CELEX: 32016D1840
Language: hr
Date: 2016-10-14 00:00:00
Title: Provedbena odluka Komisije (EU) 2016/1840 оd 14. listopada 2016. o izmjeni Priloga IV. Direktivi Vijeća 2009/156/EZ u pogledu metoda za dijagnosticiranje konjske kuge (priopćeno pod brojem dokumenta C(2016) 6509) (Tekst značajan za EGP)

18.10.2016   
            
            
               HR
            
            
               Službeni list Europske unije
            
            
               L 280/33
            
         PROVEDBENA ODLUKA KOMISIJE (EU) 2016/1840
   оd 14. listopada 2016.
   o izmjeni Priloga IV. Direktivi Vijeća 2009/156/EZ u pogledu metoda za dijagnosticiranje konjske kuge
   
      
         (priopćeno pod brojem dokumenta C(2016) 6509)
      
   
   (Tekst značajan za EGP)
   EUROPSKA KOMISIJA,
   uzimajući u obzir Ugovor o funkcioniranju Europske unije,
   uzimajući u obzir Direktivu Vijeća 2009/156/EZ od 30. studenoga 2009. o uvjetima zdravlja životinja kojima se uređuje premještanje i uvoz kopitara iz trećih zemalja (1), a posebno njezin članak 20.,
   budući da:
   
               (1)
            
            
               Prilogom IV. Direktivi 2009/156/EZ utvrđuju se dijagnostičke metode za konjsku kugu koje se upotrebljavaju, kada je to potrebno, za ispitivanje kopitara prije njihova premještanja unutar Unije ili uvoza iz zemalja koje nisu članice EU-a.
            
         
               (2)
            
            
               Od donošenja Direktive 2009/156/EZ razvijeni su kapaciteti laboratorija za provođenje naprednih, vrlo osjetljivih i učinkovitih ispitivanja za dijagnosticiranje konjske kuge. Paralelno s time izmijenjeno je poglavlje Priručnika o dijagnostičkim testovima i cjepivima za kopnene životinje Svjetske organizacije za zdravlje životinja (OIE) (2) koje se odnosi na dijagnosticiranje konjske kuge, kako bi odražavalo taj razvoj.
            
         
               (3)
            
            
               U okviru svojeg programa rada za 2014. Referentni laboratorij Europske unije za konjsku kugu (3) izradio je izvješće o tehničkoj procjeni dijagnostičkih metoda opisanih u Prilogu IV. Direktivi 2009/156/EZ. Procjenom, koja je predstavljena Komisiji u svibnju 2015., zaključeno je da kompetitivni imunoenzimni test (ELISA) više nije dostupan, indirektni test ELISA obično se ne upotrebljava, ali se može osigurati u roku od 4 – 6 mjeseci nakon zahtjeva te da je blokirajući test ELISA dostupan na tržištu i da se obično upotrebljava za analizu uzoraka tijekom ispitivanjâ osposobljenosti koja organizira Referentni laboratorij Europske unije za konjsku kugu.
            
         
               (4)
            
            
               Osim toga, iz izvješća se može vidjeti da metode prepoznavanja nukleinske kiseline obrnutom transkripcijom lančane reakcije polimerazom (RT-PCR) imaju prednost pred serološkim dijagnostičkim metodama, jer se njima omogućuje otkrivanje bolesti u ranom stadiju infekcije. Osim toga, većina nacionalnih referentnih laboratorija država članica Europske unije upotrebljava metode RT-PCR-a u stvarnom vremenu, uključujući za dijagnostiku konjske kuge, za koje se u godišnjim ispitivanjima osposobljenosti provedenima u razdoblju od 2009. do 2014. pokazalo da su primjerene svrsi. U izvješću je isto tako naznačeno da se izvan Unije nalazi niz referentnih laboratorija OIE i drugih laboratorija koji imaju specifična stručna znanja o konjskoj kugi koji za otkrivanje genoma konjske kuge primjenjuju najmanje jednu metodu RT-PCR-a u stvarnom vremenu.
            
