CELEX: 31997D0647
Language: el
Date: 1997-09-09 00:00:00
Title: 97/647/ΕΚ: Απόφαση της Επιτροπής της 9ης Σεπτεμβρίου 1997 για τη λεπτομερή έκθεση προσωρινής μεθόδου για τη διάγνωση, ανίχνευση και ταυτοποίηση της Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith στα γεώμηλα

Avis juridique important

|

31997D0647

97/647/ΕΚ: Απόφαση της Επιτροπής της 9ης Σεπτεμβρίου 1997 για τη λεπτομερή έκθεση προσωρινής μεθόδου για τη διάγνωση, ανίχνευση και ταυτοποίηση της Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith στα γεώμηλα  

Επίσημη Εφημερίδα αριθ. L 273 της 06/10/1997 σ. 0001 - 0025

ΑΠΟΦΑΣΗ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ της 9ης Σεπτεμβρίου 1997 για τη λεπτομερή έκθεση προσωρινής μεθόδου για τη διάγνωση, ανίχνευση και ταυτοποίηση της Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith στα γεώμηλα (97/647/ΕΚ)Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,Έχοντας υπόψη:τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Κοινότητας,την οδηγία 77/93/ΕΟΚ του Συμβουλίου, της 21ης Δεκεμβρίου 1976, περί προστατευτικών μέτρων κατά της εισαγωγής στην Κοινότητα οργανισμών οι οποίοι είναι επιβλαβείς για τα φυτά ή τα φυτικά προϊόντα και κατά της εξάπλωσης τους στο κοινοτικό έδαφος (1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την οδηγία 97/14/ΕΚ (2), και ιδίως το άρθρο 15 παράγραφος 3,Εκτιμώντας:ότι τα κράτη μέλη, σύμφωνα με την απόφαση 95/506/ΕΚ της Επιτροπής, της 24ης Νοεμβρίου 1995, η οποία τους επιτρέπει προσωρινά να λαμβάνουν επιπρόσθετα μέτρα κατά της εξάπλωσής της Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith όσον αφορά το Βασίλειο των Κάτω Χωρών (3), όπως τροποποιήθηκε από την απόφαση 96/599/ΕΚ (4), και ιδίως το άρθρο 1, παράγραφος 2α στοιχείο ββ), και βάσει της οποίας υποβάλλουν τα γεώμηλα σε επίσημες ή υπό επίσημη εποπτεία δοκιμασίες, είναι υποχρεωμένα να χρησιμοποιούν τη διαδικασία καραντίνας αριθ. 26 για την Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, όπως ορίζεται από τον ευρωπαϊκό και μεσογειακό οργανισμό φυτοπροστασίας (ΕΡΡΟ) (5), ή κάποια άλλη εγκεκριμένη μέθοδο, σύμφωνα με τη διαδικασία που προβλέπει το άρθρο 16α της οδηγίας 77/93/ΕΟΚ.ότι η ad hoc Επιτροπή Εμπειρογνωμόνων για μικροβιακές ασθένειες φυτών, η οποία συστάθηκε από την Επιτροπή των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων υπό την αιγίδα της μόνιμης φυτοϋγειονομικής επιτροπής, έχει καθορίσει τις λεπτομέρειες μιας προσωρινής μεθόδου δοκιμασίας που λαμβάνει υπόψη τις διαδικασίες αποτελεσματικότερης ανίχνευσης και ελέγχου, οι οποίες έχουν αναπτυχθεί μετά τη δημοσίευση της διαδικασίας καραντίντας αριθ. 26 του ΕΡΡΟ 7 ότι η εν λόγω μέθοδος είναι προσωρινή, δεδομένου ότι διεξάγονται περαιτέρω έρευνες ειδικά όσον αφορά την ευαισθησία και την εξειδίκευση μεμονωμένων δοκιμασιών, με στόχο την επιλογή και τη μετατροπή σε πρότυπα των αποδοτικότερων δοκιμασιών, οι οποίες θα συμπεριληφθούν σε μία εκσυγχρονισμένη μέθοδο 7ότι η προσωρινή μέθοδος που προβλέπεται στην παρούσα απόφαση είναι σύμφωνη με τη γνώμη της μόνιμης φυτοϋγειονομικής επιτροπής,ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΑΠΟΦΑΣΗ:Άρθρο 1Με στόχο την εφαρμογή της διάταξης του άρθρου 1 παράγραφος 2α στοιχείο ββ) της απόφασης 95/506/ΕΚ όπως τροποποιήθηκε τελευταία, η διαδικασία καραντίνας αριθ. 26 για την Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, όπως ορίζεται από τον ευρωπαϊκό και μεσογειακό οργανισμό φυτοπροστασίας (ΕΡΡΟ), πρόκειται να αντικατασταθεί από την προσωρινή μέθοδο για τη διάγνωση, ανίχνευση και ταυτοποίηση της Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith την οποία προβλέπει το παράρτημα της παρούσας απόφασης.Άρθρο 2Η παρούσα απόφαση απευθύνεται στα κράτη μέλη.Βρυξέλλες, 9. Σεπτεμβρίου 1997.Για την ΕπιτροπήFranz FISCHLERΜέλος της Επιτροπής(1) ΕΕ L 26 της 31. 1. 1977, σ. 20.(2) ΕΕ L 87 της 2. 4. 1997, σ. 17.(3) ΕΕ L 291 της 6. 12. 1995, σ. 48.(4) ΕΕ L 265 της 18. 10. 1996, σ. 18.(5) Δελτίο EPPO/OEPP 20, 255-262 (1990).ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΠΡΟΣΩΡΙΝΟ ΣΧΗΜΑ ΔΟΚΙΜΩΝ ΓΙΑ ΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ, ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ PSEUDOMONAS SOLANACEARUM (SMITH) SMITH ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΤΟΥ ΣΧΗΜΑΤΟΣ ΔΟΚΙΜΩΝ Στο παρόν σχήμα περιγράφονται οι διάφορες διαδικασίες για:i) τη διάγνωση της καστανής σήψης σε φυτά και κονδύλους πατάτας 7ii) την ανίχνευση της Pseudomonas solanacearum σε δείγματα κονδύλων πατάτας 7iii) την ταυτοποίηση της Pseudomonas solanacearum.Στα προσαρτήματα παρέχονται λεπτομέρειες για την παρασκευή των χρησιμοποιουμένων για τις δοκιμές υλικών, δηλαδή θρεπτικών υποστηρωμάτων, ρυθμιστικών διαλυμάτων, διαλυμάτων, αντιδραστηρίων.ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Μέρος Ι. Εφαρμογή του σχήματος δοκιμών . 41. Διάγνωση της καστανής σήψης σε φυτά και κονδύλους πατάτας . 42. Ανίχνευση και ταυτοποίηση της Pseudomonas solanacearum σε δείγματα κονδύλων πατάτας . 6Μέρος ΙΙ. Διάγνωση της καστανής σήψης σε φυτά και κονδύλους πατάτας . 81. Συμπτώματα της καστανής σήψης . 82. Δοκιμές ταχείας διαλογής . 83. Διαδικασία απομόνωσης . 94. Δοκιμές επιβεβαίωσης . 9Μέρος ΙΙΙ. Ανίχνευση και ταυτοποίηση της Pseudomonas solanacearum σε δείγματα κονδύλων πατάτας . 121. Προετοιμασία του δείγματος για τη δοκιμή . 122. Δοκιμή ανοσοφθορισμού (IF) . 133. Δοκιμή (ELISA) . 154. Δοκιμή αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCRTM) . 155. Δοκιμή εκλεκτικής απομόνωσης επί στερεού υποστρώματος . 176. Βιοδοκιμή . 187. Δοκιμές εμπλουτισμού . 188. Δοκιμή παθογένειας . 18Προσάρτημα 1. Θρεπτικά υλικά για την απομόνωση και καλλιέργεια της Pseudomonas solanacearum . 19Προσάρτημα 2. Υλικά για την προετοιμασία του δείγματος . 20Προσάρτημα 3. Υλικά για τη δοκιμή IF . 21Προσάρτημα 4. Προσδιορισμός του βαθμού μόλυνσης στη δοκιμή IF . 22Προσάρτημα 5. Υλικά για τη δοκιμή ELISA . 23Προσάρτημα 6. Υλικά για τη δοκιμή PCR . 24Προσάρτημα 7. Υλικά για τη δοκιμή εκλεκτικής απομόνωσης επί στερεού υποστρώματος και εμπλουτισμού . 24Βιβλιογραφία . 25Μέρος Ι ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΟΥ ΣΧΗΜΑΤΟΣ ΔΟΚΙΜΩΝ 1. Διάγνωση της καστανής σήψης σε φυτά και κονδύλους πατάτας Η περιγραφόμενη διαδικασία εξέτασης προορίζεται για φυτά και κονδύλους που παρουσιάζουν τυπικά συμπτώματα ή γεννούν υπόνοιες για ύπαρξη καστανής σήψης. Η διαδικασία περιλαμβάνει μία διαλογής δοκιμή ταχείας εξέτασης, απομόνωση του παθογόνου αιτίου από μολυσμένο αγγειώδη ιστό σε διαγνωστικά υλικά και, σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος, ταυτοποίηση της καλλιέργειας ως Pseudomonas solanacearumΔιάγραμμα ροής της διαδικασίας >ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΗΚΟ>Παραπομπές διαγράμματος >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΗΚΟΥ>(1) Περιγραφή των συμπτωμάτων δίδεται στο μέρος ΙΙ.1.(2) Οι δοκιμές ταχειάς διαλογής διευκολύνουν την προκαταρκτική διάγνωση.Κατάλληλες δοκιμές είναι:- Η δοκιμή εκκρίσεων του αγγειώδους ιστού του στελέχους (μέρος ΙΙ.2),- Η δοκιμή για πολυ -β- υδροξυβουτυρικά κοκκία (μέρος ΙΙ.2),- Η δοκιμή ΙF (μέρος ΙΙΙ.2),- Η δοκιμή ELISA (μέρος ΙΙΙ.3),- Η δοκιμή PCR (μέρος ΙΙΙ.4).(3) Αν και η απομόνωση του παθογόνου αιτίου με τη διαδικασία διαδοχικών αραιώσεων επί στερεού υποστρώματος από ιστούς με τυπικά συμπτώματα είναι άμεση, η καλλιέργεια μπορεί να αποτύχει αν βρισκόμαστε σε προκεχωρημένα στάδια μολύνσεως. Σαπροφυτικά βακτήρια που αναπτύσσονται σε προσβεβλημένο ιστό μπορεί να επικαλύψουν ή να εμποδίσουν την ανάπτυξη του παθογόνου στο υλικό απομόνωσης. Εάν η δοκιμή απομόνωσης είναι αρνητική, αλλά υπάρχουν τα τυπικά συμπτώματα της ασθένειας, τότε η διαδικασία απομόνωσης πρέπει να επαναληφθεί, κατά προτίμηση με εκλεκτική απομόνωση επί στερεού υποστρώματος.(4) Αξιόπιστη ταυτοποίηση μίας καθαρής καλλιέργειας Pseudomonas solanacearum επιτυγχάνεται με μία τουλάχιστον από τις δοκιμές που παρατίθενται στο μέρος ΙΙ.4.1 σε συνδυασμό με μία δοκιμή παθογένειας (μέρος ΙΙ.4.3). Ο προσδιορισμός της βιοποικιλίας και της φυλής είναι προαιρετικός, συνιστάται όμως να γίνεται σε κάθε νέο περιστατικό.