CELEX: 31997D0647
Language: it
Date: 1997-09-09 00:00:00
Title: 97/647/CE: Decisione della Commissione del 9 settembre 1997 che stabilisce un sistema temporaneo di prove per la diagnosi, la rivelazione e l'individuazione di Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith nelle patate

Avis juridique important

|

31997D0647

97/647/CE: Decisione della Commissione del 9 settembre 1997 che stabilisce un sistema temporaneo di prove per la diagnosi, la rivelazione e l'individuazione di Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith nelle patate  

Gazzetta ufficiale n. L 273 del 06/10/1997 pag. 0001 - 0025

DECISIONE DELLA COMMISSIONE del 9 settembre 1997 che stabilisce un sistema temporaneo di prove per la diagnosi, la rivelazione e l'individuazione di Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith nelle patate (97/647/CE)LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,visto il trattato che istituisce la Comunità europea,vista la direttiva 77/93/CEE del Consiglio, del 21 dicembre 1976, concernente le misure di protezione contro l'introduzione nella Comunità di organismi nocivi ai vegetali o ai prodotti vegetali e contro la loro diffusione nella Comunità (1), modificata da ultimo dalla direttiva 97/14/CE (2), in particolare l'articolo 15, paragrafo 3,considerando che la decisione 95/506/CE della Commissione, del 24 novembre 1995, che autorizza gli Stati membri ad adottare, a titolo provvisorio, misure supplementari contro la propagazione dello Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith relativamente al Regno dei Paesi Bassi (3), modificata dalla decisione 96/599/CE (4), in particolare l'articolo 1, paragrafo 2, lettera a), punto bb) prevede che, qualora gli Stati membri effettuino sulle patate prove ufficiali o sotto controllo ufficiale, per Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith deve essere seguita la procedura di quarantena n. 26 stabilita dall'Organizzazione europea e mediterranea per la protezione delle piante (OEPP) (5) o un altro procedimento approvato conformemente al disposto dell'articolo 16 bis della direttiva 77/93/CEE;considerando che il gruppo di esperti ad hoc per le malattie batteriche delle piante, creato dai servizi della Commissione delle Comunità europee nell'ambito del comitato fitosanitario permanente, ha stabilito le modalità relative ad un sistema temporaneo di prove, che tiene conto dei più efficaci procedimenti di rivelazione e di esame messi a punto successivamente alla pubblicazione della procedura di quarantena n. 26 dell'OEPP; che tale sistema di prove ha un carattere temporaneo, in quanto sono previste altre ricerche, concernenti segnatamente la sensibilità e la specificità dei singoli procedimenti, al fine di selezionare i migliori fra di essi per includerli in un metodo aggiornato di controllo;considerando che il sistema temporaneo di prove previsto dalla presente decisione è conforme al parere del comitato fitosanitario permanente,HA ADOTTATO LA PRESENTE DECISIONE:Articolo 1Al fine di attuare le disposizioni di cui all'articolo 1, paragrafo 2, lettera a), punto bb) della decisione 95/506/CE, quale da ultimo modificata, la procedura di quarantena n. 26 stabilita per Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith dall'Organizzazione europea e mediterranea per la protezione delle piante (OEPP) è sostituita dal sistema temporaneo di prove per la diagnosi, la rivelazione e l'individuazione di Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, figurante nell'allegato alla presente decisione.Articolo 2Gli Stati membri sono destinatari della presente decisione.Fatto a Bruxelles, il 9 settembre 1997.Per la CommissioneFranz FISCHLERMembro della Commissione(1) GU L 26 del 31. 1. 1977, pag. 20.(2) GU L 87 del 2. 4. 1997, pag. 17.(3) GU L 291 del 6. 12. 1995, pag. 48.(4) GU L 265 del 18. 10. 1996, pag. 18.(5) Bollettino EPPO/OEPP 20, 255-262 (1990).ALLEGATO SCHEMA PROVVISORIO PER LA DIAGNOSI, IL RILEVAMENTO E L'IDENTIFICAZIONE DI PSEUDOMONAS SOLANACEARUM (SMITH) SMITH SCOPO DELLO SCHEMA DIAGNOSTICO Questo schema descrive i vari procedimenti da usare per:i) la diagnosi del marciume bruno nelle piante e nei tuberi di patata,ii) il rilevamento di Pseudomonas solanacearum nei campioni di tuberi di patata,iii) l'identificazione di Pseudomonas solanacearum.Nelle appendici vengono descritte le modalità per la preparazione dei materiali per i saggi, cioè terreni di coltura, tamponi, soluzioni, reagenti.INDICE Sezione I Applicazione dello schema . 41. Diagnosi del marciume bruno nelle piante e nei tuberi di patata . 42. Rilevamento e identificazione di Pseudomonas solanacearum in campioni di tuberi di patata . 6Sezione II Diagnosi del marciume bruno nelle piante e nei tuberi di patate . 81. Sintomi del marciume bruno . 82. Saggi rapidi per selezione preliminare . 83. Procedimento di isolamento . 94. Saggi di conferma . 9Sezione III Rilevamento e identificazione di Pseudomonas solanacearum in campioni di tuberi di patata . 121. Preparazione del campione per i saggi . 122. Colorazione di immunofluorescenza (IF) . 133. Saggio immunoenzimatico (Elisa) . 154. Reazione a catena del DNA polimerasi (PCRTM) . 155. Isolamento selettivo in piastra . 176. Saggio biologico . 187. Prove di arricchimento . 188. Prova di patogenicità . 18Appendice 1 Substrati nutritivi per l'isolamento e la coltura di Pseudomonas solanacearum . 19Appendice 2 Materiali per la preparazione del campione . 20Appendice 3 Materiali per il saggio IF . 21Appendice 4 Determinazione del livello di contaminazione nella prova IF . 22Appendice 5 Materiali per il saggio Elisa . 23Appendice 6 Materiali per la prova PCR . 24Appendice 7 Materiali per isolamento selettivo su piastra . 24Bibliografia . 25SEZIONE I APPLICAZIONE DELLO SCHEMA 1. Diagnosi del marciume bruno nelle piante e nei tuberi di patata Il procedimento qui indicato è da applicarsi alle piante e ai tuberi con sintomi tipici o sospetti di marciume bruno. Esso comporta una prova rapida di selezione preliminare, l'isolamento dell'agente patogeno dal tessuto vascolare infetto su terreni di coltura diagnostici e, in caso di esito positivo, l'identificazione della coltura come Pseudomonas solanacearum.Diagramma di flusso >RIFERIMENTO A UN GRAFICO>Riferimenti del diagramma di flusso >INIZIO DI UN GRAFICO>(1) La descrizione dei sintomi è fornita nella sezione II, paragrafo 1.(2) I saggi rapidi di selezione preliminare permettono di formulare una diagnosi presunta.I saggi idonei sono:- fuoriuscita a filamenti della massa batterica dal tessuto vascolare del fusto (sezione II, paragrafo 2);- saggio dei granuli di poli-beta-idrossibutirrato (sezione II, paragrafo 2);- colorazione IF (sezione III, paragrafo 2);- Saggio Elisa (sezione III, paragrafo 3);- PCR (sezione III, paragrafo 4).(3) Sebbene l'isolamento del patogeno da materiali con sintomi tipici mediante la tecnica della diluizione in piastra sia immediato, in fasi avanzate di infezione la crescita delle sue colonie può non aver luogo. I batteri saprofiti che si sviluppano nel tessuto malato possono eliminare o inibire il patogeno sul substrato di isolamento. Se l'isolamento è negativo, ma i sintomi della malattia sono tipici, l'isolamento deve essere ripetuto, preferibilmente su un substrato selettivo.