CELEX: 31973L0046
Language: cs
Date: 1972-12-05 00:00:00
Title: Čtvrtá Směrnice Komise ze dne 5. prosince 1972, kterou se stanoví analytické metody Společenství pro úřední kontrolu krmiv

Důležité právní upozornění

|

31973L0046

Čtvrtá Směrnice Komise ze dne 5. prosince 1972, kterou se stanoví analytické metody Společenství pro úřední kontrolu krmiv  

Úřední věstník L 083 , 30/03/1973 S. 0021 - 0034 Finské zvláštní vydání: Kapitola 3 Svazek 5 S. 0115  Řecké zvláštní vydání: Kapitola 03 Svazek 9 S. 0114  Švédské zvláštní vydání: Kapitola 3 Svazek 5 S. 0115  Španělské zvláštní vydání: Kapitola 03 Svazek 6 S. 0230  Portugalské zvláštní vydání Kapitola 03 Svazek 6 S. 0230  CS.ES Kapitola 03 Svazek 02 S. 12  - 25 ET.ES Kapitola 03 Svazek 02 S. 12  - 25 HU.ES Kapitola 03 Svazek 02 S. 12  - 25 LT.ES Kapitola 03 Svazek 02 S. 12  - 25 LV.ES Kapitola 03 Svazek 02 S. 12  - 25 MT.ES Kapitola 03 Svazek 02 S. 12  - 25 PL.ES Kapitola 03 Svazek 02 S. 12  - 25 SK.ES Kapitola 03 Svazek 02 S. 12  - 25 SL.ES Kapitola 03 Svazek 02 S. 12  - 25

		Čtvrtá Směrnice Komiseze dne 5. prosince 1972,kterou se stanoví analytické metody Společenství pro úřední kontrolu krmiv(73/46/EHS)KOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ,s ohledem na Smlouvu o založení Evropského hospodářského společenství,s ohledem na směrnici Rady ze dne 20. července 1970 o zavedení metod odběru vzorků a analytických metod Společenství pro úřední kontrolu krmiv [1], ve znění směrnice 72/275/EHS ze dne 20. července 1972 [2], a zejména na článek 2 uvedené směrnice,vzhledem k tomu, že ona směrnice požaduje, aby byly oficiální kontroly krmiv prováděny za použití metod Společenství pro vzorkování a analýzy za účelem kontroly souladu požadavků stanovených zákonem, nařízením nebo správním předpisem týkajícím se kvality a složení krmiv;vzhledem k tomu, že směrnice 71/250/EHS ze dne 15. července 1971 [3], 71/393/EHS ze dne 18. listopadu 1971 [4] a 72/199/EHS ze dne 27. dubna 1972 [5] již stanovily řadu analytických metod Společenství; vzhledem k tomu, že postup prací od té doby činí vhodným přijmout čtvrtou sérii metod;vzhledem k tomu, že opatření uvedená v této směrnici jsou v souladu se stanoviskem Stálého výboru pro krmiva;PŘIJALA TUTO SMĚRNICI:Článek 1Členské státy stanoví, aby byly analýzy pro oficiální kontrolu krmiv, co se týče jejich obsahů vlhkosti u živočišných a rostlinných tuků a olejů a obsahů hořčíku a hrubé vlákniny v krmivech, prováděny podle metod popsaných v příloze I této směrnice.Obecná ustanovení stanovená v části 1 (úvod) přílohy první směrnice Komise 71/250/EHS ze dne 15. června 1971 se vztahují i na metody popsané v příloze I této směrnice.Článek 2Členské státy stanoví, aby byly analýzy pro oficiální kontrolu krmiv, co se týče jejich obsahů retinolu (vitamín A), thiaminu (aneurin, vitamín B1), askorbové a dehydroaskorbové kyseliny (vitamín C), prováděny podle metod popsaných v příloze II této směrnice.Obecná ustanovení stanovená v části 1 (úvod) přílohy první směrnice Komise č. 71/250/EHS ze dne 15. června 1971 se, s výjimkou části týkající se přípravy vzorku, jež má být analyzován, vztahují i na metody popsané v příloze II této směrnice.Článek 3Členské státy uvedou v účinnost právní a správní předpisy nezbytné pro dosažení souladu s touto směrnicí nejpozději od 1. ledna 1974. Neprodleně o nich uvědomí Komisi.Článek 4Tato směrnice je určena členským státům.V Bruselu dne 5. prosince 1972.Za KomisiS. L. Mansholtpředseda[1] Úř. věst. L 170, 3.8.1970, s. 2.[2] Úř. věst. L 171, 29.7.1972, s. 39.[3] Úř. věst. L 155, 12.7.1971, s. 13.[4] Úř. věst. L 279, 20.12.1971, s. 7.[5] Úř. věst. L 123, 29.5.1972, s. 6.--------------------------------------------------PŘÍLOHA I1. STANOVENÍ VLHKOSTI V ŽIVOČIŠNÝCH A ROSTLINNÝCH TUCÍCH A OLEJÍCH1. Účel a rozsahTato metoda umožňuje stanovit obsah vody a těkavých látek v živočišných a rostlinných tucích a olejích.2. PrincipVzorek se suší do konstantní hmotnosti při 103 oC. Ztráta hmotnosti se stanoví vážením.3. Přístroje3.1 Miska s plochým dnem z nekorozního materiálu, 8 až 9 cm v průměru a přibližně 3 cm vysoká.3.2 Rtuťový teploměr se zesílenou baňkou a expanzní trubicí na horním konci, odstupňovaný přibližně od 80 oC po nejméně 110 oC, a přibližně 10 cm dlouhý.3.3 Písková lázeň nebo elektrická varná plotýnka.3.4 Exsikátor obsahující výkonné sušící činidlo.3.5 Analytické váhy.4. PostupOdvažte s přesností na mg přibližně 20 g homogenizovaného vzorku do suché, odvážené misky (3.1) s teploměrem (3.2). Zahřejte pískovou lázeň nebo plotýnku (3.3) za stálého míchání teploměrem tak, aby teplota dosáhla 90 oC během asi 7 minut.Snižte ohřev a sledujte frekvenci, se kterou vystupují bubliny