CELEX: 31991D0180
Language: ro
Date: 1991-02-14 00:00:00
Title: Decizia Comisiei din 14 februarie 1991 privind anumite metode de analiză și de testare a laptelui crud și a laptelui tratat termic

03/Volumul 09
            
               RO
            
               Jurnalul Ofícial al Uniunii Europene
            
               179
            31991D0180
               L 093/1
            
               JURNALUL OFÍCIAL AL UNIUNII EUROPENE
            
               
            
      DECIZIA COMISIEI
   din 14 februarie 1991privind anumite metode de analiză și de testare a laptelui crud și a laptelui tratat termic(91/180/CEE)COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE,având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Economice Europene,având în vedere Directiva 85/397/CEE a Consiliului din 5 august 1985 privind problemele de sănătate și de inspecție veterinară în cadrul schimburilor intracomunitare de lapte tratat termic (1), astfel cum a fost modificată ultima dată prin Directiva 89/662/CEE (2), în special articolul 10 alineatul (2),întrucât, în conformitate cu articolul 10 alineatul (2) din Directiva 85/397/CEE, Comisia adoptă metodele de analiză și verificare ce trebuie utilizate pentru controlul respectării normelor cu privire la laptele crud și la laptele tratat termic;întrucât, în ceea ce privește laptele crud, trebuie adoptate metode care să permită determinarea conținutului de germeni, a conținutului de celule, a punctului de congelare și a prezenței antibioticelor;întrucât, în ceea ce privește laptele pasteurizat, trebuie adoptate metode care să permită determinarea absenței germenilor patogeni, a numărului de coliformi, a conținutului de germeni, a absenței fosfatazelor, a prezenței peroxidazelor, a absenței antibioticelor și a punctului de congelare;întrucât, în ceea ce privește laptele sterilizat și laptele prelucrat „la temperaturi ultra înalte” (UHT), trebuie adoptate metode care să permită determinarea conținutului de germeni și a absenței antibioticelor;întrucât, din motive tehnice, într-o primă fază este importantă adoptarea unor metode de referință pentru analizele și testele având ca scop asigurarea respectării anumitor norme; întrucât este deosebit de importantă continuarea examinării condițiilor de utilizare a metodelor de rutină, de analiză și testare; întrucât, în așteptarea rezultatelor acestei examinări, autoritățile competente trebuie să asigure utilizarea metodelor de rutină corespunzătoare în vederea respectării normelor din Directiva 85/397/CEE;întrucât stabilirea metodelor de referință de analiză și testare presupune stabilirea procedurilor de analiză și a criteriilor de fidelitate în vederea asigurării unei interpretări uniforme a rezultatelor;întrucât măsurile prevăzute de prezenta decizie sunt conforme cu avizul Comitetului veterinar permanent,ADOPTĂ PREZENTA DECIZIE:Articolul 1Procedurile de referință de analiză și testare a laptelui crud sunt următoarele:
               —
            
               determinarea punctului de congelare;
            
               —
            
               inventarierea microorganismelor – conținutul de germeni la 30 °C;
            
               —
            
               inventarierea celulelor somatice;
            
               —
            
               detectarea antibioticelor și a sulfamidelor.
            Articolul 2Procedurile de referință de analiză și testare a laptelui pasteurizat sunt următoarele:
               —
            
               determinarea punctului de congelare;
            
               —
            
               determinarea activității fosfatazice;
            
               —
            
               determinarea activității peroxidazice;
            
               —
            
               inventarierea microorganismelor – conținutul de germeni la 30 °C;
            
               —
            
               inventarierea microorganismelor – conținutul de germeni la 21 °C;
            
               —
            
               inventarierea coliformilor – numărarea coloniilor la 30 °C;
            
               —
            
               detectarea antibioticelor și sulfamidelor;
            
               —
            
               detectarea microorganismelor patogene.
            Articolul 3Procedurile de referință de analiză și testare a laptelui UHT și a laptelui sterilizat sunt următoarele:
               —
            
               determinarea punctului de congelare;
            
               —
            
               inventarierea microorganismelor – conținutul de germeni la 30 °C;
            
               —
            
               detectarea antibioticelor și sulfamidelor.
            Articolul 4Punerea în aplicare a procedurilor de referință de analiză și testare, stabilirea criteriilor de fidelitate ce trebuie folosite și recoltarea eșantioanelor trebuie să se efectueze în conformitate cu regulile descrise în anexa I.Articolul 5Procedurile de referință de analiză și testare menționate la articolele 1, 2 și 3 sunt descrise în anexa II.Articolul 6Prezenta decizie va fi reexaminată înainte de 31 decembrie 1992, pentru a se putea ține seama de evoluția cunoștințelor științifice și tehnice.Articolul 7Prezenta decizie se adresează statelor membre.
      Adoptată la Bruxelles, 14 februarie 1991.
      
         
            Pentru Comisie
         
         Ray MAC SHARRY
         
         
            Membru al Comisiei
         
      
   
      (1)  JO L 226, 24.8.1985, p. 13.
      (2)  JO L 395, 30.12.1989, p. 13.ANEXA ICUPRINS
               I.
            Dispoziții generale …
               II.
            Eșantionarea laptelui crud și a laptelui tratat termic …
      I.   DISPOZIȚII GENERALE1.   Introducere
   Dispozițiile generale se referă la reactivi, materialul de laborator, exprimarea rezultatelor, criteriile de fidelitate și rapoartele de analiză. Autoritățile competente ale statelor membre și laboratoarele însărcinate cu prelevarea și analiza laptelui sunt obligate să respecte aceste dispoziții.2.   Reactivi
   2.1.   Apa
   2.1.1.   Cu excepția cazurilor când există indicații contrare, apa utilizată pentru operațiile de obținere a soluției, de diluare sau de spălare trebuie să fie în mod obligatoriu apă distilată, apă deionizată sau apă demineralizată de puritate cel puțin echivalentă. Pentru analizele microbiologice, apa nu trebuie să conțină substanțe susceptibile de a afecta sau de a influența creșterea microorganismelor în condițiile de operare descrise.2.1.2.   Prin „soluție” sau „diluare”, fără nici o altă precizare, se înțelege „soluție în apă” sau „diluare cu apă”.2.2.   Produse chimice
   Cu excepția cazurilor când există indicații contrare, toate produsele chimice utilizate trebuie să fie de calitate analitică recunoscută.3.   Materiale
   3.1.   Lista de materiale
   Lista de materiale pentru diferitele proceduri de referință se referă la materialele cu utilizare specifică și care prezintă caracteristici particulare.3.2.   Balanța analitică
   Prin balanță analitică se înțelege o balanță capabilă să cântărească cu o eroare de maximum 0,1 mg.4.   Exprimarea rezultatelor
   4.1.   Rezultatele
   Cu excepția cazurilor când există indicații contrare, rezultatul care figurează în raportul analizei trebuie să fie media aritmetică a două teste care respectă criteriul de repetabilitate (5.1) stabilit pentru metoda respectivă. Dacă nu a fost respectat criteriul de repetabilitate, testul trebuie repetat; dacă nu este posibilă repetarea, rezultatul va fi anulat.4.2.   Calculul procentului
   Cu excepția cazurilor când există indicații contrare, rezultatul trebuie calculat în procente de masă a eșantionului.5.   Criterii de fidelitate: repetabilitatea și reproductibilitatea
   Criteriile de fidelitate care figurează la fiecare procedură se definesc după cum urmează:5.1.1.   Repetabilitatea (r) este valoarea sub care se situează valoarea absolută a diferenței dintre două rezultate individuale obținute urmându-se aceeași procedură, cu un produs identic și în aceleași condiții (același analist, aceeași aparatură, același laborator și un interval scurt de timp între analize).5.1.2.   Reproductibilitatea (R) este valoarea sub care se situează valoarea absolută a diferenței dintre două rezultate individuale obținute urmându-se aceeași procedură, cu un produs identic, în condiții diferite (analiști diferiți, aparatură diferită, laboratoare diferite și/sau intervale de timp diferite).5.1.3.   Cu excepția cazurilor când există indicații contrare, valorile repetabilității și reproductibilității care figurează în paragrafele respective ale fiecărei proceduri sunt exprimate la un nivel de probabilitate de 95 %, conform normei ISO 5725, a doua ediție, 1986. Acestea sunt calculate pe baza rezultatelor unor teste inelare recunoscute realizate în scopul evaluării metodelor. Totuși există metode care nu au fost evaluate prin teste inelare. În acest caz, valorile repetabilității și reproductibilității sunt doar estimative.5.1.4.   Testele inelare și studiile menționate la punctul 5.1.3 trebuie planificate și realizate în conformitate cu orientările internaționale.6.   Raportul analizei
   Raportul analizei trebuie să precizeze procedura utilizată și rezultatele obținute. În plus, în raport trebuie menționate toate detaliile de operare nespecificate în metoda de analiză sau facultative, precum și toate circumstanțele ce ar fi putut influența rezultatele. Raportul analizei trebuie să cuprindă toate informațiile care permit o identificare completă a eșantionului.
      II.   EȘANTIONAREA LAPTELUI CRUD ȘI A LAPTELUI TRATAT TERMIC1.   Obiectul și domeniul de aplicare
   Prezenta normă descrie procedura de referință de eșantionare a laptelui crud și a laptelui tratat termic. Aceasta, la fel ca procedurile de transport și de conservare a eșantioanelor, se aplică laptelui crud livrat de producători, precum și laptelui crud și laptelui tratat termic conservat în cuve de stocare și în cisterne de transport.Procedurile menționate la punctele 2, 4.4, 5 și 6 se aplică eșantionării laptelui tratat termic destinat consumului direct.2.   Considerații de ordin general
   Eșantionarea laptelui crud și a laptelui tratat termic păstrat în bidoane, cisterne etc., trebuie efectuată de către persoane autorizate, instruite în acest sens înainte de a proceda la eșantionare.Dacă acest lucru este considerat necesar, autoritățile competente sau laboratorul de analiză vor instrui personalul însărcinat cu eșantionarea cu privire la tehnicile de eșantionare, pentru a se asigura că eșantioanele sunt reprezentative și conforme cu ansamblul lotului.Dacă acest lucru este considerat necesar, autoritățile competente sau laboratorul de analiză vor instrui personalul însărcinat cu eșantionarea cu privire la etichetarea eșantioanelor, pentru ca identificarea acestora să nu poată fi contestată.3.   Echipamentul destinat eșantionării
   3.1.   Generalități
   Echipamentul folosit la eșantionare trebuie nu numai să fie fabricat din oțel inoxidabil sau din orice alt material corespunzător, care are rezistența cerută, ci și să fie construit în funcție de utilizarea prevăzută (omogenizare, eșantionare etc.). Plonjoarele și agitatoarele destinate omogenizării lichidelor în recipiente trebuie să aibă o suprafață destul de mare pentru a permite o bună omogenizare a produsului, fără a produce apariția unui gust de rânced. Polonicele trebuie să fie prevăzute cu mânere solide, de lungime destul de mare pentru a permite prelevarea de eșantioane de la orice adâncime a recipientului. Capacitatea polonicelor trebuie să fie de cel puțin 50 ml.Recipientele pentru eșantioane, precum și capacele acestora, trebuie să fie din sticlă, metal sau plastic de calitate corespunzătoare.Materialele folosite la fabricarea echipamentului destinat eșantionării (inclusiv recipiente și capace) nu trebuie să producă nici o modificare a eșantionului, care ar putea influența rezultatul analizelor. Echipamentul însuși și recipientele pentru eșantioane trebuie să aibă o suprafață curată, uscată, netedă și fără crăpături, cu colțuri rotunjite.3.2.   Materialul de eșantionare pentru analiza microbiologică
   Materialul folosit la eșantionare (inclusiv recipientele) trebuie să respecte prevederile de la punctul 3.1 și să fie steril.Dacă un material este folosit pentru mai multe eșantionări, acesta trebuie curățat și sterilizat după fiecare eșantionare conform instrucțiunilor sau cerințelor impuse de laboratorul de analiză sau de autoritatea competentă, astfel încât să nu influențeze rezultatele diferitelor analize succesive.4.   Procedura de eșantionare
   4.1.   Generalități
   Indiferent de tipul de analiză ce trebuie efectuată, înainte de prelevare, laptele trebuie corect omogenizat, printr-un mijloc manual sau mecanic.Eșantionul trebuie prelevat imediat după omogenizare, cât timp laptele este încă în mișcare.Atunci când trebuie prelevate în același timp mai multe eșantioane de lapte din cisternă, pentru diferite teste, eșantionul destinat analizei microbiologice va fi prelevat primul.Volumul eșantionului trebuie să fie în conformitate cu necesitățile analizei. Capacitatea recipientelor utilizate trebuie aleasă astfel încât recipientele să fie aproape umplute de eșantion, permițând în același timp o bună omogenizare a conținutului înainte de analiză, dar evitând smântânirea laptelui în timpul transportului.4.2.   Eșantionarea manuală
   4.2.1.   
         Prelevarea din găleți cu lapte sau din bidoane
      
   Pentru a obține rapid agitarea dorită a laptelui, se omogenizează cu plonjorul de sus în jos în găleată sau bidon, astfel încât laptele să fie bine omogenizat și smântâna să nu adere la gâtul bidonului. Se prelevează apoi un eșantion reprezentativ pentru întregul lot conform punctului 4.2.4.4.2.2.   
         Prelevarea din bazine de refrigerare
      
   Se agită mecanic sau manual laptele până la obținerea unei omogenități suficiente.Dacă volumul de lapte nu permite utilizarea unui agitator mecanic, se agită manual.4.2.3.   
         Prelevarea din cuva de măsurare
      
   Este esențial ca laptele să fie bine omogenizat la turnarea în cuva de măsurare. Este posibil să fie necesar ca după omogenizare să se mai agite laptele manual sau mecanic, pentru a obține o repartizare omogenă a substanței grase. Dacă volumul lotului din care trebuie prelevat eșantionul depășește capacitatea cuvei de măsurare, se prelevează un eșantion reprezentativ pentru întregul lot conform punctului 4.2.4.4.2.4.   
         Eșantionarea dintr-un lot divizat
      
   Atunci când cantitatea totală de lapte ce trebuie analizată este împărțită în mai multe recipiente, se prelevează o cantitate reprezentativă din fiecare recipient și se notează cantitatea de lapte căreia îi corespunde fiecare eșantion. În afara cazului când eșantioanele provenite din fiecare recipient trebuie supuse unor analize separate, se omogenizează porții din cantitățile reprezentative, proporționale cu cantitatea de lapte din recipientul din care a fost prelevat eșantionul. După omogenizare, se prelevează unul sau mai multe eșantioane din aceste cantități proporționale.4.2.5.   
         Prelevarea din recipiente de mare capacitate – cuve de stocare, camioane-cisternă și vagoane-cisternă
      
   4.2.5.1.   Se omogenizează laptele printr-un procedeu adecvat înainte de eșantionare.Pentru omogenizarea conținutului recipientelor mari (cuve de stocare, camioane-cisternă sau vagoane-cisternă) se recomandată agitarea mecanică (4.2.5.2).Durata procesului de omogenizare depinde de perioada în care laptele a fost lăsat să se odihnească. Este necesar să se dovedească în fiecare caz că procedura de omogenizare folosită este cea adecvată scopurilor analizei respective; eficiența omogenizării influențează în mod considerabil similitudinea rezultatelor analizelor efectuate pe eșantioane prelevate fie din locuri diferite din lot, fie la gura de evacuare a cuvei, la intervale regulate, în timpul golirii. Modalitatea de omogenizare a laptelui (crud sau integral) este eficientă dacă diferența între conținutul de grăsimi a două eșantioane, prelevate în condițiile arătate, este mai mică de 0,1 %.Într-un recipient de mare capacitate prevăzut cu o gură de evacuare în partea inferioară, se poate întâlni, la punctul de evacuare, o cantitate mică de lapte nereprezentativă pentru întregul conținut nici măcar după omogenizare. Din acest motiv, este preferabil ca prelevarea să se facă printr-o gură de acces. În cazul prelevării eșantioanelor la gura de evacuare, se lasă să se scurgă o cantitate de lapte suficientă pentru a garanta faptul că eșantioanele sunt reprezentative.4.2.5.2.   Omogenizarea conținutului recipientelor de mare capacitate sau al cuvelor de stocare, al camioanelor-cisternă și al vagoanelor-cisternă se poate efectua:
               —
            
               cu ajutorul unui agitator mecanic introdus în rezervor și acționat de un motor electric;
            
               —
            
               cu ajutorul unei elice sau al unui agitator acționat de un motor electric și introdus prin gura de acces, agitatorul fiind suspendat în lapte;
            
               —
            
               în cazul camioanelor sau vagoanelor-cisternă, prin reciclarea laptelui în tubul flexibil de transfer legat la pompă și introdus prin gura de acces;
            
               —
            
               cu aer comprimat filtrat și curat. Se vor utiliza o presiune și un volum de aer minime, pentru a se evita apariția unui gust de rânced.
            4.3.   Eșantionarea automată sau semiautomată
   Pentru prelevarea eșantioanelor de lapte crud livrat de producători, se poate utiliza un echipament de eșantionare automat sau semiautomat, în conformitate cu instrucțiunile date de către laboratorul însărcinat cu analiza sau de către o altă autoritate competentă.Înainte de a fi utilizat prima dată și apoi la intervale regulate, echipamentul trebuie supus controalelor indicate de autoritatea responsabilă. Trebuie verificată conformitatea tehnicilor de eșantionare pentru a se putea stabili:
               —
            
               volumul minim de lapte colectat din care se pot preleva eșantioane corespunzătoare;
            
               —
            
               amploarea unei antrenări oarecare (legată de volumul minim recoltat);
            