(4) Si può perseguire una identificazione affidabile di una coltura pura di Pseudomonas solanacearum per mezzo di almeno uno dei saggi elencati nella sezione II, paragrafo 4.1 abbinata a una prova di patogenicità (sezione II, paragrafo 4.3). La caratterizzazione del ceppo è facoltativa ma è consigliabile per ogni nuovo caso.>FINE DI UN GRAFICO>2. Rilevamento e identificazione di Pseudomonas solanacearum in campioni di tuberi di patata Il procedimento è inteso a rilevare le infezioni latenti nei tuberi di patata mediante uno o, preferibilmente, più saggi di selezione preliminare che, se positivi, vengono confermati dall'isolamento del patogeno e quindi, in caso di isolamento di colonie tipiche, dall'identificazione di una coltura pura di Pseudomonas solanacearum.Diagramma di flusso >RIFERIMENTO A UN GRAFICO>Riferimenti del diagramma di flusso >INIZIO DI UN GRAFICO>(1) CampioneIl campione standard è di 200 tuberi. Tuttavia il procedimento può essere convenientemente applicato anche a campioni aventi meno di 200 tuberi.(2) Saggio (saggi) di selezione preliminareUn singolo saggio di selezione preliminare può non essere sufficientemente sensibile o affidabile per rilevare Pseudomonas solanacearum in un campione. È quindi consigliabile eseguire più di un saggio. Se possibile, tali saggi dovrebbero essere fatti con metodologie differenti.(3) Colorazione di immunofluorescenza (IF)La colorazione IF (metodo indiretto) è un saggio di selezione preliminare ben collaudato. Esso ha pertanto vantaggi rispetto ad altre prove non ancora pienamente sviluppate o convalidate. Secondo i parametri di lettura specificati in tale metodo si tratta di un saggio sensibile (soglia di 103-104 cellule per ml di pellet di estratto di patata).Il fattore critico per l'affidabilità dell'esito del saggio è la qualità dell'antisiero. Solo un antisiero ad alto titolo (minimo 2 000 per l'antisiero grezzo) è accettabile e tutte le prove devono essere eseguite con antisiero a tale titolo o con una diluizione inferiore a detto titolo. Il metodo indiretto è preferibile. Il metodo diretto può essere usato se il saggio ha un livello di sensibilità e di specificità equivalente a quello del metodo indiretto.Il saggio IF ha il vantaggio di consentire una interpretazione soggettiva della morfologia di colorazione della cellula e dell'intensità della fluorescenza che forniscono le informazioni sulla specificità della reazione. Sono frequenti le reazioni incrociate con batteri sierologicamente affini provenienti dal suolo o associati a tessuti della patata con morfologia cellulare di Pseudomonas solanacearum. Il saggio IF può essere usato come unico saggio di selezione preliminare sebbene, qualora si sospettino reazioni incrociate, dovrebbe essere fatto un saggio preliminare addizionale basato su differente base biologica. In questi casi l'isolamento selettivo è il più appropriato.(4) Isolamento selettivo in piastraSi tratta di un saggio sensibile e selettivo per Pseudomonas solanacearum se fatto con substrato SMSA modificato e con la metodologia specificata in questo schema. Il risultato è disponibile da 3 a 6 giorni dopo la preparazione del campione. Il patogeno viene ottenuto direttamente in coltura e può essere facilmente identificato. Ai fini di un perfetto sfruttamento del suo potenziale, il saggio richiede un'accurata preparazione di coni ombelicali piccoli per eliminare i batteri secondari associati al tessuto della patata che sono competitori di Pseudomonas solanacearum sul terreno di coltura e ne possono influenzare la crescita. Alcuni ceppi possono stentare a crescere in quanto anche i componenti del terreno possono condizionare l'organismo obiettivo. Occorre particolare attenzione anche per distinguere Pseudomonas solanacearum da altri batteri che si possono sviluppare sul terreno di coltura. L'isolamento selettivo in piastra può essere usato come unico saggio di selezione preliminare sebbene, nel caso in cui si ottenga un risultato negativo e si sospetti l'inibizione di Pseudomonas solanacearum da parte di altri batteri presenti sul terreno di coltura, dovrebbe essere fatto un saggio di selezione preliminare di altro tipo per confermare o confutare la diagnosi. In tali casi, la colorazione IF è la più appropriata.(5) Saggio ElisaIl saggio Elisa è generalmente meno sensibile della colorazione IF (soglia di 104-105 cellule/ml di pellet di estratto di patata). Il saggio è economico e veloce ma, generalmente, è più soggetto a falsi risultati positivi (reazioni incrociate) e a falsi risultati negativi (inibizione da parte di molecole fenoliche nell'estratto di patata). È richiesta una specificità dell'antisiero estremamente alta. Il saggio Elisa non può essere usato come unico saggio di selezione preliminare.(6) PCRIl saggio PCR ha potenzialmente un'elevata sensibilità di rilevamento. Il saggio viene facilmente inibito da componenti presenti nell'estratto di pianta o di tubero che portano a una falsa negatività. Alcune cultivar di patata contengono più inibitori di altre. È pertanto necessario rimuovere tali inibitori. Gli inibitori possono essere evitati con la diluizione, ma in tal modo anche le popolazioni di Pseudomonas solanacearum vengono diluite. È necessario prestare molta attenzione in tutte le fasi di preparazione del campione e del saggio per impedire la contaminazione che porterebbe a risultati falsamente positivi. Falsi risultati positivi possono derivare anche da sequenze omologhe presenti in altri organismi. Per tali motivi la PCR diretta non può essere usata come unico saggio di selezione preliminare.(7) Prova di arricchimentoL'incubazione di campioni di sedimenti di centrifuga di estratto di patata in un brodo di coltura semiselettivo, come un brodo SMSA modificato, consente la moltiplicazione di Pseudomonas solanacearum. Inoltre, cosa forse ancora più importante, diluisce i potenziali inibitori dei saggi Elisa o PCR. Pseudomonas solanacearum può in tal modo essere rilevato nel brodo di arricchimento con i saggi IF, Elisa o PCR. Non consigliamo di fare l'isolamento diretto in piastra usando i brodi arricchiti. Questi metodi di arricchimento non sono stati ancora sperimentati e provati in modo approfondito. Sono stati inclusi in questo schema per il loro buon potenziale. Tuttavia, data la relativa mancanza di esperienza nella loro esecuzione, non possono essere utilizzati come unici metodi di rilevamento.(8) Saggio biologicoIl saggio biologico è usato per l'isolamento di Pseudomonas solanacearum dai sedimenti di centrifuga di estratti di patata sfruttando una pianta ospite come mezzo selettivo di arricchimento e può essere fatto su piante di pomodoro o di melanzana. Il saggio richiede condizioni ottimali di incubazione, come specificato in tale metodo. È molto probabile che in tale saggio i batteri inibitori di Pseudomonas solanacearum sul mezzo SMSA non interferiscono.(9) Saggio(i) di confermaÈ possibile ottenere una identificazione affidabile di coltura pura di Pseudomonas solanacearum almeno con uno dei saggi elencati nella sezione II, paragrafo 4.1 abbinata a una prova di patogenicità (sezione II, paragrafo 4.3). La caratterizzazione del ceppo è facoltativa, anche se consigliabile per ogni nuovo caso.