CELEX: 31978L0633
Language: cs
Date: 1978-06-15 00:00:00
Title: Osmá směrnice Komise ze dne 15. června 1978, kterou se stanoví analytické metody Společenství pro úřední kontrolu krmiv

Důležité právní upozornění

|

31978L0633

Úřední věstník L 206 , 29/07/1978 S. 0043 - 0055 Finské zvláštní vydání: Kapitola 3 Svazek 10 S. 0071  Řecké zvláštní vydání: Kapitola 03 Svazek 22 S. 0067  Švédské zvláštní vydání: Kapitola 3 Svazek 10 S. 0071  Španělské zvláštní vydání: Kapitola 03 Svazek 14 S. 0230  Portugalské zvláštní vydání Kapitola 03 Svazek 14 S. 0230 

		Osmá směrnice Komiseze dne 15. června 1978,kterou se stanoví analytické metody Společenství pro úřední kontrolu krmiv(78/633/EHS)KOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ,s ohledem na Smlouvu o založení Evropského hospodářského společenství,s ohledem na směrnici Rady 70/373/EHS ze dne 20. července 1970 o zavedení metod odběru vzorků a analytických metod Společenství pro úřední kontrolu krmiv [1], naposledy pozměněnou aktem o přistoupení, a zejména na článek 2 uvedené směrnice,vzhledem k tomu, že směrnice stanoví, aby byla oficiální kontrola krmiv prováděna s použitím metod odběru vzorků a analytických metod Společenství pro účely kontroly souladu požadavků stanovených právními nebo správním předpisy týkajícím se jakosti a složení krmiv;vzhledem k tomu, že směrnice komise 71/250/EHS ze dne 15. června 1971 [2], 71/393/EHS ze dne 18. listopadu 1971 [3], 72/199/EHS ze dne 27. dubna 1972 [4], 73/46/EHS ze dne 5. prosince 1972 [5], 74/203/EHS ze dne 25. března 1974 [6], 75/84/EHS ze dne 20. prosince 1974 [7] a 76/372/EHS ze dne 1. března 1976 [8] již ustanovily určitý počet analytických metod Společenství; že pokrok v práci od té doby činí vhodným přijmout osmou sérii metod;vzhledem k tomu, že opatření této směrnice jsou v souladu se stanoviskem Stálého výboru pro krmiva,PŘIJALA TUTO SMĚRNICI:Článek 11. Členské státy stanoví, aby byly analýzy pro oficiální kontrolu krmiv, co se týče jejich obsahů zinkbacitracinu, flavofosfolipolu, železa, mědi, manganu a zinku, prováděny v souladu s metodami popsanými v příloze této směrnice.2. Obecná ustanovení stanovená v části 1 "Úvod" přílohy první směrnice 71/250/EHS, se s výjimkou části týkající se přípravy vzorku, jež má být analyzován, vztahují i na metody popsané v příloze této směrnice.Článek 2Členské státy uvedou 1. ledna 1979 v účinnost právní a správní předpisy nezbytné pro dosažení souladu s touto směrnicí. Neprodleně o nich uvědomí Komisi.Článek 3Tato směrnice je určena členským státům.V Bruselu dne 15. června 1978.Za KomisiFinn Gundelachmístopředseda[1] Úř. věst. L 170, 3.8.1970, s. 2.[2] Úř. věst. L 155, 12.7.1971, s. 13.[3] Úř. věst. L 279, 20.12.1971, s. 7.[4] Úř. věst. L 123, 29.5.1972, s. 6.[5] Úř. věst. L 83, 30.3.1973, s. 21.[6] Úř. věst. L 108, 22.4.1974, s. 7.[7] Úř. věst. L 32, 5.2.1975, s. 26.[8] Úř. věst. L 102, 15.4.1976, s. 8.--------------------------------------------------PŘÍLOHA1. STANOVENÍ ZINKBACITRACINU DIFÚZÍ NA AGARU1. ÚČEL A ROZSAHTato metoda je určena pro stanovení zinkbacitracinu v krmivech, koncentrátech a premixech. Dolní mez stanovení je 5 mg/kg (5 ppm) [1]. Metoda není použitelná v přítomnosti ovlivňujících látek, zvláště velkých množství mědi nebo kyseliny askorbové.2. PRINCIPVzorek je extrahován při pH 2 směsí methanol/voda/kyselina chlorovodíková. Extrakt je upraven na pH 6,5, koncentrován (pokud je to nutné) a zředěn. Jeho antibiotická aktivita se stanoví měřením difúze zinkbacitracinu na agaru naočkovaném mikroorganizmem Micrococcus luteus (Syn. M. flavus). Difúze se projevuje formací inhibičních zón mikroorganizmu. Průměr těchto zón je přímo úměrný logaritmu antibiotické koncentrace nad rozsah použitých antibiotických koncentrací.3. MIKROORGANISMUS: MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 102403.1. Udržování zásobní kulturyNaočkujte Micrococcus luteus do zkumavky se šikmým agarem (4.1). Inkubujte 24 hodin při 30 až 37 °C, skladujte v chladničce při 4 °C a znovu přeočkujte každé dva týdny na šikmý agar.3.2. Příprava bakteriální suspenze [2]Smyjte bakterie ze zkumavky se šikmým agarem (3.1) za použití 2 až 3 ml roztoku chloridu sodného (4.3). Tuto suspenzi použijte k naočkování 250 ml kultivačního média (4.1) v Rouxově baňce a inkubujte 18 až 20 hodin při 30 až 37 °C. Smyjte mikroorganizmus do 25 ml roztoku chloridu sodného (4.3) a