               —
            
               capacitatea de a furniza un eșantion reprezentativ pentru întregul lot după o agitare convenabilă.
            Pentru utilizarea unui echipament de eșantionare automat sau semiautomat, autoritatea națională competentă poate indica:
               —
            
               volumul minim de lapte din care se pot preleva eșantioane;
            
               —
            
               volumul minim al eșantionului;
            
               —
            
               cantitatea maximă ce poate fi antrenată;
            
               —
            
               analizele ce pot fi realizate sau precauțiile care se impun.
            4.4.   Eșantionarea laptelui tratat termic destinat consumului direct și condiționat pentru vânzarea cu amănuntul
   În ceea ce privește laptele tratat termic destinat consumului direct și condiționat pentru vânzarea cu amănuntul, eșantionarea se face în mod obligatoriu din recipiente intacte și care nu au fost deschise. Eșantioanele trebuie prelevate, dacă este posibil, în timpul condiționării sau în camera frigorifică a unității de tratare, cât mai curând posibil după tratare (în cazul laptelui pasteurizat, în chiar ziua pasteurizării).Trebuie să fie prelevat un număr de eșantioane din fiecare tip de lapte tratat termic (pasteurizat, prelucrat „la temperaturi ultra înalte” (UHT) și sterilizat) corespunzător numărului de analize care trebuie efectuate și în conformitate cu indicațiile date de către laboratorul însărcinat cu analiza sau de către orice altă autoritate competentă.5.   Identificarea eșantionului
   Eșantionul trebuie să primească un cod de identificare care să permită identificarea sa rapidă conform indicațiilor date de către laboratorul însărcinat cu analiza sau de către autoritatea competentă (vezi punctul 2).6.   Transportul și depozitarea eșantioanelor
   În acord cu autoritatea națională competentă, laboratorul de analiză stabilește instrucțiunile cu privire la termenul și condițiile de transport și de depozitare ce trebuie respectate între momentul prelevării eșantioanelor și analizarea acestora, în funcție de tipul de lapte și de procedura de analiză care trebuie urmată.Instrucțiunile stipulează următoarele:
               —
            
               în timpul transportului și depozitării, se iau măsuri de precauție pentru izolarea eșantionului de orice miros nedorit, precum și de lumina directă a soarelui. Dacă recipientul cu eșantionul este transparent, va fi depozitat într-un loc ferit de lumină;
            
               —
            
               eșantioanele de lapte crud destinate analizelor microbiologice trebuie transportate și păstrate la o temperatură situată între 0 și 4 °C. Perioada dintre prelevare și analiză trebuie să fie cât mai scurtă cu putință și să nu depășească în nici un caz 36 de ore. Autoritatea competentă poate accepta o temperatură de păstrare între 0 și 6 °C, dacă termenul menționat anterior nu depășește 24 de ore;
            
               —
            
               eșantioanele de lapte pasteurizat destinate analizelor microbiologice trebuie transportate și păstrate la o temperatură situată între 0 și 4 °C. Perioada dintre prelevare și analiză trebuie să fie cât mai scurtă cu putință și să nu depășească în nici un caz 24 de ore;
            
               —
            
               eșantioanele de alte tipuri de lapte decât laptele crud și pasteurizat destinate analizelor microbiologice trebuie păstrate la rece în laborator, iar perioada dintre prelevare și analiză trebuie să fie cât mai scurtă cu putință.
            Măsurile de precauție specifice fiecărei analize sunt indicate în descrierea diverselor metode utilizate.ANEXA IICUPRINS
               I.
            Determinarea punctului de congelare …
               II.
            Determinarea activității fosfatazice …
               III.
            Determinarea activității peroxidazice …
               IV.
            Inventarierea microorganismelor – numărare pe placă la 30°C …
               V.
            Inventarierea microorganismelor – numărare pe placă la 21°C …
               VI.
            Inventarierea coliformilor – numărarea coloniilor la 30°C …
               VII.
            Inventarierea celulelor somatice …
               VIII.
            Detectarea antibioticelor și a sulfamidelor …
               IX.
            Detectarea microorganismelor patogene …
      I.   DETERMINAREA PUNCTULUI DE CONGELARE1.   Obiectul și domeniul de aplicare
   Prezentul capitol descrie procedura de referință de determinare a punctului de congelare a laptelui integral, degresat sau parțial degresat, crud, pasteurizat, prelucrat „la temperaturi ultra înalte” (UHT) sau sterilizat cu ajutorul unui aparat (crioscopul cu termistor), în care baia controlată de un termostat este răcită electric și sonda cu termistor înlocuiește termometrul din sticlă cu mercur.Există două tipuri de instrumente. Primul determină punctul maxim de congelare pe „palierul” curbei de congelare, în timp ce al doilea este, din motive comerciale, reglat pentru a efectua citirea la un moment determinat după începerea congelării. Dat fiind că curbele de congelare pot varia nu doar de la un tip de lapte la altul, dar chiar și de la lapte la soluțiile etalon utilizate pentru etalonare, această procedură de referință necesită folosirea unor instrumente care să caute palierul. Instrumentele cu termen fix pot fi utilizate în cazul analizelor de rutină pentru trierea laptelui.Punctul de congelare poate fi utilizat pentru estimarea proporției de apă străină în lapte, cu condiția ca aciditatea eșantionului să nu depășească 0,18 g de acid lactic la 100 de ml (a se vedea punctul 7.4).2.   Definiție
   
      Punctul de congelare al laptelui: valoarea măsurată conform procedurii descrise în prezenta normă și exprimată în grade Celsius (°C).3.   Principiu
   Răcirea unei probe până la temperatura corespunzătoare, în funcție de aparat, și declanșarea cristalizării prin vibrație mecanică, antrenând o creștere rapidă a temperaturii până la palierul corespunzător punctului de congelare al probei.Instrumentul este etalonat astfel încât să se obțină citiri corecte pentru două soluții etalon folosindu-se același mod de operare ca și în cazul eșantioanelor de lapte. În aceste condiții, palierul dă punctul de congelare al laptelui în grade Celsius.4.   Aparatură și sticlărie
   Materialul obișnuit dintr-un laborator și, în special:4.1.   Crioscop
   Crioscopul este alcătuit dintr-o baie de răcire controlată de un termostat, o sondă cu termistor (termometru cu rezistență semiconductoare) cu circuit asociat, un galvanometru, sau „cititor”, un agitator pentru eșantioane, un sistem pentru declanșarea congelării și eprubete pentru eșantioane.4.1.1.   Baia de răcire
   Pot fi utilizate două tipuri de baie de răcire.4.1.1.1.   Tipul cu imersiune
   Acest tip constă într-o baie perfect izolată care conține un lichid de răcire corespunzător, agitat astfel încât diferența de temperatură între două puncte oarecare din lichid să nu depășească 0,2°C. Temperatura lichidului nu poate varia cu mai mult de ± 0,5°C față de valoarea nominală stabilită de producător.Este important ca lichidul din baie să fie menținut la un nivel constant. Întreaga suprafață a eprubetei cu eșantionul de sub linia de reper a volumului trebuie să fie scufundată în lichidul de răcire.4.1.1.2.   Tipul cu circulație
   Un curent continuu de lichid de răcire corespunzător circulă în jurul tubului cu eșantionul. Temperatura lichidului nu poate varia cu mai mult de ± 0,5°C față de valoarea nominală stabilită de producător.O soluție apoasă de 1,2 etandiol (etilenglicol) la 33 % (v/v) constituie un lichid de răcire potrivit.4.1.2.   Termistorul și circuitul conex
   Termistorul trebuie să fie tip sondă de sticlă (diametru maxim 1,80 ± 0,2 mm și diametru conductor maxim de 0,31 mm). Constanta timp a termistorului trebuie să fie mai mică de 2 secunde, iar valoarea β (a se vedea nota) trebuie să fie ridicată. Tensiunea de serviciu, curentul și constanta de disipare trebuie să aibă niște valori care să garanteze că temperatura termistorului nu va urca cu mai mult de 0,0005°C în jurul valorii de –0,512°C. Toleranța maximă a rezistenței trebuie să fie de ± 5 %.Când sonda este în poziție de serviciu în crioscop, extremitatea părții de sticlă trebuie să se afle pe axa eprubetei cu proba și la 44,6 ± 0,1 mm sub capătul superior al eprubetei (a se vedea figura de la pagina 15). Trebuie să se furnizeze un dispozitiv de centrare care să permită utilizatorului să plaseze sonda în această poziție.Notăβ definește caracteristicile termice ale termistorului după formula:unde:
               T
            
               reprezintă temperatura în grade Kelvin,
            
               R
            
               reprezintă rezistența în ohmi la temperatura T,
            
               
                  
            
               reprezintă coeficientul de temperatură,
            
               β
            
               este o constantă care depinde de materialul folosit la fabricarea termistorului. În practica curentă, se recomandă în general o valoare mai mare de 3 000.
            4.1.3.   Aparatul de măsură și de citire
   4.1.3.1.   Principiul de măsurare
   Instrumentul utilizat trebuie să funcționeze pe principiul de căutare a primului „palier” de pe curba de congelare. Palierul corespunde părții din curbă unde temperatura rămâne constantă la cca ± 0,002°C timp de cel puțin 20 de secunde.4.1.3.2.   Operarea manuală
   Rezistența termistorului trebuie echilibrată cu ajutorul unei punți Wheatstone sau a unui aparat similar, utilizându-se rezistențe stabile de calitate superioară, a căror toleranță maximă este de ± 10 % și al căror coeficient de temperatură nu depășește 2x10-5°C.Rezistența de referință trebuie să aibă o liniaritate a gamei sale de utilizare mai mare de 0,3 % din valoarea sa maximă.Trebuie să se poată ajusta rezistențele pentru etalonare.Distanța între gradațiile cadranului de măsurare nu trebuie să fie mai mare de 0,001°C.4.1.3.3.   Operarea automată
   Aparatul de citire trebuie să permită o distincție de cel puțin 0,001°C în gama de la 0 la -1°C.Stabilitatea aparatului de citire și a circuitului asociat trebuie să fie de așa natură încât diferența între două citiri succesive ale aceleiași temperaturi să nu fie mai mare de 0,001°C.Liniaritatea circuitului trebuie să fie de așa natură încât nici o eroare mai mare de ± 0,001°C să nu fie posibilă în nici un punct al gamei de la -0,400 la -0,600°C, atunci când aparatul este utilizat corect.4.1.4.   Agitatorul
   Pentru omogenizarea probei se folosește o tijă de metal, inertă față de lapte, cu un diametru cuprins între 1 și 1,5 mm.Agitatorul trebuie să aibă amplitudinea reglată și să fie instalat pe verticală, extremitatea sa inferioară fiind la același nivel cu vârful sondei cu termistor. Se admite o toleranță de aproximativ 1,5 mm deasupra sau dedesubtul acestei poziții.Agitatorul trebuie să vibreze pe laterală cu o amplitudine indicată de producător (cel puțin ± 1,5 mm) și suficientă pentru a asigura o temperatură uniformă a probei pe parcursul determinării. În timpul funcționării, agitatorul nu trebuie să atingă, în nici un moment, sonda cu termistor sau peretele exterior al eprubetei.4.1.5.   Dispozitivul de declanșare a congelării
   Acest dispozitiv poate fi orice aparat care, în momentul funcționării, declanșează instantaneu congelarea probei, astfel ca temperatura probei să ajungă în jurul punctului de congelare. Și agitatorul poate fi utilizat în acest scop; una dintre metode constă în mărirea amplitudinii vibrației timp de 1 sau 2 secunde, astfel încât agitatorul să poată atinge peretele exterior al eprubetei cu eșantionul.4.1.6.   Eprubetele pentru eșantioane
   Eprubetele pentru eșantioane (a se vedea figura 1) trebuie să fie din sticlă, să aibă o lungime de 50,8 ± 0,1 mm, un diametru exterior de 16,0 ± 0,1 mm și un diametru interior de 13,5 ± 0,1 mm. Grosimea sticlei nu poate varia cu mai mult de 0,1 mm pe ansamblul peretelui exterior al eprubetei.Eprubetele trebuie să aibă o gradație-reper situată la 29,8 mm sub marginea superioară (21 mm deasupra bazei eprubetei) pentru a indica un volum al eșantionului de 2,5 ± 0,1 ml.4.1.7.   Alimentarea cu electricitate
   Tensiunea de alimentare trebuie stabilizată, fie în interiorul, fie în exteriorul aparatului, astfel ca eventualele fluctuații să nu depășească ± 1 % din valoarea nominală atunci când alimentarea principală variază cu ± 6 %.4.2.   Balanță analitică
   4.3.   Baloane gradate cu o gradație de 1 000 ml capacitate, clasa A
                
            
               
                  Etuvă, bine ventilată, reglabilă la 130 ± 1°C
               sau
            
                
            
               
                  Cuptor electric, ventilat, reglabil la 300 ± 25°C.
            4.5.   Exsicator
   5.   Reactivi
   5.1.   Apă distilată într-un aparat de sticlă borosilicată, fiartă și răcită la 20 ± 2°C într-un balon dotat cu un tub care să absoarbă anhidrida carbonică.5.2.   Clorură de sodiu, de calitate analitică, fin mărunțită, uscată timp de cinci ore la 300 ± 25°C în cuptorul electric (4.4) sau uscată în etuvă (4.4) la 130 ± 1°C timp de cel puțin 24 de ore și răcită la temperatura ambiantă într-un exsicator eficient.5.3.   Soluții etalon
   Se cântărește cantitatea potrivită (vezi tabelul de mai jos) de clorură de sodiu uscată (5.2) într-un vas de cântărit. Se dizolvă în apă (5.1), se transvazează cantitatea într-un balon gradat de 1 000 ml și se completează până la gradația reper cu apă la 20 ± 2°C.Această soluție se păstrează timp de două luni la maximum 5°C în flacoane de polietilenă bine închise, cu o capacitate maximă de 250 ml.Punctul de congelare al soluțiilor de clorură de sodiu la 20°C
               g NaCl/l
            