>FINE DI UN GRAFICO>SEZIONE II DIAGNOSI DEL MARCIUME BRUNO NELLE PIANTE E NEI TUBERI DI PATATA 1. Sintomi del marciume bruno Pianta di patata La fase iniziale dell'infezione consiste nella perdita di turgore delle foglie della parte superiore della pianta con le alte temperature diurne e loro ripresa durante la notte. La flaccidezza si aggrava, diventa presto irreversibile e porta a morte la pianta. Il tessuto vascolare dei fusti di piante avvizzite tagliato trasversalmente può diventare bruno e un liquido lattiginoso può essudare dalla superficie tagliata o può essere facilmente fatto uscire per compressione. Quando uno stelo tagliato viene immerso verticalmente in acqua, filamenti di mucillagine colano dai fasci vascolari.Tubero di patata I tuberi di patata devono essere tagliati trasversalmente vicino all'ombelico (punto di attacco dello stolone). La fase iniziale dell'infezione consiste in una alterazione di colore da giallo vitreo a marrone chiaro dell'anello vascolare da cui fuoriesce spontaneamente un liquido color crema chiaro dopo pochi minuti o quando viene esercitata una lieve pressione delle dita sulla buccia vicino alla superficie sezionata. In seguito lo scoloramento vascolare diventa di un marrone più netto e la necrosi può estendersi al tessuto parenchimatico. Nelle fasi avanzate l'infezione si espande centrifugamente sino ad emergere in corrispondenza dell'ombelico e degli occhi dove causa tacche bruno-rossastre, leggermente infossate e fuoriscita di gocciole di essudato cui rimangono aderenti particelle di terreno.2. Saggi rapidi per selezione preliminare Un saggio di selezione preliminare facilita la formulazione di una diagnosi presunta. Usare uno o più dei seguenti saggi.Prova dell'essudato batterico sul fusto La presenza di Pseudomonas solanacearum nei fusti di patata aventi foglie flaccide può essere accertata mediante la seguente prova presuntiva.Tagliare lo stelo appena al di sopra del livello del suolo. Porre la superficie tagliata in un bicchiere contenente acqua. Poco dopo, filamenti di mucillagine batterica coleranno spontaneamente dai fasci vascolari. Altri batteri che causano infezione vascolare nelle piante di patate non provocheranno questo fenomeno.Rilevamento dei granuli di poli-beta-idrossibutirrato (PHB) I granuli PHB nelle cellule di Pseudomonas solanacearum sono resi visibili con la colorazione blu Nilo A o nero Sudan B.Preparare uno striscio dell'essudato o della sospensione di tessuto su un vetrino da microscopio oppure preparare uno striscio di una coltura di 48 ore su YPGA o SPA (appendice 1). Preparare strisci di controllo positivo di un ceppo biovar 2, razza 3.Lasciare seccare. Passare rapidamente diverse volte la parte inferiore del vetrino sopra la fiamma fino a quando lo striscio sia fissato.Colorazione blu Nilo 1. Coprire lo striscio fissato con una soluzione acquosa all'1 % di blu Nilo A. Mantenere in incubazione per 10 minuti a 55 °C.2. Far sgocciolare la soluzione colorante. Lavare rapidamente sotto un getto leggero di acqua corrente. Eliminare l'acqua in eccesso con carta bibula.3. Coprire lo striscio con una soluzione di acido acetico all'8 %. Mantenere in incubazione per 1 minuto a temperatura di laboratorio.4. Lavare sotto un getto leggero di acqua corrente. Asciugare tamponando con carta bibula.5. Riumidificare con una goccia d'acqua. Applicare un vetrino coprioggetto.6. Esaminare lo striscio colorato con un microscopio a epifluorescenza a 450 nm in olio da immersione a 1 000 ingrandimenti.Osservare se vi sia una fluorescenza arancio vivo dei granuli PHB. Osservare anche a luce normale per accertare che i granuli siano intracellulari e che la morfologia della cellula sia tipica di Pseudomonas solanacearum.Colorazione nero Sudan 1. Coprire lo striscio fissato con una soluzione allo 0,3 % di nero Sudan B in 70 % di etanolo. Mantenere in incubazione per 10 minuti a temperatura ambiente.2. Far sgocciolare la soluzione colorante. Lavare rapidamente in acqua corrente. Eliminare l'acqua in eccesso con carta bibula.3. Immergere rapidamente lo striscio in xilolo. Asciugare tamponando con carta bibula.Attenzione! Lo xilolo è un prodotto nocivo. Operare in ambiente provvisto di cappa a tiraggio forzato.4. Coprire lo striscio con una soluzione acquosa di safranina allo 0,5 % (p/v) e lasciare per 10 secondi a temperatura ambiente.Attenzione! La safranina è un prodotto nocivo. Operare in ambiente provvisto di cappa a tiraggio forzato.5. Lavare sotto un getto leggero di acqua corrente. Asciugare tamponando con carta bibula. Applicare un vetrino coprioggetto.6. Esaminare lo striscio colorato con un microscopio ottico a luce trasmessa con olio da immersione a 1 000 ingrandimenti.I granuli PHB in cellule di Pseudomonas solanacearum si colorano di blunero. La parete della cellula si colora di rosa.Altri saggi Altri saggi appropriati per la selezione preliminare sono la colorazione IF (sezione III.2), il saggio Elisa (sezione III.3) e il saggio PCR (sezione III.4).3. Procedimento di isolamento 3.1. Rimuovere l'essudato o le parti di tessuto cromaticamente alterate dall'anello vascolare del tubero e dai fasci vascolari dello stelo. Sospenderlo in una piccola quantità di acqua distillata sterile o in tampone fosfato a 50 mM. Lasciare riposare per 5-10 minuti.3.2. Della sospensione preparare almeno due diluizioni decimali, 1:10 e 1:100, od altre se opportune.3.3. Trasferire un volume standard della sospensione su un substrato nutritivo generale (NA, YPGA, SPA, appendice 1) e/o sul substrato di Kelman al tetrazolio (appendice 1) e/o sul substrato selettivo SMSA (appendice 7) e inseminare le piastre con tecnica appropriata o con un'ansa, arroventandola tra un inseminamento e l'altro. Se viene usato SMSA, preparare a parte una serie di piastre con una colture diluita in sospensione di cellule di Pseudomonas solanacearum di ceppo virulento biovar 2, razza 3, come controllo positivo.3.4. Mantenere le piastre in incubazione per 3 giorni a 28 °C. L'incubazione può essere prolungata fino a 6 giorni se la crescita è lenta, ma le colonie su piastre di SMSA spesso divengono atipiche e muoiono.Sul terreno nutritivo generale gli isolati virulenti di Pseudomonas solanacearum sviluppano colonie bianco-perlacee, piatte, irregolari e fluide, spesso con caratteristici vortici.Sul substrato di Kelman le colonie tipiche degli isolati virulenti di Pseudomonas solanacearum sono fluide, irregolari, piatte, bianco-latte, con vortici color rosso sangue al centro. Le forme avirulente di Pseudomonas solancearum divengono butirrose di color rosso scuro.Su substrato SMSA gli isolati virulenti di Pseudomonas solanacearum sviluppano colonie bianco latte, piatte, irregolari e fluide con centri color rosso sangue.Le forme non virulente di Pseudomonas solancearum sviluppano colonie meno fluide che sono completamente di colore tra il rosa e il rosso.3.5. Purificare le colonie con morfologia caratteristica mediante subcoltura su un terreno nutritivo generale. Evitare di fare subcolture ripetute che possono portare a perdita di virulenza.4. Saggi di conferma 4.1. Identificazione di Pseudomonas solanacearum Identificare le colture pure di Pseudomonas solanacearum con almeno uno dei seguenti procedimenti:Saggi nutrizionali ed enzimatici Nota: includere appropriati ceppi di controllo in ogni saggio che si effettua.Sono universalmente presenti o assenti le seguenti proprietà fenotipiche:>SPAZIO PER TABELLA>Substrati e metodi reperibili su Lelliott e Stead (1987).Colorazione IFPreparare una sospensione di concentrazione a 106 cellule per ml dalla coltura in esame e da un ceppo