         
               (5)
            
            
               Na Zajedničkoj radionici za konjsku kugu/bolest plavog jezika koja se održala 24. i 25. studenoga 2015. u Ascotu u Ujedinjenoj Kraljevini, Referentni laboratorij Europske unije za konjsku kugu zajedno s nacionalnim referentnim laboratorijima preporučio je uključivanje u Prilog IV. Direktivi 2009/156/EZ metode obrnute transkripcije lančane reakcije polimerazom u stvarnom vremenu radi otkrivanja virusa konjske kuge.
            
         
               (6)
            
            
               Iako su sve dostupne metode RT-PCR-a u stvarnom vremenu dovoljno osjetljive za otkrivanje genoma konjske kuge, laboratoriji najčešće upotrebljavaju postupak koji su opisali Agüero et al. 2008. (4). Metoda koju su opisali Guthrie et al. 2013. (5) specifično je osmišljena kako bi se omogućilo sigurno premještanje konja iz područja koja su ugrožena konjskom kugom nakon minimalnog razdoblja karantene koje je potrebno u skladu s Kodeksom o zdravlju kopnenih životinja OIE-a (6).
            
         
               (7)
            
            
               Stoga je primjereno Prilogom IV. Direktivi 2009/156/EZ obuhvatiti metode za identifikaciju uzročnika bolesti i za otkrivanje protutijela kao komplementarne metode za brzo dijagnosticiranje konjske kuge.
            
         
               (8)
            
            
               Prilog IV. Direktivi 2009/156/EZ potrebno je stoga izmijeniti brisanjem kompetitivnog testa ELISA i ažuriranjem postupaka za neizravni test ELISA i blokirajući test ELISA u skladu s poglavljem 2.5.1. Priručnika o dijagnostičkim testovima i cjepivima za kopnene životinje OIE-a, izdanje 2016., na temelju verzije koju je u svibnju 2012. donijela opća skupština delegata OIE-a (7). Istodobno, postupke RT-PCR-a u stvarnom vremenu kako su ih opisali Agüero et al. 2008. i Guthrie et al. 2013. trebalo bi dodati u taj Prilog kako bi ti testovi za identifikaciju uzročnika bolesti postali dostupni za potrebe testiranja prije premještanja.
            
         
               (9)
            
            
               Direktivu 2009/156/EZ trebalo bi stoga na odgovarajući način izmijeniti.
            
         
               (10)
            
            
               Mjere predviđene ovom odlukom u skladu su s mišljenjem Stalnog odbora za bilje, životinje, hranu i hranu za životinje,
            
         DONIJELA JE OVU ODLUKU:
   Članak 1.
   Prilog IV. Direktivi 2009/156/EZ zamjenjuje se tekstom utvrđenim u Prilogu ovoj Uredbi.
   Članak 2.
   Ova je Odluka upućena državama članicama.
   
      Sastavljeno u Bruxellesu 14. listopada 2016.
      
         
            Za Komisiju
         
         Vytenis ANDRIUKAITIS
         
            Član Komisije
         
      
   
   
      (1)  SL L 192, 23.7.2010., str. 1.
   
   
      (2)  http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.05.01_AHS.pdf
   
      (3)  Direktiva Vijeća 92/35/EEZ od 29. travnja 1992. o utvrđivanju pravila kontrole i mjera suzbijanja konjske kuge (SL L 157, 10.6.1992., str. 19.).
   
      (4)  Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. i Jimenez-Clavero A. 2008. Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus. (Test fluorogenske obrnute transkripcije lančane reakcije polimerazom u stvarnom vremenu za otkrivanje virusa konjske kuge.) J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325.–328.
   
      (5)  Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus. (Dijagnostička točnost testa dvostruke obrnute transkripcije kvantitativne lančane reakcije polimerazom u stvarnom vremenu za otkrivanje virusa konjske kuge.) Journal of Virological Methods. 2013;189(1):30.-35.
   
      (6)  http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahc/current/chapitre_ahs.pdf.
   
      (7)  Vidjeti bilješku 2.
   
      PRILOG
      
         
            „PRILOG IV.
            
