CELEX: 31991D0180
Language: sk
Date: 1991-02-14 00:00:00
Title: Rozhodnutie Komisie zo 14. februára 1991, ktorým sa stanovujú určité metódy analýz a vyšetrovania surového mlieka a tepelne ošetreného mlieka

Dôležité právne oznámenie

|

31991D0180

Úradný vestník L 093 , 13/04/1991 S. 0001 - 0048 Fínske špeciálne vydanie: Kapitola 3 Zväzok 37 S. 0012  Švédske špeciálne vydanie: Kapitola 3 Zväzok 37 S. 0012 

		Rozhodnutie Komisiezo 14. februára 1991,ktorým sa stanovujú určité metódy analýz a vyšetrovania surového mlieka a tepelne ošetreného mlieka(91/180/EHS)KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV,so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva,so zreteľom na smernicu Rady 85/397/EHS z 5. augusta 1985 o zdravotných problémoch a o problémoch so zdravím zvierat ovplyvňujúcich obchod s tepelne ošetreným mliekom [1] v rámci spoločenstva, naposledy zmenenú a doplnenú smernicou 89/662/EHS [2], a najmä na jej článok 10 bod 2,keďže článok 10 (2) ustanovuje, že Komisia stanovuje metódy analýz a vyšetrovania, ktoré sa budú používať na sledovanie súladu s normami týkajúcimi sa surového mlieka a tepelne ošetreného mlieka;keďže je pre surové mlieko nevyhnutné stanoviť metódy najmä na určenie celkového počtu mikroorganizmov, počtu somatických buniek a bodu tuhnutia a na prítomnosť antibiotík;keďže je pre pasterizované mlieko nevyhnutné stanoviť metódy najmä na určenie neprítomnosti patogénov, počtu koliformných organizmov, celkového počtu mikroorganizmov, neprítomnosti fosfatázy, prítomnosti peroxidázy, neprítomnosti antibiotík a bodu tuhnutia;keďže je pre sterilizované mlieko a UHT (ultravysoko ohriate) mlieko nevyhnutné stanoviť metódy na určenie celkového počtu mikroorganizmov a neprítomnosť antibiotík;keďže z technických dôvodov je vhodné, ako prvý krok, stanoviť referenčné metódy analýz a vyšetrovania s cieľom dosiahnuť súlad s určitými normami; keďže je nevyhnutné naďalej skúmať podmienky, za ktorých sa musia používať bežné, analytické a skúšobné metódy; keďže, očakávajúc výsledky takéhoto skúmania, sú to členské štáty, ktoré sú zodpovedné za používanie primeraných bežných metód na dosiahnutie súladu s normami uvedenými v smernici 85/397/EHS;keďže určenie referenčných analytických a skúšobných metód zahŕňa aj určenie analytických postupov, ktoré sa musia dodržiavať a stanovenie kritérií presnosti na zabezpečenie jednotnej interpretácie výsledkov;keďže opatrenia stanovené v tomto rozhodnutí sú v súlade so stanoviskom Stáleho veterinárneho výboru,PRIJALA TOTO ROZHODNUTIE:Článok 1Referenčnými metódami pre analýzu a vyšetrovanie surového mlieka sú nasledovné:- stanovenie bodu tuhnutia,- stanovenie celkového počtu mikroorganizmov — skúška počtu platňovou metódou pri 30 oC,- stanovenie počtu somatických buniek- stanovenie antibiotík a sulfonamidov.Článok 2Referenčnými postupmi pre analýzu a vyšetrovanie pasterizovaného mlieka sú nasledovné:- stanovenie bodu tuhnutia,- stanovenie aktivity fosfatázy,- stanovenie aktivity peroxidázy,- stanovenie celkového počtu mikroorganizmov — skúška počtu platňovou metódou pri 30 oC,- stanovenie celkového počtu mikroorganizmov — skúška počtu platňovou metódou pri 21 oC,- stanovenie počtu koliformných organizmov — počet kolónií pri 30 oC,- stanovenie antibiotík a sulfonamidov,- stanovenie patogénnych mikroorganizmov.Článok 3Referenčnými postupmi pre analýzu a vyšetrovanie UHT mlieka a sterilizovaného mlieka sú nasledovné:- stanovenie celkového počtu mikroorganizmov — skúška počtu platňovou metódou pri 30 oC,- stanovenie bodu tuhnutia,- stanovenie antibiotík a sulfonamidov.Článok 4Referenčné analytické a skúšobné metódy a kritériá presnosti, ktoré sa budú používať, sa musia realizovať a zber vzoriek sa musí vykonávať v súlade s pravidlami uvedenými v prílohe 1.Článok 5Referenčné analytické a skúšobné metódy uvedené v článkoch 1, 2 a 3 sú stanovené v prílohe 2.Článok 6Toto rozhodnutie sa znovu preskúma do 31. decembra 1992 tak, aby sa zohľadnil vývoj v oblasti vedeckých a technických poznatkov.Článok 7Toto rozhodnutie je adresované členským štátom.V Bruseli 14. februára 1991Za KomisiuRay Mac Sharryčlen Komisie[1] Ú. v. ES L 226, 24.8.1985, s. 13.[2] Ú. v. ES L 395, 30.12.1989, s. 13.--------------------------------------------------PRÍLOHA IOBSAHI. | Všeobecné ustanovenia… | 187 |II. | Vzorkovanie surového a tepelne ošetreného mlieka … | 189 |I. VŠEOBECNÉ USTANOVENIA1. ÚvodSú opísané všeobecné ustanovenia, pokiaľ ide o reagenty, zariadenie, vyjadrovanie výsledkov, správy o presnosti a skúšobné protokoly. Príslušné úrady členských štátov a vykonávacie laboratória poverené vzorkovaním a skúšaním mlieka musia dodržiavať všeobecné ustanovenia.2. Reagenty2.1. Voda2.1.1. Všade, kde je zmienka o vode na prípravu roztokov, na riedenie alebo na účely oplachovania, sa musí používať destilované voda, deionizovaná voda alebo demineralizovaná voda o minimálne ekvivalentnej čistote, pokiaľ nie je stanovené inak. Pre mikrobiologické účely nesmie obsahovať látky, ktoré by mohli spôsobiť alebo ovplyvniť rast mikroorganizmov v skúšobných podmienkach.2.1.2. Všade tam, kde je uvedený odkaz na "roztok" alebo "riedenie" bez ďalšieho označenia, tak sa myslí "roztok vo vode" alebo "riedenie vodou".2.2. ChemikálieVšetky používané chemikálie sa musia vyznačovať uznávanou analytickou kvalitou reagentov — pokiaľ nie je stanovené inak.3. Vybavenie3.1. Zoznamy vybaveniaTieto zoznamy vybavenia uvedené v rôznych referenčných metródach obsahujú iba tie položky, ktoré majú špecializované použitie a položky so zvláštnou špecifikáciou.3.2. Analytické váhyPod pojmom analytické váhy sa rozumejú váhy schopné vážiť s presnosťou 0,1 mg.4. Vyjadrenie výsledkov4.1. VýsledkyPokiaľ nie je stanovené inak, výsledky uvedené v analytickej správe musia predstavovať strednú aritmetickú hodnotu získanú z dvoch skúšok, ktoré spĺňajú kritérium opakovateľnosti (5.1.) stanovené pre túto metódu. Pokiaľ kritérium opakovateľnosti nebude splnené, skúška sa musí zopakovať alebo výsledok sa musí prehlásiť za neplatný.4.2. Výpočet percentaAž na prípady, keď je stanovené inak, výsledok musí byť vypočítaný ako hmotnostné percento vzorky.5. Kritériá presnosti: opakovateľnosť a reprodukovateľnosť5.1. Kritériá presnosti, uvedené pre každý postup, sú definované nasledovne:5.1.1. Opakovateľnosť (r) je hodnota, pod ktorou sa nachádza absolútny rozdiel medzi dvoma jednotlivými výsledkami skúšky, získanými tým istým postupom na identickom skúšobnom materiáli, za takých istých podmienok (ten istý pracovník, ten istý prístroj, to isté laboratórium a krátky časový interval).5.1.2. Reprodukovateľnosť (R) je hodnota, pod ktorou sa nachádza absolútny rozdiel medzi dvoma jednotlivými výsledkami skúšky, získanými tým istým postupom na identickom skúšobnom materiáli, za rozdielnych podmienok (rôzni pracovníci, rôzne prístroje, rôzne laboratóriá alebo v rôznom čase).5.1.3. Pokiaľ nie je špecifikované inak, hodnoty pre kritéria opakovateľnosti — a –reprodukovateľnosti, uvedené v príslušných doložkách ku každému postupu predstavujú 95 % intervaly úrovne spoľahlivosti definované podľa ISO 5725: druhé vydanie 1986. Sú vypočítané z výsledkov uznávaných pokusov vykonaných v rámci spolupráce, ktoré sa použili na vyhodnotenie postupu. U niektorých postupov sa však pokusy v rámci spolupráce nevykonali. V takomto prípade boli hodnoty opakovateľnosti a reprodukovateľnosti odhadnuté.5.1.4. Pokusy v rámci spolupráce a štúdie uvedené v 5.1.3. sa musia plánovať a realizovať v súlade s medzinárodnými smernicami.6. Skúšobný protokolV skúšobnom protokole musí byť špecifikovaná použitá analytická metóda, ako aj získané výsledky. Navyše, musia byť v protokole uvedené podrobnosti o použitom postupe, ktoré neboli špecifikované v analytickej metóde, alebo ktoré sú voliteľné, ako aj všetky ostatné okolnosti, ktoré mohli ovplyvniť získané výsledky. V skúšobnom protokole musia byť uvedené všetky informácie potrebné na úplnú identifikáciu vzorky.II. VZORKOVANIE SUROVÉHO A TEPELNE OŠETRENÉHO MLIEKA1. Rozsah a oblasť použitiaTento postup špecifikuje referenčnú metódu odberu vzoriek surového a tepelne ošetreného mlieka. Metódy odberu vzoriek a spôsob prepravy a skladovanie vzoriek sú uplatniteľné na surové mlieko z dodávok výrobcov a na surové mlieko a tepelne ošetrené mlieko v skladovacích tankoch a prepravných cisternách.Postupy uvedené v 2, 4.4., 5 a 6 sú použiteľné na odber vzoriek tepelne ošetreného mlieka určeného na priamu spotrebu.2. VšeobecneVzorkovanie surového a tepelne ošetreného mlieka z kanvíc, cisterien atď. bude vykonávať kvalifikovaný pracovník, ktorý bol zaškolený pred vzorkovaním mlieka.Ak to budú považovať za vhodné, príslušné úrady alebo skúšobné laboratóriá oboznámia pracovníkov určených na odber vzoriek s technikami odberu vzoriek tak, aby zabezpečili, že vzorka bude reprezentatívna za celú dávku.Ak to budú považovať za vhodné, príslušné úrady alebo príslušné laboratóriá oboznámia pracovníkov určených na odber vzoriek o spôsoboch označovania vzorky tak, aby bola zabezpečená jednoznačná identita vzorky.3. Vzorkovacie zariadenie3.1. VšeobecneVzorkovacie zariadenie musí byť vyrobené z nehrdzavejúcej ocele alebo z iného vhodného materiálu o primeranej pevnosti a musí mať konštrukciu vhodnú na daný účel (miešanie, vzorkovanie atď). Plunžery a miešadlá na miešanie kvapalín v kontajneroch musia mať dostatočne veľkú plochu na dosiahnutie adekvátneho premiešania produktu, a to bez spôsobenia vzniku stuchnutej príchute. Naberačky musia mať pevnú rukoväť o dostatočnej dĺžke tak, aby bolo možné odoberať vzorku z ľubovoľnej hĺbky kontajnera. Objem naberačky nesmie byť menší ako 50 ml.Vzorkovnice a uzávery musia byť zo skla, z vhodných kovov alebo z plastov.Materiály, z ktorých je vzorkovacie zariadenie (vrátane vzorkovníc a uzáverov) vyrobené, nesmú spôsobovať žiadnu zmenu vzorky, ktorá by mohla ovplyvniť výsledky skúšky. Všetky povrchy vzorkovacieho zariadenia a vzorkovníc musia byť čisté a suché, hladké a bez akýchkoľvek trhlín a puklín, rohy musia byť zaoblené.3.2. Vzorkovacie zariadenie pre mikrobiologické skúšanieVzorkovacie zariadenie vrátane vzorkovníc kontajnerov musí byť okrem ustanovení uvedených v 3.1. aj sterilnéAk sa to isté vzorkovacie zariadenie používa na následné vzorkovanie, po každom vzorkovaní musí byť očistené a sterilizované v súlade s pokynmi alebo požiadavkami stanovenými skúšobným laboratóriom alebo príslušným úradom tak, aby zostala zachovaná integrita následných vzoriek.4. Technika odberu vzoriek4.1. VšeobecneBez ohľadu na skúšky, ktoré sa musia vykonať, mlieko musí byť pred vzorkovaním dôkladne premiešané, a to ručne alebo mechanickým spôsobom.Vzorka sa musí odobrať ihneď po premiešaní, zatiaľ čo sa mlieko ešte stále mieša.Pokiaľ sa z tankov odoberá niekoľko vzoriek mlieka v rovnakom čase pre rôzne skúšky, vzorka určená na mikrobiologické skúšanie sa odoberie ako prvá.Objem vzorky je daný požiadavkami na skúšanie. Objem použitých vzorkovníc musí byť taký, aby boli nádoby vzorkou naplnené takmer úplne, čím sa umožní riadne premiešanie obsahu pred skúšaním, avšak zabráni sa zrážaniu smotany na maslo počas prepravy.4.2. Ručný odber vzoriek4.2.1. Odber vzoriek z mliečnych vedier a kanvíNa účely dosiahnutia miešania rýchle pohybujte plunžerom smerom hore a nadol vo vedre alebo v kanve a zabezpečte riadne premiešanie mlieka a aby na hrdle kanvy neuľpievala žiadna smotana. Vzorku reprezentatívnu pre celú zásielku získate v súlade s bodom 4.2.4.4.2.2. Odber vzoriek z chladiarenských tankov alebo kanví na farmárske mliekoMlieko miešajte mechanicky alebo ručne, kým nedosiahnete dostatočnú homogénnosť.Ak je objem mlieka taký veľký, že mechanické miešadlo nedokáže mlieko premiešať, vykonávajte ručné miešanie.4.2.3. Vzorkovanie z navažovacej nádobyJe dôležité, aby bolo mlieko riadne premiešané — keď sa vylieva do navažovacej nádoby. Zabezpečenie rovnomerného rozdelenia tuku si môže vyžiadať dodatočné ručné alebo mechanické miešanie. Ak objem zásielky, ktorá sa má vzorkovať, presahuje obsah navažovacej nádoby, vzorku reprezentatívnu pre celú zásielku získate v súlade s bodom 4.2.4.4.2.4. Vzorkovanie rozdeleného objemuAk množstvo mlieka, ktoré sa musí vzorkovať, je väčšie ako jeden kontajner, odoberte reprezentatívne množstvo z každého kontajnera a poznamenajte si množstvo mlieka týkajúce sa každej vzorky. Pokiaľ sa vzorky z každého kontajnera nemajú skúšať jednotlivo, zmiešajte diely týchto reprezentatívnych množstiev v takých množstvách, ktoré sú proporcionálne množstvu v tom kontajneri, z ktorého bola každá vzorka odobraná. Po premiešaní odoberte vzorku/-y z týchto hromadných pomerných objemov.4.2.5. Odber vzoriek z veľkých nádob — skladovacie tanky, železničné a autocisterny4.2.5.1. Pred odberom vzorky premiešajte mlieko vhodným spôsobom.Ak je potrebné premiešať obsah veľkých nádob alebo skladovacích, železničných cisterien alebo autocisterien, odporúča sa použiť mechanické miešadlo (4.2.5.2.).Rozsah miešania musí byť primeraný dobe, po ktorú bolo mlieko v pokoji. Účinnosť spôsobu premiešania použitého za zvláštnych okolností sa musí preukázať ako dostatočná na účely plánovanej analýzy, kritérium účinnosti premiešania ovplyvňuje podobnosť medzi analytickými výsledkami zo vzoriek odobraných buď z rôznych častí zásielok, alebo na výstupe zo zásobníka počas vypúšťania. Spôsob premiešavania mlieka sa bude považovať za účinný vtedy, ak rozdiel v obsahu tuku medzi dvoma vzorkami odobranými za takýchto podmienok, bude menší ako 0,1 %.Vo veľkej nádobe s výpúšťacím ventilom na dne sa môže v mieste výpúšťania nachádzať malé množstvo mlieka, ktoré nebude reprezentatívne