CELEX: 32002R2091
Language: sl
Date: 2002-11-26 00:00:00
Title: Uredba Komisije (ES) št. 2091/2002 z dne 26. novembra 2002 o spremembi Uredbe (ES) št. 2870/2000 o določitvi referenčnih metod Skupnosti za analizo žganih pijač

Pomembno pravno obvestilo

|

32002R2091

Uredba Komisije (ES) št. 2091/2002 z dne 26. novembra 2002 o spremembi Uredbe (ES) št. 2870/2000 o določitvi referenčnih metod Skupnosti za analizo žganih pijač  

Uradni list L 322 , 27/11/2002 str. 0011 - 0027 CS.ES poglavje 3 zvezek 37 str. 395  - 411 ET.ES poglavje 3 zvezek 37 str. 395  - 411 HU.ES poglavje 3 zvezek 37 str. 395  - 411 LT.ES poglavje 3 zvezek 37 str. 395  - 411 LV.ES poglavje 3 zvezek 37 str. 395  - 411 MT.ES poglavje 3 zvezek 37 str. 395  - 411 PL.ES poglavje 3 zvezek 37 str. 395  - 411 SK.ES poglavje 3 zvezek 37 str. 395  - 411 SL.ES poglavje 3 zvezek 37 str. 395  - 411

		Uredba Komisije (ES) št. 2091/2002z dne 26. novembra 2002o spremembi Uredbe (ES) št. 2870/2000 o določitvi referenčnih metod Skupnosti za analizo žganih pijačKOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE –ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske gospodarske skupnosti,ob upoštevanju Uredbe Sveta (EGS) št. 1576/89 z dne 29. maja 1989 o določitvi splošnih pravil za opredelitev, opis in predstavitev žganih pijač [1], kakor je bila spremenjena z Aktom o pristopu Avstrije, Finske in Švedske, in zlasti člena 4(8) Uredbe,ob upoštevanju naslednjega:(1) Uredba Komisije (ES) št. 2870/2000 z dne 19. decembra 2000 o določitvi referenčnih metod Skupnosti za analizo žganih pijač [2] vsebuje opise teh metod v Prilogi.(2) Štiri metode analize za določitev trans-anetola v žganih pijačah z janežem, glicirizinske kisline in halkonov v pastisu ter rumenjaka v jajčnem likerju in likerju z dodatkom jajc so potrjene v skladu z mednarodno priznanimi merili v okviru raziskovalnega projekta, ki ga podpira Komisija.(3) Te štiri metode se lahko priznajo kot referenčne metode Skupnosti in morajo biti dodane Prilogi k Uredbi (ES) št. 2870/2000.(4) Ukrepi, predvideni s to uredbo, so v skladu z mnenjem Odbora za izvajanje določb o žganih pijačah –SPREJELA NASLEDNJO UREDBO:Člen 1Priloga k Uredbi (ES) št. 2870/2000 se spremeni:1. V kazalu Priloge se črta navedbe "(p. m.)" v točkah V, VI, VII in IX.2. Za poglavjem III se dodajo poglavja V, VI, VII in IX iz Priloge k tej uredbi.Člen 2Ta uredba začne veljati sedmi dan po objavi v Uradnem listu Evropskih skupnosti.Ta uredba je v celoti zavezujoča in se neposredno uporablja v vseh državah članicah.V Bruslju, 26. novembra 2002Za KomisijoFranz FischlerČlan Komisije[1] UL L 160, 12.6.1989, str. 1.[2] UL L 333, 29.12.2000, str. 20.--------------------------------------------------PRILOGAV. ANETOL. DOLOČITEV TRANS-ANETOLA V ŽGANIH PIJAČAH S PLINSKO KROMATOGRAFIJO1. Področje uporabeTa metoda je ob uporabi plinske kromatografije primerna za določitev trans-anetola v žganih pijačah z janežem.2. Normativne referenceISO 3696: 1987 Voda za analitično laboratorijsko uporabo – specifikacija in testne metode.3. NačeloVsebnost trans-anetola v žganju določimo s plinsko kromatografijo (GC). Enako količino internega standarda (npr.: 4-alinasola (estragola), kadar estragol ni naravno prisoten v vzorcu) dodamo testnemu vzorcu in referenčni raztopini znane koncentracije in oba raztopimo v 45-odstotni raztopini etanola ter neposredno vbrizgnemo v sistem GC. Pred pripravo vzorca in analizo likerjev, ki vsebujejo velike količine sladkorja, je potrebna ekstrakcija.4. Reagenti in materialiZa analizo uporabljamo samo reagente s čistostjo vsaj 98 %. Uporabimo vodo vsaj 3. razreda, kakor je opredeljena v standardu ISO 3696.Referenčne kemikalije je treba hraniti v hladnem (pri 4 °C) in temnem prostoru v aluminijastih posodah ali v pobarvanih (rumenkastorjavih) steklenicah za reagente. Zamaške je po možnosti treba opremiti z aluminijasto folijo. Trans-anetol je treba pred uporabo "odtaliti" iz njegovega kristaliziranega stanja, vendar v tem primeru njegova temperatura ne bi smela nikoli presegati 35 °C.4.1 Etanol, 96 vol % (CAS 64-17-5)4.2 1-metoksi-4-(1-propenil) benzol; (trans-anetol) (CAS 4180-23-8)4.3 4-alilanisole, (estragol) (CAS 140-67-0), priporočeni interni standard (IS)4.4 Etanol, 45 vol %.Dodamo 560 g destilirane vode 378 gramom etanola 96 vol %.4.5 Priprava standardnih raztopinVse standardne raztopine je treba hraniti v temnem prostoru pri sobni temperaturi (15 do 35 °C ) v aluminijastih posodah ali v pobarvanih (rumenkastorjavih) steklenicah za reagente. Zamaške je treba po možnosti opremiti z aluminijasto folijo.Trans-anetol in 4-alilanisol sta praktično