CELEX: 31974L0203
Language: it
Date: 1974-03-25 00:00:00
Title: Quinta direttiva 74/203/CEE della Commissione, del 25 marzo 1974, che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali

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31974L0203

Quinta direttiva 74/203/CEE della Commissione, del 25 marzo 1974, che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali  

Gazzetta ufficiale n. L 108 del 22/04/1974 pag. 0007 - 0024 edizione speciale finlandese: capitolo 3 tomo 5 pag. 0210  edizione speciale greca: capitolo 03 tomo 10 pag. 0168  edizione speciale svedese/ capitolo 3 tomo 5 pag. 0210  edizione speciale spagnola: capitolo 03 tomo 7 pag. 0191  edizione speciale portoghese: capitolo 03 tomo 7 pag. 0191 

++++ ( 1 ) GU n . L 170 del 3 . 8 . 1970 , pag . 2 .   ( 2 ) GU n . L 73 del 27 . 3 . 1972 , pag . 14 .   ( 3 ) GU n . L 73 del 27 . 3 . 1972 , pag . 5 .   ( 4 ) GU n . L 155 del 12 . 7 . 1971 , pag . 13 .   ( 5 ) GU n . L 279 del 20 . 12 . 1971 , pag . 7 .   ( 6 ) GU n . L 123 del 29 . 5 . 1972 , pag . 6 .   ( 7 ) GU n . L 83 del 30 . 3 . 1973 , pag . 21 .  QUINTA DIRETTIVA DELLA COMMISSIONE  del 25 marzo 1974  che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali   ( 74/203/CEE )  LA COMMISSIONE DELLE COMUNITA EUROPEE ,  visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea ,  vista la direttiva del Consiglio , del 20 luglio 1970 , concernente l'introduzione di modi di prelevamento dei campioni e di metodi d'analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per gli animali ( 1 ) , modificata per ultimo dall'atto ( 2 ) , allegato al trattato relativo all'adesione di nuovi Stati membri alla Comunità economica europea e alla Comunità europea dell'energia atomica ( 3 ) , firmato a Bruxelles il 22 gennaio 1972 , in particolare l'articolo 2 ,  considerando che la suddetta direttiva prevede che i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali destinati a constatare l'osservanza delle condizioni prescritte in virtù delle disposizioni legislative , regolamentari o amministrative concernenti le qualità e la composizione degli alimenti per gli animali , siano effettuati secondo i modi di prelevamento di campioni ed i metodi di analisi comunitari ;  considerando che le direttive n . 71/250/CEE , n . 71/393/CEE , n . 72/199/CEE e n . 73/46/CEE della Commissione , del 15 giugno 1971 ( 4 ) del 18 novembre 1971 ( 5 ) , del 27 aprile 1972 ( 6 ) e del 5 dicembre 1972 ( 7 ) , hanno già fissato un certo numero di metodi di analisi comunitari ; che , tenuto conto dello stato d'avanzamento dei lavori sin qui effettuati , è necessario adottare una quinta serie di metodi ;  considerando che le misure previste dalla presente direttiva sono conformi al parere del comitato permanente degli alimenti per gli animali ,  HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA :  Articolo 1  Gli Stati membri prescrivono che le analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali , per quanto riguarda il contenuto in amido ed in prodotti di degradazione ad elevato peso molecolare dell'amido degli alimenti che contengono fettucce , polpe , foglie o colletti essiccati di barbabietole , polpe di patate , lieviti disidratati , prodotti ricchi in inulina o ciccioli , siano effettuate secondo i metodi descritti all'allegato I della presente direttiva .  Le disposizioni generali di cui alla prima parte ( introduzione ) dell'allegato della prima direttiva n . 71/250/CEE della Commissione , del 15 giugno 1971 , si applicano ai metodi descritti all'allegato I della presente direttiva .  Articolo 2  Gli Stati membri prescrivono che le analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali , per quanto riguarda il loro contenuto in amprolium , etopabato , dinitolmide ( DOT ) , nicarbazina e menadione ( vitamina K3 ) , siano effettuate secondo i metodi descritti all'allegato II della presente direttiva .  Le disposizioni generali di cui alla prima parte ( introduzione ) dell'allegato della prima direttiva n . 71/250/CEE della Commissione , del 15 giugno 1971 , eccetto la parte relativa alla preparazione del campione da analizzare , si applicano ai metodi descritti all'allegato II della presente direttiva .  Articolo 3  Gli Stati membri provvedono all'entrata in vigore , non oltre il 1 novembre 1974 , delle disposizioni legislative , regolamentari e amministrative necessarie per conformarsi alle disposizioni della presente direttiva e ne informano immediatamente la Commissione .  Articolo 4  Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva .  Fatto a Bruxelles , il 25 marzo 1974 .  Per la Commissione  Il Presidente  Francois-Xavier ORTOLI  ALLEGATO I  DETERMINAZIONE DELL'AMIDO   _ metodo alla pancreatina _  1 . Scopo e campo di applicazione  Il metodo consente di determinare il contenuto in amido ed in prodotti di degradazione ad elevato peso molecolare dell'amido degli alimenti che contengono fettucce , polpe , foglie o colletti essiccati di barbabietole , polpe di patate , lieviti disidratati , prodotti ricchi in inulina ( ad esempio fettucce e farina di topinambur ) o ciccioli . La determinazione deve essere eseguita soltanto quando l'esame microscopico rivela la presenza nel campione di quantità non trascurabili di amido .  2 . Principio  Gli zuccheri presenti nel campione vengono eliminati per estrazione con etanolo . L'amido del residuo di estrazione viene saccarificato dalla pancreatina . Gli zuccheri formatisi vengono idrolizzati dall'acido cloridrico ed il glucosio formatosi viene determinato col metodo di Luff-Schoorl . Moltiplicando la quantità di glucosio così ottenuta per un fattore costante , si ottiene il contenuto in amido del campione .  3 . Reattivi  3.1 . Etanolo al 90 % ( v / v ) , neutro alla fenolftaleina .  3.2 . Alcole n-amilico p.a .  3.3 . Toluene p.a .  3.4 . Soluzione tampone : sciogliere in acqua 9,078 g di fosfato monopotassico KH2PO4 e 11,876 g di fosfato bisodico Na2HPO4 * 2H2O . Portare ad 1 l con acqua .  3.5 . Soluzione di cloruro di sodio 0,2 N .  3.6 . Soluzione di Carrez I : sciogliere in acqua 21,9 g di acetato di zinco Zn ( CH3 COO ) 2 * 2H2O e 3 g di acido acetico glaciale . Portare a 100 ml con acqua .  3.7 . Soluzione di Carrez II : sciogliere in acqua 10,6 g di ferrocianuro di potassio K4 ( Fe ( CN6 ) ) * 3H2O . Portare a 100 ml con acqua .  3.8 . Acido cloridrico N .  3.9 . Acido cloridrico p.a . , 8 N circa , d : 1,125 .  3.10 . Soluzione di idrossido di sodio p.a . , 10 N circa , d : 1,33 .  3.11 . Indicatore : soluzione allo 0,1 % ( p / v ) di metilarancio .  