CELEX: 32016D1840
Language: bg
Date: 2016-10-14 00:00:00
Title: Решение за изпълнение (ЕС) 2016/1840 на Комисията от 14 октомври 2016 година за изменение на приложение IV към Директива 2009/156/ЕО на Съвета по отношение на методите за диагностициране на болестта африканска чума по конете (нотифицирано под номер С(2016) 6509) (Текст от значение за ЕИП)

18.10.2016   
            
            
               BG
            
            
               Официален вестник на Европейския съюз
            
            
               L 280/33
            
         РЕШЕНИЕ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ (ЕС) 2016/1840 НА КОМИСИЯТА
   от 14 октомври 2016 година
   за изменение на приложение IV към Директива 2009/156/ЕО на Съвета по отношение на методите за диагностициране на болестта африканска чума по конете
   
      
         (нотифицирано под номер С(2016) 6509)
      
   
   (текст от значение за ЕИП)
   ЕВРОПЕЙСКАТА КОМИСИЯ,
   като взе предвид Договора за функционирането на Европейския съюз,
   като взе предвид Директива 2009/156/ЕО на Съвета от 30 ноември 2009 г. относно ветеринарно-санитарните условия, регулиращи движението и вноса от трети страни на еднокопитни животни (1), и по-специално член 20 от нея,
   като има предвид, че:
   
               (1)
            
            
               В приложение IV към Директива 2009/156/ЕО се определят диагностичните методи за болестта африканска чума по конете, които при необходимост да се използват за изследване на еднокопитни животни преди тяхното движение в рамките на Съюза или при вноса от държави, които не са членки на ЕС.
            
         
               (2)
            
            
               От приемането на Директива 2009/156/ЕО насам капацитетът на лабораториите за извършване на авангардни, високо чувствителни и ефективни изследвания за диагностициране на африканска чума по конете нарасна. Същевременно главата, свързана с диагностицирането на африканска чума по конете, в Ръководството за диагностични тестове и ваксини за сухоземни животни на Световната организация за здравеопазване на животните (OIE) (2) беше изменена, за да бъде отразен този напредък.
            
         
               (3)
            
            
               Като част от своята работна програма за 2014 г. референтната лаборатория на Европейския съюз за африканска чума по конете (3) изготви доклад за техническата оценка на диагностичните методи, описани в приложение IV към Директива 2009/156/ЕО. В оценката, която бе представена на Комисията през май 2015 г., се стига до заключението, че анализът конкурентна ELISA (ензимно-свързан имуносорбентен анализ) вече не е наличен, анализът индиректна ELISA не се предлага за широка употреба, но може да бъде предоставен в срок от 4—6 месеца след заявка, и че анализът блокадна ELISA е достъпен на пазара и широко използван за анализ на проби по време на изпитванията за пригодност, организирани от референтната лаборатория на Европейския съюз за африканска чума по конете.
            
         
               (4)
            
            
               Освен това в доклада се посочва, че методите за разпознаване на нуклеиновата киселина чрез обратно транскриптазна полимеразна верижна реакция в реално време (RT-PCR) имат повече предимства пред серологичните диагностични методи, тъй като те позволяват болестта да бъде открита в ранен стадий на инфекцията. Освен това повечето от националните референтни лаборатории на държавите — членки Европейския съюз, използват методите RT-PCR в реално време, включително за диагностициране на африканска чума по конете, които е доказано, че са подходящи за целта в ежегодното изпитване за пригодност, извършвано от 2009 г. до 2014 г. В доклада се посочва също така, че извън Съюза има няколко референтни лаборатории на OIE и други лаборатории със специални експертни познания за болестта африканска чума по конете, които са въвели поне един от методите RT-PCR в реално време за откриване на генома на вируса, причиняващ африканска чума по конете.
            
         
               (5)
            
            
               На 24—25 ноември 2015 г. на съвместния семинар на референтните лаборатории на Европейския съюз за африканска чума по конете и син език и на националните референтни лаборатории, проведен в Аскот, Обединеното кралство, бе препоръчано в приложение IV към Директива 2009/156/ЕО да бъдат включени методите обратно транскриптазна полимеразна верижна реакция (PCR) в реално време (RRT) за откриване на вируса на африканската чума по конете.
            