pre celý objem, a to dokonca ani po premiešaní. Z tohto dôvodu je potrebné vzorky prednostne odoberať cez prielez. Ak sa vzorky odoberajú z vypúšťacieho ventilu, nechajte odtiecť dostatočné množstvo mlieka, aby ste si boli istí, že vzorky sú reprezentatívne za celé množstvo.4.2.5.2. Premiešanie obsahu veľkých nádob alebo skladovacích, železničných cisterien alebo autocisterien sa môže vykonať:- mechanickým miešadlom zabudovaným do cisterien a poháňaným elektromotorom,- vrtuľou alebo miešadlom poháňaným elektromotorom a umiestneným na prieleze, pričom miešadlo bude ponorené v mlieku,- v prípade železničných cisterien alebo autocisterien recirkuláciou mlieka cez prečerpávaciu hadicu pripojenú k čerpadlám na vyprázdňovanie cisterien a vloženú cez prielez,- čistým filtrovaným stlačeným vzduchom. V takomto prípade sa musí používať minimálny tlak a objem vzduchu s cieľom zabrániť vzniku zatuchnutosti.4.3. Automatický alebo poloautomatický odber vzoriekAutomatické alebo poloautomatické zariadenia na odber vzorkiek surového mlieka z dodávok výrobcov sa môžu používať v súlade s pokynmi vydanými skúšobným laboratóriom alebo iným príslušným úradom.Takéto zariadenie sa musí — pred používaním a v pravidelných intervaloch počas používania — podrobiť príslušným skúškam predpísaným zodpovedným úradom. Vhodnosť postupov pri odbere vzoriek sa musí overiť s cieľom zabezpečiť:- odber minimálneho objemu mlieka, ktoré sa bude dať riadne vzorkovať,- rýchlosť unášania (ktorá súvisí s minimálnym objemom vzorky),- schopnosť získať reprezentatívnu vzorku celého množstva po riadnom premiešaní.Ak sa používa automatické alebo poloautomatické zariadenie na odber vzoriek, zodpovedný príslušný národný úrad môže predpísať:- minimálny objem mlieka, z ktorého sa budú odoberať vzorky,- minimálny objem vzorky,- maximálne chybu z prenosu,- aká analýza sa môže vykonať a aké bezpečnostné opatrenia sa musia prijať.4.4. Odber vzorky tepelne ošetreného mlieka určeného na priamu spotrebu v maloobchodných obalochVzorky tepelne ošetreného mlieka na priamu spotrebu v maloobchodných obaloch sa musia odobrať z úplne utesnených obalov. Ak je to možné, vzorky sa musia odoberať z baliaceho stroja alebo z chladiarenskej komory spracovateľského zariadenia okamžite po spracovaní. V prípade pasterizovaného mlieka v deň spracovania.Vzorky sa odoberú z každého druhu tepelne ošetreného mlieka (pasterizované, UHT a sterilizované) v počtoch zodpovedajúcich skúškam, ktoré sa musia vykonať a v súlade s pokynmi vydanými skúšobným laboratóriom alebo iným príslušným orgánom.5. Označenie vzorkyVzorka musí byť označená identifikačným kódom tak, aby bolo možné ľahko identifikovať pomocou pokynov vydaných skúšobným laboratóriom alebo iným príslušným orgánom s cieľom zabezpečiť identitu vzorky (pozri 2).6. Preprava a skladovanie vzoriekPokyny týkajúce sa podmienok prepravy, skladovania a doby medzi vzorkovaním a analyzovaním mlieka vypracuje skúšobné laboratórium v súlade s druhom mlieka a analytickou metódou, ktorá sa musí použiť. Tieto pokyny budú stanovené v súlade s príslušným národným orgánom.Pokyny budú obsahovať nasledovné body:- počas prepravy skladovania sa musia prijať bezpečnostné opatrenia na zabránenie vystaveniu kontaminujúcim pachom a priamemu slnečnému svetlu. Ak je používaná vzorkovnica priehľadná, musí sa skladovať na tmavom mieste,- vzorky surového mlieka odobraté na mikrobiologickú analýzu sa musia prepravovať a skladovať pri teplote medzi 0 oC a 4 oC. Čas medzi odberom vzoriek a analyzovaním musí byť čo možno najkratší, v žiadnom prípade nie dlhší ako 36 hodín. Ak doba medzi odberom vzoriek a analyzovaním nie je dlhšia ako 24 hodín, príslušný orgán môže akceptovať teplotu skladovania medzi 0 oC a 6 oC,- vzorky pasterizovaného mlieka, odobraté na mikrobiologickú analýzu sa musia prepravovať a skladovať pri teplote medzi 0 oC a 4 oC. Čas medzi odberom vzoriek a analyzovaním musí byť čo možno najkratší, v žiadnom prípade nie dlhší ako 24 hodín,- vzorky mlieka, okrem surového mlieka a pasterizovaného mlieka pre mikrobiologickú analýzu, sa musia skladovať v laboratóriu v chladničke a čas medzi odberom vzoriek a analyzovaním musí byť čo možno najkratší.Špeciálne bezpečnostné opatrenia pre niektoré analýzy sú uvedené v rôznych metódach.--------------------------------------------------PRÍLOHA IIOBSAHI. | Stanovenie bodu tuhnutia… | 193 |II. | Stanovenie aktivity fosfatázy… | 199 |III. | Stanovenie aktivity peroxidázy… | 202 |IV. | Stanovenie celkového počtu mikroorganizmov — skúška platňovou metódou pri 30 oC… | 203 |V. | Stanovenie celkového počtu mikroorganizmov — skúška platňovou metódou pri 21 oC… | 208 |VI. | Stanovenie počtu koliformných organizmov — počet kolónií pri 30 oC… | 212 |VII. | Stanovenie počtu somatických buniek… | 216 |VIII. | Stanovenie antibiotík a sulfonamidov… | 222 |IX. | Stanovenie patogénnych mikroorganizmov… | 231 |I. STANOVENIE BODU TUHNUTIA1. Rozsah a oblasť použitiaTáto metóda opisuje referenčnú metódu stanovenia bodu tuhnutia surového, pasterizovaného, UHT spracovaného a sterilizovaného plnotučného mlieka, polotučného mlieka a odstredeného mlieka s použitím prístroja (termistorový kryoskop), v ktorom termostaticky regulovaný kúpeľ je chladený elektrickým chladením a sonda termistora nahrádza ortuťový teplomer.Sú k dispozícii dva druhy prístrojov. Prvý prístroj je taký prístroj, ktorý vyhľadá maximálny bod tuhnutia na "plató" krivke tuhnutia, zatiaľ čo druhý prístroj — určený na obchodné účely — je nastavený tak, aby zaznamenával v pevných intervaloch po začiatku tuhnutia. Krivky bodov tuhnutia sa môžu u jednotlivých druhov mlieka líšiť tak, ako sa môžu líšiť aj medzi mliekom a štandardnými roztokmi používanými na kalibráciu, táto referenčná metóda si vyžaduje použitie prístrojov vyhľadávajúcich plató. Prístroje s pevným intervalom sa môžu používať na bežné orientačné merania.Bod tuhnutia sa môže použiť na odhadnutie podielu vedľajšej vody v mlieku, za predpokladu, že kyslosť vzorky neprekračuje hodnotu 0,18 g kyseliny mliečnej na 100 ml (pozri 7.4.).2. DefiníciaBod tuhnutia mlieka: Hodnota získaná pri meraní v súlade s opísanou metódou a vyjadrená v stupňoch Celzia (oC).3. PrincípSkúšaná časť objemu mlieka sa podchladí na príslušnú teplotu, v závislosti od prístroja a kryštalizácia sa vyvolá mechanickými vibráciami, ktoré spôsobia, že teplota rýchle stúpne na plató, ktoré zodpovedá tuhnutiu vzorky.Prístroj je kalibrovaný, takže je nastavený tak, aby poskytol dva správne údaje pre dva štandardné roztoky pri použití tej istej metódy, ako pre vzorky mlieka. Za týchto podmienok plató udáva bod tuhnutia mlieka v stupňoch Celzia.4. Aparatúra a laboratórne skloBežné laboratórne zariadenie, najmä:4.1. KryoskopKryoskop sa skladá z termostaticky regulovaného chladiaceho kúpeľa, sondy termistora (polovodičový odporový teplomer) s príslušným obvodom a galvanometra alebo "odčítavania" z miešadla vzorky a zo zariadenia na iniciovanie tuhnutia spolu so vzorkovnicami..4.1.1. Chladiaci kúpeľMôžu sa použiť dva druhy chladiaceho kúpeľa.4.1.1.1. Typ ponoreniaDobre izolovaná vaňa obsahujúca vhodnú chladiacu kvapalinu, ktorá sa mieša tak, aby teplotný rozdiel medzi ľubovoľnými dvoma bodmi v kvapaline neprekročil hodnotu 0,2 oC. Teplota kvapaliny nesmie kolísať o viac ako ± 0,5 oC od menovitej hodnoty určenej výrobcom.Je dôležité, aby hladina kvapaliny v chladiacom kúpeli bola konštantná. Celý objem vzorkovnice musí byť pokrytý chladiacou kvapalinou.4.1.1.2. Spôsob cirkulácieOkolo vzorkovnice cirkuluje trvalý prúd vhodnej chladiacej kvapaliny. Teplota kvapaliny nesmie kolísať o viac ako ± 0,5 oC od menovitej hodnoty určenej výrobcom.Vhodnou chladiacou kvapalinou je 33 % (v/v) vodný roztok etán 1,2 diolu (etylénglykol).4.1.2. Termistor a sprievodný okruhIde o druh termistora so sklenenou sondou o priemere nie väčšom ako 1,80 ± 0, 2 mm a s priemerom prívodného vedenia nie väčším ako 0,31 mm. Časová konštanta termistora musí byť menšia ako dve sekundy a hodnota β (pozri poznámku) bude vysoká. Pracovné napätie, prúd a konštanta rozptylu musia byť také, aby teplota termistora nestúpla o viac ako 0,0005 oC nad okolitú teplotu pri – 0,512 oC. Maximálna tolerancia na odpore bude ± 5 %.Ak sa sonda v kryoskope nachádza v pracovnej polohe, hrot sklenenej guľôčky musí byť v osi vzorkovnice a v bode 44,6 ± 0, 1 mm pod hornou časťou rúrky (pozri obr. na strane 15). Súčasťou kryoskopu musí byť šablóna, ktorá umožní používateľovi nastaviť sondu do tejto polohy.Poznámkaβ definuje charakteristiky odporu — teplota termistora podľa vzorca:-×=βT2pričom:T  je teplota v Kelvinoch,R  je odpor v ohmoch pri teplote T,−×1R  je teplotný koeficientβ  je konštanta závislá od materiálu použitého na výrobu termistora. V bežnej praxi sa odporúča hodnota nad 3000.4.1.3. Meracie a odčítavacie zariadenie4.1.3.1. Princíp meraniaPoužitý prístroj pracuje na princípe hľadania prvého plató na krivke bodov tuhnutia. Plató je taká časť krivky, v ktorej teplota zostane konštantná na ± 0, 002 oC po dobu minimálne 20 sekúnd.4.1.3.2. Ručné ovládanieOdpor termistora bude vyrovnávaný pomocou Wheatstone mostíka alebo podobného zariadenia, s použitím stálych odporov najvyššej kvality, ktorých tolerancia nebude väčšia ako ± 10 % a ktorých teplotný koeficient neprekročí hodnotu 2 × 10– 5oC.Menlivý (vyrovnávací) odpor sa neodchýli od lineárnosti v celom svojom rozsahu o viac ako 0,3 % svojej maximálnej hodnoty.Musia existovať možnosti na nastavovanie odporov na účely kalibrácie.Meracia kruhová stupnica bude delená po dielikoch nie väčších ako 0,001 oC.4.1.3.3. Automatické ovládanieOdčítavacie zariadenie musí mať rozlíšenie najmenej 0,001 oC v rozsahu od 0 oC do - 1oC.Stálosť odčítavacieho zariadenia a jeho pridruženého obvodu bude taká, aby sa následné indikácie tej istej teploty nelíšili o viac ako 0,001 oC.Lineárnosť obvodu musí byť taká, aby sa nevyskytla žiadna chyba väčšia ako ± 0, 001 oC v ľubovoľnom bode v rozsahu od – 0,400 oC do - 0,600 oC, ak je prístroj správne prevádzkovaný.4.1.4. Miešací drôtNa miešanie skúšobného podielu sa používa drôt z kovu inertného voči mlieku o priemere 1 až 1,5 mm.Miešací drôt musí vyť nastavený na amplitúdu a musí sa montovať vertikálne, pričom jeho spodný koniec bude v jednej rovine s hrotom sondy termistora. Dovolená je tolerancia cca 1,5 mm nad alebo pod touto polohou.Miešací drôt bude vibrovať priečne s dostatočnou amplitúdou určenou výrobcom (nie menej ako ± 1, 5 mm) tak, aby sa zabezpečilo, že teplota v skúšanej časti zostane počas stanovovania rovnaká. Počas bežného procesu miešania sa miešací drôt v žiadnom momente nesmie dotknúť sondy termistora a ani steny skúmavky.4.1.5. Prístroj na iniciáciu tuhnutiaMôže to byť akýkoľvek prístroj, ktorý v prípade, že je v prevádzke, okamihovo iniciuje tuhnutie vzorky tak, že teplota skúšanej časti stúpa smerom k bodu tuhnutia. Na tento účel sa môže použiť miešací drôt; jednou z metód je zvýšiť amplitúdu vibrácií na jednu až dve sekundy tak, aby sa miešací drôt dotkol steny vzorkovnice4.1.6. Vzorkovnice (vzorková skúmavka)Vzorkovnice (pozri obr. 1) sú vyrobené zo skla a musia byť dlhé 50,8 ± 0,1 mm, s vonkajším priemerom 16,0 ± 0,1 mm a s vnútorným priemerom 13,5 ± 0,1 mm. Hrúbka steny skúmavky sa nesmie líšiť o viac ako 0,1 mm.Skúmavky musia mať objemovú značku 29,8 mm pod koncom (21 mm nad dnom rúrky), čím je označený objem vzorky 2,5 ± 0, 1 ml.4.1.7. Zásobovanie elektrickou energiouNapájacie napätie musí byť stablizované buď v aparatúre, alebo externe tak, aby kolísanie nepresiahlo ± 1 % menovitej hodnoty, keď napájanie zo siete kolíše ± 6 %.4.2. Analytické váhy.4.3. Odmerné banky s jednou značkou, obsah 1000 ml, trieda A.4.4. Sušiaca pec, dobre odvetrávaná, s možnosťou regulácie teploty na 130 ± 1 °CaleboElektrická pec, vetraná, s možnosťou regulácie teploty na 300 ± 25 °C4.5. Exsikátor5. Reagenty5.1. Destilovaná voda v borokremičitom skle, privedená do varu a ochladená na 20 ± 2 °C v banke opatrenej absorbčnou rúrkou s oxidom uhličitým.5.2. Chlorid sodný, kvalita analytického reagentu, jemne mletý, sušený po dobu 5 hodín pri 300 ± 25 °C v peci alebo alternatívne sušený v sušiarni pri teplote 130 ± 1 °C počas 24 hodín a ochladený na izbovú teplotu vo výkonnom exsikátore.5.3. Príprava štandardných roztokovNavážte príslušné množstvo (pozri tabuľku 1) suchého chloridu sodného (5.2.) do navažovačky. Rozpustite v destilovanej vode (5.1.), preneste kvantitatívne do 1000 ml odmernej banky s jednou značkou a rozrieďte až po značku vodou pri teplote 20 ± 2 °C.Skladujte pri teplote približne 5 °C v dobre zazátkovaných polyetylénových fľašiach o obsahu nie väčšom ako 250 ml a nie dlhšie ako dva mesiace.Bod tuhnutia roztokov chloridu sodného pri 20 °Cg NaCl/l | oC |6,859 | –0,408 |7,818 | –0,464 |8,149 | –0,483 |8,314 | –0,492 |8,480 | –0,502 |8,646 | –0,512 |8,811 | –0,521 |8,977 | –0,531 |9,143 | –0,541 |10,155 | –0,600 |Pred použitím štandardného roztoku fľašu niekoľkokrát jemne prevráťte a zatočte ňou tak, aby sa jej obsah dôkladne premiešal. Štandardný roztok sa nesmie miešať prudko, aby do neho nevnikol vzduch.Vzorky štandardného roztoku sa odoberajú z fľaše vyliatím roztoku do čistej suchej kadičky, napr. na tento účel sa nikdy nesmú požívať pipety.Roztoky sa nemôžu používať z fliaš, ktoré sú plné menej ako do jednej štvrtiny a pokiaľ nie sú chránené fungicídnou látkou (napr. thiomersalový roztok, 10 g/l), nemôžu sa používať, ak sú staršie ako dva mesiace.6. Kalibrácia termistorového kryoskopuKryoskop musí byť uložený tak, aby sa teplota okolitého vzduchu nelíšila o viac ako 1 oC od teploty, pri ktorej sa vykonáva kalibrácia. Kryoskop nesmie byť vystavený slnečnému svetlu, prievanu a ani izbovej teplote vyššej ako 26 až 27 oC.Presvedčte sa, či je kryoskop v dobrom prevádzkovom stave v súlade s pokynmi výrobcu a či bol pred kalibráciou zapnutý najmenej 12 hodín. Skontrolujte polohu sondy, amplitúdu vibrácií miešacieho drôtu a teplotu chladiacich kvapalín.Vyberte dva štandardné roztoky (pozri tabuľku 1 vyššie), ktoré sa tesne približujú očakávanej hodnote bodu tuhnutia vzoriek mlieka, ktoré sa budú skúšať. Rozdiel bodov tuhnutia medzi týmito dvoma roztokmi by podľa možnosti nemal byť menší ako - 0,100 oC.