promíchejte. Zřeďte suspenzi na jednu desetinu roztokem chloridu sodného (4.3). Světelná transmise suspenze musí být okolo 75 %, měřeno při 650 nm v 1 cm kyvetě proti roztoku chloridu sodného (4.3).4. KULTIVAČNÍ MÉDIA A CHEMIKÁLIE4.1. Kultivační půda [3]Pepton z masa | 6,0 g |Trypton | 4,0 g |Extrakt z kvasnic | 3,0 g |Extrakt z masa | 1,5 g |Glukosa | 1,0 g |Agar | 15,0 g |Voda | 1000 ml |pH 6,5 až 6,6 (po sterilizaci) | |4.2. Zkušební půda [4]Trypton | 10,0 g |Extrakt z kvasnic | 3,0 g |Extrakt z masa | 1,5 g |Glukosa | 1,0 g |Agar | 20,0 g |Tween 80 | 1 ml |Voda | 1000 ml |pH 6,5 (po sterilizaci) | |4.3. Roztok chloridu sodného 0,8 % (váhově-objemových): rozpusťte 8 g chloridu sodného p.a. ve vodě a zřeďte do 1000 ml; sterilizujte.4.4. Směs čistého methanolu/vody/kyseliny chlorovodíkové p.a. (d: 1,18 až 1,19): 80/17,5/2,5 (objemově).4.5. Fosfátový pufr, pH 6,5Hydrogen fosforečnan draselný K2HPO4 p.a. (22,15 g).Dihydrogen fosforečnan draselný K2HPO4 p.a (27,85 g).Voda do 1000 ml.4.6. Kyselina chlorovodíková p.a. (d: 1,18 až 1,19).4.7. Kyselina chlorovodíková p.a. (0,1 N).4.8. N roztok hydroxidu sodného p.a.4.9. Roztok bromokresolové červeně 0,04 % (váhově-objemových): rozpusťte 0,1 g bromokresolové červeně v 18,5 ml 0,01 N roztoku hydroxidu sodného. Doplňte vodou do objemu 250 ml a promíchejte.4.10. Standardní látky: zinkbacitracin o známé aktivitě (v i.u.).5. STANDARDNÍ ROZTOKYOdvažte množství standardního zinkbacitracinu (4.10) odpovídající 1050 i.u. (podle uvedené aktivity). Přidejte 5 ml 0,1 N kyseliny chlorovodíkové (4.7) a nechejte ustát 15 minut. Přidejte 30 ml vody, upravte pH na 4,5 fosfátovým pufrem pH 6,5 (4.5) (okolo 4 ml), doplňte vodou do objemu 50 ml a dobře promíchejte (1 ml = 21 i.u.).Z tohoto roztoku připravte postupným ředěním fosfátovým pufrem pH 6,5 (4.5) následující roztoky:S8 | 0,42 | i.u./ml |S4 | 0,21 | i.u./ml |S2 | 0,105 | i.u./ml |S1 | 0,0525 | i.u./ml |6. PŘÍPRAVA EXTRAKTU6.1. Extrakce6.1.1. Koncentráty, premixy a minerální krmivaOdvažte množství vzorku 2,0 až 5,0 g, přidejte 30 ml směsi (4.4) a krátce protřepejte. Zkontrolujte, že je pH okolo 2. Třepejte 10 minut, přidejte 30 ml fosfátového pufru pH 6,5 (4.5) a třepejte 15 minut. Zřeďte fosfátovým pufrem (4.5), abyste obdrželi očekávaný obsah zinkbacitracinu 0,42 i.u./ml) (= U8).6.1.2. Bílkovinné koncentrátyOdvažte množství vzorku 10,0 g, přidejte 50 ml směsi (4.4) a krátce protřepejte. Zkontrolujte, že je pH okolo 2. Třepejte 10 minut, přidejte 50 ml fosfátového pufru pH 6,5 (4.5) a třepejte 15 minut. Zřeďte fosfátovým pufrem (4.5), abyste obdrželi očekávaný obsah zinkbacitracinu 0,42 i.u./ml) (= U8).6.1.3. Ostatní krmivaOdvažte množství 10,0 g vzorku (20,0 g pro očekávaný obsah zinkbacitracinu 5 mg/kg), přidejte 25 ml směsi (4.4) a homogenizujte asi 10 minut. Přidejte 25 ml fosfátového pufru pH 6,5 (4.5), třepejte 15 minut a odstřeďte. Odeberte 20 ml roztoku supernatantu a upravte pH na 6,5 s použitím 1 N roztoku hydroxidu sodného (4.8) s roztokem bromokresolové červeně (4.9) jako indikátorem. Odpařte na přibližně 4 ml na rotačním odpařovači při teplotě nepřesahující 35 °C. Zřeďte zbytek vodou, abyste obdrželi očekávaný obsah zinkbacitracinu 0,42 i.u./ml (= U8).6.2. Zkušební roztokyZ roztoku U8 připravte roztok U4 (očekávaný obsah: 0,21 i.u./ml), U2 (očekávaný obsah: 0,105 i.u./ml) a U1 (očekávaný obsah: 0,0525 i.u./ml) s použitím postupného ředění (1 + 1) fosfátovým pufrem (4.5).7. ZKUŠEBNÍ POSTUP7.1. Očkování zkušebního médiaOčkujte zkušební médium (4.2) bakteriální suspenzí (3.2) při asi 50 °C. Předběžnými pokusy na miskách se zkušebním médiem (4.2) stanovte množství požadované bakteriální suspenze, které poskytne největší a nejjasnější inhibiční zóny s různými koncentracemi zinkbacitracinu.7.2. Příprava misekDifúze na agaru je prováděna v miskách za použití čtyřech koncentrací standardního roztoku (S8, S4, S2, S1) a čtyřech koncentrací zkušebního roztoku (U8, U4, U2, U1). Tyto čtyři koncentrace extraktu a standardu musí být nezbytně umístěny do každé plotny. Pro tento účel vyberte plotny, které jsou dostatečně velké, aby umožnily udělat v agaru nejméně 8 otvorů o průměru 10 až 13 mm a nejméně 30 mm mezi jejich středy. Pokus může být prováděn na plotnách sestávajících z plochých skleněných desek vybavených dokonale rovným hliníkovým nebo plastovým kroužkem, umístěným na vrchu, 200 mm v průměru a 20 mm výšky.Rozlijte