         
               (6)
            
            
               Въпреки че всички методи RT-PCR в реално време за откриване на генома на вируса на африканска чума по конете са достатъчно чувствителни, процедурата, описана от Agüero et al. (2008) (4), е най-често прилаганата от лабораториите. Методът, описан от Guthrie et al. (2013) (5), е специално разработен, за да бъде осигурен безопасен транспорт за коне, които са от области с риск от болестта африканска чума по конете, след изтичането на карантинния срок, изискван в съответствие с ръководството по здравеопазване на сухоземни животни (6) на OIE.
            
         
               (7)
            
            
               Поради това в приложение IV към Директива 2009/156/ЕО е целесъобразно да се включат методи за идентификация на агенти и за откриване на антитела като допълнителни методи за бързо диагностициране на болестта африканска чума по конете.
            
         
               (8)
            
            
               Приложение IV към Директива 2009/156/ЕО следва да бъде съответно изменено посредством заличаване на теста конкурентна ELISA и посредством актуализиране на процедурите за тестовете индиректна ELISA и блокадна ELISA в съответствие с глава 2.5.1. от Ръководството за диагностични тестове и ваксини за сухоземни животни на OIE, издание 2016 г., въз основа на изданието, прието от Световната асамблея на делегатите на OIE през май 2012 г. (7). Същевременно процедурите за RT-PCR в реално време, описани от Agüero et al. (2008), както и от Guthrie et al. (2013), следва да бъдат включени в посоченото приложение, за да може тестовете за идентификация на агента да бъдат на разположение за целите на изследванията преди движението на животните.
            
         
               (9)
            
            
               Поради това Директива 2009/156/ЕО следва да бъде съответно изменена.
            
         
               (10)
            
            
               Мерките, предвидени в настоящото решение, са в съответствие със становището на Постоянния комитет по растенията, животните, храните и фуражите,
            
         ПРИЕ НАСТОЯЩОТО РЕШЕНИЕ:
   Член 1
   Приложение IV към Директива 2009/156/ЕО се заменя с текста в приложението към настоящата директива.
   Член 2
   Адресати на настоящото решение са държавите членки.
   
      Съставено в Брюксел на 14 октомври 2016 година.
      
         
            За Комисията
         
         Vytenis ANDRIUKAITIS
         
            Член на Комисията
         
      
   
   
      (1)  ОВ L 192, 23.7.2010 г., стр. 1.
   
      (2)  http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.05.01_AHS.pdf
   
      (3)  Директива 92/35/ЕИО на Съвета от 29 април 1992 г. за определяне на правила за контрол и мерките за борба с болестта африканска чума по конете (ОВ L 157, 10.6.1992 г., стр. 19).
   
      (4)  Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. and Jimenez-Clavero A. (2008). Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325–328.
   
      (5)  Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus. Journal of Virological Methods (Бюлетин за вирусологичните методи). 2013;189(1):30—35.
   
      (6)  http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahc/current/chapitre_ahs.pdf.
   
      (7)  Вж. бележка под линия 2.
   
      ПРИЛОЖЕНИЕ
      
         
            „ПРИЛОЖЕНИЕ IV
            
               АФРИКАНСКА ЧУМА ПО КОНЕТЕ
            
            
               ДИАГНОЗА
            
            ЧАСТ A
            Серологични тестове
            Серологичният метод, описан по-долу, е ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) и се основава на глава 2.5.1, раздел В, точка 2 от Ръководството за диагностични тестове и ваксини за сухоземни животни, издание 2016 г., прието от Световната асамблея на делегатите на OIE през май 2012 г.
            Вирусният протеин VP7 е имунодоминантен основен антиген на вируса на африканската чума по конете (АЧК) и присъства в деветте серотипа на вируса на АЧК. Рекомбинантните протеини на вируса на АЧК и VP7 са се доказали като стабилни и безвредни и са подходящи за използване като антигени в процедурите ELISA за определяне на антителата на вируса на АЧК с висока степен на чувствителност и специфичност (Laviada et al., 1992b (1); Maree and Paweska, 2005). Тестовете индиректна ELISA и блокадна ELISA са двата теста ELISA за АЧК-VP7, подходящи за серологично диагностициране на африканската чума по конете.
            1.   Тест индиректна ELISA за откриване на антитела на вируса на африканската чума по конете (АЧК)
            
            Конюгатът, използван в този метод, е пероксидаза от хрян, антиконски гама-глобулин, който реагира със серума от коне, мулета и магарета. За метода, описан от Maree & Paweska (2005) (2), се използва протеин G като конюгат, който също реагира със серум от зебра.
            Антигенът може да бъде предоставен от центъра за изследване на животните Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA), Испания, в срок от 4 до 6 месеца от искането.
            1.1.   Тестова процедура
            
            1.1.1.   Твърда фаза
            
                     
                        1.1.1.1.
                     
