CELEX: 32014R0260
Language: cs
Date: 2014-01-24 00:00:00
Title: Nařízení Komise (EU) č. 260/2014 ze dne 24. ledna 2014 , kterým se přizpůsobuje technickému pokroku nařízení (ES) č. 440/2008, kterým se stanoví zkušební metody podle nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek  Text s významem pro EHP

19.3.2014   
            
            
               CS
            
            
               Úřední věstník Evropské unie
            
            
               L 81/1
            
         
      NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) č. 260/2014
   ze dne 24. ledna 2014,
   kterým se přizpůsobuje technickému pokroku nařízení (ES) č. 440/2008, kterým se stanoví zkušební metody podle nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek
   (Text s významem pro EHP)
   EVROPSKÁ KOMISE,
   s ohledem na Smlouvu o fungování Evropské unie,
   s ohledem na nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 ze dne 18. prosince 2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek, o zřízení Evropské agentury pro chemické látky, o změně směrnice 1999/45/ES a o zrušení nařízení Rady (EHS) č. 793/93, nařízení Komise (ES) č. 1488/94, směrnice Rady 76/769/EHS a směrnic Komise 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES (1), a zejména na čl. 13 odst. 3 uvedeného nařízení,
   vzhledem k těmto důvodům:
   
               (1)
            
            
               Nařízení Komise (ES) č. 440/2008 (2) obsahuje zkušební metody pro určování fyzikálně-chemických vlastností látek, jejich toxicity a ekotoxicity, které se mají používat pro účely nařízení (ES) č. 1907/2006.
            
         
               (2)
            
            
               Nařízení (ES) č. 440/2008 je třeba aktualizovat a přednostně do něj zahrnout nové a aktualizované alternativní zkušební metody, jež nedávno schválila OECD, aby v souladu se směrnicí Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU ze dne 22. září 2010 o ochraně zvířat používaných pro vědecké účely (3) a směrnicí Rady 86/609/EHS ze dne 24. listopadu 1986 o sbližování právních a správních předpisů členských států týkajících se ochrany zvířat používaných pro pokusné a jiné vědecké účely došlo ke snížení počtu zvířat používaných pro pokusné účely (4).
            
         
               (3)
            
            
               Přizpůsobení spočívá v začlenění dvou metod stanovení fyzikálně-chemických vlastností včetně aktualizované zkoušky rozpustnosti ve vodě a nových zkušebních metod pro stanovení rozdělovacího koeficientu, které pomohou posoudit perzistentní, bioakumulativní a toxické (PBT) vlastnosti; čtyř nových a jedné aktualizované metody pro stanovení ekotoxicity a osudu a chování v životním prostředí; devíti metod stanovení toxických a jiných účinků na zdraví včetně čtyř zkušebních metod inhalační toxicity, jejichž součástí je aktualizace tří metod a jedna nová metoda za účelem snížení počtu použitých zvířat a zlepšení posuzování dopadů, aktualizace zkušební metody orální toxicity 28denní opakovanou aplikací zahrnující parametry pro hodnocení endokrinní činnosti, aktualizace zkušební metody toxikokinetiky pro příslušné uspořádání a pochopení toxikologických studií a aktualizace zkušební metody chronické toxicity, karcinogenity a kombinované chronické toxicity a karcinogenity.
            
         
               (4)
            
            
               Nařízení (ES) č. 440/2008 by proto mělo být odpovídajícím způsobem změněno.
            
         
               (5)
            
            
               Opatření stanovená tímto nařízením jsou v souladu se stanoviskem výboru zřízeného podle článku 133 nařízení (ES) č. 1907/2006,
            
         PŘIJALA TOTO NAŘÍZENÍ:
   Článek 1
   Příloha nařízení (ES) č. 440/2008 se mění v souladu s přílohou tohoto nařízení.
   Článek 2
   Toto nařízení vstupuje v platnost třetím dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropské unie.
   
      Toto nařízení je závazné v celém rozsahu a přímo použitelné ve všech členských státech.
      V Bruselu dne 24. ledna 2014.
      
         
            Za Komisi
         
         José Manuel BARROSO
         
         
            předseda
         
      
   
   
      (1)  Úř. věst. L 396, 30.12.2006, s. 1.
   
      (2)  Úř. věst. L 142, 31.5.2008, s. 1.
   
      (3)  Úř. věst. L 276, 20.10.2010, s. 33.
   
      (4)  Úř. věst. L 358, 18.12.1986, s. 1.
   
      PŘÍLOHA
      Příloha nařízení (ES) č. 440/2008 se mění takto:
      
                  1)
               
               
                  Kapitola A.6 se nahrazuje tímto:
                  „A.6   ROZPUSTNOST VE VODĚ
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda odpovídá Pokynům OECD pro zkoušení (TG) 105 (1995). Tato zkušební metoda je revidovanou verzí původních pokynů TG 105, které byly přijaty v roce 1981. Současná verze se obsahově od verze z roku 1981 neliší. Změnil se převážně formát textu. Revize vycházela ze zkušební metody EU „Rozpustnost ve vodě“ (1).
                           
                        VÝCHOZÍ ÚVAHY
                  
                              2.
                           
                           
                              Rozpustnost látky ve vodě může být značně ovlivněna přítomností nečistot. Tato zkušební metoda se zabývá stanovením rozpustnosti ve vodě u víceméně čistých látek, které jsou stabilní ve vodě a nejsou těkavé. Před stanovením rozpustnosti ve vodě je vhodné mít k dispozici předběžné informace o zkoušené chemické látce, například o strukturním vzorci, tlaku par, disociační konstantě a hydrolýze jako funkci pH.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              V této zkušební metodě jsou popsány dvě metody, a sice sloupcová eluční metoda pro rozpustnost nižší než 10–2 g/l a baňková metoda pro rozpustnost vyšší. Rovněž je zde popsána jednoduchá předběžná zkouška. Ta umožňuje přibližně stanovit vhodné množství vzorku, který se má použít v konečné zkoušce, a rovněž dobu nezbytnou k dosažení saturace.
                           
                        DEFINICE A JEDNOTKY
                  
                              4.
                           
                           
                              Rozpustnost látky ve vodě je veličina udávající hmotnostní koncentraci jejího nasyceného vodného roztoku při dané teplotě.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Rozpustnost ve vodě se vyjadřuje jako hmotnost rozpuštěné látky v objemu roztoku. Jednotkou v soustavě SI je kg/m3, ale může se používat také g/l.
                           
                        REFERENČNÍ CHEMICKÉ LÁTKY
                  
                              6.
                           
                           
                              Při vyšetřování zkoušené chemické látky není nutné používat referenční chemické látky.
                           
                        POPIS METOD
                  
                     Zkušební podmínky
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Zkouška se provádí optimálně při teplotě 20 ± 0,5 °C. Zvolenou teplotu je třeba udržovat ve všech důležitých částech aparatury konstantní.
                           
                        
                     Předběžná zkouška
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Ke vzorku o hmotnosti přibližně 0,1 g (pevné zkoušené chemické látky musí být v práškové formě) umístěnému do odměrného válce o objemu 10 ml uzavíratelného skleněnou zátkou se při laboratorní teplotě přidávají po krocích neustále narůstající objemy vody. Po každém přidání dílčího objemu vody se směsí intenzivně třepe po dobu 10 minut a vizuálně se kontroluje obsah nerozpuštěných částic vzorku. Zůstanou-li vzorek nebo jeho část po přidání 10 ml vody nerozpuštěny, pokračuje se v experimentu v odměrném válci o objemu 100 ml. Přibližná rozpustnost je uvedena v tabulce 1 pod objemem vody potřebným k úplnému rozpuštění vzorku. Je-li rozpustnost nízká, může být doba potřebná k rozpuštění zkoušené chemické látky dlouhá a je třeba vyčkat alespoň 24 hodin. Není-li zkoušená chemická látka ani po 24 hodinách rozpuštěna, je třeba vyčkat delší dobu (až 96 hodin) nebo se pokusit o další ředění, aby se zjistilo, zda by se měla použít sloupcová eluční metoda nebo baňková metoda.
                              
                                 Tabulka 1
                              
                              
                                          ml vody na 0,1 g rozpouštěné látky
                                       
                                       
                                          0,1
                                       
                                       
                                          0,5
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          2
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                       
                                          100
                                       
                                       
                                          > 100
                                       
                                    
                                          přibližná rozpustnost v g/l
                                       
                                       
                                          > 1 000
                                       
                                       
                                          1 000–200
                                       
                                       
                                          200–100
                                       
                                       
                                          100–50
                                       
                                       
                                          50–10
                                       
                                       
                                          10–1
                                       
                                       
                                          < 1
                                       
                                    
                        
                     Sloupcová eluční metoda
                  
                  
                     Podstata
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Tato metoda je založena na vymývání zkoušené chemické látky vodou z mikrokolony naplněné inertním nosičem pokrytým přebytkem zkoušené chemické látky (2). Rozpustnost ve vodě udává hmotnostní koncentrace eluátu poté, co dosáhla rovnovážného nasycení v závislosti na čase.
                           
                        
                     Aparatura
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Aparatura se skládá z mikrokolony (obrázek 1) udržované při konstantní teplotě. Je připojena buď k oběhovému čerpadlu (obrázek 2) nebo k vyrovnávací nádobě (obrázek 3). Mikrokolona obsahuje inertní nosič, který je fixován na místě pomocí malého smotku skelné vaty, který současně slouží k odfiltrování částeček. Materiály, které lze použít jako nosič, jsou skleněné kuličky, infuzoriová hlinka nebo jiné inertní materiály.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Mikrokolona na obrázku 1 je vhodná pro konfiguraci s oběhovým čerpadlem. Prostor hlavy této mikrokolony pojme pět objemů sloupce (které se na začátku pokusu vypustí) a objem pěti vzorků (které se během experimentu odebírají k analýze). Velikost hlavy kolony může být menší, pokud lze během experimentu přidávat do systému vodu k nahrazení původních pěti objemů sloupce eluovaných s nečistotami. Kolona je připojena hadičkami z inertního materiálu k oběhovému čerpadlu, které je schopno zajistit průtok asi 25 ml/h. Oběhovým čerpadlem může být například peristaltické nebo membránové čerpadlo. Je třeba dbát na to, aby nedošlo ke kontaminaci materiálu hadičky a/nebo adsorpci na něj.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Obrázek 3 ukazuje schematické uspořádání při použití vyrovnávací nádoby. V tomto uspořádání je mikrokolona vybavena jednocestným uzavíracím kohoutem. Spojení s vyrovnávací nádobou se skládá ze zabroušeného skleněného spoje a hadičky z inertního materiálu. Průtoková rychlost z vyrovnávací nádoby by měla být přibližně 25 ml/h.
                              
                                 Obrázek 1
                              
                              
                                 
                              Rozměry v mm
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          připojení pro skleněný zabroušený spoj
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          hlava kolony
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          vnitřní průměr 5
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          vnější průměr 19
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          smotek skelné vaty
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          uzavírací kohout
                                       
                                    
                                 Obrázek 2
                              
                              
                                 
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          vyrovnání atmosférického tlaku
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          průtokoměr
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          mikrokolona
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          termostatované čerpadlo
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          oběhové čerpadlo
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          dvoucestný kohout pro odběr vzorků
                                       
                                    
                                 Obrázek 3
                              
                              
                                 
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          Vyrovnávací nádoba (např. chemická baňka o objemu 2,5 l)
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          Kolona
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          Sběrač frakcí
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          Termostat
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          Teflonová hadička
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          Skleněný zabroušený spoj
                                       
                                    
                                          G.
                                       
                                       
                                          Hadice na vodu (mezi termostatem a kolonou, s vnitřním průměrem asi 8 mm)
                                       
                                    
                        
                              13.
                           
                           
                              Přibližně 600 mg nosiče se převede do 50 ml baňky s kulatým dnem. Vhodné množství zkoušené chemické látky se rozpustí v těkavém rozpouštědle o jakosti analytického činidla a příslušné množství tohoto roztoku se přidá k nosiči. Rozpouštědlo se zcela odpaří, např. za použití rotační odparky, jinak se nedosáhne úplného nasycení nosiče vodou během elučního kroku v důsledku rozdělování na povrchu nosiče. Nosič s nanesenou látkou se nechá dvě hodiny bobtnat v asi 5 ml vody a poté se suspenze nalije do mikrokolony. Je také možné naplnit mikrokolonu, která byla předtím naplněna vodou, suchým nosičem s nanesenou látkou a poté nechat během dvou hodin ustavit rovnováhu.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Nanášení zkoušené chemické látky na nosič může způsobit problémy a vést k chybným výsledkům, např. usazuje-li se zkoušená chemická látka jako olej. Tyto problémy by se měly prozkoumat a zaznamenat příslušné podrobné údaje.
                           
                        
                     Postup s použitím oběhového čerpadla
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Zahájí se vymývání kolony. Doporučená rychlost průtoku je asi 25 ml/h, což odpovídá u popsané kolony desetinásobku objemu sloupce za hodinu. Nejméně prvních pět objemů sloupce obsahujících nečistoty rozpustné ve vodě se odstraní. Poté se nechá běžet oběhové čerpadlo až do ustavení rovnováhy, které je dosaženo, neliší-li se koncentrace pěti po sobě následujících vzorků při náhodném výběru o více než ± 30 %, přičemž rozdíly jsou nepravidelné. Tyto vzorky by se měly odebírat v intervalech, během kterých kolonou projde nejméně desetinásobek objemu sloupce. V závislosti na použité analytické metodě může být vhodnější stanovit křivku závislosti koncentrace na čase, aby se prokázalo dosažení rovnováhy.
                           
                        
                     Postup s použitím vyrovnávací nádoby
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Po sobě následující podíly eluátu se shromažďují a jejich koncentrace se analyzují zvolenou metodou. Pro stanovení rozpustnosti se použijí prostřední frakce eluátu, ve kterých zůstávají koncentrace nejméně v pěti po sobě jdoucích frakcích konstantní v rozmezí ± 30 %.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Nejvhodnějším eluentem je dvakrát destilovaná voda. Rovněž lze použít deionizovanou vodu s odporem vyšším než 10 ΜΩ/cm a s celkovým obsahem organického uhlíku nižším než 0,01 %.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              V obou postupech se druhé promytí provede při poloviční průtokové rychlosti. Shodují-li se výsledky obou pokusů, považuje se výsledek zkoušky za uspokojivý. Je-li naměřená rozpustnost při nižší průtokové rychlosti vyšší, je nutno pokračovat ve snižování průtoku vždy na polovinu tak dlouho, dokud dvě po sobě následující měření nepovedou k stejné hodnotě rozpustnosti.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              V obou postupech by se měly frakce otestovat na přítomnost koloidních částic zkouškou Tyndallova jevu. Při přítomnosti částic je výsledek zkoušky neplatný a zkouška by se měla zopakovat po zlepšení filtrační funkce kolony.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Mělo by se změřit pH každého vzorku, pokud možno pomocí speciálních indikátorových papírků.
                           
                        
                     Baňková metoda
                  
                  
                     Podstata
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Zkoušená chemická látka (pevné látky musí být ve formě prášku) se rozpustí ve vodě při teplotě, která je o něco vyšší než teplota měření. Po dosažení nasycení se směs ochladí a udržuje se při zkušební teplotě. Jinou možností je provést měření přímo při zkušební teplotě, pokud je vhodným vzorkováním prokázáno, že je dosaženo saturační rovnováhy. Hmotnostní koncentrace zkoušené chemické látky ve vodném roztoku, který nesmí obsahovat žádné nerozpuštěné částice, se následně stanoví vhodnou analytickou metodou (3).
                           
                        
                     Aparatura
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Je třeba toto vybavení:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          běžné laboratorní skleněné nádoby a pomůcky,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          zařízení pro třepání roztoků při regulované konstantní teplotě,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          odstředivka (nejlépe termostatovaná), je-li nutná v případě emulzí a
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analytické vybavení.
                                       
                                    
                        
                     Postup
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Množství zkoušené chemické látky potřebné pro nasycení požadovaného objemu vody se odhadne na základě předběžné zkoušky. Do každé ze tří skleněných nádobek opatřených skleněnými zátkami (např. centrifugačních kyvet, baněk) se naváží asi pětinásobek tohoto množství. Dále se do každé z nádobek přidá množství vody zvolené v závislosti na analytické metodě a rozmezí rozpustnosti. Nádobky se těsně uzavřou a poté se jimi třepe při 30 °C. K tomuto účelu by se měla použít třepačka nebo míchačka pracující při konstantní teplotě, např. magnetické míchání v termostatované vodní lázni. Po jednom dni se jedna z nádobek uvede během 24 hodin při zkušební teplotě za občasného protřepání do rovnováhy. Poté se obsah nádobky odstředí při zkušební teplotě a v čiré vodné fázi se vhodnou analytickou metodou stanoví koncentrace zkoušené chemické látky. Po dvou, resp. třech dnech se zbylé dvě baňky po počátečním ustavení rovnováhy při 30 °C zpracují podobným způsobem. Pokud se koncentrace naměřené v nejméně dvou posledních nádobkách neliší o více než 15 %, považuje se výsledek zkoušky za uspokojivý. Pokud hodnoty koncentrací pro nádobky 1, 2 a 3 vykazují stoupající tendenci, mělo by se celé stanovení zopakovat s prodloužením doby pro ustavení rovnováhy.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Zkoušku lze provést i bez předběžné inkubace při 30 °C. Aby se zjistila rychlost ustavení saturační rovnováhy, odebírají se vzorky do té doby, dokud doba míchání ovlivňuje měřené koncentrace.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Mělo by se změřit pH každého vzorku, pokud možno pomocí speciálních indikátorových papírků.
                           
                        
                     Analytické stanovení
                  
                  
                              26.
                           
                           
                              Upřednostňuje se metoda specifická pro danou látku, protože malá množství rozpuštěných nečistot mohou způsobit velké chyby při stanovení rozpustnosti ve vodě. Příklady takových metod jsou plynová nebo kapalinová chromatografie, titrace, fotometrie, voltametrie.
                           
                        ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ
                  
                     Údaje
                  
                  
                     Sloupcová eluční metoda
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Pro každý pokus by se měla vypočítat střední hodnota a směrodatná odchylka z nejméně pěti po sobě následujících vzorků vybraných z oblasti po dosažení rovnovážného nasycení. Střední hodnoty získané ze dvou měření při různých průtokových rychlostech by se neměly lišit o více než 30 %.
                           
                        
                     Baňková metoda
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Zprůměrují se jednotlivé výsledky pro každou ze tří baněk, které by se neměly lišit o více než 15 %.
                           
                        
                     Protokol o zkoušce
                  
                  
                     Sloupcová eluční metoda
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto údaje:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          výsledky předběžné zkoušky,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          chemickou identitu látky a nečistoty (předběžný purifikační krok, pokud se použije),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          koncentrace, průtokové rychlosti a pH každého vzorku,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          střední hodnoty a směrodatné odchylky nejméně pro pět vzorků z rovnovážné oblasti křivky nasycení z každého pokusu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          průměrnou hodnotu nejméně dvou po sobě jdoucích měření,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          teplotu vody během procesu tvorby nasyceného roztoku,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analytickou metodu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          druh materiálu nosiče,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          způsob nanesení zkoušené chemické látky na nosič,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          použité rozpouštědlo,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          poznatky o jakékoli chemické nestálosti látky během zkoušky,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všechny informace, které mají význam pro interpretaci výsledků, zvláště s ohledem na nečistoty a fyzikální stav zkoušené chemické látky.
                                       
                                    
                        
                     Baňková metoda
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto údaje:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          výsledky předběžné zkoušky,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          chemickou identitu látky a nečistoty (předběžný purifikační krok, pokud se použije),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          výsledky jednotlivých analytických stanovení a průměrné hodnoty, pokud byla pro každou nádobku stanovena více než jedna hodnota,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          hodnotu pH každého vzorku,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          průměrnou hodnotu pro různé nádobky, jejichž výsledky jsou ve shodě,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          teplotu při zkoušce,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analytickou metodu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          poznatky o jakékoli chemické nestálosti látky během zkoušky,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všechny informace, které mají význam pro interpretaci výsledků, zvláště s ohledem na nečistoty a fyzikální stav zkoušené chemické látky.
                                       
                                    
                        
                     LITERATURA:
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              Směrnice Komise 92/69/EHS ze dne 31. července 1992, kterou se po sedmnácté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek, Úř. věst. L 383 A, 29.12.1992, s. 54.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.“
                           
                        
            
                  2)
               
               
                  Doplňuje se kapitola A.23:
                  „A.23   ROZDĚLOVACÍ KOEFICIENT (OKTAN-1-OL/VODA): METODA POMALÉHO MÍCHÁNÍ
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda odpovídá Pokynům OECD pro zkoušení (TG) č. 123 (2006). Metodou pomalého míchání byly přesně stanoveny hodnoty rozdělovacího koeficientu oktan-1-ol/voda (Pow) až po hodnotu log Pow = 8,2 (1). Proto je vhodným experimentálním postupem pro přímé stanovení Pow vysoce hydrofobních látek.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Dalšími metodami stanovení rozdělovacího koeficientu oktan-1-ol/voda (Pow) jsou metoda „třepací lahve“ (2) a stanovení Pow z retenčního chování při reverzní fázi HPLC (3). Při metodě „třepací lahve“ může dojít k artefaktům v důsledku přenosu mikrokapiček oktanolu do vodné fáze. Při vzrůstajících hodnotách Pow vede přítomnost těchto kapiček ve vodné fázi k zvyšujícímu se nadhodnocení odhadu koncentrace zkoušené chemické látky ve vodě. Proto je její použití omezeno na látky s log Pow < 4. Druhá metoda závisí na spolehlivosti údajů přímo stanovených hodnot Pow, které se používají ke kalibraci vztahu mezi retenčním chováním při HPLC a naměřenými hodnotami Pow. Pro stanovení rozdělovacích koeficientů oktan-1-ol/voda u ionizovatelných látek byla k dispozici pracovní verze pokynů OECD (4), ta se však již nemá nadále používat.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda byla vyvinuta v Nizozemsku. Přesnost zde popisovaných metod byla validována a optimalizována ve validační studii mezilaboratorních testů, které se zúčastnilo 15 laboratoří (5).
                           
                        VÝCHOZÍ ÚVAHY
                  
                     Význam a použití
                  
                  
                              4.
                           
                           
                              U inertních organických látek byl zjištěn velmi významný vztah mezi rozdělovacími koeficienty oktan-1-ol/voda (Pow) a jejich bioakumulací v rybách. Dále bylo prokázáno, že Pow koreluje s toxicitou pro ryby a rovněž se sorpcí chemických látek na pevné látky, např. půdu a sedimenty. V literatuře je uveden rozsáhlý přehled těchto vztahů (6).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Byla stanovena široká škála vztahů mezi rozdělovacím koeficientem oktan-1-ol/voda a dalšími vlastnostmi látek s významem pro environmentální toxikologii a chemii. V důsledku toho se stal rozdělovací koeficient oktan-1-ol/voda klíčovým parametrem při posuzování rizik chemických látek pro životní prostředí a rovněž při odhadu osudu chemických látek v životním prostředí.
                           
                        
                     Oblast použití
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Má se za to, že experiment používající pomalé míchání omezuje tvorbu mikrokapiček z kapiček oktan-1-olu ve vodné fázi. Proto nedochází k nadhodnocení odhadu koncentrace zkoušené chemické látky ve vodné fázi v důsledku molekul zkoušené chemické látky asociovaných na tyto kapičky. Metoda pomalého míchání je proto vhodná zejména k stanovení Pow u látek s předpokládanou hodnotou log Pow = 5 a vyšší, u nichž má metoda třepací lahve (2) tendenci vést k chybným výsledkům.
                           
                        DEFINICE A JEDNOTKY
                  
                              7.
                           
                           
                              Rozdělovací koeficient látky pro rozdělení mezi vodu a lipofilní rozpouštědlo (oktan-1-ol) charakterizuje rovnovážný stav distribuce chemické látky mezi těmito dvěma fázemi. Rozdělovací koeficient oktan-1-ol/voda (Pow) je definován jako poměr rovnovážných koncentrací zkoušené chemické látky v oktan-1-olu nasyceném vodou (Co) a ve vodě nasycené oktan-1-olem (Cw).
                              
                                 
                              Protože se jedná o podíl dvou koncentrací, je bezrozměrný. Nejčastěji se udává jako dekadický logaritmus (log Pow). Hodnota Pow závisí na teplotě a vykazované údaje by měly zahrnovat i teplotu měření.
                           
                        PODSTATA METODY
                  
                              8.
                           
                           
                              Pro stanovení rozdělovacího koeficientu se musí vzájemně ekvilibrovat voda, oktan-1-ol a zkoušená chemická látka při konstantní teplotě. Poté se stanoví koncentrace zkoušené chemické látky v obou fázích.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Potíže při provádění experimentu spojené s tvorbou mikrokapiček během experimentu používajícího metodu třepací lahve lze omezit zde navrhovanou metodou pomalého míchání. Při experimentu používajícím metodu pomalého míchání se rovnováhy mezi vodou, oktan-1-olem a zkoušenou chemickou látkou dosáhne v termostatovaném míchaném reaktoru. Výměna mezi fázemi je urychlena mícháním. Při míchání dochází jen k omezeným turbulencím, což zlepšuje výměnu mezi oktan-1-olem a vodou bez současné tvorby mikrokapiček (1).
                           
                        POUŽITELNOST ZKOUŠKY
                  
                              10.
                           
                           
                              Protože přítomnost jiných látek než zkoušené chemické látky může ovlivnit aktivitní koeficient zkoušené chemické látky, měla by se ověřit čistota zkoušené chemické látky. Pro stanovení rozdělovacího koeficientu oktan-1-ol/voda by se měla použít látka o nejvyšší čistotě, která je komerčně dostupná.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Tato metoda se používá u čistých látek, které nedisociují ani neasociují a nejsou výrazně povrchově aktivní. U takových látek a směsí je možné metodu použít ke stanovení rozdělovacího koeficientu oktan-1-ol/voda. Pokud se tato metoda používá u směsí, jsou stanovené rozdělovací koeficienty oktan-1-ol/voda podmíněné a závisejí na chemickém složení zkoušené směsi a na složení elektrolytu použitého jako vodná fáze. Pokud se podniknou doplňující kroky, lze tuto metodu použít rovněž pro disociující nebo asociující sloučeniny (odstavec 12).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Vzhledem k mnohonásobným rovnovážným stavům ve vodě a oktan-1-olu při rozdělování disociujících látek, jako jsou organické kyseliny a fenoly, organické báze a látky na organokovové sloučeniny, je rozdělovací koeficient oktan-1-ol/voda podmíněnou konstantou, která výrazně závisí na složení elektrolytu (7)(8). Stanovení rozdělovacího koeficientu oktan-1-ol/voda proto vyžaduje, aby bylo pH a složení elektrolytu v experimentu regulované a aby se zaznamenalo. Při hodnocení těchto rozdělovacích koeficientů je třeba vycházet z odborného posudku. S pomocí hodnoty disociační(ch) konstant(y) se musí zvolit vhodné hodnoty pH, aby se stanovil rozdělovací koeficient pro každý ionizační stav. Při zkoušení organokovových sloučenin se musí použít nekomplexující pufry (8). Vezmou-li se v úvahu stávající znalosti z oblasti chemie vodných roztoků (konstanty stability komplexu, disociační konstanty), měly by se zvolit experimentální podmínky takovým způsobem, aby bylo možno odhadnout, jaké formy vytvoří zkoušená chemická látka ve vodné fázi. Iontová síla by měla být ve všech experimentech identická díky použití základního elektrolytu.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Provádění této zkoušky může být problemetické v případě látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokým Pow, protože jejich koncentrace ve vodě je tak nízká, že je obtížné ji přesně stanovit. Tato zkušební metoda uvádí pokyny, jak tento problém řešit.
                           
                        INFORMACE O ZKOUŠENÉ CHEMICKÉ LÁTCE
                  
                              14.
                           
                           
                              Chemická činidla by měla mít analytickou nebo vyšší čistotu. Doporučuje se použít neznačené zkoušené chemické látky se známým chemickým složením a pokud možno o čistotě alespoň 99 % nebo radioizotopově značené zkoušené chemické látky se známým chemickým složením a radiochemickou čistotou. V případě značek s krátkým eliminačním poločasem by se měly provést korekce na rozpad. V případě radioizotopově značených zkoušených látek by se měla použít chemická specifická analytická metoda k zajištění toho, aby naměřená radioaktivita přímo souvisela se zkoušenou chemickou látkou.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Odhad hodnoty log Pow lze vypočítat pomocí komerčně dostupného softwaru pro odhad hodnoty log Pow nebo použitím podílu rozpustností v obou rozpouštědlech.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Před provedením experimentu používajícím pomalé míchání k stanovení hodnoty Pow je třeba mít k dispozici následující informace o zkoušené chemické látce:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          strukturní vzorec;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          vhodné analytické metody k stanovení koncentrace látky ve vodě a oktan-1-olu;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          disociační konstanta (konstanty) ionizovatelných látek (Pokyny OECD 112 (9));
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          rozpustnost ve vodě (10);
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          abiotická hydrolýza (11);
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          snadná biologická rozložitelnost (12);
                                       
                                    
                                          g)
                                       
                                       
                                          tlak par (13).
                                       
                                    
                        POPIS METODY
                  
                     Vybavení a aparatura
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Je třeba standardní laboratorní vybavení, zejména:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          magnetické míchačky a magnetické míchací tyčinky s teflonovým povlakem k míchání vodné fáze,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analytické přístroje vhodné k stanovení koncentrace zkoušené chemické látky v předpokládaném rozmezí koncentrací,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          míchací nádoba s kohoutem v dolní části. V závislosti na odhadované hodnotě log Pow a mezi stanovitelnosti (LOD) zkoušené sloučeniny se musí zvážit použití reakční nádoby stejného tvaru o objemu větším než jeden litr, aby bylo možno získat dostatečný objem vody pro chemickou extrakci a analýzu. Koncentrace ve vodném extraktu tak budou vyšší a tím bude i k analytické stanovení spolehlivější. V příloze 1 naleznete tabulku, v níž jsou uvedeny odhady minimálního potřebného objemu, LOD sloučeniny, její odhadované hodnoty log Pow a její rozpustnost ve vodě. Tabulka je založena na vztahu mezi hodnotou log Pow a poměrem rozpustností v oktanolu a ve vodě, jak jej uvádí Pinsuwanet al. (14):
                                          
                                             
                                          kde
                                          
                                              (v jednotkách molární koncentrace),
                                          a na vztahu pro odhad rozpustnosti ve vodě, jak jej uvádí Lyman (15). Hodnoty rozpustnosti ve vodě vypočítané podle rovnice uvedené v příloze 1 se musí považovat za první odhad. Je třeba poznamenat, že uživatel může k získání odhadu rozpustnosti ve vodě použít bez omezení jakýkoli vztah, o němž se má za to, že lépe vyjadřuje vztah mezi hydrofobicitou a rozpustností. Například u sloučenin v pevném skupenství se doporučuje zahrnout do odhadu rozpustnosti bod tání. V případě, že se použije pozměněný vzorec, je třeba se ujistit, že vzorec pro výpočet rozpustnosti v oktanolu i nadále platí. V dodatku 2 je uveden schematický nákres míchací nádoby se skleněným pláštěm o objemu asi jeden litr. Proporce nádoby uvedené v dodatku 2 se osvědčily jako vhodné a měly by se zachovat i při použití aparatury jiné velikosti,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          během experimentu používajícího pomalé míchání je nezbytné udržovat konstantní teplotu.
                                       
                                    
                        
                              18.
                           
                           
                              Nádoby by měly být vyrobeny z inertního materiálu, aby byla adsorpce na povrch nádoby zanedbatelná.
                           
                        
                     Příprava roztoků ke zkoušce
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Stanovení hodnoty Pow by se mělo provádět s oktan-1-olem o nejvyšší čistotě, který je komerčně dostupný (nejméně 99 %). Doporučuje se přečištění oktan-1-olu extrakcí kyselinou, zásadou a vodou s následným vysušením. Kromě toho se může oktan-1-ol přečistit destilací. Purifikovaný oktan-1-ol se použije k přípravě standardních roztoků zkoušené chemické látky. Při stanovení hodnoty Pow by se měla používat voda destilovaná ve skleněné nebo křemenné aparatuře nebo získaná z purifikačního systému nebo se může použít voda v čistotě pro HPLC. U destilované vody je nutná filtrace přes 0,22μm filtr a měly by se zahrnout slepé pokusy za účelem ověření, že koncentrované extrakty neobsahují žádné nečistoty, které by mohly interferovat se zkoušenou chemickou látkou. Používá-li se filtr ze skleněných vláken, měl by se vyčistit vystavením teplotě 400 °C po dobu nejméně tří hodin.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Obě rozpouštědla se před experimentem vzájemně nasytí tím, že uvedením do rovnovážného stavu v dostatečně velké nádobě. Dosáhne se toho pomalým mícháním tohoto dvoufázového systému po dobu dvou dnů.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Zvolí se vhodná koncentrace zkoušené chemické látky a látka se rozpustí v oktan-1-olu (nasyceném vodou). Rozdělovací koeficient oktan-1-ol/voda se musí stanovit v ředěných roztocích látky v oktan-1-olu a vodě. Proto by koncentrace zkoušené chemické látky neměla přesáhnout 70 % její rozpustnosti, přičemž maximální koncentrace v každé fázi by měla být 0,1 M (1). Roztoky oktan-1-olu použité v experimentu nesmějí obsahovat suspendované pevné částečky zkoušené chemické látky.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Vhodné množství zkoušené chemické látky se rozpustí v oktan-1-olu (nasyceném vodou). Pokud je odhadovaná hodnota log Pow větší než pět, je třeba pečlivě zajistit, aby roztoky oktan-1-olu používané v experimentu neobsahovaly suspendované pevné částečky zkoušené chemické látky. K tomu je třeba použít u chemických látek s odhadovanou hodnotou log Pow > 5 tento postup:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          zkoušená chemická látka se rozpustí v oktan-1-olu (nasyceném vodou),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          roztok se nechá po dostatečně dlouhou dobu ustálit, aby se suspendovaná pevná látka usadila. V průběhu usazování se sleduje koncentrace zkoušené chemické látky,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          poté, co naměřené koncentrace látky v roztoku oktan-1-olu dosáhnou stálých hodnot, naředí se zásobní roztok vhodným objemem oktan-1-olu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          koncentrace ředěného zásobního roztoku se změří. Jestliže naměřená koncentrace odpovídá ředění, může se naředěný zásobní roztok použít v experimentu s pomalým mícháním.
                                       
                                    
                        
                     Extrakce a analýza vzorků
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Stanovení zkoušené chemické látky by se mělo provádět validovanou analytickou metodou. Experimentátoři musí podat důkaz o tom, že se koncentrace látky v oktan-1-olové fázi nasycené vodou a rovněž ve vodné fázi nasycené oktan-1-olem během experimentu nacházejí nad mezí stanovitelnosti použitých analytických postupů. V případě, že jsou nutné extrakční metody, musí se před experimentem stanovit analyticky výtěžky zkoušené chemické látky z vodné fáze a z oktan-1-olové fáze. Analytický signál se musí korigovat s ohledem na slepé vzorky a je třeba zajistit, aby se jeden vzorek nemohl kontaminovat analytem z jiného vzorku.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Před analýzou bude pravděpodobně nutné provést extrakci vodné fáze organickým rozpouštědlem a zakoncentrování extraktu, protože koncentrace hydrofobních zkoušených látek ve vodné fázi je poměrně nízká. Ze stejného důvodu je nezbytné snížit případné koncentrace slepých vzorků. Proto je třeba použít rozpouštědla o vysoké čistotě, nejlépe rozpouštědla pro analýzu reziduí. Kromě toho může použití předem pečlivě vyčištěného(např. umytím v rozpouštědle nebo pečením při zvýšené teplotě) skla pomoci zabránit křížové kontaminaci.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Odhad hodnoty log Pow lze získat pomocí programu pro odhady nebo na základě odborného posudku. Je-li tato hodnota vyšší než šest, je třeba pečlivě sledovat korekce na slepé vzorky a případnou kontaminaci analytu. Podobně, přesáhne-li odhadovaná hodnota log Pow šest, je povinné použití náhradního standardu pro korekci na výtěžnost, aby bylo možné dosáhnout vysokých faktorů zakoncentrování. K odhadu hodnoty log Pow je komerčně dostupná řada počítačových programů (1), např. Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) a ACD log P (19). V literatuře (20–22) jsou uvedeny popisy metod odhadu.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Pomocí schválených metod se určí meze stanovitelnosti (LOQ) zkoušené chemické látky v oktan-1-olu a vodě. Na základě empirie lze mezní hodnotu kvantitativní stanovitelnosti dané metody určit jako koncentraci látky ve vodě nebo oktan-1-olu, při které je poměr signálu k šumu deset. Měla by se zvolit vhodná metoda extrakce a předběžného zakoncentrování a také by se měly specifikovat analyticky výtěžky. Zvolí se vhodný faktor zakoncentrování, aby se při analytickém stanovení získal signál požadované velikosti.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Na základě parametrů analytické metody a očekávaných hodnot koncentrace se určí přibližná velikost vzorku nezbytného pro přesné stanovení koncentrace sloučeniny. Vodné vzorky by neměly být příliš malé, protože by analytický signál nemusel být dostatečný. Zároveň by neměly být vodné vzorky příliš velké, aby celkové množství vody stačilo na minimální počet požadovaných analýz (n = 5). V dodatku 1 je uvedeno, že minimální objem vzorku závisí na objemu nádoby, mezi stanovitelnosti zkoušené chemické látky (LOD) a na rozpustnosti zkoušené chemické látky.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Kvantifikace zkoušené chemické látky se provádí porovnáním s kalibračními křivkami příslušné sloučeniny. Koncentrace v analyzovaných vzorcích musí být doplněny koncentracemi standardů v závorkách.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              U zkoušených látek s odhadovanou hodnotou log Pow větší než šest je třeba přidat k vodnému vzorku před extrakcí náhradní standard za účelem registrace ztrát během extrakce a zakoncentrování vodných vzorků. Pro přesnou korekci na výtěžnost musí mít náhradní standardy vlastnosti velmi podobné vlastnostem zkoušené chemické látky nebo identické vlastnosti. K tomuto účelu se přednostně používají (stabilní) izotopově značené analogy dotčených látek (například značené deuteriem nebo izotopy 13C). Není-li možno použít značení stabilními izotopy, tj. 13C nebo 2H, mělo by se prokázat pomocí spolehlivých údajů z literatury, že jsou fyzikálně-chemické vlastnosti náhradního standardu velmi podobné vlastnostem zkoušené chemické látky. Během extrakce typu kapalina-kapalina v případě vodné fáze mohou vznikat emulze. Lze je omezit přidáním soli a ponecháním emulze, aby se přes noc usadila. Je třeba uvést metody použité pro extrakci a předběžné zakoncentrování vzorků.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Vzorky odebrané z oktan-1-olové fáze se mohou před analýzou v případě potřeby naředit vhodným rozpouštědlem. Dále se použití náhradních standardů pro korekci na výtěžnost doporučuje u látek, u nichž experimenty stanovující výtěžnost prokázaly vysoký stupeň rozptylu v těchto experimentech (relativní směrodatná odchylka > 10 %).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Je třeba uvést podrobnosti o analytické metodě. To zahrnuje metodu extrakce, faktory zakoncentrování a ředění, parametry přístrojů, kalibrační postup, kalibrační rozpětí, analytický výtěžek zkoušené chemické látky z vody, přidání náhradních standardů pro korekci na výtěžnost, hodnoty slepých vzorků, meze stanovitelnosti a meze kvantitativní stanovitelnosti.
                           
                        
                     Provedení zkoušky
                  
                  
                     Optimální poměry objemu oktan-1-olu/vody
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Při volbě objemu vody a oktan-1-olu je třeba vzít v potaz mez stanovitelnosti (LOQ) v oktan-1-olu a vodě, koncentrační faktory použité u vodných vzorků, objemy vzorků odebíraných z oktan-1-olu a vody a očekávané koncentrace. Z experimentálních důvodů by se měl zvolit takový objem oktan-1-olu v systému pomalého míchání, aby byla vrstva oktan-1-olu dostatečně silná (> 0,5 cm), a umožnila tak odběr vzorků z oktan-1-olové fáze bez jejího porušení.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Obvyklé poměry mezi fázemi používané pro stanovení sloučenin s hodnotou log Pow = 4,5 a vyšší činí 20–50 ml oktan-1-olu a 950–980 ml vody v nádobě o objemu jeden litr.
                           
                        
                     Zkušební podmínky
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Reakční nádoba se v průběhu zkoušky termostatuje, aby nedocházelo ke kolísání teploty o více než 1 °C. Stanovení by se mělo provádět při teplotě 25 °C.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Experimentální systém by měl být chráněn před denním světlem buď prováděním experimentu v tmavé komoře, nebo zakrytím reakční nádoby hliníkovou fólií.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Experiment by se měl provádět v (co možná nejvíce) bezprašném prostředí.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Systém oktan-1-ol–voda se míchá až do dosažení rovnovážného stavu. V zkušebním experimentu se stanoví doba, za jakou dojde k ustavení rovnováhy, provedením experimentu s pomalým mícháním a odebíráním vzorků vody a oktan-1-olu v pravidelných intervalech. Časy odběru jednotlivých vzorků by měly být navzájem odděleny intervalem alespoň pěti hodin.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Každé stanovení Pow se musí provést pomocí nejméně tří nezávislých experimentů s pomalým mícháním.
                           
                        
                     Stanovení doby ustavení rovnováhy
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Předpokládá se, že rovnovážného stavu je dosaženo, když regrese podílu koncentrací v oktan-1-olu/vodě v závislosti na čase v časovém rozmezí čtyř časových bodů vede ke směrnici, která se při hladině p = 0,05 výrazně neliší od nuly. Minimální doba nutná k ustavení rovnováhy, než lze zahájit odběr vzorků, je jeden den. Dle empirického pravidla lze u látek s odhadovanou hodnotou log Pow menší než pět zahájit odběr vzorků během druhého a třetího dne. U hydrofobnějších látek může být nutné tuto dobu ekvilibrace prodloužit. Sloučenina s hodnotou log Pow 8,23 (dekachlorobifenyl) stačilo k dosažení rovnováhy 144 hodin. Rovnováha se stanoví pomocí opakovaného odběru vzorků z jedné nádoby.
                           
                        
                     Zahájení experimentu
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Na začátku experimentu se reakční nádoby naplní oktan-1-olem nasyceným vodou. Je třeba vyčkat dostatečnou dobu, aby se dosáhlo teploty termostatování.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Požadované množství zkoušené chemické látky (rozpuštěné v potřebném objemu oktan-1-olu nasyceného vodou) se opatrně přidá do reakční nádoby. Tento krok je kritický, neboť je nutno zabránit turbulentnímu promíchání obou fází. Proto se oktan-1-olová fáze se pipetuje pomalu proti stěně experimentální nádoby v blízkosti povrchu vody. oktan-1-olová fáze poté steče po skleněné stěně a vytvoří vrstvičku nad vodnou fází. Vždy by se mělo zabránit přímé dekantaci oktan-1-olu do nádoby, kapičky oktan-1-olu by neměly padat přímo do vody.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Po zahájení míchání by se měla pomalu zvyšovat rychlost míchání. Nelze-li míchací motory vhodně nastavit, mělo by se zvážit použití transformátoru. Rychlost míchání by se měla nastavit tak, aby se v místě fázového rozhraní vody a oktan-1-olu vytvořil vír o hloubce 0,5 až maximálně 2,5 cm. Rychlost míchání by se měla snížit, jestliže hloubka víru překročí 2,5 cm. Jinak se mohou z kapiček oktan-1-olu ve vodě vytvořit mikrokapičky, což vede k přecenění odhadu koncentrace zkoušené chemické látky ve vodě. Tato maximální rychlost míchání 2,5 cm se doporučuje na základě výsledků validační studie mezilaboratorních testů (5). Jedná se o kompromis mezi rychlým dosažením rovnováhy a omezením tvorby mikrokapiček oktan-1-olu.
                           
                        
                     Odběr a zpracování vzorků
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Před odběrem vzorků by se měla míchačka vypnout a vyčkat, až ustane pohyb kapaliny. Po dokončení odběru vzorků se míchačka opět pomalu spustí způsobem popsaným výše a rychlost míchání se postupně zvýší.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Vzorky vodné fáze se odebírají z uzavíracího kohoutu ve spodní části reakční nádoby. Vždy je třeba vylít mrtvý objem vody, který zůstává v kohoutcích (přibližně 5 ml u nádoby vyobrazené v dodatku 2). Voda v kohoutcích se nemíchá, a proto není v rovnováze s hlavním objemem vody v nádobě. Zaznamená se objem vodných vzorků. Při stanovování látkové bilance je nutné vzít v úvahu množství zkoušené chemické látky obsažené ve vylité vodě. Ztráty odparem by se měly minimalizovat tím, že se voda nechá pomalu vtékat do dělící nálevky tak, aby se při tom nenarušila vrstva voda/oktan-1-ol.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Oktan-1-olové vzorky se získají odebráním malého množství (asi 100 μl) oktan-1-olové vrstvy pomocí 100mikrolitrové sklo-kovové stříkačky. Je třeba dát pozor, aby se nenarušila hranice mezi fázemi. Objem odebraného vzorku se zaznamená. Malé množství stačí, neboť oktan-1-klový vzorek se bude ředit.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Vzorky není vhodné zbytečně převádět. Proto by se měl objem vzorku stanovit gravimetricky. V případě vodných vzorků toho lze dosáhnout soustředěním vodného vzorku do dělící nálevky, která již obsahuje požadovaný objem rozpouštědla.
                           
                        ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ
                  
                              47.
                           
                           
                              V souladu se stávající zkušební metodou se Pow stanoví provedením tří experimentů používajících pomalé míchání (tři experimentální jednotky) se studovanou sloučeninou za identických podmínek. Regrese použitá k prokázání dosažení rovnovážného stavu by měla vycházet z výsledků alespoň čtyř stanovení Co/Cw po sobě jdoucích časových bodech. To umožňuje vypočítat rozptyl jako měřítko neurčitosti průměrné hodnoty získané u každé experimentální jednotky.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Pow lze charakterizovat rozptylem údajů získaných pro každou experimentální jednotku. Tato informace se použije k výpočtu Pow jako váženého průměru výsledků jednotlivých experimentálních jednotek. Provede se to tak, že se převrácená hodnota rozptylu výsledků experimentálních jednotek použije jako váha. Údaje s velkou variabilitou (vyjádřenou jako rozptyl), a tedy s nižší spolehlivostí, pak budou mít menší vliv na výsledek než údaje s nízkou variabilitou.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Analogicky se vypočítá vážená směrodatná odchylka. Ta charakterizuje opakovatelnost měření Pow. Nízká hodnota vážené směrodatné odchylky naznačuje, že stanovení Pow bylo v rámci jedné laboratoře vysoce opakovatelné. Formální statistické zpracování údajů je uvedeno níže.
                           
                        
                     Zpracování výsledků
                  
                  
                     Prokázání dosažení rovnovážného stavu
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Pro každý čas odběru vzorku se vypočítá logaritmus podílu koncentrace zkoušené chemické látky v oktan-1-olu a vodě (log (Co/Cw)). Dosažení chemické rovnováhy se prokáže z grafu závislosti tohoto podílu na čase. Plato v grafu, které prochází alespoň čtyřmi po sobě jdoucími časovými body, dokazuje, že bylo dosaženo rovnovážného stavu a že sloučenina je skutečně rozpuštěna v oktan-1-olu. Pokud tomu tak není, je třeba ve zkoušce pokračovat, dokud se směrnice čtyř po sobě jdoucích bodů nebude jen málo odlišovat od nuly při hladině p = 0,05, což dokazuje, že hodnota log Co/Cw nezávisí na čase.
                           
                        
                     Výpočet log Pow
                     
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Hodnota log Pow experimentální jednotky se vypočítá jako vážený průměr log Co/Cw pro tu část křivky závislosti log Co/Cw na čase, pro niž bylo prokázáno dosažení rovnovážného stavu. Vážený průměr se vypočítá tak, že se jako váha údajů použije převrácená hodnota rozptylu, takže vliv údajů na konečný výsledek je nepřímo úměrný neurčitosti údajů.
                           
                        
                     Průměrná hodnota log Pow
                     
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Průměrná hodnota log Pow různých experimentálních jednotek se vypočítá jako průměr výsledků jednotlivých experimentálních jednotek vážený jejich příslušnými rozptyly.
                              Výpočet se provádí takto:
                              
                                 
                              kde:
                              
                                          log Pow,i
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          hodnota log Pow jednotlivé experimentální jednotky i;
                                       
                                    
                                          log Pow,Av
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          hodnota váženého průměru jednotlivých stanovení log Pow;
                                       
                                    
                                          wi
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          statistická váha přidělená hodnotě log Pow experimentální jednotky i.
                                       
                                    Jako wi se použije reciproká hodnota rozptylu log Pow,i
                                 
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Chyba průměru log Pow se odhadne jako opakovatelnost log Co/Cw stanoveného během rovnovážné fáze v jednotlivých experimentálních jednotkách. Vyjadřuje se jako vážená směrodatná odchylka log Pow,Av (σlog Pow,Av), která je zase měřítkem chyby spojené s log Pow,Av. Váženou směrodatnou odchylku σσlze vypočítat z váženého rozptylu (varlog Pow,Av) (varlog Pow,Av) takto:
                              
                                 
                              
                                 
                              Písmeno „n“ označuje počet experimentálních jednotek.
                           
                        
                     Protokol o zkoušce
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              Protokol o zkoušce by měl obsahovat tyto údaje:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkoušená chemická látka:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      obecný název, chemický název, číslo CAS, strukturní vzorec (určující polohu značky, pokud se používá radioizotopově značkovaná látka) a příslušné fyzikálně-chemické vlastnosti (viz odstavec 17),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      čistota (nečistoty) zkoušené chemické látky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      čistota značky u značených chemických látek a molární aktivitu (je-li to vhodné),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      předběžný odhad hodnoty log Pow a rovněž metodu použitou k jejímu odvození.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkušební podmínky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      data provedení studií,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      teplota během experimentu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      objemy oktan-1-olu a vody na začátku zkoušky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      objemy odebraných vzorků oktan-1-olu a vody,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zbylé objemy oktan-1-olu a vody ve zkušebních nádobách,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popis použitého laboratorního nádobí a podmínek míchání (rozměry míchací tyčinky a zkušební nádoby, výška víru v mm a rychlost míchání, je-li k dispozici),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analytické metody použité k stanovení zkoušené chemické látky a mez kvantitativní stanovitelnosti dané metody,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      časy odběru vzorků,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pH vodné fáze a použité pufry, jestliže je pH upraveno s ohledem na ionizovatelné molekuly,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet opakování.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opakovatelnost a citlivost použitých analytických metod,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stanovené koncentrace zkoušené chemické látky v oktan-1-olu a vodě v závislosti na čase,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vyjádření látkové bilance,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      teplota a směrodatná odchylka teplotního rozmezí během experimentu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      regrese podílu koncentrací v závislosti na čase,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      průměrná hodnota log Pow,Av a její směrodatná odchylka,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      diskuse a interpretace výsledků,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      příklady naměřených údajů z reprezentativní analýzy (všechny naměřené údaje musí být uloženy v souladu se zásadami správné laboratorní praxe), včetně výtěžků náhrad a počtu ředění použitých při kalibraci (spolu s kritérii pro korelační koeficient kalibrační křivky) a výsledky zajištění kvality/kontroly kvality (QA/QC),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      případně validační zpráva o postupu zkoušky (uvede se v literatuře).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA:
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the ’slow-stirring‘ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              Kapitola A.8 této přílohy, Rozdělovací koeficient.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Kapitola A.8 této přílohy, Rozdělovací koeficient.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596-2602.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paris.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Kapitola A.6 této přílohy, Rozpustnost ve vodě.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Kapitola C.7 této přílohy, Rozklad – Abiotický rozklad – hydrolýza jako funkce pH.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              Kapitola C.4 – část II–VII (metoda A až F) této přílohy, Stanovení „snadné“ biologické rozložitelnosti.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Kapitola A.4 této přílohy, Tlak par.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623-626.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 to 2-52.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA.
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.
                           
                        
                              19)
                           
                           
                              ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001.
                           
                        
                              20)
                           
                           
                              Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C.
                           
                        
                              21)
                           
                           
                              Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479-488.
                           
                        
                              22)
                           
                           
                              Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386-390.
                           
                        
                     Dodatek 1
                     
                        Tabulka pro výpočet minimálních objemů vody nutných k detekci zkoušených látek o různých hodnotách log Pow ve vodné fázi
                     
                     Předpoklady:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Maximální objem jednotlivých podílů = 10 % celkového objemu; 5 podílů = 50 % celkového objemu.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 
                                    . V případě nižších koncentrací budou potřeba větší objemy.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Objem použitý ke stanovení meze stanovitelnosti (LOD) = 100 ml.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 log Pow oproti log Sw a log Pow oproti SR (So/Sw) vhodně vyjadřují vztahy zkoušených chemických látek.
                              
                           
                        Odhad Sw
                        
                     
                     
                                 log Pow
                                 
                              
                              
                                 rovnice
                              
                              
                                 log Sw
                                 
                              
                              
                                 Sw (mg/l)
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 0,496
                              
                              
                                 3,133E+00
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 0,035
                              
                              
                                 1,084E+00
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –0,426
                              
                              
                                 3,750E-01
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –0,887
                              
                              
                                 1,297E-01
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –1,348
                              
                              
                                 4,487E-02
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –1,809
                              
                              
                                 1,552E-02
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –2,270
                              
                              
                                 5,370E-03
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –2,731
                              
                              
                                 1,858E-03
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –3,192
                              
                              
                                 6,427E-04
                              
                           
                        Odhad So
                        
                     
                     
                                 log Pow
                                 
                              
                              
                                 rovnice
                              
                              
                                 So (mg/l)
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 3,763E+04
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 4,816E+04
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 6,165E+04
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 7,890E+04
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,010E+05
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,293E+05
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,654E+05
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 2,117E+05
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 2,710E+05
                              
                           
                        
                     
                                 Celková hmotnost m zkoušené chemické látky
                                 (mg)
                              
                              
                                 mo/mw
                                 
                              
                              
                                 mw
                                 
                                 (mg)
                              
                              
                                 Cw
                                 
                                 (mg/l)
                              
                              
                                 mo
                                 
                                 (mg)
                              
                              
                                 Co
                                 
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 1 319
                              
                              
                                 526
                              
                              
                                 2,5017
                              
                              
                                 2,6333
                              
                              
                                 1 317
                              
                              
                                 26 333
                              
                           
                                 1 686
                              
                              
                                 1 664
                              
                              
                                 1,0127
                              
                              
                                 1,0660
                              
                              
                                 1 685
                              
                              
                                 33 709
                              
                           
                                 2 158
                              
                              
                                 5 263
                              
                              
                                 0,4099
                              
                              
                                 0,4315
                              
                              
                                 2 157
                              
                              
                                 43 149
                              
                           
                                 2 762
                              
                              
                                 16 644
                              
                              
                                 0,1659
                              
                              
                                 0,1747
                              
                              
                                 2 762
                              
                              
                                 55 230
                              
                           
                                 3 535
                              
                              
                                 52 632
                              
                              
                                 0,0672
                              
                              
                                 0,0707
                              
                              
                                 3 535
                              
                              
                                 70 691
                              
                           
                                 4 524
                              
                              
                                 1664 36
                              
                              
                                 0,0272
                              
                              
                                 0,0286
                              
                              
                                 4 524
                              
                              
                                 90 480
                              
                           
                                 5 790
                              
                              
                                 5263 16
                              
                              
                                 0,0110
                              
                              
                                 0,0116
                              
                              
                                 5 790
                              
                              
                                 115 807
                              
                           
                                 7 411
                              
                              
                                 1 664 357
                              
                              
                                 0,0045
                              
                              
                                 0,0047
                              
                              
                                 7 411
                              
                              
                                 148 223
                              
                           
                                 9 486
                              
                              
                                 5 263 158
                              
                              
                                 0,0018
                              
                              
                                 0,0019
                              
                              
                                 9 486
                              
                              
                                 189 713
                              
                           
                        Výpočet objemů
                     
                     
                        Minimální požadovaný objem vodné fáze při jednotlivých koncentracich LOD
                     
                     
                                 log Pow
                                 
                              
                              
                                 LOD (mikrogramy/l)→
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,00
                              
                              
                                 10
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,04
                              
                              
                                 0,38
                              
                              
                                 3,80
                              
                              
                                 38
                              
                              
                                 380
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,09
                              
                              
                                 0,94
                              
                              
                                 9,38
                              
                              
                                 94
                              
                              
                                 938
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,23
                              
                              
                                 2,32
                              
                              
                                 23,18
                              
                              
                                 232
                              
                              
                                 2 318
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,57
                              
                              
                                 5,73
                              
                              
                                 57,26
                              
                              
                                 573
                              
                              
                                 5 726
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,41
                              
                              
                                 14,15
                              
                              
                                 141
                              
                              
                                 1 415
                              
                              
                                 14 146
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 3,50
                              
                              
                                 34,95
                              
                              
                                 350
                              
                              
                                 3 495
                              
                              
                                 34 950
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 8,64
                              
                              
                                 86,35
                              
                              
                                 864
                              
                              
                                 8 635
                              
                              
                                 86 351
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 21,33
                              
                              
                                 213
                              
                              
                                 2 133
                              
                              
                                 21 335
                              
                              
                                 213 346
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 52,71
                              
                              
                                 527
                              
                              
                                 5 271
                              
                              
                                 52 711
                              
                              
                                 527 111
                              
                           
                                 Objem použitý pro LOD (l)
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                        Legenda k výpočtům:
                     
                     Představuje < 10 % celkového objemu vodné fáze, ekvilibrační nádoba o objemu 1 litr.
                     Představuje < 10 % celkového objemu vodné fáze, ekvilibrační nádoba o objemu 2 litry.
                     Představuje < 10 % celkového objemu vodné fáze, ekvilibrační nádoba o objemu 5 litrů.
                     Představuje < 10 % celkového objemu vodné fáze, ekvilibrační nádoba o objemu 10 litrů.
                     Přesahuje 10 % objemu, a to i u ekvilibrační nádoby o objemu 10 litrů.
                     
                        Přehled požadovaných objemů v závislosti na rozpustnosti ve vodě a log Pow
                        
                     
                     Minimální požadovaný objem fáze H2O při každé koncentraci LOD (ml)
                     
                                 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Sw (mg/l)
                              
                              
                                 LOD (mikrogramy/l)→
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,00
                              
                              
                                 10
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,12
                              
                              
                                 1,19
                              
                              
                                 11,90
                              
                              
                                 118,99
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,02
                              
                              
                                 0,24
                              
                              
                                 2,38
                              
                              
                                 23,80
                              
                              
                                 237,97
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 3
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,04
                              
                              
                                 0,40
                              
                              
                                 3,97
                              
                              
                                 39,66
                              
                              
                                 396,62
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,12
                              
                              
                                 1,19
                              
                              
                                 11,90
                              
                              
                                 118,99
                              
                              
                                 1 189,86
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,02
                              
                              
                                 0,20
                              
                              
                                 2,03
                              
                              
                                 20,34
                              
                              
                                 203,37
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                 0,51
                              
                              
                                 5,08
                              
                              
                                 50,84
                              
                              
                                 508,42
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,02
                              
                              
                                 10,17
                              
                              
                                 101,68
                              
                              
                                 1 016,83
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,20
                              
                              
                                 2,03
                              
                              
                                 20,34
                              
                              
                                 203,37
                              
                              
                                 2 033,67
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,09
                              
                              
                                 0,87
                              
                              
                                 8,69
                              
                              
                                 86,90
                              
                              
                                 869,01
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,17
                              
                              
                                 1,74
                              
                              
                                 17,38
                              
                              
                                 173,80
                              
                              
                                 1 738,02
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,375
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,23
                              
                              
                                 2,32
                              
                              
                                 23,18
                              
                              
                                 231,75
                              
                              
                                 2 317,53
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,43
                              
                              
                                 4,35
                              
                              
                                 43,45
                              
                              
                                 434,51
                              
                              
                                 4 345,05
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 0,4
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,19
                              
                              
                                 1,86
                              
                              
                                 18,57
                              
                              
                                 185,68
                              
                              
                                 1 856,79
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,37
                              
                              
                                 3,71
                              
                              
                                 37,14
                              
                              
                                 371,36
                              
                              
                                 3 713,59
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,74
                              
                              
                                 7,43
                              
                              
                                 74,27
                              
                              
                                 742,72
                              
                              
                                 7 427,17
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,49
                              
                              
                                 14,85
                              
                              
                                 148,54
                              
                              
                                 1 485,43
                              
                              
                                 14 854,35
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,63
                              
                              
                                 6,35
                              
                              
                                 63,48
                              
                              
                                 634,80
                              
                              
                                 6 347,95
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,27
                              
                              
                                 12,70
                              
                              
                                 126,96
                              
                              
                                 1 269,59
                              
                              
                                 12 695,91
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 2,54
                              
                              
                                 25,39
                              
                              
                                 253,92
                              
                              
                                 2 539,18
                              
                              
                                 25 391,82
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 5,08
                              
                              
                                 50,78
                              
                              
                                 507,84
                              
                              
                                 5 078,36
                              
                              
                                 50 783,64
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 0,025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 2,17
                              
                              
                                 21,70
                              
                              
                                 217,02
                              
                              
                                 2 170,25
                              
                              
                                 21 702,46
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 4,34
                              
                              
                                 43,40
                              
                              
                                 434,05
                              
                              
                                 4 340,49
                              
                              
                                 43 404,93
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,006
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 9,04
                              
                              
                                 90,43
                              
                              
                                 904,27
                              
                              
                                 9 042,69
                              
                              
                                 90 426,93
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,003
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 18,09
                              
                              
                                 180,85
                              
                              
                                 1 808,54
                              
                              
                                 18 085,39
                              
                              
                                 180 853,86
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 0,006
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 7,73
                              
                              
                                 77,29
                              
                              
                                 772,89
                              
                              
                                 7 728,85
                              
                              
                                 77 288,50
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,003
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 15,46
                              
                              
                                 154,58
                              
                              
                                 1 545,77
                              
                              
                                 15 457,70
                              
                              
                                 154 577,01
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0015
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 23,19
                              
                              
                                 231,87
                              
                              
                                 2 318,66
                              
                              
                                 23 186,55
                              
                              
                                 231 865,51
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 46,37
                              
                              
                                 463,73
                              
                              
                                 4 637,31
                              
                              
                                 46 373,10
                              
                              
                                 463 731,03
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 0,002
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 19,82
                              
                              
                                 198,18
                              
                              
                                 1 981,77
                              
                              
                                 19 817,73
                              
                              
                                 198 177,33
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 39,64
                              
                              
                                 396,35
                              
                              
                                 3 963,55
                              
                              
                                 39 635,47
                              
                              
                                 396 354,66
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0005
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 79,27
                              
                              
                                 792,71
                              
                              
                                 7 927,09
                              
                              
                                 79 270,93
                              
                              
                                 792 709,32
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,00025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 158,54
                              
                              
                                 1 585,42
                              
                              
                                 15 854,19
                              
                              
                                 158 541,86
                              
                              
                                 1 585 418,63
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 33,88
                              
                              
                                 338,77
                              
                              
                                 3 387,68
                              
                              
                                 33 876,77
                              
                              
                                 338 767,72
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0005
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 67,75
                              
                              
                                 677,54
                              
                              
                                 6 775,35
                              
                              
                                 67 753,54
                              
                              
                                 677 535,44
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,00025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 135,51
                              
                              
                                 1 355,07
                              
                              
                                 13 550,71
                              
                              
                                 135 507,09
                              
                              
                                 1 355 070,89
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,000125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 271,01
                              
                              
                                 2 710,14
                              
                              
                                 27 101,42
                              
                              
                                 271 014,18
                              
                              
                                 2 710 141,77
                              
                           
                                 Objem použitý pro LOD (l)
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                  
                     Dodatek 2
                     
                        Příklad nádoby se skleněným pláštěm pro experiment používající metodu pomalého míchání k stanovení Pow
                        
                     
                     
                        
                  “
            
                  3)
               
               
                  Kapitola B.2 se nahrazuje tímto:
                  „B.2   AKUTNÍ INHALAČNÍ TOXICITA
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda odpovídá Pokynům OECD pro zkoušení (TG) 403 (2009) (1). Původní Pokyny pro zkoušení 403 (TG 403) akutní inhalační toxicity byly schváleny v roce 1981. Revidovaná verze zkušební metody B.2 (odpovídá revidované verzi TG 403) popisovaná v této kapitole byla navržena tak, aby byla flexibilnější, omezila použití zvířat a splňovala regulační potřeby. Revidovaná verze zkušební metody uvádí dva typy studií: tradiční protokol LC50 a protokol koncentrace krát čas (C × t). Hlavními vlastnostmi této zkušební metody jsou schopnost poskytnout vztah mezi koncentrací a odezvou v rozmezí od neletálních až po letální výsledky, který umožňuje odvodit medián letální koncentrace (LC50), prahovou hodnotu neletální koncentrace (např. LC01) a směrnici a určit možnou citlivost pohlaví. Protokol C × t by se měl použít v případě specifické regulační nebo vědecké potřeby, která vyžaduje zkoušky na zvířatech po několik časových období, např. pro účely plánování reakcí na nouzové situace [např. odvození hodnot směrodatných úrovní akutní expozice (AEGL), pokynů pro plánování reakce na nouzové situace (ERPG;) nebo prahových úrovní akutní expozice (AETL) nebo pro plánování využití půdy.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Pokyny k provádění a interpretaci studií používajících tuto zkušební metodu naleznete v Pokynech k zkouškám akutní inhalační toxicity (GD 39) (2).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Definice použité v kontextu této zkušební metody naleznete na konci této kapitoly a v GD 39 (2).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda umožňuje chemickou charakterizaci a kvantitativní posouzení rizik a umožňuje rozdělit a klasifikovat zkoušené chemické látky podle nařízení (ES) č. 1272/2008 (3). Dokument GD 39 (2) uvádí pokyny pro výběr vhodné zkušební metody pro akutní zkoušky. Požadují-li se pouze informace o klasifikaci a označení, doporučuje se obvykle kapitola B.52 této přílohy (4) [viz GD 39 (2)]. Zkušební metoda B.2 není výslovně určena pro zkoušky speciálních materiálů, jako jsou špatně rozpustné kompozitní vláknové nebo izometrické částicové materiály či průmyslově vyráběné nanomateriály.
                           
