CELEX: 31974L0203
Language: el
Date: 1974-03-25 00:00:00
Title: Πέμπτη οδηγία 74/203/ΕΟΚ της Επιτροπής της 25ης Μαρτίου 1974 περί καθορισμού κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών

Avis juridique important

|

31974L0203

Πέμπτη οδηγία 74/203/ΕΟΚ της Επιτροπής της 25ης Μαρτίου 1974 περί καθορισμού κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών  

Επίσημη Εφημερίδα αριθ. L 108 της 22/04/1974 σ. 0007 - 0024 Φινλανδική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 3 τόμος 5 σ. 0210  Ελληνική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 03 τόμος 10 σ. 0168  Σουηδική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 3 τόμος 5 σ. 0210  Ισπανική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 03 τόμος 7 σ. 0191  Πορτογαλική ειδική έκδοση : Κεφάλαιο 03 τόμος 7 σ. 0191 

ΠΕΜΠΤΗ ΟΔΗΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ της 25ης Μαρτίου 1974 περί καθορισμού κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφώνΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,  Έχοντας υπόψη:  τη συνθήκη περί ιδρύσεως της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινότητος,  την οδηγία του Συμβουλίου της 20ής Ιουλίου 1970 περί εισαγωγής κοινοτικών τρόπων δειγματοληψίας και μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεχγο των ζωοτροφών (1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την πράξη (2) τη συνημμένη στη συνθήκη περί προσχωρήσεως  νέων Κρατών Μελών στην Ευρωπαϊκή Οικονομική Κοινότητα και στην Ευρωπαϊκή Κοινότητα Ατομικής Ενεργείας (3), η οποία υπεγράφη στις Βρυξέλλες, την 22α Ιανουαρίου 1972, και ιδίως το άρθρο 2,  Εκτιμώντας:  ότι η ανωτέρω οδηγία προβλέπει ότι οι επίσημοι έλεγχοι των ζωοτροφών, για να διαπιστωθεί αν τηρούνται οι προδιαγραφόμενες δυνάμει των νομοθετικών, κανονιστικών, ή διοικητικών διατάξεων προϋποθέσεις, για την ποιότητα και τη σύνθεση των ζωοτροφών,  διενεργούνται σύμφωνα με τους κοινοτικούς τρόπους δειγματοληψίας και τις κοινοτικές μεθόδους αναλύσεως- ότι οι οδηγίες αριθ. 71/250/ΕΟΚ, 71/393/ΕΟΚ, 72/199/ΕΟΚ και 73/46/ΕΟΚ της Επιτροπής της 15ης Ιουνίου 1971 (4), της 18ης Νοεμβρίου 1971 (5), της 27ης Απριλίου 1972 (6) και της 5ης Δεκεμβρίου 1972 (7) αντιστοίχως έχουν ήδη καθορίσει έναν ορισμένο αριθμό  κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως- ότι, λαμβανομένης υπόψη της προόδου των πραγματοποιηθεισών έκτοτε εργασιών, πρέπει να καθιερωθεί μία πέμπτη σειρά μεθόδων- ότι τα μέτρα που προβλέπονται στην παρούσα οδηγία είναι σύμφωνα με τη γνώμη της Μονίμου Επιτροπής Ζωοτροφών,  ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΟΔΗΓΙΑ:   Άρθρο 1  Τα Κράτη Μέλη καθορίζουν ότι οι αναλύσεις για τους επισήμους ελέγχους των ζωοτροφών, όσον αφορά την περιεκτικότητα σε άμυλο και σε προϊόντα αποικοδομήσεως του αμύλου, μεγάλου μοριακού βάρους, στις ζωοτροφές, οι οποίες περιέχουν τεμαχίδια,  πούλπα, αποξηραμένα φύλλα ή "κορυφές" τεύτλων, πούλπα πατατών, αποξηραμένη ζύμη, προϊόντα πλούσια σε ινουλίνη ή υπόλοιπα τήξεως λίπους, πραγματοποιούνται σύμφωνα με τη μέθοδο η οποία περιγράφεται στο παράρτημα I της παρούσας οδηγίας.  Οι γενικές διατάξεις, που περιλαμβάνονται στο τμήμα I (εισαγωγή) του παραρτήματος της πρώτης οδηγίας 71/250/ΕΟΚ της Επιτροπής της 15ης Ιουνίου 1971 εφαρμόζονται στη μέθοδο που περιγράφεται στο παράρτημα I της παρούσας οδηγίας.   Άρθρο 2  Τα Κράτη Μέλη καθορίζουν ότι οι αναλύσεις για τους επισήμους ελέγχους των ζωοτροφών, όσον αφορά την περιεκτικότητά τους σε amprolium, ethopabate, dinitolmide (DOT), nicarbazine και menadione (βιταμίνη Κ3), πραγματοποιούνται σύμφωνα με τις  μεθόδους, οι οποίες περιγράφονται στο παράρτημα II της παρούσας οδηγίας.  Οι γενικές διατάξεις, οι οποίες περιλαμβάνονται στο τμήμα 1 (εισαγωγή) του παραρτήματος της πρώτης οδηγίας 71/250/ΕΟΚ της Επιτροπής της 15ης Ιουνίου 1971 εκτός από το μέρος το οποίο αφορά την προετοιμασία του προς ανάλυση δείγματος, εφαρμόζονται στις  μεθόδους που περιγράφονται στο παράρτημα II της παρούσας οδηγίας.   Άρθρο 3  Τα Κράτη Μέλη θέτουν σε ισχύ, την 1η Νοεμβρίου 1974 το αργότερο, τις νομοθετικές, κανονιστικές και διοικητικές διατάξεις που είναι αναγκαίες για να συμμορφωθούν προς την παρούσα οδηγία. Ενημερώνουν σχετικά αμέσως την Επιτροπή.   Άρθρο 4  Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα Κράτη Μέλη.  Έγινε στις Βρυξέλλες, στις 25 Μαρτίου 1974.  Για την Επιτροπή Ο Πρόεδρος Francois-Xavier ORTOLI  (1) ΕΕ αριθ. Ν 170 της 3.8.1970, σ. 2 (2) ΕΕ αριθ. Ν 73 της 27.3.1972, σ. 14.  (3) ΕΕ αριθ. Ν 73 της 27.3.1972, σ. 5.  (4) ΕΕ αριθ. Ν 155 της 12.7.1971 σ. 13.  (5) ΕΕ αριθ. Ν 279 της 20.12.1971, σ. 7 (6)( ΕΕ αριθ. Ν 123 της 29.5.1972, σ. 6.  (7) ΕΕ αριθ. Ν 83 της 30.3.1973, σ. 21.      ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I   ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΜΥΛΟΥ - μέθοδος με παγκρεατίνη -  1. Αντικείμενο και τομέας εφαρμογής Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της περιεκτικότητος σε άμυλο και σε προϊόντα αποικοδομήσεως του αμύλου μεγάλου μοριακού βάρους στις ζωοτροφές, οι οποίες περιέχουν τεμαχίδια, πούλπα, αποξηραμένα φύλλα ή "κορυφές" τεύτλων, πούλπα πατατών, αποξηραμένη  ζύμη, προϊόντα πλούσια σε ινουλίνη (π.χ. τεμαχίδια και άλευρο ψευδοκολοκασίου) (ηλίανθος κονδυλόρριζος) ή υπόλοιπα τήξεως λίπους. Ο προσδιορισμός γίνεται μόνο όταν η μικροσκοπική εξέταση εμφανίσει την ύπαρξη μέσα στο δείγμα σημαντικών ποσοτήτων αμύλου.   2. Αρχή Τα ευρισκόμενα μέσα στο δείγμα σάκχαρα απομακρύνονται δι' εκχυλίσεως με αιθανόλη. Το άμυλο του υπολείμματος της εκχυλίσεως σακχαροποιείται με παγκρεατίνη. Τα σάκχαρα υδρολύονται με υδροχλωρικό οξύ και η σχηματιζόμενη γλυκόζη προσδιορίζεται με τη μέθοδο  Luff-Schoorl. Η ποσότητα της κατ' αυτόν τον τρόπο παραγομένης γλυκόζης, πολλαπλασιαζομένη επί ένα σταθερό συντελεστή, δίδει την περιεκτικότητα του δείγματος σε άμυλο.  3. Αντιδραστήρια 3.1. Αιθανόλη 90 τοις εκατό (ό/ό), ουδέτερα στη φαινολοφθαλεΐνη.  3.2. Αμυλική αλκοόλη p.a.  3.3. Τολουόλιο p.a.  3.4. Ρυθμιστικό διάλυμα: Διαλύονται σε ύδωρ 9,078 g δισοξίνου φωσφορικού καλίου KH2PO4 και 11,876 g οξίνου φωσφορικού νατρίου Na2HPO4-2H2O. Συμπληρώνεται έως 1 1 με ύδωρ.  3.5. Διάλυμα χλωριούχου νατρίου 0,2 Ν.  3.6. Διάλυμα Carrez I: Διαλύονται σε ύδωρ 21,9 g οξικού ψευδαργύρου Zn(CH3COO)2-2H2O και 3 g οξικού οξέος (glacial). Συμπληρώνεται μέχρι 100 ml με ύδωρ.  3.7. Διάλυμα Carrez II: Διαλύονται σε ύδωρ 10,6 g σιδηροκυανιούχου καλίου K4[Fe(CN6)]-3H2O. Συμπληρώνεται μέχρι 100 ml με ύδωρ.  3.8. Υδροχλωρικό οξύ N.  3.9. Υδροχλωρικό οξύ p.a., περίπου 8 N, d: 1,125.  3.10. Διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου p.a., περίπου 10 N, d: 1,33.  3.11. Δείκτης: διάλυμα σε 0,1% (βάρος/όγκο) ηλιανθίνης (πορτοκαλόχρουν του μεθυλίου).  3.12. Παγκρεατίνη σε σκόνη, ανταποκρινόμενη στις προδιαγραφές, οι οποίες δίδονται στο σημείο 8. Διατηρείται σε πωματισμένα φιαλίδια προστατευμένα από το φως και την υγρασία.  