                     
                        Натоварете плаките ELISA с рекомбиниран вирус на АЧК-4 VP7, разреден в карбонатно-бикарбонатен буфер с pH 9,6. Инкубирайте плаките в продължение на една нощ при 4 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.1.2.
                     
                     
                        Промийте петкратно плаките с дестилирана вода, съдържаща 0,01 % (v/v) Tween 20 (измиващ разтвор). Внимателно оставете плаките върху абсорбиращ материал, за да премахнете остатъчен измиващ разтвор.
                     
                  
                     
                        1.1.1.3.
                     
                     
                        Накапете плаките с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) с pH 7,2 + 5 % (w/v) обезмаслено мляко (обезмаслено сухо мляко Nestlé Dry Skim MilkTM), 200 μl/ямка за 1 час при 37 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.1.4.
                     
                     
                        Отстранете блокиращия разтвор и подсушете внимателно плаките с абсорбиращ материал.
                     
                  1.1.2.   Тестови проби
            
                     
                        1.1.2.1.
                     
                     
                        Серумните проби за тестване, положителните и отрицателните контролни серуми се разреждат 1 към 25 във фосфатно буфериран физиологичен разтвор + 5 % (w/v) обезмаслено мляко + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl за ямка. Инкубирайте в продължение на 1 час при температура 37 °C.
                        За титруване направете двойна серия разреждане от 1 към 25 (100 μl/ямка), един серум на колонка от плаки, и направете същото с положителните и с отрицателните контроли. Инкубирайте в продължение на 1 час при температура 37 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.2.2.
                     
                     
                        Промийте петкратно плаките с дестилирана вода, съдържаща 0,01 % (v/v) Tween 20 (измиващ разтвор). Внимателно оставете плаките върху абсорбиращ материал, за да премахнете остатъчен измиващ разтвор.
                     
                  1.1.3.   Конюгат
            
                     
                        1.1.3.1.
                     
                     
                        Смесете 100 μl/ямка от пероксидаза от хрян — смесена с антиконски гама-глобулин, разреден във фосфатно буфериран физиологичен разтвор + 5 % мляко + 0,05 % Tween 20 с pH 7,2. Инкубирайте в продължение на 1 час при температура 37 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.3.2.
                     
                     
                        Промийте петкратно плаките с дестилирана вода, съдържаща 0,01 % (v/v) Tween 20 (измиващ разтвор). Внимателно оставете плаките върху абсорбиращ материал, за да премахнете остатъчен измиващ разтвор.
                     
                  1.1.4.   Хромоген/Субстрат
            
                     
                        1.1.4.1.
                     
                     
                        Добавете 200 μl/ямка от разтвор хромоген/субстрат (10 ml от 80,6 mM DMAB (диметил аминобензалдехид) + 10 ml от 1,56 mM MBTH (3-метил-2-бензо-тиазолин хидразон хидрохлорид) + 5 μl H2O2).
                        Цветната реакция се спира чрез прибавяне на 50 μl 3N H2SO4 след около 5—10 минути (преди отрицателната контрола да започне да се оцветява).
                        Други хромогени като ABTS (2,2′-Азино-бис-[3-етилбензоатиазолин-6-сулфонова киселина]), TMB (тетраметил бензидин) или OPD (орто-фетилдиамин) могат също да се използват.
                     
                  
                     
                        1.1.4.2.
                     
                     
                        Отчетете плаките при 600 nm (или 620 nm).
                     
                  1.2.   Разчитане на резултатите
            
            
                     
                        1.2.1.
                     
                     
                        Изчислете праговата стойност чрез добавяне на 0,06 към стойността на отрицателната контрола (0,06 е стандартното отклонение, получено от група от 30 отрицателни серума).
                     
                  
                     
                        1.2.2.
                     
                     
                        Тестови проби, даващи стойности на поглъщане под праговата стойност, се считат за отрицателни.
                     
                  
                     
                        1.2.3.
                     
