CELEX: 31991D0180
Language: el
Date: 1991-02-14 00:00:00
Title: 91/180/ΕΟΚ: Απόφαση της Επιτροπής της 14ης Φεβρουαρίου 1991 για την καθιέρωση ορισμένων μεθόδων που αφορούν τις αναλύσεις και δοκιμασίες που πραγματοποιούνται στο νωπό γάλα και στο θερμικά επεξεργασμένο γάλα

Avis juridique important

|

31991D0180

91/180/ΕΟΚ: Απόφαση της Επιτροπής της 14ης Φεβρουαρίου 1991 για την καθιέρωση ορισμένων μεθόδων που αφορούν τις αναλύσεις και δοκιμασίες που πραγματοποιούνται στο νωπό γάλα και στο θερμικά επεξεργασμένο γάλα  

Επίσημη Εφημερίδα αριθ. L 093 της 13/04/1991 σ. 0001 - 0048 Φινλανδική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 3 τόμος 37 σ. 0012  Σουηδική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 3 τόμος 37 σ. 0012 

ΑΠΟΦΑΣΗ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ της 14ης Φεβραυαρίου 1991 για την καθιέρωση ορισμένων μεθόδων που αφορούν τις αναλύσεις και δοκιμασίες που πραγματοποιούνται στο νωπό γάλα και στο θερμικά επεξεργασμένο γάλα ( 91/180/ΕΟΚ ) Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΙΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,  Έχοντας υπόψη :  τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινότητας,  την οδηγία 85/397/ΕΟΚ του Συμβουλίου της 5ης Αυγούστου 1985 για τα υγειονομικά προβλήματα και την υγειονομική πολιτική κατά τις ενδοκοινοτικές συναλλαγές του θερμικά επεξεργασμένου γάλακτος ( 1 ), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την οδηγία 89/662/ΕΟΚ  ( 2 ), και ιδίως το άρθρο 10 παράγραφος 2,  Εκτιμώντας :  ότι, σύμφωνα με το άρθρο 10 παράγραφος 2 της οδηγίας 85/397/ΕΟΚ, η Επιτροπή καθορίζει τις μεθόδους ανάλυσης και δοκιμής που πρέπει να χρησιμοποιούνται για να ελέγχει την τήρηση των προδιαγραφών σχετικά με το νωπό γάλα και το θερμικά επεξεργασμένο γάλα - ότι, για το νωπό γάλα, σημασία έχει να θεσπιστούν κυρίως οι μέθοδοι που επιτρέπουν τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε μικρόβια, της περιεκτικότητας σε κύτταρα, του σημείου κατάψυξης και της παρουσίας αντιβιοτικών - ότι, για το παστεριωμένο γάλα, πρέπει να θεσπιστούν κυρίως μέθοδοι που να επιτρέπουν τη διαπίστωση απουσίας παθογόνων οργανισμών, του αριθμού των κολοβακτηριδίων, της περιεκτικότητας σε μικρόβια, της απουσίας φωσφατάσης, της παρουσίας υπεροξειδάσης, της  απουσίας αντιβιοτικών και του σημείου κατάψυξης - ότι, για το αποστειρωμένο γάλα και το γάλα "a ultra haute temperature" ( UHT ), πρέπει να θεσπιστούν κυρίως οι μέθοδοι που καθιστούν δυνατό τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε μικρόβια και της απουσίας αντιβιοτικών - ότι, για τεχνικούς λόγους, πρέπει σε ένα πρώτο στάδιο να θεσπιστούν οι μέθοδοι αναφοράς σχετικά με τις αναλύσεις και τις δοκιμασίες οι οποίες αποσκοπούν στην εξασφάλιση της τήρησης ορισμένων προδιαγραφών - ότι πρέπει, ειδικότερα, να συνεχιστεί η εξέταση  των όρων χρησιμοποίησης των συνήθων μεθόδων και των μεθόδων ανάλυσης και δοκιμασίας - ότι, εν αναμονή του αποτελέσματος της εξέτασης αυτής, εναπόκειται στις αρμόδιες αρχές να μεριμνήσουν ώστε να χρησιμοποιούνται οι κατάλληλες συνήθεις μέθοδοι προκειμένου  να τηρούνται οι προδιαγραφές της οδηγίας 85/397/ΕΟΚ -  ότι ο προσδιορισμός των μεθόδων αναφοράς για τις αναλύσεις και δοκιμασίες περιλαμβάνει την επιλογή των διαδικασιών ανάλυσης και τον καθορισμό κριτηρίων αξιοπιστίας, προκειμένου να εξασφαλιστεί μια ενιαία ερμηνεία των αποτελεσμάτων - ότι τα μέτρα που προβλέπονται από την παρούσα απόφαση είναι σύμφωνα με τη γνώμη της Μόνιμης Κτηνιατρικής Επιτροπής,  ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΑΠΟΦΑΣΗ :  Άρθρο 1 Οι διαδικασίες αναφοράς σχετικά με τις αναλύσεις και τις δοκιμασίες για το νωπό γάλα είναι οι ακόλουθες :  - προσδιορισμός του σημείου κατάψυξης,  - διαπίστωση του αριθμού των μικροοργανισμών - περιεκτικότητα σε μικρόβια στους 30 γC,  - διαπίστωση του αριθμού των σωματικών κυττάρων,  - ανίχνευση αντιβιοτικών και σουλφοναμιδών .  Άρθρο 2 Οι διαδικασίες αναφοράς σχετικά με τις αναλύσεις και τις δοκιμασίες για το παστεριωμένο γάλα είναι οι ακόλουθες :  - προσδιορισμός του σημείου κατάψυξης,  - προσδιορισμός της δραστηριότητας της φωσφατάσης,  - προσδιορισμός της δραστηριότητας της υπεροξειδάσης,  - διαπίστωση του αριθμού των μικροοργανισμών - περιεκτικότητα σε μικρόβια στους 30 γC,  - διαπίστωση του αριθμού των μικροοργανισμών - περιεκτικότητα σε μικρόβια στους 21 γC,  - διαπίστωση του αριθμού των κολοβακτηριδίων - καταμέτρηση των αποικιών στους 30 γC,  - ανίχνευση αντιβιοτικών και σουλφοναμιδών,  - ανίχνευση παθογόνων μικροοργανισμών .  Άρθρο 3 Οι διαδικασίες αναφοράς σχετικά με τις αναλύσεις και τις δοκιμασίες για το UΗΤ και το αποστειρωμένο γάλα είναι οι ακόλουθες :  - προσδιορισμός του σημείου κατάψυξης,  - διαπίστωση του αριθμού των μικροοργανισμών - περιεκτικότητα σε μικρόβια στους 30 γC,  - ανίχνευση αντιβιοτικών και σουλφοναμιδών .  Άρθρο 4 Η εφαρμογή των διαδικασιών αναφοράς σχετικά με τις αναλύσεις και τις δοκιμασίες, τα κριτήρια αξιοπιστίας που πρέπει να ληφθούν υπόψη και η συλλογή των δειγμάτων πρέπει να πραγματοποιούνται σύμφωνα με τους κανόνες που καθορίζονται στο παράρτημα  Ι .  Άρθρο 5 Οι διαδικασίες αναφοράς σχετικά με τις αναλύσεις και τις δοκιμασίες που αναφέρονται στα άρθρα 1, 2 και 3 περιγράφονται στο παράρτημα ΙΙ .  Άρθρο 6 Η παρούσα απόφαση επανεξετάζεται πριν από τις 31 Δεκεμβρίου 1992 προκειμένου να ληφθεί υπόψη η εξέλιξη των επιστημονικών και τεχνικών γνώσεων .  Άρθρο 7 Η παρούσα απόφαση απευθύνεται στα κράτη μέλη .  Βρυξέλλες, 14 Φεβρουαρίου 1991 . Για την Επιτροπή Ray Mac SHARRY Μέλος της Επιτροπής ( 1 ) ΕΕ αριθ . L 226 της 24 . 8 . 1985, σ . 13.(2 )  ΕΕ αριθ . L 395 της 30 . 12 . 1989, σ . 13 .   ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι     ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ  Σελίδα ΙΙ .  Γενικές διατάξεις .  4 ΙΙ .  Δειγματοληψία ανεπεξέργαστου και θερμικά επεξεργασμένου γάλακτος .  6 Ι . ΓΕΝΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΞΕΙΣ  1 .  Εισαγωγή Στο παρόν κεφάλαιο περιγράφονται γενικές διατάξεις σε ό,τι αφορά τα αντιδραστήρια, τον εξοπλισμό, τη διατύπωση των αποτελεσμάτων, την ακρίβεια των μεθόδων και τις εκθέσεις . Οι αρμόδιες αρχές των κρατών μελών και τα εργαστήρια ελέγχου δειγματοληψίας και  παρακολούθησης της ποιότητας του γάλακτος πρέπει να τηρούν τις γενικές διατάξεις .  2 .  Αντιδραστήρια 2.1 .  Νερό 2.1.1 .  Οπουδήποτε γίνεται μνεία νερού για διαλύματα, αραιώσεις ή εκπλύσεις, χρησιμοποιείται νερό αποσταγμένο, απιονισμένο ή αφαλατωμένο ισοδύναμης τουλάχιστον καθαρότητας, εκτός αν διευκρινίζεται διαφορετικά . Για μικροβιολογικές χρήσεις πρέπει να είναι  ελεύθερο ουσιών που μπορούν να βλάψουν ή να επηρεάσουν την ανάπτυξη των μικροοργανισμών κάτω από τις συνθήκες της δοκιμασίας .  2.1.2 .  Οπουδήποτε γίνεται μνεία σε "διάλυμα" ή "αραίωση" χωρίς παραπέρα διευκρίνιση νοείται "διάλυμα σε νερό" ή "αραίωση με νερό ".  2.2 .  Χημικές ουσίες ιΟλες οι χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται πρέπει να είναι αναγνωρισμένης ποιότητας αναλυτικού βαθμού εκτός αν ορίζεται διαφορετικά .  3 .  Εξοπλισμός 3.1 .  Κατάλογοι οργάνων Οι κατάλογοι οργάνων που δίνονται στις διάφορες μεθόδους αναφοράς περιέχουν μόνο τα όργανα εξειδικευμένης χρήσης ή με ιδιαίτερες προδιαγραφές .  3.2 .  Αναλυτικός ζυγός Αναλυτικός ζυγός νοείται ζυγός ικανός να ζυγίζει 0,1 mg .  4 .  Αποτελέσματα 4.1 .  Αν δεν προβλέπεται ρητά κάτι διαφορετικό, τα αποτελέσματα που θα αναφέρονται στο δελτίο ανάλυσης πρέπει να είναι η μέση τιμή που λαμβάνεται από δύο δοκιμασίες ανταποκρινόμενες στο αριθμητικό κριτήριο της επαναληψιμότητας ( βλέπε σημείο 5.1 ) που έχει  καθοριστεί για τη μέθοδο με την οποία πραγματοποιήθηκε η δοκιμασία . Αν το κριτήριο της επαναληψιμότητας δεν πληρούται, τότε η δοκιμή πρέπει να επαναληφθεί όποτε τούτο είναι δυνατό, διαφορετικά πρέπει να κριθεί ότι το αποτέλεσμα δεν ισχύει .  4.2 .  Υπολογισμός της επί τοις εκατό αναλογίας Εκτός αν ορίζεται διαφορετικά, το αποτέλεσμα πρέπει να υπολογίζεται επί τοις εκατό μάζας του δείγματος .  5 .  Κριτήρια ακριβείας : επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα 5.1 .  Τα κριτήρια ακριβείας που δίνονται σε κάθε μέθοδο καθορίζονται ως εξής :  5.1.1 .  Επαναληψιμότητα ( r ) είναι η τιμή κάτω από την οποία τοποθετείται η απόλυτη διαφορά μεταξύ δύο αποτελεσμάτων μονών δοκιμασιών που πάρθηκαν με την ίδια μέθοδο, σε ταυτόσημο υλικό δοκιμασίας, κάτω από ίδιες συνθήκες ( ίδιος αναλυτής, ίδιες συσκευές, ίδιο  εργαστήριο και βραχεία χρονική διαφορά μεταξύ δοκιμασιών ).  5.1.2 .  Αναπαραγωγιμότητα ( R ) είναι η τιμή κάτω από την οποία τοποθετείται η απόλυτη διαφορά μεταξύ δύο αποτελεσμάτων μονών δοκιμασιών που πάρθηκαν με την ίδια μέθοδο, ταυτόσημο υλικό δοκιμασίας, κάτω από διαφορετικές συνθήκες ( διαφορετικοί αναλυτές,  διαφορετικές συσκευές, διαφορετικά εργαστήρια ή/και διάφορες χρονικές στιγμές ).  5.1.3 .  Αν δεν προβλέπεται ρητά κάτι το διαφορετικό, οι τιμές για τα κριτήρια επαναληψιμότητας και αναπαραγωγιμότητας που δίνονται στις αντίστοιχες παραγράφους για κάθε μέθοδο παριστούν τις περιοχές επιπέδου αξιοπιστίας 95 % όπως καθορίζεται από τον ISO 5725 :  δεύτερη έκδοση 1986 . Υπολογίζονται από τα αποτελέσματα αναγνωρισμένων δοκιμασιών συνεργασίας που χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των μεθόδων . Εντούτοις, για μερικές από τις μεθόδους, δεν πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες συνεργασίας . Σε τέτοια περίπτωση  οι τιμές της επαναληψιμότητας και αναπαραγωγιμότητας έχουν καθορισθεί κατ' εκτίμηση .  5.1.4 .  Οι δοκιμασίες συνεργασίας και οι μελέτες που αναφέρονται στο σημείο 5.1.3 θα πρέπει να προγραμματιστούν και διεξαχθούν σύμφωνα με τις διεθνείς κατευθυντήριες γραμμές .  6 .  Δελτίο ανάλυσης Το δελτίο ανάλυσης πρέπει να διευκρινίζει τη μέθοδο ανάλυσης που χρησιμοποιήθηκε καθώς και τα αποτελέσματα που προέκυψαν . Επιπλέον πρέπει να δίνει όλες τις λεπτομέρειες της διαδικασίας που χρησιμοποιήθηκε και που δεν διευκρινίζεται στη μέθοδο ανάλυσης ή  που μπορεί να επιλεγεί, καθώς και όλα τα άλλα περιστατικά που είναι δυνατόν να έχουν επηρεάσει τα αποτελέσματα . Το δελτίο ανάλυσης πρέπει να δίνει όλα τα στοιχεία τα απαραίτητα για την πλήρη ταυτοποίηση του δείγματος .  ΙΙ . ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑ ΑΝΕΠΕΞΕΡΓΑΣΤΟΥ ΚΑΙ ΘΕΡΜΙΚΑ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΜΕΝΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ  1 .  Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής Η διαδικασία αυτή προσδιορίζει την επίσημη μέθοδο δειγματοληψίας ανεπεξέργαστου και θερμικά επεξεργασμένου γάλακτος . Οι μέθοδες αυτές για δειγματοληψία, μεταφορά και αποθήκευση των δειγμάτων είναι εφαρμόσιμες στο ανεπεξέργαστο γάλα για παραδόσεις από  παραγωγούς και για ανεπεξέργαστο και θερμικά επεξεργασμένο γάλα σε βυτία αποθήκευσης και μεταφοράς .  Οι μέθοδοι που δίνονται στα σημεία 2, 4.4, 5 και 6 είναι εφαρμόσιμες στη δειγματοληψία θερμικά επεξεργασμένου γάλακτος για άμεση κατανάλωση .  2 .  Γενικά Δειγματοληψία ανεπεξέργαστου και θερμικά επεξεργασμένου γάλακτος σε τενεκέδες, βυτία κ.λπ πρέπει να πραγματοποιείται από έμπειρο χειριστή που να έχει ακολουθήσει κατάλληλη εκπαίδευση πριν την ανάληψη της δειγματοληψίας του γάλακτος .  Αν κριθεί ότι ενδείκνυται, οι αρμόδιες αρχές ή το εργαστήριο εξέτασης καθοδηγεί το προσωπικό δειγματοληψίας σχετικά με την δειγματοληψία και την τεχνική της δειγματοληψίας ώστε να εξασφαλιστεί ότι το δείγμα είναι αντιπροσωπευτικό και ανταποκρίνεται στο  σύνολο της παρτίδας .  Αν κριθεί ότι ενδείκνυται, οι αρμόδιες αρχές ή το εργαστήριο εξέτασης καθοδηγεί το προσωπικό δειγματοληψίας σχετικά με την επισήμανση του δείγματος για να εξασφαλιστεί η πέραν αμφιβολίας πιστοποίηση της ταυτότητας του δείγματος .  3 .  Εξοπλισμός δειγματοληψίας 3.1 .  Γενικά Ο εξοπλισμός δειγματοληψίας πρέπει να είναι από ανοξείδωτο χάλυβα ή άλλο κατάλληλο υλικό κατάλληλης αντοχής και κατασκευής που ενδείκνυται για τη συγκεκριμένη χρήση ( ανάμειξη, δειγματοληψία κ.λπ.). Οι διατάξεις ανάσυρσης δείγματος και οι αναδευτήρες  υγρών σε βυτία πρέπει να διαθέτουν αρκετό χώρο για να επιτυγχάνεται η καλή ανάμειξη του προϊόντος αλλά αποφεύγοντας την ανάπτυξη ταγγής γεύσης . Οι δειγματολήπτες ( δοχεία ) πρέπει να έχουν στερεό βραχίονα αρκετού μήκους ώστε να μπορεί να γίνει  δειγματοληψία σε οποιοδήποτε βάθος του βυτίου χρειαστεί . Η χωρητικότητα του δειγματολήπτη πρέπει να μην είναι μικρότερη από 50 ml .  Οι υποδοχείς του δείγματος και τα πώματα πρέπει να είναι από γυαλί κατάλληλα μέταλλα ή πλαστικά .  Τα υλικά από τα οποία ο εξοπλισμός δειγματοληψίας ( περιλαμβάνονται οι υποδοχές και τα πώματα ) είναι κατασκευασμένος δεν πρέπει να προκαλούν καμία αλλαγή στο δείγμα που να μπορεί να προσβάλλει τα αποτελέσματα της εξέτασης . Όλες οι επιφάνειες του  εξοπλισμού δειγματοληψίας και των βυτίων πρέπει να είναι καθαρές και στεγνές, λείες και απαλλαγμένες σχισμών . Οι γωνίες πρέπει να έχουν αμβλυνθεί .  3.2 .  Εξοπλισμός δειγματοληψίας για μικροβιολογική εξέταση Ο εξοπλισμός δειγματοληψίας και οι υποδοχείς, επιπλέον από όσα προβλέπονται στο σημείο 3.1, πρέπει να έχουν αποστειρωθεί .  Αν ο ίδιος εξοπλισμός δειγματοληψίας χρησιμοποιείται σε διαδοχικές δειγματοληψίες, πρέπει να καθαρίζεται και αποστειρώνεται μετά από κάθε χρήση, σύμφωνα με οδηγίες και τις προδιαγραφές που θεσπίζονται από το εργαστήριο δοκιμών ή την αρμόδια αρχή και  κατά τρόπο που να διασφαλίζεται η ακεραιότητα των διαδοχικών δειγμάτων .  4 .  Τεχνική δειγματοληψίας 4.1 .  Γενικά Ανεξάρτητα από τις δοκιμασίες που πρόκειται να πραγματοποιηθούν, το γάλα πρέπει να έχει αναμειχθεί πριν τη δειγματοληψία είτε με χειροκίνητο είτε με μηχανικό μέσο .  Το δείγμα πρέπει να λαμβάνεται αμέσως μετά την ανάμειξη και όσο το γάλα βρίσκεται ακόμη σε ανακίνηση .  Όταν λαμβάνονται πολλά δείγματα γάλακτος από βυτία κατά τον ίδιο χρόνο και για διαφορετικές εξετάσεις, το δείγμα για μικροβιολογική εξέταση πρέπει να λαμβάνεται πρώτο .  Ο όγκος του δείγματος πρέπει να είναι ο κατάλληλος για τις απαιτήσεις της εξέτασης . Η χωρητικότητα των υποδοχέων που χρησιμοποιούνται πρέπει να είναι τέτοια που να πληρούνται σχεδόν εντελώς οι υποδοχείς από το δείγμα σε τρόπο που να μπορεί να ανακινηθεί  το περιεχόμενο πριν την εξέταση αλλά να αποφεύγεται ανατάραξη κατά τη μεταφορά .  4.2 .  Δειγματοληψία διά της χειρός 4.2.1 .  Δειγματοληψία από κουβάδες και τενεκέδες γάλακτος Για να επιτευχθεί ταχεία ανακίνηση, βυθίζεται ένας πλωτήρας πάνω και κάτω μέσα στον κουβά ή τενεκέ έτσι ώστε το γάλα να αναδευτεί ικανοποιητικά και ποσότητα κρέμας του γάλακτος να μη προσκολλάται στο χείλος του τενεκέ . Ένα δείγμα αντιπροσωπευτικό της  ποσότητας που παραδόθηκε πρέπει να ληφθεί σύμφωνα με το σημείο 4.2.4 .  4.2.2 .  Δειγματοληψία από ψυκτικά βυτία ή δεξαμενές αγροκτήματος Ανακινείται με μηχανή ή με το χέρι το γάλα μέχρις ότου ληφθεί ικανοποιητική ομοιογένεια .  Αν ο όγκος του γάλακτος είναι τέτοιος που δεν επιτρέπει την μηχανική του ανάμειξη, τότε αυτή πραγματοποιείται με χειροκίνητο μέσο .  4.2.3 .  Δειγματοληψία από ζυγιστική συσκευή Επιβάλλεται, όταν το γάλα φέρεται σε υποδοχέα ζυγιστικής συσκευής, να έχει κατάλληλα αναμειχθεί . Μπορεί να χρειαστεί να χρησιμοποιηθεί συμπληρωματική χειροκίνητη ή μηχανική ανακίνηση για να εξασφαλιστεί ομοιόμορφη κατανομή του λίπους . Όταν ο όγκος της  ποσότητας προς παραλαβή που πρόκειται να δειγματισθεί υπερβαίνει την χωρητικότητα του υποδοχέα ζύγισης, πρέπει να ληφθεί ένα δείγμα αντιπροσωπευτικό της όλης ποσότητας σύμφωνα με το σημείο 4.2.4 .  4.2.4 .  Δειγματοληψία υποδιαιρεμένου φορτίου Όταν η ποσότητα του γάλακτος που πρέπει να δειγματισθεί φέρεται σε περισσότερους από έναν περιέκτες, λαμβάνεται μια αντιπροσωπευτική ποσότητα από κάθε περιέκτη και σημειούται η ποσότητα του γάλακτος στην οποία αντιστοιχεί κάθε δείγμα . Εκτός από την  περίπτωση κατά την οποία δείγματα από κάθε περιέκτη πρέπει να εξεταστούν εξατομικευμένα, αναμειγνύονται μέρη από αυτές τις αντιπροσωπευτικές ποσότητες σε αναλογίες αντίστοιχες με τις ποσότητες των υποδοχέων από τους οποίους κάθε δείγμα έχει ληφθεί .  Λαμβάνεται δείγμα ( ή δείγματα ) από αυτές τις αναλογικά συνενωμένες ποσότητες έπειτα από ανάμειξη .  4.2.5 .  Δειγματοληψία από μεγάλες δεξαμενές πλοίων - βυτία αποθήκευσης ή σιδηροδρομικής ή οδικής διακίνησης 4.2.5.1 .  Αναμειγνύεται το γάλα με κατάλληλη μέθοδο πριν την δειγματοληψία .  Για την ανάμειξη του περιεχομένου μεγάλων δεξαμενών πλοίων ή βυτίων αποθήκευσης ή βυτίων οδικής ή σιδηροδρομικής μεταφοράς, συνιστάται η χρησιμοποίηση μηχανικής ανακίνησης ( βλέπε σημείο 4.2.5.2 ).  Η διάρκεια της ανάμειξης πρέπει να είναι η κατάλληλη για τη χρονική περίοδο κατά την οποία το γάλα έμεινε ακίνητο . Η αποτελεσματικότητα της μεθόδου ανάμειξης που εφαρμόστηκε σε όποιες ιδιαίτερες περιστάσεις πρέπει να αποδειχθεί ότι ταιριάζει για τις  ανάγκες της αναλυσης που μέλει να πραγματοποιηθεί . Το πρόβλημα της ανάμειξης επηρεάζει ιδιαίτερα την ομοιότητα των αναλυτικών αποτελεσμάτων για δείγματα που πάρθηκαν είτε από διαφορετικά μέρη της ποσότητας παραλαβής είτε από τον κρουνό της δεξαμενής  κατά διαστήματα κατά τη διάρκεια της απόχυσης . Μια μέθοδος ανάμειξης του γάλακτος πρέπει να θεωρείται αποτελεσματική αν η διαφορά σε περιεκτικότητα σε λίπος μεταξύ δύο δειγμάτων, που πάρθηκαν κάτω από αυτές τις συνθήκες, είναι μικρότερη από 0,1 %.  