netopljiva v vodi, zato je treba trans-anetol in 4-alilanisol raztopiti v delu 96-odstotnega etanola (4.1), preden dodamo 45-odstotni etanol (4.4).Osnovne raztopine je treba na novo pripraviti tedensko.4.5.1 Standardna raztopina AOsnovne raztopine trans-anetola (koncentracija: 2 g/l)Stehtamo 40 mg trans-anetola (4.2) v 20-mililitrsko merilno bučko (ali 400-mg v 200- mililitrsko, itn.). Dodamo nekaj 96-odstotnega etanola (4.1) in dopolnimo s 45-odstotnim etanolom (4.4) ter temeljito premešamo.4.5.2 Interni standard BOsnovna raztopina internega standarda, npr. estragola (koncentracija: 2 g/l)Stehtamo 40 mg estragola (4.3) v 20-mililitrsko merilno bučko (ali 400-mg v 200- mililitrsko, itn.). Dodamo nekaj 96-odstotnega etanola (4.1) in dopolnimo s 45-odstotnim etanolom (4.4) ter temeljito premešamo.4.5.3 Raztopine, ki se uporabljajo za preverjanje linearnosti odziva plamensko-ionizacijskega detektorja (FID)Linearni odziv FID-a se mora preverjati pri analizi, upoštevajoč razpon koncentracij trans-anetola v žganju od 0 g/l do 2,5 g/l. V postopku analize se neznani vzorci žganja 10-krat razredčijo (8.3). Da bi ustvarili analizne pogoje, opisane v metodi, se osnovne raztopine koncentracij 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, in 0,25 g/l trans-anetola pripravijo tako: vzamemo 0,5, 1, 1,5, 2, in 2,5 ml osnovne raztopine A (4.5.1) in jih odpipetiramo v ločene 20-mililitrske merilne bučke; v vsako merilno bučko dodamo 2 ml interne standardne raztopine B (4.5.2) in dopolnimo s 45-odstotnim etanolom (4.4) ter temeljito premešamo.Kot slepa proba (8.4) se uporablja raztopina koncentracije 0 g/l. (8.4).4.5.4 Standardna raztopina C2 ml standardne raztopine A (4.5.1) odpipetiramo v ločeno 20-mililitrsko merilno bučko, dodamo 2 ml internega standarda B (4.5.2) ter dopolnimo s 45-odstotnim etanolom (4.4) ter temeljito premešamo.5. Aparature in oprema5.1 Plinska kromatografija, opremljena s plamensko-ionizacijskim detektorjem (FID) in integratorjem ali drugim sistemom za obdelavo podatkov, ki lahko meri višine ali površine pikov, ter avtomatskim vzorčevalcem ali potrebno opremo za ročno vbrizgavanje vzorcev.5.2 Injektor tipa split/splitless5.3 Kapilarna kolona, npr.:Dolžina: 50 mNotranji premer: 0,32 mmDebelina prevleke: 0,2 μmStacionarna faza: FFAP – modificiran TPA zamrežen polietilen glikol.5.4 Laboratorijska oprema: Steklene merilne posode razreda A, analitska tehtnica (natančnost: ± 0,1 mg).6. Kromatografski pogojiTip in dimenzije kolone ter pogoji delovanja plinske kromatografije morajo biti taki, da sta anetol in interni standard ločena eden od drugega ter od drugih motečih snovi. Tipične razmere za kolono, ki je dana kot primer v 5.3, so:6.1 Nosilni plin: analitski helij6.2 Pretok: 2 ml/min6.3 Temperatura injektorja: 250 °C6.4 Temperatura detektorja: 250 °C6.5 Temperaturne razmere pečice: izotermne, 180 °C, čas delovanja 10 minut6.6 Prostornina vbrizga: 1 μl, split 1:40.7. VzorciVzorce hranimo pri sobni temperaturi v hladnem in temnem prostoru.8. Postopek8.1 Preverjanje prisotnosti estragolaZa potrditev odsotnosti estragola v vzorcu je treba opraviti slepo analizo brez dodatka internega standarda. Če je estragol naravno prisoten, moramo uporabiti drug interni standard (na primer mentol).Odipetiramo 2 ml vzorca v 20-mililitrsko bučko in dopolnimo s 45-odstotnim etanolom (4.4) ter temeljito premešamo.8.2 Priprava neznanih vzorcevOdipetiramo 2 ml vzorca v 20-mililitrsko merilno bučko, nato dodamo 2 ml internega standarda B (4.5.2) in dopolnimo s 45-odstotnim etanolom (4.4) ter temeljito premešamo.8.3 Slepi poskusOdipetiramo 2 ml internega standarda B (4.5.2) v 20-mililitrsko merilno bučko in jo dopolnimo s 45-odstotnim etanolom (4.4) ter temeljito premešamo.8.4 Test linearnostiPred začetkom analize je treba preveriti linearnost odziva FID z zaporedno trikratno analizo linearnosti standardnih raztopin (4.5.3).Na podlagi največjih površin ali višin integratorja izdelamo za vsak vbrizg graf koncentracije izvornih raztopin v g/l proti razmerju R za vsako raztopino.R = površina ali višina trans-anetola, deljena s površino ali višino estragola.Dobiti moramo linearno odvisnost.8.5 DoločitevVbrizgamo slepi poskus (8.3), nato standardno raztopino C (4.5.4), nato enega od standardov linearnosti (4.5.3), ki delujejo kot kontrolni vzorec kakovosti (tega lahko izberemo s sklicevanjem na verjetno koncentracijo trans-etanola v neznanem vzorcu), nato pet neznanih vzorcev (8.2). Standardni vzorec (kontrolni vzorec) vbrizgamo po petih neznanih vzorcih, da zagotovimo analitično stabilnost.9. Izračun faktorja odzivnostiMerimo bodisi površino