               °C
            
               6,859
            
               -0,408
            
               7,818
            
               -0,464
            
               8,149
            
               -0,483
            
               8,314
            
               -0,492
            
               8,480
            
               -0,502
            
               8,646
            
               -0,512
            
               8,811
            
               -0,521
            
               8,977
            
               -0,531
            
               9,143
            
               -0,541
            
               10,155
            
               -0,600
            Înaintea utilizării unei soluții etalon, aceasta se omogenizează bine, prin agitare și întoarceri succesive ale flaconului. A nu se agita violent soluția etalon, pentru a evita încorporarea de aer.Recoltarea probei de soluție etalon se efectuează prin scurgerea într-un pahar de laborator uscat și curat. A nu se utiliza pipete.A nu se utiliza soluții din flacoane pe trei sferturi goale și nici soluții mai vechi de două luni dacă nu conțin un fungicid (soluție de tiomersal 10 g/l, spre exemplu).6.   Etalonarea crioscopului cu termistor
   Crioscopul trebuie reglat astfel încât diferența dintre temperatura ambiantă și temperatura de etalonare să nu fie mai mare de 1°C. Crioscopul nu trebuie expus luminii solare, curenților de aer sau unei temperaturi ambiante mai mari de 26-27°C.Crioscopul trebuie să fie în stare de funcționare conform indicațiilor producătorului și trebuie pus în funcțiune cu cel puțin 12 ore înainte de etalonare. Se verifică poziția sondei, amplitudinea vibrațiilor agitatorului și temperatura fluidelor criogenice.Se aleg două soluții etalon (a se vedea tabelul anterior) care să fie apropiate de valoarea presupusă a punctului de congelare presupus al laptelui de analizat. Ar fi preferabil ca diferența dintre punctele de congelare ale celor două soluții să nu depășească - 0,100°C.(La anumite tipuri de crioscoape disponibile la ora actuală, circuitul asociat termistorului este conceput astfel încât să se stabilizeze la o valoare specifică a punctului de congelare din gama de măsuri a aparatului. În acest caz, alegerea, dintre soluțiile etalon posibile, a unei soluții etalon cu acest punct de congelare facilitează etalonarea; producătorul trebuie să indice această valoare.)Se introduc, cu ajutorul unei pipete, 2,5 ± 0,1 ml de soluție etalon într-o eprubetă pentru eșantioane curată și uscată, apoi se trece la măsurarea cu ajutorul crioscopului.NotăEprubetele pentru eșantioane utilizate la etalonare trebuie să fie fabricate și tratate la fel cu cele utilizate la eșantionarea laptelui (același tip de sticlă, spălate și limpezite cu apă demineralizată). Temperaturile soluțiilor etalon trebuie să fie identice cu cele ale eșantioanelor de lapte.Se trece la controlarea etalonării, respectându-se indicațiile producătorului, până când citirea crioscopului indică un punct de congelare identic cu cel al soluției etalon. Se repetă operația cu cealaltă soluție etalon și se alternează astfel până când citirile succesive indică, pentru fiecare soluție, valoarea corectă a punctului lor de congelare fără reglaj suplimentar. În acest moment, crioscopul este gata de utilizare și indică direct, fără corecții, punctul de congelare al eșantionului de lapte.7.   Pregătirea eșantionului pentru analiză
   7.1.   Dacă este necesar, eșantioanele se păstrează la o temperatură cuprinsă între 0 și 5°C.7.2.   Se elimină din eșantion orice corp străin vizibil sau orice substanță grasă solidă prin filtrare, dacă este necesar într-un recipient uscat și curat, apoi se omogenizează încet eșantionul. Dacă se folosește un filtru, acesta trebuie să fie inert față de lapte și eficient la temperatura laboratorului.7.3.   Laptele poate fi analizat la temperatura sa de conservare (între 0 și 5°C) sau poate fi adus la temperatura laboratorului imediat înainte de începerea analizei. În timpul utilizării, soluțiile etalon și eșantioanele de lapte trebuie totuși să fie la aceeași temperatură.7.4.   Se determină aciditatea titrabilă a laptelui, pe cât posibil în același timp cu determinarea punctului de congelare. Eșantioanele a căror aciditate depășește 0,18 g de acid lactic la 100 ml de lapte nu pot fi analizate.7.5.   Laptele UHT și laptele sterilizat trebuie lăsate să se odihnească cel puțin 20 de minute într-un recipient deschis înainte de a fi analizate.8.   Modul de operare
   8.1.   Verificări preliminare
   Nivelul și temperatura lichidului de răcire trebuie să fie conforme cu indicațiile producătorului, iar sonda cu termistor trebuie să se afle într-o eprubetă goală, în poziția exactă a eșantionului. Se pune crioscopul în funcțiune, având grijă ca lichidul de răcire să fie omogenizat sau circulat corect, după caz. Dacă crioscopul a funcționat în prealabil cel puțin 12 ore, se verifică temperatura lichidului de răcire, precum și poziția agitatorului și amplitudinea vibrațiilor sale.8.2.   Verificarea de rutină a etalonării
   Înainte fiecărei serii de teste, se măsoară punctul de congelare al unei soluții etalon de clorură de sodiu (de exemplu, o soluție cu punctul de congelare de - 0,512°C) până când valorile obținute după două determinări consecutive nu diferă între ele cu mai mult de 0,001°C. Dacă media acestor valori diferă cu mai mult de 0,002°C de punctul de congelare al soluției etalon, se etalonează din nou crioscopul conform descrierii de la punctul 6.Dacă crioscopul este utilizat continuu, se face verificarea de rutină a etalonării cel puțin o dată pe oră, respectându-se indicațiile producătorului.8.3.   Determinarea punctului de congelare al laptelui
   Se omogenizează conținutul recipientului cu eșantionul de lapte prin agitări moderate și întoarceri succesive ale recipientului. A nu se agita violent eșantionul, pentru a evita încorporarea de aer.Se introduc, cu ajutorul unei pipete, 2,5 ± 0,1 ml de lapte într-o eprubetă uscată și curată. Sonda și agitatorul trebuie să fie curate, uscate și șterse, dacă este nevoie, de jos în sus, cu o țesătură moale, curată și care nu scămoșează.Se pune eprubeta cu eșantionul în crioscopul etalonat urmându-se indicațiile producătorului. Laptele este răcit și congelarea declanșată, la ± 0,1°C față de temperatura indicată de către producător.(La anumite aparate automate, această temperatură apare pe afișajul digital; la aparatele manuale, precizia necesară este obținută urmărindu-se dacă începe congelarea în momentul când acul sau firul galvanometrului ajunge în dreptul reperului corespunzător.)Dacă, dintr-un motiv oarecare, congelarea începe înainte sau după intervalul de temperatură indicat, se oprește analiza și se reîncepe cu o altă probă de lapte. Dacă și noua probă se congelează înainte de temperatura indicată, se încălzește o fracțiune alicotă din laptele supus analizei la 45°C și se menține la această temperatură timp de cinci minute, pentru a permite topirea substanței grase cristaline.Se răcește apoi până la temperatura de testare și se trece imediat la o nouă analiză. Temperatura laptelui după începerea congelării crește rapid până la o valoare care va rămâne practic constantă, pentru o perioadă, înainte de a coborî din nou. Punctul de congelare corespunde temperaturii celei mai ridicate atinse în această perioadă, valoare care trebuie notată.NotăTimpul în care temperatura rămâne constantă și intervalul de timp dintre începutul congelării și obținerea temperaturii celei mai ridicate diferă de la un eșantion la altul și sunt mult mai scurte la apă și la soluțiile etalon de clorură de sodiu decât la lapte. Este esențială reținerea temperaturii celei mai ridicate.Când măsurarea s-a efectuat satisfăcător, se îndepărtează eprubeta, se spală cu apă, apoi se șterge sonda cu termistor și agitatorul de jos în sus, cu o țesătură moale, curată și care nu scămoșează și se trece la o a doua determinare pe o nouă probă.Dacă diferența dintre punctele de congelare obținute este superioară valorii de repetabilitate (0,004°C), se efectuează o a doua determinare pe o altă probă. Dacă valorile celor două determinări concordă cu o eroare maximă de 0,400°C, ele pot fi reținute și folosite în calculul final.8.4.   Răcirea sondei
   După folosirea aparatului, se plasează o eprubetă goală în locul unde se află proba și se coboară mandrina astfel încât sonda să fie păstrată la rece. (Cu anumite tipuri de crioscop, acest lucru nu este posibil; în acest caz, sonda trebuie să fie bine răcită înainte de efectuarea măsurătorilor, lucru verificat, de exemplu, prin mai multe false determinări până la obținerea de citiri identice.)9.   Exprimarea rezultatelor
   9.1.   Calculul
   Dacă etalonarea este confirmată prin verificarea de rutină a etalonării, se ia ca rezultat media celor două valori acceptabile obținute pentru punctul de congelare, rotunjită la trei zecimale.Dacă suma celor două valori acceptabile obținute la determinările efectuate de câte două ori este un număr impar, media trebuie rotunjită la valoarea pară cea mai apropiată, după cum arată și exemplul următor:Punct de congelare (°C)
               Valorile celor două determinări
            
               Media
            
               -0,544
            
               -0,545
            
               -0,544
            
               -0,545
            
               -0,546
            
               -0,546
            9.2.   Fidelitatea
   9.2.1.   Repetabilitatea (r): 0,004°C.
   9.2.2.   Reproductibilitatea (R): 0,006°C.
   
      
      II.   DETERMINAREA ACTIVITĂȚII FOSFATAZICE1.   Obiectul și domeniul de aplicare
   Prezentul capitol descrie procedura de referință pentru determinarea activității fosfatazice a laptelui pasteurizat.2.   Definiție
   2.1.   Activitatea fosfatazică este măsura cantității de fosfatază alcalină activă prezentă în produs. Aceasta se exprimă prin cantitatea de fenol în mg per ml de lapte pasteurizat în condițiile descrise în cele ce urmează.2.2.   Activitatea fosfatazică a laptelui este negativă dacă este inferioară valorii de 4 mg fenol per ml.3.   Principiu
   Eventuala activitate fosfatazică din eșantion va elibera fenol din fenilfosfatul disodic adăugat. Fenolul eliberat reacționează cu dibrom chinona cloramidă producând dibrom-indofenol (de culoare albăstruie) măsurat la 610 nm la proba martor (eșantion în care activitatea enzimelor a fost distrusă).4.   Reactivi
   4.1.   Soluție-tampon de borat și de hidroxid de bariu
   4.1.1.   Se dizolvă 50,0 g hidroxid de bariu [Ba(OH)2.8H2O] în apă și se completează până la 1 000 ml.4.1.2.   Se dizolvă 22,0 g acid boric (H3BO3) în apă și se completează până la 1 000 ml.4.1.3.   Se încălzesc 500 ml din fiecare soluție la 50°C, se omogenizează, se agită, se răcește rapid la aproximativ 20°C, se ajustează pH-ul dacă este necesar, la 10,6 ± 0,1 cu ajutorul soluției 4.1.1 sau 4.1.2. Se filtrează. Soluția se păstrează într-un recipient închis ermetic.4.1.4.   Înainte de utilizare, soluția se diluează cu un volum de apă echivalent.4.2.   Soluție-tampon de dezvoltare a colorației
   Se dizolvă 6,0 g metaborat de sodiu (NaBO2) sau 12,6 g NaBO2 . 4H2O și 20,0 g clorură de sodiu (NaCl) în apă și se completează până la 1 000 ml.4.3.   Soluție-tampon de colorare diluată
   Se diluează 10 ml de soluție-tampon de dezvoltare a colorației (4.2) în apă și se completează până la 100 ml.4.4.   Soluție tamponată
   Se dizolvă 0,1 g fenilfosfat disodic deshidratat fără fenol în 100 ml de soluție-tampon (4.1.3) sau 0,5 g fenilfosfat disodic în 4,5 ml de soluție-tampon de dezvoltare a colorației (4.2), apoi se adaugă două picături de soluție BCC (4.6) și se lasă să se odihnească la temperatura ambiantă timp de 30 de minute. Se extrage culoarea astfel formată cu ajutorul a 2,5 ml de 1-butanol și se lasă să se odihnească până la separarea 1-butanolului. Se decantează 1-butanolul și se elimină. Dacă e nevoie, se repetă extracția.Soluția poate fi păstrată câteva zile în frigider; se lasă colorația să se dezvolte și se trece la o nouă extracție înainte de utilizare. Soluția tamponată se prepară chiar înainte de utilizare, diluând 1 ml din această soluție în 100 ml cu ajutorul soluției-tampon de borat și de hidroxid de bariu (4.1.3).4.5.   Precipitatul cupru-zinc
   Se dizolvă 3,0 g sulfat de zinc (ZnSO4 · 7H2O) și 0,6 g sulfat de cupru (II) (CuSO4 · 5H2O) în apă și se completează până la 100 ml.4.6.   Soluția de dibrom-2,6 chinono-cloramidă (soluție BCC)Se dizolvă 40 ± 1 mg dibrom-2,6 chinono-cloramidă (BCC) (C6H2Br2CINO6) în 10 ml alcool etilic 96 % (v/v).Se păstrează în frigider, într-o sticlă de culoare închisă. Dacă își schimbă culoarea sau dacă este mai veche de o lună, soluția trebuie aruncată.4.7.   Soluția de sulfat de cupru (II)
   Se dizolvă 0,05 g sulfat de cupru (II) (CuSO4 ·5H2O) în apă și se completează până la 100 ml.4.8.   Soluțiile etalon de fenol
   4.8.1.   Se cântăresc 200 ± 2 mg fenol anhidru pur, se transvazează într-un balon gradat de 100 ml, se adaugă apă, se omogenizează și se completează până la 100 ml. Soluția rămâne stabilă vreme de mai multe luni dacă este ținută la frigider.4.8.2.   Se diluează 10 ml de soluție concentrată în apă, se completează până la 100 ml și se omogenizează. 1 ml conține 200 μg fenol.5.   Aparatură și sticlărie de laborator
   Note
               (a)
            
               Toată sticlăria de laborator, precum și toate dopurile și instrumentele de eșantionare trebuie curățate cu grijă. Este recomandat să fie spălate cu apă distilată proaspăt fiartă sau trecute prin vapori.
            
               (b)
            
               Anumite tipuri de dopuri din plastic pot antrena o contaminare cu fenol; a se evita utilizarea dopurilor de aceste tipuri.
            Materialul obișnuit de laborator și, mai ales:5.1.   Balanță analitică
   5.2.   Baie de apă reglabilă la 37 ± 1°C.5.3.   Spectrofotometru care să permită efectuarea citirilor pe o lungime de undă de 610 nm.5.4.   Eprubete, 16 sau 18 x 150 mm, de preferință gradate la fiecare 5 sau 10 ml.5.5.   Pipete
   5.6.   Pâlnii de sticlă de dimensiuni corespunzătoare, de exemplu cu diametrul de 5 cm.5.7.   Filtre cu pliuri cu diametrul de 9 cm, pentru o viteză de filtrare medie5.8.   Baloane gradate pentru pregătirea soluțiilor etalon.6.   Modul de operare
   Note
               (a)
            
               A se evita contactul direct cu lumina solară pe timpul determinării.
            
               (b)
            
               Urmele de salivă sau de transpirație pot genera rezultate fals pozitive și trebuie prin urmare evitate. În consecință, trebuie luate măsuri speciale de precauție la mânuirea pipetelor.
            6.1.   Pregătirea eșantionului pentru test
   6.1.1.   Analiza se efectuează imediat după eșantionare. În caz contrar, eșantionul se păstrează la frigider, însă nu mai mult de două zile.6.2.   Proba
   Se pipetează în fiecare dintre cele două eprubete (5.4) 1 ml de eșantion, utilizându-se una dintre eprubete ca probă martor.6.3.   Determinarea
   6.3.1.   Se încălzește proba martor timp de două minute în apă fierbinte; se acoperă eprubeta și recipientul cu apa fierbinte cu o folie de aluminiu, astfel încât întreaga eprubetă să se încălzească. Se răcește apoi rapid la temperatura ambiantă.6.3.2.   Se tratează eșantionul pentru test și proba martor în mod identic pe durata restului operațiunii. Se adaugă 10 ml de soluție tamponată (4.4) și se omogenizează.6.3.3.   Se incubează imediat probele în baia de apă (5.2) timp de 60 de minute omogenizându-se din când în când (de cel puțin patru ori).6.3.4.   Se încălzește în apă fierbinte timp de două minute, în același fel ca la punctul 6.3.1. Se răcește rapid la temperatura ambiantă.6.3.5.   Se adaugă 1 ml de precipitat cupru-zinc (4.5) în fiecare eprubetă și se omogenizează cu atenție.6.3.6.   Se filtrează prin hârtie de filtru uscată, se aruncă primii doi mililitri, se refiltrează dacă este necesar, până când filtratul este complet limpede și se iau apoi 5 ml din el într-o eprubetă.6.3.7.   Se adaugă 5 ml de soluție-tampon de dezvoltare a colorației (4.2).6.3.8.   Se adaugă 0,1 ml de soluție BCC (4.6), se omogenizează și se lasă să se dezvolte colorația timp de 30 de minute la temperatura ambiantă.6.3.9.   Se măsoară absorbția în raport cu cea a probei martor pe o lungime de undă de 610 nm (5.3).6.3.10.   Dacă absorbția măsurată la punctul 6.3.9 depășește absorbția soluției etalon conținând 20 g de fenol per eprubetă măsurată conform punctului 6.4.4, se repetă operațiunea de determinare cu o diluare potrivită a eșantionului. Se pregătește diluția omogenizându-se un volum de eșantion cu un volum corespunzător dintr-o porție din același eșantion adusă cu atenție la starea de fierbere astfel încât să se dezactiveze fosfataza.6.4.   Pregătirea curbei de etalonare
   6.4.1.   Se pregătește, cu ajutorul unei soluții etalon de fenol (4.8.2), o gamă de soluții etalon cu conținut de 0 (pentru martor sau proba martor), 2, 5, 10 și 20 μg fenol per mililitru. Se pipetează câte 1 ml de apă și 1 ml din cele patru soluții etalon de fenol în fiecare dintre cele cinci eprubete.6.4.2.   Se adaugă în fiecare eprubetă 1 ml de soluție de sulfat de cupru (II) (4.7), 5 ml de soluție-tampon de colorare diluată (4.3), 3 ml de apă și 0,1 ml soluție BCC (4.6); se omogenizează.6.4.3.   Se lasă să se dezvolte colorația timp de 30 de minute la temperatura ambiantă.6.4.4.   Se măsoară absorbția în raport cu martorul sau proba martor pe o lungime de undă de 610 nm (5.3).6.4.5.   Pornind de la valorile de absorbție (6.4.4) obținute pentru fiecare cantitate de fenol adăugată (6.4.1), se calculează curba de regresie prin metoda celor mai mici pătrate.7.   Exprimarea rezultatelor
   7.1.   Calcul și formulă
   7.1.1.   Pornind de la valoarea măsurată a absorbției (6.3.9), se calculează cantitatea de fenol cu ajutorul curbei de regresie (6.4.5).7.1.2.   Se calculează activitatea fosfatazică, exprimată în μg de fenol per mililitru de lapte pasteurizat cu ajutorul următoarei formule:
      Activitatea fosfatazică = 2,4 x A x Dunde
               A
            
               este cantitatea de fenol în mg obținută la 7.1.1;
            
               D
            
               este factorul de diluare a diluării efectuate la 6.3.10 (în absența diluării, D = 1);
            2,4 este factorul de diluare (5/12 din 1 ml de probă) – A se lua în considerare punctul 6.2 coroborat cu punctele 6.3.2, 6.3.5 și 6.3.6.7.2.   Fidelitatea
   7.2.1.   Repetabilitatea (r): 2 mg fenol/ml.7.2.2.   Reproductibilitatea (R): 3 (preliminar) mg fenol/ml.7.2.3.   Dacă s-a efectuat o diluare conform punctului 6.3.10, limitele specificate la punctele 7.2.1 și 7.2.2 se referă la rezultatele obținute cu eșantionul diluat.
      III.   DETERMINAREA ACTIVITĂȚII PEROXIDAZICE1.   Obiectul și domeniul de aplicare
   Prezentul capitol descrie procedura de referință pentru determinarea prezenței sau absenței enzimei de peroxidază în lapte, care servește la controlul pasteurizării.2.   Definiții
   