               KONJSKA KUGA
            
            
               DIJAGNOSTIKA
            
            DIO A
            Serološki testovi
            Serološka metoda koja se opisuje dalje u tekstu jesu imunoenzimni testovi (ELISA) koji se temelje na poglavlju 2.5.1. odjeljku B, točki 2. Priručnika o dijagnostičkim testovima i cjepivima za kopnene životinje, izdanje 2016., koji je donijela opća skupština delegata OIE-a u svibnju 2012.
            Virusni protein VP7 glavni je imunološki dominantan antigen virusa konjske kuge (VKK) i sačuvan je u devet VKK serotipova. Rekombinirani proteini VKK-VP7 pokazali su se stabilnima, neškodljivima i prikladnima za upotrebu kao antigeni u postupcima ELISA za otkrivanje protutijela VKK-a s velikim stupnjem osjetljivosti i specifičnosti (Laviada et al., 1992b (1); Maree i Paweska, 2005.). Indirektni test ELISA i blokirajući test ELISA dva su KK-VP7 testa ELISA koja su primjerena za serološku dijagnostiku konjske kuge (KK).
            1.   Indirektni test ELISA za otkrivanje protutijela za virus konjske kuge (VKK)
            
            Konjugat koji se upotrebljava u ovoj metodi jest peroksidaza iz hrena anti-konjskog gama-globulina koja reagira sa serumom konja, mula i magaraca. Metoda koju su opisali Maree i Paweska 2005. (2) kao konjugat upotrebljava protein G koji reagira i sa serumom zebri.
            Centar Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA) iz Španjolske može osigurati antigen u roku od 4 do 6 mjeseci od podnošenja zahtjeva.
            1.1.   Postupak ispitivanja
            
            1.1.1.   Čvrsta faza
            
                     
                        1.1.1.1.
                     
                     
                        Na ELISA plitice nanijeti rekombinantni VKK-4 VP7 razrijeđen u karbonatnom/bikarbonatnom puferu, pH 9,6. Inkubirati plitice preko noći na 4 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.1.2.
                     
                     
                        Plitice isprati pet puta destiliranom vodom koja sadrži 0,01 % (v/v) Tween 20 (otopina za ispiranje). Lagano pritisnuti plitice na upijajući materijal kako bi se uklonili ostaci ispiranja.
                     
                  
                     
                        1.1.1.3.
                     
                     
                        Plitice blokirati stavljajući u svaku jažicu 200 μl fosfatnog pufera (PBS- phosphate buffered saline) pH 7,2 + 5 % (w/v) obranog mlijeka (Nestlé Dry Skim MilkTM) i ostaviti 1 sat na 37 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.1.4.
                     
                     
                        Ukloniti blokirajuću otopinu i lagano pritisnuti plitice na upijajući materijal.
                     
                  1.1.2.   Ispitni uzorci
            
                     
                        1.1.2.1.
                     
                     
                        Uzorci seruma koji se pretražuju, te pozitivni i negativni kontrolni serumi, razrijede se u omjeru 1: 25 u PBS + 5 % (w/v) obranog mlijeka + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl po jažici. Inkubirati 1 sat na 37 °C.
                        Za titraciju napraviti serije dvostrukog razrjeđenja od 1: 25 (100 μl po jažici), koristeći jedan stupac plitice za svaki serum, te isto učiniti s pozitivnim i negativnim kontrolama. Inkubirati 1 sat na 37 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.2.2.
                     
                     
                        Plitice isprati pet puta destiliranom vodom koja sadrži 0,01 % (v/v) Tween 20 (otopina za ispiranje). Lagano pritisnuti plitice na upijajući materijal kako bi se uklonili ostaci ispiranja.
                     
                  1.1.3.   Konjugat
            
                     
                        1.1.3.1.
                     
                     
                        U svaku jažicu staviti pipetom po 100 μl anti-konjskih gamaglobulina konjugiranih peroksidazom iz hrena razrijeđenih u PBS-u + 5 % mlijeka + 0,05 % Tween 20, pH 7,2. Inkubirati 1 sat na 37 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.3.2.
                     
                     
                        Plitice isprati pet puta destiliranom vodom koja sadrži 0,01 % (v/v) Tween 20 (otopina za ispiranje). Lagano pritisnuti plitice na upijajući materijal kako bi se uklonili ostaci ispiranja.
                     
                  1.1.4.   Kromogen/Supstrat
            
                     
                        1.1.4.1.
                     
