CELEX: 31978L0633
Language: es
Date: 1978-06-15 00:00:00
Title: Octava Directiva 78/633/CEE de la Comisión, de 15 de junio de 1978, por la que se fijan los métodos de análisis comunitario para el control oficial de los alimentos para animales

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31978L0633

Octava Directiva 78/633/CEE de la Comisión, de 15 de junio de 1978, por la que se fijan los métodos de análisis comunitario para el control oficial de los alimentos para animales  

Diario Oficial n° L 206 de 29/07/1978 p. 0043 - 0055 Edición especial en finés : Capítulo 3 Tomo 10 p. 0071  Edición especial griega: Capítulo 03 Tomo 22 p. 0067  Edición especial sueca: Capítulo 3 Tomo 10 p. 0071  Edición especial en español: Capítulo 03 Tomo 14 p. 0230  Edición especial en portugués: Capítulo 03 Tomo 14 p. 0230 

 OCTAVA DIRECTIVA DE LA COMISIÓN    de 15 de junio de 1978    por la que se fijan los métodos de análisis   comunitario para el control oficial de los alimentos   para animales     ( 78/633/CEE )    LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,    Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad   Económica Europea ,    Vista la Directiva 70/373/CEE del Consejo , de 20   de julio de 1970 , referente a la introducción de modos   de toma de muestras y de métodos de análisis   comunitarios para el control oficial de los alimentos   para animales (1) , modificado en último lugar por el   Acta de adhesión , y en particular su artículo 2 ,    Considerando que la Directiva anteriormente contemplada   prevé que los controles oficiales de los alimentos   para animales dirigidos a comprobar que las condiciones   prescritas en virtud de las disposiciones legales ,   reglamentarias o administrativas referentes a la calidad   y a la composición de los animales se respetan y se   realizan según modos de toma de muestras y de métodos   de análisis comunitarios ;    Considerando que las Directivas de la Comisión   71/250/CEE , de 15 de junio de 1971 (2) , 71/393/CEE de   18 de noviembre de 1971 (3) , 72/199/CEE de 27 de   abril de 1972 (4) , 73/46/CEE de 5 de diciembre de 1972   (5) , 74/203/CEE de 25 de marzo de 1974 (6) , 75/84/CEE   de 20 de diciembre de 1974 (7) y 76/372/CEE de 1 de   marzo de 1976 (8) han fijado ya un determinado número   de métodos de análisis comunitarios ; que , teniendo   en cuenta el grado de desarrollo de los trabajos realizados   desde entonces , procede establecer una octava serie   de métodos ;    Considerando que las medidas previstas en la presente   Directiva concuerdan con el dictamen del Comité   permanente de alimentación animal ,    HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA :    Artículo 1    1 . Los Estados miembros prescribirán que los   análisis para los controles oficiales de los alimentos   para animales , en lo referente a su contenido en   bacitracina-cinc , flavofosfolipol , hierro , cobre ,   manganeso y cinc , se realizarán según los métodos   descritos en el anexo de la presente Directiva .    2 . Las disposiciones generales que figuren en el   punto 1 « Introducción » del anexo de la primera   Directiva 71/250/CEE , excepto la parte referente a la   preparación de la muestra por analizar , se podrán   aplicar a los métodos descritos en el anexo de la   presente Directiva .    Artículo 2    Los Estados miembros aplicarán , el 1 de enero de   1979 , las disposiciones legales , reglamentarias y   administrativas necesarias para cumplir las disposiciones   de la presente Directiva e informarán de ello   inmediatamente a la Comisión .    Artículo 3    Los destinatarios de la presente Directiva serán   los Estados miembros .    Hecho en Bruselas , el 15 de junio de 1978 .    Por la Comisión    Finn GUNDELACH    Vicepresidente    (1) DO n º L 170 de 3 . 8 . 1970 , p. 2 .    (2) DO n º L 155 de 12 . 7 . 1971 , p. 13 .    (3) DO n º L 279 de 20 . 12 . 1971 , p. 7 .    (4) DO n º L 123 de 29 . 5 . 1972 , p. 6 .    (5) DO n º L 83 de 30 . 3 . 1973 , p. 21 .    (6) DO n º L 108 de 22 . 4 . 1974 , p. 7 .    (7) DO n º L 32 de 5 . 2 . 1975 , p. 26 .    (8) DO n º L 102 de 15 . 4 . 1976 , p. 8 .    ANEXO    1 . DOSIFICACIÓN DE LA BACITRACINA-CINC POR   DIFUSIÓN EN GELOSA    1 . OBJETO Y DOMINIO DE APLICACIÓN    El método permitirá dosificar la bacitracina-cinc   en los alimentos , los concentrados y las premezclas .   El límite inferior de dosificación será de 5 mg/kg   ( 5 ppm ) (*) . El método no será valedero en   presencia de sustancias perturbadoras , en particular   de fuertes cantidades de cobre o de ácido ascórbico .    2 . PRINCIPIO    Se someterá la muestra a una extracción a pH 2   por una mezcla de metanol/agua/ácido clorhídrico . Se   llevará el extracto a pH 6,5 , concentrado si fuere   necesario y diluido . Se determinará su actividad   antibiótica por medida de la difusión de la   bacitracina-cinc en un medio de gelosa , sembrado con   « Micrococcus luteus » ( sinónimo : « M.   flavus » ) . Se revelará la difusión por la   formación de zonas de inhibición del microorganismo .   Se considerará el diámetro de dichas zonas como   directamente proporcional al logaritmo de la concentración   en antibiótico para la gama de las concentraciones   utilizadas .    3 . MICROORGANISMO : MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240    3.1 . Mantenimiento del extracto base    Sembrar el medio de cultivo ( 4.1 ) , en tubos   inclinados , con « Micrococcus luteus » . Incubar   24 h a 30-37 ° C , conservar en refrigerador a 4 ° C   aproximadamente y renovar la siembra cada dos semanas .    