>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΗΚΟΥ>2. Ανίχνευση και ταυτοποίηση της Pseudomonas solanacearum σε δείγματα κονδύλων πατάτας Η διαδικασία αποσκοπεί στην ανίχνευση μολύνσεων σε λανθάνουσα μορφή σε κονδύλους πατάτας με μία ή, κατά προτίμηση, περισσότερες δοκιμές διαλογής οι οποίες, εφόσον είναι θετικές επιβεβαιώνονται με την απομόνωση του παθογόνου οργανισμού, ακολουθεί δε, στην περίπτωση απομόνωσης τυπικών αποικιών, ταυτοποίηση μιας καθαρής καλλιέργειας ως καλλιέργειας Pseudomonas solanacearum.Διάγραμμα ροής της διαδικασίας >ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΗΚΟ>Παραπομπές διαγράμματος >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΗΚΟΥ>(1) Μέγεθος δείγματοςΤο κανονικό μέγεθος δείγματος είναι 200 κόνδυλοι. Η δοκιμασία όμως μπορεί να εφαρμοσθεί και για δείγματα μικρότερα των 200 κονδύλων.(2) Δοκιμή(-ές) ανίχνευσηςΓια την ανίχνευση της Pseudomonas solanacearum μπορεί να μην αρκεί από πλευράς ευαισθησίας ή αξιοπιστίας η πραγματοποίηση μίας μόνον δοκιμής σε ένα δείγμα. Συνεπώς, συνιστάται να πραγματοποιούνται περισσότερες από μία δοκιμές, οι οποίες θα πρέπει να βασίζονται κατά προτίμηση σε διαφορετικές βιολογικές αρχές.(3) Δοκιμή ανοσοφθορισμού (IF)Η δοκιμή ανοσοφθορισμού είναι μία καλά καθιερωμένη δοκιμή διαλογής. Το γεγονός αυτό συνιστά πλεονέκτημα σε σχέση με άλλες δοκιμές που δεν έχουν ακόμη αναπτυχθεί πλήρως ή δεν έχει ακόμη επιβεβαιωθεί η εγκυρότητά τους. Η δοκιμή αυτή χρησιμοποιείται για πολλά άλλα καθορισμένα βακτήρια, όπως την Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Βάσει των καθορισμένων παραμέτρων ανάγνωσης της μεθόδου, αυτή είναι μία ευαίσθητη δοκιμή [όριο ευαισθησίας 103--104 κύτταρα ανά ml εκχυλίσματος ιζήματος πατάτας].Η ποιότητα του αντιορού αποτελεί κρίσιμο παράγοντα για την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων της δοκιμής. Αποδεκτοί είναι μόνον αντιοροί με υψηλό τίτλο (κατ' ελάχιστον 2 000 για τον αρχικό αντιορό), όλες δε οι δοκιμές πρέπει να πραγματοποιούνται με τον τίτλο του αντιορού ή μία αραίωση κάτω του τίτλου. Προτιμάται η έμμεση μέθοδος. Η άμεση μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί εάν το επίπεδο ευαισθησίας και εξειδίκευσης της δοκιμής είναι ισοδύναμο με εκείνο της έμμεσης μεθόδου.Η δοκιμή IF έχει το πλεονέκτημα της υποκειμενικής ερμηνείας της μορφολογίας χρώσεως των κυττάρων και της έντασης του φθορισμού, χαρακτηριστικά που παρέχουν στοιχεία σχετικά με την εξειδίκευση της αντίδρασης. Αποτελεί σύνηθες φαινόμενο η εμφάνιση μη ειδικής θετικής αντίδρασης (cross-reaction) ορολογικά σχετιζομένων βακτηρίων, που προέρχονται από το έδαφος ή σχετίζονται με ιστούς πατάτας και έχουν μορφολογία κυττάρων εκείνη της Pseudomonas solanacearum. Η δοκιμή IF μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως η αποκλειστική δοκιμή διαλογής, αν και σε περιπτώσεις υποψίας μη εκλεκτικών αντιδράσεων μπορεί να γίνει μια επιπρόσθετη δοκιμή διαλογής που βασίζεται σε διαφορετική βιολογική αρχή. Σ' αυτές τις περιπτώσεις η πιό κατάλληλη δοκιμή είναι η εκλεκτική απομόνωση επί στερεού θρεπτικού υποστρώματος.(4) Εκλεκτική απομόνωση επί στερεού υποστρώματοςΜε το τροποποιημένο υλικό SMSA και τη μεθοδολογία εξέτασης που εξιδικεύεται σ' αυτή τη μέθοδο, αυτή συνιστά μία ευαίσθητη και εκλεκτική δοκιμή για την Pseudomonas solanacearum. Το αποτέλεσμα λαμβάνεται 3-6 ημέρες μετά την προετοιμασία του δείγματος. Το παθογόνο λαμβάνεται απ' ευθείας στην καλλιέργεια και μπορεί να ταυτοποιηθεί εύκολα. Για την πλήρη εκμετάλλευση των δυνατοτήτων της, η δοκιμή απαιτεί να γίνεται προσεκτική προετοιμασία των τεμαχίων ιστού λαμβανομένων από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου για την αποφυγή δευτερογενών βακτηρίων σχετιζομένων με τους κονδύλους πατάτας που είναι ανταγωνιστές της Pseudomonas solanacearum στο θρεπτικό υπόστρωμα και μπορούν να επηρεάζουν την ανάπτυξη του παθογόνου μικροοργανισμού.Ορισμένα βακτηριακά στελέχη μπορεί να αναπτυχθούν πολύ λίγο καθώς τα συστατικά του υποστρώματος μπορεί να επηρεάσουν τον οργανισμό-στόχο. Χρειάζεται επίσης προσοχή ώστε η Pseudomonas solanacearum να διαφοροποιείται από τυχόν άλλα βακτήρια που μπορεί να αναπτυχθούν στο θρεπτικό υπόστρωμα. Η εκλεκτική απομόνωση μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αποκλειστική δοκιμή διαλογής με την προϋπόθεση ότι σε περιπτώσεις που υπάρχει υποψία παρεμπόδισης της ανάπτυξης της Pseudomonas solanacearum από άλλα βακτήρια επί των τρυβλίων, και προκύπτει αρνητικό αποτέλεσμα, το δείγμα επανεξετάζεται χρησιμοποιώντας διαφορετική δοκιμή για την επικύρωση ή απόρριψη της διάγνωσης. Στις περιπτώσεις αυτές η δοκιμή IF είναι η καταλληλότερη.(5) Δοκιμή ELISAΗ δοκιμη ELISA είναι εν γένει λιγότερο ευαίσθητη από τη δοκιμή IF (όριο ευαισθησίας 104-105 κύτταρα ανά ml εκχυλίσματος ιζήματος πατάτας). Η δοκιμή είναι φθηνή και γρήγορη, είναι όμως εν γένει πιο επιρρεπής στην εμφάνιση εσφαλμένων θετικών (μη ειδικών θετικών αντιδράσεων) αποτελεσμάτων και εσφαλμένων αρνητικών (παρεμπόδιση από φαινολικά μόρια στο εκχύλισμα πατάτας) αποτελεσμάτων. Οι απαιτήσεις από πλευράς εξειδίκευσης του αντιορού είναι εξαιρετικά μεγάλες. Η δοκιμή ELISA δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αποκλειστική δοκιμή εξέτασης.(6) Δοκιμή PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης)Η ανίχνευση με PCR είναι πολύ ευαίσθητη. Αν και σε ένα δείγμα είναι δυνατόν να ανιχνευθεί ακόμη και ένα μεμονωμένο μόριο DNA, η δοκιμή παρεμποδίζεται εύκολα από διάφορα συστατικά του εκζυλίσματος του φυτού ή του κονδύλου που οδηγούν σε εσφαλμένο αρνητικό αποτέλεσμα. Ορισμένες καλλιεργούμενες ποικιλίες πατάτας περιέχουν περισσότερους παρεμποδιστές από άλλες. Χρειάζεται επομένως οι παρεμποδιστές αυτοί να απομακρύνονται. Η παρεμπόδιση μπορεί να μειωθεί με αραίωση αλλά έτσι αραιώνονται και οι πληθυσμοί της Pseudomonas solanacearum. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δίνεται σε όλα τα στάδια ετοιμασίας του δείγματος και της δοκιμής για να αποκλείεται τυχόν μόλυνση που θα μπορούσε να οδηγήσει σε εσφαλμένα θετικά αποτελέσματα. Γι' αυτό η άμεση PCR δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως η αποκλειστική δοκιμή εξέτασης.(7) Δοκιμή εμπλουτισμούΕπωάζοντας δείγματα εκζυλίσματος ιζήματος πατάτας σε ένα ημιεκλεκτικό θρεπτικό ζωμό, όπως ο τροποποιημένος SMSA, μπορούμε να επιτύχουμε τον πολλαπλασιασμό της Pseudomonas solanacearum. Το σημαντικότερο ίσως στην περίπτωση αυτή είναι ότι έτσι αραιώνονται και οι εν δυνάμει παρεμποδιστές της δοκιμής ELISA ή PCR. Έτσι, η Pseudomonas solanacearum σε εμπλουτισμένο ζωμό μπορεί να ανιχνευθεί με τις μεθόδους IF, ELISA και PCR. Συνιστούμε να μη γίνεται άμεση απομόνωση επί στερεού υποστρώματος από τους εμπλουτισμένους ζωμούς. Οι μέθοδοι αυτές εμπλουτισμού δεν έχουν δοκιμαστεί επισταμένως. Περιλαμβάνονται στο παρόν γιατί έχουν καλές προοπτικές. Εντούτοις, λόγω της σχετικής έλλειψης εμπειριών, δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αποκλειστικές μέθοδοι ανιχνεύσεως.(8) ΒιοδοκιμήΗ βιοδοκιμή χρησιμοποιείται για την απομόνωση της Pseudomonas solanacearum από ιζήματα εκχυλισμάτων πατάτας κατόπιν εκλεκτικού εμπλουτισμού σε ένα φυτό ξενιστή και μπορεί να γίνει σε φυτά τομάτας ή πελιτζάνας. Η δοκιμή απαιτεί άριστες συνθήκες επωάσεως όπως καθορίζονται στη μέθοδο αυτή, κατά πάσα πιθανότητα, τυχόν βακτήρια που δρουν παρεμποδιστικά έναντι της Pseudomonas solanacearum σε SMSA δεν δρουν παρεμβατικά στη δοκιμή αυτή.(9) Δοκιμή(-ές) επιβεβαίωσηςΑξιόπιστη ταυτοποίηση καθαρής καλλιέργειας Pseudomonas solanacearum επιτυγχάνεται με μία τουλάχιστον από τις δοκιμές που παρατίθενται στο μέρος ΙΙ.4.1 σε συνδυασμό με μία δοκιμή παθογένειας (μέρος ΙΙ.4.3). Ο χαρακτηρισμός του στελέχους είναι προαιρετικός, αλλά συστήνεται για κάθε νέα περίπτωση.