di controllo positivo. Preparare una serie di diluizioni 1:2 dell'antisiero. Applicare il procedimento IF (sezione III, paragrafo 2). Il titolo IF della coltura in esame deve essere equivalente a quella del controllo positivo.Saggio ElisaPreparare una sospensione di concentrazione superiore a 106 cellule per ml dalla coltura in esame e da un ceppo di controllo positivo. Applicare il procedimento Elisa (sezione III, paragrafo 3). Il valore Elisa della coltura in esame deve essere equivalente a quello del controllo positivo.Saggio PCRPreparare una sospensione di 106 cellule per ml dalla coltura in esame e da un ceppo di controllo positivo. Applicare la PCR (sezione III, paragrafo 4). Il prodotto PCR della coltura in esame deve avere le stesse dimensioni e profilo enzimatico di restrizione (REA) del controllo positivo.Ibridazione fluorescente in situ (FISH)Preparare una sospensione di 106 cellule per ml dalla coltura in esame e da un ceppo di controllo positivo. Applicare il procedimento FISH (Van Beuningen et al., 1995) con il primer OLI-1 PCR (Seal et al., 1993). La coltura in esame deve manifestare la stessa reazione del controllo positivo.Profilo delle proteineLe proteine cellulari totali denaturate vengono separate mediante elettroforesi in gel di poliacrilamide - PAGE (Stead, 1992a).Profilo degli acidi grassi (FAP)Far crescere la coltura in esame e un ceppo di controllo positivo per 48 ore a 28 °C su TSA e applicare il procedimento FAP (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead, 1992b). Il profilo della coltura in esame deve essere identico a quello del controllo positivo. In base alle condizioni specificate, gli acidi grassi caratteristici sono: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH e 18:1 2OH.4.2. Caratterizzazione del ceppo La caratterizzazione del ceppo è opzionale, ma si raccomanda per ogni nuovo caso usando almeno uno dei seguenti schemi:Determinazione delle biovar Pseudomonas solanacearum è suddiviso in biovar in base alla capacità di produrre acidità da tre alcoli esosi e tre zuccheri (Hayward, 1964 & 1994).>SPAZIO PER TABELLA>Ulteriori saggi differenziano la biovar 2 in subfenotipi (Hayward, 1994):>SPAZIO PER TABELLA>Determinazione della razza La razza (Buddenhagen et al., 1962) viene determinata con prova di patogenicità su piante di pomodoro o melanzana e su piante di tabacco e con la reazione di ipersensibilità (HR) nelle foglie di tabacco (Lozano e Sequeira, 1970):>SPAZIO PER TABELLA>La caratterizzazione della razza in base ai saggi di patogenicità o di ipersensibilità su tabacco può non essere molto affidabile ed allora può essere dedotta dalla biovar e dall'ospite naturale di origine.La coltura in esame può essere ulteriormente caratterizzata mediante le seguenti tecniche.Impronte genomiche La differenziazione molecolare dei ceppi nel complesso di Pseudomonas solanacearum può essere effettuata mediante:- analisi RFLP (Cook et al., 1989).- PCR su sequenze ripetute [REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995)].4.3. Prova di patogenicità Questa prova è intesa per confermare la diagnosi di Pseudomonas solanacearum e per valutare la virulenza delle colture identificate come Pseudomonas solanacearum.Preparare un inoculo di 106 cellule per ml dalla coltura in esame e da un ceppo di controllo positivo. Inoculare 5-10 piante di pomodoro o melanzana preferibilmente allo stadio fogliare 3 (sezione III, paragrafo 6). Mantenere in incubazione per un massimo di due settimane a temperatura tra 22 °C e 28 °C ed alta umidità relativa e innaffiare giornalmente. Tenere in osservazione per sintomi di collasso e/o epinastia, clorosi e nanismo.Effettuare isolamenti dalle piante sintomatiche come segue:- asportare una sezione di tessuti di fusto, 2 cm sopra il punto di inoculazione,- ridurla a pezzetti, sospendere il tutto in un piccolo volume di acqua distillata o di tampone fosfato 50 mM, inseminare in piastra, incubare e controllare se si sviluppano colonie di Pseudomonas solanacearum.SEZIONE III RILEVAMENTO E IDENTIFICAZIONE DI PSEUDOMONAS SOLANACEARUM IN CAMPIONI DI TUBERI DI PATATA Nota: Il campione standard è di 200 tuberi. Tuttavia il procedimento può essere convenientemente applicato anche a campioni aventi meno di 200 tuberi.1. Preparazione del campione per i saggi N.B.: Il sedimento di centrifuga di estratto di patata ottenuto in questo procedimento può essere usato anche per il rilevamento di Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.Procedere alle seguenti opzioni prima del saggio, se ritenuto utile.i) Mantenere in incubazione il campione a 25-30 °C per un massimo di 2 settimane per favorire la moltiplicazione di basse popolazioni di Pseudomonas solanacearum;ii) lavare i tuberi in acqua corrente con disinfettanti e detergenti appropriati. Far asciugare i tuberi all'aria.1.1. Rimuovere la buccia con un bisturi o con un coltello per ortaggi intorno all'ombelico del tubero in modo da rendere visibili i tessuti vascolari. Asportare accuratamente un piccolo cono (3-5 mm di diametro) di tessuto vascolare dall'ombelico di ciascun tubero. Ridurre al minimo la quantità di tessuto non vascolare. Togliere il cono ombelicale da ciascun tubero del campione.N.B.: L'esame viviso dei tuberi (sezione II, paragrafo 1) può essere effettuato durante questa fase. Mettere da parte i tuberi con sintomi gravemente marcescenti e saggiarli individualmente (sezione II).1.2. Raccogliere i coni ombelicali in un contenitore chiuso. I coni ombelicali dovrebbero preferibilmente essere trattati immediatamente. Se ciò non fosse possibile, conservarli per non più di 24 ore o, a 4 °C, non oltre 72 ore.1.3. Trattare i coni ombelicali in uno dei seguenti modi:i) Trasferire i coni ombelicali in un contenitore idoneo.Aggiungere un volume sufficiente di tampone di macerazione (appendice 2) per coprire i coni.Sminuzzare i coni in un Waring Blender o con Ultra Thurrax fino a completa omogeneizzazione. Evitare un'omogeneizzazione eccessiva.Lasciar riposare il macerato per 15-30 minuti.ii) Trasferire i coni ombelicali in un contenitore idoneo.Aggiungere un volume sufficiente di tampone di macerazione per coprire i coni.Porre il contenitore in un agitatore rotativo.Mantenere in incubazione a 50-100 giri/m per 4 ore a 20-22 °C o per 16-24 ore a 4 °C.iii) Trasferire i coni ombelicali in un robusto sacchetto monouso (per esempio sacchetti da Stomacher di dimensioni 105 mm × 150 mm, sterile per irradiazione).Schiacciare accuratamente i coni ombelicali con uno strumento appropriato, per esempio un martello, fino al raggiungimento della completa omogeneizzazione.Aggiungere un volume sufficiente di tampone di macerazione sino a coprire i coni schiacciati.Lasciar riposare il macerato per 15-30 minuti.1.4. Estrarre i batteri dal macerato dei coni ombelicali in uno dei seguenti modi.i) Far decantare lentamente il macerato in una provetta da centrifuga lasciando i frammenti nel contenitore o nel sacchetto. Se il macerato decantato è molto torbido, centrifugare a non oltre 180 × g per 10 minuti a una temperatura inferiore a 10 °C.Centrifugare il macerato decantato o il sopranatante della prima fase di centrifugazione a 7 000 × g per 15 minuti o a 10 000 × g per 10 minuti a una temperatura inferiore ai 10 °C.Scartare il sopranatante senza far muovere il sedimento.ii) Filtrare il macerato con un sistema di filtraggio avente