                        VÝCHOZÍ ÚVAHY
                  
                              5.
                           
                           
                              Zkušební laboratoř by měla dříve, než začne uvažovat o provedení zkoušek v souladu s touto zkušební metodou, vzít v úvahu veškeré dostupné informace o zkoušené chemické látce, včetně stávajících studií (např. kapitola B.52 této přílohy (4)), jejichž výsledky by podpořily neprovádění dalších zkoušek, aby se minimalizovalo použití zvířat. Při výběru nejvhodnějších druhů, kmenů, pohlaví, způsobu expozice a vhodných zkušebních koncentrací mohou pomoci informace o identitě, chemické struktuře a fyzikálně-chemických vlastnostech zkoušené chemické látky, výsledcích jakýchkoli testů toxicity in vitro nebo in vivo, předpokládaných použitích a potenciální expozici u člověka, jakož i dostupné údaje (Q)SAR a toxikologické údaje o strukturně příbuzných látkách [viz GD 39 (2)].
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Zkouškám žíravých a/nebo dráždivých chemických látek při koncentracích, které podle očekávání způsobí intenzivní bolest a/nebo utrpení, by se mělo v co možná nejvyšší míře zabránit. Potenciál žíravosti/dráždivosti by se měl vyhodnotit na základě odborného posouzení informací získaných na základě zkušeností s účinky na člověka a zvířata (např. údaje ze studií s opakovanou dávkou provedených při nežíravých/dráždivých koncentracích), stávající údaje in vitro (např. z kapitol B.40, (5), B.40 BIS (6) této přílohy nebo OECD TG 435 (7)), hodnoty pH, informace o podobných látkách nebo jakékoli další relevantní údaje, za účelem prozkoumání, zda je možno od dalších zkoušek upustit. Pro specifické regulační potřeby (např. pro účely plánování reakce na nouzové situace) lze tuto zkušební metodu použít k expozici zvířat těmto materiálům, poněvadž vedoucímu studie nebo vedoucímu výzkumného týmu zajišťuje kontrolu nad výběrem cílových koncentrací. Cílové koncentrace by však neměly vyvolat intenzivní dráždivé/žíravé účinky, zároveň by však měly být dostačující k prodloužení křivky závislosti odezvy na koncentraci k hodnotám, které umožní splnit regulační a vědecký účel této zkoušky. Tyto koncentrace by se měly volit případ od případu a mělo by se poskytnout zdůvodnění zvolené koncentrace [viz GD 39 (2)].
                           
                        PODSTATA ZKOUŠKY
                  
                              7.
                           
                           
                              Tato revidovaná zkušební metoda B.2 byla navržena tak, aby umožnila získat dostatečné informace o akutní toxicitě zkoušené chemické látky pro její klasifikaci a poskytovala údaje o letalitě (např. LC50, LC01 a směrnici) pro obě pohlaví, které jsou potřebné pro kvantitativní posouzení rizik. Tato zkušební metoda nabízí dva způsoby, jak informace získat. Prvním je tradiční protokol, v němž jsou skupiny zvířat vystaveny mezní koncentraci (limitní zkouška) nebo sérii koncentrací v postupu prováděném po krocích po předem stanovenou dobu, obvykle 4 hodiny. Pro specifické regulační účely mohou být použity i jiné doby trvání expozice. Druhým je protokol (C × t), v němž jsou skupiny zvířat vystaveny jedné koncentraci (mezní koncentrace) nebo sérii několika koncentrací po různě dlouhou dobu.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Umírající zvířata nebo zvířata, která zjevně projevují příznaky bolesti nebo značného a přetrvávajícího utrpení, by se měla humánně utratit a při analýze výsledků se hodnotí jako zvířata uhynulá při zkoušce. Kritéria rozhodování o utracení umírajících nebo značně trpících zvířat a pokyny týkající se rozpoznání předvídatelného nebo blížícího se uhynutí jsou předmětem pokynů OECD č. 19 o humánních parametrech (8).
                           
                        POPIS METODY
                  
                     Výběr zvířecích druhů
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Měla by se použít mladá zdravá dospělá zvířata běžně používaných laboratorních plemen. Upřednostňovaným druhem je potkan, a pokud se použijí jiné druhy, mělo by se uvést odůvodnění.
                           
                        
                     Příprava zvířat
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Samice musí být nullipary a nesmí být březí. V den expozice by mělo jít o mladé dospělé jedince ve stáří 8 až 12 týdnů a jejich tělesná hmotnost by se u obou pohlaví měla pohybovat v rozmezí ± 20 % průměrné hmotnosti dříve exponovaných zvířat stejného stáří. Zvířata jsou náhodně vybrána a označena pro potřeby individuální identifikace. Zvířata se umístí do klecí nejméně 5 dnů před začátkem studie, aby si mohla zvyknout na laboratorní podmínky. Zvířata by se také měla nechat po krátkou dobu před zahájením zkoušky zvyknout na zkušební zařízení, neboť to sníží stres způsobený novým prostředím.
                           
                        
                     Zvířecí chov
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Teplota v experimentální místnosti, v níž se zvířata chovají, by měla být 22 ± 3 °C. Relativní vlhkost by se měla ideálně udržovat v rozmezí 30 až 70 %, což nemusí být proveditelné, používá-li se jako nosič voda. Před expozicí a po ní by se měla zvířata držet v klecích rozdělena do skupin podle pohlaví a koncentrace, avšak počet zvířat v jedné kleci by neměl bránit jasnému pozorování každého zvířete a měl by minimalizovat ztráty v důsledku kanibalismu nebo bojů. Jsou-li zvířata vystavena látce pouze nazální cestou, může být nutné je nechat zvyknout si na omezující trubičky. Zkumavky omezující pohyb by neměly zvířatům způsobovat přílišný fyzický, termální nebo imobilizační stres. Omezení může ovlivnit fyziologické cílové parametry, jako je tělesná teplota (hypertermie) a/nebo respirační objem za minutu. Jsou-li k dispozici obecné údaje, které prokazují, že k takovým změnám nedochází ve značné míře, není předběžná adaptace na omezující trubičky nutná. Zvířata, jež jsou vystavena aerosolu celým tělem, by se měla držet během expozice odděleně, aby se zabránilo pronikání zkoušeného aerosolu z jejich těla do srsti ostatních zvířat v kleci. Mohou se používat konvenční a certifikovaná laboratorní krmiva, vyjma období expozice, spolu s neomezeným množstvím pitné vody z vodovodu. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy.
                           
                        
                     Inhalační komory
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Při výběru inhalační komory by se měla zvážit povaha zkoušené chemické látky a cíl zkoušky. Upřednostňuje se expozice pouze nazální cestou (přičemž pod pojmem nazální se rozumí i expozice hlavy, nosu nebo tlamy) Expozice pouze nazální cestou se obvykle upřednostňuje ve studiích kapalných nebo pevných aerosolů a par, které mohou kondenzací vytvářet aerosoly. Speciálních cílů studie lze snáze dosáhnout, použije-li se celotělová expozice, avšak tato skutečnost by se měla zdůvodnit ve zprávě o studii. Pro zajištění stability atmosféry v komoře pro celotělovou expozici by neměl celkový objem zaplněný pokusnými zvířaty přesáhnout 5 % objemu komory. Principy techniky expozice pouze nazální cestou a celotělové expozice a jejich konkrétní výhody a nevýhody jsou popsány v dokumentu GD 39 (2).
                           
                        PODMÍNKY EXPOZICE
                  
                     Podání koncentrací
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Expozice pouze nazální cestou mohou u potkanů trvat jakoukoli dobu až po 6 hodin. U myší by expozice pouze nazální cestou neměla obvykle přesáhnout 4 hodiny. Jsou-li nutné studie s delší dobou expozice, mělo by se uvést zdůvodnění [viz GD 39 (2)]. Zvířata vystavená aerosolům v komorách pro celotělovou expozici by se měla držet odděleně, aby se zabránilo pozření zkoušené chemické látky při vzájemné péči o srst s ostatními zvířaty v kleci. Během expozice by se mělo pozastavit krmení zvířat. Během celotělové expozice je možno zvířatům podávat vodu.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Zvířata jsou vystavena zkoušené chemické látce ve formě plynu, páry, aerosolu nebo jejich směsi. Skupenství látky, které se má zkoušet, závisí na fyzikálně-chemických vlastnostech zkoušené chemické látky, zvolené koncentraci a/nebo fyzické formě, v níž se bude zkoušená chemická látka s největší pravděpodobností nacházet při manipulaci a používání. Hygroskopické a chemicky reaktivní zkoušené chemické látky by se měly zkoušet v podmínkách suchého vzduchu. Je třeba dbát na to, aby nevznikly explozivní koncentrace.
                           
                        
                     Distribuce velikosti částic
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              U všech aerosolů a par, které mohou kondenzací vytvořit aerosoly by se měla stanovit velikost částic. Aby byla možná expozice všech důležitých částí dýchací soustavy, doporučují se aerosoly s hodnotami hmotnostního mediánu aerodynamických průměrů (MMAD) v rozmezí od 1 do 4 μm a s geometrickou směrodatnou odchylkou (σg) v intervalu 1,5 až 3,0 (2) (9) (10). Přestože by se mělo vynaložit dostatečné úsilí k splnění tohoto standardu, není-li to možné, je třeba poskytnout odborný posudek. Například kovové výpary mohou být menší než je tento standard a nabité částice, vlákna a hygroskopické materiály (které ve vlhkém prostředí dýchacích cest nabývají na velikosti) mohou být naopak větší.
                           
                        
                     Příprava zkoušené chemické látky na nosiči
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              K dosažení vhodné koncentrace a velikosti částic zkoušené chemické látky v ovzduší lze použít nosič. Zpravidla by se měla dávat přednost vodě. Částicový materiál se může zpracovat mechanickými postupy, aby se dosáhlo požadované distribuce velikosti částic, avšak mělo by se zajistit, aby nedošlo k rozkladu nebo přeměně zkoušené chemické látky. Pokud lze předpokládat, že by mechanické postupy mohly změnit chemické složení zkoušené chemické látky (např. intenzivní mletí spojené s třením extrémně zvyšuje teplotu), mělo by se složení zkoušené chemické látky analyticky ověřit. Je třeba dostatečně dbát na to, aby se zkoušená chemická látka nekontaminovala. Nedrolivé zrnité materiály, které jsou záměrně zformulovány tak, aby je nebylo možno vdechnout, není třeba zkoušet. K prokázání skutečnosti, že při manipulaci se zrnitým materiálem nevznikají vdechovatelné částice, by se měla použít zkouška otěru. Pokud při zkoušce otěru vzniknou vdechovatelné částice, měla by se provést zkouška inhalační toxicity.
                           
                        
                     Kontrolní zvířata
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Souběžná negativní kontrolní skupina (vystavená pouze vzduchu) není nutná. Používá-li se k vytvoření zkušební atmosféry jiný nosič než voda, měla by se kontrolní skupina s nosičem použít pouze tehdy, nejsou-li k dispozici dřívější údaje o inhalační toxicitě nosiče. Jestliže studie toxicity zkoušené chemické látky formulované na nosiči neodhalí žádnou toxicitu, vyplývá z toho, že nosič je při zkoušené koncentraci netoxický, a kontrola s nosičem tudíž není nutná.
                           
                        MONITOROVÁNÍ PODMÍNEK EXPOZICE
                  
                     Proudění vzduchu komorou
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Proudění vzduchu komorou by se mělo pečlivě řídit, neustále sledovat a zaznamenávat alespoň v hodinových intervalech při každé expozici. Monitorování koncentrace (nebo stability) látky ve zkušební atmosféře je nedílnou součástí měření všech dynamických parametrů a poskytuje nepřímý prostředek k řízení všech důležitých parametrů generování dynamické atmosféry. V komorách určených k expozici pouze nazální cestou by se měl brát zvláštní ohled na to, aby se zamezilo opětovnému vdechování, v případech, kdy proudění vzduchu expozičním systémem není dostačující k zajištění dynamického proudění zkušební chemické atmosféry. Existují předepsané metodiky, které lze použít k prokázání skutečnosti, že za vybraných provozních podmínek nedochází k opětovnému vdechování (2) (11). Koncentrace kyslíku by měla být alespoň 19 % a koncentrace oxidu uhličitého by neměla přesáhnout 1 %. Pokud se předpokládá, že se takový standard nedodrží, měly by se koncentrace kyslíku a oxidu uhličitého měřit.
                           
                        
                     Teplota a relativní vlhkost v komoře
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Teplota v komoře by se měla udržovat na 22 ± 3 °C. Relativní vlhkost v zóně, kde zvířata dýchají, jak při expozici pouze nazální cestou, tak při celotělové expozici, by se měla sledovat a zaznamenat alespoň třikrát při době expozice až 4 hodiny a každou hodinu při kratších expozicích. Relativní vlhkost by se měla v ideálním případě udržovat v rozmezí 30 až 70 %, ale může se stát, že se nepodaří takovou hodnotu dosáhnout (např. při zkoušení směsí na bázi vody) nebo nebude měřitelná v důsledku interference zkoušené chemické látky se zkušební metodou.
                           
                        
                     Zkoušená chemická látka: Nominální koncentrace
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Pokud to je proveditelné, měla by se vypočítat a zaznamenat nominální koncentrace zkoušené chemické látky v expoziční komoře. Nominální koncentrace je hmotnost generované zkoušené chemické látky vydělená celkovým objemem vzduchu procházejícím komorovým systémem. Nominální koncentrace se nepoužívá k charakterizaci expozice zvířat, avšak porovnání nominální koncentrace a skutečné koncentrace je ukazatelem výkonnosti zkušebního systému při generování zkušební atmosféry, a tudíž ji lze použít k odhalení problémů při generování.
                           
                        
                     Zkoušená chemická látka: Skutečná koncentrace
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Skutečná koncentrace je koncentrace zkoušené chemické látky v inhalační komoře v zóně, kde zvířata dýchají. Skutečné koncentrace lze změřit specifickými metodami (např. přímý odběr vzorků, adsorpční metody nebo metody založené na chemické reakci a následná analytická charakterizace) nebo nespecifickými metodami, jako je vážková analýza (gravimetrie). Použití gravimetrie je přípustné pouze u práškových aerosolů obsahujících jedinou složku nebo u aerosolů z kapalin s nízkou těkavostí a mělo by se podložit příslušnou specifickou charakterizací zkoušené chemické látky před provedením studie. Koncentraci práškového aerosolu sestávajícího z více složek lze rovněž stanovit gravimetricky. Vyžaduje to však analytické údaje, které prokazují, že složení materiálu ve vzduchu je podobné složení výchozího materiálu. Nejsou-li tyto informace k dispozici, může být nutné provádět během studie v pravidelných intervalech opakovanou analýzu zkoušené chemické látky (ideálně ve formě, v níž se šíří vzduchem). U látek ve formě aerosolu, které se mohou vypařovat nebo sublimovat, by se mělo prokázat, že byly vybranou metodou zachyceny všechny fáze. Ve zprávě o studii by se měly uvést cílové, nominální a skutečné koncentrace, avšak k výpočtu hodnot letální koncentrace ve statistických analýzách se použijí pouze skutečné koncentrace.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Měla by se použít pokud možno jedna šarže zkoušené chemické látky a zkoušený vzorek by se měl skladovat za takových podmínek, aby se uchoval čistý, homogenní a stabilní. Před zahájením studie by se měla provést charakterizace zkoušené chemické látky, včetně určení její čistoty a, je-li to technicky proveditelné, identity a množství identifikovaných příměsí a nečistot. Je možné to prokázat mimo jiné těmito údaji: retenční čas a relativní plocha píku, molekulová hmotnost určená hmotnostní spektroskopií nebo plynovou chromatografií nebo jiné odhady. Přestože určení identity zkoušeného vzorku není povinností laboratoře provádějící zkoušku, je vhodné alespoň do jisté míry ověřit popis látky poskytnutý zadavatelem (např. pokud jde o barvu, fyzikální povahu apod.).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Expoziční atmosféra by se měla udržovat co nejstálejší a měla by se monitorovat buď nepřetržitě, nebo v pravidelných intervalech v závislosti na analytické metodě. Používá-li se odběr vzorků v pravidelných intervalech, měly by se vzorky atmosféry v komoře odebrat ve čtyřhodinové studii alespoň dvakrát. Není-li to v důsledku omezené rychlosti proudění vzduchu nebo nízké koncentrace možné, může se během celého období expozice odebrat jeden vzorek. Objeví-li se výrazné výkyvy mezi jednotlivými vzorky, měly by se u dalších zkoušených koncentrací použít čtyři vzorky na každou expozici. Koncentrace stanovená v jednotlivých vzorcích atmosféry v komoře by se neměla lišit od průměrné koncentrace o více než ± 10 % u plynů a par či o více než ± 20 % u kapalných nebo pevných aerosolů. Měla by se vypočítat a zaznamenat doba potřebná k dosažení rovnovážného stavu v komoře (t95). Doba expozice zahrnuje i dobu, během níž je zkoušená chemická látka generována, a ta bere v úvahu dobu nutnou k dosažení t95. Pokyny k výpočtu t95 jsou uvedeny v dokumentu GD 39 (2).
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              U vysoce komplexních směsí složených z plynů/par a aerosolů (např. atmosféry obsahující produkty spalování a zkoušené chemické látky vystřikované z účelových výrobků/zařízení pro koncové použití) se může každá fáze chovat v inhalační komoře odlišně, proto by se pro každou fázi (plyn/pára a aerosol) měla zvolit alespoň jedna indikační látka (analyt), obvykle hlavní účinná látka ve směsi. Je-li zkoušenou chemickou látkou směs, měla by se uvést i analytická koncentrace směsi, nikoliv pouze účinné látky nebo složky (analytu). Další informace týkající se skutečných koncentrací naleznete v dokumentu GD 39 (2).
                           
                        
                     Zkoušená chemická látka: Distribuce velikosti částic
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Distribuce velikosti částic aerosolů by se měla během čtyřhodinové expozice stanovit alespoň dvakrát pomocí kaskádového impaktoru nebo jiného přístroje, např. aerodynamického spektrometru částic. Je-li možno prokázat shodu výsledků získaných pomocí kaskádového impaktoru nebo jiného přístroje, může se tento jiný přístroj používat v průběhu celé studie. Vedle primárního přístroje by se měl použít ještě druhý přístroj, např. gravimetrický filtr nebo impinger/promývačka plynu, k ověření účinnosti záchytu primárním přístrojem. Hmotnostní koncentrace získaná analýzou velikosti částic by měla ležet v přiměřeném rozmezí hmotnostní koncentrace získané vážkovou analýzou [viz dokument GD 39 (2)]. Je-li možné v časné fázi studie prokázat jejich rovnocennost, lze od dalších potvrzujících měření upustit. Z důvodu zajištění dobrých životních podmínek zvířat by se měly podniknout kroky k minimalizaci neprůkazných údajů, které mohou vést k nutnosti opakovat expozici. U par by se mělo provést měření velikosti částic, pokud existuje možnost, že kondenzace páry povede ke vzniku aerosolu nebo pokud jsou v parách detekovány částice s potenciálem pro tvorbu smíšených fází (viz odstavec 15).
                           
                        POSTUP
                  
                              26.
                           
                           
                              Níže jsou popsány dva typy studie: tradiční protokol a protokol C × t. Oba protokoly mohou zahrnovat orientační studii, hlavní studii a/nebo limitní zkoušku (tradiční protokol) nebo zkoušku při mezní koncentraci (C × t). Je-li známo, že jedno pohlaví je citlivější, může se vedoucí studie rozhodnout provést tyto studie pouze u citlivého pohlaví. Jsou-li k expozici pouze nazální cestou použity jiné druhy hlodavců než potkani, je možno upravit maximální doby expozice za účelem minimalizace druhově specifického utrpení. Před zahájením zkoušky je třeba zvážit veškeré dostupné údaje, aby se minimalizovalo použití zvířat. Například použitím údajů získaných podle kapitoly B.52 této přílohy (4) je možné se provádění orientační studie vyhnout a může se jimi rovněž prokázat, zda je jedno pohlaví citlivější [viz GD 39 (2)].
                           
                        TRADIČNÍ PROTOKOL
                  
                     Obecné úvahy: Tradiční protokol
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              V tradiční studii se skupiny zvířat vystaví zkoušené chemické látce po fixně dané časové období (obvykle 4 hodiny) buď v komoře pro expozici pouze nazální cestou nebo v komoře pro celotělovou expozici. Zvířata jsou vystavena buď mezní koncentraci (limitní zkouška) nebo alespoň třem koncentracím v postupných krocích (hlavní studie). Hlavní studii může předcházet studie orientační, pokud již nejsou o zkoušené chemické látce k dispozici nějaké informace, např. údaje z dříve provedené studie B.52 [viz dokument GD 39 (2)].
                           
                        
                     Orientační studie: Tradiční protokol
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Orientační studie se používá k odhadu účinnosti zkoušené chemické látky, zjištění rozdílů v citlivosti jednotlivých pohlaví a k výběru úrovně expoziční koncentrace pro hlavní studii nebo limitní zkoušku. Při výběru úrovní koncentrací pro orientační studii by se měly použít veškeré dostupné informace, včetně dostupných údajů (Q)SAR a údajů o podobných chemických látkách. Každé koncentraci by se měli vystavit maximálně tři samci a tři samice (k stanovení rozdílu mezi pohlavími se obvykle používají od každého pohlaví 3 jedinci). Orientační studie může používat pouze jedinou koncentraci, avšak v případě potřeby je možné vyzkoušet více koncentrací. Orientační studie by neměla zkoušet tolik zvířat a koncentrací, aby připomínala hlavní studii. Namísto orientační studie je možné použít dříve provedenou studii B.52 (4) [viz dokument GD 39 (2)].
                           
                        
                     Limitní zkouška: Tradiční protokol
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Limitní zkouška se používá v případě, že je o zkoušené chemické látce známo, že je prakticky netoxická, tj. vyvolává toxickou reakci pouze při koncentraci vyšší, než je regulační mezní koncentrace, nebo se to o ní předpokládá. Při limitní zkoušce se vystavuje jedna skupina tří samců a tří samic zkoušené chemické látce o mezní koncentraci. Informace o toxicitě zkoušené chemické látky lze získat ze znalostí o podobných zkoušených chemických látkách, vezme-li se v úvahu identita a procento složek, o nichž se ví, že jsou toxikologicky významné. V situacích, kdy existuje jen málo informací nebo vůbec žádné informace o toxicitě nebo kdy se očekává, že zkoušená chemická látka bude toxická, by se měla provést hlavní zkouška.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Volba mezních koncentrací obvykle závisí na regulačních požadavcích. Používá-li se nařízení (ES) č. 1272/2008, činí mezní koncentrace pro plyny 20 000 ppm, pro páry 20 mg/l a pro aerosoly 5 mg/l (nebo maximální dosažitelná koncentrace) (3). Generovat mezní koncentrace některých zkoušených chemických látek může být technicky náročné, zejména ve formě par nebo aerosolů. Při zkoušení aerosolů by mělo být primárním cílem dosažení vdechovatelné velikosti částic (MMAD = 1–4 μm). U většiny zkoušených chemických látek je toho možno dosáhnout při koncentraci 2 mg/l. Zkoušení aerosolů při koncentracích větších než 2 mg/l by se mělo provádět pouze, pokud je možné dosáhnout vdechovatelné velikosti částic [viz dokument GD 39 (2)]. Nařízení (ES) č. 1272/2008 nedoporučuje zkoušky při koncentracích přesahujících mezní koncentraci z důvodů zajištění šetrného zacházení se zvířaty. O mezní koncentraci by se mělo uvažovat pouze v případě, že existuje velká pravděpodobnost, že výsledky takové zkoušky budou mít přímý význam pro ochranu lidského zdraví (3) a že se ve zprávě o studii uvede zdůvodnění. V případě potenciálně výbušných zkoušených chemických látek je třeba zajistit, aby nedošlo k explozi. Aby se zamezilo zbytečnému použití zvířat, měla by se před limitní zkouškou provést jedna zkouška bez zvířat, kterou se zjistí, zda lze v komoře dosáhnout podmínek pro limitní zkoušku.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Pokud je při mezní koncentraci pozorována mortalita či umírání, mohou výsledky limitní zkoušky sloužit jako orientační studie pro další zkoušky při jiných koncentracích (viz hlavní studie). Jestliže fyzikální nebo chemické vlastnosti zkoušené chemické látky znemožňují dosažení mezní koncentrace, měla by se zkoušet maximální dosažitelná koncentrace. Pokud při maximální dosažitelné koncentraci dojde k letalitě menší než 50 %, nejsou nutné žádné další zkoušky. Nelze-li dosáhnout mezní koncentrace, měly by se ve zprávě o studii uvést vysvětlující a podpůrné údaje. Jestliže maximální dosažitelná koncentrace páry nevyvolává toxicitu, může být zapotřebí generovat zkoušenou chemickou látku ve formě kapalného aerosolu.
                           
                        
                     Hlavní studie: Tradiční protokol
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Hlavní studie se obvykle provádí s použitím pěti samců a pěti samic (nebo 5 zvířat citlivého pohlaví, je-li známo) pro každou koncentraci s tím, že se zkouší nejméně tři různé koncentrace. Zvolené koncentrace by měly být dostatečné, aby statistická analýza byla průkazná. Časový interval mezi exponovanými skupinami závisí na době nástupu, trvání a závažnosti příznaků toxicity. S expozicí zvířat další úrovni koncentrace by se mělo vyčkat, dokud není dostatečná jistota, že dříve zkoušená zvířata přežila. To vedoucímu studie umožní upravit cílovou koncentraci pro další exponovanou skupinu. U inhalačních studií to však nemusí být vždy praktické, v důsledku závislosti na sofistikovaných technologiích, a tak by expozice zvířat na další úrovni koncentrace měla vycházet z předchozích zkušeností a vědeckého úsudku. Při zkouškách směsí je třeba nahlédnout do dokumentu GD 39 (2).
                           
                        PROTOKOL KONCENTRACE × ČAS (C × T)
                  
                     Obecné úvahy: Protokol C × t
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              Při hodnocení inhalační toxicity se jako alternativa k tradičnímu protokolu může zvážit stupňovaná studie C × t (12) (13) (14). Tento přístup umožňuje vystavit zvířata zkoušené chemické látce na různých úrovních koncentrace a po několik časových období. Zkouška se provádí v komoře pro expozici pouze nazální cestou (celotělové komory nejsou pro tento protokol vhodné). Schéma postupu v dodatku 1 objasňuje tento protokol. Simulační analýzy prokázaly, že tradiční protokol i protokol C × t jsou oba schopny vést k průkazným hodnotám LC50, avšak protokol C × t je obecně lepší pro získání průkazných hodnot LC01 a LC10 (15).
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Simulační analýza prokázala, že použití dvou zvířat na každý interval C × t (jedno od každého pohlaví při použití obou pohlaví nebo dva jedinci citlivějšího pohlaví) může být obvykle dostačující při zkoušení 4 koncentrací a 5 dob expozice v hlavní studii. Za určitých okolností se může vedoucí studie rozhodnout použít dva potkany od každého pohlaví na každý interval C × t (15). Použití 2 zvířat od každého pohlaví pro každou koncentraci a časový bod může snížit zkreslení a variabilitu odhadů, zvýšit míru úspěšnosti odhadu a zlepšit pokrytí intervalu spolehlivosti. Nicméně v případě, kdy jsou údaje pro odhad nedostatečné (při použití jednoho zvířete od každého pohlaví nebo dvou zvířat citlivějšího pohlaví) může stačit rovněž 5. expoziční koncentrace. Další pokyny ohledně počtu zvířat a koncentrací, které se mají použít ve studii C × t, naleznete v dokumentu GD 39 (2).
                           
                        
                     Orientační studie: Protokol C × t
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Orientační studie se používá k odhadu účinnosti zkoušené chemické látky a k pomoci při výběru úrovní expoziční koncentrace pro hlavní studii. K výběru vhodné výchozí koncentrace pro hlavní studii a k minimalizaci počtu použitých zvířat může být zapotřebí provést orientační studii s použitím až tří zvířat/pohlaví/koncentrací [podrobnosti viz dodatek III dokumentu GD 39 (2)]. K stanovení rozdílu mezi pohlavími může být třeba použití tří zvířat od každého pohlaví. Tato zvířata by se měla vystavit látce po jedinou dobu trvání, obvykle 240 min. Schopnost generovat příslušnou zkušební atmosféru by se měla posoudit během předběžných technických zkoušek bez zvířat. Jsou-li k dispozici údaje o mortalitě ze studie B.52, není obvykle nutné provádět orientační studii. Při výběru první cílové koncentrace ve studii B.2 by měl vedoucí studie vzít v úvahu vzorce mortality pozorované v dostupných studiích B.52 (4) u obou pohlaví a při všech zkoušených koncentracích [viz dokument GD 39 (2)].
                           
                        
                     Počáteční koncentrace: Protokol C × t
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Počáteční koncentrace (expoziční cyklus I) (dodatek 1) bude buď mezní koncentrace, nebo koncentrace zvolená vedoucím studie na základě orientační studie. Skupiny s jedním zvířetem od každého pohlaví jsou vystaveny této koncentraci po různě dlouhou dobu (např. 15, 30, 60, 120, nebo 240 minut), takže celkový počet zvířat je 10 (tomu se říká expoziční cyklus I) (dodatek 1).
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Volba mezních koncentrací obvykle závisí na regulačních požadavcích. Používá-li se nařízení (ES) č. 1272/2008, činí mezní koncentrace pro plyny 20 000 ppm, pro páry 20 mg/l a pro aerosoly 5 mg/l (nebo maximální dosažitelná koncentrace) (3). Generovat mezní koncentrace některých zkoušených chemických látek může být technicky náročné, zejména ve formě par nebo aerosolů. Při zkoušení aerosolů by mělo být cílem dosažení vdechovatelné velikosti částic (tj. MMAD = 1–4 μm) při mezní koncentraci 2 mg/l. Toho je možné dosáhnout u většiny zkoušených chemických látek. Zkoušení aerosolů při koncentracích větších než 2 mg/l by se mělo provádět pouze, pokud je možné dosáhnout vdechovatelné velikosti částic [viz dokument GD 39 (2)]. Nařízení (ES) č. 1272/2008 odrazuje od zkoušek při koncentracích přesahujících mezní koncentraci z důvodů zajištění dobrých životních podmínek zvířat. O zkoušce při koncentraci převyšující mezní koncentraci by se mělo uvažovat pouze v případě, že existuje velká pravděpodobnost, že výsledky takové zkoušky budou mít přímý význam pro ochranu lidského zdraví (3) a že se ve zprávě o studii uvede zdůvodnění. V případě potenciálně výbušných zkoušených chemických látek je třeba dbát na to, aby nedošlo k explozi. Aby se zamezilo zbytečnému použití zvířat, měla by se před zkouškou při počáteční koncentraci provést jedna zkouška bez zvířat, aby se zajistilo, že lze v komoře dosáhnout podmínek pro tuto koncentraci.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Pokud se při počáteční koncentraci pozoruje mortalita či agonie, mohou výsledky při této koncentraci sloužit jako výchozí bod pro další zkoušky při jiných koncentracích (viz hlavní studie). Jestliže fyzikální nebo chemické vlastnosti zkoušené chemické látky znemožňují dosažení mezní koncentrace, měla by se testovat maximální dosažitelná koncentrace. Pokud při maximální dosažitelné koncentraci dojde k letalitě menší než 50 %, nejsou nutné žádné další zkoušky. Nelze-li dosáhnout mezní koncentrace, měly by se ve zprávě o studii uvést vysvětlující a podpůrné údaje. Jestliže maximální dosažitelná koncentrace páry nemá toxické účinky, může být zapotřebí generovat zkoušenou chemickou látku ve formě kapalného aerosolu.
                           
                        
                     Hlavní studie: Protokol C × t
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Počáteční koncentrace (Expoziční cyklus I) (Dodatek 1) zkoušená v hlavní studii bude buď mezní koncentrace, nebo koncentrace zvolená vedoucím studie na základě orientační studie. Jestliže byla během expozičního cyklu I nebo po ní pozorována mortalita, bude minimální expozice (C × t), která vede k mortalitě, použita jako vodítko k určení koncentrace a délek expozice pro expoziční cyklus II. Každý následující expoziční cyklus bude záviset na předcházejícím expozičním cyklu (viz dodatek 1).
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              U mnoha zkoušených chemických látek budou výsledky získané při počáteční koncentraci spolu s třemi dalšími expozičními cykly se souřadnicovou sítí o menším časovém kroku (tj. geometrické odstupňování dob expozice určené násobkem, jímž se liší po sobě jdoucí periody, obvykle √2) dostačující k stanovení vztahu mezi C × t a mortalitou (15), avšak může být užitečné použít i 5. expoziční koncentraci [viz dodatek 1 a dokument GD 39 (2)]. Matematické zpracování výsledků protokolu C × t naleznete v dodatku 1.
                           
                        POZOROVÁNÍ
                  
                              41.
                           
                           
                              Během období expozice by se měla zvířata často klinicky sledovat. Po expozici by se měla provést klinická pozorování alespoň dvakrát v den expozice nebo častěji, pokud to naznačuje reakci zvířat na expozici, a poté alespoň jednou denně po dobu celkem 14 dní. Délka období sledování není stanovená pevně, ale měla by se určit na základě povahy a doby nástupu klinických příznaků a délky období zotavení. Doba, kdy se příznaky toxicity objeví a vymizí, je důležitá zejména v případě tendence ke zpožděným příznakům toxicity. Veškerá pozorování se systematicky zaznamenávají, přičemž záznamy se vedou pro každé zvíře jednotlivě. Umírající zvířata a zvířata se známkami prudkých bolestí nebo s přetrvávajícími příznaky značného utrpení by se měla humánně utratit z důvodu zajištění dobrých životních podmínek zvířat. Při vyšetřování klinických příznaků toxicity je třeba dbát na to, aby se počáteční špatný stav a přechodné respirační změny v důsledku postupu expozice neinterpretovaly mylně jako toxicita spojená se zkoušenou chemickou látkou, která by vyžadovala předčasné utracení zvířat. Měly by se vzít v úvahu principy a kritéria shrnuté v pokynech o humánních parametrech (GD 19) (7). Pokud jsou zvířata z humánních důvodů utracena nebo je zjištěn jejich úhyn, je nutné dobu uhynutí zaznamenat co nejpřesněji.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Pozorování v kleci se soustřeďují na změny na kůži, na srsti, na očích, na sliznicích a rovněž změny dýchání, krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Je-li to možné, měly by se zaznamenat jakékoli rozdíly mezi místními a systémovými účinky. Pozornost je třeba věnovat třesu, křečím, slinění, průjmu, letargii, spánku a kómatu. Měření rektální teploty může poskytnout podpůrné důkazy pro reflexní bradypnoe nebo hypo/hypertermii spojenou s expozicí nebo držením v kleci.
                           
                        
                     Tělesné hmotnosti
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Hmotnosti jednotlivých zvířat by se měly zaznamenat jednou během období aklimatizace, v den expozice před expozicí (den 0), a minimálně v den 1, 3 a 7 (a poté jednou týdně) a v době uhynutí nebo utracení, pokud k němu dojde po dni 1. Tělesná hmotnost je uznávána jako zásadní ukazatel toxicity, a proto by se měla zvířata vykazující přetrvávající úbytek hmotnosti ≥ 20 % v porovnání s hodnotami před studií pečlivě sledovat. Na konci období po expozici se zvířata, která přežila, zváží a humánně utratí.
                           
                        
                     Patologie
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Všechna pokusná zvířata, včetně těch, která v průběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena z důvodu zajištění dobrého zacházení se zvířaty, by se měla podrobit pitvě. Není-li možné pitvu provést ihned po objevení uhynulého zvířete, mělo by se zvíře uchovávat v chladicím boxu (nikoli zmrazené) při teplotách dostatečně nízkých k minimalizaci autolýzy. Pitvy by se měly provést co možná nejdříve, obvykle během jednoho nebo dvou dnů. U každého zvířete by se měly zaznamenat všechny makroskopické patologické nálezy, přičemž se věnuje zvláštní pozornost jakýmkoli nálezům v dýchacích cestách.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Je možné zvážit další vyšetření zahrnutá a priori v návrhu za účelem zvětšení interpretační hodnoty studie, např. měření hmotnosti plic přeživších potkanů a/nebo poskytnutí důkazů o podráždění pomocí mikroskopického vyšetření dýchacích cest. Mezi vyšetřované orgány mohou patřit také ty, které vykazují makroskopické patologické známky u zvířat přežívajících po 24 či více hodin a orgány, o nichž je známo nebo se očekává, že budou postiženy. Mikroskopické vyšetření celých dýchacích cest může poskytnout užitečné informace u zkoušených chemických látek, které reagují s vodou, například u kyselin a hygroskopických zkoušených látek.
                           
                        ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ
                  
                     Údaje
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Měly by se uvést údaje o tělesné hmotnosti a pitevních nálezech pro každé jednotlivé zvíře. Údaje z klinického sledování by se měly shrnout do tabulky, přičemž se u každé zkušební skupiny uvede počet použitých zvířat, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, počet zvířat uhynulých v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních důvodů, doba uhynutí jednotlivých zvířat, popis, časový průběh a vratnost toxických účinků a pitevní nálezy.
                           
                        
                     Protokol o zkoušce
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Protokol o zkoušce by měl obsahovat následující informace:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Pokusná zvířata a podmínky chovu
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popis podmínek v klecích uvádějící: počet (nebo změnu počtu) zvířat v každé kleci, materiál podestýlky, teplotu a relativní vlhkost prostředí, světelné období a druh stravy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použitý druh/kmen a odůvodnění použití jiného druhu než potkan,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet, stáří a pohlaví zvířat,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda randomizace,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné údaje o kvalitě krmení a vody (včetně druhu/zdroje stravy, zdroje vody),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popis jakékoliv přípravy před zkouškou včetně krmení, karantény a léčby onemocnění.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkoušená chemická látka
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikální povaha, čistota a tam, kde je to podstatné, fyzikálně-chemické vlastnosti (včetně izomerizace),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikační údaje a číslo v registru Chemical Abstract Services (CAS), je-li známo.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosič
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění použití nosiče a zdůvodnění výběru nosiče (pokud se nepoužije voda),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      historické nebo současné údaje prokazující, že nosič neovlivňuje výsledek studie.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhalační komora
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popis inhalační komory včetně jejích rozměrů a objemu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj a popis zařízení použitého pro expozici zvířat a rovněž pro generování atmosféry,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zařízení pro měření teploty, vlhkosti, velikosti částic a skutečné koncentrace,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj vzduchu a úprava dodávaného/odsávaného vzduchu a systém použitý pro klimatizaci,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metody použité ke kalibraci zařízení k zajištění homogenní zkušební atmosféry,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozdíl tlaků (kladný nebo záporný),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet expozičních otvorů v každé komoře (nazální expozice), umístění zvířat v systému (celotělová expozice),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      homogenita/stabilita zkušební atmosféry v čase,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      umístění teplotních čidel, čidel vlhkosti a odběr vzorků zkušební atmosféry z komory,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      průtokové rychlosti vzduchu, průtoková rychlost vzduchu/expoziční otvor (nazální expozice) nebo množství zvířat/komora (celotělová expozice),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informace o zařízení použitém k měření kyslíku a oxidu uhličitého, používá-li se,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      doba nutná k dosažení rovnovážného stavu v inhalační komoře (t95)
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet výměn objemu vzduchu za hodinu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      měřicí přístroje (používají-li se).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Údaje o expozici
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění volby cílové koncentrace v hlavní studii,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominální koncentrace (celková hmotnost zkoušené chemické látky generované do inhalační komory vydělená objemem vzduchu prošlým komorou),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skutečné koncentrace zkoušené chemické látky naměřené v dýchací zóně zvířat. U směsí, které vytvářejí heterogenní fyzikální formy (plyny, páry, aerosoly), je možné analyzovat každou zvlášť,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      veškeré koncentrace látky ve vzduchu by se měly uvádět v hmotnostních jednotkách (např. mg/l, mg/m3, atd.), v závorce je možné uvést také hodnotu v objemových jednotkách (např. ppm, ppb, atd.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      distribuce velikosti částic, hmotnostní medián aerodynamického průměru (MMAD) a geometrická směrodatná odchylka (σg), včetně metod jejich výpočtu. Měly by se uvést jednotlivé analýzy velikosti částic.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkušební podmínky
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné údaje o přípravě zkoušené chemické látky včetně postupů použitých k snížení velikosti částic pevných látek nebo k přípravě roztoků zkoušené chemické látky. V případě, kdy mohly mechanické postupy změnit chemické složení zkoušené chemické látky, uveďte také výsledky analýz ověřujících složení zkoušené chemické látky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popis (nejlépe včetně nákresu) zařízení použitého ke generování zkušební atmosféry k expozici zvířat zkušební atmosféře,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné údaje o použité chemické analytické metodě a validaci metody (včetně účinnosti výtěžnosti zkoušené chemické látky ze vzorkovaného média),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění výběru zkoušených koncentrací.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o teplotě, vlhkosti a průtoku vzduchu v komoře,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o nominální a skutečné koncentraci v komoře,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o velikosti částic včetně údajů o odběru analytických vzorků, distribuce velikosti částic a výpočtů MMAD a σg,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o odezvě a úrovni koncentrace u každého zvířete (tj. zvířata vykazující příznaky toxicity včetně mortality, charakter, závažnost, doba nástupu a trvání účinků),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hmotnosti jednotlivých zvířat ve studii, datum a čas uhynutí, pokud k němu došlo před plánovaným utracením, časový průběh nástupu příznaků toxicity a zda byly vratné u každého zvířete,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pitevní a histopatologické nálezy pro každé zvíře, pokud jsou k dispozici,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odhady letality (např. LC50, LD01) včetně 95 % intervalů spolehlivosti a směrnice (pokud ji lze metodou hodnocení získat),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      statistická závislost včetně odhadu exponentu n (protokol C × t). Měl by se uvést název použitého statistického softwaru.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Diskuse a interpretace výsledků
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Měl by se klást zvláštní důraz na popis metod použitých ke splnění kritérií této zkušební metody, např. mezní koncentrace nebo velikost částic.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Je třeba zabývat se vdechovatelností částic s ohledem na celkové nálezy, zejména pokud nebylo možno splnit kritéria pro velikost částic.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Mělo by se uvést vysvětlení, pokud bylo nutno humánně utratit zvířata trpící bolestí nebo vykazující známky intenzivního a přetrvávajícího utrpení na základě kritérií uvedených v pokynech OECD o humánních parametrech (8).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Bylo-li ve prospěch této zkušební metody B.2 přerušeno provádění zkoušky podle kapitoly B.52 této přílohy (4), mělo by se uvést zdůvodnění.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      V celkovém hodnocení studie by se měla popsat konzistentnost metod použitých k stanovení nominálních a skutečných koncentrací a vztah mezi aktuální a skutečnou koncentrací.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Měla by se uvést pravděpodobná příčina úhynu a převládající mechanismus účinku (systémový nebo místní).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA:
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Dostupné na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Dostupné na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 ze dne 16. prosince 2008 o klasifikaci, označování a balení látek a směsí, o změně a zrušení směrnic 67/548/EHS a 1999/45/ES a o změně nařízení (ES) č. 1907/2006, Úř. věst. L 353, 31.12.2008, s. 1.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Kapitola B.52 této přílohy, Akutní inhalační toxicita – metoda stanovení třídy akutní toxicity (ATC).
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Kapitola B.40 této přílohy, Leptavé účinky na kůži in vitro: Zkouška transkutánního elektrického odporu (TER).
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Kapitola B.40bis této přílohy, Leptavé účinky na kůži in vitro: Zkouška pomocí modelu lidské kůže.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion.. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 425, OECD, Paris. Dostupné na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs a. s. Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Dostupné na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Dostupné na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, London/New York.
                           
                        DEFINICE
                  Zkoušená chemická látka: Jakákoli látka nebo směs zkoušená pomocí této zkušební metody.
                  
                     Dodatek 1
                     
                        Protokol C × t
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Při hodnocení inhalační toxicity se jako alternativa k tradičnímu protokolu může použít vícestupňová studie C × t (12) (13) (14). Přednostně by se měla provádět v případě, kdy je pro specifické regulační nebo vědecké účely třeba provést zkoušky na zvířatech po několik časových období např. pro účely plánování reakce na nouzové situace nebo plánování využití půdy. Tento postup obvykle začíná zkouškou při mezní koncentraci (expoziční cyklus I), při níž se zvířata vystaví zkoušené chemické látce po pět různě dlouhých časových období (např. 15, 30, 60, 120 a 240 min.), takže se v rámci jediného expozičního cyklu získají údaje z několika různých časových období (viz obrázek 1). Používá-li se nařízení (ES) č. 1272/2008, činí mezní koncentrace pro plyny 20 000 ppm, pro páry 20 mg/l a pro aerosoly 5 mg/l. Tyto úrovně se smí překročit, pouze pokud je pro specifické regulační nebo vědecké účely třeba provést zkoušky na těchto úrovních (viz odstavec 37 v hlavním textu kapitoly B.2).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 V situacích, kdy je k dispozici pouze málo informací o toxicitě zkoušené chemické látky nebo informace zcela chybí, měla by se provést orientační studie, v níž se obvykle po dobu 240 minut vystaví maximálně 3 zvířata od každého pohlaví cílovým koncentracím, které vybral vedoucí studie.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Jestliže se během expozičního cyklu I zkouší mezní koncentrace a je pozorována mortalita menší než 50 %, není třeba provádět žádné další zkoušky. Existuje-li regulační nebo vědecká potřeba stanovit vztah mezi koncentrací/časem/odezvou při vyšších úrovních, než je uvedená mezní koncentrace, měla by se další expozice provést při vyšší úrovni, například při dvojnásobku mezní koncentrace (tj. 2L na obrázku 1).
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Jestliže je při mezní koncentraci pozorována toxicita, je třeba provést další zkoušky (hlavní studii). Tyto další expozice se provádějí buď při nižších koncentracích (na obrázku 1: expoziční cykly II, III nebo IV), nebo při vyšších koncentracích po kratší časová období (na obrázku 1: expoziční cyklus IV), přičemž tato časová období jsou upravena a není mezi nimi velký časový odstup.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Zkouška (počáteční koncentrace a dalších koncentrací) se provádí za použití 1 zvířete od každého pohlaví pro každou koncentraci/časový bod nebo se 2 zvířaty citlivějšího pohlaví pro každou koncentraci/časový bod. Za určitých okolností se může vedoucí studie rozhodnout použít 2 potkany od každého pohlaví pro každou koncentraci/časový bod (nebo 4 zvířata citlivějšího pohlaví pro každou koncentraci/časový bod) (15). Použití 2 zvířat od každého pohlaví pro každou koncentraci/časový bod většinou sníží zkreslení a variabilitu odhadů, zvýší míru úspěšnosti odhadu a zlepší pokrytí intervalu spolehlivosti týkajícího se zde popsaného protokolu. Další podrobnosti jsou uvedeny v dokumentu GD 39 (2).
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 V ideálním případě se každý expoziční cyklus provede během jednoho dne. To dává možnost vyčkat s další expozicí, dokud není dostatečná jistota, že zvířata přežila, a vedoucímu studie to umožňuje upravit cílové koncentrace a doby expozice pro další expoziční cyklus. Doporučuje se zahájit každý expoziční cyklus skupinou, která bude látce vystavena po nejdelší dobu, např. se začne skupinou s 240minutovou expozicí, po ní následuje skupina s 120minutovou expozicí atd. Jestliže například zvířata v 240 minutové skupině po 90 minutách umírají nebo vykazují závažné příznaky toxicity (např. extrémní změny v dechovém vzorci jako třeba namáhavé dýchání), nemělo by smysl vystavovat další skupinu 120 minutové expozici, neboť mortalita by pravděpodobně činila 100 %. Vedoucí studie by měl proto pro takovou koncentraci zvolit kratší dobu expozice (např. 90, 65, 45, 33 a 25 minut).
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Koncentrace látky v komoře by se měla často měřit, aby se stanovil časem vážený průměr koncentrace pro každé trvání expozice. Kdykoli je to možné, měl by se v statistické analýze použít čas uhynutí každého zvířete (místo trvání expozice).
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 Výsledky prvních čtyř expozičních cyklů by se měly přezkoumat, aby se zjistily chybějící údaje na křivce závislosti koncentrace na čase (viz obrázek 1). V případě, že není dostatek údajů, lze provést další expozici (5. koncentrace). Koncentrace a doba expozice pro 5. expozici by se měly zvolit tak, aby pokryly tyto chybějící údaje.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Všechny expoziční cykly (včetně prvního expozičního cyklu) se použijí k výpočtu vztahu mezi koncentrací, časem a odezvou pomocí statistické analýzy (16). Je-li to možné, měly by se pro každý interval C × t použít časem vážené průměrné hodnoty koncentrace a doby expozice do uhynutí (dojde-li během expozice k uhynutí).
                                 
                                    Obrázek 1
                                 
                                 
                                    Hypotetické znázornění vztahu mezi koncentrací–časem–mortalitou u potkanů
                                 
                                 
                                    
                                 Prázdné značky = zvířata, která přežila; plné značky = uhynulá zvířata
                                 Trojúhelníčky = samice; kroužky = samci
                                 Plná čára = hodnoty LC50 (rozmezí 7,5–240 min) pro samce, pokud n = 1
                                 Přerušovaná čára = hodnoty LC50 (rozmezí 7,5–240 min) pro samice, pokud n = 1
                                 Čerchované čáry = hypotetické hodnoty LC50 pro samce a samice, pokud n = 2 (12).
                                 Slovníček pojmů
                                 Koncentrace:
                                 Doba expozice:
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Níže je uveden příklad postupu prováděného po krocích:
                                 
                                    Expoziční cyklus I –   zkouška při mezní koncentraci (viz obrázek 1)
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Jedno zvíře od každého pohlaví pro každou koncentraci / časový bod, celkem deset zvířat (2)
                                             
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Cílová koncentrace (3) = mezní koncentrace.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Vystavte pět skupin zvířat této cílové koncentraci po dobu 15, 30, 60, 120 a 240 minut.
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    Expoziční cyklus II
                                     (4)
                                    –   hlavní studie
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Jedno zvíře od každého pohlaví pro každou koncentraci/časový bod, celkem deset zvířat.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Pět skupin zvířat vystavte nižší koncentraci (5) (1/2L) po dobu expozice o něco delší (koeficient odstupňování √2, viz obrázek 1).
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    Expoziční cyklus III –   hlavní studie
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Jedno zvíře od každého pohlaví pro každou koncentraci/časový bod, celkem deset zvířat.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Pět skupin zvířat vystavte nižší koncentraci (5) (1/4L) po dobu expozice o něco delší (koeficient odstupňování √2, viz obrázek 1).
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    Expoziční cyklus IV‘–   hlavní studie
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Jedno zvíře od každého pohlaví pro každou koncentraci/časový bod, celkem deset zvířat.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Pět skupin zvířat vystavte nižší koncentraci (5) (1/8L) po dobu expozice o něco delší (koeficient odstupňování √2, viz obrázek 1).
                                          
                                       
                                    ↓ nebo
                                 
                                 
                                    Expoziční cyklus IV –   hlavní studie
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Jedno zvíře od každého pohlaví pro každou koncentraci/časový bod, celkem deset zvířat.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Pět skupin zvířat vystavte vyšší koncentraci (6) (2L) po dobu expozice o něco kratší (koeficient odstupňování √2, viz obrázek 1).
                                          
                                       
                           
                        Matematické zpracování výsledků protokolu C × t
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Postupem C × t provedeným se 4 nebo 5 expozičními koncentracemi a pěti různými dobami expozice se získá 20 nebo 25 bodů. Z těchto bodů lze pomocí statistické analýzy vypočítat vztah C × t (16):
                                 
                                    Rovnice 1:
                                 
                                 
                                    
                                 kde C = koncentrace, t = doba expozice nebo
                                 
                                    Rovnice 2:
                                 
                                 
                                    
                                 kde 
                                 Pomocí rovnice 1 lze vypočítat hodnotu LC50 pro dané časové období (např. 4 hodiny, 1 hodina, 30 minut nebo jakékoli časové období v rozmezí zkoušených časových období) za použití P = 5 (50 % odezva). Haberův zákon však lze použít, pouze pokud n = 1. Hodnotu LC01 lze vypočítat za použití P = 2,67.
                              
                           “
            
                  4)
               
               
                  Kapitoly B.7 a B.8 se nahrazují tímto:
                  „B.7   STUDIE ORÁLNÍ TOXICITY U HLODAVCŮ – 28DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda odpovídá Pokynům OECD pro zkoušení (TG) 407 (2008). Původní Pokyny pro provádění testů 407 byly schváleny v roce 1981. V roce 1995 byla schválena revidovaná verze obsahující pokyny k získání dalších informací o zvířeti používaném ve studii, zejména o neurotoxicitě a imunotoxicitě.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              V roce 1998 zahájila OECD činnost s vysokou prioritou, a sice revizi stávajících Pokynů pro provádění testů a vývoj nových Pokynů pro zkoušení určených ke screeningu a zkouškám potenciálních endokrinních disruptorů (8). Součástí této činnosti byla aktualizace stávajících pokynů OECD pro „studii orální toxicity u hlodavců – 28denní opakovaná aplikace“ (TG 407) doplněním parametrů vhodných k detekci endokrinního působení zkoušených chemických látek. Tento postup prošel rozsáhlým mezinárodním programem, při němž se zkoušela relevance a praktičnost těchto doplňujících parametrů, funkčnost těchto parametrů u chemických látek s (anti)estrogenním, (anti)androgenním a (anti)tyreoidálním působením, vnitrolaboratorní a mezilaboratorní reprodukovatelnost a interference nových parametrů s parametry požadovanými předchozími pokyny TG 407. Získá se velké množství údajů, které jsou shrnuty a podrobně vyhodnoceny v souhrnné zprávě OECD (9). Tato aktualizovaná zkušební metoda B.7 (odpovídající TG 407) je výsledkem zkušeností a výsledků shromážděných v rámci mezinárodního zkušebního programu. Tato zkušební metoda umožňuje zkoumat souvislosti mezi určitými endokrinními účinky a jinými toxikologickými účinky.
                           
                        VÝCHOZÍ ÚVAHY A OMEZENÍ
                  
                              3.
                           
                           
                              Při posuzování a hodnocení toxických vlastností chemické látky lze po získání prvních informací o toxicitě ze zkoušek akutní toxicity pomocí opakované aplikace dávek stanovit orální toxicitu. Tato zkušební metoda je určena ke zkoumání účinků toxicity u velmi širokého spektra potenciálních cílových míst. Poskytuje informace o možných rizicích pro zdraví, které mohou pravděpodobně vzniknout při opakované expozici v relativně omezeném časovém období, včetně účinků na nervový, imunitní a endokrinní systém. S ohledem na tyto konkrétní cílové parametry by tato metoda měla identifikovat chemické látky s neurotoxickým potenciálem, které mohou vyžadovat jeho další důkladné prozkoumání, a chemické látky působící na štítnou žlázu. Rovněž může poskytnout údaje o chemických látkách, které působí na samčí a/nebo samičí pohlavní orgány u mladých dospělých zvířat, a mohou se pomocí ní zjistit imunologické účinky látek.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Výsledky této zkušební metody B.7 by se měly použít k identifikaci nebezpečnosti a posouzení rizik. Výsledky získané pro parametry související s endokrinním působením by se měly interpretovat v kontextu „koncepčního rámce OECD pro zkoušky a hodnocení chemických látek způsobujících endokrinní poruchy“ (11). Tato metoda se skládá ze základní studie toxicity po opakovaných dávkách, kterou lze použít u chemických látek, u nichž není důvod pro 90denní studii (např. když objem výroby nepřekračuje určité limity) nebo jako předběžnou studii k dlouhodobé studii. Expozice by měla trvat 28 dní.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Mezinárodní program validace parametrů vhodných k potenciální detekci endokrinního působení zkoušené chemické látky ukázal, že kvalita údajů získaných touto zkušební metodou B.7 bude velmi záviset na zkušenostech laboratoře provádějící zkoušku. Týká se to konkrétně histopatologického určení cyklických změn v samičích pohlavních orgánech a stanovení hmotnosti malých orgánů závislých na hormonech, které se obtížně pitvají. Byly vyvinuty pokyny k histopatologickému vyšetření (19). K dispozici jsou na veřejných webových stránkách OECD věnovaných pokynům pro zkoušení (Test Guidelines). Mají za cíl pomoci patologům při vyšetřování a pomoci zvýšit citlivost rozborů. Byla nalezena řada různých parametrů svědčících o toxicitě pro endokrinní systém a tyto parametry byly začleněny do zkušební metody. Parametry, u nichž nebyl k dispozici dostatek údajů k ověření jejich použitelnosti nebo které vykazovaly pouze slabou průkaznost ve validačním programu hodnotícím jejich schopnost pomoci detekovat endokrinní disruptory, jsou navrženy jako volitelné cílové parametry (viz dodatek 2).
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Na základě údajů získaných ve validačním postupu je nutné zdůraznit, že citlivost tohoto stanovení není dostatečná pro identifikaci všech látek s (anti)androgenními nebo (anti)estrogenními účinky (9). Tato zkušební metoda se neprovádí ve fázi života, v které je endokrinní systém nejcitlivější na poškození. Nicméně během validačního postupu tato metoda identifikovala látky, které slabě nebo silně ovlivňují funkci štítné žlázy a látky, které vykazují silný nebo středně silný endokrinní účinek prostřednictvím estrogenových nebo adrogenových receptorů, ve většině případů však byla neúspěšná při identifikaci endokrinně působících látek, které účinkují slabě na estrogenové nebo androgenové receptory. Nelze ji tudíž označit za screeningové stanovení endokrinního působení.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Nepřítomnost účinků souvisejících s těmito mechanismy působení proto nelze pokládat za důkaz nepřítomnosti účinků na endokrinní systém. Co se týká účinků zprostředkovaných endokrinní cestou, neměla by se tedy charakterizace látky zakládat pouze na výsledcích této zkušební metody, nýbrž by se měly tyto výsledky použít v rámci přístupu zvažování závažnosti důkazů, který používá všechny stávající údaje o chemické látce k charakterizaci jejího potenciálního endokrinního působení. Z tohoto důvodu by mělo regulační rozhodování o endokrinním působení (charakterizaci látky) vycházet z široké škály údajů, a nemělo by se opírat pouze o výsledky získané touto zkušební metodou.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Uznává se, že veškeré postupy používající zvířata musí splňovat místní normy péče o zvířata. Popisy péče a zacházení uvedené níže jsou minimálními standardy a budou nahrazeny místními předpisy, pokud ty jsou přísnější. Další pokyny o humánním zacházení se zvířaty poskytuje OECD (14).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.
                           
                        PODSTATA ZKOUŠKY
                  
                              10.
                           
                           
                              Zkoušená chemická látka se denně orálně podává v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat; každé skupině se podává jedna úroveň dávky po dobu 28 dnů. V průběhu období podávání se zvířata každý den pečlivě pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která v průběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena, se pitvají a na konci zkoušky se utratí zvířata, která přežila, a rovněž se pitvají. 28denní studie poskytuje informace o účincích opakované orální expozice a může se ukázat, že jsou třeba další dlouhodobé studie. Také může poskytnout informace o výběru koncentrací pro dlouhodobé studie. Údaje získané použitím této zkušební metody by měly umožnit charakterizaci toxicity zkoušené chemické látky, určení vztahu mezi dávkou a odezvou a stanovení hladiny bez pozorovaného nepříznivého účinku ((NOAEL).
                           
                        POPIS METODY
                  
                     Výběr zvířecích druhů
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Dává se přednost potkanům, ale lze použít i jiný druh hlodavců. Jestliže se parametry uvedené v této zkušební metodě B.7 zkoumají u jiných druhů hlodavců, mělo by se podat podrobné zdůvodnění. Přestože je biologicky možné, že jiné druhy budou reagovat na toxické látky podobným způsobem jako potkan, použití menších druhů může vést ke zvýšené variabilitě v důsledku technické obtížnosti pitvy menších orgánů. V mezinárodním validačním programu detekce endokrinních disruptorů byl jediným použitým druhem potkan. Měla by se použít mladá zdravá dospělá zvířata běžně používaných laboratorních kmenů. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Podávání látky by mělo začít co nejdříve po odstavení a v každém případě dříve, než zvířata dosáhnou stáří devíti týdnů. Na začátku studie by měly být odchylky hmotnosti zvířat minimální a neměly by překročit ± 20 % průměrné hmotnosti pro každé pohlaví. Provádí-li se studie opakovaného orálního podávání látky jako předběžná studie pro dlouhodobou studii, měla by se v obou studiích použít nejlépe zvířata stejného kmene a stejného původu.
                           
                        
                     Umístění a krmení zvířat
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Všechny postupy by měly splňovat místní standardy péče o laboratorní zvířata. Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla být 22 °C (± 3 °C). Relativní vlhkost vzduchu by měla být minimálně 30 % a pokud možno nepřesáhnout 70 % kromě doby čištění místnosti. Cílem by měla být hodnota 50–60 %. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní krmivo s neomezenou dodávkou pitné vody. Výběr krmiva může být ovlivněn potřebou zajistit vhodnou přísadu zkoušené chemické látky, podává-li se látka tímto způsobem. Zvířata by měla být chována v malých skupinkách stejného pohlaví. Je-li to vědecky odůvodněné, mohou být zvířata umístěna jednotlivě. Při chovu zvířat v klecích by v jedné kleci nemělo být umístěno více než pět zvířat.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Krmivo by se mělo pravidelně analyzovat, aby se zjistila přítomnost kontaminantů. Vzorek stravy by se měl uchovávat až do dokončení zprávy.
                           
                        
                     Příprava zvířat
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Zdravá mladá dospělá zvířata se náhodně přiřadí do kontrolních a experimentálních skupin. Klece by měly být uspořádány tak, aby byl případný vliv jejich polohy minimalizován. Zvířata se jednoznačně identifikují a před započetím studie se nechají v laboratorních podmínkách alespoň pět dní aklimatizovat.
                           
                        
                     Příprava dávek
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Zkoušená chemická látka se podává žaludeční sondou nebo v krmivu či v pitné vodě. Metoda orálního podání závisí na účelu studie a na fyzikálních/chemických/toxikokinetických vlastnostech zkoušeného materiálu.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Zkoušená chemická látka se v případě potřeby rozpustí nebo suspenduje ve vhodném nosiči. Kdykoli je to možné, doporučuje se zvážit nejprve použití vodného roztoku/suspenze, poté použití olejového roztoku/emulze (např. kukuřičného oleje) a nakonec roztoku v jiných nosičích. U nosičů jiných než voda je nutné znát jejich toxické vlastnosti. Měla by se stanovit stabilita zkoušené chemické látky v daném nosiči.
                           
                        POSTUP
                  
                     Počet a pohlaví zvířat
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Pro každou úroveň dávky by se mělo použít nejméně deset zvířat (pět samic a pět samců). Pokud se budou zvířata utrácet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou utracena před ukončením studie. Mělo by se zvážit přidání další satelitní skupiny deseti zvířat (pět zvířat od každého pohlaví) do kontrolní skupiny a do skupiny s nejvyšší dávkou, aby se po dobu nejméně 14 dní po ukončení aplikace mohla sledovat vratnost, přetrvávání nebo opožděný nástup toxických účinků.
                           