pika (z uporabo integratorja ali drugega podatkovnega sistema) bodisi višino (ročna integracija) trans-anetola in internega standarda.9.1 Izračun faktorja odzivnosti (RFi)Faktor odzivnosti se izračuna:RFi = (Ci/površina ali višinai)*(površina ali višinais/Cis),pri čemer je:Ci  koncentracija trans-anetola v standardni raztopini A (4.5.1)Cis  koncentracija internega standarda v standardni raztopini B (4.5.2)površinai  površina (ali višina) trans-anetolapovršinais  površina (ali višina) internega standardaRFi se izračuna na podlagi petih vzorcev raztopine C (4.5.4).9.2 Analiza linearnosti odziva testnih vzorcevVbrizgamo testne vzorce linearnosti odziva (4.5.3).9.3 Analiza vzorcaVbrizgamo neznane vzorce (8.2).10. Izračun rezultatovFormula za izračun koncentracije trans-anetola je:ci = Cis * (površina ali višinai/površina ali višinais)*RFi,pri čemer je:ci  neznana koncentracija trans-anetolaCis  koncentracija internega standarda v neznani raztopini (4.5.2)površina ali višinai  površina (ali višina) trans-anetolapovršina ali višinais  površina (ali višina) internega standardaRFi  odzivnost koeficienta (izracunanega kakor v 9.1)Koncentracija trans-anetola se izraža v gramih na liter, zaokroženih na eno decimalno mesto.11. Zagotovitev kakovosti in nadzoraKromatogrami morajo biti taki, da sta anetol in interni standard ločena drug od drugega ter od katere koli moteče snovi. Vrednost RFi se izračuna na podlagi rezultatov petih vbrizgov raztopine C (4.5.4). Če je koeficient variacije (CV % = (standardni odmik/srednja vrednost)*100)) v intervalu plus ali minus 1 %, je srednja vrednost RFi sprejemljiva.Zgornji izračun uporabimo za koncentracijo trans-anetola v vzorcu, izbranem za nadzor kakovosti na podlagi linearnosti kontrolnih raztopin (4.5.3).Če je srednja vrednost rezultatov izračunana na podlagi vzorcev linearnosti, izbrana za interni kontrolni vzorec kakovosti (IQC), v intervalu plus ali minus 2,5 % od teoretične vrednosti, so rezultati za neznani vzorec sprejemljivi.12. Ravnanje z vzorci žganih pijač z veliko vsebnostjo sladkorja in vzorci likerjev pred analizo s plinsko kromatografijoEkstrakcija alkohola iz žgane pijače z veliko vsebnostjo sladkorja, zato da bi se omogočila določitev koncentracije trans-anetola, uporabljajoč plinsko kromatografijo (GC).12.1 NačeloVzamemo alikvot vzorca likerja in mu dodamo interni standard v podobni koncentraciji kakor analitu (trans-anetola) v likerju. Nato dodamo natrijev fosfat dodekahidrat in brezvodni amonijev sulfat. Mešanico dobro pretresemo in ohladimo, razvijeta se dve plasti, nato odstranimo zgornjo plast alkohola. Vzamemo alikvot te plasti alkohola in razredčimo s 45-odstotno raztopino etanola (4.4) (Opomba: v tej fazi se ne dodaja noben interni standard, ker je že dodan). Pridobljeno raztopino analiziramo s plinsko kromatografijo.12.2 Reagenti in materialiMed ekstrakcijo uporabimo samo reagente čistosti 99 % in več.12.2.1 Amonijev sulfat, brezvodni (CAS 7783-20-2).12.2.2 Natrijev fosfat dodekahidrat, dvobazni (CAS 10039-32-4).12.3 Aparature in opremaErlenmajerice, liji ločniki, hladilnik.12.4 Postopek12.4.1 Preverjanje prisotnosti estragolaZa preverjanje odsotnosti estragola Č v vzorcu, je treba izvesti slepo ekstrakcijo (12.6.2) in analizo brez dodajanja internega standarda. Če je estragol naravno prisoten, uporabimo drug interni standard.12.4.2 EkstrakcijaOd Pipetiramo 5 ml 96-odstotnega etanola (4.1) v erlenmajerico in vanjo stehtamo 50 mg internega standarda (4.3) ter dodamo 50 ml vzorca. Dodamo 12 g brezvodnega amonijevega sulfata(12.2.1) in 8.6 g dvobaznega natrijevega fosfatadodekahidrata (12.2.2). Zamašimo erlenmajerico.Erlenmajerico stresamo vsaj 30 minut. Lahko uporabimo mehanski stresalnik, vendar ne magnetnega mešala, prevlečenega s teflonom, ker bi teflon absorbiral nekaj analita. Upoštevamo, da se dodane soli ne bodo raztopile v celoti.Zamašeno erlenmajerico damo v hladilnik (T < 5 C) za vsaj dve uri.Medtem se morajo ustvariti dve ločeni plasti in trdni ostanek. Plast alkohola mora biti čista, če ni, damo erlenmajerico ponovno v hladilnik, dokler ne dosežemo jasne ločitve.Ko je plast alkohola čista, previdno odvzamemo alikvot (npr. 10 ml) brez dotikanja vodne plasti, damo v temno stekleničko in trdno zapremo.12.4.3 Priprava ekstrahiranega vzorcaPustimo, da ekstrakt (12.4.2) doseže sobno temperaturo.Vzamemo 2 ml alkoholne plasti vzorca pri sobni temperaturi in ga odpipetiramo v 20-mililitrsko merilno bučko, dopolnimo s 45-odstotnim etanolom (4.4) in temeljito premešamo.12.5 DoločitevSledimo postopku, kakor je opisan v 8.5.12.6 Izračun rezultatovUporabimo naslednjo formulo