>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΗΚΟΥ>ΜΕΡΟΣ ΙΙ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΚΑΣΤΑΝΗΣ ΣΗΨΗΣ ΣΕ ΦΥΤΑ ΚΑΙ ΚΟΝΔΥΛΟΥΣ ΠΑΤΑΤΑΣ 1. Συμπτώματα καστανής σήψης Στο φυτό της πατάτας Στο αρχικό στάδιο της ασθένειας εμφανίζεται μαρασμός των φύλλων προς την κορυφή του φυτού σε υψηλές θερμοκρασίες κατά τη διάρκεια της ημέρας με ανάληψη κατά τη διάρκεια της νύχτας. Σύντομα ο μαρασμός καθίσταται μη αναστρέψιμος και οδηγεί στο θάνατο του φυτού. Ο αγγειώδης ιστός σε εγκαρσίως κομμένα στελέχη από μαραμένα φυτά μπορεί να γίνει καστανός, από δε την κομμένη επιφάνεια εκρέει, ή μπορεί να εξέλθει εύκολα συμπιέζοντάς την, ένα γαλακτώδες εξίδρωμα. Όταν ένα κομμένο στέλεχος τοποθετηθεί κατακόρυφα μέσα σε νερό, από τις αγγειώδεις δέσμες εκρέουν κλωστές γλοιώδους υγρού.Στον κόνδυλο πατάτας Οι κόνδυλοι πρέπει να κόβονται εγκαρσίως κοντά στο σημείο πρόσφυσης του στολονίου. Στο αρχικό στάδιο της ασθένειας εμφανίζεται ένας υαλώδους όψεως, κίτρινος προς ανοικτό καστανό, μεταχρωματισμός του αγγειώδους δακτυλίου από τον οποίο εκρέει αυθόρμητα μετά λίγα λεπτά ή μετά από ελαφρά πίεση με τους αντίχειρες στο φλοιό κοντά στην κομμένη επιφάνεια, ένα υπόλευκο εξίδρωμα. Αργότερα, ο αγγειακός μεταχρωματισμός καθίσταται εντονότερα καστανός και η νέκρωση μπορεί να επεκταθεί στον παρεγχυματώδη ιστό. Σε προκεχωρημένα στάδια της ασθένειας, η μόλυνση εκδηλώνεται εξωτερικά από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου και τους οφθαλμούς και εμφανίζονται στην επιδερμίδα ερυθροκάστανες, ελαφρώς βαθουλωμένες κηλίδες από τις οποίες μπορεί να εκρέει βακτηριακό εξίδρωμα προκαλώντας την προσκόλληση σωματιδίων του εδάφους.2. Δοκιμές ταχείας διαλογής Οι δοκιμές ταχείας διαλογής διευκολύνουν την προκαταρκτική διάγνωση. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί μία ή περισσότερες από τις ακόλουθες δοκιμές:Δοκιμή εκκρίσεων από το στέλεχος Η παρουσία Pseudomonas solanacearum σε μαραμένα στελέχη πατάτας μπορεί να εκτιμηθεί με την ακόλουθη απλή προκαταρκτική δοκιμή:Κόβουμε το στέλεχος πάνω ακριβώς από το έδαφος. Τοποθετούμε την κομμένη επιφάνεια σε ποτήρι ζέσεως με νερό. Λίγο μετά, από τις αγγειώδεις δέσμες αρχίζει να τρέχει αυθόρμητα με μορφή κλωστών ένα βακτηριακό γλοιώδες έκκριμα. Κανένα από τα βακτήρια που προκαλούν αδροβακτηρίωση σε φυτά της πατάτας δεν εμφανίζει το φαινόμενο αυτό.Ανίχνευση πολυ-ί-υδροξυβουτυρικών (PHB) κοκκίων Τα κοκκία PHB στα κύτταρα των Pseudomonas solanacearum καθίστανται ορατά διά χρώσεως με Nile Blue A ή με Sudan Black B.Παρασκευάζουμε επίχρισμα του εξιδρώματος ή του αιωρήματος του ιστού σε αντικειμενοφόρο πλάκα μικροσκοπίου ή επίχρισμα 48ωρης καλλιέργειας σε YPGA ή SPA (προσάρτημα 1). Παρασκευάζουμε επίσης επιχρίσματα στελέχους βιοποικιλίας 2, φυλής 3 ως θετικούς μάρτυρες και αν θεωρηθεί χρήσιμο ένα επίχρισμα ετερολόγου στελέχους, ως αρνητικό μάρτυρα.Αφήνουμε να ξηρανθούν. Περνάμε μερικές φορές γρήγορα την κάτω πλευρά της αντικειμενοφόρου πλάκας μέσα από φλόγα μέχρι να προσηλωθεί το επίχρισμα.Δοκιμή Nile Blue 1. Περιλούζουμε το προσηλωμένο επίχρισμα με 1 % υδατικό διάλυμα Nile Blue A και το αφήνουμε για επώαση επί 10 λεπτά στους 55 °C.2. Αποστραγγίζουμε το διάλυμα χρώσεως, πλένουμε την πλάκα για λίγο προσεκτικά με ρέον νερό της βρύσης και απομακρύνουμε την περίσσεια του νερού με απορροφητικό χαρτί.3. Περιλούζουμε το επίχρισμα με 8 % υδατικό διάλυμα οξικού οξέος και το αφήνουμε για επώαση επί 1 λεπτό σε θερμοκρασία εργαστηρίου.4. Ξεπλένουμε ελαφρά με ρέον νερό της βρύσης και το στεγνώνουμε με απορροφητικό χαρτί.5. Ξαναρίχνουμε μία σταγόνα νερό και τοποθετούμε μία καλυπτρίδα.6. Εξετάζουμε το χρωσμένο επίχρισμα με μικροσκόπιο επιφθορισμού στα 450 nm με ελαιοκαταδυτικό φακό σε μεγέθυνση 1 000χ.Εφόσον υπάρχουν κοκκία PHB αυτά φθορίζουν με λαμπρό πορτοκαλί χρώμα. Τα κοκκία παρατηρούνται επίσης και σε κανονικό φως για να ελεγχθεί αν είναι ενδοκυτταρικά και αν η κυτταρική μορφολογία είναι η τυπική μορφολογία της Pseudomonas solanacearum.Δοκιμή Sudan Black 1. Περιλούζουμε το προσηλωμένο επίχρισμα με διάλυμα 0,3 % Sudan Black B σε 70 % αιθανόλη και το αφήνουμε για επώαση επί 10 λεπτά σε θερμοκρασία εργαστηρίου.2. Αποστραγγίζουμε το διάλυμα χρώσεως, ξεπλένουμε για λίγο με νερό της βρύσης και απομακρύνουμε την περίσσεια του νερού με απορροφητικό χαρτί.3. Βυθίζουμε το επίχρισμα για μικρό χρονικό διάστημα σε ξυλόλη και το στεγνώνουμε με απορροφητικό χαρτί.Προσοχή! Η ξυλόλη είναι επιβλαβής, γι' αυτό πρέπει να εργαζόμαστε σε απαγωγό εστία.4. Περιλούζουμε το επίχρισμα με 0,5 % (β/ο) υδατικό διάλυμα σαφρανίνης και το αφήνουμε για 10 δευτερόλεπτα σε θερμοκρασία εργαστηρίου.Προσοχή! Η σαφρανίνη είναι επιβλαβής, γι' αυτό πρέπει να εργαζόμαστε σε απαγωγό εστία.5. Ξεπλένουμε ήπια με ρέον νερό της βρύσης, στεγνώνουμε με απορροφητικό χαρτί και τοποθετούμε μία καλυπτρίδα.6. Εξετάζουμε το χρωσμένο επίχρισμα σε φωτομικροσκόπιο με ελαιοκαταδυτικό φακό και με κλίμακα μεγέθυνσης 1 000χ.Τα κοκκία PHB στα κύτταρα της Pseudomonas solanacearum εμφανίζονται χρωσμένα μπλε-μαύρα. Το κυτταρικό τοίχωμα εμφανίζεται με ροζ χρώση.Άλλες δοκιμές Άλλες κατάλληλες δοκιμές διαλογής είναι η δοκιμή IF (μέρος ΙΙΙ.2) η δοκιμή ELISA (μέρος ΙΙΙ.3) και η δοκιμή PCR (μέρος ΙΙΙ.4).3. Διαδικασία απομόνωσης 3.1. Λαμβάνεται εξίδρωμα ή τμήματα μεταχρωματισμένου ιστού από τον αγγειώδη δακτύλιο του κονδύλου ή τις αγγειώδεις δέσμες του στελέχους. Παρασκευάζεται αιώρημα των ανωτέρω σε μικρό όγκο αποστειρωμένου απεσταγμένου νερού ή σε 50 mM φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος. Το αιώρημα αφήνεται για 5-10 λεπτά πάνω στον πάγκο.3.2. Παρασκευάζονται σειρές δεκαπλών αραιώσεων του αιωρήματος π.χ.>NUM>1/>DEN>10 και >NUM>1/>DEN>100 ή περισσότερες αν θεωρηθεί απαραίτητο.3.3. Συγκεκριμένη ποσότητα του αιωρήματος και των αραιώσεων μεταφέρεται σε γενικής χρήσης θρεπτικό υπόστρωμα (NA, YPGA και SPA, προσάρτημα 1) ή/και σε υπόστρωμα του Kelman με tetrazolium (προσάρτημα 1) ή/και σε εκλεκτικό υπόστρωμα SMSA (προσάρτημα 7) και απλώνεται ή εξαπλώνεται γραμμωτά με κατάλληλη τεχνική αραιώσεως επί του υποστρώματος. Αν θεωρηθεί χρήσιμο, προετοιμάζονται ξεχωριστά τρυβλία από κάθε υπόστρωμα με αραιωμένο αιώρημα καλλιέργειας παθογόνου στελέχους Pseudomonas solanacearum βιοποικιλίας 2, φυλής 3 που χρησιμοποιείται ως θετικός μάρτυρας.3.4. Τα τρυβλία επωάζονται 3 ημέρες στους 28 °C. Η επώαση μπορεί να παραταθεί στις 6 ημέρες, αν η ανάπτυξη είναι αργή, αλλά οι αποικίες επί SMSA συχνά γίνονται μη τυπικές και νεκρώνονται.Στα γενικής χρήσεως θρεπτικά υποστρώματα οι παθογόνες απομονώσεις Pseudomonas solanacearum αναπτύσσουν μαργαριτώδους χροιάς λευκές, επίπεδες, ακανόνιστες και ρευστώδεις αποικίες που εμφανίζουν συχνά χαρακτηριστικές σπείρες.Σε υπόστρωμα Kelman με tetrazolium, τυπικές αποικίες παθογόνων απομονώσεων της Pseudomonas solanacearum είναι κρεμώδεις, επίπεδες, με ακανόνιστο περιθώριο και υδαρείς με αιματέρυθρες ελικώσεις στο κέντρο. Μη παθογόνες απομονώσεις της Pseudomonas solanacearum αναπτύσσουν βουτυρώδεις έντονα ερυθρές αποικίες.Στο SMSA, τυπικές αποικίες παθογόνων απομονώσεων της Pseudomonas solanacearum αναπτύσσουν γαλακτώδους χροιάς λευκές, επίπεδες, ακανόνιστες στο περιθώριο και ρευστώδεις αποικίες με αιματέρυθρα κέντρα.Οι μη παθογόνες μορφές Pseudomonas solanacearum αναπτύσσουν λιγότερο ρευστώδες αποικίεις, οι οποίες στο SMSA εμφανίζονται τελείως ροζ προς ερυθρές.3.5. Οι αποικίες με χαρακτηριστική μορφολογία καθαρίζονται με εκ νέου καλλιέργεια σε γενικής χρήσεως θρεπτικό υπόστρωμα. Πρέπει να αποφεύγονται επανειλημμένες εκ νέου καλλιέργειες γιατί αυτό μπορεί να οδηγήσει σε μείωση της παθογένειας.4. Δοκιμη(-ές) επιβεβαίωσης 4.1. Ταυτοποίηση της Pseudomonas solanacearum Η ταυτοποίηση καθαρών καλλιεργειών της Pseudomonas solanacearum γίνεται με μία από τις ακόλουθες διαδικασίες:Θρεπτικές και ενζυματικές δοκιμές Σημείωση: Να περιλαμβάνονται κατάλληλα στελέχη ως μάρτυρες σε κάθε δοκιμή.Η Pseudomonas solanacearum παρουσιάζει ή όχι εν γένει τις ακόλουθες φαινοτυπικές ιδιότες:>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Υλικά και μέθοδοι παρέχονται στην εργασία των Lelliott & Stead (1987).Δοκιμή IFΠαρασκευάζουμε αιώρημα 106 κυττάρων ανά ml από την καλλιέργεια και ένα θετικό μάρτυρα. Παρασκευάζουμε επίσης μία σειρά αραιώσεων του αντιορού στο διπλάσιο. Εφαρμόζουμε τη διαδικασία IF (μέρος ΙΙΙ.2). Ο τίτλος IF της καλλιέργειας πρέπει να είναι ισοδύναμος με εκείνον του θετικού μάρτυρα.