3.2 . Preparación de la suspensión bacteriana (a)    Recoger los gérmenes de un tubo de gelosa ( 3.1 ) , de   preparación reciente , mediante 2 a 3 ml de solución   de cloruro de sodio ( 4.3 ) . Sembrar en superficie con   esta suspensión 250 ml del medio de cultivo ( 4.1 ) en   un frasco de Roux e incubar de 18 a 20 h a 30-37 ° C .   Recoger los gérmenes en 25 ml de solución de cloruro   de sodio ( 4.3 ) y homogeneizar . Diluir la suspensión   a 1/10 mediante la solución de cloruro de sodio ( 4.3 ) .   La transmisión luminosa de la suspensión , medida a   650 nm bajo un espesor de 1 cm en comparación con la   solución de cloruro de sodio ( 4.3 ) , deberá ser   de 75 % aproximadamente .    4 . MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS    4.1 . Medio de mantenimiento del extracto base (b)    Peptona de carne 6,0 g    Triptona 4,0 g    Extracto de levadura 3,0 g    Extracto de carne 1,5 g    Glucosa 1,0 g    Gelosa 15,0 g    Agua 1 000 ml    pH 6,5-6,6 ( después de esterilizar ) 1 000 ml    4.2 . Medio de base de la dosificación (b)    Triptona 10,0 g    Extracto de levadura 3,0 g    Extracto de carne 1,5 g    Glucosa 1,0 g    Gelosa 20,0 g    Tween 80 1 ml    Agua 1 000 ml    pH 6,5 ( después de esterilizado )    4.3 . Solución a 0,8 % ( p/v ) de cloruro de sodio :   disolver en agua 8 g de cloruro sodio p.a. ; diluir a   1 000 ml y esterilizar .    4.4 . Mezcla de metanol puro/agua/ácido clorhídrico   p.a. ( d : 1,18-1,19 ) : 80/17,5/2,5 ( v/v/v ) .    4.5 . Tapón fosfato , pH 6,5 :    Fosfato bipotásico K2HPO4 p.a. 22,15 g    Fosfato monopotásico KH2PO4 p.a. 27,85 g    Agua hasta 1 000 ml    4.6 . Ácido clorhídrico p.a. , d : 1,18-1,19    4.7 . Ácido clorhídrico p.a. 0,1 N    4.8 . Solución 1 N de hidróxido de sodio p.a.    4.9 . Solución a 0,04 % ( p/v ) de púrpura de   bromocresol :    Disolver 0,1 g de púrpura de bromocresol en 18,5 ml de   solución 0,01 N de hidróxido de sodio . Completar   hasta 250 ml con agua y homogeneizar .    4.10 . Sustancia patrón : bacitracina-cinc de   actividad conocida ( en UI ) .    5 . SOLUCIONES PATRÓN    Pesar una cantidad de bacitracina-cinc patrón ( 4.10 )   correspondiente a 1 050 UI ( según la dosificación   indicada ) . Añadir 5 ml de ácido clorhídrico 0,1 N   ( 4.7 ) y dejar reposar 15 minutos . Añadir 30 ml de   agua , ajustar el pH a 4,5 mediante el tapón fosfato   pH 6,5 ( 4.5 ) ( alrededor de 4 ml ) , completar con   agua hasta 50 ml y homogeneizar ( 1 ml = 21 UI ) .    Preparar a partir de dicha solución y por diluciones   sucesivas mediante el tapón fosfato pH 6,5 ( 4.5 )   las siguientes soluciones :    S8 0,42 UI/ml    S4 0,21 UI/ml    S2 0,105 UI/ml    S1 0,0525 UI/ml    6 . PREPARACIÓN DEL EXTRACTO    6.1 . Extracción    6.1.1 . Concentrados , premezclas y alimentos minerales    Pesar una cantidad de muestra de 2 a 5 g , añadir   30 ml de la mezcla ( 4.4 ) y agitar brevemente .   Comprobar que el pH es de 2 aproximadamente . Agitar   durante 10 minutos , añadir 30 ml de tapón fosfato   pH 6,5 ( 4.5 ) y agitar durante 15 minutos . Diluir   mediante el tapón fosfato ( 4.5 ) para obtener una   concentración presunta en bacitracina-cinc de   0,42 UI/ml ( = U8 ) .    6.1.2 . Concentrados proteínicos    Pesar una cantidad de muestra de 10 g , añadir 50 ml   de la mezcla ( 4.4 ) y agitar brevemente . Comprobar   que el pH es de 2 aproximadamente . Agitar durante   10 minutos , añadir 50 ml de tapón fosfato   pH 6,5 ( 4.5 ) y agitar durante 15 minutos . Diluir   mediante el tapón fosfato ( 4.5 ) para obtener   una concentración presunta en bacitracina-cinc   de 0,42 UI/ml ( = U8 ) .    6.1.3 . Otros alimentos    Pesar una cantidad de muestra de 10 g ( 20 g para   una presunta concentración en bacitracina-cinc   de 5 mg/kg ) , añadir 25 ml de la mezcla ( 4.4 ) y   homogeneizar durante 10 minutos aproximadamente . Añadir   25 ml de tapón fosfato pH 6,5 ( 4.5 ) , agitar durante   15 minutos y centrifugar . Sacar 20 ml de la solución   que sobrenade y ajustar el pH a 6,5 mediante la solución   1 N de hidróxido de sodio ( 4.8 ) utilizando como   indicador la solución de púrpura de bromocresol   ( 4.9 ) . Evaporar hasta 4 ml aproximadamente en un   evaporador rotativo a una temperatura que no sobrepase .   35 ° C . Diluir el residuo con agua para obtener una   presunta concentración en bacitracina-cinc de   0,42 UI/ml ( = U8 ) .    6.2 . Soluciones del extracto    Preparar a partir de la solución U8 y por diluciones   sucesivas ( 1 + 1 ) mediante el tapón fosfato ( 4.5 )   las soluciones U4 ( presunta concentración 0,21 UI/ml ) ,   U2 ( presunta concentración : 0,105 UI/ml ) y U1   ( presunta concentración : 0,0525 UI/ml ) .    7 . MODALIDADES DE DOSIFICACIÓN    7.1 . Inoculación del medio de cultivo    Sembrar a 50 ° C aproximadamente el medio de base   de dosificación ( 4.2 ) por la suspensión bacteriana   ( 3.2 ) . Mediante ensayos preliminares sobre placas   con el medio ( 4.2 ) , determinar la cantidad de   suspensión bacteriana que permita obtener para las   distintas concentraciones en bacitracina-cinc zonas de   inhibición tan extensas como sea posible y que   permanezcan aún nítidas .    