za izračun rezultatov:Ci = (mis/V)* (površinai/površina is) *RFi,pri čemer je:mis  masa internega standarda (4.3), ki je uporabljen (12.4.2) (v miligramih),V  prostornina neznanega vzorca (50 ml)RFi  faktor odzivnosti (9.1)površinai  površina trans-anetolapovršinais  površina internega standardaRezultate izrazimo v gramih na liter, zaokroženih na eno decimalno mesto.12.7 Nadzor in zagotovitev kakovostiSledimo postopku, kakor je opisan v 11 zgoraj.13. Značilnosti rezultatov metode (natančnost)Statistični rezultati medlaboratorijskega poskusa:naslednje tabele vsebujejo vrednosti za anetol.Naslednji podatki so pridobljeni na podlagi mednarodnega medlaboratorijskega preskusa, ki je opravljen v skladu z mednarodno priznanimi postopki.Leto medlaboratorijskega poskusa | 1998 |Število laboratorijev | 16 |Število vzorcev | 10 |Analit | anetol |Pastis:Vzorci | A | B | C | D | E | F |Število preostalih laboratorijev po izločitvi | 15 | 15 | 15 | 13 | 16 | 16 |Število izločenih (laboratorijev) | 1 | 1 | 1 | 3 | — | — |Število sprejetih rezultatov | 30 | 30 | 30 | 26 | 16 | 16 |Srednja vrednost g/l | 1,477 | 1,955 | 1,940 | 1,833 | 1,741 | 1,754 |Standardni odklon ponovljivosti (Sr) g/l | 0,022 | 0,033 | 0,034 | 0,017 | — | — |Relativni standarni odklon ponovljivosti (RSDr) (%) | 1,5 | 1,7 | 1,8 | 0,9 | — | — |Meja ponovljivosti (r) g/l | 0,062 | 0,093 | 0,096 | 0,047 | — | — |Standardni odklon obnovljivosti (SR) g/l | 0,034 | 0,045 | 0,063 | 0,037 | 0,058 | 0,042 |Relativni standardni odklon obnovljivosti (RSDR) ( %) | 2,3 | 2,3 | 3,2 | 2,0 | 3,3 | 2,4 |Meja obnovljivosti (R) g/l | 0,094 | 0,125 | 0,176 | 0,103 | 0,163 | 0,119 |Vrste vzorcev:A  pastis, slepi, duplikatiB  pastis, slepi, duplikatiC  pastis, slepi, duplikatiD  pastis, slepi, duplikatiE  pastis, posamezni, duplikatiF  pastis, posamezni, duplikatiDruge žgane pijače z janežem:Vzorci | G | H | I | J |Število preostalih laboratorijev po izločitvi | 16 | 14 | 14 | 14 |Število izločenih (laboratorijev) | — | 2 | 1 | 1 |Število sprejetih rezultatov | 32 | 28 | 28 | 28 |Srednja vrednost g/l | 0,7780,530 (*) | 1,742 | 0,351 | 0,599 |Standardni odklon ponovljivosti (Sr) g/l | 0,020 | 0,012 | 0,013 | 0,014 |Relativni standardni odklon ponovljivosti (RSDr) (%) | 3,1 | 0,7 | 3,8 | 2,3 |Meja ponovljivosti (r) g/l | 0,056 | 0,033 | 0,038 | 0,038 |Standardni odklon obnovljivosti (SR) g/l | 0,031 | 0,029 | 0,021 | 0,030 |Relativni standardni odklon obonovljivosti (RSDR) (%) | 4,8 | 1,6 | 5,9 | 5,0 |Meja obnovljivosti (R) g/l | 0,088 | 0,080 | 0,058 | 0,084 |Vrste vzorcev:G  ouzo, split (*)H  jane, slepi duplikatiI  liker z janežem, duplikatiJ  liker z janežem, duplikatiVI. GLICIRIZINSKA KISLINA. DOLOČITEV GLICIRIZINSKE KISLINE Z UPORABO TEKOČINSKE KROMATOGRAFIJE VISOKE LOČLJIVOSTI1. Področje uporabeTa metoda je primerna za določitev glicirizinske kisline v žganih pijačah z janežem z uporabo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC). Uredba (EGS) št. 1576/89 določa, da mora žgana pijača "pastis" vsebovati med 0,05 in 0,5 g glicirizinske kisline na liter.2. Normativne referenceISO 3696: 1987 Voda za analitično laboratorijsko uporabo – specifikacija in testne metode.3. NačeloKoncentracijo glicirizinske kisline določimo z uporabo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC) z UV-detektorjem. Standardno raztopino in testni vzorec filtriramo in ju ločeno vbrizgamo neposredno v sistem tekočinske kromatografije.4. Reagenti in materialiZa analizo uporabljamo le reagente, ki ustrezajo zahtevam tekočinske kromatografije, absolutni etanol in vodo 3. razreda, kakor je definirana s standardom ISO 3696.4.1 Etanol, 96 vol % (CAS 64-17-5).4.2 Amonijev glicirizinat, C42H62O16.NH3 (amonijeva sol glicirizinske kisline)(Mol. Wt.: 839,98)(CAS 53956-04-0): vsaj 90-odstotna čistost(Mol. Wt.: glicirizinska kislina 822,94).4.3 Ocetna kislina (ledocet), CH3COOH, (CAS 64-19-7).4.4 Metanol, CH3OH (CAS 67-56-1).4.5 Etanol, 50 vol %.Za 1000 ml pri 20 °C:- etanol, 96 vol. % (4.1): 521 ml- voda (2.0): 511 ml.4.6 Priprava elucijskih raztopin za visoko učinkovito tekoče izpiranje4.6.1 Mobilna faza (topilo) A (primer)80 delov (prostornina) vode (2.0)20 delov (prostornina) ocetne kisline (4.3).Razplinjujemo topilo pet minut.Opomba:Če uporabljena voda ni mikrofiltrirana, je priporočljivo filtrirati pripravljeno topilo skozi filter za organska topila z velikostjo lukenj 0,45 μm ali manj.4.6.2 Mobilna faza (topilo) B (primer)Metanol (4.4).4.7 Priprava standardnih raztopinVse standardne raztopine moramo sveže pripraviti po dveh mesecih.4.7.1 Referenčna raztopina CZ natančnostjo na 0,1 mg stehtamo 25 mg amonijevega