3.12 . Pancreatina , in polvere , conforme alle prescrizioni di cui al punto 8 . Conservarla in recipienti chiusi , al riparo dalla luce e dall'umidità .  3.13 . Reattivo di Luff-Schoorl : versare , agitando prudentemente , la soluzione di acido citrico ( 3.13.2 ) nella soluzione di carbonato di sodio ( 3.13.3 ) . Aggiungere quindi la soluzione di solfato di rame ( 3.13.1 ) e portare ad 1 l con acqua . Lasciar riposare una notte e filtrare . Controllare la normalità del reattivo così ottenuto ( Cu 0,1 N ; Na2CO3 2 N ) . Il pH della soluzione deve essere di 9,4 circa  3.13.1 . Soluzione di solfato di rame : sciogliere 25 g di solfato di rame p.a . CuSO4 * 5H2O in 100 ml di acqua  3.13.2 . Soluzione di acido citrico : sciogliere 50 g di acido citrico p.a . C6H8O7 * H2O in 50 ml di acqua  3.13.3 . Soluzione di carbonato di sodio : sciogliere 143,8 g di carbonato di sodio anidro p.a . in 300 ml circa di acqua calda . Lasciar raffreddare .  3.14 . Granelli di pietra pomice bolliti nell'acido cloridrico , lavati con acqua ed essiccati .  3.15 . Soluzione al 30 % ( p / v ) di ioduro di potassio p.a .  3.16 . Acido solforico , 6 N circa , d : 1,18 .  3.17 . Soluzione di tiosolfato di sodio 0,1 N .  3.18 . Soluzione di amido : aggiungere a 1 l di acqua bollente una miscela di 5 g di amido solubile in 30 ml di acqua . Far bollire per tre minuti , lasciar raffreddare . Prepararla poco prima dell'uso .  4 . Apparecchiatura  4.1 . Estrattore ( vedasi schema pag . 12 ) , comprendente :  4.1.1 . Una beuta da 500 ml , a collo largo ,  4.1.2 . Un refrigerante a ricadere adattato alla beuta mediante un tappo ,  4.1.3 . Un'asta scorrevole nel tubo centrale del refrigerante , la cui estremità inferiore è provvista di un attacco . Una pinza per fissare l'asta ,  4.1.4 . Un cestello metallico , destinato ad essere sospeso all'attacco dell'asta ( 4.1.3 ) e a sostenere il crogiolo filtrante ( 4.1.5 ) ,  4.1.5 . Un crogiolo filtrante per filtrazione rapida , dimensione massima dei pori : 90 _ 150 um ( ad esempio G1 ) , 30 ml circa ,  4.1.6 . Filtro di carta , di formato adatto al crogiolo filtrante ( 4.1.5 ) .  4.2 . Stufa termostatica , regolata a 38 C  4.3 . Palloni tarati da 200 ml , a smerigliatura unificata , con refrigerante a ricadere .  4.4 . Palloni tarati da 100 ml , a smerigliatura unificata , con refrigerante a ricadere .  5 . Modo di operare  5.1 . Preparazione del campione  Macinare il campione in modo da farlo passare completamente attraverso un setaccio a maglie di 0,5 mm .  5.2 . Estrazione  Pesare , con l'approssimazione di 1 mg , 2 g del campione e introdurli nel crogiolo filtrante ( 4.1.5 ) il cui fondo è stato precedentemente ricoperto di un filtro di carta ( 4.1.6 ) imbevuto di etanolo ( 3.1 ) . Introdurre nella beuta ( 4.1.1 ) 55 ml di etanolo ( 3.1 ) e qualche granello di pietra pomice ( 3.14 ) . Collocare il crogiolo filtrante nel cestello metallico ( 4.1.4 ) e sospenderlo all'attacco dell'asta ( 4.1.3 ) . Sistemare il refrigerante sulla beuta e abbassare l'asta in maniera che il fondo del crogiolo sfiori la superficie dell'etanolo . Fissare l'asta a questa altezza per mezzo della pinza . Portare l'etanolo ad ebollizione e farlo bollire per tre ore . Lasciar quindi raffreddare e rialzare l'asta ( 4.1.3 ) in modo da far risalire il crogiolo il più in alto possibile nella beuta . Aprire prudentemente la beuta e lasciar scorrere 45 ml di acqua lungo le sue pareti . Sistemare di nuovo il refrigerante sull'erlenmeyer e mantenere il crogiolo filtrante a 10 cm al di sopra del livello del liquido . Portare il liquido ad ebollizione e farlo bollire per tre ore . Lasciare quindi raffreddare , aprire la beuta e togliere il crogiolo dal cestello .  5.3 . Saccarificazione e idrolisi  Collocare il crogiolo sopra una beuta da vuoto ed essiccare per aspirazione . Trasferire il residuo dell'estrazione in un mortaio e macinarlo finemente . Trasportare quantitativamente la polvere in un pallone tarato da 200 ml a smerigliatura unificata con l'ausilio di circa 60 ml di acqua , ed aggiungere alcune gocce di alcole amilico ( 3.2 ) . Applicare sul pallone un refrigerante a ricadere . Riscaldare all'ebollizione e far bollire per 1 ora . Lasciar quindi raffreddare e staccare il refrigerante .  Aggiungere 25 ml di soluzione tampone ( 3.4 ) , 250 mg di pancreatina ( 3.12 ) , 2,5 ml di soluzione di cloruro di sodio ( 3.5 ) e 10 gocce di toluene ( 3.3 ) . Agitare per due minuti , collocare il pallone nella stufa termostatica ( 4.2 ) e lasciarvelo per 21 ore , agitando di tanto in tanto . Lasciare poi raffreddare sino a temperatura ambiente .  Aggiungere 5 ml di soluzione di Carrez I ( 3.6 ) e agitare per un minuto . Aggiungere quindi 5 ml di soluzione di Carrez II ( 3.7 ) ed agitare nuovamente per un minuto . Portare a volume con acqua , mescolare e filtrare . Prelevare con una pipetta 50 ml del filtrato e porli in un pallone tarato da 100 ml ( si puo operare anche su 100 ml di filtrato in un pallone tarato da 200 ml ) . Aggiungere qualche goccia di indicatore ( 3.11 ) ed acidificare con l'acido cloridrico 8 N ( 3.9 ) fino a viraggio al rosso . Aggiungere quindi un eccesso di 6,25 ml di acido cloridrico 8 N ( 3.9 ) ( 12,50 ml se si opera su 100 ml di filtrato ) . Applicare sul pallone il refrigerante a ricadere , portare la soluzione all'ebollizione e far bollire per 1 ora . Lasciar raffreddare , neutralizzare con la soluzione di idrossido di sodio 10 N ( 3.10 ) fino a viraggio al giallo dell'indicatore . Acidificare quindi leggermente aggiungendo un po' di acido cloridrico N ( 3.8 ) , portare a volume con acqua e mescolare . Determinare il contenuto in glucosio col metodo di Luff-Schoorl , come indicato al punto 5.4 .  5.4 . Titolazione secondo Luff-Schoorl  Prelevare con la pipetta 25 ml del reattivo di Luff-Schoorl ( 3.13 ) e porli in una beuta da 300 ml ; aggiungere 25 ml , esattamente misurati , della soluzione ottenuta al punto 5.3 contenente al massimo 60 mg di glucosio . Aggiungere 2 granelli di pietra pomice ( 3.14 ) , riscaldare , agitando a mano , su una fiamma libera di media altezza e portare il liquido ad ebollizione in circa 2 minuti . Porre immediatamente la beuta su una tela metallica provvista di uno schermo di amianto provvisto di un foro del diametro di circa 6 cm , sotto la quale è stata precedentemente accesa una fiamma . Questa viene regolata in modo tale che soltanto il fondo della beuta venga riscaldato . Applicare quindi sulla beuta un refrigerante a ricadere . Subito dopo far bollire per 10 minuti esatti . Raffreddare immediatamente in acqua fredda e dopo circa 5 minuti titolare come segue :  Aggiungere 10 ml di soluzione di ioduro di potassio ( 3.15 ) e , subito dopo e con cautela ( perché sussiste il pericolo che si formi un'abbondante schiuma ) , 25 ml di acido sulforico 6 N ( 3.16 ) . Titolare quindi con la soluzione di tiosolfato di sodio 0,1 N ( 3.17 ) sino a comparsa di una colorazione gialla smorta , aggiungere l'indicatore all'amido ( 3.18 ) e completare la titolazione .  