CELEX: 51991PC0304
Language: it
Date: 1991-07-30
Title: PROPOSTA DI REGOLAMENTO ( CEE ) DEL CONSIGLIO CHE ISTITUISCE MISURE COMUNITARIE DI LOTTA CONTRO L' INFLUENZA AVIARE

COMVIISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE
                                  COM(91)30A   cief.
                                  Bruxelles, 30   luglio 1991
                        Proposta di
             REGOLAMENTO (CEE) DEL CONSIGLIO
        che istituisce misure comunitarie di lotta
                contro l'influenza aviare
              (presentata dalla Commissione)
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                                      REtAZIONE
   L'influenza avi are, nella sua forma altamente patogena, è una grave
   malattia contagiosa dei vol at 111. Essa è provocata da un virus la cui
   patogenicità e I cui sintomi sono estremamente vari nei volatili
   recettivi. La malattia è diffusa in tutto il mondo ed il virus può essere
   presente anchi negli uccelli migratori, in particolare quelli acquatici.
   La direttiva 90/539/CEE del Consiglio, del 15 ottobre 1990, relativa alle
   norme di polizia sanitaria per gli scambi intracomunltarI e le importazioni
   in provenienza dai paesi terzi di pollame e uova da cova ( 1 ) , prevede
   all'articolo 19 l'adozione di misure di lotta contro l'influenza aviare
   prima del 1' luglio 1991.
   Le misure proposte intendono eradicare e prevenire la diffusione
   dell'influenza aviare qualora dovessero scoppiare delie epidemie. Questo
   risultato sarà ottenuto eliminando il pollame con o senza vaccinazione, e
   controllando accuratamente gli spostamenti del pollame, dei prodotti a base
   di pollame, del veicoli e di qualsiasi altra sostanza suscettibile di
   trasmettere il virus della malattia. Le misure devono essere introdotte non
   appena si sospetta la presenza dell'influenza aviare, cosi da consentire un
    intervento immediato ed efficace.
   Per mettere in pratica le azioni di cui sopra, la presente proposta
   prevede, per gli Stati membri, vari obblighi tra cui:
   - organizzare un'indagine per confermare o escludere la presenza di
      influenza aviare in caso di sospetta infezione;
   - sorvegliare le aziende e proibire trasporti da e verso le stesse durante
      il periodo di sorveglianza in caso di sospetta presenza dell'influenza
      aviare;
   - uccidere e distruggere i volatili infetti una volta che l'influenza
      aviare sia stata confermata;
2) (1) GU n* L 303 del 31.10.1990, pag. 6
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- effettuare un'inchiesta epizootica accurata una volta che la presenza
  dell'influenza aviare sia stata sospettata e confermata;
- istituire zone di protezione (3 km) e di sorveglianza (10 km) attorno
  alle aziende infette;
- istituire laboratori che forniscano l'assistenza tecnica necessaria ad
  una corretta applicazione delle misure di lotta contro la malattia;
- Informare la Commissione in merito ai programmi di vaccinazione;
- preparare un piano di emergenza.
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                                   Proposta
                    Regolamento (CEE) del Consiglio
                    che istituisce misure comunitarie di
                       lotta contro l'influenza aviare
LA CONSIGLIO DELLE COMUNITÀ EUROPEE,
Visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea, in
particolare I'articolo 43,
Vista la proposta della Commissione,
Visto il parere del Parlamento europeo,
Visto il parere del Comitato economico e sociale,
Considerando che i volatili sono compresi nell'allegato II dei trattato;
che la loro commercializzazione costituisce un importante fonte di reddito
per la popolazione agricola;
considerando la necessità di istituire, a livello comunitario, le misure di
lotta da prendere in caso di insorgenza dell'influenza aviare in forma
altamente patogena, provocata da un virus dell'influenza con
caratteristiche specifiche, in prosieguo denominata "influenza aviare",
allo scopo di garantire lo sviluppo del settore avicolo e contribuire alla
protezione sanitaria degli animali nella Comunità.
considerando che l'insorgere dell'influenza aviare può rapidamente assumere
un carattere di epizoozia provocando mortalità e perturbazioni tali da
compromettere gravemente la redditività dell'allevamento del pollame in
generale;
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considerando che è indispensabile agire non appena si sospetta la presenza
di tale malattia, in modo da prendere provvedimenti immediati ed efficaci
di lotta in caso di successiva conferma;
considerando che occorre evitare la diffusione del Sa malattia fin dalla sua
prima comparsa, sottoponendo ad attento controllo i trasporti degli animali
e l'uso di prodotti che possano essere contaminati e procedendo ad
eventuale vaccinazione;
considerando che la diagnosi della malattia deve essere effettuata sotto
l'egida di laboratori responsabili, il cui operato deve essere coordinato
da un laboratorio di riferimento comunitario;
considerando che il mantenimento di un livello zoosanitario uniforme nella
Comunità presuppone l'adozione di misure comuni per la lotta contro
 I'influenza aviare;
considerando l'opportunità di affidare alla Commissione il compito di
prendere le necessarie misure di applicazione,
HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:
                                  Articolo 1
1. Il presente regolamento definisce le misure comunitarie di lotta da
    applicare in caso di comparsa dell'influenza aviare nei volatili da
    cortile, fatte salve le disposizioni che disciplinano gli scambi
    intracomuni tar i.
2. Il presente regolamento non si applica se la malattia viene individuata
    in altri volatili: tuttavia, in questo caso, gli Stati membri mettono al
    corrente la Commissione sulle misure eventualmente adottate.
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                                  Articolo 2
1. Ai fini del presente regolamento si applicano, se del caso, le
   definizioni di cui all'articolo 2 della direttiva 90/539/CEE del
   Consiglio, relativa alle norme di polizia sanitaria per gli scambi
    intracomunitari e le importazioni in provenienza dei paesi terzi di
   pollame e uova da cova ( 1 ^.
2. Inoltre si intende per:
   a) "pollame infetto" qualsiasi volatile:
       - in cui sia stata ufficialmente confermata la presenza
         dell'influenza aviare, ai sensi dell'allegato I, a seguito di un
         esame effettuato da un laboratorio riconosciuto oppure
       - nel caso di un secondo focolaio constatato o di focolai successivi,
         che presenti sintomi clinici o lesioni post-mortem che possano
         essere attribuiti all'influenza aviare;
   b) "pollame sospetto di infezione": qualsiasi volatile che presenti
       sintomi clinici o lesioni post-mortem tali da indurre ragionevolmente
       a sospettare la presenza dell'influenza aviare, o nel quale sia stata
       accertata la presenza del virus A dell'influenza, sottotipo H5 o H7;
   e) "pollame sospetto di contaminazione": qualsiasi volatile che abbia
       potuto essere esposto, direttamente o indirettamente, al virus
       dell'influenza aviare, oppure al virus A dell'influenza, sottotipo H5
       O H7;
   d) "autorità competente": l'autorità veterinaria all'uopo designata
       dall'amministrazione nazionale del paese in questione, la quale
       risponde direttamente e riferisce a detta amministrazione nell'ambito
       del presente regolamento;
   e) "veterinario ufficiale": il veterinario designato dal l'autorità
       competente dello Stato membro.