ze dna misky. Teplota nesmí překročit 105 oC. Pokračujte v míchání ode dna nádoby, dokud se nepřestanou tvořit bubliny.Aby bylo zajištěno úplné odstranění vlhkosti, zahřejte několikrát na 103 oC ± 2 oC, mezi následnými ohřevy ochlaďte na 93 oC. Potom nechejte vychladnout na pokojovou teplotu v exsikátoru (3.4) a zvažte. Opakujte tuto operaci, dokud ztráta hmoty mezi dvěma váženími již nepřekračuje 2 mg.Poznámka:Vzestup hmotnosti vzorku po opakovaném ohřevu naznačuje oxidaci tuku, v takovém případě počítáme výsledek z vážení provedeného okamžitě před tím, než se hmotnost začala zvětšovat.5. Výpočet výsledkůObsah vlhkosti, jako procento vzorku, je dán následující rovnicí:·Mkde:M0 = hmota testovaného vzorku v gramech;M1 = hmota misky s obsahem v gramech před ohřevem;M2 = hmota misky s obsahem v gramech po ohřevu.Výsledky nižší než 0,05 % se musejí zaznamenávat jako "nižší než 0,05 %".OpakovatelnostRozdíl ve vlhkosti mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit 0,05 % v absolutní hodnotě.2. STANOVENÍ HOŘČÍKU— atomovou absorpční spektrofotometrií —1. Účel a pole působnostiTato metoda umožňuje stanovit množství hořčíku v krmivech. Je zvláště vhodná pro stanovení obsahu hořčíku nižšího než 5 %.2. PrincipVzorek je zpopelněn a rozpuštěn ve zředěné kyselině chlorovodíkové. Pokud neobsahuje organické látky, je rozpuštěn přímo ve zředěné kyselině chlorovodíkové. Roztok se rozředí a obsah hořčíku se stanoví atomovou absorpční spektrofotometrií při vlnové délce 285,2 nm.3. Chemikálie3.1 Kyselina chlorovodíková p.a. d: 1,16.3.2 Koncentrovaná kyselina chlorovodíková p.a. d: 1,19.3.3 Hořčíkový pásek nebo drát, nebo MgSO4 7H2O, sušený za pokojové teploty.3.4 Roztok soli stroncia (chlorid nebo dusičnan) 2,5 % (76,08 g SrCl2 6H2O p.a., nebo 60,38 g Sr(No3)2 p.a.).3.5 Standardní roztok hořčíku: odvažte s přesností na mg 1 g hořčíku (3.3), u kterého byla předem opatrně odstraněna oxidační vrstva, nebo odpovídající množství (10,143 g) MgSO47H2O (3.3). Vložte do 1000 ml odměrné baňky, přidejte 80 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1), nechejte rozpustit a doplňte do 1000 ml vodou. 1 ml tohoto roztoku obsahuje 1,000 mg hořčíku.4. Přístroje4.1 Platinové, křemíkové nebo porcelánové spalovací kelímky.4.2 Termostaticky řízená elektrická muflová pec.4.3 Atomový absorpční spektrofotometr.5. Postup5.1 Příprava roztoku vzorku5.1.1 Krmiva složená výlučně z minerálních látekOdvažte s přesností na mg 5 g vzorku do 500 ml odměrné baňky s 250 až 300 ml vody. Přidejte 40 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1), uveďte do varu a udržujte kapalinu při mírném varu po dobu 30 minut. Nechejte vychladnout, doplňte vodou na objem, promíchejte a přefiltrujte do suché kádinky přes suchý skládaný filtr. Vyřaďte prvních 30 ml filtrátu. V přítomnosti křemíku rozpusťte 5 g vzorku v dostatečném množství (15-30 ml) kyseliny chlorovodíkové (3.2), odpařte do sucha na vodní lázni a vložte na jednu hodinu do sušárny o 105 oC. Pokračujte, jak je uvedeno od třetí věty v 5.1.2.5.1.2 Krmiva složená převážně z minerálních látekOdvažte s přesností na mg 5 g vzorku do kelímku a zpopelněte při 550 oC v muflové peci, dokud není získán popel, který je bez uhlíkatých částic, a nechejte vychladnout. Aby byl odstraněn křemík, přidejte do popela dostatečné množství (15-30 ml) kyseliny chlorovodíkové (3.2), odpařte do sucha na vodní lázni a vložte na jednu hodinu do sušárny o 105 oC. Zbytek rozpusťte 10 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1) a převeďte do 500 ml odměrné baňky za užití horké vody. Nechejte vychladnout a doplňte na objem vodou. Promíchejte a přefiltrujte do suché kádinky přes suchý skládaný filtr. Vyřaďte prvních 30 ml filtrátu.5.1.3 Krmiva složená převážně z organických látekOdvažte s přesností na mg 5 g vzorku do kelímku a zpopelněte při 550 oC v muflové peci, dokud není získán popel, který je bez uhlíkatých částic. Popel ošetřete 5 ml kyseliny chlorovodíkové (3.2), odpařte do sucha na vodní lázni a převeďte na jednu hodinu do sušárny o 105 oC, aby se sloučeniny křemíku staly nerozpustnými. Popel ošetřete 5 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1), převeďte do 250 ml odměrné baňky za užití horké vody, uveďte do varu, nechejte vychladnout a doplňte na objem vodou. Promíchejte a přefiltrujte do suché kádinky přes suchý skládaný filtr. Vyřaďte prvních 30 ml filtrátu.5.2 Měření atomovou absorpcíRozředěním standardního roztoku (3.5) vodou připravte nejméně 5 referenčních roztoků o vzrůstající koncentraci odpovídající optimálnímu rozsahu měření spektrofotometru. Přidejte do každého roztoku 10 ml roztoku soli stroncia (3.4) a potom doplňte objem do 100 ml vodou. Rozřeďte