3.13. Αντιδραστήρια κατά Luff-Schoorl: προστίθεται αναταράσσοντας προσεκτικά το διάλυμα του κιτρικού οξέος (3.13.2.) μέσα στο διάλυμα του ανθρακικού νατρίου (3.13.3.). Προστίθεται κατόπιν το διάλυμα του θεϊκού χαλκού (3.13.1) και συμπληρώνεται μέχρι 1 l  με ύδωρ. Αφήνεται επί μία νύκτα σε ηρεμία και διηθείται. Ελέγχεται η κανονικότητα του κατ' αυτόν τον τρόπο ληφθέντος αντιδραστηρίου (Cu O,1 N, Na2CO32N). Το pH του διαλύματος πρέπει να είναι 9,4 περίπου.  3.13.1. Διάλυμα θειϊκού χαλκού: διαλύονται 25 g θειικού χαλκού p.a. CuSO4-5H2O μέσα σε 100 ml ύδατος.  3.13.2. Διάλυμα κιτρικού οξέος: διαλύονται 50 g κιτρικού οξέος p.a. C6H8O7-H2O μέσα σε 50 ml ύδατος.  3.13.3.Διάλυμα ανθρακικού νατρίου: διαλύονται 143,8 g ανύδρου ανθρακικού νατρίου p.a. μέσα σε 300 ml περίπου θερμού ύδατος. Αφήνεται να ψυχθεί.  3.14. Κόκκοι ελαφρόπετρας βρασμένοι σε υδρωχλωρικό οξύ, πλυμένοι με ύδωρ και στεγνωμένοι.  3.15. Διάλυμα 30% (βάρος/όγκο) ιωδιούχου καλίου p.a.  3.16. Θειικό οξύ, 6 Ν περίπου, d: 1,18.  3.17. Διάλυμα θειοθειικού νατρίου 0,1 Ν.  3.18. Διάλυμα αμύλου: προστίθεται μίγμα 5 g διαλυτού αμύλου και 30 ml ύδατος σε 1 l ζέοντος ύδατος. Ζέεται επί 3 λεπτά και αφήνεται να ψυχθεί. Παρασκευάζεται λίγο πριν από τη χρηση.  4. Συσκευές 4.1. Συσκευή εκχυλίσεως (βλ.σχήμα) αποτελουμένη από:  4.1.1. Μία κωνική φιάλη των 500 ml με ευρύ στόμιο- 4.1.2. Έναν κάθετο ψυκτήρα προσαρμοσμένο στην κωνική φιάλη με πώμα- 4.1.3. Ένα στέλεχος, το οποίο ολισθαίνει μέσα στον κεντρικό σωλήνα του ψυκτήρα, και το οποίο φέρει στο κατώτερο άκρο του ένα άγκιστρο, μία λαβίδα για τη στερέωση του στελέχους- 4.1.4. Έναν μεταλλικό υποδοχέα ο οποίος θα κρεμαστεί στο άγκιστρο του στελέχους (4.1.3.) και θα στηρίξει τη διηθητική χοάνη- 4.1.5. Διηθητική χοάνη, ταχείας διηθήσεως: μέγιστο μέγεθος πόρων 90 έως 150 microns (π.χ. Gl, χωρητικότητος περίπου 30 ml)- 4.1.6. Διηθητικός χάρτης, κατάλληλος σε σχήμα και μέγεθος για τη διηθητική χοάνη (4.1.5).  4.2. Επωαστικός κλίβανος, ρυθμισμένος στους 38 oC.  4.3. Ογκομετρικές φιάλες των 200 ml, με κάθετο ψυκτήρα.  4.4. Ογκομετρικές φιάλες των 100 ml, με κάθετο ψυκτήρα.  5. Τρόπος εργασίας 5.1. Προετοιμασία του δείγματος Κονιοποιείται το δείγμα, έτσι ώστε να περνά από κόσκινο μεγέθους βροχίδων 0,5 mm (ISO κόσκινο των R 565).  5.2. Εκχύλιση Ζυγίζονται, με ακρίβεια 1 mg, 2g δείγματος και εισάγονται στη διηθητική χοάνη (4.1.5), της οποίας ο πυθμένας έχει προηγουμένως καλυφθεί με διηθητικό χάρτη (4.1.6) εμποτισμένο με αιθανόλη (3.1). Εισάγονται στην κωνική φιάλη (4.1.1) 55 ml αιθανόλης (3.1)  και μερικοί κόκκοι ελαφρόπετρας (3.14). Τοποθετείται η διηθητική χοάνη μέσα στον μεταλλικό υποδοχέα (4.1.4) και κρεμάται αυτός στο άγκιστρο του στελέχους (4.1.3).Τοποθετείται ο ψυκτήρας στην κωνική φιάλη και χαμηλώνεται το στέλεχος έτσι ώστε ο πυθμένας  της χοάνης να εφάπτεται της επιφανείας της αιθανόλης. Στερεώνεται το στέλεχος στο ύψος αυτό με τη βοήθεια της λαβίδος. Ζέεται η αιθανόλη επί 3 ώρες. Κατόπιν αφήνεται να ψυχθεί και αποσύρεται το στέλεχος (4.1.3) έτσι ώστε η χοάνη να ανέλθει όσο το δυνατό  υψηλότερα στην κωνική φιάλη. Αφαιρείται προσεκτικά το πώμα της κωνικής φιάλης και αφήνεται να τρέξουν 45 ml ύδατος κατά μήκος των παρειών του φιαλιδίου. Τοποθετείται πάλι ο ψυκτήρας στην κωνική φιάλη και διατηρείται η διηθητική χοάνη 10 cm επάνω από τη  στάθμη του υγρού. Ζέεται το υγρό επί 3 ώρες. Κατόπιν αφήνεται να ψυχθεί, αφαιρείται το πώμα της κωνικής φιάλης και αποσύρεται η χοάνη από τον υποδοχέα.  5.3. Σακχαροποίηση και υδρόλυση Τοποθετείται η χοάνη σε μια φιάλη κενού και ξηραίνεται κατόπιν αναρροφήσεως. Φέρεται το υπόλοιπο της εκχυλίσεως σε ιγδίο και λεπτοκονιοποιείται. Μεταγγίζεται ποσοτικά η σκόνη με τη βοήθεια 60 ml περίπου ύδατος μέσα σε μια ογκομετρική σφαιρική φιάλη των  200 ml και προστίθενται μερικές σταγόνες αμυλικής αλκοόλης (3.2). Προσαρμόζεται στη σφαιρική φιάλη ένας κάθετος ψυκτήρας. Ζέεται επί μία ώρα. Αφήνεται κατόπιν να ψυχθεί και αποσυνδέεται ο ψυκτήρας. Προστίθενται 25 ml ρυθμιστικού διαλύματος (3.4), 250 mg  παγκρεατίνης (3.12), 2,5 ml διαλύματος χλωριούχου νατρίου (3.5) και 10 σταγόνες τολουολίου (3.3). Αναταράσσεται επί 2 λεπτά, τοποθετείται η σφαιρική φιάλη στον επωαστικό κλίβανο (4.2) και διατηρείται εκεί επί 21 ώρες αναταράσσοντας από καιρό σε καιρό.  Αφήνεται κατόπιν να ψυχθεί στη θερμοκρασία του περιβάλλοντος.  Προστίθενται 5 ml διαλύματος Carrez 1 (3.6) και αναταράσεται επί 1 λεπτό. Προστίθενται κατόπιν 5 ml διαλύματος Carrez II(3.7) και αναταράσσεται εκ νέου 1 λεπτό. Συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με ύδωρ, αναδεύεται και διηθείται. Λαμβάνονται με το σιφώνιο  50 ml από το διήθημα και φέρονται σε ογκομετρική σφαιρική φιάλη των 100 ml (δύναται επίσης να γίνει η δοκιμασία επί 100 ml διηθήματος σε ογκομετρική σφαιρική φιάλη των 200 ml).  Προστίθενται μερικές σταγόνες δείκτου (3.11) και οξινίζεται με υδροχλωρικό οξύ 8 N (3.9) έως ότου αρχίσει να μεταβάλλεται το χρώμα σε ερυθρό. Προστίθεται κατόπιν περίσσεια 6,25 ml υδροχλωρικού οξέος 8 N (3.9) (12,50 ml αν εργάζεται κανείς με 100 ml  διηθήματος). Προσαρμόζεται η σφαιρική φιάλη στον κάθετο ψυκτήρα, και ζέεται το διάλυμα επί 1 ώρα. Αφήνεται να ψυχθεί, εξουδετερώνεται με διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου 10 N (3.10) μέχρι μεταβολής του χρώματος του δείκτου σε κίτρινο. Οξινίζεται κατόπιν  ελαφρά προσθέτοντας λίγο υδροχλωρικό οξύ N (3.8), συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με ύδωρ και αναδεύεται. Προσδιορίζεται η περιεκτικότητα σε γλυκόζη σύμφωνα με τη μέθοδο Luff-Schoorl όπως ορίζεται στην 5.4.  5.4. Τιτλοδότηση κατά Luff-Schoorl Λαμβάνονται με σιφώνιο 25 ml αντιδραστηρίου κατά Luff-Schoorl (3.13) και φέρονται σε κωνική φιάλη των 300 ml. Προστίθενται 25 ml, μετρηθέντα ακριβώς, από το διάλυμα που ελήφθη στην 5.3 και που περιέχει κατ' ανώτατο όριο 60 mg γλυκόζης. Προστίθενται 2  κόκκοι ελαφρόπετρας (3.14), θερμαίνεται αναταράσσοντας με το χέρι, σε φλόγα μέσου ύψους και ζέεται το υγρό επί 2 λεπτά περίπου. Τοποθετείται αμέσως η κωνική φιάλη επάνω σε μεταλλικό πλέγμα εφοδιασμένο με οθόνη αμιάντου, η οποία φέρει οπή διαμέτρου 6 cm  περίπου, και κάτω από την οποία υπάρχει αναμμένη φλόγα. Αυτή είναι ρυθμισμένη ώστε μόνον ο πυθμένας της κωνικής φιάλης να θερμαίνεται. Προσαρμόζεται κατόπιν στην κωνική φιάλη ένας κάθετος ψυκτήρας. Ζέεται επί 10 λεπτά ακριβώς, ψύχεται αμέσως εντός  ψυχρού ύδατος και μετά από 5 λεπτά περίπου τιτλοδοτείται ως εξής:  Προστίθενται 10 ml διαλύματος ιωδιούχου καλίου (3.15) και αμέσως κατόπιν με προσοχή (εξ αιτίας του κινδύνου σχηματισμού αφθόνου αφρού) 25 ml θειικού οξέος 6 N (3.16). Τιτλοδοτείται κατόπιν με διάλυμα θειοθειικού νατρίου 0,1 N (3.17) μέχρι να εμφανισθεί  βαθύ κίτρινο χρώμα, προστίθεται ο δείκτης αμύλου και συμπληρώνεται η τιτλοδότηση.  Πραγματοποιείται η ίδια τιτλοδότηση σε μίγμα ακριβώς μετρηθέν, 25 ml αντιδραστηρίου Luff-Schoorl (3.13) και 25 ml ύδατος, αφού προστεθούν 10 ml διαλύματος ιωδιούχου καλίου (3.15) και 25 ml θειικού οξέος 6 N (3.16),παραλείποντας το βρασμό.  