' ttestjar alternattivi fi ħdan strateġija ta' ttestjar (sekwenzjali) jaf ikunu kapaċi jieħdu post it-test Draize tal-għajnejn (6). L-approċċ minn Fuq għal Isfel (7) huwa mfassal sabiex jintuża meta, fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, sustanza kimika tkun mistennija li jkollha potenzjal għoli ta' irritazzjoni, filwaqt li l-approċċ minn Isfel għal Fuq (7) huwa mfassal sabiex jintuża meta, fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, sustanza kimika ma tkunx mistennija tikkaġuna biżżejjed irritazzjoni tal-għajnejn sabiex tkun teħtieġ li tiġi kklassifikata. Il-metodu ta' ttestjar tal-ICE huwa metodu ta' ttestjar in vitro li jista' jintuża f'ċerti ċirkustanzi u fi ħdan limitazzjonijiet speċifiċi kif deskritti fil-paragrafi 8 sa 10 għall-klassifikazzjoni tal-periklu għall-għajnejn u t-tikkettar ta' sustanzi kimiċi. Filwaqt li ma jitqiesx li huwa validu bħala sostitut awtonomu għat-test in vivo tal-għajnejn fuq il-fniek, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP huwa rakkomandat bħala pass inizjali fi ħdan strateġija ta' ttestjar, bħall-approċċ minn Fuq għal Isfel issuġġerit minn Scott et al. (7) sabiex jiġu identifikati sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn, jiġifieri sustanzi kimiċi li jiġu klassifikati fil-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU, mingħajr ma jsiru iktar testijiet (4). Il-metodu ta' ttestjar tal-ICE huwa rakkomandat ukoll sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, kif definiti mill-GHS tan-NU (Ebda Kategorija, NC) (4) u għalhekk jista' jintuża bħala l-ewwel pass fi ħdan approċċ ta' strateġija ta' ttestjar minn Isfel għal Fuq (7). Madankollu, sustanza kimika li mhijiex prevista li tikkaġuna ħsara serja lill-għajnejn jew bħala mhux klassifikata għal irritazzjoni tal-għajnejn/ħsara serja lill-għajnejn bil-metodu ta' ttestjar tal-ICE tkun teħtieġ iktar testijiet (in vitro u/jew in vivo) sabiex tistabbilixxi klassifikazzjoni definittiva. Barra minn hekk, għandhom jiġu kkonsultati l-awtoritajiet regolatorji xierqa qabel ma l-ICE jintuża f'approċċ minn isfel għal fuq skont skemi ta' klassifikazzjoni oħrajn li mhumiex il-GHS tan-NU.
                     L-għan ta' dan il-metodu ta' ttestjar huwa li jiddeskrivi l-proċeduri użati għall-evalwazzjoni tal-potenzjal li sustanza kimika tat-test tikkawża periklu għall-għajen kif imkejjel mill-ħila tagħha li tinduċi jew le tossiċità f'għajn enukleata ta' tiġieġa. Effetti tossiċi għall-kornea jitkejlu permezz ta' (i) valutazzjoni kwalitattiva tal-opaċità, (ii) valutazzjoni kwalitattiva tal-ħsara għall-epitelju fuq il-bażi tal-applikazzjoni tal-fluworexxeina fl-għajn (żamma tal-fluworexxeina), (iii) kejl kwantitattiv ta' żieda fil-ħxuna (nefħa), u (iv) evalwazzjoni kwalitattiva ta' ħsara morfoloġika makroskopika fis-superfiċje. Il-valutazzjonijiet tal-opaċità, tan-nefħa, u tal-ħsara fil-kornea wara l-esponiment għal sustanza kimika tat-test jiġu vvalutati b'mod individwali u jiġu kkombinati sabiex tiġi dderivata Klassifikazzjoni tal-Irritazzjoni tal-Għajnejn.
                     Id-definizzjonijiet huma pprovduti fl-Appendiċi 1.
                     KUNSIDERAZZJONIJIET U LIMITAZZJONIJIET INIZJALI
                     Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bbażat fuq il-protokoll issuġġerit fid-Dokument ta' Gwida 160 tal-OECD (8), li ġie żviluppat b'segwitu għal studju ta' validazzjoni internazzjonali tal-ICCVAM (1) (3) (9), b'kontribuzzjonijiet mingħand iċ-Ċentru Ewropew għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ECVAM) u ċ-Ċentru Ġappuniż għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi, u d-Dipartiment tat-Tossikoloġija u l-Farmakoloġija Applikata tat-TNO Kwalità tal-Ħajja (in-Netherlands). Il-protokoll huwa bbażat fuq informazzjoni miksuba minn protokolli ppubblikati, kif ukoll il-protokoll attwali użat mit-TNO (10) (11) (12) (13) (14).
                     Saru testijiet fuq firxa wiesgħa ta' sustanzi kimiċi fil-validazzjoni li hija l-bażi ta' dan il-metodu ta' ttestjar u d-database empirika tal-istudju ta' validazzjoni rriżultaw f'152 sustanza kimika inklużi 72 sustanza u 80 taħlita (5). Il-metodu ta' ttestjar huwa applikabbli għal solidi, likwidi, emulsjonijiet u ġellijiet. Il-likwidi jistgħu jkunu jew ma jkunux milwiema; is-solidi jistgħu jkunu jew ma jkunux solubbli fl-ilma. Il-gassijiet u l-aerosols għadhom ma ġewx eżaminati fi studju ta' validazzjoni.
                     Il-metodu ta' ttestjar tal-ICE jista' jintuża sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn, jiġifieri sustanzi kimiċi li jiġu klassifikati taħt il-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU (4). Meta jintużaw għal dan il-għan, il-limitazzjonijiet identifikati għall-metodu ta' ttestjar tal-ICE huma bbażati fuq ir-rati għoljin ta' foloz pożittivi għal alkoħols u r-rati għoljin ta' foloz negattivi għal solidi u aġenti tensjoattivi (1) (3) (9). Barra minn hekk, f'dan il-kuntest ir-rati ta' foloz negattivi (tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU identifikati li mhumiex tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU) mhumiex kritiċi peress li s-sustanzi kimiċi kollha tat-test li jiġu negattivi mbagħad jiġu ttestjati b'test(ijiet) in vitro vvalidat b'mod adegwat ieħor, jew bħala l-aħħar alternattiva, fil-fniek, skont ir-rekwiżiti regolatorji, bl-użu ta' strateġija ta' ttestjar sekwenzjali f'approċċ tal-piż tal-evidenza. Ta' min jinnota li s-solidi jistgħu jwasslu għal kundizzjonijiet varjabbli u ta' esponiment estrem fit-test Draize in vivo tal-irritazzjoni tal-għajnejn, li jitsgħu jirriżultaw fi previżjonijiet irrilevanti tal-potenzjal ta' irritazzjoni veru tagħhom (15). L-investigaturi għandhom jikkunsidraw jużaw dan il-metodu ta' ttestjar għat-tipi kollha ta' sustanzi kimiċi, f'liema każ riżultat pożittiv għandu jiġi aċċettat bħala indikatur ta' ħsara serja lill-għajnejn, jiġifieri klassifikazzjoni bħala tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU mingħajr ma jsiru iktar testijiet. Madankollu, riżultati pożittivi miksuba bl-alkoħols għandhom jiġu interpretati b'ċerta kawtela minħabba r-riskju ta' tbassir eċċessiv.
                     Meta jintuża sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU), il-metodu ta' ttestjar tal-ICE għandu preċiżjoni kumplessiva ta' 86 % (120/140), rata ta' foloz pożittivi ta' 6 % (7/113) u rata ta' foloz negattivi ta' 48 % (13/27) meta mqabbel mad-dejta tal-metodu ta' ttestjar in vivo fuq għajnejn il-fniek ikklassifikat skont is-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (4) (5).
                     Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP jista' jintuża wkoll sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, skont is-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (4). Għandhom jiġu kkonsultati l-awtoritajiet regolatorji xierqa qabel ma l-ICE jintuża f'approċċ minn isfel għal fuq skont skemi ta' klassifikazzjoni oħrajn. Dan il-metodu ta' ttestjar jista' jintuża għat-tipi kollha ta' sustanzi kimiċi, fejn riżultat negattiv jista' jiġi aċċettat għan-nuqqas ta' klassifikazzjoni ta' sustanza kimika għal irritazzjoni tal-għajnejn u ħsara serja lill-għajnejn. Madankollu, fuq il-bażi ta' riżultat wieħed mid-database tal-validazzjoni, żebgħa antifouling li fiha solvent organiku tista' tkun sottovalutata fil-previżjonijiet (5).
                     Meta jintuża sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn u ħsara serja lill-għajnejn, il-metodu ta' ttestjar tal-ICE għandu preċiżjoni kumplessiva ta' 82 % (125/152), rata ta' foloz pożittivi ta' 33 % (26/79) u rata ta' foloz negattivi ta' 1 % (1/73) meta mqabbel mad-dejta tal-metodu ta' ttestjar in vivo fuq għajnejn il-fniek ikklassifikat skont is-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (4) (5). Meta s-sustanzi kimiċi tat-test fi ħdan ċerti klassijiet (jiġifieri antifouling żebgħat li fiha solvent organiku) jiġu esklużi mid-database, il-preċiżjoni tal-metodu ta' ttestjar tal-ICE hija ta' 83 % (123/149), ir-rata ta' foloz pożittivi 33 % (26/78), u r-rata ta' foloz negattivi ta' 0 % (0/71) għas-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (4) (5).
                     Il-metodu ta' ttestjar tal-ICE mhuwiex rakkomandat għall-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi tat-test li għandhom jiġu klassifikati bħala irritanti għall-għajnejn (jiġifieri Kategorija 2 jew Kategorija 2A tal-GHS tan-NU) jew sustanzi kimiċi tat-test li għandhom jiġu klassifikati bħala ftit irritanti għall-għajnejn (Kategorija 2B tal-GHS tan-NU) minħabba n-numru konsiderevoli ta' sustanzi kimiċi tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU bħala sustanzi kimiċi tal-Kategorija 2, 2A jew 2B tal-GHS tan-NU u ta' Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU sovraklassifikati bħala Kategorija 2, 2A jew 2B tal-GHS tan-NU. Għal dan il-għan, jista' jkun hemm bżonn li jsiru iktar testijiet b'metodu xieraq ieħor.
                     Il-proċeduri kollha li jinvolvu għajnejn tat-tiġieġ għandhom isegwu r-regolamenti u l-proċeduri applikabbli tal-istallazzjoni tal-ittestjar f'dak li għandu x'jaqsam mal-manipulazzjoni ta' materjali derivati mill-bnedmin jew l-annimali, li jinkludu, iżda li mhumiex limitati għal, tessuti u fluwidi tat-tessuti. Huwa rakkomandat li jittieħdu l-prekawzjonijiet universali tal-laboratorju (16).
                     Filwaqt li l-metodu ta' ttestjar tal-ICE ma jqisx feriti konġuntivali u iridali kif evalwati fil-metodu ta' ttestjar tal-irritazzjoni okulari fil-fniek, dan jindirizza l-effetti korneali, li huma kawża primarja tal-klassifikazzjoni in vivo meta titqies il-Klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU. Barra dan, għalkemm ir-reversibilità tal-feriti fil-kornea ma tistax tiġi evalwata per se fil-metodu ta' ttestjar tal-ICE, ġie propost, fuq il-bażi ta' studji fuq għajnejn il-fniek, li valutazzjoni tal-fond inizjali tal-ferita fil-kornea tista' tintuża sabiex jiġu identifikati uħud mit-tipi ta' effetti irreversibbli (17). B'mod partikolari, hemm bżonn ta' iktar għarfien xjentifiku sabiex nifhmu kif iseħħu effetti irreversibbli mhux marbtin ma' ferita inizjali ta' livell għoli. Fl-aħħar nett, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP ma jippermettix li ssir valutazzjoni tal-potenzjal għal tossiċità sistemika assoċjata ma' esponiment okulari.
                     Dan il-metodu ta' ttestjar sejjer jiġi aġġornat kull ċertu żmien iktar ma jkun hemm informazzjoni u dejta ġodda kkunsidrati. Pereżempju, l-istopatoloġija tista' tkun potenzjalment siewja meta jkun hemm bżonn ta' karatterizzazzjoni iktar kompluta tal-ħsara fil-kornea. Sabiex jevalwaw din il-possibbiltà, dawk li jużawh huma mħeġġin jippreservaw l-għajnejn u jħejju kampjuni għall-istopatoloġija li jistgħu jintużaw sabiex jiġu żviluppati database u kriterji dwar id-deċiżjonijiet li jistgħu jkomplu jtejbu l-preċiżjoni ta' dan il-metodu ta' ttestjar. L-OECD żviluppat Dokument ta' Gwida dwar l-użu ta' metodi ta' ttestjar tat-tossiċità okulari in vitro, li jinkludi proċeduri dettaljati dwar il-ġbir ta' kampjuni tal-istopatoloġija u informazzjoni dwar fejn għandhom tiġi sottomessa dejta dwar il-kampjuni u/jew l-istopatoloġija (8).
                     Għal kwalunkwe laboratorju li inizjalment ikun qiegħed jistabbilixxi dan l-assaġġ, għandhom jintużaw is-sustanzi kimiċi ta' profiċjenza pprovduti fl-Appendiċi 2. Laboratorju jista' juża dawn is-sustanzi kimiċi sabiex juri l-kompetenza teknika tiegħu fit-twettiq tal-metodu ta' ttestjar tal-ICE qabel ma jissottometti dejta tal-ICE għall-finijiet tal-klassifikazzjoni regolatorja tal-perikli.
                     IL-PRINĊIPJU TAT-TEST
                     Il-metodu ta' ttestjar tal-ICE huwa mudell organotipiku li jipprovdi manutenzjoni fuq terminu ta' żmien qasir fuq għajnejn it-tiġieġ in vitro. F'dan il-metodu ta' ttestjar, il-ħsara mis-sustanza kimika tat-test tiġi vvalutata bid-determinazzjoni tan-nefħa, l-opaċità u ż-żamma tal-fluworexxeina fil-kornea. Filwaqt li l-aħħar żewġ parametri jinvolvu valutazzjoni kwalitattiva, analiżi tan-nefħa fil-kornea tipprovdi valutazzjoni kwantitattiva. Kull kejl jiġi kkonvertit f'punteġġ kwantitattiv użat għall-kalkolu ta' Indiċi tal-Irritazzjoni Kumplessiv, jew inkella jiġi assenjat kategorizzazzjoni kwalitattiva li tintuża sabiex tiġi assenjata klassifikazzjoni tal-periklu okulari in vitro, jew bħala Kategorija 1 tal-GHS tan-NU jew bħala mhux klassifikat fil-GHS tan-NU. Imbagħad jista' jintuża wieħed minn dawn l-eżiti sabiex jitbassar il-potenzjal ta' ħsara serja lill-għajnejn in vivo jew ebda rekwiżit għall-klassifikazzjoni ta' periklu għall-għajnejn ta' sustanza kimika tat-test (ara l-Kriterji tad-Deċiżjoni). Madankollu, ma tista' tingħata ebda klassifikazzjoni għal sustanzi kimiċi li mhumiex previsti li jikkaġunaw ħsara serja lill-għajnejn jew li mhumiex ikklassifikati bil-metodu ta' ttestjar tal-ICE (ara l-paragrafu 11).
                     
                        Sors u Età ta' Għajnejn it-Tiġieġ
                     
                     Storikament, għal dan l-assaġġ intużaw għajnejn li jkunu ttieħdu mit-tiġieġ minn biċċerija fejn jinqatlu għall-konsum mill-bniedem, u b'hekk ġiet eliminata l-ħtieġa ta' annimali tal-laboratorju. Jintużaw biss għajnejn ta' annimali b'saħħithom li huma xierqa sabiex jidħlu fil-katina alimentari tal-bniedem.
                     Għalkemm ma twettaq l-ebda studju kontrollat għall-valutazzjoni tal-età ideali tat-tiġieġ, l-età u l-piż tat-tiġieġ użati storikament f'dan il-metodu ta' ttestjar huma dawk ta' tiġieġ tar-rebbiegħa li tradizzjonalment jiġu pproċessati minn biċċerija tat-tjur (jiġifieri bejn wieħed u ieħor ta' età ta' 7 ġimgħat, u piż ta' 1.5 — 2.5 kg).
                     
                        Ġbir u Trasport tal-Għajnejn lejn il-Laboratorju
                     
                     L-irjus għandhom jitneħħew immedjatament wara s-sedazzjoni tat-tiġieġ, ġeneralment b'xokk elettriku u inċiżjoni tal-għonq għall-fsada. Għandu jiġi lokalizzat sors lokali ta' tiġieġ qrib il-laboratorju sabiex l-irjus tat-tiġieġ jiġu ttrasferiti mill-biċċerija sal-laboratorju malajr biżżejjed sabiex kemm jista' jkun jonqos/tonqos id-deterjorament u/jew il-kontaminazzjoni mill-batterji. L-intervall tal-ħin li jgħaddi minn meta jinġabru l-irjus tat-tiġieġ u t-tqegħid tal-għajnejn fil-kavità tas-superfużjoni wara l-enuklerazzjoni għandu jitnaqqas kemm jista' jkun (normalment fi żmien sagħtejn) sabiex jiġi żgurat li jintlaħqu l-kriterji ta' aċċettazzjoni tal-assaġġ. L-għajnejn kollha użati fl-assaġġ għandhom ikunu mill-istess grupp ta' għajnejn miġbura f'ġurnata speċifika.
                     Minħabba l-fatt li l-għajnejn jiġu ddissektjati fil-laboratorju, l-irjus intatti jiġu ttrasportati mill-biċċerija f'temperatura ambjentali (normalment bejn 18 °C u 25 °C) f'kaxex tal-plastik umdifikati b'karti mxarrba b'soluzzjoni iżotonika ta' ilma bil-melħ.
                     
                        Il-Kriterji tal-Għażla u n-Numru ta' Għajnejn Użati fl-ICE
                     
                     Għajnejn li jkollhom punteġġ għoli ta' tilwin bil-fluworexxeina (jiġifieri > 0.5) jew punteġġ għoli ta' opaċità fil-kornea (jiġifieri > 0.5) wara li jitneħħew mill-ħofra tal-għajn jitwarrbu.
                     Kull grupp tat-trattament u tal-kontroll pożittiv parallel jikkonsisti minn tal-anqas tliet għajnejn. Il-grupp tal-kontrolli negattivi jew il-kontroll tas-solvent (jekk jintuża solvent li ma jkunx salina) jikkonsisti minn tal-anqas għajn waħda.
                     Fil-każ ta' materjali solidi li jwasslu għal eżitu ta' NC tal-GHS, huwa rakkomandat li tintuża t-tieni sensiela ta' tliet għajnejn sabiex jiġi kkonfermat jew miċħud ir-riżultat negattiv.
                     PROĊEDURA
                     
                        Preparazzjoni tal-Għajnejn
                     
                     Il-kappell tal-għajn jinqata' barra b'ħafna attenzjoni sabiex ma ssir l-ebda ħsara fil-kornea. L-integrità tal-kornea tiġi vvalutata malajr b'qatra fluworexxeina tas-sodju 2 % (w/v) li tiġi applikata fuq is-superfiċje tal-kornea għal ftit sekondi, u mbagħad titlaħlaħ b'salina iżotonika. Imbagħad l-għajnejn ittrattati bil-fluworexxeina jiġu eżaminati b'mikroskopju korneali sabiex jiġi żgurat li l-kornea ma jkollha l-ebda ħsara (jiġifieri punteġġi taż-żamma tal-fluworexxeina u tal-opaċità tal-kornea ≤ 0.5).
                     Jekk l-għajn ma jkollha l-ebda ħsara, tinqata' mill-kranju b'attenzjoni kbira sabiex ma ssir l-ebda ħsara lill-kornea. Il-boċċa tal-għajn tinġibed mill-orbita billi wieħed iżomm sod il-membrana nittitanti b'forċipi kirurġiċi, u l-muskoli tal-għajn jinqatgħu b'imqass mgħawweġ u b'ponta spuntata. Huwa importanti li wieħed jevita li jikkawża ħsara fil-kornea minħabba pressjoni eċċessiva (jiġifieri artefatti ta' kompressjoni.)
                     Meta l-għajn titneħħa mill-orbita, porzjon viżibbli tan-nerv ottiku għandu jibqa' mwaħħal. Ladarba titneħħa mill-orbita, l-għajn titqiegħed fuq kuttunar assorbenti u l-membrana nittitanti u tessut konnettiv ieħor jinqatgħu.
                     L-għajn imneħħija mill-ħofra tagħha titqiegħed fuq klamp tal-azzar inossidabbli b'tali mod li l-kornea tkun f'pożizzjoni vertikali. Imbagħad il-klamp jiġi ttrasferit f'kavità fl-apparat tas-superfużjoni (18). Il-klampijiet għandhom jitqiegħdu fl-apparat tas-superfużjoni b'tali mod li l-kornea sħiħa tiġi fornita bid-drip salina iżotonika (3-4 taqtiriet fil-minuta jew 0.1 sa 0.15 ml/min). Il-kavitajiet tal-apparat tas-superfużjoni għandu jkollhom temperatura kkontrollata ta' 32 ± 1.5 °C. L-Appendiċi 3 jipprovdi dijagramma ta' apparat tipiku tas-superfużjoni u l-klampijiet tal-għajnejn, li jistgħu jinxtraw jew jinbnew. L-apparat jista' jitbiddel sabiex jissodisfa l-ħtiġijiet ta' laboratorju individwali (eż. biex jakkomoda għadd differenti ta' għajnejn).
                     Wara li jitqiegħdu fl-apparat tas-superfużjoni, l-għajnejn jerġgħu jiġu eżaminati b'mikroskopju tal-kornea sabiex jiġi żgurat li ma tkun saritilhom l-ebda ħsara waqt il-proċedura tad-dissezzjoni. Il-ħxuna tal-kornea fil-quċċata tal-kornea għandha titkejjel ukoll issa bl-użu tal-apparat li jkejjel il-fond fuq il-mikroskopju korneali. Għajnejn b'; (i) punteġġ ta' żamma ta' fluworexxeina ta' > 0.5; (ii) opaċità korneali > 0,5; jew, (iii), kwalunkwe sinjal addizzjonali ta' ħsara għandhom jiġu ssostitwiti. Għal għajnejn li ma jintremewx fuq il-bażi ta' kwalunkwe wieħed minn dawn il-kriterji, għajnejn individwali bi ħxuna tal-kornea li tiddevja b'aktar minn 10 % mill-valur medju għall-għajnejn kollha għandhom jintremew. L-utenti għandhom ikunu konxji li l-mikroskopji korneali jistgħu jagħtu kejl differenti tal-ħxuna tal-kornea jekk l-issettjar tal-wisgħa tal-fetħa jkun differenti. Il-wisgħa tal-fetħa għandha tkun stabbilita għal 0,095 mm.
                     Ladarba l-għajnejn kollha jiġu eżaminati u approvati, l-għajnejn jiġu inkubati għal madwar 45 sa 60 minuta sabiex jiġu ekwilibrati mas-sistema tat-test qabel id-dożaġġ. Wara l-perjodu ta' ekwilibrazzjoni, jiġi rreġistrat il-punt żero ta' referenza għall-ħxuna u l-opaċità tal-kornea sabiex iservi bħala bażi (jiġifieri ħin = 0). Il-punteġġ tal-fluworexxeina ddeterminat fid-dissezzjoni jintuża bħala l-ewwel kejl għal dak il-punt ta' tmiem.
                     
                        Applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test
                     
                     Eżatt wara l-kejl tal-punt żero ta' referenza, l-għajn (fl-apparat fejn titqiegħed) titneħħa mill-apparat tas-superfużjoni, titqiegħed f'pożizzjoni orizzontali, u s-sustanza kimika tat-test tiġi applikata fuq il-kornea.
                     Sustanzi kimiċi tat-test likwidi tipikament jiġu ttestjati mhux iddilwiti, iżda jistgħu jiġu ddilwiti jekk dan jitqies neċessarju (eż. bħala parti mit-tfassil tal-istudju). Is-solvent preferut għas-sustanzi kimiċi tat-test dilwiti huwa s-salina fiżjoloġika. Madankollu, jistgħu jintużaw solventi alternattivi ukoll f'kundizzjonijiet ikkontrollati, iżda għandu jintwera li dawn ikunu solventi xierqa biex jintużaw minflok is-salina fiżjoloġika.
                     Sustanzi kimiċi tat-test likwidi jiġu applikati fuq il-kornea b'tali mod li s-superfiċje sħiħa tal-kornea tkun miksija b'mod indaqs bis-sustanza kimika tat-test; il-volum standard huwa ta' 0.03 ml.
                     Jekk possibbli, is-sustanzi kimiċi tat-test solidi għandhom jintaħnu f'mehrież u lida, sa ma jkunu kemm jista' jkun fini, jew f'għodda tat-tħin komparabbli. It-trab jiġi applikat fuq il-kornea b'tali mod li l-kornea tkun miksija b'mod uniformi bis-sustanza kimika tat-test; l-ammont standard huwa ta' 0.03 gm.
                     Is-sustanza kimika tat-test (likwida jew solida) tiġi applikata għal 10 sekondi u mbagħad titlaħlaħ minn fuq l-għajn bis-salina iżotonika (madwar 20 ml) f'temperatura ambjentali. Imbagħad l-għajn (fl-apparat fejn titqiegħed) terġa' titqiegħed fl-apparat tas-superfużjoni fil-pożizzjoni wieqfa oriġinali. Jekk ikun hemm bżonn, jista' jsir iktar tlaħliħ wara l-applikazzjoni ta' 10 sek u f'punti ta' żmien sussegwenti (eż. jekk jinstabu residwi ta' sustanza kimika tat-test fuq il-kornea). B'mod ġenerali, l-ammont ta' salina li tintuża b'mod addizzjonali għat-tlaħliħ mhuwiex kritiku, iżda l-osservazzjoni tal-aderenza tas-sustanza kimika mal-kornea hija importanti.
                     
                        Sustanzi Kimiċi tal-Kontroll
                     
                     Kontrolli negattivi jew tas-solvent/veikolu paralleli u kontrolli pożittivi għandhom jiġu inklużi f'kull esperiment.
                     Meta jkunu qegħdin jiġu ttestjati likwidi f'100 % jew solidi, tintuża salina fiżjoloġika bħala l-kontroll negattiv parallel fil-metodu ta' ttestjar tal-ICE sabiex jiġu individwati bidliet mhux speċifiċi fis-sistema tat-test, u sabiex jiġi żgurat li l-kundizzjonijiet tal-assaġġ ma jirriżultawx bla bżonn f'rispons irritanti.
                     Meta jkunu qegħdin jiġu ttestjati likwidi ddilwiti, fil-metodu ta' ttestjar tal-ICE jiġi inkluż grupp ta' kontrolli tas-solvent/veikolu parallel sabiex jiġu individwati bidliet mhux speċifiċi fis-sistema tat-test, u sabiex jiġi żgurat li l-kundizzjonijiet tal-assaġġ ma jirriżultawx bla bżonn f'rispons irritanti. Skont il-paragrafu 31, jista' jintuża biss solvent/veikolu li jkun intwera li ma jkollu l-ebda effett avvers fuq is-sistema tat-test.
                     F'kull esperiment jiġi inkluż irritant għall-għajnejn magħruf sabiex jiġi vverifikat li jkun ġie kkawżat rispons xieraq. Minħabba li l-assaġġ ICE qed jintuża f'dan il-metodu ta' ttestjar biex jidentifika sustanzi kimiċi korrużivi jew irritanti severi, il-kontroll pożittiv għandu jkun sustanza ta' referenza li tikkawża rispons sever f'dan il-metodu ta' ttestjar. Madankollu, sabiex jiġi żgurat li l-varjabilità fir-rispons tal-kontroll pożittiv tkun tista' tiġi vvalutata tul iż-żmien, id-daqs tar-rispons sever ma għandux ikun eċċessiv. Għandha tiġi ġġenerata biżżejjed dejta in vitro għall-kontroll pożittiv sabiex għall-kontroll pożittiv tkun tista' tiġi kkalkolata skala ta' valuri ddefiniti statistikament li tkun aċċettabbli. Jekk ma jkunx hemm disponibbli dejta storika xierqa tal-metodu ta' ttestjar tal-ICE għal kontroll pożittiv partikolari, jista' jkun meħtieġ li jsiru studji li jipprovdu din l-informazzjoni.
                     Eżempji ta' kontrolli pożittivi għal sustanzi kimiċi tat-test likwidi huma l-aċidu aċetiku 10 % jew il-klorur tal-benżalkonju 5 %, filwaqt li eżempji ta' kontrolli pożittivi għal sustanzi kimiċi tat-test solidi huma l-idrossidu tas-sodju jew l-imidażol.
                     Is-sustanzi kimiċi ta' riferiment huma utli għall-evalwazzjoni tal-potenzjal li sustanzi kimiċi mhux magħrufa ta' klassi speċifika ta' kimiċi jew tal-prodotti jikkawżaw irritazzjoni okulari, jew għall-evalwazzjoni tal-potenzjal relattiv li sustanza irritanti għall-għajnejn tikkawża irritazzjoni okulari fi ħdan skala speċifika ta' risponsi ta' sustanzi irritanti.
                     
                        Punti ta' Tmiem Imkejlin
                     
                     Il-korneji ttrattati jiġu evalwati qabel it-trattament u mbagħad fit-30, fil-75, fil-120, fil-180 u fil-240 minuta (± 5 minuti) wara t-tlaħliħa ta' wara t-trattament. Dawn il-punti tal-ħin jipprovdu għadd xieraq ta' kejl tul il-perjodu tat-trattament ta' erba' sigħat, filwaqt li jħallu biżżejjed ħin jgħaddi bejn kejl u ieħor sabiex isiru l-osservazzjonijiet neċessarji li għandhom isiru għall-għajnejn kollha.
                     Il-punti ta' tmiem evalwati għall-opaċità, in-nefħa, iż-żamma tal-fluworexxeina fil-kornea u l-effetti morfoloġiċi (eż. tħaffir jew illaxkar tal-epitelju). Il-punti ta' tmiem kollha, bl-eċċezzjoni taż-żamma tal-fluworexxeina (li tiġi ddeterminata biss qabel it-trattament u 30 minuta wara l-esponiment għas-sustanza kimika tat-test) jiġu ddeterminati f'kull wieħed mill-punti tal-ħin imsemmija hawn fuq.
                     It-teħid ta' ritratti huwa rrakkomandat għad-dokumentazzjoni tal-opaċità, iż-żamma tal-fluworexxeina, l-effetti morfoloġiċi fil-kornea u, jekk issir, l-istopatoloġija.
                     Wara l-eżami finali wara erba' sigħat, l-utenti huma mħeġġin jippreservaw l-għajnejn f'fissativ xieraq (eż. formalina bbaferjata newtrali) għal eżami istopatoloġiku possibbli (ara l-paragrafu 14 u r-referenza (8) għal iktar dettalji).
                     In-nefħa fil-kornea tiġi ddeterminata mill-kejl tal-ħxuna fil-kornea li jsir permezz ta' pakimetru ottiku fuq mikroskopju korneali. In-nefħa tiġi espressa bħala perċentwal u tiġi kkalkolata mill-kejl tal-ħxuna tal-kornea skont il-formula li ġejja:
                     
                        
                     Il-perċentwal medju tan-nefħa fil-kornea għat-testijiet kollha tal-għajnejn jiġi kkalkolat għall-punti tal-ħin ta' osservazzjoni kollha. Fuq il-bażi tal-ogħla punteġġ medju għan-nefħa fil-kornea, kif jiġi osservat fi kwalunkwe punt tal-ħin, jingħata punteġġ tal-kategorija għal kull sustanza kimika tat-test (ara l-paragrafu 51).
                     L-opaċità korneali tiġi evalwata billi tintuża l-iktar parti tal-kornea opaċifikata b'densità għall-punteġġar kif muri fit-Tabella 1. Il-valur medju tal-opaċità fil-kornea għat-testijiet kollha tal-għajnejn jiġi kkalkolat għall-punti tal-ħin ta' osservazzjoni kollha. Fuq il-bażi tal-ogħla punteġġ medju għall-opaċità fil-kornea, kif jiġi osservat fi kwalunkwe punt tal-ħin, jingħata punteġġ tal-kategorija għal kull sustanza kimika tat-test (ara l-paragrafu 51).
                     
                        Tabella 1
                     
                     
                        Punteġġi tal-opaċità tal-kornea.
                     
                     
                                 Punteġġ
                              
                              
                                 Osservazzjoni
                              
                           
                                 0
                              
                              
                                 L-ebda opaċità
                              
                           
                                 0.5
                              
                              
                                 Opaċità ħafifa ħafna
                              
                           
                                 1
                              
                              
                                 Żoni mifruxin jew diffużi; id-dettalji tal-iris jidhru b'mod ċar
                              
                           
                                 2
                              
                              
                                 Parti trasluċida li tintlemaħ faċilment; id-dettalji tal-iris huma kemxejn oskuri
                              
                           
                                 3
                              
                              
                                 Opaċità severa fil-kornea; ma jidher l-ebda dettall speċifiku tal-iris; id-daqs tal-pupilla bilkemm jintlemaħ
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 Opaċità totali fil-kornea; iris inviżibbli
                              
                           Iż-żamma tal-fluworexxeina tiġi evalwata fil-punt tal-ħin ta' osservazzjoni ta' 30 minuta biss kif muri fit-Tabella 2. Il-valur medju taż-żamma tal-fluworexxeina għall-għajnejn kollha tat-test jiġi kkalkolat għall-punt tal-ħin osservat ta' 30 minuta, u jintuża għall-punteġġ kumplessiv tal-kategorija għal kull sustanza kimika tat-test (ara l-paragrafu 51).
                     
                        Tabella 2
                     
                     
                        Punteġġi taż-żamma tal-fluworexxeina.
                     
                     
                                 Punteġġ
                              
                              
                                 Osservazzjoni
                              
                           
                                 0
                              
                              
                                 L-ebda żamma ta' fluworexxeina
                              
                           
                                 0,5
                              
                              
                                 Tilwin batut ħafna ta' ċelloli individwali
                              
                           
                                 1
                              
                              
                                 Tilwin taċ-ċelloli individwali mifrux fil-parti ttrattata kollha tal-kornea
                              
                           
                                 2
                              
                              
                                 Tilwin ta' ċelloli individwali dens fokali jew konfluwenti
                              
                           
                                 3
                              
                              
                                 Partijiet kbar konfluenti tal-kornea jżommu l-fluworexxeina
                              
                           Effetti morfoloġiċi inkluż “tħaffir” taċ-ċelloli tal-epitelju tal-kornea, “illaxkar” tal-epitelju, “taħrix” tas-superfiċje tal-kornea u “twaħħi” tas-sustanza kimika tat-test mal-kornea. Dawn is-sejbiet jistgħu jvarjaw fis-severità u jistgħu iseħħu b'mod simultanju. Il-klassifikazzjoni ta' dawn is-sejbiet hija soġġettiva skont l-interpretazzjoni tal-investigatur.
                     DEJTA U RAPPORTAR
                     
                        Evalwazzjoni tad-Dejta
                     
                     Ir-riżultati tal-opaċità, in-nefħa, u ż-żamma tal-fluworexxeina fil-kornea għandhom jiġu evalwati b'mod separat sabiex tinħoloq klassi separata għal kull punt ta' tmiem. Imbagħad il-klassijiet tal-ICE għal kull punt ta' tmiem jiġu kkombinati sabiex tinħoloq Klassifikazzjoni tal-Irritazzjoni għal kull sustanza kimika tat-test.
                     
                        Kriterji tad-Deċiżjoni
                     
                     Ladarba jkun ġie evalwat kull punt ta' tmiem, il-klassijiet tal-ICE jistgħu jiġu assenjati fuq il-bażi ta' skala ta' valuri ddeterminata minn qabel. L-interpretazzjoni tan-nefħa tal-kornea (it-Tabella 3), l-opaċità (it-Tabella 4), u ż-żamma tal-fluworexxeina (it-Tabella 5) bl-użu ta' erba' klassijiet tal-ICE ssir skont l-iskali murijin hawn taħt. Ta' min jinnota li l-punteġġi tan-nefħa tal-kornea murija fit-Tabella 3 huma applikabbli biss jekk il-ħxuna titkejjel b'mikroskopju korneali (pereżempju Haag-Streit BP900) b'apparat tal-kejl tal-fond Nru 1 u ssettjar tal-wisgħa tal-ferq ta' 9, jiġifieri 0,095 mm. L-utenti għandhom ikunu konxji li l-mikroskopji korneali jistgħu jagħtu kejl differenti tal-ħxuna tal-kornea jekk l-issettjar tal-wisgħa tal-fetħa jkun differenti.
                     
                        Tabella 3
                     
                     
                        Kriterji tal-klassifikazzjoni tal-ICE għan-nefħa tal-kornea.
                     
                     
                                 Nefħa Medja tal-Kornea (%) (*2)
                                 
                              
                              
                                 Klassi tal-ICE
                              
                           
                                 0 sa 5
                              
                              
                                 I
                              
                           
                                 > 5 sa 12
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 > 12 sa 18 (> 75 min wara t-trattament)
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 > 12 sa 18 (≤ 75 min wara t-trattament)
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 > 18 sa 26
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 > 26 sa 32 (> 75 min wara t-trattament)
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 > 26 sa 32 (≤ 75 min wara t-trattament)
                              
                              
                                 IV
                              
                           
                                 > 32
                              
                              
                                 IV
                              
                           
                        
                     
                        Tabella 4
                     
                     
                        Kriterji tal-klassifikazzjoni tal-ICE għall-opaċità.
                     
                     
                                 Punteġġ Medju Massimu tal-Opaċità (*3)
                                 
                              
                              
                                 Klassi tal-ICE
                              
                           
                                 0,0-0,5
                              
                              
                                 I
                              
                           
                                 0,6-1,5
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 1,6-2,5
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 2,6-4,0
                              
                              
                                 IV
                              
                           
                        
                     
                        Tabella 5
                     
                     
                        Kriterji tal-klassifikazzjoni tal-ICE għaż-żamma medja tal-fluworexxeina.
                     
                     
                                 Punteġġ Medju taż-Żamma tal-Fluworexxeina fit-30 minuta ta' wara t-trattament (*4)
                                 
                              
                              
                                 Klassi tal-ICE
                              
                           
                                 0,0-0,5
                              
                              
                                 I
                              
                           
                                 0,6-1,5
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 1,6-2,5
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 2,6-3,0
                              
                              
                                 IV
                              
                           Il-klassifikazzjoni in vitro għal sustanza kimika tat-test hija vvalutata billi tinqara l-klassifikazzjoni tal-GHS li tikkorrispondi għat-taħlita ta' kategoriji miksuba għal nefħa korneali, opaċità korneali, u żamma tal-fluworexxeina kif deskritti fit-Tabella 6.
                     
                        Tabella 6
                     
                     
                        Klassifikazzjonijiet in vitro kumplessivi.
                     
                     
                                 Klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU
                              
                              
                                 Taħlitiet tat-3 Punti ta' Tmiem
                              
                           
                                 Ebda Kategorija
                              
                              
                                 3 × I
                                 2 × I, 1 × II
                              
                           
                                 Ma tista' ssir ebda previżjoni
                              
                              
                                 Taħlitiet oħrajn
                              
                           
                                 Kategorija 1
                              
                              
                                 3 × IV
                                 2 × IV, 1 × III
                                 2 × IV, 1 × II (*5)
                                 
                                 2 × IV, 1 × I (*5)
                                 
                                 Opaċità tal-kornea ≥ 3 fit-30 min (tal-anqas f'2 għajnejn)
                                 Opaċità tal-kornea = 4 fi kwalunkwe ħin (tal-anqas f'żewġ (2) għajnejn)
                                 Illaxkar sever tal-epitelju (tal-anqas f'għajn waħda)
                              
                           
                        Kriterji ta' Aċċettazzjoni tal-Istudju
                     
                     Test jitqies aċċettabbli jekk il-kontrolli negattivi jew tal-veikolu/solvent paralleli u l-kontrolli pożittivi paralleli jiġu identifikati bħala Mhux Ikklassifikati taħt il-GHS u tal-Kategorija 1 tal-GHS, rispettivament.
                     
                        Rapport tat-test
                     
                     Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja, jekk tkun rilevanti għat-twettiq tal-istudju:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanza Kimika tat-Test u Sustanzi Kimiċi tal-Kontroll
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Isem tas-sustanza kimika (jew sustanzi kimiċi) pereżempju l-isem strutturali użat mill-Chemical Abstracts Service (CAS), segwit minn ismijiet oħrajn, jekk ikunu magħrufin;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             in-Numru tar-Reġistru (RN) tas-CAS, jekk ikun magħruf;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-purità u l-kompożizzjoni tas-sustanzi kimiċi tat-test / tal-kontroll (f'perċentwal(i) skont il-piż), sakemm din l-informazzjoni tkun disponibbli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Proprjetajiet fiżikokimiċi bħall-istat fiżiku, il-volatilità, il-pH, l-istabilità, il-klassi kimika, is-solubilità fl-ilma rilevanti għat-twettiq tal-istudju;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Trattament tas-sustanzi kimiċi tat-test/ta' kontroll qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             L-istabilità, jekk tkun magħrufa;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Informazzjoni dwar l-Isponser u l-Faċilità tat-Test
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             L-isem u l-indirizz tal-isponser, tal-faċilità tat-test u tad-direttur tal-istudju;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Identifikazzjoni tas-sors tal-għajnejn (eż. il-faċilità minn fejn inġabru);
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Il-Kundizzjonijiet tal-Metodu ta' Ttestjar
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni tas-sistema tat-test użata;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-mikrosopju korneali użat (eż. mudell) u l-issettjar tal-istrument għall-mikroskopju korneali użat;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Referenza għal riżultati storiċi tal-kontroll pożittiv u negattiv u, jekk applikabbli, dejta storika li turi l-meded aċċettabbli tal-kontroll ta' referenza parallel;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-proċedura użata sabiex tiġi żgurata l-integrità (jiġifieri l-preċiżjoni u l-affidabilità) tal-metodu ta' ttestjar maż-żmien (eż. ittestjar perjodiku tas-sustanzi kimiċi tal-profiċjenza).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Il-Ġbir u l-Preparazzjoni tal-Għajnejn
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             L-età u l-piż tal-annimal donatur u, jekk disponibbli, karatteristiċi oħrajn tal-annimali li minnhom inġabru l-għajnejn (eż. sess, razza);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-kundizzjonijiet tat-trasport u l-ħżin tal-għajnejn (eż., id-data u l-ħin meta nġabru l-għajnejn, l-intervall tal-ħin bejn il-ġbir tal-irjus tat-tiġieġ u t-tqegħid tal-għajnejn enukleati f'kavità tas-superfużjoni);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-preparazzjoni u l-immuntar tal-għajnejn, inklużi dikjarazzjonijiet fuq il-kwalità tagħhom, it-temperatura tal-kavitajiet tal-għajnejn, u l-kriterji għall-għażla tal-għajnejn użati għall-ittestjar.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Proċedura tat-test
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             In-numru ta' repliki użati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             L-identità tal-kontrolli negattivi u pożittivi użati (jekk applikabbli, anki s-solvent u l-kontrolli ta' riferiment);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Id-doża tas-sustanza kimika tat-test, l-applikazzjoni u l-ħin tal-esponiment użati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-punti tal-ħin tal-osservazzjoni (qabel u wara t-trattament);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni tal-kriterji ta' evalwazzjoni u deċiżjoni użati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni tal-kriterji ta' aċċettazzjoni tal-istudju użati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni ta' kwalunkwe modifika tal-proċedura tat-test.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ir-riżultati
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Tabella li tispjega l-punteġġi ta' żamma tal-fluworexxeina, l-opaċità u n-nefħa korneali miksubin għal kull għajn individwali f'kull punt tal-ħin tal-osservazzjoni, inklużi l-punteġġi medji f'kull ħin tal-osservazzjoni tal-għajnejn ittestjati kollha;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             L-ogħla punteġġi ta' nefħa tal-kornea, opaċità u żamma tal-fluworexxeina osservati (minn kwalunkwe punt tal-ħin), u l-klassi tal-ICE marbutin.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni ta' kull effett ieħor osservat;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU in vitro derivata;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Jekk xieraq, ritratti tal-għajn;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Diskussjoni tar-Riżultati
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Konklużjoni
                                 
                              
                           TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report — In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Disponibbli fuq: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Disponibbli fuq: http://ecvam.jrc.it/index.htm.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report — Current Status of in vitro Test Methods for Identifying Mild/Moderate Ocular Irritants: The Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 10-7553A. Disponibbli fuq: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 United Nations (UN) (2011). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fourth revised edition, UN New York and Geneva, 2011. Disponibbli fuq: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Streamlined Summary Document Supporting OECD Test Guideline 438 on the Isolated Chicken Eye for Eye Irritation/Corrosion. Series on Testing and Assessment no. 188 (Part 1 and Part 2), OECD, Paris.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu B.5 ta' dan l-Anness, Irritazzjoni/korrużjoni akuta tal-għajnejn.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Scott L, Eskes C, Hoffman S, Adriaens E, Alepee N, Bufo M, Clothier R, Facchini D, Faller C, Guest R, Hamernik K, Harbell J, Hartung T, Kamp H, Le Varlet B, Meloni M, Mcnamee P, Osborn R, Pape W, Pfannenbecker U, Prinsen M, Seaman C, Spielmann H, Stokes W, Trouba K, Vassallo M, Van den Berghe C, Van Goethem F, Vinardell P, Zuang V (2010). A proposed Eye Irritation Testing Strategy to Reduce and Replace in vivo Studies Using Bottom-up and Top-down Approaches. Toxicology In Vitro 24, 1-9.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 OECD (2011) Guidance Document on The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-Severe Irritants. Series on Testing and Assessment no. 160, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 ICCVAM. (2006). Background review document: Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Disponibbli fuq: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits. Fd. Chem. Toxicol. 31:69-76.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 DB-ALM (INVITTOX) (2009). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET) / Isolated Chicken Eye Test, 13pp. Disponibbli fuq: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol. In Vitro 9:871-929.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials. Food Chem. Toxicol. 34:291-296.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation. Food Chem. Toxicol. 35:23-37.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicology in Vitro 20,78-81.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Disponibbli fuq: http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The in vitro assessment of severe irritants. Fd. Cosmet.- Toxicol.- 19, 471-480.
                              
                           
                        Appendiċi 1
                        DEFINIZZJONIJIET
                        
                           
                              Preċiżjoni
                           : Il-qrubija fil-livell ta' qbil bejn ir-riżultati tal-metodu ta' ttestjar u l-valuri ta' referenza aċċettati. Hija kejl tal-prestazzjoni tal-metodu ta' ttestjar u wieħed mill-aspetti ta'“rilevanza”. It-terminu jintuża spiss minflok “konkordanza” sabiex ifisser il-proporzjon ta' riżultati tajbin tal-metodu ta' ttestjar.
                        
                           
                              Sustanza kimika ta' riferiment
                           : Sustanza kimika użata bħala standard għall-paragun ma' sustanza kimika tat-test. Sustanza kimika ta' riferiment għandu jkollha l-proprjetajiet li ġejjin; (i), sors(i) konsistenti u affidabbli; (ii), similarità strutturali u funzjonali mal-klassi ta' sustanzi kimiċi ttestjati; (iii), karatteristiċi fiżiċi/kimiċi magħrufin; (iv), dejta ta' appoġġ dwar effetti magħrufin; (v), potenza magħrufa fl-iskala tar-rispons mixtieq
                        
                           
                              Approċċ Minn Isfel Għal Fuq
                           : approċċ sekwenzjali użat għal sustanza kimika ssuspettata li ma teħtieġx klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, li jibda bid-determinazzjoni ta' sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni (eżitu negattiv) minn sustanzi kimiċi oħrajn (eżitu pożittiv).
                        
                           
                              Sustanza kimika
                           : Sustanza jew taħlita.
                        
                           
                              Kornea
                           : Il-parti trasparenti tal-parti ta' quddiem tal-boċċa tal-għajn li tiksi l-iris u l-pupilla u tħalli d-dawl jgħaddi għal ġol-parti interna tal-għajn.
                        
                           
                              Opaċità tal-kornea
                           : Kejl tal-estensjoni tal-opaċità tal-kornea wara esponiment għal sustanza kimika tat-test. Żieda fl-opaċità tal-kornea hija indikattiva ta' ħsara fil-kornea.
                        
                           
                              Nefħa fil-kornea
                           : Kejl oġġettiv fit-test tal-ICE tal-estensjoni tad-distensjoni tal-kornea wara esponiment għas-sustanza kimika tat-test. Din tiġi espressa bħala perċentwal u kkalkolata mill-ewwel kejl (qabel id-dożaġġ) tal-ħxuna tal-kornea u l-ħxuna rreġistrata f'intervalli regolari wara esponiment għas-sustanza kimika tat-test, fit-test tal-ICE. Il-grad tan-nefħa tal-kornea huwa indikattiv tal-ħsara fil-kornea.
                        
                           
                              Irritazzjoni tal-għajnejn
                           : Il-produzzjoni ta' tibdiliet fl-għajnejn wara l-applikazzjoni ta' sustanza kimika tat-test fil-wiċċ anterjuri tal-għajn, li huma kompletament reversibbli fi żmien 21 jum mill-applikazzjoni. Interkambjabbli ma' “Effetti reversibbli fuq l-Għajnejn” u mal-“Kategorija 2 tal-GHS tan-NU” (4).
                        
                           
                              Rata ta' negattivi foloz
                           : Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi pożittivi kollha identifikati b'mod falz bħala negattivi permezz ta' metodu ta' ttestjar. Dan huwa wieħed mill-indikaturi tal-prestazzjoni tal-metodu ta' ttestjar.
                        
                           
                              Rata ta' foloz pożittivi
                           : Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi negattivi kollha identifikati b'mod falz bħala pożittivi permezz ta' metodu ta' ttestjar. Dan huwa wieħed mill-indikaturi tal-prestazzjoni tal-metodu ta' ttestjar.
                        
                           
                              Żamma tal-fluworexxeina
                           : Kejl suġġettiv fit-test tal-ICE ta' kemm is-sodju tal-fluworexxeina jinżamm miċ-ċelloli tal-epitelju fil-kornea wara l-esponiment għas-sustanza tat-test. L-ammont ta' fluworexxeina li jinżamm huwa indikattiv tal-ħsara fl-epitelju tal-kornea.
                        
                           
                              Periklu
                           : Proprjetà inerenti ta' aġent jew sitwazzjoni li għandhom il-potenzjal li jikkawżaw effetti avversi meta organiżmu, sistema jew (sub)popolazzjoni jiġu esposti għal dak l-aġent.
                        
                           
                              Effetti irreversibbli fuq l-għajnejn
                           : ara “Ħsara serja lill-għajnejn” u “Kategorija 1 tal-GHS tan-NU”.
                        
                           
                              Taħlita
                           : Taħlita jew soluzzjoni msawra minn żewġ sustanzi jew iktar li fiha ma jirreaġixxux (4)
                        
                           
                              Kontroll negattiv
                           : Replika mhux ittrattata li fiha l-komponenti kollha ta' sistema tat-test. Dan il-kampjun jiġi proċessat b'kampjuni ttrattati bis-sustanza kimika tat-test u kampjuni tal-kontroll oħrajn sabiex jiġi ddeterminat jekk is-solvent ikollux interazzjoni mas-sistema tat-test.
                        
                           
                              Mhux ikklassifikati
                           : Sustanzi li mhumiex ikklassifikati għal irritazzjoni tal-għajnejn (Kategorija 2 tal-GHS tan-NU) jew ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU). Interkambjabbli ma' “Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU”.
                        
                           
                              Kontroll pożittiv
                           : Replika li jkun fiha l-komponenti kollha ta' sistema tat-test u ttrattata b'sustanza li jkun magħruf li tikkawża rispons pożittiv. Sabiex jiġi żgurat li l-varjabilità fir-reazzjoni tal-kontroll pożittiv tkun tista' tiġi vvalutata tul iż-żmien, id-daqs tar-rispons sever ma għandux ikun eċċessiv.
                        
                           
                              Affidabilità
                           : Kejliet ta' kemm metodu ta' ttestjar jista' jitwettaq b'mod riproduċibbli fil-laboratorji u bejn il-laboratorji tul iż-żmien, meta jitwettaq billi jintuża l-istess protokoll. Tiġi vvalutatata bil-kalkolu tar-riproduċibilità fil-laboratorju u bejn laboratorju u ieħor u r-ripetibilità fil-laboratorju.
                        
                           
                              Effetti reversibbli fuq l-Għajnejn
                           : ara “Irritazzjoni tal-għajnejn” u “Kategorija 2 tal-GHS tan-NU”.
                        
                           
                              Ħsara serja lill-għajnejn
                           : Il-produzzjoni ta' ħsara fit-tessut fl-għajnejn, jew tnaqqis fiżiku serju tal-vista, wara li tiġi applikata sustanza kimika fuq il-wiċċ quddiemi tal-għajn, li ma jkunux riversibbli fi żmien 21 jum mill-applikazzjoni. Interkambjabbli ma' “Effetti irreversibbli fuq l-għajnejn” u mal-“Kategorija 1 tal-GHS tan-NU” (4).
                        
                           
                              Mikroskopju korneali
                           : Strument li jintuża biex l-għajn tiġi eżaminata b'mod dirett taħt l-ingrandiment ta' mikroskopju binokulari billi joħloq immaġni dritta u stereoskopika. Fil-metodu ta' ttestjar tal-ICE, dan l-istrument jintuża sabiex wieħed ikun jista' jara l-istrutturi anterjuri ta' għajn it-tiġieiġa kif ukoll biex ikejjel b'mod oġġettiv il-ħxuna tal-kornea b'apparat li jitwaħħal mal-istrument u li jkejjel il-fond.
                        
                           
                              Kontroll tas-solvent/veikolu
                           : Kampjun mhux ittrattat li fih il-komponenti kollha ta' sistema tat-test, inkluż is-solvent jew il-veikolu li jiġi pproċessat mal-kampjuni ttrattati bis-sustanza kimika tat-test u kampjuni tal-kontroll oħrajn sabiex jiġi stabbilit ir-rispons bażi għall-kampjuni ttrattati bis-sustanza kimika tat-test dissolta fl-istess solvent jew veikolu. Meta jiġi ttestjat ma' kontroll negattiv parallel, dan il-kampjun juri wkoll jekk is-solvent jew il-veikolu jkollux interazzjoni mas-sistema tat-test.
                        
                           
                              Sustanza
                           : Elementi kimiċi u l-komposti tagħhom fl-istat naturali jew miksubin bi kwalunkwe proċess ta' produzzjoni, inkluż kwalunkwe addittiv meħtieġ għall-preservazzjoni tal-istabilità tal-prodott u ta' kwalunkwe impurità li toriġina mill-proċess użat, imma eskluż kwalunkwe solvent li jista' jkun separat mingħajr ma jaffetwa l-istabilità tas-sustanza jew ibiddel il-kompożizzjoni tagħha (4).
                        
                           
                              Tensjoattiv
                           : Imsejjaħ ukoll aġent tensjoattiv, dan huwa sustanza, bħal deterġent, li tista' tnaqqas it-tensjoni fil-wiċċ ta' likwidu u b'hekk tippermettilu jtella' r-ragħwa jew jippenetra solidi; huwa magħruf ukoll bħala aġent li jxarrab.
                        
                           
                              Approċċ Minn Fuq Għal Isfel
                           : approċċ sekwenzjali użat għal sustanza kimika ssuspettata li tikkawża ħsara serja lill-għajnejn, li jibda bid-determinazzjoni ta' sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (eżitu pożittiv) minn sustanzi kimiċi oħrajn (eżitu negattiv).
                        
                           
                              Sustanza kimika tat-test
                           : Kwalunkwe sustanza jew taħlita li tkun qiegħda tiġi ttestjata permezz ta' dan il-Metodu ta' Ttestjar.
                        
                           
                              Strateġija ta' ttestjar sekwenzjali
                           : Strateġija ta' ttestjar gradwali li biha l-informazzjoni eżistenti kollha dwar sustanza kimika tat-test tiġi riveduta, f'ordni speċifiku, permezz ta' proċess tal-piż tal-evidenza f'kull livell sabiex jiġi ddeterminat jekk hemmx biżżejjed informazzjoni disponibbli għal deċiżjoni dwar il-klassifikazzjoni tal-periklu, qabel ma wieħed jgħaddi għal-livell li jmiss. Jekk il-potenzjal ta' irritazzjoni ta' sustanza kimika tat-test jista' jiġi assenjat fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, ma jkun meħtieġ l-ebda ttestjar ieħor. Jekk il-potenzjal ta' irritazzjoni ta' sustanza kimika tat-test ma jkunx jista' jiġi assenjat fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, għandha ssir proċedura ta' ttestjar sekwenzjali fuq l-annimali sakemm tkun tista' ssir klassifikazzjoni mhux ekwivoka.
                        
                           
                              Is-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta' Sustanzi Kimiċi tan-Nazzjonijiet Uniti (GHS tan-NU)
                           : Sistema li tipproponi l-klassifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) skont it-tipi u l-livelli standardizzati ta' perikli fiżiċi, sanitarji u ambjentali, u tindirizza l-elementi ta' komunikazzjoni korrispondenti, bħal pittogrammi, kliem ta' twissija, dikjarazzjonijiet ta' periklu, dikjarazzjonijiet ta' prekawzjoni u skedi ta' tagħrif dwar is-sikurezza, sabiex jitwassal tagħrif dwar l-effetti avversi bil-għan li n-nies ikunu protetti (inklużi min iħaddem, il-ħaddiema, it-trasportaturi, il-konsumaturi u l-ħaddiema tal-emerġenza) u l-ambjent (4).
                        
                           
                              Kategorija 1 tal-GHS tan-NU
                           : ara “Ħsara serja lill-għajnejn” u/jew “Effetti irreversibbli fuq l-għajnejn”.
                        
                           
                              Kategorija 2 tal-GHS tan-NU
                           : ara “Irritazzjoni tal-Għajnejn” u/jew “Effetti reversibbli fuq l-għajnejn”.
                        
                           
                              Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU
                           : Sustanzi li ma jissodisfawx ir-rekwiżiti għall-klassifikazzjoni fil-Kategorija 1 jew 2 (2A jew 2B) tal-GHS tan-NU. Interkambjabbli ma' “Mhux ikklassifikati”.
                        
                           
                              Metodu ta' ttestjar ivvalidat
                           : Metodu ta' ttestjar li għalih ikunu tlestew studji ta' validazzjoni sabiex tiġi ddeterminata r-rilevanza (inkluża l-preċiżjoni) u l-affidabilità għal għan speċifiku. Ta' min jinnota li jista' jkun li metodu ta' ttestjar ivvalidat ma jkollux prestazzjoni tajba biżżejjed f'termini ta' preċiżjoni u affidabilità sabiex jitqies aċċettabli għall-għan propost.
                        
                           
                              Piż tal-evidenza
                           : Il-proċess fejn jitqiesu l-qawwiet u d-dgħufijiet ta' biċċiet ta' informazzjoni varji sabiex tintlaħaq u tiġi appoġġata konklużjoni rigward il-potenzjal ta' sustanza kimika li tkun ta' periklu.
                     
                     
                        Appendiċi 2
                        
                           SUSTANZI KIMIĊI TA' PROFIĊJENZA GĦALL-METODU TA' TTESTJAR TAL-ICE
                        
                        Qabel l-użu ta' rutina ta' metodu ta' ttestjar li jaderixxi ma' dan il-metodu ta' ttestjar, il-laboratorji għandhom juru l-profiċjenza teknika billi jidentifikaw b'mod korrett il-klassifikazzjoni tal-ħsara lill-għajnejn ta' 13-il sustanza kimika rrakkomandati fit-Tabella 1. Dawn is-sustanzi kimiċi ntgħażlu sabiex jirrappreżentaw il-firxa ta' risponsi għal perikli tal-għajnejn fuq il-bażi tar-riżultati mit-test in vivo fuq l-għajnejn tal-fniek (TG 405) u s-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (jiġifieri l-Kategoriji 1, 2A, 2B jew Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU) (4)(6). Kriterji tal-għażla oħrajn kienu li s-sustanzi kimiċi huma disponibbli fis-suq, li hemm dejta ta' referenza in vivo ta' kwalità għolja għad-dispożizzjoni, u li hemm dejta ta' kwalità għolja miksuba mill-metodu in vitro tal-ICE. Hemm dejta ta' referenza disponibbli fl-SSD (5) u fid-Dokument ta' Reviżjoni ta' Sfond tal-ICCVAM għall-metodu ta' ttestjar tal-ICE (9).
                        
                           Tabella 1
                        
                        
                           Is-sustanzi kimiċi rakkomandati għall-wiri tal-profiċjenza teknika bl-ICE
                        
                        
                                    Sustanza Kimika
                                 
                                 
                                    CASRN
                                 
                                 
                                    Klassi kimika (13)
                                    
                                 
                                 
                                    Forma Fiżika
                                 
                                 
                                    Klassifikazzjoni In Vivo
                                        (14)
                                    
                                 
                                 
                                    Klassifikazzjoni In Vitro
                                        (15)
                                    
                                 
                              
                                    Klorur tal-benżalkonju (5 %)
                                 
                                 
                                    8001-54-5
                                 
                                 
                                    Kompost tal-onju
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                              
                                    Kloressidin
                                 
                                 
                                    55-56-1
                                 
                                 
                                    Ammin, Ammidin
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                              
                                    Aċidu dibenżojl-L-tartariku
                                 
                                 
                                    2743-38-6
                                 
                                 
                                    Aċidu karbossiliku, Ester
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                              
                                    Imidażol
                                 
                                 
                                    288-32-4
                                 
                                 
                                    Eteroċikliku
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                              
                                    Aċidu trikloroaċetiku (30 %)
                                 
                                 
                                    76-03-9
                                 
                                 
                                    Aċidu Karbossiliku
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                              
                                    2,6-diklorobenż-ojl klorur
                                 
                                 
                                    4659-45-4
                                 
                                 
                                    Aloġenur tal-aċil
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 2A
                                 
                                 
                                    Ma tista' ssir ebda previżjoni (16)
                                    
                                 
                              
                                    Nitrat tal-ammonju
                                 
                                 
                                    6484-52-2
                                 
                                 
                                    Melħ inorganiku
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 2A (17)
                                    
                                 
                                 
                                    Ma tista' ssir ebda previżjoni (16)
                                    
                                 
                              
                                    Etil-2-metilaċeto-aċetat
                                 
                                 
                                    609-14-3
                                 
                                 
                                    Keton, Ester
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 2 B
                                 
                                 
                                    Ma tista' ssir ebda previżjoni (16)
                                    
                                 
                              
                                    Sulfossidu tad-dimetil
                                 
                                 
                                    67-68-5
                                 
                                 
                                    Kompost tal-kubrit organiku
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Ebda Kategorija
                                 
                                 
                                    Ebda Kategorija
                                 
                              
                                    Gliċerol
                                 
                                 
                                    56-81-5
                                 
                                 
                                    Alkoħol
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Ebda Kategorija
                                 
                                 
                                    Ebda kategorija (fil-limitu)
                                 
                              
                                    Metilċiklopentan
                                 
                                 
                                    96-37-7
                                 
                                 
                                    Idrokarbur (ċikliku)
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Ebda Kategorija
                                 
                                 
                                    Ebda Kategorija
                                 
                              
                                    n-Essan
                                 
                                 
                                    110-54-3
                                 
                                 
                                    Idrokarbur (aċikliku)
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Ebda Kategorija
                                 
                                 
                                    Ebda Kategorija
                                 
                              
                                    Triaċetin
                                 
                                 
                                    102-76-1
                                 
                                 
                                    Lipidu
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Mhux ikklassifikat
                                 
                                 
                                    Ebda Kategorija
                                 
                              
                                    Taqsiriet: CASRN = Numru tar-Reġistru tal-Chemical Abstracts Service
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 3
                        
                           DIJAGRAMMI TAL-APPARAT TAS-SUPERFUŻJONI TAS-SILĠ U L-KLAMPI TAL-GĦAJNEJN
                        
                        
                           (Ara Burton et al. (18) għal deskrizzjonijiet ġeneriċi addizzjonali tal-apparat tas-superfużjoni u l-klampijiet tal-għajnejn)
                        
                        
                                    Nru tal-Oġġett
                                 
                                 
                                    Deskrizzjoni
                                 
                                 
                                    Nru tal-Oġġett
                                 
                                 
                                    Deskrizzjoni
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    Ilma sħun tal-iżbokk
                                 
                                 
                                    9
                                 
                                 
                                    Kompartiment
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    Bieb jiżżerżaq
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    Apparat fejn titqiegħed l-għajn
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    Apparat tas-superfużjoni
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    Għajn tat-tiġieġa
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    Strument tal-kejl ottiku
                                 
                                 
                                    12
                                 
                                 
                                    Soluzzjoni salina tal-iżbokk
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    Bokka tal-ilma sħun
                                 
                                 
                                    13
                                 
                                 
                                    Vit
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                    Soluzzjoni salina
                                 
                                 
                                    14
                                 
                                 
                                    Lieva ta' fuq aġġustabbli
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                    Ilma sħun
                                 
                                 
                                    15
                                 
                                 
                                    Lieva t'isfel aġġustabbli
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                    Soluzzjoni salina tal-bokka
                                 
                                 
                                     
                                 
                              ”
               
                     (14)
                  
                  
                     Fil-Parti B, il-Kapitolu B.49 huwa sostitwit b'dan li ġej:
                     “B.49   Test In Vitro Tal-Mikronukleu Taċ-Ċelloli Tal-Mammiferi
                     
                     INTRODUZZJONI
                     Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test 487 (2016). Huwa parti minn sensiela ta' metodi ta' ttestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika. Ġie żviluppat dokument tal-OECD li jipprovdi informazzjoni sintetika dwar l-ittestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika u ħarsa ġenerali dwar it-tibdil reċenti la sar f'dawk il-Linji Gwida tat-Test (1).
                     It-test in vitro tal-mikronukleu (MNvit) hija test tal-ġenotossiċità għall-individwazzjoni ta' mikronukleji (MN) fiċ-ċitoplażma ta' ċelloli fl-interfażi. Il-mikronukleji jistgħu joriġinaw minn frammenti ta' kromożomi aċentriċi (jiġifieri li ma għandhomx ċentromeru), jew kromożomi sħaħ li ma jistgħux jemigraw lejn il-poli waqt l-istadju tal-anafażi tad-diviżjoni taċ-ċelloli. Għaldaqstant, it-test MNvit huwa metodu in vitro li jipprovdi bażi komprensiva għall-investigazzjoni ta' potenzjal ta' ħsara fil-kromożomi in vitro għaliex kemm l-anewġeni kif ukoll il-klastoġeni jistgħu jiġu individwati (2) (3) f'ċelloli li tkun saritilhom diviżjoni taċ-ċelloli matul jew wara l-esponiment għas-sustanza kimika tat-test (ara l-paragrafu 13 għal iktar dettalji). Il-mikronukleji jirrappreżentaw ħsara li ġiet trażmessa lil ċelloli dixxendenti, filwaqt li aberrazzjonijiet tal-kromożomi magħduda fiċ-ċelloli fil-metafażi jistgħu ma jiġux trażmessi. Il-bidliet xorta waħda jistgħu ma jkunux kompatibbli mas-sopravvivenza taċ-ċelloli.
                     Dan il-metodu ta' ttestjar jippermetti l-użu ta' protokolli bl-inibitur taċ-ċitokalażina B tal-polimerizzazzjoni tal-attina (ċitoB) u mingħajr dan l-inibitur. Iż-żieda taċ-ċitoB qabel il-mitożi tirriżulta f'ċelloli li jkunu binukleati u, għalhekk, tippermetti li jiġu identifikati u analizzati mikronukleji biss f'dawk iċ-ċelloli li jkunu għamlu mitożi waħda (4) (5). Dan il-metodu ta' ttestjar jippermetti wkoll l-użu ta' protokolli mingħajr imblokkatur taċ-ċitokineżi, sakemm ikun hemm evidenza li l-popolazzjoni ta' ċelloli analizzati għaddiet minn mitożi.
                     Minbarra l-użu tat-test tal-MNvit sabiex jiġu identifikati sustanzi kimiċi li jinduċu l-mikronukleji, l-użu ta' tikkettar immunokimiku ta' kinetoċori, jew l-ibridizzazzjoni b'sondi ċentromeriċi/telomeriċi (ibridizzazzjoni in situ ta' fluworexxenza (FISH)), ukoll jistgħu jipprovdu informazzjoni addizzjonali dwar il-mekkaniżmi ta' ħsara fil-kromożomi u tal-formazzjoni ta' mikronukleji (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17). Dawk il-proċeduri ta' tikkettar u ibridizzazzjoni jistgħu jintużaw meta jkun hemm żieda fil-formazzjoni ta' mikronukleji u l-investigatur ikun jixtieq jiddetermina jekk iż-żieda kinitx ir-riżultat ta' avvenimenti klastoġeniċi u/jew anewġeniċi.
                     Peress li l-mikronukleji fiċ-ċelloli fl-interfażi jistgħu jiġu vvalutati b'mod relattivament oġġettiv, il-persunal tal-laboratorju jrid jiddetermina biss in-numru ta' ċelloli binukleati meta tintuża ċitoB u l-inċidenza ta' ċelloli mikronukleati fil-każijiet kollha. Għalhekk, il-lametti jistgħu jiġu kklassifikati relattivament malajr u l-analiżi tista' tiġi awtomatizzata. Dan jagħmilha prattika li eluf minflok mijiet ta' ċelloli jiġu kklassifikati f'kull trattament, biex b'hekk tiżdied il-qawwa tat-test. Fl-aħħar nett, minħabba li l-mikronukleji jistgħu joħorġu minn kromożomi tardivi, hemm il-potenzjal li wieħed jindividwa sustanzi li jinduċu anewplojdi li huma diffiċli li wieħed jistudjahom f'testijiet konvenzjonali tal-aberrazzjoni kromożomika, eż. il-Kapitolu B.10 ta' dan l-anness (18). Madankollu, it-test MNvit kif deskritt fil-metodu ta' ttestjar ma jippermettix li ssir differenzazzjoni bejn sustanzi kimiċi li jinduċu bidliet fin-numru ta' kromożomi u/jew plojdija minn dawk li jinduċu klastoġeniċità mingħajr tekniki speċjali bħall-FISH imsemmijin fil-paragrafu 4.
                     It-test MNvit huwa b'saħħitu u jista' jsir f'varjetà ta' tipi ta' ċelloli, u fil-preżenza jew fin-nuqqas ta' ċitoB. Hemm dejta estensiva li ssostni l-validità tat-test MNvit bl-użu ta' diversi tipi ta' ċelloli (kulturi ta' linji ta' ċelloli jew kulturi ta' ċelloli primarji) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36). Dawn jinkludu, b'mod partikolari, l-istudji ta' validazzjoni internazzjonali kkoordinati mis-Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (19) (20) (21) (22) (23) u r-rapporti tal-Grupp ta' Ħidma Internazzjonali dwar l-Ittestjar tal-Ġenotossiċità (5) (17). Id-dejta disponibbli ġiet evalwata mill-ġdid fi studju ta' validazzjoni retrospettiv skont il-piż tal-evidenza miċ-Ċentru Ewropew għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ECVAM) tal-Kummissjoni Ewropea (KE), u l-metodu tat-test ġie approvat bħala xjentifikament validu mill-Kumitat Xjentifiku Konsultattiv tal-ECVAM (ESAC) (37) (38) (39).
                     It-test in vitro MNvit taċ-ċelloli tal-mammiferi jista' juża kulturi ta' linji ta' ċelloli jew kulturi ta' ċelloli primarji ta' oriġini mill-bniedem jew minn rodituri. Minħabba li l-frekwenza tal-isfond tal-mikronukleji tinfluwenza s-sensittività tat-test, huwa rrakkomandat li jintużaw tipi ta' ċelloli bi frekwenza ta' sfond definita u stabbli ta' formazzjoni ta' mikronukleji. Iċ-ċelloli użati jintgħażlu fuq il-bażi tal-ħila li jikbru sew fil-kultura, l-istabilità tal-karjotip (inkluż in-numru ta' kromożomi) u l-frekwenza spontanja ta' mikronukleji (40). Bħalissa, id-dejta disponibbli ma tippermettix li jinħarġu rakkomandazzjonijiet assoluti iżda tissuġġerixxi li, meta jiġu evalwati l-perikli kimiċi, huwa importanti li jiġu kkunsidrati l-istatus p53, l-istabilità ġenetika (karjotip), il-kapaċità ta' tiswija tad-DNA u l-oriġini (minn rodituri jew mill-bniedem) taċ-ċelloli magħżulin għall-ittestjar. Għalhekk, dawk li jużaw dan il-metodu ta' ttestjar huma mħeġġin jikkunsidraw l-influwenza ta' dawn il-karatteristiċi u karatteristiċi oħrajn taċ-ċelloli fuq il-prestazzjoni ta' linja ta' ċelloli fis-sejbien tal-induzzjoni ta' mikronukleji, peress li l-għarfien dejjem qiegħed jiżdied f'dan il-qasam.
                     Id-definizzjonijiet użati huma pprovduti fl-Appendiċi 1.
                     KUNSIDERAZZJONIJIET U LIMITAZZJONIJIET INIZJALI
                     It-testijiet li jsiru in vitro ġeneralment jirrekjedu l-użu ta' sors eżoġeniku ta' attivazzjoni metabolika sakemm iċ-ċelloli ma jkunux metabolikament kompetenti fir-rigward tas-sustanzi kimiċi tat-test. Is-sistema eżoġena ta' attivazzjoni metabolika ma timitax għalkollox il-kundizzjonijiet in vivo. Wieħed għandu joqgħod attent sabiex jevita kundizzjonijiet li jitsgħu jwasslu għal riżultati pożittivi artefattwali li ma jirriflettux il-ġenotossiċità tas-sustanzi kimiċi tat-test. Kundizzjonijiet bħal dawn jinkludu bidliet fil-pH (41) (42) (43) jew l-ożmolalità, interazzjoni mal-medium tal-kultura taċ-ċelloli (44) (45) jew livelli eċċessivi ta' ċitotossiċità (ara l-paragrafu 29).
                     Sabiex wieħed janalizza l-induzzjoni tal-mikronukleji, huwa essenzjali li l-mitożi tkun seħħet kemm fil-kultivazzjonijiet ittrattati kif ukoll f'dawk mhux ittrattati. L-iktar stadju informattiv għall-għadd tal-mikronukleji huwa f'ċelloli li temmew mitożi waħda waqt jew wara t-trattament bis-sustanza kimika tat-test. Għal Nanomaterjali Manifatturati, hemm bżonn li jsiru adattamenti speċifiċi ta' dan il-metodu ta' ttestjar li ma jkunux deskritti fih.
                     Qabel ma jintuża dan il-metodu ta' ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta' dejta għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet ma jkunux meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita.
                     IL-PRINĊIPJU TAT-TEST
                     Il-kulturi ta' ċelloli ta' oriġini umana jew minn mammiferi oħrajn huma esposti għas-sustanza kimika tat-test kemm b'sors eżoġenu ta' attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajr dan is-sors sakemm ma jintużawx ċelloli b'kapaċità metabolizzanti adegwata (ara l-paragrafu 19).
                     Matul jew wara l-esponiment għas-sustanza kimika tat-test, iċ-ċelloli jitkabbru għal perjodu twil biżżejjed sabiex il-ħsara fil-kromożomi jew effetti oħran fuq iċ-ċiklu taċ-ċellola/id-diviżjoni taċ-ċellola jwasslu għall-formazzjoni ta' mikronukleji fiċ-ċelloli fl-interfażi. Għall-induzzjoni tal-anewplojdi, is-sustanza kimika tat-test għandha normalment tkun preżenti waqt il-mitożi. Ċelloli fl-interfażi miġbura u mlewna jiġu analizzati għall-preżenza ta' mikronukleji. Idealment, il-mikronukleji għandhom jingħaddu biss f'dawk iċ-ċelloli li jkunu temmew il-mitożi waqt l-esponiment għas-sustanza kimika tat-test jew waqt il-perjodu ta' wara t-trattament, jekk jintuża wieħed. F'kulturi li ġew ittrattati b'imblokkatur taċ-ċitokineżi, dan jinkiseb faċilment billi jingħaddu biss iċ-ċelloli binukleati. Fin-nuqqas ta' mblokkatur taċ-ċitokineżi, importanti li jintwera li ċ-ċelloli analizzati aktarx li jkunu għaddew minn diviżjoni taċ-ċelloli, fuq il-bażi ta' żieda fil-popolazzjoni taċ-ċelloli, matul jew wara l-esponiment għas-sustanza kimika tat-test. Għall-protokolli kollha, huwa importanti li jintwera li l-proliferazzjoni taċ-ċelloli seħħet kemm fil-kulturi tal-kontroll kif ukoll f'dawk tat-trattament, u l-grad ta' ċitotossiċità jew ċitostażi indotta mis-sustanza kimika tat-test għandu jiġi vvalutat fil-kulturi kollha li jingħaddu għall-mikronukleji.
                     DESKRIZZJONI TAL-METODU
                     
                        Ċelloli
                     
                     Jistgħu jintużaw linfoċiti periferiċi tad-demm primarji kkulturati mill-bniedem jew mammiferi oħrajn (7) (20) (46) (47) u numru ta' linji ta' ċelloli ta' rodituri bħal CHO, V79, CHL/IU, u ċelloli L5178Y jew linji ta' ċelloli tal-bniedem bħat-TK6 (19) (20) (21) (22) (23) (26) (27) (28) (29) (31) (33) (34) (35) (36) (ara l-paragrafu 6). Linji ta' ċelloli oħrajn bħal HT29 (48), Caco-2 (49), HepaRG (50) (51), ċelloli HepG2 (52) (53), A549 u ċelloli primarji tal-Embriju tal-Ħamster Sirjan (54) intużaw għall-ittestjar tal-mikronukleji iżda, għalissa, għadhom ma ġewx ivvalidati b'mod estensiv. Għaldaqstant, l-użu ta' dawk il-linji u tipi ta' ċelloli għandu jkun iġġustifikat abbażi tal-prestazzjoni tagħhom murija fit-test, kif deskritt fit-taqsima dwar il-Kriterji ta' Aċċettazzjoni. Ġie rrapportat li ċito B għandha l-potenzjal li tħalli impatt fuq it-tkabbir taċ-ċelloli L5178Y u, għalhekk, mhijiex irrakkomandata ma' din il-linja ta' ċelloli (23). Meta jintużaw ċelloli prmiarji, għal raġunijiet ta' trattament xieraq tal-annimali, għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' ċelloli ta' oriġini umana meta dan ikun fattibbli u dawn għandhom jiġu kampjunati skont il-prinċipji u r-regolamenti etiċi umani.
                     Il-linfoċiti periferiċi tad-demm tal-bniedem għandhom jinkisbu mingħand individwi żgħażagħ (madwar 18-35 sena) li ma jpejpux u li ma għandhom ebda marda magħrufa jew li ma kinux esposti riċentement għal aġenti ġenotossiċi (eż. sustanzi kimiċi, radjazzjoni jonizzanti) f'livelli li jżidu l-inċidenza ta' sfond ta' ċelloli mikronukleati. Dan jiżgura li l-inċidenza ta' sfond ta' ċelloli mikronukleati tibqa' baxxa u konsistenti. L-inċidenza bażi ta' ċelloli mikronukleati tiżdied mal-età, u din it-tendenza hija iktar evidenti fin-nisa milli fl-irġiel (55). Jekk jinġabru flimkien ċelloli mingħand iktar minn donatur wieħed, għandu jiġi speċifikat l-għadd ta' donaturi. Hemm bżonn li jintwera li ċ-ċelloli nqasmu sa mill-bidu nett tat-trattament bis-sustanza kimika tat-test sal-kampjunar taċ-ċelloli. Il-kulturi taċ-ċelloli jinżammu f'fażi ta' tkabbir esponenzjali (linji ta' ċelloli) jew jiġu stimolati sabiex jinqasmu (kulturi primarji ta' linfoċiti), sabiex jesponu ċ-ċelloli fi stadji differenti taċ-ċiklu taċ-ċelloli, peress li jaf ma tkunx magħrufa s-sensittività tal-istadji taċ-ċelloli għas-sustanzi kimiċi. Iċ-ċelloli primarji li jeħtieġu stimolazzjoni b'aġenti mitoġeniċi sabiex jinqasmu ġeneralment ma jibqgħux sinkronizzati matul l-esponiment għas-sustanza kimika tat-test (eż. linfoċiti umani wara stimolazzjoni mitoġenika ta' 48 siegħa). L-użu ta' ċelloli sinkronizzati matul it-trattament bis-sustanza kimika tat-test mhuwiex rakkomandat, iżda jista' jkun aċċettabbli jekk ikun iġġustifikat.
                     
                        Il-kundizzjonijiet tal-media tal-kultura
                     
                     Għandhom jintużaw kundizzjonijiet xierqa tal-media tal-kultura u tal-inkubazzjoni (reċipjenti tal-kultura, atmosfera umidifikata ta' 5 % CO2 jekk xieraq, temperatura ta' inkubazzjoni ta' 37 °C) għaż-żamma tal-kulturi. Il-linji ta' ċelloli għandhom jiġu verifikati b'mod regolari għall-istabilità tal-għadd ta' kromożomi modali u l-assenza ta' kontaminazzjoni tal-Mikoplażma, u ċ-ċelloli ma għandhomx jintużaw jekk ikunu kontaminati jew jekk jinbidel l-għadd ta' kromożomi modali. It-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli tal-linji ta' ċelloli jew il-kulturi prmiarji użati fil-laboratorju tat-testijiet għandu jkun stabbilit u konsistenti mal-karatteristiċi taċ-ċelloli ppubblikati.
                     
                        Preparazzjoni tal-kulturi
                     
                     Linji ta' ċelloli: iċ-ċelloli huma propagati minn kulturi omm, imqegħdin fil-medium tal-kultura f'densità b'tali mod li ċ-ċelloli f'sospensjonijiet jew f'monosaffi jibqgħu jikbru b'mod esponenzjali sal-ħin tal-ġbir (eż. għandha tiġi evitata konfluwenza għal ċelloli li jikbru f'monosaffi).
                     Linfoċiti: demm sħiħ ittrattat b'antikoagulant (eż. eparina) jew linfoċiti separati jiġu kulturati (eż. għal 48 siegħa għal linfoċiti umani) fil-preżenza ta' mitoġenu (eż. fitoemagglutinina (PHA għal linfoċiti umani) sabiex tiġi indotta diviżjoni taċ-ċelloli qabel l-esponiment għas-sustanza kimika tat-test u ċitoB.
                     
                        Attivazzjoni metabolika
                     
                     Għandhom jintużaw sistemi eżoġeni ta' metabolizzazzjoni meta jintużaw ċelloli b'kapaċità metabolika endoġena inadegwata. L-iktar sistema użata spiss li hija l-ewwel rakkomandata, sakemm ma tkunx iġġustifikata sistema oħra, hija frazzjoni postmitokondrijali ssupplimentata minn kofatturi (S9) imħejjija mill-fwied ta' rodituri (ġeneralment firien) ittrattati b'indutturi enzimatiċi bħal Aroclor 1254 (56) (57) jew taħlita ta' fenobarbital u b-naftoflavon (58) (59) (60). Din it-taħlita msemmija l-aħħar ma tmurx kontra l-Konvenzjoni ta' Stokkolma dwar Materjal Organiku Persistenti li Jniġġes (61) u ntwera li hija effettiva daqs Aroclor 1254 għall-induzzjoni ta' ossidażijiet b'funzjoni mħallta (58) (59) (60). Il-frazzjoni S9 normalment tintuża f'konċentrazzjonijiet li jvarjaw minn 1 sa 2 % (v/v) iżda tista' tiżdied sa 10 % (v/v) fil-medium tat-test finali. L-użu ta' prodotti li jnaqqsu l-indiċi mitotiku, speċjalment prodotti ta' kumplessazzjoni tal-kalċju (62) għandu jiġi evitat matul it-trattament. L-għażla tat-tip u l-konċentrazzjoni ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika eżoġena jew induttur metaboliku użati tista' tkun influwenzata mill-klassi tas-sustanzi kimiċi li jiġu ttestjati.
                     
                        Preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test
                     
                     Is-sustanzi kimiċi solidi tat-test għandhom jiġu ppreparati f'solventi xierqa u jiġu dilwiti, jekk dan ikun xieraq, qabel it-trattament taċ-ċelloli. Is-sustanzi kimiċi likwidi tat-test jistgħu jiżdiedu direttament mas-sistema tat-test u/jew jiġu dilwiti qabel it-trattament tas-sistema tat-test. Is-sustanzi kimiċi gassużi jew volatili tat-test għandhom jiġu ttestjati b'modifiki xierqa fil-protokolli standard, bħat-trattament f'reċipjenti ssiġillati (63) (64) (65). Il-preparamenti tas-sustanza kimika tat-test għandhom isiru eżatt qabel it-trattament, sakemm id-dejta dwar l-istabilità ma turix l-aċċettabilità tal-ħżin.
                     
                        Kundizzjonijiet tat-test
                     
                     
                        Solventi
                     
                     Is-solvent għandu jingħażel sabiex tiġi ottimizzata s-solubilità tas-sustanza kimika tat-test mingħajr ma jitħalla impatt avvers fuq it-twettiq tal-assaġġ, jiġifieri bidla fit-tkabbir taċ-ċelloli, effett fuq l-integrità tas-sustanza kimika tat-test, reazzjoni ma' reċipjenti tal-kultura, indeboliment tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika. Huwa rakkomandat li, kull meta dan ikun possibbli, l-ewwel għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent milwiem (jew medium tal-kultura). Fost is-solventi ferm stabbiliti hemm l-ilma jew is-sulfossidu tad-dimetil (DMSO). B'mod ġenerali, is-solventi organiċi ma għandhomx jaqbżu l-1 % (v/v). Jekk iċ-ċitoB tiġi dissolta f'DMSO, l-ammont totali ta' solvent organiku użat kemm għas-sustanza kimika tat-test kif ukoll għaċ-ċitoB ma għandux jaqbeż il-1 % (v/v); inkella, għandhom jintużaw kontrolli mhux ittrattati sabiex jiġi żgurat li l-perċentwal ta' solvent organiku ma jkollux effett avvers. Is-solventi milwiema (salina jew ilma) ma għandhomx jaqbżu l-10 % (v/v) fil-medium tat-trattament finali. Jekk jintużaw solventi mhux ferm stabbiliti (eż. etanol jew aċeton), l-użu tagħhom għandu jkun sostnut minn dejta li tindika l-kompatibilità tagħhom mas-sustanza kimika tat-test, is-sistema tat-test u n-nuqqas tagħhom ta' tossiċità ġenetika fil-konċentrazzjoni użata. Fin-nuqqas ta' dik id-dejta ta' sostenn, importanti li jiġu inklużi kontrolli mhux ittrattati (ara l-Appendiċi 1) kif ukoll kontrolli tas-solvent sabiex jintwera li s-solvent magħżul ma jinduċi ebda effett dannuż jew kromożomiku (eż. anewplojdija jew klastoġeniċità).
                     
                        L-użu ta' ċitoB bħala imblokkatur taċ-ċitokineżi
                     
                     Waħda mill-aktar kunsiderazzjonijiet importanti fit-twettiq tat-test MNvit hija l-iżgurar li ċ-ċelloli magħduda temmew il-mitożi waqt it-trattament jew il-perjodu ta' inkubazzjoni wara t-trattament, jekk jintuża wieħed. L-għadd tal-mikronukleji, għalhekk, għandu jkun illimitat għal ċelloli li għaddew minn mitożi waqt jew wara t-trattament. ĊitoB hija s-sustanza li ntużat l-aktar sabiex timblokka ċ-ċitokineżi minħabba li tinibixxi l-ġbir tal-attina, u b'hekk tipprevjeni s-separazzjoni taċ-ċelloli dixxendenti wara l-mitożi, li twassal għall-formazzjoni ta' ċelloli binukleati (6) (66) (67). L-effett tas-sustanza kimika tat-test fuq il-kinetika tal-proliferazzjoni taċ-ċelloli jista' jitkejjel fl-istess ħin, jekk tintuża ċitoB. Iċ-ċitoB għandha tintuża bħala imblokkatur taċ-ċitokineżi meta l-linfoċiti tal-bniedem jintużaw minħabba li l-ħinijiet taċ-ċikli taċ-ċelloli jkunu varjabbli fost id-donaturi u minħabba li mhux il-linfoċiti kollha jirreaġixxu għall-istimolazzjoni tal-PHA. Iċ-ċitoB mhijiex obbligatorja għal tipi ta' ċelloli oħrajn jekk ikun stabbilit li għaddew minn diviżjoni kif deskritta fil-paragrafu 27. Barra minn hekk, ġeneralment iċ-ċitoB ma tintużax meta l-kampjuni jiġu evalwati għal mikronukleji bl-użu ta' metodi ċitometriċi tal-fluss.
                     Il-konċentrazzjoni xierqa taċ-ċitoB għandha tiġi stabbilita mil-laboratorju għal kull tip ta' ċellola sabiex tinkiseb il-frekwenza ottimali ta' ċelloli binukleati fil-kulturi tal-kontroll tas-solvent u għandu jintwera li din tipproduċi ammont tajjeb ta' ċelloli binukleati għall-għoti ta' punteġġ. Il-konċentrazzjoni xierqa ta' ċitoB normalment tkun bejn 3 u 6 μg/ml (19).
                     
                        Il-kejl tal-proliferazzjoni taċ-ċelloli u ċ-ċitotossiċità u l-għażla tal-konċentrazzjonijiet tat-trattament
                     
                     Meta wieħed jistabbilixxi l-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test, għandhom jiġu evitati konċentrazzjonijiet li għandhom il-kapaċità li jipproduċu rispons pożittiv artefattwali, bħal dawk li jipproduċu ċitotossiċità eċċessiva (ara l-paragrafu 29), il-preċipitazzjoni fil-medium tal-kultura (ara l-paragrafu 30), jew bidliet ċari fil-pH jew ożmolalità (ara l-paragrafu 9). Jekk is-sustanza kimika tat-test tikkaġuna bidla ċara fil-pH tal-medium fi żmien iż-żieda, il-pH tista' tiġi aġġustata bl-ibbaferjar tal-medium tat-trattament finali sabiex jiġu evitati riżultati pożittivi artifattwali u sabiex jinżammu l-kundizzjonijiet xierqa tal-kultura.
                     Il-kejliet tal-proliferazzjoni taċ-ċelloli jsiru sabiex ikun żgurat li biżżejjed ċelloli ttrattati jkunu laħqu l-fażi tal-mitożi waqt it-test u li t-trattamenti jsiru fil-livelli xierqa ta' ċitotossiċità (ara l-paragrafu 29). Iċ-ċitotossiċità għandha tiġi stabbilita fl-esperiment ewlieni b'attivazzjoni metabolika u mingħajr bl-użu ta' indikazzjoni xierqa ta' mewt u tkabbir taċ-ċelloli (ara l-paragrafi 26 u 27). Filwaqt li l-evalwazzjoni taċ-ċitotossiċità f'test preliminari inizjali tista' tkun siewja sabiex jiġu definiti aħjar il-konċentrazzjonijiet li sejrin jintużaw fl-esperiment ewlieni, test inizjali mhuwiex obbligatorju. Jekk isir, ma għandux isir minflok il-kejl taċ-ċitotossiċità fl-esperiment ewlieni.
                     It-trattament tal-kulturi b'ċitoB, u l-kejl tal-frekwenzi relattivi ta' ċelloli mononukleati, binukleati jew multinukleati fil-kultura, jipprovdi metodu eżatt tal-kwantifikazzjoni tal-effett fuq il-proliferazzjoni taċ-ċelloli u l-attività ċitotossika jew ċitostatika ta' trattament (6), u jiżgura li ċelloli li nqasmu waqt jew wara t-trattament biss jingħaddu bil-mikroskopju. L-indiċi tal-proliferazzjoni b'imblokkar taċ-ċitokineżi (CBPI) (6) (27) (68) jew l-Indiċi tar-Replikazzjoni (RI) minn tal-inqas 500 ċellola għal kull kultura (ara l-Appendiċi 2 għall-formuli) huma rakkomandati sabiex tiġi stmata l-attività ċitotossika u ċitostatika ta' trattament billi jitqabblu l-valuri fil-kulturi tat-trattament u tal-kontroll. Il-valutazzjoni ta' indikaturi oħrajn ta' ċitotossiċità (eż. l-integrità taċ-ċelloli, l-apoptożi, in-nekrożi, l-għadd tal-metafażi, iċ-ċiklu taċ-ċelloli) tista' tkun informazzjoni siewja, iżda ma għandhiex tintuża minflok is-CBPI jew l-RI.
                     Fi studji mingħajr ċitoB, hemm bżonn li jintwera li ċ-ċelloli fil-kultura nqasmu, sabiex sehem sostanzjali taċ-ċelloli magħdudin ikunu ġew diviżi matul jew wara t-trattament bis-sustanza kimika tat-test, inkella jistgħu jiġu prodotti risponsi foloz negattivi. Il-kejl tal-Irduppjar Relattiv tal-Popolazzjoni (RPD) jew iż-Żieda Relattiva fl-Għadd taċ-Ċelloli (RICC) huwa rakkomandat sabiex tiġi stmata l-attività ċitotossika u ċitostatika ta' trattament (17) (68) (69) (70) (71) (ara l-Appendiċi 2 għall-formuli). F'ħinijiet tal-kampjunar estiżi (eż. trattament għal darba u nofs jew id-doppju tat-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli u ġbir wara darba u nofs jew id-doppju tat-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli, li jwasslu għal ħinijiet tal-kampjunar itwal minn 3-4 darbiet it-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli b'kollox kif deskritt fil-paragrafi 38 u 39), l-RPD jista' jissottovaluta ċ-ċitotossiċità (71). F'dawn iċ-ċirkustanzi, l-RICC tista' tipprovdi kejl aħjar jew inkella l-evalwazzjoni taċ-ċitotossiċità wara darba u nofs sad-doppju tat-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli normali tkun stima siewja. Il-valutazzjoni ta' indikaturi oħrajn ta' ċitotossiċità jew ċitostażi (eż. l-integrità taċ-ċelloli, l-apoptożi, in-nekrożi, l-għadd tal-metafażi, l-Indiċi tal-proliferazzjoni (PI), iċ-ċiklu taċ-ċelloli, il-pontijiet nukleoplażmiċi jew l-għejun nukleari) tista' tkun informazzjoni addizzjonali siewja, iżda ma għandhiex tintuża minflok l-RPD jew l-RICC.
                     Għandhom jiġu evalwati tal-inqas tliet konċentrazzjonijiet tat-test (mhux inklużi l-kontroll tas-solvent u pożittivi) li jissodisfaw il-kriterji ta' aċċettabilità (iċ-ċitotossiċità xierqa, in-numru ta' ċelloli, eċċ.). Ikun xi jkun it-tip taċ-ċelloli (linji ta' ċelloli jew kulturi primarji ta' linfoċiti), jistgħu jintużaw kulturi rreplikati jew kulturi uniċi ttrattati f'kull konċentrazzjoni ttestjata. Filwaqt li l-użu ta' kulturi duplikati huwa rakkomandat, kulturi uniċi huma aċċettabbli wkoll diment li jingħata punteġġ lill-istess numru totali ta' ċelloli għal kulturi uniċi jew kulturi duplikati. L-użu ta' kulturi waħedhom huwa ta' rilevanza partikolari meta jiġu vvalutati iktar minn 3 konċentrazzjonijiet (ara l-paragrafi 44-45). Ir-riżultati miksubin fil-kulturi rreplikati indipendenti f'konċentrazzjoni partikolari jistgħu jinġabru flimkien għall-analiżi tad-dejta. Għal sustanzi kimiċi tat-test li juru tossiċità baxxa jew ebda tossiċità, intervalli tal-konċentrazzjoni ta' madwar id-doppju jew it-tripplu normalment ikunu xierqa. Meta sseħħ ċitotossiċità, il-konċentrazzjonijiet tat-test magħżulin għandhom ikopru firxa minn dik iċ-ċitotossiċità produttiva kif spjegat fil-paragrafu 29 u jinkludu konċentrazzjonijiet li fihom ikun hemm ċitotossiċità moderata u baxxa jew ebda ċitotossiċità. Ħafna sustanzi kimiċi tat-test juru kurvi konċentrazzjoni rispons wiqfin u, sabiex tinkiseb dejta f'ċitotossiċità baxxa u moderata jew sabiex tiġi studjata r-relazzjoni bejn id-doża u r-rispons f'dettall, sejjer ikun hemm bżonn li jintużaw konċentrazzjoni spazjati iktar qrib xulxin u/jew iktar minn tliet konċentrazzjonijiet (kulturi waħedhom jew repliki), speċjalment f'sitwazzjonijiet li fihom ikun hemm bżonn li jsir esperiment ripetut (ara l-paragrafu 60).
                     Jekk il-konċentrazzjoni massima tkun ibbażata fuq iċ-ċitotossiċità, l-ogħla konċentrazzjoni għandu jkollha l-għan li tikseb ċitotossiċità ta' 55 ± 5 % bl-użu tal-parametri rakkomandati dwar iċ-ċitotossiċità (jiġifieri tnaqqis fl-RICC u l-RPD għal linji ta' ċelloli meta ma tintużax ċitoB, u tnaqqis fis-CBPI jew l-RI meta tintuża ċitoB għal 45± 5 % tal-kontroll negattiv parallel) (72). Wieħed għandu joqgħod attent meta jinterpreta riżultati pożittivi li mbagħad jistgħu jinstabu li huma fil-parti superjuri ta' din il-firxa ta' ċitotossiċità ta' 55 ± 5 % (71).
                     Għal sustanzi kimiċi tat-test ftit li xejn solubbli li mhumiex ċitotossiċi f'konċentrazzjonijiet inqas mill-inqas konċentrazzjoni insolubbli, l-ogħla konċentrazzjoni analizzata għandha tipproduċi turbidità jew preċipitat viżibbli bl-għajnejn jew bl-għajnuna ta' mikroskopju invertit fi tmiem it-test bis-sustanza kimika tat-test. Anki jekk iċ-ċitotossiċità sseħħ f'livelli inqas mill-inqas konċentrazzjoni insolubbli, huwa rakkomandat li l-ittestjar isir f'konċentrazzjoni waħda biss li tinduċi turbidità jew bi preċipitat viżibbli għaliex jistgħu jirriżultaw effetti artifattwali mill-preċipitat. Fil-konċentrazzjoni li tipproduċi preċipitat, għandha tingħata attenzjoni sabiex jiġi żgurat li l-preċipitat ma jxekkilx it-twettiq tat-test (eż. tilwin jew punteġġar). Id-determinazzjoni tas-solubilità fil-medium tal-kultura qabel l-esperiment tista' tkun utli.
                     Jekk ma jiġu osservati ebda preċipitat jew ċitotossiċità li tillimita, l-ogħla konċentrazzjoni tat-test għandha tkun tikkorrispondi għal 10 mM, 2 mg/ml jew 2 μl/ml, liema minnhom tkun l-inqas (73) (74) (75). Meta s-sustanza kimika tat-test ma jkollhiex kompożizzjoni definita, eż. sustanza b'kompożizzjoni mhux magħrufa jew varjabbli, il-prodotti ta' reazzjoni kumplessa jew il-materjal bijoloġiku (UVCB) (76), estratt ambjentali eċċ, il-konċentrazzjoni massima jaf trid tkun ogħla (eż. 5 mg/ml), fin-nuqqas ta' ċitotossiċità suffiċjenti, sabiex tiżdied il-konċentrazzjoni ta' kull wieħed mill-komponenti. Madankollu, ta' min jinnota li dawn ir-rekwiżiti jistgħu jvarjaw għall-prodotti farmaċewtiċi għall-bniedem (93).
                     
                        Kontrolli
                     
                     Għal kull ħin tal-ġbir għandhom ikunu inklużi kontrolli negattivi paralleli (ara l-paragrafu 21), li jikkonsistu f'solvent waħdu fil-medium tat-trattament u pproċessat bl-istess mod bħall-kulturi tat-trattament.
                     Kontrolli pożittivi paralleli huma meħtieġa sabiex juru l-ħila tal-laboratorju fl-identifikazzjoni ta' klastoġeni u anewġeni fil-kundizzjonijiet tal-protokoll tat-test użat u l-effikaċja tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika eżoġena (meta applikabbli). Fit-tabella 1 ta' hawn taħt jingħataw xi eżempji ta' kontrolli pożittivi. Jistgħu jintużaw sustanzi kimiċi ta' kontroll pożittiv oħrajn, jekk ikunu ġġustifikati.
                     Fil-preżent, l-ebda anewġen ma huwa magħruf li jeħtieġ attivazzjoni metabolika għall-attività ġenotossika tiegħu (17). Peress li t-testijiet in vitro taċ-ċelloli tal-mammiferi huma standardizzati biżżejjed għal trattamenti fuq terminu qasir li jsiru b'mod parallel ma' u mingħajr attivazzjoni metabolika bl-użu tal-istess durata tat-trattament, l-użu tal-kontrolli pożittivi jista' jkun limitat għal klastoġenu li jeħtieġ attivazzjoni metabolika. F'dan il-każ, rispons tal-kontroll pożittiv klastoġeniku wieħed sejjer juri kemm l-attività tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika u kemm hija risponsiva s-sistema tat-test. Madankollu, trattament fit-tul (mingħajr S9) għandu jkollu l-kontroll pożittiv tiegħu stess peress li d-durata tat-trattament sejra tvarja mit-test bl-użu tal-attivazzjoni metabolika. Jekk jingħażel klastoġenu bħala l-uniku kontroll pożittiv għal trattament fuq terminu qasir b'attivazzjoni metabolika u mingħajr, għandu jingħażel anewġen għat-trattament fit-tul mingħajr attivazzjoni metabolika. F'ċelloli metabolikament kompetenti li ma jeħtiġux S9, għandhom jintużaw kontrolli pożittivi kemm għall-klastoġeniċità kif ukoll għall-anewġeniċità.
                     Kull kontroll pożittiv għandu jintuża f'konċentrazzjoni waħda jew iktar mistennija li toffri żidiet riproduċibbli u identifikabbli fuq l-isfond sabiex tintwera s-sensittività tas-sistema tat-test (jiġifieri l-effetti huma ċari iżda ma jikxfux minnufih l-identità tal-lametti kodifikati lill-qarrej), u r-rispons ma għandux ikun f'riskju minħabba ċitotossiċità li taqbeż il-limiti speċifikati f'dan il-metodu ta' ttestjar.
                     
                        Tabella 1
                     
                     
                        Sustanzi kimiċi ta' referenza rakkomandati għall-valutazzjoni tal-profiċjenza tal-laboratorju u għall-għażla tal-kontrolli pożittivi
                     
                     
                                 Kategorija
                              
                              
                                 Sustanza Kimika
                              
                              
                                 CASRN
                              
                           
                                 1.   Klastoġeni attivi mingħajr attivazzjoni metabolika
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Metansulfonat tal-metil
                              
                              
                                 66-27-3
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Mitomiċina C
                              
                              
                                 50-07-7
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 4-Nitrokinolina-N-Ossida
                              
                              
                                 56-57-5
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Ċitożina arabinosida
                              
                              
                                 147-94-4
                              
                           
                                 2.   Klastoġeni li jeħtieġu attivazzjoni metabolika
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Benżo(a)piren
                              
                              
                                 50-32-8
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Ċiklofosfammid
                              
                              
                                 50-18-0
                              
                           
                                 3.   Anewġeni
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Kolċisina
                              
                              
                                 64-86-8
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Vinblastina
                              
                              
                                 143-67-9
                              
                           PROĊEDURA
                     
                        Skeda tat-trattament
                     
                     Sabiex tkun massimizzata l-probabbiltà tal-identifikazzjoni ta' anewġenu jew klastoġenu li jaġixxu fi stadju speċifiku fiċ-ċiklu taċ-ċelloli, huwa importanti li għadd suffiċjenti ta' ċelloli li jirrappreżenta d-diversi stadji kollha taċ-ċikli taċ-ċelloli tagħhm jiġu ttrattati bis-sustanza kimika tat-test. It-trattamenti kollha għandhom jibdew u jintemmu meta ċ-ċelloli jkunu qegħdin jikbru b'mod esponenzjali u ċ-ċelloli għandhom ikomplu jikbru sal-ħin tal-kampjunar. Għalhekk, l-iskeda tat-trattament għal-linji ta' ċelloli u l-kulturi ta' ċelloli primarji tista' tvarja mhux ftit minn dik tal-linfoċiti li jeħtieġu li l-istimolazzjoni mitoġenika tibda ċ-ċiklu taċ-ċelloli tagħhom (17). Għal-linfoċiti, l-iktar approċċ effiċjenti huwa li t-trattament jinbeda bis-sustanza kimika tat-test 44-48 siegħa wara l-istimolazzjoni tal-PHA, meta ċ-ċelloli jkunu qegħdin jinqsmu b'mod asinkroniku (6).
                     Id-dejta ppubblikata (19) tindika li ħafna mill-anewġeni u l-klastoġeni sejrin jinqabdu sa perjodu ta' trattament ta' 3 sa 6 sigħat fil-preżenza u n-nuqqas ta' S9, segwita mit-tneħħija tas-sustanza kimika tat-test u l-kampjunar f'ħin ekwivalenti għal madwar darba u nofs sad-doppju tat-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli wara l-bidu tat-trattament (7).
                     Madankollu, għal evalwazzjoni dettaljata, li tkun meħtieġa sabiex jiġi konkluż eżitu negattiv, għandhom isiru t-tliet kundizzjonijiet sperimentali kollha kemm huma li ġejjin bl-użu ta' trattament fuq terminu qasir b'attivazzjoni metabolika u mingħajrha u trattament fit-tul mingħajr attivazzjoni metabolika (ara l-paragrafi 56, 57 u 58):
                     
                                 —
                              
                              
                                 Iċ-ċelloli għandhom ikunu esposti għas-sustanza kimika tat-test mingħajr attivazzjoni metabolika għal 3-6 sigħat, u jiġu kampjunati f'ħin ekwivalenti għal madwar kull darba u nofs sad-doppju tat-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli mindu jinbeda t-trattament (19),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Iċ-ċelloli għandhom ikunu esposti għas-sustanza kimika tat-test mingħajr attivazzjoni metabolika għal 3-6 sigħat, u jiġu kampjunati f'ħin ekwivalenti għal madwar kull darba u nofs sad-doppju tat-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli mindu jinbeda t-trattament (19),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Iċ-ċelloli għandhom ikunu esposti bla heda għas-sustanza kimika tat-test mingħajr attivazzjoni metabolika sal-kampjunar f'ħin għal madwar kull darba u nofs sad-doppju tat-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli.
                              
                           F'każ li xi waħda mill-kundizzjonijiet sperimentali ta' hawn fuq twassa għal rispons pożittiv, jaf ma jkunx hemm bżonn li jiġi investigat xi wieħed mir-reġimi tat-trattament l-oħrajn.
                     Jekk ikun magħruf jew issuspettat li s-sustanza kimika tat-test taffettwa l-ħin taċ-ċikli taċ-ċelloli (eż meta jiġu ttestjati analogi nukleosidiċi), speċjalment għal ċelloli kompetenti p53 (35) (36) (77), il-ħinijiet tal-kampjunar jew tal-irkupru jistgħu jiġu estiżi sa darba u nofs sad-doppju tat-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli (jiġifieri total ta' 3 sa 4 darbiet it-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli mindu jibdew it-trattamenti fuq terminu qasir u fit-tul). Dawn l-għażliet jindirizzaw is-sitwazzjonijiet li jista' jkun hemm tħassib dwarhom fir-rigward tal-interazzjonijiet possibbli bejn is-sustanza kimika tat-test u ċ-ċitoB. Meta jintużaw ħinijiet tal-kampjunar estiżi (jiġifieri total ta' 3 sa 4 darbiet iż-żmien tal-kultura tat-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli), wieħed għandu joqgħod attent li jiżgura li ċ-ċelloli jkunu għadhom qegħdin jinqasmu b'mod attiv. Pereżempju, għal linfoċiti, it-tkabbir esponenzjali jista' jibda jonqos wara 96 siegħa wara l-istimolazzjoni u kulturi monosaffi taċ-ċelloli jistgħu jsiru konfluwenti.
                     L-iskedi ssuġġeriti għat-trattament taċ-ċelloli huma miġburin fit-Tabella 2. Dawn l-iskedi ta' trattament ġenerali jistgħu jiġu mmodifikati (u għandhom ikunu ġġustifikati) skont l-istabilità jew ir-reattività tas-sustanza kimika tat-test jew il-karatteristiċi ta' tkabbir partikolari taċ-ċelloli li jkunu qegħdin jintużaw.
                     
                        Tabella 2.
                     
                     
                        It-trattament taċ-ċelloli u l-perjodi tal-ġbir għat-test MNvit
                     
                     
                                 Linfoċiti, ċelloli primarji u linji ta' ċelloli ttrattati biċ-ċitoB
                              
                              
                                 + S9
                                 Trattament qasir
                              
                              
                                 Trattament għal 3-6 sigħat fil-preżenza ta' S9;
                                 tneħħija tal-S9 u l-medium tat-trattament;
                                 żieda ta' medium ġdid u ċitoB;
                                 ġbir wara darba u nofs sad-doppju tat-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli mindu jibda t-trattament.
                              
                           
                                 – S9
                                 Trattament qasir
                              
                              
                                 Trattament għal 3-6 sigħat;
                                 tneħħija tal-medium tat-trattament;
                                 żieda ta' medium ġdid u ċitoB;
                                 ġbir wara darba u nofs sad-doppju tat-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli mindu jibda t-trattament.
                              
                           
                                 – S9
                                 Trattament estiż
                              
                              
                                 Trattament għal darba u nofs sad-doppju tat-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli fil-preżenza taċ-ċitoB;
                                 ġbir fi tmiem il-perjodu tat-trattament.
                              
                           
                                 Linji ta' ċelloli ttrattati mingħajr ċitoB
                                 (L-istess bħall-iskedi tat-trattament spjegati hawn fuq, bl-eċċezzjoni li ma tiżdied ebda ċitoB)
                              
                           Għal kulturi monosaffi, iċ-ċelloli mitotiċi (identifikabbli għaliex huma tondi u maqlugħin mill-wiċċ) jistgħu jkunu preżenti fl-aħħar tat-trattament ta' bejn 3 u 6 sigħat. Minħabba li dawn iċ-ċelloli mitotiċi jistgħu jinqalgħu faċilment, jistgħu jintilfu meta jitneħħa l-medium li jkun fih is-sustanza kimika tat-test. Jekk hemm evidenza ta' żieda sostanzjali fin-numru ta' ċelloli mitotiċi meta mqabbla mal-kontrolli, xi ħaġa li tindika inibizzjoni mitotika, iċ-ċelloli għandhom jinġabru b'ċentrifugazzjoni u jiżdiedu lura mal-kulturi, sabiex jiġi evitat milli jintilfu ċelloli li huma f'mitożi, u f'riskju ta' aberrazzjoni kromożomika, f'ħin il-ġbir.
                     
                        Il-ġbir taċ-ċelloli u l-preparazzjoni tal-lametti
                     
                     Kull kultura għandha tinġabar u tiġi pproċessata separatament. Il-preparazzjoni taċ-ċelloli tista' tinvolvi trattament ipotoniku, iżda dan il-pass mhuwiex neċessarju jekk jinkiseb tifrix adegwat taċ-ċelloli b'mod ieħor. Jistgħu jintużaw tekniki differenti fil-preparazzjoni tal-lametti sakemm jinkisbu preparazzjonijiet taċ-ċelloli ta' kwalità għolja għall-għoti tal-punti. Iċ-ċelloli b'membrana taċ-ċelloli intatti u ċitoplażma intatta għandhom jinżammu sabiex ikunu jistgħu jiġu individwati l-mikronukleji u (fil-metodu ta' mblokkar taċ-ċitokineżi) identifikazzjoni affidabbli ta' ċelloli binukleati.
                     Il-lametti jistgħu jingħataw il-kulur bl-użu ta' metodi varji, bħal Giemsa jew żebgħat speċifiċi fluworexxenti tad-DNA. L-użu ta' żebgħa fluworexxenti xierqa (eż. oranġjo tal-akridina (78) jew Hoechst 33258 plus pyronin-Y (79)) jista' jelimina xi wħud mill-artifatti assoċjati mal-użu ta' tilwin mhux speċifiku għad-DNA. Antikorpi antikinetoċori, FISH b'sondi tad-DNA panċentromeriċi jew tikkettar in situ mogħti primer bi primers speċifiċi għall-panċetromeri, flimkien mal-kontrotilwin xieraq tad-DNA, sabiex jiġi identifikat il-kontenut (kromożomi sħaħ sejrin jiġu mlewnin filwaqt li frammenti tal-kromożomi aċentriċi le) ta' mikronukleji jekk l-informazzjoni mekkanistika dwar il-formazzjoni tagħhom tkun ta' interess (16) (17). Jistgħu jintużaw metodi oħrajn għal divrenzjar bejn il-klastoġeni u l-anewġeni jekk ikun intwera li dawn huma effettivi u vvalidati. Pereżempju, għal ċerti linji ta' ċelloli, il-kejliet ta' nukleji sub-2N bħala avvenimenti ipodiplojdi bl-użu ta' tekniki bħall-analiżi tal-immaġnijiet, iċ-ċitometrija ta' skennjar bil-laser jew ċitometrija tal-fluss jistgħu jipprovdu informazzjoni siewja wkoll (80) (81) (82). L-osservazzjonijiet morfoloġiċi tan-nukleji jistgħu jagħtu indikazzjonijiet ta' anewplojdija possibbli wkoll. Barra minn hekk, test għal aberrazzjonijiet kromożomiċi fil-metafażi, idealment fl-istess tip ta' ċellola u protokoll b'sensittività komparabbli, jista' jkun siewi wkoll sabiex jiġi stabbilit jekk il-mikronukleji humiex dovuti għal tkissir tal-kromożomi (filwaqt li jkun magħruf li telf ta' kromożomi ma jkunx identifikat fit-test tal-aberrazzjonijiet kromożomiċi).
                     
                        Analiżi
                     
                     Il-lametti kollha, inklużi dawk tas-solvent u l-kontrolli mhux ittrattati (jekk użati) u pożittivi, għandhom ikunu kodifikati b'mod indipendenti qabel l-analiżi bil-mikroskopju ta' frekwenzi tal-mikronukleji. Għandhom jintużaw tekniki xierqa sabiex jiġi kkontrollat kwalunkwe preġudizzju jew deriva meta tintuża sistema tal-punteġġ awtomatizzata, pereżempju, ċitometrija tal-fluss, ċitometrija ta' skennjar bil-laser jew analiżi tal-immaġnijiet. Indipendentement mill-pjattaforma awtomatizzata li tintuża sabiex jiġu nnumerati l-mikronukleji, is-CBPI, l-RI, l-RPD jew l-RICC għandhom jiġu vvalutati b'mod parallel.
                     F'kulturi ttrattati biċ-ċitoB, il-frekwenzi tal-mikronukleji għandhom jiġu analizzati f'tal-inqas 2 000 ċellola binukleata għal kull konċentrazzjoni u kontroll (83), maqsumin indaqs bejn ir-repliki, jekk jintużaw repliki. Fil-każ ta' kulturi waħedhom għal kull doża (ara l-paragrafu 28), għandhom jingħaddu tal-inqas 2 000 ċellola binukleata għal kull kultura (83) f'din il-kultura waħedha. Jekk għall-għoti tal-punti f'kull konċentrazzjoni jkunu disponibbli sostanzjalment inqas minn 1 000 ċellola binukleata għal kull kultura (għal kulturi duplikati), jew 2 000 (għal kultura singola), u jekk ma tiġi osservata ebda żieda sinifikanti fil-mikronukleji, it-test għandu jiġi ripetut bl-użu ta' aktar ċelloli, jew f'konċentrazzjonijiet inqas ċitotossiċi, skont xi jkun l-aktar xieraq. Wieħed għandu joqgħod attent li ma jgħoddx ċelloli binukleati b'forom irregolari jew meta ż-żewġ nukleji jkunu jvarjaw ħafna fid-daqs. Barra minn hekk, iċ-ċelloli binukleati ma għandhomx jitħalltu ma' ċelloli multinukelati li ma nfirxux wisq. Ċelloli li fihom iktar minn żewġ nukleji ewlenin ma għandhomx jiġu analizzati għal mikronukleji, peress li l-frekwenza tal-mikronukleu bażi tista' tkun ogħla f'dawn iċ-ċelloli (84). L-għadd ta' ċelloli mikronukleati huwa aċċettabbli jekk jintwera li s-sustanza kimika tat-test tinterferixxi mal-attività ta' ċitoB. Test ripetut mingħajr ĊitoB jista' jkun siewi f'dawn il-każijiet. L-għadd ta' ċelloli mononukleati minbarra ċ-ċelloli binukleati jista' jipprovdi informazzjoni siewja (85) (86), iżda mhuwiex obbligatorju.
                     F'linji ta' ċelloli ttestjati mingħajr trattament b'ċitoB, il-mikronukleji għandhom jingħaddu f'tal-inqas 2 000 ċellola għal kull konċentrazzjoni tat-test u kontroll (83), maqsumin indaqs bejn ir-repliki, jekk jintużaw repliki. Meta jintużaw kulturi waħedhom għal kull konċentrazzjoni (ara l-paragrafu 28), għandhom jingħaddu tal-inqas 2 000 ċellola għal kull kultura f'din il-kultura waħedha. Jekk għall-għoti tal-punti f'kull konċentrazzjoni jkunu disponibbli sostanzjalment inqas minn 1 000 ċellola għal kull kultura (għal kulturi duplikati), jew 2 000 (għal kultura singola), u jekk ma tiġi osservata ebda żieda sinifikanti fil-mikronukleji, it-test għandu jiġi ripetut bl-użu ta' aktar ċelloli, jew f'konċentrazzjonijiet inqas ċitotossiċi, skont xi jkun l-aktar xieraq.
                     Meta tintuża ċ-ċitoB, għandhom jiġu stabbiliti CBPI jew RI sabiex tiġi vvalutata l-proliferazzjoni taċ-ċelloli (ara l-Appendiċi 2) bl-użu ta' mill-inqas 500 ċellola għal kull kultura. Meta t-trattamenti jitwettqu fin-nuqqas ta' ċitoB, huwa essenzjali li tiġi pprovduta evidenza li ċ-ċelloli fil-kultura nqasmu, kif diskuss fil-paragrafi 24-28.
                     
                        Il-profiċjenza tal-laboratorju
                     
                     Sabiex tiġi stabbilita biżżejjed esperjenza bl-assaġġ qabel ma jintuża għall-ittestjar ta' rutina, il-laboratorju għandu jkun għamel sensiela ta' esperimenti b'sustanzi kimiċi pożittivi ta' referenza li jaġixxu permezz ta' mekkaniżmi differenti (tal-inqas waħda b'attivazzjoni metabolika u waħda mingħajr, u waħda li taġixxi permezz ta' mekkaniżmu anewġeniku, u magħżula mis-sustanzi kimiċi elenkati fit-Tabella 1) u bosta kontrolli negattivi (inklużi kulturi mhux ittrattati u bosta solventi/veikoli). Dawn ir-risponsi tal-kontroll pożittiv u negattiv reazzjonijiet għandhom ikunu konsistenti mat-tagħrif. Dan mhuwiex applikabbli għal laboratorju li għandhom esperjenza, jiġifieri li għandhom database storika disponibbli kif definita fil-paragrafi 49 sa 52.
                     Għandha tiġi investigata firxa ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv (ara t-Tabella 1) bi trattamenti qosra u twal fin-nuqqas ta' attivazzjoni metabolika, u anki bi trattament qasir fil-preżenza ta' attivazzjoni metabolika, sabiex tintwera l-ħila li jinqabdu sustanzi kimiċi klastoġeniċi u anewġeniċi u tiġi stabbilita l-effikaċja tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika u jintwera li l-proċeduri tal-għadd huma xierqa (l-analiżi viżwali bil-mikroskopju, iċ-ċitometrija tal-fluss, iċ-ċitometrija ta' skennjar bil-laser jew l-analiżi tal-immaġnijiet). Għandha tingħażel medda ta' konċentrazzjonijiet tas-sustanzi kimiċi magħżulin sabiex jingħataw żidiet riproduċibbli u marbutin mal-konċentrazzjoni fuq l-isfond sabiex jintwerew is-sensittività u l-firxa dinamika tas-sistema tat-test.
                     
                        Dejta storika tal-kontroll
                     
                     Il-laboratorju għandu jistabbilixxi:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Medda u distribuzzjoni storiċi tal-kontroll pożittiv,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Medda u distribuzzjoni storiċi tal-kontroll negattiv (mhux ittrattat, solvent).
                              
                           Meta għall-ewwel tinkiseb id-dejta għal distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu konsistenti mad-dejta tal-kontroll negattiv ippubblikata, meta tkun teżisti. Peress li tiżdied iktar dejta sperimentali mad-distribuzzjoni tal-kontroll, idealment il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % ta' dik id-distribuzzjoni (87) (88). Id-database storika tal-kontrolli negattivi tal-laboratorju għall-ewwel għandha tinbena b'minimu ta' 10 esperimenti iżda idealment tkun tikkonsisti f'tal-inqas 20 esperiment imwettqin f'kundizzjonijiet sperimentali paragunabbli. Il-laboratorji għandhom jużaw metodi ta' kontroll tal-kwalità, bħal karti tal-kontroll (eż. C-charts jew X-bar charts (88)), sabiex jidentifikaw kemm hija varjabbli d-dejta tal-kontroll pożittiv u negattiv tagħhom, u sabiex juru li l-metodoloġija hija “taħt kontroll” fil-laboratorju tagħhom (83). Rakkomandazzjonijiet ulterjuri dwar kif jibnu u jużaw id-dejta storika (jiġifieri kriterji għall-inklużjoni u l-esklużjoni ta' dejta fid-dejta storika u l-kriterji ta' aċċettabilità għal esperiment partikolari) jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (87).
                     Kwalunkwe bidla fil-protokoll tal-esperimenti għandha tiġi kkunsidrata fid-dawl tal-konsistenza tad-dejta mad-databases tal-kontroll storiċi eżistenti tal-laboratorju. Kwalunkwe inkonsistenza kbira għandha tirriżulta fl-istabbiliment ta' database storika ġdida tal-kontroll.
                     Id-dejta tal-kontroll negattiv għandha tikkonsisti fl-inċidenza taċ-ċelloli mikronukleati minn kultura waħedha jew is-somma tal-kulturi ta' replika kif deskritti fil-paragrafu 28. Idealment, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % tad-distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju (87) (88). Meta d-dejta tal-kontroll negattiv parallel toħroġ mil-limiti ta' kontroll ta' 95 %, din tista' titqies aċċettabbli li tiddaħħal fid-distribuzzjoni storika tal-kontroll diment li din id-dejta ma tkunx eċċezzjoni estrema u jkun hemm evidenza li s-sistema tat-test tkun “taħt kontroll” (ara l-paragrafu 50) u hemm evidenza ta' nuqqas ta' żball tekniku jew uman.
                     DEJTA U RAPPORTAR
                     
                        Preżentazzjoni tar-riżultati
                     
                     Jekk tintuża t-teknika ta' mblokkar taċ-ċitokineżi, huma biss il-frekwenzi taċ-ċelloli binukleati b'mikronukleji (indipendenti mill-għadd ta' mikronukleji għal kull ċellola) li għandhom jintużaw fl-evalwazzjoni tal-induzzjoni tal-mikronukleji. L-għadd tan-numri ta' ċelloli b'mikronukleu wieħed, tnejn jew iktar jista' jiġi rrapportat għalih u jista' jipprovdi informazzjoni siewja, iżda mhuwiex obbligatorju.
                     Għandhom jiġu stabbiliti miżuri simultanji ta' ċitotossiċità u/jew ċitostażi għall-kulturi ttrattati, tal-kontroll pożittiv u negattiv kollha (16). Is-CBPI jew l-RI għandhom jiġu kkalkolati għall-kulturi kollha ttrattati u ta' kontroll bħala kejl tad-dewmien taċ-ċiklu taċ-ċelloli meta jintuża l-metodu ta' mblokkar taċ-ċitokineżi. Fin-nuqqas ta' ċitoB, għandhom jintużaw l-RPD jew l-RICC (ara l-Appendiċi 2).
                     Għandha tiġi pprovduta dejta dwar il-kultura individwali. Barra minn hekk, id-dejta kollha għandha tinġabar taħt forma ta' tabella.
                     
                        Kriterji ta' Aċċettabilità
                     
                     L-aċċettazzjoni ta' test hija bbażata fuq il-kriterji li ġejjin:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Il-kontroll negattiv parallel jitqies aċċettabbli għaż-żieda fid-database storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju kif deskritt fil-paragrafu 50.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-kontrolli negattivi paralleli (ara l-paragrafu 50) għandhom jinduċu risponsi li huma kompatibbli ma' dawk iġġenerati fid-database storika tal-kontroll pożittiv tal-laboratorju u jipproduċu żieda statistikament sinifikanti meta mqabblin mal-kontroll negattiv parallel.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-kriterji ta' proliferazzjoni taċ-ċelloli fil-kontroll tas-solventi għandhom ikunu ssodisfati (paragrafi 25-27).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-kundizzjonijiet sperimentali kollha ġew ittestjati sakemm wieħed ma rriżultax f'riżultati pożittivi (il-paragrafi 36-40).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Hemm numru adegwat ta' ċelloli u konċentrazzjonijiet li huma analizzabbli (paragrafi 28 u -46).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-kriterji għall-għażla tal-ogħla konċentrazzjoni huma konsistenti ma' dawk deskritti fil-paragrafi 24-31.
                              
                           
                        Evalwazzjoni u interpretazzjoni tar-riżultati
                     
                     Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva biċ-ċar jekk, fi kwalunkwe waħda mill-kundizzjonijiet sperimentali analizzati (ara l-paragrafi 36-39):
                     
                                 —
                              
                              
                                 tal-inqas waħda mill-konċentrazzjonijiet tat-test turi żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv parallel (89)
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 żieda hija marbuta mad-doża f'tal-inqas kundizzjoni sperimentali waħda meta tiġi evalwata b'test xieraq tat-tendenzi (ara l-paragrafu 28)
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kwalunkwe wieħed mir-riżultati jaqa' barra mid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson; ara l-paragrafu 52).
                              
                           Meta jiġu ssodisfati dawn il-kriterji kollha, is-sustanza kimika tat-test imbagħad tiġi kkunsidrata kapaċi tinduċi tkissir tal-kromożomi u/jew gwadann jew telf f'din is-sistema tat-test. Ir-rakkomandazzjonijiet għall-iktar metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu wkoll mit-tagħrif (90) (91) (92).
                     Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija negattiva biċ-ċar jekk, fil-kundizzjonijiet sperimentali analizzati kollha (ara l-paragrafi 36-39):
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-ebda waħda mill-konċentrazzjonijiet tat-test ma turi żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv parallel,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ma hemm l-ebda żieda marbuta mal-konċentrazzjoni meta tiġi evalwata b'test xieraq tat-tendenzi,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ir-riżultati kollha jaqgħu fid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson; ara l-paragrafu 52).
                              
                           Is-sustanza kimika tat-test imbagħad tiġi kkunsidrata li mhijiex kapaċi tinduċi tkissir tal-kromożomi u/jew gwadann jew telf f'din is-sistema tat-test. Ir-rakkomandazzjonijiet għall-iktar metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu wkoll mit-tagħrif (90) (91) (92).
                     Ma hemm l-ebda ħtieġa għall-verifika ta' rispons posittiv jew negattiv ċar.
                     F'każ li r-rispons la jkun negattiv ċar u lanqas pożittiv ċar kif spjegat hawn fuq u/jew sabiex tgħin fl-istabbiliment tar-rilevanza bijoloġika ta' riżultat, id-dejta għandha tiġi evalwata b'ġudizzju espert u/jew b'investigazzjonijiet ulterjuri. L-ikklassifikar ta' ċelloli addizzjonali (fejn xieraq) jew it-twettiq ta' esperiment ripetut possibilment bl-użu ta' kundizzjonijiet modifikati tal-esperiment (eż. spazjar tal-konċentrazzjonijiet, kundizzjonijiet ta' attivazzjoni metabolika oħrajn [jiġifieri konċentrazzjoni S9 jew oriġini S9]) jista' jkun siewi.
                     F'każijiet rari, anki wara investigazzjonijiet ulterjuri, is-sett ta' dejta mhuwiex sejjer jippermetti li tinħareġ konklużjoni pożittiva jew negattiva u, għalhekk, sejjer jiġi konkluż bħala ekwivoku.
                     Sustanzi kimiċi tat-test li jinduċu mikronukleji fit-test MNvit jistgħu jagħmlu dan minħabba li jinduċu ksur tal-kromożomi, telf tal-kromożomi jew taħlita tat-tnejn. Jistgħu jintużaw analiżi ulterjuri li tuża antikorpi antikinetoċoru, sondi in situ speċifiċi għaċ-ċentromeri, jew metodi oħrajn sabiex jiġi stabbilit jekk il-mekkaniżmu ta' induzzjoni tal-mikronukleji huwiex dovut għal attività klastoġenika u/jew anewġenika.
                     
                        Rapport tat-test
                     
                     Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanza kimika tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             is-sors, in-numru tal-lott, id-data ta' limitu għall-użu, jekk disponibbli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test stess, jekk magħrufa;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ir-reattività tas-sustanzi kimiċi tat-test mas-solvent/mezz jew il-media tal-kultura taċ-ċelloli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             is-solubilità u l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent, jekk magħrufin;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kejl tal-pH, l-ożmolalità u l-preċipitat fil-medium tal-kultura li miegħu żdiedet is-sustanza kimika tat-test, kif xieraq.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanza monokostitwenti:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             id-dehra fiżika, is-solubilità fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanzi multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             ikkaratterizzati safejn possibbli mill-identità kimika (ara iktar 'il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Solventi:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-perċentwal ta' solvent fil-medium tal-kultura finali
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ċelloli:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             it-tip u s-sors taċ-ċelloli użati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             l-adattabilità tat-tip ta' ċelloli użati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             in-nuqqas ta' mikoplażma, fil-każ ta' linji ta' ċelloli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             għal-linji ta' ċelloli, informazzjoni dwar it-tul taċ-ċiklu taċ-ċellola jew l-indiċi tal-proliferazzjoni;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             meta jintużaw linfoċiti, is-sess tad-donaturi tad-demm, l-età u kwalunkwe informazzjoni rilevanti dwar id-donatur, id-demm sħiħ jew il-linfoċiti separati, il-mitoġenu użat;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             iż-żmien normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli (kontroll negattiv);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             in-numru ta' passaġġi, jekk disponibbli, għal-linji ta' ċelloli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodi għall-manutenzjoni tal-kulturi taċ-ċelloli, għal-linji ta' ċelloli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             in-numru modali ta' kromożomi, għal-linji ta' ċelloli.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kundizzjonijiet tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             l-identità tas-sustanza li timblokka ċ-ċitokineżi (eż. ċitoB), jekk tintuża, u l-konċentrazzjoni tagħha, flimkien mad-durata tal-esponiment taċ-ċelloli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test espressa bħala konċentrazzjoni finali fil-medium tal-kultura (eż. μg jew mg/mL jew mM tal-medium tal-kultura);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ir-raġuni għall-għażla tal-konċentrazzjonijiet u l-għadd ta' kulturi, inkluża dejta dwar iċ-ċitotossiċità u l-limitazzjonijiet tas-solubilità;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kompożizzjoni tal-media, il-konċentrazzjoni tas-CO2 jekk applikabbli, il-livell ta' umdità;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-konċentrazzjoni (u/jew il-volum) tas-solvent u s-sustanza kimika tat-test miżjuda fil-medium tal-kultura;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             it-temperatura u l-ħin tal-inkubazzjoni;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-durata tat-trattament;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-ħin tal-ġbir wara t-trattament;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-densità taċ-ċelloli waqt l-injettar, jekk applikabbli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             it-tip u l-kompożizzjoni tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika (is-sors ta' S9, il-metodu ta' preparazzjoni tat-taħlita ta' S9, il-konċentrazzjoni jew il-volum ta' taħlita ta' S9 u l-S9 fil-medium tal-kultura finali, il-kontrolli tal-kwalità tal-S9 (eż. l-attività enzimatika, l-isterilità, il-kapaċità metabolika);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             is-sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv u negattiv, il-konċentrazzjonijiet finali, il-kundizzjonijiet u d-durati tat-trattament u l-perjodi ta' rkupru;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodi tal-preparazzjoni tal-lametti u t-teknika użata għat-tilwin;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kriterji għall-għadd taċ-ċelloli mikronukelati (għażla taċ-ċelloli analizzabbli u l-identifikazzjoni tal-mikronukleu);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             l-għadd ta' ċelloli analizzati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodi għall-kejl taċ-ċitotossiċità;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kwalunkwe informazzjoni supplimentari rilevanti għaċ-ċitotossiċità u l-metodu użat;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kriterji biex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodu/i tal-analiżi statistika użat(i);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodi, bħall-użu ta' antikorp antikinetoċoru jew sondi speċifiċi panċentromeriċi, sabiex jiġi kkaratterizat jekk mikronukleu fihx kromożomi sħaħ jew frammentati, jekk applikabbli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodi użati sabiex jiġu stabbiliti l-pH, l-ożmolalità u l-preċipitazzjoni.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ir-riżultati:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             definizzjoni taċ-ċelloli aċċettabbli għall-analiżi;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             fin-nuqqas ta' ċitoB, l-għadd ta' ċelloli ttrattati u l-għadd ta' ċelloli miġburin għal kull kultura fil-każ tal-linji ta' ċelloli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kejl taċ-ċitotossiċità użat, eż. CBPI jew RI fil-każ ta' metodu ta' mblokkar taċ-ċitokineżi; RICC jew RPD meta ma jintużawx metodi ta' mblokkar taċ-ċitokineżi; osservazzjonijiet oħrajn jekk jeżistu (eż. konfluwenza taċ-ċelloli, apoptożi, nekrożi, għadd tal-metafażi, frekwenza ta' ċelloli binukleati);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             is-sinjali ta' preċipitazzjoni u l-ħin tad-determinazzjoni;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dejta dwar il-pH u l-ożmolalità tal-medium tat-trattament, jekk ikun stabbilit;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-distribuzzjoni taċ-ċelloli mononukleati, binukleati u multinukleati jekk jintuża l-metodu ta' mblokkar taċ-ċitokineżi;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             l-għadd ta' ċelloli b'mikronukleji mogħtija separatament għal kull kultura tat-trattament u tal-kontroll, u jekk hux minn ċelloli binukleati jew mononukleati, fejn xieraq,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ir-relazzjoni konċentrazzjoni rispons, fejn possibbli,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-dejta tal-kontroll negattiv (solvent) u pożittiv (konċentrazzjonijiet u solventI) parallel;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-dejta tal-kontroll negattiv (solvent) u pożittiv, b'meded, medji u devjazzjonijiet standard u limiti ta' kontroll ta' 95 % għad-distribuzzjoni, kif ukoll in-numru ta' dejta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             analiżi statistika; il-valuri p, jekk ikun hemm.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Diskussjoni tar-riżultati.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Konklużjonijiet.
                                 
                              
                           TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. (1997). Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 1-4.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Parry, J.M., A. Sors (1993). The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project. Mutation Research, Vol. 287/1, pp. 3-15.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Fenech, M., A.A. Morley (1985). Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay. Cytobios, Vol. 43/172-173, pp. 233-246.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. et al. (2000). Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 167-172.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Fenech, M. (2007). Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols, Vol. 2/5, pp. 1084-1104.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Fenech, M., A.A. Morley (1986). Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation. Mutation Research, Vol. 161/2, pp. 193-198.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Eastmond, D.A., J.D. Tucker (1989). Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 13/1, pp. 34-43.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Eastmond, D.A., D. Pinkel (1990). Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probe. Mutation Research, Vol. 234/5, pp. 9-20.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Miller, B.M. et al. (1991). Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA. Mutagenesis, Vol. 6/4, pp. 297-302.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Farooqi, Z., F. Darroudi, A. T. Natarajan (1993). The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes. Mutagenesis, Vol. 8/4, pp. 329-334.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Migliore, L. et al. (1993). Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe. Mutation Research, Vol. 319/3, pp. 205-213.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Norppa, H., L. Renzi, C. Lindholm (1993). Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization. Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 519-525.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Eastmond, D.A, D.S. Rupa, L.S. Hasegawa (1994). Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes. Mutation Research, Vol. 322/1, pp. 9-20.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Marshall, R.R. et al. (1996). Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy. Mutation Research, Vol. 372/2, pp. 233-245.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Zijno, P. et al. (1996). Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes. Mutation Research, Vol. 372/2, 211-219.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders et al. (2003). Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Research, Vol. 540/2, pp. 153-163.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu 10 ta' dan l-Annes: In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test,.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Lorge, E. et al. (2006). SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 13-36.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Clare, G. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 37-60.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Aardema, M.J. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 61-87.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Wakata, A. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 88-124.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Oliver, J. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 125-152.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Albertini, S. et al. (1997). Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 187-208.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Miller, B. et al. (1997). Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 45-59.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Miller, B. et al. (1998). Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Research, Vol. 410, pp. 81-116.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Kalweit, S. et al. (1999). Chemically induced micronucleus formation in V79 cells — comparison of three different test approaches. Mutation Research, Vol. 439/2, pp. 183-190.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 Kersten, B. et al. (1999). The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity. Mutation Research, Vol. 445/1, pp. 55-71.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 von der Hude, W. et al. (2000). In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells — results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances. Mutation Research, Vol. 468/2, pp. 137-163.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Garriott, M.L., J.B. Phelps, W.P. Hoffman (2002). A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity. Mutation Research, Vol. 517/1-2, pp. 123-134.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Matsushima, T. et al. (1999). Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU). Mutagenesis, Vol. 14/6, pp. 569-580.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Elhajouji, A., E. Lorge (2006). Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 1-152.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Kirkland, D. (2010). Evaluation of different cytotoxic and cytostatic measures for the in vitromicronucleus test (MNVit): Introduction to the collaborative trial. Mutation Research, Vol. 702/2, pp. 139-147.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Hashimoto K. et al. (2011). Comparison of four different treatment conditions of extended exposure in the in vitro micronucleus assay using TK6 lymphoblastoid cells. Regulatory Toxicology and Pharmacology, Vol. 59/1, pp. 28-36.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Honma, M., M. Hayashi (2011). Comparison of in vitro micronucleus and gene mutation assay results for p53-competent versus p53-deficient human lymphoblastoid cells. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 52/5, pp. 373-384.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Zhang, L.S. et al. (1995). A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test. Mutation Research Letters, Vol. 347/3-4, pp. 105-115.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 ECVAM (2006). Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. Il-25 laqgħa tal-ESAC, 16-17 ta' Novembru 2006, Disponibbli fuq: http://ecvam.jrc.it/index.htm.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 ESAC (2006). ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel. Disponibbli fuq: http://ecvam.jrc.it/index.htm.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 Corvi, R. et al. (2008). ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT). Mutagenesis, Vol 23/4, pp. 271-283.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 ILSI paper (draft). Lorge, E., M.M. Moore, J. Clements, M. O'Donovan, M. Honma, A. Kohara, J. van Benthem, S. Galloway, M.J. Armstrong, A. Sutter, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Young-Tannir. Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. Mutation Research.
                                 
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Scott, D. et al. (1991). International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Research, Vol. 257/2, pp. 147-205.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 Morita, T. et al. (1992). Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells. Mutation Research, Vol. 268/2, pp. 297-305.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 Brusick, D. (1986). Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations. Environmental Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 789-886.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 Long, L.H. et al. (2007). Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium. Mutation Research, Vol. 634/1-2, pp. 177-183.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 Nesslany, F. et al. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environmental and Molecular Mutation., Vol. 49, pp. 439-452.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Fenech, M., A.A. Morley (1985). Measurement of micronuclei in lymphocytes. Mutation Research, Vol. 147/1-2, pp. 29-36.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Fenech, M. (1997). The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method. Mutation Research, Vol. 392, pp. 11-18.
                              
                           
                                 (48)
                              
                              
                                 Payne, C.M. et al. (2010). Hydrophobic bile acid-induced micronuclei formation, mitotic perturbations, and decreases in spindle checkpoint proteins: relevance to genomic instability in colon carcinogenesis. Nutrition and Cancer, Vol. 62/6, pp. 825-840.
                              
                           
                                 (49)
                              
                              
                                 Bazin, E. et al. (2010). Genotoxicity of a Freshwater Cyanotoxin,Cylindrospermopsin, in Two Human Cell Lines: Caco-2 and HepaRG. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 51/3, pp. 251-259.
                              
                           
                                 (50)
                              
                              
                                 Le Hegarat, L. et al. (2010). Assessment of the genotoxic potential of indirect chemical mutagens in HepaRG cellsby the comet and the cytokinesis-block micronucleus assays. Mutagenesis, Vol. 25/6, pp. 555-560.
                              
                           
                                 (51)
                              
                              
                                 Josse, R. et al. (2012). An adaptation of the human HepaRG cells to the in vitro micronucleus assay. Mutagenesis, Vol. 27/3, pp. 295-304.
                              
                           
                                 (52)
                              
                              
                                 Ehrlich, V. et al. (2002). Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells. Mutagenesis, Vol. 17/3, pp. 257-260.
                              
                           
                                 (53)
                              
                              
                                 Knasmüller, S. et al. (2004). Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge. Toxicology, Vol. 198/1-3, pp. 315-328.
                              
                           
                                 (54)
                              
                              
                                 Gibson, D.P. et al. (1997). Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 61-70.
                              
                           
                                 (55)
                              
                              
                                 Bonassi, S. et al. (2001). HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 37/1, pp. 31-45.
                              
                           
                                 (56)
                              
                              
                                 Maron, D.M., B.N. Ames (1983). Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research, Vol. 113/3-4, pp. 173-215.
                              
                           
                                 (57)
                              
                              
                                 Ong, T.-m. et al. (1980). Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver. Journal of Environmental Pathology and Toxicology, Vol. 4/1, pp. 55-65.
                              
                           
                                 (58)
                              
                              
                                 Elliott, B.M. et al. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, Vol. 7, pp. 175-177.
                              
                           
                                 (59)
                              
                              
                                 Matsushima, T. et al. (1976). (1976), “A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems”, in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J. et al. (eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
                              
                           
                                 (60)
                              
                              
                                 Johnson, T.E., D. R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996). Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 28, pp. 51-59.
                              
                           
                                 (61)
                              
                              
                                 UNEP (2001). Konvenzjoni ta' Stokkolma dwar Materjal Organiku Persistenti li Jniġġes, Programm tan-Nazzjonijiet Uniti għall-Ambjent (UNEP). Disponibbli fuq: http://www.pops.int/
                              
                           
                                 (62)
                              
                              
                                 Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987). Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes. Mutation Research, Vol.190/3, pp. 225-8.
                              
                           
                                 (63)
                              
                              
                                 Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982). “CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids”, in Genotoxic Effects of Airborne Agents. Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (eds.), Plenum, New York, pp. 91-103.
                              
                           
                                 (64)
                              
                              
                                 Zamora, P.O. et al. (1983). Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay. Environmental Mutagenesis, Vol. 5/6, pp. 795-801.
                              
                           
                                 (65)
                              
                              
                                 Asakura, M. et al. (2008). An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay. Mutation Research, Vol. 652/2, pp. 122-130.
                              
                           
                                 (66)
                              
                              
                                 Fenech, M. (1993). The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations. Mutation Research, Vol. 285/1, pp. 35-44.
                              
                           
                                 (67)
                              
                              
                                 Phelps, J.B., M.L. Garriott, W.P. Hoffman (2002). A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity. Mutation Research, Vol. 521/1-2, pp. 103-112.
                              
                           
                                 (68)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. et al. (2004). Corrigendum to “Report from the in vitro micronucleus assay working group”. Mutation Research, 564, 97-100.
                              
                           
                                 (69)
                              
                              
                                 Lorge, E. et al. (2008). Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects. Mutation Research, Vol. 655/1-2, pp. 1-3.
                              
                           
                                 (70)
                              
                              
                                 Surralles, J. et al. (1995). Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research, Vol. 341/3, pp. 169-184.
                              
                           
                                 (71)
                              
                              
                                 Honma, M. (2011). Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test. Mutation Research, Vol. 724, pp. 86-87.
                              
                           
                                 (72)
                              
                              
                                 Pfuhler, S. et al. (2011). In vitro genotoxicity test approaches with better predictivity: Summary of an IWGT workshop. Mutation Research, Vol. 723/2, pp. 101-107.
                              
                           
                                 (73)
                              
                              
                                 OECD (2014). Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487). ENV/JM/TG(2014)17. Disponibbli fuq talba.
                              
                           
                                 (74)
                              
                              
                                 Morita T., M. Honma, K. Morikawa (2012). Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity. Mutation Research, Vol. 741, pp. 32-56.
                              
                           
                                 (75)
                              
                              
                                 Brookmire L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the in vitro Chromosome Aberrations Assay. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 54/1, pp. 36-43.
                              
                           
                                 (76)
                              
                              
                                 EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances. http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt.
                              
                           
                                 (77)
                              
                              
                                 Sobol, Z. et al. (2012). Development and validation of an in vitro micronucleus assay platform in TK6 cells. Mutation Research, Vol.746/1, pp. 29-34.
                              
                           
                                 (78)
                              
                              
                                 Hayashi, M., T. Sofuni, M. Jr. Ishidate (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 241-247.
                              
                           
                                 (79)
                              
                              
                                 MacGregor, J. T., C.M. Wehr, R.G. Langlois (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 269-275.
                              
                           
                                 (80)
                              
                              
                                 Bryce, S.M. et al. (2011). Miniaturized flow cytometry-based CHO-K1 micronucleus assay discriminates aneugenic and clastogenic modes of action. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 52/4, pp. 280–286.
                              
                           
                                 (81)
                              
                              
                                 Nicolette, J. et al. (2011). in vitro micronucleus screening of pharmaceutical candidates by flow cytometry in Chinese hamster V79 cells. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 52/5, pp. 355–362.
                              
                           
                                 (82)
                              
                              
                                 Shi, J., R. Bezabhie, A. Szkudlinska (2010). Further evaluation of a flow cytometric in vitro micronucleus assay in CHO-K1 cells: a reliable platform that detects micronuclei and discriminates apoptotic bodies. Mutagenesis, Vol. 25/1, pp. 33-40.
                              
                           
                                 (83)
                              
                              
                                 OECD (2014). Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines. OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on testing and assessment, No.198, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (84)
                              
                              
                                 Fenech, M. et al. (2003). HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research, Vol. 534/1-2, pp. 65-75.
                              
                           
                                 (85)
                              
                              
                                 Elhajouji, A., M. Cunha, M. Kirsch-Volders (1998). Spindle poisons can induce polyploidy by mitotic slippage and micronucleate mononucleates in the cytokinesis-block assay. Mutagenesis, Vol. 13/2, pp. 193-8.
                              
                           
                                 (86)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. et al. (2011). The in vitro MN assay in 2011: origin and fate, biological significance, protocols, high throughput methodologies and toxicological relevance. Archives of Toxicology, Vol. 85/8, pp. 873-99.
                              
                           
                                 (87)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2010). Compilation and use of genetic toxicity historical control Data. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol.723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 (88)
                              
                              
                                 Ryan, T. P. (2000). Statistical Methods for Quality Improvement. 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 (89)
                              
                              
                                 Hoffman, W.P., M.L. Garriott, C. Lee (2003). “In vitro micronucleus test”, in Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, 2nd ed. Chow, S. (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, pp. 463-467.
                              
                           
                                 (90)
                              
                              
                                 Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, 3rd ed. John Wiley & Sons, New York.
                              
                           
                                 (91)
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1987). Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175.
                              
                           
                                 (92)
                              
                              
                                 Richardson, C. et al. (1989). Analysis of Data from in vitro Cytogenetic Assays. in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.
                              
                           
                                 (93)
                              
                              
                                 International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use.
                              
                           
                        Appendiċi 1
                        DEFINIZZJONIJIET
                        
                           
                              Anewġenu
                           : kwalunkwe sustanza kimika jew proċess li, meta jinteraġġixxu mal-komponenti tal-apparat taċ-ċiklu tad-diviżjoni taċ-ċellola mitotika u mejotika, iwasslu għal anewplojdija f'ċelloli jew organiżmi.
                        
                           
                              Anewplojdija
                           : kwalunkwe devjazzjoni mill-għadd ta' diplojdi (jew aplojdi) normali ta' kromożomi minn kromożomu wieħed jew aktar, iżda mhux mis-sett(ijiet) kollu/kollha ta' kromożomi (poliplojdija).
                        
                           
                              Apoptożi
                           : mewta programmata taċ-ċelloli kkaratterizzata minn sensiela ta' passi li jwasslu għad-diżintegrazzjoni taċ-ċelloli fil-partikoli mwaħħlin mal-membrana li mbagħad jiġu eliminati permezz ta' fagoċitożi jew permezz ta' tixrid.
                        
                           
                              Proliferazzjoni taċ-ċelloli
                           : iż-żieda fl-għadd ta' ċelloli bħala riżultat ta' diviżjoni mitotika taċ-ċelloli.
                        
                           
                              Ċentromeru
                           : ir-reġjun tad-DNA ta' kromożomu wieħed fejn iż-żewġ kromatidi jinżammu flimkien u li fuqu hemm imwaħħlin ġenb ma' ġenb iż-żewġ kinetokori.
                        
                           
                              Sustanza kimika
                           : sustanza jew taħlita.
                        
                           
                              Konċentrazzjonijiet
                           : tirreferi għal konċentrazzjonijiet finali tas-sustanza kimika tat-test fil-medium tal-kultura.
                        
                           
                              Klastoġenu
                           : kwalunkwe sustanza kimika jew avveniment li jikkawżaw aberrazzjonijiet kromożomiċi f'popolazzjonijiet ta' ċelloli jew organiżmi ewkarjotiċi.
                        
                           
                              Ċitokineżi
                           : il-proċess ta' diviżjoni taċ-ċelloli minnufih wara mitożi sabiex jifforma żewġ ċelloli żgħar, fejn kull waħda jkun fiha nukleu wieħed.
                        
                           
                              Indiċi tal-Proliferazzjoni b'Imblokkar taċ-Ċitokineżi (CBPI)
                           : il-proporzjon ta' ċelloli tat-tieni diviżjoni fil-popolazzjoni ttrattata meta mqabbla mal-kontroll mhux ittrattat (ara l-Appendiċi 2 għall-formula).
                        
                           
                              Ċitostażi
                           : inibizzjoni tat-tkabbir taċ-ċelloli (ara l-Appendiċi 2 għall-formula).
                        
                           
                              Ċitotossiċità
                           : Għall-assaġġi koperti f'dan il-metodu ta' ttestjar li jsiru fil-preżenza ta' ċitokalażina B, iċ-ċitotossiċità tiġi identifikata bħala tnaqqis fl-indiċi tal-proliferazzjoni b'imblokkatur taċ-ċitokineżi (CBPI) jew l-Indiċi tar-Replikazzjoni (RI) taċ-ċelloli ttrattati meta mqabbla mal-kontroll negattiv (ara l-paragrafu 26 u l-Appendiċi 2)
                        Għall-assaġġi koperti f'dan il-metodu ta' ttestjar imwettqin fin-nuqqas ta' ċitokalażina B, iċ-ċitotossiċità hija identifikata bħala tnaqqis fl-irduppjar relattiv tal-popolazzjoni (RPD) jew iż-żieda relattiva fl-għadd taċ-ċelloli (RICC) taċ-ċelloli ttrattati meta mqabblin mal-kontroll negattiv (ara l-paragrafu 27 u l-Appendiċi 2).
                        
                           
                              Ġenotossiċi
                           : terminu ġenerali li jkopri t-tipi kollha ħsara lid-DNA jew lill-kromożomi, inklużi ksur, tħassiriet, addotti, modifiki u konnessjonijiet tan-nukleotidi, riarranġamenti, mutazzjonijiet tal-ġeni, aberrazzjonijiet kromożomiċi, u anewplojdija. Mhux it-tipi kollha ta' effetti ġenotossiċi jirriżultaw f'mutazzjonijiet jew ħsara fil-kromożomi stabbli.
                        
                           
                              Ċelloli fl-interfażi
                           : ċelloli li mhumiex fl-istadju mitotiku.
                        
                           
                              Kinetoċoru
                           : struttura li fiha l-proteina li tgħaqqad fiċ-ċentromeru ta' kromożoma li magħha jaqbdu l-fibri rqaq matul id-diviżjoni taċ-ċelloli, sabiex b'hekk ikun hemm il-moviment ordinat ta' kromożomi dixxendenti għall-poli taċ-ċelloli dixxendenti.
                        
                           
                              Mikronukleji
                           : nukleji żgħar, separati minn u addizzjonali għan-nukleji ewlenin ta' ċelloli, prodotti waqt it-telofażi ta' mitożi jew mejożi permezz frammenti ta' kromożomi li jibqa' jew kromożomi sħaħ.
                        
                           
                              Mitożi
                           : diviżjoni tan-nukleu taċ-ċelloli li normalment jinqasam fi profażi, prometafażi, metafażi, anafażi u telofażi.
                        
                           
                              Indiċi mitotiku
                           : il-proporzjon ta' ċelloli fil-metafażi diviż bin-numru totali ta' ċelloli osservati f'popolazzjoni ta' ċelloli; indikazzjoni tal-livell ta' profilerazzjoni taċ-ċelloli ta' dik il-popolazzjoni.
                        
                           
                              Mutaġeniku
                           : jipproduċi bidla ereditarja ta' sekwenza(i) tal-koppja ta' bażijiet tad-DNA f'ġeni jew tal-istruttura tal-kromożomi (aberrazzjonijiet kromożomiċi).
                        
                           
                              Nondisġunzjoni
                           : nuqqas min-naħa tal-kromatidi f'pari milli jinfirdu u jissegregaw ruħhom sew sabiex jiżviluppaw ċelloli dixxendenti, u dan jirriżulta f'ċelloli żgħar b'għadd anormali ta' kromożomi.
                        
                           
                              Status p53
                           : il-proteina p53 hija involuta fir-regolamentazzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelloli, l-apoptożi u t-tiswija tad-DNA. Ċelloli b'defiċjenza fil-proteina p53 funzjonali, li mhux kapaċi jinibixxu ċ-ċiklu taċ-ċelloli jew jelimintaw iċ-ċelloli bil-ħsara b'apoptożi jew mekkaniżmi oħrajn (eż. induzzjoni tat-tiswija tad-DNA) marbutin mal-funzjonijiet p53 f'rispons għall-ħsara fid-DNA, teoretikament għandhom ikunu iktar suxxettibbli għal mutazzjonijiet tal-ġeni jew aberrazzjonijiet kromożomiċi.
                        
                           
                              Poliplojdija
                           : aberrazzjonijiet kromożomiċi numeriċi f'ċelloli jew organiżmi li jinvolvu sett(ijiet) sħiħ(sħaħ) ta' kromożomi, meta mqabbla ma' kromożoma individwali jew kromożomi (anewplojdija).
                        
                           
                              Indiċi tal-Proliferazzjoni (PI)
                           : metodu għall-kejl taċ-ċitotossiċità meta ma tintużax iċ-ċitoB (ara l-Appendiċi 2 għall-formula).
                        
                           
                              Żieda Relattiva fl-Għadd taċ-Ċelloli (RICC)
                           : metodu għall-kejl taċ-ċitotossiċità meta ma tintużax iċ-ċitoB (ara l-Appendiċi 2 għall-formula).
                        
                           
                              Irduppjar Relattiv tal-Popolazzjoni (RPD)
                           : metodu għall-kejl taċ-ċitotossiċità meta ma tintużax iċ-ċitoB (ara l-Appendiċi 2 għall-formula).
                        
                           
                              Indiċi tar-Replikazzjoni (RI)
                           : il-proporzjon taċ-ċikli tad-diviżjoni taċ-ċelloli mwettqa f'kultura ttrattata, fir-rigward tal-kontroll mhux trattat, matul il-perjodu ta' esponiment u l-irkupru (ara Appendiċi 2 għall-formula).
                        
                           
                              Frazzjoni tal-fwied S9
                           : supernatant ta' omoġenat tal-fwied wara ċentrifugazzjoni ta' 9 000g, jiġifieri estratt minn fwied mhux ipproċessat.
                        
                           
                              Taħlita ta' F9
                           : taħlita tal-frazzjoni tal-fwied S9 u l-kofatturi neċessarji għall-attività tal-enzimi metaboliċi.
                        
                           
                              Kontrolli tas-solvent
                           : Terminu ġenerali li jiddefinixxi l-kulturi tal-kontroll li jirċievu s-solvent waħdu użat sabiex jiddisolvi s-sustanza kimika tat-test.
                        
                           
                              Sustanza kimika tat-test
                           : Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta' dan il-metodu ta' ttestjar.
                        
                           
                              Kontroll mhux ittrattat
                           : kulturi li ma jirċievu ebda trattament (jiġifieri ebda sustanza kimika tat-test u lanqas solvent) iżda jiġu pproċessati fl-istess ħin bl-istess mod bħall-kulturi li jirċievu s-sustanza kimika tat-test.
                     
                     
                        Appendiċi 2
                        
                           FORMOLI GĦALL-VALUTAZZJONI TAĊ-ĊITOTOSSIĊITÀ
                        
                        
                           
                              
                                 Meta tintuża ċ-ċitoB
                              
                           , l-evalwazzjoni taċ-ċitotossiċità għandha tkun ibbażata fuq l-Indiċi tal-Profilerazzjoni b'Imblokkar taċ-Ċitokineżi (CBPI) jew l-Indiċi tar-Replikazzjoni (RI) (17) (69). Is-CBPI tindika l-għadd medju ta' nukleji għal kull ċellola, u tista' tintuża sabiex tiġi kkalkolata l-proliferazzjoni taċ-ċelloli. L-RI tindika l-għadd relattiv ta' ċikli taċ-ċelloli għal kull ċellola matul il-perjodu ta' esponiment għaċ-ċitoB f'kulturi ttrattati meta mqabblin ma' kulturi tal-kontroll u tista' tintuża sabiex jiġi kkalkolat il- % ta' ċitostażi:
                        % Cytostasis = 100 - 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)}
                        Kif ukoll:
                        
                                    T
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    kultura tat-trattament bis-sustanza kimika tat-test
                                 
                              
                                    C
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    kultura tal-kontroll
                                 
                              Fejn:
                        
                           
                        Għaldaqstant, CBPI ta' 1 (iċ-ċelloli kollha huma mononukleati) hija ekwivalenti għal ċitostażi ta' 100 %.
                        Ċitostażi = 100-RI
                        
                           
                        
                                    T
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    kulturi ttrattati
                                 
                              
                                    C
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    kulturi tal-kontroll
                                 
                              B'hekk, RI ta' 53 % ifisser li, meta mqabbel mal-għadd ta' ċelloli li jkunu nqasmu biex jiffurmaw ċelloli binukleati u multinukleati fil-kultura ta' kontroll, 53 % biss ta' dan l-għadd ġew diviżi fil-kultura trattata, jiġifieri ċitostażi ta' 47 %.
                        
                           
                              
                                 Meta ma tintużax ċitoB
                              
                           , hija rrakkomandata evalwazzjoni taċ-ċitotossiċità fuq il-bażi taż-Żieda Relattiva fl-Għadd taċ-Ċelloli (RICC) jew fuq l-Irduppjar tal-Popolazzjoni Relattiva (RPD) (69), minħabba li t-tnejn iqisu l-proporzjon tal-popolazzjoni taċ-ċelloli li tkun inqasmet.
                        
                           
                        
                           
                        fejn:
                        
                           Irduppjar tal-Popolazzjoni = [log (Numru ta' ċelloli wara t-trattament ÷ Numru ta' ċelloli inizjali)] ÷ log 2
                        B'hekk, RICC, jew RPD ta' 53 % jindikaw 47 % ċitotossiċità/ċitostażi.
                        Billi jintuża Indiċi tal-Proliferazzjoni (PI), iċ-ċitotossiċità tista' tiġi vvalutata pemrezz tal-għadd tan-numru ta' kloni li jikkonsistu f'ċellola 1 (cl1), 2 ċelloli (cl2), 3 sa 4 ċelloli (cl4) u 5 sa 8 ċelloli (cl8).
                        