(1) GU n° L 303 del 31.10.1990, pag. 6
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                                  Articolo 3
Qualsiasi caso sospetto di influenza aviare deve essere notificato
immediatamente all'autorità competente.
                                  Articolo 4
1. Qualora si sospetti che il pollame sia infetto o contaminato
   dall'influenza aviare, il veterinario ufficiale deve avviare
    immediatamente un'indagine allo scopo di confermare o escludere la
   presenza della malattia e, in particolare, prelevare o far prelevare i
   campioni necessari per gli esami di laboratorio.
2. Non appena è notificato un caso sospetto di infezione, l'autorità
   competente pone l'azienda interessata sotto controllo ufficiale e
   dispone in particolare che:
   a) venga compilato un registro di tutte le categorie di volatili
       presenti nell'azienda specificando, per ciascuna di esse/quanti
       volatili sono morti, quanti presentano sintomi clinici e quanti non
       presentano sintomi.Il registro in questione deve essere tenuto
       aggiornato ed essere presentato su richiesta, potendo essere
       controllato in occasione di ciascuna visita;
   b) tutti i volatili presenti nell'azienda restino sequestrati nei locali
       in cui sono allevati o in qualsiasi altro locale in cui possano
       essere isolati e senza contatti con altri volatili;
   e) nessun volatile possa entrare nell'azienda o uscirne;
   d) qualsiasi movimento:
       - di persone, di altri animali e di veicoli in provenienza
         dall'azienda o a destinazione della stessa
       - di carni o carcasse di volatili, mangimi, attrezzi, rifiuti,
         lettiere o qualsiasi altro materiale che possa trasmettere il virus
         dell'influenza aviare dall'azienda
       venga proibito, salvo autorizzazione del veterinario ufficiale;
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   e) dall'azienda non siano fatte uscire uova, tranne le uova da mensa che
      siano state previamente disinfettate in modo ritenuto soddisfacente
      dal veterinario ufficiale;
   f) venga fatto ricorso a mezzi appropriati di disinfezione alle entrate
      e alle uscite dei fabbricati in cui sono allevati i volatili, nonché
      de 11'az ienda stessa ;
   g) venga effettuata una indagine epidemiologica conformemente
      all'articolo 7.
3. Finché le misure ufficiali di cui al paragrafo 2 restano in vigore, il
   proprietario o l'allevatore del pollame sospetto di infezione adopera
   per garantire il rispetto del paragrafo 2, in particolare delle lettere
   (b), (e), (d) e (e).
4. L'autorità competente può estendere qualsiasi misura di cui al
   paragrafo 2 ad altre aziende qualora, tenuto conto dell'ubicazione e
   della configurazione dei fabbricati o di eventuali contatti con
   l'azienda nella quale si sospetta la presenza della malattia, vi siano
   fondati motivi per sospettare un'eventuale contaminazione.
5. Le misure di cui ai paragrafi 2, 3 e 4 rimangono applicabili finché ia
   sospetta presenza dell'influenza aviare sia escBusa dal veterinario
   ufficiale.
                                 Articolo 5
1. Non appena viene confermata ufficialmente la presenza dell'influenza
   aviare in una azienda, l'autorità competente dispone, oltre
   all'applicazione delle misure elencate nell'articolo 4, paragrafo 2:
   a) che tutti i volatili presenti nell'azienda siano abbattuti in loco. I
      volatili morti o abbattuti e tutte le uova devono essere distrutti.
      Le operazioni di cui sopra devono essere eseguite in modo da ridurre
      al minimo il rischio di diffusione della malattia.
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b) che tutti i materiali e i rifiuti, come il mangime, la lettiera o il
    letame, che potrebbero essere contaminati, vengano distrutti o
   sottoposti a trattamento; quest'ultimo, eseguito conformemente alle
    istruzioni del veterinario ufficiale, deve garantire la distruzione
   del virus dell'influenza aviare eventualmente presente;
e) che, qualora i volatili siano stati macellati durante il periodo
   presunto di incubazione della malattia, le carni da essi ottenute
   vengano, nella misura del possibile, individuate e distrutte;
d) che le uova da cova deposte durante il presunto periodo di
    incubazione e uscite dall'azienda siano individuate e distrutte;!
   pulcini già nati da queste uova devono essere posti sotto controllo
   ufficiale; le uova da mensa deposte durante il presunto periodo di
    incubazione e uscite dall'azienda devono, nella misura del possibile,
   essere individuate e distrutte;
e) che, ultimate le operazioni di cui alla lettera a ) , i fabbricati
   adibiti all'allevamento e. le loro vicinanze nonché i veicoli usati
   per il trasporto e tutte le attrezzature che possono essere
   contaminate vengano puliti e disinfettati conformemente alle
   disposizioni dell'articolo 11;
f) che nell'azienda non vengano reintrodotti volatili per almeno 21
   giorni a decorrere dall'ultimazione delle operazioni di cui alla
   lettera e ) ;
g) che venga effettuata un'indagine epidemiologica conformemente
   al l'articolo 7.
L'autorità competente può estendere le misure di cui al paragrafo 1 ad
altre aziende qualora, tenuto conto dell'ubicazione e della
configurazione dei fabbricati o di eventuali contatti con l'azienda
nella quale é stata confermata la presenza della malattia, esistano
fondati motivi di sospettare un'eventuale contaminazione.
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                                      Articolo g
    1. Nel caso di allevamenti costituiti da due o più branchi separati,
       l'autorità competente può derogare alle disposizioni dell'articolo 5,
       paragrafo 1, lettera a) per i branchi sani di una azienda infetta, a
       condizione che il veterinario ufficiale confermi che le operazioni ivi
       effettuate lasciano i branchi completamente separati per quanto riguarda
       la stabulazione, il governo e l'alimentazione, per cui il virus non può
       propagarsi da un branco all'altro.
    2. La Commissione può, conformemente alla procedura di cui all'articolo 21,
       definire i criteri da applicare per concedere una deroga a norma del
       paragrafo 1.
                                      Articolo 7
    1. L'indagine epidemiologica verte sui seguenti aspetti:
       - il periodo nel quale può essere stata presente nell'azienda
          I'influenza aviare;
       - l'origine probabile dell'influenza aviare e l'identificazione delle
         altre aziende il cui pollame può essere stato infettato o contaminato
         dalla stessa fonte del virus;
       - i movimenti di persone, pollame o altri animali, veicoli, uova, carni
         e carcasse, nonché attrezzi o materiali che abbiano potuto veicolare
          il virus della malattia nell'azienda in questione o in provenienza da
         esse.
    2. Per coordinare pienamente tutte le misure necessarie al reradicazione
       dell'influenza aviare con la massima tempestività e per condurre
       l'indagine epidemiologica, viene istituita un'unità di crisi.