                     
                        Тестови проби, даващи стойности на поглъщане над праговата стойност + 0,15 се считат за положителни.
                     
                  
                     
                        1.2.4.
                     
                     
                        Тестови проби, даващи усреднени стойности на поглъщане, се считат за недостатъчни за формулиране на заключение и трябва да се приложи втора техника за потвърждаване на резултата.
                     
                  2.   Тест блокадна ELISA за откриване на антитела на вируса на африканската чума по конете (АЧК)
            
            Тестът конкурентна блокадна ELISA е предназначен за откриване на специфични антитела на вируса на АЧК в серум от еднокопитни животни, т. е. коне, магарета, зебри и техните кръстоски, като се избягва проблемът със специфичността, който понякога възниква при използването на тестовете индиректна ELISA.
            Принципът на теста е блокиране на реакцията между рекомбинантния протеин VP7, погълнат в плаката на ELISA, и конюгираното моноклонално антитяло, специфично за АЧК-VP7 (Mab). Антителата в тестовия серум ще блокират взаимодействието между антигена и Mab, в резултат на което ще се намали оцветяването. Поради това, че Маb също е насочено срещу VP7, анализът ще даде висока степен на чувствителност и определеност.
            Тестът конкурентна блокадна ELISA се предлага в търговската мрежа.
            2.1.   Тестова процедура
            
            2.1.1.   Твърда фаза
            
                     
                        2.1.1.1.
                     
                     
                        Плаките ELISA се покриват с 50-100 ng рекомбинант AHSV-4 VP7, разреден с карбонатен/бикарбонатен буфер, pH 9,6. Инкубирайте плаките за една нощ при 4 °C.
                     
                  
                     
                        2.1.1.2.
                     
                     
                        Измийте плаките три пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) 0,1x, съдържащ 0,135 M NaCl и 0,05 % (v/v) Tween 20. Внимателно оставете плаките върху абсорбиращ материал, за да премахнете остатъчен измиващ разтвор.
                     
                  2.1.2.   Тестови проби и контроли
            
                     
                        2.1.2.1.
                     
                     
                        Серумните проби за тестване, положителните и отрицателните контролни серуми се разреждат 1 към 5 в разредител, съдържащ 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 и 0,1 % Kathon, 100 μl за ямка. Инкубирайте в продължение на 1 час при температура 37 °C.
                        За титруване направете двойна серия разреждане на тестовите серуми от 1 към 10 до 1 към 280 в 8 ямки (100 μl/ямка), един серум на колонка от плаки, и направете същото с положителните и с отрицателните контроли. Инкубирайте в продължение на 1 час при температура 37 °C.
                     
                  
                     
                        2.1.2.2.
                     
                     
                        Измийте плаките пет пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) 0,1×, съдържащ 0,135 M NaCl и 0,05 % (v/v) Tween 20. Внимателно оставете плаките върху абсорбиращ материал, за да премахнете остатъчен измиващ разтвор.
                     
                  2.1.3.   Конюгат
            
                     
                        2.1.3.1.
                     
                     
                        Смесете 100 μl/ямка от пероксидаза от хрян — конюгиран Mab анти-VP7. Преди това този Mab е бил разреден 1/5 000–1/15 000 в 1/1 разтвор на StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics. Reference: SZ03) в дестилирана вода. Инкубирайте 30 минути при температура 37 °C.
                     
                  
                     
                        2.1.3.2.
                     
                     
                        Измийте плаките пет пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) 0,1×, съдържащ 0,135 M NaCl и 0,05 % (v/v) Tween 20. Внимателно оставете плаките върху абсорбиращ материал, за да премахнете остатъчен измиващ разтвор.
                     
                  2.1.4.   Хромоген/Субстрат
            Добавете 100 μl/ямка разтвор хромоген/субстрат, т.е. 1 ml ABTS (2,2′-Азино-бис-[3-етилбензотиазолин-6-сулфонова киселина]) 5 mg/ml + 9 ml субстратен буфер (0,1 М фосфатно-цитратен буфер pH 4, съдържащ 0,03 % H2O2) и инкубирайте 10 минути при стайна температура. Оцветяването се спира с добавяне 100 μl/ямка на 2 % (w/v) натриев додецил сулфат.
            2.1.5.   Отчитане
            Отчетете при 405 nm в четец на ELISA.
            2.2.   Разчитане на резултатите
            
            
                     
                        2.2.1.
                     