      Reacția pozitivă la testul peroxidazei:
   Dacă laptele este bine pasteurizat, la 30 de secunde după omogenizare apare o colorație albăstruie.
      Reacția negativă la testul peroxidazei:
   Nu apare nici o colorație după 30 de secunde de la omogenizare.3.   Principiu
   Peroxidaza descompune peroxidul de hidrogen. Oxigenul atomic eliberat transformă prin oxidare parafenilendiamina incoloră în indofenol de culoare purpurie (testul Storch). Intensitatea colorației este proporțională cu concentrația enzimei.4.   Reactivi
   4.1.   Soluția de 1,4-fenilendiamină
   Se dizolvă 2 g de 1,4-fenilendiamină (C6H8N2) în apă caldă (50°C) și se completează până la 100 ml. Se păstrează soluția într-un flacon închis la culoare, cu dop de sticlă, la adăpost de lumină și la răcoare. La o zi sau două după preparare, soluția de 1,4-fenilendiamină formează o depunere care trebuie eliminată.4.2.   Soluția de peroxid de hidrogen
   Se diluează 9 ml de peroxid de hidrogen de concentrație 30 % în apă și se completează până la 100 ml. Pentru stabilizare, se adaugă câte 1 ml de acid sulfuric concentrat la fiecare litru de soluție.Soluția de peroxid de hidrogen este stabilă timp de o lună dacă este păstrată la răcoare și ferită de lumină, într-un flacon închis, cu un dop de sticlă care împiedică orice contact cu compuși organici.5.   Mod de operare
   5.1.   Se introduc 5 ml din laptele supus analizei într-o eprubetă curată prevăzută cu dop potrivit.5.2.   Se adaugă 5 ml de soluție de 1,4-fenilendiamină (4.1).5.3.   Se adaugă două picături de soluție de peroxid de hidrogen (4.2).5.4.   Se examinează colorația în primele 30 de secunde după omogenizare. Dacă apare o colorație albastră la mai mult de 30 de secunde după adăugarea reactivilor, reacția nu este specifică.
      IV.   INVENTARIEREA MICROORGANISMELOR – NUMĂRARE PE PLACĂ LA 30°C1.   Obiectul și domeniul de aplicare
   Prezentul capitol descrie procedura de referință de inventariere a microorganismelor prin tehnica numărării coloniilor obținute la 30°C. Metoda se aplică în cazul laptelui crud, al laptelui pasteurizat, al laptelui UHT și al laptelui sterilizat preincubat la 30°C timp de 15 zile.2.   Definiție
   „Microorganisme” reprezintă toate organismele care formează colonii ce pot fi numărate după o incubație în aerobioză în condițiile de operare descrise.3.   Principiu
   Omogenizarea unui volum determinat de eșantion de lapte într-un mediu de cultură pe o cutie Petri și incubare la 30°C timp de 72 de ore. Se numără coloniile și se calculează numărul de microorganisme per mililitru de lapte crud sau pasteurizat sau per 0,1 ml de lapte sterilizat sau UHT preincubat.4.   Aparatură și sticlărie de laborator
   Materialul obișnuit de laborator și, mai ales:4.1.   Aparatură
   4.1.1.   Cuptor cu aer cald, reglabil la 170–175°C.4.1.2.   Autoclavă, reglabilă la 121 ± 1°C.4.1.3.   Etuvă, reglabilă la 30 ± 1°C.4.1.4.   pH-metru, cu corecție de temperatură, sensibil la unități pH de ordinul 0,1.4.1.5.   Baie de apă reglabilă la 45 ± 1°C.4.1.6.   Lupă de ordinul 2-4 x.4.1.7.   Lupă de ordinul 8-10 x.4.1.8.   Contor cu înregistrare4.1.9.   Agitator capabil să omogenizeze 1 ml de eșantion de lapte sau o diluție zecimală cu 9 ml de diluant și al cărui principiu de funcționare se bazează pe o mișcare de rotație excentrică a conținutului eprubetei.4.2.   Sticlăria de laborator
   4.2.1.   Eprubete cu dopuri corespunzătoare și o capacitate suficient de mare pentru a putea conține, cu un spațiu suficient care să permită o agitare convenabilă, 10 ml din prima diluție sau din diluțiile zecimale următoare.4.2.2.   Baloane cu capacitate de la 150 la 250 ml sau eprubete pentru mediul de cultură cu capacitate de aproximativ 20 ml.4.2.3.   Pipete (înfundate cu vată) din sticlă sau din material sintetic steril, neciobite, cu capacitate nominală de 1 ml, cu un orificiu de scurgere de diametru între 1,75 și 3 mm.4.2.4.   Cutii Petri din sticlă sau material sintetic steril, transparent și incolor, fundul plăcilor având un diametru interior de aproximativ 90-100 mm. Adâncimea interioară trebuie să fie de cel puțin 10 mm. Fundul nu trebuie să prezinte nici un fel de neregularități care ar putea stânjeni numărarea coloniilor.4.2.5.   Sterilizarea sticlăriei:
   Sticlăria de laborator trebuie sterilizată folosindu-se una dintre următoarele metode:
               (a)
            
               în cuptorul cu aer cald, la o temperatură de 170 până la 175°C, timp de cel puțin o oră (4.1.1);
            
               (b)
            
               în autoclavă, la o temperatură de 121 ± 1°C, timp de cel puțin 20 de minute (punctul 4.1.2).
            În autoclavă trebuie luate toate măsurile de precauție pentru asigurarea unei penetrări adecvate a vaporilor: dacă materialul este sterilizat în recipiente, acestea nu trebuie să fie închise ermetic, iar dopurile sau capacele baloanelor trebuie să fie desfăcute.Se usucă sticlăria sterilizată în autoclavă pentru eliminarea tuturor vaporilor.Pipetele trebuie sterilizate în cuptorul cu aer cald (punctul 4.1.1).5.   Mediul de cultură – numărarea germenilor din lapte pe placa de geloză
   5.1.   Compoziție:
   
               Extract de drojdie
            
               2,5 g
            
               Tripton
            
               5,0 g
            
               D (+) Glucoză sau dextroză
            
               1,0 g
            
               Lapte praf degresat
            
               1,0 g
            
               Agar-agar
            
               între 10 și 15 g, în funcție de proprietățile gelifiante ale agar-agarului
            
               Apă
            
               1 000 ml
            Laptele praf degresat nu are voie să conțină substanțe inhibitoare; acest lucru se verifică cu ajutorul unor teste comparative realizate utilizându-se lapte praf degresat cunoscut ca fiind lipsit de substanțe inhibitoare.
      Mod de preparare:
   Se aduc în stare de suspensie dizolvându-se în apă, în ordine, extractul de drojdie, triptonul, glucoza și, în sfârșit, laptele praf degresat. Încălzirea suspensiei facilitează operațiunea. Se adaugă apoi agar-agarul și se aduce în stare de fierbere agitându-se des, până la dizolvarea completă a agar-agarului sau se încălzește la abur timp de aproximativ 30 de minute.Dacă este nevoie, se filtrează prin hârtie de filtru.Se verifică pH-ul cu ajutorul unui pH-metru (4.1.4); dacă este necesar, se ajustează pH-ul cu ajutorul unei soluții (cel puțin 0,1 mol/l) de hidroxid de sodiu sau de acid clorhidric astfel încât, după sterilizare, să fie de 6,9 ± 0,1 la o temperatură de 25°C.5.2.   Repartizarea, sterilizarea și conservarea mediului de cultură
   Se împarte mediul (5.1) în cantități de 100 până la 150 ml în baloane sau în cantități de 12 până la 15 ml în eprubete (4.2.2). Se astupă baloanele și eprubetele.Se sterilizează în autoclavă (4.1.2) la 121 ± 1°C timp de 15 minute.Se verifică pH-ul mediului.Dacă mediul de cultură nu va fi utilizat imediat, se păstrează la adăpost de lumină, la o temperatură între 1 și 5°C, cel mult o lună după prepararea sa.5.3.   Mediul de cultură complet deshidratat disponibil pe piață
   Mediul de cultură (5.1) poate fi preparat cu un mediu de cultură complet deshidratat disponibil pe piață. Se urmează indicațiile producătorului, dar înainte de dizolvare se adaugă laptele praf degresat, dacă acesta nu intră în compoziția produsului.Se ajustează pH-ul la 6,9 ± 0,1 la 25°C după metoda descrisă la punctul 5.1, apoi se repartizează, se sterilizează și se pune la păstrare mediul conform indicațiilor date la punctul 5.2.6.   Diluanții
   6.1.   Soluția peptonă/sare
   Compoziție:
               Peptonă
            
               1,0 g
            
               Clorură de sodiu (NaCl)
            
               8,5 g
            
               Apă
            
               1 000 ml
            
      Mod de preparare:
   Se dizolvă compușii în apă, încălzind dacă este necesar.Se verifică pH-ul cu ajutorul pH-metrului (4.1.4); dacă este necesar, se ajustează pH-ul utilizându-se o soluție (cel puțin 0,1 mol/l) de hidroxid de sodiu sau de acid clorhidric astfel încât, după sterilizare, valoarea lui să fie de 7,0 ± 0,1, la o temperatură de 25°C.6.2.   Repartizarea, sterilizarea și conservarea diluantului
   Se repartizează diluantul (6.1) în eprubete (4.2.1) în așa fel încât, după sterilizare, fiecare eprubetă să conțină 9,0 ± 0,2 ml de diluant. Se astupă eprubetele.Se sterilizează în autoclavă (4.1.2) la 121 ± 1°C timp de 15 minute.Se verifică pH-ul diluantului.Dacă diluantul nu va fi utilizat imediat, se păstrează la adăpost de lumină, la o temperatură între 1 și 5°C, cel mult o lună după preparare.6.3.   Diluanți complet deshidratați disponibili pe piață
   Prafurile sau comprimatele deshidratate disponibile pe piață pot fi folosite la prepararea diluantului (6.1). A se urma instrucțiunile producătorului. Se ajustează pH-ul după metoda descrisă la 6.1 și se repartizează, se sterilizează și se pune la păstrare conform indicațiilor date la punctul 6.2.7.   Mod de operare
   7.1.   Topirea mediului
   Înainte de a trece la analiza microbiologică, se topește rapid cantitatea de mediu necesară și se răcește mediul la 45 ± 1°C în baia de apă (4.1.5).7.2.   Pregătirea eșantionului de lapte
   Se amestecă bine eșantionul pentru a se obține o repartizare cât mai omogenă a microorganismelor, întorcându-se rapid recipientul cu eșantionul de 25 de ori. Trebuie evitată formarea de spumă sau spuma trebuie lăsată să se disperseze. Timpul scurs între omogenizare și prelevarea eșantionului nu trebuie să depășească 3 minute.7.3.   Pregătirea primei diluții (10-1) (lapte crud și pasteurizat)Se transferă, cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.3), 1 ml de eșantion (7.2) de lapte crud sau de lapte pasteurizat în 9 ml de diluant (6.1), evitându-se orice contact între pipetă și diluant. Temperatura diluantului trebuie să fie identică cu cea a eșantionului de lapte. Se omogenizează cu grijă această primă diluție cu ajutorul agitatorului (4.1.9) timp de 5 până la 10 secunde.Se obține astfel prima diluție 10-1.7.4.   Pregătirea diluțiilor zecimale următoare (lapte crud și lapte pasteurizat)
   Se transferă, cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.3), 1 ml din prima diluție (7.3) în 9 ml de diluant (6.1), urmându-se indicațiile de la punctul 7.3.Se obține astfel o diluție 10-2.Se repetă aceste operațiuni de obținere a diluțiilor zecimale următoare până se ajunge la numărul adecvat de microorganisme (8.1.1).7.5.   Inocularea cutiilor Petri
   7.5.1.   Lapte crud: se transferă, cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.3), 1 ml de eșantion și/sau de diluție zecimală corespunzătoare pe o placă (4.2.4). Analiza trebuie să examineze cel puțin două diluții. Pentru fiecare diluție, se pregătește o placă aleasă corespunzător (8.1.1).7.5.2.   Lapte pasteurizat: se transvazează, cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.3), 1 ml de eșantion și/sau de diluție zecimală corespunzătoare pe o placă (4.2.4). Analiza trebuie să examineze cel puțin două diluții. Pentru fiecare diluție, se pregătesc două plăci alese corespunzător (8.1.1).7.5.3.   Lapte UHT și lapte sterilizat (analiza făcându-se după incubare pe timp de 15 zile la 30°C – Directiva 85/397/CEE, anexa A capitolul VII punctul 5):Se transferă, cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.3), 0,1 ml de eșantion de lapte (7.2) pe o placă (4.2.4). Se pregătesc două plăci.7.6.   Turnarea mediului
   Se toarnă cca 15–18 ml de mediu (7.1) pe fiecare placă inseminată.Se omogenizează imediat prin rotirea cutiei Petri pentru a se obține o repartizare uniformă a coloniilor după incubare.Timpul scurs între încheierea preparării eșantionului și omogenizarea, în funcție de tipul de lapte, a probei sau a diluției cu mediul nu trebuie să depășească 15 minute.Se lasă să se odihnească pe o suprafață orizontală rece și curată până la solidificarea mediului.7.7.   Incubarea cutiilor Petri
   Se introduc plăcile în etuvă (4.1.3). Se incubează plăcile răsturnate. Nu trebuie așezate mai mult de șase una peste cealaltă. Plăcile nu trebuie să se atingă între ele, nici să fie în contact cu pereții sau cu partea superioară a etuvei.Se incubează la 30 ± 1°C timp de 72 ± 2 ore.7.8.   Numărarea coloniilor
   Se numără coloniile de pe cutiile Petri cu cel mult 300 de colonii.Se examinează plăcile la lumină scăzută. Se pot folosi o lupă (4.1.6) și/sau un contor cu înregistrare (4.1.8) pentru facilitarea numărării. A nu se confunda particulele de materie precipitată cu coloniile de mărimea unui vârf de ac. Dacă există dubii, se face o analiză minuțioasă, utilizându-se, dacă este cazul, o lupă de ordin superior (4.1.7) pentru a distinge coloniile de materiile străine.O colonie invadatoare este luată în calcul ca una singură. Dacă acest tip de colonie acoperă mai puțin de un sfert din placă, se numără coloniile de pe partea neatinsă a plăcii și se calculează numărul corespunzător pentru întreaga placă. Dacă coloniile invadatoare acoperă mai mult de un sfert din placă, se elimină placa.8.   Calculul și exprimarea rezultatelor
   8.1.   Laptele crud și pasteurizat
   8.1.1.   Se folosesc rezultatele plăcilor ce conțin între 10 și 300 de colonii (a se vedea 8.1.3 și 8.1.4).8.1.2.   Se calculează numărul de microorganisme per mililitru de lapte crud sau pasteurizat cu ajutorul formulei următoare:
      unde
               ΣC
            
               este suma totală a coloniilor numărate conform punctului 8.1.1,
            
               (n1 + 0,1n2) d
            
               este egal cu volumul eșantionului inseminat, unde:
            
               n1
               
            
               este numărul de plăci numărate la prima diluare,
            
               n2
               
            
               este numărul de plăci numărate la a doua diluare,
            
               d
            
               este factorul de diluare cu ajutorul căruia s-au făcut primele numărători.
            Numărul se rotunjește la două cifre semnificative. Dacă cifra ce trebuie rotunjită este 5, se rotunjește astfel încât prima cifră de la stânga să fie pară.Exemplu (lapte pasteurizat):Diluție 10-2: 278 și 290 de coloniiDiluție 10-3: 33 și 28 de colonii
               Număr/ml
            
               
                  
            
                
            
               
                  
            
                
            
               = 28 590
            
                
            
               = 29 000
            
                
            
               = 2,9 × 104
               
            8.1.3.   Dacă toate inventarierile dau o valoare mai mică de 10, se va nota că numărul de microorganisme per mililitru este „mai mic de 10 x d”, „d” fiind inversul factorului de diluare celui mai slab.8.1.4.   Dacă toate inventarierile dau valori mai mari de 300 și dacă numărătoarea este posibilă, se face o estimare și se înmulțește cu inversul factorului de diluare. Se exprimă rezultatul adăugându-se indicația „număr estimat de microorganisme per mililitru”.8.2.   Lapte UHT și lapte sterilizat
   Cantitățile de germeni mai mari de 10 colonii per 0,1 ml sunt considerate necorespunzătoare prevederilor Directivei 85/397/CEE.9.   Fidelitatea
   Nu dispunem încă de rezultatele vreunor teste inelare recunoscute la nivel internațional.
      V.   INVENTARIEREA MICROORGANISMELOR - NUMĂRARE PE PLACĂ LA 21°C1.   Obiectul și domeniul de aplicare
   Prezentul capitol descrie procedura de referință de inventariere a microorganismelor prin tehnica numărării coloniilor la 21°C, în laptele pasteurizat preincubat timp de cinci zile la 6°C, în principal în scopul determinării gradului de contaminare a laptelui pasteurizat cu microorganisme psihotrope capabile să se înmulțească în lapte la temperatura de 6°C.2.   Definiție
   „Microorganisme” reprezintă toate organismele care formează colonii ce pot fi numărate după o incubație în aerobioză în condițiile de operare descrise.3.   Principiu
   Incubarea laptelui pasteurizat la 6°C timp de cinci zile. Omogenizarea unui volum determinat de eșantion de lapte preincubat cu mediul de cultură pe cutii Petri la 21°C timp de 25 de ore. Numărarea coloniilor și calculul numărului de microorganisme per mililitru de lapte pasteurizat.4.   Aparatură și sticlărie de laborator
   Materialul obișnuit de laborator și, mai ales:4.1.   Aparatură
   4.1.1.   Cuptor cu aer cald, reglabil la 170–175°C.4.1.2.   Autoclavă reglabilă la 121 ± 1°C.4.1.3.   Etuve reglabile la o temperatură uniformă de:
               (a)
            
               6 ± 0,2°C.
            