                           
                        Il-PI ntuża bħala parametru siewi u affidabbli taċ-ċitotossiċità anki għal linji ta' ċelloli kkulturati in vitro fin-nuqqas ta' ċitoB (35) (36) (37) (38) u jista' jitqies bħala parametru addizzjonali siewi.
                        Fi kwalunkwe każ, l-għadd ta' ċelloli qabel it-trattament għandu jkun l-istess għal kulturi tat-trattament u tal-kontroll negattiv.
                        Filwaqt li l-RCC (jiġifieri n-Numru ta' ċelloli f'kulturi tat-trattament/ Numru ta' ċelloli f'kulturi tal-kontroll) intuża bħala parametru taċ-ċitotossiċità fl-imgħoddi, illum ma għadux rakkomandat għaliex jista' jissottovaluta ċ-ċitotossiċità
                        Meta jintużaw sistemi tal-klassifikazzjoni awtomatizzati, pereżempju, ċitometrija tal-fluss, ċitometrija ta' skennjar bil-laser jew analiżi tal-immaġnijiet, in-numru ta' ċelloli fil-formula jista' jiġi sostitwit bin-numru ta' nukleji.
                        Fil-kulturi tal-kontroll negattiv, l-irduppjar tal-popolazzjoni jew l-indiċi tar-replikazzjoni għandu jkun kompatibbli mar-rekwiżit li jittieħed kampjun taċ-ċelloli wara t-trattament fi żmien ekwivalenti għal madwar darba u nofs sad-doppju tat-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli.
                     ”
               
                     (15)
                  
                  
                     Fil-Parti B, jiżdiedu l-Kapitoli li ġejjin:
                     “B.59   Sensitizzazzjoni tal-Ġlda In Chemico: Assaġġ Dirett tar-Reattività tal-Peptidi (DPRA)
                     
                     INTRODUZZJONI
                     Dan il-metodu ta' ttestjar (TM) huwa ekwivalenti għal-linja gwida tal-ittestjar (TG) 442C tal-OECD (2015). Sensitizzatur tal-ġilda jirreferi għal sustanza li sejra twassal għal reazzjoni allerġika wara kuntatt mal-ġilda kif definita mis-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta' Sustanzi Kimiċi (GHS) tan-Nazzjonijiet Uniti (NU) (1) u r-Regolament (KE) Nru 1272/2008 dwar il-Klassifikazzjoni, l-Ittikkettar u l-Imballaġġ tas-Sustanzi u t-Taħlitiet (CLP) (18). Dan il-metodu ta' ttestjar jipprovdi proċedura in chemico (Assaġġ Dirett tar-Reattività tal-Peptidi — DPRA) li tintuża sabiex tappoġġja d-diskriminazzjoni bejn sensitizzaturi tal-ġilda u mhux sensitizzaturi tal-ġilda skont il-GHS tan-NU u s-CLP.
                     Hemm qbil ġenerali dwar l-avvenimenti bijoloġiċi ewlenin li jwasslu għas-sensitizzazzjoni tal-ġilda. L-għarfien eżistenti dwar il-mekkaniżmi kimiċi u bijoloġiċi assoċjati mas-sensitizzazzjoni tal-ġilda nġabar fil-forma ta' Passaġġ tal-Eżitu Avvers (AOP) (2), mill-avveniment ta' inizjazzjoni molekolari permezz tal-avvenimenti intermedji għall-effett avvers, jiġifieri dermatite b'kuntatt allerġiku fil-bniedem jew ipersensittività b'kuntatt f'rodituri. Fi ħdan l-AOP tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda, l-avveniment ta' inizjazzjoni molekolari huwa l-irbit kovalenti ta' sustanzi elettrofiliċi ma' ċentri nukleofiliċi fil-proteini tal-ġilda.
                     Normalment, il-valutazzjoni tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda kienet tinvolvi l-użu ta' annimali tal-laboratorju. Il-metodi klassiċi bbażati fuq fniek tal-indi, it-Test ta' Massimizzazzjoni tal-Fniek tal-Indi ta' Magnusson Kligman (GMPT) u t-Test Buehler (TM B.6 (3)), jistudjaw kemm il-fażi tal-induzzjoni kif ukoll il-fażi tal-eliċitazzjoni tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda. Test murin, l-Assaġġ Lokali tal-Limfonodi (LLNA, TM B.42 (4)) u ż-żewġ modifiki mhux radjuattivi tiegħu, LLNA: DA (TM B.50 (5)) u LLNA: BrdU-ELISA (TM B.51 (6)), li lkoll jivvalutaw ir-rispons tal-induzzjoni b'mod esklussiv, ġew aċċettati wkoll peress li jagħtu vantaġġ fuq it-testijiet fuq il-ħnieżer tal-indi f'termini tat-trattament xieraq tal-annimali u kejl oġġettiv tal-fażi tal-induzzjoni tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda.
                     Iktar riċentement, metodi ta' ttestjar in chemico u in vitro bbażati mekkanistikament tqiesu xjentifikament validi għall-evalwazzjoni tal-periklu ta' sensitizzazzjoni tal-ġilda tas-sustanzi kimiċi. Madankollu, taħlitiet ta' metodi mhux tal-annimali (in silico, in chemico, in vitro) fi ħdan Approċċi Integrati għall-Ittestjar u l-Valutazzjoni (IATA) sejrin ikunu meħtieġa sabiex ikunu sostitwiti bis-sħiħ it-testijiet fuq l-annimali li jintużaw bħalissa fid-dawl tal-kopertura mekkanistika ristretta tal-AOP ta' kull wieħed mill-metodi ta' ttestjar mhux fuq l-annimali li għandna għad-dispożizzjoni bħalissa (2) (7).
                     Id-DPRA huwa propost sabiex jindirizza l-avveniment ta' inizjazzjoni molekolari tal-AOP tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda, jiġifieri r-reattività tal-proteina, billi jikkwantifika r-reattività tas-sustanzi kimiċi tat-test lejn peptidi sintetiċi mudell li fihom liżina jew ċisteina (8). Imbagħad, il-valuri perċentwali ta' tnaqqis tal-peptidi taċ-ċisteina u l-liżina jintużaw sabiex sustanza titqassam f'waħda mill-erba' klassijiet ta' reattività għall-appoġġ tad-diskriminazzjoni bejn sensitizzaturi tal-ġilda u mhux sensitizzaturi tal-ġilda (9).
                     Id-DPRA ġie evalwat fi studju ta' validazzjoni mmexxi mil-Laboratorju ta' Referenza tal-Unjoni Ewropea għal Alternattivi għal Testijiet fuq l-Annimali (EURL ECVAM) u reviżjoni bejn il-pari indipendenti sussegwenti mill-Kumitat Konsultattiv Xjentifiku tal-EURL ECVAM (ESAC) u tqies li huwa xjentifikament validu (10) sabiex jintuża bħala parti minn IATA għall-appoġġ tad-diskriminazzjoni bejn sensitizzaturi tal-ġilda u mhux sensitizzaturi tal-ġilda għall-fini ta' klassifikazzjoni u tikkettar tal-periklu. Eżempji dwar l-użu tad-dejta tad-DPRA flimkien ma' informazzjoni oħra huma rrapportati fit-tagħrif (11) (12) (13) (14).
                     Id-definizzjonijiet huma pprovduti fl-Appendiċi I.
                     KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI, APPLIKABILITÀ U LIMITAZZJONIJIET
                     Il-korrelazzjoni tal-attività tal-proteini mal-potenzjal ta' sensitizzazzjoni tal-ġilda hija ferm stabbilita (15) (16) (17). Minkejja dan, peress li l-irbit tal-proteina jirrappreżenta avveniment ewlieni wieħed biss, li huwa l-avveniment ta' inizjazzjoni molekolari tal-AOP tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda, informazzjoni dwar ir-reattività tal-proteina ġġenerata b'metodi ta' ttestjar u mhux ta' ttestjar jaf ma tkunx biżżejjed waħedha sabiex tinħareġ konklużjoni dwar in-nuqqas ta' potenzjal ta' sensitizzazzjoni tal-ġilda tas-sustanzi kimiċi. Għaldaqstant, dejta ġġenerata b'dan il-metodu ta' ttestjar għandha tiġi kkunsidrata fil-kuntest ta' approċċi integrati bħall-IATA, biex b'hekk tiġi kombinata ma' informazzjoni komplimentari oħra, eż. derivata minn assaġġi in vitro li jindirizzaw avvenimenti ewlenin oħrajn tal-AOP tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda kif ukoll metodi mhux ta' ttestjar inkluż read-across minn analogi kimiċi.
                     Dan il-metodu ta' ttestjar jista' jintuża, flimkien ma' informazzjoni komplimentari oħra, sabiex jappoġġja d-diskriminazzjoni bejn is-sensitizzaturi tal-ġilda (jiġifieri Kategorija 1 tal-GHS tan-NU/CLP) u mhux sensitizzaturi fil-kuntest tal-IATA. Dan il-metodu ta' ttestjar ma jistax jintuża waħdu, lanqas sabiex jiġu sottokategorizzati sensitizzaturi tal-ġilda f'sottokategoriji 1A u 1B kif definiti mill-GHS/CLP tan-NU, u lanqas sabiex titbassar il-potenza għal deċiżjonijiet dwar il-valutazzjoni tas-sikurezza. Madankollu, skont il-qafas regolatorju, riżultat pożittiv bid-DPRA jista' jintuża waħdu sabiex sustanza kimika tiġi klassifikata fil-kategorija 1 tal-GHS/CLP tan-NU.
                     Il-metodu ta' ttestjar tad-DPRA wera li huwa trasferibbli għal laboratorju b'esperjenza f'analiżi tal-kromatografija likwida bi prestazzjoni għolja (HPLC). Il-livell ta' riproduċibbilità fil-previżjonijiet li jista' jkun mistenni mill-metodu ta' ttestjar huwa fl-ordni ta' 85 % fi ħdan il-laboratorji u 80 % bejn il-laboratorji (10). Ir-riżultati ġġenerati fl-istudju ta' validazzjoni (18) u l-istudji ppubblikati (19) b'mod ġenerali jindikaw li l-preċiżjoni tad-DPRA fid-diskriminazzjoni ta' sensitizzaturi (jiġifieri Kat. 1 tal-GHS tan-NU/CLP ) minn mhux sensitizzaturi hija ta' 80 % (N=157) b'sensittività ta' 80 % (88/109) u speċifiċità ta' 77 % (37/48) meta mqabblin mar-riżultati tal-LLNA. Id-DPRA għandu probabilità ikbar li jbassar sustanzi kimiċi li juru potenza baxxa sa moderata tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda (jiġifieri sottokategorija 1B tas-CLP/GHS tan-NU) minn sustanzi kimiċi li juru potenza għolja tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda (jiġifieri sottokategorija 1A tas-CLP/GHS tan-NU) (18) (19). Madankollu, il-valuri tal-preċiżjoni mogħtijin hawnhekk għad-DPRA bħala metodu ta' ttestjar waħdu huma indikattivi biss peress li l-metodu ta' ttestjar għandu jiġi kkunsidrat flimkien ma' sorsi oħrajn ta' informazzjoni fil-kuntest ta' IATA u skont id-dispożizzjonijiet tal-paragrafu 9 ta' hawn fuq. Barra minn hekk, meta jiġu evalwati metodi mhux fuq l-annimali għas-sensitizzazzjoni tal-ġilda, ta' min jiftakar li t-test LLNA kif ukoll testijiet oħrajn fuq l-annimali jaf ma jirriflettux is-sitwazzjoni sħiħa fl-ispeċi ta' interess, jiġifieri fil-bniedem. Fuq il-bażi tad-dejta kumplessiva disponibbli, intwera li d-DPRA huwa applikabbli għal sustanzi kimiċi tat-test li jkopru firxa ta' gruppi funzjonali organiċi, mekkaniżmi ta' reazzjoni, potenza tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda (kif stabbiliti fi studji in vivo) u proprjetajiet fiżikokimiċi (8) (9) (10) (19). Meħuda kollha f'daqqa, din l-informazzjoni tindika l-utilità tad-DPRA sabiex jikkontribwixxi għall-identifikazzjoni tal-periklu ta' sensitizzazzjoni tal-ġilda.
                     It-terminu “sustanza kimika tat-test” jintuża f'dan il-metodu ta' ttestjar sabiex jirreferi għal dak li jkun qiegħed jiġi ttestjat u mhux b'rabta mal-applikabilità tad-DPRA għall-ittestjar ta' sustanzi u/jew taħlitiet. Dan il-metodu ta' ttestjar mhuwiex applikabbli għall-ittestjar ta' komposti tal-metall peress li dawn huma magħrufin li jirreaġixxu ma' proteini b'mekkaniżmi li mhumiex ta' rbit kovalenti. Sustanza kimika tat-test għandha tkun solubbli f'solvent xiearq f'konċentrazzjoni finali ta' 100 mM (ara l-paragrafu 18). Madankollu, is-sustanzi kimiċi tat-test li mhumiex solubbli f'din il-konċentrazzjoni xorta waħda jistgħu jiġu ttestjati f'konċentrazzjoni solubbli iktar baxxi. F'dan il-każ, xorta waħda jista' jintuża riżultat pożittiv sabiex isostni l-identifikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test bħala sensitizzatur tal-ġilda, iżda ma għandha tinħareġ ebda konklużjoni assoluta dwar in-nuqqas ta' reattività minn riżultat negattiv. Bħalissa hemm biss informazzjoni limitata disponibbli dwar l-applikabilità tad-DPRA għal taħlitiet ta' kompożizzjoni magħrufa (18) (19). Minkejja dan, id-DPRA jitqies li huwa teknikament applikabbli għall-ittestjar ta' sustanzi multikostitwenti u taħlitiet b'kompożizzjoni magħrufa (ara l-paragrafu 18). Qabel ma jintuża dan il-metodu ta' ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta' dejta għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet ma jkunux meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita. Il-mudell ta' tbassir attwali ma jistax jintuża għal taħlitiet kumplessi b'kompożizzjoni mhux magħrufa jew għal sustanzi b'kompożizzjoni mhux magħrufa jew varjabbli, prodotti b'reazzjoni kumplessa jew materjali bijoloġiċi (jiġifieri sustanzi UVCB) minħabba l-proporzjon molari definit tas-sustanza kimika tat-test u l-peptid. Għal dan il-għan, sejjer ikollu jiġi żviluppat mudell ġdid ta' tbassir imsejjes fuq approċċ gravimetriku. F'każijiet li fihom tista' tiġi pprovduta evidenza fuq in-nuqqas ta' applikabilità tal-metodu ta' ttestjar għal kategoriji speċifiċi ta' sustanzi kimiċi, il-metodu ta' ttestjar ma għandux jintuża għal dawk il-kategoriji speċifiċi ta' sustanzi kimiċi.
                     Dan il-metodu ta' ttestjar huwa metodu in chemico li ma jkoprix sistema metabolika. Sustanzi kimiċi li jeħtieġu bijoattivazzjoni enzimatika sabiex jeżerċitaw il-potenzjal tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda tagħhom (jiġifieri proapteni) ma jistgħux jiġu individwati mill-metodu ta' ttestjar. Sustanzi kimiċi li jsiru sensitizzaturi wara trasformazzjoni abijotika (jiġifieri preapteni) huma rrapportati li f'xi każijiet jiġu individwati kif suppost mill-metodu ta' ttestjar (18). Fid-dawl ta' dan li ntqal hawn fuq, riżultati negattivi miksubin bil-metodu ta' ttestjar għandhom jiġu interpretati fil-kuntest tal-limitazzjonijiet stipulati u b'rabta ma' sorsi ta' informazzjoni oħrajn fi ħdan il-qafas ta' IATA. Sustanzi kimiċi tat-test li ma jorbtux b'mod kovalenti mal-peptid iżda jippromwovu l-ossidazzjoni tiegħu (jiġifieri dimerizzazzjoni taċ-ċisteina) jistgħu jwasslu għal potenzjal ta' sopravalutazzjoni tat-tnaqqis tal-peptidi, li jirriżulta fi tbassir possibbli ta' foloz pożittivi u/jew assenjament għal klassi ta' reattività ogħla (ara l-paragrafi 29 u 30).
                     Kif deskritt, id-DPRA jsostni d-diskriminazzjoni bejn sensitizzaturi tal-ġilda u mhux sensitizzaturi tal-ġilda. Madankollu, għandu l-potenzjal li jikkontribwixxi għall-valutazzjoni tal-potenza ta' sensitizzazzjoni (11) ukoll meta jintuża f'approċċi integrati bħall-IATA. Madankollu, hemm bżonn li jsir iktar xogħol, idealment fuq il-bażi ta' dejta mill-bniedem, sabiex jiġi stabbilit kif ir-riżultati tad-DPRA jistgħu jinformaw valutazzjoni tal-potenza.
                     IL-PRINĊIPJU TAT-TEST
                     Id-DPRA huwa metodu in chemico li jikkwantifika l-konċentrazzjoni li jifdal ta' peptid li fih ċisteina jew liżina wara inkubazzjoni ta' 24 siegħa bis-sustanza kimika tat-test f'25 ± 2.5 °C. Il-peptidi sintetiċi fihom fenilalanina sabiex tgħin fl-individwazzjoni. Konċentrazzjoni relattiva ta' peptidi hija mkejla minn kromatografija likwida bi prestazzjoni għolja (HPLC) b'elwizzjoni gradjenti u detezzjoni tal-UV f'220 nm. Imbagħad, il-valuri tat-tnaqqis fil-perċentwal ta' peptidi taċ-ċisteina u liżina jiġu kkalkolati u jintużaw f'mudell ta' tbassir (ara l-paragrafu 29) li jippermettu li s-sustanza kimika tat-test tiġi assenjata għal waħda mill-erba' klassijiet ta' reattività għall-appoġġ tad-diskriminazzjoni bejn sensitizzaturi u mhux sensitizzaturi.
                     Qabel l-użu ta' rutina tal-metodu ta' ttestjar f'dan il-metodu ta' ttestjar, il-laboratorji għandhom juru l-profiċjenza teknika billi jużaw l-għaxar sustanzi ta' profiċjenza elenkati fl-Appendiċi 2.
                     PROĊEDURA
                     Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bbażat fuq il-protokoll DB-ALM DPRA Nru 154 (20) li jirrappreżenta l-protokoll użat għall-istudju ta' validazzjoni koordinat mill-ECVAM tal-EURL. Huwa rakkomandat li dan il-protokoll jintuża meta jiġi implimentat u jintuża l-metodu fil-laboratorju. Din li ġejja hija deskrizzjoni tal-komponenti u l-proċeduri ewlenin ta' ttestjar għad-DPRA. Jekk jintuża ssettjar alternattiv tal-HPLC, għandha tintwera l-ekwivalenza tiegħu għall-issettjar ivvalidat deskritt fil-protokoll DB-ALM (eż. bl-ittestjar tas-sustanzi ta' profiċjenza fl-Appendiċi 2).
                     
                        Preparazzjoni tal-peptidi li fihom iċ-ċisteina jew il-liżina
                     
                     Soluzzjonijiet ewlenin ta' ċisteina (Ac-RFAACAA-COOH) u liżina (Ac-RFAAKAA-COOH) li fihom peptidi sintetiċi ta' purità ogħla minn 85 % u idealment fil-medda ta' 90-95 %, għandhom jitħejjew ġodda eżatt qabel ma jiġu inkubati mas-sustanza kimika tat-test. Il-konċentrazzjoni finali tal-peptid taċ-ċisteina għandha tkun ta' 0.667 mM f'bafer tal-fosfat b'pH ta' 7.5 filwaqt li l-konċentrazzjoni finali tal-peptid tal-liżina għandha tkun ta' 0.667 mM f'bafer tal-aċetat tal-ammonju b'pH ta' 10.2. Is-sekwenza tas-sessjoni tal-HPLC għandha tiġi stabbilita sabiex il-ħin tal-analiżi tal-HPLC jinżamm għal inqas minn 30 siegħa. Għall-issettjar tal-HPLC użat fl-istudju ta' validazzjoni u deskritt f'dan il-metodu ta' ttestjar, jistgħu jiġu akkomodati sa 26 kampjun tal-analiżi (li jinkludu s-sustanza kimika tat-test, il-kontroll pożittiv u n-numru xieraq ta' kontrolli tas-solvent fuq il-bażi tan-numru ta' solventi individwali użati fit-test, ilkoll ittestjati fi triplikat), f'sessjoni waħda tal-HPLC. Ir-repliki kollha analizzati fl-istess sessjoni għandhom jużaw l-istess soluzzjonijiet ewlenin tal-peptid taċ-ċisteina u l-liżina. Huwa rakkomandat li jingħataw provi ta' lottijiet ta' peptidi individwali għas-solubilità xierqa qabel ma jintużaw.
                     
                        Preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test
                     
                     Is-solubilità tas-sustanza kimika tat-test f'solvent xieraq għandha tiġi vvalutata qabel ma jsir l-assaġġ wara l-proċedura ta' solubilizzazzjoni deskritta fil-protokoll DB-ALM tad-DPRA (20). Solvent xieraq jiddisolvi s-sustanza kimika tat-test għalkollox. Peress li fid-DPRA s-sustanza kimika tat-test tiġi inkubata f'eċċess kbir b'peptidi taċ-ċisteina jew il-peptidi tal-liżina, spezzjoni viżwali tal-ifformar ta' soluzzjoni ċara titqies li hija biżżejjed sabiex jiġi żgurat li ġiet dissolta s-sustanza kimika tat-test (u l-komponenti kollha tagħha fil-każ ta' ttestjar ta' sustanza jew taħlita multikostitwenti). Solventi xierqa huma aċetonitril, ilma, taħlita 1:1 ilma:aċetonitril, isopropanol, aċetonaċeton jew taħlita 1:1 aċeton:aċetonitril. Jistgħu jintużaw solventi oħrajn diment li ma jħallux impatt fuq l-istabilità tal-peptid kif issorveljat b'kontrolli ta' referenza C (jiġifieri kampjuni kostitwiti mill-peptid waħdu dissolt fis-solvent xieraq; ara l-Appendiċi 3). Bħala l-aħħar alternattiva, jekk is-sustanza kimika tat-test ma tkunx solubbli fi kwalunkwe wieħed minn dawn is-solventi, għandu jsir tentattiv sabiex tiġi solubilizzata fi 300 μL DMSO u s-soluzzjoni li tirriżulta tiġi dilwita b'2 700 μL ta' aċetonitril u, jekk is-sustanza kimika tat-test ma tkunx solubbli f'din it-taħlita, għandhom isiru tentattivi sabiex jiġi solubizzat l-istess ammont ta' sustanza kimika tat-test f'1 500 μL DMSO u s-soluzzjoni li jifdal b'1 500 μL ta' aċetonitril. Is-sustanza kimika tat-test għandha tintiżen minn qabel f'kunjetti tal-ħġieġ u tiġi dissolta eżatt qabel l-ittestjar b'solvent xieraq sabiex titħejja soluzzjoni ta' 100 mM. Għal taħlitiet u sustanzi multikostitwenti b'kompożizzjoni magħrufa, purità waħda għandha tiġi stabbilita mis-somma tal-proporzjon tal-kostitwenti tagħha (eskluż l-ilma), u għandu jiġi stabbilit piż molekolari apparenti wieħed billi jiġu kkunsidrati l-piżijiet molekolari individwali ta' kull komponent fit-taħlita (eskluż l-ilma) u l-proporzjonijiet individwali tagħhom. Imbagħad għandhom jintużaw il-purità li tirriżulta u l-piż molekolari apparenti sabiex jiġi kkalkolat il-piż tas-sustanza kimika tat-test neċessarju sabiex titħejja soluzzjoni ta' 100 mM. Għal polimeri li għalihom ma jistax jiġi stabbilit piż molekolari predominanti, il-piż molekolari tal-monomer (jew il-piż molekolari apparenti tal-bosta monomeri li jikkostitwixxu l-polimer) jistgħu jiġu kkunsidrati sabiex titħejja soluzzjoni ta' 100 mM. Madankollu, meta jiġu ttestjati taħlitiet, sustanzi multikostitwenti jew polimeri b'kompożizzjoni magħrufa, għandu jiġi kkunsidrat ukoll l-ittestjar tas-sustanza kimika pura. Għal likwidi, is-sustanza kimika pura għandha tiġi ttestjata kif inhi mingħajr ebda dilwizzjoni minn qabel billi tiġi inkubata bi proporzjon molari ta' 1:10 u 1:50 bil-peptidi taċ-ċisteina u l-liżina, rispettivament. Għal solidi, is-sustanza kimika tat-test għandha tiġi dissolta għall-konċentrazzjoni solubbli massima tagħha fl-istess solvent użat għat-tħejjija tas-soluzzjoni apparenti ta' 100 mM. Imbagħad għandha tiġi ttestjata kif inhi mingħajr ebda dilwizzjoni ulterjuri minn qabel billi tiġi inkubata bi proporzjon ta' 1:10 u 1:50 bil-peptidi taċ-ċisteina u l-liżina, rispettivament. Ir-riżultati konkordanti (reattivi jew mhux reattivi) bejn is-soluzzjoni apparenti ta' 100 mM u s-sustanza kimika pura għandhom jippermettu li tinħareġ konklużjoni ċara fuq ir-riżultat.
                     
                        Preparazzjoni tal-kontroll pożittiv, kontrolli ta' referenza u l-kontrolli ta' koelwizzjoni
                     
                     Aldeid ċinnamiku (CAS 104-55-2; ≥ 95 % purità tal-grad tal-ikel) għandu jintuża bħala l-kontroll pożittiv (PC) f'konċentrazzjoni ta' 100 mM fl-aċetonitril. Jistgħu jintużaw kontrolli pożittivi xierqa oħrajn li idealment jipprovdu valuri ta' tnaqqis fil-medda medja jekk ikun hemm dejta storika disponibbli sabiex jinkisbu kriterji ta' aċċettazzjoni tas-sessjoni komparabbli. Barra minn hekk, kontrolli ta' referenza (jiġifieri kampjuni li fihom biss il-peptid dissolt fis-solvent xieraq) għandhom ikunu inklużi wkoll fis-sekwenza tas-sessjoni tal-HPLC u dawn jintużaw sabiex tiġi verifikata l-idoneità tas-sistema tal-HPLC qabel ma ssir l-analiżi (kontrolli ta' referenza A), l-istabilità tal-kontrolli ta' referenza tul iż-żmien (kontrolli ta' referenza B) u sabiex jiġi verifikat li s-solvent użat sabiex tiġi dissolta s-sustanza kimika tat-test ma jħallix impatt fuq il-perċentwal ta' tnaqqis ta' peptidi (kontrolli ta' referenza Ċ) (ara l-Appendiċi 3). Il-kontroll ta' referenza xieraq għal kull sustanza kimika jintuża sabiex jiġi kkalkolat it-tnaqqis fil-perċentwal ta' peptidi għal dik is-sustanza kimika (ara l-paragrafu 26). Barra minn hekk, għandu jkun inkluż kontroll tal-koelwizzjoni kostitwit mis-sustanza kimika tat-test waħedha għal kull waħda mis-sustanzi kimiċi tat-test analizzati fis-sekwenza tas-sessjoni sabiex tiġi individwata l-koelwizzjoni possibbli tas-sustanza kimika tat-test b'peptid tal-liżina jew taċ-ċisteina.
                     
                        Inkubazzjoni tas-sustanza kimika tat-test bis-soluzzjonijiet tal-peptidi taċ-ċisteina u l-liżina
                     
                     Is-soluzzjonijiet tal-peptidi taċ-ċisteina u l-liżina għandhom jiġu inkubati f'kunjetti tal-ħġieġ tal-awtokampjunar bis-sustanza kimika tat-test bi proporzjon ta' 1:10 u 1:50, rispettivament. Jekk jiġi osservat preċipiatat eżatt wara li tiżdied is-soluzzjoni tas-sustanza kimika tat-test mas-soluzzjoni tal-peptid, minħabba solubilità milwiema baxxa tas-sustanza kimika tat-test, f'dan il-każ wieħed ma jistax ikun żgur dwar kemm is-sustanza kimika tat-test baqgħet fis-soluzzjoni sabiex tirreaġixxi mal-peptid. Għalhekk, f'każ bħal dan, riżultat pożittiv xorta waħda jista' jintuża, iżda riżultat negattiv huwa inċert u għandu jiġi interpretat bil-galbu (ara wkoll id-dispożizzjonijiet fil-paragrafu 11 għall-ittestjar ta' sustanzi kimiċi mhux solubbli sa konċentrazzjoni ta' 100 mM). Is-soluzzjoni tar-reazzjoni għandha titħalla fid-dlam f'25 ± 2.5 °C għal 24 ± 2 siegħa qabel ma ssir l-analiżi tal-HPLC. Kull sustanza kimika tat-test għandha tiġi analizzata fi triplikat għaż-żewġ peptidi. Il-kampjuni jridu jiġu spezzjonati viżwalment qabel l-analiżi tal-HPLC. Jekk jiġu osservati preċipitat jew separazzjoni tal-fażi, il-kampjuni jistgħu jiġu ċentrifugati b'veloċità baxxa (100-400xg) sabiex il-preċipitat jiġi mġiegħel għal qiegħ il-kunjett bħala prekawzjoni, peress li ammonti kbar ta' preċipitat jistgħu jsoddu t-tubi jew il-kolonni tal-HPLC. Jekk tiġi osservata preċipitazzjoni jew separazzjoni tal-fażi wara l-perjodu ta' inkubazzjoni, it-tnaqqis tal-peptidi jista' jiġi sottovalutat u ma tistax tinħareġ konklużjoni dwar in-nuqqas ta' reattività b'biżżejjed kunfidenza fil-każ ta' riżultat negattiv.
                     
                        Preparazzjoni tal-kurva ta' kalibrazzjoni standard tal-HPLC
                     
                     Kurva ta' kalibrazzjoni standard għandha tiġi ġġenerata kemm għall-peptidi taċ-ċisteina kif ukoll tal-liżina. L-istandards tal-peptidi għandhom jitħejjew f'soluzzjoni ta' 20 % jew 25 % aċetonitril: bafer li juża bafer tal-fosfat (pH 7.5) għall-bafer tal-aċetat tal-ammonju u l-peptid taċ-ċisteina (pH 10.2) għall-peptid tal-liżina. L-użu ta' standards ta' dilwizzjoni serjali tas-soluzzjoni ewlenija tal-peptid (0,667 mM), 6 soluzzjonijiet tal-kalibraġġ għandhom jitħejjew sabiex ikopru l-medda minn 0.534 sa 0.0167 mM. Inbjank tal-bafer ta' dilwizzjoni għandu jkun inklż ukoll fil-kurva ta' kalibrazzjoni standard. Il-kurvi ta' kalibrazzjoni xierqa għandu jkollhom r2> 0.99.
                     
                        Preparazzjoni u analiżi tal-HPLC
                     
                     L-idoneità tas-sistema tal-HPLC għandha tiġi vverifikata qabel ma ssir l-analiżi. It-tnaqqis tal-peptidi jiġi ssorveljat mill-HPLC flimkien ma' detettur tal-UV (detettur b'serje ta' fotodijodi jew detettur tal-assorbiment tat-tul ta' mewġa fiss b'sinjal ta' 220 nm). Il-kolonna xierqa tiġi installata fis-sistema tal-HPLC. L-issettjar tal-HPLC deskritt fil-protokoll ivvalidat juża mikron Zorbax SB-C-182,1 mm × 100 mm × 3.5 bħala l-kolonna ppreferita. Bil-kolonna ta' fażi inversa tal-HPLC, is-sistema sħiħa għandha tiġi ekwilibrata għal 30 °C b'fażi A ta' 50 % (0,1 % (v/v) aċidu trifluworoaċetiku fl-ilma) u fażi B ta' 50 % (0,085 % (v/v) aċidu trifluworoaċetiku fl-aċetonitril) għal tal-inqas sagħtejn qabel ma ssir is-sessjoni. L-analiżi tal-HPLC għandha ssir bl-użu ta' rata tal-fluss ta' 0,35 ml/min u gradjent lineari minn 10 % għal 25 % aċetonitril għal 10 minuti, segwita minn żieda rapida għal 90 % aċetonitril sabiex jitneħħew materjali oħrajn. Għandhom jiġu injettati volumi indaqs ta' kull standard, kampjun u kontroll. Il-kolonna għandha terġa' tiġi ekwilibrata għall-kundizzjonijiet inizjali għal 7 minuti bejn l-injezzjonijiet. Jekk tintuża kolonna ta' fażi inversa differenti tal-HPLC, il-parametri tal-issettjar deskritti hawn fuq jista' jkollhom bżonn li jiġu aġġustati sabiex jiggarantixxu elwizzjoni u integrazzjoni xierqa tal-peptidi taċ-ċisteina u l-liżina, inkluż il-volum tal-injezzjoni, li jista' jvarja skont is-sistema użata (tipikament fil-medda ta' bejn 3-10 μl). Ta' min jgħid li jekk jintuża ssettjar alternattiv tal-HPLC, għandha tintwera l-ekwivalenza tiegħu għall-issettjar ivvalidat deskritt hawn fuq (eż. bl-ittestjar tas-sustanzi ta' profiċjenza fl-Appendiċi 2). L-assorbità hija ssorveljata f'220 nm. Jekk jintuża detettur b'serje ta' fotodijodi, għandha tiġi rreġistrata l-assorbità f'258 nm ukoll. Ta' min jinnota li wħud mill-provvisti ta' aċetonitril jista' jkollhom impatt negattiv fuq l-istabilità tal-peptidi u dan irid jiġi vvalutat meta jintuża lott ġdid ta' aċetonitril. Il-proporzjon tal-erja tal-ogħla livell ta' 220 u l-erja tal-ogħla livell ta' 258 jista' jintuża bħala indikatur ta' koelwizzjoni. Għal kull kampjun, proporzjon fil-medda ta' proporzjon tal-erja < medja (19) ta' 90 % tal-kampjuni tal-kontroll < 100 % tkun indikazzjoni tajba li ma seħħitx koelwizzjoni.
                     Jista' jkun hemm sustanzi kimiċi tat-test li jistgħu jippromwovu l-ossidazzjoni tal-peptid taċ-ċisteina. L-ogħla livell tal-peptid taċ-ċisteina dimerizzat jista' jiġi ssorveljat viżwalment. Jekk jidher li tkun seħħet dimerizzazzjoni, din għandha titniżżel peress li tnaqqis fil-perċentwal ta' peptidi jista' jkun sopravvalutat u jwassal għal tbassir ta' foloz pożittivi u/jew assenjament fi klassi ta' reattività ogħla (ara l-paragrafi 29 u 30).
                     L-analiżi tal-HPLC għall-peptidi taċ-ċisteina u l-liżina tista' ssir b'mod parallel (jekk ikun hemm żewġ sistemi tal-HPLC disponibbli( jew f'jiem separati. Jekk l-analiżi ssir f'jiem separati, is-soluzzjonijiet kimiċi kollha tat-test għandhom jitħejjew ġodda għaż-żewġ assaġġi f'kull jum. L-analiżi għandha tiġi ssir f'ħin allokat sabiex jiġi żgurat li l-injezzjoni tal-ewwel kampjun tibda 22 sa 26 siegħa wara li s-sustanza kimika tat-test tħalltet mas-soluzzjoni tal-peptidi. Is-sekwenza tas-sessjoni tal-HPLC għandha tiġi stabbilita sabiex il-ħin tal-analiżi tal-HPLC jinżamm għal inqas minn 30 siegħa. Għall-issettjar tal-HPLC użat fl-istudju ta' validazzjoni u deskritt f'dan il-metodu ta' ttestjar, jistgħu jiġu akkomodati sa 26 kampjun tal-analiżi f'sessjoni waħda tal-HPLC (ara l-paragrafu 17 ukoll). Eżempju tat-twettiq tal-analiżi tal-HPLC huwa pprovdut fl-Appendiċi 3.
                     DEJTA U RAPPORTAR
                     
                        Evalwazzjoni tad-Dejta
                     
                     Il-konċentrazzjoni tal-peptid taċ-ċisteina jew il-liżina tiġi stabbilita b'mod fotometriku f'220 nm f'kull kampjun billi titkejjel l-erja tal-ogħla livell (erja taħt il-kurva, AUC) tal-livelli għoljin xierqa u billi tiġi kkalkolata l-konċentrazzjoni tal-peptid bl-użu tal-kurva ta' kalibrazzjoni lineari derivata mill-istandards.
                     It-tnaqqis fil-perċentwal ta' peptidi huwa stabbilit f'kull kampjun billi titkejjel l-erja tal-ogħla livell u tiġi diviża bl-erja tal-ogħla livell medja tal-kontrolli ta' referenza rilevanti C (ara l-Appendiċi 3) skont il-formula deskritta hawn taħt.
                     
                        
                     
                        Kriterji ta' aċċettazzjoni
                     
                     Sabiex sessjoni titqies valida għandhom jiġu ssodisfati l-kundizzjonijiet li ġejjin:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 il-kurva ta' kalibrazzjoni standard għandu jkollha r2> 0,99,
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 il-valur medju tat-tnaqqis fil-perċentwal ta' peptidi tat-tliet repliki għall-aldeid ċinnamiku tal-kontroll pożittiv għandu jkun ta' bejn 60.8 % u 100 % għall-peptid taċ-ċisteina u bejn 40,2 % u 69,0 % għall-peptid tal-liżina u d-devjazzjoni standard massima (SD) għar-repliki tal-kontroll pożittiv għandha tkun ta' < 14,9 % għat-tnaqqis fil-perċentwal ta' ċisteina u < 11,6 % għat-tnaqqis fil-perċentwal ta' liżina, u
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 il-konċentrazzjoni medja tal-peptidi tal-kontrolli ta' referenza A għandha tkun ta' 0,50 ± 0.05 mM u l-koeffiċjent ta' varjazzjoni (CV) tal-erji tal-ogħla livell tal-peptidi għad-disa' kontrolli ta' referenza B u Ċ fl-aċetonitril għandha tkun ta' < 15.0 %.
                              
                           Jekk ma jkunx issodisfat wieħed jew iktar minn dawn il-kriterji, is-sessjoni għandha terġa' ssir.
                     Sabiex ir-riżultati ta' sustanza kimika tat-test jitqiesu validi għandhom jiġu ssodisfati l-kundizzjonijiet li ġejjin:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 id-devjazzjoni standard massima għar-repliki tas-sustanza kimika tat-test għandha tkun ta' <14.9 % għat-tnaqqis fil-perċentwal ta' ċisteina u <11.6 % għat-tnaqqis fil-perċentwal ta' liżina,
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 il-konċentrazzjoni medja tal-peptidi tat-tliet kontrolli ta' referenza C fis-solvent xieraq għandha tkun ta' 0.50±0.05 mM. Jekk ma jkunux issodisfati dawn il-kriterji, id-dejta għandha tiġi miċħuda u s-sessjoni għandha terġa' ssir għal dik is-sustanza kimika tat-test speċifika.
                              
                           
                        Mudell ta' tbassir
                     
                     Il-valur medju ta' tnaqqis fil-perċentwal ta' liżina u ċisteina jiġi kkalkolat għal kull sustanza kimika tat-test. Tnaqqis negattiv jitqies bħala “0” meta tiġi kkalkolata l-medja. Bl-użu tal-mudell ta' tbassir ta' ċisteina 1:10/liżina 1:50 muri fit-Tabella 1, il-limitu ta' tnaqqis medju ta' 6.38 % tal-peptidi għandu jintuża sabiex isostni d-diskriminazzjoni bejn sensitizzaturi tal-ġilda u mhux sensitizzaturi tal-ġilda fil-kuntest ta' IATA. L-applikazzjoni tal-mudell ta' tbassir għall-assenjament ta' sustanza kimika tat-test għal klassi ta' reattività (jiġifieri reattività baxxa, moderata u għolja) forsi tista' tkun siewja sabiex tiġi informata l-valutazzjoni tal-potenza fi ħdan il-kuntest ta' IATA.
                     
                        Tabella 1
                     
                     
                        Mudell ta' tbassir ta' ċisteina 1:10/liżina 1:50
                         (20)
                     
                     
                                 Medja tat-tnaqqis fil-% ta' ċisteina u liżina
                              
                              
                                 Klassi tar-reattività:
                              
                              
                                 Tbassir tad-DPRA (21)
                                 
                              
                           
                                 0 % ≤ tnaqqis medju % ≤ 6,38 %
                              
                              
                                 Ebda reattività jew reattività minima
                              
                              
                                 Negattiv
                              
                           
                                 6,38 % < tnaqqis medju % ≤ 22,62 %
                              
                              
                                 Reattività baxxa
                              
                              
                                 Pożittiv
                              
                           
                                 22,62 % < tnaqqis medju % ≤ 42,47 %
                              
                              
                                 Reattività moderata
                              
                           
                                 42,47 % < tnaqqis medju % ≤ 100 %
                              
                              
                                 Reattività għolja
                              
                           Jista' jkun hemm każijiet li fihom is-sustanza kimika tat-test (is-sustanza jew wieħed jew bosta mill-komponenti ta' sustanza multikostitwenti jew taħlita) tassorbi b'mod sinifikanti f'220 nm u jkollha l-istess ħin ta' ritenzjoni bħall-peptid (koelwizzjoni). Il-koelwizzjoni tista' tiġi solvita billi jiġi aġġustat bi ftit l-issettjar tal-HPLC sabiex ikompli jiġi separat il-ħin tal-elwizzjoni tas-sustanza kimika tat-test u l-peptid. Jekk jintuża ssettjar alternattiv tal-HPLC sabiex tipprova tiġi solvita l-koelwizzjoni, għandha tintwera l-ekwivalenza tiegħu għall-issettjar ivvalidat (eż. bl-ittestjar tas-sustanzi ta' profiċjenza fl-Appendiċi 2). Meta sseħħ koelwizzjoni, l-ogħla livell tal-peptid ma jistax jiġi integrat u l-kalkolu tat-tnaqqis fil-perċentwal ta' peptidi ma jkunx possibbli. Jekk il-koelwizzjoni tat-tali sustanzi kimiċi tat-test isseħħ kemm bil-peptidi taċ-ċisteina kif ukoll tal-liżina, l-analiżi għandha tiġi rrapportata bħala “inkonklużiva”. F'każijiet li fihom il-koelwizzjoni sseħħ biss bil-peptid tal-liżina, jista' jintuża l-mudell ta' tbassir ta' ċisteina 1:10 irrapportat fit-Tabella 2.
                     
                        Tabella 2
                     
                     
                        Mudell ta' tbassir ta' ċisteina 1:10
                         (22)
                     
                     
                                 Tnaqqis fil-% ta' ċisteina (Cys) %
                              
                              
                                 Klassi ta' reattività
                              
                              
                                 Tbassir tad-DPRA (23)
                                 
                              
                           
                                 0 % ≤ tnaqqis % Cys ≤ 13,89 %
                              
                              
                                 Ebda reattività jew reattività minima
                              
                              
                                 Negattiv
                              
                           
                                 13,89 % < tnaqqis % Cys ≤ 23,09 %
                              
                              
                                 Reattività baxxa
                              
                              
                                 Pożittiv
                              
                           
                                 23,09 % < tnaqqis % Cys ≤ 98,24 %
                              
                              
                                 Reattività moderata
                              
                           
                                 98,24 % < tnaqqis % Cys ≤ 100 %
                              
                              
                                 Reattività għolja
                              
                           Jista' jkun hemm każijiet oħrajn li fihom it-trikkib fil-ħin ta' ritenzjoni bejn is-sustanza kimika tat-test u wieħed mill-peptidi jkun inkomplut. F'dawn il-każijiet, il-valuri ta' tnaqqis fil-perċentwal ta' peptidi jista' jiġi stmat u jintuża fil-mudell ta' tbassir taċ-ċisteina 1:10/liżina 1:50, iżda s-sustanza kimika tat-test ma tistax tiġi assenjata għal klassi ta' reattività bi preċiżjoni.
                     Analiżi waħda tal-HPLC kemm għall-peptid taċ-ċisteina kif ukoll tal-liżina għandha tkun biżżejjed għal sustanza kimika tat-test meta r-riżultat ikun inekwivoku. Madankollu, fi klassijiet ta' riżultati li jiġu qrib il-limitu użat sabiex jiddistingwi bejn riżultati pożittivi u negattivi (jiġifieri riżultati fil-limitu), jaf ikun hemm bżonn li jsiru iktar testijiet. F'sitwazzjonijiet fejn it-tnaqqis fil-perċentwal medju jaqa' fil-medda ta' bejn 3 % sa 10 % għall-mudell ta' tbassir ta' ċisteina 1:10/liżina 1:50 jew it-tnaqqis fil-perċentwal ta' ċisteina jaqa' fil-medda ta' 9 % sa 17 % għall-mudell ta' tbassir ta' ċisteina 1:10, għandha tiġi kkunsidrata t-tieni sessjoni, kif ukoll it-tielet waħda jekk ikun hemm riżultati li ma jaqblux bejn l-ewwel żewġ sessjonijiet.
                     
                        Rapport tat-test
                     
                     Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanza kimika tat-test
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Sustanza monokostitwenti
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Identifikazzjoni kimika, bħall-isem (jew ismijiet) IUPAC jew CAS, in-numru/i CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, u/jew identifikaturi oħrajn;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Id-dehra fiżika, is-solubilità fl-ilma, il-piż molekolari, u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali, meta jkunu disponibbli;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Trattament qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-konċentrazzjoni(jiet) ittestjata/i;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabilità, safejn ikunu disponibbli.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Sustanza multikostitwenti, UVCB u taħlita:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Karatterizzazzjoni safejn possibbli, eż. bl-identità kimika (ara iktar 'il fuq), il-purità, l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti (ara iktar 'il fuq) tal-kostitwenti, safejn ikunu disponibbli;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Id-dehra fiżika, is-solubilità fl-ilma u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali, meta jkunu disponibbli;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-piż molekolari jew il-piż molekolari apparenti fil-każ ta' taħlitiet/polimeri b'kompożizzjonijiet magħrufin jew informazzjoni oħra rilevanti għat-twettiq tal-istudju;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Trattament qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-konċentrazzjoni(jiet) ittestjata/i;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabilità, safejn ikunu disponibbli.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kontrolli
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Kontroll pożittiv
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Identifikazzjoni kimika, bħall-isem (jew ismijiet) IUPAC jew CAS, in-numru/i CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, u/jew identifikaturi oħrajn;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Id-dehra fiżika, is-solubilità fl-ilma, il-piż molekolari, u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali, meta jkunu disponibbli;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Trattament qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-konċentrazzjoni(jiet) ittestjata/i;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabilità, safejn ikunu disponibbli;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Referenza għar-riżultati storiċi tal-kontroll pożittiv li juru kriterji xierqa ta' aċċettazzjoni tas-sessjoni, jekk applikabbli.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Solvent/veikolu
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Is-solvent/il-veikolu użat u l-proporzjon tal-kostitwenti tiegħu, jekk applikabbli;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Identifikazzjoni(jiet) kimika, bħall-isem/ismijiet IUPAC jew CAS, in-numru/i CAS, u/jew identifikaturi oħrajn;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Id-dehra fiżika, is-solubilità fl-ilma, il-piż molekolari, u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali f'każ li jintużaw solventi / veikoli oħrajn li mhumiex dawk imsemmijin fil-metodu ta' ttestjar u safejn ikunu disponibbli;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabilità, safejn ikunu disponibbli;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent għal kull sustanza kimika tat-test;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Għall-aċetonitril, ir-riżultati tat-test tal-impatt fuq l-istabilità tal-peptid.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Preparazzjoni tal-peptidi, il-kontroll pożittiv u s-sustanza kimika tat-test
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-karatterizzazzjoni tas-soluzzjonijiet tal-peptid (il-fornitur, il-lott, il-piż eżatt tal-peptid, il-volum miżjud għas-soluzzjoni ewlenija);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Karatterizzazzjoni tas-soluzzjoni tal-kontroll pożittiv (il-piż eżatt tas-sustanza tal-kontroll pożittiv, il-volum miżjud għas-soluzzjoni tat-test);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Karatterizzazzjoni tas-soluzzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test (il-piż eżatt tas-sustanza kimika tat-test, il-volum miżjud għas-soluzzjoni tat-test).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    L-issettjar tal-istrument u l-analiżi tal-HPLC
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             It-tip ta' strument tal-HPLC, il-kolonni tal-HPLC u l-prekolonni, id-detettur, l-awtokampjunatur;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-parametri rilevanti għall-analiżi tal-HPLC bħat-temperatura tal-kolonna, il-volumi tal-injezzjoni, ir-rata tal-fluss u l-gradjent.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    L-idoneità tas-sistema:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             L-erja tal-ogħla livell tal-peptid f'220 nm ta' kull replika standard u tal-kontroll A ta' referenza;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Kurva ta' kalibrazzjoni lineari rappreżentata b'mod grafiku u r-r2 irrapportata;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-konċentrazzjoni tal-peptid ta' kull replika tal-kontroll A ta' referenza;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-konċentrazzjoni medja tal-peptidi (mM) tat-tliet kontrolli ta' referenza A, SD u CV;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-konċentrazzjoni tal-peptid tal-kontroll ta' referenza A u C.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sekwenza tal-analiżi
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Għall-kontrolli ta' referenza:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         L-erja tal-ogħla livell tal-peptid f'220 nm ta' kull replika B u C;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         L-erja tal-ogħla livell medja tal-peptid f'220 nm tad-disa' kontrolli ta' referenza B u C fl-aċetonitril, SD u CV (għall-istabilità tal-kontrolli ta' referenza tul il-ħin tal-analiżi);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Għal kull solvent użat, l-erja tal-ogħla livell medja tal-peptidi f'220 nm tat-tliet kontrolli ta' referenza xierqa C (għall-kalkolu tat-tnaqqis fil-perċentwal ta' peptidi);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Għal kull solvent użat, il-konċentrazzjoni ta' peptidi (mM) tat-tliet kontrolli ta' referenza xierqa C;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Għal kull solvent użat, il-konċentrazzjoni medja ta' peptidi (mM) tat-tliet kontrolli ta' referenza xierqa C, SD u CV.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Għall-kontroll pożittiv:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         L-erja tal-ogħla livell tal-peptid f'220 nm ta' kull replika;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         It-tnaqqis fil-perċentwal ta' peptidi ta' kull replika;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         It-tnaqqis medju fil-perċentwal ta' peptidi tat-tliet repliki, SD u CV.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Għal kull sustanza kimika tat-test:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Id-dehra tal-preċipitat fit-taħlita tar-rispons fi tmiem il-ħin tal-inkubazzjoni, jekk osservat. Jekk il-preċipitat reġa' ġie solubilizzat jew ġie ċentrifugat;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-preżenza ta' koelwizzjoni;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Deskrizzjoni ta' kull osservazzjoni rilevanti oħra osservata, jekk applikabbli;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         L-erja tal-ogħla livell tal-peptid f'220 nm ta' kull replika;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         It-tnaqqis fil-perċentwal ta' peptidi ta' kull replika;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-medja tat-tnaqqis fil-perċentwal ta' peptidi tat-tliet repliki, SD u CV;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-medja tal-valuri ta' tnaqqis fil-perċentwal ta' ċisteina u liżina;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-mudell ta' tbassir użat u t-tbassir tad-DPRA.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ittestjar tal-profiċjenza
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Jekk applikabbli, il-proċedura użata sabiex tintwera l-profiċjenza tal-laboratorju sabiex iwettaq il-metodu ta' ttestjar (eż. billi jiġu ttestjati s-sustanzi ta' profiċjenza) jew sabiex tintwera prestazzjoni riproduċibbli tal-metodu ta' ttestjar matul iż-żmien.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Diskussjoni tar-riżultati
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Diskussjoni tar-riżultati miksubin bil-metodu ta' ttestjar tad-DPRA;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Diskussjoni tar-riżultati tal-metodu ta' ttestjar fil-kuntest ta' IATA jekk ikun hemm informazzjoni rilevanti oħra disponibbli.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Konklużjoni
                                 
                              
                           TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2013. Disponibbli fuq: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Series on Testing and Assessment No. 168, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu B.6 ta' dan l-Anness: Sensitizzazzjoni tal-ġilda.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu B.42 ta' dan l-Anness: L-Assaġġ Lokali tal-Limfonodi
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu B.50 ta' dan l-Anness: Sensitizzazzjoni tal-ġilda: Assaġġ Lokali tal-Limfonodi: DA.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu B.51 ta' dan l-Anness: Sensitizzazzjoni tal-ġilda: Assaġġ Lokali tal-Limfonodi BrdU-ELISA
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Adler et al. (2011). Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010. Archives of Toxicology 85:367-485.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Gerberick et al. (2004). Development of a peptide reactivity assay for screening contact allergens. Toxicological Sciences 81:332-343.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Gerberick et al. (2007). Quantification of chemical peptide reactivity for screening contact allergens: A classification tree model approach. Toxicological Sciences 97:417-427.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 EC EURL-ECVAM (2013). Recommendation on the Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) for skin sensitisation testing. Disponibbli fuq: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Jaworska et al. (2013). Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice. Journal of Applied Toxicology, published online, 14 May 2013, DOI: 10.1002/jat.2869.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Bauch et al. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potential. Regulatory Toxicology and Pharmacology 63: 489-504.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Nukada et al. (2013). Data integration of non-animal tests for the development of a test battery to predict the skin sensitizing potential and potency of chemicals. Toxicology in vitro 27:609 618.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Ball et al (2011). Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach. Regulatory Toxicology and Pharmacology 60:389-400.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Landsteiner and Jacobs (1936). Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds. Journal of Experimental Medicine 64:625-639.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Dupuis and Benezra (1982). Allergic contact dermatitis to simple chemicals: a molecular approach. New York & Basel: Marcel Dekker Inc.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Lepoittevin et al. (1998). Allergic contact dermatitis: the molecular basis. Springer, Berlin.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 EC EURL ECVAM (2012). Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) Validation Study Report 74pp. Disponibbli fuq: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Natsch et al. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation. Journal of Applied Toxicology, published online, 9 April 2013, DOI:10.1002/jat.2868.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 DB-ALM (INVITTOX) Protocol 154: Direct Peptide Reactivity assay (DPRA) for skin sensitisation testing 17pp. Disponibbli fuq: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Series on Testing and Assessment, No. 34. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris, France.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 FDA (Food and Drug Administration (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation 22pp. Disponibbli fuq: www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidance/ucm070107.pdf — 138
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87).
                              
                           
                        Appendiċi 1
                        DEFINIZZJONIJIET
                        
                           
                              Preċiżjoni
                           : Il-qrubija fil-livell ta' qbil bejn ir-riżultati tal-metodu ta' ttestjar u l-valuri ta' referenza aċċettati. Hija kejl tal-prestazzjoni tal-metodu ta' ttestjar u wieħed mill-aspetti ta'“rilevanza”. It-terminu jintuża spiss minflok “konkordanza” sabiex ifisser il-proporzjon ta' riżultati tajbin tal-metodu ta' ttestjar (21).
                        
                           
                              AOP (Passaġġ tal-Eżitu Avvers)
                           : Sekwenza ta' avvenimenti mill-istruttura kimika ta' sustanza kimika fil-mira jew grupp ta' sustanzi kimiċi simili permezz tal-avveniment ta' inizjazzjoni molekolari għal eżitu ta' interess in vivo (2).
                        
                           
                              Kurva ta' kalibrazzjoni
                           : Ir-relazzjoni bejn il-valur tar-rispons sperimentali u l-konċentrazzjoni analitika (imsejħa wkoll kurva standard) ta' sustanza magħrufa.
                        
                           
                              Sustanza Kimika
                           : Sustanza jew taħlita.
                        
                           
                              Koeffiċjent ta' varjazzjoni
                           : Kejl tal-varjabbiltà li huwa kkalkolat għal grupp ta' dejta dwar ir-repliki billi d-devjazzjoni standard tiġi diviża bil-medja. Jista' jiġi mmoltiplikat b'100 għall-espressjoni bħala perċentwal.
                        
                           
                              Periklu
                           : Proprjetà inerenti ta' aġent jew sitwazzjoni li għandhom il-potenzjal li jikkawżaw effetti avversi meta organiżmu, sistema jew (sub)popolazzjoni jiġu esposti għal dak l-aġent.
                        
                           
                              IATA (Approċċ Integrat għall-Ittestjar u l-Valutazzjoni)
                           : Approċċ strutturat użat għall-identifikazzjoni ta' perikli (potenzjal), il-karatterizzazzjoni tal-perikli (potenza) u/jew valutazzjoni tas-sikurezza (potenzjal/potenza u esponiment ) ta' sustanza kimika jew grupp ta' sustanzi kimiċi, li tintegra b'mod strutturat u jiżen id-dejta rilevanti kollha sabiex jinforma deċiżjoni regolatorja dwar il-periklu u/jew ir-riskju u/jew il-ħtieġa potenzjali għal ittestjar immirat ulterjuri li, għaldaqstant, ikun minimu.
                        
                           
                              Avveniment ta' Inizjazzjoni Molekolari
                           : Perturbazzjoni indotta kimikament ta' sistema bijoloġika fil-livell molekolari identifikata li hija l-avveniment tal-bidu fil-passaġġ tal-eżitu avvers.
                        
                           
                              Taħlita
                           : Taħlita jew soluzzjoni msawra minn żewġ sustanzi jew iktar li fiha ma jirreaġixxux (1).
                        
                           
                              Sustanza monokostitwenti
                           : Sustanza, definita mill-kompożizzjoni kwantitattiva tagħha, lifiha kostitwent ewlieni wieħed ikun preżenti għal tal-inqas 80 % (w/w).
                        
                           
                              Sustanza multikostitwenti
                           : Sustanza, definita mill-kompożizzjoni kwantitattiva tagħha, li fiha iktar minn kostitwent ewlieni wieħed ikunu preżenti f'konċentrazzjoni ≥ 10 % (w/w) u < 80 % (w/w). Sustanza multikostitwenti hija r-riżultat ta' proċess tal-manifattura. Id-differenza bejn taħlita u sustanza multikostitwenti hija li taħlita tinkiseb bl-amalgamar ta' żewġ sustanzi jew iktar mingħajr reazzjoni kimika. Sustanza multikostitwenti hija r-riżultat ta' reazzjoni kimika.
                        
                           
                              Kontroll pożittiv
                           : Replika li jkun fiha l-komponenti kollha ta' sistema tat-test u trattata b'sustanza li jkun magħruf li tikkawża rispons pożittiv. Sabiex jiġi żgurat li l-varjabilità fir-rispons tal-kontroll pożittiv tkun tista' tiġi vvalutata tul iż-żmien, id-daqs tar-rispons pożittiv ma għandux ikun eċċessiv.
                        
                           
                              Kontroll ta' referenza
                           : Kampjun mhux ittrattat li fih il-komponenti kollha ta' sistema tat-test, inkluż is-solvent jew il-veikolu li jiġi pproċessat mal-kampjuni ttrattati bis-sustanza kimika tat-test u kampjuni tal-kontroll oħrajn sabiex jiġi stabbilit ir-rispons bażi għall-kampjuni ttrattati bis-sustanza kimika tat-test dissolta fl-istess solvent jew veikolu. Meta jiġi ttestjat ma' kontroll negattiv parallel, dan il-kampjun juri wkoll jekk is-solvent jew il-veikolu jkollux interazzjoni mas-sistema tat-test.
                        
                           
                              Rilevanza
                           : Deskrizzjoni tar-relazzjoni tat-test għall-effett ta' interess u jekk huwiex sinifikanti u utli għal skop partikolari. Din tiddetermina kemm it-test għandu l-ħila jkejjel jew ibassar b'mod korrett l-effett bijoloġiku ta' interess. Ir-rilevanza tinkorpora l-kunsiderazzoni tal-preċiżjoni (konkordanza ta' metodu ta' ttestjar) (21).
                        
                           
                              Affidabilità
                           : Kejliet ta' kemm metodu ta' ttestjar jista' jitwettaq b'mod riproduċibbli fil-laboratorji u bejn il-laboratorji tul iż-żmien, meta jitwettaq billi jintuża l-istess protokoll. Din tiġi evalwata billi tkun ikkalkolata r-riproduċibbilità fl-istess u bejn il-laboratorarji u r-ripetibilità fl-istess laboratorju (21).
                        
                           
                              Riproduċibilità
                           : Il-qbil bejn ir-riżultati miksub mill-ittestjar tal-istess sustanza kimika bl-użu tal-istess protokoll tat-test (ara affidabbiltà) (21).
                        
                           
                              Sensittività
                           : Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi pożittivi/attivi kollha li huma klassifikati kif suppost mill-metodu ta' ttestjar. Hija kejl tal-preċiżjoni għal metodu ta' ttestjar li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hija kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta' metodu ta' ttestjar (21).
                        
                           
                              Speċifiċità
                           : Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi negattivi/inattivi kollha li huma klassifikati kif suppost mill-metodu ta' ttestjar. Hija kejl tal-preċiżjoni għal metodu ta' ttestjar li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hija kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta' metodu ta' ttestjar (21).
                        
                           
                              Sustanza
                           : Elementi kimiċi u l-komposti tagħhom fl-istat naturali jew miksubin bi kwalunkwe proċess ta' produzzjoni, inkluż kwalunkwe addittiv meħtieġ għall-preservazzjoni tal-istabilità tal-prodott u ta' kwalunkwe impurità li toriġina mill-proċess użat, imma eskluż kwalunkwe solvent li jista' jkun separat mingħajr ma jaffetwa l-istabilità tas-sustanza jew ibiddel il-kompożizzjoni tagħha (1).
                        
                           
                              L-idoneità tas-sistema
                           : L-istabbiliment tal-prestazzjoni tal-istrument (eż. is-sensittività) b'analiżi ta' standard ta' referenza qabel ma ssir l-analiżi tal-lott (22).
                        
                           
                              Sustanza kimika tat-test
                           : It-terminu “sustanza kimika tat-test” jintuża sabiex jirreferi għal dik li qiegħda tiġi ttestjata.
                        
                           
                              Is-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta' Sustanzi Kimiċi tan-Nazzjonijiet Uniti (GHS tan-NU)
                           : Sistema li tipproponi l-klassifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) skont it-tipi u l-livelli standardizzati ta' perikli fiżiċi, sanitarji u ambjentali, u tindirizza l-elementi ta' komunikazzjoni korrispondenti, bħal pittogrammi, kliem ta' twissija, dikjarazzjonijiet ta' periklu, dikjarazzjonijiet ta' prekawzjoni u skedi ta' tagħrif dwar is-sikurezza, sabiex jitwassal tagħrif dwar l-effetti avversi bil-għan li n-nies ikunu protetti (inklużi min iħaddem, il-ħaddiema, it-trasportaturi, il-konsumaturi u l-ħaddiema tal-emerġenza) u l-ambjent (1).
                        
                           
                              UVCB
                           : Sustanzi kimiċi b'kompożizzjoni mhux magħrufa jew varjabbli, prodotti b'reazzjoni kumplessa jew materjali bijoloġiċi.
                        
                           
                              Metodu ta' ttestjar validu
                           : Metodu ta' ttestjar meqjus li għandu biżżejjed rilevanza u affidabilità għal skop speċifiku u li huwa bbażat fuq prinċipji xjentifiċi sodi. Metodu ta' ttestjar qatt ma jkunx validu f'sens assolut, iżda biss b'rabta ma' skop definit (21).
                     
                     
                        Appendiċi 2
                        SUSTANZI TA' PROFIĊJENZA
                        
                           Sensitizzazzjoni tal-Ġilda In Chemico: Assaġġ Dirett tar-Reattività tal-Peptidi
                        
                        Qabel l-użu ta' rutina ta' dan il-metodu ta' ttestjar, il-laboratorji għandhom juru l-profiċjenza teknika billi jiksbu b'mod korrett it-tbassir mistenni tad-DPRA għall-10 sustanzi ta' profiċjenza rakkomandati fit-Tabella 1 u billi jiksbu valuri ta' tnaqqis taċ-ċisteina u l-liżina li jaqgħu fi ħdan il-medda ta' referenza rispettiva għal 8 mill-10 sustanzi ta' profiċjenza għal kull peptid. Dawn is-sustanzi ta' profiċjenza ntgħażlu sabiex jirrappreżentaw il-firxa ta' risponsi għal perikli ta' sensitizzazzjoni tal-ġilda. Kriterji tal-għażla oħrajn kienu li jkunu disponibbli fis-suq, li hemm dejta ta' referenza in vivo ta' kwalità għolja u dejta in vitro ta' kwalità għolja bid-DPRA għad-dispożizzjoni, u li ntużaw fl-istudju ta' validazzjoni koordinat mill-ECVAM tal-EURL sabiex tintwera l-implimentazzjoni b'suċċess tal-metodu ta' ttestjar fil-laboratorji li jieħdu sehem fl-istudju.
                        
                           Tabella 1
                        
                        
                           Sustanzi ta' profiċjenza rrakkomandati sabiex tintwera l-profiċjenza teknika bl-Assaġġ Dirett tar-Reattività tal-Peptidi
                        
                        
                                    Sustanzi ta' Profiċjenza
                                 
                                 
                                    CASRN
                                 
                                 
                                    stat fiżiku
                                 
                                 
                                    Tbassir In Vivo
                                        (24)
                                    
                                 
                                 
                                    Tbassir tad-DPRA (25)
                                    
                                 
                                 
                                    Medda (26) ta' % tnaqqis tal-peptidi taċ-ċisteina
                                 
                                 
                                    Medda (26) ta' % tnaqqis tal-peptidi tal-liżina
                                 
                              
                                    2,4-Dinitroklorobenżen
                                 
                                 
                                    97-00-7
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Sensitizzatur
                                    (estrem)
                                 
                                 
                                    Pożittiv
                                 
                                 
                                    90-100
                                 
                                 
                                    15-45
                                 
                              
                                    Ossażolon
                                 
                                 
                                    15646-46-5
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Sensitizzatur
                                    (estrem)
                                 
                                 
                                    Pożittiv
                                 
                                 
                                    60-80
                                 
                                 
                                    10-55
                                 
                              
                                    Formaldeid
                                 
                                 
                                    50-00-0
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Sensitizzatur
                                    (b'saħħtu)
                                 
                                 
                                    Pożittiv
                                 
                                 
                                    30-60
                                 
                                 
                                    0-24
                                 
                              
                                    Benżiliden-aċeton
                                 
                                 
                                    122-57-6
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Sensitizzatur
                                    (moderat)
                                 
                                 
                                    Pożittiv
                                 
                                 
                                    80-100
                                 
                                 
                                    0-7
                                 
                              
                                    Farnesal
                                 
                                 
                                    19317-11-4
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Sensitizzatur
                                    (dgħajjef)
                                 
                                 
                                    Pożittiv
                                 
                                 
                                    15-55
                                 
                                 
                                    0-25
                                 
                              
                                    2,3-Butanedjon
                                 
                                 
                                    431-03-8
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Sensitizzatur
                                    (dgħajjef)
                                 
                                 
                                    Pożittiv
                                 
                                 
                                    60-100
                                 
                                 
                                    10-45
                                 
                              
                                    1-Butanol
                                 
                                 
                                    71-36-3
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Mhux sensitizzatur
                                 
                                 
                                    Negattiv
                                 
                                 
                                    0-7
                                 
                                 
                                    0-5,5
                                 
                              
                                    6-Metilkumarin
                                 
                                 
                                    92-48-8
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Mhux sensitizzatur
                                 
                                 
                                    Negattiv
                                 
                                 
                                    0-7
                                 
                                 
                                    0-5,5
                                 
                              
                                    Aċidu Lattiku
                                 
                                 
                                    50-21-5
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Mhux sensitizzatur
                                 
                                 
                                    Negattiv
                                 
                                 
                                    0-7
                                 
                                 
                                    0-5,5
                                 
                              
                                    4-Metossiaċetofenon
                                 
                                 
                                    100-06-1
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Mhux sensitizzatur
                                 
                                 
                                    Negattiv
                                 
                                 
                                    0-7
                                 
                                 
                                    0-5,5
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 3
                        
                           EŻEMPJI TA' SEKWENZA TAL-ANALIŻI
                        
                        
                                    
                                       L-istandards tal-kalibraġġ u l-kontrolli ta' referenza
                                    
                                 
                                 
                                    STD1
                                    STD2
                                    STD3
                                    STD4
                                    STD5
                                    STD6
                                    Bafer ta' dilwizzjoni
                                    Kontroll ta' referenza A, rep 1
                                    Kontroll ta' referenza A, rep 2
                                    Kontroll ta' referenza A, rep 3
                                 
                              
                                    
                                       Kontrolli ta' koelwizzjoni
                                    
                                 
                                 
                                    Kontroll ta' koelwizzjoni 1 għas-sustanza kimika tat-test 1
                                    Kontroll ta' koelwizzjoni 2 għas-sustanza kimika tat-test 2
                                 
                              
                                    
                                       Kontrolli ta' referenza
                                    
                                 
                                 
                                    Kontroll ta' referenza B, rep 1
                                    Kontroll ta' referenza B, rep 2
                                    Kontroll ta' referenza B, rep 3
                                 
                              
                                    
                                       L-ewwel sett ta' repliki
                                    
                                 
                                 
                                    Kontroll ta' referenza C, rep 1
                                    Aldeid ċinnamiku, rep 1
                                    Kampjun 1, rep 1
                                    Kampjun 2, rep 1
                                 
                              
                                    
                                       It-tieni sett ta' repliki
                                    
                                 
                                 
                                    Kontroll ta' referenza C, rep 2
                                    Aldeid ċinnamiku, rep 2
                                    Kampjun 1, rep 2
                                    Kampjun 2, rep 2
                                 
                              
                                    
                                       It-tielet sett ta' repliki
                                    
                                 
                                 
                                    Kontroll ta' referenza C, rep 3
                                    Aldeid ċinnamiku, rep 3
                                    Kampjun 1, rep 3
                                    Kampjun 2, rep 3
                                 
                              
                                    
                                       Kontrolli ta' referenza
                                    
                                 
                                 
                                    Kontroll ta' referenza B, rep 4
                                    Kontroll ta' referenza B, rep 5
                                    Kontroll ta' referenza B, rep 6
                                 
                              
                                    Fis-sekwenza tal-analiżi għandhom ikunu inklużi tliet settijiet ta' kontrolli ta' referenza (jiġifieri kampjuni kostitwiti biss mill-peptid dissolt fis-solvent xieraq):
                                    
                                                 
                                             
                                             
                                                Kontroll ta' referenza A: użat sabiex tiġi vverifikata l-idoneità tas-sistema tal-HPLC.
                                             
                                          
                                                 
                                             
                                             
                                                Kontroll ta' referenza B: inkluż fil-bidu u fi tmiem is-sekwenza tal-analiżi sabiex tiġi verifikata l-istabilità tal-kontrolli ta' referenza tul il-ħin tal-analiżi.
                                             
                                          
                                                 
                                             
                                             
                                                Kontroll ta' referenza C: inkluż fis-sekwenza tal-analiżi sabiex jiġi verifikat li s-solvent użat sabiex tiġi dissolta s-sustanza kimika tat-test ma jħallix impatt fuq il-perċentwal ta' tnaqqis ta' peptidi.
                                             
                                          
                              
                     B.60   Sensitizzazzjoni tal-Ġilda In Vitro: Metodu ta' Ttestjar tal-ARE-Nrf2 Luciferase
                     
                     INTRODUZZJONI
                     Dan il-metodu ta' ttestjar (TM) huwa ekwivalenti għal-linja gwida tal-ittestjar (TG) 442D tal-OECD (2015). Sensitizzatur tal-ġilda jirreferi għal sustanza li sejra twassal għal reazzjoni allerġika wara kuntatt mal-ġilda kif definita mis-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta' Sustanzi Kimiċi (GHS) tan-Nazzjonijiet Uniti (NU) (1) u r-Regolament (KE) Nru 1272/2008 dwar il-Klassifikazzjoni, l-Ittikkettar u l-Imballaġġ tas-Sustanzi u t-Taħlitiet (CLP) (27). Dan il-metodu ta' ttestjar jipprovdi proċedura in vitro (l-assaġġ tal-ARE-Nrf2 luciferase) li tintuża sabiex tappoġġja d-diskriminazzjoni bejn sensitizzaturi tal-ġilda u mhux sensitizzaturi tal-ġilda skont il-GHS tan-NU (1) u s-CLP.
                     Hemm qbil ġenerali dwar l-avvenimenti bijoloġiċi ewlenin li jwasslu għas-sensitizzazzjoni tal-ġilda. L-għarfien eżistenti dwar il-mekkaniżmi kimiċi u bijoloġiċi assoċjati mas-sensitizzazzjoni tal-ġilda nġabar fil-forma ta' Passaġġ tal-Eżitu Avvers (AOP) (2), mill-avveniment ta' inizjazzjoni molekolari permezz tal-avvenimenti intermedji għall-effett avvers fuq is-saħħa, jiġifieri dermatite b'kuntatt allerġiku fil-bniedem jew ipersensittività b'kuntatt f'rodituri (2) (3). L-avveniment ta' inizjazzjoni molekolari huwa l-irbit kovalenti ta' sustanzi elettrofiliċi ma' ċentri nukleofiliċi fil-proteini tal-ġilda. It-tieni avveniment ewlieni f'dan l-AOP iseħħ fil-keratinoċiti u jinkludi risponsi infjammatorji kif ukoll l-espressjoni tal-ġeni assoċjata mal-passaġġi tas-sinjalar taċ-ċelloli speċifiċi bħall-passaġġi dipendenti fuq l-element ta' rispons tal-elettrofili/antiossidanti (ARE). It-tielet avveniment ewlieni huwa l-attivazzjoni ta' ċelloli dendritiċi, tipikament ivvalutata bl-espressjoni ta' markaturi tal-wiċċ taċ-ċelloli, kemikini u ċitokini speċifiċi. Ir-raba' element ewlieni huwa l-proliferazzjoni taċ-ċellola-T, li tiġi vvalutata b'mod indirett fl-Assaġġ Lokali tal-Limfonodi murin (4).
                     Normalment, il-valutazzjoni tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda kienet tinvolvi l-użu ta' annimali tal-laboratorju. Il-metodi klassiċi bbażati fuq fniek tal-indi, it-Test ta' Massimizzazzjoni tal-Fniek tal-Indi ta' Magnusson Kligman (GMPT) u t-Test Buehler (TM B.6 (5)), jistudjaw kemm il-fażi tal-induzzjoni kif ukoll il-fażi tal-eliċitazzjoni tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda. Test murin, l-Assaġġ Lokali tal-Limfonodi (LLNA, TM B.42 (4)) u ż-żewġ modifiki mhux radjuattivi tiegħu, LLNA: DA (TM B.50 (6)) u LLNA: BrdU-ELISA (TM B.51 (7)), li lkoll jivvalutaw ir-rispons tal-induzzjoni b'mod esklussiv, ġew aċċettati wkoll peress li jagħtu vantaġġi fuq it-testijiet fuq il-ħnieżer tal-indi kemm f'termini tat-trattament xieraq tal-annimali kif ukoll tal-kejl oġġettiv tal-fażi tal-induzzjoni tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda.
                     Iktar riċentement, metodi ta' ttestjar in chemico u in vitro bbażati mekkanistikament tqiesu xjentifikament validi għall-evalwazzjoni tal-periklu ta' sensitizzazzjoni tal-ġilda tas-sustanzi kimiċi. Madankollu, taħlitiet ta' metodi mhux tal-annimali (in silico, in chemico, in vitro) fi ħdan Approċċi Integrati għall-Ittestjar u l-Valutazzjoni (IATA) sejrin ikunu meħtieġa sabiex ikunu sostitwiti bis-sħiħ it-testijiet fuq l-annimali li jintużaw bħalissa fid-dawl tal-kopertura mekkanistika ristretta tal-AOP ta' kull wieħed mill-metodi ta' ttestjar mhux fuq l-annimali li għandna għad-dispożizzjoni bħalissa (2) (3).
                     Dan il-metodu ta' ttestjar (assaġġ tal-ARE-Nrf2 luciferase) huwa propost sabiex jiġi indirizzat it-tieni avveniment ewlieni kif spjegat fil-paragrafu 2. Is-sensitizzaturi tal-ġilda ġew irrapportati li jinduċu ġeni li huma rregolati mill-element ta' rispons tal-antiossidanti (ARE) (8) (9). Sustanzi elettrofiliċi żgħar bħal sensitizzaturi tal-ġilda jistgħu jaġixxu fuq il-proteina sensur Keap1 (proteina 1 assoċjata mal-ECH bħall-Kelch), b'pereżempju modifika kovalenti tar-residwu taċ-ċisteina tagħha, li tirriżulta fid-dissoċjazzjoni tagħha mill-fattur ta' traskrizzjoni Nrf2 (fattur 2 relatat mal-eritrojde 2 tal-fattur nukleari). Imbagħad l-Nrf2 dissoċjat jista' jattiva ġeni dipendenti fuq l-ARE bħal dawk li jikkodifikaw għal enzimi detossifikanti tal-fażi II (8) (10) (11).
                     Bħalissa, l-uniku assaġġ in vitro ARE-Nrf2 luciferase kopert minn dan il-metodu ta' ttestjar huwa l-assaġġ KeratinoSensTM li għalih saru studji ta' validazzjoni (9) (12) (13) segwiti minn reviżjoni bejn il-pari indipendenti li ssir mil-Laboratorju ta' Referenza tal-Unjoni Ewropea għal Alternattivi għall-Ittestjar fuq l-Annimali (EURL ECVAM) (14). L-assaġġ KeratinoSensTM tqies li huwa xjentifikament validu sabiex jintuża bħala parti minn IATA għall-appoġġ tad-diskriminazzjoni bejn sensitizzaturi tal-ġilda u mhux sensitizzaturi tal-ġilda għall-fini ta' klassifikazzjoni u tikkettar tal-periklu (14). Il-laboratorji li lesti li jimplimentaw il-metodu ta' ttestjar jistgħu jiksbu l-linja ta' ċelloli rikombinanti użata fl-assaġġ KeratinoSensTM billi jistabbilixxu qbil fuq il-liċenzji mal-iżviluppatur tal-metodu ta' ttestjar (15).
                     Id-definizzjonijiet huma pprovduti fl-Appendiċi 1.
                     KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI, APPLIKABILITÀ U LIMITAZZJONIJIET
                     Peress li l-attivazzjoni tal-passaġġ tal-Keap1-Nrf2-ARE tindirizza biss it-tieni avveniment ewlieni tal-AOP tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda, l-informazzjoni mill-metodi ta' ttestjar fuq il-bażi tal-attivazzjoni ta' dan il-passaġġ aktarx li ma tkunx biżżejjed meta tintuża waħedha sabiex tinħareġ konklużjoni fuq il-potenzjal ta' sensitizzazzjoni tal-ġilda tas-sustanzi kimiċi. Għaldaqstant, dejta ġġenerata b'dan il-metodu ta' ttestjar għandha tiġi kkunsidrata fil-kuntest ta' approċċi integrati bħall-IATA, biex b'hekk tiġi kombinata ma' informazzjoni komplimentari oħra, eż. derivata minn assaġġi in vitro li jindirizzaw avvenimenti ewlenin oħrajn tal-AOP tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda kif ukoll metodi mhux ta' ttestjar inkluż read-across minn analogi kimiċi. Eżempji dwar kif jintuża l-metodu ta' ttestjar ARE-Nrf2 luciferase flimkien ma' informazzjoni oħra huma rrapportati fit-tagħrif (13) (16) (17) (18) (19).
                     Dan il-metodu ta' ttestjar jista' jintuża sabiex jappoġġja d-diskriminazzjoni bejn is-sensitizzaturi tal-ġilda (jiġifieri Kategorija 1 tal-GHS tan-NU/CLP) u mhux sensitizzaturi fil-kuntest tal-IATA. Dan il-metodu ta' ttestjar ma jistax jintuża waħdu, lanqas sabiex jiġu sottokategorizzati sensitizzaturi tal-ġilda f'sottokategoriji 1A u 1B kif definiti mill-GHS/CLP tan-NU, u lanqas sabiex titbassar il-potenza għal deċiżjonijiet dwar il-valutazzjoni tas-sikurezza. Madankollu, skont il-qafas regolatorju, riżultat pożittiv jista' jintuża waħdu sabiex sustanza kimika tiġi klassifikata fil-kategorija 1 tal-GHS/CLP tan-NU.
                     Fuq il-bażi tas-sett ta' dejta mill-istudju ta' validazzjoni u l-ittestjar li jsir internament għar-reviżjoni bejn il-pari indipendenti tal-metodu ta' ttestjar, l-assaġġ KeratinoSensTM wera li huwa trasferibbli għal laboratorji esperjenzati fil-kultura taċ-ċelloli. Il-livell ta' riproduċibbilità fil-previżjonijiet li jistgħu jkunu mistennijin mill-metodu ta' ttestjar huwa fl-ordni ta' 85 % fi ħdan il-laboratorji u bejn il-laboratorji (14). Il-preċiżjoni (77 % — 155/201), is-sensittività (78 % — 71/91) u l-ispeċifiċità (76 % — 84/110) tal-assaġġ KeratinoSensTM għad-diskriminazzjoni bejn sensitizzaturi tal-ġilda (jiġifieri Kat. 1 tal-GHS tan-NU/CLP) u mhux sensitizzaturi meta mqabblin mar-riżultati tal-LLNA ġew ikkalkolati billi ġiet ikkunsidrata d-dejta kollha li ġiet sottomessa lill-EURL ECVAM għall-evalwazzjoni u reviżjoni bejn il-pari tal-metodu ta' ttestjar (14). Dawn il-figuri huma simili għal dawk li dan l-aħħar ġew ippubblikati dwar l-ittestjar li sar internament ta' madwar 145 sustanza (77 % preċiżjoni, 79 % sensittività, 72 % speċifiċità) (13). L-assaġġ KeratinoSensTM għandu probabilità ikbar li jbassar sustanzi kimiċi li juru potenza baxxa sa moderata tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda (jiġifieri sottokategorija 1B tas-CLP/GHS tan-NU) minn sustanzi kimiċi li juru potenza għolja tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda (jiġifieri sottokategorija 1A tas-CLP/GHS tan-NU) (13) (14). Meħuda kollha f'daqqa, din l-informazzjoni tindika l-utilità tal-assaġġ KeratinoSensTM sabiex jikkontribwixxi għall-identifikazzjoni tal-periklu ta' sensitizzazzjoni tal-ġilda. Madankollu, il-valuri tal-preċiżjoni mogħtijin hawnhekk għall-assaġġ KeratinoSensTM bħala metodu ta' ttestjar waħdu huma indikattivi biss peress li l-metodu ta' ttestjar għandu jiġi kkunsidrat flimkien ma' sorsi oħrajn ta' informazzjoni fil-kuntest ta' IATA u skont id-dispożizzjonijiet tal-paragrafu 9 ta' hawn fuq. Barra minn hekk, meta jiġu evalwati metodi mhux fuq l-annimali għas-sensitizzazzjoni tal-ġilda, ta' min jiftakar li l-LLNA kif ukoll testijiet oħrajn fuq l-annimali jaf ma jirriflettux is-sitwazzjoni sħiħa fl-ispeċi ta' interess, jiġifieri fil-bniedem.
                     It-terminu “sustanza kimika tat-test” jintuża f'dan il-metodu ta' ttestjar sabiex jirreferi għal dak li jkun qiegħed jiġi ttestjat u mhux b'rabta mal-applikabilità tal-metodu ta' ttestjar tal-ARE-Nrf2 luciferase għall-ittestjar ta' sustanzi u/jew taħlitiet. Fuq il-bażi tad-dejta attwali disponibbli, intwera li l-assaġġ KeratinoSensTM huwa applikabbli għal sustanzi kimiċi tat-test li jkopru firxa ta' gruppi funzjonali organiċi, mekkaniżmi ta' reazzjoni, potenza tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda (kif stabbiliti fi studji in vivo) u proprjetajiet fiżikokimiċi (9) (12) (13) (14). Fil-parti l-kbira ġew ittestjati sustanzi monokostitwenti, għad li jeżisti wkoll ammont limitat ta' dejta fuq l-ittestjar ta' taħlitiet (20). Il-metodu ta' ttestjar xorta waħda huwa teknikament applikabbli għall-ittestjar ta' sustanzi multikostitwenti u taħlitiet. Madankollu, qabel ma jintuża dan il-metodu ta' ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta' dejta għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet ma jkunux meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita. Barra minn hekk, meta jiġu ttestjati sustanzi multikostitwenti jew taħlitiet, għandha tingħata kunsiderazzjoni lill-interferenza possibbli tal-kostitwenti ċitotissiċi bir-risponsi osservati. Il-metodu ta' ttestjar huwa applikabbli għal sustanzi kimiċi tat-test solubbli jew li jifformaw dispersjoni stabbli (jiġifieri kollojde jew sospensjoni li fiha s-sustanza kimika tat-test ma tissedimentax jew tissepara mis-solvent f'fażijiet differenti) jew fl-ilma jew f'DMSO (inklużi l-komponenti kollha tas-sustanza kimika tat-test fil-każ ta' ttestjar ta' sustanza multikostitwenti jew taħlita). Is-sustanzi kimiċi li ma jissodisfawx dawn il-kundizzjonijiet fl-ogħla konċentrazzjoni finali meħtieġa ta' 2 000 μM (ara l-paragrafu 22) xorta waħda jistgħu jiġu ttestjati f'konċentrazzjoni inqas. F'dan il-każ, ir-riżultati li jissodisfaw il-kriterji għall-pożittività deskritti fil-paragrafu 39 xorta waħda jistgħu jintużaw sabiex isostnu l-identifikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test bħala sensitizzatur tal-ġilda, filwaqt li riżultat negattiv iksub b'konċentrazzjonijiet < 1 000 μM għandu jitqies bħala inkonklużiv (ara l-mudell ta' tbassir fil-paragrafu 39). F'sustanzi ġenerali b'LogP sa 5 li ġew ittestjati b'suċċess filwaqt li sustanzi ferm idrofobiċi b'LogP ta' iktar minn 7 jiġu barra l-applikabilità magħrufa tal-metodu ta' ttestjar (14). Għal sustanzi b'LogP bejn 5 u 7, hemm biss informazzjoni limitata.
                     Riżultati negattivi għandhom jiġu interpretati bil-galbu peress li sustanzi b'reattività esklussiva għal residwi tal-liżina jistgħu jiġu individwati bħala negattivi mill-metodu ta' ttestjar. Barra minn hekk, minħabba l-kapaċità metabolika limitata tal-linja ta' ċelloli użata (21) u minħabba l-kundizzjonijiet tal-esperiment, proapteni (jiġifieri sustanzi kimiċi li jeħtieġu attivazzjoni enzimatika, pereżempju enzimi P450) u preapteni (jiġifieri sustanzi kimiċi attivati b'awtoossidazzjoni) b'mod partikolari b'rata ta' ossidazzjoni baxxa jistgħu jipprovdu riżultati negattivi wkoll. Min-naħa l-oħra, sustanzi kimiċi tat-test li ma jaġixxux bħala sensitizzatur iżda xorta waħda jkunu stressers kimiċi jistgħu jwasslu għal riżultati foloz pożittivi (14). Barra minn hekk, sustanzi kimiċi tat-test ferm ċitotossiċi dejjem jistgħu jiġu vvalutati b'mod affidabbli. Finalment, sustanzi kimiċi tat-test li jinterferixxu mal-enzima luċiferażi jistgħu jħawdu l-attività ta' luċiferażi f'assaġġi bbażati fuq iċ-ċelloli li jikkawżaw inibizzjoni apparenti jew luminexxenza ikbar (22). Pereżempju, konċentrazzjonijiet ta' fitoestroġen ikbar minn 1 μM ġew irrapportati li jinterferixxu mas-sinjali ta' luminexxenza f'assaġġi oħrajn tal-ġene indikatur ibbażati fuq luċiferażi minħabba sovrattivazzjoni tal-ġene indikatur ta' luċiferażi (23). Bħala konsegwenza, l-espressjoni ta' luċiferażi miksuba f'konċentrazzjonijiet għoljin ta' fitoestroġeni jew sustanzi kimiċi simili ssuspettati li jipproduċu sovrattivazzjoni bħall-fitoestroġen tal-ġene indikatur ta' luċiferażi jridu jiġu eżaminati bir-reqqa (23). F'każijiet li fihom tista' tiġi pprovduta evidenza fuq in-nuqqas ta' applikabilità tal-metodu ta' ttestjar għal kategoriji speċifiċi ta' sustanzi kimiċi tat-test, il-metodu ta' ttestjar ma għandux jintuża għal dawk il-kategoriji speċifiċi.
                     Minbarra li jgħin fid-diskriminazzjoni bejn sensitizzaturi tal-ġilda u mhux sensitizzaturi, l-assaġġ KeratinoSensTM jipprovdi wkoll informazzjoni dwar ir-rispons għall-konċentrazzjoni li għandha l-potenzjal li tikkontribwixxi għall-valutazzjoni tal-potenza ta' sensitizzazzjoni ukoll meta jintuża f'approċċi integrati bħall-IATA (19). Madankollu, hemm bżonn li jsir iktar xogħol, idealment fuq il-bażi ta' dejta affidabbli mill-bniedem, sabiex jiġi stabbilit kif ir-riżultati tal-assaġġ KeratinoSensTM jistgħu jikkontribwixxu għall-valutazzjoni tal-potenza (24) u għas-sottokategorizzazzjoni tas-sensitizzaturi skont il-GHS tan-NU/CLP.
                     IL-PRINĊIPJU TAT-TEST
                     Il-metodu ta' ttestjar tal-ARE-Nrf2 luciferase jagħmel użu minn linja ta' ċelloli aderenti immortalizzata miksuba minn keratinoċiti umani HaCaT transfessi b'mod stabbli bi plażmid selezzjonabbli. Il-linja ta' ċelloli li fiha l-ġene luċiferażi taħt il-kontroll transkrizzjonali ta' promotur kostitwittiv fuż ma' element ARE minn ġene li huwa magħruf li jiġi sopraregolat minn sensitizzaturi ta' kuntatt (25) (26). Is-sinjal ta' luċiferażi jirrifletti l-attivazzjoni minn sensitizzaturi ta' ġeni dipendenti Nrf2 endoġeni, u ntweriet id-dipendenza tas-sinjal ta' luċiferażi fil-linja ta' ċelloli rikombinanti fuq Nrf2 (27). Dan jippermetti li jsir kejl kwantitattiv (b'detezzjoni tal-luminexxenza) tal-induzzjoni tal-ġene ta' luċiferażi, bl-użu ta' sottostrati ta' luċiferażi li jipproduċu d-dawl ferm stabbiliti, bħala indikatur tal-attività tal-fattur ta' traskrizzjoni ta' Nrf2 f'ċelloli wara l-esponiment għal sustanzi elettrofiliċi.
                     Is-sustanzi kimiċi tat-test jitqiesu pożittivi fl-assaġġ KeratinoSens™ jekk jinduċu induzzjoni statistikament sinifikanti tal-attività ta' luċiferażi f'livell ogħla minn limitu partikolari (jiġifieri > żieda b'darba u nofs jew 50 %), taħt konċentrazzjoni definita li ma taffettwax b'mod sinifikanti l-vijabbiltà (jiġifieri inqas minn 1 000 μM u f'konċentrazzjoni li fiha l-vijabbiltà ċellolari tkun ogħla minn 70 % (9) (12)). Għal dan il-għan, tiġi stabbilita l-induzzjoni tad-drabi massimali tal-attività ta' luċiferażi fuq il-kontroll tas-solvent (negattiv) (Imax). Barra minn hekk, peress li ċ-ċelloli huma esposti għal sensiela ta' konċentrazzjonijiet tas-sustanzi kimiċi tat-test, il-konċentrazzjoni meħtieġa għal induzzjoni statistikament sinifikanti ta' attività ta' luċiferażi ogħla mil-limitu (jiġifieri valur tal-EC1.5) għandha tiġi interpolata mill-kurva ta' doża — rispons (ara l-paragrafu 32 għall-kalkoli). Finalment, għandhom isiru kejliet taċ-ċitotossiċità paralleli sabiex jiġi vvalutat jekk il-livelli ta' induzzjoni tal-attività ta' luċiferażi jseħħux f'konċentrazzjonijiet sottoċitotossiċi.
                     Qabel l-użu ta' rutina tal-assaġġ tal-ARE-Nrf2 luciferase li jaderixxi għal dan il-metodu ta' ttestjar, il-laboratorji għandhom juru l-profiċjenza teknika billi jużaw l-għaxar Sustanzi ta' Profiċjenza elenkati fl-Appendiċi 2.
                     Standards tal-prestazzjoni (PS) (28) huma disponibbli sabiex tiġi ffaċilitata l-validazzjoni ta' metodi ta' ttestjar in vitro tal-ARE-Nrf2 luciferase simili għall-assaġġ KeratinoSens™ u jippermettu għall-emendar fil-ħin ta' dan il-metodi ta' ttestjar għall-inklużjoni tagħhom. Aċċettazzjoni Reċiproka tad-Dejta (MAD) skont il-ftehim tal-OECD sejjer ikun garantit biss għal metodi ta' ttestjar ivvalidati skont il-PS, jekk dawn il-metodi ta' ttestjar ġew riveduti u inklużi fil-linja gwida ta' ttestjar korrispondenti mill-OECD.
                     PROĊEDURA
                     Bħalissa, l-uniku metodu kopert minn dan il-metodu ta' ttestjar huwa l-assaġġ xjentifikament validu KeratinoSensTM (9) (12) (13) (14). Il-Proċeduri Operazzjonali Standard (SOP) għall-assaġġ KeratinoSensTM huma disponibbli u għandhom jitħaddmu meta jiġi implimentat u jintuża l-metodu ta' ttestjar fil-laboratorju (15). Il-laboratorji li lesti li jimplimentaw il-metodu ta' ttestjar jistgħu jiksbu l-linja ta' ċelloli rikombinanti użata fl-assaġġ KeratinoSensTM billi jistabbilixxu qbil fuq il-liċenzji mal-iżviluppatur tal-metodu ta' ttestjar (15). Il-paragrafi li ġejjin jipprovdu deskrizzjoni tal-komponenti u l-proċeduri ewlenin ta' ttestjar tal-metodu ta' ttestjar tal-ARE-Nrf2 luciferase.
                     
                        Preparazzjoni tal-kulturi tal-keratinoċiti
                     
                     Għandha tintuża linja ta' ċelloli transġenika b'inserzjoni stabbli tal-ġene indikatur ta' luċiferażi taħt il-kontroll tal-element ARE (eż. linja ta' ċelloli tal-KeratinoSens™). Malli jiġu riċevuti, iċ-ċelloli jiġu propagati (eż. 2 sa 4 passiġġieri) u jinħażnu ffriżati bħala stokk omoġenu. Ċelloli minn dan l-istokk oriġinali jistgħu jiġu propagati sa numru massimu ta' passiġġieri (jiġifieri 25 fil-każ ta' KeratinoSensTM) u jitħaddmu għall-ittestjar ta' rutina bl-użu tal-medium ta' manutenzjoni xieraq (fil-każ ta' KeratinoSensTM dan jirrappreżenta DMEM b'serum u Ġenetiċina).
                     Għall-ittestjar, iċ-ċelloli għandhom ikunu 80-90 % konfluwenti, u wieħed għandu joqgħod attent li jiżgura li ċ-ċelloli qatt ma jikbru għal konfluwenza sħiħa. Jum wieħed qabel ma jiġu ttestjati, iċ-ċelloli jinġabru u jiġu distribwiti fi pjastri b'96 bwejra (10 000 ċellola/bwejra fil-każ ta' KeratinoSensTM). Għandha tingħata attenzjoni sabiex tiġi evitata sedimenazzjoni taċ-ċelloli matul it-tiżrigħ sabiex tiġi żgurata distribuzzoni ta' numru omoġenu ta' ċelloli bejn il-bwejriet. Jekk dan mhuwiex il-każ, dan l-istadju jista' jwassal għal varjabbiltà kbira bejn bwejra u oħra. Għal kull ripetizzjoni, jintużaw tliet repliki għall-kejliet tal-attività ta' luċiferażi, u replika parallela waħda użata għall-assaġġ tal-vijabbiltà taċ-ċelloli.
                     
                        Preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test u tas-sustanzi tal-kontroll
                     
                     Is-sustanza kimika tat-test u s-sustanzi tal-kontroll jitħejjew dakinhar tal-ittestjar. Għall-assaġġ KeratinoSensTM, is-sustanzi kimiċi tat-test jiġu dissolti fis-sulfossidu tad-dimetil (DMSO) għall-konċentrazzjoni finali mixtieqa (eż. 200 mM). Is-soluzzjonijiet tad-DMSO jistgħu jitqiesu awtosterelizzanti, u b'hekk ma hemm bżonn ta' ebda filtrazzjoni sterili. Is-sustanza kimika tat-test mhux solubbli fid-DMSO tiġi dissolta f'ilma sterili jew medium tal-kultura sterili, u s-soluzzjonijiet sterelizzati b'pereżempju filtrazzjoni. Għal sustanza kimika tat-test li ma għandha ebda piż molekolari definit (MW), titħejja soluzzjoni ewlenija għal konċentrazzjoni prestabbilita (40 mg/mL jew 4 % (w/v)) fl-assaġġ KeratinoSensTM. F'każ li jintużaw solventi oħrajn li mhumiex DMSO, ilma jew il-medium tal-kultura, għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xjentifika suffiċjenti.
                     Fuq il-bażi tas-soluzzjonijiet ewlenin DMSO tas-sustanza kimika tat-test, isiru dilwizzjonijiet serjali bl-użu tad-DMSO sabiex jinkisbu 12-il konċentrazzjoni ewlenija tas-sustanza kimika li sejra tiġi ttestjata (minn 0.098 sa 200 mM fl-assaġġ KeratinoSensTM assay). Għal sustanza kimika tat-test mhux solubbli fid-DMSO, id-dilwizzjonijiet sabiex jinkisbu l-konċentrazzjonijiet ewlenin isiru bl-użu ta' ilma sterili jew medium tal-kultura sterili. Indipendentement mis-solvent użat, il-konċentrazzjonijiet ewlenin, imbagħad jiġu dilwiti għal 25 darba fil-medium tal-kultura li fih is-serum, u finalment jintużaw għat-trattament b'fattur ta' dilwizzjoni 4 darbiet oħra sabiex il-konċentrazzjonijiet finali tas-sustanza kimika ttestjata jvarjaw minn 0.98 sa 2 000 μM fl-assaġġ KeratinoSensTM. Jistgħu jintużaw konċentrazzjonijiet oħrajn jekk tiġi pprovduta ġustifikazzjoni (eż. fil-każ ta' ċitotossiċità jew solubilità baxxa).
                     Il-kontroll negattiv (solvent) użat fl-assaġġ KeratinoSensTM huwa DMSO (Nru CAS 67-68-5, ≥ purità ta' 99 %), li għalih jitħejjew sitt bwejriet għal kull pjastra. Jgħaddi mill-istess dilwizzjoni kif deskritta għall-konċentrazzjonijiet ewlenin fil-paragrafu 22, sabiex il-konċentrazzjoni tal-kontroll negattiv (solvent) finali tkun 1 %, magħrufa li ma taffettwax il-vijabbiltà taċ-ċelloli u tikkorrispondi għall-istess konċentrazzjoni tad-DMSO li tinstab fis-sustanza kimika ttestjata u fil-kontroll pożittiv. Għal sustanza kimika tat-test mhux solubbli fid-DMSO, li għaliha d-dilwizzjonijiet saru fl-ilma, il-livell tad-DMSO fil-bwejriet kollha tas-soluzzjoni finali tat-test irid jiġi aġġustat għal 1 % bħal għas-sustanzi kimiċi tat-test u s-sustanzi tal-kontroll l-oħrajn.
                     Il-kontroll pożittiv użat fl-assaġġ KeratinoSensTM huwa aldeid ċinnamiku (Nru CAS 14371-10-9, ≥ purità ta' 98 %), li għalih titħejja sensiela ta' 5 konċentrazzjoni ewlenin li jvarjaw minn 0.4 sa 6.4 mM fid-DMSO (minn soluzzjoni ewlenija ta' 6.4 mM) u dilwiti kif deskritt għall-konċentrazzjonijiet ewlenin fil-paragrafu 22, sabiex il-konċentrazzjoni finali tal-kontroll pożittiv tvarja minn 4 sa 64 μM. Jistgħu jintużaw kontrolli pożittivi xierqa oħrajn, idealment li jipprovdu valuri fil-medda medja tal-EC1.5, jekk ikun hemm dejta storika disponibbli sabiex jinkisbu kriterji ta' aċċettazzjoni tas-sessjoni paragunabbli.
                     
                        Applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test u tas-sustanzi tal-kontroll
                     
                     Għal kull sustanza kimika tat-test u sustanza tal-kontroll pożittiv, huwa meħtieġ esperiment wieħed sabiex jinkiseb tbassir (pożittiv jew negattiv), li jikkonsisti f'tal-inqas żewġ ripetizzjonijiet indipendenti li kull wieħed ikun fih tliet repliki (jiġifieri n=6). Fil-każ ta' riżultati li ma jaqblux bejn iż-żewġ ripetizzjonijiet indipendenti, għandha ssir it-tielet ripetizzjoni li fiha tliet repliki (jiġifieri n=9). Kull ripetizzjoni indipendenti ssir f'ġurnata differenti b'soluzzjoni ewlenija ġdida tas-sustanzi kimiċi tat-test u ċelloli miġburin indipendentement. Madankollu, iċ-ċelloli jistgħu jkunu ġejjin mill-istess passaġġ.
                     Wara t-tiżrigħ deskritt fil-paragrafu 20, iċ-ċelloli jitkabbru għal 24 siegħa fil-pjastri għall-mikrotitraġġ b'96 bwejra. Imbagħad il-medium jitneħħa u jiġi sostitwit ma' medium tal-kultura ġdid (medium tal-kultura ta' 150 μl li fih serum iżda mingħajr Ġenetiċina fil-każ ta' KeratinoSensTM) li miegħu jiżdiedu 50 μl tas-sustanza kimika tat-test u s-sustanzi tal-kontroll dilwiti 25 darba. Tal-inqas bwejra waħda għal kull pjastra għandha titħalla vojta (ebda ċellola u ebda trattament) sabiex jiġu vvalutati l-valuri ta' sfond.
                     Il-pjastri ttrattati mbagħad jiġu inkubati għal madwar 48 siegħa f'37 ± 1 °C fil-preżenza ta' 5 % CO2 fl-assaġġ KeratinoSensTM. Għandha tingħata attenzjoni sabiex tiġi evitata l-evaporazzjoni ta' sustanzi kimiċi tat-test volatili u kontaminazzjoni inkroċjata bejn bwejriet minn sustanzi kimiċi tat-test, eż. billi l-pjastri jitgħattew bil-fojl qabel l-inkubazzjoni bis-sustanzi kimiċi tat-test.
                     
                        Kejliet tal-attività ta' luċiferażi
                     
                     Tliet fatturi huma kritiċi sabiex jiġi żgurat qari tajjeb tal-valuri tal-luminexxenza:
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-għażla ta' luminometru sensittiv,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-użu ta' format ta' pjastra għolja biżżejjed sabiex tevita kontaminazzjoni kroċjata ħafifa; u
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-użu ta' sottostrat ta' luċiferażi b'biżżejjed output ta' dawl sabiex jiġu żgurati sensittività suffiċjenti u varjabbiltà baxxa.
                              
                           Qabel l-ittestjar, għandu jsir issettjar tal-esperiment tal-kontroll kif deskritt fl-Appendiċi 3 sabiex jiġ żgurat li jkunu ssodisfati dawn it-tliet punti.
                     Wara l-ħin tal-esponiment ta' 48 siegħa bis-sustanza kimika tat-test u s-sustanzi tal-kontroll fl-assaġġ KeratinoSensTM, iċ-ċelloli jinħaslu b'salina bbaferjata bil-fosfat, u l-bafer tal-liżi rilevanti għall-qari tal-valuri tal-luminexxenza jiżdied f'kull bwejra għal 20 min f'temperatura ambjentali.
                     Il-pjastri bil-liżat taċ-ċelloli mbagħad jitqiegħdu fil-luminometri għall-qari ta' liema fl-assaġġ KeratinoSensTM hija programmata sabiex: (i) iżżid is-sottostrat ta' luċiferażi f'kull bwejra (jiġifieri 50 μl), (ii) tistenna sekonda, u (iii) tintegra l-attività ta' luċiferażi għal 2 sekondi. F'każ li jintuża ssettjar differenti, eż. skont il-mudell tal-luminometru użat, dan għandu jkun iġġustifikat. Barra minn hekk, jista' jintuża wkoll sottostrat li jiddi diment li jkun ta' suċċess l-esperiment tal-kontroll tal-kwalità tal-Appendiċi 3.
                     
                        Valutazzjoni taċ-Ċitotossiċità
                     
                     Għall-assaġġ tal-vijabbiltà taċ-ċelloli KeratinoSensTM, il-medium jiġi sostitwit wara l-ħin tal-esponiment ta' 48 siegħa b'medium ġdid li fih MTT (3-(4,5-Dimetiltjażol-2-yl)-2,5-difeniltetrażolju bromur, Tjażolil blu tetrażolju bromur; Nru CAS 298-93-1) u ċ-ċelloli inkubati għal 4 sigħat f'37 °C fil-preżenza ta' 5 % CO2. Imbagħad jitneħħa l-medium tal-MTT u ċ-ċelloli jiġu lizzati (eż. billi tiżdied soluzzjoni SDS ta' 10 % f'kull bwejra) mal-lejl. Wara t-tħawwid, jitkejjel l-assorbiment f'600 nm b'fotometru.
                     DEJTA U RAPPORTAR
                     
                        Evalwazzjoni tad-Dejta
                     
                     Il-parametri li ġejjin huma kkalkolati fl-assaġġ KeratinoSensTM:
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-induzzjoni medja massimali tad-drabi tal-valur ta' attività ta' luċiferażi (Imax) osservat fi kwalunkwe konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test u l-kontroll pożittiv;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 inkiseb il-valur tal-EC1.5 li jirrappreżenta l-konċentrazzjoni li għaliha l-induzzjoni tal-attività ta' luċiferażi tkun ogħla mil-limitu ta' darba u nofs (jiġifieri attività ta' luċiferażi msaħħa ta' 50 %); u
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-valuri tal-konċentrazzjoni tal-IC50 u IC30 għal tnaqqis ta' 50 % u 30 % tal-vijabbiltà ċellolari.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 L-induzzjoni tad-drabi tal-attività ta' luċiferażi tiġi kkalkolata bl-Ekwazzjoni 1, u l-induzzjoni tad-drabi massimali kumplessiva (Imax) tiġi kkalkolata bħala l-medja tar-ripetizzjonijiet individwali.
                              
                           
                        Ekwazzjoni 1:
                     
                     
                        
                     fejn
                     
                                 Lkampjun
                                 
                              
                              
                                 hija l-valur ta' luminexxenza fil-bwejra tas-sustanza kimika tat-test
                              
                           
                                 Linbjank
                                 
                              
                              
                                 hija l-valur ta' luminexxenza fil-bwejra inbjank li ma fiha ebda ċellola u ebda trattament
                              
                           
                                 Lsolvent
                                 
                              
                              
                                 hija l-valur medju tal-luminexxenza fil-bwejriet li fihom ċelloli u kontroll tas-solvent (negattiv)
                              
                           EC1.5 tiġi kkalkolata bl-interpolazzjoni lineari skont l-Ekwazzjoni 2, u l-EC1.5 kumplessiva tiġi kkalkolata bħala l-medja ġeometrika tar-ripetizzjonijiet individwali.
                     
                        Ekwazzjoni 2:
                     
                     
                        
                     fejn
                     
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 hija l-inqas konċentrazzjoni f'μM b'induzzjoni ta' > darba u nofs
                              
                           
                                 Cb
                                 
                              
                              
                                 hija l-ogħla konċentrazzjoni f'μM b'induzzjoni ta' < darba u nofs
                              
                           
                                 Ia
                                 
                              
                              
                                 hija l-induzzjoni tad-drabi mkejla fl-inqas konċentrazzjoni b'induzzjoni ta' > darba u nofs (medja ta' tliet bwejriet ta' replika)
                              
                           
                                 Ib
                                 
                              
                              
                                 hija l-induzzjoni tad-drabi mkejla fl-ogħla konċentrazzjoni b'induzzjoni ta' < darba u nofs (medja ta' tliet bwejriet ta' replika)
                              
                           Il-vijabbiltà hija kkalkolata bl-Ekwazzjoni 3:
                     
                        Ekwazzjoni 3:
                     
                     
                        
                     fejn
                     
                                 Vkampjun
                                 
                              
                              
                                 hija l-valur tal-assorbiment tal-MTT fil-bwejra tas-sustanza kimika tat-test
                              
                           
                                 Vinbjank
                                 
                              
                              
                                 hija l-valur tal-assorbiment tal-MTT fil-bwejra inbjank li ma fiha ebda ċellola u ebda trattament
                              
                           
                                 Vsolvent
                                 
                              
                              
                                 hija l-valur medju l-valur tal-assorbiment tal-MTT fil-bwejriet li fihom ċelloli u kontroll tas-solvent (negattiv)
                              
                           IC50 u IC30 jiġu kkalkolati bl-interpolazzjoni lineari skont l-Ekwazzjoni 4, u l-IC50 u IC30 kumplessivi jiġu kkalkolati bħala l-medja ġeometrika tar-ripetizzjonijiet individwali.
                     
                        Ekwazzjoni 4:
                     
                     
                        
                     fejn
                     
                                 X
                              
                              
                                 huwa t-tnaqqis % fil-konċentrazzjoni li jrid jiġi kkalkolat (50 u 30 għal IC50 u IC30)
                              
                           
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 hija l-inqas konċentrazzjoni f'μM bi tnaqqis ta' > x % fil-vijabbiltà
                              
                           
                                 Cb
                                 
                              
                              
                                 hija l-ogħla konċentrazzjoni f'μM bi tnaqqis ta' < x % fil-vijabbiltà
                              
                           
                                 Va
                                 
                              
                              
                                 hija l-vijabbiltà % fl-inqas konċentrazzjoni bi tnaqqis ta' > x % fil-vijabbiltà
                              
                           
                                 Vb
                                 
                              
                              
                                 hija l-vijabbiltà % fl-ogħla konċentrazzjoni bi tnaqqis ta' < x % fil-vijabbiltà
                              
                           Għal kull konċentrazzjoni li turi induzzjoni tal-attività ta' luċiferażi ta' > darba u nofs, tiġi kkalkolata s-sinifikanza statistika (eż. b'test-t ta' Student b'żewġt idnieb), billi jitqabblu l-valuri tal-luminexxenza għat-tliet kampjuni repliki mal-valuri tal-luminexxenza fil-bwejriet tal-kontroll tas-solvent (negattiv) sabiex jiġi stabbilit jekk l-induzzjoni tal-attività ta' luċiferażi hijiex statistikament sinifikanti (p < 0.05). L-inqas konċentrazzjoni b'induzzjoni tal-attività ta' luċiferażi ta' > darba u nofs hija l-valur li jistabbilixxi l-valur tal-EC1.5. Huwa vverifikat f'kull każ jekk dan il-valur huwiex inqas mill-valur tal-IC30, xi ħaġa li tindika li hemm inqas minn tnaqqis ta' 30 % fil-vijabbiltà ċellolari fil-konċentrazzjoni li tiddetermina l-EC1.5.
                     Huwa rakkomandat li d-dejta tiġi vverifikata b'mod viżwali bl-għajnuna ta' graffijiet. Jekk ma tiġi osservata ebda kurva ċara ta' doża — rispons, jew jekk il-kurva ta' doża — rispons miksuba tkun bifażika (jiġifieri taqbeż il-limitu ta' 1.5 darbtejn), l-esperiment għandu jerġa' jsir sabiex jiġi verifikat jekk din hijiex speċifika għas-sustanza kimika tat-test jew hijiex dovuta għal artefatt tal-esperiment. F'każ li r-rispons bifażiku jkun riproduċibbli f'esperiment indipendenti, għandu jiġi rrapportat il-valur inferjuri tal-EC1.5 (il-konċentrazzjoni meta l-limitu ta' 1.5 jinqabeż għall-ewwel darba).
                     Fil-każijiet rari li fihom tiġi osservata induzzjoni mhux statistikament sinifikanti ogħla minn darba u nofs segwita minn konċentrazzjoni ogħla b'induzzjoni statistikament sinifikanti, ir-riżultati minn din ir-ripetizzjoni jitqiesu bħala validi u pożittivi biss jekk l-induzzjoni statistikament sinifikanti ogħla mil-limitu ta' 1.5 inkisbet għal konċentrazzjoni mhux ċitotossika.
                     Finalment, għal sustanzi tat-test li jiġġeneraw induzzjoni ta' darba u nofs jew ikbar diġà fl-inqas konċentrazzjoni tat-test ta' 0.98 μM, jiġi stabbilit il-valur tal-EC1.5 ta' <0.98 fuq il-bażi ta' spezzjoni viżwali tal-kurva ta' doża — rispons.
                     
                        Kriterji ta' aċċettazzjoni
                     
                     Għandhom jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettazzjoni li ġejjin meta jintuża l-assaġġ KeratinoSensTM. L-ewwel nett, l-induzzjoni tal-attività ta' luċiferażi miksuba bil-kontroll pożittiv, l-aldeid ċinnamiku, għandha tkun statistikament sinifikanti ogħla mil-livell ta' 1.5 (eż. bl-użu ta' test-T) f'tal-inqas waħda mill-konċentrazzjonijiet ittestjati (minn 4 sa 64 μM).
                     It-tieni, il-valur tal-EC1.5 għandu jkun fi ħdan żewġ devjazzjonijiet standard tal-medja storika tal-faċilità ta' ttestar (eż. bejn 7 μM u 30 μM fuq il-bażi tas-sett ta' dejta ta' validazzjoni) li għandha tiġi aġġornata b'mod regolari. Barra minn hekk, l-induzzjoni medja fit-tliet repliki għall-aldeid ċinnamiku f'64 μM għandha tkun ta' bejn 2 u 8. Jekk ma jkunx issodisfat dan l-aħħar kriterju, ir-rispons għad-doża tal-aldeid ċinnamiku għandu jiġi vverifikat bil-galbu, u t-testijiet jisgtħu jiġu aċċettati biss jekk ikun hemm rispons għad-doża ċar b'induzzjoni tal-attività ta' luċiferażi li tiżdied meta jiżdiedu l-konċentrazzjonijiet għall-kontroll pożittiv.
                     Fl-aħħar nett, il-koeffiċjent medju tal-varjazzjoni tal-qari tal-valur tal-luminexxenza għad-DMSO tal-kontroll negattiv (solvent) għandu jkun inqas minn 20 % f'kull ripetizzjoni li tikkonsisti f'6 bwejriet ittestjati fi triplikat. Jekk il-varjabbiltà tkun ogħla, ir-riżultati għandhom jiġu injorati.
                     
                        Interpretazzjoni tar-riżultati u l-mudell ta' tbassir
                     
                     Tbassir ta' KeratinoSensTM jitqies pożittiv jekk ikunu ssodisfati l-4 kundizzjonijiet li ġejjin fi 2 minn 2 jew fl-istess 2 minn 3 ripetizzjonijiet, inkella t-tbassir ta' KeratinoSensTM jitqies negattiv (Figura 1):
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Imax hija ogħla (>) minn darba u nofs u statistikament differenti b'mod sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll tas-solvent (negattiv) (kif stabbilit mit-test-T Student diżakkoppjat b'żewġt idnieb);
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 il-vijabbiltà ċellolari hija ogħla minn (>) 70 % fl-inqas konċentrazzjoni bl-induzzjoni ta' attività ta' luċiferażi ikbar minn darba u nofs (jiġifieri fil-konċentrazzjoni li tiddetermina l-EC1.5);
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 il-valur tal-EC1.5 huwa inqas minn (<) 1 000 μM (jew < 200 μg/ml għal sustanzi kimiċi tat-test mingħajr MW definit);
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 hemm rispons għad-doża apparenti kumplessiv għall-induzzjoni ta' luċiferażi (jew rispons bifażiku kif imsemmi fil-paragrafu 33).
                              
                           Jekk f'ripetizzjoni partikolari, jiġu ssodisfati l-ewwel tliet kundizzjonijiet iżda ma jistax jiġi osservat rispons ċar għad-doża għall-induzzjoni ta' luċiferażi, ir-riżultat ta' dik ir-ripetizzjoni għandu jitqies bħala inkonklużiv u jista' jkun hemm bżonn ta' iktar ittestjar (Figura 1). Barra minn hekk, riżultat negattiv miksub b'konċentrazzjonijiet < 1 000 μM (jew < 200 g/ml għal sustanzi kimiċi tat-test mingħajr MW definit) għandu jiġi kkunsidrat bħala inkonklużiv ukoll (ara l-paragrafu 11).
                     
                        Figura 1
                     
                     
                        Il-mudell ta' tbassir użat fl-assaġġ KeratinoSensTM. Tbassir tal-assaġġ KeratinoSensTM għandu jitqies fil-kuntest ta' IATA u skont id-dispożizzjonijiet tal-paragrafi 9 u 11.
                     
                     
                        
                     F'każijiet rari, is-sustanzi kimiċi tat-test li jinduċu l-attività ta' luċiferażi ferm qrib il-livelli ta' tossiċità jistgħu jkunu pożittivi f'ċerti ripetizzjonijiet f'livelli mhux ċitotossiċi (jiġifieri konċentrazzjoni li tistabbilixxi l-EC1.5 inqas (<) mill-IC30), u f'ripetizzjonijiet oħrajn f'livelli tossiċi biss (jiġifieri konċentrazzjoni li tiddetermina l-EC1.5 ikbar (>) mill-IC30). Dawn is-sustanzi kimiċi tat-test għandhom jerġgħu jiġu ttestjati b'analiżi tar-rispons għad-doża iktar ristretta bl-użu ta' fattur ta' dilwizzjoni inferjuri (eż. dilwizzjoni għal 1,33 jew Öid-doppju (= 1,41) bejn il-bwejriet), sabiex jiġi stabbilit jekk seħħitx induzzjoni f'livelli ċitotossiċi jew le (9).
                     
                        Rapport tat-test
                     
                     Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanza kimika tat-test
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Sustanza monokostitwenti
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Identifikazzjoni kimika, bħall-isem (jew ismijiet) IUPAC jew CAS, in-numru/i CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, u/jew identifikaturi oħrajn;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Id-dehra fiżika, is-solubilità fl-ilma, is-solubilità fid-DMSO, il-piż molekolari, u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali, meta jkunu disponibbli;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Trattament qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-konċentrazzjoni(jiet) ittestjata/i;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabilità, safejn ikunu disponibbli.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Sustanza multikostitwenti, UVCB u taħlita:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Karatterizzazzjoni safejn possibbli, eż. bl-identità kimika (ara iktar 'il fuq), il-purità, l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti (ara iktar 'il fuq) tal-kostitwenti, safejn ikunu disponibbli;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Id-dehra fiżika, is-solubilità fl-ilma, is-solubilità fid-DMSO u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali, meta jkunu disponibbli;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-piż molekolari jew il-piż molekolari apparenti fil-każ ta' taħlitiet/polimeri b'kompożizzjonijiet magħrufin jew informazzjoni oħra rilevanti għat-twettiq tal-istudju;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Trattament qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-konċentrazzjoni(jiet) ittestjata/i;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabilità, safejn ikunu disponibbli.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kontrolli
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Kontroll pożittiv
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Identifikazzjoni kimika, bħall-isem (jew ismijiet) IUPAC jew CAS, in-numru/i CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, u/jew identifikaturi oħrajn;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Id-dehra fiżika, is-solubilità fl-ilma, is-solubilità fid-DMSO, il-piż molekolari, u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali, meta jkunu disponibbli u fejn applikabbli;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Trattament qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-konċentrazzjoni(jiet) ittestjata/i;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabilità, safejn ikunu disponibbli;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Referenza għar-riżultati storiċi tal-kontroll pożittiv li juru kriterji xierqa ta' aċċettazzjoni tas-sessjoni, jekk applikabbli.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Kontroll negattiv (veikolu)
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Identifikazzjoni kimika, bħall-isem/ismijiet IUPAC jew CAS, in-numru/i CAS, u/jew identifikaturi oħrajn;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Id-dehra fiżika, is-solubilità fl-ilma, il-piż molekolari, u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali f'każ li jintużaw kontrolli negattivi / veikoli oħrajn li mhumiex dawk imsemmijin f'dan il-metodu ta' ttestjar u safejn ikunu disponibbli;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-kundizzjonijiet tal-ħżin u l-istabilità, safejn ikunu disponibbli;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent għal kull sustanza kimika tat-test;
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Il-Kundizzjonijiet tal-Metodu ta' Ttestjar
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             L-isem u l-indirizz tal-isponser, tal-faċilità tat-test u tad-direttur tal-istudju;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni tal-metodu ta' ttestjar użat;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-linja ta' ċelloli użata, il-kundizzjonijiet tal-ħżin u s-sors tagħha (eż. il-faċilità mnejn inkisbet);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             In-numru tal-passaġġ u l-livell ta' konfluwenza ta' ċelloli użati għall-ittestjar;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-metodu ta' għadd taċ-ċelloli għat-tiżrigħ qabel l-ittestjar u l-miżuri meħudin sabiex tiġi żgurata distribuzzjoni omoġena tan-numru ta' ċelloli (ara l-paragrafu 20);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-luminometru użat (eż. il-mudell), inkluż l-issettjar tal-istrument, is-sottostrat ta' luċiferażi użat, u wiri tal-kejliet ta' luminexxenza xierqa fuq il-bażi tat-test tal-kontroll deskritt fl-Appendiċi 3;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-proċedura użata sabiex tintwera l-profiċjenza tal-laboratorju sabiex iwettaq il-metodu ta' ttestjar (eż. billi jiġu ttestjati s-sustanzi ta' profiċjenza) jew sabiex tintwera prestazzjoni riproduċibbli tal-metodu ta' ttestjar matul iż-żmien.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Proċedura tat-test
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             In-numru ta' ripetizzjonijiet u repliki użati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika, il-proċedura ta' applikazzjoni u l-ħin tal-esponiment użat (jekk ikun differenti minn dak rakkomandat)
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni tal-kriterji ta' evalwazzjoni u deċiżjoni użati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni tal-kriterji ta' aċċettazzjoni tal-istudju użati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni ta' kwalunkwe modifika tal-proċedura tat-test.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ir-riżultati
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             It-tqegħid f'tabella tal-valuri tal-Imax, EC1.5 u tal-vijabbiltà (jiġifieri IC50, IC30) miksubin għas-sustanza kimika tat-test u għall-kontroll pożittiv għal kull ripetizzjoni kif ukoll il-valuri medji (Imax: medja; EC1.5 u l-valuri tal-vijabbiltà: medja ġeometrika) u SD ikkalkolata bl-użu ta' dejta mir-ripetizzjonijiet individwali kollha u indikazzjoni tal-klassifikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test skont il-mudell ta' tbassir;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-koeffiċjent ta' varjazzjoni miksub bil-qari tal-valuri tal-luminexxenza għall-kontroll negattiv għal kull esperiment;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Graff li turi l-kurvi ta' doża — rispons għall-induzzjoni tal-attività ta' luċiferażi u l-vijabbiltà;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni ta' kull osservazzjoni rilevanti oħra osservata, jekk applikabbli.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Diskussjoni tar-riżultati
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Diskussjoni tar-riżultati miksubin bil-metodu ta' ttestjar tal-assaġġ KeratinoSensTM;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Kunsiderazzjoni tar-riżultati tal-metodu ta' ttestjar fil-kuntest ta' IATA jekk ikun hemm informazzjoni rilevanti oħra disponibbli.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Konklużjoni
                                 
                              
                           TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2013. Disponibbli fuq: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment No. 168. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Adler S., Basketter D., Creton S., Pelkonen O., van Benthem J., Zuang V., Andersen K.E., Angers-Loustau A., Aptula A., Bal-Price A., Benfenati E., Bernauer U., Bessems J., Bois F.Y., Boobis A., Brandon E., Bremer S., Broschard T., Casati S., Coecke S., Corvi R., Cronin M., Daston G., Dekant W., Felter S., Grignard E., Gundert-Remy U., Heinonen T., Kimber I., Kleinjans J., Komulainen H., Kreiling R., Kreysa J., Leite S.B., Loizou G., Maxwell G., Mazzatorta P., Munn S., Pfuhler S., Phrakonkham P., Piersma A., Poth A., Prieto P., Repetto G., Rogiers V., Schoeters G., Schwarz M., Serafimova R., Tähti H., Testai E., van Delft J., van Loveren H., Vinken M., Worth A., Zaldivar J.M. (2011). Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010. Archives of Toxicology 85, 367-485.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu B.42 ta' dan l-Anness: Sensitizzazzjoni tal-ġilda: Assaġġ Lokali tal-Limfonodi.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu B.6 ta' dan l-Anness: Sensitizzazzjoni tal-ġilda.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu B.50 ta' dan l-Anness: Sensitizzazzjoni tal-ġilda: Assaġġ Lokali tal-Limfonodi. DA.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu B.51 ta' dan l-Anness: Sensitizzazzjoni tal-ġilda: Assaġġ Lokali tal-Limfonodi. BrdU-ELISA.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Natsch A. (2010). The Nrf2-Keap1-ARE Toxicity Pathway as a Cellular Sensor for Skin Sensitizers-Functional Relevance and Hypothesis on Innate Reactions to Skin Sensitizers. Toxicological Sciences 113, 284-292.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Emter R., Ellis G., Natsch A. (2010). Performance of a novel keratinocyte-based reporter cell line to screen skin sensitizers in vitro. Toxicology and Applied Pharmacology 245, 281-290.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Dinkova-Kostova A.T., Holtzclaw W.D., Kensler T.W. (2005). The role of Keap1 in cellular protective responses. Chem. Res. Toxicol. 18, 1779-1791.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Kansanen E., Kuosmanen S.M., Leinonen H., Levonen A.L. (2013). The Keap1-Nrf2 pathway: Mechanisms of activation and dysregulation in cancer. Redox Biol. 1(1), 45-49.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Natsch A., Bauch C., Foertsch L., Gerberick F., Normann K., Hilberer A., Inglis H., Landsiedel R., Onken S., Reuter H., Schepky A., Emter R. (2011). The intra- and inter-laboratory reproducibility and predictivity of the KeratinoSens assay to predict skin sensitizers in vitro: results of a ring-study in five laboratories. Toxicol. In Vitro 25, 733-744.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Natsch A., Ryan C.A., Foertsch L., Emter R., Jaworska J., Gerberick G.F., Kern P. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation. Journal of Applied Toxicology, 33, 1337-1352.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 EURL-ECVAM (2014). Recommendation on the KeratinoSensTM assay for skin sensitisation testing, 42 pp. Available at: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/recommendation-keratinosens-skin-sensitisation.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 DB-ALM (INVITTOX) (2013) Protocol 155: KeratinoSensTM., 17 pp. Available: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/beta/index.cfm/methodsAndProtocols/index
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Natsch A., Emter R., Ellis G. (2009). Filling the concept with data: integrating data from different in vitro and in silico assays on skin sensitizers to explore the battery approach for animal-free skin sensitization testing. Toxicol. Sci. 107, 106-121.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Ball N., Cagen S., Carrillo J.C., Certa H., Eigler D., Emter R., Faulhammer F., Garcia C., Graham C., Haux C., Kolle S.N., Kreiling R., Natsch A., Mehling A. (2011). Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach. Regul. Toxicol. Pharmacol. 60, 389-400.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Bauch C., Kolle S.N., Ramirez T., Eltze T., Fabian E., Mehling A., Teubner W., van Ravenzwaay B., Landsiedel R. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potentials. Regul. Toxicol. Pharmacol. 63, 489-504.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Jaworska J., Dancik Y., Kern P., Gerberick F., Natsch A. (2013). Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice. J Appl Toxicol. 33, 1353-1364.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Andres E., Sa-Rocha V.M., Barrichello C., Haupt T., Ellis G., Natsch A. (2013). The sensitivity of the KeratinoSensTM assay to evaluate plant extracts: A pilot study. Toxicology In Vitro 27, 1220-1225.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Fabian E., Vogel D., Blatz V., Ramirez T., Kolle S., Eltze T., van Ravenzwaay B., Oesch F., Landsiedel R. (2013). Xenobiotic metabolizin enzyme activities in cells used for testing skin sensitization in vitro. Arch. Toxicol. 87, 1683-1969.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Thorne N., Inglese J., Auld D.S. (2010). Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology. Chemistry and Biology 17, 646-657.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 OECD (2012). BG1Luc Estrogen Receptor Transactivation Test Method for Identifying Estrogen Receptor Agonists and Antagonists. OECD Guidelines for Chemical Testing No. 457. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87).
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Gildea L.A., Ryan C.A., Foertsch L.M., Kennedy J.M., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2006). Identification of gene expression changes induced by chemical allergens in dendritic cells: opportunities for skin sensitization testing. J. Invest. Dermatol., 126, 1813-1822.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Ryan C.A., Gildea L.A., Hulette B.C., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2004). Gene expressing changes in peripheral blood-derived dendritic cells following exposure to a contact allergen. Toxicol. Lett. 150, 301-316.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Emter R., van der Veen J.W., Adamson G., Ezendam J., van Loveren H., Natsch A. (2013). Gene expression changes induced by skin sensitizers in the KeratinoSens™ cell line: Discriminating Nrf2-dependent and Nrf2-independent events. Toxicol. in vitro 27, 2225-2232.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 OECD (2015). Performance Standards for assessment of proposed similar or modified in vitro skin sensitisation ARE-Nrf2 luciferase test methods. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment N0 213, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment No.34. OECD, Paris, France.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 NAFTA (North American Free Trade Agreement) (2012). Technical Working Group on Pesticides — (Quantitative) Structure Activity Relationship ((Q)SAR) Guidance Document. 186 pp. http://www.epa.gov/oppfead1/international/naftatwg/guidance/qsar-guidance.pdf
                              
                           
                        Appendiċi 1
                        DEFINIZZJONIJIET
                        
                           
                              Preċiżjoni
                           : Il-qrubija fil-livell ta' qbil bejn ir-riżultati tal-metodu ta' ttestjar u l-valuri ta' referenza aċċettati. Hija kejl tal-prestazzjoni tal-metodu ta' ttestjar u wieħed mill-aspetti ta'“rilevanza”. It-terminu jintuża spiss minflok “konkordanza” sabiex ifisser il-proporzjon ta' riżultati tajbin tal-metodu ta' ttestjar (29).
                        
                           
                              AOP (Passaġġ tal-Eżitu Avvers)
                           : Sekwenza ta' avvenimenti mill-istruttura kimika ta' sustanza kimika fil-mira jew grupp ta' sustanzi kimiċi simili permezz tal-avveniment ta' inizjazzjoni molekolari għal eżitu ta' interess in vivo (2).
                        
                           
                              ARE
                           : Element tar-rispons tal-antiossidanti (imsejjaħ ukoll EpRE, element tar-rispons tal-elettrofili), huwa element ta' rispons li jinsab fir-reġjun tal-promotur upstream ta' ħafna ġeni ċitoprotettivi u tal-fażi II. Meta jiġi attivat minn Nfr2, iservi ta' medjatur għall-induzzjoni transkrizzjonali ta' dawn il-ġeni.
                        
                           
                              Sustanza kimika
                           : Sustanza jew taħlita.
                        
                           
                              Koeffiċjent ta' varjazzjoni
                           : Kejl tal-varjabbiltà li huwa kkalkolat għal grupp ta' dejta dwar ir-repliki billi d-devjazzjoni standard tiġi diviża bil-medja. Jista' jiġi mmoltiplikat b'100 għall-espressjoni bħala perċentwal.
                        
                           
                              EC1,5
                              
                           : Il-konċentrazzjoni interpolata għal induzzjoni ta' luċiferażi għal darba u nofs
                        
                           
                              IC30
                              
                           : Il-konċentrazzjoni li twassal għal tnaqqis ta' 30 % fil-vijabbiltà ċellolari.
                        
                           
                              IC50
                              
                           : Il-konċentrazzjoni li twassal għal tnaqqis ta' 50 % fil-vijabbiltà ċellolari.
                        
                           
                              Periklu
                           : Proprjetà inerenti ta' aġent jew sitwazzjoni li għandhom il-potenzjal li jikkawżaw effetti avversi meta organiżmu, sistema jew (sub)popolazzjoni jiġu esposti għal dak l-aġent.
                        
                           
                              IATA (Approċċ Integrat għall-Ittestjar u l-Valutazzjoni)
                           : Approċċ strutturat użat għall-identifikazzjoni ta' perikli (potenzjal), il-karatterizzazzjoni tal-perikli (potenza) u/jew valutazzjoni tas-sikurezza (potenzjal/potenza u esponiment ) ta' sustanza kimika jew grupp ta' sustanzi kimiċi, li tintegra b'mod strutturat u jiżen id-dejta rilevanti kollha sabiex jinforma deċiżjoni regolatorja dwar il-periklu u/jew ir-riskju u/jew il-ħtieġa potenzjali għal ittestjar immirat ulterjuri li, għaldaqstant, ikun minimu.
                        
                           Imax
                           : Il-fattur ta' induzzjonali massimali tal-attività ta' luċiferażi meta mqabbla mal-kontroll tas-solvent (negattiv) imkejjel fi kwalunkwe konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test.
                        
                           
                              Keap1
                           : Proteina 1 assoċjata mal-ECH bħall-Kelch, hija proteina sensorjali li tista' tirregola l-attività Nrf2. F'kundizzjonijiet mhux indotti, il-proteina sensorjali Keap1 timmira l-fattur ta' transkrizzjoni tal-Nrf2 għal ubikwitinilazzjoni u degradazzjoni proteolitika fil-proteażoma. Il-modifika kovalenti tar-residwi ta' ċisteina reattiva tal-Keap 1 minn molekoli żgħar tista' twassal għal dissoċjazzjoni ta' Nrf2 minn Keap1 (8) (10) (11).
                        
                           
                              Taħlita
                           : Taħlita jew soluzzjoni msawra minn żewġ sustanzi jew iktar li fiha ma jirreaġixxux (1).
                        
                           
                              Sustanza monokostitwenti
                           : Sustanza, definita mill-kompożizzjoni kwantitattiva tagħha, lifiha kostitwent ewlieni wieħed ikun preżenti għal tal-inqas 80 % (w/w).
                        
                           
                              Sustanza multikostitwenti
                           : Sustanza, definita mill-kompożizzjoni kwantitattiva tagħha, li fiha iktar minn kostitwent ewlieni wieħed ikunu preżenti f'konċentrazzjoni ≥ 10 % (w/w) u < 80 % (w/w). Sustanza multikostitwenti hija r-riżultat ta' proċess tal-manifattura. Id-differenza bejn taħlita u sustanza multikostitwenti hija li taħlita tinkiseb bl-amalgamar ta' żewġ sustanzi jew iktar mingħajr reazzjoni kimika. Sustanza multikostitwenti hija r-riżultat ta' reazzjoni kimika.
                        
                           
                              Nrf2
                           : Il-fattur nukleari (derivat mill-eritrojde 2)-bħal 2, huwa fattur ta' transkrizzjoni involut fil-passaġġ tar-rispons tal-antiossidanti. Meta Nrf2 ma jkunx ubikwitinilat, jinġema' fiċ-ċitoplażma u jittrażloka fin-nukleu, fejn jingħaqad mal-ARE fir-reġjun promotur upstream ta' ħafna ġeni ċitoprotettivi, sabiex iniedi t-transkrizzjoni tagħhom (8) (10) (11).
                        
                           
                              Kontroll pożittiv
                           : Replika li jkun fiha l-komponenti kollha ta' sistema tat-test u trattata b'sustanza li jkun magħruf li tikkawża rispons pożittiv. Sabiex jiġi żgurat li l-varjabilità fir-rispons tal-kontroll pożittiv tkun tista' tiġi vvalutata tul iż-żmien, id-daqs tar-rispons pożittiv ma għandux ikun eċċessiv.
                        
                           
                              Rilevanza
                           : Deskrizzjoni tar-relazzjoni tat-test għall-effett ta' interess u jekk huwiex sinifikanti u utli għal skop partikolari. Din tiddetermina kemm it-test għandu l-ħila jkejjel jew ibassar b'mod korrett l-effett bijoloġiku ta' interess. Ir-rilevanza tinkorpora l-kunsiderazzoni tal-preċiżjoni (konkordanza ta' metodu ta' ttestjar) (29).
                        
                           
                              Affidabilità
                           : Kejliet ta' kemm metodu ta' ttestjar jista' jitwettaq b'mod riproduċibbli fil-laboratorji u bejn il-laboratorji tul iż-żmien, meta jitwettaq billi jintuża l-istess protokoll. Din tiġi evalwata billi tkun ikkalkolata r-riproduċibbilità fl-istess u bejn il-laboratorarji u r-ripetibilità fl-istess laboratorju (29).
                        
                           
                              Riproduċibilità
                           : Il-qbil bejn ir-riżultati miksub mill-ittestjar tal-istess sustanza kimika bl-użu tal-istess protokoll tat-test (ara affidabbiltà) (29).
                        
                           
                              Sensittività
                           : Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi pożittivi/attivi kollha li huma klassifikati kif suppost mill-metodu ta' ttestjar. Hija kejl tal-preċiżjoni għal metodu ta' ttestjar li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hija kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta' metodu ta' ttestjar (29).
                        
                           
                              Kontroll tas-solvent/veikolu
                           : Replika li fiha l-komponenti kollha ta' sistema tat-test ħlief is-sustanza kimika tat-test, iżda tinkludi s-solvent li jintuża. Jintuża sabiex jiġi stabbilit ir-rispons bażi għall-kampjuni ttrattati bis-sustanza kimika tat-test dissolta fl-istess solvent.
                        
                           
                              Speċifiċità
                           : Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi negattivi/inattivi kollha li huma klassifikati kif suppost mill-metodu ta' ttestjar. Hija kejl tal-preċiżjoni għal metodu ta' ttestjar li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hija kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta' metodu ta' ttestjar (29).
                        
                           
                              Sustanza
                           : Elementi kimiċi u l-komposti tagħhom fl-istat naturali jew miksubin bi kwalunkwe proċess ta' produzzjoni, inkluż kwalunkwe addittiv meħtieġ għall-preservazzjoni tal-istabilità tal-prodott u ta' kwalunkwe impurità li toriġina mill-proċess użat, imma eskluż kwalunkwe solvent li jista' jkun separat mingħajr ma jaffetwa l-istabilità tas-sustanza jew ibiddel il-kompożizzjoni tagħha (1).
                        
                           
                              Sustanza kimika tat-test
                           : It-terminu “sustanza kimika tat-test” jintuża sabiex jirreferi għal dik li qiegħda tiġi ttestjata.
                        
                           
                              Is-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta' Sustanzi Kimiċi tan-Nazzjonijiet Uniti (GHS tan-NU)
                           : Sistema li tipproponi l-klassifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) skont it-tipi u l-livelli standardizzati ta' perikli fiżiċi, sanitarji u ambjentali, u tindirizza l-elementi ta' komunikazzjoni korrispondenti, bħal pittogrammi, kliem ta' twissija, dikjarazzjonijiet ta' periklu, dikjarazzjonijiet ta' prekawzjoni u skedi ta' tagħrif dwar is-sikurezza, sabiex jitwassal tagħrif dwar l-effetti avversi bil-għan li n-nies ikunu protetti (inklużi min iħaddem, il-ħaddiema, it-trasportaturi, il-konsumaturi u l-ħaddiema tal-emerġenza) u l-ambjent (1).
                        
                           
                              UVCB
                           : Sustanzi kimiċi b'kompożizzjoni mhux magħrufa jew varjabbli, prodotti b'reazzjoni kumplessa jew materjali bijoloġiċi.
                        
                           
                              Metodu ta' ttestjar validu
                           : Metodu ta' ttestjar meqjus li għandu biżżejjed rilevanza u affidabilità għal skop speċifiku u li huwa bbażat fuq prinċipji xjentifiċi sodi. Metodu ta' ttestjar qatt ma jkunx validu f'sens assolut, iżda biss b'rabta ma' skop definit (29).
                     
                     
                        Appendiċi 2
                        SUSTANZI TA' PROFIĊJENZA
                        
                           Sensitizzazzjoni tal-Ġilda In Vitro: Metodu ta' Ttestjar tal-ARE-Nrf2 Luciferase
                        
                        Qabel l-użu ta' rutina ta' dan il-metodu ta' ttestjar, il-laboratorji għandhom juru l-profiċjenza teknika billi jiksbu b'mod korrett it-tbassir mistenni ta' KeratinoSens™ għall-10 Sustanzi ta' Profiċjenza rakkomandati fit-Tabella 1 u billi jiksbu l-valuri tal-EC1,5 u IC50 li jaqgħu fi ħdan il-medda ta' referenza rispettiva għal tal-inqas 8 mill-10 sustanzi ta' profiċjenza. Dawn is-sustanzi ta' profiċjenza ntgħażlu sabiex jirrappreżentaw il-firxa ta' risponsi għal perikli ta' sensitizzazzjoni tal-ġilda. Fost kriterji tal-għażla oħrajn kien hemm id-disponibilità kummerċjali, id-disponibilità ta' referenza in vivo ta' kwalità għolja u d-disponibilità ta' dejta in vitro ta' kwalità għolja mill-assaġġ KeratinoSensTM.
                        
                           Tabella 1
                        
                        
                           Sustanzi rrakkomandati biex tintwera profiċjenza teknika mal-assaġġ KeratinoSens™
                        
                        
                                    Sustanzi ta' Profiċjenza
                                 
                                 
                                    CASRN
                                 
                                 
                                    Forma Fiżika
                                 
                                 
                                    Tbassir In Vivo
                                        (28)
                                    
                                 
                                 
                                    Tbassir KeratinoSens™ (29)
                                    
                                 
                                 
                                    Medda ta' Referenza tal-EC1,5 (μM) (30)
                                    
                                 
                                 
                                    Medda ta' Referenza tal-IC50 (μM) (30)
                                    
                                 
                              
                                    Isopropanol
                                 
                                 
                                    67-63-0
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Mhux sensitizzatur
                                 
                                 
                                    Negattiv
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Aċidu saliċiliku
                                 
                                 
                                    69-72-7
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Mhux sensitizzatur
                                 
                                 
                                    Negattiv
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Aċidu lattiku
                                 
                                 
                                    50-21-5
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Mhux sensitizzatur
                                 
                                 
                                    Negattiv
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Gliċerol
                                 
                                 
                                    56-81-5
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Mhux sensitizzatur
                                 
                                 
                                    Negattiv
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Alkoħol taċ-ċinnamil
                                 
                                 
                                    104-54-1
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Sensitizzatur (dgħajjef)
                                 
                                 
                                    Pożittiv
                                 
                                 
                                    25 - 175
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Dimetakrilat tal-etilen glikol
                                 
                                 
                                    97-90-5
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Sensitizzatur (dgħajjef)
                                 
                                 
                                    Pożittiv
                                 
                                 
                                    5 - 125
                                 
                                 
                                    > 500
                                 
                              
                                    2-Merkaptobenżotjażol
                                 
                                 
                                    149-30-4
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Sensitizzatur (moderat)
                                 
                                 
                                    Pożittiv
                                 
                                 
                                    25 - 250
                                 
                                 
                                    > 500
                                 
                              
                                    Glutaronitril tal-metildibromo
                                 
                                 
                                    35691-65-7
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Sensitizzatur (qawwi)
                                 
                                 
                                    Pożittiv
                                 
                                 
                                    < 20
                                 
                                 
                                    20 - 100
                                 
                              
                                    4-Metilaminofenol sulfat
                                 
                                 
                                    55-55-0
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Sensitizzatur (qawwi)
                                 
                                 
                                    Pożittiv
                                 
                                 
                                    < 12.5
                                 
                                 
                                    20 - 200
                                 
                              
                                    2,4-Dinitro-klorobenżen
                                 
                                 
                                    97-00-7
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Sensitizzatur (estrem)
                                 
                                 
                                    Pożittiv
                                 
                                 
                                    < 12.5
                                 
                                 
                                    5 - 20
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 3
                        
                           KONTROLL TAL-KWALITÀ TAL-KEJLIET TAL-LUMINEXXENZA
                        
                        
                           Esperiment bażiku għall-iżgurar ta' kejl ottimali tal-luminexxenza fl-assaġġ KeratinoSensTM
                           
                        
                        It-tliet parametri li ġejjin huma kritiċi għall-iżgurar tal-kisba ta' riżultati affidabbli bil-luminometru:
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    li jkun hemm biżżejjed sensittività li tagħti sfond stabbli fi bwejriet tal-kontroll;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    li ma jkun hemm ebda gradjent fuq il-pjastra minħabba ħinijiet twal tal-qari; u
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    li ma jkun hemm ebda kontaminazzjoni ta' dawl fil-bwejriet biswit minn bwejriet attivi ħafna.
                                 
                              Qabel l-ittestjar huwa rakkomandat li jiġi żgurat li jkun hemm il-kejliet tal-luminexxenza xierqa, billi tiġi ttestjata pjastra tal-kontroll stabbilita kif deskritt hawn taħt (analiżi tat-triplikati).
                        
                           L-issettjar tal-pjastri tal-ewwel esperiment ta' taħriġ
                        
                        
                                     
                                 
                                 
                                    1
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    3
                                 
                                 
                                    4
                                 
                                 
                                    5
                                 
                                 
                                    6
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                    8
                                 
                                 
                                    9
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    12
                                 
                              
                                    A
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    B
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    C
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    
                                       D
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 0.98
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 1.95
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 3.9
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 7.8
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 15.6
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 31.25
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 62.5
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 125
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 250
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 500
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 1000
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 2000
                                    
                                 
                              
                                    E
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    F
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    G
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    H
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    
                                       CA 4
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 8
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 16
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 32
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 64
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       Inbjank
                                    
                                 
                              
                           EGDMA= Dimetakrilat tal-etilen glikol (Nru CAS: 97-90-5) sustanza kimika b'induzzjoni qawwija
                        
                           CA= Aldeid ċinnamiku, referenza pożittiva (Nru CAS: 104-55-2)
                        
                           L-analiżi tal-kontroll tal-kwalità għandha turi:
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    rispons għad-doża ċar fir-ringiela D, bl-Imax > 20 darba ikbar mill-isfond (f'ħafna każijiet, jintlaħqu valuri tal-Imax ta' bejn 100 u 300);
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    ebda rispons għad-doża fir-ringiela C u E (ebda valur ta' induzzjoni iktar minn 1.5 (idealment mhux iktar minn 1.3) minħabba kontaminazzjoni possibbli tad-dawl, speċjalment qrib bwejriet ferm attivi fir-ringiela tal-EGDMA;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    ebda differenza statistikament sinifikanti bejn ir-ringieli A, B,, E, F u G (jiġifieri ebda gradjent fuq il-pjastra); u
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    il-varjabbiltà fi kwalunkwe waħda mir-ringieli A, B,, E, F u G u fil-bwejriet tad-DMSO fir-ringiela H għandha tkun inqas minn 20 % (jiġifieri sfond stabbli).
                                 
                              
                     B.61   Metodu ta' Ttestjar tat-Tnixxija ta' Fluworexxeina għall-Identifikazzjoni ta' Korrużivi Okulari u Irritanti Severi
                     
                     INTRODUZZJONI
                     Dan il-metodu ta' ttestjar (TM) huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 460 tal-OECD (2012). Il-metodu ta' ttestjar tat-Tnixxija tal-Fluworexxeina huwa metodu ta' ttestjar in vitro li jista' jintuża f'ċerti ċirkustanzi u b'limitazzjonijiet speċifiċi sabiex jiġu kklassifikati sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) bħala korrużivi okulari u irritanti severi, kif definiti mis-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta' Sustanzi Kimiċi (GHS) tan-Nazzjonijiet Uniti (NU) (Kategorija 1), ir-Regolament (KE) Nru 1272/2008 dwar il-Klassifikazzjoni, l-Ittikkettar u l-Imballaġġ tas-Sustanzi u t-Taħlitiet (CLP) (31) (Kategorija 1), u (Kategorija I) tal-Aġenzija għall-Protezzjoni tal-Ambjent (EPA) tal-Istati Uniti (1)(2). Għall-fini ta' dan il-metodu ta' ttestjar, irritanti okulari severi huma definiti bħala sustanzi kimiċi li jikkaġunaw ħsara fit-tessut fl-għajnejn wara l-għoti tas-sustanza kimika tat-test li ma tkunx riversibbli fi żmien 21 jum tal-applikazzjoni jew tikkawża tħassir fiżiku serju tal-vista, filwaqt li korrużivi okulari huma sustanzi kimiċi li jikkaġunaw ħsara irriversibbli fit-tessut tal-għajnejn. Dawn is-sustanzi kimiċi huma klassifikati fil-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU, il-Kategorija 1 tas-CLP tal-UE, jew il-Kategorija 1 tal-EPA l-Istati Uniti.
                     Filwaqt li l-metodu ta' ttestjar tal-FL ma jitqiesx li huwa validu bħala sostitut komplut għat-test in vivo fuq l-għajnejn tal-fniek, l-FL huwa rakkomandat sabiex jintuża bħala parti minn strateġija ta' ttestjar sekwenzjali għall-klassifikazzjoni u t-tikkettar regolatorji. B'hekk, l-FL huwa rakkomandat bħala l-ewwel pass fi ħdan approċċ minn Fuq għal Isfel sabiex jiġu identifikati korrużivi okulari/irritanti severi, speċifikament għal tipi limitati ta' sustanzi kimiċi (jiġifieri sustanzi u taħlitiet solubbli fl-ilma) (3)(4).
                     Ġeneralment huwa aċċettat li, fil-futur qarib, ebda test in vitro tal-irritazzjoni tal-għajnejn waħdu ma huwa sejjer ikun kapaċi jieħu post it-test in vivo tal-għajnejn (TM B.5 405 (5)) sabiex ibassar il-medda sħiħa ta' irritazzjonijiet għal klassijiet ta' sustanzi kimiċi differenti. Madankollu, it-taħlitiet strateġiċi ta' bosta metodi ta' ttestjar alternattivi fi ħdan strateġija ta' ttestjar (sekwenzjali) jaf ikunu jistgħu jieħdu post it-test in vivo tal-għajnejn (4). L-approċċ minn Fuq għal Isfel (4) huwa mfassal sabiex jintuża meta, fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, sustanza kimika tkun mistennija li jkollha potenzjal għoli ta' irritazzjoni.
                     Fuq il-bażi tal-mudell ta' tbassir spjegat fil-paragrafu 35, il-metodu ta' ttestjar tal-FL jista' jidentifika sustanzi kimiċi fi ħdan dominju ta' applikabilità limitat bħala korrużivi okulari/irritanti severi (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU; il-Kategorija 1 tas-CLP tal-UE; Kategorija I tal-EPA tal-Istati Uniti) mingħajr ebda test ieħor. L-istess huwa supponut għat-taħlitiet, għad li t-taħlitiet ma ntużawx fil-validazzjoni. Għaldaqstant, il-metodu ta' ttestjar tal-FL jista' jintuża sabiex jistabbilixxi l-irritazzjoni għall-għajnejn/il-korrużività tas-sustanzi kimiċi, billi tiġi segwita l-istrateġija ta' ttestjar sekwenzjali tat-TM B.5 (5). Madankollu, sustanza kimika li mhijiex imbassra bħala korrużiv okulari jew irritant sever bil-metodi ta' ttestjar tal-FL ikollha bżonn tiġi ttestjata f'metodu ta' ttestjar wieħed jew iktar addizzjonali (in vitro u/jew in vivo) li kapaċi jidentifika bi preċiżjoni i) sustanzi kimiċi li huma korrużivi okulari/irritanti severi foloz negattivi in vitro fl-FL (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU; il-Kategorija 1 tas-CLP tal-UE; Kategorija I tal-EPA tal-Istati Uniti); ii) sustanzi kimiċi li mhumiex ikklassifikati għal korrużjoni/irritazzjoni tal-għajnejn (Kategorija Nru tal-GHS tan-NU; Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU: Kategorija IV tal-EPA tal-Istati Uniti); u/jew iii) sustanzi kimiċi li huma irritanti moderati/ħfief għall-għajnejn (Kategoriji 2A u 2B tal-GHS tan-NU; il-Kategorija 2 tas-CLP tal-UE; Kategoriji II u III tal-EPA tal-Istati Uniti);
                     L-għan ta' dan il-metodu ta' ttestjar huwa li jiddeskrivi l-proċeduri użati għall-evalwazzjoni tal-potenzjal ta' sustanza kimika tat-test li tikkawża korrużività jew irritanza severa potenzjali kif imkejla mill-ħila tagħha li tinduċi ħsara lil monosaff tal-epitelju konfluwenti impermeabbli. L-integrità tal-permeabilità transepiteljali hija funzjoni ewlenija ta' epitelju bħal dak li jinsab fil-konġuntiva u l-kornea. Il-permeabilità transepiteljali hija kkontrollata minn bosta ġunzjonijiet dojoq. Intwera li żieda fil-permeabilità tal-epitelju korneali in vivo jikkorrelata mal-livell ta' infjammazzjoni u l-ħsara fil-wiċċ osservata hi u tiżviluppa l-irritazzjoni tal-għajnejn.
                     Fil-metodu ta' ttestjar tal-FL, l-effetti tossiċi wara ħin tal-esponiment qasir għas-sustanza kimika tat-test jitkejlu minn żieda fil-permeabilità tal-fluworexxeina tas-sodju permezz tal-monosaff epiteljali taċ-ċelloli tal-Kilwa Kanina Madin-Darby (MDCK) ikkulturati fuq inserzjonijiet permeabbli. L-ammont ta' tnixxija ta' fluworexxeina li sseħħ huwa proporzjonat għall-ħsara indotta mis-sustanza kimika fil-ġunzjonijiet dojoq, il-ġunzjonijiet desmożomali u l-membrani taċ-ċelloli, u jista' jintuża sabiex jiġi stmat il-potenzjal ta' tossiċità okulari ta' sustanza kimika tat-test. L-Appendiċi 1 jipprovdi dijagramma taċ-ċelloli tal-MDCK imkabbrin fuq membrana li tiddaħħal għall-metodu ta' ttestjar tal-FL.
                     Id-definizzjonijiet huma pprovduti fl-Appendiċi 2.
                     KUNSIDERAZZJONIJIET U LIMITAZZJONIJIET INIZJALI
                     Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bbażat fuq il-protokoll INVITTOX Nru 71 (6) li ġie evalwat miċ-Ċentru Ewropew għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ECVAM), f'kollaborazzjoni mal-Kumitat ta' Koordinazzjoni Interaġenzjali tal-Istati Uniti għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ICCVAM) u ċ-Ċentru Ġappuniż għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (JaCVAM).
                     Il-metodu ta' ttestjar tal-FL mhuwiex rakkomandat sabiex jiġu identifikati sustanzi kimiċi li għandhom jiġu kklassifikati bħala irritanti ħfief/moderati jew sustanzi kimiċi li ma għandhomx ikunu kklassifikati għal irritazzjoni okulari (sustanzi u taħlitiet) jiġifieri Kat. 2A/2B tal-GHS, ebda kategorija; Kat. 2 tas-CLP tal-UE, ebda kategorija; Kategoriji II/III/IV tal-EPA tal-Istati Uniti), kif muri mill-istudju ta' validazzjoni (3) (7).
                     Il-metodu ta' ttestjar huwa applikabbli biss għal sustanzi kimiċi solubbli fl-ilma (sustanzi u taħlitiet). Il-potenzjal ta' irritazzjoni severa okulari ta' sustanzi kimiċi li huma solubbli fl-ilma u/jew fejn l-effett tossiku mhuwiex affettwat minn dilwizzjoni ġeneralment jitbassar b'mod preċiż bil-metodu ta' ttestjar tal-FL (7). Sabiex sustanza kimika tiġi kategorizzata bħala solubbli fl-ilma, f'kundizzjonijiet sperimentali, għandha tkun solubbli f'Soluzzjoni sterili tal-Melħ Bilanċjata ta' Hanks (HBSS) mingħajr fenol aħmar li fiha l-kalċju (f'konċentrazzjoni ta' 1.0-1.8 mM) f'konċentrazzjoni ta' ≥ 250 mg/ml (doża ogħla mil-limitu ta' 100 mg/ml). Madankollu, jekk is-sustanza kimika tat-test hija solubbli taħt il-konċentrazzjoni ta' 100 mg/ml, iżda diġà tinduċi induzzjoni tal-FL ta' 20 % f'dik il-konċentrazzjoni (jiġifieri FL20 < 100 mg/ml), xorta waħda tista' tiġi kklassifikata bħala tal-Kat. 1 tal-GHS jew Kat. 1 tal-EPA.
                     Il-limitazzjonijiet identifikati għal dan il-metodu ta' ttestjar jeskludu aċidi u bażijiet b'saħħithom, fissattivi ta' ċelloli u sustanzi kimiċi ferm volatili mid-dominju ta' applikabilità. Dawn is-sustanzi kimiċi għandhom mekkaniżmi li ma jitkejlux mill-metodu ta' ttestjar tal-FL, eż. koagulazzjoni estensia, saponifikazzjoni jew kimiki reattivi speċifiċi. Limitazzjonijiet identifikati oħrajn għal dan il-metodu huma msejsin fuq ir-riżultati għall-kapaċità ta' tbassir għal sustanza kimika tat-test ikkulurita u viskuża (7). Huwa ssuġġerit li ż-żewġ tipi ta' sustanzi kimiċi diffiċli jitneħħew mill-monosaff wara l-perjodu ta' esponiment qasir u li l-prevedibbiltà tal-metodu ta' ttestjar tista' tittejjeb jekk jintuża numru ikbar ta' stadji tal-ħasil. Sustanzi kimiċi solidi sospiżi f'likwidu għandhom il-propensità li jippreċipitaw 'il barra u jaf ikun diffiċli li tiġi stabbilita l-konċentrazzjoni finali għaċ-ċelloli. Meta s-sustanzi kimiċi ta' dawn il-klassijiet kimiċi u fiżiċi jiġu esklużi mid-database, il-preċiżjoni tal-FL skont is-sistemi ta' klassifikazzjoni tal-UE, l-EPA u l-GHS titjieb b'mod sostanzjali (7).
                     Fuq il-bażi tat-tir ta' dan il-metodu ta' ttestjar (jiġifieri li jidenifika korrużivi okulari/irritanti severi biss), ir-rati ta' foloz negattivi (ara l-Paragrafu 13) mhumiex kritiċi peress li t-tali sustanzi kimiċi mbagħad jiġu ttestjati b'testijiet in vitro validati adegwatament oħrajn jew fil-fniek, skont ir-rekwiżiti regolatorji, bl-użu ta' strateġija ta' ttestjar sekwenzjali f'approċċ tal-piż tal-evidenza (5) (ara l-paragrafi 3 u 4 ukoll).
                     Il-limitazzjonijiet identifikati l-oħrajn tal-metodu ta' ttestjar tal-FL huma bbażati fuq rati ta' foloz negattivi u foloz pożittivi. Meta jintuża bħala l-ewwel pass fi ħdan approċċ minn Fuq għal Isfel sabiex jiġu identifikati sustanzi u taħlitiet korrużivi okulari/irritanti severi solubbli fl-ilma (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU; il-Kategorija 1 tas-CLP tal-UE; Kategorija I tal-EPA tal-Istati Uniti), ir-rata ta' foloz pożittivi għall-metodu ta' ttestjar tal-FL varjat minn 7 % (7/103; GHS tan-NU u CLP tal-UE) sa 9 % (9/99; EPA tal-Istati Uniti) u r-rata ta' foloz negattivi varjat minn 54 % (15/28; EPA tal- Istati Uniti) sa 56 % (27/48; GHS tan-NU u CLP tal-UE) meta mqabblin ma' riżultati in vivo. Il-gruppi ta' sustanzi kimiċi li juru riżultati ta' foloz pożittivi u/jew foloz negattivi fil-metodu ta' ttestjar tal-FL mhumiex definiti hawnhekk.
                     Ċerti limitazzjonijiet tekniċi huma speċifiċi għall-kultura taċ-ċelloli tal-MDCK. Il-ġunzjonijiet dojoq li jimblokkaw il-passaġġ tal-kulurant fluworexxein mill-monosaff dejjem jiġu f'riskju ikbar minħabba numru dejjem ikbar ta' passaġġi ta' ċelloli. Formazzjoni inkompluta tar-riżultati tal-ġunzjonijiet dojoq f'FL ikbar fil-kontroll mhux ittrattat. Għaldaqstant, tnixxija massimali permessibbli definita fil-kontrolli mhux ittrattati hija importanti (ara l-paragrafu 38: tnixxija 0 %). Bħal bl-assaġġi in vitro kollha, hemm il-potenzjal li ċ-ċelloli jiġu ttrasformati maż-żmien, u b'hekk huwa vitali li jinbdew il-meded tan-numru ta' passaġġi għall-assaġġi.
                     Id-dominju ta' applikabilità attwali jista' jiżdied f'ċerti każijiet, iżda biss wara li jiġi analizzatt sett ta' dejta mifrux ta' sustanzi kimiċi tat-test studjati, idealment miksub wara testijiet (3). Dan il-metodu ta' ttestjar sejjer jiġi aġġornat kif xieraq iktar ma jkun hemm informazzjoni u dejta ġodda kkunsidrati.
                     Għal kwalunkwe laboratorju li inizjalment ikun qed jistabbilixxi dan l-assaġġ, għandhom jintużaw is-sustanzi kimiċi ta' profiċjenza pprovduti fl-Appendiċi 3. Il-laboratorji jistgħu jużaw dawn is-sustanzi kimiċi sabiex juru l-kompetenza teknika tagħhom fit-twettiq tal-metodu ta' ttestjar tal-FL qabel ma jissottomettu dejta tal-assaġġ tal-FL għall-finijiet tal-klassifikazzjoni regolatorja tal-perikli.
                     IL-PRINĊIPJU TAT-TEST
                     Il-metodu ta' ttestjar tal-FL huwa assaġġ in vitro bbażat fuq il-funzjoni taċ-ċelloli u ċ-ċitotossiċità li jsir fuq monosaff konfluwenti ta' ċelloli tal-epitelju tubulari CB997 tal-MDCK li jitkabbru fuq inserzjonijiet semipermeabbli u jimmudellaw l-istat mhux proliferanti tal-epitelju korneali in vivo. Il-linja ta' ċelloli tal-MDCK hija ferm stabbilita u tifforma ġunzjonijiet dojoq u ġunzjonijiet desmosomali simili għal dawk li jinstabu fuq in-naħa apika tal-epitelju tal-konġuntiva u tal-kornea. Ġunzjonijiet dojoq u desmosomali in vivo jipprevjenu soluti u materjali estranei milli jippenetraw l-epitelju tal-kornea. It-telfien tal-impermeabilità transepiteljali, minħabba l-ġunzjonijiet dojoq u l-ġunzjonijiet desmosomali li jġarrbu ħsara, huwa wieħed mill-avvenimenti bikrin fl-irritazzjoni okulari indotta mis-sustanzi kimiċi.
                     Is-sustanza kimika tat-test hija applikata għas-saff konfluwenti ta' ċelloli mkabbrin fuq in-naħa apika tal-inserzjoni. Normalment tintuża esposizzjoni qasira ta' minuta sabiex tirrifletti r-rata ta' kklerjar normali fl-esponimenti tal-bniedem. Vantaġġ tal-perjodu ta' esponiment qasir huwa li s-sustanzi u t-taħlitiet ibbażati fuq l-ilma jistgħu jiġu ttestjati puri, jekk ikunu jistgħu jitneħħew faċilment wara l-perjodu tal-esponiment. Dan jippermetti li jsiru paraguni iktar diretti tar-riżultati mal-effetti kimiċi fil-bniedem. Imbagħad is-sustanza kimika tat-test titneħħa u l-kulurant fluworexxein tas-sodju ferm fluworexxenti u mhux tossiku jiżdied man-naħa apika tal-monosaff għal 30 minuta. Il-ħsara kkaġunata mis-sustanza kimika tat-test fil-ġunzjonijiet dojoq tiġi stabbilita bl-ammont ta' fluworexxeina li tnixxi minn ġos-saff taċ-ċelloli fi ħdan perjodu ta' ħin definit.
                     L-ammont ta' kulurant fluworexxein tas-sodju li jgħaddi minn ġol-monosaff u l-membrana tal-inserzjoni f'volum stabbilit ta' soluzzjoni preżenti fil-bwejra (li fiha jnixxi l-kulurant fluworexxein tas-sodju) jiġi stabbilit billi titkejjel spettrofluworometrikament il-konċentrazzjoni ta' fluworexxeina fil-bwejra. L-ammont ta' tnixxija tal-fluworexxeina (FL) jiġi kkalkolat b'referenza għall-valuri tal-intensità tal-fluworexxenza (FI) miż-żewġ kontrolli: kontroll inbjank, u kontroll tat-tnixxija massima. Il-perċentwal ta' tnixxija u, għalhekk, l-ammont ta' ħsara fl-inġunzjonijiet dojoq huma espressi, b'rabta ma' dawk il-kontrolli, għal kull waħda mill-konċentrazzjonijiet stabbiliti tas-sustanza kimika tat-test. Imbagħad, jiġi kkalkolat l-FL20 (jiġifieri l-konċentrazzjoni li tikkawża FL ta' 20 % b'rabta mal-valur irreġistrat għall-monosaff konfluwenti mhux ittrattat u l-inserzjonijiet mingħajr ċelloli). Il-valur tal-FL20 (mg/ml) jintuża fil-mudell ta' tbassir għall-identifikazzjoni ta' korrużivi okulari u irritanti severi (ara l-paragrafu 35).
                     L-irkupru għandu sehem importanti mill-profil tat-tossiċità ta' sustanza kimika tat-test li jiġi vvalutat mit-test ta' irritazzjoni okulari in vivo wkoll. L-analiżijiet preliminari indikaw li d-dejta dwar l-irkupru (sa 72 siegħa wara l-esponiment għas-sustanza kimika tat-test) tista' potenzjalment iżżid il-kapaċità ta' tbassir tal-Protokoll 71 ta' INVITTOX iżda hemm bżonn ta' iktar evalwazzjoni u tkun tibbenefika minn dejta addizzjonali, idealment miksub b'iktar testijiet (6). Dan il-metodu ta' ttestjar sejjer jiġi aġġornat kif xieraq iktar ma jkun hemm informazzjoni u dejta ġodda kkunsidrati.
                     PROĊEDURA
                     
                        Preparazzjoni tal-monosaff ċellolari
                     
                     Il-monosaff taċ-ċelloli CB997 tal-MDCK jitħejja bl-użu ta' ċelloli sottokonfluwenti li jikbru fi flasks tal-kultura taċ-ċelloli f'DMEM/Taħlita tan-Nutrijenti F12 (1x konċentrat b'L-glutamina, 15 mM HEPES, kalċju (f'konċentrazzjoni ta' 1.0-1.8 mM) u 10 % FCS/FBS inattivat bis-sħana). Fuq kollox, il-media/is-soluzzjonijiet kollha użati fi ħdan l-assaġġ tal-FL għandu jkun fihom kalċju f'konċentrazzjoni ta' bejn 1.8 mM (200 mg/l) u 1.0 mM (111 mg/l) sabiex jiġu żgurati formazzjoni u integrità tal-ġunzjonijiet dojoq. Il-medda tan-numru ta' passaġġi ta' ċelloli għandha tiġi kkontrollata sabiex tiġi żgurata formazzjoni bbilanċjata u riproduċibbli tal-ġunzjonijiet dojoq. Idealment, iċ-ċelloli għandhom ikunu fi ħdan il-medda ta' passaġġi 3-30 mit-taħlil peress li ċ-ċelloli fi ħdan din il-medda ta' passaġġi għandhom funzjonalità simili, li tgħin sabiex ir-riżultati tal-assaġġ ikunu riproduċibbli.
                     Qabel ma jsir il-metodu ta' ttestjar tal-FL, iċ-ċelloli jinqalgħu mill-flask bi tripsinizzazzjoni, jiġu ċentrifugati u ammont xieraq ta' ċelloli jinżera' fl-inserzjonijiet imqegħdin fi pjastri b'24 bwejra (ara l-Appendiċi 1). Għat-tiżrigħ taċ-ċelloli għandhom jintużaw inserzjonijiet b'dijametru ta' tnax-il mm b'membrana ta' esteri taċ-ċelluloża mħallta, ħxuna ta' 80-150 μm u qies tal-pori ta' 0.45 μm. Fl-istudju ta' validazzjoni, intużaw inserzjonijiet Millicell-HA ta' 12-il mm. Il-proprjetajiet tat-tip ta' inserzjoni u membrana huma importanti peress li dawn jistgħu jaffettwaw it-tkabbir taċ-ċelloli u l-irbit tas-sustanza kimika. Ċerti tipi ta' sustanzi kimiċi jistgħu jaqbdu mal-membrana tal-inserzjoni Millicell-HA, xi ħaġa li tista' taffettwa l-interpretazzjoni tar-riżultati. Is-sustanzi kimiċi ta' profiċjenza (ara l-Appendiċi 3) għandhom jintużaw sabiex tintwera l-ekwivalenza jekk jintużaw membrani oħrajn.
                     L-irbit tas-sustanza kimika mal-membrana tal-inserzjoni huwa iktar komuni għal sustanzi kimiċi katjoniċi, bħall-klorur tal-benzalkonju, li huma attratti għall-membrana ċċarġjata (7). Is-sustanza kimika li torbot mal-membrana tal-inserzjoni tista' żżid il-perjodu ta' esponiment għas-sustanza kimika, xi ħaġa li twassal għal sopravalutazzjoni tal-potenzjal tossiku tas-sustanza kimika, iżda tista' tnaqqas ukoll it-tnixxija fiżika ta' fluworexxeina minn ġol-inserzjoni bl-irbit tal-kulurant mas-sustanza kimika katjonika marbuta mal-membrana tal-inserzjoni, u dan iwassal għal sottovalutazzjoni tal-potenzjal tossiku tas-sustanza kimika. Dan jista' jiġi ssorveljat minnufih billi l-membrana waħedha tiġi esposta għall-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza kimika ttestjata u mbagħad jiżdied il-kulurant tal-fluworexxeina tas-sodju bil-konċentrazzjoni normali għall-ħin standard (ebda kontroll taċ-ċelloli). Jekk iseħħ l-irbit tal-kulurant tal-fluworexxeina tas-sodju, il-membrana tal-inserzjoni tidher safra wara li jitlaħlaħ il-materjal tat-test. Għalhekk, huwa essenzjali li wieħed ikun jaf x'inhuma l-proprjetajiet ta' rbit tas-sustanza kimika tat-test sabiex ikun jista' jinterpreta l-effett tas-sustanza kimika fuq iċ-ċelloli.
                     It-tiżrigħ taċ-ċelloli fuq inserzjonijiet għandu jipproduċu monosaff konfluwenti fi żmien l-esponiment għas-sustanza kimika. 1,6 × 105 ċellola f'kull inserzjoni (400 μl ta' sospensjoni taċ-ċelloli b'densità ta' 4 × 105 ċellola / ml). F'dawn il-kundizzjonijiet, normalment monosaff konfluwenti jinkiseb wara 96 siegħa fil-kultura. L-inserzjonijiet għandhom jiġu eżaminati viżwalment qabel it-tiżrigħ, sabiex jiġi żgurat li kwalunkwe ħsara rreġistrata fil-kontroll viżiv deskritta fil-paragrafu 30 hija dovuta għall-immaniġġjar.
                     Il-kulturi taċ-ċelloli tal-MDCK għandhom jinżammu f'inkubaturi f'atmosfera umdifikata, f'5 % ± 1 % CO2 u 37 ± 1 °C. Iċ-ċelloli għandhom ikunu ħielsa minn kontaminazzjoni minn batterji, vajrusis, mikroplażma u fungi.
                     