[3)
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   Le norme general I riguardanti le unità di crisi nazionali e l'unità di
   crisi comunitaria sono contenute nel regolamento (CEE) n               del
   Consigilo< 1 >.
                                     Articolo 8
1. Qualora il veterinario u f f i d a l e abbia fondati motivi per  sospettare che
   il pollame di una azienda possa essere stato contaminato        in conseguenza
   di movimenti di persone, animali o veicoli o in qualsiasi        altro modo,
   l'azienda in questione é sottoposta a controllo ufficiale        conformemente
   al paragrafo 2.
2. Il controllo ufficiale ha lo scopo di individuare immediatamente
   qualsiasi caso sospetto di influenza aviare, di tenere un registro del
   pollame detenuto nell'azienda e di controllarne i movimenti nonché, ove
   occorra, di prendere le misure elencate al paragrafo 3.
3. Quando una azienda é sottoposta a controllo ufficiale conformemente alle
   disposizioni del paragrafo 2, l'autorità competente vieta l'uscita di
   volatili dall'azienda tranne per il loro trasferimento diretto in un
   macello, sotto controllo ufficiale, ai fini della loro immediata
   macellazione. L'autorizzazione é concessa previa esecuzione, da parte
   del veterinario ufficiale, di un esame clinico del pollame da cui
   risulti l'assenza dell'influenza aviare nell'azienda. Le suddette
   restrizioni ai movimenti degli animali saranno applicate per un periodo
   di almeno 21 giorni a decorrere dall'ultima data in cui può essersi
   verificata la contaminazione. Tali restrizioni devono comunque essere
   applicate per un periodo di almeno sette giorni.
4. Qualora ritenga che le condizioni lo permettono, l'autorità competente
   può limitare le misure di cui al presente articolo a una parte
   dell'azienda e al pollame che si trova in tale parte, a condizione che
   il pollame in questione sia stato completamente separato dal restante
   quanto al ricovero, al governo e all'alimentazione e che le relative
   operazioni siano state eseguite da addetti diversi.
(1) GU n. L ... del              pag
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                                 Articolo 9
1. Non appena é ufficialmente confermata la presenza dell'influenza aviare,
   l'autorità competente delimita, attorno all'azienda infetta, una zona
   infetta che comprende una zona di protezione di almeno 3 km di raggio e
   una zona di sorveglianza di almeno 10 km di raggio. Nel delimitare
   queste zone si tiene conto dei confini naturali e dell'epidemiologia del
   foco I a i o.
2. Le misure applicate nella zona di protezione comprendono:
   a) l'identificazione di tutte le aziende che detengono pollame situate
      ne 11 a zona ;
   b) visite periodiche di tutte le aziende che detengono pollame, l'esame
      clinico del pollame in questione, compresa, ove occorra, la raccolta
      di campioni da sottoporre ad esami di laboratorio; va tenuto inoltre
      un registro delle visite e dei risultati degli esami;
   e) il sequestro di tutto il pollame nei locali in cui è allevato o in
      qualsiasi altro locale in cui possa essere tenuto isolato-,
   d) il ricorso a mezzi appropriati di disinfezione agli ingressi e alle
      uscite delle aziende;
   e) il controllo dei movimenti degli addetti alla manipolazione del
      pollame, delle carcasse di pollame e delle uova, nonché dei veicoli
      adibiti al trasporto di pollame, di carcasse e di uova all'interno
      della zona; in linea di massima il trasporto del pollame é vietato,
      fatta eccezione per il transito sui grandi assi stradali o
      ferroviari ;
   f) il divieto di uscita del pollame e di uova da cova dall' azienda in
      cui si trovano, tranne qualora l'autorità competente abbia
      autorizzato il trasporto:
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       i)    di pollame destinato alla macellazione immediata in un macello
             situato, di preferenza, nella zona infetta o, in casi di
              impossibilità, in un macello designato dall'autorità competente
             al di fuori della zona infetta.
             Le carni di tale pollame devono recare il marchio sanitario
             speciale previsto all'articolo 6, paragrafo 1 del
             regolamento.../.../CEE del Consiglio relativo alle norme di
             polizia sanitaria per gli scambi intracomunitari e le
              importazioni in provenienza dai paesi terzi di carni fresche di
             volatili da cortile e di selvaggina da penna allevata ( 1 ) ;
      (il)   di pulcini di un giorno o di pollastre pronte per la
             deposizione in una azienda situata nella zona infetta, in cui
             non è presente altro pollame. L'azienda destinataria deve
             essere sottoposta al controllo ufficiale di cui all'articolo 8,
             paragrafo 2;
     (iii)   di uova da cova in un incubatoio situato nella zona infetta o
              in incubatoio esterno alla zona infetta, designato
             dall'autorità competente; prima della spedizione, le uova e gli
              imballaggi che le contengono devono essere disinfettati.
    I trasporti autorizzati di cui ai punti ( i ) , (ii) e (iii), devono essere
   effettuati direttamente e sotto controllo ufficiale. Essi sono
   autorizzati soltanto previa esecuzione, da parte del veterinario
   ufficiale, di una ispezione sanitaria dell'azienda. I mezzi di trasporto
   usati devono essere puliti e disinfettati prima e dopo l'uso.
   g) il divieto di spostare o spandere letame o lettiere di pollame senza
       autorizzazione;
   h) il divieto di fiere, mercati, esposizioni e altri raduni di pollame o
       di altri volati Ii.
3. Le misure applicate nella zona di protezione restano in vigore per
   almeno 21 giorni dopo l'esecuzione delle operazioni preliminari di
   pulizia e di disinfezione dell'azienda infetta, conformemente
   all'articolo 11. La zona di protezione entra allora a far parte della
   zona di sorveglianza.
(1) COM(89)507 def.
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4. Le misure applicate nella zona di sorveglianza comprendono:
   a) l'identificazione di tutte le aziende che detengono pollame situate
       ne 11 a zona ;
   b) il controllo dei movimenti di pollame e di uova da cova nell'ambito
       de 11 a zona ;
   e) il divieto di uscita del pollame dalla zona per i primi 15 giorni,
       tranne per il trasporto diretto dei volatili ad un macello situato
       fuori dalla zona di sorveglianza, designato dall'autorità competente.
       Le carni di tale pollame devono recare il marchio sanitario speciale
       previsto all'articolo 6 del regolamento .../.../CEE del Consiglio
       relativo alle norme di polizia sanitaria per gli scambi
       intracomunitari e le importazioni in provenienza dai paesi terzi di
       carni fresche di volatili da cortile e di selvaggina da penna
       al levata;
   d) il divieto di uscita di uova da cova dalla zona di sorveglianza,
       tranne per il trasporto ad uno stabilimento designato dall'autorità
       competente.Prima della spedizione le uova e gli imballaggi che le
       contengono devono essere disinfettati;
   e) il divieto di uscita, dalla zona, di concime e lettiera di pollame;
   f) il divieto di fiere, mercati, esposizioni o altri raduni di pollame o
       di altri volati 11 ;
   g) fatte salve le disposizioni di cui alle lettere b) e e ) , il divieto
       di trasporto di pollame, fatta eccezione per il transito sui grandi
       assi stradali o ferroviari.