5.5. "Τυφλό" πείραμα Πραγματοποιείται "τυφλό" πείραμα, ακολουθώντας τον τρόπο εργασίας ο οποίος περιγράφεται στην 5.3 και 5.4, απουσία δείγματος.  6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων Υπολογίζεται με τη βοήθεια του πίνακα, η ποσότητα της γλυκόζης σε mg η οποία αντιστοιχεί στη διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων των 2 τιτλοδοτήσεων (εκφραζομένων σε ml θειοθειϊκού νατρίου 0,1 N) που αναφέρεται αφ' ενός μεν στην ανάλυση του δείγματος και  αφ' ετέρου στο τυφλό πείραμα.  Η επί τοις εκατό περιεκτικότητα σε άμυλο του δείγματος δίδεται από τον τύπο:  0,72 (α - β) στον οποίο:  α = mg γλυκόζης αναφερομένης στο δείγμα- β = mg γλυκόζης αναφερομένης στο "τυφλό πείραμα" (βλέπε παρατήρηση 7.2.).  7. Παρατηρήσεις:  7.1 Η ταυτόχρονη παρουσία στο δείγμα αμύλου, μερικώς ή ολικώς δεξτρινοποιημένου και λακτόζης, δύναται να δώσει αποτέλεσμα υπερβάλλον κατά 0,5-3% σε άμυλο. Στην περίπτωση αυτή η πραγματική περιεκτικότητα σε άμυλο ευρίσκεται ως εξής:  α) προσδιορίζεται η περιεκτικότητα του αιθανολικού εκχυλίσματος σε αναγωγικά σάκχαρα, τα οποία ελήφθησαν στην 5.2 και εκφράζεται το αποτέλεσμα σε γλυκόζη επί τοις εκατό- β) προσδιορίζεται η περιεκτικότητα του αιθανολικού εκχυλίσματος σε αναγωγικά σάκχαρα, τα οποία ελήφθησαν στην 5.2 και εκφράζεται το αποτέλεσμα σε γλυκόζη επί τοις εκατό- γ) αφαιρείται το λαμβανόμενο αποτέλεσμα στην α) από αυτό το οποίο ελήφθη στη β) και πολλαπλασιάζεται η διαφορά επί 0,9- δ) αφαιρείται η λαμβανόμενη τιμή στη γ) από την περιεκτικότητα σε άμυλο, η οποία ελήφθη εφαρμόζοντας τη μέθοδο και υπολογίζοντας όπως υποδεικνύεται στην 6.  7.2 Η ποσότητα της γλυκόζης, η οποία αναφέρεται στο "τυφλό" πείραμα ανέρχεται κανονικά σε 0,25 mg. Δεν δύναται να είναι ανωτέρα του 0,50 mg.  8. Προδιαγραφές που αφορούν την παγκρεατίνη Περιγραφή: Κόνις λευκοκτρίνη άμορφη.  Περιεκτικότητα σε γλυκόζη: Η ποσότητα της γλυκόζης του τυφλού πειράματος (βλ. 5.5) είναι κανονικά 0,25 mg. Ένα αποτέλεσμα ανώτερο του 0,50 mg αποδεικνύει ότι η παγκρεατίνη δεν είναι πλέον χρησιμοποιήσιμη.  Έλεγχος καταναλώσεως ιωδίου: Παρασκευάζεται εναιώρημα 62,5 mg παγκρεατίνης εντός 50 ml ύδατος περίπου το οποίο θερμαίνεται στους 25-30 oC. Προστίθεται 1 ml διαλύματος ιωδίου 0,1 N. Αναδεύεται επί 2 λεπτά. Τιτλοδοτείται με διάλυμα θειοθειϊκού νατρίου 0,1  N, παρουσία δείκτου αμύλου. Η κατανάλωση του διαλύματος του ιωδίου από την παγκρεατίνη δεν πρέπει να υπερβεί το 0,5 ml.  Έλεγχος της αμυλολυτικής δραστηριότητος: Αναμιγνύονται 100 ml διαλύματος αμύλου (3.18), 5 ml ρυθμιστικού διαλύματος (3.4), 0,5 ml διαλύματος χλωριούχου νατρίου (3.5) και 62,5 mg παγκρεατίνης. Θερμαίνεται το μείγμα στους 25-30 oC και αναδεύεται επί 2  λεπτά. Προστίθεται 1 ml διαλύματος ιωδίου 0,1 N. Ο κυανούς χρωματισμός πρέπει να εξαφανισθεί μέσα στα 15 λεπτά που ακολουθούν, μετά την προσθήκη του διαλύματος ιωδίου.    Πίνακας τιμών για 25 ml αντιδραστηρίου Luff-Schoorl ml Na2S2O3 0,1 N- 2 λεπτά θέρμανση- 10 λεπτά βρασμός  "" ID="1" ASSV="2">1> ID="2">2-4> ID="4">3-6> ID="6">3-9> ID="8">1"> ID="3">2-4> ID="5">3-7> ID="7">3-9"> ID="1" ASSV="2">2> ID="2">4-8>  ID="4">7-3> ID="6">7-8> ID="8">2"> ID="3">2-4> ID="5">3-7> ID="7">3-9"> ID="1" ASSV="2">3> ID="2">7-2> ID="4">11-0> ID="6">11-7> ID="8">3"> ID="3">2-5> ID="5">3-7> ID="7">3-9"> ID="1" ASSV="2">4> ID="2">9-7> ID="4">14-7> ID="6">15-6> ID="8">4">  ID="3">2-5> ID="5">3-7> ID="7">4-0"> ID="1" ASSV="2">5> ID="2">12-2> ID="4">18-4> ID="6">19-6> ID="8">5"> ID="3">2-5> ID="5">3-7> ID="7">3-9"> ID="1" ASSV="2">6> ID="2">14-7> ID="4">22-1> ID="6">23-5> ID="8">6"> ID="3">2-5> ID="5">3-7> ID="7">4-0">  ID="1" ASSV="2">7> ID="2">17-2> ID="4">25-8> ID="6">27-5> ID="8">7"> ID="3">2-6> ID="5">3-7> ID="7">4-0"> ID="1" ASSV="2">8> ID="2">19-8> ID="4">29-5> ID="6">31-5> ID="8">8"> ID="3">2-6> ID="5">3-7> ID="7">4-0"> ID="1" ASSV="2">9> ID="2">22-4>  ID="4">33-2> ID="6">35-5> ID="8">9"> ID="3">2-6> ID="5">3-8> ID="7">4-0"> ID="1" ASSV="2">10> ID="2">25-0> ID="4">37-0> ID="6">39-5> ID="8">10"> ID="3">2-6> ID="5">3-8> ID="7">4-0"> ID="1" ASSV="2">11> ID="2">27-6> ID="4">40-8> ID="6">43-5>  ID="8">11"> ID="3">2-7> ID="5">3-8> ID="7">4-0"> ID="1" ASSV="2">12> ID="2">30-3> ID="4">44-6> ID="6">47-5> ID="8">12"> ID="3">2-7> ID="5">3-8> ID="7">4-1"> ID="1" ASSV="2">13> ID="2">33-0> ID="4">48-4> ID="6">51-6> ID="8">13"> ID="3">2-7>  ID="5">3-8> ID="7">4-1"> ID="1" ASSV="2">14> ID="2">35-7> ID="4">52-2> ID="6">55-7> ID="8">14"> ID="3">2-8> ID="5">3-8> ID="7">4-1"> ID="1" ASSV="2">15> ID="2">38-5> ID="4">56-0> ID="6">59-8> ID="8">15"> ID="3">2-8> ID="5">3-9> ID="7">4-1"> ID="1"  ASSV="2">16> ID="2">41-3> ID="4">59-9> ID="6">63-9> ID="8">16"> ID="3">2-9> ID="5">3-9> ID="7">4-1"> ID="1" ASSV="2">17> ID="2">44-2> ID="4">63-8> ID="6">68-0> ID="8">17"> ID="3">2-9> ID="5">3-9> ID="7">4-2"> ID="1" ASSV="2">18> ID="2">47-1>  ID="4">67-7> ID="6">72-2> ID="8">18"> ID="3">2-9> ID="5">4-0> ID="7">4-3"> ID="1" ASSV="2">19> ID="2">50-0> ID="4">71-7> ID="6">76-5> ID="8">19"> ID="3">3-0> ID="5">4-0> ID="7">4-4"> ID="1" ASSV="2">20> ID="2">53-0> ID="4">75-7> ID="6">80-9>  ID="8">20"> ID="3">3-0> ID="5">4-1> ID="7">4-5"> ID="1" ASSV="2">21> ID="2">56-0> ID="4">79-8> ID="6">85-4> ID="8">21"> ID="3">3-1> ID="5">4-1> ID="7">4-6"> ID="1" ASSV="2">22> ID="2">59-1> ID="4">83-9> ID="6">90-0> ID="8">22"> ID="3">3-1>  ID="5">4-1> ID="7">4-6"> ID="1" ASSV="2">23> ID="2">62-2> ID="4">88-0> ID="6">94-6> ID="8">23">       ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II   1. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ AMPROLIUM [Υδροχλωρική χλωριούχος 1-(4-αμινο-2-προπυλο-5-πυριμιδυλομέθυλο)-2-πικολίνη] [Chlorhydrate de chlorure 1-(4-amino-2-propyl-5-pyrimidylmethyl-2-picolinium]  1. Αντικείμενο και τομέας εφαρμογής Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό του amprolium στις ζωοτροφές, στα συμπυκνώματα ζωοτροφών και στα προμίγματα. Το κατώτατο όριο του προσδιορισμού είναι 40 ppm.  2. Αρχή Το δείγμα εκχυλίζεται με διάλυμα αραιωμένης μεθανόλης. Το εκχύλισμα υποβάλλεται σε καθαρισμό με στήλη οξειδίου του αργιλίου και κατεργάζεται με μεθανολικό διάλυμα 2,7-διυδροξυναφθαλινίου, σιδηροκυανιούχου καλίου, κυανιούχου καλίου και υδροξειδίου του  νατρίου. Εμφανίζεται πορφυρή χροιά. Το amprolium προσδιορίζεται με φασματοφωτόμετρο στα 530 nm.  3. Αντιδραστήρια 3.1. Μεθανόλη p.a.  3.2. Διάλυμα μεθανόλης: Αναμιγνύονται 2 όγκοι μεθανόλης (3.1) με έναν όγκο ύδατος.  3.3. Διάλυμα 0,2% (βάρος/όγκο) σιδηροκυανιούχου καλίου K3 Fe(CN)6 p.a. Το διάλυμα αυτό παραμένει σταθερό επί 2 εβδομάδες.  3.4. Διάλυμα 1% (βάρος/όγκο) κυανιούχου καλίου p.a. Το διάλυμα αυτό παραμένει σταθερό επί 2 εβδομάδες.  3.5. Διάλυμα 1,125% (βάρος/όγκο) υδροξειδίου του νατρίου p.a.  3.6. Μεθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου: Λαμβάνονται 15 ml διαλύματος (3.5) και συμπληρώνονται μέχρι τα 2 ml με μεθανόλη (3.1).  