Δοκιμή ELISAΠαρασκευάζουμε αιώρημα >106 κυττάρων ανά ml από την καλλιέργεια και ένα θετικό μάρτυρα. Εφαρμόζουμε τη διαδικασία ELISA (μέρος ΙΙΙ.3). Ο τίτλος ELISA της καλλιέργειας πρέπει να είναι ισοδύναμος με εκείνον του θετικού μάρτυρα.Δοκιμή PCRΠαρασκευάζουμε αιώρημα 106 κυττάρων ανά ml από την καλλιέργεια και ένα θετικό μάρτυρα. Εφαρμόζουμε τη διαδικασία PCR (μέρος ΙΙΙ.4). Το προϊόν PCR της καλλιέργειας πρέπει να έχει το ίδιο μέγεθος και μορφή REA με εκείνα του θετικού μάρτυρα.Φθορίζων in situ υβριδισμός (FISH)Παρασκευάζουμε αιώρημα 106 κυττάρων ml από την καλλιέργεια και ένα θετικό μάρτυρα. Εφαρμόζουμε τη διαδικασία FISH (van Beuningen ετ αλ., 1995) χρησιμοποιώντας τον εκκινητή (primer) PCR OLI-1 (Seal et al., 1993). Η καλλιέργεια πρέπει να εμφανίζει την ίδια αντίδραση με το θετικό μάρτυρα.Προφίλ πρωτεϊνώνΟι μετουσιωμένες ολοκυτταρικές πρωτεΐνες διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμίδιου - PAGE (Stead, 1992a).Προφίλ σε λιπαρά οξέα (FAP)Αναπτύσσουμε την καλλιέργεια και ένα στέλεχος θετικού μάρτυρα για 48 ώρες στους 28 °C σε trypticase soy agar και εφαρμόζουμε τη διαδικασία FAP (Janse, 1991, Stead, 1992a, Stead, 1992b). Το προφίλ λιπαρών οξέων της καλλιέργειας πρέπει να είναι ίδιο με εκείνο του θετικού μάρτυρα. Στις καθορισμένες συνθήκες, τα χαρακτηριστικά λιπαρά οξέα είναι 14:0 3ΟΗ, 16:0 2ΟΗ, 16:1 2ΟΗ και 18:1 2ΟΗ.4.2. Χαρακτηρισμός στελέχους Ο χαρακτηρισμός του στελέχους είναι προαιρετικός αλλά συστήνεται για κάθε νέα περίπτωση, χρησιμοποιώντας τουλάχιστον μία από τις ακόλουθες διαδικασίες:Χαρακτηρισμός βιοποικιλίας Η Pseudomonas solanacearum διαχωρίζεται σε βιοποικιλίες βάσει της ικανότητάς της να παράγει οξύ από τρεις εξοζοαλκοόλες και τρία σάκχαρα (Hayward, 1964 & 1994).>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Με πρόσθετες δοκιμές, η βιοποικιλία 2 μπορεί να διαφοροποιηθεί σε υποφαινοτύπους (Hayward, 1994):>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Προσδιορισμός φυλής Η φυλή (Buddenhagen et al., 1962) μπορεί να προσδιορισθεί με βάση μία δοκιμή παθογένειας σε φυτά τομάτας ή μελιτζάνας και σε φυτά καπνού και με μία αντίδραση υπερευαισθησίας (HR) σε φύλλα καπνού (Lozano και Sequeira, 1970):>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Ο χαρακτηρισμός της φυλής με τις δοκιμές παθογένειας ή υπερευαισθησίας σε καπνό, δεν είναι ίσως πολύ αξιόπιστος και αντ' αυτών μπορεί να προκύψει από τη βιοποικιλία και το φυσικό ξενιστή προέλευσης.Το γενωμικό αποτύπωμα Η μοριακή διαφοροποίηση των στελεχών στο σύμπλοκο Pseudomonas solanacearum μπορεί να γίνει με:Ανάλυση RFLP (Cook et al., 1989)Επαναληπτική αλληλουχία PCR [REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al., 1995 7 Smith et al., 1995)].4.3. Δοκιμή παθογένειας Η δοκιμή αυτή αποσκοπεί στην επιβεβαίωση της διάγνωσης του Pseudomonas solanacearum και την εκτίμηση της παθογένειας των καλλιεργειών που ταυτοποιούνται ως Pseudomonas solanacearum.Παρασκευάζουμε μόλυσμα με 106 κύτταρα ανά ml από την καλλιέργεια και ένα θετικό στέλεχος μάρτυρα. Μολύνουμε 5-10 φυτά τομάτας ή μελιτζάνας στο τρίτο κατά προτίμηση πραγματικό στάδιο φυλλοφορίας (μέρος ΙΙΙ.6). Αφήνουμε για επώαση μέχρι 2 εβδομάδες σε θερμοκρασία 22-28 °C και υψηλή σχετική υγρασία με καθημερινό πότισμα. Παρατηρούμε αν εμφανίζονται συμπτώματα μαρασμού ή/και επιναστία, χλώρωση ή νανισμός.Απομονώνουμε από φυτά που παρουσιάζουν συμπτώματα, ως ακολούθως:- αφαιρούμε ένα μέρος ιστού από το στέλεχος, 2 cm πάνω από το σημείο μόλυνσης,- τεμαχίζουμε τους ιστούς και παρασκευάζουμε αιώρημα σε ένα μικρό όγκο αποστειρωμένου, αποσταγμένου νερού ή σε 50 mM φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος. Ακολούθως γίνεται εξάπλωση επί στερεού θρεπτικού υποστρώματος, επώαση και έλεγχος παρουσίας τυπικών αποικιών του Pseudomonas solanacearum.ΜΕΡΟΣ ΙΙΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ PSEUDOMONAS SOLANACEARUM ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΚΟΝΔΥΛΩΝ ΠΑΤΑΤΑΣ Σημείωση: Το κανονικό μέγεθος δείγματος είναι 200 κόνδυλοι. Η δοκιμασία όμως μπορεί να εφαρμοσθεί και για δείγματα μικρότερα των 200 κονδύλων.1. Προετοιμασία του δείγματος για δοκιμή Σημείωση: Το εκχυλισμένο ίζημα πατάτας που λαμβάνεται με τη διαδικασία αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για την ανίχνευση της Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.Εφόσον κριθεί σκόπιμο, μπορούν να γίνουν και οι εξής προκαταρκτικές εργασίες:i) το δείγμα επωάζεται στους 25-30 °C για διάστημα μέχρι 2 εβδομάδες για την ενθάρρυνση πολλαπλασιασμού τυχόν χαμηλών πληθυσμών Pseudomonas solanacearum 7ii) οι κόνδυλοι πλένονται κάτω από ρέον νερό της βρύσης με κατάλληλα απολυμαντικά και απορρυπαντικά. Οι κόνδυλοι στεγνώνουν στον αέρα.1.1. Με ένα καθαρό και απολυμασμένο νυστέρι ή ειδικό μαχαίρι λαχανικών, αφαιρείται η επιδερμίδα γύρω από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου του κονδύλου έτσι ώστε να φανούν πρώτα οι αγγειώδεις ιστοί. Αποκόπτουμε με προσοχή ένα μικρό κώνο (διάμετρος 3-5 mm) αγγειώδους ιστού από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου κάθε κονδύλου. Προσοχή ώστε η αφαιρούμενη ποσότητα μη αγγειώδους ιστού να είναι η ελάχιστη δυνατή. Συνέχιση της διαδικασίας για κάθε κόνδυλο του δείγματος.Σημείωση: Στο στάδιο αυτό οι κόνδυλοι μπορούν να εξεταστούν μακροσκοπικά (μέρος ΙΙ.1). Κάθε κόνδυλος με συμπτώματα ή έντονη σήψη αφήνεται παράμερα και εξετάζεται χωριστά (μέρος ΙΙ).1.2. Οι κώνοι ιστών συλλέγονται μέσα σε ένα κλειστό δοχείο. Κατά προτίμηση, οι κώνοι από τα σημεία πρόσφυσης του στολονίου πρέπει να υποβάλλονται σε κατεργασία αμέσως. Εάν αυτό δεν είναι δυνατόν, αποθηκεύονται για χρονικό διάστημα όχι μεγαλύτερο από 24 ώρες, ή στους 4 °C για χρονικό διάστημα μεγαλύτερο από 72 ώρες.1.3. Οι κώνοι από τα σημεία πρόσφυσης του στολονίου υποβάλλονται σε κατεργασία με μία από τις ακόλουθες διαδικασίες:i) Οι κώνοι μεταφέρονται σε κατάλληλο δοχείο.Προστίθεται ικανή ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος διαβροχής (προσάρτημα 2) ώστε να καλυφθούν οι κώνοι.Οι κώνοι θρυματίζονται σε ένα Waring-Blender (μίξερ) ή με Ultra Thurrax μέχρι πλήρους ομοιογενοποιήσεως. Πρέπει να αποφεύγεται η υπερβολική ομοιογενοποίηση.Αφήνουμε το προϊόν να διαβραχεί για 15-30 λεπτά.ii) Οι κώνοι μεταφέρονται σε κατάλληλο δοχείο.Προστίθεται ικανή ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος διαβροχής ώστε να καλυφθούν οι κώνοι.Το δοχείο τοποθετείται σε περιστροφικό αναδευτήρα.Το περιεχόμενο αφήνεται να επωαστεί σε 50-100 rpm για 4 ώρες στους 20-22 °C ή για 16-24 ώρες στους 4 °C.iii) Οι κώνοι μεταφέρονται σε ένα ανθεκτικό σάκο διαβροχής μίας χρήσης (π.χ. σάκκο Stomacher με διαστάσεις 105 mm Χ 150 mm, αποστειρωμένο με ακτινοβολία).Οι κώνοι συνθλίβονται προσεκτικά με ένα κατάλληλο εργαλείο, π.χ. σφυρί, μέχρι πλήρους ομοιογενοποιήσεως.Προστίθεται ικανή ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος διαβροχής για την επικάλυψη των συνθλιμμένων κώνων και το υγρό διαβροχής αφήνεται να κατακαθίσει για 15-30 λεπτά της ώρας.1.4. Τα βακτήρια εξάγονται από τους κατεργασμένους κώνους με μία από τις ακόλουθες διαδικασίες:i) Το υγρό διαβροχής μεταγγίζεται απαλά μέσα σε σωλήνα φυγοκέντρησης αφήνοντας τυχόν υπολείμματα ιστού μέσα στο δοχείο ή τον σάκο. Εφόσον το μεταγγιζόμενο υγρό διαβροχής εμφανίζεται θολό φυγοκεντρείται με ταχύτητα όχι μεγαλύτερη από 180 xg για 10 λεπτά σε θερμοκρασία κάτω από τους 10 °C.Το μεταγγισθέν υγρό διαβροχής ή το υπερκείμενο υγρό από το πρώτο στάδιο φυγοκέντρησης φυγοκεντρείται με ταχύτητα 7 000 xg για 15 λεπτά ή με ταχύτητα 10 000 xg για 10 λεπτά σε θερμοκρασία μικρότερη από τους 10 °C.Το υπερκείμενο υγρό απορρίπτεται προσέχοντας να μη διαταραχθεί το ίζημα.ii) Το υγρό διαβροχής διηθείται μέσω φίλτρου με μέγεθος πόρων 40-100 μm. Η διήθηση ενισχύεται με αντλία κενού.Το διήθημα συλλέγεται σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης.Το φίλτρο πλένεται με ρυθμιστικό διάλυμα διαβροχής.Το διήθημα φυγοκεντρείται με ταχύτητα 7 000 xg για 15 λεπτά ή με ταχύτητα 10 000 xg για λεπτά σε θερμοκρασία μικρότερη από τους 10 °C.Το υπερκείμενο υγρό απορρίπτεται προσέχοντας να μη διαταραχθεί το ίζημα.1.5. Το ίζημα αναδιαλύεται σε 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος του ιζήματος (προσάρτημα 2).