pori di dimensioni di 40-100 µm.Accelerare il filtraggio utilizzando una pompa a vuoto.Raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga.Lavare il filtro con il tampone di macerazione.Centrifugare il filtrato a 7 000 × g per 15 minuti o a 10 000 × g per 10 minuti a una temperatura inferiore ai 10 °C.Scartare il sopranatante senza far muovere il sedimento.1.5. Risospendere il sedimento in 1 ml di tampone per il sedimento da centrifuga (appendice 2).Dividere in due parti uguali e trasferire ciascuna parte in una microprovetta.Utilizzare una microprovetta per la prova. Conservare la parte di estratto non usata a 4 °C durante il saggio.Aggiungere 10-25 % (v/v) di glicerolo sterile all'altra microprovetta. Mescolare nel vortex. Conservare a - 18 °C (per settimane) o a - 70 °C (per mesi).2. Colorazione di immunofluorescenza (IF) Usare un antisiero per Pseudomonas solanacearum, preferibilmente di biovar 2 razza 3. Determinare il titolo di una sospensione di 106 cellule per ml da un ceppo omologo di Pseudomonas solanacearum con un'appropriata diluizione del coniugato di isotiocianato di fluoresceina (FITC), secondo le istruzioni del produttore. L'antisiero grezzo dovrebbe avere un titolo IF almeno 1:2 000.Utilizzare vetrini multipli per microscopio preferibilmente con 10 pozzetti di almeno 6 mm di diametro.Includere un controllo del coniugato FITC e un controllo del tampone fosfato isotonico (PBS) su ciascun vetrino del saggio. Il saggio dovrebbe essere ripetuto con il controllo PBS incluso se viene notata qualche cellula positiva nel controllo FITC.Preparare vetrini separati di controllo positivo con una sospensione di 106 cellule per ml da un ceppo di appropriata razza biovar di Pseudomonas solanacearum. Usare un vetrino in ciascuna serie di prove.2.1. Preparare i vetrini di saggio con uno dei seguenti procedimenti.i) Per sedimento con relativamente poco amido:Trasferire con una pipetta un volume standard misurato (15 µl è adeguato per un pozzetto di 6 mm di diametro - aumentare il volume per pozzetti più grandi) del sedimento risospeso su una fila di pozzetti. L'altra fila può essere usata come duplicato o per un secondo campione, come illustrato nella figura 1.ii) Per altri sedimenti:Preparare diluizioni decimali >NUM>(1:>DEN>10,>NUM>1:>DEN>100 e >NUM>1:>DEN>1 000) del sedimento risospeso nel tampone per sedimento. Trasferire con una pipetta un volume standard misurato (15 µl è adeguato per un pozzetto di 6 mm di diametro - aumentare il volume per pozzetti più grandi) di sedimento risospeso su una fila di pozzetti. L'altra fila può essere utilizzata come duplicato o per un secondo campione, come illustrato nella figura 2.2.2. Lasciare seccare le goccioline. Fissare le cellule batteriche al vetrino scaldando o passando alla fiamma o con etanolo al 95 %.2.3. Procedimento IFi) Secondo la preparazione del vetrino di saggio di cui al paragrafo 2.1 i):Preparare una serie di diluizioni 1:2 del titolo (T) dell'antisiero nel tampone IF (appendice 3):¼ (>NUM>T/>DEN>4), ½ (>NUM>T/>DEN>2), pari al titolo e il doppio del titolo (2T).ii) Secondo la preparazione del vetrino di saggio di cui al paragrafo 2.1 ii):Preparare la diluizione di lavoro (WD) dell'antisiero nel tampone IF. La diluizione WD è la diluizione dell'antisiero con specificità ottimale ed è abitualmente pari alla metà del titolo.>SPAZIO PER TABELLA>>SPAZIO PER TABELLA>2.3.1. Disporre i vetrini su carta bibula umida.Coprire i pozzetti di saggio con la (le) diluizione (i) di antisiero. Mettere PBS sui pozzetti FITC. Il volume di antisiero messo sui pozzetti deve essere equivalente al volume di estratto.2.3.2. Mantenere in incubazione sotto copertura per 30 minuti a temperatura ambiente.2.3.3. Scuotere via le goccioline di antisiero dal vetrino e sciacquare accuratamente con tampone IF. Lavare per 5 minuti con tampone IF Tween e poi per 5 minuti nel tampone IF (appendice 3).Eliminare accuratamente l'umidità in eccesso con carta bibula e lasciar asciugare i pozzetti.2.3.4. Disporre i vetrini su carta bibula umida.Coprire i pozzetti di saggio e il pozzetto FITC con la diluizione di coniugato di FITC utilizzato per determinare la concentrazione. Il volume di coniugato messo sui pozzetti deve essere identico al volume dell'antisiero.2.3.5. Mantenere in incubazione sotto copertura per 30 minuti a temperatura ambiente.2.3.6. Scuotere via le goccioline di coniugato dal vetrino. Sciacquare e lavare come in precedenza (paragrafo 2.3.3).Rimuovere accuratamente l'umidità in eccesso.2.3.7. Trasferire con una pipetta 5-10 µl di tampone fosfato 0,1 M aggiunto di glicerina o simile liquido di montaggio su ciascun pozzetto e applicare un vetrino coprioggetti (appendice 3).2.4. Lettura della colorazione IFEsaminare i vetrini con un microscopio a epifluorescenza dotato di filtri idonei all'eccitazione del FITC, in olio di immersione, a 500-1000 ingrandimenti. Esaminare attentamente i pozzetti lungo due diametri ad angolo retto e lungo il perimetro.Esaminare anzitutto il vetrino del controllo positivo. Le cellule devono avere fluorescenza brillante ed essere colorate interamente.Nota: il saggio deve essere ripetuto se la colorazione è aberrante.Passare ora ad osservare i vetrini di saggio. Verificare prima l'assenza di cellule fluorescenti nei pozzetti di controllo PBS e FITC. Cellule fluorescenti nel controllo FITC indicano un legame non specifico del coniugato a autofluorescenza o contaminazione. Nota: in questo caso ripetere il saggio.Verificare la presenza di cellule fluorescenti brillanti con morfologia caratteristica di Pseudomonas solanacearum nei pozzetti di saggio. L'intensità della fluorescenza deve essere equivalente al ceppo di controllo positivo con la stessa diluizione di antisiero. Le cellule con colorazione a pelle di leopardo o incompleta o con debole fluorescenza devono essere ignorate, a meno che non siano numerose. (Vedi interpretazione del risultato della colorazione IF).Interpretazione del risultato della colorazione IF i) Per ciascun campione in cui non vengono trovate cellule fluorescenti brillanti con morfologia caratteristica il saggio IF è negativo.ii) Per ciascun campione in cui vengono trovate cellule fluorescenti brillanti con morfologia caratteristica, determinare il numero medio di cellule per campo ottico e calcolare il numero di cellule (N) per ml di sedimento centrifuga risospeso (appendice 4).Una popolazione approssimativamente di 10³ cellule per millilitro di «pellet» in sospensione deve essere considerata quale limite per la diagnosi secondo il metodo dell'immunoflorescenza:- per i campioni con N &gt; 10³, il saggio IF è positivo,- per i campioni con N &lt; 10³, il saggio IF può essere considerato positivo.iii) Se si trova un elevato numero di cellule (&gt; 105 cellule/ml) aventi fluorescenza incompleta o debole ad una diluizione di antisiero pari al titolo, si deve fare un secondo saggio basato:- su un differente principio biologico- o ripetere la colorazione IF con un altro antisiero o una diluizione decimale del sedimento.3. Saggio immunoenzimatico (Elisa) (Secondo Robinson Smith et al., 1995)Usare un antisiero per Pseudomonas solanacearum, preferibilmente di razza 3 biovar 2. Determinare il titolo su una sospensione di 106 cellule per ml dal ceppo omologo di Pseudomonas solanacearum.