7.2 . Preparación de las cajas    La difusión en gelosa se realizará en cajas con   las cuatro concentraciones de la solución patrón   ( S8 , S4 , S2 , S1 ) y las cuatro concentraciones del   extracto ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Cada caja deberá   recibir necesariamente las cuatro concentraciones del   patrón y del extracto . A tal fin , escoger la   dimensión de las cajas de modo que se pueda ahuecar   en el medio de gelosa al menos ocho cavidades de 10 a   13 mm de diámetro , cuyos centros no estén a menos   de 30 mm de distancia . Se podrán utilizar como cajas   placas de vidrio planas , coronadas por un anillo de   aluminio o de materia plástica de 200 mm de diámetro   y 20 mm de altura .    Introducir en las cajas una cantidad del medio ( 4.2 ) ,   sembrado como se indica en 7.1 , que permita obtener   una capa de unos 2 mm de espesor ( 50 ml para una caja   de 200 mm de diámetro ) . Dejar solidificar , ahuecar las   cavidades y depositar en ellas volúmenes exactamente   medidos de las soluciones del patrón y del extracto   ( 0,10 a 0,15 ml por cavidad , según el diámetro ) .    Hacer al menos cuatro repeticiones de cada concentración   de modo que cada determinación sea objeto de una   evaluación de 32 zonas de inhibición .    7.3 . Incubación    Incubar las cajas de 16 a 18 horas a 30 ° C   aproximadamente .    8 . EVALUACIÓN    Medir el diámetro de las zonas de inhibición con   0,1 mm de tolerancia . Para cada concentración , registrar   las medidas medias en papel semi-logarítmico anotando el   logaritmo de las concentraciones en frente de los   diámetros de las zonas de inhibición . Trazar las   rectas más ajustadas para la solución patrón y para   el extracto procediendo , por ejemplo , de la siguiente   manera .    Determinar el punto más apropiado del nivel más   bajo de la solución patrón ( SL ) mediante la   fórmula :     ( a ) SL = ( 7 S1 + 4 S2 + S4 - 2 S8 ) /10    Determinar el punto más apropiado del nivel más   elevado de la solución patrón ( SH ) mediante la   fórmula :     ( b ) SH = ( 7 S8 + 4 S4 + S2 - 2 S1 ) /10    Determinar del mismo modo los puntos más apropiados   del extracto para el nivel más bajo ( UL ) y el nivel   más elevado ( UH ) sustituyendo S1 , S2 , S4 y S8 en   las fórmulas antes citadas por U1 , U2 , U4 y U8 .    Inscribir los valores SL y SH en el mismo gráfico .   Juntando los dos puntos , se obtendrá la recta   más ajustada para la solución patrón . Procediendo   del mismo modo para UL y UH , se obtendrá la recta   más ajustada para el extracto .    En ausencia de cualquier interferencia , las rectas   deberían ser paralelas . En la práctica , se   las considerará como paralelas cuando ( SH - SL ) y   ( UH - UL ) no difieren de más de 10 % de su media .    Si las rectas no son paralelas , se podrán eliminar   o bien U1 y S1 , o bien U8 y S8 . Los valores SL , SH ,   UL y UH que permiten conseguir las rectas más ajustadas   se calcularán entonces mediante las fórmulas   siguientes :     ( a' ) ( 5 S1 + 2 S2 - S4 ) /6 o ( 5 S2 + 2 S4 -   S8 ) /6     ( b' ) ( 5 S4 + 2 S2 - S1 ) /6 o ( 5 S8 + 2 S4 -   S2 ) /6    y fórmulas análogas para UL y UH . Al utilizar dicha   alternativa se deberá igualmente proceder a una   comprobación en cuanto al paralelismo de las rectas ,   como indicado más arriba . Se deberá mencionar en el   boletín de análisis la obtención de un resultado   procedente de los tres niveles .    Cuando las rectas se consideren como paralelas , se   calculará el logaritmo de la actividad relativa   ( log. A ) de acuerdo con una de las fórmulas   siguientes .    Para 4 niveles     ( c ) log. A = ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 -   S8 ) × 0,602/U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2    Para 3 niveles     ( d ) log. A = ( ( U1 + U2 + U4 - S1 - S2 -   S4 ) × 0,401 ) / ( U4 + S4 - U1 - S1 )     ( d' ) log. A = ( ( U2 + U4 + U8 - S2 - S4 -   S8 ) × 0,401 ) / ( U8 + S8 - U2 - S2 )    Actividad real = presunta actividad × actividad   relativa .    Cuando se consideren las rectas como no paralelas , se   repetirá la determinación . Si la misma   continuara sin permitir alcanzar el paralelismo ,   se calculará el logaritmo de la actividad relativa   ( log. A ) mediante la fórmula ( c ) . No obstante   se deberá considerar el resultado conseguido   como una aproximación y procederá mencionarlo así en el   boletín de análisis .    9 . REPETIBILIDAD    La diferencia entre los resultados de dos determinaciones   realizadas con una misma muestra por un mismo   analista no debería pasar de :    20 % del resultado más elevado para contenidos   de baciatracina-cinc de 5 a 25 mg/kg ,    5 mg/kg , en valor absoluto , para los contenidos   superiores a 25 mg/kg y hasta 50 mg/kg ,    10 % del resultado más elevado para contenidos   superiores a 50 mg/kg .    2 . DOSIFICACIÓN DEL FLAVOFOSFOLIPOL POR   DIFUSIÓN EN GELOSA    1 . OBJETO Y DOMINIO DE APLICACIÓN    El método permitirá dosificar el flavofosfolipol   en los alimentos , los concentrados y las premezclas .   El límite inferior de dosificación será de 1 mg/kg   ( 1 ppm ) .    2 . PRINCIPIO    Se someterá la muestra a una extracción por   metanol diluido mediante calentamiento por reflujo .   El extracto será centrifugado , purificado si fuere   necesario en resinas intercambiadoras de iones y   diluido . Se determinará su actividad antibiótica   por medida de la difusión del flavofosfolipol en un   medio de gelosa , sembrado con Staphylococcus aureus .   