3.7. Διαλύματα 0,0025% (βάρος/όγκο) 2,7-διυδροξυναφθαλινίου: Διαλύονται 25 mg 2,7-διυδροξυναφθαλινίου p.a. στη μεθανόλη (3.1) και συμπληρώνονται μέχρι τα 1 000 ml με μεθανόλη (3.1).  3.8. Αντιδραστήριο χρωματισμού: Εισάγονται 90 ml διαλύματος 2,7-διυδροξυναφθαλινίου (3.7) σε κωνική φιάλη των 250 ml (4.1), προστίθενται 5 ml διαλύματος σιδηροκυανιούχου καλίου (3.3) και αναδεύονται καλά. Προστίθενται κατόπιν 5 ml διαλύματος κυανιούχου  καλίου (3.4), πωματίζεται η φιάλη και αναδεύεται. Αφήνεται σε ηρεμία επί 30-35 λεπτά, προστίθενται 100 ml μεθανολικού διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου (3.6), αναδεύεται και διηθείται σε διηθητική χοάνη (4.3). Χρησιμοποιείται το αντιδραστήριο αυτό σε  75 λεπτά από το τέλος της διηθήσεως.  3.9. Οξείδιο του αργιλίου για χρωματογραφία σε στήλη. Πριν από τη χρήση ανακινούνται επί 30 λεπτά 100 g οξειδίου του αργιλίου με 500 ml ύδατος, διηθούνται, εκλένεται 3 φορές το παραμένον επί του ηθμού υπόλειμμα με 50 ml μεθανόλης (3.1) κάθε φορά,  ξηραίνεται υπό κενό, αφήνεται να ηρεμήσει επί μία νύκτα και ξηραίνεται επί 2 ώρες στους 100 oC σε κλίβανο υπό κενό. Αφήνεται να ψυχθεί μέσα σε ξηραντήρα. Ελέγχεται η δραστικότητα υποβάλλοντας σε ανάλυση από το σημείο 5.2 μία ορισμένη ποσότητα του  διαλύματος γνωστής συγκεντρώσεως (πρότυπον-standard) (3.11). Το ποσοστό του λαμβανομένου amprolium οφείλει να είναι 100% +- 4%.  3.10. Ουσία για παρασκευή του προτύπου διαλύματος: amprolium καθαρό το οποίο ανταποκρίνεται στα κατωτέρω χαρακτηριστικά:  Σημείο τήξεως (αποσυνθέσεως): 248 oC.  Συντελεστής μοριακής αποσβέσεως στα 265 και 235 nm σε απεσταγμένο ύδωρ:11,0x103.  3.11. Πρότυπο διάλυμα: Ζυγίζονται, με ακρίβεια 0,1 mg, 50 mg της προτύπου ουσίας (3.10). Διαλύονται στο διάλυμα μεθανόλης (3.2) μέσα σε σφαιρική ογκομετρική φιάλη των 500 ml, συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με τον ίδιο διαλύτη και ομογενοποιούνται.  Λαμβάνονται 10,0 ml, συμπληρώνονται μέχρι τα 50 mml με το διάλυμα μεθανόλης (3.2) μέσα σε σφαιρική ογκομετρική φιάλη και ομογενοποιούνται. 1ml αυτού του διαλύματος περιέχει 20 mg amprolium.  4. Συσκευές 4.1. Κωνικές φιάλες των 50, 250 και 500 ml με εσμυρισμένα πώματα.  4.2. Αναδευτήρας.  4.3. Διηθητική χοάνη, πορώδους G3, διαμέτρου: 60 mm.  4.4. Υάλινος σωλήνας χρωματογραφίας (εσωτερική διάμετρος: 9 mm μήκος: 400-500 mm).  4.5. Φυγόκεντρος με σωλήνες των 25 ml και με εσμυρισμένα πώματα.  4.6. Φασματοφωτόμετρο με κυψελίδες πάχους 10 mm.  5. Τρόπος εργασίας 5.1. Εκχύλιση και καθαρισμός 5.1.1. Ζωοτροφές και προμίγματα Ζυγίζονται, με ακρίβεια 1 mg, 10 g δείγματος λεπτά διαμερισμένου και ομογενοποιημένου. Για τα προμίγματα ζυγίζονται 3 έως 6 g, με ακρίβεια 1 mg. Εισάγεται η ποσότητα του δείγματος μέσα σε κωνική φιάλη των 250 ml (4.1) και προστίθενται 100 ml ακριβώς  διαλύματος μεθανόλης (3.2). Ανακινούνται επί 60 λεπτά και διηθούνται. Αραιώνεται εάν είναι αναγκαίο με αραιή μεθανόλη (3.2), ώστε να ληφθεί διάλυμα που να περιέχει 5-15 mug amprolium ανά ml.  Εισάγονται μέσα σε σωλήνα χρωματογραφίας (4.4), ο οποίος φέρει στο κατώτερο άκρο του πώμα από βαμβάκι, 5 g οξειδίου του αργιλίου (3.9) και κατόπιν 25,0 ml εκχυλίσματος. Αφήνεται να ρεύσει το υγρό, απορρίπτονται τα 5 πρώτα ml και συλλέγονται τα επόμενα  12 ml μέσα σε βαθμολογημένο δοκιμαστικό σωλήνα.  5.1.2. Συμπυκνώματα ζωοτροφών Ζυγίζονται, με ακρίβεια 1 mg, 0,5 g δείγματος λεπτώς διαμερισθέντος και ομογενοποιηθέντος, φέρονται μέσα σε κωνική φιάλη των 500 ml (4.1), προστίθενται 250 ml διαλύματος μεθανόλης (3.2), ανακινείται η φιάλη επί 60 λεπτά και το μίγμα διηθείται.  Παραλαμβάνονται 5,0 ml διηθήματος και συμπληρώνονται μέχρι τα 200 ml με διάλυμα μεθανόλης (3.2) μέσα σε ογκομετρική σφαιρική φιάλη.  5.2. Ανάπτυξη της χρώσεως και μέτρηση της οπτικής πυκνότητος Λαμβάνονται 5,0 ml από το διάλυμα το οποίο ελήφθη στην 5.1.1 ή στην 5.1.2 και εισάγονται μέσα σε φυγοκεντρικό σωλήνα Α (4.5). Μέσα σε φυγοκεντρικό σωλήνα Β (4.5) φέρονται 5,0 ml διαλύματος αραιωμένης μεθανόλης (3.2) Προστίθενται μέσα σε κάθε σωλήνα 10,0  ml αντιδραστηρίου χρώσεως (3.8), πωματίζονται οι σωλήνες, ομογενοποιούνται και αφήνονται σε ηρεμία επί 18 λεπτά. Φυγοκεντρούνται κατόπιν επί 3 λεπτά ώστε να ληφθούν διαυγή διαλύματα και μεταγγίζονται τα διαλύματα Α και Β μέσα σε κωνικές φιάλες των 50 ml  (4.1).  Μετράται αμέσως στο φασματοφωτόμετρο, στα 530 nm η οπτική πυκνότητα του διαλύματος Α, χρησιμοποιώντας σαν "τυφλό" το διάλυμα Β. Προσδιορίζεται η ποσότητα του amprolium, με τη βοήθεια της καμπύλης αναφοράς (5.3).  5.3. Καμπύλη αναφοράς Εισάγονται μέσα στους φυγοκεντρικούς σωλήνες (4.5) αντιστοίχως 1,0 - 2,0 -3,0 - 4,0 και 5,0 ml του προτύπου διαλύματος (3.11). Συμπληρώνεται ο όγκος των τεσσάρων πρώτων σωλήνων μέχρι τα 5,0 ml με το μεθανολικό διάλυμα (3.2). Προστίθενται μέσα στους  πέντε σωλήνες 10,0 ml αντιδραστηρίου χρωματισμού (3.8), πωματίζονται οι σωλήνες, ομογενοποιούνται και αφήνονται σε ηρεμία επί 18 λεπτά. Φυγοκεντρούνται κατόπιν επί 3 λεπτά και μεταγγίζονται τα διαλύματα μέσα σε κωνικές φιάλες των 50 ml (4.1).  Μετράται αμέσως στο φασματοφωτόμετρο, στα 530 nm, η οπτική πυκνότητα των διαλυμάτων χρησιμοποιώντας σαν "τυφλά" ένα μίγμα 5 ml αραιωμένης μεθανόλης (3.2) και 10 ml αντιδραστηρίου χρωματισμού (3.8). Χαράσσεται η καμπύλη αναφοράς φέροντας στον άξονα των  τεταγμένων τις τιμές της οπτικής πυκνότητος και άξονα των τετμημένων τις αντίστοιχες ποσότητες του amprolium σε mg.  6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων 6.1. Ζωοτροφές και προμίγματα Η περιεκτικότητα σε mg amprolium ανά kg δείγματος δίδεται από τον τύπο - F- 20 000 όπου:  A = ποσότης σε mg του amprolium, προσδιορισθείσα φωτομετρικώς P = βάρος σε g του δείγματος F = συντελεστής αραιώσεως (ενδεχομένως πραγματοποιηθείσα στην 5.1.1).  6.2. Συμπυκνώματα ζωοτροφών Η περιεκτικότητα σε amprolium επί τοις εκατό του δείγματος δίδεται από τον τύπο - 200 όπου:  A = ποσότης σε mg του amprolium προσδιορισθέντος φωτομετρικώς P = βάρος σε g του προς δοκιμή δείγματος.  7. Επαναληπτικότητα Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων 2 παραλλήλων προσδιορισμών, πραγματοποιηθέντων επί του ιδίου δείγματος, δεν πρέπει να υπερβαίνει:  10 ppm, σε απόλυτο τιμή, για περιεκτικότητες σε amprolium κατώτερες των 100 ppm το 10%, σε σχετική τιμή, για περιεκτικότητες μεταξύ 100 και 5 000 ppm,  500 ppm, σε απόλυτο τιμή, για περιεκτικότητες μεταξύ 5 000 και 10 000 ppm,  το 5%, σε σχετική τιμή, για περιεκτικότητες ανώτερες των 10 000 ppm.   2. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ETHOPABATE  (Μεθυλικός εστέρας του 4-ακεταμιδο-2-αιθοξυ-βενζοϊκού οξέος) (methyl-4-acetamido-2-ethoxybenzoate) 1. Αντικείμενο και τομέας εφαρμογής Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό του ethopabate στις ζωοτροφές, στα συμπυκνώματα ζωοτροφών και στα προμίγματα. Το κατώτερο όριο του προσδιορισμού είναι 2 ppm.  2. Αρχή Το δείγμα εκχυλίζεται με αραιωμένη μεθανόλη. Το διάλυμα οξινίζεται και εκχυλίζεται με χλωροφόρμιο. Το εκχύλισμα με χλωροφόρμιο εκπλύνεται πρώτα με αλκαλικό διάλυμα και έπειτα με ύδωρ. Το καθαρισμένο εκχύλισμα συμπυκνώνεται, το ethopabate υδρολύεται με  αραιό υδροχλωρικό οξύ. Το αμινικό παράγωγο το οποίο σχηματίζεται κατ' αυτόν τον τρόπο ενώνεται με το άζωτο και συζεύγνυται με τη Ν-(1-ναφθυλο) αιθυλενοδιανίμη (Ν-(naphtyl)-ethylenediamine). Το κεχρωσμένο σύμπλοκο εκχυλίζεται με βουτανόλη και η οπτική  πυκνότητα του διαλύματος μετράται στα 555 nm.  3. Αντιδραστήρια 3.1. Μεθανόλη p.a.  3.2. Μεθανόλη 50% (όγκος/όγκο): Αναμιγνύονται ίσοι όγκοι μεθανόλης (3.1) και ύδατος.  