                        
                     Dávkování
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Obecně by se měly použít nejméně tři experimentální a jedna kontrolní skupina, ale pokud se na základě vyhodnocení jiných údajů neočekávají žádné účinky při dávce 1 000 mg/kg tělesné hmotnosti na den, může se provést limitní zkouška. Nejsou-li dostupné žádné vhodné údaje, může se provést předběžná studie (na zvířatech stejného kmene a původu) pro stanovení rozmezí dávek, které mají být použity. S výjimkou aplikace zkoušené chemické látky je třeba se zvířaty v kontrolní skupině zacházet stejným způsobem jako se zvířaty v experimentální skupině. Používá-li se pro usnadnění aplikace zkoušené chemické látky nosič, podává se kontrolní skupině nosič v nejvyšším použitém objemu.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Při výběru úrovní dávek by se měly vzít v úvahu veškeré existující údaje o toxických a (toxiko)kinetických vlastnostech, které jsou pro zkoušenou chemickou látku nebo příbuzné chemické látky dostupné. Nejvyšší úroveň dávky by se měla zvolit tak, aby vyvolala toxické účinky, ne však uhynutí nebo velké utrpení. Poté by se měla zvolit sestupná řada úrovní dávek, aby se prokázaly účinky související s dávkou a nepřítomnost nepříznivých účinků při nejnižší úrovni dávky (NOAEL). Pro nastavení sestupných úrovní dávek bývá optimální dvoj- až čtyřnásobný interval mezi dávkami a často je vhodnější přidat čtvrtou experimentální skupinu než použít velmi velké intervaly (odpovídající např. koeficientu většímu než 10).
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              V přítomnosti pozorované obecné toxicity (např. snížená tělesná hmotnost, účinky na játra, srdce, plíce nebo ledviny atd.) nebo jiných změn, které nemusí být odezvou na toxicitu (např. snížený příjem krmiva, zvětšení jater), je třeba pozorované účinky na imunitní, neurologické nebo endokrinní citlivé cílové parametry interpretovat obezřetně.
                           
                        
                     Limitní zkouška
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Pokud zkouška provedená podle postupů popsaných v této studii při jedné dávce nejméně 1 000 mg na kg tělesné hmotnosti na den nebo v případě podávání v krmivu nebo v pitné vodě v odpovídající koncentraci (na základě stanovení tělesné hmotnosti) nevyvolá pozorovatelné toxické účinky a pokud se na základě údajů o chemických látkách s podobnou strukturou nepředpokládá toxicita, není úplná studie za použití tří úrovní dávek nutná. Limitní zkouška se použije s výjimkou případu, kdy údaje o expozici člověka naznačují, že je nezbytné použití vyšší úrovně dávek.
                           
                        
                     Podávání dávek
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Zkoušená chemická látka se zvířatům podává denně 7 dní v týdnu po dobu 28 dnů. Pokud se zkoušená chemická látka podává nitrožaludečně, podává se zvířatům v jediné dávce za použití žaludeční sondy nebo vhodné intubační kanyly. Maximální objem kapaliny, kterou lze jednorázově podat, závisí na velikosti pokusného zvířete. Toto množství by nemělo překročit 1 ml/100 g tělesné hmotnosti, s výjimkou vodných roztoků, kde lze použít 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. Kromě dráždivých nebo žíravých chemických látek, u kterých se ve vyšších koncentracích stupňují účinky, by měly být rozdíly ve zkušebním objemu minimalizovány úpravou koncentrace tak, aby byl při všech úrovních dávek podáván konstantní objem.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              U látek podávaných v krmivu nebo v pitné vodě je důležité zajistit, aby množství použité zkoušené chemické látky neovlivňovalo normální výživu nebo vodní rovnováhu. Podává-li se zkoušená chemická látka v krmivu, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm), nebo konstantní dávkování vzhledem k tělesné hmotnosti zvířete; použitá možnost musí být specifikována. U látky podávané prostřednictvím žaludeční sondy je třeba dávku podávat každý den přibližně ve stejnou dobu a alespoň jednou týdně ji přizpůsobit tak, aby se udržela konstantní úroveň dávky vzhledem k tělesné hmotnosti zvířete. Pokud se studie s opakovaným podáváním provádí jako předběžná studie k dlouhodobé studii, měla by se v obou studiích použít stejná krmivo.
                           
                        
                     Pozorování
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Doba pozorování by měla být 28 dnů. Zvířata v satelitní skupině určená pro následná pozorování by měla být po dalších nejméně 14 dnů bez aplikace, aby se zachytil opožděný nástup, přetrvávání nebo zotavení se z toxických účinků.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Všeobecné klinické pozorování by se mělo provádět nejméně jednou denně, nejlépe ve stejnou dobu (stejné doby) a s uvážením doby očekávaného maxima účinku po podání látky. Měl by se zaznamenat zdravotní stav zvířat. Nejméně dvakrát denně se provede prohlídka všech zvířat za účelem zjištění morbidity a mortality.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Před expozicí látce a dále nejméně jednou týdně by se mělo provést důkladné klinické vyšetření všech zvířat (za účelem intraindividuálního porovnání). Toto pozorování by se mělo provádět mimo chovnou klec ve standardním pozorovacím prostoru a nejlépe pokaždé ve stejnou dobu. Pozorování by se měla pečlivě zaznamenávat, nejlépe za použití systému bodování explicitně definovaného ve zkušební laboratoři. Mělo by se usilovat o to, aby rozdíly ve zkušebních podmínkách byly co nejmenší a aby vyšetření prováděly nejlépe osoby, které nevědí, jakým testem zvířata procházejí. Vyšetření by mělo mimo jiné zahrnovat změny kůže, srsti, očí a sliznic, výskyt sekretů a exkretů a vegetativní funkce (slzení, zježení srsti, velikost zornic, nezvyklé dýchání). Zaznamenávat by se měly změny chůze, držení těla a reakce na manipulaci, dále přítomnost klonických a tonických pohybů, stereotypů v chování (např. nadměrného čištění nebo opakovaného kroužení) nebo bizarního chování (např. sebepoškozování, chůze pozpátku) (2).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Ve čtvrtém týdnu expozice látce by se měly vyšetřit reakce na různé smyslové podněty (2) (např. sluchové, zrakové, proprioceptivní), (3), (4), (5), síla úchopu (6) a motorická aktivita (7). Další informace o postupech, které lze použít, jsou uvedeny v příslušné literatuře. Místo postupů popsaných v této literatuře však lze použít také alternativní postupy.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Pozorování funkčních poruch ve čtvrtém týdnu expozice látce lze případně vynechat, pokud je studie prováděna jako předběžná pro následnou subchronickou (90denní) studii. V takovém případě by se mělo pozorování funkčních poruch zahrnout do této dlouhodobé studie. Dostupnost údajů o pozorovaných funkčních poruchách ze studie opakovaného podávání dávky může na druhé straně usnadnit výběr úrovní dávek pro následnou subchronickou studii.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Pozorování funkčních poruch lze výjimečně vynechat u skupin, které vykazují příznaky toxicity v takové míře, že by při posuzování funkčního stavu vadily.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Při pitvě lze určit estrální cyklus všech samic (volitelné) odebráním vaginálních stěrů. Tato pozorování poskytnou informace ohledně fáze estrálního cyklu v čase utracení zvířete a pomohou při histologickém vyšetření tkání citlivých na estrogen [viz pokyny k histopatologickému vyšetření (19)].
                           
                        
                     Tělesná hmotnost a spotřeba krmiva/vody
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Všechna zvířata by se měla nejméně jednou týdně zvážit. Měření spotřeby krmiva by se mělo provádět nejméně jednou týdně. Pokud se látka podává v pitné vodě, měla by se nejméně jednou týdně měřit také spotřeba vody.
                           
                        
                     Hematologická vyšetření
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Na konci zkoušky by se měla provést tato hematologická vyšetření: stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, retikulocytů, celkového počtu a diferenciálního rozpočtu leukocytů a trombocytů a stanoví se protrombinový čas. Jestliže zkoušená chemická látka nebo její domnělé metabolity mají oxidační vlastnosti nebo existuje podezření, že je mají, měly by se stanovit také koncentrace methemoglobinu a Heinzových tělísek.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Krevní vzorky by se měly odebírat z určeného místa těsně před utracením zvířat nebo v jeho průběhu a měly by se skladovat za vhodných podmínek. Zvířata by se měla před utracením ponechat přes noc nalačno (7).
                           
                        
                     Biochemické vyšetření
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Klinické biochemické analýzy za účelem vyšetření hlavních toxických účinků na tkáně, a zejména účinků na játra a ledviny, by se měly provést na krevních vzorcích odebraných všem zvířatům těsně před utracením nebo v jeho průběhu (kromě zvířat nalezených v agónii a/nebo utracených před dokončením studie). Vyšetření plazmy a séra obsahuje stanovení sodíku, draslíku, glukózy, celkového cholesterolu, močoviny, kreatininu, celkových bílkovin a albuminu, nejméně dvou enzymů indikujících účinky na jaterní buňky (jako je alaninaminotransferáza, aspartátaminotransferáza, alkalická fosfatáza, gama-glutamyltranspeptidáza a glutamátdehydrogenáza) a žlučových kyselin. Stanovení dalších enzymů (jaterního nebo jiného původu) a bilirubinu může za určitých okolností poskytnout užitečné informace.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Dále je možné v průběhu posledního týdne studie provést následující analýzy moči za použití časově definovaného sběru: vzhled, objem, osmolalita nebo specifická hmotnost, pH, bílkoviny, glukóza a krev/krvinky.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Dále by se mělo zvážit vyšetření sérových markerů celkového poškození tkání. Další vyšetření by se mělo provést, jestliže známé vlastnosti zkoušené chemické látky mohou (nebo existuje podezření, že mohou) ovlivnit související metabolické profily, včetně vápníku, fosfátů, triglyceridů, specifických hormonů a cholinesterázy. Tyto profily je třeba identifikovat pro chemické látky patřící do určitých tříd nebo případ od případu.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Přestože v mezinárodním hodnocení cílových parametrů týkajících se endokrinního působení nebylo možno prokázat jasnou výhodu stanovení tyreoidních hormonů (T3, T4) a TSH, může být užitečné uchovat vzorky plazmy či séra k změření T3, T4 a TSH (volitelné), existuje-li náznak působení na osu hypofýza–štítná žláza. Tyto vzorky je možno uchovat zmrazené na – 20 °C. Následující faktory mohou ovlivnit variabilitu a absolutní koncentrace stanovovaných hormonů:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          doba utracení vzhledem k diurnálním odchylkám v koncentracích hormonů,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          způsob utracení – mělo by se zabránit zbytečnému stresu zvířat, který může ovlivnit koncentrace hormonů,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          testovací soupravy pro stanovení hormonů, jejichž standardní křivky se mohou lišit.
                                       
                                    Definitivní identifikace chemických látek působících na štítnou žlázu je spolehlivější, pokud se provede pomocí histopatologické analýzy spíše než stanovením hladin hormonů.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Vzorky plazmy určené speciálně k stanovení hormonů by se měly odebírat zhruba ve stejnou denní dobu. Doporučuje se, aby se zvážilo stanovení T3, T4 a TSH při nálezu histopatologických změn štítné žlázy. Číselné hodnoty získané při analýze koncentrací hormonů se u různých komerčních testovacích souprav liší. V důsledku toho nemusí být možné poskytnout kritéria účinnosti vycházející z jednotných historických údajů. Laboratoře by se měly snažit udržovat kontrolní koeficienty odchylky pod hodnotou 25 pro T3 a T4 a pod hodnotou 35 pro TSH. Všechny koncentrace je nutno uvádět v jednotkách ng/ml.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Pokud nejsou údaje o výchozích hodnotách z dřívějších pozorování dostatečné, mělo by se zvážit stanovení hematologických a klinických biochemických parametrů před začátkem podávání dávky nebo přednostně u skupiny zvířat nezahrnutých do experimentálních skupin.
                           
                        PATOLOGIE
                  
                     Makroskopická pitva
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              U všech zvířat zařazených do studie se provede celková, podrobná pitva, zahrnující pečlivé vyšetření vnějšího povrchu těla, všech otvorů a lebeční, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledvinky, varlata, nadvarlata, prostata + semenné váčky s Cowperovými žlázami jako celek, brzlík, slezina, mozek a srdce všech zvířat (kromě zvířat nalezených umírajících a/nebo zvířat utracených před ukončením studie) by měly být zbaveny všech přirostlých tkání a co nejdříve po pitvě se ve vlhkém stavu zváží, aby nedošlo k vyschnutí. Při ořezávání přirostlých tkání z komplexu prostaty je třeba postupovat opatrně, aby se zabránilo propíchnutí semenných váčků naplněných tekutinou. Nebo je možné semenné váčky a prostatu odříznout a zvážit po fixaci.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Kromě toho lze volitelně zvážit hned po sekci další dvě tkáně, aby se zabránilo jejich vyschnutí, a to párové vaječníky (vlhká hmotnost) a dělohu, včetně děložního hrdla (pokyny k odběru a přípravě děložních tkání k měření hmotnosti jsou uvedeny v OECD TG 440 (18)).
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Hmotnost štítné žlázy (volitelné) lze stanovit po fixaci. Odříznutí by se mělo rovněž provádět velmi opatrně a teprve po fixaci, aby se zamezilo poškození tkáně. Poškození tkáně by mohlo narušit histopatologickou analýzu.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Následující tkáně by se měly konzervovat v nejvhodnějším fixačním médiu pro daný typ tkáně a zamýšlené následné histopatologické vyšetření (viz odstavec 47): všechny makroskopicky viditelné léze, mozek (reprezentativní oblasti zahrnující hemisféry, mozeček a most), mícha, oko, žaludek, tenké a tlusté střevo (včetně Peyerových plátů), játra, ledviny, nadledvinky, slezina, srdce, brzlík, štítná žláza, průdušnice a plíce (konzervované naplněním fixačním roztokem a následným ponořením), gonády (varlata a vaječníky), přídatné pohlavní orgány (děloha a hrdlo děložní, nadvarlata, prostata + semenné váčky s Cowperovými žlázami), vagina, močový měchýř, lymfatické uzliny (kromě nejproximálnější svodné uzliny by se měla odebrat ještě jedna uzlina dle laboratorních zkušeností (15)), periferní nerv (n. ischiadicus nebo n. tibialis) přednostně v blízkosti svalu, kosterní sval a kost, s kostní dření (řez nebo čerstvý nátěr z aspirované kostní dřeně). Doporučuje se fixovat varlata ponořením do Bouinova nebo modifikovaného Davidsonova fixačního média (16), (17). Tunica albuginea se musí jemně a mělce propíchnout jehlou na obou koncích orgánu, aby se umožnilo rychlé proniknutí fixativa. Na základě klinických nebo jiných nálezů může být nezbytné zkoumat i další tkáně. Konzervovat by se měly také všechny orgány považované na základě známých vlastností zkoušené chemické látky za možné cílové orgány.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Následující tkáně mohou poskytnout cenné svědectví o endokrinních účincích: gonády (vaječníky a varlata), přídatné pohlavní orgány (děloha včetně děložního hrdla, nadvarlata, semenné váčky s Cowperovými žlázami, dorzolaterální a ventrální prostata), vagina, hypofýza, samčí prsní žláza, štítná žláza a nadledvinka. Změny na samčích prsních žlázách nebyly dostatečně zdokumentovány, avšak tento parametr může být velmi citlivý na látky s estrogenním působením. Pozorování orgánů/tkání, které nejsou uvedeny v odstavci 43, jsou volitelná (viz dodatek 2).
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Pokyny k histopatologickému vyšetření (19) podrobně popisují pitvu, fixaci, tvorbu řezů a histopatologické vyšetření endokrinních tkání.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              V mezinárodním zkušebním programu byly získány určité důkazy, že mírné endokrinní účinky chemických látek s nízkou účinností ovlivňující homeostázu pohlavních hormonů lze identifikovat podle poruch synchronizace estrálního cyklu v různých tkáních a v menší míře tolik na základě klinicky zřejmých histopatologických změn samičích pohlavních orgánů. Přestože pro tyto účinky nebyl získán definitivní důkaz, doporučuje se, aby se důkazy možné asynchronie estrálního cyklu vzaly v úvahu při interpretaci histopatologických nálezů na vaječnících (folikulární, thekální a granulózní buňky), děloze, hrdle děložním a vagině. Pokud se pomocí poševních stěrů vyhodnotí také fáze cyklu, může se do tohoto srovnání zařadit.
                           
                        
                     Histopatologické vyšetření
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              U všech zvířat kontrolní skupiny a skupiny, které byla podána vysoká dávka, by se mělo provést celkové histopatologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Toto vyšetření by se mělo rozšířit i na zvířata všech ostatních dávkových skupin, pokud jsou u skupiny s vysokou dávkou pozorovány změny orgánů vyvolané zkoušenou dávkou.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Vyšetří se všechny makroskopické léze.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              V případě použití satelitní skupiny by se mělo provést histopatologické vyšetření tkání a orgánů, na kterých byly pozorovány účinky u exponovaných skupin.
                           
                        ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ
                  
                     Údaje
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Měly by se uvést údaje pro každé jednotlivé zvíře. Navíc by měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, přičemž se uvede u každé experimentální skupiny počet zvířat na začátku zkoušky, počet zvířat nalezených uhynulých v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních důvodů a dobu úmrtí nebo utracení, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, popis pozorovaných toxických příznaků, včetně doby nástupu, trvání a závažnosti každého toxického účinku, počet zvířat vykazujících léze, typ lézí, jejich závažnost a procento zvířat vykazujících jednotlivé typy léze.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Číselné výsledky by měly být pokud možno vyhodnoceny vhodnou a obecně uznávanou statistickou metodou. Srovnáním účinků v celém rozpětí dávkování by se mělo zamezit použití mnohonásobných t-testů. Statistické metody by se měly vybrat již při plánování studie.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Za účelem kontroly jakosti se navrhuje, aby se shromáždily dřívější kontrolní údaje a vypočítaly se koeficienty rozptylu pro číselné údaje, zejména pro parametry spojené s detekcí endokrinních disruptorů. Tyto údaje pak lze použít pro účely srovnání při hodnocení stávajících studií.
                           
                        
                     Protokol o zkoušce
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto údaje:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkoušená chemická látka:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikální povaha, čistota a fyzikálně-chemické vlastnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikační údaje.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosič (je-li použit):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění výběru nosiče, pokud je jiný než voda.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Pokusná zvířata:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použitý druh/kmen,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet, stáří a pohlaví zvířat,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj, podmínky chovu, krmivo atd.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hmotnosti jednotlivých zvířat na začátku zkoušky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění použití druhu, pokud je jiný než potkan.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkušební podmínky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění výběru úrovně dávky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné údaje o použité formě zkoušené chemické látky/úpravě krmiva, o dosažené koncentraci, stabilitě a homogenitě přípravku,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné údaje o podávání zkoušené chemické látky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popřípadě přepočet koncentrace zkoušené chemické látky v krmivu/pitné vodě (ppm) na skutečnou denní dávku (mg/kg tělesné hmotnosti/den),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné údaje o kvalitě krmiva a vody.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Volitelné zkoumané cílové parametry
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      seznam volitelných zkoumaných cílových parametrů.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tělesná hmotnost a změny tělesné hmotnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      spotřeba krmiva, popřípadě spotřeba vody,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o toxických reakcích podle pohlaví a úrovně dávky, včetně příznaků toxicity,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      povaha, závažnost a trvání klinických projevů (ať vratných, či nevratných),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      posouzení reaktivity na smyslové podněty, úchopové síly a motorické aktivity,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematologická vyšetření s příslušnými základními hodnotami (normami),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klinická biochemická vyšetření s příslušnými výchozími hodnotami (normami),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tělesná hmotnost při utracení a údaje o hmotnosti orgánů,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pitevní nálezy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobný popis všech histopatologických nálezů,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o absorpci, jsou-li dostupné,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popřípadě statistické zpracování výsledků.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Diskuse o výsledcích.
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Závěry.
                                          
                                       
                                    
                        
                     Dodatek 1
                     DEFINICE
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Androgenicita je schopnost chemické látky působit v organismu savců jako přirozený androgenní hormon (např. testosteron).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Antiandrogenicita je schopnost chemické látky potlačit v organismu savců působení přirozeného androgenního hormonu (např. testosteronu).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Antiestrogenicita je schopnost chemické látky potlačit v organismu savců působení přirozeného estrogenního hormonu (např. estradiolu 17ß).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Antityreoidální působení je schopnost chemické látky potlačit v organismu savců působení přirozeného hormonu štítné žlázy (např. T3).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Dávkování je obecný termín zahrnující dávku, její četnost a trvání podávání látky.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Dávka je podávané množství zkoušené chemické látky. Dávka se vyjadřuje jako hmotnost zkoušené chemické látky na jednotku tělesné hmotnosti zvířete za den (např. mg/kg tělesné hmotnosti/den) nebo jako konstantní koncentrace v krmivu.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Zřejmá toxicita je obecný termín popisující jasné příznaky toxicity po podání zkoušené chemické látky. Ty by měly být dostačující pro posouzení nebezpečnosti a měly by být takové, že při zvýšení podávané dávky lze očekávat rozvoj závažných toxických příznaků a pravděpodobnou mortalitu.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    NOAEL je zkratka pro angl. „no-observed-adverse-effect level“. Je to nejvyšší úroveň dávky, při které nejsou pozorovány žádné nepříznivé účinky spojené se zkouškou.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Estrogenicita je schopnost chemické látky působit v organismu savců jako přirozený estrogenní hormon (např. estradiolu 17ß).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Zkoušená chemická látka: Jakákoli látka nebo směs zkoušená pomocí této zkušební metody.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tyreoidální působení je schopnost chemické látky působit jako přirozený hormon štítné žlázy (např. T3) v savčím organismu.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Validace je vědecký postup určený k charakterizaci provozních požadavků a omezení zkušební metody a k prokázání její spolehlivosti a relevantnosti pro konkrétní účel.
                              
                           
                  
                     Dodatek 2
                     
                        Cílové parametry doporučené k detekci endokrinních disruptorů (ED) v této zkušební metodě B.7
                     
                     
                                 Povinné cílové parametry
                              
                              
                                 Volitelné cílové parametry
                              
                           
                                 Hmotnost
                              
                           
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             varlata
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nadvarlata
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nadledvinky
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             prostata a semenné váčky s Cowperovými žlázami
                                          
                                       
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             vaječníky
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             děloha včetně hrdla děložního
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             štítná žláza
                                          
                                       
                           
                                 Histopatologické vyšetření
                              
                           
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             gonády:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         varlata a
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vaječníky
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             přídatné pohlavní orgány:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         nadvarlata
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         prostata a semenné váčky s Cowperovými žlázami
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         děloha včetně hrdla děložního
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nadledvinky
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             štítná žláza
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pochva
                                          
                                       
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             poševní stěry
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             samčí prsní žlázy
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             hypofýza
                                          
                                       
                           
                                 Měření hormonů
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             hladiny cirkulujícího T3 a T4
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             hladina cirkulujícího TSH
                                          
                                       
                           
                  
                     LITERATURA:
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404-407.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85.
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No 440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties.
                           
                        
                              19)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.
                           
                        B.8   SUBAKUTNÍ INHALAČNÍ TOXICITA: 28DENNÍ STUDIE
                  
                  SHRNUTÍ
                  Tato revidovaná zkušební metoda B.8 byla navržena s cílem plně charakterizovat inhalační toxicitu zkoušené chemické látky po opakované expozici po omezené časové období (28 dnů) a získat údaje pro kvantitativní posouzení rizik inhalace. Skupiny alespoň 5 samců a 5 samic hlodavců se vystaví 6 hodin denně po dobu 28 dnů a) zkoušené chemické látce na třech nebo více úrovních koncentrace, b) filtrovanému vzduchu (negativní kontrola) a/nebo c) nosiči (kontrola s nosičem). Zvířata jsou obvykle exponována 5 dnů v týdnu, avšak expozice po 7 dnů v týdnu je rovněž povolena. Zkouška se vždy provádí se samci i samicemi, avšak jednotlivá pohlaví mohou být vystavena odlišným úrovním koncentrace, pokud je známo, že je jedno pohlaví citlivější vůči dané zkušební chemické látce. Tato metoda poskytuje vedoucímu studie možnost zařadit do zkoušky satelitní skupiny (k sledování vratnosti), bronchoalveolární laváž (BAL), neurologické testy a další klinická patologická a histopatologická vyšetření za účelem lepší charakterizace toxicity zkoušené chemické látky.
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda odpovídá Pokynům OECD pro zkoušení 412 (2009). Původní Pokyny pro zkoušení 412 (TG 412) pro subakutní inhalační toxicitu byly schváleny v roce 1981 (1). Tato zkušební metoda B.8 (odpovídající revidovaným pokynům TG 412) byla aktualizována tak, aby odrážela stav vědeckého poznání a naplňovala stávající a budoucí regulační potřeby.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Tato metoda umožňuje charakterizaci nepříznivých účinků po opakované denní inhalační expozici zkoušené chemické látce po dobu 28 dnů. Údaje získané z 28denních studií subakutní inhalační toxicity lze použít ke kvantitativnímu posouzení rizik (pokud se po ní neprovádí 90denní studie subchronické inhalační toxicity (Kapitola B.29 této přílohy)). Tyto údaje mohou rovněž poskytovat informace pro výběr koncentrací pro dlouhodobější studie, jako je 90denní studie subchronické inhalační toxicity. Tato zkušební metoda není speciálně určena pro zkoušky nanomateriálů. Definice použité v kontextu této zkušební metody naleznete na konci této kapitoly a v Pokynech GD 39 (2).
                           
                        VÝCHOZÍ ÚVAHY
                  
                              3.
                           
                           
                              Před zahájením této studie by měla laboratoř provádějící zkoušky vzít v úvahu veškeré dostupné informace o zkoušené chemické látce, aby se zvýšila kvalita studie a minimalizovalo použití zvířat. Mezi informace, které usnadňují výběr vhodných zkušebních koncentrací, patří identita zkoušené chemické látky, její chemická struktura a fyzikálně-chemické vlastnosti, výsledky jakýchkoli testů toxicity in vitro nebo in vivo, předpokládaná použití a možnost expozice lidí, dostupné údaje (Q)SAR a toxikologické údaje o strukturně příbuzných látkách a údaje odvozené ze zkoušek akutní inhalační toxicity. Očekává-li se nebo je-li v průběhu studie pozorována neurotoxicita, může se vedoucí studie rozhodnout zařadit vhodná vyšetření, například funkční pozorovací baterii (functional observational battery, FOB) a měření motorické aktivity. Přestože načasování expozic s ohledem na konkrétní vyšetření může být velmi důležité, nemělo by provádění těchto doplňkových činností narušovat základní plán studie.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Roztoky žíravých nebo dráždivých zkoušených chemických látek lze testovat při koncentracích, které povedou k požadovanému stupni toxicity [viz GD 39 (2)]. Při vystavování zvířat těmto materiálům by však měly být cílové koncentrace dostatečně nízké, aby nezpůsobily výraznou bolest a utrpení, zároveň by však měly být dostačující k prodloužení křivky závislosti odezvy na koncentraci k hodnotám, které umožní splnit regulační a vědecký účel této zkoušky. Tyto koncentrace by se měly volit individuálně případ od případu, nejlépe na základě výsledků vhodně navržené studie ke stanovení dávkování, která poskytuje informace o kritickém cílovém parametru, prahu dráždivosti a době nástupu účinků (viz odstavce 11–13). Mělo by se uvést zdůvodnění výběru dané koncentrace.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Umírající zvířata nebo zvířata, která očividně trpí bolestí nebo vykazují známky závažného a přetrvávajícího stresu by se měla humánním způsobem utratit. Umírající zvířata se posuzují stejným způsobem jako zvířata, která při zkoušce uhynou. Kritéria rozhodování o utracení umírajících nebo značně trpících zvířat a pokyny týkající se rozpoznání předvídatelného nebo blížícího se uhynutí jsou předmětem Pokynů OECD o humánních cílových parametrech (3).
                           
                        POPIS METODY
                  
                     Výběr zvířecích druhů
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Měli by se použít mladí zdraví dospělí hlodavci běžně používaných laboratorních kmenů. Nejvhodnějším druhem je potkan. Pokud se použijí jiné druhy, mělo by se uvést odůvodnění.
                           
                        
                     Příprava zvířat
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Samice musí být nullipary a nesmí být březí. V den randomizace by mělo jít o mladé dospělé jedince staré 7 až 9 týdnů. Tělesná hmotnost by se měla pohybovat v rozmezí ± 20 % průměrné hmotnosti u každého pohlaví. Zvířata se náhodně vyberou, označí pro potřeby individuální identifikace a umístí do klecí nejméně 5 dnů před začátkem zkoušky, aby si mohla zvyknout na laboratorní podmínky.
                           
                        
                     Zvířecí chov
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Zvířata by měla být individuálně označena, nejlépe pomocí subkutánních transpondérů, aby se usnadnila pozorování a zamezilo záměně. Teplota zkušební místnosti, v níž se uchovávají zvířata, by měla být 22 ± 3 °C. Relativní vlhkost by se měla udržovat optimálně v rozmezí 30 až 70 %, ačkoliv to nemusí být proveditelné, používá-li se jako nosič voda. Před expozicí a po ní by se měla zvířata držet v klecích rozdělena do skupin podle pohlaví a koncentrace, avšak počet zvířat v jedné kleci by neměl bránit jasnému pozorování každého zvířete a měl by minimalizovat ztráty v důsledku kanibalismu nebo bojů. Jsou-li zvířata vystavena látce pouze nazální cestou, může být nutné nechat je zvyknout si na zkumavky omezující pohyb. Zkumavky by neměly zvířatům způsobovat přílišný fyzický, termální nebo imobilizační stres. Omezení může ovlivnit fyziologické cílové parametry, jako je tělesná teplota (hypertermie) a/nebo respirační objem za minutu. Jsou-li k dispozici obecné údaje, které prokazují, že k takovým změnám nedochází ve značné míře, není předběžná adaptace na zkumavky omezující pohyb nutná. Zvířata, jež jsou vystavena aerosolu celým tělem, by se měla držet během expozice odděleně, aby se zabránilo pronikání zkoušeného aerosolu z jejich těla do srsti ostatních zvířat v kleci. Mohou se používat konvenční a certifikovaná laboratorní krmiva, kromě období expozice, podávaná s neomezeným množstvím pitné vody z vodovodu. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy.
                           
                        
                     Inhalační komory
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Při výběru inhalační komory by se měla zvážit povaha zkoušené chemické látky a cíl zkoušky. Upřednostňuje se expozice pouze nazální cestou (přičemž tento termín zahrnuje i expozici hlavy, nosu a tlamy) Expozice pouze nazální cestou se obecně upřednostňuje u studií kapalných nebo pevných aerosolů a par, které mohou kondenzací vytvářet aerosoly. Speciálních cílů studie lze snáze dosáhnout, použije-li se celotělová expozice, avšak tato skutečnost by se měla zdůvodnit ve zprávě o studii. Pro zajištění stability atmosféry v komoře pro celotělovou expozici by neměl celkový objem zaplněný pokusnými zvířaty přesáhnout 5 % objemu komory. Principy techniky expozice pouze nazální cestou a celotělové expozice a jejich konkrétní výhody a nevýhody jsou popsány v dokumentu GD 39 (2).
                           
                        STUDIE TOXICITY
                  
                     Mezní koncentrace
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Na rozdíl od akutních studií nejsou v 28denních studiích subakutní inhalační toxicity žádné definované mezní koncentrace. Maximální zkoušená koncentrace by měla zohledňovat: 1) maximální dosažitelnou koncentraci, 2) úroveň expozice člověka v „nejhorším případě“, 3) potřebu udržet dostatečný přívod kyslíku a/nebo 4) dobré životní podmínky zvířat. Chybí-li mezní hodnoty založené na skutečných údajích, mohou se použít akutní limity z nařízení (ES) č. 1272/2008 (13) (tj. maximálně 5 mg/l pro aerosoly, 20 mg/l pro páry a 20 000 ppm pro plyny), viz GD 39 (2). Pokud je při zkouškách plynů nebo vysoce těkavých chemických látek (např. chladicí prostředky) potřeba tyto limity překročit, mělo by se uvést zdůvodnění. Z mezní koncentrace by mělo být možné odvodit jednoznačnou toxicitu bez toho, aby byly zvířata vystavena nadměrnému stresu nebo aby byla ovlivněna délka jejich života.
                           
                        
                     Studie k stanovení rozsahu
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Před zahájením hlavní studie může být nutné provést studii k stanovení rozsahu. Studie k stanovení rozsahu je komplexnější než orientační studie, protože není omezená na výběr koncentrace. Poznatky získané ve studii k stanovení rozsahu mohou vést k úspěšné hlavní studii. Studie k stanovení rozsahu může například poskytnout technické informace týkající se analytických metod, velikosti částic, odhalení toxických mechanismů, klinické patologie a histopatologických údajů a odhady koncentrací NOAEL a MTC v hlavní studii. Vedoucí studie se může rozhodnout použít studii ke stanovení rozsahu pro určení prahové hodnoty pro podráždění dýchacích cest (např. pomocí histopatologického vyšetření dýchacích cest, zkoušení plicních funkcí nebo bronchoalveolární laváže), horní hranice koncentrace, kterou zvířata snáší bez nadměrného stresu, a parametrů, které budou nejlépe charakterizovat toxicitu zkoušené chemické látky.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Studie ke stanovení rozsahu může obsahovat jednu nebo více úrovní koncentrace. Každé úrovni koncentrace by se měli vystavit maximálně tři samci a tři samice. Studie ke stanovení rozsahu by měla trvat minimálně 5 dní a obvykle ne déle než 14 dní. Ve zprávě o studii by se mělo uvést zdůvodnění výběru koncentrací pro hlavní studii. Cílem hlavní studie je ukázat vztah mezi koncentrací a odezvou založený na předpokládaném nejcitlivějším cílovém parametru. Nízká koncentrace by měla být v ideálním případě koncentrace, při níž nejsou pozorovány nepříznivé účinky, zatímco z vysoké koncentrace by mělo být možné odvodit jednoznačnou toxicitu, aniž by se zvířatům způsobil nadměrný stres nebo se ovlivnila délka jejich života (3).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Při výběru úrovní koncentrace pro studii k stanovení rozsahu by se měly zvážit veškeré dostupné informace, včetně vztahů mezi strukturou a aktivitou a údajů o podobných chemických látkách (viz odstavec 3). Studie ke stanovení rozsahu může potvrdit/vyvrátit cílové parametry, které se považují z mechanistického hlediska za nejvíce citlivé, např. inhibice cholinesterázy organickými fosfáty, tvorba methemoglobinu v důsledku erytrocytotoxických látek, hormony štítné žlázy (T3, T4) u tyreotoxických látek, bílkoviny, LDH nebo neutrofily v bronchoalveolární laváži u neškodných špatně rozpustných částic nebo aerosolů dráždících plíce.
                           
                        
                     Hlavní studie
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Hlavní studie subakutní toxicity se obvykle skládá ze tří úrovní koncentrace a rovněž zahrnuje souběžné negativní kontroly (se vzduchem) a/nebo dle potřeby kontroly s nosičem (viz odstavec 17). Při výběru vhodných úrovní expozice je třeba použít veškeré dostupné údaje, včetně výsledků studií systémové toxicity, metabolismu a kinetiky (zvláštní důraz by se měl klást na vyloučení vysokých úrovní koncentrace, které saturují kinetické procesy). Každá experimentální skupina obsahuje alespoň 10 hlodavců (5 samců a 5 samic), kteří jsou vystaveni zkoušené chemické látce každý den 6 hodin 5 dnů v týdnu po dobu 4 týdnů (celková doba trvání studie je 28 dní). Zvířata lze rovněž vystavit látce 7 dní v týdnu (např. při zkouškách inhalačních farmaceutik). Je-li známo, že je jedno pohlaví vůči dané zkoušené chemické látce citlivější, je možné vystavit jednotlivá pohlaví odlišným úrovním koncentrace, aby se optimalizoval vztah mezi koncentrací a odezvou, jak popisuje odstavec 15. Jsou-li k expozici pouze nazální cestou použity jiné druhy hlodavců než potkani, je možno upravit maximální doby expozice za účelem minimalizace druhově specifického utrpení. Použije-li se doba expozice kratší než 6 hodin/den nebo pokud je třeba provést studii celotělové expozice s dlouhou dobou expozice (např. 22 hodin/den), mělo by se uvést zdůvodnění [viz GD 39 (2)]. Během expozice by se mělo pozastavit krmení zvířat, jestliže doba expozice nepřesahuje 6 hodin. Během celotělové expozice je možno zvířatům podávat vodu.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Zvolené cílové koncentrace by měly vést k identifikaci cílového orgánu (cílových orgánů) a ukázat jasný vztah mezi koncentrací a odezvou:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Vysoká úroveň koncentrace by měla mít toxické účinky, avšak neměla by způsobovat trvalé následky či letalitu, které by zabránily smysluplnému vyhodnocení.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Střední úrovně koncentrací mezi mezními hodnotami by měly odstupňovány, aby se toxické účinky zvyšovaly od nízké po vysokou koncentraci.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Nízká úroveň koncentrace by měla vyvolat malé nebo žádné příznaky toxicity.
                                       
                                    
                        
                     Satelitní studie (k sledování vratnosti)
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Satelitní studii (ke sledování vratnosti) je možné použít k pozorování vratnosti, přetrvávání nebo opožděného nástupu toxicity během dostatečně dlouhého období po expozici, nejméně však po 14 dnů. Skupiny v satelitní studii (ke sledování vratnosti) jsou složeny z pěti samců a pěti samic a jsou látce vystaveny současně s pokusnými zvířaty v hlavní studii. Skupiny v satelitní studii (ke sledování vratnosti) by se měly vystavit nejvyšší úrovni koncentrace zkoušené chemické látky a měly by se použít souběžné kontroly se vzduchem a/nebo s nosičem, dle potřeby (viz odstavec 17).
                           
                        
                     Kontrolní zvířata
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Se zvířaty v souběžné negativní (vzduch) kontrolní skupině by se mělo zacházet stejným způsobem jako se zvířaty v experimentální skupině až na to, že se namísto zkoušené chemické látce vystaví filtrovanému vzduchu. Pokud se ke generování zkušební atmosféry používá také voda nebo jiná látka, měla by se do studie namísto negativní kontroly se vzduchem zařadit kontrolní skupina s nosičem. Kdykoli je to možné, měla by se jako nosič použít voda. Použije-li se jako nosič voda, měla by se kontrolní zvířata vystavit vzduchu o stejné relativní vlhkosti jako experimentální skupiny. Výběr vhodného nosiče by se měl zakládat na vhodně provedené předběžné studii nebo na historických údajích. Není-li toxicita nosiče dobře známa, může se vedoucí studie rozhodnout použít jak negativní kontrolu (vzduch), tak kontrolu s nosičem, ale takový postup se rozhodně nedoporučuje. Jestliže historické údaje ukážou, že nosič není toxický, není třeba používat negativní (vzduch) kontrolní skupinu a měla by se použít pouze kontrolní skupina s nosičem. Jestliže předběžná studie zkoušené chemické látky formulované na nosiči neodhalí žádnou toxicitu, vyplývá z toho, že nosič je při zkoušené koncentraci netoxický a měla by se použít tato kontrola s nosičem.
                           
                        PODMÍNKY EXPOZICE
                  
                     Podávání koncentrací
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Zvířata jsou vystavena zkoušené chemické látce ve formě plynu, páry, aerosolu nebo jejich směsi. Skupenství látky, které se má zkoušet, závisí na fyzikálně-chemických vlastnostech zkoušené chemické látky, zvolené koncentraci a/nebo fyzické formě, v níž se bude zkoušená chemická látka s největší pravděpodobností nacházet při manipulaci a používání. Hygroskopické a chemicky reaktivní zkoušené chemické látky by se měly zkoušet v podmínkách suchého vzduchu. Je třeba pečlivě zabránit vzniku explozivních koncentrací. Materiál složený z částic je možno podrobit mechanickým postupům na snížení velikosti částic. Další pokyny jsou uvedeny v dokumentu GD 39 (2).
                           
                        
                     Distribuce velikosti částic
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              U všech aerosolů a par, které mohou kondenzací vytvořit aerosoly, by se mělo provést stanovení rozměrů částic. Aby byla možná expozice všech důležitých částí dýchací soustavy, doporučují se aerosoly s hodnotami hmotnostního mediánu aerodynamického průměru (MMAD) v rozmezí 1 až 3 μm a s geometrickou směrodatnou odchylkou (σg) v rozmezí 1,5 až 3,0 (4). Přestože by se mělo vynaložit dostatečné úsilí k splnění této normy, není-li to možné, je třeba předložit odborný posudek. Například částice kovových výparů mohou být menší, než je tato norma, a nabité částice a vlákna ji mohou překračovat.
                           
                        
                     Příprava zkoušené chemické látky na nosiči
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              V ideálním případě by se měla zkoušená chemická látka testovat bez nosiče. Jestliže je nutno použít nosič k získání vhodné koncentrace a velikosti částic zkoušené chemické látky, měla by se přednostně použít voda. Kdykoli je zkoušená chemická látka v tomto nosiči rozpuštěna, měla by se prokázat její stabilita.
                           
                        MONITOROVÁNÍ PODMÍNEK EXPOZICE
                  
                     Proudění vzduchu komorou
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Proudění vzduchu expoziční komorou by se mělo při každé expozici pečlivě kontrolovat, neustále monitorovat a zaznamenávat alespoň v hodinových intervalech. Monitorování koncentrace (nebo stability) látky ve zkušební atmosféře je nedílnou součástí měření všech dynamických parametrů a poskytuje nepřímý prostředek ke kontrole všech důležitých dynamických inhalačních parametrů. Monitoruje-li se koncentrace v reálném čase, je možno snížit frekvenci měření průtoku vzduchu komorou na jediné měření pro každou expozici za den. Zvláštní pozornost je třeba věnovat tomu, aby se zamezilo opětovnému vdechování látky v komorách s nazální cestou expozice. Koncentrace kyslíku by měla být alespoň 19 % a koncentrace oxidu uhličitého by neměla přesáhnout 1 %. Existuje-li důvod se domnívat, že tyto normy nelze splnit, měly by se koncentrace kyslíku a oxidu uhličitého měřit. Jestliže měření v první den expozice ukážou, že jsou úrovně těchto plynů správné, není třeba další měření provádět.
                           
                        
                     Teplota a relativní vlhkost v komoře
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Teplota v komoře by se měla udržovat na 22 ± 3 °C. Relativní vlhkost v dýchací zóně zvířat, jak při expozici pouze nazální cestou, tak při celotělové expozici, by se měla nepřetržitě sledovat a zaznamenávat pokud možno nejméně v hodinových intervalech během každé expozice. Relativní vlhkost by se měla udržovat nejlépe v rozmezí 30 až 70 %, to však může být neproveditelné (např. při zkoušení směsí na bázi vody) nebo obtížně měřitelné v důsledku interference zkoušené chemické látky se zkušební metodou.
                           
                        
                     Zkoušená chemická látka: Nominální koncentrace
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Je-li to možné, měla by se vypočítat a zaznamenat nominální koncentrace zkoušené chemické látky v expoziční komoře. Nominální koncentrace je hmotnost generované zkoušené chemické látky vydělená celkovým objemem vzduchu procházejícím systémem inhalační komory. Nominální koncentrace se nepoužívá k charakterizaci expozice zvířat, avšak porovnání nominální koncentrace a skutečné koncentrace je ukazatelem výkonnosti zkušebního systému při generování zkušební atmosféry, a tudíž ji lze použít k odhalení problémů při generování.
                           
                        
                     Zkoušená chemická látka: Skutečná koncentrace
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Skutečná koncentrace je koncentrace zkoušené chemické látky ve vzorcích odebraných v dýchací zóně zvířat v inhalační komoře. Skutečné koncentrace lze změřit specifickými metodami (např. přímý odběr vzorků, adsorpční metody nebo metody založené na chemické reakci a následná analytická charakterizace) nebo nespecifickými metodami, jako je vážková analýza (gravimetrie). Použití gravimetrie je přípustné pouze u práškových aerosolů obsahujících jedinou složku nebo u aerosolů z kapalin s nízkou těkavostí a mělo by se podložit příslušnou specifickou charakterizací zkoušené chemické látky před provedením studie. Koncentraci práškového aerosolu sestávajícího z více složek lze rovněž stanovit gravimetricky. Vyžaduje to však analytické údaje, které prokazují, že složení materiálu rozptýleného ve vzduchu je podobné složení výchozího materiálu. Nejsou-li tyto informace k dispozici, je během studie nutné provádět v pravidelných intervalech opakovanou analýzu zkoušené chemické látky (ideálně ve vzdušné formě). U látek v aerosolové formě, které se mohou vypařovat nebo sublimovat, by se mělo prokázat, že byly vybranou metodou zachyceny všechny fáze.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Během celé studie by se měla používat pokud možno jedna šarže zkoušené chemické látky a zkoušený vzorek by se měl uchovávat za takových podmínek, aby zůstal čistý, homogenní a stabilní. Před zahájením studie by se měla provést charakterizace zkoušené chemické látky, včetně určení její čistoty a je-li to technicky proveditelné, její identity a množství identifikovaných příměsí a nečistot. Prokázat to lze mimo jiné těmito údaji: retenční čas a relativní plocha píku, molekulová hmotnost z hmotnostní spektroskopie nebo plynové chromatografie nebo jiné odhady. Přestože určení identity zkoušeného vzorku není povinností laboratoře provádějící zkoušku, je vhodné alespoň do určité míry ověřit popis látky poskytnutý zadavatelem (např. barvu, fyzikální vlastnosti atp.).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Dle možností by se měla udržovat konstantní expoziční atmosféra. K prokázání stability podmínek expozice lze použít přístroj pro sledování v reálném čase, například fotometr pro aerosoly nebo analyzátor celkových uhlovodíků pro páry. Skutečné koncentrace v komoře by se měly měřit alespoň třikrát během každého dne expozice a pro každou úroveň expozice. Není-li to v důsledku omezené rychlosti proudění vzduchu nebo nízké koncentrace možné, je přípustné použít jeden vzorek pro každé období expozice. V ideálním případě by se měl tento vzorek odebírat po celou dobu expozice. Jednotlivé vzorky k stanovení koncentrace v komoře by se neměly lišit od průměrné hodnoty koncentrace v komoře o více než ± 10 % u plynů a par a o více než ± 20 % u kapalných nebo pevných aerosolů. Měla by se vypočítat a zaznamenat doba potřebná k dosažení rovnovážného stavu v komoře (t95). Doba expozice zahrnuje i dobu, během níž je zkoušená chemická látka generována. Bere se při tom v úvahu doba nutná k dosažení rovnovážného stavu v komoře (t95) a doba rozpadu. Pokyny k výpočtu t95 naleznete v dokumentu GD 39 (2).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              U vysoce komplexních směsí složených z plynů/par a aerosolů (např. atmosféry obsahující produkty spalování a zkoušené chemické látky vystřikované z účelových výrobků/zařízení pro koncové použití) se může každá fáze chovat v inhalační komoře jinak. Proto by se pro každou fázi (plyn/pára a aerosol) měla zvolit alespoň jedna indikační látka (analyt), obvykle hlavní účinná látka ve směsi. Je-li zkoušená chemická látka směsí, měla by se uvést analytická koncentrace celkové směsi, a nikoliv pouze účinné látky nebo indikační látky (analytu). Další informace týkající se skutečných koncentrací naleznete v dokumentu GD 39 (2).
                           
                        
                     Zkoušená chemická látka: Distribuce velikosti částic
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Distribuce velikosti částic aerosolů by se měla stanovit alespoň jednou týdně pro každou úroveň koncentrace pomocí kaskádového impaktoru nebo jiného přístroje, např. aerodynamického spektrometru částic (APS). Je-li možno prokázat shodu výsledků získaných pomocí kaskádového impaktoru a jiného přístroje, může se tento jiný přístroj používat v průběhu celé studie.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Kromě primárního přístroje by se měl použít ještě druhý přístroj, např. gravimetrický filtr nebo impinger/plynová promývačka, k ověření účinnosti záchytu primárním přístrojem. Hmotnostní koncentrace získaná analýzou velikosti částic by měla ležet v přiměřeném rozmezí hmotnostní koncentrace získané vážkovou analýzou [viz dokument GD 39 (2)]. Je-li možno v časné fázi studie prokázat u veškerých zkoušených koncentrací jejich rovnocennost, lze od dalších potvrzujících měření upustit. Z důvodu zajištění dobrých životních podmínek zvířat by se měly podniknout kroky k minimalizaci neprůkazných údajů, které mohou vést k nutnosti opakovat studii.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              U par by se mělo provést měření velikosti částic, pokud existuje možnost, že kondenzace páry povede ke vzniku aerosolu nebo pokud jsou v parách detekovány částice s potenciálem pro tvorbu smíšených fází.
                           
                        POZOROVÁNÍ
                  
                              31.
                           
                           
                              Zvířata by se měla klinicky sledovat před expozicí, během expozice i po expozici. Mohou být nutná častější pozorování v závislosti na reakci zvířat během expozice. Je-li pozorování zvířat znemožněno použitím zkumavek omezujících pohyb zvířat, špatným osvětlením v komorách pro celotělovou expozici nebo neprůhlednou atmosférou, měla by se zvířata pečlivě pozorovat po expozici. Pozorování před následujícím dnem expozice mohou vést k vyhodnocení případné reverzibility nebo exacerbace toxických účinků.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Všechna sledování se zaznamenávají, přičemž záznamy se vedou pro každé zvíře zvlášť. Pokud jsou zvířata z humánních důvodů utracena nebo je zjištěn jejich úhyn, je třeba dobu uhynutí zaznamenat co nejpřesněji.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Pozorování v kleci by se měla zaměřit na změny kůže, srsti, očí, sliznic, a rovněž na změny dýchání, krevního oběhu, změny funkce nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Je třeba pozorně sledovat, zde se neobjeví tremor, křeče, slinění, průjmy, letargie, spánek a kóma. Měření rektální teploty může poskytnout podpůrné důkazy pro reflexní bradypnoe nebo hypo/hypertermii spojenou s expozicí nebo držením v kleci. Do protokolu studie je možno zahrnout doplňující vyšetření, například kinetiku, biomonitoring, plicní funkce, zadržování špatně rozpustných materiálů, které se hromadí v plicní tkáni a změny v chování.
                           
                        TĚLESNÉ HMOTNOSTI
                  
                              34.
                           
                           
                              Tělesná hmotnost jednotlivých zvířat by se měla zaznamenat krátce před první expozicí (den 0), poté dvakrát týdně (například každý pátek a pondělí, aby se prokázalo zotavení po víkendu bez expozice, nebo v takovém časovém intervalu, který umožňuje posouzení systémové toxicity) a v čase uhynutí nebo utracení. Pokud se během prvních 2 týdnů neobjeví žádné účinky na tělesnou hmotnost, lze ji po zbytek studie měřit pouze jednou týdně. Zvířata v satelitní skupině (sledování reverzibility) (jsou-li použita) by se měla nadále vážit jednou týdně po celé období zotavování. Na konci studie by se měla všechna zvířata krátce před utracením zvážit, aby bylo možno provést nezkreslený výpočet podílů hmotnosti orgánů vůči tělesné hmotnosti.
                           
                        SPOTŘEBA KRMIVA A VODY
                  
                              35.
                           
                           
                              Spotřeba krmiva by se měla měřit jednou týdně. Rovněž by se měla měřit spotřeba vody.
                           
                        KLINICKÁ PATOLOGIE
                  
                              36.
                           
                           
                              Klinická patologická vyšetření by se měla provést u všech zvířat, včetně zvířat v kontrolní a satelitní (sledování reverzibility) skupině, když jsou utracena. Měl by se zaznamenat časový interval mezi koncem expozice a odběrem krve, zejména pokud je obnova příslušného cílového parametru rychlá. Odběr vzorků po ukončení expozice je indikován pro parametry s krátkým eliminačním poločasem v plazmě (např. COHb, CHE a MetHb).
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Tabulka 1 uvádí klinické patologické parametry, které jsou obvykle vyžadovány ve všech toxikologických studiích. Analýza moči se běžně nevyžaduje, může se však provést, pokud se to považuje za vhodné na základě očekávané nebo pozorované toxicity. Vedoucí studie se může rozhodnout vyšetřit další parametry k lepší charakterizaci toxicity zkoušené chemické látky (např. cholinesteráza, lipidy, hormony, acidobazická rovnováha, methemoglobin nebo Heinzova tělíska, kreatinkináza, poměr myeloidní/erythroidní buňky, troponiny, vyšetření krevních plynů, laktátdehydrogenáza, sorbitoldehydrogenáza, glutamátdehydrogenáza a gamaglutamyltranspeptidáza).
                              
                                 Tabulka 1
                              
                              
                                 Standardní klinické patologické parametry
                              
                              
                                          Hematologická vyšetření
                                       
                                    
                                          počet erytrocytů
                                          hematokrit
                                          koncentrace hemoglobinu
                                          průměrné množství hemoglobinu v erytrocytu
                                          střední objem erytrocytu
                                          průměrná koncentrace hemoglobinu v erytrocytu
                                          retikulocyty
                                       
                                       
                                          celkový počet leukocytů
                                          diferenciální rozpočet leukocytů
                                          počet trombocytů
                                          srážlivost (vyberte jednu z možností):
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      protrombinový čas
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      koagulační čas
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      parciální tromboplastinový čas
                                                   
                                                
                                    
                                          Klinická biochemická vyšetření
                                       
                                    
                                          glukóza (8)
                                          
                                          celkový cholesterol
                                          triglyceridy
                                          močovinový dusík v krvi
                                          celkový bilirubin
                                          kreatinin
                                          celkový obsah proteinů
                                          albuminy
                                          globuliny
                                       
                                       
                                          alaninaminotransferáza
                                          aspartátaminotransferáza
                                          alkalická fosfatáza
                                          draslík
                                          sodík
                                          vápník
                                          fosfor
                                          chloridy
                                       
                                    
                                          Rozbor moči (volitelný)
                                       
                                    
                                          vzhled (barva a zákal)
                                          objem
                                          relativní hustota nebo osmolalita
                                          pH
                                       
                                       
                                          celkový obsah proteinů
                                          glukóza
                                          krev/krvinky
                                       
                                    
                        
                              38.
                           
                           
                              Existují-li důkazy o tom, že hlavním místem depozice a retence jsou dolní cesty dýchací (tj. alveoly), jako technika pro kvantitativní analýzu hypotetických parametrů závislosti účinku na dávce zaměřená na alveolitidu, plicní zánět a fosfolipidózu, může být zvolena bronchoalveolární laváž (BAL). Umožňuje vhodně vyšetřit změny ve vztazích dávka–odezva a čas–průběh při poškození plicních sklípků. V tekutině z BAL lze stanovit diferenciální rozpočet leukocytů, celkový obsah proteinů a laktátdehydrogenázu. Další parametry, jejichž analýzu je možno zvážit, jsou ty, které svědčí o lysozomálním poškození, fosfolipidóze, fibróze, zánětu z podráždění nebo alergickém zánětu, což může zahrnovat stanovení prozánětlivých cytokinů/chemokinů. Měření v tekutině BAL obecně doplňují výsledky histopatologických vyšetření, avšak nemohou je nahradit. Pokyny, jak provádět laváž plic, jsou uvedeny v dokumentu GD 39 (2).
                           
                        PITVA A HMOTNOSTI ORGÁNŮ
                  
                              39.
                           
                           
                              Všechna pokusná zvířata, včetně těch, která v průběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena z důvodu ohleduplného zacházení se zvířaty, by se měla podrobit úplnému vykrvení (je-li proveditelné) a pitvě. Měla by se zaznamenat doba mezi koncem poslední expozice zvířete a jeho utracením. Není-li možno pitvu provést ihned po objevení uhynulého zvířete, mělo by se zvíře uchovávat v chladicím boxu (nikoli zmrazené) při teplotě dostatečně nízké k minimalizaci autolýzy. Pitvy by se měly provést co možná nejdříve, obvykle během jednoho nebo dvou dnů. U každého zvířete by se měly zaznamenat všechny makroskopické patologické nálezy, přičemž se věnuje zvláštní pozornost jakýmkoli nálezům v dýchacích cestách.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Tabulka 2 uvádí orgány a tkáně, které by se měly během pitvy konzervovat ve vhodném médiu pro histopatologické vyšetření. Uchovávání orgánů a tkání [uvedených v závorkách] a jakýchkoli dalších orgánů a tkání závisí na rozhodnutí vedoucího studie. Orgány uvedené tučným písmem by se měly co nejdříve po vyjmutí z těla zbavit přirostlých tkání a zvážit, než začnou vysychat. Štítná žláza a nadvarlata by se měly vážit pouze v případě potřeby, neboť artefakty z ořezávání přirostlých tkání mohou bránit histopatologickému vyšetření. Tkáně a orgány by se měly fixovat v 10 % pufrovaném formalínu nebo jiném vhodném fixativu ihned po provedení pitvy a ne později než 24–48 hodin před ořezáváním přirostlých tkání v závislosti na použitém fixativu.
                              
                                 Tabulka 2
                              
                              
                                 Orgány a tkáně, které se během pitvy konzervují
                              
                              
                                 Nadledvinky
                              
                              Kostní dřeň (a/nebo čerstvý aspirát)
                              
                                 Mozek (zahrnující řezy mozkových hemisfér, mozečku a prodloužené míchy/Varolova mostu)
                              [Oči (sítnice, oční nerv) a oční víčka]
                              
                                 Srdce
                              
                              
                                 Ledviny
                              
                              Hrtan (3 úrovně, 1 úroveň by měla zahrnovat bázi epiglottis)
                              
                                 Játra
                              
                              
                                 Plíce (všechny laloky v jedné úrovni včetně hlavních bronchů)
                              Lymfatické uzliny z oblasti plicního hilu, zejména v případě špatně rozpustných partikulárních zkoušených chemických látek. Pro podrobnější vyšetření a/nebo studie s imunologickým zaměřením lze uvažovat i o dalších lymfatických uzlinách, např. z oblasti mediastina, oblasti cervikální, submandibulární a aurikulární.
                              Nosohltanové tkáně (alespoň 4 úrovně, 1 úroveň by měla zahrnovat ductus nasopharyngeus a lymfatickou tkáň nosní sliznice (NALT))
                              Jícen
                              [Bulbus olfactorius]
                              Vaječníky
                              Semenné váčky
                              Mícha (krční, střední hrudní a bederní)
                              
                                 Slezina
                              
                              Žaludek
                              
                                 Varlata
                              
                              
                                 Brzlík
                              
                              Štítná žláza
                              Průdušnice (alespoň dvě úrovně zahrnující 1 podélný řez skrz carinu tracheae a 1 příčný řez)
                              [Močový měchýř]
                              Děloha
                              Všechny makroskopicky viditelné léze
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Plíce je třeba vyjmout bez poškození, zvážit a fixovat vhodným médiem při tlaku 20–30 cm vodního sloupce, aby se zachovala struktura plic (5). U všech laloků by se měly řezy odebrat na jedné úrovni, včetně hlavních bronchů, avšak provádí-li se plicní laváž, měly by se u nevyplachovaného laloku provést řezy na třech úrovních (nikoli sériové řezy).
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Měly by se vyšetřit alespoň 4 úrovně tkání nosohltanu, z nichž jedna by měla zahrnovat ductus nasopharyngeus (5, 6, 7, 8, 9), aby bylo možno dostatečně vyšetřit dlaždicový, přechodný (respirační bez řasinek), respirační (řasinkový respirační) a čichový epitel a svodnou lymfatickou tkáň (NALT; 10, 11). Měly by se vyšetřit tři úrovně hrtanu a jedna z těchto úrovní by měla zahrnovat bázi příklopky hrtanové (12). Měly by se vyšetřit alespoň dvě úrovně průdušnice, a to tak, že jeden podélný řez se povede skrz carina tracheae v místě bifurkace a jeden příčný řez.
                           
                        HISTOPATOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ
                  
                              43.
                           
                           
                              Mělo by se provést histopatologické vyšetření všech orgánů a tkání uvedených v tabulce 2 u kontrolní skupiny a skupiny vystavené vysoké koncentraci látky a u všech zvířat, která uhynou nebo jsou utracena během studie. Zvláštní pozornost je třeba věnovat dýchacím cestám, cílovým orgánům a makroskopicky viditelným lézím. Orgány a tkáně, u nichž se objeví léze u skupiny zvířat vystavené vysoké koncentraci látky, by se měly vyšetřit ve všech skupinách. Vedoucí studie se může rozhodnout provést histopatologická vyšetření v dalších skupinách, aby se prokázala jasná odezva na koncentraci. V případě použití satelitní skupiny (sledování reverzibility) by se mělo provést histopatologické vyšetření všech tkání a orgánů, na kterých byly pozorovány účinky u exponovaných skupin. Pokud ve skupině s expozicí vysoké koncentraci látky příliš brzy uhyne velký počet zvířat nebo vzniknou jiné problémy, které by mohly zpochybnit významnost údajů, měla by se histopatologicky vyšetřit nejbližší nižší koncentrace. Měl by se učinit pokus porovnat makroskopicky viditelné změny s mikroskopickými nálezy.
                           
                        ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ
                  
                     Údaje
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              U každého zvířete by se měly uvést údaje o tělesné hmotnosti, spotřebě krmiva, klinické patologické údaje, údaje z pitvy, hmotnosti orgánů a histopatologické nálezy. Údaje z klinického sledování by se měly shrnout do tabulky, přičemž se u každé zkušební skupiny uvede počet použitých zvířat, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, počet zvířat uhynulých v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních důvodů, čas uhynutí jednotlivých zvířat, popis, časový průběh a vratnost toxických účinků a pitevní nálezy. Všechny výsledky, kvantitativní a incidentální, by se měly vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Lze použít všeobecně uznávanou statistickou metodu. Statistické metody by se měly zvolit během vypracovávání návrhu studie.
                           
                        
                     Protokol o zkoušce
                  
                  
                              45.
                           
                           
                              Protokol o zkoušce by měl obsahovat následující informace:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Pokusná zvířata a podmínky chovu
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popis podmínek v klecích uvádějící počet (nebo změnu počtu) zvířat v každé kleci, materiál podestýlky, teplotu a relativní vlhkost prostředí, délku světelné fáze a druh krmiva,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použitý druh/kmen a odůvodnění, pokud se použil jiný druh než potkan. Je možné uvést údaje ze zdroje a historické údaje, pokud se týkají zvířat, která byla exponována za podobných podmínek expozice, chovu a lačnění,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet, stáří a pohlaví zvířat,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda randomizace,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popis jakékoliv přípravy před zkouškou včetně krmiva, karantény a léčby onemocnění.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkoušená chemická látka
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikální povaha, čistota a v případě potřeby fyzikálně-chemické vlastnosti (včetně izomerizace),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikační údaje a registrační číslo CAS (Chemical Abstract Services), je-li známo.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosič
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění použití nosiče a zdůvodnění výběru nosiče (pokud je jiný než voda),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      historické nebo současné údaje prokazující, že nosič neovlivňuje výsledek studie.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhalační komora
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popis inhalační komory včetně objemu a nákresu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj a popis zařízení použitého k expozici zvířat a rovněž pro generování atmosféry,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zařízení k měření teploty, vlhkosti, velikosti částic a skutečné koncentrace,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj vzduchu a použitý klimatizační systém,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metody použité ke kalibraci zařízení k zajištění homogenní zkušební atmosféry,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozdíl tlaků (kladný nebo záporný),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet expozičních otvorů v každé komoře (v případě nazální expozice), umístění zvířat v komoře (v případě celotělové expozice),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stabilita zkušební atmosféry,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      umístění čidel ke snímání teploty a vlhkosti a odběr vzorků zkušební atmosféry v komoře,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      úprava dodávaného/odsávaného vzduchu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      průtokové rychlosti vzduchu, průtoková rychlost vzduchu/expoziční otvor (nazální expozice) nebo množství zvířat/komora (celotělová expozice),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      doba nutná k dosažení rovnovážného stavu v inhalační komoře (t95),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet výměn objemu vzduchu za hodinu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      měřicí přístroje (používají-li se).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Údaje o expozici
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění volby cílové koncentrace v hlavní studii,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominální koncentrace (celková hmotnost zkoušené chemické látky generované do inhalační komory vydělená objemem vzduchu prošlým komorou),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skutečné koncentrace zkoušené chemické látky naměřené v dýchací zóně zvířat. U směsí, které vytvářejí heterogenní fyzikální formy (plyny, páry, aerosoly), je možné analyzovat každou zvlášť,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      veškeré koncentrace látky ve vzduchu by se měly uvádět raději v hmotnostních jednotkách (mg/l, mg/m3, atd.) než v objemových jednotkách (ppm, ppb atd.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      distribuce velikosti částic, hmotnostní medián aerodynamického průměru (MMAD) a geometrická směrodatná odchylka (σg), včetně metod jejich výpočtu. Měly by se uvést jednotlivé analýzy velikosti částic.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkušební podmínky
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné údaje o přípravě zkoušené chemické látky včetně postupů použitých ke snížení velikosti částic pevných látek nebo k přípravě roztoků zkoušené chemické látky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popis (pokud možno s nákresem) zařízení použitého ke generování zkušební atmosféry k expozici zvířat zkušební atmosféře,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné údaje o zařízení použitém k monitorování teploty a vlhkosti v komoře a proudění vzduchu komorou (tj. vývoj kalibrační křivky),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné údaje o zařízení použitém k odběru vzorků ke stanovení koncentrace látky v komoře a distribuce velikosti částic,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné údaje o použité chemické analytické metodě a validaci metody (včetně účinnosti výtěžnosti zkoušené chemické látky ze vzorkovaného média),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda randomizace použitá k rozdělení zvířat do zkoušených a kontrolních skupin,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobnosti o jakosti vody a krmiva (včetně druhu/zdroje krmiva, zdroje vody),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění výběru zkoušených koncentrací.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o teplotě, vlhkosti a průtoku vzduchu v komoře,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o nominální a skutečné koncentraci v komoře,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o velikosti částic včetně údajů o odběru analytických vzorků, distribuce velikosti částic a výpočtů MMAD a σg,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o odezvě a úrovni koncentrace u každého zvířete (tj. zvířata vykazující příznaky toxicity včetně mortality, charakter, závažnost, doba nástupu a trvání účinků),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o tělesné hmotnosti jednotlivých zvířat,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o spotřebě krmiva,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s klinickými patologickými údaji,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pitevní a histopatologické nálezy pro každé zvíře, pokud jsou k dispozici,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka se všemi dalšími měřenými parametry.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Diskuse a interpretace výsledků
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zvláštní důraz by se měl klást na popis metod použitých ke splnění kritérií této zkušební metody, např. mezní koncentrace nebo velikost částic,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      je třeba zabývat se vdechovatelností částic s ohledem na celkové nálezy, zejména pokud nebylo možné splnit kritéria pro velikost částic,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      v celkovém hodnocení studie by se měla uvést konzistentnost metod použitých ke stanovení nominálních a skutečných koncentrací a vztahu mezi aktuální a skutečnou koncentrací,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      měla by se uvést pravděpodobná příčina úhynu a převládající mechanismus účinku (systémový nebo lokální),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      mělo by se uvést vysvětlení, pokud bylo nutné humánně utratit zvířata trpící bolestí nebo vykazující známky intenzivního a přetrvávajícího utrpení, na základě kritérií uvedených v pokynech OECD o humánních parametrech (3),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      měl(y) by se určit cílový (cílové) orgán(y),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      měla by se stanovit hodnota NOAEL a LOAEL.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA:
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 412, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419-428.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 ze dne 16. prosince 2008 o klasifikaci, označování a balení látek a směsí, o změně a zrušení směrnic 67/548/EHS a 1999/45/ES a o změně nařízení (ES) č. 1907/2006, Úř. věst. L 353, 31.12.2008, s. 1.
                           