(Pri určitých konštrukčných prevedeniach bežne dostupných kryoskopov je obvod združený s termistorom navrhnutý tak, aby bol vyrovnaný pri špecifickej hodnote bodu tuhnutia v rámci rozsahu merania prístroja). V takýchto prípadoch použitie štandardného roztoku majúceho rovnaký bod tuhnutia ako jeden z kalibračných roztokov uľahčí proces kalibrácie a výrobca musí túto hodnotu uviesť).Odoberte pipetou 2,5 ± 0, 1 ml jedného zo štandardov do čistej suchej skúmavky na vzorku a uveďte kryoskop do činnosti.PoznámkaSkúmavky na vzorky, ktoré sa používajú počas kalibrácie, musia byť vyrobené z rovnakého druhu skla a umyté a vypláchnuté demineralizovanou vodou súčasne s tými, ktoré sa používajú pri skúšaní vzoriek mlieka. Teplota štandardných roztokov musí byť podobná teplote vzoriek mlieka.Nastavujte ovládacie prvky na kalibráciu — podľa pokynov výrobcu — kým údaj na stupnici kryoskopu nebude totožný s bodom tuhnutia štandardného roztoku. Tento postup zopakujte s druhým štandardným roztokom a pokračujte alternatívne týmto spôsobom, kým následné odčítané hodnoty pri každom roztoku nebudú ukazovať správnu hodnotu bodu tuhnutia každého jedného roztoku bez ďalšieho nastavovania pomocou ovládacích prvkov na kalibráciu. Potom už bude kryoskop pripravený na používanie a bude udávať priamo bod tuhnutia vzorky mlieka bez toho, aby bolo potrebné použiť akúkoľvek korekciu.7. Príprava skúšobnej vzorky7.1. Ak to bude potrebné, vzorky skladujte pri teplote 0 až 5 oC.7.2. Odstráňte všetky viditeľné cudzie telieska alebo tuhý mliečny tuk zo vzorky a, ak je potrebné, prefiltrovaním do čistej suchej nádoby a vzorku jemne premiešajte. Filter, pokiaľ sa použije, musí byť inertný voči mlieku a musí byť účinný, ak sa používa pri laboratórnej teplote.7.3. Mlieko je možné skúšať, keď sa nachádza pri svojej skladovacej teplote (0 až 5 oC) alebo môže dosiahnuť laboratórnu teplotu bezprostredne pred začatím skúšky. Je však nevyhnutné, aby používané štandardné roztoky a vzorky mlieka mali rovnakú teplotu.7.4. Stanovte titrovateľnú kyslosť mlieka čo možno v najbližšom časovom momente ako skúšku bodu tuhnutia. Vzorky s kyslosťou presahujúcou hodnotu 0,18 g kyseliny mliečnej na 100 ml mlieka sa nemôžu skúšať.7.5. UHT spracované a sterilizované mlieko nechajte stáť najmenej 20 minút pred skúškou v otvorenej vzorkovnici.8. Postup8.1. Predbežné kontrolySkontrolujte, či je hladina a teplota chladiacej kvapaliny v súlade s pokynmi výrobcu a či — ak to pripadá do úvahy — sa sonda termistora nachádza v prázdnej skúmavke v jímke na vzorku Zapnite kryoskop a presvedčte sa, či bola chladiaca kvapalina riadne miešaná alebo cirkulovaná. Ak bol kryoskop zapnutý najmenej 12 hodín, skontrolujte teplotu chladiacej kvapaliny a polohu a amplitúdu vibrácií miešacieho drôtu.8.2. Bežná kontrola kalibráciePred každým skúšobným chodom merajte bod tuhnutia štandardného roztoku chloridu sodného (napr. roztok s bodom tuhnutia - 0,512 oC), až kým sa dve následné stanovenia nebudú líšiť o viac ako 0,001 oC. Ak sa priemer týchto dvoch hodnôt líši od bodu tuhnutia štandardného roztoku o viac ako 0,002 oC, kalibráciu kryoskopu zopakujte spôsobom opísaným v bode 6.Ak sa kryoskop používa trvalo, bežnú kontrolu kalibrácie vykonávajte najmenej jedenkrát za hodinu. Pokyny výrobcu sa musia brať do úvahy.8.3. Stanovovanie bodu tuhnutia mliekaVzorkovnicu s mliekom jemne prevráťte a otočte ňou niekoľkokrát tak, aby sa jej obsah premiešal. Vzorka sa nikdy nesmie miešať prudko, aby do nej nevnikol vzduch.Odoberte pipetou 2,5 ± 0, 1 ml mlieka do čistej suchej skúmavky na vzorky a nadbytočné množstvo odstráňte pomocou pipety. Presvedčte sa, či je sonda a miešací drôt čistý a suchý a v prípade potreby utierajte opatrne mäkkou, čistou handričkou zbavenou textilného prachu zdola nahor.Vložte skúmavku so vzorkou do kalibrovaného kryoskopu v súlade s pokynmi výrobcu. Mlieko sa ochladí a tuhnutie bude iniciované pri teplote určenej výrobcom s presnosťou na 0,1 oC.(Pri niektorých automatických prístrojoch je možné túto teplotu sledovať na digitálnej zobrazovacej jednotke; pri ručných prístrojoch sa potrebná presnosť dosiahne tým, že sa zabezpečí, aby tuhnutie začalo vtedy, keď ručička galvanometra alebo vlasová čiara zhoduje s príslušnou značkou).Ak sa z akejkoľvek príčiny začne tuhnutie pod alebo nad predpísaným teplotným rozmedzím, skúšku zrušte a zopakujte ju s inou časťou skúšaného mlieka. Ak opakovaná vzorka bude taktiež tuhnúť pod alebo nad určenou teplotou, ďalšiu časť vzorky treba zohriať na 45 oC a ponechať ju pri tejto teplote po dobu päť minút tak, aby sa mohol roztopiť kryštalický tuk.Potom znovu ochlaďte na skúšobnú teplotu a okamžite vykonajte skúšku. Teplota mlieka po začatí tuhnutia bude prudko stúpať na hodnotu, ktorá zostane virtuálne konštantnou na určitú dobu skôr, ako začne znovu klesať. Bod tuhnutia zodpovedá najvyššej teplote dosiahnutej počas tejto doby a táto hodnota sa musí zaznamenať.PoznámkaČas, po ktorý teplota zostane konštantná a časový interval medzi začatím tuhnutia a dosiahnutím najvyššej teploty sa budú líšiť od vzorky ku vzorke a budú podstatne kratšie pre vodu a štandardné roztoky chloridu sodného ako pre mlieko. Túto najvyššiu teplotu treba bezpodmienečne zaznamenať.Ak bude meranie uspokojivo ukončené, vyberte skúmavku, vypláchnite ju vodou, a potom vysušte sondu termistora a miešací drôt suchou, čistou handričkou zbavenou textilného prachu smerom zdola nahor a vykonajte duplicitné stanovenie na ďalšej časti vzorky mlieka.Ak rozdiel medzi získanými bodmi tuhnutia bude väčší ako hodnota opakovateľnosti, (0,004 oC), vykonajte duplicitné stanovenie na ďalšej časti vzorky. Za predpokladu, že tieto dve stanovenia sa budú zhodovať s presnosťou na 0,004 oC, tieto hodnoty sa musia zaznamenať a použiť pri výpočte konečného výsledku.8.4. Chladenie sondyPo použití prístroja umiestnite do jímky na vzorku prázdnu skúmavku na vzorku a spustite pracovnú hlavu s cieľom udržať sondu chladnú. (Pri určitých konštrukčných prevedeniach kryoskopu toto nemusí byť možné; v takýchto prípadoch je nevyhnutné zabezpečiť, aby sonda bola primerane ochladená pred vykonávaním meraní, napríklad tak, že sa vykoná niekoľko slepých stanovení, až kým sa nezískajú zhodné hodnoty na prístroji).9. Vyjadrenie výsledkov9.1. VýpočetAk — po bežnej kontrole kalibrácie — bude kalibrácia potvrdená, vypočítajte priemer získaných akceptovateľných duplicitných hodnôt bodov tuhnutia, zaokrúhlený na tretie desatinné miesto.Ak súčet dvoch akceptovateľných duplicitných hodnôt je nepárnym číslom, tak priemer sa musí zaokrúhliť na najbližšiu párnu hodnotu tak, ako je to uvedené v nasledovnom príklade:Bod tuhnutia ( oC)Duplicitné hodnoty | Priemer || |-0,544 | -0,545 | -0,544 |-0,545 | -0,546 | -0,546 |9.2. Presnosť9.2.1. Opakovateľnosť (r): 0,004 oC.9.2.2. Reprodukovateľnosť (R): 0,006 oC+++++ TIFF +++++Obrázok 1Detail termistorického kryoskopu 4.1. (postavenie vzorkovacej trubice vo vzťahu k sonde a miešaciemu drôtu)II. STANOVENIE AKTIVITY FOSFATÁZY1. Rozsah a oblasť použitiaTáto metóda špecifikuje referenčnú metódu stanovenia aktivity fosfatázy v pasterizovanom mlieku.2. Definícia2.1. Aktivita fosfatázy je mierou množstva aktívnej alkalickej fosfatázy prítomnej v produkte, vyjadrenej ako množstvo fenolu v mikrogramoch, uvoľnené za podmienok uvedených v tejto metóde z 1 ml pasterizovaného mlieka.2.2. Každé mlieko, ktorého aktivita fosfatázy je nižšia 4 μg/ml, sa považuje za fosfatázovo negatívne.3. PrincípAktivita fosfatázy sa vyhodnocuje z množstva fenolu uvoľneného z fenyl fosforečnanu disodného pridaného do vzorky. Uvoľnený fenol reaguje s dibromchinonchlorimidom za tvorby dibromindofenolu (modrastej farby), ktorý sa meria kolorimetricky pri 610 nm. Porovnanie sa vykoná so vzorkou, ktorej bol enzým fosfatáza zničený.4. Reagenty4.1. Tlmivý roztok boritanu — hydroxidu barnatého4.1.1. Rozpustite 50,0 g hydroxidu barnatého [Ba(OH)2 · 8H2O] vo vode a doplňte na 1000 ml.4.1.2. Rozpustite 22,0 g kyseliny boritej [H3BO3] vo vode a doplňte na 1000 ml.4.1.3. Zahrejte 500 ml z každého roztoku na 50 oC, roztoky premiešajte, zamiešajte, prudko ochlaďte približne na 20 oC a podľa potreby upravte pH na hodnotu 10,6 ± 0, 1 pridaním roztoku podľa bodu 4.1.1. alebo 4.1.2. Prefiltrujte. Roztok uchovávajte v tesne uzatvorenej vzorkovnici.4.1.4. Pred použitím roztok zrieďte rovnakým množstvom vody.4.2. Tlmivý roztok tvoriaci farbuRozpustite 6,0 g metaboritanu sodného (NaBO2) alebo 12,6 g (NaBO2 · 4H2O) a 20,0 g chloridu sodného (NaCl) vo vode a doplňte na 1000 ml.4.3. Tlmivý roztok zrieďujúci farbuZrieďte 10 ml tlmivého roztoku tvoriaceho farbu (4.2.) vodou na 100 ml.4.4. Tlmivý substrátRozpustite 0,1 g fenylfosforečnanu disodného, dehydratujte voľný fenol v 100 ml tlmivého roztoku (4.1.3.) alebo rozpustite 0,5 g fenylfosforečnanu disodného v 4,5 ml tlmivého roztoku tvoriaceho farbu (4.2.), pridajte dve kvapky roztoku BQC (4.6.) a nechajte stáť pri izbovej teplote 30 minút. Extrahujte takto vytvorenú farbu pomocou 2,5 ml 1 — butanolu a nechajte stáť, kým sa 1- butanol neoddelí. 1- butanol odstráňte a vyhoďte. V prípade potreby extrakciu opakujte.Roztok sa môže skladovať niekoľko dní v chladničke; pred použitím vytvorte farbu a reextrahujte ju. Tlmený substrát pripravujte bezprostredne pred použitím tak, že 1 ml tohto roztoku zriedite na 100 ml pomocou tlmivého roztoku boritanu — hydroxidu bárnatého (4.1.3.).4.5. Precipitant zinku — mediRozpustite 3,0 g síranu zinočnatého (ZnSO4 · 7H2O) a 0,6 g síranu meďnatého (CuSO4.5 H2O) vo vode a doplňte na 100 ml4.6. 2.6-dibróm chinón chlorimid (roztok BQC)Rozpustite 40 ± 1 mg 2,6 — dibróm chinón chlorimidu (BQC) (C6H2Br2ClNO6) v 10 ml 96 % (obj/obj) etylalkoholu.Skladujte v chladničke v tmavej fľaši. Ak dôjde k odfarbeniu alebo roztok bude starší ako jeden mesiac, roztok vyhoďte.4.7. Roztok síranu meďnatéhoRozpustite 0,05 g síranu meďnatého (CuSO4 · 5H2O) vo vode a doplňte na 100 ml.4.8. Štandardné roztoky fenolu4.8.1. Odvážte 200 ± 2 mg čistého bezvodého fenolu, preneste ho do 100 ml odmernej banky, pridajte vodu, premiešajte a doplňte po značku. Tento zásobný roztok zostane v chladničke stály niekoľko mesiacov.4.8.2. Zrieďte 10 ml zásobného roztoku vodou na 100 ml a premiešajte. 1 ml obsahuje 200 μg fenolu.5. Aparatúra a laboratórne skloPoznámky:a) Všetko laboratórne sklo, zátky a nástroje na odber vzoriek musia byť dôkladne očistené. Odporúča sa vypláchnuť ich čerstvo zovretou destilovanou vodou alebo ich vyvariť.b) Určité druhy plastových zátok môžu spôsobovať kontamináciu fenolom a ich používanie nesmie byť dovolené.Bežné laboratórne zariadenie a najmä:5.1. Analytické váhy5.2. Vodný kúpeľ, s možnosťou regulácie teploty na 37 ± 1oC.5.3. Spektrofotometer vhodný na odčítania údajov prístroja pri vlnovej dĺžke 610 nm.5.4. Skúmavky, 16 alebo 18 x 150 mm, prednostne kalibrované po 5 a 10 ml.5.5. Pipety5.6. Sklené lieviky vhodnej veľkosti, napr. o priemere 5 cm.5.7. Skladané filtre o priemere najmenej 9 cm, pre strednú filtračnú rýchlosť.5.8. Odmerné banky na prípravu štandardných roztokov.6. PostupPoznámky:a) Počas stanovovania zabráňte účinkom priameho slnečného svetla.b) Kontaminácia stopami slín alebo potu môže poskytnúť nesprávne kladné výsledky a musí sa jej zabrániť. V tomto smere sa musí klásť zvláštny dôraz na proces pipetovania.6.1. Príprava skúšobnej vzorky6.1.1. Analýzu vykonajte priamo po vzorkovaní. V opačnom prípade uchovávajte vzorku v chladničke, nie dlhšie ako dva dni.6.2. Testovaná časť vzorkyNapipetujte do dvoch skúmaviek (5.4.) 1 ml skúšobnej vzorky, pričom jednu skúmavku použite ako kontrolnú alebo slepú.6.3. Stanovenie6.3.1. Zahrievajte slepú vzorku po dobu dvoch minút vo vriacej vode; skúmavku a kadičku s vriacou vodou zakryte hliníkovou fóliou tak, aby bola istota, že sa celá skúmavka zahreje. Prudko ochlaďte na izbovú teplotu.6.3.2. So slepou vzorkou a skúšobnou vzorkou zaobchádzajte obdobne po celý priebeh procesu. Pridajte 10 ml tlmivého substrátu (4.4.) a premiešajte.6.3.3. Ihneď inkubujte vzorky vo vodnom kúpeli (5.2.) 