5. Le misure applicate nella zona di sorveglianza restano in vigore per
   almeno 30 giorni dopo l'esecuzione delle operazioni preliminari di
   pulizia e di disinfezione dell'azienda infetta, conformemente
   al l'articolo 11.
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                                   Articolo 10
1. L'autorità competente stabilisce le procedure che le consentono di
   seguire i movimenti di uova e di pollame.
2. Il proprietario o il responsabile dell'allevamento dei pollame é tenuto
   a fornire all'autorità competente, su richiesta di quest'ultima, le
    informazioni relative al pollame e alle uova che entrano o escono
   dal l'azienda.
3. Le persone addette al trasporto o alla commercializazione di pollame e
   di uova devono poter comunicare all'autorità competente le informazioni
   relative agli spostamenti del pollame e delle uova da esse trasportato o
   commercializzato e a fornire qualsiasi altro dettaglio in materia.
                                   Articolo 11
1. I disinfettanti da usare e le relative concentrazioni devono essere
   approvati dall'autorità competente.
2. Le operazioni di pulizia e disinfezione vanno effettuate sotto controllo
   ufficiale, conformemente alle istruzioni impartite dal veterinario
   ufficiale.
                                   Articolo 12
La raccolta dei campioni e gli esami di laboratorio volti ad accertare la
presenza del virus dell'influenza aviare devono essere effettuati
conformemente all'allegato I.
                                   Articolo 13
1. Ogni Stato membro provvede a designare:
   a) uno o più laboratori nazionali muniti delle attrezzature e del
       personale specializzato necessari per poter procedere alla
       valutazione della patogenesi degli isolati del virus dell'influenza
       (allegato I, capitolo 7 ) , nonché all'identificazione dei virus
       dell'influenza dei sottotipi H5 o H7;
 ---pagebreak---                                     - 13 -
   b) uno o più laboratori nazionali per l'esecuzione delle prove sui
       reagenti da usare nei laboratori regionali;
   e) uno o più istituti o laboratori nazionali dove vaccini autorizzati
       possono essere provati al fine di controllare la loro conformità con
       quanto viene specificato dall'autorizzazione di mercato.
2. I laboratori nazionali di cui all'allegato II sono competenti per il
   coordinamento delle norme e dei metodi di diagnosi, per l'uso dei
   reagenti e per la prova dei vaccini.
3. I laboratori nazionali che si occupano dell'influenza aviare menzionati
   al paragrafo 2 sono competenti per il coordinamento delle norme e dei
   metodi diagnostici definiti in ciascuno dei laboratori specializzati
   nella malattia all'interno dello Stato membro. A questo scopo essi:
   a) possono fornire i reagenti diagnostici ai laboratori regionali;
   b) controllano la qualità di tutti   i reagenti diagnostici usati nello
       Stato membro;
   e) organizzano periodicamente prove comparative;
   d) detengono isolati del virus dell'influenza aviare, provenienti da
       casi individuati nello Stato membro;
   e) garantiscono la conferma di risultati positivi ottenuti nei
       laboratori diagnostici regionali.
4. I laboratori nazionali elencati nell'allegato II si mantengono in
   contatto col laboratorio comunitario di riferimento di cui all'articolo
   14.
                                 Articolo 14
Il laboratorio comunitario di riferimento per l'influenza aviare é indicato
nell'allegato III. Le sue mansioni e attribuzioni, nella misura in cui non
siano disciplinate dall'articolo 28 della decisione 90/424/CEE del
Consiglio relativa a talune spese nel settore v e t e r i n a r i o ^ , vengono
fissate secondo la procedura descritta all'articolo 21.
(1) GU n. L 224 del 18.8.1990, pag. 19
 ---pagebreak---                                         - 14 -
                                     Articolo 15
1. La vaccinazione contro l'influenza aviare mediante vaccini autorizzati
   dall'autorità competente può essere praticata soltanto per integrare le
   misure di lotta messe in applicazione in caso di comparsa della
   malattia.
2. La decisione di introdurre la vaccinazione per integrare le misure di
    lotta viene adottata dalla Commissione, in collaborazione con lo Stato
   membro interessato, secondo la procedura descritta all'articolo 21. Tale
   descisione tiene conto dei seguenti elementi:
   - concentrazione di volatili nella zona colpita,
   - caratteristiche e composizione dei vaccini da utilizzare,
   - modalità di controllo della distribuizone, della conservazione e
      de II'i mp iego de i vacc ini,
   - spese e categorie di volatili da sottoporre a vaccinazione,
   - zone nelle quali deve essere eseguita la vaccinazione.
3. Qualora uno Stato membro venga autorizzato, a norma del paragrafo 2, ad
   effettuare la vaccinazione d'emergenza in una parte delimitata del
   proprio territorio, tale misura non modifica lo status del territorio
   restante purché le misure di immobilizzazione degli animali vaccinati
   restino in vigore per un periodo di tre mesi dalla fine delle operazioni
   di vaccinazione.
                                     Articolo 16
1. Qualora, in una determinata regione, una epizoozia di influenza aviare
   si riveli eccezionalmente grave e presenti tendenza a diffondersi, lo
   Stato membro interessato:
   - dichiara "zona ad alto rischio sanitario" una sezione territorialmente
      delimitata, comprendente almeno tutte le zone di protezione e di
      sorveglianza che vi si trovano;
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   - mette in applicazione nella "zona ad alto rischio sanitario" le misure
      previste all'articolo 9, paragrafo 3;
   - vieta l'uscita dalla "zona ad alto rischio sanitario" di tutto il
      pollame vivo e delle uova da cova;
   - informa la Commissione e gli altri Stati membri, nell'ambito del
      comitato veterinario permanente, in merito all'evolversi
      dell'epizoozia e alle misure di lotta applicate.
2. I confini della "zona ad alto rischio sanitario" possono essere
   riesaminati in funzione della progressiva eliminazione di zone di
   sorveglianza. Le misure di cui al paragrafo 1 sono abrogate quando à
   stata eliminata l'ultima zona di sorveglianza.
3. In caso di persistenza di una situazione di eccezionale gravità, le
   misure che lo Stato membro interessato deve adottare, in particolare
   l'istituzione della "zona ad alto rischio sanitario" e il ricorso alle
   disposizioni dell'articolo 15, possono essere decise conformemente alla
   procedura di cui all'articolo 21.
                                 Articolo 17
1. Ciascuno Stato membro redige un piano d'allarme nel quale vengono
   specificate le misure nazionali da applicare in caso di comparsa
   de 11'i nfIuenza avI are.
   Il piano deve consentire l'accesso agli edifici, alle attrezzature, al
   personale e a tutti gli altri materiali necessari per una rapida ed
   efficace eradicazione della malattia. Esso deve precisare il fabbisogno
   di vaccino che ciascuno Stato membro ritiene necessario per
   l'eventualità di una vaccinazione di emergenza.