El diámetro de dichas zonas se considerará   como si fuera directamente proporcional al logaritmo   de la concentración en antibiótico para la   gama de las concentraciones utilizadas .    3 . MICROORGANISMO : STAPHYLOCOCCUS AUREUS   ATCC 6538 P    3.1 . Mantenimiento del extracto base    Sembrar el medio de cultivo ( 4.1 ) , en tubos   inclinados , con Staphylococcus aureus . Incubar   24 horas a 37 ° C , conservar en refrigerador   a 4 ° C aproximadamente y renovar la siembra cada mes .    3.2 . Preparación de la suspensión bacteriana (c)    Extraer dos tubos que contengan el cultivo-madre   ( 3.1 ) y renovar la siembra cada semana . Incubar   24 horas a 37 ° C y conservar en refrigerador a   4 ° C aproximadamente .    24 horas antes de la dosificación , sembrar   mediante dichos cultivos dos a cuatro tubos   inclinados que contengan el medio de cultivo ( 4.1 ) .    Incubar de 16 a 18 horas a 37 ° C . Poner luego   los gérmenes en suspensión en la solución de   cloruro de sodio ( 4.3 ) . La transmisión   luminosa de la suspensión , medida a 578 nm bajo un   espesor de 1 cm por comparación con la solución   de cloruro de sodio , deberá ser de 40 % aproximadamente .    4 . MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS    4.1 . Medio de mantenimiento del extracto base (d)    Peptona de carne 6,0 g    Triptona 4,0 g    Extracto de levadura 3,0 g    Extracto de carne 1,5 g    Glucosa 1,0 g    Gelosa 15,0 g    Agua 1 000 ml    pH 6,5 ( después esterilización )    4.2 . Medio de base de la dosificación    4.2.1 . Capa inferior (e)    Peptona de carne 6,0 g    Extracto de levadura 3,0 g    Extracto de carne 1,5 g    Gelosa 10,0 g    Agua 1 000 ml    pH 6,5 ( después esterilización )    4.2.2 . Capa por sembrar    Medio ( 4.1 ) sumado a 2 g de emulsión   antiespumante de silicona (f)    4.3 . Solución a 0,4 % ( p/v ) de cloruro   de sodio : disolver en agua 4 g de cloruro de sodio   p.a. , diluir hasta 1 000 ml y esterilizar .    4.4 . Metanol puro .    4.5 . Metanol a 50 % ( v/v ) : diluir 500 ml de   metanol por 500 ml de agua .    4.6 . Metanol a 80 % ( v/v ) : diluir 800 ml   de metanol ( 4.4 ) por 200 ml de agua .    4.7 . Tris ( hidroximetil ) aminometano p.a.    4.8 . Solución metanólica a 1,5 % ( p/v ) de   cloruro de potasio : disolver 1,5 g de cloruro de   potasio p.a. en 20 ml de agua , completar hasta   100 ml con metanol ( 4.4 ) .    4.9 . Intercambiador de cationes : Dowex 50 WX8 ,   20-50 mesh , forma Na ( cat. Serva n º 41600 ) o   equivalente .    4.10 . Intercambiador de aniones : Dowex 1X2 ,   50-100 mesh , forma Cl ( cat. Serva n º 41010 )   o equivalente . Antes de utilizarlo , mantener el   producto durante 12 a 14 horas en metanol a 80 % ( 4.6 ) .    4.11 . Lana de vidrio .    4.12 . Papel indicador de pH ( pH 6,6-8,1 )    4.13 . Ácido ascórbico .    4.14 . Sustancia patrón : flavofosfolipol de   actividad conocida .    5 . EQUIPO    5.1 . Tubo para cromatografía , de vidrio ,   diámetro interior : 9 mm , longitud : 150 a 200 mm ,   provisto de un grifo en la parte afilada de la   extremidad inferior y de un esmerilado normalizado ( para   empalme del embudo ) en la parte superior .    5.2 . Embudo con depósito de 250 ml , con grifo   y esmerilado normalizado .    5.3 . Frasco cónico de 250 ml , de esmerilado   normalizado .    5.4 . Refrigerante de reflujo , de esmerilado normalizado .    6 . SOLUCIONES PATRÓN    Disolver una cantidad exactamente pesada de sustancia   patrón ( 4.14 ) en metanol a 50 % ( 4.5 ) y diluir   para obtener una solución madre de flavofosfolipol   a 100 µg/ml . Conservada en frasco tapado a 4 ° C ,   dicha solución será estable durante dos meses .    Preparar a partir de dicha solución y por   diluciones sucesivas mediante metanol a 50 % ( 4.5 ) las   soluciones siguientes :    S8 0,2 µg/ml    S4 0,1 µg/ml    S2 0,05 µg/ml    S1 0,025 µg/ml    7 . PREPARACIÓN DEL EXTRACTO    7.1 . Extracción    7.1.1 . Concentrados , premezclas y alimentos minerales    Pesar una cantidad de muestra de 2 a 5 g y   añadirle unos 150 mg de ácido ascórbico ( 4.13 ) .   Mezclar a 150 mg de metanol a 50 % ( 4.5 ) en un   frasco ( 5.3 ) y ajustar el pH a 8,1-8,2 mediante   unos 400 mg de tris ( hidroximetil ) aminometano   ( 4.7 ) . Controlar el pH mediante papel indicador   ( 4.12 ) . Dejar macerar 15 minutos , ajustar de   nuevo el pH a 8,1-8,2 mediante tris ( hidroximetil )   aminometano ( 4.7 ) y luego hacer hervir durante   10 minutos con refrigerante de reflujo ( 5.4 )   agitando constantemente . Dejar enfriar , luego   centrifugar y decantar el extracto .    7.1.2 . Otros alimentos    Pesar una cantidad de muestra de 5 a 30 g que   contenga al menos 30 µg de flavofosfolipol .   Mezclar a 150 ml de metanol a 50 % ( 4.5 ) en un frasco   ( 5.3 ) y ajustar el pH a 8,1-8,2 mediante unos   400 mg de tris ( hidroximetil ) aminometano ( 4.7 ) .   Controlar el pH mediante el papel indicador   ( 4.12 ) . Dejar macerar 15 minutos , ajustar de nuevo   el pH a 8,1-8,2 mediante tris(hidroximetil)   aminometano ( 4.7 ) y luego hacer hervir durante   10 minutos con refrigerante de reflujo ( 5.4 )   agitando constantemente . Dejar enfriar , luego   centrifugar y decantar el extracto .    7.2 . Purificación ( se podrá omitir dicha   modalidad para los concentrados , las premezclas y los   alimentos minerales )    Mezclar 110 ml del extracto a 11 g de intercambiador   de cationes ( 4.9 ) , hacer hervir durante un   minuto con refrigerante de reflujo ( 5.4 ) agitando   constantemente . Separar el intercambiador de cationes   por centrifugación o filtración . Mezclar 100 ml   del extracto a 150 ml de metanol ( 4.4 ) y dejar   reposar la solución de 12 a 15 horas a 4 ° C .   