60 minút, obsah príležitostne premiešajte (najmenej štyrikrát).6.3.4. Zahrievajte vo vriacej vode dve minúty tým istým spôsobom ako v bode 6.3.1. Prudko ochlaďte na izbovú teplotu.6.3.5. Pridajte do každej skúmavky 1 ml precipitantu na zinok-meď a dôkladne premiešajte.6.3.6. Prefiltrujte cez suchý filtračný papier, prvé dva ml vyhoďte, v prípade potreby opakujte filtrovanie tak dlho, až kým filtrát nebude úplne číry a vložte do skúmavky 5 ml.6.3.7. Pridajte 5 ml tlmivého roztoku vytvárajúceho farbu (4.2.).6.3.8. Pridajte 0,1 ml roztoku BQC (4.6.), premiešajte a nechajte vytvárať farbu 30 minút pri izbovej teplote.6.3.9. Merajte absorbanciu voči kontrolnej alebo slepej vzorke v spektrofotometri (5.3.) pri vlnovej dĺžke 610 nm.6.3.10. Opakujte stanovenie s vhodným zriedením vzorky, ak bude absorbancia zameraná podľa bodu 6.3.9. vyššia ako absorbancia štandardu obsahujúceho 20 μg fenolu v jednej skúmavke nameraná podľa bodu 6.4.4. Pripravte takéto zriedenie zmiešaním jedného objemu skúšobnej vzorky s príslušným objemom časti tej istej skúšobnej vzorky zahriatej opatrne na bod varu s cieľom inaktivovať fosfatázu.6.4. Zostrojenie kalibračnej krivky6.4.1. Pripravte vhodný rozsah zriedených štandardov, začínajúc štandardným fenolom (4.8.2.) obsahujúcim 0 (kontrolná alebo slepá vzorka), 2, 5, 10 a 20 μg fenolu na mililiter a napipetujte 1 ml vody a 1 ml štyroch štandardných roztokov fenolu do každej z piatich skúmaviek.6.4.2. Do každej skúmavky pridajte 1 ml roztoku síranu meďnatého (4.7.), 5 ml tlmivého roztoku riediaceho farbu (4.3.), 3 ml vody a 0,1 ml roztoku BQC (4.6.); premiešajte.6.4.3. Nechajte farbu vyvíjať sa 30 minút pri izbovej teplote.6.4.4. Odmerajte absorbanciu voči kontrolnej alebo slepej vzorke v spektrofotometri (5.3.) pri vlnovej dĺžke 610 nm.6.4.5. Z hodnôt absorbancie (6.4.4.), získaných pre každý prídavok fenolu (6.4.1.) vypočítajte metódou najmenších štvorcov regresnú čiaru.7. Vyjadrenie výsledkov7.1. Výpočet a vzorec7.1.1. Z odčítaného údaja absorbancie (6.3.9.) vypočítajte s použitím získanej regresnej čiary množstvo fenolu.7.1.2. Z nasledovného vzorca vypočítajte aktivitu fosfatázy vyjadrenú v mikrogramoch fenolu na mililiter pasterizovaného mlieka:Aktivita fasfatázy = 2,4 x A x Dpričom:A  je množstvo fenolu v mikrogramoch získané podľa bodu 7.1.1.;D  je zrieďovací faktor riedenia podľa bodu 6.3.10. (v prípade nulového zrieďovania, D = 1).Faktor 2,4 je zrieďovací faktorom (5/12 1 ml skúšobnej vzorky) — Pozri 6.2. v súvislosti 6.3.2., 6.3.5., 6.3.6.7.2. Presnosť7.2.1. Opakovateľnosť (r) 2 μg fenolu/ml7.2.2. Reprodukovateľnosť (R): 3 (predbežne) μg fenolu/ml7.2.3. Ak sa použije zriedenie podľa bodu 6.3.10., tak medzná hodnota uvedená v 7.2.1. a vzťahuje sa na výsledky získané v zriedenej vzorke.III. STANOVOVANIE AKTIVITY PEROXIDÁZY1. Rozsah a oblasť použitiaTento postup špecifikuje referenčnú metódu stanovenia prítomnosti alebo neprítomnosti enzýmu peroxidáza v mlieku ako kontrolu pasterizácie.2. DefiníciaReakcia pozitívna na peroxidázuAk je mlieko správne pasterizované, modrá farba sa objaví do 30 sekúnd po zmiešaní.Reakcia negatívna na peroxidázuŽiadna farba sa do 30 sekúnd po zmiešaní neobjaví.3. PrincípEnzým poroxidáza rozkladá peroxid vodíka. Uvoľnený atomárny kyslík oxiduje bezfarebný 1,4 — fenyléndiamín na purpurový indofenol (skúška podľa Storcha). Intenzita farby je úmerná koncentrácii enzýmu.4. Reagenty4.1. Roztok 1,4 — fenyléndiamínuRozpustite 2 g 1,4 — fenyléndiamínu (C6H8N2) v teplej (50 oC) vode a doplňte na objem 100 ml. Roztok uchovávajte v tmavej hnedej fľaši so sklenou zátkou a skladujte ho na tmavom a chladnom mieste. Po príprave začne roztok 1,4 — fenyléndiamínu vytvárať za jeden až dva dni sediment: potom sa musí vyhodiť.4.2. Roztok peroxidu vodíkaZrieďte 9 ml 30 % peroxidu vodíka vodou a doplňte na objem 100 ml. Kvôli stabilizácii pridajte 1 ml koncentrovanej kyseliny sírovej na liter roztoku.Roztok peroxidu vodíka je stály jeden mesiac, pokiaľ sa uchováva na chladnom, tmavom mieste vo fľaši so sklenou zátkou zabraňujúcou akémukoľvek kontaktu s organickými zlúčeninami.5. Postup5.1. Vložte 5 ml vzorky mlieka do čistej skúmavky opatrenej vhodným uzáverom.5.2. Pridajte 5 ml roztoku 1,4 — fenyléndiamínu (4.1.).5.3. Pridajte 2 kvapky roztoku peroxidu vodíka (4.2.).5.4. Sledujte tvorbu farby do 30 sekúnd po premiešaní. Pokiaľ sa modrá farba objaví neskôr ako 30 sekúnd po pridaní reagentov, reakcia je nešpecifická.IV. STANOVENIE CELKOVÉHO POČTU MIKROORGANIZMOV — SKÚŠKA POČTU PLATŇOVOU METÓDOU PRI 30 oC1. Rozsah a oblasť použitiaTento postup špecifikuje referenčnú metódu spočítavania mikroorganizmov technikou počtu kolónií pri 30 oC. Táto metóda sa dá použiť na surové a pasterizované mlieko a na UHT spracované a sterilizované mlieko kultivované 15 dní pri teplote 30 oC.2. DefiníciaPod označením "mikroorganizmy" sa rozumejú: organizmy tvoriace spočítateľné kolónie kultivované aeróbne za opísaných podmienok.3. PrincípDefinovaný objem vzorky mlieka sa v Petriho miskách zmieša so živnou pôdou a kultivuje sa 72 hodín pri teplote 30 oC. Kolónie sa spočítajú a vypočíta sa počet mikroorganizmov na 1 ml surového alebo pasterizovaného mlieka alebo na 0,1 ml kultivovaného UHT spracovaného alebo sterilizovaného mlieka.4. Aparatúra a laboratórne skloBežné laboratórne zariadenie a najmä:4.1. Prístroje4.1.1. Teplovzdušná sušiareň, s možnosťou regulácie teploty od 170 do 175 oC.4.1.2. Autokláv, s možnosťou regulácie teploty na 121 ± 1 oC.4.1.3. Termostat, s možnosťou regulácie teploty na 30 ± 1 oC v celom svojom objeme.4.1.4. pH meter, s teplotnou kompenzáciou, s presnosťou na ± 0, 1 pH jednotky.4.1.5. Vodný kúpeľ, s možnosťou regulácie teploty na 45 ± 1 oC.4.1.6. Šošovka, zväčšenie 2 — 4 krát.4.1.7. Šošovka, zväčšenie 8 — 10 krát.4.1.8. Počítadlo etikiet4.1.9. Miešadlo s možnosťou premiešať 1 ml vzorky mlieka alebo desatinné zriedenie 9 ml riedidla a pracujúce na princípe excentrickej rotácie obsahu skúmavky.4.2. Laboratórne sklo4.2.1. Skúmavky s vhodnými uzávermi a s dostatočným obsahom, aby boli schopné pojať s adekvátnym voľným priestorom medzi náplňou a uzáverom kvôli premiešaniu 10 ml primárneho riedenia alebo ďalších desatinných riedení.4.2.2. Banky o obsahu 150 až 250 ml alebo skúmavky o obsahu cca 20 ml na uchovávanie živnej pôdy.4.2.3. Pipety (zazátkované vatou) zo skla alebo sterilného syntetického materiálu s neodlomeným hrotom, s menovitým obsahom 1 ml a s výtokovým otvorom o priemere 1,75 až 3 mm.4.2.4. Petriho misky z číreho bezfarebného skla alebo zo sterilného plastu, spodná miska s vnútorným priemerom 90-100 mm. Vnútorná hĺbka musí byť minimálne 10 mm. Na dne sa nesmú vyskytovať žiadne nepravidelnosti, ktoré by rušivo zasahovali do počítania kolónií.4.2.5. Sterilizácia laboratórneho sklaLaboratórne sklo sa musí sterilizovať jedným z nasledovných postupov:a) tým, že sa ponechá pri teplote 170 až 175 oC najmenej jednu hodinu v teplovzdušnej sušiarni (4.1.1.);b) tým, že sa ponechá pri teplote 121 ±1 oC najmenej 20 minút v autokláve (4.1.2.).V autokláve treba dávať pozor nato, aby sa zabezpečil adekvátny prienik pary — napríklad ak sa zariadenie sterilizuje v kontajneroch, tak tieto nemôžu byť tesne uzatvorené, banky musia mať uvoľnené viečka.Laboratórne sklo sterilizované v autokláve sa musí vysušiť odsávaním pary.Pipety musia byť sterilizované v teplovzdušnej sušiarni (4.1.1.).5. ivná pôda — počet mliečnych doštičiek v agare5.1. Zloženie:Kvasnicový extrakt | 2,5 g |Tryptón | 5,0 g |Glukóza D (+) alebo dextróza | 1,0 g |Sušené odstredené mlieko | 1,0 g |Agar | 10 až 15 g, v závislosti od želírovacích vlastností použitého agaru. |Voda | 1000 ml |Sušené odstredené mlieko nesmie obsahovať reziduá inhibičných látok. Toto sa musí overiť pomocou komparatívnych skúšok použitím sušeného odstredeného mlieka, o ktorom je známe, že neobsahuje inhibičné látky.Príprava:Ponorte a rozpustite komponenty v nasledovnom poradí: kvasnicový extrakt, tryptón, glukóza a nakoniec sušené odstredené mlieko — vo vode. Zahrievanie suspenzie bude tento proces podporovať. Pridajte agar a zahrejte do varu, trvalo miešajte, až kým nebude agar úplne rozpustený alebo parte po dobu približne 30 minút.V prípade potreby prefiltrujte cez filtračný papier.Skontrolujte pH pomocou pH metra (4.1.4.) a v prípade potreby upravte pH tak, aby po sterilizácii bolo 6,9 ±0, 1 pri teplote 25 oC s použitím roztoku (najmenej 0,1 mol/l) hydroxidu sodného alebo kyseliny chlorovodíkovej.5.2. Distribúcia, sterilizácia a skladovanie živnej pôdyNadávkujte médium (5.1.) v množstvách 100 až 150 ml do baniek alebo množstvách 12 do 15 ml do skúmaviek (4.2.2.). Banky a skúmavky zazátkujte.Sterilizujte v autokláve (4.1.2.) 15 minút pri teplote 121 ± 1 oC.Skontrolujte pH média.Ak sa médium nebude používať ihneď, uchovávajte ho v tme pri teplote 1-5 oC najviac jeden mesiac po jeho príprave.5.3. Komerčná dehydratovaná živná pôdaŽivnú pôdu (5.1.) je možné pripraviť z komerčnej dehydratovanej živnej pôdy. Riaďte sa pokynmi výrobcu a pred rozpustením pridajte sušené odstredené mlieko, pokiaľ nie je komponentom.Upravte pH na hodnotu 6,9 ± 0, 1 pri teplote 25 oC spôsobom opísaným v 5.1. a nadávkujte, sterilizujte a skladujte médium spôsobom opísaným v 5.2.6. Riedidlá6.1. Peptón/soľný roztokZloženie:Peptón | 1,0 g |Chlorid sodný (NaCl) | 8,5 g |Voda | 1000 ml |Príprava:Komponenty rozpustite vo vode, v prípade potreby zahrievajte.Skontrolujte pH pomocou pH metra (4.1.4.) a v prípade potreby upravte pH tak, aby po sterilizácii bolo 7,0 ± 0, 1 pri teplote 25 oC s použitím roztoku (najmenej 0,1 mol/l) hydroxidu sodného alebo kyseliny chlorovodíkovej.6.2. Distribúcia, sterilizácia a skladovanie riedidlaNadávkujte riedidlo (6.1.) do skúmaviek (4.2.1.) v takých množstvách, aby o sterilizácii každá skúmavka obsahovala 9,0 ± 0, 2 ml riedidla. Skúmavky zazátkujte.Sterilizujte v autokláve (4.1.2.) 15 minút pri teplote 121 ± 1 oC.Skontrolujte pH riedidla.Ak sa riedidlo nebude používať ihneď, uchovávajte ho v tme pri teplote 1-5 oC najviac jeden mesiac po jeho príprave.6.3. Komerčné dehydratované riedidláRiedidlo (6.1.) je možné pripraviť z komerčných dehydratovaných tabliet alebo prášku. Riaďte sa pokynmi výrobcu. Upravte pH spôsobom opísaným v 6.1. a riedidlá nadávkujte, sterilizujte a skladujte spôsobom uvedeným v 6.2.7. Postup7.1. Rozpustenie médiaPred začiatkom mikrobiologických skúšok rozpustite požadované množstvo média rýchlo a médium temperujte vo vodnom kúpeli na teplotu 45 ± 1 oC (4.1.5.).7.2. Príprava vzorky mliekaVzorku mlieka dôkladne premiešajte tak, aby boli mikroorganizmy rozdelené čo možno najrovnomernejšie tak, že kontajner so vzorkou mlieka 25 krát rýchle prevrátite. Musí sa zabrániť peneniu alebo penu treba nechať dispergovať. Časový interval medzi premiešavaním a odobratím skúšobnej časti vzorky nesmie presiahnuť tri minúty.7.3. Príprava primárneho riedenia (10-1) (surové alebo pasterizované mlieko)Preneste pomocou sterilnej pipety (4.2.3.) 1 ml vzorky (7.2.) surového mlieka alebo pasterizovaného mlieka do 9 ml riedidla (6.1.), pričom sa musí zabrániť kontaktu medzi pipetou a riedidlom. Teplota riedidla musí byť približne rovnaká, ako teplota vzorky mlieka. Toto primárne riedenie opatrne miešajte v miešadle (4.1.9.) po dobu 5 až 10 sekúnd.Takto sa získa primárne riedenie (10— 1).7.4. Príprava ďalších decimálnych riedení (surové a pasterizované mlieko)Preneste pomocou sterilnej pipety (4.2.3.) 1 ml primárneho riedenia (7.3.) do 9 ml riedidla (6.1.) v súlade s pokynmi uvedenými v 7.3.Takto sa získa riedenie 10— 2.Opakujte tieto kroky s cieľom získať ďalšie decimálne riedenia dovtedy, až kým nebudete očakávať získanie príslušného počtu mikroorganizmov (8.1.1.).7.5. Očkovanie Petriho misiek7.5.1. Surové mlieko: Preneste pomocou sterilnej pipety (4.2.3.) 1 ml vzorky a/alebo príslušného decimálneho roztoku do misky (4.2.4.). Musia sa skúšať minimálne dve riedenia. Pripravte jednu misku z každého riedenia, ktoré si vyberiete ako vhodné (8.1.1.).7.5.2. Pasterizované mlieko: Preneste pomocou sterilnej pipety (4.2.3.) 1 ml vzorky a/alebo príslušného decimálneho roztoku do misky (4.2.4.). Musia sa skúšať minimálne dve riedenia. Pripravte dve misky z každého riedenia, ktoré si vyberiete ako vhodné (8.1.1.).7.5.3. UHT spracované a sterilizované mlieko (skúšané po kultivácii 15 dní pri teplote 30 oC — smernica, príloha A, kapitola VII, bod 5):Preneste pomocou sterilnej pipety (4.2.3.) 0,1 ml vzorky mlieka (7.2.) do misky (4.2.4.). Pripravte dve misky.7.6. NalievanieNalejte cca 15 až 18 ml média (7.1.) do každej naočkovanej misky.Ihneď po naliatí premiešajte tak, že budete otáčať Petriho miskou s cieľom získať rovnomerne dispergované kolónie po kultivácii.