                        Applikazzjoni tas-Sustanzi Kimiċi tat-Test u tal-Kontroll
                     
                     Għandha titħejja soluzzjoni ewlenija ġdida tas-sustanza kimika tat-test għal kull sessjoni sperimentali u tintuża fi żmien 30 minuta mit-tħejjija. Is-sustanzi kimiċi tat-test għandhom jitħejjew f'HBSS li fiha l-kalċju (f'konċentrazzjoni ta' 1.0-1.8 mM), mingħajr fenol aħmar sabiex jiġi evitat l-irbit tal-proteina tas-seru. Qabel l-ittestjar għandha tiġi vvalutata s-solubilità tas-sustanza kimika f'250 mg/ml fl-HBSS. Jekk f'din il-konċentrazzjoni s-sustanza kimika tifforma sospensjoni jew emulsjoni stabbli (jiġifieri żżomm uniformità u ma tissedimentax u lanqas ma tissepara f'iktar minn fażi waħda) fi 30 minuta, l-HBSS xorta waħda tista' tintuża bħala solvent. Madankollu, jekk jinstab li s-sustanza kimika hija insolubbli fl-HBSS f'din il-konċentrazzjoni, għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' metodi ta' ttestjar oħrajn minflok l-FL. L-użu ta' żejt minerali ħafif bħala solvent, f'każijiet li fihom jinstab li s-sustanza kimika hija insolubbli fl-HBSS, għandu jiġi kkunsidrat bir-reqqa peress li ma hemmx biżżejjed dejta għad-dispożizzjoni sabiex tinħareġ konklużjoni fuq it-twettiq tal-assaġġ tal-FL f'dawn il-kundizzjonijiet.
                     Is-sustanzi kimiċi kollha li jkunu sejrin jiġu ttestjati jitħejjew f'HBSS sterili mingħajr fenol aħmar li fiha l-kalċju (f'konċentrazzjoni ta' 1.0-1.8 mM) mis-soluzzjoni ewlenija, f'ħames konċentrazzjonijiet dilwiti fuq bażi ta' piż skont il-volum: 1, 25, 100, 250 mg/ml u soluzzjoni pura jew saturata. Meta tiġi ttestjata sustanza kimika solida, għandha tkun inkluża konċentrazzjoni għolja ħafna ta' 750 mg/ml. Din il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika jaf ikollha tiġi applikata fuq iċ-ċelloli bl-użu ta' pipetta bi spostament pożittiv. Jekk jinstab li t-tossiċità taqa' bejn 25 u 100 mg/ml, il-konċentrazzjonijiet addizzjonali li ġejjin għandhom jiġu ttestjati darbtejn: 1, 25, 50, 75, 100 mg/ml. Il-valur tal-FL20 għandu jinkiseb minn dawn il-konċentrazzjonijiet diment li jkunu ġew issodisfati l-kriterji ta' aċċettazzjoni.
                     Is-sustanzi kimiċi tat-test jiġu applikati għall-monosaffi taċ-ċelloli konfluwenti wara li jitneħħa l-medium tal-kultura taċ-ċelloli u wara ħasil darbtejn b'HBSS sterili, sħuna (37 °C), mingħajr fenol aħmar li fiha l-kalċju (f'konċentrazzjoni ta' 1.0-1.8 mM). Qabel, il-filtri jkunu ġew ivverifikati viżwalment għal xi ħsarat preeżistenti li jistgħu jiġu attribwiti bi żball għal inkompatibilitajiet potenzjali mas-sustanzi kimiċi tat-test. Tal-inqas għandhom jintużaw tliet repliki għal kull konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test u għall-kontrolli f'kull sessjoni. Wara minuta esponiment f'temperatura ambjentali, is-sustanza kimika tat-test għandha titneħħa bil-galbu bl-aspirazzjoni, il-monosaff għandu jinħasel darbtejn b'HBSS sterili, sħuna (37 °C), mingħajr fenol aħmar li fiha l-kalċju (f'konċentrazzjoni ta' 1.0-1.8 mM), u t-tnixxija tal-fluworexxeina għandha titkejjel minnufih.
                     Għandhom jintużaw kontrolli negattivi (NC) u pożittivi (PC) paralleli f'kull sessjoni sabiex jintwera li l-integrità tal-monosaff (NC) u s-sensittività taċ-ċelloli (PC) jaqgħu fi ħdan medda ta' aċċettazzjoni storika definita. Is-sustanza kimika tal-PC issuġġerita hija Brij 35 (Nru CAS 9002-92-0) f'100 mg/ml. Din il-konċentrazzjoni għandha tagħti tnixxija tal-fluworexxeina ta' madwar 30 % (medda aċċettabbli ta' tnixxija tal-fluworexxeina hija ta' 20-40 %, jiġifieri ħsara fis-saff taċ-ċellola). Is-sustanza kimika tal-NC issuġġerita hija f'HBSS (mhux ittrattata, kontroll inbjank) li fiha l-kalċju (f'konċentrazzjoni ta' 1.0-1.8 mM), mingħajr fenol aħmar. Kontroll tat-tnixxija massima għandu jkun inkluż f'kull sessjoni wkoll sabiex ikunu jistgħu jiġu kkalkolati l-valuri tal-FL20. It-tnixxija massima hija stabbilita billi jintużaw inserzjonijiet tal-kontroll mingħajr ċelloli.
                     
                        Determinazzjoni tal-permeabilità tal-fluworexxeina
                     
                     Eżatt wara li jitneħħew is-sustanzi kimiċi tat-test u tal-kontroll, jiżdiedu mal-inserzjonijiet (eż. Millicell-HA) 400μl ta' 0.1 mg/ml soluzzjoni tal-fluworexxeina tas-sodju (0.01 % (w/v) f'HBSS li fiha l-kalċju [f'konċentrazzjoni ta' 1.0-1.8 mM], mingħajr fenol). Il-kulturi jinżammu għal 30 minuta f'temperatura ambjentali. Fi tmiem l-inkubazzjoni bil-fluworexxeina, l-inserzjonijiet jitneħħew bil-galbu minn kull bwejra. Il-verifika viżwali ssir fuq kull filtru u tiġi rreġistrata kwalunkwe ħsara li setgħet seħħet matul l-immaniġġjar.
                     L-ammont ta' fluworexxeina li nixxiet mill-monosaff u l-inserzjoni huwa kkwantifikat fis-soluzzjoni li jibqa' fil-bwejriet wara t-tneħħija tal-inserzjonijiet. Il-kejl isir fi spettrofluworometru f'tul ta' mewġa tal-eċċitazzjoni u l-emissjoni ta' 485 nm u 530 nm, rispettivament. Is-sensittività tal-ispettrofluworometru għandha tiġi ssettjata sabiex ikun hemm l-ikbar differenza numerika bejn l-FL massima (inserzjoni mingħajr ċelloli) u l-FL minima (inserzjoni b'monosaff konfluwenti ttrattati bl-NC). Minħabba d-differenzi fl-ispettrofluworometru użat, huwa ssuġġerit li tintuża sensittività li tagħti intensità tal-fluworexxenza ta' > 4 000 fil-kontroll tat-tnixxija massima tal-fluworexxeina. Il-valur massimu tal-FL ma għandux ikun ikbar minn 9999. L-intensità tat-tnixxija massima tal-fluworexxenza għandha taqa' fi ħdan il-medda lineari tal-ispettrofluworometru użat.
                     
                        Interpretazzjoni tar-riżultati u l-mudell ta' tbassir
                     
                     L-ammont ta' FL huwa proporzjonat għall-ħsara indotta mis-sustanza kimika fil-ġunzjonijiet dojoq. Il-perċentwal ta' FL għal kull konċentrazzjoni ttestjata tas-sustanza kimika jiġi kkalkolat mill-valuri tal-FL miksubin għas-sustanza kimika tat-test b'referenza għall-valuri FL mill-NC (qari tal-valuri mill-monosaff konfluwenti taċ-ċelloli ttratatti bl-NC) u kontroll tat-tnixxija massima (qari tal-valuri għall-ammont ta' FL minn ġo inserzjoni mingħajr ċelloli).
                     L-intensità tal-fluworexxenza tat-tnixxija massima medja = x
                     L-intensità tal-fluworexxenza tat-tnixxija 0 % medja = y
                     It-tnixxija 100 % medja tinkiseb bit-tnaqqis tat-tnixxjia 0 % medja mit-tnixxija massima medja,
                     jiġifieri x – y = z
                     It-tnixxija perċentwali għal kull doża fissa tinkiseb bit-tnaqqis tat-tnixxija 0 % mill-intensità tal-fluworexxenza medja tat-tliet valuri tar-repliki (m), u bid-diviżjoni ta' dan il-valur bit-tnixxija 100 %, jiġifieri %FL = [(m-y) / z] × 100 %, fejn:
                     
                                 m
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 l-intensità tal-fluworexxenza medja tat-tliet kejliet tar-repliki għall-konċentrazzjoni involuta
                              
                           
                                 % FL
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 il-perċentwal tal-fluworexxeina li tnixxi minn ġos-saff taċ-ċelloli
                              
                           Għandha tiġi applikata l-ekwazzjoni li ġejja għall-kalkolu tal-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika li tikkaġuna l-FL 20 %:
                     FLD = [(A-B) / (C-B)] × (MC – MB) + MB
                     
                     Fejn:
                     
                                 D
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 % tal-inibizzjoni
                              
                           
                                 A
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 % ħsara (20 % tnixxija tal-fluworexxeina)
                              
                           
                                 B
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 % tnixxija tal-fluworexxeina < A
                              
                           
                                 C
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 % tnixxija tal-fluworexxeina > A
                              
                           
                                 MC
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 Konċentrazzjoni (mg/ml) ta' C
                              
                           
                                 MB
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 Konċentrazzjoni (mg/ml) ta' B
                              
                           Il-valur limitu tal-FL20 għat-tbassir tas-sustanzi kimiċi bħala korrużivi okulari/irritanti severi jingħata hawn taħt:
                     
                                 FL20 (mg/ml)
                              
                              
                                 C&L tal-GHS tan-NU
                              
                              
                                 C&L tas-CLP tal-UE
                              
                              
                                 C&L tal- EPA tal-Istati Uniti
                              
                           
                                 ≤ 100
                              
                              
                                 Kategorija 1
                              
                              
                                 Kategorija 1
                              
                              
                                 Kategorija I
                              
                           
                                 C&L: klassifikazzjoni u tikkettar
                              
                           Il-metodu ta' ttestjar tal-FL huwa rakkomandat biss għall-identifikazzjoni ta' korrużivi okulari u irritanti severi solubbli fl-ilma (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU, Kategorij 1 tas-CLP tal-UE, Kategorija I tal-EPA tal-Istati Uniti) (ara l-paragrafi 1 u 10).
                     Sabiex is-sustanzi kimiċi solubbli fl-ilma (sustanzi u taħlitiet) (3) (6) (7) jiġu identifikati bħala “li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn” (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU/tas-CLP tal-UE) jew bħala “korrużiv okulari jew irritant sever” (Kategorija I tal-EPA tal-Istati Uniti), is-sustanza kimika tat-test għandha tinduċi valur tal-FL20 ta' ≤ 100 mg/ml.
                     
                        Aċċettazzjoni tar-riżultati
                     
                     Il-valur tat-tnixxija medja massima (x) għandu jkun ogħla minn 4 000 (ara l-paragrafu 31), it-tnixxija 0 % medja (y) għandha tkun 300 jew inqas, u t-tnixxija 100 % medja (z) għandha tkun bejn 3 700 u 6 000.
                     Test jitqies aċċettabbli jekk il-kontroll pożittiv jipproduċi ħsara ta' 20 % sa 40 % fis-saff taċ-ċellola (kejl bħala % tat-tnixxija tal-fluworexxeina).
                     DEJTA U RAPPORTAR
                     
                        Dejta
                     
                     Għal kull sessjoni, id-dejta minn bwejriet individwali ta' replika (eż., valuri tal-intensità tal-fluworexxenza u dejta tal-FL perċentwali kkalkolata għal kull sustanza kimika tat-test, inkluża l-klassifikazzjoni) għandha tiġi rrapportata f'forma ta' tabella. Barra minn hekk, għandhom jiġu rrapportati l-medji ± SD tal-kejliet tar-repliki individwali f'kull sessjoni.
                     
                        Rapport tat-test
                     
                     Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanzi Kimiċi tat-Test u tal-Kontroll
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Isem tas-sustanza kimika (jew sustanzi kimiċi) pereżempju l-isem strutturali użat mill-Chemical Abstracts Service (CAS), segwit minn ismijiet oħrajn, jekk ikunu magħrufin;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Numru CAS tas-sustanza kimika, jekk magħruf;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-purità u l-kompożizzjoni tas-sustanza jew it-taħlita (f'perċentwal(i) skont il-piż), sakemm din l-informazzjoni tkun disponibbli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti għat-twettiq tal-istudju (eż. l-istat fiżiku, il-volatilità, il-pH, l-istabilità, is-solubilità fl-ilma, il-klassi tas-sustanza kimika);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             It-trattament tas-sustanza kimika tat-test/tal-kontroll qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (eż. tisħin, tħin);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-kundizzjonijiet tal-ħżin;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ġustifikazzjoni tal-metodu ta' ttestjar u tal-Protokoll Użati
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Għandha tinkludi kunsiderazzjonijiet dwar id-dominju tal-applikabilità u l-limitazzjonijiet tal-metodu ta' ttestjar;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kundizzjonijiet tat-test
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni tas-sistema ta' ċelloli użata, inkluż ċertifikat tal-awtentiċità u l-istatus tal-mikroplażma tal-linja ta' ċelloli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Dettalji tal-proċedura tat-test użata;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Is-sustanza kimika (jew sustanzi kimiċi) tat-test użata;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Id-durata tal-esponiment għas-sustanza kimika tat-test;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Id-durata tal-inkubazzjoni bil-fluworexxeina;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni ta' kwalunkwe modifika tal-proċedura tat-test;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni tal-kriterji ta' evalwazzjoni użati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Referenza għad-dejta storika tal-mudell (eż. kontrolli negattivi u pożittivi, sustanzi kimiċi ta' referenza, jekk applikabbli);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Informazzjoni dwar il-profiċjenza teknika murija mil-laboratorju;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ir-riżultati
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             It-tqassim f'tabella tad-dejta miksuba minn sustanzi kimiċi tat-test u l-kontrolli individwali għal kull sessjoni u kull kejl tar-repliki (inklużi riżultati individwali, medji u SDs individwali);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-klassifikazzjoni(jiet) derivata b'referenza għall-mudell ta' tbassir u/jew il-kriterji tad-deċiżjoni użati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni ta' effetti osservati oħrajn;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Diskussjoni tar-Riżultati
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Għandha tinkludi kunsiderazzjonijiet dwar eżitu mhux konklużiv (paragrafu 35: FL20 > 100 mg/ml) u iktar testijiet;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Konklużjonijiet.
                                 
                              
                           TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications. ISBN: 978-92-1-117006-1. Disponibbli fuq: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html]
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 U.S. EPA (1996), Label Review Manual: 2nd Edition, EPA737-B-96-001, Washington DC: U.S. Environmental Protection Agency.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 EC-ECVAM (2009), Statement on the scientific validity of cytotoxicity/cell-function based in vitro assays for eye irritation testing.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Scott, L. et al. (2010), A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using Bottom-Up and Top-Down approaches, Toxicol. In Vitro 24, 1-9
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu B.5 ta' dan l-Anness, Irritazzjoni/korrużjoni akuta tal-għajnejn
                                 
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 EC-ECVAM (1999), INVITOX Protocol 71: Fluorescein Leakage Test, Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM). Disponibbli fuq: [http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 EC-ECVAM (2008), Fluorescein Leakage Assay Background Review Document as an Alternative Method for Eye Irritation Testing.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34. OECD, Paris.
                              
                           
                        Appendiċi 1
                        
                           DIJAGRAMMA TAĊ-ĊELLOLI MDCK IMKABBRIN FUQ MEMBRANA LI TIDDAĦĦAL GĦALL-METODU TA' TTESTJAR TAL-FL
                        
                        Saff konfluwenti ta' ċelloli MDCK jitkabbar fuq il-membrana semipermeabbli ta' inserzjoni. L-inserzjonijiet jitqiegħdu fil-bwejriet ta' pjastri b'24 bwejra.
                        Figura meħuda minn: Wilkinson, P.J. (2006), Development of an in vitro model to investigate repeat ocular exposure, Ph.D. Thesis, University of Nottingham, UK.
                     
                     
                        Appendiċi 2
                        DEFINIZZJONIJIET
                        
                           
                              Preċiżjoni
                           : Il-qrubija fil-livell ta' qbil bejn ir-riżultati tal-metodu ta' ttestjar u l-valuri ta' referenza aċċettati. Hija kejl tal-prestazzjoni tal-metodu ta' ttestjar u wieħed mill-aspetti ta'“rilevanza”. It-terminu jintuża spiss minflok “konkordanza” sabiex ifisser il-proporzjon ta' riżultati tajbin tal-metodu ta' ttestjar.
                        
                           
                              Sustanza kimika
                           : Sustanza jew taħlita.
                        
                           
                              Kategorija I tal-EPA
                           : Sustanzi kimiċi li jipproduċu involviment korrużiv (qerda irriversibbli tat-tessut okulari) jew involviment tal-kornea jew irritazzjoni li tippersisti għal aktar minn 21 jum (2).
                        
                           
                              CLP tal-UE (Ir-Regolament (KE) Nru 1272/2008 dwar il-Klassifikazzjoni, l-Ittikkettar u l-Imballaġġ tas-Sustanzi u t-Taħlitiet): Timplimenta fl-Unjoni Ewropea (UE) is-sistema tal-GHS tan-NU għall-klassifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet).
                        
                           
                              Rata ta' negattivi foloz
                           : Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi pożittivi kollha identifikati b'mod falz bħala negattivi permezz ta' metodu ta' ttestjar. Dan huwa wieħed mill-indikaturi tal-prestazzjoni tal-metodu ta' ttestjar.
                        
                           
                              Rata ta' foloz pożittivi
                           : Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi negattivi kollha identifikati b'mod falz bħala pożittivi permezz ta' metodu ta' ttestjar. Dan huwa wieħed mill-indikaturi tal-prestazzjoni tal-metodu ta' ttestjar.
                        
                           
                              FL20
                              
                           : Tista' tiġi stmata bid-determinazzjoni tal-konċentrazzjoni li fiha s-sustanza kimika ttestjata tikkawża 20 % tat-tnixxija tal-fluworexxeina mis-saff taċ-ċelloli.
                        
                           
                              Tnixxija tal-fluworexxeina
                           : l-ammont ta' fluworexxeina li jgħaddi minn ġos-saff taċ-ċellola, imkejjel spettrofluworometrikament.
                        
                           
                              GHS (Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta' Sustanzi Kimiċi tan-Nazzjonijiet Uniti (NU))
                           : Sistema li tipproponi l-klassifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) skont it-tipi u l-livelli standardizzati ta' perikli fiżiċi, sanitarji u ambjentali, u tindirizza l-elementi ta' komunikazzjoni korrispondenti, bħal pittogrammi, kliem ta' twissija, dikjarazzjonijiet ta' periklu, dikjarazzjonijiet ta' prekawzjoni u skedi ta' tagħrif dwar is-sikurezza, sabiex jitwassal tagħrif dwar l-effetti avversi bil-għan li n-nies ikunu protetti (inklużi min iħaddem, il-ħaddiema, it-trasportaturi, il-konsumaturi u l-ħaddiema tal-emerġenza) u l-ambjent.
                        
                           
                              Kategorija 1 tal-GHS
                           : Il-produzzjoni ta' ħsara fit-tessut fl-għajnejn, jew tnaqqis fiżiku serju tal-vista, wara li tiġi applikata sustanza kimika fuq il-wiċċ quddiemi tal-għajn, li ma jkunux riversibbli fi żmien 21 jum mill-applikazzjoni.
                        
                           
                              Periklu
                           : Proprjetà inerenti ta' aġent jew sitwazzjoni li għandhom il-potenzjal li jikkawżaw effetti avversi meta organiżmu, sistema jew (sub)popolazzjoni jiġu esposti għal dak l-aġent.
                        
                           
                              Taħlita
                           : Użata fil-kuntest tal-GHS tan-NU bħala taħlita jew soluzzjoni msawra minn żewġ sustanzi jew iktar li fiha ma jirreaġixxux.
                        
                           
                              Kontroll negattiv
                           : Replika mhux ittrattata li fiha l-komponenti kollha ta' sistema tat-test. Dan il-kampjun jiġi proċessat b'kampjuni ttrattati bis-sustanza kimika tat-test u kampjuni tal-kontroll oħrajn sabiex jiġi ddeterminat jekk is-solvent ikollux interazzjoni mas-sistema tat-test.
                        
                           
                              Mhux ikklassifikati
                           : Sustanzi kimiċi li mhumiex ikklassifikati bħala tal-Kategoriji 1, 2A jew 2B tal-GHS tan-NU; il-Kategorija 1 jew 2 tas-CLP tal-UE; jew irritanti okulari tal-Kategorija I, II jew III tal-EPAtal-Istati Uniti.
                        
                           
                              Korrużiva okulari
                           : (a) Sustanza kimika li tikkawża ħsara irreversibbli fit-tessut għall-għajn; (b) Sustanzi kimiċi li huma klassifikati bħala irritanti tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU; il-Kategorija 1 tas-CLP tal-UE; jew irritanti okulari tal- Kategorija I tal-EPA tal-Istati Uniti.
                        
                           
                              Irritanti okulari
                           : (a) Sustanza kimika li tipproduċi bidla reversibbli fl-għajnejn wara l-applikazzjoni fil-wiċċ anterjuri tal-għajn; (b) Sustanzi kimiċi li huma kklassifikati bħala tal-Kategoriji 2A jew 2B tal-GHS tan-NU; il-Kategorija 2 tas-CLP tal-UE; jew irritanti okulari tal-Kategorija II jew III tal-EPA tal-Istati Uniti.
                        
                           
                              Irritant sever għall-għajnejn
                           : (a) Sustanza kimika li tikkawża ħsara fit-tessut tal-għajn wara li tiġi applikata fuq is-superfiċje anterjuri tal-għajn u li ma tkunx riversibbli fi żmien 21 jum tal-applikazzjoni jew tikkawża tħassir fiżiku serju tal-vista. (b) Sustanzi kimiċi li huma klassifikati bħala irritanti tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU; il-Kategorija 1 tas-CLP tal-UE; jew irritanti okulari tal- Kategorija I tal-EPA tal-Istati Uniti.
                        
                           
                              Kontroll pożittiv
                           : Replika li jkun fiha l-komponenti kollha ta' sistema tat-test u ttrattata b'sustanza li jkun magħruf li tikkawża rispons pożittiv. Sabiex jiġi żgurat li l-varjabilità fir-rispons tal-kontroll pożittiv tkun tista' tiġi vvalutata tul iż-żmien, id-daqs tar-rispons pożittiv ma għandux ikun estrem.
                        
                           
                              Sustanzi Kimiċi ta' Profiċjenza
                           : Sottosett tal-lista ta' Sustanzi Kimiċi ta' Referenza li jistgħu jintużaw minn laboratorju naïve sabiex juri profiċjenza bil-metodu ta' ttestjar ta' referenza vvalidat.
                        
                           
                              Rilevanza
                           : Deskrizzjoni tar-relazzjoni tat-test għall-effett ta' interess u jekk huwiex sinifikanti u utli għal skop partikolari. Din tiddetermina kemm it-test għandu l-ħila jkejjel jew ibassar b'mod korrett l-effett bijoloġiku ta' interess. Ir-rilevanza tinkorpora l-kunsiderazzoni tal-preċiżjoni (konkordanza ta' metodu ta' ttestjar) (8).
                        
                           
                              Affidabilità
                           : Kejliet ta' kemm metodu ta' ttestjar jista' jitwettaq b'mod riproduċibbli fil-laboratorji u bejn il-laboratorji tul iż-żmien, meta jitwettaq billi jintuża l-istess protokoll. Tiġi vvalutatata bil-kalkolu tar-riproduċibilità fil-laboratorju u bejn laboratorju u ieħor u r-ripetibilità fil-laboratorju.
                        
                           
                              Test ta' sostituzzjoni
                           : Test li huwa mfassal sabiex jieħu post test li huwa f'użu ta' rutina u aċċettat għall-identifikazzjoni tal-perikli u/jew il-valutazzjoni tar-riskji, u li ġie stabbilit li jipprovdi protezzjoni ekwivalenti jew imtejba tas-saħħa tal-bniedem jew tal-annimali jew l-ambjent, skont kif ikun applikabbli, meta mqabbel mat-test aċċettat, għas-sitwazzjonijiet u s-sustanzi kimiċi ta' ttestjar possibbli kollha.
                        
                           
                              Sensittività
                           : Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi pożittivi/attivi kollha li huma klassifikati kif suppost mit-test. Hija kejl tal-preċiżjoni għal metodu ta' ttestjar li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hija kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta' metodu ta' ttestjar (8).
                        
                           
                              Ħsara serja lill-għajnejn
                           : Hija l-produzzjoni ta' ħsara fit-tessut fl-għajnejn, jew tnaqqis fiżiku serju tal-vista, wara li tiġi applikata sustanza kimika fuq il-wiċċ quddiemi tal-għajn, li ma jkunux riversibbli fi żmien 21 jum mill-applikazzjoni.
                        
                           
                              Kontroll tas-solvent/veikolu
                           : Kampjun mhux ittrattat li fih il-komponenti kollha ta' sistema tat-test, inkluż is-solvent jew il-veikolu li jiġi pproċessat mal-kampjuni ttrattati bis-sustanza kimika tat-test u kampjuni tal-kontroll oħrajn sabiex jiġi stabbilit ir-rispons bażi għall-kampjuni ttrattati bis-sustanza kimika tat-test dissolta fl-istess solvent jew veikolu. Meta jiġi ttestjat ma' kontroll negattiv parallel, dan il-kampjun juri wkoll jekk is-solvent jew il-veikolu jkollux interazzjoni mas-sistema tat-test.
                        
                           
                              Speċifiċità
                           : Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi negattivi/inattivi kollha li huma klassifikati kif suppost mit-test. Hija kejl tal-preċiżjoni għal metodu ta' ttestjar li jipproduċi riżultati kategoriċi u hija kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-rilevanza ta' metodu ta' ttestjar.
                        
                           
                              Sustanza
                           : Użata fil-kuntest tal-GHS tan-NU bħala elementi kimiċi u l-komposti tagħhom fl-istat naturali jew miksubin bi kwalunkwe proċess ta' produzzjoni, inkluż kwalunkwe addittiv meħtieġ għall-preservazzjoni tal-istabilità tal-prodott u ta' kwalunkwe impurità li toriġina mill-proċess użat, imma eskluż kwalunkwe solvent li jista' jkun separat mingħajr ma jaffetwa l-istabilità tas-sustanza jew ibiddel il-kompożizzjoni tagħha.
                        
                           
                              Sustanza kimika tat-test
                           : Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta' dan il-metodu ta' ttestjar.
                        
                           
                              Strateġija ta' ttestjar sekwenzjali
                           : Strateġija ta' ttestjar gradwali li biha l-informazzjoni eżistenti kollha dwar sustanza kimika tat-test tiġi riveduta, f'ordni speċifiku, permezz ta' proċess tal-piż tal-evidenza f'kull livell sabiex jiġi ddeterminat jekk hemmx biżżejjed informazzjoni disponibbli għal deċiżjoni dwar il-klassifikazzjoni tal-periklu, qabel ma wieħed jgħaddi għal-livell li jmiss. Jekk il-potenzjal ta' irritazzjoni ta' sustanza kimika tat-test jista' jiġi assenjat fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, ma jkun meħtieġ l-ebda ttestjar ieħor. Jekk il-potenzjal ta' irritazzjoni ta' sustanza kimika tat-test ma jkunx jista' jiġi assenjat fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, għandha ssir proċedura ta' ttestjar sekwenzjali fuq l-annimali sakemm tkun tista' ssir klassifikazzjoni mhux ekwivoka.
                        
                           
                              Metodu ta' ttestjar ivvalidat
                           : Metodu ta' ttestjar li għalih ikunu tlestew studji ta' validazzjoni sabiex tiġi ddeterminata r-rilevanza (inkluża l-preċiżjoni) u l-affidabilità għal għan speċifiku. Ta' min jinnota li jista' jkun li metodu ta' ttestjar ivvalidat ma jkollux prestazzjoni tajba biżżejjed f'termini ta' preċiżjoni u affidabilità sabiex jitqies aċċettabli għall-għan propost (8).
                        
                           
                              Piż tal-evidenza
                           : Il-proċess fejn jitqiesu l-qawwiet u d-dgħufijiet ta' biċċiet ta' informazzjoni varji sabiex tintlaħaq u tiġi appoġġata konklużjoni rigward il-potenzjal ta' sustanza kimika li tkun ta' periklu.
                     
                     
                        Appendiċi 3
                        
                           SUSTANZI KIMIĊI TA' PROFIĊJENZA GĦALL-METODU TA' TTESTJAR TAL-FL
                        
                        Qabel l-użu ta' rutina ta' dan il-metodu ta' ttestjar, il-laboratorji għandhom juru l-profiċjenza teknika billi jidentifikaw b'mod korrett il-klassifikazzjoni tal-korrużività okulari tat-8 sustanzi kimiċi rrakkomandati fit-Tabella 1. Dawn is-sustanzi kimiċi ntgħażlu sabiex jirrappreżentaw il-firxa ta' risponsi għal koorużjoni/irritazzjoni tal-għajnejn, li hija bbażata fuq ir-riżultati fit-test in vivo fuq l-għajnejn tal-fniek (TG 405, TM B.5(5)) (jiġifieri l-Kategoriji 1, 2A, 2B jew Mhux Ikklassifikati skont il-GHS tan-NU). Madankollu, fid-dawl tal-utilità vvalidata tal-assaġġ FL (jiġifieri li jidentifika korrużivi okulari/irritanti severi biss), hemm biss żewġ eżiti tat-test għall-finijiet ta' klassifikazzjoni (korrużivi/irritanti severi jew mhux korrużivi/irritanti mhux severi) sabiex tintwera l-profiċjenza. Kriterji tal-għażla oħrajn kienu li s-sustanzi kimiċi huma disponibbli fis-suq, li hemm dejta ta' referenza in vivo ta' kwalità għolja għad-dispożizzjoni, u li hemm dejta ta' kwalità għolja miksuba mill-metodu ta' ttestjar tal-FL. Għal din ir-raġuni, is-sustanzi kimiċi ta' profiċjenza ntgħażlu mill-“Fluorescein Leakage Assay Background Review Document as an Alternative Method for Eye Irritation Testing” (8), li ntuża għall-validazzjoni retrospettiva tal-metodu ta' ttestjar tal-FL
                        
                           Tabella 1
                        
                        
                           Is-sustanzi kimiċi rakkomandati għall-wiri tal-profiċjenza teknika bl-FL
                        
                        
                                    Sustanza Kimika
                                 
                                 
                                    NRU CAS
                                 
                                 
                                    Klassi kimika (32)
                                    
                                 
                                 
                                    Forma Fiżika
                                 
                                 
                                    Klassifikazzjoni In Vivo (33)
                                    
                                 
                                 
                                    Klassifikazzjoni In Vitro
                                        (34)
                                    
                                 
                              
                                    Klorur tal-benżalkonju (5 %)
                                 
                                 
                                    8001-54-5
                                 
                                 
                                    Kompost tal-onju
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                                 
                                    Korrużivi/ Irritanti Severi
                                 
                              
                                    Kloridrat tal-prometażina
                                 
                                 
                                    58-33-3
                                 
                                 
                                    Amina/Amidina, Eteroċikliku, Kompost tal-kubrit organiku
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                                 
                                    Korrużivi/ Irritanti Severi
                                 
                              
                                    Idrossidu tas-sodju (10 %)
                                 
                                 
                                    1310-73-2
                                 
                                 
                                    Alkali
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                                 
                                    Korrużivi/ Irritanti Severi
                                 
                              
                                    Sulfat lauril tas-sodju (15 %)
                                 
                                 
                                    151-21-3
                                 
                                 
                                    Aċidu karbossiliku (melħ)
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 1
                                 
                                 
                                    Korrużivi/ Irritanti Severi
                                 
                              
                                    4-karbossi-benżaldeid
                                 
                                 
                                    619-66-9
                                 
                                 
                                    Aċidu karbossiliku, Aldeid
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 2(A)
                                 
                                 
                                    Mhux korrużivi/ Irritanti mhux severi
                                 
                              
                                    Nitrat tal-ammonju
                                 
                                 
                                    6484-52-2
                                 
                                 
                                    Melħ inorganiku
                                 
                                 
                                    Solidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 2(A)
                                 
                                 
                                    Mhux korriżivi/ Irritanti mhux severi
                                 
                              
                                    Etil-2-metilaċeto-aċetat
                                 
                                 
                                    609-14-3
                                 
                                 
                                    Keton, Ester
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Kategorija 2(B)
                                 
                                 
                                    Mhux korriżivi/ Irritanti mhux severi
                                 
                              
                                    Gliċerol
                                 
                                 
                                    56-81-5
                                 
                                 
                                    Alkoħol
                                 
                                 
                                    Likwidu
                                 
                                 
                                    Ebda Kategorija
                                 
                                 
                                    Mhux korriżivi/ Irritanti mhux severi
                                 
                              
                                    Taqsiriet: Nru CAS = Numru tar-Reġistru tal-Chemical Abstracts Service
                                 
                              
                     B.62   Assaġġ In Vivo Kometa Tal-Alkalini Tal-Mammiferi
                     
                     INTRODUZZJONI
                     Dan il-metodu ta' ttestjar (TM) huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 489 tal-OECD (2016). L-assaġġ kometa alkalin in vivo (tal-elettroforeżi b'ġell ta' ċellola waħda) (minn hawn 'il quddiem imsejjaħ sempliċiment l-assaġġ kometa) jintuża għall-identifikazzjoni ta' ksur fil-ħajta tad-DNA f'ċelloli jew nukleji iżolati minn diversi tessuti tal-annimali, normalment rodituri, li ġew esposti għal materjal(i) potenzjalment ġenotossiku. L-assaġġ kometa ġie rivedut u ġew ippubblikati rakkomandazzjonijiet minn bosta gruppi ta' esperti (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10). Dan il-metodu ta' ttestjar huwa parti minn sensiela ta' metodi ta' ttestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika. Ġie żviluppat dokument tal-OECD li jipprovdi informazzjoni sintetika dwar l-ittestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika u ħarsa ġenerali dwar it-tibdil reċenti la sar f'dawk il-Linji Gwida tat-Test (11).
                     L-iskop tal-assaġġ kometa huwa li jidentifika sustanzi kimiċi li jikkaġunaw ħsara fid-DNA. F'kundizzjonijiet alkalini (> pH 13), l-assaġġ kometa jista' jidentifika ħsara f'ħajta waħda u fit-tnejn, li tirriżulta, pereżempju, minn interazzjonijiet diretti mad-DNA, siti alkali li jinbidlu jew bħala konsegwenza ta' ħsarat tranżjenti fil-ħjut tad-DNA li jirriżultaw minn tiswija ta' qtugħ tad-DNA. Dawn il-ħsarat fil-ħjut jistgħu jissewwew, b'tali mod li ma jwassalx għal effett persistenti, jistgħu jkunu letali għaċ-ċellola, jew jistgħu jissewwew f'mutazzjoni li tirriżulta f'bidla vijabbli permanenti. Jistgħu jwasslu wkoll għal ħsara fil-kromożomi li hija assoċjata wkoll ma' ħafna mardiet tal-bniedem, inkluż il-kanċer.
                     Prova ta' validazzjoni formali tal-assaġġ kometa in vivo fir-rodituri sar fl-2006-2012, koordinat miċ-Ċentru Ġappuniż għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (JaCVAM), flimkien maċ-Ċentru Ewropew għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ECVAM), il-Kumitat ta' Koordinazzjoni Interaġenzjali dwar il-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ICCVAM), u ċ-Ċentru Interaġenzjali tal-NTP għall-Evalwazzjoni ta' Metodi Tossikoloġiċi Alternattivi (NICEATM) (12). Dan il-metodu ta' ttestjar jinkludi l-użu rakkomandat u l-limitazzjonijiet tal-assaġġ kometa, u huwa bbażat fuq il-protokoll finali (12) użat fil-prova ta' validazzjoni, u fuq dejta (proprjetarja tal-laboratorji) addizzjonali rilevanti ppubblikata u mhux ippubblikata.
                     Id-definizzjonijiet tat-termini ewlenin huma stabbiliti fl-Appendiċi 1. Huwa osservat li jistgħu jintużaw ħafna pjattaformi differenti għal dan l-assaġġ (lametti tal-mikroskopju, ponot tal-ġell, pjastri b'96 bwejra, eċċ.). Għall-konvenjenza, it-terminu “lametta” jintuża fil-bqija ta' dan id-dokument iżda jkopri l-pjattaformi kollha l-oħrajn.
                     KUNSIDERAZZJONIJIET U LIMITAZZJONIJIET INIZJALI
                     L-assaġġ kometa huwa metodu għall-kejl tal-ħsarat fil-ħjut tad-DNA f'ċelloli ewkarjotiċi. Ċelloli individwali/nukleji inkorporati f'agarożju fuq lametta jiġu liżati b'deterġent u konċentrazzjoni għolja ta' melħ. Dan l-istadju tal-liżi jiddiġesti l-membrani ċellolari u nukleari u jippermetti r-rilaxx tal-loops tad-DNA koljati li ġeneralment jissejħu nukleojdi u frammenti tad-DNA. L-elettroforeżi f'riżultati għoljin tal-pH fi strutturi li jixbhu kometi, li, meta jintuża tilwin fluworexxenti, jistgħu jiġu osservati bil-mikroskopija tal-fluworexxenza; il-frammenti tad-DNA jitbiegħdu mir-“ras” lejn id-“denb” fuq il-bażi tal-qies tagħhom, u l-intensità tad-denb tal-kometa b'rabta mal-intensità totali (ras flimkien mad-denb) tirrifletti l-ammont ta' ħsara fid-DNA (13) (14) (15).
                     L-assaġġ kometa alkalin in vivo huwa ta' rilevanza partikolari għall-valutazzjoni tal-periklu ġenotossiku peress li r-risponsi tal-assaġġ jiddependu mill-ADME in vivo (assorbiment, distribuzzjoni, metaboliżmu u eskrezzjoni), kif ukoll mill-proċessi ta' tiswija tad-DNA. Dawn jistgħu jvarajw bejn speċi u oħra, tessut u ieħor u bejn it-tipi ta' ħsarat tad-DNA.
                     Sabiex jiġu ssodisfati r-rekwiżiti ta' trattament xieraq tal-annimali, b'mod partikolari t-tnaqqis fl-użu ta' annimali (bl-Ingliż imsejħin “3Rs — Replacement, Reduction, Refinement-- principles” il-prinċipji ta' Sostituzzjoni, Tnaqqis u Rfinar), dan l-assaġġ jista' jiġi integrat ukoll ma' studji tossikoloġiċi oħrajn, eż. studji tat-tossiċità b'doża ripetuta (10) (16) (17), jew il-punt ta' tmiem jista' jiġi kombinat ma' punti ta' tmiem oħrajn tal-ġenotossiċità bħall-assaġġ tal-mikronukleu tal-eritroċiti tal-mammiferi in vivo (18) (19) (20). L-assaġġ kometa jsir l-iktar f'rodituri, għad li ġie applikat għal speċijiet mammiferi u mhux mammiferi oħrajn. L-użu ta' speċijiet mhux rodituri għandu jkun iġġustifikat b'mod xjentifiku u etiku fuq il-bażi ta' każ b'każ u huwa tassew rakkomandat li l-assaġġ kometa jsir biss fuq speċijiet li mhumiex rodituri bħala parti minn studju ieħor tat-tossiċità, u mhux bħala test waħdu.
                     L-għażla tar-rotta tal-esponiment u t-tessut(i) li sejrin jiġu studjati għandha ssir fuq il-bażi tal-għarfien disponibbli/eżistenti kollu dwar is-sustanzi kimiċi tat-test, eż. ir-rotta maħsuba/mistennija tal-esponiment tal-bniedem, il-metaboliżmu u d-distribuzzjoni, il-potenzjal għal effetti fis-sit ta' kuntatt, it-twissijiet strutturali, dejta oħra dwar il-ġenotossiċità jew it-tossiċità, u l-iskop tal-istudju. B'hekk, fejn xieraq, il-potenzjal ġenotossiku tas-sustanzi kimiċi tat-test jista' jiġi vvalutat fit-tessut(i) fil-mira ta' effetti karċinoġeniċi u/jew tossiċi oħrajn. L-assaġġ huwa kkunsidrat siewi wkoll sabiex tkun tista' ssir investigazzjoni ulterjuri tal-ġenotossiċità żvelata minn sistema in vitro. Xieraq li jsir assaġġ kometa in vivo f'tessut ta' interess meta jista' jkun raġonevolment mistenni li t-tessut ta' interess sejjer ikun espost b'mod adegwat.
                     L-assaġġ ġie vvalidat bl-iktar mod estensiv f'tessuti somatiċi ta' firien irġiel fi studji kollaborattivi bħall-prova tal-JaCVAM (12) u f'Rothfuss et al., 2010 (10). Fil-prova ta' validazzjoni internazzjonali tal-JaCVAM intużaw il-fwied u l-istonku. Il-fwied, għaliex huwa l-iktar organu attiv fil-metaboliżmu tas-sustanzi kimiċi u spiss organiku fil-mira għall-karċinoġeniċità wkoll. L-istonku, għaliex normalment ikun l-ewwel sit ta' kuntatt għas-sustanzi kimiċi wara esponiment orali, għad li żoni oħrajn tal-apparat gastrointestinali bħad-duwodenu u l-ġeġunu għandhom jiġu kkunsidrati wkoll bħala tessuti tas-sit ta' kuntatt u jistgħu jitqiesu li huma iktar rilevanti għal bnedmin mill-istonku glandulari tar-rodituri. Wieħed għandu joqgħod attent li jiżgura li t-tali tessuti ma jkunux esposti għal konċentrazzjonijiet għoljin wisq tas-sustanzi kimiċi tat-test (21). Fil-prinċipju, it-teknika hija applikabbli għal kwalunkwe tessut li minnu jistgħu jinkisbu sospensjonijiet ta' ċellola waħda/nukleji. Id-dejta proprjetarja minn bosta laboratorji turi l-applikazzjoni b'suċċess tagħha għal ħafna tessuti differenti, u hemm ħafna pubblikazzjonijiet li juru l-applikabilità tat-teknika għal organi jew tessuti oħrajn apparti l-fwied u l-istoniku, eż. il-ġeġunu (22), il-kilwa (23) (24), il-ġilda (25) (26), jew il-borża tal-awrina (27) (28), il-fwied u ċ-ċelloli tal-ħasil bronkoalveolari (rilevanti għal studji tas-sustanzi kimiċi meħudin man-nifs) (29) (30), u saru testijiet f'bosta organi wkoll (31) (32).
                     Filwaqt li jista' jkun hemm interess f'effetti ġenotossiċi f'ċelloli ġerminali, ta' min jgħid li l-assaġġ kometa alkalin standard kif deskritt f'dan il-metodu ta' ttestjar ma jitqiesx li huwa xieraq sabiex jitkejlu l-ħsarat fil-ħjut tad-DNA f'ċelloli ġerminali maturi. Peress li l-livelli ta' sfond varjabbli u għoljin fil-ħsara tad-DNA ġew irrapportati f'reviżjoni tat-tagħrif fuq l-użu tal-assaġġ kometa għall-ġenotossiċità taċ-ċelloli ġerminali (33), jitqies li huwa neċessarju li jsiru modifiki fil-protokoll flimkien ma' standardizzazzjoni aħjar u studji ta' validazzjoni qabel ma l-assaġġ kometa dwar iċ-ċelloli ġerminali maturi (eż. l-isperma) ikun jista' jiġi inkluż fil-metodu ta' ttestjar. Barra minn hekk, ir-reġimen tal-esponiment rakkomandat f'dan il-metodu ta' ttestjar mhuwiex ottimali u jkun hemm bżonn ta' esponimenti itwal jew ħinijiet tal-kampjunar itwal sabiex tkun tista' ssir analiżi sinifikanti tal-ħsarat fil-ħjut tad-DNA fi sperma matura. L-effetti ġenotossiċi kif imkejlin mill-assaġġ kometa f'ċelloli testikolari fi stadji differenti tad-differenzazzjoni ġew deskritti fit-tagħrif (34) (35). Madankollu, ta' min jgħid li l-gonadi fihom taħlita ta' ċelloli somatiċi u ġerminali. Għalhekk, riżultati pożittivi fil-gonad sħiħ (testikoli) mhux bilfors jirriflettu ħsara fiċ-ċellola ġerminali; minkejja dan, jindikaw li s-sustanza kimika (jew sustanzi kimiċi) ittestjata u/jew il-metaboliti tagħha laħqu l-gonad.
                     Retikolazzjonijiet ma jistgħux jiġu identifikati b'mod affidabbli fil-kundizzjonijiet sperimentali standard tal-assaġġ kometa. F'ċerti kundizzjonijiet sperimentali modifikati, jistgħu jiġu identifikati retikolazzjonijiet DNA-DNA u DNA-proteina, u modifiki bażi oħrajn bħal bażijiet ossidizzati (23) (36) (37) (38) (39). Iżda jkun hemm bżonn li ssir iktar ħidma sabiex jiġu kkaratterizzati b'mod adegwat il-modifiki neċessarji fil-protokoll. B'hekk, l-identifikazzjoni ta' aġenti f'retikolazzjoni mhijiex l-iskop primarju tal-assaġġ kif deskritt hawnhekk. L-assaġġ mhuwiex adattat, lanqas b'modifiki, għall-identifikazzjoni ta' anewġeni.
                     Minħabba l-istat attwali tal-għarfien, bosta limitazzjonijiet oħrajn (ara l-Appendiċi 3) huma assoċjati mal-assaġġ kometa in vivo. Huwa mistenni li l-metodu ta' ttestjar sejjer jiġi rivedut fil-ġejjieni u, jekk hemm bżonn, rivedut fid-dawl tal-esperjenza miksuba.
                     Qabel ma jintuża dan il-metodu ta' ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta' dejta għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet ma jkunux meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita.
                     PRINĊIPJU TAL-METODU
                     L-annimali huma esposti għas-sustanza kimika tat-test permezz ta' rotta xierqa. Deskrizzjoni dettaljata tad-dożaġġ u l-kampjunar hija mogħtija fil-paragrafi 36-40. Fil-ħin(ijiet) tal-kampjunar magħżulin, it-tessuti ta' interess huma dissezzjonati u jitħejjew is-sospensjonijiet taċ-ċelloli individwali/in-nukleji (tista' ssir perfużjoni in situ meta titqies siewja, eż. il-fwied) u jiġu inkorporati f'agar artab sabiex jiġu immobilizzati fuq lametti. Iċ-ċelloli/nukleji jiġu ttrattati b'bafer tal-liżi sabiex titneħħa l-membrana ċellolari u/jew nukleari, u jiġu esposti għal alkali b'saħħithom, eż. pH≥13 sabiex id-DNA jkun jista' jinħall u jiġu rilaxxati loops u frammenti tad-DNA rilassati. Imbagħad, id-DNA nukleari fl-agar jiġi soġġett għal elettroforeżi. Il-molekoli tad-DNA mhux frammentati normali jibqgħu fil-pożizzjoni fejn kien id-DNA nukleari fl-agar, filwaqt li kwalunkwe loop tad-DNA frammentat u tad-DNA rilassat jimxu lejn l-anodu. Wara l-elettroforeżi, id-DNA jiġi viżwalizzat bl-użu ta' tilwin fluworexxenti xieraq. Il-preparazzjonijiet għandhom jiġu analizzati bl-użu ta' mikroskopju u sistemi ta' analiżi tal-immaġnijiet awtomatizzati għalkollox jew semiawtomatizzati. L-ammont ta' DNA li jimxi matul l-elettroforeżi u d-distanza tal-mixi jirriflettu l-ammont u d-daqs tal-frammenti tad-DNA. Hemm bosta punti ta' tmiem għall-assaġġ kometa. Il-kontenut ta' DNA fid-denb ( % tad-DNA tad-dnieb jew % tal-intensità tad-dnieb) ġie rrakkomandat sabiex tiġi vvalutata l-ħsara fid-DNA (12) (40) (41) (42). Wara li jiġi analizzat numru biżżejjed ta' nukleji, id-dejta tiġi analizzata b'metodi xierqa sabiex jiġu ġġudikati r-riżultati tal-assaġġ.
                     Ta' min jinnota li l-alterazzjoni ta' bosta aspetti tal-metodoloġija, inklużi t-tħejjija tal-kampjuni, il-kundizzjonijiet tal-elettroforeżi, il-parametri tal-analiżi viżwali (eż. l-intensità tat-tilwin, l-intensità tad-dawl mill-bozza tal-mikroskopju, u l-użu ta' filtri tal-mikroskopju u dinamiki tal-kamera) u l-kundizzjonijiet ambjentali (eż. dawl ta' sfond), ġew investigati u jistgħu jaffettwaw il-mixi tad-DNA (43) (44) (45) (46).
                     VERIFIKA TAL-PROFIĊJENZA TAL-LABORATORJU
                     Kull laboratorju għandu jistabbilixxi kompetenza sperimentali fl-assaġġ kometa billi juri l-ħila li jikseb sospensjonijiet ta' ċelloli individwali jew nukleji ta' kwalità għolja biżżejjed għal kull tessut(i) fil-mira għal kull speċi użata. Il-kwalità tal-preparazzjonijiet sejra tiġi evalwata l-ewwel mill- % tad-DNA tad-dnieb għall-annimali ttrattati bil-veikolu li jaqgħu fi ħdan medda baxxa riproduċibbli. Id-dejta attwali tissuġġerixxi li l- % medju tad-DNA tad-dnieb tal-grupp (fuq il-bażi tal-medja tal-medjani — ara l-paragrafu 57 għal dettalji dwar dawn it-termini) fil-fwied tal-firien idealment ma għandux jaqbeż is-6 %, li jkun konsistenti mal-valuri fil-prova ta' validazzjoni tal-JaCVAM (12) u minn dejta ppubblikata u proprjetarja oħra. Ma hemmx biżżejjed dejta għalissa sabiex issir rakkomandazzjoni dwar il-meded ottimali jew aċċettabbli għal tessuti oħrajn. Dan ma jipprekludix l-użu ta' tessuti oħrajn, jekk dan ikun iġġustifikat. Ir-rapport tat-test għandu jipprovdi reviżjoni xierqa tat-twettiq tal-assaġġ kometa f'dawk it-tessuti b'rabta mat-tagħrif ippubblikat jew minn dejta proprjetarja. L-ewwel nett, medda baxxa ta' % tad-DNA tad-dnieb hija l-ideali sabiex tiġi pprovduta meda dinamika biżżejjed ħalli jiġi identifikat effett pożittiv. It-tieni, kull laboratorju għandu jkun kapaċi jirriproduċi r-risponsi mistennijin għal mutaġeni diretti u promutaġeni, b'modi ta' azzjoni differenti kif issuġġerit fit-Tabella 1 (paragrafu 29).
                     Jistgħu jintgħażlu sustanzi pożittivi, pereżempju mill-prova ta' validazzjoni tal-JaCVAM (12) jew minn dejta ppubblikata oħra (ara l-paragrafu 9), jekk xieraq, b'ġustifikazzjoni, u billi jintwerew risponsi ċari u pożittivi fit-tessuti ta' interess. Il-ħila li jiġu identifikati effetti dgħajfin ta' mutaġeni magħrufin eż. EMS f'dożi baxxi, għandha tintwera wkoll, pereżempju billi jiġu stabbiliti relazzjonijiet bejn id-doża u r-rispons b'numri u spazjar xierqa tad-dożi. L-isforzi inizjali għandhom jiffokaw fuq l-istabbiliment tal-profiċjenza bl-iktar tessuti użati spiss, eż. fwied tar-rodituri, meta jkun jista' jsir paragun mad-dejta eżistenti u r-riżultati mistennijin (12). Fl-istess ħin tista' tinġabar dejta minn tessuti oħrajn, eż. l-istonku/id-duwodenu/il-ġeġunu, id-demm, eċċ. Il-laboratorju jrid juri l-profiċjenza b'kull tessut individwali f'kull speċi li biħsiebu jistudja, u sejjer ikollu bżonn juri li jista' jinkiseb rispons pożittiv aċċettabbli b'mutaġenu magħruf (eż. EMS) f'dak it-tessut.
                     Id-dejta tal-kontroll tal-veikolu/negattiv għandha tinġabar sabiex tintwera r-riproduċibbilità tar-risponsi tad-dejta negattivi, u sabiex jiġi żgurat li l-aspetti tekniċi tal-assaġġ kienu kkontrollati kif xieraq jew sabiex jiġi ssuġġerit il-bżonn li jerġgħu jiġu stabbiliti l-meded storiċi tal-kontroll (ara l-paragrafu 22).
                     Ta' min jinnota li, filwaqt li jistgħu jinġabru bosta tessuti matul in-nekropsija u dawn jistgħu jiġu pproċessati għall-analiżi kometa, il-laboratorju jrid ikun profiċjenti fil-ġbir ta' bosta tessuti minn annimal wieħed, u b'hekk jiġi żgurat li kwalunkwe leżjoni tad-DNA ma tintilifx u l-analiżi kometa ma tkunx f'riskju. It-tul ta' żmien mill-ewtanażja sat-tneħħija tat-tessuti għall-ipproċessar jista' jkun kritiku (ara l-paragrafu 44).
                     It-trattament xieraq tal-annimali jrid jiġi kkunsidrat filwaqt li tiġi żviluppata l-profiċjenza f'dan it-test u, għalhekk, it-tessuti minn annimali użati f'testijiet oħrajn jistgħu jintużaw meta tiġi żviluppata l-kompetenza fil-bosta aspetti tat-test. Barra minn hekk, jaf ma jkunx hemm bżonn li jsir studju sħiħ matul l-istadji tal-istabbiliment ta' metodu ġdid ta' ttestjar f'laboratorju u jistgħu jintużaw inqas annimali jew konċentrazzjonijiet tat-test meta jiġu żviluppati l-ħiliet meħtieġa.
                     
                        Dejta storika tal-kontroll
                     
                     Matul l-investigazzjonijiet tal-profiċjenza, il-laboratorju għandu jibni database storika sabiex jistabbilixxi l-meded tal-kontroll pożittiv u negattiv u d-distribuzzjonijiet għat-tessuti u l-ispeċijiet rilevanti. Rakkomandazzjonijiet dwar kif jibnu u jużaw id-dejta storika (jiġifieri kriterji għall-inklużjoni u l-esklużjoni ta' dejta fid-dejta storika u l-kriterji ta' aċċettabilità għal esperiment partikolari) jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (47). Tessuti u speċijiet differenti, kif ukoll veikoli u rotot tal-amministrazzjoni differenti, jistgħu jrendu valuri tal- % tad-DNA tad-dnieb tal-kontroll negattiv differenti. Għaldaqstant, huwa importanti li jiġu stabbiliti meded tal-kontroll negattiv għal kull tessut u speċi. Il-laboratorji għandhom jużaw metodi ta' kontroll tal-kwalità, bħal karti tal-kontroll (eż. C-charts jew X-bar charts (48)), sabiex jidentifikaw kemm hija varjabbli d-dejta tagħhom, u sabiex juru li l-metodoloġija hija “taħt kontroll” fil-laboratorju tagħhom. L-għażla ta' sustanzi tal-kontroll pożittiv, il-meded tad-dożi u l-kundizzjonijiet sperimentali xierqa (eż. il-kundizzjonijiet tal-elettroforeżi) jaf ikollha bżonn tiġi ottimizzata wkoll għall-identifikazzjoni ta' effetti dgħajfin (ara l-paragrafu 17).
                     Kwalunkwe bidla fil-protokoll tal-esperimenti għandha tiġi kkunsidrata fid-dawl tal-konsistenza tagħha mad-databases tal-kontroll storiċi eżistenti tal-laboratorju. Kwalunkwe inkonsistenza kbira għandha tirriżulta fl-istabbiliment ta' database storika ġdida tal-kontroll.
                     DESKRIZZJONI TAL-METODU
                     
                        Preparamenti
                     
                     
                        Għażla ta' speċi tal-annimali
                     
                     Normalment jintużaw razez tal-laboratorju komuni ta' rodituri adulti żgħar b'saħħithom (età ta' 6-10 ġimgħat fil-bidu tat-trattament, għad li jistgħu jiġu aċċettati annimali ftit ixjaħ ukoll). L-għażla tal-ispeċi ta' rodituri għandha tkun ibbażata fuq (i) speċijiet użati fi studji tat-tossiċità oħrajn (li jridu jkunu kapaċi jikkorrelataw dejta u jippermettu li jsiru studji integrati), (ii) speċijiet li żviluppaw tumuri fi studju tal-karċinoġeniċità (meta ġie investigat il-mekkaniżmu tal-karċinoġenesi), jew (iii) speċijiet l-iktar metaboliżmu rilevanti għall-bniedem, jekk magħrufin. F'dan it-test spiss jintużaw il-firien. Madankollu, jistgħu jintużaw speċijiet oħrajn jekk ikunu etikament u xjentifikament iġġustifikati.
                     
                        Kundizzjonijiet tal-abitazzjoni u l-għalf tal-annimali
                     
                     Għar-rodituri, idealment, it-temperatura fil-kamra tal-annimali esperimentali għandha tkun ta' 22 °C (± 3 °C). Idealment, l-umdità relattiva għandha tkun ta' 50-60 %, u tal-inqas 30 % u, idealment, ma taqbiżx is-70 % ħlief matul it-tindif tal-kamra. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, b'sekwenza ta' 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Dwar l-għalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta' ilma tax-xorb. L-għażla tad-dieta tista' tkun influwenzata mill-bżonn li tiġi żgurata taħlita xierqa ta' sustanza kimika tat-test meta tingħata minn din ir-rotta. Ir-rodituri għandhom jitrabbew fi gruppi żgħar (normalment mhux iktar minn ħamsa) tal-istess sess jekk ma tkun mistennija ebda mġiba aggressiva. L-annimali jistgħu jitrabbew waħedhom biss jekk dan ikollu ġustifikazzjoni xjentifika. Art solida għandha tintuża kull meta jkun possibbli għaliex art tal-gradilji tista' tikkawża korrimenti serji (49). Irid jiġi pprovdut arrikkiment xieraq tal-bejta.
                     
                        Preparazzjoni tal-annimali
                     
                     L-annimali jiġu assenjati b'mod każwali lill-gruppi tal-kontroll u tat-trattament. L-annimali jiġu identifikati b'mod uniku u jitħallew iderru fil-kundizzjonijiet tal-laboratorju għal tal-inqas ħamest ijiem qabel ma jibda t-trattament. Irid jintuża l-inqas metodu invażiv ta' identifikazzjoni b'mod uniku tal-annimali. Metodi xierqa jinkludu ċrieki, tikketti, mikroċipep u identifikazzjoni bijometrika. Il-qtugħ tas-swaba' u tal-widnejn mhuwiex xjentifikament iġġustifikat f'dawn it-testijiet. Il-gaġeġ għandhom ikunu rranġati b'mod li jkunu mminimizzati l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid tal-gaġeġ. Fil-bidu tal-istudju, il-varjazzjoni fil-piż tal-annimali għandha tkun minima u ma taqbiżx ± 20 %.
                     
                        Preparazzjoni tad-dożi
                     
                     Is-sustanzi kimiċi solidi tat-test għandhom jinħallu jew jiġu sospiżi f'veikoli xierqa jew jitħalltu f'dieta jew ilma tajjeb għax-xorb qabel id-dożaġġ tal-annimali. Is-sustanzi kimiċi likwidi tat-test jistgħu jiġu dożati direttament jew jiġu dilwiti qabel id-dożaġġ. Għal esponiment bit-teħid man-nifs, is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jingħataw bħala gass, fwar jew aerosol solidu/likwidu, skont il-proprjetajiet fiżikokimiċi tagħhom (50) (51).
                     Għandhom jintużaw preparati ġodda tas-sustanza kimika tat-test sakemm id-dejta dwar l-istabilità ma turix l-aċċettabilità tal-ħżin u tiddefinixxi l-kundizzjonijiet tal-ħżin xierqa.
                     
                        Kundizzjonijiet tat-test
                     
                     
                        Il-veikolu
                     
                     Il-veikolu ma għandhomx jipproduċu effetti tossiċi fil-volumi tad-doża użati, u ma għandhomx ikunu ssuspettati b'reazzjoni kimika mas-sustanzi kimiċi tat-test. Jekk jintużaw veikoli oħrajn li mhumiex magħrufin sew, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun sostnuta permezz ta' dejta ta' referenza li tindika l-kompatibbiltà tagħhom f'termini tal-annimali tat-test, ir-rotta tal-amministrazzjoni u l-punt ta' tmiem. Huwa rakkomandat li, fejn jista' jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/veikolu milwiem. Ta' min jgħid li ċerti veikoli (speċjalment veikoli viskużi) jistgħu jinduċu infjammazzjoni u jżidu l-livelli ta' sfond tal-ħsarat fil-ħjut tad-DNA fis-sit ta' kuntatt, speċjalment b'amministrazzjonijiet multipli.
                     
                        Kontrolli
                     
                     
                        Kontrolli pożittivi
                     
                     Bħalissa, ma' kull test normalment għandhom ikunu inklużi tal-inqas 3 annimali analizzabbli ta' sess wieħed, jew ta' kull sess jekk jintużaw it-tnejn (ara l-paragrafu 32), ittrattati b'sustanza tal-kontroll pożittiv. Fil-ġejjieni, jaf ikun possibbli li tintwera profiċjenza adegwata sabiex jonqos il-bżonn ta' kontrolli pożittivi. Jekk jintużaw bosta ħinijiet tal-kampjunar (eż. bi protokoll tal-amministrazzjoni wieħed), hemm bżonn li jkunu inklużi biss kontrolli pożittivi f'wieħed mill-ħinijiet tal-kampjunar, iżda għandu jkun żgurat disinn ibbilanċjat (ara l-paragrafu 48). Ma hemmx bżonn li jiġu amministrati sustanzi tal-kontroll pożittiv parallel mill-istess rotta bħas-sustanza kimika tat-test, għad li huwa importanti li tintuża l-istess rotta meta jitkejlu l-effetti fis-sit ta' kuntatt. Is-sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv għandhom ikunu murijin li jinduċu ħsarat fil-ħjut tad-DNA fit-tessuti ta' interess kollha għas-sustanza kimika tat-test, u EMS aktarx li jkun il-kontroll pożittiv tal-għażla peress li pproduċa ħsarat fil-ħjut tad-DNA fit-tessuti kollha li ġew studjati. Id-dożi tas-sustanzi tal-kontroll pożittiv għandhom jintgħażlu sabiex jipproduċu effetti moderati li jivvalutaw b'mod kritiku l-prestazzjoni u s-sensittività tal-assaġġ u jistgħu jkunu bbażati fuq il-kurvi ta' doża — rispons stabbilita mil-laboratorju matul il-wiri tal-profiċjenza. Il- % tad-DNA tad-dnieb fl-annimali tal-kontroll pożittiv parallel għandu jkun konsistenti mal-medda tal-laboratorju prestabbilita għal kull tessut individwali u ħin tal-kampjunar għal dik l-ispeċi (ara l-paragrafu 16). Fit-Tabella 1 hemm inklużi eżempji ta' sustanzi tal-kontroll pożittiv u uħud mit-tessuti fil-mira (f'rodituri) tagħhom. Jistgħu jintgħażlu sustanzi li mhumiex fost dawk mogħtijin fit-Tabella 1 jekk ikunu ġġustifikati xjentifikament.
                     
                        Tabella 1
                     
                     
                        Eżempji ta' sustanzi tal-kontroll pożittiv u uħud mit-tessuti fil-mira tagħhom
                     
                     Sustanzi u Nru RN tas-CAS
                     Etil metansulfonat (RN tas-CAS 62-50-0) għal kwalunkwe tessut
                     Etil nitrosurea (RN tas-CAS 759-73-9) għal fwied u stonku, duwodenu jew ġeġunu
                     Metil metansulfonat (RN tas-CAS 66-27-3) għal fwied, stonku, duwodenu jew ġeġunu, fwied u ċelloli tal-ħasil bronkoalveolari (BAL), kilwa, bużżieqa tal-awrina, pulmun, testikoli u mudullun tal-għadam/demm
                     N-Metil-N′-nitro-N-nitrosogwanidina (RN tas-CAS: 70-25-7) għal stonku, duwodenu jew ġeġunu
                     1,2-Dimetilidrażina 2HCl (RN tas-CAS 306-37-6) għal fwied u intestin
                     N-metil-N-nitrosurea (RN tas-CAS 684-93-5) għal fwied, mudullun tal-għadam, demm, kilwa, stonku, ġeġunu u moħħ.
                     
                        Kontrolli negattivi
                     
                     Grupp ta' annimali tal-kontroll negattiv, ittrattati b'veikolu waħdu, u fil-bqija ttrattati bl-istess mod bħall-gruppi tat-trattament, għandu jkun inkluż ma' kull test għal kull ħin tal-kampjunar u tessut. Il- % tad-DNA tad-dnieb fl-annimali tal-kontroll negattiv għandu jkun fi ħdan il-medda prestabbilita ta' sfond tal-laboratorju għal kull tessut individwali u ħin tal-kampjunar għal dik l-ispeċi (ara l-paragrafu 16). Fin-nuqqas ta' dejta storika jew ippubblikata tal-kontroll li turi li ma huwa indott ebda effet dannuż jew ġenotossiku mill-veikolu magħżul, min-numru ta' amministrazzjonijiet jew mir-rotta tal-amministrazzjoni, l-istudji inizjali għandhom isiru qabel ma jsir l-istudju sħiħ, sabiex tiġi stabbilita l-aċċettabilità tal-kontroll tal-veikolu.
                     PROĊEDURA
                     
                        In-numru u s-sess tal-annimali
                     
                     Għad li ftit li xejn hemm dejta fuq annimali nisa li minnhom jista' jsir paragun bejn is-sessi b'rabta mal-assaġġ kometa, b'mod ġenerali, risponsi tal-ġenotossiċità in vivo oħrajn huma simili bejn annimali rġiel u annimali nisa u, għalhekk, ħafna mill-istudji jistgħu jsiru f'kull sess. Dejta li turi d-differenzi rilevanti bejn l-irġiel u n-nisa (eż. differenzi fit-tossiċità sistemika, il-metaboliżmu, il-bijodisponibilità, eċċ. inkluż, eż. fi studju għat-tiftix tal-medda) tħeġġeġ l-użu taż-żewġ sessi. F'dan il-każ, jaf ikun xieraq li jsir studju fiż-żewġ sessi, eż. bħala parti minn studju ripetut tat-tossiċità tad-doża. Jaf ikun xieraq li jintuża d-disinn fattorjali f'każ li jintużaw iż-żewġ sessi. Dettalji dwar kif tiġi analizzata d-dejta bl-użu ta' dan id-disinn huma mogħtijin fl-Appendiċi 2.
                     Id-daqsijiet tal-grupp fil-bidu tal-istudju (u matul l-istabbiliment tal-profiċjenza) għandhom jiġu stabbiliti bil-għan li jiġu pprovduti tal-inqas 5 annimali analizzabbli ta' sess wieħed, jew ta' kull sess jekk jintużaw it-tnejn, għal kull grupp (inqas fil-grupp tal-kontroll pożittiv parallel — ara l-paragrafu 29). Fejn l-esponiment umana għas-sustanzi kimiċi tista' tkun speċifika għas-sess, bħal ma jseħħ pereżempju għal ċerti prodotti farmaċewtiċi, it-test għandu jsir b'annimali tas-sess xieraq. Bħala gwida għal rekwiżiti tipiċi massimi tal-annimali, studju mwettaq skont il-parametri stabbiliti fil-paragrafu 33 bi tliet gruppi tad-doża u kontrolli negattivi u pożittivi paralleli (kull grupp imsawwar minn ħames annimali ta' sess uniku), ikun jeħtieġ bejn 25 u 35 annimal.
                     SKEDA TAT-TRATTAMENT
                     L-annimali għandhom jingħataw trattamenti kuljum għal jumejn jew iktar (jiġifieri żewġ trattamenti jew iktar f'intervalli ta' madwar 24 siegħa), u l-kampjuni għandhom jinġabru darba sagħtejn sa sitt sigħat (jew fit-Tmax) wara l-aħħar trattament (12). Kampjuni minn reġimi tad-doża estiżi (eż. dożaġġ kuljum għal 28 jum) jistgħu jiġu aċċettati. Intweriet b'suċċess it-taħlita tal-analiżi tal-kometa u t-test tal-mikronuklei tal-eritroċiti (10) (19). Madankollu, trid tingħata kunsiderazzjoni bir-reqqa lil-loġistika involuta fil-kampjunar tat-tessuti għall-analiżi tal-kometi flimkien mar-rekwiżiti tal-kampjunar tat-tessut għal tipi oħrajn ta' valutazzjonijiet tossikoloġiċi. F'ħafna każijiet, il-ġbir 24 siegħa wara l-aħħar doża, li huwa tipiku għal studju tat-tossiċità ġenerali, mhuwiex adattat (ara l-paragrafu 40 dwar il-ħin tal-kampjunar). L-użu ta' skedi tat-trattament u tal-kampjunar oħrajn għandu jkun iġġustifikat (ara l-Appendiċi 3). Pereżempju, trattament wieħed b'kampjunar multiplu jista' jintuża, iżda ta' min jgħid li dan ikun jeħtieġ iktar annimali għal studju b'amministrazzjoni waħda minħabba l-bżonn ta' bosta drabi tal-kampjunar, iżda kultant dan jista' jkun aħjar, eż. meta s-sustanza kimika tat-test tinduċi tossiċità eċċessiva wara amministrazzjonijiet ripetuti.
                     Isir kif isir it-test, jista' jiġi aċċettat diment li s-sustanza kimika tat-test tagħti rispons pożittiv jew, għal studju negattiv, diment li tkun ingħatat l-evidenza diretta jew indiretta li ssostni l-esponiment ta', jew it-tossiċità għat-tessut(i) fil-mira jew jekk tinkiseb id-doża limitu (ara l-paragrafu 36).
                     Is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jingħataw ukoll bħala doża maqsuma, jiġifieri żewġ trattamenti fl-istess ġurnata separati b'mhux iktar minn sagħtejn jew tlieta) sabiex jiġi ffaċilitat l-għoti ta' volum kbir. F'dawn iċ-ċirkustanzi, il-ħin tal-kampjunar għandu jiġi skedat fuq il-bażi tal-ħin tal-aħħar dożaġġ (ara l-paragrafu 40).
                     
                        Livelli tad-doża
                     
                     Jekk isir studju preliminari għat-tiftix tal-medda għaliex ma jkun hemm ebda dejta xierqa disponibbli minn studji rilevanti oħrajn sabiex tgħin fl-għażla tad-doża, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, bl-użu tal-istess speċijiet, razza, sess u reġim tat-trattament li jrid jintuża fl-istudju ewlieni skont l-approċċi attwali għat-twettiq ta' studji ta' individwazzjoni tad-doża. L-istudju għandu jkollu l-għan li jidentifika d-doża massima tollerata (MTD), definita bħala d-doża li tinduċi effetti tossiċi ħfief b'rabta mad-durata tal-perjodu ta' studju (pereżempju, sinjali kliniċi ċari bħal imġiba jew reazzjonijiet anormali, dipressjoni minuri tal-piż tal-ġisem jew ċitotossiċità tat-tessut fil-mira), iżda mhux mewt jew evidenza ta' uġigħ, tbatija jew diffikultà li tirrekjedi l-ewtanażja. Għal sustanza kimika tat-test mhux tossika, b'perjodu ta' amministrazzjoni ta' 14-il jum jew iktar, id-doża (limitu) massima hija ta' 1 000 mg/kg piż tal-ġisem/jum. Għal perjodi ta' għoti ta' 14-il jum jew inqas, id-doża (limitu) massimu hija ta' 2 000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum. Għal ċerti tipi ta' sustanzi kimiċi tat-test (eż. prodotti farmaċewtiċi għall-bniedem) koperti minn regolamenti speċifiċi, dawn il-limiti jistgħu jvarjaw.
                     Sustanzi kimiċi li jesibixxu saturazzjoni tal-proprjetajiet tossikokinetiċi, jew jinduċu proċessi ta' ditossifikazzjoni li jistgħu jwasslu għal tnaqqis fl-esponiment wara għoti fit-tul jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta' ssettar tad-dożi u għandhom jiġu evalwati fuq bażi ta' każ b'każ.
                     Kemm għal verżjonijiet akuti kif ukoll dawk sottoakuti tal-assaġġ kometa, minbarra d-doża massima (MTD, doża massima fattibbli, esponiment massimu jew doża limitu), għandha tingħażel sekwenza dixxendenti ta' tal-inqas żewġ livelli tad-doża addizzjonali differenti biżżejjed (idealment separati b'inqas minn 10) għal kull ħin tal-kampjunar sabiex jintwerew ir-risponsi relatati mad-doża. Madankollu, il-livelli tad-doża użati idealment għandhom ikopru wkoll medda mill-massimu sa doża li tipproduċi ftit tossiċità jew ebda tossiċità. Meta tiġi osservata tossiċità tat-tessut fil-mira fil-livelli tad-doża kollha ttestjati, huwa rakkomandat li jsir studju ulterjuri f'dożi mhux tossiċi (ara l-paragrafi 54-55). Studji li jkollhom l-għan li jinvestigaw iktar bis-sħiħ il-forma tal-kurva ta' doża — rispons jistgħu jeħtieġu grupp(i) tad-doża addizzjonali.
                     
                        Amministrazzjoni tad-Dożi
                     
                     Ir-rotta antiċipata tal-esponiment tal-bniedem għandha tiġi kkunsidrata meta jitfassal assaġġ. Għaldaqstant, jistgħu jingħażlu rotot tal-esponiment bħal rotta djetetika, mal-ilma tax-xorb, subkuntanja topika, fil-vini, orali (gavage), mat-teħid man-nifs, intratrakeali, jew b'impjant, kif iġġustifikati. Fi kwalunke każ, ir-rotta għandha tingħażel sabiex jiġi żgurat esponiment adegwat tat-tessut(i) fil-mira. Ġeneralment ma tkunx rakkomandata injezzjoni intraperitoneali peress li mhijiex rotta tipikament rilevanti ta' esponiment tal-bniedem, u din għandha tintuża biss b'ġustifikazzjoni xjentifika speċifika (eż. ċerti sustanzi tal-kontroll pożittiv, għal finijiet investigattivi, jew għal ċerti mediċini li jingħataw mir-rotta intraperitoneali). Il-volum massimu ta' likwidu li jista' jingħata b'gavage jew injezzjoni f'darba jiddependi mid-daqs tal-annimal tat-test. Il-volum m'għandux ikun aktar minn 1 ml/100 g tal-piż tal-ġisem ħlief fil-każ ta' soluzzjonijiet fl-ilma fejn jistgħu jintużaw 2 ml/100g tal-piż tal-ġisem. L-użu ta' volumi ikbar minn dan (jekk ikunu permessi mil-leġiżlazzjoni dwar it-trattament xieraq tal-annimali) għandu jkun iġġustifikat. Kull meta jkun possibbli, għandhom jinkisbu livelli tad-doża differenti billi tiġi aġġustata l-konċentrazzjoni tal-formulazzjoni tad-dożaġġ sabiex jiġi volum kostanti b'rabta mal-piż tal-ġisem fil-livelli kollha tad-doża.
                     
                        Ħin tal-Kampjunar
                     
                     Il-ħin tal-kampjun huwa varjabbli kruċjali għaliex huwa stabbilit mill-perjodu meħtieġ sabiex is-sustanzi kimiċi tat-test jilħqu l-konċentrazzjoni massima fit-tessut fil-mira u sabiex jiġu indotti l-ħsarat fil-ħjut tad-DNA iżda qabel ma jitilqu jew jissewwew dawn il-ħsarat u qabel ma dawn iwasslu għall-mewt taċ-ċelloli. Il-persistenza ta' wħud mil-leżjonijiet li jwasslu għall-ħsarat fil-ħjut tad-DNA identifikati mill-assaġġ kometa tista' tkun qasira ħafna, tal-inqas għal uħud mis-sustanzi kimiċi ttestjati in vitro (52) (53). Għalhekk, jekk ikun hemm suspett ta' leżjonijiet tad-DNA trażjenti bħal dawn, għandhom jittieħdu miżuri sabiex jiġi mitigat it-telf tagħhom billi jiġi żgurat li jittieħed kampjun tat-tessuti minn kmieni, forsi qabel il-ħinijiet prestabbiliti mogħtijin hawn taħt. Il-ħin(ijiet) tal-kampjunar ottimali jista' jkun speċifiku għas-sustanza kimika jew ir-rotta li tirriżulta, pereżempju, f'esponiment rapidu tat-tessut b'amministrazzjoni ġol-vina jew esponiment bit-teħid man-nifs. Għalhekk, meta tkun disponibbli, il-ħinijiet tal-kampjunar għandhom ikunu stabbiliti minn dejta kinetika (eż. il-ħin (Tmax) li fih tinkiseb il-quċċata tal-plażma jew il-konċentrazzjoni fit-tessut (Cmax), jew fl-istat stabbli għal amministrazzjonijiet multipli). Fin-nuqqas ta' dejta kinetika, kompromess xieraq għall-kejl tal-ġenotossiċità huwa li jittieħed kampjun wara sagħtejn sa sitt sigħat mill-aħħar trattament għal żewġ trattamenti jew iktar, jew wara sagħtejn sa sitt sigħat u sittax sa sitta u għoxrin siegħa wara amministrazzjoni waħda, għad li wieħed għandu joqgħod attent li ssir nekropsija lill-annimali kollha fl-istess ħin wara l-aħħar (jew l-unika) doża. Tista' tintuża wkoll informazzjoni dwar id-dehra tal-effetti tossiċi fl-organi fil-mira (jekk disponibbli) sabiex jingħażlu l-iktar ħinijiet tal-kampjunar xierqa.
                     
                        Osservazzjonijiet
                     
                     Għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi ġenerali marbutin mas-saħħa fuq l-annimali u dawn għandhom jiġu rreġistrati tal-inqas darba kuljum, idealment fl-istess ħin(ijiet) kuljum u filwaqt li jiġi kkunsidrat il-perjodu ta' wara d-dożaġġ li fih sejrin jidhru l-iktar l-effetti antiċipati (54). Tal-inqas darbtejn kuljum, l-annimali kollha għandhom ikunu osservati għal morbidità u mortalità. Għal studji b'durata itwal, l-annimali kollha għandhom jintiżnu tal-inqas darba fil-ġimgħa, u meta jispiċċa l-perjodu ta' ttestjar. Il-konsum tal-ikel għandu jitkejjel f'kull bidla tal-ikel u tal-inqas darba fil-ġimgħa. Jekk is-sustanza kimika tat-test tingħata mal-ilma tax-xorb, il-konsum tal-ilma għandu jitkejjel f'kull bidla tal-ilma u tal-inqas darba fil-ġimgħa. L-annimali li jesibixxu indikaturi mhux letali ta' tossiċità eċċessiva għandhom jiġu ewtanazzati qabel jintemm il-perjodu ta' ttestjar, u ġeneralment ma jintużawx għall-analiżi kometa.
                     
                        Ġbir tat-Tessuti
                     
                     Peress li huwa possibbli li l-induzzjoni tal-ħsarat fil-ħjut tad-DNA (kometi) tiġi studjata prattikament fi kwalunkwe tessut, il-ġustifikazzjoni għaliex intgħażel it-tessut(i) li jrid jinġabar għandha tkun definita ċara u bbażata fuq ir-raġuni għat-twettiq tal-istudju flimkien ma' kwalunkwe dejta dwar l-ADME, il-ġenotossiċità, il-karċinoġeniċità jew dejta oħra dwar it-tossiċità għas-sustanzi kimiċi tat-test investigati. Fatturi importanti x'jiġu kkunsidrati għandhom jinkludu r-rotta tal-amministrazzjoni (fuq il-bażi tar-rotta (jew rotot) tal-esponiment probabbli tal-bniedem), id-distribuzzjoni u l-assorbiment tat-tessut imbassrin, ir-rwol tal-metaboliżmu u l-mekkaniżmu possibbli ta' azzjoni tas-sustanzi kimiċi tat-test. Il-fwied kien l-iktar tessut studjat spiss u li fuqu hemm l-iktar dejta. Għaldaqstant, fin-nuqqas ta' kwalunkwe informazzjoni ta' sfond, u jekk ma jiġi identifikat ebda tessut speċifiku ta' interess, il-kampjunar tal-fwied ikun iġġustifikat peress li dan huwa sit primarju ta' metaboliżmu ksenobijotiku u spiss ikun espost ħafna kemm għal sustanza/sustanzi prinċipali kif ukoll metabolita/i. F'ċerti każijiet, l-eżaminazzjoni ta' sit ta' kuntatt dirett (pereżempju, għal sustanzi kimiċi mogħtijin oralment, l-istonku glandulari jew id-duwodenu/ġeġunu, jew għal sustanzi kimiċi meħudin man-nifs, il-pulmun) tista' tkun l-iktar rilevanti. Għandhom jintgħażlu tessuti addizzjonali jew alternattivi fuq il-bażi tar-raġunijiet speċifiċi li għalihom qiegħed isir it-test iżda jista' jkun siewi li jiġu eżaminati bosta tessuti fl-istess annimali diment li l-laboratorju jkun wera li huwa profiċjenti b'dawk it-tessuti u kompetenti fl-immaniġġjar ta' bosta tessuti fl-istess ħin.
                     
                        Preparazzjoni tal-kampjuni
                     
                     Għall-proċessi deskritti fil-paragrafi li ġejjin (44-49), importanti li s-soluzzjonijiet jew is-sospensjonijiet stabbli kollha jintużaw sad-data ta' skadenza tagħhom, jew inkella jiġu ppreparati ġodda jekk ikun hemm bżonn. Anki fil-paragrafi li ġejjin, il-ħinijiet meħudin sabiex (i) jitneħħa kull tessut wara n-nekropsija, (ii) jiġi pproċessat kull tessut f'sospensjonijiet taċ-ċelloli/nukleji, u (iii) tiġi pproċessata s-sospensjoni u jiġu ppreparati l-lametti lkoll jitqiesu varjabbli kritiċi (ara Definizzjonijiet, Appendiċi 1), u t-tul aċċettabbli ta' żmien għal kull wieħed minn dawn l-istadi għandu jkun ġie stabbilit matul it-tfassil tal-metodu u l-wiri tal-profiċjenza.
                     L-annimali sejrin jiġu ewtanazzati, b'mod konsistenti mal-leġiżlazzjoni effettiva dwar it-trattament xieraq tal-annimali u l-prinċipji 3Rs, fil-ħin(ijiet) xieraq wara l-aħħar trattament b'sustanza kimika tat-test. It-tessut(i) magħżul jitneħħa, jiġi dissezzjonat, u sehem minnu jinġabar għall-assaġġ kometa, filwaqt li fl-istess ħin għandha tinqata' biċċa mill-istess parti tat-tessut u titqiegħed fis-soluzzjoni tal-formaldeid jew fissattiv xieraq għall-analiżi tal-istopatoloġija possibbli (ara l-paragrafu 55) skont il-metodi standard (12). It-tessut għall-assaġġ kometa jitqiegħed f'bafer tat-tqattigħ, imlaħlaħ biżżejjed b'bafer tat-tqattigħ kiesaħ sabiex jitneħħa d-demm residwu, u jinħażen f'bafer tat-tqattigħ kiesaħ silġ sakemm jiġi pproċessat. Tista' ssir perfużjoni in situ wkoll, eż. għall-fwied, kilwa.
                     Jeżistu ħafna metodi ppubblikati għall-iżolament taċ-ċelloli/nuklei. Dawn jinkludu t-tqattigħ tat-tessuti bħall-fwied u l-kilwa, il-brix tal-uċuħ mukożali fil-każ tal-apparat gastrointestinali, l-omoġenizzazzjoni u d-diġestjoni enzimika. Il-prova tal-validazzjoni tal-JaCVAM studjat biss ċelloli iżolati, u għalhekk f'termini ta' stabbiliment tal-metodu u sabiex ikun jista' jsir riferiment għad-dejta tal-prova tal-JaCVAM għall-wiri tal-profiċjenza, aħjar jintużaw ċelloli iżolati. Madankollu, intwera li essenzjalment ma hemm ebda differenza essenzjali fir-riżultat tal-assaġġ bejn meta jintużaw ċelloli iżolati u meta jintużaw nuklei iżolati (8). Anki metodi differenti sabiex jiġu iżolati ċ-ċelloli/in-nukleji (eż. omoġenizzazzjoni, tqattigħ, diġestjoni enzimatika u filtrazzjoni bix-xibka) taw riżultati komparabbli (55). Konsegwentement, jistgħu jintużaw ċelloli iżolati jew nukleji iżolati. Laboratorju għandu jevalwa bir-reqqa u jivvalida l-metodi speċifiċi għat-tessut ta' iżolament ta' ċelloli/nukleji individwali. Kif diskuss fil-paragrafu 40, il-persistenza ta' wħud mil-leżjonijiet li jwasslu għall-ħsarat fil-ħjut tad-DNA identifikati mill-assaġġ kometa tista' tkun qasira ħafna (52) (53). Għaldaqstant, ikun xi jkun il-metodu użat sabiex jitħejjew is-sospensjonijiet taċ-ċelloli/nukleji individwali, importanti li t-tessuti jiġu pproċessati mill-iktar fis possibbli wara li l-annimali jkunu ġew ewtanazzati u jitqiegħdu f'kundizzjonijiet li jnaqqsu t-tneħħija tal-leżjonijiet (eż. billi t-tessut jinżamm f'temperatura baxxa). Is-sospensjonijiet taċ-ċelloli għandhom jinżammu kisħin silġ sakemm ikunu lesti sabiex jintużaw, sabiex ikun jista' jintwera li hemm varjazzjoni minima bejn il-kampjuni u risponsi tal-kontroll pożittiv u negattiv xierqa.
                     PREPARAZZJONI TAL-LAMETTI
                     Il-preparazzjoni tal-lametti għandha ssir mill-iktar fis possibbli (idealment f'temp ta' siegħa) wara l-preparazzjoni taċ-ċelloli/nukleji individwali, iżda t-temperatura u l-ħin bejn il-mewt tal-annimal u l-preparazzjoni tal-lametta għandhom ikunu kkontrollati bir-reqqa u vvalidati fil-kundizzjonijiet tal-laboratorju. Il-volum tas-sospensjoni taċ-ċelloli miżjuda mal-agarożju b'punt tat-tidwib baxx (normalment 0.5-1.0 %) sabiex isiru l-lametti ma għandux inaqqas il-perċentwal tal-agarożju b'punt tat-tidwib baxx għal inqas minn 0.45 %. Id-densità ottimali taċ-ċelloli sejra tiġi stabbilita bis-sistema ta' analiżi tal-immaġnijiet użata għall-għadd tal-kometi.
                     
                        Il-liżi
                     
                     Il-kundizzjonijiet tal-liżi huma varjabbli b'mod kritiku wkoll u jistgħu jxekklu fil-ħsarat fil-ħjut li jirriżultaw minn tipi speċifiċi ta' modifiki tad-DNA (ċerti alkilazzjonijiet tad-DNA u addotti bażi). Għaldaqstant huwa rakkomandat li l-kundizzjonijiet tal-liżi jinżammu l-iktar kostanti possibbli għal-lametti kollha fi ħdan esperiment. Ladarba jitħejjew, il-lametti għandhom jitgħaddsu f'soluzzjoni tal-liżi mkessħa għal tal-inqas siegħa (jew tul il-lejl) f'madwar 2-8 °C f'kundizzjonijiet ta' dawl bati eż. dawl isfar (jew fid-dlam) li jevitaw esponiment għal dawl abjad li jista' jkun fih komponenti tal-UV. Wara dan il-perjodu ta' inkubazzjoni, il-lametti għandhom jitlaħalħu sabiex jitneħħa d-deterġent u l-imluħ residwi qabel l-istadju ta' taħlil tal-alkali. Dan jista' jsir bl-użu ta' ilma purifikat, bafer ta' newtralizzazzjoni jew bafer tal-fosfat. Jista' jintuża wkoll bafer tal-elettroforeżi. Dan iżomm il-kundizzjonijiet alkalini fil-kompartiment tal-elettroforeżi.
                     
                        Taħlil u elettroforeżi
                     
                     Il-lametti għandhom jitqiegħdu b'mod aleatorju fuq il-pjattaforma ta' unità tal-elettroforeżi tat-tip sottomarin li jkun fiha biżżejjed soluzzjoni tal-elettroforeżi b'tali mod li l-uċuħ tal-lametti jkunu mgħottijin għalkollox (il-fond li fih huma mgħottijin għalkollox għandu jkun konsistenti bejn sessjoni u oħra wkoll). F'tip ieħor ta' unitajiet tal-elettroforeżi tal-assaġġ kometa, jiġifieri bi tkessiħ attiv, ċirkulazzjoni u provvista tal-enerġija b'kapaċità għolja, soluzzjoni li tgħatti iktar fonda tirriżulta f'kurrent elettriku ikbar filwaqt li l-vultaġġ jibqa' kostanti. Għandu jintuża disinn ibbilanċjat sabiex il-lametti jitqiegħdu fit-tank tal-elettroforeżi sabiex jiġu mitigati l-effetti ta' kwalunkwe xejra jew effett fit-tarf ġewwa t-tank u sabiex titnaqqas kemm jista' jkun il-varjabbiltà bejn lott u ieħor, jiġifieri f'kull sessjoni tal-elettroforeżi, għandu jkun hemm għandu jkun inkluż l-istess numru ta' lametti minn kull annimal fl-istudju u kampjuni mill-gruppi tad-dożaġġ differenti, il-kontrolli negattivi u pożittivi. Il-lametti għandhom jitħallew għal tal-inqas 20 minuta sabiex id-DNA jinħall mill-koljatura, u mbagħad jiġu soġġetti għal elettroforeżi f'kundizzjonijiet ikkontrollati li sejrin jimmassimizzaw is-sensittività u l-medda dinamika tal-assaġġ (jiġifieri f'livelli aċċettabbli ta % tad-DNA tad-dnieb għal kontrolli negattivi u pożittivi li jimmassimizzaw is-sensittività). Il-livell tal-migrazzjoni tad-DNA huwa assoċjat b'mod lineari mad-durata tal-elettroforeżi, u anki mal-potenzjal (V/cm). Fuq il-bażi tal-prova tal-JaCVAM, dan jista' jkun 0.7 V/cm għal tal-inqas 20 minuta. Id-durata tal-elettroforeżi titqies li hija varjabbli kritiku u l-ħin tal-elettroforeżi għandu jiġi stabbilit sabiex tiġi ottimizzata l-medda dinamika. Ħinijiet itwal tal-elettroforeżi (eż. 30 jew 40 minuta sabiex tiġi massimizzata s-sensittività) normalment iwasslu għal risponsi pożittivi iktar b'saħħithom b'mutaġeni magħrufin. Madankollu, ħinijiet itwal tal-elettroforeżi jistgħu jwasslu wkoll għal migrazzjoni eċċessiva fil-kampjuni tal-kontroll. F'kull esperiment, il-vultaġġ għandu jinżamm kostanti, u l-varjabbiltà fil-parametri l-oħrajn għanda tkun fi ħdan medda ristretta u speċifikata, pereżempju fil-prova tal-JaCVAM 0.7 V/cm fornew kurrent tal-bidu ta' 300 mA. Il-fond tal-bafer għandu jiġi aġġustat sabiex jinkisbu l-kundizzjonijiet meħtieġa u għandu jinżamm matul l-esperiment kollu. Il-kurrent fil-bidu u fi tmiem il-perjodu tal-elettroforeżi għandu jiġi rreġistrat. Għaldaqstant, il-kundizzjonijiet ottimali għandhom jiġu stabbiliti matul il-wiri inizjali tal-profiċjenza fil-laboratorju kkonċernat b'kull tessut studjat. It-temperatura tas-soluzzjoni tal-elettroforeżi permezz tat-taħlil u l-elettroforeżi għandha tinżamm baxxa, normalment 2-10 °C (10). It-temperatura tas-soluzzjoni tal-elettroforeżi fil-bidu tat-taħlil, il-bidu tal-elettroforeżi, u tmiem l-elettroforeżi għandha tiġi rreġistrata.
                     Wara li titlesta l-elettroforeżi, il-lametti għandhom jitgħaddsu/jitlaħalħu fil-bafer ta' newtralizzazzjoni għal tal-inqas 5 minuti. Il-ġellijiet jistgħu jitlewnu u jingħataw punteġġ “friski” (eż. fi żmien jum jew jumejn) jew jistgħu jiġu deidratati sabiex jingħataw punteġġ iktar tard (eż. fi żmien ġimgħa jew ġimagħtejn wara t-tilwin) (56). Madankollu, il-kundizzjonijiet għandhom jiġu vvalidati matul il-wiri tal-profiċjenza u d-dejta storika għandha tinkiseb u tinżamm b'mod separat għal kull waħda minn dawn il-kundizzjonijiet. Fl-aħħar każ, il-lametti għandhom jiġu deidratati b'immersjoni fl-etanol assolut għal tal-inqas 5 minuti, jitħallew jinxfu bl-arja, u mbagħad jinħażnu, jew f'temperatura ambjentali jew inkella f'kontenitur fi friġġ sakemm jingħataw punteġġ.
                     
                        Metodi tal-Kejl
                     
                     Il-kometi għandhom jingħataw punteġġ b'mod kwantitattiv bl-użu ta' sistema awtomatizzata jew semiawtomatizzata ta' analiżi tal-immaġnijiet. Il-lametti sejrin jitlewnu b'tilwin fluworexxenti xieraq, eż. SYBR Gold, Green I, jodur tal-propidju jew bromur tal-etidju u jitkejlu b'lenti ffokata kif xieraq (eż. 200x) taħt mikroskopju mgħammar b'epifluworexxenza u detetturi xierqa jew kamera diġitali (eż. CCD).
                     Iċ-ċelloli jistgħu jiġu kklassifikati fi tliet kategoriji kif deskritti fl-atlas tal-immaġnijiet tal-kometa (57), jiġifieri jistgħu jingħaddu, ma jistgħux jingħaddu u “qanfud” (ara l-paragrafu 56 għal diskussjoni iktar dettaljata). Ċelloli li jistgħu jingħaddu biss (ras u denb defiiti ċari bla ebda interferenza ma' ċelloli biswit) għandhom jingħaddu għall- % tad-DNA tad-dnieb sabiex jiġu evitati artefatti. Ma hemmx bżonn li tiġi rrapportata l-frekwenza taċ-ċelloli li ma jistgħux jingħaddu. Il-frekwenza tal-qniefed għandha tiġi stabbilita fuq il-bażi tal-punteġġ viżwali (peress li n-nuqqas ta' ras definita ċara sejjer ifisser li ma jistgħux jiġu identifikati minnufih bl-analiżi tal-immaġnijiet) ta' tal-inqas 150 ċellola għal kull kampjun (ara l-paragrafu 56 għal diskussjoni iktar dettaljata) u dokumentata għaliha.
                     Il-lametti kollha għall-analiżi, inklużi dawk tal-kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati b'mod indipendenti u jingħaddu “mgħammdin” sabiex min jaqrahom ma jkunx jaf x'inhi l-kundizzjoni tat-trattament. Għal kull kampjun (għal kull tessut għal kull annimal), għandhom jiġu analizzati tal-inqas 150 ċellola (esklużi qniefed — ara l-paragrafu 56). L-għadd ta' 150 ċellola għal kull annimal f'tal-inqas 5 annimali għal kull doża (inqas fil-kontroll pożittiv parallel — ara l-paragrafu 29) jipprovdi saħħa statistika adegwata skont l-analiżi ta' Smith et al., 2008 (5). Jekk jintużaw il-lametti, dan jista' jkun minn 2 jew 3 lametti magħdudin għal kull kampjun meta jintużaw ħames annimali għal kull grupp. Għandhom jiġu osservati bosta partijiet tal-lametta f'densità li tiżgura li ma jkun hemm ebda trikkib tad-dnieb. Għandu jiġi evitat l-għadd fit-truf tal-lametti.
                     Il-ħsarat fil-ħjut tad-DNA fl-assaġġ kometa jistgħu jitkejlu b'punti ta' tmiem indipendenti bħall- % tad-DNA tad-dnieb, it-tul tad-denb u l-mument tad-denb. It-tliet kejliet kollha kemm huma jistgħu jsiru jekk tintuża s-sistema xierqa ta' softwer ta' analiżi tal-immaġnijiet. Madankollu, il- % tad-DNA tad-dnieb (magħruf ukoll bħala l- % tal-intensità tad-dnieb) huwa rakkomandat għall-evalwazzjoni u l-interpretazzjoni tar-riżultati (12) (40) (41) (42), u huwa stabbilit bl-intensità tal-frammenti tad-DNA fid-denb espressa bħala perċentwal tal-intensità totali taċ-ċellola (13).
                     
                        Ħsara fit-tessut u ċitotossiċità
                     
                     Sejbiet pożittivi fl-assaġġ kometa jaf ma jkunux dovuti biss għall-ġenotossiċità, it-tossiċità tat-tessut fil-mira tista' tirriżulta wkoll f'żidiet fil-migrazzjoni tad-DNA (12) (41). Għall-kuntrarju, ċitotossiċità baxxa jew moderata spiss tidher b'ġenotossini magħrufin (12), xi ħaġa li turi li mhwuiex possibbli li ssir distinzjoni bejn migrazzjoni tad-DNA indotta mill-ġenotossiċità u dik indotta miċ-ċitotossiċità fl-assaġġ kometa waħdu. Madankollu, meta jiġu osservati żidiet fil-migrazzjoni tad-DNA, huwa rakkomandat li ssir eżaminazzjoni ta' indikatur wieħed jew iktar taċ-ċitotossiċità peress li din tista' tgħin fl-interpretazzjoni tas-sejbiet. Żidiet fil-migrazzjoni tad-DNA fil-preżenza ta' evidenza ċara ta' ċitotossiċità għandhom jiġu interpretati bil-galbu.
                     Ġew proposti ħafna kejliet taċ-ċitotossiċità u, minn dawn, il-bidliet istopatoloġiċi jitqiesu li huma kejl rilevanti tat-tossiċità tat-tessut. Osservazzjonijiet bħal infjammazzjoni, infiltrazzjoni taċ-ċelloli, bidliet apoptotiċi jew nekrotiċi ġew assoċjati ma' żidiet fil-migrazzjoni tad-DNA, madankollu, kif muri mill-prova ta' validazzjoni tal-JaCVAM (12), ma hemm ebda lista definittiva ta' bidliet istopatoloġiċi li dejjem ikunu assoċjati ma' migrazzjoni ikbar tad-DNA għad-dispożizzjoni. Anki bidliet fil-kejliet tal-kimika klinika (eż. AST, ALT) jistgħu jipprovdu informazzjoni siewja fuq il-ħsarat fit-tessut u jistgħu jiġu kkunsidrati wkoll indikaturi addizzjonali bħal attivazzjoni tal-kaspażi, tilwin TUNEL, tilwin tal-Annessin V, eċċ. Madankollu, ftit li xejn hemm dejta ppubblikata fejn dawn tal-aħħar intużaw għal studji in vivo u wħud jaf ikunu inqas affidabbli minn oħrajn.
                     Qniefed (jew sħabiet, ċelloli fatati) huma ċelloli li jesibixxu immaġni mikroskopika li tikkonsisti f'ras żgħira jew ineżistenti, u dnieb diffużi twal u jitqiesu li huma ċelloli li ġarrbu ħsara kbira, għad li l-etjoloġija tal-qniefed mhijiex ċerta (ara l-Appendiċi 3). Minħabba d-dehra tagħhom, il-kejliet tal- % tad-DNA tad-dnieb bl-analiżi tal-immaġnijiet ma jitsgħux jinqraw u, għalhekk, il-qniefed għandhom jiġu evalwati b'mod separat. Għandha tittieħed nota u tiġi rrapportata l-okkorrenza tal-qniefed u kwalunkwe żieda rilevanti li hija ssuspettata li hija dovuta għas-sustanza kimika tat-test għandha tiġi investigata u interpretata bil-galbu. L-għarfien tal-modalità ta' azzjoni potenzjali tas-sustanzi kimiċi tat-test jista' jgħin fit-tali kunsiderazzjonijiet.
                     DEJTA U RAPPORTAR
                     
                        Trattament tar-riżultati
                     
                     L-annimal huwa l-unità sperimentali u, għalhekk, kemm id-dejta dwar l-annimali individwali kif ukoll ir-riżultati miġburin fil-qosor għandhom jiġu ppreżentati f'forma ta' tabelli. Minħabba l-għamla ġerarkika tad-dejta, huwa rakkomandat li jiġi stabbilit il- % medju tad-DNA tad-dnieb għal kull lametta u li jiġi kkalkolat il-medju tal-valuri medjani għal kull annimal (12). Imbagħad tiġi stabbilita l-medja tal-medji tal-annimal individwali sabiex tingħata medja tal-grupp. Dawn il-valuri kollha għandhom ikunu inklużi fir-rapport. Jistgħu jintużaw approċċi alternattivi (ara l-paragrafu 53) jekk ikunu xjentifikament u statistikament iġġustifikati. L-analiżi statistika tista' ssir bl-użu ta' firxa ta' approċċi (58) (59) (60) (61). Meta jintgħażlu l-metodi statistiċi li sejrin jintużaw, il-ħtieġa ta' trasformazzjoni (eż. log jew għerq kwadrat) tad-dejta u/jew żieda ta' numru żgħir (eż. 0.001) għall-valuri kollha (anki mhux żero) sabiex jiġu mitigati l-effetti tal-valuri taċ-ċelloli żero, għandhom jiġu kkunsidrati kif diskuss fir-referenzi msemmijin hawn fuq. Fl-Appendiċi 2 jingħataw id-dettalji tal-analiżi tal-interazzjonijiet bejn it-trattament u s-sess meta jintużaw iż-żewġ sessi, u l-analiżi sussegwenti tad-dejta meta jinstabu differenzi jew ma tinstab ebda differenza. Għandha tiġi rrapportata dejta dwar it-tossiċità u s-sinjali kliniċi wkoll.
                     
                        Kriterji ta' Aċċettabilità
                     
                     L-aċċettazzjoni ta' test hija bbażata fuq il-kriterji li ġejjin:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 Il-kontroll negattiv parallel jitqies aċċettabbli għaż-żieda fid-database storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju kif deskritt fil-paragrafu 16.
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 Il-kontrolli negattivi paralleli (ara l-paragrafu 29) għandhom jinduċu risponsi li huma kompatibbli ma' dawk iġġenerati fid-database storika tal-kontroll pożittiv u jipproduċu żieda statistikament sinifikanti meta mqabblin mal-kontroll negattiv parallel.
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 Ġew analizzati numri adegwati ta' ċelloli u konċentrazzjonijiet (paragrafi 52 u 36-38).
                              
                           
                                 d.
                              
                              
                                 Il-kriterji għall-għażla tal-ogħla doża huma konsistenti ma' dawk deskritti fil-paragrafu 36.
                              
                           
                        Evalwazzjoni u Interpretazzjoni tar-Riżultati
                     
                     Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva biċ-ċar jekk:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 tal-inqas waħda mid-dożi tat-test turi żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv parallel,
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 iż-żieda hija marbuta mad-doża meta tiġi evalwata b'test xieraq tat-tendenzi,
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 kwalunkwe wieħed mir-riżultati jaqa' barra mid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv għal speċijiet, veikolu, rotta u tessut partikolari u numru ta' amministrazzjonijiet.
                              
                           Meta jiġu ssodisfati dawn il-kriterji kollha, is-sustanza kimika tat-test imbagħad tiġi kkunsidrata kapaċi tinduċi ħsara fil-ħjut tad-DNA fit-tessuti studjati f'din is-sistema tat-test. Jekk huwa ssodisfat kriterju wieħed jew tnejn minn dawn il-kriterji, ara l-paragrafu 62.
                     Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija negattiva biċ-ċar jekk:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 l-ebda waħda mill-konċentrazzjonijiet tat-test ma turi żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv parallel,
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 ma hemm l-ebda żieda marbuta mal-konċentrazzjoni meta tiġi evalwata b'test xieraq tat-tendenzi,
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 ir-riżultati kollha jaqgħu fid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv għal speċijiet, veikolu, rotta u tessut partikolari u numru ta' amministrazzjonijiet.
                              
                           
                                 d.
                              
                              
                                 tkun ingħatat l-evidenza diretta jew indiretta li ssostni l-esponiment ta', jew it-tossiċità għat-tessut(i) fil-mira.
                              
                           Is-sustanza kimika tat-test imbagħad tiġi kkunsidrata li mhijiex kapaċi tinduċi ħsara fil-ħjut tad-DNA fit-tessuti studjati f'din is-sistema tat-test.
                     Ma hemm l-ebda ħtieġa għall-verifika ta' rispons posittiv jew negattiv ċar.
                     F'każ li r-rispons la jkun negattiv ċar u lanqas pożittiv ċar (jiġifieri mhumiex issodisfati l-kriterji kollha elenkati fil-paragrafi 59 jew 60) u sabiex tgħin fl-istabbiliment tar-rilevanza bijoloġika ta' riżultat, id-dejta għandha tiġi evalwata b'ġudizzju espert u/jew b'investigazzjonijiet ulterjuri mwettqin, jekk ikunu ġġustifikati xjentifikament. L-għadd ta' ċelloli addizzjonali (fejn xieraq) jew it-twettiq ta' esperiment ripetut possibilment bl-użu ta' kundizzjonijiet ottimizzati tal-esperiment (eż. spazjar tad-dożi, rotot oħrajn tal-amministrazzjoni, ħinijiet tal-kampjunar oħrajn jew tessuti oħrajn) jista' jkun siewi.
                     F'każijiet rari, anki wara investigazzjonijiet ulterjuri, is-sett ta' dejta sejjer jipprekludi milli tinħareġ konklużjoni ta' riżultati pożittivi jew negattivi u, għalhekk, sejjer jiġi konkluż bħala ekwivoku.
                     Sabiex tiġi vvalutata r-rilevanza bijoloġika ta' riżultat pożittiv jew ekwivoku, hemm bżonn ta' informazzjoni dwar iċ-ċitotossiċità fit-tessut fil-mira (ara l-paragrafi 54-55). Meta sejbiet pożittivi jew ekwivoċi jiġu osservati biss fil-preżenza ta' evidenza ċara ta' ċitotossiċità, l-istudju jiġi konkluż bħala ekwivoku għall-ġenotossiċità sakemm ma jkunx hemm biżżejjed informazzjoni li ssostni konklużjoni definittiva. Fil-każijiet ta' eżitu tal-istudju negattiv fejn ikun hemm sinjali ta' tossiċità fid-dożijiet kollha ttestjati, jista' jkun xieraq li jsir studju ulterjuri b'dożi mhux tossiċi.
                     
                        Rapport tat-test
                     
                     Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanza kimika tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             is-sors, in-numru tal-lott jekk disponibbli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test, id-data limitu għall-użu jew id-data għall-analiżi mill-ġdid, jekk magħrufa.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanza monokostitwenti:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             id-dehra fiżika, is-solubilità fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanzi multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             ikkaratterizzati safejn possibbli mill-identità kimika (ara iktar 'il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Solvent/veikolu:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             il-ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent/tal-veikolu;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             is-solubilità u l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent/veikolu, jekk magħrufin;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-preparazzjoni tal-formulazzjonijiet tad-doża;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-determinazzjonijiet analitiċi dwar il-formulazzjonijiet (eż., l-istabilità, l-omoġenità, il-konċentrazzjonijiet nominali).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    L-annimali tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             l-ispeċi/ir-razza użata u ġustifikazzjonijiet xjentifiċi u etiċi għall-għażla;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             l-għadd, l-età u s-sess tal-annimali;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             is-sors, il-kundizzjonijiet tal-abitazzjoni, id-dieta, l-arrikkiment, eċċ.;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-piż individwali tal-annimali fil-bidu u fi tmiem it-test, inklużi l-medda tal-piż tal-ġisem, id-devjazzjoni medja u standard għal kull grupp.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kundizzjonijiet tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             dejta tal-kontroll pożittiv u negattiv (veikolu/solvent);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             riżultati mill-istudju għat-tiftix tal-medda (jekk sar);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ir-raġuni għall-għażla tal-livell tad-doża;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dettalji dwar l-għoti tas-sustanza kimika tat-test;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ir-raġuni għar-rotta tal-amministrazzjoni;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             is-sit tal-injezzjoni (għal studji taħt il-ġilda jew ġol-vina);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metodi għall-preparazzjoni tal-kampjun, fejn disponibbli, analiżijiet istopatoloġiċi, speċjalment għal sustanza kimika li tagħti rispons pożittiv tal-kometa;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ir-raġuni għall-għażla tat-tessut;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodi għall-verifika li s-sustanza kimika tat-test laħqet it-tessut fil-mira, jew iċ-ċirkolazzjoni ġenerali, jekk jinkisbu riżultati negattivi;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-doża propja (mg/kg piż tal-ġisem/jum) ikkalkolata mill-konċentrazzjoni (ppm) u l-konsum tas-sustanza kimika tat-test fid-dieta/ilma tax-xorb, jekk applikabbli;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dettalji dwar il-kwalità tad-dieta u tal-ilma;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             deskrizzjoni dettaljata tal-iskedi tat-trattament u tal-kampjunar u ġustifikazzjonijiet għall-għażliet (eż. dejta tossikokinetika, fejn disponibbli);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodu ta' taffija mill-uġigħ, l-analġeżija;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodu tal-ewtanażja;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-proċeduri għall-iżolament u l-preservazzjoni tat-tessuti;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodi għall-preparazzjoni tas-sospensjoni taċ-ċellola/nukleu individwali;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             is-sors u n-numru tal-lott tar-reaġenti kollha (fejn possibbli);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodi għall-evalwazzjoni taċ-ċitotossiċità;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kundizzjonijiet tal-elettroforeżi;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             it-tekniki tat-tilwin użati; u
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-metodi għall-għadd u l-kejl tal-kometi.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ir-riżultati:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             L-osservazzjonijiet kliniċi ġenerali, jekk jeżistu, qabel u matul il-perjodu ta' ttestjar għal kull annimal;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             evidenza taċ-ċitotossiċità jekk issir;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             għal studji itwal minn ġimgħa: Il-piżijiet tal-ġisem individwali matul l-istudju, inklużi l-medda tal-piż individwali, id-devjazzjoni medja u standard għal kull grupp; il-konsum tal-ikel;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ir-relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn tkun evidenti;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             għal kull tessut/annimal, il- % tad-DNA tad-dnieb (jew kejliet oħrajn, jekk jintgħażlu) u l-valuri medjani għal kull lametta, il-valuri medji għal kull annimal u l-valuri medji għal kull grupp;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dejta ta' kontroll negattiv konkurrenti u storiku b'meded, medji/medjani u devjazzjonijiet standard għal kull tessut evalwat;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dejta storika tal-kontroll pożittiv u parallel;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             għal tessuti li mhumiex il-fwied, kurva ta' doża — rispons bl-użu tal-kontroll pożittiv. Din tista' tkun minn dejta miġbura matul il-wiri tal-profiċjenza (ara l-paragrafi 16-17) u għandha tkun akkumpanjata minn ġustifikazzjoni, b'referenzi mit-tagħrif attwali, għax-xerqien tal-kobor u t-tifrix tar-risponsi għall-kontrolli f'dak it-tessut;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             l-analiżijiet statistiċi u l-metodi applikati; u l-kriterji sabiex rispons jitqies pożittiv, negattiv jew ekwivoku;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-frekwenza ta' qniefed f'kull grupp u għal kull annimal.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Diskussjoni tar-riżultati
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Konklużjoni
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Referenzi
                                 
                              
                           TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Kirkland, D., G. Speit (2008), Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens III. Appropriate follow-up testing in vivo, Mutation Research, Vol. 654/2, pp. 114-32.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Brendler-Schwaab, S. et al. (2005), The in vivo Comet assay: use and status in genotoxicity testing, Mutagenesis, Vol. 20/4, pp. 245-54.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Burlinson, B. et al. (2007), Fourth International Workgroup on Genotoxicity Testing: result of the in vivo Comet assay workgroup, Mutation Research, Vol. 627/1, pp. 31-5.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Burlinson, B. (2012), The in vitro and in vivo Comet assays, Methods in Molecular Biology, Vol. 817, pp. 143-63.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Smith, C.C. et al. (2008), Recommendations for design of the rat Comet assay, Mutagenesis, Vol. 23/3, pp. 233-40.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Hartmann, A. et al. (2003), Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay, Mutagenesis, Vol. 18/1, pp. 45-51.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 McKelvey-Martin, V.J. et al. (1993), The single cell gel electrophoresis assay (Comet assay): a European review, Mutation Research, Vol. 288/1, pp. 47-63.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Tice, R.R. et al. (2000), Single cell gel/Comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 206-21.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Singh, N.P. et al. (1988), A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells, Experimental Cell Research, Vol. 175/1, pp. 184-91.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Rothfuss, A. et al. (2010), Collaborative study on fifteen compounds in the rat-liver Comet assay integrated into 2- and 4-week repeat-dose studies, Mutation Research, Vol., 702/1, pp. 40-69.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 OECD (2014), Reports of the JaCVAM initiative international pre-validation and validation studies of the in vivo rodent alkaline comet assay for the detection of genotoxic carcinogens, Series on Testing and Assessment, Nos. 195 and 196, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Olive, P.L., J.P. Banath, R.E. Durand (1990), Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells using the “Comet” assay, Radiation Research, Vol. 122/1, pp. 86-94.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Tice, R.R., G.H. Strauss (1995), The single cell gel electrophoresis/Comet assay: a potential tool for detecting radiation-induced DNA damage in humans, Stem Cells, Vol. 13/1, pp. 207-14.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Collins, A.R (2004), The Comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations, Molecular Biotechnology, Vol. 26/3, pp. 249-61.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Rothfuss, A. et al. (2011), Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 108-20.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Kushwaha, S. et al. (2010), Evaluation of multi-organ DNA damage by Comet assay from 28 days repeated dose oral toxicity test in mice: A practical approach for test integration in regulatory toxicity testing, Regulatory Toxicology and Pharmacology, Vol. 58/1, pp. 145–54.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Vasquez, M.Z. (2010), Combining the in vivo Comet and micronucleus assays: a practical approach to genotoxicity testing and data interpretation, 
                                       Mutagenesis
                                    
                                    , Vol. 25/2, pp. 187-99.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Bowen, D.E. (2011), Evaluation of a multi-endpoint assay in rats, combining the bone-marrow micronucleus test, the Comet assay and the flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, Mutation Research, Vol. 722/1, pp. 7-19.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Recio, L. et al. (2010), Dose-response assessment of four genotoxic chemicals in a combined mouse and rat micronucleus (MN) and Comet assay protocol, The Journal of Toxicological Science, Vol. 35/2, pp. 149-62.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 O'Donovan, M., B. Burlinson (2013), Maximum dose levels for the rodent comet assay to examine damage at the site of contact or to the gastrointestinal tract, Mutagenesis, Vol. 28/6, pp. 621-3.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Hartmann, A. (2004), Use of the alkaline
                                    
                                       in vivo
                                    
                                    Comet assay for mechanistic genotoxicity investigations,
                                    Mutagenesis, Vol. 19/1, pp. 51-9.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Nesslany, F. (2007), In vivo Comet assay on isolated kidney cells to distinguish genotoxic carcinogens from epigenetic carcinogens or cytotoxic compounds, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 630/1, pp. 28-41.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Brendler-Schwaab, S.Y., B.A. Herbold (1997), A new method for the enrichment of single renal proximal tubular cells and their first use in the Comet assay, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 393/1-2, pp. 175-8.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Toyoizumi, T. et al. (2011), Use of the in vivo skin Comet assay to evaluate the DNA-damaging potential of chemicals applied to the skin, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 726/2, pp. 175-80.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Struwe, M. et al. (2008), Detection of photogenotoxicity in skin and eye in rat with the photo Comet assay, Photochemical and Photobiological Sciences, Vol. 7/2, pp. 240-9.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Wada, K. et al. (2012), A comparison of cell-collecting methods for the Comet assay in urinary bladders of rats, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 742/1-2, pp. 26-30.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 (2007), Measurement of DNA damage in rat urinary bladder transitional cells: improved selective harvest of transitional cells and detailed Comet assay protocols, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 634/ 1-2, pp. 51-9.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 Burlinson, B. et al. (2007), In Vivo Comet Assay Workgroup, part of the Fourth International Workgroup on Genotoxicity Testing. Fourth International Workgroup on Genotoxicity testing: results of the in vivo Comet assay workgroup, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 627/1, pp. 31-5.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Jackson, P. et al. (2012), Pulmonary exposure to carbon black by inhalation or instillation in pregnant mice: effects on liver DNA strand breaks in dams and offspring, Nanotoxicology, Vol. 6/5, pp. 486-500.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Sasaki, Y.F. et al. (2000), The comet assay with multiple mouse organs: comparison of Comet assay results and carcinogenicity with 208 chemicals selected from the IARC monographs and U.S. NTP Carcinogenicity Database, Critical Reviews in Toxicology, Vol. 30/6, pp. 629-799.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Sekihashi, K. et al. (2002), Comparative investigations of multiple organs of mice and rats in the Comet assay, Mutation Research, Vol. 517/1-2, pp. 53-74.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Speit, G, M. Vasquez, A. Hartmann (2009), The comet assay as an indicator test for germ cell genotoxicity,
                                    Mutation Research, Vol. 681/1, pp. 3-12.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Zheng, H., P.L. Olive (1997), Influence of oxygen on radiation-induced DNA damage in testicular cells of C3H mice, International Journal of Radiation Biology, Vol. 71/3, pp. 275-282.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Cordelli, E. et al. (2003), Evaluation of DNA damage in different stages of mouse spermatogenesis after testicular X irradiation, Journal of Radiation Research, Vol. 160/4, pp. 443-451.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Merk, O., G. Speit (1999), Detection of crosslinks with the Comet assay in relationship to genotoxicity and cytotoxicity, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 33/2, pp. 167-72.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Pfuhler, S., H.U. Wolf (1996), Detection of DNA-crosslinking agents with the alkaline Comet assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 27/3, pp. 196-201.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 Wu, J.H., N.J. Jones (2012), Assessment of DNA interstrand crosslinks using the modified alkaline Comet assay, Methods in Molecular Biology, Vol. 817, pp. 165-81.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 Spanswick, V.J., J.M. Hartley, J.A. Hartley (2010), Measurement of DNA interstrand crosslinking in individual cells using the Single Cell Gel Electrophoresis (Comet) assay,
                                    Methods in Molecular Biology, Vol. 613, pp. 267-282.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Kumaravel, T.S., A.N. Jha (2006), Reliable Comet assay measurements for detecting DNA damage induced by ionizing radiation and chemicals, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 605(1-2), pp. 7-16.
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Burlinson, B. et al. (2007), Fourth International Workgroup on Genotoxicity Testing: result of the in vivo Comet assay workgroup, Mutation Research, Vol.627/1, pp. 31-5.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 Kumaravel, T.S. et al. (2009), Comet Assay measurements: a perspective, Cell Biology and Toxicology, Vol. 25/1, pp. 53-64.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 Ersson, C., L. Möller (2011), The effects on DNA migration of altering parameters in the Comet assay protocol such as agarose density, electrophoresis conditions and durations of the enzyme or the alkaline treatments, Mutagenesis, Vol. 26/6, pp. 689-95.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 Møller, P. et al. (2010), Assessment and reduction of Comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group, Mutagenesis, Vol. 25/2, pp. 109-11.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 Forchhammer, L. et al. (2010), Variation in the measurement of DNA damage by Comet assay measured by the ECVAG inter-laboratory validation trial, Mutagenesis, Vol. 25/2, pp. 113-23.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Azqueta, A. et al. (2011), Towards a more reliable comet assay: Optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions, Mutation Research, Vol. 724/1-2, pp. 41-45.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research, Vol. 723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 (48)
                              
                              
                                 Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, John Wiley and Sons, New York 2nd ed.
                              
                           
                                 (49)
                              
                              
                                 Appendix A of the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS No. 123)
                              
                           
                                 (50)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu B.8 ta' dan l-Anness: Tossiċità ta' Inalazzjoni Subakuta: Studju ta' 28 Jum.
                                 
                              
                           
                                 (51)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu B.29 ta' dan l-Anness: Tossiċità ta' Inalazzjoni Subkronika: Studju ta' 90 Jum.
                                 
                              
                           
                                 (52)
                              
                              
                                 Blakey, D.H., G.R. Douglas (1984), Transient DNA lesions induced by benzo[a]pyrene in Chinese hamster ovary cells, Mutation Research, Vol. 140/2-3, pp. 141-45.
                              
                           
                                 (53)
                              
                              
                                 Blakey, D.H., G.R. Douglas (1990), The role of excision repair in the removal of transient benzo[a]pyrene-induced DNA lesions in Chinese hamster ovary cells, Mutation Research, Vol. 236/1, pp. 35-41.
                              
                           
                                 (54)
                              
                              
                                 OECD (2002), “Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation” OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 19, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (55)
                              
                              
                                 Nakajima, M. (2012), Tissue sample preparation for in vivo rodent alkaline Comet assay, Genes and Environment, Vol. 34/1, pp. 50-4.
                              
                           
                                 (56)
                              
                              
                                 Hartmann, A. et al. (2003), Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay, Mutagenesis, Vol.18/1, pp.45–51.
                              
                           
                                 (57)
                              
                              
                                 Atlas of Comet Assay Images, Scientist Press Co., Ltd., Tokyo, Japan.
                              
                           
                                 (58)
                              
                              
                                 Lovell, D.P., G. Thomas, R. Dubow (1999), Issues related to the experimental design and subsequent statistical analysis of in vivo and in vitro Comet studies, Teratogenesis Carcinogenesis Mutagenesis, Vol. 19/2, pp. 109-19.
                              
                           
                                 (59)
                              
                              
                                 Wiklund, S.J., E. Agurell (2003), Aspects of design and statistical analysis in the Comet assay, Mutagenesis, Vol. 18/2, pp. 167-75.
                              
                           
                                 (60)
                              
                              
                                 Bright, J. et al. (2011), Recommendations on the statistical analysis of the Comet assay, Pharmaceutical Statistics, Vol. 10/6, pp. 485-93.
                              
                           
                                 (61)
                              
                              
                                 Lovell, D.P., T. Omori (2008), Statistical issues in the use of the Comet assay, Mutagenesis, Vol. 23/3, pp. 171-82.
                              
                           
                        Appendiċi 1
                        DEFINIZZJONIJIET
                        
                           
                              Elettroforeżi alkalina b'ġell ta' ċellola waħda
                           : Teknika sensittiva għall-identifikazzjoni ta' ħsara primarja fid-DNA fil-livell ta' ċelloli/nukleu individwali.
                        
                           
                              Sustanza kimika
                           : Sustanza jew taħlita
                        
                           
                              Kometa
                           : Il-forma li jadottaw in-nukleojdi wara li jiġu sottomessi għal kamp elettroforetiku wieħed, minħabba s-similarità tiegħu għall-kometi: ir-ras hija n-nukleu u d-denb huwa kostitwit mid-DNA li jimxi 'l barra min-nukleu fil-kamp elettriku.
                        
                           
                              Varjabbli/parametru kritiku
                           : Dan huwa varjabbli tal-protokoll li għalih bidla żgħira jista' jkollha impatt kbir fuq il-konklużjoni tal-assaġġ. Varjabbli kritiċi jistgħu jkunu speċifiċi għat-tessut. Varjabbli kritiċi ma għandhomx ikunu mibdulin, speċjalment f'test, mingħajr ma jiġi kkunsidrat kif l-alterazzjoni sejra tibdel rispons tal-assaġġ, pereżempju kif indikat mill-kobor u l-varjabilità fil-kontrolli pożittivi u negattivi. Ir-rapport tat-test għandu jelenka l-alterazzjonijiet tal-varjabbli kritiċi li saru matul it-test jew imqabblin mal-protokoll standard għal-laboratorju u jipprovdi ġustifikazzjoni għal kull alterazzjoni.
                        
                           
                              L-intensità tad-dnieb jew il- % tad-DNA tad-dnieb
                           : Dan jikkorrispondi għall-intensità tad-denb tal-kometa fir-rigward tal-intensità totali (ras u denb). Dan jirrifletti l-ammont ta' ħsara fid-DNA, espressa bħala perċentwal.
                        
                           
                              Sustanza kimika tat-test
                           : Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta' dan il-metodu ta' ttestjar.
                        
                           
                              UVCB
                           : Sustanzi kimiċi b'kompożizzjoni mhux magħrufa jew varjabbli, prodotti b'reazzjoni kumplessa jew materjali bijoloġiċi.
                     
                     
                        Appendiċi 2
                        
                           ID-DISINN FATTORJALI GĦALL-IDENTIFIKAZZJONI TAD-DIFFERENZI BEJN IS-SESSI FL-ASSAĠĠ KOMETA IN VIVO
                           
                        
                        
                           Id-disinn fattorjali u l-analiżi tiegħu
                        
                        F'dan id-disinn, jiġu ttestjati tal-inqas 5 irġiel u 5 nisa f'kull livell tal-konċentrazzjoni li jirriżultaw f'disinn li juża tal-inqas 40 annimal (20 raġel u 20 mara, flimkien ma' kontrolli pożittivi rilevanti).
                        Id-disinn, li huwa wieħed mill-iktar disinni fattorjali sempliċi, huwa ekwivalenti għal analiżi bidirezzjonali tal-varjanza bis-sess u l-livell ta' konċentrazzjoni li huma l-effetti ewlenin. Id-dejta tista' tiġi analizzata billi jintużaw pakketti ta' softwer statistiku standard bħal SPSS, SAS, STATA, Genstat kif ukoll bl-użu ta' R.
                        L-analiżi tagħmel partizzjoni tal-varjabbiltà fis-sett ta' dejta bejn is-sessi, bejn il-konċentrazzjonijiet u b'rabta mal-interazzjoni bejn is-sessi u l-konċentrazzjonijiet. Kull wieħed mit-termini jiġi ttestjat kontra stima tal-varjabbiltà bejn l-annimali rreplikati fi ħdan il-gruppi ta' annimali tal-istess sess bl-istess konċentrazzjoni. Id-dettalji sħaħ dwar il-metodoloġija sottostanti huma disponibbli f'ħafna kotba standard dwar l-istatistika (ara r-referenzi) u fil-faċilitajiet tal-għajnuna pprovduti mal-pakketti statistiċi.
                        L-analiżi tkompli billi ssir spezzjoni tat-terminu ta' interazzjoni sess x konċentrazzjoni fit-tabella ANOVA (35). Fin-nuqqas ta' terminu ta' interazzjoni sinifikanti, il-valuri kombinati bejn is-sessi jew fost il-livelli ta' konċentrazzjoni jipprovdu testijiet statistiċi validi bejn il-livelli bbażati fuq it-terminu tal-varjabbiltà tar-raggruppati fi ħdan il-grupp tal-ANOVA.
                        L-analiżi tkompli billi tagħmel partizzjoni bejn l-istima tal-varjabbiltà bejn il-konċentrazzjonijiet f'kuntrasti li jipprovdu għal test għal kuntrasti lineari u kwadratiċi tar-risponsi bejn il-livelli tal-konċentrazzjonijiet. Meta jkun hemm interazzjoni sinifikanti sess x konċentrazzjoni, tista' ssir partizzjoni ta' dan it-terminu f'kuntrasti ta' interazzjoni lineari x sess u kwadradiku x sess ukoll. Dawn it-termini jipprovdu testijiet ta' jekk ir-risponsi għall-konċentrazzjoni humiex paralleli għaż-żewġ sessi jew jekk hemmx rispons differenzjali bejn iż-żewġ sessi.
                        L-istima tal-varjabbiltà tal-miġburin fi ħdan il-grupp tista' tintuża sabiex tipprovdi testijiet bejn il-pari tad-differenza bejn il-medji. Dawn il-paraguni jistgħu jsiru bejn il-medji għaż-żewġ sessi u bejn il-medji għal-livell ta' konċentrazzjoni differenti bħal fil-każ tal-paraguni mal-livelli tal-kontroll negattiv. F'dawk il-każijiet li fihom ikun hemm interazzjoni sinifikanti, jistgħu jsiru paraguni bejn il-medji ta' konċentrazzjonijiet differenti fi ħdan sess jew bejn il-medji tas-sessi fl-istess konċentrazzjoni.
                        
                           Referenzi
                        
                        Hemm ħafna kotba dwar l-istatistika li jiddiskutu t-teorija, id-disinn, il-metodoloġija, l-analiżi u l-interpretazzjoni tad-disinni fattorjali li jvarjaw mill-iktar analiżijiet b'żewġ fatturi sempliċi sal-iktar forom kumplessi użati fil-metodoloġija dwar id-Disinn tal-Esperiment. Din li ġejja mhijiex lista eżawrjenti. Uħud mill-kotba jipprovdu eżempji maħdumin ta' disinni komparabbli, f'ċerti każijiet b'kodiċi għat-twettiq tal-analiżijiet bl-użu ta' diversi pakketti ta' softwer.
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987) Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007) Analysis of Variance and Covariance: How to choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Mead, R. (1990) The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Montgomery D.C. (1997) Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Winer, B.J. (1971) Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.
                                 
                              
                                    (7)
                                 
                                 
                                    Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009) Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 3
                        
                           LIMITAZZJONIJIET ATTWALI TAL-ASSAĠĠ
                        
                        Minħabba l-istat attwali tal-għarfien, bosta limitazzjonijiet huma assoċjati mal-assaġġ kometa in vivo. Huwa mistenni li dawn il-limitazzjonijiet sejrin jonqsu jew jiġu definiti b'mod iktar speċifiku peress li hemm iktar esperjenza bl-applikazzjoni tal-assaġġ sabiex iwieġeb għal kwistjonijiet marbutin mas-sikurezza f'kuntest regolatorju.
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Ċerti tipi ta' ħsara fid-DNA jistgħu jkunu qosra, jiġifieri jistgħu jissewwew malajr wisq sabiex jilħqu jiġu osservati 24 siegħa jew iktar wara l-aħħar doża. Ma hemm ebda lista identifikabbli tat-tipi ta' ħsarat qosra, u lanqas tas-sustanzi kimiċi li aktarx li jikkaġunaw dan it-tip ta' ħsara, u lanqas ma huwa magħruf kemm irid jgħaddi ħin sabiex ikun jista' jiġi individwat dan it-tip ta' ħsara. Il-ħin(ijiet) tal-kampjunar ottimali jista' jkun speċifiku għas-sustanza kimika jew għar-rotta u l-ħinijiet tal-kampjunar għadhom jiġu stabbiliti minn dejta kinetika (pereżempju l-ħin, Tmax, li fih tinkiseb il-quċċata tal-plażma jew il-konċentrazzjoni fit-tessut), meta tkun teżisti t-tali dejta. Ħafna mill-istudji ta' validazzjoni li jsostnu dan il-metodu ta' ttestjar speċifikaw nekropsija sagħtejn jew tlieta wara l-amministrazzjoni tal-aħħar doża. Ħafna mill-istudji fit-tagħrif ippubblikat jiddeskrivu l-amministrazzjoni tal-aħħar doża bejn sagħtejn sa sitt sigħat qabel is-sagrifikar. Għaldaqstant, dawn l-esperjenzi ntużaw bħala l-bażi għar-rakkomandazzjoni fil-metodu ta' ttestjar li, fin-nuqqas ta' dejta li tindika xi ħaġa oħra, l-aħħar doża għandha tingħata f'punt ta' żmien speċifikat bejn sagħtejn u sitt sigħat wara n-nekropsija.
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Ma hemm ebda dejta ta' studju identifikabbli li jeżaminaw is-sensittività tat-test għall-identifikazzjoni ta' ħsara qasira fid-DNA wara l-għoti fl-ikel jew l-ilma tax-xorb meta mqabbel mal-għoti b'gavage. Il-ħsara fid-DNA ġiet individwata wara l-għoti fl-għalf u l-ilma tax-xorb, iżda ftit li xejn hemm rapporti bħal dawn meta mqabblin mal-esperjenza ferm ikbar bil-gavage u l-għoti i.p. B'hekk, is-sensittività tal-assaġġ tista' titnaqqas għal sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara fil-qosor mogħtijin mal-ikel jew l-ilma tax-xorb.
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Ma sar ebda studju bejn laboratorji f'tessuti apparti l-fwied u l-istonku, u għalhekk ma ġiet stabbilita ebda rakkomandazzjoni dwar kif jinkiseb rispons sensittiv u riproduċibbli f'tessuti apparti l-fwied, bħal meded tal-kontroll pożittiv u negattiv mistenni. Għall-fwied, lanqas ma seta' jintlaħaq qbil fuq l-issettjar ta' limitu inqas għall-valur tal-kontroll negattiv.
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Għad li hemm bosta pubblikazzjonijiet li juru l-effett ta' konfużjoni taċ-ċitotossiċità in vitro, ftit li xejn ġiet ippubblikata dejta in vivo u għalhekk ma tista' tiġi rakkomandata ebda miżura waħedha taċ-ċitotossiċità. Bidliet istopatoloġiċi bħal infjammazzjoni, infiltrazzjoni taċ-ċelloli, bidliet apoptotiċi jew nekrotiċi ġew assoċjati ma' żidiet fil-migrazzjoni tad-DNA, madankollu, kif muri mill-prova ta' validazzjoni tal-JaCVAM (OECD, 2014), dawn il-bidliet mhux dejjem jirriżultaw f'sejbiet tal-kometa pożittivi u, għaldaqstant, ma hemm ebda lista definittiva ta' bidliet istopatoloġiċi li dejjem ikunu assoċjati ma' migrazzjoni ikbar tad-DNA għad-dispożizzjoni. Fl-imgħoddi ġie ssuġġerit li qniefed (jew sħab, ċelloli fatati) huma indikatur ta' ċitotossiċità, madankollu, l-etjoloġija tal-qniefed mhijiex ċerta. Teżisti dejta li tissuġġerixxi li jistgħu jkunu kkaġunati minn ċitotossiċità relatata mas-sustanza kimika, ħsara mekkanika/indotta mill-enzimi mibdija matul it-tħejjija tal-kampjun (Guerard et al., 2014) u/jew effett iktar estrem tal-ġenotossiċità tas-sustanza kimika tat-test. Dejta oħra donnha turi li huma dovuti għal ħsara fid-DNA estensiva, iżda li forsi tista' tissewwa (Lorenzo et al., 2013).
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    It-tessuti jew nukleji taċ-ċelloli ġew iffriżati b'suċċess sabiex jiġu analizzati iktar tard. Normalment dan jirriżulta f'effett li jista' jitkejjel fuq ir-rispons għall-veikolu u l-kontroll pożittiv (Recio et al., 2010; Recio at al., 2012; Jackson at al., 2013). Jekk jużahom, il-laboratorju għandu juri li huwa kompetenti fil-metodoloġiji tal-iffriżar u jikkonferma meded aċċettabbli baxxi tal- % tad-DNA tad-dnieb fit-tessuti fil-mira tal-annimali ttrattati bil-veikolu, u li għadhom jistgħu jiġu individwati risponsi pożittivi. Fit-tagħrif, l-iffriżar tat-tessuti ġie deskritt bl-użu ta' metodi differenti. Madankollu, bħalissa ma hemm ebda qbil fuq kif l-aħjar jiġu ffriżati u jitħallew jinħallu t-tessuti, u kif jiġi vvalutat jekk rispons potenzjalment alterat jista' jaffettwa s-sensittività tat-test.
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Il-ħidma riċenti turi li l-lista ta' varjabbli kritika hija mistennija li tkompli tiqsar u li jkomplu jiġu definiti l-parametri għall-varjabbli kritiċi (Guerard et al., 2014).
                                 
                              
                           Referenzi
                        
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Guerard, M., C. Marchand, U. Plappert-Helbig (2014), Influence of Experimental Conditions on Data Variability in the Liver Comet Assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 55/2, pp. 114-21.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Jackson, P. et al. (2013), Validation of use of frozen tissues in high-throughput comet assay with fully-automatic scoring, Mutagenesis, Vol. 28/6, pp. 699-707.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Lorenzo, Y. et al. (2013), The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead, Mutagenesis, Vol. 28/4, pp. 427-32.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    OECD (2014), Reports of the JaCVAM initiative international pre-validation and validation studies of the in vivo rodent alkaline comet assay for the detection of genotoxic carcinogens, Series on Testing and Assessment, Nos. 195 and 196, OECD Publishing, Paris.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Recio L, Hobbs C, Caspary W, Witt KL, (2010), Dose-response assessment of four genotoxic chemicals in a combined mouse and rat micronucleus (MN) and Comet assay protocol, J. Toxicol. Sci. 35:149-62.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Recio, L. et al. (2012), Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 53/2, pp. 101-13.
                                 
                              ”
               
                     (16)
                  
                  
                     Fil-Parti C, il-Kapitolu C.13 huwa sostitwit b'dan li ġej:
                     “C.13   Bijoakkumulazzjoni fil-Ħut: Esponiment Milwiem u Djetetiku
                     
                     INTRODUZZJONI
                     Dan il-metodu ta' ttestjar (TM) huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 305 tal-OECD (2012). L-għan ewlieni ta' din ir-reviżjoni tal-metodu ta' ttestjar jinqasam fi tnejn. L-ewwel nett, huwa maħsub sabiex jinkorpora test tal-bijoakkumulazzjoni djetetika (36) xieraq sabiex jiġi stabbilit il-potenzjal ta' bijoakkumulazzjoni ta' sustanzi b'solubilità fl-ilma baxxa ħafna. It-tieni, huwa maħsub li jinħoloq metodu ta' ttestjar li, meta xieraq, juża inqas ħut għal raġunijiet ta' trattament xieraq tal-annimali, u dan huwa iktar kosteffikaċi.
                     Fis-snin ta' wara l-adozzjoni tal-metodu ta' ttestjar konsolidat C.13 (1), bosta sustanzi ġew ittestjati, u nkisbet esperjenza konsiderevoli kemm mil-laboratorji kif ukoll minn awtoritajiet regolatorji. Dan wassal għall-fehma li l-kumplessità tat-test tista' titnaqqas jekk jiġu ssodisfati kriterji speċifiċi (ara l-paragrafu 88), u li huwa possibbli li jsir approċċ sekwenzjali. L-esperjenza weriet ukoll li fatturi bijoloġiċi bħat-tkabbir u l-kontenut lipidu ta' ħut jista' jkollhom impatt qawwi fuq ir-riżultati u jaf ikun hemm bżonn li jiġu kkunsidrati. Barra minn hekk, ġie rikonoxxut li l-ittestjar ta' sustanzi ftit li xejn solubbli fl-ilma jaf ma jkunx teknikament fattibbli. Barra minn hekk, għal sustanzi b'solubilità fl-ilma baxxa ħafna fl-ambjent akkwatiku, l-esponiment minn ġol-ilma jista' jkollu importanza limitata meta mqabbla mar-rotta djetetika. Dan wassal għall-iżvilupp ta' metodu ta' ttestjar li fih il-ħut jiġi espost permezz tad-dieta tiegħu (ara l-paragrafi 7-14 u 97 iktar 'il quddiem). Il-validazzjoni (ringtest) tat-test tal-esponiment djetetiku saret fl-2010 (51).
                     Il-bidliet ewlenin jinkludu:
                     
                                 —
                              
                              
                                 L-ittestjar ta' konċentrazzjoni waħda tat-test jista' jitqies li huwa biżżejjed, meta jkun probabbli li l-fattur ta' bijokonċentrazzjoni (BCF) ikun indipendenti mill-konċentrazzjoni tat-test.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Disinn ta' test tal-esponiment milwiem minimizzat li fih ikun possibbli l-użu ta' numru iżgħar ta' punti tal-kampjuni, jekk ikunu ssodisfati kriterji speċifiċi.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-kontenut lipidu ta' ħut għandu jitkejjel sabiex il-BCF ikun jista' jiġi espress fuq bażi ta' kontenut lipidu ta' 5 %.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Enfasi ikbar fuq l-istima tal-BCF kinetiku (meta possibbli) wara l-istima tal-BCF fl-istat kostanti.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Għal ċerti gruppi ta' sustanzi, sejjer jiġi propost test tal-esponiment djetetiku, meta dan jitqies li huwa iktar xieraq minn test tal-esponiment milwiem.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-piż tal-ħut għandu jitkejjel sabiex il-BCFk ikun jista' jiġi korrett għad-dilwizzjoni tat-tkabbir.
                              
                           Qabel ma jsir kwalunkwe wieħed mit-testijiet tal-bijoakkumulazzjoni, għandha tkun magħrufa l-informazzjoni li ġejja dwar is-sustanza għat-test:
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 Is-sensittività tat-teknika analitika għall-kejl tat-tessut u l-konċentrazzjonijiet milwiema jew tal-ikel kemm tas-sustanza tat-test u l-metaboliti possibbli (ara l-paragrafu 65).
                              
                           
                                 (b)
                              
                              
                                 Is-solubilità fl-ilma [TM A.6; (2)]; (2)]; dan għandu jiġi stabbilit skont metodu li huwa xieraq għall-medda (stamta) tas-solubilità sabiex jinkiseb valur affidabbli. Għal sustanzi idrofobiċi, dan ġeneralment sejjer ikun il-metodu ta' elwizzjoni tal-kolonna.
                              
                           
                                 (c)
                              
                              
                                 koeffiċjent tal-partizzjoni tal-n-Ottanol-ilma, KOW
                                     (37) [TMs A.8 (4), A.24 (5), A.23 (6)]; jew informazzjoni xierqa oħra dwar imġiba tal-partizzjonar (eż. is-sorbiment għal-lipidi, KOC); dan għandu jiġi stabbilit skont metodu li huwa xieraq għall-medda (stmata) tal-KOW sabiex jinkiseb valur affidabbli. Għal sustanzi idrofobiċi, dan ġeneralment sejjer ikun il-metodu ta' tħawwid bil-galbu [TM A.23 (6)];
                              
                           
                                 (d)
                              
                              
                                 L-istabilità tas-sustanza fl-ilma (idroliżi [TM C.7 (7)];
                              
                           
                                 (e)
                              
                              
                                 L-istabilità tas-sustanza fl-ikel (speċjalment meta jintgħażel approċċ tat-test tal-esponiment djetetiku);
                              
                           
                                 (f)
                              
                              
                                 Informazzjoni dwar il-fototrasformazzjoni rilevanti għall-kundizzjonijiet tal-irradjazzjoni fit-test (8);
                              
                           
                                 (g)
                              
                              
                                 It-tensjoni fil-wiċċ (jiġifieri għal sustanzi meta l-log KOW ma jkunx jista' jiġi stabbilit) [TM A.5 (9)];
                              
                           
                                 (h)
                              
                              
                                 Pressjoni tal-fwar [TM A.4 (10)];
                              
                           
                                 (i)
                              
                              
                                 Kwalunkwe informazzjoni dwar degradazzjoni bijotika jew abijotika fl-ilma, bħal (iżda mhux ristretti għal) bijodegradabilità pronta (TMs C.4 partijiet II sa VII (11), C.29 (12)], fejn xieraq;
                              
                           
                                 (j)
                              
                              
                                 Informazzjoni dwar metaboliti: struttura, log KOW, formazzjoni u degradabilità, fejn xieraq;
                              
                           
                                 (k)
                              
                              
                                 Kostant ta' dissoċjazzjoni tal-aċidu (pK
                                    a) għal sustanzi li jistgħu jonizzaw. Jekk ikun hemm bżonn, il-pH tal-ilma tat-test għandha tiġi aġġustata sabiex jiġi żgurat li s-sustanza hija fil-forma mhux jonizzata fit-test jekk tkun kompatibbli mal-ispeċi tal-ħut.
                              
                           Indipendentement mill-metodu ta' esponiment magħżul jew l-iskema ta' kampjunar, dan il-metodu ta' ttestjar jiddeskrivi proċedura għall-karatterizzazzjoni tal-potenzjal ta' bijoakkumulazzjoni ta' sustanzi fil-ħut. Għad li r-reġimi tat-test bi fluss kontinwu huma ppreferiti, reġimi semistatiċi huma permessibbli, diment li jkunu ssodisfati l-kriterji tal-validità (ara l-paragrafi 24 u 113). Fir-rotta tal-esponiment djetetiku, is-sistema tal-fluss kontinwu mhijiex neċessara sabiex jinżammu konċentrazzjonijiet milwiema tas-sustanza ttestjata, iżda sejra tgħin sabiex jinżammu l-konċentrazzjonijiet adegwati ta' ossiġenu dissolt u tgħin sabiex jiġi żgurat ilma nadif u jitneħħew l-influwenzi ta', pereżempju, prodotti tal-eskrezzjoni.
                     Indipendentement mill-metodu ta' ttestjar magħżul, jingħataw biżżejjed dettalji fil-metodu ta' ttestjar għat-twettiq tat-test filwaqt li titħalla libertà adegwata għall-adattament tad-disinn sperimentali għall-kundizzjonijiet b'mod partikolari laboratorji u għall-karatteristiċi varjabbli tas-sustanzi tat-test. It-test tal-esponiment milwiem hija applikata bl-iktar mod xieraq għal sustanzi organiċi stabbli bil-valuri tal-log KOW bejn 1.5 u 6.0 (13) iżda xorta waħda jista' jiġi applikat għal sustanzi ferm idrofobiċi (b'log KOW > 6.0), jekk jista' jintwera li hemm konċentrazzjoni stabbli u kompletament dissolta tas-sustanza tat-test fl-ilma. Jekk ma jistax jintwera li hemm konċentrazzjoni stabbli tas-sustanza tat-test fl-ilma, studju milwiem ma jkunx xieraq u għalhekk ikun meħtieġ approċċ djetetiku għall-ittestjar tas-sustanza fil-ħut (għad li l-interpretazzjoni u l-użu tar-riżultati tat-test djetetiku jistgħu jiddependu mill-qafas regolatorju). L-istimi minn qabel tal-fattur ta' bijokonċentrazzjoni (BCF, kultant imsejjaħ KB) għal sustanzi organiċi b'valuri tal-log KOW li jaslu sa 9.0 jistgħu jinkisbu bl-użu tal-ekwazzjoni ta' Bintein et al.(14) L-istimi minn qabel tal-fattur ta' bijokonċentrazzjoni għal sustanzi tant idrofobiċi tista' tkun ogħla mill-valur tal-fattur ta' bijokonċentrazzjoni fi stat stazzjonarju (BCFSS) mistenni li jinkiseb minn esperimenti tal-laboratorju, speċjalment meta jintuża mudell lineari sempliċi għall-istima minn qabel. Il-parametri li jikkaratterizzaw il-potenzjal ta' bijoakkumulazzjoni jinkludu l-kostant tar-rata ta' teħid (k
                        1), il-kostanti tar-rata ta' telf inkluż il-kostant tar-rata ta' tisfija (k
                        2), il-fattur ta' bijokonċentrazzjoni fi stat stazzjonarju (BCFSS), il-fattur ta' bijokonċentrazzjoni kinetika (BCFK) u l-fattur ta' bijomanjifikazzjoni djetetika (BMF) (38).
                     Sustanzi tat-test radjotikkettati jistgħu jiffaċilitaw l-analiżi tal-ilma, l-ikel u l-kampjuni tal-ħut u jistgħu jintużaw sabiex jiġi ddeterminat jekk l-identifikazzjoni u l-kwantifikazzjoni tal-metaboliti humiex neċessarji jew le. Jekk ir-residwi radjuattivi totali jitkejlu waħedhom (eż. b'kombustjoni jew solubilizzazzjoni tat-tessuti), il-BCF jew il-BMF huwa bbażat fuq it-total tas-sustanza priniċipali, kwalunkwe metabolit miżmum u karbonju assimiliat ukoll. Għalhekk, il-valuri tal-BCF jew il-BMF ibbażati fuq ir-residwi radjuattivi totali jaf ma jkunux direttament paragunabbli għal BCF jew BMF derivat minn analiżi kimika speċifika tas-sustanza prinċipali biss. Jistgħu jitħaddmu proċeduri ta' separazzjoni, bħal TLC, HPLC jew GC (39) qabel l-analiżi fi studji radjotikkettati sabiex jiġi stabbilit il-BCF jew il-BMF fuq il-bażi tas-sustanza prinċipali. Meta jiġu applikati t-tekniki ta' separazzjoni, għandhom isiru l-identifikazzjoni u l-kwantifikazzjoni ta' sustanza prinċipali u metaboliti rilevanti (40) (ara l-paragrafu 65) jekk il-BCF jew il-BMF sejjer ikun ibbażat fuq il-konċentrazzjoni tas-sustanza prinċipali fil-ħut u mhux fuq ir-residwi radjotikkettati totali. Huwa possibbli wkoll li studju tal-metaboliżmu tal-ħut jew studju tad-distribuzzjoni in vivo jiġi kombinat ma' studju tal-bijoakkumulazzjoni skont l-analiżi u l-identifikazzjoni tar-residwi fit-tessuti. Il-possibbiltà ta' metaboliżmu tista' titbassar b'għodod xierqa (eż. toolbox tal-QSAR tal-OECD (15) u programmi proprjetarji tal-QSAR).
                     Id-deċiżjoni dwar jekk it-twettiq ta' test tal-esponiment milwiem jew djetetika, u f'liema ssettjar, għandha tkun ibbażata fuq il-fatturi fil-paragrafu 3 ikkunsidrati flimkien mal-qafas regolatorju rilevanti. Pereżempju, għal sustanzi, li għandhom log KOW għoli iżda xorta juru solubilità fl-ilma sinifikanti fir-rigward tas-sensittività ta' tekniki analitiċi disponibbli, test tal-esponiment milwiem għandu jiġi kkunsidrat qabel kollox. Madankollu, huwa possibbli li l-informazzjoni dwar is-solubilità fl-ilma mhijiex definittiva għal dawn it-tipi idrofobiċi tas-sustanzi, sabiex il-possibilità ta' tħejjija ta' konċentrazzjonijiet milwiema dissolti stabbli li jistgħu jitkejlu (emulsjonijiet stabbli mhumiex permessi) applikabbli għal studju tal-esponiment milwiem għandha tiġi investigata qabel ma tittieħed deċiżjoni fuq liema metodu ta' ttestjar għandu jintuża (16). Mhuwiex possibbli li tingħata gwida preskrittiva eżatta dwar il-metodu li jrid jintuża fuq il-bażi tal-kriterji “limitu” tas-solubilità fl-ilma u l-koeffiċjent ta' partizzjoni ottanol/ilma, peress li fatturi oħrajn (tekniki analitiċi, degradazzjoni, assorbiment, eċċ.) jista' jkollhom influwenza qawwija fuq l-applikabilità tal-metodu għar-raġunijiet spjegati iktar 'il fuq. Madankollu, log KOW ikbar minn 5 u solubilità fl-ilma ta' inqas minn ~0.01 — 0.1 mg/l jindikaw il-medda tas-sustanza fejn l-ittestjar permezz tal-esponiment milwiem jista' jsir dejjem iktar diffiċli.
                     Fatturi oħrajn li jistgħu jinfluwenzaw l-għażla tat-test għandhom jiġu kkunsidrati, inkluż il-potenzjal tas-sustanza għall-assorbiment tar-reċipjenti tat-test u l-apparat, l-istabilità tagħha f'soluzzjoni milwiema kontra l-istabilità tagħha fl-ikel tal-ħut (17) (18), eċċ.
                     Informazzjoni dwar aspetti prattiċi bħal dawn tista' tkun disponibbli minn studji milwiema oħrajn li saru. Iktar informazzjoni dwar l-evalwazzjoni tal-aspetti b'rabta mat-twettiq ta' studji tal-bijoakkumulazzjoni hija disponibbli fit-tagħrif (eż. (19)).
                     Għal sustanzi fejn is-solubilità jew iż-żamma tal-konċentrazzjoni milwiema kif ukoll l-analiżi ta' dawn il-konċentrazzjonijiet ma jimponu ebda restrizzjoni għat-twettiq ta' metodu tal-esponiment milwiem, dan il-metodu huwa ppreferut sabiex jiġi stabbilit il-potenzjal ta' bijoakkumulazzjoni tas-sustanza. Xorta waħda għandu jiġi vverifikat li l-konċentrazzjoni(jiet) tal-esponiment milwiem li tiġi applikata taqa' fi ħdan is-solubilità milwiema fil-medja tat-test. Jistgħu jintużaw metodi differenti għaż-żamma ta' konċentrazzjonijiet stabbli tas-sustanza tat-test dissolta, bħall-użu ta' soluzzjonijiet ewlenin jew sistemi tad-dożaġġ passiv (eż. metodu ta' elwizzjoni tal-kolonna), diment li jkun jista' jintwera li jistgħu jinżammu konċentrazzjonijiet stabbli u l-media tat-test mhumiex mibdulin minn dawk irrakkomandati fil-paragrafu 27.
                     Għal sustanzi ferm idrofobiċi (log KOW > 5 u solubilità ta' inqas minn ~ 0,01-0,1 mg/l), l-ittestjar permezz tal-esponiment milwiem jista' jsir dejjem iktar diffiċli. Ir-raġunijiet għar-restrizzjonijiet jistgħu jkunu li l-konċentrazzjoni milwiema ma tistax tinżamm f'livell li jitqies li huwa kostanti biżżejjed (eż. dovut għas-sorbiment għall-ħġieġ tal-kontenituri tal-esponiment jew it-teħid rapidu mill-ħut) jew li l-konċentrazzjoni milwiema li sejrin jiġu applikati tant huma baxxi li jaqgħu fl-istess medda daqs jew inqas mil-limitu analitiku ta' kwantifikazzjoni (41). Għal dawn is-sustanzi ferm idrofobiċi, it-test djetetiku huwa rakkomandat, diment li t-test ikun konsistenti mal-qafas regolatorju rilevanti u l-ħtiġijiet ta' valutazzjoni tar-riskji.
                     Għal aġenti tensjoattivi, għandu jiġi kkunsidrat jekk it-test tal-bijokonċentrazzjoni milwiema huwiex fattibbli, fid-dawl tal-proprjetajiet tas-sustanza, inkella aktarx li studju djetetiku jkun iktar adattat. L-aġenti tensjoattivi huma aġenti li jaġixxu fil-wiċċ, li jbaxxu t-tensjoni interfaċjali bejn żewġ likwidi. L-għamla amfifilika tagħhom (jiġifieri fihom parti idrofilika u parti idrofobika) tikkaġuna sabiex dawn jakkumulaw f'interfaċċji bħall-interfaċċja ilma-arja, l-interfaċċja ilma-ikel, u ħitan tal-ħġieġ, xi ħaġa li xxekkel id-determinazzjoni tal-konċentrazzjoni milwiema tagħhom.
                     It-test djetetiku jista' jevita wħud mill-aspetti tal-esponiment għal taħlitiet kumplessi b'komponenti ta' limiti differenti tas-solubilità fl-ilma, peress li esponiment komparabbli għall-komponenti kollha tat-taħlita għandu probabilità ikbar li jseħħ fil-metodu milwiem (ara (20)).
                     Ta' min jgħid li l-approċċ djetetiku jrendi fattur ta' bijomanjifikazzjoni djetetiku (BMF) minflok fattur ta' bijokonċentrazzjoni (BCF) (42). Hemm approċċi disponibbli sabiex jiġi stmat fattur ta' bijokonċentrazzjoni kinetika (BCFK) minn dejta ġġenerata fl-istudju djetetiku (kif diskuss fl-Appendiċi 8, iżda dawn l-approċċi għandhom jintużaw bil-galbu). B'mod ġenerali, dawn l-approċċi jassumu kinetika tal-ewwel ordni, u huma applikabbli biss għal ċerti gruppi ta' komposti. Huwa improbabbli li t-tali approċċi jistgħu jiġu applikati għal aġenti tensjoattivi (ara l-paragrafu 12).
                     Test tal-esponiment milwiem minimizzat issettjat b'inqas punti tal-kampjunar sabiex jitnaqqas in-numru ta' annimali u/jew riżorsi (ara l-paragrafu 83 u ta' warajh) għandu jiġi applikat biss għal dawk is-sustanzi meta jkun hemm raġuni għaliex wieħed jistenna li t-teħid u d-depurazzjoni sejrin isegwu kinetika tal-ewwel ordni bejn wieħed u ieħor (jiġifieri b'mod ġenerali sustanzi organiċi mhux jonizzati, ara l-paragrafu 88).
                     C.13 — I   Test tal-Bijokonċentrazzjoni tal-Esposizzjoni Milwiema fil-Ħut
                     
                     IL-PRINĊIPJU TAT-TEST
                     It-test jikkonsisti f'żewġ fażijiet: il-fażijiet tal-esponiment (teħid) u ta' wara l-esponiment (tisfija). Matul il-fażi ta' teħid, grupp ta' ħut ta' speċi waħda jiġi espost għas-sustanza tat-test f'konċentrazzjoni magħżula waħda jew iktar, skont il-proprjetajiet tas-sustanza tat-test (ara l-paragrafu 49). Imbagħad jiġu trasferiti għal medium mingħajr is-sustanza tat-test għall-fażi ta' tisfija. Fażi ta' tisfija dejjem tkun meħtieġa sakemm it-teħid tas-sustanza matul il-fażi ta' teħid ma kienx insinifikanti. Il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test ġo/fuq il-ħut (jew it-tessut speċifiku tieghu) tiġi segwita matul iż-żewġ fażijiet tat-test. Minbarra l-grupp espost, grupp tal-kontroll tal-ħut jinżamm f'kundizzjonijiet identiċi ħlief għan-nuqqas tas-sustanza tat-test, sabiex jiġu konnessi effetti avversi possibbli osservati fit-test tal-bijokonċentrazzjoni għal grupp tal-kontroll li jaqbel u sabiex jinkisbu konċentrazzjonijiet ta' sfond tas-sustanza tat-test (43).
                     Fit-test tal-esponiment milwiem, il-fażi ta' teħid normalment tinfirex fuq 28 jum. Id-durata tista' tittawwal jekk ikun hemm bżonn (ara l-paragrafu 18), jew titqassar jekk jintwera li l-istat stazzjonarju ntlaħaq qabel (ara l-Appendiċi 1, definizzjonijiet u unitajiet) Tbassir tat-tul tal-fażi ta' teħid u l-ħin għall-istat stazzjonarju jista' jsir bl-ekwazzjonijiet fl-Appendiċi 5. Imbagħad jibda l-perjodu ta' tisfija li fih il-ħut ma jibqax espost għas-sustanza tat-test, billi l-ħut jiġi ttrasferit fl-istess medium iżda mingħajr is-sustanza tat-test f'reċipjent nadif. Meta dan ikun possibbli, il-fattur ta' bijokonċentrazzjoni jiġi kkalkolat kemm bħala l-proporzjon tal-konċentrazzjoni fil-ħut (Cf) u fl-ilma (Cw) fi stat stazzjonarju (BCFSS; ara l-Appendiċi 1, definizzjoni) u bħala fattur ta' bijokonċentrazzjoni kinetika (BCFK; ara l-Appendiċi 1, definizzjonijiet u unitajiet), li huwa stmat bħala l-proporzjon tal-kostanti tar-rata ta' teħid (k1) u t-tisfija (k2) filwaqt li tiġi supponuta kinetika tal-ewwel ordni (44)
                     
                     Jekk ma jinkisibx stat stazzjonarju fi żmien 28 jum, il-BCF jiġi kkalkolat bl-użu tal-approċċ kinetiku (ara l-paragrafu 38) jew inkella tista' tiġi estiża l-fażi ta' teħid. Jekk dan iwassal għal fażi ta' teħid twila wisq tant li tkun imprattika sakemm jintlaħaq l-istat stazzjonarju (ara l-paragrafi 37 u 38, l-Appendiċi 5), l-approċċ kinetiku huwa ppreferut. Inkella, għal sustanzi ferm idrofobiċi, it-twettiq ta' studju djetetiku għandu jiġi kkunsidrat (45), diment li t-test djetetiku jkun konsistenti mal-qafas regolatorju rilevanti.
                     Il-kostant tar-rata ta' teħid, il-kostant (jew il-kostanti, fejn ikunu involuti mudelli aktar kumplessi) tar-rata ta' tisfija (telf), il-fattur ta' biokonċentrazzjoni (fi stat stazzjonarju u/jew kinetika), u fejn huwa possibbli, il-limiti tal-kunfidenza ta' kull wieħed minn dawn il-parametri huma kkalkolati mill-mudell li jiddeskrivi bl-aħjar mod il-konċentrazzjonijiet imkejlin tas-sustanza tat-test fil-ħut u l-ilma (ara l-Appendiċi 5).
                     Iż-żieda fil-massa tal-ħut matul it-test sejra tirriżulta fi tnaqqis fil-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħut li qiegħed jikber (l-hekk imsejħa dilwizzjoni tat-tkabbir), u b'hekk il-BCF kinetiku sejjer jiġi sottovalutat jekk ma jiġix ikkoreġut għat-tkabbir (ara l-paragrafi 72 u 73).
                     Il-BCF huwa bbażat fuq il-konċentrazzjoni totali fil-ħut (jiġifieri għal kull piż niedi totali tal-ħut). Madankollu, għal għanijiet speċjali, jistgħu jintużaw tessuti jew organi speċifiċi (eż. muskolu, fwied) jekk il-ħut ikun kbir biżżejjed jew jekk il-ħut ikun jista' jinqasam fi frazzjonijiet li jittieklu (fletti) u li ma jittieklux (vixxri). Ladarba, għal ħafna sustanzi organiċi, hemm relazzjoni ċara bejn il-potenzjal għall-bijokonċentrazzjoni u l-idrofobiċità, hemm ukoll relazzjoni korrispondenti bejn il-kontenut tal-lipidu tal-ħut tat-test u l-bijokonċentrazzjoni osservata tat-tali sustanzi. B'hekk, sabiex jonqos dan is-sors ta' varjabbiltà fir-riżultati tat-test għal dawk is-sustanzi b'lipofiliċità għolja (jiġifieri bil-log KOW > 3), il-bijokonċentrazzjoni għandha tkun espressa bħala normalizzata għal ħut b'kontenut lipidu ta' 5 % (fuq il-bażi tal-piż niedi tal-ġisem sħiħ) minbarra dik derivata direttament mill-istudju. Dan huwa neċessarju sabiex tiġi pprovduta bażi li fuqha jistgħu jitqabblu ma' xulxin ir-riżultati għal sustanzi u/jew speċijiet tat-test differenti. Il-figura ta' kontenut lipidu ta' 5 % intużat spiss peress li tirrappreżenta l-kontenut lipidu medju ta' ħut użat spiss f'dan il-metodu ta' ttestjar (21).
                     INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA TAT-TEST
                     Minbarra l-proprjetajiet tas-sustanza tat-test mogħtija fl-Introduzzjoni (paragrafu 3), informazzjoni oħra meħtieġa hija t-tossiċità għall-ispeċi tal-ħut li sejra tintuża fit-test, idealment l-LC50 asintomatika (jiġifieri indipendenti mill-ħin) u/jew it-tossiċità stmata mit-testijiet fil-ħut fit-tul (eż. TMs C.47 (22), C.15 (23), C.14 (24)).
                     Metodu analitiku xieraq, ta' reqqa, preċiżjoni u sensittività magħrufin, għall-kwantifikazzjoni tas-sustanza fis-soluzzjonijiet tat-test u f'materjal bioloġiku għandu jkun disponibbli, flimkien mad-dettalji tal-preparazzjoni tal-kampjun u tal-ħażna. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni analitika tas-sustanza tat-test kemm fll-ilma kif ukoll fit-tessuti tal-ħut għandu jkun magħruf ukoll. Meta tintuża sustanza tat-test radjotikkettata, għandha tkun tal-ogħla purità (eż. idealment > 98 %) u l-perċentwal tar-radjuattività assoċjat mal-impuritajiet għandu jkun magħruf.
                     VALIDITÀ TAT-TEST
                     Sabiex test ikun validu, japplikaw il-kundizzjonijiet li ġejjin:
                     
                                  
                              
                              
                                 Il-varjazzjoni fit-temperatura tal-ilma hija inqas minn ± 2 °C, għaliex devjazzjonijiet kbar jistgħu jaffettwaw il-parametri bijoloġiċi rilevanti għat-teħid u t-tisfija kif ukoll jikkaġunaw stress għall-annimali;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Il-konċentrazzjoni tal-ossiġenu dissolt ma taqax taħt saturazzjoni ta' 60 %;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-kompartimenti tinżamm fi ħdan ± 20 % tal-medja tal-valuri mkejlin matul il-fażi ta' teħid,
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test hija taħt il-limitu ta' solubilità tagħha fl-ilma, filwaqt li jitqies l-effett li jista' jkollu l-ilma tat-test fuq is-solubilità effettiva (46);
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Il-mortalità jew effetti avversi oħrajn/mard kemm fil-ħut tal-kontroll kif ukoll dak tat-trattament huma inqas minn 10 % fi tmiem it-test; fejn it-test jiġi estiż tul ħafna ġimgħat jew xhur, mewt jew effetti avversi oħrajn fiż-żewġ settijiet tal-ħut għandhom ikunu inqas minn 5 % fix-xahar u ma jaqbżux it-30 % b'kollox. Differenzi sinifikanti fit-tkabbir medju bejn il-gruppi tat-test u tal-kontroll tal-ħut kampjunat jistgħu jkunu indikazzjoni ta' effett tossiku tas-sustanza tat-test.
                              