 ---pagebreak---                                                 - 16 -
2. I criteri da seguire per la stesura del piano sono definiti dalla decisione
   91/42/CEE della C o m m i s s i o n e ^ , dell'8 gennaio 1991, che stabilisce i
   criteri da osservare per l'elaborazione dei piani di allarme per la lotta
   contro l'afta epizootica in applicazione dell'articolo 5 della direttiva del
   Consiglio 90/423/CEE, che si applica mutatis mutandis.
   Secondo la procedura di cui all'articolo 21, la Commissione può modificare o
   completare tali criteri, tenendo conto della natura specifica dell'influenza
   aviare.
3. I piani redatti in conformità con i criteri di cui ai paragrafo 2 vengono
   presentati alla Commissione non oltre 12 mesi dopo l'entrata in vigore del
   presente regolamento.
4. La Commissione esamina i piani allo scopo di determinare se essi consentano
   di raggiungere l'obiettivo perseguito e suggerisce allo Stato membro
    interessato gli eventuali emendamenti necessari, in particolare, a garantirne
    la compatibilità con quelli degli altri Stati membri.
   La Commissione approva i piani, se necessario modificati, in conformità con
    la procedura prevista all'articolo 21.
    I piani possono successivamente essere modificati o completati secondo la
   stessa procedura, in modo da tener conto dell'evolversi della situazione.
                                             Articolo 18
Se necessario per garantire l'applicazione uniforme del presente regolamento,
esperti veterinari della Commissione possono, in collaborazione con le autorità
dello Stato membro interessato, effettuare controlli in loco-, la Commissione
informa gli Stati membri sui risultati dell'ispezione.
  (1) GU n. L 23 del 29.1.1991, pag. 29
 ---pagebreak---                                        - 17 -
Lo Stato membro sul cui territorio viene effettuata l'ispezione presta tutta
l'assistenza necessaria affinché gli esperti possano espletare le loro mansioni.
Le disposizioni generali per l'attuazione del presente articolo vengono
determinate In conformità con la procedura prevista all'articolo 21.
                                    Articolo 19
Le modalità per la partecipazione finanziaria della Comunità alle azioni
previste nel presente regolamento sono fissate nella decisione 90/424/CEE del
Consiglio relativa a talune spese nel settore veterinario.
                                    Articolo 20
Gli allegati al presente regolamento possono essere modificati dalla Commissione
in conformità con la procedura dì cui all'articolo 21, soprattutto per tener
conto dell'evoluzione dei metodi diagnostici.
                                    Articolo 21
1. La Commissione é assistita dal comitato veterinario permanente, istituito con
   decisione 68/361/CEE del Consiglio ( 1 ) , in appresso denominato "iI
   comitato".
2. Ove si faccia ricorso alla procedura di cui al presente articolo, si
   applicano le seguenti disposizioni.
   Il rappresentante della Commissione sottopone al comitato un progetto delle
   misure da adottare, il comitato, entro un termine che il presidente può
   fissare in funzione del l'urgenza del la questione in esame, formula il suo
   parere sul progetto, eventualmente procedendo a votazione.
   Il parere é iscritto a verbale-, inoltre, ciascuno Stato membro ha il diritto
   di chiedere che la sua posizione figuri a verbale.
  (1) GU n. L 255 del 18.10.1968, pag. 23
 ---pagebreak---                                       - 18 - •
   La Commissione tiene in massima considerazione il parere formulato dal
   comitato. Essa lo informa del modo in cui ha tenuto conto del suo parere
                                   Articolo 22
Il presente regolamento entra in vigore il 1* luglio 1991.
Il presente regolamento è obbligatorio un tutti i suoi elementi e direttamente
applicabile in ciascuno Stato membro.
Fatto a Bruxelles,                           Per il Consiglio
 ---pagebreak---                                          -</$.-
                                     ALLEGATO I
                 METODI DIAGNOSTICI PER LA CONFERMA E LA DIAGNOSI
                        DIFFERENZIALE DELL'INFLUENZA AVIARE
I metodi sotto descritti per isolare e individuare i virus dell'influenza aviare
devono essere considerati come orientamenti e criteri minimi da applicare nella
suddetta diagnosi.
Ai fini delle procedure diagnostiche per la conferma e la diagnosi differenziale
dell'influenza aviare si applica la seguente definizione:
Per "influenza aviare" si intende un'infezione dei volatili causata da qualsiasi
virus A dell'influenza avente un indice di patogenicità intravenosa superiore a
1,2 nei pulcini di sei settimane, ovvero qualsiasi infezione provocata da virus
A dell'influenza, sottotipo H5 o H7, per il quale il sequenziamento dei
nucleotidi abbia rivelato la presenza di molteplici amminoacidi basici nel sito
di clivaggio dell'emoagglutinina.
                                     CAPITOLO 1
                      Campionatura e trattamento dei campioni
1. campioni
   Frammenti prelevati mediante tampone nell'intestino (o feci) e nella trachea
   di volatili malati; feci o contenuti dell'intestino, tessuti cerebrali,
   trachea, polmoni, fegato, milza e altri organi dell'animale malato, prelevati
   da volatili morti di recente.
2. Trattamento dei campioni
   Gli organi e i frammenti di tessuto sopra elencati possono essere trattati
   insieme, salvo per quanto riguarda le feci, per le quali é essenziale un
   trattamento separato. I materiali prelevati devono essere immersi
   completamente in un quantitativo sufficiente di antibiotico. I campioni di
   feci e gì I organi devono essere omogeneizzati (in un miscelatore chiuso o in
   un mortalo con pestello e sabbia sterile) in un mezzo antibiotico e portati
   in sospensione in tale mezzo al 10-20% p/v. Le sospensioni devono essere
   lasciate riposare per circa due ore a temperatura ambiente (o per un
   intervallo superiore a 4*C) e successivamente chiarificati mediante
   centrifugazione (ad esempio da 800 a 1000 x g per 10 minuti).
 ---pagebreak---                                         - 20-
3. Mezzo antibiotico
   Numerosi laboratori hanno utilizzato con successo mezzi antibiotici di varia
   composizione e i laboratori nazionali potranno essere consultati in proposito
   nel rispettivi paesi. Per i campioni di feci occorre una elevata
   concentrazione di antibiotici; una miscela tipica è la seguente:
    10.000 unità/mi di penecillina, 10 mg/mi di streptomicina, 0,25 mg/mi di
   gentamicina e 5.000 unità/mi di micostatina in una soluzione salina tampone
   di fosfato. Queste dosi possono essere ridotte fino a 5 volte per i tessuti e
   per i prelievi di trachea. Per l'accertamento della CI ami di a. si possono
   aggiungere 50 mg/mi di ossitetraciclina. Nel la preparazione del mezzo
   antibiotico, occorre assolutamente controllare il pH dopo l'aggiunta degli
   antibiotici e portarlo al valore 7,0-7,4.