               (b)
            
               21 ± 1°C
            4.1.4.   pH-metru cu corecție de temperatură, sensibil la unități pH de ordinul 0,1.4.1.5.   Baie de apă reglabilă la 45 ± 1°C.4.1.6.   Lupă de ordinul 2-4x.4.1.7.   Lupă de ordinul 8-10x.4.1.8.   Contor cu înregistrare
   4.1.9.   Agitator capabil să omogenizeze 1 ml din eșantionul de lapte sau din diluția zecimală cu 9 ml de diluant și al cărui principiu de funcționare se bazează pe o mișcare de rotație excentrică a conținutului eprubetei.4.2.   Sticlăria de laborator
   4.2.1.   Eprubete cu dopuri corespunzătoare și de capacitate adecvată pentru a putea conține, cu un spațiu suficient care să permită o agitare convenabilă, 10 ml din prima diluție sau din diluțiile zecimale următoare.4.2.2.   Baloane cu capacitate între 150 și 250 ml sau eprubete cu capacitate de aproximativ 20 ml pentru mediul de cultură.4.2.3.   Pipete (înfundate cu vată) din sticlă sau din material sintetic steril, neciobite, cu capacitate nominală de 1 ml, cu un orificiu de scurgere cu diametrul între 1,75 și 3 mm.4.2.4.   Cutii Petri din sticlă sau din material sintetic steril, transparent și incolor, fundul plăcilor având un diametru interior de aproximativ 90-100 mm. Adâncimea interioară trebuie să fie de cel puțin 10 mm. Fundul nu trebuie să prezinte nici un fel de neregularități care ar putea stânjeni numărarea coloniilor.4.2.5.   Sterilizarea sticlăriei
   Sticlăria de laborator trebuie sterilizată cu ajutorul uneia dintre următoarele metode:
               (a)
            
               în cuptorul cu aer cald (4.1.1.), la o temperatură între 170 și 175°C, timp de cel puțin o oră;
            
               (b)
            
               în autoclavă (4.1.2), la o temperatură de 121 ± 1°C, timp de cel puțin 20 de minute.
            În autoclavă trebuie luate toate măsurile de precauție pentru asigurarea unei penetrări adecvate a vaporilor: dacă materialul este sterilizat în recipiente, acestea nu trebuie să fie închise ermetic, iar dopurile sau capacele baloanelor nu trebuie să fie strânse.Se usucă sticlăria sterilizată în autoclavă pentru eliminarea tuturor vaporilor.Pipetele trebuie sterilizate în cuptorul cu aer cald (4.1.1).5.   Mediul de cultură – numărarea germenilor din lapte pe placa de agar-agar
   5.1.   Compoziție
   
               Extract de drojdie
            
               2,5 g
            
               Tripton
            
               5,0 g
            
               D (+) Glucoză sau dextroză
            
               1,0 g
            
               Lapte praf degresat
            
               1,0 g
            
               Agar-agar
            
               între 10 și 15 g, în funcție de proprietățile gelifiante ale agar-agarului
            
               Apă
            
               1 000 ml
            Laptele praf degresat nu are voie să conțină substanțe inhibitoare; acest lucru se verifică cu ajutorul unor teste comparative în care se folosește lapte praf degresat cunoscut ca fiind lipsit de substanțe inhibitoare.
      Mod de preparare
   Se aduce în stare de suspensie dizolvându-se în apă, în ordine, extractul de drojdie, triptonul, glucoza și, în sfârșit, laptele praf degresat. Încălzirea suspensiei facilitează operațiunea. Se adaugă apoi agar-agarul și se aduce în starea de fierbere agitându-se adesea până la dizolvarea completă a agar-agarului sau se încălzește la abur timp de aproximativ 30 de minute.Dacă este nevoie, se filtrează prin hârtie de filtru.Se verifică pH-ul cu ajutorul unui pH-metru (4.1.4); dacă este necesar, se ajustează pH-ul cu ajutorul unei soluții (cel puțin 0,1 mol/l) de hidroxid de sodiu sau de acid clorhidric astfel ca, după sterilizare, acesta să fie de 6,9 ± 0,1 la o temperatură de 25°C.5.2.   Repartizarea, sterilizarea și conservarea mediului de cultură
   Se împarte mediul de cultură (5.1) în cantități de 100 până la 150 ml în baloane sau în cantități de 12 până la 15 ml în eprubete (4.2.2). Se astupă baloanele și eprubetele.Se sterilizează în autoclavă (4.1.2) la 121 ± 1°C timp de 15 minute.Se verifică pH-ul mediului.Dacă mediul de cultură nu va fi utilizat imediat, se păstrează la adăpost de lumină, la o temperatură între 1 și 5°C, cel mult o lună după preparare.5.3.   Mediul de cultură complet deshidratat disponibil pe piață
   Mediul de cultură (5.1) poate fi preparat cu un mediu de cultură complet deshidratat disponibil pe piață. Se vor urma indicațiile producătorului, dar înainte de dizolvare se adaugă laptele praf degresat, dacă acesta nu intră în compoziția produsului.Se ajustează pH-ul la 6,9 ± 0,1 la 25°C după metoda de la punctul 5.1, apoi se repartizează, se sterilizează și se pune la păstrare mediul conform indicațiilor date la punctul 5.2.6.   Diluanții
   6.1.   Soluția peptonă/sare
   
      Compoziție:
   
               Peptonă
            
               1,0 g
            
               Clorură de sodiu (NaCl)
            
               8,5 g
            
               Apă
            
               1 000 ml
            
      Mod de preparare:
   Se dizolvă compușii în apă, încălzindu-se dacă este necesar.Se verifică pH-ul cu ajutorul pH-metrului (4.1.4); dacă este necesar, se ajustează pH-ul utilizându-se o soluție (cel puțin 0,1 mol/l) de hidroxid de sodiu sau de acid clorhidric astfel ca, după sterilizare, pH-ul să fie de 7,0 ± 0,1 la o temperatură de 25°C.6.2.   Repartizarea, sterilizarea și păstrarea diluantului
   Se repartizează diluantul (6.1) în eprubete (4.2.1) în asemenea cantități încât, după sterilizare, fiecare eprubetă să conțină 9,0 ± 0,2 ml de diluant. Se astupă eprubetele.Se sterilizează în autoclavă (4.1.2) la 121 ± 1°C timp de 15 minute. Se verifică pH-ul diluantului.Dacă diluantul nu se utilizează imediat, se păstrează la adăpost de lumină, la o temperatură între 1 și 5°C, cel mult o lună după preparare.6.3.   Diluanți complet deshidratați disponibili pe piață
   Prepararea diluantului (6.1) se poate face pe bază de prafuri sau comprimate deshidratate disponibile pe piață. Se vor urma instrucțiunile producătorului. Se ajustează pH-ul după metoda descrisă la 6.1, apoi se repartizează, se sterilizează și se pune la păstrare conform indicațiilor date la punctul 6.2.7.   Mod de operare
   7.1.   Topirea mediului
   Înainte de a începe analiza microbiologică, se topește rapid cantitatea de mediu necesară și se răcește mediul la 45 ± 1°C în baia de apă (4.1.5).7.2.   Pregătirea eșantionului de lapte
   7.2.1.   Se incubează laptele pasteurizat într-un ambalaj închis sau, dacă acest lucru nu este posibil, un eșantion reprezentativ de cel puțin 100 ml, timp de 120 ± 2 ore la 6 ± 0,5°C într-o etuvă [punctul 4.1.3 litera (a)].7.2.2.   După incubare, se omogenizează bine eșantionul de lapte pentru a se obține o repartizare cât mai omogenă a microorganismelor, întorcându-se rapid recipientul cu eșantionul de 25 de ori. Trebuie evitată formarea spumei sau lăsată spuma să se disperseze. Timpul scurs între omogenizare și prelevarea probei nu trebuie să depășească 3 minute.7.3.   Pregătirea primei diluții (10-1)
   Se transferă, cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.3), 1 ml de eșantion (7.2.2) în 9 ml de diluant (6.1), evitându-se orice contact între pipetă și diluant. Temperatura diluantului trebuie să fie identică cu cea a eșantionului de lapte. Se omogenizează cu grijă această primă diluție cu ajutorul agitatorului (4.1.9) timp de 5 până la 10 secunde.Se obține astfel prima diluție 10-1.7.4.   Pregătirea diluțiilor zecimale următoare
   Se transferă, cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.3), 1 ml din prima diluție (7.3) în 9 ml de diluant (6.1), urmându-se indicațiile de la punctul 7.3.Se obține astfel o diluție 10-2.Se repetă aceste operațiuni de obținere a diluțiilor zecimale următoare până se ajunge la numărul adecvat de microorganisme (8.1).7.5.   Inocularea cutiilor Petri
   Se transferă, cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.3), 1 ml de eșantion sau de diluție zecimală corespunzătoare pe o placă (4.2.4). Analiza trebuie să examineze cel puțin două diluții. Pentru fiecare diluție, se pregătesc două plăci alese corespunzător (8.1).7.6.   Turnarea mediului
   Se toarnă cca 15–18 ml de mediu (7.1) pe fiecare placă inseminată.Se omogenizează imediat prin rotirea cutiei Petri pentru a obține o repartizare uniformă a coloniilor după incubare.Timpul scurs între sfârșitul pregătirii eșantionului și omogenizarea diluției cu mediul nu trebuie să depășească 15 minute.Se lasă să se odihnească pe o suprafață orizontală rece și curată.7.7.   Incubarea cutiilor Petri
   Se introduc plăcile în etuvă [punctul 4.1.3 litera (b)]. Se incubează plăcile răsturnate. Nu trebuie așezate mai mult de șase una peste cealaltă. Plăcile nu trebuie să se atingă între ele, nici să fie în contact cu pereții sau cu partea superioară a etuvei.Se incubează la 21 ± 1°C timp de 25 ore.7.8.   Numărarea coloniilor
   Se numără coloniile de pe cutiile Petri cu cel mult 300 de colonii.Se examinează plăcile la lumină scăzută. Se poate folosi o lupă (punctul 4.1.6) și/sau un contor cu înregistrare (4.1.8) pentru facilitarea numărării. A nu se confunda particulele de materie precipitată cu coloniile de mărimea unui vârf de ac. Dacă există îndoieli, se face o analiză minuțioasă, utilizând, dacă este cazul, o lupă de ordin superior (4.1.7) pentru a distinge coloniile de materiile străine.O colonie invadatoare este luată în calcul ca fiind una singură. Dacă acest tip de colonie acoperă mai puțin de un sfert din placă, se numără coloniile de pe partea neatinsă a plăcii și se calculează numărul corespunzător pentru întreaga placă. Dacă aceste colonii invadatoare acoperă mai mult de un sfert din placă, se elimină placa.8.   Calculul și exprimarea rezultatelor
   8.1.   Se vor folosi rezultatele plăcilor ce conțin între 10 și 300 de colonii (a se vedea punctele 8.3 și 8.4).8.2.   Se calculează numărul de microorganisme per mililitru de lapte pasteurizat cu ajutorul formulei următoare:
      unde
               ΣC
            
               este suma totală a coloniilor numărate conform punctului 8.1,
            
               (n1 + 0,1n2) d
            
               este egal cu volumul eșantionului inseminat, unde:
            
               n1
               
            
               este numărul de plăci numărate la prima diluare,
            
               n2
               
            
               este numărul de plăci numărate la a doua diluare,
            
               d
            
               este factorul de diluare cu ajutorul căruia s-au făcut primele numărători.
            Numărul se rotunjește la două cifre semnificative. Dacă cifra care trebuie rotunjită este 5, se rotunjește astfel încât cifra plasată imediat la stânga să fie pară.Exemplu:Diluție 10-2: 278 și 290 de coloniiDiluție 10-3: 33 și 28 de colonii
               Număr/ml
            
               
                  
            
                
            
               
                  
            
                
            
               = 28 590
            
                
            
               = 29 000
            
                
            
               = 2,9 × 104
               
            8.3.   Dacă toate inventarierile dau valori mai mici de 10, se va nota că numărul de microorganisme per mililitru este „mai mic de 10 x d”, „d” fiind inversul factorului de diluare celui mai slab.8.4.   Dacă toate inventarierile dau valori mai mari de 300 și dacă numărătoarea este posibilă, se face o estimare și se înmulțește cu inversul factorului de diluare. Rezultatul se exprimă indicându-se „număr estimat de microorganisme per mililitru”.9.   Fidelitatea
   Nu dispunem încă de rezultatele vreunor teste inelare recunoscute la nivel internațional.
      VI.   INVENTARIEREA COLIFORMILOR – METODA NUMĂRĂRII COLONIILOR OBȚINUTE LA 30°C1.   Obiectul și domeniul de aplicare
   Prezentul capitol descrie procedura de referință de inventariere a coliformilor din laptele pasteurizat prin tehnica numărării coloniilor la 30°C.2.   Definiție
   „Coliformi” reprezintă bacteriile care, la 30°C, formează colonii caracteristice sau colonii necaracteristice care fermentează lactoza cu producere de gaz în condițiile de operare descrise.3.   Principiu
   Amestecarea unui volum determinat din eșantionul de lapte cu mediul de cultură pe cutiile Petri puse la incubare la 30°C timp de 24 de ore. Numărarea coloniilor caracteristice și, dacă este cazul, confirmarea identității coloniilor necaracteristice verificând capacitatea lor de a fermenta lactoza. Apoi, calcularea numărului de coliformi per mililitru de lapte pasteurizat.4.   Aparatură și sticlărie de laborator
   Materialul obișnuit de laborator și, mai ales:4.1   Aparatură
   4.1.1.   Cuptor cu aer cald, reglabil la 170–175°C.4.1.2.   Autoclavă, reglabilă la 121 ± 1°C.4.1.3.   Etuvă, reglabilă la 30 ± 1°C.4.1.4.   pH-metru, cu corecție de temperatură, sensibil la unități pH de ordinul ± 0,1.4.1.5.   Baie de apă reglabilă la 45 ± 1°C.4.1.6.   Ansă din platină-iridiu sau din nichel-crom.4.2.   Sticlăria de laborator
   4.2.1.   Eprubete cu dopuri corespunzătoare și cu capacitate de aproximativ 20 ml, pentru a putea conține mediul de confirmare (5.2) și clopote Durham de dimensiuni care să permită utilizarea lor în aceste eprubete.4.2.2.   Baloane cu capacitate de la 150 la 250 ml pentru mediul selectiv solid (5.1).4.2.3.   Pipete din sticlă sau din material sintetic steril, neciobite, cu capacitate nominală de 1-10 ml, cu un orificiu de scurgere cu diametru între 1,75 și 3 mm.4.2.4.   Cutii Petri din sticlă sau material sintetic steril, transparent și incolor, fundul plăcilor având un diametru interior de aproximativ 90-100 de mm. Înălțimea interioară trebuie să fie de cel puțin 10 mm. Fundul nu trebuie să prezinte nici un fel de neregularități care ar putea stânjeni numărarea coloniilor.4.2.5.   Sterilizarea sticlăriei:
   Sticlăria de laborator trebuie sterilizată cu ajutorul uneia dintre următoarele metode:
               (a)
            
               în cuptorul cu aer cald (4.1.1), la o temperatură de 170 până la 175°C, timp de cel puțin o oră;
            
               (b)
            
               în autoclavă (4.1.2), la o temperatură de 121 ± 1°C, timp de cel puțin 20 de minute.
            În autoclavă trebuie luate toate măsurile de precauție pentru asigurarea unei penetrări adecvate a vaporilor; dacă materialul este sterilizat în recipiente, acestea nu trebuie să fie închise ermetic, dopurile sau capacele baloanelor sau flacoanelor nu trebuie să fie strânse.Se usucă sticlăria sterilizată în autoclavă pentru eliminarea tuturor vaporilor.Pipetele trebuie sterilizate în cuptorul cu aer cald (4.1.1).5.   Mediile de cultură
   5.1.   Geloză lactozată cu bilă și cristal violet sau roșu neutru (VRBL). Mediu selectiv solid.
      Compoziție:
   
               Peptonă
            
               7 g
            
               Extract de drojdie
            
               3 g
            
               Lactoză (C12H22O11 · H2O)
            
               10,0 g
            
               Clorură de sodiu (NaCl)
            
               5 g
            
               Săruri biliare
            
               1,5 g
            
               Roșu neutru
            
               0,03 g
            
               Cristal violet
            
               0,002 g
            
               Agar-agar
            
               10-15 g (în funcție de proprietățile gelifiante ale agar-agarului)
            
               Apă
            
               1 000 ml
            
      Mod de preparare:
   Se aduce în stare de suspensie, dizolvându-se compușii în apă și lăsându-se să se odihnească timp de câteva minute. Se amestecă apoi energic.Se verifică pH-ul cu ajutorul unui pH-metru (4.1.4); dacă este necesar, se ajustează pH-ul cu ajutorul unei soluții (cel puțin 0,1 mol/l) de hidroxid de sodiu sau de acid clorhidric astfel încât, după fierbere, pH-ul să fie de 7,4 ± 0,1 la o temperatură de 25°C.Se aduce rapid la starea de fierbere agitându-se din când în când și se repartizează imediat mediul în cantități de 100 până la 150 ml în baloane sterile (4.2.2). Se răcește mediul la 45 ± 1°C într-o baie de apă (4.1.5).Sterilitatea mediului trebuie verificată în momentul utilizării (a se vedea punctul 6.4).Mediul se folosește imediat, în primele trei ore de la prepararea sa.5.2.   Bulion lactozat cu bilă și verde strălucitor. Mediul de confirmare.
      Compoziție:
   
               Peptonă
            
               10 g
            
               Lactoză (C12H22O11 · H2O)
            