                     
                        U svaku jažicu dodati 200 μl otopine kromogena/supstrata (10 ml 80,6 mM DMAB (dimetil aminobenzaldehid) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metil-2-benzo-tiazolin hidrazon hidroklorid) + 5 μl H2O2).
                        Razvijanje boje zaustaviti dodavanjem 50 μl 3N H2SO4 nakon približno 5 do 10 minuta (prije nego se počne bojiti negativna kontrola).
                        Mogu se upotrebljavati i drugi kromogeni kao što su ABTS (2,2′-azino-bis-[3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina]), TMB (tetrametil benzidin) ili OPD (orto-fenildiamin).
                     
                  
                     
                        1.1.4.2.
                     
                     
                        Očitati plitice na 600 nm (ili 620 nm).
                     
                  1.2.   Tumačenje rezultata
            
            
                     
                        1.2.1.
                     
                     
                        Izračunati graničnu vrijednost tako da se vrijednosti negativne kontrole doda 0,06 (0,06 je standardna devijacija dobivena sa skupinom od 30 negativnih seruma).
                     
                  
                     
                        1.2.2.
                     
                     
                        Pretraživani uzorci koji daju vrijednost apsorbancije nižu od granične vrijednosti smatraju se negativnima.
                     
                  
                     
                        1.2.3.
                     
                     
                        Pretraživani uzorci koji daju vrijednost apsorbancije veću od granične vrijednosti + 0,15 smatraju se pozitivnima.
                     
                  
                     
                        1.2.4.
                     
                     
                        Pretraživane uzorke koji daju vrijednost apsorbancije između pozitivnih i negativnih smatra se dvojbenima i mora se primijeniti druga metoda kako bi se rezultat potvrdio.
                     
                  2.   Blokirajući test ELISA za otkrivanje protutijela za virus konjske kuge (VKK)
            
            Kompetitivni blokirajući test ELISA namijenjen je otkrivanju specifičnih protutijela za VKK u serumima životinja svih vrsta kopitara, tj. konja, magaraca, zebra i njihovih križanaca čime se sprečava problem specifičnosti do kojeg povremeno dolazi pri upotrebi indirektnih testova ELISA.
            Test se temelji na prekidanju reakcije između rekombinantnog proteina VP7 koji se apsobrira na ELISA pliticu i konjugiranog monoklonskog protutijela (Mpt) specifičnog za KK-VP7. Protutijela u pretraživanim serumima blokirat će reakciju između antigena i monoklonskog protutijela što će dovesti do smanjenja obojenja. Budući da je monoklonsko protutijelo usmjereno i protiv VP7, test pruža visoku razinu osjetljivosti i specifičnosti.
            Kompetitivni blokirajući test ELISA dostupan je na tržištu.
            2.1.   Postupak ispitivanja
            
            2.1.1.   Čvrsta faza
            
                     
                        2.1.1.1.
                     
                     
                        Na ELISA plitice nanijeti 50-100 ng rekombinantnog VKK-4 VP7 razrijeđenog u karbonatnom/bikarbonatnom puferu, pH 9,6. Inkubirati preko noći na 4 °C.
                     
                  
                     
                        2.1.1.2.
                     
                     
                        Plitice isprati tri puta fosfatnim puferom (PBS) 0,1x koji sadrži 0,135 M NaCl i 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Lagano pritisnuti plitice na upijajući materijal kako bi se uklonili ostaci ispiranja.
                     
                  2.1.2.   Pretraživani uzorci i kontrole
            
                     
                        2.1.2.1.
                     
                     
                        Uzorci seruma koji se pretražuju, te pozitivni i negativni kontrolni serumi, razrijede se u omjeru 1: 5 u sredstvu za razrjeđivanje koje sadržava 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 i 0,1 % Kathona, 100 μl po jažici. Inkubirati 1 sat na 37 °C.
                        Za titraciju napraviti serije dvostrukog razrjeđenja seruma koje se pretražuju od 1: 10 do 1: 280 u osam jažica (100 μl po jažici), koristeći jedan stupac plitice za svaki serum, te isto učiniti s pozitivnim i negativnim kontrolama. Inkubirati 1 sat na 37 °C.
                     
                  
                     
                        2.1.2.2.
                     