3.3. Υδροχλωρικό οξύ p.a., d: 1,19.  3.4. Υδροχλωρικό οξύ αραιωμένο στο : Λαμβάνονται 10,0 ml υδροχλωρικού οξέος (3.3) και συμπληρώνονται μέχρι τα 100 ml με ύδωρ.  3.5. Υδροχλωρικό οξύ 0,3 Ν περίπου: Λαμβάνονται 25,0 ml υδροχλωρικού οξέος (3.3) και συμπληρώνονται μέχρι τα 1 000 ml με ύδωρ.  3.6. Χλωροφόρμιο p.a.  3.7. Διάλυμα 4% (βάρος/όγκο) p.a. ανθρακικού νατρίου: Διαλύονται 40,0 g ανύδρου ανθρακικού νατρίου p.a. σε ύδωρ και συμπληρώνονται μέχρι τα 1 000 ml με ύδωρ.  3.8. Διάλυμα 0,2% (βάρος/όγκο) νιτρώδους νατρίου: Διαλύονται σε ύδωρ 100 mg νιτρώδους νατρίου p.a. και συμπληρώνονται μέχρι τα 50 ml με ύδωρ μέσα σε ογκομετρική σφαιρική φιάλη. Παρασκευάζεται αμέσως πριν από τη χρήση.  3.9. Διάλυμα 1,0% (βάρος/όγκο) σουλφαμινικού αμμωνίου: Διαλύονται σε ύδωρ 500 mg σουλφαμινικού αμμωνίου p.a. και συμπληρώνονται στα 50 ml με ύδωρ μέσα σε ογκομετρική σφαιρική φιάλη. Παρασκευάζεται αμέσως πριν από τη χρήση.  3.10. Διάλυμα 0,2% (βάρος/όγκο), Ν-(1-ναφθυλο) αιθυλενοδιαμίνης, Ν-(1-naphtyl) ethylenediamine: Διαλύονται σε ύδωρ 100 mg N-(1-naphtyl) ethylenediamine p.a. και συμπληρώνονται στα 50 ml με ύδωρ μέσα σε ογκομετρική σφαιρική φιάλη. Παρασκευάζεται αμέσως  πριν από τη χρήση.  3.11. Άνυδρο χλωριούχο νάτριο p.a.  3.12. n-βουτανόλη p.a.  3.13. Ουσία για παρασκευή προτύπου διαλύματος: ethopabate καθαρό.  3.14. Πρότυπα διαλύματα:  3.14.1. Διάλυμα 0,040 mg ethopabate ανά ml: Ζυγίζονται, με ακρίβεια 0,1 mg, 40 g προτύπου ουσίας (3.13). Διαλύονται με αραιωμένη μεθανόλη (3.2) σε ογκομετρική σφαιρική φιάλη των 100 ml, συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με τον ίδιο διαλύτη και  ομογενοποιούνται. Λαμβάνονται 10,0 ml, συμπληρώνονται στα 100 ml με μεθανόλη (3.2) μέσα σε ογκομετρική σφαιρική φιάλη και ομογενοποιούνται. Το διάλυμα αυτό παραμένει σταθερό επί ένα μήνα.  3.14.2. Διάλυμα 0,016 mg ethopabate ανά 20 ml: Λαμβάνονται 5,0 ml διαλύματος (3.14.1), συμπληρώνονται στα 250 ml με αραιωμένη μεθανόλη (3.2) μέσα σε ογκομετρική σφαιρική φιάλη και ομογενοποιούνται. Παρασκευάζεται αμέσως πριν από τη χρήση.  4. Συσκευές 4.1. Κωνικές φιάλες των 250 ml με εσμυρισμένο πώμα.  4.2. Διαχωριστικές χοάνες των 100 ml με εσμυρισμένο πώμα.  4.3. Αναδευτήρας.  4.4. Συσκευή εξατμίσεως υπό κενό με περιστρεφόμενη σφαιρική φιάλη των 250 ml.  4.5. Υδρόλουτρο.  4.6. Φυγόκεντρος με σωλήνες των 15 και 50 ml, με εσμυρισμένα πώματα.  4.7. Ψυκτήρας αέρας.  4.8. Φασματοφωτόμετρο με κυψελίδες πάχους 10 mm.  5. Τρόπος εργασίας 5.1. Εκχύλιση Ζυγίζεται με ακρίβεια 1 mg ποσότητα δείγματος λεπτά διαμερισμένου και ομογενοποιημένου περιέχοντος 80 mg περίπου ethopabate. Εισάγεται το δείγμα σε κωνική φιάλη των 250 ml (4.1) και προστίθεται 100,0 ml αραιωμένης μεθανόλης (3.2). Αναμιγνύονται,  πωματίζεται η φιάλη και αναδεύεται επί 1 ώρα με τη βοήθεια ενός αναδευτήρα (4.3). Αφήνεται να ηρεμήσει, διηθείται και απορρίπτονται τα πρώτα ml του διηθήματος.  5.2. Καθαρισμός Σημείωση: Όλες οι εργασίες οι οποίες αναφέρονται στο σημείο αυτό πρέπει να πραγματοποιηθούν ταχέως.  Εισάγονται 20,0 ml διαυγούς εκχυλίσματος μέσα σε διαχωριστική χοάνη των 100 ml (4.2). Προστίθενται 5,0 ml υδροχλωρικού οξέος αραιωμένου στο  (3.4) και 20,0 ml χλωροφορμίου (3.6). Αναδεύονται στην αρχή με προσοχή και κατόπιν δραστικά επί 3 λεπτά.  Αφήνεται να ημεμήσει μέχρι διαχωρισμού των στιβάδων και συλλέγεται η στιβάδα του χλωροφορμίου μέσα σε μία δεύτερη διαχωριστική χοάνη των 100 ml (4.2).  Εκχυλίζεται η όξινη στιβάδα δύο φορές διαδοχικά με 20,0 ml χλωροφορμίου (3.6) κάθε φορά. Συλλέγονται τα εκχυλίσματα του χλωροφορμίου στη δεύτερη διαχωριστική χοάνη και απομακρύνεται η όξινη στιβάδα. Προστίθενται στο διάλυμα χλωροφορμίου 10 ml διαλύματος  ανθρακικού νατρίου (3.7), αναδεύεται επί 3 λεπτά και αφήνεται σε ηρεμία μέχρι διαχωρισμού των φάσεων. Συλλέγεται η χλωροφορμική στιβάδα σε μία τρίτη διαχωριστική χοάνη των 100 ml (4.2) και απορρίπτεται η υδατική στιβάδα. Προστίθενται στο διάλυμα  χλωροφορμίου 10 ml διαλύματος ανθρακικού νατρίου (3.7), αναδεύεται επί 3 λεπτά και αφήνεται να ηρεμήσει μέχρι διαχωρισμού των φάσεων.  Συλλέγεται η χλωροφορμική στιβάδα σε μια τέταρτη διαχωριστική χοάνη των 100 ml (4.2), εκπλύνεται 2 φορές διαδοχικά, με 25 ml ύδατος κάθε φορά, διαχωρίζονται οι υδατικές φάσεις και συλλέγεται ποσοτικά το χλωροφορμικό εκχύλισμα μέσα σε σφαιρική φιάλη των  250 ml (4.4). Συγκεντρώνονται οι υδατικές στιβάδες- εκπλένονται οι κενές διαχωριστικές χοάνες με μερικά ml χλωροφορμίου (3.6)- εκπλένεται κατόπιν η υδατική στιβάδα με το χλωροφόρμιο αυτό. Διαχωρίζεται η φάση του χλωροφορμίου και προστίθεται στο  εκχύλισμα το οποίο έχει συλλεγεί σε μιά σφαιρική φιάλη.  5.3. Υδρόλυση Εξατμίζεται το εκχύλισμα χλωροφορμίου μέχρι 2 ml περίπου, σε υδρόλουτρο 50 oC, με τη βοήθεια της συσκευής εξατμίσεως υπό κενό (4.4). Διαλύεται το υπόλειμμα με 2 έως 3 ml μεθανόλης (3.1), μεταγγίζεται ποσοτικά το διάλυμα μέσα σε φυγοκεντρικό σωλήνα των  50 ml (4.6) με τη βοήθεια δύο δόσεων των 10 ml και μιας των 5 ml υδροχλωρικού οξέος 0,3 Ν περίπου (3.5). Προστίθενται μερικά τεμάχια ελαφρόπετρας, ομογενοποιούνται και ο σωλήνας εφοδιάζεται με ψυκτήρα αέρος (4.7). Βυθίζεται ο σωλήνας μέσα σε ζέον  υδρόλουτρο και παραμένει εκεί επί 45 λεπτά. Αφήνεται κατόπιν να ψυχθεί σε ρεύμα ψυχρού ύδατος.  5.4. Ανάπτυξη του χρώματος και μέτρηση της οπτικής πυκνότητος Προστίθεται 1,0 ml διαλύματος νιτρώδους νατρίου (3.8), ανακινείται και αφήνεται να ηρεμήσει επί 2 λεπτά. Προστίθεται 1,0 ml διαλύματος σουλφαμινικού αμμωνίου (3.9), ανακινείται και αφήνεται σε ηρεμία επί 2 λεπτά. Προστίθενται 1,0 ml διαλύματος  Ν-(1-ναφθυλο) αιθυλενοδιαμίνης Ν-(1-naphtyl) ethylenediamine (3.10), ανακινείται και αφήνεται σε ηρεμία επί 10 λεπτά. Προστίθενται 5,0 g χλωριούχου νατρίου (3.11) και 10,0 ml βουτανόλης (3.12), ανακινείται ισχυρά μέχρις πλήρους διαλύσεως του χλωριούχου  νατρίου.  Λαμβάνεται το επιπλέον διάλυμα βουτανόλης με τη βοήθεια σιφωνίου, εισάγεται σε φυγοκεντρικό σωλήνα των 15 ml (4.6) και φυγοκεντρείται. Μετράται κατόπιν η οπτική πυκνότητα EA στο φασματοφωτόμετρο, στα 555 n.m. δια συγκρίσεως με την n-βουτανόλη (3.12).  5.5. "Τυφλό" πείραμα Πραγματοποιείται "τυφλό" πείραμα, ακολουθώντας τον ίδιο τρόπο εργασίας, από το σημείο 5.2, με 20,0 ml αραιωμένης μεθανόλης (3.2). Μετράται η οπτική πυκνότητα EB στα 555 nm δια συγκρίσεως με την n-βουτανόλη (3.12).  5.6. Δοκιμή με πρότυπο διάλυμα Πραγματοποιείται ακολουθώντας τον ίδιο τρόπο εργασίας, από το σημείο 5.2, με 20,0 ml προτύπου διαλύματος (3.14.2). Μετράται η οπτική πυκνότητα EC στα 555 nm, δια συγκρίσεως με την n-βουτανόλη (3.12.).  