na misky množství média (4.2), naočkovaného jako v bodě 7.1, aby vytvořilo vrstvu asi 2 mm silnou (50 ml na misku o průměru 200 mm). Nechejte ustát v rovnovážné pozici, vytvořte díry a umístěte do nich přesně odměřené objemy zkušebních a standardních roztoků (mezi 0,10 a 0,15 ml na díru, podle průměru).Každou koncentraci použijte nejméně čtyřikrát tak, že každému stanovení podléhá vyhodnocení 32 inhibičních zón.7.3. InkubaceInkubujte plotny 16 až 18 hodin při 28 až 30 °C.8. VYHODNOCENÍZměřte průměr inhibičních zón s přesností na 0,1 mm. Zaznamenejte střední měření pro každou koncentraci na semilogaritmickém grafickém papíře, znázorňujíc logaritmus koncentrací ve vztahu k průměrům inhibičních zón. Narýsujte nejvhodnější křivky standardního roztoku a extraktu, například jako je to uvedeno níže.Stanovte "nejvhodnější" bod pro nejnižší úroveň standardu (SL) s použitím rovnice:SL =7 S+ 4 S+ S- 2 S810Stanovte "nejvhodnější" bod pro nejvyšší úroveň standardu (SH) s použitím rovnice:SH =7 S+ 4 S+ S- 2 S110Podobně vypočtěte "nejvhodnější" body pro nejnižší úroveň extraktu (UL) a nejvyšší úroveň extraktu (UH) nahrazením U1, U2, U4 a U8 za S1, S2, S4 a S8 v nahoře uvedených rovnicích.Zaznamenejte vypočítané hodnoty SL a SH na stejný grafický papír a spojte je, abyste obdrželi "nejvhodnější" křivku pro roztok standardu. Podobně zaznamenejte UL a UH a spojte je, abyste obdrželi "nejvhodnější" křivku pro extrakt.V nepřítomnosti jakýchkoli ovlivnění by měly být křivky paralelní. Pro praktické účely mohou být křivky považovány za paralelní, pokud se hodnoty (SH-SL) a (UH-UL) neliší o více než 10 % od jejich střední hodnoty.Pokud jsou křivky shledány jako neparalelní, může být pominuto buď U1 a S1 nebo U8 a S8 a SL, SH, UL a UH vypočteny za použití alternativních rovnic, které poskytují alternativní "nejvhodnější" křivky:SL =5 S+ 2 S- S6SH =5 S+ 2 S- S6a podobně pro UL a UH. Alternativní nejvhodnější křivky musí být kontrolovány na paralelnost jako předtím. Skutečnost, že byl výsledek počítán ze tří úrovní, musí být uvedena v závěrečné zprávě.Když jsou křivky považovány za paralelní, vypočtěte logaritmus relativní aktivity (log. A) pomocí jedné s následujících rovnic.Pro čtyři úrovnělog A =× 0,602U+ U+ S+ S- U- U- S- S2Pro tři úrovnělog A =× 0,401U+ S- U- S1nebolog A =× 0,401U+ S- U- S2Skutečná aktivita = předpokládaná aktivita x relativní aktivita.Když jsou křivky považovány za neparalelní, opakujte stanovení. Pokud není paralelnost stále docílena, vypočítejte logaritmus relativní aktivity (log. A) pomocí rovnice c). Nicméně, obdržený výsledek musí být považován za přibližný a toto musí být uvedeno v závěrečné zprávě.9. OPAKOVATELNOSTRozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených u stejného vzorku stejným analytikem nesmí překročit:20 % rel. z vyšší hodnoty pro obsahy zinkbacitracinu od 5 a do 25 mg/kg;5 mg/kg v absolutní hodnotě pro obsahy větší než 25 a do 50 mg/kg;10 % rel. z vyšší hodnoty pro obsahy nad 50 mg/kg.2. STANOVENÍ FLAVOFOSFOLIPOLU DIFÚZÍ NA AGARU1. ÚČEL A ROZSAHTato metoda je určena pro stanovení flavofosfolipolu v krmivech, koncentrátech a premixech. Dolní mez stanovení je 1 mg/kg (1 ppm).2. PRINCIPVzorek je extrahován zředěným methanolem za varu pod zpětným chladičem. Po odstředění je extrakt přečištěn (kde je to nutné) na ionexu a zředěn. Jeho antibiotická aktivita se stanoví měřením difúze flavofosfolipolu na agaru naočkovaném mikroorganizmem Staphylococcus aureus. Difúze se projevuje formací inhibičních zón mikroorganizmu. Průměr těchto zón je přímo úměrný logaritmu antibiotické koncentrace v rozsahu použitých antibiotických koncentrací.3. MIKROORGANISMUS: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P3.1. Udržování zásobní kulturyNaočkujte Staphylococcus aureus do zkumavky se šikmým agarem (4.1). Inkubujte 24 hodin při 37 °C, skladujte v chladničce při 4 °C a znovu přeočkujte každý měsíc na šikmý agar.3.2. Příprava bakteriální suspenze [5]Oddělte dvě zkumavky obsahující zásobní kulturu (3.1) a týdně ji přeočkovávejte. Inkubujte 24 hodin při 37 °C a skladujte v chladničce při asi 4 °C.24 hodin před zkouškou naočkujte touto kulturou dvě až čtyři zkumavky obsahující šikmé kultivační médium (4.1). Inkubujte 16 až 18 hodin při 37 °C. Vytvořte suspenzi kultury v roztoku chloridu sodného (4.3). Světelná transmitance suspenze musí být okolo 40 %, měřeno při 578 nm v 1 cm kyvetě