Effettuare la stessa titolazione su una miscela , esattamente misurata , di 25 ml di reattivo di Luff-Schoorl ( 3.13 ) e 25 ml d'acqua , dopo aver aggiunto 10 ml di soluzione di ioduro di potassio ( 3.15 ) e 25 ml di acido sulforico 6 N ( 3.16 ) , senza portare all'ebollizione .  5.5 . Prova in bianco  Eseguire una prova in bianco applicando il modo di operare descritto ai punti 5.3 e 5.4 , senza il campione .  6 . Calcolo dei risultati  Stabilire , con l'ausilio della tavola allegata , la quantità di glucosio in mg corrispondente alla differenza tra i risultati delle due titolazioni ( espressi in ml di tiosolfato di sodio 0,1 N ) riferentisi da un lato all'analisi del campione e dall'altro alla prova in bianco .  Il contenuto percentuale in amido del campione è dato dalla seguente formula :  0,72 ( a _ b )  in cui  a = mg di glucosio riferentisi al campione ,  b = mg di glucosio riferentisi alla prova in bianco ( vedasi osservazione 7.2 ) .  7 . Osservazioni  7.1 . La presenza contemporanea , nel campione , di amido parzialmente o totalmente destrinizzato e di lattosio puo dar luogo a un risultato per eccesso di 0,5 _ 3 % di amido . In questo caso , il contenuto effettivo in amido viene ottenuto come segue :  a ) determinare il contenuto in zuccheri riduttori dell'estratto etanolico ottenuto al punto 5.2 ed esprimere il risultato in percentuale di glucosio ;  b ) determinare il contenuto del campione in zuccheri riduttori solubili in acqua , ed esprimere il risultato in percentuale di glucosio ;  c ) sottrarre il risultato ottenuto in a ) da quello ottenuto in b ) e moltiplicare la differenza per 0,9 ;  d ) sottrarre il valore ottenuto in c ) dal contenuto in amido ottenuto applicando il metodo e calcolato come indicato al punto 6 .  7.2 . La quantità di glucosio riferentesi alla prova in bianco è normalmente di 0,25 mg . Essa non puo essere superiore a 0,50 mg .  8 . Prescrizioni riguardanti la pancreatina  Aspetto fisico : polvere bianco-giallastra , amorfa .  Contenuto in glucosio : la quantità di glucosio della prova in bianco ( vedasi 5.5 ) è normalmente di 0,25 mg . Un risultato superiore a 0,50 mg indica che la pancreatina non è più utilizzabile .  Controllo del consumo di iodio : mettere in sospensione 62,5 mg di pancreatina in circa 50 ml d'acqua portati a 25 _ 30 C . Aggiungere 1 ml di soluzione di iodio 0,1 N . Agitare per due minuti . Titolare con una soluzione di tiosolfato di sodio 0,1 N in presenza di indicatore all'amido . Il consumo di soluzione di iodio da parte della pancreatina non deve essere superiore a 0,5 ml .  Controllo dell'attività amilolitica : mescolare 100 ml di soluzione di amido ( 3.18 ) , 5 ml di soluzione tampone ( 3.4 ) , 0,5 ml di soluzione di cloruro di sodio ( 3.5 ) e 62,5 mg di pancreatina . Portare la miscela a 25 _ 30 C , agitare per due minuti . Aggiungere 1 ml di soluzione di iodio 0,1 N . La colorazione azzurra deve scomparire durante i 15 minuti dopo l'aggiunta della soluzione di iodio .  Tavola dei valori per 25 ml di reattivo di Luff-Schoorl  ml di Na2S2O3 0,1 N , 2 minuti di riscaldamento , 10 minuti di ebollizione   * Glucosio , fruttosio ,  Na2S2O3 * * Lattosio * Maltosio * Na2S2O3   * zucchero invertito  0,1 N * * C12H22O11 * C12H22O11 * 0,1 N   * C6H12O6  ml * mg * differenza * mg * differenza * mg * differenza * ml  1 * 2,4 * * 3,6 * * 3,9 * * 1   * * 2,4 * * 3,7 * * 3,9  2 * 4,8 * * 7,3 * * 7,8 * * 2   * * 2,4 * * 3,7 * * 3,9  3 * 7,2 * * 11,0 * * 11,7 * * 3   * * 2,5 * * 3,7 * * 3,9  4 * 9,7 * * 14,7 * * 15,6 * * 4   * * 2,5 * * 3,7 * * 4,0  5 * 12,2 * * 18,4 * * 19,6 * * 5   * * 2,5 * * 3,7 * * 3,9  6 * 14,7 * * 22,1 * * 23,5 * * 6   * * 2,5 * * 3,7 * * 4,0  7 * 17,2 * * 25,8 * * 27,5 * * 7   * * 2,6 * * 3,7 * * 4,0  8 * 19,8 * * 29,5 * * 31,5 * * 8   * * 2,6 * * 3,7 * * 4,0  9 * 22,4 * * 33,2 * * 35,5 * * 9   * * 2,6 * * 3,8 * * 4,0  10 * 25,0 * * 37,0 * * 39,5 * * 10   * * 2,6 * * 3,8 * * 4,0  11 * 27,6 * * 40,8 * * 43,5 * * 11   * * 2,7 * * 3,8 * * 4,0  12 * 30,3 * * 44,6 * * 47,5 * * 12   * * 2,7 * * 3,8 * * 4,1  13 * 33,0 * * 48,4 * * 51,6 * * 13   * * 2,7 * * 3,8 * * 4,1  14 * 35,7 * * 52,2 * * 55,7 * * 14   * * 2,8 * * 3,8 * * 4,1  15 * 38,5 * * 56,0 * * 59,8 * * 15   * * 2,8 * * 3,9 * * 4,1  16 * 41,3 * * 59,9 * * 63,9 * * 16   * * 2,9 * * 3,9 * * 4,1  17 * 44,2 * * 63,8 * * 68,0 * * 17   * * 2,9 * * 3,9 * * 4,2  18 * 47,1 * * 67,7 * * 72,2 * * 18   * * 2,9 * * 4,0 * * 4,3  19 * 50,0 * * 71,7 * * 76,5 * * 19   * * 3,0 * * 4,0 * * 4,4  20 * 53,0 * * 75,7 * * 80,9 * * 20   * * 3,0 * * 4,1 * * 4,5  21 * 56,0 * * 79,8 * * 85,4 * * 21   * * 3,1 * * 4,1 * * 4,6  22 * 59,1 * * 83,9 * * 90,0 * * 22   * * 3,1 * * 4,1 * * 4,6  23 * 62,2 * * 88,0 * * 94,6 * * 23  vedi figura : J.O .  ALLEGATO II  1 . DETERMINAZIONE DELL'AMPROLIUM   ( cloridrato di cloruro di 1 - ( 4-ammino-2-propil-5-pirimidilmetil ) -2-picolinio )  1 . Scopo e campo di applicazione  Il metodo permette di determinare l'amprolium nei mangimi , nei concentrati e nelle premiscele . Il limite minimo di determinazione è di 40 ppm .  2 . Principio  Il campione viene sottoposto ad estrazione con metanolo diluito . L'estratto viene purificato su colonna di ossido di alluminio e trattato con una soluzione metanolica di 2,7-diidrossinaftalene , ferricianuro di potassio , cianuro di potassio e idrossido di sodio . Si sviluppa una colorazione porpora . L'amprolium viene determinato per spettrofotometria a 530 nm .  3 . Reattivi  3.1 . Metanolo p.a .  3.2 . Metanolo diluito ( mescolare 2 volumi di metanolo p.a . e 1 volume di acqua ) .  3.3 . Soluzione allo 0,2 % ( p / v ) di ferricianuro di potassio K3 Fe - ( CN ) 6 p.a . questa soluzione si conserva per due settimane .  3.4 . Soluzione all'1 % ( p / v ) di cianuro di potassio p.a . Questa soluzione si conserva per 2 settimane .  3.5 . Soluzione all'1,125 % ( p / v ) di idrossido di sodio p.a .  3.6 . Soluzione metanolica di idrossido di sodio : prelevare 15 ml della soluzione ( 3.5 ) e portare a 200 ml con metanolo ( 3.1 ) .  3.7 . Soluzione allo 0,0025 % ( p / v ) di 2,7-diidrossinaftalene : sciogliere 25 mg di 2,7-diidrossinaftalene p.a . nel metanolo ( 3.1 ) e portare a 1 000 ml con metanolo ( 3.1 ) .  