                           SUSTANZI TA' REFERENZA
                     L-użu ta' sustanzi ta' referenza b'potenzjal ta' bijokonċentrazzjoni magħruf u metaboliżmu baxx ikun siewi fil-verifika tal-proċedura sperimentali, meta tkun meħtieġa (eż. meta laboratorju ma jkollu ebda esperjenza fl-imgħoddi bit-test jew ikunu nbidlu l-kundizzjonijiet tal-esperiment).
                     DESKRIZZJONI TAL-METODU
                     
                        Apparat
                     
                     Għandha tingħata attenzjoni sabiex jiġi evitat l-użu tal-materjali — għall-partijiet kollha tat-tagħmir — li jistgħu jiddisolvu, jassorbu jew jillixivjaw u jkollhom effett avvers fuq il-ħut. Jistgħu jintużaw tankijiet standard rettangolari jew ċilindriċi, magħmula minn materjal kimikament inerti u b'kapaċità adatta b'konformità mar-rata ta' tagħbija (ara l-paragrafu 43). L-użu ta' tubi tal-plastik rotob għandu jitnaqqas kemm jista' jkun. Għandhom jintużaw tubi tal-politetrafluworoeteilen, tal-azzar inossidabbli u/jew tal-ħġieġ. L-esperjenza wriet li għal sustanzi tat-test b'koeffiċjent ta' assorbiment għoli, bħall-piretrojdi sintetiċi, jista' jkun meħtieġ ħġieġ silanizzat. F'dawn is-sitwazzjonijiet, it-tagħmir għandu jintrema wara li jintuża. Idealment is-sistemi tat-test jiġu esposti għall-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test li sejrin jintużaw fl-istudju għat-tul ta' żmien metħieġ sabiex tintwera ż-żamma ta' konċentrazzjonijiet tal-esponiment stabbli qabel l-introduzzjoni tal-organiżmi tat-test.
                     
                        Ilma
                     
                     Ġeneralment fit-test jintuża ilma naturali u dan għandu jinkiseb minn sors mhux ikkontaminat u ta' kwalità uniformi. Iżda ilma rikostitwit (jiġifieri ilma demineralizzat b'nutrijenti speċifiċi miżjudin f'ammonti magħrufin) jista' jkun iktar adattat sabiex jiggarantixxi kwalità uniformi tul iż-żmien. L-ilma tad-dilwizzjoni, li huwa l-ilma li jitħallat mas-sustanza tat-test qabel ma tidħol fir-reċipjent tat-test (ara l-paragrafu 30), għandu jkun ta' kwalità li tippermetti li l-ispeċi tal-ħut magħżula tibqa' ħajja għad-durata tal-perjodu ta' akklimatizzazzjoni u l-perjodi tat-test mingħajr ma turi ebda dehra jew imġiba anormali. Idealment, għandu jintwera li l-ispeċi tat-test tista' tibqa' ħajja, tikber u tirriproduċi fl-ilma ta' dilwizzjoni (eż. fil-kultura tal-laboratorju jew test tat-tossità taċ-ċiklu tal-ħajja). L-ilma ta' dilwizzjoni għandu jkun karatterizzat mill-inqas minn pH, ebusija, solidi totali, karbonju organiku totali (TOC (47)) u, preferibbilment ammonju wkoll, nitrit u alkalinità u, għall-ispeċijiet marini, is-salinità. Il-parametri li huma importanti għall-aktar trattament xieraq tal-ħut mhumiex magħrufin kollha, iżda l-Anness 2 jagħti l-konċentrazzjonijiet massimi rakkomandati għal numru ta' parametri għal ilmijiet ħelwin u marittimi tat-test.
                     L-ilma ta' dilwizzjoni għandu jkun ta' kwalità kostanti matul il-perjodu ta' test. Il-valur tal-pH għandu jkun fil-medda ta' 6.0 sa 8.5 fil-bidu tat-test, iżda matul test speċifiku għandu jkun f'medda ta' ± 0.5 tal-unitajiet tal-pH. Sabiex ikun żgurat li d-dilwizzjoni tal-ilma mhijiex sejra tinfluwenza għalxejn ir-riżultat tat-test (pereżempju, bil-kumplessazzjoni tas-sustanza tat-test) jew taffettwa b'mod avvers il-prestazzjoni tal-istokk tal-ħut, għandhom jittieħdu kampjuni kull ċertu żmien għall-analiżi, tal-inqas fil-bidu u fi tmiem it-test. Meta jkun magħruf li l-ilma tad-dilwizzjoni huwa relattivament kostanti fil-kwalità, għandhom jiġu determinati l-metalli tqal (eż. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, u Ni), ta' anjoni u katjoni ewlenin (eż. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, u SO4
                        2–), ta' pestiċidi (eż. pestiċidi organofosforiċi totali u pestiċidi organoklorurati totali), ta' karbonju organiku u ta' solidi sospiżi totali, pereżempju kull tliet xhur. Jekk ikun intwera li l-kwalità tal-ilma ta' dilwizzjoni hija kostanti għal tal-anqas sena, id-determinazzjonijiet jistgħu jkunu inqas spissi u l-intervalli jistgħu jittawlu (eż. kull sitt xhur).
                     Il-kontenut tal-partiċelli naturali kif ukoll il-karbonju organiku totali tal-ilma ta' dilwizzjoni għandu jkun baxx kemm jista' jkun sabiex jiġi evitat assorbiment tas-sustanza tat-test għal materja organika, li jista' jnaqqas il-bijodisponibilità tiegħu u b'hekk jirriżulta f'sottovalutazzjoni tal-BCF. Il-valur massimu aċċettabbli huwa ta' 5 mg/l għall-oġġett partikolari (oġġett niexef/xott, li ma jgħaddix il-filtru ta' 0.45 μm) u 2 mg/l għall-karbonju totali organiku (ara Anness 2). Jekk hemm bżonn, l-ilma ta' dilwizzjoni għandu jiġi ffiltrat qabel l-użu. Il-kontribuzzjoni għall-kontenut ta' karbonju organiku fl-ilma tat-test mill-ħut tat-test (eskrezzjonijiet) u mir-residwi fl-ikel għandha tinżamm baxxa kemm jista' jkun (ara l-paragrafu 46).
                     
                        Soluzzjonijiet tat-Test
                     
                     Ħejji soluzzjoni ewlenija tas-sustanza tat-test f'konċentrazzjoni adattata. Idealment is-soluzzjoni ewlenija titħejja billi s-sustanza tat-test tiġi sempliċiment imħallta u mheżża fl-ilma ta' dilwizzjoni. Alternattiva li tista' tkun xierqa f'ċerti każijiet hija l-użu ta' sistema ta' dożaġġ ta' desorbiment tal-fażi solida. Ġeneralment mhuwiex rakkomandat li jintużaw solventi u aġenti dispersivi (aġenti solubilizzanti) (ara (25)); madankollu, l-użu ta' dawn il-materjali jista' jkun aċċettabbli sabiex tiġi prodotta soluzzjoni ewlenija kkonċentrata kif suppost, iżda għandu jsir kull sforz sabiex jitnaqqas kemm jista' jkun l-użu tat-tali materjali u l-konċentrazzjoni kritika ta' miċelli ma għandhiex tinqabeż (jekk rilevanti). Solventi li jistgħu jintużaw huma l-aċeton, l-etanol, il-metanol, il-formamid tad-dimetil u l-glikol tat-trietilen; aġenti dispersivi li ntużaw huma Tween 80, metilċelluloża 0.01 % u HCO-40. Il-konċentrazzjoni tas-solvent fil-medium tat-test finali għandha tkun l-istess fit-trattamenti kollha (jiġifieri tkun xi tkun il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test) u ma għandhiex taqbeż il-limiti tat-tossiċità korrispondenti stabbiliti għas-solvent fil-kundizzjonijiet tat-test. Il-livell massimu huwa konċentrazzjoni ta' 100 mg/l (jew 0.1 ml/l). Huwa improbabbli li konċentrazzjoni tas-solvent ta' 100 mg/l sejra tibdel b'mod sinifikanti l-konċentrazzjoni dissolta massima tas-sustanza tat-test li tista' tinkiseb fil-medium (25). Il-kontribuzzjoni tas-solvent (flimkien mas-sustanza tat-test) għall-kontenut kollu tal-karbonju organiku fl-ilma tat-test għandha tkun magħrufa. Matul it-test, il-konċentrazzjoni ta' karbonju organiku totali fir-reċipjenti tat-test ma għandhiex taqbeż il-konċentrazzjoni ta' karbonju organiku li joriġina mis-sustanza tat-test u, jekk jintuża s-solvent jew l-aġent solubilizzanti (48), b'iktar minn 10 mg/l (± 20 %). Il-kontenut ta' materja organika jista' jkollu effett sinifikatni fuq l-ammont ta' sustanza tat-test dissolta liberament matul it-testijiet fuq il-ħut bi fluss kontinwu, speċjalment għal sustanzi ferm lipofiliċi. Il-mikroestrazzjoni tal-fażi solida (ara l-paragrafu 60) tista' tipprovdi informazzjoni importanti fuq il-proporzjon ta' bejn il-komposti mqabbdin u dawk dissolti liberament, li fosthom dawn tal-aħħar huma supponuti li jirrappreżentaw il-frazzjoni bijodisponibbli. Il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test għandha tkun inqas mil-limitu ta' solubilità tas-sustanza tat-test fil-media tat-test minkejja l-użu ta' solvent jew aġent solubilizzanti. Għandha tingħata attenzjoni meta jintużaw solventi bijodigradabbli lesti peress li dawn jistgħu jikkawżaw problemi bit-tkabbir ta' batterji fit-testijiet bi fluss kontinwu. Jekk mhuwiex possibbli li titħejja soluzzjoni ewlenija mingħajr ma jintuża aġent solubilizzanti, għandha tiġi kkunsidrata l-idoneità ta' studju ta' esponiment milwiem għall-kuntrarju ta' studju ta' esponiment djetetiku.
                     Għat-testijiet bi fluss kontinwu, sistema li kontinwament tiddistribwixxi u tiddilwixxi soluzzjoni ewlenija tas-sustanza tat-test (eż. pompa tal-kejl, dilwitur proporzjonali, sistema ta' saturazzjoni) jew sistema ta' dożaġġ ta' desorbiment tal-fażi solida hija meħtieġa sabiex tforni l-konċentrazzjonijiet tat-test fil-kompartimenti tat-test. Idealment, għandhom jitħallew jgħaddu tal-inqas ħames sostituti tal-volum minn kull kompartiment tat-test kuljum. Il-modalità tal-fluss kontinwu għandha tkun ippreferuta, iżda fejn din mhijiex possibbli (eż. fejn l-organiżmi tat-test ikunu affettwati b'mod avvers), tista' tintuża teknika semistatika ladarba jkunu ssodisfati l-kriterji ta' validità (ara l-paragrafu 24). Ir-rati tal-fluss tas-soluzzjonijiet ewlenin u l-ilma ta' dilwizzjoni għandhom ikunu kkontrollati kemm 48 siegħa qabel kif ukoll tal-inqas kuljum matul it-test wara dan. Inkludi f'dan il-kontroll id-determinazzjoni tar-rata tal-fluss minn ġewwa kull kompartiment tat-test u ara li din ma tvarjax b'aktar minn 20 % fi ħdan l-istess kompartiment jew bejn kompartimenti differenti.
                     
                        L-għażla tal-ispeċijiet
                     
                     Kriterji importanti fl-għażla tal-ispeċi huma li dejjem ikunu lesti għad-dispożizzjoni, jistgħu jitkisbu f'daqsijiet konvenjenti u jistgħu jinżammu b'mod sodisfaċenti fil-laboratorju. Kritejri oħrajn għall-għażla tal-ispeċi tal-ħut jinkludu importanza rikreazzjonali, kummerċjali u ekoloġika kif ukoll is-sensittività komparabbli, l-użu b'suċċess fl-imgħoddi, eċċ. Fl-Appendiċi 3 jingħataw l-ispeċijiet tat-test rakkomandati. Jistgħu jintużaw speċijiet oħrajn iżda l-proċedura tat-test jista' jkollha tiġi adattata sabiex tipprovdi kundizzjonijiet xierqa tat-test. F'dan il-każ, ir-raġuni li tiġġustifika l-għażla tal-ispeċi u l-metodu sperimentali għandhom jiġu rrapportati. B'mod ġenerali, l-użu ta' speċijiet ta' ħut iżgħar sejjer iqassar il-ħin għall-istat stazzjonarju, iżda jista' jkun hemm bżonn ta' iktar ħut (kampjuni) sabiex jiġu analizzati l-kontenut lipidu u l-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test b'mod adegwat fil-ħut. Barra minn hekk, huwa possibbli li differenzi fir-rata ta' respirazzjoni u metaboliżmu bejn ħut iżgħar u ikbar fl-età jistgħu jxekklu l-paraguni tar-riżultati bejn testijiet differenti u speċijiet tat-test differenti. Ta' min jinnota li l-ispeċi tal-ħut ittestjata fi stadju tal-ħajja bi tkabbir rapidu (meta jkun għadu qed jikber) jista' jikkomplika l-interpretazzjoni tad-dejta.
                     
                        Iż-żamma tal-ħut (rilevanti għall-esponiment milwiem u djetetika)
                     
                     Il-popolazzjoni tal-istokk tal-ħut għandha titħalla dderri għal tal-inqas ġimagħtejn fl-ilma (ara l-paragrafu 28) fit-temperatura u l-għalf tat-test fuq dieta suffiċjenti (ara l-paragrafu 45). Kemm l-ilma kif ukoll id-dieta għandhom ikunu tal-istess tip bħal dawk li sejrin jintużaw matul it-test.
                     Wara perjodu ta' 48 siegħa li fih il-ħut jitħallew joqogħdu, jiġu rreġistrati l-mortalitajiet u jiġu applikati l-kriterji li ġejjin:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Mortalitajiet ta' aktar minn 10 % tal-popolazzjoni f'sebat ijiem: iċħad il-lott sħiħ;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Mortalitajiet ta' bejn 5 u 10 % tal-popolazzjoni f'sebat ijiem: ħallihom iderru għal sebat ijiem oħra — jekk ikun hemm mortalità ogħla minn 5 % matul it-tieni sebat ijiem, iċħad il-lott sħiħ;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Mortalitajiet ta' inqas minn 5 % tal-popolazzjoni f'sebat ijiem: aċċetta l-lott sħiħ.
                              
                           Il-ħut użat fit-testijiet għandu jkun ħieles minn mard u anormalitajiet osservabbli. Kwalunkwe ħut marid għandu jitwarrab. Il-ħut ma għandux jirċievi trattament għall-mard fil-gimagħtejn ta' qabel it-test, jew matul it-test.
                     IT-TWETTIQ TAT-TEST
                     
                        Test preliminari
                     
                     Jista' jkun siewi li jsir esperiment preliminari sabiex jiġu ottimizzati l-kundizzjonijiet tat-test tat-test definittiv, eż. l-għażla ta' konċentrazzjoni(jiet) tas-sustanza tat-test, id-durata tal-fażijiet ta' teħid u ta' tisfija, jew sabiex jiġi stabbilit jekk hemmx bżonn li jsir test sħiħ. Id-disinn tat-test prelimnari għandu jkun tali li tinkiseb l-informazzjoni metieġa. Jista' jiġi kkunsidrat jekk test minimizzat jista' jkun biżżejjed għall-kisba ta' BCF, jew jekk ikun hemm bżonn li jsir studju sħiħ (ara l-paragrafi 83-95 fuq it-test minimizzat).
                     
                        Kundizzjonijiet tal-Esponiment
                     
                     
                        Durata tal-fażi ta' teħid
                     
                     Tbassir tad-durata tal-fażi ta' teħid jista' jinkiseb mill-esperjenza prattika (eż. minn studju preċedenti jew studju tal-akkumulazzjoni fuq sustanza relatata strutturalment) jew minn ċerti relazzjonijiet empiriċi li jużaw għarfien jew dwar is-solubilità fl-ilma jew il-koeffiċjent ta' partizzjoni ottanol/ilma tas-sustanza tat-test (diment li t-teħid isegwi l-kinetika tal-ewwel ordni, ara l-Appendiċi 5).
                     Il-fażi ta' teħid għandha ssir għal 28 jum sakemm ma jkunx jista' jintwera li l-istat stazzjonarju ntlaħaq qabel (ara l-Appendiċi 1, definizzjonijiet u unitajiet). Stat stazzjonarju jintlaħaq fil-plott tas-sustanza tat-test fil-ħut (Cf) kontra l-ħin meta l-kurva ssir parallela għall-assi tal-ħin u tlett analiżijiet suċċessivi tas-Cf magħmula fuq kampjuni meħuda fl-intervalli ta' mill-inqas jumejn huma fi ħdan ± 20 % minn xulxin, u ma hemmx żieda sinifikanti ta' Cf fil-ħin bejn l-ewwel u l-aħħar analiżi suċċessivi. Meta jiġu analizzati l-kampjuni miġbura flimkien, hemm bżonn ta' mill-inqas erba' analiżijiet suċċessivi. Għas-sustanzi tat-test li jittieħdu bil-mod, ikun aktar xieraq li l-intervalli jkunu ta' sebat ijiem. Jekk l-istat stazzjonarju ma jintlaħaqx sal-jum 28, il-BCF jiġi kkalkolat bl-użu tal-approċċ kinetiku biss, li ma jiddependix mill-ilħuq tal-istat stazzjonarju, jew inkella l-fażi ta' teħid tista' tiġi estiża, sabiex jittieħdu iktar kejliet, sakemm jintlaħaq l-istat stazzjonarju jew għal 60 jum, skont liema minnhom ikun l-iqsar. Barra minn hekk, il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħut fi tmiem il-fażi ta' teħid trid tkun għolja biżżejjed sabiex tiġi żgurata stima affidabbli ta' k
                        2 mill-fażi ta' tisfija. Jekk ma jkunx hemm teħid sinifikanti wara 28 jum, it-test jista' jitwaqqaf.
                     
                        Durata tal-fażi ta' tisfija
                     
                     Għal sustanzi li jsegwu l-kinetika tal-ewwel ordni, perjodu ta' nofs id-durata tal-fażi ta' teħid normalment ikun biżżejjed sabiex iseħħ tnaqqis xieraq (eż. 95 %) fil-preżenza fil-ġisem tas-sustanza (ara l-Appendiċi 5 għall-ispjegazzjoni tal-istima). Jekk il-ħin meħtieġ biex jintlaħaq it-telf ta' 95 % ikun twil b'mod imprattiku, għaliex pereżempju jaqbeż bid-doppju d-durata normali tal-fażi ta' teħid (jiġifieri iktar minn 56 jum), jista' jintuża perjodu iqsar (eż. sakemm il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test tiġi inqas minn 10 % tal-konċentrazzjoni tal-istat stazzjonarju). Madankollu, jista' jkun hemm bżonn ta' perjodi ta' tisfija itwal għal sustanzi b'mudelli iktar kumplessi ta' teħid u tisfija minn dawk rappreżentati minn mudell tal-ħut b'kompartiment wieħed li jrendi kinetika tal-ewwel ordni. Jekk jiġu osservati u/jew antiċipati xejriet kumplessi bħal dawn, huwa rakkomandat li jitfittex li jinkiseb parir mingħand espert tal-bijostatistika u/jew tal-farmakokinetika sabiex jiġi żgurat issettjar xieraq tat-test. Peress li l-perjodu ta' tisfija huwa estiż, in-numri ta' ħut għall-kampjunar jista' jkun fattur ta' limitazzjoni u d-differenzi fit-tkabbir bejn il-ħut jistgħu jinfluwenzaw ir-riżultati. Il-perjodu sejjer jiġi rregolat ukoll mill-perjodu li matulu l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħut tibqa' ogħla mil-limitu analitiku tal-kwantifikazzjoni.
                     
                        Numri ta' ħut tat-test
                     
                     Agħżel in-numri ta' ħut għal kull konċentrazzjoni tat-test b'tali mod li jkun hemm minimu ta' erba' ħutiet disponibbli f'kull punt tal-kampjunar. Il-ħut għandu jinġabar flimkien biss jekk l-analiżi ta' ħuta waħda ma tkunx fattibbli. Jekk ikun hemm skop ta' preċiżjoni ikbar fl-iffittjar tal-kurva (u l-parametri derivati) jew jekk ikun hemm bżonn ta' studji dwar il-metaboliżmu (eż. sabiex issir distinzjoni bejn metaboliti u sustanzi prinċipali meta jintużaw sustanzi tat-test radjotikkettati), sejjer ikun hemm bżonn ta' iktar ħut għal kull punt tal-kampjunar. Il-kontenut lipidu għandu jiġi determinat fuq l-istess materjal bijoloġiku li jintuża sabiex tiġi determinata l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test. Jekk dan ma jkunx fattibbli, jista' jkun hemm bżonn ta' iktar ħut (ara l-paragrafi 56 u 57).
                     Jekk jintuża ħut adult (jiġifieri li laħaq il-maturità sesswali), dan ma għandux ikun fi stat riproduttiv jew irriproduċa dan l-aħħar (jiġifieri diġà rriproduċa) la qabel u lanqas matul it-test. Għandu jiġi rrapportat ukoll jekk jintużawx irġiel jew nisa jew jekk tintużax taħlita ta' dawn fl-esperiment. Jekk jintużaw iż-żewġ sessi, id-differenzi fit-tkabbir u l-kontenut lipidu bejn is-sessi għandu jkun dokumentat bħala mhux sinifikanti qabel ma jibda l-esponiment, speċjalment jekk ikun antiċipat li l-ġbir flimkien tal-ħut irġiel u nisa sejjer ikun neċessarju sabiex jiġu żgurati konċentrazzjonijiet tas-sustanza u/jew kontenut lipidu identifikabbli.
                     Fi kwalunkwe test, agħżel ħut b'piż simili b'tali mod li l-iżgħar ma jkunux iżgħar minn żewġ terzi tal-piż tal-ikbar. Ilkoll għandhom ikunu tal-istess sena-klassi u ġejjin mill-istess sors. Peress li l-piż u l-età ta' ħuta jista' jkollhom effett importanti fuq il-valuri tal-BCF (12) dawn id-dettalji għandhom jiġu rreġistrati b'mod preċiż. Huwa rakkomandat li sottokampjun tal-istokk tal-ħut jintiżen ftit qabel ma jibda t-test sabiex jiġi stmat il-piż medju (ara l-paragrafu 61).
                     
                        Tagħbija
                     
                     Għandhom jintużaw proporzjonijiet għoljin ta' ilma għall-ħut sabiex jonqos it-tnaqqis fil-konċentrazzjoni tal-kompost tat-test fl-ilma kkaġunat miż-żieda tal-ħut fil-bidu tat-test u anki sabiex jiġi evitat tnaqqis fil-konċentrazzjoni tal-ossiġenu dissolt. Huwa importanti li r-rata ta' tagħbija tkun adattata għall-ispeċi tat-test użata. F'kull każ, normalment tkun rakkomandata rata ta' tagħbija ħut-ilma ta' 0.1-1.0 g ħut (piż niedi) għal kull litru fil-ġurnata. Jistgħu jintużaw rati ogħla ta' tagħbija ħut-ilma jekk jintwera li l-konċentrazzjonijiet meħtieġa tas-sustanza tat-test jistgħu jinżammu f'limiti ta' ± 20 %, u li l-konċentrazzjoni tal-ossiġenu dissolt ma taqax taħt 60 % saturazzjoni (ara l-paragrafu 24).
                     Meta tagħżel ir-reġimi tat-tagħbija xierqa, qis il-ħabitat normali tal-ispeċi tal-ħut. Pereżempju, ħut li jgħix fil-qiegħ jista' jirrikjedi qiegħ tal-akkwarju ikbar għall-istess volum ta' ilma meta mqabbel ma' speċi ta' ħut pelaġiku.
                     
                        Għalf
                     
                     Matul il-perjodi ta' akklimatizzazzjoni u tat-test, itma' dieta xierqa ta' lipidu magħruf u kontenut totali ta' proteina lill-ħut f'ammont biżżejjed sabiex jibqgħu f'kundizzjoni tajba tas-saħħa u jżommu l-piż tal-ġisem (huwa permess ftit tkabbir). Itma' kuljum matul il-perjodi ta' akklimatizzazzjoni u tat-test f'livell stabbilit skont l-ispeċi użata, il-kundizzjonijiet tal-esperiment u l-valur kaliriku tal-ikel (pereżempju għal trota qawsalla, bejn madwar 1 sa 2 % tal-piż tal-ġisem kuljum). Ir-rata tal-għalf għandha tingħażel b'tali mod li jiġu evitati tkabbir veloċi u żieda kbira fil-kontenut lipidu. Sabiex tinżamm l-istess rata tal-għalf, l-ammont tal-għalf għandu jerġa' jiġi kkalkolat kif xieraq, pereżempju darba fil-ġimgħa. Għal dan il-kalkolu, il-piż tal-ħut f'kull kompartiment tat-test jista' jkun stmat mill-piż tal-ħut li ddaħħal l-aħħar fil-kampjun f'dak il-kompartiment. Tiżinx il-ħut li jifdal fil-kompartiment.
                     Ikel mhux mittiekel u r-rawt għandhom jinġibdu kuljum mill-kompartimenti tat-test ftit wara t-tagħlif (30 minuta sa siegħa wara). Il-kompartimenti għandhom jinżammu fl-iktar stat nadif possibbli matul it-test sabiex il-konċentrazzjoni ta' materja organika tibqa' baxxa kemm jista' jkun (ara l-paragrafu 29), peress li l-preżenza ta' karbonju organiku tista' tillimita l-bijodisponibilità tas-sustanza tat-test (12).
                     Peress li ħafna għalf jiġi minn ħut mitħun, għandu jiġi żgurat li l-għalf mhuwiex sejjer jinfluwenza r-riżultati tat-test jew jinduċi effetti avversi, eż. billi jkun fih (traċċi ta') pestiċidi, metalli tqal u/jew is-sustanza tat-test innifisha.
                     
                        Dawl u temperatura
                     
                     Huwa rakkomandat fotoperjodu ta' 12 sa 16-il siegħa u t-temperatura (± 2 °C) għandha tkun adattata għall-ispeċi tat-test (ara l-Appendiċi 3). It-tip u l-karatteristiċi tad-dawl għandhom ikunu magħrufin. Għandha tingħata attenzjoni għall-fototrasformazzjoni possibbli tas-sustanza tat-test fil-kundizzjonijiet ta' irradjazzjoni tal-istudju. Għandu jintuża dawl xieraq sabiex jiġi evitat esponiment tal-ħut għal fotoprodotti mhux naturali. F'xi każijiet jista' jkun xieraq li jintuża filtru sabiex ma tidħolx irradjazzjoni tal-UV ta' inqas minn 290 nm.
                     
                        Konċentrazzjonijiet tat-test
                     
                     Oriġinarjament it-test tfassal għal sustanzi organiċi mhux polari. Għal dan it-tip ta' sustanza, l-esponiment tal-ħut għal konċentrazzjoni waħda huwa mistennij li jkun biżżejjed, peress li ma huwa mistenni ebda effett tal-konċentrazzjoni, għad li jista' jkun hemm bżonn ta' żewġ konċentrazzjonijiet għall-qafas regolatorju rilevanti. Jekk jiġu ttestjati sustanzi barra dan id-dominju, jew ikunu magħrufin indikazzjonijiet oħrajn ta' dipendenza mill-konċentrazzjoni possibbli, it-test għandu jsir b'żewġ konċentrazzjonijiet jew iktar. Jekk tiġi ttestjata konċentrazzjoni waħda biss, għandha tingħata ġustifikazzjoni għall-użu ta' konċentrazzjoni waħda (ara l-paragrafu 79). Barra minn hekk, il-konċentrazzjoni ttestjata għandha tkun l-inqas konċentrazzjoni possibbli f'livell prattiku u tekniku (jiġifieri mhux qrib il-limitu tas-solubilità).
                     F'ċerti każijiet jista' jkun antiċipat li l-bijokonċentrazzjoni ta' sustanza tiddependi mill-konċentrazzjoni tal-ilma (eż. għall-metalli, meta t-teħid tas-sustanza mill-ħut jista' jkun irregolat tal-inqas b'mod parzjali). F'dan il-każ, hemm bżonn li jiġu ttestjati tal-inqas żewġ konċentrazzjonijiet, iżda idealment iktar (ara l-paragrafu 49), li jkunu ambjentalment rilevanti. Anki għal sustanzi li fihom il-konċentrazzjonijiet ittestjati jridu jkunu qrib il-limitu tas-solubilità għal raġunijiet prattiċi, huwa rakkomandat li tal-inqas jiġu ttestjati żewġ konċentrazzjonijiet, għaliex dan jista' jagħti idea ta' kemm huma affidabbli l-konċentrazzjonijiet tal-esponiment. L-għażla tal-konċentrazzjonijiet tat-test għandha tinkorpora l-konċentrazzjoni ambjentalment realistika kif ukoll il-konċentrazzjoni li hija rilevanti għall-fini tal-valutazzjoni speċifika.
                     Il-konċentrazzjoni(jiet) tas-sustanza tat-test għandha tingħażel bħala waħda inqas mil-livell tal-effett kroniku tagħha jew 1 % mil-LC50 asintomatika akuta tagħha fi ħdan medda ambjentalment rilevanti u tal-inqas ordni ta' kobor ikbar mil-limitu ta' kwantifikazzjoni tagħha fl-ilma bil-metodu analitiku użat. L-ikbar konċentrazzjoni tat-test permissibbli tista' tiġi stabbilita wkoll bid-diviżjoni tal-LC50 akuta ta' 96 siegħa bi proporzjon akut/ kroniku xieraq (eż. proporzjonijiet xierqa għal ċerti sustanzi huma madwar tlieta, iżda wħud huma ikbar minn 100). Jekk tintuża t-tieni konċentrazzjoni, din għandha tvarja minn dik ta' hawn fuq b'fattur ta' għaxra. Jekk dan mhuwiex possibbli għaliex il-kriterju tat-tossiċità (li jillimita l-konċentrazzjoni tat-test superjuri) u l-limitu analitiku (li jillimita l-konċentrazzjoni tat-test inferjuri), jista' jintuża fattur ta' inqas minn għaxra u għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' sustanza tat-test radjotikkettata (tal-ogħla prijorità, eż. idealment > 98 %). Għandha tingħata attenzjoni sabiex ma tintuża ebda konċentrazzjoni li tkun ogħla mil-limitu tas-solubilità tas-sustanza tat-test fil-medja tat-test.
                     
                        Kontrolli
                     
                     Kontroll tal-ilma ta' dilwizzjoni wieħed jew, jekk rilevanti (ara l-paragrafi 30 u 31), kontroll wieħed li fih is-solvent għandu jsir ukoll minbarra s-sensiela ta' testijiet.
                     
                        Il-Frekwenza tal-Kejliet tal-Kwalità tal-Ilma
                     
                     Matul it-test, l-ossiġenu dissolt, it-TOC, il-pH u t-temperatura għandhom jitkejlu fir-reċipjenti kollha tat-test u tal-kontroll. L-ebusija u s-salinità totali (jekk rilevanti) għandhom jitkejlu fil-kontroll(i) u f'reċipjent wieħed. Jekk jiġu ttestjati żewġ konċentrazzjonijiet jew iktar, kejjel dawn il-parametri fil-konċentrazzjoni għolja (jew fl-ogħla waħda). Bħala minimu, l-ossiġenu dissolt u s-salinità (jekk relevanti) għandhom jitkejlu tliet darbiet — fil-bidu, madwar in-nofs u fl-aħħar tal-perjodu tal-perjodu ta' teħid — u darba fil-ġimgħa fil-perjodu ta' tisfija. It-TOC għandu jitkejjel fil-bidu tat-test (24 siegħa u 48 siegħa qabel il-bidu tat-test tal-fażi ta' teħid) qabel jiddaħħal il-ħut u mill-inqas darba fil-ġimgħa, kemm matul il-fażi ta' teħid kif ukoll dik ta' tisfija. It-temperatura għandha titkejjel u tiġi rreġistrata kuljum, il-pH fil-bidu u fl-aħħar ta' kull perjodu u l-ebusija darba f'kull test. Idealment, it-temperatura tiġi ssorveljata kontinwament mill-inqas f'reċipjent wieħed.
                     
                        Kampjunar u Analiżi tal-Ħut u l-Ilma
                     
                     
                        Skeda tal-kampjunar tal-ħut u l-ilma
                     
                     L-ilma għandu jiġi kampjunat mill-kompartimenti tat-test għad-determinazzjoni tal-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test qabel ma jiddaħħal il-ħut u matul kemm il-fażi ta' teħid kif ukoll ta' tisfija. L-ilma għandu jiġi kampjunat qabel l-għalf, fl-istess ħin bħall-kampjunar tal-ħut. Jista' jkun siewi li l-kampjunar isir iktar spiss sabiex jiġu żgurati konċentrazzjonijiet stabbli wara l-introduzzjoni tal-ħut. Matul il-fażi ta' teħid, il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test għandhom jiġu stabbiliti sabiex tiġi verifikata l-konformità mal-kriterji ta' validità (paragrafu 24). Jekk l-analiżijiet tal-kampjun tal-ilma fil-bidu tal-fażi ta' tisfija juru li s-sustanza tat-test mhijiex identifikata, dan jista' jintuża bħala ġustifikazzjoni sabiex ma jitkejjilx l-ilma tat-test u tal-kontroll għas-sustanza tat-test għall-bqija tal-fażi ta' tisfija.
                     Il-ħut għandu jiġi kampjunat tal-inqas ħames darbiet matul il-fażi ta'teħid u tal-inqas erba' darbiet matul il-fażi ta' tisfjia għas-sustanza tat-test. Peress li xi drabi sejjer ikun diffiċli li tiġi kkalkolata stima preċiża raġonevoli tal-valur tal-BCF fuq il-bażi ta' dan in-numru ta' kampjuni (speċjalment meta tkun indikata kinetika li mhijiex dik ta' teħid u tisfija sempliċi tal-ewwel ordni), jista' jkun rakkomandat li l-kampjuni jittieħdu iktar spiss fiż-żewġ perjodi (ara l-Appendiċi 4).
                     Il-kontenut lipidu għandu jiġi determinat fuq l-istess materjal bijoloġiku li jintuża sabiex tiġi determinata l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test tal-inqas fil-bidu u fi tmiem il-fażi ta' teħid u fi tmiem il-fażi ta' tisfija. Jekk dan ma jkunx fattibbli, għandu jittieħed kampjun ta' tal-inqas tliet ħutiet indipendenti sabiex jiġi stabbilit il-kontenut lipidu tal-istess tliet punti ta' żmien. In-numru ta' ħut għal kull tank fil-bidu tal-esperiment għandu jiġi aġġustat kif xieraq (49). Inkella, jekk ma jinstab ebda ammont sinifikanti tas-sustanza tat-test fil-ħut tal-kontroll (jiġifieri ħut mill-popolazzjoni tal-istokk), il-ħut tal-kontroll mit-test jista' jiġi analizzat għal kontenut lipidu biss u l-analiżi tas-sustanza tat-test fil-grupp(i) tat-test (u l-kostant tar-rata ta' teħid relatata, il-kostant tar-rata ta' tisfija u l-valuri tal-BCF) tista' tiġi kkoreġuta għal bidliet skont il-kontenut lipidu tal-grupp tal-kontroll matul it-test (50).
                     Ħut mejjet jew marid ma għandux jiġi analizzat għas-sustanza tat-test jew il-konċentrazzjoni lipida.
                     Eżempju ta' skeda aċċettabbli tal-kontrolli jingħata fl-Appendiċi 4. Skedi oħrajn jistgħu jiġu kkalkolati minnufih bl-użu ta' valuri supponuti oħrajn ta' KOW sabiex jiġi kkalkolat il-ħin tal-esponiment għal teħid ta' 95 % (irreferi għall-Appendiċi 5 għall-kalkoli).
                     Il-kampjunar għandu jitkompla matul il-fażi ta' teħid sakemm ikun ġie stabbilit stat stazzjonarju (ara l-Appendiċi 1, definizzjonijiet u unitajiet) jew il-fażi ta' teħid tiġi terminata b'mod ieħor (wara 28 jew 60 jum, ara l-paragrafi 37 u 38). Qabel ma tibda l-fażi ta' tisfija, il-ħut għandu jiġi ttrasferit f'reċipjenti nodfa.
                     
                        Kampjunar u tħejjija tal-kampjun
                     
                     Il-kampjuni tal-ilma għandhom jinkisbu għall-analiżi eż. b'sifun minn ġot-tubi inerti minn punt ċentrali fil-kompartiment tat-test. La l-filtrazzjoni u lanqas iċ-ċentrifugazzjoni ma jidhru li dejjem jisseparaw il-frazzjoni mhux bijodisponibbli tas-sustanza tat-test minn dik li hija bijodisponibbli. Jekk tiġi applikata teknika ta' separazzjoni, dejjem għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni għal, jew validazzjoni tat-teknika ta' separazzjoni fir-rapport tat-test minħabba d-diffikultajiet tal-bijodisponibilità (25). B'mod partikolari għal sustanzi ferm idrofobiċi (jiġifieri dawk is-sustanzi b'log KOW > 5) (12) (26), fejn jista' jseħħ l-adsorbiment għall-matriċi tal-filtru jew il-kontenituri ta' ċentrifugrazzjoni, il-kampjuni ma għandhomx ikunu soġġetti għal dawk it-trattamenti. Minflok, għandhom jittieħdu miżuri sabiex it-tankijiet jinżammu nodfa kemm jista' jkun (ara l-paragrafu 46) u l-kontenut tal-karbonju organiku totali għandu jiġi ssorveljat kemm matul il-fażi ta' teħid kif ukoll ta' tisfija (ara l-paragrafu 53). Sabiex jiġu evitati intoppi possibbli b'inqas bijodisponibilità, jista' jintuża l-kampjunar b'tekniki ta' mikroestrazzjoni tal-fażi solida għal sustanzi ftit li xejn solubbli u ferm idrofobiċi.
                     Il-ħut fil-kampjun għandu jiġi ewtanizzati minnufih, bl-użu tal-iktar metodu xieraq u umanitarju (għal kejl tal-ħut sħiħ, ebda proċess ieħor apparati t-tlaħliħ bl-ilma (ara l-paragrafu 28) u l-ħut għandu jitnixxef bit-taptip). Iżen u kejjel it-tul totali (51). F'kull ħuta individwali, il-piż u t-tul imkejlin għandhom ikunu marbutin mal-konċentrazzjoni tas-sustanza analizzata (u l-kontenut lipidu, jekk applikabbli), pereżempju bl-użu ta' kodiċi identifikatur uniku għal kull ħuta kampjunata.
                     Huwa preferibbli li jiġu analizzati l-ħut u l-ilma immedjatament wara l-kampjunar sabiex tkun evitata degradazzjoni jew aktar telf u sabiex jiġu kkalkolati l-kostanti approssimativi ta' teħid u r-rata ta' tisfija filwaqt li jitkompla t-test. Analiżi minnufih tevita wkoll dewmien fl-istabbiliment ta' jekk intlaħaqx plateau (stat stazzjonarju).
                     Jekk ma ssirx analiżi immedjata, il-kampjuni għandhom jinħażnu b'metodu xieraq. Qabel ma jibda l-istudju, għandha tinkiseb informazzjoni dwar il-metodu xieraq ta' ħżin għas-sustanza tat-test partikolari — pereżempju, iffriżar profond, żamma f'4 °C, estrazzjoni, eċċ. Id-durata tal-ħżin għandha tingħażel sabiex jiġi żgurat li s-sustanza ma ddegradatx matul il-ħżin.
                     
                        Kwalità tal-metodu analitiku
                     
                     Peress li l-proċedura sħiħa hija rregolata essenzjalment mir-reqqa, il-preċiżjoni u s-sensittività tal-metodu analitiku użat għas-sustanza tat-test, ivverifika b'mod esperimentali li r-reqqa, il-preċiżjoni u r-riproduċibbilità tal-analiżi tas-sustanza, kif ukoll l-irkupru tas-sustanza tat-test kemm mill-ilma kif ukoll mill-ħut huma sodisfaċenti għall-metodu partikolari. Dan għandu jkun parti mit-testijiet preliminari. Ara wkoll li s-sustanza tat-test mhijiex fl-ilma ta' dilwizzjoni użat. Jekk ikun hemm bżonn, irranġa l-valuri tal-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fl-ilma u l-ħut miksuba mit-test għall-irkupri u l-valuri ta' sfond tal-kontrolli. Il-kampjuni tal-ħut u l-ilma għandhom jiġu mmaniġġjati l-ħin kollu b'tali mod li jnaqqas kemm jista' jkun il-kontaminazzjoni u t-telf (eż. li jirriżultaw mill-adsorbiment bl-apparat tal-kampjunar).
                     
                        Analizi tal-kampjuni tal-ħut
                     
                     Jekk fit-test jintużaw materjali radjotikkettati, huwa possibbli li jiġu analizzati għar-radjotikketta totali (jiġifieri prinċipali u metaboliti) jew il-kampjuni jistgħu jitnaddfu sabiex is-sustanza prinċipali tkun tista' tiġi analizzata għaliha. Jekk il-BCF sejjer ikun ibbażat fuq is-sustanza prinċipali, il-metaboliti ewlenin għandhom jiġu kkaratterizzati, tal-inqas fi tmiem il-fażi ta' teħid (ara l-paragrafu 6). Il-metaboliti ewlenin huma dawk li jirrappreżentaw ≥ 10 % tar-residwi totali fit-tessuti tal-ħut, dawk li jirrappreżentaw ≥ 5 % f'żewġ punti tal-kampjunar konsekuttivi, dawk li juru livelli ikbar matul il-fażi ta' teħid, u dawk ta' tħassib tossikoloġiku magħruf. Jekk il-BCF għall-ħut sħiħ f'termini tar-residwi radjotikkettati totali huwa ≥ 500, jista' jkun siewi — u għal ċerti kategoriji ta' sustanzi bħal pestiċidi ferm rakkomandat — li jiġu identifikati u kkwantifikati l-metaboliti ewlenin. Il-kwantifikazzjoni tat-tali metaboliti tista' tkun meħtieġa minn ċerti awtoritajiet regolatorji. Jekk degradati li jirrappreżentaw ≥ 10 % tar-residwi radjotikkettati totali fit-tessut tal-ħut huma identifikati u kkwantifikati, huwa rakkomandat ukoll li mbagħad jiġu identifikati u kkwantifikati d-degradati fl-ilma tat-test. Jekk dan ma jkunx fattibbli, dan għandu jkun spjegat fir-rapport.
                     Normalment il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test għandha tkun determinata għal kull ħuta individwali mwieżna. Jekk dan ma jkunx possibbli, ir-raggruppar tal-kampjuni f'kull okkażjoni tal-kampjunar jista' jsir iżda r-raggruppar ma jirrestrinġix il-proċeduri statistiċi li jistgħu jiġu applikati għad-dejta, u b'hekk fit-test għandu jkun inkluż numru adegwat ta' ħut sabiex jiġi akkomodat ir-raggruppament mixtieq, il-proċedura statistika u s-saħħa statistika. Ir-referenzi (27) u (28) jistgħu jintużaw bħala introduzzjoni għall-proċeduri tar-raggruppar rilevanti.
                     Il-BCF għandu jkun espress bħala normalizzat għal ħut b'kontenut lipidu ta' 5 % (fuq il-bażi tal-piż niedi) minbarra dak derivat direttament mill-istudju (ara l-paragrafu 21), sakemm ma jkunx jista' jiġi argumentat li s-sustanza tat-test ma takkumulax primarjament f'lipidi. Il-kontenut lipidu tal-ħut għandu jiġi stabbilit f'kull mument tal-kampjunar, jekk dan ikun possibbli, idealment fl-istess estratt bħal dak prodott għall-analiżi għas-sustanza tat-test, peress li spiss il-lipidi jkollhom jitneħħew mill-estratt qabel ma jkun jista' jiġi analizzat kromatografikament. Madankollu, l-analiżi tas-sustanzi tat-test spiss teħtieġ proċeduri ta' estrazzjoni speċifiċi li jistgħu jikkontradixxu l-metodi ta' ttestjar għad-determinazzjoni lipida. F'dan il-każ (sakemm ikun hemm metodi strumentali xierqa u mhux qerrieda disponibbli), huwa rakkomandat li titħaddem strateġija differenti sabiex jiġi stabbilit il-kontenut lipidu tal-ħut (ara l-paragrafu 56). Għandhom jintużaw metodi xierqa sabiex jiġi stabbilit il-kontenut lipidu (20). It-teknika ta' estrazzjoni tal-kloroform/metanol (29) tista' tkun rakkomandata bħala metodu standard (30), iżda l-metodu Smedes (31) huwa rakkomandat bħala teknika alternattiva. Dan il-metodu msemmi l-aħħar huwa kkaratterizzat minn effiċjenza komparabbli ta' estrazzjoni, preċiżjoni għolja, l-użu ta' solventi organiċi inqas tossiċi u faċilità tat-twettiq. Jistgħu jintużaw metodi oħrajn li għandhom preċiżjoni aħjar mill-metodi rakkomandati jekk ikunu ġġustifikati kif xieraq. Huwa importanti li jingħataw id-dettalji dwar il-metodu użat.
                     
                        Kejl tat-tkabbir tal-ħut
                     
                     Fil-bidu tat-test, ħames sa għaxar ħutiet mill-popolazzjoni tal-istokk iridu jintiżnu b'mod individwali u jitkejjel it-tul totali tagħhom. Dawn jistgħu jkunu l-istess ħutiet użati għall-analiżi lipida (ara l-paragrafu 56). Il-piż u t-tul tal-ħut użat għal kull kampjun meħud kemm mill-grupp tat-test kif ukoll tal-kontroll għandhom jitkejlu qabel ma ssir l-analiżi kimika jew lipida. Il-kejliet tal-ħut fil-kampjun jistgħu jintużaw sabiex jiġu stmati l-piż u t-tul tal-ħut li jifdal fit-tankijiet tat-test u tal-kontroll (ara l-paragrafu 45).
                     DEJTA U RAPPORTAR
                     
                        Trattament tar-riżultati
                     
                     Il-kurva tat-teħid tas-sustanza tat-test għandha tinkiseb bl-ipplottjar tal-konċentrazzjoni tagħha fil-ħut jew fuqu (jew tessuti speċifiċi) fil-fażi ta' teħid kontra l-ħin fuq skali aritmetiċi. Jekk il-kurva laħqet plateau, jiġifieri, issir dejjem iktar asintomatika għall-assi tal-ħin, il-BCF fi stat stazzjonarju (BCFSS) għandu jiġi kkalkolat minn:
                     
                        
                     L-iżvilupp ta' Cf jista' jkun influwenzat mit-tkabbir tal-ħut (ara l-paragrafu 72 u 73). Il-konċentrazzjoni tal-esponiment medja (C
                           w
                        ) hija influwenzata minn varjazzjoni tul iż-żmien. Jista' jkun mistenni li konċentrazzjoni medja ponderata għall-ħin tkun iktar rilevanti u preċiża għal studji tal-bijoakkumulazzjoni, anki jekk il-varjazzjoni tkun fi ħdan il-medda ta' validità xierqa (ara l-paragrafu 24). Konċentrazzjoni tal-ilma medja ponderata għall-ħin (TWA) tista' tiġi kkalkolata skont l-Appendiċi 5, sezzjoni 1.
                     Il-fattur ta' bijokonċentrazzjoni kinetika (BCFK) għandu jiġi stabbilit bħala l-proporzjon k
                        1/k
                        2, iż-żewġ kostanti tar-rata kinetika tal-ewwel ordni. Il-kostanti tar-rata k
                        1 u k
                        2 u BCFK jistgħu jiġu derivati bl-iffittjar fl-istess ħin tal-fażi ta' teħid kif ukoll dik ta' tisfija. Inkella, k
                        1 u k
                        2 jistgħu jiġu stabbiliti b'mod sekwenzjali (ara l-Appendiċi 5 għal deskrizzjoni u paragun ta' dawn il-metodi). Il-kostant tar-rata ta' tisfija (k
                        2) jista' jkun jeħtieġ li jiġi kkoreġut għad-dilwizzjoni tat-tkabbir (ara l-paragrafu 72 u 73). Jekk ikun ovvju li l-kurva tat-teħid u/jew it-tisfija mhijiex l-ewwel ordni, għandhom jintużaw mudelli iktar kumplessi (ara r-referenzi fl-Appendiċi 5) u għandu jitfittex parir mingħand espert tal-bijostatistika u/jew tal-farmakokinetika.
                     
                        Dejta dwar il-piż/it-tul tal-ħut
                     
                     Il-piżijiet niedja u t-tul totali tal-ħut individawli għall-intervalli tal-kampjunar kollha jitqiegħdu f'tabella b'mod separat għall-gruppi tat-test u tal-kontroll matul il-fażijiet ta' teħid (inkluża l-popolazzjoni tal-istokk għall-bidu tat-teħid) u ta' tisfija. F'kull ħuta individwali, il-piż u t-tul imkejlin għandhom ikunu marbutin mal-konċentrazzjoni kimika analizzata, pereżempju bl-użu ta' kodiċi identifikatur uniku għal kull ħuta kampjunata. Il-piż huwa l-kejl ippreferut tat-tkabbir għall-fini ta' korrezzjoni tal-valuri tal-BCF kinetiku għad-dilwizzjoni tat-tkabbir (ara l-paragrafu 73 u l-Appendiċi 5 għall-metodu użat għall-korrezzjoni tad-dejta għad-dilwizzjoni tat-tkabbir).
                     
                        Korrezzjoni tad-Dilwizzjoni tat-Tkabbir u n-Normalizzazzjoni tal-Lipidi
                     
                     It-tkabbir tal-ħut matul il-fażi ta' tisfija jista' jbaxxi l-konċentrazzjonijiet kimiċi mkejlin fil-ħut bl-effett li l-kostant totali tar-rata ta' tisfija (k
                        2) ikun ikbar minn dak li jirriżulta minn proċessi ta' tneħħija (eż. respirazzjoni, metaboliżmu, eġestjoni) waħedhom. Il-fatturi ta' bijokonċentrazzjoni kinetika għandhom jiġu kkoreġuti għad-dilwizzjoni tat-tkabbir. BCFSS sejjer ikun influwenzat mit-tkabbir ukoll, iżda ma hemm ebda proċedura miftiehma disponibbli għall-korrezzjoni ta' BCFSS għat-tkabbir. F'każijiet ta' tkabbir sinifikanti, il-BCFK, ikkoreġut għat-tkabbir (BCFKg), għandu jinkiseb ukoll peress li jista' jkun kejl iktar rilevanti tal-fattur ta' bijokonċentrazzjoni. Il-kontenuti lipidi tal-ħut tat-test (li huma ferm assoċjati mal-bijoakkumulazzjoni ta' sustanzi idrofobiċi) jistgħu jvarjaw biżżejjed fil-prattika tant li jkun hemm bżonn normalizzazzjoni għal kontenut lipidu tal-ħut stabbilit (5 % w/w) sabiex jiġu ppreżentati l-fatturi tal-bijokonċentrazzjoni kinetika kif ukoll fi stat stazzjonarju b'mod sinifikanti, sakemm ma jkunx jista' jiġi argumentat li s-sustanza tat-test ma takkumulax primarjament f'lipidu (eż. ċerti sustanzi perfluworinati jistgħu jaqbdu mal-proteini). L-ekwazzjonijiet u l-eżempji għal dawn il-kalkoli jistgħu jinkisbu fl-Appendiċi 5.
                     Sabiex jiġi kkoreġut BCF kinetiku għad-dilwizzjoni tat-tkabbir, il-kostant tar-rata ta' tisfija għandu jiġi kkoreġut għat-tkabbir. Dan il-kostant tar-rata ta' tisfija kkoreġut għat-tkabbir (k
                        2g) huwa kkalkolat billi l-kostant tar-rata ta' tkabbir (k
                        g, kif miksub mid-dejta dwar il-piż imkejjel) jitnaqqas mill-kostant tar-rata ta' tisfija totali (k
                        2). Imbagħad jiġi kkalkolat il-fattur ta' bijokonċentrazzjoni kinetika kkoreġut għat-tkabbir billi l-kostant tar-rata ta' teħid (k
                        1) jiġi diviż bil-kostant tar-rata ta' tisfija kkoreġut għat-tkabbir (k
                        2g) (ara l-Appendiċi 5). F'ċerti każijiet dan l-approċċ ikun f'riskju. Pereżempju, għal sustanzi li jissaffew bil-mod ħafna ttestjati f'ħut li jikber malajr, il-k
                        2g derivat jista' jkun żgħir ħafna u b'hekk l-iżball fiż-żewġ kostanti tar-rati użati sabiex jinkiseb isir kritiku, u f'ċerti każijiet l-istimi tal-kg jistgħu jkunu ikbar mill-k
                        2. Approċċ alternattiv li jevita l-ħtieġa ta' korrezzjoni tad-dilwizzjoni tat-tkabbir jinvolvi l-użu ta' dejta dwar it-tisfija tal-massa tas-sustanza tat-test għal kull ħuta (fuq il-bażi tal-ħuta sħiħa) minflok id-dejta tas-soltu dwar il-massa tas-sustanza tat-test għal kull unità tal-massa tal-ħut (konċentrazzjoni). Dan jista' jinkiseb faċilment peress li t-testijiet skont dan il-metodu ta' ttestjat għandhom jorbtu l-konċentrazzjonijiet tat-tessut irreġistrati mal-piżijiet tal-ħut individwali. Il-proċedura sempliċi għal dan hija spjegata fl-Appendiċi 5. Kun af li l-k
                        2 xorta waħda għandu jiġi stmat u rrapportat, anki jekk jintuża dan l-approċċ.
                     Il-fatturi tal-bijokonċentrazzjoni kinetika u fi stat stazzjonarju għandhom jiġu rrapportati wkoll b'rabta mal-kontenut lipidu tal-ħut prestabbilit ta' 5 % (w/w), sakemm ma jkunx jista' jiġi argumentat li s-sustanza tat-test ma takkumulax primarjament f'lipidu. Id-dejta dwar il-konċentrazzjoni tal-ħut, jew il-BCF, huma normalizzati skont il-proporzjon bejn 5 % u l-kontenut lipidu medju (individwali) attwali (f' % piż niedi) (ara l-Appendiċi 5).
                     Jekk l-analiżijiet kimiċi u lipidi saru fuq l-istess ħut, id-dejta normalizzata għal-lipidu tal-ħut individwali għandha tintuża sabiex jiġi kkalkolat BCF normalizzat għal-lipidu. Inkella, jekk it-tkabbir fil-ħut tal-kontroll u l-ħut espost ikun simili, jista' jintuża l-kontenut lipidu tal-ħut tal-kontroll waħdu għall-korrezzjoni għal-lipidu (ara l-paragrafu 56). Metodu għall-kalkolu ta' BCF normalizzat għal-lipidu huwa deskritt fl-Appendiċi 5.
                     
                        Interpretazzjoni tar-riżultati
                     
                     Ir-riżultati għandhom jiġu interpretati b'kawtela meta l-konċentrazzjonijiet imkejlin tas-soluzzjonijiet tat-test iseħħu f'livelli qrib il-limitu ta' detezzjoni tal-metodu analitiku.
                     Fil-prinċipju, it-tkabbir medju fil-grupp tat-test kif ukoll f'tal-kontroll ma għandux ikun wisq differenti sabiex jiġu esklużi l-effetti tossiċi. Il-kostanti tar-rata ta' tkabbir jew il-kurvi tat-tkabbir taż-żewġ gruppi għandhom jitqabblu permezz ta' proċedura xierqa (52)).
                     Kurvi tat-teħid u t-tisfija definiti ċari huma indikazzjoni ta' dejta dwar il-bijokonċentrazzjoni ta' kwalità tajba. Għall-kostanti tar-rati, ir-riżultat ta' test χ2 ta' kemm joqgħod tajjeb għandu juri li joqgħod tajjeb (jiġifieri perċentwal żgħir ta' żball fil-kejl (32)) għall-mudell ta' bijoakkumulazzjoni, sabiex il-kostanti tar-rati jkunu jistgħu jitqiesu affidabbli (ara l-Appendiċi 5). Jekk tintuża iktar minn konċentrazzjoni tat-test waħda, il-varjazzjoni fil-kostanti ta' teħid/tisfija bejn il-konċentrazzjonijiet tat-test għandha tkun inqas minn 20 % (53). Jekk le, tista' tiġi indikata d-dipendenza fuq il-konċentrazzjoni. Għandhom ikunu rreġistrati d-differenzi sinifikanti osservati fir-rati ta' teħid/tisfija bejn il-konċentrazzjonijiet applikati tat-test u jingħataw l-ispjegazzjonijiet possibbli. Ġeneralment, il-limitu ta' kunfidenza ta' 95 % tal-BCFs minn studju ddisinjati kif xieraq joqrob lejn ± 20 % tal-BCF derivat.
                     Jekk jiġu ttestjati żewġ konċentrazzjonijiet jew iktar, ir-riżultati taż-żewġ konċentrazzjonijiet jew kollha kemm huma jintużaw sabiex jiġi eżaminat jekk ir-riżultati humiex konsistenti u sabiex jintwera jekk hemmx dipendenza fuq il-konċentrazzjoni. Jekk tiġi ttestjata konċentrazzjoni waħda biss sabiex jitnaqqas l-użu ta' annimali u/jew riżorsi, għandha tingħata ġustifikazzjoni għall-użu ta' konċentrazzjoni waħda.
                     Il-BCFSS li jirriżulta jkun dubjuż jekk il-BCFK ikun ferm ikbar mill-BCFSS, peress li dan jista' jkun indikazzjoni li l-istat stazzjonarju ma ntlaħaqx jew li d-dilwizzjoni tat-tkabbir u l-proċessi tat-telf ma ġewx ikkunsidrati. F'każijiet li fihom il-BCFSS ikun ferm ogħla mill-BCFK, id-derivazzjoni tal-kostanti tar-rata ta' teħid u ta' tisfija għandha tiġi vverifikata għal żbalji u terġa' tiġi evalwata. Proċedura ta' ffittjar differenti tista' ttejjeb l-istima tal-BCFK (ara l-Appendiċi 5).
                     
                        Rapport tat-test
                     
                     Apparti l-informazzjoni dwar is-sustanza tat-test indikata fil-paragrafu 3, ir-rapport tat-test jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanza tat-test:
                                 
                                 L-għamla fiżika u, fejn rilevanti, il-proprjetajiet fiżjokimiċi;
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Dejta dwar l-identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ. (inkluż il-kontenut ta' karbonju organiku, jekk xieraq).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Għal sustanzi multikostitwenti u UVCB (sustanzi kimiċi b'kompożizzjoni Mhux Magħrufa jew Varjabbli, Prodotti ta' reazzjoni kumplessa u Materjali bijoloġiċi) deskrizzjoni, safejn possibbli, tal-identità kimika tal-kostitwenti individwali u, għal kull wieħed, tal-perċentwal tiegħu mill-massa totali tas-sustanza. Għandu jiġi spjegat fil-qosor kif il-metodu analitiku użat fit-test jirrifletti kejl tal-konċentrazzjoni tas-sustanza; il-proċeduri analitiċi kollha għandhom jiġu deskritti, inklużi l-preċiżjoni tal-metodu, il-limitu ta' detezzjoni tal-metodu, u l-limitu ta' kwantifikazzjoni.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Jekk radjotikkettati, il-pożizzjoni preċiża tal-atomu/i tikkettati u l-perċentwal tar-radjuattività assoċjata mal-impuritajiet.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Informazzjoni dwar it-tossiċità tas-sustanza tat-test għall-ħut (idealment l-ispeċi tat-test). It-tossiċità għandha tiġi rrapportata bħala LC50 akuta fuq 96 siegħa u NOAEC & LOAEC minn studju kroniku (jiġifieri test fi stadju bikri tal-ħajja jew test taċ-ċiklu sħiħ tal-ħajja, jekk disponibbli).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-kundizzjonijiet tal-ħżin tas-sustanza kimika tat-test jew is-sustanza tat-test u l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test jew is-sustanza tat-test fil-kundizzjonijiet tal-ħżin jekk kienet maħżuna qabel ma ntużat.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Speċijiet tat-test:
                                 
                                 L-isem xjentifiku, ir-razza, is-sors, kwalunkwe pretrattament, l-akklimatizzazzjoni, l-età, is-sess (jekk rilevanti), il-medda tad-daqs (piż u tul), eċċ.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kundizzjonijiet tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-proċedura tat-test użata (eż. bi fluss kontinwu jew semistatika); studju regolari jew disinn minimizzat (inklużi raġuni u ġustifikazzjoni).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             It-tip u l-karatteristiċi tal-illuminazzjoni użata u l-fotoperjodu/i.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Id-disinn tat-test (eż. in-numru u l-kobor tal-kompartimenti tat-test, ir-rata tal-bdil tal-volum tal-ilma, ir-rata ta' tagħbija, in-numru tar-repliki, in-numru tal-ħut għal kull replika, in-numru tal-konċentrazzjonijiet tat-test, it-tul tal-fażijiet ta' teħid u tisfija, il-frekwenza tal-kampjunar għall-kampjuni tal-ħut u tal-ilma),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Metodu tal-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet tal-ħażna u l-frekwenza tar-rinnovar (is-solvent, il-konċentrazzjoni tiegħu u l-kontribuzzjoni tiegħu għall-kontenut ta' karbonju organiku tal-ilma tat-test għandhom jingħataw, meta jintużaw) jew deskrizzjoni tas-sistema ta' dożaġġ alternattiva.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-konċentrazzjonijiet nominali tat-test, il-mezzi tal-valuri mkejlin u d-devjazzjonijiet standard tagħhom fir-reċipjenti tat-test u l-metodu li nkisbu bih.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Is-sors tal-ilma ta' dilwizzjoni, deskrizzjoni ta' kwalunkwe pretrattament, ir-riżultati ta' kwalunkwe wiri tal-ħila tal-ħut tat-test li jgħix fl-ilma, u l-karatteristiċi tal-ilma: il-pH, l-ebusija, it-temperatura, il-konċentrazzjoni ta' ossiġenu dissolt, il-livelli ta' kloru residwu (jekk imkejla), il-karbonju organiku totali, is-solidi sospiżi, is-salinità tal-medium tat-test (jekk xieraq) u kwalunkwe kejl ieħor li jsir.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-kwalità tal-ilma fir-reċipjenti tat-test, il-pH, l-ebusija, it-TOC, it-temperatura u l-konċentrazzjoni tal-ossiġenu dissolt; il-metodi użati u l-frekwenza tal-kejliet.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Informazzjoni ddetaljata fuq l-għalf, eż. it-tip ta' ikel, is-sors, il-komposizzjoni (tal-inqas tal-kontenut lipidu u tal-proteini jekk possibbli), ir-rata tal-għalf magħżula, l-ammont mogħti u l-frekwenza;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Informazzjoni fuq it-trattament tal-kampjuni tal-ħut u tal-ilma, inklużi d-dettalji dwar il-preparazzjoni, il-ħżin, l-estrazzjoni u l-proċeduri analitiċi (u l-preċiżjoni) għas-sostanza tat-test u l-kontenut lipidu.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-metodi użati għall-każwalizzazzjoni tat-trattament u l-assenjament tal-ħut għar-reċipjent tat-test.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Id-data tat-tidħil tal-organiżmi tat-test fis-soluzzjonijiet tat-test u d-durata tat-test.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni tat-testijiet tas-sejbien tal-medda u r-riżultati, jekk disponibbli.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ir-riżultati:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Ir-riżultati minn kwalunkwe studju preliminari li sar.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-mortalità tal-ħut tal-kontroll u l-ħut f'kull kompartiment tal-esponiment u kwalunkwe mġiba anormali osservata.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Informazzjoni dwar kwalunkwe effett avvers osservat.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni sħiħa tal-proċeduri ta' analiżi kimika kollha mħaddmin inklużi l-limiti ta' detezzjoni u l-kwantifikazzjoni, il-varjabbiltà u l-irkupru.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-kontenut lipidu tal-ħut, inkluż il-metodu użat u, jekk derivat, il-fattur ta' normalizzazzjoni tal-lipidu (Ln, fattur sabiex jiġu espressi riżultati relattivi għall-kontenut lipidu tal-ħut ta' 5 %).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Dejta f'tabella tal-piż (u t-tul) tal-ħut, b'rabta mal-konċentrazzjonijiet kimiċi tal-ħut individwali (u l-kontenut lipidu, jekk applikabbli), kemm għall-gruppi tal-kontroll u tal-esponiment (pereżempju bl-użu ta' identifikaturi uniċi għal kull ħuta fil-kampjun) u kalkoli għall-kostant(i) tar-rata ta' tkabbir derivat.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Dejta f'tabella tal-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħut (Cf, marbuta mal-ħut individwali) u l-ilma (Cw) (bil-valuri medji għall-grupp tat-test u l-kontroll, id-devjazzjoni standard u l-medda, jekk xierqa) għall-ħinijet tal-kampjunar kollha (Cf espressa f'mg/kg piż niedi tal-ġisem sħiħ jew tessuti speċifikati fih, eż. lipid, u Cw f'mg/l). Valuri tas-Cw għas-serje tal-kontroll (l-isfond għandu jiġi rrapportat ukoll).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-kurvi (inkluża d-dejta mkejla kollha), li juru dan li ġej (jekk applikabbli, il-konċentrazzjonijiet jistgħu jiġu espressi b'rabta mal-ġisem sħiħ u l-kontenut lipidu normalizzat għal 5 % tal-annimal jew tessuti speċifiċi tiegħu):
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         it-tkabbir, jiġifieri l-piż tal-ħut vs il-ħin jew il-piż trasformat tal-logaritma naturali vs il-ħin (inkluż il-kostant tar-rata ta' tkabbir derivata, k
                                                            g);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         it-teħid u t-tisfija tas-sustanza tat-test fil-ħut (fi graff wieħed);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-ħin għall-istat stazzjonarju (jekk jinkiseb);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-konċentrazzjoni trasformata tal-logaritma naturali vs il-ħin tat-teħid (inkluż il-kostant tar-rata ta' teħid derivat k
                                                            1);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-konċentrazzjoni trasformata tal-logaritma naturali (f'konċentrazzjoni) vs il-ħin tat-tisfija (inkluż il-kostant tar-rata ta' tisfija derivat k
                                                            2); u
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-kurvi tal-fażi ta' teħid kif ukoll ta' tisfija, li juru kemm id-dejta kif ukoll il-mudell iffittjat.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Jekk spezzjoni viżiva ta' plott turi eċċezzjonijiet ovvji, jista' jiġi applikat test tal-eċċezzjonijiet statistikament validu sabiex jitneħħew punti ta' dejta spurji kif ukoll tingħata ġustifikazzjoni dokumentata għaliex tneħħew.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-fattur ta' bijokonċentrazzjoni fi stat stazzjonarju (BCFSS), jekk (kważi) jinkiseb stat stazzjonarju.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-fattur ta' bijokonċentrazzjoni kinetika (BCFK) u l-kostanti tar-rata ta' tisfija u teħid derivati k
                                                1 u k
                                                2, flimkien mal-varjanzi f'k
                                                2 (pendil u interċetta) jekk jintuża ffittjar sekwenzjali.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-limiti tal-kunfidenza, id-devjazzjoni standard (kif disponibbli) u l-metodi ta' kalkolu/analiżi tad-dejta għal kull parametru għal kull konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test użata.
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Kwalunkwe informazzjoni li tikkonċerna metaboliti radjotikkettati tas-sustanza tat-test u l-akkumulazzjoni tagħhom.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-kostant(i) tar-rata ta' tkabbir (inkluż l-intervall(i) ta' kunfidenza ta' 95 %) u l-valuri tal-kostant tar-rata ta' tisfija kkoreġut għat-tkabbir ikkalkolat (k
                                                            2g), tan-nofs ħajja u tal-BCF (BCFKg).
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Kwalunkwe ħaġa li mhijiex tas-soltu dwar it-test, kwalunkwe devjazzjoni minn dawn il-proċeduri, u kwalunkwe informazzjoni rilevanti oħra.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Tabella li tiġbor id-dejta mkejla u kkalkolata rilevanti, kif spjegat hawn:
                                                         
                                                                     Il-Kostanti tar-Rata ta' Teħid u Tisfija tas-Sustanza u l-Fatturi ta' Bijokonċentrazzjoni (BCF)
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        g (kostant tar-rata ta' tkabbir; jum– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Daħħal Valur (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        1 (kostant totali tar-rata ta' teħid; l kg– 1 jum– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Daħħal Valur (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        2 (kostant totali tar-rata tat-tisfija; jum– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Daħħal Valur (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        2g (kostant tar-rata ta' tisfija korrett għat-tkabbir; jum– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Daħħal Valur (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     Cf (konċentrazzjoni kimika fil-ħut fi stat stazzjoanrju; mg kg– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Daħħal Valur ± SD (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     Cw (konċentrazzjoni kimika fl-ilma; mg l– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Daħħal Valur ± SD (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     Ln (fattur ta' normalizzazzjoni għal-lipidu):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Daħħal Valur (3)
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFSS (BCF fi stat stazzjonarju; l kg– 1)
                                                                  
                                                                  
                                                                     Daħħal Valur ± SD (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFSSL BCF fi stat stazzjonarju normalizzat għal-lipidu; l kg– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Daħħal Valur (3) ± SD (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFK (BCF kinetiku; l kg– 1)
                                                                  
                                                                  
                                                                     Daħħal Valur (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFKg (BCF kinetiku kkoreġut għat-tkabbir; l kg– 1)
                                                                  
                                                                  
                                                                     Daħħal Valur (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        t
                                                                        1/2g (nofs ħajja kkoreġuta għat-tkabbir; jum):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Daħħal Valur (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFKL (BCF kinetiku normalizzat għal-lipidu; l kg– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Daħħal Valur
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFKL (BCF kinetiku kkoreġut għat-tkabbir normalizzat għal-lipidu; l kg– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Daħħal Valur
                                                                  
                                                               Ir-riżultati rrapportati bħala “mhux identifikati/ikkwalifikati fil-limitu ta' detezzjoni/kwantifikazzjoni” bi żvilupp ta' metodu ta' qabel l-ittestjar u disinn sperimentali għandhom jiġu evitati, peress li dawn ir-riżultati ma jistgħux jintużaw għal kalkoli tal-kostanti tar-rati.
                                                      
                                                   
                                       
                           C.13 — II   Test tal-Ħut tal-Esponiment Milwiem Minimizzat
                     
                     INTRODUZZJONI
                     L-esperjenza dejjem ikbar li nkisbet fit-twettiq u l-interpretazzjoni tat-test sħiħ, kemm mil-laboratorji kif ukoll mill-korpi regolatorji, turi li — bi ftit eċċezzjonijiet — il-kinetika tal-ewwel ordni tapplika għall-istima tal-kostanti tar-rati ta' teħid u tisfija. B'hekk, il-kostanti tar-rata ta' teħid u tisfija jistgħu jiġu stmati b'minimu ta' punti tal-kampjunar, u l-BCF kinetiku derivat.
                     L-iskop inizjali tal-eżaminazzjoni ta' disinni alternattivi għall-istudji tal-BCF kien li jiġi żviluppat test żgħir li jintuża fi stadju ta' ttestjar intermedju jew li jiġu kkonfermati l-istimi tal-BCF fuq il-bażi tal-KOW u l-QSARs u sabiex tiġi eliminata l-ħtieġa ta' studju sħiħ għal ħafna sustanzi, u sabiex jiġu minimizzati l-kost u l-użu ta' annimali bit-tnaqqis fil-kampjunar u fin-numru ta' sekwenzi analitiċi mwettqin. Filwaqt li jiġi segwit id-disinn ewlieni tal-metodu ta' ttestjar preċedenti sabiex ikunu jistgħu jiġu intergrati r-riżultati tat-test mad-dejta tal-BCF eżistenti, u sabiex jitħaffu t-twettiq tal-ittestjar u l-interpretazzjoni tad-dejta, l-iskop kien li jiġu pprovduti stimi tal-BCF b'reqqa u preċiżjoni adegwati għal deċiżjonijiet dwar il-valutazzjoni tar-riskju. Ħafna mill-istess kunsiderazzjonijiet japplikaw bħal fit-test sħiħ, eż. kriterji tal-validità (ara l-paragrafu 24) u l-waqfien ta' test jekk jidher teħid inisinifikanti fi tmiem il-fażi ta' teħid (ara l-paragrafi 16 u 38).
                     Is-sustanzi li jkunu eliġibbli għad-disinn tat-test minimizzat għandhom jappartjenu għad-dominju ġenerali li għalih ġie żviluppat dan il-metodu ta' ttestjar, jiġifieri sustanzi organiċi mhux polari (ara l-paragrafu 49). Jekk hemm xi indikazzjoni li s-sustanza li sejra tiġi ttestjata tista' turi mġiba differenti (eż. devjazzjoni ċara mill-kinetika tal-ewwel ordni), għandu jsir test sħiħ għal finijiet regolatorji.
                     Tipikament, it-test minimizzat ma jsirx tul perjodu iqsar mit-test tal-BCF standard, iżda jinvolvi inqas kampjunar tal-ħut (ara l-Appendiċi 6 għar-raġuni). Madankollu, il-perjodu ta' tisfija jista' jitqassar għal sustanzi li jissaffew malajr sabiex jiġi evitat milli l-konċentrazzjonijiet fil-ħut jaqgħu taħt il-limitu ta' detezzjoni/kwantifikazzjoni qabel ma jintemm it-test. Jista' jintuża test tal-ħut b'esponiment minimizzat b'konċentrazzjoni waħda sabiex tiġi stabbilita l-ħtieġa ta' test sħiħ, u jekk id-dejta li tirriżulta użata sabiex jiġu kkalkolati l-kostanti tar-rati u l-BCF tkun robusta (ara l-paragrafu 93), it-test sħiħ jista' jiġi evitat jekk il-BCF li jirriżulta ma jkun xejn qrib il-valuri regolatorji ta' tħassib.
                     F'ċerti każijiet, jista' jkun ta' vantaġġ li jsir id-disinn tat-test minimizzat b'iktar minn konċentrazzjoni tat-test waħda bħala test preliminari sabiex jiġi stabbilit jekk l-istimi tal-BCF għal sustanza humiex dipendenti mill-konċentrazzjoni. Jekk l-istimi tal-BCF mit-test minimizzat juru dipendenza mill-konċentrazzjoni, bilfors ikollu jitwettaq it-test sħiħ. Jekk, fuq il-bażi ta' test minimizzat bħal dan, l-istimi tal-BCF ma jkunux dipendenti mill-konċentrazzjoni iżda r-riżultati ma jitqisux definittivi, kwlunkwe test sħiħ sussegwenti jista' jsir b'konċentrazzjoni waħda, u b'hekk jonqos l-użu ta' annimali meta mqabbel ma' test sħiħ b'żewġ konċentrazzjonijiet (jew iktar).
                     Sustanzi potenzjalment eliġibbli għat-test minimizzat:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Għandu jkollhom probabilità li jesibixxu teħid tal-ewwel ordni approssimattiv u kinetika ta' tisfija, eż. derivati minn read-across b'sustanzi simili;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Għandu jkollhom log KOW < 6 sakemm ma jkunx mistenni metaboliżmu rapidu (56);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Għandhom ikunu solubbli fl-ilma fir-rigward tat-teknika analitika (ara l-paragrafu 24);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Għandhom ikunu kwantifikabbli (jiġifieri l-konċentrazzjonijiet għandhom ikunu tal-inqas ordni ta' kobor ikbar mil-limitu ta' kwantifikazzjoni), kemm fil-ħut kif ukoll fl-ilma, it-tikkettar radjuattiv huwa rakkomandat (ara l-paragrafu 23); u
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Għandu jkollhom perjodu ta' tisfija ikbar min-nofs ħajja prevista tagħhom (ara l-Appendiċi 5 għall-kalkoli), jew id-durata tat-tisfija għandha tiġi aġġustata kif xieraq (ara l-paragrafu 91). Eċċezzjoni għal din ir-regola hija permessa jekk ikun mistenni metaboliżmu rapidu tas-sustanza.
                              
                           SKEDA TAL-KAMPJUNAR GĦAL STUDJI SKONT ID-DISINN MINIMIZZAT
                     
                        Kampjunar tal-Ħut
                     
                     Il-kampjunar tal-ħut jitnaqqas għal erba' punti tal-kampjunar:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Fin-nofs u fi tmiem il-fażi ta' teħid (din tal-aħħar li hija l-bidu tat-tisfija wkoll), eż. wara 14 u 28 jum (33).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 F'nofs il-fażi ta' tisfija u fi tmiem l-istudju (meta l-konċentrazzjoni tas-sustanza tkun < 10 % tal-konċentrazzjoni massima, jew tal-inqas biċ-ċar oltre nofs ħajja waħda tas-sustanza), eż. wara 7 u 14-il jum ta' tisfija (33). Jekk tkun mistennija jew osservata tisfija rapida, jista' jkun hemm bżonn li jitqassar il-perjodu ta' tisfija sabiex jiġi evitat milli l-konċentrazzjonijiet fil-ħut jaqgħu taħt il-limitu ta' kwantifikazzjoni.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Kejl tal-lipidu bħal fl-istudju sħiħ.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Korrezzjoni tat-tkabbir bħal fl-istudju sħiħ.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-BCF huwa kkalkolat bħala BCF kinetiku.
                              
                           
                        Kampjunar tal-ilma
                     
                     Għad-disinn minimizzat, l-ilma jiġi kampjunat bħal fl-istudju sħiħ (ara l-paragrafu 54) jew tal-inqas ħames darbiet maqsumin bl-eżatt matul il-fażi ta' teħid, u kull ġimgħa fil-fażi ta' tisfija.
                     
                        Modifiki fid-disinn
                     
                     Fid-dawl tal-proprjetajiet tas-sustanza tat-test, previżjonijiet validi tal-QSAR u l-iskop speċifiku tal-istudju, jistgħu jiġu kkunsidrati ċerti modifiki fid-disinn tal-istudju:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Jekk ikun hemm bżonn ta' perċezzjoni ikbar, jista' jintuża iktar ħut (6 jew 8 minflok 4) għall-kampjun fi tmiem il-fażi ta' teħid.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 L-inklużjoni ta' grupp “żejjed” ta' ħut li sejjer jintuża jekk it-tisfija wara 14-il jum (jew it-tmiem imbassar tal-fażi ta' tisfija) ma tkunx biżżejjed għal tisfija adegwata (jiġifieri > 50 %). Jekk id-durata mbassra tal-fażi ta' tisfija tkun iqsar jew itwal minn 14-il jum, l-iskeda ta' kampjunar għandha tiġi adattata (jiġifieri grupp tal-ħut wieħed fit-tmiem imbassar tal-fażi ta' tisfija, u grupp wieħed wara nofs dak iż-żmien).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 L-użu ta' żewġ konċentrazzjonijiet tat-test sabiex tiġi esplorata d-dipendenza possibbli mill-konċentrazzjoni. Jekk ir-riżultati tat-test minimizzat, imwettaq b'żewġ konċentrazzjonijiet tat-test, juru li l-BCF mhuwiex dipendenti mill-konċentrazzjoni (jiġifieri jvarja inqas minn 20 %), konċentrazzjoni tat-test waħda tista' tiġi kkunsidrata biżżejjed f'test sħiħ, jekk isir.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Jidher probabbli li l-mudelli tal-proċessi ta' bijoakkumulazzjoni bħal dawk proposti minn Arnot et al. (35) jistgħu jintużaw sabiex jgħinu fl-ippjanar tat-tul tal-fażijiet ta' teħid u tisfija (ara wkoll l-Appendiċi 5).
                              
                           
                        Kalkoli
                     
                     Ir-raġuni wara dan l-approċċ hija li l-fattur ta' bijokonċentrazzjoni f'test sħiħ jista' jew jiġi stabbilit bħala fattur ta' bijokonċentrazzjoni fi stat stazzjonarju (BCFSS) billi jiġi kkalkolat il-proporzjon tal-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fit-tessut tal-ħut għall-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fl-ilma, jew billi jiġi kkalkolat il-fattur ta' bijokonċentrazzjoni kinetika (BCFK) bħala l-proporzjon tal-kostant tar-rata ta' teħid k
                        1 għall-kostant tar-rata ta' tisfija k
                        2. Il-BCFK huwa validu anki jekk ma tintlaħaqx konċentrazzjoni fi stat fiss ta' sustanza matul it-teħid, diment li t-teħid u t-tisfija jaġixxu bejn wieħed u ieħor skont il-proċessi tal-kinetika tal-ewwel ordni. Bħala minimu assolut, huma meħtieġa żewġ punti ta' dejta sabiex jiġu stmati l-kostanti tar-rati ta' teħid u tisfija, wieħed fi tmiem il-fażi ta' teħid (jiġifieri fil-bidu tal-fażi ta' tisfija) u wieħed fi tmiem il-fażi ta' tisfija (jew wara parti sinifikanti tagħha). Il-punt ta' kampjunar intermedju huwa rakkomandat bħala verifika fuq il-kinetika tat-teħid u t-tisfija (57). Għall-kalkoli, ara l-Appendiċijiet 5 u 6.
                     
                        Interpretazzjoni tar-riżultati
                     
                     Sabiex jiġu vvalutati l-validità u l-valur informattiv tat-test, ivverifika li l-perjodu ta' tisfija jaqbeż nofs ħajja waħda. Barra minn hekk, il-BCFKm (BCF kinetiku derivat minn test minimizzat) għandu jitqabbel mal-valur tal-BCFSS minimizzat (li huwa l-BCFSS ikkalkolat fi tmiem il-fażi ta' teħid, jekk jiġi supponut li ntlaħaq stat stazzjonarju. Dan jista' jiġi supponut biss, għaliex in-numru ta' punti ta' kampjunar mhuwiex biżżejjed sabiex tingħata prova ta' dan). Jekk il-BCFKm < BCFSS minimizzat, il-BCFSS minimizzat għandu jkun il-valur ippreferut. Jekk il-BCFKm ikun inqas minn 70 % tal-BCFSS minimizzat, ir-riżultati mhumiex validi, u għandu jsir test sħiħ.
                     Jekk it-test minimizzat jagħti BCFKm ta' madwar kwalunkwe valur ta' tħassib regolatorju, għandu jsir test sħiħ. Jekk ir-riżultat ma jkun qrib ebda valur regolatorju ta' tħassib (ferm ogħla jew inqas), jaf ma jkunx hemm bżonn li jsir test sħiħ, jew jista' jsir test sħiħ b'konċentrazzjoni waħda jekk dan ikun meħtieġ mill-qafas regolatorju rilevanti.
                     Jekk jinstab li test sħiħ huwa neċessarju wara test minimizzat f'konċentrazzjoni waħda, dan jista' jsir bit-tieni konċentrazzjoni. Jekk ir-riżultati jkunu konsistenti, jista' ma jsirx test ieħor sħiħ f'konċentrazzjoni differenti, peress li l-bijokonċentrazzjoni tas-sustanza ma tkunx mistennija li tkun dipendenti mill-konċentrazzjoni. Jekk it-test minimizzat sar f'żewġ konċentrazzjonijiet, u r-riżultati ma juru ebda dipendenza mill-konċentrazzjoni, it-test sħiħ jista' jsir b'konċentrazzjoni waħda biss (ara l-paragrafu 87).
                     
                        Rapport tat-test
                     
                     Ir-rapport tat-test għat-test minimizzat għandu jinkludi l-informazzjoni kollha mitluba għat-test sħiħ (ara l-paragrafu 81), ħlief dik li ma tistax tiġi elaborata (jiġifieri kurva li turi l-ħin għall-istat stazzjonarju u l-fattur ta' bijokonċentrazzjoni fi stat stazzjonarju; għal dan tal-aħħar, minflok għandu jingħata l-BCFss minimizzat). Barra minn hekk, għandu jinkludi wkoll ir-raġuni għall-użu tat-test minimizzat u l-BCFKm li jirriżulta.
                     C.13 — III   Test tal-Bijoakkumulazzjoni b'Esponiment Djetetiku fil-Ħut
                     
                     INTRODUZZJONI
                     Il-metodu deskritt f'din is-sezzjoni għandu jintuża għal sustanzi li fihom il-metodoloġija ta' esponiment milwiem ma tkunx prattikabbli (pereżempju għaliex ma jitsgħux jinżammu konċentrazzjonijiet stabbli u li jistgħu jitkejlu fl-ilma, jew inkella ma jistgħux jinkisbu preżenzi adegwati fil-ġisem fi żmien 60 jum mill-esponiment; ara s-sezzjonijiet preċedenti fuq il-metodu ta' esponiment milwiem). Iżda ta' min jagħraf li l-punt ta' tmiem minn dan it-test sejjer ikun fattur ta' bijomanjifikazzjoni djetetiku (BMF) minflok fattur ta' bijokonċentrazzjoni (BCF) (58).
                     F'Mejju 2001, fil-konferenza ta' SETAC Europe li saret f'Madrid (36) ġie ppreżentat metodu ġdid għall-ittestjar tal-bijoakkumulazzjoni ta' sustanzi organiċi ftit li xejn solubbli fl-ilma. Dan bena fuq bosta studji tal-bijoakkumulazzjoni rrapportati fit-tagħrif bl-użu ta' metodu tad-dożaġġ li kien jinvolvi għalf miżjud (eż. (37)). Kmieni fl-2004, abbozz ta' protokoll (38), imfassal sabiex ikejjel il-potenzjal ta' bijoakkumulazzjoni ta' sustanzi organiċi ftit li xejn solubbli fl-ilma li għalihom il-metodu ta' bijokonċentrazzjoni standard ta' esponiment fl-ilma ma kienx prattikabbli, flimkien ma' dokument ta' sfond ta' sostenn (39), ġie sottomess lil grupp ta' ħidma tal-UE dwar il-PBT. Ġustifikazzjoni ulterjuri mogħtija għall-metodu kienet li l-esponiment ambjentali potenzjali għal sustanzi ftit li xejn solubbli bħal dawn (jiġifieri log KOW > 5) jista' jseħħ l-iktar mad-dieta (ara (40) (41) (42) (43) (44)). Għalhekk, isir riferiment għal testijiet tal-esponiment djetetiku f'ċerti regolamenti ppubblikati dwar is-sustanzi kimiċi (59). Madankollu, għandu jiġi realizzat li, fil-metodu deskritt hawnhekk, l-esponiment permezz tal-fażi milwiema tiġi evitata bir-reqqa u, b'hekk, valur tal-BMF minn dan il-metodu ta' ttestjar ma jistax jitqabbel direttament ma' valur tal-BMF minn studju prattiku (li fih jistgħu jiġu kombinati l-esponiment mill-ilma kif ukoll l-esponiment djetetiku).
                     Din is-sezzoni ta' dan il-metodu ta' ttestjar hija bbażata fuq dan il-protokoll (38) u hija metodu ġdid li ma deherx fil-verżjoni ta' qabel tat-TM C.13. Dan it-test alternattiv jippermetti sabiex il-passaġġ ta' esponiment djetetiku jiġi investigat direttament f'kundizzjonijiet tal-laboratorju kkontrollati.
                     L-investigaturi potenzjali għandhom jirreferu għall-paragrafi 1 sa 14 ta' dan il-metodu ta' ttestjar għal informazzjoni dwar meta t-test tal-esponiment djetetiku jista' jkun ippreferut fuq it-test tal-esponiment milwiem. Informazzjoni dwar il-bosta kunsiderazzjonijiet tas-sustanza tiġi stabbilita, u għandha tiġi kkunsidrata qabel ma jsir test.
                     L-użu ta' sustanzi tat-test radjotikkettati jista' jitqies b'kunsiderazzjonijiet simili bħall-metodu tal-esponiment milwiem (ara l-paragrafi 6 u 65).
                     Il-metodu djetetiku jista' jintuża sabiex jiġu ttestjati iktar minn sustanza waħda f'test wieħed, diment li jkunu ssodisfati ċerti kriterji; dawn huma mistħarrġin iktar fil-paragrafu 112. Għas-sempliċità, il-metodoloġija hawnhekk tiddeskrivi test li juża sustanza waħda biss tat-test.
                     It-test djetetiku huwa simili għall-metodu ta' esponiment milwiem f'diversi aspetti, bl-eċċezzjoni ovvja tar-rotta ta' esponiment. B'hekk, ħafna aspetti tal-metodu deskritt hawnhekk huma l-istess bħall-metodu ta' esponiment milwiem deskritt fis-sezzjoni ta' qabel. Safejn possibbli saret kontroreferenza għall-paragrafi rilevanti fis-sezzjoni ta' qabel, iżda fl-interessi ta' leġibbiltà u fehim, ċertu ammont ta' dupplikazzjoni huwa inevitabbli.
                     IL-PRINĊIPJU TAT-TEST
                     Jistgħu jintużaw kundizzjonijiet bi fluss kontinwu jew semistatiċi (ara l-paragrafu 4); kundizzjonijiet bi fluss kontinwu huma rrakkomandati sabiex jiġi limitat l-esponiment potenzjali tas-sustanza tat-test permezz tal-ilma bħala riżultat ta' kwalunkwe desorbiment minn ikel miżjud jew rawt. It-test jikkonsisti f'żewġ fażijiet: it-teħid (għalf miżjud bis-sustanza tat-test) u tisfija (għalf nadif mhux ittrattat) (ara l-paragrafu 16). Fil-fażi ta' teħid, grupp tat-“test” ta' ħut jingħata dieta stabbilita ta' ikel kummerċjali għall-ħut b'kompożizzjoni magħrufa, miżjud bis-sustanza tat-test, kuljum. Idealment il-ħut għandu jikkonsma l-ikel kollu offrut (ara l-paragrafu 141). Imbagħad il-ħut jingħata ikel kummerċjali għall-ħut mhux ittrattat u pur matul il-fażi ta' tisfija. Bħall-metodu ta' esponiment milwiem, jekk ikun hemm bżonn jistgħu jintużaw iktar minn grupp tat-test wieħed b'konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test miżjuda differenti, iżda għall-parti l-kbira ta' sustanzi tat-test organiċi ferm idrofobiċi, grupp tat-test wieħed huwa biżżejjed (ara l-paragrafi 49 u 107). Jekk jintużaw kundizzjonijiet semistatiċi, il-ħut għandu jiġi ttrasferit f'medium ġdid u/jew kompartiment tat-test ġdid fi tmiem il-fażi ta' teħid (f'każ li l-medium u/jew l-apparat użat fil-fażi ta' teħid jiġi kontaminat bis-sustanza tat-test matul il-lixxivjazzjoni). Il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test fil-ħut jitkejlu fiż-żewġ fażijiet tat-test. Minbarra l-grupp tal-ħut mogħti d-dieta miżjuda (il-grupp tat-test), grupp tal-kontroll tal-ħut jinżamm fl-istess kundizzjonijiet u jingħata l-istess ikel ħlief li d-dieta tal-ikel kummerċjali għall-ħut ma tkunx miżjuda bis-sustanza tat-test. Dan il-grupp tal-kontroll jippermetti sabiex ikunu jistgħu jiġu kkwantifikati l-livelli ta' sfond tas-sustanza tat-test f'ħut mhux espost u jservi bħala paragun għal kwalunkwe effett avvers relatat mat-trattament osservat fil-grupp(i) tat-test (60). Jippermetti wkoll li jitqabblu l-kostanti tar-rati ta' tkabbir bejn il-gruppi bħala verifika li ġew ikkonsmati kwantitajiet simili tad-dieta offruta (differenzi potenzjali fil-palatabilità bejn id-dieti għandhom jiġu kkunsidrati wkoll meta jiġu spjegati l-kostanti tar-rati ta' tkabbir differenti; ara l-paragrafu 138). Importanti li matul il-fażi ta' teħid kif ukoll ta' tisfija, il-gruppi tat-test u tal-kontroll jingħataw dieti ta' ekwialenza nutrizzjonali.
                     Fażi ta' teħid li ddum 7-14-il jum ġeneralment tkun biżżejjed, fuq il-bażi tal-esperjenza miksuba minn dawk li żviluppaw il-metodu (38) (39). Din il-medda għandha tnaqqas il-kost tat-twettiq tat-test filwaqt li tiżgura biżżejjed esponiment għal ħafna mis-sustanzi. Madankollu, f'ċerti każijiet, il-fażi ta' teħid tista' tiġi estiża (ara l-paragrafu 127). Matul il-fażi ta' teħid, il-konċentrazzjoni tas-sustanza fil-ħut jaf ma tilħaqx stat stazzjonarju, u b'hekk id-dejta dwar it-trattament u r-riżultati minn dan il-metodu normalment ikunu bbażati fuq analiżi kinetika tar-residwi tat-tessut. (Nota: L-ekwazzjonijiet għall-istima taż-żmien għall-istat stazzjonarju jistgħu jiġu applikati hawnhekk bħal fil-każ tat-test tal-esponiment milwiem — ara l-Appendiċi 5). Il-fażi ta' tisfija tibda meta l-ħut l-ewwel jingħata dieta mhux miżjuda u tipikament iddum sa 28 jum jew sakemm is-sustanza tat-test ma tkunx tista' tibqa' tiġi kkwantifikata fil-ħut sħiħ, skont liema jiġi l-ewwel. Il-fażi ta' tisfija tista' titqassar jew tittawwal iktar minn 28 jum, skont il-bidla biż-żmien fil-konċentrazzjonijiet kimiċi mkejlin u d-daqs tal-ħut.
                     Dan il-metodu jippermettu li tiġi stabbilita n-nofs ħajja speċifika għas-sustanza (t
                        1/2, mill-kostant tar-rata ta' tisfija, k
                        2), l-effiċjenza ta' assimilazzjoni (l-assorbiment fl-imsaren; a), il-fattur ta' bijomanjifikazzjoni djetetika kinetika (BMFK), il-fattur ta' bijomanjifikazzjoni djetetika kinetika kkoreġut għat-tkabbir (BMFKg), u l-fattur ta' bijomanjifikazzjoni djetetika kinetika kkoreġut għal-lipidu (61) (BMFKL) (u/jew il-fattur ta' bijomanjifikazzjoni djetetika kinetika kkoreġut għat-tkabbir u l-lipidu, BMFKgL) għas-sustanza tat-test fil-ħut. Bħal fil-metodu ta' esponiment milwiem, żieda fil-massa tal-ħut matul it-test sejra tirriżulta f'dilwizzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħut li qiegħed jikber u, b'hekk, il-BMF kinetiku sejjer jiġi sottovalutat jekk ma jiġix ikkoreġut għat-tkabbir (ara l-paragrafi 162 u 163). Barra minn hekk, jekk jiġi stmat li l-istat stazzjonarju ntlaħaq fil-fażi ta' teħid, jista' jiġi kkalkolat BMF indikattiv fi stat stazzjonarju. Hemm approċċi disponibbli li jagħmluha possibbli li jiġi stmat fattur ta' bijokonċentrazzjoni kinetika (BCFK) minn dejta ġġenerata fl-istudju djetetiku (ez. .(44) (45) (46) (47) (48)). Il-vantaġġi u l-iżvantaġġi tat-tali approċċi huma diskussi fl-Appendiċi 8.
                     It-test tfassal primarjament għal sustanzi organiċi mhux polari ftit li xejn solubbli li jsegwu kinetika ta' teħid u tisfija ta' bejn wieħed u ieħor l-ewwel ordni fil-ħut. F'każ li tiġi ttestjata sustanza li ma ssegwix kinetika ta' teħid u tisfija ta' bejn wieħed u ieħor l-ewwel ordni, għandhom jintużaw mudelli iktar kumplessi (ara r-referenzi fl-Appendiċi 5) u għandu jitfittex parir minn espert tal-bijostatistika u/jew tal-farmakokinetika.
                     Normalment il-BMF jiġi stabbilit bl-użu ta' analiżi tas-sustanza tat-test tal-ħuta sħiħa (bażi tal-piż niedi). Jekk rilevanti għall-objettivi tal-istudju, tessuti speċifiċi (eż. muskolu, fwied) jistgħu jiġu kampjunati jekk il-ħut jinqasam f'partijiet li jittieklu u li ma jittiklux (ara l-paragrafu 21). Barra minn hekk, jistgħu jsiru tneħħija u analiżi separata tal-apparat gastrointestinali sabiex tiġi stabbilita l-kontribuzzjoni għall-konċentrazzjonijiet tal-ħut sħiħ għal punti tal-kampjun fi tmiem il-fażi ta' teħid u qrib il-bidu tal-fażi ta' tisfija, jew bħala parti minn approċċ ta' bilanċ tal-massa.
                     Għandu jitkejjel il-kontenut lipidu ta' ħut sħiħ kampjunat sabiex il-konċentrazzjonijiet ikunu jistgħu jiġu kkoreġuti għal-lipidu, filwaqt li jitqies il-kontenut lipidu tad-dieta kif ukoll tal-ħut (ara l-paragrafi 56 u 57, u l-Appendiċi 7).
                     Il-piż tal-ħut ta' individwi fil-kampjun għandu jitkejjel u jiġi rreġistrat, u jkun marbut mal-konċentrazzjoni kimika analizzata għal dak l-individwu (eż. irrapportat bl-użu ta' kodiċi identifikatur uniku għal kull ħuta kampjunata), għall-fini ta' kalkolu tat-tkabbir li jista' jseħħ matul it-test. It-tul totali tal-ħut għandu jitkejjel ukoll, meta possibbli (62). Id-dejta dwar il-piż hija meħtieġa wkoll sabiex jiġi stmat il-BCF bl-użu ta' dejta dwar it-tisfija mit-test djetetiku.
                     INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA TAT-TEST
                     Għandu jkun hemm għad-dispożizzjoni informazzjoni dwar is-sustanza tat-test kif deskritta fil-paragrafi 3 u 22. Normalment ma jkunx hemm bżonn li jsir metodu analitiku għall-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test fl-ilma; huma meħtieġa metodi b'sensittività xierqa għall-kejl tal-konċentrazzjonijiet fl-ikel tal-ħut u t-tessut tal-ħut.
                     Il-metodu jista' jintuża sabiex jiġu ttestjati iktar minn sustanza waħda f'test wieħed. Madankollu, is-sustanzi tat-test għandhom ikunu kompatibbli ma' xulxin sabiex ma jinteraġixxux u lanqas ma jibdlu l-identità kimika tagħhom malli jiżdiedu fl-ikel tat-test. L-għan huwa li r-riżultati mkejlin għal kull sustanza ttestjata flimkien ma jvarjawx ħafna mir-riżultati li jinkisbu li kieku t-testijiet individwali saru fuq kull sustanza tat-test. Il-ħidma analitika preliminari għandha tistabbilixxi li kull sustanza tista' tiġi rkuprata minn kampjun tal-ikel miżjud b'mod multiplu u tessut tal-ħut bi i) rkupru għoljin (eż. > 85 % tan-nominal) u ii) is-sensittività neċessarja għall-ittestjar. Id-doża totali tas-sustanzi ttestjati flimkien għandha tkun inqas mill-konċentrazzjoni kombinata li tista' tikkaġuna effetti tossiċi (ara l-paragrafu 51). Barra minn hekk, effetti avversi possibbli fil-ħut u l-potenzjal għal effetti interattivi (eż. effetti metaboliċi) assoċjati mal-ittestjar ta' bosta sustanzi fl-istess ħin għandhom jittieħdu f'kunsiderazzjoni fid-disinn sperimentali. Għandu jiġi evitat milli jiġu ttestjati sustanzi jonizzabbli fl-istess ħin. F'termini tal-esponiment, il-metodu huwa xieraq ukoll għal taħlitiet kumplessi (ara l-paragrafu 13, għad li sejrin japplikaw l-istess limitazzjonijiet fl-analiżi bħal għal kwalunkwe metodu ieħor).
                     VALIDITÀ TAT-TEST
                     Sabiex test ikun validu, japplikaw il-kundizzjonijiet li ġejjin (ara l-paragrafu 24):
                     
                                 —
                              
                              
                                 Il-varjazzjoni fit-temperatura hija inqas minn ± 2 °C fil-gruppi tat-trattament jew tal-kontroll.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-konċentrazzjoni tal-ossiġenu dissolt ma taqax taħt is-60 % tal-valur ta' saturazzjoni tal-arja
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fl-ikel tal-ħut qabel u fi tmiem il-fażi ta' teħid taqa' fi ħdan medda ta' ± 20 % (fuq il-bażi ta' tal-inqas tliet kampjuni fiż-żewġ punti ta' żmien)
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Għandu jintwera grad għoli ta' omoġenità tas-sustanza fl-ikel fil-ħidma analitika preliminari fid-dieta miżjuda; tal-inqas tliet konċentrazzjonijiet tal-kampjun għas-sustanza meħuda fil-bidu tat-test ma għandhomx ivarjaw b'iktar minn ± 15 % mill-medja
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test mhumiex individwati, jew huma preżenti biss f'livelli ta' traċċi tipiċi, f'ikel mhux miżjud jew tessuti tal-ħut tal-kontroll relatati mal-kampjuni ttrattati
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-mortalità jew effetti avversi oħrajn/mard kemm fil-ħut tal-grupp tal-kontroll kif ukoll dak tal-grupp tat-test għandhom ikunu ≤ 10 % fi tmiem it-test; jekk it-test jiġi estiż għal xi raġuni, l-effetti avversi fiż-żewġ gruppi għandhom ikunu ≤ 5 % fix-xahar, u ≤ 30 % b'mod kumulattiv. Differenzi sinifikanti fit-tkabbir medju bejn il-gruppi tat-test u tal-kontroll tal-ħut kampjunat jistgħu jkunu indikazzjoni ta' effett tossiku tas-sustanza tat-test.
                              
                           SUSTANZI TA' REFERENZA
                     Jekk laboratorju ma jkunx għamel l-assaġġ qabel jew jekk ikunu saru bidliet sostanzjali (eż. bidla fir-razza tal-ħut jew tal-fornitur, speċi tal-ħut differenti, bidla sinifikanti fid-daqs tal-ħut, l-ikel tal-ħut jew il-metodu ta' żieda tas-sustanza, eċċ.) huwa rrakkomandat li jsir studju tal-profiċjenza teknika, bl-użu ta' sustanza ta' referenza. Is-sustanza ta' referenza tintuża primarjament sabiex jiġi stabbilit jekk it-teknika ta' żieda tas-sustanza mal-ikel hijiex adegwata sabiex jiġu żgurati omoġenità u bijodisponibilità massimi tas-sustanzi tat-test. Eżempju minnhom li ntuża fil-każ ta' sustanzi idrofobiċi mhux polari huwa l-essaklorobenżen (HCB), iżda għandhom jiġu kkunsidrati sustanzi oħrajn b'dejta affidabbli eżistenti dwar it-teħid u l-bijomanjifikazzjoni minħabba l-proprjetà dannuża tal-HCB (63). Jekk tintuża, fir-rapport tat-test għandha tiġi ppreżentata informazzjoni bażika dwar is-sustanza ta' referenza, inkluż l-isem, il-purità, in-numru CAS, l-istruttura, id-dejta dwar it-tossiċità (jekk disponibbli) bħal fil-każ tas-sustanzi tat-test (ara l-paragrafi 3 u 22).
                     DESKRIZZJONI TAL-METODU
                     
                        Apparat
                     
                     Il-materjali u l-apparat għandhom jintużaw kif deskritt fil-metodu tal-esponiment milwiem (ara l-paragrafu 26). Għandha tintuża sistema tat-test tat-tiġdid bi fluss kontinwu jew statiku li tipprovdi volum biżżejjed ta' ilma ta' dilwizzjoni għat-tankijiet tat-test. Ir-rati tal-fluss għandhom jiġu rreġistrati
                     
                        Ilma
                     
                     L-ilma tat-test għandu jintuża kif deskritt fil-metodu tal-esponiment milwiem (ara l-paragrafi 27-29). Il-medium tat-test għandu jkun ikkaratterizzat kif spjegat u l-kwalità tiegħu għandha tibqa' konsistenti matul it-test. Il-kontenut ta' partiċelli naturali u l-karbonju organiku totali għandhom ikunu baxxi kemm jista' jkun (≤ 5 mg/l materja partikolata; ≤ 2 mg/l karbonju organiku totali) qabel ma jibda t-test. It-TOC trid titkejjel biss qabel it-test bħala parti mill-karatterizzazzjoni tal-ilma tat-test (ara l-paragrafu 53).
                     
                        Dieta
                     
                     Huwa rakkomandat ikel kummerċjalment disponibbli għall-ħut (dieta f'gerbub li jżomm fil-wiċċ u/jew li jegħreq bil-mod) li huwa kkaratterizzat f'termini ta' tal-inqas kontenut ta' proteina u ta' xaħam. L-ikel għandu jkollu qies uniformi tal-gerbub sabiex tiżdied l-effiċjenza tal-esponiment tal-għalf, jiġifieri l-ħut sejjer jiekol iktar ikel minflok ma jiekol il-biċċiet il-kbar u jitlef iż-żgħar. Il-gerbub għandu jkun ta' qies xieraq għad-daqs tal-ħuta fil-bidu tat-test (eż. jistgħu jintużaw dijametri tal-gerbub ta' madwar 0.6-0.85 mm għal ħut ta' tul totali ta' bejn 3 u 7 cm, u 0.85-1.2 mm għal ħut ta' tul totali ta' bejn 6 u 12-il cm). Id-daqs tal-gerbub jista' jiġi rranġat skont kemm jikber il-ħut fil-bidu tal-fażi ta' tisfija. Eżempju ta' kompożizzjoni xierqa tal-ikel, kif fornit kummerċjalment, jingħata fl-Appendiċi 7. Id-dieti tat-test b'kontenut lipidu totali ta' bejn 15 u 20 % (w/w) intużaw ta' spiss fl-iżvilupp ta' dan il-metodu. Ikel tal-ħut b'konċentrazzjoni lipida tant għolja jaf ma jkunx disponibbli f'ċerti reġjuni. F'dawn il-każijiet, jistgħu jsiru studju b'konċentrazzjoni lipida inqas fl-ikel u, jekk ikun hemm bżonn, ir-rata tal-għalf tiġi aġġustata kif xieraq sabiex tinżamm is-saħħa tal-ħut (fuq il-bażi tal-ittestjar preliminari). Il-kontenut lipidu totali tad-dieti tal-grupp tat-test u tal-grupp tal-kontroll irid jitkejjel u jiġi rreġistrat qabel ma jibda t-test u fi tmiem il-fażi ta' teħid. Id-dettalji pprovduti mill-fornitur tal-għalf kummerċjali tal-analiżi għal nutrijenti, umdità, fibra u rmied u, jekk possibbli, minerali u residwi ta' pestiċidi (eż. sustanzi niġġiesa “standard” ta' prijorità), għandhom jiġu ppreżentati fir-rapport tal-istudju.
                     Meta l-ikel jiġi miżjud bis-sustanza tat-test, għandhom isiru l-isforzi kollha possibbli sabiex tiġi żgurata omoġenità fl-ikel tat-test. Il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fl-ikel għall-grupp tat-test għandha tingħażel filwaqt li titqies is-sensittività tat-teknika analitika, it-tossiċità tas-sustanza tat-test (NOEC, jekk magħrufa) u d-dejta fiżikokimika rilevanti. Jekk tintuża, idealment is-sustanza ta' referenza għandha tiġi inkorporata f'konċentrazzjoni ta' madwar 10 % ta' dik tas-sustanza tat-test (jew fi kwalunkwe każ fl-inqas mod prattikabbli), soġġetta għas-sensittività tal-analiżi (eż. għall-essaklorobenżen, instab li konċentrazzjoni fl-ikel ta' 1-100 μg/g hija aċċettabbli; ara (47) għal iktar informazzjoni dwar l-effiċjenzi ta' assimilazzjoni tal-HCB).
                     Is-sustanza tat-test tista' tiġi miżjuda mal-ikel tal-ħut b'bosta modi skont il-karatteristiċi fiżiċi u s-solubilità tagħha (ara l-Appendiċi 7 għal iktar dettalji dwar il-metodi ta' kif tiżdied is-sustanza):
                     
                                 —
                              
                              
                                 Jekk is-sustanza hija solubbli u stabbli fit-trigliċeridi, is-sustanza għandha tiġi dissolta f'ammont żgħir ta' żejt tal-ħut jew żejt veġetali li jittiekel qabel ma titħallat mal-ikel tal-ħut. F'dan il-mument, għandha tingħata attenzjoni sabiex tiġi evitata l-produzzjoni ta' porzjon li jkun għoli wisq f'lipidu, filwaqt li jitqies il-kontenut lipidu naturali tal-għalf miżjud, billi tiżdied il-kwantità magħrufa minima ta' żejt meħtieġa sabiex jinkisbu distribuzzjoni u omoġenità tas-sustanza tat-test fl-ikel, jew;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 L-ikel għandu jiġi miżjud bl-użu ta' solvent organiku xieraq, diment li l-omoġenità u l-bijodisponibilità ma jitqegħdux f'riskju (huwa possibbli li jifformaw (mikro)kristalli tas-sustanza tat-test fl-ikel minħabba l-evaporazzjoni tas-solvent u ma hemm ebda mod faċli kif jintwera bil-provi li dan ma seħħx; ara. (49)), jew;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Likwidi mhux viskużi għandhom jiżdiedu direttament mal-ikel tal-ħut iżda għandhom ikunu mħalltin sew għall-finijiet ta' omoġenità u sabiex tiġi ffaċilitata assimilazzjoni tajba. It-teknika għat-tħallit għandha tiżgura omoġenità tal-għalf miżjud.
                              
                           Fi ftit każijiet, eż. sustanzi tat-test inqas idrofobiċi b'tendenza ikbar ta' disorbiment mill-ikel, jista' jkun hemm bżonn li l-gerbub tal-ikel ippreparati jinksew bi kwantità żgħira ta' żejt tal-ħut/tal-qamħirrum (ara l-paragrafu 142). F'dawn il-każijiet, l-ikel tal-kontroll għandu jiġi ttrattat b'mod simili u l-għalf ippreparat finali jintuża għall-kejl tal-lipidu.
                     Jekk tintuża, ir-riżultati tas-sustanza ta' referenza għandhom jitqabblu mad-dejta mill-istudji tat-tagħrif imwettqin f'kundizzjonijiet simili b'rata tal-għalf komparabbli (ara l-paragrafu 45) u l-parametri speċifiċi għas-sustanza ta' referenza għandhom jissodisfaw il-kriterji rilevanti fil-paragrafu 113 (it-3et, ir-4a u l-5es punti).
                     Jekk jintuża żejt jew solvent trasportatur bħala veikolu għas-sustanza tat-test, ammont ekwivalenti tal-istess veikolu (eskluża s-sustanza tat-test) għandu jitħallat mad-dieta tal-kontroll sabiex tinżamm l-ekwivalenza mad-dieta miżjuda. Importanti li matul il-fażi ta' teħid kif ukoll ta' tisfija, il-gruppi tat-test u tal-kontroll jingħataw dieti ta' ekwivalenza nutrizzjonali.
                     Id-dieta miżjuda għandha tinħażen f'kundizzjonijiet li jżommu l-istabilità tas-sustanza tat-test fi ħdan it-taħlita tal-għalf (eż. tkessiħ) u dawn il-kundizzjonijiet għandhom jiġu rrapportati.
                     
                        Għażla tal-ispeċi ta' ħut
                     
                     Tista' tintuża l-ispeċi ta' ħut kif speċifikati għall-esponiment milwiem (ara l-paragrafu 32 u l-Appendiċi 3). Trota qawsalla (Oncorhynchus mykiss), karpjun komuni (Cyprinus carpio) u karpjun buras (Pimephales promelas) intużaw ta' spiss fi studji tal-bijoakkumulazzjoni djetetika b'sustanzi organiċi qabel ma ġie pubblikat dan it-TM. L-ispeċi tat-test għandu jkollha mġiba tal-għalf li tirriżulta f'konsum rapidu tal-proprozjon tal-ikel amministrat sabiex jiġi żgurat li kwalunkwe fattur li jinfluwenza l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fl-ikel (eż. lixxivjazzjoni fl-ilma u l-possibbiltà ta' esponiment milwiem) jinżamm għall-minimu. Għandu jintuża ħut fi ħdan il-medda ta' qies/piż rakkomandat (ara l-Appendiċi 3). Il-ħut ma għandux ikun żgħir wisq tant li jxekkel il-faċilità tal-analiżijiet fuq bażi individwali. Speċi tal-ħut ittestjata fi stadju tal-ħajja bi tkabbir rapidu (meta jkun għadu qed jikber) jista' jikkomplika l-interpretazzjoni tad-dejta, u rati ta' tkabbir għoljin jistgħu jinfluwenzaw il-kalkolu tal-effiċjenza tal-assimilazzjoni (64).
                     
                        Iż-żamma tal-ħut
                     
                     Il-kriterji ta' akklimatizzazzjoni, mortalità u aċċettazzjoni tal-mard huma l-istess bħal tal-metodu tal-esponiment milwiem qabel it-twettiq tat-test (ara l-paragrafi 33-35).
                     IT-TWETTIQ TAT-TEST
                     
                        Il-ħidma ta' qabel l-istudju u t-test tas-sejbien tal-medda
                     
                     Hemm bżonn li ssir ħidma analitika ta' qabel l-istudju sabiex jintwera l-irkupru tas-sustanza minn ikel miżjud/tessut tal-ħut miżjud. Mhux bilfors dejjem ikun hemm bżonn li jsir test tas-sejbien tal-medda sabiex tingħażel konċentrazzjoni xierqa fl-ikel. Sabiex jintwera li ma huwa osservat ebda effett avvers u tiġi evalwata l-palatabilità tad-dieta miżjuda, is-sensittività tal-metodu analitiku għat-tessut tal-ħut u l-ikel, u jingħażlu rata tal-għalf u intervalli tal-kampjunar xierqa matul il-fażi ta' tisfija, eċċ., jistgħu jsiru esperimenti preliminari dwar l-għalf, iżda dawn mhumiex obbligatorji. Studju preliminari jista' jkun siewi sabiex jiġu stmati n-numri ta' ħut meħtieġa għall-kampjunar matul il-fażi ta' tisfija. Dan jista' jirriżulta fi tnaqqis sinifikanti fin-numru ta' ħut użat, speċjalment għal sustanzi tat-test li jkunu partikolarment suxxettibbli għall-metaboliżmu.
                     
                        Kundizzjonijiet tal-Esponiment
                     
                     
                        Durata tal-Fażi ta' Teħid
                     
                     Fażi ta' teħid ta' 7-14-il jum normalment tkun biżżejjed, li matulha grupp wieħed ta' ħut jingħata d-dieta tal-kontroll u grupp ieħor ta' ħut id-dieta tat-test kuljum b'porzjon fissa skont l-ispeċi ttestjata u l-kundizzjonijiet tal-esperiment, eż. bejn 1-2 % tal-piż tal-ġisem (piż niedi) fil-każ ta' trota qawsalla. Ir-rata tal-għalf għandha tingħażel b'tali mod li jiġu evitati tkabbir veloċi u żieda kbira fil-kontenut lipidu. Jekk ikun hemm bżonn, il-fażi ta' teħid tista' tiġi estiża fuq il-bażi tal-esperjenza prattika minn studji preċedenti jew l-għarfien dwar it-teħid/tisfija tas-sustanza tat-test (jew analogu) fil-ħut. Il-bidu tat-test huwa definit bħala l-ħin tal-ewwel għalf b'ikel miżjud. Jum sperimentali jibda mill-ħin tal-għalf sa ftit qabel il-ħin tal-għalf li jmiss (eż. siegħa). B'hekk, l-ewwel jum sperimentali tat-teħid jibda mill-ħin tal-ewwel għalf b'ikel miżjud u jintemm ftit qabel it-tieni għalf b'ikel miżjud. Fil-prattika, il-fażi ta' teħid tintemm ftit qabel (eż. siegħa) l-ewwel għalf b'sustanza tat-test mhux miżjuda filwaqt li l-ħut ikompli jiddiġerixxi l-ikel miżjud u jassorbi s-sustanza tat-test fl-24 siegħa ta' wara. Importanti li jiġi żgurat li tinkiseb preżenza fil-ġisem għolja biżżejjed (mhux tossika) tas-sustanza tat-test fir-rigward tal-metodu analitiku, sabiex tal-inqas ikun jista' jitkejjel tnaqqis ta' ordni ta' kobor matul il-fażi ta' tisfija. F'każijiet speċjali, tista' tintuża fażi ta' teħid estiża (sa 28 jum) b'kampjunar addizzjonali sabiex tinkiseb idea ta' kif taħdem il-kinetika tat-teħid. Matul it-teħid, il-konċentrazzjoni fil-ħut tista' ma tilħaqx stat stazzjonarju. L-ekwazzjonijiet għall-istima taż-żmien għall-istat stazzjonarju, bħala indikazzjoni tad-durata probabbli meħtieġa sabiex jinkisbu konċentrazzjonijiet tal-ħut sinifikanti, jistgħu jiġu applikati hawnhekk bħal fil-każ tat-test tal-esponiment milwiem (ara l-Appendiċi 5).
                     F'ċerti każijiet, jista' jkun magħruf li t-teħid ta' sustanza fil-ħut għal iktar minn 7-14-il jum mhuwiex sejjer ikun biżżejjed għall-konċentrazzjoni tal-ikel użata sabiex tintlaħaq konċentrazzjoni tal-ħut għolja biżżejjed sabiex tal-inqas jiġi analizzat tnaqqis ta' ordni ta' kobor matul it-tisfija, jew minħabba sensittività analitika batuta jew effiċjenza tal-assimilazzjoni baxxa. F'dawn il-każijiet, jista' jkun ta' vantaġġ li l-fażi tal-għalf inizjali tiġi estiża għal iktar minn 14-il jum, jew, speċjalment għal sustanzi ferm metabolizzabbli, għandha tiġi kkunsidrata konċentrazzjoni djetetika ogħla. Madankollu, għandha tingħata attenzjoni sabiex it-toqol tal-ġisem matul it-teħid jinżamm inqas mill-konċentrazzjoni kronika (stmata) bla effett osservat fit-tessut tal-ħut (ara l-paragrafu 138).
                     
                        Durata tal-fażi ta' tisfija
                     
                     It-tisfija normalment iddum 28 jum, u tibda malli l-ħut tal-grupp tat-test jingħata dieta mhux ittrattata u pura wara l-fażi ta' teħid. It-tisfija tibda bl-ewwel tagħlif ta' ikel “mhux miżjud” minflok eżatt wara l-aħħar tagħlif ta' ikel “miżjud” peress li l-ħut sejjer ikompli jiddiġerixxi l-ikel u jassorbi s-sustanza tat-test fl-24 siegħa ta' wara, kif osservat fil-paragrafu 126. B'hekk, l-ewwel kampjun fil-fażi ta' tisfija jittieħed ftit wara t-tieni tagħlif bid-dieta mhux miżjuda. Dan il-perjodu ta' tisfija huwa mfassal sabiex ikopri sustanzi b'nofs ħajja potenzjali li tasal sa 14-il jum, li hija konsistenti ma' dik ta' sustanzi bijoakkumulattivi (65), u b'hekk 28 jum jinvolvu żewġ nofs ħajjiet ta' sustanzi bħal dawn. F'każijiet ta' sustanzi b'bijoakkumulazzjoni għolja ħafna, jista' jkun siewi li tiġi estiża l-fażi ta' tisfija (jekk indikata mill-ittestjar preliminari).
                     Jekk sustanza tissaffa bil-mod ħafna b'tali mod li jaf ma tiġix stabbilita nofs ħajja fil-fażi ta' tisfija, l-informazzjoni xorta waħda tista' tkun biżżejjed għal finijiet ta' valutazzjoni sabiex tindika livell għoli ta' bijoakkumulazzjoni. Għall-kuntrarju, jekk sustanza tissaffa tant malajr li ma tistax tinkiseb konċentrazzjoni żero f'ħin affidabbli (konċentrazzjoni fi tmiem it-teħid/il-bidu tat-tisfija, C0,d) u ma jistax jinkiseb k
                        2, tista' ssir stima konservattiva tal-k
                        2 (ara l-Appendiċi 7).
                     Jekk l-analiżijiet tal-ħut f'intervalli bikrin (eż. 7 jew 14-il jum) juru li s-sustanza ssaffiet f'livelli inqas minn dawk ta' kwantifikazzjoni qabel il-perjodu sħiħ ta' 28 jum, il-kampjunar sussegwenti jista' jitwaqqaf u t-test jista' jiġi terminat.
                     Fi ftit każijiet, jista' ma jkun seħħ ebda teħid li jitkejjel tas-sustanza tat-test fi tmiem il-perjodu tat-teħid (jew bit-tieni kampjun tat-tisfija). Jekk jista' jintwera li: i) huma ssodisfat l-kriterji ta' validità fil-paragrafu 113; u ii) nuqqas ta' teħid mhuwiex dovut għal xi nuqqas ieħor fit-test (eż. durata tat-teħid mhux twila biżżejjed, nuqqas fit-teknika ta' kif tiżdied is-sustanza mal-ikel li jwassal għal bijodisponibilità batuta, nuqqas ta' sensittività tal-metodu analitiku, ħut li ma jikkonsmax l-ikel, eċċ.); jista' jkun possibbli li jintemm l-istudju mingħajr il-bżonn li jerġa' jsir b'durata tat-teħid itwal. Jekk il-ħidma preliminari indikat li dan jista' jkun il-każ, analiżi tar-rawt, jekk possibbli, għal sustanza tat-test mhux iddiġerita tista' tkun rakkomandata bħala parti minn approċċ ta' “bilanċ tal-massa”.
                     
                        Numri ta' ħut tat-test
                     
                     B'mod simili għat-test tal-esponiment milwiem, għandu jingħażel ħut b'piż u tul simili, bl-iżgħar ħut li ma jkunx iżgħar minn żewġ terzi tal-piż tal-ikbar (ara l-paragrafi 40-42).
                     In-numru totali ta' ħut għall-istudju għandu jingħażel fuq il-bażi tal-iskeda ta' kampjunar (tal-inqas kampjun wieħed fi tmiem il-fażi ta' teħid u erba' sa sitt kampjuni matul il-fażi ta' tisfija, iżda skont id-durati tal-fażijiet), filwaqt li jitqiesu s-sensittività tat-teknika analitika, il-konċentrazzjoni li aktarx li sejra tinkiseb fi tmiem il-fażi ta' teħid (fuq il-bażi tal-għarfien preċedenti) u d-durata tat-tisfija (jekk tkun tista' ssir stima bis-saħħa tal-għarfien preċedenti). F'kull okkażjoni għandhom jiġu kampjunati ħames sa għaxar ħutiet, bil-parametri tat-tkabbir (piż u tul totali) li jitkejlu qabel l-analiżi kimika jew lipida.
                     Minħabba l-varjabbiltà inerenti fid-daqs, ir-rata ta' tkabbir, u l-fiżjoloġija bejn il-ħut u l-varjazzjoni probabbli fil-kwantità ta' dieta mogħtija li kull ħuta tikkonsma, għandu jittieħed kampjun ta' tal-inqas ħames ħutiet f'kull intervall mill-grupp tat-test u ħames ħutiet mill-grupp tal-kontroll sabiex tiġi stabbilita b'mod adegwat il-konċentrazzjoni medja u l-varjabbiltà tagħha. Il-varjabbiltà bejn il-ħut użat aktarx li tikkontribwixxi iktar għall-varjabbiltà mhux ikkontrollata ġenerali fit-test mill-varjabbiltà inerenti fil-metodoloġiji analitiċi użati, u b'hekk tiġustifika l-użu ta' massimu ta' għaxar ħutiet għal kull punt tal-kampjun f'ċerti każijiet. Madankollu, jekk il-konċentrazzjonijiet ta' sfond tas-sustanza tat-test fil-ħut tal-kontroll ma jistgħux jitkejlu fil-bidu tat-tisfija, l-analiżi kimika ta' żewġ-tliet ħutiet tal-kontroll fl-intervall finali tal-kampjunar biss tista' tkun biżżejjed diment li l-ħut tal-kontroll li jifdal fil-punti tal-kampjunar kollha xorta waħda jiġu kampjunati għall-piż u t-tul totali (sabiex jiġi kampjunat l-istess numru mill-gruppi tat-test u tal-kontroll għat-tkabbir). Il-ħut għandu jinħażen, jintiżen individwalment (anki jekk ikun neċessarju li wara r-riżultati tal-kampjun jiġu kombinati) u għandu jitkejjel it-tul totali.
                     Għal test standard, pereżempju, b'durata ta' tisfija ta' 28 jum inklużi ħames kampjuni ta' tisfija, dan ifisser total ta' 59-120 ħuta mit-test u 50-110 mill-gruppi tal-kontroll, jekk jiġi supponut li t-teknika analitika tas-sustanza tippermetti li l-analiżi tal-kontenut lipidu ssir fuq l-istess ħuta. Jekk l-analiżi lipida ma tistax issir fuq l-istess ħuta bħall-analiżi kimika, u l-użu ta' ħut tal-kontroll għall-analiżi lipida biss ma jkunx fattibbli (ara l-paragrafu 56), ikunu meħtieġa 15-il ħuta oħra (tlieta mill-popolazzjoni tal-istokk fil-bidu tat-test, tlieta mill-grupp tal-kontroll u tlieta mill-grupp tat-test fil-bidu tat-tisfija u tlieta mill-gruppi tal-kontroll u tlieta mill-gruppi tat-test fi tmiem l-esperiment). Eżempju tal-iskeda tal-kampjunar bin-numri tal-ħut jista' jinkiseb mill-Appendiċi 4.
                     
                        Tagħbija
                     
                     B'mod simili, għandhom jintużaw proporzjonijiet għoljin ta' ilma għall-ħut bħal fil-metodu tal-esponiment milwiem (ara l-paragrafi 43 u 44). Għad li r-rati ta' tagħbija tal-ħut għall-ilma ma għandhomx effett fuq il-konċentrazzjonijiet tal-esponiment f'dan it-test, hija rakkomandata rata ta' tagħbija ta' 0.1-1.0 g ħut (piż niedi) għal kull litru fil-ġurnata sabiex jinżammu konċentrazzjonijiet adegwati tal-ossiġenu dissolt u jiġi minimizzat l-istress tal-organiżmi tat-test.
                     
                        Dieta tat-test u Għalf
                     
                     Matul il-perjodu ta' akklimatizzazzjoni, il-ħut għandu jingħata dieta xierqa kif spjegat iktar 'il fuq (il-paragrafu 117). Jekk it-test isir f'kundizzjonijiet bi fluss kontinwu, il-fluss għandu jkun sospiż filwaqt li jingħata l-ikel lill-ħut.
                     Matul it-test, id-dieta għall-grupp tat-test għandha taderixxi għal dik deskritta iktar 'il fuq (paragrafi 116-121). Minbarra li jiġu kkunsidrati fatturi speċifiċi għas-sustanza, is-sensittività analitika, il-konċentrazzjoni mistennija fid-dieta f'kundizzjonijiet ambjentali u l-livelli ta' tossiċità kronika/toqol tal-ġisem, l-għażla tal-konċentrazzjoni mira taż-żieda tas-sustanza għandha tqis il-palatabilità tal-ikel (sabiex il-ħut ma jevitax milli jiekol). Il-konċentrazzjoni taż-żieda nominali tas-sustanza tat-test għandha tiġi dokumentata fir-rapport. Fuq il-bażi tal-esperjenza, il-konċentrazzjonijiet taż-żidiet fil-medda ta' 1-1 000 μg/g jipprovdu medda operazzjonali prattika għas-sustanzi tat-test li ma jesibixxux mekkaniżmu tossiku speċifiku. Għal sustanzi li jaġixxu permezz ta' mekkaniżmu mhux speċifiku, il-livelli tar-residwu tat-tessut ma għandhomx jaqbżu l-5 μmol/g lipidu peress li residwi f'livelli ogħla minn hekk aktarx li jġibu magħhom effetti kroniċi (19) (48) (50) (66). Għal sustanzi oħrajn għandha tingħata attenzjoni sabiex ma jseħħ ebda effett avvers mill-esponiment akkumulat (ara l-paragrafu 127). Dan huwa partikolarment minnu jekk ikunu qegħdin jiġu ttestjati iktar minn sustanza waħda fl-istess ħin (ara l-paragrafu 112).
                     L-ammont xieraq tas-sustanza tat-test jista' jiżdied mal-ikel tal-ħut f'wieħed minn tliet modi, kif spjegat fil-paragrafu 119 u l-Appendiċi 7. Il-metodi u l-proċeduri għaż-żieda tas-sustanza mal-għalf għandhom jiġu dokumentati fir-rapport. Ikel mhux ittrattat jingħata lill-ħut tal-kontroll, u dan ikun fih kwantità ekwivalenti ta' veikolu taż-żejt mhux miżjud jekk dan ikun intuża fl-għalf miżjud għall-fażi ta' teħid, jew li jkun ġie ttrattat b'solvent “pur” jekk intuża veikolu tas-solvent għall-preparazzjoni tad-dieta tal-grupp tat-test. Id-dieti ttrattati u mhux ittrattati għandhom jitkejlu b'mod analitiku tal-inqas fi triplikat għall-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test qabel ma tibda u fi tmiem il-fażi ta' teħid. Wara l-esponiment għall-għalf ittrattat (fażi ta' teħid), il-ħut (żewġ gruppi) jingħataw ikel mhux ittrattat (fażi ta' tisfija).
                     Il-ħut jingħata porzjon fiss (skont l-ispeċi; eż. madwar 1-2 % tal-piż niedi tal-ġisem kuljum fil-każ ta' trota qawsalla). Ir-rata tal-għalf għandha tingħażel b'tali mod li jiġu evitati tkabbir veloċi u żieda kbira fil-kontenut lipidu. Għandha tiġi rreġistrata r-rata tal-għalf eżatta stabbilita matul l-esperiment. It-tagħlif inizjali għandu jkun ibbażat fuq il-kejliet tal-piż skedati tal-popolazzjoni tal-istokk eżatt qabel ma jibda t-test. L-ammont tal-għalf għandu jiġi aġġustat fuq il-bażi tal-piżijiet niedja tal-ħut kampjunat f'kull okkażjoni tal-kampjunar sabiex jingħata kunsiderazzjoni lit-tkabbir matul l-esperiment. Il-piżijiet u t-tul tal-ħut fit-tankijiet tat-test u tal-kontroll jistgħu jiġu stmati mill-piżijiet u t-tul totali tal-ħut użat f'kull okkażjoni tal-kampjunar; tiżinx u tkejjilx il-ħut li jifdal fit-tankijiet tat-test u tal-kontroll. Importanti li tinżamm l-istess rata tal-għalf stabbilita matul l-esperiment.
                     L-għalf għandu jkun osservat sabiex jiġi żgurat li l-ħut ikun qiegħed jikkonsma l-ikel kollu ppreżentat sabiex jiġi garantit li fil-kalkoli jintużaw ir-rati ta' inġestjoni xierqa. L-esperimenti preliminari tal-għalf jew l-esperjenza preċedenti għandhom jingħataw kunsiderazzjoni meta tingħażel ir-rata ta' tagħlif sabiex jiġi żgurat li jiġi kkonsmat l-ikel kollu mit-tagħlif ta' darba kuljum. F'każ li ta' spiss ikun hemm ikel li ma jintmissx, jista' jkun rakkomandat li d-doża tinfirex tul perjodu ta' tagħlif ieħor f'kull jum tal-esperiment (eż. jinbidel it-tagħlif ta' dabra kuljum ma' tagħlif ta' nofs l-ammont darbtejn kuljum). Jekk ikun hemm bżonn, it-tieni tagħlif għandu jseħħ f'ħin stabbilit u jinżamm il-ħin sabiex jgħaddi l-perjodu massimu tal-ħin possibbli qabel ma jiġi kampjunat il-ħut (eż. il-ħin għat-tieni tagħlif jiġi stabbilit fi ħdan l-ewwel nofs ta' jum tal-esperiment).
                     Għad li ġeneralment il-ħut malajr jikkonsma l-ikel, importanti li jiġi żgurat li s-sustanza tibqa' adsorbita fl-ikel. Għandhom isiru sforzi sabiex jiġi evitat milli s-sustanza tat-test tiġi dispersa fl-ilma mill-ikel, u b'hekk tesponi l-ħut għal konċentrazzjonijiet milwiema tas-sustanza tat-test minbarra r-rotta djetetika. Dan jista' jinkiseb billi jitneħħa kwalunkwe ikel li ma jittikilx (u rawt) mit-tankijiet tat-test u tal-kontroll fi żmien siegħa mit-tagħlif, iżda idealment fi żmien 30 minuta. Barra minn hekk, tista' tintuża sistema li fiha l-ilma jitnaddaf kontinwament b'filtru tal-karbonju attiv sabiex jiġi assorbit kwalunkwe kontaminant “dissolt”. Sistemi bi fluss kontinwu jistgħu jgħinu sabiex jitneħħew malajr partiċelli tal-ikel u sustanzi dissolti (67). F'ċerti każijiet, teknika ta' preparazzjoni tal-ikel miżjud modifikata ftit tista' tgħin sabiex tittaffa din il-problema (ara l-paragrafu 119).
                     
                        Dawl u temperatura
                     
                     Rigward il-metodu tal-esponiment milwiem (ara l-paragrafu 48), huwa rakkomandat fotoperjodu ta' 12 sa 16-il siegħa u temperatura (± 2 °C) xierqa għall-ispeċi tat-test użata (ara l-Appendiċi 3). It-tip u l-karatteristiċi tad-dawl għandhom ikunu magħrufin u ddokumentati.
                     
                        Kontrolli
                     
                     Għandu jintuża grupp tal-kontroll wieħed, bil-ħut li jingħata l-istess porzjon ta' ikel bħall-grupp tat-test iżda mingħajr is-sustanza tat-test fl-għalf. Jekk intuża żejt jew veikolu tas-solvent sabiex tiġi miżjuda s-sustanza fl-għalf fil-grupp tat-test, l-ikel tal-grupp tal-kontroll għandu jiġi ttrattat bl-istess mod iżda mingħajr is-sustanza tat-test sabiex id-dieti tal-grupp tat-test u l-grupp tal-kontroll ikunu ekwivalenti (ara l-paragrafi 121 u 139).
                     
                        Il-Frekwenza tal-Kejliet tal-Kwalità tal-Ilma
                     
                     Il-kundizzjonijiet deskritti fil-metodu tal-esponiment milwiem japplikaw hawn ukoll, ħlief li t-TOC trid titkejjel biss qabel it-test bħala parti mill-karatterizzazzjoni tal-ilma tat-test (ara l-paragrafu 53).
                     
                        Kampjunar u Analiżi tal-Ħut u d-Dieta
                     
                     
                        Analiżi tal-Kampjuni tad-Dieta
                     
                     Il-kampjuni tad-dieti tat-test u tal-kontroll għandhom jiġu analizzati tal-inqas fi triplikat għas-sustanza tat-test u għall-kontenut lipidu qabel ma tibda u fi tmiem il-fażi ta' teħid. Il-metodi ta' analiżi u l-proċeduri għall-iżgurar u l-omoġenità tad-dieta għandhom ikunu inklużi fir-rapport.
                     Il-kampjuni għandhom ikunu analizzati għas-sustanza tat-test bil-metodu stabbilit u vvalidat. Għandha ssir ħidma ta' qabel l-istudju sabiex jiġu stabbiliti l-limitu tal-kwantifikazzjoni, l-irkupru perċentwali, l-interferenzi u l-varjabbiltà analitika fil-matriċi tal-kampjun fil-mira. Jekk jiġi ttestjat matejal radjotikkettat, għandhom jitqiesu l-istess kunsiderazzjonijiet bħal dawk għall-metodu tal-esponiment milwiem bl-analiżi tal-għalf li tieħu post l-analiżi tal-ilma (ara l-paragrafu 65).
                     
                        Analizi tal-Ħut
                     
                     F'kull okkażjoni tal-kampjunar tal-ħut, sejjer jittieħed kampjun ta' 5-10 individwi mit-trattamenti tal-esponiment u tal-kontroll (f'ċerti każijiet, in-numri ta' ħut tal-kontroll jistgħu jitnaqqsu; ara l-paragrafu 134).
                     L-okkażjonijiet tal-kampjunar għandhom iseħħu fl-istess ħin f'kull jum tal-esperiment (b'rabta mal-ħin tal-għalf), u għandhom isiru f'ħin li fih ma jkunx probabbli li l-ikel ikun għadu fl-imsaren matul il-fażi ta' teħid u l-parti bikrija tal-fażi ta' tisfija sabiex jiġu evitati kontribuzzjonijiet spurji għall-konċentrazzjonijiet totali tas-sustanza tat-test (jiġifieri l-ħut fil-kampjun għandu jitneħħa fi tmiem jum tal-esperiment, filwaqt li wieħed jiftakar li jum tal-esperiment jibda minn ħin it-tagħlif u jintemm fil-ħin tat-tagħlif li jmiss, madwar 24 siegħa wara. It-tisfija tibda bl-ewwel tagħlif ta' ikel mhux miżjud; ara l-paragrafu 128). L-ewwel kampjun tal-fażi ta' tisfija (meħud ftit wara t-tieni tagħlif b'ikel mhux miżjud) hija importanti peress li tintuża estrapolazzjoni ta' ġurnata qabel minn dan il-kejl sabiex tiġi stmata l-konċentrazzjoni fiż-żmien żero (C0,d, il-konċentrazzjoni fil-ħut fi tmiem it-teħid/il-bidu tat-tisfija). Inkella, l-apparat gastrointestinali tal-ħut jista' jitneħħa u jiġi analizzat għalih fi tmiem it-teħid u fil-jiem 1 u 3 tat-tisfija.
                     F'kull okkażjoni tal-kampjunar, il-ħut għandu jitneħħa miż-żewġ reċipjenti tat-test u jiġi ttrattat bl-istess mod kif deskritt fil-metodu milwiem (ara l-paragrafi 61-63).
                     Il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test fil-ħut sħiħ (piż niedi) jitkejlu tal-inqas fi tmiem il-fażi ta' teħid u matul il-fażi ta' tisfija kemm fil-gruppi tal-kontroll kif ukoll tat-test. Matul il-fażi ta' tisfija, huma rakkomandati erba' sa sitt punti tal-kampjunar (eż. 1, 3, 7, 14 u 28 jum). Inkella, jista' jiġi inkluż punt tal-kampjunar ieħor wara t-teħid għal 1-3 ijiem sabiex tiġi stmata l-effiċjenza tal-assimilazzjoni mill-fażi lineari ta' teħid għall-ħut filwaqt li ż-żmien ikun għadu qrib il-perjodu tal-esponiment. Jeżistu żewġ devjazzjonijiet ewlenin mill-iskeda: i) jekk tintuża fażi ta' teħid estiża għall-finijiet ta' investigazzjoni tal-kinetika tat-teħid, sejjer ikun hemm punti tal-kampjunar addizzjonali matul il-fażi ta' teħid u, b'hekk, sejjer ikollu jintuża iktar ħut (ara l-paragrafu 126); ii) jekk l-istudju ġie terminat fi tmiem il-fażi ta' teħid minħabba ebda teħid li jista' jitkejjel (ara l-paragrafu 131). Il-ħut individwali li jittieħed fil-kampjun għandu jintiżen (u jitkejjel it-tul totali tiegħu) sabiex ikunu jistgħu jiġu stabbiliti l-kostanti tar-rata ta' tkabbir. Il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza f'tessut speċifiku tal-ħut (porzjonijiet li jittieklu u li ma jittiklux) jistgħu jitkejlu wkoll fi tmiem il-ħinijiet ta' teħid u l-ħinijiet ta' tisfija magħżulin. Jekk jiġi ttestjat matejal radjotikkettat, għandhom jitqiesu l-istess kunsiderazzjonijiet bħal dawk għall-metodu tal-esponiment milwiem bl-analiżi tal-għalf li tieħu post l-analiżi tal-ilma (ara l-paragrafu 65).
                     Għall-użu perjodiku ta' sustanza ta' referenza (ara l-paragrafu 25), idealment il-konċentrazzjonijiet jitkejlu fil-grupp tat-test fi tmiem it-teħid u fil-ħinijiet ta' tisfija kollha speċifikati għas-sustanza tat-test (ħut sħiħ); il-konċentrazzjonijiet iridu jiġu analizzati biss fil-grupp tal-kontroll fi tmiem it-teħid (ħut sħiħ). F'ċerti ċirkustanzi (pereżempju jekk it-tekniki tal-analiżi għas-sustanza tat-test u s-sustanza ta' referenza jkunu inkompatibbli, b'tali mod li jkun hemm bżonn ta' iktar ħut sabiex tiġi segwita l-iskeda tal-kampjunar), jista' jintuża approċċ ieħor kif ġej sabiex jitnaqqas in-numru ta' ħut addizzjonali meħtieġ. Il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza ta' referenza jitkejlu matul it-tisfija biss fil-jiem 1, 3 u żewġ punti ta' kampjunar oħrajn, magħżulin b'tali mod li l-istimi affidabbli tal-konċentrazzjoni fiż-żmien żero (C0,d) u k
                        2 ikunu jistgħu jsiru għas-sustanza ta' referenza.
                     Jekk possibbli, il-kontenut lipidu tal-ħut individwali għandu jiġi stabbilit f'kull okkażjoni tal-kampjunar, jew tal-inqas fil-bidu u fi tmiem il-fażi ta' teħid u fi tmiem il-fażi ta' tisfija. (ara l-paragrafi 56 u 67). Skont il-metodu analitiku (irreferi għall-paragrafu 67 u għall-Appendiċi 4), jista' jkun possibbli li jintuża l-istess ħut għad-determinazzjoni tal-kontenut lipidu kif ukoll tal-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test. Dan huwa ppreferut għaliex inaqqas in-numri ta' ħut. Madankollu, jekk dan ma jkunx possibbli, jista' jintuża l-istess approċċ kif deskritt fil-metodu tal-esponiment milwiem (ara l-paragrafu 56 għal dawn l-għażliet alternattivi ta' kejl tal-lipidu). Il-metodu użat sabiex jiġi kkwantifikat il-kontenut lipidu għandu jiġi ddokumentat fir-rapport.
                     
                        Kwalità tal-metodu analitiku
                     
                     Għandhom isiru verifiki sperimentali sabiex jiġu żgurati l-ispeċifiċità, ir-reqqa, il-preċiżjoni u r-riproduċibbilità tat-teknika analitika speċifika għas-sustanza, kif ukoll l-irkupri tas-sustanza tat-test kemm mill-ikel kif ukoll mill-ħut.
                     
                        Kejl tat-tkabbir tal-ħut
                     
                     Fil-bidu tat-test, irid jintiżen kampjun ta' ħut mill-popolazzjoni tal-istokk (u jitkejjel it-tul totali ta' dawn). Dan il-ħut għandu jiġi kampjunat ftit qabel l-ewwel tagħlif miżjud (eż. siegħa), u jiġi assenjat għall-jum 0 tal-esperiment. In-numru ta' ħut għal dan il-kampjun għandu jkun tal-inqas l-istess bħal dak għall-kampjuni matul it-test. Uħud minn dawn jistgħu jkunu l-istess ħutiet użati għall-analiżi lipida qabel ma tibda l-fażi ta' teħid (ara l-paragrafu 153). F'kull intervall tal-kampjunar, il-ħut l-ewwel jintiżen u jitkejjel it-tul tiegħu. F'kull ħuta individwali, il-piż imkejjel (u t-tul) għandu jkun marbut mal-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika analizzata (u l-kontenut lipidu, jekk applikabbli), pereżempju bl-użu ta' kodiċi identifikatur uniku għal kull ħuta fil-kampjun. Il-kejliet tal-ħut kampjunat jistgħu jintużaw sabiex jiġu stmati l-piż (u t-tul) tal-ħut li jifdal fit-tankijiet tat-test u tal-kontroll.
                     
                        Evalwazzjoni tal-Esperiment
                     
                     Kuljum għandhom isiru u jiġu rreġistrati osservazzjonijiet tal-mortalità. Għandhom isiru osservazzjonijiet oħrajn għal effetti avversi, pereżempju għal imġiba jew pigmentazzjoni anormali, u dawn għandhom jiġu rreġistrati. Il-ħut jitqies mejjet jekk ma jkun hemm ebda ċaqliq respiratorju u ma tiġi individwata ebda reazzjoni għal stimolu mekkaniku ħafif. Kwalunkwe ħut mejjet jew fi stat moribond ċar għandu jitneħħa.
                     DEJTA U RAPPORTAR
                     
                        Trattament tar-riżultati
                     
                     Ir-riżultati tat-test jintużaw sabiex jinkiseb il-kostant tar-rata ta' tisfija (k
                        2) bħala funzjoni tal-piż niedi totali tal-ħut. Jiġi kkalkolat il-kostant tar-rata ta' tkabbir, k
                        g, ibbażat fuq iż-żieda medja fil-piż tal-ħut, u dan jintuża sabiex jiġi prodott il-kostant tar-rata ta' tisfija kkoreġut għat-tkabbir, k
                        2g, jekk xieraq. Barra minn hekk, għandhom ikunu rrapportati l-effiċjenza tal-assimilazzjoni (a; assorbiment mill-imsaren), il-fattur ta' bijomanjifikazzjoni kinetika (BMFK) (jekk ikun hemm bżonn ikkoreġut għat-tkabbir, BMFKg), il-valur ikkoreġut għal-lipidu tiegħu (BMFKL jew BMFKgL, jekk ikkoreġut għad-dilwizzjoni tat-tkabbir) u r-rata tat-tagħlif. Barra minn hekk, jekk tista' ssir stima tal-ħin għall-istat stazzjonarju fil-fażi ta' teħid (eż. 95 % tal-istat stazzjonarju jew t
                        95 = 3.0/k
                        2), stima tal-BMF fi stat stazzjonarju (BMFSS) tista' tkun inkluża (ara l-paragrafi 105 u 106, u l-Appendiċi 5) jekk il-valur t
                        95 jindika li jista' jkun li ntlaħqu l-kundizzjonijiet tal-istat stazzjonarju. Għandha tiġi applikata l-istess korrezzjoni tal-lipidu għal dan il-BMFSS bħalma tiġi applikata għall-BMF derivat kinetikament (BMFK) sabiex jinħareġ valur ikkoreġut għal-lipidu, BMFSSL (kun af li ma hemm ebda proċedura miftiehma disponibbli sabiex jiġi kkoreġut BMF fi stat stazzjonarju għad-dilwizzjoni tat-tkabbir). Il-formuli u l-kalkoli eżempji huma ppreżentati fl-Appendiċi 7. Hemm approċċi disponibbli li jagħmluha possibbli li jiġi stmat fattur ta' bijokonċentrazzjoni kinetika (BCFK) minn dejta ġġenerata fl-istudju djetetiku. Dan huwa diskuss fl-Appendiċi 8.
                     
                        Dejta dwar il-piż/it-tul tal-ħut
                     
                     Il-piżijiet niedja u t-tul tal-ħut individawli għall-perjodi ta' żmien kollha jitqiegħdu f'tabella b'mod separat għall-gruppi tat-test u tal-kontroll għall-jiem tal-kampjunar kollha matul il-fażi ta' teħid (il-popolazzjoni tal-istokk għall-bidu tat-teħid; il-grupp tal-kontroll u l-grupp tat-test għal tmiem it-teħid u, jekk issir, il-fażi bikrija (eż. jum 1-3 tat-teħid) u l-fażi ta' tisfija (eż. il-jiem 1, 2, 4, 7, 14, 28, għall-grupp tal-kontroll u l-grupp tat-test). Il-piż huwa l-kejl ippreferut tat-tkabbir għall-finijiet ta' korrezzjoni tad-dilwizzjoni tat-tkabbir. Ara hawn taħt (paragrafi 162 u 163) u l-Appendiċi 5 għall-metodu/i użat sabiex id-dejta tiġi kkoreġuta għad-dilwizzjoni tat-tkabbir.
                     
                        Dejta dwar il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħut
                     
                     Il-kejliet tar-residwu fit-test tal-ħut individwali (jew kampjuni tal-ħut raggruppati jekk ma jkunux possibbli kejliet tal-ħut individwali), mogħtijin f'termini tal-konċentrazzjoni tal-piż niedi (w/w), jitqiegħdu f'tabella għall-ħut tal-kontroll u tat-test għal ħinijiet tal-kampjunar individwali. Jekk saret analiżi tal-lipidu fuq kull ħuta fil-kampjun, jistgħu jinkisbu u jiddaħħlu f'tabella l-konċentrazzjonijiet individwali kkoreġuti għal-lipidu, f'termini tal-konċentrazzjoni tal-lipidu (lipidu w/w).
                     
                                 —
                              
                              
                                 Il-kejliet tar-residwu tas-sustanza tat-test f'ħut individwali (jew kampjuni tal-ħut raggruppati jekk ma jkunx possibbli li jsiru kejliet tal-ħut individwali, ara l-paragrafu 66) għall-perjodu ta' tisfija jiġu kkonvertiti fil-logaritmi naturali tagħhom u jiġu plottjati kontra ż-żmien (jum). Jekk spezzjoni viżiva tal-plott turi eċċezzjonijiet ovvji, jista' jiġi applikat test tal-eċċezzjonijiet statistikament validu sabiex jitneħħew punti ta' dejta spurji kif ukoll tingħata ġustifikazzjoni dokumentata għaliex tneħħew.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Korrelazzjoni tal-inqas kaxex lineari tiġi kkalkolata għad-dejta dwar ln(konċentrazzjoni) vs. tisfija (jum). Il-pendil u l-interċetta tal-linja jiġu rrapportati bħala l-kostant totali tar-rata ta' tisfija (k
                                    2) u l-logaritma naturali tal-konċentrazzjoni derivata fiż-żmien żero (C0,d) (ara l-Appendiċi 5 u l-Appendiċi 7 għal iktar dettalji). Jekk dan ma jkunx possibbli għaliex il-konċentrazzjonijiet jaqgħu taħt il-limitu tal-kwantifikazzjoni għat-tieni kampjun ta' tisfija, tista' ssir stima konservattiva tal-k
                                    2 (ara l-Appendiċi 7).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-varjanzi fil-pendil u l-interċetta tal-linja huma kkalkolati bl-użu tal-proċeduri statistiċi standard u l-intervalli ta' kunfidenza ta' 90 % (jew 95 %) madwar dawn ir-riżultati jiġu evalwati u ppreżentati.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-konċentrazzjoni medja mkejla fil-ħut għall-jum finali tat-teħid (il-konċentrazzjoni fiż-żmien żero mkejla, C0,m) tiġi kkalkolata wkoll u titqabbel mal-valur derivat C0,d. F'każ li l-valur derivat ikun inqas mill-valur imkejjel, id-differenza tista' tissuġġerixxi l-preżenza ta' ikel miżjud mhux iddiġerit fl-imsaren. Jekk il-valur derivat ikun ferm ogħla mill-valur imkejjel, dan jista' jkun indikazzjoni li l-valur derivat mir-rigressjoni lineari tad-dejta dwar it-tisfija huwa żbaljat u għandu jerġa' jiġi evalwat (ara l-Appendiċi 7).
                              
                           
                        Rata ta' tisfija u fattur ta' bijomanjifikazzjoni
                     
                     Sabiex jiġi kkalkolat il-fattur ta' bijomanjifikazzjoni mid-dejta, l-ewwel għandha tinkiseb l-effiċjenza tal-assimilazzjoni (adsorbiment tas-sustanza tat-test fl-imsaren, α). Sabiex isir hekk, għandha tintuża l-ekwazzjoni A7.1 fl-Appendiċi 7, li teħtieġ li jkunu magħrufin il-konċentrazzjoni derivata fil-ħut fiż-żmien żero tal-fażi ta' tisfija (C0,d), il-kostant (totali) tar-rata ta' tisfija (k
                        2), il-konċentrazzjoni fl-ikel (Cfood), il-kostant tar-rata ta' inġestjoni tal-ikel (I) u d-durata tal-perjodu ta' teħid (t). Il-pendil u l-interċetta tar-relazzjoni lineari bejn ln(konċentrazzjoni) u l-ħin ta' tisfija jiġu rrapportati bħala l-kostant totali tar-rata ta' tisfija (k
                        2 = pendil) u l-konċentrazzjoni fiż-żmien żero (C0,d = einterċetta), kif spjegat hawn fuq. Il-valuri derivati għandhom jiġu vverifikati għall-plawżibbiltà bijoloġika (eż. l-effiċjenza tal-assimilazzjoni bħala frazzjoni mhijiex ikbar minn 1). (I) hija kkalkolata bid-diviżjoni tal-massa tal-ikel bil-massa tal-ħut magħlef kuljum (jekk jingħata ikel li jiżen 2 % tal-piż tal-ġisem, (I) sejjer ikun 0.02). Madankollu, ir-rata ta' tagħlif użata fil-kalkolu jaf ikollha bżonn tiġi aġġustata għat-tkabbir tal-ħut (dan jista' jsir bl-użu tal-kostant magħruf tar-rata ta' tkabbir sabiex jiġi stmat il-piż tal-ħut f'kull punt ta' żmien matul il-fażi ta' teħid; ara l-Appendiċi 7). F'każijiet li fihom ma jistgħux jinkisbu k
                        2 and C0,d għaliex, pereżempju, il-konċentrazzjonijiet waqgħu taħt il-limitu ta' detezzjoni għat-tieni kampjun ta' tisfija, jistgħu jsiru stima konservattiva ta' k
                        2 u BMFk“ta' livell superjuri” (ara l-Appendiċi 7).
                     Ladarba tinkiseb l-effiċjenza tal-assimilazzjoni (α), il-fattur ta' bijomanjifikazzjoni jista' jiġi kkalkolat billi α tiġi moltiplikata bil-kostant tar-rata ta' inġestjoni (I) u bid-diviżjoni bil-kostant (totali) tar-rata ta' tisfija (k
                        2). Il-fattur ta' bijomanjifikazzjoni kkoreġut għat-tkabbir huwa kkalkolat bl-istess mod iżda bl-użu tal-kostant tar-rata ta' tisfija kkoreġut għat-tkabbir (k
                        2g; ara l-paragrafi 162 u 163. Stima alternattiva tal-effiċjenza tal-assimilazzjoni tista' tinkiseb jekk l-analiżi tat-tessut saret fuq ħut kampjunat fil-fażi lineari bikrija tal-fażi ta' teħid; ara l-paragrafu 151 u l-Appendiċi 7. Dan il-valur jirrappreżenta stima indipendenti tal-effiċjenza tal-assimilazzjoni għal organiżmu essenzjalment mhux espost (jiġifieri l-ħut huwa qrib il-bidu tal-fażi ta' teħid). L-effiċjenza tal-assimilazzjoni stmata mid-dejta ta' tisfija normalment tintuża sabiex jinkiseb il-BMF.
                     
                        Korrezzjoni għal-Lipidu u Korrezzjoni tad-Dilwizzjoni tat-Tkabbir
                     
                     It-tkabbir tal-ħut matul il-fażi ta' tisfija jista' jbaxxi l-konċentrazzjonijiet kimiċi mkejlin fil-ħut bl-effett li l-kostant totali tar-rata ta' tisfija, k
                        2, ikun ikbar minn dak li jirriżulta minn proċessi ta' tneħħija (eż. metaboliżmu, eġestjoni) waħedhom (ara l-paragrafu 72). Il-kontenuti lipidi tal-ħut tat-test (li huma ferm assoċjati mal-bijoakkumulazzjoni ta' sustanzi idrofobiċi) u kontenuti lipidi tal-ikel jistgħu jvarjaw biżżejjed fil-prattika tant li jkun hemm bżonn li jiġu kkoreġuti sabiex il-fatturi ta' bijomanjifikazzjoni jkunu ppreżentati b'mod sinifikanti. Il-fattur ta' bijomanjifikazzjoni għandu jiġi kkoreġut għad-dilwizzjoni tat-tkabbir (bħall-BCF kinetiku fil-metodu tal-esponiment milwiem) u jiġi kkoreġut għall-kontenut lipidu tal-ikel marbut ma' dak tal-ħut (il-fattur ta' korrezzjoni għal-lipidu). L-ekwazzjonijiet u l-eżempji għal dawn il-kalkoli jistgħu jinkisbu fl-Appendiċi 5 u l-Appendiċi 7, rispettivament.
                     Sabiex issir korrezzjoni għad-dilwizzjoni tat-tkabbir, għandu jiġi kkalkolat il-kostant tar-rata ta' tisfija kkoreġut għat-tkabbir (k
                        2g) (ara l-Appendiċi 5 għall-ekwazzjonijiet). Imbagħad, dan il-kostant tar-rata ta' tisfija kkoreġut għat-tkabbir (k
                        2g) jintuża sabiex jiġi kkalkolat il-fattur ta' bijomanjifikazzjoni kkoreġut għat-tkabbir, bħal fil-paragrafu 73. F'ċerti każijiet dan l-approċċ ma jkunx possibbli. Approċċ alternattiv li jevita l-ħtieġa ta' korrezzjoni tad-dilwizzjoni tat-tkabbir jinvolvi l-użu ta' dejta dwar it-tisfija tal-massa tas-sustanza tat-test għal kull ħuta (fuq il-bażi tal-ħuta sħiħa) minflok id-dejta tas-soltu dwar il-massa tas-sustanza tat-test għal kull unità tal-massa tal-ħut (konċentrazzjoni). Dan jista' jinkiseb faċilment peress li t-testijiet skont dan il-metodu għandhom jorbtu l-konċentrazzjonijiet tat-tessut irreġistrati mal-piżijiet tal-ħut individwali. Il-proċedura sempliċi għal dan hija spjegata fl-Appendiċi 5. Kun af li l-k
                        2 xorta waħda għandu jiġi stmat u rrapportat, anki jekk jintuża dan l-approċċ.
                     Sabiex issir korrezzjoni għall-kontenut lipidu tal-ikel u l-ħut meta l-analiżi tal-lipidu ma tkunx saret fuq il-ħut kollu fil-kampjun, jinkisbu l-frazzjonijiet lipidi medji (w/w) fil-ħut u fl-ikel (68). Imbagħad jiġi kkalkolat il-fattur ta' korrezzjoni għal-lipidu (Lc
                        ) bid-diviżjoni tal-frazzjoni tal-lipidu medju fil-ħut bil-frazzjoni tal-lipidu medju fl-ikel. Il-fattur ta' bijomanjifikazzjoni, ikkoreġut għat-tkabbir jew le skont kif ikun applikabbli, jiġi diviż bil-fattur ta' korrezzjoni għal-lipidu sabiex jiġi kkalkolat il-fattur ta' bijomanjifikazzjoni kkoreġut għal-lipidu.
                     Jekk l-analiżijiet kimiċi u lipidi saru fuq l-istess ħut fl-istess punt tal-kampjunar, tista' tintuża d-dejta dwar it-tessut ikkoreġuta għal-lipidu għal ħut individwali sabiex jiġi kkalkolat BMF ikkoreġut għal-lipidu direttament (ara (37)). Il-plott tad-dejta dwar il-konċentrazzjoni kkoreġuta għal-lipidu jagħti C0,d fuq bażi lipida u k
                        2. Imbagħad, l-analiżi matematika tista' tkompli bl-użu tal-istess ekwazzjonijiet fl-Appendiċi 7, iżda l-effiċjenza tal-assimilazzjoni (a) tiġi kkalkolata bl-użu tal-kostant tar-rata ta' inġestjoni tal-ikel normalizzata għal-lipidu (I
                        lipidu) u l-konċentrazzjoni djetetika fuq bażi lipida (Cikel-lipidu). Imbagħad, il-parametri kkoreġuti għal-lipidu jintużaw b'mod simili sabiex jiġi kkalkolat il-BMF (kun af li l-korrezzjoni tal-kostant tar-rata ta' tkabbir għandha tiġi applikata wkoll għall-frazzjoni tal-lipidu minflok il-piż niedi tal-ħut sabiex jiġi kkalkolat il-BMFKgL ikkoreġut għat-tkabbir u kkoreġut għal-lipidu).
                     
                        Interpretazzjoni tar-riżultati
                     
                     Fil-prinċipju, it-tkabbir medju fil-grupp tat-test kif ukoll f'tal-kontroll ma għandux ikun wisq differenti sabiex jiġu esklużi l-effetti tossiċi. Il-kostanti tar-rata ta' tkabbir jew il-kurvi tat-tkabbir taż-żewġ gruppi għandhom jitqabblu permezz ta' proċedura xierqa (69)).
                     
                        Rapport tat-test
                     
                     Wara li jintemm l-istudju, jitħejja rapport finali li jkun fih l-informazzjoni dwar is-Sustanza tat-Test, l-Ispeċi tat-Test u l-Kundizzjonijiet tat-Test kif elenkata fil-paragrafu 81 (bħal fil-każ tal-metodu tal-esponiment milwiem). Barra minn hekk, hija meħtieġa l-informazzjoni li ġejja:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanza tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Kwalunkwe informazzjoni dwar l-istabilità tas-sustanza fl-ikel imħejji;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kundizzjonijiet tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-konċentrazzjoni nominali tas-sustanza fl-ikel, it-teknika ta' kif tiżdied is-sustanza, l-ammont ta' veikolu (lipidu) użat fil-proċess ta' żieda tas-sustanza fl-ikel (jekk jintuża), il-kejliet tal-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fid-dieta miżjuda bis-sustanza għal kull analiżi (tal-inqas fi triplikat qabel il-bidu tal-istudju u tmiem it-teħid) u l-valuri medji;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Jekk jintuża, it-tip u l-kwalità taż-żejt trasportatur jew is-solvent (grad, fornitur, eċċ.) użat għaż-żieda tas-sustanza mal-ikel;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             It-tip ta' ikel użat (analiżi prossima (70), grad jew kwalità, fornitur, eċċ.), ir-rata tat-tagħlif matul il-fażi ta' teħid, l-ammont ta' ikel mogħti u l-frekwenza (inkluż kwalunkwe aġġustament fuq il-bażi tal-piż tal-ħut fil-kampjun);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-ħin li fih inġabar u li fih ġie ewtanizzat il-ħut għall-analiżi kimika għal kull punt tal-kampjunar (eż. siegħa qabel it-tagħlif tal-ġurnata li jmiss);
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ir-riżultati:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Ir-riżultati minn kwalunkwe ħidma ta' studju preliminari;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Informazzjoni dwar kwalunkwe effett avvers osservat.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Deskrizzjoni sħiħa tal-proċeduri ta' analiżi kimika kollha mħaddmin inklużi l-limiti ta' detezzjoni u l-kwantifikazzjoni, il-varjabbiltà u l-irkupru.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-konċentrazzjonijiet ta' lipidu mkejlin fl-ikel (dieta miżjuda u tal-kontroll), il-valuri individwali, medji u d-devjazzjonijiet standard;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Dejta f'tabella tal-piż (u t-tul) tal-ħut, b'rabta mal-ħut individwali, kemm għall-gruppi tal-kontroll u tal-esponiment (pereżempju bl-użu ta' identifikaturi uniċi għal kull ħuta) u kalkoli, il-kostant(i) tar-rata ta' tkabbir derivat u intervall(i) ta' kunfidenza ta' 95 %;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Id-dejta f'tabella dwar il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħut, il-konċentrazzjoni medja mkejla fi tmiem it-teħid (C
                                                0,m), u l-kostant (totali) derivat tar-rata ta' tisfija (k
                                                2) u l-konċentrazzjoni fil-ħut fil-bidu tal-fażi ta' tisfija (C
                                                0,d) flimkien mal-varjanzi f'dawn il-valuri (pendil u interċetta);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Id-dejta f'tabella dwar il-kontenuti ta' lipidu fil-ħut (elenkata kontra l-konċentrazzjonijiet tas-sustanza speċifiċi, jekk applikabbli), il-valuri medji għall-grupp tat-test u l-kontroll fil-bidu tat-test, tmiem it-teħid u tmiem it-tisfija;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-kurvi (inkluża d-dejta mkejla kollha), li juru dan li ġej (jekk applikabbli, il-konċentrazzjonijiet jistgħu jiġu espressi b'rabta mal-ġisem sħiħ tal-annimal jew tessuti speċifiċi tiegħu):
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         it-tkabbir (jiġifieri l-piż tal-ħut (u t-tul) vs il-ħin) jew il-piż trasformat tal-logaritma naturali vs il-ħin;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         it-tisfija tas-sustanza tat-test fil-ħut; u
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-konċentrazzjoni trasformata tal-logaritma naturali (f'konċentrazzjoni) vs il-ħin tat-tisfija (inkluż il-kostant tar-rata ta' tisfija derivat k
                                                            2, u l-konċentrazzjoni derivata tal-logaritma naturali fil-ħut fil-bidu tal-fażi ta' tisfija, C
                                                            0,d).
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Jekk spezzjoni viżiva ta' plott turi eċċezzjonijiet ovvji, jista' jiġi applikat test tal-eċċezzjonijiet statistikament validu sabiex jitneħħew punti ta' dejta spurji kif ukoll tingħata ġustifikazzjoni dokumentata għaliex tneħħew.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-kostant tar-rata ta' tisfija kkoreġut għat-tkabbir u n-nofs ħajja kkoreġuta għat-tkabbir ikkalkolati.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             L-effiċjenza tal-assimilazzjoni (α) ikkalkolata.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             BMF djetetiku “mhux raffinat” BMF kinetiku kkoreġut għad-dilwizzjoni tat-tkabbir u l-lipidu (“mhux raffinat” u kkoreġut għal-lipidu fuq il-bażi tal-piż niedi tal-ħut sħiħ), il-BMF speċifiku għat-tessut jekk applikabbli.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Kwalunkwe informazzjoni li tikkonċerna metaboliti radjotikkettati tas-sustanza tat-test u l-akkumulazzjoni tagħhom.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Kwalunkwe ħaġa li mhijiex tas-soltu dwar it-test, kwalunkwe devjazzjoni minn dawn il-proċeduri, u kwalunkwe informazzjoni rilevanti oħra.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Tabella li tiġbor id-dejta mkejla u kkalkolata rilevanti, kif spjegat hawn;
                                             
                                                         Kostanti tar-Rata ta' Tisfija tas-Sustanza u Fatturi ta' Bijomanjifikazzjoni (BMFK)
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            k
                                                            g (kostant tar-rata ta' tkabbir; jum– 1):
                                                      
                                                      
                                                         Daħħal Valur (95 % CI) (71)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            k
                                                            2 (kostant totali tar-rata tat-tisfija, jum:
                                                      
                                                      
                                                         Daħħal Valur (95 % CI)
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            k
                                                            2g (kostant tar-rata ta' tisfija korrett għat-tkabbir; jum– 1):
                                                      
                                                      
                                                         Daħħal Valur (95 % CI) (71)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            C
                                                            0,m (konċentrazzjoni mkejla fiż-żmien żero, il-konċentrazzjoni fil-ħut fi tmiem it-teħid) (μg/g):
                                                      
                                                      
                                                         Daħħal Valur ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            C
                                                            0,d (konċentrazzjoni fiż-żmien żero derivata tal-fażi ta' tisfija; μg/g):
                                                      
                                                      
                                                         Daħħal Valur ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            I (rata ta' inġestjoni tal-għalf stabbilita; g ikel/g ħut/jum):
                                                      
                                                      
                                                         Daħħal Valur
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            I
                                                            g (rata ta' tagħlif effettiva, aġġustata għat-tkabbir; g ikel/g ħut/jum) (72):
                                                      
                                                      
                                                         Daħħal Valur ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         Cfood (konċentrazzjoni kimika fl-ikel; μg/g):
                                                      
                                                      
                                                         Daħħal Valur ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         α (effiċjenza tal-assimilazzjoni tas-sustanza):
                                                      
                                                      
                                                         Daħħal Valur ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         BMFK (BMF djetetiku kinetiku):
                                                      
                                                      
                                                         Daħħal Valur (95 % CI) (71)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         BMFKg (BMF djetetiku kinetiku kkoreġut għat-tkabbir):
                                                      
                                                      
                                                         Daħħal Valur (95 % CI) (71)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            t
                                                            1/2g (nofs ħajja kkoreġuta għat-tkabbir f'jiem);
                                                      
                                                      
                                                         Daħħal Valur ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            Lc (fattur ta' korrezzjoni għal-lipidu):
                                                      
                                                      
                                                         Daħħal Valur
                                                      
                                                   
                                                         BMFKgL (BMF kinetiku kkoreġut għat-tkabbir u kkoreġut għal-lipidu):
                                                      
                                                      
                                                         Daħħal Valur
                                                      
                                                   
                                                         BMFSS-L (BMF indikattiv fi stat stazzjonarju kkoreġut għal-lipidu) (72):
                                                      
                                                      
                                                         Daħħal Valur ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                       
                           TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Chapter C.13 of this Annex, Bioconcentration: Flow-through Fish Test.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Chapter A.6 of this Annex, Water Solubility
                                 
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Li A, Doucette W.J. (1993), The effect of cosolutes on the aqueous solubilities and octanol/water partition coefficients of selected polychlorinated biphenyl congeners. Environ Toxicol Chem 12: 2031-2035
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Chapter A.8 of this Annex, Partition Coefficient (n-octanol/water): Shake Flask Method.
                                 