proti roztoku chloridu sodného (4.3).4. KULTIVAČNÍ MÉDIA A CHEMIKÁLIE4.1. Kultivační médium [6]Pepton z masa | 6,0 g |Trypton | 4,0 g |Extrakt z kvasnic | 3,0 g |Extrakt z masa | 1,5 g |Glukosa | 1,0 g |Agar | 15,0 g |Voda | 1000 ml |pH 6,5 (po sterilizaci) | |4.2. Zkušební médium4.2.1. Základní vrstva [7]Pepton z masa | 6,0 g |Extrakt z kvasnic | 3,0 g |Extrakt z masa | 1,5 g |Agar | 10,0 g |Voda | 1000 ml |pH 6,5 (po sterilizaci) | |4.2.2. Očkovací vrstvaJako v bodě 4.1, s přídavkem 2,0 g silikonové protipěnící emulze [8].4.3. Roztok chloridu sodného 0,4 % (hmotnostně-objemových): rozpusťte 4 g chloridu sodného p.a. ve vodě a zřeďte do 1000 ml; sterilizujte.4.4. Methanol, čistý.4.5. Methanol 50 % (objemových): zřeďte 500 ml methanolu (4.4) 500 ml vody.4.6. Methanol 80 % (objemových): zřeďte 800 ml methanolu (4.4) 200 ml vody.4.7. Tris (hydroxymetyl) aminometan p.a.4.8. Methanolový roztok chloridu draselného 1,5 % (váhově-objemových): rozpusťte 1,5 g chloridu draselného p.a. ve 20 ml vody, doplňte methanolem (4.4) do objemu 100 ml.4.9. Kationtový měnič: Dowex 50 Wx8, 20 až 50 mesh, Na forma (kat. Serva č. 41600) nebo ekvivalent.4.10. Aniontový měnič: Dowex 1x2, 50 až 100 mesh, Cl forma (kat. Serva č. 41010) nebo ekvivalent. Před použitím udržujte 12 až 14 hodin v 80 % methanolu (4.6).4.11. Skelná vlna.4.12. pH indikátorový papírek (pH 6,06 až 8.1).4.13. Kyselina askorbová.4.14. Standardní látka: flavofosfolipol o známé aktivitě.5. PŘÍSTROJE5.1. Skleněné trubice pro chromatografii, vnitřní průměr: 9 mm, délka 150 až 200 mm, vybavené zavíracím kohoutem ve zúžené části dolního konce a skleněným zábrusem (ke spojení s dávkovací nálevkou (5.2)) v horní části.5.2. Dávkovací nálevka 250 ml, vybavená zavíracím kohoutem a skleněným zábrusem.5.3. 250 ml kónická baňka se skleněným zábrusem.5.4. Zpětný chladič se skleněným zábrusem.6. STANDARDNÍ ROZTOKYRozpusťte přesně odvážené množství standardní látky (4.14) v 50 % methanolu (4.5) a zřeďte, abyste obdrželi zásobní roztok obsahující 100 μg flavofosfolipolu na mililitr. Pokud je tento roztok skladován v zazátkované baňce při 4 °C, je stabilní až dva měsíce.Z tohoto zásobního roztoku připravte postupným ředěním 50 % methanolem (4.5) následující roztoky:S8 | 0,2 | μg/ml |S4 | 0,1 | μg/ml |S2 | 0,05 | μg/ml |S1 | 0,025 | μg/ml |7. PŘÍPRAVA EXTRAKTU7.1. Extrakce7.1.1. Koncentráty, premixy a minerální krmivaOdvažte množství vzorku 2,0 až 5,0 g, přidejte asi 150 mg kyseliny askorbové (4.13). Homogenizujte se 150 ml 50 % methanolu (4.5) v kónické baňce (5.3) a upravte pH na 8,1 až 8,2 asi 400 mg tris (hydroxymetyl) aminometanem (4.7). Zkontrolujte pH indikačním papírkem (4.12). Nechejte ustát 15 minut, potom znovu upravte pH na 8,1 až 8,2 tris (hydroxymetyl) aminometanem (4.7) a vařte 10 minut pod zpětným chladičem (5.4) při stálém míchání. Nechejte vychladnout, odstřeďte směs a dekantujte extrakt.7.1.2. Ostatní krmivaOdvažte množství 5,0 až 30,0 g vzorku obsahujícího nejméně 30 μg flavofosfolipolu. Homogenizujte se 150 ml 50 % methanolu (4.5) v kónické baňce (5.3) a upravte pH na 8,1 až 8,2 asi 400 mg tris (hydroxymetyl) aminometanem (4.7). Zkontrolujte pH indikačním papírkem (4.12). Nechejte ustát 15 minut, potom znovu upravte pH na 8,1 až 8,2 tris (hydroxymetyl) aminometanem (4.7) a vařte 10 minut pod zpětným chladičem (5.4) při stálém míchání. Nechejte vychladnout, odstřeďte směs a dekantujte extrakt.7.2. Přečištění (tento krok může být pominut u koncentrátů, premixů a minerálních krmiv)Rozmíchejte 110 ml extraktu s 11 g kationtového měniče (4.9), vařte jednu minutu pod zpětným chladičem (5.4) při stálém míchání. Oddělte kationtový měnič odstředěním nebo filtrací. Promíchejte 100 ml extraktu se 150 ml methanolu (4.4) a skladujte roztok 12 až 15 hodin při 4 °C. Odfiltrujte vločkovitou hmotu dokud je roztok chladný.Vložte zátku ze skelné vlny (4.11) do spodního konce skleněné trubice (5.1), vlijte do trubice 5 ml aniontového měniče (4.10) a promyjte kolonu 100 ml 80 % methanolu (4.6). S použitím nálevky (5.2), přeneste do kolony nejméně 100 ml filtrátu, u kterého se očekává, že obsahuje 16 μg flavofosfolipolu (200 ml na 30 g vzorku krmiva při 1 ppm). Kde je to nutné, zřeďte filtrát před aplikací do kolony 80 % methanolem (4.6), abyste obdrželi očekávaný obsah flavofosfolipolu 16 μg/100 ml. Průtok upravte na asi 2 ml/minutu. Odstraňte efluentvýtok. Jímejte 50 