                     
                        Определете процента на блокиране (BP) на всяка проба, като прилагате следната формула, в която съкращението Abs означава антитела:
                        
                           
                     
                  
                     
                        2.2.2.
                     
                     
                        Проби, чиято BP стойност е по-висока от 50 %, следва да се считат за положителни за антитела на вируса на АЧК.
                     
                  
                     
                        2.2.3.
                     
                     
                        Проби, чиято BP стойност е по-ниска от 45 %, следва да се считат за отрицателни за антитела на вируса на АЧК.
                     
                  
                     
                        2.2.4.
                     
                     
                        Проби, чиято BP стойност е между 45 % и 50 %, следва да се считат за недостатъчни за формулиране на заключение и трябва повторно да бъдат подложени на тест. Ако резултатът отново е недостатъчен за формулиране на заключение, животните следва отново да бъдат изследвани не по-рано от две седмици след вземането на пробата, която е счетена за недостатъчна за формулиране на заключение.
                     
                  ЧАСТ Б
            Идентификация на агента
            Обратно транскриптазна полимеразна верижна реакция в реално време (rRT-PCR)
            Тестовете за идентификация на агента, базирани на методите, свързани с нуклеиновата киселина, трябва да откриват референтни щамове от девет вирусни серотипа на вируса на АЧК.
            Методът, описан в точка 2.1, се основава на глава 2.5.1, раздел В, точка 1.2 от Ръководството за диагностични тестове и ваксини за сухоземни животни, издание 2016 г., прието от Световната асамблея на делегатите на OIE през май 2012 г.
            Всеки RT-PCR метод за откриване, използван за изследване на проби (кръв или далак) в контекста на Директива 2009/156/ЕО, трябва да е с чувствителност, еквивалентна или по-голяма от тази на методологиите, описани в точка 2.
            Инактивиран вирус на референтни щамове на серотипове 1—9 може да бъде получен от референтната лаборатория на Европейския съюз или от референтната лаборатория на OIE за африканска чума по конете, Алхете, Испания.
            1.   Извличане на вирусна РНК
            
            За да се гарантира добра реакция, е необходимо от пробата да се извлече РНК с високо качество на вируса на АЧК. Извличането на нуклеинови киселини от клиничните проби може да бъде извършено по няколко вътрешни метода или методи, достъпни в търговската мрежа.
            Комплектите, предлагани в търговската мрежа, използват различни подходи за изолиране на РНК. Повечето от тях се основават на една от следните процедури:
            
                        —
                     
                     
                        фенол-хлороформно извличане на нуклеинови киселини;
                     
                  
                        —
                     
                     
                        адсорбция на нуклеинови киселини върху филтърна система;
                     
                  
                        —
                     
                     
                        адсорбция на нуклеинови киселини върху система от магнитни топчета.
                     
                  По-долу е представен пример за вътрешен метод за извличане на РНК:
            
                        1.1.
                     
                     
                        1 g тъканна проба се хомогенизира с 1 ml денатуриран разтвор (4 M гуанидиум тиоцианат, 25 mM натриев цитрат, 0,1 М 2-меркаптоетанол, 0,5 % саркозил).
                     
                  
                        1.2.
                     
                     
                        След центрофугирането към супернатанта се добавят 1 μg от РНК от дрожди, 0,1 ml от 2 M натриев ацетат, pH 4, 1 ml от фенол и 0,2 ml смес хлороформ/изоамилов алкохол (49/1).
                     
                  
                        1.3.
                     
                     
                        Суспензията се разклаща енергично и се охлажда върху лед за 15 минути.
                     
                  
                        1.4.
                     
                     
                        След центрофугирането РНК, присъстваща във водната фаза, се извлича във фенол, утаява се в етанол и повторно се суспендира в стерилна вода.
                     