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Chapter A.24 of this Annex, Partition Coefficient (n-octanol/water), HPLC Method.
                                 
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Chapter A.23 of this Annex, Partition Coefficient (1-Octanol/Water): Slow-Stirring Method.
                                 
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Chapter C.7 of this Annex, Hydrolysis as a Function of pH.
                                 
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 (OECD (1997), OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment Number 7: Guidance Document on Direct Phototransformation of Chemicals in Water OCDE/GD(97)21. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), Paris, France.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Chapter A.5 of this Annex, Surface Tension of Aqueous Solutions.
                                 
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Chapter A.4 of this Annex, Vapour Pressure.
                                 
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Chapter C.4 of this Annex, Ready Biodegradability.
                                 
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Chapter C.29 of this Annex, Ready Biodegradability — CO2 in sealed vessels
                                 
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Connell D.W. (1988), Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102: 117-156.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993), Nonlinear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR QSAR Environ. Res. 1: 29-39.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 OECD (2011), QSAR Toolbox 2.1. February 2011. Available from: http://www.oecd.org/document/54/0,3746,en_2649_34379_42923638_1_1_1_1,00.html.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Brown R.S., Akhtar P., Åkerman J., Hampel L., Kozin I.S., Villerius L.A. and Klamer H.J.C. (2001), Partition controlled delivery of hydrophobic substances in toxicity tests using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) films. Environ. Sci. Technol. 35: 4097-4102.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Fernandez J.D., Denny J.S. and Tietge J.E. (1998), A simple apparatus for administering 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin to commercially available pelletized fish food. Environ. Toxicol. Chem. 17: 2058-2062.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Nichols J.W., Fitzsimmons P.N., Whiteman F.W. and Dawson T.D. (2004), A physiologically based toxicokinetic model for dietary uptake of hydrophobic organic compounds by fish: I. Feeding studies with 2,2′, 5,5′-tetrachlorobiphenyl. Toxicol. Sci. 77: 206-218.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Parkerton T.F., Arnot J.A., Weisbrod A.V., Russom C., Hoke R.A., Woodburn K., Traas T., Bonnell M., Burkhard L.P. and Lampi M.A. (2008), Guidance for evaluating in vivo fish bioaccumulation data. Integr. Environ. Assess. Manag. 4: 139-155.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Verbruggen E.M.J., Beek M., Pijnenburg J. and Traas T.P. (2008). Ecotoxicological environmental risk limits for total petroleum hydrocarbons on the basis of internal lipid concentrations. Environ. Toxicol. Chem. 27: 2436-2448.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Schlechtriem C., Fliedner A. and Schäfers C. (2012), Determination of lipid content in fish samples from bioaccumulation studies: Contributions to the revision of OECD Test Guideline 305. Environmental Sciences Europe 2012, 24:13. published: 3 April 2012.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Chapter C.47 of this Annex, Fish, Early-Life Stage Toxicity Test.
                                 
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Chapter C.15 of this Annex, Fish, Short-term Toxicity Test on Embryo and Sac-Fry Stages
                                 
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Chapter C.14 of this Annex, Fish, Juvenile Growth Test.
                                 
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 OECD (2000), OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 23: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures ENV/JM/MONO(2000)6. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), Paris, France.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 US-EPA (1994), Great Lake water quality initiative technical support document for the procedure to determine bioaccumulation factors 822-R-94-002. US EPA, Office of Water, Office of Science and Technology, Washington, DC, USA.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 US-FDA (1999), Pesticide analytical manual (PAM). Vol.1. US Food and Drug Administration, Rockville, MD, USA.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 US-EPA (1974), Section 5, A (1) Analysis of Human or Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson, J.F., Editor. US-EPA, Research Triangle Park, NC, USA
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 Bligh E.G. and Dyer W.J. (1959), A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Gardner W.S., Frez W.A., Cichocki E.A. and Parrish C.C. (1985), Micromethod for lipids in aquatic invertebrates. Limnol. Oceanogr. 30: 1099-1105.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Smedes F. (1999), Determination of total lipid using non-chlorinated solvents. Analyst. 124: 1711-1718.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 OECD (2006), OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 54: Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application. ENV/JM/MONO(2006)18. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), Paris, France.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Springer T.A., Guiney P.D., Krueger H.O. and Jaber M.J. (2008), Assessment of an approach to estimating aquatic bioconcentration factors using reduced sampling. Environ. Toxicol. Chem. 27: 2271-2280.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Springer T.A. (2009), Statistical Research Related to Update of OECD Guideline 305. Wildlife International, Ltd, Easton, MD, USA.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Arnot J.A., Meylan W., Tunkel J., Howard P.H., Mackay D., Bonnell M. and Boethling R.S. (2009), A quantitative structure-activity relationship for predicting metabolic biotransformation rates for organic chemicals in fish. Environ. Toxicol. Chem. 28: 1168-1177.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Parkerton T., Letinski D., Febbo E., Davi R., Dzambia C., Connelly M., Christensen K. and Peterson D. (2001), A practical testing approach for assessing bioaccumulation potential of poorly water soluble organic chemicals (presentation). in SETAC Europe 12th Annual Meeting: Madrid, Spain.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Fisk A.T., Cymbalisty C.D., Bergman Ã. and Muir D.C.G. (1996), Dietary accumulation of C12- and C16-chlorinated alkanes by juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Environ. Toxicol. Chem. 15: 1775-1782.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 Anonymous (2004), Fish, dietary bioaccumulation study — Basic protocol, document submitted to the TC-NES WG on PBT.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 Anonymous (2004), Background document to the fish dietary study protocol, document submitted to the TC-NES WG on PBT.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Bruggeman W.A., Opperhuizen A., Wijbenga A. and Hutzinger O. (1984), Bioaccumulation of super-lipophilic chemicals in fish, Toxicol. Environ. Chem. 7: 173-189.
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Muir D.C.G., Marshall W.K. and Webster G.R.B. (1985), Bioconcentration of PCDDs by fish: effects of molecular structure and water chemistry. Chemosphere. 14: 829-833.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 Thomann R.V. (1989), Bioaccumulation model of organic chemical distribution in aquatic food chains. Environ. Sci. Technol. 23: 699-707.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 Nichols J.W., Fitzsimmons P.N. and Whiteman F.W. (2004), A physiologically based toxicokinetic model for dietary uptake of hydrophobic organic compounds by fish: II. Stimulation of chronic exposure scenarios. Toxicol. Sci. 77: 219-229.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 Gobas F.A.P.C., de Wolf W., Burkhard L.P., Verbruggen E. and Plotzke K. (2009), Revisiting bioaccumulation criteria for POPs and PBT assessments. Integr. Environ. Assess. Manag. 5: 624-637.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 Sijm D.T.H.M. and van der Linde A. (1995), Size-dependent bioconcentration kinetics of hydrophobic organic chemicals in fish based on diffusive mass transfer and allometric relationships. Environ. Sci. Technol. 29: 2769-2777.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., de Jonge W.J., Pärt P. and Opperhuizen A. (1995), Allometry in the uptake of hydrophobic chemicals determined in vivo and in isolated perfused gills. Toxicol. Appl. Pharmacol. 131: 130-135.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Fisk A.T., Norstrom R.J., Cymbalisty C.D. and Muir D.G.G. (1998), Dietary accumulation and depuration of hydrophobic organochlorines: Bioaccumulation parameters and their relationship with the octanol/water partition coefficient. Environ. Toxicol. Chem. 17: 951-961.
                              
                           
                                 (48)
                              
                              
                                 McGrath J.A., Parkerton T.F. and Di Toro D.M. (2004), Application of the narcosis target lipid model to algal toxicity and deriving predicted-no-effect concentrations. Environ. Toxicol. Chem. 23: 2503-2517.
                              
                           
                                 (49)
                              
                              
                                 Poppendieck D.G. (2002), Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Desorption Mechanisms from Manufactured Gas Plant Site Samples. Dissertation. Department of Civil, Architectural and Environmental Engineering, University of Texas, Austin, TX, USA.
                              
                           
                                 (50)
                              
                              
                                 McCarty L.S. and Mackay D. (1993), Enhancing ecotoxicological modelling and assessment: body residues and modes of toxic action. Environ. Sci. Technol. 27: 1718-1728.
                              
                           
                                 (51)
                              
                              
                                 OECD (2012), OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 175: Part I — Validation Report of a ring test for the OECD TG 305 dietary exposure bioaccumulation fish test. Part II — Additional Report including comparative analysis of trout and carp results ENV/JM/MONO(2012)20. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), Paris, France.
                              
                           
                        Appendiċi 1
                        DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET
                        
                                     
                                 
                                 
                                    L-effiċjenza tal-assimilazzjoni (α) hija kejl tal-ammont relattiv tas-sustanza assorbita mill-imsaren fl-organiżmu (α hija mingħajr unità, iżda spiss tingħata bħala perċentwal iktar milli frazzjoni).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Ġeneralment il-bijoakkumulazzjoni tissejjaħ proċess li fih il-konċentrazzjoni tas-sustanza f'organiżmu tilħaq livell li jaqbeż dak fil-medium respiratorju (eż. l-ilma għal ħuta jew l-arja għal mammiferu), id-dieta, jew it-tnejn (1).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-bijokonċentrazzjoni hija ż-żieda fil-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test ġo jew fuq organiżmu (jew tessuti speċifiċi tiegħu) relatata mal-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-medium li jiċċirkundaha.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-fattur ta' bijokonċentrazzjoni (BCF jew K
                                       B) fi kwalunkwe ħin matul il-fażi ta' teħid ta' dan it-test tal-akkumulazzjoni hija l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test ġo/fuq il-ħut jew it-tessuti speċifiċi tiegħu (C
                                       f bħala mg/kg) diviża bil-konċentrazzjoni tas-sustanza fil-mezz li jiċċirkundaha (C
                                       w bħala mg/l). BCF huwa espress f'l·kg– 1. Jekk jogħġbok kun af li l-korrezzjonijiet għat-tkabbir u/jew il-kontenut lipidu standard mhumiex meqjusin.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-bijomanjifikazzjoni hija ż-żieda fil-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test ġo jew fuq organiżmu (jew tessuti speċifiċi tiegħu) relatata mal-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fl-ikel.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-fattur ta' bijomanjifikazzjoni (BMF) huwa l-konċentrazzjoni ta' sustanza fi predatur b'rabta mal-konċentrazzjoni fil-priża (jew l-ikel) tal-predatur fi stat stazzjonarju. Fil-metodu deskritt f'dan il-metodu ta' ttestjar, l-esponiment permezz tal-fażi milwiema jiġi evitat bir-reqqa u, b'hekk, valur tal-BMF minn dan il-metodu ta' ttestjar ma jistax jitqabbel direttament ma' valur tal-BMF minn studju prattiku (li fih jistgħu jiġu kombinati l-esponiment mill-ilma kif ukoll l-esponiment djetetiku).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-fattur ta' bijomanjifikazzjoni djetetika (BMF djetetiku) hwua t-terminu użat f'dan il-metodu ta' ttestjar sabiex jiġi deskritt ir-riżultat tat-test ta' esponiment djetetiku, li fih l-esponiment permezz tal-fażi milwiema jiġi evitat bir-reqqa u, b'hekk, il-BMF djetetiku minn dan il-metodu ta' ttestjar ma jistax jitqabbel direttament ma' valur tal-BMF minn studju prattiku (li fih jistgħu jiġu kombinati l-esponiment mill-ilma kif ukoll l-esponiment djetetiku).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-fażi ta' tisfija jew ta' wara l-esponiment (telf) hija l-ħin, wara t-trasferiment tal-ħut tat-test minn medium li fih is-sustanza tat-test għal medium liberu ta' dik is-sustanza, li matulu tiġi studjata t-tisfija (jew it-telf nett) tas-sustanza mill-ħut tat-test (jew tessut speċifiku tiegħu).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-kostant tar-rata ta' tisfija (telf) (k
                                       2) huwa l-valur numeriku li jiddefinixxi r-rata ta' tnaqqis fil-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħut tat-test (jew tessuti speċifiċi tiegħu) wara t-trasferiment tal-ħut tat-test minn medium li fih is-sustanza tat-test għal medium liberu ta' dik is-sustanza (k
                                       2 huwa espress f'jum-1).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-karbonju organiku dissolt (DOC) huwa kejl tal-konċentrazzjoni tal-karbonju li joriġina minn sorsi organiċi dissolti fil-media tat-test.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-fażi tal-esponiment jew ta' teħid hija ż-żmien li matulu l-ħut jiġu esposti għas-sustanza tat-test.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Ir-rata ta' inġestjoni tal-ikel (I) hija l-ammont medju ta' ikel meħud minn kull ħuta kuljum, b'rabta mal-piż medju stmat tal-ġisem tal-ħut sħiħ (espress f'termini ta' g ikel/g ħut/jum).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-fattur ta' bijokonċentrazzjoni kinetika (BCFK) huwa l-proporzjon tal-kostant tar-rata ta' teħid, k
                                       1, għall-kostant tar-rata ta' tisfija, k
                                       2 (jiġifieri k
                                       1/k
                                       2 — ara d-definizzjonijiet korrispondenti f'dan l-Appendiċi). Fil-prinċipju, il-valur għandu jkun komparabbli mal-BCFSS (ara d-definizzjoni iktar 'il fuq), iżda jista' jkun hemm devjazzjonijiet jekk l-istat stazzjonarju kien inċert jew jekk ġew applikati korrezzjonijiet għat-tkabbir għall-BCF kinetiku.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-fattur ta' bijokonċentrazzjoni kinetika normalizzat għal-lipidu (BCFKL) huwa normalizzat għal ħuta b'kontenut lipidu ta' 5 %.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-fattur ta' bijokonċentrazzjoni kinetika kkoreġut għat-tkabbir normalizzat għal-lipidu (BCFKgL) huwa normalizzat għal ħuta b'kontenut lipidu ta' 5 % u kkoreġut għat-tkabbir matul il-perjodu ta' studju kif spjegat fl-Appendiċi 5.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-fattur ta' bijokonċentrazzjoni fi stat stazzjonarju normalizzat għal-lipidu (BCFSSL) huwa normalizzat għal ħuta b'kontenut lipidu ta' 5 %.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Sustanza multikostitwenti hija definita għall-fini tar-REACH bħala sustanza li għandha iktar minn kostitwent ewlieni wieħed preżenti f'konċentrazzjoni ta' bejn 10 % u 80 % (w/w).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-koeffiċjent ta' partizzjoni ottanol/ilma (KOW) huwa l-proporzjon tas-solubilità ta' sustanza f'n-ottanol u ilma f'ekwilibriju (Metodi A.8 (2), A.24 (3), A.23 (4)); espress ukoll bħala POW. Il-logaritma ta' KOW tintuża bħala indikazzjoni tal-potenzjal ta' sustanza għal bijokonċentrazzjoni minn organiżmi akwatiċi.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-karbonju organiku partikulat (POC) huwa kejl tal-konċentrazzjoni tal-karbonju li joriġina minn sorsi organiċi sospiżi fil-media tat-test.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-mikroestrazzjoni tal-fażi solida (SPME) hija teknika analitika mingħajr solvent żviluppata għal sistemi dilwiti. F'dan il-metodu, fibra miksija b'polimeru tiġi esposta għall-fażi gassuża jew likwida li fiha l-analit ta' interess. Ġeneralment, jiġi impost żmien miminu tal-analiżi sabiex jiġu stabbiliti kundizzjonijiet ta' ekwlibriju bejn il-fażijiet solidi u fluwidi, fir-rigward tal-ispeċi mkejla. Imbagħad, tkun tista' tiġi stabbilita l-konċentrazzjoni tal-analit ta' interess direttament mill-fibra jew wara li tiġi estratta mill-fibra f'solvent, skont it-teknika ta' determinazzjoni.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Stat stazzjonarju jintlaħaq fil-plott tas-sustanza tat-test fil-ħut (Cf) kontra l-ħin meta l-kurva ssir parallela għall-assi tal-ħin u tlett analiżijiet suċċessivi tas-Cf magħmula fuq kampjuni meħuda fl-intervalli ta' mill-inqas jumejn huma fi ħdan ± 20 % minn xulxin, u ma hemmx żieda sinifikanti ta' Cf fil-ħin bejn l-ewwel u l-aħħar analiżi suċċessivi. Meta jiġu analizzati l-kampjuni miġbura flimkien, hemm bżonn ta' mill-inqas erba' analiżijiet suċċessivi. Għas-sustanzi tat-test li jittieħdu bil-mod, ikun aktar xieraq li l-intervalli jkunu ta' sebat ijiem.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-fattur ta' bijokonċentrazzjoni fi stat stazzjonarju (BCFSS) ma jinbidilx b'mod sinifikanti tul perjodu mġedded ta' żmien, bil-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-medium li jiċċirkundaha li tibqa' kostanti tul dan il-perjodu ta' żmien (ara d-Definizzjoni ta' stat stazzjonarju).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-karbonju organiku totali (TOC) huwa kejl tal-konċentrazzjoni tal-karbonju li joriġina mis-sorsi organiċi kollha fil-media tat-test, inklużi sorsi partikulati u dissolti.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-kostant tar-rata ta' teħid (k
                                       1) huwa l-valur numeriku li jiddefinixxi r-rata ta' żieda fil-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test f'ħut tat-test jew fuqu (jew tessuti speċifiċi tiegħu) meta l-ħut ikun espost għal dik is-sustanza (k
                                       1 huwa espress f'l kg– 1 jum– 1).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Sustanzi b'kompożizzjoni Mhux Magħrufa jew Varjabbli, Prodotti ta' reazzjoni kumplessa u Materjali bijoloġiċi huma magħrufin bħala UVCB
                                    
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Sustanza kimika hija sustanza jew taħlita.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Sustanza kimika tat-test hija kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata bl-użu ta' dan il-metodu ta' ttestjar.
                                 
                              TAGĦRIF
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Gobas F.A.P.C., de Wolf W., Burkhard L.P., Verbruggen E. and Plotzke K. (2009), Revisiting bioaccumulation criteria for POPs and PBT assessments. Integr. Environ. Assess. Manag. 5: 624-637.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Il-Kapitolu A.8 ta' dan l-Anness,Koeffiċjent ta' Partizzjoni (n-ottanol/ilma): Metodu tat-Tħawwid tal-Flask
                                    
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Il-Kapitolu A.24 ta' dan l-Anness, Koeffiċjent ta' Partizzjoni (n-ottanol/ilma), Metodu HPLC.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Il-Kapitolu A.23 ta' dan l-Anness, Koeffiċjent ta' Partizzjoni (1-Ottanol/Ilma): Metodu ta' Tħawwid bil-Mod.
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 2
                        
                           ĊERTI KARATTERISTIĊI KIMIĊI TA' ILMA TA' DILWIZZJONI AĊĊETTABBLI
                        
                        
                                    Komponent
                                 
                                 
                                    Konċentrazzjonijiet limitu
                                 
                              
                                    Materja partikolata
                                 
                                 
                                    5 mg/l
                                 
                              
                                    Karbonju organiku totali
                                 
                                 
                                    2 mg/l
                                 
                              
                                    Ammonijaka mhux jonizzata
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kloru residwu
                                 
                                 
                                    10 μg/l
                                 
                              
                                    Pestiċidi organofosforiċi totali
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    Pestiċidi organoklorurati totali flimkien ma' bifenili poliklorinati
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    Kloru organiku totali
                                 
                                 
                                    25 ng/l
                                 
                              
                                    Aluminju
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Arseniku
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kromu
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kobalt
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Ram
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Ħadid
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Ċomb
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Nikil
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Żingu
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kadmju
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    Merkurju
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    Fidda
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 3
                        
                           SPEĊIJIET TA' ĦUT RAKKOMANDATI GĦALL-ITTESTJAR
                        
                        
                                    Speċijiet rakkomandati
                                 
                                 
                                    Medda rakkomandata għat-temperatura tat-test (°C)
                                 
                                 
                                    It-tul totali rakkomandat tal-annimal tat-test (cm) (74)
                                    
                                 
                              
                                    
                                       Danio rerio
                                        (73)
                                    
                                    (Teleostei, Cyprinidae)
                                    (Hamilton-Buchanan) Żebra
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    3,0 ± 0,5
                                 
                              
                                    
                                       Pimephales promelas
                                    
                                    (Teleostei, Cyprinidae)
                                    (Rafinesque) Karpjun buras
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    5,0 ± 2,0
                                 
                              
                                    
                                       Cyprinus carpio
                                    
                                    (Teleostei, Cyprinidae)
                                    (Linnaeus) Karpjun komuni
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    8,0 ± 4,0 (75)
                                    
                                 
                              
                                    
                                       Oryzias latipes
                                    
                                    (Teleostei, Poecilliidae)
                                    (Temminck and Schlegel) Medaka
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    4,0 ± 1,0
                                 
                              
                                    
                                       Poecilia reticulata
                                    
                                    (Teleostei, Poeciliidae)
                                    (Peters) Gapi
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    3,0 ± 1,0
                                 
                              
                                    
                                       Lepomis macrochirus
                                    
                                    (Teleostei Centrarchidae)
                                    (Rafinesque) Dott tal-misluta blu
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    5,0 ± 2,0
                                 
                              
                                    
                                       Oncorhynchus mykiss
                                    
                                    (Teleostei Salmonidae)
                                    (Walbaum) Trota qawsalla
                                 
                                 
                                    13 – 17
                                 
                                 
                                    8,0 ± 4,0
                                 
                              
                                    
                                       Gasterosteus aculeatus
                                    
                                    (Teleostei, (Gasterosteidae)
                                    (Linnaeus) Spinarell
                                 
                                 
                                    18 – 20
                                 
                                 
                                    3,0 ± 1,0
                                 
                              
                           Hemm diversi speċijiet tal-ilma salmura u marittimi li ntużaw inqas spiss, pereżempju:
                        
                        
                                    Taqtuqa tat-tebgħa
                                 
                                 
                                    (Leiostomus xanthurus)
                                 
                              
                                    Karpjun tas-snien varjegati
                                 
                                 
                                    (Cyprinodon variegatus)
                                 
                              
                                    Menidja tal-marea
                                 
                                 
                                    (Menidia beryllina)
                                 
                              
                                    Dott fiddien
                                 
                                 
                                    (Cymatogaster aggregata)
                                 
                              
                                    Barbun Ingliż
                                 
                                 
                                    (Parophrys vetulus)
                                 
                              
                                    Skorfna korazzata
                                 
                                 
                                    (Leptocottus armatus)
                                 
                              
                                    Spinarell
                                 
                                 
                                    (Gasterosteus aculeatus)
                                 
                              
                                    Spnotta
                                 
                                 
                                    (Dicentracus labrax)
                                 
                              
                                    Karpjun ta' Al Bura
                                 
                                 
                                    (Alburnus alburnus)
                                 
                              Il-ħut tal-ilma ħelu mniżżel fit-tabella ta' hawn fuq huwa faċli biex jittrabba u/jew jinstab b'mod komuni matul is-sena, filwaqt li d-disponibbilità tal-ispeċijiet marittimi u tal-ilma salmura huwa parzjalment limitat għall-pajjiżi rispettivi. Huwa kapaċi jitrabba u jiġi kkultivat f'farms tal-ħut jew fil-laboratorju, f'kundizzjonijiet ikkontrollati għal kontra l-mard u l-parasiti, sabiex l-annimal tat-test ikun b'saħħtu u b'parentela magħrufa. Dan il-ħut huwa disponibbli f'bosta bnadi tad-dinja.
                        TAGĦRIF
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Meyer A., Biermann C.H. and Orti G. (1993), The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: An invitation to the comparative method Proc. R. Soc. Lond. B. 252: 231-236.
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 4
                        
                           SKEDI TAL-KAMPJUNAR GĦAL TESTIJIET TAL-ESPONIMENT MILWIEM U DJETETIKU
                        
                        1.   Eżempju teoriku ta' skeda tal-kampjunar għal test sħiħ tal-bijokonċentrazzjoni b'esponiment milwiem ta' sustanza b'log KOW = 4.
                        
                        
                                    Kampjunar tal-Ħut
                                 
                                 
                                    Skeda tal-ħin tal-kampjun
                                 
                                 
                                    Nru ta' kampjuni tal-ilma (76)
                                    
                                 
                                 
                                    Nru ta' ħut għal kull kampjun (76)
                                    
                                 
                              
                                    Frekwenza minima meħtieġa (jiem) (77)
                                    
                                 
                                 
                                    Kampjunar addizzjonali (jiem) (77)
                                    
                                 
                              
                                    Fażi ta' Teħid
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    – 1
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2 (78)
                                    
                                 
                                 
                                    4 (79)
                                    
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (3 (81))
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    0,3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    0,4
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    0,6
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    0,9
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    1,2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    1,7
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    2,4
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    3,3
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                    4,7
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4 – 8 (80)
                                    
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (3 (81))
                                 
                              
                                    Fażi ta' tisfija
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Trasferiment tal-ħut f'ilma ħieles mis-sustanza tat-test
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                    5,0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5,3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                    5,9
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    7,0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    9
                                 
                                 
                                    9,3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    11,2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    10
                                 
                                 
                                    14,0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4 – 8 (80)
                                    
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    17,5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (4 + 3 (81))
                                 
                              
                                    TOTAL
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    40 – 72
                                    (48 – 80) (80)
                                    
                                 
                              2.   Eżempju teoriku tal-iskeda tal-kampjunar għat-test tal-bijoakkumulazzjoni djetetika tas-sustanza wara fażijiet ta' 10 ijiem teħid u 42 jum tisfija.
                        
                        
                                    Okkażjoni tal-kampjunar
                                 
                                 
                                    Skeda tal-ħin tal-kampjun
                                 
                                 
                                    Nru ta' kampjuni tal-ikel
                                 
                                 
                                    Nru ta' ħut għal kull kampjun
                                 
                              
                                    Jum tal-fażi
                                 
                                 
                                    Kampjuni addizzjonali tal-ħut?
                                 
                                 
                                    Grupp tat-Test
                                 
                                 
                                    Grupp tal-Kontroll
                                 
                              
                                    Fażi ta' Teħid
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    Possibbli (82)
                                        (83)
                                    
                                 
                                 
                                    3 — grupp tat-test
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    3 — grupp tal-kontroll (82)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (8 – 13) (83)
                                    
                                 
                              
                                    1A (84)
                                    
                                 
                                 
                                    1-3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    Iva (85)
                                    
                                 
                                 
                                    3 — grupp tat-test
                                 
                                 
                                    10 – 15 (85)
                                    
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    3 — grupp tal-kontroll (82)
                                    
                                 
                                 
                                    (13 – 18) (86)
                                    
                                 
                                 
                                    (8 – 13) (86)
                                    
                                 
                              
                                    Fażi ta' tisfija
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    1
                                 
                                 
                                    Iva (85)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 – 15 (85)
                                    
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    4
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                    Iva (85)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 – 15 (85)
                                    
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                    14
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                    28
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    9
                                 
                                 
                                    42
                                 
                                 
                                    Iva (85)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 – 15 (85)
                                    
                                    (13 – 18) (86)
                                    
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                    (8 – 13) (86)
                                    
                                 
                              
                                    TOTAL
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    59 – 120
                                    (63 – 126) (85)
                                        (86)
                                    
                                 
                                 
                                    50 – 110
                                    (56 – 116) (85)
                                        (86)
                                    
                                 
                              
                           Nota dwar il-fażi u ż-żmien tal-kampjunar: Il-fażi ta' teħid tibda bl-ewwel tagħlif ta' ikel miżjud. Jum tal-esperiment jibda mit-tagħlif sa ftit qabel it-tagħlif li jmiss, 24 siegħa wara. L-ewwel okkażjoni ta' kampjunar (1 fit-tabella) għandha tiġi ftit qabel l-ewwel tagħlif (eż. siegħa). Il-kampjunar matul studju idealment għandu jsir ftit qabel it-tagħlif tal-għada (jiġifieri madwar 23 siegħa wara t-tagħlif tal-jum tal-kampjunar). Il-fażi ta' teħid tintemm ftit qabel l-ewwel tagħlif b'dieta mhux miżjuda, meta tibda l-fażi ta' tisfija (huwa probabbli li l-ħut tal-grupp tat-test ikun għadu qiegħed jiddiġerixxi għalf miżjud fl-24 siegħa ta' wara l-aħħar tagħlif ta' dieta miżjuda). Dan ifisser li l-kampjun ta' tmiem it-teħid għandu jittieħed ftit qabel l-ewwel tagħlif b'dieta mhux miżjuda u l-ewwel kampjun tal-fażi ta' tisfija għandu jittieħed madwar 23 siegħa wara l-ewwel tagħlif b'għalf mhux miżjud.
                     
                     
                        Appendiċi 5
                        
                           KALKOLI ĠENERALI
                        
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Introduzzjoni
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Tbassir tad-durata tal-fażi ta' teħid
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Tbassir tad-durata tal-fażi ta' tisfija
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Metodu sekwenzjali: determinazzjoni tal-kostant tar-rata ta' tisfija (telf) k
                                       2
                                    
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Metodu sekwenzjali: determinazzjoni tal-kostant tar-rata ta' teħid k
                                       1 (metodu tal-esponiment milwiem biss)
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Mudell simultanju għall-kalkolu tal-kostanti tar-rati ta' teħid u tisfija (telf) (metodu tal-esponiment milwiem biss)
                                 
                              
                                 
                                    7.
                                 
                                 
                                    Korrezzjoni tad-dilwizzjoni tat-tkabbir għall-BCF u l-BMF kinetiċi
                                 
                              
                                 
                                    8.
                                 
                                 
                                    Normalizzazzjoni għal-lipidu għal kontenut lipidu ta' 5 % (metodu tal-esponiment milwiem biss)
                                 
                              1.   INTRODUZZJONI
                        Il-mudell tal-bijoakkumulazzjoni akkwatika ġenerali fil-ħut jista' jiġi deskritt f'termini tal-proċessi ta' teħid u telf, filwaqt li jiġi injorat it-teħid mal-ikel. L-ekwazzjoni differenzjali (d
                           Cf/dt) li tiddeskrivi r-rata ta' bidla fil-konċentrazzjoni fil-ħut (mg · kg– 1·jum– 1) tinkiseb bi (1):
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.1]
                                 
                              Fejn
                        
                                    
                                       k
                                       1
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    Kostant tar-rata tal-ewwel ordni għat-teħid fil-ħut (l · kg– 1·jum– 1).
                                 
                              
                                    
                                       k
                                       2
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    Kostant tar-rata tal-ewwel ordni għat-tisfija mill-ħut (jum– 1).
                                 
                              
                                    
                                       kg
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    Kostant tar-rata tal-ewwel ordni għat-tkabbir tal-ħut (“dilwizzjoni tat-tkabbir”) (jum– 1).
                                 
                              
                                    
                                       km
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    Kostant tar-rata tal-ewwel ordni għat-trasformazzjoni metabolika (jum– 1)
                                 
                              
                                    
                                       ke
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    Kostant tar-rata tal-ewwel ordni għall-eġestjoni tar-rawt (jum– 1)
                                 
                              
                                    
                                       C
                                       w
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    Konċentrazzjoni fl-ilma (mg · l– 1).
                                 
                              
                                    
                                       Cf
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    Konċentrazzjoni fil-ħut (mg · kg– 1 piż niedi).
                                 
                              Għal sustanzi bijoakkumulanti, jista' jkun mistenni li medja ponderata għall-ħin (TWA) hija l-iktar konċentrazzjoni tal-esponiment rilevanti fl-ilma (C
                           w) fi ħdan il-medda awtorizzata ta' fluttwazzjoni (ara l-paragrafu 24). Huwa rakkomandat li tiġi kkalkolata konċentrazzjoni tal-ilma TWA, skont il-proċedura tal-Appendiċi 6 tat-TM C.20 (2). Ta' min jgħid li l-In-trasformazzjoni tal-konċentrazzjoni tal-ilma hija xierqa meta jkun mistenni li sseħħ diżintegrazzjoni esponenzjali bejn il-perjodi ta' tiġdid, eż. f'disinn tat-test semistatiku. F'sistema bi fluss kontinwu, jaf ma jkunx hemm bżonn ln-trasformazzjoni tal-konċentrazzjonijiet tal-esponiment. Jekk jinkisbu l-konċentrazzjonijiet tal-ilma TWA, dawn għandhom jiġu rrapportati u jintużaw f'kalkoli sussegwenti.
                        F'test tal-BCF standard fuq il-ħut, it-teħid u t-tisfija jistgħu jiġu deskritti f'termini ta' żewġ proċessi kinetiċi tal-ewwel ordni.
                        
                                    
                                       Rate of uptake = k1
                                        × C
                                       w
                                    
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.2]
                                 
                              
                                    
                                       Overall loss rate = (k
                                       2 + k
                                       g + k
                                       m
                                       + ke
                                       ) × C
                                       f
                                    
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.3]
                                 
                              Fi stat stazzjonarju, jekk jiġu supponuti tkabbir u metaboliżmu negliġibbli (jiġifieri l-valuri għal k
                           g u k
                           m ma jistgħux jiġu distinti minn żero), ir-rata ta' teħid tilħaq ir-rata ta' tisfija, u b'hekk it-tagħqid tal-Ekwazzjoni A5.2 u l-Ekwazzjoni A5.3 jagħti r-relazzjoni li ġejja:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.4]
                                 
                              Fejn
                        
                                    
                                       C
                                       f-SS
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    Konċentrazzjoni fil-ħut fi stat stazzjonarju (mg kg– 1 piż niedi).
                                 
                              
                                    
                                       C
                                       w-SS
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    Konċentrazzjoni fl-ilma fi stat stazzjonarju (mg l– 1).
                                 
                              Il-proporzjon ta' k
                           1/k
                           2 huwa l-BCF kinetiku (BCFK) u għandu jkun daqs il-BCF fi stat stazzjonarju (BCFSS) miksub mill-proporzjon tal-konċentrazzjoni fi stat stazzjonarju fil-ħut għal dik fl-ilma, iżda jista' jkun hemm devjazzjonijiet jekk l-istat stazzjonarju kien inċert jew jekk ġew applikati korrezzjonijiet għat-tkabbir għall-BCF kinetiku. Madankollu, peress li k
                           1 u k
                           2 huma kostanti, l-istat stazzjonarju ma għandux bżonn jintlaħaq sabiex jinkiseb BCFK.
                        Fuq il-bażi ta' dawn l-ekwazzjonijiet tal-ewwel ordni, dan l-Appendiċi 5 jinkludi l-kalkoli ġenerali meħtieġa kemm għal metodi ta' bijoakkumulazzjoni tal-esponiment milwiem kif ukoll djetetiku. Madankollu, is-sezzjonijiet 5, 6 u 8 huma rilevanti biss għall-metodu tal-esponiment milwiem iżda huma inklużi hawnhekk peress li huma tekniki “ġenerali”. Il-metodi sekwenzjali (sezzjonijiet 4 u 5) u simultanji (sezzjoni 6) jippermettu li jiġu kkalkolati l-kostanti ta' teħid u tisfija li jintużaw sabiex jinkisbu l-BCFs kinetiċi. Il-metodu sekwenzjali għad-determinazzjoni tal-k
                           2 (sezzjoni 4) huwa importanti għall-metodu djetetiku peress li huwa meħtieġ sabiex jiġu kkalkolati l-effiċjenza tal-assimilazzjoni kif ukoll il-BMF. L-Appendiċi 7 jispjega l-kalkoli li huma speċifiċi għall-metodu djetetiku.
                        2.   TBASSIR TAD-DURATA TAL-FAŻI TA' TEĦID
                        Qabel ma jsir it-test, stima tal-k
                           2 u, b'hekk, ċertu perċentwal tal-ħin meħtieġ sabiex jintlaħaq stat stazzjonarju jistgħu jinkisbu mir-relazzjonijiet empiriċi bejn il-k
                           2 u l-koeffiċjent ta' partizzjoni n-ottanol/ilma (KOW) jew k
                           1 u BCF. Madankollu, ta' min jgħid li l-ekwazzjonijiet f'din is-sezzjoni japplikaw biss meta t-teħid u t-tisfija jsegwu kinetika tal-ewwel ordni. Jekk jidher ċar li dan mhuwiex il-każ, huwa rakkomandat li jitfittex parir mingħand espert fil-bijostatistika u/jew fil-farmakokinetika, jekk wieħed ikun jixtieq tbassiriet tal-fażi ta' teħid.
                        Stima tal-k
                           2 (jum– 1) tista' tinkiseb b'bosta metodi. Pereżempju, għall-ewwel jistgħu jintużaw ir-relazzjonijiet empiriċi li ġejjin (87):
                        
                                    log k
                                       2 = 1,47 – 0,414logKOW
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    (r2 = 0,95) [(3); Ekwazzjoni A5.5]
                                 
                              jew
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.6]
                                 
                              
                                    Fejn k
                                       1 = 520 × W
                                       – 0,32 (għal sustanzi b'log KOW > 3)
                                 
                                 
                                    (r
                                       2 = 0,85) [(4); Ekwazzjoni A5.7]
                                 
                              U
                                       
                                 
                                 
                                    (r
                                       2 = 0,90) [(5); Ekwazzjoni A5.8]
                                 
                              
                           W = piż medju tal-ħut tat-trattament (grammi piż niedi) fi tmiem it-teħid/bidu tat-tisfija (88)
                        
                        Għal relazzjonijiet oħrajn, ara (6). Jista' jkun ta' vantaġġ li jintużaw mudelli iktar ikkumplikati fl-istima tal-k
                           2 jekk, pereżempju, ikun probabbli li jista' jseħħ metaboliżmu sinifikanti (7) (8). Madankollu, iktar ma tiżdied il-kumplessità tal-mudell, iktar wieħed għandu joqgħod attent fl-interpretazzjoni tat-tbassiriet. Pereżempju, il-preżenza ta' gruppi nitro tista' tindika metaboliżmu veloċi, iżda dan mhuwiex dejjem il-każ. Għalhekk, l-utent għandu jiżen ir-riżultati tal-metodu tat-tbassir kontra l-istruttura kimika u kwalunkwe informazzjoni rilevanti oħra (pereżempju studji prelimianri) fl-iskedar ta' studju.
                        Iż-żmien sabiex jintlaħaq ċertu perċenwal ta' stat stazzjonarju jista' jinkiesb, billi tiġi applikata l-istima tal-k
                           2, mill-ekwazzjoni kinetika ġenerali li tiddeskrivi t-teħid u t-tisfija (kinetika tal-ewwel ordni), jekk jiġi supponut li t-tkabbir u l-metaboliżmu jkunu negliġibbli. Jekk iseħħ tkabbir sostanzjali matul l-istudju, l-istimi deskritti hawn taħt ma jibqgħux affidabbli. F'dawn il-każijiet, aħjar li jintuża k
                           2g ikkoreġut għat-tkabbir kif deskritt iktar tard (ara s-Sezzjoni 7 ta' dan l-Appendiċi):
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.9]
                                 
                              jew, jekk C
                           w huwa kostant:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.10]
                                 
                              Meta joqrob l-istat stazzjonarju (t → ∞), l-Ekwazzjoni A5.10 (ara (9) (10)) tista' titnaqqas għal:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.11]
                                 
                              jew
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.12]
                                 
                              Il-BCF × C
                           w huwa approssimazzjoni għall-konċentrazzjoni fil-ħut fi stat stazzjonarju (Cf-SS). [Nota: jista' jintuża l-istess approċċ meta jiġi stmat BMF fi stat stazzjonarju bit-test djetetiku. F'dan il-każ, il-BCF huwa sostitwit mal-BMF u C
                           w ma' C
                           food, il-konċentrazzjoni fl-ikel, fl-ekwazzjonijiet ta' hawn fuq]
                        L-Ekwazzjoni A5.10 tista' tkun traskritta għal:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.13]
                                 
                              jew
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.14]
                                 
                              Bl-applikazzjoni tal-Ekwazzjoni A5.14, il-ħin sakemm jintlaħaq ċertu perċentwal ta' stat stazzjonarju jista' jitbassar meta k
                           2 jiġi stmat minn qabel bl-Ekwazzjoni A5.5 jew l-Ekwazzjoni A5.6.
                        Bħala linja ta' gwida, l-aħjar durata statistika tal-fażi ta' teħid għall-produzzjoni ta' dejta statistikament aċċettabbli (BCFK) hija dak il-perjodu li huwa meħtieġ għall-kurva tal-logaritma tal-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħut plottjata kontra l-ħin lineari sabiex jintlaħaq tal-inqas 50 % tal-istat stazzjonarju (jiġifieri 0,69/k
                           2), iżda mhux iktar minn 95 % tal-istat stazzjonarju (jiġifieri 3,0/k
                           2) (11). F'każ li l-akkumulazzjoni titla' għal iktar minn 95 % tal-istat stazzjonarju, il-kalkolu ta' BCFSS isir fattibbli.
                        Il-ħin sabiex jintlaħaq 80 % tal-istat stazzjonarju huwa (bl-użu tal-Ekwazzjoni A5.14):
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.15]
                                 
                              jew
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.16]
                                 
                              B'mod simili, il-ħin sabiex jintlaħaq 95 fil-mija tal-istat stazzjonarju huwa:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.17]
                                 
                              Pereżempju, id-durata tal-fażi ta' teħid (jiġifieri l-ħin sabiex jintlaħaq ċertu perċentwal ta' stat stazzjonarju, eż. t
                           80 jew t
                           95) għal sustanza tat-test b'log KOW = 4 tkun (bl-użu tal-Ekwazzjoni A5.5, l-Ekwazzjoni A5.16 u l-Ekwazzjoni A5.17):
                        
                           logk
                           2 = 1,47 – 0,414 · 4
                        
                           k
                           2 = 0,652 jum– 1
                        
                        
                           
                        jew 
                        Inkella, l-espressjoni:
                        
                                    
                                       teSS
                                        = 6,54 · 10 – 3 · K
                                       OW + 55,31 (hours)
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.18]
                                 
                              tista' tintuża sabiex jiġi kkalkolat il-ħin sabiex jintlaħaq stat stazzjonarju effettiv (t
                           eSS) (12). Għal sustanza tat-test b'log KOW = 4 dan jirriżulta fi:
                        
                           teSS
                            = 6,54 · 10 – 3 · 104 + 55,31 = 121 hours
                        
                        3.   TBASSIR TAD-DURATA TAL-FAŻI TA' TISFIJA
                        Tbassir taż-żmien meħtieġ sabiex jitnaqqas it-toqol fil-ġisem għal ċertu perċentwal tal-konċentrazzjoni inizjali jista' jinkiseb mill-ekwazzjoni ġenerali li tiddeskrivi t-teħid u t-tisfija (jekk tiġi supponuta kinetika tal-ewwel ordni, ara l-Ekwazzjoni A5.9 (1) (13).
                        Għall-fażi ta' tisfija, huwa supponut li C
                           w (jew C
                           food għat-test djetetiku) hija żero. Imbagħad l-ekwazzjoni tista' titnaqqas għal:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.19]
                                 
                              jew
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.20]
                                 
                              fejn Cf,0 hija l-konċentrazzjoni fil-bidu tal-perjodu ta' tisfija.
                        imbagħad tintlaħaq tisfija ta' 50 fil-mija fil-ħin (t
                           50):
                        
                           
                        jew
                        
                           
                        B'mod simili, tisfija ta' 95 fil-mija sejra tintlaħaq fi:
                        
                           
                        Jekk jintuża teħid ta' 80 % għall-ewwel perjodu (1,6/k
                           2) u telf ta' 95 % fil-fażi ta' tisfija (3,0/k
                           2), il-fażi ta' tisfija tkun madwar id-doppju tad-durata tal-fażi ta' teħid.
                        Kun af li l-istimi huma bbażati fuq is-suppożizzjoni li x-xejriet ta' teħid u tisfija sejrin isegwu l-kinetika tal-ewwel ordni. Jekk ikun ovvju li mhijiex segwita l-kinetika tal-ewwel ordni, dawn l-istimi ma jkunux validi.
                        4.   METODU SEKWENZJALI: DETERMINAZZJONI TAL-KOSTANT TAR-RATA TA' TISFIJA (TELF) K
                           2
                        
                        Ħafna mid-dejta dwar il-bijokonċentrazzjoni ġiet supponuta bħala deskritta “raġonevolment” tajjeb b'sempliċi mudell b'żewġ kompartimenti/żewġ parametri, kif indikat mill-kurva rettilineari li tqarreb għall-punti għall-konċentrazzjonijiet fil-ħut (f'In skala), matul il-fażi ta' tisfjia.
                        
                           
                        Test ta 'immaġni
                        
                           In(concentration)
                           Cf2
                           Cf1
                           t2
                           t1
                           time
                        
                        Kun af li d-devjazzjonijiet minn linja dritta jistgħu jindikaw xejra ta' tisfija iktar kumplessa mill-kinetika tal-ewwel ordni. Il-metodu grafiku jista' jiġi applikat sabiex ikunu riżolti tipi ta' tisfija li jiddevjaw mill-kinetika tal-ewwel ordni.
                        Sabiex jiġi kkalkolat il-k
                           2 għall-punti ta' ħin multipli (ta' kampjunar), agħmel rigressjoni lineari tal-ln(konċentrazzjoni) kontra l-ħin. Il-pendil tal-linja ta' rigressjoni huwa stima tal-kostant tar-rata ta' tisfija k
                           2
                            (89). Mill-interċetta faċilment tista' tiġi kkalkolata l-konċentrazzjoni medja fil-ħut fil-bidu tal-fażi ta' tisfija (C
                           0,d; li hija daqs il-konċentrazzjoni medja fil-ħut fi tmiem il-fażi ta' teħid) (inklużi l-marġnijiet ta' żball) (89):
                        
                                    
                                       C0,d
                                        = eintercept
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.21]
                                 
                              Sabiex tikkalkola k
                           2 meta jkun hemm żewġ punti ta' ħin (tal-kampjunar) disponibbli (bħal fid-disinn minimizzat), issostitwixxi ż-żewġ konċentrazzjonijiet medji fl-ekwazzjoni li ġejja
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.22]
                                 
                              Meta ln(Cf1) u ln(Cf2) ikunu l-logaritmi naturali tal-konċentrazzjonijiet fil-ħinijiet t
                           1 u t
                           2, rispettivament, u t
                           2 u t
                           1 huma l-ħinijiet meta nġabru ż-żewġ kampjuni b'rabta mal-bidu tat-tisfija (90).
                        5.   METODU SEKWENZJALI: DETERMINAZZJONI TAL-KOSTANT TAR-RATA TA' TEĦID K
                           1 (METODU TAL-ESPONIMENT MILWIEM BISS)
                        Sabiex issib valur għall-k
                           1 b'sett ta' dejta dwar il-konċentrazzjoni tal-ħin sekwenzjali għall-fażi ta' teħid, uża programm tal-kompjuter sabiex tħaddem il-mudell li ġej:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.23]
                                 
                              Fejn k
                           2 jinkiseb bil-kalkolu preċedenti, C
                           f(t) u C
                           w(t) huma l-konċentrazzjonijiet fil-ħut u l-ilma, rispettivament, fil-ħin t.
                        Sabiex tikkalkola k
                           1 meta jkun hemm żewġ punti ta' ħin (tal-kampjunar) biss disponibbli (bħal fid-disinn minimizzat), uża l-formula li ġejja:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.24]
                                 
                              Meta k
                           2 jinkiseb bil-kalkolu preċedenti, C
                           f hija l-konċentrazzjoni fil-ħut fil-bidu tal-fażi ta' tisfija, u C
                           w hija l-konċentrazzjoni medja fl-ilma matul il-fażi ta' teħid (91).
                        Tista' ssir spezzjoni viżiva tal-pendili tal-k
                           1 u k
                           2 meta plottjati kontra d-dejta tal-punti tal-kampjun imkejla sabiex tiġi vvalutata l-idoneità tal-iffittjar. Jekk minn dan jirriżulta li l-metodu sekwenzjali ta stima ħażina għall-k
                           1, għandu jiġi applikat l-approċċ simultanju sabiex jiġu kkalkolati l-k
                           1 u l-k
                           2 (ara s-sezzjoni 6 li jmiss). Mill-ġdid, il-pendili li jirriżultaw għandhom jitqabblu mad-dejta mkejla plottjata għall-ispezzjoni viżiva tal-idoneità tal-iffittjar. Jekk l-iffittjar ikun għadu ħażin, dan jista' jkun indikazzjoni li l-kinetika tal-ewwel ordni ma tapplikax u li għandhom jintużaw mudelli oħrajn iktar kumplessi.
                        6.   MUDELL SIMULTANJU GĦALL-KALKOLU TAL-KOSTANTI TAR-RATI TA' TEĦID U TISFIJA (TELF) (METODU TAL-ESPONIMENT MILWIEM BISS)
                        Jistgħu jintużaw programmi tal-kompjuter sabiex jinstabu l-valuri għal k
                           1 u k
                           2 b'sett ta' dejta dwar il-konċentrazzjoni tal-ħin sekwenzjali u l-mudell:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    0 < t < t
                                       c
                                    
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.25]
                                 
                              
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    
                                       t > t
                                       c
                                    
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.26]
                                 
                              fejn
                        
                                    
                                       t
                                       c
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    il-ħin fi tmiem il-fażi ta' teħid.
                                 
                              Dan l-approċċ jipprovdi direttament żbalji standard għall-istimi ta' k
                           1 u k
                           2. Meta k
                           1/k
                           2 jiġi sostitwit mill-BCF (ara l-Ekwazzjoni A5.4) fl-Ekwazzjoni A5.25 u l-Ekwazzjoni A5.26, l-iżball standard u s-CI ta' 95 % tal-BCF jistgħu jiġu stmati wkoll. Dan huwa partikolarment siewi meta jitqabblu stimi differenti minħabba t-trasformazzjoni tad-dejta. Il-varjabbli dipendenti (konċentrazzjoni tal-ħut) jista' jiġi ffittjat bl-ln trasformazzjoni jew mingħajr, u tista' tiġi evalwata l-inċertezza li tirriżulta tal-BCF.
                        Peress li teżisti korrelazzjoni b'saħħitha bejn iż-żewġ parametri k
                           1 u k
                           2 jekk jiġu stmati fl-istess ħin, jista' jkun rakkomandat li l-ewwel jiġi kkalkolat il-k
                           2 mid-dejta dwar it-tisfija biss (ara iktar 'il fuq); k
                           2 f'ħafna mill-każijiet jista' jiġi stmat mill-kurva ta' tisfija bi preċiżjoni relattivament kbira. Imbagħad ikun jista' jiġi kkalkolat il-k
                           1 mid-dejta dwar it-teħid bl-użu ta' rigressjoni mhux lineari (92). Huwa rakkomandat li tintuża l-istess trasformazzjoni tad-dejta meta jsir iffittjar sekwenzjali.
                        Tista' ssir spezzjoni viżiva tal-pendili li jirriżultaw meta plottjati kontra d-dejta tal-punti tal-kampjun imkejla sabiex tiġi vvalutata l-idoneità tal-iffittjar. Jekk minn dan jirriżulta li dan il-metodu ta stima ħażina għall-k
                           1, ikun jista' jiġi applikat l-approċċ simultanju sabiex jiġu kkalkolati l-k
                           1 u l-k
                           2. Mill-ġdid, il-mudell iffittjat għandu jitqabbel mad-dejta mkejla plottjata għall-ispezzjoni viżiva tat-tjubija tal-iffittjar u l-istimi tal-parametri li jirriżultaw għal k
                           1, k
                           2 u l-BCF li jirriżulta u l-iżbalji standard tagħhom u/jew l-intervalli ta' kunfidenza għandhom jitqabblu bejn tipi differenti ta' ffittjar.
                        Jekk l-iffittjar ikun ħażin, dan jista' jkun indikazzjoni li l-kinetika tal-ewwel ordni ma tapplikax u li għandhom jintużaw mudelli oħrajn iktar kumplessi. Waħda mill-iktar kumplikazzjonijiet komuni hija tkabbir tal-ħut matul it-test.
                        7.   KORREZZJONI TAD-DILWIZZJONI TAT-TKABBIR GĦALL-BCF U L-BMF KINETIĊI
                        Din is-sezzjoni tiddeskrivi metodu standard għall-korrezzjoni minħabba t-tkabbir tal-ħut matul it-test (l-hekk imsejħa “dilwizzjoni tat-tkabbir”) li huwa validu biss meta tkun tapplika kinetika tal-ewwel ordni. F'każ li jkun hemm indikazzjonijiet li ma tapplikax kinetika tal-ewwel ordni, huwa rakkomandat li jitfittex parir mingħand espert fil-bijostatistika għal korrezzjoni tajba tad-dilwizzjoni tat-tkabbir jew għall-użu tal-approċċ ibbażat fuq il-massa deskritt hawn taħt.
                        F'ċerti każijiet, dan il-metodu għall-korrezzjoni tad-dilwizzjoni tat-tkabbir huwa soġġett għal nuqqas ta' preċiżjoni u kultant ma jaħdimx (pereżempju għal sustanzi b'tisfija bil-mod ħafna ttestjati f'ħut li jikber malajr, il-kostant tar-rata ta' tisfija derivat ikkoreġut għad-dilwizzjoni tat-tkabbir, il-k
                           2g, jista' jkun żgħir ħafna u b'hekk l-errur fiż-żewġ kostanti tar-rati użati sabiex jinkiseb isir kritiku, u f'ċerti każijiet l-istimi tal-k
                           g jistgħu jkunu ikbar mill-k
                           2). F'dawn il-każijiet, jista' jintuża approċċ alternattiv (jiġifieri approċċ tal-massa), li jaħdem ukoll meta ma tkunx segwita kinetika tat-tkabbir tal-ewwel ordni, li jevita l-bżonn tal-korrezzjoni. Dan l-approċċ huwa spjegat fi tmiem din is-sezzjoni.
                        
                           Metodu ta' tnaqqis tal-kostant tar-rata ta' tkabbir għall-korrezzjoni tat-tkabbir
                        
                        Għall-metodu standard, id-dejta dwar il-piż u t-tul individwali kollha tiġi konvertita f'logaritmi naturali u ln(piż) jew ln(1/piż) jiġi plottjat vs iż-żmien (jum), b'mod separat għall-gruppi tat-trattament u tal-kontroll. Isir l-istess proċess għad-dejta mill-fażijiet ta' teħid u tisfija b'mod separat. Ġeneralment, għall-korrezzjoni tad-dilwizzjoni tat-tkabbir, huwa iktar xieraq li tintuża d-dejta dwar il-piż mill-istudju sħiħ sabiex jinkiseb il-kostant tar-rata ta' tkabbir (k
                           g), iżda differenzi statistikament sinifikanti bejn il-kostanti tar-rata ta' tkabbir derivati għall-fażi ta' teħid u l-fażi ta' tisfija jistgħu jindikaw li għandu jintuża l-kostant tar-rata tal-fażi ta' tisfija. Ir-rati ta' tkabbir kumplessivi għal studji milwiema għall-gruppi tat-test u tal-kontroll jistgħu jintużaw sabiex jiġi verifikat hemmx xi effett marbut mat-trattament.
                        Tiġi kkalkolata korrelazzjoni tal-inqas kwadri lineari għal-ln(piż tal-ħut) vs il-jum (u għal-ln(1/piż) vs il-jum) għal kull grupp (gruppi tat-test(ijiet) u tal-kontroll, dejta individwali, mhux valuri medji ta' kuljum) għall-istudju sħiħ, il-fażijiet ta' teħid u tisfija bl-użu ta' proċeduri statistiċi standard. Il-varjanzi fil-pendili tal-linji huma kkalkolati u jintużaw sabiex tiġi evalwata s-sinifikanza statistika (p = 0,05) tad-differenza fil-pendili (kostanti tar-rata ta' tkabbir) bl-użu tat-test-t ta' Student (jew ANOVA jekk jiġu ttestjati iktar minn konċentrazzjoni waħda). Ġeneralment hija ppreferuta dejta dwar il-piż għal finijiet ta' korrezzjoni tat-tkabbir. Id-dejta dwar it-tul, ittrattata bl-istess mod, tista' tkun siewja sabiex jitqabblu l-gruppi tal-kontroll u tat-test għal effetti relatati mat-trattament. Jekk ma jkun hemm ebda differenza statistikament sinifikanti fl-analiżi tad-dejta dwar il-piż, id-dejta dwar it-test u l-kontroll tista' tinġabar f'daqqa u jiġi kkalkolat kostant totali tar-rata ta' tkabbir tal-ħut għall-istudju (k
                           g) bħala l-pendil totali tal-korrelazzjoni lineari. Jekk jiġu osservati differenzi statistikament sinifikanti, il-kostanti tar-rata ta' tkabbir għal kull grupp tal-ħut, u/jew il-fażi ta' studju, jiġu rrapportati b'mod separat. Imbagħad, il-kostant tar-rata minn kull grupp tat-trattament għandu jintuża għall-finijiet ta' korrezzjoni tad-dilwizzjoni tat-tkabbir ta' dak il-grupp. Jekk ġew osservati differenzi statistiċi bejn il-kostanti tar-rata tal-fażi ta' teħid u tisfija, għandhom jintużaw il-kostanti tar-rata ta' teħid tal-fażi ta' tisfija.
                        Il-kostant tar-rata ta' tkabbir ikkalkolat (k
                           g espress bħala jum-1) jista' jitnaqqas mill-kostant totali tar-rata ta' tisfija (k
                           2) sabiex jinħareġ kostant tar-rata ta' tisfija, k
                           2g.
                        
                                    
                                       k2g
                                        = k2
                                        – kg
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.27]
                                 
                              Il-kostant tar-rata ta' teħid jiġi diviż bil-kostant tar-rata ta' tisfija kkoreġut għat-tkabbir sabiex jinkiseb il-BCF kinetiku kkoreġut għat-tkabbir, il-BCFKg (jew BMFKg) denotat.
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.28]
                                 
                              Il-kostant tar-rata ta' tkabbir derivat għal studju djetetiku jintuża fl-Ekwazzjoni A7.5 sabiex jiġi kkalkolat il-BMFKg ikkoreġut għat-tkabbir (ara l-Appendiċi 7).
                        
                           Metodu bbażat fuq il-massa għall-korrezzjoni tat-tkabbir
                        
                        Kif inhu spjegat hawn, tista' tintuża alternattiva għall-“metodu ta' tnaqqis tal-kostant tar-rata ta' tkabbir” imsemmi iktar 'il fuq li jevita l-ħtieġa ta' korrezzjoni għat-tkabbir. Il-prinċipju huwa li tintuża dejta dwar it-tisfija fuq bażi ta' massa għal ħut sħiħ minflok fuq bażi ta' konċentrazzjoni.
                        Ikkonverti l-konċentrazzjonijiet tat-tessut fil-fażi ta' tisfija (massa ta' sustanza tat-test/massa unitarja tal-ħut) f'massa ta' sustanza tat-test/ħut: qabbel il-konċentrazzjonijiet u l-piżijiet tal-ħut individwali f'forma ta' tabella (eż. fi spreadsheet fuq il-kompjuter) u mmoltiplika kull konċentrazzjoni bil-piż tal-ħut totali għal dak il-kejl sabiex toħroġ sett ta' sustanza tat-test tal-massa/ħut għall-kampjuni kollha tal-fażi ta' tisfija.
                        Ipplottja l-logaritma naturali li tirriżulta tad-dejta dwar il-massa tas-sustanza kontra ż-żmien għall-esperiment (fażi ta' tisfija) kif isir normalment.
                        Għall-metodu tal-esponiment milwiem, ġib il-kostant tar-rata ta' teħid f'rutina (ara s-sezzjonijiet 4 u 6), kun af li għandu jintuża l-valur “normali” tal-k
                           2 fl-ekwazzjonijiet tal-iffittjar tal-kurva għal k
                           1) u oħroġ il-kostant tar-rata ta' tisfija mid-dejta ta' hawn fuq. Peress li l-valur li jirriżulta għall-kostant tar-rata ta' tisfija huwa indipendenti mit-tkabbir peress li nħareġ fuq il-bażi tal-massa għal kull ħuta sħiħa, dan għandu jiġi denotat bħala k
                           2g u mhux k
                           2.
                        8.   NORMALIZZAZZJONI GĦAL-LIPIDU GĦAL KONTENUT LIPIDU TA' 5 % (METODU TAL-ESPONIMENT MILWIEM BISS)
                        Ir-riżultati tal-BCF (kinetiku u fi stat stazzjonarju) minn testijiet tal-esponiment milwiem għandu jiġi rrapportat ukoll b'rabta mal-kontenut lipidu tal-ħut prestabbilit ta' 5 % piż niedi, sakemm ma jkunx jista' jiġi argumentat li s-sustanza tat-test ma takkumulax primarjament f'lipidu (eż. ċerti sustanzi perfluworinati jistgħu jaqbdu mal-proteini). Id-dejta dwar il-konċentrazzjoni fil-ħut, jew il-BCF, trid tiġi kkonvertita f'bażi tal-piż niedi tal-kontenut lipidu ta' 5 %. Jekk intuża l-istess ħut għall-kejl tal-konċentrazzjonijiet tas-sustanza u l-kontenuti ta' lipidu fil-punti ta' kampjunar kollha, dan jeħtieġ li kull konċentrazzjoni mkejla individwali fil-ħut tiġi kkoreġuta għall-kontenut lipidu ta' dik il-ħuta.
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.29]
                                 
                              fejn
                        
                                    Cf,L
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    konċentrazzjonijiet fil-ħut normalizzata għal-lipidu (mg kg– 1 piż niedi)
                                 
                              
                                    
                                       L
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    frazzjoni ta' lipidu (abbażi tal-piż niedi)
                                 
                              
                                    
                                       C
                                       f
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħut (mg kg– 1 piż niedi)
                                 
                              Jekk l-analiżi tal-lipidu ma saritx fil-ħut kollu fil-kampjun, jintuża valur medju tal-lipidu sabiex jiġi normalizat il-BCF. Għall-BCF fi stat stazzjonarju, għandu jintuża l-valur medju rreġistrat fi tmiem il-fażi ta' teħid fil-grupp tat-trattament. Għan-normalizzazzjoni ta' BCF kinetiku, jista' jkun hemm xi bidliet li fihom ikun iġġustifikat li jittieħed approċċ differenti, pereżempju jekk il-kontenut lipidu jkun inbidel sew matul il-fażi ta' teħid jew tisfija. Madankollu, rata ta' tagħlif li tnaqqas kemm jista' jkun il-bidliet drammatiċi fil-kontenut lipidu għandha tintuża bħala rutina xorta waħda.
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A5.30]
                                 
                              fejn
                        
                                    BCFKL
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    BCF kinetiku normalizzat għal-lipidu (L kg– 1)
                                 
                              
                                    
                                       L
                                       n
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    frazzjoni medja ta' lipidu (abbażi tal-piż niedi)
                                 
                              
                                    BCFK
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    BCF kinetiku (L kg– 1)
                                 
                              TAGĦRIF
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Arnot J.A. and Gobas F.A.P.C. (2004), A food web bioaccumulation model for organic chemicals in aquatic ecosystems, Environ. Toxicol. Chem. 23: 2343–2355.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Chapter C.20 of this Annex, Daphnia magna Reproduction Test.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Spacie A. and Hamelink J.L. (1982), Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1: 309-320.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., de Jonge W.J., Pärt P. and Opperhuizen A. (1995), Allometry in the uptake of hydrophobic chemicals determined in vivo and in isolated perfused gills. Toxicol. Appl. Pharmacol. 131: 130-135.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993), Nonlinear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR QSAR Environ. Res. 1: 29-39.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Kristensen P. (1991), Bioconcentration in fish: comparison of BCF's derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute, Hørsholm, Denmark.
                                 
                              
                                    (7)
                                 
                                 
                                    Arnot J.A., Meylan W., Tunkel J., Howard P.H., Mackay D., Bonnell M. and Boethling R.S. (2009), A quantitative structure-activity relationship for predicting metabolic biotransformation rates for organic chemicals in fish. Environ. Toxicol. Chem. 28: 1168-1177.
                                 
                              
                                    (8)
                                 
                                 
                                    OECD (2011), QSAR Toolbox 2.1. February 2011. Available from: http://www.oecd.org/document/54/0,3746,en_2649_34379_42923638_1_1_1_1,00.html.
                                 
                              
                                    (9)
                                 
                                 
                                    Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975). Bioconcentration of 2,2',4,4' tetrachlorobiphenyl in rainbow trout as measured by an accelerated test. T. Am. Fish. Soc. 104: 785-792.
                                 
                              
                                    (10)
                                 
                                 
                                    Ernst W. (1985), Accumulation in aquatic organisms, in Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals, Sheeman, P., et al., Editors. John Wiley & Sons Ltd, New York, NY, USA: 243-255.
                                 
                              
                                    (11)
                                 
                                 
                                    Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff M.W. (1977), Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models. Can. J. Chem. Eng. 55: 614-622.
                                 
                              
                                    (12)
                                 
                                 
                                    Hawker D.W. and Connell D.W. (1988), Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701-707.
                                 
                              
                                    (13)
                                 
                                 
                                    Konemann H. and van Leeuwen K. (1980), Toxicokinetics in fish: Accumulation and elimination of six chlorobenzenes by guppies. Chemosphere. 9: 3-19.
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 6
                        
                           SEZZJONI TAL-EKWAZZJONI GĦAT-TEST TAL-ESPONIMENT MILWIEM: DISINN TAT-TEST MINIMIZZAT
                        
                        Ir-raġuni wara dan l-approċċ hija li l-fattur ta' bijokonċentrazzjoni f'test sħiħ jista' jew jiġi stabbilit bħala fattur ta' bijokonċentrazzjoni fi stat stazzjonarju (BCFSS) billi jiġi kkalkolat il-proporzjon tal-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fit-tessut tal-ħut għall-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fl-ilma, jew billi jiġi kkalkolat il-fattur ta' bijokonċentrazzjoni kinetika (BCFK) bħala l-proporzjon tal-kostant tar-rata ta' teħid k
                           1 għall-kostant tar-rata ta' tisfija k
                           2. Il-BCFK huwa validu anki jekk ma tintlaħaqx konċentrazzjoni fi stat fiss ta' sustanza matul it-teħid, diment li t-teħid u t-tisfija jaġixxu bejn wieħed u ieħor skont il-proċessi tal-kinetika tal-ewwel ordni.
                        Jekk isir kejl tal-konċentrazzjoni tas-sustanza fit-tessuti (C
                           f1) meta jintemm l-esponiment (t
                           1) u l-konċentrazzjoni fit-tessut (C
                           f2) terġa' titkejjel wara li jgħaddi perjodu ta' żmien (t
                           2), ikun jista' jiġi stmat il-kostant tar-rata ta' tisfija (k
                           2) bl-użu tal-Ekwazzjoni A5.22 mill-Appendiċi 5.
                        Imbagħad ikun jista' jiġi stabbilit b'mod alġebrajku l-kostant tar-rata ta' teħid, k
                           1, bl-użu tal-Ekwazzjoni A5.23 mill-Appendiċi 5 (fejn C
                           f hija daqs 
                              C
                           
                           f1 u t huwa daqs t
                           1) (1). B'hekk, il-fattur ta' bijokonċentrazzjoni kinetika għad-disinn minimizzat (deżinjat bħala BCFKm sabiex jintgħaraf mill-fattur ta' bijokonċentrazzjoni kinetika ddeterminati bl-użu ta' metodi oħrajn) huwa:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A6.1]
                                 
                              Il-konċentrazzjonijiet jew ir-riżultati għandhom jiġu kkoreġuti għad-dilwizzjoni tat-tkabbir u jiġu normalizzati għal kontenut lipidu tal-ħut ta' 5 %, kif inhu deskritt fl-Appendiċi 5.
                        Il-BCF
                           SS minimizzat huwa l-BCF ikkalkolat fi tmiem il-fażi ta' teħid, filwaqt li jiġi supponut li ntlaħaq stat stazzjonarju. Dan jista' jiġi supponut biss, għaliex in-numru ta' punti ta' kampjunar mhuwiex biżżejjed sabiex tingħata prova ta' dan).
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A6.2]
                                 
                              Fejn
                        
                           
                              C
                              f-minSS
                           = Konċentrazzjoni fil-ħut fi stat stazzjonarju supponut fi tmiem it-teħid (mg kg– 1 piż niedi).
                        
                           
                              C
                              w-minSS
                           = Konċentrazzjoni fl-ilma fi stat stazzjonarju supponut fi tmiem it-teħid (mg l– 1).
                        TAGĦRIF
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Springer T.A., Guiney P.D., Krueger H.O. and Jaber M.J. (2008), Assessment of an approach to estimating aquatic bioconcentration factors using reduced sampling. Environ. Toxicol. Chem. 27: 2271-2280.
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 7
                        
                           SEZZJONI TAL-EKWAZZJONI GĦAT-TEST TAL-ESPONIMENT DJETETIKU
                        
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Eżempju ta' kwantitajiet kostitwenti ta' ikel kummerċjali xieraq għall-ħut
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Eżempji ta' teknika ta' żieda tas-sustanza mal-ikel
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Kalkolu tal-effiċjenza tal-assimilazzjoni u l-fattur ta' bijomanjifikazzjoni
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Korrezzjoni għal-lipidu
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Evalwazzjoni tad-differenzi bejn konċentrazzjoni mkejla fiż-żmien żero (C
                                       0,m) u konċentrazzjoni derivata fil-ħin żero (C
                                       0,d)
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Gwida għal sustanzi tat-test b'tisfija veloċi ħafna
                                 
                              1.   EŻEMPJU TA' KWANTITAJIET KOSTITWENTI TA' IKEL KUMMERĊJALI XIERAQ GĦALL-ĦUT
                        
                                    Kostitwent ewlieni
                                 
                                 
                                    ħut mitħun
                                 
                              
                                    Proteina Mhux Raffinata
                                 
                                 
                                    ≤ 55,0 %
                                 
                              
                                    Xaħam mhux raffinat
                                 
                                 
                                    ≤ 15,0 % (93)
                                    
                                 
                              
                                    Fibra Mhux Raffinata
                                 
                                 
                                    ≥ 2,0 %
                                 
                              
                                    Umdità
                                 
                                 
                                    ≥ 12 %
                                 
                              
                                    Irmied
                                 
                                 
                                    ≥ 8 %
                                 
                              2.   EŻEMPJI TA' TEKNIKA TA' ŻIEDA TAS-SUSTANZA MAL-IKEL
                        
                           Punti Ġenerali
                        
                        Id-dieti tal-kontroll għandhom jitħejjew bl-istess mod eżatt bħad-dieta miżjuda, iżda fin-nuqqas tas-sustanza tat-test.
                        Sabiex tiġi verifikata l-konċentrazzjoni tad-dieta ttrattata, għandhom jiġu estratti kampjuni triplikati tal-ikel dożat b'metodu ta' estrazzjoni xieraq u titkejjel il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test jew ir-radjuattività fl-estratti. Għandhom jintwerew irkupri ta' grad għoli (> 85 %) b'varjazzjoni baxxa bejn il-kampjuni (tliet konċentrazzjonijiet tal-kampjun għas-sustanza meħuda fil-bidu tat-test ma għandhomx ivarjaw b'iktar minn ± 15 % mill-medja).
                        Matul it-test djetetiku, għandhom jinġabru tliet kampjuni tad-dieta għall-analiżi fil-jum 0 u fi tmiem il-fażi ta' teħid sabiex jiġi stabbilit il-kontenut tas-sustanza tat-test fid-dieta.
                        
                           Preparazzjoni tal-ikel tal-ħut b'materjal tat-test likwidu (pur)
                        
                        Tiġi stabbilita konċentrazzjoni nominali fil-mira tat-test fl-ikel tal-ħut tat-trattament, pereżempju 500 μg sustanza tat-test/g ikel. Il-kwantità xierqa (skont il-massa molari jew ir-radjuattività speċifika) tas-sustanza tat-test pura tiżdied ma' massa magħrufa ta' ikel tal-ħut f'ġarra tal-ħġieġ jew bozza tal-evaporazzjoni rotatorja. Il-massa tal-ikel tal-ħut għandha tkun biżżejjed għad-durata tal-fażi ta' teħid (filwaqt li titqies il-ħtieġa ta' kwantitajiet ikbar f'kull għalf minħabba li jikber il-ħut). L-għalf tal-ħut/is-sustanza tat-test għandhom jitħalltu matul il-lejl b'tħawwid bil-mod (eż. bl-użu ta' roto-rack mixer jew b'rotazzjoni jekk tintuża bozza tal-evaporazzjoni rotatorja). Id-dieta miżjuda għandha tinħażen f'kundizzjonijiet li jżommu l-istabilità tas-sustanza tat-test fi ħdan it-taħlita tal-għalf (eż. tkessiħ) sakemm tintuża.
                        
                           Preparazzjoni tal-ikel tal-ħut b'veikolu taż-żejt tal-qamħirrum jew tal-ħut
                        
                        Is-sustanzi solidi tat-test għandhom jintaħnu f'mehrież biex jiġu trab fin. Is-sustanzi likwidi tat-test jistgħu jiżdiedu direttament maż-żejt tal-qamħirrum jew tal-ħut. Is-sustanza tat-test hija dissolta fi kwantità magħrufa ta' żejt tal-qamħirrum jew tal-ħut (eż. 5-15-il ml). Iż-żejt iddożat jiġi ttrasferit b'mod kwantitattiv f'bozza tal-evaporazzjoni rotatorja ta' qies xiearq. Il-flask użat għat-tħejjija taż-żejt iddożat għandu jitlaħlaħ b'żewġ alikwoti żgħar ta' żejt u dawn jiżdiedu fil-bozza sabiex jiġi żgurat li tiġi ttrasferita s-sustanza dissolta kollha tat-test. Sabiex tiġi żgurata dissoluzzjoni/dispersjoni sħiħa fiż-żejt (jew jekk tintuża iktar minn sustanza waħda tat-test fl-istudju), jiżdied mikroħawwad, jingħalaq il-flask u t-taħlita titħawwad b'mod rapidu matul il-lejl. Fil-bozza tiżdied kwantità xierqa ta' dieta tal-ħut (normalment fil-forma ta' gerbub) għat-test, u l-kontenuti tal-bozza jitħalltu b'mod omoġenju bil-qlib kontinwu tal-bozza tal-ħġieġ għal tal-inqas 30 minuta, iżda idealment matul il-lejl sħiħ. Għalhekk, l-ikel miżjud bis-sustanza jinħażen kif xieraq (eż. imkessaħ) sabiex tiġi żgurata stabilità fis-sustanza tat-test fl-ikel sakemm tintuża.
                        
                           Preparazzjoni tal-ikel tal-ħut b'solvent organiku
                        
                        Kwantità xierqa tas-sustanza tat-test (b'massa molari jew radjuattività speċifika) biżżejjed sabiex tintlaħaq id-doża fil-mira tiġi dissolta f'solvent organiku xieraq (eż. ċikloessan jew aċeton; 10-40 ml, iżda volum ikbar jekk ikun hemm bżonn, skont il-kwantità tal-ikel li miegħu trid tiżdied is-sustanza). Alikwota ta' din is-soluzzjoni, jew kollha kemm hi (miżjuda skont il-porzjon), titħallat mal-massa xierqa ta' ikel tal-ħut li tkun biżżejjed sabiex it-test jilħaq il-livell nominali meħtieġ tad-doża. L-ikel/is-sustanza tat-test jistgħu jitħalltu fi skutella tat-taħlit tal-azzar inossidabbli u l-ikel tal-ħut iddożat frisk li jifdal fl-iskutella f'hood tal-laboratorju għal jumejn (jitħawwad kultant) sabiex is-solvent żejjed ikun jista' jevapora, jew jitħallat f'bozza b'evaporazzjoni rotatorja b'rotazzjoni kontinwa. Is-solvent żejjed jista' “jittajjar” taħt fluss ta' arja jew nitroġenu, jekk ikun hemm bżonn. Għandha tingħata attenzjoni sabiex jiġi żgurat li s-sustanza tat-test ma tikkristallizzax hu u jitneħħa s-solvent. Id-dieta miżjuda għandha tinħażen f'kundizzjonijiet li jżommu l-istabilità tas-sustanza tat-test fi ħdan it-taħlita tal-għalf (eż. tkessiħ) sakemm tintuża.
                        3.   KALKOLU TAL-EFFIĊJENZA TAL-ASSIMILAZZJONI U L-FATTUR TA' BIJOMANJIFIKAZZJONI
                        Sabiex tiġi kkalkolata l-effiċjenza tal-assimilazzjoni, l-ewwel għandu jiġi stmat il-kostant totali tar-rata ta' tisfija skont is-sezzjoni 4 tal-Appendiċi 5 (bl-użu tal-“metodu sekwenzjali”, jiġifieri rigressjoni lineari standard) bl-użu tal-konċentrazzjonijiet medji tal-kampjun mill-fażi ta' tisfija. Il-kostant tar-rata ta' tagħlif, I, u d-durata tat-teħid, t, huma parametri magħrufin tal-istudju. C
                           food, il-konċentrazzjoni mkejla medja tas-sustanza tat-test fl-ikel hija varjabbli mkejla fl-istudju. C0,d, il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħut fi tmeim il-fażi ta' teħid, normalment tinkiseb mill-interċetta ta' plott ta' ln(konċentrazzjoni) vs il-jum tat-tisfija.
                        L-effiċjenza tal-assimilazzjoni tas-sustanza (a, l-assorbiment tas-sustanza tat-test fl-imsaren) tiġi kkalkolata bħala:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A7.1]
                                 
                              fejn:
                        
                           
                              C
                              0,d
                           = il-konċentrazzjoni derivata fil-ħut fiż-żmien żero tal-fażi ta' tisfija (mg kg– 1);
                        
                           
                              k
                              2
                           = il-kostant totali tar-rata ta' tisfija (mhux ikkoreġut għat-tkabbir) (jum– 1), ikkalkolat skont l-ekwazzjonijiet fl-Appendiċi 5, Sezzjoni 3;
                        
                           
                              I
                           = il-kostant tar-rata ta' inġestjoni tal-ikel (g ikel g– 1 ħut jum– 1);
                        
                           
                              C
                              food
                           = il-konċentrazzjoni fl-ikel (mg kg– 1 ikel);
                        
                           t= id-durata tal-perjodu tat-tagħlif (jum)
                        Madankollu, ir-rata ta' tagħlif, I, użata fil-kalkolu jaf ikollha bżonn tiġi aġġustata għat-tkabbir tal-ħut sabiex tagħti effiċjenza tal-assimilazzjoni preċiża, a. F'test li fih il-ħut jikber b'mod sinifikanti matul il-fażi ta' teħid (li fiha ma ssir ebda korrezzjoni tal-kwantitajiet ta' għalf sabiex tinżamm ir-rata ta' tagħlif stabbilita), ir-rata ta' tagħlif effettiva hi u tkompli l-fażi ta' teħid sejra tkun inqas minn dik stabbilita, u tirriżulta f'effiċjenza tal-assimilazzjoni “vera” ogħla. (Kun af li dan mhuwiex importanti għall-kalkolu tal-BMF totali peress li t-termini tal-I effettivament jgħibu bejn l-Ekwazzjoni A7.1 u l-Ekwazzjoni A7.4). Ir-rata ta' tagħlif medja kkoreġuta għad-dilwizzjoni tat-tkabbir, I
                           g, tista' tinkiseb b'bosta modi, iżda mod veloċi u rigoruż huwa li jintuża l-kostant magħruf tar-rata ta' tkabbir (k
                           g) sabiex jiġu stmati l-piżijiet tal-ħut tat-test fil-punti ta' żmien matul il-fażi ta' teħid, jiġifieri:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A7.2]
                                 
                              fejn
                        
                           
                              W
                              f(t)= piż medju tal-ħut fil-jum tat-teħid t
                        
                        
                           
                              W
                              f,0
                           = piż medju tal-ħut fil-bidu tal-esperiment
                        B'dan il-mod (tal-inqas) jista' jiġi stmat il-piż medju tal-ħut fl-aħħar jum ta' esponiment (W
                           f,tmiem it-teħid). Peress li r-rata ta' tagħlif kienet stabbilita fuq il-bażi ta' W
                           f,0, ir-rata ta' tagħlif effettiva għal kull jum tat-teħid tista' tiġi kkalkolata bl-użu ta' dawn iż-żewġ valuri tal-piż. Imbagħad, ir-rata ta' tagħlif ikkoreġuta għat-tkabbir, I
                           g (g ikel g– 1 ħut jum– 1), li għandha tintuża minflok I f'każijiet ta' tkabbir rapidu matul il-fażi ta' teħid, tista' tiġi kkalkolata bħala
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A7.3]
                                 
                              Ladarba tinkiseb l-effiċjenza tal-assimilazzjoni, il-BMF jista' jiġi kkalkolat billi tiġi moltiplikata bil-kostant tar-rata ta' tagħlif I (jew I
                           g, jekk tintuża sabiex tiġi kkalkolata α) u bid-diviżjoni tar-riżultat tal-moltiplikazzjoni bil-kostant totali tar-rata ta' tisfija k
                           2:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A7.4]
                                 
                              Il-fattur ta' bijomanjifikazzjoni kkoreġut għat-tkabbir għandu jiġi kkalkolat bl-istess mod ukoll, bl-użu tal-kostant tar-rata ta' tisfija kkoreġut għat-tkabbir (kif derivat skont is-sezzjoni 7 fl-Appendiċi 5). Mill-ġdid, jekk intużat I
                           g sabiex tiġi kkalkolata α, din għandha tintuża hawnhekk ukoll minflok I:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A7.5]
                                 
                              fejn:
                        
                           
                              α
                           = l-effiċjenza tal-assimilazzjoni (l-assorbiment tas-sustanza tat-test fl-imsaren);
                        
                           
                              k
                              2
                           = il-kostant totali tar-rata ta' tisfija (mhux ikkoreġut għat-tkabbir) (jum– 1), ikkalkolat skont l-ekwazzjonijiet fl-Appendiċi 5, Sezzjoni 3;
                        
                           
                              k
                              2g
                           = kostant tar-rata ta' tisfija korrett għat-tkabbir (jum– 1);
                        
                           
                              I
                           = il-kostant tar-rata ta' inġestjoni tal-ikel (g ikel g– 1 ħut jum– 1);
                        In-nofs ħajja kkoreġuta għat-tkabbir (t
                           1/2) hija kkalkolata kif ġej.
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A7.6]
                                 
                              L-effiċjenza tal-assimilazzjoni tas-sustanza mid-dieta tista' tiġi stmata wkoll jekk ir-residwi tat-tessut jiġu stabbiliti matul il-fażi lineari tal-fażi ta' teħid (bejn jum u tlieta). F'dan il-każ, l-effiċjenza tal-assimilazzjoni tas-sustanza (α) tista' tiġi stabbilita kif ġej:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A7.7]
                                 
                              Fejn
                        
                           
                              C
                              fish
                              (t)
                           = konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħut fiż-żmien t (mg kg– 1 piż niedi).
                        4.   KORREZZJONI GĦAL-LIPIDU
                        Jekk il-kontenut lipidu tkejjel fl-istess ħuta bħall-analiżi kimika għall-intervalli ta' kampjunar kollha, il-konċentrazzjonijiet individwali għandhom jiġu kkoreġuti fuq il-bażi ta' lipidu u l-ln(konċentrazzjoni, ikkoreġuta għal-lipidu) tiġi pplottjata kontra t-tisfija (jum) sabiex jinħarġu C
                           0,d u k
                           2. Imbagħad, l-effiċjenza tal-assimilazzjoni (Ekwazzjoni A7.1) tista' tiġi kkalkolata fuq bażi lipida, bl-użu ta' C
                           ikel fuq bażi lipida (jiġifieri C
                           ikel tiġi moltiplikata bil-frazzjoni medja ta' lipidu tal-ikel). Il-kalkolu sussegwenti bl-użu tal-Ekwazzjoni A7.4 u l-Ekwazzjoni A7.5 sejjer jagħti l-BMF ikkoreġut għal-lipidu (u kkoreġut għad-dilwizzjoni tat-tkabbir) direttament.
                        Inkella, il-fattur lipidu medju (w/w) fil-ħut u fl-ikel jinkiseb kemm għall-grupp tat-trattament kif ukoll tal-kontroll (għall-ikel u l-ħut tal-grupp tal-kontroll, normalment minn dejta mkejla fil-bidu u fi tmiem l-esponiment); għall-ħut tal-grupp tat-trattament, normalment minn dejta mkejla fi tmiem l-esponiment biss). F'ċerti studji, il-kontenut lipidu tal-ħut jista' jiżdied ħafna; f'dawn il-każijiet ikun iktar xieraq li tintuża konċentrazzjoni medja ta' lipidu fil-ħut tat-test ikkalkolata mill-valuri mkejlin fi tmiem l-esponiment u fi tmiem it-tisfija. B'mod ġenerali, dejta mill-grupp tat-trattament biss għandha tintuża sabiex jinkisbu ż-żewġ frazzjonijiet ta' lipidu.
                        Il-fattur ta' korrezzjoni għal-lipidu (L
                           c) huwa kkalkolat bħala:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A7.8]
                                 
                              fejn Lħut u Likel huma l-frazzjonijiet medji ta' lipidu fil-ħut u l-ikel, rispettivament.
                        Il-fattur ta' korrezzjoni għal-lipidu jintuża sabiex jiġi kkalkolat il-fattur ta' bijomanjifikazzjoni kkoreġut għal-lipidu (BMFL):
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Ekwazzjoni A7.9]
                                 
                              5.   EVALWAZZJONI TAD-DIFFERENZI BEJN KONĊENTRAZZJONI MKEJLA FIŻ-ŻMIEN ŻERO (C
                           0,M) U KONĊENTRAZZJONI DERIVATA FIL-ĦIN ŻERO (C
                           0,D)
                        Il-konċentrazzjoni mkejla fiż-żmien żero (C
                           0,m) u l-konċentrazzjoni derivata fiż-żmien żero (C
                           0,d) għandhom jitqabblu. Jekk huma simili ħafna, dan jappoġġja l-mudell tal-ewwel ordni sabiex jinkisbu l-parametri ta' tisfija.
                        F'ċerti studji, jista' jkun hemm differenza kbira bejn il-valur derivat fiż-żmien żero, C
                           0,d, u l-konċentrazzjoni medja mkejla fiż-żmien żero. C
                           0,m (ara l-aħħar bullet tal-paragrafu 159 ta' dan il-metodu ta' ttestjar). F'każ li C
                           0,d tkun ferm inqas minn C
                           0,m (C
                           0,d << C
                           0,m), id-differenza tista' tissuġġerixxi l-preżenza ta' ikel miżjud mhux iddiġerit fl-imsaren. Dan jista' jiġi ttestjat b'mod sperimentali billi ssir analiżi separata fuq l-imsaren maqtugħin barra jekk ittieħdu iktar kampjuni (ta' ħut sħiħ) u dawn jinħażnu fi tmiem il-fażi ta' teħid. Inkella, jekk test tal-eċċezzjonijiet statistikament validu applikat għar-rigressjoni lineari tal-fażi ta' tisfija jindika li l-ewwel punt ta' kampjunar tat-tisfija huwa elevat b'mod żbaljat, jista' jkun xieraq li ssir ir-rigressjoni lineari sabiex jinkiseb k
                           2 iżda mingħajr l-ewwel punt ta' konċentrazzjoni tat-tisfija. F'dawn il-każijiet, jekk l-inċertezza fir-rigressjoni lineari titnaqqas ħafna, u jkun ċar li ġiet segwita bejn wieħed u ieħor il-kinetika tat-tisfija tal-ewwel ordni, jista' jkun xieraq li jintużaw il-valuri li jirriżultaw tal-C
                           0,d u k
                           2 fil-kalkolu tal-effiċjenza tal-assimilazzjoni. Dan għandu jkun iġġustifikat bis-sħiħ fir-rapport. Huwa possibbli wkoll li fil-fażi ta' tisfija kienet qiegħda topera kinetika mhux tal-ewwel ordni. Jekk dan huwa probabbli (jiġifieri d-dejta ttrasformata tal-logaritma naturali tidher li ssegwi kurva meta mqabbla mal-plott ta' rigressjoni lineari b'linja dritta), mhuwiex probabbli li l-kalkoli tal-k
                           2 u C
                           0,d ikunu validi u għandu jitfittex il-parir ta' espert tal-bijostatistika.
                        Jekk C
                           0,d hija ferm ogħla mill-valur imkejjel (C
                           0,d >> C
                           0,m), dan jista' jindika: li s-sustanza ssaffiet malajr ħafna (jiġifieri l-punti ta' kampjunar qorbu lejn il-limitu ta' kwantifikazzjoni tal-metodu analitiku fi żmien ferm bikri fil-fażi ta' tisfija, ara s-Sezzjoni 6 ta' hawn taħt); li kien hemm devjazzjoni mill-kinetika tat-tisfija tal-ewwel ordni; li r-rigressjoni lineari sabiex jinkisbu k
                           2 u C0 fiha l-iżbalji; jew li seħħet problema bil-konċentrazzjonijiet imkejlin fl-istudju f'ċerti punti ta' żmien tal-kampjunar. F'każijiet bħal dawn, il-plott ta' rigressjoni lineari għandu jiġi skrutinizzat għall-evidenza ta' kampjuni fil-limitu ta' kwantifikazzjoni jew kważi, għal eċċezzjonijiet u għal kurvatura ovvja (li tissuġġerixxi kinetika mhux tal-ewwel ordni), u enfasizzati fir-rapport. Għandha tiġi deskritta u ġġustifikata kwalunkwe rievalwazzjoni sussegwenti tar-rigressjoni lineari sabiex jitjiebu l-valuri stmati. Jekk tiġi osservata devjazzjoni kbira mill-kinetika tal-ewwel ordni, mhuwiex probabbli li l-kalkoli tal-k
                           2 u C
                           0,d ikunu validi u għandu jitfittex il-parir ta' espert tal-bijostatistika.
                        6.   GWIDA GĦAL SUSTANZI TAT-TEST B'TISFIJA VELOĊI ĦAFNA
                        Kif ġie diskuss fil-paragrafu 129 tal-metodu ta' ttestjar, ċerti sustanzi jistgħu jissaffew tant malajr li ma jkunux jistgħu jinkisbu konċentrazzjoni affidabbli taż-żmien żero, C
                           0,d, u k
                           2 għaliex fil-kampjuni ferm bikrin fil-fażi ta' tisfija (jiġifieri mit-tieni kampjun ta' tisfija 'l quddiem), is-sustanza effettivament ma tibqax titkejjel (konċentrazzjonijiet irrapportati fil-limitu tal-kwantifikazzjoni). Din is-sitwazzjoni ġiet osservata fir-ringtest imwettaq b'appoġġ ta' dan il-metodu ta' ttestjar bil-benżo[a]piren, u ġiet iddokumentata fir-rapport ta' validazzjoni għall-metodu. F'dawn il-każijiet, ma tistax issir rigressjoni lineari affidabbli, u aktarx li din tagħti stima għolja wisq tas-C
                           0,d, li tirriżulta f'effiċjenza tal-assimilazzjoni apparenti ferm ikbar minn 1. Huwa possibbli li tiġi kkalkolata stima konservattiva tal-k
                           2 u BMF ta' “limitu superjuri” f'dawn il-każijiet.
                        Bl-użu ta' dawk il-punti ta' dejta tal-fażi ta' tisfija fejn tkejlet konċentrazzjoni, sa u inkluża l-ewwel konċentrazzjoni “mhux individwata” (konċentrazzjoni stabbilita fil-limitu tal-kwantifikazzjoni), rigressjoni lineari (bl-użu tad-dejta dwar il-konċentrazzjoni trasformata tal-logaritma naturali kontra ż-żmien) sejra tagħti stima tal-k
                           2. Għal dawn it-tipi ta' każijiet, aktarx li dan sejjer jinvolvi żewġ punti ta' dejta biss (eż. jiem 1 u 2 tal-kampjun tat-tisfija) u mbagħad ikun jista' jiġi stmat k
                           2 bl-użu tal-Ekwazzjoni A5.22 fl-Appendiċi 5. Din l-istima tal-k
                           2 tista' tintuża sabiex tiġi stmata effiċjenza tal-assimilazzjoni skont l-ekwazzjoni A7.1, billi jiġi sostitwit il-valur ta' C0,d fl-ekwazzjoni mal-konċentrazzjoni mkejla fiż-żmien żero (C0,m) f'każijiet fejn C0,d tkun stmata b'mod ċar bħala ferm ogħla minn dak li seta' jinkiseb fit-test. Jekk C0,m ma setgħetx titkejjel, għandu jintuża l-limitu ta' detezzjoni fit-tessut tal-ħut. Jekk, f'ċerti każijiet, dan jagħti valur ta' α > 1, l-effiċjenza tal-assimilazzjoni hija supponuta bħala 1 bħala “l-agħar każ”.
                        Imbagħad il-BMFK massimu jista' jiġi stmat bl-użu tal-Ekwazzjoni A7.4, u għandu jiġi kkwotat bħala valur “ferm inqas minn” (<<). Pereżempju, għal studju mwettaq b'rata ta' tagħlif ta' 3 % u nofs ħajja tat-tisfija inqas minn 3 ijiem, u α “l-agħar każ” ta' 1, il-BMFK aktarx li jkun inqas b'madwar 0.13. Fid-dawl tal-iskop ta' din l-istima u l-fatt li l-valuri, fl-għamla tagħhom, sejrin ikunu konservattivi, ma hemmx bżonn li jiġu kkoreġuti għad-dilwizzjoni tat-tkabbir jew il-kontenut lipidu tal-ħut u l-ikel.
                     
                     
                        Appendiċi 8
                        
                           APPROĊĊI SABIEX JIĠU STMATI L-BCFS TENTATTIVI MID-DEJTA MIĠBURA FL-ISTUDJU TAL-ESPONIMENT DJETETIKU
                        
                        Il-metodu djetetiku huwa inkluż f'dan il-metodu ta' ttestjar għall-ittestjar tal-bijoakkumulazzjoni tas-sustanzi li fil-prattika ma jistgħux jiġu ttestjati bl-użu tal-metodu tal-esponiment milwiem. Il-metodu tal-esponiment milwiem jagħti fattur ta' bijokonċentrazzjoni, filwaqt li l-metodu djetetiku jwassal direttament għal informazzjoni dwar il-potenzjal ta' bijomanjifikazzjoni tat-tagħlif. F'ħafna reġimi dwar is-sikurezza tas-sustanza kimika, hemm bżonn ta' informazzjoni dwar il-bijokonċentrazzjoni akkwatika (pereżempju fil-valutazzjoni tar-riskju u s-Sistema ta' Armonizzazzjoni Globalizzata tal-Klassifikazzjoni). B'hekk, hemm bżonn li tintuża d-dejta ġġenerata fi studju djetetiku sabiex jiġi stmat fattur ta' bijokonċentrazzjoni li huwa paragunabbli għal testijiet imwettqin skont il-metodu tal-esponiment milwiem (94). Din is-sezzjoni tixtarr approċċi li jistgħu jiġu segwiti biex isir hekk, filwaqt li tirrikonoxxi n-nuqqasijiet li huma inerenti fl-istimi.
                        L-istudju djetetiku jkejjel it-tisfija sabiex jagħti kostant tar-rata ta' tisfija, k
                           2. Jekk ikun jista' jiġi stmat kostant tar-rata ta' teħid bid-dejta disponibbli għas-sitwazzjoni fejn il-ħut kien espost għas-sustanza tat-test mill-ilma, ikun jista' jiġi stmat BCF kinetiku.
                        L-istima ta' kostant tar-rata ta' teħid għall-esponiment mill-ilma ta' sustanza tat-test hija msejsa fuq ħafna suppożizzjonijiet, u lkoll sejrin jikkontribwixxu għall-inċertezza tal-istima. Barra minn hekk, dan l-approċċ sabiex jiġi stmat BCF jassumi li r-rata totali ta' tisfija (inklużi fatturi kontributorji bħad-distribuzzjoni fil-ġisem u l-proċessi ta' tisfija individwali) huwa indipendenti mit-teknika ta' esponiment użata sabiex jiġi prodott toqol fil-ġisem tas-sustanza tat-test.
                        Is-suppożizzjonijiet ewlenin inerenti fl-approċċ tal-istima jistgħu jinġabru fil-qasir kif ġej.
                        It-tisfija wara t-teħid djetetiku hija l-istess bħat-tisfija wara l-esponiment milwiem għal sustanza partikolari
                        It-teħid mill-ilma jsegwi l-kinetika tal-ewwel ordni
                        Skont il-metodu użat sabiex jiġi stmat it-teħid:
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    it-teħid jista' jiġi korrelatat mal-piż tal-ħut waħdu
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    it-teħid jista' jiġi korrelatat mal-koeffiċjent ta' partizzjoni ottanol/ilma tas-sustanza waħdu
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    it-teħid jista' jiġi korrelatat ma' taħlita tal-piż tal-ħut mal-koeffiċjent ta' partizzjoni ottanol/ilma tas-sustanza
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    fatturi li jistgħu jaffettwaw it-teħid fi studju ta' esponiment milwiem fil-prattika bħall-bijodisponibbiltà tas-sustanza, l-adsorbiment mal-apparat, id-daqs molekolari, eċċ. ftit li xejn għandhom effett
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    u, b'mod kruċjali:
                                 
                              Id-database (“sett ta' taħriġ” użata sabiex jiġi żviluppat il-metodu ta' stima tat-teħid tirrappreżenta s-sustanza kkunsidrata
                        Bosta pubblikazzjonijiet fit-tagħrif disponibbli ħarġu ekwazzjonijiet li rabtu t-teħid mill-ilma fil-ħut permezz tal-garġi mal-koeffiċjent ta' partizzjoni ottanol/ilma ta' sustanza, il-piż tal-ħut (1) (2) (3) (4), il-volum u/jew il-kontenut lipidu, il-permeazzjoni/id-diffużjoni tal-membrana (5) (6), il-volum ta' ventilazzjoni tal-ħut (7) u b'approċċ tal-bilanċ tal-fugaċità/massa (8) (9) (10). Fi Crookes & Brooke tingħata valutazzjoni dettaljata ta' dawn il-metodi f'dan il-kuntest (11). Pubblikazzjoni minn Barber (12) iffokata fuq l-immudellar tal-bijoakkumulazzjoni permezz tat-teħid djetetiku hija siewja wkoll f'dan il-kuntest peress li tinkludi kontribuzzjonijiet mill-mudelli tar-rata ta' teħid mill-garġi. Sezzjoni tad-dokument ta' sfond għall-protokoll djetetiku tal-2004 (13) kienet iddedikata għal dan l-aspett ukoll.
                        Ħafna minn dawn il-mudelli jidhru li nkisbu bl-użu ta' databases limitati. Għal mudelli li għalihom hemm disponibbli d-dettalji tad-database użata sabiex jinbena l-mudell, jidher li t-tipi ta' sustanzi użati spiss ikunu ta' struttura jew klassi simili (f'termini ta' funzjonalità, eż. organoklori). Dan iżid mal-inċertezza fl-użu ta' mudell li jbassar kostant tar-rata ta' teħid għal tip ta' sustanza differenti, minbarra kunsiderazzjonijiet speċifiċi għat-test bħal speċi, temperatura, eċċ.
                        Reviżjoni tat-tekniki disponibbli (11) weriet li ebda metodu wieħed ma huwa “iktar korrett” mill-oħrajn. Għalhekk, għandha tingħata ġustifikazzjoni ċara għall-mudell użat. Meta jkun hemm bosta metodi disponibbli li jista' jiġi ġġustifikat l-użu tagħhom, jista' jkun prudenti li jiġu ppreżentati bosta stimi tal-k
                           1 (u b'hekk il-BCF) jew medda ta' valuri tal-k
                           1 (u l-BCF) skont bosta metodi għall-istima tat-teħid. Madankollu, minħabba d-differenzi fit-tipi ta' mudelli u s-settijiet ta' dejta użati sabiex jiġu żviluppati, it-teħid ta' valur mill-istimi derivati b'mod differenti ma jkunx xieraq.
                        Ċerti riċerkaturi stipulaw li l-istimi tal-BCF ta' din ix-xorta jeħtieġu korrezzjoni tal-bijodisponibilità sabiex jitqies l-adsorbiment ta' sustanza għal karbonju organiku dissolt (DOC) f'kundizzjonijiet tal-esponiment milwiem, sabiex l-istimi tinġieb konformi mar-riżultati minn studji tal-esponiment milwiem (eż. (13) (14)). Madankollu, din il-korrezzjoni ma tistax tkun xieraq minħabba l-livelli baxxi ta' DOC meħtieġa fi studju tal-esponiment milwiem għal stima tal-“agħar każ” (jiġifieri proporzjon tas-sustanza bijodisponibbli għal sustanza kif imkejla fis-soluzzjoni). Għal sustanzi ferm idrofobiċi, it-teħid fil-garġi jista' jsir limitat minħabba r-rata ta' diffużjoni passiva qrib il-wiċċ tal-garġi; f'dan il-każ, huwa possibbli li l-korrezzjoni tista' tkun tqis dan l-effett minflok għal dak li kienet imfassla għalih.
                        Huwa rakkomandat li jiġi ffokat fuq il-metodi li jeħtieġu inputs li għalihom sejjer ikun hemm dejta disponibbli għal sustanzi ttestjati skont l-istudju djetetiku deskritt hawn (jiġifieri log KOW, piż tal-ħut). Jistgħu jiġu applikati metodi oħrajn li jeħtieġu inputs iktar kumplessi, iżda dawn jistgħu jkunu jeħtieġu kejliet addizzjonali fit-test jew għarfien dettaljat dwar is-sustanza tat-test jew l-ispeċi tal-ħut li jaf ma jkunux għad-dispożizzjoni faċilment. Barra minn hekk, l-għażla tal-mudell tista' tkun influwenzata mil-livell ta' validazzjoni u d-dominju ta' applikabilità (ara (11) għal reviżjoni u paragun ta' metodi differenti).
                        Ta' min jiftakar li l-istima tal-k
                           1 li tirriżulta, u l-BCF stmat, huma inċerti u jista' jkollhom bżonn jiġu ttrattati f'approċċ tal-piż tal-evidenza flimkien mal-BMF u l-parametri tas-sustanza (eż. id-daqs tal-molekoli) għal stampa sħiħa tal-potenzjal ta' bijoakkumulazzjoni ta' sustanza. L-interpretazzjoni u l-użu ta' dawn il-parametri jistgħu jiddependu mill-qafas regolatorju.
                        TAGĦRIF
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Sijm D.T.H.M., Pärt P. and Opperhuizen A. (1993), The influence of temperature on the uptake rate constants of hydrophobic compounds determined by the isolated perfused gills of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquat. Toxicol. 25: 1-14.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., Part P. and Opperhuizen A. (1994), Experimentally determined blood and water flow limitations for uptake of hydrophobic compounds using perfused gills of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): Allometric applications. Aquat. Toxicol. 30: 325-341.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., de Jonge W.J., Pärt P. and Opperhuizen A. (1995), Allometry in the uptake of hydrophobic chemicals determined in vivo and in isolated perfused gills. Toxicol. Appl. Pharmacol. 131: 130-135.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Barber M.C. (2003), A review and comparison of models for predicting dynamic chemical bioconcentration in fish. Environ. Toxicol. Chem. 22: 1963-1992.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Opperhuizen A. (1986), Bioconcentration of hydrophobic chemicals in fish, in Aquatic Toxicology and Environmental Fate, STP 921, Poston, T.M. and Purdy, R., Editors. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, PA, USA: 304-315.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Arnot J.A. and Gobas F.A.P.C. (2004), A food web bioaccumulation model for organic chemicals in aquatic ecosystems. Environ. Toxicol. Chem. 23: 2343-2355.
                                 
                              
                                    (7)
                                 
                                 
                                    Thomann R.V. (1989), Bioaccumulation model of organic chemical distribution in aquatic food chains. Environ. Sci. Technol. 23: 699-707.
                                 
                              
                                    (8)
                                 
                                 
                                    Hendriks A.J., van der Linde A., Cornelissen G. and Sijm D.T.H.M. (2001). The power of size. 1. Rate constants and equilibrium ratios for accumulation of organic substances related to octanol-water partition ratio and species weight. Environ. Toxicol. Chem. 20: 1399-1420.
                                 
                              
                                    (9)
                                 
                                 
                                    Campfens J. and Mackay D. (1997), Fugacity-based model of PCB bioaccumulation in complex aquatic food webs. Environ. Sci. Technol. 31: 577-583.
                                 
                              
                                    (10)
                                 
                                 
                                    Arnot J.A. and Gobas F.A.P.C. (2003), A generic QSAR for assessing the bioaccumulation potential of organic chemicals in aquatic food webs. QSAR Comb. Sci. 22: 337-345.
                                 
                              
                                    (11)
                                 
                                 
                                    Crookes M. and Brooke D. (2010), Estimation of fish bioconcentration factor (BCF) from depuration data. Draft Report. Environmental Agency, Bristol, UK.
                                 
                              
                                    (12)
                                 
                                 
                                    Barber M.C. (2008), Dietary uptake models used for modelling the bioaccumulation of organic contaminants in fish. Environ. Toxicol. Chem. 27: 755-777
                                 
                              
                                    (13)
                                 
                                 
                                    Anonymous (2004), Background document to the fish dietary study protocol, document submitted to the TC-NES WG on PBT.
                                 
                              
                                    (14)
                                 
                                 
                                    Gobas F. and Morrison H. (2000), Bioconcentration and biomagnification in the aquatic environment, in Handbook of property estimation methods for chemicals, Boethling, R.S. and Mackay, D., Editors. Lewis Publishers, Boca Racton, FL, USA: 189-231.
                                 
                              ”
               
                     (17)
                  
                  
                     Fil-Parti C, il-Kapitolu C.20 huwa sostitwit b'dan li ġej:
                     “C.20   Test tar-Riproduzzjoni Daphnia magna
                        
                     
                     INTRODUZZJONI
                     Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 211 tal-OECD (2012). Il-linji gwida tat-test tal-OECD jiġu riveduti perjodikament fid-dawl tal-progress xjentifiku. Il-linja gwida tat-test 211 dwar ir-riproduzzjoni toriġina mil-linja gwida tat-test 202, Parti II, Daphnia sp. reproduction test (1984). Ġeneralment kien rikonoxxut li dejta minn testijiet li jsiru skont dik it-TG 202 tista' tvarja. Dan wassal għal sforz konsiderevoli ddedikat għall-identifikazzjoni tar-raġunijiet għal din il-varjabbiltà bil-għan li jiġi prodott metodu ta' ttestjar aħjar. Il-linja gwida tat-test 211 hija msejsa fuq l-eżitu ta' dawn l-attivitajiet ta' riċerka, ringtests u studji ta' validazzjoni mwettqin fl-1992 (1), l-1994 (2) u l-2008 (3).
                     Id-differenzi ewlenin bejn il-verżjoni inizjali (TG 202, 1984), u t-tieni verżjoni (TG 211, 1998) tal-linja gwida tat-test dwar ir-riproduzzjoni huma:
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-ispeċijiet rakkomandati sabiex jintużaw fid-Daphnia magna;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-durata tat-test hija ta' 21 jum.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 għal testijiet semistatiċi, in-numru ta' annimali li sejrin jintużaw f'kull konċentrazzjoni tat-test tnaqqas minn tal-inqas 40, idealment maqsumin f'erba' gruppi ta' 10 annimali, għal tal-inqas 10 annimali miżmumin għalihom (għad li jistgħu jintużaw disinni differenti għal testijiet bi fluss kontinwu);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 saru rakkomandazzjonijiet iktar speċifiċi fir-rigward tal-medium tat-test u l-kundizzjonijiet tat-tagħlif.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-differenzi ewlenin bejn it-tieni verżjoni tal-linja gwida tat-test dwar ir-riproduzzjoni (TG 211, 1998), u din il-verżjoni huma:
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 żdied l-Appendiċi 7 sabiex jiġu deskritti l-proċeduri għall-identifikazzjoni tas-sess tal-wild, jekk ikun hemm bżonn. B'konformità mal-verżjonijiet ta' qabel ta' dan il-metodu ta' ttestjar, il-proporzjon tas-sess huwa punt ta' tmiem fakultattiv;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru tal-varjabbli tar-rispons ta' nisel li jgħix prodott għal kull annimal ġenitur li jibqa' ħaj ġie ssupplimentat minn varjabbli tar-rispons addizzjonali għar-riproduzzjoni ta' Daphnia, jiġifieri n-numru totali ta' nisel ħaj prodott fi tmiem it-tst għal kull daphnia ġenitur fil-bidu tat-test, eskluż mill-analiżi tal-mortalità aċċidentali u/jew mhux intenzjonata tal-ġenituri. L-iskop tal-varjabbli tar-rispons miżjud huwa li dan il-varjabbli tar-rispons jiġi allinjat ma' metodi ta' ttestjar tar-riproduzzjoni oħrajn fuq l-invertebrati. Barra minn hekk, b'rabta ma' dan il-varjabbli tar-rispons, f'dan il-metodu ta' ttestjar huwa possibbli li jitneħħa sors ta' żball, jiġifieri l-effett ta' mortalità mhux intenzjonata u/jew aċċidentali tal-ġenituri, jekk iseħħ matul il-perjodu ta' esponiment.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 gwida statistika addizzjonali għad-disinn tat-test u għat-trattament tar-riżultati ġiet inkluża kemm għall-ECx (eż. EC10 jew EC50) kif ukoll għall-approċċ NOEC/LOEC.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 huwa introdott test tal-limitu.
                              
                           Fl-Appendiċi 1 jingħataw id-definizzjonijiet użati.
                     IL-PRINĊIPJU TAT-TEST
                     L-għan primarju tat-test huwa li jiġi vvalutat l-effett tal-kimiku fuq ir-riżultat riproduttiv tad-Daphnia magna. Għal dan il-għan, Daphnia femminili żgħar (l-annimali ġenituri), li jkollhom inqas minn 24 siegħa fil-bidu tat-test, jiġu esposti għas-sustanza kimika tat-test miżjuda mal-ilma f'medda ta' konċentrazzjonijiet. Id-durata tat-test hija ta' 21 jum. Fi tmiem it-test jiġi vvalutat in-numru totali ta' nisel ħaj prodott. Ir-riżultat riproduttiv tal-annimali ġenituri jista' jkun espress permezz ta' modi oħrajn (eż. numru ta' nisel ħaj prodott minn kull annimal kull jum mill-ewwel ġurnata li fih beda jiġi osservat in-nisel) iżda dan għandu jiġi rrapportat minbarra n-nisel ħaj prodott fi tmiem it-test. Minħabba d-disinn partikolari tat-test semistatiku meta mqabbel ma' metodi ta' ttestjar oħrajn tar-riproduzzjoni tal-invertebrati, huwa possibbli wkoll li jingħadd in-numru ta' nisel ħaj prodott minn kull annimal ġenitur individwali. Dan jippermetti sabiex, għall-kuntrarju ta' metodi oħrajn ta' ttestjar tar-riproduzzjoni fl-invertebrati, jekk l-annimal ġenitur imut b'mod aċċidentali u/jew b'mod mhux intenzjonat, il-produzzjoni ta' nisel tiegħu tista' tiġi eskluża mill-valutazzjoni tad-dejta. B'hekk, jekk isseħħ mortalità tal-ġenituri f'repliki esposti, għandu jiġi kkunsidrat jekk il-mortalità ssegwix mudell ta' rispons għall-konċentrazzjoni, eż. jekk hemmx rigressjoni sinifikanti tar-rispons kontra l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test b'pendil pożittiv (għal dan jista' jintuża test statistiku bħat-test tat-tendenza ta' Cochran-Armitage). Jekk il-mortalità ma ssegwix xejra ta' rispons għall-konċentrazzjoni, dawk ir-repliki b'mortalità tal-ġenituri għandhom jiġu esklużi mill-analiżi tar-riżultat tat-test. Jekk il-mortalità ssegwi xejra ta' rispons għall-konċentrazzjoni, il-mortalità tal-ġenituri għandha tiġi assenjata bħala effett tas-sustanza kimika tat-test u r-repliki ma għandhomx jiġu esklużi mill-analiżi. Jekk l-annimal ġenitur imut matul it-test, jiġifieri aċċidentalment minħabba mmaniġġjar ħażin jew aċċident, jew b'mod mhux intenzjonat minħabba l-inċident mhux spjegat mhux marbut mal-effett tas-sustanza kimika tat-test jew jirriżulta li huwa raġel, ir-replika tiġi eskluża mill-analiżi (ara iktar fil-paragrafu 51). L-effett tossiku tas-sustanza kimika tat-test fuq l-eżitu riproduttiv jingħata bħala ECx billi d-dejta titqiegħed f'mudell xieraq permezz ta' rigressjoni mhux lineari sabiex tiġi stmata l-konċentrazzjoni li tikkaġuna tnaqqis ta' x % fl-eżitu riproduttiv, rispettivament, jew inkella bħala l-valur NOEC/LOEC (4). Idealment, il-konċentrazzjonijiet tat-test jiġbru l-inqas mill-konċentrazzjonijiet tal-effett użati (eż. EC10) xi ħaġa li tfisser li dan il-valur huwa kkalkolat b'interpolazzjoni u mhux estrapolazzjoni.
                     
                     Is-sopravvivenza tal-annimali ġenituri u ż-żmien sal-produzzjoni tal-ewwel ħut riproduttur għandu jkun irrapportat ukoll. Effetti oħrajn marbutin mas-sustanza kimika fuq parametri bħat-tkabbir (eż. it-tul), u r-rata possibilment intrinsika taż-żieda fil-popolazzjoni, jistgħu jiġu eżaminati wkoll (ara l-paragrafu 44).
                     INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA KIMIKA TAT-TEST
                     Ir-riżultati ta' test tat-tossiċità akuta (ara l-kapitolu C.2 ta' dan l-Anness: Test tal-immobilizzazzjoni akuta ta' Daphnia sp.) imwettaq b'Daphnia magna jista' jkun utli fl-għażla ta' medda xierqa ta' konċentrazzjonijiet tat-test fit-testijiet tar-riproduzzjoni. Is-solubilita fl-ilma u l-pressjoni tal-fwar tas-sustanza kimika tat-test għandhom ikunu magħrufin u għandu jkun hemm disponibbli metodu analitiku affidabbli għall-kwantifikazzjoni tas-sustanza kimika fis-soluzzjonijiet tat-test b'effiċjenza ta' rkupru rraportata u l-limitu ta' determinazzjoni.
                     Informazzjoni fuq is-sustanza kimika tat-test, li tista' tkun siewja sabiex jiġu stabbiliti l-kundizzjonijiet tat-test, tinkludi l-formula strutturali, il-purità tas-sustanza kimika, l-istabilità fil-kundizzjonijiet tat-test, il-pKa, POW u riżultati ta' test għall-bijodegradabilità faċli (ara l-kapitoli C.4 (determinazzjoni ta' bijodegradabilità “faċli”) u C.29 (bijodegradabilità faċli — CO2 f'reċipjenti ssiġillati) ta' dan l-Anness).
                     VALIDITÀ TAT-TEST
                     Sabiex test ikun validu, dawn il-kriterji ta' eżekuzzjoni li ġejjin, għandhom ikunu ssodisfati fil-kontroll(i):
                     
                                 —
                              
                              
                                 il-mortalità tal-annimali ġenituri (Daphnia femminili) ma taqbiżx l-20 % fi tmiem it-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru medju ta' nisel ħaj prodott għal kull annimal ġenitur li jibqa' ħaj fi tmiem it-test huwa ta' > 60.
                              
                           Nota: Jista' jintuża l-istess kriterju ta' validità (20 %) għal mortalità aċċidentali u mhux intenzjonata tal-ġenituri għall-kontrolli kif ukoll għal kull waħda mill-konċentrazzjonijiet tat-test.
                     DESKRIZZJONI TAL-METODU
                     
                        Apparat
                     
                     Ir-reċipjenti tat-test u apparat ieħor li sejrin jiġu f'kuntatt mas-soluzzjonijiet tat-test għandhom ikunu magħmula kompletament mill-ħġieġ jew materjal kimikament inerti ieħor. Normalment ir-reċipjenti tat-test ikunu bekkijiet tal-ħġieġ.
                     Barra minnn hekk, huma meħtieġa wħud jew kull wieħed mill-apparati ta' hawn taħt:
                     
                                 —
                              
                              
                                 ossiġenometru (b'mikroelettrodu jew apparat xieraq ieħor għall-kejl tal-ossiġenu dissolt f'kampjuni ta' volum baxx);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 apparat adegwat għall-kontroll tat-temperatura;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 miter tal-pH;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 apparat għad-determinazzjoni tal-ebusija tal-ilma;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 apparat għad-determinazzjoni tal-konċentrazzjoni ta' karbonju organiku totali (TOC) tal-ilma jew apparat għad-determinazzjoni tad-domanda kimika ta' ossiġenu (COD),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 apparat adegwat għall-kontroll tar-reġim tad-dawl u l-kejl tal-intesita' tad-dawl.
                              
                           
                        Organiżmu tat-Test
                     
                     L-ispeċi li għandha tintuża fit-test hija Daphnia magna Straus (95).
                     Idealment, il-klonu għandu jkun ġie identifikat bil-ġenotipar. Riċerka (1) uriet li l-prestazzjoni riproduttiva tal-Klonu A (li oriġina minn IRCHA fi Franza) (5) konsistentament laħaq il-kriterju ta' validità ta' medja ta' ≥ 60 nisel ħaj kull annimal ġenitur li jkun baqa' ħaj meta kkulturati fil-kundizzjonijiet deskritti f'dan il-metodu ta' ttestjar. Madankollu, kloni oħrajn jistgħu jiġu aċċettati diment li jintwera li l-kultura tad-Daphnia tilħaq il-kriterji ta' validità għat-test.
                     Fil-bidu tat-test, l-annimali għandu jkollhom inqas minn 24 siegħa u ma għandhomx l-ewwel wild tad-duqqajs. Għandhom ikunu derivati minn stokk b'saħħtu (jiġifieri ma juri l-ebda sinjal ta' stress bħall-mortalità għolja, il-preżenza ta' maskili u efippja, dewmien fil-produzzjoni tal-ewwel duqqajs, annimali skuluriti, eċċ.). L-annimali tal-istokk għandhom jinżammu f'kundizzjonijiet tal-kultura (dawl, temperatura, medium, għalf u annimali għall-kull unità ta' volum) simili għal dawk użati fit-test. Jekk il-medium tal-kultura ta' Daphnia li jkun sejjer jintuża fit-test huwa differenti minn dak użat għall-kultura tas-soltu ta' Daphnia, hija prattika tajba li jkun inkluż perjodu ta' akklimatizzazzjoni ta' qabel it-test li normalment jieħu 3 ġimgħat (jiġifieri ġenerazzjoni waħda) sabiex ikun evitat stress fuq l-annimali ġenituri.
                     
                        Medium tat-test
                     
                     Huwa rakkomandat li jintuża medium li huwa kompletament definit f'dan it-test. Dan jista' jevita l-użu ta' addittivi (eż. alga, estratt tal-ħamrija), li diffiċli jiġu kkaratterizzati, u għalhekk itejjeb l-opportunitajiet għall-istandardizzar bejn il-laboratoji. Instab li media Elendt M4 (6) u M7 (ara l-Appendiċi 2) huma adegwati għal dan il-għan. Madankollu, media oħrajn (eż. (7) (8)) huma aċċettabbli diment li jintwera li l-prestazzjoni tal-kultura ta' Daphnia tissodisfa l-kriteji ta' validità għat-test.
                     Jekk jintużaw media li jinkludu addittivi li mhumiex definiti, dawn l-addittivi għandhom ikunu speċifikati ċari u l-informazzjoni għandha tkun ipprovduta fir-rapport tat-test dwar il-kompożizzjoni, partikolarment fir-rigward tal-kontenut ta' karbonju għaliex dan jista' jikkontribwixxi għad-dieta stipulata. Huwa rakkomandat li jiġi ddeterminat il-karbonju organiku totali (TOC) u/jew id-domanda kimika ta' ossiġenu (COD) tal-preparazzjoni tal-istokk tal-addittiv organiku u li ssir stima tal-kontribuzzjoni li tirriżulta tal-TOC/COD fil-medium tat-test. Huwa rakkomandat ukoll li l-livelli ta' TOC fil-medium (jiġifieri qabel iż-żieda tal-algi) ikunu inqas minn 2 mg/l (9).
                     Meta jkunu qegħdin jiġu ttestjati sustanzi kimiċi li fihom hemm metalli, huwa importanti li wieħed jirrikonoxxi li l-medium tat-test (eż. ebusija, kapaċità kelanti) jista' jkollu impatt fuq it-tossiċità tas-sustanza kimika tat-test. Għal din ir-raġuni, idealment jintuża medium kompletament definit. Madankollu, bħalissa, l-uniċi media li huma definiti kompletament magħrufin bħala adegwati għall-kultura fit-tul ta' Daphnia magna huma Elendt M4 u M7. Iż-żewġ media fihom l-aġent kelanti EDTA. Ix-xogħol wera (2) illi t-“tossiċità apparenti” tal-kadmju hija ġeneralment inqas meta t-test tar-riproduzzjoni isir fil-media M4 u M7 milli meta kienu fil-media li ma kienx fihom EDTA. Għalhekk, M4 u M7 mhumiex irrakkomandati għall-ittestjar ta' sustanzi kimiċi li fihom metalli, u media oħrajn magħrufin li fihom aġenti kelanti għandhom ikunu evitati wkoll. Għal sustanzi kimiċi li fihom il-metall, jista' jkun rakkomandat li jintuża medium ieħor bħal, pereżempju ilma ħelu iebes rikostitwit tal-ASTM (9), li ma fih ebda EDTA. Dan it-taħlita ta' ilma ħelu iebes rikostitwit tal-ASTM u estratt tal-alga (10) hija xierqa għall-kultura fit-tul ta' Daphnia magna (2).
                     Il-konċentrazzjoni tal-ossiġenu dissolt għandha tkun ogħla minn 3 mg/l fil-bidu u matul it-test. Il-pH għandha tkun bejn 6 — 9, u normalment m'għandhiex tvarja b'aktar minn 1.5 unitajiet f'test wieħed. Hija rakkomandata ebusija 'il fuq minn 140 mg/l (bħal CaCO3). Testijiet f'dan il-livell u iktar urew prestazzjoni riproduttiva konformi mal-kriteji ta' validità (11) (12).
                     
                        Soluzzjonijiet tat-test
                     
                     Is-soluzzjonijiet tat-test tal-konċentrazzjonijiet magħżulin normalment jitħejjew b'dilwizzjoni ta' soluzzjoni ewlenija. Idealment, is-soluzzjonijiet ewlenin għandhom jiġu ppreparati, mingħajr ma jintuża ebda solvent jew aġent dispersiv, permezz ta' tħallit jew theżżiż tas-sustanza kimika tat-test fil-medium tat-test bl-użu ta' mezzi mekkaniċi bħat-theżżiż, it-tħawwid jew l-ultrasonikazzjoni, jew metodi xierqa oħrajn. Idealment is-sistemi tat-test jiġu esposti għall-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test li sejrin jintużaw fl-istudju għat-tul ta' żmien metħieġ sabiex tintwera ż-żamma ta' konċentrazzjonijiet tal-esponiment stabbli qabel l-introduzzjoni tal-organiżmi tat-test. Jekk is-sustanza kimika tat-test diffiċli biex tiġi dissolta fl-ilma, għandhom jiġu segwiti l-proċeduri deskritti fil-Gwida tal-OECD għall-immaniġġjar ta' sustanzi diffiċli (13). L-użu ta' solventi jew aġenti dispersivi għandu jiġi evitat iżda jista' jkun meħtieġ f'ċerti każijiet sabiex tiġi prodotta soluzzjoni ewlenija kkonċentrata kif suppost għad-dożaġġ.
                     Kontroll bl-ilma ta' dilwizzjoni b'repliki adegwati u, jekk dan ma jkunx evitabbli, kontroll tas-solvent b'repliki adegwati għandu jintuża minbarra l-konċentrazzjonijiet tat-test. Fit-test għandhom jintużaw solventi jew aġenti dispersivi biss li ġew investigati li ma għandhomx effetti sinifikanti jew minimi biss fuq il-varjabbli tar-rispons. Eżempji ta' solventi xierqa (eż. aċeton, etanol, metanol, dimetilformammid u glikol tat-trietilen) u aġenti dispersivi (eż. Cremophor RH40, metilċelluloża 0.01 % u HCO-40) jingħataw fi (13). Meta jintuża solvent jew aġent dispersiv, il-konċentrazzjoni finali tiegħu ma għandhiex tkun ikbar minn 0.1 ml/l (13) u għandha tkun l-istess konċentrazzjoni fir-reċipjenti kollha tat-test, ħlief il-kontroll bl-ilma ta' dilwizzjoni. Madankollu, għandu jsir kull sforz biex il-konċentrazzjoni tas-solvent tinżamm għall-minimu possibbli.
                     PROĊEDURA
                     
                        Kundizzjonijiet tal-Esponiment
                     
                     
                        Durata
                     
                     Id-durata tat-test hija ta' 21 jum.
                     
                        Tagħbija
                     
                     L-annimali ġenituri jinżammu għalihom, wieħed għal kull reċipjent tat-test, normalment b'50 — 100 ml (għal Daphnia magna, jistgħu jkunu possibbli volummi iżgħar, speċjalment għal dafnidi iżgħar eż. Ceriodaphnia dubia) ta' medium f'kull reċipjent, sakemm ma jkunx hemm bżonn ta' disinn tat-test bi fluss kontinwu għall-ittestjar.
                     Kultant jista' jkun hemm bżonn ta' volumi akbar sabiex jintlaħqu r-rekwiżiti tal-proċedura analitika użata sabiex tkun determinata l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test, għalkemm ir-raggruppament tar-repliki għall-analiżi kimika huwa permess ukoll. Jekk jintużaw volumi akbar minn 100 ml, il-porzjon mogħtija lid-Daphnia jaf ikollha bżonn li tiżdied sabiex ikun żgurat li jkun hemm provvista adegwata tal-ikel u konformità mall-kriterji tal-validità.
                     
                        L-annimali tat-test
                     
                     Għat-testijiet semistatiċi, tal-inqas 10 annimali miżmuma individwalment f'kull konċentrazzjoni tat-test u tal-inqas 10 annimali miżmuma individwalment f'serje tal-kontrolli.
                     Għal testijiet bi fluss kontinwu, intwera li 40 annimal maqsuma f'erba' gruppi ta' 10 annimali f'kull konċentrazzjoni tat-test huma adegwati (1). Huwa rakkomandat li jintuża numru iżgħar ta' organiżmi tat-test u tal-inqas 20 annimal għal kull konċentrazzjoni maqsuma f'żewg repliki jew iktar bl-istess numru ta' annimali (e.ż. erba' repliki kull wieħed b'ħames dafnidi). Kun af li għal testijiet li fihom l-annimali jinżammu fil-gruppi, mhuwiex sejjer ikun possibbli li jiġi eskluż kwalunkwe nisel mill-analiżi statistika jekk isseħħ mortalità mhux intenzjonata/ aċċidentali tal-ġenitur meta tkun bdiet ir-riproduzzjoni, u b'hekk f'dawn il-każijiet l-eżitu riproduttiv għandu jiġi espress bħala n-numru totali ta' nisel ħaj prodott għal kull ġenitur preżenti fil-bidu tat-test.
                     It-trattamenti għandhom ikunu allokati għar-reċipjenti tat-test u kull immaniġġjar sussegwenti tar-reċipjenti tat-test għandhom isiru b'mod aleatorju. Nuqqas milli jsir hekk jista' jirriżulta fi preġudizzju li jista' jittieħed bħala effett ta' konċentrazzjoni. B'mod partikolari, jekk unitajiet esperimentali jiġu mmaniġjati f'ordni tat-trattament jew tal-konċentrazzjoni, jiġri li xi effett relatat mal-ħin, bħall-għeja tal-operatur jew xi żball ieħor, jista' jwassal għall-effetti akbar f'konċentrazzjonijiet ogħla. Barra minn hekk, jekk ir-riżultati tat-test aktarx li sejrin ikunu affettwati minn kundizzjoni inizjali jew ambjentali tat-test, bħall-posizzjoni fil-laboratorju, għandu jiġi kkunsidrat l-imblokkar tat-test.
                     
                        Għalf
                     
                     Għal testijiet semistatiċi, idealment it-tagħlif għandu jsir kulljum, iżda mill-inqas tliet darbiet fil-ġimgħa (jiġifieri li jikkorrispondi għall-bidliet fil-media). Id-dilwizzjoni possibbli tal-konċentrazzjonijiet tal-esponiment b'żieda tal-ikel għandha tiġi kkunsidrata u evitata kemm jista' jkun b'sospensjonijiet tal-alga kkonċentrati sew. Għandhom ikunu rrapportati devjazzjonijiet minn dan (eż. għal testijiet bi fluss kontinwu).
                     Waqt it-test, idealment, id-dieta tal-annimali ġenituri għandha tkun ċelloli ta' algi ħajjin ta' waħda jew aktar minn dawn li ġejjin: Chlorella sp., Pseudokirchneriella subcapitata (qabel kienet imsejħa Selenastrum capricornutum) u Desmodesmus subspicatus (qabel kienet imsejħa Scenedesmus subspicatus). Id-dieta mogħtija għandha tkun ibbażata fuq l-ammont ta' karbonju organiku (C) ipprovduta f'kull annimal ġenitur. Ir-riċerka (14) uriet li, għal Daphnia magna, livelli ta' porzjon ta' bejn 0.1 u 0.2 mg C/Daphnia/jum huma biżżejjed sabiex jintlaħaq in-numru mitlub ta' nisel ħaj sabiex jintlaħaq il-kriteju ta' validità tat-test. Il-porzjon tista' tkun fornita f'rata kostanti matul il-perjodu tat-test, jew, jekk mixtieq, tista' tintuża rata aktar baxxa fil-bidu u mbagħad tiżdied matul it-test sabiex jittieħed f'kunsiderazzjoni t-tkabbir tal-annimali ġenituri. F'dan il-każ, il-porzjon xorta għandha tibqa' fil-medda rakkomandata ta' 0.1 — 0.2 mg C/Daphnia/jum f'kull ħin.
                     Jekk jintużaw miżuri surrogati, bħan-numru ta' ċelloli ta' algi jew l-assorbiment tad-dawl, sabiex jingħataw il-livell meħtieġ ta' porzjon (jiġifieri għall-konvenjenza minħabba li l-kejl tal-kontenut ta' karbonju jieħu l-ħin), kull laboratorju għandu jipproduċi n-nomograff proprju tiegħu relatat mal-miżura sostituta tal-kontenut ta' karbonju tal-kulturi ta' algi (ara l-Appendiċi 3 għal pariri dwar il-produzzjoni ta' nomograff). In-nomografi għandhom ikunu vverifikati mill-inqas kull sena jew aktar jekk jinbidlu l-kundizzjonijiet tal-kultura tal-algi. Instab li l-assorbiment tad-dawl huwa surrogat aħjar għall-kontenut ta' karbonju milli numru ta' ċelloli (15).
                     Għandha tingħata sospensjoni ta' alga kkonċentrata lid-Daphnia sabiex jitnaqqas il-volum ta' medium tal-kultura ta' algi ttrasferit fir-reċipjenti tat-test. Il-konċentrazzjoni tal-algi tista' tinkiseb b'ċentrifugazzjoni segwita mir-risospensjoni fil-medium tal-kultura ta' Daphnia.
                     
                        Dawl
                     
                     16-il siegħa dawl f'intensità li ma taqbiżx il-15-20 μE ߦ m– 2 ߦ s– 1 imkejla fil-wiċċ tal-ilma tar-reċipjent. Għal strumenti li jkejlu d-dawl ikkalibrati f'lux, medda ekwivalenti ta' 1 000 — 1 500 lux għal dawl abjad bati tikkorrispondi bejn wieħed u ieħor għall-intensità ta' dawl rakkomandata ta' 15-20 μE·m– 2·s– 1.
                     
                        Temperatura
                     
                     It-temperatura tal-media tat-test għandha tkun fi ħdan il-medda ta' 18-22 °C. Madankollu, għal kull test, it-temperatura ma għandhiex tvarja, kemm jista' jkun possibbli, b'aktar minn 2 °C bejn dawn il-limiti (eż. 18-20, 19-21 jew 20-22 °C) bħala medda ta' kuljum. Jista' ikun xieraq li jintuża reċipjent tat-test ieħor għall-fini ta' monitoraġġ tat-temperatura.
                     
                        Ossiġenazzjoni
                     
                     Ir-reċipjenti tat-test ma għandhomx jiġu ossiġenati matul it-test.
                     
                        Disinn tat-test
                     
                     
                        Test tas-sejbien tal-medda
                     
                     Meta jkun hemm bżonn, isir test tas-sejbien tal-medda, pereżempju b'ħames konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test u żewġ repliki għal kull trattament u kontroll. Informazzjoni addizzjonali, minn testijiet b'sustanzi kimiċi simili jew minn tagħrif, dwar it-tossiċità akuta għad-Daphnia u/jew organiżmi akkwatiċi oħrajn, tista' tkun siewja wkoll meta tittieħed deċiżjoni fuq il-medda ta' konċentrazzjonijiet li ser jintużaw fit-test tas-sejbien tal-medda.
                     Id-durata tat-test tas-sejbien tal-medda hija ta' 21 jum jew durata twila biżżejjed sabiex ikunu jistgħu jitbassru b'mod affidabbli l-livelli tal-effetti. Fi tmiem it-test tiġi vvalutata r-riproduzzjoni tad-Daphnia. Għandhom jiġu rreġistrati n-numru ta' ġenituri u l-okkorrenza ta' nisel.
                     
                        Test definittiv
                     
                     Normalment għandu jkun hemm tal-inqas ħames konċentrazzjonijiet tat-test, li jkopru l-konċentrazzjoni effettiva (eż. ECx), u dawn għandhom ikunu rranġati f'serje ġeometrika b'fattur ta' separazzjoni li idealment ma jaqbiżx it-3.2 Għandu jintuża numru xieraq ta' repliki għal kull konċentrazzjoni tat-test (ara l-paragrafi 24-25). Għandha tingħata ġustifikazzjoni jekk jintużaw inqas minn ħames konċentrazzjonijiet. Is-sustanzi kimiċi ma għandhomx ikunu ittestjati 'il fuq mill-limitu ta' solubilità tagħhom fil-medium tat-test. Qabel ma jsir l-esperiment, huwa rakkomandat li tiġi kkunsidrata s-saħħa statistika tad-disinn tat-testijiet u li jintużaw metodi statistiċi xierqa (4). Fl-istabbiliment tal-medda ta' konċentrazzjonijiet, wieħed għandu jżomm f'moħħu dan li ġej:
                     
                                 (i)
                              
                              
                                 Jekk tiġi stmata l-ECx għall-effetti fuq ir-riproduzzjoni, huwa rakkomandatli jintużaw konċentrazzjonijiet għoljin biżżejjed sabiex tiġi definita l-ECx b'livell xieraq ta' kunfidenza. Idealment, il-konċentrazzjonijiet tat-test użati għandhom ikopru l-ECx stmata b'tali mod li l-ECx tinstab b'interpolazzjoni minflok estrapolazzjoni. Huwa vantaġġ għall-analiżi statistika li ġejja li jintużaw iktar konċentrazzjonijiet tat-test (eż. 10) u inqas repliki f'kull konċentrazzjoni (eż. 5 b'hekk jinżamm in-numru totali ta' kostant tar-reċipjenti) u b'10 kontrolli.
                              
                           
                                 (ii)
                              
                              
                                 Meta tiġi stmata l-LOEC u/jew l-NOEC, l-inqas konċentrazzjoni tat-test għandha tkun baxxa biżżejjed sabiex b'hekk l-eżitu riproduttiv f'dik il-konċentrazzjoni ma jkunx sinifikatament inqas minn dak tal-kontroll. Jekk dan mhuwiex il-każ, it-test għandu jkun ripetut bl-inqas konċentrazzjoni mnaqqsa.
                              
                           
                                 (iii)
                              
                              
                                 Meta tiġi stmata l-LOEC u/jew l-NOEC, l-ogħla konċentrazzjoni tat-test għandha tkun għolja biżżejjed sabiex b'hekk l-eżitu riproduttiv f'dik il-konċentrazzjoni jkun sinifikatament inqas minn dak tal-kontroll. Jekk dan ma jkunx il-każ, it-test għandu jiġi ripetut bl-ogħla konċentrazzjoni miżjuda sakemm ma tintużax il-konċentrazzjoni tat-test massima meħtieġa għall-ittestjar tal-effetti kroniċi (jiġifieri 10 mg/l) bħala l-ogħla konċentrazzjoni tat-test fit-test inizjali.
                              
                           Jekk ma jiġi osservat ebda effett fl-ogħla konċentrazzjoni fit-test tas-sejbien tal-medda (eż. f'10 mg/l), jew meta s-sustanza kimika tat-test jkolllha probabilità għolja li tkun baxxa/ ebda tossiċità fuq il-bażi tat-tossiċità għal organiżmi oħrajn u/jew ebda teħid/teħid baxx, it-test tar-riproduzzjoni jista' jsir bħala test tal-limitu, bl-użu ta' konċentrazzjoni tat-test ta' eż. 10 mg/l u l-kontroll. Għandhom jintużaw għaxar repliki kemm għall-grupp tat-trattament kif ukoll tal-kontroll. Meta jista' jkollu bżonn isir test tal-limitu f'sistema bi fluss kontinwu, ikun biżżejjed li jintgħażlu inqas repliki. Test tal-limitu sejjer jipprovdi l-opportunità li jintwera li ma hemm ebda effett statistikament sinifikanti fil-konċentrazzjoni ta' limitu, iżda jekk jiġu rreġistrati effetti, normalment ikun hemm bżonn li jsir test sħiħ.
                     
                        Kontrolli
                     
                     Minbarra s-serje tat-test, għandha ssir ukoll serje waħda tal-kontroll tal-medium tat-test u, jekk rilevanti, serje waħda tal-kontroll li fiha s-solvent jew l-aġent dispersiv. Meta tintuża, il-konċentrazzjoni tas-solvent jew tal-aġent dispersiv għandha tkun l-istess bħal dik użata fir-reċipjenti li fihom is-sustanza kimika tat-test. Għandu jintuża n-numru xieraq ta' repliki (ara l-paragrafi 23-24).
                     Ġeneralment, f'test magħmul tajjeb, il-koeffiċjent ta' varjazzjoni madwar in-numru medju ta' nisel ħaj prodott għal kull annimal ġenitur fil-kontroll(i) għandu jkun ta' ≤ 25 %, u dan għandu jkun irrapportat għad-disinni tat-test bl-użu ta' annimali miżmumin individwalment.
                     
                        Tiġdid tal-medium tat-test
                     
                     Il-frekwenza tat-tiġdid tal-medium tiddependi mill-istabilità tas-sustanza kimika tat-test, iżda għandha tkun mill-inqas ta' tliet darbiet fil-ġimgħa. Jekk, mit-testijiet preliminari tal-istabilità (ara l-paragrafu 7) il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test ma tkunx stabbli (jiġifieri barra l-medda ta' 80 — 120 % tal-valur nominali jew li taqa' taħt it-80 % tal-konċentrazzjoni inizjali mkejla) fuq il-perjodu massimu ta' tiġdid (jiġifieri 3 ijiem), wieħed għandu jieħu f'kunsiderazzjoni it-tiġdid iktar spiss tal-medium, jew l-użu ta' test bi fluss kontinwu.
                     Meta l-medium jiġġedded f'testijiet semistatiċi, titħejja t-tieni sensiela ta' reċipjenti tat-test u l-annimali ġenituri jiġu ttrasferiti fihom, pereżempju, b'pipetta tal-ħġieġ b'dijametru xieraq. Il-volum ta' medium ittrasferit bid-Daphnia għandu jkun minimizzat.
                     
                        Osservazzjonijiet
                     
                     Ir-riżultati tal-osservazzjonijiet li jsiru matul it-test għandhom jiġu rreġistrati fuq skedi ta' dejta (ara l-eżempji fl-Appendiċijiet 4 u 5). Jekk ikunu meħtieġa miżuri oħrajn (ara l-paragrafu 44), jista' jkun hemm bżonn ta' osservazzjonijiet addizzjonali.
                     
                        Nisel
                     
                     In-nisel prodott minn kull annimal ġenitur idealment għandu jitneħħa u jingħadd ta' kuljum mid-dehra tal-ewwel duqqajs sabiex jiġi evitat milli dawn jieklu ikel maħsub għall-ġenitur. Għall-fini ta' dan il-metodu ta' ttestjar, huwa biss in-numru ta' nisel ħaj li jrid jingħadd, iżda l-preżenza ta' bajd abortit jew nisel mejjet għandha tiġi rreġistrata.
                     
                        Mortalità
                     
                     Mortalità fl-annimali ġenituri għandha tkun irreġistrata, idealment kuljum, jew tal-inqas bl-istess frekwenza li biha jingħadd in-nisel.
                     
                        Parametri oħrajn
                     
                     Għalkemm dan il-metodu huwa maħsub prinċiparjament sabiex jiġi vvalutat l-eżitu riproduttiv, huwa possibbli li jkunu kkwantifikati biżżejjed effetti oħra li jippermettu li ssir analiżi statika. Jista' jiġi rreġistrat l-eżitu riproduttiv għal kull annimal ġenitur, jiġifieri n-numru ta' nisel ħaj prodott matul it-test għal kull ġenitur sopravissut. Dan it-test jista' jitqabbel mal-varjabbli tar-rispons ewlieni (eżitu riproduttiv għal kull annimal ġenitur fil-bidu tat-test li ma mietx b'mod mhux intenzjonat jew aċċidentali matul it-test). Jekk isseħħ mortalità tal-ġenituri f'repliki esposti, għandu jiġi kkunsidrat jekk il-mortalità ssegwix mudell ta' rispons għall-konċentrazzjoni, eż. jekk hemmx rigressjoni sinifikanti tar-rispons kontra l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test b'pendil pożittiv (għal dan jista' jintuża test statistiku bħat-test tat-tendenza Cochran-Armitage). Jekk il-mortalità ma ssegwix xejra ta' rispons għall-konċentrazzjoni, dawk ir-repliki b'mortalità tal-ġenituri għandhom jiġu esklużi mill-analiżi tar-riżultat tat-test. Jekk il-mortalità ssegwi xejra ta' rispons għall-konċentrazzjoni, il-mortalità tal-ġenituri għandha tiġi assenjata bħala effett tas-sustanza kimika tat-test u r-repliki ma għandhomx jiġu esklużi mill-analiżi tar-riżultat tat-test. Il-kejliet tat-tkabbir ikunu tassew siewja għaliex jipprovdu informazzjoni fuq effetti sottoletali possibbli li jistgħu jkunu utli għaliex iżidu mal-miżuri ta' riproduzzjoni waħedhom; huwa rakkomandat li jitkejjel it-tul tal-annimali ġenituri (jiġifieri t-tul tal-ġisem minbarra l-ispina anali). Parametri oħrajn li jistgħu jitkejlu jew jiġu kkalkolati jinkludu ż-żmien għall-produzzjoni tal-ewwel duqqajs (u dawk ta' wara), in-numru u d-daqs tad-duqqajs għal kull annimal, in-numru ta' duqqajs abortit, il-preżenza ta' neonati rġiel (OECD, 2008) jew efippja u possibilment ir-rata intrinsika ta' żieda fil-popolazzjoni (ara l-Appendiċi 1 għad-definizzjoni u l-Appendiċi 7 għall-identifikazzjoni tas-sess tan-neonati).
                     
                        Il-frekwenza tad-determinazzjonijiet analitiċi u tal-kejliet
                     
                     Il-konċentrazzjoni ta' ossiġenu, it-temperatura, l-ebusija u l-valuri tal-pH għandhom jitkejlu mill-inqas darba fil-ġimgħa, f'media ġodda u qodma, fil-kontroll(i) u fl-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test.
                     Matul it-test, il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test jiġu ddeterminati f'intervalli regolari.
                     F'testijiet semistatiċi fejn il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test tkun maħsuba li sejra tibqa' bejn ± 20 fil-mija tan-nominali (jiġifieri fil-limitu ta' 80 — 120 fil-mija- ara l-paragrafi 6, 7 u 39), huwa rrakomandat li, bħala minimu, jiġu analizzati l-ogħla u l-inqas konċentrazzjonijiet tat-test meta jkunu ppreparati ġodda u fil-ħin tat-tiġdid darba waqt l-ewwel ġimgħa tat-test (jiġifieri l-analiżijiet għandhom isiru fuq kampjun tal-istess soluzzjoni — meta tkun għadha kemm ġiet ippreparata u meta tiġġedded). Dawn id-determinazzjonijiet għandhom ikunu irripetuti mill-inqas f'intervalli ta' kull ġimgħa wara dan.
                     Għal testijiet li fihom il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test ma tkunx maħsuba li sejra tibqa' fil-limiti ± 20 fil-mija tan-nominali, huwa neċessarju li ssir analiżi tal-konċentrazzjonijiet kollha tat-test, meta tiġi ppreparata ġdida jew meta tiġġedded. Madankollu, għal dawk it-testijiet fejn il-konċentrazzjoni inizjali mkejla tas-sustanza kimika tat-test ma tkunx fl-± 20 fil-mija tan-nominali iżda tista' tiġi pprovduta biżżejjed evidenza li turi li l-konċentrazzjonijiet inizjali huma ripetibbli u stabbli (jiġifieri fil-limitu ta' 80-120 fil-mija tal-konċentrazzjonijiet inizjali), id-determinazzjonijiet kimiċi jistgħu jitnaqqsu fil-ġimgħat 2 u 3 tat-test għall-ogħla u l-inqas konċentrazzjonijiet tat-test. Fil-każijiet kollha, id-determinazzjoni tal-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test qabel jiġġeddu tista' ssir f'reċipjent tar-replika wieħed f'kull konċentrazzjoni tat-test.
                     Jekk jintuża test bi fluss kontinwu, reġim tal-kampjunar simili għal dak deskritt għat-testijiet semistatiċi jkun adattat (iżda l-kejl ta' soluzzjonijiet “qodma” ma jkunx applikabbli f'dan il-każ). Madankollu, jista' jkun rakkomandat li jiżdied in-numru ta' okkażjonijiet ta' kampjunar matul l-ewwel ġimgħa (eż. tliet settijiet ta' kejl) sabiex jiġi żgurat li l-konċentrazzjonijiet tat-test jibqgħu stabbli. F'dawn it-tipi ta' testijiet, ir-rata tal-fluss tad-dilwent u s-sustanza kimika tat-test għandha tiġi vverifikata kuljum.
                     Jekk ikun hemm evidenza li l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika li tkun qiegħda tiġi ttestjata inżammet kif xieraq fl-± 20 fil-mija tan-nominali jew fil-konċentrazzjoni inizjali matul it-test, mela r-riżultati jistgħu jkunu ibbażati fuq il-valuri nominali jew inizjali mkjelin. Jekk id-devjazzjoni mill-konċentrazzjoni nominali jew dik inizjali mkejla tkun ikbar minn ±20 fil-mija, ir-riżultati għandhom jingħataw f'termini tal-medja ponderata għaż-żmien (ara l-gwida dwar il-kalkolu fl-Appendiċi 6).
                     DEJTA U RAPPORTAR
                     
                        Trattament tar-riżultati
                     
                     L-iskop ta' dan it-test huwa li jistabbilixxi l-effett tas-sustanza kimika tat-test fuq l-eżitu riproduttiv. In-numru totali ta' nisel ħaj għal kull annimal ġenitur għandu jiġi kkalkolat għal kull reċipjent tat-test (jiġifieri replika). Barra minn hekk, ir-riproduzzjoni tista' tiġi kkalkolata fuq il-bażi tal-produzzjoni ta' nisel ħaj mill-organiżmu ġenitur li jkun għadu ħaj. Madankollu, l-iktar varjabbli tar-rispons ekoloġikament rilevanti huwa n-numru totali ta' nisel ħaj prodott għal kull annimal ġenitur li ma jmutx b'mod aċċidentali (96) jew mhux intenzjonat (97) matul it-test. Jekk l-annimal ġenitur imut b'mod aċċidentali jew mhux intenzjonat matul it-test, jew jirriżulta li huwa raġel, ir-replika tiġi eskluża mill-analiżi. Imbagħad l-analiżi sejra tkun ibbażata fuq numru iżgħar ta' repliki. Jekk isseħħ mortalità tal-ġenituri f'repliki esposti, għandu jiġi kkunsidrat jekk il-mortalità ssegwix mudell ta' rispons għall-konċentrazzjoni, eż. jekk hemmx rigressjoni sinifikanti tar-rispons kontra l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test b'pendil pożittiv (għal dan jista' jintuża test statistiku bħat-test tat-tendenza Cochran-Armitage). Jekk il-mortalità ma ssegwix xejra ta' rispons għall-konċentrazzjoni, dawk ir-repliki b'mortalità tal-ġenituri għandhom jiġu esklużi mill-analiżi tar-riżultat tat-test. Jekk il-mortalità ssegwi xejra ta' rispons għall-konċentrazzjoni, il-mortalità tal-ġenituri għandha tiġi assenjata bħala effett tas-sustanza kimika tat-test u r-repliki ma għandhomx jiġu esklużi mill-analiżi tar-riżultat tat-test.
                     Fil-qosor, meta jintużaw LOEC u NOEC jew ECx sabiex jesprimu l-effetti, huwa rakkomandat li jiġi kkalkolat l-effett fuq ir-riproduzzjoni bl-użu taż-żewġ varjabbli tar-risponsi msemmijin hawn fuq, jiġifieri
                     
                                 —
                              
                              
                                 bħala n-numru totali ta' nisel ħaj prodott għal kull annimal li ma jmutx b'mod aċċidentali jew mhux intenzjonata matul it-test u;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 bħala n-numru ta' nisel ħaj prodott għal kull annimal ġenitur li jibqa' ħaj;
                              
                           u mbagħad sabiex jintuża bħala r-riżultat finali, l-inqas valur NOEC u LOEC jew ECx ikkalkolat bl-użu ta' wieħed minn dawn iż-żewġ varjabbli tar-rispons.
                     Qabel ma tintuża l-analiżi statistika, eż. proċeduri ANOVA, paragun tat-trattamenti għall-kontroll bit-test-t Student, it-test Dunnett, it-test Williams, jew it-test stepdown Jonckheere-Terpstra, huwa rakkomandat li tiġi kkunsidrata t-trasformazzjoni ta' dejta jekk ikun hemm bżonn għall-issodsfar tar-rekwiżiti tat-test statistiku partikolari. Bħala alternattivi mhux parametriċi, wieħed jista' jikkunsidra t-testijiet Dunn jew Mann-Whitney. L-intervalli ta' kunfidenza ta' 95 % huma kkalkolati għal medji tat-trattamenti individwali.
                     In-numru ta' ġenituri sopravissuti fil-kontrolli mhux ittrattati huwa kriterju ta' validità, u għandu jiġi ddokumentat u rrapportat. Anki l-effetti dannużi kollha l-oħrajn ukoll, eż. imġiba anormali u sejbiet tossikoloġiċi sinifikanti, għandhom jiġu rrapportati fir-rapport finali.
                     
                        ECx
                     
                     Il-valuri ECx, inklużi l-limiti ta' kunfidenza inferjuri u superjuri assoċjati magħhom huma kkalkolati bl-użu ta' metodi statistiċi xierqa (eż. il-funzjoni loġistika jew ta' Weibull, il-metodu ta' Spearman-Karber trimmjat, jew sempliċi interpolazzjoni). Sabiex tiġi kkalkolata l-EC10, EC50 jew kwalunkwe ECx oħra, is-sett sħiħ ta' dejta għandu jkun soġġett għal analiżi tar-rigressjoni.
                     
                        NOEC/LOEC
                     
                     Jekk analiżi statistika jkollha l-għan li ssib l-NOEC/LOEC, għandhom jintużaw metodi statistiċi xierqa skont id-Dokument 54 tal-OECD dwar Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application (4). B'mod ġenerali, effetti avversi tas-sustanza kimika tat-test meta mqabbla mal-kontroll huma investigati bl-użu ta' ttestjar tal-ipoteżi fuq naħa waħda b'p ≤ 0.05.
                     Distribuzzjoni normali u omoġenità tal-varjanza jistgħu jiġu ttestjati bl-użu ta' test statistiku xieraq, eż. it-test ta' Shapiro-Wilk u t-test ta' Levene, rispettivament (p≤ 0.05). Jistgħu jsiru ANOVA unidirezzjonali u testijiet multiparaguni sussegwenti. Jistgħu jintużaw testijiet b'bosta paraguni (eż. it-test ta' Dunnett) jew testijiet tax-xejriet rigressivi (eż. it-test ta' Williams, jew it-test stepdown ta' Jonckheere-Terpstra) sabiex jiġi kkalkolat jekk hemmx differenzi importanti (p ≤ 0.05) bejn il-kontrolli u l-bosta konċentrazzjonijiet tas-sustanzi kimiċi tat-test (għażla tat-test irrakkomandat skont id-Dokument ta' Gwida 54 tal-OECD (4)). Inkella, jistgħu jintużaw metodi mhux parametriċi (eż. test-U-Bonferroni skont it-test tax-xejriet ta' Holm jew Jonckheere-Terpstra) sabiex jiġu stabbiliti l-NOEC u l-LOEC.
                     
                        Test tal-limitu
                     
                     Jekk sar test tal-limitu (paragun tal-kontroll u trattament wieħed biss) u l-prerekwiżiti tal-proċeduri tat-test parametriku (normalità, omoġenità) huma ssodisfati, ir-risponsi metriċi jistgħu jiġu evalwati mit-test ta' Student (test-t). Jista' jintuża test-t tal-varjanza mingħajr ekwivoku (bħat-test ta' Welch) jew test mhux parametriku, bħat-test ta' Mann-Whitney-U, jekk ma jkunux issodisfati dawn ir-rekwiżiti.
                     Biex jiġu ddeterminati differenzi sinifikanti bejn il-kontrolli (kontroll u kontroll tas-solvent jew kontroll dispersiv), ir-repliki ta' kull kontroll jistgħu jiġu ttestjati kif deskritt għat-test tal-limitu. Jekk dawn it-testijiet ma jidentifikawx differenzi sinifikanti, ir-repliki tal-kontroll u tal-kontrolli tas-solventi kollha jistgħu jiġu raggruppati. Inkella t-trattamenti kollha għandhom jitqabblu mal-kontroll tas-solvent.
                     
                        Rapport tat-test
                     
                     Ir-rapport tat-test jinkludi dan li ġej:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sustanza kimika tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             l-għamla fiżika u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dejta dwar l-identifikazzjoni tas-sustanza kimika, inkluża l-purità.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Speċijiet tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             il-klonu (jekk ġiex tipat ġenetikament), il-fornitur jew is-sors (jekk magħruf) u l-kundizzjonijiet tal-kultura użati. Jekk tintuża speċi differenti minn Daphnia magna, din għandha tiġi rrapportata u ġġustifikata.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kundizzjonijiet tat-test:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             il-proċedura tat-test użata (eż. semistatika jew fluss kontinwu, il-volum, it-tagħbija f'numru ta' Daphnia kull litru);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-fotoperjodu u l-intensità tad-dawl;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             id-disinn tat-test (eż. numru ta' repliki, numru ta' ġenituri għal kull replika);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dettalji dwar il-medium tal-kultura użat;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             jekk jintużaw, żidiet ta' materjali organiċi inklużi l-kompożizzjoni, is-sors, il-metodu ta' tħejjija, it-TOC/COD tal-preparazzjonijiet tal-istokk, stima tat-TOC/COD li jirriżultaw fil-medium tat-test;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             informazzjoni dettaljata dwar l-għalf, inkluż ammont (f'mg C/daphnia/jum) u l-iskeda (eż. tip ta' ikel, inkluż għall-algi b'ismijiet speċifiċi (speċi) u, jekk magħrufin, ir-razza, il-kundizzjonijiet tal-kultura);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metodu tal-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet tal-ħażna u l-frekwenza tat-tiġdid (is-solvent jew l-aġent dispersiv u l-konċentrazzjoni tagħhom għandhom jingħataw, meta jintużaw).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ir-riżultati:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             riżultati minn kwalunkwe studju preliminari fuq l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-konċentrazzjonijiet tat-test nominali u r-riżultati tal-analiżijiet kollha sabiex tiġi stabbilita l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test fir-reċipjenti tat-test (ara l-iskedi ta' dejta ta' eżempju fl-Appendiċi 5); l-effiċjenza tal-irkupru tal-metodu u l-limitu tad-determinazzjoni għandhom ikunu irrapportati wkoll;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-kwalità tal-ilma fir-reċipjenti tat-test (jiġifieri l-pH, it-temperatura u l-konċentrazzjoni tal-ossiġenu dissolt, u TOC u/jew COD u l-ebusija fejn applikabbli (ara l-iskedi ta' dejta ta' eżempju fl-Appendiċi 4);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ir-rekord sħiħ tal-produzzjoni ta' niesl ħaj matul it-test minn kull annimal ġenitur (ara l-iskeda ta' dejta ta' eżempju fl-Appendiċi 4);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             in-numru ta' mwiet fost l-annimali ġenituri u l-jum meta seħħew (ara l-iskedi ta' dejta ta' eżempju fl-Appendiċi 4);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-koeffiċjent ta' varjazzjoni għall-eżitu riproduttiv fil-kontroll (fuq il-bażi tan-numru totali ta' nisel ħaj għal kull annimal ġenitur ħaj fi tmiem it-test);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             il-plott tan-numru totali ta' nisel ħaj prodott għal kull ġenitur ħaj f'kull replika eskluż kwalunkwe annimal ġenitur li seta' miet b'mod aċċidentali jew mhux intenzjonat matul it-test kontra l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kif xieraq, ipplottja n-numru totali ta' nisel ħaj prodott għal kull annimal ġenitur li jkun għadu ħaj f'kull replika kontra l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             fejn xieraq, il-Konċentrazzjoni bl-Inqas Effett Osservat (LOEC) għar-riproduzzjoni, inkluża deskrizzjoni tal-proċeduri statistiċi użati u indikazzjoni ta' x'daqs tal-effett jista' jkun mistenni li jiġi individwat (analiżi tas-saħħa tista' ssir qabel ma jibda l-esperiment sabiex jiġi pprovdut) u l-Konċentrazzjoni Bla Effett Osservat (NOEC) għar-riproduzzjoni; l-informazzjoni li fuqha ntuża l-varjabbli tar-rispons għall-kalkolu tal-valur tal-LOEC u l-NOEC (jew bħala nisel ħaj totali għal kull organiżmu matern li ma mietx b'mod aċċidentali jew mhux intenzjonat matul it-test jew bħala numru totali ta' nisel ħaj għal kull organiżmu matern li jkun għadu ħaj), fejn xieraq, għandhom jiġu rrapportati wkoll l-LOEC u l-NOEC għall-mortalità tal-annimali ġenituri;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             fejn xiearq, l-ECx għar-riproduzzjoni u l-intervalli ta' kunfidenza (eż. 90 % jew 95 %) u graff tal-mudell iffittjat użat għall-kalkolu ta' dawn, il-pendil tal-kurva ta' konċentrazzjoni — rispons u l-iżball standard tagħha;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kejliet jew effetti bijoloġiċi osservati oħrajn: irrapporta kwalunkwe effett bijoloġiku ieħor li ġie osservat jew li tkejjel (eż. tkabbir ta' annimali ġenituri) inkluża kwalunkwe ġustifikazzjoni xierqa;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             spjegazzjoni ta' kwalunkwe devjazzjoni mill-metodu ta' ttestjar.
                                          
                                       
                           TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD Test Guidelines Programme. Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, U.K., 20-21 March 1993.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (1997). Report of the Final Ring Test of the Daphnia magna Reproduction Test. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.6. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 OECD (2008). Validation report for an enhancement of OECD TG 211 Daphnia magna reproduction test. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, No.88. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment Number 54. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Baird, D.J., et al. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Straus. Ecotox. and Environ. Safety, 21, 257-265.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Elendt, B.-P. (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 EPA (2002). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. Fifth Edition. EPA/821/R-02/012. U.S. Environmental Protection Agency, Office of Water, Washington, DC. www.epa.gov/waterscience/methods
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Vigano, L. (1991). Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 47, 775-782.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 ASTM. (2008) Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates, and Amphibians. Fi: Annual Book of ASTM Standards; Water and Environmental Technology, vol. 11.04; ASTM E729 — 96 (2007) American Society for Testing and Materials, Philadelphia, PA
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Baird, D.J., et al. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. Fi: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988. (H. Løkke, H. Tyle and F. Bro-Rasmussen. Eds.) pp 144-148.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Parkhurst, B.R., J.L Forte. And G.P. and Wright (1981) Reproducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26: 1-8.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Cowgill, U.M. and Milazzo, D.P. (1990). The sensitivity of two cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2): 185-196.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Sims, I.R., S. Watson. and D. Holmes (1993) Toward a standard Daphnia juvenile production test. Environ. Toxicol. and Chem., 12, 2053-2058.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Sims, I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, 459-466.
                              
                           
                        Appendiċi 1
                        DEFINIZZJONIJIET
                        Għall-finijiet ta' dan il-metodu ta' ttestjar, jintużaw id-definizzjonijiet li ġejjin:
                        
                           
                              Mortalità aċċidentali
                           : mortalità mhux marbuta mas-sustanza kimika kkaġunata minn inċidenza aċċidentali (jiġifieri kawża magħrufa)
                        
                           
                              Sustanza Kimika
                           : sustanza jew taħlita.
                        
                           
                              ECx
                              
                           : il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test dissolta fl-ilma li tirriżulta fi tnaqqis ta' x fil-mija fir-riproduzzjoni ta' Daphnia fi ħdan perjodu ta' esponiment ddikjarat.
                        
                           
                              Mortalità mhux intenzjonata
                           : mortalità mhux marbuta mas-sustanza kimika b'kawża mhux magħrufa.
                        