                                     CAPITOLO 2
                                Isolamento del virus
Isolamento dei virus nelle uova embrionate di galline
Inoculare 0,1-0,2 mi del liquido sopranatante chiarificato nella cavità
allant foca di almeno 4 uova embrionate di gallina previamente sottoposte a
incubazione per 8-10 giorni. Idealmente si dovrebbero utilizzare uova
provenienti da un branco indenne da organismi patogeni specifici, ma, in caso di
impossibilità, si possono utilizzare uova provenienti da un branco nel quale sia
comprovata l'assenza di anticorpi dell'influenza aviarie. Le uova inoculate sono
mantenute alla temperatura di 37° C ed esaminate ogni giorno in controluce. Le
uova nelle quali si constata che l'embrione è morto o è morente, nonché tutte le
uova restanti 6 giorni dopo l'inoculazione, vengono refrigerate a 4*C e il
liquido al tantoico-amniotico sottoposto alla prova dell'attività
emoagglut inante. Qualora non si constati emoagglut inazione, il procedimento
sopra descritto deve essere ripetuto inoculando nelle uova liquido
allantoico/amniotico non diluito.
Quando viene constatata emoagglut inazione, la presenza di batteri deve essere
esclusa mediante coltura. In caso di presenza di batteri, far passare i liquidi
attraverso un filtro a membrana di 450 mn, quindi aggiungere altri antibiotici e
procedere nuovamente, come indicato sopra, alla inoculazione in uova embrionate.
 ---pagebreak---                                      CAPITOLO 3
                               Diagnosi differenziale
1. Differenziazione preliminare
   Data l'importanza di porre in atto al più presto possibile provvedimenti
   volti a limitare la propagazione del virus, ciascun laboratorio regionale
   dovrebbe essere in grado di identificare qualsiasi virus isolato che provoca
   emoagglut inazione, come i virus dell'influenza di sottotipo H5 o H7, oltre al
   virus della malattia di Newcastle.
   Occore pertanto utilizzare i liquidi emoaggluti nanti eseguendo una prova di
   inibizione del I'emoaggIut inazione come descritto ai Capitoti 5 e 6. Una
   inibizione positiva, cioè pari a 2 4 o più, con l'antisiero poli e Iona le
   specifico dei sottotipi H5 o H7 dell'influenza A ed avente un titolo noto,
   pari almeno a 2 9 , potrà servire per una identificazione preliminare sulla
   cui base istituire misure provvisorie di contenimento.
2. identificazione di conferma
   Dal momento che esistono 13 sottotipi di emoagglut inina e 9 sottotipi di
   neuraminidasi dei virus dell'influenza, con varianti all'interno di ciascuno
   di essi, non è pratico né economicamente fattibile, per i singoli laboratori
   nazionali, conservare antisieri che consentano di effettuare una
   caratterizzazione antigenica completa degli isolati d'influenza. Nondimeno,
   ciascun laboratorio nazionale è tenuto a:
   (i)         confermare che l'isolato è un virus A dell'influenza, mediante
               prova di doppia immunodiffusione atta a rivelare l'antigene del
               gruppo, come indicato al capitolo 9 del presente allegato (si
               possono Impiegare altresì, secondo le preferenze del laboratorio
               nazionale, le tecniche di immunofluorescenza o ELISA);
 ---pagebreak---                                         -n
   (M)         determinare se l'isolato appartiene al sottotipo H5 o H7;
   (iii)       eseguire una prova dell'indice di patogeni e ita intravenosa su
               pulcini di sei settimane, come indicato al capitolo 7. Indici di
               patogenicità intravenosa superiori a 1,2 denotano la presenza di
               virus e richiedono quindi la gamma completa delle misure
               profilattiche (è utile che i laboratori nazionali eseguano prove
               anche per determinare l'attitudine di un isolato a produrre
               placche nelle colture di cellule, come specificato ai capitolo 8)
   I laboratori nazionali devono trasmettere immediatamente al laboratorio
   comunitario di riferimento, per una caratterizzazione completa, tutti gli
   iso tati di Influenza aviare e di virus H5 e H7.
3. Altre prove di individuazione del tipo e delle caratteristiche degli Isolati
   I laboratori nazionali dovrebbero trasmettere al laboratorio comunitario di
   riferimento tutti i virus emoagglutinanti, da sottoporre ad ulteriori esami
   antigeni ci e genetici, ai fini di una maggiore comprensione
   dell'epidemiologia della malattia/delle malattie nella Comunità europea,
   conformemente al compiti assegnati al laboratorio di riferimento.
   Oltre a questi compiti, il laboratorio comunitario di riferimento effettua
   una tipizzazione antigenica completa di tutti i virus dell'influenza
   ricevuti. Per i virus H5 e H7 con indici di patogenicità intravenosa non
   superiori a 1,2, si dovrebbe effettuare altresì un sequenziamento dei
   nucieotidi del gene del l'emoagglutinina per determinare l'eventuale presenza
   di amminoacidi basici multipli nel sito di clivaggio della proteina
   de 11'emoaggI ut In i na.
 ---pagebreak---                                              -Zi-
                                     CAPITOLO 4
           Prove sierologiche per individuare gii anticorpi del virus
                               dell'influenza aviare
1. Nei programmi di eradicazione in cui è noto il sottotipo H del virus, oppure
   se si usa come antigene il virus omologo, il monitoraggio sierologico per la
   rivelazione dell'infezione può essere effettuato mediante le prove
   d'inibizione dell'emoagglutinazione di cui ai capitoli 5 e 6.
   Se il sottotipo di emoagglutinina non è noto, l'infezione da virus A
   dell'influenza può essere dimostrata mediante la rivelazione di anticorpi
   contro gli antigeni specifici del gruppo. A questo scopo si può ricorrere
   alla prova di doppia immunodiffusione (descritta al capitolo 9) oppure alla
   prova ELISA (che presenta peraltro il problema di essere specifica
   all'ospite, in quanto dipende dalla rivelazione delle immunogIobuIine
   dell'ospite). La prova di doppia immunodiffus ione dà raramente risultati
   positivi negli uccelli acquatici, tranne quando è noto il sottotipo; si può
   quindi utilizzare su questo tipo di volatili soltanto per la ricerca di
   anticorpi dei sottotipi H5 e H7.
2. (a) campioni
   Prelevare campioni di sangue da tutti i volatili, se il branco è costituito
   da meno di 20 capi, e da 20 esemplari in caso di branchi più numerosi (si ha,
   in tal modo, una probabilità superiore al 99% di individuare almeno un caso
   siero-positivo se almeno il 25% degli individui del branco é positivo,
   indipendentemente dalle dimensioni del branco stesso). Lasciar coagulare il
   sangue e asportare il siero da sottoporre alla prova.
   (b) Ricerca deoli anticorpi
   Verificare la capacità di singoli campioni di siero di inibire l'antigene
   emoagglut inante del virus del l'I.A. mediante prove standard di inibizione
   dell'emoagglutinazione come indicato nel capitolo 6.