                     
                        Plitice isprati pet puta fosfatnim puferom (PBS) 0,1× koji sadržava 0,135 M NaCl i 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Lagano pritisnuti plitice na upijajući materijal kako bi se uklonili ostaci ispiranja.
                     
                  2.1.3.   Konjugat
            
                     
                        2.1.3.1.
                     
                     
                        U svaku jažicu staviti pipetom po 100 μl monoklonskih protutijela protu-VP7 konjugiranih peroksidazom iz hrena. Prije toga su ta monoklonska protutijela razrijeđena 1/5 000 – 1/15 000 u otopini 1/1 StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics. Uputa: SZ03) u destiliranoj vodi. Inkubirati 30 minuta na 37 °C.
                     
                  
                     
                        2.1.3.2.
                     
                     
                        Plitice isprati pet puta fosfatnim puferom (PBS) 0,1× koji sadržava 0,135 M NaCl i 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Lagano pritisnuti plitice na upijajući materijal kako bi se uklonili ostaci ispiranja.
                     
                  2.1.4.   Kromogen/Supstrat
            U svaku jažicu dodati 100 μl otopine kromogena/supstrata tj. 1 ml ABTS (2,2′-azino-bis[3-etilbemzotiazolin-6-sulfonska kiselina]) 5 mg/ml + 9 ml supstratnog pufera (0,1 M fosfat-citratni pufer s pH 4 koji sadržava 0,03 % H2O2) i inkubirati 10 minuta na sobnoj temperaturi. Razvijanje boje zaustavlja se tako da se u svaku jažicu doda 100 μl 2 % (w/v) SDS-a (natrij dodecil sulfat).
            2.1.5.   Čitanje
            Očitati na 405 nm u ELISA čitaču.
            2.2.   Tumačenje rezultata
            
            
                     
                        2.2.1.
                     
                     
                        Odredite blokirajući postotak (BP) svakog uzorka primjenom sljedeće formule u kojoj ‘Abs’ znači protutijela:
                        
                           
                     
                  
                     
                        2.2.2.
                     
                     
                        Uzorke čija je vrijednost blokirajućeg postotka veća od 50 % treba smatrati pozitivnima na protutijela za VKK.
                     
                  
                     
                        2.2.3.
                     
                     
                        Uzorke čija je vrijednost blokirajućeg postotka niža od 45 % treba smatrati negativnima na protutijela za VKK.
                     
                  
                     
                        2.2.4.
                     
                     
                        Uzorke čija je vrijednost blokirajućeg postotka između 45 % i 50 % treba smatrati dvojbenima i za njih se ispitivanje mora ponoviti. Ako je rezultat ponovno dvojben, životinje bi trebalo ponovno testirati na uzorcima koji bi se uzeli najranije dva tjedna nakon uzimanja uzorka koji se smatralo dvojbenim.
                     
                  DIO B
            Identifikacija uzročnika bolesti
            Obrnuta transkripcija lančane reakcije polimerazom u stvarnom vremenu (rRT-PCR)
            Testovi za identifikaciju uzročnika bolesti utemeljeni na metodama nukleinske kiseline moraju među devet serotipova virusa VKK-a otkriti referentne sojeve.
            Metoda opisana u točki 2.1. utemeljena je na poglavlju 2.5.1. odjeljku B, točki 1.2. Priručnika o dijagnostičkim testovima i cjepivima za kopnene životinje, izdanje 2016., koji je donijela opća skupština delegata OIE-a u svibnju 2012.
            Svaka metoda otkrivanja transkripcijom lančane reakcije polimerazom koja se upotrebljava za ispitivanje uzoraka krvi ili slezene u kontekstu Direktive 2009/156/EZ mora dati rezultate koji su po osjetljivosti jednaki rezultatima metodologija opisanih u točki 2. ili bolji od njih.
            Referentni sojevi inaktiviranog virusa serotipa 1 do 9 mogu se nabaviti od Referentnog laboratorija Europske unije ili Referentnih laboratorija OIE-a za bolest konjske kuge u Algeteu, Španjolska.
            1.   Ekstrakcija virusne RNK
            
            Kako bi se osigurala dobra reakcija, potrebno je iz uzorka VKK-a ekstrahirati visokokvalitetnu RNK. Ekstrakcija nukleinskih kiselina iz kliničkih uzoraka može se izvesti nizom internih metoda i metoda dostupnih na tržištu.
            Komercijalna oprema upotrebljava različite pristupe izolaciji RNK. Većina ih se temelji na jednom od sljedećih postupaka:
            
                        —
                     
                     
                        ekstrakcija nukleinske kiseline fenol-kloroformom,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        adsorpcija nukleinskih kiselina filtarskim sustavom,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        adsorpcija nukleinskih kiselina sustavom magnetskih kuglica.
                     