glicirizinata (4.2) v 100-mililitrsko merilno bučko. Dodamo nekaj 50 –odstotnega etanola (4.5) in raztopimo amonijev glicirizinat. Ko se raztopi, dopolnimo do oznake s 50-odstotnim etanolom. (4.5).Filtriramo skozi filter za organska topila.4.7.2 Standardne raztopine, ki se uporabljajo za preverjanje linearnosti odziva instrumentovOsnovno raztopino 1,0 g/l pripravimo s tehtanjem, z natančnostjo na 0,1 mg. 100 mg amonijevega glicirizinata stehtamo v 100-mililitrsko merilno bučko. Dodamo nekaj 50-odstotnega etanola (4.5) in raztopimo amonijev glicirizinat. Ko se raztopi, dopolnimo do oznake s 50 –odstotnim etanolom (4.5).Pripravimo vsaj štiri druge raztopine, ki ustrezajo koncentracijam amonijevega glicirizinata 0,05, 0,1, 0,25 in 0,5 g/l, s posamičnim pipetiranjem 5 ml, 10 ml, 25 ml in 50 ml osnovne raztopine s koncentracijo 1,0 g/l v ločene 100-mililitrske merilne bučke. Nato do oznake dopolnimo s 50-odstotnim etanolom (4.5) in temeljito premešamo.Filtriramo vse raztopine skozi filter za organska topila.5. Aparature in oprema5.1 Separacijski sistem5.1.1 Tekoča kromatografija visoke ločljivosti5.1.2 Črpalni sistem, ki nam omogoča doseganje in ohranjanje stalnega programiranega pretoka z veliko natančnostjo.5.1.3 UV-spektrofotometrični detekcijski sistem: nastavimo na 254 nm.5.1.4 Sistem za razplinjanje topil.5.2 Računalniški integrator ali registrator združljiv z drugim sistemom.5.3 Kolona (primer):Material: nerjaveče jeklo ali stekloNotranji premer: 4 do 5 mmDolžina: 100 do 250 mmStacionarna faza: silika, oplaščena z oktadecilno skupino (C18), velikost delca: 5 μm.5.4 Laboratorijska oprema5.4.1 Analitska tehtnica z natančnostjo 0,1 mg5.4.2 Merilna posoda razreda A5.4.3 Priprave za filtriranje za mikromembransko filtracijo majhnih prostornin6. Kromatografski pogoji6.1 Elucijske značilnosti: (primer)- pretok: 1 ml/minuto,- topilo A = 30 %,- topilo B = 70 %,6.2 Detekcija:- UV = 254 nm7. Postopek7.1 Priprava vzorca žgane pijačePo potrebi filtriramo skozi filter za organska topila (premer lukenj: 0,45 μm).7.2 DoločitevKo se ustalijo kromatografski pogoji,- vbrizgamo 20 μl referenčne raztopine C (4.7.1),- vbrizgamo 20 μl vzorčne raztopine,- primerjamo oba kromatograma. Identificiramo pike glicirizinske kisline na podlagi njihovega retenzijskega časa. Izmerimo njihove površine (ali višine) in izračunamo koncentracijo v g/l, zaokroženo na dve decimalni mesti natančno, z naslednjo enačbo:c =c × h × P × 823H × 100 × 840pri čemer je:c  koncentracija v gramih na liter glicirizinske kisline v žgani pijači, ki jo analiziramoC  koncentracija v gramih na liter amonijevega glicirizinata v referenčni raztopinih  površina (ali višina) glicirizinske kisline v žgani pijači, ki jo analiziramoH  površina (ali višina) glicirizinske kisline v referenčni raztopiniP  čistost referencnega amonijevega glicirizinata (v %)823  masa enega mola glicirizinske kisline840  masa enega mola amonijevega glicirizinata.8. Značilnosti rezultatov metode (natančnost)Statistični rezultati medlaboratorijskega preskusa:naslednja tabela vsebuje vrednosti glicirizinske kisline.Naslednji podatki so pridobljeni na podlagi mednarodnega medlaboratorijskega poskusa, opravljenega v skladu z mednarodno priznanimi postopki.Leto medlaboratorijskega poskusa | 1998 |Število laboratorijev | 16 |Število vzorcev | 5 |Analit | glicirizinska kislina |Vzorci | A | B | C | D | E |Število preostalih laboratorijev po izločitvi | 13 | 14 | 15 | 16 | 16 |Število izločenih (laboratorijev) | 3 | 2 | 1 | — | — |Število sprejetih rezultatov | 26 | 28 | 30 | 32 | 32 |Srednja vrednost g/l | 0,046 | 0,092(*) 0,099 | 0,089 | 0,249 | 0,493 |Standardni odklon ponovljivosti (Sr) g/l | 0,001 | 0,001 | 0,001 | 0,002 | 0,003 |Relativni standardni odklon ponovljivosti (RSDr) (%) | 1,5 | 1,3 | 0,7 | 1,0 | 0,6 |Meja ponovljivosti (r) g/l | 0,002 | 0,004 | 0,002 | 0,007 | 0,009 |Standardni odklon obnovljivosti(SR) g/l | 0,004 | 0,007 | 0,004 | 0,006 | 0,013 |Relativni standardni odklon obnovljivosti (RSDR) (%) | 8,6 | 7,2 | 4,0 | 2,5 | 2,7 |Meja obnovljivosi (R) g/l | 0,011 | 0,019 | 0,010 | 0,018 | 0,037 |Vrste vzorcev:A  pastis, slepi, duplikatiB  pastis, split (*)C  pastis, slepi, duplikatiD  pastis, slepi, duplikatiE  pastis, slepi, duplikatiVII. HALKONI. METODA TEKOČINSKE KROMATOGRAFIJE VISOKE LOČLJIVOSTI ZA PREVERJANJE PRISOTNOSTI HALKONOV V PASTISU1. Področje uporabeTa metoda je primerna za določitev prisotnosti halkonov v pijačah z janežem. Halkoni so naravna barvila iz družine flavonoidov, ki jih najdemo v koreninah sladkega golostebelnega korena (Glycyrrhiza glabra).