vodou jednu alikvotní část filtrátu získaného podle 5.1.1, 5.1.2 nebo 5.1.3 tak, že se získá koncentrace hořčíku, která je v úrovni limitů koncentrace referenčních roztoků. Koncentrace kyseliny chlorovodíkové tohoto roztoku nesmí překročit 0,4 N. Přidejte 10 ml roztoku soli stroncia (3.4) a potom doplňte objem do 100 ml vodou. Změřte absorpci roztoku, který má být stanoven, a referenčních roztoků při vlnové délce 285,2 nm.6. Výpočet výsledkůVypočtěte množství hořčíku ve vzorku porovnáním s referenčními vzorky. Výsledek vyjádřete jako procento vzorku.OpakovatelnostRozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit 5 % rel.3. STANOVENÍ HRUBÉ VLÁKNINY1. Účel a rozsahTato metoda umožňuje stanovit v krmivu obsah tukuprostých organických látek, jež jsou nerozpustné v kyselých a zásaditých médiích a jsou konvenčně označeny jako hrubá vláknina.2. PrincipOdtučněný vzorek, kde je to třeba, je ošetřován postupně vroucími roztoky kyseliny sírové a hydroxidu draselného stanovených koncentrací. Zbytek je oddělen filtrací za přítomnosti azbestu, promýván, usušen, zvážen a zpopelněn při 900 oC. Ztráta váhy vyplývající ze zpopelnění odpovídá přítomnosti hrubé vlákniny v testovaném vzorku.3. Chemikálie3.1 Kyselina sírová 0,26 N.3.2 Ošetřený azbest: přidejte k azbestu typu užívanému s Goochovým kelímkem přibližně 5 násobek jeho váhy zředěné kyseliny chlorovodíkové (1 díl kyseliny chlorovodíkové, d: 1,19 + 3 díly vody). Vařte směs přibližně 45 minut, nechejte vychladnout, přefiltrujte přes Buchnerovu nálevku. Promývejte zbytek nejdříve vodou, dokud kyselina chlorovodíková nezmizí z promývací vody, a potom acetonem (3.6). Vysušte azbest v sušárně a potom spalujte 2 hodiny při 900 oC. Nechejte vychladnout a uchovávejte v zazátkované láhvi. Tímto způsobem ošetřený azbest může být použit několikrát. Musí splňovat požadavky dané v bodě 5, pokud se týče slepého pokusu.3.3 Protipěnící emulse (tj. silikon).3.4 Roztok hydroxidu draselného 0,23 N.3.5 Kyselina chlorovodíková 0,5 N.3.6 Aceton.3.7 Diethyether.4. Přístroje4.1 Kádinky o objemu alespoň 600 ml s označením úrovně 200 ml.4.2 Porcelánové kotouče přibližně 80 mm v průměru a přibližně 4 mm silné, perforované přibližně 32 otvory, každý přibližně o průměru 4 mm.4.3 Vakuové lahve uzavřené gumovými zátkami o objemu přibližně 2 litry s označením úrovně 800 ml a uzpůsobené pro skleněné nálevky 120 mm v průměru.4.4 Filtrační desky přibližně 40 mm v průměru a přibližně 4 mm silné se skosenými okraji uzpůsobenými pro kužel nálevky (4.3), perforované přibližně 16 otvory, každá o průměru přibližně 4 mm a pokryté drátěnou síťovinou, velikost ok přibližně 1 mm. Desky i síťovina musejí být odolné proti kyselinám a zásadám.4.5 Platinové nebo křemíkové spalovací kelímky.4.6 Elektrická muflová pec regulovaná termostatem.4.7 Exsikátor.4.8 Asbestový filtr: Suspendujte 2,0 g azbestu (3.2) ve 100 ml vody.Filtrujte za vakua přes filtrační desky pokryté drátěnou síťovinou (4.4) a umístněné v nálevce vakuové lahve (4.3). Zachyťte filtrát a filtrujte ještě jednou přes stejný filtr. Vyřaďte filtrát.5. PostupOdvažte s přesností na mg 3 g vzorku a 2 g ošetřeného azbestu (3.2) do kádinky (4.1), přidejte 200 ml kyseliny sírové (3.1) a několik kapek protipěnící emulse (3.3). Uveďte rychle do varu a nechejte vařit přesně 30 minut. Pro udržení konstantního objemu zakryjte kádinku chladícím zařízením jako je 500 ml láhev s kulatým dnem, ve které cirkuluje studená voda. Zastavte var přidáním přibližně 50 ml studené vody a filtrujte okamžitě za vakua přes předem připravený azbestový filtr, jak je uvedeno ve 4.8.Vymývejte zbytek pěti dávkami přibližně 100 ml velmi horké vody, aby se získal konečný objem filtrátu 800 ml. Přeneste zbytek kvantitativně do kádinky (4.1), která byla nejdříve vybavena porcelánovým kotoučem (4.2) pro regulaci varu. Přidejte 200 ml roztoku hydroxidu draselného (3.4). Uveďte rychle do varu a nechejte vařit přesně 30 minut. Přidejte přibližně 50 ml studené vody a přefiltrujte ihned za vakua přes čerstvý předem připravený azbestový filtr, jak je uvedeno ve 4.8. Vymývejte zbytek velmi horkou vodou, dokud není vymývací voda neutrální (testujte lakmusovým papírkem), potom 3krát acetonem (3.6) (přibližně 100 ml acetonu celkem).Přeneste zbytek kvantitativně do spalovacího kelímku (4.5), rozdrťte, pokud je to potřeba, a usušte do konstantní hmotnosti v sušárně při 130 oC.Nechejte vychladnout v exsikátoru (4.7) a rychle zvažte.Vložte kelímek do muflové pece (4.6) a nechejte zpopelnit po dobu 30 minut při 900 oC. Nechejte vychladnout v exsikátoru (4.7) a rychle zvažte.Proveďte slepý pokusza použití stejného postupu u ošetřeného azbestu (3.2), ale bez vzorku. Ztráta