                           
                              Rata intrinsika ta' żieda fil-popolazzjoni
                           : kejl tat-tkabbir tal-popolazzjoni li jintegra l-eżitu riproduttiv u l-mortalità speċifika għall-età (1) (2) (3). F'popolazzjonijiet fi stat stazzjonarju, sejra tkun żero. Għall-popolazzjonijiet li qegħdin jikbru din tkun posittiva u għall-popolazzjonijiet li qegħdin jonqsu din tkun negattiva. Huwa ċar li tal-aħħar mhijiex sostenibbli u finalment sejra twassal għal estinzjoni.
                        
                           
                              Limitu ta' detezzjoni
                           : l-inqas konċentrazzjoni li tista' tiġi identifikata iżda mhux ikkwantifikata.
                        
                           
                              Limitu ta' determinazzjoni
                           : l-inqas konċentrazzjoni li tista' titkejjel b'mod kwantitattiv.
                        
                           
                              Konċentrazzjoni bl-Inqas Effett Osservat (LOEC)
                           : l-inqas konċentrazzjoni ttestjata li fiha s-sustanza hija osservata li jkollha effett statistikalment sinifikanti fuq ir-riproduzzjoni u l-mortalità tal-ġenituri (b'p < 0.05) meta mqabbla mall-kontroll, fi ħdan perjodu ta' esponiment stipulat. Madankollu, il-konċentrazzjonijiet tat-test kollha li jkunu ogħla mil-LOEC għandu jkollhom effett dannuż daqs jew ikbar minn dawk osservati fl-LOEC. Meta dawn iż-żewġ kundizzjonijiet ma jkunux jistgħu jiġu ssodisfati, għandha tingħata spjegazzjoni sħiħa dwar kif intgħażlet l-LOEC (u għalhekk l-NOEC).
                        
                           
                              Mortalità
                           : annimal huwa rreġistrat bħala mejjet meta jkun immobbli, jiġifieri meta ma jkunx aktar kapaci jgħum, jew jekk ma jkun osservat ebda moviment tal-appendiċi jew tal-postaddome, fi żmien 15-il sekonda minn theżżiża bil-galbu tal-kontenitur tat-test. (Jekk tintuża definizzjoni oħra, din għandha tkun irrapportata flimkien mar-referenza tagħha).
                        
                           
                              Konċentrazzjoni Bla Effett Osservat (NOEC)
                           : il-konċentrazzjoni tat-test eżatt inqas mil-LOEC, li meta titqabbel mal-kontroll, ma jkollha l-ebda effett statistikament sinifikanti (p < 0.05), fi ħdan perjodu ta' esponiment stipulat.
                        
                           
                              Nisel
                           : id-Daphnia żgħar prodotti mill-annimali ġenituri waqt it-test.
                        
                           
                              Annimali Ġenituri
                           : dawk id-Daphnia femminili li jkunu preżenti fil-bidu tat-test u li l-eżitu riproduttiv tagħhom ikun l-oġġett ta' studju.
                        
                           
                              Eżitu riproduttiv
                           : in-numru ta' nisel ħaj prodott mill-annimali ġenituri fi ħdan il-perjodu ta' ttestjar
                        
                           
                              Sustanza kimika tat-test
                           : Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta' dan il-metodu ta' ttestjar.
                        Tagħrif
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Wilson, E.O. and Bossert, W.H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Poole, R.W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. Mc Graw Hill Series in Population Biology, New York, p 532.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Meyer, J. S., Ingersoll, C. G., McDonald, L.L. and Boyce, M.S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, 1156-1166.
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 2
                        
                           PREPARAZZJONI TAL-MEDIA ELENDT M7 U M4 DEFINITI KOMPLETAMENT
                        
                        
                           Akklimazzjoni għall-media Elendt M7 u M4
                        
                        Xi laboratorji sabu xi diffikultajiet meta trasferixxew direttament id-Daphnia għal media M4 (1) u M7. Madankollu, kien hemm xi suċċess b'akklimazzjoni gradwali, jiġifieri biċ-ċaqliq mill-medium proprju għal 30 % Elendt, u wara għal 60 % Elendt u mbagħad għal 100 % Elendt. Il-perjodi ta' akklimatizzazzjoni jistgħu jdumu sa xahar.
                        
                           Preparamenti
                        
                        
                           Mikroelementi
                        
                        L-ewwel jitħejjew soluzzjonijiet ewlenin separati (I) ta' mikroelementi individwali fl-ilma ta' purità xierqa, eż. dejonizzat, distillat jew b'ożmożi riversa. Minn dawn is-soluzzjonijiet ewlenin differenti (I) titħejja t-tieni soluzzjoni ewlenija waħedha (II), li jkun fiha l-mikroelementi kollha (soluzzjoni kombinata), jiġifieri:
                        
                                    Soluzzjoni(jiet) ewlenija/ ewlenin I
                                    (sustanza waħedha)
                                 
                                 
                                    Ammont miżjud mal-ilma
                                 
                                 
                                    Konċentrazzjoni (relatata mal-medium M4)
                                 
                                 
                                    Sabiex titħejja soluzzjoni ewlenija kombinata II, żid l-ammont li ġej ta' soluzzjoni ewlenija I mal-ilma
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    mg/l
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    ml/l
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    M 4
                                 
                                 
                                    M 7
                                 
                              
                                    H3BO3
                                    
                                 
                                 
                                    57 190 
                                 
                                 
                                    20 000  darba
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    MnCl2· 4 H2O
                                 
                                 
                                    7 210 
                                 
                                 
                                    20 000  darba
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    LiCl
                                 
                                 
                                    6 120 
                                 
                                 
                                    20 000  darba
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    RbCl
                                 
                                 
                                    1 420 
                                 
                                 
                                    20 000  darba
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    SrCl2 · 6 H2O
                                 
                                 
                                    3 040 
                                 
                                 
                                    20 000  darba
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    NaBr
                                 
                                 
                                    320
                                 
                                 
                                    20 000  darba
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    Mo Na2O4 · 2 H2O
                                 
                                 
                                    1 260 
                                 
                                 
                                    20 000  darba
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    CuCl2 · 2 H2O
                                 
                                 
                                    335
                                 
                                 
                                    20 000  darba
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    ZnCl2
                                    
                                 
                                 
                                    260
                                 
                                 
                                    20 000  darba
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    CoCl2 · 6 H2O
                                 
                                 
                                    200
                                 
                                 
                                    20 000  darba
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    KI
                                 
                                 
                                    65
                                 
                                 
                                    20 000  darba
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    Na2SeO3
                                    
                                 
                                 
                                    43,8
                                 
                                 
                                    20 000  darba
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    NH4VO3
                                    
                                 
                                 
                                    11,5
                                 
                                 
                                    20 000  darba
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    Na2EDTA · 2 H2O
                                 
                                 
                                    5 000 
                                 
                                 
                                    2 000  darba
                                 
                                 
                                    —
                                 
                                 
                                    —
                                 
                              
                                    FeSO4 · 7 H2O
                                 
                                 
                                    1 991 
                                 
                                 
                                    2 000  darba
                                 
                                 
                                    —
                                 
                                 
                                    —
                                 
                              
                                    Iż-żewġ soluzzjonijiet Na2EDTA u FeSO4 jitħejjew waħedhom, jitferrgħu flimkien u jiġu awtoklavati minnufih. Dan jagħti:
                                 
                              
                                    Soluzzjoni Fe-EDTA
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    1 000  darba
                                 
                                 
                                    20,0
                                 
                                 
                                    5,0
                                 
                              
                           Media M4 u M7
                        
                        Il-media M4 u M7 jiġu ppreparati bl-użu tas-soluzzjoni ewlenija II, il-makronutrijenti u l-vitamini kif ġej:
                        
                                     
                                 
                                 
                                    Ammont miżjud mal-ilma
                                 
                                 
                                    Konċentrazzjoni (relatata mal-medium M4)
                                 
                                 
                                    Ammont ta' soluzzjoni ewlenija miżjuda sabiex jiġi ppreparat il-medium
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    mg/l
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    ml/l
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    M 4
                                 
                                 
                                    M 7
                                 
                              
                                    Soluzzjoni ewlenija II
                                    (mikroelementi kombinati)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    20 darba
                                 
                                 
                                    50
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    Soluzzjonijiet ewlenija makronutrijenti (sustanza waħedha)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    CaCl2 · 2 H2O
                                 
                                 
                                    293 800 
                                 
                                 
                                    1 000  darba
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    MgSO4 · 7 H2O
                                 
                                 
                                    246 600 
                                 
                                 
                                    2 000  darba
                                 
                                 
                                    0,5
                                 
                                 
                                    0,5
                                 
                              
                                    KCl
                                 
                                 
                                    58 000 
                                 
                                 
                                    10 000  darba
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    NaHCO3
                                    
                                 
                                 
                                    64 800 
                                 
                                 
                                    1 000  darba
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    Na2SiO3 · 9 H2O
                                 
                                 
                                    50 000 
                                 
                                 
                                    5 000  darba
                                 
                                 
                                    0,2
                                 
                                 
                                    0,2
                                 
                              
                                    NaNO3
                                    
                                 
                                 
                                    2 740 
                                 
                                 
                                    10 000  darba
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    KH2PO4
                                    
                                 
                                 
                                    1 430 
                                 
                                 
                                    10 000  darba
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    K2HPO4
                                    
                                 
                                 
                                    1 840 
                                 
                                 
                                    10 000  darba
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    Stokk tal-Vitamini Kombinati
                                 
                                 
                                    —
                                 
                                 
                                    10 000  darba
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    Is-soluzzjoni ewlenija tal-vitamini kombinati titħejja billi jiżdiedu t-3 vitamini ma' litru ilma, kif muri hawn taħt:
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    mg/l
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Kloridrat tat-tjamina
                                 
                                 
                                    750
                                 
                                 
                                    10 000  darba
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Ċjanokobalamin (B12)
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    10 000  darba
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Bijotina
                                 
                                 
                                    7,5
                                 
                                 
                                    10 000  darba
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              L-istokk tal-vitamini kombinati jinħażen f'alikwoti żgħar. Il-vitamini jiżdiedu fil-media ftit qabel l-użu.
                        
                                    
                                       N.B:
                                    
                                 
                                 
                                    Sabiex tiġi evitata l-preċipitazzjoni tal-imluħ meta jitħejjew il-media sħaħ, żid l-alikwoti tas-soluzzjonijiet ewlenin ta' madwar 500 — 800 ml ilma dejonizzat u mbagħad imla sa litru.
                                 
                              
                                    
                                       N.N.B
                                    
                                 
                                 
                                    L-ewwel pubblikazzjoni tal-medium M4 tista' tinstab f'Elendt, B.P. Selenium deficiency in crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 3
                        
                           ANALIŻI TA' KARBONJU ORGANIKU TOTALI (TOC) U L-PRODUZZJONI TA' NOMOGRAFF GĦALL-KONTENUT TA' TOC TAL-GĦALF TAL-ALGA
                        
                        Huwa rikonoxxut li l-kontenut ta' karbonju tal-għalf tal-alga normalment ma jitkejjilx direttament iżda minn korrelazzjonijiet (jiġifieri nomografi) b'miżuri sostituti bħall-għadd taċ-ċelloli tal-alga jew l-assorbiment tad-dawl).
                        It-TOC għandu jitkejjel b'ossidazzjoni tat-temperatura għolja minflok b'metodi tal-UV jew tal-persulfat. (Għal pariri, ara: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).
                        Għall-produzzjoni ta' nomograff, l-algi għandhom ikunu sseparati mill-medium tat-tkabbir b'ċentrifugrazzjoni segwita mir-risospensjoni f'ilma distillat. Kejjel il-parametru sostitut u l-konċentrazzjoni TOC f'kull kampjun fi triplikat. Inbjanki ta' ilma distillat għandhom ikunu analizzati u l-konċentrazzjoni ta' TOC trid titnaqqas minn dik tat-TOC tal-kampjun tal-algi.
                        In-nomografi għandhom ikunu lineari tul il-medda meħtieġa ta' konċentrazzjonijiet ta' karbonju. Hawn taħt jingħataw eżempji.
                        
                                    
                                       N.B
                                    
                                 
                                 
                                    dawn ma għandhomx jintużaw għal konverżjonijiet; huwa essenzali li l-laboratorji jippreparaw in-nomografi tagħhom.
                                 
                              
                           Chlorella vulgaris var. viridis (CCAP 211/12).
                        Rigressjoni ta' mg/1 piż niedi fuq mg C/1. Dejta mis-sospensjonijiet ikkonċentrati ta' ċelloli kkulturati tal-lott semikontinwi, risospiżi f'ilma distillat.
                        assi x: mg C/1 ta' għalf tal-alga kkonċentrat
                        assi y: mg/1 piż xott ta' għalf tal-alga kkonċentrat
                        Koeffiċjent ta' korrezzjoni – 0,980
                        
                           Chlorella vulgaris var. viridis (CCAP 211/12).
                        Rigressjoni tan-numru ta' ċelloli fuq mg C/1. Dejta mis-sospensjonijiet ikkonċentrati ta' ċelloli kkulturati tal-lott semikontinwi, risospiżi f'ilma distillat.
                        assi x: mg C/1 ta' għalf tal-alga kkonċentrat
                        assi y: Nru ċelloli/1 tal-għalf tal-alga kkonċentrat
                        Koeffiċjent ta' korrezzjoni – 0,926
                        
                           Chlorella vulgaris var. viridis (CCAP 211/12).
                        Rigressjoni tal-assorbiment fuq mg C/1 (tul tal-passaġġ ta' 1 cm). Dejta mis-sospensjonijiet ikkonċentrati ta' ċelloli kkulturati tal-lott semikontinwi, risospiżi f'ilma distillat.
                        assi x: mg C/1 ta' għalf tal-alga kkonċentrat
                        assi y: Assorbiment f'440 nm ta' dilwizzjoni ta' 1/10 tal-għalf tal-alga kkonċentrat
                        Koeffiċjent ta' korrezzjoni – 0,998
                     
                     
                        Appendiċi 4
                        
                           SKEDA TA' DEJTA TA' EŻEMPJU GĦAR-REĠISTRAZZJONI TAT-TIĠDID TAL-MEDIUM, ID-DEJTA FIŻIKA/KIMIKA TA' MONITORAĠĠ, IT-TAGĦLIF, IR-RIPRODUZZJONI TAD-DAPHNIA U L-MORTALITÀ TAL-ĠENITURI
                        
                        
                                    Esperiment Nru:
                                 
                                 
                                    Data tal-bidu:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Klonu:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Medium:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Tip ta' ikel:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Sustanza Kimika tat-Test:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Konċ nominali:
                                 
                              
                                    Jum
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    1
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    3
                                 
                                 
                                    4
                                 
                                 
                                    5
                                 
                                 
                                    6
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                    8
                                 
                                 
                                    9
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    12
                                 
                                 
                                    13
                                 
                                 
                                    14
                                 
                                 
                                    15
                                 
                                 
                                    16
                                 
                                 
                                    17
                                 
                                 
                                    18
                                 
                                 
                                    19
                                 
                                 
                                    20
                                 
                                 
                                    21
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Tiġdid tal-medium (immarka)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    pH (*6)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    ġdid
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    qadim
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    O2 (mg/l) (*6)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    ġdid
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    qadim
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Temp (°C) (*6)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    ġdid
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    qadim
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Ikel ipprovdut (immarka)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Nru ta' nisel ħaj (*7)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Total
                                 
                              
                                    Reċipjent 1
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    9
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    10
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Total
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Mortalità kumulattiva tal-ġenituri (*8)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 5
                        
                           SKEDA TA' DEJTA TA' EŻEMPJU GĦAR-REĠISTRAZZJONI TA' RIŻULTATI TAL-ANALIŻI KIMIKA
                        
                        (a)   Il-konċentrazzjonijiet imkejlin
                        
                        
                                    Konċ. nominali
                                 
                                 
                                    Kampjun tal-ġimgħa 1
                                 
                                 
                                    Kampjun tal-ġimgħa 2
                                 
                                 
                                    Kampjun tal-ġimgħa 3
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Frisk
                                 
                                 
                                    Qadim
                                 
                                 
                                    Frisk
                                 
                                 
                                    Qadim
                                 
                                 
                                    Frisk
                                 
                                 
                                    Qadim
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              (b)   Il-konċentrazzjonijiet imkejlina bħala perċentwali tan-nominali
                        
                        
                                    Konċ. nominali
                                 
                                 
                                    Kampjun tal-ġimgħa 1
                                 
                                 
                                    Kampjun tal-ġimgħa 2
                                 
                                 
                                    Kampjun tal-ġimgħa 3
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Frisk
                                 
                                 
                                    Qadim
                                 
                                 
                                    Frisk
                                 
                                 
                                    Qadim
                                 
                                 
                                    Frisk
                                 
                                 
                                    Qadim
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 6
                        
                           KALKOLU TAL-MEDJA PONDERATA GĦALL-ĦIN
                        
                        
                           Il-medja kkalkolata għall-ħin
                        
                        Meta wieħed iqis li l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test tul il-perjodu bejn it-tiġdidiet tal-medium, hemm bżonn li jiġi kkunsidrat liema konċentrazzjoni għandha tingħażel sabiex tirrappreżenta l-medda ta' konċentrazzjonijiet esperjenzati mid-Daphnia ġenituri. L-għażla għandha tkun ibbażata fuq kunsiderazzjonijiet bioloġiċi kif ukoll statistiċi. Pereżempju, jekk huwa maħsub li r-riproduzzjoni hija l-aktar milquta mill-konċentrażżjoni massima esperjenzata, allura għandha tintuża l-ogħla konċentrazzjoni. Madankollu, jekk l-effett akkumulat jew l-effett aktar fit-tul tas-sustanza kimika tossika huwa kkunsidrat bħala aktar importanti, allura l-konċentrazzjoni medja hija aktar rilevanti. F'dan il-każ, ikun xieraq li tintuża medja tal-konċentrazzjoni ponderata għall-ħin, peress li din tqis il-varjazzjoni fil-konċentrazzjoni istantanja fuq medda ta' żmien.
                        
                           Figura 1
                        
                        
                           Eżemoju tal-medja ponderata għall-ħin
                        
                        Il-Figura 1 turi eżempju ta' test (simplifikat) li jdum sebat ijiem b'tiġdid tal-medium fil-Jiem 0, 2 u 4.
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Il-linja żigużajg irqiqa tirrappreżenta l-konċentrazzjoni fi kwalunkwe waqt. It-tnaqqis fil-konċentrazzjoni huwa supponut li jsegwi proċess ta' degradazzjoni esponenzjali.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Is-6 punti pplottjati jirrappreżentaw il-konċentrazzjonijiet osservati mkejlin fil-bidu u fi tmiem kull perjodu ta' tiġdid.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Il-linja solida u ħoxna tindika l-pożizzjoni tal-medja ponderata għall-ħin.
                                 
                              Il-medja ponderata għall-ħin hija kkalkolata b'tali mod li l-erja taħt il-medja ponderata għall-ħin tkun daqs l-erja taħt il-kurva ta' konċentrazzjoni. Il-kalkolu għall-eżempju ta' hawn fuq jintwera fit-Tabella 1.
                        
                           Tabella 1
                        
                        
                           Kalkolu tal-Medja ponderata għall-ħin
                        
                        
                                    Tiġdid Nru
                                 
                                 
                                    Jiem
                                 
                                 
                                    Konċ 0
                                 
                                 
                                    Konċ 1
                                 
                                 
                                    Ln(Konċ 0)
                                 
                                 
                                    Ln(Konċ 1)
                                 
                                 
                                    Erja
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    10,000
                                 
                                 
                                    4,493
                                 
                                 
                                    2,303
                                 
                                 
                                    1,503
                                 
                                 
                                    13,767
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    11,000
                                 
                                 
                                    6,037
                                 
                                 
                                    2,398
                                 
                                 
                                    1,798
                                 
                                 
                                    16,544
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    3
                                 
                                 
                                    10,000
                                 
                                 
                                    4,066
                                 
                                 
                                    2,303
                                 
                                 
                                    1,403
                                 
                                 
                                    19,781
                                 
                              
                                    Jiem Totali:
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Erja Totali:
                                 
                                 
                                    50,092
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Medja tat-TW:
                                 
                                 
                                    7,156
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Jiem huwa n-numru ta' jiem fil-perjodu ta' tiġdid
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Konċ 0 hija l-konċentrazzjoni mkejla fil-bidu ta' kull perjodu ta' tiġdid
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Konċ 1 hija l-konċentrazzjoni mkejla fi tmiem kull perjodu ta' tiġdid
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Ln(Konċ 0) hija l-logaritma naturali tal-Konċ 0
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Ln(Konċ 1) hija l-logaritma naturali tal-Konċ 1
                                 
                              L-erja hija l-erja taħt il-kurva esponenzjali għal kull perjodu ta' tiġdid. Il-vijabbiltà hija kkalkolata bi:
                        
                           
                        Il-medja ponderata għall-ħin (Medja tat-TW) hija l-Erja Totali diviża bil-Jiem Totali.
                        Naturalment, għat-test tar-riproduzzjoni tad-Daphnia, it-tabella għandha tiġi estiża sabiex tkopri 21 jum.
                        Huwa ċar li meta jsiru osservazzjonijiet biss fil-bidu u fit-tmiem ta' kull perjodu ta' tiġdid, mhuwiex possibbli li jiġi kkonfermat li l-proċess ta' tħassir huwa, fil-fatt, esponenzali. Kurva differenti tirriżulta f'kalkolu differenti għall-Erja. Madankollu, il-proċess ta' degradazzjoni esponenzali huwa plawżibbli u aktarx li huwa l-aħjar kurva li tista' tintuża fin-nuqqas ta' aktar informazzjoni.
                        Madankollu, hemm bżonn li jsir xogħol bil-galbu jekk l-analiżi kimika tonqos milli ssib xi sustanza kimika fi tmiem il-perjodu ta' tiġdid. Kemm-il darba ma jkunx possibbli li ssir valutazzjoni ta' kemm is-sustanza kimika tisparixxi malajr mis-soluzzjoni, inkun impossibbli li tinkiseb erja realistika taħt il-kurva u għalhekk ikun impossibbli li tinkiseb medja raġonevoli ponderata għall-ħin.
                     
                     
                        Appendiċi 7
                        
                           GWIDA GĦALL-IDENTIFIKAZZJONI TAS-SESS NEONAT
                        
                        Il-produzzjoni ta' rġiel neonati tista' sseħħ f'kundizzjonijiet ambjentali li jinbidlu, bħal fotoperjodu li jiqsar, temperatura, konċentrazzjoni inqas ta' ikel, u densità tal-popolazzjoni li tiżdied (Hobaek and Larson, 1990; Kleiven et al., 1992). Il-produzzjoni ta' rġiel hija rispons magħruf għal ċerti regolaturi tat-tkabbir ta' insetti (Oda et al., 2005). F'kundizzjonijiet li fihom stressaturi kimiċi jkunu qegħdin jinduċu tnaqqis fin-nisel riproduttiv min-nisa partenoġeniċi, ikun mistenni numru ikbar ta' rġiel (OECD, 2008). Fuq il-bażi tal-informazzjoni disponibbli, mhuwiex possibbli li jitbassar liema mill-proporzjon tas-sess jew mill-punt ta' tmiem tar-riproduzzjoni sejjer ikun iktar sensittiv; madankollu, hemm indikazzjonijiet (referenza “rapport ta' validazzjoni”, parti 1) li din iż-żieda fin-numru ta' rġiel tista' tkun inqas sensittiva miż-żieda fin-nisel. Peress li l-iskop primarju tal-metodu ta' ttestjar huwa li jivvaluta n-numru ta' nisel prodott, il-feġġa ta' rġiel hija osservazzjoni fakultattiva. Jekk dan il-punt ta' tmiem fakultattiv jiġi evalwat fi studju, għandu jintuża kriterju ta' validità addizzjonali tat-test ta' mhux iktar minn 5 % irġiel fil-kontrolli.
                        L-iktar mod prattiku u faċli kif jiġu differenzjati s-sessi tad-Daphnia huwa li jintużaw il-karatteristiċi fenotipiċi tagħhom, peress li l-irġiel u n-nisa huma ġenetikament l-istess u s-sess tagħhom jiġi stabbilit mill-ambjent. L-irġiel u n-nisa huma differenti fit-tul u fil-morfoloġija tal-ewwel antenni, li huma itwal fl-irġiel milli fin-nisa (Fig. 1). Din id-differenza tingħaraf mill-ewwel wara t-twelid, għad li jiżviluppaw karatteristiċi sesswali sekondarji oħrajn huma u jikbru (eż. ara l-Fig. 2 f'Olmstead and LeBlanc, 2000).
                        Sabiex jiġi osservat is-sess morfoloġiku, neonati prodotti minn kull annimal tat-test għandhom jiġu ttrasferiti b'pipetta u jitqiegħdu f'dixx petri bil-medium tat-test. Il-medium jinżamm għal minimu sabiex jiġi ristrett il-moviment tal-annimali. L-osservazzjoni tal-ewwel antenni tista' ssir taħt sterjomikroskopju (× 10-60).
                        
                           Fig. 1
                        
                        
                           
                              D. magna raġel (xellug) u mara (lemin) f'età ta' 24 siegħa. L-irġiel jistgħu jingħarfu minħabba t-tul u l-morfoloġija tal-ewwel antenni tagħhom meta mqabblin man-nisa, kif muri fiċ-ċrieki (Tatarazako et al., 2004).
                        
                        REFERENZI
                        Hobaek A and Larson P. 1990. Sex determination in Daphnia magna. Ecology 71: 2255-2268.
                        Kleiven O.T., Larsson P., Hobaek A. 1992. Sexual reproduction in Daphnia magna requires three stimuli. Oikos 65, 197-206.
                        Oda S., Tatarazako N, Watanabe H., Morita M., and Iguchi T. 2005. Production of male neonates in Daphnia magna (Cladocera, Crustacea) exposed to juvenile hormones and their analogs. Chemosphere 61:1168-1174.
                        OECD, 2008. Validation report for an enhancement of OECD TG 211 Daphnia magna reproduction test. OECD Series on Testing and Assessment, Number 88. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.
                        Olmstead, A.W., LeBlanc, G.A., 2000. Effects of endocrine-active chemicals on the development characteristics of Daphnia magna. Environmental Toxicology and Chemistry 19:2107-2113.
                        Tatarazako, N., Oda, S., Abe, R., Morita M. and Iguchi T., 2004. Development of a screening method for endocrine disruptors in crustaceans using Daphnia magna (Cladocera, Crustacea). Environmental Science 17, 439-449.
                     ”
               
                     (18)
                  
                  
                     Fil-Parti C, il-Kapitolu C.29, il-paragrafu 66 huwa sostitwit b'dan li ġej:
                     
                                 “66.
                              
                              
                                 Test jitqies validu jekk:
                                 
                                             a)
                                          
                                          
                                             il-perċentwali medju ta' degradazzjoni fir-reċipjenti FC li jkun fihom is-sustanza kimika ta' referenza jkun > 60 % sal-14-il jum ta' inkubazzjoni; u
                                          
                                       
                                             b)
                                          
                                          
                                             l-ammont medju ta' TIC li jkun hemm fil-kontrolli inbjank FB fi tmiem it-test ikun < 3mg C/l.
                                          
                                       Jekk dawn il-limiti ma jkunux issodisfati, it-test għandu jiġi ripetut b'inokulu minn sors ieħor u/jew għandhom jerġgħu jiġu eżaminati l-proċeduri użati. Pereżempju, jekk il-produzzjoni għolja ta' inbjank IC tkun problema, għandha tkun segwita l-proċedura mogħtija fil-paragrafi 27 sa 32.”
                              
                           
               
                     (19)
                  
                  
                     Fil-Parti Ċ, jiżdiedu l-Kapitoli li ġejjin:
                     “C.47   Test tat-Tossiċità fi Stadju Bikri tal-Ħajja tal-Ħut
                     
                     INTRODUZZJONI
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 210 tal-OECD (2013). It-testijiet fl-istadji bikrija tal-ħajja tal-ħut huma maħsuba biex jiddefinixxu l-effetti letali u subletali tas-sustanzi kimiċi fuq l-istadji u l-ispeċijiet ittestjati. Huma jrendu informazzjoni ta' valur għall-istima tal-effetti letali u subletali kroniċi tas-sustanza kimika fuq speċijiet ta' ħut oħrajn.
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Il-linja gwida tat-test 210 hija bbażata fuq proposta mir-Renju Unit li ġiet diskussa f'laqgħa ta' esperti tal-OECD li saret f'Medmenham (ir-Renju Unit) f'Novembru 1988 u li kompliet tiġi aġġornata fl-2013 sabiex tkun tirrifletti l-esperjenza fl-użu tat-test u r-rakkomandazzjonijiet minn sessjoni ta' ħidma tal-OECD dwar l-ittestjar tat-tossiċità tal-ħut, li ġiet organizzata f'Settembru 2010 (1).
                              
                           IL-PRINĊIPJU TAT-TEST
                     
                              
                                 3.
                              
                              
                                 L-istadji bikrija tal-ħajja tal-ħut huma esposti għal firxa ta' konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test maħlula fl-ilma. Huma ppreferuti kundizzjonijiet bi fluss kontinwu; madankollu, jekk dawn ma jkunux possibbli, huma aċċettabbli wkoll kundizzjonijiet semistatiċi. Għad-dettalji, għandu jiġi kkonsultat id-dokument ta' gwida tal-OECD dwar l-ittestjar tat-tossiċità akwatika ta' sustanzi u taħlitiet diffiċli (2). It-test jinbeda billi l-bajd fertilizzat jitqiegħed f'kompartimenti tat-test u jitkompla għal perjodu ta' żmien speċifiku għall-ispeċi li huwa neċessarju sabiex il-ħut taħt kontroll jilħaq stadju bikri tal-ħajja. L-effetti letali u subletali jiġu vvalutati u mqabbla mal-valuri tal-kontroll sabiex tiġi ddeterminata l-konċentrazzjoni bl-inqas effett osservat (LOEC) jew (i) il-konċentrazzjoni bla effett osservat (NOEC) u/jew (ii) l-ECx (eż. EC10, EC20) permezz ta' mudell ta' rigressjoni sabiex tiġi stmata l-konċentrazzjoni li tikkawża bidla ta' x % fl-effett imkejjel. Ir-rappurtar tal-konċentrazzjonijiet tal-effett u l-parametri rilevanti jista' jiddependi fuq il-qafas regolatorju. Il-konċentrazzjonijiet tat-test għandhom jibbrakitjaw l-ECx biex b'hekk l-ECx toħroġ mill-interpolazzjoni aktar milli mill-estrapolazzjoni (ara l-Appendiċi 1 għad-definizzjonijiet).
                              
                           INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA KIMIKA TAT-TEST
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Is-sustanza kimika tat-test tirreferi għal dak li qed jiġi ttestjat. Għandhom ikunu magħrufa s-solubbiltà fl-ilma (ara l-kapitolu A.6 ta' dan l-Anness) u l-pressjoni tal-fwar (ara l-kapitolu A.4 ta' dan l-Anness) tas-sustanza kimika tat-test u għandu jkun disponibbli metodu analitiku affidabbli għall-kwantifikazzjoni tas-sustanza kimika fis-soluzzjonijiet tat-test bi preċiżjoni u limitu ta' kwantifikazzjoni magħrufa u rrappurtati. Għalkemm mhuwiex neċessarju li jsir it-test, ir-riżultati minn test tat-tossiċità akuta (ara l-kapitoli C.1 jew C.49 ta' dan l-Anness), preferibbilment imwettaq bl-ispeċijiet magħżula għal dan it-test, jistgħu jipprovdu informazzjoni siewja.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Jekk il-metodu ta' ttestjar jintuża għall-ittestjar ta' taħlita, il-kompożizzjoni tagħha għandha tiġi kkaratterizzata kemm jista' jkun possibbli, pereżempju, mill-identità kimika tal-kostitwenti tagħha, l-okkorrenza kwantitattiva tagħhom u l-proprjetajiet speċifiċi għas-sustanzi tagħhom (bħal dawk imsemmija fuq). Qabel jintuża l-metodu ta' ttestjar għall-ittestjar regolatorju ta' taħlita, għandu jiġi kkunsidrat jekk dan huwiex ser jipprovdi riżultati aċċettabbli għall-iskop regolatorju maħsub.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 L-informazzjoni siewja tinkludi l-formula strutturali, il-purità tas-sustanza, is-solubbiltà fl-ilma, l-istabilità fl-ilma u fid-dawl, il-pKa, il-Pow u r-riżultati ta' test għall-bijodegradabilità immedjata (pereżempju, il-kapitoli C.4 jew C.29 ta' dan l-Anness).
                              
                           IL-VALIDITÀ TAT-TEST
                     
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Sabiex test ikun validu japplikaw il-kundizzjonijiet li ġejjin:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-konċentrazzjoni tal-ossiġenu dissolt għandha tkun > 60 % tal-valur tas-saturazzjoni tal-arja matul it-test;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             it-temperatura tal-ilma ma għandhiex tvarja b'aktar minn ± 1,5 °C bejn il-kompartimenti tat-test jew bejn il-jiem suċċessivi fi kwalunkwe ħin matul it-test u għandha tinżamm fi ħdan il-meded tat-temperaturi speċifikati għall-ispeċi tat-test (Appendiċi 2);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Il-kejl analitiku tal-konċentrazzjonijiet tat-test huwa obbligatorju.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             is-sopravivenza ġenerali tal-bajd fertilizzat u s-suċċess fil-kontrolli wara t-tifqis u, fejn rilevanti, fil-kontrolli tas-solventi, għandhom ikunu akbar minn jew daqs il-limiti definiti fl-Appendiċi 2.
                                          
                                       
                           
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Jekk tiġi osservata devjazzjoni żgħira mill-kriterji tal-validità, għandhom jiġu kkunsidrati l-konsegwenzi b'rabta mal-affidabbiltà tad-dejta tat-test u dawn il-kunsiderazzjonijiet għandhom jiġu inklużi fir-rapport. L-effetti fuq is-sopravivenza, it-tifqis jew it-tkabbir li jseħħu fil-kontroll tas-solvent, meta mqabbel mal-kontroll negattiv, għandhom jiġu rrapportati u diskussi fil-kuntest tal-affidabbiltà tad-dejta tat-test.
                              
                           DESKRIZZJONI TAL-METODU
                     
                        Kompartimenti tat-test
                     
                     
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Jistgħu jintużaw reċipjenti tal-ħġieġ, tal-azzar inossidabbli jew ta' kwalunkwe materjal kimikament inerti ieħor. Billi s-silikon huwa magħruf bħala li għandu kapaċità qawwija li jassorbi sustanzi lipofiliċi, l-użu ta' tubi tas-silikon fi studji bi fluss kontinwu u l-użu ta' siġilli tas-silikon f'kuntatt mal-ilma għandhom jitnaqqsu bl-użu ta', pereżempju, akkwarji ta' ħġieġ magħmul minn blokka waħda. Id-dimensjonijiet tar-reċipjenti għandhom ikunu kbar biżżejjed sabiex jippermettu tkabbir xieraq fil-kontroll, iż-żamma tal-konċentrazzjoni ta' ossiġenu dissolt (pereżempju, għall-ispeċijiet ta' ħut żgħir, din tista' tinkiseb b'tank b'volum ta' 7 litri) u l-konformità mal-kriterji tar-rata tat-tagħbija msemmija fil-paragrafu 19. Idealment, il-kompartimenti tat-test jitqiegħdu f'pożizzjoni għal għarrieda fiż-żona tat-test. Disinn bi blokki aleatorji b'kull trattament preżenti f'kull blokka huwa ppreferut minn disinn kompletament aleatorju. Il-kompartimenti tat-test għandhom ikunu protetti minn disturbanza mhux mixtieqa. Preferibbilment, is-sistema tat-test għandha tiġi kkondizzjonata bil-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test għal tul ta' żmien suffiċjenti sabiex ikunu jistgħu jintwerew konċentrazzjonijiet ta' esponiment stabbli qabel l-introduzzjoni tal-organiżmi tat-test.
                              
                           
                        Għażla ta' speċijiet
                     
                     
                              
                                 10.
                              
                              
                                 L-ispeċijiet ta' ħut irrakkomandati huma mogħtija fit-Tabella 1. Dan ma jeskludix l-użu ta' speċijiet oħrajn, iżda jista' jkun li l-proċedura tat-test ikollha tiġi adatta sabiex tipprovdi kundizzjonijiet tat-test addattati. F'dan il-każ, ir-raġuni li tiġġustifika l-għażla tal-ispeċi u l-metodu sperimentali għandhom ikunu magħrufa.
                              
                           
                        Iż-żamma tal-ħut riproduttiv
                     
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Id-dettalji dwar iż-żamma tal-istokk riproduttiv taħt kundizzjonijiet sodisfaċenti jistgħu jinstabu fl-Appendiċi 3 u fir-referenzi ċċitati (3)(4)(5).
                              
                           
                        It-trattament tal-bajd iffertilizzat, tal-embrijuni u tal-larvi
                     
                     
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Fil-bidu, il-bajd iffertilizzat, l-embrijuni u l-larvi jistgħu jiġu esposti f'reċipjenti iżgħar tal-ħġieġ jew tal-azzar inossidabbli fi ħdan ir-reċipjent ewlieni, mgħammrin bi xbieki fil-ġenb jew fit-truf biex ikun hemm fluss tas-soluzzjoni tat-test mir-reċipjent. Fluss kontinwu mhux turbolenti f'dawn ir-reċipjenti żgħar jista' jiġi indott billi jiġu sospiżi minn fergħa mqiegħda biex ir-reċipjent jiċċaqlaq 'il fuq u 'l isfel, iżda l-organiżmi għandhom dejjem jinżammu mgħaddsin. Il-bajd iffertilizzat ta' ħut salmonidu jista' jiġi sistemat fuq xkafef jew xbieki b'fetħiet kbar biżżejjed li jippermettu lil-larvi jgħaddu minnhom wara li jfaqqsu.
                              
                           
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Meta jkunu intużaw kontenituri tal-bajd, grilji jew xbieki biex il-bajd jinżamm fir-reċipjent ewlieni tat-test, dawn ir-restrizzjonijiet għandhom jitneħħew wara li jfaqqsu l-larvi, skont il-gwida pprovduta fl-Appendiċi 3, ħlief li x-xbieki għandhom jinżammu biex jiġi evitat li l-larva taħrab. Jekk ikun hemm bżonn li jiġu ttrasferiti l-larvi, dawn ma għandhomx ikunu esposti għall-arja u ma għandhomx jintużaw xbieki biex il-larvi jinħelsu mill-kontenituri tal-bajd. It-twaqqit ta' dan it-trasferiment ivarja skont l-ispeċijiet u għandu jiġi ddokumentat fir-rapport. Madankollu, mhux dejjem ikun neċessarju li jsir trasferiment.
                              
                           
                        Ilma
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Kwalunkwe ilma li fih l-ispeċi tat-test juru sopravivenza u tkabbir adegwati fit-tul jista' jintuża bħala ilma tat-test (ara l-Appendiċi 4). Għandu jkun ta' kwalità kostanti matul il-perjodu tat-test. Sabiex jiġi żgurat li l-lima tad-dilwizzjoni mhuwiex ser ikollu influwenza żejda fuq ir-riżultat tat-test (pereżempju b'kumplessazzjoni tas-sustanza kimika tat-test) jew jaffettwa b'mod avvers il-prestazzjoni tal-istokk riproduttiv, għandhom jittieħdu kampjuni f'intervalli għal analiżi. Għandu jsir il-kejl tal-metalli tqal (eż. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), l-anjoni u l-katjoni kbar (eż. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, SO4
                                    2–), l-ammonja, il-pestiċidi klorini residwi totali, il-karbonju organiku totali u s-solidi sospiżi, pereżempju, fuq bażi biennali meta l-ilma tad-dilwizzjoni jkun magħruf li huwa relattivament kostanti fil-kwalità. Jekk l-ilma jkun magħruf li huwa ta' kwalità varjabbli, il-kejl għandu jsir aktar ta' spiss; il-frekwenza tiddependi fuq kemm il-kwalità tkun varjabbli. Fl-Appendiċi 4 jissemmew xi karatteristiċi kimiċi ta' ilma tad-dilwizzjoni aċċettabbli.
                              
                           
                        Is-soluzzjonijiet tat-test
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 Għat-testijiet bi fluss kontinwu, hija meħtieġa sistema li tiddistribwixxi u tiddilwixxi b'mod kontinwu soluzzjoni ewlenija tas-sustanza kimika tat-test (pereżempju, pompa tal-kejl, dilwitur proporzjonali, sistema ta' saturazzjoni) sabiex twassal serje ta' konċentrazzjonijiet fil-kompartimenti tat-test. Ir-rati tal-fluss tas-soluzzjonijiet ewlenin u l-ilma tad-dilwizzjoni għandhom jiġu kkontrollati f'ċerti intervalli matul it-test u ma għandhomx ivarjaw b'aktar minn 10 % matul it-test. Instab li rata tal-fluss ekwivalenti għal mill-inqas ħames volumi tal-kompartimenti tat-test kull 24 siegħa hija xierqa (3). Madankollu, jekk ir-rata tat-tagħbija speċifikata fil-paragrafu 19 tiġi rrispettata, rata ta' fluss aktar baxxa ta', pereżempju, 2-3 volumi tal-kompartimenti tat-test tkun possibbli sabiex jiġi evitat li l-ikel jitneħħa malajr.
                              
                           
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Is-soluzzjonijiet tat-test tal-konċentrazzjonijiet magħżula jiġu preparati billi tiġi dilwita soluzzjoni ewlenija. Preferibbilment, is-soluzzjoni ewlenija għandha titħejja sempliċiment billi s-sustanza kimika tat-test titħallat jew tiġi aġitata f'ilma tad-dilwizzjoni bl-użu ta' mezzi mekkaniċi (eż. tħawwid u/jew ultrasonikazzjoni). Jistgħu jintużaw kolonni ta' saturazzjoni (kolonni tas-solubilità) jew metodi ta' dożaġġ passiv (6) sabiex tinkiseb soluzzjoni ewlenija kkonċentrata kif xieraq. L-użu ta' portatur ta' solvent mhuwiex rakkomandat. Madankollu, f'każ li jkun hemm bżonn ta' solvent, fl-istess ħin għandu jsir kontroll tas-solvent, fl-istess konċentrazzjoni tas-solvent bħat-trattamenti kimiċi; i.e. preferibbilment, il-livell tas-solvent għandu jkun ugwali fil-konċentrazzjonijiet kollha, kif ukoll fil-kontroll tas-solvent. Għal xi sistemi ta' dilwituri, dan jista' jkun teknikament diffiċli; hawnhekk, il-konċentrazzjoni tas-solvent fil-kontroll tas-solvent għandha tkun daqs l-ogħla konċentrazzjoni tas-solvent fil-grupp tat-trattament. Għal sustanzi li diffiċli jiġu ttestjati, għandu jiġi kkonsultat id-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru. 23 dwar l-ittestjar tat-tossiċità akwatika ta' sustanzi u taħlitiet diffiċli (2). Jekk jintuża solvent, l-għażla tas-solvent tiġi ddeterminata mill-proprjetajiet kimiċi tas-sustanza. Id-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru. 23 jirrakkomanda konċentrazzjoni massima ta' 100 μl/l. Sabiex jiġi evitat l-effett potenzjali tas-solvent fuq il-punti tat-tmiem imkejla (7), huwa rakkomandat li l-konċentrazzjoni tas-solvent tinżamm kemm jista' jkun baxxa possibbli.
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Għal test semistatiku, jistgħu jiġu segwiti żewġ proċeduri ta' tiġdid differenti. Kwalunkwe waħda mis-soluzzjonijiet ġodda tat-test jitħejjew f'kompartimenti nodfa u l-bajd u l-larvi li jibqgħu ħajjin jiġu ttrasferiti bil-galbu f'kompartimenti ġodda, jew l-organiżmi tat-test jinżammu fil-kompartimenti tat-test, filwaqt li jinbidel proporzjon (mill-inqas żewġ terzi) tas-soluzzjoni tat-test / tal-volum tal-kontroll.
                              
                           PROĊEDURA
                     
                        Kundizzjonijiet tal-Esponiment
                     
                     
                        Durata
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 It-test għandu jibda mill-aktar fis possibbli wara li l-bajd ikun iffertilizza u preferibbilment wara li jkun ġie mgħaddas fis-soluzzjonijiet tat-test qabel jibda t-tifriq tal-blastodisc, jew kemm jista' jkun qrib wara dan l-istadju. Id-durata tat-test ser tiddependi fuq l-ispeċijiet użati. Xi durati rakkomandati huma mogħtija fl-Appendiċi 2.
                              
                           
                        Tagħbija
                     
                     
                              
                                 19.
                              
                              
                                 In-numru ta' bajd fertilizzat fil-bidu tat-test għandu jkun biżżejjed sabiex jiġu ssodisfati r-rekwiżiti tal-istatistika. Huma għandhom jiġu distribwiti b'mod aleatorju fost it-trattamenti u għandhom jintużaw mill-inqas 80 bajda, li jinqasmu b'mod ugwali bejn mill-inqas erba' kompartimenti tat-test irreplikati. Ir-rata tat-tagħbija (il-bijomassa skont il-volum tas-soluzzjoni tat-test) għandha tkun baxxa biżżejjed sabiex tkun tista' tinżamm konċentrazzjoni maħlula ta' ossiġenu ta' mill-inqas 60 % tal-valur ta' saturazzjoni tal-arja mingħajr ossiġenazzjoni matul l-istadju tal-bajda u tal-larva. Għat-testijiet bi fluss kontinwu, ġiet rakkomandata rata ta' tagħbija b'piż imxarrab ta' mhux aktar minn 0.5 g/l kull 24 siegħa u mhux inqas minn 5 g/l ta' soluzzjoni fi kwalunkwe ħin (3).
                              
                           
                        Id-dawl u t-temperatura
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Il-fotoperjodu u t-temperatura tal-ilma għandhom ikunu adattati għall-ispeċi tat-test (ara Appendiċi 2).
                              
                           
                        Tmigħ
                     
                     
                              
                                 21.
                              
                              
                                 L-ikel u t-tmigħ huma kritiċi u huwa essenzjali li jiġi fornut l-ikel korrett għal kull stadju tal-ħajja minn żmien xieraq u f'livell suffiċjenti sabiex jiġi sostnut it-tkabbir normali. It-tmigħ għandu jkun bejn wieħed u ieħor ugwali fost ir-repliki, sakemm ma jiġix aġġustat biex jieħu kont tal-mortalità. Għandhom jitneħħew l-ikel u r-rawt żejda, skont kif ikun hemm bżonn, sabiex tiġi evitata akkumulazzjoni ta' skart. Ir-reġimi tat-tmigħ dettaljati huma mogħtija fl-Appendiċi 3 iżda, bl-esperjenza li qiegħda tinkiseb, ir-reġimi tal-ikel u tat-tmigħ qegħdin jiġu raffinati kontinwament sabiex tittejjeb is-sopravivenza u jiġi ottimizzat it-tkabbir. L-ikel ħaj jipprovdi sors ta' arrikkiment ambjentali u, għalhekk, għandu jintuża minflok jew flimkien mal-ikel imnixxef jew iffriżat, kull meta jkun xieraq għall-ispeċijiet u għall-istadju tal-ħajja.
                              
                           
                        Il-konċentrazzjonijiet tat-test
                     
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Normalment ikunu meħtieġa ħames konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test, b'minimu ta' erba' repliki kull konċentrazzjoni, spazjati b'fattur kostanti ta' mhux aktar minn 3.2. Jekk tkun disponibbli, għandha tiġi kkunsidrata l-informazzjoni dwar l-ittestjar akut, preferibbilment bl-istess speċi u/jew test tas-sejbien tal-medda (1) meta tintgħażel il-medda tal-konċentrazzjonijiet tat-test. Madankollu, għandhom jiġu kkunsidrati s-sorsi ta' informazzjoni kollha meta tintgħażel il-medda tal-konċentrazzjonijiet tat-test, inklużi sorsi bħal, pereżempju, “read-across” dejta dwar l-ittestjar tat-tossiċità akuta tal-embrijuni tal-ħut. Test tal-limitu, jew test tal-limitu estiż, b'inqas minn ħames konċentrazzjonijiet bħala t-test definittiv, jista' jkun aċċettabbli meta jkunu jridu jiġu stabbiliti biss l-NOECs empiriċi. Għandha tingħata ġustifikazzjoni jekk jintużaw inqas minn ħames konċentrazzjonijiet. Konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test ta' aktar minn 96 siegħa LC50 jew 10 mg/l, skont liema tkun l-aktar baxxa, ma hemmx bżonn li jiġu ttestjati.
                              
                           
                        Kontrolli
                     
                     
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Għandu jsir kontroll tal-ilma tad-dilwizzjoni u, jekk ikun meħtieġ, kontroll tas-solvent li jkun fih it-trasportatur tas-solvent biss, minbarra s-serje tal-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test (ara l-paragrafu 16).
                              
                           
                        Il-Frekwenza tal-Kejl u d-Determinazzjonijiet Analitiċi
                     
                     
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Qabel il-bidu tal-perjodu ta' esponiment, għandha tiġi żgurata l-funzjoni xierqa tas-sistema tal-kunsinna tas-sustanza kimika fost ir-repliki kollha (pereżempju, billi jitkejlu l-konċentrazzjonijiet tat-test). Għandhom jiġu stabbiliti l-metodi analitiċi meħtieġa, inkluż limitu xieraq ta' kwantifikazzjoni (LOQ) u għarfien suffiċjenti dwar l-istabilità tas-sustanza fis-sistema tal-ittestjar. Matul it-test, il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test jiġu ddeterminati f'intervalli regolari sabiex jiġi kkaratterizzat l-esponiment. Huwa meħtieġ minimu ta' ħames determinazzjonijiet. Fis-sistemi bi fluss kontinwu, il-kejl analitiku tas-sustanza kimika tat-test f'replikat wieħed għal kull konċentrazzjoni għandu jsir mill-inqas darba fil-ġimgħa u jinbidel sistematikament fost ir-repliki. Id-determinazzjonijiet analitiċi addizzjonali ta' spiss itejbu l-kwalità tal-eżitu tat-test. Jista' jkun meħtieġ li l-kampjuni jiġu ffiltrati sabiex titneħħa kwalunkwe materja partikulata (eż. bl-użu ta' daqs ta' 0.45 μm tal-pori) jew inkella jiġu ċċentrifugati sabiex jiġi żgurat li d-determinazzjonijiet fuq is-sustanza kimika jsiru f'soluzzjoni vera. Sabiex jitnaqqas l-adsorbiment tas-sustanza kimika tat-test, il-filtri għandhom jiġu ssaturati qabel jintużaw. Meta l-konċentrazzjonijiet imkejla ma jibqgħux fil-medda ta' 80-120 % tal-konċentrazzjoni nominali, il-konċentrazzjonijiet tal-effett għandhom jiġu ddeterminati u espressi b'mod relattiv għall-konċentrazzjoni medja aritmetika għat-testijiet bi fluss kontinwu (ara l-Appendiċi 6 tal-metodu tal-ittestjar C.20 għall-kalkolazzjoni tal-medja aritmetika (8)) u jiġu espressi b'mod relattiv għall-medja ġeometrika tal-konċentrazzjonijiet imkejla għat-testijiet semistatiċi (ara l-Kapitolu 5 fid-Dokument ta' Gwida tal-OECD dwar l-ittestjar tat-tossiċità akwatika ta' sustanzi u taħlitiet diffiċli (2)).
                              
                           
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Matul it-test, l-ossiġenu dissolt, il-pH u t-temperatura għandhom jitkejlu fir-reċipjenti kollha tat-test, mill-inqas kull ġimgħa, filwaqt li s-salinità u l-ebusija, jekk ikunu ġustifikati, għandhom jitkejlu fil-bidu u fi tmiem it-test. Idealment, it-temperatura għandha tiġi ssorveljata kontinwament f'mill-inqas reċipjent wieħed tat-test.
                              
                           
                        Osservazzjonijiet
                     
                     26.   
                           Stadju tal-iżvilupp embrijoniku
                        : l-istadju embrijoniku fil-bidu tal-esponiment għas-sustanza kimika tat-test għandu jiġi vverifikat bl-aktar mod preċiż possibbli. Dan jista' jsir bl-użu ta' kampjun rappreżentattiv ta' bajd ippreservat u mnaddaf kif xieraq.
                     27.   
                           Tifqis u sopravivenza
                        : l-osservazzjonijiet fuq it-tifqis u s-sopravivenza għandhom isiru mill-inqas darba kuljum u n-numri jridu jiġu rreġistrati. Jekk jiġi osservat fungu fuq il-bajd fi stadju bikri tal-iżvilupp tal-embrijun (eż. fl-ewwel jew fit-tieni jum tat-test), dak il-bajd għandu jingħadd u jitneħħa. Embrijuni, larva u ħut żgħir mejtin għandhom jitneħħew malli jiġu osservati minħabba li jistgħu jitmermru malajr u jistgħu jitfarrku minħabba l-azzjonijiet tal-ħut l-ieħor. Għandha tingħata attenzjoni estrema meta jitneħħew individwi mejtin sabiex ma ssirx ħsara fiżika lill-bajd/larva li jmissu magħhom. Is-sinjali ta' mewt ivarjaw skont l-ispeċi u l-istadju tal-ħajja. Pereżempju:
                     
                                 —
                              
                              
                                 għall-bajd fertilizzat: partikolarment fl-istadji bikrija, nuqqas notevoli ta' trasluċidità u bidla fil-kulur, kawża ta' koagulazzjoni u/jew preċipitazzjoni ta' proteini, li twassal għal dehra bajda opaka;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 għall-embrijuni, għal-larva u għall-ħut żgħir: immobilità u/jew nuqqas ta' moviment respiratorju u/jew nuqqas ta' taħbit tal-qalb u/jew nuqqas ta' reazzjoni għal stimulu mekkaniku.
                              
                           28.   
                           Dehra anormali
                        : in-numru ta' larva jew ħut żgħir li juru anormalità fil-forma tal-ġisem għandu jiġi rreġistrat f'intervalli adegwati skont id-durata tat-test u n-natura tal-anormalità deskritta. Ta' min jinnota larva u ħut żgħir anormali jseħħu b'mod naturali u jistgħu jkunu fl-ordni ta' perċentwal kbir fil-kontroll(i) f'xi speċijiet. Meta d-deformitajiet u l-imġiba anormali assoċjata jitqiesu li huma tant severi li jkun hemm tbatija konsiderevoli għall-organiżmu u dan ikun laħaq punt fejn ma jkunx jista' jirkupra, huwa jista' jitneħħa mit-test. Dawn l-annimali għandhom jiġu ewtanizzati u ttrattati bħala mortalitajiet għal analiżi tad-dejta sussegwenti. L-iżvilupp normali tal-embrijuni kien iddokumentat għall-maġġoranza tal-ispeċijiet irrakkomandati f'dan il-metodu ta' ttestjar (9) (10) (11) (12).
                     29.   
                           Imġiba anormali
                        : l-anormalitajiet, pereżempju, iperventilazzjoni, għawm mhux ikkoordinat, trankwillità atipika u mġiba atipika tat-tmigħ għandhom jiġu rreġistrati f'intervalli adegwati skont id-durata tat-test (pereżempju darba kuljum għal speċijiet li jgħixu f'ilma sħun). Dawn l-effetti, għalkemm diffiċli jiġu kkwantifikati, jistgħu, meta jiġu osservati, jgħinu fl-interpretazzjoni tad-dejta dwar il-mortalità.
                     30.   
                           Piż
                        : fi tmiem it-test, il-ħut kollu li jibqa' ħaj jintiżen mill-inqas fuq bażi replikata (permezz tar-rappurtar tal-għadd ta' annimali fir-replikat u tal-piż medju għal kull annimal): il-piż imxarrab — (imnixxef bit-taptip) huwa ppreferut, madankollu, tista' tiġi rrapportata wkoll dejta dwar il-piż xott (13).
                     31.   
                           Tul
                        : fi tmiem it-test, jitkejlu t-tulijiet individwali. It-tul totali huwa rrakkomandat, madankollu, jekk il-ġewnaħ tad-denb jitħassar jew jitħaffer, jista' jintuża it-tul standard. L-istess metodu għandu jintuża għall-ħut kollu f'test partikolari. It-tul individwali jista' jitkejjel permezz ta', pereżempju, kalipers, kamera diġitali jew mikrometru okulari kkalibrat. It-tulijiet minimi tipiċi huma definiti fl-Appendiċi 2.
                     DEJTA U RAPPORTAR
                     
                        Trattament tar-riżultati
                     
                     
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Huwa rrakkomandat li d-disinn tal-esperiment u l-għażla tat-test statistiku jippermettu qawwa adegwata (80 % jew ogħla) sabiex jiġu identifikati l-bidliet ta' importanza bijoloġika fil-punti tat-tmiem fejn għandha tiġi rrapportata NOEC. Ir-rappurtar tal-konċentrazzjonijiet tal-effett u l-parametri rilevanti jista' jiddependi fuq il-qafas regolatorju. Jekk irid jiġi rrapportat ECx, id-disinn tal-esperiment u l-għażla tal-mudell ta' rigressjoni għandhom jippermettu li ssir stima tal-ECx sabiex b'hekk (i) l-intervall ta' fiduċja ta' 95 % irrapportat għal ECx ma jkunx fih żero u ma jkunx wiesa' żżejjed, (ii) l-intervall ta' fiduċja ta' 95 % għall-medja mbassra f'ECx ma jkunx fih il-medja tal-kontroll u (iii) ma jkun hemm ebda nuqqas ta' adattament sinifikanti tal-mudell ta' rigressjoni għad-dejta. Kwalunkwe wieħed mill-approċċi jirrikjedi l-identifikazzjoni tal-bidla perċentwali f'kull punt ta' tmiem li huwa importanti li jiġi identifikat jew stmat. Id-disinn sperimentali għandha jitfassal biex jippermetti dan. Meta l-kundizzjonijiet għad-determinazzjoni tal-ECx ma jiġux issodisfati, għandu jintuża l-approċċ ta' NOEC. Mhuwiex probabbli li l-istess bidla perċentwali tapplika għall-punti tat-tmiem kollha, lanqas ma huwa probabbli li jkun jista' jiġi ddisinjat esperiment fattibbli li jissodisfa dawn il-kriterji għall-punti tat-tmiem kollha, għalhekk huwa importanti li wieħed jiffoka fuq il-punti tat-tmiem, li huma importanti għall-esperiment rispettiv sabiex l-esperiment jiġi ddisinjat kif xieraq. Il-flow diagrams ta' statistika u l-gwida għal kull approċċ huma disponibbli fl-Appendiċijiet 5 u 6 sabiex iservu ta' gwida fit-trattament tad-dejta u fl-għażla tal-aktar test ta' statistika jew mudell xieraq li għandu jintuża. Jistgħu jintużaw approċċi ta' statistika oħrajn, diment li jkunu xjentifikament ġustifikati.
                              
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Ser ikun neċessarju li l-varjazzjonijiet jiġu analizzati f'kull sett ta' repliki bl-użu ta' analiżi tal-varjanza jew proċeduri b'tabella ta' kontinġenza u li jintużaw il-metodi ta' analiżi statistika xierqa abbażi ta' din l-analiżi. Sabiex ikunu jistgħu jsiru paraguni multipli bejn ir-riżultati fil-konċentrazzjonijiet individwali u dawk għall-kontrolli, huwa rrakkomandat li jsir it-test ta' tendenza rigressiva ta' Jonckheere-Terpstra jew ta' Williams għal risponsi kontinwi u test ta' tendenza rigressiva ta' Cochran-Armitage għal risponsi kwantali li huma konsistenti ma' rispons ta' konċentrazzjoni monotona u mingħajr ebda evidenza ta' varjanza extra-binomjali (14). Meta jkun hemm evidenza ta' varjanza extra-binomjali, hija rrakkomandata modifika ta' Rao-Scott tat-test ta' Cochran-Armitage (15) (16) jew jiġi applikat it-test ta' Williams jew Dunnett (wara trasformazzjoni arcsin-square-root) jew ta' Jonckheere-Terpstra għall-proporzjonijiet irreplikati. Meta d-dejta ma tkunx konsistenti ma' rispons ta' konċentrazzjoni monotona, il-metodu ta' Dunnett jew Dunn jew dak ta' Mann-Whitney jista' jinstab li huwa utli għal risponsi kontinwi, filwaqt li t-test Eżatt ta' Fisher jista' jinstab li huwa utli għal risponsi kwantali (14) (17) (18). Għandha tingħata attenzjoni meta jiġi applikat kwalunkwe metodu jew mudell ta' statistika sabiex ikun żgurat li r-rekwiżiti tal-metodu jew tal-mudell jiġu ssodisfati (eż. il-varjabbiltà minn kompartiment minn ieħor hija stmata u kkunsidrata fid-disinn sperimentali u fit-test jew fil-mudell użat). Id-dejta għandha tiġi evalwata għan-normalità u l-Appendiċi 5 jindika x'għandu jsir fuq ir-residwi minn ANOVA. L-Appendiċi 6 jiddiskuti kunsiderazzjonijiet addizzjonali għall-approċċ ta' rigressjoni. Għandhom jiġu kkunsidrati t-trasformazzjonijiet sabiex jiġu ssodisfati r-rekwiżiti ta' test tal-istatistika. Madankollu, it-trasformazzjonijiet li jippermettu t-tqabbil ta' mudell ta' rigressjoni jeħtieġu attenzjoni kbira, minħabba li, pereżempju, bidla ta' 25 % fir-reazzjoni mhux ittrasformata ma tikkorrespondix għal bidla ta' 25 % f'rispons ittrasformat. Fl-analiżijiet kollha, il-kompartiment tat-test, mhux il-ħut individwali, huwa l-unità tal-analiżi u l-unità sperimentali u kemm it-testijiet tal-ipoteżi kif ukoll ir-rigressjoni għandhom jirriflettu dan (3) (14) (19) (20).
                              
                           
                        Rapport tat-test
                     
                     
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Sustanza kimika tat-test:
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Sustanza monokostitwenti
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     l-identifikazzjoni tas-sustanza kimika, bħall-IUPAC jew l-isem CAS, in-numru CAS, SMILES jew il-kodiċi InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità tas-sustanza kimika tal-impuritajiet, kif xieraq u prattikament fattibbli, eċċ. (Inkluż il-kontenut tal-karbonju organiku, jekk ikun xieraq.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Sustanza multi-kostitwenti, UVCBs u taħlitiet:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     ikkaratterizzati kemm jista' jkun possibbli, eż., mill-identità tas-sustanza kimika (ara fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Speċijiet tat-test:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         l-isem xjentifiku, ir-razza, is-sors u l-metodu tal-ġbir tal-bajd iffertilizzat u t-trattament sussegwenti.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Kundizzjonijiet tat-test:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-proċedura tat-test użata (pereżempju, semistatika jew bi fluss kontinwu, tagħbija);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fotoperjodu/i;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         id-disinn tat-test (pereżempju, l-għadd ta' kompartimenti tat-test u repliki, l-għadd ta' bajd għal kull replika, il-materjal u d-daqs tal-kompartiment tat-test (l-għoli, il-wisa', il-volum), il-volum tal-ilma għall-kompartiment tat-test);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-metodu ta' tħejjija tas-soluzzjonijiet ewlenin u l-frekwenza tat-tiġdid (għandhom jingħataw l-aġent solubilizzanti u l-konċentrazzjoni tiegħu, meta jintużaw);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-metodu li jintuża għad-dożaġġ tas-sustanza kimika tat-test (eż. pompi, sistemi ta' dilwizzjoni)
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         l-effiċjenza tal-irkupru tal-metodu u l-konċentrazzjonijiet tat-test nominali, il-limitu tal-kwantifikazzjoni, il-medji tal-valuri mkejla u d-devjazzjonijiet standard tagħhom fir-reċipjenti tat-test u l-metodu li permezz tiegħu nkisbu u evidenza li l-kejl jirreferi għall-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test f'soluzzjoni vera;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-karatteristiċi tal-ilma tad-dilwizzjoni: pH, l-ebusija, it-temperatura, il-konċentrazzjoni tal-ossiġenu dissolt, il-livelli tal-klorin residwu (jekk jitkejjel), il-karbonju organiku totali (jekk jitkejjel), is-solidi sospiżi (jekk jitkejlu), is-salinità tal-medium tat-test (jekk titkejjel) u kwalunkwe kejl ieħor li jsir;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-kwalità tal-ilma fir-reċipjenti tat-test, il-pH, l-ebusija, it-temperatura u l-konċentrazzjoni tal-ossiġenu dissolt;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         informazzjoni dettaljati dwar it-tmigħ (pereżempju, it-tip ta' ikel, is-sors, l-ammont mogħti u l-frekwenza).
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Riżultati rrapportati individwalment (jew fuq bażi rreplikata) u bħala medja u koeffiċjent tal-varjazzjoni, kif xieraq, għall-punti tat-tmiem li ġejjin:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         evidenza li l-kontrolli ssodisfaw l-istandard ta' aċċettabbiltà tas-sopravivenza globali tal-ispeċi għat-test (Appendiċi 2);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         dejta dwar il-mortalità f'kull stadju (embrijun, larva u żgħir) u l-mortalità kumulattiva;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         jiem għat-tifqis, numru ta' larva li faqqsu kull jum u t-tmiem tat-tifqis;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         in-numru ta' ħut f'saħħtu fi tmiem it-test;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         dejta għat-tul (speċifika l-istandard jew l-ammont totali) u l-piż tal-annimali li jibqgħu ħajjin;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         l-inċidenza, id-deskrizzjoni u n-numru ta' anormalitajiet morfoloġiċi, jekk hemm;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         l-inċidenza, id-deskrizzjoni u n-numru ta' effetti ta' mġiba, jekk hemm;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         l-approċċ għall-analiżi statistika (analiżi ta' rigressjoni jew analiżi tal-varjanza) u t-trattament tad-dejta (it-test statistiku jew il-mudell użat);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-konċentrazzjoni bla effett osservat għal kull rispons ivvalutat (NOEC);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-konċentrazzjoni bl-inqas effett osservat (p = 1,05) għal kull rispons ivvalutat (LOEC);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         ECx għal kull rispons ivvalutat, jekk applikabbli, u l-intervalli ta' kunfidenza (eż. 90 % jew 95 %) u graff tal-mudell imqabbel għall-kalkolazzjoni tagħha, l-inklinazzjoni tal-kurva tar-rispons ta' konċentrazzjoni, il-formula tal-mudell ta' rigressjoni, il-parametri stmati tal-mudell u l-iżbalji standard tagħhom.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Kwalunkwe devjazzjoni mill-metodu tal-ittestjar.
                                             
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Diskussjoni tar-riżultati, inkluża kwalunkwe influwenza tad-devjazzjonijiet mill-metodu ta' ttestjar fuq l-eżitu tat-test.
                                             
                                          
                                       
                                    Tabella 1
                                 
                                 
                                    Speċi ta' ħut rakkomandat għat-test
                                 
                                 
                                             ILMA ĦELU
                                          
                                          
                                             ILMA SALMURA U BAĦAR
                                          
                                       
                                             
                                                Oncorhynchus mykiss
                                             
                                             Trota qawsalla
                                          
                                          
                                             
                                                Cyprinodon variegatus
                                             
                                             Karpjun tas-snien varjegati
                                          
                                       
                                             
                                                Pimephales promelas
                                             
                                             Karpjun buras
                                          
                                          
                                             
                                                Menidia sp.
                                             Menidja
                                          
                                       
                                             
                                                Danio rerio
                                             
                                             Żebra
                                          
                                          
                                              
                                          
                                       
                                             
                                                Oryzias latipes
                                             
                                             Medaka
                                          
                                          
                                              
                                          
                                       
                           TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.171, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment. No. 23, OECD Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 ASTM (1988), Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials, E 1241-88. 26 pp.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Brauhn, J.L. and R.A. Schoettger (1975), Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Brungs, W.A. and B.R. Jones (1977), Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Adolfsson-Erici, et al. (2012), A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests, Chemosphere 86, 593-599.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Hutchinson, T.H. et al. (2006), Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review, Aquatic Toxicology, 76, 69-92.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu 20 ta' dan l-Anness, Daphnia magna Reproduction Test.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Hansen, D.J. and P.R. Parrish (1977), Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for life-cycle toxicity tests, In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.L. Mayer and J.L. Hamelink), ASTM STP 634.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Kimmel, H. B.et al. (1995), Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203:253–310.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Gonzalez-Doncel, M. et al (2005), A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae) Journal of Applied Ichthyology, 20:1–14.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Devlin, E.W. et al. (1996), Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USEPA, Office of Research and Development, Washington, D.C..
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Oris, J.T., S.C. Belanger, and A.J. Bailer, (2012), Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test, Environmental Toxicology and Chemistry 31; 2, 370 — 376.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1999), A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Dunnett C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of Ameican Statistical Association, 50, 1096-1121.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Dunnett C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Rand, G.M. and S.R. Petrocelli (1985), Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, New York.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 McClave, J.T., J.H. Sullivan and J.G. Pearson (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data, Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.
                              
                           
                        Appendiċi 1
                        DEFINIZZJONIJIET
                        
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Tul sal-furketta (fork length - FL): jirreferi għat-tul mill-ponta tal-geddum sat-tarf tax-xewk tal-pinen f'nofs id-denb u jintuża f'ħut fejn huwa diffiċli li wieħed jgħid fejn tispiċċa l-kolonna vertebrali (www.fishbase.org)
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Tul standard (standard length - SL): jirreferi għat-tul ta' ħuta mkejjel mill-ponta tal-geddum sat-tarf ta' wara tal-aħħar vertebra jew sat-tarf ta' wara tal-porzjon midlaterali tal-hypural plate. Fi kliem sempliċi, dan il-kejl jeskludi t-tul tad-denb. (www.fishbase.org)
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Tul totali (total length - TL): jirreferi għat-tul mill-ponta tal-geddum sal-ponta tal-lobu itwal tad-denb, ġeneralment imkejjel bil-lobi kkumpressati tul il-linja tan-nofs. Dan huwa kejl ta' linja dritta, li ma jitkejjilx fuq il-kurva tal-ġisem (www.fishbase.org)
                                    
                                       Figura 1
                                    
                                    
                                       Deskrizzjoni tat-tulijiet differenti użati
                                    
                                    
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Sustanza kimika: sustanza jew taħlita
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       ECx: (Konċentrazzjoni effettiva għal effett ta' x %) hija l-konċentrazzjoni li tikkawża x % ta' effett fuq l-organiżmi tat-test f'perjodu ta' esponiment partikolari meta mqabbla ma' kontroll. Pereżempju, EC50 hija konċentrazzjoni stmata li tikkawża effett fuq il-punt ta' tmiem l-ittestjar f'50 % ta' popolazzjoni esposta fuq perjodu ta' esponiment definit.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Konċentrazzjoni bl-inqas effett osservat (LOEC) hija l-inqas konċentrazzjoni ttestjata ta' sustanza kimika tat-test li fiha tiġi osservata s-sustanza kimika sabiex ikollha effett statistikament sinifikanti (p < 0,05) meta mqabbla mal-kontroll. Madankollu, il-konċentrazzjonijiet kollha tat-test 'il fuq mil-LOEC għandu jkollhom effett ta' ħsara daqs jew akbar minn dawk osservati fl-LOEC. Meta dawn iż-żewġ kundizzjonijiet ma jkunux jistgħu jiġu ssodisfati, għandha tingħata spjegazzjoni sħiħa għal kif intgħażlet l-LOEC (u b'hekk l-NOEC). L-appendiċijiet 5 u 6 jipprovdu gwida.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Konċentrazzjoni bla effett osservat (NOEC) hija l-konċentrazzjoni tat-test immedjatament taħt l-LOEC, li meta mqabbla mal-kontroll, ma għandha ebda effett statistikament sinifikanti (p < 0,05), f'perjodu ta' esponiment ddikjarat.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Sustanza kimika tat-test: Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata bl-użu ta' dan il-metodu tal-ittestjar
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       UVCB: sustanzi ta' kompożizzjoni varjabbli jew mhux magħrufa, prodotti ta' reazzjoni kumplessa jew materjali bijoloġiċi.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry (Unjoni Internazzjonali tal-Kimika Pura u Applikata).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       SMILES: Simplified Molecular Input Line Entry Specification.
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 2
                        
                           IL-KUNDIZZJONIJIET TAT-TEST, ID-DURATA U L-KRITERJI TAS-SOPRAVIVENZA GĦALL-ISPEĊIJIET IRRAKKOMANDATI
                        
                        
                                    SPEĊIJIET
                                 
                                 
                                    IL-KUNDIZZJONIJIET TAT-TEST
                                 
                                 
                                    IRRAKKOMANDATI DURATA TAT-TEST
                                 
                                 
                                    It-tul totali medju minimu tipiku tal-ħut tal-kontroll fi tmiem l-istudju (mm) (98)
                                    
                                 
                                 
                                    IS-SOPRAVIVENZA TAL-KONTROLLI (minima)
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    It-temperatura (°C)
                                 
                                 
                                    Salinità (0/00)
                                 
                                 
                                    Fotoperjodu (sigħat)
                                 
                                 
                                    Is-suċċess tat-tifqis
                                 
                                 
                                    Is-suċċess wara t-tifqis
                                 
                              
                                    
                                       Ilma Ħelu:
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oncorhynchus mykiss
                                       
                                    
                                    Trota qawsalla
                                 
                                 
                                    10 ± 1,5 (99)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    12 - 16 (100)
                                    
                                 
                                 
                                    ġimagħtejn wara li l-kontrolli jibdew jieklu weħidhom (jew 60 jum wara t-tifqis)
                                 
                                 
                                    40
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Pimephales promelas
                                       
                                    
                                    Karpjun buras
                                 
                                 
                                    25 ± 1,5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    16
                                 
                                 
                                    32 jum mill-bidu tat-test (jew 28 jum wara t-tifqis)
                                 
                                 
                                    18
                                 
                                 
                                    70 %
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Danio rerio
                                       
                                    
                                    Żebra
                                 
                                 
                                    26 ± 1,5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    12 - 16 (101)
                                    
                                 
                                 
                                    30 jum wara t-tifqis
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    70 %
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oryzias latipes
                                       
                                    
                                    Medaka
                                 
                                 
                                    25 ± 2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    12 - 16 (101)
                                    
                                 
                                 
                                    30 jum wara t-tifqis
                                 
                                 
                                    17
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                              
                                    
                                       Tal-Estwarju u tal-Baħar:
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Cyprinodon variegatus
                                       
                                    
                                    Karpjun tas-snien varjegati
                                 
                                 
                                    25 ± 1,5
                                 
                                 
                                    15-35 (102)
                                    
                                 
                                 
                                    12 - 16 (101)
                                    
                                 
                                 
                                    32 jum mill-bidu tat-test (jew 28 jum wara t-tifqis)
                                 
                                 
                                    17
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                              
                                    
                                       Menidia sp.
                                    
                                    Menidja
                                 
                                 
                                    22 - 25
                                 
                                 
                                    15-35 (102)
                                    
                                 
                                 
                                    13
                                 
                                 
                                    28 jum
                                 
                                 
                                    20
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                                 
                                    60 %
                                 
                              
                              
                     
                        Appendiċi 3
                        
                           GWIDA DWAR IT-TMIGĦ U T-TRATTAMENT GĦAR-RIPRODUZZJONI U L-ITTESTJAR TA' ANNIMALI TAL-ISPEĊIJIET IRRAKKOMANDATI
                        
                        
                                    SPEĊIJIET
                                 
                                 
                                    IKEL (*9)
                                    
                                 
                                 
                                    IL-ĦIN TAT-TRASFERIMENT WARA T-TIFQIS
                                 
                                 
                                    IL-ĦIN SAL-EWWEL TMIGĦ
                                 
                              
                                    Ħut riproduttiv
                                 
                                 
                                    Larva li għadha tfaqqas
                                 
                                 
                                    Żgħar
                                 
                              
                                    Tip
                                 
                                 
                                    Frekwenza
                                 
                              
                                    
                                       Ilma Ħelu:
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oncorhynchus mykiss
                                       
                                    
                                    Trota qawsalla
                                 
                                 
                                    ikel tat-trota
                                 
                                 
                                    Xejn (1)
                                    
                                 
                                 
                                    ikel tal-bidu tat-trota BSN
                                 
                                 
                                    2-4 porzjonijiet ta' għalf kuljum
                                 
                                 
                                    14-16-il jum wara t-tifqis jew fl-għawma (mhux essenzjali)
                                 
                                 
                                    19-il jum wara t-tifqis jew fl-għawma
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Pimephales promelas
                                       
                                    
                                    Karpjun buras
                                 
                                 
                                    BSN, ikel imsaffaf, FBS
                                 
                                 
                                    BSN
                                 
                                 
                                    BSN48, ikel imsaffaf
                                 
                                 
                                    2-3 darbiet kuljum
                                 
                                 
                                    ladarba t-tifqis ikun 90 %
                                 
                                 
                                    jumejn wara t-tifqis
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Danio rerio
                                       
                                    
                                    Żebra
                                 
                                 
                                    BSN, ikel imsaffaf,
                                 
                                 
                                    Ikel tal-larva kummerċjali, protożoa (2), proteina (3)
                                    
                                 
                                 
                                    BSN48, ikel imsaffaf
                                 
                                 
                                    BSN darba kuljum; Ikel imsaffaf darbtejn kuljum
                                 
                                 
                                    ladarba t-tifqis ikun 90 %
                                 
                                 
                                    jumejn wara t-tifqis
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oryzias latipes
                                       
                                    
                                    Medaka
                                 
                                 
                                    ikel imsaffaf
                                 
                                 
                                    BSN, ikel imsaffaf (jew protożoa jew rotiferi)
                                 
                                 
                                    BSN48, ikel imsaffaf (jew rotiferi)
                                 
                                 
                                    BSN darba kuljum; ikel imsaffaf darbtejn kuljum jew ikel imsaffaf u rotiferi darba kuljum
                                 
                                 
                                    mhux applikabbli
                                 
                                 
                                    6-7 ijiem wara l-bidien
                                 
                              
                                    
                                       Tal-Estwarju u tal-Baħar:
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Cyprinodon varieqatus
                                       
                                    
                                    Karpjun tas-snien varjegati
                                 
                                 
                                    BSN, ikel imsaffaf, FBS
                                 
                                 
                                    BSN
                                 
                                 
                                    BSN48
                                 
                                 
                                    2-3 porzjonijiet ta' għalf kuljum
                                 
                                 
                                    mhux applikabbli
                                 
                                 
                                    jum wara t-tifqis/l-għawma
                                 
                              
                                    
                                       Menidia sp.
                                    
                                    Menidja
                                 
                                 
                                    BSN48, ikel imsaffaf
                                 
                                 
                                    BSN
                                 
                                 
                                    BSN48
                                 
                                 
                                    2-3 porzjonijiet ta' għalf kuljum
                                 
                                 
                                    mhux applikabbli
                                 
                                 
                                    jum wara t-tifqis/l-għawma
                                 
                              
                              
                     
                        Appendiċi 4
                        
                           XI KARATTERISTIĊI KIMIĊI TA' ILMA TAD-DILWIZZJONI AĊĊETTABBLI
                        
                        
                                    Komponent
                                 
                                 
                                    Konċentrazzjoni limitu
                                 
                              
                                    Materja partikolata
                                 
                                 
                                    5 mg/l
                                 
                              
                                    Karbonju organiku totali
                                 
                                 
                                    2 mg/l
                                 
                              
                                    Ammonja mhux jonizzata
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kloru residwu
                                 
                                 
                                    10 μg/l
                                 
                              
                                    Pestiċidi organofosforiċi totali
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    Pestiċidi organofosforiċi totali flimkien ma' bifenili poliklorinati
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    Kloru organiku totali
                                 
                                 
                                    25 ng/l
                                 
                              
                                    Aluminju
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Arseniku
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kromju
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kobalt
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Ram
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Ħadid
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Ċomb
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Nikil
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Żingu
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kadmju
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    Merkurju
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    Fidda
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 5
                        
                           GWIDA STATISTIKA GĦAD-DETERMINAZZJONI TAL-NOEC
                        
                        
                           Ġenerali
                        
                        It-tank irreplikat huwa l-unità tal-analiżi. B'hekk, għall-kejl kontinwu, bħad-daqs, għandhom jiġu kkalkolati l-medji tal-irreplikati jew il-medjani tal-irreplikati u dawn il-valuri tal-irreplikati huma d-dejta għall-analiżi. Għandha tintwera l-qawwa tat-testijiet użati, preferibbilment abbażi ta' database storika adegwata għal kull laboratorju. L-effett tad-daqs li jista' jiġi identifikat b'qawwa ta' 75-80 % għandu jiġi pprovdut għal kull punt tat-tmiem bit-test statistiku li jrid jintuża.
                        Id-databases disponibbli fiż-żmien tal-iżvilupp ta' dan il-metodu ta' ttestjar jistabbilixxu l-qawwa possibbli skont il-proċeduri statistiċi rrakkomandati. Laboratorju individwali għandu juri l-abbiltà tiegħu li jissodisfa dan ir-rekwiżit tal-qawwa billi jwettaq l-analiżi tal-qawwa tiegħu stess jew billi juri li l-Koeffiċjent tal-Varjazzjoni (CV) għal kull rispons ma jaqbiżx id-90 perċentil tas-CVs użati fl-iżvilupp tat-TG. It-Tabella 1 tipprovdi dawn is-CVs. Jekk ikunu disponibbli biss il-medji tal-irreplikati jew il-medjani tal-irreplikati, mela allura s-CV irreplikat jista' jiġi injorat.
                        
                           Tabella 1
                        
                        
                           Id-90 Perċentil tas-CVs għall-Ispeċijiet tal-Ilma Ħelu magħżula
                        
                        
                                    Speċijiet
                                 
                                 
                                    Rispons
                                 
                                 
                                    CV_Bejn ir-Repliki
                                 
                                 
                                    CV_Fi ħdan ir-Repliki
                                 
                              
                                    Trota Qawsalla
                                 
                                 
                                    Tul
                                 
                                 
                                    17,4
                                 
                                 
                                    9,8
                                 
                              
                                    Piż
                                 
                                 
                                    10,1
                                 
                                 
                                    28
                                 
                              
                                    Karpjun Buras
                                 
                                 
                                    Tul
                                 
                                 
                                    16,9
                                 
                                 
                                    13,5
                                 
                              
                                    Piż
                                 
                                 
                                    11,7
                                 
                                 
                                    38,7
                                 
                              
                                    Żebra
                                 
                                 
                                    Tul
                                 
                                 
                                    43,7
                                 
                                 
                                    11,7
                                 
                              
                                    Piż
                                 
                                 
                                    11,9
                                 
                                 
                                    32,8
                                 
                              Kważi għat-testijiet statistiċi kollha użati għall-evalwazzjoni tal-istudji tossikoloġiċi fil-laboratorji, il-paraguni ta' interess għandhom jiġu kkontrollati mill-gruppi ta' trattament. Għal dik ir-raġuni, mhuwiex xieraq li jintalab li jsir test F sinifikanti ta' ANOVA qabel l-użu tat-test ta' Dunnett jew ta' Williams jew test sinifikanti ta' Kruskal-Wallis qabel l-użu tat-test ta' Jonckheere-Terpstra, Mann-Whitney jew Dunn (Hochberg and Tamhane 1987, Hsu 1996, Dunnett 1955, 1964, Williams 1971, 1972, 1975, 1977, Robertson et al. 1988, Jonckheere 1954, Dunn 1964).
                        It-test ta' Dunnett għandu aġġustament ta' multipliċità inkorporat u r-rati pożittivi foloz u negattivi foloz tiegħu huma affettwati b'mod avvers bl-użu tat-test F bħala għassies. B'mod simili, it-testijiet b'tendenza rigressiva ta' Williams u Jonckheere-Terpstra li jużaw livell ta' sinifikat ta 0.05 f'kull pass jippreservaw rata pożittiva falza globali ta' 5 % u r-rata u l-qawwa tat-testijiet jiġu affettwati b'mod avvers bl-użu tat-test F- jew Kruskal-Wallis bħala kustodju. It-testijiet ta' Mann-Whitney u ta' Dunn għandhom jiġu aġġustati għall-multipliċità u huwa rrakkomandat l-aġġustament ta' Bonferroni-Holm.
                        Diskussjoni fil-fond rigward il-maġġoranza tar-rakkomandazzjonijiet dwar l-ittestjar tal-ipoteżi u l-verifika tas-suppożizzjonijiet sottostanti għal dawn it-testijiet hija mogħtija fl-OECD (2006), li tinkludi wkoll bibljografija estensiva.
                        
                           It-trattament tal-Kontrolli meta Jintuża Solvent
                        
                        Jekk jintuża solvent, għandhom jiġu inklużi kemm kontroll tal-ilma tad-dilwizzjoni kif ukoll kontroll tas-solvent. Iż-żewġ kontrolli għandhom jitqabblu għal kull rispons u jiġu kkombinati għal analiżi statistika jekk ma tinstab ebda differenza sinifikanti bejn il-kontrolli. Altrimenti, għandu jintuża l-kontroll tas-solventi għad-determinazzjoni tal-NOEC jew għall-istima tal-ECx u ma jintużax il-kontroll tal-ilma. Ara r-restrizzjoni fil-kriterji tal-validità (Paragrafu 7).
                        Għat-tul, il-piż, il-proporzjon ta' tifqis tal-bajd jew mortalità tal-larva jew larva anormali, u għall-ewwel jew l-aħħar jum tat-tifqis jew tal-għawma, għandu jintuża T-test jew it-test ta' Mann-Whitney sabiex il-kontroll tal-ilma tad-dilwizzjoni jitqabbel mal-kontroll tas-solvent f'livell ta' sinifikat ta' 0.05, billi jiġu injorati l-gruppi tat-trattamenti kollha. Ir-riżultati ta' dawn it-testijiet għandhom jiġu rrapportati.
                        
                           Il-kejl tad-daqs (it-tul u l-piż)
                        
                        Il-valuri tat-tul u tal-piż tal-ħut individwali jistgħu jiġu distribwiti b'mod normali jew log-normali. Fi kwalunkwe każ, il-valuri medji rreplikati għandhom it-tendenza li jkunu distribwiti b'mod normali permezz tas-Central Limit Theorem u kkonfermati mid-dejta minn aktar minn 100 studju tal-ELS ta' tliet speċijiet li jgħixu fl-ilma ħelu. Inkella, meta d-dejta jew id-databases storiċi jissuġġerixxu distribuzzjoni b'log-normali għall-valuri ta' daqsijiet ta' ħut individwali, jista' jiġi kkalkolat il-logaritmu medju rreplikat tal-valuri tal-ħut individwali u d-dejta għall-analiżi tista' mbagħad tkun l-anti-logs ta' dawn il-logaritmi medji rreplikati.
                        Id-dejta għandha tiġi evalwata għall-konsistenza b'distribuzzjoni normali u omoġeneità tal-varjanza. Għal dan il-għan, għandhom jintużaw ir-residwi minn mudell ANOVA b'konċentrazzjoni bħall-varjabbli tal-klassi ta' spjegazzjoni waħda. Tista' tintuża determinazzjoni viżiva minn plotts ta' diffużjoni u istogrammi jew minn stem-and-leaf plots. B'mod alternattiv, jista' jintuża test formali bħal Shapiro-Wilk jew Anderson-Darling. Il-konsistenza mal-omoġeneità tal-varjanza tista' tiġi vvalutata minn eżaminazzjoni viżiva tal-istess plott ta' diffużjoni jew b'mod formali permezz tat-test ta' Levene. Huma biss it-testijiet parametriċi (eż. ta' Williams, Dunnett) li jeħtieġ li jiġu evalwati għan-normalità jew għall-omoġeneità tal-varjanza.
                        Għandha tingħata attenzjoni lill-outliers possibbli u lill-effett tagħhom fuq l-analiżi. Jistgħu jintużaw it-test tal-outlier ta' Tukey u l-ispezzjoni viżiva tal-istess plottijiet ta' residwi deskritti hawn fuq. Għandu jiġi mfakkar li l-osservazzjonijiet huma repliki sħaħ, għalhekk, it-tħollija barra ta' outlier mill-analiżi għandha ssir biss wara kunsiderazzjoni bir-reqqa.
                        It-testijiet statistiċi li jagħmlu użu mill-karatteristiċi tad-disinn sperimentali u l-aspettattiva bijoloġika huma testijiet b'tendenza rigressiva, bħal Williams u Jonckheere-Terpstra. Dawn it-testijiet jassumu rispons ta' konċentrazzjoni monotona u d-dejta għandha tiġi vvalutata għall-konsistenza ma' dik is-suppożizzjoni. Dan jista' jsir b'mod viżiv minn plott ta' diffużjoni tal-medji rreplikati fl-isfond tal-konċentrazzjoni tat-test. Ikun utli jekk dak il-plott ta' diffużjoni jiġi sovrappost bi plott lineari segmentat li jgħaqqad il-medji tal-konċentrazzjoni ponderati skont id-daqs tal-kampjun irreplikat. Devjazzjoni kbira ta' dan il-plott lineari segmentat minn monotoniċità tindika l-ħtieġa possibbli li jintużaw testijiet mingħajr tendenza. B'mod alternattiv, jistgħu jintużaw testijiet formali. Test formali sempliċi huwa għall-komputazzjoni tal-kuntrasti lineari u kwadratiċi tal-medji tal-konċentrazzjoni. Jekk il-kuntrast kwadratiku jkun sinifikanti u l-kuntrast lineari ma jkunx sinifikanti, din hija indikazzjoni ta' problema possibbli bil-monotoniċità, li għandha tiġi evalwata aktar mill-plotts. Meta n-normalità jew l-omoġeneità tal-varjanza tikkostitwixxi kwistjoni, dawn il-kuntrasti jistgħu jinbnew minn dejta ttrasformata skont l-ordni tal-klassifikazzjoni. Jistgħu jintużaw proċeduri alternattivi, bħat-test ta' Bartholomew, għall-monotoniċità, iżda dawn iżidu l-kumplessità.
                        
                           Figura 2
                        
                        
                           Flow-Chart bil-Kejl tad-Daqs tal-NOEC (it-tul u l-piż)
                        
                        Sakemm id-dejta ma tkunx konsistenti mar-rekwiżiti għal dawn it-testijiet, l-NOEC tiġi ddeterminata minn applikazzjoni b'tendenza rigressiva tat-test ta' Williams jew ta' Jonckheere-Terpstra. OECD (2006) jipprovdi dettalji dwar dawn il-proċeduri. Għad-dejta li mhijiex konsistenti mar-rekwiżiti għal test b'tendenza rigressiva, jista' jintuża t-test ta' Dunnett jew ta' Tamhane-Dunnett (T3), li t-tnejn li huma għandhom aġġustamenti inkorporati għall-multipliċità. Dawn it-testijiet jassumu n-normalità u, fil-każ ta' Dunnett, l-omoġeneità tal-varjanza. Meta dawk il-kundizzjonijiet ma jiġux issodisfati, jista' jintuża t-test mhux parametriku ta' Dunn. OECD (2006) jinkludi dettalji għal dawn it-testijiet kollha. Il-figura 2 tagħti ħarsa ġenerali lejn kif tista' ssib it-test tal-għażla tiegħek.
                        
                           It-Tifqis tal-Bajd u s-Sopravivenza tal-Larva
                        
                        Id-dejta hija dwar il-proporzjonijiet ta' bajd li jfaqqas jew larva li tibqa' ħajja f'repliki individwali. Dawn il-proporzjonijiet għandhom jiġu vvalutati għall-varjanza extra-binomjali, li hija komuni iżda mhux universali għal dan il-kejl. Il-flowchart fil-figura 3 hija gwida għat-test tal-għażla; ara t-test għal deskrizzjonijiet iddettaljati.
                        Normalment jintużaw żewġ testijiet. Dawn huma t-test ta' Tarone C(α) (Tarone, 1979) u l-chi-squared tests, kull wieħed applikat separatament għal kull konċentrazzjoni tat-test. Jekk tinstab varjanza extra-binomjali f'konċentrazzjoni waħda tat-test, mela allura għandhom jintużaw metodi li jakkomodaw.
                        
                           Formula 1
                        
                        
                           It-test ta' Tarone C (α) (Tarone 1979)
                        
                        
                           
                        fejn ̂ huwa l-proporzjon medju għal konċentrazzjoni partikolari, m huwa l-għadd ta' tankijiet irreplikati, nj
                            huwa l-għadd ta' suġġetti fir-replika j u xj
                            huwa l-għadd ta' suġġetti f'dik ir-replika li tirrispondi, eż. mhux imfaqqsin jew mejta. Dan it-test jiġi applikat għal kull konċentrazzjoni separatament. Dan it-test jista' jitqies bħala test aġġustat tal-chi-square, iżda s-simulazzjonijiet b'qawwa limitata magħmula minn Tarone wrew li huwa aktar b'saħħtu minn test tal-chi-square.
                        
                           Figura 3
                        
                        
                           Flow Chart tal-NOEC għat-Tifqis tal-Bajd u l-Mortalità tal-Larva
                        
                        Meta ma jkun hemm ebda evidenza sinifikanti ta' varjanza extra-binomjali, jista' jintuża t-test b'tendenza rigressiva ta' Cochran-Armitage. Dan it-test jinjora r-repliki, għalhekk, fejn ikun hemm tali evidenza, huwa rrakkomandat li jsir aġġustament ta' Rao-Scott għat-test ta' Cochran-Armitage (RSCA), li jieħu f'kunsiderazzjoni r-repliki, id-daqsijiet tar-repliki u l-varjanza extra-binomjali. It-testijiet alternattivi jinkludu t-testijiet b'tendenza rigressiva ta' Williams u Jonckheere-Terpstra u t-test ta' Dunnett kif deskritti għall-kejl tad-daqs. Dawn it-testijiet japplikaw irrispettivament minn jekk ikunx hemm varjanza extra-binomjali, iżda għandhom qawwa kemmxejn aktar baxxa (Agresti 2002, Morgan 1992, Rao and Scott 1992, 1999, Fung et al. 1994, 1996).
                        
                           L-Ewwel jew l-Aħħar Jum tat-Tifqis jew tal-Għawma
                        
                        Ir-rispons huwa inteġer, li jagħti l-jum tat-test li fih tiġi osservata l-osservazzjoni indikata għal tank irreplikat partikolari. Il-medda tal-valuri ġeneralment tkun limitata ħafna u sikwit ikun hemm proporzjonijiet kbar ta' valuri marbuta, pereżempju, jiġi osservat l-istess l-ewwel jum ta' tifqis fir-replikati ta' kontroll u forsi f'konċentrazzjoni waħda jew żewġ konċentrazzjonijiet baxxi tat-test. Testijiet parametriċi bħal Williams u Dunnett mhumiex addattati għal tali dejta. Sakemm ma jkunx hemm evidenza fuq non-monotoniċità serja, it-test b'tendenza rigressiva ta' Jonckheere-Terpstra huwa b'saħħtu ħafna għad-detezzjoni tal-effetti tas-sustanza kimika tat-test. Altrimenti, jista' jintuża t-test ta' Dunn.
                        
                           Anormalitajiet tal-Larva
                        
                        Ir-rispons huwa l-għadd ta' larva li b'xi mod tinstab li hija anormali. Dan ir-rispons ta' spiss ikun ta' inċidenza baxxa u jesperjenza wħud mill-istess problemi bħall-ewwel jum tat-tifqis, kif ukoll xi drabi juri rispons erratiku għall-konċentrazzjoni. Jekk id-dejta mill-inqas bejn wieħed u ieħor issegwi forma ta' konċentrazzjoni monotona, it-test b'tendenza rigressiva ta' Jonckheere-Terpstra huwa b'saħħtu għall-identifikazzjoni tal-effetti. Altrimenti, jista' jintuża t-test ta' Dunn.
                        REFERENZI
                        Agresti, A. (2002); Categorical Data Analysis, second edition, Wiley, Hoboken.
                        Dunnett C. W. (1955); A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, J. American Statistical Association 50, 1096-1121.
                        Dunn O. J. (1964 ); Multiple Comparisons Using Rank Sums, Technometrics 6, 241-252.
                        Dunnett C. W. (1964); New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20, 482-491.
                        Fung, K.Y., D. Krewski, J.N.K. Rao, A.J. Scott (1994); Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data, Risk Analysis 14, 639-648.
                        Fung, K.Y, D. Krewski, R.T. Smythe (1996); A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay, Canadian Journal of Statistics 24, 431-454.
                        Hochberg, Y. and A. C. Tamhane (1987); Multiple Comparison Procedures, Wiley, New York.
                        Hsu, J.C. (1996); Multiple Comparisons: Theory and Methods; Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton.
                        Jonckheere A. R. (1954); A distribution-free k-sample test against ordered alternatives, Biometrika 41, 133.
                        Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London.
                        OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment, No. 54. Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris..
                        Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992) — A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585.
                        Rao J.N.K. and Scott A.J. (1999) — A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385.
                        Robertson, T., Wright F.T. and Dykstra R.L. (1988); Order restricted statistical inference, Wiley.
                        Tarone, R.E. (1979); Testing the goodness of fit of the Binomial distribution, Biometrika 66, 585-590.
                        Williams D.A. (1971); A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, 103-117.
                        Williams D.A. (1972); The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, 519-531.
                        Williams D. A. (1975); The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratotlogy, Biometrics 31, 949-952.
                        Williams D.A. (1977); Some inference procedures for monotonically ordered normal means, Biometrika 64, 9-14.
                     
                     
                        Appendiċi 6
                        
                           GWIDA STATISTIKA GĦALL-ESTIMI TA' RIGRESSJONI
                        
                        
                           Ġenerali
                        
                        L-osservazzjonijiet użati biex jiddaħħal mudell huma medji rreplikati (tul u piż) jew proporzjonijiet irreplikati (tifqis tal-bajd u mortalità tal-larva) (OECD 2006).
                        Ġeneralment, hija rrakkomandata rigressjoni ponderata li tuża d-daqs tal-kampjun irreplikat bħala l-piż. Huma possibbli skemi ta' ponderazzjoni oħrajn, bħall-ponderazzjoni b'rispons medju mbassar jew kombinazzjoni ta' dan u d-daqs tal-kampjun irreplikat. Mhix irrakkomandata l-ponderazzjoni b'varjanza reċiproka fi ħdan il-kampjun ta' konċentrazzjoni (Bunke et al. 1999, Seber and Wild, 2003, Motulsky and Christopoulos 2004, Huet et al. 2003).
                        Kwalunkwe trasformazzjoni tar-risponsi qabel analiżi għandha tippreserva l-indipendenza tal-osservazzjonijiet u l-ECx u l-limiti ta' kunfidenza tagħha għandhom jiġu espressi fl-unitajiet oriġinali tal-kejl, aktar milli f'unitajiet ittrasformati. Pereżempju, bidla ta' 20 % fil-logaritmu tat-tul mhijiex ekwivalenti għal bidla ta' 20 % fit-tul (Lyles et.al 2008, Draper and Smith 1999).
                        Il-flowchart fil-figura 4 tagħti ħarsa ġenerali lejn l-estimi tal-ECx. Id-dettalji huma deskritti fit-test ta' hawn taħt.
                        
                           Figura 4
                        
                        
                           Flow chart għal ECx Stima tat-Tul, tal-Piż jew tal-Proporzjon Medju Replikat tat-Tifqis tal-Bajd jew tal-Mortalità tal-Larva, ara t-test għal aktar dettalji
                        
                        
                           Kunsiderazzjonijiet għat-Tifqis tal-Bajd u għall-Mortalità tal-Larva
                        
                        Għat-tifqis tal-bajd u l-mortalità tal-larva, huwa ġeneralment aħjar li jiddaħħal mudell ta' tnaqqis, sakemm ma jiddaħħalx mudell probit kif deskritt hawn taħt. Jiġifieri, wieħed għandu jimmudella l-proporzjon ta' bajd li ma jfaqqasx jew ta' larvi li jmutu. Ir-raġuni għal dan hija li ECx tirreferi għal konċentrazzjoni li fiha jkun hemm bidla ugwali għal x % tar-rispons medju tal-kontroll. Jekk ikun hemm 5 % tal-bajd fil-kontroll li ma jfaqqsux u wieħed jimmudella n-nuqqas ta' tifqis, mela allura l-EC20 tirreferi għal konċentrazzjoni li fiha jkun hemm bidla ugwali għal 20 % tal-5 % tal-bajd fil-kontroll li ma jfaqqsux, jiġifieri bidla ta' 0,2 × 0,05 = 0,01 jew punt perċentwal wieħed għal 6 % tal-bajd li ma jfaqqsux. Din il-bidla żgħira ma tistax tiġi stmata bi kwalunkwe mod sinifikanti mid-dejta disponibbli u mhijiex bijoloġikament importanti. Filwaqt li, jekk wieħed jimmudella l-proporzjon tal-bajd li jfaqqsu, il-proporzjon tal-kontroll ikun 95 % f'dan l-eżempju u tnaqqis ta' 20 % mill-medja tal-kontroll ikun ifisser bidla ta' 0,95 × 0,2 = 0,18, għalhekk, minn rata ta' suċċess tat-tifqis ta' 95 % għal suċċess ta' tifqis ta' 77 % (= 95-18) u l-konċentrazzjoni tal-effetti tista' tiġi stmata u preżumibbilment hija ta' interess akbar. Din ma tikkostitwixxi ebda kwistjoni bil-kejl tad-daqs, għalkemm l-effetti avversi fuq id-daqs ġeneralment ifissru tnaqqis fid-daqs.
                        
                           Mudelli għad-Daqs (tul jew piż) u s-Suċċess tat-Tifqis tal-Bajd jew is-Sopravivenza tal-Larva.
                        
                        Għajr għall-mudell ormetiku ta' Brain-Cousens, dawn il-mudelli kollha huma deskritti u rrakkomandati fl-OECD (2006). Dawn il-mudelli, imsejħa OECD 2-5, huma diskussi wkoll għall-esperimenti tal-ekotossiċità fi Slob (2002). Ovvjament, hemm ħafna mudelli oħrajn li jistgħu jkunu utli. Bunke, et al. (1999) isemmi bosta mudelli li mhumiex inklużi hawnhekk u hemm għadd kbir ta' referenzi għal mudelli oħrajn. Dawk imsemmija hawn taħt huma ssuġġeriti bħala partikolarment xierqa fl-esperimenti tal-ekotossiċità u jintużaw ħafna.
                        
                           B'5 konċentrazzjonijiet tat-test flimkien mal-kontroll
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Bruce-Versteeg
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Esponenzjali Sempliċi (OECD 2)
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Esponenzjali bil-parametru tal-forma (OECD 3)
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Esponenzjali Sempliċi b'Livell Inferjuri (OECD 4)
                                 
                              
                           B'6 konċentrazzjonijiet tat-test jew aktar flimkien mal-kontroll
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Esponenzjali b'parametru tal-forma u livell inferjuri (OECD 5)
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Michaelis-Menten
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Hill
                                 
                              Fejn ikun hemm evidenza viżiva ta' ormeżi (mhux probabbli b'suċċess ta' tifqis tal-bajd jew sopravivenza tal-larva, iżda xi drabi osservata fl-osservazzjonijiet tad-daqs)
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Brain-Cousens Hormetic; Brain and Cousens (1989)
                                 
                              
                           Mudelli alternattivi għall-falliment fit-tifqis tal-bajd u l-mortalità tal-larva
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Il-mudelli dejjem jiżdiedu għal dawn ir-risponsi jistgħu jiddaħħlu b'mudelli probit (jew loġistiċi) jekk ma jkun hemm ebda evidenza ta' varjanza extra-binomjali u l-inċidenza tal-kontroll tkun stmata fil-mudell addattat. Dan mhuwiex il-metodu ppreferut, minħabba li jittratta l-individwu, mhux ir-replika, bħala l-unità tal-analiżi (Morgan 1992, O'Hara Hines and Lawless 1993, Collett 2002, 2003).
                                 
                              
                           L-idoneità tal-adattament ta' mudell waħdieni
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Qabbel b'mod viżiv it-tnaqqis perċentwali osservat u mbassar f'kull konċentrazzjoni tat-test (Motulsky and Christopoulos 2004, Draper and Smith 1999).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Qabbel il-medja kwadratika tal-iżball ta' rigressjoni mal-medja kwadratika tal-iżball pur bl-użu ta' F-test (Draper and Smith 1999).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Ivverifika li kull terminu fil-mudell huwa differenti b'mod sinifikanti minn żero (jiġifieri ddetermina jekk it-termini kollha użati fil-mudell humiex importanti), (Motulsky and Christopoulos 2004).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Il-plotts ta' residwi minn rigressjoni kontra l-konċentrazzjoni tat-test, possibbilment fuq skala log(conc). Ma għandu jkun hemm ebda mudell għal dan il-plott; il-punti għandhom ikunu mifruxa b'mod aleatorju madwar linja orizzontali f'għoli ta' żero.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Id-dejta għandha tiġi evalwata għan-normalità u għall-omoġeneità tal-varjanza bl-istess mod kif indikat fl-Appendiċi 5.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Barra minn hekk, in-normalità tar-residwi dwar il-mudell ta' rigressjoni għandha tiġi vvalutata bl-użu tal-istess metodi indikati fl-Appendiċi 5 għar-residwi minn ANOVA
                                 
                              
                           Qabbel il-mudelli
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Uża l-kriterji AICc ta' Akiake Valuri ta' AICc iżgħar juru adattamenti aħjar u jekk AICc(B)-AICc(A)≥10, il-mudell A huwa kważi ċertament aħjar mill-mudell B (Motulsky and Christopoulos (2004).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Qabbel iż-żewġ mudelli viżwalment skont kemm jissodisfaw tajjeb il-kriterji tal-mudell waħdieni msemmija fuq.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Huwa rrakkomandat il-prinċipju ta' parsimonja, fejn jintuża l-aktar mudell sempliċi li jkun adattat b'mod raġonevoli għad-dejta (Ratkowsky 1993, Lyles et.al 2008).
                                 
                              
                           Stima tal-kwalità tal-ECx
                           
                        
                        L-intervall ta' kunfidenza (confidence interval — CI) għall-ECx ma għandux ikun wiesa' żżejjed. Huwa meħtieġ ġudizzju statistiku sabiex jiġi deċiż kemm jista' jkun wiesa' l-intervall ta' kunfidenza u l-ECx jibqgħu utli. Is-simulazzjonijiet għall-mudelli ta' rigressjoni adattati għat-tifqis tal-bajd u d-dejta dwar id-daqs juru li madwar 75 % tal-intervalli ta' kunfidenza għal ECx (x=10, 20 jew 30) huma mifruxa fuq mhux aktar minn żewġ konċentrazzjonijiet tat-test. Dan jipprovdi gwida ġenerali għal x'inhu aċċettabbli u gwida prattika għal dak li jista' jinkiseb. Bosta awturi jasserixxu l-ħtieġa li jiġu rrapportati l-intervalli ta' kunfidenza għall-parametri tal-mudelli kollha u li l-intervalli ta' kunfidenza wiesgħa għall-parametri tal-mudelli jindikaw mudelli inaċċettabbli (Ott and Longnecker 2008, Alvord and Rossio 1993, Motulsky and Christopoulos 2004, Lyles et al. 2008, Seber and Wild 2003, Bunke et al. 1999, Environment Canada 2005).
                        Is-CI għall-ECx (jew kwalunkwe parametru ta' mudell ieħor) ma għandux jinkludi żero (Motulsky and Christopoulos 2004). Din hija r-rigressjoni ekwivalenti għad-differenza sinifikanti minima li sikwit tiġi ċċitata fl-approċċi tal-ittestjar ipotetiku (eż. Wang et al 2000). Hija tikkorrespondi għall-intervall ta' kunfidenza sabiex ir-risponsi medji fl-LOEC ma jkunux jinkludu l-medja tal-kontroll. Wieħed għandu jistaqsi jekk l-estimi tal-parametru humiex xjentifikament plawżibbli. Pereżempju, jekk l-intervall ta' kunfidenza għal y0 ikun ±20 %, ma hija plawżibbli ebda stima ta' EC10. Jekk il-mudell jipprevedi effett ta' 20 % f'konċentrazzjoni C u l-effett massimu osservat f'C u konċentrazzjonijiet aktar baxxi jkun 10 %, mela allura l-EC20 ma tkunx plawżibbli (Motulsky and Christopoulos 2004, Wang et al. 2000, Environment Canada 2005).
                        ECx ma għandhiex tirrikjedi estrapolazzjoni barra l-medda ta' konċentrazzjonijiet pożittivi (Draper and Smith 1999, OECD 2006). Pereżempju, gwida ġenerali tista' tkun li l-ECx ma tkunx aktar minn madwar 25 % taħt l-inqas konċentrazzjoni ttestjata jew aktar mill-ogħla konċentrazzjoni ttestjata.
                        REFERENZI
                        Alvord, W.G., Rossio, J.L. (1993); Determining confidence limits for drug potency in immunoassay, Journal of Immunological Methods 157, 155-163.
                        Brain P. and Cousens R. (1989); An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. 29: 93-96.
                        Bunke, O., Droge, B. and Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33, 197-240.
                        Collett, D. (2002); Modelling Binary Data, second edition, Chapman and Hall, London.
                        Collett, D. (2003); Modelling Survival Data in Medical Research, second edition, Chapman and Hall, London.
                        Draper, N.R. and Smith, H. (1999); Applied Regression Analysis, third edition. New York: John Wiley & Sons.
                        Environment Canada (2005); Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, Report EPS 1/RM/46
                        Huet, S., A. Bouvier, M.-A. Poursat, E. Jolivet (2003); Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples, Springer Series in Statistics, New York.
                        Lyles, R. H., C. Poindexter, A. Evans, M. Brown, and C.R. Cooper (2008); Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data, Contemp Clin Trials. 2008 November; 29(6): 878–886.
                        Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London.
                        Motulsky, H., A. Christopoulos (2004); Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting, Oxford University Press, USA.
                        O'Hara Hines, R. J. and J. F. Lawless (1993); Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time, Biometrics Vol. 49, pp. 107-121
                        OECD (2006); Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, No. 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris.
                        Ott, R.L., M.T. Longnecker, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, sixth edition, 2008, Brooks-Cole, Belmont, CA
                        Ratkowsky, D.A. (1993); Principles of nonlinear regression, Journal of Industrial Microbiology 12, 195-199.
                        Seber, G.A.F., C.J. Wild, Nonlinear Regression, Wiley, 2003
                        Slob W. (2002); Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66, 298-312
                        Wang, Q., D.L. Denton, and R. Shukla (2000); Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 19, pp. 113–117, 2000.
                     
                     C.48   Assaġġ tar-Riproduzzjoni tal-Ħut Fuq Żmien Qasir
                     
                     INTRODUZZJONI
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 229 tal-OECD (2012). Il-ħtieġa li jiġi żviluppat u vvalidat assaġġ tal-ħut li jkun jista' jidentifika ċerti sustanzi kimiċi attivi fis-sistema endokrinali ġejja mit-tħassib li l-livelli ambjentali tas-sustanzi kimiċi jistgħu jikkawżaw effetti avversi kemm fil-bnedmin kif ukoll fl-organiżmi selvaġġi minħabba l-interazzjoni ta' dawn is-sustanzi kimiċi mas-sistema endokrinali. Fl-1998, l-OECD bdiet attività ta' prijorità għolja biex tirrevedi l-linji gwida eżistenti u tiżviluppa linji gwida ġodda għall-iskrinjar u l-ittestjar ta' sustanzi li potenzjalment ifixklu s-sistema endokrinali. Element minnhom tal-attività kien li tiġi żviluppata linja gwida tat-test għall-iskrinjar ta' sustanzi kimiċi attivi fis-sistema endokrinali tal-ispeċi tal-ħut. L-Assaġġ tar-Riproduzzjoni tal-Ħut Fuq Żmien Qasir għadda minn programm estensiv ta' validazzjoni li jikkonsisti fi studji interlaboratorji b'sustanzi kimiċi magħżula biex jintwerew ir-rilevanza u l-affidabbiltà tal-assaġġ għad-detezzjoni ta' sustanzi kimiċi li jħallu impatt fuq ir-riproduzzjoni tal-ħut b'diversi mekkaniżmi, inklużi modalitajiet endokrinali (1, 2, 3, 4, 5 ). Il-punti tat-tmiem kollha tal-linja gwida tat-test tal-OECD ġew ivvalidati fuq il-karpjun buras u subsett ta' punti tat-tmiem ġie vvalidat fuq il-medaka Ġappuniża (jiġifieri l-vitelloġenina u l-karatteristiċi sesswali sekondarji) u fuq iż-żebra (jiġifieri vitelloġenina). Il-ħidma ta' validazzjoni ġiet riveduta permezz ta' evalwazzjoni bejn il-pari minn bord ta' esperti nnominati mill-Koordinaturi Nazzjonali tal-Programm tal-Linji Gwida tat-Test tal-OECD (6) u minn bord ta' esperti indipendenti kkummissjonati mill-Aġenzija għall-Ħarsien Ambjentali tal-Istati Uniti (29). L-assaġġ mhuwiex imfassal biex jidentifika mekkaniżmi speċifiċi ta' tfixkil ormonali minħabba li l-annimali tat-test għandhom assi ipotalamika-pitwitarja-gonadali (HPG) intatta, li jista' jkollha rispons għal sustanzi kimiċi li għandhom impatt fuq l-assi HPG f'livelli differenti.
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Dan il-metodu ta' ttestjar jiddeskrivi assaġġ ta' skrinjar in vivo li fih ħut maskili sesswalment matur u ħut femminili li jkun qed ibid jinżammu flimkien u jiġu esposti għal sustanza kimika matul parti limitata miċ-ċiklu tal-ħajja tagħhom (21 jum). Fi tmiem il-perjodu ta' esponiment ta' 21 jum, jitkejlu żewġ punti ta' tmiem bijomarkaturi fl-irġiel u n-nisa bħala indikaturi tal-attività endokrinali tas-sustanza kimika tat-test; dawn il-punti ta' tmiem huma l-vitelloġenina u l-karatteristiċi sesswali sekondarji. Il-vitelloġenina titkejjel fil-karpjun buras, fil-medaka Ġappuniża u fiż-żebra, filwaqt li l-karatteristiċi sesswali sekondarji jitkejlu fil-karpjun buras u fil-medaka Ġappuniża. Barra minn hekk, il-fekondità kwantitattiva tiġi mmonitorjata kuljum matul it-test. Il-gonadi jiġu ppreservati wkoll u l-istopatoloġija tista' tiġi evalwata sabiex tkun ivvalutata l-idoneità riproduttiva tal-annimali tat-test u tiżdied mal-piż tal-evidenza ta' punti tat-tmiem oħrajn.
                              
                           
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Dan il-bijoassaġġ iservi bħala assaġġ ta' skrinjar riproduttiv in vivo u l-applikazzjoni tiegħu għandha titqies fil-kuntest tal-“Qafas Kunċettwali tal-OECD għall-Ittestjar u l-Valutazzjoni ta' Sustanzi Kimiċi li Jfixklu s-Sistema Endokrinali” (30). F'dan il-Qafas Kunċettwali, l-Assaġġ tar-Riproduzzjoni Fuq Żmien Qasir huwa propost fil-Livell 3 bħala assaġġ in vivo li jipprovdi dejta dwar il-mekkaniżmu/i jew il-passaġġ(i) endokrinali magħżula.
                              
                           KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Normalment il-vitelloġenina (VTG) tiġi prodotta mill-fwied ta' vertebrati ovipari femminili bħala rispons għall-estroġenu endoġenu li jkun qed jiċċirkola. Hija prekursur tal-proteini tal-isfar tal-bajd u, ladarba tiġi prodotta fil-fwied, tgħaddi mad-demm u tidħol fl-ovarji, fejn tiġi assorbita u modifikata mill-bajd li jkun qed jiżviluppa. Il-vitelloġenina hija kważi intraċċabbli fil-plażma ta' ħut femminili u maskili immaturi għaliex ma għandhomx biżżejjed estroġenu jiċċirkola; madankollu, il-fwied kapaċi jissintetizza u jnixxi l-vitelloġenina bħala rispons għal stimulazzjoni tal-estroġenu eżoġenu.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Il-kejl tal vitelloġenina jservi għad-detezzjoni ta' sustanzi kimiċi li għandhom diversi modi ta' azzjoni estroġenika. Id-detezzjoni ta' sustanzi kimiċi estroġeniċi tista' ssir bil-kejl tal-induzzjoni tal-vitelloġenina fil-ħut maskili, u ġiet dokumentata sew fil-letteratura xjentifika evalwata bejn il-pari (eż. (7)). L-induzzjoni tal-vitelloġenina ntweriet ukoll wara espożizzjoni għal androġeni aromatizzabbli (8, 9). Tnaqqis fil-livell ta' estroġenu li jiċċirkola fin-nisa, pereżempju, permezz tal-inibizzjoni tal-aromatażi li tikkonverti l-androġenu endoġenu f'estroġenu naturali 17β-estradjol, jikkawża tnaqqis fil-livell ta' vitelloġenina, li jintuża għad-detezzjoni ta' sustanzi kimiċi li għandhom karatteristiċi inibitorji tal-aromatażi (10, 11). Ir-rilevanza bijoloġika tar-rispons tal-vitelloġenina wara inibizzjoni estroġenika/tal-aromatażi hija stabbilita u ġiet iddokumentata b'mod estensiv. Madankollu, huwa possibbli wkoll li l-produzzjoni tal-VTG fin-nisa tiġi affettwata mit-tossiċità ġenerali u modi ta' azzjoni tossiċi mhux endokrinali, eż. epatotossiċità.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Ġew żviluppati b'suċċess diversi metodi ta' kejl u dawn ġew standardizzati għall-użu ta' rutina. Dan huwa l-każ fil-metodi ta' Assaġġ ta' Immunoassorbiment Enzimatiku (ELISA) speċifiċi għall-ispeċi li jużaw l-immunokimika għall-kwantifikazzjoni tal-VTG prodotta f'kampjuni żgħar tad-demm jew tal-fwied miġbura minn ħut individwali (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). Għall-kejl tal-VTG jittieħed kampjun tad-demm tal-karpjun buras, id-demm taż-żebra jew l-omoġenat tar-ras/denb, u l-fwied tal-medaka. Fil-medaka, hemm korrelazzjoni tajba bejn il-VTG imkejla mid-demm u mill-fwied (19). L-Appendiċi 6 jipprovdi l-proċeduri rrakkomandati għall-ġbir tal-kampjuni għal analiżi tal-VTG. Kits għall-kejl tal-vitelloġenina jistgħu jinkisbu faċilment; dawn il-kits għandhom ikunu bbażati fuq metodu ELISA vvalidat li jkun speċifiku għall-ispeċi.
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Il-karatteristiċi sesswali sekondarji f'ħut maskili ta' ċerti speċijiet jidhru fuq barra, huma kwantifikabbli u jirrispondu għal-livelli ta' androġeni endoġeni li jiċċirkolaw; dan huwa l-każ għall-karpjun buras u l-medaka — iżda mhux għaż-żebra, li ma għandhiex karatteristiċi sesswali sekondarji kwantifikabbli. In-nisa jżommu l-kapaċità li jiżviluppaw karatteristiċi sesswali sekondarji maskili, meta jiġu esposti għal sustanzi kimiċi androġeniċi fl-ilma. Hemm bosta studji disponibbli fil-letteratura xjentifika li jiddokumentaw dan it-tip ta' rispons fil-karpjun buras (20) u fil-medaka (21). Tnaqqis fil-karatteristiċi sesswali sekondarji fl-irġiel għandu jiġi interpretat b'kawtela minħabba saħħa statistika dgħajfa, u għandu jkun ibbażat fuq ġudizzju espert u l-piż tal-evidenza. Hemm limitazzjonijiet dwar l-użu taż-żebra f'dan assaġġ, minħabba n-nuqqas ta' karatteristiċi sesswali sekondarji kwantifikabbli li jirrispondu għal sustanzi kimiċi b'effetti androġeniċi.
                              
                           
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Fil-karpjun buras, l-indikatur ewlieni ta' esponiment androġeniku eżoġenu huwa l-għadd ta' tuberkuli tan-namra (nuptial tubercles) li jinsabu fuq imnieħer il-ħuta femminili. Fil-medaka, l-għadd ta' proċessi papillari jikkostitwixxi l-markatur ewlieni ta' esponiment eżoġenu għal sustanzi kimiċi androġeniċi f'ħut femminili. L-Appendiċi 5A u l-Appendiċi 5B jindikaw il-proċeduri rrakkomandati li għandhom jiġu segwiti għall-evalwazzjoni tal-karatteristiċi sesswali fil-karpjun buras u fil-medaka, rispettivament.
                              
                           
                              
                                 9.
                              
                              
                                 L-assaġġ ta' 21 jum jinkludi l-evalwazzjoni tal-produzzjoni kwantitattiva tal-bajd u l-preservazzjoni tal-gonadi għal eżaminazzjoni fakultattiva tal-istopatoloġija. Xi awtoritajiet regolatorji jistgħu jirrikjedu dan il-punt ta' tmiem addizzjonali għal evalwazzjoni aktar sħiħa tal-idoneità riproduttiva tal-annimali tat-test, jew f'dawk il-każijiet fejn il-vitelloġenina u l-karatteristiċi sesswali sekondarji ma rrispondewx għall-esponiment kimiku. Għalkemm xi punti ta' tmiem jistgħu jkunu dijanjostiċi ħafna (eż. induzzjoni tal-VTG fl-irġiel u formazzjoni tat-tuberkuli fin-nisa), mhux il-punti tat-tmiem kollha (eż. fekondità u istopatoloġija gonadali) fl-assaġġ huma maħsuba biex jidentifikaw b'mod inekwivoku l-mekkaniżmi ċellulari speċifiċi ta' azzjoni. Minflok, il-firxa ta' punti ta' tmiem, b'mod kollettiv, tippermetti li jsiru inferenzi fir-rigward tad-disturbanzi endokrinali possibbli u, b'hekk, tipprovdi gwida għal aktar ittestjar. Għalkemm mhijiex speċifika għall-endokrini, il-fekondità, minħabba s-sensittività murija minnha fost is-sustanzi kimiċi attivi endokrinali magħrufa (5), hija punt ta' tmiem importanti li jrid jiġi inkluż, minħabba li meta dan u punti ta' tmiem oħrajn ma jkunux affettwati, wieħed huwa aktar kunfidenti li kompost mhux probabbli jkun attiv fis-sistema endokrinali. Madankollu, meta l-fekondità tkun affettwata, hija tikkontribwixxi ħafna għall-inferenzi fil-piż tal-evidenza. F'dan il-metodu ta' ttestjar hija pprovduta gwida dwar l-interpretazzjoni tad-dejta u l-aċċettazzjoni tar-riżultati tat-test.
                              
                           
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Id-definizzjonijiet użati f'dan il-metodu ta' ttestjar huma mogħtija fl-Appendiċi 1.
                              
                           IL-PRINĊIPJU TAT-TEST
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Fl-assaġġ, il-ħut maskili u dawk femminili li jkunu fi stat riproduttiv jiġu esposti f'reċipjenti tat-test flimkien. L-istat adult u riproduttiv tagħhom jippermetti sabiex issir differenzjazzjoni ċara bejn is-sessi, u b'hekk tkun tista' ssir analiżi relatata mas-sess ta' kull punt ta' tmiem, u jiżgura s-sensittività tagħhom lejn sustanzi kimiċi esoġeni. Fi tmiem it-test, is-sess jiġi kkonfermat permezz ta' eżami makroskopiku tal-gonadi wara ftuħ ventrali tal-addome b'imqass. Fl-Appendiċi 2 tingħata ħarsa ġenerali lejn il-kundizzjonijiet rilevanti tal-bijoassaġġ. Normalment, l-assaġġ jinbeda b'kampjun ta' ħut minn popolazzjoni li tkun f'kundizzjoni riproduttiva; ma għandhomx jintużaw annimali li qed jixjieħu. Fis-sezzjoni dwar l-Għażla tal-ħut hija pprovduta gwida dwar l-età tal-ħut u dwar l-istatus riproduttiv. L-assaġġ isir permezz ta' tliet konċentrazzjonijiet ta' sustanzi kimiċi li jintużaw għall-espożizzjoni kif ukoll kontroll tal-ilma, u kontroll tas-solvent jekk ikun hemm bżonn. Għaż-żebra jintużaw żewġ reċipjenti jew repliki għal kull trattament (kull reċipjent ikun fih 5 irġiel u 5 nisa). Għall-karpjun buras jintużaw erba' reċipjenti jew repliki għal kull trattament (kull reċipjent ikun fih 2 irġiel u 4 nisa). Dan isir biex tiġi akkomodata l-imġiba territorjali tal-karpjun buras maskili filwaqt li jinżamm assaġġ b'saħħtu biżżejjed. Għall-medaka jintużaw erba' reċipjenti jew repliki għal kull trattament (kull reċipjent ikun fih 3 irġiel u 3 nisa). L-espożizzjoni ssir għal 21 jum u l-kampjunar tal-ħut isir fil-21 jum tal-esponiment. Il-fekondità kwantitattiva tiġi mmonitorjata kuljum.
                              
                           
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Mal-kampjunar fil-jum 21, l-annimali kollha jinqatlu bla tbatija. Il-karatteristiċi sesswali sekondarji jitkejlu fil-karpjun buras u fil-medaka (ara l-Appendiċi 5A u l-Appendiċi 5B); fiż-żebra u l-karpjun buras jinġabru kampjuni tad-demm għad-determinazzjoni tal-vitelloġenina, inkella jistgħu jinġabru r-ras/id-denb għad-determinazzjoni tal-vitelloġenina fiż-żebra (Appendiċi 6); fil-medaka, il-fwied jinġabar għall-analiżi tal-VTG (Appendiċi 6); il-gonadi jinżammu jew magħqudin flimkien bħala ħaġa sħiħa jew inkella mifrudin għal evalwazzjoni istopatoloġika potenzjali (22).
                              
                           IL-KRITERJI TA' AĊĊETTAZZJONI TAT-TEST
                     
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Biex ir-riżultati tat-test ikunu aċċettabbli, japplikaw il-kundizzjonijiet li ġejjin:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             il-mortalità fil-kontrolli tal-ilma (jew tas-solvent) ma għandhiex taqbeż l-10 fil-mija fi tmiem il-perjodu ta' esponiment;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             matul il-perjodu ta' esponiment, il-konċentrazzjoni ta' ossiġenu dissolt għandha tilħaq minimu ta' 60 fil-mija tal-valur tas-saturazzjoni tal-arja (ASV);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             it-temperatura tal-ilma ma għandhiex tvarja b'aktar minn ± 1,5 °C bejn ir-reċipjenti tat-test fi kwalunkwe ħin matul il-perjodu ta' esponiment u għandha tinżamm fi ħdan 2 °C tal-meded tat-temperaturi speċifikati għall-ispeċi tat-test (Appendiċi 2);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             għandha tkun disponibbli evidenza li turi li l-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test fis-soluzzjoni jkunu nżammu b'mod sodisfaċenti fi ħdan ± 20 % tal-valuri medji mkejla;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             evidenza li l-ħut qed jirriproduċi b'mod attiv fir-repliki kollha qabel Jinbeda esponiment kimiku u fir-repliki ta' kontroll matul it-test.
                                          
                                       
                           DESKRIZZJONI TAL-METODU
                     
                        Apparat
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Tagħmir normali tal-laboratorju u speċjalment dan li ġej:
                                 
                                             a.
                                          
                                          
                                             ossiġenometri u apparati li jkejlu l-pH;
                                          
                                       
                                             b.
                                          
                                          
                                             tagħmir għad-determinazzjoni tal-ebusija u l-alkalinità tal-ilma;
                                          
                                       
                                             c.
                                          
                                          
                                             apparat adegwat għall-kontroll tat-temperatura u preferibbilment monitoraġġ kontinwu;
                                          
                                       
                                             d.
                                          
                                          
                                             tankijiet magħmulin minn materjal kimiku inerti u ta' kapaċità adattata b'rabta mad-densità rrakkomandata tat-tagħbija u tal-istokkjar (ara l-Appendiċi 2);
                                          
                                       
                                             e.
                                          
                                          
                                             sottostrat tal-bidien għall-karpjun buras u ż-żebra, l-Appendiċi 4 jagħti d-dettalji neċessarji.
                                          
                                       
                                             f.
                                          
                                          
                                             bilanċ preċiż biżżejjed (jiġifieri preċiż sa ± 0.5mg).
                                          
                                       
                           
                        Ilma
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 Kwalunkwe ilma li fih l-ispeċi tat-test juru sopravivenza u tkabbir adegwat fit-tul jista' jintuża bħala ilma tat-test. Għandu jkun ta' kwalità kostanti matul il-perjodu tat-test. Il-pH tal-ilma għandha tkun fil-medda ta' 6.5 sa 8.5, iżda matul test speċifiku għandha tkun f'medda ta' ± 0.5 unitajiet tal-pH. Sabiex jiġi żgurat li l-ilma tad-dilwizzjoni ma jinfluwenzax bla bżonn ir-riżultat tat-test (pereżempju billi jbiddel is-sustanza kimika tat-test); għandhom jittieħdu kampjuni f'intervalli sabiex jiġu analizzati. Għandu jsir il-kejl tal-metalli tqal (eż. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), l-anjoni u l-katjoni kbar (eż. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl– u SO4
                                    2–), il-pestiċidi (eż. pestiċidi organofosforiċi totali u pestiċidi organokloriniċi totali), il-karbonju organiku totali u s-solidi sospiżi, pereżempju, kull tliet xhur meta l-ilma tad-dilwizzjoni jkun magħruf li huwa relattivament kostanti fil-kwalità. Jekk ikun intwera li l-kwalità tal-ilma hija kostanti matul tal-anqas sena, id-determinazzjonijiet jistgħu jkunu inqas spissi u l-intervalli jistgħu jittawlu (eż. kull sitt xhur). Xi karatteristiċi kimiċi ta' ilma b'dilwizzjoni aċċettabbli huma elenkati fl-Appendiċi 3.
                              
                           
                        Is-soluzzjonijiet tat-test
                     
                     
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Is-soluzzjonijiet tat-test tal-konċentrazzjonijiet magħżula jiġu preparati billi tiġi dilwita soluzzjoni ewlenija. Idealment, is-soluzzjoni ewlenija għandha tiġi ppreparata permezz ta' sempliċi tħallit jew theżżiż tas-sustanza kimika tat-test f'ilma tad-dilwizzjoni bl-użu ta' mezzi mekkaniċi (eż. tħawwid jew ultrasonikazzjoni). Biex tinkiseb soluzzjoni ewlenija konċentrata adegwata jistgħu jintużaw kolonni ta' saturazzjoni (kolonni ta' solubilità). L-użu ta' portatur ta' solvent mhuwiex rakkomandat. Madankollu, f'każ li jkun hemm bżonn ta' solvent, fl-istess ħin għandu jsir kontroll tas-solvent, fl-istess konċentrazzjoni tas-solvent bħat-trattamenti kimiċi; Għal sustanzi kimiċi li diffiċli jiġu ttestjati, solvent jista' teknikament ikun l-aħjar soluzzjoni; għandu jiġi kkonsultat id-Dokument ta' Gwida tal-OECD dwar l-ittestjar tat-tossiċità akwatika ta' sustanzi u taħlitiet diffiċli (23). L-għażla tas-solvent tiġi ddeterminata mill-proprjetajiet kimiċi tas-sustanza jew tat-taħlita. Id-Dokument ta' Gwida tal-OECD jirrakkomanda massimu ta' 100μl/l, li għandu jiġi osservat. Madankollu, reviżjoni riċenti (24) enfasizzat fuq tħassib addizzjonali meta jintużaw solventi għall-ittestjar tal-attività fis-sistema endokrinali. Għalhekk, huwa rrakkomandat li l-konċentrazzjoni tas-solvent, jekk ikun meħtieġ, tiġi minimizzata meta dan ikun teknikament fattibbli (skont il-proprjetajiet fiżikokimiċi tas-sustanza kimika tat-test).
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Għandha tintuża sistema ta' test bi fluss kontinwu. Sistema bħal din tiddistribwixxi u tiddilwixxi b'mod kontinwu soluzzjoni ewlenija tas-sustanza kimika tat-test (eż. pompa tal-kejl, dilwitur proporzjonali, sistema ta' saturazzjoni) sabiex twassal serje ta' konċentrazzjonijiet fil-kompartimenti tat-test. Ir-rati tal-fluss tas-soluzzjonijiet ewlenin u tal-ilma tad-dilwizzjoni għandhom jiġu ċċekkjati kull ċertu żmien, idealment kuljum, matul it-test u m'għandhomx ivarjaw b'aktar minn 10 % matul it-test. Għandha tingħata attenzjoni biex jiġi evitat l-użu ta' tubi tal-plastik ta' grad baxx jew materjal ieħor li jista' jkun fih sustanzi kimiċi bijoloġikament attivi. Meta jkun qed jintgħażel il-materjal għas-sistema bi fluss kontinwu, għandha titqies il-possibilità li s-sustanza kimika tat-test tiġi adsorbita f'dan il-materjal.
                              
                           
                        Iż-żamma tal-ħut
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 Il-ħut tat-test għandu jintgħażel minn popolazzjoni tal-laboratorju, idealment minn stokk wieħed, li jkun idderra għal mill-inqas ġimgħatejn qabel it-test fil-kondizzjonijiet ta' kwalità tal-ilma u ta' illuminazzjoni li jkunu simili għal dawk użati fit-test. Importanti li r-rata tat-tagħbija u d-densità tal-istokkjar (għad-definizzjonijiet, ara l-Appendiċi 1) jkunu xierqa għall-ispeċi tat-test użata (ara l-Appendiċi 2).
                              
                           
                              
                                 19.
                              
                              
                                 Wara perjodu ta' 48 siegħa li fih il-ħut jitħallew joqogħdu, jiġu rreġistrati l-mortalitajiet u jiġu applikati l-kriterji li ġejjin:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             mortalitajiet ta' aktar minn 10 % tal-popolazzjoni f'sebat ijiem: jintrema l-lott kollu;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             mortalitajiet ta' bejn 5 % u 10 % tal-popolazzjoni: akklimatizzazzjoni għal sebat ijiem oħra; jekk ikun hemm mortalità ogħla minn 5 % matul it-tieni sebat ijiem, il-lott kollu jitwarrab;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             mortalitajiet ta' inqas minn 5 % tal-popolazzjoni f'sebat ijiem: il-lott jiġi aċċettat.
                                             
                                          
                                       
                           
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Matul il-perjodu ta' akklimatizzazzjoni, fil-perjodu ta' qabel l-esponiment, jew matul il-perjodu ta' esponiment l-ħut m'għandux jingħata kura għal mard.
                              
                           
                        Perjodu ta' qabel l-esponiment u l-għażla tal-ħut
                     
                     
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Il-perjodu ta' qabel l-esponiment ta' bejn ġimgħa u ġimgħatejn huwa rrakkomandat għall-annimali mqiegħda f'reċipjenti simili għat-test proprju. Matul il-perjodu ta' żamma u matul il-fażi ta' esponiment, il-ħut għandu jiġi mitmugħ ad libitum. Il-fażi ta' esponiment tinbeda b'ħut adult sesswalment dimorfiku minn provvista tal-laboratorju ta' annimali maturi biżżejjed għar-riproduzzjoni (eż. b'karatteristiċi sesswali sekondarji li jidhru fir-rigward tal-karpjun buras u l-medaka), u li jkunu qed ibidu b'mod attiv. Għal gwida ġenerali biss (u dan ma għandux jitqies mingħajr l-osservazzjoni tal-istatus riproduttiv propju ta' lott partikolari ta' ħut), il-karpjuni buras għandu jkollhom madwar 20 (± 2) ġimgħa, jekk wieħed jassumi li jkunu ġew ikkulturati f'temperatura ta' 25 ± 2 °C matul ħajjithom. Il-medaka Ġappuniża għandu jkollha madwar 16 (± 2)il-ġimgħa, jekk wieħed jassumi li jkunu ġew ikkulturati f'temperatura ta' 25 ± 2 °C matul ħajjithom. Iż-żebra għandu jkollha madwar 16 (± 2)il-ġimgħa, jekk wieħed jassumi li jkunu ġew ikkulturati f'temperatura ta' 26 ± 2 °C matul ħajjithom. Il-produzzjoni tal-bajd għandha tiġi vvalutata kuljum matul il-fażi ta' qabel l-esponiment. Huwa rrakkomandat li r-riproduzzjoni tiġi osservata fit-tankijiet irreplikati kollha qabel l-inklużjoni fil-fażi tal-esponiment tal-assaġġ. F'dan l-istadju, ma tistax tiġi pprovduta gwida kwantitattiva dwar il-produzzjoni tal-bajd mixtieqa ta' kuljum, iżda huwa relattivament komuni li jiġu osservati bidien medji ta' > 10 bajdiet/femminili/jum għal kull speċi. Għandu jintuża disinn bi blokki aleatorji skont l-output tal-produzzjoni tal-bajd sabiex jiġu allokati repliki għad-diversi livelli sperimentali bil-għan li tiġi żgurata distribuzzjoni bilanċjata tar-repliki.
                              
                           ID-DISINN TAT-TEST
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Jintużaw tliet konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test, kontroll wieħed (tal-ilma) u, jekk ikun hemm bżonn, kontroll tas-solvent. Id-dejta tista' tiġi analizzata sabiex jiġu determinati differenzi statistikament sinifikanti bejn ir-risponsi għat-trattament u għall-kontroll. Dawn l-analiżijiet ser jindikaw jekk hemmx il-ħtieġa ta' ittestjar ulterjuri aktar fit-tul għal effetti avversi (jiġifieri, is-sopravivenza, l-iżvilupp, it-tkabbir u r-riproduzzjoni) għas-sustanza kimika, aktar milli għall-użu fil-valutazzjoni tar-riskju (25).
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Għaż-żebra, fil-jum 21 tal-esperiment, jittieħdu kampjuni ta' rġiel u nisa minn kull livell ta' trattament (5 irġiel u 5 nisa f'kull wieħed miż-żewġ repliki) u mill-kontroll(i) għall-kejl tal-vitelloġenina. Għall-medaka, fil-jum 21 tal-esperiment, jittieħdu kampjuni ta' rġiel u nisa minn kull livell ta' trattament (3 irġiel u 3 nisa f'kull wieħed mill-erba' repliki) u mill-kontroll(i) għall-kejl tal-vitelloġenina u tal-karatteristiċi sesswali sekondarji. Għall-karpjun buras, fil-jum 21 ta' esponiment, l-irġiel u n-nisa (2 irġiel u 4 nisa f'kull wieħed mill-erba' repliki) u mill-kontroll(i) jiġu kampjunati għall-kejl tal-vitelloġenina u tal-karatteristiċi sesswali sekondarji. Hija meħtieġa valutazzjoni kwantitattiva tal-fekondità u t-tessuti gonadali għandhom jitqiegħdu sħaħ jew mifrudin tkun tista' ssir evalwazzjoni istopatoloġika, jekk tkun meħtieġa.
                              
                           
                        L-għażla tal-konċentrazzjonijiet tat-test
                     
                     
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Għall-finijiet ta' dan it-test, l-ogħla konċentrazzjoni tat-test għandha tiġi stabbiliti mill-konċentrazzjoni massima tollerata (MTC) li tiġi ddeterminata minn range finder jew minn dejta oħra dwar it-tossiċità, jew 10 mg/l, jew is-solubilità massima fl-ilma, skont liema tkun l-aktar baxxa. L-MTC hija definita bħala l-ogħla konċentrazzjoni tat-test tas-sustanza kimika li twassal għal mortalità ta' inqas minn 10 %. L-użu ta' dan l-approċċ jassumi li teżisti dejta empirika dwar tossiċità akuta jew dejta oħra dwar it-tossiċità li minnha tista' tiġi stmata l-MTC. L-istima tal-MTC tista' ma tkunx eżatta u normalment teħtieġ ċertu ġudizzju professjonali.
                              
                           
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Huma meħtieġa tliet konċentrazzjonijiet tat-test, spazjati b'fattur kostanti li ma jaqbiżx l-10, u kontroll ta' ilma tad-dilwizzjoni (u kontroll tas-solvent jekk ikun meħtieġ). Huwa rrakkomandat li l-fatturi ta' spazjar jkunu f'firxa ta' bejn 3.2 u 10.
                              
                           PROĊEDURA
                     
                        L-għażla u l-użin tal-ħut tat-test
                     
                     
                              
                                 26.
                              
                              
                                 Huwa importanti li fil-bidu tal-assaġġ tiġi minimizzata l-varjazzjoni fil-piż tal-ħut. Il-meded ta' daqsijiet adattati għall-ispeċi differenti rrakkomandati għall-użu f'dan it-test huma mogħtija fl-Appendiċi 2. Għal-lott kollu ta' ħut użat fit-test, il-medda tal-piżijiet individwali għall-ħut maskili u femminili fil-bidu tat-test għandha, jekk possibbli, tinżamm bejn ± 20 % tal-piż medju aritmetiku tal-istess sess. Huwa rrakkomandat li qabel it-test jintiżen sottokampjun tal-istokk tal-ħut sabiex jiġi stmat il-piż medju.
                              
                           
                        Kundizzjonijiet tal-Esponiment
                     
                     
                        Durata
                     
                     
                              
                                 27.
                              
                              
                                 It-test idum għaddej 21 jum, wara perjodu ta' qabel l-esponiment. Il-perjodu ta' qabel l-esponiment rrakkomandat huwa ta' bejn ġimgħa u ġimgħatejn.
                              
                           
                        Tmigħ
                     
                     
                              
                                 28.
                              
                              
                                 Il-ħut għandu jiġi mitmugħ ad libitum b'ikel addattat (Appendiċi 2) b'rata suffiċjenti biex tinżamm il-kundizzjoni tal-ġisem. Għandha tingħata attenzjoni biex jiġi evitat tkabbir mikrobiku u turbidità fl-ilma. Bħala gwida ġenerali, ir-razzjon ta' kuljum jista' jinqasam f'żewġ jew tliet porzjonijiet ugwali għal tmigħ multiplu kuljum, separat b'mill-inqas tliet sigħat bejn kull tmigħ. Huwa aċċettabbli li jingħata razzjon akbar uniku b'mod partikolari għal tmiem il-ġimgħa. Il-ħut m'għandux jingħata x'jiekol għal 12-il siegħa qabel il-kampjunar/nekroskopija.
                              
                           
                              
                                 29.
                              
                              
                                 L-ikel tal-ħut għandu jiġi evalwat għall-preżenza ta' kontaminanti bħal pestiċidi organokloriniċi, idrokarboni aromatiċi poliċikliċi (PAHs), bifenili poliklorinati (PCBs). Għandu jiġi evitat ikel b'livell għoli ta' fitoestroġeni li jista' jikkomprometti r-rispons tal-assaġġ għal agonisti magħrufa tal-estroġenu (eż. 17b- estradiol).
                              
                           
                              
                                 30.
                              
                              
                                 Ikel mhux mikul u materjal tar-rawt għandu jitneħħa mir-reċipjent tat-test tal-inqas darbtejn fil-ġimgħa, eż. billi l-qiegħ ta' kull tank jitnaddaf sew permezz ta' sifun.
                              
                           
                        Id-dawl u t-temperatura
                     
                     
                              
                                 31.
                              
                              
                                 Il-fotoperjodu u t-temperatura tal-ilma għandhom ikunu adattati għall-ispeċi tat-test (ara Appendiċi 2).
                              
                           
                        Il-Frekwenza tal-Kejl u d-Determinazzjonijiet Analitiċi
                     
                     
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Qabel jibda l-perjodu ta' qabel l-esponiment, għandu jiġi żgurat li s-sistema tat-twassil tas-sustanza kimika taħdem kif suppost. Għandhom jiġu stabbiliti l-metodi analitiċi kollha meħtieġa, inkluż għarfien suffiċjenti dwar l-istabilità kimika fis-sistema tat-test. Matul it-test, il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test jiġu determinati f'intervalli regolari, kif ġej: preferibbilment, ir-rati tal-fluss tas-soluzzjoni ewlenija dilwenti u tossikanti għandhom jiġu vverifikati kuljum, iżda mill-inqas darbtejn fil-ġimgħa, u ma għandhomx ivarjaw b'aktar minn 10 % matul it-test. Huwa rrakkomandat li l-konċentrazzjonijiet tas-sustanzi kimiċi tat-test innifsu jitkejlu fir-reċipjenti kollha fil-bidu tat-test u f'intervalli ta' ġimgħa wara dan.
                              
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Huwa rrakkomandat li r-riżultati jkunu bbażati fuq il-konċentrazzjonijiet imkejla. Madankollu, jekk matul it-test il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test fis-soluzzjoni tkun inżammet b'mod sodisfaċenti bejn ±20 % tal-konċentrazzjoni nominali, ir-riżultati jkunu jistgħu jiġu bbażati fuq valuri nominali jew valuri mkejla.
                              
                           
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Il-kampjuni jistgħu jeħtieġu jiġu ffiltrati (eż. bl-użu ta' pori ta' μ0.45 μm) jew jiġu ċentrifugati. Jekk ikun hemm bżonn, imbagħad iċ-ċentrifugazzjoni hija l-proċedura rrakkomandata. Madankollu, jekk il-materjal tat-test ma jiġix adsorbit mill-filtri, il-filtrazzjoni tista' tkun aċċettabbli wkoll.
                              
                           
                              
                                 35.
                              
                              
                                 Matul it-test, l-ossiġenu dissolt, it-temperatura, u l-pH għandhom jitkejlu fir-reċipjenti kollha tat-test tal-inqas darba fil-ġimgħa. L-ebusija u l-alkalinità totali għandhom jitkejlu fil-kontrolli u f'reċipjent wieħed fl-ogħla konċentrazzjoni tal-anqas darba fil-ġimgħa. Idealment, it-temperatura għandha tiġi ssorveljata kontinwament f'mill-inqas reċipjent wieħed tat-test.
                              
                           
                        Osservazzjonijiet
                     
                     
                              
                                 36.
                              
                              
                                 Għadd ta' risponsi ġenerali (eż. sopravivenza) u risponsi bijoloġiċi ewlenin (eż. il-livelli tal-vitelloġenina) jiġu vvalutati matul l-assaġġ jew fi tmiem l-assaġġ. Jeħtieġ li kuljum isir il-monitoraġġ kwantitattiv tal-fekondità. Il-kejl u l-valutazzjoni ta' dawn il-punti ta' tmiem u l-utilità tagħhom huma deskritti hawn taħt.
                              
                           
                        Sopravivenza
                     
                     
                              
                                 37.
                              
                              
                                 Matul il-perjodu tat-test, il-ħut għandu jiġi eżaminat kuljum u kwalunkwe mortalità għandha tiġi rreġistrata u l-ħut mejjet għandu jitneħħa malajr kemm jista' jkun. Il-ħut mejjet m'għandux jiġi sostitwit la fir-reċipjent tal-kontroll u lanqas fir-reċipjent tat-trattament. Is-sess tal-ħut li jmut matul it-test għandu jiġi determinat permezz ta' evalwazzjoni makroskopika tal-gonadi.
                              
                           
                        Imġiba u dehra
                     
                     
                              
                                 38.
                              
                              
                                 Għandha tittieħed nota ta' kwalunkwe mġiba abnormali (relatata mal-kontrolli); din tista' tinkludi sinjali ta' tossiċità ġenerali inklużi iperventilazzjoni, għawm mhux ikkoordinat, telf tal-bilanċ u inattivitá jew tmigħ mhux tas-soltu. Barra minn hekk għandha tittieħed nota ta' anormalitajiet esterni (bħal emorraġija, skolorazzjoni). Dawn is-sinjali ta' tossiċità għandhom jiġu kkunsidrati bir-reqqa waqt l-interpretazzjoni tad-dejta peress li jistgħu jindikaw konċentrazzjonijiet li fihom il-bijomarkaturi ta' attività endokrinali ma jkunux affidabbli. Dawn l-osservazzjonijiet tal-imġiba jistgħu anke jipprovdu informazzjoni kwalitattiva biex jinkiseb tagħrif dwar rekwiżiti futuri potenzjali għall-ittestjar tal-ħut. Pereżempju, fil-karpjuni buras, f'irġiel normali jew f'nisa b'karatteristiċi maskili ġiet osservata aggressività territorjali matul esponiment androġeniku; fiż-żebra, l-imġiba karatteristika ta' tgħammir u riproduzzjoni wara li jinxtegħel id-dawl tiddgħajjef jew tiġi mfixkla minn esponiment estroġeniku jew antiandroġeniku.
                              
                           
                              
                                 39.
                              
                              
                                 Billi xi aspetti tad-dehra (primarjament il-kulur) jistgħu jinbidlu malajr bit-tqandil, importanti li l-osservazzjonijiet kwalitattivi jsiru qabel ma l-annimali jitneħħew mis-sistema tat-test. L-esperjenza miksuba sa issa bil-karpjuni buras tissuġġerixxi li, għall-ewwel, xi sustanzi kimiċi attivi fis-sistema endokrinali jistgħu jikkawżaw tibdil fil-karatteristiċi esterni li ġejjin: il-kulur tal-ġisem (ċar jew skur), mudelli ta' kolorazzjoni (il-preżenza ta' strixxi vertikali) u l-forma tal-ġisem (ir-ras u r-reġjun pettorali). Għalhekk, l-osservazzjonijiet dwar id-dehra fiżika tal-ħut għandhom isiru matul it-test, u fi tmiem l-istudju
                              
                           
                        Fekondità
                     
                     
                              
                                 40.
                              
                              
                                 L-osservazzjonijiet kwantitattivi ta' kuljum tar-riproduzzjoni għandhom jiġu rreġistrati fuq bażi rreplikata. Il-produzzjoni tal-bajd għandha tiġi rreġistrata bħala l-għadd ta' bajd/nisa li jibqgħu ħajjin/jum fuq bażi rreplikata. Il-bajd jitneħħa kuljum mill-kompartimenti tat-test. Is-sottostrati riproduttivi għandhom jitqiegħdu fil-kompartimenti tat-test għall-karpjun buras u għaż-żebra sabiex il-ħut ikun jista' jbid f'kundizzjonijiet normali. L-Appendiċi 4 jagħti aktar dettalji tas-sottostrati riproduttivi għaż-żebra (Appendiċi 4A) u għall-karpjun buras (Appendiċi 4B). Mhuwiex meqjus bħala neċessarju li jiġi pprovdut sottostrat riproduttiv għall-medaka.
                              
                           
                        Il-qtil bla tbatija tal-ħut
                     
                     
                              
                                 41.
                              
                              
                                 Fil-jum 21, jiġifieri fi tmiem l-esponiment, il-ħut għandu jiġi ewtanizzat b'ammonti xierqa ta' Trikaina (Trikaina metan sulfonat, Metakaina, MS-222 (CAS 886-86-2), 100-500 mg/l ibbaferjat bi 300 mg/l NaHCO3 (bikarbonat tas-sodju, CAS.144-55-8) biex titnaqqas l-irritazzjoni fil-membrana mukuża; imbagħad jittieħed kampjun tad-demm jew tat-tessut għad-determinazzjoni tal-vitelloġenina, kif spjegat fis-sezzjoni tal-vitelloġenina.
                              
                           
                        Osservazzjoni tal-karatteristiċi sesswali sekondarji
                     
                     
                              
                                 42.
                              
                              
                                 Ċerti sustanzi kimiċi attivi fis-sistema endokrinali jistgħu jikkawżaw tibdil fil-karatteristiċi sesswali sekondarji speċjalizzati (l-għadd ta' tuberkuli tan-namra fil-karpjun buras maskili, il-proċessi papillari fil-medaka maskili). B'mod partikolari, sustanzi kimiċi li jkollhom ċerti modi ta' azzjoni jistgħu jikkawżaw l-okkorrenza anormali ta' karatteristiċi sesswali sekondarji fl-annimali tas-sess oppost; pereżempju, agonisti tar-riċettur tal-androġenu, bħal trenbolon, metiltestosteron u diidrotestosteron, jistgħu jwasslu sabiex il-karpjuni buras femminili jiżviluppaw tuberkuli tan-namra prominenti jew sabiex il-medaka femminili tiżviluppa proċessi papillari (11, 20, 21). Ġie rrapportat ukoll li l-agonisti tar-riċettur tal-estroġenu jistgħu jnaqqsu l-għadd tat-tuberkuli tan-namra u d-daqs tal-kuxxinett tal-kozz dorsali f'irġiel adulti ta' karpjun buras (26, 27). Dawn l-osservazzjonijiet morfoloġiċi grossi jistgħu jipprovdu tagħrif kwalitattiv u kwantitattiv siewi biex jingħata tagħrif dwar rekwiżiti futuri potenzjali għall-ittestjar tal-ħut. L-għadd u d-daqs tat-tuberkuli tan-namra fil-karpjun buras u l-proċessi papillari fil-medaka jistgħu jiġu kkwantifikati b'mod dirett jew b'mod aktar prattiku f'kampjuni ppreservati. Il-proċeduri rrakkomandati għall-evalwazzjoni tal-karatteristiċi sesswali sekondarji fil-karpjun buras u fil-medaka huma disponibbli mill-Appendiċi 5A u mill-Appendiċi 5B, rispettivament.
                              
                           
                        Vitelloġenina (VTG)
                     
                     
                              
                                 43.
                              
                              
                                 Id-demm jinġabar mill-arterja/vina kawdali permezz ta' tubulu kapillari mikroematokritiku eparinizzat, jew inkella permezz ta' titqiba fil-qalb b'siringa. Skont kemm hi kbira l-ħuta, il-volumi tad-demm li jistgħu jinġabru ġeneralment ivarjaw bejn 5 u 60 μl għal kull ħuta individwali għall-karpjuni buras u minn 5-15 μl għal kull ħuta individwali għaż-żebra. Il-plażma tiġi separata mid-demm permezz ta' ċentrifugazzjoni, u tinħażen ma' inibituri tal-proteażi f'temperatura ta' – 80 °C, sakemm tiġi analizzata għall-vitelloġenina. Inkella, fil-medaka jintuża l-fwied, u fiż-żebra jista' jintuża l-omoġenat tar-ras/denb bħala sors ta' tessut għad-determinazzjoni tal-vitelloġenina (Appendiċi 6). Il-kejl tal-VTG għandu jkun imsejjes fuq metodu ELISA omologu vvalidat, bl-użu ta' standard omologu tal-VTG u antikorpi omologi. Huwa rrakkomandat li jintuża metodu li jkun kapaċi jiskopri livelli ta' VTG baxxi daqs ftit ng/ml fil-plażma (jew ng/mg fit-tessut), li huwa l-livell ta' sfond f'ħut maskili li ma jkunx ġie espost.
                              
                           
                              
                                 44.
                              
                              
                                 Il-kontroll tal-kwalità tal-analiżi tal-vitelloġenina jintlaħaq permezz tal-użu ta' standards, bjanki u mill-inqas analiżijiet duplikati. Għal kull metodu ELISA, għandu jsir test għall-effett matriċi (effett ta' dilwizzjoni ta' kampjun) biex jiġi determinat il-fattur minimu tad-dilwizzjoni tal-kampjun. Kull platt ELISA li jintuża għall-assaġġi tal-VTG għandu jinkludi l-kampjuni tal-kontroll tal-kwalità li ġejjin: mill-inqas 6 standards ta' kalibrazzjoni li jkopru l-firxa ta' konċentrazzjonijiet mistennija tal-vitelloġenina u mill-inqas bjank tal-assaġġ vinkolanti mhux speċifiku wieħed (analiżi duplikata). L-assorbiment ta' dawn il-bjanki għandu jkun ta' anqas minn 5 % tal-assorbiment standard massimu ta' kalibrazzjoni. Minn kull kampjun ta' dilwizzjoni jiġu analizzati tal-anqas żewġ alikwoti (well-duplicates). Well-duplicates li jvarjaw b'aktar minn 20 % għandhom jerġgħu jiġu analizzati.
                              
                           
                              
                                 45.
                              
                              
                                 Il-koeffiċjent tal-korrelazzjoni (R2) għall-kurvi ta' kalibrazzjoni għandu jkun ta' aktar minn 0.99. Madankollu, korrelazzjoni għolja mhijiex biżżejjed biex tiggarantixxi tbassir adegwat tal-konċentrazzjoni fil-meded kollha. Minbarra li jkun hemm korrelazzjoni għolja biżżejjed għall-kurva ta' kalibrazzjoni, il-konċentrazzjoni ta' kull standard, kif ikkalkolata mill-kurva ta' kalibrazzjoni, dejjem għandha taqa' bejn 70 u 120 % tal-konċentrazzjoni nominali tiegħu. Jekk il-konċentrazzjonijiet nominali jxaqilbu lil hinn mil-linja ta' rigressjoni tal-kalibrazzjoni (eż. f'konċentrazzjonijiet inqas), jista' jkun hemm bżonn li l-kurva ta' kalibrazzjoni tinqasam f'meded baxxi u għoljin jew li jintuża mudell nonlineari li jaqbel b'mod adegwat mad-dejta dwar l-assorbiment. Jekk il-kurva tinqasam, iż-żewġ segmenti tal-linja għandu jkollhom R2 > 0.99.
                              
                           
                              
                                 46.
                              
                              
                                 Il-limitu ta' detezzjoni (LOD) huwa definit bħala l-konċentrazzjoni tal-inqas standard analitiku, u l-limitu ta' kwantitazzjoni (LOQ) huwa definit bħala l-konċentrazzjoni tal-inqas standard analitiku mmoltiplikata bl-inqas fattur ta' dilwizzjoni.
                              
                           
                              
                                 47.
                              
                              
                                 F'kull jum li fih isiru l-assaġġi tal-vitelloġenina għandu jiġi analizzat kampjun ta' fortifikazzjoni permezz ta' standard ta' referenza interassaġġi (Appendiċi 7). Il-proporzjon tal-konċentrazzjoni mistennija għall-konċentrazzjoni mkejla jiġi rrapportat flimkien mar-riżultati minn kull sett ta' assaġġi li jkunu saru dakinhar.
                              
                           
                        Evalwazzjoni tal-istopatoloġija gonadali
                     
                     
                              
                                 48.
                              
                              
                                 Jista' jkun meħtieġ li ssir istopatoloġija gonadali mill-awtoritajiet regolatorji sabiex ikunu jistgħu jistudjaw l-organu fil-mira fuq l-assi tal-HPG wara l-esponiment kimiku. F'dan ir-rigward, il-gonadi jitqiegħdu sħaħ jew dissezzjonati. Meta tkun meħtieġa istopatoloġija, għandhom jiġu mfittxija risponsi endokrinali speċifiċi fuq il-gonadi fil-valutazzjoni tal-attività endokrinali tas-sustanza kimika tat-test. Dawn ir-risponsi dijanjostiċi essenzjalment jinkludu l-preżenza ta' ooċiti testikulari, iperplażja taċ-ċellula Leydig, tnaqqis fil-formazzjoni tal-isfar tal-bajd, żieda fl-ispermatogonija u iperplażja perifollikulari. Leżjonijiet gonadali oħrajn, bħal atreżja tal-ooċiti, diġenerazzjoni testikulari u bidliet fl-istadji, jista' jkollhom diversi kawżi. Id-dokument ta' Gwida dwar l-istopatoloġija gonadali tal-ħut jispeċifika l-proċeduri li jintużaw fid-dissezzjoni, il-fissazzjoni, is-sezzjonar u l-evalwazzjoni istopatoloġika tal-gonadi (22).
                              
                           DEJTA U RAPPORTAR
                     
                        Valutazzjoni tar-Risponsi tal-Bijomarkatur permezz ta' Analiżi tal-Varjanza (ANOVA)
                     
                     
                              
                                 49.
                              
                              
                                 Biex tiġi identifikata l-attività endokrinali potenzjali ta' sustanza kimika, ir-risponsi jitqabblu bejn il-gruppi ta' trattament u ta' kontroll permezz ta' analiżi tal-varjanza (ANOVA). Meta jintuża kontroll tas-solvent, għandu jsir test statistiku xieraq bejn il-kontroll tal-ilma tad-dilwizzjoni u l-kontroll tas-solvent għal kull punt ta' tmiem. Gwida dwar kif tittratta d-dejta dwar il-kontroll tal-ilma tad-dilwizzjoni u tas-solvent fl-analiżi statistika sussegwenti tista' tinstab fl-OECD, 2006c (28). Id-dejta kollha dwar ir-rispons bijoloġiku għandha tiġi analizzata u rrapportata separatament skont is-sess. Jekk ma jintlaħqux is-suppożizzjonijiet meħtieġa għall-metodi parametriċi — distribuzzjoni mhux normali (eż. it-test ta' Shapiro-Wilk) jew varjanza eteroġena (it-test ta' Bartlett jew it-test ta' Levene), għandha tiġi kkunsidrata l-possibilità li d-dejta tiġi konvertita f'varjanzi omoġenizzati qabel ma ssir l-ANOVA, jew qabel ma ssir ANOVA ponderata. It-test ta' Dunnett (parametriku) fuq tqabbiliet multipli bejn pari jew it-test ta' Mann-Whitney b'aġġustament Bonferroni (mhux parametriku) jista' jintuża għal rispons mhux monotonu għad-doża. Jekk ir-rispons għad-doża ikun kważi monotonu jistgħu jintużaw testijiet statistiċi oħra (eż. it-test ta' Jonckheere-Terpstra jew it-test ta' Williams). Fl-Appendiċi 8 ġiet ipprovduta flowchart statistika biex tgħin fid-deċiżjoni dwar l-aktar test statistiku xieraq li għandu jintuża. Tagħrif addizzjonali jista' jinkiseb ukoll mid-Dokument tal-OECD dwar Approċċi Attwali lejn l-Analiżi Statistika ta' Dejta dwar l-Ekotossiċità (28).
                              
                           
                        Rappurtar tar-riżultati tat-test
                     
                     
                              
                                 50.
                              
                              
                                 Id-dejta tal-istudju għandha tinkludi:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Il-faċilità tal-ittestjar:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-persunal responsabbli u r-responsabilitajiet tal-istudju tiegħu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Kull laboratorju għandu jkun wera profiċjenza fl-użu ta' firxa ta' sustanzi kimiċi rappreżentattivi
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Sustanza kimika tat-test:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Karatterizzazzjoni tas-sustanza kimika tat-test
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         In-natura fiżika u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-metodu u l-frekwenza tal-preparazzjoni tal-konċentrazzjonijiet tat-test
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Informazzjoni dwar l-istabbiltà u l-bijodegradabilità
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Solvent:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-karatterizzazzjoni tas-solvent (in-natura, il-konċentrazzjoni użata)
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Ġustifikazzjoni tal-għażla tas-solvent (jekk ma jkunx ilma)
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Annimali tat-test:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         L-ispeċi u r-razza
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-fornitur u l-faċilità speċifika tal-fornitur,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         L-età tal-ħut fil-bidu tat-test u l-istatus ta' riproduzzjoni
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Dettalji tal-proċedura ta' akklimatizzazzjoni tal-annimali
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-piż tal-ġisem tal-ħut fil-bidu tal-esponiment (minn sottokampjun tal-istokk tal-ħut)
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Kundizzjonijiet tat-test:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         II-proċedura tat-test użata (it-tip tat-test, ir-rata tat-tagħbija, id-densità tal-istokkjar, eċċ.);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-metodu ta' preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ewlenin u r-rata tal-fluss;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-konċentrazzjonijiet nominali tat-test, il-konċentrazzjonijiet tas-soluzzjonijiet tat-test imkejla kull ġimgħa u l-metodu analitiku użat, il-medji tal-valuri mkejla u d-devjazzjonijiet standard fir-reċipjenti tat-test u evidenza li l-kejl jirreferi għall-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test fis-soluzzjoni vera;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-karatteristiċi tal-ilma tad-dilwizzjoni (inkluż il-pH, l-ebusija, l-alkalinità, it-temperatura, il-konċentrazzjoni tal-ossiġenu dissolt, il-livelli ta' klorin residwu, il-karbonju organiku totali, is-solidi sospiżi u kwalunkwe kejl ieħor li jkun sar)
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-kwalità tal-ilma fir-reċipjenti tat-test: il-pH, l-ebusija, it-temperatura u l-konċentrazzjoni tal-ossiġenu dissolt;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Informazzjoni ddettaljata dwar it-tmigħ (eż. it-tip ta' ikel, is-sors, l-ammont li ngħata u l-frekwenza u analiżijiet għal kontaminanti relevanti jekk disponibbli (eż. PCBs, PAHs u pestiċidi organoklorurati).
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Riżultati
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Evidenza li l-kontrolli jissodisfaw il-kriterji ta' aċċettazzjoni tat-test;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Dejta dwar il-mortalitajiet li jseħħu fi kwalunkwe konċentrazzjoni tat-test u fil-kontroll;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Tekniki analitiċi statistiċi użati, it-trattament tad-dejta u ġustifikazzjoni tat-tekniki użati;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Dejta dwar osservazzjonijiet bijoloġiċi ta' morfoloġija grossa, inklużi l-karatteristiċi sesswali sekondarji, il-produzzjoni tal-bajd u l-vitelloġenina;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Riżultati tal-analiżi tad-dejta, idealment f'forma tabulari u grafika;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Inċidenza ta' kwalunkwe reazzjoni mhux tas-soltu mill-ħut u kwalunkwe effett viżibbli kkawżat mis-sustanza kimika tat-test
                                                      
                                                   
                                       
                           GWIDA GĦALL-INTERPRETAZZJONI U L-AĊĊETTAZZJONI TAR-RIŻULTATI TAT-TEST
                     
                              
                                 51.
                              
                              
                                 Din is-sezzjoni fiha ftit kunsiderazzjonijiet li għandhom jitqiesu fl-interpretazzjoni tar-riżultati tat-test għad-diversi punti ta' tmiem imkejla. Ir-riżultati għandhom jiġu interpretati b'kawtela fejn is-sustanza kimika tat-test tidher li tkun qed tikkawża tossiċità evidenti jew li qed ikollha impatt fuq il-kundizzjoni ġenerali tal-annimal tat-test.
                              
                           
                              
                                 52.
                              