3.8 . Reattivo per colorazione : introdurre 90 ml di soluzione di 2,7-diidrossinaftalene ( 3.7 ) in un erlenmeyer da 250 ml ( 4.1 ) , aggiungere 5 ml di soluzione di ferricianuro di potassio ( 3.3 ) e mescolare . Aggiungere quindi 5 ml di soluzione di cianuro di potassio ( 3.4 ) , chiudere l'erlenmeyer e mescolare . Lasciar riposare per 30 _ 35 minuti , aggiungere 100 ml di soluzione metanolica di idrossido di sodio ( 3.6 ) , mescolare e filtrare su crogiolo filtrante ( 4.3 ) . Usare il presente reattivo entro i 75 minuti successivi alla filtrazione .  3.9 . Ossido di alluminio per crematografia su colonna . Agitare prima dell'uso , per 30 minuti , 100 g di ossido di alluminio con 500 ml di acqua , filtrare , lavare il deposito tre volte sul filtro , con 50 ml di metanolo ( 3.1 ) ogni volta , asciugare per aspirazione , lasciar riposare una notte ed essiccare quindi per 2 h a 100 C in una stufa a vuoto . Lasciar raffreddare in un essiccatore . Verificare l'attività analizzando a partire dal punto 5.2 una quantità determinata di soluzione campione ( 3.11 ) . Il tasso di recupero dell'amprolium deve essere del 100 % più o meno 4 % .  3.10 . Sostanza tipo : amprolium puro , rispondente alle caratteristiche seguenti . Punto di fusione ( decomposizione ) : 248 C .  Coefficiente di estinzione molecolare a 265 ed a 235 nm in acqua distillata : 11,0 per 10 3 .  3.11 . Soluzione campione : pesare , con l'approssimazione di 0,1 mg , 50 mg di sostanza tipo ( 3.10 ) . Sciogliere con metanolo diluito ( 3.2 ) in pallone tarato da ml 500 , portare a volume con lo stesso solvente e mescolare . Prelevare 10,0 ml , portare a 50 ml con metanolo diluito ( 3.2 ) in pallone tarato e mescolare . 1 ml di questa soluzione contiene 20 ug di amprolium .  4 . Apparecchiatura  4.1 . Erlenmeyers da 50 , 250 e 500 ml , a collo merigliato .  4.2 . Agitatore .  4.3 . Crogiolo filtrante , porosità G 3 , diametro : 60 mm .  4.4 . Colonne per cromatografia , in vetro ( diametro interno : 9 mm ; lunghezza : 400 _ 500 mm ) .  4.5 . Centrifuga , con tubi di 25 ml a tappo merigliato .  4.6 . Spettrofotometro , con vaschetta di 10 mm di spessore .  5 . Modo di procedere  5.1 . Estrazione e purificazione  5.1.1 . Mangimi e premiscele  Per i mangimi , pesare , con l'approssimazione di 1 mg , 10 g del campione finemente macinato ed omogeneizzato . Per le premiscele pesare 3 _ 6 g con l'approssimazione di 1 mg . Introdurre la quantità di sostanza da sottoporre ad analisi in un erlenmeyer da 250 ml ( 4.1 ) ed aggiungere esattamente 100 ml di metanolo diluito ( 3.2 ) . Agitare per 60 minuti e filtrare . Diluire , se necessario , con metanolo diluito ( 3.2 ) fino a ottenere una soluzione contenente 5 _ 15 um di amprolium per ml .  Introdurre in una colonna per cromatografia ( 4.4 ) , precedentemente chiusa alla sua estremità inferiore con un tampone di cotone , 5 g di ossido di alluminio ( 3.9 ) e quindi 25,0 ml dell'estratto . Lasciare scorrere il liquido , eliminare i primi 5 ml e raccogliere i 12 ml che seguono in una provetta graduata .  5.1.2 . Concentrati  Pesare , con l'approssimazione di 1 mg , 0,5 g del campione finemente macinato ed omogeneizzato , introdurli in un erlenmeyer da 500 ml ( 4.1 ) , aggiungere 250 ml di metanolo diluito ( 3.2 ) , agitare per 60 minuti e filtrare .  Prelevare 5,0 ml del filtrato e portare a 200 ml con metanolo diluito ( 3.2 ) in un pallone tarato .  5.2 . Sviluppo della colorazione e misura della densità ottica  Prelevare 5,0 ml della soluzione ottenuta al punto 5.1.1 oppure 5.1.2 ed introdurli in un tubo da centrifuga A ( 4.5 ) . Introdurre 5,0 ml di metanolo diluito ( 3.2 ) in un tubo da centrifuga B ( 4.5 ) . Aggiungere in ciascun tubo 10,0 ml del reattivo per colorazione ( 3.8 ) , chiudere i tubi , mescolare e lasciar riposare per 18 minuti . Centrifugare quindi per 3 minuti fino ad ottenere soluzioni limpide e decantare le soluzioni A e B in erlenmeyers da 50 ml ( 4.1 ) . Misurare immediatamente allo spettrofotometro , a 530 nm la densità ottica della soluzione A , usando la soluzione B come bianco . Determinare la quantità di amprolium riferendosi alla curva di taratura ( 5.3 ) .  5.3 . Curva di taratura  Introdurre in tubi da centrifuga ( 4.5 ) volumi rispettivamente di 1,0-2,0-3,0-4,0 e 5,0 ml di soluzione campione ( 3.11 ) . Portare il volume dei primi quattro tubi a 5,0 ml con metanolo diluito ( 3.2 ) . Aggiungere nei cinque tubi 10,0 ml del reattivo per colorazione ( 3.8 ) , chiudere i tubi , mescolare e lasciar riposare per 18 minuti . Centrifugare quindi per 3 minuti fino ad ottenere soluzioni limpide e decantare le soluzioni in erlenmeyers da 50 ml ( 4.1 ) .  Misurare immediatamente allo spettrofotometro , a 530 nm la densità ottica delle soluzioni usando una miscela di 5 ml di metanolo diluito ( 3.2 ) e di 10 ml di reattivo per colorazione ( 3.8 ) . Tracciare la curva di taratura riportando in ordinata i valori della densità ottica ed in ascissa le quantità corrispondenti di amprolium in mg .  6 . Calcolo dei risultati  6.1 . Mangimi e premiscele  Il contenuto in mg di amprolium per kg di campione è dato dalla formula  A / P . F . 20 000  dove :  A = quantità in mg di amprolium determinata fotometricamente ,  P = peso in grammi della quantità di sostanza sottoposta all'analisi ,  F = coefficiente di diluizione ( eventualmente effettuata al punto 5.1.1 ) .  6.2 Concentrati  La percentuale di amprolium del campione è data dalla formula  A / P . 200  dove :  A = quantità in mg di amprolium determinata fotometricamente ,  P = peso in g della quantità di sostanza sottoposta all'analisi .  7 . Ripetibilità  La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare :  10 ppm , in valore assoluto , per i contenuti di amprolium inferiori a 100 ppm ;  10 % , in valore relativo , per i contenuti compresi tra 100 e 5 000 ppm ;  500 ppm , in valore assoluto , per i contenuti compresi tra 5 000 e 10 000 ppm ;  5 % , in valore relativo , per i contenuti superiori a 10 000 ppm .  2 . DETERMINAZIONE DELL'ETOPABATO   ( metil-4-acetamido-2-etossibenzoato )  1 . Scopo e campo di applicazione  Il metodo permette di dosare l'etopabato nei mangimi , nei concentrati e nelle premiscele . Il limite minimo di determinazione è di 2 ppm .  2 . Principio  Il campione viene sottoposto ad estrazione con metanolo diluito . La soluzione e acidificata ed estratta con cloroformio . L'estratto cloroformico viene lavato prima con una soluzione alcalina , e poi con acqua . Si concentra l'estratto purificato e l'etopabato viene idrolizzato con acido cloridrico diluito . Il derivato amminico così formato , è poi diazotato e copulato con la N - ( 1-naftiletilendiammina ) . Il complesso colorato viene estratto con butanolo e la densità ottica della soluzione misurata a 555 nm .  