váhy, vyplývající ze zpopelnění 6 g azbestu, nesmí překročit 10 mg.6. Výpočet výsledkůObsah hrubé vlákniny, jako procento vzorku, je dán poměrem:· 100kde:a = ztráta váhy po zpopelnění během stanovení;b = ztráta váhy po zpopelnění během slepého pokusu.OpakovatelnostRozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit:0,3 v absolutní hodnotě u obsahů hrubé vlákniny nižších než 10 %;3 % rel. u obsahů hrubé vlákniny rovných nebo větších než 10 %.7. Poznámky7.1 Krmiva obsahující více než 10 % olejů a tuků musí být před analýzou odtučněna diethyletherem (3.7). Pro provedení odtučnění vložte testovaný vzorek (3 g s přesností na mg) na azbestový filtr (4.8). Zalijte třikrát přibližně 50 ml diethyletheru (3.7) a pokaždé opatrně filtrujte za vakua. Převeďte odtučněný testovaný vzorek a azbest kvantitativně do kádinky (4.1) a pokračujte v analýze, jak je uvedeno v bodě 5.7.2 Krmiva obsahující oleje a tuky, jež nemohou být extrahovány přímo, musí být odtučněna jak uvedeno v 7.1 a následně potom, co bylo provedeno promytí kyseliny ze zbytku.Pro provedení odtučnění promyjte zbytek třikrát acetonem (3.6) (100 ml celkem), potom třikrát 50 ml diethyletheru (3.7). Potom převeďte zbytek kvantitativně do kádinky (4.1) a pokračujte v analýze, jak je uvedeno ve druhém odstavci bodu 5 (ošetření roztokem hydroxidu draselného).7.3 Pokud jsou krmiva bohatá na vápník (více než 2 % vápníku), vložte testovaný vzorek (3 g s přesností na mg) do kádinky (4.1) se 100 ml kyseliny chlorovodíkové 0,5 N (3.5) a nechejte stát v chladnu po dobu 5 minut. Přefiltrujte okamžitě a promyjte studenou vodou. Jako filtr použijte 2,0 g azbestu určeného pro var s kyselinou sírovou. Pokud se filtrace ukáže být obtížnou, rozřeďte suspensi acetonem (3.6). Potom postupujte tak, jak uvedeno v bodě 5.--------------------------------------------------PŘÍLOHA II1. STANOVENÍ RETINOLU (VITAMÍN A)1. Účel a rozsahTato metoda umožňuje stanovit množství retinolu (vitamín A) v krmivech, koncentrátech a premixech. Limit detekce je 10000 IU/kg pro vysoce pigmentovaná krmiva a 4000 IU/kg pro ostatní [1]. Produkty jsou rozděleny do dvou skupin, podle jejich předpokládaného obsahu retinolu:Skupina A: obsahy nižší než 200000 IU/kg;Skupina B: obsahy rovnající se nebo vyšší než 200000 IU/kg.2. PrincipVzorek je hydrolyzován za horka roztokem hydroxidu draselného v ethanolovém médiu a za přítomnosti antioxidantu nebo v dusíkaté atmosféře. Směs je extrahována 1,2-dichlorethanem. Extrakt je odpařen do sucha a ošetřen petroletherem. Roztok je chromatografován na koloně oxidu hlinitého (u produktů skupiny B je chromatografie požadována pouze v určitých případech). U produktů skupiny A je retinol stanoven spektrofotometricky při 610 nm po vytvoření barevného komplexu podle Carr-Priceovy reakce; u produktů skupiny B spektrofotometricky v UV oblasti při 325 nm.3. Chemikáliea) užívané pro analýzu produktů skupin A a B3.1 96 % (V/V) ethanol.3.2 10 % (váhově vzhledem k objemu) roztok askorbanu sodného p.a. nebo3.3 čištěný dusík.3.4 50 % (váhově vzhledem k objemu) roztok hydroxidu draselného p.a.3.5 1 N roztok hydroxidu draselného p.a.3.6 0,5 N roztok hydroxidu draselného p.a.3.7 1,2-dichlorethan p.a.3.8 Petrolether, rozsah varu: 30–50 oC. Pokud je to potřeba, přečistěte následujícím způsobem: míchejte 1000 ml petroletheru se 20 ml dávkami koncentrované kyseliny sírové, dokud zůstává kyselina bezbarvá. Odstraňte kyselinu a promývejte petrolether postupně 500 ml vody, dvakrát 250 ml 10 % (váhově vzhledem k objemu) roztoku hydroxidu sodného a třikrát 500 ml vody. Odstraňte vodnatou vrstvu, odsušte petrolether po dobu 1 hodiny přes aktivní uhlí a bezvodý síran sodný, přefiltrujte a destilujte.3.9 Oxid hlinitý, standardizovaný podle Brockmanna: žíhejte po dobu 8 hodin při 750 oC, vychlaďte v exsikátoru a uskladněte v láhvi z hnědého skla vybavené zábrusovou skleněnou zátkou. Před použitím ve chromatografii zvlhčete následovně: do lahve z hnědého skla vložte 10 g oxidu hlinitého a 0,7 ml vody, uzavřete zátkou, zahřívejte po dobu 5 minut v lázni s vroucí vodou za současného protřepávání. Nechejte vychladnout. Ověřte aktivitu takto připraveného hliníku pomocí známého množství retinolu (3.17) (cca 500 IU) podle postupu uvedeného v 5.3 a 5.4 a kontrolním testem.3.10 Bázický oxid hlinitý, stupeň aktivity 1 (Woelm, Merck nebo ekvivalentní).3.11 Čistý diethylether. Odstraňte peroxidy a stopy vody chromatograficky na koloně bázického oxidu hlinitého (3.10). (25 g oxidu hlinitého na 250 ml diethyletheru.)3.12 Roztoky petroletheru (3.8) ve 4, 8, 12, 16 a 20 % (V/V) diethyletheru (3.11).3.13 0,5 mol/l roztok síranu sodného v 70 % (V/V) glycerinu připravený ze síranu sodného