È consigliato l'uso di piastre da microtitolazione NUNC Polysorp.Includere un controllo negativo di estratto di patata e un controllo con tampone fosfato isotonico (PBS).Usare una sospensione di concentrazione superiore a 106 cellule per ml di una razza biovar appropriata di Pseudomonas solanacearum come controllo positivo. Eseguire la prova come per il (i) campione(i), ma tenendo una netta separazione dei campioni sulla piastra da microtitolazione.3.1. Trasferire con una pipetta 100-200 µl del sedimento risospeso in una microprovetta.Scaldare per 4 minuti a 100 °C. Trasferire la microfiala su ghiaccio.3.2. Aggiungere un volume equivalente di tampone di rivestimento carbonato a doppia forza (appendice 5). Mescolare in agitatore.3.3. Applicare a ciascuno di almeno due pozzetti della piastra da microtitolazione, aliquote di 100 µl. Mantenere in incubazione per 1 ora a 37 °C o per una notte a 4 °C.3.4. Dare dei colpetti per espellere gli estratti dai pozzetti. Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween (appendice 5), lasciando l'ultima soluzione di lavaggio nei pozzetti per almeno 5 minuti.3.5. Preparare la diluizione appropriata di antisiero di Pseudomonas solanacearum in un tampone di bloccaggio (appendice 5). Applicare ai pozzetti 100 µl di diluizione di antisiero.Mantenere in incubazione per 1 ora a 37 °C.3.6. Dare dei colpetti per espellere l'antisiero dai pozzetti. Lavare i pozzetti come in precedenza (paragrafo 3.4).3.7. Preparare la diluizione appropriata di coniugato di fosfatasi alcalina nel tampone di bloccaggio. Applicare 100 µl di diluizione di coniugato ai pozzetti.Mantenere in incubazione per 1 ora a 37 °C.3.8. Dare dei colpetti per espellere il coniugato dai pozzetti. Lavare i pozzetti come in precedenza (paragrafi 3.4 e 3.6).3.9. Preparare la soluzione di substrato per la fosfatasi alcalina (appendice 5). Applicare 100 µl ai pozzetti. Mantenere in incubazione da 30 minuti a un'ora al buio a temperatura di laboratorio.3.10. Leggere l'assorbimento a 409 nm.Interpretazione del saggio Elisa Il saggio Elisa è negativo se la densità ottica (D.O.) del campione è minore di 2 × D.O. del controllo negativo.Il saggio Elisa è positivo se la densità ottica del campione è maggiore di 2 × D.O. del controllo negativo.4. Reazione a catena del DNA polimerasi (PCR) (Secondo Seal et al., 1993)N.B.: Durante tutte le fasi di preparazione della PCR e le relative manipolazioni devono essere utilizzate pipette munite di filtro.Preparare una sospensione di 106 cellule per ml da un ceppo di razza 3, biovar 2 di Pseudomonas solanacearum come controllo positivo. Eseguire il saggio nello stesso modo del (dei) campione (i).4.1. Trasferire con una pipetta 100 µl del sedimento risospeso in una micro provetta.In alternativa, trasferire 90 µl del sedimento risospeso in una microprovetta contenente 10 µl di NaOH 0,5 M. Mescolare invertendo ripetutamente la microprovetta.4.2. Scaldare per 4 minuti a 100 °C. Trasferire la microprovetta immediatamente in ghiaccio.4.3. Preparare almeno due diluizioni decimali, per esempio >NUM>1:>DEN>10 e >NUM>1:>DEN>100, o di più - se si ritengono opportune - in acqua distillata sterile o ultrapura (UPW).4.4. Preparare la miscela di reazione PCR (appendice 6) in una provettina sterile aggiungendo i seguenti componenti nell'ordine indicato.>SPAZIO PER TABELLA>Per più reazioni Calcolare la quantità di ciascun componente per il numero voluto di reazioni. Miscelare i componenti e trasferire 45-48 µl della miscela in provettine da PCR sterili. Tenere le provettine con la miscela di reazione PCR in ghiaccio.Per volumi di reazione di 25 µl: ridurre conseguentemente i componenti.4.5. Amplificazione della PCR 4.5.1. Facoltativo! Centrifugare a impulsi le provettine con il campione bollito e il controllo positivo.Aggiungere nelle provettine la miscela di reazione PCR e nell'ordine specificato, 2-5 µl del (i) campione (i), del controllo acqua e del controllo positivo. Porre le provettine nel blocco di riscaldamento della macchina per cicli termici DNA.4.5.2. Eseguire il seguente programma:1 ciclo di:i) 2 minuti a 96 °C: denaturazione dello stampo50 cicli di:ii) 20 secondi a 94 °C: denaturazioneiii) 20 secondi a 68 °C: appaiamento dei primeriv) 30 secondi a 72 °C: allungamento della copia1 ciclo di:v) 10 minuti a 72 °C: ulteriore allungamento1 ciclo di:vi) mantenere a 4 °CN.B.: Questi sono i parametri di un apparecchio Perkin Elmer 9600. Altre macchine per cicli termici possono richiedere una copertura di olio nelle provettine di reazione PCR e/o modifiche della durata delle fasi ii), iii) e iv) nel profilo di amplificazione.4.5.3. Togliere le provettine dalla macchina per cicli termici. Analizzare il prodotto della PCR. Se non lo si fa immediatamente, mantenere le fiale a 4 °C per un uso nello stesso giorno o a -18 °C se devono essere conservate più a lungo.4.6. Analisi del prodotto della PCR I frammenti prodotti dalla PCR vengono evidenziati mediante elettroforesi in gel di agarosio e colorazione con etidio bromuro.4.6.1. Preparare un gel appropriato di agarosio portando lentamente a ebollizione l'agarose in tampone di elettroforesi triacetato (TAE).4.6.2. Raffreddare l'agarosio fuso a 50-60 °C, versarlo nello stampo dell'unità di elettroforesi e inserire il pettine. Lasciare solidificare.4.6.3. Togliere il pettine. Immergere il gel in TAE in modo che sia appena coperto (2-3 mm) con il tampone.4.6.4. Mettere goccioline da 3 µl di tampone di caricamento su parafilm. Aggiungere 12 µl del prodotto della PCR di ciascun campione, del prodotto positivo e del controllo acqua e mescolare aspirando piano con la punta della pipetta prima di caricare. I volumi stabiliti possono essere modificati per adeguarsi alla capacità dei pozzetti nel gel di agarosio.4.6.5. Caricare accuratamente i pozzetti del gel. Includere come riferimento un marcatore DNA appropriato in almeno un pozzetto.4.6.6. Collegare i fili all'alimentatore di corrente e alla cella per l'elettroforesi. Attivare il gel a 5-8 V/cm fino a quando il fronte dell'indicatore della corrente superficiale si trovi a meno di 1 cm dalla fine del gel.4.6.7. Spegnere l'alimentatore. Scollegare i fili dalla cella per l'elettroforesi. Rimuovere accuratamente il gel. Immergerlo in una soluzione di etidio bromuro per 30-45 minuti.N.B.: Usare guanti usa e getta ogni volta che si manipola l'etidio bromuro poiché si tratta di un potente mutageno.4.6.8. Decolorare in acqua distillata per 10-15 minuti.4.6.9. Visualizzare il (i) frammento (i) amplificato (i) di DNA con transilluminazione UV. Il prodotto PCR di Pseudomonas solanacearum con primer OLI-1 e Y-2 ha una lunghezza di 288 bp. Confrontare con il marcatore DNA e con il controllo positivo.N.B.: Il controllo acqua deve essere comunque negativo. Se positivo, ripetere la prova.4.6.10. Fotografare il gel se è richiesta una documentazione permanente.4.6.11. Confermare l'autenticità del frammento amplificato con l'analisi di restrizione enzimatica (REA).4.7. Analisi di restrizione enzimatica (REA). 