Το αιώρημα διαιρείται σε δύο ίσα μέρη και κάθε μέρος μεταφέρεται σε ένα μικροφιαλίδιο.Το ένα μικροφιαλίδιο χρησιμοποιείται για τη δοκιμή. Το υπόλοιπο από το εκχύλισμα αυτό διατηρείται κατά τη διάρκεια της δοκιμής στους 4 °C.Στο άλλο μικροφιαλίδιο προστίθεται αποστειρωμένη γλυκερίνη σε τελική συγκέντρωση 10-25 % (V/V). Ανακατεύεται με στροβιλισμό (vortex). Αποθηκεύεται στους - 18 °C (εβδομάδες) ή στους - 70 °C (μήνες).2. Δοκιμή ανοσοφθορισμού (IF) Χρησιμοποιείται αντιορός για Pseudomonas solanacearum, κατά προτίμηση για φυλή 3, βιοποικιλία 2. Ο τντλος προσδιορίζεται σε αιώρημα 106 κυττάρων ανά ml από το ομόλογο στέλεχος Pseudomonas solanacearum με κατάλληλη αραίωση συμπλόκου ισοθειοκυανικής φθορεϊσίνης (FITC), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο πρωτογενής αντιορός πρέπει να έχει τίτλο IF τουλάχιστον 1:2 000.Χρησιμοποιούνται πολυφατνιακές αντικειμενοφόροι πλάκες μικροσκοπίου με 10 κατά προτίμηση φατνία διαμέτρου τουλάχιστον 6 mm.Σε κάθε αντικειμενοφόρο περιλαμβάνεται μάρτυρας συμπλόκου FITC. Αν τυχόν στο μάρτυρα FITC παρατηρηθούν θετικά κύτταρα η δοκιμή θα πρέπει να επαναλαμβάνεται συμπεριλαμβάνοντας και το μάρτυρα PBS.Παρασκευάζονται ξεχωριστά ως θετικοί μάρτυρες αντικειμενοφόροι με αιώρημα 106 κυττάρων ανά ml από στέλεχος Pseudomonas solanacearum κατάλληλης φυλής/βιοποικιλίας (π.χ. φυλής 3, βιοποικιλίας 2). Σε κάθε σειρά δοκιμών χρησιμοποιείται μία αντικειμενοφόρος.2.1. Οι προς δοκιμή αντικειμενοφόροι ετοιμάζονται με μία από τις ακόλουθες διαδικασίες:i) Σε περίπτωση ιζημάτων με μικρή σχετικά ποσότητα αμύλου:Σε μία σειρά φατνίων, φέρεται μετρημένος με σιφώνιο συγκεκριμένος όγκος (15 ϴl είναι αρκετός για φατνία με διάμετρο 6 mm - ο όγκος κλιμακώνεται προς τα άνω για μεγαλύτερα φατνία) του αιωρήματος του ιζήματος. Η άλλη σειρά μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείγμα εις διπλούν ή για ένα δεύτερο δείγμα όπως φαίνεται στην εικόνα 1.ii) Σε περίπτωση άλλων ιζημάτων:Παρασκευάζονται δεκαπλές αραιώσεις, δηλαδή >NUM>1/>DEN>10,>NUM>1/>DEN>100 και >NUM>1/>DEN>1 000 του αιωρήματος του ιζήματος σε ρυθμιστικό διάλυμα ιζήματος. Σε μία σειρά φατνίων, φέρεται μετρημένος με σιφώνιο συγκεκριμένος όγκος (15 ϴl είναι αρκετός για φατνία με διάμετρο 6 mm - ο όγκος κλιμακώνεται προς τα άνω για μεγαλύτερα φατνία) του αιωρήματος του ιζήματος από κάθε αραίωση. Η άλλη σειρά μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείγμα εις διπλούν ή για ένα δεύτερο δείγμα όπως φαίνεται στην εικόνα 2.2.2. Το περιεχόμενο των φατνίων αφήνεται να ξηρανθεί. Τα βακτηριακά κύτταρα στην αντικειμενοφόρο προσηλώνονται με θέρμανση, με φλόγα ή με 95 % αιθανόλη.2.3. Διαδικασία IFi) Σύμφωνα με την ετοιμασία της αντικειμενοφόρου στο σημείο 2.1.i):Παρασκευάζεται μία σειρά αραιώσεων του αντιορού στο διπλάσιο σε ρυθμιστικό διάλυμα για IF (προσάρτημα 3):Ό του τίτλου (Τ/4), ½ του τίτλου (Τ/2), ο τίτλος (Τ) και το διπλάσιο του τίτλου (2Τ).ii) Σύμφωνα με την ετοιμασία της αντικειμενοφόρου στο σημείο 2.1.ii):Παρασκευάζεται η αραίωση εργασίας (WD) του αντιορού σε ρυθμιστικό διάλυμα για IF. Αραίωση εργασίας είναι η αραίωση του αντιορού που εμφανίζει την καλύτερη εξειδίκευση και είναι συνήθως το μισό του τίτλου.>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>2.3.1. Οι αντικειμενοφόροι τοποθετούνται πάνω σε ένυγρο απορροφητικό χαρτί.Τα φατνία δοκιμής καλύπτονται με την ή τις αραιώσεις του αντιορού. Στα φατνία FITC φέρεται PBS. Ο όγκος του χρησιμοποιούμενου στα φατνία αντιορού πρέπει να είναι ισοδύναμος με τον όγκο του χρησιμοποιούμενου εκχυλίσματος.2.3.2. Οι αντικειμενοφόροι τοποθετούνται κάτω από ένα κάλυμμα και επωάζονται για 30 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος.2.3.3. Τα σταγονίδια του αντιορού απομακρύνονται με ένα ελαφρό τίναγμα από την αντικειμενοφόρο και οι αντικειμενοφόροι ξεπλένονται προσεκτικά με ρυθμιστικό διάλυμα IF. Πλύση επί 5 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα-Tween IG και ακολούθως επί 5 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα IF (προσάρτημα 3).Η περίσσεια του υγρού απομακρύνεται προσεκτικά.2.3.4. Οι αντικειμενοφόροι τοποθετούνται πάνω σε ένυγρο απορροφητικό χαρτί.Τα φατνία δοκιμής και το φατνίο του FITC καλύπτονται με την αραίωση του συμπλόκου FITC που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του τίτλου. Ο όγκος του χρησιμοποιούμενου στα φατνία συμπλόκου πρέπει να είναι ίδιος με τον όγκο του χρησιμοποιούμενου αντιορού.2.3.5. Οι αντικειμενοφόροι τοποθετούνται κάτω από ένα κάλυμμα και επωάζονται για 30 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος.2.3.6. Τα σταγονίδια του συμπλόκου τινάζονται μακρυά από την αντικειμενοφόρο και οι αντικειμενοφόροι ξεπλένονται και πλένονται όπως προηγουμένως (2.3.3). Η περίσσεια του νερού απομακρύνεται προσεκτικά.2.3.7. Σε κάθε φατνίο φέρονται με σιφώνιο 5-10 ϴl φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος γλυκερίνης 0,1Μ (προσάρτημα 3) ή παρομοίου ρευστού και τα φατνία καλύπτονται με μία καλυπτρίδα.2.4. Ανάγνωση της δοκιμής IFΟι αντικειμενοφόροι δοκιμής εξτάζονται σε μικροσκόπιο επιφθορισμού με φίλτρα κατάλληλα για την διέγερση του FITC, με ελαιοκαταδυτικό φακό και με μεγέθυνση 50-1 000. Τα φατνία εξετάζονται κατά μήκος δύο καθέτων διαμέτρων και κατά την περίμετρό τους. Πρώτα ελέγχεται η αντικειμενοφόρος του θετικού μάρτυρα. Τα κύτταρα πρέπει να είναι πλήρως χρωσμένα με λαμπρό φθορισμό. Σημείωση: Σε περίπτωση αποτυχίας, η δοκιμή επαναλαμβάνεται.Τίνεται ανάγνωση αντικειμενοφόρων δοκιμής.Ελέγχεται κατ' αρχάς ότι δεν υπάρχουν φθορίζοντα κύτταρα στα φατνία των μαρτύρων FITC. Αν υπάρχουν φθορίζοντα κύτταρα στο φατνίο FITC αυτό δείχνει μη ειδική σύζευξη του συμπλόκου, αυτοφθορισμό ή επιμόλυνση. Σημείωση: Στις περιπτώσεις αυτές, η δοκιμή επαναλαμβάνεται.Εξετάζεται αν υπάρχουν φθορίζοντα κύτταρα με τη χαρακτηριστική μορφολογία της Pseudomonas solanacearum στα φατνία δοκιμής. Η ένταση του φθορισμού πρέπει να είναι ίδια με εκείνη του θετικού μάρτυρα με ίδια αραίωση αντιορού. Κύτταρα με ατελή χρώση ή με ασθενή φθορισμό δεν πρέπει να λαμβάνονται υπόψη, εκτός κι αν υπάρχουν πολλά τέτοια κύτταρα (βλέπε ερμηνεία αποτελεσμάτων της δοκιμής IF).Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμής IF i) Εφόσον σε ένα δείγμα δεν ανευρίσκονται λαμπρώς φθορίζοντα κύτταρα με χαρακτηριστική μορφολογία, η δοκιμή IF είναι αρνητική.ii) Εφόσον σε ένα δείγμα βρίσκονται λαμπρώς φθορίζοντα κύτταρα με χαρακτηριστική μορφολογία, προσδιορίζεται ο μέσος αριθμός κυττάρων ανά πεδίο μικροσκοπίου και υπολογίζεται ο αριθμός των κυττάρων (Ν) ανά ml του αναδιαλυμένου ιζήματος (προσάρτημα 4).Ένας πληθυσμός 10³ περίπου ανά ml αναδιαλυμένο6υ ιξήματος, θεωρείται το όριο ανίχνευσης της δοκιμής IF:- σε δείγματα με Ν &gt; 10³ κύτταρα ανά ml αναδιαλυμένου ιζήματος, η δοκιμή IF θεωρείται θετική,- σε δείγματα με Ν &gt; 10³ κύτταρα ανά ml αναδιαλυμένου ιζήματος, η δοκιμή IF μπορεί να θεωρηθεί ως θετική.iii) Αν παρατηρηθούν μεγάλοι αριθμοί (Ν &gt; 105 κύτταρα ανά ml) κυττάρων με ατελή ή ασθενή φθορισμό, με τον τίτλο του αντιορού, πρέπει να πραγματοποιείται μία δεύτερη δοκιμή:- είτε μία δοκιμή βασισμένη σε μία διαφορετική βιολογική αρχή,- ή επανάληψη της δοκιμής IF, με ένα δεύτερο αντιορό ή με 10 φορές αραιωμένο ίζημα.3. Δοκιμή ELISA (βασίζεται στην εργασία των Robinson-Smith et al., 1995)Χρησιμοποιείται αντιορός για Pseudomonas solanacearum, κατά προτίμηση έναντι φυλής 3, βιοποικιλίας 2. Ο τίτλος προσδιορίζεται σε αιώρημα 106 κυττάρων ανά ml από το ομόλογο στέλεχος Pseudomonas solanacearum.Συνιστάται η χρήση μικρότιτλων πλακών NUNC Polysorp.Περιλαμβάνεται ένας αρνητικός μάρτυρας εκχυλίσματος πατάτας και ένας μάρτυρας από ρυθμιστικό φωσφορικό διάλυμα αλατιού (PBS).Ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιείται αιώρημα &gt; 106 κυττάρων ανά ml από στέλεχος Pseudomonas solanacearum κατάλληλης φυλής/βιοποικιλίας. Η δοκιμή γίνεται με ταυτόσημο τρόπο με εκείνη του ή των δειγμάτων αλλά διαχωρίζεται σαφώς από τα δείγματα στη πλάκα.3.1. 