Σε μια μεγάλη δεξαμενή με κρουνό απόχυσης στον πυθμένα μπορεί να υπάρχει στο σημείο εκφόρτωσης μια μικρή ποσότητα γάλακτος που να μην είναι αντιπροσωπευτική του όλου περιεχομένου ακόμη και μετά την ανάμειξη . Για το λόγο αυτό, τα δείγματα πρέπει να  λαμβάνονται κατά προτίμηση από την ανθρωποθυρίδα . Αν τα δείγματα λαμβάνονται κατά προτίμηση, αφήνεται να ρεύσει αρκετό γάλα για να εξασφαλιστεί ότι τα δείγμτα είναι αντιπροσωπευτικά του συνόλου .  4.2.5.2 .  Η ανάμειξη του περιεχομένου μεγάλων δεξαμενών ή βυτίων αποθήκευσης ή βυτίων σιδηροδρομικής ή οδικής μεταφοράς μπορεί να πραγματοποιηθεί :  - με μηχανικό αναδευτήρα εγκατεστημένο μέσα στην δεξαμενή και κινούμενο με ηλεκτρικό κινητήρα,  - με προπέλλα ή αναδευτήρα κινούμενο με ηλεκτρικό κινητήρα και τοποθετημένο στην ανθρωποθυρίδα με τον αναδευτήρα αιωρούμενο μέσα στο γάλα,  - στην περίπτωση βυτίων σιδηροδρομικής ή οδικής μεταφοράς με επανακυκλοφορία του γάλακτος μέσα από τον σωλήνα μεταφοράς με προσαρμογή στο βυτίο έπειτα από αποφόρτιση των αντλιών και με εισαγωγή τους από την ανθρωποθυρίδα .  - με καθαρό διηθημένο πεπιεσμένο άερα . Σε αυτή την περίπτωση η πίεση και ο όγκος του αέρος πρέπει να είναι όσο γίνεται πιο μικρός για να προληφθεί το τάγγισμα του γάλακτος .  4.3 .  Αυτόματη ή ημιαυτόματη δειγματοληψία Αυτόματες ή ημιαυτόματες διατάξεις δειγματοληψίας ανεπεξέργαστου γάλακτος από παραδόσεις παραγωγών μπορούν να χρησιμοποιηθούν σύμφωνα με οδηγίες που δίνονται από το εργαστήριο εξέτασης ή άλλη αρμόδια αρχή .  Τέτοιες διατάξεις πρέπει, πριν την χρησιμοποίηση και σε τακτικά διαστήματα κατά την χρησιμοποίηση, να υφίστανται κατάλληλους ελέγχους, όπως ορίζεται από τις υπεύθυνες αρχές . Η καταλληλότητα των διαδικασιών δειγματοληψίας πρέπει να επαληθεύεται  προκειμένου να καθοριστούν :  - ο ελάχιστος όγκος συλλεγομένου γάλακτος που μπορεί κατά κύριο λόγο να δειγματιστεί,  - το ποσοστό του μεταφερόμενου όγκου ( που σχετίζεται με τον ελάχιστο όγκο δείγματος ),  - η ικανότητα λήψεως αντιπροσωπευτικού δείγματος έπειτα από κατάλληλη ανάδευση .  Όταν χρησιμοποιείται αυτόματος ή ημιαυτόματος εξοπλισμός δειγματοληψίας, η αρμόδια εθνική αρχή μπορεί να ορίσει προδιαγραφές για :  - τον ελάχιστο όγκο γάλακτος από τον οποίο πρέπει να ληφθούν δείγματα,  - τον ελάχιστο όγκο δείγματος,  - το μέγιστο μεταφερόμενο όγκο,  - τις αναλύσεις που πρέπει να πραγματοποιηθούν ή ποιες προφυλάξεις πρέπει να παρθούν .  4.4 .  Δειγματοληψία θερμικά επεξεργασμένου γάλακτος για άμεση κατανάλωση σε συσκευασίες λιανικής πώλησης Ως δείγμα θερμικά επεξεργασμένου γάλακτος για άμεση κατανάλωση σε συσκευασίες λιανικής πώλησης θεωρείται μια πλήρης σφραγισμένη συσκευασία . Αν είναι δυνατόν τα δείγματα πρέπει να λαμβάνονται από τη μηχανή συσκευασίας ή το ψυχρό θάλαμο αποθήκευσης στην  εγκατάσταση επεξεργασίας το συντομότερο δυνατό μετά την επεξεργασια για το παστεριωμένο γάλα την ίδια ημέρα με την επεξεργασία .  Τα δείγματα λαμβάνονται από κάθε τύπο θερμικά επεξεργασμένου γάλακτος ( παστεριωμένου, UHT και αποστειρωμένου ) σε αριθμούς αντίστοιχους με τις εξετάσεις που πρόκειται να πραγματοποιηθούν και σε συμφωνία με τις οδηγίες που έχουν καταρτισθεί από το  εργαστήριο εξέτασης ή άλλη αρμόδια αρχή .  5 .  Ταυτοποίηση του δείγματος Το δείγμα πρέπει να επισημαίνεται με κωδικό αναγνώρισης έτσι ώστε να μπορεί εύκολα να αναγνωρίζεται με βάση τις οδηγίες που δίδονται από το εργαστήριο αναλύσεων ( βλέπε σημείο 2 ).  6 .  Μεταφορά και αποθήκευση δειγμάτων Οι οδηγίες σχετικά με τις συνθήκες μεταφοράς, αποθήκευσης και χρονικής περιόδου μεταξύ συλλογής και ανάλυσης του γάλακτος πρέπει να συντάσσονται από το εργαστήριο ελέγου ανάλογα με τον τύπο του γάλακτος και τη χρησιμοποιούμενη μέθοδο ανάλυσης . Οι  οδηγίες πρέπει να θεσπίζονται σύμφωνα με την αρμόδια εθνική αρχή . Στις οδηγίες πρέπει να συμπεριλαμβάνονται τα ακόλουθα σημεία :  - πρέπει να λαμβάνονται προφυλάξεις κατά τη μεταφορά και αποθήκευση ώστε να προληφθεί η έκθεση σε μολυσματικές οσμές και απευθείας στο ηλιακό φως . Εάν το δοχείο που χρησιμοποιείται για τα δείγματα είναι διαφανές, πρέπει να φυλάσσεται σε σκοτεινό μέρος,   - τα δείγματα ακατέργαστου γάλακτος που λαμβάνονται για μικροβιολογικές αναλύσεις πρέπει να μεταφέρονται και αποθηκεύονται μεταξύ 0 και 4 γC . Το διάστημα μεταξύ δειγματοληψίας και ανάλυσης πρέπει να είναι κατά το δυνατόν συντομότερο και σε καμία  περίπτωση μεγαλύτερο από 36 ώρες . Η αρμόδια αρχή μπορεί να αποδέχεται μια θερμοκρασία αποθήκευσης μεταξύ 0 και 6 γC, εάν το διάστημα μεταξύ δειγματοληψίας και ανάλυσης δεν είναι μεγαλύτερο από 24 ώρες,  - τα δείγματα παστεριωμένου γάλακτος που λαμβάνονται για μικροβιολογικές αναλύσεις πρέπει να μεταφέρονται και αποθηκεύονται μεταξύ 0 και 4 γC . Το διάστημα μεταξύ δειγματοληψίας και ανάλυσης πρέπει να είναι κατά το δυνατόν συντομότερο και σε καμία  περίπτωση μεγαλύτερο από 24 ώρες,  - τα δείγματα γάλακτος εκτός ακατέργαστου γάλακτος και παστεριωμένου γάλακτος προς μικροβιολογική ανάλυση πρέπει να αποθηκεύονται στο εργαστήριο σε ψύξη, και το διάστημα μεταξύ δειγματοληψίας και ανάλυσης πρέπει να είναι κατά το δυνατόν συντομότερο .  Στις διάφορες μεθόδους αναφέρονται ειδικές προφυλάξεις για ορισμένες αναλύσεις .   ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ     ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ  Σελίδα Ι .  Προσδιορισμός σημείου πήξης .  10 ΙΙ .  Προσδιορισμός ενεργότητας φωσφατάσης .  16 ΙΙΙ .  Προσδιορισμός ενεργότητας υπεροξειδάσης .  19 ΙV .  Καταμέτρηση μικροοργανισμών - Δοκιμή μέτρησης τρυβλίου στους 30 γC .  20 V .  Καταμέτρηση μικροοργανισμών - Δοκιμή μέτρησης τρυβλίου στους 21 γC .  25 VΙ .  Καταμέτρηση κολοβακτηριδίων - Μέτρηση αποικίας στους 30 γC .  29 VΙΙ .  Καταμέτρηση σωματικών κυττάρων .  33 VΙΙΙ .  Ανίχνευση αντιβιοτικών και σουλφοναμιδίων .  39 ΙΧ .  Ανίχνευση παθογόνων μικροοργανισμών .  48 Ι . ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΗΜΕΙΟΥ ΠΗΞΗΣ  1 .  Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής Η διαδικασία αυτή καθορίζει τη μέθοδο αναφοράς για τον προσδιορισμό του σημείου πήξης ακατέργαστου, παστεριωμένου, UHT, επεξεργασμένου και αποστεριωμένου πλήρους γάλακτος, μερικώς αποβουτυρωμένου γάλακτος και αποβουτυρωμένου γάλακτος, χρησιμοποιώντας  ένα όργανο ( κρυοσκόπιο θερμίστορα ) στο οποίο το θερμοστατικά ελεγχόμενο λουτρό ψύχεται με ηλεκτρικό ψύκτη και ένας διερευνητής θερμίστορα αντικαθιστά το γυάλινο θερμόμετρο υδράργυρου .  Διατίθενται δύο τύποι οργάνου . Ο πρώτος είναι ένα όργανο που ανιχνεύει το μέγιστο σημείο πήξης στην περιοχή οριζοντιοποίησης της καμπύλης ψύξης, ενώ ο δεύτερος, για εμπορικούς λόγους, έχει ρυθμιστεί να κάνει μια ανάγνωση σε ένα καθορισμένο χρόνο μετά  την έναρξη της ψύξης . Καθώς οι καμπύλες σημείου ψύξης μπορεί να διαφέρουν από το ένα γάλα στο άλλο και μεταξύ γάλακτος και των τυποποιημένων διαλυμάτων που χρησιμοποιούνται για τη βαθμονόμηση, η εν λόγω μέθοδος αναφοράς απαιτεί τη χρήση οργάνων που  αναζητούν την περιοχή οριζοντιοποίησης . Όργανα προκαθορισμένου χρόνου μπορούν να χρησιμοποιηθούν για μετρήσεις ρουτίνας ανίχνευσης/διαχωρισμού .  Το σημείο πήξης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να εκτιμηθεί η αναλογία πρόσθετου νερού στο γάλα, εφόσον η οξύτητα του δείγματος δεν υπερβαίνει τα 0,18 gr γαλακτικού οξέος ανά 100 ml ( βλέπε σημείο 7.4 ).  2 .  Ορισμός Σημείο πήξης γάλακτος : η λαμβανόμενη τιμή κατά τη μέτρηση σύμφωνα με την περιγραφόμενη διαδικασία και εκφρασμένη σε βαθμούς Κελσίου ( γC ).  3 .  Αρχή Μια δοκιμαστική δόση γάλακτος υπερψύχεται στην κατάλληλη θερμοκρασία, ανάλογα με το όργανο, και η κρυστάλλωση διεγείρεται με μηχανική δόνηση που προκαλεί τη γρήγορη άνοδο της θερμοκρασίας έως μια περιοχή οριζοντιοποίησης η οποία αντιστοιχεί στο σημείο  πήξης του δείγματος .  Το όργανο βαθμονομείται με προσαρμογή του ώστε να δίνει τη σωστή ανάγνωση για δύο πρότυπα διαλύματα, χρησιμοποιώντας την ίδια διαδικασία όπως και για δείγματα γάλακτος . Κάτω από τις συνθήκες αυτές, η περιοχή οριζοντιοποίησης αποδίδει το σημείο πήξης του  γάλακτος σε βαθμούς Κελσίου .  4 .  ιΟργανα και γυάλινα σκεύη Συνηθισμένος εργαστηριακός εξοπλισμός και ιδιαίτερα :  4.1 .  Κρυοσκόπιο Το κρυοσκόπιο αποτελείται από ένα θερμοστατικά ελεγχόμενο λουτρό ψύξης, ένα διερευνητή θερμίστορα ( ένα θερμόμετρο αντίστασης ημιαγωγού ) με συνδεδεμένο κύκλωμα και γαλβανόμετρο ή διάταξη ανάγνωσης, ένα αναδευτήρα δείγματος και συσκευή για την εκκίνηση  της πήξης μαζί με σωλήνες υποδοχής του δείγματος .  4.1.1 .  Λουτρό ψύξης Μπορούν να χρησιμοποιηθούν δύο τύποι λουτρού ψύξης .  4.1.1.1 .  Τύπος κατάδυσης ιΕνα καλά μονωμένο υγρό που περιέχει κατάλληλο ψυκτικό υγρό, το οποίο αναδεύεται έτσι ώστε η διαφορά θερμοκρασίας μεταξύ δύο τυχόντων σημείων του υγρού να μην υπερβαίνει του 0,2 γC . Η θερμοκρασία του υγρού δεν πρέπει να κυμαίνεται περισσότερο από π 0,5  γC από την ονομαστική τιμή που δηλώνεται από τον κατασκευαστή .  Είναι σημαντικό, το υγρό στο λουτρό ψύξης να διατηρείται σε σταθερό επίπεδο . Ολόκληρη η επιφάνεια του σωλήνα υποδοχής δείγματος κάτω από τη χαραγή ένδειξης όγκου πρέπει να καλύπτεται από το ψυκτικό υγρό .  4.1.1.2 .  Τύπος κυκλοφορίας ιΕνα συνεχές ρεύμα κατάλληλου ψυκτικού υγρού κυκλοφορεί γύρω από το σωλήνα υποδοχής δείγματος . Η θερμοκρασία του δείγματος δεν πρέπει να κυμαίνεται περισσότερο από π 0,5 γC από την ονομαστική τιμή που δηλώνεται από τον κατασκευαστή .  Ένα κατάλληλο ψυκτικό υγρό είναι υδατικό διάλυμα 33 % ( ν/ν ) 1,2 αιθανοδιόλης ( αιθυλενογλυκόλης ).  4.1.2 .  Θερμίστορας και συνοδεύον κύκλωμα Ο θερμίστορας πρέπει να είναι τύπου γυάλινου καθετήρα, διαμέτρου όχι μεγαλύτερης από 1,80 π 0,2 mm και διαμέτρου εξοχής όχι μεταλύτερης από 0,31 mm . Η σταθερά χρόνου του θερμίστορα πρέπει να είναι μικρότερη από δύο δευτερόλεπτα και η τιμή του β ( βλέπε  σημείωση ) πρέπει να είναι υψηλή . Η τιμή της τάσης εργασίας, ρεύματος και σταθεράς απόσβεσης πρέπει να είναι τέτοια ώστε η θερμοκρασία του θερμίστορα να μην αυξάνεται περισσότερο από 0,0005 γC πάνω από το άμεσο περιβάλλον του στους -0,512 γC . Η μέγιστη  ανοχή επί της αντίστασης πρέπει να είναι π 5 %.  Όταν ο καθετήρας είναι στη θέση λειτουργίας στο κρυοσκόπιο, η άκρη της γυάλινης σφαίρας, πρέπει να κείται πάνω στον άξονα του σωλήνα υποδοχής δείγματος και σε ένα σημείο 44,6 π 0,1 mm κάτω από την κορυφή του σωλήνα ( βλέπε σχήμα στη σελίδα 15 ). Πρέπει να  υπάρχει ένα υποστήριγμα για να βοηθά το χειριστή να θέσει τον καθετήρα στη θέση αυτή .  Σημείωση ως β ορίζονται τα χαρακτηριστικά αντίστασης-θερμοκρασίας του θερμίστορα σύμφωνα με τη σχέση :  -  d R  x  R=  T 2  ,  - d Rd T x 1 R = β T  2   όπου :  T είναι η θερμοκρασία σε Kelvin,  R είναι η αντίσταση σε ohms σε θερμοκρασία Τ,  -  d R  x  R   Temperaturkoeffizient,  - d R d T x 1 R  είναι ο συντελεστής της θερμοκρασίας,   β είναι μια σταθερά που εξαρτάται από το υλικό κατασκευής του θερμίστορα . Στη συνήθη πρακτική συνίσταται μια τιμή που ξεπερνά το 3 000 .   4.1.3 .  Διάταξη μέτρησης και ανάγνωσης 4.1.3.1 .  Αρχή της μέτρησης Το χρησιμοποιούμενο όργανο πρέπει να λειτουργεί πάνω στην αρχή της ανίχνευσης της πρώτης περιοχής οριζοντιοποίησης της καμπύλης σημείου πήξης . Η περιοχή οριζοντιοποίησης είναι το τμήμα της καμπύλης στο οποίο η θερμοκρασία παραμένει σταθερή μέσα στο όριο  των π 0,002 γC επί 20 δευτερόλεπτα τουλάχιστον .  4.1.3.2 .  Χειρισμός με το χέρι Η αντίσταση του θερμίστορα πρέπει να αντισταθμιστεί με τη βοήθεια γέφυρας Wheatsdtone ή παρόμοιας διάταξης, χρησιμοποιώντας σταθερούς ρυθμιστές αντίστασης υψηλής ποιότητας, των οποίων η ανοχή δεν είναι μεγαλύτερη του π 10 % και των οποίων ο συντελεστής  θερμοκρασίας δεν υπερβαίνει το 2 x 10-5 γC .  Ο μεταβλητός ( αντισταθμιζόμενος ) ρυθμιστής αντίστασης δεν πρέπει να αποκλίνει από τη γραμμικότητα σε όλη την περιοχή εμβέλειάς του περισσότερο από 0,3 % της μέγιστης τιμής του .  Πρέπει να υπάρχει τρόπος προσαρμογής των ρυθμιστών αντίστασης με σκοπό τη βαθμονόμησή τους .  Ο δίσκος μέτρησης πρέπει να είναι βαθμολογημένος σε διαστήματα όχι μεγαλύτερα από 0,001 γC .  4.1.3.3 .  Αυτόματη λειτουργία Η διάταξη ανάγνωσης πρέπει να επιτρέπει διαχωρισμό τουλάχιστον 0,001 γC στην περιοχή από 0 έως -0,600 γC όταν το όργανο λειτουργεί σωστά .  Η σταθερότητα της διάταξης μέτρησης και του αντιστοίχου κυκλώματος πρέπει να είναι τέτοια που διαδοχικές ενδείξεις της ίδιας θερμοκρασίας να μην έχουν μεγαλύτερη διαφορά από 0,001 γC .  Η γραμμικότητα του κυκλώματος πρέπει να είναι τέτοια ώστε να μην εισάγεται σφάλμα μεγαλύτερο από π 0,001 γC σε καμία περιοχή μεταξύ -0,400 γC και -0,600 γC όταν το όργανο λειτουργεί σωστά .  4.1.4 .  Σύρμα ανάδευσης Ένα σύρμα από μέταλλο αδρανές στο γάλα και με διάμετρο μεταξύ 1 και 1,5 mm χρησιμοποιείται για την ανάδευση της δοκιμαστικής δόσης .  Το σύρμα ανάδευσης πρέπει να προσαρμόζεται ως προς το πλάτος του και να τοποθετείται κάθετα με το επίπεδο του κατώτερου άκρου του ίδιο με το άκρο του καθετήρα του θερμίστορα . Επιτρέπεται μια ανοχή περίπου 1,5 mm πάνω ή κάτω από τη θέση αυτή .  Το σύρμα ανάδευσης πρέπει να δονείται επιμήκως με ένα επαρκές πλάτος δηλούμενο από τον κατασκευαστή (όχι μικρότερο από π 1,5 mm ) για να εξασφαλιστεί ότι η θερμοκρασία μέσα στη δοκιμαστική δόση παραμένει σταθερή . Κατά τη διάρκεια της κανονικής  λειτουργίας ανάδευσης δεν πρέπει ο αναδευτήρας να προσκρούσει στον καθετήρα του θερμίστορα ή το τοίχωμα του σωλήνα .  4.1.5 .  Διάταξη προς έναρξη της ψύξης Αυτή μπορεί να είναι οποιαδήποτε διάταξη η οποία κατά τη λειτουργία της προκαλεί τη στιγμιαία ψύξη του δείγματος έτσι ώστε η θερμοκρασία της δοκιμαστικής δόσης ανέρχεται στο σημείο πήξης . Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για το σκοπό αυτό το σύρμα ανάδευσης -  μία μέθοδος είναι να αυξηθεί το πλάτος δόνησης επί ένα έως δύο δευτερόλεπτα έτσι ώστε το σύρμα ανάδευσης να προσκρούσει στο τοίχωμα του σωλήνα υποδοχής δείγματος .  4.1.6 .  Σωλήνες υποδοχής δείγματος Οι σωλήνες υποδοχής δείγματος ( βλέπε σχήμα στη σελίδα 15 ) πρέπει να είναι κατασκευασμένοι από γυαλί και να έχουν μήκος 50,8 π 0,1 mm, εξωτερική διάμετρο 16,0 π 0,1 mm και εσωτερική διάμετρο 13,5 π 0,1 mm . Το πάχος του τοιχώματος σε όλο το μήκος του  σωλήνα δεν πρέπει να μεταβάλλεται περισσότερο από 0,1 mm .  Οι σωλήνες πρέπει να φέρουν χαραγή ένδειξης όγκου 29,8 mm κάτω από το άκρο ( 21 mm πάνω από τη βάση του σωλήνα ) προς ένδειξη, αντίστοιχα, όγκου δείγματος 2,5 π 0,1 mm .  4.1.7 .  Ηλεκτρική παροχή Η τάση παροχής πρέπει να σταθεροποιείται, είτε μέσα στη συσκευή είτε εξωτερικά, έτσι ώστε η διακύμανση να μην ξεπερνά το π 1 % της ονομαστικής τιμής όταν η κύρια παροχή κυμαίνεται κατά π 6 %.  4.2 .  Αναλυτικός ζυγός 4.3 .  Ογκομετρικές φιάλες μιας χαραγής χωρητικότητας 1 000 ml, κλάσης Α .  4.4 .  Κλίβανος ξήρανσης, καλά εξαεριζόμενος, ικανός να διατηρεί θερμοκρασία 130 π 1 γC ή Ηλεκτρικός φούρνος, καλά εξαεριζόμενος, ικανός να διατηρεί θερμοκρασίας 300 π 25 γC .  4.5 .  Αποξηραντής 5 .  Αντιδραστήρια 5.1 .  Νερό απεσταγμένο σε βοροπυριτικό γυαλί, βρασθέν και ψυχθέν στους 20 π 2 γC σε φιάλη εφοδιασμένη με σωλήνα απορρόφησης διοξειδίου του άνθρακα .  5.2 .  Χλωριούχο νάτριο, ποιότητας αναλυτικού αντιδραστηρίου, λεπτά λειοτριβημένο, αποξηραμένο επί πέντε ώρες στους 300 π 25 γC σε φούρνο ηλεκτρικό ( βλέπε σημείο 4.4 ) ή, εναλλακτικά, αποξηραμένο σε κλίβανο ( βλέπε σημείο 4.4 ) στους 130 π 1 γC επί 24 ώρες  τουλάχιστον και ψυχθέν σε θερμοκρασία δωματίου σε κατάλληλο αποξηραντή .  5.3 .  Παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων Ζυγίζεται η κατάλληλη ποσότητα ( βλέπε πίνακα κατωτέρω ) ξηρού χλωριούχου νατρίου ( βλέπε σημείο 5.2 ) σε φιάλη ζύγισης . Διαλύεται σε απεσταγμένο νερό ( βλέπε σημείο 5.1 ), μεταφέρεται ποσοτικά σε ογκομετρική φιάλη μίας χαραγής των 1 000 ml και αραιώνεται με  νερό μέχρι τη χαραγή στους 20 π 2 γC .  Διατηρείται στους 5 γC περίπου σε καλά πωματισμένες φιάλες από πολυαιθυλένιο χωρητικότητας όχι μεγαλύτερης από 250 ml επί όχι περισσότερο από δύο μήνες .  Σημείο πήξης διαλυμάτων χλωριούχου νατρίου στους 20 γC  g NaCl/l oC  6,859  7,818  8,149  8,314  8,480  8,646  8,811  8,977  9,143 10,155 - 0,408 - 0,464 - 0,483 - 0,492 - 0,502 - 0,512 - 0,521 - 0,531 - 0,541 - 0,600 Prin xrhsimopoihuei ena protzpo dialzma, anastrefetai elafra, kai h fialh peristrefetai arketew forew gia na anameixuozn plhrvw ta periexomena thw . Se kamia stigmh den prepei ena protzpo dialzma na anataxuei toso yvhra poz na egklvbistei aeraw .  Deigmata protzpoz dialzmatow prepei na analambanontai apo th fialh me ekxzsh toz dialzmatow se kauaro, stegno pothri yeshw, dhladh den prepei pote na xrhsimopoihuozn sifvnia gia to skopo azto .  