4.7.1. Trasferire 8,5 µl di prodotto della PCR (paragrafo 4.5.3) in una nuova microprovetta. Aggiungere 1 µl di 10 × tampone enzimatico e 0,5 µl di enzima di restrizione Avall.4.7.2. Miscelare aspirando piano nella cima della pipetta. Se rimangono gocce sulle pareti della fiala, far ruotare a impulsi in una microcentrifuga. Mantenere in incubazione per 1 ora a 37 °C.4.7.3. Analizzare il frammento della PCR digerito con elettroforesi in gel di agarosio come in precedenza (paragrafo 4.6).Interpretazione del risultato della prova PCR La prova PCR è negativa se non si evidenzia la presenza del caratteristico frammento di 288 bp, mentre il frammento è rilevato per il ceppo di controllo positivo di Pseudomonas solanacearum.La prova PCR è positiva se si evidenzia il frammento di 288 bp e l'analisi REA di questo frammento dà risultati identici a quello prodotto dal ceppo di controllo positivo di Pseudomonas solanacearum.5. Isolamento selettivo in piastra (Secondo Elphinstone et al., 1996)5.1. Eseguire la prova con una tecnica appropriata di diluizione in piastra, per esempio come segue:i) Preparare almeno due diluizioni decimali, per esempio 1:10 e 1:100, del sedimento risospeso nel tampone da sedimento. Trasferire con una pipetta un volume standard misurato (50-100 µl) del sedimento risospeso e ciascuna diluizione su substrato selettivo SMSA modificato (appendice 7) e distribuirlo con un bastoncino di vetro sull'intera superficie del substrato.Se ritenuto utile, inseminare il sedimento risospeso con ansa da 10 µl in aree successive. Arroventare alla fiamma l'ansa tra una inseminazione e l'altra.ii) Trasferire un volume standard misurato (50-100 µl) del sedimento risospeso sul substrato selettivo SMSA modificato e inseminarlo con un bastoncino di vetro sull'intera superficie del mezzo. Far scorrere il bastoncino senza esporlo alla fiamma su almeno altre 2 piastre di SMSA modificato.5.2. Inseminare, con la stessa tecnica di diluizione in piastra, una sospensione di 106 cellule per ml di un ceppo razza 3, biovar 2 di Pseudomonas solanacearum come controllo positivo su una serie di altre piastre di SMSA modificato.5.3. Tenere in incubazione le piastre a 28 °C. Cominciare a leggere le piastre dopo 3 giorni. Se il risultato è negativo, mantenere ancora in incubazione fino a un massimo di 6 giorni. Gli isolati virulenti di Pseudomonas solanacearum sviluppano colonie di color bianco-latte, piatte, irregolari e fluide con centri distinti di colore rosso sangue che mostrano delle striature interne e dei vortici.5.4. Purificare le colonie a morfologia caratteristica con subcoltura su un mezzo nutritivo generale (appendice 1).5.5. Identificare le colture pure (sezione II, paragrafo 4.1) e confermare che le colture siano di Pseudomonas solanacearum con una prova di patogenicità (sezione II, paragrafo 4.3).Interpretazione del risultato dell'isolamento selettivo in piastra L'isolamento selettivo in piastra è negativo se non si trovano colonie dopo sei giorni o se non si trovano colonie caratteristiche di Pseudomonas solanacearum, purché non si sospetti inibizione da parte di colonie di altri batteri e che nel controllo positivo trovino le caratteristiche colonie di Pseudomonas solanacearum.L'isolamento in piastra è positivo se si trovano colonie caratteristiche di Pseudomonas solanacearum.6. Saggio biologico (Secondo Janse, 1988)6.1. Usare 10 piante, di saggio (piantine suscettibili di pomodoro o di melanzana) ciascuna allo stadio di tre foglie vere. Non innaffiare le piante nelle 24 ore precedenti l'inoculazione.6.2. Distribuire 100 µl di sedimento risospeso tra le piante. Inoculare il fusto tra i cotiledoni e in uno o due altri punti.6.3. Inoculare, con la stessa tecnica, 10 piantine con una sospensione di 106 cellule per ml di un ceppo di Pseudomonas solanacearum di razza 3, biovar 2 come controllo negativo. Separare le piante del controllo positivo dalle altre per evitare contaminazione.6.4. Far crescere le piantine a una temperatura di 22 °C e 28 °C per 4 settimane ad alta umidità relativa con innaffiature giornaliere. Vedere se si sviluppano sintomi di collasso, epinastia, clorosi e/o rallentamento della crescita.6.5. Fare isolamenti dalle piante infettate (sezione II). Identificare le colture pure con morfologia caratteristica (sezione II, paragrafo 4.1) e confermare le colture positive con una prova di patogenicità (sezione II, paragrafo 4.3).6.6. Se si ritiene utile, verificare l'assenza di infezione nei lotti di piante asintomatiche usate per la prova. Rimuovere da ciascuna pianta una sezione di 1 cm di fusto a 2 cm al di sopra del punto di inoculazione. Omogeneizzare i tessuti in un tampone di macerazione. Effettuare l'isolamento per diluizione in piastra (sezione III, paragrafo 5.1). Se positiva, identificare le colture con morfologia caratteristica (sezione II, paragrafo 4.1) e confermare le colture positive con una prova di patogenicità (sezione II, paragrafo 4.3).Interpretazione del risultato del saggio biologico Il saggio biologico è negativo se le piante inoculate non risultano infettate da Pseudomonas solanacearum.Il saggio biologico è positivo se le piante inoculate risultano infettate da Pseudomonas solanacearum.7. Prove di arricchimento (J. G. Elphinstone et al., 1996)7.1. Trasferire 100 µl del sedimento di centrifuga risospeso in 3 ml del brodo SMSA modificato (appendice 7).7.2. Mantenere in incubazione per 48 ore e, comunque, non oltre 72 ore a 28 °C con il tappo della provetta non chiuso perfettamente per consentire l'aerazione.7.3. Chiudere bene il tappo e mescolare nel vortex. Prendere frazioni del liquido per la colorazione IF (la presente sezione, paragrafo 2), il saggio Elisa (la presente sezione, paragrafo 3), e/o per la PCR (la presente sezione, paragrafo 4).8. Prova di patogenicità Si faccia riferimento a sezione II, paragrafo 4.3.Appendice 1 Substrati nutritivi per l'isolamento e la coltura di Pseudomonas solanacearum Agar nutritivo (NA)>SPAZIO PER TABELLA>Preparare volumi da mezzo litro del terreno in matracci da 1 litro.Disciogliere gli ingredienti.Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.Portare a 50 °C. Versare nelle piastre.Lievito peptone glucosio agar (YPGA)>SPAZIO PER TABELLA>Preparare volumi da mezzo litro del terreno in matracci da 1 litro.Disciogliere gli ingredienti.Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.Portare a 50 °C. Versare nelle piastre.Saccarosio-peptone-agar (SPA)>SPAZIO PER TABELLA>Preparare volumi da mezzo litro del terreno in matracci da 1 litro.Disciogliere gli ingredienti. Se necessario, regolare a pH 7,2-7,4.Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.Portare a 50 °C. Versare nelle piastre.Substrato Kelman al tetrazolio>SPAZIO PER TABELLA>Preparare volumi da mezzo litro del terreno in matracci da 1 litro.Disciogliere gli ingredienti. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.Portare a 50 °C.Aggiungere una soluzione acquosa di cloruro di trifeniltetrazolo (Sigma), sterilizzata per filtrazione, fino a concentrazione finale di 50 mg/litro.Versare nelle piastre.Appendice 2 Materiali per la preparazione del campione Tampone di macerazione: tampone fosfato 50 mM, pH 7,0Questo tampone è impiegato per la macerazione dei tessuti.>SPAZIO PER TABELLA>Disciogliere gli ingredienti e controllare il pH. Distribuire secondo opportunità. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.Quando si effettua la PCR diretta, è raccomandabile aggiungere il 5 % di Polivinilpirrolinone p.m. 40 000 (PVP-40), per limitare l'effetto inibitore sull'amplificazione dovuto alla presenza delle molecole aromatiche nell'estratto.Quando si adoperano il miscelatore Waring o il procedimento di omogenizzazione Ultra Turrax per la macerazione dei coni ombelicali delle patate, si raccomanda di aggiungere un deflocculante, un antischiuma od un antiossidante.