                  Primjer interne ekstrakcije RNK naveden je u nastavku:
            
                        1.1.
                     
                     
                        1 g uzorka tkiva homogenizira se u 1 ml otopine za denaturiranje (4 M gvanidin tiocijanata, 25 mM natrijeva citrata, 0,1 M 2-merkaptoetanola, 0,5 % sarkozila).
                     
                  
                        1.2.
                     
                     
                        Nakon centrifugiranja supernatantu se dodaju 1 μg kvaščane RNK, 0,1 ml 2 M natrijeva acetata pH 4, 1 ml fenola i 0,2 ml alkoholne mješavine kloroform/izoamila (49/1).
                     
                  
                        1.3.
                     
                     
                        Otopina se jako protrese i 15 minuta hladi na ledu.
                     
                  
                        1.4.
                     
                     
                        Nakon centrifugiranja, iz RNK prisutne u vodenoj fazi ekstrahira se fenol, taloži etanol i ponovno je se suspendira u sterilnoj vodi.
                     
                  2.   Postupak RT-PCR-a u stvarnom vremenu
            
            2.1.   Grupno specifični RT-PCR u stvarnom vremenu, Agüero et al., 2008.
                (3)
            
            Ovaj grupno specifični RT-PCR u stvarnom vremenu usredotočen je na VP7 VKK-a te se njime može otkriti sve poznate serotipe i sojeve VKK-a koji trenutačno kruže. Nacionalni referentni laboratoriji država članica Europske unije koji sudjeluju u ispitivanjima osposobljenosti što ih je Referentni laboratorij Europske unije godišnje organizirao tijekom razdoblja od 2009. do 2015. upotrebljavali su ga i dobivali vrlo dobre rezultate. Osim toga, taj je protokol vrlo visoko rangiran među drugima tijekom međunarodnog interlaboratorijskog istraživanja organiziranog 2015. u okviru mreže referentnih laboratorija OIE-a.
            Nizovi početnica i sondi za otkrivanje virusa vrste VKK:
            
                        —
                     
                     
                        uzvodna početnica
                     
                     
                        5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        nizvodna početnica
                     
                     
                        5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        sonda MGB-TaqMan
                     
                     
                        5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
                     
                  
                        2.1.1.
                     
                     
                        Radna koncentracija početnica razrijeđena je na radnu koncentraciju od 8 μM (‘radna zaliha početnica 8 μM’), a sonda je razrijeđena na radnu koncentraciju od 50 μM (‘radna zaliha sonde 50 μM’). Raspored ispitne plitice potrebno je osmisliti i učitati u softver stroja za PCR u stvarnom vremenu. Upotrebljavajući raspored kao vodilju 2,5 μl svake radne zalihe početnica 8 μM dodaje se svakoj jažici koja će sadržavati uzorke RNK, pozitivne i/ili negativne kontrole (konačna koncentracija početnice bit će 1 μM u 20 μl mješavine RT-PCR-a). Plitica se čuva na ledu.
                     
                  
                        2.1.2.
                     
                     
                        2 μl izolirane RNK (ispitni uzorci i pozitivne kontrole) ili 2 μl vode bez RNAse u negativnim kontrolama reakcija miješa se s uzvodnim i nizvodnim početnicama. Ta se mješavina denaturira zagrijavanjem na 95 °C tijekom 5 minuta nakon čega slijedi brzo hlađenje na ledu tijekom najmanje 5 minuta.
                     
                  
                        2.1.3.
                     