                              
                                 Meta tkun qed tiġi stabbilita l-medda tal-konċentrazzjonijiet tat-test, għandha tingħata attenzjoni biex ma tinqabiżx il-konċentrazzjoni massima tollerata biex tkun tista' ssir interpretazzjoni valida tad-dejta. Importanti li tal-anqas ikun hemm trattament wieħed li fih ma jkunx hemm sinjali ta' effetti tossiċi. Sinjali ta' mard u sinjali ta' effetti tossiċi għandhom jiġu vvalutati u rrapportati f'ċertu dettall. Pereżempju, huwa possibbli li l-produzzjoni tal-VTG fin-nisa tiġi affettwata wkoll mit-tossiċità ġenerali u modi ta' azzjoni tossiċi mhux endokrinali, eż. epatotossiċità. Madankollu, l-interpretazzjoni tal-effetti tista' tiġi sostnuta minn livelli oħra ta' kura li ma jitfixklux mit-tossiċità sistemika.
                              
                           
                              
                                 53.
                              
                              
                                 Hemm xi aspetti li wieħed irid iqis għall-aċċettazzjoni tar-riżultati tat-test. Bħala gwida, il-livelli tal-VTG fi gruppi ta' kontroll tal-irġiel u tan-nisa għandhom ikunu distinti u separati b'madwar tliet ordnijiet ta' kobor fil-karpjun buras u fiż-żebra, u b'madwar ordni uniku ta' kobor għall-medaka. Eżempji tal-medda ta' valuri li wieħed jista' jiltaqa' magħhom fil-gruppi ta' kontroll u ta' kura huma disponibbli fir-rapporti ta' validazzjoni (1, 2, 3, 4). Valuri għolja tal-VTG fl-irġiel ta' kontroll jistgħu jikkompromettu r-rispons tal-assaġġ u l-kapaċità tiegħu li jiskopri agonisti dgħajfa tal-estroġenu. Valuri baxxi tal-VTG fin-nisa ta' kontroll jistgħu jikkompromettu r-risponsività tal-assaġġ u l-ħila tiegħu li jiskopri inibituri tal-aromatażi u antagonisti tal-estroġenu. Biex tinbena dik il-gwida ntużaw l-istudji ta' validazzjoni.
                              
                           
                              
                                 54.
                              
                              
                                 F'dak li għandu x'jaqsam mal-kwantifikazzjoni tal-produzzjoni tal-bajd, dan huwa soġġett għal varjazzjonijiet importanti [il-koeffiċjent tal-varjazzjoni (CV) jista' jvarja minn 20 sa 60 %] li jaffettwaw il-kapaċità tal-assaġġ li jidentifika tnaqqis sinifikanti fil-produzzjoni tal-bajd iżgħar minn 70 %, hekk kif is-CV javviċina 50 % jew aktar. Meta s-CV ikun limitat għal valuri aktar baxxi (madwar 20-30 %), l-assaġġ ikollu qawwa aċċettabbli (80 %) sabiex jidentifika tnaqqis ta' 40-50 % fil-produzzjoni tal-bajd. Id-disinn tat-test użat għall-karpjun buras, inklużi erba' repliki għal kull livell tat-trattament, għandu jippermetti aktar qawwa lill-punt tat-tmiem tal-fekondità, imqabbel ma' disinn tat-test b'2 repliki biss.
                              
                           
                              
                                 55.
                              
                              
                                 Jekk laboratorju ma jkunx għamel l-assaġġ qabel jew jekk ikunu saru bidliet sostanzjali (eż. bidla fir-razza tal-ħut jew tal-fornitur) huwa rrakkomandat li jsir studju tal-profiċjenza teknika. Huwa rrakkomandat li jintużaw sustanzi kimiċi li jkopru firxa ta' modi ta' azzjoni jew impatti fuq għadd tal-punti ta' tmiem tat-test. Fil-prattika, kull laboratorju huwa mħeġġeġ jibni dejta storika ta' kontroll proprja għall-irġiel u għan-nisa u biex jagħmel kimika ta' kontroll pożittiv għall-attività estroġenika (eż. 17β-estradjol f'doża ta' 100 ng/l, jew agonist dgħajjef magħruf) li twassal għal żieda fil-VTG fil-ħut maskili, kimika ta' kontroll pożittiv għall-inibizzjoni tal-aromatażi (eż. fadrozole jew prochloraz f'doża ta' 300 μg/l) li twassal għal tnaqqis fil-VTG fil-ħut nisa, u kimika ta' kontroll pożittiv għall-attività androġenika (eż. 17β-trenbolon f'doża ta' 5 μg/l) li twassal għall-induzzjoni ta' karatteristiċi sesswali sekondarji fil-karpjun buras u l-medaka femminili. Din id-dejta kollha tista' titqabbel ma' dejta disponibbli mill-istudji ta' validazzjoni (1, 2, 3) biex tiġi żgurata l-profiċjenza tal-laboratorju.
                              
                           
                              
                                 56.
                              
                              
                                 B'mod ġenerali, il-kejl tal-vitelloġenina għandu jitqies pożittiv jekk ikun hemm żieda statistikament sinifikanti fil-VTG fl-irġiel (p < 0,05), jew tnaqqis statistikament sinifikanti fin-nisa (p < 0,05) tal-anqas fl-ogħla doża ttestjata meta mqabbla mal-grupp ta' kontroll, u fin-nuqqas ta' sinjali ta' tossiċità ġenerali. Riżultat pożittiv jikseb sostenn ikbar meta jintwera li hemm relazzjoni bijoloġikament plawżibbli bejn id-doża u l-kurva tar-rispons. Kif intqal qabel, it-tnaqqis fil-vitelloġenina jaf ma jkollux oriġini kompletament endokrinali; madankollu, ġeneralment riżultat pożittiv għandu jiġi interpretat bħala evidenza ta' attività endokrinali in vivo, u normalment għandu jagħti bidu għal azzjonijiet għal kjarifika ulterjuri.
                              
                           
                              
                                 57.
                              
                              
                                 Tista' tkun meħtieġa evalwazzjoni tal-istopatoloġija gonadali mill-awtoritajiet regolatorji sabiex tiġi ddeterminata l-idoneità riproduttiva tal-annimali tat-test u sabiex tkun tista' ssir valutazzjoni tal-piż tal-evidenza tar-riżultati tat-test. L-eżekuzzjoni ta' istopatoloġija gonadali tista' ma tkunx meħtieġa f'każijiet fejn il-VTG jew il-karatteristiċi sesswali sekondarji jkunu pożittivi (jiġifieri żieda jew tnaqqis fil-VTG jew induzzjoni tal-karatteristiċi sesswali sekondarji).
                              
                           TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2006a). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1A). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.60, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2006b). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1B). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.61, Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 OECD (2007). Final report of the Validation of the 21-day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine Active Substances. Phase 2: Testing Negative Substances. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.78, Paris.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Owens JW (2007). Phase 3 report of the validation of the OECD Fish Screening Assay. CEFIC LRI Project, Endocrine. http://www.cefic-lri.org/index.php?page=projects (accessed 18/09/08).
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 US EPA (2007). Validation of the Fish Short-Term Reproduction Assay: Integrated Summary Report. 15 December 2007. US Environmental Protection Agency, Washington, DC. 104 pp.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 OECD (2008). Report of the Validation Peer Review for the 21-Day Fish Endocrine Screening Assay and Agreement of the Working Group of the National Coordinators of the Test Guidelines Programme on the Follow-up of this Report. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.94, Paris.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Sumpter J.P. and S. Jobling (1995). Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment. Environmental Health Perspectives; 103 Suppl 7:173-8 Review.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Pawlowski S., et al. (2004). Androgenic and estrogenic effects of the synthetic androgen 17alpha-methyltestosterone on sexual development and reproductive performance in the fathead minnow (Pimephales promelas) determined using the gonadal recrudescence assay. Aquatic Toxicology; 68(3):277-91.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Andersen L., et al (2006). Short-term exposure to low concentrations of the synthetic androgen methyltestosterone affects vitellogenin and steroid levels in adult male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology; 76(3-4):343-52.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Ankley G.T., et al. (2002). Evaluation of the aromatase inhibitor fadrozole in a short-term reproduction assay with the fathead minnow (Pimephales promelas). Toxicological Sciences; 67(1):121-30.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Panter G.H., et al. (2004). Successful detection of (anti-)androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development. Aquatic Toxicology; 70(1):11-21.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Parks L.G., et al. (1999). Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 123(2):113-25.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Panter G.H., et al. (1999). Application of an ELISA to quantify vitellogenin concentrations in fathead minnows (Pimephales promelas) exposed to endocrine disrupting chemicals. CEFIC-EMSG research report reference AQ001. CEFIC, Brussels, Belgium.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Fenske M., et al. (2001). Development and validation of a homologous zebrafish (Danio rerio Hamilton- Buchanan) vitellogenin enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and its application for studies on estrogenic chemicals. Comp. Biochem. Phys. C 129 (3): 217-232.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Holbech H., et al. (2001). Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 130: 119-131
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Rose J., et al. (2002). Vitellogenin induction by 17b-estradiol and 17a-ethinylestradiol in male zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C 131: 531-539.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Brion F., et al. (2002). Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry; vol 21: 1699-1708.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Yokota H., et al. (2001). Development of an ELISA for determination of the hepatic vitellogenin in Medaka (Oryzias latipes). Jpn J Environ Toxicol 4:87–98.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Tatarazako N., et al. (2004). Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the Medaka. Journal of Health Science 50:301-308.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Ankley G.T., et al. (2003). Effects of the androgenic growth promoter 17-beta-trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environmental Toxicology and Chemistry; 22(6): 1350-60.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Seki M, et al (2004). Fish full life-cycle testing for androgen methyltestosterone on medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry; 23(3):774-81.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 OECD (2010). Guidance Document on Fish Gonadal Histopathology. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 123, Paris.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 OECD (2000) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No. 23. Paris
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Hutchinson T.H., et al. (2006a). Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Review. Aquatic Toxicology, 76; pp.69–92.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Hutchinson T.H., et al. (2006b). Screening and testing for endocrine disruption in fish-biomarkers as “signposts,” not “traffic lights,” in risk assessment. Environmental Health Perspectives; 114 Suppl 1:106-14.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Miles-Richardson S.R., et al. (1999). Effects of waterborne exposure to 17β-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of the fathead minnow (Pimephales promelas). Aquat. Toxicol. 47, 129-145.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Martinovic D., et al. (2008). Characterization of reproductive toxicity of vinclozolin in the fathead minnow and co-treatment with an androgen to confirm an anti-androgenic mode of action. Environ. Toxicol. Chem. 27, 478-488.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 OECD (2006c), Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.54, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 US EPA (2008), Peer-Review Results for the Fish Short-Term Reproduction Assay, dated 30 January 2008, US Environmental Protection Agency, Washington DC. 110 pp.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 OECD (2012), OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupters, OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 150, OECD, Paris.
                              
                           
                        Appendiċi 1
                        ABBREVJAZZJONIJIET U DEFINIZZJONIJIET
                        
                           
                              Sustanza kimika
                           : sustanza jew taħlita
                        
                           
                              CV
                           : koeffiċjent tal-varjazzjoni
                        
                           
                              ELISA
                           : Assaġġ ta' Immunoassorbiment Enżimatiku
                        
                           
                              Assi HPG
                           : assi ipotalamika-pitwitarja-gonadali
                        
                           
                              Rata ta' tagħbija
                           : il-piż imxarrab tal-ħut skont il-volum ta' ilma.
                        
                           
                              MTC
                           : Konċentrazzjoni Massima Tollerata, li tirrapreżenta madwar 10 % tal-LC50
                        
                        
                           
                              Densità tal-istokkjar
                           : l-għadd ta' ħut għal kull volum ta' ilma.
                        
                           
                              Sustanza kimika tat-test
                           : Kwalunkwe sustanza jew taħlita li tkun qed tiġi ttestjata permezz ta' dan il-metodu ta' ttestjar.
                        
                           
                              VTG
                           : vitelloġenina hija prekursur tal-fosfolipoglikoproteina għall-proteina fl-isfar tal-bajd li normalment iseħħ f'nisa sesswalment attivi tal-ispeċijiet ovipari kollha.
                     
                     
                        Appendiċi 2
                        
                           KUNDIZZJONIJIET SPERIMENTALI GĦALL-ASSAĠĠ TAL-ISKRINJAR TAS-SISTEMA ENDOKRINALI TAL-ĦUT
                        
                        
                                    
                                                1.
                                             
                                             
                                                Speċijiet rakkomandati
                                             
                                          
                                 
                                    Karpjun buras
                                    (Pimephales promelas)
                                 
                                 
                                    Medaka
                                    (Oryzias latipes)
                                 
                                 
                                    Żebra
                                    (Danio rerio)
                                 
                              
                                    
                                                2.
                                             
                                             
                                                Tip ta' test
                                             
                                          
                                 
                                    Bi fluss kontinwu
                                 
                                 
                                    Bi fluss kontinwu
                                 
                                 
                                    Bi fluss kontinwu
                                 
                              
                                    
                                                3.
                                             
                                             
                                                Temperatura tal-ilma
                                             
                                          
                                 
                                    25 ± 2 °C
                                 
                                 
                                    25 ± 2 °C
                                 
                                 
                                    26 ± 2 °C
                                 
                              
                                    
                                                4.
                                             
                                             
                                                Kwalità tal-illuminazzjoni
                                             
                                          
                                 
                                    Bozoz fluworexxenti (bi spettru wiesa')
                                 
                                 
                                    Bozoz fluworexxenti (bi spettru wiesa')
                                 
                                 
                                    Bozoz fluworexxenti (bi spettru wiesa')
                                 
                              
                                    
                                                5.
                                             
                                             
                                                Intensità tad-dawl
                                             
                                          
                                 
                                    10-20 μE/m2/s, 540-1 000  lux, jew 50-100 ft-c (livelli tal-laboratorju ambjentali)
                                 
                                 
                                    10-20 μE/m2/s, 540-1 000  lux, jew 50-100 ft-c (livelli tal-laboratorju ambjentali)
                                 
                                 
                                    10-20 μE/m2/s, 540-1 000  lux, jew 50-100 ft-c (livelli tal-laboratorju ambjentali)
                                 
                              
                                    
                                                6.
                                             
                                             
                                                Fotoperjodu (it-tranżizzjonijiet bejn tlugħ ix-xemx / inżul ix-xemx huma fakultattivi, madanakollu ma jitqisux neċessarji)
                                             
                                          
                                 
                                    16-il siegħa ta' dawl, 8 sigħat ta' dlam
                                 
                                 
                                    12-16-il siegħa ta' dawl, 12-8 sigħat ta' dlam
                                 
                                 
                                    12-16-il siegħa ta' dawl, 12-8 sigħat ta' dlam
                                 
                              
                                    
                                                7.
                                             
                                             
                                                Rata ta' tagħbija
                                             
                                          
                                 
                                    < 5 g għal kull l
                                 
                                 
                                    < 5 g għal kull l
                                 
                                 
                                    < 5 g għal kull l
                                 
                              
                                    
                                                8.
                                             
                                             
                                                Id-daqs tal-kompartiment tal-ittestjar
                                             
                                          
                                 
                                    10 l (minimu)
                                 
                                 
                                    2 l (minimu)
                                 
                                 
                                    5 l (minimu)
                                 
                              
                                    
                                                9.
                                             
                                             
                                                Volum tas-soluzzjoni tat-test
                                             
                                          
                                 
                                    8 l (minimu)
                                 
                                 
                                    1,5 l (minimu)
                                 
                                 
                                    4 l (minimu)
                                 
                              
                                    
                                                10.
                                             
                                             
                                                Volum tal-iskambji tas-soluzzjonijiet tat-test
                                             
                                          
                                 
                                    Minimu ta' 6 kuljum
                                 
                                 
                                    Minimu ta' 5 kuljum
                                 
                                 
                                    Minimu ta' 5 kuljum
                                 
                              
                                    
                                                11.
                                             
                                             
                                                L-età tal-organiżmi tat-test
                                             
                                          
                                 
                                    Ara l-paragrafu 21
                                 
                                 
                                    Ara l-paragrafu 21
                                 
                                 
                                    Ara l-paragrafu 21
                                 
                              
                                    
                                                12.
                                             
                                             
                                                Piż imxarrab approssimattiv tal-ħut adulti (g)
                                             
                                          
                                 
                                    Nisa: 1,5 ± 20 %
                                    Irġiel: 2,5 ± 20 %
                                 
                                 
                                    Nisa: 0,35 ± 20 %
                                    Irġiel: 0,35 ± 20 %
                                 
                                 
                                    Nisa: 0,65 ± 20 %
                                    Irġiel: 0,4 ± 20 %
                                 
                              
                                    
                                                13.
                                             
                                             
                                                Nru ta' ħut f'kull reċipjent tat-test
                                             
                                          
                                 
                                    6 (2 irġiel u 4 nisa)
                                 
                                 
                                    6 (3 irġiel u 3 nisa)
                                 
                                 
                                    10 (5 irġiel u 5 nisa)
                                 
                              
                                    
                                                14.
                                             
                                             
                                                Nru. ta' trattamenti
                                             
                                          
                                 
                                    = 3 (flimkien mal-kontrolli xierqa)
                                 
                                 
                                    = 3 (flimkien mal-kontrolli xierqa)
                                 
                                 
                                    = 3 (flimkien mal-kontrolli xierqa)
                                 
                              
                                    
                                                15.
                                             
                                             
                                                Nru ta' reċipjenti għal kull trattament
                                             
                                          
                                 
                                    Minimu ta' 4
                                 
                                 
                                    Minimu ta' 4
                                 
                                 
                                    Minimu ta' 2
                                 
                              
                                    
                                                16.
                                             
                                             
                                                Nru. ta' ħut għal kull konċentrazzjoni tat-test
                                             
                                          
                                 
                                    16-il mara adulta u 8 irġiel (4 nisa u 2 irġiel f'kull reċipjent irreplikat)
                                 
                                 
                                    12-il mara adulta u 12 irġiel (3 nisa u 3 irġiel f'kull reċipjent irreplikat)
                                 
                                 
                                    10-il mara adulta u 10 irġiel (5 nisa u 5 irġiel f'kull reċipjent irreplikat)
                                 
                              
                                    
                                                17.
                                             
                                             
                                                Reġim ta' tmigħ
                                             
                                          
                                 
                                    Gambli adulti jew nauplii tal-ilma mielaħ ħajjin jew iffriżati darbtejn jew tliet darbiet kuljum (ad libitum), ikel disponibbli fis-suq jew taħlita ta' dawn ta' hawn fuq
                                 
                                 
                                    Gambli nauplii tal-ilma mielaħ darbtejn jew tliet darbiet kuljum (ad libitum), ikel disponibbli fis-suq jew taħlita ta' dawn ta' hawn fuq
                                 
                                 
                                    Gambli nauplii tal-ilma mielaħ darbtejn jew tliet darbiet kuljum (ad libitum), ikel disponibbli fis-suq jew taħlita ta' dawn ta' hawn fuq
                                 
                              
                                    
                                                18.
                                             
                                             
                                                Ossiġenazzjoni
                                             
                                          
                                 
                                    Xejn ħlief jekk il-konċentrazzjoni tad-DO taqa' taħt is-60 % tas-saturazzjoni tal-arja
                                 
                                 
                                    Xejn ħlief jekk il-konċentrazzjoni tad-DO taqa' taħt is-60 % tas-saturazzjoni tal-arja
                                 
                                 
                                    Xejn ħlief jekk il-konċentrazzjoni tad-DO taqa' taħt is-60 % tas-saturazzjoni tal-arja
                                 
                              
                                    
                                                19.
                                             
                                             
                                                Ilma tad-dilwizzjoni
                                             
                                          
                                 
                                    Ilma tal-wiċċ, tal-bir jew rikostitwit jew ilma tal-vit deklorinat nadif
                                 
                                 
                                    Ilma tal-wiċċ, tal-bir jew rikostitwit jew ilma tal-vit deklorinat nadif
                                 
                                 
                                    Ilma tal-wiċċ, tal-bir jew rikostitwit jew ilma tal-vit deklorinat nadif
                                 
                              
                                    
                                                20.
                                             
                                             
                                                Perjodu ta' pre-espożizzjoni
                                             
                                          
                                 
                                    perjodu rakkomandat ta' 7-14-il jum
                                 
                                 
                                    perjodu rakkomandat ta' 7-14-il jum
                                 
                                 
                                    perjodu rakkomandat ta' 7-14-il jum
                                 
                              
                                    
                                                21.
                                             
                                             
                                                Id-durata tal-esponiment kimiku
                                             
                                          
                                 
                                    21 jum
                                 
                                 
                                    21 jum
                                 
                                 
                                    21 jum
                                 
                              
                                    
                                                22.
                                             
                                             
                                                Punti ta' tmiem bijoloġiċi
                                             
                                          
                                 
                                    
                                                —
                                             
                                             
                                                sopravivenza
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                imġiba
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                fekondità
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                karatteristiċi sesswali sekondarji
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                VTG
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                istopatoloġija gonadali b'mod fakultattiv
                                             
                                          
                                 
                                    
                                                —
                                             
                                             
                                                sopravivenza
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                imġiba
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                fekondità
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                karatteristiċi sesswali sekondarji
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                VTG
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                istopatoloġija gonadali b'mod fakultattiv
                                             
                                          
                                 
                                    
                                                —
                                             
                                             
                                                sopravivenza
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                imġiba
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                fekondità
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                VTG
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                istopatoloġija gonadali b'mod fakultattiv
                                             
                                          
                              
                                    
                                                23.
                                             
                                             
                                                Aċċettabilità tat-test
                                             
                                          
                                 
                                    Ossiġenu dissolt ≥ 60 % tas-saturazzjoni; temperatura medja ta' 25 ± 2 °C; sopravivenza ta' 90 % tal-ħut fil-kontrolli; konċentrazzjonijiet imkejla tat-test fi ħdan 20 % tal-valuri medji mkejla għal kull livell ta' trattament.
                                 
                                 
                                    Ossiġenu dissolt ≥ 60 % tas-saturazzjoni; temperatura medja ta' 25 ± 2 °C; sopravivenza ta' 90 % tal-ħut fil-kontrolli; konċentrazzjonijiet imkejla tat-test fi ħdan 20 % tal-valuri medji mkejla għal kull livell ta' trattament.
                                 
                                 
                                    Ossiġenu dissolt ≥ 60 % tas-saturazzjoni; temperatura medja ta' 26 ± 2 °C; sopravivenza ta' 90 % tal-ħut fil-kontrolli; konċentrazzjonijiet imkejla tat-test fi ħdan 20 % tal-valuri medji mkejla għal kull livell ta' trattament.
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 3
                        
                           XI KARATTERISTIĊI KIMIĊI TA' ILMA TAD-DILWIZZJONI AĊĊETTABBLI
                        
                        
                                    KOMPONENT
                                 
                                 
                                    KONĊENTRAZZJONIJIET
                                 
                              
                                    Materja partikolata
                                 
                                 
                                    < 20mg/l
                                 
                              
                                    Karbonju organiku totali
                                 
                                 
                                    < 2 mg/l
                                 
                              
                                    Ammonijaka mhux jonizzata
                                 
                                 
                                    < 1 μg/l
                                 
                              
                                    Kloru residwu
                                 
                                 
                                    < 10 μg/l
                                 
                              
                                    Pestiċidi organofosforiċi totali
                                 
                                 
                                    < 50 ng/l
                                 
                              
                                    Pestiċidi organofosforiċi totali flimkien ma' bifenili poliklorinati
                                 
                                 
                                    < 50 ng/l
                                 
                              
                                    Kloru organiku totali
                                 
                                 
                                    < 25 ng/l
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 4A
                        
                           SOTTOSTRAT TAL-BIDIEN GĦAŻ-ŻEBRA
                        
                        
                           
                              Trej għall-bidien
                           : dixx kollu tal-ħġieġ, pereżempju 22 × 15 × 5,5 cm (l x w x d), kopert b'kannizzata tal-azzar inossidabbli li tista' titneħħa (xibka wiesgħa 2mm). Il-kannizzata għandha tgħatti l-bokka tad-dixx f'livell taħt ix-xifer.
                        Is-sottostrat tal-bidien għandu jitpoġġa fuq il-kannizzata. Għandu jipprovdi struttura biex il-ħut ikunu jistgħu jidħlu fiha. Pereżempju, pjanti artifiċjali tal-akkwarji magħmulin minn materjal aħdar tal-plastik huma tajbin (NB: għandu jitqies l-adsorbiment possibbli tal-kimika tat-test fil-materjal tal-plastik). Il-materjal tal-plastik għandu jitbattal f'volum suffiċjenti ta' ilma sħun għal tul ta' żmien suffiċjenti biex jiġi żgurat li ma tintreħa ebda sustanza kimika fl-ilma tat-test. Meta jkun qed jintuża materjal tal-ħġieġ għandu jiġi żgurat li l-ħut la jindarab u lanqas ma jkun iffullat matul l-azzjonijiet vigorużi tiegħu.
                        Id-distanza bejn it-trej u l-panewwi tal-ħġieġ għandha tkun ta' mill-inqas 3 cm biex jiġi żgurat li l-bidien ma jsirx barra mit-trej. Il-bajd li jitbied fuq it-trej jaqa' minn ġol-kannizzata u jista' jiġi kampjunat tliet kwarti sa siegħa wara l-bidu tal-illuminazzjoni. Il-bajd trasparenti ma jeħilx u jista' jingħadd faċilment permezz tal-użu ta' dawl transversali. Meta jkunu qed jintużaw ħames nisa f'kull reċipjent, sa 20 bajda f'ġurnata jistgħu jitqiesu bħala kwantità baxxa, sa 100 bħala medja u aktar minn 100 bħala kwantità għolja. It-trej tal-bidien għandu jitneħħa, il-bajd għandu jinġabar u t-trej tal-bidien għandu jerġa' jiddaħħal fir-reċipjent tat-test, jew l-aktar tard possibbli filgħaxija jew kmieni ħafna filgħodu. It-trej tal-bidien m'għandux jitħalla aktar minn siegħa biex jerġa' jiddaħħal peress li nkella s-sinjal tas-sottostrat tal-bidien jista' jinduċi tgħammir individwali u bidien fi żmien mhux tas-soltu. Jekk sitwazzjoni tkun teħtieġ li t-trej tal-bidien jiddaħħal aktar tard, dan għandu jsir mill-inqas 9 sigħat wara l-bidu tal-illuminazzjoni. F'dan il-ħin tard fil-ġurnata, il-bidien ma jibqax jiġi indott iktar. 7Appendiċi 4B
                     
                     
                        Appendiċi 4 B
                        
                           SOTTOSTRAT TAL-BIDIEN GĦALL-KARPJUN BURAS
                        
                        F'kull kompartiment tat-test jitqiegħdu żewġ jew tliet madumiet jew trejs riproduttivi kkombinati tal-plastik/ċeramika/ħġieġ jew tal-azzar inossidabbli (eż. kanal semiċirkulari griż twil 80mm imqiegħed fuq trej bix-xoffa twil 130mm) (ara l-istampa). Intwera li madum taċ-ċeramika jew tal-PVC akklimatizzati sew joqgħod bħala sottostrat tal-bidien (Thorpe et al, 2007).
                        Huwa rrakkomandat li l-madum jinbarax biex tittejjeb l-adeżjoni. It-trej għandu jiġi skrinjat ukoll biex il-ħut jitwaqqaf milli jaċċessa l-bajd li jkun waqa' sakemm ma tkunx intweriet effiċjenza tas-sottostrat tal-bidien użat fl-adeżjoni tal-bajd.
                        Il-bażi hija ddisinjata biex iżżomm kwalunkwe bajd li ma jeħilx mal-wiċċ tal-madum u għalhekk jaqa' f'qiegħ it-tank (jew dak il-bajd li jitbied direttament fuq il-bażi ċatta tal-plastik). Qabel jintużaw, is-sottostrati tal-bidien għandhom jitbattlu lkoll għal mhux inqas minn 12-il siegħa, f'ilma tad-dilwizzjoni.
                        Thorpe KL, Benstead R, Hutchinson TH, Tyler CR, 2007. An optimised experimental test procedure for measuring chemical effects on reproduction in the fathead minnow, Pimephales promelas. Aquatic Toxicology, 81, 90–98.
                     
                     
                        Appendiċi 5 A
                        
                           VALUTAZZJONI TAL-KARATTERISTIĊI SESSWALI SEKONDARJI FIL-KARPJUN BURAS GĦAD-DETEZZJONI TA' ĊERTI SUSTANZI KIMIĊI ATTIVI FIS-SISTEMA ENDOKRINALI
                        
                        
                           Ħarsa ġenerali
                        
                        Karatteristiċi potenzjalment importanti fid-dehra fiżika fil-karpjuni buras adulti fl-ittestjar għal sustanzi li jfixklu s-sistema endokrinali jinkludu l-kulur tal-ġisem (jiġifieri ċar/skur), il-mudelli ta' kolorazzjoni (jiġifieri l-preżenza jew in-nuqqas ta' faxex vertikali), il-forma tal-ġisem (jiġifieri l-forma tar-ras u tar-reġjun pettorali, id-distensjoni tal-addome), u l-karatteristiċi sesswali sekondarji speċjalizzati (jiġifieri l-għadd u d-daqs tat-tuberkuli tan-namra, id-daqs tal-kuxxinett dorsali u tal-ovipożitur).
                        It-tuberkuli tan-namra jinsabu fuq ir-ras (il-kuxxinett dorsali) tal-karpjuni buras irġiel riproduttivament-attivi, u ġeneralment ikunu rranġati f'mudell bilateralment simmetriku (Jensen et al. 2001). In-nisa tal-kontroll u l-irġiel u n-nisa żgħar ma juru l-ebda żvilupp ta' tuberkuli (Jensen et al. 2001). Jista' jkun hemm sa tmien tuberkuli individwali madwar l-għajnejn u bejn l-imnifsejn tal-irġiel. L-akbar għadd ta' tuberkuli u l-akbar tuberkuli jinsabu f'żewġ linji paralleli eżatt taħt l-imnieħer u fuq il-ħalq. F'ħafna ħut hemm gruppi ta' tuberkuli taħt ix-xedaq t'isfel; dawk l-eqreb tal-ħalq ġeneralment jinsabu bħala par uniku, filwaqt li l-aktar sett ventrali jista' jkun magħmul minn massimu ta' erba' tuberkuli. L-għadd attwali ta' tuberkuli rarament ikun ta' aktar minn 30 (medda, 18-28; Jensen et al. 2001). It-tuberkuli predominanti (f'termini ta' għadd) huma preżenti bħala struttura waħda, relattivament tonda, b'għoli kważi ekwivalenti għar-raġġ. Ħafna mill-irġiel attivi fir-riproduzzjoni għandhom ukoll, tal-anqas ftit, tuberkuli mkabbrin u evidenti li m'humiex distingwibbli bħala strutturi individwali.
                        Xi tipi ta' sustanzi kimiċi li jfixklu s-sistema endokrinali jistgħu jikkawżaw l-okkorrenza anormali ta' ċerti karatteristiċi sesswali sekondarji fis-sess oppost; pereżempju, agonisti tar-riċettur tal-androġenu, bħal 17α-metiltestosteron jew 17β-trenbolon, jistgħu jikkawżaw l-iżvilupp ta' tuberkuli tan-namra fil-karpjuni buras nisa (Smith 1974; Ankley et al. 2001; 2003), filwaqt li agonisti tar-riċettur tal-estroġenu jistgħu jnaqqsu l-għadd jew id-daqs tat-tuberkuli tan-namra fl-irġiel (Miles-Richardson et al. 1999; Harries et al. 2000).
                        Hawn taħt hawn deskrizzjoni tal-karatterizzazzjoni tat-tuberkuli tan-namra fil-karpjuni buras fuq il-bażi ta' proċeduri użati fil-laboratorju tal-Aġenzija għall-Ħarsien tal-Ambjent f'Duluth, MN, l-Istati Uniti. Prodotti u/jew tagħmir speċifiċi jistgħu jiġu sostitwiti ma' materjali paragunabbli disponibbli.
                        L-osservazzjoni ssir l-aħjar bl-użu ta' lenti illuminata jew mikroskopju 3X illuminat għad-dissezzjonijiet. Ħares lejn il-ħuta mil-lat dorsali u anterjuri 'l quddiem (ir-ras lejn min ikun qed josserva).
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Poġġi l-ħuta f'dixx Petri żgħir (eż. b'dijametru ta' 100 mm), anterjuri 'l quddiem, u ventrali 'l isfel. Iffoka l-viewfinder biex tippermetti l-identifikazzjoni tat-tuberkuli. Bil-galbu u bil-mod dawwar il-ħuta minn naħa għall-oħra biex tidentifika ż-żoni fejn ikun hemm it-tuberkuli. Għodd u kklassifika t-tuberkuli.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Irripeti l-osservazzjoni fuq il-lat ventrali tar-ras billi tpoġġi l-lat anterjuri dorsali tal-ħuta 'l quddiem fid-dixx Petri.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    L-osservazzjonijiet għandhom jitlestew fi żmien 2 minuti għal kull ħuta.
                                 
                              
                           L-Għadd u l-Klassifikazzjoni tat-Tuberkuli
                        
                        Ġew identifikati sitt żoni speċifiċi għall-valutazzjoni tal-preżenza u tal-iżvilupp tat-tuberkuli f'karpjuni buras adulti. Ġie żviluppat mudell biex jiġu mmappjati l-post u l-kwantità tat-tuberkuli preżenti (ara fl-aħħar ta' dan l-Appendiċi). L-għadd ta' tuberkuli jiġi rreġistrat u d-daqs tagħhom jista' jiġi kklassifikat b'mod kwantitattiv bħala: 0- xejn, 1-preżenti, 2-imkabbrin u 3-evidenti għal kull organiżmu (Fig. 1).
                        Klassifikazzjoni ta' 0- ebda tuberkulu preżenti. Klassifikazzjoni ta' 1-preżenti, hija identifikata bħala kwalunkwe tuberkulu li jkollu punt uniku li l-għoli tiegħu ikun kważi ekwivalenti għar-raġġ tiegħu. Klassifikazzjoni ta' 2-mkabbrin, hija identifikata bħala tessut li fid-dehra jixbah asterisk, li ġeneralment ikollu bażi radjali kbira bi xquq jew kanali ħerġin miċ-ċentru. Ħafna drabi l-għoli tat-tuberkuli ikun aktar ippizzjat iżda xi drabi jista' jkun naqra fit-tond. Klassifikazzjoni ta' 3-evidenti, ġeneralment ikun pjuttost kbir u ttundjat bi struttura inqas definita. Xi drabi dawn it-tuberkuli ikunu qrib xulxin u jiffurmaw massa waħda tul żona individwali jew taħlita ta' żoni (B, C u D, deskritti hawn taħt). Il-kolorazzjoni u d-disinn huma simili għall-klassifikazzjoni ta' 2 iżda xi drabi ikunu pjuttost indiskriminati. Ġeneralment, l-użu ta' din is-sistema ta' klassifikazzjoni jwassal għal punteġġi globali ta' tuberkuli ta' < 50 f'raġel normali tal-kontroll b'għadd ta' 18 sa 20 tuberkulu (Jensen et al. 2001).
                        
                           Figura 1
                        
                        F'ċertu ħut, l-għadd proprju ta' tuberkuli jista' jkun akbar mill-kaxxi tal-mudelli għal żona partikolari ta' klassifikazzjoni. F'dan il-każ, in-numri addizzjonali ta' klassifikazzjoni jistgħu jiġu mmarkati ġewwa, fuq il-lemin jew fuq ix-xellug tal-kaxxa. Għalhekk, il-mudell ma għandux bżonn juri simmetrija. Teknika addizzjonali għall-immappjar tat-tuberkuli f'pari jew mehmużin vertikalment tul il-pjan orizzontali tal-ħalq tista' ssir billi f'kaxxa waħda jitniżżlu żewġ punti ta' klassifikazzjoni tat-tuberkuli.
                        
                           Reġjuni ta' mmappjar:
                        
                        
                                     
                                 
                                 
                                    A - Tuberkuli li jinsabu madwar l-għajnejn. Jiġu mmappjati mil-lat dorsali għal dak ventrali madwar ir-rimm anterjuri tal-għajn. Komunement dawn ikunu f'multipli f'irġiel maturi ta' kontroll, ma jkunux preżenti f'nisa ta' kontroll, ikunu ġeneralment f'par (wieħed ħdejn kull għajn) jew waħedhom f'nisa esposti għall-androġeni.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    B - Tuberkuli li jinsabu bejn l-imnieħer, (pori sensorjali fil-kanal). Normalment dawn ikunu f'pari f'irġiel tal-kontroll f'livelli aktar elevati (2- imkabbrin jew 3- evidenti) ta' żvilupp. Mhux preżenti f'nisa tal-kontroll b'xi okkorrenza u żvilupp f'nisa esposti għall-androġeni.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    C - Tuberkuli li jinsabu eżatt wara l-imnieħer, paralleli mal-ħalq. Ġeneralment dawn ikunu mkabbrin jew evidenti f'irġiel maturi tal-kontroll. Preżenti jew imkabbrin f'irġiel anqas żviluppati jew f'nisa ttrattati bl-androġeni.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    D - Tuberkuli li jinsabu paralleli tul il-linja tal-ħalq. Ġeneralment ikklassifikatati bħala żviluppati f'irġiel tal-kontroll. Assenti f'nisa tal-kontroll iżda preżenti f'nisa esposti għall-androġeni.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    E - Tuberkuli li jinsabu fuq ix-xedaq t'isfel, qrib il-ħalq, normalment ikunu żgħar u ġeneralment ikunu f'pari. Ivarjaw f'irġiel tal-kontroll jew ittrattati, u f'nisa ttrattati.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    F - Tuberkuli li jinsabu fil-lat ventrali għal E. Normalment ikunu żgħar u f'pari. Preżenti f'irġiel tal-kontroll u f'nisa esposti għall-androġeni.
                                 
                              REFERENZI
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Ankley GT, Jensen KM, Kahl MD, Korte JJ, Makynen ME. 2001. Description and evaluation of a short-term reproduction test with the fathead minnow (Pimephales promelas). Environ Toxicol Chem 20:1276-1290.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Ankley GT, Jensen KM, Makynen EA, Kahl MD, Korte JJ, Hornung MW, Henry TR, Denny JS, Leino RL, Wilson VS, Cardon MC, Hartig PC, Gray EL. 2003. Effects of the androgenic growth promoter 17-β trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environ Toxicol Chem 22:1350-1360.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Harries JE, Runnalls T, Hill E, Harris CA, Maddix S, Sumpter JP, Tyler CR. 2000. Development of a reproductive performance test for endocrine disrupting chemicals using pair-breeding fathead minnows (Pimephales promelas). Environ Sci Technol 34:3003-3011.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Jensen KM, Korte JJ, Kahl MD, Pasha MS, Ankley GT. 2001. Aspects of basic reproductive biology and endocrinology in the fathead minnow (Pimephales promelas). Comp Biochem Physiol C 128:127-141.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Kahl MD, Jensen KM, Korte JJ, Ankley GT. 2001. Effects of handling on endocrinology and reproductive performance of the fathead minnow. J Fish Biol 59:515-523.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Miles-Richardson SR, Kramer VJ, Fitzgerald SD, Render JA, Yamini B, Barbee SJ, Giesy JP. 1999. Effects of waterborne exposure of 17-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of fathead minnows (Pimephales promelas). Aquat Toxicol 47:129-145.
                                 
                              
                                    (7)
                                 
                                 
                                    Smith RJF. 1974. Effects of 17α-methyltestosterone on the dorsal pad and tubercles of fathead minnows (Pimephales promelas). Can J Zool 52:1031-1038.
                                 
                              
                           
                        Test ta 'immaġni
                        
                           Mudell għat-Tuberkuli:
                           ID
                           Klassifikazzjoni Numerika
                           Data
                           1-preżenti
                           Punteġġ Totali
                           2-imkabbar
                           3-pronunzjat
                           A
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           B
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           C
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           D
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           E
                           X1
                           X1
                           F
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                        
                     
                     
                        Appendiċi 5 B
                        
                           VALUTAZZJONI TAL-KARATTERISTIĊI SESSWALI SEKONDARJI FIL-MEDAKA GĦAD-DETEZZJONI TA' ĊERTI SUSTANZI KIMIĊI ATTIVI FIS-SISTEMA ENDOKRINALI
                        
                        Hawn taħt tingħata deskrizzjoni tal-kejl tal-proċessi papillari (*10), li huma l-karatteristiċi sesswali sekondarji fil-medaka (Oryzias latipes).
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Wara l-qtugħ tal-fwied (Appendiċi 6), il-karkassa titqiegħed f'tubu koniku li jkun fih madwar 10 ml ta' 10 % formalina newtrali bbaferjata ('il fuq: ir-ras, 'l isfel: id-denb). Jekk il-gonada titqiegħed f'soluzzjoni oħra li mhijiex 10 % formalina newtrali bbaferjata, agħmel qatgħa trasversali tul il-karkassa bejn ir-reġjun anterjuri tal-pinna anali u l-anus permezz ta' xafra, u ara li ma tagħmilx ħsara lill-gonopori u l-gonada stess (Fig.3). Poġġi n-naħa kranjali tal-ġisem tal-ħuta fis-soluzzjoni fissattiva biex tippreserva l-gonada, u n-naħa tad-denb tal-ġisem tal-ħuta f'10 % formalina newtrali bbaferjata kif deskritta hawn fuq.
                                 
                              
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Wara li tpoġġi l-ġisem tal-ħuta f'10 % formalina newtrali bbaferjata, aqbad ir-reġjun anterjuri tal-pinna anali b'pinzetta u itwih għal madwar 30 sekonda biex iżomm il-pinna anali miftuħa. Meta tkun qed taqbad il-pinna anali b'pinzetta, aqbad ftit xewk tal-pinen fir-reġjun anterjuri bil-galbu biex ma tobroxx il-proċessi papillari.
                                 
                              
                                 
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Wara li żżomm il-pinna anali miftuħa għal madwar 30 sekonda, aħżen ġisem il-ħuta f'10 % formalina newtrali bbaferjata f'temperatura ambjentali sakemm jitkejlu l-proċessi papillari (il-kejl għandu jsir wara ffissar għal mhux anqas minn 24 siegħa).
                                 
                              Kejl
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Wara l-iffissar tal-ġisem tal-ħuta f'10 % formalina newtrali bbaferjata għal mill-inqas 24 siegħa, iġbor il-karkassa tal-ħuta mit-tubu koniku u imsaħ il-formalina fuq il-karta tal-filtru (jew b'xugaman tal-karta).
                                 
                              
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Poġġi l-ħut bl-addome 'l fuq. Imbagħad aqta' l-pinna anali b'imqass żgħar tad-dissezzjoni bil-galbu (idealment għandek taqta' l-pinna anali b'ammont żgħir ta' pteriġjofora).
                                 
                              
                                 
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Aqbad ir-reġjun anterjuri tal-pinna anali li tkun inqatgħet b'pinzetta u poġġiha fuq lastra tal-ħġieġ b'diversi qtar tal-ilma. Imbagħad agħtti l-pinna anali b'għatu tal-ħġieġ. Ara li meta tkun qed taqbad il-pinna anali bil-pinzetta ma tobroxx il-proċessi papillari.
                                 
                              
                                 
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Għodd in-numru tal-joint plate bi proċessi papillari permezz ta' kontatur taħt mikroskopju bijoloġiku (mikroskopju wieqaf jew mikroskopju invertit). Il-proċessi papillari jingħarfu meta jkun hemm formazzjoni żgħira ta' proċessi viżibbli fuq in-naħa posterjuri tal-joint plate. Ikteb in-numru tal-patt magħqud li jkollu proċessi papillari f'kull xewka tal-pinna fuq il-worksheet (eż. l-ewwel xewka tal-pinna: 0, it-tieni xewka tal-pinna: 10, it-tielet xewka tal-pinna: 12, eċċ.) u daħħal it-total ta' dan in-numru fuq l-spreadsheet tal-Excel għal kull ħuta individwali. Jekk ikun hemm bżonn, ħu ritratt tal-pinna anali u għodd in-numru tal-joint plate bi proċessi papillari fuq ir-ritratt.
                                 
                              
                                 
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Wara l-kejl, poġġi l-pinna anali fit-tubu koniku deskritt f'(1) u aħżnu.
                                 
                              
                           Fig.1.
                        
                        
                           Dijagramma li turi differenza sesswali fil-forma u d-daqs tal-pinna anali. A, raġel; B, mara. Oka, T. B., 1931. On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209-218.
                        
                        
                           Fig.2.
                        
                        
                           A, Proċessi fuq joint plates ta' xewka tal-pinna anali. J.P., joint plate; A.S., spazju assjali; P., proċess. B, Estremità distali tax-xewka tal-pinna. L-Aktinotrikiji (Act.) qegħdin fuq il-ponta. Oka, T. B., 1931. On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209-218.
                        
                        
                           Fig.3.
                        
                        
                           Ritratt tal-ġisem ta' ħuta li juri l-post tal-qtugħ meta l-gonada tkun iffissata fis-soluzzjoni fissattiva li mhijiex 10 % formalina newtrali bbaferjata. F'dak il-każ, il-ġisem li jifdal jinqata' bejn ir-reġjun anterjuri tal-pinna anali u l-anus b'xafra (strixxa ħamra), u l-parti tar-ras tal-ġisem tal-ħuta titqiegħed fis-soluzzjoni fissattiva għall-gonada u l-parti tad-denb ta' ġisem il-ħuta titqiegħed f'10 % formalina newtrali bbaferjata.
                        
                        
                     
                        Appendiċi 6
                        
                           PROĊEDURI RAKKOMANDATI GĦALL-ĠBIR TAL-KAMPJUNI GĦALL-ANALIŻI TAL-VITELLOĠENINA
                        
                        Għandha tingħata attenzjoni biex tiġi evitata kontaminazzjoni kroċjata bejn il-kampjuni tal-VTG tal-irġiel u tan-nisa.
                        
                           
                              Proċedura 1 A:   Karpjun Buras, Il-Ġbir ta' Demm mill-Vina/Arterja Kawdali
                        
                        Wara li tingħata l-anestesija, il-pedunkulu kawdali jinqata' parzjalment b'xafra tal-iskarpell u d-demm jinġabar mill-vina/arterja kawdali b'tubu kapillari mikroematokritiku eparinizzat. Wara li jinġabar id-demm, il-plażma tiġi iżolata malajr permezz ta' ċentrifugazzjoni għal 3 min f'15 000g (jew inkella għal 10 min. f'15 000g f'temperatura ta' 4 °C). Jekk ikun mixtieq, il-perċentwal tal-ematokrit jista' jiġi ddeterminat wara ċ-ċentrifugazzjoni. Imbagħad il-porzjon tal-plażma jitneħħa mit-tubu mikroematokritiku u jinħażen ġo tubu ċentrifugu b'0,13-il unità ta' aprotinin (inibitur tal-proteażi) f'temperatura ta' – 80 °C sakemm tkun tista' ssir id-determinazzjoni tal-vitelloġenina. Skont id-daqs tal-karpjun buras (li jiddependi mis-sess), il-volumi tal-plażma li jistgħu jinġabru ġeneralment ivarjaw minn 5 sa 60 mikrolitru għal kull ħuta (Jensen et al. 2001).
                        
                           
                              Proċedura 1 B:   Karpjun Buras, Il-Ġbir ta' Demm mill-Qalb
                        
                        Inkella d-demm jista' jinġabar ukoll permezz ta' titqiba fil-qalb b'siringa eparinizzata (1 000 unità eparina għal kull ml). Id-demm jiġi ttrasferit f'tubi Eppendorf (miżmuma fuq is-silġ) u mbagħad jiġi ċentrifugat (5 min, 7 000 g, f'temperatura ambjentali). Il-plażma għandha tiġi ttrasferita f'tubi Eppendorf nodfa (f'alikwoti jekk il-volum tal-plażma jippermetti li dan isir) u dlonk tiġi ffriżata f'temperatura ta' – 80 °C, sakemm tiġi analizzata (Panter et al., 1998).
                        
                           
                              Proċedura 2 A:   Medaka Ġappuniża, il-Qtugħ tal-Fwied fil-Medaka
                        
                        
                           It-tneħħija tal-ħuta tat-test mill-kompartiment tat-test
                        
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Il-ħut tat-test għandu jitneħħa mill-kompartiment tat-test permezz ta' xibka żgħira f'forma ta' mgħarfa (spoon-net). Ara li ma twaqqax il-ħut tat-test fil-kompartimenti l-oħra tat-test.
                                 
                              
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Fil-prinċipju, il-ħut tat-test għandu jitneħħa fl-ordni li ġejja: il-kontroll, il-kontroll tas-solvent (fejn xieraq), l-inqas konċentrazzjoni, il-konċentrazzjoni tan-nofs, l-ogħla konċentrazzjoni u l-kontroll pożittiv. Barra minn hekk, l-irġiel kollha għandhom jitneħħew minn kompartiment wieħed tat-test qabel ma jitneħħew in-nisa li jifdal.
                                 
                              
                                 
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Is-sess ta' kull ħuta tat-test jiġi identifikat abbażi tal-karatteristiċi sesswali sekondarji esterni (eż. il-forma tal-pinna anali).
                                 
                              
                                 
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Poġġi l-ħut tat-test f'reċipjent għat-trasport u ġorru lejn l-istazzjon tax-xogħol għall-qtugħ tal-fwied. Iċċekkja t-tikketti tal-kompartiment tat-test u tar-reċipjent tat-trasport għall-eżattezza u biex tikkonferma li l-għadd ta' ħut li jkun tneħħa mill-kompartiment tat-test u li l-għadd ta' ħut li fadal fil-kompartiment tat-test huma konsistenti ma' dak li huwa mistenni.
                                 
                              
                                 
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Jekk is-sess ma jkunx jista' jiġi identifikat mid-dehra esterna tal-ħuta, neħħi l-ħut kollu mill-kompartiment tat-test. F'dan il-każ, is-sess għandi jiġi identifikat billi jiġu osservati l-gonadi jew il-karatteristiċi sesswali sekondarji taħt mikroskopju sterjoskopiku.
                                 
                              
                           Qtugħ tal-fwied
                        
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Ittrasferixxi l-ħut tat-test mir-reċipjent biex jiġi trasportat lejn is-soluzzjoni anestetika bix-xibka żgħira f'forma ta' mgħarfa.
                                 
                              
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Wara li l-ħut tat-test ikun ġie anestetizzat, ittrasferixxi l-ħut tat-test fuq karta fitru (jew biċċa tal-karti) b'pinzetta (tip bażiku). Meta tkun qed iżżomm il-ħut tat-test, applika l-pinzetta fuq il-ġnub tar-ras biex tevita milli tikser id-denb.
                                 
                              
                                 
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Imsaħ l-ilma fuq wiċċ il-ħuta tat-test fuq il-karta filtru (jew il-biċċa tal-karti).
                                 
                              
                                 
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Poġġi l-ħut bl-addome 'l fuq. Imbagħad agħmel inċiżjoni trażversali żgħira bejn ir-reġjun ventrali tal-għonq u r-reġjun addominali tan-nofs b'imqass tad-dissezzjoni.
                                 
                              
                                 
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Daħħal l-imqass tad-dissezzjoni fl-inċiżjoni ż-żgħira, u agħmel inċiżjoni fl-addome minn punt kawdali għall-branchial mantle għan-naħa kranjali tal-anus tul il-linja tan-nofs tal-addome. Ara li ma daħħalx l-imqass tad-dissezzjoni wisq fil-fond biex tevita milli tagħmel ħsara fil-fwied u l-gonadi.
                                 
                              
                                 
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Wettaq l-operazzjonijiet li ġejjin taħt il-mikroskopju sterjoskopiku.
                                 
                              
                                 
                                    (7)
                                 
                                 
                                    Poġġi l-ħut tat-test bl-addome 'l fuq, fuq il-biċċa tal-karti (dixx Petri tal-ħġieġ jew lastri tal-ħġieġ huma disponibbli wkoll).
                                 
                              
                                 
                                    (8)
                                 
                                 
                                    Estendi l-ħitan tal-kavità addominali b'pinzetta ta' preċiżjoni u oħroġ l-organi interni fuq barra. Huwa aċċettabbli wkoll li toħroġ l-organi interni fuq barra billi tneħħi naħa waħda tal-ħajt tal-kavità addominali jekk ikun meħtieġ.
                                 
                              
                                 
                                    (9)
                                 
                                 
                                    Esponi l-parti mqabbda tal-fwied u tal-marrara b'pinzetta oħra ta' preċiżjoni. Imbagħad aqbad il-kanal tal-bili u aqta' l-marrara barra. Ara li ma tiksirx il-marrara.
                                 
                              
                                 
                                    (10)
                                 
                                 
                                    Aqbad l-esofagu u bl-istess mod aqta' l-passaġġ gastrointestinali minn mal-fwied. Ara li l-kontenut tal-passaġġ gastrointestinali ma jnixxix. Aqta' l-passaġġ gastrointestinali kawdali minn mal-anus u neħħi l-passaġġ mill-kavità addominali.
                                 
                              
                                 
                                    (11)
                                 
                                 
                                    Ittrimmja l-massa ta' xaħam u t-tessuti l-oħrajn mill-periferija tal-fwied. Ara li ma tobroxx il-fwied.
                                 
                              
                                 
                                    (12)
                                 
                                 
                                    Aqbad iż-żona portali tal-fwied permezz tal-pinzetta ta' preċiżjoni u neħħi l-fwied mill-kavità addominali.
                                 
                              
                                 
                                    (13)
                                 
                                 
                                    Poġġi l-fwied fuq il-lastra tal-ħġieġ. Permezz tal-pinzetta ta' preċiżjoni, neħħi kwalunkwe xaħam addizzjonali u tessut estranju (eż. ir-rita addominali), jekk ikun meħtieġ, mill-wiċċ tal-fwied.
                                 
                              
                                 
                                    (14)
                                 
                                 
                                    Kejjel il-piż tal-fwied b'mikrotubu ta' 1,5 ml bħala tara permezz ta' miżien analitiku elettroniku. Irreġistra l-valur fuq il-worksheet (jinqara: 0,1 mg). Ikkonferma l-informazzjoni ta' identifikazzjoni fuq it-tikketta tal-mikrotubu.
                                 
                              
                                 
                                    (15)
                                 
                                 
                                    Agħlaq l-għatu tal-mikrotubu li fih il-fwied. Żommu maħżun fi xtilliera għat-tkessiħ (jew fi xtilliera tas-silġ).
                                 
                              
                                 
                                    (16)
                                 
                                 
                                    Wara l-qtugħ ta' fwied wieħed, naddaf l-istrumenti tad-dissezzjoni jew ibdilhom ma' oħrajn nodfa.
                                 
                              
                                 
                                    (17)
                                 
                                 
                                    Neħħi l-fwied mill-ħut kollu fir-reċipjent tat-trasport kif deskritt hawn fuq.
                                 
                              
                                 
                                    (18)
                                 
                                 
                                    Wara l-qtugħ tal-fwied mill-ħut kollu fir-reċipjent tat-trasport (jiġifieri l-irġiel jew in-nisa kollha f'kompartiment tat-test), poġġi l-kampjuni kollha tal-fwied fi xtilliera għat-tubi b'tikketta għall-identifikazzjoni u aħżinha fil-friża. Meta l-fwied jingħata għal pretrattament ftit wara l-qtugħ, il-kampjuni jittieħdu fl-istazzjon tax-xogħol li jmiss fi xtilliera għat-tkessiħ (jew fi xtilliera tas-silġ).
                                 
                              Wara l-qtugħ tal-fwied, il-karkassa tal-ħuta tkun disponibbli għall-istoloġija gonadali u għall-kejl tal-karatteristiċi sesswali sekondarji.
                        
                           Kampjun
                        
                        Aħżen il-kampjuni tal-fwied li ttieħdu mill-ħut tat-test f'temperatura ta' ≤ – 70 °C jekk ma jintużawx għall-pretrattament ftit wara l-qtugħ.
                        
                           Fig-1
                        
                        
                           Issir qatgħa eżatt wara l-pinen pettorali bi mqass.
                        
                        
                           Fig-2
                        
                        
                           Inċiżjoni fil-linja tan-nofs tal-addome b'imqass sa punt madwar 2 mm kranjali għall-anu.
                        
                        
                           Fig-3
                        
                        
                           Il-ħitan addominali jinferqu b'forċipi biex jiġi espost il-fwied u organi interni oħra.
                        
                        (Inkella, il-ħitan addominali jistgħu jiġu ppinjati lateralment). Il-vleġġa turi l-fwied.
                        Il-vleġġa turi l-fwied.
                        
                           Fig-4
                        
                        
                           Il-fwied ġie dissezzjonat u jinqata' malajr bil-forċipi.
                        
                        
                           Fig-5
                        
                        
                           L-intestini jinħarġu bil-galbu permezz tal-forċipi.
                        
                        
                           Fig-6
                        
                        
                           Iż-żewġ trufijiet tal-intestini u kwalunkwe Appendiċi meżenterika jinqatgħu bl-imqass.
                        
                        
                           Fig-7 (mara)
                        
                        
                           Il-proċedura hija identika għall-mara.
                        
                        
                           Fig-8
                        
                        
                           Il-proċedura lesta.
                        
                        
                           
                              Proċedura 2 B:   Medaka Ġappuniża (Oryzias latipes), Pretrattament tal-Fwied għall-Analiżi tal-Vitelloġenina
                        
                        Ħu l-flixkun tal-bafer omoġenat mill-kitt ELISA u kessħu b'silġ imfarrak (temperatura tas-soluzzjoni: ≤ 4°C). Jekk ikun qed jintuża bafer omoġenat mis-sistema EnBio ELISA, ħalli s-soluzzjoni toqgħod f'temperatura tal-kamra, u mbagħad kessaħ il-flixkun bis-silġ imfarrak.
                        Ikkalkola l-volum tal-bafer omoġenat għall-fwied fuq il-bażi tal-piż tiegħu (żid 50 μl ta' bafer omoġenat għal kull mg tal-piż tal-fwied). Pereżempju, jekk il-piż tal-fwied ikun ta' 4,5 mg, il-volum tal-bafer omoġenat għall-fwied ikun ta' 225 μl. Ħejji lista tal-volum tal-bafer omoġenat għall-fwied kollu.
                        
                           Tħejjija tal-fwied għal pretrattament
                        
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Oħroġ il-mikrotubu ta' 1,5 ml li jkun fih il-fwied mill-friża eżatt qabel it-trattament minn qabel.
                                 
                              
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Il-pretrattament tal-fwied mill-irġiel għandu jsir qabel dak tan-nisa biex tiġi evitata kontaminazzjoni tal-vitelloġenina. Barra minn hekk, il-pretrattament għall-gruppi tat-test għandu jsir fl-ordni li ġejja: il-kontroll, il-kontroll tas-solvent (fejn xieraq), l-inqas konċentrazzjoni, il-konċentrazzjoni tan-nofs, l-ogħla konċentrazzjoni u l-kontroll pożittiv.
                                 
                              
                                 
                                    (3)
                                 
                                 
                                    L-għadd ta' mikrotubi ta' 1,5 ml li jkun fihom kampjuni tal-fwied meħudin mill-friża fi żmien partikolari m'għandux jaqbeż l-għadd li jista' jiġi ċentrifugat dak il-ħin.
                                 
                              
                                 
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Irranġa l-mikrotubi ta' 1,5 ml li fihom il-kampjuni tal-fwied fl-ordni tan-numru tal-kampjun fuq ix-xtilliera tas-silġ (m'hemmx bżonn li l-fwied jinħall).
                                 
                              
                           Operazzjoni tal-pretrattament
                        
                        1)   Żieda tal-bafer omoġenat
                        Iċċekkja l-lista għall-volum tal-bafer omoġenat li ser jintuża għal kampjun partikolari ta' fwied u aġġusta l-mikropipetta (medda tal-volum: 100-1 000 μl) sakemm jintlaħaq il-volum xieraq. Waħħal ponta nadifa mal-mikropipetta.
                        Ħu l-bafer omoġenat mill-flixkun tar-reaġent u żid il-bafer mal-mikrotubu ta' 1,5 ml li jkun fih il-fwied.
                        Żid il-bafer omoġenat fil-mikrotubi kollha ta' 1,5 ml li jkun fihom il-fwied skont il-proċedura deskritta hawn fuq. M'hemmx bżonn li tibdel il-ponta tal-mikropipetta ma' waħda ġdida. Madanakollu, jekk il-ponta tkun kontaminata jew ikun hemm suspett li tkun kontaminata, il-ponta għandha tinbidel.
                        2)   Omoġenizzazzjoni tal-fwied
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Waħħal lida ġdida għall-omoġenizzazzjoni mal-omoġenizzatur tal-mikrotubu.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Daħħal il-lida fil-mikrotubu ta' 1,5 ml. Żomm l-omoġenizzatur tal-mikrotubu biex tagħfas il-fwied bejn il-wiċċ tal-lida u l-ħajt intern tal-mikrotubu ta' 1,5 ml.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Ħaddem l-omoġenizzatur tal-mikrotubu għal 10 sa 20 sekonda. Matul l-operazzjoni kessaħ il-mikrotubu ta' 1,5 ml b'silġ imfarrak.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Neħħi l-lida mill-mikrotubu ta' 1,5 ml u ħalliha tistrieħ għal madwar 10 sekondi. Imbagħad spezzjona viżwalment l-istat tas-sospensjoni.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Jekk tara biċċiet ta' fwied fis-sospensjoni, irripeti l-operazzjonijiet (3) u (4) biex tħejji omoġenat sodisfaċenti tal-fwied.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Kessaħ l-omoġenat tal-fwied sospiż fuq l-ixtilliera tas-silġ sakemm issir iċ-ċentrifugazzjoni.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Biddel il-lida ma' waħda ġdida għal kull omoġenat.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Omoġenizza l-fwied kollha bil-bafer omoġenat skont il-proċedura deskritta hawn fuq.
                                 
                              3)   Ċentrifugazzjoni tal-omoġenat tal-fwied sospiż
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Ikkonferma li t-temperatura tal-kompartiment taċ-ċentrifugazzjoni imkessaħ tkun ta' ≤ 5°C.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Daħħal il-mikrotubi ta' 1,5 ml li jkun fihom l-omoġenat tal-fwied sospiż f'ċentrifuga mkessħa (aġġusta l-bilanċ jekk ikun hemm bżonn).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Iċċentrifuga l-omoġenat tal-fwied sospiż f'13 000 g għal 10 min f'temperatura ta' ≤ 5°C. Madankollu, jekk is-supernatanti ikunu ġew separati b'mod adegwat, il-forza ċentrifuga u l-ħin jistgħu jiġu aġġustati skont il-bżonn.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Wara ċ-ċentrifugazzjoni, ara li s-supernatanti jkunu separati b'mod adegwat (saff tal-wiċċ: lipidu, saff intermedju: supernatant, saff tal-qiegħ: tessut tal-fwied). Jekk is-separazzjoni ma tkunx adegwata, erġa' ċċentrifuga s-sospensjoni fl-istess kondizzjonijiet.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Neħħi l-kampjuni kollha miċ-ċentrifugu mkessaħ u rranġahom fl-ordni tan-numru tal-kampjun fuq l-ixtilliera tas-silġ. Ara li ma terġax tissospendi kull saff li jkun ġie sseparat wara ċ-ċentrifugazzjoni.
                                 
                              4)   Il-ġbir tas-supernatant
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Poġġi erba' mikrotubi ta' 0,5 ml biex fihom taħżen is-supernatant fl-ixtilliera tat-tubi.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Iġbor 30 μl minn kull supernatant (separat bħala s-saff intermedju) bil-mikropipetta u poġġih f'wieħed mill-mikrotubi ta' 0,5 ml. Ara li ma tiġborx il-lipidu fuq il-wiċċ jew it-tessut tal-fwied fis-saff tal-qiegħ.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Iġbor is-supernatant u qassmu fiż-żewġ mikrotubi l-oħra ta' 0,5 ml bl-istess mod kif deskritt hawn fuq.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Iġbor il-bqija tas-supernatant bil-mikropipetta (jekk dan ikun jista' jsir: ≥ 100 μl). Imbagħad itfa' s-supernatant fil-mikrotubu ta' 0,5 ml li jifdal. Ara li ma tiġborx il-lipidu fuq il-wiċċ jew it-tessut tal-fwied fis-saff tal-qiegħ.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Agħlaq l-għatu tal-mikrotubu ta' 0,5 ml u ikteb il-volum tas-supernatant fuq it-tikketta. Imbagħad kessaħ minnufih il-mikrotubi fuq l-ixtilliera tas-silġ.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Biddel il-ponta tal-mikropipetta b'waħda ġdida għal kull supernatant. Jekk ikun hemm ammont kbir ta' lipidu mwaħħal mal-ponta, ibdilha ma' waħda ġdida minnufih biex tiġi evitata kontaminazzjoni tal-estratt tal-fwied bix-xaħam.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Qassam is-supernatant ċentrifugat kollu f'erba' mikrotubi ta' 0,5 ml skont il-proċedura deskritta hawn fuq.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Wara li tkun qassamt is-supernatant fil-mikrotubi ta' 0,5 ml, poġġihom kollha fl-ixtilliera tat-tubi bit-tikketta ta' identifikazzjoni, u mbagħad iffriżahom fil-friża minnufih. Jekk il-konċentrazzjonijiet tal-VTG jitkejlu eżatt wara l-pretrattament, żomm mikrotubu wieħed ta' 0,5 ml (li fih 30 μl ta' supernatant) kiesaħ fl-ixtilliera tat-tubi u ttrasferixxih fl-istazzjon tax-xogħol fejn se jsir l-assaġġ ELISA. F'dan il-każ, poġġi l-mikrotubi li fadal fl-ixtillieri tat-tubi u ffriżahom fil-friża.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Wara li tiġbor is-supernatant, armi l-fdalijiet b'mod adegwat.
                                 
                              
                           Ħażna tal-kampjun
                        
                        Aħżen il-mikrotubi ta' 0,5 ml li jkun fihom is-supernatant tal-omoġenat tal-fwied f'temperatura ta' ≤ -70 oC sakemm jintużaw għall-ELISA.
                        
                           
                              Proċedura 3 A:   Żebra, Il-Ġbir ta' Demm mill-Vina / Arterja Kawdali
                        
                        Eżatt wara li tingħata l-anestesija, il-pedunkulu kawdali jinqata' b'mod trażversali, u d-demm jittieħed mill-vina/arterja kawdali permezz ta' tubu kapillari mikroematokritiku eparinizzat. Il-volumi tad-demm ivarjaw minn 5 sa 15 μl skont id-daqs tal-ħuta. Mat-tubu mikrokapillari jiżdied volum indaqs ta' bafer ta' aprotinin (6 μg/ml f'PBS) u l-plażma tiġi sseparata mid-demm permezz ta' ċentrifugazzjoni (5 minuti b'600 g). Il-plażma tinġabar fit-tubi tat-test u tinħażen f'temperatura ta' – 20 °C sakemm tiġi analizzata għall-vitelloġenina jew għal proteini oħrajn ta' interess.
                        
                           
                              Proċedura 3 B:   Żebra, Il-Ġbir ta' Demm permezz ta' Titqiba fil-Qalb
                        
                        Biex jiġi evitat milli d-demm jikkoagula u l-proteini jiddegradaw, il-kampjuni jinġabru f'bafer ta' salina b'bafer tal-Fosfat (PBS) li jkun fih eparina (1 000 unità/ml) u l-inibitur tal-proteażi aprotinin (2 TIU/ml). Bħala ingredjenti għall-bafer, huma rrakkomandati eparina, melħ tal-ammonijaka u aprotinin lijofilizzat. Għall-kampjunar tad-demm, hija rrakkomandata siringa (1 ml) b'labra fissa rqiqa (eż. Braun Omnikan-F). Is-siringa għandha timtela minn qabel b'bafer (madwar 100 μl) biex il-volumi żgħar tad-demm minn kull ħuta jitneħħew kompletament. Il-kampjuni tad-demm jittieħdu permezz ta' titqiba fil-qalb. L-ewwel il-ħut għandu jiġi anestetizzat b'MS-222 (100 mg/l). Il-pjan xieraq ta' anestesija jippermetti sabiex l-utent jiddistingwi t-taħbita tal-qalb taż-żebra. Waqt li tkun qed ittaqqab il-qalb, żomm il-pistun tas-siringa taħt pressjoni baxxa. Il-volumi tad-demm li jistgħu jinġabru jvarjaw bejn 20 — 40 mikrolitru. Wara t-titqiba tal-qalb, it-taħlita tad-demm/bafer għandha tintefa' fit-tubu tat-test. Il-plażma tiġi separata mid-demm permezz ta' ċentrifugazzjoni (20 min; 5 000g) u għandha tinħażen f'temperatura ta' – 80 °C sakemm tkun meħtieġa għall-analiżi.
                        
                           
                              Proċedura 3C:   SOP: Żebra, l-omoġenizzazzjoni tar-ras u tad-denb
                        
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Il-ħut jiġi anestetizzat u ewtanizzat skont id-deskrizzjoni tat-test.
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Ir-ras u d-denb jinqatgħu mill-ħuta skont il-Figura 1.
                                    Importanti: L-istrumenti kollha tad-dissezzjoni, u l-injama tat-tqattigħ għandhom jitlaħalħu u jitnaddfu sew (eż. b'96 % etanol) bejn l-immaniġġjar ta' kull ħuta biex jiġi evitat “tniġġis tal-vitelloġenina” minn nisa jew irġiel indotti lil irġiel li ma ġewx indotti.
                                    
                                    
                                       Figura 1
                                    
                                    
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Il-piż ikkombinat tar-ras u d-denb minn kull ħuta jitkejjel sal-eqreb mg
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Wara li jintiżnu, il-partijiet jitpoġġew f'tubi adattati (eż. Eppendorf ta' 1,5 ml) u jiġu ffriżati f'– 80 °C sakemm jiġu omoġenizzati jew jiġu omoġenizzati direttament fuq is-silġ b'żewġ pistilli tal-plastik. (Jistgħu jintużaw metodi oħrajn jekk isiru fuq is-silġ u r-riżultat ikun massa omoġena). Importanti: It-tubi għandhom jiġu nnumerati sew sabiex ir-ras u d-denb mill-ħuta jkunu jistgħu jiġu relatati mas-sezzjoni tal-ġisem rispettiva tagħhom użata għall-istoloġija gonadali.
                                    
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Meta tintlaħaq massa omoġena, jiżdied bafer omoġenizzanti
                                        (*11) kiesaħ silġ li jkun 4 darbiet il-piż tat-tessut. Kompli aħdem bil-pistili sakemm it-taħlita tkun omoġenja. Nota importanti: Għal kull ħuta jintużaw pistili ġodda.
                                    
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Il-kampjuni jitqiegħdu fuq is-silġ sakemm issir ċentrifugazzjoni 4 °C b'50 000 x g għal 30 min.
                                 
                              
                                 
                                    7.
                                 
                                 
                                    Uża pipetta biex tqassam porzjonijiet ta' 20 μl ta' supernatant f'mill-inqas żewġ tubi billi tgħaddas il-ponta tal-pipetta taħt is-saff tax-xaħam fuq il-wiċċ u tiġbed bil-mod is-supernatant mingħajr frazzjonijiet ta' xaħam jew ta' gerbub.
                                 
                              
                                 
                                    8.
                                 
                                 
                                    It-tubi jinħażnu f'temperatura ta' – 80°C sakemm jiġu biex jintużaw.
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 7
                        
                           KAMPJUNI B'FORTIFIKAZZJONI TA' VITELLOĠENINA U STANDARD TA' REFERENZA INTERASSAĠĠ
                        
                        F'kull jum li jsiru l-assaġġi tal-vitelloġenina, irid jiġi analizzat kampjun taż-żieda magħmul permezz ta' standard ta' referenza interassaġġ. Il-vitelloġenina użata biex isir l-istandard ta' referenza interassaġġ għandha tkun minn lott differenti minn dak użat għat-tħejjija ta' standards tal-kalibrazzjoni għall-assaġġ imwettaq.
                        Il-kampjun taż-żieda se jittieħed billi tiżdied kwantità magħrufa tal-istandard interassaġġ ma' kampjun ta' plażma tal-irġiel tal-kontroll. Il-kampjun ser jiġi miżjud sabiex tinkiseb konċentrazzjoni tal-vitelloġenina bejn 10 u 100 darba l-konċentrazzjoni mistennija tal-vitelloġenina tal-ħut maskili ta' kontroll. Il-kampjun tal-plażma tal-irġiel tal-kontroll li huwa miżjud jista' jittieħed minn ħuta waħda jew jista' jkun ġej minn diversi ħut.
                        Sottokampjun tal-plażma tal-irġiel tal-kontroll mhux miżjuda se jiġi analizzat f'tal-anqas żewġ wells duplikati. Il-kampjun miżjud se jiġi analizzat f'tal-anqas żewġ wells duplikati wkoll. Il-kwantità medja tal vitelloġenina fiż-żewġ kampjuni tal-plażma mhux miżjuda tal-irġiel tal-kontroll tiżdied mal-kwantità kkalkolata tal-vitelloġenina miżjuda maż-żieda tal-kampjuni biex tiġi determinata konċentrazzjoni mistennija. Il-proporzjon ta' din il-konċentrazzjoni mistennija għall-konċentrazzjoni mkejla ser jiġi rrapportat flimkien mar-riżultati minn kull sett ta' assaġġi li jkunu saru dakinhar.
                     
                     
                        Appendiċi 8
                        
                           FLOWCHART DEĊIŻJONALI GĦALL-ANALIŻI STATISTIKA
                        
                        
                     C.49   Test tat-Tossiċità Akuta tal-Embrijuni tal-Ħut (FET)
                     
                     INTRODUZZJONI
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Dan il-metodu ta' ttestjar (TM) huwa ekwivalenti għal-linji gwida tal-OECD (TG) 236 (2013). Dan jiddeskrivi t-Test tat-Tossiċità Akuta tal-Embrijuni tal-Ħut (FET) bl-użu taż-żebra (Danio rerio). Dan it-test huwa maħsub biex jiddetermina t-tossiċità akuta ta' sustanzi kimiċi fl-istadji embrijoniċi tal-ħut. It-test FET huwa bbażat fuq studji u attivitajiet ta' validazzjoni mwettqa fuq iż-żebra (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14). It-test FET kien applikat b'suċċess għal firxa wiesgħa ta' sustanzi kimiċi li juru diversi modi ta' azzjoni, solubilitajiet, volatilitajiet u idrofobiċitajiet (riveduti f'15 u 16).
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Id-definizzjonijiet użati f'dan il-metodu ta' ttestjar jingħataw fl-Appendiċi 1.
                              
                           IL-PRINĊIPJU TAT-TEST
                     
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Bajd taż-żebra li jkunu għadhom kif ġew fertilizzati jiġu esposti għas-sustanza kimika tat-test għal perjodu ta' 96 siegħa. Kull 24 siegħa, sa erba' osservazzjonijiet apikali jiġu rreġistrati bħala indikaturi tal-letalità (6): (i) koagulazzjoni tal-bajd fertilizzat, (ii) nuqqas ta' formazzjoni somite, (iii) nuqqas ta' distakkament tat-tail-bud mill-borża tal-isfar tal-bajd, u (iv) nuqqas ta' taħbit tal-qalb. Fl-aħħar tal-perjodu ta' esponiment, it-tossiċità akuta tiġi ddeterminata fuq il-bażi ta' riżultat pożittiv fi kwalunkwe wieħed mill-erba' osservazzjonijiet apikali rreġistrati, u l-LC50 jiġi kkalkulat.
                              
                           KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 It-tagħrif utli dwar il-karatteristiċi speċifiċi għas-sustanza jinkludi l-formula strutturali, il-piż molekulari, il-purità, l-istabilità fl-ilma u d-dawl, pKa u Kow, is-solubilità tal-ilma u l-pressjoni tal-fwar, kif ukoll ir-riżultati ta' test għal bijodegradabilità immedjata (TM C.4 (17) jew TM C.29 (18)). Is-solubilità u l-pressjoni tal-fwar jistgħu jintużaw biex jikkalkulaw il-kostant tal-liġi ta' Henry, li se jindika jekk it-telf minħabba l-evaporazzjoni tas-sustanza kimika tat-test jistax iseħħ. Għandu jkun hemm metodu ta' min jorbot fuqu disponibbli, għall-kwantifikazzjoni tas-sustanza fis-soluzzjonijiet tat-test, b'eżattezza magħrufa u rappurtata kif ukoll il-limitu ta' rivelazzjoni.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Jekk il-metodu ta' ttestjar jintuża għall-ittestjar ta' taħlita, il-kompożizzjoni tiegħu għandha, sa fejn ikun possibbli, tkun karatterizzata, eż. bl-identità kimika tal-kostitwenti tagħha, l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet speċifiċi għas-sustanza tagħhom (ara l-paragrafu 4). Qabel l-użu tal-metodu ta' ttestjar għall-ittestjar regolatorju ta' taħlita, għandu jiġi kkunsidrat jekk hux se jipprovdi riżultati aċċettabbli għall-iskop regolatorju maħsub.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Rigward sustanzi li jistgħu jiġu attivati permezz tal-metaboliżmu, hemm evidenza li l-embrijuni taż-żebra għandhom kapaċitajiet tal-bijotrasformazzjoni (19)(20)(21)(22). Madankollu, il-kapaċità metabolika tal-ħut embrijoniku mhix dejjem simili għal dik ta' ħut żgħir jew adult. Pereżempju, il-protosikant alkoħol allyl (9) huwa nieqes fil-FET. Għalhekk, jekk ikun hemm xi indikazzjonijiet li metaboliti jew prodotti tat-trasformazzjoni ta' rilevanza oħrajn jistgħu jkunu aktar tossiċi mill-kompost oriġinarju, huwa wkoll rakkomandat li jitwettaq it-test b'dawn il-metaboliti/prodotti tat-trasformazzjoni u li jużaw dawn ir-riżultati meta jagħmlu konklużjoni dwar it-tossiċità tas-sustanzi kimiċi tat-test, jew inkella jwettqu test ieħor li jieħu aktar kont tal-metaboliżmu.
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Għal sustanzi b'piż molekulari ≥ 3kDa, struttura molekulari goffa ħafna, u sustanzi li jikkawżaw tfaqqis imdewwem jew inaqqsu l-esponiment ta' wara t-tfaqqis, l-embrijuni mhumiex mistennija li jkunu sensittivi minħabba bijodisponibbiltà limitata tas-sustanza, u testijiet tat-tossiċità oħra jistgħu jkunu aktar xierqa.
                              
                           VALIDITÀ TAT-TEST
                     
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Biex ir-riżultati tat-test ikunu validi, japplikaw il-kriterji li ġejjin:
                                 
                                             a)
                                          
                                          
                                             Ir-rata tal-fertilizzazzjoni ġenerali tal-bajd kollha miġbura għandha tkun ≥ 70 % fil-grupp ittestjat.
                                          
                                       
                                             b)
                                          
                                          
                                             It-temperatura tal-ilma għandha tinżamm 26 ± 1 °C fil-kompartiment tat-test fi kwalunkwe ħin waqt it-test.
                                          
                                       
                                             c)
                                          
                                          
                                             Is-sopravivenza totali tal-embrijuni fil-kontroll negattiv (dilwizzjoni-ilma), u, fejn rilevanti, fil-kontroll tas-solvent għandha tkun ≥ 90 % sal-aħħar tal-esponiment ta' 96 siegħa.
                                          
                                       
                                             d)
                                          
                                          
                                             Esponiment għall-kontroll pożittiv (eż. 4.0 mg/l 3,4-dikloroanilina għaż-żebra) għandu jirriżulta f'mortalità minima ta' 30 % fl-aħħar tal-esponiment ta' 96 siegħa.
                                          
                                       
                                             e)
                                          
                                          
                                             Ir-rata tat-tfaqqis fil-kontroll negattiv (u kontroll tas-solvent jekk xieraq) għandha tkun ≥80 % fit-tmiem tal-esponiment ta' 96 siegħa.
                                          
                                       
                                             f)
                                          
                                          
                                             Fl-aħħar tas-96 siegħa esponiment, il-konċentrazzjoni tal-ossiġenu maħlul fil-kontroll negattiv u fil-konċentrazzjoni tal-ogħla test għandha tkun ta' ≥80 % tas-saturazzjoni.
                                          
                                       
                           DESKRIZZJONI TAL-METODU
                     
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Ħarsa ġenerali tal-kundizzjonijiet rakkomandati tal-manutenzjoni u tat-test hija disponibbli fl-Appendiċi 2.
                              
                           
                        Tagħmir
                     
                     
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Huwa meħtieġ it-tagħmir li ġej:
                                 
                                             a)
                                          
                                          
                                             Tankijiet tal-ħut magħmula minn materjal kimiku inert (eż. ħġieġ) u ta' kapaċità adattata rigward tat-tagħbija rakkomandata (ara “Manutenzjoni tal-ħut riproduttur”, paragrafu 14);
                                          
                                       
                                             b)
                                          
                                          
                                             Mikroskopju maqlub u/jew binokulari b'kapaċità ta' tkabbir ta' mill-inqas 80 darba. Jekk il-kamra li tintuża għar-reġistrazzjoni tal-osservazzjonijiet ma tistax tiġi aġġustata għal 26 ± 1 °C, l-istadju tal-moviment laterali bit-temperatura kkontrollata jew metodi oħrajn biex tinżamm it-temperatura huma meħtieġa;
                                          
                                       
                                             c)
                                          
                                          
                                             Kmamar tat-test; eż., 24-well plates standard b'fond ta' madwar 20 mm. (ara “Kmamar tat-test”, paragrafu 11);
                                          
                                       
                                             d)
                                          
                                          
                                             eż., fojl li jeħel waħdu biex jgħatti l-24 well-plates;
                                          
                                       
                                             e)
                                          
                                          
                                             Inkubatur jew kamra bl-arja kundizzjonata bit-temperatura kontrollata, li tippermetti li tinżamm 26 ±1 °C fil-bjar (jew fil-kmamar tat-test);
                                          
                                       
                                             f)
                                          
                                          
                                             miter tal-pH;
                                          
                                       
                                             g)
                                          
                                          
                                             Ossiġenometru;
                                          
                                       
                                             h)
                                          
                                          
                                             Apparat għad-determinazzjoni tal-ebusija tal-ilma u l-konduttività;
                                          
                                       
                                             i)
                                          
                                          
                                             Nassa tal-bajd: trejs tal-istrumenti tal-ħġieġ, azzar inossidabbli jew materjali inerti oħra; malja tal-ħadid (daqs tal-gradilja ta' 2 ± 0.5 mm) tal-azzar inossidabbli jew materjal inert ieħor li jipproteġi l-bajd meta jinbiedu; sottostrat riproduttiv (eż. imitazzjonijiet ta' pjanti ta' materjal inert) (TM C.48, Appendiċi 4a (23));
                                          
                                       
                                             j)
                                          
                                          
                                             Pipetti bi ftuħ imwessa' sabiex jiġbru l-bajd;
                                          
                                       
                                             k)
                                          
                                          
                                             Reċipjenti tal-ħġieġ biex jippreparaw konċentrazzjonijiet tat-test differenti u ilma għat-trattib (beakers, flasks gradwati, ċilindri gradwati u pipetti gradwati) jew biex jiġbru l-bajd taż-żebra (eż. beakers, dixxijiet tal-kristallizzazzjoni);
                                          
                                       
                                             l)
                                          
                                          
                                             Jekk sistemi tal-esponiment alternattivi, bħall-fluss (24) jew id-dożaġġ passiv (25) jintużaw biex isir it-test, huma meħtieġa faċilitajiet u tagħmir xierqa.
                                          
                                       
                           
                        Kompartimenti tat-test
                     
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Għandhom jintużaw kompartimenti tat-test tal-ħġieġ jew tal-polistiren (eż. 24-well plates b'kapaċità tal-mili ta' 2.5-5 ml għal kull bir). Fil-każ li jkun hemm suspett tal-adsorbiment tal-polistiren (eż., għal sustanzi mhux polari, ċatti b'KOW) għoli, għandhom jintużaw materjali inerti (ħġieġ) biex jitnaqqas it-telf minħabba l-adsorbiment (26). Kompartimenti tat-test għandhom ikunu ppożizzjonati b'mod każwali fl-inkubatur.
                              
                           
                        Kundizzjonijiet tal-ilma u tat-test
                     
                     
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Hija rrakkomandata dilwizzjoni tal-ilma tal-manutenzjoni biex jinkisbu livelli ta' ebusija tipiċi ta' varjetà wiesgħa ta' ilmijiet tal-wiċċ. L-ilma tad-dilwizzjoni għandu jiġi ppreparat minn ilma rikostitwit (27). L-ammont ta' ġebla li jirriżulta li jkun fih l-ilma għandu jkun ekwivalenti għal 100-300 mg/l CaCO3 sabiex tiġi evitata preċipitazzjoni eċċessiva tal-karbonat tal-kalċju. Jista' jintuża ilma b'wiċċ karatterizzat tal-bir ieħor jew ilma tal-bir. L-ilma rikostitwit jista' jiġi adattat għal ilma tal-manutenzjoni b'ammont baxx ta' melħ minn diluzzjoni ma' ilma dejonizzat sa proporzjon ta' 1:5 għal ebusija minima ta' 30-35 mg/l CaCO3. L-ilma huwa arjat għas-saturazzjoni tal-ossiġenu qabel iż-żieda tal-kimika tat-test. It-temperatura għandha tinżamm 26 ± 1 °C, fil-bjar, matul it-test. Il-pH għandu jkun f'medda ta' bejn pH 6.5 u 8.5, u ma jvarjax f'din il-medda b'aktar minn 1.5 unità matul it-test. Jekk il-pH mhux mistenni li jibqa' f'din il-medda, għandu jsir aġġustament tal-pH qabel ma jinbeda t-test. L-aġġustament tal-pH għandu jsir b'tali mod li l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-ħażna ma tinbidilx b'xi mod sinifikanti u li l-ebda reazzjoni kimika jew preċipitazzjoni tas-sustanza kimika tat-test ma tiġi kkawżata. L-użu tal-klorur tal-idroġenu (HCl) u l-idrossidu tas-sodju (NaOH) biex jikkoreġu l-pH fis-soluzzjonijiet li jkun fihom is-sustanza kimika tat-test huwa rrakkomandat.
                              
                           
                        Is-soluzzjonijiet tat-test
                     
                     
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Is-soluzzjonijiet tat-test tal-konċentrazzjonijiet magħżula jistgħu jiġu ppreparati, eż. bid-dilwizzjoni ta' soluzzjoni tal-ħażna. Is-soluzzjonijiet tal-ħażna għandhom preferibbilment jiġu ppreparati billi sempliċiment titħallat jew titħawwad is-sustanza kimika tat-test fl-ilma tad-dilwizzjoni b'mezzi mekkaniċi (eż. billi tħawwad jew bl-ultrasonifikazzjoni). Jekk is-sustanza kimika tat-test hija diffiċli biex tinħall fl-ilma, għandhom jiġu segwiti l-proċeduri deskritti fid-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 23 għall-ġestjoni ta' sustanzi u taħlitiet diffiċli għandhom jiġu segwiti (28). L-użu ta' solventi għandu jiġi evitat, iżda jista' jkun meħtieġ f'xi każijiet sabiex jipproduċi soluzzjoni tal-ħażna konċentrata b'mod xieraq. Fejn jintuża solvent biex jassisti fil-preparazzjoni tas-soluzzjoni tal-ħażna, il-konċentrazzjoni finali tiegħu m'għandhiex taqbeż il-100 μl/l u għandha tkun l-istess fir-reċipjenti tat-test kollha. Meta jintuża solvent, huwa meħtieġ kontroll tas-solvent addizzjonali.
                              
                           
                        Manutenzjoni tal-ħut riproduttiv
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Il-ħażna għat-trobbija taż-żebra mhux espost u tat-tip selvaġġ b'rata ta' fertilizzazzjoni tal-bajd dokumentata sew tintuża għall-produzzjoni tal-bajd. Il-ħut għandu jkun ħieles minn sintomi makroskopikament dixxernibbli ta' infezzjoni u mard u m'għandux ikun sarlu kwalunkwe trattament farmaċewtiku (akut jew profilattiku) għal xahrejn qabel ir-riproduzzjoni. Il-ħut riproduttiv jinżamm f'akwarji b'kapaċità tat-tagħbija rakkomandata ta' 1 l ilma għal kull ħuta u fotoperjodu fiss ta' 12 — 16-il siegħa (29)(30)(31)(32)(33). Ir-rati ta' filtrazzjoni ottimali għandhom jiġu aġġustati; rati ta' filtrazzjoni li jikkawżaw perturbazzjoni żejda tal-ilma għandhom jiġu evitati. Għal kundizzjonijiet tal-għalf, ara Appendiċi 2. Għandu jiġi evitat l-għalf żejjed, u l-kwalità tal-ilma u l-indafa tal-akwarji għandhom jiġu mmonitorjati b'mod regolari u jerġgħu jiġu ssettjati għall-istat inizjali, jekk ikun hemm bżonn.
                              
                           
                        Ittestjar tal-profiċjenza
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 Bħala sustanza kimika ta' referenza, 3,4-dikloroanilina (użat fl-istudji ta' validazzjoni (1)(2)), għandha tiġi ttestjata f'medda tar-rispons ta' konċentrazzjoni sħiħa biex tiġi ċċekkjata s-sensittività tar-razza tal-ħut użata, preferibbilment darbtejn f'sena. Għal kwalunkwe laboratorju li jistabbilixxi inizjalment dan l-assaġġ, għandha tintuża s-sustanza kimika ta' referenza. Laboratorju jista' juża din is-sustanza kimika biex juri l-kompetenza teknika tagħhom fit-twettiq tal-assaġġ qabel jissottometti d-dejta għal skopijiet regolatorji.
                              
                           
                        Produzzjoni tal-bajd
                     
                     
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Bajd taż-żebra jistgħu jiġu prodotti permezz ta' gruppi riproduttivi (f'tankijiet riproduttivi individwali) jew permezz ta' riproduzzjoni tal-massa (fit-tankijiet tal-manutenzjoni). Fil-każ ta' gruppi tar-riproduzzjoni, irġiel u nisa (eż., fi proporzjon ta' 2:1) fi grupp tat-tgħammir jitpoġġew f'tankijiet riproduttivi ftit sigħat qabel il-bidu ta' meta jidlam fil-jum ta' qabel it-test. Peress li gruppi tar-riproduzzjoni taż-żebra jistgħu kultant jonqsu milli jbidu, l-użu parallel ta' mill-inqas tliet tankijiet riproduttivi huwa rakkomandat. Biex jiġi evitat ix-xaqlib ġenetiku, il-bajd jinġabar minn minimu ta' tliet gruppi tat-tgħammir, imħallta u magħżula b'mod każwali.
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Għall-ġbir tal-bajd, nases tar-riproduzzjoni jitpoġġew fit-tankijiet tar-riproduzzjoni jew fit-tankijiet tal-manutenzjoni qabel il-bidu ta' meta jisbaħ fil-jum tat-test. Biex tkun evitata l-predazzjoni tal-bajd minn żebra adulti, in-nases tar-riproduzzjoni huma miksijin b'malja tal-ħadid inerti ta' daqs xieraq (madwar 2 ± 0.5 mm). Jekk jitqies neċessarju, jistgħu jitwaħħlu pjanti artifiċjali magħmula minn materjal inerti (eż., plastik jew ħġieġ) mal-malja bħala stimolu riproduttiv (3)(4)(5)(23)(35). Għandhom jintużaw materjali tal-plastik użati li ma jiffiltrawx (eż., ftalati). It-tgħammir, ir-riproduzzjoni u l-fertilizzazzjoni jseħħu fi żmien 30 minuta wara l-bidu tad-dawl u n-nases tar-riproduzzjoni bil-bajd miġbur jistgħu jitneħħew b'attenzjoni. Huwa rrakkomandat it-tlaħliħ tal-bajd b'ilma rikostitwit wara li jinġabru min-nases tar-riproduzzjoni.
                              
                           
                        Id-differenzjazzjoni tal-bajd
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 F'26 °C, il-bajd fertilizzat jgħaddi mill-ewwel qasma wara madwar 15-il minuta u l-qasmiet konsekuttivi sinkroniċi jifformaw 4, 8, 16 u 32 blastomers taċ-ċellola (ara Appendiċi 3)(35). F'dawn l-istadji, il-bajd fertilizzat jista' jiġi identifikat b'mod ċar mill-iżvilupp ta' blastula.
                              
                           PROĊEDURA
                     
                        Kundizzjonijiet tal-esponiment
                     
                     
                              
                                 19.
                              
                              
                                 Għoxrin embrijun għal kull konċentrazzjoni (embrijun wieħed għal kull bir) huma esposti għas-sustanza kimika tat-test. L-esponiment għandu jkun b'tali mod li ± 20 % tal-konċentrazzjoni nominali kimika tinżamm matul it-test. Jekk dan mhux possibbli fis-sistema statika, għandu jiġi applikat intervall maniġġevoli semistatiku (eż. tiġdid kull 24 siegħa). F'dawn il-każijiet il-konċentrazzjonijiet tal-esponiment jeħtieġu jiġu vverifikati bħala minimu fl-ogħla u l-inqas konċentrazzjonijiet tat-test fil-bidu u fit-tmiem ta' kull intervall tal-esponiment (ara l-paragrafu 36). Jekk konċentrazzjoni ta' esponiment ta' ± 20 % tal-konċentrazzjonijiet nominali ma tistax tiġi sostnuta, il-konċentrazzjonijiet għandhom bżonn jitkejlu fil-bidu u fit-tmiem ta' kull intervall tal-esponiment (ara l-paragrafu 36). Waqt it-tiġdid, għandha tingħata attenzjoni li l-embrijuni jibqgħu miksijin b'ammont żgħir tas-soluzzjonijiet tat-test qodma biex ikun evitat li jinxfu. Id-disinn tat-test jista' jiġi adattat biex jissodisfa r-rekwiżiti tat-test ta' sustanzi speċifiċi (eż,. fluss kontinwu (24) jew sistemi tad-dożaġġ passivi (25) għal sustanzi faċilment degradabbli jew adsorbivi ħafna (29), jew oħrajn għal sustanzi volatili (36)(37)). Fi kwalunkwe każ, għandha tingħata attenzjoni biex jitnaqqas kwalunkwe stress lill-embrijuni. Il-kompartimenti tat-test għandhom jiġu kkondizzjonati mill-inqas għal 24 siegħa bis-soluzzjonijiet tat-test qabel il-bidu tat-test. Il-kundizzjonijiet tat-test huma miġbura fil-qosor fl-Appendiċi 2.
                              
                           
                        Konċentrazzjonijiet tat-test
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Normalment, ħames konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test spazjati b'fattur kostanti li ma jaqbiżx it-2.2 huma meħtieġa biex jiġu ssodisfati r-rekwiżiti statistiċi. Għandha tingħata ġustifikazzjoni jekk jintużaw inqas minn ħames konċentrazzjonijiet. L-ogħla konċentrazzjoni ttestjata għandha preferibbilment tirriżulta f'letalità ta' 100 %, u l-inqas konċentrazzjoni ttestjata preferibbilment ma għandha tagħti l-ebda effett osservabbli, kif definit fil-paragrafu 28. Test tat-tfittix tal-medda qabel it-test definittiv jippermetti l-għażla tal-firxa tal-konċentrazzjoni xierqa. It-tiftix tal-medda normalment jitwettaq bl-użu ta' għaxar embrijuni għal kull konċentrazzjoni. L-istruzzjonijiet li ġejjin jirreferu għat-twettiq tat-test f'24-well plates. Jekk jintużaw kompartimenti tat-test differenti (eż. dixxijiet Petri żgħar) jew jiġu ttestjati aktar konċentrazzjonijiet, l-istruzzjonijiet għandhom jiġu aġġustati kif jixraq.
                              
                           
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Dettalji u struzzjonijiet viżwali għall-allokazzjoni ta' konċentrazzjonijiet tul l-24-well plates huma disponibbli fil-paragrafu 27 u l-Appendiċi 4, Figura 1.
                              
                           
                        Kontrolli
                     
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Huma meħtieġa kontrolli tal-ilma tad-dilwizzjoni kemm bħala kontroll negattiv kif ukoll bħala kontrolli tal-plate interni. Jekk jiġi osservat aktar minn embrijun 1 mejjet fil-kontroll tal-plates, il-plate tiġi rrifjutata, b'hekk jonqos l-għadd ta' konċentrazzjonijiet użati biex tinkiseb l-LC50. Jekk plate sħiħa tiġi rrifjutata l-abbiltà li tevalwa u tagħraf l-effetti osservati tista' tkun aktar diffiċli, speċjalment jekk il-plate rrifjutata hija l-plate tal-kontroll tas-solvent jew plate li fiha embrijuni trattati jkunu affettwati wkoll. Fl-ewwel każ, it-test għandu jiġi ripetut. Fit-tieni waħda, it-telf ta' grupp(i) tat-trattament kollu minħabba mortalità tal-kontroll interna jista' jillimita l-ħila li jiġu evalwati effetti u jiġu determinati l-valuri LC50.
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Isir kontroll pożittiv f'konċentrazzjoni fissa ta' 4 mg/l 3,4-dikloroanilina għal kull lott tal-bajd użat għall-ittestjar.
                              
                           
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Fil-każ li jintuża solvent, grupp addizzjonali ta' 20 embrijun jiġi espost għas-solvent fuq 24-well plate separati, b'hekk ikunu qed iservu bħala kontroll tas-solvent. Biex it-test jiġi kkunsidrat aċċettabbli, is-solvent għandu jintwera li ma jkollu l-ebda effett sinifikanti fuq il-ħin biex ifaqqas, biex jibqa' ħaj, jew jipproduċi kwalunkwe effett avvers ieħor fuq l-embrijuni (ara paragrafu 8c).
                              
                           
                        Bidu tal-esponiment u durata tat-test
                     
                     
                              
                                 25.
                              
                              
                                 It-test jinbeda kemm jista' jkun malajr wara l-fertilizzazzjoni tal-bajd u jintemm wara 96 siegħa ta' esponiment. L-embrijuni għandhom ikunu mgħaddsa fis-soluzzjonijiet tat-test qabel tinbeda l-qasma blastodiska, jew, l-aktar tard, l-istadju 16 taċ-ċellola. Biex jibda l-esponiment b'dewmien minimu, jintgħażel mill-inqas id-doppju tan-numru tal-bajd meħtieġa għal kull grupp tat-trattament u dawn jiġu trasferiti fil-konċentrazzjonijiet u l-kontrolli rispettivi (eż. f'dixxijiet tal-kristallizzazzjoni 100 ml; il-bajd għandhom ikunu mgħottija għal kollox) mhux aktar tard minn 90 minuta wara l-fertilizzazzjoni.
                              
                           
                              
                                 26.
                              
                              
                                 Bajd fertilizzat vijabbli għandu jiġi separat minn bajd mhux fertilizzat u jiġi trasferit għal 24-well plates ikkundizzjonati minn qabel għal 24 siegħa u jerġgħu jimtlew b'soluzzjonijiet tat-test ippreparati friski 2 ml fi żmien 180 minuta wara l-fertilizzazzjoni. Permezz tal-istereomikroskopija (preferibbilment tkabbir ta' ≥30-darba), jintagħżel bajd fertilizzat li għaddej minn qsim u ma juri l-ebda irregolarità ovvja waqt il-qsim (eż. nuqqas ta' simetrija, formazzjoni ta' nfafet) jew korrimenti tal-korjon. Għall-ġbir u s-separazzjoni tal-bajd, ara l-Appendiċi 3, Grafika 1 u 3 u l-Appendiċi 4, Grafika 2.
                              
                           
                        Distribuzzjoni tal-bajd fl-24-well plates
                     
                     
                              
                                 27.
                              
                              
                                 Il-bajd huma mqassma f'well plates fin-numri li ġejjin (ara wkoll l-Appendiċi 4, Grafika 1)
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             20 bajda fuq plate waħda għal kull konċentrazzjoni tat-test;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             20 bajda bħala kontroll tas-solvent fuq plate waħda (jekk ikun meħtieġ);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             20 bajda bħala kontroll pożittiv fuq plate waħda;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             4 bajdiet f'ilma tad-dilwizzjoni bħala kontroll tal-plate intern fuq kull wieħed mill-plates t'hawn fuq;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             24 bajda fl-ilma tad-dilwizzjoni bħala kontroll negattiv fuq plate waħda.
                                          
                                       
                           
                        Osservazzjonijiet
                     
                     
                              
                                 28.
                              
                              
                                 Osservazzjonijiet apikali mwettqa fuq kull embrijun ittestjat jinkludu: koagulazzjoni tal-embrijuni, nuqqas ta' formazzjoni somite, nuqqas ta' distakkament tad-denb, u nuqqas ta' taħbit tal-qalb (Tabella 1). Dawn l-osservazzjonijiet jintużaw għad-determinazzjoni tal-letalità: Kwalunkwe riżultat pożittiv f'wieħed minn dawn l-osservazzjonijiet ifisser li l-embrijun taż-żebra ikun mejjet. Barra minn hekk, it-tfaqqis huwa rreġistrat fil-gruppi tat-trattament u tal-kontroll fuq bażi ta' kuljum u jibda minn 48 siegħa. Osservazzjonijiet huma reġistrati kull 24 siegħa, sal-aħħar tat-test.
                                 
                                    Tabella 1
                                 
                                 
                                    Osservazzjonijiet apikali tat-tossiċità akuta fl-embrijuni taż-żebra 24-96 siegħa wara l-fertilizzazzjoni.
                                 
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Ħinijiet tal-esponiment
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             24 siegħa
                                          
                                          
                                             48 siegħa
                                          
                                          
                                             72 siegħa
                                          
                                          
                                             96 siegħa
                                          
                                       
                                             Embrijuni koagulati
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                                             Nuqqas ta' formazzjoni somite
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                                             Nuqqas ta' distakkament tad-denb
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                                             Nuqqas ta' taħbit tal-qalb
                                          
                                          
                                              
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                           
                              
                                 29.
                              
                              
                                 
                                    Koagulazzjoni tal-embrijun: Embrijuni koagulati huma bojod ħalib u jidhru skuri taħt il-mikroskopju (ara l-Appendiċi 5, Grafika 1). In-numru tal-embrijuni koagulati huwa determinat wara 24, 48, 72 u 96 siegħa.
                              
                           
                              
                                 30.
                              
                              
                                 
                                    Nuqqas ta' formazzjoni somite: F'temperatura ta' 26 ± 1 °C, madwar 20 somites iffurmaw wara 24 siegħa (ara l-Appendiċi 5, Grafika 2) f'embrijun taż-żebra żviluppat normali. Embrijun żviluppat normali juri movimenti involontarji (kontrazzjonijiet minn ġenb għal ġenb). Movimenti involontarji jindikaw il-formazzjoni tas-somites. In-nuqqas ta' somites huwa rreġistrat wara 24, 48, 72 u 96 siegħa. In-nuqqas ta' formazzjoni ta' somites wara 24 siegħa jista' jkun dovut għal ittardjar ġenerali tal-iżvilupp. Mhux aktar tard minn 48 siegħa wara, il-formazzjoni tas-somites għandha tiġi żviluppata. Jekk le, l-embrijuni huma meqjusin mejta.
                              
                           
                              
                                 31.
                              
                              
                                 
                                    Nuqqas ta' distakkament tad-denb: F'embrijun taż-żebra li jiżviluppa normali, id-distakkament tad-denb (ara l-Appendiċi 5, Grafika 3) mill-isfar huwa osservat wara li jitwal il-ġisem embrijoniku. In-nuqqas ta' distakkament tad-denb huwa rreġistrat wara 24, 48, 72 u 96 siegħa.
                              
                           
                              
                                 32.
                              
                              
                                 
                                    Nuqqas ta' taħbit tal-qalb: F'embrijun taż-żebra li jiżviluppa normali f'temperatura ta' 26 ± 1 °C, it-taħbit tal-qalb huwa viżibbli wara 48 siegħa (ara l-Appendiċi 5, Grafika 4). Għandha tittieħed attenzjoni partikolari meta jiġi rreġistrat dan il-punt minħabba li taħbit tal-qalb irregolari (erratiku) m'għandux jiġi rreġistrat bħala letali. Barra minn hekk, taħbit tal-qalb viżibbli mingħajr iċ-ċirkolazzjoni fl-aorta abdominalis huwa kkunsidrat mhux letali. Biex jiġi rreġistrat dan l-effett, embrijuni li ma juru l-ebda taħbit tal-qalb għandhom jiġu osservati taħt tkabbir minimu ta' 80x għal mill-inqas minuta. In-nuqqas ta' taħbit tal-qalb huwa rreġistrat wara 48, 72 u 96 siegħa.
                              
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Rati tat-tfaqqis tal-gruppi tat-trattament u tal-kontroll kollha għandhom jiġu rreġistrati minn 48-il siegħa l-quddiem u jiġu rappurtati. Għalkemm it-tfaqqis mhux effett użat għall-kalkolu tal-LC50, it-tfaqqis jiżgura l-esponiment tal-embrijun mingħajr funzjoni ta' xkiel tal-korjon, u bħala tali jista' jgħin l-interpretazzjoni tad-dejta.
                              
                           
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Deskrizzjonijiet dettaljati tal-iżvilupp normali (35) u eżempji ta' żvilupp anormali tal-embrijuni taż-żebra huma murija fl-Appendiċi 3 u 5.
                              
                           
                        Kejliet analitiċi
                     
                     
                              
                                 35.
                              
                              
                                 Fil-bidu u fit-tmiem tat-test, jitkejlu l-pH, l-ebusija totali u l-konduttività fil-kontroll(i) u fl-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test. F'sistemi tat-tiġdid semistatiċi, il-pH għandu jitkejjel qabel u wara t-tiġdid tal-ilma. Il-konċentrazzjoni ta' ossiġenu maħlul titkejjel fl-aħħar tat-test fil-kontrolli negattivi u fl-ogħla konċentrazzjoni tat-test b'embrijuni vijabbli, fejn għandha tkun f'konformità mal-kriterji tal-validità tat-test (ara l-paragrafu 8f). Jekk hemm tħassib li t-temperatura tvarja madwar l-24-well plates, it-temperatura titkejjel fi tliet reċipjenti magħżula b'mod każwali. It-temperatura għandha tiġi rreġistrata preferibbilment b'mod kontinwu matul it-test jew, bħala minimu, kuljum.
                              
                           
                              
                                 36.
                              
                              
                                 F'sistema statika, il-konċentrazzjoni tal-kimika tat-test għandha titkejjel, bħala minimu, fl-ogħla u l-inqas konċentrazzjonijiet tat-test, iżda preferibbilment fit-trattamenti kollha, fil-bidu u fl-aħħar tat-test. F'testijiet semistatiċi (tat-tiġdid) fejn il-konċentrazzjoni tal-kimika tat-test tkun mistennija li tibqa' fi ± 20 % tal-valuri nominali, huwa rrakkomandat li, bħala minimu, l-ogħla u l-inqas konċentrazzjonijiet tat-test ikunu analizzati meta ppreparati friski u immedjatament qabel it-tiġdid. Għal testijiet fejn il-konċentrazzjoni tal-kimika tat-test mhux mistennija li tibqa fi ± 20 % tal-valur nominali, il-konċentrazzjonijiet tat-test kollha għandhom jiġu analizzati meta ppreparati friski u immedjatament qabel it-tiġdid. Fil-każ ta' volum insuffiċjenti għall-analiżi, l-amalgamazzjoni tas-soluzzjonijiet tat-test, jew l-użu ta' kompartimenti surrogati li jkunu tal-istess materjal u li jkollhom l-istess volum tal-proporzjoni tal-wiċċ bħal 24-well plates, jistgħu jkunu utli. Huwa rrakkomandat ħafna li r-riżultati jkunu bbażati fuq konċentrazzjonijiet imkejla. Meta l-konċentrazzjonijiet ma jibqgħux fi ħdan it-80-120 % tal-konċentrazzjoni nominali, il-konċentrazzjonijiet tal-effett għandhom jiġu espressi fir-rigward tal-medja ġeometrika tal-konċentrazzjonijiet imkejla; ara l-Kapitolu 5 fid-Dokument ta' Gwida tal-OECD dwar l-Ittestjar tat-Tossiċità Akwatika ta' Sustanzi u Taħlitiet Diffiċli għal aktar dettalji (28).
                              
                           IT-TEST TAL-LIMITU
                     
                              
                                 37.
                              
                              
                                 Permezz tal-proċeduri deskritti f'dan il-metodu ta' ttestjar, test tal-limitu jista' jitwettaq fuq 100 mg/l tas-sustanza kimika tat-test jew fil-limitu tas-solubbiltà fil-medium tat-test (liema minnhom ikun l-inqas) sabiex juri li l-LC50 hija ogħla minn din il-konċentrazzjoni. It-test tal-limitu għandu jitwettaq bl-użu ta' 20 embrijun fit-trattament, il-kontroll pożittiv u — jekk meħtieġ- fil-kontroll tas-solvent u l-24 embrijun fil-kontroll negattiv. Jekk il-perċentwal tal-letalità fil-konċentrazzjoni ttestjata jaqbeż il-mortalità fil-kontroll negattiv (jew il-kontroll tas-solvent) b'10 %, għandu jitwettaq studju sħiħ. Kwalunkwe effett osservat għandu jiġi rreġistrat. Jekk il-mortalità taqbeż l-10 % fil-kontroll negattiv (jew il-kontroll tas-solvent, it-test isir invalidu u għandu jiġi ripetut.
                              
                           DATA U RAPPORTAR
                     
                        Trattament tar-riżultati
                     
                     
                              
                                 38.
                              
                              
                                 F'dan it-test, il-wells individwali huma kkunsidrati repliki indipendenti għall-analiżi statistika. Il-perċentwali tal-embrijuni li għalihom mill-inqas waħda mill-osservazzjonijiet apikali hija pożittiva f'48 u/jew 96 siegħa huma mmarkati kontra l-konċentrazzjonijiet tat-test. Għall-kalkolu tal-inklinazzjonijiet tal-kurva, valuri LC50 u l-limiti tal-kunfidenza (95 %), għandhom jiġu applikati metodi statistiċi xierqa (38) u d-Dokument ta' Gwida tal-OECD dwar l-Analiżi Statistika tad-Dejta tal-Ekotossiċità għandu jiġi kkonsultat (39).
                              
                           
                        Rapport tal-ittestjar
                     
                     
                              
                                 39.
                              
                              
                                 Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Sustanza kimika tat-test:
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Sustanza monokostitwenti
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     dehra fiżika, solubbiltà fl-ilma, u karatteristiċi fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, numru CAS, kodiċi SMILES jew InChi, formula strutturali, purità, identità kimika tal-impuritajiet bħala xieraq u prattikament fattibbli, eċċ. (inkluż il-kontenut tal-karbonju organiku, jekk xieraq).
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Sustanza multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     karatterizzati kemm jista' jkun bl-identità kimika (ara hawn fuq), okkorrenza kwantitattiva u karatteristiċi fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Organiżmi tat-test:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         isem xjentifiku, razza, sors u metodu tal-ġbir tal-bajd fertilizzat, u l-użu sussegwenti.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Kundizzjonijiet tat-test:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-proċedura tat-test użata (eż., tiġdid semistatiku);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fotoperjodu;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         id-disinn tat-test (eż., numru ta' kompartimenti tat-test, tipi ta' kontrolli);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         karatteristiċi tal-kwalità tal-ilma fil-manutenzjoni tal-ħut (eż. pH, kemm fih ġebla, temperatura, konduttività, ossiġenu maħlul);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         konċentrazzjoni tal-ossiġenu maħlul, pH, ebusija totali, temperatura u konduttività tas-soluzzjonijiet tat-test fil-bidu u wara 96 siegħa;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         metodu ta' preparazzjoni tas-soluzzjonijiet tal-ħażna u soluzzjonijiet tat-test kif ukoll il-frekwenza tat-tiġdid;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         ġustifikazzjoni għall-użu ta' solvent u ġustifikazzjoni għall-għażla ta' solvent, jekk huwa xi ħaġa oħra barra ilma;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-konċentrazzjonijiet nominali tat-test u r-riżultat tal-analiżijiet kollha biex tiddetermina l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test fir-reċipjenti tat-test; l-effiċjenza tal-irkupru tal-metodu u l-limitu ta' kwantifikazzjoni (LoQ) għandhom ukoll jiġu rrappurtati;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         evidenza li l-kontrolli ssodisfaw il-kriterji ġenerali tal-validità tas-sopravivvenza;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         rata tal-fertilizzazzjoni tal-bajd;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         rata tat-tfaqqis fil-gruppi tat-trattament u tal-kontroll.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Riżultati:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         konċentrazzjoni massima li ma tikkawżax mortalità matul id-durata tat-test;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         konċentrazzjoni minima li tikkawża mortalità ta' 100 % matul id-durata tat-test;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         mortalità kumulattiva għal kull konċentrazzjoni fil-ħinijiet tal-osservazzjoni rakkomandati;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-valuri LC50 fis-96 siegħa (u possibbilment fit-48 siegħa) għall-mortalità b'limiti tal-kunfidenza ta' 95 %, jekk possibbli;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         grafika tal-kurva tal-konċentrazzjoni-mortalità fl-aħħar tat-test;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-mortalità fil-kontrolli (kontrolli negattivi, kontrolli interni tal-plate, kif ukoll kontroll pożittiv u kwalunkwe kontroll tas-solvent użat);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         dejta dwar ir-riżultat ta' kull wieħed mill-erba' osservazzjonijiet apikali;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         inċidenza u deskrizzjoni ta' anormalitajiet morfoloġiċi u fiżjoloġiċi, jekk ikun hemm (ara l-eżempji pprovduti fl-Appendiċi 5, Grafika 2);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         inċidenti fil-kors tat-test li setgħu influwenzaw ir-riżultati;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         analiżi statistika u trattament tad-dejta (analiżi probit, mudell tar-rigressjoni loġistika u medja ġeometrika għal-LC50);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         limiti tal-inklinazzjoni u tal-kunfidenza tar-rigressjoni tal-kurva tal-konċentrazzjoni-rispons (trasformata).
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Kwalunkwe devjazzjoni mill-metodu ta' ttestjar u spjegazzjonijiet rilevanti.
                                             
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Diskussjoni u interpretazzjoni tar-riżultati.
                                             
                                          
                                       
                           TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2011) Validation Report (Phase 1) for the Zebrafish Embryo Toxicity Test: Part I and Part II. Series on Testing and Assessment No. 157, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2012) Validation Report (Phase 2) for the Zebrafish Embryo Toxicity Test: Part I and Part II (Annexes). Series on Testing and Assessment No. 179, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Braunbeck, T., Böttcher, M., Hollert, H., Kosmehl, T., Lammer, E., Leist, E., Rudolf, M. and Seitz, N. (2005) Towards an alternative for the acute fish LC50 test in chemical assessment: The fish embryo toxicity test goes multi-species-an update. ALTEX 22: 87-102.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 ISO (2007) International Standard Water quality — Determination of the acute toxicity of waste water to zebrafish eggs (Danio rerio). ISO 15088:2007(E) International Organization for Standardization.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Nagel, R. (2002) DarT: The embryo test with the zebrafish (Danio rerio) — a general model in ecotoxicology and toxicology. ALTEX 19: 38-48.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Schulte, C. and Nagel, R. (1994) Testing acute toxicity in embryo of zebrafish, Brachydanio rerio as alternative to the acute fish test — preliminary results. ATLA 22, 12-19.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Bachmann, J. (2002) Development and validation of a teratogenicity screening test with embryos of the zebrafish (Danio rerio). PhD-thesis, Technical University of Dresden, Germany.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Lange, M., Gebauer, W., Markl, J. and Nagel, R. (1995) Comparison of testing acute toxicity on embryo of zebrafish (Brachydanio rerio), and RTG-2 cytotoxicity as possible alternatives to the acute fish test. Chemosphere 30/11: 2087-2102.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Knöbel, M., Busser, F.J.M., Rico-Rico, A., Kramer, N.I., Hermens, J.L.M., Hafner, C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Scholz, S. (2012). Predicting adult fish acute lethality with the zebrafish embryo: relevance of test duration, endpoints, compound properties, and exposure concentration analysis. Environ. Sci. Technol. 46, 9690-9700.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Kammann, U., Vobach, M. and Wosniok, W. (2006) Toxic effects of brominated indoles and phenols on zebrafish embryos. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 51: 97-102.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Groth, G., Kronauer, K. and Freundt, K.J. (1994) Effects of N,N-diemethylformamide and its degradation products in zebrafish embryos. Toxicol. In Vitro 8: 401-406.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Groth, G., Schreeb, K., Herdt, V. and Freundt, K.J. (1993) Toxicity studies in fertilized zebrafish fish eggs treated with N-methylamine, N,N-dimethylamine, 2-aminoethanol, isopropylamine, aniline, N-methylaniline, N,N-dimethylaniline, quinone, chloroacetaldehyde, or cyclohexanol. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 50: 878-882.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Nguyen, L.T. and Janssen, C.R. (2001) Comparative sensitivity of embryo-larval toxicity assays with African catfish (Clarias gariepinus) and zebra fish (Danio rerio). Environ. Toxicol. 16: 566-571.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Cheng, S.H., Wai, A.W.K., So, C.H. and Wu, R.S.S. (2000) Cellular and molecular basis of cadmium-induced deformities in zebrafish embryos. Environ. Toxicol. Chem. 19: 3024-3031.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Belanger, S. E., Rawlings J. M. and Carr G. J. (2013). Use of Fish Embryo Toxicity Tests for the Prediction of Acute Fish Toxicity to Chemicals. Environmental Toxicology and Chemistry 32: 1768-1783.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Lammer, E., Carr, G. J., Wendler, K., Rawlings, J. M., Belanger, S. E., Braunbeck, T. (2009) Is the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio) a potential alternative for the fish acute toxicity test? Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol.: 149 (2), 196-209
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Chapter C.4 of this Annex: Ready Biodegradability.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Chapter C.29 of this Annex: Ready Biodegradability, CO2 in sealed vessels.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Weigt, S., Huebler, N., Strecker, R., Braunbeck, T., Broschard, T.H. (2011) Zebrafish (Danio rerio) embryos as a model for testing proteratogens. Toxicology 281: 25-36.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Weigt, S., Huebler, N., Strecker, R., Braunbeck, T., Broschard, T.H. (2012) Developmental effects of coumarin and the anticoagulant coumarin derivative warfarin on zebrafish (Danio rerio) embryos. Reprod. Toxicol. 33: 133-141.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Incardona, J.P, Linbo, T.L., Scholz, N.L. (2011) Cardiac toxicity of 5-ring polycyclic aromatic hydrocarbons is differentially dependent on the aryl hydrocarbon receptor 2 isoform during zebrafish development. Toxicol. Appl. Pharmacol. 257: 242-249.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Kubota, A., Stegeman, J.J., Woodin, B.R., Iwanaga, T., Harano, R., Peterson, R.E., Hiraga, T., Teraoka, H. (2011) Role of zebrafish cytochrome P450 CYP1C genes in the reduced mesencephalic vein blood flow caused by activation of AHR2. Toxicol. Appl. Pharmacol. 253: 244-252.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu C.48 ta' dan l-Anness: Fish Short Term Reproduction Assay.. Ara l-Appendiċi 4a.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Lammer, E., Kamp, H.G., Hisgen, V., Koch, M., Reinhard, D., Salinas, E.R., Wendlar, K., Zok, S., Braunbeck, T. (2009) Development of a flow-through system for the fish embryo toxicity test (FET) with zebrafish (Danio rerio). Toxicol. in vitro 23: 1436-1442.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Brown, R.S., Akhtar, P., Åkerman, J., Hampel, L., Kozin, I.S., Villerius, L.A., Klamer, H.J.C., (2001) Partition controlled delivery of hydrophobic substances in toxicity tests using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) ﬁlms. Environ. Sci. Technol. 35, 4097–4102.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Schreiber, R., Altenburger, R., Paschke, A., Küster, E. (2008) How to deal with lipophilic and volatile organic substances in microtiter plate assays. Environ. Toxicol. Chem. 27, 1676-1682.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 ISO (1996) International Standards. Water quality — Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)]. ISO 7346-3: Flow-through method. Disponibbli: [http://www.iso.org].
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 OECD (2000) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Series on Testing and Assessment No. 23, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 Laale, H.W. (1977) The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio, in fisheries research. A literature review. J. Fish Biol. 10: 121-173.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Westerfield, M. (2007) The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). 5th edition. Eugene, University of Oregon Press, Institute of Neuroscience, USA.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Canadian Council on Animal Care (2005) Guidelines on: the Care and Use of Fish in Research, Teaching and Testing, ISBN: 0-919087-43-4 http://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Fish.pdf
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Kummissjoni Ewropea (2007) Rakkomandazzjoni tal-Kummissjoni 2007/526/KE tat-18 ta' Ġunju 2007 dwar linji gwida għall-akkomodazzjoni u l-kura tal-annimali użati għal skopijiet sperimentali u oħrajn xjentifiċi (notifikat skont in-numru tad-dokument C(2007) 2525) [http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2007:197:0001:0089:EN:PDF]
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Unjoni Ewropea (2010) Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta' Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali użati għal skopijiet xjentifiċi. Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea, L 276:33-79; 20.10.2010
                                 http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:EN:PDF
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Nagel, R. (1986) Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling (Brachydanio rerio, Ham.-Buch.). J. Appl. Ichthyol. 2: 173-181.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Kimmel, C.B., Ballard, W.W., Kimmel, S.R., Ullmann, B. and Schilling, T.F. (1995) Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203: 253-310.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu C.2 ta' dan l-Anness: Daphnia sp., Test tal-Immobilizzazzjoni Akuta.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Weil, M., Scholz, S., Zimmer, M., Sacher, F., Duis, K. (2009) Gene expression analysis in zebrafish embryos: a potential approach to predict effect conentrations in the fish early life stage test. Environ. Toxicol. Chem. 28: 1970-1978
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 ISO (2006) Standard Internazzjonali. Water quality — Guidance on statistical interpretation of ecotoxicity data ISO TS 20281. Disponibbli: [http://www.iso.org].
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 OECD (2006) Guidance Document on Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No. 54. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Braunbeck, T., Lammer, E., 2006. Dokument ta' reviżjoni dettaljata “Fish embryo toxicity assays” Rapport UBA taħt il-kuntratt Nru 20385422 Aġenzija Federali tal-Ambjent Ġermaniża, Berlin. 298 pp.
                              
                           
                        Appendiċi 1
                        DEFINIZZJONIJIET
                        
                           
                              Punt ta' tmiem apikali
                           : Li jikkaġuna effett fil-livell tal-popolazzjoni.
                        
                           
                              Blastula
                           : Formazzjoni ċellulari madwar il-pol tal-annimal li jkopri ċertu parti tal-isfar.
                        
                           
                              Sustanza Kimika
                           : Sustanza jew taħlita
                        
                           
                              Epibolija
                           : hija proliferazzjoni enormi ta' ċelloli fil-biċċa l-kbira epidermali fil-fażi tal-gastrulazzjoni tal-embrijun u l-moviment tagħhom mill-ġenb dorsali għal dak ventrali, li permezz tagħha s-saffi taċ-ċelloli entodermali huma internalizzati fi proċess simili għall-invaġinazzjoni u l-isfar ikun inkorporat fl-embrijun.
                        
                           
                              Test tal-fluss kontinwu
                           : Test bi fluss kontinwu ta' soluzzjonijiet tat-test fis-sistema tat-test matul id-durata tal-esponiment.
                        
                           
                              Kontroll Intern tal-Plate
                           : Il-kontroll intern jikkonsisti f'4 wells mimlija bl-ilma tad-dilwizzjoni għal kull 24-well plate biex jidentifika l-kontaminazzjoni potenzjali tal-plates mill-manifattur jew mir-riċerkatur waqt il-proċedura, u kwalunkwe effett tal-plate li potenzjalment jinfluwenza l-eżitu tat-test (eż. gradjent tat-temperatura).
                        
                           
                              IUPAC
                           : Unjoni Internazzjonali tal-Kimika Pura u Applikata
                        
                           
                              Manutenzjoni tal-ilma
                           : Ilma li fih titwettaq it-trobbija tal-ħut adult.
                        
                           
                              Konċentrazzjoni Letali Medjana (LC50)
                           : Il-konċentrazzjoni ta' sustanza kimika tat-test li hija stmata li tkun letali għal 50 % tal-organiżmi tat-test fid-durata tat-test.
                        
                           
                              Test tat-tiġdid semistatiku
                           : Test b'tiġdid regolari tas-soluzzjonijiet tat-test wara perjodi definiti (eż., kull 24 siegħa).
                        
                           
                              SMILES
                           : Simplified Molecular Input Line Entry Specification
                        
                           
                              Somite
                           : Fl-embrijun vertebrat li qed jiżviluppa, is-somites huma mases ta' mesoderm imqassma b'mod laterali mat-tubu newrali, li eventwalment jiżviluppa d-dermis (dermatom), fil-muskoli skeletali (mijotom), u vertebri (sklerotom).
                        
                           
                              It-test statiku
                           : Test fejn is-soluzzjonijiet tat-test ma jinbidlux matul id-durata tat-test.
                        
                           
                              Sustanza kimika tat-test
                           : Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata bl-użu ta' dan il-metodu ta' ttestjar
                        
                           
                              UVCB
                           : Sustanzi ta' kompożizzjoni mhux magħrufa jew varjabbli, prodotti ta' reazzjoni kumplessa jew materjali bijoloġiċi
                     
                     
                        Appendiċi 2
                        
                           MANUTENZJONI, TGĦAMMIR U KUNDIZZJONIJIET TIPIĊI GĦAT-TESTIJIET TAT-TOSSIĊITÀ AKUTA TAL-EMBRIJUNI TAŻ-ŻEBRA
                        
                        
                                    
                                       Żebra (Danio rerio)
                                    
                                 
                              
                                    Oriġini tal-ispeċi
                                 
                                 
                                    Indja, Burma, Malakka, Sumatra
                                 
                              
                                    Dimorfiżmu sesswali
                                 
                                 
                                    Nisa: żaqq tisporġi 'l barra, meta jġorru l-bajd
                                    Irġiel: aktar irqaq, lewn oranġjo bejn strixxi lonġitudonali blu (partikolarment evidenti fix-xewka anali)
                                 
                              
                                    Reġim tal-għalf
                                 
                                 
                                    Frak tal-ikel xott (flake food) (mass. 3 % piż tal-ħut fil-ġurnata) 3 — 5 darba kuljum; addizzjonalment gambli tal-ilma mielaħ (Artemia spec.) nauplii u / jew daphnids żgħar ta' daqs xieraq miksuba minn sors mhux kontaminat. L-għalf tal-ikel ħaj jipprovdi sors ta' arrikkiment ambjentali u għalhekk l-ikel ħaj għandu jingħata kull meta jkun possibbli. Biex ikun hemm garanzija għal kwalità tal-ilma ottimali, ikel u ppurgar żejda għandhom jitneħħew madwar siegħa wara l-għalf.
                                 
                              
                                    Piż approssimattiv tal-ħut adult
                                 
                                 
                                    Nisa: 0,65 ± 0,13 g
                                    Irġiel: 0,5 ± 0,1 g
                                 
                              
                                    Manutenzjoni tal-ħut ġenitur
                                 
                                 
                                    Illuminazzjoni
                                 
                                 
                                    Bozoz fluworexxenti (bi spettru wiesa); 10-20 μE/m2/s, 540-1 080  lux, jew 50-100 ft-c (livelli tal-laboratorju ambjent); fotoperjodu ta' 12 sa 16-il siegħa
                                 
                              
                                    Temperatura tal-ilma
                                 
                                 
                                    26 ± 1 °C
                                 
                              
                                    Il-kwalità tal-ilma
                                 
                                 
                                    O2 ≥ 80 % saturazzjoni, ebusija: eż. ~ 30-300 mg/l CaCO3, NO3
                                       -: ≤ 48mg/l, NH4
                                       + u NO2
                                       -: < 0,001 mg/l, kloru residwu < 10 μg/l, kloru organiku totali < 25 ng/l, pH = 6,5 – 8,5
                                 
                              
                                    Aktar kriterji tal-kwalità tal-ilma
                                 
                                 
                                    Materja f'partikoli < 20 mg/l, karbonju organiku totali < 2 mg/l, pestiċidi organofosforiċi totali < 50 ng/l, pestiċidi organokloriċi totali flimkien ma' bifenili poliklorinati < 50 ng/l
                                 
                              
                                    Daqs tat-tank għall-manutenzjoni
                                 
                                 
                                    eż. 180 l, 1 ħuta/l
                                 
                              
                                    Tisfija tal-ilma
                                 
                                 
                                    Permanenti (iffiltrata bil-faħam); possibbiltajiet oħra jinkludu kombinazzjonijiet b'manutenzjoni tat-tiġdid semistatika jew sistema tal-flus bit-tiġdid tal-ilma kontinwu
                                 
                              
                                    Proporzjon tat-tnissil irġiel għal nisa rakkomandat
                                 
                                 
                                    2:1 (jew riproduzzjoni tal-massa)
                                 
                              
                                    Tankijiet riproduttivi
                                 
                                 
                                    eż. tankijiet ta' 4 l mgħammra b'qiegħ ta' gradilja tal-azzar u pjanta finta bħala stimulant għar-riproduzzjoni; twapet tas-sħana esterni, jew riproduzzjoni tal-massa fit-tankijiet tal-manutenzjoni
                                 
                              
                                    Struttura u dehra tal-bajd
                                 
                                 
                                    Korjon stabbli (jiġifieri trasparenti ħafna, li ma jwaħħalx, dijametru ~ 0,8-1,5 mm)
                                 
                              
                                    Rata tar-riproduzzjoni
                                 
                                 
                                    Mara matura waħda tbid mill-inqas 50-80 bajda fil-ġurnata. Skont ir-razza, ir-rati riproduttiva jistgħu jkunu konsiderevolment ogħla. Ir-rata tal-fertilizzazzjoni għandha tkun ≥ 70 %. Għal ħut li jbid l-ewwel darba, ir-rati tal-fertilizzazzjoni tal-bajd jistgħu jkunu inqas fl-ewwel ftit drabi li jbidu.
                                 
                              
                                    Tip ta' test
                                 
                                 
                                    Kompartimenti tat-test statiċi, tat-tiġdid semistatiku, tal-fluss, 26 ± 1 °C, 24 siegħa kondizzjonati (eż. 24-well plates 2,5-5 ml għal kull kavità)
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 3
                        
                           ŻVILUPP NORMALI TAŻ-ŻEBRA F'26 °C
                        
                        
                     
                        Appendiċi 4
                        
                           Grafika 1
                        
                        
                           Tqassim ta' 24-well plates
                        
                        
                                    1-5
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    ħames konċentrazzjonijiet tat-test / sustanza kimika;
                                 
                              
                                    nC
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    kontroll negattiv (ilma tad-dilwizzjoni);
                                 
                              
                                    iC
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    kontroll tal-plate intern (ilma tad-dilwizzjoni);
                                 
                              
                                    pC
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    kontroll pożittiv (3,4-DCA 4mg/l);
                                 
                              
                                    sC
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    kontroll tas-solvent
                                 
                              
                           Grafika 2
                        
                        
                           Skema tal-proċess tat-test tat-tossiċita akuta tal-embrijun taż-żebra (mix-xellug għal-lemin): produzzjoni tal-bajd, ġbir tal-bajd, esponiment minn qabel immedjatament wara l-fertilizzazzjoni f'reċipjenti tal-ħġieġ, għażla tal-bajd fertiliżżat b'mikroskopju maqlub jew binokulari u distribuzzjoni tal-bajd fertilizzat f'24-well plate ippreparata bil-konċentrazzjonijiet/kontrolli tat-test rispettivi, n = numru tal-bajd meħtieġ għal kull konċentrazzjoni/kontroll tat-test (hawn 20), hpf = sigħat wara l-fertilizzazzjoni.
                        
                     
                        Appendiċi 5
                        
                           ATLAS TA' PUNTI TAT-TMIEM LETALI GĦAT-TEST TAT-TOSSIĊITÀ AKUTA TAL-EMBRIJUNI TAŻ-ŻEBRA
                        
                        Il-punti tat-tmiem letali li ġejjin jindikaw tossiċità akuta u, konsegwentement, il-mewt tal-embrijuni: koagulazzjoni tal-embrijun, nuqqas ta' distakk tad-denb, nuqqas ta' formazzjoni somite u nuqqas ta' taħbit tal-qalb. Il-mikrografiċi li ġejjin intgħażlu biex juru dawn il-punti tat-tmiem.
                        
                           Grafika 1:
                        
                        
                           Koagulazzjoni tal-embrijun
                        
                        Taħt illuminazzjoni qawwija, l-embrijuni koagulati taż-żebra juru varjetà ta'inklużjonijiet mhux trasparenti.
                        
                           Grafika 2:
                        
                        
                           Nuqqas ta' formazzjoni somite
                        
                        Għalkemm ritardati fl-iżvilupp b'madwar 10 sigħat, l-embrijun taż-żebra ta' 24 siegħa f'(a) juri somites żviluppati tajjeb (→), filwaqt li l-embrijun f'(b) ma juri l-ebda sinjal ta' formazzjoni somite (→). Għalkemm juri edema tal-borża tal-isfar tal-bajda evidenti (*), l-embrijun taż-żebra ta' 48 siegħa f'(c) juri żvilupp distint tas-somites (→), filwaqt li l-embrijun taż-żebra ta' 96 siegħa muri f'(d) ma juri l-ebda sinjal ta' formazzjoni somite (→). Innota wkoll il-kurvatura tas-sinsla (skoljożi) u l-edema perikardjali (*) fl-embrijun murija f'(d).
                        
                           Grafika 3:
                        
                        
                           Nuqqas ta' distakkament
                        
                        
                           Grafika 4:
                        
                        
                           Nuqqas tat-taħbit tal-qalb
                        
                        In-nuqqas tat-taħbit tal-qalb huwa, b'definizzjoni, diffiċli biex jintwera f'mikrografika. In-nuqqas tat-taħbit tal-qalb huwa indikat bin-nuqqas ta' konvulżjoni tal-qalb (vleġġa doppja). L-immobbiltà taċ-ċelloli tad-demm, eż. fl-aorta abdominalis (→ fid-daħla) mhix indikatur għal nuqqas ta' taħbit tal-qalb. Innota wkoll in-nuqqas ta' formazzjoni somite f'dan l-embrijun (*, dehra omoġenja mhux segmentali tat-tessuti muskolari). Il-ħin ta' osservazzjoni biex tirreġistra nuqqas ta' taħbit tal-qalb għandu jkun mill-inqas minuta bi tkabbir minimu ta' 80×.
                     
                     C.50   
                           Myriophyllum spicatum ħieles mis-sediment
                     
                     INTRODUZZJONI
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linji gwida tat-test OECD 238 (2014). Huwa mfassal biex jevalwa t-tossiċità tas-sustanzi kimiċi għall-Myriophyllum spicatum, speċi tal-familja tal-ħaxixa tal-morliti tal-ilma. Huwa bbażat fuq metodu ta' ttestjar eżistenti ASTM (1) modifikat bħala sistema tat-test ħielsa mis-sediment (2) biex jistima l-ekotossiċità intrinsika tas-sustanzi kimiċi tat-test (indipendentement mill-imġiba tad-distribuzzjoni tas-sustanza kimika tat-test bejn l-ilma u s-sediment). Sistema tat-test mingħajr sediment għandha kumplessità analitika baxxa (fil-fażi tal-ilma biss) u r-riżultati jistgħu jiġu analizzati b'mod parallel u/jew f'paragun ma dawk miksuba fit-test Lemna sp. (3); barra minn hekk, il-kundizzjonijiet sterili meħtieġa biex l-effetti tal-mikroorganiżmi u tal-alka (assorbiment kimiku/degradazzjoni, eċċ.) jinżammu baxxi kemm jista' jkun. Dan it-test ma jissostitwixxix testijiet tat-tossiċità akwatika oħrajn; minflok dan għandu jikkumplimentahom sabiex tkun tista' ssir valutazzjoni aktar kompleta tal-periklu akwatiku tal-pjanti u tar-riskju. Dan il-metodu ta' ttestjar ġie vvalidat permezz ta' ring-test (4).
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Dettalji tal-ittestjar bit-tiġdid (semistatiku) u mingħajr it-tiġdid (statiku) tas-soluzzjoni tat-test huma deskritti. Skont l-objettivi tat-test u r-rekwiżiti regolatorji, huwa rakkomandat l-użu tal-metodu semistatiku, eż. għal sustanzi li jintilfu malajr minn soluzzjoni bħala riżultat tal-volatilizzazzjoni, adsorbiment, fotodegradazzjoni, idroliżi, preċipitazzjoni jew bijodegradazzjoni. F'(5) tingħata gwida ulterjuri. Dan il-metodu ta' ttestjar japplika għal sustanzi li għalihom il-metodu ta' ttestjar ġie vvalidat, (ara d-dettalji fir-rapport tar-ring test (4)) jew għal formulazzjonijiet, jew taħlitiet magħrufa; jekk taħlita tkun ġiet ittestjata, il-kostitwenti tagħha għandhom kemm jista' jkun jiġu identifikati u kwantifikati. Il-metodu ta' ttestjar Myriophyllum spicatum mingħajr sediment jikkumplimenta t-Test tat-Tossiċità tas-sediment tal-ilma Myriophyllum spicatum (6). Qabel l-użu tal-metodu ta' ttestjar għall-ittestjar ta' taħlita maħsuba għal skop regolatorju, għandu jiġi kkunsidrat jekk, u jekk ikun hekk għaliex, jista' jipprovdi riżultati adegwati għal dan il-għan. Tali kunsiderazzjonijiet mhumiex meħtieġa, meta hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita.
                              
                           IL-PRINĊIPJU TAT-TEST
                     
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Kulturi ta' pjanti li jikbru kontinwament ta' Myriophyllum spicatum (biss fil-medium Andrews modifikat, ara l-Appendiċi 2) huma permessi li jikbru bħala monokulturi f'konċentrazzjonijiet differenti tas-sustanza kimika tat-test matul perjodu ta' 14-il ġurnata f'sistema tat-test mingħajr sediment. L-objettiv tal-ittestjar huwa li jikkwantifika l-effetti relatati mas-sustanzi kimiċi fuq it-tkabbir veġettativ matul dan il-perjodu abbażi ta' valutazzjonijiet tal-varjabbli ta' kejl magħżula. It-tkabbir tat-tul tar-rimja, tal-fergħat laterali u l-għeruq kif ukoll l-iżvilupp tal-piż frisk u niexef u żieda fis-sepali huma l-varjabbli tal-kejl. Barra minn hekk, jingħata kas tal-bidliet kwalitattivi distinti fl-organiżmi tat-test, bħall-isfigurament jew il-klorożi u n-nekrożi indikati bil-kulur isfar jew abjad u kannella. Biex jikkwantifika l-effetti relatati mas-sustanzi kimiċi, it-tkabbir fis-soluzzjonijiet tat-test huwa mqabbel ma' dak tal-kontrolli u l-konċentrazzjoni li ġġib inibizzjoni speċifikata x % tat-tkabbir li hija determinata u espressa bħala ECx; “x” tista' tkun kwalunkwe valur skont ir-rekwiżiti regolatorji, eż. EC10, EC20, EC50. Għandu jiġi nnotat li l-istimi tal-valuri EC10 u EC20 huma biss affidabbli u xierqa f'testijiet fejn il-koeffiċjenti tal-varjazzjoni fil-pjanti tal-kontroll jaqgħu taħt il-livell tal-effett li qed ikun stmat, jiġifieri l-koeffiċjenti tal-varjazzjoni għandhom ikunu <20 % għal stima robusta ta' EC20.
                              
                           
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Kemm ir-rata tat-tkabbir medja speċifika (stmata minn evalwazzjonijiet tat-tul ewlieni tar-rimja u tliet varjabbli tal-kejl addizzjonali) u r-rendiment (stmat miż-żieda fit-tul ewlieni tar-rimja u tliet varjabbli tal-kejl addizzjonali) ta' pjanti mhux trattati u trattati għandhom jiġu determinati. Ir-rata speċifika tat-tkabbir (r) u r-rendiment (y) huma sussegwentement użati biex jiġu determinati ErCx (e.g. ErC10, ErC20, ErC50) u EyCx (e.g. EyC10, EyC20, EyC50), rispettivament.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Barra minn hekk, jistgħu jiġu stabbiliti statistikament il-konċentrazzjoni bl-inqas effett osservat (LOEC) u l-konċentrazzjoni bla effett osservat (NOEC).
                              
                           INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA KIMIKA TAT-TEST
                     
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Għandu jkun disponibbli metodu analitiku, b'sensittività xierqa għall-kwantifikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test fil-mezz tat-test. Informazzjoni dwar is-sustanza kimika tat-test li tista' tkun utli biex jistabbilixxu l-kundizzjonijiet tat-test tinkludi l-formula strutturali, il-purità u l-impuritajiet, is-solubbiltà tal-ilma, l-istabilità fl-ilma u fid-dawl, il-kostant tad-dissoċjazzjoni tal-aċidu (pKa), il-koeffiċjent tal-partizzjoni oktanol-ilma (Kow), il-pressjoni tal-fwar u l-bijodegrabbiltà. Is-solubbiltà fl-ilma u l-pressjoni tal-fwar jistgħu jintużaw biex jiġi kkalkolat il-kostant ta' Henry's Law, li jindika jekk huwiex probabbli telf sinifikanti fis-sustanza kimika tat-test matul il-perjodu tal-ittestjar. Dan sejjer jgħin biex jindika jekk għandhomx jittieħdu passi partikolari biex jiġi kkontrollat tali telf. Meta l-informazzjoni dwar is-solubbiltà u l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test mhix ċerta, huwa rrakkomandat li din tiġi vvalutata skont il-kundizzjonijiet tat-test, jiġifieri medium tat-tkabbir, temperatura, reġim tad-dawl li għandhom jintużaw fit-test.
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Il-kontroll tal-pH tal-medium tat-test huwa partikolarment importanti, eż. meta jiġu ttestjati metalli jew sustanzi li huma idrolitikament instabbli. Aktar gwida għall-ittestjar tas-sustanzi kimiċi b'karatteristiċi kimiċi fiżiċi li jagħmluha diffiċli biex isir it-test hija pprovduta fid-Dokument ta' Gwida tal-OECD (5).
                              
                           VALIDITÀ TAT-TEST
                     
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Sabiex it-test ikun validu, il-ħin tal-irduppjar tat-tul tar-rimja prinċipali fil-kontroll għandu jkun inqas minn 14-il ġurnata. Bl-użu tal-kundizzjonijiet tal-midja u tat-test deskritti f'dan il-metodu ta' ttestjar, dan il-kriterju jista' jinkiseb bl-użu ta' reġim tat-test statiku jew semistatiku.
                              
                           
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Il-koeffiċjent medju tal-varjazzjoni għar-rendiment ibbażat fuq kejl tal-piż frisk tar-rimja (jiġifieri mill-bidu tat-test għat-terminazzjoni tat-test) u l-varjabbli tal-kejl addizzjonali (ara l-paragrafu 37) fil-kulturi ma jaqbżux il-35 % bejn ir-repliki.
                              
                           
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Aktar minn 50 % tar-repliki tal-grupp ta' kontroll jinżammu sterili matul il-perjodu ta' esponiment ta' 14-il ġurnata, li jfisser li jkunu viżibbilment ħielsa mill-kontaminazzjoni minn organiżmi oħra bħall-alka, fungi u batterji (soluzzjoni ċara). Nota: Gwida dwar kif tiġi vvalutata l-isterilità hija pprovduta fir-rapport tar-ring-test (4).
                              
                           SUSTANZA KIMIKA TA' REFERENZA
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Sustanza(i) ta' referenza, bħal 3,5-diklorofenol użat fir-ring test (4), jistgħu jiġu ttestjati bħala mezz tal-kontroll tal-proċedura tat-test. mid-dejta tar-ring test, il-valuri medji EC50 ta' 3,5-DCP għall-varjabbli tar-rispons differenti (ara l-paragrafi 37-41 ta' dan il-metodu ta' ttestjar) huma bejn 3.2 mg/l u 6.9 mg/l (ara r-rapport tar-ring test għal dettalji dwar l-intervall tal-kunfidenza għal dawn il-valuri). Huwa rrakkomandat li tiġi ttestjata sustanza kimika ta' referenza tal-inqas darbtejn f'sena jew, fejn jitwettaq ittestjar bi frekwenza inqas, b'mod parallel mad-determinazzjoni tat-tossiċità ta' sustanza kimika tat-test.
                              
                           DESKRIZZJONI TAL-METODU
                     
                        Tagħmir
                     
                     
                              
                                 12.
                              
                              
                                 It-tagħmir kollu f'kuntatt mal-media tat-test għandu jkun magħmul mill-ħġieġ jew materjal kimikament inerti ieħor. L-oġġetti tal-ħġieġ li jintużaw għal finijiet ta' kulturi u ttestjar għandhom jitnaddfu minn kontaminanti kimiċi li jistgħu jinfiltraw fil-medium tat-test u għandhom ikunu sterili. Ir-reċipjenti tat-test għandhom ikunu twal biżżejjed għar-rimja fir-reċipjenti tal-kontroll biex jikbru fil-fażi tal-ilma mingħajr ma jilħqu l-wiċċ tal-medium tat-test fl-aħħar tat-test. Huma rrakkomandati tubi tat-testijiet tal-ħġieġ tal-borosilikat ħoxnin mingħajr xoffa, dijametru ta' madwar 20 mm, tul ta' madwar 250 mm, b'tappijiet tal-aluminju.
                              
                           
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Peress li l-medium Andrews modifikat fih is-sukrosju (li jistimula t-tkabbir tal-fungi u l-batterji), is-soluzzjonijiet tat-test għandhom jiġu ppreparati taħt kundizzjonijiet sterili. Il-likwidi kollha kif ukoll it-tagħmir huma sterilizzati qabel l-użu. L-isterilizzazzjoni ssir permezz ta' trattament tal-arja msaħħna (210 °C) għal 4 sigħat jew awtoklava għal 20 minuta f'121 °C. Barra minn hekk, il-flasks, dixxijiet, skutelli, eċċ. kollha u tagħmir ieħor jgħaddu minn trattament tal-fjamma fuq workbench sterili eżatt qabel l-użu.
                              
                           
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Il-kulturi u r-reċipjenti tat-test ma għandhomx jinżammu flimkien. Dan jintlaħaq bl-aħjar mod permezz ta' kompartimenti, inkubaturi, jew kmamar ta' tkabbir ambjentali separati. L-illuminazzjoni u t-temperatura għandhom ikunu kontrollabbli u jinżammu f'livell kostanti.
                              
                           
                        Organiżmu tat-test
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 
                                    Myriophyllum spicatum — dikotiledon akwatiku mgħarraq — huwa speċi tal-familja tal-ħaxixa tal-morliti tal-ilma. Bejn Ġunju u Awwissu, fjuri roża-bojod moħbija jisporġu minn fuq il-wiċċ tal-ilma. Il-pjanti huma miżrugħin fl-art permezz ta' sistema ta' riżomi robusti u jistgħu jinstabu fl-emisfera tat-tramuntana kollha f'ilmijiet kalmi ewtrofiċi, iżda mhux imniġġsa u aktar kalċiferi b'sottostrat tat-tajn. Il-Myriophyllum spicatum jippreferi l-ilma frisk, iżda jinsab fl-ilma salmastru wkoll.
                              
                           
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Għat-test tat-tossiċità mingħajr sediment, huma meħtieġa pjanti sterili. Jekk il-laboratorju tal-ittestjar ma jkollux kulturi regolari tal-Myriophyllum spicatum, il-materjal tal-pjanti sterili jista' jinkiseb minn laboratorju ieħor jew materjal tal-pjanti (mhux sterili) jista' jittieħed mill-post jew jiġi pprovdut minn fornitur kummerċjali; jekk il-pjanti jiġu mill-post, tkun prevista verifikazzjoni tassonomika tal-ispeċi. Jekk miġbura mill-post jew pprovduti minn fornitur kummerċjali, il-pjanti għandhom jiġu sterilizzati (1) u miżmuma f'kultura fl-istess medium bħal dak użat għall-ittestjar għal minimu ta' tmien ġimgħat qabel l-użu. Siti tal-kamp użati għall-ġbir tal-kulturi tal-bidu għandhom ikunu ħielsa minn sorsi ovvji tal-kontaminazzjoni. Għandha tingħata attenzjoni kbira biex jiġi żgurat li l-ispeċi korretta tinkiseb meta tinġabar il-Myriophyllum spicatum mill-post, speċjalment f'reġjuni fejn tista' tibridizza ma' speċi oħra Myriophyllum. Jekk miksuba minn laboratorju ieħor għandhom jinżammu b'mod simili għal minimu ta' tliet ġimgħat. Is-sors tal-materjal tal-pjanti u l-ispeċi użati għall-ittestjar dejjem għandhom jiġu rrappurtati.
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Il-kwalità u l-unformità tal-pjanti użati għall-ittestjar sejjer ikollhom influwenza sinifikanti fuq l-eżitu tal-ittestjar u għandhom għalhekk jintgħażlu b'attenzjoni. Għandhom jintużaw pjanti żgħar li jikbru rapidament mingħajr leżjonijiet jew diskolorazzjoni (klorożi) evidenti. Dettalji dwar il-preparazzjoni tal-organiżmu tat-test huma mogħtija fl-Appendiċi 4.
                              
                           
                        Kultivazzjoni
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 Biex titnaqqas il-frekwenza tal-manteniment tal-kultura (eż. meta l-ebda test għal Myriophyllum ma jkun ippjanat għal perjodu), il-kulturi jistgħu jinżammu taħt illuminazzjoni u temperatura mnaqqsa(50 μE m– 2 s– 1, 20 ± 2 °C). Id-dettalji tal-produzzjoni ta' kulturi huma mogħtija fl-Appendiċi 3.
                              
                           
                              
                                 19.
                              
                              
                                 Mill-inqas 14 sa 21 ġurnata qabel l-ittestjar, huma trasferiti b'mod asettiku biżżejjed organiżmi tat-test f'medium sterili frisk u jiġu kkulturati għal 14 sa 21 ġurnata taħt il-kundizzjonijiet tat-test bħala kultura ta' qabel. Dettalji għall-preparazzjoni tal-pre-kultura huma mogħtija fl-Appendiċi 4.
                              
                           
                        Medium tat-test
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Medium tan-nutrijent wieħed biss huwa rrakkomandat għall-Myriophyllum spicatum f'sistema tat-test ħielsa mis-sediment, kif deskritt fl-Appendiċi 2. Modifika tal-medium Andrews hija rakkomandata għall-kulturazzjoni u l-ittestjar bil-Myriophyllum spicatum kif deskritt f'(1). Minn ħames soluzzjonijiet tal-ħażna tan-nutrijenti ppreparati b'mod separat biż-żieda ta' 3 % sukrosju, se jiġi rranġat il-medium Andrews modifikat. Dettalji dwar il-preparazzjoni tal-medium huma mogħtija fl-Appendiċi 2.
                              
                           
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Medium Andrews ikkonċentrat għaxar darbiet huwa meħtieġ biex jinkisbu s-soluzzjonijiet tat-test (bid-dilwizzjoni kif xieraq). Il-kompożizzjoni ta' dan il-medium hija mogħtija fl-Appendiċi 2.
                              
                           
                        Is-soluzzjonijiet tat-test
                     
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Is-soluzzjonjiet tal-ittestjar, ġeneralment jiġu ppreparati bid-dilwizzjoni ta' soluzzjoni ewlenija. Is-soluzzjonijiet tal-ħażna tas-sustanza kimika tat-test huma normalment ippreparati billi tinħall is-sutanza kimika f'ilma demineralizzat (jiġifieri distillat jew dejonizzat). Iż-żieda tan-nutrijenti se tinkiseb bl-użu tal-medium Andrews modifikat ikkonċentrat għaxar darbiet.
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Is-soluzzjonijiet tal-ħażna tas-sustanza kimika tat-test jistgħu jiġu sterilizzati b'awtoklava f'121 °C għal 20 minuta jew bil-filtrazzjoni sterili, sakemm it-teknika tal-isterilizzazzjoni użata ma tiddenaturalizzax is-sustanza kimika tat-test. Soluzzjonijiet tat-test jistgħu jiġu ppreparati f'ilma jew f'medium sterili demineralizzat, taħt kundizzjonijiet sterili. L-istabilità termali u l-adsorbiment fuq uċuħ differenti għandhom jitqiesu fl-għażla tal-proċedura tal-isterilizzazzjoni tas-soluzzjonijiet tal-ħażna tas-sustanza kimika tat-test. Minħabba dan, huwa rrakkomandat li s-soluzzjonijiet tal-ħażna jiġu ppreparati taħt kundizzjonijiet sterili, jiġifieri bl-użu ta' materjal sterili biex tinħall is-sustanza kimika tat-test taħt kundizzjonijiet sterili (eż. sterilizzazzjoni bi fjamma, kapep għall-fluss luminari, eċċ.) f'ilma sterili. Din it-teknika tal-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet tal-ħażna sterili hija valida għaż-żewġ sustanzi u taħlitiet.
                              
                           
                              
                                 24.
                              
                              
                                 L-ogħla konċentrazzjoni ttestjata tas-sustanza kimika tat-test normalment m'għandhiex teċċedi s-solubbiltà tal-ilma taħt il-kundizzjonijiet tat-test. Għal sustanzi kimiċi ta' solubbiltà tal-ilma baxxa jista' jkun meħtieġ li tiġi ppreparata soluzzjoni tal-ħażna konċentrata jew dispersjoni tas-sustanza kimika bl-użu ta' solvent organiku jew dispersant sabiex jiffaċilita ż-żieda ta' kwantitajiet preċiżi tas-sustanza kimika tat-test għall-medium tat-test u jgħin fid-dispersjoni u x-xoljiment tiegħu. Għandu jsir kull sforz possibbli biex jiġi evitat l-użu ta' tali materjali. Ma għandu jkun hemm ebda fitotossiċità li tirriżulta mill-użu ta' solventi jew aġenti dispersivi awżiljarji. Pereżempju, solventi li jintużaw b'mod komuni li ma jikkawżawx fitotossiċità fil-konċentrazzjonijiet sa 100 μl//l jinkludu aċeton u dimetilformamid. Jekk jintuża solvent jew aġent dispersiv, il-konċentrazzjoni finali tiegħu għandha tiġi rrappurtata u miżmuma l-inqas possibbli (≤ 100 μl/l), u t-trattamenti u l-kontrolli kollha għandu jkollhom l-istess konċentrazzjoni ta' solvent jew aġent dispersiv. F'(5) tingħata gwida ulterjuri dwar l-użu ta' aġenti dispersivi.
                              
                           
                        Gruppi tat-test u ta' kontroll
                     
                     
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Għarfien minn qabel tat-tossiċità tas-sustanza kimika tat-test għal Myriophyllum spicatum minn test li jsib il-medda se jgħin fl-għażla tal-konċentrazzjonijiet tat-test xierqa. Fit-test definittiv tat-tossiċità, għandu normalment ikun hemm ħames (bħal fit-test tal-inibizzjoni tat-tkabbir Lemna, Kapitolu C.26 ta' dan l-Anness) għal seba' konċentrazzjonijiet tat-test irranġati f'serje ġeometrika; għandhom jintagħżlu sabiex il-valuri NOEC u EC50 jiġu kklassifikati skont il-medda tal-konċentrazzjoni (ara hawn taħt). Preferibbilment il-fattur tas-separazzjoni bejn il-konċentrazzjonijiet tat-test m'għandux jaqbeż it-3.2; madankollu, jista' jintuża valur ogħla meta l-kurva tal-konċentrazzjoni-rispons tkun waħda ċatta. Għandha tingħata ġustifikazzjoni meta jintużaw inqas minn ħames konċentrazzjonijiet. Mill-inqas għandhom jintużaw ħames repliki f'kull konċentrazzjoni tat-test.
                              
                           
                              
                                 26.
                              
                              
                                 Fl-istabbiliment tal-medda tal-konċentrazzjonijiet tat-test (għas-sejba tal-medda u/jew għat-test finali tat-tossiċità), għandu jiġi kkunsidrat li ġej:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Għad-determinazzjoni ta' ECx, il-konċentrazzjonijiet tat-test iridu jsostnu l-valur ECx sabiex jiġi żgurat livell ta' kunfidenza adegwat. Pereżempju, jekk tkun qed tikkalkula EC50, l-iktar konċentrazzjoni għolja għandha tkun ikbar mill-valur tal-EC50. Jekk il-valur EC50 jinstab barra l-firxa ta' konċentrazzjonijiet tat-test, intervalli ta' kunfidenza assoċjati jkunu kbar u valutazzjoni xierqa tal-fit statistiku tal-mudell tista' ma tkunx possibbli.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Jekk l-għan huwa li jiġu stmati l-LOEC/NOEC, l-inqas konċentrazzjoni tat-test għandha tkun baxxa biżżejjed biex b'hekk it-tkabbir ma jkunx ferm iktar baxx minn dak tal-kontroll. Barra minn hekk, l-ogħla konċentrazzjoni tat-test għandha tkun għolja biżżejjed biex b'hekk it-tkabbir ikun ferm inqas milli fil-kontroll. Jekk dan ma jkunx il-każ, it-test għandu jiġi ripetut permezz ta' medda ta' konċentrazzjoni differenti (sakemm l-ogħla konċentrazzjoni tkun fil-limitu tas-solubbiltà jew il-konċentrazzjoni limitu meħtieġa massima, eż. 100 mg/l).
                                          
                                       
                           
                              
                                 27.
                              
                              
                                 Kull test għandu jinkludi kontrolli li jikkonsistu fl-istess medium tan-nutrijent, organiżmu tat-test (l-għażla tal-materjal tal-pjanti l-aktar omoġenja possibbli, friegħi laterali friski minn kulturi ta' qabel, imqassra għal 2.5 cm mill-bażi), kundizzjonijiet u proċeduri ambjentali bħala reċipjenti tat-test iżda mingħajr is-sustanza kimika tat-test. Jekk jintuża solvent jew aġent dispersiv awżiljari, għandu jiġi inkluż trattament ta' kontroll addizzjonali bis-solvent/aġent dispersiv preżenti fl-istess konċentrazzjoni bħar-reċipjenti bis-sustanza kimika tat-test. In-numru ta' reċipjenti tal-kontroll ripetut (u reċipjenti tas-solvent, jekk applikabbli) għandu jkun mill-inqas għaxra.
                              
                           
                              
                                 28.
                              
                              
                                 Jekk ma tkunx meħtieġa determinazzjoni tal-NOEC, id-disinn tal-ittestjar jista' jiġi mmodifikat biex jiżdied in-numru ta' konċentrazzjonijiet u jitnaqqas in-numru ta' repliki għal kull konċentrazzjoni. Madankollu, fi kwalunkwe każ in-numru ta' repliki tal-kontroll għandu jkun mill-inqas għaxra.
                              
                           
                        Esponiment
                     
                     
                              
                                 29.
                              
                              
                                 Friegħi laterali friski minn kultura minn qabel imqassra għal 2.5cm mill-bażi huma assenjati b'mod każwali fir-reċipjenti tat-test taħt kundizzjonijiet asettiċi; kull reċipjent tat-test għandu jkun fih fergħa laterali ta' 2.5 cm li għandu jkollha meristem apikali fuq tarf wieħed. Il-materjal tal-pjanti magħżul għandu jkun tal-istess kwalità f'kull reċipjent tat-test.
                              
                           
                              
                                 30.
                              
                              
                                 Huwa meħtieġ disinn aleatorju għal-lokazzjoni tar-reċipjenti tat-test fl-inkubatur biex titnaqqas l-influwenza tad-differenzi spazjali fl-intensità tad-dawl jew it-temperatura. Huwa meħtieġ ukoll disinn ibblokkat jew pożizzjonar każwali tar-reċipjenti (jew pożizzjonar mill-ġdid aktar frekwenti) meta jsiru l-osservazzjonijiet.
                              
                           
                              
                                 31.
                              
                              
                                 Jekk test preliminari tal-istabilità juri li l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test ma tistax tinżamm (jiġifieri l-konċentrazzjoni mkejla taqa' taħt it-80 % tal-konċentrazzjoni mkejla inizjali) matul id-durata tat-test (14-il ġurnata), huwa rakkomandat reġim tat-test semistatiku. F'dan il-każ, il-pjanti għandhom jiġu esposti għal test u soluzzjonijiet tal-kontroll ippreparati friski mill-inqas f'okkażjoni waħda waqt it-test (eż.. jum 7). Il-frekwenza ta' esponiment għal medium ġdid se tiddependi fuq l-istabbilità tas-sustanza kimika tat-test; jaf tkun meħtieġa frekwenza ogħla biex jinżammu konċentrazzjonijiet viċin għall-kostanti ta' sustanzi kimiċi volatili u mhux stabbli ħafna.
                              
                           
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Ix-xenarju ta' esponiment permezz ta' applikatur tal-weraq (sprej) mhuwiex kopert f'dan il-metodu ta' ttestjar;
                              
                           
                        Kundizzjonijiet tat-test
                     
                     
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Dawl fluworexxenti baxx u/jew qawwi għandu jintuża biex jipprovdi irradjanza tad-dawl fil-firxa ta' madwar 100-150 μE m– 2 s– 1 meta mkejjel bħala radjazzjoni attiva fotosintetika (400-700 nm) f'punti fl-istess distanza mis-sors tad-dawl bħall-qiegħ tar-reċipjenti tat-test (ekwivalenti għal ca. 6 000 to 9 000 lux) u bl-użu ta' ċiklu dawl-dlam ta' 16:8 h. Il-metodu ta' detezzjoni u kejl tad-dawl, b'mod partikolari t-tip ta' senser, sejjer jaffettwa l-valur imkejjel. Is-sensers sferiċi (li jirrispondu għad-dawl minn angoli 'l fuq u taħt il-pjan ta' kejl) u s-sensers “cosine” (li jirrispondu għad-dawl mill-angoli kollha 'l fuq mill-pjan ta' kejl) huma ppreferuti minn sensers unidirezzjonali, u ser jagħtu riżultati tal-qari ogħla, għal sors ta' dawl b'ħafna punti tat-tip deskritt hawnhekk.
                              
                           
                              
                                 34.
                              
                              
                                 It-temperatura fir-reċipjenti tat-test għandha tkun ta' 23 ± 2 °C. Hija meħtieġa iktar attenzjoni f'każijiet speċjali bħal meta jiġu ttestjati sustanzi kimiċi mhux stabbli jew metalli; il-pH għandu jibqa' fil-medda 6-9. Ara (5) għal gwida ulterjuri.
                              
                           
                        Durata
                     
                     
                              
                                 35.
                              
                              
                                 It-test jintemm 14-il jum wara li l-pjanti jiġu trasferiti fir-reċipjenti tat-test.
                              
                           
                        Kejliet u determinazzjonijiet analitiċi
                     
                     
                              
                                 36.
                              
                              
                                 Fil-bidu tat-test, it-tul tar-rimja prinċipali tal-organiżmu tat-test huwa 2.5 cm (ara l-paragrafu 29); huwa mkejjel b'riga (ara l-Appendiċi 4) jew bl-analiżi tal-fotografija jew l-immaġni. It-tul tar-rimja prinċipali ta' organiżmu tat-test li jidher normali jew anormali għandu jiġi determinat fil-bidu tat-test, mill-inqas darba waqt il-perjodu tal-esponiment ta' 14-il ġurnata u fit-terminazzjoni tat-test. Nota: Bħala alternattiva għal dawk li m'għandhomx analiżi tal-immaġni, jekk il-workbench ikun sterilizzat qabel iż-żieda tal-pjanti fir-reċipjenti tat-test, riga sterili tista' tintuża wkoll biex jitkejjel it-tul tar-rimja prinċipali fil-bidu tat-test u waqt it-test. Bidliet fl-iżvilupp tal-pjanti, eż. fid-deformazzjoni tar-rimjiet, fid-dehra, fl-indikazzjoni tan-nekrożi, klorożi, fit-tkissir jew nuqqas ta' żamma fil-wiċċ u fit-tul u fid-dehra tal-għeruq, għandhom jiġu nnotati. Karatteristiċi sinifikanti tal-medium tat-test (eż. il-preżenza ta' materjal mhux maħlul, it-tkabbir tal-alka, fungi u batterji fir-reċipjent tat-test) għandhom jiġu nnotati.
                              
                           
                              
                                 37.
                              
                              
                                 Flimkien mad-determinazzjonijiet tat-tul tar-rimja prinċipali, l-effetti tas-sustanza kimika tat-test fuq tlieta (jew aktar) mill-varjabbli tal-kejl li ġejjin għandhom jiġu evalwati wkoll:
                                 
                                             i.
                                          
                                          
                                             Tul tal-fergħat laterali totali
                                          
                                       
                                             ii.
                                          
                                          
                                             Tul tar-rimja totali
                                          
                                       
                                             iii.
                                          
                                          
                                             Tul tal-għeruq totali
                                          
                                       
                                             iv.
                                          
                                          
                                             Piż frisk
                                          
                                       
                                             v.
                                          
                                          
                                             Piż xott
                                          
                                       
                                             vi.
                                          
                                          
                                             Għadd ta sepali
                                          
                                       
                                             
                                                Nota 1:
                                             
                                          
                                          
                                             L-osservazzjonijiet magħmula waqt it-test tas-sejbien tal-medda jistgħu jgħinu fl-għażla tal-kejl addizzjonali rilevanti fost is-sitt varjabbli elenkati hawn fuq.
                                          
                                       
                                             
                                                Nota 2:
                                             
                                          
                                          
                                             Id-determinazzjoni tal-piżijiet friski u xotti (parametri iv u v) hija mixtieqa ħafna.
                                          
                                       
                                             
                                                Nota 3:
                                             
                                          
                                          
                                             Minħabba l-fatt li s-sukrosju u d-dawl (esponiment tal-għeruq għad-dawl waqt it-test) jista' jkollhom influwenza fuq it-trasportaturi tal-auxin (ormon tat-tkabbir tal-pjanti), u li ċerti sustanzi kimiċi jista' jkollhom mod ta' azzjoni tat-tip auxin, l-inklużjoni tal-punti tat-tmiem tal-għeruq (parametru iii) hija dubjuża.
                                          
                                       
                                             
                                                Nota 4:
                                             
                                          
                                          
                                             Ir-riżultati tar-ring test juru koeffiċjenti għoljin tal-varjazzjoni (> 60 %) għat-tul totali tal-fergħa laterali (parametru i). It-tul totali tal-fergħa laterali huwa fi kwalunkwe każ inkluż fi ħdan il-kejl tat-tul tar-rimja totali (parametru ii) li juri koeffiċjenti aktar aċċettabbli tal-varjazzjoni ta' < 30 %.
                                          
                                       
                                             
                                                Nota 5:
                                             
                                          
                                          
                                             B'riżultat mill-kunsiderazzjonijiet preċedenti, il-punti tat-tmiem prinċipali rakkomandati huma: tul totali tar-rimja, piż frisk u niexef (parametri ii, iv u v); parametru vi — numru ta' sepali — jitħalla għall-ġudizzju ta' min qed jesperimenta.
                                          
                                       
                           
                              
                                 38.
                              