ml 80 % methanolu (4.6) a odstraňte výtok.Eluujte flavofosfolipol methanolovým roztokem chloridu draselného (4.8) při průtoku asi 2 ml/minutu. Seberte 50 ml eluátu do odměrné baňky, přidejte 30 ml vody a promíchejte. Tento roztok by měl mít obsah flavofosfolipolu 0,2 μg/ml (= U8).7.3. Zkušební roztokyKde je to nutné (tj. když bylo pominuto předčištění), zřeďte extrakt získaný v bodě 7.1.1 50 % methanolem (4.5), abyste obdrželi očekávaný obsah flavofosfolipolu 0,2 μg/ml (= U8).Z roztoku U8 připravte roztok U4 (očekávaný obsah: 0,1 μg/ml), U2 (očekávaný obsah: 0,05 μg/ml) a U1 (očekávaný obsah: 0,025 μg/ml) s použitím postupného ředění (1 + 1) 50 % methanolem (4.5).8. ZKUŠEBNÍ POSTUP8.1. Očkování zkušebního médiaOčkujte zkušební médium (4.2.2) bakteriální suspenzí (3.2) při asi 50 °C. Předběžnými pokusy na miskách se zkušebním médiem (4.2.2) stanovte množství požadované bakteriální suspenze, které poskytne největší a nejjasnější inhibiční zóny s různými koncentracemi flavofosfolipolu (asi 30 ml/litr).8.2. Příprava misekDifúze na agaru je prováděna v miskách za použití čtyřech koncentrací standardního roztoku (S8, S4, S2, S1) a čtyřech koncentrací zkušebního roztoku (U8, U4, U2, U1). Tyto čtyři koncentrace extraktu a standardu musí být nezbytně umístěny do každé plotny. Pro tento účel vyberte plotny, které jsou dostatečně velké, aby umožnily udělat v agaru nejméně 8 otvorů o průměru 10 až 13 mm a nejméně 30 mm mezi jejich středy. Pokus může být prováděn na miskách sestávajících z plochých skleněných ploten vybavených dokonale rovným hliníkovým nebo plastovým rámem 200 mm v průměru a 20 mm výšky.Rozlijte na plotny množství média (4.2.1), aby vytvořilo vrstvu asi 1,5 mm silnou (45 ml na misku o průměru 200 mm). Nechejte ustát ve vodorovné pozici a potom přelijte množstvím média (4.2.2) naočkovaného jako v bodě 8.1, aby vytvořilo vrstvu 1 mm silnou (30 ml na misku o průměru 200 mm). Nechejte znovu ustát v rovnovážné pozici, vytvořte otvory a umístěte do nich přesně odměřené objemy zkušebních a standardních roztoků (mezi 0,10 a 0,15 ml na díru, podle průměru).Každou koncentraci použijte nejméně čtyřikrát tak, že každému stanovení podléhá vyhodnocení 32 inhibičních zón.8.3. InkubaceInkubujte plotny 16 až 18 hodin při 28 až 30 °C.9. VYHODNOCENÍZměřte průměr inhibičních zón s přesností na 0,1 mm. Zaznamenejte střední hodnotu pro každou koncentraci na semilogaritmickém grafickém papíře, znázorňujíc logaritmus koncentrací ve vztahu k průměrům inhibičních zón. Narýsujte nejvhodnější křivky standardního roztoku a extraktu, například jako je to uvedeno níže.Stanovte "nejvhodnější" bod pro nejnižší úroveň standardu (SL) s použitím rovnice:SL =7 S+ 4 S+ S- 2 S810SH =7 S+ 4 S+ S- 2 S110Podobně vypočtěte "nejvhodnější" body pro nejnižší úroveň extraktu (UL) a nejvyšší úroveň extraktu (UH) nahrazením U1, U2, U4 a U8 za S1, S2, S4 a S8 ve výše uvedených rovnicích.Zaznamenejte vypočítané hodnoty SL a SH na stejný grafický papír a spojte je, abyste obdrželi "nejvhodnější" křivku pro roztok standardu. Podobně zaznamenejte UL a UH a spojte je, abyste obdrželi "nejvhodnější" křivku pro extrakt.V nepřítomnosti jakýchkoli ovlivnění by měly být křivky paralelní. Pro praktické účely mohou být křivky považovány za paralelní, pokud se hodnoty (SH-SL) a (UH-UL) neliší o více než 10 % od jejich střední hodnoty.Pokud jsou křivky shledány jako neparalelní, může být pominuto buď U1 a S1 nebo U8 a S8 a SL, SH, UL a UH vypočteny za použití alternativních rovnic, které poskytují alternativní "nejvhodnější" křivky:SL =5 S+ 2 S- S6SH =5 S+ 2 S- S6a podobně pro UL a UH. Alternativní nejvhodnější křivky musí být kontrolovány na paralelnost jako předtím. Skutečnost, že byl výsledek počítán ze tří úrovní, musí být uvedena v závěrečné zprávě.Když jsou křivky považovány za paralelní, vypočtěte logaritmus relativní aktivity (log. A) pomocí jedné s následujících rovnic.Pro čtyři úrovnělog A =× 0,602U+ U+ S+ S- U- U- S- S2Pro tři úrovnělog A =× 0,401U+ S- U- S1nebolog A =× 0,401U+ S- U- S2Skutečná aktivita = předpokládaná aktivita x relativní aktivita.Když jsou křivky považovány za neparalelní, opakujte stanovení. Pokud není paralelnost stále docílena, vypočítejte logaritmus relativní aktivity (log. A) prostřednictvím rovnice c). Nicméně, obdržený výsledek musí být považován za přibližný a toto musí být uvedeno v závěrečném hlášení.10. OPAKOVATELNOSTRozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených u stejného vzorku stejným analytikem nesmí překročit:0,5 mg/kg v absolutní hodnotě pro obsahy flavofosfolipolu od 1 do 2 mg/kg;25 % rel. z vyšší hodnoty pro obsahy větší než 2 do10 mg/kg;20 % rel. z vyšší hodnoty pro obsahy větší než 10 do 25 mg/kg;5 mg/kg v absolutní hodnotě pro obsahy větší než 25 do 50 mg/kg;10 % rel. z vyšší hodnoty pro obsahy nad 50 mg/kg.3. STANOVENÍ STOPOVÝCH PRVKŮ ŽELEZA, MĚDI, MANGANU A ZINKU1. ÚČEL A ROZSAHTato metoda umožňuje stanovit stopové prvky železo, měď, mangan a zinek v krmivech. Dolní meze stanovení jsou:železo (Fe): 20 mg/kgměď (Cu): 10 mg/kgmangan (Mn): 20 mg/kgzinek (Zn): 20 mg/kg2. PRINCIPVzorek je převeden do roztoku kyselinou chlorovodíkovou po destrukci organické hmoty, pokud je obsažena. Prvky železo, měď, mangan a zinek jsou stanoveny po příslušném zředění atomovou absorpční spektrofotometrií.3. CHEMIKÁLIEÚvodní poznámkyPro přípravu chemikálií a analytických roztoků používejte vodu, u které bylo stanoveno, že je bez kationtů, získanou buď dvounásobnou destilací vody v borosilikátovém nebo křemíkatém destilačním přístroji nebo dvounásobným působením ionexu.Chemikálie musí být nejméně analytické kvality (p.a.). Nepřítomnost prvků, které mají být stanoveny, musí být kontrolována slepým pokusem. Pokud je to nutné, musí být chemikálie dále přečištěny.Namísto standardních roztoků popsaných níže, mohou být použity komerční standardní roztoky za předpokladu, že jsou garantovány a před použitím byly překontrolovány.3.1. Kyselina chlorovodíková p.a. (d: 1,19).3.2. Kyselina chlorovodíková p.a. (6 N).3.3. Kyselina chlorovodíková p.a. (0,5 N).3.4. Kyselina fluorovodíková 38 až 40 % (objemových) mající obsah železa menší než 1 mg Fe/litr a zbytek po odpaření menší než 10 mg (jako sulfát)/litr.3.5. Kyselina sírová p.a. (d: 1,84).3.6. Peroxid vodíku p.a. (přibližně 100 objemů kyslíku (30 % hmotnostně)).3.7. Standardní roztok železa (1000 μg Fe/ml) připravený následovně: rozpusťte 1 g železného drátu p.a. ve 200 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové (3.2), přidejte 16 ml peroxidu vodíku (3.6) a doplňte do jednoho litru vodou.3.7.1. Pracovní standardní roztok železa (100 μg Fe/ml) připravený zředěním standardního roztoku (3.7) 1 + 9 vodou.3.8. Standardní roztok mědi (1000 μg Cu/ml) připravený následovně: rozpusťte 1 g mědi v práškové formě (p.a.) ve 25 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové (3.2), přidejte 5 ml peroxidu vodíku (3.6) a doplňte do jednoho litru vodou.3.8.1. Pracovní standardní roztok mědi (10 μg Cu/ml) připravený zředěním standardního roztoku (3.8) 1 + 9 vodou a potom zředěním výsledného roztoku 1 + 9 vodou.3.9. Standardní roztok manganu (1000 μg Mn/ml) připravený následovně: rozpusťte 1 g manganu v práškové formě (p.a.) ve 25 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové (3.2), přidejte 5 ml peroxidu vodíku (3.6) a doplňte do jednoho litru vodou.3.9.1. Pracovní standardní roztok manganu (10 μg Mn/ml) připravený zředěním standardního roztoku (3.9) 1 + 9 vodou a potom zředěním výsledného roztoku 1 + 9 vodou.3.10. Standardní roztok zinku (1000 μg Zn/ml) připravený následovně: rozpusťte 1 g zinku ve formě pásku nebo plátku (p.a.) ve 25 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové (3.2) a doplňte do jednoho litru vodou.3.10.1. Pracovní standardní roztok zinku (10 μg Zn/ml) připravený zředěním standardního roztoku (3.10) 1 + 9 vodou a potom zředěním výsledného roztoku 1 + 9 vodou.3.11. Roztok chloridu lanthanitého připravený následovně: rozpusťte 12 g kysličníku lanthanitého ve 150 ml vody, přidejte 100 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové (3.2) a doplňte do jednoho litru vodou.4. PŘÍSTROJE4.1. Muflová pec s regulací teploty a záznamníkem.4.2. Skleněné nádobí musí být rezistentního borosilikátového typu a doporučuje se používat přístroje, které jsou výlučně rezervovány pro stanovení stopových prvků.4.3. Platinové kelímky a (volitelně) křemenné kelímky.4.4. Atomový absorpční spektrofotometr splňující požadavky metody, co se týče citlivosti a přesnosti v požadovaném rozsahu.5. POSTUP5.1. Vzorky obsahující organickou hmotu5.1.1. Žíhání a příprava roztoku pro analýzu [9]i) Vložte 5 až 10 g vzorku, odváženého s přesností na 0,2 mg, do křemenného nebo platinového kelímku (4.3) (viz poznámka b)), vysušte v sušárně při 