>SPAZIO PER TABELLA>Sterilizzare separatamente in autoclave. Aggiungere fino alla concentrazione desiderata.Tampone per il sedimento: tampone fosfato 10 mM, pH 7,2Questo tampone va impiegato per riportare in sospensione e diluire il sedimento di centrifuga ottenuto dai coni ombelicali.>SPAZIO PER TABELLA>Disciogliere gli ingredienti e verificare il pH. Distribuire secondo opportunità. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.Appendice 3 Materiali per il saggio IF Tampone IF: soluzione fisiologica tamponata al fosfato (PBS), 10 mM, pH 7,2Questo tampone viene impiegato per la diluizione degli antisieri.>SPAZIO PER TABELLA>Disciogliere gli ingredienti e verificare il pH. Distribuire secondo opportunità.Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.Tampone IF - TweenQuesto tampone viene impiegato per lavare i vetrini. Aggiungere lo 0,1 % di Tween 20 al tampone IF.Glicerolo tamponato al fosfato 0,1 M, pH 7,6Questo tampone viene impiegato come fluido di montaggio sui pozzetti dei vetrini IF, per incrementare la fluorescenza>SPAZIO PER TABELLA>Appendice 4 Determinazione del livello di contaminazione nella prova IF Superficie del pozzetto (S) del vetrino multiplo per immunofluorescenza= >NUM>ð D²>DEN>4>SPAZIO PER TABELLA> (1)Superficie del campo (s) dell'obiettivo= >NUM>ð d²>DEN>4>SPAZIO PER TABELLA> (2)Calcolare d misurando direttamente o mediante le seguenti formule:s = >NUM>ð i²>DEN>G² K² × 4 (3)>SPAZIO PER TABELLA>Dalla (2) si ricava:d = &radic;>NUM>4 s>DEN>ð (4)Dalla (3):d = &radic;>NUM>4 × >NUM>ð i²>DEN>G² K² × 4>DEN>ð = >NUM>i>DEN>GKConteggiare il numero di cellule IF tipiche per campo (c).Calcolare il numero di cellule IF tipiche per pozzetto (C).C = c >NUM>S>DEN>sCalcolare il numero di cellule IF tipiche per ml di precipitato (N)N = C × >NUM>1 000>DEN>y × F>SPAZIO PER TABELLA>Appendice 5 Materiali per il saggio Elisa Tampone di ricopertura al carbonato (pH 9,6), a doppia forza>SPAZIO PER TABELLA>Disciogliere gli ingredienti e controllare il pH. Suddividere in aliquote secondo convenienza.Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.Se l'estratto contiene una percentuale elevata di molecole aromatiche, si può aggiungere solfito sodico come antiossidante, fino a concentrazione dello 0,2 %.Soluzione fisiologica tamponata al fosfato (Phosphate Buffered Saline, PBS) 10 ×, pH 7,4>SPAZIO PER TABELLA>Disciogliere gli ingredienti e verificare il pH. Suddividere in aliquote secondo convenienza.Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.Soluzione fisiologica tamponata fosfato Tween (PBS-T)>SPAZIO PER TABELLA>Tampone bloccante (anticorpi) (da preparare al momento dell'uso)>SPAZIO PER TABELLA>Soluzione substrato fosfatasi alcalina pH 9,8>SPAZIO PER TABELLA>Mescolare e regolare a pH 9,8 con HCl concentrato.Portare a 1 litro acqua distillata.Aggiungere 0,2 g di MgCl2.Disciogliere due compresse di substrato 5 mg pasticche alla fosfatasi (Sigma) per ogni 15 ml di soluzione.Appendice 6 Materiali per la prova PCR Sequenze dei primer:>SPAZIO PER TABELLA>Seal et al. (1993).Appendice 7 Materiali per l'isolamento selettivo su piastra Substrato selettivo SMSA (Engelbrecht, 1994, modificato da Elphinstone et al., 1996)Terreno di base>SPAZIO PER TABELLA>Preparare volumi da mezzo litro in matracci da 1 litro.Disciogliere gli ingredienti e verificare il pH. Se necessario, prima di sterilizzare in autoclave regolare il pH a 6,5. Su un terreno a pH &gt; 7,0 Pseudomonas solanacearum non si svilupperebbe adeguatamente.Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.Portare a 50 °C.Aggiungere i seguenti ingredienti (tutti di produzione Sigma), in modo da ottenere le concentrazioni finali specificate:>SPAZIO PER TABELLA>Disciogliere gli ingredienti in etanolo al 70 % fino alle concentrazioni indicate per il volume di terreno preparato. Per disciogliere alcuni ingredienti (polimixina B e cloramfenicolo) è necessario riscaldare leggermente ed agitare.Brodo SMSA (Elphinstone et al., 1996)Preparare come per il terreno selettivo SMSA, eliminando l'agar.Distribuire in porzioni da 3 ml, in provette a perdere «Universal» da 30 ml.Bibliografia Buddenhagen, I.W.; Sequeira, L. and Kelman, A., 1962, Description of races in Pseudomonas solanacearum. Phytopathology 52, 726.Cook, D.; Elizabeth B. and Sequeira L., 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphism with DNA probes that specify virulence and hypersensitive respons. Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 113-121.Dinesen I.G. and DeBoer, S.H., 1995. Extraction of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus from composite samples of potato tubers. American Potato Journal 72, 133-142.Elphinstone, J.G.; Hennessy, J.; Wilson, J. and Stead, D.E., 1996. Sensitivity of different methods for the detection of Pseudomonas solanacearum (Smith)Smith in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26.Engelbrecht, M.C., 1994. Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. ACIAR Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5.Hayward, A.C., 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27, 265-277.Hayward, A.C., 1994. Systematic and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related bacteria. In: Bacterial Wilt: the disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum (eds. A.C. Hayward and G.L. Hartman) CAB International Oxford, 127-135.Janse, J.D., 1988. A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. EPPO Bulletin 18, 343-351.Janse, J.D., 1991. Infra- and intraspecific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14, 335-345.Kelman, A., 1954. The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 64, 293-695.Lelliot, R.A. and Stead, D.E., 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. (T.F. Preece ed.) Blackwell Scientific Publications, Oxford. 216 pp.Louws, F.J.; Fulbright, D.W.; Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85, 528-536.Lozano, J.C. and Sequeira, L., 1970. Differentiation of races of Pseudomonas solanacearum by a leaf infiltration technique. Phytopathology 60, 838.Mirza, M.S.; Rademaker, J.W.L.; Janse, J.D. and Akkermans, A.D.L., 1993, Specific 16S ribosomal RNA targeted oligonucleotide probe against Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Canadian Journal of Microbiology 39, 1029-1034.Robinson-Smith, A.; Jones, P.; Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D., 1995. Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.Seal, S.E.; Jackson, L.A.; Young, J.P.W. and Daniels, M.J., 1993. Differentiation of Pseudomonas solanacearum, P. syzygii, P. picketti and the blood disease bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology 139, 1587-1594.Smith, J.J.; Offord, L.C.; Holderness, M. and Saddler, G.S., 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61, 4262-4268.Stead, D.E., 1992a. Techniques for detecting and identifying plant pathogenic bacteria. In: Techniques for rapid detection of plant pathogens (eds. J.M. Duncan and L. Torrance). Blackwell Scientific Publications, Oxford, 76-111.Stead, D.E., 1992b. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42, 281-295.Van Beuningen, A.; Derks, H. and Janse J.D., 1995. Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in-situ hybridisation (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungsforschung 2, 266-269.