Žgana pijača z imenom "pastis" mora vsebovati halkone (Uredba (EGS) št. 1576/89).2. Normativne referenceISO 3696: 1987 Voda za analitsko laboratorijsko uporabo – specifikacija in testne metode.3. NačeloPripravimo referenčno raztopino ekstraktov iz sladkega golostebelnega korena. Prisotnost ali odsotnost halkonov določimo z uporabo tekoče kromatografije visoke ločljivosti (HPLC) z UV-detektorjem.4. Reagenti in materialiZa analizo uporabimo le reagente, ki ustrezajo zahtevam tekočinske kromatografije. Etanol mora biti vsaj 96-odstoten. Uporablja se voda 3. razreda, kakor je definirana v standardu ISO 3696.4.1 Etanol, 96 vol % (CAS 64-17-5)4.2 Acetonitril, CH3CN, (CAS 75-05-8)4.3 Referenčna snov: Glycyrrhiza glabra: sladki golostebelni korenGrobo zmlete korenine sladkega golostebelnega korena (Glycyrrhiza glabra). Povprečne dimenzije delcev: dolžina: 10 do 15 mm, debelina: 1 do 3 mm.4.4 Natrijev acetat, CH3COONa, (CAS 127-09-3)4.5 Ocetna kislina (ledocet), CH3COOH, (CAS 64-19-7)4.6 Priprava raztopin4.6.1 Etanol, 50 vol %Za 1000 ml pri 20 °C:- etanol, 96 vol. % (4.1): 521 ml,- voda (2.0): 511 ml.4.6.2 Topilo A: acetonitrilAcetonitril (4.2) z analitično čistostjo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti.Razplinimo.4.6.3 Topilo B: 0,1 M pufer raztopina natrijevega acetata, pH 4,66.V merilno bučko stehtamo 8,203 g natrijevega acetata (4.4), dodamo 6,005 g ocetne kisline (ledocet) (4.5) in z vodo dopolnimo do 1000 ml (2).5. Priprava referenčnih ekstraktov iz Glycyrrhiza glabra (4.3)5.1 Stehtamo 10 g zmletih korenin sladkega golostebelnega korena (Glycyrrhiza glabra) (4.3) in damo v destilacijsko bučko z okroglim dnom- dodamo 100 ml etanola z vsebnostjo 50 vol. % (4.6.1),- vremo eno uro ob povratnem toku (refluksu),- filtriramo,- shranimo filtrat za kasnejšo uporabo.5.2 Vzamemo ekstrakt korena iz filtra- damo v destilacijsko bučko z okroglim dnom- dodamo 100 ml 50-odstotnega etanola, (4.6.1),- vremo eno uro ob povratnem toku (refluksu),- filtriramo. Shranimo filtrat za kasnejšo uporabo.5.3 Ekstrakcija korenine sladkega golostebelnega korena se opravi trikrat zaporedoma.5.4 Združimo vse tri filtrate.5.5 Pustimo, da topilna faza (iz 5.4) izhlapi na rotacijskem evaporatorju.5.6 Preostali ekstrakt (iz 5.5) dopolnimo s 100 ml 50-odstotnega etanola. (4.6.1).6. Aparature in oprema6.1 Separacijski sistem.6.1.1 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti6.1.2 Črpalni sistem, ki lahko doseže in ohrani stalno ali programirano hitrost pretoka pri visokem pritisku.6.1.3 UV/vidni spektrofotometrični detektor, ki se lahko nastavi na 254 in 370 nm.6.1.4 Sistem za razplinjanje topil:6.1.5 Termostat kolone, ki se lahko nastavi na temperaturo 40 ± 0,1 °C.6.2 Računalniški integrator ali registrator združljiv z drugim separacijskim sistemom.6.3 KolonaMaterial: nerjaveče jeklo ali stekloNotranji premer: 4 do 5 mmStacionarna faza: silika, oplaščena z oktadecilno skupino (C 18), velikost delca: 5 μm.6.4 Običajna laboratorijska oprema:6.4.1 analitska tehtnica (natančnost: ± 0,1 mg)6.4.2 destilacijska aparatura s kondenzatorjem povratnega toka (refluksa), vključujoč npr.:- 250-mililitrsko bučko z okroglim dnom s standardiziranim obrusom iz brušenega stekla,- 30 cm dolgi kondenzator povratnega toka in- vir toplote (z uporabo ustrezne priprave moramo preprečiti vsako pirogeno reakcijo nepredestilirane snovi).6.4.3 Rotacijski evaporator.6.4.4 Filtracijski sistem (tj. Buchnerjevega lija).6.5 Kromatografski pogoji (primer).6.5.1 Elucijske značilnosti topil A (4.6.2) in B (4.6.3):- gradient iz 20/80 (v/v) na 50/50 (v/v) v 15 minutah,- gradient iz 50/50 (v/v) na 75/25 (v/v) v petih minutah,- izenačimo 75/25 (v/v) za pet minut,- stabilizacija kolone med vbrizgi,- izenačimo 20/80 (v/v) za pet minut,6.5.2 Pretok: 1 ml/minuto.6.5.3 Nastavitve UV-detektorja:Detektor mora biti nastavljen na 370 nm za detekcijo halkonov in potem na 254 nm za detekcijo glicirizinske kisline.Opomba:sprememba valovne dolžine (z 370 nm na 254 nm) mora biti opravljena 30 sekund prej, preden elucija glicirizinske kisline začne dosegati največje vrednosti.7. Postopek7.1 Priprava vzorca žgane pijačeFiltriramo skozi filter za organska topila (premer lukenj: 0,45 μm).7.2 Priprava ekstrakta iz sladkega golostebelnega korena (5.6)Naredimo raztopino ena proti deset s 50-odstotnim etanolom (4.6.1)7.3 Določitev7.3.1 Vbrizgamo 20 μl pripravljenega ekstrakta (7.2). Analizo izvedemo pri kromatografskih pogojih, ki so opisani zgoraj (6.5).7.3.2 Vbrizgamo 20 μl vzorca (7.1) (vzorec žgane pijače z janežem). Analizo izvedemo pri kromatografskih pogojih, ki so opisani zgoraj (6.5).7.3.3 Primerjamo oba kromatograma. Podobnost