105 °C a vložte kelímek do chladné muflové pece (4.1). Zavřete pec (viz poznámka c)) a postupně zvyšujte teplotu na 470 až 475 °C po asi 90 minut. Udržujte tuto teplotu 4 až 16 hodin (např. přes noc), aby se odstranil uhlíkatý materiál a potom otevřete pec a nechejte vychladnout (viz poznámka d)).Vymyjte kelímek celkem asi 5 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1) a přidejte kyselinu pomalu a opatrně do kádinky (může proběhnout prudká reakce díky tvorbě CO2). Přidejte po kapkách kyselinu chlorovodíkovou (3.1) za míchání, dokud neustane šumění. Odpařte do sucha za příležitostného míchání skleněnou tyčinkou.Dále přidejte ke zbytku 15 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové (3.2) a následně asi 120 ml vody. Míchejte skleněnou tyčinkou, která by měla být ponechána v kádince a zakryjte kádinku hodinovým sklem. Uveďte mírně do varu a udržujte na bodu varu dokud již není vidět nerozpuštěný popel. Přefiltrujte přes filtrační papír bez obsahu popela a jímejte do 250 ml odměrné baňky. Kádinku a filtr vymyjte 5 ml horké 6 N kyseliny chlorovodíkové (3.2) a dvakrát vroucí vodou. Doplňte odměrnou baňku po značku vodou (koncentrace HCl asi 0,5 N).ii) Pokud je zbytek na filtru zbarven černě (uhlík), dejte jej zpět do pece a žíhejte znovu při 450 až 475 °C. Toto žíhání, které vyžaduje pouze několik hodin (asi tři až pět hodin), je dokončeno, když je popel bílý nebo téměř bílý. Rozpusťte zbytek asi 2 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1), odpařte do sucha a přidejte 5 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové (3.2). Zahřejte, přefiltrujte roztok do odměrné baňky a doplňte po značku vodou (koncentrace HCl asi 0,5 N).Poznámky:a) Při stanovení stopových prvků je důležité být ostražitý vůči rizikům kontaminace, zejména zinkem, mědí a železem. Z tohoto důvodu musí být vybavení používané při přípravě vzorků bez těchto kovů.Ke snížení obecného rizika kontaminace, pracujte v bezprašné atmosféře s úzkostlivě čistým vybavením a pečlivě umývaným nádobím. Stanovení zinku je zvláště citlivé na mnoho typů kontaminace, např. z nádobí, chemikálií, prachu, atd.b) Váha vzorku, který má být žíhán, je počítána z přibližného obsahu stopového prvku v krmivu ve vztahu k citlivosti použitého spektrofotometru. U určitých krmiv s nízkým obsahem stopových prvků může být nezbytné začít s 10 až 20 g vzorku a doplnit konečný roztok na pouze 100 ml.c) Žíhání musí být prováděno v zavřené peci bez vhánění vzduchu nebo kyslíku.d) Teplota ukazovaná pyrometrem nesmí překročit 475 °C.5.1.2. Spektrofotometrické stanovení5.1.2.1. Příprava kalibračních roztokůPro každý prvek, který má být stanoven, připravte z pracovních standardních roztoků získaných dle bodů 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 a 3.10.1 řadu kalibračních roztoků, každý kalibrační roztok s koncentrací HCL okolo 0,5 N a (v případě železa, manganu a zinku) koncentrací chloridu lanthanitého ekvivalentní 0,1 % La (hmotnostně-objemových). Koncentrace vybraných stopových prvků musí ležet v rozsahu citlivosti použitého spektrofotometru. Tabulky uvedené níže ukazují příkladně složení typických řad kalibračních roztoků; v závislosti na typu a citlivosti použitého spektrofotometru může být nicméně nutno vybrat další koncentrace.Železoμg Fe/ml | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |ml pracovního standardního roztoku (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe) | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |+ ml 6 N HCl (3.2) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |+ 10 ml roztoku chloridu lanthanitého (3.11) a doplnit do 100 ml vodou. |Měďμg Cu/ml | 0 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0 |ml pracovního standardního roztoku (3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu) | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |+ ml 6 N HCl (3.2) | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 |Doplnit do 100 ml vodou. |Manganμg Mn/ml | 0 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0 |ml pracovního standardního roztoku (3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn) | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |+ ml 6 N HCl (3.2) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |+ 10 ml roztoku chloridu lanthanitého (3.11) a doplnit do 100 ml vodou. |Zinekμg Zn/ml | 0 | 0,05 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 |ml pracovního standardního roztoku (3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn) | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 |+ ml 6 N HCl (3.2) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |+ 10 ml roztoku chloridu lanthanitého (3.11) a doplnit do 100 ml vodou. |5.1.2.2. Příprava roztoku pro analýzyU stanovení mědi může být roztok připravený z bodu 5.1.1 normálně použit přímo. Pokud je nezbytné přivést jeho koncentraci na úroveň kalibračních roztoků, může být alikvotní část pipetována do 100 ml odměrné baňky a doplněna po značku 0,5 N kyselinou chlorovodíkovou (3.3).U stanovení železa, manganu a zinku odpipetujte alikvotní podíl roztoku připraveného podle bodu 5.1.1 do 100 ml odměrné baňky, přidejte 10 ml chloridu lanthanitého (3.11) a doplňte po značku 0,5 N kyselinou chlorovodíkovou (3.3) (viz rovněž bod 8 poznámky).5.1.2.3. Slepý pokusSlepý pokus musí zahrnovat všechny předepsané kroky postupu kromě toho, že je pominut materiál vzorku.Kalibrační roztok "0" nemůže být použit jako slepý.5.1.2.4. Měření atomové absorpceZměřte atomovou absorpci kalibračních roztoků a roztoku, který má být analyzován, s použitím okysličujícího plamene vzduch-acetylen při následujících vlnových délkách:Fe: 248,3 nmCu: 324,8 nmMn: 279,5 nmZn: 213,8 nmProveďte každé měření čtyřikrát.5.2. Minerální krmivaPokud vzorek neobsahuje organickou hmotu, není nezbytné spalování. Pokračujte, jak je to popsáno v bodě 5.1.1 i) počínaje druhým odstavcem. Odpaření s kyselinou fluorovodíkovou může být pominuto.6. VÝPOČET VÝSLEDKŮS použitím kalibrační křivky vypočtěte koncentraci stopového prvku v roztoku, který má být analyzován a vyjádřete výsledek v miligramech stopového prvku na kilogram vzorku (ppm).7. OPAKOVATELNOSTRozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku stejným analytikem nesmí překročit:- 5 mg/kg v absolutní hodnotě u obsahů příslušného stopového prvku do 50 mg/kg,- 10 % z vyššího výsledku u obsahů příslušného stopového prvku od 50 do 100 mg/kg,- 10 mg/kg, v absolutní hodnotě u obsahů příslušného stopového prvku od 100 do 200 mg/kg,- 5 % z vyššího výsledku u obsahů příslušného stopového prvku přes 200 mg/kg.8. POZNÁMKYP· 2, může být přídavek roztoku chloridu lanthanitého (3.11) do roztoku pro analýzy a do kalibračních roztoků pominuto.[1] 1 mg krmného zinkbacitracinu je ekvivalentní 42 mezinárodním jednotkám (i.u.).[2] Jiné metody mohou být použity za předpokladu, že bylo stanoveno, že dávají podobné bakteriální suspenze.[3] Může být použito jakékoli komerční kultivační médium podobného složení a dávající stejné výsledky.[4] Může být použito jakékoli komerční kultivační médium podobného složení a dávající stejné výsledky.[5] Jiné metody mohou být použity za předpokladu, že bylo stanoveno, že dávají podobné bakteriální suspenze.[6] Může být použito jakékoli komerční kultivační médium podobného složení a dávající stejné výsledky, např. oxoid antibiotické médium 1 (CM 327) s přídavkem oxoid agaru č. 3 (L 13).[7] Může být použito jakékoli komerční kultivační médium podobného složení a dávající stejné výsledky, např. oxoid antibiotické médium 2 (CM 335) s přídavkem oxoid agaru č. 3 (L 13).[8] Např. SE 2 od Wacker Chemie Gmbh, Mnichov.[9] Zelené pícniny (čerstvé nebo suché) často obsahují velká množství rostlinného křemíku, který může zadržovat stopové prvky a musí být odstraněn. U vzorků těchto krmiv musí být proto dodržen následující modifikovaný postup.Proveďte operaci 5.1.1 i) až po filtraci. Vymyjte filtrační papír obsahující nerozpustný zbytek dvakrát vroucí vodou a vlažte jej do platinového kelímku (4.3). Spalte v muflové peci (4.1) při teplotě pod 550 °C, dokud všechen uhlíkatý materiál zcela nezmizel. Nechejte vychladnout, přidejte několik kapek vody a následně 10 až 15 ml kyseliny fluorovodíkové (3.4) a odpařte do sucha při asi 150 °C. Pokud zůstane nějaký křemičitý zbytek, rozpusťte jej znovu v několika mililitrech kyseliny fluorovodíkové (3.4) a odpařte do sucha. Přidejte pět kapek kyseliny sírové (3.5) a zahřívejte dokud se nepřestane uvolňovat bílý kouř. Po přidání 5 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové (3.2) a asi 30 ml vody, zahřejte, přefiltrujte roztok do 250 ml odměrné baňky a doplňte po značku vodou (koncentrace HCL asi 0,5 N). Poté pokračujte stanovením od bodu 5.1.3.--------------------------------------------------