100-200 ϴl του αιωρήματος του ιζήματος φέρονται με σιφώνιο σε ένα μικροφιαλίδιο και θερμαίνονται για 4 λεπτά στους 100 °C. Κατόπιν το μικροφιαλίδιο τοποθετείται σε πάγο.3.2. Προστίθεται ίσος όγκος ανθρακικού ρυθμιστικού διαλύματος επικάλυψης διπλής ιοντικής ισχύος (προσάρτημα 5) και το περιεχόμενο ανακατεύεται σε συσκευή vortex.3.3. Σε δύο τουλάχιστον φατνία της μικρότιτλης πλάκας φέρονται από 100 ϴl του ανωτέρω διαλύματος και επωάζονται για 1 ώρα στους 37 °C ή όλη τη νύκτα στους 4 °C.3.4. Η πλάκα τινάζεται ελαφρά για να απομακρυνθούν τα εκχυλίσματα από τα φατνία. Τα φατνία πλένονται τρεις φορές με PBS-Tween (προσάρτημα 5), αφήνοντας το τελευταίο διάλυμα πλυσίματος στα φατνία για 5 λεπτά τουλάχιστον.3.5. Παρασκευάζεται η κατάλληλη αραίωση αντιορού Pseudomonas solanacearum σε ρυθμιστικό διάλυμα δεσμεύσεως (προσάρτημα 5). Στα φατνία φέρονται 100 ϴl αραίωσης αντιορού και επωάζονται για 1 ώρα στους 37 °C.3.6. Η πλάκα τινάζεται ελαφρά για να απομακρυνθεί ο αντιορός από τα φατνία και τα φατνία πλένονται όπως και προηγουμένως (σημείο 3.4).3.7. Παρασκευάζεται η κατάλληλη αραίωση συμπλόκου αλκαλικής φωσφατάσης σε ρυθμιστικό διάλυμα δεσμεύσεως. Φέρονται στα φατνία 100 ϴl από αυτή και επωάζονται για 1 ώρα στους 37 °C.3.8. Η πλάκα τινάζεται ελαφρά για να απομακρυνθούν τα υπολείμματα του συμπλόκου από τα φατνία και τα φατνία πλένονται όπως και προηγουμένως (σημεία 3.4 και 3.6).3.9. Παρασκευάζεται διάλυμα υποστρώματος αλκαλικής φωσφατάσης (προσάρτημα 5). Φέρονται στα φατνία 100 ϴl από αυτό και ακολουθεί επώαση για 30 λεπτά έως 1 ώρα στο σκοτάδι σε θερμοκρασία εργαστηρίου.3.10. Διαβάζεται η απορρόφηση στα 409 nm.Ερμηνεία της δοκιμής ELISA Η δοκιμή ELISA είναι αρνητική εάν η οπτική πυκνότητα (O.D) του δείγματος είναι &lt; 2 Χ O.D του αρνητικού μάρτυρα.Η δοκιμή ELISA είναι θετική εάν η οπτική πυκνότητα (O.D) του δείγματος είναι &gt; 2 Χ O.D του αρνητικού μάρτυρα.4. Δοκιμή PCR (βασίζεται στην εργασία των Seal et al., 1993)Σημείωση: Κατά τη διάρκεια της παρασκευής του δείγματος καθώς και των υπόλοιπων εργασιών για τη δοκιμή PCR, πρέπει να χρησιμοποιούνται ογκομετρικά ακροστόμια (pipette tips) με φίλτρο.Παρασκευάζεται αιώρημα 106 κυττάρων ανά ml από στέλεχος Pseudomonas solanacearum φυλής 3, βιοποικιλίας 2 ως θετικός μάρτυρας. Η δοκιμή γίνεται με ταυτόσημο τρόπο με εκείνη του ή των δειγμάτων.4.1. 100 ϴl του αιωρήματος του ιζήματος φέρονται με σιφώνιο σε ένα μικροφιαλίδιο.Εναλλακτικώς, 90 ϴl του αιωρήματος μεταφέρονται σε μικροφιαλίδιο περιέχον 10 ϴl NaOH 0,5M. Το περιεχόμενο του φιαλιδίου ανακατεύεται αναποδογυρίζοντας επανειλημμένα πάνω-κάτω το μικροφιαλίδιο.4.2. Το φιαλίδιο θερμαίνεται για 4 λεπτα στους 100 °C και κατόπιν απομακρύνεται αμέσως πάνω σε πάγο.4.3. Παρασκευάζονται δύο τουλάχιστον δεκαδικές αραιώσεις, π.χ.>NUM>1/>DEN>10 και >NUM>1/>DEN>100, ή περισσότερες αν θεωρηθεί απαραίτητο, σε αποστειρωμένο απεσταγμένο ή υπέρ καθαρό νερό (UPW).4.4. Παρασκευάζεται το μείγμα αντίδρασης PCR (προσάρτημα 6) προσθέτοντας σε αποστειρωμένο φιαλίδιο τα παρακάτω συστατικά με την ακόλουθη σειρά:>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Για περισσότερες αντιδράσεις Υπολογίζεται η ποσότητα κάθε συστατικού για τον απαιτούμενο αριθμό αντιδράσεων. Τα συστατικά αναμειγνύονται και 45 ϴl-48 ϴl του μείγματος μεταφέρονται σε αποστειρωμένα φιαλίδια PCR. Τα φιαλίδια με το μείγμα αντίδρασης PCR διατηρούνται σε πάγο.Για όγκο 25 ϴl Η ποσότητα των συστατικών μειώνεται αναλογικά.4.5. Σύνθεση PCR 4.5.1. Προαιρετικό! Τα φιαλίδια με το βρασμένο δείγμα και τον θετικό μάρτυρα υποβάλλονται σε παλμική φυγοκέντρηση.Προστίθενται, με την καθοριζόμενη σειρά, 2-5 ϴl του ή των δειγμάτων, υδατικού μάρτυρα και θετικού μάρτυρα στα φιαλίδια με το μείγμα αντίδρασης PCR. Τα φιαλίδια τοποθετούνται στο θερμικό μπλόκ στη μονάδα θέρμανσης του θερμικού κυκλοποιητή DNA.4.5.2. Ακολουθείται το εξής πρόγραμμα:1 κύκλος από:i) 2 λεπτά στους 96 °C: μετουσίωση του αρχικού DNA50 κύκλοι από:ii) 20 δευτερόλεπτα στους 94 °C: μετουσίωσηiii) 20 δευτερόλεπτα στους 68 °C: προσκόλληση εκκινητώνiv) 30 δευτερόλεπτα στους 72 °C: επέκταση αντιγράφου1 κύκλος από:v) 10 λεπτά στους 72 °C: περαιτέρω επέκταση1 κύκλος συνιστάμενος σε:vi) διατήρηση στους 4 °CΣημείωση: Οι παράμετροι αυτές ισχύουν για θερμικό κυκλοποιητή DNA Perkin Elmer 9600. Άλλοι θερμικοί κυκλοποιητές μπορεί να απαιτούν επίστρωση ορυκτελαίου στα φιαλίδια PCR ή/και τροποποίηση της διάρκειας των σταδίων ii), iii) και iv) στο πρόγραμμα σύνθεσης.4.5.3. Τα φιαλίδια απομακρύνονται από τον θερμικό κυκλοποιητή. Το προϊόν PCR αναλύεται. Εάν αυτό δεν γίνει αμέσως, τα φιαλίδια αποθηκεύονται στους 4 °C για χρήση την ίδια μέρα ή στους -18 °C για αργότερα.4.6. Ανάλυση του προϊόντος PCR Τα τμήματα DNA PCR ανιχνεύονται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αναρόζης και χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο.4.6.1. Παρασκευάζεται κατάλληλη πηκτή αγαρόζης βράζοντας ήπια ποσότητα αγαρόζης σε tris-οξεικό ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης (TAE).4.6.2. Η τηγμένη αγαρόζη ψύχεται στους 50-60 °C, χύνεται στο καλούπι της μονάδας ηλεκτροφόρησης και εισάγεται η χτένα. Η πηκτή αφήνεται να στερεοποιηθεί.4.6.3. Απομακρύνεται η χτένα. Η πηκτή βυθίζεται σε ΤΑΕ έτσι ώστε ίσα-ίσα να καλύπτεται (2-3 mm) από το ρυθμιστικό διάλυμα.4.6.4. 3 ϴl ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης φέρονται πάνω σε παραφίλμ. Προστίθενται 12 ϴl του προϊόντος PCR από τα δείγματα, το θετικό μάρτυρα ή τον υδατικό μάρτυρα και αναμειγνύονται με ελαφρά αναρρόφηση στο ογκομετρικό ακροστόμιο πριν από την φόρτωση στην πηκτή. Οι αναφερόμενοι όγκοι μπορούν να τροποποιηθούν προκειμένου να προσαρμοστούν στη χωρητικότητα των φατνίων στην πηκτή αγαρόζης.4.6.5. Η φόρτωση γίνεται με προσοχή στα φατνία της πηκτής. Σε ένα τουλάχιστον φατνίο φέρεται για λόγους αναφοράς κατάλληλος ιχνηθέτης DNA.4.6.6. Συνδέονται τα καλώδια στη συσκευή ηλεκτροφόρησης και την πηγή τροφοδοσίας. Εφαρμόζεται τάση 5-8 V/cm μέχρις ότου το μέτωπο του ιχνηλάτη δείκτη φθάσει στο 1 cm από το άκρο της πηκτής.4.6.7. Διακόπτεται η τροφοδοσία ρεύματος. Τα καλώδια αποσυνδέονται από τη μονάδα ηλεκτροφόρησης, απομακρύνεται με προσοχή η πηκτή και εμβαπτίζεται σε βρωμιούχο αιθίδιο για 30-45 λεπτα.Σημείωση: Όταν χρησιμοποιούμε βρωμιούχο αιθίδιο, πρέπει να φορούμε πάντοτε γάντια γιατί είναι ισχυρό μεταλλαξιογόνο.4.6.8. Ακολουθεί αποχρωματισμός σε απεσταγμένο νερό για 10-15 λεπτά.4.6.9. Το ή τα συντεθειμένα τμήματα DNA εμφανίζονται με υπεριώδη ακτινοβολία. Το προϊόν PCR του Pseudomonas solanacearum με εκκινητές OLI-1 και Y-2 έχει μήκος 288 bp. Συγκρίνεται σε σχέση με τον ιχνηθέτη DNA και τον θετικό μάρτυρα.Σημείωση: Ο υδατικός μάρτυρας πρέπει σε κάθε περίπτωση να είναι αρνητικός. Εάν είναι θετικός, η δοκιμή επαναλαμβάνεται.4.6.10. Η πηκτή, εφόσον χρειάζεται για το αρχείο, φωτογραφίζεται.4.6.11. Η αυθεντικότητα του συντεθημένου τμήματος DNA επιβεβαιώνεται με ανάλυση με ένζυμο περιορισμού (REA).4.7. Ανάλυση με περιοριστικό ένζυμο (REA) 4.7.1. 8,5 ϴl από το προϊόν PCR (σημείο 4.5.3) μεταφέρονται σε νέο μικροφιαλίδιο. Προστίθεται 1 ϴl 10 Χ ρυθμιστικού διαλύματος του ενζύμου και 0,5 ϴl ένζυμο περιορισμού AvaII.4.7.2. Αναμειγνύονται με ήπια αναρρόφηση στο ακροστόμιο. Εάν στα τοιχώματα του φιαλιδίου παραμείνουν σταγόνες, φυγοκεντρείται σε παλμική μικροφυγόκεντρο. Ακολουθεί επώαση για 1 ώρα στους 37 °C.4.7.3. Το τμήμα DNA που υπέστη πέψη αναλύεται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης όπως προηγουμένως (σημείο 4.6).Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμής PCR Η δοκιμή PCR είναι αρνητική εφόσον δεν ανιχνεύεται το χαρακτηριστικό τμήμα 288 bp και το τμήμα ανιχνεύεται στο θετικό μάρτυρα Pseudomonas solanacearum.Η δοκιμή PCR είναι θετική εάν το τμήμα 288 bp ανιχνεύεται και η ανάλυση REA του συντεθειμένου τμήματος είναι ίδια με εκείνη του θετικού μάρτυρα Pseudomonas solanacearum.5. Εκλεκτική απομόνωση επί στερεού υποστρώματος (βασίζεται στην εργασία των Elphinstone et al., 1996)5.1. Η δοκιμή πραγματοποιείται με κατάλληλη τεχνική αραιώσεων επί στερεού υποστρώματος, π.