Čas medzi ukončením prípravy vzorky mlieka a premiešaním — v závislosti od druhu mlieka v skúšobnej časti alebo riedenia médiom — nesmie byť dlhší ako 15 minút.Nechajte stuhnúť na čistom, studenom horizontálnom povrchu.7.7. Kultivácia Petriho misiekPreneste misky do termostatu (4.1.3.). Misky kultivujte v obrátenej polohe. Nestohujte vyššie ako šesť misiek. Stohy misiek musia byť vzájomne oddelené a tiež musia byť oddelené od stien a hornej časti termostatu.Kultivujte pri teplote 30 ± 1 oC po dobu 72 ± 2 hodín.7.8. Spočítavanie kolóniíSpočítajte kolónie v Petriho miskách neobsahujúcich viac ako 300 kolónií.Misky skontrolujte v tlmenom svetle. Na uľahčenie spočítania sa môže použiť vhodná šošovka (4.1.6.) a/alebo počítadlo etikiet (4.1.8.). Na zvýraznenie kolónií zabráňte výskytu častíc vyzrážanej látky v miskách. Pochybné objekty dôkladne preskúmajte s použitím šošovky s výraznejším zväčšením (4.1.7.), aby sa dali odlíšiť kolóny od cudzích látok.Rozptýlené kolónie sa považujú za jedinú kolóniu. Ak je rozptýlenými kolóniami prerastená menej ako jedna štvrtina misky, spočítajte kolónie na nenapadnutej časti misky a vypočítajte zodpovedajúci počet pre celú misku. Ak je rozptýlenými kolóniami prerastená viac ako jedna štvrtina misky, tak misku vyhoďte.8. Výpočet a vyjadrenie výsledkov8.1. Surové a pasterizované mlieko8.1.1. Použite počty zo všetkých misiek obsahujúcich 10 až 300 kolónií (pozri 8.1.3. a 8.1.4.).8.1.2. Počet mikroorganizmov na 1 ml surového alebo pasterizovaného mlieka je daný vzorcom:dpričom:∑C  je súčet kolónií vypočítaných podľa 8.1.1.,(n1 + 0,1 n2) d  je rovný objemu vzorky na miske, pričom:n1  je počet misiek spočítaných v prvom riedení,n2  je počet misiek spočítaných v druhom riedení,d  je faktor zriedenia, z ktorého sa získali prvé počty.Tento počet sa udáva na dve platné číslice. Tam, kde sa číslica, ktorá sa musí zaokrúhliť, je päť, zaokrúhlite tak, aby číslica bezprostredne vľavo bola párna.Príklad (pasterizované mlieko):Riedenie 10— 2: 278 a 290 kolóniíRiedenie 10— 3: 33 a 28 kolóniíPočet/ml | = 278 + 290 + 33 + 282 + 0,1 × 210-2 || = 6290,022 || = 28590 || = 29000 || = 2,9 × 104 |8.1.3. Ak sa vyskytujú počty menšie ako 10, uveďte počet mikroorganizmov na mililiter ako "menší ako 10 x d na ml", pričom "d" je recipročná hodnota najnižšieho faktora zriedenia.8.1.4. Ak sa vyskytujú iba počty viac ako 300 kolónií, avšak spočítanie je možné, vypočítajte odhadovaný počet a vynásobte ho recipročnou hodnotou faktora riedenia. Výsledok uveďte ako "odhadovaný počet mikroorganizmov na ml".8.2. UHT a sterilizované mliekoPočty na miske s viac ako 10 kolóniami v 0,1 ml sa budú považovať za nevyhovujúce požiadavkám smernice 85/397/EHS.9. PresnosťVýsledky medzinárodne prijatých pokusov vykonaných v iných laboratóriách nie sú ešte k dispozícii.V. STANOVENIE POČTU MIKROORGANIZMOV — SKÚŠKA POČTU PLATŇOVOU METÓDOU PRI 21 oC1. Rozsah a oblasť použitiaTento postup špecifikuje referenčnú metódu pre výpočet mikroorganizmov technikou počtu kolónií pri 21 oC v pasterizovanom mlieku po kultivácii mlieka pri teplote 6 oC po dobu päť dní s cieľom stanoviť stupeň kontaminácie pasterizovaného mlieka psychotropných mikroorganizmov schopných rozmnožovať sa v mlieku pri teplote 6 oC.2. DefiníciaPod označením "mikroorganizmy" sa rozumejú: organizmy tvoriace spočítateľné kolónie, ak sa aeróbne kultivujú za opísaných podmienok.3. PrincípPasterizované mlieko sa kultivuje pri teplote 6 oC po dobu päť dní. Definovaný objem vzorky mlieka sa v Petriho miskách zmieša so živnou pôdou a kultivuje sa 25 hodín pri teplote 21 oC. Kolónie sa spočítajú a vypočíta sa počet mikroorganizmov na 1 ml pasterizovaného mlieka.4. Aparatúra a laboratórne skloBežné laboratórne zariadenie a najmä:4.1. Prístroje4.1.1. Teplovzdušná sušiareň, s možnosťou regulácie teploty od 170 do 175 oC.4.1.2. Autokláv, s možnosťou regulácie teploty na 121 ± 1 oC.4.1.3. Termostat, s možnosťou regulácie teploty na:a) 6 ±0, 2 oCb) 21 ± 1 oCv celom svojom objeme.4.1.4. pH meter, s teplotnou kompenzáciou, s presnosťou na ± 0, 1 pH jednotky.4.1.5. Vodný kúpeľ, s možnosťou regulácie teploty na 45 ± 1 oC.4.1.6. Šošovka, zväčšenie 2 — 4 krát.4.1.7. Šošovka, zväčšenie 8 — 10 krát.4.1.8. Počítadlo etikiet.4.1.9. Miešadlo schopné premiešať 1 ml vzorky mlieka alebo desatinné zriedenie 9 ml riedidla a pracujúce na princípe excentrickej rotácie obsahu skúmavky.4.2. Laboratórne sklo4.2.1. Skúmavky s vhodnými uzávermi a s dostatočným obsahom, aby boli schopné pojať s adekvátnym voľným priestorom medzi náplňou a uzáverom kvôli premiešaniu 10 ml primárneho riedenia alebo ďalších desatinných riedení.4.2.2. Banky s obsahom 150 až 250 ml alebo skúmavky o obsahu cca 20 ml na uchovávanie živnej pôdy.4.2.3. Pipety (zazátkované vatou) zo skla alebo sterilného plastu s neodlomeným hrotom, s menovitým obsahom 1 ml a s výtokovým otvorom o priemere 1,75 až 3 mm.4.2.4. Petriho misky z číreho bezfarebného skla alebo zo sterilného plastového materiálu, spodná miska s vnútorným priemerom 90-100 mm. Vnútorná hĺbka musí byť minimálne 10 mm. Na dne sa nesmú vyskytovať žiadne nepravidelnosti, ktoré by rušivo zasahovali do počítania kolónií.4.2.5. Sterilizácia laboratórneho sklaLaboratórne sklo sa musí sterilizovať jedným z nasledovných postupov:a) tým, že sa ponechá pri teplote 170 až 175 oC najmenej jednu hodinu v teplovzdušnom sterilizátore (4.1.1.);b) tým, že sa ponechá pri teplote 121 ± 1 oC najmenej 20 minút v autokláve (4.1.2.).V autokláve treba dávať pozor nato, aby sa zabezpečil adekvátny prietok pary — napríklad ak sa zariadenie sterilizuje v kontajneroch, tak tieto nemôžu byť tesne uzatvorené, banky musia mať uvoľnené viečka.Laboratórne sklo sterilizované v autokláve sa musí vysušiť odsávaním pary.Pipety musia byť sterilizované v teplovzdušnom sterilizátore (4.1.1.).5. Živná pôda — počet mliečnych platničiek v agare5.1. ZloženieKvasnicový extrakt | 2,5 g |Tryptón | 5,0 g |Glukóza D (+) alebo dextróza | 1,0 g |Sušené odstredené mlieko | 1,0 g |Agar | 10 až 15 g, v závislosti od želirovacích vlastností použitého agaru. |Voda | 1000 ml |Sušené odstredené mlieko nesmie obsahovať inhibičné látky. Toto sa musí overiť pomocou komparatívnych skúšok použitím sušeného odstredeného mlieka, o ktorom je známe, že neobsahuje inhibičné látky.Príprava:Ponorte a rozpustite komponenty v nasledovnom poradí: kvasnicový extrakt, tryptón, glukóza a nakoniec sušené odstredené mlieko — vo vode. Zahrievanie suspenzie bude tento proces podporovať. Pridajte agar a zahrejte do varu, trvalo miešajte, až kým nebude agar úplne rozpustený alebo parte po dobu približne 30 minút.V prípade potreby prefiltrujte cez filtračný papier.Skontrolujte pH pomocou pH metra (4.1.4.) a v prípade potreby upravte pH tak, aby po sterilizácii bolo 6,9 ± 0, 1 pri teplote 25 oC s použitím roztoku (najmenej 0,1 mol/l) hydroxidu sodného alebo kyseliny chlorovodíkovej.5.2. Distribúcia, sterilizácia a skladovanie živnej pôdyNadávkujte médium (5.1.) v množstvách 100 až 150 ml do baniek alebo množstvách 12 do 15 ml do skúmaviek (4.2.2.). Banky a skúmavky zazátkujte.Sterilizujte v autokláve (4.1.2.) 15 minút pri teplote 121 ± 1 oC.Skontrolujte pH média.Ak sa médium nebude používať ihneď, uchovávajte ho v tme pri teplote 1-5 oC najviac jeden mesiac po jeho príprave.5.3. Komerčná dehydratovaná živná pôdaŽivnú pôdu (5.1.) je možné pripraviť z komerčnej dehydratovanej živnej pôdy. Riaďte sa pokynmi výrobcu a pred rozpustením pridajte sušené odstredené mlieko, pokiaľ nie je komponentom.Upravte pH na hodnotu 6,9 ± 0, 1 pri teplote 25 oC spôsobom opísaným v 5.1. a nadávkujte, sterilizujte a skladujte médium spôsobom opísaným v 5.2.6. Riedidlá6.1. Peptón/soľný roztokZloženie:Peptón | 1,0 g |Chlorid sodný (NaCl) | 8,5 g |Voda | 1000 ml |Príprava:Zložky rozpustite vo vode, v prípade potreby zahrievajte.Skontrolujte pH pomocou pH metra (4.1.4.) a v prípade potreby upravte pH tak, aby po sterilizácii bolo 7,0 ± 0, 1 pri teplote 25 oC s použitím roztoku (najmenej 0,1 mol/l) hydroxidu sodného alebo kyseliny chlorovodíkovej.6.2. Distribúcia, sterilizácia a skladovanie riedidlaNadávkujte riedidlo (6.1.) do skúmaviek (4.2.1.) v takých množstvách, aby pri sterilizácii každá skúmavka obsahovala 9,0 ± 0, 2 ml riedidla. Skúmavky zazátkujte.Sterilizujte v autokláve (4.1.2.) 15 minút pri teplote 121 ± 1 oC. Skontrolujte pH riedidla.Ak sa médium nebude používať ihneď, uchovávajte ho v tme pri teplote 1-5 oC najviac jeden mesiac po jeho príprave.6.3. Komerčné dehydratované riedidláRiedidlo (6.1.) je možné pripraviť z komerčných dehydratovaných tabletiek alebo prášku. Riaďte sa pokynmi výrobcu. Upravte pH spôsobom opísaným v 6.1. a riedidlá nadávkujte, sterilizujte a skladujte spôsobom uvedeným v 6.2.7. Postup7.1. Rozpúšťanie médiaPred začiatkom mikrobiologických skúšok rozpustite požadované množstvo média rýchlo a médium temperujte vo vodnom kúpeli na teplotu 45 ± 1 oC (4.1.5.).7.2. Príprava vzorky mlieka7.2.1. Inkubujte neotvorené balenie pasterizovaného mlieka alebo, ak toto nie je možné, reprezentatívnu vzorku najmenej 100 ml po dobu 120 ± 2 hodiny pri teplote 6 ± 0, 5 oC v termostate (4.1.3. a)).7.2.2. Vzorku mlieka dôkladne premiešajte tak, aby boli mikroorganizmy rozdelené čo možno najrovnomernejšie tak, že vzorkovnica so vzorkou mlieka 25 krát rýchle prevrátite. Musí sa zabrániť peneniu alebo penu treba odstrániť. Časový interval medzi premiešavaním a odobratím skúšobnej časti vzorky nesmie presiahnuť tri minúty.7.3. Príprava primárneho zriedenia (10 – 1)Preneste pomocou sterilnej pipety (4.2.3.) 1 ml vzorky (7.2.2.) do 9 ml riedidla (6.1.), pričom sa musí zabrániť kontaktu medzi pipetou a riedidlom. Teplota riedidla musí byť približne rovnaká ako teplota vzorky mlieka. Toto primárne riedenie opatrne miešajte v miešadle (4.1.9.) po dobu 5 až 10 sekúnd.Takto sa získa primárne riedenie (10– 1).7.4. Príprava ďalších decimálnych riedeníPreneste pomocou sterilnej pipety (4.2.3.) 1 ml primárneho riedenia (7.3.) do 9 ml riedidla (6.1.) v súlade s pokynmi uvedenými v 7.3.Takto sa získa riedenie 10– 2.Opakujte tieto kroky s cieľom získať ďalšie decimálne riedenia dovtedy, až kým nebudete očakávať získanie príslušného počtu mikroorganizmov (8.1.).7.5. Očkovanie Petriho misiekPreneste pomocou sterilnej pipety (4.2.3.) 1 ml vzorky a/alebo príslušného decimálneho roztoku do misky (4.2.4.). Musia sa skúšať minimálne dve riedenia. Pripravte dve misky z každého riedenia, ktoré si vyberiete ako vhodné (8.1.).7.6. NalievanieNalejte cca 15 až 18 ml média (7.1.) do každej naočkovanej misky.Ihneď po naliatí premiešajte tak, že budete otáčať Petriho miskou s cieľom získať rovnomerne dispergované kolónie po inkubácii.Čas medzi ukončením prípravy vzorky mlieka a premiešaním zriedeného roztoku s médiom nesmie byť dlhší ako 15 minút.Nechajte stuhnúť na čistom, studenom horizontálnom povrchu.7.7. Kultivácia Petriho misiekPreneste misky do termostatu (4.1.3. b)). Misky kultivujte v obrátenej polohe. Nestohujte vyššie ako šesť misiek. Stohy misiek musia byť vzájomne oddelené a tiež musia byť oddelené od stien a hornej časti termostatu.Kultivujte pri teplote 21 ± 1 oC počas 25 hodín.7.8. Spočítavanie kolóniíSpočítajte kolónie v Petriho miskách neobsahujúcich viac ako 300 kolónií.Misky skontrolujte v tlmenom svetle. Na uľahčenie spočítania sa môže použiť vhodná šošovka (4.1.6.) a/alebo počítadlo etikiet (4.1.8.). Na zvýraznenie kolónií zabráňte výskytu častíc vyzrážanej látky v miskách. Pochybné objekty dôkladne preskúmajte s použitím šošovky s výraznejším zväčšením (4.1.7.), aby sa dali odlíšiť kolóny od cudzích látok.Roztrúsené kolónie sa považujú za samostatné kolónie. Ak je rozptýlenými kolóniami prerastená menej ako jedna štvrtina misky, spočítajte kolónie na nenapadnutej časti misky a vypočítajte zodpovedajúci počet pre celú misku. Ak je rozptýlenými kolóniami prerastená viac ako jedna štvrtina misky, misku vyhoďte.8. Výpočet a vyjadrenie výsledkov8.1. Použite počty zo všetkých misiek obsahujúcich 10 až 300 kolónií (pozri 8.3. a 8.4.).8.2. Počet mikroorganizmov na 1 ml pasterizovaného mlieka je daný vzorcom:dpričom:∑C  je súčet kolónií vypočítaných podľa 8.1.1.,(n1 + 0,1 n2) d  je rovný objemu vzorky na miske, pričom:n1  je počet misiek spočítaných v prvom riedení,n2  je počet misiek spočítaných v druhom riedení,d  je faktor zriedenia, z ktorého sa získali prvé počty.Tento počet sa udáva na dve platné číslice. Tam, kde sa číslica, ktorá sa musí zaokrúhliť, je päť, zaokrúhlite tak, aby číslica bezprostredne vľavo bola párna.Príklad:Riedenie 10– 2: 278 a 290 kolóniíRiedenie 10– 3: 33 a 28 kolóniíPočet/ml | = 278 + 290 + 33 + 282 + 0,1 × 210-2 || = 6290,022 || = 28590 || = 29000 || = 2,9 × 104 |8.3. Ak sa vyskytujú počty iba menšie ako 10, uveďte počet mikroorganizmov na mililiter ako "menší ako 10 x d na ml", pričom "d" je recipročná hodnota najnižšieho faktora zriedenia.8.4. Ak sa vyskytujú iba počty viac ako 300 kolónií, avšak spočítanie je možné, vypočítajte odhadovaný počet a vynásobte ho recipročnou hodnotou faktora riedenia. Výsledok uveďte ako "odhadovaný počet mikroorganizmov na ml".9. PresnosťVýsledky medzinárodne prijatých pokusov vykonaných v iných laboratóriách nie sú ešte k dispozícii.VI. STANOVENIE POČTU KOLIFORMNÝCH MIKROORGANIZMOV — POČET KOLÓNIÍ PRI 30 oC1. Rozsah a oblasť použitiaTento postup špecifikuje referenčnú metódu spočítavania koliformných mikroorganizmov v pasterizovanom mlieku technikou počtu kolónií pri 30 oC.2. DefiníciaPod označením "koliformné organizmy" sa rozumejú baktérie, ktoré pri 30 oC vytvárajú charakteristické kolónie alebo necharakteristické kolónie, ktoré fermentujú laktózu za tvorby plynu v opísaných podmienkach.3. PrincípDefinovaný objem vzorky mlieka sa v Petriho miskách zmieša so živnou pôdou a kultivuje sa 24 hodín pri teplote 30 oC. Charakteristické kolónie sa spočítajú a, ak je to potrebné, identita necharakteristických kolónií sa potvrdí skúškou schopnosti fermentovať laktózu. Potom sa vypočíta počet koliformných mikroorganizmov na 1 ml pasterizovaného mlieka.4. Aparatúra a laboratórne skloBežné laboratórne zariadenie a najmä:4.1. Prístroje4.1.1. Teplovzdušná sušiareň, s možnosťou regulácie teploty od 170 do 175 oC.4.1.2. Autokláva, s možnosťou regulácie teploty na 121 ± 1 oC.4.1.3. Termostat, s možnosťou regulácie teploty na 30 ± 1 oC v celom svojom objeme.4.1.4. pH meter, s teplotnou kompenzáciou s presnosťou na ± 0, 1 pH jednotky.4.1.5. Vodný kúpeľ, s možnosťou regulácie teploty na 45 ± 1 oC.4.1.6. Ihla z drôtu vyrobeného z platiny — irídia, niklu — chrómu.4.2. Laboratórne sklo4.2.1. Skúmavky s vhodnými uzávermi o obsahu 20 ml na uchovávanie overovacieho média (5.2.) alebo Durhamove rúrky o príslušných rozmeroch, určené na používanie so skúmavkami.4.2.2. Banky o obsahu 150 až 250 ml na uchovávanie tuhého selektívneho média (5.1.).4.2.3. Pipety (zazátkované vatou) zo skla alebo sterilného plastu s neodlomeným hrotom, s menovitým obsahom 1-10 ml a s výtokovým otvorom o priemere 1,75 až 3 mm.4.2.4. Petriho misky z číreho bezfarebného skla alebo zo sterilného plastu, spodná miska s vnútorným priemerom 90-100 mm. Vnútorná hĺbka musí byť minimálne 10 mm. Na dne sa nesmú vyskytovať žiadne nepravidelnosti, ktoré by rušivo zasahovali do počítania kolónií.4.2.5. Sterilizácia laboratórneho sklaLaboratórne sklo sa musí sterilizovať jedným z nasledovných postupov:a) tým, že sa ponechá pri teplote 170 až 175 oC najmenej jednu hodinu v teplovzdušnej sušiarni (4.1.1.);b) tým, že sa ponechá pri teplote 121 ± 1 oC najmenej 20 minút v autokláve (4.1.2.).V autokláve treba dávať pozor nato, aby sa zabezpečil adekvátny prietok pary — napríklad ak sa zariadenie sterilizuje v kontajneroch, tieto nemôžu byť tesne uzatvorené, banky alebo fľaše musia mať uvoľnené uzávery.Laboratórne sklo sterilizované v autokláve sa musí vysušiť odsávaním pary.Pipety musia byť sterilizované v teplovzdušnej sušiarni (4.1.1.).5. Živné pôdy5.1. Agar s fialovo — červenou žlčovou laktózou (VRBL agar). Tuhé selektívne médium.Zloženie:Peptón | 7 g |Kvasnicový extrakt | 3 g |Laktóza (C12H22O11. H2O) | 10 g |Chlorid sodný | 5 g |Žlčové soli | 1,5 g |Neutrálna červeň | 0,03 g |Kryštálová violeť | 0,002 g |Agar | 10 až 15 g, v závislosti od želirovacích vlastností použitého agaru. |Voda | 1000 ml |Príprava:Ponorte a rozpúšťajte komponenty vo vode a nechajte stáť niekoľko minút, potom intenzívne premiešavajte.Skontrolujte pH pomocou pH metra (4.1.4.) a v prípade potreby upravte pH tak, aby po sterilizácii bolo 7,4 ±0,1 pri teplote 25 oC s použitím roztoku (najmenej 0,1 mol/l) hydroxidu sodného alebo kyseliny chlorovodíkovej.Uveďte rýchlo do varu za občasného miešania a okamžite nadávkujte v množstvách 100 až 150 ml do sterilných baniek (4.2.2.). Médium temperujte vo vodnom kúpeli (4.1.5.) pri teplote 45 ± 1 oC .V čase použitia sa musí skontrolovať sterilnosť média (pozri 6.4.).Médium použite do troch hodín po jeho príprave.5.2. Živná pôda s laktózovou žlčou a brilantnou zeleňou. Overovacie médium.Zloženie:Peptón | 10 g |Laktóza (C12H22O11. H2O) | 10 g |Dehydrovaná volská žlč | 20 g |Briliantová zeleň | 0,0133 g |Voda | 1000 ml |Príprava:Komponenty rozpustite vo vode povarením.Skontrolujte pH pomocou pH metra (4.1.4.) a v prípade potreby upravte pH tak, aby po sterilizácii bolo 7,2 ± 0, 1 pri teplote 25 oC s použitím roztoku (najmenej 0,1 mol/l) hydroxidu sodného alebo kyseliny chlorovodíkovej.Nadávkujte médium v množstvách po 10 ml do skúmaviek (4.2.1.) obsahujúcich Durhamove rúrky. Skúmavky zazátkujte.Sterilizujte v autokláve (4.1.2.) 