Den prepei na xrhsimopoiozntai dialzmata apo fialew ligotero apo ena tetarto plhreiw kai, ean den diathrozntai me mzkhtoktono ( gia paradeigma dialzma Thiomersal, 10 g/l ), den prepei na xrhsimopoiozntai ean einai palaiotera apo dzo mhnew .  6 .  Βαθμονόμηση του κρυοσκοπίου θερμίστορα Το κρυοσκόπιο πρέπει να εγκατασταθεί έτσι ώστε η θερμοκρασία του περιβάλλοντα αέρα να μην αποκλίνει περισσότερο από 1 γC από τη θερμοκρασία στην οποία πραγματοποιήθηκε η βαθμονόμηση . Το κρυοσκόπιο δεν πρέπει να εκτίθεται σε ηλιακό φως ή ρεύματα και  θερμοκρασία δωματίου μεγαλύτερη από 26-27 γC .  Εξασφαλίζεται ότι το κρυοσκόπιο είναι σε καλή κατάσταση λειτουργίας σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και ότι έχει τεθεί σε λειτουργία τουλάχιστον 12 ώρες πριν τη βαθμονόμηση . Ελέγχεται η θέση του καθετήρα, το πλάτος δόνησης του σύρματος ανάδευσης  και η θερμοκρασία των ψυκτικών υγρών .  Επιλέγονται δύο πρότυπα διαλύματα ( πλέπε πίνακα ανατέρω ) που περικλείουν κατά προσέγγιση την αναμενόμενη τιμή του σημείου πήξης των δειγμάτων γάλακτος προς ανάλυση . Η διαφορά μεταξύ των σημείων πήξης των δύο διαλυμάτων πρέπει, κατά προτίμηση, να μην είναι μικρότερη από -0,100 γC .  ( Σε ορισμένα μοντέλα κρυοσκοπίων διαθέσιμων κατά την περίοδο αυτή, το συνδεδεμένο με το θερμίστορα κύκλωμα έχει σχεδιαστεί ώστε να εξισορροπείται σε μια ειδική τιμή του σημείου πήξης εντός της περιοχής μέτρησης του οργάνου . Σε αυτές τις περιπτώσεις η  χρήση ενός πρότυπου διαλύματος έχοντος αυτό το σημείο πήξης σαν ένα από τα διαλύματα βαθμονόμησης, διευκολύνει τη διαδικασία βαθμονόμησης και ο κατασκευαστής πρέπει να υποδεικνύει την τιμή αυτή ).  Μεταφέρονται με σιφώνιο 2,5 π 0,1 ml ενός πρότυπου μέσα σε καθαρό, στεγνό σωλήνα υποδοχής δείγματος και το κρυοσκόπιο τίθεται σε λειτουργία .  Σημείωση Οι χρησιμοποιούμενοι σωλήνες υποδοχής δείγματος κατά τη διάρκεια της βαθμονόμησης πρέπει να είναι κατασκευασμένοι από τον ίδιο τύπο γυαλιού και να πλένονται και να εκπλύονται με αφαλατισμένο νερό την ίδια στιγμή με αυτούς που χρησιμοποιούνται κατά τη  διάρκεια της ανάλυσης των δειγμάτων γάλακτος . Η θερμοκρασία των πρότυπων διαλυμάτων πρέπει να είναι όμοια προς αυτή των δειγμάτων γάλακτος .  Η βαθμονόμηση ελέγχεται με προσαρμογή, όπως υποδεικνύεται από τον κατασκευαστή, έως ότου η ένδειξη ανάγνωσης του κρυοσκοπίου είναι ίση με το σημείο πήξης του πρότυπου διαλύματος . Η διαδικασία επαναλαμβάνεται με το άλλο πρότυπο διάλυμα και συνεχίζεται  εναλλακτικά με τον ίδιο τρόπο, έως ότου διαδοχικές αναγνώσεις κάθε διαλύματος, χωρίς περαιτέρω προσαρμογή ελέγχου της βαθμονόμησης, δίνουν την σωστή τιμή του σημείου πήξης καθενός . Το κρυοσκόπιο είναι τότε έτοιμο προς χρήση και θα δείξει κατευθείαν το  σημείο πήξης του δείγματος γάλακτος, χωρίς την εφαρμογή οποιασδήποτε διόρθωσης .  7 .  Προετοιμασία του δείγματος προς ανάλυση 7.1 .  Τα δείγματα διατηρούνται, εάν χρειαστεί, σε θερμοκρασία μεταξύ 0 και 5 γC .  7.2 .  Απομακρύνονται από το δείγμα τυχόν ξένα σώματα ή στερεό βούτυρο, εάν χρειαστεί, με διήθηση μέσα σε καθαρό, στεγνό δοχείο, και το δείγμα αναμειγνύεται ελαφρά . Ο ηθμός, εάν χρησιμοποιηθεί, πρέπει να είναι αδρανής στο γάλα και να μπορεί να χρησιμοποιηθεί  σε θερμοκρασία εργαστηρίου .  7.3 .  Το γάλα μπορεί να αναλυθεί όταν είναι στη θερμοκρασία διατήρησης του ( μεταξύ 0 και 5 γC ) ή μπορεί να αφεθεί να αποκτήσει τη θερμοκρασία εργαστηρίου αμέσως πριν από την έναρξη της ανάλυσης . Ωστόσο, είναι απαραίτητο τα πρότυπα διαλύματα και τα δείγματα  γάλακτος να είναι στην ίδια θερμοκρασία όταν χρησιμοποιούνται .  7.4 .  Η τιτλοδοτήσιμη οξύτητα του γάλακτος προσδιορίζεται, κατά το δυνατόν, ταυτόχρονα με την ανάλυση του σημείου πήξης . Δείγματα με οξύτητα υπερβαίνουσα τα 0,18 g γαλακτικού οξέος ανά 100 ml γάλακτος δεν μπορούν να εξεταστούν .  7.5 .  Το UHT, το επεξεργασμένο και το αποστειρωμένο γάλα πρέπει να μένει επί τουλάχιστον 20 λεπτά σε ανοικτό δοχείο πριν εξεταστεί .  8 .  Διαδικασία 8.1.  Προκαταρκτικοί έλεγχοι Ελέγχεται εάν το επίπεδο και η θερμοκρασία του ψυκτικού υγρού είναι σε συμφωνία με τις οδηγίες του κατασκευαστή και εάν, εφόσον χρειαστεί, ο καθετήρας του θερμίστορα είναι μέσα σε ένα άδειο σωλήνα υποδοχής δείγματος στην κοιλότητα υποδοχής δείγματος . Το  κρυοσκόπιο τίθεται σε λειτουργία και εξασφαλίζεται ότι το ψυκτικό υγρό αναδεύεται ή κυκλοφορεί σωστά, όπως επιβάλλεται . Αφού το κρυοσκόπιο είναι σε λειτουργία επί τουλάχιστον 12 ώρες, ελέγχεται η θερμοκρασία του ψυκτικού υγρού και η θέση και το πλάτος  ανάδευσης του σύρματος ανάδευσης .  8.2 .  ιΕλεγχος βαθμονόμησης ρουτίνας Πριν από κάθε κύκλο ελέγχου, μετράται το σημείο πήξης πρότυπου διαλύματος χλωριούχου νατρίου ( π.χ . διάλυμα με σημείο πήξης -0,512 γC ) έως ότου δύο διαδοχικοί προσδιορισμοί δεν διαφέρουν κατά περισσότερο από 0,001 γC . Εάν ο μέσος όρος των τιμών αυτών  διαφέρει από το σημείο πήξης του πρότυπου διαλύματος περισσότερο από 0,002 γC, το κρυοσκόπιο βαθμονομείται ξανά όπως περιγράφηκε στο σημείο 6 .  Εάν το κρυοσκόπιο χρησιμοποιείται συνεχώς, ο έλεγχος βαθμονόμησης ρουτίνας εκτελείται τουλάχιστον μία φορά ανά ώρα . Πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι οδηγίες του κατασκευαστή .  8.3 .  Προσδιορισμός του σημείου πήξης του γάλακτος Η φιάλη με το δείγμα του γάλακτος αναστρέφεται ελαφρά και περιστρέφεται αρκετές φορές για να αναμειχθούν τα περιεχόμενά της . Σε καμία στιγμή δεν πρέπει ένα δείγμα να αναταραχθεί τόσο ζωηρά που να εγκλωβιστεί αέρας .  Μεταφέρονται με σιφώνιο 2,5 π 0,1 ml του γάλακτος μέσα σε καθαρό, στεγνό σωλήνα υποδοχής δείγματος και απομακρύνεται τυχόν πλεόνασμα με σιφώνιο . Εξασφαλίζεται ότι ο καθετήρας και το σύρμα ανάδευσης είναι καθαρά και στεγνά, σκουπίζοντάς τα, εάν  χρειαστεί, με ένα μαλακό, καθαρό, χωρίς χνούδι ύφασμα από κάτω προς τα πάνω .  Ο σωλήνας υποδοχής δείγματος εισάγεται στο βαθμονομημένο κρυοσκόπιο σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή . Το γάλα θα ψυχθεί και η πήξη θα αρχίσει σε μια θερμοκρασία που καθορίζεται από τον κατασκευαστή με προσέγγιση 0,1 γC .  ( Σε ορισμένα αυτόματα όργανα η θερμοκρασία αυτή μπορεί να παρατηρηθεί σε ψηφιακή διάταξη ανάγνωσης - σε χειροκίνητα όργανα η απαραίτητη ακρίβεια επιτυγχάνεται εξασφαλίζοντας ότι η πήξη αρχίζει όταν ο δείκτης ή η χορδή του γαλβανόμετρου συμπέσει με την  κατάλληλη ένδειξη ).  Εάν, για οποιοδήποτε λόγο, η πήξη αρχίσει πριν ή μετά την καθορισμένη περιοχή θερμοκρασίας, η δοκιμή εγκαταλείπεται και επαναλαμβάνεται με άλλη δοκιμαστική δόση του γάλακτος . Εάν και το επαναληπτικό δείγμα πήξει πριν την καθορισμένη θερμοκρασία, μια  περαιτέρω δόση του δείγματος πρέπει να θερμανθεί στους 45 γC και να διατηρηθεί επί πέντε λεπτά για να μπορέσει να λυώσει το κρυσταλλικό λίπος .  Μετά ψύχεται ξανά στη θερμοκρασία ανάλυσης και αναλύεται αμέσως . Η θερμοκρασία του γάλακτος μετά την έναρξη της πήξης θα ανέβει γρήγορα σε μια τιμή η οποία θα παραμείνει ουσιαστικά σταθερή επί κάποιο χρονικό διάστημα πριν πέσει και πάλι . Το σημείο πήξης  αντιστοιχεί στην υψηλότερη θερμοκρασία που αποκτήθηκε κατά την περίοδο αυτή, και αυτή η τιμή πρέπει να καταγραφεί .  Σημείωση  Το χρονικό διάστημα κατά το οποίο η θερμοκρασία παραμένει σταθερή και το χρονικό διάστημα μεταξύ της έναρξης της πήξης και της επίτευξης της υψηλότερης θερμοκρασίας θα διαφέρει από δείγμα σε δείγμα και θα είναι σημαντικά μικρότερο για το νερό και τα  πρότυπα διαλύματα χλωριούχου νατρίου από ότι για το γάλα . Είναι απαραίτητο, η υψηλότερη θερμοκρασία να είναι αυτή η οποία καταγράφεται .  Όταν η μέτρηση έχει ολοκληρωθεί ικανοποιητικά, ο σωλήνας αποσύρεται, εκπλύεται με νερό και ο καθετήρας του θερμίστορα και ο αναδευτήρας στεγνώνονται με μαλακό, καθαρό, χωρίς χνούδι ύφασμα από κάτω προς τα πάνω και εκτελείται πανομοιότυπος προσδιορισμός  σε άλλη δόση του δείγματος γάλακτος .  Εάν η διαφορά των σημείων πήξης που αποκτήθηκαν είναι μεγαλύτερη από την τιμή επαναληψιμότητας ( 0,004 γC ), εκτελείται πανομοιότυπος προσδιορισμός σε άλλη δόση του δείγματος . Εφόσον οι δύο προσδιορισμοί συμφωνούν μέσα σε όρια των 0,004 γC, οι τιμές  πρέπει να καταγραφούν και να χρησιμοποιηθούν στον υπολογισμό του τελικού αποτελέσματος .  8.4 .  Ψύξη του καθετήρα Μετά τη χρήση του οργάνου, χρησιμοποιείται ένας άδειος σωλήνας υποδοχής δείγματος στην κοιλότητα υποδοχής δείγματος και η κεφαλή λειτουργίας χαμηλώνεται για να διατηρηθεί ψυχρός ο καθετήρας .  ( Σε ορισμένα μοντέλα κρυοσκόπιου αυτό μπορεί να μην είναι δυνατόν - σε τέτοιες περιπτώσεις, είναι απαραίτητο να εξασφαλιστεί ότι ο καθετήρας έχει φυχθεί επαρκώς πριν ληφθούν μετρήσεις, για παράδειγμα, με εκτέλεση αρκετών πλασματικών προσδιορισμών έως  ότου αποκτηθούν σταθερές τιμές ανάγνωσης ).  9 .  ιΕκφραση αποτελεσμάτων 9.1 .  Υπολογισμός Εάν, ακολουθώντας τον έλεγχο βαθμονόμησης ρουτίνας, επιβεβαιωθεί η βαθμονόμηση, υπολογίζεται ο μέσος όρος των αποδεκτών επαναληπτικών τιμών σημείου πήξης που παρελήφθησαν, στρογγυλεύοντας στην τρίτη δεκαδική θέση .  Εάν το άθροισμα δύο αποδεκτών επαναληπτικών τιμών είναι περιττός αριθμός, ο μέσος όρος πρέπει να στρογγυλοποιηθεί στην πλησιέστερη άρτια τιμή όπως δέιχνει το ακόλουθο παράδειγμα :  Σημείο πήξης ( 1 )     Επαναληπτικές τιμές Μέσος όρος - 0,544   - 0,545 - 0,545   - 0,546 - 0,544 - 0,546  9.2 .  Ακρίβεια 9.2.1 .  Epanalhcimothta ( r ): 0,004 gC .  9.2.2 .  Anaparagvgimothta ( R ): 0,006 gC . ΙΙ . ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΦΩΣΦΑΤΑΣΗΣ  1 .  Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής Η μέθοδος αυτή καθορίζει τη διαδικασία αναφοράς προσδιορισμού της ενεργότητας φωσφατάσης σε παστεριωμένο γάλα .  2 .  Ορισμός 2.1 .  Η ενεργότητα φωσφατάσης είναι ένα μέτρο της ποσότητας της ενεργού αλκαλικής φωσφατάσης στο προϊόν, εκφρασμένη ως η ποσότητα φαινόλης, σε μg ανά ml, που αποδεσμεύεται κάτω από τις μνημονευόμενες στη διαδικασία συνθήκες του παστεριωμένου γάλακτος .  2.2 .  Κάθε γάλα του οποίου η ενεργότητα φωσφατάσης είναι κάτω από 4 μg/ml φαινόλης θεωρείται αρνητικό σε αντίδραση φωσφατάσης .  3 .  Αρχή Η ενεργότητα φωσφατάσης αξιολογείται από την ποσότητα φαινόλης που αποδεσμεύεται από το φαινυλοφωσφορικό δινάτριο που προστίθεται στο δείγμα . Η αποδεσμευμένη φαινόλη αντιδρά με διβρωμοκινονοχλωροϊμίδιο παράγοντας διβρωμοϊνδοφαινόλη ( υποκύανου χρώματος)  η οποία μετράται χρωμομετρικά στα 610 nm . Γίνεται σύγκριση με δείγμα στο οποίο το ένζυμο της φωσφατάσης έχει καταστραφεί .  4 .  Αντιδραστήρια 4.1 .  Ρυθμιστικό διάλυμα βορικού βάριου και υδροξείδιου του βάριου 4.1.1 .  Διαλύονται 50,0 g υδροξειδίου βάριου [Ba(OH)2-8H2O] σε νερό και ο όγκος συμπληρώνεται έως τα 1 000 ml .  4.1.2 .  Διαλύονται 22,0 g βορικού οξέος ( Η3ΒΟ3 ) σε νερό και ο όγκος συμπληρώνεται έως τα 1 000 ml .  4.1.3 .  Θερμαίνονται 500 ml κάθε διαλύματος στους 50 γC, τα διαλύματα αναμειγνύονται, αναδεύονται, ψύχονται γρήγορα στους 20 γC, το pH διορθώνεται, εάν χρειαστεί, στα 10,6 π 0,1 με προσθήκη διαλύματος 4.1.1 ή 4.1.2 . Διήθηση . Το διάλυμα διατηρείται σε στεγανά  πωματισμένο δοχείο .  4.1.4 .  Το διάλυμα αραιώνεται πριν τη χρήση με ίσο όγκο νερού .  4.2 .  Ρυθμιστικό διάλυμα ανάπτυξης χρώματος Διαλύονται 6,0 g μεταβορικού νατρίου ( NaBO2 ) ή 12,6 g NaBO2-4H2O, και 20,0 g χλωριούχου νατρίου ( NaCl ) σε νερό και ο όγκος συμπληρώνεται έως τα 1 000 ml .  4.3 .  Ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης χρώματος Αραιώνονται 10 ml ρυθμιστικού διαλύματος ανάπτυξης χρώματος ( 4.2 ) στα 100 ml με νερό .  4.4 .  Ρυθμιστικό διάλυμα υποστρώματος Διαλύονται 0,1 g άνυδρου φαινυλοφωσφορικού δινάτριου απηλλαγμένου φαινόλης σε 100 ml ρυθμιστικού διαλύματος ( 4.1.3 ) ή διαλύονται 0,5 ml φαινυλοφωσφορικού δινάτριου σε 4,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος ανάπτυξης χρώματος ( 4.2 ), προστίθενται δύο σταγόνες  διαλύματος BQC ( 4.6 ) και αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου επί 30 λεπτά . Το χρώμα που σχηματίζεται έτσι εκχυλίζεται με 2,5 ml βουταν-1-όλης και αφήνεται έως η βουταν-1-όλη διαχωριστεί . Η βουταν-1-όλη αφαιρείται και απορρίπτεται . Εάν χρειαστεί, η εκχύλιση  επαναλαμβάνεται .  Το διάλυμα μπορεί να φυλαχθεί σε ψυγείο επί μερικές μέρες - το χρώμα αναπτύσσεται και επανεκχυλίζεται πριν από τη χρήση . Το ρυθμιστικό διάλυμα υποστρώματος παρασκευάζεται πριν από τη χρήση με αραίωση 1 ml του διαλύματος αυτού στα 100 ml, με το ρυθμιστικό  διάλυμα βορικού βαρίου, υδροξειδίου βαρίου ( 4.1.3 ).  4.5 .  Διάλυμα καταβύθισης ψευδαργύρου-χαλκού Διαλύονται 3,0 g θειικού ψευδαργύρου ( ZnSO4-7H2O ) και 0,6 g θειικού χαλκού ( ΙΙ ) ( CuSO4-5H2O ) σε νερό και ο όγκος συμπληρώνεται έως στα 100 ml .  4.6 .  Διάλυμα 2,6-διβρωμοκινονοχλωριμίδιου ( διάλυμα BQC ) Διαλύονται 40 π 1 mg 2,6-διβρωμικονονοχλωριμίδιου ( BQC ) ( C6H2Br2ClNO6 ) σε 10 ml αιθανόλης 96 % ( v/v ).  Διατηρείται σε φιάλη σκούρου χρώματος σε ψυγείο . Εάν είναι αποχρωματισμένο ή παλιότερο από ένα μήνα απορρίπτεται .  4.7 .  Διάλυμα θειικού χαλκού ( ΙΙ ) Διαλύονται 0,05 g θειικού χαλκού ( ΙΙ ) ( CuSO4-5H2O ) σε νερό και ο όγκος συμπληρώνεται έως τα 100 ml .  4.8 .  Πρότυπα διαλύματα φαινόλης 4.8.1 .  Ζυγίζονται 200 π 2 mg καθαρής άνυδρης φαινόλης, μεταφέρονται σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml, προστίθεται νερό, αναμειγνύεται και ο όγκος συμπληρώνεται έως τη χαραγή . Αυτό το μητρικό διάλυμα παραμένει σταθερό επί αρκετούς μήνες στο ψυγείο .  4.8.2 .  Αραιώνονται 10 ml του μητρικού διαλύματος στα 100 ml με νερό και αναμειγνύονται . 1 μl περιέχει 200 mg φαινόλης .  5 .  ιΟργανα και γυάλινα σκεύη Σημειώσεις :  α )  όλα τα γυάλινα σκεύη, τα πώματα και τα εργαλεία δειγματοληψίας πρέπει να είναι προσεκτικά καθαρισμένα . Συνιστάται να εκπλυθούν με πρόσφατα βρασμένο απεσταγμένο νερό ή να ατμιστούν - β )  ορισμένοι τύποι πλαστικών πωμάτων μπορούν να προκαλέσουν μόλυνση με φαινολικές ουσίες και η χρήση τους δεν πρέπει να επιτρέπεται .  Συνηθισμένος εργαστηριακός εξοπλισμός, και ιδιαίτερα :  5.1 .  Αναλυτικός ζυγός 5.2 .  Υδρόλουτρο, ικανό να διατηρείται στους 37 π 1 γC .  5.3 .  Φασματοφωτόμετρο κατάλληλο για αναγνώσεις σε μήκος κύματος 610 nm .  5.4 .  Δοκιμαστικοί σωλήνες, 16 ή 18 mm x 150 mm, κατά προτίμηση βαθμολογημένοι στα 5 και 10 ml .  5.5 .  Σιφώνια 5.6 .  Γυάλινα χωνιά, κατάλληλου μεγέθους, για παράδειγμα διαμέτρου 5 cm . 5.7 .  Πτυχωτοί ηθμοί διαμέτρου τουλάχιστον 9 cm για μέση ταχύτητα διήθησης .  5.8 . Ογκομετρικές φιάλες για την παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων .  6 .  Διαδικασία Σημειώσεις :  α )  αποφεύγεται η επίδραση απευθείας ηλιακού φωτός κατά τη διάρκεια του προσδιορισμού - β )  μόλυνση με ίχνη σάλιου ή αναπνοής μπορεί να δώσει εσφαλμένα θετικά αποτελέσματα και πρέπει να αποφεύγεται . Από την άποψη αυτή, ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δίνεται στη διαδικασία σιφωνισμού .  6.1 .  Προετοιμασία του δείγματος προς ανάλυση 6.1.1 .  Η ανάλυση πραγματοποιείται αμέσως μετά τη δειγματοληψία . Διαφορετικά, το δείγμα φυλλάσσεται σε ψυγείο, αλλά όχι για περισσότερο από δύο ημέρες .  6.2 .  Δοκιμαστική δόση Μεταφέρεται με σιφώνιο μέσα σε καθένα από δύο δοκιμαστικούς σωλήνες ( 5.4 ) 1 ml του δείγματος προς ανάλυση, χρησιμοποιώντας ένα σωλήνα ως έναν έλεγχο ή μάρτυρα ( τυφλό ).  6.3 .  Προσδιορισμός 6.3.1 .  Ο μάρτυρας θερμαίνεται επί δύο λεπτά σε ζέον νερό - ο δοκιμαστικός σωλήνας και το ποτήρι ζέσης νερού καλύπτονται με φύλλο αλουμίνιου για να εξασφαλιστεί η θέρμανση ολόκληρου του σωλήνα . Ψύχεται γρήγορα σε θερμοκρασία δωματίου .  6.3.2 .  Ο μάρτυρας και το δείγμα προς ανάλυση επεξεργάζονται με τον ίδιο τρόπο κατά το υπόλοιπο μέρος της διαδικασίας . Προστίθενται 10 ml ρυθμιστικού διαλύματος υποστρώματος ( 4.4 ) και αναμειγνύονται .  6.3.3 .  Τα δείγματα επωάζονται αμέσως στο υδρόλουτρο ( 5.2 ) επί 60 λεπτά, αναμειγνύοντας κατά διαστήματα τα περιεχόμενα ( τουλάχιστον τέσσερις φορές ).  6.3.4 .  Θερμαίνονται σε ζέον νερό επί δυό λεπτά με τον ίδιο τρόπο όπως στο σημείο 6.3.1 . Ψύχονται γρήγορα σε θερμοκρασία δωματίου .  6.3.5 .  Προστίθεται 1 ml διαλύματος καταβύθισης ψευδαργύρου-χαλκού ( 4.5 ) σε κάθε σωλήνα και αναμειγνύεται πλήρως .  6.3.6 .  Γίνεται διήθηση μέσα από στεγνό διηθητικό χάρτη, απορρίπτονται τα πρώτα 2 ml, ξαναγίνεται διήθηση, εάν χρειαστεί, έως ότου το διήθημα γίνει τελείως διαυγές και συλλέγονται 5 ml σε δοκιμαστικό σωλήνα .  6.3.7 .  Προστίθενται 5 ml ρυθμιστικού διαλύματος ανάπτυξης χρώματος ( 4.2 ).  6.3.8 .  Προστίθενται 0,1 ml διαλύματος BQC ( 4.6 ), αναμειγνύονται, και το χρώμα αφήνεται να αναπτυχθεί επί 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου .  6.3.9 .  Μετράται η απορρόφηση σε σχέση με τον έλεγχο ή μάρτυρα στο φασματοφωτόμετρο σε μήκος κύματος 610 nm ( 5.3 ).  6.3.10 .  Ο προσδιορισμός επαναλαμβάνεται με κατάλληλη αραίωση του δείγματος εάν η απορρόφηση, όπως μετρήθηκε στο σημείο 6.3.9 υπερβαίνει την απορρόφηση του πρότυπου που περιέχει 20 μg φαινόλης ανά σωλήνα, όπως μετρήθηκε στο σημείο 6.4.4 .  