3 . Reattivi  3.1 . Metanolo p.a .  3.2 . Metanolo al 50 % ( v / v ) : mescolare volumi uguali di metanolo ( 3.1 ) e di acqua .  3.3 . Acido cloridrico p.a . , d : 1,19 .  3.4 . Acido cloridrico diluito a 1/10 : prelevato 10,0 ml d'acido cloridrico ( 3.3 ) , portare a 100 ml con acqua .  3.5 . Acido cloridrico 0,3 N circa : prelevare 25,0 ml d'acido cloridrico ( 3.3 ) , portare a 1 000 ml con acqua .  3.6 . Cloroformio p.a .  3.7 . Soluzione al 4 % ( p / v ) di carbonato di sodio : sciogliere 40,0 g di carbonato di sodio anidro p.a . in acqua e portare a 1 000 ml con acqua .  3.8 . Soluzione allo 0,2 % ( p / v ) di nitrito di sodio : sciogliere in acqua 100 mg di nitrito di sodio p.a . e portare a 50 ml con acqua in un pallone tarato . Preparare al momento dell'uso .  3.9 . Soluzione all'1,0 % ( p / v ) di solfammato di ammonio : sciogliere in acqua 500 mg di solfammato d'ammonio p.a . e portare a 50 ml , con acqua , in un pallone tarato . Preparare al momento dell'uso .  3.10 . Soluzione allo 0,2 % ( p / v ) di N - ( 1-naftil ) etilendiammina : sciogliere nell'acqua 100 mg di N - ( 1-naftil ) etilendiammina p.a . e portare a 50 ml , con acqua , in un pallone tarato . Preparare al momento dell'uso .  3.11 . Cloruro di sodio anidro , p.a .  3.12 . n-butanolo , p.a .  3.13 . Sostanza tipo : etopabato puro .  3.14 . Soluzioni campione :  3.14.1 . Soluzione di 0,040 mg di etopabato per ml : pesare , con l'approssimazione di 0,1 mg , 40 mg di sostanza tipo ( 3.13 ) . Sciogliere con metanolo diluito ( 3.2 ) in pallone tarato da 100 ml , portare a volume con lo stesso solvente e mescolare . Prelevare , 10,0 ml , portare a 100 ml con metanolo diluito ( 3.2 ) in pallone tarato e mescolare . Questa soluzione si conserva stabilmente per un mese .  3.14.2 . Soluzione di 0,016 mg di etopabato per 20 ml : prelevare 5,0 ml della soluzione ( 3.14.1 ) , portare a 250 ml con metanolo diluito ( 3.2 ) in un pallone tarato e mescolare . Preparare al momento dell'uso .  4 . Apparecchiatura  4.1 . Erlenmeyer da 250 ml , a tappo smerigliato .  4.2 . Imbuti separatori da 100 ml a tappo smerigliato .  4.3 . Agitatore .  4.4 . Evaporatore rotante sotto vuoto , provvisto di palloni da 250 ml .  4.5 . Bagnomaria .  4.6 . Centrifuga , con tubi da 50 ml e 15 ml , a tappo smerigliato .  4.7 . Refrigerante ad aria con collo smerigliato .4.8 . Spettrofotometro , con vaschette di 10 mm di spessore .  5 . Modo di procedere  5.1 . Estrazione  Pesare , con l'approssimazione di 1 mg , una quantità di campione finemente macinata ed omogeneizzata , contenente 80 ug circa di etopabato . Introdurre la quantità di sostanza da sottoporre all'analisi in un erlenmeyer da 250 ml ( 4.1 ) ed aggiungere 100,0 ml di metanolo diluito ( 3.2 ) . Mescolare , chiudere l'erlenmeyer e agitare per un'ora mediante un agitatore ( 4.3 ) . Lasciar decantare , filtrare ed eliminare i primi ml di filtrato .  5.2 . Purificazione  N.B . Tutte le operazioni descritte sotto questo punto devono essere eseguite rapidamente . Introdurre 20,0 ml dell'estratto limpido in un imbuto separatore da 100 ml ( 4.2 ) , aggiungere 5,0 ml di acido cloridrico diluito a 1/10 ( 3.4 ) e 20,0 ml di cloroformio ( 3.6 ) . Agitare dapprima cautamente , quindi energicamente per 3 minuti . Lasciar riposare fino a separazione delle fasi e raccogliere la fase cloroformica in un secondo imbuto separatore da 100 ml ( 4.2 ) .  Estrarre la fase acida in due volte successive con 20,0 ml di cloroformio ( 3.6 ) per volta . Riunire gli estratti cloroformici nel secondo imbuto separatore ed eliminare la fase acida . Aggiungere alla soluzione cloroformica 10 ml di soluzione di carbonato di sodio ( 3.7 ) , agitare per 3 minuti e lasciar riposare fino a separazione delle fasi . Raccogliere la fase cloroformica in un terzo imbuto separatore da 100 ml ( 4.2 ) ed eliminare la fase acquosa . Aggiungere alla soluzione cloroformica 10 ml di soluzione di carbonato di sodio ( 3.7 ) , agitare per 3 minuti e lasciar riposare fino a separazione delle fasi .  Raccogliere la fase cloroformica in un quarto imbuto separatore da 100 ml ( 4.2 ) , lavare due volte successivamente con 25,0 ml di acqua ogni volta , separare le fasi acquose e raccogliere quantitativamente l'estratto cloroformico in un pallone da 250 ml ( 4.4 ) . Riunire le fasi acquose , lavare gli imbuti separatori utilizzati con qualche ml di cloroformio ( 3.6 ) , lavare successivamente anche la fase acquosa con questo cloroformio . Separare la fase cloroformica ed aggiungerla all'estratto raccolto nel pallone .  5.3 . Idrolisi  Evaporare l'estratto cloroformico fino a 2 ml circa su bagnomaria a 50 C mediante l'apparecchio rotativo ad evaporazione sotto vuoto ( 4.4 ) . Sciogliere il residuo con 2 o 3 ml di metanolo ( 3.1 ) , versare quantitativamente la soluzione in un tubo da centrifuga da 50 ml ( 4.6 ) mediante due porzioni da 10 ml ed una porzione da 5 ml di acido cloridrico 0,3 N circa ( 3.5 ) . Mescolare , aggiungere qualche frammento di pietra porosa ed inserire sul tubo un refrigerante ad aria ( 4.7 ) . Porre il tubo sopra un bagnomaria bollente e lasciarvelo per 45 minuti ; quindi raffreddare sotto corrente di acqua fredda .  5.4 . Sviluppo della colorazione e misura della densità ottica  Aggiungere 1,0 ml di soluzione di nitrito di sodio ( 3.8 ) , agitare e lasciar riposare 2 minuti . Aggiungere 1,0 ml di soluzione di solfammato di ammonio ( 3.9 ) , agitare e lasciar riposare 2 minuti . Aggiungere 1,0 ml di soluzione di N - ( 1-naftil ) etilendiammina ( 3.10 ) , agitare e lasciar riposare 10 minuti . Aggiungere 5,0 g di cloruro di sodio ( 3.11 ) e 10,0 ml di n-butanolo ( 3.12 ) , agitare energicamente fino a scioglimento completo del cloruro di sodio . Prelevare la soluzione butanolica superiore mediante una pipetta , introdurla in un tubo da centrifuga da 15 ml ( 4.6 ) e centrifugare . Misurare quindi la densita ottica EA allo spettrofotometro a 555 nm contro n-butanolo ( 3.12 ) .  5.5 . Prova in bianco  Eseguire la prova in bianco applicando lo stesso modo di operare , a cominciare dal punto ( 5.2 ) su 20,0 ml di metanolo diluito ( 3.2 ) . Misurare la densita ottica EB a 555 nm contro n-butanolo ( 3.12 ) .  5.6 . Prova campione  Effettuare una prova campione applicando lo stesso modo di operare a cominciare dal punto ( 5.2 ) su 20,0 ml di soluzione campione ( 3.14.2 ) . Misurare la densita ottica EC a 555 nm contro n-butanolo ( 3.12 ) .  6 . Calcolo dei risultati  Il contenuto in mg di etopabato per kg di prodotto in esame è dato dalla formula :   ( EA _ EB ) / ( EC _ EB ) . 