15 minút pri teplote 121 ± 1 oC.Durhamove rúrky nesmú po sterilizácii obsahovať vzduchové bublinky.Skontrolujte pH média.Ak sa médium nebude používať ihneď, tuchovávajte ho v tme pri teplote 0-5 oC najviac jeden mesiac po jeho príprave.5.3. Komerčná dehydratovaná živná pôdaŽivné pôdy (5.1., 5.2.) je možné pripraviť z komerčných dehydrovaných médií. Riaďte sa pokynmi výrobcu. Upravte pH a nadávkujte, povarte alebo sterilizujte a skladujte médiá spôsobom opísaným v bode 5.1. a 5.2.6. Postup6.1. MédiumPoužite médium (VRBL agar) tak, ako je opísané v 5.1.6.2. Príprava vzorky mliekaVzorku mlieka dôkladne premiešajte tak, aby boli mikroorganizmy rozdelené čo možno najrovnomernejšie tak, že kontajner so vzorkou mlieka 25 krát rýchle prevrátite. Musí sa zabrániť peneniu alebo penu treba odstrániť. Časový interval medzi premiešavaním a odobratím skúšobnej časti vzorky nesmie presiahnuť tri minúty.6.3. Očkovanie Petriho misiek3 ml vzorky mlieka (6.2.) sa naočkujú prenesením pomocou sterilnej pipety (4.2.3.) 1 ml vzorky mlieka do každej z troch misiek (4.2.4.).6.4. NalievanieNalejte VRBL agar (6.1.) do každej naočkovanej misky v množstve 12 ml.Ihneď po naliatí premiešajte tak, že budete otáčať Petriho miskou s cieľom získať rovnomerne dispergované kolónie po kultivácii.Čas medzi ukončením prípravy vzorky mlieka a premiešaním skúšobnej časti s médiom nesmie byť dlhší ako 15 minút.Z dôvodov sterility pripravte ako kontrolu jednu nenaočkovanú misku, s použitím 12 ml VRBL agaru použitého pre naočkované misky.Nechajte tuhnúť na čistom, studenom horizontálnom povrchu, až kým médium nestvrdne.Po úplnom stuhnutí nalejte minimálne 4 ml VRBL agaru (6.1.) na povrch naočkovaného média.Nechajte stuhnúť.6.5. Kultivácia Petriho misiekPreneste misky do termostatu (4.1.3.). Misky kultivujte v obrátenej polohe. Nestohujte vyššie ako šesť misiek. Stohy misiek musia byť vzájomne oddelené a tiež musia byť oddelené od stien a hornej časti termostatu.Kultivujte pri teplote 30 ± 1 oC po dobu 24 ± 2 hodín.6.6. Spočítavanie kolónií6.6.1. Spočítajte kolónie v Petriho miskách neobsahujúcich viac ako 150 kolónií. Spočítajte do tmavočervena sfarbené kolónie s priemerom najmenej 0,5 mm s alebo bez obklopujúceho precipitátu charakteristického pre koliformné organizmy.6.6.2. Ak všetky alebo len niektoré kolónie majú necharakteristický vzhľad (napr. líšia sa farbou, veľkosťou alebo tvorbou precipitátu od typických kolónií), vykonajte overovaciu skúšku (6.7.).6.7. Overovacia skúškaV súlade s indikáciami uvedenými v 6.6.2. vykonajte overovaciu skúšku na vhodnom počte (napr. tri až päť) necharakteristických kolónií naočkovaním do skúmaviek živnej pôdy s laktózovou žlčou a brilantnou zeleňou (5.2.) s použitím drôtenej ihly (4.1.6.). Skúmavky inkubujte pri teplote 30 ± 1 oC po dobu 24 ± 2 hodiny.Kolónie, ktoré v Durhamovej rúrke vyvíjajú plyn, považujte za potvrdené koliformné mikroorganizmy.7. Výpočet a vyjadrenie výsledkov7.1. Použite počty (pozri 7.) z misiek neobsahujúcich viac ako 150 kolónií.7.2. Ak sa použije overovacia skúška, počet kolónií koliformných mikroorganizmov vypočítajte z percenta potvrdených koliformných kolónií.7.3. Počet koliformných mikroorganizmov na 1 ml pasterizovaného mlieka je daný vzorcom:npričom:∑C  je celkový počet kolónií koliformných mikroorganizmov (7.1. v súčinnosti so 7.2.), zistený skúškou vzorky mlieka (3 ml),n  je počet mililitrov skúmanej vzorky (6.3.) (3 ml).Počet sa udáva na dve platné číslice, ak ide o viac ako 100 kolónií. Tam, kde číslica, ktorá sa musí zaokrúhliť, je päť, zaokrúhlite tak, aby číslica bezprostredne vľavo bola párna.Ak sa vyskytli iba počty nad 150 kolónií, výsledok uveďte ako "odhadovaný počet koliformných organizmov na 1 ml".8. PresnosťVýsledky medzinárodne prijatých pokusov vykonaných v iných laboratóriách nie sú ešte k dispozícii.VII. STANOVENIE POČTU SOMATICKÝCH BUNIEKTento postup špecifikuje dve metódy, ako referenčné metódy pre výpočet somatických buniek:A. mikroskopická metódaB. fluoro-opto-elektronická metódaA. Mikroskopická metóda1. Rozsah a oblasť použitiaTento postup špecifikuje referenčnú metódu pre výpočet somatických buniek v surovom mlieku.Tento postup špecifikuje metódu pre výpočet počtu buniek vo vzorke mlieka na účely kalibrácie a kontroly presnosti fluoro- optoelektronickej metódy.2. DefiníciaV tejto metóde sa za somatické bunky považujú tie bunky, napr. leukocyty a epitelové bunky, ktorých jadrá sa dajú použitím metylénovej modrej zreteľne zafarbiť.3. Princíp0,01 ml mlieka sa rozotrie na podložnom sklíčku o ploche 1 cm2. Film sa vysuší a zafarbí. Spočítavanie sa vykoná pomocou mikroskopu. Počet spočítaných somatických buniek na definovanej ploche sa vynásobí pracovným faktorom na získanie počtu buniek/ml.4. ReagentyMusia sa používať chemikálie analytickej kvality.Farbiaci roztok:Zloženie:Metylénová modrá | 0,6 g |Etanol — 99 % | 54 ml |1,1,1 — trichlóretán alebo tetrachlóretán | 40 ml |Ľadová kyselina octová | 6 ml |VarovanieTetrachlóretán je jedovatý. Ak sa s ním manipuluje, jeho príprava a aj použitie musí prebehnúť v digestore.Príprava:Zmiešajte etanol a 1,1,1 — trichlóretán alebo tetrachlóretán vo fľaške a zahrejte vo vodnom kúpeli na teplotu 60 až 70 oC. Pridajte metylénovú modrú, opatrne premiešajte, v priebehu 12 až 24 hodín ochlaďte v chladničke na 4 oC a pridajte ľadovú kyselinu octovú. Prefiltrujte s použitím filtra s veľkosťou pórov od 10 do 12 mikrónov alebo menej a farbiaci roztok skladujte vo vzduchotesnej fľaši. Pokiaľ sa budú tvoriť sediment alebo častice, pred použitím znovu prefiltrujte.5. Aparatúraa laboratórne sklo5.1. Mikroskop s 500 až 1000 násobným zväčšením.5.2. Mikropipeta, 0,01 ml s presnosťou ± 2 % alebo vyššou.5.3. Podložné sklíčko, s vyznačenou plochou 20 mm x 5 mm pre film alebo štandardné podložné sklíčko a šablóna 20 mm x 5 mm pre film.5.4. Vodorovná zahrievacia platnička (30 až 50 oC) na sušenie podložných sklíčok.5.5. Ventilátor (sušič na vlasy) na sušenie filmu.5.6. Vodný kúpeľ, pracujúci pri teplote 30 až 40 oC na zahrievanie vzorky mlieka.5.7. Stupňovité mikrometrické podložné sklíčko, ryté po 0,01 mm.6. Postup6.1. Vzorka mliekaVzorka mlieka sa musí vyskúšať do šiestich hodín — po odbere vzorky. Počas skladovania teplota vzorky nesmie prekročiť 6 oC. Musí sa zabrániť zamrznutiu.6.2. Príprava vzorky v laboratóriuVzorku zahrejte vo vodnom kúpeli na teplotu 30 až 40 oC. Potom opatrne premiešajte. Ochlaďte na teplotu, pri ktorej bola kalibrovaná mikropipeta (5.2.), napr. 20 oC.6.3. Predbežná úprava podložných sklíčokPodložné sklíčka očistite (5.3.), napr. etanolom, vysušte bezprašným papierom, vyžíhajte a ochlaďte. Skladujte v krabici tak, aby sa zabránilo vniknutiu prachu.6.4. Príprava filmuOdoberte 0,01 ml mlieka zo vzorky pripravenej vyššie uvedeným spôsobom s použitím mikropipety (5.2.). Opatrene očistite vonkajšiu stranu striekačky, ktorá sa dostala do kontaktu s mliekom. Položte pipetu na podložné sklíčko (5.3.) a najskôr narysujte obrysovú čiaru tvaru (20 mm x 5 mm). Potom túto plochu naplňte čo možno najrovnomernejšie. Film sušte na vodorovnej zahrievacej platničke (5.4.), až kým nebude úplne suchý.Z každej vzorky mlieka sa musia pripraviť a preskúmať dva aspoň filmy.6.5. Farbenie filmovPonorte na 10 minút do farbiaceho roztoku (4). Vysušte, podľa potreby ventilátorom (5.5.). Ponorte filmy do vodovodnej vody, až kým sa nevymyje všetka prebytočná farba. Potom znovu vysušte a uchovávajte chránené pred prachom.6.6. Kalibrácia zorného poľa mikroskopuV závislosti od zvoleného zväčšenia (500 až 1000 násobné) určte pomocou odstupňovaného mikrometrického podložného sklíčka (5.7.) priemer zorného poľa mikroskopu.7. Spočítanie a výpočet7.1. Spočítanie buniekPoužitie mikroskopu (5.1.). Namiesto počítania buniek sa spočítajú iba bunkové jadrá. Tieto sú jasne rozoznateľné a na účely stanovenia počtu musí byť minimálne polovica jadier viditeľná v zornom poli mikroskopu. Spočítajte pásiky a políčka priečne v strednej tretine filmu, pričom sa vyhnite spočítavaniu pásikov alebo políčok vybraných výhradne z obvodových plôch filmu. Opatrná príprava filmov a tým pádom spoľahlivosť výsledkov sa musí kontrolovať minimálne jedenkrát mesačne spočítaním rôznych častí filmu. Spočítanie sa dá vykonať aj spočítaním zorných políčok mikroskopu rozšírený v systéme takým spôsobom, že všetky časti filmu sú rovnako zastúpené.7.2. Minimálny počet buniek, ktoré sa musia spočítavaťNakoľko mikroskopické počítanie somatických buniek sa môže použiť aj na štandardizáciu automatických a mechanických metód počítania, relatívna smerodajná odchýlka počtov u identických vzoriek nesmie byť vyššia ako v prípade elektronických prístrojov. Relatívna smerodajná odchýlka u vzorky mlieka obsahujúcej 400000 až 600000 buniek/ml nesmie prekročiť hodnotu 5 %.Počet somatických buniek, ktorý sa musí spočítať v každej vzorke, musí byť v súlade s charakteristikami Poissonového rozdelenia, najmenej 400, s cieľom dosiahnuť takúto opakovateľnosť.Poissonového rozdelenie predpokladáM = V = s2pričom:M  je stredná hodnotaV  je štvorec smerodajnej a odchýlkys  je smerodajná odchýlka.Relatívna smerodajná odchýlka je:CV =MaleboCV =saleboCV =M (stredná hodnota) označuje počet častíc (buniek) ktoré boli spočítané (napr. 400 pre CV = 5 %).7.3. Výpočet pracovného faktoraPracovný faktor sa vypočíta podľa 7.3.1. alebo 7.3.2. s použitím 0,01 ml mlieka.7.3.1 Spočítavanie pásikov na filmePásiky, ktoré sa musia počítať, musia mať každý dĺžku 5 mm. Šírka pásiku zodpovedá priemeru zorného poľa mikroskopu tak, ako bola určená pomocou odstupňovaného mikrometrického podložného sklíčka (5.7.).Pracovný faktor =20 × 100d × bpričom:d  je priemer zorného poľa mikroskopu v mm tak, ako bol určený pomocou odstupňovaného mikrometrického podložného sklíčka (5.7.),b  je počet všetkých spočítaných pásikov.7.3.2. Spočítanie zorných polí mikroskopu v strednej tretine filmu alebo pomocou mriežky:Pracovný faktor =Π × d× s=12732d2× spričom:d  je priemer zorného poľa mikroskopu v mm tak, ako bol určený pomocou odstupňovaného mikrometrického podložného sklíčka (5.7.),s  je počet spočítaných políčok.7.4. Výpočet obsahu bunkyPočet spočítaných somatických buniek (7.1. a 7.2.) sa vynásobí pracovným faktorom (7.3.) na získanie počet buniek na ml mlieka.7.5. PresnosťRelatívna smerodajná odchýlka (7.2.) nesmie prekročiť 5 %.Výsledky medzinárodne akceptovaných pokusov vykonaných v iných laboratóriách nie sú ešte k dispozícii.B. Fluoro-opto-elektronická metóda1. Rozsah a oblasť použitiaTento postup špecifikuje referenčnú metódu, ktorá sa po správnej kalibrácii (pozri A.1) dá použiť na spočítanie somatických buniek v surovom mlieku — s alebo bez chemickej konzervácie.2. DefiníciaPri tejto metóde sa pod somatickými bunkami rozumejú častice, ktoré majú minimálnu intenzitu fluorescencie v dôsledku zafarbenia DNA v jadrách somatických buniek.3. PrincípČasť vzorky (napr. 0,2 ml) sa dôkladne zmieša s tlmivým roztokom a fluoreskujúcim roztokom. Časť tejto zmesi sa potom prenesie vo forme tenkého filmu na otáčavý kotúč, ktorý slúži ako podložné sklíčko pre mikroskop.Každá bunka generuje elektrický impulz, ktorý sa zosilňuje a zaznamenáva. Počet somatických buniek sa vytlačí v tisíckach ml.4. ReagentyPokiaľ nie je stanovené inak, musia sa používať chemikálie analytickej kvality. Voda musí byť buď destilovaná, alebo deionizovaná alebo mať ekvivalentnú čistotu.4.1. Tlmivý roztokZloženie:Hydrogénftalát draselný | 51,0 g |Hydroxid draselný | 13,75 g |Polyetylénglykol-mono-p(1,1,3,3-tetrametylbutyl)-fenyl-éter (napr. Triton X-100, 1 % obj.) | 10 ml |pH 5,7 až 5,9 doplňte vodou nad 10000 ml. | |Príprava:Jednotlivé komponenty sa zmiešajú. Vzduchotesné