Η αραίωση αυτή παρασκευάζεται με ανάμειξη ενός όγκου του δείγματος προς ανάλυση με κατάλληλο όγκο μέρους του ίδιου δείγματος θερμανθέντος προσεκτικά μέχρι βρασμού ώστε να αδρανοποιηθεί η περιεχόμενη φωσφατάση .  6.4 .  Κατασκευή της καμπύλης βαθμονόμησης 6.4.1 .  Παρασκευάζεται κατάλληλη σειρά αραιωμένων πρότυπων, αρχίζοντας από το πρότυπο φαινόλης ( 4.8.2 ), που περιέχουν 0 ( έλεγχος ή μάρτυρας ), 2, 5, 10 και 20 μg φαινόλης ανά χιλιοστόλιτρο . Μεταφέρονται με σιφώνιο αντίστοιχα 1 ml νερού και 1 ml από τα τέσσερα  πρότυπα διαλύματα φαινόλης σε κάθε ένα από πέντε δοκιμαστικούς σωλήνες .  6.4.2 .  Προστίθεται σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα 1 ml διαλύματος θειικού χαλκού ( ΙΙ ) ( 4.7 ), 5 ml ρυθμιστικού διαλύματος αραίωσης χρώματος ( 4.3 ), 3 ml νερού και 0,1 ml διαλύματος BQC ( 4.6 )- αναμειγνύονται .  6.4.3 .  Το χρώμα αφήνεται να αναπτυχθεί επί 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου .  6.4.4 .  Μετράται η απορρόφηση σε σχέση με τον έλεγχο ή μάρτυρα σε φασματοφωτόμετρο σε μήκος κύματος 610 nm ( 5.3 ).  6.4.5 .  Από τις τιμές απορρόφησης ( 6.4.4 ) που ελήφθησαν για κάθε ποσότητα φαινόλης που προστέθηκε ( 6.4.1 ), υπολογίζεται η γραμμή παλινδρόμησης με τη μέθοδο των ελάχιστων τετράγωνων .  7 .  ιΕκφραση αποτελεσμάτων 7.1 .  Υπολογισμός και σχέση 7.1.1 .  Από την ανάγνωση της απορρόφησης ( 6.3.9 ) υπολογίζεται η ποσότητα της φαινόλης χρησιμοποιώντας τη γραμμή παλινδρόμησης που ελήφθη ( 6.4.5 ).  7.1.2 .  Υπολογίζεται η ενεργότητα φωσφατάσης, εκφρασμένη σε μg φαινόλης ανά χιλιοστόλιτρο του παστεριωμένου γάλακτος από την ακόλουθη σχέση :  Ενεργότητα φωσφατάσης = 2,4 x A x D όπου :  Α είναι η ποσότητα της φαινόλης σε μg σύμφωνα με το σημείο 7.1.1,  D είναι ο συντελεστής αραίωσης της αραίωσης σύμφωνα με το σημείο 6.3.10 . ( στην περίπτωση μη αραίωσης, D = 1 ),  2,4 είναι ο συντελεστής αραίωσης ( 5/12 1 ml δείγματος προς ανάλυση ) - Βλέπε σημέιο 6.2 σε συνδυασμό με τα σημεία 6.3.2, 6.3.5 και 6 .3.6 .  7.2 Ακρίβεια 7.2.1 .  Επαναληψιμότητα ( r ): 2 μg φαινόλης/ml .  7.2.2 .  Αναπαραγωγιμότητα ( R ): 3 μg φαινόλης/ml ( προκαταρκτικά ).  7.2.3 .  Εάν χρησιμοποιηθεί μια αραίωση σύμφωνα με το σημείο 6.3.10 το όριο που μνημονεύεται στα σημεία 7.2.1 και 7.2.2 αναφέρεται στα αποτελέσματα που προέκυψαν από το αραιωμένο δείγμα .  ΙΙΙ . ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΑΣΗΣ  1 .  Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής Η μέθοδος αυτή καθορίζει τη διαδικασία αναφοράς προσδιορισμού της παρουσίας ή απουσίας ενζύμου υπεροξειδάσης σε γάλα σαν ένα έλεγχο της παστερίωσης .  2 .  Ορισμός Θετική αντίδραση υπεροξειδάσης Εάν το γάλα έχει παστεριωθεί σωστά, ένα κυανό χρώμα θα προκύψει μέσα σε 30 δευτερόλεπτα από την ανάμειξη .  Αρνητική αντίδραση υπεροξειδάσης Κανένα χρώμα δεν θα προκύψει μέσα σε 30 δευτερόλεπτα από την ανάμειξη .  3 .  Αρχή Το ένζυμο της υπεροξειδάσης διασπά το υπεροξείδιο του υδρογόνου . Το αποδεσμευόμενο ατομικό οξυγόνο οξειδώνει την άχρωμη 1,4-φαινυλενοδιαμίνη προς την πορφυρή ινδοφαινόλη (δοκιμή Storch ). Η ένταση του χρώματος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ένζυμου .   4 .  Αντιδραστήρια 4.1 .  Διάλυμα 1,4-φαινυλενοδιαμίνης Διαλύονται 2 g 1,4-φαινυλενοδιαμίνης ( C6H8N2 ) σε θερμό ( 50 γC ) νερό και ο όγκος συμπληρώνεται έως τα 100 ml . Το διάλυμα φυλάσσεται σε σκουρόχρωμη φιάλη με γυάλινο πώμα και διατηρείται σε ψυχρό και σκοτεινό μέρος . Μετά την παρασκευή του, ένα διάλυμα  1,4-φαινυλενοδιαμίνης σχηματίζει ένα ίζημα μέσα σε μία ή δύο ημέρες : αυτό πρέπει μετά να απορριφθεί .  4.2 .  Διάλυμα υπεροξειδίου υδρογόνου Αραιώνονται 9 ml υπεροξειδίου υδρογόνου 30 % σε νερό και ο όγκος συμπληρώνεται έως τα 100 ml . Για σταθεροποίηση, προστίθεται 1 ml πυκνού θειικού οξέος ανά λίτρο διαλύματος .  Το διάλυμα υπεροξειδίου υδρογόνου είναι σταθερό επί ένα μήνα, εάν φυλαχθεί σε ψυχρό, σκοτεινό μέρος και σε φιάλη με γυάλινο πώμα, αποκλείοντας κάθε επαφή με οργανικές ενώσεις .  5 .  Διαδικασία 5.1 .  Εισάγονται 5 ml του δείγματος γάλακτος μέσα σε καθαρό δοκιμαστικό σωλήνα με κατάλληλο κλείσιμο .  5.2 .  Προστίθενται 5 ml διαλύματος 1,4-φαινυλενοδιαμίνης ( 4 .1 ).  5.3 .  Προστίθενται δύο σταγόνες διαλύματος υπεροξειδίου υδρογόνου ( 4.2 ).  5.4 .  Παρατηρείται η παραγωγή χρώματος μέσα σε 30 δευτερόλεπτα από την ανάμειξη . Εάν το κυανό χρώμα προκύψει αργότερα από 30 δευτερόλεπτα από την προσθήκη των αντιδραστήριων, η αντίδραση δεν μπορεί να χαρακτηριστεί .  ΙV . ΚΑΤΑΜΕΤΡΗΣΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ - ΔΟΚΙΜΗ ΜΕΤΡΗΣΗΣ ΤΡΥΒΛΙΟΥ ΣΤΟΥΣ 30 gC  1 .  Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής Η μέθοδος αυτή καθορίζει την διαδικασία αναφοράς καταμέτρησης μικροοργανισμών με τη βοήθεια μίας τεχνικής καταμέτρησης αποικίας στους 30 gC . Η μέθοδος είναι εφαρμόσιμη σε ακατέργαστο γάλα και παστεριωμένο γάλα και σε γάλα UHT επεξεργασμένο και  αποστειρωμένο προεπωασμένο στους 30 gC επί 15 ημέρες .  2 .  Ορισμός Ο όρος "μικροοργανισμοί" σημαίνει : οργανισμοί σχηματίζοντες καταμετρήσιμες αποικίες όταν επωασθούν αεροβίως κάτω από τις περιγραφόμενες συνθήκες .  3 .  Αρχή ιΕνας καθορισμένος όγκος του δείγματος γάλακτος αναμειγνύεται με το υπόστρωμα της καλλιέργειας σε τρυβλία Petri και επωάζεται στους 30 gC επί 72 ώρες . Οι αποικίες καταμετρώνται και υπολογίζεται ο αριθμός των μικροοργανισμών ανά ml ακατέργαστου ή  παστεριωμένου γάλακτος ή ανά 0,1 ml προεπωασμένου UHT επεξεργασμένου ή αποστειρωμένου γάλακτος .  4 .  ιΟργανα και γυάλινα σκεύη Συνηθισμένος εργαστηριακός εξοπλισμός, και ιδιαίτερα :  4.1 .  ιΟργανα 4.1.1 .  Κλίβανος θερμού αέρα, ικανός να λειτουργεί στους 170-175 gC .  4.1.2 .  Αυτόκλειστο, ικανό να λειτουργεί στους 121 p 1 oC .  4.1.3 .  Επωαστής, ικανός να διατηρεί θερμοκρασία 30 p 1 oC σε όλα τα σημεία του εσωτερικού του .  4.1.4 .  ρΗμετρο, με δυνατότητα εξίσωσης θερμοκρασίας, ακρίβειας p 0,1 μονάδας pΗ .  4.1.5 .  Υδρόλουτρο, ικανό να λειτουργεί στους 45 p 1 oC .  4.1.6 .  Φακός, μεγεθυντική ικανότητα 2-4 x .  4.1 .7 .  Φακός, μεγεθυντική ικανότητα 8-10 x .  4.1.8 .  Καταμετρητής 4.1.9 .  Αναμεικτήρας, ικανός να αναμειγνύει 1 ml του δείγματος γάλακτος ή δεκαδική αραίωση με 9 ml διαλύτη και λειτουργώντας πάνω στην αρχή της εκκέντρου περιστροφής των περιεχόμενων του δοκιμαστικού σωλήνα .  4.2 .  Γυάλινα σκεύη 4.2.1 .  Δοκιμαστικοί σωλήνες, με κατάλληλες διατάξεις κλεισίματος και επαρκή χωρητικότητα για να περιέχουν, με επαρκή κενό χώρο για ανάδευση, 10 ml της αρχικής αραίωσης ή περαιτέρω δεκαδικές αραιώσεις .  4.2.2 .  Φιάλες χωρητικότητας 150 έως 250 ml ή σωλήνες, χωρητικότητας περίπου 20 ml, για να φέρουν το υπόστρωμα καλλιέργειας .  4.2.3 .  Σιφώνια ( πωματισμένα με ακατέργαστο βαμβάκι ) από γυαλί ή αποστειρωμένο συνθετικό υλικό,  με ακέραια άκρη, ονομαστικής χωρητικότητας 1 ml και έχοντας απόληξη διαμέτρου 1,75 έως 3 mm .  4.2.4 .  Τρυβλία Petri, από διαυγές άχρωμο γυαλί ή αποστειρωμένο συνθετικό υλικό, με το από κάτω τρυβλίο ( πυθμένα ) να έχει εσωτερική διάμετρο περίπου 90 έως 100 mm . Το εσωτερικό βάθος πρέπει να είναι τουλάχιστον 10 mm . Ο πυθμένας δεν πρέπει να έχει ανωμαλίες που  να παρεμποδίζουν την καταμέτρηση των αποικιών .  4.2.5 .  Αποστείρωση των γυάλινων σκευών Τα γυάλινα σκεύη πρέπει να αποστειρώνονται με μια από τις ακόλουθες μεθόδους :  α )  με διατήρηση στους 170 έως 175 gC επί όχι λιγότερο από μία ώρα μέσα σε κλίβανο θερμού αέρα ( 4.1.1 )- β )  με διατήρηση στους 121 p 1 oC επί όχι λιγότερο από 20 λεπτά μέσα σε αυτόκλειστο ( 4.1.2 ).  Πρέπει να ληφθεί μέριμνα ώστε να εξασφαλιστεί επαρκής διείσδυση ατμού στο αυτόκλειστο : εάν ο εξοπλισμός αποστειρώνεται σε δοχεία, αυτά δεν πρέπει να κλείνονται στεγανά, οι φιάλες πρέπει να έχουν χαλαρά τοποθετημένα πώματα .  Τα γυάλινα σκεύη που αποστειρώθηκαν μέσα στο αυτόκλειστο πρέπει να στεγνώνονται με απάντληση του ατμού .  Τα σιφώνια πρέπει να αποστειρώνονται σε κλίβανο θερμού αέρα ( 4.1.1 ).  5 .  Υπόστρωμα καλλιέργειας - ιΑγαρ για καταμέτρηση τρυβλίου με γάλα 5.1 .  Σύσταση Εκχύλισμα μαγιάς 2,5 g Τρυπτόνη 5,0 g D (+) γλυκόζη ή δεξτρόζη 1,0 g Αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη 1,0 g ΦΑ-2>Αγαρ 10 έως 15 g, ανάλογα με τις πηκτικές ιδιότητες του χρησιμοποιούμενου άγαρ Νερό 1 000 ml Το αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη πρέπει να είναι απηλλαγμένο από αναστολείς . Αυτό πρέπει να ελεγχθεί με συγκριτικές δοκιμές χρησιμοποιώντας αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη που είναι με βεβαιότητα απηλλαγμένο από αναστολείς .  Παρασκευή :  Τα συστατικά διασπείρονται σε αιώρημα και διαλύονται με την ακόλουθη σειρά : εκχύλισμα μαγιάς, τρυπτόνη, γλυκόζη και τελικά, αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη, μέσα σε νερό . Η θέρμανση του αιωρήματος θα βοηθήσει τη διαδικασία αυτή . Προστίθεται το άγαρ και  θερμαίνεται μέχρι βρασμού, αναδεύοντας συνεχώς έως ότου το άγαρ διαλυθεί εντελώς ή ατμίζεται επί 30 λεπτά περίπου .  Εάν χρειαστεί, γίνεται διήθηση μέσα από διηθητικό χάρτη .  Το pΗ ελέγχεται με pΗ μετρο ( 4.1.4 ) και, εάν χρειαστεί, το ρΗ προσαρμόζεται έτσι ώστε, μετά την αποστείρωση, να είναι 6,9 p 0,1 στους 25 gC χρησιμοποιώντας διάλυμα ( τουλάχιστον 0,1 mol/l ) υδροξειδίου νατρίου ή υδροχλωρικού οξέος .  5.2 .  Κατανομή, αποστείρωση και διατήρηση του υποστρώματος καλλιέργειας Το υπόστρωμα ( 5.1 ) μοιράζεται σε ποσότητες των 100 έως 150 ml μέσα σε φιάλες ή 12 έως 15 ml μέσα σε σωλήνες ( 4.2.2 ). Οι φιάλες και οι σωλήνες πωματίζονται .  Αποστειρώνονται στο αυτόκλειστο ( 4.1.2 ) στους 121 p 1 oC επί 15 λεπτά .  Ελέγχεται το pΗ του υποστρώματος .  Εάν το υπόστρωμα δεν πρόκειται να χρησιμοποιηθεί αμέσως, φυλάσσεται στο σκοτάδι σε θερμοκρασία μεταξύ 1 και 5 gC επί όχι περισσότερο από ένα μήνα από την παρασκευή .  5.3 .  Άνυδρο υπόστρωμα καλλιέργειας του εμπορίου Το υπόστρωμα καλλιέργειας ( 5.1 ) μπορεί να παρασκευαστεί από άνυδρο υπόστρωμα του εμπορίου . Ακολουθούνται οι οδηγίες του κατασκευαστή, αλλά το αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη προστίθεται πριν διαλυθεί αν δεν αποτελεί συσταστικό .  Το pΗ προσαρμόζεται στο 6,9 p 0,1 στους 25 gC όπως περιγράφηκε στο σημείο 5.1 και το υπόστρωμα κατανέμεται, αποστειρώνεται και φυλάσσεται όπως περιγράφηκε στο σημείο 5.2 .  6 .  Διαλύτες 6.1 .  Διάλυμα πεπτόνης/φυσιολογικού ορού Σύσταση Πεπτόνη     1,0 g Χλωριούχο νάτριο     8,5 g Νερό 1 000   ml Παρασκευή Τα συστατικά διαλύονται στο νερό, αν χρειαστεί θερμαίνοντας.  Το pH ελέγχεται με ένα pHμετρο ( 4.1.4 )- εάν χρειαστεί, το pH διορθώνεται έτσι ώστε, μετά την αποστείρωση, να είναι 7,0 p 0,1 στους 25 gC χρησιμοποιώντας διάλυμα ( τουλάχιστον 0,1 mol/l ) υδροξειδίου νατρίου ή υδροχλωρικού οξέος .  6.2 .  Κατανομή, αποστείρωση και φύλαξη του αραιωτικού Το αραιωτικό ( 6.1 ) κατανέμεται μέσα σε δοκιμαστικούς σωλήνες ( 4.2.1 ) σε τέτοιες ποσότητες ώστε μετά την αποστείρωση κάθε σωλήνας να περιέχει 9,0 p 0,2 ml αραιωτικού . Οι σωλήνες πωματίζονται .  Αποστειρώνονται στο αυτόκλειστο ( 4.1.2 ) στους 121 +- 1 oC επί 15 λεπτά .  Ελέγχεται το pH του αραιωτικού .  Εάν το αραιωτικό δεν πρόκειται να χρησιμοποιηθεί αμέσως, φυλάσσεται στο σκοτάδι σε θερμοκρασία μεταξύ 1 και 5 oC επί όχι περισσότερο από έναν μήνα από την παρασκευή .  6.3 .  Άνυδρα αραιωτικά του εμπορίου Το αραιωτικό ( 6.1 ) μπορεί να παρασκευαστεί από αφυδατωμένα δισκία ή σκόνες του εμπορίου . Ακολουθούνται οι οδηγίες του κατασκευαστή . Το pH διορθώνεται όπως περιγράφηκε στο σημείο 6.1 και τα αραιωτικά κατανέμονται, αποστειρώνονται και φυλάσσονται όπως  περιγράφηκε στο σημείο 6.2 .  7 .  Διαδικασία 7.1 .  Τήξη του υποστρώματος Πριν αρχίσει η μικροβιολογική εξέταση, η απαιτούμενη ποσότητα υποστρώματος λιώνεται γρήγορα και το υπόστρωμα στερεοποιείται στους 45 p 1 oC σε υδρόλουτρο ( 4.1.5 ).  7.2 .  Προετοιμασία του δείγματος γάλακτος Το δείγμα του γάλακτος αναμειγνύεται πλήρως, έτσι ώστε οι μικροοργανισμοί να κατανεμηθούν κατά το δυνατόν ομοιόμορφα, αναστρέφοντας γρήγορα το δοχείο με το δείγμα γάλακτος 25 φορές . Πρέπει να αποφεύγεται ο αφρισμός ή να αφήνεται ο αφρός να διαλυθεί . Το  χρονικό διάστημα μεταξύ ανάμειξης και ανάληψης της δοκιμαστικής δόσης δεν πρέπει να υπερβαίνει τα τρία λεπτά .  7.3 . Προετοιμασία της αρχικής αραίωσης ( 10-1 ) ( ακατέργαστο και παστεριωμένο γάλα ) Μεταφέρεται με αποστειρωμένο σιφώνιο ( 4.2 .3 ) 1 ml του δείγματος ( 7.2 ) ακατέργαστου γάλακτος ή παστεριωμένου γάλακτος μέσα σε 9 ml αραιωτικού ( 6.1 ) αποφεύγοντας την επαφή μεταξύ του σιφωνίου και του αραιωτικού . Η θερμοκρασία του αραιωτικού πρέπει να  είναι περίπου η ίδια με αυτήν του δείγματος γάλακτος . Η αρχική αυτή αραίωση αναμειγνύεται προσεκτικά στον αναμικτήρα ( 4.1.9 ) επί 5 έως 10 δευτερόλεπτα .  Έτσι αποκτάται μία αρχική αραίωση 10-1 .  7.4 .  Παρασκευή περαιτέρω δεκαδικών αραιώσεων ( ακατέργαστο και παστεριωμένο γάλα ) Μεταφέρεται με αποστειρωμένο σιφώνιο ( 4.2.3 ) 1 ml της αρχικής αραίωσης ( 7.3 ) μέσα σε 9 ml αραιωτικού ( 6.1 ) ακολουθώντας τις οδηγίες που δόθηκαν στο σημείο 7.3 .  Έτσι αποκτάται η αραίωση 10-2 .  Οι διαδικασίες αυτές επαναλαμβάνονται για να αποκτηθούν περαιτέρω δεκαδικές αραιώσεις έως ότου υπολογιστεί ότι αποκτήθηκε ο κατάλληλος αριθμός μικροοργανισμών ( 8.1.1 ).  7.5 .  Εμβολιασμός τρυβλίων Petri 7.5.1 .  Ακατέργαστο γάλα : μεταφέρεται με αποστειρωμένο σιφώνιο ( 4.2.3 ) 1 ml του δείγματος ή/και της κατάλληλης δεκαδικής αραίωσης μέσα σε τρυβλίο ( 4.2.4 ). Πρέπει να εξετάζονται δύο αραιώσεις τουλάχιστον . Προετοιμάζεται ένα τρυβλίο από κάθε αραίωση κατάλληλα  επιλεγμένη ( 8.1.1 ).  7.5.2 .  Παστεριωμένο γάλα : μεταφέρεται με αποστειρωμένο σιφώνιο ( 4.2.3 ) 1 ml του δείγματος ή/και της κατάλληλης δεκαδικής αραίωσης μέσα σε τρυβλίο ( 4.2 .4 ). Πρέπει να εξετάζονται δύο αραιώσεις τουλάχιστον . Προετοιμάζονται δύο τρυβλία από κάθε αραίωση κατάλληλα  επιλεγμένη ( 8.1.1).  7.5.3 .  Γάλα UHT - επεξεργασμένο και αποστειρωμένο ( εξετάζεται μετά από επώαση 15 ημερών στους 30 gC - Οδηγία 85/397/CEE παράρτημα Α κεφάλαιο VII σημείο 5 ):  Μεταφέρεται με αποστειρωμένο σιφώνιο ( 4.2.3 ) 0,1 ml του δείγματος του γάλακτος ( 7.2 ) μέσα σε τρυβλίο ( 4.2.4 ). Προετοιμάζονται δύο τρυβλία .  7.6 .  Απόψυση Αποχύονται περίπου 15 έως 18 ml υποστρώματος ( 7.1 ) μέσα σε κάθε εμβολιασμένο τρυβλίο .  Αναμειγνύονται αμέσως μετά την έκχυση, περιστρέφοντας επαρκώς το τρυβλίο Petri ώστε να αποκτηθούν ομοιόμορφα κατανεμημένες αποικίες μετά την επώσαη .  Ο χρόνος μεταξύ τους τέλους της προετοιμασίας του δείγματος του γάλακτος και της ανάμειξης, ανάλογα με το είδος του γάλακτος, τη δοκιμαστική δόση ή την αραίωση του υποστρώματος δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 15 λεπτά .  Αφήνονται να στερεοποιηθούν πάνω σε καθαρή, ψυχρή, οριζόντια επιφάνεια .  7.7 .  Επώαση των τρυβλίων Petri Τα τρυβλία μεταφέρονται στον επωαστή ( 4.1.3 ). Τα τρυβλία επωάζονται ανεστραμμένα . Δεν στοιβάζονται περισσότερα από έξι κατά ύψος . Οι στήλες των τρυβλίων πρέπει να απέχουν η μία από τηνάλλη και από τα τοιχώματα και την κορυφή του επωαστή .  Επωάζονται στους 30 +- 1 oC επί 72 p 2 ώρες .  7.8 .  Καταμέτρηση αποικιών Οι αποικίες καταμετρούνται μέσα στα τρυβλία Petri που δεν περιέχουν περισσότερες από300 αποικίες .  Τα τρυβλία εξετάζονται σε χαμηλό φως . Για να διευκολυνθεί η καταμέτρηση, μπορεί να χρησιμοποιηθεί κατάλληλος φακός ( 4.1.6 ) ή/και καταμετρητής ( 4.1.8 ). Αποφεύγεται η λανθασμένη θεώρηση σωματιδίων ή κατακαθισμένου υλικού στα τρυβλία ως σημειακές αποικίες .  Εξετάζονται προσεκτικά αμφίβολα αντικείμενα, χρησιμοποιώντας φακό υψηλής μεγέθυνσης ( 4.1.7 ), όπου απαιτείται, για να ξεχωρίσουν τις αποικίες από ξένο υλικό .  Εκτεινόμενες αποικίες θεωρούνται ως μόνες αποικίες . Εάν λιγότερο από ένα τέταρτο του τρυβλίου έχει καλυφθεί από εκτεινόμενες αποικίες, οι αποικίες καταμετρούνται στο απρόσβλητο τμήμα του τρυβλίου και υπολογίζεται ο αριθμός που αντιστοιχεί σε ολόκληρο το  τρυβλίο . Εάν περισσότερο από ένα τέταρτο του τρυβλίου έχει καλυφθεί από εκτεινόμενες αποικίες, το τρυβλίο απορρίπτεται .  8 .  Υπολογισμός και έκφραση αποτελεσμάτων 8 .1 .  Ακατέργαστο και παστεριωμένο γάλα 8.1.1 .  Χρησιμοποιούνται μετρήσεις από όλα τα τρυβλία που περιέχουν από 10 έως 300 αποικίες ( βλέπε σημεία 8.1.3 και 8.1.4 ).  8.1.2 .  Ο αριθμός των μικροοργανισμών ανά ml ακατέργαστου ή παστεριωμένου γάλακτος δίνεται από τη σχέση :   ( n1 + 0,1 n2 ) d   Σ C ( n1 + 0,1 n2 ) d  όπου Σ C   είναι το άρθροισμα των αποικιών όπως καταμετρήθηκαν στην 8.1.1,  ( n1 + 0,1 n2 ) d   είναι ίσο με τον όγκο του δείγματος στο τρυλβίο, στο οποίο :  n1   είναι ο αριθμός των τρυβλίων που καταμετρήθηκαν στην πρώτη αραίωση,  n2   είναι ο αριθμός των τρυβλίων που καταμετρήθηκαν στη δεύτερη αραίωση,  d   είναι ο συντελεστής αραίωσης με τον οποίο έγιναν οι πρώτες μετρήσεις .  Η μέτρηση δίνεται με δύο σημαντικά ψηφία . Όταν το ψηφίο που πρέπει να στρογγυλευθεί είναι το 5, στρογγυλοποιείται έτσι ώστε το ψηφίο ακριβώς στα αριστερά να είναι περιττό .  Παράδειγμα ( παστεριωμένο γάλα ) Αραίωση 10-2 : 278 και 290 αποικίες Αραίωση 10-3 :  33 και  28 αποικίες Αριθμός/ml =  278 + 290 + 33 + 28   Αριθμός/ml = 278 + 290 +33 + 28 ( 2 + 0,1 x 2) 10-2 Αριθμός/ml =  0,022   = 629 0,022 = 28 590 = 29 000 = 2,9 x 10 %.   