                     
                        U skladu sa sljedećim uputama proizvođača priprema se odgovarajući volumen glavne mješavine za RT-PCR u jednom koraku u stvarnom vremenu za niz uzoraka koje je potrebno ispitati. 0,1μl radne zalihe sonde 50 μM dodaje se u svaku jažicu koja sadržava uzorke RNK (konačna koncentracija sonde bit će 0,25 μM u svakoj jažici koja sadržava uzorke RNK). 13 μl glavne mješavine za RT-PCR u jednom koraku u stvarnom vremenu distribuira se u svaku jažicu na PCR plitici koja sadržava denaturirane početnice i RNK.
                     
                  
                        2.1.4.
                     
                     
                        Plitica se stavlja u ciklični termostat u stvarnom vremenu programiran za obrnutu transkripciju i otkrivanje pojačavanja cDNA/fluorescencije. Uvjeti pojačavanja sastoje se od prvog koraka obrnute transkripcije pri 48 °C tijekom 25 minuta, nakon čega slijedi 10 minuta na 95 °C (‘vrući početak’) i 40 ciklusa od 15 sekundi na 95 °C, 35 sekundi na 55 °C i 30 sekundi na 72 °C (ili 40 ciklusa na 97 °C tijekom 2 sekunde i 55 °C tijekom 30 sekundi ako se upotrebljavaju reagensi i ciklični termostat koji dopuštaju brze reakcije). Podaci o fluorescenciji prikupljaju se krajem koraka na 55 °C.
                     
                  
                        2.1.5.
                     
                     
                        Ako se dobiju atipične krivulje pojačanja, smatra se da test nije valjan te ga se mora ponoviti.
                        Uzorke se smatra pozitivnima ako je Ct vrijednost (broj ciklusa pri kojem fluorescencija generirana reakcijom premašuje prag fluorescencije) niža od definiranog praga Ct-a (35) ili jednaka njemu u 40 ciklusa PCR-a (Ct ≤ 35).
                        Uzorke se smatra dvojbenima ako je Ct vrijednost viša od definiranog praga Ct-a (35) u 40 ciklusa PCR-a (Ct ≥ 35).
                        Uzorke se smatra negativnima ako se dobila horizontalna krivulja pojačanja koja ne prelazi prag u 40 ciklusa PCR-a.
                     
                  2.2.   Grupno specifični RT-PCR u stvarnom vremenu, Guthrie et al., 2013.
                (4)
            
            RT-PCR u stvarnom vremenu koji upotrebljava sonde energetskog prijenosa rezonancije fluorescencije (FRET) za otkrivanje nukleinske kiseline VKK-a.
            Opisani test RT-PCR VKK-a osmišljen je uz uporabu nizova iz širokog raspona terenskih sojeva VKK-a koji trenutačno kruže (Quan et al., 2010. (5)). On uključuje vlasnički sintetički test vanjske kontrole kojim se provjerava ispravno funkcioniranje komponenti testa.
            Oprema za PCR u jednom koraku u stvarnom vremenu dostupna je na tržištu. U nastavku su neki osnovni koraci kako su ih opisali Guthrie et al. 2013. koji se mogu izmijeniti ovisno o lokalnim zahtjevima/zahtjevima specifičnima za predmet, upotrijebljena oprema i dostupna oprema.
            Nizovi početnica i sondi za otkrivanje virusa vrste VKK:
            
                        —
                     
                     
                        uzvodna početnica
                     
                     
                        5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        nizvodna početnica
                     
                     
                        5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        sonda MGB-TaqMan
                     
                     
                        5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′
                     
                  
                        2.2.1.
                     
                     
                        Radne otopine mješavina početnica i sondi napravljene su u koncentraciji 25× pri 5 μΜ za uzvodne i nizvodne početnice i 3 μΜ za sondu. Raspored ispitne plitice potrebno je osmisliti i učitati u softver stroja za PCR u stvarnom vremenu. Upotrebljavajući raspored kao vodilju uzorci 5 μl RNK, uključujući ispitne uzorke te pozitivne i negativne kontrole, dodaju se odgovarajućim jažicama plitica u skladu s rasporedom.
                     
                  
                        2.2.2.
                     
                     
                        RNK je denaturirana zagrijavanjem na 95 °C tijekom 5 minuta nakon čega slijedi brzo hlađenje na ledu tijekom najmanje 3 minute.
                     
                  
                        2.2.3.
                     