med dvema kromatografoma mora biti velika v območju halkona (med ugotavljanjem pri 370 nm pri zgoraj opisanih pogojih analize.) (Glej Diagram 1)8. Značilni kromatogram za pastis+++++ TIFF +++++9. Značilnosti rezultatov metode (natančnost)Rezultati medilaboratorijskega poskusa:Naslednja tabela opisuje rezultate ugotavljanja halkona v pastisu in žganih pijačah z aromo janeža.Naslednji podatki so pridobljeni na podlagi mednarodnega medlaboratorijskega poskusa, ki je opravljen v skladu z mednarodno sprejetimi postopki.Leto medlaboratorijskega poskusa | 1998 |Število laboratorijev | 14 |Število vzorcev | 11 |Analit | halkoni |Vzorci | A | B | C | D | E | F |Število preostalih laboratorijev po izločitvi | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 | 13 |Število izločenih (laboratorijev) | — | — | — | — | — | 1 [1] |Število sprejetih rezultatov | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 | 26 |Število rezultatov, ki kažejo na prisotnost halkona | 28 | 14 | 14 | 0 | 28 | 0 |Število rezultatov, ki kažejo na odsotnost halkonov | 0 | 0 | 0 | 28 | 0 | 26 |Odstotek pravilnih rezultatov ( %) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |Vzorci | G | H | I | J | K |Število preostalih laboratorijev po izločitvi | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 |Število izločenih (laboratorijev) | — | — | — | — | — |Število sprejetih rezultatov | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 |Število rezultatov, ki kažejo prisotnost halkonov | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |Število rezultatov, ki kažejo na odsotnost halkonov | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 |Odstotek pravilnih rezultatov (%) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |Vrste vzorcev:A  pastis, slepi, duplikatiB  pastis, posamezni vzorciC  pastis, posamezni vzorciD  "pastis" (brez vsebnosti halkonov), slepi, duplikatiE  "pastis" (brez vsebnosti halkonov), slepi, duplikatiF  liker z janežem (brez vsebnosti halkonov), slepi, duplikatG  liker z janežem (brez vsebnosti halkonov), slepi, duplikatH  ouzo (brez vsebnosti halkonov), posamezni vzorecI  ouzo (brez vsebnosti halkonov), posamezni vzorecJ  jane (brez vsebnosti halkonov), slepi duplikatiK  "pastis" (brez vsebnosti halkonov, slepi duplikati.IX. RUMENJAK. DOLOČITEV KONCENTRACIJE RUMENJAKA V ŽGANIH PIJAČAH – FOTOMETRIČNA METODA1. Področje uporabeTa metoda je primerna za določitev koncentracije rumenjaka v razponu med 40 in 250 g/l v jajčnem likerju in likerju z jajci.2. Normativne referenceISO 3696:1897 Voda za analitično laboratorijsko uporabo – specifikacija in testne metode.3. NačeloFosforne spojine, topne v etanolu, in jih najdemo v jajcu, se ekstrahirajo in ovrednotijo fotometrično kot fosfomolibdenski kompleks.4. Reagenti in materiali4.1 Dvakrat destilirana voda4.2 Diatomejska zemlja4.3 Etanol, 96 vol % (CAS 64-17-5)4.4 15 % raztopina magnezijevega acetatata (CAS 16674-78-5)4.5 10 % žveplena kislina (CAS 7664-93-9)4.6 1 N žveplena kislina4.7 0,16 g/l raztopine kalijevega dihidrogen fosfata (CAS 778-77-0), KH2PO44.8 Reagenti za določitev fosfata:20 g amonijevega molibdata (CAS 12054-85-2), (NH4)6Mo7O24.4H2O raztopimo v 400 ml vode pri 50 °C;v drugi posodi raztopimo 1 g amonijevega vanadata (CAS 7803-55-6) NH4VO3 v 300 ml vroče vode, pustimo, da se ohladi, in dodamo 140 ml koncentrirane dušikove kisline (CAS 7697-37-2). Združimo ohlajene raztopine v 1000-mililitrski merilni bučki in dopolnimo do oznake.5. Aparature in oprema5.1 1100-mililitrska erlenmajerica5.2 Ultrazvočna kopel (ali magnetno mešalo)5.3 3100-mililitrska merilna bučka5.4 Vodna kopel pri 25 °C5.5 Filter (whatman št. 4 ali enakovreden)5.6 Porcelanski (ali platinasti) lonček5.7 Vodna kopel5.8 Plošča za izparevanje5.9 Talilna peč5.10 50-mililitrska merilna bučka5.11 20-mililitrska merilna bučka5.12 Spektrofotometer, nastavljen na 420 nm.5.13 1-centimetrska kiveta.6. VzorciVzorci se pred analizo hranijo na sobni temperaturi.7. Postopek7.1 Priprava vzorca7.1.1 Stehtamo 10 g vzorca v 100-mililitrsko erlenmajerico (5.1).7.1.2 Postopno dodajamo 70 ml etanola (4.3) v majhnih količinah, obračamo erlenmajerico ob vsakem dodatku, nato damo v ultrazvočno kopel (5.2) za 15 minut (ali mešamo z magnetnim mešalom (5.2) 10 minut na sobni temperaturi).7.1.3 Vsebino erlenmajerice prenesemo v 100-mililitrsko merilno bučko (5.3) ob splakovanju z etanolom (4.3). Do oznake dopolnimo z etanolom (4.3) in damo bučko v vodno kopel pri 20 °C (5.4). Dopolnimo do oznake pri 20 °C.7.1.4 Dodamo majhno količino diatomejske zemlje (4.2), filtriramo (5.5) in zavržemo prvih 20 ml.7.1.5 Prenesemo 25 ml filtrata v porcelanasti (ali platinasti) lonček (5.6). Nato filtrat koncentriramo z izhlapevanjem v vreli vodni kopeli (5.7) ob dodatku 5 ml 15-odstotne raztopine magnezijevega acetata (4.4).7.1.6 Lonček postavimo na ploščo za izparevanje (5.8) in segrevamo do izsušitve.7.1.7 Preostanek sežgemo pri 600 °C v peči (5.9), dokler pepel ne pobeli. Postopek naj traja najmanj eno uro in pol, vendar lahko pustimo čez noč.7.1.8 Pepel prelijemo z 10 ml 10-odstotne žveplene kisline in ga prenesemo ob spiranju z destilirano vodo (4.1) v 50-mililitrsko merilno bučko (5.10) in jo napolnimo do oznake pri sobni temperaturi z destilirano vodo (4.1). 