8.1.3 .  Εάν υπάρχουν μόνο μετρήσεις μικρότερες από 10, ο αριθμός των μικροοργανισμών ανά χιλιοστόλιτρο αναφέρεται ως "μικρότερος από 10 x d ανά ml", με το "d" να είναι το αντίστροφο του μικρότερου συντελεστή αραίωσης .  8.1.4 .  Εάν υπάρχουν μόνο μετρήσεις που υπερβαίνουν τις 300 αποικίες αλλά είναι δυνατή η μέτρηση, υπολογίζεται μια κατ' εκτίμηση μέτρηση και πολλαπλασιάζεται επί το αντίστροφο του συντελεστή αραίωσης . Το αποτέλεσμα αναφέρεται ως "Εκτιμούμενος αριθμός  μικροοργανισμών ανά ml ".  8.2 .  Γάλα UHT - επεξεργασμένο και αποστειρωμένο Οι μετρήσεις τρυβλίου περισσότερο από 10 αποικίες ανά 0,1 ml πρέπει να θεωρείται ότι δεν ικανοποιούν πλέον τις απαιτήσεις της οδηγίας 85/397/ΕΟΚ .  9 .  Ακρίβεια Δεν είναι προς το παρόν διαθέσιμα αποτελέσματα διεθνώς αναγνωρισμένων δοκιμών συνεργασίας .  V . ΚΑΤΑΜΕΤΡΗΣΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ - ΔΟΚΙΜΗ ΜΕΤΡΗΣΗΣ ΤΡΥΒΛΙΟΥ ΣΤΟΥΣ 21 oC  1 .  Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής Η μέθοδος αυτή καθορίζει τη διαδικασία αναφοράς καταμέτρησης μικροοργανισμών με τη βοήθεια μιας τεχνικής καταμέτρησης αποικιών στους 21 oC σε παστεριωμένο γάλα μετά από επώαση του γάλακτος στους 6 oC επί πέντε ημέρες για να προσδιοριστεί ο βαθμός  μόλυνσης του παστεριωμένου γάλακτος από ψυχροτροπικούς οργανισμούς ικανούς προς πολλαπλασιασμό σε γάλα στους 6 oC .  2 .  Ορισμός Ο ορισμός "μικροοργανισμοί" σημαίνει : οργανισμοί σχηματίζοντες καταμετρήσιμες αποικίες όταν επωασθούν αεροβίως κάτω από τις περιγραφόμενες συνθήκες .  3 .  Αρχή Το παστεριωμένο γάλα επωάζεται στους 6 oC επί μέρες . Ένας καθορισμένος όγκος του δείγματος του γάλακτος αναμειγνύεται με το υπόστρωμα της καλλιέργειας σε τρυβλία Petri και επωάζεται στους 21 oC επί 25 ώρες . Οι αποικίες καταμετρώνται και υπολογίζεται ο  αριθμός των μικροοργανισμών ανά ml παστεριωμένου γάλακτος .  4 .  ιΟργανα και γυάλινα σκεύη Συνηθισμένος εργαστηριακός εξοπλισμός και ιδιαίτερα :  4.1 .  ιΟργανα 4.1.1 .  Κλίβανος θερμού αέρα, ικανός να λειτουργεί στους 170 έως 175 oC .  4.1.2 .  Αυτόκλειστο, ικανό να λειτουργεί στους 121 +- 1 oC .  4.1.3 .  Επωαστές, ικανοί να διατηρούν θερμοκρασία :  α )   6 +- 0,2 oC - β )  21 +- 1 oC σε όλα τα σημεία του εσωτερικού τους .  4.1.4 .  pHμετρο, με δυνατότητα εξίσωσης θερμοκρασίας, ακρίβειας p 0,1 μονάδας pH .  4.1.5 .  Υδρόλουτρο, ικανό να λειτουργεί στους 45 +- 1 oC .  4.1.6 .  Φακός, μεγεθυντική ικανότητα 2-4 x .  4.1.7 .  Fakow, megeuzntikh ikanothta 8-10 x .  4.1.8 .  Katametrhthw 4.1.9 .  Anameikthraw, ikanow na anameignzei 1 ml toz deigmatow galaktow h dekadikh araivsh me 9 ml dialzth kai leitozrgvntaw panv sthn arxh thw ekkentroz peristrofhw tvn periexomenvn toz dokimastikoz svlhna .  4.2 .  Γυάλινα σκεύη 4.2.1 .  Δοκιμαστικοί σωλήνες, με κατάλληλες διατάξεις κλεισίματος και επαρκή χωρητικότητα για να περιέχουν, με επαρκή κενό χώρο για ανάδευση, 10 ml της αρχικής αραίωσης ή περαιτέρω δεκαδικές αραιώσεις .  4.2.2 .  Φιάλες χωρητικότητας 150 έως 250 ml ή σωλήνες, χωρητικότητας περίπου 20 ml, για να φέρουν το υπόστρωμα καλλιέργειας .  4.2.3 .  Σιφώνια ( πωματισμένα με ακατέργαστο βαμβάκι ) από γυαλί ή αποστειρωμένο συνθετικό υλικό, με ακέραια άκρη, ονομαστικής χωρητικότητας 1 ml και έχοντας απόληξη διαμέτρου 1,75 έως 3 mm .  4.2.4 .  Τρυβλία Petri, από διαυγές άχρωμο γυαλί ή αποστειρωμένο συνθετικό υλικό, με το από κάτω τρυβλίο ( πυθμένα ) να έχει εσωτερική διάμετρο περίπου 90-100 mm . Το εσωτερικό βάθος πρέπει να είναι τουλάχιστον 10 mm . Ο πυθμένας δεν πρέπει να έχει ανωμαλίες που να  παρεμποδίζουν την καταμέτρηση των αποικιών .  4.2.5 .  Αποστείρωση των γυάλινων σκευών :  Τα γυάλινα σκεύη πρέπει να αποστειρώνονται με μια από τις ακόλουθες μεθόδους :  α )  με διατήρηση στους 170 έως 175 oC επί όχι λιγότερο από μια ώρα μέσα σε κλίβανο θερμού αέρα ( 4.1.1 )- β ) με διατήρηση στους 121 +- 1 oC επί όχι λιγότερο από 20 λεπτά μέσα σε αυτόκλειστο ( 4.1.2 ).  Πρέπει να ληφθεί μέριμνα ώστε να εξασφαλιστεί επαρκής διείσδυση ατμού στο αυτόκλειστο : εάν ο εξοπλισμός αποστειρώνεται σε δοχεία, αυτά δεν πρέπει να κλείνονται στεγανά, οι φιάλες πρέπει να έχουν χαλαρά τοποθετημένα πώματα .  Τα γυάλινα σκεύη που αποστειρώθηκαν μέσα στο αυτόκλειστο πρέπει να στεγνώνονται με απάντληση του ατμού .  Τα σιφώνια πρέπει να αποστειρώνονται σε κλίβανο θερμού αέρα ( 4.1.1 ).  5 .  Υπόστρωμα καλλιέργειας - άγαρ για καταμέτρηση τρυβλίου με γάλα 5.1 .  Σύσταση Εκχύλισμα μαγιάς 2,5 g Τρυπτόνη 5,0 g D (+) Γλυκόζη 1,0 g Αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη 1,0 g ΦΑ-2>Αγαρ 10 έως 15 g, ανάλογα με τις πηκτικές ιδιότητες του χρησιμοποιούμενου άγαρ Νερό 1 000 ml Το αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη πρέπει να είναι απηλλαγμένο από αναστολείς . Αυτό πρέπει να ελεχθεί με συγκριτικές δοκιμές χρησιμοποιώντας αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη που είναι με βεβαιότητα απηλλαγμένα από αναστολείς .  Παρασκευή Τα συστατικά διασπείρονται σε αιώρημα και διαλύονται με την ακόλουθη σειρά : εκχύλισμα μαγιάς, τρυπτόνη, γλυκόζη και τελικά, αποβουτυρωμμένο γάλα σε σκόνη, μέσα σε νερό . Η θέρμανση του αιωρήματος θα βοηθήσει τη διαδικασία αυτή . Προστίθεται το άγαρ και  θερμαίνεται μέχρι βρασμού, αναδεύοντας συνεχώς έως ότου το άγαρ διαλυθεί εντελώς ή ατμίζεται επί 30 λεπτά περίπου .  Εάν χρειαστεί, γίνεται διήθηση μέσα από διηθητικό χάρτη .  Το pH ελέγχεται με pHμετρο ( 4.1.4 ) και, εάν χρειαστεί, το pH προσαρμόζεται έτσι ώστε, μετά την αποστείρωση, να είναι 6,9 +- 0,1 στους 25 oC χρησιμοποιώντας διάλυμα ( τουλάχιστον 0,1 mol/l ) υδροξειδίου νατρίου ή υδροχλωρικού οξέος .  5.2 .  Κατανομή, αποστείρωση και διατήρηση του υποστρώματος καλλιέργειας Το υπόστρωμα ( 5.1 ) μοιράζεται σε ποσότητες των 100 έως 150 ml μέσα σε φιάλες ή 12 έως 15 ml μέσα σε σωλήνες ( 4.2.2 ). Οι φιάλες και οι σωλήνες πωματίζονται .  Αποστειρώνονται στο αυτόκλειστο (4.1.2 ) στους 121 +- 1 oC επί 15 λεπτά .  Ελέγχεται το pH του υποστρώματος .  Εάν το υπόστρωμα δεν πρόκεται να χρησιμοποιηθεί αμέσως, φυλάσσεται στο σκόταδι, σε θερμοκρασία μεταξύ 1 και 5 oC επί όχι περισσότερο από ένα μήνα από την παρασκευή .  5.3 .  Άνυδρο υπόστρωμα καλλιέργειας του εμπορίου Το υπόστρωμα καλλιέργειας ( 5.1 ) μπορεί να παρασκευασθεί από άνυδρο υπόστρωμα του εμπορίου . Ακολουθούνται οι οδηγίες του κατασκευαστή αλλά το αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη προστίθεται πριν διαλυθεί αν δεν αποτελεί συστατικό .  Το pH προσαρμόζεται στο 6,9 +- 0,1 στις 25 oC όπως περιγράφηκε στο σημείο 5.1 και το υπόστρωμα κατανέμεται, αποστειρώνεται και φυλάσσεται όπως περιγράφηκε στο σημείο 5.2 .  6 .  Διαλύτες 6.1 .  Διάλυμα πεπτόνης/φυσιολογικού ορού :  Σύσταση Πεπτόνη 1,0 g Χλωριούχο νάτριο ( NaCl ) 8,5 g Νερό 1 000 ml Παρασκευή :  Τα συστατικά διαλύονται στο νερό, αν χρειαστεί θερμαίνοντας .  Το pΗ ελέγχεται με ένα ρΗμετρο ( 4.1.4 ) και εάν χρειαστεί, το ρΗ διορθώνεται έτσι ώστε, μετά την αποστείρωση, να είναι 7,0 p 0,1 στους 25 gC χρησιμοποιώντας διάλυμα ( τουλάχιστον 0,1 mol/l ) υδροξειδίου νατρίου ή υδροχλωρικού οξέος .  6.2 .  Κατανομή, αποστείρωση και φύλαξη τουν αραιωτικού Το αραιωτικό ( 6.1 ) κατανέμεται μέσα σε δοκιμαστικούς σωλήνες ( 4.2.1 ) σε τέτοιες ποσότητες ώστε, μετά την αποστείρωση, κάθε σωλήνας να περιέχει 9,0 p 0,2 ml αραιωτικού . Οι σωλήνες πωματίζονται .  Αποστειρώνονται στο αυτόκλειστο ( 4.1.2 ) στους 121 p 1 oC επί 15 λεπτά .  Ελέγχεται το ρΗ του αραιωτικού .  Εάν το αραιωτικό δεν πρόκειται να χρησιμοποιηθεί αμέσως, φυλάσσεται στο σκοτάδι σε θερμοκρασία μεταξύ 1 και 5 gC επί όχι περισσότερο από ένα μήνα από την παρασκευή .  6.3 .  Άνυδρα αραιωτικά του εμπορίου Το αραιωτικό ( 6.1 ) μπορεί να παρασκευαστεί από αφυδατωμένα δισκία ή σκόνες του εμπορίου . Ακολουθούνται οι οδηγίες του κατασκευαστή . Το pΗ διορθώνεται όπως περιγράφηκε στο σημείο 6.1 και τα αραιωτικά κατανέμονται, αποστειρώνονται και φυλάσσονται όπως  περιγράφηκε στο σημείο 6.2 .  7 .  Διαδικασία 7.1 .  Τήξη του υποστρώματος Πριν αρχίσει η μικροβιολογική εξέταση, η απαιτούμενη ποσότητα υποστρώματος λιώνεται γρήγορα και το υπόστρωμα στερεοποιείται στους 45 p 1 oC σε υδρόλουτρο ( 4.1.5 ).  7.2 .  Προετοιμασία του δείγματος γάλακτος 7.2.1 .  Επωάζεται μια κλειστή συσκευασία παστεριωμένου γάλακτος ή, εάν αυτό είναι αδύνατο, ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα όχι λιγότερο από 100 ml επί 120 p2 ώρες στους 6 p 0,5 oC σε επώαση [4.1.3.α )].  7.2.2 .  Μετά την επώαση, το δείγμα του γάλακτος αναμειγνύεται πλήρως έτσι ώστε οι μικροοργανισμοί να κατανεμηθούν κατά το δυνατόν ομοιόμορφα, αναστρέφοντας γρήγορα το δοχείο με το δείγμα του γάλακτος 25 φορές. Πρέπει να αποφεύγεται ο αφρισμός ή να αφήνεται ο  αφρός να διασπαρεί . Το μεσοδιάστημα μεταξύ ανάμειξης και ανάληψης της δοκιμαστικής δόσης δεν πρέπει να υπερβαίνει τα τρία λεπτά .  7.3 .  Προετοιμασία της αρχικής αραίωσης ( 10-1 ) Μεταφέρεται, με αποστειρωμένο σιφώνιο ( 4.2.3 ), 1 ml του δείγματος ( 7.2.2 ) ακατέργαστου γάλακτος ή παστεριωμένου γάλακτος μέσα σε 9 ml αραιωτικού (6.1 ) αποφεύγοντας την επαφή μεταξύ του σιφώνιου και του αραιωτικού . Η θερμοκρασία του αραιωτικού πρέπει να  είναι περίπου η ίδια με αυτή του δείγματους γάλακτος . Η αρχική αυτή αραίωση αναμειγνύεται προσεκτικά στον αναμεικτήρα ( 4.1.9 ) επί 5 έως 10 δευτερόλεπτα .  Έτσι αποκτάται μια αρχική αραίωση 10-1 .  7.4 .  Παρασκευή περαιτέρω δεκαδικών αραιώσεων Μεταφέρεται, με αποστειρωμένο σιφώνιο ( 4.2.3 ), 1 ml της αρχικής αραίωσης ( 7.3 ) μέσα σε 9 ml αραιωτικού ( 6.1 ) ακολουθώντας τις οδηγίες που δόθηκαν στο σημείο 7.3 .  Έτσι αποκτάται η αραίωση 10-1 .  Οι διαδικασίες αυτές επαναλαμβάνονται για να αποκτηθούν περαιτέρω δεκαδικές αραιώσεις έως ότου υπολογιστεί ότι αποκτήθηκε ο κατάλληλος αριθμός μικροοργανισμών ( 8.1 ).  7.5 .  Εμβολιασμός τρυβλίων Petri Μεταφέρεται, με αποστειρωμένο σιφώνιο ( 4.2.3 ), 1 ml του δείγματος ή/και της κατάλληλης δεκαδικής αραίωσης μέσα σε τρυβλίο ( 4.2.4 ). Πρέπει να εξετάζονται δύο αραιώσεις τουλάχιστον . Προετοιμάζονται δύο τρυβλία από κάθε αραίωση κατάλληλα επιλεγμένη ( 8.1 ).   7.6 .  Απόχυση Αποχύονται περίπου 15 έως 18 ml υποστρώματος (7.1 ) μέσα σε κάθε εμβολιασμένο τρυβλίο .  Αναμειγνύονται αμέσως μετά την έκχυση, περιστρέφοντας επαρκώς το τρυβλίο Petri, ώστε να αποκτηθούν ομοιόμορφα κατανεμημένες αποικίες μετά την επώαση .  Ο χρόνος μεταξύ τους τέλους της προετοιμασίας του δείγματος γάλακτος και της ανάμειξης αραίωσης και υποστρώματος δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 15 λεπτά .  Αφήνονται να στερεοποιηθούν πάνω σε καθαρή, ψυχρή, οριζόντια επιφάνεια .  7.7 Επώαση των τρυβλίων Petri Τα τρυβλία μεταφέρονται στον επωαστή [4.1.3.β )]. Τα τρυβλία επωάζονται ανεστραμμένα . Δεν στοιβάζονται περισσότερο από έξι κατά ύψος . Οι στήλες των τρυβλίων πρέπει να απέχουν η μια από την άλλη και από τα τοιχώματα και από την κορυφή του επωαστή .  Επωάζονται στους 21 p 1 oC επί 25 ώρες .  7.8 .  Καταμέτρηση αποικιών Οι αποικίες καταμετρούνται μέσα στα τρυβλία Petri που δεν περιέχουν περισσότερες από 300 αποικίες .  Τα τρυβλία εξετάζονται σε χαμηλό φως . Για να διευκολυνθεί η καταμέτρηση, μπορεί να χρησιμοποιηθεί κατάλληλος φακός ( 4.1.6 ) ή/και καταμετρητής ( 4.1.8 ). Αποφεύγεται η λανθασμένη θεώρηση σωματιδίων ή κατακαθισμένου υλικού στα τρυβλία ως σημειακές αποικίες .  Εξετάζονται προσεκτικά αμφίβολα αντικείμενα, χρησιμοποιώντας φακό υψηλής μεγέθυνσης ( 4.1.7 ) όπου απαιτείται, για να ξεχωρίσουν οι αποικίες από ξένο υλικό .  Εκτεινόμενες αποικίες θεωρούνται ως μόνες αποικίες . Εάν λιγότερο από ένα τέταρτο του τρυβλίου έχει καλυφθεί από εκτεινόμενες αποικίες, οι αποικίες καταμετρούνται στο απρόσβλητο τμήμα του τρυβλίου και υπολογίζεται ο αριθμός που αντιστοιχεί σε ολόκληρο το  τρυβλίο . Εάν περισσότερο από ένα τέταρτο του τρυβλίου έχει καλυφθεί από εκτεινόμενες αποικίες, το τρυβλίο απορρίπτεται .  8 .  Υπολογισμός και έκφραση αποτελεσμάτων 8.1 .  Χρησιμοποιούνται μετρήσεις από όλα τα τρυβλία που περιέχουν από 10 έως 300 αποικίες ( βλέπε σημεία 8.3 και 8.4 ).  8.2 .  Ο αριθμός των μικροοργανισμών ανά ml παστεριωμένου γάλακτος δίνεται από τη σχέση :   ( n1 + 0,1 n2 ) d   Σ C ( n1 + 0,1 n2 ) d  όπου Σ C είναι το άθροισμα των αποικιών όπως καταμετρήθηκαν στην 8.1,  ( n1 + 0,1 n2 ) d είναι ίσο με τον όγκο του δείγματος στο τρυβλίο, στο οποίο :  n1 είναι ο αριθμός των τρυβλίων που καταμετρήθηκαν στη πρώτη αραίωση,  n2 είναι ο αριθμός των τρυβλίων που καταμετρήθηκαν στη δεύτερη αραίωση,  d είναι ο συντελεστής αραίωσης με τον οποίο έγιναν οι πρώτες μετρήσεις .  Η μέτρηση δίνεται με δύο σημαντικά ψηφία . Όταν το ψηφίο που πρέπει να στρογγυλευθεί είναι το 5, στρογγυλοποιείται έτσι ώστε το ψηφίο ακριβώς στα αριστερά να είναι περιττό .  Παράδειγμα :  Αραιώση 10-2 : 278 και 290 αποικίες Αραίωση 10-3 :  33 και  28 αποικίες Αριθμος/ml =  278 + 290 + 33 + 28   Αριθμός/ml = 278 + 290 +33 + 28 ( 2 + 0,1 x 2 ) 10-2 Αριθμος/ml =  0,022   = 629 0,022 = 28 590 = 29 000 = 2,9 x 10 %.   8.3 . Εάν υπάρχουν μόνον μετρήσεις μικρότερες από 10, ο αριθμός των μικροοργανισμών ανά χιλιοστόλιτρο αναφέρεται ως "μικρότερος από 10 x d ανά ml, με το "d" να είναι το αντίστροφο του μικρότερου συντελεστή αραίωσης .  8.4 .  Εάν υπάρχουν μόνο μετρήσεις που υπερβαίνουν τις 300 αποικίες αλλά είναι δυνατή η μέτρηση, υπολογίζεται μια κατ' εκτίμηση μέτρηση και πολλαπλασιάζεται επί το αντίστροφο του συντελεστή αραίωσης . Το αποτέλεσμα αναφέρεται ως "Εκτιμούμενος αριθμός  μικροοργανισμών ανά ml .  9 .  ΑκρίβειαΔεν υπάρχουν αποτελέσματα διεθνώς αποδεκτών δοκιμών συνεργασίας .  VΙ . ΚΑΤΑΜΕΤΡΗΣΗ ΚΟΛΟΒΑΚΤΗΡΙΔΙΩΝ - ΜΕΤΡΗΣΗ ΑΠΟΙΚΙΩΝ ΣΤΟΥΣ 30 oC  1 .  Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής Η μέθοδος αυτή καθορίζει τη διαδικασία αναφοράς καταμέτρησης κολοβακτηριδίων σε παστεριωμένο γάλα με τη βοήθεια μιας τεχνικής καταμέτρησης αποικιών στους 30 oC .  2 .  Ορισμός Ο ορισμός "κολοβακτηρίδια" σημαίνει βακτήρια τα οποία στους 30 oC σχηματίζουν χαρακτηριστικές ή μη χαρακτηριστικές αποικίες που προκαλούν ζύμωση της λακτόζης με παραγωγή αερίου κάτω από τις περιγραφόμενες συνθήκες .  3 .  Αρχή ιΕνας καθορισμένος όγκος του δείγματος του γάλακτος αναμειγνύεται με το υπόστρωμα καλλιέργειας σε τρυβλία Petri και επωάζεται στους 30 oC επί 24 ώρες . Καταμετρώνται οι χαρακτηριστικές αποικίες και, εάν χρειαστεί, επιβεβαίωνεται η ταυτότητα των μη  χαρακτηριστικών αποικιών με έλεγχο της ικανότητας ζύμωσης της λακτόζης . Μετά υπολογίζεται ο αριθμός κολοβακτηριδίων ανά ml παστεριωμένου γάλακτος .  4 .  ιΟργανα και γυάλινα σκεύη Ο συνηθισμένος εργαστηριακός εξοπλισμός, και ιδιαίτερα :  4.1 .  ιΟργανα 4.1.1 .  Κλίβανος θερμού αέρα, ικανός να λειτουργεί στους 170 έως 175 oC .  4.1.2 .  Αυτόκλειστο, ικανό να λειτουργεί στους 121 +- 1 oC .  4.1.3 .  Epvasthw, ikanow na diathrei uermokrasia 30 +- 1 oC σε όλα τα σημεία του εσωτερικού του .  4.1.4 .  pHμετρο, με δυνατότητα εξίσωσης θερμοκρασίας, ακρίβειας p 0,1 μονάδας pH .  4.1.5 .  Υδρόλουτρο, ικανό να λειτουργεί στους 45 +- 1 oC .  4.1.6 .  Συρμάτινη βελόνα, από λευκόχρυσο-ιρίδιο ή νικέλιο-χρώμιο .  4.2 .  Γυάλινα σκεύη 4.2.1 .  Δοκιμαστικοί σωλήνες με κατάλληλο κλείσιμο και χωρητικότητα 20 ml, για να φέρουν το υπόστρωμα επιβεβαίωσης ( 5.2 ) και σωλήνες Durham κατάλληλων διαστάσεων για χρήση με τους δοκιμαστικούς σωλήνες .  4.2.2 .  Φιάλες χωρητικότητας 150 έως 250 ml για να φέρουν το στερεό επιλεκτικό υπόστρωμα ( 5.1 ).  4.2.3 .  Σιφώνια ( πωματισμένα με ακατέργαστο βαμβάκι ) από γυαλί ή αποστειρωμένο συνθετικό υλικό, με ακέραια άκρη, ονομαστικής χωρητικότητας 1-10 ml και έχοντας απόληξη διαμέτρου 1,75 έως 3 mm .  4.2.4 .  Τρυβλία Petri, από διαυγές άχρωμο γυαλί ή αποστειρωμένο συνθετικό υλικό, με το από κάτω τρυβλίο ( πυθμένα ) να έχει εσωτερική διάμετρο περίπου 90-100 mm . Το εσωτερικό βάθος πρέπει να είναι τουλάχιστον 10 mm . Ο πυθμένας δεν πρέπει να έχει ανωμαλίες που να  παρεμποδίζουν την καταμέτρηση των αποικιών .  4.2.5 .  Αποστείρωση των γυάλινων σκευών Τα γυάλινα σκεύη πρέπει να αποστειρώνονται με μια από τις ακόλουθες μεθόδους :  α )  με διατήρηση στους 170 έως 175 oC επί όχι λιγότερο από μία ώρα μέσα σε κλίβανο θερμού αέρα ( 4.1.1 )- β ) με διατήρηση στους 121 +- 1 oC επί όχι λιγότερο από 20 λεπτά μέσα σε αυτόκλειστο ( 4.1.2 ).  Πρέπει να ληφθεί μέριμνα ώστε να εξασφαλιστεί επαρκής διείσδυση ατμού στο αυτόκλειστο : αν ο εξοπλισμός αποστειρώνεται σε δοχεία, αυτά δεν πρέπει να είναι σφικτά κλεισμένα, οι φιάλες και τα φιαλίδια πρέπει να έχουν χαλαρά τοποθετημένα πώματα .  Τα γυάλινα σκεύη που αποστειρώθηκαν μέσα στο αυτόκλειστο πρέπει να στεγνώνονται με απάντληση του ατμού .  Τα σιφώνια πρέπει να αποστειρώνονται σε κλίβανο θερμού αέρα ( 4.1.1 ).  5 .  Υποστρώματα καλλιέργειας 5.1 .  Ιώδες-ερυθρό άγαρ χολής-λακτόξης ( άγαρ VRBL ). Στερεό εκλεκτικό υπόστρωμα .  