p.a.b) užívané výlučně pro analýzu produktů skupiny A3.14 Krystalizaceschopný benzen p.a.3.15 Chloroform p.a. Odstraňte ethanol, fosgen a stopy vody chromatograficky na koloně bázického oxidu hlinitého (3.10) (50 g oxidu hlinitého na 200 ml chloroformu; doporučuje se chromatografovat prvních 50 ml eluátu podruhé).3.16 Carr-Priceovo činidlo: míchejte přibližně 25 g chloridu antimonitého p.a. (udržujte v exsikátoru) se 100 ml chloroformu (3.15), dokud není roztok nasycený. Malá usazenina chloridu antimonitého nečiní problém. Přidejte 2 ml acethanhydridu p.a. Udržujte v chladničce v láhvi z hnědého skla se skleněnou zábrusovou zátkou. Roztok má trvanlivost několik týdnů.3.17 Retinol – spektrofotometricky standardizovaný.c) užívané výlučně pro analýzu produktů skupiny B3.18 Isopropanol pro chromatografii.4. Přístroje4.1 Vodní lázeň.4.2 Vakuová odparka s kulatými lahvemi o různém objemu.4.3 Skleněné chromatografické trubice (délka: 300 mm; vnitřní průměr: okolo 13 mm).4.4 Spektrofotometr s 10ml kyvetami. Měření v oblasti UV vyžadují křemenné kyvety.4.5 UV lampy vhodné pro 365 nm.5. PostupPoznámka:Všechny postupy musejí být prováděny mimo přímé světlo, pokud je to potřeba, v zařízení z hnědého skla.5.1 Testovaný vzorekZ jemně rozmělněného vzorku odeberte testovaný vzorek v poměru k předpokládanému obsahu retinolu, takto:0,1–1,0 g pro koncentráty (obsahy větší než 20000 IU/g);3,0–5,0 g pro premixy (obsahy mezi 400 a 20000 IU/g);10–20 g pro minerální směsi;30 g pro produkty skupiny A.Ihned umístněte testovaný vzorek do 500 ml láhve se skleněnou zábrusovou zátkou.5.2 Hydrolýza a extrakce [2]Přidejte postupně k testovanému vzorku 40 ml ethanolu (3.1), 2 ml roztoku askorbanu sodného (3.2) [3], 10 ml roztoku hydroxidu draselného (3.4) a 2 ml roztoku síranu sodného (3.13).Zahřívejte po dobu 30 minut při 70-80 oC pod zpětným chladičem a potom nechejte vychladnout pod proudem vody. Přidejte 50 ml ethanolu (3.1) a 100 ml 1,2-dichlorethanu (3.7) (odebíraného pipetou). Silně protřepejte a potom přelijte kapalný supernatant do dekantační nádoby. Přidejte do nádoby 150 ml roztoku hydroxidu draselného (3.5), protřepejte po dobu 30 vteřin a nechejte stát, dokud nejsou vrstvy odděleny. Odeberte vrstvu dichlorethanu (spodní vrstva) do dekantační nádoby, přidejte 40 ml roztoku hydroxidu draselného (3.6), protřepejte po dobu 10 vteřin a nechejte stát, dokud nejsou vrstvy odděleny. Odeberte vrstvu dichlorethanu do dekantační nádoby a propláchněte 6–8 krát 40 ml dávkami vody, dokud není odstraněna zásaditost (fenolftaleinový test). Odeberte vrstvu dichlorethanu a odstraňte poslední stopy vody za použití proužků filtračního papíru.Odpařte do sucha alikvotní část roztoku za vakua a ve vodní lázni při 40 oC. Rychle ošetřete zbytek 5 ml petroletheru (3.8).Pro produkty skupiny A chromatografujte podle postupu uvedeného v 5.3.1.Pro produkty skupiny B přeneste roztok do 50 ml odměrné baňky, doplňte na objem petroletherem (3.8), promíchejte a změřte optickou hustotu, jak je uvedeno v 5.4.2.5.3 Chromatografie5.3.1 Produkty skupiny ANaplňte chromatografickou trubici (4.3) do výše 200 mm 10 g oxidu hlinitého (3.9) předem rozmíchaného s petroletherem (3.8). Do trubice převeďte roztok získaný v 5.2 a ihned přidejte 20 ml petroletheru (3.8). Vyluhujte postupně 10 ml dávkami roztoků lehkého petroleje ve 4, 8, 12, 16 a 20 % diethyletheru (3.12) za tlaku nebo částečného vakua, úroveň průtoku je 2 až 3 kapky za vteřinu.Nejdříve je vyluhován karoten [4]. Retinol je obecně vyluhován roztokem petroletheru ve 20 % diethyletheru (3.12). Vyluhování probíhá za UV osvětlení (krátké ozáření trubice rtuťovou výbojkou). Fluorescenční zóna retinolu je jasně oddělena od žlutých zón xantofylu, jež následují. Extrakční frakci obsahující retinol shromážděte do Erlenmeyerovy baňky.5.3.2 Produkty skupiny BChromatografie musí být prováděna pouze, pokud měření optické hustoty získaná v 5.4.2 nesplňují požadavky dané v 5.4.2.Pokud se ukáže být chromatografie nezbytnou, umístněte do chromatografické kolony alikvotní část roztoku v petroletheru, získaného v 5.2, obsahujícího přibližně 500 IU retinolu, a chromatografujte podle postupu uvedeného v 5.3.1.5.4 Měření optické hustoty5.4.1 Produkty skupiny AOdpařte do sucha za vakua eluát obsahující retinol získaný v 5.3.1. Ošetřete zbytek 2 ml benzenu (3.14). Odeberte 0,3 ml tohoto roztoku a přidejte 3 ml Carr-Priceova činidla (3.16). Vytvoří se modré zbarvení. Změřte optickou hustotu spektrofotometrem při 610 nm přesně 30 vteřin poté, co reakce započala. Stanovte obsah retinolu odkazem na standardní křivku získanou z benzenových roztoků o vzrůstajících standardních retinolových koncentracích ošetřených Carr-Priceovým činidlem (2 až 16 IU standard-retinolu (3.17) na 0,3 ml benzenu (3.14) + 3 ml Carr-Priceova činidla (3.16)). Standardní křivka musí být kontrolována pravidelně a často za použití standardu a čerstvě připraveného roztoku Carr-Priceova činidla.5.4.2 Produkty skupiny BOdeberte alikvotní část roztoku v petroletheru, získaného v 5.2, obsahujícího přibližně 200 IU retinolu. Odpařte do sucha za vakua a ošetřete zbytek 25 ml isopropanolu (3.18) Změřte optickou hustotu ve spektrofotometru při 325, 310 a 334 nm. Maximální absorpce se nachází ve 325 nm. Obsah retinolu v roztoku se vypočítá následovně:E325 . 