               10 g
            
               Bilă de vită deshidratată
            
               20 g
            
               Verde strălucitor
            
               0,0133 g
            
               Apă
            
               1 000 ml
            
      Mod de preparare:
   Se dizolvă compușii în apa adusă la starea de fierbere.Se verifică pH-ul cu ajutorul unui pH-metru (4.1.4) și, dacă este necesar, se ajustează pH-ul cu ajutorul unei soluții (cel puțin 0,1 mol/l) de hidroxid de sodiu sau de acid clorhidric astfel ca, după sterilizare, să fie de 7,2 ± 0,1 la o temperatură de 25°C.Se repartizează mediul, în cantități de câte 10 ml, în eprubetele (4.2.1) cu clopote Durham (4.2.1). Se astupă eprubetele.Se sterilizează în autoclavă (4.1.2) la 121 ± 1°C timp de 15 minute.Clopotele Durham nu au voie să conțină bule de aer după sterilizare.Se verifică pH-ul mediului.Dacă mediul nu este utilizat imediat, se păstrează la adăpost de lumină, la o temperatură între 0 și 5°C, timp de cel mult o lună de la preparare.5.3.   Medii de cultură complete deshidratate disponibile pe piață
   Mediile de cultură (punctele 5.1, 5.2) pot fi preparate cu ajutorul unor medii complete deshidratate disponibile pe piață. Se vor urma indicațiile producătorului. Se ajustează pH-ul, se repartizează, se fierbe sau se sterilizează și se conservă mediile conform indicațiilor de la punctele 5.1 și 5.2.6.   Mod de operare
   6.1.   Mediul
   Se folosește mediul [geloză (VRBL)] descris la punctul 5.1.6.2.   Pregătirea eșantionului de lapte
   Se agită energic eșantionul de lapte pentru a se obține o repartizare cât mai omogenă a microorganismelor, întorcându-se rapid, de 25 de ori, recipientul cu eșantionul. Trebuie evitată formarea spumei sau lăsată spuma să se disperseze. Timpul scurs între omogenizare și prelevarea probei nu trebuie să depășească 3 minute.6.3.   Inseminarea cutiilor Petri
   Se inseminează 3 ml de eșantion de lapte (6.2) transferându-se, cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.3), 1 ml de eșantion pe fiecare dintre cele trei plăci (4.2.4).6.4.   Turnarea mediului
   Se toarnă geloza VRBL (6.1) pe fiecare placă inseminată în cantități de cca 12 ml.Se omogenizează imediat geloza prin rotirea cutiilor Petri pentru a se obține o repartizare uniformă a coloniilor după incubare.Timpul scurs între finalizarea pregătirii eșantionului și omogenizarea probei cu mediul nu trebuie să depășească 15 minute.Pentru controlul sterilității, se pregătește o placă martor cu 12 ml de geloză VRBL utilizată pentru plăcile inseminate.Se lasă să se odihnească pe o suprafață orizontală rece și curată până la solidificarea mediului.După solidificarea completă a mediului, se toarnă 4 ml de geloză VRBL (punctul 6.1) pe suprafața mediului inseminat.Se lasă să se solidifice.6.5.   Incubarea cutiilor Petri
   Se introduc plăcile în etuvă (4.1.3). Se incubează plăcile răsturnate. Nu trebuie așezate mai mult de șase una peste cealaltă. Plăcile nu trebuie să se atingă între ele și nici să fie în contact cu pereții sau cu partea superioară a etuvei.Se incubează la 30 ± 1°C timp de 24 ± 2 ore.6.6.   Numărarea coloniilor
   6.6.1.   Se numără coloniile de pe cutiile Petri cu cel mult 150 de colonii. Se vor număra coloniile roșu închis cu un diametru de cel puțin 0,5 mm, cu sau fără precipitat în jur, caracteristice coliformilor.6.6.2.   Dacă toate sau câteva dintre colonii au un aspect necaracteristic (diferență de culoare, de mărime sau de formare a precipitatului față de coloniile tipice), se aplică testul de confirmare (6.7).6.7.   Testul de confirmare
   Conform indicațiilor date la punctul 6.6.2, testul de confirmare se aplică pe un număr potrivit de colonii (de exemplu între 3 și 5) necaracteristice, inseminându-le în eprubete cu bulion lactozat cu bilă și verde strălucitor (5.2) cu ajutorul unei anse cu buclă (4.1.6). Se incubează eprubetele la 30 ± 1°C timp de 24 ± 2 ore.Coloniile care produc gaz în clopotele Durham vor fi considerate coliformi.7.   Calculul și exprimarea rezultatelor
   7.1.   Se vor reține pentru numărare (a se vedea punctul 7.4) plăcile cu cel mult 150 de colonii.7.2.   Dacă este nevoie de un test de confirmare, se calculează numărul de colonii de coliformi cu ajutorul procentajului de colonii de coliformi confirmat.7.3.   Se calculează numărul de coliformi per ml de lapte pasteurizat cu ajutorul următoarei formule:
      unde:
               ∑C
            
               este suma totală de colonii de coliformi (punctul 7.1 în relație cu punctul 7.3) găsite la analiza eșantionului de lapte (3 ml);
            
               n
            
               este numărul de mililitri de eșantion analizat (6.3) (3 ml).
            Numărul se rotunjește la două cifre semnificative dacă există mai mult de 100 de colonii. Dacă cifra care trebuie rotunjită este 5, se rotunjește astfel ca prima cifră de la stânga să fie pară.Dacă toate inventarierile dau rezultate mai mari de 150 de colonii, rezultatul se exprimă indicându-se „numărul estimat de coliformi pe ml”.8.   Fidelitatea
   Nu dispunem încă de nici un rezultat al testelor inelare recunoscute la nivel internațional.
      VII.   INVENTARIEREA CELULELOR SOMATICEPrezentul capitol descrie două proceduri de referință în inventarierea celulelor somatice:
               A.
            
               Procedeul microscopic
            
               B.
            
               Procedeul fluoro-opto-electronic
            A.   
         Procedeul microscopic
      
   1.   Obiectul și domeniul de aplicare
   Prezenta normă descrie procedeul de referință al inventarierii celulelor somatice din laptele crud.Prezenta normă descrie procedeul de inventariere a numărului „efectiv” de celule somatice dintr-un eșantion de lapte pentru etalonarea și verificarea preciziei procedeului fluoro-opto-electronic (a se vedea litera B punctul 1).2.   Definiție
   În cazul prezentului procedeu, celule somatice reprezintă celulele (de exemplu leucocitele și celulele epiteliale) al căror nucleu poate fi colorat diferit de albastrul de metilen.3.   Principiu
   Etalarea a 0,01 ml de lapte pe o suprafață de 1 cm2 a unei lame port-obiect. Pelicula de lapte este uscată și colorată. Numărarea se efectuează cu ajutorul unui microscop. Numărul celulelor somatice inventariate pentru o suprafață determinată se înmulțește cu un factor de multiplicare pentru a se obține numărul de celule pe ml.4.   Reactivi
   Produsele chimice trebuie să fie de calitate analitică.
      Soluția colorantă:
   Compoziție:
               Albastru de metilen
            
               0,6 g
            
               Etanol – 99 %
            
               54 ml
            
               1,1,1-triclor-etan sau tetraclor-etan
            
               40 ml
            
               Acid acetic glacial
            
               6 ml
            
      Atenție!
   Tetraclor-etanul fiind toxic, manipulările trebuie să se facă sub o hotă de aspirație.Mod de preparare:Se amestecă etanolul și 1,1,1-triclor-etanul sau tetraclor-etanul într-o eprubetă și se încălzesc într-o baie de apă la 60-70°C. Se adaugă albastrul de metilen, se amestecă cu grijă, se răcește în frigider la 4°C timp de 12 până la 24 de ore, apoi se adaugă acidul acetic glacial. Se filtrează cu un filtru de porozitate maximă de 10-12 microni și se păstrează soluția colorantă într-o eprubetă etanșă. În caz de formare a particulelor de sedimente, se filtrează din nou înainte de utilizare.5.   Aparatură și sticlărie de laborator
   5.1.   Microscop care mărește de 500 până la 1 000 de ori.5.2.   Microseringă care permite repartizarea cantităților de 0,01 ml cu o precizie de minimum 2 %.5.3.   Lamă port-obiect pentru etalonarea peliculei cu dreptunghi gradat de 20 mm x 5 mm sau lamă standard cu gabarit de 20 mm × 5 mm.5.4.   Placă încălzitoare orizontală (30–50°C) pentru uscarea lamelor.5.5.   Ventilator (tip uscător de păr) pentru uscarea peliculei.5.6.   Baie de apă, reglabilă la 30–40°C pentru încălzirea eșantionului de lapte.5.7.   Micrometru obiectiv gradat la 1/100 mm.6.   Mod de operare
   6.1.   Eșantionul de lapte
   Eșantionul de lapte trebuie să fie analizat în primele șase ore după prelevare. În timpul depozitării, temperatura eșantionului nu trebuie să depășească 6°C. A se evita congelarea.6.2.   Pregătirea eșantionului în laborator
   Se încălzește eșantionul într-o baie de apă (5.6) la 30-40°C, apoi se amestecă cu grijă. Se răcește la temperatura de etalonare a microseringii (5.2), de exemplu 20°C.6.3.   Pregătirea lamelor
   Se curăță lamele (5.3) cu etanol, de exemplu, se șterg cu ajutorul unei bucăți de hârtie care nu lasă urme, se flambează și se lasă să se răcească. Se conservă într-o cutie, la adăpost de praf.6.4.   Pregătirea peliculei
   Cu ajutorul microseringii (5.2) se prelevează 0,01 ml din eșantionul de lapte pregătit după instrucțiunile de mai sus. Se curăță cu grijă partea exterioară a seringii care intră în contact cu laptele. Conținutul seringii se depune pe lamă (5.3), după ce s-au delimitat cu atenție contururile dreptunghiului (20 mm × 5 mm). Se repartizează apoi pelicula cât mai uniform posibil pe această suprafață. Se lasă să se usuce pelicula pe o placă încălzitoare orizontală (5.4) până la uscarea completă.Se pregătesc pentru analiză cel puțin două pelicule din fiecare eșantion.6.5.   Colorarea peliculelor
   Se introduc într-o soluție colorantă (4) timp de 10 minute. Se usucă, eventual cu ajutorul unui ventilator (5.5). Se scufundă peliculele în apă până la eliminarea completă a surplusului de colorant. Se usucă din nou și se păstrează la adăpost de praf.6.6.   Etalonarea câmpului microscopic
   În funcție de puterea de mărire aleasă (de 500–1 000 de ori), se măsoară cu ajutorul micrometrului obiectiv (5.7) diametrul câmpului microscopic.7.   Numărarea și calcularea
   7.1.   Inventarierea celulelor
   Se utilizează un microscop (5.1). În locul inventarierii celulelor, se inventariază doar nucleele acestora, ușor de recunoscut și vizibile în proporție de cel puțin 50 % în câmpul microscopic. Se numără benzile sau câmpurile aflate în treimea centrală a peliculei, evitându-se numărarea benzilor sau a câmpurilor alese exclusiv din zonele periferice ale peliculei. Măsurile de precauție la pregătirea peliculelor și deci fidelitatea rezultatelor trebuie verificate cel puțin o dată pe lună, numărându-se părți diferite din peliculă. Inventarierea se poate face și prin numărarea câmpurilor microscopice repartizate în așa fel încât toate părțile peliculei să fie reprezentate în mod echivalent.7.2.   Determinarea numărului minim de celule de numărat
   Dat fiind faptul că inventarierea microscopică a celulelor somatice poate fi utilizată și pentru etalonarea tehnicilor de numărare mecanică și automată, coeficientul de variație al numărărilor pe eșantioane identice nu trebuie să fie mai mare decât cel obținut cu aparatele electronice. Coeficientul de variație pentru un eșantion de lapte care conține de la 400 000 la 600 000 de celule pe ml nu trebuie să depășească 5 %.După legea distribuției lui Poisson, pentru a se obține această repetabilitate, numărul celulelor somatice de inventariat în fiecare eșantion nu trebuie să fie mai mic de 400.După legea distribuției lui Poisson,M = V = s2,unde
               M
            
               este valoarea mediei aritmetice,
            
               V
            
               este varianța
            și
               s
            
               este abaterea standard.
            Coeficientul variației este:
      sausauM (media) reprezintă numărul de particule (celule) care au fost inventariate (de exemplu, 400 pentru CV = 5 %).7.3.   Calculul factorului de multiplicare
   Folosindu-se 0,01 ml de lapte, factorul de multiplicare se calculează conform punctelor 7.3.1 sau 7.3.2.7.3.1.   Numărarea benzilor în peliculă
   Lungimea benzilor de inventariat este de 5 mm, adică exact lățimea peliculei. Lățimea benzilor corespunde în schimb diametrului câmpului microscopic, determinat cu micrometrul obiectiv (5.7).
      unde:
               d
            
               este diametrul în milimetri al câmpului microscopic, determinat cu micrometrul obiectiv (5.7).
            
               b
            
               este numărul total al benzilor numărate.
            7.3.2.   Numărarea câmpurilor microscopice în treimea centrală a peliculei sau cu ajutorul unei grile:
   
      unde
               d
            
               reprezintă diametrul în milimetri al câmpului microscopic determinat cu micrometrul obiectiv (5.7);
            
               s
            
               reprezintă numărul câmpurilor numărate.
            7.4.   Calcularea conținutului de celule
   Numărul celulelor somatice inventariate (punctele 7.1 și 7.2) se înmulțește cu factorul de multiplicare (7.3), pentru a se obține numărul de celule pe ml de lapte.7.5.   Precizia
   Coeficientul de variație al repetabilității (a se vedea punctul 7.2) nu trebuie să depășească 5 %.Nu dispunem încă de rezultatele nici unui test inelar al preciziei recunoscut internațional.B.   
         Procedeul fluoro-opto-electronic
      
   1.   Obiectul și domeniul de aplicare
   Prezenta normă descrie procedeul oficial care, după o etalonare adecvată (a se vedea litera A punctul 1), poate fi utilizat pentru inventarierea celulelor somatice din laptele crud – cu sau fără adăugare de conservanți chimici.2.   Definiție
   În cadrul acestui procedeu, celulele somatice sunt particule cu intensitate de fluorescență minimă datorată colorării ADN-ului celular.3.   Principiu
   Un volum de eșantion (de exemplu, 0,2 ml) se amestecă în mod corespunzător cu soluția tampon și cu soluția fluorescentă. O parte din acest amestec este apoi transferată sub forma unei pelicule subțiri pe un disc rotativ cu rol de port-obiect.Fiecare celulă produce un impuls electric care este amplificat și înregistrat. Numărul celulelor somatice este înregistrat în mii pe ml.4.   Reactivi
   În afara indicațiilor contrare, nu se utilizează decât produse chimice de calitate analitică. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau deionizată sau apă de o puritate echivalentă.4.1.   Soluția tampon
   
      Compoziție:
   
               Hidrogenoftalat de potasiu
            
               51,0 g
            
               Hidroxid de potasiu
            
               13,75 g
            
               Polietilenglicol-mono-p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenil-eter (de exemplu, triton X-100), 1 % volum
            
               10,0 ml
            
               pH 5,7–5,9. Se completează cu apă distilată până la 10 000 ml.
            
                
            
      Mod de preparare:
   Se amestecă diferitele componente. Soluția se păstrează într-un recipient etanș, dar nu mai mult de 7 zile.4.2.   Soluția fluorescentă (soluția mamă)
   
      Compoziție:
   
               Bromură de etidiu
            
               1,0 g
            Se completează până la 1 000 ml cu apă.
      Mod de preparare:
   Se dizolvă bromura de etidiu în apă. Soluția se păstrează într-un recipient etanș, ferit de lumină, dar nu mai mult de 2 luni.4.3.   Soluția fluorescentă (soluție pentru analiză)
   Se amestecă 20 ml din soluția mamă (4.2) cu soluția tampon (4.1), astfel încât să se obțină 1 000 ml. Soluția pentru analiză nu trebuie să fie utilizată mai mult de 7 zile.4.4.   Soluția de spălare
   
      Compoziție:
   
               Soluție tampon (4.1)
            
               10,0 ml
            
               Polietilenglicol-mono-p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenil-eter (de exemplu, triton X-100), 1 % volum
            
               10,0 ml
            
               Amoniac, cu 25 % volum
            
               25,0 ml
            Se completează cu apă până la 10 000 ml.
      Mod de preparare:
   Se amestecă diferitele componente. A nu se păstra mai mult de 30 de zile.5.   Aparatură și sticlărie de laborator
   5.1.   Contor care funcționează după principiul fluorescenței optice.NotăÎnainte de folosire, se etalonează instrumentul. Astfel se determină relația dintre volumul particulelor de inventariat și pragul limită de la care se aplică inventarierile. Etalonarea aparatului se efectuează urmându-se instrucțiunile producătorului, utilizându-se eșantioane al căror conținut de celule a fost determinat prin metoda microscopică (litera A).5.2.   Baia de apă, cu circulație, reglabilă la 40 ± 1 oC.5.3.   Eprubetă, cu capac potrivit, de aproximativ 15 ml.6.   Eșantionul de lapte
   6.1   Eșantionul trebuie păstrat într-o eprubetă (5.3), la temperatură joasă. Dacă eșantionul nu conține conservant chimic, inventarierea nu trebuie efectuată în timpul primelor 24 de ore de după muls, dat fiind faptul că conținutul de germeni ar fi prea scăzut. Temperatura de conservare nu trebuie să depășească 6°C.6.2.   Adăugarea conservanților
   Conservarea chimică trebuie realizată în primele 24 de ore. Adăugarea de conservanți trebuie efectuată cât mai repede posibil după prelevarea eșantionului.6.2.1.   Conservarea chimică a eșantionului se face prin adăugarea unuia dintre următorii conservanți:
               —
            
               acid ortoboric:
               concentrația finală a acidului ortoboric din eșantion nu trebuie să depășească 0,6 g/100 ml. Eșantionul conservat astfel poate fi păstrat încă 24 de ore, la 6-12°C;
            
               —
            
               dicromat de potasiu:
               concentrația finală a dicromatului de potasiu nu trebuie să depășească 0,2 g/100 ml. Eșantionul conservat astfel poate fi păstrat încă 72 de ore, la 6-12°C;
            
               —
            
               azidă de sodiu:
               eșantionul poate fi conservat cu azidă de sodiu la o concentrație finală de 0,024 g/100 ml, cu condiția ca acesta să fie răcit la o temperatură de 6-12°C imediat după prelevare și numărat în primele 48 de ore de după prelevare;
            