80 / P  dove :  EA = densità ottica della soluzione proveniente dal campione in esame ;  EB = densità ottica della soluzione risultante dalla prova in bianco ;  EC = densità ottica della soluzione risultante dalla prova campione ;  P = peso in grammi della quantità di sostanza sottoposta all'analisi .  7 . Ripetibilità  La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare :  20 % , in valore relativo , per i contenuti in etopabato inferiori a 7,5 ppm ;  1,5 ppm , in valore assoluto , per i contenuti compresi tra 7,5 e 10 ppm ;  15 % , in valore relativo , per i contenuti superiori a 10 ppm .  3 . DETERMINAZIONE DELLA DINITOLMIDE ( DOT )   ( 3,5-dinitro-o-toluamide )  1 . Scopo e campo di applicazione  Il metodo permette di determinare la dinitolmide ( DOT ) nei mangimi , nei concentrati e nelle premiscele . I derivati del nitrofurano interferiscono . Il limite minimo di determinazione è di 40 ppm .  2 . Principio  Il campione viene sottoposto ad estrazione con acetonitrile . L'estratto viene purificato su ossido di alluminio e filtrato . Un'aliquota del filtrato viene evaporata a secco ed il residuo è ripreso con la dimetilformammide e trattato con etilendiammina . Si sviluppa una colorazione porpora . La dinitolmide viene determinata per spettrofotometria a 560 nm .  3 . Reattivi  3.1 . Acetonitrile a 85 % ( v / v ) : mescolare 850 ml di acetonitrile puro e 150 ml di acqua . Distillare la miscela prima dell'uso . Raccogliere la frazione che distilla tra 75 e 77 C .  3.2 . Ossido di alluminio per cromatografia su colonna .  Calcinare per almeno 2 ore a 750 C , raffreddare in essiccatore e conservare in flacone di vetro bruno e tappo smerigliato . Prima dell'uso umidificare come segue : introdurre in un flacone di vetro scuro 10 g d'ossido di alluminio e 0,7 ml d'acqua , chiudere ermeticamente , riscaldare per cinque minuti in bagno-maria bollente agitando energicamente . Lasciar raffreddare agitando ; verificare l'attività sottoponendo ad analisi , a cominciare dal punto 5.1 , una quantità determinata di soluzione campione ( 3.6 ) . Il tasso di recupero della dinitolmide deve essere del 100 % più o meno 2 % .  3.3 . N,N-dimetilformammide al 95 % ( v / v ) : mescolare 95,0 ml di N,N-dimetilformammide p.a . e 5,0 ml d'acqua .  3.4 . Etilendiammina p.a . , contenuto massimo di acqua : 2,0 % .  3.5 . Sostanza tipo : 3,5-dinitro-o-toluamide pura , rispondente alle caratteristiche seguenti :  Punto di fusione 177 C ;  Coefficiente di estinzione molecolare a 248 nm nell'acetonitrile : 13,1 per 10 3 ;  Coefficiente di estinzione molecolare a 266 nm nella N,N-dimetilformammide : 10,1 per 103 .  3.6 . Soluzione campione : pesare , con l'approssimazione di 0,1 mg , 40 mg di sostanza tipo ( 3.5 ) . Sciogliere con l'acetonitrile ( 3.1 ) in pallone tarato di 200 ml portare a volume con lo stesso solvente ed omogeneizzare . Prelevare 20,0 ml , portare a 100 ml con acetonitrile ( 3.1 ) in pallone tarato e omogeneizzare . 1 ml di questa soluzione contiene 40 ug di dinitolmide .  4 . Apparecchiatura  4.1 . Erlenmeyer da 250 ml , a collo smerigliato .  4.2 . Refrigerante a ricadere a collo smerigliato .  4.3 . Crogiolo filtrante , porosità G 3 , diametro 60 mm .  4.4 . Apparecchio da filtrazione sotto vuoto ( es . : apparecchio di Witt ) .  4.5 . Bagnomaria , regolato a 50 C .  4.6 . Spettrofotometro , con vaschette di 10 mm di spessore .  5 . Modo di procedere  5.1 . Estrazione e purificazione  Pesare , con l'approssimazione di 1 mg , 10 g del campione finemente macinato ed omogeneizzato . Per i concentrati e le premiscele , pesare 1 g , con l'approssimazione di 1 mg . Introdurre la quantità di sostanza da sottoporre ad analisi in un erlenmeyer da 250 ml ( 4.1 ) ed aggiungere 65 ml di acetonitrile ( 3.1 ) . Mescolare , munire l'erlenmeyer di un refrigerante a ricadere ( 4.2 ) e riscaldare su bagnomaria ( 4.5 ) per 30 minuti agitando continuamente . Lasciar raffreddare sotto corrente d'acqua fredda . Aggiungere 20 g di ossidi di alluminio ( 3.2 ) , agitare per 3 minuti e la lasciar decantare .  Porre un pallone graduato da 100 ml nell'apparecchio da filtrazione sotto vuoto ( 4.4 ) , adattarvi il crogiuolo filtrante ( 4.3 ) e raccogliere nel pallone il liquido filtrato per aspirazione . Versare successivamente il deposito nel crogiuolo con l'ausilio di qualche ml di acetonitrile ( 3.1 ) ed aspirare . Interrompere il vuoto , riportare il deposito in sospensione con qualche ml di acetonitrile ( 3.1 ) ed aspirare nuovamente . Ripetere queste ultime operazioni fino a quando il volume del filtrato raggiunge all'incirca i 95 ml . Portare a 100 ml con acetonitrile ( 3.1 ) ed omogeneizzare . Se necessario prelevare un'aliquota e diluire con acetonitrile ( 3.1 ) fino ad ottenere una soluzione contenente 5 _ 15 ug di dinitolmide per ml .  5.2 . Sviluppo della colorazione e misura della densità ottica  Introdurre in tre beckers da 50 ml ( A , B , C ) rispettivamente 4,0 ml della soluzione ottenuta al punto 5.1 . Aggiungere inoltre soltanto nel becker C , 1,0 ml di soluzione campione ( 3.6 ) . Portare i tre beckers sul bagnomaria ( 4.5 ) situato sotto una cappa ben ventilata ed evaporare a secco , in corrente d'aria . Lasciare raffreddare fino a temperatura ambiente , aggiungere 10,0 ml di N,N-dimetilformammide ( 3.3 ) nel becker A e 2,0 ml rispettivamente nei beckers B e C . Lasciare qualche minuto a contatto agitando leggermente fino a scioglimento completo del residuo . Aggiungere successivamente 8,0 ml di etilendiammina ( 3.4 ) nei beckers B e C e omogeneizzare . Misurare , esattamente cinque minuti dopo l'aggiunta di etilendiammina , la densità ottica delle tre soluzioni allo spettrofotometro ( 4.6 ) a 560 nm usando come bianco la N,N-dimetilformammide ( 3.3 ) .  6 . Calcolo dei risultati  Il contenuto in mg di dinitolmide per kg di campione è dato dalla formula :   ( EB - EA ) / ( EC - EB ) . F / P . 1 000  dove :  EA = densità ottica della soluzione A ( testimone ) ;  EB = densità ottica della soluzione B ( campione in esame ) ;  EC = densità ottica della soluzione C ( standard interno ) ;  P = peso in grammi della quantità di sostanza sottoposta all'analisi ;  F = coefficiente di diluzione ( eventualmente effettuata al punto 5.1 ) .  7 . Ripetibilità  La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare :  10 ppm , in valore assoluto , per i contenuti in dinitolmide inferiori a 100 ppm ;  10 % , in valore relativo , per i contenuti compresi tra 100 e 5 000 ppm ;  500 ppm , in valore assoluto , per i contenuti compresi tra 5 000 e 10 000 ppm ;  5 % , in valore relativo , per i contenuti superiori a 10 000 ppm .  