6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων Η περιεκτικότητα σε mg ethopabate ανά kg δείγματος δίδεται από τον τύπο  -  όπου:  EA = οπτική πυκνότητα του διαλύματος, το οποίο προέρχεται από το δείγμα.  EB = οπτική πυκνότητα του διαλύματος που προκύπτει από το "τυφλό" πείραμα.  EC = οπτική πυκνότητα του διαλύματος που προκύπτει από τη δοκιμή με πρότυπο διάλυμα.  P = βάρος σε g του δείγματος.  7. Επαναληπτικότητα Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παραλλήλων προσδιορισμών πραγματοποιουμένων επί του ιδίου δείγματος δεν πρέπει να υπερβαίνει:  το 20%, σε σχετική τιμή, για περιεκτικότητες του ethopabate κατώτερες των 7,5 ppm- 1,5 ppm, σε απόλυτη τιμή, για περιεκτικότητες μεταξύ 7,5 και 10 ppm- το 1,5%, σε σχετική τιμή για περιεκτικότητες μεγαλύτερες των 10 ppm.   3. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ DINITOLMIDE (DOT) (3,5-δινιτρο-ο-τολουαμίδιο) (3,5-dinitro-toluamide)  1. Αντικείμενο και τομέας εφαρμογής Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό του dinitolmide (DOT) στις ζωοτροφές, στα συμπυκνώματα ζωοτροφών και στα προμίγματα. Τα παράγωγα του νιτροφουρανίου υπεισέρχονται στον προσδιορισμό. Το κατώτατο όριο του προσδιορισμού είναι 40 ppm.  2. Αρχή Το δείγμα εκχυλίζεται με ακετονιτρίλιο. Το εκχύλισμα καθαρίζεται σε στήλη οξειδίου του αργιλίου και διηθείται. Μία ποσότητα του διηθήματος εξατμίζεται μέχρι ξηρού. Το υπόλειμμα παραλαμβάνεται με διμεθυλοφορμαμίδη και κατεργάζεται με αιθυλενοδιαμίνη.  Εμφανίζεται πορφυρός χρωματισμός. Το dinitolmide προσδιορίζεται με φασματοφωτόμετρο στο 560 nm.  3. Αντιδραστήρια 3.1. Ακενιτρίλιο 85% (όγκος/όγκο): Αναμιγνύονται 85 ml καθαρού ακετονιτριλίου και 150 ml ύδατος. Το μίγμα αποστάζεται πριν από τη χρήση. Συλλέγεται το κλάσμα της αποστάξεως μεταξύ 75 και 77 oC.  3.2. Οξείδιο του αργιλίου, για χρωματογραφία σε στήλη. Πυρώνεται επί 2 ώρες τουλάχιστον στους 750 oC, ψύχεται σε ξηραντήρα και διατηρείται σε φιάλη εκ σκοτεινής υάλου με εσμυρισμένο πώμα. Πριν από τη χρήση υγροποιείται ως ακολούθως: Εισάγονται σε φιάλη  σκοτεινής υάλου 10 g οξειδίου του αργιλίου και 0,7 ml ύδατος, η φιάλη πωματίζεται ερμητικά, θερμαίνεται επί 5 λεπτά σε ζέον υδρόλουτρο ανακινώντας συγχρόνως ισχυρά. Αφήνεται να ψυχθεί ανακινώντας συνεχώς. Ελέγχεται η δραστικότητα, υποβάλλοντας σε  ανάλυση από το σημείο 5.1, μία ορισμένη ποσότητα προτύπου διαλύματος (γνωστής συγκεντρώσεως) (3.6). Το ποσοστό της ανακτήσεως του dimitolmide πρέπει να είναι 100% +- 2%.  3.3. Ν,Ν-διμεθυλοφορμαμίδη 95% (όγκος/όγκο): Αναμιγνύονται 95,0 ml. Ν,Ν-διμεθυλοφορμαμίδης p.a. και 5,0 ml ύδατος.  3.4. Αιθυλενοδιαμίνη p.a., μεγίστης περιεκτικότητος σε ύδωρ: 2,0%.  3.5. Πρότυπος ουσία: 3,5-δινιτρο-ο-τολουαμίδιο (3,5 dinitro-o-toluamide) καθαρό, ανταποκρινόμενο στα ακόλουθα χαρακτηριστικά:  σημείο τήξεως: 117 oC-συντελεστής μοριακής αποσβέσεως στα 248 nm σε ακετονιτρίλιο: 13,1 x 103- συντελεστής μοριακής αποσβέσεως στα 266 nm σε Ν,Ν-διμεθυφορμαμίδη 10,1 x 103.  3.6. Πρότυπο διάλυμα: Ζυγίζονται, με ακρίβεια 0,1 mg, 40 mg προτύπου ουσίας (3.5). Διαλύονται με ακετονιτρίλιο (3.1) μέσα σε ογκομετρική σφαιρική φιάλη των 200 ml, συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με τον ίδιο διαλύτη και ομογενοποιείται. Λαμβάνονται 20,0  ml, συμπληρώνονται μέχρι τα 100 ml με ακετονιτρίλιο (3.1) μέσα σε ογκομετρική σφαιρική φιάλη και ομογενοποιούνται. 1 ml του διαλύματος αυτού περιέχει 40 mg dinitolmide.  4. Συσκευές 4.1. Κωνική φιάλη 250 ml με εσμυρισμένο πώμα.  4.2. Κάθετος ψυκτήρας.  4.2. Διηθητική χοάνη, πορώδους G3, διαμέτρου 60 mm.  4.4. Συσκευή διηθήσεως υπό κενό (π.χ. συσκευή του Witt) 4.5. Υδρόλουτρο ρυθμισμένο στους 50 oC.  4.6. Φασματοφωτόμετρο με κυψελίδες πάχους 10 mm.  5. Τρόπος εργασίας 5.1. Εκχύλιση και καθαρισμός Ζυγίζονται με ακρίβεια 1 mg 10 g του δείγματος λεπτά διαμερισμένου και ομογενοποιημένου. Για τα συμπυκνώματα και τα προμίγματα, ζυγίζεται 1 g, με ακρίβεια 1 mg. Εισάγεται το δείγμα σε μια κωνική φιάλη των 250 ml (4.1) και προστίθενται 65 ml  ακετονιτριλίου (3.1).  Αναμιγνύονται, προσαρμόζεται στην κωνική φιάλη κάθετος ψυκτήρας (4.2) και θερμαίνεται σε υδρόλουτρο (4.5) επί 30 λεπτά, ανακινώντας συνεχώς. Κατόπιν ψύχεται δια ρέοντος ύδατος. Προστίθενται 20 g οξειδίου του αργιλίου (3.2), ανακινείται επί 3 λεπτά και  αφήνεται να ηρεμήσει. Τοποθετείται μία ογκομετρική σφαιρική φιάλη των 100 ml στη συσκευή διηθήσεως (4.4), προσαρμόζεται η διηθητική χοάνη (4.3) και το υγρό διηθείται υπό κενό. Μεταγγίζεται κατόπιν το ίζημα στο χοάνη με τη βοήθεια μερικών ml  ακετονιτριλίου (3.1) και εφαρμόζεται πάλι κενό. Διακόπτεται η διήθηση υπό κενό, επανακατεργάζεται το ίζημα με μερικά ml ακετονιτριλίου (3.1) και εφαρμόζεται το κενό εκ νέου. Οι τελευταίες αυτές εργασίες επαναλαμβάνονται μέχρις ότου ο όγκος του  διηθήματος φθάσει τα 95 ml περίπου. Συμπληρώνεται ο όγκος στα 100 ml με ακετονιτρίλιο (3.1) και ομογενοποιείται. Αν είναι αναγκαίο, λαμβάνεται ένα μέρος και αραιώνεται με ακετονιτρίλιο (3.1) ώστε να ληφθεί διάλυμα που να περιέχει 5 ως 15 mg dinitolmide  ανά ml.  5.2. Ανάπτυξη του χρωματισμού και μέτρηση της οπτικής πυκνότητος Εισάγονται αντίστοιχα σε τρία ποτήρια ζέσεως των 50 ml, A, B και C, 4,0 ml του διαλύματος το οποίο ελήφθη στην 5.1. Προστίθεται εξ άλλου, στο ποτήρι C μόνο, 1,0 ml προτύπου διαλύματος (3.6). Φέρονται τα τρία ποτήρια στο υδρόλουτρο (4.5), τοποθετούνται  κάτω από καλά αεριζόμενο απορροφητήρα και εξατμίζεται το περιεχόμενο σε ρεύμα αέρος, μέχρι ξηρού. Αφήνονται να ψυχθούν μέχρι θερμοκρασίας περιβάλλοντος.  Προστίθενται 10,0 ml Ν,Ν-διμεθυλοφορμαμίδης (3.3) στο ποτήρι Α και 2,0 ml αντίστοιχα στα ποτήρια B και C. Αφήνονται σε επαφή επί μερικά λεπτά, ανακινώντας ελαφρά, μέχρι πλήρους διαλύσεως του ιζήματος. Προστίθενται κατόπιν 8,0 ml αιθυλενοδιαμίνης (3.4)  στα ποτήρια B και C και ομογενοποιούνται. Μετράται, πέντε λεπτά ακριβώς μετά την προσθήκη της αιθυλενοδιαμίνης, η οπτική πυκνότητα των τριών διαλυμάτων στο φασματοφωτόμετρο (4.6) στα 560 nm, χρησιμοποιώντας ως "τυφλό" τη Ν,Ν-διμελοφορμαμίδη (3.3).  6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων Η περιεκτικότης σε mg του dimitolmide ανά kg δείγματος δίδεται από τον τύπο:   - - 1 000 όπου:  EA = οπτική πυκνότητα του διαλύματος A (μάρτυρας).  EB = οπτική πυκνότητα του διαλύματος B (δείγμα).  EC = οπτική πυκνότητα του διαλύματος C (εσωτερικό πρότυπο).  P = βάρος εις g του δείγματος.  F = συντελεστής αραιώσεως (πραγματοποιουμένης ενδεχομένως στο 5.1).  7. Επαναληπτικότητα Η διαφορά μεταξύ των δύο παραλλήλων προσδιορισμών που πραγματοποιούνται στο ίδιο δείγμα, δεν πρέπει να υπερβεί:  τα 10 ppm, σε απόλυτη τιμή για περιεκτικότητες σε dinitolmide κατώτερες των 100 ppm- το 10%, σε σχετική τιμή, για περιεκτικότητες μεταξύ 100 και 5 000 ppm- τα 500 ppm, σε απόλυτη τιμή, για περιεκτικότητες μεταξύ 5 000 και 10 000 ppm- το 5%, σε σχετική τιμή, για περιεκτικότητες ανώτερες των 10 000 ppm.   4. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΝΙΚΑΡΒΑΖΙΝΗΣ (ισομοριακό μίγμα του 4,4-δινιτροκαρβανιλιδίου και της 2-υδροξυ-4,6-διμεθυλοπυριμιδίνης)  1. Αντικείμενο και τομέας εφαρμογής Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της νικαρβαζίνης μέσα στις ζωοτροφές, τα συμπυκνώματα ζωοτροφών και τα προμίγματα τα οποία δεν περιέχουν περισσότερο από 5% αλεύρου χόρτων. Τα παράγωγα του νιτροφουρανίου, το acetylenheptine και το carbadox  υπεισέρχονται στη μέτρηση. Το κατώτερο όριο προσδιορισμού είναι 20 ppm.  2. Αρχή Το δείγμα εκχυλίζεται με Ν,Ν-διμεθυλοφορμαμίδη. Το εκχύλισμα καθαρίζεται με χρωματογραφία σε στήλη οξειδίου του αργιλίου. Η νικαρβαζίνη εκλούεται με αιθανόλη. Το εκχύλισμα κατεργάζεται με αλκοολικό διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου. Αναπτύσσεται κίτρινη  χρώση. Η νικαρβαζίνη προσδιορίζεται με φασματοφωτόμετρο στα 430 nm.  3. Αντιδραστήρια 3.1. Ν,Ν-διμεθυλοφορμαμίδη p.a.  3.2. Οξείδιο αργιλίου για χρωματογραφία σε στήλη. Πυρώνεται επί δύο ώρες τουλάχιστο στους 750 oC. Ψύχεται μέσα σε ξηραντήρα και διατηρείται σε φιάλη σκοτεινού χρώματος με εσμυρισμένο πώμα. Πριν από τη χρήση ελέγχεται η δραστικότητα, υποβάλλοντας σε  ανάλυση, από το σημείο 5.2, μία ορισμένη ποσότητα προτύπου διαλύματος (3.8.3). Το ποσοστό της ανακτήσεως της νικαρβαζίνης πρέπει να είναι 100% +- 2%.  3.3. Αιθανόλη 95% (όγκος/όγκο).  3.4. Αιθανόλη 80% (όγκος/όγκο).  3.5. Διάλυμα 50% (βάρος/όγκο) υδροξειδίου του νατρίου p.a.  3.6. Αιθανολικό διάλυμα 1% (βάρος/όγκο) υδροξειδίου του νατρίου: φέρεται 1 ml διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου (3.5) μέσα σε ογκομετρική σφαιρική φιάλη των 50 ml και συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με αιθανόλη 80% (3.4). Παρασκευάζεται αμέσως πριν από  τη χρήση.  3.7. Ουσία για παρασκευή των προτύπων διαλυμάτων: νικαρβαζίνη καθαρή, συντελεστής μοριακής αποσβέσεως στα 362 nm στη Ν,Ν-διμεθυλοφορμαμίδη 37,8x103.  3.8. Πρότυπα διαλύματα:  3.8.1. Διάλυμα 1,25 mg νικαρβαζίνης ανά ml: ζυγίζονται, με ακρίβεια 0,1 mg, 125 mg της ουσίας (3.7). Διαλύονται με 75 mg Ν,Ν-διμεθυλοφορμαμίδης (3.1) σε μια ογκομετρική σφαιρική φιάλη των 100 ml θερμαίνοντας ελαφρά. Αφήνεται να ψυχθεί, συμπληρώνεται  μέχρι τη χαραγή με τον ίδιο διαλύτη και ομογενοποιείται. Διατηρείται μακριά από το φως.  3.8.2. Διάλυμα 0,125 mg νικαρβαζίνης ανά ml: λαμβάνονται 10,0 ml διαλύματος (3.8.1), συμπληρώνονται στα 100 ml με Ν,Ν-διμεθυλοφορμαμίδη (3.1) μέσα σε ογκομετρική σφαιρική φιάλη και ομογενοποιούνται.  3.8.3. Διάλυμα 0,025 mg νικαρβαζίνης ανά ml: λαμβάνονται 20,0 ml διαλύματος (3.8.2), συμπληρώνεται στα 100 ml με Ν,Ν-διμεθυλοφορμαμίδη (3.1) μέσα σε ογκομετρική σφαιρική φιάλη και ομογενοποιούνται.  4. Συσκευές 4.1. Κωνική φιάλη των 250 ml, με εσμυρισμένο στόμιο.  4.2. Κάθετος ψυκτήρας, με εσμυρισμένο στόμιο.  4.3. Υδρόλουτρο.  4.4. Φυγόκεντρος με σωλήνες των 120 ml.  4.5. Υάλινος σωλήνας για χρωματογραφία (εσωτερικής διαμέτρου: 25 mm, μήκους: 300 mm).  4.6. Φασματοφωτόμετρο με κυψελίδες των 10 mm.  4.7. Προχοΐδα βαθμολογημένη ανά 1/10 ml.  5. Τρόπος εργασίας 5.1. Εκχύλιση Ζυγίζονται, με ακρίβεια 1 mg, 10 g του δείγματος λεπτά διαμερισμένου και ομογενοποιημένου. Για τα συμπυκνώματα ζωοτροφών και για τα προμίγματα, ζυγίζεται 1 g, με ακρίβεια 1 mg. Εισάγεται το δείγμα σε κωνική φιάλη των 250 ml (4.1) και προστίθενται  ακριβώς 100 ml Ν,Ν-διμεθυλοφορμαμίδης (3.1). Αναμιγνύονται, εφοδιάζεται η φιάλη με έναν κάθετο ψυκτήρα (4.2) και θερμαίνεται σε ζέον υδρόλουτρο (4.3) επί 15 λεπτά, ανακινώντας από καιρού σε καιρό. Αφήνεται να ψυχθεί σε ρεύμα ψυχρού ύδατος. Μεταγγίζεται  κατόπιν το υγρό το οποίο επιπλέει μέσα σε φυγοκεντρικό σωλήνα (4.4) και φυγοκεντρείται επί 3 λεπτά περίπου. Αν είναι αναγκαίο λαμβάνονται 25,0 ml από το υγρό το οποίο επιπλέει και αραιώνονται με Ν,Ν-διμεθυλοφορμαμίδη (3.1) ώστε να ληφθεί διάλυμα  περιέχον 2,0 ως 10,0 mg νικαρβαζίνης ανά ml.  5.2. Χρωματογραφία Εισάγονται σε σωλήνα χρωματογραφίας (4.5) 30 g αργιλίου (3.2) εν αιωρήσει μέσα σε Ν,Ν-διμεθυλοφορμαμίδη (3.1). Αφήνεται να κατέλθει το υγρό μέχρι ύψους 1 cm υπεράνω της στήλης του οξειδίου του αργιλίου και εισάγονται κατόπιν στη στήλη 25,0 ml από το  εκχύλισμα, το οποίο ελήφθη στην 5.1. Αφήνεται να ρεύσει το υγρό φροντίζοντας ώστε να μη μείνει η στήλη χωρίς υγρό και εκπλύνεται αυτή τρεις φορές με 10 ml Ν,Ν-διμεθυλοφορμαμίδης (3.1) κάθε φορά. Εκλούεται κατόπιν με το 70 ml αιθανόλης 95% (3.3).  Απορρίπτονται τα 10 πρώτα ml του εκλούσματος και παραλαμβάνεται το υπόλοιπο κλασματικά ως ακολούθως:  ένα κλάσμα (α) των 5 ml.  ένα κλάσμα (β) των 50 ml μέσα σε ογκομετρική σφαιρική φιάλη.  ένα κλάσμα (γ) των 5 ml.  Ελέγχεται ώστε τα κλάσματα (α) και (γ) να μη δίδουν κίτρινη χρώση με προσθήκη αιθανολικού διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου (3.6). Συνεχίζεται η εργασία στο κλάσμα (β) όπως καθορίζεται στην (5.3).  5.3. Ανάπτυξη του χρώματος και μέτρηση της οπτικής πυκνότητος Εισάγονται αντιστοίχως 20,0 ml του κλάσματος (β) του εκλούσματος μέσα σε δύο ογκομετρικές σφαιρικές φιάλες Α και Β των 25 ml. Προστίθενται στη σφαιρική φιάλη Α 5,0 ml αιθανολικού διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου (3.6) και στη σφαιρική φιάλη Β 5,0 ml  αιθανόλης 95% (3.3). Ομογενοποιούνται.  Μετράται, στα 5 λεπτά που ακολουθούν, η οπτική πυκνότητα των δύο διαλυμάτων στα 430 nm, χρησιμοποιώντας σαν "τυφλή" μέτρηση ένα μίγμα 20,0 ml αιθανόλης 95% (3.3) και 5,0 ml αιθανολικού διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου (3.6).  Αφαιρείται η τιμή της οπτικής πυκνότητος του διαλύματος Β από εκείνη του διαλύματος Α. Προσδιορίζεται βάσει αυτής της τιμής, η ποσότητα της νικαρβαζίνης ανατρέχοντας στην καμπύλη αναφοράς (5.4).  5.4. Καμπύλη αναφοράς 25,0 ml προτύπου διαλύματος (3.8.3) υποβάλλονται σε χρωματογραφία όπως υποδεικνύεται στην 5.2. Μεταγγίζεται στην προχοΐδα το κλάσμα (β) του εκλούσματος και αφήνονται να ρεύσουν στις ογκομετρικές σφαιρικές φιάλες των 25 ml αντιστοίχως 2,0-4,0-6,0-8,0 και  10,0 ml που αντιστοιχούν σε 0,025-0,050-0,075-0,100 και 0,125 mg (νικαρβαζίνης). Προστίθενται μέσα σε κάθε σφαιρική φιάλη 5,0 ml αιθανολικού διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου (3.6), συμπληρώνωνται μέχρι τη χαραγή με αιθανόλη 95% (3.3) και  ομογενοποιούνται.  Μετράται στα 5 λεπτά που ακολουθούν η οπτική πυκνότητα των διαλυμάτων στα 430 nm, χρησιμοποιώντας σαν "τυφλή" μέτρηση ένα μίγμα 20,0 ml αιθανόλης 95% (3.3) και 5,0 ml αιθανολικού διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου (3.6) Χαράσσεται η καμπύλη αναφοράς σημειώνοντας στον άξονα των τεταγμένων τις τιμές της οπτικής πυκνότητος και στον άξονα των τετμημένων τις αντίστοιχες ποσότητες της νικαρβαζίνης σε mg.  6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων Η περιεκτικότητα σε mg της νικαρβαζίνης ανά kg δείγματος δίδεται από τον τύπο:  - F- 10 000 όπου:  A = ποσότης της νικαρβαζίνης σε mg προσδιοριζομένης φωτομετρικώς- P = βάρος σε g του δείγματος- F = συντελεστής αραιώσεως (πραγματοποιηθείσα ενδεχομένως στην 5.1).  