χ.:i) Παρασκευάζονται δύο τουλάχιστον δεκαδικές αραιώσεις, συγκεκριμένα >NUM>1/>DEN>10 και >NUM>1/>DEN>100 ή περισσότερες αν θεωρηθεί χρήσιμο, του αιωρήματος του ιζήματος σε ρυθμιστικό διάλυμα ιζήματος. Συγκεκριμένος όγκος (50-100 ϴl) του αιωρήματος και κάθε αραίωσης μετρημένος με σιφώνιο φέρεται σε τροποποιημένο εκλεκτικό υπόστρωμα SMSA (προσάρτημα 7) και απλώνεται με μία γυάλινη ράβδο σε όλη την επιφάνεια του υποστρώματος.Εφόσον κρίνεται σκόπιμο, πραγματοποιείται γραμμική εξάπλωση αραίωσης, 10 ϴl αναδιαλυμένου ιζήματος περνώντας κάθε φορά τη βελόνα από φλόγα.ii) Συγκεκριμένος όγκος (50-100 ϴl) του αιωρήματος μετρημένος με σιφώνιο μεταφέρεται σε τροποποιημένο εκλεκτικό υπόστρωμα SMSA και απλώνεται με μία γυάλινη ράβδο σε όλη την επιφάνεια του υποστρώματος. Η ράβδος σύρεται γραμμωτά σε δύο ακόμη τροποποιημένα τρυβλία SMSA χωρίς να την περάσουμε από φλόγα.5.2. Αιώρημα 106 κυττάρων ανά ml από παθογόνο στέλεχος Pseudomonas solanacearum φυλής 3, βιοποικιλίας 2 που παίζει ρόλο θετικού μάρτυρα εξαπλούται, με την ίδια τεχνική, σε μία σειρά ξεχωριστών τρυβλίων τροποποιημένου SMSA.5.3. Τα τρυβλία επωάζονται στους 28 °C. Μετά 3 ημέρες ξεκινά η ανάγνωση των τρυβλίων. Εάν το αποτέλεσμα είναι αρνητικό, αφήνονται να επωαστούν ακόμη μέχρι 6 ημέρες. Οι παθογόνες απομονώσεις Pseudomonas solanacearum αναπτύσσουν γαλακτώδους χροιάς λευκές, επίπεδες, ακανόνιστες και ρευστώδεις αποικίες με διάκριτα ερυθρά προς το πορφυρούν κέντρα που εμφανίζουν εσωτερικές ραβδώσεις ή ελικώσεις.5.4. Οι αποικίες με χαρακτηριστική μορφολία καθαρίζονται με εκ νέου καλλιέργεια σε θρεπτικό υπόστρωμα γενικής χρήσεως (προσάρτημα 1).5.5. Οι καθαρές καλλιέργειες ταυτοποιούνται (μέρος ΙΙ.4.1) και οι καλλιέργειες της Pseudomonas solanacearum επιβαιώνονται με μία δοκιμή παθογένειας (μέρος ΙΙ.4.3).Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμής (εκλεκτικής απομόνωσης επί στερεού υποστρώματος) Η δοκιμή είναι αρνητική εάν δεν απομονωθούν αποικίες βακτηρίων μετά 6 ημέρες ή εάν δεν απομονωθούν χαρακτηριστικές αποικίες Pseudomonas solanacearum υπό την προϋπόθεση ότι δεν υπάρχουν υπόνοιες για παρεμπόδιση από αποικίες άλλων βακτηρίων και χαρακτηριστικές αποικίες της Pseudomonas solanacearum απομονώνονται από τους θετικούς μάρτυρες.Η δοκιμή είναι θετική εάν απομονωθούν χαρακτηριστικές αποικίες Pseudomonas solanacearum.6. Βιοδοκιμή (βασίζεται στην εργασία του Janse, 1988)6.1. Χρησιμοποιούνται 10 προς δοκιμή ευαίσθητα σπορόφυτα τομάτας ή μελιτζάνας ευρισκόμενα στο στάδιο του 3ου πραγματικού φύλλου για κάθε δείγμα. Τα φυτά δεν ποτίζονται για 24 ώρες πριν από τη μόλυνση.6.2. 100 ϴl του αιωρήματος του ιζήματος κατανέμονται μεταξύ των πειραματοφύτων. Τα στελέχη μολύνονται μεταξύ των κοτυληδόνων και σε ένα ή περισσότερα άλλα σημεία.6.3. 10 σπορόφυτα μολύνονται με την ίδια τεχνική με αιώρημα 106 κυττάρων ανά ml από παθογόνο στέλεχος Pseudomonas solanacearum φυλής 3, βιοποικιλίας 2 για να χρησιμεύσουν ως θετικός μάρτυρας και με ρυθμιστικό διάλυμα ιζήματος για να χρησιμεύσουν ως αρνητικός μάρτυρας. Τα φυτά θετικοί μάρτυρες, διαχωρίζονται από τα άλλα φυτά προς αποφυγή επιμολύνσεων.6.4. Τα σπορόφυτα αφήνονται να αναπτυχθούν για 4 εβδομάδες σε θερμοκρασία 22-28 °C με καθημερινό πότισμα και υψηλή σχετική υγρασία. Παρατηρούμε αν θα παρουσιαστούν συμπτώματα μαρασμού, επιναστίας, χλώρωσης ή/και νανισμού.6.5. Από τα προσβεβλημένα φυτά γίνεται απομόνωση (μέρος ΙΙ). Ταυτοποιούνται οι καθαρές καλλιέργειες με χαρακτηριστική μορφολογία (μέρος ΙΙ.4.1) και οι καλλιέργειες της Pseudomonas solanacearum επιβεβαιώνονται με δοκιμή παθογένειας (μέρος ΙΙ.4.3).6.6. Αν θεωρηθεί χρήσιμο, ελέγχεται η απουσία μόλυνσης σε παρτίδες πειροματοφύτων που δεν παρουσιάζουν ένδειξη μόλυνσης. Από κάθε φυτό αφαιρείται τμήμα του στελέχους μήκους 1 cm από σημείο ευρισκόμενο σε απόσταση 2 cm πάνω από το σημείο μόλυνσης. Οι ιστοί ομοιογενοποιούνται σε ρυθμιστικό διαλυμά διαβροχής. Εκτελείται δοκιμή απομόνωσης με την τεχνική των αραιώσεων σε στερεό υπόστρωμα (μέρος ΙΙΙ.5.1). Εάν η δοκιμή αποδειχθεί θετική, οι καθαρές καλλιέργειες με χαρακτηριστική μορφολογία ταυτοποιούνται (μέρος ΙΙ.4.1) και οι καλλιέργειες Pseudomonas solanacearum επιβεβαιώνονται με δοκιμή παθογένειας (μέρος ΙΙ.4.3).Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της βιοδοκιμής Η βιοδοκιμή είναι αρνητική αν τα φυτά δοκιμής δεν είναι προσβεβλημένα από Pseudomonas solanacearum υπό τον όρο ότι η Pseudomonas solanacearum ανιχνεύεται στους θετικούς μάρτυρες.Η βιοδοκιμή είνα θετική αν τα φυτά δοκιμής είναι προσβεβλημένα από Pseudomonas solanacearum.7. Δοκιμή εμπλουτισμού (βασίζεται στην εργασία των Elphinstone et al., 1996)7.1. 100 ϴl του αιωρήματος του ιζήματος μεταφέρονται σε 3 ml τροποποιημένου ζωμού SMSA (προσάρτημα 7).7.2. Επωάζονται για 48 ώρες, εν πάση δε περιπτώσει όχι περισσότερο από 72 ώρες, στους 28 °C διατηρώντας το καπάκι του σωλήνα προσαρμοσμένο χαλαρά για να αερίζονται.7.3. Το καπάκι σφίγγεται και ακολουθεί ανάδευση σε συσκευή vortex. Λαμβάνεται κατάλληλη ποσότητα για τη δοκιμή IF (μέρος ΙΙΙ.2), τη δοκιμή ELISA (μέρος ΙΙΙ.3) ή/και τη δοκιμή PCR (μέρος ΙΙΙ.4).8. Δοκιμή παθογένειας Αναφέρεται στο μέρος ΙΙ.4.3.Προσάρτημα 1 Θρεπτικά υλικά για την απομόνωση και καλλιέργεια της Pseudomonas solanacearum Nutrient Agar (NA)>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Παρασκευάζονται ποσότητες ½ λίτρου από το θρεπτικό υλικό σε φιάλες 1 λίτρου.Διαλύονται τα συστατικά.Το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά.Ακολουθεί ψύξη μέχρι τους 50 °C και κατανέμεται σε τρυβλία.Yeast-Peptone-Glucose-Agar (YPGA)>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Παρασκευάζονται ποσότητες ½ λίτρου από το θρεπτικό υλικό σε φιάλες 1 λίτρου.Διαλύονται τα συστατικά.Το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά.Ακολουθεί ψύξη μέχρι τους 50 °C και κατανέμεται σε τρυβλία.Sucrose Peptone Agar (SPA)>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Παρασκευάζονται ποσότητες ½ λίτρου από το θρεπτικό υλικό σε φιάλες 1 λίτρου.Διαλύονται τα συστατικά και ρυθμίζεται το pH σε μία τιμή από 7,2 έως 7,4, αν είναι απαραίτητο.Το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά.Ακολουθεί ψύξη μέχρι τους 50 °C και κατανέμεται σε τρυβλία.Θρεπτικό υλικό Kelman's tetrazolium>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Παρασκευάζονται ποσότητες ½ λίτρου από το θρεπτικό υλικό σε φιάλες 1 λίτρου.Διαλύονται τα συστατικά.Το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά.Ακολουθεί ψύξη μέχρι τους 50 °C.Προστίθεται υδατικό διάλυμα χλωριούχου τριφαινυλο-τετραζολίου (Sigma), το οποίο έχει αποστειρωθεί με διήθηση από φίλτρο, ώστε να ληφθεί τελική συγκέντρωση 50 mg ανά λίτρο.Το σύνολο κατανέμεται σε τρυβλία.Προσάρτημα 2 Υλικά για την προετοιμασία του δείγματος δοκιμής Ρυθμιστικό διάλυμα διαβροχής: Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ιόντων 50 mM, pH 7,0Το εν λόγω ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιείται για τη διαβροχή ιστών.>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Διαλύονται τα συστατικά και ελέγχεται η τιμή του pH. Κατανέμονται κατάλληλες ποσότητες ανάλογα με τις ανάγκες.Το διάλυμα αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά.Κατά τη διεξαγωγή της δοκιμής PCR συνιστάται η προσθήκη διαλύματος poly vinyl pyrrolidone-40 000 (PVP-40) 5 % προκειμένου να περιοριστεί η παρεμόδιση της σύνθεσης DNA λόγω της παρουσίας αρωματικών μορίων στο εκχύλισμα.Για τη διαβροχή των τεμαχίων των ιστών των γεωμήλων, συνιστάται η προσθήκη αντικροκιδωτικού, αντιαφριστικού παράγοντα ή αντιοξειδωτικού με την εφαρμογή της διαδικασίας ομογενοποίησης Waring Blender ή Ultra Thurrax.>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Το υλικό αυτό αποστειρώνεται ξεχωριστά σε αυτόκαυστο. Ακολουθεί προσθήκη (στο υλικό διαβροχής), έως ότου ληφθεί η επιθυμητή συγκέντρωση.Ρυθμιστικό διάλυμα ιζήματος: Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ιόντων 10 mM, pH 7,2Το εν λόγω ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιείται για τον επανασχηματισμό αιωρήματος και την αραίωση των ιζημάτων των κώνων του σημείου πρόσφυσης του στολονίου των γεωμήλων.>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Διαλύονται τα συστατικά και ελέγχεται η τιμή του pH. Κατανέμονται κατάλληλες πσότητες ανάλογα με τις ανάγκες.