Eliminar la materia floculante por filtración en frío .    Poner en el extremo inferior de un tubo ( 5.1 )   un tapón de lana de vidrio ( 4.11 ) , verter en   el tubo 5 ml de intercambiador de aniones ( 4.10 ) y   lavar la columna con 100 ml de metanol a 80 % ( 4.6 ) .   Luego trasvasar en la columna mediante el embudo   ( 5.2 ) un volumen de filtrado de 100 ml que se   supondrá contiene al menos 16 µg de flavofosfolipol   ( 200 ml para una muestra de 30 g de alimento a 1 ppm ) .   Si fuere necesario , diluir el filtrado antes de trasvasarlo   en la columna mediante metanol a 80 % ( 4.6 ) para   obtener una presunta concentración en flavofosfolipol   de 16 µg por 100 ml . Regular el caudal de salida   del líquido a 2 ml aproximadamente por minuto .   Eliminar la totalidad del filtrado . Lavar luego   la columna mediante 50 ml de metanol a 80 % ( 4.6 ) y   eliminar el filtrado .    Diluir el flavofosfolipol mediante la solución   metanólica de cloruro de potasio ( 4.8 ) manteniendo   el caudal de goteo alrededor de 2 ml por minuto .   Recoger 50 ml de la disolución en un matraz   aforado , añadir 30 ml de agua y homogeneizar .   Esta disolución debería tener un contenido en   flavofosfolipol de 0,2 µg/ml ( = U8 ) .    7.3 . Soluciones del extracto    Si fuere necesario ( en particular en los casos en que   se hubiere omitido la purificación ) , diluir el   extracto obtenido en 7.1.1 con metanol a 50 % ( 4.5 )   para obtener una presunta concentración en   flavofosfolipol de 0,2 µg/ml ( = U8 ) .    Preparar a partir de la solución U8 por diluciones   sucesivas ( 1 + 1 ) mediante metanol a 50 % ( 4.5 )   las soluciones U4 ( presunta concentración ) :   0,1 µg/ml ) , U2 ( presunta concentración :   0,05 µg/ml ) y U1 ( presunta concentración :   0,025 µg/ml ) .    8 . MODALIDADES DE LA DOSIFICACIÓN    8.1 . Inoculación del medio de cultivo    Sembrar a 50 ° C aproximadamente el medio de base   de la dosificación ( 4.2.2 ) a través de la   suspensión bacteriana ( 3.2 ) . Gracias a ensayos   preliminares en placas con el medio ( 4.2.2 ) , determinar   la cantidad de suspensión bacteriana que permita obtener   para las distintas concentraciones en flavofosfolipol   zonas de inhibición tan extensas como sea posible   y que permanezcan aún nítidas ( unos 30 ml por   litro ) .    8.2 . Preparación de las cajas    La difusión en gelosa se realizará en cajas con   las cuatro concentraciones de la solución patrón   ( S8 , S4 , S2 , S1 ) y las cuatro concentraciones del   extracto ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Cada caja deberá   necesariamente recibir las cuatro concentraciones del   patrón y del extracto . A tal fin , escoger la   dimensión de las cajas de forma tal que se pueda   ahuecar en el medio de gelosa al menos ocho cavidades   de 10 a 13 mm de diámetro , cuyos centros no estén   separados por menos de 30 mm . Se podrá utilizar   como cajas placas de vidrio planas , coronadas por un   anillo de aluminio o de materia plástica de 200 mm de   diámetro y 20 mm de altura .    Introducir en las cajas una cantidad del medio   ( 4.2.1 ) que permita obtener una capa de 1,5 mm   aproximadamente de espesor ( 45 ml para una caja de   200 mm de diámetro ) . Dejar solidificar y añadir   una cantidad del medio ( 4.2.2 ) , sembrado como   indicado en el punto 8.1 , que permita obtener una   capa de 1 mm de espesor ( 30 ml para una caja de 200 mm   de diámetro ) . Dejar solidificar , ahuecar   las cavidades y depositar en las mismas volúmenes   exactamente medidos de las soluciones del patrón y del   extracto ( 0,10 a 0,15 ml por cavidad , según el   diámetro ) .    Hacer al menos cuatro repeticiones de cada   concentración de modo que cada determinación   sea objeto de una evaluación de 32 zonas de inhibición .    8.3 . Incubación    Incubar las cajas de 16 a 18 horas a 28-30 ° C .    9 . EVALUACIÓN    Medir el diámetro de las zonas de inhibición   con una tolerancia de 0,1 mm . Para cada concentración ,   registrar las medidas en papel semi-logarítmico   anotando el logaritmo de las concentraciones frente   a los diámetros de las zonas de inhibición .   Trazar las rectas mejor ajustadas para la solución   patrón y para el extracto procediendo , por   ejemplo , de la siguiente manera .    Determinar el punto más apropiado del nivel   más bajo de la solución patrón ( SL ) mediante la   fórmula :     ( a ) SL = ( 7 S1 + 4 S2 + S4 - 2 S8 ) /10    Determinar el punto más apropiado del nivel más   elevado de la solución patrón ( SH ) mediante la   fórmula :     ( b ) SH = ( 7 S8 + 4 S4 + S2 - 2 S1 ) /10    Determinar del mismo modo los puntos más   apropiados del extracto para el nivel más bajo ( UL )   y el nivel más elevado ( UH ) sustituyendo S1 ,   S2 , S4 y S8 en las fórmulas arriba mencionadas   por U1 , U2 , U4 y U8 .    Inscribir los valores SL y SH en el mismo   gráfico . Uniendo los dos puntos , se obtendrá la   recta mejor ajustada para la solución patrón .   Procediendo del mismo modo para UL y UH , se conseguirá   la recta mejor ajustada para el extracto .    En ausencia de cualquier interferencia , las rectas   deberían ser paralelas . En la práctica , se las   considerará como si fueren paralelas cuando   ( SH-SL ) y ( UH-UL ) no diferieren de más del   10 % de su media .    