4 . DETERMINAZIONE DELLA NICARBAZINA   ( miscela equimolecolare di 4,4-dinitrocarbanilide e di 2-idrossi-4,6-dimetilpirimidina )  1 . Scopo e campo di applicazione  Il metodo permette di determinare la nicarbazina nei mangimi , nei concentrati e nelle premiscele che non contengano più del 5 % di farine d'erba . I derivati del nitrofurano , l'acetileneptina e il carbadox interferiscono . Il limite minimo di determinazione è di 20 ppm .  2 . Principio  Il campione viene sottoposto ad estrazione con N,N-dimetilformammide . L'estratto è purificato mediante cromatografia su colonna di ossido di alluminio ; la nicarbazina viene eluita con etanolo e l'eluato trattato con una soluzione etanolica di idrossido di sodio : si sviluppa una colorazione gialla . La nicarbazina viene determinata spettrofotometricamente a 430 nm .  3 . Reattivi  3.1 . N,N-dimetilformammide p.a .  3.2 . Ossido di alluminio per cromatografia su colonna . Calcinare per almeno 2 h a 750 C , raffreddare in essiccatore e conservare in flacone di vetro scuro a tappo smerigliato . Prima dell'impiego verificare l'attività sottoponendo ad analisi , a partire dal punto 5.2 , una quantità determinata di soluzione campione ( 3.8.3 ) . Il tasso di recupero della nicarbazina deve essere del 100 % più o meno 2 % .  3.3 . Etanolo a 95 % ( v / v ) .  3.4 . Etanolo all'80 % ( v / v ) .  3.5 . Soluzione al 50 % ( p / v ) di idrossido di sodio p.a .  3.6 . Soluzione etanolica all'1 % ( p / v ) di idrossido di sodio : porre 1 ml di soluzione di idrossido di sodio ( 3.5 ) in un pallone tarato da 50 ml , portare a volume con etanolo all'80 % ( 3.4 ) . Preparare al momento dell'uso .  3.7 . Sostanza tipo : nicarbazina pura , coefficiente di estinzione molecolare a 362 nm in N,N-dimetilformammide : 37,8 per 10 3  3.8 . Soluzioni campione  3.8.1 . Soluzione di 1,25 mg di nicarbazina per ml : pesare , con l'approssimazione di 0,1 mg , 125 mg di sostanza tipo ( 3.7 ) . Sciogliere con 75 ml di N,N-dimetilformammide ( 3.1 ) in un pallone tarato da 100 ml , scaldando leggermente . Lasciar raffreddare , portare a volume con lo stesso solvente ed omogeneizzare . Conservare al riparo dalla luce .  3.8.2 . Soluzione di 0,125 mg di nicarbazina per ml : prelevare 10,0 ml della soluzione ( 3.8.1 ) , portare a 100 ml con la N,N-dimetilformammide ( 3.1 ) in un pallone tarato ed omogeneizzare  3.8.3 . Soluzione di 0,025 mg di nicarbazina per ml : prelevare 20,0 ml della soluzione ( 3.8.2 ) , portare a 100 ml con la N,N-dimetilformammide ( 3.1 ) in un pallone tarato ed omogeneizzare .  4 . Apparecchiatura  4.1 . Erlenmeyer da 250 ml , a collo smerigliato .  4.2 . Refrigerante a ricadere con collo smerigliato .  4.3 . Bagnomaria bollente .  4.4 . Centrifuga con tubi da 120 ml .  4.5 . Colonne per cromatografia in vetro ( diametro interno , 25 mm , lunghezza : 300 mm ) .  4.6 . Spettrofotometro , con vaschette da 10 mm di spessore .  4.7 . Buretta graduata a 1/10 ml .  5 . Modo di procedere  5.1 . Estrazione  Pesare , con l'approssimazione di 1 mg , 10 mg di campione finemente macinato ed omogeneizzato . Per i concentrati e le premiscele pesare 1 g , con l'approssimazione di 1 mg . Introdurre la quantità di sostanza da sottoporre all'analisi in un erlenmeyer da 250 ml ( 4.1 ) ed aggiungere esattamente 100 ml di N,N-dimetilformammide ( 3.1 ) . Mescolare , munire l'erlenmeyer di refrigerante a ricadere ( 4.2 ) e riscaldare su bagnomaria ( 4.3 ) per 15 minuti agitando di tanto in tanto . Lasciar raffreddare sotto corrente di acqua fredda .  Versare quindi il liquido superiore in un tubo da centrifuga ( 4.4 ) e centrifugare per 3 minuti circa . Se necessario prelevare 25,0 ml del liquido superiore e diluire con la N,N-dimetilformammide ( 3.1 ) per ottenere una soluzione contenente da 2 a 10,0 ug di nicarbazina per ml .  5.2 . Cromatografia  Introdurre in un tubo per cromatografia ( 4.5 ) 30 g di ossido di alluminio ( 3.2 ) in sospensione nella N,N-dimetilformammide ( 3.1 ) . Lasciar eluire il liquido fino a 1 cm al di sopra della colonna di ossido di alluminio e introdurre quindi nella colonna 25,0 ml dell'estratto ottenuto al punto 5.1 . Lasciar eluire il liquido evitando che la colonna vada a secco e lavare in tre riprese la colonna con 10 ml di N,N-dimetilformammide ( 3.1 ) ogni volta . Eluire quindi con 70 ml di etanolo al 95 % ( 3.3 ) . Eliminare i primi 10 ml di eluato e raccogliere il reato frazionando come segue :  una frazione ( a ) di 5 ml ;  una frazione ( b ) di 50 ml in un pallone tarato ;  una frazione ( c ) di 5 ml .  Controllare che le frazioni ( a ) e ( c ) non diano colorazione gialla per aggiunta di soluzione etanolica di idrossido di sodio ( 3.6 ) . Continuare le operazioni sulla frazione ( b ) come indicato al punto 5.3 .  5.3 . Sviluppo del colore e misura della densità ottica  Introdurre rispettivamente 20,0 ml della frazione ( B ) dell'eluato in due palloni tarati A e B da 25 ml . Aggiungere nel pallone A 5,0 ml di soluzione etanolica di idrossido di sodio ( 3.6 ) e nel pallone B 5,0 ml di etanolo al 95 % ( 3.3 ) . Omogeneizzare .  Entro i 5 minuti che seguono misurare la densità ottica delle due soluzioni a 430 nm , usando come bianco una miscela di 20,0 ml di etanolo al 95 % ( 3.3 ) e 5,0 ml di soluzione etanolica di idrossido di sodio ( 3.6 ) .  Detrarre il valore della densità ottica della soluzione B da quello della soluzione A . Partendo da questo valore , determinare la quantità di nicarbazina riferendosi alla curva di taratura ( 5.4 ) .  5.4 . Curva di taratura  Cromatografare 25,0 ml della soluzione campione ( 3.8.3 ) come indicato al punto 5.2 . Travasare nella buretta graduata ( 4.7 ) la frazione ( b ) dell'eluato e versare in palloni tarati da 25 ml rispettivamente volumi di 2,0-4,0-6,0-8,0 e 10,0 ml ( corrispondenti rispettivamente a 0,025-0,050-0,075-0,100 e 0,125 mg di nicarbazina ) . Aggiungere in ciascun pallone 5,0 ml di soluzione etanolica di idrossido di sodio ( 3.6 ) , portare a volume con etanolo al 95 % ( 3.3 ) ed omogeneizzare .  Misurare entro i 5 minuti successivi la densità ottica delle soluzioni a 430 nm , usando come bianco una miscela di 20,0 ml di etanolo al 95 % ( 3.3 ) e 5,0 ml di soluzione etanolica di idrossido di sodio ( 3.6 ) .  Tracciare la curva di taratura portando sulle ordinate i valori della densità ottica e sulle ascisse le quantità corrispondenti di nicarbazina in mg .  6 . Calcolo dei risultati  Il contenuto in mg di nicarbazina per kg di campione è data dalla formula :  A / P . F . 10 000  dove :  A = quantità in mg di nicarbazina determinata fotometricamente ;  P = peso in g della quantità di sostanza sottoposta all'analisi ;  F = coefficiente di diluzione ( eventualmente effettuata al punto 5.1 ) .  