                        
                     Dodatek 1
                     DEFINICE
                     Zkoušená chemická látka: jakákoli látka nebo směs zkoušená pomocí této zkušební metody.
                  “
            
                  5)
               
               
                  Kapitoly B.29 a B.30 se nahrazují takto:
                  „B.29   SUBCHRONICKÁ INHALAČNÍ TOXICITA: 90DENNÍ STUDIE
                  
                  SHRNUTÍ
                  Tato revidovaná zkušební metoda B.29 byla navržena s cílem plně charakterizovat toxicitu zkoušené chemické látky podávané inhalační cestou při subchronické expozici (90 dnů) a získat průkazné údaje pro kvantitativní posouzení rizik inhalace. Skupiny 10 samců a 10 samic hlodavců se vystaví 6 hodin denně po dobu 90 dnů (13 týdnů) a) zkoušené chemické látce na třech nebo více úrovních koncentrace, b) filtrovanému vzduchu (negativní kontrola) a/nebo c) nosiči (kontrola s nosičem). Zvířata jsou obvykle exponována 5 dnů týdně, avšak expozice po 7 dnů v týdnu je rovněž povolena. Zkouška se vždy provádí se samci i samicemi, avšak mohou být vystaveni odlišným úrovním koncentrace, pokud je známo, že je jedno pohlaví citlivější vůči dané zkušební chemické látce. Tato metoda poskytuje vedoucímu studie možnost zařadit do zkoušky satelitní (reverzibilní) skupiny, předběžná utracení, bronchoalveolární laváž (BAL), neurologické testy a další klinická patologická a histopatologická vyšetření za účelem lepší charakterizace toxicity zkoušené chemické látky.
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda odpovídá Pokynům OECD pro zkoušení 413 (2009). Původní Pokyny pro zkoušení 413 (TG 413) subchronické inhalační toxicity byly schváleny v roce 1981 (1). Tato zkušební metoda B.29 (odpovídající revidovaným pokynům TG 413 (2009)) byla aktualizována tak, aby odrážela stav vědeckého poznání a naplňovala stávající a budoucí regulační potřeby.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Studie subchronické inhalační toxicity se používají především k odvození regulačních koncentrací pro posouzení rizika pro pracovníky v pracovním prostředí. Také se používají k posouzení rizika pro člověka v obytných prostorách, v dopravě a rizika pro životní prostředí. Tato metoda umožňuje charakterizaci nepříznivých účinků po opakované denní inhalační expozici zkoušené chemické látce po dobu 90 dnů (přibližně 10 % délky života potkana). Údaje získané ve studiích subchronické inhalační toxicity lze použít ke kvantitativnímu posouzení rizik a k výběru koncentrací pro chronické studie. Tato zkušební metoda není speciálně určena pro zkoušky nanomateriálů. Definice použité v kontextu této zkušební metody jsou uvedeny na konci této kapitoly a v Pokynech GD 39 (2).
                           
                        VÝCHOZÍ ÚVAHY
                  
                              3.
                           
                           
                              Před zahájením této studie by měla laboratoř provádějící zkoušky vzít v úvahu veškeré dostupné informace o zkoušené chemické látce, aby se zvýšila kvalita studie a minimalizovalo použití zvířat. Mezi informace, které usnadňují výběr vhodných zkušebních koncentrací, patří identita zkoušené chemické látky, její chemická struktura a fyzikálně-chemické vlastnosti, výsledky jakýchkoli testů toxicity in vitro nebo in vivo, předpokládaná použití a potenciální expozice člověka, dostupné údaje (Q)SAR a toxikologické údaje o strukturně příbuzných látkách a údaje získané při jiných zkouškách toxicity po opakované expozici. Očekává-li se nebo je-li v průběhu studie pozorována neurotoxicita, může se vedoucí studie rozhodnout zahrnout vhodná vyšetření, například funkční pozorovací baterii (functional observational battery, FOB) a měření motorické aktivity. Přestože načasování expozic s ohledem na konkrétní vyšetření může být velmi důležité, nemělo by provádění těchto doplňkových činností narušovat základní plán studie.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Roztoky žíravých nebo dráždivých zkoušených chemických látek lze testovat při koncentracích, které povedou k požadovanému stupni toxicity. Další informace naleznete v dokumentu GD 39 (2). Při vystavování zvířat těmto materiálům by však měly být cílové koncentrace dostatečně nízké, aby nezpůsobily výraznou bolest a utrpení, zároveň by však měly být dostačující k prodloužení křivky závislosti odezvy na koncentraci k hodnotám, které umožní splnit regulační a vědecký účel této zkoušky. Tyto koncentrace by se měly volit případ od případu, nejlépe na základě výsledků vhodně navržené studie ke stanovení dávkování, která poskytuje informace o kritickém cílovém parametru, prahu dráždivosti a době nástupu účinků (viz odstavce 11–13). Mělo by se uvést zdůvodnění výběru dané koncentrace.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Umírající zvířata nebo zvířata, která očividně trpí bolestí nebo vykazují známky závažného a přetrvávajícího stresu, by se měla humánním způsobem utratit. Umírající zvířata se posuzují stejným způsobem jako zvířata, která při zkoušce uhynou. Kritéria rozhodování o utracení umírajících nebo značně trpících zvířat a pokyny týkající se rozpoznání předvídatelného nebo blížícího se uhynutí jsou předmětem Pokynů OECD o humánních cílových parametrech (3).
                           
                        POPIS METODY
                  
                     Výběr zvířecích druhů
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Měli by se použít mladí zdraví dospělí hlodavci běžně používaných laboratorních kmenů. Nejvhodnějším druhem je potkan. Pokud se použijí jiné druhy, mělo by se uvést odůvodnění.
                           
                        
                     Příprava zvířat
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Samice musí být nullipary a nesmí být březí. V den randomizace by mělo jít o mladé dospělé jedince staré 7 až 9 týdnů. Tělesná hmotnost by se měla pohybovat v rozmezí ± 20 % průměrné hmotnosti u každého pohlaví. Zvířata se náhodně vyberou, označí pro potřeby individuální identifikace a umístí se do klecí nejméně 5 dnů před začátkem zkoušky, aby si mohla zvyknout na laboratorní podmínky.
                           
                        
                     Zvířecí chov
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Zvířata by měla být individuálně označena, nejlépe pomocí subkutánních transpondérů, aby se usnadnila pozorování a zamezilo záměně. Teplota zkušební místnosti, v níž se zvířata uchovávají, by měla být 22 ± 3 °C. Relativní vlhkost by se měla ideálně udržovat v rozmezí 30 až 70 %, ačkoliv to nemusí být proveditelné, používá-li se jako nosič voda. Před expozicí a po ní by se měla zvířata držet v klecích rozdělena do skupin podle pohlaví a koncentrace, avšak počet zvířat v jedné kleci by neměl bránit jasnému pozorování každého zvířete a měl by minimalizovat ztráty v důsledku kanibalismu nebo bojů. Jsou-li zvířata vystavena látce pouze nazální cestou, může být nutné nechat je zvyknout si na zkumavky omezující pohyb. Zkumavky by neměly zvířatům způsobovat přílišný fyzický, termální nebo imobilizační stres. Omezení může ovlivnit fyziologické cílové parametry, jako je tělesná teplota (hypertermie) a/nebo minutový dechový objem. Jsou-li k dispozici obecné údaje, které prokazují, že k takovým změnám nedochází ve značné míře, není předběžná adaptace na omezující trubičky nutná. Zvířata, jež jsou vystavena aerosolu celým tělem, by se měla držet během expozice odděleně, aby se zabránilo pronikání zkoušeného aerosolu z jejich těla do srsti ostatních zvířat v kleci. Mohou se používat konvenční a certifikovaná laboratorní krmiva, kromě období expozice, podávaná s neomezeným množstvím pitné vody z vodovodu. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy.
                           
                        
                     Inhalační komory
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Při výběru inhalační komory by se měla zvážit povaha zkoušené chemické látky a cíl zkoušky. Upřednostňuje se expozice pouze nazální cestou (přičemž tento termín zahrnuje i expozici hlavy, nosu nebo tlamy) Expozice pouze nazální cestou se obecně upřednostňuje u studií kapalných nebo pevných aerosolů a par, které mohou kondenzací vytvářet aerosoly. Speciálních cílů studie lze snáze dosáhnout, použije-li se celotělová expozice, avšak tato skutečnost by se měla zdůvodnit ve zprávě o studii. Pro zajištění stability atmosféry v komoře pro celotělovou expozici by neměl celkový objem zaplněný pokusnými zvířaty přesáhnout 5 % objemu komory. Principy techniky expozice pouze nazální cestou a celotělové expozice a jejich konkrétní výhody a nevýhody jsou popsány v dokumentu GD 39 (2).
                           
                        STUDIE TOXICITY
                  
                     Mezní koncentrace
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Na rozdíl od akutních studií nejsou ve studiích subchronické inhalační toxicity žádné definované mezní koncentrace. Maximální zkoušená koncentrace by měla zohledňovat: 1) maximální dosažitelnou koncentraci, 2) úroveň expozice člověka v „nejhorším případě“, 3) potřebu udržet dostatečný přívod kyslíku, a/nebo 4) dobré životní podmínky zvířat. Chybí-li mezní hodnoty založené na skutečných údajích, mohou se použít akutní limity z nařízení (ES) č. 1272/2008 (13) (tj. maximálně 5 mg/l pro aerosoly, 20 mg/l pro páry a 20 000 ppm pro plyny), viz GD 39 (2). Pokud je při zkouškách plynů nebo vysoce těkavých chemických látek (např. chladicí prostředky) potřeba tyto limity překročit, mělo by se uvést zdůvodnění. Z mezní koncentrace by mělo být možné odvodit jednoznačnou toxicitu bez toho, aby byly zvířata vystavena nadměrnému stresu nebo aby byla ovlivněna délka jejich života.
                           
                        
                     Studie ke stanovení rozsahu
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Před zahájením hlavní studie je obvykle nutno provést studii ke stanovení rozsahu. Studie ke stanovení rozsahu je komplexnější než orientační studie, protože není omezená na výběr koncentrace. Poznatky získané ve studii ke stanovení rozsahu mohou vést k úspěšné hlavní studii. Studie k stanovení rozsahu může například poskytnout technické informace týkající se analytických metod, stanovení velikosti částic, odhalení toxických mechanismů, klinické patologie a histopatologických údajů a odhady koncentrací NOAEL a MTC v hlavní studii. Vedoucí studie se může rozhodnout použít studii ke stanovení rozsahu pro určení prahové hodnoty pro podráždění dýchacích cest (např. pomocí histopatologického vyšetření dýchacích cest, zkoušení plicních funkcí nebo bronchoalveolární laváže), horní hranice koncentrace, kterou zvířata snášejí bez nadměrného stresu, a parametry, které budou nejlépe charakterizovat toxicitu zkoušené chemické látky.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Studie ke stanovení rozsahu se může skládat z jedné nebo více úrovní koncentrace. V závislosti na zvolených cílových parametrech by se mělo každé úrovni koncentrace vystavit tři až šest samců a tři až šest samic. Studie ke stanovení rozsahu by měla trvat minimálně 5 dní a obvykle ne déle než 28 dní. Ve zprávě o studii by se mělo uvést zdůvodnění výběru koncentrací pro hlavní studii. Cílem hlavní studie je ukázat vztah mezi koncentrací a odezvou založený na předpokládaném nejcitlivějším cílovém parametru. Nízká koncentrace by měla být v ideálním případě koncentrace, při níž nejsou pozorovány nepříznivé účinky, zatímco z vysoké by mělo být možné odvodit jednoznačnou toxicitu, aniž by se zvířatům způsobil nadměrný stres nebo se ovlivnila délka jejich života (3).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Při výběru úrovní koncentrace pro studii ke stanovení rozsahu by se měly zvážit veškeré dostupné informace, včetně vztahů mezi strukturou a aktivitou a údajů o podobných chemických látkách (viz odstavec 3). Studie ke stanovení rozsahu může potvrdit/vyvrátit cílové parametry, které se považují z mechanistického hlediska za nejvíce citlivé, např. inhibice cholinesterázy organickými fosfáty, tvorba methemoglobinu v důsledku erytrocytotoxických látek, hormony štítné žlázy (T3, T4) u tyreotoxických látek, bílkoviny, LDH nebo neutrofily v bronchoalveolární laváži u neškodných špatně rozpustných částic nebo aerosolů dráždících plíce.
                           
                        
                     Hlavní studie
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Hlavní studie subchronické toxicity se obvykle skládá ze tří úrovní koncentrace a rovněž zahrnuje souběžné negativní kontroly (se vzduchem) a/nebo dle potřeby kontroly s nosičem (viz odstavec 18). Při výběru vhodných úrovní expozice je třeba použít veškeré dostupné údaje, včetně výsledků studií systémové toxicity, metabolismu a kinetiky (zvláštní důraz by se měl klást na vyloučení vysokých úrovní koncentrace, které saturují kinetické procesy). Každá experimentální skupina obsahuje alespoň 10 samců a 10 samic hlodavců, kteří jsou vystaveni zkoušené chemické látce 6 hodin denně 5 dnů v týdnu po dobu 13 týdnů (celková doba trvání studie je alespoň 90 dní). Zvířata lze rovněž vystavit látce 7 dní v týdnu (např. při zkouškách inhalačních farmaceutik). Je-li známo, že je jedno pohlaví vůči dané zkoušené chemické látce citlivější, je možné vystavit jednotlivá pohlaví odlišným úrovním koncentrace, aby se optimalizoval vztah mezi koncentrací a odezvou, jak popisuje odstavec 15. Jsou-li k expozici pouze nazální cestou použity jiné druhy hlodavců než potkani, je možné upravit maximální doby expozice za účelem minimalizace druhově specifického utrpení. Použije-li se doba expozice kratší než 6 hodin/den, nebo pokud je nutné provést studii celotělové expozice s dlouhou dobou expozice (např. 22 hodin/den), mělo by se uvést zdůvodnění (viz GD 39) (2). Během expozice by se mělo pozastavit krmení zvířat, jestliže doba expozice nepřesahuje 6 hodin. Během celotělové expozice je možné zvířatům podávat vodu.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Zvolené cílové koncentrace by měly vést k identifikaci cílového orgánu (cílových orgánů) a ukázat jasný vztah mezi koncentrací a odezvou:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Vysoká úroveň koncentrace by měla mít toxické účinky, avšak neměla by způsobovat trvalé následky či letalitu, které by zabránily smysluplnému vyhodnocení.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Střední úrovně koncentrací mezi mezními hodnotami by měly odstupňovány, aby se toxické účinky zvyšovaly od nízké po vysokou koncentraci.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Nízká úroveň koncentrace by měla vyvolat malé nebo žádné příznaky toxicity.
                                       
                                    
                        
                     Předběžná utracení
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Je-li plánováno utracení některých zvířat před ukončením studie, měl by se počet zvířat na každé úrovni expozice zvýšit o počet zvířat určených k utracení před koncem studie. Předběžná utracení by se měla zdůvodnit a náležitě zohlednit ve statistických analýzách.
                           
                        
                     Satelitní studie (reverzibility)
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Satelitní studii (reverzibility) je možné použít k pozorování reverzibility, přetrvávání nebo opožděného nástupu toxicity během dostatečně dlouhého období po expozici, nejméně však po 14 dnů. Skupiny v satelitní studii (studii reverzibility) tvořené deseti samci a deseti samicemi se látce vystaví současně s pokusnými zvířaty v hlavní studii. Skupiny v satelitní studii (studii reverzibility) by se měly vystavit nejvyšší úrovni koncentrace zkoušené chemické látky a měly by se použít souběžné kontroly se vzduchem a/nebo s nosičem, dle potřeby (viz odstavec 18).
                           
                        
                     Kontrolní zvířata
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Se zvířaty v souběžné negativní kontrolní skupině (se vzduchem) by se mělo zacházet stejným způsobem jako se zvířaty v experimentální skupině, místo zkoušené chemické látce se však vystaví filtrovanému vzduchu. Pokud se ke generování zkušební atmosféry používá také voda nebo jiná látka, měla by se do studie místo negativní kontroly se vzduchem zařadit kontrolní skupina s nosičem. Kdykoli je to možné, měla by se jako nosič použít voda. Použije-li se jako nosič voda, měla by se kontrolní zvířata vystavit vzduchu o stejné relativní vlhkosti jako experimentální skupiny. Výběr vhodného nosiče by měl vycházet z vhodně provedené předběžné studie nebo dříve získaných údajů. Není-li toxicita nosiče dostatečně známá, může se vedoucí studie rozhodnout použít jak negativní kontrolu (se vzduchem), tak kontrolu s nosičem, ale takový postup se rozhodně nedoporučuje. Jestliže historické údaje ukážou, že nosič není toxický, není třeba používat negativní kontrolní skupinu (se vzduchem) a měla by se použít pouze kontrolní skupina s nosičem. Jestliže předběžná studie zkoušené chemické látky formulované na nosiči neodhalí žádnou toxicitu, vyplývá z toho, že nosič je při zkoušené koncentraci netoxický a měla by se použít tato kontrola s nosičem.
                           
                        PODMÍNKY EXPOZICE
                  
                     Podání koncentrací
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Zvířata jsou vystavena zkoušené chemické látce ve formě plynu, páry, aerosolu nebo jejich směsi. Skupenství látky, které se má zkoušet, závisí na fyzikálně-chemických vlastnostech zkoušené chemické látky, zvolených koncentracích a/nebo fyzické formě, v níž se bude zkoušená chemická látka s největší pravděpodobností nacházet při manipulaci a používání. Hygroskopické a chemicky reaktivní zkoušené chemické látky by se měly zkoušet v podmínkách suchého vzduchu. Je třeba pečlivě zabránit vzniku explozivních koncentrací. Partikulární materiály je možné podrobit mechanickým postupům ke snížení velikosti částic. Další pokyny jsou uvedeny v dokumentu GD 39 (2).
                           
                        
                     Distribuce velikosti částic
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              U všech aerosolů a par, které mohou kondenzací vytvořit aerosoly, by se mělo provést stanovení velikosti částic. Aby byla možná expozice všech důležitých částí dýchací soustavy, doporučují se aerosoly s hodnotami hmotnostního mediánu aerodynamického průměru (MMAD) v rozmezí 1 až 3 μm a s geometrickou směrodatnou odchylkou (σg) v rozmezí 1,5 až 3,0 (4). Přestože by se mělo vynaložit dostatečné úsilí k splnění této normy, není-li to možné, je třeba předložit odborný posudek. Například částice kovových výparů mohou být menší, než je tato norma, a nabité částice a vlákna ji mohou překračovat.
                           
                        
                     Příprava zkoušené chemické látky na nosiči
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              V ideálním případě by se měla zkoušená chemická látka testovat bez nosiče. Jestliže je nutné použít nosič k získání vhodné koncentrace a velikosti částic zkoušené chemické látky, měla by se přednostně použít voda. Kdykoli je zkoušená chemická látka v tomto nosiči rozpuštěna, měla by se prokázat její stabilita.
                           
                        MONITOROVÁNÍ PODMÍNEK EXPOZICE
                  
                     Proudění vzduchu komorou
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Proudění vzduchu expoziční komorou by se mělo při každé expozici pečlivě kontrolovat, neustále monitorovat a zaznamenávat nejméně v hodinových intervalech. Aktuální monitorování koncentrace látky ve zkušební atmosféře (nebo stability v čase) je nedílnou součástí měření všech dynamických parametrů a poskytuje nepřímý prostředek ke kontrole všech důležitých dynamických inhalačních parametrů. Monitoruje-li se koncentrace v reálném čase, je možné snížit frekvenci měření průtoku vzduchu komorou na jediné měření pro každou expozici za den. Zvláštní pozornost je třeba věnovat tomu, aby se zamezilo opětovnému vdechování látky v komorách s nazální cestou expozice. Koncentrace kyslíku by měla být alespoň 19 % a koncentrace oxidu uhličitého by neměla přesáhnout 1 %. Existuje-li důvod se domnívat, že tyto normy nelze splnit, měly by se koncentrace kyslíku a oxidu uhličitého měřit. Jestliže měření v první den expozice ukážou, že jsou úrovně těchto plynů správné, není třeba provádět další měření.
                           
                        
                     Teplota a relativní vlhkost v komoře
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Teplota v komoře by se měla udržovat na 22 ± 3 °C. Relativní vlhkost v dýchací zóně zvířat, jak při expozici pouze nazální cestou, tak při celotělové expozici, by se měla nepřetržitě sledovat a zaznamenávat pokud možno alespoň v hodinových intervalech během každé expozice. Relativní vlhkost by se měla udržovat nejlépe v rozmezí 30 až 70 %, to však může být neproveditelné (např. při zkoušení směsí na bázi vody) nebo neměřitelné v důsledku interference zkoušené chemické látky se zkušební metodou.
                           
                        
                     Zkoušená chemická látka: Nominální koncentrace
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Je-li to možné, měla by se vypočítat a zaznamenat nominální koncentrace zkoušené chemické látky v expoziční komoře. Nominální koncentrace je hmotnost generované zkoušené chemické látky vydělená celkovým objemem vzduchu, který prošel systémem inhalační komory. Nominální koncentrace se nepoužívá k charakterizaci expozice zvířat, ale porovnání nominální koncentrace a skutečné koncentrace je ukazatelem výkonnosti zkušebního systému při generování zkušební atmosféry, a tudíž ji lze použít ke zjištění problémů při generování.
                           
                        
                     Zkoušená chemická látka: Skutečná koncentrace
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Skutečná koncentrace je koncentrace zkoušené chemické látky ve vzorcích odebraných v dýchací zóně zvířat v inhalační komoře. Skutečné koncentrace lze změřit specifickými metodami (např. přímý odběr vzorků, adsorpční metody nebo metody založené na chemické reakci a následná analytická charakterizace) nebo nespecifickými metodami, jako je vážková analýza (gravimetrie). Použití gravimetrie je přípustné pouze u práškových aerosolů obsahujících jedinou složky nebo u aerosolů z kapalin s nízkou těkavostí a mělo by se podložit příslušnou specifickou charakterizací zkoušené chemické látky před provedením studie. Koncentraci práškového aerosolu sestávajícího z více složek lze rovněž stanovit gravimetricky. Vyžaduje to však analytické údaje, které prokazují, že složení materiálu ve vzduchu je podobné složení výchozího materiálu. Nejsou-li tyto informace k dispozici, může být nutné provádět během studie v pravidelných intervalech opakovanou analýzu zkoušené chemické látky (ideálně ve vzdušné formě). U látek v aerosolové formě, které se mohou vypařovat nebo sublimovat, by se mělo prokázat, že byly vybranou metodou zachyceny všechny fáze.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Během celé studie by se měla použít pokud možno jedna šarže zkoušené chemické látky a zkoušený vzorek by se měl uchovávat za takových podmínek, aby zůstal čistý, homogenní a stabilní. Před zahájením studie by se měla provést charakterizace zkoušené chemické látky, včetně určení její čistoty a, je-li to technicky proveditelné, identity a množství identifikovaných kontaminujících látek a nečistot. Je možné to prokázat mimo jiné těmito údaji: retenční čas a relativní plocha píku, molekulová hmotnost z hmotnostní spektroskopie nebo plynové chromatografie, nebo jiné odhady. Přestože určení identity zkoušeného vzorku není povinností laboratoře provádějící zkoušku, je vhodné alespoň do jisté míry ověřit popis látky poskytnutý zadavatelem (např. barvu, fyzikální vlastnosti atp.).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Podle možností je třeba udržovat expoziční atmosféru konstantní. K prokázání stability podmínek expozice lze použít přístroj pro sledování v reálném čase, například fotometr pro aerosoly nebo analyzátor celkových uhlovodíků pro páry. Skutečné koncentrace v komoře by se měly měřit alespoň třikrát během každého dne expozice a pro každou úroveň expozice. Není-li to v důsledku omezené rychlosti proudění vzduchu nebo nízké koncentrace možné, je přípustné použít jeden vzorek pro každé období expozice. V ideálním případě by se měl tento vzorek odebírat po celou dobu expozice. Jednotlivé vzorky k stanovení koncentrace v komoře by se neměly lišit od průměrné hodnoty koncentrace v komoře o více než ± 10 % u plynů a par a o více než ± 20 % u kapalných nebo pevných aerosolů. Měla by se vypočítat a zaznamenat doba potřebná k dosažení rovnovážného stavu v komoře (t95). Doba expozice zahrnuje i dobu, během níž je zkoušená chemická látka generována. Bere se při tom v úvahu doba nutná k dosažení rovnovážného stavu v komoře (t95) a doba rozpadu. Pokyny k výpočtu t95 naleznete v dokumentu GD 39 (2).
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              U vysoce komplexních směsí složených z plynů/par a aerosolů (např. atmosféry obsahující produkty spalování a zkoušené chemické látky vystřikované z účelových výrobků/zařízení pro koncové použití) se může každá fáze chovat v inhalační komoře jinak. Proto by se pro každou fázi (plyn/pára a aerosol) měla zvolit alespoň jedna indikační látka (analyt), obvykle hlavní účinná složka ve směsi. Je-li zkoušená chemická látka směsí, měla by se uvést analytická koncentrace celkové směsi, a nikoliv pouze účinné látky nebo indikační látky (analytu). Další informace týkající se skutečných koncentrací naleznete v dokumentu GD 39 (2).
                           
                        
                     Zkoušená chemická látka: Distribuce velikosti částic
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Distribuce velikosti částic aerosolů by se měla stanovit alespoň jednou týdně pro každou úroveň koncentrace pomocí kaskádového impaktoru nebo jiného přístroje, např. aerodynamického spektrometru částic (APS). Je-li možné prokázat shodu výsledků získaných pomocí kaskádového impaktoru a jiného přístroje, může se tento jiný přístroj používat v průběhu celé studie.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Kromě primárního přístroje by se měl použít ještě druhý přístroj, např. gravimetrický filtr nebo impinger / plynová promývačka, k ověření účinnosti záchytu primárním přístrojem. Hmotnostní koncentrace získaná analýzou velikosti částic by měla ležet v přiměřeném rozmezí hmotnostní koncentrace získané vážkovou analýzou [viz dokument GD 39 (2)]. Je-li možné v časné fázi studie prokázat u veškerých zkoušených koncentrací jejich rovnocennost, lze od dalších potvrzujících měření upustit. Z důvodu zajištění dobrých životních podmínek zvířat by se měly podniknout kroky k minimalizaci neprůkazných údajů, které mohou vést k nutnosti opakovat studii.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              U par by se mělo provést měření velikosti částic, pokud existuje možnost, že kondenzace páry povede ke vzniku aerosolu nebo pokud jsou v parách detekovány částice s potenciálem pro tvorbu smíšených fází.
                           
                        POZOROVÁNÍ
                  
                              32.
                           
                           
                              Zvířata by se měla klinicky sledovat před expozicí, během expozice i po expozici. Mohou být nutná častější pozorování v závislosti na reakci zvířat během expozice. Je-li pozorování zvířat znemožněno použitím zkumavek omezujících pohyb zvířat, špatným osvětlením v komorách pro celotělovou expozici nebo neprůhlednou atmosférou, měla by se zvířata pečlivě pozorovat po expozici. Pozorováním před expozicí následující den je možné zhodnotit případnou reverzibilitu nebo exacerbaci toxických účinků.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Všechna sledování se zaznamenávají, přičemž záznamy se vedou pro každé zvíře zvlášť. Pokud jsou zvířata z humánních důvodů utracena nebo je zjištěn jejich úhyn, je nutné dobu uhynutí zaznamenat co nejpřesněji.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Pozorování v kleci by měla zaznamenat změny kůže, srsti, očí, sliznic, a rovněž změny dýchání, krevního oběhu, změny funkce nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Je třeba pozorně sledovat, zde se neobjeví tremor, křeče, slinění, průjmy, letargie, spánek a kóma. Měření rektální teploty může poskytnout podpůrné důkazy pro reflexní bradypnoe nebo hypo/hypertermii spojenou s expozicí nebo držením v kleci. Do protokolu studie je možné zahrnout doplňující vyšetření, například kinetiku, biomonitoring, plicní funkce, zadržování špatně rozpustných materiálů, které se hromadí v plicní tkáni a změny v chování.
                           
                        TĚLESNÉ HMOTNOSTI
                  
                              35.
                           
                           
                              Tělesná hmotnost jednotlivých zvířat by se měla zaznamenat krátce před první expozicí (den 0), poté dvakrát týdně (například každý pátek a pondělí, aby se prokázalo zotavení po víkendu bez expozice, nebo v takovém časovém intervalu, který umožňuje posouzení systémové toxicity) a v čase uhynutí nebo utracení. Pokud se během prvních 4 týdnů neobjeví žádné účinky na tělesnou hmotnost, lze ji po zbytek studie měřit pouze jednou týdně. Zvířata v satelitní skupině (sledování reverzibility) (jsou-li použita) by se měla nadále vážit jednou týdně po celé období zotavování. Na konci studie by se měla všechna zvířata krátce před utracením zvážit, aby bylo možné provést nezkreslený výpočet podílů hmotnosti orgánů vůči tělesné hmotnosti.
                           
                        SPOTŘEBA KRMIVA A VODY
                  
                              36.
                           
                           
                              Spotřeba krmiva by se měla měřit jednou týdně. Rovněž by se měla měřit spotřeba vody.
                           
                        KLINICKÁ PATOLOGIE
                  
                              37.
                           
                           
                              Klinická patologická vyšetření by se měla provést u všech zvířat, včetně zvířat v kontrolní a satelitní (sledování reverzibility) skupině, když jsou utracena. Měl by se zaznamenat časový interval mezi koncem expozice a odběrem krve, zejména pokud je obnova příslušného cílového parametru rychlá. Odběr vzorků po ukončení expozice je indikován pro parametry s krátkým eliminačním poločasem v plazmě (např. COHb, CHE a MetHb).
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Tabulka 1 uvádí klinické patologické parametry, které jsou obvykle vyžadovány ve všech toxikologických studiích. Analýza moči se běžně nevyžaduje, může se však provést, pokud se to považuje za vhodné na základě očekávané nebo pozorované toxicity. Vedoucí studie se může rozhodnout vyšetřit další parametry k lepší charakterizaci toxicity zkoušené chemické látky (např. cholinesteráza, lipidy, hormony, acidobazická rovnováha, methemoglobin nebo Heinzova tělíska, kreatinkináza, poměr myeloidní/erythroidní buňky, troponiny, vyšetření krevních plynů, laktátdehydrogenáza, sorbitoldehydrogenáza, glutamátdehydrogenáza a gamaglutamyltranspeptidáza).
                              
                                 Tabulka 1
                              
                              
                                 Standardní klinické patologické parametry
                              
                              
                                          Hematologická vyšetření
                                       
                                    
                                          Počet erytrocytů
                                          Hematokrit
                                          Koncentrace hemoglobinu
                                          Průměrné množství hemoglobinu v erytrocytu (MHC)
                                          Střední objem erytrocytu (MCV)
                                          Průměrná koncentrace hemoglobinu v erytrocytu
                                          Retikulocyty
                                       
                                       
                                          Celkový počet leukocytů
                                          Diferenciální rozpočet leukocytů
                                          Počet trombocytů
                                          Srážlivost (vyber jednu z možností):
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      protrombinový čas
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      koagulační čas
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      parciální tromboplastinový čas
                                                   
                                                
                                    
                                          Klinická biochemická vyšetření
                                       
                                    
                                          Glukóza (9)
                                          
                                          Celkový cholesterol
                                          Triglyceridy
                                          Dusík močoviny v krvi
                                          Celkový bilirubin
                                          Kreatinin
                                          Celkový obsah proteinů
                                          Albuminy
                                          Globuliny
                                       
                                       
                                          Alaninaminotransferáza
                                          Aspartátaminotransferáza
                                          Alkalická fosfatáza
                                          Draslík
                                          Sodík
                                          Vápník
                                          Fosfor
                                          Chloridy
                                       
                                    
                                          Rozbor moči (volitelný)
                                       
                                    
                                          Vzhled (barva a zákal)
                                          Objem
                                          Relativní hustota nebo osmolalita
                                          pH
                                       
                                       
                                          Celkový obsah proteinů
                                          Glukóza
                                          Krev/krvinky
                                       
                                    
                        
                              39.
                           
                           
                              Existují-li důkazy o tom, že hlavním místem depozice a retence jsou dolní cesty dýchací (tj. alveoly), jako technika pro kvantitativní analýzu hypotetických parametrů závislosti účinku na dávce zaměřená na alveolitidu, plicní zánět a fosfolipidózu, může být zvolena bronchoalveolární laváž (BAL). Umožňuje to vhodně vyšetřit změny ve vztahu dávka–odezva a čas–průběh při poškození plicních sklípků. V tekutině z BAL lze stanovit diferenciální rozpočet leukocytů, celkový obsah proteinů a laktátdehydrogenázu. Další parametry, které je možno zvážit, jsou ty, které svědčí o lysozomálním poškození, fosfolipidóze, fibróze, zánětu z podráždění nebo alergickém zánětu, což může zahrnovat stanovení prozánětlivých cytokinů/chemokinů. Měření v tekutině BAL obecně doplňují výsledky histopatologických vyšetření, avšak nemohou je nahradit. Pokyny, jak provádět laváž plic je možné nalézt v dokumentu GD 39 (2).
                           
                        OFTALMOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ
                  
                              40.
                           
                           
                              Pomocí oftalmoskopu nebo obdobného přístroje by se mělo provést oftalmologické vyšetření fundu, lomivých prostředí oka, duhovky a spojivek u všech zvířat před podáním zkoušené chemické látky a u všech skupin s vysokou koncentrací látky a u kontrolních skupin také při ukončení studie. Zjistí-li se na očích změny, měla by se vyšetřit také všechna zvířata v ostatních skupinách, včetně satelitní skupiny (sledování reverzibility).
                           
                        PITVA A HMOTNOSTI ORGÁNŮ
                  
                              41.
                           
                           
                              Všechna pokusná zvířata, včetně těch, která v průběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena z důvodu ohleduplného zacházení se zvířaty, by se měla podrobit úplnému vykrvení (je-li proveditelné) a pitvě. Měl by se zaznamenat doba mezi koncem poslední expozice zvířete a jeho utracením. Není-li možné pitvu provést ihned po objevení uhynulého zvířete, mělo by se zvíře uchovávat v chladicím boxu (nikoli zmrazené) při teplotě dostatečně nízké k minimalizaci autolýzy. Pitva by se měla provést co možná nejdříve, obvykle během jednoho nebo dvou dnů. U každého zvířete by se měly zaznamenat všechny makroskopické patologické nálezy, přičemž se věnuje zvláštní pozornost jakýmkoli nálezům v dýchacích cestách.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Tabulka 2 uvádí orgány a tkáně, které by se měly během pitvy konzervovat ve vhodném médiu pro histopatologické vyšetření. Uchovávání orgánů a tkání uvedených [v závorkách] a jakýchkoli dalších orgánů a tkání závisí na rozhodnutí vedoucího studie. Orgány uvedené tučným písmem by se měly co nejdříve po vyjmutí z těla zbavit přirostlých tkání a zvážit, dříve než vyschnou. Štítná žláza a nadvarlata by se měly vážit pouze v případě potřeby, neboť artefakty z ořezávání přirostlých tkání mohou bránit histopatologickému vyšetření. Tkáně a orgány by se měly fixovat v 10 % pufrovaném formalínu nebo jiném vhodném fixativu ihned po provedení pitvy, a ne později než 24–48 hodin před ořezáváním přirostlých tkání v závislosti na použitém fixativu.
                              
                                 Tabulka 2
                              
                              
                                 Orgány a tkáně, které se během pitvy konzervují
                              
                              
                                 Nadledvinky
                              
                              Aorta
                              Kostní dřeň (a/nebo čerstvý aspirát)
                              
                                 Mozek (zahrnující řezy mozkových hemisfér, mozečku a prodloužené míchy/mostu)
                              Slepé střevo
                              Tlusté střevo
                              Dvanáctník
                              [Nadvarlata]
                              [Oči (sítnice, oční nerv) a oční víčka]
                              
                                 Femur a kolenní kloub
                              Žlučník (je-li přítomen)
                              [Harderova žláza]
                              
                                 Srdce
                              
                              
                                 Ileum
                              
                              
                                 Jejunum
                              
                              
                                 Ledviny
                              
                              [Slzné žlázy (extraorbitální)]
                              Hrtan (3 úrovně včetně báze epiglottis)
                              
                                 Játra
                              
                              
                                 Plíce (všechny laloky v jedné úrovni včetně hlavních bronchů)
                              Lymfatické uzliny z oblasti plicního hilu, zejména v případě špatně rozpustných partikulárních zkoušených chemických látek. Pro podrobnější vyšetření a/nebo studie s imunologickým zaměřením lze uvažovat i o dalších lymfatických uzlinách, např. z oblasti mediastina, oblasti cervikální, submandibulární a aurikulární.
                              Lymfatické uzliny (distálně od místa vstupu)
                              Prsní žlázy (samičí)
                              Sval (stehenní)
                              Nosohltanové tkáně (alespoň 4 úrovně, 1 úroveň by měla zahrnovat ductus naso-pharyngeus a lymfatickou tkáň nosní sliznice (NALT))
                              Jícen
                              [Bulbus olfactorius]
                              
                                 Vaječníky
                              
                              Slinivka břišní
                              Příštítná tělíska
                              Periferní nerv (nervus ischiadicus nebo nervus tibialis, nejlépe blízko svalu)
                              Hypofýza
                              Prostata
                              
                                 Rectum
                              
                              Slinné žlázy
                              Semenné váčky
                              Kůže
                              Mícha (krční, střední hrudní a bederní)
                              
                                 Slezina
                              
                              Sternum
                              Žaludek
                              Zuby
                              
                                 Varlata
                              
                              
                                 Brzlík
                              
                              
                                 Štítná žláza
                              
                              [Jazyk]
                              Průdušnice (alespoň 2 úrovně zahrnující 1 podélný řez skrz carinu tracheae a 1 příčný řez)
                              [Močovod]
                              [Močová trubice]
                              Močový měchýř
                              
                                 Děloha
                              
                              Cílové orgány
                              Veškeré makroskopicky viditelné léze a masy
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Plíce je třeba vyjmout bez poškození, zvážit a fixovat vhodným médiem při tlaku 20–30 cm vody, aby se zachovala struktura plic (5). U všech laloků by se měly odebrat řezy na jedné úrovni, včetně hlavních bronchů, avšak provádí-li se plicní laváž, měly by se u nevyplachovaného laloku provést řezy na třech úrovních (nikoli sériové řezy).
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Měly by se vyšetřit alespoň 4 úrovně tkání nosohltanu, z nichž jedna by měla zahrnovat ductus nasopharyngeus (5), (6), (7), (8), (9), aby bylo možné dostatečně vyšetřit epitel dlaždicový, přechodný (respirační bez řasinek), respirační (řasinkový respirační) a čichový a svodnou lymfatickou tkáň (NALT) (10), (11). Měly by se vyšetřit tři úrovně hrtanu a jedna z těchto úrovní by měla zahrnovat bázi epiglottis (12). Měly by se vyšetřit alespoň dvě úrovně průdušnice zahrnující jeden podélný řez skrz carinu tracheae v místě bifurkace a jeden příčný řez.
                           
                        HISTOPATOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ
                  
                              45.
                           
                           
                              Mělo by se provést histopatologické vyšetření všech orgánů a tkání uvedených v tabulce 2 u kontrolní skupiny a skupiny vystavené vysoké koncentraci látky a u všech zvířat, která uhynou nebo jsou utracena během studie. Zvláštní pozornost je třeba věnovat dýchacím cestám, cílovým orgánům a makroskopicky viditelným lézím. Orgány a tkáně, na nichž se objevily léze u skupiny zvířat vystavené vysoké koncentraci látky, by se měly vyšetřit ve všech skupinách. Vedoucí studie se může rozhodnout provést histopatologická vyšetření v dalších skupinách, aby se prokázala jasná odezva na koncentraci. V případě použití satelitní skupiny (sledování reverzibility) by se mělo provést histopatologické vyšetření všech tkání a orgánů, na kterých byly pozorovány účinky u exponovaných skupin. Pokud ve skupině s expozicí vysoké koncentraci látky příliš brzy uhyne velký počet zvířat nebo vzniknou jiné problémy, které by mohly zpochybnit významnost údajů, měla by se histopatologicky vyšetřit nejbližší nižší koncentrace. Měl by se učinit pokus porovnat makroskopicky viditelné změny s mikroskopickými nálezy.
                           
                        ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ
                  
                     Údaje
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              U každého zvířete by se měly uvést údaje o tělesné hmotnosti, spotřebě krmiva, klinické patologické údaje, údaje z pitvy, hmotnosti orgánů a histopatologické nálezy. Údaje z klinického sledování by se měly shrnout do tabulky, přičemž se u každé zkušební skupiny uvede počet použitých zvířat, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, počet zvířat uhynulých v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních důvodů, doba uhynutí jednotlivých zvířat, popis, časový průběh a vratnost toxických účinků a pitevní nálezy. Všechny výsledky, kvantitativní a incidentální, by se měly vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Lze použít všeobecně uznávanou statistickou metodu. Statistické metody by se měly zvolit během vypracovávání návrhu studie.
                           
                        
                     Protokol o zkoušce
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Protokol o zkoušce by měl obsahovat následující informace:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Pokusná zvířata a podmínky chovu
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popis podmínek v klecích uvádějící: počet (nebo změnu počtu) zvířat v každé kleci, materiál podestýlky, teplotu a relativní vlhkost prostředí, délku světelné fáze a druh stravy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použitý druh/kmen a odůvodnění, pokud se použije jiný druh než potkan. Je možné uvést údaje ze zdroje a historické údaje, pokud se týkají zvířat, která byla exponována za podobných podmínek expozice, chovu a lačnění,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet, stáří a pohlaví zvířat,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda randomizace,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popis jakékoliv přípravy před zkouškou včetně stravy, karantény a léčby onemocnění.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkoušená chemická látka
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikální povaha, čistota a v případě potřeby fyzikálně-chemické vlastnosti (včetně izomerizace),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikační údaje a registrační číslo CAS (Chemical Abstract Services), je-li známo.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosič
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění použití nosiče a zdůvodnění výběru nosiče (pokud je jiný než voda),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      historické nebo současné údaje prokazující, že nosič neovlivňuje výsledek studie.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhalační komora
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popis inhalační komory, včetně objemu a nákresu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj a popis zařízení použitého pro expozici zvířat a rovněž pro generování atmosféry,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zařízení k měření teploty, vlhkosti, velikosti částic a skutečné koncentrace,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj vzduchu a použitý klimatizační systém,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metody použité ke kalibraci zařízení k zajištění homogenní zkušební atmosféry,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozdíl tlaků (kladný nebo záporný),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet expozičních otvorů v každé komoře (v případě nazální expozice), umístění zvířat v komoře (v případě celotělová expozice),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stabilita zkušební atmosféry,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      umístění čidel ke snímání teploty a vlhkosti a odběr vzorků zkušební atmosféry v komoře,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      úprava dodávaného/odsávaného vzduchu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      průtokové rychlosti vzduchu, průtoková rychlost vzduchu na jeden expoziční otvor (v případě nazální expozice) nebo množství zvířat na jednu komoru (v případě celotělové expozice),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      doba nutná k dosažení rovnovážného stavu v inhalační komoře (t95),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet výměn objemu vzduchu za hodinu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      měřicí přístroje (používají-li se).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Údaje o expozici
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění volby cílové koncentrace v hlavní studii,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominální koncentrace (celková hmotnost zkoušené chemické látky generované do inhalační komory vydělená objemem vzduchu prošlým komorou),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skutečné koncentrace zkoušené chemické látky naměřené v dýchací zóně zvířat. U směsí, které vytvářejí heterogenní fyzikální formy (plyny, páry, aerosoly), je možné analyzovat každou zvlášť,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      veškeré koncentrace látky ve vzduchu by se měly uvádět raději v hmotnostních jednotkách (mg/l, mg/m3, atd.), než v objemových jednotkách (ppm, ppb atd.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      distribuce velikosti částic, hmotnostní medián aerodynamického průměru (MMAD) a geometrická směrodatná odchylka (σg), včetně metod jejich výpočtu. Měly by se uvést jednotlivé analýzy velikosti částic.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkušební podmínky
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné údaje o přípravě zkoušené chemické látky včetně postupů použitých k snížení velikosti částic pevných látek nebo k přípravě roztoků zkoušené chemické látky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popis (pokud možno s nákresem) zařízení použitého ke generování zkušební atmosféry k expozici zvířat zkušební atmosféře,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné údaje o zařízení použitém k monitorování teploty a vlhkosti v komoře a proudění vzduchu komorou (tj. vývoj kalibrační křivky),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné údaje o zařízení použitém k odběru vzorků k stanovení koncentrace látky v komoře a distribuce velikosti částic,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné údaje o použité chemické analytické metodě a validaci metody (včetně účinnosti výtěžnosti zkoušené chemické látky ze vzorkovaného média),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda randomizace použitá k rozdělení zvířat do zkoušených a kontrolních skupin,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobnosti o jakosti vody a krmiva (včetně druhu/zdroje stravy, zdroje vody),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění výběru zkoušených koncentrací.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o teplotě, vlhkosti a průtoku vzduchu v komoře,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o nominální a skutečné koncentraci v komoře,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o velikosti částic včetně údajů o odběru analytických vzorků, distribuce velikosti částic a výpočtů MMAD a σg,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o odezvě a úrovni koncentrace u každého zvířete (tj. zvířata vykazující příznaky toxicity včetně mortality, charakter, závažnost, doba nástupu a trvání účinků),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o tělesné hmotnosti jednotlivých zvířat,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o spotřebě krmiva,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s klinickými patologickými údaji,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pitevní a histopatologické nálezy pro každé zvíře, pokud jsou k dispozici.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Diskuse a interpretace výsledků
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zvláštní důraz by se měl klást na popis metod použitých ke splnění kritérií této zkušební metody, např. mezní koncentrace nebo velikost částic,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      je třeba zabývat se vdechovatelností částic s ohledem na celkové nálezy, zejména pokud nebylo možné splnit kritéria pro velikost částic,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      v celkovém hodnocení studie by se měla uvést konzistentnost metod použitých ke stanovení nominálních a skutečných koncentrací a vztah mezi aktuální a skutečnou koncentrací,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      měla by se uvést pravděpodobná příčina úhynu a převládající mechanismus účinku (systémový nebo lokální),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      mělo by se uvést vysvětlení, pokud bylo nutno humánně utratit zvířata trpící bolestí nebo vykazující známky intenzivního a přetrvávajícího utrpení, na základě kritérií uvedených v pokynech OECD o humánních parametrech (3),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      měl(y) by se určit cílový (cílové) orgán(y),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      měla by se stanovit hodnota NOAEL a LOAEL.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA:
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 413, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419-428.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 ze dne 16. prosince 2008 o klasifikaci, označování a balení látek a směsí, o změně a zrušení směrnic 67/548/EHS a 1999/45/ES a o změně nařízení (ES) č. 1907/2006, Úř. věst. L 353, 31.12.2008, s. 1.
                           
                        
                     Dodatek 1
                     DEFINICE
                     Zkoušená chemická látka: jakákoli látka nebo směs zkoušená pomocí této zkušební metody.
                  
                  B.30   STUDIE CHRONICKÉ TOXICITY
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda odpovídá Pokynům OECD pro zkoušení (TG) 452 (2009). Původní Pokyny pro zkoušení 452 byly schváleny v roce 1981. Revize zkušební metody B.30 byla považována za nezbytnou k zohlednění nejnovějšího vývoje v oblasti zajištění dobrých životních podmínek zvířat a regulačních požadavků (1) (2) (3) (4). Aktualizace této zkušební metody B.30 se prováděla paralelně s revizemi kapitoly B.32 této přílohy, Studie karcinogenity, a kapitoly B.33 této přílohy, Kombinovaná studie chronické toxicity/karcinogenity, aby se získaly další informace o zvířatech použitých ve studii a poskytnout další podrobnosti o výběru dávky. Tato zkušební metoda je určena ke zkouškám široké škály chemických látek, včetně pesticidů a průmyslových chemikálií.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Většina studií chronické toxicity se provádí na hlodavcích, a tato zkušební metoda je proto primárně určena k použití pro studie prováděné na nich. Je-li potřeba provést studie na nehlodavcích, lze rovněž použít principy a postupy uvedené v této zkušební metodě spolu s těmi, které jsou uvedeny v kapitole B.27 této přílohy, Studie orální toxicity na nehlodavcích – 90denní opakovaná aplikace (5), příslušně pozměněné, jak je uvedeno v pokynech OECD, Pokyny č. 116 o přípravě a provádění studií chronické toxicity a karcinogenity (6).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Třemi hlavními způsoby podávání používanými ve studiích chronické toxicity jsou orální podávání, dermální aplikace a inhalační podávání. Výběr cesty podání závisí na fyzikálních a chemických vlastnostech zkoušené chemické látky a na převládající cestě expozice u lidí. Další informace o výběru cesty expozice jsou uvedeny v pokynech OECD č. 116 (6).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda se zaměřuje na expozici orální cestou, což je cesta, která se ve studiích chronické toxicity používá nejběžněji. Přestože dlouhodobé studie chronické toxicity zahrnující expozici dermální nebo inhalační cestou mohou být k posouzení rizik pro lidské zdraví rovněž nezbytné a/nebo mohou být vyžadovány v rámci určitých regulačních režimů, jsou studie používající tyto cesty expozice značně technicky složité. Zde uvedená zkušební metoda posouzení a vyhodnocení chronické toxicity při orálním podávání může sloužit jako základ protokolu pro inhalační a/nebo dermální studie pokud jde o doporučení pro období expozice, klinické a patologické parametry atd., studie je však třeba navrhovat individuálně případ od případu. K dispozici jsou pokyny OECD týkající se podávání zkoušených chemických látek inhalační (6), (7) a dermální cestou (6). Při navrhování dlouhodobých studií zahrnujících expozici inhalační cestou by se měla konkrétně použít kapitola B.8 této přílohy (8) a kapitoly B.29 této přílohy (9) a rovněž pokyny OECD ke zkouškám akutní inhalační toxicity (7). V případě, že se zkoušky provádí dermální cestou, je třeba použít kapitolu B.9 této přílohy (10).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Studie chronické toxicity poskytuje informace o možných rizicích pro zdraví, která může opakovaná expozice po značnou část života použitých druhů představovat. Studie rovněž poskytne informace o toxických účincích zkoušené chemické látky, určí cílové orgány a možnost akumulace. Může také poskytnout odhad hodnoty dávky bez pozorovaných nepříznivých účinků, což lze použít při stanovení kritérií pro bezpečnou expozici člověka. Důraz se klade také na pečlivé klinické pozorování zvířat s cílem získat co nejvíce informací.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Cíle studií zahrnutých v této zkušební metodě jsou:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikace chronické toxicity zkoušené chemické látky,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikace cílových orgánů,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          charakterizace vztahu mezi dávkou a odezvou,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          určení hodnoty dávky bez pozorovaného nepříznivého účinku (NOAEL) nebo výchozího bodu pro stanovení referenční dávky (BMD),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          předpověď chronických toxických účinků na úrovních expozice člověka,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          získání údajů ke zkoušení hypotéz ohledně způsobu účinku (6).
                                       
                                    
                        VÝCHOZÍ ÚVAHY
                  
                              7.
                           
                           
                              Zkušební laboratoř by měla před provedením studie vzít v úvahu při posuzování a hodnocení toxikologických vlastností zkoušené chemické látky veškeré dostupné informace o zkoušené chemické látce, aby zaměřila uspořádání studie směrem k účinnějšímu zkoušení potenciálu chronické toxicity a minimalizovala použití zvířat. Mezi informace, které usnadní vytváření plánu studie, patří identita zkoušené chemické látky, její chemická struktura a fyzikálně-chemické vlastnosti, všechny informace o způsobu účinku, výsledky jakýchkoli testů toxicity in vitro nebo in vivo, předpokládaná použití a potenciální expozici u člověka, dostupné údaje (Q)SAR a toxikologické údaje o strukturně příbuzných chemických látkách, dostupné toxikokinetické údaje (kinetika při jednorázové dávce a rovněž při opakovaných dávkách, je-li k dispozici) a údaje získané v jiných studiích toxicity po opakované expozici. Stanovení chronické toxicity by se mělo provádět pouze poté, co byly získány úvodní informace o toxicitě z 28denních a/nebo 90denních zkoušek toxicity po opakované dávce. Jako součást celkového zhodnocení potenciálních nepříznivých účinků konkrétní zkoušené chemické látky na zdraví by se měl zvážit postup zkoušení prováděný po fázích při zkouškách chronické toxicity (11), (12), (13), (14).
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Nejvhodnější statistické metody pro analýzu výsledků s ohledem na uspořádání a cíle experimentu by se měly stanovit před zahájením studie. Je třeba zvážit, zda by měla statistika zahrnovat korekci vztahující se k přežití zvířat a analýzu v případě předčasného ukončení zkoušky u jedné nebo více skupin. Pokyny ohledně vhodných statistických analýz a klíčové odkazy na mezinárodně uznávané statistické metody jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (6) a rovněž v Pokynech č. 35 o analýze a hodnocení studií chronické toxicity a karcinogenity (15).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Při provádění studie chronické toxicity je nutné řídit se vždy vůdčími principy a úvahami uvedenými v Pokynech OECD č. 19 o rozpoznání, vyšetření a použití klinických příznaků jako lidských cílových parametrů u pokusných zvířat používaných při hodnocení bezpečnosti (16), zejména v odstavci 62 těchto pokynů. Tento odstavec uvádí, že „Ve studiích zahrnujících opakované podávání dávky by se mělo v případě, kdy zvíře vykazuje klinické příznaky, které jsou progresivní a vedou k dalšímu zhoršení jeho stavu, učinit informované rozhodnutí, zda zvíře humánně utratit, či ne. Toto rozhodnutí by mělo obsahovat posouzení hodnoty informací, které se získají, bude-li se zvíře i nadále udržovat ve studii, oproti jeho celkovému stavu. Dospěje-li se k rozhodnutí pokračovat ve zkoušce na zvířeti, měla by se dle potřeby zvýšit četnost pozorování. Rovněž je možné, aniž by to nepříznivě ovlivnilo účel zkoušky, dočasně pozastavit podávání dávky, jestliže to zmírní bolest či utrpení, nebo snížit zkoušenou dávku.“
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Podrobné pokyny a diskuse o principech výběru dávky pro studie chronické toxicity a karcinogenity uvádí Pokyny č. 116 (6) a rovněž dvě publikace ústavu International Life Sciences Institute (17), (18). Hlavní strategie výběru dávky závisí na primárním cíli nebo cílech studie (odstavec 6). Při výběru vhodných úrovní dávky by se mělo dosáhnout rovnováhy mezi screeningem nebezpečnosti na jedné straně a charakterizací odezev na nízkou dávku a jejich významu na straně druhé. To je důležité zejména v situaci, kdy je nutno provést kombinovanou studii chronické toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 této přílohy) (odstavec 11).
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Mělo by se uvážit, zda neprovést raději kombinovanou studii chronické toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 této přílohy) nežli jen dvě samostatné studie – chronické toxicity (tato zkušební metoda B.30) a karcinogenity (kapitola B.32 této přílohy). Kombinovaná zkouška zajišťuje větší efektivitu ve smyslu času a nákladů v porovnání s prováděním dvou samostatných studií, a zároveň nezhoršuje kvalitu údajů ani ve fázi zkoušení chronické toxicity, ani ve fázi zkoušení karcinogenity. Při provádění kombinované studie chronické toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 této přílohy) však je třeba pečlivě zvážit zásady výběru dávky (odstavce 9 a 20–25) a rovněž se uznává, že v určitých regulačních rámcích mohou být vyžadovány samostatné studie.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Definice použité v kontextu této zkušební metody naleznete na konci této kapitoly a v Pokynech č. 116 (6).
                           
                        PODSTATA ZKOUŠKY
                  
                              13.
                           
                           
                              Zkoušená chemická látka se podává denně v postupně rostoucích dávkách několika skupinám pokusných zvířat po dobu 12 měsíců, avšak je možné zvolit i delší nebo kratší dobu expozice v závislosti na regulačních požadavcích (viz odstavec 33). Tato doba trvání by se měla zvolit dostatečně dlouhá na to, aby umožnila manifestaci jakýchkoli účinků kumulativní toxicity, bez zkreslujících příznaků geriatrických změn. Odchylky od doby expozice 12 měsíců by měly být odůvodněny, zejména v případě kratších expozic. Zkoušená chemická látka se obvykle podává orální cestou, avšak zkoušky prováděné inhalační nebo dermální cestou mohou být také vhodné. Plán studie může rovněž zahrnovat jedno nebo více předběžných utracení, např. za 3 a 6 měsíců, a je možné přidat další skupiny zvířat, aby se tato skutečnost kompenzovala (viz odstavec 19). V průběhu období podávání se zvířata každý den pečlivě pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která v průběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena, se pitvají a na konci zkoušky se přeživší zvířata utratí a rovněž pitvají.
                           
                        POPIS METODY
                  
                     Výběr zvířecích druhů
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda primárně zahrnuje posouzení a vyhodnocení chronické toxicity u hlodavců (viz odstavec 2), avšak uznává se, že v určitých regulačních rámcích mohou být vyžadovány podobné studie u nehlodavců. Výběr druhu by měl být zdůvodněn. Plán a provedení studií chronické toxicity u nehlodavců, jsou-li požadovány, by měl vycházet z principů uvedených v této zkušební metodě spolu s principy v kapitole B.27 této přílohy, 90denní studie orální toxicity po opakované aplikaci na nehlodavcích (5). Další informace o výběru druhu a kmene jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (6).
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              V této zkušební metodě se dává přednost potkanům, ale lze použít i jiný druh hlodavců, např. myš. Krysy a myši jsou upřednostňovanými experimentálními modelovými organismy díky své relativně krátké době života, široce rozšířenému použití ve farmakologických a toxikologických studiích, citlivosti k indukci nádoru a dostupnosti dostatečně charakterizovaných kmenů. V důsledku těchto vlastností je k dispozici velké množství informací o jejich fyziologii a patologii. Měla by se použít mladá zdravá dospělá zvířata běžně používaných laboratorních kmenů. Studie chronické toxicity by se měla provádět na zvířatech ze stejného kmene a zdroje, jako byla zvířata použitá v předběžných studiích toxicity s kratší dobou trvání. Samice musí být nullipary a nesmějí být březí.
                           
                        
                     Podmínky chovu a krmení
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Zvířata lze chovat jednotlivě nebo v klecích po malých skupinkách jedinců stejného pohlaví. Individuální chov by se měl použít pouze tehdy, je-li to vědecky odůvodněné (19), (20), (21). Klece by měly být uspořádány tak, aby byl případný vliv jejich polohy minimalizován. Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla být 22 °C (± 3 °C). Relativní vlhkost vzduchu by měla být minimálně 30 % a pokud možno nepřesáhnout 70 % kromě doby úklidu místnosti. Cílem by měla být hodnota 50–60 %. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní krmivo s neomezenou dodávkou pitné vody. Strava by měla splňovat všechny nutriční požadavky zkoušených druhů a obsah příměsí ve stravě zahrnující mimo jiné zbytky pesticidů, perzistentní organopolutanty, fytoestrogeny, těžké kovy a mykotoxiny, které mohou ovlivnit výsledek zkoušky, by měl být co možná nejnižší. Pravidelně by se měly získávat analytické informace o nutričních hodnotách stravy a množství příměsí ve stravě, alespoň na začátku studie a pokaždé, když se změní používaná šarže, a měly by se začlenit do závěrečné zprávy. Obdobně by se měla poskytnout analýza pitné vody. Výběr stravy může být ovlivněn nutností zajistit vhodnou přísadu zkoušené chemické látky, podává-li se látka v krmivu, a splnit nutriční potřeby zvířat.
                           
                        
                     Příprava zvířat
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Použijí se zdravá zvířata, která se alespoň 7 dnů aklimatizovala na laboratorní podmínky a která nebyla dříve podrobena žádným experimentálním postupům. V případě hlodavců by se mělo podávání látky zahájit co možná nejdříve po jejich odstavení a aklimatizaci, nejlépe před dosažením stáří 8 týdnů. Pokusná zvířata by měla být charakterizována podle druhu, kmenu, původu, pohlaví, hmotnosti a stáří. Na začátku studie by měly být odchylky hmotnosti zvířat u každého pohlaví minimální a neměly by překročit ± 20 % průměrné hmotnosti pro všechna zvířata ve studii, pro každé pohlaví zvlášť. Zvířata by měla být rozdělena náhodným výběrem do kontrolních a experimentálních skupin. Po randomizaci by neměly být výrazné rozdíly v průměrných hodnotách tělesné hmotnosti mezi skupinami v rámci každého pohlaví. Existují-li statisticky významné rozdíly, měla by se randomizace pokud možno zopakovat. Každému zvířeti by se mělo přidělit jedinečné identifikační číslo a mělo by se tímto číslem trvale označit pomocí tetování, implantací mikročipu nebo jinou vhodnou metodou.
                           
                        POSTUP
                  
                     Počet a pohlaví zvířat
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Měla by se použít obě pohlaví. Mělo by se použít dostatečné množství zvířat, aby bylo na konci studie v každé skupině dost zvířat pro podrobné biologické a statistické vyhodnocení. U hlodavců by se mělo obvykle použít alespoň 20 zvířat od každého pohlaví pro každou skupinu při každé úrovni dávky, oproti tomu u nehlodavců se doporučuje použít minimálně 4 jedince od každého pohlaví pro každou skupinu. Ve studiích používajících myši může být nutné přidat další zvířata do každé skupiny s příslušnou dávkou, aby se mohla provést všechna požadovaná hematologická vyšetření.
                           
                        
                     Zajištění předběžných utracení, satelitních skupin a ověřovacích zvířat
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Studie může zajistit zvířata pro předběžná utracení (alespoň 10 zvířat/pohlaví/skupinu) např. v 6. měsíci, aby se získaly informace o progresi toxikologických změn a mechanistické informace, je-li to vědecky odůvodněné. Jsou-li tyto informace již k dispozici z předchozích studií toxicity zkoušené chemické látky po opakovaných dávkách, nemusí být předběžná utracení vědecky odůvodněná. Rovněž je možné zařadit do studie satelitní skupiny k monitorování reverzibility toxikologických změn vyvolaných zkoumanou chemickou látkou; ty budou obvykle omezeny na nejvyšší úroveň dávky ve studii plus kontrolu. Také je možné zařadit do studie další skupinu ověřovacích zvířat (obvykle 5 zvířat od každého pohlaví) k monitorování stavu onemocnění v průběhu studie, je-li to nutné (22). Pokud se plánují předběžná utracení zvířat nebo začlenění satelitní nebo ověřovací skupiny, je nutno zvýšit počet zvířat zařazených do studie o počet zvířat, která budou utracena před ukončením studie. U těchto zvířat by se měly obvykle sledovat stejné parametry, zahrnující tělesnou hmotnost, spotřebu krmiva/vody, hematologická a klinická biochemická měření a patologická vyšetření, jako u zvířat ve fázi chronické toxicity v hlavní studii, avšak měření se také mohou omezit (ve skupinách určených k předběžnému utracení) na konkrétní klíčové parametry, jako je neurotoxicita a imunotoxicita.
                           