7. Επαναληπτικότητα Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παραλλήλων μετρήσεων, οι οποίες πραγματοποιήθηκαν επί του ιδίου μίγματος δεν πρέπει να υπερβαίνουν:  τα 10 ppm, σε απόλυτο τιμή, για περιεκτικότητες σε νικαρβαζίνη κατώτερες των 100 ppm- το 10%, σε σχετική τιμή, για περιεκτικότητες μεταξύ 100 και 5 000 ppm- τα 500 ppm, σε απόλυτη τιμή, για περιεκτικότητες μεταξύ 5 000 και 10 000 ppm- το 5%, σε σχετική τιμή, για περιεκτικότητες ανώτερες των 10 000 ppm.   5. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ MENADIONE (BITAMINH K3)  1. Αντικείμενο και τομέας εφαρμογής Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της menadione (βιταμίνη K3) μέσα στις ζωοτροφές, στα συμπυκνώματα ζωοτροφών και στα προμίγματα. Το κατώτερο όριο του προσδιορισμού είναι 1 ppm.  2. Αρχή Το δείγμα εκχυλίζεται με αραιή αιθανόλη. Το μίγμα καθαρίζεται με διάλυμα ταννίνης και φυγοκεντρείται. Το εκχύλισμα κατεργάζεται με διάλυμα ανθρακικού νατρίου. Η απελευθερουμένη menadione παραλαμβάνεται με 1,2-διχλωροαιθάνιο. Το διχλωροαιθανικό εκχύλισμα  κατεργάζεται ανάλογα με την περιεκτικότητά του σε menadione είτε απ' ευθείας, είτε κατόπιν εξατμίσεως με αιθανολικό διάλυμα 2,4-δινιτροφαινυλυδραζίνης οξισμένο με υδροχλωρικό οξύ. Η λαμβανομένη υδραζόνη κατόπιν προσθήκης περίσσειας αμμωνίας δίδει  σύμπλοκο κυανοπράσινο, του οποίου η οπτική πυκνότητα μετράται στα 635 nm.  3. Αντιδραστήρια 3.1. Αιθανόλη 96% (όγκος/όγκο).  3.2. Αιθανόλη (3.1) αραιωμένη στα 40% με ύδωρ.  3.3. Διάλυμα 10% (βάρος/όγκο) ταννίνης, από καθαρή ταννίνη σε σκόνη.  3.4. 1,2-διχλωροαιθάνιο p.a.  3.5. Διάλυμα 10% (βάρος/όγκο) ανύδρου ανθρακικού νατρίου p.a.  3.6. Υδροχλωρικό οξύ 37% (βάρος/όγκο), d=1,19.  3.7. Απόλυτος αιθανόλη p.a.  3.8. Αντιδραστήριο 2,4-δινιτροφαινυλυδραζίνης: Διαλύονται 40 mg 2,4-δινιτροφαινυλυδραζίνης p.a. σε 40 ml περίπου απολύτου αιθανόλης σε βρασμό (3.7), αφήνεται να ψυχθεί και μεταγγίζεται σε ογκομετρική σφαιρική φιάλη των 50 ml. Προστίθεται 1 ml  υδροχλωρικού οξέος (3.6) και συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με απόλυτο αιθανόλη (3.7). Παρασκευάζεται αμέσως πριν από τη χρήση.  3.9. Αμμωνία 25% (βάρος/όγκο), d=0,91.  3.10. Αμμωνιακό διάλυμα αιθανόλης. Αναμιγνύεται ένας όγκος αιθανόλης (3.7) με έναν όγκο αμμωνίας (3.9).  3.11. Πρότυπα διαλύματα menadione: Διαλύονται 20 mg menadione (βιταμίνη K3) μέσα σε 1,2-διχλωροαιθάνιο (3.4) και συμπληρώνονται μέχρι τα 200 ml. Αραιώνονται κατάλληλες ποσότητες του διαλύματος αυτού με 1,2-διχλωροαιθάνιο (3.4) ώστε να ληφθεί σειρά  διαλυμάτων των οποίων οι συγκεντρώσεις σε menadione είναι μεταξύ 2 και 10 mg ανά ml. Τα διαλύματα αυτά πρέπει να είναι πρόσφατα.  4. Συσκευές 4.1. Μηχανικός αναδευτήρας.  4.2. Φυγόκεντρος (3 000 ως 5 000 στρ/λεπτό).  4.3. Διαχωριστικές χοάνες των 100 και 250 ml με εσμυρισμένο πώμα.  4.4. Συσκευή εξατμίσεως υπό κενό, με περιστρεφομένη φιάλη, με σφαιρικές φιάλες των 250 ml.  4.5. Υδρόλουτρο.  4.6. Φασματοφωτόμετρο με κυψελίδες πάχους 10 mm.  5. Τρόπος εργασίας Σημείωση: Όλες οι εργασίες πρέπει να γίνονται σε χώρο ο οποίος προστατεύεται από τον απ' ευθείας φωτισμό, ενδεχομένως σε συσκευή από φαιά ύαλο.  5.1. Δειγματοληψία Λαμβάνεται δείγμα, λεπτά διαμερισμένο, ανάλογο της υποτιθεμένης περιεκτικότητος σε menadione ήτοι: 0,1 ως 5,0 g για τα συμπυκνώματα και προμίγματα, 20-30 g για τις ζωοτροφές. Εισάγεται αμέσως το δείγμα στη φιάλη των 250 ml με το εσμυρισμένο πώμα.  5.2. Εκχύλιση Προστίθενται 96 ml ακριβώς διαλύματος αιθανόλης (3.2) και αναδεύονται μηχανικά επί 15 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Προστίθενται κατόπιν 4,0 ml διαλύματος ταννίνης (3.3), αναμιγνύονται, μεταγγίζεται το εκχύλισμα μέσα σε φυγοκεντρικό σωλήνα,  φυγοκεντρείται (3 000-5 000 στρ./λεπτό) και αφήνεται να καθιζάνει.  Εισάγονται 20-40 ml εκχυλίσματος, ακριβώς μετρηθέντα, μέσα σε διαχωριστική χοάνη των 250 ml προστίθενται με το σιφώνιο 50 ml 1,2-διχλωροαιθανίου (3.4), αναμιγνύονται και προστίθενται με σιφώνιο 20 ml, διαλύματος ανθρακικού νατρίου (3.5). Αναδεύεται  ισχυρά επί 30 δευτερόλεπτα και παραλαμβάνεται κατόπιν η στιβάδα του διχλωροαιθανίου μέσα σε διαχωριστική χοάνη των 100 ml. Προστίθενται 20 ml ύδατος, αναδεύονται επί 15 δευτερόλεπτα ακόμη, παραλαμβάνεται στιβάδα του διχλωροαιθανίου και απομακρύνονται τα  ίχνη του ύδατος με τη βοήθεια λωρίδων διηθητικού χάρτου.  Για τα συμπυκνώματα και προμίγματα λαμβάνεται ένα μέρος του εκχυλίσματος και αραιώνεται με 1,2-διχλωροαιθάνιο (3.4) ώστε να ληφθεί μία συγκέντρωση σε menadione 2-10 mg ανά ml. Για τις ζωοτροφές, εξατμίζεται μέχρι ξηρού ένα μέρος του εκχυλίσματος υπό  ελαττωμένη πίεση και σε ατμόσφαιρα αζώτου, σε υδρόλουτρο θερμοκρασίας 40 oC. Λαμβάνεται πάλι ταχέως το υπόλειμμα με 1,2 διχλωροαιθάνιο (3.4) ώστε να ληφθεί διάλυμα περιέχον 2 ως 10 mg menadione ανά ml.  5.3. Σχηματισμός υδραζόνης Φέρονται 2 ml εκχυλίσματος του διχλωροαιθανίου το οποίο ελήφθη στο 5.2 σε μια ογκομετρική φιάλη των 10 ml και προστίθενται 3,0 ml αντιδραστηρίου της 2,4-δινιτροφαινυλυδραζίνης (3.8), πωματίζεται η σφαιρική φιάλη με πώμα από φελλό ή teflon έτσι ώστε να  αποφευχθεί οιαδήποτε εξάτμιση και θερμαίνεται επί 2 ώρες σε υδρόλουτρο. Αφήνεται να ψυχθεί, προστίθενται 3,0 ml αμμωνιακού διαλύματος αιθανόλης (3.10), αναμιγνύονται, συμπληρώνεται ο όγκος με απόλυτο αιθανόλη (3.7) και αναμιγνύεται εκ νέου.  5.4. Μέτρηση της οπτικής πυκνότητος Μετράται η οπτική πυκνότητα του κυανοπρασίνου συμπλόκου στο φασματοφωτόμετρο στα 635 nm, δια συγκρίσεως με ένα "τυφλό" πείραμα του αντιδραστηρίου, που ελήφθη δια κατεργασίας 2,0 ml 1,2-διχλωροαιθανίου (3.4) όπως υποδεικνύεται στην 5.3. Προσδιορίζεται η  ποσότητα της menadione ανατρέχοντας στην καμπύλη αναφοράς, η οποία χαράχθηκε για κάθε σειρά αναλύσεων.  5.5. Καμπύλη αναφοράς 2,0 ml προτύπων διαλυμάτων menadione (3.11) κατεργάζονται όπως υποδεικνύεται στην 5.3. Μετράται η οπτική πυκνότητα όπως υποδεικνύεται στην 5.4. Χαράσσεται η καμπύλη αναφοράς σημειώνοντας στον άξονα των τεταγμένων τις τιμές της οπτικής πυκνότητος και  στον άξονα των τετμημένων τις αντίστοιχες ποσότητες της menadione, σε mg.  6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων Υπολογίζεται η περιεκτικότητα σε menadione του δείγματος λαμβάνοντας υπόψη το βάρος του δείγματος και τις αραιώσεις που πραγματοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της αναλύσεως. Το αποτέλεσμα εκφράζεται σε mg menadione ανά kg.  7. Επαναληπτικότητα Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παραλλήλων προσδιορισμών, πραγματοποιηθέντων επί του ιδίου δείγματος, δεν πρέπει να υπερβαίνει:  το 20%, σε σχετική τιμή, για περιεκτικότητες σε menadione κατώτερες των 10 ppm.  τα 2% ppm, σε απόλυτη τιμή, για περιεκτικότητες μεταξύ 10 και 14 ppm,  το 15%, σε σχετική τιμή, για περιεκτικότητες μεταξύ 14 και 100 ppm,  τα 15 ppm, σε απόλυτη τιμή, για περιεκτικότητες μεταξύ 100-150 ppm,  το 10%, σε σχετική τιμή, για περιεκτικότητες ανώτερες των 150 ppm.