7 . Ripetibilità  La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare :  10 ppm , in valore assoluto , per i contenuti di nicarbazina inferiori a 100 ppm ;  10 % , in valore relativo , per contenuti compresi tra 100 e 5 000 ppm ;  500 ppm , in valore assoluto , per contenuti compresi tra 5 000 e 10 000 ppm ;  5 % , in valore relativo , per i contenuti superiori a 10 000 ppm .  5 . DETERMINAZIONE DEL MENADIONE ( VITAMINA K3 )  1 . Scopo e campo di applicazione  Il metodo permette di determinare il menadione ( vitamina K3 ) nei mangimi , nei concentrati e nelle premiscele . Il limite inferiore di determinazione è di 1 ppm .  2 . Principio  Il campione viene estratto con etanolo diluito . La miscela viene defecata con una soluzione di tannino e centrifugata . L'estratto è trattato con una soluzione di carbonato di sodio ; il menadione così liberato viene estratto con 1'1,2-dicloroetano . A seconda del suo contenuto di menadione , l'estratto dicloroetanico viene trattato , o direttamente , o dopo evaporazione , con la soluzione di 2,4-dinitrofenilidrazina in etanolo acidificato con acido cloridrico . L'idrazone ottenuto , addizionato di un eccesso di ammoniaca , dà luogo alla formazione di un complesso colorato in bluverde , la cui densità ottica viene determinata a 635 nm .  3 . Reattivi  3.1 . Etanolo al 96 % ( v / v ) .  3.2 . Etanolo ( 3.1 ) diluito al 40 % in acqua .  3.3 . Soluzione al 10 % ( p / v ) di tannino preparata , partendo da tannino puro in polvere .  3.4 . 1,2-dicloroetano p.a .  3.5 . Soluzione al 10 % ( p / v ) di carbonato di sodio anidro p.a .  3.6 . Acido cloridrico al 37 % ( p / p ) , d = 1,19 .  3.7 . Etanolo assoluto p.a .  3.8 . Reattivo alla 2,4-dinitrofenilidrazina : sciogliere 40 mg di 2,4-dinitrofenilidrazina p.a . in 40 ml circa di etanolo assoluto ( 3.7 ) bollente , lasciar raffreddare e versare in un pallone tarato da 50 ml . Aggiungere 1 ml di acido cloridrico ( 3.6 ) e portare a volume con etanolo assoluto ( 3.7 ) . Preparare immediatamente prima dell'uso .  3.9 . Ammoniaca al 25 % ( p / p ) , d = 0,91 .  3.10 . Soluzione ammoniacale di etanolo : mescolare un volume di etanolo ( 3.7 ) e un volume di ammoniaca ( 3.9 ) .  3.11 . Soluzioni standard di menadione : sciogliere 20 mg di menadione ( vitamina K3 ) in 1,2-dicloroetano ( 3.4 ) e portare a 200 ml . Diluire parti aliquote di questa soluzione con 1,2-dicloroetano ( 3.4 ) fino ad ottenere una serie di soluzioni le cui concentrazioni in menadione siano comprese tra i 2 e i 10 ug per ml . Preparare di fresco , prima dell'uso .  4 . Apparecchiatura  4.1 . Agitatore meccanico .  4.2 . Centrifuga ( 3 000 _ 5 000 g / m ) .  4.3 . Imbuti separatori da 100 e 250 ml , a tappo smerigliato .  4.4 . Evaporatore rotante sotto vuoto corredato di palloni di 250 ml .  4.5 . Bagnomaria .  4.6 . Spettrofotometro con vaschette di 10 mm di spessore .  5 . Modo di operare  N.B . Tutte le operazioni debbono essere eseguite in assenza di luce diretta ed impiegando vetreria scura .  5.1 . Entità del campione  Prelevare una quantità di campione , finemente macinato , proporzionale al presunto contenuto in menadione , e cioè :  g 0,1 _ 5,0 per i concentrati e le premiscele ;  g 20 _ 30 per i mangimi .  Introdurre immediatamente la quantità di sostanza da sottoporre ad analisi in un pallone di 250 ml munito di tappo smerigliato .  5.2 . Estrazione  Aggiungere 96 ml esatti di etanolo diluito ( 3.2 ) ed agitare meccanicamente per 15 minuti a temperatura ambiente . Aggiungere quindi 4,0 ml di soluzione di tannino ( 3.3 ) , mescolare , versare l'estratto in un tubo da centrifuga , centrifugare ( 3 000 _ 5 000 g / m ) e decantare .  Introdurre da 20 a 40 ml esatti del supernatante in un imbuto separatore da 250 ml , aggiungere 50 ml di 1,2-dicloroetano ( 3.4 ) , mescolare ed aggiungere ancora 20 ml di soluzione di carbonato di sodio ( 3.5 ) . Agitare energicamente per 30 secondi e raccogliere quindi la fase dicloroetanica in un imbuto separatore da 100 ml . Aggiungere 20 ml d'acqua , agitare ancora per 15 secondi , raccogliere la fase dicloroetanica ed eliminarne le tracce d'acqua a mezzo di strisce di carta da filtro .  Per i concentrati e le premiscele , prelevare una parte aliquota dell'estratto e diluire con 1,2-dicloroetano ( 3.4 ) fino ad ottenere una concentrazione in menadione di 2 _ 10 ug per ml . Per i mangimi evaporare a secco una parte aliquota dell'estratto , a pressione ridotta ed in atmosfera di azoto a 40 C . Riprendere rapidamente il residuo con 1,2-dicloroetano in modo da ottenere una soluzione contenente da 2 a 10 ug di menadione per ml .  5.3 . Formazione dell'idrazone  Introdurre 2,0 ml dell'estratto dicloroetanico ottenuto al punto 5.2 in un pallone tarato di 10 ml ed aggiungere 3,0 ml del reattivo alla 2,4-dinitrofenilidrazina ( 3.8 ) . Chiudere il pallone con un tappo di sughero o di teflon per evitare qualsiasi evaporazione e scaldare per 2 h a 70 C su bagnomaria . Lasciar raffreddare , aggiungere 3,0 ml di soluzione ammoniacale di etanolo ( 3.10 ) , mescolare , portare a volume con etanolo assoluto ( 3.7 ) e mescolare ancora .  5.4 . Misura della densità ottica  Misurare la densità ottica del complesso colorato in blu-verde allo spettrofotometro , a 635 nm , confrontando con un bianco costituito da reattivi e ottenuto trattando 2,0 ml di 1,2-dicloroetano ( 3.4 ) come indicato al punto 5.3 . Determinare la quantità di menadione facendo riferimento ad una curva di taratura stabilita per ogni serie di analisi .  5.5 . Curva di taratura  Trattare 2,0 ml delle soluzioni standard di menadione ( 3.11 ) come indicato al punto 5.3 . Misurarne la densità ottica come indicato al punto 5.4 . Tracciare la curva di taratura portando sulle ordinate i valori della densità ottica e sulle ascisse le quantità corrispondenti di menadione in ug .  6 . Calcolo del risultato  Calcolare il contenuto in menadione del campione tenendo conto della quantità della sostanza pesata per l'analisi e delle diluizioni effettuate nel corso dell'analisi medesima . Esprimere il risultato in mg di menadione per kg .  7 . Ripetibilità  La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare :  20 % , in valore relativo , per i contenuti in menadione inferiori a 10 ppm ;  2 ppm , in valore assoluto , per i contenuti compresi tra 10 e 14 ppm ;  15 % , in valore relativo , per i contenuti compresi tra 14 e 100 ppm ;  15 ppm , in valore assoluto , per i contenuti compresi tra 100 e 150 ppm ;  10 % , in valore relativo , per i contenuti superiori a 150 ppm .