Σύσταση Πεπτόνη 7 g Εκχύλισμα μαγιάς 3 g Λακτόζη ( C12H22O11.H2O ) 10 g Χλωριούχο νάτριο ( NaCl ) 5 g Χολικά άλατα 1,5 g Ουδέτερο ερυθρό 0,03 g Κρυσταλλικό ιώδες 0,002 g ΦΑ-2>Αγαρ 10-15 g ( ανάλογα με τις πηκτικές ιδιότητες του χρησιμοποιοούμενου άγαρ ) Νερό 1 000 ml Παρασκευή Τα συστατικά διασπείρονται σε αιώρημα και διαλύονται στο νερό και αφήνονται να σταθούν επί αρκετά λεπτά . Μετά αναμειγνύονται ζωηρά .  Ελέγχεται το pH με pHμετρο ( 4.1.4 ) και, εάν χρειαστεί, το pH προσαρμόζεται έτσι, ώστε μετά το βρασμό, να είναι 7.4 +- 0,1 στους 25 oC χρησιμοποιώντας διάλυμα ( τουλάχιστον 0,1 mol/l ) υδροξείδιου νάτριου ή υδροχλωρικού οξέος .  Φέρονται γρήγορα σε βρασμό, αναδεύοντας κατά διαστήματα και αμέσως κατανέμενονται σε ποσότητες των 100 έως 150 ml μέσα σε αποστειρωμένες φιάλες ( 4.2.2 ). Το υπόστρωμα ψύχεται σε υδρόλουτρο ( 4.1.5 ) στους 45 +- 1 oC .  Η στειρότητα του υλικού πρέπει να ελέγχεται την ώρα της χρησιμοποίησής του ( βλέπε σημείο 6.4 ).   Το υλικό χρησιμοποιείται μέσα σε τρεις ώρες από την παρασκευή του .  5.2 .  Λαμπρός - πράσινος ζωμός λακτόζης - χολής . Υπόστρωμα επιβεβαίωσης .  Σύσταση Πεπτόνη 10 g Λακτόζη ( C12H22O11-H2O ) 10 g Afzdatvmenh xolh boow 20 g Lampro prasino 0,0133 g Nero 1 000 ml Paraskezh Ta szstatika dialzontai mesa sto nero me brasmo .  Elegxetai to pH me pHμετρο ( 4.1.4 ) και, εάν χρειαστεί, το pH προσαρμόζεται έτσι ώστε, μετά την αποστείρωση, να είναι 7,2 +- 0,1 στους 25 oC χρησιμοποιώντας διάλυμα ( τουλάχιστον 0,1 mol/l ) υδροξειδίου νατρίου ή υδροχλωρικού οξέος .  Το υπόστρωμα κατανέμεται, σε ποσότητες των 10 ml, μέσα σε δοκιμαστικούς σωλήνες ( 4.2.1 ) που περιέχουν σωλήνες Durham . Οι σωλήνες πωματίζονται .  Αποστειρώνονται στο αυτόκλειστο ( 4.1.2 ) στους 121 +- 1 oC επί 15 λεπτά .  Οι σωλήνες Durham δεν πρέπει να περιέχουν φυσαλίδες αέρα μετά την αποστείρωση .  Ελέγχεται το pH του υποστρώματος .  Εάν το υπόστρωμα δεν πρόκειται να χρησιμοποιηθεί αμέσως, φυλάσσεται στο σκοτάδι σε θερμοκρασία μεταξύ 0 και 5 oC επί όχι περισσότερο από ένα μήνα από την παρασκευή .  5.3 .  Αφυδατωμένα υποστρώματα καλλιέργειας του εμπορίου Τα υποστρώματα καλλιέργειας ( 5.1, 5.2 ) μπορούν να παρασκευαστούν από αφυδατωμένα υποστρώματα του εμπορίου . Ακολουθούνται οι οδηγίες του κατασκευαστή . Το pH διορθώνεται και τα υποστρώματα διανέμονται, βράζονται ή αποστειρώνονται και διατηρούνται όπως  περιγράφηκε στα σημεία 5.1 και 5.2 .  6.  Διαδικασία 6.1 .  Το υπόστρωμα Χρησιμοποιείται το υπόστρωμα ( άγαρ VRBL ) όπως περιγράφηκε στο σημείο 5.1 .  6.2 .  Προετοιμασία του δείγματος του γάλακτος Το δείγμα του γάλακτος αναμειγνύεται πλήρως, έτσι ώστε οι μικροοργανισμοί να κατανεμηθούν κατά το δυνατόν ομοιόμορφα, αναστρέφοντας γρήγορα το δοχείο με το δείγμα γάλακτος 25 φορές . Πρέπει να αποφεύγεται ο αφρισμός ή ο αφρός να αφήνεται να διαλυθεί . Το  χρονικό διάστημα μεταξύ της ανάμειξης και ανάληψης της δοκιμαστικής δόσης πρέπει να μην υπερβαίνει τα τρία λεπτά .  6.3 .  Εμβολιασμός τρυβλίων Petri Εμβολιάζονται 3 ml του δείγματος γάλακτος ( 6.2 ) μεταφέροντας, με αποστειρωμένο σιφώνιο ( 4.2.3 ), 1 ml του δείγματος γάλακτος μέσα σε καθένα από τα τρία τρυβλία ( 4.2.4 ).  6.4 .  ιΕκχυση Το άγαρ VRBL ( 6.1 ) εκχύεται σε κάθε εμβολιασμένο τρυβλίο σε ποσότητα 12 ml περίπου .  Αναμειγνύεται αμέσως μετά την ανάμειξη με περιστροφή του τρυβλίου Petri επαρκώς ώστε να προκύψουν ομοιόμορφα κατανεμημένες αποικίες μετά την επώαση .  Ο χρόνος μεταξύ του τέλους της προετοιμασίας του δείγματος γάλακτος και της ανάμειξης της δοκιμαστικής δόσης με το υπόστρωμα δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 15 λεπτά .  Προετοιμάζεται ένα μη εμβολιασμένο τρυβλίο με σκοπό τον έλεγχο της αποστείρωσης, με 12 ml από το άγαρ VRBL που χρησιμοποιείται για τα επωασμένα τρυβλία .  Αφήνονται να στερεοποιηθούν πάνω σε καθαρή, ψυχρή, οριζόντια επιφάνεια έως ότου το υπόστρωμα κατακαθίσει .  Μετά την πλήρη στερεοποίηση, εκχύονται τουλάχιστον 4 ml άγαρ VRBL ( 6.1 ) πάνω στην επιφάνεια του επωασμένου υποστρώματος .  Αφήνονται να στερεοποιηθούν .  6.5 .  Επώαση των τρυβλίων Petri Τα τρυβλία μεταφέρονται στον επωαστή ( 4.1.3 ). Τα τρυβλία επωάζονται ανεστραμμένα . Δεν στοιβάζονται περισσότερα από έξι κατά ύψος . Οι στιβάδες των τρυβλίων πρέπει να απέχουν μεταξύ τους και από τα τοιχώματα και την κορυφή του επωαστήρα .  Επωάζονται στους 30 +- 1 oC επί 24 +- 2 ώρες .  6.6 .  Καταμέτρηση αποικιών 6.6.1 .  Οι αποικίες καταμετρούνται στα τρυβλία Petri που δεν περιέχουν περισσότερες από 150 αποικίες . Καταμετρώνται οι αποικίες με χρώμα σκούρο ερυθρό και διάμετρο τουλάχιστον 0,5 mm με ή χωρίς περιβάλλον ίζημα, χαρακτηριστικό για κολοβακτηρίδια .  6.6.2 .  Εάν όλες ή μερικές αποικίες έχουν μη χαρακτηριστική εμφάνιση ( διαφέρουν σε χρώμα, μέγεθος ή το σχηματισμό ιζήματος από τυπικές αποικίες ) εκτελείται δοκιμή επιβεβαίωσης ( 6.7 ).  6.7 .  Δοκιμή επιβεβαίωσης Σύμφωνα με τις ενδείξεις που δόθηκαν στο σημείο 6.6.2 εκτελείται μια δοκιμή επιβεβαίωσης σε κατάλληλο αριθμό ( π.χ . 3 έως 5 ) μη χαρακτηριστικών αποικιών με εμβολιασμό λαμπρού πράσινου ζωμού λακτόζης-χολής ( 5.2 ) μέσα σε σωλήνες χρησιμοποιώντας συρμάτινη  βελόνα ( 4.1.6 ). Οι σωλήνες επωάζονται στους 30 +- 1 oC επί 24 +- 2 ώρες .  Οι αποικίες που παράγουν αέριο στο σωλήνα Durham θεωρούνται επιβεβαιωμένες αποικίες κολοβακτηριδίων .  7 .  Υπολογισμός και έκφραση αποτελεσμάτων 7.1 .  Χρησιμοποιούνται μετρήσεις ( βλέπε σημείο 7.4 ) από τρυβλία που δεν περιέχουν περισσότερες από 150 αποικίες .  7.2 .  Εάν εκτελεστεί δοκιμή επιβεβαίωσης, ο αριθμός αποικιών κολοβακτηριδίων επιβεβαιώνεται από το ποσοστό επιβεβαιωμένων αποικιών κολοβακτηριδίων .  7.3 .  Ο αριθμός των κολοβακτηριδίων ανά ml πστεριωμένου γάλακτος δίνεται από τη σχέση :   Σ C  ,  S C η  ,  όπου S C = είναι ο ολικός αριθμός αποικιών κολοβακτηριδίων ( σημείο 7.1 σε συνδυασμό με το σημείο 7 .2 ) που βρέθηκαν με την εξέταση του δείγματος γάλακτος ( 3 ml ).  η = είναι ο αριθμός των ml του εξετασθέντος δείγματος ( 6.3 ) ( 3 ml ).  Η μέτρηση δίνεται με ακρίβεια δύο σημαντικών ψηφίων όταν πρόκειται για περισσότερες από 100 αποικίες . Όταν το ψηφίο που πρέπει να στρογγυλοποιηθεί είναι 5, στρογγυλοποιείται έτσι ώστε το ψηφίο που παραμένει αριστερά του να είναι ζυγός αριθμός .   Εάν υπάρχουν μόνο μετρήσεις υπερβαίνουσες τις 150 αποικίες, το αποτέλεσμα αναφέρεται ως ο "Εκτιμούμενος αριθμός κολοβακτηριδίων ανά ml ".  8 .  Ακρίβεια Δεν υπάρχουν αποτελέσματα διεθνώς αναγνωρισμένων δοκιμών συνεργασίας .  VΙΙ . ΚΑΤΑΜΕΤΡΗΣΗ ΣΩΜΑΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ  Η μέθοδος αυτή καθορίζει δύο μεθόδους ως διαδικασίες αναφοράς καταμέτρησης σωματικών κυττάρων :   Α .  Τη μικροσκοπική μέθοδο  B .  Τη φθοριο-οπτικο-ηλεκτρονική μέθοδο  Α . Μικροσκοπική μέθοδος 1 .  Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής Η διαδικασία αυτή καθορίζει τη διαδικασία αναφοράς καταμέτρησης σωματικών κυττάρων σε ακατέργαστο γάλα .  Η διαδικασία αυτή καθορίζει τη διαδικασία καταμέτρησης του αριθμού των κυττάρων σε δείγμα γάλακτος για να βαθμονομηθεί και ελεγχθεί η ακρίβεια της φθοριο-οπτικο-ηλεκτρονικής μεθόδου ( βλέπε σημείο Β.Ι ).  2 .  Ορισμός Για τη διαδικασία αυτή σωματικά κύτταρα είναι εκείνα τα κύτταρα, π.χ . λευκοκύτες και επιθηλιακά κύτταρα των οποίων οι πυρήνες χρωματίζονται χαρακτηριστικά με κυανό του μεθυλίου .  3 .  Αρχή 0,01 ml γάλακτος απλώνονται πάνω σε 1 cm 2 μιας πλάκας . Ο υμένας ξηραίνεται και χρωματίζεται . Η καταμέτρηση πραγματοπιοείται με τη βοήθεια μικροσκοπίου . Ο αριθμός των σωματικών κυττάρων που καταμετρήθηκε σε μια ορισμένη περιοχή πολλαπλασιάζεται επί τον  πειραματικό συντελεστή για να δώσει τον αριθμό κυττάρων ανά ml .  4 .  Αντιδραστήρια Πρέπει να χρησιμοποιούνται χημικιά αναλυτικού βαθμού .  Διάλυμα χρωστικής Σύσταση Κυανό μεθυλενίου 0,6 g Αιθανόλη - 99 % 54,6ml 1,1,1-τριχλωροαιθάνιο ή τετραχλωροαιθάνιο 40,6ml Παγωμένο οξεικό οξύ  6,6ml Προειδοποίηση Το τετραχλωροαιθάνιο είναι δηλητηριώδες . Εάν χρησιμοποιηθεί, η παρασκευή και ο χειρισμός πρέπει να γίνουν σε απαγωγό εστία .  Παρασκευή Αναμειγνύονται η αιθανόλη και το 1, 1, 1-τριχλωροαιθάνιο ή τετραχλωροαιθάνιο σε φιάλη και θερμαίνονται σε υδρόλουτρο στους 60-70 γC . Προστίθεται το κυανό του μεθυλενίου, αναμειγνύονται προσεκτικά, ψύχονται σε ψυγείο στους 4 γC επί 12 έως 24 ώρες και  προστίθεται το παγωμένο οξεικό οξύ . Διηθούνται, χρησιμοποιώντας ηθμό με πόρους μεγέθους 10 έως 12 μικρών το λιγότερο, και το διάλυμα της χρωστικής φυλάσσεται σε αεροστεγή φιάλη . Εάν σχηματιστούν σωματίδια ή ίζημα, επαναδιηθείται πριν από τη χρήση .  5 .  ιΟργανα και γυάλινα σκεύη 5.1 .  Μικροσκόπιο, μεγεθυντικής ικανότητας x 500 έως x 1 000 .  5.2 .  Μικροσύριγγα, 0,01 ml, ακιβειας 2 % ή καλύτερης .  5.3 .  Πλάκα, με σημειωμένη περιοχή 20 mm x 5 mm για τον υμένα, ή τυποποιημένη πλάκα και πλακέτα 20 mm x 5 mm για τον υμένα .  5.4 .  Επίπεδη θερμαινόμενη πλάκα, ( 30-50 oC ) για ξήρανση του υμένα :  5 .6 .  Υδρόλουτρο, ικανό να λειτουργεί στους 30-40 γC για θέρμανση του δείγματος γάλακτος .  5.7 .  Μικρομετρικός κανόνας, βαθμονομημένος, σε υποδιαιρέσεις των 0,01 mm .  6 .  Διαδικασία 6.1.  Δείγμα γάλακτος Το δείγμα του γάλακτος πρέπει να εξετάζεται μέσα σε έξι ώρες από τη δειγματοληψία . Κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης η θερμοκρασία του δείγματος δεν πρέπει να υπερβαίνει τους 6 γC . Πρέπει να αποφεύγεται η κατάψυξη .  6.2 .  Προετοιμασία του δείγματος στο εργαστήριο Το δείγμα θερμαίνεται σε υδρόλουτρο ( 5.6 ) στους 30-40 γC . Κατόπιν αναμειγνύεται προσεκτικά . Ψύχεται στην θερμοκρασία στην οποία η μικροσύριγγα ( 5.2 ) έχει βαθμονομηθεί, π.χ . 20 γC .  6.3 .  Προεπεξεργασία των πλακών Οι πλάκες ( 5.3 ) καθαρίζονται, για παράδειγμα με αιθανόλη, στεγνώνονται με χαρτί απηλλαγμένο σκόνης, περνούν πάνω από φλόγα και ψύχονται . Φυλάσσονται σε δοχείο για να προφυλαχθούν από σκόνη .  6.4 .  Παρασκευή του υμένα Αναλαμβάνονται 0,01 ml γάλακτος από το δείγμα που προετοιμάστηκε κατά τα ανωτέρω, χρησιμοποιώντας μικροσύριγγα ( 5.2 ). Καθαρίζεται προσεκτικά το εξωτερικό μέρος της σύριγγας που ήρθε σε επαφή με γάλα . Η σύριγγα τοποθετείται πάνω στην πλάκα ( 5.3 ), πρώτα  ακολουθώντας τον περίγυρο του σχήματος ( 20 mm x 5 mm ). Μετά γεμίζεται η επιφάνεια εσωτερικά, κατά το δυνατόν ομοιόμορφα . Ο υμένας ξηραίνεται πάνω σε επίπεδη θερμαινόμενη πλάκα ( 5.4 ) έως ότου ξηρανθεί εντελώς .  Πρέπει να παρασκευαστούν και εξεταστούν τουλάχιστον δύο υμένες από κάθε δείγμα γάλακτος .  6.5 .  Χρωματισμός των υμένων Βυθίζονται στο διάλυμα χρωστικής ( 4 ) επί δέκα λεπτά . Ξηραίνονται, εάν χρειαστεί, συμπληρωματικά με ανεμιστήρα ( 5.5 ). Οι υμένες βυθίζονται σε νερό της βρύσης έως ότου όλη η επιπλέον χρωστική ξεπλυθεί . Μετά ξηραίνονται ξανά και φυλάσσονται προφυλαγμένοι  από τη σκόνη .  6.6 .  Βαθμονόμηση του μικροσκοπικού πεδίου Η διάμετρος του μικροσκοπικού πεδίου προσδιορίζεται με τη βοήθεια του μικρομετρικού κανόνα ( 5.7 ) ανάλογα με την επιλεγόμενη μεγέθυνση ( x 500 -x 1 000 ).  7 .  Καταμέτρηση και υπολογισμός 7.1 .  Καταμέτρηση κυττάρων Χρησιμοποιείται μικροσκόπιο ( 5.1 ). Αντί να καταμετρηθούν κύτταρα, καταμετρώνται μόνο πυρήνες κυττάρων . Αυτοί είναι ευκρινώς αναγνωρίσιμοι και για την καταμέτρηση πρέπει τουλάχιστον ο μισός πυρήνας να είναι ορατός στο μικροσκοπικό πεδίο . Καταμετρώνται  λωρίδες ή περιοχές κατά μήκος του μεσαίου τρίτου του υμένα, αποφεύγεται η καταμέτρηση λωρίδων ή περιοχών επιλεγμένων αποκλειστικά από τις περιφερειακές περιοχές του υμένα . Η προσεκτική παρασκευή των υμένων και, επομένως η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων,  πρέπει να ελέγχεται τουλάχιστον μια φορά το μήνα, καταμετρώντας διαφορετικά τμήματα του υμένα . Η καταμέτρηση μπορεί επίσης να πραγματοποιηθεί καταμετρώντας μικροσκοπικά πεδία σε τέτοια κατανομή ώστε όλα τα τμήματα του υμένα να αντιπροσωπεύονται  ισοδύναμα .  7.2 .  Ελάχιστος αριθμός κυττάρων προς καταμέτρηση Αφού η μικροσκοπική καταμέτρηση σωματικών κυττάρων μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τυποποίηση αυτοματοποιημένων και μηχανοποιημένων διαδικασιών καταμέτρησης, ο συντελεστής διακύμανσης μετρήσεων ταυτόσημων δειγμάτων δεν πρέπει να είναι υψηλότερος από  αυτόν των ηλεκτρονικών οργάνων . Ο συντελεστής διακύμανσης για δείγμα γάλακτος περιέχοντος 400 000 έως 600 000 κύτταρα/ml δεν πρέπει να υπερβαίνει το 5 %.  Ο αριθμός σωματικών κυττάρων προς καταμέτρηση σε κάθε δείγμα πρέπει, σύμφωνα με τα χαρακτηριστικά της κατανομής Poisson, να είναι τουλάχιστον 400, για να επιτυγχάνεται η επαναληψιμότητα αυτή .  Η κατανομή Poisson προϋποθέτει :  M = V = S 2,  όπου M είναι η μέση αριθμητική τιμή,  V είναι η διακύμανση και s είναι η τυπική απόκλιση .  Ο συντελεστής διακύμανσης είναι :  CV =  s x 100 %  η CV =  100 %  η CV =  100 %   CV = s x 100 %M η CV = 100 % s η CV = 100 % wM - Το M ( μέσος όρος ) υποδηλώνει τον αριθμό των σωματιδίων ( κυττάρων ) που έχουν καταμετρηθεί ( π.χ . 400 για CV = 5 %).  7.3 .  Υπολογισμός του πειραματικού συντελεστή Ο πειραματικός συντελεστής υπολογίζεται χρησιμοποιώντας 0,01 ml γάλακτος σύμφωνα με τα σημεία 7.3.1 ή 7.3.2 .  7.3.1 Καταμέτρηση λωρίδων κατά μήκος του υμένα Το μήκος των λωρίδων προς καταμέτρηση είναι 5 mm η καθεμία . Το πλάτος μιας λωρίδας αντιστοιχεί στη διάμετρο του μικροσκοπικού πεδίου όπως προσδιορίστηκε με το μικρομετρικό κανόνα ( 5.7 ).   Πειραματικος συντελεστης  = 20x 100   Πειραματικός συντελεστής =  20 x 100 d x b όπου d = είναι η διάμετρος του μικροσκοπικού πεδίου σε mm όπως προσδιορίστηκε με τον μικρομετρικό κανόνα ( 5.7 ),  b = είναι ο αριθμός των λωρίδων που έχουν πλήρως καταμετρηθεί .  7.3.2 .  Καταμέτρηση μικροσκοπικών πεδίων στο μεσαίο τρίτο του υμένα ή με πλέγμα  Πειραματικός συντελεστής =  20 x 5 x 100  =  12 732   Πειραματικός συντελεστής = 20 x 5 x 100 Π x d 2 x s 4 = 12 732 d 2 x s όπου d = είναι η διάμετρος του μικροσκοπικού πεδίου σε mm όπως προσδιορίστηκε με τον μικρομετρικό κανόνα ( 5.7 ),  s = είναι ο αριθμός των πεδίων που μετρήθηκαν .  7.4 .  Υπολογισμός της περιεκτικότητας κυττάρων Ο αριθμός των σωματικών κυττάρων που μετρήθηκαν ( 7.1 και 7.2 ) πολλαπλασιάζεται επί το πειραματικό συντελεστή ( 7.3 ), για να δώσει τον αριθμό κυττάρων ανά ml γάλακτος .  7.5 .  Ακρίβεια Ο συντελεστής διακύμανσης ( 7.2 ) δεν πρέπει να υπερβαίνει το 5 %.  Δεν υπάρχουν αποτελέσματα από διεθνώς αναγνωρισμένες δοκιμές συνεργασίας όσον αφορά την ακρίβεια .   Β .  Φθοριο-οπτικο-ηλεκτρονική μέθοδος 1 .  Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής Η διαδικασία αυτή καθορίζει τη διαδικασία αναφοράς, η οποία μετά από ορθή βαθμονόμηση ( βλέπε Α.1 ), μπορεί να χρησιμοποιηθεί προς καταμέτρηση σωματικών κυττάρων σε ακατέργαστο γάλα - με ή χωρίς χημική διατήρηση .  2 .  Ορισμός Για τη διαδικασία αυτή, σωματικά κύτταρα είναι κύτταρα με μια ελάχιστη ένταση φθορισμού οφειλόμενη στη χρώση του DNA του πυρήνα των σωματικών κυττάρων .  3 .  Αρχή ιΕνα μέρος του δείγματος ( π.χ . 0,2 ml ) αναμειγνύεται πλήρως με ρυθμιστικό διάλυμα και διάλυμα φθορισμού . Μέρος του μείγματος αυτού μεταφέρεται μετά στη μορφή λεπτού υμένα σε περιφερόμενο δίσκο που χρησιμεύει ως αντικειμενικό πεδίο του μικροσκόπιου .  Κάθε κύτταρο παράγει ένα ηλεκτρικό παλμό ο οποίος ενισχύεται και καταγράφεται . Ο αριθμός των σωματικών κυττάρων εκτυπώνεται σε χιλιάδες ανά ml .  4 .  Αντιδραστήρια Πρέπει να χρησιμοποιούνται χημικά αναλυτικού βαθμού, εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά . Το νερό πρέπει να είναι είτε απεσταγμένο είτε απιονισμένο είτε ισοδύναμης καθαρότητας .  4.1 .  Ρυθμιστικό διάλυμα Σύσταση Υδροφθαλικό κάλιο 51,0 g Υδροξείδιο καλίου 13,75 g Πολυαιθυλενογλυκολο-μονο-π(1,1,3,3-τετραμεθυλοβουτυλο)-φαινυλαιθέρας ( π.χ . triton Χ-100 ), 1 % κατά όγκο 10 ml pH 5,7-5.9 . Ο όγκος συμπληρώνεται με νερό έως τα 10 000 ml .  Παρασκευή Αναμειγνύονται τα ανεξάρτητα συστατικά . Η αεροστεγής φύλαξη δεν πρέπει να υπερβαίνει τις επτά ημέρες.  4.2 .  Διάλυμα φθορισμού ( μητρικό διάλυμα ) Σύσταση Βρωμιούχο αιθίδιο 1,0 g Ο όγκος συμπληρώνεται με νερό έως τα 1 000 ml Παρασκευή Διαλύεται βρωμιούχο εθίδιο σε νερό . Η φύλαξη σε αδιαφανή και αεροστεγή φιάλη δεν πρέπει να υπερβαίνει τους δύο μήνες .  4.3 .  Διάλυμα φθορισμού ( διάλυμα εργασίας ) Αναμειγνύονται 20 ml μητρικού διαλύματος ( 4.2 ) με το ρυθμιστικό διάλυμα ( 4.1 ) για να δώσουν 1 000 ml . Το διάλυμα εργασίας δεν πρέπει να χρησιμοποιείται επί περισσότερο από επτά ημέρες .  4.4 .  Διάλυμα καθαρισμού Σύσταση Ρυθμιστικό διάλυμα ( 4.1 ) 10 ml Πολυαιθυλενογλυκολο-μονο-π-(1,1,3,3-τετραμεθυλβουτυλ)-φαινυλαιθέρας ( π.χ . triton Χ-100 ), 1 % κατά όγκο 10 ml Αμμωνία, 25 % κατά όγκο 25 ml Ο όγκος συμπληρώνεται με νερό έως τα 10 000 ml Παρασκευή Αναμειγνύονται τα ανεξάρτητα συστατικά . Η φύλαξη δεν πρέπει να υπερβαίνει τις 30 ημέρες .  5 .  ιΟργανα και γυάλινα σκεύη 5.1 .  ιΟργανο μέτρησης, που λειτουργεί με βάση την οπτική αρχή του φθορισμού .  Σημείωση Το όργανο πρέπει να βαθμονομηθεί πριν από τη χρήση . Προσδιορίζεται έτσι η σχέση μεταξύ του όγκου των σωματιδίων προς καταμέτρηση και του κατώτερου ορίου πάνω από το οποίο γίνονται οι μετρήσεις . Η βαθμονόμοηση της συσκευής γίνεται σύμφωνα με τις οδηγίες  του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας δείγματα των οποίων η περιεκτικότητα κυττάρων έχει προσδιοριστεί με τη μικροσκοπική μέθοδο ( Α ).  