Si las rectas no fueren paralelas , se podrá   eliminar o bien U1 y S1 o bien U8 y S8 . Los   valores SL , SH , UL y UH que permitan obtener   las rectas mejor ajustadas se calcularán entonces   mediante las fórmulas siguientes :     ( a' ) SL = ( 5 S1 + 2 S2 - S4 ) /6 o   ( 5 S2 + 2 S4 - S8 ) /6     ( b' ) SH = ( 5 S4 + 2 S2 - S1 ) /6 o   ( 5 S8 + 2 S4 - S2 ) /6    y fórmulas análogas para UL y UH . La   utilización de dicha alternativa deberá   igualmente ser objeto de una verificación   en cuanto al paralelismo de las rectas como   indicado más arriba . Se deberá mencionar   en el boletín de análisis la obtención de   un resultado procedente de tres niveles .    Cuando se consideren las rectas como paralelas ,   se calculará el logaritmo de la actividad relativa   ( log. A ) mediante alguna de las fórmulas siguientes .    Para 4 niveles     ( c ) log. A = ( ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 -   S4 - S8 ) × 0,602 ) / ( U4 + U8 + S4 + S8 -   U1 - U2 - S1 - S2 )    Para 3 niveles     ( d ) log. A = ( ( U1 + U2 + U4 - S1 - S2 - S4 ) ×   0,401 ) / ( U4 + S4 - U1 - S1 )     ( d' ) log. A = ( ( U2 + U4 + U8 - S2 - S4 - S8 ) ×   0,401 ) / ( U8 + S8 - U2 - S2 )    Actividad real = actividad presunta × actividad   relativa .    Cuando las rectas se consideren como no paralelas ,   repetir la determinación . Si la misma continuara   sin permitir alcanzar el paralelismo , calcular el   logaritmo de la actividad relativa ( log. A ) mediante   la fórmula ( c ) . Sin embargo , se deberá   considerar el resultado obtenido como aproximativo y será   procedente mencionarlo en el boletín de análisis .    10 . REPETIBILIDAD    La diferencia entre los resultados de dos determinaciones   realizadas en la misma muestra por el mismo analista   no debería sobrepasar :    0,5 mg/kg , en valor absoluto , para los contenidos   en flavofosfolipol de 1 a 2 mg/kg ,    25 % del resultado más elevado para los contenidos   superiores a 2 mg/kg y hasta 10 mg/kg ,    20 % del resultado más elevado para los contenidos   superiores a 10 mg/kg y hasta 25 mg/kg ,    5 mg/kg , en valor absoluto , para los contenidos   superiores a 25 mg/kg y hasta 50 mg/kg ,    10 % del resultado más elevado para los contenidos   superiores a 50 mg/kg .    3 . DOSIFICACIÓN DE LOS OLIGOELEMENTOS HIERRO ,   COBRE , MANGANESO Y CINC    1 . OBJETO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN    El método permitirá dosificar los oligoelementos   hierro , cobre , manganeso y cinc en los alimentos   de los animales . Los límites inferiores de   determinación serán los siguientes :    Hierro ( Fe ) 20 mg/kg ,    Cobre ( Cu ) 10 mg/kg    Manganeso ( Mn ) 20 mg/kg    Cinc ( Zn ) 20 mg/kg    2 . PRINCIPIO    Se meterá en solución la muestra en el ácido   clorhídrido después de la eventual destrucción de las   materias orgánicas . Se determinarán los elementos   hierro , cobre , manganeso y cinc , después de   dilución apropiada , por espectrometría de   absorción atómica .    3 . REACTIVOS    Observaciones preliminares    El agua utilizada para la preparación de los reactivos   y de las soluciones requeridas en el transcurso del   análisis deberán estar exentos de los cationes por   determinar . Se obtendrá bien por doble destilación   en un aparato de borosilicato o de cuarzo , bien   por doble permutación en resina intercambiadora de   iones .    Los reactivos deberán ser al menos de la calidad   « para análisis » ( p.a. ) . La ausencia del   elemento por determinar deberá ser controlada por un   ensayo en blanco . Si fuere necesario , se someterán   los reactivos a una purificación más profunda .    Se podrán sustituir las soluciones patrón   descritas a continuación por soluciones patrón   comerciales con tal que las mismas sean garantizadas   y controladas antes de su empleo .    3.1 . Ácido clorhídrico p.a. , d : 1,19 .    3.2 . Ácido clorhídrico p.a. , 6 N .    3.3 . Ácido clorhídrico p.a. , 0,5 N .    3.4 . Ácido fluorhídrico a 38-40 % ( v/v ) , con   un contenido de hierro inferior a 1 mg/l y cuyo residuo   de evaporación sea inferior a 10 mg ( expresados en   sulfatos )/l .    3.5 . Ácido sulfúrico p.a. , d : 1,84 .   3.6 . Agua oxigenada p.a. , a 100 vol. aproximadamente   de oxígeno ( 30 % en peso ) .    3.7 . Solución patrón de hierro ( 1 000 mg   Fe/ml ) : disolver 1 g de hierro de hilo p.a. en   200 ml de ácido clorhídrico 6 N ( 3,2 ) , añadir   16 ml de agua oxigenada ( 3.6 ) y completar con   agua hasta 1 l .    3.7.1 . Solución patrón de trabajo   ( 100 mg Fe/ml ) : diluir la solución patrón   ( 3.7 ) con agua a 1 + 9 .    3.8 . Solución patrón de cobre ( 100 mg Cu/ml ) :   disolver 1 g de cobre en polvo pa en 25 ml de ácido   clorhídrico 6 N ( 3.2 ) , añadir 5 ml de agua   oxigenada ( 3.6 ) y completar con agua hasta 1 l .    3.8.1 . Solución patrón de trabajo   ( 10 mg Cu/ml ) : diluir la solución patrón   ( 3.8 ) a 1 + 9 con agua ; diluir luego con agua   la solución obtenida a 1 + 9 .    3.9 . Solución patrón de manganeso   ( 1 000 mg Mn/ml ) : disolver 1 g de manganeso en   polvo p.a. en 25 ml de ácido clorhídrico 6 N   ( 3.2 ) y completar con agua hasta 1 l .    3.9.1 . Solución patrón de trabajo   ( 10 mg Mn/ml ) : diluir la solución patrón   ( 3.9 ) con agua a 1 + 9 ; diluir luego con agua la   solución obtenida a 1 + 9 .    3.10 . Solución patrón de cinc   ( 1 000 mg Zn/ml ) : disolver 1 g de cinc en cinta   o en placa p.a. en 25 ml de ácido clorhídrico   6 N ( 3.2 ) y completar con agua hasta 1 l .    