skladovanie maximálne sedem dní.4.2. Fluoreskujúci roztok (zásobný roztok)Zloženie:Ethídiumbromid | 1,0 g |Doplňte vodou na 1000 ml.Príprava:Ethídiumbromid sa rozpustí vo vode. Skladujte vo svetlotesnej a vzduchotesnej fľaši najdlhšie dva mesiace.4.3. Fluoreskujúci roztok (pracovný roztok)20 ml zásobného roztoku (4.2.) sa zmieša s tlmivým roztokom (4.1.) na celkový objem 1000 ml. Pracovný roztok sa nesmie používať dlhšie ako sedem dní.4.4. Čistiaci roztokZloženie:Tlmivý roztok (4.1.) | 10 ml |Polyetylénglykol-mono-p(1,1,3,3-tetrametylbutyl)-fenyl-éter (napr. Triton X-100, 1 % obj.) | 10 ml |amoniak, 25 % obj. | 25 ml |Doplňte vodou na 10000 mlPríprava:Jednotlivé komponenty sú zmiešané. Skladovanie nemôže byť dlhšie ako 30 dní.5. Aparatúra a laboratórne sklo5.1. Počítací prístroj pracujúci na základe optického princípu fluorescencie.PoznámkaPrístroj pred použitím kalibrujte. Tým je určený pomer medzi objemom častíc, ktoré sa musia spočítať a prahovou úrovňou, nad ktorou sa prevedú spočítania. Kalibrácia prístroja sa vykoná v súlade s pokynmi výrobcu s použitím vzoriek, v ktorých bol obsah buniek stanovený mikroskopickou metódou (A).5.2. Vodný kúpeľ s cirkuláciou, s možnosťou regulácie teploty na teplote 40 ± 1oC.5.3. Skúmavka s vhodným utesnením, približne 15 ml.6. Vzorka mlieka6.1. Vzorka sa musí skladovať pri nízkej teplote v skúmavke (5.3.). Ak vzorka nie je chemicky konzervovaná, nemôže sa spočítať počas prvých 24 hodín po nadojení, pretože počty by boli príliš nízke. Teplota skladovania nesmie prekročiť hodnotu 6 oC.6.2. KonzerváciaChemická konzervácia sa musí vykonať do 24 hodín. Konzervácia sa musí vykonať čo možno najskôr po vzorkovaní.6.2.1. Chemická konverzácia vzorky sa dá dosiahnuť pridaním jednej z nasledovných konzervačných látok:- kyselina ortoboritá:konečná koncentrácia kyseliny ortoboritej vo vzorke nesmie prekročiť hodnotu 0,6g/100 ml. Takto konzervovaná vzorka sa môže skladovať ďalších 24 hodín pri teplote 6 až 12 oC,- dichroman didraselný:konečná koncentrácia dichromanu didraselného nesmie prekročiť hodnotu 0,2g/100 ml. Takto konzervované vzorky sa môžu skladovať ďalších 72 hodín pri teplote 6 až 12 oC,- azid sodný:vzorky sa môžu konzervovať azidom sodným na konečnú koncentráciu 0,024 g/100 ml za predpokladu, že vzorka sa okamžite po vzorkovaní ochladí na teplotu 6 až 12 oC a spočítanie sa vykoná do 48 hodín po vzorkovaní,- bronopol:vzorky sa môžu konzervovať bronopolom na konečnú koncentráciu 0,05 g/100 ml za predpokladu, že vzorka sa okamžite po vzorkovaní ochladí na teplotu 6 až 12 oC a spočítanie sa vykoná do 72 hodín po vzorkovaní.6.2.2. Vzorka už konzervovaná kyselinou ortoboritou sa môže ďalej konzervovať na 48 hodín s použitím dichromanu didraselného.PoznámkaV prípade vzoriek konzervovaných dichromanom didraselným sa musia dodržiavať miestne podmienky týkajúce sa vypúšťania tekutých odpadov.7. Postup7.1. Predúprava vzorky.Mlieko, ktoré sa má skúšať, sa po nadojení musí skladovať minimálne 24 hodín pri teplote 2 až 6 oC. Počítanie vzoriek v deň dojenia bez predúpravy sa neodporúča, nakoľko výsledky by boli príliš nízke. Pokiaľ je spočítanie takejto vzorky nevyhnutné, potom sa musí aspoň na tri hodiny predupravovať dichromanom didraselným (pozri 6.2.1.).7.2. PrípravaPredupravená vzorka (pozri 7.1.) alebo neupravená vzorka, stará aspoň jeden deň, sa zahreje vo vodnom kúpeli (5.2.) na teplotu približne 40 oC. Potom sa vzorka skladuje pri izbovej teplote, až kým sa nevykoná spočítavanie.7.3. Spočítanie buniekSpočítanie sa musí vykonať s použitím počítacieho prístroja (5.1.) do 15 minút od ukončenia zahrievania (pozri 7.2.). Bezprostredne pred spočítaním sa vzorka musí dôkladne premiešať, aby sa dosiahlo čo možno najhomogénnejšie rozdelenie somatických buniek.Ďalšie riedenie a príprava vzorky prebehne v prístroji automaticky.8. PresnosťČíselné hodnoty opakovateľnosti (r) a reprodukovateľnosti (R) z medzinárodných skúšok v rámci spolupráce nie sú k dispozícii. V budúcnosti sa budú uvádzať presné údaje.Údaje dostupné na národnej úrovni dovoľujú nasledovné odhady:(1) úroveň počtu buniek400000a500000/ml- smerodajná odchýlka opakovateľnosti:sr = 20000 buniek/ml(ekvivalentný relatívnej smerodajnej odchýlke alebo 5 — 4 %)- smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti:sR = 40000 buniek/ml(ekvivalentný relatívnej smerodajnej odchýlke alebo 10-8 %).9. Kontrola správnostiKontrola správnosti sa vykoná s použitím vzoriek so známymi obsahmi buniek stanovenými mikroskopickými spočítaniami buniek v národnom referenčnom laboratóriu.VIII. STANOVENIE ANTIBIOTÍK A SULFONAMIDOVROZSAH A OBLASŤ POUŽITIATento postup špecifikuje referenčnú metódu na stanovenie antibiotík a sulfonamidov v surovom mlieku a v tepelne ošetrenom mlieku.Súčasťou tejto referenčnej metódy je:A. Kvalitatívna metódaTento postup predstavuje prvotný postup, pomocou ktorého sa selektujú vzorky mlieka obsahujúce antibiotiká, ktorých súčasťou sú sulfonamidy. Opísaný postup je iba jedným z viacerých podobných postupov, ktoré všetky používajú v zásade Bacillus stearothermophilus var. calidolactis, ATTC 10149 ako skúšobný organizmus. Pre tieto skúšky bol zvolený ako reprezentatívny postup tento postup.B. Spôsob potvrdenia a identifikácie penicilínu.Na potvrdenie výsledkov kvalitatívnej metódy, na identifikáciu penicilínu a na stanovenie koncentrácie penicilínu sa musí použiť táto metóda.A. Kvalitatívna metóda1. Rozsah a oblasť použitiaTento postup špecifikuje kvalitatívne stanovenie antibiotík a sulfonamidov v surovom a tepelne ošetrenom mlieku, prekračujúcich medzné hodnoty uvedené v nasledovnej tabuľke.Detektovateľné koncentrácie rôznych antibiotík a sulfonamidov [1]| Citlivosť metódy |Všetko negatívne | Všetko pozitívne |Benzylpenicillin | 0,002 | 0,006 |Ampicillin | 0,002 | 0,005 |Cloxacillin | 0,015 | 0,035 |Nafcillin | 0,006 | 0,011 |Tetracycline | 0,10 | 0,40 |Oxytetracycline | 0,20 | 0,45 |Chlortetracycline | 0,15 | 0,50 |Chloramphenicol | 7 | 15 |Dihydrostreptomycin | 4 | 13 |Neomycine | 1 | 22 |Kanamycin | 9 | 28 |Bacitracin | 0,06 | 0,14 |Erythromycin | 1 | 2,25 |Rifamycin | 0,01 | 0,14 |Diaphenylsulfone | 0,01 | 0,1 |Sulphamethazine (Sulphadimidine) | 0,5 | 1 |Kvasnicový extrakt | 2 g |Peptón | 5 g |Mäsový extrakt | 1 g |Chlorid sodný | 5 g |Agar | 10-15 g |Voda | 1000 m l |Zložky rozpustite vo vode.Za občasného miešania priveďte do varu. pH upravte tak, aby po sterilizácii činili 7,4 ± 0, 1 pri 25 oC.Nadávkujte 10 ml množstva do skúmaviek tak, aby ste získali šikmé agary alebo do fliaš v množstve po 100 ml.Sterilizujte pri teplote 121 ± 1 oC počas 15 minút.5.1.2. Agarové médiumZloženie:Chlorid sodný | 2 g |Agar | 15 g |Voda | 1000 ml |Roztok Trimethoprim alebo Tetroxoprim (pozri 5.1.3.) | 10 ml |Príprava:Rozpustite vo vode zložky až na trimethoprim alebo tetroxoprim. Za občasného rozvírenia priveďte do varu. Pridajte trimethoprim alebo tetroxoprim a sterilizujte pri teplote 121 ± 1 oC počas 15 minút; pH upravte tak, aby po sterilizácii činilo 7,0 ± 0, 1 pri 25 oC.5.1.3. Roztok trimethoprim alebo tetroxoprimZloženie:Trimethoprim | 5 mg |alebo Tetroxoprim | 30 mg |Etanol 96 % | 5 ml/30 ml |Voda do | 1000 ml |Príprava:Trimethoprim alebo tetroxoprim rozpustite v etanole (5 alebo 30 ml) a zrieďte vodou.5.1.4. ŽivinyZloženie:Kvasnicový extrakt | 0,75 mg |Glukóza | 5,0 mg |Rozpustný škrob | 8,0 mg |Bromkrezolový purpur | 0,025 g |Voda do | 50 ml |Príprava:Živiny a indikátor rozpustite vo vode, v prípade potreby zahrejte, sterilizujte filtráciou. Živina je komerčne dostupná vo forme tabliet.5.2. Štandardné roztoky penicilínu5.2.1. Pripravte roztok penicilínu 60 μg/ml = (100 IU/ml) rozpustením kryštalického benzylpenicilínu sodného alebo draselného v sterilnej destilovanej vode vo vhodne uzatvorenej sterilnej fľaši.5.2.2. Pripravte pracovný roztok penicilínu tak, že 1,25 ml roztoku penicilínu (5.2.1.) doplníte sterilnou destilovanou vodou na 1000 ml. Tento pracovný roztok obsahuje 0,075 μg (= 0,125 IU/ml).5.2.3. Pripravte 75 ml štandardného penicilínového roztoku obsahujúceho 0,004 μg/ml (= 0,0067 IU/ml) pridaním 71 ml mlieka bez reziduí inhibičných látok (5.3.) k 4 ml pracovného penicilínového roztoku (5.2.2.) a premiešajte.5.2.4. Penicilínové roztoky uvedené v 5.2.1. až 5.2.3. sa musia pripraviť v deň vykonania skúšky.5.3. Mlieko bez prítomnosti reziduí inhibičných látokPripravte ako porovnávací pokus mlieko bez prítomnosti reziduí inhibičných látok rekonštituovaním sušeného odstredeného mlieka (10 % hm/obj.) už predtým analyzovaného a bez prítomnosti reziduí inhibičných látok v sterilnej destilovanej vode. Alternatívne sa môže nadávkovať do fliaš dostatočné množstvo čerstvého mlieka zo zberní, ktorého skúškou sa zistilo, že neobsahuje reziduá inhibičných látok, zahrievať jednu hodinu pri teplote 100 oC, a potom uskladniť v chladničke pri teplote 0 — 6 oC maximálne jeden týždeň.5.4. Testovací mikroorganizmus5.4.1. Ako testovací mikroorganizmus sa použije Bacillus stearothermophilus var. calidolactus kmeň ATCC 10149. Tento kmeň je identický s C 953.5.4.2. Pripravte zásobnú kultúru na udržiavanie testovacej kultúry. Testovacia kultúra sa uchováva na šikmom živnom agare (5.1.1.). Šikmý agar sa naočkuje na povrch s použitím kľučky testovacej kultúry a inkubuje sa za aeróbnych podmienok počas 48 hodín pri teplote 63 ± 1 oC. Po inkubácii sa skúmavka tesne uzatvorí použitím sterilnej gumovej zátky. Takto získaná zásobná kultúra sa môže uchovávať v chladničke pri 0 až 5 oC niekoľko mesiacov.5.5. Testovacia kultúra (suspenzia spór)5.5.1. 20 ml živného agaru (5.1.1.) sa prenesie asepticky na Petriho misku (4.2.2.) a ochladí sa na izbovú teplotu.5.5.2. Pomocou sterilnej pipety (4.2.4.) preneste 5 ml sterilnej destilovanej vody do skúmavky so zásobnou kultúrou (5.4.2.) a použitím sterilnej kľučky sa spláchnu spóry zo šikmého agaru. Táto suspenzia spór sa musí uchovávať pri teplote 0 až 5 oC a musí sa použiť do 36 hodín.5.5.3. Pomocou sterilnej pipety (4.2.4.) preneste 0,5 ml suspenzie spór (5.5.2.) na misku s kultúrou (5.5.1.) a na očkovaciu látku dôkladne rozotrite po celom povrchu pomocou zahnutej sklenej tyčinky. Inkubujte pri teplote 63 ± 1 oC (4.1.1.) po dobu 16 až 18 hodín.Ak používate zásobnú kultúru (5.4.2.) alebo kultúry, ktorá je staršia ako 36 hodín, proces preočkovania sa musí vykonať minimálne dvakrát, pričom časový interval medzi preočkovaniami nesmie byť dlhší ako 36 hodín.5.5.4. S použitím sterilnej pipety preneste (4.2.4.) 10 ml destilovanej vody na misku s kultúrou (5.5.3.) a pomocou sklenej tyčinky preneste spóry z povrchu do suspenzie.Suspenziu spór preneste do fľaše (4.2.3.) obsahujúcej 250 ml sterilnej destilovanej vody. Fľašu zatvorte a dôkladne zatrepte. Kultúry, ktoré sa nebudú preočkovávať ihneď, sa musia skladovať v chladničke pri teplote 0 až 6 oC.5.5.5. Suspenziu spór musí vykazovať počet životaschopných kolónií 5 až 10 miliónov na ml na miske s agarovým médiom inkubovaným pri teplote 63 ± 1 oC počas 16 až 18 hodín. Suspenzia spór musí byť rovnomerne zakalená a ak obsahuje zhluky alebo sediment, musí sa nahradiť a zo zásobnej kultúry (5.4.2.) sa musí pripraviť nová suspenzia.5.6. Príprava testovacích skúmaviek/liekoviek5.6.1. Agarové médium (5.1.2.) rozpustite a ochlaďte na teplotu 55 oC.5.6.2. Pridajte jeden diel čerstvej suspenzie spór (5.5.4.) k piatim dielom agarového média (5.6.1.) do skúmavky alebo fľaše a dôkladne premiešajte.5.6.3. Preneste 0,3 ml naočkovaného média (5.6.2.) vypočítaného tak, aby poskytlo vrstvu o hrúbke 5 mm do sterilnej skúmavky alebo liekovky (4.2.6.) a uzavrite zátkou alebo viečkom, alebo zatavením hrotu. Skúšobné skúmavky/liekovky nechajte chladnúť vo vzpriamenej polohe, médium nechajte stuhnúť, a potom ho nechajte stáť po dobu najmenej 12 hodín.5.6.4. Skúmavky/liekovky sa môžu použiť v ten istý deň, môžu sa však uchovávať aj niekoľko mesiacov, za predpokladu, že boli ochladené ihneď po príprave a uchovávané pri teplote 0-6 oC.6. Postup6.1. Vzorky sa musia skúšať čo možno najskôr a najlepšie do 24 hodín po odbere vzoriek, pričom sa vzorky budú uchovávať pri teplote 0-6 oC. Ak nie je možné vzorky skúšať do 24 hodín, musia sa uchovávať hlboko zmrazené (- 30 oC až - 15 oC) s cieľom minimalizovať inaktiváciu penicilínu.6.2. Každú skúmavku/liekovku (5.6.) označte čitateľne a nezmazateľne. Odstráňte viečko alebo zátku. Umiestnite požadovaný počet pre vzorky a porovnávacie pokusy (5.2. a 5.3.) — ktoré sa musia analyzovať — do vhodného stojana (4.1.3.).6.3. Pridajte 50 mikrolitrov živín podľa 5.1.4. do každej skúmavky/liekovky.6.4. Vzorku mlieka dôkladne premiešajte a preneste automatickou pipetou (4.1.4.) 0,1 ml do príslušne označenej skúmavky/liekovky. Pre každú vzorku, ktorá sa prenáša, použite čisté jednorázové špičky.6.5. Postup opísaný v 6.4. zopakujte dvakrát s použitím štandardného penicilínového roztoku obsahujúceho namiesto vzorky mlieka (5.2.3.) 