5-milimetrski alikvot te raztopine pepela se uporabi za pripravo vzorčne raztopine za fotometrični preskus.7.2 Fotometrični preskus7.2.1 Primerjalne raztopine7.2.1.1 10 ml 10-odstotne žveplene kisline (4.5) nalijemo v 50-mililitrsko merilno bučko (5.10) in napolnimo do oznake z destilirano vodo (4.1).7.2.1.2 5 mililitrom alikvota raztopine (7.2.1.1) v 20-mililitrski merilni bučki (5.11) dodamo 1 ml 1N žveplene kisline (4.6) in 2 ml fosfatovega reagenta (4.8) ter dopolnimo do oznake z destilirano vodo (4.1).7.2.1.3 Zamašimo z rahlo vstavljenim zamaškom, pretresemo in segrevamo v vreli vodni kopeli (5.7) 10 minut, nato hladimo 20 minut v vodni kopeli pri 20 °C (5.4).7.2.1.4 Napolnimo 1-centimetrsko kiveto (5.13) s to primerjalno raztopino.7.2.2 Raztopina vzorca7.2.2.1 5 mililitrom alikvota raztopine pepela (7.1.8) v 20-mililitrski merilni bučki (5.11) dodamo 1 ml 1 N žveplene kisline (4.6) in 2 ml fosfatovega reagenta (4.8) in dopolnimo do oznake z destilirano vodo (4.1).7.2.2.2 Zamašimo z rahlo vstavljenim zamaškom, pretresemo in segrevamo v vreli vodni kopeli (5.7) 10 minut, nato hladimo v vodni kopeli 20 minut pri 20 °C (5.4).7.2.2.3 Rumeno raztopino, ki se razvije, nemudoma analiziramo s spektrofotometrično (5.12) v 1-centimetrski kiveti (5.13) pri 420 nm glede na primerjalne raztopine (7.2.1.4).7.2.3 Umeritvena krivulja7.2.3.1 Za izdelavo umeritvene krivulje dodamo 2 ml alikvota fosfatovega reagenta (4.8) v 20-mililitrske merilne bučke (5.11), od katerih vsaka vsebuje 1 ml 1 N žveplene kisline (4.6) in 0, 2, 4, 6, 8, ter 10 ml raztopine kalijevega dihidrogenega fosfata (4.7). Dopolnimo do oznake z destilirano vodo (4.1).7.2.3.2 Zamašimo z rahlo vstavljenim zamaškom, pretresemo in segrevamo na vreli vodni kopeli (5.7) 10 minut, nato hladimo v vodni kopeli pri 20 °C (5.4) 20 minut ter analiziramo s spektrofotometrom (5.12) v 1-centimetrski kiveti (5.13) pri 420 nm glede na primerjalno raztopino (7.2.1.4).7.2.3.3 Izdelava kalibracijske krivuljeraztopina dihidrogenega fosfata (ml) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |P2O5 (mg) | 0 | 0,167 | 0,334 | 0,501 | 0,668 | 0,835 |8. Navajanje rezultatovVsebnost rumenjaka v g/l se izračuna z naslednjo formulo:g/l rumenjak = mg PO×110 × gostotaE/40pri čemer je:110  faktor pretvorbe za celotni P2O5 v gramih v 100 g rumenjakamg P2O5  na osnovi umeritvene krivulje ugotovljena vrednostgostota  masa na enoto prostornine (g/ml) likerja na osnovi rumenjaka pri 20 °CE  masa likerja na osnovi jajc v gramih40  faktor razredčitve za 5 ml alikvota raztopine pepela.9. Značilnosti rezultatov metode (natančnost)Statistični rezultati medlaboratorijskega poskusa:naslednja tabela vsebuje vrednosti za rumenjak.Naslednji podatki so pridobljeni na podlagi mednarodnega medlaboratorijskega poskusa, ki je opravljen v skladu z mednarodno sprejetimi postopki.Leto interlaboratorijskega testa: | 1998 |Število laboratorijev: | 24 |Število vzorcev: | 5 |Analit: | rumenjak |Vzorci | A | B | C | D | E |Število preostalih laboratorijev po izločitvi | 19 | 20 | 22 | 20 | 22 |Število izločenih (laboratorijev) | 3 | 4 | 2 | 4 | 2 |Število sprejetih rezultatov | 38 | 40 | 44 | 40 | 44 |Srednja vrednost | 147,3 | 241,1 | 227,4 | 51,9 (*)72,8 (*) | 191,1 |Standardni odklon ponovljivosti (Sr) g/l | 2,44 | 4,24 | 3,93 | 1,83 | 3,25 |Relativni standardni odklon ponovljivosti (RSDR) (%) | 1,7 | 1,8 | 1,8 | 2,9 | 1,7 |Meja ponovljivosti (r) g/l | 6,8 | 11,9 | 11,0 | 5,1 | 9,1 |Standardni odklon obnovljivosti (SR) g/l | 5,01 | 6,06 | 6,66 | 3,42 | 6,87 |Relativni standardni odklon obnovljivosti(RSDR) (%) | 3,4 | 2,5 | 2,9 | 5,5 | 3,6 |Meja obnovljivosti (R) g/l | 14,0 | 17,0 | 18,7 | 9,6 | 19,2 |Vrste vzorcevA  Advocaat, slepi duplikatiB  Advocaat, slepi duplikatiC  Advocaat, slepi duplikatiD  Advocaat (razredčen), vrednosti split (*)E  Advocaat, slepi duplikati[1] Neskladni rezultati med dvema duplikatoma, ki so pripisani napaki vzorčenja.--------------------------------------------------