 ---pagebreak---                                                 -Zk-
Un aspetto discusso é se nella prova di inibizione del l'emoagglutinante occorre
usare 4 o 8 unità di emoagglutinina. Entrambe le ipotesi sembrano valide; la
scelta deve essere quindi lasciata a discrezione dei laboratori nazionali.
Tuttavia l'antigene usato incide sul livello al quale un siero è considerato
positivo: usando 4 unità di emoagglutinina, un siero è considerato positivo se
rivela un titolo uguale o superiore a 2 4 ; usando 8 unità dì emoagglutinina, un
siero ò considerato positivo se rivela un titolo uguale o superiore a 2 3 '
                                     CAPITOLO s
                           PROVA PI EMOAGGLUTINAZIONE (HA)
Reagent i
 1. Soluzione salina isotonica tamponata con fosfato (0.05M) al pH 7,0-7,4.
2. Prelevare globuli rossi da almeno 3 volatili esenti da organismi patogeni
    specifici (in caso di impossibilità, il sangue può' essere prelevato da
    volatili regolarmente sottoposti a controllo e che non presentano anticorpi
    del I'influenza aviare), raggrupparli e aggiungerli ad un volume uguale di
    soluzione di Al sever. Prima dell'uso, i globuli rossi devono essere lavati 3
    volte in soluzione salina tamponata con fosfato. Per l'esecuzione della prova
    si raccomanda una sospensione all' 1% (globuli confezionati v/v) in soluzione
    sai ina tamponata.
3. Il laboratorio comunitario di riferimento fornirà o raccomanderà, come
    antigene standard, I virus H5 e H7 a bassa virulenza.
Procedimento
1. Porre 0,025 mi di soluzione in ciascuno dei pozzetti di una piastra di
    microtitolazione in materiale plastico (usare pozzetti a V ) .
2. Versare 0,025 mi di sospensione del virus (ad esempio liquido ailantoico) nel
    primo pozzetto.
3. Usare un diluente da microtitolazione per raddoppiare la diluizione (da 1:2 a
    1:4096) di virus nella piastra.
4. Aggiungere altri 0,25 di soluzione salina in ogni pozzetto.
5. Aggiungere 0,025 mi di globuli rossi all' 1% in ogni pozzetto.
 ---pagebreak---                                            -zy-
6. Mescolare agitando leggermente e porre a riposo alla temperatura di 4*C.
7. La lettura viene effettuata 30-40 minuti dopo, una vol ta stabi Iizzati i
   globuli rossi di controllo. La lettura si effettua inclinando la piastra ed
   osservando la presenza o l'assenza di globuli rossi raggruppati a forma di
   goccia. Il flusso nei pozzetti che non presentano emoagglutinazione deve
   essere identico a quello constatato presso i globuli rossi di controlio
   esenti dal virus.
8. Il titolo di emoagglut inazione é costituito dalla diluizione più elevata che
   provoca agglutinazione dei globuli rossi. Tale diluizione può' essere
   considerata come contenente una unità emoagglutinante (HAU). Un metodo più
   accurato per la determinazione del titolo di emoagglutinazione consiste
   nel l'effettuare prove di agglutinazione sul virus in una serie di diluizioni
   iniziali progressive, ad esempio 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, ecc. Si raccomanda
   questa procedura per una preparazione accurata dell'antigene per le prove di
   inibizione del l'emoagglutinazione (Capitolo 6 ) .
                                    CAPITOLO e
                    PROVA DI INIBIZIONE DELL'EMOAGGLUTINAZIONE
Reagent i
1. Soluzione salina tamponata con fosfato.
2. Liquido ailantoico contenente il virus, diluito nella soluzione sai ina in
   modo da avere un contenuto di 4 o 8 unità di emoagglutinazione per 0,025 mi.
3. Globuli rossi di pollame: 1%
4. Siero di pollame negativo di controllo.
5. Siero positivo di controllo.
Procedimento
1. Versare 0,025 mi di soluzione salina tamponata con fosfato in tutti i
   pozzetti di una piastra di microtitolazione in materiale plastico (i pozzetti
   devono avere una forma a V ) .
2. Versare 0,025 mi di siero nel primo pozzetto della piastra.
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3. Usare un diluente da microtitolazione per ottenere una diluizione di 1:2 di
   siero sul la piastra.
4. Aggiungere 0,025 mi di liquido ailantoico diluito contenente 4 o 8 unità di
   emoaggI utinazione.
5. Mescolare picchiettando e conservare alla temperatura di 4*C per almeno 60
   minuti o a temperatura ambiente per almeno 30 minuti.
6. Aggiungere 0,025 mi di globuli rossi all' 1% in tutti i pozzetti.
7. Mescolare picchiettando leggermente e porre a riposo alla temperatura di 4*C.
8. La lettura delle piastre è effettuata dopo 30-40 minuti, dopo che i globuli
   rossi di controllo si sono stabilizzati. La lettura viene effettuata
   inclinando la piastra e osservando se nel flusso del liquido vi é o meno
   formazione di gocce in misura uguale a quelle dei pozzetti di controllo che
   contengono unicamente globuli rossi (0,025 mi) e soluzione salina (0,05 m i ) .
9. Il titolo di inibizione delremoagglut inazione é costituito dalla diluizione
   massima di antisiero che comporta una inibizione totale di 4 o 8 unità di
   virus (ciascuna prova dovrebbe comprendere una titolazione di
   emoagglutinazione a scopo di conferma della presenza delle unità di
   agglutinazione richieste).
10. I risultati sono validi se si ottiene un titolo inferiore a 2* per 4 unità
    di agglutinazione o 2 2 per 8 unità di agglutinazione con il siero negativo
    di controllo ed un titolo inferiore o uguale a 1 con una diluizione del
    siero di controllo positivo del titolo noto.
                                       CAPITOLO 7
               PROVA DELL'INDICE DI PATOGENICITÀ ENDOVENOSA M VP M
1. Diluire di I O - 1 , in una soluzione isotonica salina sterile, liquido
   ailantoico infetto prelevato dall'ultimo livello di passaggio disponibile,
   preferibilmente dall'isolamento iniziale senza selezione.
2. Iniettare per via endovenosa 0,1 mi di virus diluito in dieci pulcini di se
   settimane (deve trattarsi di animali esenti dallo specifico patogeno).
3. Esaminare i pulcini per 10 giorni, ad intervalli di 24 ore.
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4. Classificare ognuno del pulcini ad ogni osservazione nel modo seguente: 0
   normale; 1 - malato; 2 - gravemente malato; 3 - morto.