                              
                                 It-tul tar-rimja prinċipali u n-numru ta' sepali għandhom vantaġġ, fis-sens li jistgħu jkunu determinati għal kull reċipjent tat-test u tal-kontroll fil-bidu, waqt, u fl-aħħar tat-test bl-analiżi tal-fotografija u tal-immaġni, għalkemm riga (sterili) tista' tintuża wkoll.
                              
                           
                              
                                 39.
                              
                              
                                 Tul tal-fergħat laterali totali, tul tal-għeruq totali (bħala somma tal-fergħat jew għeruq totali kollha) u tul tar-rimja totali (bħala somma tat-tul tar-rimja prinċipali u t-tul tal-fergħat laterali totali) jistgħu jitkejlu b'riga fl-aħħar tal-esponiment.
                              
                           
                              
                                 40.
                              
                              
                                 Il-piż frisk u/jew niexef għandu jiġi determinat fil-bidu tat-test minn kampjun tar-rappreżentat tal-kultura ta' qabel ta' dak li se jintuża biex jinbeda t-test, fl-aħħar tat-test b'materjal tal-pjanti minn kull reċipjent tat-test u tal-kontroll.
                              
                           
                              
                                 41.
                              
                              
                                 It-tul tal-fergħat laterali totali, it-tul tar-rimja totali, it-tul tal-għeruq totali, il-piż frisk, il-piż niexef u n-numru ta' sepali jistgħu jiġu determinati kif ġej:
                                 i.   
                                       Tul tal-fergħat laterali totali
                                    : It-tul tal-fergħat laterali jista' jiġi determinat bil-kejl tal-fegħat laterali kollha b'riga fl-aħħar tal-esponiment. It-tul tal-fergħat laterali totali huwa s-somma tal-fergħat laterali kollha ta' kull reċipjent tat-test u tal-kontroll.
                                 ii.   
                                       Tul tar-rimja totali
                                    : It-tul tar-rimja prinċipali jista' jiġu determinat bl-analiżi tal-immaġni jew bl-użu ta' riga. It-tul tar-rimja totali huwa s-somma tat-tul tal-fergħat laterali totali u t-tul tar-rimja prinċipali ta' kull reċipjent tat-test u tal-kontroll fl-aħħar tal-esponiment.
                                 iii.   
                                       Tul tal-għeruq totali
                                    : It-tul tal-għeruq jista' jiġi determinat bil-kejl tal-għeruq kollha b'riga fl-aħħar tal-esponiment. It-tul tal-għeruq totali huwa s-somma tal-għeruq kollha ta' kull reċipjent tat-test u tal-kontroll.
                                 iv.   
                                       Piż frisk
                                    : Il-piż frisk jista' jiġi determinat billi l-organiżmi tat-test jintiżnu fl-aħħar tal-esponiment. Il-materjal tal-pjanti ta' kull reċipjent tat-test u tal-kontroll se jitlaħlaħ bl-ilma distillat, ixxuttat bil-mod bil-karta ċelluloża. Wara din il-preparazzjoni, il-piż frisk se jiġi determinat billi jintiżen. Il-bijomassa tal-bidu (piż frisk) hija determinata fuq il-bażi ta' kampjun tal-organiżmi tat-test meħud mill-istess lott użat biex jitlaqqmu r-reċipjenti tat-test.
                                 v.   
                                       Piż xott
                                    : Wara l-preparazzjonijiet għad-determinazzjoni tal-piż frisk, l-organiżmi tat-test se jiġu mnixxfin f'temperatura ta' 60 °C għal piż kostanti. Din il-massa hija l-piż niexef. Il-bijomassa tal-bidu (piż niexef) hija determinata fuq il-bażi ta' kampjun tal-organiżmi tat-test meħud mill-istess lott użat biex jitlaqqmu r-reċipjenti tat-test.
                                 vi.   
                                       Għadd ta sepali
                                    : Is-sepali kollha se jingħaddu tul ir-rimja prinċipali.
                              
                           
                        Frekwenza tal-kejl u determinazzjonijiet analitiċi
                     
                     
                              
                                 42.
                              
                              
                                 Jekk jintuża disinn ta' test statiku, għandu jitkejjel il-pH ta' kull trattament fil-bidu u fi tmiem it-test. Jekk jintuża disinn tat-test semistatiku, il-pH għandu jitkejjel f'kull lott ta' soluzzjoni tat-test “ġdid” qabel kull tiġdid u anki fis-soluzzjonijiet korrispondenti “użati”
                              
                           
                              
                                 43.
                              
                              
                                 L-intensità tad-dawl għandha titkejjel fil-kamra tat-tkabbir, fl-inkubatur jew fi kmamar f'punti fl-istess distanza mis-sors tad-dawl bħall-organiżmi tat-test. Il-kejliet għandhom isiru tal-inqas darba matul it-test. It-temperatura tal-medium fil-kontenitur sostitwit miżmum fl-istess kundizzjonjiet tal-kamra ta' tkabbir, inkubatur jew kamra għandhom jiġu rreġistrati mill-inqas darba kuljum (jew kontinwament b'logger tad-dejta).
                              
                           
                              
                                 44.
                              
                              
                                 Waqt it-test, il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika (sustanzi kimiċi) tat-test jiġu determinati f'intervalli xierqa. F'testijiet statiċi, ir-rekwiżit minimu huwa li jiġu ddeterminati l-konċentrazzjonijiet fil-bidu u fi tmiem it-test.
                              
                           
                              
                                 45.
                              
                              
                                 F'testijiet semistatiċi fejn il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika (sustanzi kimiċi) mhumiex mistennija li jibqgħu fi ħdan l-± 20 % tal-konċentrazzjoni nominali, huwa meħtieġ li jiġu analizzati s-soluzzjonijiet tat-test ippreparati friski u l-istess soluzzjonijiet f'kull tiġdid. Madankollu, għal dawk it-testijiet fejn il-konċentrazzjonijiet inizjali mkejla tas-sustanza kimika (sustanzi kimiċi) tat-test mhumiex fi ħdan l-± 20 % tan-nominali iżda fejn tista' tiġi pprovduta evidenza suffiċjenti biex turi li l-konċentrazzjonijiet inizjali huma ripetibbli u stabbli (jiġifieri fi ħdan il-medda ta' 80 — 120 % tal-konċentrazzjoni inizjali), id-determinazzjonijiet kimiċi jistgħu jitwettqu biss fuq l-ogħla u l-inqas konċentrazzjonijiet tat-test. Fil-każijiet kollha, id-determinazzjoni tal-konċentrazzjonijiet tat-test qabel it-tiġdid għandhom biss isiru fuq reċipjent replikat wieħed f'kull konċentrazzjoni tat-test (jew il-kontenut tar-reċipjenti miġbura skont ir-replika).
                              
                           
                              
                                 46.
                              
                              
                                 Jekk hemm evidenza li l-konċentrazzjoni tat-test inżammet b'mod sodisfaċenti fi ħdan l-± 20 % tal-konċentrazzjoni inizjali nominali jew imkejla matul it-test, l-analiżi tar-riżultati tista' tkun ibbażata fuq valuri inizjali nominali jew imkejla. Jekk id-devjazzjoni mill-konċentrazzjoni inizjali nominali jew imkejla mhix fi ħdan l-± 20 %, l-analiżi tar-riżultati għandha tkun ibbażata fuq il-konċentrazzjoni medja ġeometrika waqt l-esponiment jew mudelli li jiddeskrivu t-tnaqqis tal-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test (5).
                              
                           
                        Test tal-limitu
                     
                     
                              
                                 47.
                              
                              
                                 Taħt ċertu ċirkostanzi, eż. meta test preliminari jindika li s-sustanza kimika tat-test m'għandha l-ebda effett tossiku f'konċentrazzjonijiet sa 100 mg/l jew sal-limitu tas-solubbiltà tagħha fil-medium tat-test jew fil-każ ta' formulazzjoni sal-limitu tad-dispersibbiltà, jista' jsir test tal-limitu li jinvolvi paragun tar-risposti fi grupp tal-kontroll u fi grupp tat-trattament wieħed (100 mg/l jew konċentrazzjoni ugwali għal-limitu tas-solubbiltà). Huwa rrakkomandat ħafna li dan ikun appoġġjat bl-analiżi tal-konċentrazzjoni tal-esponiment. Japplikaw il-kundizzjonijiet tat-test u l-kriterji ta' validità deskritti preċedentement kollha għal test tal-limitu, bl-eċċezzjoni li n-numru ta' repliki tat-trattament għandu jiġi dduplikati. It-tkabbir fil-grupp ta' kontroll u trattament jista' jiġi analizzat permezz ta' test tal-istatistika biex jitqabblu l-media, eż. Test-t ta' Student.
                              
                           DATA U RAPPORTAR
                     
                        Varjabbli ta' rispons
                     
                     
                              
                                 48.
                              
                              
                                 L-iskop tat-test huwa li jiddetermina l-effetti ta' sustanza kimika tat-test fuq it-tkabbir veġetattiv tal-Myriophyllum spicatum. Dan il-metodu ta' ttestjar jiddeskrivi żewġ varjabbli tar-rispons.
                                 a)   
                                       Rata ta' tkabbir speċifika medja
                                    : Dan il-varjabbli tar-rispons huwa kkalkulat fuq il-bażi ta' tibdil fil-logarittmi tat-tul tar-rimja prinċipali, u barra minn hekk, fuq il-bażi ta' tibdil fil-logarittmi ta' parametru tal-kejl oħrajn, jiġifieri it-tul tar-rimja totali, il-piż frisk, il-piż niexef jew in-numru ta' sepali matul iż-żmien (espressi bħala ġranet) fil-kontrolli u f'kull grupp tat-trattament. Nota: Għall-parametru tal-kejl it-tul tal-fergħat laterali totali u t-tul tal-għeruq totali, mhux possibbli kalkolu tar-rata medja speċifika tat-tkabbir. Fil-bidu tat-test, l-organiżmu tat-test m'għandu l-ebda fergħa laterali u l-ebda għeruq (abbażi tal-preparazzjoni mill-kultura ta' qabel); meta tibda mill-valur żero, il-kalkolu tar-rata tat-tkabbir speċifika medja mhux definit.
                                 b)   
                                       Rendiment
                                    : Dan il-varjabbli tar-rispons huwa kkalkulat fuq il-bażi ta' tibdil fit-tul tar-rimja prinċipali, u barra minn hekk, fuq il-bażi ta' tibdil f'parametri tal-kejl oħra — jiġifieri preferibbilment it-tul tar-rimja totali, il-piż frisk, il-piż niexef jew in-numru ta' sepali, u parametri oħra jekk jitqiesu utli — fil-kontrolli u f'kull grupp tat-trattament sal-aħħar tat-test.
                              
                           
                              
                                 49.
                              
                              
                                 Stimi tat-tossiċità għandhom ikunu bbażati fuq it-tul tar-rimja prinċipali u tliet varjabbli tal-kejl addizzjonali (jiġifieri preferibbilment it-tul tar-rimja totali, il-piż frisk, il-piż niexef, in-numru ta' sepali, ara l-paragrafu 37 u n-Noti 2, 4 u 5 ta' dan il-paragrafu), minħabba li ċertu sustanzi kimiċi jaffettwaw varjabbli oħra tal-kejl ħafna aktar mit-tul tar-rimja prinċipali. Dan l-effett ma jiġix rivelat bil-kalkolu tat-tul tar-rimja biss.
                              
                           
                        Rata ta' tkabbir speċifika medja
                     
                     
                              
                                 50.
                              
                              
                                 Ir-rata tat-tkabbir speċifiku medju għal perjodu speċifiku hija kkalkulata bħala ż-żieda logaritmika fil-varjabbli tat-tkabbir — tul tar-rimja prinċipali u tliet varjabbli tal-kejl addizzjonali (jiġifieri it-tul tar-rimja totali, il-piż frisk, il-piż niexef jew in-numru tas-sepali) — bl-użu tal-formula t'hawn taħt għal kull replikazzjoni tal-kontroll u t-trattamenti:
                                 
                                    
                                 fejn:
                                 
                                    μi-j
                                    : rata ta' tkabbir speċifika medja mill-ħin i sa j
                                 
                                    Ni
                                    : varjabbli ta' kejl fil-kontenitur tat-test jew kontroll f'ħin i
                                 
                                    Nj
                                    : varjabbli ta' kejl fil-kontenitur tat-test jew kontroll f'ħin j
                                 
                                    t: perjodu ta' ħin minn i sa j
                                 Għal kull grupp ta' trattament u kull grupp ta' kontroll, ikkalkola valur medju għar-rata ta' tkabbir flimkien mal-istimi tal-varjanza.
                              
                           
                              
                                 51.
                              
                              
                                 Ir-rata ta' tkabbir speċifika medja għandha tiġi kkalkolata għall-perjodu ta' ttestjar kollu (il-ħin “i” fil-formola ta' hawn fuq huwa l-bidu tat-test u l-ħin “j” huwa t-tmiem tat-test). Għal kull konċentrazzjoni tat-test u ta' kontroll, ikkalkola valur medju għar-rata ta' tkabbir speċifika medja flimkien mal-istimi tal-varjanza. Barra minn hekk, għandha tiġi vvalutata r-rata ta' tkabbir skont is-sezzjoni sabiex jiġu evalwati l-effetti tas-sustanza kimika tat-test li jseħħu matul il-perjodu ta' esponiment (eż.. billi jiġu spezzjonati l-kurvi ta' tkabbir ittrasformati mil-log).
                              
                           
                              
                                 52.
                              
                              
                                 Perċentwal ta' inibizzjoni tar-rata ta' tkabbir (Ir) jista' jiġi kkalkulat fuq kull konċentrazzjoni tat-test (grupp ta' trattament) bil-formula li ġejja:
                                 
                                    
                                 fejn:
                                 
                                    % Ir: perċentwal ta' inibizzjoni f'rata medja ta' tkabbir speċifiku
                                 
                                    μC: valur medju għal μ fil-kontroll
                                 
                                    μT: valur medju għal μ fil-grupp tat-trattament
                              
                           
                        Rendiment
                     
                     
                              
                                 53.
                              
                              
                                 Effetti fuq ir-rendiment huma determinati fuq il-bażi tat-tul tar-rimja prinċipali tal-varjabbli tal-kejl u tliet varjabbli tal-kejl addizzjonali (jiġifieri preferibbilment it-tul tar-rimja totali, il-piż frisk, il-piż niexef jew in-numru tas-sepali) preżenti f'kull reċipjent tat-test fil-bidu u fl-aħħar tat-test. Għall-piż frisk jew piż niexef, il-bijomassa tal-bidu hija determinata fuq il-bażi ta' kampjun tal-organiżmi tat-test meħud mill-istess lott użat biex jitlaqqmu r-reċipjenti tat-test. Għal kull konċentrazzjoni tat-test u ta' kontroll, ikkalkula valur medju għar-rendiment flimkien mal-istimi tal-varjanza. Il-perċentwal medju fir-rendiment ( % Iy) jista' jiġi kkalkulat għal kull grupp tat-trattament kif ġej:
                                 
                                    
                                 fejn:
                                 
                                    % Iy: tnaqqis perċentwali fir-rendiment
                                 
                                    bC: bijomassa finali li minnha titnaqqas il-bijomassa tal-bidu għall-grupp ta' kontroll
                                 
                                    bT: bijomassa finali li minnha titnaqqas il-bijomassa tal-bidu fil-grupp ta' trattament
                              
                           
                        Ħin għall-irdoppjar
                     
                     
                              
                                 54.
                              
                              
                                 Biex jiġi ddeterminat il-ħin tal-irduppjar (Td) tat-tul tar-rimja prinċipali u l-aderenza għal dan il-kriterju tal-validità (ara l-paragrafu 8), il-formula li ġejja hija użata bid-dejta miksuba mir-reċipjenti tal-kontroll:
                                 Td = ln 2/μ
                                 Fejn μ hija r-rata speċifika tat-tkabbir medja determinata kif deskritt fil-paragrafi 50-52.
                              
                           
                        Ipplottjar tal-kurvi konċentrazzjoni-rispons
                     
                     
                              
                                 55.
                              
                              
                                 Il-kurvi tal-konċentrazzjoni-rispons li għandhom x'jaqsmu mal-inibizzjoni tal-perċentwal medju tal-varjabbli tar-rispons (Ir, jew Iy ikkalkulat kif jidher fil-paragrafu 53) u l-konċentrazzjoni tal-log tas-sustanza kimika tat-test għandhom jiġu pplottjati.
                              
                           
                        Stimi tal-ECx
                        
                     
                     
                              
                                 56.
                              
                              
                                 Stimi tal-ECx għandhom ikunu bbażati kemm fuq ir-rata speċifika tat-tkabbir medja (ErCx) kif ukoll ir-rendiment (EyCx), li kull wieħed minnhom għandu mbagħad ikun ibbażat fuq it-tul tar-rimja prinċipali, u possibbilment varjabbli tal-kejl addizzjonali (jiġifieri preferibbilment it-tul tar-rimja totali, il-piż frisk, il-piż niexef jew in-numru tas-sepali). Dan minħabba li hemm sustanzi kimiċi li jagħmlu impatt fuq it-tul tar-rimja prinċipali u varjabbli tal-kejl oħrajn b'mod differenti. Il-parametri ta' tossiċità mixtieqa huma għalhekk erba' valuri ECx għal kull livell ta' inibizzjoni kkalkulat: ErCx (tul tar-rimja prinċipali); ErCx (jiġifieri preferibbilment it-tul tar-rimja totali, il-piż frisk, il-piż niexef, jew in-numru tas-sepali); EyCx (tul tar-rimja prinċipali); EyCx (jiġifieri preferibbilment it-tul tar-rimja totali, il-piż frisk, il-piż niexef, jew in-numru tas-sepali);
                              
                           
                              
                                 57.
                              
                              
                                 Għandu jiġi nnotat li l-valuri ECx ikkalkulati bl-użu ta' dawn il-varjabbli tar-rispons mhumiex komparabbli u din id-differenza hija rikonoxxuta meta jintużaw ir-riżultati tat-test. Valuri ECx ibbażati fuq ir-rata tat-tkabbir speċifika medja (ErC) fil-maġġoranza tal-każi se jkunu ogħla minn riżultati bbażati fuq ir-rendiment (EyCx) — jekk il-kundizzjonijiet tat-test ta' dan il-metodu ta' ttestjar huma osservati — minħabba l-bażi matematika tal-approċċi rispettivi. Din id-differenza m'għandhiex tkun interpretata bħala differenza fis-sensittività bejn iż-żewġ varjabbli tar-rispons, iżda sempliċiment li l-valuri huma differenti matematikament.
                              
                           
                        Proċeduri ta' statistika
                     
                     
                              
                                 58.
                              
                              
                                 L-għan huwa li tinkiseb relazzjoni bejn il-konċentrazzjoni u r-rispons b'analiżi tar-rigressjoni. Huwa possibbli li tintuża rigressjoni lineari ponderata wara li tkun twettqet trasformazzjoni linearizzanti tad-data dwar ir-rispons — eż. ma' modelli probit jew logit jew Weibull (7), iżda proċeduri ta' rigressjoni mhux lineari huma tekniki ppreferuti li jimmaniġġjaw aħjar irregolaritajiet inevitabbli fid-dejta u devjazzjonijiet minn distribuzzjonijiet uniformi. Meta jkunu viċin iż-żero jew inibizzjoni totali, tali irregolaritajiet jistgħu jitkabbru bit-trasformazzjoni, u dan jinterferixxi mal-analiżi (7). Għandu jiġi nnotat li l-metodi standard tal-analiżi li jużaw it-trasformazzjonijiet probit, logit jew Weibull huma maħsuba għall-użu fuq id-data kwantali (eż. mortalità jew sopravivenza), u għandhom jiġu modifikati biex jakkomodaw ir-rata tat-tkabbir jew irendu d-dejta. Proċeduri speċifiċi għad-determinazzjoni tal-valuri ECx minn dejta kontinwa jistgħu jinsabu f'(8) (9) (10).
                              
                           
                              
                                 59.
                              
                              
                                 Għal kull varjabbli ta' rispons li jiġi analizzat, għandha tintuża r-relazzjoni konċentrazzjoni-rispons biex jiġu kkalkulati l-estimi ta' punti ta' valuri ECx. Fejn ikun possibbli, għandhom jiġu stmati l-limiti ta' kunfidenza ta' 95 % għal kull stima. It-tjubija tad-dwar ir-rispons tad-dejta għall-mudell ta' rigressjoni għandha tiġi vvalutata grafikament jew statistikament. L-analiżi tar-rigressjoni għandha ssir permezz ta' risponsi tar-repliki individwali, mhux il-medji tal-grupp ta' trattament.
                              
                           
                              
                                 60.
                              
                              
                                 Stimi EC50 u limiti ta' kunfidenza jistgħu wkoll jiġi miksuba bl-użu ta' interpolazzjoni lineari b'sekwenza ta' istruzzjonijiet inizjali (10), jekk il-mudelli/metodi ta' regressjoni aċċessibli m'humiex xierqa għad-dejta.
                              
                           
                              
                                 61.
                              
                              
                                 Għal stima tal-LOEC u għalhekk tal-NOEC, huwa meħtieġ li jitqabblu l-medji ta' trattament permezz ta' analiżi tat-tekniki ta' varjanza (ANOVA). Il-medja għal kull konċentrazzjoni mbagħad titqabbel mal-medja tal-kontroll bl-użu ta' metodu ta' ttestjar ta' paragun multipli jew tax-xejriet xieraq. It-testijiet Dunnett jew Williams jistgħu jkunu utli (12) (13) (14) (15) (16). Huwa meħtieġ li jiġi vvalutat jekk treġġix is-suppożizzjoni tal-omoġeneità ta' varjanza ta' ANOVA. Din il-valutazzjoni tista' titwettaq grafikament jew b'test formali (15). Testijiet xierqa huma Levene jew Bartlett. Jekk is-suppożizzjoni ta' omoġeneità tal-varjanzi ma tkunx issodisfata, din kultant tista' tiġi kkoreġuta bi trasformazzjoni logaritmika tad-dejta. Jekk l-eteroġeneità tal-varjanza hija estrema u ma tistax tiġi kkoreġuta bi trasformazzjoni, għandha tiġi kkunsidrata analiżi b'metodi bħat-test ta' tendenza rigressiva ta' Jonckheere. F'(10) tista' tinstab gwida addizzjonali dwar id-determinazzjoni tal-NOEC.
                              
                           
                              
                                 62.
                              
                              
                                 Żviluppi xjentifiċi riċenti wasslu għal rakkomandazzjoni biex jiġi abbandunat il-kunċett tal-NOEC u minflok jinbidel bi stimi ECx ta' punti bbażati fuq regressjoni. Ma ġiex stabbilit valur xieraq għal x għal dan it-test Myriophyllum. Madankollu, firxa ta' 10 sa 20 % tidher xierqa (jiddependi fuq il-varjabbli tar-rispons magħżul), u preferibbilment kemm l-EC10 u l-EC20 u l-limiti tal-kunfidenza tagħhom għandhom jiġu rappurtati.
                              
                           
                        Ir-rapportar
                     
                     
                              
                                 63.
                              
                              
                                 Ir-rapport tat-test jinkludi dan li ġej:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Sustanza kimika tat-test
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Sustanza monokostitwenti:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     dehra fiżika, solubbiltà fl-ilma, u karatteristiċi fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, numru CAS, kodiċi SMILES jew InChi, formula strutturali, purità, identità kimika tal-impuritajiet bħala xieraq u prattikament fattibbli, eċċ. (inkluż il-kontenut tal-karbonju organiku, jekk xieraq).
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Sustanza multikostitwenti, UVCBs jew taħlita:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     karatterizzati kemm jista' jkun bl-identità kimika (ara hawn fuq), okkorrenza kwantitattiva u karatteristiċi fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Speċijiet tat-test
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         L-isem xjentifiku u s-sors.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Kundizzjonijiet tat-test
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-proċedura tat-test użata (statika jew semistatika).
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Id-data tal-bidu tat-test u d-durata tiegħu.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Medium tat-test
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Deskrizzjoni tad-disinn sperimentali: reċipjenti u għotjien tat-test, volumi tas-soluzzjoni, it-tul tar-rimja prinċipali għal kull reċipjent tat-test fil-bidu tat-test.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-konċentrazzjonijiet tat-test (nominali u mkejla kif xierqa) u n-numru ta' repliki għal kull konċentrazzjoni.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Metodi ta' preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ewlenin u tat-test inkluż l-użu ta' kwalunkwe solvent jew aġent dispersiv.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         It-temperatura matul it-test.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Is-sors tad-dawl, l-intensità tad-dawl u l-omoġenità.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-valuri tal-pH tal-media tat-test u ta' kontroll.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-metodu tal-analiżi tas-sustanza kimika tat-test bid-dejta tal-valutazzjoni ta' kwalità xierqa (studji tal-validazzjoni, devjazzjonijiet standard jew limiti tal-kunfidenza ta' analiżijiet).
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Metodi għad-determinazzjoni tat-tul tar-rimja prinċipali u varjabbli tal-kejl oħrajn, eż. tul tal-fergħat laterali totali, tul tar-rimja totali, tul tal-għeruq totali, piż frisk, piż niexef jew numru tas-sepali.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         L-istat tal-kultura (sterili jew mhux sterili) ta' kull reċipjent tat-test u tal-kontroll f'kull osservazzjoni.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Id-devjazzjonijiet kollha minn dan il-metodu ta' ttestjar.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Riżultati
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Dejta mhux ipproċessata: tul tar-rimja prinċipali u varjabbli tal-kejl oħrajn f'kull reċipjent tat-test u tal-kontroll f'kull osservazzjoni u okkażjoni tal-analiżi.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Medji u devjazzjonijiet standard għal kull varjabbli ta' kejl;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Kurvi tat-tkabbir għal kull varjabbli tal-kejl.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Il-varjabbli ta' rispons ikkalkolati għal kull replikat tat-trattament, bil-valuri medji u l-koeffiċjenti ta' varjazzjoni għar-repliki.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Rappreżentazzjoni grafika tar-relazzjoni bejn il-konċentrazzjoni u l-effett.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Stimi ta' punti ta' tmiem tossiċi għal varjabbli ta' rispons eż. EC50, EC10, EC20, u l-intervalli ta' kunfidenza assoċjati. Jekk ikunu kkalkolati, l-LOEC u/jew l-NOEC u l-metodi statistiċi użati għad-determinazzjoni tagħhom.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Jekk tintuża ANOVA, id-daqs tal-effett li jista' jiġi skopert (eż. id-differenza l-inqas sinifikanti).
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Kwalunkwe stimulazzjoni ta' tkabbir misjuba fi kwalunkwe trattament.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Kwalunkwe sinjal viżiva tal-fitotossiċità kif ukoll l-osservazzjonijiet tas-soluzzjonijiet tat-test.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Diskussjoni tar-riżultati, inkluż kwalunkwe influwenza fuq l-eżitu tat-test li tirriżulta mid-devjazzjonijiet minn dan il-metodu ta' ttestjar.
                                                      
                                                   
                                       
                           TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 ASTM Designation E 1913-04, Standard Guide for Conducting Static, Axenic, 14-Day Phytotoxicity Tests in Test Tubes with the Submersed Aquatic Macrophyte, Myriophyllum sibiricum Komarov.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Maletzki, D. et al. (2010), Myriophyllum spicatum als ökotoxikologischer Testorganismus: Methodenentwicklung eines sedimentfreien Testsystems und erste Ergebnisse mit 3,5-Dichlorphenol, Umweltwiss Schadst Forsch, No. 22, pp. 702–710.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu C.26 ta' dan l-Anness: Lemna sp. Test tal-Inibizzjoni mit-Tkabbir,.
                                 
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 OECD (2014), “Myriophyllum spicatum Test tat-Tossiċità: Results of an inter-laboratory ring test using a sediment-free test system” OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Serje dwar l-Ittestjar u l-Evalwazzjoni, Nru 205, Pubblikazzjoni OECD, Paris.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 OECD (2000), “Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures” OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 23, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu C.51 ta' dan l-Anness: Water-Sediment Myriophyllum spicatum Toxicity Test
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Christensen, E.R., N. Nyholm (1984), Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves, Environmental Science & Technology, Vol. 18/9, 713-718.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Nyholm, N. et al. (1992), Statistical treatment of data from microbial toxicity tests, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 11/2, pp. 157-167.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Bruce, R.D., D.J. Versteeg (1992), A statistical procedure for modelling continuous toxicity data, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 11/10, pp. 1485-1494.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 OECD (2006), “Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application” OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 54, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Norberg-King, T.J. (1988), An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach, National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88, US EPA, Duluth, MN.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Dunnett, C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of the American Statistical Association, Vol. 50/272, pp. 1096-1121.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Dunnett, C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics, Vol. 20/3, pp. 482-491.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Williams, D.A. (1971), A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics, Vol. 27/1, pp. 103-117.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Williams, D.A. (1972), The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics, Vol. 28/2, pp. 519-531.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Brain, P., R. Cousens (1989), An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses, Weed Research, Vol. 29/2, pp. 93-96.
                              
                           
                        Appendiċi 1
                        DEFINIZZJONIJIET
                        
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Bijomassa hija l-piż frisk u/jew niexef ta' materja ħajja preżenti f'popolazzjoni. F'dan it-test il-bijomassa hija s-somma tar-rimja prinċipali, tal-fergħat laterali kollha u tal-għeruq kollha.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Sustanza kimika hija sustanza jew taħlita.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Klorożi hija l-bidla tal-kulur minn aħdar għal sfurija tal-organiżmu tat-test speċjalment tas-sepali.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       ECx
                                        huwa l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test maħlula fil-medium tat-test li jirriżulta fi tnaqqis ta' x % (eż. 50 %) fit-tkabbir tal- Myriophyllum spicatum f'perjodu ta' esponiment ddikjarat (li għandu jissemma espliċitament jekk ivarja mid-durata tat-test sħiħ jew normali). Biex tindika mingħajr ambigwità valur EC li jiġi derivat minn rata tat-tkabbir, is-simbolu “ErC” jintuża għar-rata tat-tkabbir u “EyC” jintuża għar-rendiment, segwit mill-varjabbli tal-kejl użat, eż. ErC (tul tar-rimja prinċipali).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    It-tkabbir huwa żieda fil-varjabbli tal-kejl, eż. tul tar-rimja prinċipali, l-ammont tal-fergħat laterali totali, it-tul tar-rimja totali, it-tul tal-għeruq totali, il-piż frisk, il-piż niexef jew in-numru ta' sepali matul il-perjodu tat-test.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Ir-rata tat-tkabbir (rata ta' tkabbir speċifika medja) hija ż-żieda logaritmika fil-varjabbli tal-kejl waqt il-perjodu tal-esponiment. Nota: Il-varjabbli tar-rispons relatati mar-rata tat-tkabbir huma indipendenti mid-durata tat-test sakemm il-mudell tat-tkabbir ta' organiżmi tal-kontroll mhux esposti huwa esponenzjali.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-Konċentrazzjoni bl-Inqas Effett Osservat (LOEC) hija l-inqas konċentrazzjoni ttestjata li fiha s-sustanza kimika hija osservata li jkollha effett ta' tnaqqis statistikament sinifikanti fuq it-tkabbir (b'p < 0,05) meta mqabbla mal-kontroll, f'ħin ta' esponiment partikolari. Madankollu, il-konċentrazzjonijiet tat-test kollha ogħla mil-LOEC għandu jkollhom effett ta' ħsara ugwali jew ogħla minn dawk osservati fil-LOEC. Meta dawn iż-żewġ kundizzjonijiet ma jistgħux jiġu ssodisfati, għandha tingħata spjegazzjoni dettaljata għal kif il-LOEC (u b'hekk in-NOEC) intgħażlet.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Varjabbli tal-kejl huma kwalunkwe tip ta' varjabbli li huma mkejla biex jesprimu l-punt tat-tmiem tat-test bl-użu ta' wieħed jew aktar varjabbli tar-rispons differenti. F'dan il-metodu ta' ttestjar it-tul tar-rimja prinċipali, it-tul tal-fergħat laterali totali; it-tul tar-rimja prinċipali, it-tul tal-għeruq totali, il-piż frisk, il-piż xott u n-numru ta' sepali huma varjabbli tal-kejl.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Monokultura hija kultura bi speċi ta' pjanta waħda.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Nekrożi huwa tessut mejjet (jiġifieri abjad jew kannella skur) tal-organiżmu tat-test.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-Konċentrazzjoni Bla Effett Osservat (NOEC) hija l-konċentrazzjoni tat-test eżattament taħt l-LOEC.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Varjabbli tar-rispons huwa varjabbli għall-istima tat-tossiċità derivata minn kwalunkwe varjabbli mkejjel li jiddeskrivi l-bijomassa b'metodi differenti tal-kalkolu. Għal dan il-metodu ta' ttestjar, ir-rata tat-tkabbir u r-rendiment huma varjabbli tar-rispons derivati minn varjabbli tal-kejl bħat-tul tar-rimja prinċipali, tul tar-rimja totali, piż frisk, piż niexef jew numru ta' sepali.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Test semistatiku (tiġdid) huwa test fejn is-soluzzjoni tat-test tiġi sostitwita perjodikament f'intervalli speċifiċi matul it-test.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Test statiku huwa metodu ta' ttestjar mingħajr tiġdid tas-soluzzjoni tat-test matul it-test.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Sustanza kimika tat-test hija kwalunkwe sustanza jew taħlita li tiġi ttestjata billi jintuża dan il-metodu ta' ttestjar
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Punt ta' tmiem tat-test jiddeskrivi l-fattur ġenerali li jinbidel b'mod relattiv għall-kontroll mis-sustanza kimika tat-test bħala mira tat-test. F'dan il-metodu ta' ttestjar, il-punt ta' tmiem tal-ittestjar hija l-inibizzjoni li tista' tiġi espressa b'varjabbli ta' rispons differenti li huma bbażati fuq varjabbli ta' kejl wieħed jew iktar.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Medium tat-test huwa medium ta' tkabbir sintetiku komplut li fuqu jikbru l-pjanti tal-ittestjar meta esposti għas-sustanza kimika tat-test. Is-sustanza kimika tat-test tinħall fil-medium tat-test.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       UVCB hija sustanza ta' kompożizzjoni mhux magħrufa jew varjabbli, prodott ta' reazzjoni kumplessa jew materjal bijoloġiku
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Rendiment huwa l-valur ta' varjabbli ta' kejl biex tiġi espressa l-bijomassa fi tmiem il-perjodu ta' esponiment li minnu jitnaqqas il-varjabbli ta' kejl fil-bidu tal-perjodu ta' esponiment. Nota: Meta l-mudell tat-tkabbir ta' organiżmi mhux esposti huwa esponenzjali, il-varjabbli tar-rispons ibbażati fuq ir-rendiment se jonqsu matul id-durata tat-test.
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 2
                        
                           ANDREWS MODIFIKAT GĦALL-KULTURA TAL-ĦAŻNA U TA' QABEL IL-ĦAŻNA
                        
                        Minn ħames soluzzjonijiet tal-ħażna tan-nutrijent ippreparati separatament il-medium Andrews modifikat għall-kultura tal-ħażna u l-kultura ta' qabel il-ħażna se jiġi ppreparat, biż-żieda ta' 3 % sukrożju.
                        
                           Tabella 1
                        
                        
                           Kompożizzjoni tas-soluzzjoni tan-nutrijent Andrews: (Deżinjazzjoni ASTM E 1913-04)
                        
                        
                                    Il-produzzjoni ta' soluzzjonijiet tal-ħażna tan-nutrijent
                                 
                                 
                                    Il-produzzjoni ta' soluzzjoni tan-nutrijent
                                 
                              
                                    Soluzzjoni tal-ħażna
                                 
                                 
                                    Sustanza Kimika
                                 
                                 
                                    Piż inizjali għal kull 1000 ml
                                 
                                 
                                    ml għal kull 5 l soluzzjoni tan-nutrijent
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    KCl
                                 
                                 
                                    74,6 mg
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    KNO3
                                    
                                 
                                 
                                    8,08 g
                                 
                              
                                    Ca(NO3)2 × 4 H2O
                                 
                                 
                                    18,88 g
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    MgSO4 × 7 H2O
                                 
                                 
                                    9,86 g
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    Ara hawn taħt soluzzjoni tal-ħażna 3.1
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    KH2PO4
                                    
                                 
                                 
                                    2,72 g
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    FeSO4 × 7 H2O
                                 
                                 
                                    0,278 g
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    Na2EDTA × 2 H2O
                                 
                                 
                                    0,372 g
                                 
                              Is-soluzzjonijiet tal-ħażna jistgħu jinżammu fi friġġ għal 6 xhur (f'temperatura ta' 5-10 °C). Hija biss is-soluzzjoni tal-ħażna Nru. 5 li għandha ħajja fuq l-ixkaffa mnaqqsa (xahrejn).
                        
                           Tabella 2
                        
                        
                           Produzzjoni tas-soluzzjoni tal-ħażna 3.1 għall-preparazzjoni tas-soluzzjoni tal-ħażna 3
                        
                        
                                    Sustanza Kimika
                                 
                                 
                                    Piż inizjali ta' g/100 ml
                                 
                              
                                    MnSO4 * 4 H2O
                                 
                                 
                                    0,223
                                 
                              
                                    ZnSO4 * 7 H2O
                                 
                                 
                                    0,115
                                 
                              
                                    H3BO3
                                    
                                 
                                 
                                    0,155
                                 
                              
                                    CuSO4 * 5 H2O
                                 
                                 
                                    0,0125
                                 
                              
                                    (NH4)6Mo7O24 * 4 H2O
                                 
                                 
                                    0,0037
                                 
                              Wara li tipproduċi s-soluzzjoni tal-ħażna 3,1 (Tabella 2), iffriża malajr din is-soluzzjoni fi 11 ml alikwoti (f'temperatura ta' – 18 °C mill-inqas). Il-porzjonijiet iffriżati malajr għandhom żmien tal-ħżin ta' ħames snin.
                        Biex tipproduċi soluzzjoni tal-ħażna 3, neħħi mill-friża s-soluzzjoni tal-ħażna 3,1, ilma 10 ml minnu fi flixkun volumetriku ta' 1 l u żid ilma pur ħafna sal-marka tal-flixkun.
                        Biex tikseb medium Andrews modifikat, imla madwar 2 500 ml ilma pur ħafna ġo flixkun volumetriku 5 l. Wara li żżid 50 ml ta' kull soluzzjoni tal-ħażna, imla 90 % tal-flixkun volumetriku b'ilma pur ħafna u taġġusta l-pH għal 5,8.
                        Wara dan, żid 150 g sukrożju maħlul (3 % għal kull 5 l); imbagħad, żid il-flixkun volumetriku b'ilma pur ħafna sal-marka. Finalment, is-soluzzjoni tan-nutrijent timtela fil-fliexken Schott ta' 1 l u maqsuma f'temperatura ta' 121 °C għal 20 minuta.
                        Is-soluzzjoni tan-nutrijenti prodotta tista' tinżamm sterili fi friġġ (f'temperatura ta' 5-10 °C) għal tliet xhur.
                        
                           Medium Andrews modifikat għal test tat-tossiċità ħieles mis-Sediment
                        
                        Mis-soluzzjonijiet tal-ħażna ta' ħames nutrijenti diġà msemmija fit-Tabelli 1 u 2, medium Andrews modifikat ikkonċentrat għal għaxar darbiet meħtieġ biex jinkisbu s-soluzzjonijiet tat-test se jkunu ppreparati, biż-żieda ta' 30 % sukrożju. Biex tagħmel dan, imla madwar 100 ml ilma pur ħafna ġo flixkun volumetriku 1 l. Wara li żżid 100 ml ta' kull wieħed mis-soluzzjonijiet tal-ħażna, aġġusta l-pH għal 5,8. Wara dan, żid 30 % tas-sukrożju maħlul (300 g għal kull 1 000 ml); imbagħad, żid il-flixkun volumetriku b'ilma pur ħafna sal-marka.
                        Finalment, is-soluzzjoni tan-nutrijent timtela fil-fliexken Schott ta' 0,5 l u maqsuma f'temperatura ta' 121 °C għal 20 minuta.
                        Is-soluzzjoni tan-nutrijenti konċentrata għal għaxar darbiet prodotta tista' tinżamm sterili fi friġġ (f'temperatura ta' 5-10 °C) għal tliet xhur.
                     
                     
                        Appendiċi 3
                        
                           ŻAMMA TAL-KULTURA TAL-ĦAŻNA
                        
                        F'din l-Appendiċi 3, il-kultura tal-ħażna Myriophyllum spicatum L (103), dikotiledonu akwatiku mgħarraq, hija deskritta speċi tal-ħaxixa tal-morliti tal-ilma. Bejn Ġunju u Awwissu, fjuri roża-bojod moħbija jisporġu minn fuq il-wiċċ tal-ilma. Il-pjanti huma miżrugħin fl-art permezz ta' sistema ta' riżomi robusti u jistgħu jinstabu fl-emisfera tat-tramuntana kollha f'ilmijiet kalmi ewtrofiċi, iżda mhux imniġġsa u aktar kalċiferi b'sottostrat tat-tajn. Il-Myriophyllum spicatum jippreferi l-ilma frisk, iżda jinsab fl-ilma salmastru wkoll.
                        Għall-kultura tal-ħażna ħielsa mis-sediment taħt kundizzjonijiet tal-laboratorju, huma meħtieġa pjanti sterili. Pjanti sterili huma disponibbli mil-laboratorju tal-ekotossikoloġija tal-Umweltbundesamt Ġermaniż (Aġenzija Federali Ambjentali tal-Ġermanja).
                        Inkella, l-organiżmi tat-test jistgħu jiġu ppreparati minn pjanti mhux sterili skont id-deżinjazzjoni ASTM E 1913-04. Ara hawn taħt — estratt mill-Gwida Standard ASTM — il-proċedura għall-ikkulturar tal-Myriophyllum sibiricum miġbur mill-post:
                        
                           “Jekk tibda mill-post fejn miġbura, pjanti mhux sterili, iġbor il-blanzuni tal-M. sibiricum fil-ħarifa. Poġġi l-blanzuni f'akwarju ta' 20 l li fih 5 cm sediment sterili li huwa mgħotti bir-ramel silica jew pereżempju bit-Turface® u 18 l ta' ilma reaġent. Qalleb l-akwarju u żomm f'temperatura ta' 15 °C u rata tal-fluenza ta' 200 sa 300 μmol m– 2 s– 1 għal 16-il siegħa fil-ġurnata. Il-kultura tal-pjanti fl-akwarju tista' tinżamm bħala sors ta' riżerva ta' pjanti fil-każ li l-kulturi tal-pjanti sterili jinqerdu b'malfunzjoni mekkanika fil-kabinett tat-tkabbir, bil-kontaminazzjoni jew xi raġuni oħra. Il-pjanti mkabbra fl-akwarju mhumiex sterili u kulturi sterili ma jistgħux jinżammu f'sistema tal-kultura tal-lott. Biex tiġi sterilizzata l-kultura, il-pjanti jitneħħew mill-akwarju u jitlaħalħu taħt ilma ġieri dejonizzat għal madwar nofs siegħa. Taħt kundizzjonijiet asettiċi f'kabinett tal-arja laminari, il-pjanti huma diżinfettati għal inqas minn 20 minuta (sakemm il-maġġoranza tat-tessut tal-pjanta jiġi bbliċjat u l-apiċi li qed tikber tibqa' ħadra) f'soluzzjoni ta' 3 % (w/v) tas-sodju ipokloritu li fiha 0,01 % tal-aġent tensjoattiv xieraq. Ħawwad id-diżinfettant u l-materjal tal-pjanti. Segmenti b'diversi nodi huma trasferiti f'tubi tal-kulturi sterili li fihom 45 ml medium Andrews sterilizzat u modifikat u magħluqa b'għeluq tat-tubu tal-kultura sempliċi. Segment tal-pjanti wieħed biss jitpoġġa f'kull kompartiment tat-test. Film tal-issiġillar tal-laboratorju jintuża biex jiżgura l-għeluq lir-reċipjent tal-kultura. Ladarba tkun ġiet stabbilita kultura sterili, is-segmenti tal-pjanti li fihom bosta nodi għandhom jiġu ttrasferiti fil-kompartimenti tat-test ġodda li jkun fihom midja tan-nutrijenti likwida friska kull għaxar sa tnax-il ġurnata. Kif muri bl-ikkulturar fuq il-plates tal-agar, il-pjanti għandhom ikunu sterili u jibqgħu sterili għal tmien ġimgħat qabel jista' jinbeda l-ittestjar.”
                        
                        Peress li l-medium Andrews modifikat fih is-sukrożju (li jistimula t-tkabbir tal-fungi u tal-batterji), il-materjali, soluzzjonijiet u l-ikkulturar kollha għandhom isiru taħt kundizzjonijiet sterili. Il-likwidi kollha kif ukoll it-tagħmir huma sterilizzati qabel l-użu. L-isterilizzazzjoni ssir permezz ta' trattament tal-arja msaħħna (210 °C) għal 4 sigħat jew awtoklava għal 20 minuta f'121 °C. Barra minn hekk, il-flasks, dixxijiet, skutelli, eċċ. kollha u tagħmir ieħor jgħaddu minn trattament tal-fjamma fuq workbench sterili eżatt qabel l-użu.
                        Kulturi tal-ħażna jistgħu jinżammu taħt illuminazzjoni u temperatura mnaqqsaμE m– 2 s– 1, 20 ± 2 °C) għal ħinijiet itwal mingħajr il-bżonn li jerġgħu jiġu stabbiliti. Il-medium tat-tkabbir Myriophyllum għandu jkun l-istess bħal dak użat għall-ittestjar iżda midja oħra rikka fin-nutrijenti tista' tintuża għall-kulturi tal-ħażna.
                        Is-segmenti tal-pjanti huma distribwiti assenikament f'diversi fliexken tal-500 ml Erlenmeter u/jew 2 000 ml Fernbach, kull wieħed mimli b'madwar 450 u rispettivament 1 000 ml medium Andrews modifikat. Imbagħad, il-fliexken isirilhom plagg bit-tapp assenikament ċellulożi.
                        Barra minn hekk, it-trattament bil-fjamma ta' tagħmir fil-workbench sterili eżatt qabel l-użu huwa assolutament neċessarju. Skont in-numru u d-daqs, il-pjanti għandhom jiġu trasferiti fis-soluzzjoni tan-nutrijent friska madwar kull tliet ġimgħat.
                        Jistgħu jintużaw apiċi kif ukoll segmenti tal-parti tan-nofs taz-zokk għal din il-kultura mġedda. In-numru u d-daqs tal-pjanti trasferiti (jew tas-segmenti tal-pjanti) jiddependi fuq kemm huma meħtieġa pjanti. Pereżempju, tista' tittrasferixxi ħames segmenti tar-rimja fi flixkun Fernbach wieħed u tliet segmenti tar-rimja fi flixkun Erlenmeyer wieħed, kull waħda b'tul ta' 5 cm. Armi kwalunkwe partijiet bl-għeruq, bil-fjuri, mejta jew li jkunu evidenti b'xi mod jew ieħor.
                        
                           Figura 1
                        
                        
                           Il-qtugħ tal-pjanti għall-ħażna u l-kultura ta' qabel wara 3 ġimgħat tal-kultivazzjoni.
                        
                        Il-kultura tal-pjanti għandha titwettaq fi fliexken tal-500 ml Erlenmeyer u fil-fliexken tal-2 000 ml Fernbach f'inkubatur li jkessaħ f'temperatura ta' 20 ± 2 °C b'dawl kontinwu f'madwar 100-150 μE m– 2 s– 1 jew 6 000-9 000 Lux (emess minn illuminazzjoni tal-kompartiment bil-kulur tat-temperatura “dawl abjad baxx”).
                        
                           Figura 2
                        
                        
                           Il-kultura tal-pjanti f'inkubatur li jkessaħ b'kompartiment tal-illuminazzjoni.
                        
                        Għandhom jintużaw reċipjenti tal-kulturi tal-ħġieġ kimikament nodfa (maħsula bl-aċidu) u sterilizzati kif ukoll tekniki ta' mmanniġġar asettiċi. Fil-każ ta' kontaminazzjoni tal-kultura tal-ħażna eż. bl-alka, fungi u/jew batterji, kultura ġdida għandha tiġi ppreparata jew kultura tal-ħażna minn laboratorju għandha tintuża biex tiġġedded waħda mill-kulturi.
                     
                     
                        Appendiċi 4
                        
                           MANUTENZJONI TAL-KULTURA TA' QABEL U PREPARAZZJONI TAL-ORGANIŻMU TAT-TEST GĦALL-ITTESTJAR
                        
                        Biex tikseb kultura ta' qabel, aqta r-rimjiet mill-kultura tal-ħażna f'segmenti b'żewġ sepali kull wieħed; poġġi s-segmenti fil-fliexken Fernbach mimlija b'medium Andrews modifikat (bi 3 % sukrożju). Kull flixkun jista' jkollu sa 50 segment tar-rimja. Madankollu, għandha tingħata attenzjoni li s-segmenti huma vitali u m'għandhom l-ebda għeruq u fergħat laterali fuq il-blanzuni (ara l-figura 1 fl-Appendiċi 3).
                        L-organiżmi tal-kultura ta' qabel huma kkulturati għal 14 sa 21 ġurnata taħt kundizzjonijiet sterili f'kompartiment ambjentali b'fażijiet li jalternaw id-dawl/dlam ta' 16/8 sigħat. Intensità tad-dawl magħżula mill-firxa ta 100-150 μE m– 2 s– 1. It-temperatura fir-reċipjenti tat-test għandha tkun ta' 23 ± 2 °C.
                        Peress li l-medium Andrews modifikat fih is-sukrosju (li jistimula t-tkabbir tal-fungi u l-batterji), għandhom jiġu ppreparati soluzzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test u l-ikkulturar għandu jsir taħt kundizzjonijiet sterili. Il-likwidi kollha kif ukoll it-tagħmir huma sterilizzati qabel l-użu. L-isterilizzazzjoni ssir permezz ta' trattament tal-arja msaħħna (210 °C) għal 4 sigħat jew awtoklava għal 20 minuta f'121 °C. Barra minn hekk, il-flasks, dixxijiet, skutelli, eċċ. kollha u tagħmir ieħor jgħaddu minn trattament tal-fjamma fuq workbench sterili eżatt qabel l-użu.
                        Rimjiet huma mneħħija b'mod asseniku mill-fliexkien tal-kultura ta' qabel, bl-għażla ta' materjal li huwa omoġenju kemm jista' jkun. Kull test jeħtieġ mill-inqas 60 organiżmu tat-test (l-ittestjar bi tmien konċentrazzjonijiet kimiċi tat-test). Għall-ittestjar, aqbad friegħi laterali friski minn kulturi ta' qabel, qassarhom għal 2,5 cm mill-bażi (bl-użu ta' riga) u ttrasferihom għal beaker li fih medium Andrews modifikat sterili. Dawn il-friegħi laterali friski jistgħu jintużaw għat-test tat-tossiċità ħieles mis-sediment Myriophyllum spicatum.
                        
                           Figura 2
                        
                        
                           Qtugħ tal-pjanti minn pre-kultura għat-test tat-tossiċità ħieles mis-sediment Myriophyllum spicatum.
                        
                        
                     C.51   
                           Myriophyllum spicatum tas-sediment tal-ilma
                     
                     INTRODUZZJONI
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linji gwida tat-test tal-OECD 239 (2014). Metodi tat-test huma disponibbli għall-pjanta li tibqa' f'wiċċ l-ilma, monokotiledonja akwatika, Lemna speċi (1) u għall-alka speċi (2). Dawn il-metodi normalment jintużaw biex jiġġeneraw dejta biex jindirizzaw ir-riskju tas-sustanzi kimiċi tat-test, b'mod partikolari sustanzi kimiċi b'attività erbiċidali, għal speċi ta' pjanti akwatiċi mhux fil-mira. Madankollu, f'ċertu każijiet, tista' tkun meħtieġa dejta għal speċi makrofiti addizzjonali. Gwida riċenti ppubblikata mill-workshop tas-Soċjetà għat-Tossikoloġija u l-Kimika Ambjentali (SETAC) dwar il-Valutazzjoni tar-Riskju tal-Makrofiti Akwatiċi għall-Pestiċidi (AMRAP) ipproponiet li d-dejta għal speċi makrofiti tal-għeruq jistgħu jkunu meħtieġa għas-sustanzi kimiċi tat-test fejn il-Lemna u l-alki huma magħrufa li ma jkunux sensittivi għall-mod ta' azzjoni jew jekk il-qsim tas-sediment huwa ta' tħassib, iwassal għal esponiment permezz tal-assorbiment tal-għeruq (3). Abbażi tal-għarfien u l-esperjenza attwali, Myriophyllum spp intgħażlu bħala l-ispeċi ppreferuta f'każijiet fejn id-dejta hija meħtieġa għal speċi ta' taħt l-ilma, dikotiledoni bl-għeruq (4) (5) (6). Dan it-test ma jissostitwixxix testijiet tat-tossiċità akwatika oħrajn; minflok dan għandu jikkumplimentahom sabiex tkun tista' ssir valutazzjoni aktar kompleta tal-periklu akwatiku tal-pjanti u tar-riskju. Il-metodu ta' ttestjar tas-sediment tal-ilma Myriophyllum spicatum jikkumplimenta t-Test tat-Tossiċità tas-sediment tal-ilma Myriophyllum spicatum (7).
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Dan id-dokument jiddeskrivi metodu ta' ttestjar, li jippermetti evalwazzjoni tal-effetti ta' ssutanza kimika tat-test fuq l-ispeċi tal-pjanta akwatika bl-għeruq Myriophyllum spicatum, li tikber f'sistema tas-sediment tal-ilma. Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bbażat parzjalment fuq il-metodi eżistenti (1) (2) (8) u jqis ir-riċerka riċenti relatata mal-valutazzjoni tar-riskju tal-pjanti akwatiċi (3). Il-metodu tas-sediment tal-ilma ġie vvalidat minn ring test internazzjonali li twettaq bl-ispeċijiet Myriophyllum li tkabbret f'kundizzjonijiet statiċi, li ġew esposti għas-sustanza kimika tat-test permezz ta' applikazzjonijiet magħmula permezz tal-kolonna tal-ilma (9). Madankollu, is-sistema tat-test hija faċilment adattata biex tippermetti għal esponiment permezz tas-sediment modifikat jew esponiment permezz tal-fażi tal-ila f'xenarji semistatiċi jew bid-doża pulsata, għalkemm dawn ix-xenarji ma ġewx formalment ittestjati. Barra minn hekk, il-metodu ġenerali jista' jintuża għal speċijiet oħrajn bl-għeruq, mgħaddsa u emerġenti, inkluż speċi oħra tal-Myriophyllum (eż Myriophyllum aquaticum) u Glyceria maxima (10). Modifikazzjonijiet tal-kundizzjonijiet tat-test, tad-disinn u tad-durata jistgħu jkunu meħtieġa għal speċi alternattivi. B'mod partikolari, huwa meħtieġ aktar xogħol biex jiġu definiti l-proċeduri xierqa għall-Myriophyllum aquaticum. Dawn l-għażliet mhumiex ippreżentati fid-dettall f'dan il-metodu ta' ttestjar, li jiddeskrivi l-approċċ standard għall-esponiment tal-Myriophyllum spicatum f'sistema statika permezz tal-fażi tal-ilma.
                              
                           
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Il-metodu ta' ttestjar japplika għal sustanzi, li għalihom il-metodu ta' ttestjar ġie vvalidat, (ara d-dettalji fir-rapport tar-ring test (9)) jew għal formulazzjonijiet jew taħlitiet magħrufa. Jista' jitwettaq test Myriophyllum biex jissodisfa rekwiżit tad-dejta tal-Livell 1 ikkawżat minn sustanza kimika tat-test potenzjali tal-qsim tas-sediment jew mod ta' azzjoni/kwistjonijiet tas-selettività. Bl-istess mod, jista' jkun meħtieġ test Myriophyllum ibbażat fil-laboratorju bħala parti minn strateġija ta' livell ogħla biex jiġi indirizzat tħassib dwar ir-riskju għal pjanti akwatiċi. Ir-raġuni speċifika għat-twettiq ta' test sejra tiddetermina r-rotta tal-esponiment (jiġifieri permezz tal-ilma jew tas-sediment). Qabel l-użu ta' dan il-metodu ta' ttestjar għall-ittestjar ta' taħlita maħsuba għal skop regolatorju, għandu jiġi kkunsidrat jekk, u jekk ikun hekk għaliex, jista' jipprovdi riżultati adegwati għal dak il-għan. Tali kunsiderazzjonijiet mhumiex meħtieġa, meta hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita.
                              
                           IL-PRINĊIPJU TAT-TEST
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 It-test huwa mfassal biex jevalwa l-effetti relatati mat-tkabbir veġetattiv tal-pjanti tal-Myriophyllum li jikbru fil-midja standardizzata (ilma, sediment u nutrijenti). Għal dan il-għan, apiċi tar-rimjiet ta' pjanti b'saħħithom li ma jifjorixxux huma mħawla f'sediment standardizzat, artifiċjali, li huwa ssupplimentat b'nutrijenti addizzjonali biex jiġi żgurat it-tkabbir tal-pjanti adegwat, u mbagħad jinżamm f'medium Smart u Barko (Appendiċi 1). Wara perjodu ta' stabbilment biex jippermetti għall-formazzjoni tal-għeruq, il-pjanti huma esposti għal serje ta' konċentrazzjonijiet tat-test miżjuda mal-kolonna tal-ilma. Inkella, l-esponiment permezz tas-sediment jista' jiġi simulat billi jiġi modifikat is-sediment artifiċjali bis-sustanza kimika tat-test u jiġu trapjantati l-pjanti f'dan is-sediment modifikat. Fiż-żewġ każijiet, il-pjanti huma sussegwentement miżmuma taħt kundizzjonijiet ambjentali kontrollati għal 14-il ġurnata. Effetti fuq it-tkabbir huma determinati minn valutazzjonijiet kwantitattivi tat-tul tar-rimja, tal-piż frisk u tal-piż niexef, kif ukoll osservazzjonijiet kwalitattivi ta' sintomi bħall-klorożi, nekrożi jew sfigurazzjoni tat-tkabbir.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Biex jikkwantifika l-effetti relatati mas-sustanzi kimiċi, it-tkabbir fis-soluzzjonijiet tat-test huwa mqabbel mat-tkabbir tal-pjanti tal-kontroll, u l-konċentrazzjoni li tikkawża inibizzjoni speċifikata x % tat-tkabbir li hija determinata u espressa bħala ECx; “x” tista' tkun kwalunkwe valur skont ir-rekwiżiti regolatorji, eż. EC10, EC20, EC50. Għandu jiġi nnotat li l-istimi tal-valuri EC10 u EC20 huma biss affidabbli u xierqa f'testijiet fejn il-koeffiċjenti tal-varjazzjoni fil-pjanti tal-kontroll jaqgħu taħt il-livell tal-effett li qed ikun stmat, jiġifieri l-koeffiċjenti tal-varjazzjoni għandhom ikunu <20 % għal stima robusta ta' EC20.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Kemm ir-rata tat-tkabbir medja speċifika (stmata minn evalwazzjonijiet tat-tul tar-rimja, piż tar-rimja friska u piż tar-rimja niexfa) u r-rendiment (stmat miż-żieda fit-tul tar-rimja, piż tar-rimja friska u piż tar-rimja niexfa) ta' pjanti mhux trattati u trattati għandhom jiġu determinati. Ir-rata speċifika tat-tkabbir (r) u r-rendiment (y) huma sussegwentement użati biex jiġu determinati ErCx (e.g. ErC10, ErC20, ErC50) u EyCx (e.g. EyC10, EyC20, EyC50), rispettivament.
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Jekk meħtieġ, il-konċentrazzjoni bl-inqas effett osservat (LOEC) u l-konċentrazzjoni bl-ebda effett osservat (NOEC) jistgħu jiġu determinati statistikament minn stimi tar-rati tat-tkabbir speċifiċi u mir-rendiment.
                              
                           INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA KIMIKA TAT-TEST
                     
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Metodu analitiku, b'sensittività xierqa għall-kwantifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi fil-mezz tat-test, għandu jkun disponibbli.
                              
                           
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Informazzjoni dwar is-sustanza kimika tat-test li tista' tkun utli biex jiġu stabbiliti l-kundizzjonijiet tat-test tinkludi l-formula strutturali, il-kompożizzjoni u fil-każ ta' sustanzi multi kostitwenti, UVCBs, taħlitiet u formulazzjonijiet, il-purità, is-solubbiltà tal-ilma, l-istabilità fl-ilma u fid-dawl, il-kostant tad-dissoċjazzjoni tal-aċidu (pKa), il-koeffiċjent tal-partizzjoni oktanol-ilma (Kow), jekk disponibbli Kd għas-sedimenti, il-pressjoni tal-fwar u l-bijodegrabbiltà. Is-solubilità tal-ilma u l-pressjoni tal-fwar jistgħu jintużaw biex jikkalkulaw il-kostant tal-Liġi ta' Henry, li se jindika jekk huwiex probabbli li jkun hemm telf sinifikanti tas-sustanza kimika tat-test waqt il-perjodu tat-test. Jekk it-telf tas-sustanzi kimiċi tat-test huwa probabbli, it-telf għandu jkun ikkwantifikat u għandhom jiġu dokumentati l-passi sussegwenti biex jiġi kontrollat tali telf. Meta l-informazzjoni dwar is-solubbiltà u l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test ma tkunx waħda ċerta, huwa rrakkomandat li dawn il-karatteristiċi jiġu vvalutati skont il-kundizzjonijiet tat-test, jiġifieri medium tat-tkabbir, temperatura, reġim tad-dawl li għandhom jintużaw fit-test. Nota: meta erbiċidi perossidanti li jiddependu fuq id-dawl jiġu ttestjati, id-dawl tal-laboratorju għandu jkun fih il-preżenza ekwivalenti tad-dawl ultravjola tax-xemx li jinsab fid-dawl tax-xemx naturali.
                              
                           
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Il-pH għandu jitkejjel u jiġi aġġustat fil-medium tat-test bħala xieraq. Il-kontroll tal-pH tal-medium tat-test huwa partikolarment importanti, eż. meta jiġu ttestjati metalli jew sustanzi kimiċi li huma instabbli idrolitikament. Aktar gwida għall-ittestjar tas-sustanzi kimiċi b'karatteristiċi kimiċi fiżiċi li jagħmluha diffiċli biex isir it-test hija pprovduta fid-Dokument ta' Gwida tal-OECD (11).
                              
                           VALIDITÀ TAT-TEST
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Biex ikunu validi r-riżultati tat-test, it-tul tar-rimja totali medju u l-piż frisk tar-rimja totali medju fil-pjanti tal-kontroll għandhom mill-inqas jirdoppjaw waqt il-fażi tal-esponiment tat-test. Barra minn hekk, il-pjanti tal-kontroll m'għandhomx juru xi sintomu viżiv ta' klorożi u għandhom ikunu viżwalment ħielsa mill-kontaminazzjoni minn organiżmi oħra bħall-algi u/jew films batterjali fuq il-pjanti, fuq il-wiċċ tas-sediment u fil-medium tat-test.
                              
                           
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Il-koeffiċjent medju tal-varjazzjoni għar-rendiment ibbażat fuq il-kejl tal-piż frisk tar-rimja (jiġifieri mill-bidu tat-test sat-tmiem tat-test) fil-kulturi tal-kontroll ma jaqbiżx il-35 % bejn ir-repliki.
                              
                           SUSTANZA KIMIKA TA' REFERENZA
                     
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Sustanza(i) ta' referenza, bħal 3,5-diklorofenol użat fir-ring test (9), għandhom jiġu ttestjati perjodikament sabiex tiġi ċċekkjata l-prestazzjoni tal-proċedura tat-test matul iż-żmien. Id-dejta tar-ring test tindika li l-valuri medji EC50 ta' 3,5-DCP għall-varjabbli tar-rispons differenti kienu bejn 4.7 u 6.1 mg/l (ara r-rapport tar-ring test għal dettalji tal-intervall tal-kunfidenza antiċipat madwar dawn il-valuri). Huwa rakkomandabbli li tittestja sustanza kimika tar-referenza mill-inqas darbtejn f'sena jew, fejn l-ittestjar ma jitwettaqx b'mod frekwenti, b'mod parallel mat-testijiet tat-tossiċità definittivi. Gwida għall-valuri EC50 mistennija għal 3,5-DCP hija pprovduta fir-Rapport Statistiku tar-Ring test Internazzjonali (9).
                              
                           DESKRIZZJONI TAL-METODU
                     
                        L-apparat tat-test
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 It-test għandu jitwettaq taħt kundizzjonijiet ambjentali kontrollati, jiġifieri f'kompartiment tat-tkabbir, kamra tat-tkabbir jew laboratorju, b'tul tal-jum, dawl u temperatura kontrollabbli (ara t-taqsima “Kundizzjonijiet tat-test” paragrafi 56-58). Il-kulturi tal-ħażna għandhom jinżammu separatament mir-reċipjenti tat-test.
                              
                           
                              
                                 15.
                              
                              
                                 L-istudju għandu jitwettaq bl-użu ta' reċipjenti tat-test tal-ħġieġ bħal akwarji jew beakers; beakers tal-ħġieġ taż-2-l (ta' madwar 24 cm għoli u 11 cm dijametru) jintużaw ta' spiss. Madankollu, reċipjenti oħrajn (jiġifieri ikbar) jistgħu jkunu adattati sakemm ikun hemm biżżejjed fond tal-ilma biex jippermetti tkabbir mingħajr limitu u jżomm il-pjanti mgħarrqa tul id-durata tat-test.
                              
                           
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Qsari tal-pjanti tal-plastik jew tal-ħġieġ (madwar 9 cm dijametru u 8 cm għoljin u 500 ml volum) jistgħu jintużaw bħala kontenituri biex iżommu l-pjanti fis-sediment. Inkella, jistgħu jintużaw beakers tal-ħġieġ u huma ppreferuti f'ċertu każijiet (eż. l-ittestjar ta' sustanzi kimiċi idrofobiċi jew sustanzi kimiċi b'Kow għoli).
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 L-għażla tad-daqs tal-qasrija/beaker għandha tiġi kkunsidrata flimkien mal-għażla tar-reċipjenti tat-test u d-disinn tat-test ippreferut (ara hawn taħt). Jekk jintuża d-Disinn tat-Test A (rimja waħda għal kull qasrija bi tliet qsari f'kull reċipjent) b'hekk jistgħu jkunu meħtieġa qsari iżgħar jew reċipjenti ikbar. Jekk jintuża d-Disinn tat-Test B (tliet rimjiet għal kull qasrija u qasrija waħda għal kull reċipjent) b'hekk id-daqsijiet tal-qasrija u tar-reċipjent iddikjarati għandhom ikunu adegwati. Fil-każijiet kollha, il-fond minimu tal-ilma għandu jkun 12 cm 'il fuq mill-quċċata tas-sediment u l-proporzjon tal-erja tas-superfiċje/volum tal-wiċċ tas-sediment għall-erja tas-superfiċje/volum tal-ilma għandu jiġi rreġistrat.
                              
                           
                        Organiżmu tat-test
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 L-approċċi ġenerali deskritti f'dan il-metodu ta' ttestjar jistgħu jintużaw biex jittestjaw firxa ta' speċi tal-pjanti akwatiċi. Madankollu, il-kundizzjonijiet deskritti f'dan il-metodu ta' ttestjar ġew imfassla għall-ittestjar tal-ispeċi tal-ħaxixa tal-morliti tal-ilma, Myriophyllum spicatum. Din l-ispeċi tappartjeni għall-familja dikotiledoni, Haloragaceae.
                              
                           
                              
                                 19.
                              
                              
                                 
                                    Myriophyllum spicatum (ħaxixa tal-morliti tal-Ewrasja) hija speċi bl-għeruq li tittollera firxa wiesgħa ta' kundizzjonijiet u tinsab f'korpi tal-ilma kemm statiċi kif ukoll mexxejja. M. spicatum hija perenni li tmut lura għall-għeruq tagħha matul ix-xitwa. Il-pjanti normalment jiffjorixxu u jitfgħu iż-żerriegħa liberament għalkemm il-propogazzjoni minn frammenti tal-blanzuni awżiljarji jew taz-zokk li jinqatgħu b'mod naturali jew wara disturb, hija ta' spiss il-metodu primarju tal-kolonizzazzjoni.
                              
                           
                        Kultivazzjoni tal-organiżmu tat-test
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Il-pjanti jistgħu jinkisbu minn popolazzjonijiet naturali jew minn fornituri tal-pjanti akwatiċi. Fiż-żewġ każijiet, is-sors tal-pjanti għandu jiġi dokumentat u l-identità tal-ispeċi għandha tiġi verifikata. Għandha tingħata attenzjoni kbira biex jiġi żgurat li l-ispeċi korretta tinkiseb meta tinġabar il-Myriophyllum spicatum mill-post, speċjalment f'reġjuni fejn tista' tibridizza ma' speċi oħra Myriophyllum. Jekk ikun hemm xi dubju, l-użu ta' kulturi tal-laboratorju verifikati minn sorsi magħrufa huwa rakkomandat. Pjanti li ġew esposti għal kwalunkwe kontaminanti kimiċi, jew miġbura minn siti li huma magħrufa li huma kontaminati, m'għandhomx jintużaw f'dan it-test.
                              
                           
                              
                                 21.
                              
                              
                                 F'reġjuni fejn M. spicatum mhix disponibbli matul ix-xhur tax-xitwa, jista' jkun meħtieġ il-manteniment fit-tul tal-kulturi tal-ħażna taħt kundizzjonijiet ta' serra jew laboratorju. Kulturi tal-ħażna għandhom jinżammu taħt kundizzjonijiet simili għall-kundizzjonijiet tat-test għalkemm jistgħu jitnaqqsu l-irradjanza u t-temperatura sabiex titnaqqas il-frekwenza tal-manutenzjoni tal-kultura (eż. meta testijiet tal-Myriophyllum mhumiex ippjanati għal perjodu). Użu ta' akkwarji u qsari tal-pjanti ikbar minn dawk li jintużaw fit-test, huwa rrakkomandat sabiex jippermetti l-ispazju għall-proliferazzjoni. Il-kompożizzjoni tas-sediment u tal-midja tal-ilma għandha tkun l-istess bħal dik użata għat-testijiet għalkemm metodi alternattivi tal-fertilizzazzjoni tat-test jistgħu jiġu adottati (eż. l-użu ta' formulazzjonijiet tal-fertilizzant kummerċjali ta' rilaxx bil-mod)
                              
                           
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Pjanti tal-ħażna għandhom ikunu viżibilment ħielsa mill-kontaminazzjoni ma' kwalunkwe organiżmi oħra, inkluż bebbux, alka filamentuża, fungi u insetti, eż. bajd jew larva tal-kamla Paraponyx stratiotata u larva jew adulti tal-curculionidae Eubrychius velutus. Jista' jkun meħtieġ it-tlaħliħ tal-materjal tal-pjanti fl-ilma frisk biex tiġi eliminata kontaminazzjoni viżibbli. Barra minn hekk, għandhom isiru sforzi biex jitnaqqas l-iżvilupp tal-alka uniċellulari u l-kontaminazzjoni batterjoloġija għalkemm l-isterilità kompleta tal-materjal tal-pjanti mhix neċessarja. Kulturi tal-ħażna għandhom jiġu sorveljati u trapjantati kif meħtieġ biex jiġi evitat l-iżvilupp tal-kontaminazzjoni tal-alka u tal-batterji. L-arjazzjoni tal-kulturi tal-ħażna tista' tkun ta' benefiċċju jekk il-kontaminazzjoni tal-alga jew tal-batterji ssir problematika.
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Fil-każijiet kollha, il-planti huma kkulturati/akklimatizzati taħt kundizzjonijiet li huma simili, iżda mhux neċessarjament identiċi, għal dawk użati fit-test għal perjodu adegwat (jiġifieri > ġimagħtejn) qabel l-użu tagħhom f'test.
                              
                           
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Kulturi tal-ħażna li jifjorixxu m'għandhomx jintużaw f'test minħabba li r-rati tat-tkabbir ġeneralment jonqsu matul u wara li jifjorixxu.
                              
                           
                        Sediment
                     
                     
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Is-sediment ifformulat li ġej, ibbażat fuq is-sediment artifiċjali użat fil-Kapitolu C.28 ta' dan l-Anness (8), huwa rrakkomandat għall-użu f'dan it-test. Is-sediment huwa ppreparat kif deskritt f'TM C.28, minbarra ż-żieda tan-nutrijenti kif deskritt hawn taħt:
                                 
                                             a)
                                          
                                          
                                             4-5 % pit (piż niexef, skont 2 ± 0.5 % karbonju organiku) viċin kemm jista' jkun għal pH 5.5 sa 6.0; huwa importanti li jintuża l-pit f'forma ta' trab, mitħun fin (preferibbilment bid-daqs tal-partikola ta' < 1 mm) u jkun imnixxef bl-arja biss.
                                          
                                       
                                             b)
                                          
                                          
                                             20 % tafal tal-kawlina (piż fin-niexef) (kontenut ta' kawlina preferibbilment aktar minn 30 %).
                                          
                                       
                                             c)
                                          
                                          
                                             75-76 % ramel tal-quartz (piż fin-niexef) (għandu jippredomina ramel fin b'aktar minn 50 % tal-partiċelli bejn 50 u 200 μm).
                                          
                                       
                                             d)
                                          
                                          
                                             Medium tan-nutrijent akweju huwa miżjud b'tali mod li l-aħħar lott tas-sediment ikun fih 200 mg/Kg sediment niexef kemm tal-klorur tal-ammonju kif ukoll tal-fosfat tas-sodju u l-kontenut tal-umdità tal-aħħar taħlita huwa fil-firxa ta' 30-50 %.
                                          
                                       
                                             e)
                                          
                                          
                                             Jiżdied karbonat tal-kalċju ta' kwalità kimikament pura (CaCO3) sabiex jiġi aġġustat il-pH tat-taħlita finali tan-naqal għal 7.0 ± 0.5.
                                          
                                       
                           
                              
                                 26.
                              
                              
                                 Is-sors tal-pit, it-tafal tal-kawlina u r-ramel għandu jkun magħruf u jkun dokumentat. Jekk l-oriġini ma tkunx magħrufa jew toħloq xi livell tat-tħassib, allura l-komponenti rispettivi għandhom jiġu ċċekjati għall-assenza tal-kontaminazzjoni kimika (eż. metalli tqal, komposti organoklorurati, komposti organofosforiċi).
                              
                           
                              
                                 27.
                              
                              
                                 Il-kostitwenti niexfa tas-sediment għandhom jitħalltu b'mod omoġenju qabel titħallat is-soluzzjoni tan-nutrijent akweju kompletament fis-sediment. Is-sediment imxarrab għandu jkun ippreparat mill-inqas jumejn qabel l-użu biex jippermetti t-tixrib komplet tal-pit u biex jipprevjeni milli l-frak idrofobiċi tal-pit imorru f'wiċċ l-ilma meta s-sediment jinkesa bil-midja; qabel l-użu, is-sediment niedi jista' jinħażen fid-dlam.
                              
                           
                              
                                 28.
                              
                              
                                 Għat-test, is-sediment huwa trasferit f'kontenituri ta' daqs xieraq, bħal qsari tal-pjanti ta' dijametru li joqgħod fir-reċipjenti tal-ħġieġ (il-erja tas-superfiċje tas-sediment għandha tkopri madwar 70 % jew aktar tal-erja tas-superfiċje tar-reċipjent). F'każijiet fejn il-kontenitur għandu t-toqob fil-qiegħ, biċċa karta filtru fil-qiegħ tal-kontenitur tgħin biex iżżomm is-sediment fil-kontenitur. Il-qsari jimtlew bis-sediment b'tali mod li l-wiċċ tas-sediment huwa livell, qabel jitgħatta b'saff irqiq (~ 2-3 mm) ta' materjal inerti bħal ramel, żrar ortikulturali fin (jew qroll imfarrak) biex iżomm is-sediment f'postu.
                              
                           
                        Medium tat-test
                     
                     
                              
                                 29.
                              
                              
                                 Il-medium Smart u Barko (12) huwa rakkomandat għall-ikkulturar u l-ittestjar Myriophyllum spicatum. Il-preparazzjoni ta' dan il-medium hija deskritta fl-Appendiċi 1. Il-pH tal-medium (fażi tal-ilma) fil-bidu tat-test għandu jkun bejn 7.5 u 8.0 għat-tkabbir ottimali tal-pjanti.
                              
                           
                        Disinn sperimentali
                     
                     
                              
                                 30.
                              
                              
                                 It-test għandu jinkorpora minimu ta' sitt reċipjenti tat-test replikati għall-kontroll mhux trattat u minimu ta' erba' reċipjenti tat-test replikati għal kull wieħed minn minimu ta' ħames livelli tal-konċentrazzjoni.
                              
                           
                              
                                 31.
                              
                              
                                 Jekk ma tkunx meħtieġa determinazzjoni tal-NOEC, id-disinn tal-ittestjar jista' jiġi mmodifikat biex jiżdied in-numru ta' konċentrazzjonijiet u jitnaqqas in-numru ta' repliki għal kull konċentrazzjoni.
                              
                           
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Kull reċipjent tat-test jirrappreżenta replika li fiha tliet rimjiet. Hemm żewġ għażliet għat-tkabbir ta' tliet rimjiet f'kull reċipjent tat-test:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Disinn tat-Test A: rimja waħda għal kull qasrija u tliet qsari għal kull reċipjent.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Disinn tat-Test B: tliet rimjiet għal kull qasrija u qasrija waħda għal kull reċipjent.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Disinni tat-test alternattivi ta' rimja waħda għal kull qasrija għal kull reċipjent tat-test huma aċċettabbli sakemm ir-replikazzjoni hija aġġustata kif meħtieġ biex jinkisbu l-kriterji tal-validità meħtieġa.
                                          
                                       
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Ir-reċipjenti tat-test individwali għandhom jiġu assenjati bl-addoċċ lill-gruppi tat-trattament. Disinn bl-addoċċ għall-post tar-reċipjenti tat-test fiż-żona tat-test huwa meħtieġ biex titnaqqas l-influwenza ta' differenzi tal-ispazju fl-intensità tad-dawl jew fit-temperatura.
                              
                           
                        Konċentrazzjonijiet u gruppi ta' kontroll tas-sustanza kimika tat-test
                     
                     
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Il-konċentrazzjonijiet għandhom normalment isegwu serje ġeometrika; il-fattur tas-separazzjoni bejn il-konċentrazzjonijiet tat-test m'għandux jeċċedi it-3.2. Għarfien minn qabel tat-tossiċità tas-sustanza kimika tat-test minn test li jsib il-medda se jgħin fl-għażla tal-konċentrazzjonijiet tat-test xierqa.
                              
                           
                              
                                 35.
                              
                              
                                 Għad-determinazzjoni ta' ECx, il-konċentrazzjonijiet tat-test iridu jsostnu l-valur ECx sabiex jiġi żgurat livell ta' kunfidenza adegwat. Pereżempju, jekk tkun qed tikkalkula EC50, l-iktar konċentrazzjoni għolja għandha tkun ikbar mill-valur tal-EC50. Jekk il-valur EC50 jinstab barra l-firxa ta' konċentrazzjonijiet tat-test, intervalli ta' kunfidenza assoċjati jkunu kbar u valutazzjoni xierqa tal-fit statistiku tal-mudell tista' ma tkunx possibbli. L-użu ta' aktar konċentrazzjonijiet tat-test se jtejjeb l-intervall tal-valr ECx li jirriżulta.
                              
                           
                              
                                 36.
                              
                              
                                 Sabiex tiddetermina l-LOEC/NOEC (punt tat-tmiem mhux obbligatorju), l-inqas konċentrazzjoni tat-test għandha tkun baxxa biżżejjed li t-tkabbir ma jkunx sinifikament differenti mit-tkabbir fil-pjanti tal-kontroll. Barra minn hekk, l-ogħla konċentrazzjoni tat-test għandha tkun għolja biżżejjed li t-tkabbir ikun ferm iktar baxx minn dik ta' fil-kontroll. L-użu ta' aktar repliki se jsaħħaħ il-poter statistiku tal-konċentrazzjoni bla effett/disinn ANOVA.
                              
                           
                        Test tal-limitu
                     
                     
                              
                                 37.
                              
                              
                                 F'każijiet fejn test li jsib il-medda jindika li s-sustanza kimika tat-test m'għandha l-ebda effett negattiv f'konċentrazzjonijiet sa 100 mg/l jew sal-limitu tas-solubbiltà tagħha fil-medium tat-test jew fil-każ ta' formulazzjoni sal-limitu tad-dispersibbiltà, jista' jittieħed test tal-limitu biex jiffaċilita paragun tar-risposti fi grupp tal-kontroll u fi grupp tat-trattament wieħed — 100 mg/l jew konċentrazzjoni ugwali għal-limitu tas-solubbiltà — jew 1 000 mg/kg sediment niexef. Dan it-test għandu jsegwi l-prinċipji ġenerali ta' test tad-doża-rispons standard, bl-eċċezzjoni li żieda fin-numru minimu tar-repliċi għal sitt reċipjenti tat-test għal kull kontroll u konċentrazzjoni hija rakkomandata. It-tkabbir fil-grupp ta' kontroll u trattament jista' jiġi analizzat permezz ta' test tal-istatistika biex jitqabblu l-media, eż. Test-t ta' Student.
                              
                           
                        Is-soluzzjonijiet tat-test
                     
                     
                              
                                 38.
                              
                              
                                 Soluzzjonijiet tat-test huma normalment ippreparati bid-dilwizzjoni ta' soluzzjoni tal-ħażna, ippreparata billi tħoll jew ixxerred is-sustanza kimika tat-test fil-medium Smart u Barko, bl-użu ta' ilma demineralizzat (jiġifieri distillat jew dejonizzat) (ara l-Appendiċi 1).
                              
                           
                              
                                 39.
                              
                              
                                 L-ogħla konċentrazzjoni tat-test normalment m'għandhiex teċċedi s-solubbiltà tal-ilma tas-sustanza kimika tat-test jew, fil-każ ta' formulazzjonijiet, id-dispersibbiltà taħt il-kundizzjonijiet tat-test.
                              
                           
                              
                                 40.
                              
                              
                                 Għal sustanzi kimiċi ta' solubbiltà tal-ilma baxxa jista' jkun meħtieġ li tiġi ppreparata soluzzjoni tal-ħażna konċentrata jew dispersjoni tas-sustanza kimika bl-użu ta' solvent organiku jew dispersant sabiex jiffaċilita ż-żieda ta' kwantitajiet preċiżi tas-sustanza kimika tat-test għall-medium tat-test u jgħin fid-dispersjoni u x-xoljiment tiegħu. Għandu jsir kull sforz biex jiġi evitat l-użu ta' tali solventi jew dispersanti. Ma għandu jkun hemm ebda fitotossiċità li tirriżulta mill-użu ta' solventi jew aġenti dispersivi awżiljarji. Pereżempju, solventi li jintużaw b'mod komuni li ma jikkawżawx fitotossiċità fil-konċentrazzjonijiet sa 100 μl//l jinkludu aċeton u dimetilformamid. Jekk jintuża solvent jew dispersant, il-konċentrazzjoni finali tiegħu għandha tiġi rappurtata u miżmuma fil-minimu (≤100 μl/l). Taħt dawn iċ-ċirkostanzi, it-trattamenti u l-kontrolli (tas-solvent) kollha għandu jkun fihom l-istess konċentrazzjoni ta' solvent jew dispersant. Repliki tal-kontroll mhux trattati li ma fihomx solvent jew dispersant huma wkoll inkorporati fid-disinn tat-test. Tingħata gwida ulterjuri dwar l-użu ta' aġenti dispersivi f'Dokument ta' Gwida OECD (11).
                              
                           PROĊEDURA TAT-TEST
                     
                              
                                 41.
                              
                              
                                 Il-proċedura tat-test tvarja skont ir-rotta tal-applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test (jiġifieri permezz tal-fażi tal-ilma jew tas-sediment). L-imġiba probabbli tas-sustanza kimika tat-test f'sistema tal-ilma-sediment għandha tiġi kkunsidrata biex tinforma l-għażla tar-reġim tal-esponiment użat fit-test (jiġifieri tiġdid statiku jew mhux statiku, ilma modifikat jew sediment modifikat). Testijiet tas-sediment modifikat jistgħu jiġu ppreferuti f'ċertu każijiet għal sustanzi kimiċi li huma mbassra li jisseparaw is-sediment b'mod sinifikanti.
                              
                           
                        Fażi tal-istabbilment
                     
                     
                              
                                 42.
                              
                              
                                 Apiċi/ponot tar-rimja b'saħħithom, jiġifieri mingħajr rimjiet fil-ġenb, jinqatgħu mill-pjanti tal-kultura biex jagħtu tul tar-rimja ta' 6 cm (± 1 cm). Għad-Disinn tat-Test A (rimja waħda għal kull qasrija u tliet qsari għal kull reċipjent) ponot tar-rimja singoli huma mħawla f'kull qasrija. Għad-Disinn tat-Test B (tliet rimjiet għal kull qasrija u qasrija waħda għal kull reċipjent) erba' sa ħames apiċi huma mħawla f'kull qasrija li fiha s-sediment.
                              
                           
                              
                                 43.
                              
                              
                                 Fiż-żewġ każijiet, il-qsari żejda għandhom jiġu mħawla biex jippermettu għall-għażla ta' pjanti uniformi fil-bidu tat-test, kif ukoll biex jipprovdu pjanti żejda biex jintużaw għall-ispezzjoni tat-tkabbir tal-għeruq immedjatament qael it-trattament u pjanti żejda biex jinħasdu għall-bijomassa tar-rimja u l-kejl tat-tul fil-Jum 0.
                              
                           
                              
                                 44.
                              
                              
                                 Rimjiet huma mdaħħla b'tali mod li madwar tliet cm, li jkopru mill-inqas żewġ nodi, huma taħt il-wiċċ tas-sediment.
                              
                           
                              
                                 45.
                              
                              
                                 Il-qsari huma mbagħad trasferiti fir-reċipjenti tat-test taħt l-istess kundizzjonijiet ambjentali għall-fażi tal-esponiment u miżmuma għal sebat ijiem f'medium Smart u Barko biex jiġi kkawżat l-iżvilupp tal-għeruq.
                              
                           
                              
                                 46.
                              
                              
                                 Wara dan iż-żmien, bosta pjanti fi qsari żejda għandhom jitneħħew għall-ispezzjoni tat-tkabbir tal-għeruq. Jekk it-tkabbir tal-għeruq mhux viżibbli (jiġifieri l-punti tal-għeruq mhumiex viżibbli), allura l-fażi tal-istabbilment għandha tiġi estiża sakemm it-tkabbir tal-għeruq ikun viżibbli. Dan il-pass huwa rrakkomandat biex jiżgura li l-pjanti qed jikbru b'mod attiv fil-ħin tal-bidu tat-test.
                              
                           
                        Għażla ta' materjal tal-pjanti uniformi.
                     
                     
                              
                                 47.
                              
                              
                                 Għad-Disinn tat-Test A (rimja waħda għal kull qasrija u tliet qsari għal kull reċipjent) il-qsari huma magħżulin għall-uniformità qabel il-bidu tat-test. Għad-Disinn tat-Test B (tliet rimjiet għal kull qasrija u qasrija waħda għal kull reċipjent), pjanti żejda huma mneħħija biex iħallu tliet pjanti li huma uniformi fid-daqs u fid-dehra.
                              
                           
                        Esponiment permezz tal-fażi tal-ilma
                     
                     
                              
                                 48.
                              
                              
                                 Qsari, magħżula għall-uniformità, huma mpoġġija fir-reċipjenti tat-test kif meħtieġ għad-disinn sperimentali. Il-medium Smart u Barko huwa mbagħad miżjud mar-reċipjenti tat-test. Għandha tingħata attenzjoni biex jiġi evitat it-taħwid fis-sediment. Għal dan il-għan, jista' jiżdied mezz bl-użu ta' lembut jew diska tal-plastik biex jgħatti s-sediment waqt li l-medium jitferra' fir-reċipjenti tat-test sakemm id-diska titneħħa immedjatament wara. Inkella, il-qsari tal-pjanti jistgħu jitqiegħdu fir-reċipjenti tat-test wara ż-żieda tal-midja. Fiż-żewġ każijiet, midja friska tista' tintuża fil-bidu tal-fażi tal-esponiment, jekk meħtieġ biex timminimizza l-akkumulazzjoni potenzjali tal-alka u tal-batterji jew biex tippermetti l-preparazzjoni ta' lottijiet singoli tas-soluzzjoni tat-test madwar repliki.
                              
                           
                              
                                 49.
                              
                              
                                 It-tul tar-rimja 'l fuq mis-sediment titkejjel, jew qabel jew wara ż-żieda tal-medium.
                              
                           
                              
                                 50.
                              
                              
                                 L-ammonti rilevanti tas-sustanza kimika tat-test jistgħu jiġu miżjuda mal-medium tat-test qabel jiżdied mar-reċipjenti tat-test. Inkella, is-sustanza kimika tat-test tista' tiġi introdotta mal-medium wara li tiżdied mar-reċipjenti tat-test. F'dan il-każ, għandha tingħata attenzjoni biex jiġi żgurat li s-sustanza kimika tat-test tkun imqassma b'mod omoġenju fis-sistema tat-test mingħajr ma tiddisturba s-sediment.
                              
                           
                              
                                 51.
                              
                              
                                 Fil-każijiet kollha, id-dehra (eż. ċara, imdardra, eċċ) tal-medium tat-test hija rreġistrata fil-bidu tat-test.
                              
                           
                        Esponiment permezz tas-sediment
                     
                     
                              
                                 52.
                              
                              
                                 Sedimenti modifikati tal-konċentrazzjoni magħżula huma ppreparati biż-żieda ta' soluzzjoni tas-sustanza kimika tat-test direttament mas-sediment frisk. Soluzzjoni tal-ħażna tas-sustanza kimika tat-test dissolta f'ilma dejonizzat titħallat mas-sediment ifformulat b'mitħna tal-irrumblar, ħallat tal-għalf jew tħallit bl-idejn. Jekk ftit li xejn tinħall fl-ilma, is-sustanza kimika tat-test tista' tiġi dissolta f'volum żgħir kemm jista' jkun ta' solvent organiku xieraq (eż.. essan, aċeton jew kloroformi). Din is-soluzzjoni hija mbagħad imħallta ma' madwar 10 g ta' ramel tal-kwarz għal reċipjent tat-test wieħed. Is-solvent jitħalla jevapora u r-ramel huwa mbagħad imħallat mal-ammont xieraq tas-sediment għal kull beaker tat-test. Aġenti li huma volatili faċilment jistgħu jintużaw biex iħollu, jferrxu jew jemulsifikaw is-sustanza kimika tat-test. Għandu jiġi mfakkar li l-volum/piż tar-ramel modifikat bis-sustanza kimika tat-test għandu jiġi kkunsidrat fit-tħejjija finali tas-sediment (jiġifieri s-sediment għandu għalhekk ikun ippreparat b'inqas ramel). Għandha tingħata attenzjoni biex jiġi żgurat li s-sustanza kimika tat-test miżjuda mas-sediment tiġi distribwita sew u b'mod uniformi fis-sediment.
                              
                           
                              
                                 53.
                              
                              
                                 Is-sediment modifikat jimtela fil-qsari (kif deskritt hawn fuq). Il-pjanti, magħżula għall-uniformità u għal sistema tal-għeruq adegwata, jitneħħew mill-qsari użati waqt il-fażi tal-istabbilment u jiġu trapjantati fis-sediment modifikat kif deskritt hawn fuq.
                              
                           
                              
                                 54.
                              
                              
                                 Il-qsari jitpoġġew fir-reċipjenti tat-test kif meħtieġ għad-disinn sperimentali. Il-medium Smart u Barko huwa mbagħad miżjud b'attenzjoni (jiġifieri bl-użu ta' lembut) sabiex jiġi evitat it-taħlit fis-sediment. It-tul tar-rimja 'l fuq mis-sediment titkejjel, jew qabel jew wara ż-żieda tal-midja.
                              
                           
                        Manutenzjoni tal-livelli tal-ilma waqt id-durata tat-test
                     
                     
                              
                                 55.
                              
                              
                                 Il-volum tal-ilma finali għandu jiġi reġistrat u l-livell tal-ilma jiġi mmarkat fuq kull reċipjent tat-test. Jekk l-ilma jevapora waqt it-test b'aktar minn 10 %, il-livell tal-ilma għandu jiġi aġġustat bl-ilma distillat. Jekk ikun meħtieġ, il-beakers jistgħu jitgħattew b'mod laxk b'għatu trasparenti bħal għotjien tal-plastik trasparenti biex tiġi minimizzata l-evaporazzjoni u l-kontaminazzjoni ma' spori tal-alka.
                              
                           
                        Kundizzjonijiet tat-test
                     
                     
                              
                                 56.
                              
                              
                                 Dawl fluworexxenti baxx u/jew qawwi jintuża biex jipprovdi l-irradjanza tad-dawl fil-medda ta' madwar 140 (± 20) μE·m– 2 s– 1 meta mkejjel bħala radjazzjoni attiva fotosintetika (400-700 nm) fil-wiċċ tal-ilma u bl-użu ta' proporzjon ċar:skur ta' 16:8 h. Kwalunkwe differenza mill-irradjanza tad-dawl magħżula fl-erja tat-test m'għandhiex teċċedi l-medda ta' ± 15 %.
                              
                           
                              
                                 57.
                              
                              
                                 It-temperatura fir-reċipjenti tat-test hija ta' 20 ± 2°C.
                              
                           
                              
                                 58.
                              
                              
                                 Il-pH tal-medium ta' kontroll ma għandux jiżdied b'aktar minn 1.5 unitajiet matul it-test. Madankollu, devjazzjoni ta' aktar minn 1.5 unità ma tagħmilx it-test invalidu meta jkun jista' jintwera li l-kriterji tal-validità speċifikati qabel jiġu sodisfatti.
                              
                           
                        Durata tat-test
                     
                     
                              
                                 59.
                              
                              
                                 Il-perjodu ta' esponiment huwa ta' 14-il ġurnata.
                              
                           
                        Kejliet u determinazzjonijiet analitiċi
                     
                     
                              
                                 60.
                              
                              
                                 Wara l-fażi tal-istabbilment u immedjatament qabel it-trattament (jiġifieri fil-Ġurnata 0), pjanti żejda minn ħames qsari magħżula każwalment għat-tliet pjanti għal kull disinn tal-qasrija jew 15-il qasrija għal pjanta waħda għal kull disinn tal-qasrija, huma maħsuda għall-evalwazzjoni tat-tul tar-rimja u l-piż frisk u niexef kif deskritt hawn taħt.
                              
                           
                              
                                 61.
                              
                              
                                 Għal pjanti trasferiti fil-fażi tal-esponiment, isiru l-evalwazzjonijiet li ġejjin kif muri fit-Tabella 1:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Evalwazzjonijiet tat-tul tar-rimja prinċipali, numru tar-rimja tal-ġenb u tul tar-rimja tal-ġenb huma rreġistrati għall-inqas fl-aħħar tal-perjodu tal-esponiment (eż. fil-ġurnata 14).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Evalwazzjonijiet viżwali tas-saħħa tal-pjanti huma rreġistrati mill-inqas tliet darbiet waqt il-perjodu tal-esponiment (eż. fil-ġranet 0, 7 u 14).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Evalwazzjonijiet tal-piż frisk u l-piż xott tar-rimja huma magħmulin fl-aħħar tat-test (jiġifieri fil-Ġurnata 14).
                                          
                                       
                           
                              
                                 62.
                              
                              
                                 It-tul tar-rimja huwa determinat bl-użu ta' riga. Jekk rimjiet tal-ġenb huma preżenti, in-numru u t-tulijiet tagħhom għandhom jitkejlu wkoll.
                              
                           
                              
                                 63.
                              
                              
                                 Evalwazzjonijiet viżwali tas-saħħa tal-pjanti jsiru billi tiġi rreġistrata d-dehra tal-pjanti u l-kundizzjoni ġenerali tal-medium tat-test. Osservazzjonijiet li għandhom jiġu nnotati jinkludu:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             In-nekrożi, il-klorożi jew kwalunkwe telf tal-kulur bħal ħmurija eċċessiva relattiva għall-pjanti tal-kontroll.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             L-iżvilupp tal-kontaminazzjoni batterjali jew tal-alka;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Anormalitajiet tat-tkabbir bħal nuqqas fit-tkabbir, tul internodali mibdul, rimjiet/weraq mgħawwġin, il-proliferazzjoni ta' rimjiet tal-ġenb, telf tal-weraq, telf tal-pressjoni u frammentazzjoni taz-zokk.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Evalwazzjonijiet viżwali tas-saħħa tal-għeruq isiru fit-tmiem tat-test, billi jinħasel is-sediment b'attenzjoni mill-għeruq biex jippermettu l-osservazzjoni tas-sistema tal-għeruq. Skala għall-evalwazzjoni proposta, relattiva għall-pjanti tal-kontroll, tidher hawn taħt:
                                             
                                                         1)
                                                      
                                                      
                                                         għeruq assenti
                                                      
                                                   
                                                         2)
                                                      
                                                      
                                                         ftit għeruq
                                                      
                                                   
                                                         3)
                                                      
                                                      
                                                         żvilupp moderat tal-għeruq
                                                      
                                                   
                                                         4)
                                                      
                                                      
                                                         żvilupp tal-għeruq tajjeb ħafna, simili għall-kontrolli
                                                      
                                                   
                                       
                           
                              
                                 64.
                              
                              
                                 Evalwazzjonijiet tal-piż frisk isiru fil-bidu u fl-aħħar tat-test billi taqta' r-rimja fil-livell tas-sediment u tixxotta qabel l-użin. Għandha tingħata attenzjoni biex jitneħħew partikoli tas-sediment li jistgħu jaderixxu għall-bażi tar-rimja. Il-materjal tar-rimja mbagħad jitpoġġa f'forn tat-tnixxif f'madwar 60 °C u jiġi mnixxef għal piż kostanti, qabel jerġa' jintiżen u jiġi rreġistrat il-piż niexef.
                              
                           
                              
                                 65.
                              
                              
                                 Sommarju tal-evalwazzjonijiet bijoloġiċi minimi meħtieġa tul id-durata tat-test huwa pprovdut fit-Tabella 1.
                                 
                                    Tabella 1
                                 
                                 
                                    Skeda tal-evalwazzjoni
                                 
                                 
                                             Trattament ta' ġurnata wara
                                             (DAT)
                                          
                                          
                                             
                                                Myriophyllum spicatum
                                             
                                          
                                       
                                             Tul tar-rimja, tul tar-rimja tal-ġenb u numru
                                          
                                          
                                             Evalwazzjoni viżwali tar-rimjiet
                                          
                                          
                                             Piż frisk u niexef tar-rimja
                                             Evalwazzjoni viżwali tal-għeruq
                                          
                                          
                                             pH
                                             O2
                                             
                                          
                                       
                                             0
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                       
                                             
                                                         A
                                                      
                                                      
                                                         :
                                                      
                                                      
                                                         jindika li evalwazzjonijiet huma meħtieġa f'dawn l-okkażjonijiet
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         :
                                                      
                                                      
                                                         jindika li mhux meħtieġ il-kejl
                                                      
                                                   
                                       
                           
                        Frekwenza tal-kejl u determinazzjonijiet analitiċi
                     
                     
                              
                                 66.
                              
                              
                                 It-temperatura tal-medium fil-kontenitur supplimentari miżmum fl-istess kundizzjonjiet tal-kamra ta' tkabbir, inkubatur jew kamra għandu jiġi rreġistrat mill-inqas darba kuljum (jew kontinwament b'logger tad-dejta).
                              
                           
                              
                                 67.
                              
                              
                                 Il-konċentrazzjoni tal-pH u tal-ossiġenu tal-medium tat-test għandha tiġi ċċekkjata fil-bidu tat-test, mill-inqas darba waqt l-istudju u fl-aħħar tal-istudju fir-reċipjenti replikati kollha. F'kull okkażjoni, il-kejliet għandhom jittieħdu fl-istess ħin tal-ġurnata. Jekk jintużaw soluzzjonijiet tal-massa biex jippreparaw ir-repliki kollha f'kull konċentrazzjoni tat-test, allura kejl wieħed ta' kull soluzzjoni tal-massa huwa aċċettabbli fil-Ġurnata 0.
                              
                           
                              
                                 68.
                              
                              
                                 L-irradjanza għandha titkejjel fil-kamra tat-tkabbir, inkubatur jew kamra f'punti ekwivalenti għal-livell tal-wiċċ tal-ilma. Il-kejliet għandhom isiru mill-inqas darba fil-bidu tat-test jew waqt it-test. Il-metodu ta' detezzjoni u kejl, b'mod partikolari t-tip ta' senser, jaffettwa l-valur imkejjel. Is-sensers sferiċi (li jirrispondu għad-dawl minn angoli 'l fuq u taħt il-pjan ta' kejl) u s-sensers “cosine” (li jirrispondu għad-dawl mill-angoli kollha 'l fuq mill-pjan ta' kejl) huma ppreferuti minn sensers unidirezzjonali, u ser jagħtu riżultati tal-qari ogħla, għal sors ta' dawl b'ħafna punti tat-tip deskritt hawnhekk.
                              
                           
                        Kejliet analitiċi tas-sustanza kimika tat-test
                     
                     
                              
                                 69.
                              
                              
                                 L-applikazzjoni korretta tas-sustanza kimika tat-test għandha tiġi appoġġata mill-kejliet analitiċi tal-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test.
                              
                           
                              
                                 70.
                              
                              
                                 Kampjuni tal-ilma għandhom jinġabru għall-analiżi tas-sustanza kimika tat-test ftit wara l-bidu tat-test (jiġifieri fil-ġurnata tal-applikazzjoni għal sustanzi kimiċi tat-test stabbli jew siegħa wara l-applikazzjoni għal sustanzi kimiċi li mhumiex stabbli) u fit-tmiem tat-test għall-konċentrazzjonijiet tat-test kollha.
                              
                           
                              
                                 71.
                              
                              
                                 Il-konċentrazzjonijiet fis-sediment u fl-ilma tal-pori tas-sediment għandhom ikunu determinati fil-bidu tat-test u fit-tmiem tat-test, tal-inqas fl-ogħla konċentrazzjoni tat-test, sakemm is-sustanzi kimiċi tat-test huma magħrufa li jkunu stabbli fl-ilma (> 80 % tan-nominali). Il-kejl fis-sediment u fl-ilma tal-pori jista' ma jkunx meħtieġ jekk il-partizzjoni tas-sustanza kimika tat-test bejn l-ilma u s-sediment ġiet determinata b'mod ċar fi studju tal-ilma/sediment taħt kundizzjonijiet kumparabbli (eż. proporzjon tas-sediment ma' ilma, metodu tal-applikazzjoni, tip tas-sediment).
                              
                           
                              
                                 72.
                              
                              
                                 It-teħid ta' kampjuni tas-sediment fil-bidu tat-test huwa probabbli li jfixkel is-sistema tat-test. Għalhekk, reċipjenti tat-test trattati addizzjonali jistgħu jkunu meħtieġa biex jiffaċilitaw determinazzjonijiet analitiċi fil-bidu tat-test u fit-tmiem tat-test. Bl-istess mod, fejn evalwazzjonijiet intermedji huma neċessarji, jiġifieri fil-ġurnata 7 u l-analiżijiet jeħtieġu kampjuni kbar tas-sediment li ma jistgħux jitneħħew b'mod faċli mis-sistema tat-test, determinazzjonijiet analitiċi għandhom jitwettqu bl-użu ta' reċipjenti tat-test addizzjonali trattati bl-istess mod bħal dawk użati għall-evalwazzjonijiet bijoloġiċi.
                              
                           
                              
                                 73.
                              
                              
                                 Ċentrifugazzjoni, pereżempju, ta' 10 000 g u 4 °C għal 30 minuta hija rakkomandata biex tiżola l-ilma interstizjali. Madankollu, jekk is-sustanza kimika tat-test tintwera li ma tassorbix il-filtri, il-filtrazzjoni tista' tkun aċċettabbli wkoll. F'ċertu każijiet, jista' ma jkunx possibbli li tanalizza konċentrazzjonijiet fl-ilma tal-pori jekk id-daqs tal-kampjun huwa żgħir wisq.
                              
                           
                              
                                 74.
                              
                              
                                 F'testijiet semistatiċi (jiġifieri esponiment permezz tal-fażi tal-ilma) fejn il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika (sustanzi kimiċi) tat-test mhix mistennija li tibqa' fi ħdan l-20 % tal-konċentrazzjoni nominali tul id-durata tat-test mingħajr it-tiġdid tas-soluzzjonijiet tat-test, soluzzjonijiet tat-test użati u ppreparati friski għandhom jittieħdu kampjuni minnhom għall-analiżijiet tal-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test f'kull tiġdid.
                              
                           
                              
                                 75.
                              
                              
                                 F'każijiet fejn il-konċentrazzjoni inizjali mkejla tas-sustanza kimika tat-test mhix fi ħdan l- 20 % tan-nominali iżda fejn tista' tiġi pprovduta evidenza suffiċjenti biex turi li l-konċentrazzjonijiet inizjali huma ripetibbli u stabbli (jiġifieri fi ħdan il-medda ta' 80-120 % tal-konċentrazzjoni inizjali), id-determinazzjonijiet kimiċi jistgħu jitwettqu biss fuq l-ogħla u l-inqas konċentrazzjonijiet tat-test.
                              
                           
                              
                                 76.
                              
                              
                                 Fil-każijiet kollha, id-determinazzjoni tal-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test għandhom bżonn jitwettqu biss fuq reċipjent replikat f'kull konċentrazzjoni tat-test. Inkella, is-soluzzjonijiet tat-test tar-repliki għal kull konċentrazzjoni jistgħu jinġabru flimkien għall-analiżijiet.
                              
                           
                              
                                 77.
                              
                              
                                 Jekk hemm evidenza li l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test ġiet miżmuma fi ħdan l-20 % tal-konċentrazzjoni inizjali nominali jew imkejla matul it-test, b'hekk l-analiżi tar-riżultati u d-derivazzjoni sussegwenti tal-punti tat-tmiem tista' tkun ibbażata fuq valuri inizjali nominali jew imkejla.
                              
                           
                              
                                 78.
                              
                              
                                 F'dawn il-każijiet, konċentrazzjonijiet tal-effett għandhom ikunu bbażati fuq konċentrazzjonijiet tal-ilma nominali jew imkejla fil-bidu tat-test.
                              
                           
                              
                                 79.
                              
                              
                                 Madankollu, jekk hemm evidenza li l-konċentrazzjoni naqset (jiġifieri mhix miżmuma fi ħdan l-20 % tal-konċentrazzjoni nominali jew imkejla inizjali fil-kompartiment trattat) matul it-test, b'hekk l-analiżi tar-riżultati għandha tkun ibbażata fuq il-konċentrazzjoni medja ġeometrika waqt l-esponiment jew mudelli li jiddeskrivu t-tnaqqis tal-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test fil-kompartiment trattat (11).
                              
                           EVALWAZZJONI TAD-DEJTA
                     
                              
                                 80.
                              
                              
                                 F'każijiet fejn l-użu ta' solvent/aġent ta' dispersjoni huwa meħtieġ, id-dejta minn solvent u minn kontrolli mhux trattati tista' tinġabar flimkien għall-finijiet tal-analiżijiet statistiċi sakemm ir-risponsi tas-solvent u tal-kontrolli mhux trattati ma jkunux ferm differenti.
                              
                           
                        Varjabbli ta' rispons
                     
                     
                              
                                 81.
                              
                              
                                 L-għan tat-test huwa li jiddetermina l-effetti tas-sustanza kimika tat-test fuq it-tkabbir veġetattiv tal-ispeċi tat-test, bl-użu ta' żewġ varjabbli tar-rispons, rata tat-tkabbir speċifika medja u rendiment, kif ġej:
                              
                           
                        Rata ta' tkabbir speċifika medja
                     
                     
                              
                                 82.
                              
                              
                                 Dan il-varjabbli tar-rispons huwa bbażat fuq bidliet fil-logarittmi tat-tul tar-rimja totali, piż tar-rimja friska totali u piż tar-rimja niexfa totali, matul iż-żmien fil-kontroli u f'kull grupp tat-trattament. Dan il-varjabbli huwa kkalkulat għal kull replika ta' kull grupp tal-kontroll u tat-trattament. It-tul u l-piż medju tat-tliet pjanti għal kull reċipjent tat-test (replikat) u, sussegwentement, ir-rata tat-tkabbir għal kull replikat, għandhom jiġu kkalkulati bl-użu tal-formula li ġejja:
                                 
                                    
                                 fejn:
                                 
                                             μi-j
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             rata ta' tkabbir speċifika medja mill-ħin i sa j
                                          
                                       
                                             Ni
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             varjabbli ta' kejl fil-kontenitur tat-test jew kontroll f'ħin i
                                          
                                       
                                             Nj
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             varjabbli ta' kejl fil-kontenitur tat-test jew kontroll f'ħin j
                                          
                                       
                                             t
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             perjodu ta' ħin minn i sa j
                                          
                                       
                           
                              
                                 83.
                              
                              
                                 Mir-risposti tar-replikat, valur medju għar-rata tat-tkabbir flimkien mal-istimi tal-varjanza għandhom jiġu kkalkulati għal kull grupp tat-trattament u tal-kontroll.
                              
                           
                              
                                 84.
                              
                              
                                 Ir-rata ta' tkabbir speċifika medja għandha tiġi kkalkolata għall-perjodu ta' ttestjar kollu (il-ħin “i” fil-formola ta' hawn fuq huwa l-bidu tat-test u l-ħin “j” huwa t-tmiem tat-test). Għal kull konċentrazzjoni tat-test u ta' kontroll, ikkalkola valur medju għar-rata ta' tkabbir speċifika medja flimkien mal-istimi tal-varjanza.
                              
                           
                              
                                 85.
                              
                              
                                 Perċentwal ta' inibizzjoni tar-rata ta' tkabbir (Ir) jista' jiġi kkalkulat fuq kull konċentrazzjoni tat-test (grupp ta' trattament) bil-formula li ġejja:
                                 
                                    
                                 fejn:
                                 
                                             % Ir
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             perċentwal ta' inibizzjoni f'rata medja ta' tkabbir speċifiku
                                          
                                       
                                             μC
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             valur medju għal μin fil-kontroll
                                          
                                       
                                             μT
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             valur medju għal μin fil-grupp tat-trattament
                                          
                                       
                           
                        Rendiment
                     
                     
                              
                                 86.
                              
                              
                                 Dan il-varjabbli tar-rispons huwa bbażat fuq bidliet fit-tul tar-rimja totali, piż tar-rimja friska totali u piż tar-rimja niexfa totali, matul iż-żmien fil-kontroli u f'kull grupp tat-trattament. Il-perċentwal medju fir-rendiment ( % Iy) jista' jiġi kkalkulat għal kull grupp tat-trattament kif ġej:
                                 
                                    
                                 fejn:
                                 
                                             % Iy
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             tnaqqis perċentwali fir-rendiment
                                          
                                       
                                             bC
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             bijomassa finali li minnha titnaqqas il-bijomassa tal-bidu għall-grupp ta' kontroll
                                          
                                       
                                             bT
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             bijomassa finali li minnha titnaqqas il-bijomassa tal-bidu fil-grupp ta' trattament
                                          
                                       
                           
                        Ipplottjar tal-kurvi konċentrazzjoni-rispons
                     
                     
                              
                                 87.
                              
                              
                                 Il-kurvi tal-konċentrazzjoni-rispons li għandhom x'jaqsmu mal-inibizzjoni tal-varjabbli tar-rispons (Ir jew Iy) ikkalkulat kif jidher hawn fuq u l-konċentrazzjoni tal-log tas-sustanza kimika tat-test għandhom jiġu pplottjati.
                              
                           
                        Stimi tal-ECx
                        
                     
                     
                              
                                 88.
                              
                              
                                 Stimi tal-ECx (eż. EC50) għandhom ikunu bbażati kemm fuq ir-rata speċifika tat-tkabbir medja (ErCx) kif ukoll ir-rendiment (EyCx), li kull wieħed minnhom għandu mbagħad ikun ibbażat fuq il-piż tar-rimja friska totali, il-piż tar-rimja niexfa totali u t-tul tar-rimja totali.
                              
                           
                              
                                 89.
                              
                              
                                 Għandu jiġi nnotat li l-valuri ECx ikkalkulati bl-użu ta' dawn il-varjabbli tar-rispons mhumiex komparabbli u din id-differenza hija rikonoxxuta meta jintużaw ir-riżultati tat-test. Valuri ECx ibbażati fuq ir-rata tat-tkabbir speċifika medja (ErCx) fil-maġġoranza tal-każi se jkunu ogħla minn riżultati bbażati fuq ir-rendiment (EyCx) — jekk il-kundizzjonijiet tat-test ta' dan il-metodu ta' ttestjar huma osservati — minħabba l-bażi matematika tal-approċċi rispettivi. Din id-differenza m'għandhiex tkun interpretata bħala differenza fis-sensittività bejn iż-żewġ varjabbli tar-rispons, iżda sempliċiment li l-valuri huma differenti matematikament.
                              
                           
                        Proċeduri ta' statistika
                     
                     
                              
                                 90.
                              
                              
                                 L-għan huwa li tinkiseb relazzjoni bejn il-konċentrazzjoni u r-rispons b'analiżi tar-rigressjoni. Huwa possibbli li tintuża rigressjoni lineari ponderata wara li tkun twettqet trasformazzjoni linearizzanti tad-data dwar ir-rispons — eż. f'unitajiet probit jew logit jew Weibull (13), iżda proċeduri ta' rigressjoni mhux lineari huma tekniki ppreferuti li jimmaniġġjaw aħjar irregolaritajiet inevitabbli fid-dejta u devjazzjonijiet minn distribuzzjonijiet uniformi. Meta jkunu viċin iż-żero jew inibizzjoni totali, tali irregolaritajiet jistgħu jitkabbru bit-trasformazzjoni, u dan jinterferixxi mal-analiżi (13). Għandu jiġi nnotat li l-metodi standard tal-analiżi li jużaw it-trasformazzjonijiet probit, logit jew Weibull huma maħsuba għall-użu fuq id-data kwantali (eż. mortalità jew sopravivenza), u għandhom jiġu modifikati biex jakkomodaw ir-rata tat-tkabbir jew irendu d-dejta. Proċeduri speċifiċi għad-determinazzjoni tal-valuri ECx minn dejta kontinwa jistgħu jinsabu f'(14) (15) (16).
                              
                           
                              
                                 91.
                              
                              
                                 Għal kull varjabbli ta' rispons li jiġi analizzat, għandha tintuża r-relazzjoni konċentrazzjoni-rispons biex jiġu kkalkulati l-estimi ta' punti ta' valuri ECx. Il-limiti tal-kunfidenza ta' 95 % għal kull stima huma determinati u l-adegwatezza tad-dejta tar-rispons u l-mudell tar-rigressjoni għandhom jiġu evalwati jew grafikament jew statistikament. L-analiżi tar-rigressjoni għandha ssir permezz ta' risponsi tar-repliki individwali, mhux il-medji tal-grupp ta' trattament.
                              
                           
                              
                                 92.
                              
                              
                                 Stimi EC50 u limiti ta' kunfidenza jistgħu wkoll jiġi miksuba bl-użu ta' interpolazzjoni lineari b'sekwenza ta' istruzzjonijiet inizjali (18), jekk il-mudelli/metodi ta' regressjoni aċċessibli m'humiex xierqa għad-dejta.
                              
                           
                              
                                 93.
                              
                              
                                 Għal stima tal-LOEC u għalhekk tal-NOEC, huwa meħtieġ li jitqabblu l-medji ta' trattament permezz ta' analiżi tat-tekniki ta' varjanza (ANOVA). Il-medja għal kull konċentrazzjoni mbagħad titqabbel mal-medja tal-kontroll bl-użu ta' metodu ta' ttestjar xieraq (eż. testijiet ta' Dunnett, Williams) (19) (20) (21) (22). Huwa meħtieġ li jiġi evalwat jekk l-assunzjoni ANOVA tad-distribuzzjoni normali (ND) u tal-omoġeneità tal-varjanza (VH) tal-varjanza iżżommx. Din l-evalwazzjoni għandha titwettaq bl-użu ta' test Shapiro-Wilks (ND) jew test Levene (VH). In-nuqqas li tintħalaq l-assunzjoni ta' ND u l-omoġeneità tal-varjanzi tista' xi kultant tiġi korretta bit-trasformazzjoni logaritmika tad-dejta. Jekk l-eteroġeneità tal-varjanza u/jew tad-devjazzjoni minn ND hija estrema u ma tistax tiġi kkoreġuta bit-trasformazzjoni, l-analiżi b'metodi bħat-t-test Bonferroni-Welch, it-test step-down Jonkheere Terpstra u t-Test Bonferroni-Median għandhom jiġu kkunsidrati. F'(16) tista' tinstab gwida addizzjonali dwar id-determinazzjoni tal-NOEC.
                              
                           
                        IR-RAPPORTAR
                     
                     
                              
                                 94.
                              
                              
                                 Ir-rapport tat-test jinkludi dan li ġej:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Sustanza kimika tat-test
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Sustanza monokostitwenti:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     dehra fiżika, solubbiltà fl-ilma, u karatteristiċi fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, numru CAS, kodiċi SMILES jew InChi, formula strutturali, purità, identità kimika tal-impuritajiet bħala xierqa u prattikament fattibbli, eċċ.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Sustanza multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     karatterizzati kemm jista' jkun bl-identità kimika (ara hawn fuq), okkorrenza kwantitattiva u karatteristiċi fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Speċijiet tat-test
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         l-isem xjentifiku u s-sors.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Kundizzjonijiet tat-test
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         durata u kundizzjonijiet tal-fażi tal-istabbilment;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-proċedura tat-test użata (statika, semistatika, ppulsata);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         id-data tal-bidu tat-test u d-durata tiegħu.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-medium tat-test, jiġifieri s-sediment u l-medium tan-nutrijent likwidu;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         deskrizzjoni tad-disinn sperimentali: kompartiment/kamra tat-tkabbir jew laboratorju, reċipjenti tat-test u għotjien, volumi tas-soluzzjoni, tul u piż tal-pjanti tat-test għal kull reċipjent tat-test fil-bidu tat-test, proporzjon tal-wiċċ tas-sediment mal-wiċċ tal-ilma, proporzjon tal-volum tas-sediment u tal-ilma;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-konċentrazzjonijiet tat-test (nominali u mkejla kif xierqa) u n-numru ta' repliki għal kull konċentrazzjoni;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         metodi ta' preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ewlenin u tat-test inkluż l-użu ta' kwalunkwe solvent jew aġent dispersiv;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         it-temperatura matul it-test;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         sors tad-dawl, irradjanza (μE·m– 2 s– 1)
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         valuri pH tat-test u midja tal-kontroll kif ukoll id-dehra tal-midja tat-test fil-bidu u fit-tmiem tat-test;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         konċentrazzjonijiet tal-ossiġenu;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-metodu tal-analiżi bid-dejta tal-valutazzjoni ta' kwalità xierqa (studji tal-validazzjoni, devjazzjonijiet standard jew limiti tal-kunfidenza ta' analiżijiet);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         metodi għad-determinazzjoni tal-varjabbli tal-kejl, eż., tul, piż niexef, piż frisk;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         id-devjazzjonijiet kollha minn dan il-metodu ta' ttestjar.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Riżultati
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         dejta mhux ipproċessata: tul tar-rimja u piż tar-rimja ta' pjanti/qasira u varjabbli tal-kejl oħra f'kull reċipjent tat-test u tal-kontroll f'kull osservazzjoni u okkażjoni tal-analiżi skont l-iskeda tal-evalwazzjoni pprovduta fit-Tabella 1;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         medji u devjazzjonijiet standard għal kull varjabbli ta' kejl;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-kurvi tat-tkabbir għal kull konċentrazzjoni;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         l-irduppjar tal-ħin/rata tat-tkabbir fil-kontroll ibbażat fuq it-tul tar-rimja u l-piż frisk inkluż il-koeffiċjent tal-varjazzjoni għar-rendiment tal-piż frisk;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         il-varjabbli ta' rispons ikkalkolati għal kull replikat tat-trattament, bil-valuri medji u l-koeffiċjenti ta' varjazzjoni għar-repliki;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         rappreżentazzjoni grafika tar-relazzjoni bejn il-konċentrazzjoni u l-effett;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         stimi ta' punti ta' tmiem tossiċi għal varjabbli ta' rispons eż. EC50, u l-intervalli ta' kunfidenza assoċjati. Jekk ikunu kkalkolati, l-LOEC u/jew l-NOEC u l-metodi statistiċi użati għad-determinazzjoni tagħhom.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         jekk tintuża ANOVA, id-daqs tal-effett li jista' jiġi skopert (eż. id-differenza sinifikanti minima).
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kwalunkwe stimulazzjoni ta' tkabbir misjuba fi kwalunkwe trattament.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kwalunkwe sinjal viżiva tal-fitotossiċità kif ukoll l-osservazzjonijiet tas-soluzzjonijiet tat-test.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         diskussjoni tar-riżultati, inkluż kwalunkwe influwenza fuq l-eżitu tat-test li tirriżulta mid-devjazzjonijiet minn dan il-metodu ta' ttestjar.
                                                      
                                                   
                                       
                           TAGĦRIF
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu C.26 ta' dan l-Anness: Lemna sp. Test tal-Inibizzjoni mit-Tkabbir,.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu C.3 ta' dan l-Anness: Alga tal-Ilma Ħelu u Ċjanobatterji, Test tal-Inibizzjoni tat-Tkabbir.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Maltby, L. et al. (2010), Aquatic Macrophyte Risk Assessment for Pesticides, Guidance from the AMRAP Workshop in Wageningen (NL), 14-16 January 2008.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Arts, G.H.P. et al. (2008), Sensitivity of submersed freshwater macrophytes and endpoints in laboratory toxicity tests, Environmental Pollution, Vol. 153, pp. 199-206.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 ISO 16191:2013 Water quality — Determination of the toxic effect of sediment on the growth behaviour of Myriophyllum aquaticum.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Knauer, K. et al. (2006), Methods for assessing the toxicity of herbicides to submersed aquatic plants, Pest Management Science, Vol. 62/8, pp. 715-722.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu C.50 ta' dan l-Anness: Sediment-free Myriophyllum spicatum Toxicity Test.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Il-Kapitolu C.28 ta' dan l-Anness: Sediment-Water Chironomid Toxicity Using Spiked Water.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Ratte, M., H. Ratte (2014), “Myriophyllum Toxicity Test: Result of a ring test using M. aquaticum and M. spicatum grown in a water-sediment system” OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 206, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Davies, J. et al. (2003), Herbicide risk assessment for non-target aquatic plants: sulfosulfuron — a case study, Pest Management Science, Vol. 59/2, pp. 231 — 237.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 OECD (2000), “Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures” OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 23, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Smart, R.M., J.W. Barko (1985), Laboratory culture of submersed freshwater macrophytes on natural sediments, Aquatic Botany, Vol. 21/3, pp. 251-263.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Christensen, E.R., N. Nyholm (1984), Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves, Environmental Science Technology, Vol. 18/9, pp. 713-718.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Nyholm, N. et al. (1992), Statistical treatment of data from microbial toxicity tests, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 11/2, pp. 157-167.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Bruce, R.D., D.J. Versteeg (1992), A statistical procedure for modelling continuous toxicity data, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 11/10, 1485-1494.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 OECD (2006), “Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application” OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 54, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Brain, P., R. Cousens (1989), An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses, Weed Research, Vol. 29/2, pp/ 93-96.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Norberg-King, T.J. (1988), An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach, National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Dunnett, C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of the American Statistical Association, Vol. 50/272, pp. 1096-1121.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Dunnett, C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics, Vol. 20/3, pp. 482-491.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Williams, D.A. (1971), A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics, Vol. 27/1, pp. 103-117.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Williams, D.A. (1972), The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics, Vol. 28/2, pp. 519-531.
                              
                           
                        Appendiċi 1
                        
                           KOMPOŻIZZJONI TAL-MEDIUM SMART U BARKO
                        
                        
                                    Komponent
                                 
                                 
                                    L-ammont ta' reaġent miżjud mal-ilma (*12) (mg/l)
                                 
                              
                                    CaCl2 · 2 H2O
                                 
                                 
                                    91,7
                                 
                              
                                    MgSO4 · 7 H2O
                                 
                                 
                                    69,0
                                 
                              
                                    NaHCO3
                                    
                                 
                                 
                                    58,4
                                 
                              
                                    KHCO3
                                    
                                 
                                 
                                    15,4
                                 
                              
                                    pH (ekwilibriju fl-arja)
                                 
                                 
                                    7,9
                                 
                              
                     
                        Appendiċi 2
                        DEFINIZZJONIJIET
                        
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Bijomassa hija l-piż frisk u/jew niexef ta' materja ħajja preżenti f'popolazzjoni. F'dan it-test il-bijomassa hija s-somma tar-rimja prinċipali, tal-fergħat laterali kollha u tal-għeruq kollha.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Sustanza kimika hija sustanza jew taħlita.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Klorożi hija l-bidla tal-kulur minn aħdar għal sfurija tal-organiżmu tat-test speċjalment tas-sepali.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       ECx
                                        huwa l-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test maħlula fil-medium tat-test li jirriżulta fi tnaqqis ta' x % (eż. 50 %) fit-tkabbir tal- Myriophyllum spicatum f'perjodu ta' esponiment ddikjarat (li għandu jissemma espliċitament jekk ivarja mid-durata tat-test sħiħ jew normali). Biex tindika mingħajr ambigwità valur EC li jiġi derivat minn rata tat-tkabbir, is-simbolu “ErC” jintuża għar-rata tat-tkabbir u “EyC” jintuża għar-rendiment, segwit mill-varjabbli tal-kejl użat, eż. ErC (tul tar-rimja prinċipali).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    It-tkabbir huwa żieda fil-varjabbli tal-kejl, eż. tul tar-rimja prinċipali, l-ammont tal-fergħat laterali totali, it-tul tar-rimja totali, it-tul tal-għeruq totali, il-piż frisk, il-piż niexef jew in-numru ta' sepali matul il-perjodu tat-test.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Ir-rata tat-tkabbir (rata ta' tkabbir speċifika medja) hija ż-żieda logaritmika fil-varjabbli tal-kejl waqt il-perjodu tal-esponiment. Nota: Il-varjabbli tar-rispons relatati mar-rata tat-tkabbir huma indipendenti mid-durata tat-test sakemm il-mudell tat-tkabbir ta' organiżmi tal-kontroll mhux esposti huwa esponenzjali.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-Konċentrazzjoni bl-Inqas Effett Osservat (LOEC) hija l-inqas konċentrazzjoni ttestjata li fiha s-sustanza kimika hija osservata li jkollha effett ta' tnaqqis statistikament sinifikanti fuq it-tkabbir (b'p < 0,05) meta mqabbla mal-kontroll, f'ħin ta' esponiment partikolari. Madankollu, il-konċentrazzjonijiet tat-test kollha ogħla mil-LOEC għandu jkollhom effett ta' ħsara ugwali jew ogħla minn dawk osservati fil-LOEC. Meta dawn iż-żewġ kundizzjonijiet ma jistgħux jiġu ssodisfati, għandha tingħata spjegazzjoni dettaljata għal kif il-LOEC (u b'hekk in-NOEC) intgħażlet.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Varjabbli tal-kejl huma kwalunkwe tip ta' varjabbli li huma mkejla biex jesprimu l-punt tat-tmiem tat-test bl-użu ta' wieħed jew aktar varjabbli tar-rispons differenti. F'dan il-metodu ta' ttestjar it-tul tar-rimja prinċipali, it-tul tal-fergħat laterali totali; it-tul tar-rimja prinċipali, it-tul tal-għeruq totali, il-piż frisk, il-piż xott u n-numru ta' sepali huma varjabbli tal-kejl.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Monokultura hija kultura bi speċi ta' pjanta waħda.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Nekrożi huwa tessut mejjet (jiġifieri abjad jew kannella skur) tal-organiżmu tat-test.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Il-Konċentrazzjoni Bla Effett Osservat (NOEC) hija l-konċentrazzjoni tat-test eżattament taħt l-LOEC.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Varjabbli tar-rispons huwa varjabbli għall-istima tat-tossiċità derivata minn kwalunkwe varjabbli mkejjel li jiddeskrivi l-bijomassa b'metodi differenti tal-kalkolu. Għal dan il-metodu ta' ttestjar, ir-rata tat-tkabbir u r-rendiment huma varjabbli tar-rispons derivati minn varjabbli tal-kejl bħat-tul tar-rimja prinċipali, tul tar-rimja totali, piż frisk, piż niexef jew numru ta' sepali.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Test semistatiku (tiġdid) huwa test fejn is-soluzzjoni tat-test tiġi sostitwita perjodikament f'intervalli speċifiċi matul it-test.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Test statiku huwa metodu ta' ttestjar mingħajr tiġdid tas-soluzzjoni tat-test matul it-test.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Sustanza kimika tat-test hija kwalunkwe sustanza jew taħlita li tiġi ttestjata billi jintuża dan il-metodu ta' ttestjar
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Punt ta' tmiem tat-test jiddeskrivi l-fattur ġenerali li jinbidel b'mod relattiv għall-kontroll mis-sustanza kimika tat-test bħala mira tat-test. F'dan il-metodu ta' ttestjar, il-punt ta' tmiem tal-ittestjar hija l-inibizzjoni li tista' tiġi espressa b'varjabbli ta' rispons differenti li huma bbażati fuq varjabbli ta' kejl wieħed jew iktar.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Medium tat-test huwa medium ta' tkabbir sintetiku komplut li fuqu jikbru l-pjanti tal-ittestjar meta esposti għas-sustanza kimika tat-test. Is-sustanza kimika tat-test tinħall fil-medium tat-test.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       UVCB hija sustanza ta' kompożizzjoni mhux magħrufa jew varjabbli, prodott ta' reazzjoni kumplessa jew materjal bijoloġiku
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Rendiment huwa l-valur ta' varjabbli ta' kejl biex tiġi espressa l-bijomassa fi tmiem il-perjodu ta' esponiment li minnu jitnaqqas il-varjabbli ta' kejl fil-bidu tal-perjodu ta' esponiment. Nota: Meta l-mudell tat-tkabbir ta' organiżmi mhux esposti huwa esponenzjali, il-varjabbli tar-rispons ibbażati fuq ir-rendiment se jonqsu matul id-durata tat-test.
                                 
                              ”
               
            (1)  Ma hemm l-ebda valur disponibbli għal 20 °C, iżda jista' jiġi supponut li l-varjabbiltà tar-riżultati tal-kejl hija ikbar mid-dipendenza tat-temperatura mistennija
         
            (2)  Ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-18 ta' Diċembru 2006 dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH), li jistabbilixxi Aġenzija Ewropea għas-Sustanzi Kimiċi, li jemenda d-Direttiva 1999/45/KE u li jħassar ir-Regolament (KEE) Nru 793/93 tal-Kunsill u r-Regolament (KE) Nru 1488/94 tal-Kummissjoni kif ukoll id-Direttiva 76/769/KEE tal-Kunsill u d-Direttivi 91/155/KEE, 93/67/KEE, 93/105/KE u 2000/21/KE tal-Kummissjoni. ĠU L 304, 22.11.2007, p. 1
         
         
            (3)  The US Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods
         
            (*1)  l-parti tal-opaċità tal-kornea trid tiġi osservata
         
            (4)  Għall-użu ta' strateġija ta' ttestjar integrat għall-irritazzjoni tal-għajnejn skont ir-REACH, ara wkoll l-ECHA Guidance on information requirements and chemical safety assessment, Kapitolu R.7a: Endpoint specific guidance http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf
         
            (5)  L-esperti tal-istatistika li jieħdu approċċ għall-immudellar bħal dak li juża Mudelli Lineari Ġenerali (GLMs) jistgħu jagħmlu l-analiżi b'mod differenti iżda paragunabbli iżda mhux bilfors iħaddmu t-tabella anova tradizzjonali, li tmur lura għal approċċi algoritmiċi tal-kalkolu tal-istatistiki żviluppati qabel il-miġja tal-kompjuters.
         
            (6)  L-esperti tal-istatistika li jieħdu approċċ għall-immudellar bħal dak li juża Mudelli Lineari Ġenerali (GLMs) jistgħu jagħmlu l-analiżi b'mod differenti iżda paragunabbli iżda mhux bilfors iħaddmu t-tabella ANOVA tradizzjonali, li tmur lura għal approċċi algoritmiċi tal-kalkolu tal-istatistiki żviluppati qabel il-miġja tal-kompjuters.
         
            (7)  Regolament (KE) Nru 1272/2008 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tas-16 ta' Diċembru 2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballaġġ tas-sustanzi u t-taħlitiet, li jemenda u jħassar id-Direttivi 67/548/KEE u 1999/45/KE, u li jemenda r-Regolament (KE) Nru 1907/2006, ĠU L 353, 31.12.2008, p. 1
         
         
            (8)  Klassijiet tas-sustanzzi kimiċi ġew assenjati lil kull sustanza kimika tat-test li tuża skema ta' klassifikazzjoni standard, fuq il-bażi tas-sistema ta' klassifikazzjoni tal-Librerija Nazzjonali tal-Intestaturi tas-Suġġetti Mediċi tal-Mediċina (MeSH) (disponibbli fuq http//www.nlm.nih.gov/mesh).
         
            (9)  Fuq il-bażi tar-riżultati mit-test in vivo fuq għajnejn il-fniek (OECDTG 405) (17) u bl-użu tal-GHS tan-NU (4).
         
            (10)  Klassifikazzjoni bħala 2A jew 2B tiddependi mill-interpretazzjoni tal-kriterju tal-GHS tan-NU għad-distinzjoni bejn dawn iż-żewġ kategoriji, jiġifieri 1 minn 3 vs. 2 minn 3 annimali b'effetti fil-jum 7 neċessarji sabiex tiġi ġġenerata klassifikazzjoni tal-Kategorija 2A. L-istudju in vivo kien jinkludi 3 annimali. Il-punti ta' tmiem kollha apparati l-ħmura konġuntivali f'annimal wieħed irkupraw għal punteġġ ta' żero sal-jum 7 jew qabel. L-annimal li ma rkuprax għalkollox sal-jum 7 kellu punteġġ ta' ħmura konġuntivali ta' 1 (fil-jum 7) li rkupra għalkollox fil-jum 10.
         
            (11)  Id-dimensjonijiet ipprovduti huma bbażati fuq apparat fejn titqiegħed il-kornea li jintuża għal baqar ta' età li tvarja minn 12-il xahar sa 60 xahar. Fl-eventwalità li jintużaw annimali ta' età minn 6 xhur sa 12-il xahar, l-apparat minflok ikollu jiġi ddisinjat b'tali mod li kull kavità tesa' volum ta' 4 mLl, u kull waħda mill-kavitajiet interni tkun ta' dijametru ta' 1,5 cm u fond ta' 2,2 cm. Fi kwalunkwe apparat iddisinjat ġdid fejn titqiegħed il-kornea, huwa importanti ħafna li l-proporzjon tal-erja tas-superfiċje tal-kornea esposta mal-volum tal-kavità posterjuri ikun daqs il-proporzjon fl-apparat tradizzjonali. Dan huwa meħtieġ sabiex jiġi żgurat li l-valuri tal-permeabilità jiġu ddeterminati b'mod korrett għall-kalkolu tal-IVIS permezz tal-formula proposta
         
            (12)  Regolament (KE) Nru 1272/2008 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tas-16 ta' Diċembru 2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballaġġ tas-sustanzi u t-taħlitiet, li jemenda u jħassar id-Direttivi 67/548/KEE u 1999/45/KE, u li jemenda r-Regolament (KE) Nru 1907/2006, ĠU L 353, 31.12.2008, p. 1
         
         
            (*2)  L-ogħla punteġġ medju osservat fi kwalunkwe punt tal-ħin
         
            (*3)  Il-punteġġ medju massimu osservat fi kwalunkwe punt tal-ħin (fuq il-bażi ta' punteġġi tal-opaċità kif definiti fit-Tabella 1).
         
            (*4)  Fuq il-bażi tal-punteġġi kif definiti fit-Tabella 2.
         
            (*5)  Taħlitiet inqas probabbli li jseħħu.
         
            (13)  Klassijiet tas-sustanzi kimiċi ġew assenjati lil kull sustanza kimika tat-test li tuża skema ta' klassifikazzjoni standard, fuq il-bażi tas-sistema ta' klassifikazzjoni tal-Librerija Nazzjonali tal-Intestaturi tas-Suġġetti Mediċi tal-Mediċina (MeSH) (disponibbli fuq http//www.nlm.nih.gov/mesh)
         
            (14)  Abbażi tar-riżultati mit-test in vivo fuq għajnejn il-fniek (OECD TG 405) u bl-użu tal-GHS tan-NU (4)(6).
         
            (15)  Abbażi tar-riżultati fl-ICE kif deskritti fit-tabella 6.
         
            (16)  Taħlita tal-punteġġi tal-ICE għajr dawk deskritti fit-tabella 6 għall-identifikazzjoni ta' ebda kategorija tal-GHS u l-Kategorija 1 tal-GHS (ara t-tabella 6)
         
            (17)  Klassifikazzjoni bħala 2A jew 2B tiddependi mill-interpretazzjoni tal-kriterju tal-GHS tan-NU għad-distinzjoni bejn dawn iż-żewġ kategoriji, jiġifieri 1 minn 3 vs 2 minn 3 annimali b'effetti fil-jum 7 neċessarji sabiex tiġi ġġenerata klassifikazzjoni tal-Kategorija 2A. L-istudju in vivo kien jinkludi 3 annimali. Il-punti ta' tmiem kollha apparati l-ħmura konġuntivali f'annimal wieħed irkupraw għal punteġġ ta' żero sal-jum 7 jew qabel. L-annimal li ma rkuprax għalkollox sal-jum 7 kellu punteġġ ta' ħmura konġuntivali ta' 1 (fil-jum 7) li rkupra għalkollox fil-jum 10.
         
            (18)  Regolament (KE) Nru 1272/2008 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tas-16 ta' Diċembru 2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballaġġ tas-sustanzi u t-taħlitiet, li jemenda u jħassar id-Direttivi 67/548/KEE u 1999/45/KE, u li jemenda r-Regolament (KE) Nru 1907/2006, ĠU L 353, 31.12.2008, p. 1
         
         
            (19)  Medja tfisser medja aritmetika fid-dokument kollu.
         
            (20)  In-numri jirreferu għal valuri limitu ġġenerati statistikament u ma għandhomx x'jaqsmu mal-preċiżjoni tal-kejl.
         
            (21)  Tbassir tad-DPRA għandu jitqies fil-kuntest ta' IATA u skont id-dispożizzjonijiet tal-paragrafi 9 u 12.
         
            (22)  In-numri jirreferu għal valuri limitu ġġenerati statistikament u ma għandhomx x'jaqsmu mal-preċiżjoni tal-kejl.
         
            (23)  Tbassir tad-DPRA għandu jitqies fil-kuntest ta' IATA u skont id-dispożizzjonijiet tal-paragrafi 9 u 12.
         
            (24)  It-tbassiriet tal-periklu (u tal-potenza) in vivo huma bbażati fuq dejta tal-LLNA (19). Il-potenza in vivo tinkiseb bl-użu tal-kriterji proposti mill-ECETOC (23).
         
            (25)  Tbassir tad-DPRA għandu jitqies fil-kuntest ta' IATA u skont id-dispożizzjonijiet tal-paragrafi 9 u 11.
         
            (26)  Meded stabbiliti fuq il-bażi ta' tal-inqas 10 valuri tat-tnaqqis iġġenerati minn 6 laboratorji indipendenti.
         
            (27)  Regolament (KE) Nru 1272/2008 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tas-16 ta' Diċembru 2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballaġġ tas-sustanzi u t-taħlitiet, li jemenda u jħassar id-Direttivi 67/548/KEE u 1999/45/KE, u li jemenda r-Regolament (KE) Nru 1907/2006, ĠU L 353, 31.12.2008, p. 1
         
         
            (28)  It-tbassiriet tal-periklu (u tal-potenza) in vivo huma bbażati fuq dejta tal-LLNA (13). Il-potenza in vivo tinkiseb bl-użu tal-kriterji proposti mill-ECETOC (24).
         
            (29)  Tbassir ta' KeratinoSens™ għandu jitqies fil-kuntest ta' IATA u skont id-dispożizzjonijiet tal-paragrafi 9 u 11 ta' dan il-metodu ta' ttestjar.
         
            (30)  Fuq il-bażi tal-valuri storiċi osservati (12).
         
            (31)  Regolament (KE) Nru 1272/2008 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tas-16 ta' Diċembru 2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballaġġ tas-sustanzi u t-taħlitiet, li jemenda u jħassar id-Direttivi 67/548/KEE u 1999/45/KE, u li jemenda r-Regolament (KE) Nru 1907/2006, ĠU L 353, 31.12.2008, p. 1
         
         
            (32)  Klassijiet tas-sustanzi kimiċi ġew assenjati lil kull sustanza kimika tat-test li tuża skema ta' klassifikazzjoni standard, fuq il-bażi tas-sistema ta' klassifikazzjoni tal-Librerija Nazzjonali tal-Intestaturi tas-Suġġetti Mediċi tal-Mediċina (MeSH) (disponibbli fuq http//www.nlm.nih.gov/mesh)
         
            (33)  Abbażi tar-riżultati mit-test in vivo fuq għajnejn il-fniek (OECD TG 405, TM B.5) u bl-użu tal-GHS tan-NU u s-CLP tal-UE.
         
            (34)  Abbażi tar-riżultati miksubin bl-FL (Protokoll INVITTOX Nru 71)
         
            (35)  L-esperti tal-istatistika li jieħdu approċċ għall-immudellar bħal dak li juża Mudelli Lineari Ġenerali (GLMs) jistgħu jagħmlu l-analiżi b'mod differenti iżda paragunabbli iżda mhux bilfors iħaddmu t-tabella ANOVA tradizzjonali, li tmur lura għal approċċi algoritmiċi tal-kalkolu tal-istatistiki żviluppati qabel il-miġja tal-kompjuters.
         
            (36)  Ara l-Appendiċi 1 għal definizzjonijiet u unitajiet
         
            (37)  Kultant denotat b'P
            OW; determinat minn metodu tat-tħawwid tal-flask f'TM A.8 (4), metodu tal-HPLC f'TM A.24 (5) u metodu tat-tħawwid tal-flask f'TM A.23 (6). Kultant tintuża t-teknika tal-kolonna ġeneratur għad-determinazzjoni tal-log KOW. Hemm numru limitat ta' studji disponibbli li jużaw din it-teknika, primarjament għal dibenżodiossini u bifenili klorinati (eż. Li and Doucette, 1993) (3). Għal sustanzi li jistgħu jonizzaw, il-log KOW għandu jirreferi għall-forma mhux jonizzata.
         
            (38)  Ara l-Appendiċi 1 għal definizzjonijiet u unitajiet
         
            (39)  TLC: kromatografija fuq saff irqiq; HPLC: kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja; GC: kromatografija b'fażi gassuża
         
            (40)  F'ċerti oqfsa regolatorji, l-analiżi tal-metaboliti tista' tkun obbligatorja meta jkunu ssodisfati ċerti kundizzjonijiet (ara l-paragrafu 65).
         
            (41)  B'mod ġenerali, il-konċentrazzjonijiet imkejlin fl-ilma matul il-fażi ta' teħid għandhom ikunu tal-inqas f'ordni ta' kobor ikbar mil-limitu tal-kwantifkazzjoni sabiex ikunu jistgħu jitkejlu iktar minn nofs ħajja waħda tal-preżenza fil-ġisem fil-fażi ta' tisfija tal-istudju.
         
            (42)  Ara l-Appendiċi 1 għal definizzjonijiet u unitajiet
         
            (43)  Għal ħafna mis-sustanzi tat-test, idealment ma għandu jkun hemm ebda individwazzjoni fl-ilma tal-kontroll. Il-konċentrazzjonijiet ta' sfond għandhom ikun rilevanti biss għal materjali li jseħħu naturalment (eż. ċerti metalli) u sustanzi li ssibhom faċilment fl-ambjent.
         
            (44)  Jekk ikun ovvju li l-kinetika tal-ewwel ordni mhijiex segwita, għandhom jintużaw mudelli iktar kumplessi (ara referenzi fl-Appendiċi 5 u għandu jitfittex parir mingħand espert tal-bijostatistika.
         
            (45)  It-teħid jista' jkun limitat minn konċentrazzjonijiet tal-esponiment baxxi minħabba s-solubilità baxxa fl-ilma fit-test ta' bijokonċentrazzjoni, filwaqt li jistgħu jinkisbu konċentrazzjonijiet tal-esponiment ferm ogħla bit-test djetetiku.
         
            (46)  Għal sustanzi multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet, għandha tiġi kkunsidrata s-solubilità fl-ilma ta' kull komponent rilevanti sabiex jiġu stabbiliti l-konċentrazzjonijiet tal-esponiment xierqa.
         
            (47)  It-TOC jinkludi karbonju organiku minn partiċelli u karbonju organiku dissolt, jiġifieri TOC = POC + DOC.
         
            (48)  Għad li ġeneralment dan mhuwiex rakkomandat, jekk jintuża solvent jew aġent solubilizzanti, il-karbonju li joriġina minn dan l-aġent għandu jiżdied mal-karbonju organiku mis-sustanza tat-test sabiex tiġi evalwata l-konċentrazzjoni tal-karbonju organiku fir-reċipjenti tat-test.
         
            (49)  Jekk il-kontenut lipidu ma jiġix analizzat fl-istess ħut bħas-sustanza tat-test, il-ħut għandu tal-inqas ikun tal-istess piż u (jekk rilevanti) tal-istess sess.
         
            (50)  Din l-alternattiva hija valida biss jekk il-ħut fil-gruppi tat-test kollha jinżammu f'daqsijiet tal-grupp simili, il-ħut jitneħħa bl-istess mod u jintema' bl-istess mod. Dan jiżgura li t-tkabbir tal-ħut fil-gruppi kollha tat-test ikun simili, jekk il-konċentrazzjoni ttestjata tkun taħt il-medda tossika. Jekk it-tkabbir ikun simili, anki l-kontenut lipidu jkun mistenni li jibqa' simili. Tkabbir differenti fil-kontroll jindika effett tas-sustanza u jinvalida l-istudju.
         
            (51)  Minbarra l-piż, it-tul totali għandu jiġi rreġistrat għaliex il-paragun tal-firxa taż-żieda fit-tul matul it-test huwa indikatur tajjeb ta' jekk seħħx effett avvers.
         
            (52)  Jista' jsir test-t fuq il-kostanti tar-rata ta' tkabbir, sabiex jiġi ttestjat dwar jekk it-tkabbir ivarjax bejn il-grupp tal-kontroll u dak tat-test, jew test-F fil-każ ta' analiżi tal-varjanza. Jekk ikun hemm bżonn, jista' jintuża test tal-proporzjon ta' probabilità jew test-F sabiex jgħin fl-għażla tal-mudell tat-tkabbir xieraq (monograff 54 tal-OECD, (32).
         
            (53)  Dawn il-perċentwali jassumu li l-metodi analitiċi huma affidabbli u li n-nofs ħajja hija ta' < 14-il jum. Jekk il-metodi analitiċi jkunu inqas affidabbli jew in-nofs ħajja tiżdied (ħafna), dawn in-numru jsiru ikbar.
         
            (54)  
         
            CI: intervall ta' kunfidenza (fejn ikun possibbli li jiġi stmat)
         
            (55)  
         
            SD: Devjazzjoni standard (fejn ikun possibbli li tiġi stmata)
         
            (56)  Fil-fatt it-test minimizzat jista' jintuża sabiex jintwera metaboliżmu rapidu meta jkun magħruf li hemm probabilità ta' metaboliżmu rapidu.
         
            (57)  Meta jitkejlu żewġ punti ta' dejta biss, l-istimi tal-limiti ta' kunfidenza għall-BCFKm jistgħu jsiru bl-użu ta' metodi bootstrap. Meta jkun hemm anki punti ta' dejta intermedji disponibbli, il-limiti ta' kunfidenza għall-BCFKm jistgħu jiġu kkalkolati bħal fit-test sħiħ.
         
            (58)  Ara l-Appendiċi 1 għal definizzjonijiet u unitajiet
         
            (59)  Għall-fini tar-Regolament (KE) Nru 1907/2006 dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH) (ĠU L 396, 30.12.2006, p. 1), din il-kwistjoni hija indirizzata fil-“Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment”, kapitolu R.7c, R.7.10.3.1; R.7.10.4.1; u l-figura R7.10-2.
         
            (60)  Għal ħafna mis-sustanzi tat-test, idealment ma għandu jkun hemm ebda individwazzjoni fl-ilma tal-kontroll. Il-konċentrazzjonijiet ta' sfond għandhom ikun rilevanti biss għal materjali li jseħħu naturalment (eż. ċerti metalli) u sustanzi li ssibhom faċilment fl-ambjent.
         
            (61)  Peress li l-BMF huwa definit bħala l-proporzjon tal-konċentrazzjoni ta' sustanza f'organiżmu għal dik fl-ikel tal-organiżmu fi stat stazzjonarju, il-lipidu jiġi kkunsidrat billi ssir korrezzjoni għall-kontenuti ta' lipidu fl-organiżmu u fl-ikel, u b'hekk jiġi deskritt b'mod iktar preċiż bħala “korrezzjoni”. Dan l-approċċ ivarja min-“normalizzazzjoni” sabiex jiġi stabbilit kontenut lipidu ta' organiżmu kif isir fit-test tal-bijokonċentrazzjoni tal-esponiment milwiem.
         
            (62)  It-tul totali għandu jiġi rreġistrat ukoll matul it-test peress li huwa indikatur tajjeb ta' jekk seħħx effett avvers.
         
            (63)  HCB huwa elenkat fl-Annessi A u C għall-Konvenzjoni ta' Stokkolma, u fl-Annessi I u III tar-Regolament (KE) Nru 850/2004 dwar pollutanti organiċi persistenti (ĠU L 158, 30.4.2004, p. 7)
         
            (64)  Għat-tkabbir rapidu matul il-fażi ta' teħid, ir-rata tal-għalf vera sejra tonqos f'livell taħt dik stabbilita fil-bidu tal-esponiment.
         
            (65)  Fi studju tal-esponiment milwiem, nofs ħajja ta' 14-il jum tikkorrispondi għal BCF ta' madwar 10 000 L/kg bl-użu ta' ħut ta' 1 g b'rata ta' teħid korrispondenti ta' madwar 500 L/kg/jum (skont l-ekwazzjoni ta' Sijm et al (46)).
         
            (66)  Peress li l-konċentrazzjonijiet interni attwali jistgħu jiġu stabbiliti biss wara li jkun sar it-test, hemm bżonn ta' stima tal-konċentrazzjoni interna mistennija (eż. fuq il-bażi tal-BMF mistenni u l-konċentrazzjoni fl-ikel; ara l-Ekwazzjoni A5.8 fl-Appendiċi 5).
         
            (67)  Il-preżenza tas-sustanza tat-test fil-medium tat-test bħala riżultat tal-eskrezzjoni mill-ħut jew lixxivjazzjoni mill-ikel jaf ma tkunx tista' tiġi evitat għalkollox. Għalhekk, għażla minnhom hija li titkejjel il-konċentrazzjoni tas-sustanza fl-ilma u fi tmiem il-perjodu ta' teħid, speċjalment jekk jintuża ssettjar semistatiku, bħala għajnuna sabiex jiġi stabbilit jekk seħħx xi esponiment milwiem.
         
            (68)  Dan l-approċċ huwa speċifiku għall-istudju djetetiku, differenti mill-proċedura segwita fl-esponiment milwiem, u b'hekk intużat il-kelma “korrezzjoni” minflok “normalizzazzjoni” sabiex tiġi evitata konfużjoni — ara wkoll in-nota f'qiegħ il-paġna (106).
         
            (69)  Jista' jsir test-t fuq il-kostanti tar-rata ta' tkabbir, sabiex jiġi ttestjat dwar jekk it-tkabbir ivarjax bejn il-grupp tal-kontroll u dak tat-test, jew test-F fil-każ ta' analiżi tal-varjanza. Jekk ikun hemm bżonn, jista' jintuża test tal-proporzjon ta' probabilità jew test-F sabiex jgħin fl-għażla tal-mudell tat-tkabbir xieraq (monograff 54 tal-OECD, (32).
         
            (70)  Teknika ta' analiżi tal-oġġetti tal-ikel għall-kontenut ta' proteina, lipidu, fibra mhux raffinata u rmied; din l-informazzjoni normalment tkun disponibbli mingħand il-fornitur tal-għalf.
         
            (71)  
         
            CI: intervall ta' kunfidenza (fejn ikun possibbli li jiġi stmat)
         
            (72)  
         
            SD: Devjazzjoni standard (fejn ikun possibbli li tiġi stmata)
         
            (73)  Meyer et al. (1)
         
            (74)  Ta' min jgħid li fit-test innifsu, il-piż huwa ppreferut bħala l-kejl għad-derivazzjonijiet tad-daqs u tal-kostant tar-rata ta' tkabbir. Madankollu, huwa rikonoxxut li t-tul huwa kejl iktar prattiku jekk il-ħut irid jingħażel fuq l-għajnejn fil-bidu ta' esperiment (jiġifieri mill-popolazzjoni tal-istokk).
         
            (75)  Din il-medda ta' tul hija indikata fil-Metodi ta' Ttestjar għal Sustanzi Kimiċi Ġodda eċċ. fuq il-bażi tal-Liġi tal-Ġappun dwar il-Kontroll tas-Sustanzi Kimiċi (CSCL).
         
            (76)  Il-valuri fil-parentesi huma numri ta' kampjuni (ilma, ħut) li għandhom jittieħdu jekk isir iktar kampjunar.
         
            (77)  L-istima ta' qabel it-test tal-k
            2 għal log KOW ta' 4,0 hija ta' 0,652 jiem– 1. Id-durata totali tal-esperiment hija stabbilita għal 3 × t
            SS = 3 × 4,6 jiem, jiġifieri 14-il jum. Għall-istiam tat-t
            SS irreferi għall-Appendiċi 5.
         
            (78)  Teħid ta' kampjun tal-ilma wara li jiġu forniti tal-inqas 3 “volumi ta' kompartiment”.
         
            (79)  Jittieħed kampjun ta' dan il-ħut mill-popolazzjoni tal-istokk.
         
            (80)  Jekk ikun hemm bżonn ta' preċiżjoni ikbar jew studji dwar il-metaboliżmu li jeħtieġu iktar ħut, dawn għandhom jiġu kampjunati b'mod partikolari fi tmiem il-fażijiet ta' teħid u tisfija (ara l-paragrafu 40).
         
            (81)  Jista' jkun hemm bżonn ta' tal-inqas 3 ħutiet oħran għall-analiżi tal-kontenut lipidu jekk ma jkunx possibbli li jintuża l-istess ħut kampjunat għall-konċentrazzjonijiet tas-sustanza fil-bidu tat-test, tmiem il-fażi ta' teħid u tmiem il-fażi ta' tisfija. Kun af li f'ħafna każijiet għandu jkun possibbli li jintużaw 3 ħutiet tal-kontroll biss (ara l-paragrafu 56).
         
            (82)  3 kampjuni ta' għalf mill-gruppi tal-kontroll u tat-test analizzati għal konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test u għal kontenut lipidu.
         
            (83)  Jittieħed kampjun tal-ħut mill-popolazzjoni tal-istokk fl-iktar żmien qrib l-istudju possibbli; għandu jittieħed kampjun ta' tal-inqas 3 ħutiet mill-popolazzjoni tal-istokk fil-bidu tat-test għall-kontenut lipidu.
         
            (84)  Kampjunar (mhux obbligatorju) bikri fil-fażi ta' teħid jipprovdi dejta sabiex tiġi kkalkolata l-assimilazzjoni djetetika tas-sustanza tat-test li tista' titqabbel mal-effiċjenza tal-assimilazzjoni kkalkolata mid-dejta tal-fażi ta' tisfija.
         
            (85)  Jista' jittieħed kampjun ta' 5 ħutiet oħrajn għal analiżi speċifika għat-tessut.
         
            (86)  Jista' jkun hemm bżonn ta' tal-inqas 3 ħutiet oħran għall-analiżi tal-kontenut lipidu jekk ma jkunx possibbli li jintuża l-istess ħut kampjunat għall-konċentrazzjonijiet tas-sustanza fil-bidu tat-test, tmiem il-fażi ta' teħid u tmiem il-fażi ta' tisfija. Kun af li f'ħafna każijiet għandu jkun possibbli li jintużaw 3 ħutiet tal-kontroll biss (ara l-paragrafi 56 u 153).
         
            (87)  Bħal b'kull relazzjoni empirika, għandu jiġi verifikat li s-sustanza tat-test taqa' fi ħdan id-dominju ta' applikabilità tar-relazzjoni
         
            (88)  Il-piż tal-ħut fi tmiem il-fażi ta' teħid jista' jiġi stmat mid-dejta minn studji jew għarfien preċedenti taż-żieda probabbli fid-daqs tal-ispeċi tat-test minn piż tal-bidu tipiku tat-test tul durata tipika tat-teħid (eż. 28 jum).
         
            (89)  F'ħafna programmi li jippermettu rigressjoni lineari, jingħataw ukoll żbalji standard u intervall tal-kunfidenza (CI) tal-istimi, eż. fil-Microsoft Excel bl-użu tal-pakkett ta' għodod ta' Data Analysis.
         
            (90)  Għall-kuntrarju tal-metodu ta' rigressjoni lineari, l-użu ta' din il-formula mhuwiex sejjer irendi żball standard għall-k2.
         
            (91)  Għall-kuntrarju tal-proċedura ta' ffittjar lineari, dan il-metodu normalment ma jrendix żball standard jew intervall ta' fiduċja għall-k1 stmat.
         
            (92)  Għandu jingħad li l-inċertezza fl-istima tal-k2 ma tintużax kif suppost fil-mudell ta' bijoakkumulazzjoni meta dan essenzjalment jitqies bħala kostant meta jiġi ffittjat il-k1 fil-metodu ta' ffittjar sekwenzjali. Għalhekk, l-inċertezza tal-BCF li tirriżulta sejra tkun differenti bejn il-metodi ta' ffittjar simultanji u sekwenzjali.
         
            (93)  F'ċerti reġjuni, jista' jkun possibbli biss li jinkiseb għalf tal-ħut b'konċentrazzjoni ta' lipidu li tkun inqas minn dan il-limitu superjuri. F'ċerti każijiet, għandhom isiru studji bil-konċentrazzjoni inferjuri ta' lipidu fl-ikel kif fornit, u r-rata tat-tagħlif tiġi aġġustata kif xieraq sabiex tinżamm is-saħħa tal-annimali. Il-lipidi tad-dieta ma għandhomx jiżdiedu b'mod artifiċjali b'żieda taż-żejt eċċessiv.
         
            (94)  F'ambjenti selvaġġi, ir-rotta li twassal għall-ikbar esponiment f'ambjenti milwiema aktarx li sseħħ permezz ta' inġestjoni għal sustanzi ferm idrofobiċi u b'hekk il-BCF stmat mhuwiex strettament rappreżentattiv tat-tali potenzjal ta' bijoakkumulazzjoni tas-sustanza.
         
            (95)  Jistgħu jintużaw dafnidi oħrajn diment li dawn jissodisfaw il-kriterji ta' validita' kif xieraq (il-kriterju ta' validita' relatat mall-eżitu riproduttiv fil-kontrolli għandu jkun rilevanti għall-ispeċijiet kollha). Jekk jintużaw dafnidi oħrajn, dawn għandhom ikunu identifikati biċ-ċar u jrid jiġi ġġustifikat l-użu tagħhom.
         
            (96)  Mortalità aċċidentali: mortalità mhux marbuta mas-sustanza kimika kkaġunata minn inċidenza aċċidentali (jiġifieri kawża magħrufa)
         
            (97)  Mortalità mhux intenzjonata: mortalità mhux marbuta mas-sustanza kimika b'kawża mhux magħrufa
         
            (*6)  Indika liema reċipjent intuża għall-esperiment
         
            (*7)  Niżżel id-duqqajs abortit bħala “AB” fil-kaxxa rilevanti
         
            (*8)  Niżżel il-mortalità ta' kwalunkwe annimali ġenituri bħala “M” fil-kaxxa rilevanti
         
            (98)  It-tul totali medju minimu tipiku mhuwiex kriterju ta' validità, iżda d-devjazzjonijiet taħt iċ-ċifra indikata għandhom jiġu eżaminati bir-reqqa b'rabta mas-sensittività tat-test. It-tul totali medju minimu huwa mnissel minn għażla ta' dejta disponibbli fil-ħin attwali.
         
            (99)  Ir-razza partikolari tat-trota qawsalla ttestjata tista' tirrikjedi l-użu ta' temperaturi oħrajn. L-istokk riproduttiv għandu jinżamm fl-istess temperatura bħal dik li tintuża għall-bajd. Wara li jasal il-bajd mingħand nissiel kummerċjali, jeħtieġ li jsir adattament qasir (pereżempju ta' siegħa jew sagħtejn) sabiex tiġi ttestjata t-temperatura wara l-wasla.
         
            (100)  Dlam għal-larva sa ġimgħa wara t-tifqis, ħlief meta tkun qed tiġi spezzjonata, imbagħad dawl baxx matul it-test (fotoperjodu ta' bejn 12 u 16-il siegħa) (4).
         
            (101)  Għal kwalunkwe kundizzjonijiet tat-test partikolari, ir-reġim tad-dawl għandu jkun kostanti.
         
            (102)  Għal kwalunkwe test partikolari, dan għandu jsir għal ± 20/00.
         
            (*9)  L-ikel għandu jingħata sakemm il-ħut jixba'. Għandhom jitneħħew ikel u rawt żejda, skont kif ikun hemm bżonn, sabiex tiġi evitata akkumulazzjoni ta' skart
         
                     FBS
                  
                  
                     gambli tal-ilma mielaħ iffriżati; adulti Artemja sp
                  
               
                     BSN
                  
                  
                     gambli nauplii tal-ilma mielaħ; għadhom kif faqqsu
                  
               
                     BSN48
                  
                  
                     gambli nauplii tal-ilma mielaħ; f'età ta' 48 siegħa
                  
               
            (1)  il-larva mill-membrana tal-isfar tal-bajd ma għandhiex bżonn ikel
         
            (2)  iffiltrati minn kultura mħallta
         
            (3)  bċejjeċ żgħar minn proċess ta' fermentazzjoni
         
            (*10)  Normalment il-proċessi papillari jidhru biss f'irġiel adulti u jinsabu fuq ix-xewk tal-pinen mit-tieni sas-seba' jew it-tmien waħda jekk wieħed jgħodd min-naħa posterjuri tal-pinna anali (Fig.1 u 2). Madankollu, il-proċessi rarament jidhru fl-ewwel xewka tal-pinna mil-lat posterjuri tal-pinna anali. Dan l-SOP ikopri l-kejl ta' proċessi fuq l-ewwel xewka tal-pinna (l-għadd ta' xewk tal-pinen jirreferi għall-ordni min-naħa posterjuri tal-pinna anali f'dan l-SOP).
         
            (*11)  Bafer omoġenizzanti:
         
                     —
                  
                  
                     (50 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 % Koktejl ta' inibituri tal-proteażi (Sigma)): 12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl Koktejl ta' inibituri tal-proteażi.
                  
               
                     —
                  
                  
                     TRIS: TRIS-ULTRA PURE (ICN) eż. minn Bie & Berntsen, id-Danimarka.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Koktejl ta' inibituri tal-proteażi: Minn Sigma (għal tessut tal-mammiferi) Numru tal-prodott P 8340.
                  
               
            NOTA: Il-bafer omoġenizzanti għandu jintuża dakinhar stess meta jiġi manifatturat. Poġġi fuq is-silġ waqt li jkun qed jintuża.
         
            (103)  Carl von Linné (* it-23 ta' Mejju 1707 f' Råshult /Älmhult; † l-10 ta' Jannar 1778 f' Uppsala).
         
            (*12)  ilma demineralizzat (jiġifieri distillat jew dejonizzat)