                        
                     Dávkové skupiny a dávkování
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Pokyny ohledně veškerých aspektů výběru dávky a odstupňování úrovní dávek jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (6). S výjimkou případů, kdy se provede limitní zkouška (viz odstavec 27), by se měly použít nejméně tři úrovně dávek a souběžná kontrola. Úrovně dávek budou obecně vycházet z výsledků krátkodobých studií při opakované aplikaci nebo ze studií k stanovení rozsahu dávkování a měly by zohlednit jakékoli existující toxikologické a toxikokinetické údaje dostupné pro zkoušenou sloučeninu nebo příbuzné materiály.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Nebrání-li tomu fyzikálně-chemická povaha nebo biologické účinky zkoušené chemické látky, měla by se obvykle zvolit nejvyšší úroveň dávky za účelem identifikace hlavních cílových orgánů a toxických účinků, která by však zároveň neměla vést k utrpení, závažné toxicitě, morbiditě nebo uhynutí. Za současného zohlednění faktorů uvedených v odstavci 22 níže by se měla vybrat taková nejvyšší dávka, aby vyvolala příznaky toxicity, např. pokles přírůstku tělesné hmotnosti (přibližně 10 %).
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Nicméně v závislosti na cílech studie (viz odstavec 6) je možné zvolit nejvyšší dávku nižší, než je dávka prokazující toxicitu, např. jestliže dávka vyvolává nepříznivý účinek, který však má jen malý dopad na délku života nebo tělesnou hmotnost. Nejvyšší dávka by neměla přesáhnout 1 000 mg/kg tělesné hmotnosti/den (mezní dávka, viz odstavec 27).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Je možné zvolit úrovně dávek a jejich odstupňování ke stanovení vztahu mezi dávkou a odezvou a NOAEL nebo jiných plánovaných výsledků studie, např. BMD (viz odstavec 25) na nejnižší úrovni dávky. Faktory, které by se měly zvážit při určování nižších dávek, zahrnují předpokládanou směrnici křivky závislosti odezvy na dávce, dávky, při kterých mohou nastat důležité změny v metabolismu nebo způsobu toxického účinku, kde se předpokládá prahová hodnota nebo kde se předpokládá výchozí bod pro extrapolaci do oblasti nízkých dávek.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Odstupňování úrovní dávek bude záviset na vlastnostech zkoušené chemické látky a není možné je v této zkušební metodě předepsat, avšak dvou až čtyřnásobné intervaly obvykle vedou k dobré funkčnosti zkoušky, použijí-li se k nastavení sestupných úrovní dávek a často se upřednostňuje zařazení čtvrté zkušební skupiny před použitím velmi dlouhých intervalů (např. více než faktor přibližně 6–10) mezi dávkami. Obecně je třeba vyhnout se použití faktorů větších než 10 a jejich případné použití by se mělo zdůvodnit.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Jak je dále uvedeno v Pokynech č. 116 (6), je třeba při výběru dávky zvážit tyto body:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          známá nebo předpokládaná nelinearita či inflexní body na křivce závislosti odezvy na dávce,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toxikokinetika a rozsahy dávkování, při kterých dochází nebo nedochází k metabolické indukci, saturaci nebo nelinearitě mezi vnějšími a vnitřními dávkami,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          prekurzorové léze, známky účinku nebo indikátory probíhajících klíčových základních biologických procesů,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          klíčové (nebo předpokládané) aspekty způsobu účinku, například dávky, při kterých začíná vzrůstat cytotoxicita, narušují se hladiny hormonů, homeostatické mechanismy jsou ochromeny atd.,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          oblasti křivky závislosti odezvy na dávce, kde je nutný obzvlášť robustní odhad, např. v rozsahu předpokládané BMD nebo prahové hodnoty,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          zvážení předpokládaných úrovní expozice člověka.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              Kontrolní skupina je neexponovaná skupina nebo kontrolní skupina s nosičem, pokud se nosič při podávání zkoušené chemické látky používá. S výjimkou aplikace zkoušené chemické látky je třeba se zvířaty v kontrolní skupině zacházet stejným způsobem jako se zvířaty v experimentálních skupinách. Používá-li se nosič, podá se kontrolní skupině v nejvyšším používaném objemu v rámci skupin. Jestliže se zkoušená chemická látka podává v krmivu a způsobuje podstatné snížení příjmu potravy v důsledku snížené chutnosti krmiva, může být užitečné použít další kontrolní skupinu krmenou tak, aby měla stejně snížený příjem potravy a posloužila jako vhodnější kontrola.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Pokud je možné na základě informací z předběžných studií předpokládat, že zkouška provedená podle postupů popsaných pro tuto studii při jedné úrovni dávky nejméně 1 000 mg na kg tělesné hmotnosti na den pravděpodobně nevyvolá nepříznivé účinky a pokud se na základě údajů o strukturně příbuzných chemických látkách nepředpokládá toxicita, nemusí být úplná studie s použitím tří úrovní dávek nutná. Mezní dávka 1 000 mg/kg tělesné hmotnosti/den se může použít s výjimkou případu, kdy údaje o expozici člověka naznačují, že je nezbytné použití vyšší úrovně dávek.
                           
                        
                     Příprava dávek a podávání zkoušené chemické látky
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Zkoušená chemická látka se obvykle podává orálně, v krmivu či v pitné vodě nebo žaludeční sondou. Další informace o cestách a způsobech podání jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (6). Cesta a způsob podání závisí na účelu studie, fyzikálně-chemických vlastnostech zkoušené chemické látky, její biologické dostupnosti a převládající cestě a způsobu expozice člověka. Mělo by se uvést zdůvodnění zvolené cesty a způsobu podání. V zájmu zajištění dobrých životních podmínek zvířat by se mělo podávání žaludeční sondou zvolit pouze u těch látek, u nichž tato cesta a způsob podání náležitě reprezentují potenciální expozici člověka (např. farmaceutika). Chemické látky, které se nacházejí v potravě nebo životním prostředí, včetně pesticidů, se obvykle podávají v krmivu nebo pitné vodě. Nicméně u některých scénářů expozice, např. expozice na pracovišti, mohou být vhodnější jiné cesty podání.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Zkoušená chemická látka se v případě potřeby rozpustí nebo suspenduje ve vhodném nosiči. Je třeba podle potřeby zvážit následující vlastnosti nosiče nebo jiných přídatných látek: účinky na absorpci, distribuci, metabolismus nebo retenci zkoušené chemické látky, účinky na chemické vlastnosti zkoušené chemické látky, které mohou změnit její toxické vlastnosti a účinky na konzumaci krmiva nebo vody či na nutriční stav zvířat. Je-li to možné, doporučuje se zvážit nejprve použití vodného roztoku/suspenze, poté použití roztoku/emulze v oleji (např. v kukuřičném oleji) a nakonec roztoku v jiných nosičích. U nosičů jiných než voda je nutné znát jejich toxické vlastnosti. Měly by být k dispozici informace o stabilitě zkoušené chemické látky a homogenitě podávaných roztoků nebo krmiva (dle potřeby) za podmínek podávání (např. v krmivu).
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              U látek podávaných v krmivu nebo v pitné vodě je důležité zajistit, aby množství použité zkoušené chemické látky neovlivňovalo normální výživu nebo vodní rovnováhu. V dlouhodobých studiích toxicity s podáváním látky v krmivu by koncentrace zkoušené chemické látky v krmivu obvykle neměla přesáhnout horní mez 5 % celkového množství krmiva, aby se zabránilo nutriční nerovnováze. Podává-li se zkoušená chemická látka v krmivu, může se použít buď konstantní koncentrace v krmivu (mg/kg krmiva nebo ppm), nebo konstantní dávkování vzhledem k tělesné hmotnosti zvířete (mg/kg tělesné hmotnosti) vypočítané jednou týdně. Použitá možnost by se měla specifikovat.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              V případě orálního podávání se zvířatům podává zkoušená chemická látka denně (sedm dnů v každém týdnu), obvykle po dobu 12 měsíců (viz také odstavec 33), avšak může být nutná i delší doba v závislosti na regulačních požadavcích. Jakýkoli jiný režim podávání, např. pět dní v týdnu, musí být zdůvodněn. V případě dermální aplikace se zvířata vystavují zkoušené chemické látce alespoň po dobu 6 hodin denně, 7 dnů v týdnu, jak je specifikováno v kapitole B.9 této přílohy (10) po dobu 12 měsíců. Expozice inhalační cestou se provádí 6 hodin denně, 7 dnů v týdnu, avšak je možné použít i expozici 5 dnů v týdnu, je-li zdůvodněna. Období expozice obvykle trvá 12 měsíců. Jsou-li k expozici pouze nazální cestou použity jiné druhy hlodavců než potkani, je možné upravit maximální doby expozice za účelem minimalizace druhově specifického utrpení. Používá-li se expozice kratší než 6 hodin denně, je třeba uvést zdůvodnění. Viz také kapitola B.8 této přílohy (8).
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Pokud se zkoušená chemická látka podává zvířatům nitrožaludečně, mělo by se to provádět žaludeční sondou nebo vhodnou intubační kanylou, vždy v přibližně stejnou denní dobu. Obvykle se podává jedna dávka jednou denně. Pokud je např. chemická látka lokálně dráždící, je možné denní dávku podávat rozdělenou na dvě dávky (dvakrát denně). Maximální objem kapaliny, kterou lze jednorázově podat, závisí na velikosti pokusného zvířete. Objem by se měl udržovat co možná nejnižší a u hlodavců by obvykle neměl přesáhnout 1 ml/100 g tělesné hmotnosti (22). Kolísání objemu zkoušené chemické látky by se mělo omezit nastavením koncentrace tak, aby se zajistil konstantní objem na všech úrovních dávek. Potenciálně žíravé nebo dráždivé chemické látky jsou výjimkou a je nutné je naředit, aby se zamezilo závažným lokálním účinkům. Zkoušky při koncentracích, které by pravděpodobně vedly k poleptání nebo podráždění gastrointestinálního traktu, by se neměly provádět.
                           
                        
                     Délka studie
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              Přestože je tato zkušební metoda primárně navržena jako 12měsíční studie chronické toxicity, uspořádání studie dovoluje i jiné intervaly, a lze je tedy použít rovněž u kratších (např. 6 nebo 9 měsíců) nebo delších (např. 18 nebo 24 měsíců) studií v závislosti na požadavcích konkrétních regulačních rámců nebo pro specifické mechanistické účely. Odchylky od doby expozice 12 měsíců by měly být odůvodněny, zejména v případě kratších expozic. Satelitní skupiny zahrnuté pro monitorování reverzibility toxikologických změn vyvolaných zkoušenou chemickou látkou by se měly udržovat bez podávání látky po dobu nepřekračující 4 týdny a ne delší než jedna třetina celkové délky studie po skončení expozice. Další pokyny, včetně posouzení přežití ve studii, jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (6).
                           
                        POZOROVÁNÍ
                  
                              34.
                           
                           
                              Všechna zvířata by se měla kontrolovat s ohledem na morbiditu nebo mortalitu, obvykle na začátku a na konci každého dne, včetně víkendů a svátků. Všeobecné klinické pozorování by se mělo provádět nejméně jednou denně, přednostně ve stejnou dobu (stejné doby) a s uvážením doby očekávaných maximálních účinků po podání látky v případě podání sondou.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Před první expozicí látce (za účelem intraindividuálního porovnání), na konci prvního týdne studie a dále jednou měsíčně se by se mělo provést důkladné klinické vyšetření všech zvířat. Protokol pozorování by se měl uspořádat tak, aby byly odchylky mezi jednotlivými pozorovateli minimalizovány a byly nezávislé na experimentální skupině. Toto pozorování by se mělo provádět mimo chovnou klec ve standardním pozorovacím prostoru a přednostně pokaždé ve stejnou dobu. Pozorování by se měla pečlivě zaznamenávat, nejlépe za použití systému bodování explicitně definovaného ve zkušební laboratoři. Je třeba se pokusit zajistit, aby byly rozdíly mezi podmínkami pozorování minimální. Vyšetření by se mělo mimo jiné soustředit na změny kůže, srsti, očí a sliznic, výskyt sekretů a exkretů a vegetativní funkce (slzení, zježení srsti, velikost zornic, nezvyklé dýchání). Zaznamenávat by se měly také změny chůze, držení těla a reakce na manipulaci, dále přítomnost klonických a tonických pohybů, stereotypů v chování (např. nadměrného čištění nebo opakovaného kroužení) nebo bizarního chování (např. sebepoškozování, chůze pozpátku) (24).
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Před prvním podáním zkoušené chemické látky by se mělo u všech zvířat provést oftalmologické vyšetření s použitím oftalmoskopu nebo jiného vhodného přístroje. Na konci studie by se toto vyšetření mělo provést nejlépe u všech zvířat, avšak minimálně ve skupinách s vysokou dávkou a kontrolních skupinách. Zjistí-li se na očích změny související s podáním látky, měla by se vyšetřit všechna zvířata. Pokud analýza struktury nebo jiné informace naznačují toxicitu pro oko, měla by se četnost provádění očního vyšetření zvýšit.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              V případě chemických látek, které při předchozích 28denních a/nebo 90denních zkouškách toxicity po opakované dávce vyvolaly neurotoxické účinky, je možné volitelně vyšetřit senzorickou reaktivitu na různé druhy stimulů (24) (např. sluchové, zrakové a proprioceptivní stimuly) (25), (26), (27), sílu úchopu (28) a motorickou aktivitu (29) před zahájením studie a v tříměsíčních intervalech po začátku studie až do 12 měsíců včetně a rovněž při ukončení studie (je-li delší než 12 měsíců). Další informace o postupech, které lze použít, jsou uvedeny v příslušné literatuře. Místo postupů popsaných v této literatuře však lze použít alternativní postupy.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              V případě chemických látek, které při předchozích 28denních a/nebo 90denních zkouškách toxicity po opakované dávce vyvolaly imunotoxické účinky, je možno na konci studie volitelně provést další vyšetření tohoto cílového parametru.
                           
                        
                     Tělesná hmotnost, spotřeba krmiva/vody a využitelnost krmiva
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Všechna zvířata by se měla zvážit na začátku expozice, alespoň jednou týdně během prvních 13 týdnů a poté alespoň jednou měsíčně. Měření spotřeby krmiva a využitelnosti krmiva by se měla provádět alespoň jednou týdně během prvních 13 týdnů a poté alespoň jednou měsíčně. Spotřeba vody by se měla měřit alespoň jednou týdně během prvních 13 týdnů a poté alespoň jednou měsíčně, podává-li se chemická látka v pitné vodě. Měření spotřeby vody by se mělo zvážit také v případě studií, při kterých může dojít ke změně příjmu tekutin.
                           
                        
                     Hematologická a klinická biochemická vyšetření
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Ve studiích na hlodavcích by se měla hematologická vyšetření provádět alespoň u 10 samců a 10 samic v každé skupině, 3., 6. a 12. měsíc a rovněž na konci studie (trvá-li déle než 12 měsíců), vždy u stejných zvířat. U myší mohou být zapotřebí satelitní zvířata, aby se mohla provést všechna požadovaná hematologická stanovení (viz odstavec 18). Ve studiích na nehlodavcích se budou vzorky odebírat menšímu počtu zvířat (např. 4 zvířatům od každého pohlaví v každé skupině ve studiích na psech) v průběžných odběrových časech a na konci studie, jak je popsáno u hlodavců. Měření po třech měsících, jak u hlodavců, tak u nehlodavců, se nemusí provádět, pokud nebyl v předchozí 90denní studii provedené při srovnatelných úrovních dávky pozorován žádný účinek na hematologické parametry. Krevní vzorky by se měly odebírat z určeného místa, například srdeční punkcí nebo z retroorbitálního sinu, v anestezii.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Měly by se vyšetřit následující parametry (30): Celkový počet leukocytů, diferenciální rozpočet leukocytů, počet erytrocytů, trombocytů, koncentrace hemoglobinu, hematokrit (objem erytrocytů), střední objem erytrocytu (MCV), průměrné množství hemoglobinu v erytrocytu (MCH), průměrná koncentrace hemoglobinu v erytrocytu (MCHC), protrombinový čas a aktivovaný parciální tromboplastinový čas. Dle potřeby lze změřit také další hematologické parametry, jako jsou Heinzova tělíska či jiné atypické morfologické formy erytrocytu nebo methemoglobin, v závislosti na toxicitě zkoušené chemické látky. Celkově by se mělo postupovat flexibilně, podle pozorovaného a/nebo očekávaného účinku dané zkoušené chemické látky. Jestliže má zkoušená chemická látka účinek na systém krvetvorby, může být indikováno také vyšetření počtu retikulocytů a cytologie kostní dřeni, přestože se tato vyšetření nemusí provádět rutinně.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Klinické biochemické analýzy za účelem vyšetření hlavních toxických účinků na tkáně, a zejména na játra a ledviny, by se měly provést na krevních vzorcích odebraných alespoň 10 samcům a 10 samicím v každé skupině ve stejných časových intervalech stanovených pro hematologická vyšetření a s použitím vždy stejných zvířat. U myší mohou být zapotřebí satelitní zvířata, aby se mohla provést všechna požadovaná biochemická vyšetření. Ve studiích na nehlodavcích se budou vzorky odebírat menšímu počtu zvířat (např. ve studiích na psech 4 zvířatům od každého pohlaví v každé skupině) v průběžných odběrových časech a na konci studie tak, jak je popsáno u hlodavců. Měření po třech měsících, jak u hlodavců, tak u nehlodavců, se nemusí provádět, pokud nebyl v předchozí 90denní studii provedené při srovnatelných úrovních dávky pozorován žádný účinek na klinické biochemické parametry. Před odebráním krevních vzorků se doporučuje ponechat zvířata (s výjimkou myší) přes noc lačnit. Měly by se vyšetřit následující parametry (30): glukóza, močovina (močovinový dusík), kreatinin, celkový obsah proteinů, albuminy, vápník, sodík, draslík, celkový cholesterol, alespoň dva vhodné testy pro hepatocelulární vyšetření (alaninaminotransferáza, aspartátaminotransferáza, glutamátdehydrogenáza, celkové kyseliny žlučové) (31) a alespoň dva vhodné testy pro hepatobiliární vyšetření (alkalická fosfatáza, gamaglutamyltransferáza, 5’-nukleotidáza, celkový bilirubin, celkový obsah žlučových kyselin) (31). Dle potřeby je možné změřit také další klinické biochemické parametry, např. triglyceridy nalačno, specifické hormony a cholinesterázu, v závislosti na toxicitě zkoušené chemické látky. Celkově je třeba postup přizpůsobit pozorovanému a/nebo očekávanému účinku zkoušené chemické látky.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Rozbor moči by se měl provést alespoň u 10 samců a 10 samic v každé skupině, s použitím vzorků odebraných ve stejných intervalech, jako u hematologických a klinických biochemických vyšetření. Měření v 3. měsíci se nemusí provádět, pokud nebyl v předchozí 90denní studii provedené při srovnatelných úrovních dávky pozorován žádný účinek na složení moči. Odborné doporučení pro klinické patologické studie zahrnovalo následující parametry (30): vzhled, objem, osmolalita nebo specifická hmotnost, pH, celkový obsah proteinů a glukóza. Další stanovení zahrnují ketony, urobilinogen, bilirubin, a okultní krvácení. Zkoumání pozorovaného účinku (pozorovaných účinků) lze v případě potřeby rozšířit o další parametry.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Obecně se má za to, že ve studiích na psech je třeba před expozicí změřit výchozí hematologické a klinické biochemické parametry, avšak ve studiích na hlodavcích se stanovovat nemusí (30). Pokud jsou však historické výchozí údaje (viz odstavec 50) nedostatečné, je třeba zvážit získání těchto údajů.
                           
                        
                     Patologie
                  
                  
                     Pitva
                  
                  
                              45.
                           
                           
                              U všech zvířat zařazených do studie se obvykle provede celková podrobná pitva zahrnující pečlivé vyšetření povrchu těla, všech otvorů a lebeční, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahu. Nicméně je také možno měření omezit na konkrétní klíčové parametry (ve skupině pro předběžná utracení nebo v satelitní skupině), jako je neurotoxicita či imunotoxicita (viz odstavec 19). Zvířata se nemusí pitvat ani se u nich neprovádí postupy popsané v následujících odstavcích. V jednotlivých případech a dle uvážení vedoucího studie může být třeba provést pitvu u ověřovacích zvířat.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              U všech ostatních zvířat, kromě zvířat vyloučených v druhé části odstavce 45, by se měly zvážit orgány. Nadledvinky, mozek, nadvarlata, srdce, ledviny, játra, vaječníky, slezina, varlata, štítná žláza (vážená po fixaci, včetně příštítných tělísek) a děloha všech zvířat (kromě zvířat nalezených umírajících a/nebo zvířat utracených v průběhu zkoušky) by se měly zbavit všech přirostlých tkání a co nejdříve po vyjmutí z těla ve vlhkém stavu zvážit, než vyschnou. Ve studii používající myši je vážení nadledvinek volitelné.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Následující tkáně by se měly konzervovat v nejvhodnějším fixačním médiu s ohledem na typ tkáně a plánovaná následná histopatologická vyšetření (32) (tkáně v hranatých závorkách jsou volitelné):
                              
                                          všechny makroskopicky viditelné léze
                                       
                                       
                                          srdce
                                       
                                       
                                          slinivka břišní
                                       
                                       
                                          žaludek (předžaludek, žláznatý žaludek)
                                       
                                    
                                          nadledvinka
                                       
                                       
                                          
                                             ileum
                                          
                                       
                                       
                                          příštítná tělíska
                                       
                                       
                                          [zuby]
                                       
                                    
                                          aorta
                                       
                                       
                                          
                                             jejunum
                                          
                                       
                                       
                                          periferní nerv
                                       
                                       
                                          varlata
                                       
                                    
                                          mozek (zahrnující řezy mozkových hemisfér, mozečku a prodloužené míchy/Varolova mostu)
                                       
                                       
                                          ledviny
                                       
                                       
                                          hypofýza
                                       
                                       
                                          brzlík
                                       
                                    
                                          slepé střevo
                                       
                                       
                                          slzní žláza (extraorbitální)
                                       
                                       
                                          prostata
                                       
                                       
                                          štítná žláza
                                       
                                    
                                          cervix
                                       
                                       
                                          játra
                                       
                                       
                                          rektum
                                       
                                       
                                          [jazyk]
                                       
                                    
                                          koagulační žláza
                                       
                                       
                                          plíce
                                       
                                       
                                          slinná žláza
                                       
                                       
                                          průdušnice
                                       
                                    
                                          tlusté střevo
                                       
                                       
                                          lymfatické uzliny (povrchové i hluboké)
                                       
                                       
                                          semenný váček
                                       
                                       
                                          močový měchýř
                                       
                                    
                                          dvanáctník
                                       
                                       
                                          prsní žláza (povinné u samic a, je-li očividně možné ji vypreparovat, i u samců)
                                       
                                       
                                          kosterní sval
                                       
                                       
                                          děloha (včetně hrdla děložního)
                                       
                                    
                                          nadvarle
                                       
                                       
                                          [horní cesty dýchací, včetně nosu, nosních skořep a vedlejších dutin nosních]
                                       
                                       
                                          kůže
                                       
                                       
                                          [močovod]
                                       
                                    
                                          oko (včetně sítnice)
                                       
                                       
                                          jícen
                                       
                                       
                                          mícha (ve třech úrovních: krční, střední hrudní a bederní)
                                       
                                       
                                          [močová trubice]
                                       
                                    
                                          [femur s kloubem]
                                       
                                       
                                          [Bulbus olfactorius]
                                       
                                       
                                          slezina
                                       
                                       
                                          pochva
                                       
                                    
                                          žlučník (u jiných druhů než potkan)
                                       
                                       
                                          vaječníky
                                       
                                       
                                          [sternum],
                                       
                                       
                                          řez kostní dření a/nebo čerstvý aspirát kostní dřeni
                                       
                                    
                                          Harderova žláza
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    V případě párových orgánů, např. ledvin, nadledvinek, by se měly uchovávat oba orgány. Na základě klinických nebo jiných nálezů může být nezbytné zkoumat i další tkáně. Také by se měly uchovat všechny orgány považované na základě známých vlastností zkoušené chemické látky za možné cílové orgány. Ve studiích s dermální cestou aplikace by se měl zachovat seznam orgánů stanovený pro orální cestu, a navíc je nezbytné odebrat a konzervovat vzorky kůže z místa aplikace. V inhalačních studiích by se měl seznam tkání z dýchacích cest určených ke konzervaci a vyšetření, řídit doporučeními uvedenými v kapitole B.8 této přílohy (8) a kapitole B.29 této přílohy (9). Co se týká ostatních orgánů/tkání (kromě specificky konzervovaných tkání z dýchacích cest) by se měly vyšetřit orgány uvedené na seznamu orgánů určeném pro orální cestu.
                           
                        
                     Histopatologické vyšetření
                  
                  
                              48.
                           
                           
                              Jsou k dispozici pokyny ohledně osvědčených postupů při provádění toxikologických patologických studií (32). Histopatologická vyšetření by měla minimálně obsahovat:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          všechny tkáně ve skupinách s vysokou dávkou zkoušené chemické látky a kontrolních skupinách,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všechny tkáně ze zvířat uhynulých nebo utracených během studie,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všechny tkáně vykazující makroskopické abnormality,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          cílové tkáně nebo tkáně, které vykazují změny v souvislosti s expozicí ve skupině s vysokou dávkou, u všech zvířat ve všech ostatních experimentálních skupinách,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          v případě párových orgánů, např. ledvin, nadledvinek, by se měly vyšetřit oba orgány.
                                       
                                    
                        ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ
                  
                     Údaje
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Měly by se uvést údaje o všech hodnocených parametrech u každého jednotlivého zvířete. Kromě toho by se měly všechny údaje shrnout do tabulky, přičemž se uvede u každé experimentální skupiny počet zvířat na začátku zkoušky, počet zvířat nalezených uhynulých v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních důvodů a doba úmrtí nebo humánního utracení, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, popis příznaků toxicity, včetně doby nástupu, trvání a závažnosti každého toxického účinku, počet zvířat vykazujících léze, typ lézí a procento zvířat vykazujících každý typ léze. Tabulky se souhrnnými údaji by měly uvádět průměrné hodnoty a směrodatné odchylky (u spojitých dat ze zkoušky) u zvířat vykazujících toxické účinky nebo léze a také klasifikaci lézí.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Pro interpretaci výsledků studie mohou být cenné historické kontrolní údaje, např. v případě, kdy existují známky toho, že se současné kontroly značně odchylují od posledních údajů získaných od kontrolních zvířat ze stejného zkušebního zařízení/kolonie. Historické kontrolní údaje, pokud se hodnotí, by měly být ze stejné laboratoře a měly by pocházet od zvířat stejného věku a ze stejného kmene během pěti let předcházejících příslušné studii.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Číselné výsledky by měly být pokud možno vyhodnoceny vhodnou a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistické metody a údaje, které se mají analyzovat, by se měly zvolit již při plánování studie (odstavec 8). Tento výběr by měl zahrnovat rezervu pro případné úpravy v závislosti na přežití.
                           
                        
                     Protokol o zkoušce
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Protokol o zkoušce by měl obsahovat tyto údaje:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkoušená chemická látka:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikální vlastnosti, čistota a fyzikálně-chemické vlastnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikační údaje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj chemické látky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      číslo šarže,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      certifikát o chemické analýze.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosič (je-li použit):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění výběru nosiče (pokud není použita voda).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Pokusná zvířata:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použité druhy/kmen a zdůvodnění výběru,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet, věk a pohlaví zvířat na začátku zkoušky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj, podmínky chovu, krmivo atd.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hmotnosti jednotlivých zvířat na začátku zkoušky.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkušební podmínky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění způsobu podávání a výběru dávky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      případně statistické metody použité k analýze dat,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobnosti o použité formě zkoušené chemické látky/úpravě krmiva,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analytické údaje o dosažené koncentraci, stabilitě a homogenitě přípravku,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      cesta podání a podrobné údaje o podávání zkoušené chemické látky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      u inhalačních studií informace o tom, zda byla expozice pouze nazální cestou, nebo celotělová,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skutečné dávky (mg/kg tělesné hmotnosti/den) a případně koeficient přepočtu koncentrace zkoušené chemické látky v krmivu/pitné vodě (mg/kg nebo ppm) na skutečnou dávku (mg/kg tělesné hmotnosti/den),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné údaje o kvalitě stravy a vody.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky (měly by se předložit souhrnné tabulky údajů a údaje pro jednotlivá zvířata):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o přežití,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tělesná hmotnost/změny tělesné hmotnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      spotřeba krmiva, výpočty využitelnosti krmiva, pokud byly provedeny a případně spotřeba vody,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o toxických reakcích podle pohlaví a úrovně dávky, včetně příznaků toxicity,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      povaha, výskyt (plus závažnost, je-li hodnocena) a trvání pozorovaných klinických příznaků (zda byly přechodné, nebo trvalé),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oftalmologické vyšetření,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematologické testy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klinické biochemické testy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozbor moči,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      výsledky všech vyšetření neurotoxicity nebo imunotoxicity,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      konečná tělesná hmotnost,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hmotnosti orgánů (a jejich poměry, pokud se stanovují),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pitevní nálezy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobný popis všech histopatologických nálezů souvisejících s expozicí,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o absorpci, pokud jsou dostupné.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Statistické zpracování výsledků dle potřeby
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Diskuse o výsledcích zahrnující:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vztahy mezi dávkou a odezvou,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      posouzení všech informací o způsobu účinku,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      diskuse o všech modelovacích přístupech,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stanovení BMD, NOAEL nebo LOAEL,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      historické kontrolní údaje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      význam pro člověka.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Závěry
                                          
                                       
                                    
                        
                     LITERATURA:
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145-191.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Kapitola B.27 této přílohy, Zkouška subchronické orální toxicity studie orální toxicity na nehlodavcích (90denní opakovaná aplikace).
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment N°39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              Kapitola B.8 této přílohy, Subakutní inhalační toxicita: 28denní studie.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Kapitola B.29 této přílohy, Studie subchronické inhalační toxicity: 90denní studie.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Kapitola B.9 této přílohy, Dermální toxicita (28denní opakovaná aplikace).
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 - 837.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              19)
                           
                           
                              Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU ze dne 22. září 2010 o ochraně zvířat používaných pro vědecké účely, Úř. věst. L 276, 20.10.2010, s. 33.
                           
                        
                              20)
                           
                           
                              National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              21)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
                           
                        
                              22)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              23)
                           
                           
                              Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.
                           
                        
                              24)
                           
                           
                              IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
                           
                        
                              25)
                           
                           
                              Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.
                           
                        
                              26)
                           
                           
                              Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.
                           
                        
                              27)
                           
                           
                              Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
                           
                        
                              28)
                           
                           
                              Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
                           
                        
                              29)
                           
                           
                              Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
                           
                        
                              30)
                           
                           
                              Weingand K, Brown G, Hall R et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198-201.
                           
                        
                              31)
                           
                           
                              Dokument (návrh) agentury EMEA „Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity“ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).
                           
                        
                              32)
                           
                           
                              Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131.
                           
                        
                     Dodatek 1
                     DEFINICE
                     Zkoušená chemická látka: Jakákoli látka nebo směs zkoušená pomocí této zkušební metody.
                  “
            
                  6)
               
               
                  Kapitoly B.32 a B.33 se nahrazují takto:
                  „B.32   STUDIE KARCINOGENITY
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda odpovídá Pokynům OECD pro zkoušení (TG) 451 (2009). Původní pokyny TG 451 ke studiím karcinogenity byly schváleny v roce 1981. Revize zkušební metody B.32 byla považována za nezbytnou k zohlednění nejnovějšího vývoje v oblasti zajištění dobrých životních podmínek zvířat a regulačních požadavků (2), (3), (4), (5), (6). Aktualizace této zkušební metody B.32 se prováděla paralelně s revizemi kapitoly B.30 této přílohy, Studie chronické toxicity, a kapitoly B.33 této přílohy, Kombinovaná studie chronické toxicity/karcinogenity, s cílem získat další informace o zvířatech použitých ve studii a poskytnout další podrobnosti o výběru dávky. Tato zkušební metoda B.32 je určena ke zkouškám široké škály chemických látek, včetně pesticidů a průmyslových chemikálií. V případě farmaceutik se však některé detaily a požadavky mohou lišit (viz pokyny S1B Mezinárodní konference o harmonizaci (ICH) testování karcinogenity léků).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Většina studií karcinogenity se provádí na hlodavcích, a tato zkušební metoda je proto primárně určena k použití ve studiích prováděných na těchto druzích. Je-li třeba provést studie na jiných druzích nežli z řádu hlodavců, lze rovněž použít příslušně pozměněné principy a postupy uvedené v této zkušební metodě spolu s těmi, které jsou uvedeny v kapitole B.27 této přílohy, Studie orální toxicity na nehlodavcích – 90denní opakovaná aplikace (6). Další pokyny jsou k dispozici v pokynech OECD č. 116 o přípravě a provádění studií chronické toxicity a karcinogenity (7).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Třemi hlavními způsoby podávání používanými ve studiích karcinogenity jsou orální podávání, dermální aplikace a inhalační podávání. Výběr cesty podání závisí na fyzikálních a chemických vlastnostech zkoušené chemické látky a na převládající cestě expozice u lidí. Další informace o výběru cesty expozice jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda se zaměřuje na expozici orální cestou, což je cesta, která se ve studiích karcinogenity používá nejběžněji. Přestože studie karcinogenity zahrnující expozici dermální nebo inhalační cestou mohou být pro posouzení rizik pro lidské zdraví rovněž nezbytné a/nebo mohou být vyžadovány v rámci určitých regulačních režimů, jsou studie používající tyto cesty expozice značně technicky složité. Takové studie je třeba navrhovat individuálně pro daný případ, přestože zde uvedená zkušební metoda pro posouzení a vyhodnocení karcinogenity při orálním podávání by mohla tvořit základ protokolu pro studie inhalační a/nebo dermální, pokud jde o doporučení pro období expozice, klinické a patologické parametry atd. Jsou k dispozici pokyny OECD týkající se podávání zkoušených chemických látek dermální (7) a inhalační cestou (7), (8). Při navrhování dlouhodobých studií zahrnujících expozici inhalační cestou by se mělo konkrétně nahlédnout do kapitoly B.8 této přílohy (9) a kapitoly B.29 této přílohy (10) a rovněž do pokynů OECD pro zkoušení akutní inhalační toxicity (8). V případě, že se zkoušky provádějí dermální cestou, je třeba nahlédnout do kapitoly B.9 této přílohy (11).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Studie karcinogenity poskytuje informace o možných rizikách pro zdraví, která mohou pravděpodobně vzniknout při opakované expozici trvající až celou dobu života použitých druhů. Studie rovněž poskytne informace o toxických účincích zkoušené chemické látky, včetně potenciální karcinogenity, a může určit cílové orgány a možnost akumulace. Může také pro toxické účinky poskytnout odhad hodnoty dávky nevyvolávající pozorovatelné nepříznivé účinky a v případě negenotoxických karcinogenů pro nádorové odpovědi, což lze použít při stanovení kritérií pro bezpečnou expozici člověka. Důraz se klade také na pečlivé klinické pozorování zvířat s cílem získat co nejvíce informací.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Cíle studií karcinogenity zahrnutých v této zkušební metodě jsou:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikace karcinogenních vlastností zkoušené chemické látky vedoucích ke zvýšenému výskytu novotvarů, zvýšenému podílu maligních novotvarů nebo snížení doby do vzniku novotvarů ve srovnání se souběžnými kontrolními skupinami,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikace cílového orgánu (cílových orgánů) karcinogenity,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikace doby do vzniku novotvarů,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          charakterizace vztahu mezi dávkou a nádorovou odezvou,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          určení hodnoty dávky bez pozorovaného nepříznivého účinku (NOAEL) nebo výchozího bodu pro stanovení referenční dávky (BMD),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          extrapolace karcinogenních účinků na nízké úrovně expozice člověka,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          získání údajů k ověření hypotéz o způsobu účinku (2), (7), (12), (13), (14), (15).
                                       
                                    
                        VÝCHOZÍ ÚVAHY
                  
                              7.
                           
                           
                              Zkušební laboratoř by měla před provedením studie vzít v úvahu při posuzování a hodnocení potenciální karcinogenity zkoušené chemické látky veškeré dostupné informace o zkoušené chemické látce, aby zaměřila uspořádání studie směrem k účinnějšímu zkoušení karcinogenního potenciálu a minimalizovala použití zvířat. Obzvlášť důležité jsou informace o způsobu účinku potenciálního karcinogenu a jeho posouzení (2), (7), (12), (13), (14), (15), neboť optimální uspořádání studie se může lišit podle toho, zda je zkoušená chemická látka známým genotoxickým karcinogenem nebo je u ní pouze podezření na genotoxickou karcinogenitu. Další pokyny k rozvahám o způsobu účinku jsou uvedeny v pokynech č. 116 (7).
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Mezi informace, které usnadní vytváření plánu studie, patří identita zkoušené chemické látky, její chemická struktura a fyzikálně-chemické vlastnosti, výsledky všech testů toxicity in vitro nebo in vivo včetně testů genotoxicity, předpokládaná použití a potenciální expozice u člověka, dostupné údaje (Q)SAR, údaje o mutagenitě/genotoxicitě, karcinogenita a další toxikologické údaje o strukturně příbuzných chemických látek, dostupné toxikokinetické údaje (kinetika při jednorázové dávce a rovněž při opakovaných dávkách, je-li k dispozici) a údaje získané v jiných studiích s opakovanou expozicí. Zhodnocení karcinogenity by se mělo provádět po získání prvotních informací o toxicitě z 28denních a/nebo 90denních zkoušek toxicity v opakovaných dávkách. Krátkodobé zkoušky iniciace–propagace nádoru mohou rovněž poskytnout užitečné informace. Jako součást celkového zhodnocení potenciálních nepříznivých účinků konkrétní zkoušené chemické látky na zdraví by se měl zvážit postup zkoušení prováděný po fázích při zkouškách karcinogenity (16), (17), (18), (19).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Nejvhodnější statistické metody pro analýzu výsledků s ohledem na uspořádání a cíle experimentu by se měly stanovit před zahájením studie. Je třeba zvážit, zda by měla statistika zahrnovat korekci na přežití, analýzu kumulativních nádorových rizik ve vztahu k době přežití, analýzu doby do vzniku nádoru a analýzu v případě předčasného ukončení zkoušky u jedné nebo více skupin. Pokyny ohledně vhodných statistických analýz a klíčové odkazy na mezinárodně uznávané statistické metody jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7) a rovněž v Pokynech č. 35 o analýze a hodnocení studií chronické toxicity a karcinogenity (20).
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Při provádění studie karcinogenity je nutné řídit se vždy zásadami a úvahami uvedenými v Pokynech OECD č. 19 k rozpoznání, vyšetření a použití klinických příznaků jako lidských cílových parametrů u pokusných zvířat používaných při hodnocení bezpečnosti (21), zejména v odstavci 62 těchto pokynů. Tento odstavec uvádí, že „Ve studiích zahrnujících opakované podávání dávky by se mělo v případě, kdy zvíře vykazuje klinické příznaky, které jsou progresivní a vedou k dalšímu zhoršení jeho stavu, učinit informované rozhodnutí, zda zvíře humánně utratit, či ne. Toto rozhodnutí by mělo obsahovat posouzení hodnoty informací, které se získají, bude-li se zvíře i nadále udržovat ve studii, oproti jeho celkovému stavu. Dospěje-li se k rozhodnutí pokračovat u zvířete ve zkoušce, měla by se dle potřeby zvýšit četnost pozorování. Rovněž je možné, aniž by to nepříznivě ovlivnilo účel zkoušky, dočasně pozastavit podávání dávky, jestliže to zmírní bolest či utrpení, nebo snížit zkoušenou dávku.“
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Podrobné pokyny a diskuse o principech výběru dávky pro studie chronické toxicity a karcinogenity naleznete v Pokynech č. 116 (7) a rovněž ve dvou publikacích ústavu International Life Sciences Institute (22) (23). Hlavní strategie výběru dávky závisí na primárním cíli nebo cílech studie (odstavec 6). Při výběru vhodných úrovní dávky by se mělo dosáhnout rovnováhy mezi screeningem nebezpečnosti na straně jedné a charakterizací odezvy na nízkou dávku a jejich významu na straně druhé. To je důležité zejména v situaci, kdy je nutné provést kombinovanou studii chronické toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 této přílohy) (odstavec 12).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Mělo by se zvážit, zda raději neprovést kombinovanou studii chronické toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 této přílohy), a ne samostatné provedení studie chronické toxicity (tato zkušební metoda B.30) a studie karcinogenity (kapitola B.32 této přílohy). Kombinovaná zkouška zajišťuje větší efektivitu ve smyslu času a nákladů v porovnání s prováděním dvou samostatných studií a zároveň nezhoršuje kvalitu údajů ani ve fázi zkoušení chronické toxicity, ani ve fázi zkoušení karcinogenity. Při provádění kombinované studie chronické toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 této přílohy) však je třeba pečlivě zvážit zásady výběru dávky (odstavce 11 a 22–25) a rovněž se uznává, že v určitých regulačních rámcích mohou být vyžadovány samostatné studie.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Definice použité v kontextu této zkušební metody naleznete na konci této kapitoly a v Pokynech č. 116 (7).
                           
                        PODSTATA ZKOUŠKY
                  
                              14.
                           
                           
                              Zkoušená chemická látka se podává denně v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat po většinu jejich života, obvykle orální cestou. Expozice inhalační nebo dermální cestou může být rovněž vhodná. Zvířata se pečlivě sledují s ohledem na příznaky toxicity a rozvoj neoplastických lézí. Zvířata, která v průběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena, se pitvají a na konci zkoušky se přeživší zvířata utratí a rovněž pitvají.
                           
                        POPIS METODY
                  
                     Výběr zvířecích druhů
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda se primárně zabývá posouzením a vyhodnocením karcinogenity u hlodavců (odstavec 2). Použití nehlodavců je možné zvážit, pokud dostupné údaje naznačují, že jsou pro předpověď účinků na lidské zdraví vhodnější. Výběr druhu by měl být zdůvodněn. Upřednostňovaným druhem hlodavců je potkan, ale lze použít i jiný druh hlodavců, např. myš. Přestože použití myší ve zkouškách karcinogenity může mít omezený užitek (24), (25), (26), jsou v některých stávajících regulačních programech zkoušky karcinogenity na myších ještě stále vyžadovány, pokud se neprokáže, že taková studie není z vědeckého hlediska nezbytná. Krysy a myši jsou upřednostňovanými experimentálními modelovými organismy díky své relativně krátké době života, široce rozšířenému použití ve farmakologických a toxikologických studiích, citlivosti k indukci nádoru a dostupnosti dostatečně charakterizovaných kmenů. V důsledku těchto vlastností je k dispozici velké množství informací o jejich fyziologii a patologii. Další informace o výběru druhu a kmene jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7).
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Měla by se použít mladá zdravá dospělá zvířata běžně používaných laboratorních kmenů. Studie karcinogenity by se měla provádět nejlépe na zvířatech ze stejného kmene a zdroje, jako byla zvířata použitá v kratších předběžných studiích toxicity, i když je-li známo, že zvířata z tohoto kmene a zdroje nedosahují běžně uznávaných kritérií přežití v dlouhodobých studiích [viz Pokyny č. 116 (7)], měla by se zvážit možnost použít takový kmen zvířat, který má přijatelnou míru přežití v dlouhodobé studii. Samice musí být nullipary a nesmějí být březí.
                           
                        
                     Umístění a krmení zvířat
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Zvířata lze chovat jednotlivě nebo v klecích po malých skupinkách jedinců stejného pohlaví. Individuální chov by se měl použít pouze, je-li to vědecky odůvodněné (27), (28), (29). Klece by měly být uspořádány tak, aby byl případný vliv jejich polohy minimalizován. Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla být 22 °C (± 3 °C). Relativní vlhkost vzduchu by měla být minimálně 30 % a pokud možno nepřesáhnout 70 % kromě doby čištění místnosti, cílem by měla být hodnota 50–60 %. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní stravu s neomezenou dodávkou pitné vody. Strava by měla splňovat všechny nutriční požadavky zkoušených druhů a obsah příměsí v krmivu zahrnující mimo jiné zbytky pesticidů, perzistentní organopolutanty, fytoestrogeny, těžké kovy a mykotoxiny, které mohou ovlivnit výsledek zkoušky, by měl být co možná nejnižší. Pravidelně by se měly získávat analytické informace o nutričních hodnotách stravy a množství příměsí ve stravě, alespoň na začátku studie a pokaždé, když se změní používaná šarže, a měly by se začlenit do závěrečné zprávy. Obdobně by se měla poskytnout analýza pitné vody. Výběr krmiva může být ovlivněn nutností zajistit vhodnou přísadu zkoušené chemické látky, podává-li se látka v krmivu, a splnit nutriční potřeby zvířat.
                           
                        
                     Příprava zvířat
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Použijí se zdravá zvířata, která se alespoň 7 dnů aklimatizovala na laboratorní podmínky a která nebyla dříve podrobena žádným experimentálním postupům. V případě hlodavců by se mělo podávání látky zahájit co možná nejdříve po jejich odstavení a aklimatizaci, nejlépe před dosažením stáří 8 týdnů. Pokusná zvířata by měla být charakterizována podle druhu, kmenu, původu, pohlaví, hmotnosti a stáří. Na začátku studie by měly být odchylky hmotnosti zvířat u každého pohlaví minimální a neměly by překročit ± 20 % průměrné hmotnosti pro všechna zvířata ve studii, pro každé pohlaví zvlášť. Zvířata by měla být rozdělena náhodným výběrem do kontrolních a experimentálních skupin. Po randomizaci by neměly být výrazné rozdíly v průměrných hodnotách tělesné hmotnosti mezi skupinami v rámci každého pohlaví. Existují-li statisticky významné rozdíly, měla by se randomizace pokud možno zopakovat. Každému zvířeti by se mělo přidělit jedinečné identifikační číslo a mělo by se tímto číslem trvale označit pomocí tetování, implantací mikročipu nebo jinou vhodnou metodou.
                           
                        POSTUP
                  
                     Počet a pohlaví zvířat
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Měla by se použít obě pohlaví. Měl by se použít dostatečný počet zvířat umožňující důkladné biologické a statistické vyhodnocení. Každá exponovaná skupina a souběžná kontrolní skupina by proto měla obsahovat alespoň 50 zvířat od každého pohlaví. V závislosti na cíli studie může být možné zvýšit statistickou sílu klíčových odhadů rozdělením zvířat nerovnoměrně do skupin s různými dávkami, přičemž do skupin s nízkou dávkou se zařadí více než 50 zvířat, např. aby se odhadl karcinogenní potenciál při nízkých dávkách. Mírným zvýšením velikosti skupiny však statistická síla studie vzroste jen relativně málo. Další informace o statistickém uspořádání studie a výběru úrovní dávek k maximalizaci statistické síly jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7).
                           
                        
                     Zajištění předběžných utracení a satelitních (ověřovacích) skupin
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Studie může zajistit zvířata pro předběžná utracení např. v 12. měsíci, aby se získaly informace o progresi neoplastických změn a mechanistické informace, je-li to vědecky odůvodněné. Jsou-li tyto informace již k dispozici z předchozích studií toxicity zkoušené chemické látky po opakovaných dávkách, nemusí být předběžná utracení vědecky odůvodněná. Pokud jsou v plánu studie zahrnuta předběžná utracení zvířat, v každé exponované skupině určených k předběžnému utracení je obvykle 10 zvířat od každého pohlaví a celkový počet zvířat zařazených do studie je nutno zvýšit o počet zvířat, která budou usmrcena před ukončením studie. Také je možné zařadit do studie další skupinu ověřovacích zvířat (obvykle 5 zvířat od každého pohlaví) k monitorování stavu onemocnění v průběhu studie, je-li to nutné (30). Další pokyny jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7).
                           
                        
                     Dávkové skupiny a dávkování
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Pokyny ohledně veškerých aspektů výběru dávky a odstupňování úrovní dávek jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7). Měly by se použít alespoň tři úrovně dávek a souběžná kontrola. Úrovně dávek budou obecně vycházet z výsledků krátkodobých studií při opakované aplikaci nebo ze studií k stanovení rozsahu dávkování a měly by zohlednit jakékoli existující toxikologické a toxikokinetické údaje dostupné pro zkoušenou sloučeninu nebo příbuzné materiály.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Nebrání-li tomu fyzikálně-chemická povaha nebo biologické účinky zkoušené chemické látky, měla by se zvolit nejvyšší úroveň dávky za účelem identifikace hlavních cílových orgánů a toxických účinků, která by však zároveň neměla vést k utrpení, závažné toxicitě, morbiditě nebo uhynutí. Za současného zohlednění faktorů uvedených v odstavci 23 níže by se měla vybrat taková nejvyšší dávka, aby vyvolala příznaky toxicity, např. pokles přírůstku tělesné hmotnosti (přibližně 10 %). Nicméně v závislosti na cílech studie (viz odstavec 6) je možné zvolit nejvyšší dávku nižší, než je dávka dokazující toxicitu, např. jestliže dávka vyvolává nepříznivý účinek, který však má jen malý dopad na délku života nebo tělesnou hmotnost.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Je možné zvolit úrovně dávek a odstupňování úrovní dávek ke stanovení vztahu mezi dávkou a odezvou a NOAEL nebo jiných plánovaných výsledků studie, např. BMD (viz odstavec 25) na nejnižší úrovni dávky, a to v závislosti na způsobu účinku zkoušené chemické látky. Mezi faktory, které by se měly zvážit při určování nižších dávek, patří předpokládaná směrnici křivky závislosti odezvy na dávce, dávky, při kterých mohou nastat důležité změny v metabolismu nebo způsobu toxického účinku, kde se předpokládá prahová hodnota nebo kde se předpokládá výchozí bod pro extrapolaci do oblasti nízkých dávek.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Interval mezi jednotlivými úrovněmi dávek bude záviset na vlastnostech zkoušené chemické látky a není možno jej v této zkušební metodě předepsat, avšak dvou až čtyřnásobné intervaly obvykle vedou k dobré funkčnosti zkoušky, použijí-li se k nastavení klesajících úrovní dávek; často se upřednostňuje zařazení čtvrté zkušební skupiny před použitím velmi velkých intervalů (např. více než přibližně 6–10násobek) mezi dávkami. Obecně je třeba vyhnout se použití koeficientů větších než 10 a jejich případné použití by se mělo zdůvodnit.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Jak je dále probráno v Pokynech č. 116 (7), je třeba při výběru dávky zvážit tyto body:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          známá nebo předpokládaná nelinearita či inflexní body na křivce závislosti odezvy na dávce,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toxikokinetika a rozsahy dávkování, při kterých dochází nebo nedochází k metabolické indukci, saturaci nebo nelinearitě mezi vnějšími a vnitřními dávkami,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          prekurzorové léze, známky účinku nebo indikátory probíhajících klíčových základních biologických procesů,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          klíčové (nebo předpokládané) aspekty způsobu účinku, například dávky, při kterých začíná vzrůstat cytotoxicita, narušují se hladiny hormonů, homeostatické mechanismy jsou ochromeny atd.,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          oblasti křivky závislosti odezvy na dávce, kde je nutný obzvlášť robustní odhad, např. v rozsahu předpokládané BMD nebo prahové hodnoty,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          zvážení předpokládaných úrovní expozice člověka.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              Kontrolní skupina je neexponovaná skupina nebo kontrolní skupina s nosičem, pokud se nosič při podávání zkoušené chemické látky používá. S výjimkou aplikace zkoušené chemické látky je třeba se zvířaty v kontrolní skupině zacházet stejným způsobem jako se zvířaty v experimentálních skupinách. Používá-li se nosič, podá se kontrolní skupině v nejvyšším používaném objemu v rámci skupin. Jestliže se zkoušená chemická látka podává v krmivu a způsobuje podstatné snížení příjmu potravy v důsledku snížené chutnosti krmiva, může být užitečné použít další kontrolní skupinu krmenou tak, aby měla stejně snížený příjem potravy, která poslouží jako vhodnější kontrola.
                           
                        
                     Příprava dávek a podávání zkoušené chemické látky
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Zkoušená chemická látka se obvykle podává orálně, v krmivu či v pitné vodě nebo sondou. Další informace o cestách a způsobech podání jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7). Cesta a způsob podání závisí na účelu studie, fyzikálně-chemických vlastnostech zkoušené chemické látky, její biologické dostupnosti a převládající cestě a způsobu expozice člověka. Mělo by se uvést zdůvodnění zvolené cesty a způsobu podání. V zájmu zajištění dobrých životních podmínek zvířat by se mělo podávání žaludeční sondou zvolit pouze u těch látek, u nichž tato cesta a způsob podání náležitě reprezentují potenciální expozici člověka (např. farmaceutika). Chemické látky, které se nacházejí v potravě nebo životním prostředí, včetně pesticidů, se obvykle podávají v krmivu nebo pitné vodě. Nicméně u některých scénářů expozice, např. expozice na pracovišti, mohou být vhodnější jiné cesty podání.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Zkoušená chemická látka se v případě potřeby rozpustí nebo suspenduje ve vhodném nosiči. Případně je třeba zvážit následující vlastnosti nosiče nebo jiných přídatných látek: účinky na absorpci, distribuci, metabolismus nebo retenci zkoušené chemické látky, účinky na chemické vlastnosti zkoušené chemické látky, které mohou změnit její toxické vlastnosti a účinky na konzumaci krmiva nebo vody či na nutriční stav zvířat. Je-li to možné, doporučuje se zvážit nejprve použití vodného roztoku/suspenze, poté použití roztoku/emulze v oleji (např. v kukuřičném oleji) a nakonec roztoku v jiných nosičích. U nosičů jiných než voda je nutné znát jejich toxické vlastnosti. Měly by být k dispozici informace o stabilitě zkoušené chemické látky a homogenitě podávaných roztoků nebo krmiva (dle potřeby) za podmínek podávání (např. v krmivu).
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              U látek podávaných v krmivu nebo v pitné vodě je důležité zajistit, aby množství použité zkoušené chemické látky neovlivňovalo normální výživu nebo vodní rovnováhu. V dlouhodobých studiích toxicity s podáváním látky v krmivu by koncentrace zkoušené chemické látky v krmivu obvykle horní mez neměla přesáhnout 5 % celkového množství krmiva, aby se zabránilo nutriční nerovnováze. Podává-li se zkoušená chemická látka v krmivu, může se použít buď konstantní koncentrace v krmivu (mg/kg krmiva nebo ppm) nebo konstantní dávkování v poměru k tělesné hmotnosti zvířete (mg/kg tělesné hmotnosti), která se vypočítá jednou týdně. Použitá možnost by se měla specifikovat.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              V případě orálního podávání se zvířatům podává zkoušená chemická látka denně (sedm dnů v každém týdnu), u hlodavců obvykle po dobu 24 měsíců (viz také odstavec 32). Jakýkoli jiný režim podávání, např. pět dní v týdnu, musí být zdůvodněn. V případě dermální aplikace se zvířata vystavují zkoušené chemické látce alespoň po dobu 6 hodin denně, 7 dnů v týdnu, jak je specifikováno v kapitole B.9 této přílohy (11) po dobu 24 měsíců. Expozice inhalační cestou se provádí 6 hodin denně, 7 dnů v týdnu, avšak je možné použít i expozici 5 dnů v týdnu, je-li zdůvodněna. Období expozice obvykle trvá 24 měsíců. Jsou-li k expozici pouze nazální cestou použity jiné druhy hlodavců než potkani, je možné upravit maximální doby expozice za účelem minimalizace druhově specifického utrpení. Používá-li se expozice kratší než 6 hodin denně, je třeba uvést zdůvodnění. Viz také kapitola B.8 této přílohy (9).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Pokud se zkoušená chemická látka podává zvířatům nitrožaludečně, mělo by se to provádět žaludeční sondou nebo vhodnou intubační kanylou, vždy v přibližně stejnou denní dobu. Obvykle se podává jedna dávka jednou denně. Pokud je např. chemická látka lokálně dráždící, je možné denní dávku podávat rozdělenou na dvě dávky (dvakrát denně). Maximální objem kapaliny, kterou lze jednorázově podat, závisí na velikosti pokusného zvířete. Objem by se měl udržovat co možná nejnižší a u hlodavců by obvykle neměl přesáhnout 1 ml/100 g tělesné hmotnosti (31). Kolísání objemu zkoušené chemické látky by se mělo omezit nastavením koncentrace tak, aby se zajistil konstantní objem na všech úrovních dávek. Potenciálně žíravé nebo dráždivé chemické látky jsou výjimkou a je nutné je naředit, aby se zamezilo závažným lokálním účinkům. Zkoušky při koncentracích, které by pravděpodobně vedly k poleptání nebo podráždění gastrointestinálního traktu, by se neměly provádět.
                           
                        
                     Délka studie
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Délka studie u hlodavců je obvykle 24 měsíců, což představuje větší část normální délky života používaných zvířat. Trvání studie je možné zkrátit nebo prodloužit podle délky života kmene zvířecího druhu použitého ve studii, mělo by se však uvést zdůvodnění. U určitých kmenů myší, např. AKR/J, C3H/J nebo C57BL/6J, může být vhodnější délka studie 18 měsíců. Dále jsou uvedeny pokyny ohledně délky a ukončení studie a přežití. Další pokyny včetně posouzení přijatelnosti negativní karcinogenity vzhledem k přežití ve studii jsou uvedeny v pokynech OECD č. 116 o Uspořádání a provádění studií chronické toxicity a karcinogenity (7).
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          O ukončení studie by se mělo uvažovat v případě, kdy počet přeživších zvířat ve skupinách s nižší dávkou nebo v kontrolní skupině poklesne pod 25 %.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          V případě, kdy v důsledku toxicity předčasně uhynou zvířata pouze ve skupině s vysokou dávkou, by se studie ukončit neměla.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Přežití každého pohlaví by se mělo posuzovat odděleně.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Studie by se neměla dosáhnout míry, při které již údaje ze studie nepostačují k provedení statisticky platného zhodnocení.
                                       
                                    
                        POZOROVÁNÍ
                  
                              33.
                           
                           
                              Měla by se kontrolovat morbidita nebo mortalita u všech zvířat, obvykle na začátku a na konci každého dne, včetně víkendů a svátků. Dále by se mělo jednou denně kontrolovat, zda zvířata nevykazují konkrétní příznaky toxikologického významu a v případě podání nitrožaludečně by se měla vzít v úvahu doba očekávaných maximálních účinků po podání látky. Zvláštní pozornost je třeba věnovat rozvoji nádorů a mělo by se zaznamenat, kdy se nádor objeví, kde, jeho rozměry, vzhled a progrese každého viditelného nebo hmatného tumoru.
                           
                        
                     Tělesná hmotnost, spotřeba krmiva/vody a využitelnost krmiva
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Všechna zvířata by se měla zvážit na začátku expozice, alespoň jednou týdně během prvních 13 týdnů a poté alespoň jednou měsíčně. Měření spotřeby krmiva a využitelnosti krmiva by se měla provádět alespoň jednou týdně během prvních 13 týdnů a poté alespoň jednou měsíčně. Spotřeba vody by se měla měřit alespoň jednou týdně během prvních 13 týdnů a poté alespoň jednou měsíčně, podává-li se chemická látka v pitné vodě. Měření spotřeby vody by se mělo zvážit také v případě studií, při kterých může dojít ke změně příjmu tekutin.
                           
                        
                     Hematologická, klinická biochemická vyšetření a další měření
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Aby se ze studie získalo co nejvíce informací, zejména pro úvahy o způsobu účinku, je možno dle uvážení vedoucího studie odebrat vzorky krve pro hematologická a klinická biochemická vyšetření. Rovněž může být vhodné provést rozbor moči. Další pokyny k významu odběru těchto vzorků v rámci studie karcinogenity jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7). Považuje-li se to za vhodné, je možno provést odběry vzorků pro hematologická a klinická biochemická vyšetření a rozbor moči jako součást předběžného utracení (odstavec 20) a na konci studie u nejméně 10 zvířat od každého pohlaví v každé skupině. Krevní vzorky by se měly odebírat v anestezii z určeného místa, například srdeční punkcí nebo z retroorbitálního sinu, a měly by se případně uchovávat ve vhodných podmínkách. Také je možno připravit k vyšetření krevní nátěry, zejména pokud se zdá, že je cílovým orgánem kostní dřeň, přestože hodnota takového vyšetření k zhodnocení karcinogenního/onkogenního potenciálu se zpochybňuje (32).
                           
                        PATOLOGIE
                  
                     Pitva
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              U všech zvířat zařazených do studie (kromě ověřovacích zvířat a ostatních satelitních zvířat, viz odstavec 20) se provede celková podrobná pitva zahrnující pečlivé vyšetření povrchu těla, všech otvorů a lebeční, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahu. V jednotlivých případech a dle uvážení vedoucího studie může být třeba provést pitvu ověřovacích a ostatních satelitních zvířat. Měření hmotnosti orgánů obvykle nebývá součástí studie karcinogeneze, neboť geriatrické změny a v pozdějších stádiích rozvoj nádorů maří použitelnost údajů o hmotnosti orgánů. Mohou však být velmi důležité pro hodnocení průkaznosti důkazů, a zejména pro úvahy o způsobu účinku. Jsou-li součástí satelitní studie, měly by se získat nejpozději jeden rok po zahájení studie.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Následující tkáně by se měly konzervovat v nejvhodnějším fixačním médiu s ohledem na typ tkáně a plánovaná následná histopatologická vyšetření (33) (tkáně v hranatých závorkách jsou volitelné):
                              
                                          všechny makroskopicky viditelné léze
                                       
                                       
                                          srdce
                                       
                                       
                                          slinivka břišní
                                       
                                       
                                          žaludek (předžaludek, žláznatý žaludek)
                                       
                                    
                                          nadledvinka
                                       
                                       
                                          
                                             ileum
                                          
                                       
                                       
                                          příštítná tělíska
                                       
                                       
                                          [zuby]
                                       
                                    
                                          aorta
                                       
                                       
                                          
                                             jejunum
                                          
                                       
                                       
                                          periferní nerv
                                       
                                       
                                          varlata
                                       
                                    
                                          mozek (zahrnující řezy mozkových hemisfér, mozečku a prodloužené míchy/Varolova mostu)
                                       
                                       
                                          ledviny
                                       
                                       
                                          hypofýza
                                       
                                       
                                          brzlík
                                       
                                    
                                          slepé střevo
                                       
                                       
                                          slzní žláza (extraorbitální)
                                       
                                       
                                          prostata
                                       
                                       
                                          štítná žláza
                                       
                                    
                                          cervix
                                       
                                       
                                          játra
                                       
                                       
                                          rektum
                                       
                                       
                                          [jazyk]
                                       
                                    
                                          koagulační žláza
                                       
                                       
                                          plíce
                                       
                                       
                                          slinná žláza
                                       
                                       
                                          průdušnice
                                       
                                    
                                          tlusté střevo
                                       
                                       
                                          lymfatické uzliny (povrchové i hluboké)
                                       
                                       
                                          semenný váček
                                       
                                       
                                          močový měchýř
                                       
                                    
                                          dvanáctník
                                       
                                       
                                          prsní žláza (povinné u samic a, je-li zřejmé, že je možné ji vypreparovat, i u samců)
                                       
                                       
                                          kosterní sval
                                       
                                       
                                          děloha (včetně hrdla děložního)
                                       
                                    
                                          nadvarle
                                       
                                       
                                          [horní cesty dýchací, včetně nosu, nosních skořep a vedlejších dutin nosních]
                                       
                                       
                                          kůže
                                       
                                       
                                          [močovod]
                                       
                                    
                                          oko (včetně sítnice)
                                       
                                       
                                          jícen
                                       
                                       
                                          mícha (ve třech úrovních: krční, střední hrudní a bederní)
                                       
                                       
                                          [močová trubice]
                                       
                                    
                                          [femur s kloubem]
                                       
                                       
                                          [Bulbus olfactorius]
                                       
                                       
                                          slezina
                                       
                                       
                                          pochva
                                       
                                    
                                          žlučník (u jiných druhů než potkan)
                                       
                                       
                                          vaječníky
                                       
                                       
                                          [sternum],
                                       
                                       
                                          řez kostní dření a/nebo čerstvý aspirát kostní dřeni
                                       
                                    
                                          Harderova žláza
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    V případě párových orgánů, např. ledvin či nadledvinek, by se měly uchovávat oba orgány. Na základě klinických nebo jiných nálezů může být nezbytné zkoumat i další tkáně. Také by se měly uchovat všechny orgány považované na základě známých vlastností zkoušené chemické látky za možné cílové orgány. Ve studiích s dermální cestou aplikace by se měl zachovat seznam orgánů stanovený pro orální cestu, a navíc je nezbytné odebrat a konzervovat vzorky kůže z místa aplikace. V inhalačních studiích by se měl seznam tkání z dýchacích cest určených ke konzervaci a vyšetření řídit doporučeními v kapitole B.8 a B.29 této přílohy. Co se týká ostatních orgánů/tkání (kromě specificky konzervovaných tkání z dýchacích cest) by se měly vyšetřit orgány uvedené na seznamu orgánů určeném pro orální cestu.
                           