                  2.   Процедура полимеразна верижна реакция в реално време
            
            2.1.   Специфична за дадена група RT-PCR в реално време от Agüero et al., 2008
                (3)
            
            Тази специфична за дадена група RT-PCR в реално време е насочена към VP7 на вируса на АЧК и може да открива всички познати серотипове и щамове на вируса на АЧК, които циркулират в момента. Тя е използвана с много добри резултати от националните референтни лаборатории на държавите — членки на Европейския съюз, участващи в изпитванията за пригодност, организирани ежегодно от референтната лаборатория на Европейския съюз за периода 2009—2015 г. Освен това в международно междулабораторно изпитване, организирано през 2015 г. в рамките на мрежата от референтните лаборатории на OIE, този протокол беше оценен много високо в сравнение с останалите.
            Праймерите и секвенциите за откриване на вируса на АЧК:
            
                        —
                     
                     
                        прав праймер
                     
                     
                        5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        обратен праймер
                     
                     
                        5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        сонда MGB-TaqMan
                     
                     
                        5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
                     
                  
                        2.1.1.
                     
                     
                        Концентрацията на праймерите се разрежда до работна концентрация от 8 μM („8 μM работен запас (сток) от праймер“), а сондата се разрежда до работна концентрация 50 μM („50 μM работен запас от сонда“). Формулата на тестовата плака следва да бъде проектирана и въведена в софтуера на машината за PCR в реално време. Като за ориентир се използва формулата, 2,5 μl от всеки работен запас от праймера от 8 μM се добавя към всяка ямка, която съдържа проби от РНК, положителни и/или отрицателни контроли (окончателната концентрация на праймера е 1 μM в 20 μl смес RT-PCR). Плаката се държи върху лед.
                     
                  
                        2.1.2.
                     
                     
                        2 μl от изолирана РНК (тестови проби и положителни контроли) или 2 μl вода без РНКаза в контролна проба с отрицателна реакция се смесва с прав и обратен праймер. Тази смес се денатурира чрез нагряване при температура 95 °C в продължение на 5 минути, след което бързо се охлажда върху лед в продължение на най-малко 5 минути.
                     
                  
                        2.1.3.
                     
                     
                        Съгласно инструкциите на производителя се подготвя необходимият обем от едностъпална RT-PCR в реално време (основна смес) за няколко проби за изследване. 0,1μl от работен запас от сондата от 50 μM се добавя към всяка ямка, съдържаща проби от РНК (окончателната концентрация на сондата е 0,25 μM във всяка ямка, съдържаща проби от РНК). 13 μl от основната смес от едностъпална RT-PCR в реално време се разпределя във всяка ямка на PCR плаката, съдържаща денатурираните праймери и РНК.
                     
                  
                        2.1.4.
                     
                     
                        Плаката се поставя в термоциклер за анализ в реално време, програмиран за обратна транскриптаза и за откриване на кДНК амплификация/флуоресценция. Условията за амплификация се състоят от: като първа стъпка обратна транскриптаза при 48 °C в продължение на 25 минути, последвано от 10 минути при температура 95 °C („hot start“) и 40 цикъла от 15 секунди при температура 95 °C, 35 секунди при температура 55 °C и 30 секунди при температура 72 °С (или 40 цикъла при температура 97 °C в продължение на 2 секунди и 55 °C в продължение на 30 секунди, ако се използват реагенти и термоциклер, позволяващи бърза реакция). Данните за флуоресценция се получават в края на стъпката при 55 °C.
                     
                  
                        2.1.5.
                     
                     
                        Анализът се счита за невалиден, ако се получат атипични криви на амплификацията, и трябва да се повтори.
                        Пробите се считат за положителни, ако Ct стойността (стойност на цикъла, при която генерираната при реакцията флуоресценция преминава прага на флуоресценцията) е по-ниска от или равна на определения Ct праг (35) в рамките на 40 PCR цикъла (Ct ≤ 35).
                        Пробите се считат за недостатъчни за формулиране на заключение, ако Ct стойността е над определения Ct праг (35) в рамките на 40 PCR цикъла (Ct ≥ 35).
                        Пробите се считат за отрицателни, ако се получи хоризонтална крива на амплификацията, която не преминава прага в рамките на 40 PCR цикли.
                     
                  2.2.   Специфична за дадена група RT-PCR в реално време от Guthrie et al., 2013
                (4)
            
            RT-PCR в реално време с използване на сонди за флуоресцентен резонансен енергиен трансфер (FRET) за откриването на нуклеинова киселина на вируса на АЧК.
            Описаният анализ RT-PCR на вируса на АЧК беше създаден, като са използвани секвенции на множество циркулиращи в момента полеви щамове на вируса на АЧК (Quan et al., 2010 (5)). Той включва също така патентовани синтетични външни контролни анализи за проверка на правилното функциониране на компонентите на анализа.
            Комплекти за едностъпална PCR в реално време се предлагат в търговската мрежа. По-долу са изброени някои основни етапи, описани от Guthrie et al. (2013 г.), които могат да бъдат изменени според специфичните за конкретния случай и място изисквания, използваните комплекти и наличното оборудване.
            Праймерите и секвенциите за откриване на вируса на АЧК:
            
                        —
                     
                     
                        прав праймер
                     
                     
                        5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        обратен праймер
                     
                     
                        5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        сонда MGB-TaqMan
                     
                     
                        5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′
                     
                  
                        2.2.1.
                     