                     
                        U skladu sa sljedećim uputama proizvođača priprema se odgovarajući volumen glavne mješavine za RT-PCR u jednom koraku u stvarnom vremenu za niz uzoraka koje je potrebno ispitati. 1 μl od 25× radne otopine mješavine početnica i sondi (iz prethodne točke 2.2.1.) uključeno je u glavnu mješavinu kako bi se dobila konačna koncentracija u svakoj jažici od 200 nM za svaku početnicu i 120 nM sonde. 20 μl glavne mješavine distribuira se u svaku jažicu na PCR plitici koja sadržava denaturiranu RNK.
                     
                  
                        2.2.4.
                     
                     
                        Plitica se stavlja u ciklični termostat u stvarnom vremenu programiran za obrnutu transkripciju i otkrivanje pojačavanja cDNA/fluorescencije, kao što su predložili proizvođači. Uvjeti pojačavanja sastoje se, primjerice, od prvog koraka obrnute transkripcije pri 48 °C tijekom 10 minuta, nakon čega slijedi 10 minuta na 95 °C i 40 ciklusa od 15 sekundi na 95 °C te 45 sekundi na 60 °C.
                     
                  
                        2.2.5.
                     
                     
                        Uzorke se smatra pozitivnima ako normalizirana fluorescencija za test RT-PCR VKK-a premašuje prag od 0,1 u 36 ciklusa PCR-a u svim ponavljanjima uzorka.
                        Uzorke se smatra dvojbenima ako normalizirana fluorescencija za test RT-PCR VKK-a premašuje prag od 0,1 između 36 i 40 ciklusa PCR-a u svim ponavljanjima uzorka.
                        Uzorke se smatra negativnima ako normalizirana fluorescencija za test RT-PCR VKK-a nije premašila prag od 0,1 u 40 ciklusa PCR-a u svim ponavljanjima uzorka te ako je normalizirana fluorescencija za vlasnički sintetički test vanjske kontrole premašila prag od 0,1 u 33 ciklusa PCR-a.”
                     
                  
      
      
         (1)  Laviada M.D., Roy P. i Sanchez-Vizcaino J.M (1992b). Adaptation and evaluation of an indirect ELISA and inmunoblotting test for African horse sickness antibody detection. (Prilagodba i evaluacija indirektnog testa ELISA i testa imunobloting za otkrivanje protutijela na konjsku kugu.) U: Bluetongue, African Horse Sickness and Related Orbiviruses: Proceedings of the Second International Symposium. (Bolest plavog jezika, konjska kuga i s njima povezani orbivirusi: rezultati drugog međunarodnog simpozija.) Walton T.E. & Osburn B.l., Eds. CRC Press, Boca Raton, Florida, SAD, 646.–650.
      
         (2)  Maree S. i Paweska J.T. 2005. Preparation of recombinant African horse sickness virus VP7 antigen via a simple method and validation of a VP7-based indirect ELISA for the detection of group-specific IgG antibodies in horse sera. (Priprema antigena rekombinantnog virusa konjske kuge VP7 jednostavnom metodom i validacija indirektnog testa ELISA utemeljenog na VP7 za otkrivanje grupno specifičnih protutijela IgG u konjskim serumima.) J. Virol. Methods, 125 (1), 55.–65.
      
         (3)  Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. i Jimenez-Clavero A. 2008. Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus. (Test fluorogenske obrnute transkripcije lančane reakcije polimerazom u stvarnom vremenu za otkrivanje virusa konjske kuge.) J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325.–328.
      
         (4)  Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus. (Dijagnostička točnost dvostrukog testa obrnute transkripcije kvantitativnog PCR-a u stvarnom vremenu za otkrivanje virusa konjske kuge.) Journal of Virological Methods. 2013;189(1):30-5.
      
         (5)  Quan, M., Lourens, C.W., MacLachlan, N.J., Gardner, I.A., Guthrie, A.J., 2010. Development and optimisation of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay targeting the VP7 and NS2 genes of African horse sickness virus. (Razvoj i optimizacija dvostrukog testa obrnute transkripcije kvantitativnog PCR-a u stvarnom vremenu usredotočenog na gene VP7 i NS2 virusa konjske kuge. J. Virol. Methods 167, 45.–52.