               —
            
               bronopol:
               eșantionul poate fi conservat cu bronopol la o concentrație finală de 0,05 g/100 ml, cu condiția ca acesta să fie răcit la 6-12°C imediat după prelevare și numărat în primele 72 de ore după prelevare.
            6.2.2.   Un eșantion deja conservat cu ajutorul acidului ortoboric poate fi conservat încă 48 de ore, prin adăugare de dicromat de potasiu.NotăPentru eșantioanele conservate cu ajutorul dicromatului de potasiu, se vor respecta normele locale privitoare la evacuarea deșeurilor.7.   Mod de operare
   7.1.   Pregătirea eșantionului
   Laptele de analizat trebuie conservat după muls timp de cel puțin 24 de ore la aproximativ 2-6°C. Nu se recomandă numărarea eșantioanelor în ziua mulsului, fără tratare prealabilă, întrucât rezultatele riscă să fie prea slabe. Dacă totuși trebuie efectuată numărarea, eșantionul trebuie pretratat timp de cel puțin trei ore cu ajutorul dicromatului de potasiu (a se vedea punctul 6.2.1).7.2.   Mod de preparare
   Se încălzește eșantionul pretratat (a se vedea punctul 7.1) sau eșantionul netratat ținut cel puțin o zi în baia de apă (5.2) la aproximativ 40°C. Se conservă apoi eșantionul la temperatura ambiantă până în momentul numărării.7.3.   Numărarea celulelor
   Se trece la numărare cu ajutorul contorului (5.1) în primele 15 minute după finalizarea încălzirii (a se vedea punctul 7.2). Chiar înainte de numărare, se amestecă bine eșantioanele pentru a se obține o repartizare cât mai omogenă a celulelor somatice.Ulterior, diluarea și prepararea eșantionului trebuie să se facă automat în contor.8.   Fidelitate
   Nu dispunem de valori ale repetabilității (r) și reproductibilității (R) provenite din teste inelare recunoscute la nivel internațional. Pe viitor, criteriile de fidelitate vor fi stabilite de un laborator de referință în numărarea celulelor, însărcinat cu organizarea și evaluarea regulată de teste inelare.Datele disponibile la scară națională permit folosirea estimărilor următoare:
               1)
            
               numărul de celule cuprins între 400 000 și 500 000/ml
               
                           —
                        
                           abaterea standard referitoare la repetabilitate:
                           sr = 20 000 celule/ml
                           (adică un coeficient de variație de 5 %-4 %),
                        
                           —
                        
                           abaterea standard referitoare la reproductibilitate:
                           sR = 40 000 celule/ml
                           (adică un coeficient de variație de 10 %-8 %).
                        9.   Control de precizie
   Controlul de precizie se face cu ajutorul eșantioanelor cu un conținut de celule cunoscut, determinat printr-o numărare microscopică a celulelor într-un laborator național de referință.
      VIII.   DETECTAREA ANTIBIOTICELOR ȘI A SULFAMIDELOROBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICAREPrezentul capitol descrie procedeul de referință în detectarea antibioticelor și a sulfamidelor din laptele crud și din laptele tratat termic.Procedeul de referință presupune:
               A.
            
               Un procedeu calitativ
               Acest procedeu inițial permite selecționarea eșantioanelor de lapte care conțin antibiotice și sulfamide. Procedeul descris în continuare este unul dintre procedeele bazate pe folosirea unei tulpini de Bacillus stearothermophilus, varietatea calidolactis, ATCC 10 149 ca organism de probă. Acest procedeu a fost ales ca fiind reprezentativ pentru respectivele teste de detectare.
            
               B.
            
               Un procedeu de confirmare și de identificare a penicilinei
               Acest procedeu trebuie folosit pentru confirmarea rezultatelor „metodei A”, pentru identificarea penicilinei și determinarea concentrației.
            A.   
         Procedeul calitativ
      
   1.   Obiectul și domeniul de aplicare
   Prezenta normă descrie tehnica detectării calitative a antibioticelor și a sulfamidelor din laptele crud și din laptele tratat termic în concentrație superioară limitelor menționate în tabelul de mai jos:Concentrații decelabile ale diferitelor antibiotice și sulfamide (1)
   
                
            
               Limita de detectare
            
               Negativă
            
               Pozitivă
            
               Benzilpenicilină
            
               0,002
            
               0,006
            
               Ampicilină
            
               0,002
            
               0,005
            
               Cloxacilină
            
               0,015
            
               0,035
            
               Nafcilină
            
               0,006
            
               0,011
            
               Tetraciclină HCL
            
               0,10
            
               0,40
            
               Oxitetraciclină
            
               0,20
            
               0,45
            
               Clortetraciclină
            
               0,15
            
               0,50
            
               Cloramfenicol
            
               7
            
               15
            
               Dihidrostreptomicină
            
               4
            
               13
            
               Neomicină
            
               1
            
               22
            
               Kanamicină
            
               9
            
               28
            
               Bacitracină
            
               0,06
            
               0,14
            
               Eritromicină
            
               1
            
               2,25
            
               Rifamicină
            
               0,01
            
               0,14
            
               Diafenilsulfonă
            
               0,01
            
               0,1
            
               Sulfametazină
            
               0,5
            
               1
            2.   Definiție
   Dacă culoarea mediului rămâne neschimbată, atunci laptele conține antibiotice sau sulfamide (a se vedea punctul 7.1).3.   Principiu
   Adăugarea eșantionului de lapte și a amestecului nutritiv într-o geloză care conține un indicator de pH și spori de Bacillus stearothermophilus, varietatea calidolactis, ATCC 10 149 (a se vedea punctul 5.4.1), tulpină având în general o foarte bună sensibilitate, mai ales la penicilină. Creșterea normală și producția de acid a acestui organism după incubație produce o schimbare de culoare a indicatorului de pH, care trece de la roșu-închis la galben. Dacă laptele conține substanțe inhibante pentru creșterea organismului de probă, culoarea indicatorului de pH rămâne roșu-închis.4.   Aparatură și sticlărie de laborator
   Material obișnuit de laborator și, mai ales:4.1.   Aparatură
   4.1.1.   Etuvă reglabilă la 64 ± 1°C.4.1.2.   Baie de apă reglabilă la 64 ± 1°C.4.1.3.   Stativ pentru eprubete sau fiole.4.1.4.   Seringi de unică folosință permițând prelevarea și repartizarea a 0,1 ml.4.1.5.   Pensă.
   4.1.6.   Cuptor cu aer cald reglabil la 170-175°C.4.1.7.   Autoclavă reglabilă la 121 ± 1°C.4.1.8.   pH-metru.
   4.2.   Sticlărie de laborator
   4.2.1.   Flacoane pentru eșantioane cu capac adecvat.NotăAnumite dopuri din cauciuc pot depune substanțe inhibante la gura flaconului.4.2.2.   Cutiile Petri din material sintetic steril sau din sticlă incoloră transparentă, având un diametru interior minim de aproximativ 140 mm, cu fund perfect plat.4.2.3.   Flacoane cu o capacitate de 250 ml.4.2.4.   Pipete (astupate cu vată) din sticlă sau din material sintetic steril, cu capacitate nominală de 1 ml și de 10 ml.4.2.5.   Spatule de sticlă.
   4.2.6.   Eprubete sau fiole cu capac sau dop și un diametru interior de aproximativ 8 mm.4.2.7.   Sterilizarea sticlăriei de laborator
   Sticlăria trebuie sterilizată cu ajutorul uneia dintre următoarele metode:
               (a)
            
               în cuptorul cu aer cald, la o temperatură de 170-175°C, timp de cel puțin o oră (4.1.6);
            
               (b)
            
               în autoclavă, la o temperatură de 121°C, timp de cel puțin 20 de minute (4.1.7).
            În autoclavă, trebuie luate toate precauțiile pentru o penetrare adecvată a vaporilor; dacă materialul este sterilizat în recipiente, acestea nu trebuie închise ermetic, dopurile sau capacele fiolelor sau ale flacoanelor trebuie să fie desfăcute.Sticlăria sterilizată se usucă în autoclavă, pentru a se elimina vaporii.Se sterilizează pipetele în cuptorul cu aer cald.5.   Medii, soluții, organism de probă
   Componentele de bază ale mediilor trebuie să fie corespunzătoare analizelor bacteriologice. Apa folosită trebuie să fie apă distilată sau apă demineralizată de puritate echivalentă și nu trebuie să conțină substanțe care ar putea inhiba creșterea organismului de probă.5.1.   Medii
   5.1.1.   Geloză nutritivă
   Compoziție
               Extract de drojdie
            
               2 g
            
               Peptonă
            
               5 g
            
               Extract de carne
            
               1 g
            
               Clorură de sodiu
            
               5 g
            
               Geloză
            
               10–15 g
            
               Apă distilată
            
               1 000 ml
            Mod de preparareSe dizolvă componentele în apă. Se fierbe, amestecându-se din când în când. Se reglează pH-ul în așa fel încât, după sterilizare, acesta să fie 7,4 ± 0,1 la 25°C.Se repartizează câte 10 ml în fiecare eprubetă sau câte 100 ml în flacoane și se înclină până se obține o pantă.Se sterilizează la 121°C timp de 15 minute.5.1.2.   Mediu de geloză
   Compoziție
               Clorură de sodiu
            
               2 g
            
               Geloză
            
               15 g
            
               Apă
            
               1 000 ml
            
               Soluție de trimetoprim sau de tetroxoprim (a se vedea punctul 5.1.3) (2)
               
            
               10 ml
            Mod de preparareSe dizolvă componentele, cu excepția trimetoprimului sau a tetroxoprimului, în apă. Se aduce în stare de fierbere amestecând din când în când. Se adaugă trimetoprim sau tetroxoprim și se sterilizează la 121 ± 1°C timp de 15 minute. Se reglează pH-ul în așa fel încât, după sterilizare, acesta să fie 7,0 ± 0,1 la 25°C.5.1.3.   Soluția de trimetoprim sau de tetroxoprim
   Compoziție
               Trimetoprim
            
               5 mg
            
               sau tetroxoprim
            
               30 mg
            
               Etanol 96 %
            
               5 ml sau 30 ml
            
               Apă
            
               câte 1 000 ml
            Mod de preparareSe dizolvă trimetoprimul sau tetroxoprimul (5 sau 30 ml) în etanol și se completează cu apa.5.1.4.   Amestec nutritiv
   Compoziție
               Extract de drojdie
            
               0,75 mg
            
               Glucoză
            
               5,0 mg
            
               Amidon solubil
            
               8,0 mg
            
               Roșu de bromcrezol
            
               0,025 g
            
               Apăcâte
            
               50 ml
            Mod de preparareSe dizolvă amestecul nutritiv și indicatorul în apă încălzindu-se dacă este necesar și se sterilizează prin filtrare. Amestecul nutritiv se vinde pe piață sub formă de comprimate.5.2.   Soluții etalon de penicilină
   5.2.1.   Se prepară, în flaconul cu capac adecvat, o soluție de penicilină de 60 mg/ml = (100 UL/ml) prin dizolvarea benzilpenicilinatului de sodiu sau de potasiu în apa distilată sterilă.5.2.2.   Se prepară o soluție diluată de penicilină prin adăugarea a 1,25 ml de soluție de penicilină (5.2.1) în apă distilată sterilă și se completează până la 1 000 ml. Această soluție diluată conține 0,075 mg de penicilină/ml (= 0,125 UL de penicilină/ml).5.2.3.   Se prepară 75 ml de soluție etalon de penicilină care conține 0,004 mg de penicilină/ml (= 0,0067 UL de penicilină/ml), adăugându-se 4 ml de soluție diluată de penicilină (5.2.2) la 71 ml de lapte lipsit de substanțe inhibante (5.3) și se amestecă.5.2.4.   Soluțiile de penicilină descrise la punctele 5.2.1 la 5.2.3 trebuie preparate pe loc.5.3.   Laptele fără substanțe inhibante
   Se prepară un lapte martor fără substanțe inhibante, dizolvând, în apa distilată sterilă, lapte praf degresat (10 % m/v) în care s-a verificat în prealabil absența substanțelor inhibante. Se poate, de asemenea, folosi o cantitate adecvată de lapte proaspăt omogenizat în care s-a verificat absența substanțelor inhibante; acest lapte va fi repartizat în flacoane, încălzit timp de o oră la 100°C apoi păstrat în frigider, la 0-6 °C, timp de maximum o săptămână.5.4.   Organismul de probă
   5.4.1.   Bacillus stearothermophilus, varietatea calidolactis, tulpina ATCC 10149 este folosit ca organism de probă. Tulpina ATCC 10 149 este identică cu tulpina C 953.5.4.2.   Se pregătește o cultură de rezervă pornindu-se de la tulpina de probă pentru a se conserva tulpina. Conservarea se efectuează pe geloză nutritivă înclinată (5.1.1). Gelatina înclinată este inseminată în striuri cu ajutorul unei anse îmbibate cu tulpina de probă, apoi este incubată în aerobioză timp de 48 de ore la 63 ± 1°C. După incubare, se închide ermetic eprubeta cu ajutorul unui dop de cauciuc steril. Cultura de rezervă astfel obținută poate fi conservată mai multe luni în frigider, la 5°C.5.5.   Cultura de probă (suspensie de spori)
   5.5.1.   Se varsă aseptic 20 ml de geloză nutritivă topită (5.1.1) pe o cutie Petri sterilă (4.2.2) și se lasă să se răcească la temperatura ambiantă.5.5.2.   Cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.4), se transferă 5 ml de apă distilată sterilă în eprubeta cu cultura de rezervă (5.4.2) și se recuperează prin spălare sporii de pe gelatina înclinată, cu ajutorul unei anse sterile. Suspensia de spori se conservă la 5°C și se folosește în următoarele 36 de ore.5.5.3.   Cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.4), se transferă 0,5 ml din suspensia de spori (5.5.2) pe o placă cu mediul (5.5.1) și se etalează cu grijă inoculumul pe toată suprafața cu o spatulă de sticlă. Se incubează la 63 ± 1°C (4.1.1) timp de 16–18 ore.Dacă se folosește o cultură de rezervă (5.4.2) sau o cultură mai veche de 36 de ore, tehnica de repicare se va face de cel puțin două ori, cu un interval de maximum 36 de ore între fiecare subcultură.5.5.4.   Se transferă, cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.4), 10 ml de apă distilată în cutia cu cultura (5.5.3) și se elimină sporii în suspensie de la suprafață cu ajutorul unei baghete de sticlă.Se transferă suspensia de spori (4.2.3) într-un flacon (5.2.3) cu 250 ml de apă distilată sterilă. Se închide flaconul și se agită puternic. Culturile care nu se recoltează imediat trebuie să fie conservate la frigider, la 0-6 °C.5.5.5.   Suspensia de spori inseminată pe mediul gelatinat (5.1.2) fără trimetoprim trebuie să prezinte un număr de germeni viabili cuprins între 5 și 10 milioane pe ml după incubație la 63 ± 1°C timp de 16–18 ore. Suspensia de spori trebuie să fie uniform de tulbure și, dacă nu conține fulgi sau un sediment, trebuie înlocuită cu o nouă suspensie, preparată din cultura de rezervă (5.4.2).5.6.   Pregătirea eprubetelor
   5.6.1.   Se topește mediul gelatinat (5.1.2), apoi se răcește la 55°C.5.6.2.   Se amestecă o parte din suspensia de spori proaspeți (5.5.4) cu cinci părți de mediu gelatinat (5.6.1) într-o eprubetă sau într-un flacon; se amestecă cu grijă.5.6.3.   Se transferă într-o eprubetă sau într-o fiolă sterilă (5.6.2) 0,3 ml de mediu inseminat (4.2.6) calculat pentru a obține un strat uniform, cu o grosime de 5 mm, apoi se închide eprubeta cu un dop sau un capac și, pentru fiolă, se închide extremitatea la flacără. Se lasă să se solidifice mediul gelatinat, apoi eprubetele se țin în poziție verticală timp de cel puțin 12 ore.5.6.4.   Eprubetele pot fi folosite în aceeași zi sau se pot păstra timp de mai multe luni, la 0-6 °C, cu condiția să fie răcite imediat după preparare.6.   Mod de operare
   6.1.   Eșantioanele trebuie analizate cât mai curând posibil, de preferință în decursul primelor 24 de ore de la prelevare; între timp, ele trebuie conservate la 0-5 °C. Dacă nu este posibilă analiza eșantioanelor în cele 24 de ore, acestea se păstrează la congelator (între -30° și -15°) pentru a se reduce la minim inactivarea penicilinei.6.2.   Fiecare eprubetă sau fiolă (5.6) trebuie să aibă o etichetă lizibilă și care nu se șterge. Se ridică capacul sau dopul. Se pun pe un suport (4.1.3) numărul cerut de recipiente pentru analiza eșantioanelor și a martorilor (punctele 5.2 și 5.3).6.3.   Se adaugă 50 de microlitri din amestecul nutritiv (5.1.4) în fiecare eprubetă sau fiolă.6.4.   Se amestecă cu atenție eșantionul de lapte pentru analiză și se transferă, cu ajutorul seringii (4.1.4), 0,1 ml în eprubeta sau fiola etichetată. Se utilizează câte un capac de unică folosință pentru transferarea fiecărui eșantion.6.5.   După metoda descrisă la punctul 6.4, se prepară 2 martori din soluția etalon de penicilină ce conține 0,004 g/ml (= 0,0067 UL/ml) de penicilină.6.6.   După metoda descrisă la punctul 6.4, se prepară 2 martori din laptele martor fără substanțe inhibante (5.3).6.7.   Se închid eprubetele/fiolele și se pun pe stativul cu eprubete/fiole, într-o baie de apă la 63 ± 1°C (4.1.2), timp de cel puțin 2 ½ - 2 ¾ ore.6.8.   Se scoate stativul cu eprubete/fiole din baia de apă.6.9.   Se studiază culoarea mediului gelatinat (a se vedea punctul 7).7.   Interpretarea rezultatelor
   7.1.   O colorație roșiatică a mediului gelatinat din eprubetele/fiolele cu soluția etalon de penicilină sau cu eșantionul de lapte indică prezența antibioticelor sau a sulfamidelor (aproximativ) la nivelul „pozitiv” specificat în tabelul de la pagina 39. Sensibilitatea mediului este satisfăcătoare dacă colorația eprubetelor/fiolelor cu soluția etalon de penicilină (6.5) rămâne roșu închis.7.2.   O colorație parțial roșiatică a mediului gelatinat sau o colorație neregulată în eprubetele/fiolele cu eșantionul de lapte indică prezența unor substanțe inhibante între nivelurile specificate în tabelul de la pagina 39.7.3.   O colorație galbenă a mediului gelatinat în eprubetele/fiolele cu lapte martor fără substanțe inhibante sau cu eșantionul de lapte revelă absența substanțelor inhibante în organismul de probă.7.4.   Dacă toate eprubetele/fiolele supuse analizei, inclusiv martorul negativ, prezintă o colorație roșiatică, eprubetele/fiolele nu conțin spori viabili și eșantioanele trebuie să fie supuse unei noi analize, folosindu-se de data aceasta, pe parcursul întregului procedeu, substanțe proaspăt preparate.8.   Confirmarea rezultatelor
   8.1.   Rezultatele tuturor eșantioanelor cu reacții descrise la punctele 7.1 și 7.2 se confirmă cu ajutorul „metodei B”.Dacă eșantioanele de lapte sunt conservate înainte de confirmare, ele trebuie să fie supracongelate pentru a se evita degradarea antibioticelor.B.   
         Procedeul de confirmare a prezenți penicilinei și determinarea concentrației acesteia
      