                     
                        Смесите на стоков разтвор от праймер и сонда се приготвят в концентрация 25× при 5 μΜ за прави и обратни праймери и 3 μΜ за сондата. Формулата на тестовата плака следва да бъде проектирана и въведена в софтуера на машината за PCR в реално време. Като за ориентир се използва формулата, към съответните ямки на плаката се добавят 5 μl от РНК пробите, включително тестови проби и положителни и отрицателни контроли съгласно структурата.
                     
                  
                        2.2.2.
                     
                     
                        РНК се денатурира чрез нагряване при температура 95 °C в продължение на 5 минути, последвано от бързо охлаждане върху лед в продължение на най-малко 3 минути.
                     
                  
                        2.2.3.
                     
                     
                        Съгласно инструкциите на производителя се подготвя необходимият обем от едностъпална RT-PCR в реално време (основна смес) за няколко проби за изследване. 1 μl от концентрирания 25× стоков разтвор от праймер и сонда (от точка 2.2.1 по-горе) се включва в основната смес, за да може във всяка ямка да се получи крайна концентрация от 200 nM за всеки праймер и 120 nM за сондата. 20 μl от основната смес се разпределя във всяка ямка на PCR плаката, съдържаща денатурирана РНК.
                     
                  
                        2.2.4.
                     
                     
                        Плаката се поставя в термоциклер в реално време, програмиран за обратна транскриптаза и за откриване на cDNA амплификация/флуоресценция съгласно насоките на производителите. Условията за амплификация включват например като първа стъпка обратна транскриптаза при температура 48 °C в продължение на 10 минути, последвано от 10 минути при температура 95 °C и 40 цикъла в продължение на 15 секунди при температура 95 °C и 45 секунди при 60 °C.
                     
                  
                        2.2.5.
                     
                     
                        Пробите се считат за положителни, ако нормализираната флуоресценция за анализа RT-PCR на вируса на АЧК надвишава прага от 0,1 в рамките на 36 PCR цикъла във всички повтарящи се проби.
                        Пробите се считат за недостатъчни за формулиране на заключение, ако нормализираната флуоресценция за анализа RT-PCR на вируса на АЧК надвишава прага от 0,1 между 36 и 40 PCR цикъла във всички повтарящи се проби.
                        Пробите се считат за отрицателни, ако нормализираната флуоресценция за анализа RT-PCR на вируса на АЧК не надвишава прага от 0,1 в рамките на 40 PCR цикъла във всички повтарящи се проби и ако нормализираната флуоресценция за патентования синтетичен външен контрол надвишава прага от 0,1 в рамките на 33 PCR цикъла.“
                     
                  
      
      
         (1)  Laviada M.D., Roy P. and Sanchez-Vizcaino J.M (1992b). Adaptation and evaluation of an indirect ELISA and immunoblotting test for African horse sickness antibody detection. In: Bluetongue, African Horse Sickness and Related Orbiviruses: Proceedings of the Second International Symposium. Walton T.E. & Osburn B.l., Eds. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 646–650.
      
         (2)  Maree S. and Paweska J.T. (2005). Preparation of recombinant African horse sickness virus VP7 antigen via a simple method and validation of a VP7-based indirect ELISA for the detection of group-specific IgG antibodies in horse sera. J. Virol. Methods, 125 (1), 55–65.
      
         (3)  Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. and Jimenez-Clavero A. (2008). Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325–328.
      
         (4)  Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus. Journal of Virological Methods (Бюлетин за вирусологичните методи). 2013;189(1):30—35.
      
         (5)  Quan, M., Lourens, C.W., MacLachlan, N.J., Gardner, I.A., Guthrie, A.J., 2010. Development and optimisation of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay targeting the VP7 and NS2 genes of African horse sickness virus. J. Virol. Methods 167, 45–52.