                        
                     Histopatologické vyšetření
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Jsou k dispozici pokyny ohledně osvědčených postupů při provádění toxikologických patologických studií (33). Měly by se vyšetřit minimálně tyto tkáně:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          všechny tkáně ve skupinách s vysokou dávkou zkoušené chemické látky a kontrolních skupinách,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všechny tkáně zvířat uhynulých nebo utracených během studie,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všechny tkáně vykazující makroskopické abnormality včetně nádorů,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pokud jsou ve skupině s vysokou dávkou pozorovány histopatologické změny související s expozicí, měly by se stejné tkáně vyšetřit u všech zvířat ve všech ostatních exponovaných skupinách,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          v případě párových orgánů, např. ledvin, nadledvinek, by se měly vyšetřit oba orgány.
                                       
                                    
                        ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ
                  
                     Údaje
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Měly by se uvést údaje o všech hodnocených parametrech u každého jednotlivého zvířete. Kromě toho by se měly všechny údaje shrnout do tabulky, přičemž se uvede u každé experimentální skupiny počet zvířat na začátku zkoušky, počet zvířat nalezených uhynulých v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních důvodů a doba úmrtí nebo utracení, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, popis příznaků toxicity, včetně doby nástupu, trvání a závažnosti každého toxického účinku, počet zvířat vykazujících léze, typ lézí a procento zvířat vykazujících příslušný typ léze. Tabulky se souhrnnými údaji by měly uvádět průměrné hodnoty a směrodatné odchylky (u průběžných dat ze zkoušky) u zvířat vykazujících toxické účinky nebo léze a také klasifikaci lézí.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Pro interpretaci výsledků studie mohou být cenná historická kontrolní data, např. v případě, kdy existují známky toho, že souběžné kontroly se značně liší od posledních údajů získaných u kontrolních zvířat ze stejného zkušebního zařízení/kolonie. Historická kontrolní data, pokud se hodnotí, by měla být ze stejné laboratoře a měla by pocházet ze studie používající zvířata stejného věku a stejného kmene a měla by být z období pěti let předcházejících příslušné studii.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Číselné výsledky by měly být pokud možno vyhodnoceny vhodnou a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistické metody a data, která se mají analyzovat, by se měly zvolit již při plánování studie (odstavec 9). Tento výběr by měl zahrnovat rezervu pro případné úpravy v závislosti na přežití.
                           
                        
                     Protokol o zkoušce
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Protokol o zkoušce by měl obsahovat tyto údaje:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkoušená chemická látka:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikální povaha, čistota a fyzikálně-chemické vlastnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikační údaje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj chemické látky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      číslo šarže,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      certifikát o chemické analýze.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosič (je-li použit):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění výběru nosiče (pokud je jiný než voda).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Pokusná zvířata:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použité druhy/kmen a zdůvodnění výběru,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet, věk, a pohlaví zvířat na začátku zkoušky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj, podmínky chovu, strava atd.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      individuální hmotnosti zvířat na začátku zkoušky.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkušební podmínky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění způsobu podávání a výběru dávky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      případně statistické metody použité k analýze dat,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobnosti o použité formě zkoušené chemické látky/úpravě krmiva,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analytické údaje o dosažené koncentraci, stabilitě a homogenitě přípravku,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      cesta podání a podrobné údaje o podávání zkoušené chemické látky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      u inhalačních studií informace o tom, zda byla expozice pouze nazální cestou, nebo celotělová,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skutečné dávky (mg/kg tělesné hmotnosti/den) a případně koeficient přepočtu koncentrace zkoušené chemické látky v krmivu/pitné vodě (mg/kg nebo ppm) na skutečnou dávku (mg/kg tělesné hmotnosti/den),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné údaje o kvalitě krmiva a vody.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky (měly by se předložit souhrnné tabulky údajů a údaje pro jednotlivá zvířata)
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Obecné
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o přežití,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tělesná hmotnost/změny tělesné hmotnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      spotřeba krmiva, výpočty využitelnosti krmiva, pokud byly provedeny, a případně spotřeba vody, pokud se uplatňuje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toxikokinetické údaje, jsou-li k dispozici,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oftalmoskopické vyšetření (je-li k dispozici),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematologická vyšetření (jsou-li k dispozici),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klinická biochemická vyšetření (jsou-li k dispozici).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Klinické nálezy
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      známky toxicity,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      incidence (plus závažnost, je-li hodnocena) jakékoli abnormality,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      povaha, závažnost a trvání pozorovaných klinických příznaků (zda byly přechodné, nebo trvalé).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Pitevní údaje
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      konečná tělesná hmotnost,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hmotnosti orgánů a jejich poměry, pokud se stanovují,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pitevní nálezy; incidence a závažnost abnormalit.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Histopatologické vyšetření
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      histopatologické nálezy, které nejsou neoplastické,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      neoplastické histopatologické nálezy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vzájemný vztah mezi makroskopickými a mikroskopickými nálezy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobný popis všech histopatologických nálezů souvisejících s expozicí, včetně klasifikace závažnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zprávy o všech odborných revizích vzorků.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Statistické zpracování výsledků dle potřeby
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Diskuse o výsledcích zahrnující
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      diskuse o jakýchkoli modelovacích přístupech,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vztahy mezi dávkou a odezvou,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      historické kontrolní údaje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      posouzení jakýchkoli informací o způsobu účinku,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stanovení BMD, NOAEL nebo LOAEL,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      význam pro člověka.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Závěry
                                          
                                       
                                    
                        
                     LITERATURA:
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32:
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Kapitola B.27 této přílohy, Zkouška subchronické orální toxicity studie orální toxicity na nehlodavcích (90denní opakovaná aplikace).
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, k dispozici na veřejných webových stránkách OECD s pokyny ke zkoušení na adrese www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Kapitola B.8 této přílohy, Subakutní inhalační toxicita: 28denní opakovaná aplikace.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Kapitola B.29 této přílohy, Subchronická inhalační toxicita: 90denní studie.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Kapitola B.9 této přílohy, Dermální toxicita (28denní opakovaná aplikace).
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793-801.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.
                           
                        
                              19)
                           
                           
                              Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98.
                           
                        
                              20)
                           
                           
                              OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
                           
                        
                              21)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              22)
                           
                           
                              Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 - 837.
                           
                        
                              23)
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              24)
                           
                           
                              Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1):214.
                           
                        
                              25)
                           
                           
                              Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284.
                           
                        
                              26)
                           
                           
                              Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196-1203.
                           
                        
                              27)
                           
                           
                              Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU ze dne 22. září 2010 o ochraně zvířat používaných pro vědecké účely, Úř. věst. L 276, 20.10.2010, s. 33.
                           
                        
                              28)
                           
                           
                              National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington, D.C., US Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              29)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
                           
                        
                              30)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              31)
                           
                           
                              Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.
                           
                        
                              32)
                           
                           
                              Weingand K, et al. (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198-201.
                           
                        
                              33)
                           
                           
                              Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P, et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131.
                           
                        
                     Dodatek 1
                     DEFINICE
                     Zkoušená chemická látka: Jakákoli látka nebo směs zkoušená pomocí této zkušební metody.
                  
                  B.33   KOMBINOVANÉ STUDIE CHRONICKÉ TOXICITY A KARCINOGENITY
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda odpovídá Pokynům OECD pro zkoušení (TG) 453 (2009). Původní Pokyny pro zkoušení 453 byly schváleny v roce 1981. Revize zkušební metody B.33 byla považována za nezbytnou k zohlednění nejnovějšího vývoje v oblasti zajištění dobrých životních podmínek zvířat a regulačních požadavků (1), (2), (3), (4), (5). Aktualizace této zkušební metody B.33 se prováděla paralelně s revizemi kapitoly B.32 této přílohy, Studie karcinogenity, a kapitoly B.30 této přílohy, Studie chronické toxicity, s cílem získat další informace o zvířatech použitých ve studii a poskytnout další podrobnosti o výběru dávky. Tato zkušební metoda je určena ke zkouškám širokého spektra chemických látek, včetně pesticidů a průmyslových chemikálií. V případě farmaceutik se však některé detaily a požadavky mohou lišit (viz pokyny S1B Mezinárodní konference o harmonizaci (ICH) testování karcinogenity léků).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Většina studií chronické toxicity a karcinogenity se provádí na různých druzích hlodavců a tato zkušební metoda je proto primárně určena k použití ve studiích prováděných právě na těchto druzích. Je-li třeba tyto studie provést na nehlodavcích, lze rovněž použít principy a postupy uvedené v této zkušební metodě spolu s těmi, které jsou uvedeny v kapitole B.27 této přílohy, Studie orální toxicity na nehlodavcích – 90denní opakovaná aplikace (6), jak je uvedeno v pokynech OECD Pokyny č. 116 o přípravě a provádění studií chronické toxicity a karcinogenity (7).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Třemi hlavními způsoby podávání používanými ve studiích chronické toxicity/karcinogenity jsou orální podávání, dermální aplikace a inhalační podávání. Výběr cesty podání závisí na fyzikálních a chemických vlastnostech zkoušené chemické látky a na převládající cestě expozice u lidí. Další informace o výběru cesty expozice jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda se zaměřuje na expozici orální cestou, což je cesta, která se ve studiích chronické toxicity a karcinogenity používá nejběžněji. Přestože dlouhodobé studie zahrnující expozici dermální nebo inhalační cestou mohou být pro posouzení rizik pro lidské zdraví rovněž nezbytné a/nebo mohou být vyžadovány v rámci určitých regulačních režimů, jsou studie používající tyto cesty expozice značně technicky složité. Takové studie je třeba navrhovat individuálně pro daný případ, přestože zde uvedená zkušební metoda pro posouzení a vyhodnocení chronické toxicity a karcinogenity při orálním podávání by mohla tvořit základ protokolu pro studie inhalační a/nebo dermální, pokud jde o doporučení pro období expozice, klinické a patologické parametry atd. Jsou k dispozici pokyny OECD týkající se podávání zkoušených chemických látek inhalační (7), (8) a dermální cestou (7). Při navrhování dlouhodobých studií zahrnujících expozici inhalační cestou by se mělo konkrétně nahlédnout do kapitoly B.8 této přílohy (9) a kapitoly B.29 této přílohy (10) a rovněž do pokynů OECD ke zkouškám akutní inhalační toxicity (8). V případě, že se zkoušky provádějí dermální cestou, je třeba nahlédnout do kapitoly B.9 této přílohy (11).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Kombinovaná studie chronické toxicity/karcinogenity poskytuje informace o možných rizicích pro zdraví, která mohou pravděpodobně vzniknout při opakované expozici trvající až po celou dobu života použitého druhu. Studie rovněž poskytne informace o toxických účincích zkoušené chemické látky včetně potenciální karcinogenity a určí cílové orgány a možnost akumulace. Může také poskytnout odhad hodnoty dávky bez pozorovaných nepříznivých účinků pro toxické účinky a v případě negenotoxických karcinogenů pro nádorové odezvy, což lze použít při stanovení kritérií pro bezpečnou expozici člověka. Důraz se klade také na pečlivé klinické pozorování zvířat s cílem získat co nejvíce informací.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Cíle studií chronické toxicity/karcinogenity zahrnutých v této zkušební metodě jsou:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikace karcinogenních vlastností zkoušené chemické látky vedoucích ke zvýšenému výskytu novotvarů, zvýšenému podílu maligních novotvarů nebo snížení doby do vzniku novotvarů ve srovnání se souběžnými kontrolními skupinami,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikace doby do vzniku novotvarů,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikace chronické toxicity zkoušené chemické látky,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikace cílového orgánu (cílových orgánů) chronické toxicity a karcinogenity,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          charakterizace vztahu mezi dávkou a odezvou,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          určení hodnoty dávky bez pozorovaného nepříznivého účinku (NOAEL) nebo výchozího bodu pro stanovení referenční dávky (BMD),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          extrapolace karcinogenních účinků na nízké úrovně expozice člověka,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          předpověď chronických toxických účinků na úrovních expozice člověka,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          získání údajů ke zkoušení hypotéz ohledně způsobu účinku (2), (7), (12), (13), (14), (15).
                                       
                                    
                        VÝCHOZÍ ÚVAHY
                  
                              7.
                           
                           
                              Před zahájením studie by měla laboratoř provádějící zkoušky vzít v úvahu při posuzování a hodnocení potenciální karcinogenity a chronické toxicity zkoušené chemické látky všechny dostupné informace o zkoušené chemické látce, aby zaměřila uspořádání studie směrem k účinnějšímu zkoušení jejích toxikologických vlastností a minimalizovala použití zvířat. Obzvlášť důležité jsou informace o způsobu účinku potenciálního karcinogenu a jeho posouzení (2), (7), (12), (13), (14), (15), neboť optimální uspořádání studie se může lišit podle toho, zda je zkoušená chemická látka známý genotoxický karcinogen nebo je u ní pouze podezření na genotoxickou karcinogenitu. Další pokyny k rozvahám o způsobu účinku jsou uvedeny v pokynech č. 116 (7).
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Informace, které pomůžou při utváření plánu studie, zahrnují identitu, chemickou strukturu a fyzikálně-chemické vlastnosti zkoušené chemické látky, všechny informace o způsobu účinku, výsledky jakýchkoli testů toxicity včetně testů genotoxicity in vitro nebo in vivo, předpokládaná použití a potenciální expozici u člověka, dostupné údaje (Q)SAR, údaje o mutagenitě/genotoxicitě, karcinogenitě a další toxikologické údaje o strukturně příbuzných chemických látkách, dostupné toxikokinetické údaje (kinetika při jednorázové dávce a rovněž při opakovaných dávkách, je-li k dispozici) a údaje získané v jiných studiích s opakovanou expozicí. Stanovení chronické toxicity/karcinogenity by se mělo provádět pouze poté, co byly získány úvodní informace o toxicitě z 28denních a/nebo 90denních zkoušek toxicity po opakované dávce. Krátkodobé zkoušky iniciace – propagace mohou rovněž poskytnout užitečné informace. Jako součást celkového zhodnocení potenciálních nepříznivých účinků konkrétní zkoušené chemické látky na zdraví by se měl zvážit postup zkoušení prováděný po fázích při zkouškách karcinogenity (16), (17), (18), (19).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Nejvhodnější statistické metody pro analýzu výsledků s ohledem na uspořádání a cíle experimentu by se měly stanovit před zahájením studie. Je třeba zvážit, zda by měla statistika zahrnovat korekci na přežití, analýzu kumulativních nádorových rizik ve vztahu k době přežití, analýzu doby do vzniku nádoru a analýzu v případě předčasného ukončení zkoušky u jedné nebo více skupin. Pokyny ohledně vhodných statistických analýz a klíčové odkazy na mezinárodně uznávané statistické metody jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7) a rovněž v Pokynech č. 35 o analýze a hodnocení studií chronické toxicity a karcinogenity (20).
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Při provádění studie karcinogenity je nutné řídit se vždy vůdčími principy a úvahami uvedenými v Pokynech OECD o rozpoznání, vyšetření a použití klinických příznaků jako lidských cílových parametrů u pokusných zvířat používaných při hodnocení bezpečnosti (21), zejména v odstavci 62 těchto pokynů. Tento odstavec uvádí, že „Ve studiích zahrnujících opakované podávání dávky by se mělo v případě, kdy zvíře vykazuje klinické příznaky, které jsou progresivní a vedou k dalšímu zhoršení jeho stavu, učinit informované rozhodnutí, zda zvíře humánně utratit, či ne. Toto rozhodnutí by mělo obsahovat posouzení hodnoty informací, které se získají, bude-li se zvíře i nadále udržovat ve studii, oproti jeho celkovému stavu. Dospěje-li se k rozhodnutí, pokračovat u zvířete ve zkoušce, měla by se dle potřeby zvýšit četnost pozorování. Rovněž je možné, aniž by to nepříznivě ovlivnilo účel zkoušky, dočasně pozastavit podávání dávky, jestliže to zmírní bolest či utrpení, nebo snížit zkoušenou dávku.“
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Podrobné pokyny a diskuse o principech výběru dávky pro studie chronické toxicity a karcinogenity naleznete v Pokynech č. 116 (7) a rovněž ve dvou publikacích ústavu International Life Sciences Institute (22), (23). Hlavní strategie výběru dávky závisí na primárním cíli nebo cílech studie (odstavec 6). Při výběru vhodných úrovní dávky by se mělo dosáhnout rovnováhy mezi screeningem nebezpečnosti na straně jedné a charakterizací odezvy na nízkou dávku a jejich významu na straně druhé. To je důležité zejména v případě kombinované studie chronické toxicity a karcinogenity.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Je třeba zvážit možnost provedení této kombinované studie chronické toxicity a karcinogenity, namísto odděleného provádění studie chronické toxicity (kapitola B.30 této přílohy) a studie karcinogenity (kapitola B.32 této přílohy). Kombinovaná zkouška zajišťuje větší efektivitu ve smyslu času a nákladů a určité omezení použití zvířat v porovnání s prováděním dvou samostatných studií a zároveň nezhoršuje kvalitu údajů ani ve fázi zkoušení chronické toxicity, ani ve fázi zkoušení karcinogenity. Při provádění kombinované studie chronické toxicity a karcinogenity však je třeba pečlivě zvážit zásady výběru dávky (odstavce 11 a 22–26) a rovněž se uznává, že v určitých regulačních rámcích mohou být vyžadovány samostatné studie. Další pokyny o uspořádání kombinované studie chronické toxicity a karcinogenity s cílem dosáhnout maximální efektivity studie ve smyslu možností snížení počtu použitých zvířat a rovněž úpravou různých experimentálních postupů naleznete v Pokynech č. 116 (7).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Definice použité v kontextu této zkušební metody naleznete na konci této kapitoly a v Pokynech č. 116 (7).
                           
                        PODSTATA ZKOUŠKY
                  
                              14.
                           
                           
                              Plán studie se skládá ze dvou paralelních fází, chronické fáze a fáze karcinogenity (jejich délka viz odstavec 34 a 35). Zkoušená chemická látka se obvykle podává orální cestou, avšak zkoušky inhalační nebo dermální cestou mohou být také vhodné. V chronické fázi se zkoušená chemická látka podává denně v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat, jedna úroveň dávky na každou skupinu, obvykle po dobu 12 měsíců, avšak je možné zvolit i delší nebo kratší dobu expozice v závislosti na regulačních požadavcích (viz odstavec 34). Tato doba trvání by se měla zvolit dostatečně dlouhá na to, aby umožnila manifestaci jakýchkoli účinků kumulativní toxicity bez zkreslujících příznaků geriatrických změn. Plán studie může rovněž zahrnovat jedno nebo více předběžných utracení, např. za 3 a 6 měsíců, a je možné přidat další skupiny zvířat, aby se tato skutečnost kompenzovala (viz odstavec 20. Ve fázi karcinogenity se zkoušená chemická látka se podává denně několika skupinám pokusných zvířat po většinu jejich života. Zvířata se v obou fázích pečlivě sledují s ohledem na příznaky toxicity a rozvoj neoplastických lézí. Zvířata, která v průběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena, se pitvají a na konci zkoušky se přeživší zvířata utratí a rovněž pitvají.
                           
                        POPIS METODY
                  
                     Výběr zvířecích druhů
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda se primárně zabývá posouzením a vyhodnocením toxicity a karcinogenity u hlodavců (odstavec 2). Použití nehlodavců lze zvážit, pokud dostupné údaje naznačují, že jsou pro předpověď účinků na lidské zdraví vhodnější. Výběr druhu by měl být zdůvodněn. Upřednostňovaným druhem hlodavců je potkan, ale lze použít i jiný druh hlodavců, např. myš. Přestože použití myší ve zkouškách karcinogenity může mít omezený užitek (24), (25), (26), jsou v některých stávajících regulačních programech zkoušky karcinogenity na myších ještě stále vyžadovány, pokud se neprokáže, že taková studie není z vědeckého hlediska nezbytná. Krysy a myši jsou upřednostňovanými experimentálními modelovými organismy díky své relativně krátké době života, široce rozšířenému použití ve farmakologických a toxikologických studiích, citlivosti k indukci nádoru a dostupnosti dostatečně charakterizovaných kmenů. V důsledku těchto vlastností je k dispozici velké množství informací o jejich fyziologii a patologii. Plán a provedení studií chronické toxicity/karcinogenity u nehlodavců, jsou-li požadovány, by měly vycházet z principů uvedených v této zkušební metodě spolu s principy v kapitole B.27 této přílohy, 90denní studie orální toxicity po opakované aplikaci na nehlodavcích (6). Další informace o výběru druhu a kmene jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7).
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Měla by se použít mladá zdravá dospělá zvířata běžně používaných laboratorních kmenů. Kombinovaná studie chronické toxicity/karcinogenity by se měla provádět na zvířatech ze stejného kmene a zdroje, jako byla zvířata použitá v kratších předběžných studiích toxicity, přestože je-li známo, že zvířata z tohoto kmene a zdroje mívají potíže dosáhnout běžně uznávaných kritérií přežití v dlouhodobých studiích [viz Pokyny č. 116 (7)], měla by se zvážit možnost použít takový kmen zvířat, který má přijatelnou míru přežití v dlouhodobé studii. Samice musí být nullipary a nesmějí být březí.
                           
                        
                     Podmínky chovu a krmení
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Zvířata lze chovat jednotlivě nebo v klecích po malých skupinkách jedinců stejného pohlaví. Individuální chov by se měl použít pouze, pokud je to vědecky odůvodněné (27), (28), (29). Klece by měly být uspořádány tak, aby byl případný vliv jejich polohy minimalizován. Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla být 22 °C (± 3 °C). Relativní vlhkost vzduchu by měla být minimálně 30 % a pokud možno nepřesáhnout 70 % kromě doby úklidu místnosti, cílem by měla být hodnota 50–60 %. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní stravu s neomezenou dodávkou pitné vody. Strava by měla splňovat všechny nutriční požadavky zkoušených druhů a obsah příměsí ve stravě zahrnující mimo jiné zbytky pesticidů, perzistentní organopolutanty, fytoestrogeny, těžké kovy a mykotoxiny, které mohou ovlivnit výsledek zkoušky, by měl být co možná nejnižší. Pravidelně by se měly získávat analytické informace o nutričních hodnotách stravy a množství příměsí ve stravě, alespoň na začátku studie a pokaždé, když se změní používaná šarže, a měly by se začlenit do závěrečné zprávy. Obdobně by se měly poskytnout analytické informace o pitné vodě. Výběr stravy může být ovlivněn nutností zajistit vhodnou přísadu zkoušené chemické látky, podává-li se látka v krmivu, a splnit nutriční potřeby zvířat.
                           
                        
                     Příprava zvířat
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Použijí se zdravá zvířata, která se alespoň 7 dnů aklimatizovala na laboratorní podmínky a která nebyla dříve podrobena žádným experimentálním postupům. V případě hlodavců by se mělo podávání látky zahájit co možná nejdříve po jejich odstavení a aklimatizaci, nejlépe před dosažením stáří 8 týdnů. Pokusná zvířata by měla být charakterizována podle druhu, kmenu, původu, pohlaví, hmotnosti a stáří. Na začátku studie by měly být odchylky hmotnosti zvířat u každého pohlaví minimální a neměly by překročit ± 20 % průměrné hmotnosti pro všechna zvířata ve studii, pro každé pohlaví zvlášť. Zvířata by měla náhodným výběrem rozdělit do kontrolních a experimentálních skupin. Po randomizaci by neměly být výrazné rozdíly v průměrných hodnotách tělesné hmotnosti mezi skupinami v rámci každého pohlaví. Existují-li statisticky významné rozdíly, měla by se randomizace pokud možno zopakovat. Každému zvířeti by se mělo přidělit jedinečné identifikační číslo a mělo by se tímto číslem trvale označit pomocí tetování, implantací mikročipu nebo jinou vhodnou metodou.
                           
                        POSTUP
                  
                     Počet a pohlaví zvířat
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Měla by se použít obě pohlaví. Měl by se použít dostatečný počet zvířat umožňující důkladné biologické a statistické vyhodnocení. U hlodavců by proto každá exponovaná skupina (jak je uvedeno v odstavci 22) a souběžná kontrolní skupina určená k fázi karcinogenity měla obsahovat alespoň 50 zvířat od každého pohlaví. V závislosti na cíli studie může být možné zvýšit statistickou sílu klíčových odhadů rozdělením zvířat nerovnoměrně do skupin s různou dávkou, přičemž do skupin s nízkou dávkou se zařadí více než 50 zvířat, např. aby se odhadl karcinogenní potenciál při nízkých dávkách. Je však třeba přiznat, že mírné zvýšení velikosti skupiny povede pouze k relativně malému zvýšení statistické síly studie. V případě hlodavců by každá exponovaná skupina (jak je uvedeno v odstavci 22) a souběžná kontrolní skupina určená k fázi chronické toxicity měla obsahovat alespoň 10 zvířat od každého pohlaví. Je třeba upozornit, že je tento počet nižší než ve studii chronické toxicity (kapitola 30 této přílohy). Interpretace údajů pocházejících od omezeného počtu zvířat v každé skupině ve fázi chronické toxicity této kombinované studie však bude podepřena také údaji od většího počtu zvířat z fáze karcinogenity této studie. Ve studiích používajících myši může být nutné přidat další zvířata do každé exponované skupiny ve fázi chronické toxicity, aby se mohla provést všechna požadovaná hematologická vyšetření. Další informace o statistickém uspořádání studie a výběru úrovní dávek k maximalizaci statistické síly jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7).
                           
                        
                     Zajištění předběžných utracení, satelitní skupiny a ověřovacích zvířat
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Studie může zajistit zvířata pro předběžná utracení např. v 6. měsíci fáze chronické toxicity, aby se získaly informace o progresi non-neoplastických změn a mechanistické informace, je-li to vědecky odůvodněné. Jsou-li tyto informace již k dispozici z předchozích studií toxicity zkoušené chemické látky po opakovaných dávkách, nemusí být předběžná utracení vědecky odůvodněná. Zvířata použitá ve fázi chronické toxicity této studie trvající obvykle 12 měsíců (odstavec 34) poskytnou údaje z předběžného utracení pro fázi karcinogenity této studie, čímž se dosáhne snížení celkového počtu použitých zvířat. Do fáze chronické toxicity studie lze rovněž zařadit satelitní skupiny za účelem sledování reverzibility jakýchkoli toxikologických změn vyvolaných zkoušenou chemickou látkou, která se zkoumá. Tyto skupiny mohou být omezeny pouze na nejvyšší úroveň dávky ve studii a kontrolu. Také je možno zařadit do studie další skupinu ověřovacích zvířat (obvykle 5 zvířat od každého pohlaví) k monitorování stavu onemocnění v průběhu studie, je-li to nutné (30). Další pokyny o uspořádání studie tak, aby zahrnovalo předběžná utracení, satelitní a ověřovací zvířata a zároveň se minimalizoval celkový počet použitých zvířat, jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7).
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Pokud jsou v plánu studie zahrnuta satelitní zvířata a/nebo předběžná utracení zvířat, činí počet zvířat v každé exponované skupině určených k tomuto účelu obvykle 10 zvířat od každého pohlaví a celkový počet zvířat zařazených do studie je nutno zvýšit o počet zvířat, která budou usmrcena před ukončením studie. U předběžně utracených a satelitních zvířat by se měly obvykle sledovat stejné parametry, jako u zvířat ve fázi chronické toxicity v hlavní studii, mezi něž patří tělesná hmotnost, spotřeba krmiva/vody, hematologická a klinická biochemická měření a patologická vyšetření, nicméně měření se mohou také omezit (ve skupinách určených k předběžnému utracení) na konkrétní klíčové parametry, jakými jsou neurotoxicita a imunotoxicita.
                           
                        
                     Dávkové skupiny a dávkování
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Pokyny ohledně veškerých aspektů výběru dávky a odstupňování úrovní dávek jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7). V chronické fázi i ve fázi karcinogenity by se měly použít alespoň tři úrovně dávek a souběžná kontrola. Úrovně dávek budou obecně vycházet z výsledků krátkodobých studií při opakované aplikaci nebo ze studií k stanovení rozsahu dávkování a měly by zohlednit jakékoli existující toxikologické a toxikokinetické údaje dostupné pro zkoušenou sloučeninu nebo příbuzné materiály.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              V případě studie pro fázi chronické toxicity nemusí být úplná studie s použitím tří úrovní dávek nutná, pokud lze předpokládat, že zkouška provedená při jedné úrovni dávky nejméně 1 000 mg na kg tělesné hmotnosti na den pravděpodobně nevyvolá nepříznivé účinky. Tato úvaha by se měla zakládat na informacích z předběžných studií a předpoklad, že k toxicitě nedojde, by měl vycházet z údajů od strukturně příbuzných chemických látek. Mezní dávka 1 000 mg/kg tělesné hmotnosti/den se může použít s výjimkou případu, kdy údaje o expozici člověka naznačují, že je nezbytné použití vyšší úrovně dávek.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Nebrání-li tomu fyzikálně-chemická povaha nebo biologické účinky zkoušené chemické látky, měla by se zvolit nejvyšší úroveň dávky za účelem identifikace hlavních cílových orgánů a toxických účinků, která by však zároveň neměla vést k utrpení, závažné toxicitě, morbiditě nebo uhynutí. Obvykle by se měla vybrat taková nejvyšší dávka, aby vyvolala příznaky toxicity, např. pokles přírůstku tělesné hmotnosti (přibližně 10 %). Nicméně v závislosti na cílech studie (viz odstavec 6) je možno zvolit nejvyšší dávku nižší, než je dávka podávající důkaz o toxicitě, např. jestliže dávka vyvolává nepříznivý účinek, který však má jen malý dopad na délku života nebo tělesnou hmotnost.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Úrovně dávek a odstupňování úrovní dávek lze vybrat tak, aby mohly být stanoveny vztah mezi dávkou a odezvou a v závislosti na způsobu účinku zkoušené chemické látky také NOAEL nebo jiné plánované výsledky studie, např. BMD (viz odstavec 27). Mezi faktory, které by se měly zvážit při určování nižších dávek, patří předpokládaná směrnice křivky závislosti odezvy na dávce, dávky, při nichž mohou nastat důležité změny v metabolismu nebo ve způsobu toxického účinku, u nějž se předpokládá prahová hodnota, nebo dávky, u nichž předpokládá výchozí bod pro extrapolaci do oblasti nízkých dávek. Při provádění kombinované studie karcinogenity/chronické toxicity je hlavním cílem získat informace pro účely posouzení rizika karcinogenity a informace o chronické toxicitě jsou obvykle vedlejším cílem. Tuto skutečnost je třeba mít ve studii na paměti při výběru úrovní dávek a jejich odstupňováním.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Interval mezi jednotlivými úrovněmi dávek bude záviset na cílech studie a vlastnostech zkoušené chemické látky a není možné je v této zkušební metodě předepsat, avšak dvou až čtyřnásobné intervaly obvykle vedou k dobré funkčnosti zkoušky, použijí-li se k nastavení sestupných úrovní dávek, a často se upřednostňuje zařazení čtvrté zkušební skupiny před použitím velmi velkých intervalů (např. více než faktor přibližně 6–10) mezi dávkami. Obecně je třeba vyhnout se použití faktorů větších než 10 a jejich případné použití by se mělo zdůvodnit.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Jak je dále uvedeno v Pokynech č. 116 (7), je třeba při výběru dávky zvážit tyto body:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          známá nebo předpokládaná nelinearita či inflexní body na křivce závislosti odezvy na dávce,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toxikokinetika a rozsahy dávkování, při kterých dochází nebo nedochází k metabolické indukci, saturaci nebo nelinearitě mezi vnějšími a vnitřními dávkami,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          prekurzorové léze, známky účinku nebo indikátory probíhajících klíčových základních biologických procesů,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          klíčové (nebo předpokládané) aspekty způsobu účinku, například dávky, při kterých začíná vzrůstat cytotoxicita, narušují se hladiny hormonů, homeostatické mechanismy jsou ochromeny atd.,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          oblasti křivky závislosti odezvy na dávce, kde je nutný obzvlášť robustní odhad, např. v rozsahu předpokládané BMD nebo prahové hodnoty,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          zvážení předpokládaných úrovní expozice člověka, zejména při výběru středních a nízkých dávek.
                                       
                                    
                        
                              28.
                           
                           
                              Kontrolní skupina je neexponovaná skupina nebo kontrolní skupina s nosičem, pokud se nosič při podávání zkoušené chemické látky používá. S výjimkou aplikace zkoušené chemické látky je třeba se zvířaty v kontrolní skupině zacházet stejným způsobem jako se zvířaty v experimentálních skupinách. Používá-li se nosič, podá se kontrolní skupině v nejvyšším používaném objemu v rámci skupin. Jestliže se zkoušená chemická látka podává v krmivu a způsobuje podstatné snížení příjmu potravy v důsledku snížené chutnosti krmiva, může být užitečné použít další kontrolní skupinu krmenou tak, aby měla stejně snížený příjem potravy, která poslouží jako vhodnější kontrola.
                           
                        
                     Příprava dávek a podávání zkoušené chemické látky
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Zkoušená chemická látka se obvykle podává orálně, v krmivu či v pitné vodě, nebo žaludeční sondou. Další informace o cestách a způsobech podání jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7). Cesta a způsob podání závisí na účelu studie, fyzikálně-chemických vlastnostech zkoušené chemické látky, její biologické dostupnosti a převládající cestě a způsobu expozice člověka. Mělo by se uvést zdůvodnění zvolené cesty a způsobu podání. V zájmu zajištění dobrých životních podmínek zvířat by se mělo podávání žaludeční sondou zvolit pouze u těch látek, u nichž tato cesta a způsob podání náležitě reprezentují potenciální expozici člověka (např. farmaceutika). Chemické látky, které se nacházejí v potravě nebo v životním prostředí, včetně pesticidů, se obvykle podávají v krmivu nebo pitné vodě. Nicméně u některých scénářů expozice, např. expozice na pracovišti, mohou být vhodnější jiné cesty podání.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Zkoušená chemická látka se v případě potřeby rozpustí nebo suspenduje ve vhodném nosiči. Je třeba podle potřeby zvážit následující vlastnosti nosiče nebo jiných přídatných látek: účinky na absorpci, distribuci, metabolismus nebo retenci zkoušené chemické látky, účinky na chemické vlastnosti zkoušené chemické látky, které mohou změnit její toxické vlastnosti a účinky na konzumaci krmiva nebo vody či na nutriční stav zvířat. Je-li to možné, doporučuje se zvážit nejprve použití vodného roztoku/suspenze, poté použití roztoku/emulze v oleji (např. v kukuřičném oleji) a nakonec roztoku v jiných nosičích. U nosičů jiných než voda je nutné znát jejich toxické vlastnosti. Měly by být k dispozici informace o stabilitě zkoušené chemické látky a homogenitě podávaných roztoků nebo krmiva (dle potřeby) za podmínek podávání (např. v krmivu).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              U látek podávaných v krmivu nebo v pitné vodě je důležité zajistit, aby množství použité zkoušené chemické látky neovlivňovalo normální výživu nebo vodní rovnováhu. V dlouhodobých studiích toxicity s podáváním látky v krmivu by koncentrace zkoušené chemické látky v krmivu obvykle neměla přesáhnout horní mez 5 % celkového množství krmiva, aby se zabránilo nutriční nerovnováze. Podává-li se zkoušená chemická látka v krmivu, může se použít buď konstantní koncentrace v krmivu (mg/kg krmiva nebo ppm), nebo konstantní dávkování vzhledem k tělesné hmotnosti zvířete (mg/kg tělesné hmotnosti) vypočítané jednou týdně. Použitá možnost by se měla specifikovat.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              V případě orálního podávání se zvířatům podává zkoušená chemická látka denně (sedm dnů v každém týdnu) po dobu 12 měsíců (chronická fáze) nebo 24 měsíců (fáze karcinogenity), viz také odstavec 33 a 34. Jakýkoli jiný režim dávkování, např. pět dní v týdnu, musí být zdůvodněn. V případě dermální aplikace se zvířata vystavují zkoušené chemické látce alespoň po dobu 6 hodin denně, 7 dnů v týdnu, jak je specifikováno v kapitole B.9 této přílohy (11), po dobu 12 měsíců (chronická fáze) nebo 24 měsíců (fáze karcinogenity). Expozice inhalační cestou se provádí 6 hodin denně, 7 dnů v týdnu, avšak je možné použít i expozici 5 dnů v týdnu, je-li zdůvodněna. Období expozice obvykle trvá 12 měsíců (chronická fáze) nebo 24 měsíců (fáze karcinogenity). Jsou-li k expozici pouze nazální cestou použity jiné druhy hlodavců než potkani, je možné upravit maximální doby expozice za účelem minimalizace druhově specifického utrpení. Používá-li se expozice kratší než 6 hodin denně, je třeba uvést zdůvodnění. Viz také kapitola B.8 této přílohy (9).
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Pokud se zkoušená chemická látka podává zvířatům nitrožaluludečně, mělo by se to provádět žaludeční sondou nebo vhodnou intubační kanylou, vždy v přibližně stejnou denní dobu. Obvykle se podává jedna dávka jednou denně. Pokud je např. chemická látka lokálně dráždící, je možno denní dávku podávat rozdělenou na dvě dávky (dvakrát denně). Maximální objem kapaliny, kterou lze jednorázově podat, závisí na velikosti pokusného zvířete. Objem by se měl udržovat co možná nejnižší a u hlodavců by obvykle neměl přesáhnout 1 ml/100 g tělesné hmotnosti (31). Kolísání objemu zkoušené chemické látky by se mělo omezit nastavením koncentrace tak, aby se zajistil konstantní objem na všech úrovních dávek. Potenciálně žíravé nebo dráždivé chemické látky jsou výjimkou a je nutné je naředit, aby se zamezilo závažným lokálním účinkům. Zkoušky při koncentracích, které by pravděpodobně vedly k poleptání nebo podráždění gastrointestinálního traktu, by se neměly provádět.
                           
                        
                     Délka studie
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Období podávání dávky a délka chronické fáze této studie je obvykle 12 měsíců, avšak uspořádání studie umožňuje a lze jej použít rovněž ke kratším (např. 6 nebo 9 měsíců) nebo delším (např. 18 nebo 24 měsíců) studiím, v závislosti na požadavcích konkrétních regulačních rámců nebo k specifickým mechanistickým účelům. Odchylky od doby expozice 12 měsíců by měly být odůvodněny, zejména v případě kratších expozic. Všechny exponované skupiny zařazené do této fáze budou v určenou dobu ukončeny ke zhodnocení chronické toxicity a non-neoplastické patologie. Satelitní skupiny zahrnuté pro monitorování reverzibility toxikologických změn vyvolaných zkoušenou chemickou látkou by se měly udržovat bez podávání látky po dobu ne kratší než 4 týdny a ne delší než jedna třetina celkové délky studie po skončení expozice.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Délka fáze karcinogenity této studie bude u hlodavců obvykle 24 měsíců, což představuje většinu normální délky života používaných zvířat. Je možné použít kratší nebo delší dobu trvání studie, v závislosti na délce života kmene zvířecího druhu použitého ve studii, avšak mělo by to být zdůvodněno. U určitých kmenů myší, např. AKR/J, C3H/J nebo C57BL/6J, může být vhodnější délka studie 18 měsíců. Dále jsou uvedeny pokyny ohledně délky a ukončení studie a přežití, další pokyny včetně posouzení přijatelnosti negativní karcinogenity vzhledem k přežití ve studii jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7):
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          O ukončení studie by se mělo uvažovat v případě, kdy počet přeživších zvířat ve skupinách s nižší dávkou nebo v kontrolní skupině poklesne pod 25 %.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          K ukončení studie by neměla vést situace, kdy v důsledku toxicity předčasně uhynou zvířata pouze ve skupině s vysokou dávkou.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Přežití každého pohlaví by se mělo posuzovat odděleně.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Studie by se neměla rozšiřovat do takové míry, kdy údaje ze studie již nestačí k provedení statisticky platného zhodnocení.
                                       
                                    
                        POZOROVÁNÍ (FÁZE CHRONICKÉ TOXICITY)
                  
                              36.
                           
                           
                              Všechna zvířata by se měla kontrolovat s ohledem na morbiditu nebo mortalitu, obvykle na začátku a na konci každého dne, včetně víkendů a svátků. Všeobecné klinické pozorování by se mělo provádět nejméně jednou denně, přednostně ve stejnou dobu (stejné doby) a s uvážením doby očekávaných maximálních účinků po podání látky v případě podání žaludeční sondou.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Před první expozicí látce (za účelem intraindividuálního porovnání), na konci prvního týdne studie a dále jednou měsíčně se by se mělo provést důkladné klinické vyšetření všech zvířat. Protokol pozorování by se měl uspořádat tak, aby byly odchylky mezi jednotlivými pozorovateli minimalizovány a byly nezávislé na experimentální skupině. Toto pozorování by se mělo provádět mimo chovnou klec ve standardním pozorovacím prostoru a přednostně pokaždé ve stejnou dobu. Pozorování by se měla pečlivě zaznamenávat, nejlépe za použití systému bodování explicitně definovaného ve zkušební laboratoři. Je třeba se pokusit zajistit, aby byly rozdíly mezi podmínkami pozorování minimální. Vyšetření by mělo mimo jiné zaznamenat změny kůže, srsti, očí a sliznic, výskyt sekretů a exkretů a vegetativní funkce (např. slzení, zježení srsti, velikost zornic, nezvyklé dýchání). Zaznamenávat by se měly také změny chůze, držení těla a reakce na manipulaci, dále přítomnost klonických a tonických pohybů, stereotypů v chování (např. nadměrného čištění nebo opakovaného kroužení) nebo bizarního chování (např. sebepoškozování, chůze pozpátku) (32).
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Před prvním podáním zkoušené chemické látky by se mělo u všech zvířat provést oftalmologické vyšetření s použitím oftalmoskopu nebo jiného vhodného přístroje. Na konci studie by se toto vyšetření mělo provést nejlépe u všech zvířat, avšak minimálně ve skupinách s vysokou dávkou a kontrolních skupinách. Zjistí-li se změny na očích související s podáním látky, měla by se vyšetřit všechna zvířata. Pokud analýza struktury nebo jiné informace naznačují toxicitu pro oko, měla by se četnost provádění očního vyšetření zvýšit.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              U chemických látek, kde předchozí 28denní a/nebo 90denní zkoušky toxicity po opakované dávce ukázaly schopnost vyvolat neurotoxické účinky, je možné volitelně vyšetřit senzorickou reaktivitu na různé druhy stimulů (32) (např. sluchové, zrakové a proprioceptivní stimuly) (33), (34), (35), sílu úchopu (36) a motorickou aktivitu (37) před zahájením studie a v tříměsíčních intervalech po začátku studie až do 12 měsíců včetně a rovněž při ukončení studie (je-li delší než 12 měsíců). Další informace o postupech, které lze použít, jsou uvedeny v příslušné literatuře. Místo postupů popsaných v této literatuře však lze použít alternativní postupy.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              U chemických látek, kde předchozí 28denní a/nebo 90denní zkoušky toxicity po opakované dávce ukázaly schopnost vyvolat imunotoxické účinky, je možné na konci studie volitelně provést další vyšetření tohoto cílového parametru.
                           
                        
                     Tělesná hmotnost, spotřeba krmiva/vody a využitelnost krmiva
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Všechna zvířata by se měla zvážit na začátku expozice, alespoň jednou týdně během prvních 13 týdnů a poté alespoň jednou měsíčně. Měření spotřeby krmiva a využitelnosti krmiva by se měla provádět alespoň jednou týdně během prvních 13 týdnů a poté alespoň jednou měsíčně. Spotřeba vody by se měla měřit alespoň jednou týdně během prvních 13 týdnů a poté alespoň jednou měsíčně, podává-li se chemická látka v pitné vodě. Měření spotřeby vody by se mělo zvážit také v případě studií, při kterých může dojít ke změně příjmu tekutin.
                           
                        
                     Hematologická a klinická biochemická vyšetření
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Ve studiích na hlodavcích by se měla hematologická vyšetření provádět u všech zvířat ve studii (10 samců a 10 samic v každé skupině), 3., 6. a 12. měsíc a rovněž na konci studie (trvá-li déle než 12 měsíců). V případě myší mohou být zapotřebí satelitní zvířata, aby se mohla provést všechna požadovaná hematologická měření (viz odstavec 19). Ve studiích na nehlodavcích se budou vzorky odebírat menšímu počtu zvířat (např. 4 zvířatům od každého pohlaví v každé skupině ve studiích na psech) v průběžných odběrových časech a na konci studie, jak je popsáno u hlodavců. Měření v 3. měsíci jak u hlodavců, tak u nehlodavců, se nemusí provádět, pokud nebyl v předchozí 90denní studii provedené při srovnatelných úrovních dávky pozorován žádný účinek na hematologické parametry. Krevní vzorky by se měly odebírat z určeného místa, například srdeční punkcí nebo z retroorbitálního sinu, v anestezii.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Měly by se vyšetřit následující parametry (38): celkový počet leukocytů a diferenciální rozpočet leukocytů, počet erytrocytů, počet trombocytů, koncentrace hemoglobinu, hematokrit (objem erytrocytů), střední objem erytrocytu (MCV), průměrné množství hemoglobinu v erytrocytu (MCH), průměrná koncentrace hemoglobinu v erytrocytu (MCHC), protrombinový čas a aktivovaný parciální tromboplastinový čas. Dle potřeby lze změřit také další hematologické parametry, jako jsou Heinzova tělíska či jiné atypické morfologické formy erytrocytu nebo methemoglobin, v závislosti na toxicitě zkoušené chemické látky. Celkově by se mělo postupovat flexibilně, podle pozorovaného a/nebo očekávaného účinku dané zkoušené chemické látky. Jestliže má zkoušená chemická látka účinek na hematopoetický systém, může být indikováno také vyšetření počtu retikulocytů a cytologie kostní dřeni, přestože se tato vyšetření nemusí provádět rutinně.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Klinické biochemické analýzy za účelem vyšetření hlavních toxických účinků na tkáně, a zejména na játra a ledviny, by se měly provést na krevních vzorcích odebraných všem zvířatům ve studii (10 samcům a 10 samicím v každé skupině) ve stejných časových intervalech stanovených pro hematologická vyšetření. U myší mohou být zapotřebí satelitní zvířata, aby se mohla provést všechna požadovaná biochemická vyšetření. Ve studiích na nehlodavcích se budou vzorky odebírat menšímu počtu zvířat (např. 4 zvířatům od každého pohlaví v každé skupině ve studiích na psech) v průběžných odběrových časech a na konci studie, jak je popsáno u hlodavců. Měření v 3. měsíci, jak u hlodavců, tak u nehlodavců, se nemusí provádět, pokud nebyl v předchozí 90denní studii provedené při srovnatelných úrovních dávky pozorován žádný účinek na klinické biochemické parametry. Před odebráním krevních vzorků se doporučuje ponechat zvířata (s výjimkou myší) přes noc nalačno (10). Měly by se vyšetřit následující parametry (38): glukóza, močovina (močovinový dusík), kreatinin, celkový protein, albumin, vápník, sodík, draslík, celkový cholesterol, alespoň dva vhodné testy pro hepatocelulární vyšetření (alaninaminotransferáza, aspartátaminotransferáza, glutamátdehydrogenáza, celkové kyseliny žlučové) (39) a alespoň dva vhodné testy pro hepatobiliární vyšetření (alkalická fosfatáza, gamaglutamyltransferáza, 5’-nukleotidáza, celkový bilirubin, celkové kyseliny žlučové) (39). Dle potřeby je možné změřit také další klinické biochemické parametry, např. triglyceridy nalačno, specifické hormony a cholinesterázu, v závislosti na toxicitě zkoušené chemické látky. Celkově je třeba postupovat flexibilně, podle pozorovaného a/nebo očekávaného účinku dané zkoušené chemické látky.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Rozbor moči by se měl provést u všech zvířat ve studii (10 samců a 10 samic v každé skupině) s použitím vzorků odebraných ve stejných intervalech jako u hematologických a klinických biochemických vyšetření. Měření v 3. měsíci se nemusí provádět, pokud nebyl v předchozí 90denní studii provedené při srovnatelných úrovních dávky pozorován žádný účinek na složení moči. Odborné doporučení pro klinické patologické studie zahrnovalo následující parametry (38): vzhled, objem, osmolalita nebo specifická hmotnost, pH, celkový protein a glukóza. Další stanovení zahrnují ketony, urobilinogen, bilirubin, a okultní krev. Zkoumání pozorovaného účinku (pozorovaných účinků) lze v případě potřeby rozšířit o další parametry.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Obecně se má za to, že ve studiích na psech je třeba před expozicí změřit výchozí hematologické a klinické biochemické parametry, avšak ve studiích na hlodavcích se stanovovat nemusí (38). Pokud jsou však historické výchozí údaje (viz odstavec 58) nedostatečné, je třeba zvážit získání těchto údajů.
                           
                        PATOLOGIE
                  
                     Pitva
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              U všech zvířat zařazených do studie se obvykle provede celková podrobná pitva, zahrnující pečlivé vyšetření vnějšího povrchu těla, všech otvorů a lebeční, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahu. Nicméně je také možno zajistit (ve skupině pro předběžná utracení nebo v satelitní skupině), aby se měření omezila na konkrétní klíčové parametry, jako je neurotoxicita či imunotoxicita (viz odstavec 21). Tato zvířata se nemusí pitvat ani se u nich neprovádí postupy popsané v následujících odstavcích. U ověřovacích zvířat může být třeba provést pitvu v jednotlivých případech a dle uvážení vedoucího studie.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              U všech zvířat, kromě zvířat vyloučených v druhé části odstavce 47 by se měly zvážit orgány. Nadledvinky, mozek, nadvarlata, srdce, ledviny, játra, vaječníky, slezina, varlata, štítná žláza (vážená po fixaci, s příštítnými tělísky) a děloha všech zvířat (kromě zvířat nalezených umírajících a/nebo zvířat utracených v průběhu zkoušky) by se měly zbavit všech přirostlých tkání a co nejdříve po vyjmutí ve vlhkém stavu zvážit, aby nedošlo k vyschnutí.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Následující tkáně by se měly konzervovat v nejvhodnějším fixačním médiu s ohledem na typ tkáně a plánovaná následná histopatologická vyšetření (40) (tkáně v hranatých závorkách jsou volitelné):
                              
                                          všechny makroskopicky viditelné léze
                                       
                                       
                                          srdce
                                       
                                       
                                          slinivka břišní
                                       
                                       
                                          žaludek (předžaludek, žláznatý žaludek)
                                       
                                    
                                          nadledvinka
                                       
                                       
                                          
                                             ileum
                                          
                                       
                                       
                                          příštítná tělíska
                                       
                                       
                                          [zuby]
                                       
                                    
                                          aorta
                                       
                                       
                                          
                                             jejunum
                                          
                                       
                                       
                                          periferní nerv
                                       
                                       
                                          varlata
                                       
                                    
                                          mozek (zahrnující řezy mozkových hemisfér, mozečku a prodloužené míchy/Varolova mostu)
                                       
                                       
                                          ledviny
                                       
                                       
                                          hypofýza
                                       
                                       
                                          brzlík
                                       
                                    
                                          slepé střevo
                                       
                                       
                                          slzní žláza (extraorbitální)
                                       
                                       
                                          prostata
                                       
                                       
                                          štítná žláza
                                       
                                    
                                          
                                             cervix
                                          
                                       
                                       
                                          játra
                                       
                                       
                                          
                                             rektum
                                          
                                       
                                       
                                          [jazyk]
                                       
                                    
                                          koagulační žláza
                                       
                                       
                                          plíce
                                       
                                       
                                          slinná žláza
                                       
                                       
                                          průdušnice
                                       
                                    
                                          tlusté střevo
                                       
                                       
                                          lymfatické uzliny (povrchové i hluboké)
                                       
                                       
                                          semenný váček
                                       
                                       
                                          močový měchýř
                                       
                                    
                                          dvanáctník
                                       
                                       
                                          prsní žláza (povinné u samic a, je-li očividně možné ji vypreparovat, i u samců)
                                       
                                       
                                          kosterní sval
                                       
                                       
                                          děloha (včetně hrdla děložního)
                                       
                                    
                                          nadvarle
                                       
                                       
                                          [horní cesty dýchací, včetně nosu, nosních skořep a vedlejších dutin nosních]
                                       
                                       
                                          kůže
                                       
                                       
                                          [močovod]
                                       
                                    
                                          oko (včetně sítnice)
                                       
                                       
                                          jícen
                                       
                                       
                                          mícha (ve třech úrovních: krční, střední hrudní a bederní)
                                       
                                       
                                          [močová trubice]
                                       
                                    
                                          [femur s kloubem]
                                       
                                       
                                          [Bulbus olfactorius]
                                       
                                       
                                          slezina
                                       
                                       
                                          pochva
                                       
                                    
                                          žlučník (u jiných druhů než potkan)
                                       
                                       
                                          vaječníky
                                       
                                       
                                          [sternum],
                                       
                                       
                                          řez kostní dření a/nebo čerstvý aspirát kostní dřeni
                                       
                                    
                                          Harderova žláza
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    V případě párových orgánů, např. ledvin, nadledvinek, by se měly uchovávat oba orgány. Na základě klinických nebo jiných nálezů může být nezbytné zkoumat i další tkáně. Také by se měly uchovat všechny orgány považované na základě známých vlastností zkoušené chemické látky za možné cílové orgány. Ve studiích s dermální cestou podání by se měl vyšetřit stejný seznam orgánů, jako byl stanovený pro orální cestu, a navíc je nezbytné odebrat a konzervovat vzorky kůže z místa aplikace. V inhalačních studiích by se měl seznam tkání z dýchacích cest určených ke konzervaci a vyšetření, řídit doporučeními v kapitole B.8 této přílohy (9) a kapitole B.29 této přílohy (10). Co se týká ostatních orgánů/tkání (kromě specificky konzervovaných tkání z dýchacích cest) by se měly vyšetřit orgány uvedené na seznamu orgánů určeném pro orální cestu.
                           
                        
                     Histopatologické vyšetření
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Jsou k dispozici pokyny ohledně osvědčených postupů při provádění toxikologických patologických studií (40). Histopatologická vyšetření by měla minimálně zahrnovat:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          všechny tkáně ve skupinách s vysokou dávkou zkoušené chemické látky a kontrolních skupinách,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všechny tkáně ze zvířat uhynulých nebo utracených během studie,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všechny tkáně vykazující makroskopické abnormality,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          cílové tkáně nebo tkáně, které vykazují změny v souvislosti s expozicí ve skupině s vysokou dávkou, u všech zvířat ve všech ostatních experimentálních skupinách,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          v případě párových orgánů, např. ledvin, nadledvinek, by se měly vyšetřit oba orgány.
                                       
                                    
                        POZOROVÁNÍ (FÁZE KARCINOGENITY)
                  
                              51.
                           
                           
                              Všechna zvířata by se měla kontrolovat s ohledem na morbiditu nebo mortalitu, obvykle na začátku a na konci každého dne, včetně víkendů a svátků. Zvířata by se měla navíc jednou denně kontrolovat s ohledem na specifické příznaky, které mají toxikologický význam. V případě studií s podáváním látky žaludeční sondou by se měla zvířata kontrolovat v době těsně po podání dávky. Zvláštní pozornost je třeba věnovat rozvoji nádorů a měla by se zaznamenat doba objevení se nádoru, umístění, rozměry, vzhled a progrese každého viditelného nebo hmatného tumoru.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Všechna zvířata by se měla zvážit na začátku expozice, alespoň jednou týdně během prvních 13 týdnů a poté alespoň jednou měsíčně. Měření spotřeby krmiva a využitelnosti krmiva by se měla provádět alespoň jednou týdně během prvních 13 týdnů a poté alespoň jednou měsíčně. Spotřeba vody by se měla měřit alespoň jednou týdně během prvních 13 týdnů a poté alespoň jednou měsíčně, podává-li se chemická látka v pitné vodě. Měření spotřeby vody by se mělo zvážit také v případě studií, při kterých může dojít ke změně příjmu tekutin.
                           
                        
                     Hematologická, klinická biochemická vyšetření a další měření
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Aby se ze studie získalo co nejvíce informací, zejména pro úvahy o způsobu účinku, je možné odebrat vzorky krve pro hematologická a klinická biochemická vyšetření, přestože to závisí na uvážení vedoucího studie. Rovněž může být vhodné provést rozbor moči. Údaje o zvířatech použitých ve fázi chronické toxicity studie, která obvykle trvá 12 měsíců (odstavec 34), poskytnou informace o těchto parametrech. Další pokyny o hodnotě odběru těchto vzorků v rámci studie karcinogenity jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7). Jestliže se odebírají vzorky krve, měly by se odebrat na konci zkušebního období těsně před utracením zvířat nebo v jeho průběhu. Měly by se odebírat z určeného místa, například srdeční punkcí nebo z retroorbitálního sinu, v anestezii. Také je možné připravit k vyšetření krevní nátěry, zejména pokud se zdá, že je cílovým orgánem kostní dřeň, přestože hodnota takového vyšetření krevních nátěrů k zhodnocení karcinogenního/onkogenního potenciálu ve fázi studie zkoumající karcinogenitu byla zpochybňována (38).
                           
                        PATOLOGIE
                  
                     Pitva
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              U všech zvířat zařazených do studie, kromě ověřovacích zvířat a ostatních satelitních zvířat (viz odstavec 20), se provede celková, podrobná pitva, zahrnující pečlivé vyšetření vnějšího povrchu těla, všech otvorů a lebeční, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahu. U ověřovacích a ostatních satelitních zvířat může být třeba provést pitvu v jednotlivých případech a dle uvážení vedoucího studie. Měření hmotnosti orgánů obvykle nebývá součástí studie karcinogeneze, neboť geriatrické změny a, v pozdějších stádiích, rozvoj nádorů maří použitelnost údajů o hmotnosti orgánů. Mohou však být velmi důležité pro hodnocení průkaznosti důkazů a zejména pro úvahy o způsobu účinku. Jsou-li součástí satelitní studie, měly by se získat nejpozději jeden rok po zahájení studie.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Následující tkáně by se měly konzervovat v nejvhodnějším fixačním médiu s ohledem na typ tkáně a plánovaná následná histopatologická vyšetření (40) (tkáně v hranatých závorkách jsou volitelné):
                              
                                          všechny makroskopicky viditelné léze
                                       
                                       
                                          srdce
                                       
                                       
                                          slinivka břišní
                                       
                                       
                                          žaludek (předžaludek, žláznatý žaludek)
                                       
                                    
                                          nadledvinka
                                       
                                       
                                          
                                             ileum
                                          
                                       
                                       
                                          příštítná tělíska
                                       
                                       
                                          [zuby]
                                       
                                    
                                          aorta
                                       
                                       
                                          
                                             jejunum
                                          
                                       
                                       
                                          periferní nerv
                                       
                                       
                                          varlata
                                       
                                    
                                          mozek (zahrnující řezy mozkových hemisfér, mozečku a prodloužené míchy/Varolova mostu)
                                       
                                       
                                          ledviny
                                       
                                       
                                          hypofýza
                                       
                                       
                                          brzlík
                                       
                                    
                                          slepé střevo
                                       
                                       
                                          slzní žláza (extraorbitální)
                                       
                                       
                                          prostata
                                       
                                       
                                          štítná žláza
                                       
                                    
                                          
                                             cervix
                                          
                                       
                                       
                                          játra
                                       
                                       
                                          
                                             rektum
                                          
                                       
                                       
                                          [jazyk]
                                       
                                    
                                          koagulační žláza
                                       
                                       
                                          plíce
                                       
                                       
                                          slinná žláza
                                       
                                       
                                          průdušnice
                                       
                                    
                                          tlusté střevo
                                       
                                       
                                          lymfatické uzliny (povrchové i hluboké)
                                       
                                       
                                          semenný váček
                                       
                                       
                                          močový měchýř
                                       
                                    
                                          dvanáctník
                                       
                                       
                                          prsní žláza (povinné u samic a, je-li očividně možné ji vypreparovat, i u samců)
                                       
                                       
                                          kosterní sval
                                       
                                       
                                          děloha (včetně hrdla děložního)
                                       
                                    
                                          nadvarle
                                       
                                       
                                          [horní cesty dýchací, včetně nosu, nosních skořep a vedlejších dutin nosních]
                                       
                                       
                                          kůže
                                       
                                       
                                          [močovod]
                                       
                                    
                                          oko (včetně sítnice)
                                       
                                       
                                          jícen
                                       
                                       
                                          mícha (ve třech úrovních: krční, střední hrudní a bederní)
                                       
                                       
                                          [močová trubice]
                                       
                                    
                                          [femur s kloubem]
                                       
                                       
                                          [Bulbus olfactorius]
                                       
                                       
                                          slezina
                                       
                                       
                                          pochva
                                       
                                    
                                          žlučník (u jiných druhů než potkan)
                                       
                                       
                                          vaječníky
                                       
                                       
                                          [sternum],
                                       
                                       
                                          řez kostní dření a/nebo čerstvý aspirát kostní dřeni
                                       
                                    
                                          Harderova žláza
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    V případě párových orgánů, např. ledvin, nadledvinek, by se měly uchovávat oba orgány. Na základě klinických nebo jiných nálezů může být nezbytné zkoumat i další tkáně. Také by se měly uchovat všechny orgány považované na základě známých vlastností zkoušené chemické látky za možné cílové orgány. Ve studiích s dermální cestou podání by se měl vyšetřit stejný seznam orgánů, jako byl stanovený pro orální cestu, a navíc je nezbytné odebrat a konzervovat vzorky kůže z místa aplikace. V inhalačních studiích by se měl seznam tkání z dýchacích cest určených ke konzervaci a vyšetření, řídit doporučeními v kapitole B.8 této přílohy (8) a kapitole B.29 této přílohy (9). Co se týká ostatních orgánů/tkání (kromě specificky konzervovaných tkání z dýchacích cest) by se měly vyšetřit orgány uvedené na seznamu orgánů určeném pro orální cestu.
                           
                        
                     Histopatologické vyšetření
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Jsou k dispozici pokyny ohledně osvědčených postupů při provádění toxikologických patologických studií (40). Měly by se vyšetřit minimálně tyto tkáně:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          všechny tkáně ve skupinách s vysokou dávkou zkoušené chemické látky a kontrolních skupinách,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všechny tkáně zvířat uhynulých nebo utracených během studie,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všechny tkáně vykazující makroskopické abnormality včetně nádorů,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pokud jsou ve skupině s vysokou dávkou pozorovány histopatologické změny související s expozicí, měly by se stejné tkáně vyšetřit u všech zvířat ve všech ostatních exponovaných skupinách,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          v případě párových orgánů, např. ledvin, nadledvinek, by se měly vyšetřit oba orgány.
                                       
                                    
                        ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ (KARCINOGENITA A CHRONICKÁ TOXICITA)
                  
                     Údaje
                  
                  
                              57.
                           
                           
                              Měly by se uvést údaje o všech hodnocených parametrech u každého jednotlivého zvířete. Kromě toho by se měly všechny údaje shrnout do tabulky, přičemž se uvede u každé experimentální skupiny počet zvířat na začátku zkoušky, počet zvířat nalezených uhynulých v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních důvodů a doba úmrtí nebo humánního utracení, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, popis příznaků toxicity, včetně doby nástupu, trvání a závažnosti každého toxického účinku, počet zvířat vykazujících léze, typ lézí a procento zvířat vykazujících každý typ léze. Tabulky se souhrnnými údaji by měly uvádět průměrné hodnoty a směrodatné odchylky (u spojitých dat ze zkoušky) u zvířat vykazujících toxické účinky nebo léze a také klasifikaci lézí.
                           
                        
                              58.
                           
                           
                              Pro interpretaci výsledků studie mohou být cenná historická kontrolní data, např. v případě, kdy existují známky toho, že souběžné kontroly se značně vymykají ve srovnání s posledními údaji získanými u kontrolních zvířat ze stejného zkušebního zařízení/kolonie. Historická kontrolní data, pokud se hodnotí, by měla být ze stejné laboratoře a měla by pocházet od zvířat stejného věku a ze stejného kmene během pěti let předcházejících příslušné studii.
                           
                        
                              59.
                           
                           
                              Číselné výsledky by měly být pokud možno vyhodnoceny vhodnou a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistické metody a data, která se mají analyzovat, by se měly zvolit již při plánování studie (odstavec 9). Tento výběr by měl zahrnovat rezervu pro případné úpravy v závislosti na přežití.
                           
                        
                              60.
                           