18,30 = IU retinolu/mlNicméně, poměr optických hustotE310 : E325 a E334 : E325musí být 6 : 7 = 0,857.Pokud se jeden z těchto poměrů liší znatelně od této hodnoty (< 0,830 nebo >0,880), musí měření optické hustoty předcházet chromatografie v souladu s metodou danou v 5.3.2. Pokud měření optické hustoty provedené po chromatografii ukáže, že se uvedený poměr stále znatelně liší od hodnoty 0,857 (< 0,830 nebo > 0,880), musí být stanovení provedeno v souladu s metodou danou pro produkty skupiny A.6. Výpočet výsledkůVypočítejte obsah retinolu ve vzorku berouce v úvahu váhu testovaného vzorku a ředění provedená během analýzy. Výsledky vyjádřete v IU retinolu na kg krmiva nebo na kg koncentrátu nebo premixu.OpakovatelnostRozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit:- 20 % rel. u obsahů retinolu nižších než 75000 IU/kg,- 15000 IU u obsahů mezi 75000 a 150000 IU/kg,- 10 % rel. u obsahů mezi 150000 a 250000 IU/kg,- 25000 IU u obsahů mezi 250000 a 500000 IU/kg,- 5 % rel. u obsahů větších než 500000 IU/kg.2. STANOVENÍ THIAMINU (VITAMÍN B1, ANEURIN)1. Účel a rozsahTato metoda umožňuje stanovit obsah thiaminu (aneurinu, vitamínu B1) v krmivech, koncentrátech a premixech. Limit detekce je 5 ppm.2. PrincipRoztok je za horka ošetřen ředěnou kyselinou sírovou a potom enzymaticky hydrolyzován. Získaný roztok je podroben alkalické oxidaci. Vzniklý thiochróm je extrahován isobutanolem a stanoven fluorimetricky.3. Chemikálie3.1 Standardní roztok thiaminu 100 μg/ml: rozpusťte 112,3 mg thiaminu-HCL, předem usušeného za vakua na stálou váhu, v 1000 ml 0,2 N kyseliny sírové (3.2). Pokud je roztok uchováván na chladném a tmavém místě, je upotřebitelný po dobu jednoho měsíce.3.2 0,2 N kyselina sírová.3.3 Čistý bisulfit sodný.3.4 20 % (váhově vzhledem k objemu) roztok hexakyanoželezitanu draselného p.a.3.5 25 % (váhově vzhledem k objemu) roztok hydroxidu draselného p.a.3.6 Oxidační směs: smíchejte 2 ml roztoku hexakyanoželezitanu draselného (3.4) se 48 ml roztoku hydroxidu draselného (3.5). Tato směs je upotřebitelná jen 4 hodiny.3.7 Isobutanol p.a.3.8 2,5 N roztok octanu sodného.3.9 Multienzymatický přípravek obsahující proteázu, fosfatázu a amylázu (např. clarasu).3.10 96 % (V/V) ethanol.4. Přístroje4.1 Vodní lázeň.4.2 Odstředivka (3500 ot./min.) se 3 až 50 ml trubicemi vybavenými skleněnými zábrusovými zátkami.4.3 Fluorimetr.5. Postup5.1 Enzymatická hydrolýzaDo každé ze dvou 250 ml odměrných baněk A a B vložte totožné množství jemně rozmělněného vzorku obsahujícího přibližně 100 μg thiaminu a 125 ml kyseliny sírové (3.2). Přidejte rovněž, pouze do baňky A, 1,0 ml standardního roztoku (3.1) (interní standard).Silně protřepte lahve, umístněte je do vroucí vodní lázně a udržujte je tam po dobu 15 minut a příležitostně protřepávejte. Nechejte vychladnout na přibližně 45 oC. Přidejte do každé lahve 20 ml roztoku octanu sodného (3.8) a 0,5 g multienzymatického přípravku (3.9), potom nechejte stát po dobu 20 minut za pokojové teploty. Přidejte 20 ml roztoku octanu sodného (3.8), doplňte na objem vodou, homogenizujte a filtrujte. Odeberte filtráty A a B poté, co jste vyloučili prvních 15 ml. Připravte následující roztoky:5.1.1 Referenční roztok TDo trubice odstředivky (4.2) dejte 5 ml filtrátu A a přibližně 10 mg bisulfitu sodného (3.3). Ponořte trubici do vroucí vodní lázně na 15 minut a potom nechejte vychladnout při pokojové teplotě.5.1.2 Roztoky A (interní standard) a B (vzorek)Do trubice odstředivky (4.2) dejte 5 ml filtrátu A a 5 ml filtrátu B do jiné trubice odstředivky (4.2).5.2 OxidacePřidejte k roztokům T, A a B 5 ml oxidační směsi (3.6) a o minutu později 10 ml isobutanolu (3.7). Zazátkujte trubice a silně protřepejte 5 vteřin. Nechejte stát jednu minutu a odstřeďte tak, aby se oddělily vrstvy. Z každé trubice přeneste 5 ml supernatantu isobutanolové vrstvy do každé 25 ml odměrné baňky, doplňte na objem ethanolem (3.10) a homogenizujte (= extrakty T, A a B).5.3 Měření fluorescenceProveďte měření při vlnové délce, pro kterou dává fluorimetr optimální odezvu na fluorescenci trichrómu. Ozařujte