3.10.1 . Solución patrón de trabajo   ( 10 mg Zn/ml ) : diluir la solución patrón   ( 3.10 ) con agua a 1 + 9 ; diluir luego la solución   obtenida con agua a 1 + 9 .    3.11 . Solución de cloruro de lantano :   disolver 12 g de óxido de lantano en 150 ml de agua ,   añadir 100 ml de ácido clorhídrico 6 N   ( 3.2 ) y completar con agua hasta 1 l .    4 . EQUIPO    4.1 . Horno de mufla , de temperatura regulable y   controlada .    4.2 . Material de vidrio de borosilicato ,   resistente . Se recomendará utilizar un material que   sirva exclusivamente para las dosificaciones de los   oligoelementos .    4.3 . Cápsulas de platino y , eventualmente , de   cuarzo .    4.4 . Espectrofotómetro de absorción atómico ,   que responda a las exigencias del método en cuanto a la   sensibilidad y a la precisión en la gama de las   medidas útiles .    5 . MODO OPERATIVO    5.1 . Muestra que contenga compuestos orgánicos    5.1.1 . Incineración y preparación de la   solución por analizar (**)    i ) Colocar de 5 a 10 g de la muestra , pesados   con 0,2 mg de tolerancia , en una cápsula de cuarzo   o de platino ( 4.3 ) ( ver nota b ) , secar en   la estufa a 105 ° C e introducir la cápsula en el   horno de mufla ( 4.1 ) frío . Cerrar el horno   ( ver nota c ) y elevar progresivamente su temperatura   para alcanzar de 450 a 475 ° C en 90 minutos   aproximadamente . Mantener dicha temperatura durante   4 a 16 horas ( por ejemplo , durante la noche ) de forma   a eliminar la materia carbonosa , abrir luego   el horno y dejar enfriar ( ver nota d ) .    Humectar las cenizas con agua , luego trasvasarlas   a un vaso precipitado de 250 ml . Enjuagar la cápsula   con 5 ml de ácido clorhídrico ( 3.1 ) y trasvasar   lentamente y con precaución la solución de   enjuague en el vaso precipitado ( se podrá producir   una reacción violenta por formación de CO2 .   Añadir luego gota a gota ácido clorhídrico   ( 3.1 ) , agitando al mismo tiempo el contenido   del vaso precipitado , hasta el cese de la   efervescencia . Evaporar en seco agitando   periódicamente con una varilla de vidrio .    Añadir al residuo 15 ml de ácido clorhídrico   6 N ( 3.2 ) y luego unos 120 ml de agua . Mezclar   con la ayuda de una varilla de vidrio , dejar   la misma en el vaso precipitado y recubrir con un   vidrio de reloj . Poner el líquido en ebullición   suave y mantener la ebullición hasta que   aparentemente ya no se disuelvan las cenizas . Filtrar   en un papel filtro sin cenizas y recoger el filtrado   en un matraz aforado de 250 ml . Lavar el vaso   precipitado y el filtro con 5 ml de ácido   clorhídrico 6 N ( 3.2 ) caliente y por dos veces   con agua hirviente . Completar con agua hasta su   volumen ( la concentración en hl será de 0,5 N   aproximadamente ) .    ii ) Si el residuo que se encuentre en el filtro   apareciere negro ( carbonoso ) , colocarlo de nuevo en   el horno e incinerar a 450-475 ° C . Dicha   incineración , que requerirá únicamente algunas horas   ( 3 a 5 horas aproximadamente ) se completará   cuando las cenizas aparezcan blancas o casi blancas .   Disolver el residuo en unos 2 ml de ácido clorhídrico   ( 3.1 ) , evaporar en seco y añadir 5 ml de   ácido clorhídrico 6 N ( 3.2 ) . Calentar , filtrar   la solución en el matraz aforado y completar   con agua hasta su volumen ( la concentración en hl   será de 0,5 N aproximadamente ) .    Observaciones :    a ) Al dosificar los oligoelementos , será   oportuno llamar la atención en cuanto a los riesgos de   contaminación , en particular por el cinc , el cobre   y el hierro . Por ello los instrumentos utilizados   para la preparación de las muestras deberán ser   exentos de dichos metales .    Para reducir los riesgos de contaminación ,   convendrá trabajar en atmósfera exenta de polvo ,   con un material rigurosamente limpio y aparatos de   vidrio cuidadosamente lavados . La dosificación   del cinc será especialmente sensible a las   contaminaciones procedentes en particular de los   aparatos de vidrio , de los reactivos , del polvo , etc .    b ) Calcular el peso de la muestra por incinerar en   función del contenido aproximativo del alimento   en oligoelementos por dosificar y de la sensibilidad   del espectrofotómetro utilizado . Para determinados   alimentos pobres en oligoelementos , podrá ser   necesario extraer una muestra de 10 a 20 g y de   limitar el volumen de la solución final a 100 ml .    c ) Incinerar en un horno cerrado sin inyección   de aire o de oxígeno .    d ) La temperatura indicada por el pirómetro no   deberá sobrepasar los 475 ° C .    5.1.2 . Determinación espectrofotométrica .    5.1.2.1 . Preparación de las soluciones patrón    Preparar para cada oligoelemento por dosificar una   gama de soluciones patrón a partir de las   soluciones patrón de trabajo 3.7.1 , 3.8.1 ,   3.9.1 y 3.10.1 , de forma que cada solución patrón   tuviere una concentración en HCl de 0,5 N   aproximadamente y , en el caso del hierro , del manganeso   y del cinc , una concentración en cloruro de lantano   que corresponda a 0,1 % de lantano ( p/v ) . Las   concentraciones escogidas en oligoelementos deberán   encontrarse en la zona de sensibilidad del   espectrofotómetro utilizado . Los cuadros siguientes   darán , a título de ejemplo , tipos de composición   de solución patrón ; según el tipo y la   sensibilidad del espectrofotómetro utilizado , podrá   ser necesario escoger otras concentraciones .    