0,004 μg/ml (= 0,0067 IU/ml).6.6. Postup uvedený v 6.4. zopakujte dvakrát s použitím porovnávacieho mlieka bez prítomnosti reziduí inhibičných látok (5.3.) namiesto vzorky mlieka.6.7. Uzatvorte skúmavky/liekovky a stojan so skúmavkami/liekovkami vložte do vodného kúpeľa s teplotou 63 ± 1 oC (4.1.2.) na minimálne 2 ½ alebo2 ¾ hodín.6.8. Stojan so skúmavkami/liekovkami vyberte z vodného kúpeľa.6.9. Sledujte farbu testovacieho média (pozri 7).7. Vyjadrenie výsledkov7.1. Modrofialové sfarbenie testovacieho média v ktorejkoľvek skúmavke/liekovke so vzorkou mlieka alebo s porovnávacou vzorkou indikujte prítomnosť antibiotík alebo sulfonamidov vo vzorke na alebo približne na úrovni "všetky pozitívne", uvedenej v tabuľke na strane 39. Sfarbenie skúmaviek/liekoviek so štandardným penicilínovým roztokom (6.5.) zostane modrofialové na dôkaz toho, že skúšobné médium je dostatočne citlivé.7.2. Modrofialové sfarbenie iba časti testovacieho média alebo nepravidelné sfarbenie v ktorejkoľvek skúmavke alebo ampulke so vzorkou mlieka indikuje prítomnosť reziduí inhibičných látok vo vzorke medzi úrovňami uvedenými v tabuľke na strane 39.7.3. Žlté sfarbenie testovacieho média v ktorejkoľvek skúmavke/liekovke so vzorkou mlieka alebo s porovnávacou vzorkou indikuje neprítomnosť látok s inhibujúcim účinkom na rast testovacieho mikroorganizmu.7.4. Ak sa modrofialové sfarbenie vyskytne vo všetkých skúšaných skúmavkách/liekovkách — vrátane negatívnej porovnávacej vzorky — skúmavky/liekovky neobsahujú životaschopné spóry a vzorky sa musia znovu skúšať s čerstvo pripravenými testovacími médiami.8. Potvrdenie výsledkov8.1. Všetky vzorky potvrďte pomocou postupov opísaných v 7.1. a 7.2. v súlade s "metódou B".Pokiaľ je skladovanie vzoriek s mliekom pred potvrdením nevyhnutné, potom sa musia hlboko zmraziť s cieľom zabrániť rozloženiu antibiotík.B. Postup potvrdenia penicilínov a stanovenie koncentrácie1. Rozsah a oblasť použitiaTento postup špecifikuje overovaciu skúšku na penicilíny alebo antibiotiká, okrem penicilínov a postupu stanovenia koncentrácie penicilínu vo vzorke mlieka s pozitívnym (A.7.1) alebo nejednoznačným výsledkom. (A.7.2.).Citlivosť rôznych antibiotík podľa danej metódy.Pozri A 1.2. Definícia2.1. Vzorka mlieka obsahuje reziduá antibiotík vrátane sulfonamidu, ak vzorka podľa opísanej metódy vytvorí číru zónu inhibície najmenej 2 mm okolo disku.2.2. Ak vzorka, ktorá obsahuje reziduá antibiotík vrátane sulfonamidu (2.1.) a ku ktorej bola pridaná penicilináza (betalaktanáza) netvorí žiadnu číru zónu alebo vytvorí číru zónu o menšom priemere než bez penicilinázy, potom inhibičnou látkou je buď penicilín, alebo aj penicilín a aj iné antibiotikum obsahujúce sulfonamidy.2.3. Ak táto zóna nie inaktivovaná penicilinázou (2.2.), inhibujúcou látkou vo vzorke mlieka nie je penicilín, ale môže to byťrezíduom iných látok (pozri smernicu 85/397/EHS, príloha A, kapitola VI, A.1.f a 2 b).Niektoré z polosyntetických penicilínov, napr. cloxacillin sodný, nie sú alebo sú iba čiastočne inaktivované penicilinázou, alebo sú úplne odolné, a preto sa neidentifikujú ako penicilín (pozri 7.3.).3. PrincípDisk z pijavého papiera nasiaknutý mliekom, ktoré sa má skúmať, sa položí na povrch agarového média naočkovaného pomocou Bacillus stearothermophilus, var. calidolactis. Inkubácia, majúca za následok normálny rast mikroorganizmov, spôsobí zakalenie agaru. Prítomnosť látok v mlieku, ktoré majú inhibujúci účinok na rast mikroorganizmov, bude indikovaná čírou zónou okolo kotúča. Veľkosť čírej zóny závisí okrem iného od koncentrácie a typu inhibujúcej látky v mlieku.4. Prístroje, laboratórne sklo a zariadenie4.1 Prístroje4.1.1. Pozri A.4.1.4.1.2. Vodný kúpeľ, s možnosťou regulácie teploty na 80 ± 1 oC.4.2. Laboratórne skloPozri A.4.2.4.3. Papierové disky bez prítomnosti reziduí inhibičných látok, o priemere 9 až 13 mm, s nasávacou schopnosťou 130 mg mlieka (najlepšie uskladniť v exsikátore).5. Médiá, štandardné roztoky, roztok penicilinázy, reagenty, testovací mikroorganizmus atď.Ingrediencie médií musia byť vhodné na mikrobiologické účely. Musí sa použiť voda destilovaná v sklennej aparatúre alebo demineralizovaná voda, alebo voda ekvivalentnej čistoty. Nesmie obsahovať reziduá inhibičných látok voči testovacím mikroorganizmom.5.1. Médiá5.1.1. Živý agar (A 5.1.1.)5.1.2. Skúšobné médium na sledovanie reziduí inhibičných látokZloženie:Kvasnicový extrakt | 2,5 g |Tryptón | 5 g |Glukóza | 1 g |Roztok trimethoprim alebo tetroxoprim (A.5.1.3) | 10 ml |Agar | 10-15 g (v závislosti od želírujúcej schopnosti) |Voda | 1000 ml |Príprava:Tuhé komponenty sa úplne rozpustia vo vode zahriatím a miešaním ešte predtým, ako sa pridá roztok trimethoprimu alebo tetroxoprimu. Po pridaní roztoku trimethoprimu alebo tetroxoprimu sa pH musí upraviť tak, aby po sterilizácii činilo 8,0± 0, 1 pri 25 oC. Médium sa sterilizuje 15 minút pri teplote 121 ± 1 oC.5.2. Štandardné roztoky penicilínu v mliekupozri A.5.2.Na účely kvantifikácie inhibičných látok (8) pripravte štandardné roztoky penicilínu v mlieku bez prítomnosti reziduí inhibičných látok (A.5.3) s nasledovnými koncentráciami:a) 0,004 μg/ml (0,0067 IU/ml);b) 0,006 μg/ml (0,01 IU/ml);c) 0,03 μg/ml (0,05 IU/ml);d) 0,06 μg/ml (0,1 IU/ml).5.3. Roztok penicilinázy5.3.1. Rozpustite v sterilnej destilovanej vode dostatočné množstvo penicilinázy (betalaktanázy) tak, aby ste dosiahli koncentráciu 1000 U/ml. Tento roztok — najlepšie rozdelený do malých množstiev — sa môže skladovať pri teplote 0 až 5 oC až štyri týždne.PoznámkaPre penicilinázu neexistuje žiadna jednotná medzinárodná norma. Na účely tejto metódy sa predpokladá, že 10 jednotiek penicilinázy je postačujúci na inaktiváciu 0,6 μg (= 1 IU) penicilinázy. V prípade dodávok pencilinázy o neznámej sile je nevyhnutné skontrolovať, či tento predpoklad platí. V opačnom prípade je nevyhnutné príslušne zmeniť koncentráciu roztoku penicilinázy.5.3.2. Namiesto roztoku penicilinázy, sa môžu použiť komerčne dostupné disky napustené penicilinázou, ak sa použitím porovnávacej metódy zistí, že obsahujú príslušné množstvo penicilinázy.5.4. Testovací mikroorganizmuspozri A.5.4.5.5. Testovacia kultúra (suspenzia spór)pozri A.5.5.5.6. Príprava testovacích misiek5.6.1. Na účely detekcie inhibičných látok (5.1.2.) testovacie médium rozpusťte a ochlaďte na teplotu 55 oC.5.6.2. Pridajte do fľaše jeden diel čerstvej suspenzie spór (5.5.) k toľkým dielom testovacieho média na stanovenie reziduí inhibičných látok (5.1.2), aby sa dosiahla v zaočkovanom testovacom médiu vhodný počet kolónií a dôkladne premiešajte.5.6.3. Preneste do sterilnej Petriho misky (A.4.2.2.) — vopred temperovanej na 55 oC — naočkované testovacie médium (5.6.2.) tak, aby sa získala vrstva hrubá 0,6 až 0,8 mm. V prípade Petriho misky s vnútorným priemerom 140 mm treba naliať na dosiahnutie hrúbky 0,8 mm cca 15 ml skúšobného média.5.6.4. Položte Petriho misky na chladnú podložku nastavenú do horizontálnej polohy, vopred skontrolovanú liehovou vodováhou, odstráňte viečka a nechajte agarové médium stuhnúť. Po stuhnutí média dajte viečka naspäť na misky a misky potom prevráťte hore dnom s cieľom minimalizovať kondenzáciu na povrchu agarového média.5.6.5. Takto pripravené testovacie misky je najlepšie použiť v ten istý deň, môžu sa však uchovávať dva týždne za predpokladu, že budú uzavreté v utesnenom polyetylénovom vrecku pri teplote 5 oC ihneď po ich príprave.5.6.6. Na identifikáciu vzoriek označte dno skúšobných misiek.6. Postup6.1 Príprava vzorky6.1.1. Vzorky, ktoré poskytujú pozitívne alebo nejednoznačné výsledky podľa "metódy A" (A.7.1. a A.7.2.), sa musia skúšať znovu, identifikovať a kvantifikovať ako penicilín.6.1.2. Vzorky mlieka sa temperujú 10 minút pri teplote 80 ± 1 oC s cieľom zabrániť vplyvu termolabilných nešpecifických inhibítorov.6.1.3. Po dôkladnom premiešaní sa cca 10 ml zahriateho testovaného mlieka prenesie do vhodnej sterilnej fľaše so širokým hrdlom. K mlieku sa pridá cca 0,4 ml roztoku penicilinázy (5.3.) a dôkladne sa premieša.6.2. Sledovanie prítomnosti inhibičných látok6.2.1. Ponorte papierový disk (4.3.) do vzorky mlieka (6.1.2.) s použitím čistých suchých jemných klieští. Odstráňte prebytočné mlieko tak, že sa budete diskom dotýkať bočnej strany vzorkovnice. Položte disk na plocho na povrch testovacej misky (5.6.) a zatlačte jemne nadol pomocou jemných klieští.6.2.2. Disky impregnované rôznymi vzorkami mlieka musia byť minimálne 20 mm od seba a 10 mm od okraja.6.2.3. Na účely kontroly citlivosti sa disky (4.3.) namočia do štandardného penicilínového roztoku (5.2.), musia sa umiestniť náhodne medzi disky so vzorkou mlieka v počte minimálne 2 % z počtu diskov so vzorkou mlieka a počas každej skúšky sa musí použiť najmenej 5 štandardných diskov.6.2.4. Keď boli všetky kotúče umiestnené na agarové médium náhodným spôsobom a boli identifikované, misky obráťte a inkubujte pri teplote 63 ± 1 oC počas 2 ½ až päť hodín.6.2.5. Po inkubácii sa misky preskúmajú pred vhodným svetelným zdrojom na číre zóny inhibície okolo papierových diskov. Číre zóny sa zmerajú.6.2.6. Zóny okolo diskov obsahujúcich penicilínový štandardný roztok (6.2.3.) musia mať aspoň 2 mm.6.2.7. Číre zóny okolo diskov obsahujúce vzorky mlieka minimálne rovnakej veľkosti alebo väčšie ako 6.2.6. indikujú prítomnosť látok inhibujúcich rast testovacieho mikroorganizmu.6.3. Identifikácia a kvantifikácia rezíduí inhibičných látok6.3.1 Postup uvedený v 6.2.1. sa vykoná dvakrát na zahriatej vzorke mlieka (6.1.2.) a na vzorke upravenej penicilinázou (6.1.3.). Namiesto pridania penicilinázy k 10 ml vzorky mlieka sa môže do tejto vzorky namočiť disk napustený penicilinázou (5.3.2.) a umiestniť na skúšobnú misku.6.3.2. Postup uvedený v 6.2.1. sa vykoná dvakrát pre každý zo štandardných penicilínových roztokov uvedených v 5.2. a) — d).6.3.3. Musia sa stanoviť priemerné hodnoty priemeru čírych zón pre vzorku mlieka a pre porovnávaciu vzorku penicilinázy, ako aj pre štandardné roztoky penicilínu.7. Interpretácia výsledkov (pozri 2)7.1. Pokiaľ sa nevyskytuje žiadna číra zóna okolo disku obsahujúceho porovnávaciu vzorku penicilinázy, avšak vyskytuje sa číra zóna okolo disku obsahujúceho vzorku mlieka — rovnako veľká alebo väčšia, ako je zóna okolo disku obsahujúceho štandardný roztok penicilínu (5.2. a)) — tak inhibičná látka vo vzorke mlieka zodpovedá koncentrácii benzylpenicilínu sodného (draselného) najmenej 0,004 μg/ml.7.2. Ak priemerná hodnota priemeru čírej zóny okolo disku obsahujúceho penicilinázu je rovnaký ako priemerná hodnota priemeru čírej zóny okolo disku obsahujúceho vzorku mlieka, tak vzorka mlieka obsahuje reziduá inhibičných látok, ktoré nie je možné inaktivovať pri takých koncentráciách penicilinázy, aké sa používajú pri tomto postupe.7.3. Ak priemerná hodnota priemeru čírej zóny okolo disku obsahujúceho penicilinázu je menší ako priemerná hodnota priemeru čírej zóny okolo disku obsahujúceho vzorku mlieka zahriatu v súlade s 6.1.2., tak vzorka mlieka obsahuje penicilín spolu s inými antibiotikami vrátane sulfonamidov, okrem penicilínu alebo polosyntetického penicilínu, ktoré sa nedajú identifikovať pri takej koncentrácii penicilinázy, aká sa používa pri tomto postupe. Syntetické penicilíny, ako je cloxacillin sodný, nemôžu byť inaktivované penicilinázou za týchto testovacích podmienok a môžu byť z tohto dôvodu klasifikované ako inhibítory iné ako je penicilín.PoznámkaReziduá inhibičných látok — okrem penicilínu — sa môžu v prípade potreby identifikovať použitím vhodných metód.8. Stanovenie množstva penicilínu8.1. Stanovenie množstva penicilínu sa dá vykonať buď po nakreslení kalibračnej krivky, alebo pomocou výpočtu na základe veľkostí zón získaných pomocou štandardných roztokov penicilínu v mlieku (5.2. a) — d)).8.2. Nakreslenie kalibračnej krivkyNakoľko existuje lineárna korelácia medzi log10 koncentrácie penicilínu (dekadického logaritmu koncentrácie) a priemerom inhibičnej zóny, kalibračná krivka sa môže nakresliť na semilogaritmický papier, pričom koncentrácie penicilínu sa vyznačia na logaritmickú súradnicu a inhibičné zóny na osi. Inhibičné zóny sa vypočítajú ako priemer z opakovaných skúšok. Priemery inhibičných zón sa vyznačia proti štandardným roztokom penicilínu, a potom sa narysuje kalibračná krivka.8.3. VýpočetKoncentrácie penicilínu vo vzorke mlieka sa môžu vypočítať z priemerov ich zón s použitím rovnice alebo kalibračnej krivky. Pre presné stanovenie musí byť polomer inhibičných zón minimálne dvakrát a nie viac ako päťkrát väčší ako polomer diskov.9. Vyjadrenie výsledkov9.1. Výsledky sa vyjadria ako obsah penicilínu rovný alebo vyšší ako 0,004 μg/ml (alebo s uvedením stanovenej koncentrácie), alebo ako obsah inhibítorov okrem penicilínu.9.2. Opakovateľnosť (r) a reprodukovateľnosť (R)Číselné údaje nie sú k dispozícii a nedávajú zmysel, nakoľko kvôli porovnaniu bol zahrnutý aj štandardný roztok.IX. STANOVENIE PATOGÉNNYCH MIKROORGANIZMOV1. Rozsah a oblasť použitiaV súlade s požiadavkou smernice 85/397/EHS, príloha A, kapitola VII (2) sú v tejto metóde uvedené pokyny, ktoré sa musia pri kontrolách pasterizovaného mlieka na výskyt patogénnych mikroorganizmov dodržiavať.2. DefiníciaMusí sa vykonať skúška na tie druhy mikroorganizmov, ktoré najčastejšie spôsobujú choroby spôsobené potravinami.Pasterizácia predstavuje úpravu, ktorá je zárukou voči prítomnosti tých patogénov v mlieku, ktoré nie sú termorezistentné. Pokiaľ budú dodržané normy uvedené v prílohe A v kapitole VII (2) smernice pre počet kolónií pri 30 oC a 21 oC koliformné mikroorganizmy a fosfatázu, špecifická skúška na patogény bude nevyhnutná iba vtedy, ak existuje podozrenie, že mlieko je spojené s vypuknutím otrávenia potravín.3. PostupMetódy a častosť skúšok musí stanoviť národný úrad takým spôsobom, ktorý umožní vydávať Zdravotné certifikáty (osvedčenia) týkajúce sa tepelne ošetreného mlieka na účely obchodu vo vnútri spoločenstva. Pre stanovenie patogénnych mikroorganizmov použite tie kritériá a postupy, ktoré sú medzinárodne akceptované — pokiaľ sú k dispozícii.4. Protokol o výsledkochV prípade každého skúmaného patogénneho mikroorganizmu bude výsledok vyjadrený nasledovným spôsobom:Počet na ml mlieka alebo "prítomnosť" alebo "neprítomnosť" v objeme pasterizovaného mlieka vyžadovaného v rámci použitého postupu. V protokole bude jasne opísaný použitý postup.--------------------------------------------------