Το διάλυμα αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά.Προσάρτημα 3 Υλικά για τη δοκιμή IF Ρυθμιστικό διάλυμα IF: φυσιολογικός ορός με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ιόντων 10 mM (PBS), pH 7,2Το εν λόγω ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιείται για την αραίωση των αντιορών.>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Διαλύονται τα συστατικά και ελέγχεται η τιμή του pH. Κατανέμονται κατάλληλες ποσότητες ανάλογα με τις ανάγκες.Το διάλυμα αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά.Ρυθμιστικό διάλυμα IF-TweenΤο εν λόγω ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιείται για το πλύσιμο των πλακών. Προστίθεται 0,1 % Tween 20 στο ρυθμιστικό διάλυμα IF.0,1 M φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα γλυκερίνης, pH 7,6Αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιείται ως ρευστό προσήλωσης στα φατνία της πλάκας της IF για την ενίσχυση του φθορισμού.>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Προσάρτημα 4 Προσδιορισμός του βαθμού μόλυνσης στη δοκιμή IF Εμβαδόν (S) του φατνίου μιας πολυφατνιακής αντικειμενοφόρου:S = >NUM>π D²>DEN>4>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ> (1)Εμβαδόν (s) του οπτικού πεδίου του αντικειμενικού:s = >NUM>π d²>DEN>4>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ> (2)Το d υπολογίζεται είτε με απευθείας μέτρηση είτε με τους ακόλουθους τύπους:s = >NUM>π i²>DEN>G² K² Χ 4 (3)>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>από τον (2)d = &radic;>NUM>4 s>DEN>π (4)από τον (3)d = &radic;>NUM>4 Χ >NUM>π i²>DEN>G² K² Χ 4>DEN>p = >NUM>ι>DEN>GKΜετράται ο αριθμός των τυπικών φθοριζόντων κυττάρων ανά πεδίο (c).Υπολογίζεται ο αριθμός των τυπικών φθοριζόντων κυττάρων ανά φατνίο (C).C = c >NUM>S>DEN>sΥπολογίζεται ο αριθμός τυπικών φθοριζόντων κυττάρων ανά ml ιζήματος (N)N = C Χ >NUM>1 000>DEN>yΧ F>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Προσάρτημα 5 Υλικά για τη δοκιμή ELISA Ανθρακικό ρυθμιστικό διάλυμα επικάλυψης, διπλής ισχύος, pH 9,6>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Διαλύονται τα συστατικά και ελέγχεται η τιμή του pH. Κατανέμονται κατάλληλες ποσότητες ανάλογα με τις ανάγκες.Το διάλυμα αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά.Αν το εκχύλισμα περιέχει μεγάλο ποσοστό αρωματικών μορίων, μπορεί να προστεθεί, ως αντιοξειδωτικό, θειώδες νάτριο σε τελική συγκέντρωση 0,2 %.Φυσιολογικός ορός με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ιόντων 10 Χ (PBS), pH 7,4>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Διαλύονται τα συστατικά και ελέγχεται η τιμή του pH. Κατανέμονται κατάλληλες ποσότητες ανάλογα με τις ανάγκες.Το διάλυμα αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά.Φυσιολογικός ορός με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ιόντων-Tween (PBS-T)>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Ρυθμιστικό διάλυμα φραγμού (αντισωμάτων) (πρέπει να έχει παρασκευαστεί πρόσφατα)>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Διάλυμα υποστρώματος αλκαλικής φωσφατάσης, pH 9,8>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Αναμειγνύονται και ρυθμίζεται η τιμή του pH 9,8 με πυκνό HCl.Συμπληρώνεται αποσταγμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 1 λίτρου.Προστίθενται 0,2 g MgCl2.Διαλύονται 2 δισκία υποστρώματος φωσφατάσης των 5 mg (Sigma) ανά 15 ml διαλύματος.Προσάρτημα 6 Υλικά για τη δοκιμή PCR Ακολουθία ολιγονουκλεοτιδίων εκκινητών:>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Για τα υλικά βλέπε την εργασία των Seal et al. (1993).Προσάρτημα 7 Υλικά για την εκλεκτική απομόνωση επί στερεού θρεπτικού υποστρώματος και δοκιμές εμπλουτισμού Εκλεκτικό θρεπτικό υλικό SMSA (Engelbrecht 1994, όπως τροποποιήθηκε από τον Elphinstone et al., 1996)Βασικό θρεπτικό υλικό>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Παρασκευάζονται ποσότητες ½ λίτρου από το θρεπτικό υλικό σε φιάλες 1 λίτρου.Διαλύονται τα συστατικά και ελέγχεται η τιμή του pH. Πριν από την αποστείρωση σε αυτόκαυστο ρυθμίζεται το pH στην τιμή 6,5, αν κρίνεται απαραίτητο. Η Pseudomonas solanacearum δεν αναπτύσσεται σωστά στο θρεπτικό υλικό, αν το pH είναι μεγαλύτερο του 7,0. Το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 °C επί 15 λεπτά.Ακολουθεί ψύξη μέχρι τους 50 °C.Προστίθενται τα ακόλουθα συστατικά (όλα της Sigma) ώστε αν ληφθούν οι προδιαγεγραμμένες τελικές συγκεντρώσεις.>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>Τα συστατικά διαλύονται σε αιθανόλη 70 % μέχρι να ληφθούν οι τελικές συγκεντρώσεις για τον όγκο του θρεπτικού υλικού που πρόκειται να παρασκευασθεί. Ορισμένα συστατικά, όπως η πολυμιξίνη Β και η χλωραμφενικόλη απαιτούν ελαφρά θέρμανση και ανάδευση.Ζωμός SMSA (Elphinstone et al., 1996)Παρασκευάζεται όπως και το SMSA εκλεκτικό υλικό, αλλά παραλείπεται το άγαρ. Κατανέμεται σε ποσότητες των 3 ml σε σωλήνες Universal μίας χρήσης των 30 ml.Βιβλιογραφία Buddenhagen, I.W.; Sequeira, L. and Kelman, A., 1962, Description of races in Pseudomonas solanacearum. Phytopathology 52, 726.Cook, D.; Elizabeth B. and Sequeira L., 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphism with DNA probes that specify virulence and hypersensitive respons. Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 113-121.Dinesen I.G. and DeBoer, S.H., 1995. Extraction of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus from composite samples of potato tubers. American Potato Journal 72, 133-142.Elphinstone, J.G.; Hennessy, J.; Wilson, J. and Stead, D.E., 1996. Sensitivity of different methods for the detection of Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26.Engelbrecht, M.C., 1994. Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. ACIAR Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5.Hayward, A.C., 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27, 265-277.Hayward, A.C., 1994. Systematic and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related bacteria. In: Bacterial Wilt: the disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum (eds. A.C. Hayward and G.L. Hartman) CAB International Oxford, 127-135.Janse, J.D., 1988. A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. EPPO Bulletin 18, 343-351.Janse, J.D., 1991. Infra- and intraspecific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14, 335-345.Kelman, A., 1954. The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 64, 293-695.Lelliot, R.A. and Stead, D.E., 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. (T.F. Preece ed.) Blackwell Scientific Publications, Oxford. 216 p.Louws, F.J.; Fulbright, D.W.; Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85, 528-536.Lozano, J.C. and Sequeira, L., 1970. Differentiation of races of Pseudomonas solanacearum by a leaf infiltration technique. Phytopathology 60, 838.Mirza, M.S.; Rademaker, J.W.L.; Janse, J.D. and Akkermans, A.D.L., 1993, Specific 16S ribosomal RNA targeted oligonucleotide probe against Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Canadian Journal of Microbiology 39, 1029-1034.Robinson-Smith, A.; Jones, P.; Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D., 1995. Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.Seal, S.E.; Jackson, L.A.; Young, J.P.W. and Daniels, M.J., 1993. Differentiation of Pseudomonas solanacearum, P. syzygii, P. picketti and the blood disease bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology 139, 1587-1594.Smith, J.J.; Offord, L.C.; Holderness, M. and Saddler, G.S., 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61, 4262-4268.Stead, D.E., 1992a. Techniques for detecting and identifying plant pathogenic bacteria. In: Techniques for rapid detection of plant pathogens (eds. J.M. Duncan and L. Torrance). Blackwell Scientific Publications, Oxford, 76-111.Stead, D.E., 1992b. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42, 281-295.Van Beuningen, A.; Derks, H. and Janse J.D., 1995. Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in-situ hybridisation (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Zόchtungsforschung 2, 266-269.