                           
                              Protokol o zkoušce by měl obsahovat tyto údaje:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkoušená chemická látka:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikální povaha, čistota a fyzikálně-chemické vlastnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikační údaje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj chemické látky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      číslo šarže,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      certifikát o chemické analýze.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosič (je-li použit):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění výběru nosiče, (pokud není použita voda).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Pokusná zvířata:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použité druhy/kmen a zdůvodnění výběru,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet, věk, a pohlaví zvířat na začátku zkoušky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj, podmínky chovu, strava atd.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      individuální hmotnosti zvířat na začátku zkoušky.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkušební podmínky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění způsobu podávání a výběru dávky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      případně statistické metody použité k analýze dat,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobnosti o použité formě zkoušené chemické látky/úpravě krmiva,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analytické údaje o dosažené koncentraci, stabilitě a homogenitě přípravku,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      cesta podání a podrobné údaje o podávání zkoušené chemické látky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      u inhalačních studií informace o tom, zda byla expozice pouze nazální cestou, nebo celotělová,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skutečné dávky (mg/kg tělesné hmotnosti/den) a případně koeficient přepočtu koncentrace zkoušené chemické látky v krmivu/pitné vodě (mg/kg nebo ppm) na skutečnou dávku (mg/kg tělesné hmotnosti/den),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné údaje o kvalitě stravy a vody.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky (měly by se předložit souhrnné tabulky údajů a údaje pro jednotlivá zvířata):
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Obecné
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o přežití,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tělesná hmotnost/změny tělesné hmotnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      spotřeba krmiva, výpočty využitelnosti krmiva, pokud byly provedeny a případně spotřeba vody,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toxikokinetické údaje, jsou-li k dispozici,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oftalmoskopické vyšetření (je-li k dispozici),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematologická vyšetření (jsou-li k dispozici),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klinická biochemická vyšetření (jsou-li k dispozici).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Klinické nálezy
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      známky toxicity,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      incidence (plus závažnost, je-li hodnocena) jakékoli abnormality,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      povaha, závažnost a trvání pozorovaných klinických příznaků (zda byly přechodné, nebo trvalé).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Pitevní údaje
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      konečná tělesná hmotnost,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hmotnosti orgánů a jejich poměry, pokud se stanovují,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pitevní nálezy; incidence a závažnost abnormalit.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Histopatologické vyšetření
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      histopatologické nálezy, které nejsou neoplastické,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      neoplastické histopatologické nálezy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vzájemný vztah mezi makroskopickými a mikroskopickými nálezy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobný popis všech histopatologických nálezů souvisejících s expozicí, včetně klasifikace závažnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zprávy o všech odborných revizích vzorků.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Statistické zpracování výsledků dle potřeby
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Diskuse o výsledcích zahrnující:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      diskuse o jakýchkoli modelovacích přístupech,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vztahy mezi dávkou a odezvou,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      historické kontrolní údaje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      posouzení jakýchkoli informací o způsobu účinku,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stanovení BMD, NOAEL nebo LOAEL,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      význam pro člověka.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Závěry
                                          
                                       
                                    
                        
                     LITERATURA:
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Kapitola B.27 této přílohy, Zkouška subchronické orální toxicity studie orální toxicity na nehlodavcích (90denní opakovaná aplikace).
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, dostupné na veřejných webových stránkách OECD pro pokyny ke zkoušení na adrese www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Kapitola B.8 této přílohy, Subakutní inhalační toxicita: 28denní studie.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Kapitola B.29 této přílohy, Subchronická inhalační toxicita: 90denní studie.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Kapitola B.9 této přílohy, Dermální toxicita (28denní opakovaná aplikace).
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793-801.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1-7.
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Crit. Rev. Toxicol. 36: 9-35.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 37-68.
                           
                        
                              19)
                           
                           
                              Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69-98.
                           
                        
                              20)
                           
                           
                              OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
                           
                        
                              21)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              22)
                           
                           
                              Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 - 837.
                           
                        
                              23)
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              24)
                           
                           
                              Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1):214.
                           
                        
                              25)
                           
                           
                              Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284.
                           
                        
                              26)
                           
                           
                              Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect 105:1196-1203.
                           
                        
                              27)
                           
                           
                              Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU ze dne 22. září 2010 o ochraně zvířat používaných pro vědecké účely, Úř. věst. L 276, 20.10.2010, s. 33.
                           
                        
                              28)
                           
                           
                              National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              29)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-06-9.
                           
                        
                              30)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              31)
                           
                           
                              Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.
                           
                        
                              32)
                           
                           
                              IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
                           
                        
                              33)
                           
                           
                              Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.
                           
                        
                              34)
                           
                           
                              Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.
                           
                        
                              35)
                           
                           
                              Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
                           
                        
                              36)
                           
                           
                              Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
                           
                        
                              37)
                           
                           
                              Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
                           
                        
                              38)
                           
                           
                              Weingand K, Brown G, Hall R et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198-201.
                           
                        
                              39)
                           
                           
                              (Návrh) dokumentu agentury EMEA ‘Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity‘ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).
                           
                        
                              40)
                           
                           
                              Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131.
                           
                        
                     Dodatek 1
                     DEFINICE
                     Zkoušená chemická látka: Jakákoli látka nebo směs zkoušená pomocí této zkušební metody.
                  “
            
                  7)
               
               
                  Kapitola B.36 se nahrazuje tímto:
                  „B.36   TOXIKOKINETIKA
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda odpovídá Pokynům OECD pro zkoušení (TG) 417 (2010). Studie zkoumající toxikokinetiku (TK) zkoušené chemické látky se provádí za účelem získání náležitých informací o její absorpci, distribuci, biotransformaci (tj. metabolismu) a exkreci, které pomohou dát do souvislosti koncentraci či dávku s pozorovanou toxicitou a pomohou pochopit mechanismus její toxicity. Toxikokinetika může pomoci porozumět TK studiím tím, že prokáže, že jsou pokusná zvířata systémově vystavena zkoušené chemické látce a odhalením identity cirkulujících složek (mateřská chemická látka/metabolity). Základní TK parametry stanovené v těchto studiích rovněž poskytnou informace o schopnosti zkoušené chemické látky hromadit se v tkáních a/nebo orgánech a o schopnosti vyvolat biotransformaci v důsledku expozice zkoušené chemické látce.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              TK údaje mohou přispět k posouzení přijatelnosti a relevantnosti použití údajů o toxicitě u zvířat k extrapolaci na nebezpečnost pro člověka a/nebo posouzení rizik. Dále mohou toxikokinetické studie poskytnout užitečné informace pro stanovení úrovní dávek ve studiích toxicity (lineární vs. nelineární kinetika), účinků cesty podání, biologické dostupnosti a otázek souvisejících s uspořádáním studie. Určité druhy TK údajů lze použít k vývoji modelu toxikokinetiky na fyziologické bázi (PBTK).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Údaje o metabolitech/TK údaje jsou důležité např. k navržení možných toxických účinků a způsobů účinků a jejich vztahu k úrovni dávky a k cestě expozice. Dále mohou údaje o metabolismu poskytnout užitečné informace pro posouzení toxikologického významu expozic exogenně produkovaných metabolitů zkoušené chemické látky.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Náležité toxikokinetické údaje pomohou zajistit další přijatelnost a uplatnitelnost kvantitativních vztahů mezi strukturou a aktivitou, analogických přístupů či přístupů založených na seskupování, při hodnocení bezpečnosti chemických látek. Údaje o kinetice lze rovněž použít k zhodnocení toxikologické relevantnosti jiných studií (např. in vivo/in vitro).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Není-li uvedena jiná cesta podání (viz zejména odstavce 74–78), používá se tato zkušební metoda při orálním podávání zkoušené chemické látky.
                           
                        VÝCHOZÍ ÚVAHY
                  
                              6.
                           
                           
                              Regulační systémy mají u různých tříd chemických látek (např. pesticidy, biocidy, průmyslové chemikálie) různé požadavky a potřeby týkající se měření cílových parametrů souvisejících s toxikokinetikou. Na rozdíl od většiny zkušebních metod tato zkušební metoda popisuje zkoušky toxikokinetiky, což zahrnuje více měření a cílových parametrů. V budoucnosti může být vyvinuto nové zkušební metody a/nebo pokyny, které budou popisovat každý cílový parametr samostatně a podrobněji. V případě této zkušební metody jsou zkoušky či vyhodnocení, které se mají provést, určeny podle požadavků a/nebo potřeb každého regulačního systému.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Existuje řada studií, které lze provést ke zhodnocení TK chování zkoušené chemické látky pro regulační účely. Nicméně v závislosti na konkrétních regulačních potřebách nebo situacích nemusí být všechny tyto studie pro hodnocení zkoušené chemické látky nutné. Při plánování toxikokinetických studií je nutná flexibilita a zohlednění hodnocených vlastností zkoušené chemické látky. V některých případech je třeba prozkoumat pouze určitou sadu otázek, aby se zhodnotila nebezpečnost a obavy z rizik související se zkoušenou chemickou látkou. V některých situacích se mohou TK údaje shromáždit jako součást hodnocení v jiných toxikologických studiích. V jiných situacích může být nutné provést doplňující a/nebo rozsáhlejší studie TK, v závislosti na regulačních potřebách a/nebo pokud se při hodnocení zkoušené chemické látky objeví nové otázky.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Před zahájením této studie by měla laboratoř provádějící zkoušky vzít v úvahu veškeré dostupné informace o zkoušené chemické látce a příslušných metabolitech a analozích, aby se zvýšila kvalita studie a předešlo se zbytečnému použití zvířat. Tyto informace mohou obsahovat údaje z ostatních relevantních zkušebních metod (studie in vivo, studie in vitro a/nebo hodnocení in silico). K plánování studie a interpretaci výsledků mohou být užitečné fyzikálně-chemické vlastnosti, jakými jsou rozdělovací koeficient oktanol–voda (vyjádřený jako log Pow), pKa, rozpustnost ve vodě, tlak par a molekulová hmotnost chemické látky. Lze je stanovit pomocí vhodných metod, jak je popsáno v příslušných zkušebních metodách.
                           
                        OMEZENÍ
                  
                              9.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda není určena pro speciální okolnosti, např. březí zvířata nebo zvířata v laktaci a mláďata, či k hodnocení potenciálních reziduí u exponovaných zvířat chovaných pro potravinářské účely. Nicméně údaje získané ze studie B.36 mohou poskytnout podkladové informace, které mohou být vodítkem při plánování speciálních studií pro tyto výzkumy. Tato zkušební metoda není určena pro zkoušky nanomateriálů. Ze zprávy o předběžném přezkoumání Pokynů OECD ke zkouškám s ohledem na jejich použitelnost u nanomateriálů vyplývá, že pokyny TG 417 (odpovídající této zkušební metodě B.36) není možné v případě nanomateriálů použít (1).
                           
                        DEFINICE
                  
                              10.
                           
                           
                              Definice použité pro účely této zkušební metody jsou uvedeny v dodatku.
                           
                        ÚVAHY O ZAJIŠTĚNÍ DOBRÝCH ŽIVOTNÍCH PODMÍNEK ZVÍŘAT
                  
                              11.
                           
                           
                              Pokyny k humánnímu zacházení se zvířaty jsou k dispozici v Pokynech OECD (GD) 19 (2). U všech studií in vivo a in vitro popsaných v této zkušební metodě se doporučuje postupovat podle dokumentu OECD GD 19.
                           
                        POPIS METOD
                  
                     Pilotní studie
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Při výběru experimentálních parametrů pro studie toxikokinetiky (např. metabolismu, látkové bilance, analytických postupů, stanovení dávky, vydechovaného CO2 atd.) se doporučuje použít pilotní studie. K charakterizaci některých z těchto parametrů nemusí být nutné používat radioizotopově značené chemické látky.
                           
                        
                     Výběr zvířat
                  
                  
                     Druhy
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Zvířecí druh (a kmen) použitý pro zkoušky TK by měl být nejlépe stejný jako druh použitý v jiných toxikologických studiích prováděných s danou zkoušenou chemickou látkou. Obvykle by se měl použít potkan, neboť se v toxikologických studiích široce používá. Použití jiných nebo doplňkových druhů může být oprávněné, pokud kritické toxikologické studie prokážou výskyt významné toxicity u těchto druhů nebo pokud se ukáže, že toxicita/toxikokinetika těchto druhů je pro člověka relevantnější. Výběr zvířecího druhu a kmene by se měl zdůvodnit.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Není-li uvedeno jinak, týká se tato zkušební metoda potkana jakožto zkoušeného druhu. Pokud jsou ke zkouškám použity jiné druhy, může být nutné určité aspekty této metody upravit.
                           
                        
                     Stáří a kmen
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Měla by se použít mladá dospělá zvířata (v době podávání dávky obvykle 6–12 týdnů stará) (viz také odstavce 13 a 14). Použití zvířat, která nejsou mladá a dospělá, by se mělo zdůvodnit. Všechna zvířata by měla být na počátku studie přibližně stejného stáří. Odchylky v hmotnosti jednotlivých zvířat by v dané experimentální skupině neměly překročit ± 20 % průměrné hmotnosti. V ideálním případě by se měl použít stejný kmen, jaký se použil při získávání toxikologických dat o dané zkoušené chemické látce.
                           
                        
                     Počet a pohlaví zvířat
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Pro každou zkoumanou dávku by se měla použít alespoň čtyři zvířata od každého pohlaví. Mělo by se uvést zdůvodnění pro výběr pohlaví použitých zvířat. Jestliže existují důkazy, které svědčí o významných rozdílech v toxicitě v závislosti na pohlaví, mělo by se použití obou pohlaví (čtyř samců a čtyř samic) uvážit.
                           
                        
                     Podmínky chovu a krmení
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Zvířata by se měla v průběhu zkoušky chovat jednotlivě. Za speciálních podmínek může být odůvodněn skupinový chov. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla být 22 °C (± 3 °C) a relativní vlhkost 30–70 %. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní krmivo s neomezeným přísunem pitné vody.
                           
                        
                     Zkoušená chemická látka
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Pro látkovou bilanci a identifikaci metabolitů ve studii by se měla použít radioizotopově značená zkoušená chemická látka (pomocí 14C), avšak je-li možné prokázat, že:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          látkovou bilanci a identifikaci metabolitů lze dostatečně vyhodnotit i při použití neznačené zkoušené chemické látky,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analytická specifičnost a citlivost metody použité s neznačenou zkoušenou chemickou látkou je shodná nebo větší, než jaké by bylo možné dosáhnout s radioizotopově značenou zkoušenou chemickou látkou,
                                       
                                    pak se radioizotopově značená chemická látka nemusí používat. Kromě toho lze použít jiné radioaktivní a stabilní izotopy, zejména pokud je příslušný prvek zodpovědný za toxicitu nebo je součástí toxické části zkoušené chemické látky. Je-li to možné, měla by být radioaktivní značka umístěna ve středové části molekuly, která je metabolicky stabilní (není zaměnitelná, nelze ji metabolicky odbourat jako CO2 a nestává se součástí zásob jednouhlíkových jednotek v organismu). Někdy může být nutné označit více míst nebo specifických oblastí molekuly, aby bylo možné sledovat metabolický osud zkoušené chemické látky.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Pomocí vhodných metod by se měla stanovit čistota a identita radioizotopově značených a neznačených zkoušených chemických látek. Radiochemická čistota radioaktivní zkoušené chemické látky by měla být nejvyšší, jaké lze u dané zkoušené chemické látky dosáhnout (v ideálním případě by měla být větší než 95 %) a mělo by se vynaložit dostatečné úsilí k identifikaci nečistot přítomných v množství 2 % a větším. Čistota spolu s identitou a procentuálním zastoupením jakýchkoli nečistot, které byly identifikovány, by se měla zaznamenat. Další užitečné pokyny při definování a specifikacích zkoušených chemických látek, které jsou složeny ze směsí, a metody pro stanovení čistoty mohou být obsaženy v individuálních regulačních programech.
                           
                        
                     Výběr dávky
                  
                  
                     Pilotní studie
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Pro pilotní studii je obvykle dostačující jednorázová orální dávka. Dávka by měla být netoxická, avšak dostatečně vysoká na to, aby umožnila identifikaci metabolitů v exkretech (a případně v plazmě) a rovněž aby splňovala uvedený účel pilotní studie, jak je uveden v odstavci 12 této zkušební metody.
                           
                        
                     Hlavní studie
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Pro hlavní studie se upřednostňují minimálně dvě dávky, neboť informace získané alespoň ze dvou exponovaných skupin mohou pomoci při nastavování dávek v jiných studiích toxicity a při hodnocení vztahu mezi dávkou a odezvou v již dostupných zkouškách toxicity.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Pokud se podávají dvě dávky, měly by být obě dostatečně vysoké, aby umožnily identifikaci metabolitů v exkretech (a případně v plazmě). Při výběru dávky by se měly vzít v úvahu dostupné toxikologické údaje. Nejsou-li tyto informace k dispozici (např. ze studií akutní orální toxicity zaznamenávajících příznaky toxicity nebo ze studií toxicity po opakovaných dávkách), může se zvážit použití vyšší dávky, která je menší než odhad LD50 (orální a dermální cesta) nebo LC50 (inhalační cesta) nebo menší než nižší hodnota odhadovaného rozmezí akutní toxicity. Nižší dávka by se měla stanovit vydělením vyšší dávky.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Jestliže se zkoumá pouze jedna úroveň dávky, měla by být dávka v ideálním případě dostatečně vysoká, aby umožnila identifikaci metabolitů v exkretech (a případně v plazmě), aniž by vedla ke zjevné toxicitě. Mělo by se uvést zdůvodnění, proč nebyla zařazena druhá úroveň dávky.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Jestliže je třeba stanovit účinek dávky na kinetické procesy, nemusí být dvě dávky dostačující a alespoň jedna dávka by měla být dostatečně vysoká, aby tyto procesy saturovala. Pokud se při dvou úrovních dávky použité v hlavní studii plocha pod křivkou závislosti koncentrace v plazmě na čase (AUC) nemění lineárně, svědčí to o tom, že k saturaci jednoho nebo více kinetických procesů dochází někde mezi těmito dvěma úrovněmi dávek.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              U zkoušených chemických látek s nízkou toxicitou (podávaných orálně a dermálně) by se měla použít maximálně dávka 1 000 mg/kg tělesné hmotnosti (pokud se látka podává inhalační cestou, viz pokyny v kapitole B.2 této přílohy; obvykle tato dávka nepřesahuje 2 mg/l). Úvahy specifické pro danou chemickou látku mohou vyžadovat vyšší dávku v závislosti na potřebách regulačních opatření. Výběr dávky by měl být vždy zdůvodněn.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Údaje o toxikokinetice a distribuci látky v tkáních po jednorázové dávce mohou být dostačující pro stanovení potenciálu akumulace a/nebo perzistence. Nicméně za určitých okolností může být třeba podávat dávku opakovaně i) aby bylo úplnější zhodnocení potenciálu akumulace a/nebo perzistence či změny v TK (tj. například indukce a inhibice enzymů) nebo ii) protože to vyžaduje příslušný regulační systém. Ve studiích s opakovaným podáváním dávky obvykle postačí opakované podávání nízké dávky, avšak za jistých okolností může být nutné podávat opakovaně vysokou dávku (viz také odstavec 57).
                           
                        
                     Podávání zkoušené chemické látky
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Pokud je známo, jaký nosiči byl použit pro studie orální toxicity s danou chemickou látkou podávanou nitrožaludečně, měla by se zkoušená chemická látka rozpustit nebo homogenně suspendovat ve stejném nosiči. Mělo by se uvést zdůvodnění výběru nosiče. Výběr nosiče a objemu dávkování by se měl zvážit v návrhu studie. Obvyklým způsobem podání je žaludeční sonda, avšak ve speciálních případech může být výhodné podávat látku ve formě želatinové tobolky nebo ve směsi s potravou (v obou případech je třeba uvést zdůvodnění). Mělo by se uvést ověření skutečné dávky podané každému zvířeti.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Maximální objem tekutiny, který se podává najednou žaludeční sondou, závisí na velikosti pokusného zvířete, druhu nosiče dávky a na skutečnosti, zda je před podáním zkoušené chemické látky pozastaveno krmení či nikoli. Mělo by se uvést zdůvodnění pro podávání nebo omezení krmiva před podáním dávky. Objem dávky by měl být za běžných okolností co možná nejnižší, až už se použijí vodné nebo jiné nosiče. Objemy dávky by u hlodavců obvykle neměly přesáhnout 10 ml/kg tělesné hmotnosti. Objemy nosičů použitých pro lipofilnější zkoušené chemické látky mohou začínat na 4 ml/kg tělesné hmotnosti. Při opakovaném podávání dávky, kdy je lačnění přes den kontraindikováno, by se mělo uvažovat o nižších objemech dávky (např. 2–4 ml/kg tělesné hmotnosti). Kdykoli je to možné, může se zvážit použití stejného objemu dávky, jaký byl podáván žaludeční sondou v jiných orálních studiích zkoušené chemické látky.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              K stanovení biologické dostupnosti nebo relativní orální absorpce je možné použít nitrožilní (intravenózní, IV) podání zkoušené chemické látky a měření hladiny zkoušené chemické látky v krvi a/nebo exkretech. V případě IV studie se podává jednorázová dávka (obvykle odpovídající nižší orální dávce, avšak ji nepřesahující – viz výběr dávky) zkoušené chemické látky s pomocí vhodného nosiče. Tento materiál by se měl podávat ve vhodném objemu (např. 1 ml/kg tělesné hmotnosti) na vybraném místě podání alespoň čtyřem zvířatům vhodného pohlaví (je-li to potřeba, mohou se použít obě pohlaví, viz odstavec 16). K podání zkoušené chemické látky intravenózně je nutné, aby byla dávka plně rozpuštěna nebo suspendována. Nosič použitý při IV podání by neměl ovlivňovat integritu krve ani krevní tok. Jestliže se zkoušená chemická látka podává infuzí a používá-li se infuzní pumpa, měla by se uvést infuzní rychlost a měla by být standardizována pro všechna zvířata. Je-li zaváděna kanyla do vena jugularis (k podání zkoušené chemické látky a/nebo odběru krve) nebo podává-li se látka do arteria femoralis, měla by se použít anestézie. Druh anestézie je třeba náležitě zvážit, neboť může ovlivnit toxikokinetiku. Zvířatům by se měl ponechat dostatek času na náležité zotavení před podáním zkoušené chemické látky a nosiče.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Ostatní cesty podání, např. dermální a inhalační (viz odstavce 74–78), se mohou použít u určitých druhů zkoušených chemických látek s ohledem na jejich fyzikálně-chemické vlastnosti a očekávané použití nebo expozici u člověka.
                           
                        
                     Měření
                  
                  
                     Látková bilance
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Látková bilance se stanoví sečtením procentuálního zastoupení podané (radioaktivní) dávky, která se vyloučila močí, výkaly a vydechovaným vzduchem, a procentuálního zastoupení v tkáních, zbývajících částech mrtvého těla a ve zbytcích vymytých z klece (viz odstavec 46). Obvykle se považují celkové výtěžky podané chemické látky (radioaktivní) nad 90 % za dostatečné.
                           
                        
                     Absorpce
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Úvodní odhad absorpce lze stanovit tak, že se z látkové bilance odečte procentuální zastoupení dávky v gastrointestinálním (GI) traktu a/nebo výkalech. Výpočet procentuální absorpce uvádí odstavec 33. Vyšetření exkretů uvádí odstavce 44–49. Nelze-li ze studií látkové bilance určit přesnou míru absorpce po orálním podání dávky (např. když je více než 20 % podané dávky přítomno ve výkalech), může být nezbytné provést další vyšetření. Tyto studie se mohou zahrnovat buď 1) orální podání zkoušené chemické látky a měření obsahu zkoušené chemické látky ve žluči, nebo 2) orální a IV podání zkoušené chemické látky a měření čistého množství zkoušené chemické látky přítomné v moči a vydechovaném vzduchu a v mrtvém těle při každé z těchto dvou cest. V obou plánech studie se provádí měření radioaktivity jako náhradní metoda za chemicky specifickou analýzu zkoušené chemické látky a metabolitů.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Provádí-li se studie exkrece žlučí, používá se obvykle orální cesta podání. V této studii by se měly kanylovat žlučovody alespoň čtyř zvířat vhodného pohlaví (nebo obou pohlaví, je-li to opodstatněné) a měla by se jim podat jednorázová dávka zkoušené chemické látky. Po podání zkoušené chemické látky by se měla sledovat exkrece radioaktivní/zkoušené chemické látky ve žluči tak dlouho, jak je potřeba pro určení procentuálního podílu podané dávky, který se vylučuje touto cestou a který lze použít k přímému výpočtu míry orální absorpce takto:
                              
                                 
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              U některých tříd zkoušených chemických látek může dojít k přímé sekreci absorbované dávky přes střevní stěnu. V takových případech se měření % dávky ve výkalech po orálním podání dávky u potkana s kanylovanými žlučovody nepovažuje za odpovídající neabsorbované dávce. Doporučuje se, aby se v případě, kdy podle předpokladů dochází k sekreci látky ze střev, zakládalo stanovení % absorbované dávky na absorpci vypočítané ze srovnání exkrece po orální a IV cestě podání (potkan s kanylovanými žlučovody nebo intaktní) (viz odstavec 35). Rovněž se doporučuje, aby se v případě, kdy se považuje za nutné kvantifikovat střevní sekreci, měřila exkrece u potkana s kanylovanými žlučovody po IV podání dávky.
                           
                        
                     Biologická dostupnost
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Biologickou dostupnost lze stanovit z kinetiky látky v plazmě/krvi u skupin s orálním a IV podáním, jak popisují odstavce 50–52, specifickou chemickou analýzou zkoušené chemické látky a/nebo příslušného metabolitu (příslušných metabolitů), a radioizotopově značená zkoušená chemická látka proto není nutná. Výpočet biologické dostupnosti (F) zkoušené chemické látky nebo příslušného metabolitu (příslušných metabolitů) lze provést následovně:
                              
                                 
                           
                        kde AUC je plocha pod křivkou závislosti koncentrace v plazmě na čase a exp je experimentální cesta podání (orální, dermální nebo inhalační).
                  
                              36.
                           
                           
                              K posouzení rizika systémových účinků se obvykle upřednostňuje použití biologické dostupnosti toxické složky před procentuální absorpcí, když se porovnávají systémové koncentrace ze studií na zvířatech s analogickými údaji z biomonitorování ve studiích expozice pracovníků. Situace se může stát složitější, pokud se dávky nacházejí v nelineárním rozmezí, proto je důležité, aby se při toxikokinetickém screeningu stanovily dávky v lineárním rozmezí.
                           
                        
                     Distribuce v tkáních
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Poznatky o distribuci zkoušené chemické látky a/nebo jejích metabolitů v tkáních jsou důležité pro identifikaci cílových tkání a pochopení základních mechanismů toxicity a pro získání informací o schopnosti akumulace a perzistence zkoušené chemické látky a jejích metabolitů. Procentuální podíl celkové (radioaktivní) dávky v tkáních a rovněž ve zbylém mrtvém těle by se měl měřit alespoň při ukončení exkrečního experimentu (např. obvykle do 7 dnů či méně po podání dávky v závislosti na specifickém chování zkoušené chemické látky). Pokud při ukončení studie není v tkáních detekována žádná zkoušená chemická látka (např. protože mohlo k její eliminaci dojít ještě před ukončením studie v důsledku krátkého eliminačního poločasu), je třeba důsledně předcházet nesprávné interpretaci údajů. V takové situaci by se měla distribuce v tkáních vyšetřit v době maximální koncentrace zkoušené chemické látky (a/nebo metabolitu) v plazmě/krvi (Tmax) nebo v době maximální míry exkrece látky močí dle vhodnosti (viz odstavec 38). Kromě toho může být potřeba odebrat tkáň ještě v dalších časových bodech k stanovení distribuce zkoušené chemické látky a/nebo jejích metabolitů v tkáních, zhodnocení závislosti na čase (je-li vhodné), pomoci při stanovení látkové bilance a/nebo na základě požadavků příslušného orgánu. Mezi tkáně, které by se měly odebrat, patří játra, tuková tkáň, GI trakt, ledviny, slezina, krev jako celek, zbylé části mrtvého těla, tkáně cílových orgánů a jakékoli další tkáně (např. štítná žláza, erytrocyty, reprodukční orgány, kůže, oči – zejména u zvířat s pigmentací), které mohou mít význam při toxikologickém hodnocení zkoušené chemické látky. Měla by se zvážit analýza dalších tkání ve stejných časových bodech za účelem maximálního využití zvířat a v případě, kdy je ve studiích subchronické a chronické toxicity pozorována toxicita vůči cílovým orgánům. Měly by se rovněž uvádět (radioaktivní) zbytkové koncentrace a poměr tkání a plazmy (krví).
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Zhodnocení distribuce v tkáních v dalších časových bodech, jako je čas maximální koncentrace látky v plazmě/krvi (Tmax) nebo čas maximální míry exkrece látky močí, v příslušných experimentech zkoumajících kinetiku látky v plazmě/krvi nebo exkreci látky, může být také potřebné nebo jej může vyžadovat příslušný orgán. Tyto informace mohou být užitečné k pochopení toxicity a schopnosti akumulace a perzistence zkoušené chemické látky a jejích metabolitů. Mělo by se uvést zdůvodnění výběru vzorků. Vzorky k analýze by měly být obvykle stejné jako výše zmiňované (viz odstavec 37).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Kvantifikaci radioaktivity ve studiích distribuce v tkáních lze provést preparací orgánu, homogenizací, spálením a/nebo solubilizací, po čemž následuje kapalinová scintilační spektrometrie (LSC) zachycených reziduí. Při stanovování distribuce zkoušené chemické látky v orgánech a/nebo tkáních mohou být užitečné určité techniky, které jsou v současnosti v různých fázích vývoje, např. kvantitativní celotělová autoradiografie a receptorová mikroskopická autoradiografie (3), (4).
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              U jiných cest expozice než orální by se měly odebrat a analyzovat specifické tkáně, jako jsou plíce v inhalačních studiích a kůže v dermálních studiích. Viz odstavce 74–78.
                           
                        
                     Metabolismus
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Pro identifikaci a kvantifikaci nezměněné zkoušené chemické látky a metabolitů by se měly odebrat exkrety (a plazma, je-li to vhodné), jak je popsáno v odstavcích 44–49. Sloučení exkretů v rámci skupiny s danou dávkou k usnadnění identifikace metabolitů je přípustné. Doporučuje se určit profil metabolitů v každém časovém období. Pokud však množství vzorků a/nebo výše radioaktivity nejsou dostatečné, je přípustné sloučit moč a výkaly z několika časových bodů. Slučování vzorků odebraných různým pohlavím nebo při různých dávkách však přípustné není. K analýze moči, výkalů, radioaktivity uvolněné z exponovaných zvířat a případně žluči by se měly použít vhodné kvalitativní a kvantitativní metody.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Mělo by se vynaložit dostatečné úsilí k identifikaci všech metabolitů, které představují 5 % množství podané dávky či větším a k vytvoření metabolického schématu zkoušené chemické látky. Měly by se identifikovat zkoušené chemické látky, které byly zjištěny v exkretech v množství 5 % podané dávky a větším,. Identifikací se rozumí přesné určení struktury složek. Obvykle se identifikace provádí simultánní chromatografií metabolitu se známými standardy s použitím dvou rozdílných systémů nebo pomocí technik schopných provést pozitivní identifikaci struktury, jako je hmotnostní spektrometrie, nukleární magnetická rezonance (NMR) atd. V případě simultánní chromatografie se chromatografické techniky používající stejnou stacionární fázi se dvěma různými systémy rozpouštědla nepovažují za dostatečnou verifikaci metabolitu dvěma metodami, neboť tyto metody nejsou nezávislé. Identifikace pomocí simultánní chromatografie by se měla provést pomocí dvou rozdílných analyticky nezávislých systémů, jako je například chromatografie na tenké vrstvě (TLC) s reverzní a normální fází a vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC). Jestliže je chromatografická separace dostatečně kvalitní, není další potvrzení pomocí spektroskopických postupů nutné. Jednoznačné identifikace lze dosáhnout také pomocí metod podávajících informace o struktuře, jako je kapalinová chromatografie/hmotnostní spektrometrie (LC-MS) nebo kapalinová chromatografie/tandemová hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS), plynová chromatografie/hmotnostní spektrometrie (GC-MS) a NMR spektrometrie.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Jestliže identifikace metabolitů představujících 5 % množství podané dávky a větší není možná, mělo by se v závěrečné zprávě uvést zdůvodnění/vysvětlení. Může být vhodné identifikovat metabolity představující méně než 5 % podané dávky k lepšímu pochopení metabolické dráhy zkoušené chemické látky pro posouzení její nebezpečnosti a/nebo rizik. Kdykoli je to možné, mělo by se uvést potvrzení struktury. To může zahrnovat určení jejího profilu v plazmě, krvi nebo jiných tkáních.
                           
                        
                     Vylučování
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Rychlost a rozsah vylučování podané dávky by se měly určit měřením procentuální výtěžnosti (radioaktivní) dávky z moči, výkalů a vydechovaného vzduchu. Tyto údaje rovněž pomohou při stanovení látkové bilance. Množství zkoušené chemické látky (radioaktivita) vyloučené v moči, výkalech a vydechovaném vzduchu by se mělo stanovovat ve vhodných časových intervalech (viz odstavce 47–49). Experimenty s opakovaným podáváním dávky by měly být správně navrženy tak, aby umožnily sběr údajů o exkreci ke splnění cílů popsaných v odstavci 26. Umožní to srovnání s experimenty s jednorázovou dávkou.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Jestliže pilotní studie prokázala, že se ve vydechovaném vzduchu nevylučuje žádné významné množství zkoušené chemické látky (radioaktivity) (dle odstavce 49), nemusí se v konečné studii vydechovaný vzduch odebírat.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Každé zvíře se musí umístit do oddělené metabolické jednotky pro sběr exkretů (moč, výkaly a vydechovaný vzduch). Na konci každého období sběru (viz odstavce 47–49) by se měly metabolické jednotky vypláchnout vhodným rozpouštědlem (tomu se říká „vymytí klece“) aby se zajistil maximální výtěžek zkoušené chemické látky (radioaktivity). Sběr exkretů by se měl ukončit 7. den nebo poté, co bylo získáno alespoň 90 % podané dávky, podle toho, co nastane dříve.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Celková množství zkoušené chemické látky (radioaktivity) v moči se musí stanovit v 1. den sběru alespoň ve dvou časových bodech, z nichž jeden by měl být 24 h po podání dávky, a poté se stanovují denně až do konce studie. První den se doporučuje zvolit více než dva odběrové časy (např. po 6 h, 12 h a 24 h). Výsledky pilotních studií by se měly analyzovat, aby se získaly informace k určení alternativních nebo doplňujících odběrových časů. Odběrová schémata by měla být zdůvodněna.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Celková množství zkoušené chemické látky (radioaktivity) ve výkalech by se měla stanovovat denně, s prvním odběrem 24 h po podání dávky, až do konce studie, pokud pilotní studie nenavrhuje alternativní nebo doplňující odběrové časy. Alternativní odběrová schémata by měla být zdůvodněna.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Sběr vydechovaného CO2 a dalších těkavých materiálů lze v daném studijním experimentu ukončit, jestliže se během 24hodinového období sběru ve vydechovaném vzduchu nalezne méně než 1 % podané dávky.
                           
                        
                     Studie časového průběhu
                  
                  
                     Kinetika v plazmě/krvi
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Cílem těchto studií je získat odhady základních TK parametrů [např. Cmax, Tmax, eliminační poločas (t1/2), AUC] zkoušené chemické látky. Tyto studie lze provádět s jednou dávkou nebo – pravděpodobněji – se dvěma a více dávkami. Nastavení dávek by se mělo určit podle podstaty experimentu a/nebo příslušné tkáně. Kinetické údaje mohou být zapotřebí k řešení otázek, jako je biologická dostupnost zkoušené chemické látky a/nebo k objasnění účinku dávky na clearanci (např. k objasnění, zda je clearance saturována způsobem závisejícím na dávce).
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              V těchto studiích by se měla použít nejméně čtyři zvířata jednoho pohlaví pro každou skupinu s příslušnou dávkou. Mělo by se uvést zdůvodnění pro výběr pohlaví použitých zvířat. Použití obou pohlaví (čtyři samci a čtyři samice) by se mělo zvážit, jestliže existují důkazy, které svědčí o významných rozdílech v toxicitě v závislosti na pohlaví.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Po podání zkoušené chemické látky (radioizotopově značené) by se měly každému zvířeti ve vhodnou dobu odebrat krevní vzorky pomocí náležité metodiky odběru. Objem a množství krevních vzorků, které lze získat od jednoho zvířete, může být limitován potenciálními účinky opakovaného odběru na zdraví/fyziologii zvířete a/nebo citlivostí analytické metody. Vzorky by se měly analyzovat u každého jednotlivého zvířete zvlášť. Za určitých okolností (např. charakterizace metabolitů), může být nutné sloučit vzorky od více než jednoho zvířete. Sloučené vzorky by měly být jasně označené a mělo by se podat zdůvodnění sloučení vzorků. Používá-li se radioizotopově značená zkoušená chemická látka, může být postačující analýza celkové přítomné radioaktivity. Je-li tomu tak, měla by se celková radioaktivita analyzovat v krvi a plazmě nebo v plazmě a červených krvinkách, aby byl možný výpočet podílu látky v krvi/plazmě. V jiných případech mohou být nezbytná specifičtější vyšetření vyžadující identifikaci mateřské sloučeniny a/nebo metabolitů nebo vyhodnocení vazby na proteiny.
                           
                        
                     Kinetika v dalších tkáních
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Cílem těchto studií je získat informace o časovém průběhu, aby bylo možno zodpovědět otázky týkající se např. způsobu toxického účinku, bioakumulace a bioperzistence pomocí stanovení hladiny zkoušené chemické látky v různých tkáních. Výběr tkání a počet hodnocených časových bodů bude záviset na příslušné tkáni a na databázi toxikologických údajů o zkoušené chemické látce. Plán těchto studií kinetiky v dalších tkáních by měl brát v úvahu také informace získané postupy popsanými v odstavcích 37–40. Tyto studie mohou používat jednorázové nebo opakované podání dávky. Mělo by se uvést podrobné zdůvodnění použitého postupu.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Mezi důvody pro provádění studií kinetiky v dalších tkáních může patřit:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          důkaz prodlouženého eliminačního poločasu v krvi naznačující možnou akumulaci zkoušené chemické látky v různých tkáních nebo
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          zájem zjistit, zda bylo v konkrétních tkáních dosaženo ustáleného stavu (např. ve studiích s opakovanými dávkami může být zájem zjistit, zda bylo dosaženo ustáleného stavu v cílových tkáních v okamžiku, kdy bylo zdánlivě dosaženo ustáleného stavu zkoušené chemické látky v krvi).
                                       
                                    
                        
                              55.
                           
                           
                              V těchto typech studií sledujících časový průběh by se měla podat příslušná orální dávka zkoušené chemické látky nejméně čtyřem zvířatům pro každou dávku a každý časový bod a ve vybraných tkáních se poté sleduje časový průběh distribuce. Je možno použít pouze jedno pohlaví, pokud nebyla pozorována toxicita specifická pro pohlaví. Zda se bude analyzovat celková radioaktivita nebo mateřská chemická látka a/nebo metabolity bude rovněž záviset na příslušné tkáni. Vyhodnocení distribuce v tkáních by se mělo provádět pomocí vhodných technik.
                           
                        
                     Enzymová indukce/inhibice
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Studie sledující možné účinky enzymové indukce/inhibice nebo biotransformace studované zkoušené chemické látky mohou být zapotřebí v jednom nebo více z následujících případů:
                              
                                          1)
                                       
                                       
                                          dostupné důkazy naznačují vztah mezi biotransformací zkoušené chemické látky a zvýšenou toxicitou;
                                       
                                    
                                          2)
                                       
                                       
                                          dostupné údaje o toxicitě naznačují nelineární vztah mezi dávkou a metabolismem;
                                       
                                    
                                          3)
                                       
                                       
                                          výsledky studií identifikace metabolitů prokázaly identifikaci potenciálně toxického metabolitu, který by mohl být produkován enzymovou drahou indukovanou zkoušenou chemickou látkou;
                                       
                                    
                                          4)
                                       
                                       
                                          při vysvětlování účinků, o nichž se tvrdí, že jsou spojeny s fenoménem enzymové indukce;
                                       
                                    
                                          5)
                                       
                                       
                                          jsou-li pozorovány toxikologicky významné změny metabolického profilu zkoušené chemické látky buď v in vitro, nebo v in vivo experimentech s různými druhy či za různých podmínek, může být potřebná charakterizace zúčastněného enzymu (zúčastněných enzymů) (např. enzymy fáze I, jako jsou isoenzymy systému monooxygenázy závislém na cytochromu P450, enzymy fáze II, jako jsou isoenzymy sulfotransferázy nebo uridin-difosfát-glukuronosyl-transferázy nebo jakékoli další relevantní enzymy). Tyto informace lze použít ke zhodnocení vhodnosti mezidruhových extrapolací.
                                       
                                    
                        
                              57.
                           
                           
                              Ke zhodnocení změn TK souvisejících se zkoušenou chemickou látkou by se měly použít vhodné protokoly studie, náležitě validované a zdůvodněné. Ukázkové plány studie se skládají z opakovaného podávání dávky neznačené zkoušené chemické látky, po němž následuje 14. den jednorázová radioizotopově značená dávka nebo opakované podávání dávek radioizotopově značené zkoušené chemické látky a odběry vzorků 1., 7. a 14. den ke stanovení profilu metabolitů. Opakované podávání dávky radioizotopově značené zkoušené chemické látky může rovněž poskytnout informace o bioakumulaci (viz odstavec 26).
                           
                        DOPLŇKOVÉ POSTUPY
                  
                              58.
                           
                           
                              Doplňkové postupy nad rámec experimentů in vivo popsané v této zkušební metodě mohou poskytnout užitečné informace o absorpci, distribuci, metabolismu či eliminaci zkoušené chemické látky u určitých druhů.
                           
                        
                     Použití informací in vitro
                     
                  
                  
                              59.
                           
                           
                              Několik otázek týkajících se metabolismu zkoušené chemické látky lze vyřešit pomocí studií in vitro používajících vhodné zkušební systémy. Čerstvě izolované nebo kultivované hepatocyty a subcelulární frakce (např. mikrozomy a cytosol nebo frakce S9) z jater lze použít ke studiu možných metabolitů. Lokální metabolismus v cílovém orgánu, např. plicích, může být předmětem zájmu při posuzování rizik. K těmto účelům mohou být vhodné mikrozomální frakce cílových tkání. Studie na mikrozomech mohou být užitečné ke zkoumání potenciálních rozdílů mezi pohlavími a životními stadii a k charakterizaci enzymatických parametrů (Km a Vmax), které mohou pomoci při hodnocení závislosti metabolismu na dávce v souvislosti s úrovněmi expozice. Dále mohou být mikrozomy užitečné k identifikaci specifických mikrozomálních enzymů účastnících se metabolismu zkoušené chemické látky, které mohou být významné při mezidruhové extrapolaci (viz také odstavec 56). Schopnost indukce biotransformace lze rovněž zkoumat za použití subcelulárních frakcí z jater (např. mikrozomy a cytosol) zvířat předběžně vystavených příslušné zkoušené chemické látce, in vitro prostřednictvím studií indukce hepatocytů nebo pomocí specifických buněčných linií exprimujících příslušné enzymy. Za určitých okolností a vhodných podmínek lze uvažovat o použití subcelulárních frakcí z lidských tkání k stanovení potenciálních rozdílů v biotransformaci mezi druhy. Výsledky zkoumání in vitro mohou být rovněž užitečné při vývoji modelů PBTK (5).
                           
                        
                              60.
                           
                           
                              
                                 In vitro studie dermální absorpce mohou poskytnout doplňující informace k charakterizaci absorpce (6).
                           
                        
                              61.
                           
                           
                              Primární buněčné kultury z jaterních buněk a čerstvé tkáňové řezy lze použít k zodpovězení podobných otázek jako u jaterních mikrozomů. V určitých případech se může podařit zodpovědět konkrétní otázky za použití buněčných linií s definovanou expresí příslušného enzymu nebo buněčných linií připravených pomocí genetického inženýrství. V určitých případech může být užitečné studovat inhibici a indukci specifických isoenzymů cytochromu P450 (např. CYP1A1, 2E1, 1A2 a dalších) a/nebo enzymů fáze II mateřskou sloučeninou ve studiích in vitro. Získané informace mohou být užitečné u sloučenin s podobnou strukturou.
                           
                        
                     Použití toxikokinetických údajů ze studií toxicity jako doplňující informace
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Analýza vzorků krve, tkání a/nebo exkretů získaných během jakýchkoli jiných studií toxicity může poskytnout údaje o biologické dostupnosti, změnách v plazmatických koncentracích v čase (AUC, Cmax), schopnosti bioakumulace, rychlostech clearance a o změnách v metabolismu a kinetice souvisejících s pohlavím nebo životním stadiem.
                           
                        
                              63.
                           
                           
                              Posouzení plánu studie lze použít k zodpovězení otázek týkajících se saturace absorpce, drah biotransformace nebo exkrece při vyšších úrovních dávek, působení nových metabolických drah při vyšších úrovních dávek a omezení toxických metabolitů na vyšší dávky.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Další úvahy při hodnocení nebezpečnosti by se mohly týkat například těchto charakteristik:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          citlivosti spojené s věkem v důsledku rozdílů ve stavu hematoencefalické bariéry, ledvin a/nebo detoxikačních schopností,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          subpopulační citlivosti v důsledku rozdílů v biotransformačních schopnostech nebo jiných TK rozdílech,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          míry expozice plodu prostřednictvím transplacentárního přenosu chemických látek nebo novorozence prostřednictvím laktace.
                                       
                                    
                        
                     Použití toxikokinetického modelování
                  
                  
                              65.
                           
                           
                              Toxikokinetické modely mohou být užitečné pro různé aspekty posouzení nebezpečnosti a rizik, například při predikci systémové expozice a vnitřní dávky v tkáni. Dále je možno zabývat se v těchto modelech specifickými otázkami týkajícími se způsobu účinku a tyto modely mohou představovat základ pro mezidruhovou extrapolaci, extrapolaci mezi cestami expozice, režimy dávkování a pro posouzení rizik pro člověka. Mezi údaje, které jsou užitečné pro vývoj modelů PBTK pro zkoušenou chemickou látku u jakéhokoliv druhu, patří 1) rozdělovací koeficienty, 2) biochemické konstanty a fyziologické parametry, 3) absorpční parametry specifické pro cestu podání a 4) in vivo kinetické údaje pro modelové hodnocení [např. parametry clearance pro příslušné (> 10 %) dráhy exkrece, Km a Vmax pro metabolismus]. Experimentální data používaná při vývoji modelu by měla být získána pomocí řádných vědeckých metod a modelové výsledky by měly být validovány. K usnadnění vývoje nekompartmentálních modelů nebo modelů na fyziologické bázi se často stanovují parametry specifické pro zkoušenou chemickou látku a živočišný druh, jako jsou rychlosti absorpce, rozdělení látky mezi krev a tkáně a konstanty metabolické rychlosti.
                           
                        ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ
                  
                              66.
                           
                           
                              Doporučuje se, aby ve zprávě o studii byl uveden i její obsah.
                           
                        
                     Hlavní část zprávy
                  
                  
                              67.
                           
                           
                              Hlavní část zprávy by měla obsahovat informace získané v této zkušební metodě rozčleněné do oddílů a odstavců následujícím způsobem:
                           
                        
                     Shrnutí
                  
                  
                              68.
                           
                           
                              Tento oddíl zprávy o studii by měl obsahovat shrnutí plánu studie a popis použitých metod. Měl by také zdůraznit klíčové výsledky týkající se látkové bilance, povahy a významu metabolitů, tkáňových reziduí, rychlosti clearance, bioakumulačního potenciálu, rozdílů mezi pohlavími atd. Souhrn by měl být dostatečně podrobný, aby umožňoval zhodnocení výsledků.
                           
                        
                     Úvod
                  
                  
                              69.
                           
                           
                              Tento oddíl zprávy by měl obsahovat cíle studie, zdůvodnění a plán a rovněž příslušné odkazy na literaturu a jakékoli podkladové historické údaje.
                           
                        
                     Materiál a metody
                  
                  
                              70.
                           
                           
                              Tento oddíl zprávy by měl obsahovat podrobné popisy všech relevantních informací, mezi něž patří:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          Zkoušená chemická látka
                                          Tento pododdíl by měl obsahovat identifikaci zkoušené chemické látky: chemický název, molekulární strukturu, kvalitativní a kvantitativní stanovení jejího chemického složení, chemickou čistotu a – je-li to možné – druh a množství nečistot. Rovněž by měl obsahovat informace o fyzikálně-chemických vlastnostech včetně skupenství, barvy, přibližné rozpustnosti a/nebo rozdělovacího koeficientu, stability a případně žíravosti. Případně by se měly uvést informace o izomerech. Je-li zkoušená chemická látka radioizotopově značená, měly by se do tohoto pododdílu zahrnout informace o typu radionuklidu, pozici značky, specifické aktivitě a radiochemické čistotě.
                                          Měl by se uvést druh nebo popis jakéhokoliv nosiče, rozpouštědel, suspenzních a emulgačních činidel či jiných materiálů použitých při podávání zkoušené chemické látky.
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          Pokusná zvířata
                                          Tento pododdíl by měl obsahovat informace o pokusných zvířatech, včetně výběru druhu a zdůvodnění výběru příslušného druhu, kmene a stáří na počátku studie, pohlaví a rovněž tělesné hmotnosti, zdravotního stavu a zvířecího chovu.
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          Metody
                                          Tento pododdíl by měl obsahovat podrobnosti o plánu studie a použité metodice. Měl by zahrnovat:
                                          
                                                      1)
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění jakékoli úpravy cesty expozice a případně podmínek expozice;
                                                   
                                                
                                                      2)
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění výběru úrovní dávek;
                                                   
                                                
                                                      3)
                                                   
                                                   
                                                      popis pilotních studií použitých v experimentálním plánu následných studií, je-li to vhodné. Měly by se předložit podpůrné údaje pro pilotní studie;
                                                   
                                                
                                                      4)
                                                   
                                                   
                                                      popis přípravy podávaného roztoku a druh použitého rozpouštědla nebo nosiče, pokud se používaly;
                                                   
                                                
                                                      5)
                                                   
                                                   
                                                      počet exponovaných skupin zvířat a počet zvířat v každé skupině;
                                                   
                                                
                                                      6)
                                                   
                                                   
                                                      úrovně a objemy dávek (a specifická aktivita dávky, používá-li se radioaktivita);
                                                   
                                                
                                                      7)
                                                   
                                                   
                                                      cestu (cesty) a způsoby podání;
                                                   
                                                
                                                      8)
                                                   
                                                   
                                                      četnost podávání dávky;
                                                   
                                                
                                                      9)
                                                   
                                                   
                                                      období lačnění (pokud se použilo);
                                                   
                                                
                                                      10)
                                                   
                                                   
                                                      celkovou radioaktivitu působící na každé zvíře;
                                                   
                                                
                                                      11)
                                                   
                                                   
                                                      popis manipulace se zvířaty;
                                                   
                                                
                                                      12)
                                                   
                                                   
                                                      odběr vzorků a manipulace s nimi;
                                                   
                                                
                                                      13)
                                                   
                                                   
                                                      analytické metody použité k separaci, kvantifikaci a identifikaci metabolitů;
                                                   
                                                
                                                      14)
                                                   
                                                   
                                                      mez detekce použitých metod;
                                                   
                                                
                                                      15)
                                                   
                                                   
                                                      další použitá experimentální měření a postupy (včetně validace metod pro analýzu metabolitů).
                                                   
                                                
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          Statistická analýza
                                          Pokud se k analýze výsledků studie používá statistická analýza, měly by se uvést dostatečné informace o metodě analýzy a použitý výpočetní program, aby mohl nezávislý recenzent/statistik analýzu znovu vyhodnotit a rekonstruovat.
                                          V případě studií modelujících systémy, například PBTK, by mělo představení modelů obsahovat kompletní popis modelů umožňující nezávislou rekonstrukci a validaci modelu (viz odstavec 65 a dodatek: Definice).
                                       
                                    
                        
                     Výsledky
                  
                  
                              71.
                           
                           
                              Veškeré údaje by se měly shrnout a uvést v tabulkách spolu s příslušným statistickým vyhodnocením a popsat v textu tohoto oddílu. Naměřené údaje o radioaktivitě by se měly shrnout a uvést způsobem vhodným pro studii, obvykle jako počet mikrogramů nebo miligramů na hmotnost vzorku, lze však použít i jiné jednotky. Tento oddíl by měl obsahovat grafická znázornění výsledků, reprodukci příslušných chromatografických a spektrometrických údajů, identifikaci/kvantifikaci metabolitů a navrhované metabolické dráhy, včetně molekulární struktury metabolitů. Kromě toho by se měly v tomto oddíle uvést následující informace, je-li to možné:
                              
                                          1)
                                       
                                       
                                          kvantita a procentuální výtěžek radioaktivity v moči, výkalech, vydechovaném vzduchu a v rozpouštědle po vymytí klece od moči a výkalů:
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      u dermálních studií rovněž uveďte údaje o výtěžku zkoušené chemické látky z exponované kůže, oplachů kůže a zbytkovou radioaktivitu v materiálu pokrývajícím kůži a v metabolické jednotce a také výsledky studie oplachů kůže. Další diskusi naleznete v odstavcích 74–77,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      u inhalačních studií rovněž uveďte údaje o výtěžku zkoušené chemické látky z plic a nosních tkání (8). Další diskusi naleznete v odstavci 78;
                                                   
                                                
                                    
                                          2)
                                       
                                       
                                          distribuce v tkáních uvedená jako procento podané dávky a koncentrace (počet mikrogramů na gram tkáně) a podíly množství látky v tkáni vůči krvi nebo v tkáni vůči plazmě;
                                       
                                    
                                          3)
                                       
                                       
                                          látková bilance z každé studie zahrnující rozbor tělních tkání a exkretů;
                                       
                                    
                                          4)
                                       
                                       
                                          plazmatické koncentrace a toxikokinetické parametry (biologická dostupnost, AUC, Cmax, Tmax, clearance, eliminační poločas) po podání látky příslušnou cestou (příslušnými cestami) expozice;
                                       
                                    
                                          5)
                                       
                                       
                                          rychlost a míra absorpce zkoušené chemické látky po podání příslušnou cestou (příslušnými cestami) expozice;
                                       
                                    
                                          6)
                                       
                                       
                                          množství zkoušené chemické látky a metabolitů (uvedená jako procento podané dávky) v exkretech;
                                       
                                    
                                          7)
                                       
                                       
                                          odkaz na údaje v dodatku, které obsahují všechny údaje týkající se měřených cílových parametrů u jednotlivých zvířat (např. podání dávky, procentuální výtěžek, koncentrace, TK parametry atd.);
                                       
                                    
                                          8)
                                       
                                       
                                          Obrázek s navrhovanými metabolickými drahami a molekulárními strukturami metabolitů.
                                       
                                    
                        
                     Diskuse a závěry
                  
                  
                              72.
                           
                           
                              V tomto oddíle by měl autor (by měli autoři):
                              
                                          1)
                                       
                                       
                                          uvést navrhovanou metabolickou dráhu vycházející z výsledků týkajících se metabolismu a rozmístění zkoušené chemické látky;
                                       
                                    
                                          2)
                                       
                                       
                                          prodiskutovat jakékoli potenciální druhové a pohlavní rozdíly týkající se distribuce a/nebo biotransformace zkoušené chemické látky;
                                       
                                    
                                          3)
                                       
                                       
                                          uvést v tabulkách a prodiskutovat identifikaci a význam metabolitů, rychlosti clearance, bioakumulační potenciál a množství tkáňových reziduí mateřské sloučeniny a/nebo metabolitu (metabolitů) a rovněž změny TK parametrů v závislosti na dávce, je-li to vhodné;
                                       
                                    
                                          4)
                                       
                                       
                                          zahrnout do tohoto oddílu všechny relevantní TK údaje získané během provádění studií toxicity;
                                       
                                    
                                          5)
                                       
                                       
                                          uvést stručný a výstižný závěr, který lze podložit výsledky studie;
                                       
                                    
                                          6)
                                       
                                       
                                          přidat další oddíly (dle potřeby či vhodnosti).
                                       
                                    
                        
                              73.
                           
                           
                              Další oddíly by měly sloužit k uvedení podpůrných informací z literatury, tabulek, obrázků, dodatků atd.
                           
                        ALTERNATIVNÍ CESTY EXPOZICE
                  
                     Dermální
                  
                  
                     Dermální aplikace
                  
                  
                              74.
                           
                           
                              Tento oddíl uvádí specifické informace ohledně zkoumání toxikokinetiky zkoušené chemické látky při aplikaci dermální cestou. Pro informace o dermální absorpci je třeba nahlédnout do kapitoly B.44 této přílohy [Absorpce kůží: metoda in vivo (9)]. U ostatních cílových parametrů, jako jsou distribuce a metabolismus, je možno použít tuto zkušební metodu B.36. Při dermální aplikaci by se měla použít jedna nebo více úrovní dávky zkoušené chemické látky. Zkoušená chemická látka (např. čistý, zředěný, nebo formulovaný materiál obsahující zkoušenou chemickou látku, která je aplikována na kůži) by měla být stejná jako ta, které mohou být lidé nebo jiné potenciální cílové druhy vystaveny (nebo by měla být její realistickou náhražkou). Úroveň (úrovně) dávky by se měly vybrat v souladu s odstavci 20–26 této zkušební metody. Mezi faktory, které by se měly vzít v úvahu při výběru dermální dávky, patří očekávaná expozice člověka a/nebo dávky, při nichž byla pozorována toxicita v jiných studiích dermální toxicity. Dermální dávka (dávky) by se měla v případě potřeby rozpustit ve vhodném nosiči a aplikovat v objemu dostatečném pro její dodání. Krátce před zahájením zkoušky by se měla zvířatům ostříhat srst na zádech. Vyholení srsti je rovněž možné, mělo by se však provést asi 24 hodin před zkouškou. Při stříhání nebo holení srsti je třeba dbát na to, aby se neporanila kůže, což by mohlo změnit její prostupnost. Pro aplikaci zkoušené chemické látky by se mělo obnažit přibližně 10 % tělesného povrchu. U vysoce toxických chemických látek může být tato plocha menší než přibližně 10 %, avšak měla by se pokrýt co možná největší plocha tenkou a rovnoměrnou vrstvičkou látky. U všech zkoušených skupin by se měla k aplikaci látky použít stejná plocha povrchu. Plochy s nanesenou dávkou by se měly chránit vhodným krytím, které se upevní v daném místě. Zvířata by se měla chovat odděleně.
                           
                        
                              75.
                           
                           
                              Měla by se provést studie mytí kůže k stanovení množství aplikované dávky zkoušené chemické látky, které lze z kůže odstranit mytím ošetřené oblasti kůže jemným mýdlem a vodou. Tato studie může rovněž pomoci při stanovování látkové bilance, pokud je zkoušená chemická látka podávána dermální cestou. Při této studii mytí kůže by se měla aplikovat dvěma zvířatům jedna dávka zkoušené chemické látky. Úroveň dávky se zvolí v souladu s odstavcem 23 této zkušební metody (viz rovněž diskusi o době kontaktu s kůží v odstavci 76). Měla by se stanovit množství zkoušené chemické látky získaná z těchto mytí, aby se zhodnotila účinnost odstranění zkoušené chemické látky mytím.
                           
                        
                              76.
                           
                           
                              Pokud to není vyloučeno kvůli žíravosti, měla by se zkoušená chemická látka aplikovat a udržovat na kůži alespoň 6 hodin. Po odstranění krytí by se měla ošetřená oblast umýt postupem uvedeným ve studii mytí kůže (viz odstavec 75). V krytí i v tekutině z mytí by se měla analyzovat zbytková zkoušená chemická látka. Při ukončení studií by se měla všechna zvířata humánním způsobem utratit v souladu s (2) a ošetřená kůže se odstraní. Měla by se analyzovat příslušná část ošetřené kůže, aby se stanovila zbytková zkoušená chemická látka (radioaktivita).
                           
                        
                              77.
                           
                           
                              Pro toxikokinetické hodnocení farmaceutik mohou být zapotřebí různé postupy, v souladu s příslušným regulačním systémem.
                           
                        
                     Inhalační
                  
                  
                              78.
                           
                           
                              Měla by se použít jedna koncentrace (či více, je-li to třeba) zkoušené chemické látky. Koncentrace by se měla (měly) vybrat v souladu s odstavci 20–26 této zkušební metody. Inhalační expozice by se měly provést pomocí „nosního konusu“ nebo přístroje typu „pouze hlava“, aby se zabránilo absorpci alternativními cestami expozice (8). Používají-li se jiné podmínky inhalační expozice, mělo by být zdokumentováno zdůvodnění této změny. Měla by se definovat délka inhalační expozice, obvykle expozice trvá 4–6 hodin.
                           
                        
                     LITERATURA:
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment N°19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73-81.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor microscopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25-40.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400 – 411.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Kapitola B.45 této přílohy, Absorpce kůží: Metoda in vitro.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              IPCS (2010). Characterization and application of Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organization, International Programme on Chemical Safety.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Kapitola B.44 této přílohy, Absorpce kůží: Metoda in vivo.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Barton HA, et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel Dekker, Inc., New York.
                           
                        
                     Dodatek
                     DEFINICE
                     
                        Absorpce: Proces(y) příjmu či prostupování chemických látek tkáněmi. Absorpce se týká mateřské sloučeniny a všech jejích metabolitů. Nezaměňovat s „biologickou dostupností“.
                     
                        Akumulace (bioakumulace): Zvýšení množství zkoušené chemické látky v tkáních (obvykle v tukových tkáních po opakované expozici) postupem času. Pokud je přísun zkoušené chemické látky do těla větší než rychlost, kterou je vylučována, organismus zkoušenou chemickou látku akumuluje a je možno dosáhnout toxických koncentrací zkoušené chemické látky.
                     
                        ADME: Akronym pro „absorpce, distribuce, metabolismus a exkrece“.
                     
                        AUC: (Plocha pod křivkou závislosti plazmatické koncentrace na čase): Plocha pod křivkou v grafu vyjadřujícím závislost koncentrace zkoušené chemické látky v plazmě na čase. Představuje celkové množství zkoušené chemické látky absorbované tělem za předem stanovené časové období. Za lineárních podmínek je AUC (od času nula až do nekonečna) úměrná celkovému množství zkoušené chemické látky absorbované tělem bez ohledu na rychlost absorpce.
                     
                        Autoradiografie: (Celotělová autoradiografie): Používá se ke kvalitativnímu a/nebo kvantitativnímu určení lokalizace radioaktivní zkoušené chemické látky v tkáni. Tato technika používá radiografický film nebo v poslední době skenování využívající fosforové záznamové desky k vizualizaci radioaktivně značených molekul nebo fragmentů molekul prostřednictvím záznamu záření vydávaného studovaným objektem. Kvantitativní celotělová autoradiografie může mít v porovnání s pitvou orgánů různé výhody při hodnocení distribuce zkoušené chemické látky a stanovení celkové výtěžnosti a rozlišení radioaktivního materiálu v tkáních. Jednou, velmi podstatnou výhodou je například to, že ji lze používat u pigmentovaného zvířecího modelu k stanovení možné vazby zkoušené chemické látky na melanin, který je schopen vázat určité molekuly. Přestože tato technika může poskytovat vhodné celotělové přehledy vazebných míst o vysoké kapacitě a nízké afinitě, při rozeznávání specifických cílových míst, jako jsou receptorová vazebná místa, kde je k detekci zapotřebí poměrně vysoké rozlišení a vysoká citlivost, může mít naopak svá omezení. Používá-li se autoradiografie, měly by se experimenty určené ke stanovení látkové bilance podané sloučeniny provádět jako samostatná skupina nebo v rámci samostatné studie oddělené od experimentu stanovujícím tkáňovou distribuci, v němž se všechny exkrety (které mohou zahrnovat rovněž vydechovaný vzduch) a celá mrtvá těla homogenizují a analyzují pomocí kapalinové scintilační spektrometrie.
                     
                        Biliární exkrece: Exkrece žlučovody.
                     
                        Bioakumulace: Viz „akumulace“.
                     
                        Biologická dostupnost (biodostupnost): Frakce podané dávky, která se dostane do systémového oběhu nebo je k dispozici v místě fyziologického působení. Biologická dostupnost zkoušené chemické látky se obvykle týká mateřské sloučeniny, ale mohla by se vztahovat i na její metabolit. Bere v úvahu pouze jednu chemickou formu. Poznámka: biologická dostupnost a absorpce nejsou totéž. Rozdíl mezi např. orální absorpcí (tj. přítomností látky ve střevní stěně a portálním oběhu) a biologickou dostupností (tj. přítomností látky v systémovém oběhu a tkáních) může vzniknout mimo jiné v důsledku rozkladu látky v rámci metabolismu střevní stěny nebo transportu prostřednictvím efluxních pump zpět do dutiny střeva nebo presystémového metabolismu v játrech (10). Biologická dostupnost toxické složky (mateřské sloučeniny nebo metabolitu) je rozhodujícím parametrem při posuzování rizika pro člověka (extrapolace z vysokých dávek do oblasti nízkých dávek, extrapolace mezi cestami) k odvození vnitřní hodnoty z externích hodnot NOAEL či BMD (aplikovaná dávka). Pro účinky na játra po orálním podání je dostačující znát orální absorpci. Nicméně pro všechny ostatní účinky, kromě účinků v místě vstupu, je obecně spolehlivějším parametrem pro další použití v posouzení rizika biologická dostupnost, nikoliv absorpce.
                     
                        Bioperzistence: Viz „perzistence“.
                     
                        Biotransformace: (Obvykle enzymová) chemická konverze zkoušené chemické látky v těle na odlišnou chemickou látku. Synonymní s pojmem „metabolismus“.
                     
                        Cmax
                        : Buď maximální (vrcholová) koncentrace v krvi (plazmě/séru) po podání nebo maximální (vrcholová) exkrece (v moči nebo výkalech) po podání.
                     