Hierro    µg Fe/ml * 0 * 0,5 * 1 * 2 * 3 * 4 * 5 *    ml de solución patrón de trabajo ( 3.7.1 )   ( 1 ml = 100 µg Fe ) + ml hl 6 N ( 3.2 ) *   0 * 0,5 * 1 * 2 * 3 * 4 * 5 *      7 * 7 * 7 * 7 * 7 * 7 * 7 *     + 10 ml de solución de cloruro de lantano   ( 3.11 ) ; completar con agua hasta 100 ml .    Cobre    µg Cu/ml * 0 * 0,1 * 0,2 * 0,4 * 0,6 * 0,8 * 1,0 *    ml de solución patrón de trabajo ( 3.8.1 )   ( 1 ml = 10 µg CU ) + ml hl 6 N ( 3.2 ) * 0 * 1 * 2 *   4 * 6 * 8 * 10 *     * 8 * 8 * 8 * 8 * 8 * 8 * 8 *    Completar con agua hasta 100 ml .    Manganeso    g Mn/ml * 0 * 0,1 * 0,2 * 0,4 * 0,6 * 0,8 * 1,0 *    ml de solución patrón de trabajo ( 3.9.1 )   ( 1 ml = 10 µg Mn ) + ml hl 6 N ( 3.2 ) * 0 *   1 * 2 * 4 * 6 * 8 * 10 *     * 7 * 7 * 7 * 7 * 7 * 7 * 7 *     + 10 ml de solución de cloruro de lantano   ( 3.11 ) ; completar con agua hasta 100 ml .    Cinc    g Zn/ml * 0 * 0,05 * 0,1 * 0,2 * 0,4 * 0,6 * 0,8 *    ml de solución patrón de trabajo ( 3.10.1 )   ( 1 ml = 10 µ Zn ) + ml hl 6 N ( 3.2 ) *   0 * 0,5 * 1 * 2 * 4 * 6 * 8 *     * 7 * 7 * 7 * 7 * 7 * 7 * 7 *     + 10 ml de solución de cloruro de lantano   ( 3.11 ) ; completar con agua hasta 100 ml    5.1.2.2 . Preparación de la solución por   analizar    Para la dosificación del cobre , la solución   preparada según 5.1.1 podrá , como regla general ,   utilizarse directamente . Si fuere necesario   llevar su concentración a la gama de las concentraciones   de las soluciones patrón , se podrá introducir   con una pipeta una parte alícuota en un matraz   aforado de 100 ml y completar con ácido clorhídrico   0,5 N ( 3.3 ) hasta su volumen .    Para la dosificación del hierro , del manganeso   y del cinc , introducir con la pipeta una porción   alícuota de la solución preparada según 5.1.1   en un matraz aforado de 100 ml ; añadir 10 ml de   solución de cloruro de lantano ( 3.11 ) y completar   con ácido clorhídrico 0,5 N ( 3.3 ) ( ver también   punto 8 « Observación » ) hasta su volumen .    5.1.2.3 . Prueba en blanco    Realizar una prueba en blanco que comprenda todas   las etapas prescritas del modo operatorio , con   exclusión de la presencia de la muestra .    No se deberá utilizar la solución patrón   « O » para la prueba en blanco .    5.1.2.4 . Medida de la absorción atómica    Medir la absorción de las soluciones patrón   y de la solución por analizar , utilizando una llama   oxidante aire-acetileno , con las siguientes longitudes   de onda :    Fe 248,3 nm    Cu 324,8 nm    Mn 279,5 nm    Zn 213,8 nm .    Realizar cuatro veces cada medida .    5.2 . Compuestos minerales    En ausencia de materia orgánica , será inútil   la incineración previa . Aplicar el modo operatorio   a partir del punto 5.5.1 i ) del segundo apartado .   Se podrá omitir la evaporación en presencia de   ácido fluorhídrico .    6 . CÁLCULO DE LOS RESULTADOS    Calcular la concentración en oligoelementos en la   solución por analizar mediante una curva de   contraste y expresar el resultado en mg de oligoelemento   por kg de muestra ( ppm ) .    7 . REPETIBILIDAD    La diferencia entre los resultados de dos   determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma   muestra por el mismo analista no debiere sobrepasar :     - 5 mg/kg en valor absoluto , para los contenidos   respectivos en oligoelementos hasta 50 mg/kg ,     - 10 % del resultado más elevado para los   contenidos superiores a 50 y hasta 100 mg/kg ,     - 10 mg/kg , en valor absoluto , para los   contenidos superiores a 100 y hasta 200 mg/kg ,     - 5 % del resultado más elevado para los   contenidos superiores a 200 mg/kg .    8 . OBSERVACIÓN    La presencia de grandes cantidades de fosfatos   podrá interferir en la dosificación del hierro , del   manganeso y del cinc . Se deberá corregir dicha   interferencia por adición de solución de cloruro de   lantano ( 3.11 ) . Sin embargo , si la muestra tuviere   una relación ponderal ( Ca + Mg ) /p > 2 se podrá   omitir la adición de solución de cloruro de   lantano ( 3.11 ) a la solución por analizar y   a las soluciones patrón .    (**) Los forrajes verdes ( frescos o deshidratados )   podrán contener grandes cantidades de sílice vegetal   que puedan retener oligoelementos y que se deberán   eliminar . Se deberán someter las muestras de dichos   alimentos al siguiente tratamiento . Efectuar la   operación ( 5.1.1 i ) hasta la fase de la filtración .   Lavar el papel filtro que contenga el residuo insoluble   por dos veces con agua hirviente y colocarlo en una   cápsula de platino ( 4.3 ) . Incinerar en el horno   de mufla ( 4.1 ) a una temperatura inferior a 550 ° C   hasta que toda la materia carbonosa hubiere desaparecido   por completo . Dejar enfriar , añadir algunas gotas   de agua , luego de 10 a 15 ml de ácido fluorhídrico   ( 3.4 ) y evaporar en seco a 150 ° C aproximadamente .   Si el residuo conteniere aún sílice , disolver la   misma en algunos ml de ácido fluorhídrico ( 3.4 )   y evaporar en seco . Añadir 5 gotas de ácido   sulfúrico ( 3.5 ) y calentar hasta desaparición   de los humos blancos . Añadir 5 ml de ácido   clorhídrico 6 N ( 3.2 ) y 30 ml aproximadamente   de agua , calentar , filtrar la solución en un   matraz aforado de 250 ml y completar hasta su volumen   con agua ( la concentración de hl será de   0,5 N aproximadamente ) . Proseguir el procedimiento   a partir del punto 5.1.3 .