při přibližně 365 nm.Nastavte přístroj na nulu za použití extraktu T. Změřte intenzitu fluorescence extraktů A a B.6. Výpočet výsledkůObsah thiaminu v mg/kg vzorku je dán poměrem:ckde:a = intenzita fluorescence extraktu A (interní standard);b = intenzita fluorescence extraktu B (vzorek);c = váha testovaného vzorku v g;d = množství thiaminu v μg přidaného k testovanému vzorku (interní standard).OpakovatelnostRozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit:10 % relativní hodnoty u obsahů nižších než 500 mg/kg a5 % rel. u obsahů rovnajících se nebo větších než 500 mg/kg.3. STANOVENÍ KYSELINY ASKORBOVÉ A DEHYDROASCORBOVÉ ACID (VITAMÍN C)1. Účel a rozsahTato metoda umožňuje stanovit celkové množství kyseliny askorbové a kyseliny dehydroaskorbové (vitamín C) v krmivech, koncentrátech a premixech. Limit detekce je 5 ppm. Produkty jsou zařazeny do dvou skupin podle jejich předpokládaného obsahu vitamínu C:Skupina A: obsahy nižší než 10 g/kg;Skupina B: obsahy rovnající se nebo větší než 10 g/kg.2. PrincipVzorek je suspendován ve zředěném roztoku kyseliny metafosforečné a extrahován chloroformem. Vodní fáze je ošetřena roztokem 2,6-dichlorophenol-indophenolu, aby byla kyselina askorbová převedena na kyselinu dehydroaskorbovou, a potom roztokem 2,4-dinitrophenylhydrazinu. Vzniklý hydrazon je extrahován směsí ethyl acetátu, ledové kyseliny octové a acetonu. Roztok je chromatografován na koloně silika gelu, extrakt odpařen do sucha a zbytek rozpuštěn ve zředěné kyselině sírové. Optická hustota roztoku je měřena spektrofotometrem při 509 nm.U produktů skupiny A je extrakt vzešlý z kolonové chromatografie dále podroben tenkovrstvé chromatografii na tenké vrstvě, aby se izoloval hydrazon.3. Chemikálie3.1 Standardní roztok 0,05 % kyseliny L-askorbové: rozpusťte 50 mg kyseliny L-askorbové p.a. v přibližně 20 ml roztoku kyseliny metafosforečné (3.2) a doplňte do objemu 100 ml vodou. Připravujte bezprostředně před použitím.3.2 10 % (váhově vzhledem k objemu) roztok kyseliny metafosforečné: po jejím rozmělnění v moždíři rozpusťte ve vodě 200 g kyseliny metafosforečné p.a. a doplňte do 2000 ml vodou. Skladujte při 4oC. Roztok je stabilní po dobu jednoho týdne.3.3 Chloroform p.a.3.4 0,5 % (váhově vzhledem k objemu) roztok 2,6-dichlorophenol-indophenolu p.a. Připravte bezprostředně před použitím.3.5 Filtrační pomůcka (S. a S. č. 121 nebo ekvivalent)3.6 2 % kyselý roztok (váhově vzhledem k objemu) 2,4-dinitrophenylhydrazinu: rozpusťte 2 g 2,4-dinitrophenylhydrazinu ve 100 ml zředěné kyseliny sírové (25 ml kyseliny sírové p.a., d: 1,84, ředěná doplněním do 100 ml vodou). Tento roztok, je-li skladován v chladnu, vydrží jeden týden.3.7 Dusík nebo3.8 Kysličník uhličitý.3.9 Směs ethyl acetátu p.a./ledové kyseliny octové/acetonu p.a.: 96/2/2 objemově.3.10 Směs dichloromethanu p.a./ledové kyseliny octové: 97/3 objemově.3.11 Silika gel, velikost částic: 0,05 až 0,2 mm.3.12 Stahl silika gel stupeň H pro tenkovrstvou chromatografii.3.13 Zřeďte kyselinu sírovou: dejte 105 ml vody do 200 ml odměrné baňky, doplňte na objem kyselinou sírovou p.a., d: 1,84.3.14 Extrakční rozpouštědlo pro tenkovrstvou chromatografii: smíchejte 75 ml diethyletheru p.a., 25 ml ethyl acetátu p.a. a 4,0 ml 96 % (váhově vzhledem k objemu) kyseliny sírové p.a. Obnovte po 2 až 3 chromatogafiích.4. Přístroje4.1 Vodní lázeň vybavená termostatem nastaveným na 20 oC.4.2 Odstředivka (3500 ot./min.) se 40 až 50 ml trubicemi vybavenými skleněnými zábrusovými zátkami.4.3 Rotační vakuová odparka s 250 ml lahvemi.4.4 Skleněné chromatografické trubice (délka: 100 mm, vnitřní průměr: 20 mm), se sintrovým diskem (např. Allihnovy trubice).4.5 Spektrofotometr nebo kolorimetr s filtry s 10ml kyvetami.4.6 Přístroj pro tenkovrstvou chromatografii se silika gelovými deskami (3.12) pokrytými do hloubky 0,5 až 0,6 mm. (Vhodné jsou již vyrobené desky.) Sušte desky po 2 a půl až 3 hodiny v sušárně při 120 až 130 oC. Nechejte vychladnout a potom udržujte v exsikátoru po nejméně 24 hodin před použitím.4.7 Sušárna nastavená na 120 až 130 oC.5. Postup5.1 ExtrakceDo každé ze dvou 250 ml odměrných baněk (se skleněnými zábrusovými zátkami) A a B vložte totožné množství jemně rozmělněného vzorku obsahujícího přibližně 200 μg vitamínu C. Přidejte, pouze do baňky A, 0,4 ml standardního roztoku (3.1) a promíchejte jemným protřepáním (interní standard).Přidejte do každé lahve 30 ml chloroformu (3.3) a 25 ml roztoku kyseliny metafosforečné (3.2) při 4 oC. Krátce protřepte a nechejte stát 10 až 15 minut. Přidejte 25 ml vody, zazátkujte lahve, silně protřepejte po 10 vteřin a nechejte stát 10 až 15 minut ve vodní lázni (4.1). Odstřeďte, aby se oddělila vodní fáze