5. L'indice è calcolato come ne II'esempio che segue:
     Sintomi clinici  Giorni successivi all'inoculaz       Punteggio
                             ~~                             totale
                        1 2 3 4      5 6 7 8 9          10
     normale            10 2  0 0  0   0   0   0     0   0 1 2 x 0 -  0
     malato              0 4  2  0   0   0   0   0   0   0   6 x 1 -  6
    gravemente malato    0 2  2 2  2   0   0   0   0     0   6 x 2 - 12
     morto               0 2  6  8 10 10 10 10 10       10 76 x 3 - 228
                                                           TOTALE - 246
  L'INDICE É COSTITUITO DAL PUNTEGGIO MEDIO PER PULCINO PER OGNI
  OSSERVAZIONE, OSSIA 246/100 - 2,46
*  Deve trattarsi di un giudizio clinico soggettivo; in questo caso, tuttavia, i
   volatili presentano generalmente uno o più dei seguenti sintomi:
   complicazioni respiratorie, depressione, diarrea, cianosi del l'epidermide o
   del bargiglio, edema facciale o cranico, sintomi neuropatologici.
                                    CAPITOLO 6
               VALUTAZIONE DELLA CAPACITA DI FORMAZIONE PI PLACCA
1. Il procedimento migliore consiste nel l'utiIizzare tutta una gamma di
   diluizioni di virus per essere certi di disporre.sulla piastra dei numeri
   ottimali di piacche. Dieci diluizioni fino a 10
   in soluzione salina fosfatata dovrebbero essere sufficienti.
2. Monostrati confluenti di cellule di embrione di votatile o una linea
   cellulare adeguata (ad esempio rene bovino Madin-Darby) sono preparati e
   disposti in scatole di Petri aventi 5 cm di diametro.
3. Aggiungere in due scatole di Petri 0,2 mi di ciascuna delle diluizioni di
   virus e lasciar assorbire il virus per 30 minuti.
4. Lavare 3 volte con la soluzione salina le cellule infette, indi ricoprirle
   con il mezzo pertinente, contenente I'1% p/v di agar e 0,01 mg/mi di
   tripsina, oppure non contenente tripsina; é importante non aggiungere siero
   ai mezzo di copertura.
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5. Dopo una incubazione a 37°C per 72 ore, le placche dovrebbero avere una
    dimensione sufficiente. Per una migliore osservazione delle placche,
    asportare lo strato di agar di copertura e colorare il monostrato cellulare
    con cristalvioletto (0,5% p/v) in metanolo al 25% v/v.
6. Tutti i virus dovrebbero fornire placche evidenti, se incubati alla presenza
    di tripsina nello strato di copertura. Se nel mezzo di copertura non vi é
    tripsina, soltanto I virus virulenti per i volatili producono placche.
                                    CAPITOLO 9
                              IMMUNODIFFUSIONS DOPPIA
 Il metodo raccomandato per rivelare la presenza del virus A dell'influenza
consiste nel I'individuare gli antigeni del nucleocapside o della matrice, che
sono comuni a tutti i virus A dell'influenza. A ciò si perviene generalmente
mediante le prove di immunodiffusione doppia, utilizzando preparazioni di virus
concentrati o estratti di membrana cor io-ai tanto idea infetta.
Idonei preparati di virus concentrati si possono ottenere semplicemente
centrifugando ad alta velocità liquido ailantoico infetto e sottoponendolo ad un
trattamento a base di detergente lauro!Isarcosinato di sodio, in modo che dal
frazionamento del virus siano liberati gli antigeni che si trovano all'interno
del nucleocapside e della matrice. Si può usare anche un precipitante acido,
aggiungendo al liquido ailantoico HCL 1N, per ottenere un pH finale di 3,5-4,0,
refrigerando per circa un'ora a 0°C e centrifugando a bassa velocità (1000 g)
per 10 minuti. Il liquido supernatante può essere eliminato ed il precipitato
contenente il virus può essere rimesso in sospensione in un volume minimo di
tampone gìicina-sarcosile (lauroiIsarcosinato di sodio all' 1% tamponato con
glicina 0.5M, fino ad ottenere un pH di 9,0). Queste preparazioni possiedono
antigeni sia del nucleocapside che della matrice.
Beard (1970) ha descritto la preparazione di antigeni ricchi di nucleocapside
ottenuti dalle membrane cor io-ailantoidee prelevate da uova infette. Il
procedimento si svolge come segue: si estraggono le membrane cor io-ailantoidee
dalle uova infette con emoagglutinina positiva; si frantumano od omogeneizzano
le membrane; si congela e sgela tre volte, centrifugando quindi per 10 minuti a
1000 g; si elimina il deposito formatosi e si tratta il liquido supernatante con
formalina allo 0,1% per utilizzarlo come antigene.
 ---pagebreak---                                                -l%-
Entrambi questi antigeni possono essere utilizzati per la prova di
immunodiffus ione doppia, con gel di agarosio o di agar contenente cloruro di
sodio ali'8% portato a molar ita 0,1 con tampone fosfato a pH 7,2. li virus A
dell'influenza é confermato dal le linee di precipitina formate dall'antigene di
prova e dall'antigene positivo noto, prendendo come termine di riferimento un
antisiero positivo noto che, coalescendo, producono una linea d'identità.
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                                    ALLEGATO 11
Elenco dei laboratori nazionali designati per l'influenza aviare
   Belgio                   Institut national de recherches vétérinaires,
                           Groeselenberg 99, B-1180 Bruxelles
   Danimarca               National Veterinary Laboratory, Poultry Disease
                           Division, Hangovej 2, DK-8200 Aarhus N.
   Germania                 Institut fur Kleintierzucht der Bundesforschungs-
                           anstalt fur Landwirtschaft, Braunschweig-
                           Vôlkenrode, Postfach 280, D-3100 Celle
   Francia                 Centre National d'Etudes Vétérinaires er Alimen-
                           tation - Laboratoire Central de Recherches
                           Agricoles et Porcine, B.P. 53, F-22440 Pioufragan
   Grecia
   Irlanda                 Veterinary Research Laboratory, Abbotstown,
                           Casti eknock, Dublin 15
   Italia                   Istituto Patologia Aviare, Facoltà di Medicina
                           Veterinaria, Università di Napoli,
                           Via Aniezzo Falcone 394,
                            I - 80127 Napoli-F Delfino 1
   Lussemburgo             Institut National de Recherches Vétérinaires,
                           Groeselenberg 99, B-1180 Bruxelles
   Paesi Bassi             Centraal Diergeneeskundig Instituut, Vestiging
                           Virologie, Hourtibweg 39, NL-8221 RA Lelystad
   Por toga I lo           Laboratòrio Nacional de Investigaçao Veterinaria
                           (LNIV), Estrada de Benfica 701, 1500 Lisboa
   Spagna
   Regno Unito             Central Veterinary Laboratory, New Haw, Weybridge
                           GB-Surrey KT15 3NB
 ---pagebreak---                                    ALLEGATO M l
          Laboratorio Comunitario di riferimento per l'influenza aviare
Central Veterinary Laboratory
New Haw
Weybridge
Surrey KT15 3NB
United Kingdom
 ---pagebreak---                                                                      ISSN 0254-150S
                                                              COM(91)304def.
                                                           DOCUMENTI
IT                                                                               03
                                          N. di catalogo : CB-CO-91-344-IT-C
                                                             ISBN 92-77-74819-2
Ufficio delle pubblicazioni ufficiali delle Comunìtà europee
L-2985 Lussemburgo