5.2 .  Υδρόλουτρο, με κυκλοφορητή, ικανό να λειτουργεί στους 40 +- 1 oC .  5.3 .  Δοκιμαστικός σωλήνας, με κατάλληλο κλείσιμο, των 15 ml περίπου .  6.  Δείγμα γάλακτος 6.1 .  Το δείγμα πρέπει να διατηρείται σε χαμηλή θερμοκρασία σε δοκιμαστικό σωλήνα ( 5.3 ). Εάν το δείγμα δεν έχει συντηρηθεί χημικά, δεν πρέπει να καταμετράται μέσα στις πρώτες 24 ώρες από την άλμεξη, επειδή οι μετρήσεις θα είναι υπερβολικά χαμηλές . Η  θερμοκρασία διατήρησης δεν πρέπει να υπερβαίνει τους 6 γC .  6.2 .  Συντήρηση Η χημική συντήρηση πρέπει να πραγματοποιείται μέσα σε 24 ώρες . Η συντήρηση πρέπει να πραγματοποιείται κατά το δυνατόν συντομότερα μετά τη δειγματοληψία .  6.2.1 .  Η χημική συντήρηση του δείγματος μπορεί να επιτευχθεί με την προσθήκη ενός από τα ακόλουθα συντηρητικά :  - ορθοβορικό οξύ :  η τελική συγκέντρωση του ορθοβορικού οξέος στο δείγμα δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 0,6 g/100 ml . ιΕνα έτσι συντηρημένο δείγμα μπορεί να διατηρηθεί επί 24 ώρες ακόμα στους 6-12 γC,  - διχρωμικό κάλιο :  η τελική συγκέντρωση του διχρωμικού κάλιου δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 0,2 g/100 ml . Δείγματα συντηρημένα έτσι μπορούν να διατηρηθούν επί 72 ώρες ακόμα στους 6-12 γC,  - αζίδιο νάτριου :  τα δείγματα μπορούν να συντηρηθούν με αζίδιο νατρίου σε τελική συγκέντρωση 0,024 g/100 ml, εφόσον το δείγμα ψυχθεί στους 6-12 γC αμέσως μετά τη δειγματοληψία και μετρηθούν μέσα σε 48 ώρες από τη δειγματοληψία,  - bronopol :  το δείγμα μπορεί να διατηρηθεί με bronopol σε τελική συγκέντρωση 0,05 g/100 ml, εφόσον το δείγμα ψυχθεί στους 6-12 γC αμέσως μετά τη δειγματοληψία και μετράται μέσα σε 72 ώρες από τη δειγματοληψία .  6.2.2 .  Ένα δείγμα που έχει ήδη συντηρηθεί με ορθοβορικό οξύ μπορεί να συντηρηθεί επί 48 ώρες ακόμα χρησιμοποιώντας διχρωμικό κάλιο .  Σημείωση Πρέπει να εξετάζονται οι τοπικές συνθήκες ( όροι ) που αφορούν την απόρριψη λυμάτων για δείγματα συντηρημένα με διχρωμικό κάλιο .  7 .  Διαδικασία 7.1 .  Προεπεξεργασία του δείγματος Το γάλα προς εξέταση πρέπει να φυλάσσεται μετά την άμελξη επί τουλάχιστον 24 ώρες στους 2-6 γC περίπου . Δεν συνίσταται η μέτρηση των δειγμάτων την ημέρα της άμελξης χωρίς προεπεξεργασία, επειδή τα αποτελέσματα μπορεί να είναι υπερβολικά χαμηλά . Εάν χρειαστεί να μετρηθεί τέτοιο δείγμα, πρέπει να προεπεξεργαστεί επί τρεις τουλάχιστον ώρες με  διχρωμικό κάλιο ( βλέπε συμείο 6.2.1 ).  7.2 .  Προετοιμασία Το προεπεξεργασμένο δείγμα ( 7.1 ), ή το μη επεξεργασμένο δείγμα που είναι τουλάχιστον μιας ημέρας, θερμαίνεται σε υδρόλουτρο ( 5.2 ) στους 40 γC . Μετά, το δείγμα διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι να γίνουν οι μετρήσεις .  7.3 .  Καταμέτρηση κυττάρων Η καταμέτρηση πρέπει να πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας το όργανο μέτρησης ( 5.1 ) μέσα σε 15 λεπτά από το τέλος της θέρμανσης ( βλέπε σημείο 7.2 ). Αμέσως πριν από τη μέτρηση, το δείγμα πρέπει να αναμειχθεί πλήρως για να επιτευχθεί μια κατά το δυνατόν  ομοιογενής κατανομή των σωματικών κυττάρων .  Η περαιτέρω αραίωση και προετοιμασία του δείγματος θα πραγματοποιηθεί αυτόματα στο όργανο.  8 .  Ακρίβεια Δεν υπάρχουν στοιχεία επαναληψιμότητας ( r ) και αναπαραγωγιμότητας ( R ) από διεθνείς δοκιμές συνεργασίας .  Στο μέλλον θα αναφερθούν δεδομένα ακρίβειας .  Τα διαθέσιμα δεδομένα σε εθνικό επίπεδο επιτρέπουν τις ακόλουθες εκτιμήσεις :  Επίπεδο καταμέτρησης κυττάρων μεταξύ 400 000 και 500 000/ml - τυπική απόκλιση επαναληψιμότητας :  sr =  20 000 κύτταρα/ml ( ένας ισοδύναμος συντελεστής διακύμανσης 5-4 %),  - τυπική απόκλιση αναπαραγωγιμότητας :  sr = 40 000 κύτταρα/ml ( ένας ισοδύναμος συντελεστής διακύμανσης 10-8 %).  9 .  ιΕλεγχος πιστότητας Ο έλεγχος της πιστότητας πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας δείγματα γνωστής περιεκτικότητας κυττάρων, προσδιορισμένης με μικροσκοπικές μετρήσεις κυττάρων σε εθνικό εργαστήριο αναφοράς .  VIII . ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΣΟΥΛΦΟΝΑΜΙΔΙΩΝ  ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΚΑΙ ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ Η μέθοδος αυτή καθορίζει τη διαδικασία αναφοράς ανίχνευσης αντιβιοτικών και σουλφοναμίδιων σε ακατέργαστο γάλα και σε θερμικά επεξεργασμένο γάλα .  Η διαδικασία αναφοράς περιλαμβάνει :  Α . Ποιοτική μέθοδος Η διαδικασία αυτή είναι η αρχική διαδικασία κατά την οποία εντοπίζονται δείγματα γάλακτος περιέχοντα αντιβιοτικά περιλαμβανομένων των σουλφοναμίδιων . Η περιγραφόμενη διαδικασία είναι μια από παρόμοιες διαδικασίες, οι οποίες κατά βάση όλες χρησιμοποιούν  τον Basillus stearothermophilus var . calidolactis, ATCC 10149 ως οργανισμό ελέγχου . Η διαδικασία έχει επιλεγεί ως αντιπροσωπευτική για τέτοιους ελέγχους .  Β . Διαδικασία για επιβεβαίωση και ταυτοποίηση πενικιλλίνης Η διαδικασία αυτή πρέπει να χρησιμοποιηθεί για να επιβεβαιωθούν τα αποτελέσματα της ποιοτικής μεθόδου, να ταυτοποιηθεί η παρουσία πενικιλλίνης και να προσδιοριστεί η συγκέντρωση πενικιλλίνης .   Α . Ποιοτική μέθοδος 1 .  Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής Η διαδικασία καθορίζει τον ποιοτικό προσδιορισμό αντιβιοτικών και σουλφαμίδιων, σε ακατέργαστο και θερμικά επεξεργασμένο γάλα, που υπερβαίνουν τα όρια που καθορίζονται στον κατωτέρω πίνακα :   Ανιχνεύσιμες συγκεντρώσεις διαφόρων αντιβιοτικών και σουλφοναμίδιων (;)  Ευαισθησία δοκιμής Όλα αρνητικά Όλα θετικά Βενζυλοπενικιλλίνη 0,002  0,006 Αμπικιλλίνη 0,002  0,005 Κλοξακιλλίνη 0,015  0,035 Ναφκιλλίνη 0,006  0,011 Τετρακυκλίνη 0,10   0,40  Οξυτετρακυκλίνη 0,20   0,45  Χλωροτετρακυκλίνη 0,15   0,50  Χλωραμφενικόλη 7,  15,  Διϋδροστρεπτομυκίνη 4,  13,  Νεομυκίνη 1,  22,  Καναμυκίνη 9,  28,  Βακιτρακίνη 0,06   0,14  Ερυθρομυκίνη 1,   2,25  Ριφαμυκίνη 0,01   0,14  Διαφαινυλσουλφόνη 0,01   0,1   Σουλφαμεθαζίνη ( Σουλφαδιμιδίνη ) 0,5    1,  (;) Βενζυλοπενικιλλίνη και βακιτρακίνη εκφρασμένες σε Ul/ml, όλα τα άλλα αντιβιοτικά σε μg/ml .  2 .  Ορισμός Το γάλα περιέχει αντιβιοτικά ή σουλφοναμίδια όταν το χρώμα του υποστρώματος δεν μεταβάλλεται ( βλέπε σημείο 7.1 ).  3 .  Αρχή Προστίθεται δείγμα γάλακτος μαζί με θρεπτικά συστατικά σε πήγμα από άγαρ που περιέχει δείκτη pH και σπόρια του Bacillus Stearothermophilus Var . Calidolactis ATCC 10149 ( 5.4.1 ), ο οποίος έχει μια καλή γενική ευαισθησία και είναι ιδιαίτερα ευαίσθητος σε  αναστολή με πενικιλλίνη . Η επώαση που οδηγεί στην κανονική ανάπτυξη και παραγωγή οξέος από τον οργανισμό, προκαλεί την αλλαγή του χρώματος του δείκτη pH από πορφυρό σε κίτρινο . Η παρουσία στο γάλα ουσιών που αναστέλλουν την ανάπτυξη του οργανισμού είναι  η αιτία που το χρώμα του δείκτη pH παραμένει πορφυρό .  4 .  ιΟργανα και γυάλινα σκεύη Ο συνηθισμένος εργαστηριακός εξοπλισμός και ιδιαίτερα :  4.1 .  ιΟργανα 4.1.1 .  Επωαστής, ικανός να διατηρεί θερμοκρασία 64 π 1γC .  4.1.2 .  Υδρόλουτρο, ικανό να λειτουργεί στους 64 π 1 γC.  4.1.3 .  Στήριγμα, για σωλήνες ή φύσιγγες .  4.1.4 .  Σιφώνιο, με αντικαταστάσιμα ακροφύσια μίας χρήσης, κατάλληλα για δειγματοληψία και παροχή 0,1 ml .  4.1.5 .  Τανάλιες ή λαβίδες 4 .1.6 .  Κλίβανος θερμού αέρα, ικανός να λειτουργεί στους 170 έως 175 γC .  4.1.7 . Αυτόκλειστο, ικανό να λειτουργεί στους 121 π 1 γC .  4.1.8 .  pHμετρο 4.2 .  Γυάλινα σκεύη 4.2.1 .  Φιάλες δείγματος με κατάλληλα κλεισίματα .  Σημείωση Μερικά πώματα από ελαστικό μπορεί να αποθέσουν ανασταλτικές ουσίες στο λαιμό της φιάλης .  4.2.2 .  Τρυβλία Petri, από διαφανές, άχρωμο γυαλί ή αποστειρωμένο συνθετικό υλικό με επίπεδους πυθμένες ομοιόμορφου πάχους, ελάχιστης εσωτερικής διαμέτρου 140 mm .  4.2.3 .  Φιάλες, χωρητικότητας 250 ml .  4.2.4 .  Σιφώνια, ( πωματισμένα με ακατέργαστο βάμβακα ) από γυαλί ή αποστειρωμένο συνθετικό υλικό ονομαστικής χωρητικότητας 1 ml και 10 ml .  4.2.5 .  Γυάλινες σπάτουλες 4.2.6 .  Σωλήνες ή φύσιγγες, εσωτερικής διαμέτρου περίπου 8 mm, με καπάκια ή πώματα .  4.2.7 .  Αποστείρωση γυάλινων σκευών Τα γυάλινα σκεύη πρέπει να αποστειρώνονται με μια από τις ακόλουθες μεθόδους :  α )  διατηρούμενα στους 170 έως 175 γC επί όχι λιγότερο από μια ώρα σε κλίβανο θερμού αέρα ( 4.1 .6 )- β ) διατηρούμενα στους 121 π 1 γC επί όχι λιγότερο από 20 λεπτά σε αυτόκλειστο ( 4.1.7 ).  Πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα ώστε να εξασφαλίζεται η επαρκής διείσδυση ατμού στο αυτόκλειστο : αν ο εξοπλισμός αποστειρώνεται σε δοχεία, αυτά δεν πρέπει να είναι ερμητικά κλεισμένα, οι φιάλες και τα φιαλίδια πρέπει να έχουν χαλαρά πώματα .  Τα γυάλινα σκεύη που αποστειρώθηκαν στο αυτόκλειστο πρέπει να στεγνώνονται με απαγωγή του ατμού .  Τα σιφώνια πρέπει να αποστειρώνονται σε κλίβανο θερμού αέρα .  5 .  Υποστρώματα, διαλύματα, δοκιμαστικός οργανισμός Τα συστατικά των υποστρωμάτων πρέπει να είναι κατάλληλα για βακτηριολογικές αναλύσεις . Το χρησιμοποιούμενο νερό πρέπει να είναι απεσταγμένο σε γυάλινη διάταξη ή αφαλατωμένο ισοδύναμης καθαρότητας . Δεν πρέπει να περιέχει ουσίες ανασταλτικές στον  δοκιμαστικό οργανισμό .  5.1 .  Υποστρώματα 5.1.1 .  Θρεπτικό άγαρ Σύσταση Εκχύλισμα μαγιάς 2 g Πεπτόνη 5 g Εκχύλισμα κρέατος 1 g Χλωριούχο νάτριο 5 g ΦΑ-2>Αγαρ 10-15 g Νερό 1 000 ml Παρασκευή Τα συστατικά διαλύονται σε νερό . Φέρονται σε βρασμό, αναδευόμενα κατά διαστήματα . Το pH προσαρμόζεται έτσι ώστε μετά την αποστείρωση να είναι 7,4 π 0,1 στους 25 γC .  Κατανέμονται ποσότητες των 10 ml μέσα σε δοκιμαστικούς σωλήνες για να σχηματιστούν κεκλιμένα σώματα άγαρ ή ποσότητες των 100 ml μέσα σε φιάλες .  Αποστειρώνονται στους 121 π 1 γC επί 15 λεπτά .  5.1.2 .  Υπόστρωμα άγαρ Σύσταση Χλωριούχο νάτριο 2 g ΦΑ-2>Αγαρ 15 g Νερό 1 000 ml Διάλυμα τριμεθοπρίμης ή τετροξοπρίμης ( βλέπε σημείο 5 .1.3 ) ( 2 ) 10 ml Παρασκευή Διαλύονται τα συστατικά εκτός της τριμεθοπρίμης ή της τετροξοπρίμης σε νερό . Φέρονται σε βρασμό, αναδευόμενα κατά διαστήματα . Προστίθεται τριμεθοπρίμη ή τετροξοπρίμη και αποστειρώνονται στους 121 π 1 γC επί 15 λεπτά - το pH προσαρμόζεται έτσι ώστε μετά  την αποστείρωση να είναι 7,0 π 0,1 στους 25 γC .  5.1.3 .  Διάλυμα trimethoprim ( τριμεθοπρίμη ) ή tetroxoprim ( τετροξοπρίμη ) Σύσταση Trimethoprim  5 mg ή tetroxoprim 30 mg Αιθανόλη 96 %  5 ml ή 30 ml Νερό αποσταγμένο μέχρι 1 000 ml Παρασκευή Διαλύεται η trimethoprim ή tetroxoprim στην αιθανόλη ( 5 ή 30 ml ) και αραιώνεται με νερό .  5.1.4 .  Θρεπτικό παρασκεύασμα Σύσταση Εκχύλισμα μαγιάς  0,75 mg Γλυκόζη  5,0 mg Διαλυτό άμυλο  8,0 mg Πορφυρό βρωμοκρεζόλης  0,025 g Νερό μέχρι 50 ml Παρασκευή Τα υλικά και ο δείκτης διαλύονται σε νερό θερμαίνοντας, αν χρειάζεται, και αποστειρώνεται το διάλυμα με διήθηση . Το θρεπτικό παρασκεύασμα διατίθεται στο εμπόριο σε παστίλιες .  5.2 .  Πρότυπα διαλύματα πενικιλλίνης 5.2.1 .  Παρασκευάζεται ένα διάλυμα πενικιλλίνης των 60 μg/ml = ( 100 Ul/ml ) διαλύοντας κρυσταλλικό άλας νατρίου ή καλίου της βενζυλοπενικιλλίνης σε αποστειρωμένο αποσταγμένο νερό σε κατάλληλα πωματισμένη αποστειρωμένη φιάλη .  5.2.2 .  Παρασκευάζεται ένα διάλυμα εργασίας από πενικιλλίνη αραιώνοντας 1,25 ml από το διάλυμα πενικιλλίνης ( 5.2.1 ) στα 1 000 ml, με αποστειρωμένο αποσταγμένο νερό . Αυτό το διάλυμα εργασίας περιέχει 0,075 μg πενικιλλίνης/ml (= 0,125 Ul πενικιλλίνης/ml ).  5.2.3 .  Παρασκευάζονται 75 ml ενός προτύπου διαλύματος πενικιλλίνης που περιέχει 0,004 μg πενικιλλίνης/ml (= 0,0067 Ul πενικιλλίνης/ml ) προσθέτοντας 71 ml γάλακτος ελεύθερου αναστατικών ουσιών σε 4 ml διαλύματος εργασίας πενικιλλίνης ( 5.2.2 ) και αναμειγνύοντας  τα δύο υγρά .   5.2.4 .  Τα διαλύματα πενικιλλίνης που μνημονεύονται στα σημεία 5.2.1 έως 5.2.3, πρέπει να παρασκευάζονται την ημέρα της δοκιμασίας .  5.3 .  Γάλα απηλλαγμένο αναστολέων Παρασκευάζεται ως δείγμα ελέγχου γάλα απηλλαγμένο αναστολέων ανασυστώντας σκόνη αποβουτυρωμένου γάλακτος ( 10 % β/ο ) προηγούμενα ελεγμένου ως απηλλαγμένου ανασταλτικών ουσιών, σε αποστειρωμένο νερό . Εναλλακτικά, μια επαρκής ποσότητα νωπού χύμα γάλακτος  ελεγμένου ως απηλλαγμένου ανασταλτικών ουσιών μπορεί να διαμοιραστεί σε φιάλες, να θερμανθεί επί μια ώρα στους 100 γC και κατόπιν να διατηρηθεί σε ψυγείο στους 0-6 γC για μια μέγιστη περίοδο μιας εβδομάδας .  5.4 .  Δοκιμαστικός οργανισμός 5.4.1 .  Ως δοκιμαστικός οργανισμός χρησιμοποιείται ο Bacillus Stearothermophilus variete Calidolactus, φυλή ATCC 10149 . Η φυλή είναι η ίδια με τη C 953 .  5.4.2 .  Παρασκευάζεται μητρική καλλιέργεια προς διατήρηση της δοκιμαστικής καλλιέργειας . Η δοκιμαστική καλλιέργεια διατηρείται πάνω σε κεκλιμένο τεμάχιο θρεπτικού άγαρ ( 5.1.1 ). Το τεμάχιο του άγαρ εμβολιάζεται επιφανειακά κατά λωρίδες, χρησιμοποιώντας βρόγχο  που φέρει τη δοκιμαστική καλλιέργεια και επωάζεται αεροβίως απί 48 ώρες στους 63 π 1 γC . Μετά την αποστείρωση ο σωλήνας σφραγίζεται με αποστειρωμένο πώμα από ελαστικό . Η μητρική καλλιέργεια που παραλαμβάνεται με τον τρόπο αυτό μπορεί να διατηρηθεί επί αρκετούς μήνες σε ψυγείο στους 5 γC .  5.5 .  Δοκιμαστική καλλιέργεια ( αιώρημα σπορίων ) 5.5.1 .  Μεταφέρονται ασηπτικά 20 ml θρεπτικού άγαρ ( 5.1.1 ) σε αποστειρωμένο τρυβλίο Petri ( 4.2.2 ) και ψύχονται σε θερμοκρασία δωματίου .  5.5.2 .  Μεταφέρονται 5 ml αποστειρωμένου απεσταγμένου νερού με αποστειρωμένο σιφώνιο ( 4.2.4 ) σε σωλήνα με μητρική καλλιέργεια ( 5.4.2 ) και τα σπόρια αποξέονται από το κεκλιμένο τεμάχιο άγαρ χρησιμοποιώντας αποστειρωμένο βρόγχο . Αυτό το αιώρημα σπορίων πρέπει να  διατηρείται στους 5 γC και να χρησιμοποιείται μέσα σε 36 ώρες .  5.5.3 .  Μεταφέρονται 0,5 ml αιωρήματος σπορίων ( 5.5.2 ) με αποστειρωμένο σιφώνιο ( 4.2.4 ) σε πλάκα καλλιέργειας ( 5.5.1 ) και το εμβόλιο διασπείρεται επιμελώς πάνω σε όλη την επιφάνεια με κεκλιμμένη γυάλινη ράβδο . Επωάζεται στους 63 π 1 γC ( 4.1.1 ) επί 16 έως 18  ώρες .  Όταν χρησιμοποιείται μητρική καλλιέργεια ( 5.4.2 ) ή καλλιέργεια παλαιότερη των 36 ωρών, η διαδικασία υποκαλλιέργειας πρέπει να εκτελείται τουλάχιστον δύο φορές, με όχι περισσότερο από ένα διάστημα 36 ωρών μεταξύ τους .  5 .5.4 .  Μεταφέρονται 10 ml απεσταγμένου νερού χρησιμοποιώντας αποστειρωμένο σιφώνιο ( 4.2.4 ) στην πλάκα καλλιέργειας ( 5.5.3 ) και αποξέονται σπόρια από την επιφάνεια μέσα στο αιώρημα χρησιμοποιώντας γυάλινη ράβδο .  Το αιώρημα των σπορίων ( 4.2.3 ) μεταφέρεται σε φιάλη ( 5.2.3 ) που περιέχει 250 ml αποστειρωμένου απεσταγμένου νερού . Η φιάλη κλείνεται και ανακινείται καλά . Οι καλλιέργιες που δεν πρόκειται να υποκαλλιεργηθούν αμέσως πρέπει να διατηρηθούν σε ψυγείο στους  0-6 γC .  5.5.5 .  Το αιώρημα των σπορίων πρέπει να έχει έναν αριθμό βιώσιμων αποικιών μεταξύ 5 και 10 εκατομμυρίων ανά ml σε μέτρηση πλάκας υποστρώματος άγαρ ( 5.1.2 ) επωασμένου στους 63 π 1 γC επί 16 έως 18 ώρες . Το αιώρημα των σπορίων πρέπει να έχει ομοιόμορφη  θολερότητα και, εάν περιέχει θρομβώματα ή ίζημα, πρέπει να απορριφθεί και να παρασκευαστεί νέο αιώρημα από την μητρική καλλιέργεια ( 5.4.2 ).  5.6 .  Προετοιμασία των δοκιμαστικών σωλήνων/φυσίγγων 5.6.1 .  Το υπόστρωμα από άγαρ ( 5.1.2 ) τήκεται και ψύχεται στους 55 γC .  5.6.2 .  Προστίθεται ένα μέρος πρόσφατου αιωρήματος σπορίων ( 5.5.4 ) σε πέντε μέρη του υποστρώματος από άγαρ ( 5.6.1 ) μέσα σε σωλήνα ή φιάλη και αναμειγνύονται πλήρως .  5.6.3 .  Μεταφέρονται 0,3 ml του εμβολιασμένου υποστρώματος ( 5.6.2 ), υπολογισμένα να δημιουργήσουν μια στιβάδα πάχους 5 mm, σε αποστειρωμένο σωλήνα ή φύσιγγα ( 4.2.6 ) που κλείνεται με πώμα ή κάλυμμα ή με τήξη του στόμιου . Οι δοκιμαστικοί σωλήνες/φύσιγγες  αφήνονται να ψυχθούν σε κάθετη θέση, για να στερεοποιηθεί το υπόστρωμα και μετά αφήνονται έτσι επί τουλάχιστον 12 ώρες .  5.6.4 .  Οι δοκιμαστικοί σωλήνες/φύσιγγες μπορούν να χρησιμοποιηθούν κατά την ίδια μέρα, αλλά μπορούν να διατηρηθούν επί αρκετούς μήνες εφόσον ψυχθούν αμέσως μετά την παρασκευή και φυλαχθούν στους 0-6 γC .  6 .  Διαδικασία 6.1 .  Τα δείγματα πρέπει να εξετάζονται κατά το δυνατόν συντομότερα και κατά προτίμηση μέσα σε 24 ώρες από τη δειγματοληψία, διατηρώντας ενδιάμεσα τα δείγματα μεταξύ 0 και 5 γC . Εάν δεν είναι δυνατόν να εξεταστούν τα δείγματα μέσα σε 24 ώρες, θα πρέπει να παραμείνουν σε κατάψυξη (- 30 έως -15 γC ) για να ελαχιστοποιηθεί η αδρανοποίηση της πενικιλλίνης .  6.2 .  Κάθε σωλήνας/φύσιγγα ( 5.6 ) επισημαίνεται ευανάγνωστα και ανεξίτηλα . Αποσύρεται το κάλυμμα ή πώμα . Ο απαιτούμενος αριθμός δειγμάτων και μαρτύρων ( 5.2 και 5.3 ) προς εξέταση τοποθετείται σε κατάλληλο στήριγμα ( 4.1.3 ).  6.3 .  Προστίθενται 50 μικρολίτρα του θρεπτικού παρασκευάσματος ( 5.1.4 ) σε κάθε σωλήνα/φύσιγγα .  6.4 .  Το δείγμα γάλακτος αναμειγνύεται πλήρως και μεταφέρονται με τη σύριγγα ( 4.1.4 ) 0,1 ml μέσα στον αντίστοιχα επισημασμένο σωλήνα/φύσιγγα . Χρησιμοποιείται ένα καθαρό, αντικαταστάσιμο ακροφύσιο για κάθε μεταφερόμενο δείγμα .  6.5 .  Επαναλαμβάνεται εις διπλούν η διαδικασία που περιγράφηκε στο σημείο 6.4 χρησιμοποιώντας το πρότυπο διάλυμα πενικιλλίνης που περιέχει 0,004 μg/ml (= 0,0067 Ul/ml ) πενικιλλίνης αντί για το δείγμα γάλακτος .  