   1.   Obiectul și domeniul de aplicare
   Prezenta normă descrie procedeul de confirmare a penicilinelor sau a altor antibiotice, precum și procedeul de determinare a concentrației de penicilină a eșantioanelor de lapte cu reacție pozitivă (litera A punctul 7.1) sau discutabilă (litera A punctul 7.2).
      Sensibilitatea procedeului la diferite antibiotice
   A se vedea litera A punctul 1.2.   Definiție
   2.1.   Eșantionul de lapte conține antibiotice, inclusiv sulfamide, dacă eșantionul analizat prin metoda descrisă produce în jurul discului o zonă limpede de inhibare de cel puțin 2 mm.2.2.   Dacă un eșantion ce conține antibiotice, inclusiv sulfamide (2.1), adiționat cu penicilinază (betalactamază) nu produce o zonă limpede sau dacă diametrul zonei limpezi produse este mai mic decât cel apărut în absența penicilinazei, substanța inhibantă este fie penicilină, fie penicilină asociată cu un alt antibiotic, inclusiv sulfamidă.2.3.   Dacă zona nu este inactivată de penicilinază (2.2), substanța inhibantă prezentă în eșantionul de lapte nu este penicilină, dar poate fi alt reziduu [a se vedea Directiva 85/397/CEE, anexa A, capitolul VI litera A punctul 1 litera (f) și punctul 2 litera (b)].Anumite peniciline semisintetice, de exemplu cloxacilina sodică, nu sunt sau sunt doar parțial inhibate de penicilinază sau sunt rezistente și nu pot fi identificate ca fiind peniciline (a se vedea punctul 7.3).3.   Principiu
   Se așază un disc de hârtie absorbantă îmbibat cu lapte pentru analiză pe suprafața unui mediu gelatinat inseminat cu tulpină de Bacillus stearothermophilus, varietatea calidolactis. Creșterea normală a microorganismului după incubare tulbură mediul gelatinat. Apariția unei zone limpezi în jurul discului indică prezența în lapte a unor substanțe inhibante pentru creștere. Dimensiunea zonei limpezi depinde, printre altele, de concentrația și de tipul de substanță inhibantă prezentă în lapte.4.   Aparatură, sticlărie de laborator și material
   4.1.   Aparatură
   4.1.1.   A se vedea litera A punctul 4.1.4.1.2.   Baie de apă reglabilă la 80 ± 1°.4.2.   Sticlărie de laborator
   A se vedea litera A punctul 4.2.4.3.   Discuri de hârtie, fără substanțe inhibante, cu diametrul de 9 până la 13 mm, capabile să absoarbă în jur de 130 mg de lapte (se păstrează de obicei într-un exsicator).5.   Medii, soluții etalon, soluție de penicilinază, reactivi, organism de probă etc.
   Componentele de bază ale mediilor trebuie să fie corespunzătoare analizelor bacteriologice. Apa folosită trebuie să fie apă distilată sau apă demineralizată de puritate echivalentă și nu trebuie să conțină substanțe care ar putea inhiba creșterea organismului de probă.5.1.   Medii
   5.1.1.   Geloză nutritivă (litera A punctul 5.1.1).
   5.1.2.   Mediu pentru testul de detectare a substanțelor inhibante
   
      Compoziție
   
               Extract de drojdie
            
               2,5 g
            
               Tripton
            
               5 g
            
               Glucoză
            
               1 g
            
               Soluție de trimetoprim (sau de tetroxoprim) (litera A punctul 5.1.3)
            
               10 ml
            
               Agar-agar
            
               10-15 g (în funcție de proprietățile gelifiante)
            
               Apă
            
               1 000 ml
            
      Mod de preparare
   Se dizolvă complet componentele solide în apă, încălzindu-se și agitându-se înaintea adăugării soluției de trimetoprim sau de tetroxoprim. După adăugarea soluției de trimetoprim sau de tetroxoprim, se ajustează valoarea pH-ului în așa fel încât, după sterilizare, acesta să fie 8,0 ± 0,1 la 25°C. Se sterilizează mediul timp de 15 minute la 121 ± 1°C.5.2.   Soluții etalon de penicilină în lapte
   A se vedea litera A punctul 5.2.Pentru cuantificarea substanțelor inhibante (8), se pregătesc soluții etalon de penicilină în lapte fără substanțe inhibante (litera A punctul 5.3), la concentrațiile următoare:
               (a)
            
               0,004 μg/ml (0,0067 UL/ml);
            
               (b)
            
               0,006 μg/ml (0,01UL/ml);
            
               (c)
            
               0,03 μg/ml (0,05UL/ml);
            
               (d)
            
               0,06 μg/ml (0,1UL/ml);
            5.3.   Soluția de penicilinază
   5.3.1.   Se dizolvă o cantitate suficientă de penicilinază (betalactamază) în apa distilată sterilă pentru a se obține o concentrație de 1 000 U/ml. Această soluție, de preferință repartizată în porții mici, poate fi păstrată la 0-5 °C, timp de cel mult patru săptămâni.NotăPenicilinaza nu a fost supusă unei standardizări internaționale. În prezenta metodă, se presupune că zece unități de penicilinază sunt suficiente pentru a activa 0,6 mg (= 1 UL) de penicilină. Dacă nu se cunoaște concentrația unei penicilinaze date, va trebui să se verifice dacă presupunerea enunțată mai sus este corectă. Dacă e necesar, se ajustează concentrația soluției de penicilinază după caz.5.3.2.   În locul soluției de penicilinază, se pot folosi discuri îmbibate cu penicilinază vândute pe piață; a se verifica în acest caz dacă discurile conțin cantitatea cerută de penicilinază.5.4.   Organismul de probă
   A se vedea litera A punctul 5.4.5.5.   Cultura de probă (suspensia de spori)
   A se vedea litera A punctul 5.5.5.6.   Pregătirea cutiilor Petri
   5.6.1.   Se topește mediul pentru proba de detectare a substanțelor inhibante (5.1.2), apoi se răcește la 55°C.5.6.2.   Se amestecă, într-un flacon, o parte de suspensie de spori proaspeți (5.5) și numărul necesar de părți din mediul pentru proba de detectare a substanțelor inhibante (5.1.2), pentru a obține densitatea adecvată de colonii în mediul inseminat; se omogenizează corespunzător.5.6.3.   Se toarnă, pe o cutie Petri sterilă (litera A punctul 4.2.2), în prealabil încălzită la 55°, mediul inseminat (5.6.2), în așa fel încât să se obțină un strat gros de 0,6 la 0,8 mm. La o cutie Petri cu diametru interior de 140 de mm, e nevoie de aproximativ 15 ml de mediu pentru obținerea unui strat de 0,8 mm.5.6.4.   Cutiile Petri se așază pe o suprafață orizontală rece (în prealabil se verifică orizontalitatea cu o nivelă), se ridică capacele și se lasă să se solidifice mediul gelatinat. După solidificarea mediului, plăcile se acoperă și se întorc, pentru a se evita condensul apei la suprafața mediului gelatinat.5.6.5.   Cutiile Petri astfel pregătite trebuie utilizate de preferință în aceeași zi, dar mai pot fi folosite timp de maximum două săptămâni, cu condiția să fie puse la păstrare la o temperatură de 5°C în pungi de polietilenă sigilate imediat după preparare.5.6.6.   Pentru a putea identifica eșantioanele, se etichetează fundul cutiilor Petri.6.   Mod de operare
   6.1.   Pregătirea eșantionului
   6.1.1.   Eșantioanele cu rezultate pozitive sau nesigure obținute prin „metoda A” (litera A punctul 7.1 și litera A punctul 7.2) trebuie supuse unei noi analize pentru identificarea și cuantificarea penicilinei.6.1.2.   În prealabil, se încălzesc eșantioanele de lapte la 80 ± 1°C timp de 10 minute, pentru a se evita influența substanțelor inhibante termolabile nespecifice.6.1.3.   Se omogenizează cu grijă, apoi se transferă aproximativ 10 ml din eșantionul de lapte încălzit într-un flacon steril cu gâtul larg. Se adaugă aproximativ 0,4 ml din soluția de penicilinază (5.3) în lapte și se amestecă bine.6.2.   Detectarea substanțelor inhibante
   6.2.1.   Se scufundă un disc de hârtie absorbantă (4.3) în eșantionul de lapte (6.1.2) cu ajutorul unei pense curate și uscate. Se elimină surplusul de lapte prin presarea discului pe gâtul flaconului. Se întinde discul pe suprafața cutiei Petri (5.6) și se apasă ușor cu ajutorul pensei.6.2.2.   Discurile îmbibate cu diferitele eșantioane de lapte trebuie așezate la o distanță de cel puțin 20 mm unele de altele și la o distanță de cel puțin 10 mm de marginea plăcii.6.2.3.   Pentru a verifica finețea metodei, se dispun niște discuri (4.3) îmbibate cu o soluție etalon de penicilină [punctul 5.2 litera (a)] la întâmplare, printre discurile îmbibate cu eșantionul de lapte, în număr de cel puțin 2 % din numărul discurilor îmbibate cu eșantionul de lapte; se vor utiliza cel puțin cinci discuri etalon la fiecare test.6.2.4.   După ce s-au așezat toate discurile la întâmplare pe mediul gelatinat și după stabilirea identității fiecăruia, se întorc plăcile și se incubează la 63 ± 1°C, timp de 2 ½ până la 5 ore.6.2.5.   După incubare, se examinează cutiile Petri la lumină corespunzătoare, pentru a observa zonele limpezi de inhibare din jurul discului de hârtie. Se măsoară zonele limpezi.6.2.6.   Soluția etalon de penicilină (6.2.3) trebuie să formeze zone de cel puțin 2 mm în jurul discurilor.6.2.7.   Prezența zonelor limpezi în jurul discurilor îmbibate cu eșantionul de lapte de dimensiuni echivalente sau mai mari decât cea descrisă la punctul 6.2.6 indică prezența substanțelor inhibante în organismul de probă.6.3.   Identificarea și cuantificarea substanței inhibante
   6.3.1.   Operația de la punctul 6.2.1 se efectuează de două ori asupra eșantionului de lapte încălzit (6.1.2) și asupra eșantionului tratat cu penicilinază (6.1.3). În loc să se amestece penicilinază cu 10 ml de eșantion de lapte, se poate scufunda în eșantionul de lapte un disc îmbibat cu penicilinază (5.3.2), care se așază apoi pe placa de probă.6.3.2.   Se efectuează operația de la punctul 6.2.1 de două ori pentru fiecare dintre soluțiile etalon de penicilină descrise la punctul 5.2 literele (a)-(d).6.3.3.   Se calculează media diametrelor zonelor limpezi de inhibare corespunzătoare eșantionului de lapte, eșantionului de lapte adiționat cu penicilinază și soluțiilor etalon de penicilină.7.   Interpretarea rezultatelor (a se vedea punctul 2)
   7.1.   Dacă nu apare nici o zonă limpede în jurul discului îmbibat cu lapte adiționat cu penicilinază, dar apare în schimb o zonă limpede în jurul discului îmbibat cu lapte, zonă mai mare sau egală cu zona din jurul discului îmbibat cu soluția de penicilină etalon [punctul 5.2 litera (a)], substanța inhibantă prezentă în eșantionul de lapte corespunde unei concentrații de benzilpenicilinat de sodiu (sau de potasiu) mai mare sau egală cu 0,004 g/ml.7.2.   Dacă diametrul mediu al zonei limpezi din jurul discului îmbibat cu lapte adiționat cu penicilinază este egal cu diametrul mediu al zonei limpezi din jurul discului care conține eșantionul de lapte, atunci laptele conține substanțe inhibante imposibil de inactivat la concentrația de penicilinază folosită în prezenta metodă.7.3.   Dacă diametrul mediu al zonei limpezi din jurul discului îmbibat cu lapte adiționat cu penicilinază este mai mic decât diametrul mediu al zonei limpezi din jurul discului îmbibat cu eșantionul de lapte, încălzit conform dispozițiilor de la punctul 6.1.2, atunci eșantionul de lapte conține și penicilină și antibiotice (inclusiv sulfamide), și penicilină sau penicilină semisintetică (substanță care nu poate fi identificată la concentrația de penicilinază folosită în prezenta metodă). Penicilinele sintetice, precum cloxacilina sodică, pot să nu fie inactivate de penicilinază în condițiile descrise și pot astfel să fie clasate drept substanțe inhibante diferite de penicilină.NotăSubstanțele inhibante diferite de penicilină pot fi identificate, dacă este nevoie, prin procedee specifice.8.   Determinarea concentrației de penicilină
   8.1.   Concentrația de penicilină se poate determina fie după stabilirea unei curbe de etalonare, fie prin calcule bazate pe dimensiunile zonelor obținute cu soluțiile de penicilină etalon în lapte [punctul 5.2 literele (a)-(d)].8.2.   Trasarea curbei de etalonare
   Dat fiind faptul că există o corelație între log10 din concentrația de penicilină și diametrul zonelor de inhibare, curba de etalonare poate fi trasată pe hârtie semilogaritmică, cu concentrațiile de penicilină pe ordonată, iar diametrul zonelor de inhibare pe abscisă. Calculul diametrului zonelor de inhibare se obține din media probelor efectuate de două ori. Se desenează un grafic al diametrelor zonelor de inhibare în funcție de concentrațiile soluțiilor etalon de penicilină și, astfel, curba de etalonare este trasată.8.3.   Calculul
   Concentrațiile de penicilină ale unui eșantion de lapte se pot calcula din diametrul zonelor cu ajutorul ecuației de regresie sau al curbei de etalonare. Pentru un dozaj precis, raza zonelor de inhibare trebuie să fie de cel puțin două ori, și de cel mult cinci ori, egală cu cea a discurilor.9.   Exprimarea rezultatelor
   9.1.   Rezultatele se exprimă în concentrație de penicilină mai mare sau egală cu 0,004 g/ml (sau se indică concentrația determinată) și, pentru substanțele inhibante diferite de penicilină, în concentrație echivalentă de penicilină.9.2.   Repetabilitatea (r) și reproductibilitatea (R)
   Deoarece s-a folosit un etalon pentru comparație, valorile r și R nu sunt disponibile, nici relevante.
      IX.   DETECTAREA MICROORGANISMELOR PATOGENE1.   Obiectul și domeniul de aplicare
   Conform prevederilor anexei A capitolul VII punctul 2 din Directiva 85/397/CEE, prezentul capitol prezintă instrucțiunile pentru detectarea microorganismelor patogene din laptele pasteurizat.2.   Definiție
   Trebuie analizate bacteriile cel mai des răspunzătoare de bolile alimentare.Pasteurizarea este un tratament de protecție împotriva apariției germenilor patogeni care nu sunt termorezistenți în lapte. Dacă normele stabilite la anexa A capitolul VII punctul 2 din directiva menționată anterior sunt respectate în ceea ce privește numărarea coloniilor la 30°C și la 21°C, coliformii și fosfataza, nu e necesar să se facă o analiză specifică pentru detectarea germenilor patogeni, decât dacă se suspectează o legătură între laptele supus analizei și anumite intoxicații alimentare.3.   Mod de operare
   Metodele și frecvențele de analiză trebuie fixate de către autoritatea națională, în așa fel încât să permită eliberarea de certificate sanitare veterinare pentru laptele tratat termic destinat schimburilor intracomunitare. Pentru detectarea microorganismelor patogene, se aplică criteriile și procedeele admise pe plan internațional, dacă acestea există.4.   Proces-verbal
   Pentru fiecare microorganism patogen cercetat, rezultatul trebuie exprimat în felul următor:Număr pe mililitru de lapte sau „prezența” ori „absența” în volumul de lapte pasteurizat cerut de procedeul utilizat. Procesul-verbal trebuie să specifice clar procedeul utilizat.
      (1)  Benzilpenicilina și bacitracina sunt exprimate în UI/ml, toate celelalte antibiotice în μg/ml.
      (2)  Utilizarea mediului de cultură care conține substanțe antifolate trebuie să se efectueze respectându-se normele cu privire la brevetele care le protejează.