od chloroformové fáze. Provádějte postupy simultánně, jak je popsáno níže, u vodních extraktů A (interní standard) a B.5.2 OxidaceZa použití pipety přeneste 40 ml roztoku vodního supernatantu (lehce zakalený) získaného v 5.1 do reakční trubice vybavené skleněnou zábrusovou zátkou. Přidejte 0,5 až 1 ml roztoku 2,6-dichlorophenol-indophenolu (3.4) a promíchejte. Vytvoří se červené zbarvení, které by mělo přetrvat nejméně 15 minut. Potom přidejte přibližně 300 mg filtrační pomůcky (3.5), protřepejte a filtrujte přes suchý skládaný filtr. Filtrát nemusí být nutně čistý.5.3 Reakce s 2,4-dinitrophenylhydrazinem a extrakce hydrazonuZa použití pipety přeneste 10 ml filtrátu získaného v 5.2 do trubice odstředivky (4.2), přidejte 2 ml roztoku 2,4-dinitrophenylhydrazinu (3.6) a promíchejte. Zaveďte rychle proud dusíku (3.7) nebo kysličník uhličitý (3.8) do trubice, zazátkujte trubici a ponořte ji na přibližně 15 hodin (přes noc) do vodní lázně (4.1).Potom přidejte 3 ml vody, 20 ml směsi ethyl acetátu/ledové kyseliny octové/acetonu (3.9) a přibližně 800 mg filtrační pomůcky (3.5). Zazátkujte trubici, silně protřepejte po dobu 30 vteřin a odstřeďte. Do lahve odparky umístěte 15 ml supernatantu a za sníženého tlaku odpařujte na rotační odparce (4.3), dokud neobdržíte olejnatý zbytek. Rozpusťte zbytek ve 2 ml směsi ethyl acetátu/ledové kyseliny octové/acetonu (3.9) za ohřevu na 50 oC, nechejte vychladnout, přidejte 10 ml směsi dichloromethanu/ledové kyseliny octové (3.10) a promíchejte.5.4 Kolonová chromatografieNaplňte chromatografickou trubici (4.4) do úrovně 30 ml směsí dichloromethanu/ledové kyseliny octové (3.10). Suspendujte (silně protřepávaje) 5 g silika gelu (3.11) ve 30 ml směsi dichloromethanu/ledové kyseliny octové (3.10); nalijte suspenzi do trubice. Nechejte stát a potom stlačte pod dusíkem (3.7) při nízkém tlaku. Přelijte do trubice roztok získaný v 5.3, vypláchněte láhev malým množstvím směsi dichloromethanu/ledové kyseliny octové (3.10) a přelijte do trubice, potom naplňte trubici směsí (3.10) a pokračujte ve vyplachování trubice stejnou směsí (3 až 4 dávky přibližně 5 ml), dokud není získán bezbarvý eluát. Vyřaďte část eluátu, který je zbarven žlutě.Eluujte načervenalou zónu na vrcholu trubice směsí ethyl acetátu/ledové kyseliny octové/acetonu (3.9), odeberte eluát a odpařte do sucha.5.4.1 U produktů skupiny A (obsah vitamínu C nižší než 10 g/kg), rozpusťte zbytek ve 2,0 ml směsi ethyl acetátu/ledové kyseliny octové/acetonu (3.9) a ihned chromatografujte na tenké vrstvě, jak je uvedeno v 5.5.5.4.2 U produktů skupiny B (obsah vitamínu C se rovná nebo je větší než 10 g/kg), ošetřete olejnatý zbytek 4,0 ml zředěné kyseliny sírové (3.13), silně protřepejte, aby se zbytek zcela rozpustil a změřte optickou hustotu, jak je uvedeno v 5.6.5.5 Chromatografie na tenké vrstvěNásledující postupy provádějte duplicitně. Umístněte 0,5 ml roztoku získaného v 5.4.4 v tenké čáře na destičku (4.6). Za použití extrakčního rozpouštědla (3.14) vyvíjejte po nejméně 20 minut v tanku vyplněném výpary rozpouštědla, dokud není růžově zbarvená hydrazonová zóna jasně oddělena. Nechejte volně vysušit. Označte hranice růžové zóny, seškrabejte zónu špachtlí a prášek přeneste kvantitativně do chromatografické trubice (4.4).Eluujte postupně jednou 2 ml a dvakrát 1,5 ml směsi ethyl acetátu/ledové kyseliny octové/acetonu (3.9). Jímejte eluát do malé lahve (poslední díl musí být bezbarvý). Odpařte do sucha, ošetřete olejnatý zbytek 4,0 ml zředěné kyseliny sírové (3.13), silně protřepejte, aby se zbytek zcela rozpustil a změřte optickou hustotu.5.6 Měření optické hustotyZměřte optickou hustotu spektrofotometrem při 509 nm 20 až 30 minut po rozpuštění zbytku v kyselině sírové. Proveďte měření porovnáním se zředěnou kyselinou sírovou (3.13).5.7 Slepý pokusProveďte slepý pokus za použití stejného postupu, ale bez vzorku.6. Výpočet výsledkůObsah vitamínu C ve vzorku v g na kg je dán poměrem:·2·10dkde:a = optická hustota slepého vzorku;b = optická hustota roztoku interního standardu;c = optická hustota roztoku vzorku;d = váha testovaného vzorku v gramech.OpakovatelnostRozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit:10 % rel. u obsahů vitamínu C nižších než 10 g/kg a5 % rel. u obsahů rovnajících se nebo větších než 10 g/kg.[1] 1 IU = 0,3 μg retinolu.[2] U mléčných krmiv a výrobků s tendencí shlukovat se nebo bobtnat, zdvojnásobit množství chemikálií uvedených v prvním a druhém odstavci bodu 5.2.[3] Askorban sodný nemusí být přidán, když probíhá hydrolýza v dusíkaté atmosféře.[4] Obsah karotenu může být stanoven měřením optické hustoty při 450 nm;E 1 %1 cm = 2600.--------------------------------------------------