6.6 .  Επαναλαμβάνεται η διαδικασία του σημείου 6.4 εις διπλούν χρησιμοποιώντας το μάρτυρα από γάλα απηλλαγμένο αναστολέων ( 5.3 ) αντί για το δείγμα γάλακτος .  6.7 .  Οι σωλήνες/φύσιγγες κλείνονται, και το στήριγμα που φέρει τους σωλήνες/φύσιγγες τοποθετείται σε υδρόλουτρο στους 63π 1 γC ( 4.1.2 ) επί τουλάχιστον 2;/2-2=/4ώρες .  6.8 .  Το στήριγμα που φέρει τους σωλήνες/φύσιγγες αποσύρεται από το υδρόλουτρο .  6.9 .  Παρατηρείται το χρώμα του δοκιμαστικού υποστρώματος ( βλέπε σημείο 7 ).  7 .  Ερμηνεία αποτελεσμάτων 7.1 .  Ένας πορφυρός χρωματισμός του δοκιμαστικού υποστρώματος σε οποιοδήποτε σωλήνα/φύσιγγα του δείγματος γάλακτος ή του μάρτυρα υποδηλώνει την παρουσία στο δείγμα αντιβιοτικών ή σουλφοναμίδιων στο, ή περίπου στο, επίπεδο "όλο θετικό" όπως δίνεται στον πίνακα  της σελίδας 39 . Ο χρωματισμός των σωλήνων/φυσίγγων με πρότυπο διάλυμα πενικιλλίνης ( 6.5 ) παραμένει πορφυρός, σαν έλεγχος της επαρκούς ευαισθησίας του δοκιμαστικού υποστρώματος .  7.2 .  Πορφυρός χρωματισμός τμήματος μόνο του δοκιμαστικού υποστρώματος ή ακανόνιστος χρωματισμός σε οποιοδήποτε από τους σωλήνες/φύσιγγες του δείγματος γάλακτος υποδηλώνει την ύπαρξη στο δείγμα ανασταλτικών ουσιών μεταξύ των επιπέδων που δίνονται στον πίνακα  της σελίδας 39 .  7.3 .  Κίτρινος χρωματισμός του υποστρώματος σε οποιοδήποτε σωλήνα/φύσιγγα του δείγματος γάλακτος ή του μάρτυρα υποδηλώνει την απουσία ουσιών ανασταλτικών στον δοκιμαστικό αργανισμό .  7.4 .  Εάν υπάρχει προρφυρός χρωματισμός σε όλους του σωλήνες/φύσιγγες που εξετάστηκαν, συμπεριλαμβανόμενου και του αρνητικού ελέγχου οι σωλήνες/φύσιγγες δεν περιέχουν βιώσιμα σπόρια και τα δείγματα πρέπει να επανεξεταστούν με πρόσφατα παρασκευασμένα  δοκιμαστικά υλικά .  8 .  Επιβεβαίωση αποτελεσμάτων 8.1 .  Όλα τα δείγματα επιβεβαιώνονται με αντιδράσεις κατά τα περιγραφόμενα στα σημεία 7.1 και 7.2 σύμφωνα με τη "Μέθοδο Β ". Εάν χρειαστεί, τα δείγματα γάλακτος να αποθηκευτούν πριν την επιβεβαίωση, πρέπει να καταψυχθούν για να προληφθεί η αποδόμηση  αντιβιοτικών .   Β . Διαδικασία απιβεβαίωσης πενικιλλίνων και προσδιορισμός συγκέντρωσης 1 .  Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής Η διαδικασία καθορίζει τη δοκιμή επιβεβαίωσης πενικιλλίνων και αντιβιοτικών ακτός πενικιλλίνων και τη διαδικασία προσδιορισμού της συγκέντρωσης πενικιλλίνης σε δείγματα γάλακτος με θετική ( Α.7.1 ) ή αμφίβολη αντίδραση ( Α.7.2 ).  Ευαισθησία διαφόρων αντιβιοτικών στη μέθοδο Βλέπε Α . 1 .  2 .  Ορισμός 2.1 .  Το δείγμα γάλακτος περιέχει αντιβιοτικά συμπεριλαμβανομένου σουλφοναμίδιου όταν το δείγμα εμφανίζει με την περιγραφόμενη μέθοδο ευκρινή ζώνη αναστολής, των 2 mm τουλάχιστον, γύρω από το δίσκο .  2.2 .  Εάν ένα δείγμα, που περιέχει αντιβιοτικά, συμπεριλαμβανομένου σουλφοναμίδιου ( 2.1 ) και στο οποίο έχει προστεθεί πενικιλλινάση ( β-λακταμάση ), δεν παρουσιάζει ευκρινή ζώνη ή παρουσιάζει ευκρινή ζώνη μικρότερης διαμέτρου απ' ότι χωρίς πενικκιλλινάση, η  ανασταλτική ουσία είναι είτε πενικιλλίνη είτε πενικιλλίνη μαζί με άλλο αντιβιοτικό συμπεριλαμβανομένου του σουλφοναμίδιου .  2.3 .  Εάν η ζώνη δεν αδρανοποιείται από την πενικιλλινάση ( 2.2 ), η ανασταλτική ουσία στο δείγμα γάλακτος δεν είναι πενικιλλίνη, αλλά μπορεί να είναι κάποιο άλλο υπόλλειμμα [βλέπε οδηγία 85/397/ΕΟΚ παράρτημα Α κεφάλαιο VI σημείο Α.1.F ) και 2β )].  Μερικές από τις ημι-συνθετικές πενικιλλίνες, π.χ . άλας νατρίου της κλοξακιλλίνης, δεν αδρανοποιούνται καθόλου ή μόνο μερικώς με πινικιλλινάση ή είναι εντελώς ανθεκτικές και, επομένως, δεν αναγνωρίζονται ως πενικιλλίνη ( βλέπε σημείο 7.3 ).  3 .  Αρχή ιΕνας δίσκος απορροφητικού χάρτου διαποτισμένος με το προς εξέταση γάλα τοποθετείται στην επιφάνεια υποστρώματος άγαρ εμβολιασμένου με Bacillus stearothermophilus variete calidolactis . Η επώαση που οδηγεί στην κανονική ανάπτυξη του οργανισμού προκαλεί  το θόλωμα του άγαρ . Η παρουσία στο γάλα ουσιών που αναστέλλουν την ανάπτυξη των οργανισμών υποδηλώνεται από μια ευκρινή ζώνη γύρω από το δίσκο . Το μέγεθος της ευκρινούς ζώνης εξαρτάται, πέρα από άλλους παράγοντες, και από τη συγκέντρωση και το είδος της  ανασταλτικής ουσίας στο γάλα .  4 .  ιΟργανα, γυάλινα σκεύη και εξοπλισμός 4.1 .  ιΟργανα 4.1.1.  Βλέπε Α.4.1 .  4.1.2 .  Υδρόλουτρο, ικανό να λειτουργεί στους 80 p 1 oC .  4.2 .  Γυάλινα σκεύη Βλέπε Α.4.2 .  4.3 .  Χάρινοι δίσκοι, απηλλαγμένοι αναστολέων, διαμέτρου 9 έως 13 mm, ικανοί να συγκρατήσουν 130 mg γάλακτος περίπου ( κατά προτίμηση φυλάσσονται σε αποξηραντή ).  5 .  Συστατικά υποστρώματος, πρότυπα διαλύματα, διάλυμα πενικιλλινάσης, αντιδραστήρια, δοκιμαστικός οργανισμός, κ.λπ .  Τα συστατικά των υποστρωμάτων πρέπει να είναι κατάλληλα για βακτηριολογικές χρήσεις . Το νερό που χρησιμοποιείται πρέπει να έχει αποσταχθεί σε γυάλινη διάταξη ή απιονιστεί έως ισοδύναμη τουλάχιστον καθαρότητα . Δεν πρέπει να περιέχει ουσίες ανασταλτικές  στον δοκιμαστικό οργανισμό .  5.1 .  Υποστρώματα 5.1.1 .  Θρεπτικό άγαρ ( Α.5.1.1 ) 5.1.2 .  Δοκιμαστικό υπόστρωμα για την ανίχνευση ανασταλτικών ουσιών Σύσταση Εκχύλισμα μαγιάς  2,5 g Τρυπτόνη  5   g Γλυκόζη  1   g Διάλυμα τριμεθοπρίμης ( ή τετροξοπρίμης ) ( Α.5.1.3 ) 10 ml ΦΑ-2>Αγαρ 10-15 g ( ανάλογα με την πηκτική ιδιότητα ) Νερό 1 000 ml Παρασκευή Τα στερεά συστατικά διαλύονται πλήρως σε νερό θερμαίνοντας και αναδεύοντας πριν προστεθεί το διάλυμα τριμεθοπρίμης ή τετροξοπρίμης . Μετά την προσθήκη του διαλύματος τριμεθοπρίμης ή τετροξοπρίμης, το pH πρέπει να διορθωθεί έτσι ώστε μετά την αποστείρωση  να είναι 8,0 +- 0,1 στους 25 oC . Το υπόστρωμα αποστειρώνεται επί 15 λεπτά στους 121 +- 1 oC .  5.2 .  Πρότυπα διαλύματα πενικιλλίνης σε γάλα Βλέπε Α.5.2 .  Για τον ποσοτικό προσδιορισμό ανασταλτικών ουσιών ( 8 ) παρασκευάζονται πρότυπα διαλύματα πενικιλλίνης σε γάλα απηλλαγμένο αναστολέων ( Α.5.3 ) με τις ακόλουθες συγκεντρώσεις : α )  0,004 μg/ml ( 0,0067 Ul/ml )- β ) 0,006 μg/ml ( 0,01 Ul/ml ) - γ ) 0,03  μg/ml ( 0,05 Ul/ml )- δ ) 0,06  μg/ml ( 0,1 Ul/ml ).  5.3 .  Διάλυμα πενικιλλινάσης 5.3.1 .  Διαλύεται επαρκής ποσότητα πενικιλλινάσης ( β-λακταμάσης ) σε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό ώστε να προκύψει συγκέντρωση 1 000 U/ml . Το διάλυμα αυτό, κατά προτίμηση κατανεμημένο σε μικρές δόσεις, μπορεί να διατηρηθεί στους 0-5 oC έως τέσσερις εβδομάδες .   Σημείωση Δεν υπάρχει ενιαίο διεθνές πρότυπο για την πενικιλλινάση . Για τις ανάγκες της παρούσας μεθόδου, θεωρείται ότι δέκα μονάδες πενικιλλινάσης αρκούν για να αδρανοποιηθούν 0,6 μg (= 1 UI ) πενικιλλίνης . Για πηγές πενικιλλινάσης άγνωστης δυναμικότητας  ( ενεργότητας ) θα πρέπει να ελεγχθεί άν η εκτίμηση αυτή έχει ισχύ . Διαφορετικά θα πρέπει να μεταβληθεί ανάλογα η συγκέντρωση του διαλύματος πενικιλλινάσης .  5.3.2 . Αντί διαλύματος πενικιλλινάσης, μπορούν να χρησιμοποιηθούν προετοιμασμένοι δίσκοι με πενικιλλινάση διαθέσιμοι στο εμπόριο εάν, μετά από διαδικασία ελέγχου βρεθούν να περιέχουν κατάλληλη ποσότητα πενικιλλινάσης .  5.4 .  Δοκιμαστικός οργανισμός Βλέπε Α.5.4 .  5.5 .  Δοκιμαστική καλλιέργεια ( αιώρημα σπορίων ) Βλέπε Α.5.5 .  5.6 .  Προετοιμασια δοκιμαστικών πλακών 5.6.1 .  Το δοκιμστικό υπόστρωμα για την ανίχνευση ανασταλτικών ουσιών ( 5.1.2 ) τήκεται και ψύχεται στους 55 oC .  5.6.2 .  Προστίθεται σε φιάλη ένα μέρος πρόσφατου αιωρήματος σπορίων ( 5.5 ) σε τόσα μέρη δοκιμαστικού υποστρώματος για την ανίχνευση ανασταλιτικών ουσιών ( 5.1.2) για να προκύψει μια κατάλληλη πυκνότητα οποικιών στο εμβολιασμένο δοκιμαστικό υπόστρωμα, και  αναμειγνύονται πλήρως .  5.6.3.  Το εμβολιασμένο δοκιμαστικό υπόστρωμα ( 5.6.2 ) μεταφέρεται σε αποστειρωμένο τρυβλίο Petri ( Α.4.2.2 ) που έχει θερμανθεί προηγούμενα στους 55 oC, για να σχηματίσει στιβάδα πάχους 0,6 έως 0,8 mm . Για τρυβλίο Petri εσωτερικής διαμέτρου 140 mm χρειάζονται  περίπου 15 ml δοκιμαστικού υποστρώματος για να αποκτηθεί πάχος 0,8 mm .  5.6.4 .  Τα τρυβλία Petri μεταφέρονται σε ψυχρή, οριζόντια επιφάνεια που έχει προηγούμενα ελεχθεί με αλφάδι οινοπνεύματος, τα καλύμματα απομακρύνονται και αφήνεται να στερεοποιηθεί το υπόστρωμα από άγαρ . Όταν το υπόστρωμα έχει στερεοποιηθεί, επανατοποθετούνται  τα καλύμματα πάνω στα τρυβλία, τα οποία μετά αναστρέφονται για να ελαχιστοποιηθεί η συμπύκνωση πάνω στην επιφάνεια του υποστρώματος από άγαρ .  5.6.5 .  Οι δοκιμαστικές πλάκες που προετοιμάζονται με τον τρόπο αυτό μπορούν να διατηρηθούν έως δύο εβδομάδες εφόσον φυλαχθούν σε σφραγισμένο σάκο από πολυαιθυλένιο στους 5 oC αμέσως μετά την προετοιμασία .  5 .6.6 .  Για να αναγνωρίζονται τα δείγματα, επισημαίνεται ο πυθμένας των δοκιμαστικών πλακών .  6 .  Διαδικασία 6.1 .  Προετοιμασία του δείγματος 6.1.1 .  Δείγματα που δίνουν θετικά ή αμφίβολα αποτελέσματα στη "Μέθοδο Α" ( Α.7.1 και Α.7.2 ) πρέπει να επανελεχθούν, τα ταυτοποιοηθούν και να προσδιοριστούν ποσοτικά ως προς την πενικιλλίνη .  6.1.2 .  Αρχικά, αυτά τα δείγματα γάλακτος θερμαίνονται στους 80 +- 1 oC επί 10 λεπτά για να αποφευχθεί η επίδραση θερμοασταθών, μη εξειδικευμένων αναστολέων .  6.1 .3 .  Μετά από πλήρη ανάμειξη, μεταφέρονται περίπου 10 ml του θερμανθέντος γάλακτος προς ανάλυση μέσα σε κατάλληλη αποστειρωμένη φιάλη με ευρύ στόμιο . Προστίθενται περίπου 0,4 ml του διαλύματος πενικιλλινάσης ( 5.3 ) στο γάλα και αναμειγνύονται πλήρως .  6.2 .  Ανίχνευση αναστολέων 6.2.1 .  Ένας χάρτινος δίσκος ( 4.3) βυθίζεται μέσα στο δείγμα γάλακτος ( 6.1.2 ) χρησιμοποιώντας καθαρή, στεγνή λαβίδα . Απομακρύνεται κάθε περίσσεια γάλακτος φέρνοντας σε επαφή το δίσκο με τα τοιχώματα της φιάλης του δείγματος . Ο δίσκος τοποθετείται επίπεδα πάνω  στην επιφάνεια της δοκιμαστικής πλάκας ( 5.6 ) και πιέζεται προς τα κάτω ελαφρά με τις λαβίδες .  6.2.2 .  Οι δίσκοι που προετοιμάζονται με τα διάφορα δείγματα γάλακτος πρέπει να απέχουν τουλάχιστον 20 mm μεταξύ τους και τουλάχιστον 10 mm από την άκρη .  6.2.3 .  Προκειμένου να ελεγχθεί η ευαισθησία, οι δίσκοι ( 4.3 ) που θα βυθιστούν στο πρότυπο διάλυμα πενικιλλίνης [5.2.α )] πρέπει να τοποθετηθούν τυχαία ανάμεσα στους δίσκους με δείγματα γάλακτος σε ποσοστό τουλάχιστον 2 % των δίσκων που θα βυθιστούν ανά δείγμα  γάλακτος - πέντε πρότυποι δίσκοι πρέπει να χρησιμοποιούνται κατά τη διάρκεια κάθε δοκιμής .  6.2.4 .  Όταν όλοι οι δίσκοι έχουν τοποθετηθεί πάνω στο υπόστρωμα από άγαρ σε τυχαία διάταξη και έχουν ταυτοποιηθεί, τα τρυβλία αναστρέφονται και επωάζονται στους 63 +- 1 oC επί 2;/2έως 5 ώρες .  6.2.5 .  Μετά την επώαση τα τρυβλία εξετάζονται μπροστά από κατάλληλη πηγή φωτός ως προς την ύπαρξη διαυγών ζωνών αναστολής γύρω από τους χάρτινους δίσκους . Μετρώνται οι διαυγείς ζώνες .  6.2.6 .  Οι ζώνες γύρω από τους δίσκους που περιέχουν το πρότυπο διάλυμα πενικιλλίνης ( 6.2.3 ) πρέπει να έχουν τουλάχιστον 2 mm πλάτος .  6.2.7 .  Διαυγείς ζώνες γύρω από τους δίσκους που περιέχουν το δείγμα γάλακτος με μέγεθος ίδιο ή μεγαλύτερο από αυτές που περιγράφονται στο σημείο 6.2.6 υποδηλώνουν την παρουσία ουσιών που αναστέλλουν το δοκιμαστικό οργανισμό .  6.3 .  Ταυτοποίηση και ποσοτικός προσδιορισμός της ανασταλτικής ουσίας 6.3.1 .  Η διαδικασία του σημείου 6.2.1 πραγματοποιείται εις διπλούν στο θερμανθέν δείγμα γάλακτος ( 6.1.2 ) και στο επεξεργασμένο με πενικιλλινάση δείγμα ( 6.1.3 ). Αντί να προστεθεί πενικιλλινάση σε 10 ml του δείγματος γάλακτος, μπορεί να βυθιστεί ένας  προετοιμασμένος δίσκος πενικιλλινάσης ( 5.3 .2 ) μέσα στο δείγμα αυτό και να τοποθετηθεί πάνω στη δοκιμαστική πλάκα .  6.3.2 .  Η διαδικασία του σημείου 6.2.1 πραγματοποιείται εις διπλούν για κάθε ένα από τα πρότυπα διαλύματα πενικιλλίνης που μνημονεύτηκαν στα σημείο 5.2.α ) έως δ ).  6.3.3 .  Πρέπει να προσδιοριστεί η μέση διάμετρος των διαυγών ζωνών αναστολής για το δείγμα γάλακτος και το δείγμα ελέγχου πενικιλλινάσης, καθώς και τα πρότυπα διαλύματα πενικιλλίνης .  7 .  Ερμηνεία αποτελεσμάτων ( βλέπε σημείο 2 ) 7.1 .  Εάν δεν υπάρχει διαυγής ζώνη γύρω από το δίσκο που περιέχει το δείγμα ελέγχου πενικιλλινάσης, αλλά υπάρχει διαυγής ζώνη γύρω από το δίσκο που περιέχει το δείγμα γάλακτος, ίση με ή μεγαλύτερη από τη ζώνη γύρω από το δίσκο που περιέχει το πρότυπο διάλυμα  πενικιλλίνης [5.2.α )], η ανασταλτική ουσία στο δείγμα γάλακτος αντιστοιχεί σε συγκέντρωση άλατος νατρίου ή καλίου της βενζυλοπενικιλλίνης τουλάχιστον 0,004 μg/ml .  7.2 .  Εάν η μέση διάμετρος της διαυγούς ζώνης γύρω από τον δίσκο που περιέχει πενικιλλινάση είναι ίση με τη μέση διάμετρο της διαυγούς ζώνης γύρω από το δίσκο που περιέχει το δείγμα γάλακτος, το γάλα περιέχει ανασταλτικές ουσίες που είναι αδύνατο να  αδρανοποιηθούν με τις χρησιμοποιούμνες συγκεντρώσεις πενικιλλινάσης στη μέθοδο αυτή .  7.3 .  Εάν η μέση διάμετρος της διαυγούς ζώνης γύρω από το δίσκο που περιέχει τη πενικιλλινάση είναι μικρότερη από τη μέση διάμετρο της διαυγούς ζώνης γύρω από το δίσκο που περιέχει το δείγμα γάλακτος θερμανθέν σύμφωνα με το σημείο 6.1.2, το δείγμα γάλακτος  περιέχει πενικιλλίνη μαζί με άλλα αντιβιοτικά συμπεριλαμβανόμενων των σουλφοναμίδιων εκτός από πενικιλλίνη ή ημι-συνθετική πενικιλλίνη, η οποία δεν μπορεί να ταυτοποιοηθεί με τις χρησιμοποιούμενες συγκεντρώσεις πενικιλλινάσης στη μέθοδο αυτή . Συνθετικές  πενικιλλίνες, όπως το άλας νατρίου της κλοξακιλλίνης, μπορεί να μην αδρανοποιηθούν με πενικιλλινάση κάτω από τις συνθήκες της δοκιμής και μπορεί, επομένως, να χαρακτηρισθούν ως αναστολείς διαφορετικοί από την πενικιλλίνη .  Σημείωση Εάν χρειαστεί, μπορεί να αναγνωρισθούν ανασταλτικές ουσίες εκτός της πενικιλλίνης, χρησιμοποιώντας κατάλληλες μεθόδους .  8 .  Προσδιορισμός περιεκτικότητας πενικιλλίνης 8.1 .  Ο προσδιορισμός της περιεκτικότητας πενικιλλίνης μπορεί να πραγματοποιηθεί είτε σχεδιάζοντας καμπύλη αναφοράς είτε με υπολογισμό από τα μεγέθη των ζωνών που ελήφθησαν με τα πρότυπα διαλύματα πενικιλλίνης σε γάλα [βλέπε σημείο 5.2.α ) έως δ ].  8.2 .  Σχεδίαση καμπύλης αναφοράς Δεδομένου ότι υπάρχει γραμμική συσχέτιση μεταξύ του δεκαδικού λογάριθμου της συγκέντρωσης πενικιλλίνης και της διαμέτρου των ζωνών αναστολής, η καμπύλη αναφοράς μπορεί να σχεδιαστεί σε ημιλογαριθμικό χάρτη με τις συγκεντρώσεις πενικιλλίνης ως τη  λογαριθμική τεταγμένη και τις ζώνες αναστολής ως την τετμημένη . Οι ζώνες αναστολής υπολογίζονται ως ο μέσος όρος των διπλών δοκιμών . Οι διάμετροι των ζωνών αναστολής φέρονται έναντι των πρότυπων συγκεντρώσεων πενικιλλίνης και σχεδιάζεται η καμπύλη  αναφοράς .  8.3 .  Υπολογισμός Οι συγκεντρώσεις πενικιλλίνης στο δείγμα γάλακτος μπορούν να υπολογιστούν από τις διαμέτρους των ζωνών τους χρησιμοποιώντας την εξίσωση ή την καμπύλη αναφοράς . Για ακριβείς αναλύσεις, οι ακτίνες των ζωνών παρεμπόδισης πρέπει να είναι τουλάχιστον δύο  φορές και όχι περισσότερο από πέντε φορές μεγαλύτερες από τις ακτίνες των δίσκων .  9 .  ιΕκφραση αποτελεσμάτων 9.1 .  Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως περιεκτικότητα πενικιλλίνης ίση με ή μεγαλύτερη από 0,004 μg/ml ( ή αναφέροντας την προσδιορισθείσα συγκέντρωση ) ή ως περιεκτικότητα αναστολέων εκτός πενικιλλίνης .  9.2 .  Επαναληψιμότητα ( r ) και αναπαραγωγιμότητα ( R ) Δεν υπάρχουν στοιχεία, και δεν θα είχαν νόημα, αφού συμπεριλαμβάνεται πρότυπο προς σύγκριση .  ΙΧ . ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΑΘΟΓΟΝΩΝ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ  1 .  Αντεικείμενο και πεδίο εφαρμογής Σύμφωνα με τις απαιτήσεις του παραρτήματος Α της οδηγίας 85/397/ΕΟΚ κεφάλαιο VΙΙ σημείο 2, η διαδικασία αυτή δίνει τις οδηγίες που πρέπει να ακολουθηθούν για να ελεγχθεί το παστεριωμένο γάλα ως προς την παρουσία παθογόνων μικροοργανισμών .  2 .  Ορισμός Η εξέταση πρέπει να αφορά είδη βακτηρίων που ενέχονται με τη μεγαλύτερη συχνότητα σε ασθένειες τροφικής αιτίας .  Η παστερίωση είναι μια επεξεργασία που προλαμβάνει την ύπαρξη μη θερμοαντοχών παθογόνων σε γάλα . Εάν εκπληρούνται τα πρότυπα που καθορίζονται στο παράρτημα Α κεφάλαιο VΙΙ σημείο 2 της οδηγίας για καταμέτρηση αποικιών στους 30 γC και 21 γC, για τα κολοβακτηρίδια και τη φωσφατάση, μια ειδική δοκιμή για παθογόνα απαιτείται μόνον όταν υπάρχει υποψία ότι το γάλα έχει σχέση με εξάπλωση τροφικής δηλητηρίασης .  3 .  Διαδικασία Οι μέθοδοι και η συχνότητα των αναλύσεων πρέπει να θεσπιστεί από τις τοπικές αρχές, με τρόπο ώστε να είναι δυνατή η έκδοση πιστοποιητικών υγιεινής που να αφορούν θερμικά επεξεργασμένο γάλα προς ενδοκοινοτική διακίνηση . Για την ανίχνευση παθογόνων  μικροοργανισμών εφαρμόζονται τα κριτήρια και οι μέθοδοι που είναι διεθνώς αποδεκτές, εφόσον υπάρχουν .  4 .  ιΕκθεση αποτελεσμάτων Για κάθε παθογόνο μικροοργανισμό που ερευνάται, το αποτέλεσμα πρέπει να εκφράζεται κατά τον ακόλουθο τρόπο :  Αριθμός ανά ml γάλακτος ή "παρουσία" ή "απουσία" στον όγκο του παστεριωμένου γάλακτος που απαιτείται από τη χρησιμοποιηθείσα μέθοδο .  Η αναφορά πρέπει να περιγράφει με σαφήνεια την χρησιμοποιηθείσα μέθοδο .  ( 1 ) Η σχετική με τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας νομοθεσία, όσον αφορά στη χρήση θρεπτικών υλικών, τα οποία περιέχουν ουσίες ανασταλτικές του φολλικού οξέος, θα πρέπει να τηρείται .