                        Rychlost clearance: Kvantitativní míra rychlosti, jakou je zkoušená chemická látka odstraňována z krve, plazmy nebo určité tkáně za jednotku času.
                     
                        Kompartment: Strukturní nebo biochemická část (či jednotka) těla, tkáně nebo buňky, která je oddělena od zbytku.
                     
                        Detoxikační dráhy: Série kroků vedoucích k eliminaci toxických chemických látek z těla buď metabolickou přeměnou, nebo exkrecí.
                     
                        Distribuce: Rozšíření zkoušené chemické látky a jejích derivátů v celém organismu.
                     
                        Enzymy/isoenzymy: Proteiny, které katalyzují chemické reakce. Isoenzymy jsou enzymy, které katalyzují podobné chemické reakce, avšak liší se ve svých aminokyselinových sekvencích.
                     
                        Enzymové parametry: Km: Michaelisova konstanta a Vmax: maximální rychlost
                     
                        Exkrece: Proces(y), kterým(i) se podaná zkoušená chemická látka a/nebo její metabolity odstraňují z těla.
                     
                        Exogenně: Zavedený z vnějšku nebo produkovaný mimo organismus nebo systém.
                     
                        Extrapolace: Odvození jedné nebo více neznámých hodnot na základě známých nebo pozorovaných skutečností.
                     
                        Eliminační poločas (t1/2): Doba nutná k poklesu koncentrace zkoušené chemické látky v kompartmentu o jednu polovinu. Obvykle se vztahuje k plazmatické koncentraci nebo množství zkoušené chemické látky v celém těle.
                     
                        Indukce / enzymová indukce: Enzymová syntéza v reakci na environmentální stimul nebo molekulu induktoru.
                     
                        Linearita / lineární kinetika: Proces je ve smyslu kinetiky lineární, pokud všechny rychlosti přenosu mezi kompartmenty jsou úměrné přítomným množstvím nebo koncentracím, tj. prvního řádu. V důsledku toho jsou clearance, distribuční objemy a rovněž eliminační poločasy konstantní. Dosažené koncentrace jsou úměrné míře dávkování (expozice) a akumulaci lze snadněji předpovídat. Linearitu/nelinearitu lze vyhodnotit porovnáním příslušných parametrů, např. AUC, po různých dávkách nebo po jednorázové a opakovaných expozicích. Nepřítomnost závislosti na dávce může nasvědčovat saturaci enzymů účastnících se metabolismu dané sloučeniny, vzestup AUC po opakované expozici v porovnání s jednorázovou expozicí může naznačovat inhibici metabolismu a pokles AUC může svědčit o indukci metabolismu [viz také (11)].
                     
                        Látková bilance: Bilance zkoušené chemické látky vstupující do systému a opouštějící systém.
                     
                        Hmotnostní bilance: Viz „látková bilance“.
                     
                        Mechanismus (způsob) toxicity / mechanismus (způsob) účinku: Mechanismus účinku se vztahuje k specifickým biochemickým interakcím, pomocí nichž zkoušená chemická látka účinkuje. Způsob účinku se vztahuje k obecnějším drahám vedoucím k toxicitě zkoušené chemické látky.
                     
                        Metabolismus: Synonymní s pojmem „biotransformace“.
                     
                        Metabolity: Produkty metabolismu nebo metabolických procesů.
                     
                        Orální absorpce: Procento dávky zkoušené chemické látky absorbované z místa podání (tj. GI traktu). Tento kritický parametr lze použít k pochopení frakce podané chemické látky, která se dostane až do vrátnicové žíly a následně do jater.
                     
                        Rozdělovací koeficient: Rovněž znám jako distribuční koeficient, je měřítkem diferenciální rozpustnosti chemické látky ve dvou rozpouštědlech.
                     
                        Maximální hladiny v krvi (plazmě/séru): Maximální (vrcholová) koncentrace v krvi (plazmě/séru) po podání (viz také „Cmax“).
                     
                        Perzistence (bioperzistence): Dlouhodobá přítomnost chemické látky (v biologickém systému) v důsledku odolnosti vůči degradaci/eliminaci.
                     
                        Analogický přístup: Informace o cílovém parametru u jedné nebo více chemických látek se použijí k odhadu cílového parametru u cílové chemické látky.
                     
                        Receptorová mikroskopická autoradiografie (nebo receptorová mikroautoradiografie): Tuto techniku lze použít k vyšetření xenobiotických interakcí se specifickými místy v tkáních nebo buněčných populacích, například ve studiích vazeb na receptory či specifických způsobů účinku, které mohou vyžadovat vysoké rozlišení a vysokou citlivost, jež nemusí být dosažitelná s pomocí jiných technik, jako je celotělová autoradiografie.
                     
                        Cesta podání (orální, nitrožilní, dermální, inhalační atd.): Vztahuje se ke způsobu, jakým jsou chemické látky dopraveny do těla (např. orálně sodnou, orálně v krmivu, dermálně, inhalací, nitrožilně atd.).
                     
                        Saturace: Stav, kdy jeden nebo více kinetických (např. absorpce, metabolismus či clearance) proces(ů) dosáhne maxima (tzn. „je saturován“).
                     
                        Citlivost: Schopnost metody nebo přístroje rozlišit mezi naměřenými odezvami představujícími různé hodnoty dotčené proměnné.
                     
                        Ustálené hladiny v krvi (plazmě): Nerovnovážný stav otevřeného systému, kdy všechny síly působící na systém jsou přesně vyrovnávány opačnými silami, a to takovým způsobem, že všechny složky systému mají neměnnou koncentraci, přestože systémem proudí hmota.
                     
                        Modelování systémů (toxikokinetické založené na fyziologii, založené na farmakokinetice, farmakokinetické založené na fyziologii, založené na biologii atd.): Abstraktní model, který používá k popisu chování systému matematický jazyk.
                     
                        Cílová tkáň: Tkáň, v níž se projevuje hlavní nepříznivý účinek toxické látky.
                     
                        Zkoušená chemická látka: Jakákoli chemická látka nebo směs zkoušená pomocí této zkušební metody.
                     
                        Distribuce v tkáních: Reverzibilní pohyb zkoušené chemické látky z jednoho místa v těle do jiného. Distribuci v tkáních lze studovat pomocí pitvy orgánů, homogenizace, spálení a kapalinové scintilační spektrometrie či pomocí kvalitativní a/nebo kvantitativní celotělové autoradiografie. První způsob je užitečný pro získání hodnoty koncentrace a procentuální výtěžnosti z tkání a zbylého mrtvého těla stejných zvířat, avšak nemusí mít dostatečné rozlišení pro všechny tkáně a může mít menší než ideální celkovou výtěžnost (< 90 %). Definici druhého způsobu viz výše.
                     
                        Tmax
                        : Doba potřebná k dosažení Cmax.
                     
                        Toxikokinetika (Farmakokinetika): Studie absorpce, distribuce, metabolismu a vylučování chemických látek v průběhu času.
                     
                        Validace modelů: Postup zhodnocení adekvátnosti modelu pro účely konzistentního popisu dostupných toxikokinetických údajů. Modely lze vyhodnotit pomocí statistického a vizuálního porovnání modelových předpovědí s experimentálními hodnotami oproti společné nezávislé proměnné (např. čas). Rozsah hodnocení by se měl odůvodnit vzhledem k určenému použití modelu.
                  “
            
                  8)
               
               
                  Doplňuje se kapitola B.52:
                  „B.52   AKUTNÍ INHALAČNÍ TOXICITA – METODA STANOVENÍ TŘÍDY AKUTNÍ TOXICITY
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda odpovídá Pokynům OECD pro zkoušení (TG) 436 (2009). První pokyny k akutní inhalační toxicitě TG 403 byly schváleny v roce 1981 a od té doby byly revidovány (viz kapitola B.2 této přílohy (1)). Po schválení revidované metody stanovení třídy akutní toxicity (ATC) u orální toxicity (kapitola B.1 tris této přílohy) (5) se považovalo za vhodné vyvinout metodu ATC u inhalační toxicity (2), (3), (4). Retrospektivní zhodnocení funkčnosti zkušební metody ATC pro akutní inhalační toxicitu prokázalo, že je tato metoda vhodná pro použití k účelům klasifikace a označení (6). Inhalační ATC zkušební metoda umožní použít sérii kroků o fixních cílových koncentracích k získání klasifikace toxicity zkoušené chemické látky. Jako základní cílový parametr se používá letalita, nicméně zvířata trpící závažnou bolestí nebo strádáním, utrpením či blížícím se uhynutím by se měla humánním způsobem utratit, aby se minimalizovalo jejich utrpení. Pokyny k humánním cílovým parametrům jsou k dispozici v Pokynech OECD č. 19 (7).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Pokyny k provádění a interpretaci této zkušební metody naleznete v pokynech č. 39 – Guidance Document No. 39 on Acute Inhalation Toxicity Testing (GD 39) (8).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Definice použité v kontextu této zkušební metody naleznete v dodatku 1 a v GD 39 (8).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda poskytuje informace o nebezpečných vlastnostech a umožňuje zařadit a klasifikovat zkoušenou chemickou látku podle nařízení (ES) č. 1272/2008 pro klasifikaci chemických látek, které způsobují akutní toxicitu (9). V případě, že jsou zapotřebí bodové odhady hodnot LC50 nebo analýzy odezvy na koncentraci, je vhodnou zkušební metodou, která by se měla použít, kapitola B.2 této přílohy (1). Další pokyny k výběru zkušební metody naleznete v dokumentu GD 39 (8). Tato zkušební metoda není výslovně určena pro zkoušky speciálních materiálů, jako jsou špatně rozpustné izometrické nebo vláknité materiály či vyráběné nanomateriály.
                           
                        VÝCHOZÍ ÚVAHY
                  
                              5.
                           
                           
                              Před zamýšlením provést zkoušky v souladu s touto zkušební metodou by měla laboratoř provádějící zkoušky vzít v úvahu veškeré dostupné informace o zkoušené chemické látce, včetně stávajících studií, jejichž výsledky by podpořily neprovádění dalších zkoušek, aby se minimalizovalo použití zvířat. Informace, které mohou pomoci při výběru nejvhodnějších druhů, kmenů, pohlaví, způsobu expozice a vhodných zkušebních koncentrací, se týkají identity, chemické struktury a fyzikálně-chemických vlastností zkoušené chemické látky, výsledků jakýchkoli testů toxicity in vitro nebo in vivo, předpokládaného použití a potenciální expozice u člověka, dostupných údajů (Q)SAR a toxikologických údajů o strukturně příbuzných chemických látkách. Koncentrace, u nichž se očekává, že způsobí intenzivní bolest a utrpení vzhledem k žíravým (11) nebo silně dráždivým účinkům, by se neměly touto zkušební metodou testovat [viz GD 39 (8)].
                           
                        PODSTATA ZKOUŠKY
                  
                              6.
                           
                           
                              Podstatou zkoušky je, že se pomocí postupu prováděného po krocích získají dostatečné informace o akutní inhalační toxicitě zkoušené chemické látky během 4hodinového období expozice, které umožní její klasifikaci. Pro specifické regulační účely mohou být použity i jiné doby trvání expozice. V každém kroku s definovanou koncentrací se testují 3 zvířata od každého pohlaví. V závislosti na mortalitě a/nebo stavu agónie zvířat lze o akutní toxicitě zkoušené chemické látky rozhodnout průměrně na základě 2 kroků. Jsou-li k dispozici důkazy, že je jedno pohlaví citlivější než druhé, pak je možné ve zkoušce pokračovat pouze s citlivějším pohlavím. Výsledek předchozího kroku určí následující krok tak, že:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          nebudou nutné žádné další zkoušky;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          provede se zkouška u tří zvířat od každého pohlaví, nebo
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          provede se zkouška se 6 zvířaty pouze citlivějšího pohlaví, tj. nižší mezní odhady toxické třídy by se měly zakládat na 6 zvířatech v každé skupině se zkoušenou koncentrací, bez ohledu na pohlaví.
                                       
                                    
                        
                              7.
                           
                           
                              Umírající zvířata nebo zvířata, která zjevně projevují příznaky bolesti nebo značného a přetrvávajícího utrpení, by se měla humánně utratit a při analýze výsledků se hodnotí jako zvířata uhynulá při zkoušce. Kritéria rozhodování o utracení umírajících nebo značně trpících zvířat a pokyny týkající se rozpoznání předvídatelného nebo blížícího se uhynutí jsou předmětem Pokynů č. 19 o humánních cílových parametrech (7).
                           
                        POPIS METODY
                  
                     Výběr zvířecích druhů
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Měla by se použít mladá zdravá dospělá zvířata běžně používaných laboratorních kmenů. Upřednostňovaným druhem je potkan, a pokud se použijí jiné druhy, mělo by se uvést odůvodnění.
                           
                        
                     Příprava zvířat
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Samice musí být nullipary a nesmí být březí. V den expozice by mělo jít o mladé dospělé jedince ve stáří 8 až 12 týdnů a jejich tělesná hmotnost by se měla pohybovat v rozmezí ± 20 % průměrné hmotnosti pro každé pohlaví již dříve exponovaných zvířat stejného stáří. Zvířata jsou náhodně vybrána a označena pro potřeby individuální identifikace. Zvířata se umístí do klecí nejméně 5 dnů před začátkem studie, aby si mohla zvyknout na laboratorní podmínky. Zvířata by se také měla nechat po krátkou dobu před zahájením zkoušky zvyknout na zkušební zařízení, neboť to sníží stres způsobený novým prostředím.
                           
                        
                     Zvířecí chov
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Teplota zkušební místnosti, v níž se uchovávají zvířata, by měla být 22 ± 3 °C. Relativní vlhkost by se měla ideálně udržovat v rozmezí 30 až 70 %, ačkoliv to nemusí být možné, používá-li se jako nosič voda. Před expozicí a po ní by se měla zvířata držet v klecích rozdělena do skupin podle pohlaví a koncentrace, avšak počet zvířat v jedné kleci by neměl bránit jasnému pozorování každého zvířete a měl by minimalizovat ztráty v důsledku kanibalismu nebo bojů. Jsou-li zvířata vystavena látce pouze nazální cestou, může být nutné nechat je zvyknout si na omezující trubičky. Omezující trubičky by neměly zvířatům způsobovat přílišný fyzický, termální nebo imobilizační stres. Zábrana může ovlivnit fyziologické cílové parametry, jako je tělesná teplota (hypertermie) a/nebo minutový dechový objem. Jsou-li k dispozici obecné údaje, které prokazují, že k takovým změnám nedochází ve značné míře, není předběžná adaptace na omezující trubičky nutná. Zvířata, jež jsou vystavena aerosolu celým tělem, by se měla držet během expozice odděleně, aby se zabránilo pronikání zkoušeného aerosolu z jejich těla do srsti ostatních zvířat v kleci. Mohou se používat konvenční a certifikovaná laboratorní krmiva, kromě období expozice, podávaná s neomezeným množstvím pitné vody z vodovodu. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy.
                           
                        
                     Inhalační komory
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Při výběru inhalační komory by se měla zvážit povaha zkoušené chemické látky a cíl zkoušky. Upřednostňuje se expozice pouze nazální cestou (přičemž tento termín zahrnuje i výrazy pouze-hlava, pouze-nos, pouze-čenich). Expozice pouze nazální cestou se obecně upřednostňuje u studií kapalných nebo pevných aerosolů a par, které mohou kondenzací vytvářet aerosoly. Speciálních cílů studie lze snáze dosáhnout, použije-li se celotělová expozice, avšak tato skutečnost by se měla zdůvodnit ve zprávě o studii. Pro zajištění stability atmosféry v komoře pro celotělovou expozici by neměl celkový objem zaplněný pokusnými zvířaty přesáhnout 5 % objemu komory. Principy techniky expozice pouze nazální cestou a celotělové expozice a jejich konkrétní výhody a nevýhody jsou popsány v dokumentu GD 39 (8).
                           
                        PODMÍNKY EXPOZICE
                  
                     Podání koncentrací
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Doporučuje se fixní doba expozice čtyři hodiny, nepočítaje v to dobu potřebnou k dosažení rovnováhy. K splnění specifických požadavků mohou být třeba jiné délky trvání expozice, avšak mělo by se pro ně uvést zdůvodnění ve zprávě o studii [viz GD 39 (8)]. Zvířata vystavená látce v komorách pro celotělovou expozici by se měla držet odděleně, aby se zabránilo pozření zkoušené látky při vzájemné péči o srst s ostatními zvířaty v kleci. Během expozice by se mělo pozastavit krmení zvířat. Během celotělové expozice je možno zvířatům podávat vodu.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Zvířata jsou vystavena zkoušené chemické látce ve formě plynu, páry, aerosolu nebo jejich směsi. Skupenství látky, které se má zkoušet, závisí na fyzikálně-chemických vlastnostech zkoušené chemické látky, zvolené koncentraci a/nebo fyzické formě, v níž se bude zkoušená chemická látka s největší pravděpodobností nacházet při manipulaci a používání. Hygroskopické a chemicky reaktivní zkoušené chemické látky by se měly zkoušet v podmínkách suchého vzduchu. Je třeba pečlivě zabránit vzniku explozivních koncentrací.
                           
                        
                     Distribuce velikosti částic
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              U všech aerosolů a par, které mohou kondenzací vytvořit aerosoly, by se mělo provést stanovení velikosti částic. Aby byla možná expozice všech důležitých částí dýchací soustavy, doporučují se aerosoly s hodnotami hmotnostního mediánu aerodynamického průměru (MMAD) v rozmezí 1 až 4 μm a s geometrickou směrodatnou odchylkou (σg) v rozmezí 1,5 až 3,0 (8), (13), (14). Přestože by se mělo vynaložit dostatečné úsilí k splnění této normy, není-li to možné, je třeba poskytnout odborný posudek. Například kovové výpary mohou být menší, než je tato norma, a nabité částice, vlákna a hygroskopické materiály (které ve vlhkém prostředí dýchacích cest nabývají na velikosti) mohou tuto normu překročit.
                           
                        
                     Příprava zkoušené chemické látky na nosiči
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              K dosažení vhodné koncentrace a velikosti částic zkoušené chemické látky v ovzduší lze použít nosič. Zpravidla by se měla dávat přednost vodě. Částicový materiál se může zpracovat mechanickými postupy, aby se dosáhlo požadované distribuce velikosti částic, avšak mělo by se zajistit, že nedojde k rozkladu nebo přeměně zkoušené chemické látky. Domníváte-li se, že mechanické postupy změnily chemické složení zkoušené látky (např. extrémně vysoká teplota v důsledku frikce při intenzivním mletí), mělo by se složení zkoušené chemické látky ověřit analyticky. Je třeba dostatečně zabezpečit, aby nedošlo ke kontaminaci zkoušené chemické látky. Nedrolivé zrnité materiály, které jsou záměrně zformulovány tak, aby je nebylo možno vdechnout, není třeba zkoušet. K prokázání skutečnosti, že při manipulaci se zrnitým materiálem nevznikají vdechovatelné částice, by se měla použít zkouška otěru. Pokud při zkoušce otěru vzniknou vdechovatelné částice, měla by se provést zkouška inhalační toxicity.
                           
                        
                     Kontrolní zvířata
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Souběžná negativní (vystavena pouze vzduchu) kontrolní skupina není nutná. Používá-li se k vytvoření zkušební atmosféry jiný nosič než voda, měla by se kontrolní skupina s nosičem použít pouze tehdy, nejsou-li k dispozici historické údaje o inhalační toxicitě nosiče. Jestliže studie toxicity zkoušené chemické látky formulované na nosiči neodhalí žádnou toxicitu, vyplývá z toho, že nosič je při zkoušené koncentraci netoxický a kontrola s nosičem tudíž není nutná.
                           
                        MONITOROVÁNÍ PODMÍNEK EXPOZICE
                  
                     Proudění vzduchu komorou
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Proudění vzduchu komorou by se mělo pečlivě řídit, neustále sledovat a zaznamenávat alespoň v hodinových intervalech při každé expozici. Monitorování koncentrace látky ve zkušební atmosféře (nebo stability) je nedílnou součástí měření všech dynamických parametrů a poskytuje nepřímý prostředek k řízení všech důležitých parametrů generování dynamické atmosféry. V komorách určených k expozici pouze nazální cestou by se měl brát zvláštní ohled na to, aby se zamezilo opětovnému vdechování, v případech, kdy proudění vzduchu expozičním systémem není dostačující k zajištění dynamického proudění zkušební chemické atmosféry. Existují předepsané metodiky, které lze použít k prokázání skutečnosti, že za vybraných provozních podmínek nedochází k opětovnému vdechování (8), (15). Koncentrace kyslíku by měla být alespoň 19 % a koncentrace oxidu uhličitého by neměla přesáhnout 1 %. Existuje-li důvod se domnívat, že tyto normy nelze splnit, měly by se koncentrace kyslíku a oxidu uhličitého měřit.
                           
                        
                     Teplota a relativní vlhkost v komoře
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Teplota v komoře by se měla udržovat na 22 ± 3 °C. Relativní vlhkost v zóně, kde zvířata dýchají, jak při expozici pouze nazální cestou, tak při celotělové expozici, by se měla sledovat a zaznamenat alespoň třikrát při trvání expozice až 4 hodiny a každou hodinu při kratších expozicích. Relativní vlhkost by se měla v ideálním případě udržovat v rozmezí 30 až 70 %, to však nemusí být proveditelné (např. při zkoušení směsí na bázi vody) nebo ji nemusí být možné změřit v důsledku interference zkoušené chemické látky se zkušební metodou.
                           
                        
                     Zkoušená chemická látka: nominální koncentrace
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Je-li to možné, měla by se vypočítat a zaznamenat nominální koncentrace zkoušené chemické látky v expoziční komoře. Nominální koncentrace je hmotnost generované zkoušené chemické látky vydělená celkovým objemem vzduchu procházejícím komorovým systémem. Nominální koncentrace se nepoužívá k charakterizaci expozice zvířat, avšak porovnání nominální koncentrace a skutečné koncentrace je ukazatelem výkonnosti zkušebního systému při generování zkušební atmosféry, a tudíž ji lze použít k odhalení problémů při generování.
                           
                        
                     Zkoušená chemická látka: skutečná koncentrace
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Skutečná koncentrace je koncentrace zkoušené chemické látky v zóně, kde zvířata dýchají, v inhalační komoře. Skutečné koncentrace lze změřit specifickými metodami (např. přímý odběr vzorků, adsorpční metody nebo metody založené na chemické reakci a následná analytická charakterizace) nebo nespecifickými metodami, jako je vážková analýza (gravimetrie). Použití gravimetrie je přípustné pouze u práškových aerosolů obsahujících jedinou složku nebo u aerosolů z kapalin s nízkou těkavostí a mělo by se podložit příslušnou specifickou charakterizací zkoušené chemické látky před provedením studie. Koncentraci práškového aerosolu sestávajícího z více složek lze rovněž stanovit gravimetricky. Vyžaduje to však analytické údaje, které prokazují, že složení materiálu ve vzduchu je podobné složení výchozího materiálu. Nejsou-li tyto informace k dispozici, může být nutné provádět během studie v pravidelných intervalech opakovanou analýzu zkoušené chemické látky (ideálně ve vzdušné formě). U látek v aerosolové formě, které se mohou vypařovat nebo sublimovat, by se mělo prokázat, že byly vybranou metodou zachyceny všechny fáze. Ve zprávě o studii by se měly uvést cílové, nominální a skutečné koncentrace, avšak k výpočtu hodnot letální koncentrace ve statistických analýzách se použijí pouze skutečné koncentrace.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Měla by se použít pokud možno jedna šarže zkoušené chemické látky a zkoušený vzorek by se měl uchovávat za podmínek, které udržují jeho čistotu, homogenitu a stabilitu. Před zahájením studie by se měla provést charakterizace zkoušené chemické látky, včetně určení její čistoty a, je-li to technicky proveditelné, identity a množství identifikovaných kontaminujících látek a nečistot. Je možné to prokázat mimo jiné těmito údaji: retenční čas a relativní šířka píku, molekulová hmotnost z hmotnostní spektroskopie nebo plynové chromatografie nebo jiné odhady. Přestože určení identity zkoušeného vzorku není povinností laboratoře provádějící zkoušku, bývá rozumné, ověřit si charakterizaci látky poskytnutou zadavatelem, a sice alespoň omezeným způsobem (např. barva, fyzikální povaha atd.).
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Expoziční atmosféra by se měla udržovat co možná nejstálejší a měla by se monitorovat buď nepřetržitě, nebo v pravidelných intervalech v závislosti na analytické metodě. Používá-li se odběr vzorků v pravidelných intervalech, měly by se vzorky atmosféry v komoře odebrat ve čtyřhodinové studii alespoň dvakrát. Není-li to v důsledku omezené rychlosti proudění vzduchu nebo nízké koncentrace možné, může se během celého období expozice odebrat jeden vzorek. Objeví-li se výrazné výkyvy mezi jednotlivými vzorky, měly by se u dalších zkoušených koncentrací použít čtyři vzorky na každou expozici. Jednotlivé vzorky k stanovení koncentrace v komoře by se neměly lišit od průměrné hodnoty koncentrace v komoře o více než ± 10 % u plynů a par a o více než ± 20 % u kapalných nebo pevných aerosolů. Měla by se vypočítat a zaznamenat doba potřebná k dosažení rovnovážného stavu v komoře (t95). Doba trvání expozice zahrnuje i dobu, během níž je zkoušená chemická látka generována, a ta bere v úvahu dobu nutnou k dosažení t95. Pokyny k výpočtu t95 naleznete v dokumentu GD 39 (8).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              U vysoce komplexních směsí složených z par/plynů a aerosolů (např. atmosféry obsahující produkty spalování a zkoušené chemické látky vystřikované z účelových výrobků/zařízení pro koncové použití) se může každá fáze chovat v inhalační komoře odlišně, proto by se pro každou fázi (pára/plyn a aerosol) měla zvolit alespoň jedna indikační látka (analyt), obvykle hlavní účinná látka ve směsi. Je-li zkoušená chemická látka směsí, měla by se uvést analytická koncentrace celkové směsi, a nikoliv pouze účinné látky nebo složky (analytu). Další informace týkající se skutečných koncentrací naleznete v dokumentu GD 39 (8).
                           
                        
                     Zkoušená chemická látka: distribuce velikosti částic
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Distribuce velikosti částic aerosolů by se měla během čtyřhodinové expozice stanovit alespoň dvakrát pomocí kaskádového impaktoru nebo jiného přístroje, např. aerodynamického spektrometru částic. Je-li možné prokázat shodu výsledků získaných pomocí kaskádového impaktoru nebo jiného přístroje, může se tento jiný přístroj používat v průběhu celé studie. Kromě primárního přístroje by se měl použít ještě druhý přístroj, např. gravimetrický filtr nebo impinger/plynová promývačka, k ověření účinnosti záchytu primárním přístrojem. Hmotnostní koncentrace získaná analýzou velikosti částic by měla ležet v přiměřeném rozmezí hmotnostní koncentrace získané vážkovou analýzou [viz dokument GD 39 (8)]. Je-li možné v časné fázi studie prokázat jejich rovnocennost, lze od dalších potvrzujících měření upustit. Z důvodu zajištění dobrých životních podmínek zvířat by se měly podniknout kroky k minimalizaci neprůkazných údajů, které mohou vést k nutnosti opakovat expozici. U par by se mělo provést měření velikosti částic, pokud existuje možnost, že kondenzace páry povede ke vzniku aerosolu nebo pokud jsou v parách detekovány částice s potenciálem pro tvorbu smíšených fází (viz odstavec 14).
                           
                        POSTUP
                  
                     Hlavní zkouška
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Pro každý krok se použijí tři zvířata od každého pohlaví nebo šest zvířat citlivějšího pohlaví. Jsou-li k expozici pouze nazální cestou použity jiné druhy hlodavců než potkani, je možno upravit maximální doby trvání expozice za účelem minimalizace druhově specifického utrpení. Úroveň koncentrace, která se má použít jako počáteční dávka, se vybere z jedné ze čtyř fixních úrovní, přičemž by počáteční úroveň koncentrace měla být ta, jež u některých z exponovaných zvířat nejpravděpodobněji způsobí toxicitu. Schémata zkoušek pro plyny, páry a aerosoly (zahrnutá v dodatcích 2–4) představují zkoušky s mezními hodnotami pro kategorie 1–4 dle nařízení CLP (9) pro plyny (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4 h) (dodatek 2), pro páry (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4 h) (dodatek 3) a pro aerosoly (0,05, 0,5, 1,5 mg/l/4 h) (dodatek 4). Kategorie 5, která není v nařízení (ES) č. 1272/2008 zavedena (9), se týká koncentrací přesahujících příslušné mezní koncentrace. Pro každou počáteční koncentraci se používá příslušné schéma zkoušky. Postup zkoušení se řídí naznačenými šipkami v závislosti na počtu humánně utracených nebo uhynulých zvířat, dokud není možné provést kategorizaci.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Časový interval mezi exponovanými skupinami závisí na době nástupu, trvání a závažnosti příznaků toxicity. S expozicí zvířat další úrovni koncentrace by se mělo vyčkat, dokud není dostatečná jistota, že dříve zkoušená zvířata přežila. Mezi jednotlivými expozicemi na každé úrovni koncentrace se doporučuje ponechat dobu tří nebo čtyř dnů, aby bylo umožněno pozorování zpožděné toxicity. Časový interval lze podle potřeby upravit, např. v případě neprůkazné odezvy.
                           
                        
                     Limitní zkouška
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Limitní zkouška se používá v případě, že je o zkoušené chemické látce známo nebo se o ní předpokládá, že je prakticky netoxická, tj. vyvolává toxickou reakci pouze při koncentraci vyšší, než je regulační mezní koncentrace. Informace o toxicitě zkoušené chemické látky lze získat ze znalostí o podobných zkoušených látkách či podobných směsích, vezme-li se v úvahu identita a procento složek, o nichž se ví, že jsou toxikologicky významné. V situacích, kdy existuje jen málo informací nebo vůbec žádné informace o toxicitě nebo kdy se očekává, že zkoušená chemická látka bude toxická, by se měla provést hlavní zkouška [další pokyny naleznete v dokumentu GD 39 (8)].
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Při použití obvyklého postupu se tři zvířata od každého pohlaví nebo šest zvířat citlivějšího pohlaví vystaví koncentracím 20 000 ppm u plynů, 20 mg/l u par a 5 mg/l u prachů/mlh (jsou-li dosažitelné), což slouží jako limitní zkouška pro tuto zkušební metodu. Při zkoušení aerosolů by mělo být primárním cílem dosažení vdechovatelné velikosti částic (tj. MMAD = 1–4 μm). U většiny zkoušených chemických látek toho lze dosáhnout při koncentraci 2 mg/l. Zkoušení aerosolů při koncentracích větších než 2 mg/l by se mělo provádět pouze tehdy, lze-li dosáhnout vdechovatelné velikosti částic [viz dokument GD 39 (8)]. V souladu s GHS (16) se nedoporučuje provádět zkoušky při koncentracích přesahujících mezní koncentraci z důvodu zajištění dobrých životních podmínek zvířat. O zkoušce v GHS kategorii 5 (16), která není zavedena v nařízení (ES) č. 1272/2008 (9), by se mělo uvažovat pouze v případě, existuje-li velká pravděpodobnost, že výsledky takové zkoušky budou mít přímý význam pro ochranu lidského zdraví, a ve zprávě ze studie se uvede zdůvodnění. V případě potenciálně výbušných zkoušených chemických látek je třeba se pečlivě vyvarovat podmínek příznivých pro explozi. Aby se zamezilo zbytečnému použití zvířat, měla by se před limitní zkouškou provést jedna zkouška bez zvířat, aby se zajistilo, že lze v komoře dosáhnout podmínek pro limitní zkoušku.
                           
                        POZOROVÁNÍ
                  
                              29.
                           
                           
                              Během období expozice by se měla zvířata často klinicky sledovat. Po expozici by se měla v den expozice provést klinická pozorování alespoň dvakrát nebo častěji, pokud to naznačuje odezva zvířat na expozici a poté alespoň jednou denně po dobu celkem 14 dní. Délka období sledování není fixní, nýbrž by se měla určit na základě povahy a doby nástupu klinických příznaků a délky období zotavení. Doba, kdy se příznaky toxicity objeví a vymizí, je důležitá zejména v případě tendence ke zpožděným příznakům toxicity. Všechna sledování se systematicky zaznamenávají, přičemž záznamy se vedou zvlášť pro každé zvíře. Umírající zvířata a zvířata se známkami prudkých bolestí nebo s přetrvávajícími příznaky značného utrpení by se měla humánně utratit z důvodu zajištění dobrých životních podmínek zvířat. Při vyšetřování klinických příznaků toxicity je třeba dbát na to, aby se počáteční špatný stav a přechodné respirační změny v důsledku postupu expozice neinterpretovaly mylně jako účinky spojené se zkoušenou chemickou látkou. Měly by se vzít v úvahu principy a kritéria shrnuté v dokumentu o humánních parametrech (7). Pokud jsou zvířata z humánních důvodů utracena nebo je zjištěn jejich úhyn, je nutné dobu uhynutí zaznamenat co nejpřesněji.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Pozorování v kleci se soustřeďují na změny na kůži, na srsti, na očích, na sliznicích a rovněž změny dýchání, krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Je-li to možné, měly by se zaznamenat jakékoli rozdíly mezi místními a systémovými účinky. Pozornost je třeba věnovat pozorování tremoru, křečí, slinění, průjmu, letargie, spánku a kómatu. Měření rektální teploty může poskytnout podpůrné důkazy pro reflexní bradypnoe nebo hypo/hypertermii spojenou s expozicí nebo držením v kleci.
                           
                        
                     Tělesné hmotnosti
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Hmotnosti jednotlivých zvířat by se měly zaznamenat jednou během období aklimatizace, v den expozice před expozicí (den 0) a minimálně 1., 3. a 7. den (a poté jednou týdně) a v době uhynutí nebo utracení, pokud k němu dojde po dni 1. Tělesná hmotnost je uznávaná jako zásadní ukazatel toxicity a zvířata vykazující přetrvávající úbytek hmotnosti ≥ 20 % v porovnání s hodnotami před studií by se měla pečlivě sledovat. Na konci období po expozici se zvířata, která přežila, zváží a humánně utratí.
                           
                        
                     Patologie
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Všechna pokusná zvířata, včetně těch, která v průběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena z důvodu zajištění dobrého zacházení se zvířaty, by se měla podrobit pitvě. Není-li možno pitvu provést ihned po objevení uhynulého zvířete, mělo by se zvíře uchovávat v chladicím boxu (nikoli zmrazené) při teplotách dostatečně nízkých k minimalizaci autolýzy. Pitvy by se měly provést co možná nejdříve, obvykle během jednoho nebo dvou dnů. U každého zvířete by se měly zaznamenat všechny makroskopické patologické nálezy, přičemž se věnuje zvláštní pozornost jakýmkoli nálezům v dýchacích cestách.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Další vyšetření zahrnutá a priori v návrhu lze zvážit za účelem rozšíření interpretační hodnoty studie, např. měření hmotnosti plic přeživších potkanů a/nebo poskytnutí důkazů o podráždění pomocí mikroskopického vyšetření dýchacích cest. Mezi vyšetřované orgány mohou patřit ty, které vykazují makroskopické patologické známky u zvířat přežívajících po 24 či více hodin a orgány, o nichž je známo nebo se očekává, že budou postiženy. Mikroskopické vyšetření celých dýchacích cest může poskytnout užitečné informace u zkoušených chemických látek, které reagují s vodou, například u kyselin a hygroskopických zkoušených materiálů.
                           
                        ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ
                  
                     Údaje
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Měly by se uvést údaje o tělesné hmotnosti a pitevních nálezech pro každé jednotlivé zvíře. Údaje z klinického sledování by se měly shrnout do tabulky, přičemž se u každé zkušební skupiny uvede počet použitých zvířat, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, počet zvířat uhynulých v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních důvodů, doba uhynutí jednotlivých zvířat, popis, časový průběh a vratnost toxických účinků a pitevní nálezy.
                           
                        
                     Protokol o zkoušce
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Protokol o zkoušce by měl obsahovat následující informace:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Pokusná zvířata a podmínky chovu
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popis podmínek v klecích uvádějící: počet (nebo změnu počtu) zvířat v každé kleci, materiál podestýlky, teplotu a relativní vlhkost prostředí, světelné období a druh stravy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použitý druh/kmen a odůvodnění použití jiného druhu než potkana,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet, věk, a pohlaví zvířat,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda randomizace,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobnosti o jakosti vody a krmiva (včetně druhu/zdroje stravy, zdroje vody),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popis jakékoliv přípravy před zkouškou včetně stravy, karantény a léčby onemocnění.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkoušená chemická látka
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikální povaha, čistota a tam, kde je to podstatné, fyzikálně-chemické vlastnosti (včetně izomerizace),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikační údaje a číslo v registru Chemical Abstract Services (CAS), je-li známo.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosič
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění použití nosiče a zdůvodnění výběru nosiče (pokud se nepoužije voda),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      historické nebo současné údaje prokazující, že nosič neovlivňuje výsledek studie.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhalační komora
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popis inhalační komory včetně jejích rozměrů a objemu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj a popis zařízení použitého pro expozici zvířat a rovněž pro generování atmosféry,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zařízení pro měření teploty, vlhkosti, velikosti částic a skutečné koncentrace,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj vzduchu, úprava dodávaného/odsávaného vzduchu a systém použitý pro klimatizaci,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metody použité ke kalibraci zařízení k zajištění homogenní zkušební atmosféry,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozdíl tlaků (kladný nebo záporný),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet expozičních otvorů v každé komoře (nazální expozice), umístění zvířat v systému (celotělová expozice),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      homogenita/stabilita zkušební atmosféry v čase,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      umístění teplotních čidel a čidel vlhkosti a odběr vzorků zkušební atmosféry v komoře,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      průtokové rychlosti vzduchu, průtoková rychlost vzduchu/expoziční otvor (nazální expozice) nebo množství zvířat/komora (celotělová expozice),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informace o zařízení použitém k měření kyslíku a oxidu uhličitého, používá-li se,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      doba nutná k dosažení rovnovážného stavu v inhalační komoře (t95),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet změn objemu za hodinu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      měřicí přístroje (používají-li se).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Údaje o expozici
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění výběru cílové koncentrace v hlavní studii,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominální koncentrace (celková hmotnost zkoušené chemické látky generované do inhalační komory vydělená objemem vzduchu prošlým komorou),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skutečné koncentrace zkoušené chemické látky naměřené v dýchací zóně zvířat. U zkoušených směsí, které vytvářejí heterogenní fyzikální formy (plyny, páry, aerosoly), je možné analyzovat každou zvlášť,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      veškeré koncentrace látky ve vzduchu by se měly uvádět v hmotnostních jednotkách (např. mg/l, mg/m3, atd.), v závorce lze uvést také hodnotu v objemových jednotkách (např. ppm, ppb),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      distribuce velikosti částic, hmotnostní medián aerodynamického průměru (MMAD) a geometrická směrodatná odchylka (σg), včetně metod jejich výpočtu. Měly by se uvést jednotlivé analýzy velikosti částic.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkušební podmínky
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné údaje o přípravě zkoušené chemické látky včetně postupů použitých k snížení velikosti částic pevných látek nebo k přípravě roztoků zkoušené chemické látky. V případě, kdy mohly mechanické postupy změnit chemické složení zkoušené látky, uveďte také výsledky analýz ověřujících složení zkoušené chemické látky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popis (pokud možno obsahující nákres) zařízení použitého ke generování zkušební atmosféry k expozici zvířat zkušební atmosféře,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné údaje o použité chemické analytické metodě a validaci metody (včetně účinnosti výtěžnosti zkoušené chemické látky ze vzorkovaného média),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění výběru zkoušených koncentrací.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o teplotě, vlhkosti a průtoku vzduchu v komoře,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o nominální a skutečné koncentraci v komoře,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o velikosti částic včetně údajů o odběru analytických vzorků, distribuce velikosti částic a výpočtů MMAD a σg,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabulka s údaji o reakci a úrovni koncentrace u každého zvířete (tj. zvířata vykazující příznaky toxicity, včetně mortality, charakteru, závažnosti a trvání účinků),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hmotnosti jednotlivých zvířat naměřené ve dnech studie, datum a čas uhynutí, pokud k němu došlo před plánovaným utracením, časový průběh nástupu příznaků toxicity a zda byly vratné u každého ze zvířat,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pitevní a histopatologické nálezy pro každé zvíře, pokud jsou k dispozici,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klasifikační kategorie dle nařízení CLP a mezní hodnota LC50.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Diskuse a interpretace výsledků
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      měl by se klást zvláštní důraz na popis metod použitých ke splnění kritérií této zkušební metody, např. mezní koncentrace nebo velikost částic,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      je třeba zabývat se vdechovatelností částic s ohledem na celkové nálezy, zejména pokud nebylo možno splnit kritéria pro velikost částic,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      v celkovém hodnocení studie by se měla uvést konzistentnost metod použitých k stanovení nominálních a skutečných koncentrací a vztah mezi aktuální a skutečnou koncentrací,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      měla by se uvést pravděpodobná příčina úhynu a převládající mechanismus účinku (systémový nebo místní),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      mělo by se uvést vysvětlení, pokud bylo nutno humánně utratit zvířata trpící bolestí nebo vykazující známky intenzivního a přetrvávajícího utrpení, na základě kritérií uvedených v dokumentu OECD o humánních parametrech (7).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA:
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              Kapitola B.2 této přílohy, Akutní toxicita (inhalační).
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System. Arch. Toxicol. 77: 243-254.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic-Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations. Arch. Toxicol. 71: 537-549.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives to LD/LC50 Tests. ALTEX 1: 129-134.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Kapitola B.1 tris této přílohy, Akutní orální toxicita - metoda stanovení třídy akutní toxicity.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 105, OECD, Paris. Dostupné na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19. Dostupné na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Dostupné na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 ze dne 16. prosince 2008 o klasifikaci, označování a balení látek a směsí, o změně a zrušení směrnic 67/548/EHS a 1999/45/ES a o změně nařízení (ES) č. 1907/2006, Úř. věst. L 353, 31.12.2008, s. 1.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Kapitola B.40 této přílohy, Leptavé účinky na kůži in vitro: Zkouška transkutánního elektrického odporu (TER).
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Kapitola B.40 bis této přílohy, Leptavé účinky na kůži in vitro: Zkouška pomocí modelu lidské kůže.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Dostupné na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and Geneva. Dostupné na: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_welcome_e.html]
                           
                        
                     Dodatek 1
                     DEFINICE
                     Zkoušená chemická látka: Jakákoli látka nebo směs zkoušená pomocí této zkušební metody.
                  
                  
                     Dodatek 2
                     
                        Postup, který je nutno dodržet u každé z výchozích koncentrací u plynů (ppm/4h)
                     
                     Obecné poznámky (12)
                     
                     Systém zkoušení u každé výchozí koncentrace obsažený v této příloze nastiňuje postup, který je třeba sledovat.
                     Dodatek 2a: Výchozí koncentrace je 100 ppm
                     Dodatek 2b: Výchozí koncentrace je 500 ppm
                     Dodatek 2c: Výchozí koncentrace je 2 500 ppm
                     Dodatek 2d: Výchozí koncentrace je 20 000 ppm
                     Postup zkoušení se řídí naznačenými šipkami v závislosti na počtu humánně utracených nebo uhynulých zvířat.
                  
                  
                     Dodatek 2a
                     
                        Testy akutní toxicity:
                     
                     
                        Zkušební postupy s výchozí koncentrací plynů 100 ppm/4h
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatek 2b
                     
                        Akutní inhalační toxicita:
                     
                     
                        Zkušební postup s výchozí koncentrací plynů 500 ppm/4h
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatek 2c
                     
                        Akutní inhalační toxicita:
                     
                     
                        Zkušební postup s výchozí koncentrací plynů 2 500 ppm/4h
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatek 2d
                     
                        Akutní inhalační toxicita:
                     
                     
                        Zkušební postup s výchozí koncentrací plynů 20 000 ppm/4h
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatek 3
                     
                        Postup, který je nutno dodržet u každé z výchozích koncentrací u par (mg/1/4h)
                     
                     Obecné poznámky (13)
                     
                     Systém zkoušení u každé výchozí koncentrace obsažený v této příloze nastiňuje postup, který je třeba sledovat.
                     Dodatek 3a: Výchozí koncentrace je 0,5 mg/l
                     Dodatek 3b: Výchozí koncentrace je 2,0 mg/l
                     Dodatek 3c: Výchozí koncentrace je 10 mg/l
                     Dodatek 3d: Výchozí koncentrace je 20 mg/l
                     Postup zkoušení se řídí naznačenými šipkami v závislosti na počtu humánně utracených nebo uhynulých zvířat.
                  
                  
                     Dodatek 3a
                     
                        Akutní inhalační toxicita:
                     
                     
                        Zkušební postup s výchozí koncentrací par 0,5 mg/l/4h
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatek 3b
                     
                        Akutní inhalační toxicita:
                     
                     
                        Zkušební postup s výchozí koncentrací par 2 mg/l/4h
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatek 3c
                     
                        Akutní inhalační toxicita:
                     
                     
                        Zkušební postup s výchozí koncentrací par 10 mg/L/4h
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatek 3d
                     
                        Akutní inhalační toxicita:
                     
                     
                        Zkušebnní postup s výchozí koncentrací par 20 mg/l/4h
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatek 4
                     
                        Postup, který je nutno dodržet u každé z výchozích koncentrací u aerosolů (mg/1/4h)
                     
                     Obecné poznámky (14)
                     
                     Systém zkoušení u každé výchozí koncentrace obsažený v této příloze nastiňuje postup, který je třeba sledovat.
                     Dodatek 4a: Výchozí koncentrace je 0,05 mg/l
                     Dodatek 4b: Výchozí koncentrace je 0,5 mg/l
                     Dodatek 4c: Výchozí koncentrace je 1 mg/l
                     Dodatek 4d: Výchozí koncentrace je 5 mg/l
                     Postup zkoušení se řídí naznačenými šipkami v závislosti na počtu humánně utracených nebo uhynulých zvířat.
                  
                  
                     Dodatek 4a
                     
                        Akutní inhalační toxicita:
                     
                     
                        Zkušební postup s výchozí koncentrací par 0,05 mg/L/4h
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatek 4b
                     
                        Akutní inhalační toxicita:
                     
                     
                        Zkušební postup s výchozí konkcentrací aerosolů 0,5 mg/l/4h
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatek 4c
                     
                        Akutní inhalační toxicita:
                     
                     
                        Zkušební postup s výchozí konkcentrací aerosolů 1 mg/l/4h
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatek 4d
                     
                        Akutní inhalační toxicita:
                     
                     
                        Zkušební postup s výchozí koncentrací aerosolů 5 mg/l/4h
                     
                     
                        
                  “
            
                  9)
               
               
                  Kapitola C.10 se nahrazuje tímto:
                  „C.10   SIMULAČNÍ ZKOUŠKA AEROBNÍHO ČIŠTĚNÍ ODPADNÍCH VOD: C.10-A: JEDNOTKY AKTIVOVANÉHO KALU – C.10-B: BIOFILMY
                  
                  
                     C.10-A:   Jednotky aktivovaného kalu
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda odpovídá pokynu OECD pro zkoušení (TG) 303 (2001). V 50. letech bylo zjištěno, že nově zavedené povrchově aktivní látky způsobují nadměrné pěnění v čistírnách odpadních vod a v řekách. Tyto látky nebyly zcela odstraněny při aerobním čištění a v některých případech omezovaly odstraňování jiných organických látek. Tato skutečnost byla důvodem celé řady šetření, jakým způsobem by bylo možno odstranit povrchově aktivní látky z odpadních vod a zda by byly nové chemické látky produkované průmyslem vhodné pro čištění odpadních vod. Za tímto účelem byly použity modelové jednotky reprezentující dva hlavní druhy aerobního biologického čištění odpadních vod (aktivovaný kal a biologická perkolační nebo skrápěná filtrace). Bylo by nepraktické a velmi nákladné distribuovat každou novou chemikálii a sledovat velké čistírny odpadních vod, a to i v místním měřítku.
                           
                        VÝCHOZÍ ÚVAHY
                  
                     Jednotky aktivovaného kalu
                  
                  
                              2.
                           
                           
                              Jsou popsány modelové jednotky aktivovaného kalu, jejichž velikost se pohybuje od 300 ml přibližně do 2 000 ml. Některé byly věrnou napodobeninou plnohodnotných čistíren, kde se usazovací nádrže s usazeným kalem přečerpávají zpět do aerační nádrže, zatímco jiné neměly žádná usazovací zařízení, např. Swisher (1). Velikost zařízení je kompromisem; na jedné straně musí být dostatečně velké, aby umožňovalo úspěšné provedení mechanických operací a zajišťovalo dostatečné množství vzorků, aniž by byl ovlivněn provoz, avšak na druhé straně by nemělo být tak velké, aby kladlo nadměrné nároky na prostor a materiál.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Rozsáhle a uspokojivě jsou využívány dva druhy zařízení – Husmannův model (2) a zařízení s porézní nádobou (3),(4), jichž bylo poprvé užito při studii povrchově aktivních látek; jejich popis je uveden v této zkušební metodě. S uspokojivým výsledkem byla použita i další zařízení, například Eckenfelderův model (5). Vzhledem k poměrně vysoké ceně a náročnosti použití této simulační zkoušky byly současně zkoumány jednodušší a levnější screeningové zkoušky, které jsou nyní začleněny do kapitoly C.4 A - F této přílohy (6). Zkušenosti s celou řadou povrchově aktivních látek a dalších chemických látek ukázaly, že chemické látky, které prošly screeningovými zkouškami (snadno biologicky rozložitelné látky) se rozložily i při simulační zkoušce. Některé chemické látky, které neprošly screeningovou zkouškou, prošly zkouškami vlastní biologické rozložitelnosti (kapitoly C.12 (7) a C.19 (8) této přílohy), ale pouze některé z této posledně jmenované skupiny se rozložily při simulační zkoušce, zatímco chemické látky, které neprošly zkouškou vlastní biologické rozložitelnosti, se nerozložily ani při simulačním zkoušce (9), (10), (11).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Pro některé účely jsou simulační zkoušky prováděné na základě jediného souboru pracovních podmínek dostatečné; výsledky jsou vyjádřeny procentem úbytku zkoušené chemické látky nebo rozpuštěného organického uhlíku (DOC). Popis takové zkoušky je uveden v této zkušební metodě. Nicméně na rozdíl od předchozí verze této kapitoly, která popisovala pouze jeden typ zařízení čistícího syntetické odpadní vody ve spřaženém režimu pomocí poměrně hrubé metody odstraňování kalů, tento text uvádí celou řadu variant. Popisuje alternativy typu zařízení, způsobu provozu, likvidace odpadních vod a odstraňování kalu. Tento text se úzce drží textu normy ISO 11733 (12), který byl během jeho přípravy pečlivě zkoumán, přestože uvedená metoda nebyla podrobena mezilaboratorní porovnávací zkoušce.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Pro jiné účely je zapotřebí zjistit koncentraci zkoušené chemické látky v odtoku a k tomu je nezbytné použít složitější metodu. Je například nezbytná přesnější kontrola rychlosti odtahu kalu v průběhu každého dne a po celou dobu zkoušky a zařízení je nutno provozovat při řadě různých rychlostí odtahů kalu. U plně komplexní metody by měly zkoušky probíhat rovněž při dvou nebo třech různých teplotách: tuto metodu popisuje Birch (13), (14) a je shrnuta v dodatku 6. Na základě současných znalostí však nelze rozhodnout, který z těchto kinetických modelů lze uplatnit na biologickou rozložitelnost chemických látek při čištění odpadních vod a ve vodném prostředí obecně. Použití kinetiky dle Monoda, které je uvedeno v dodatku 6 jako příklad, je omezeno na chemické látky přítomné v množství 1 mg/l a větším, ale podle některých názorů je i toto užití nutno odůvodnit. Zkoušky při koncentracích, které věrněji odrážejí koncentrace v odpadních vodách, jsou uvedeny v dodatku 7, ale tyto zkoušky a rovněž zkoušky v dodatku 6 jsou uvedeny v dodatcích, místo aby byly vydány jako samostatné zkušební metody.
                           
                        
                     Filtry
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Mnohem menší pozornost byla věnována modelu biologických skrápěných filtrů, pravděpodobně proto, že jsou těžkopádnější a méně kompaktní než modelová zařízení s aktivovaným kalem. Gerike se spolupracovníky vyvinul zařízení pro skrápěnou filtraci a provozoval je ve spřaženém režimu (15). Tyto filtry byly poměrně velké (výška 2 m, objem 60 l) a každý z nich vyžadoval až 2 l/h odpadní vody. Baumann se spolupracovníky (16) simuloval skrápěné filtry vložením proužků polyesterového „rouna“ do trubek o délce 1 m (vnitřní průměr 14 mm) poté, co byly tyto proužky na dobu 30 minut ponořeny do koncentrovaného aktivovaného kalu. Zkoušená chemická látka jako jediný zdroj C v roztoku minerálních solí byla čerpána do svislé trubky a biologický rozklad byl posouzen na základě měření hodnot DOC v odtoku a CO2 ve vzniklém plynu.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Biofiltry byly simulovány jiným způsobem (15), na vnitřní plochy rotačních trubek skloněné pod malým úhlem k vodorovné rovině se přiváděla odpadní voda (asi 250 ml/h) se zkoušenou látkou a bez ní a shromážděný odtok pak byl analyzován na přítomnost DOC a/nebo konkrétní zkoušené chemické látky.
                           
                        PODSTATA ZKOUŠKY
                  
                              8.
                           
                           
                              Touto metodou se stanoví odstranitelnost a primární a/nebo úplný biologický rozklad ve vodě rozpustných organických látek aerobními mikroorganismy v kontinuálně pracujícím testovacím systému simulujícím proces s aktivovaným kalem. Jedinými zdroji uhlíku a energie pro mikroorganismy jsou snadno rozložitelné organické médium a zkoušená organická látka.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Dva kontinuálně pracující modely (modely aktivace nebo modely s porézní nádobou) pracují paralelně za stejných podmínek zvolených tak, aby vyhovovaly účelu zkoušky. Průměrná hydraulická doba zdržení je obvykle 6 h a průměrné stáří kalu (doba zdržení kalu) se pohybuje od 6 do 10 dnů. Kal se odtahuje jednou ze dvou metod; zkoušená chemická látka se zpravidla přidává do přítoku (organického média) pouze jednoho z modelů v koncentraci odpovídající 10–20 mg/l rozpuštěného organického uhlíku (DOC). Druhý model se provozuje jako kontrolní model pro stanovení biologické rozložitelnosti organického média.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              V pravidelných intervalech se odebírají vzorky odtoků, ve kterých se stanovuje v optimálním případě DOC, nebo chemická spotřeba kyslíku (CHSK) a rovněž koncentrace zkoušené chemické látky (je-li vyžadována) specifickou analýzou v odtoku z modelu, do něhož je vypouštěna zkoušená chemická látka. Předpokládá se, že rozdíl mezi koncentrací DOC nebo CHSK v odtoku ze zkušebního a kontrolního modelu pochází ze zkoušené chemické látky nebo jejích organických metabolitů. Tento rozdíl se porovná s koncentrací DOC nebo CHSK v přítoku pocházející ze zkoušené chemické látky, aby se určila její rozložitelnost.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Biologický rozklad lze zpravidla odlišit od bioadsorpce pečlivým prozkoumáním křivky odstranitelnosti v čase a obecně jej lze potvrdit pomocí zkoušky snadného biologického rozkladu pomocí aklimatizovaného inokula z modelu, do něhož je vypouštěna zkoušená chemická látka.
                           
                        INFORMACE O ZKOUŠENÉ CHEMICKÉ LÁTCE
                  
                              12.
                           
                           
                              Pro správnou interpretaci výsledků by měla být známa čistota zkoušené chemické látky, její rozpustnost ve vodě, těkavost a adsorpční vlastnosti. Těkavé a nerozpustné chemické látky lze zpravidla zkoušet jen tehdy, jsou-li přijata zvláštní opatření (viz dodatek 5). Pro výpočet teoretických hodnot a/nebo pro ověření naměřených hodnot parametrů, např. teoretické spotřeby kyslíku (ThOD), rozpuštěného organického uhlíku (DOC) a chemické spotřeby kyslíku (CHSK) je rovněž nutno znát chemickou strukturu nebo alespoň empirický vzorec.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Pro volbu vhodných zkušebních koncentrací mohou být užitečné informace o toxicitě zkoušené chemické látky pro mikroorganismy (viz dodatek 4); tyto informace mohou být důležité pro správnou interpretaci nízkých hodnot biologického rozkladu.
                           
                        HODNOTY, PŘI NICHŽ VÝROBEK VYHOVUJE
                  
                              14.
                           
                           
                              Při původním uplatnění této simulační (potvrzující) zkoušky na primární biologický rozklad povrchově aktivních látek je vyžadováno odstranění více než 80 % určité chemické látky, aby mohla být povrchově aktivní látka uvedena na trh. Pokud není dosaženo hodnoty 80 %, lze použít tuto simulační (potvrzující) zkoušku a povrchově aktivní látku uvést na trh pouze za předpokladu odstranění více než 90 % dané chemické látky. Obecně se chemické látky neposuzují z hlediska vyhověla/nevyhověla a při přibližných výpočtech pravděpodobné koncentrace v životním prostředí, které se užívají při posuzování rizik plynoucích z chemických látek, lze použít získané hodnoty procenta úbytku. Výsledky mají tendenci sledovat vzorec tzv. „všechno nebo nic“. V řadě studií čistých chemických látek bylo zjištěno procento úbytku DOC > 90 % u více než tří čtvrtin a > 80 % u více než 90 % chemických látek, které nevykazují žádný významný stupeň biologické rozložitelnosti.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              V odpadní vodě je přítomno relativně málo chemických látek (např. povrchově aktivních chemických látek) v koncentracích (asi 10 mg C/l) užitých při této zkoušce. Některé chemické látky mohou být v těchto koncentracích inhibující, zatímco kinetika úbytku jiných látek se může v nízkých koncentracích lišit. Přesnější stanovení rozkladu lze provést s využitím modifikovaných metod pomocí realisticky nízkých koncentrací zkoušené chemické látky a získané údaje by mohly být použity pro výpočet kinetických konstant. Potřebné experimentální techniky však dosud nejsou plně validovány a rovněž nebyly stanoveny modely kinetiky popisující reakce biologického rozkladu (viz dodatek 7).
                           
                        REFERENČNÍ CHEMICKÉ LÁTKY
                  
                              16.
                           
                           
                              Aby bylo zajištěno správné provedení experimentálního postupu, je vhodné současně se zkoumáním zkoušených chemických látek provádět občasné zkoušky látek, jejichž chování je známé. Tyto chemické látky zahrnují kyselinu adipovou, 2-fenyl fenol, 1-naftol, kyselinu difenovou,1-kyselinu naftoovou apod. (9)(10)(11).
                           
                        REPRODUKOVATELNOST VÝSLEDKŮ ZKOUŠKY
                  
                              17.
                           
                           
                              Existuje mnohem méně zpráv o studiích simulačních zkoušek než o zkouškách snadné biologické rozložitelnosti. Reprodukovatelnost mezi (simultánními) opakováními je dobrá (v rozmezí 10–15 %) u zkoušených látek rozložených z 80 % nebo více, ale u hůře rozložitelných chemických látek je variabilita větší. Také u některých hraničních chemických látek byly při různých příležitostech v průběhu 9 týdnů povolených v testu zaznamenány zcela rozdílné výsledky (např. 10 %, 90 %).
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              U výsledků získaných z uvedených dvou typů aparatur byly zaznamenány jen malé rozdíly, ale u některých chemických látek proběhl rozsáhlejší a konzistentnější rozklad za přítomnosti domovních odpadních vod než za přítomnosti syntetické odpadní vody dle OECD.
                           
                        POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
                  
                     Přístroje a pomůcky
                  
                  
                     Zkušební systém
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Zkušební systém pro jednu zkoušenou chemickou látku se skládá ze zkušebního a kontrolního modelu; pokud se však provádějí pouze specifické analýzy (primární biologický rozklad), je vyžadován pouze zkušební model. Jeden kontrolní model může být použit pro více zkušebních zařízení, do nichž se vypouštějí buď stejné, nebo odlišné zkoušené chemické látky. V případě spřaženého zařízení (dodatek 3) se používá jeden kontrolní model pro každé zkušební zařízení. Zkušebním zařízením může být buď model aktivace, tj. Husmannův model (dodatek 1, obr. 1), nebo model s porézní nádobou (Dodatek 1, obr. 2). V obou případech se použijí zásobní nádoby s dostatečným objemem pro přítok a odtok a dávkovací čerpadla pro přítok, a to buď ve směsi s roztokem zkoušené chemické látky, nebo odděleně.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Každý model aktivace se skládá z aerační nádrže se známým objemem přibližně 3 litry aktivovaného kalu a sedimentační nádoby (sekundární dosazovací nádrže), s pracovním objemem přibližně 1,5 litru; objem lze do určité míry měnit nastavením výšky sedimentační nádoby. Jsou přípustné i nádoby s odlišnými objemy, pokud model pracuje s podobným hydraulickým zatížením. Pokud není možno udržet ve zkušební místnosti teplotu v požadovaném rozsahu, doporučuje se modely temperovat vodním pláštěm. Pro kontinuální nebo v pravidelných intervalech přerušovanou recirkulaci aktivovaného kalu z dosazovací nádrže do aerační nádrže se používá dávkovací čerpadlo nebo mamutka.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Model s porézní nádobou se skládá z vnitřního porézního válce s kuželovitým zakončením, který je vložen do poněkud větší nádoby stejného tvaru z nepropustného plastového materiálu. Jako materiál pro porézní nádobu může být použit porézní polyethylen s maximální velikostí pórů 90 μm a s tloušťkou 2 mm. K separaci kalu od upraveného organického média dochází filtrací porézní stěnou. Odtok se shromažďuje v prostoru mezi nádobami a odtéká do sběrné nádoby. Nedochází k sedimentaci, a proto aktivovaný kal nerecirkuluje. Celé zařízení může být umístěno v termostatované vodní lázni. Někdy dojde v počátečním stadiu k ucpání porézní nádoby a obsah přeteče. V takovém případě se ucpaný porézní válec nahradí novým, přičemž se kal z nádoby nejprve přelije do čisté nádoby a ucpaný válec se odstraní. Po otření nepropustného vnějšího válce se vloží čistý vnitřní válec a kal se vrátí do nádoby. Veškerý kal, který ulpí na stěnách ucpaného vnitřního válce, se rovněž pečlivě seškrábe a přenese. Ucpané válce se čistí nejprve pomocí tenkého proudu vody pro odstranění zbývajícího kalu a poté ponořením do zředěného roztoku chlornanu sodného, pak do vody a nakonec se vodou dokonale vypláchnou.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Pro oba modely lze použít vhodné způsoby provzdušňování kalu v aerační nádrži, například různé provzdušňovací krychličky (rozvaděče) a tlakový vzduch. Pokud je to nutné, musí být vzduch čištěn, například vhodným filtrem a promýváním. Provzdušňování musí být dostatečné, aby byly v systému po celou dobu zkoušky zajištěny aerobní podmínky a dokonalá suspenze vloček kalu.
                           
                        
                     Filtrační přístroj nebo odstředivka
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Přístroj pro membránovou filtraci s filtry vhodné velikosti pórů (průměr pórů 0,45 μm), které co nejméně adsorbují rozpustné organické chemické látky nebo uvolňují organický uhlík. Pokud použité filtry uvolňují organický uhlík, promyjí se pečlivě horkou vodou, aby byl odstraněn vyluhovatelný organický uhlík. Lze použít rovněž odstředivku, která je schopna dosáhnout odstředivého zrychlení 40 000 m/s2.
                           
                        
                     Analytické vybavení
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Zařízení pro stanovení:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          DOC (rozpuštěného organického uhlíku) a TOC (celkového organického uhlíku), nebo CHSK (chemické spotřeby kyslíku),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          případně pro stanovení určité chemické látky,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          nerozpuštěných tuhých látek, hodnoty pH a koncentrace kyslíku ve vodě,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          teploty, zásaditosti a kyselosti,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          jestliže systém pracuje s nitrifikací, pak vybavení pro stanovení amoniakálního, dusitanového a dusičnanového dusíku.
                                       
                                    
                        
                     Voda
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Vodovodní voda s koncentrací DOC menší než 3 mg/l. Určení zásaditosti, pokud již není známé.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Deionizovaná voda s koncentrací DOC menší než 2 mg/l.
                           
                        
                     Organické médium
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Jako organické médium je přípustná syntetická odpadní voda, splašková odpadní voda nebo jejich směs. Bylo prokázáno (11), (14), že použití samotné splaškové odpadní vody často vede k většímu procentu odstranění DOC, a dokonce umožňuje odstranění a biologický rozklad některých chemických látek, které se při užití syntetické odpadní vody dle OECD biologicky nerozloží. Kontinuální nebo přerušované přidávání splaškové odpadní vody rovněž často vede ke stabilizaci aktivovaného kalu včetně zásadní schopnosti dobrého usazování. Proto se doporučuje použití splaškové odpadní vody. Koncentrace DOC nebo CHSK se stanovuje v každé nové šarži organického média. Má být známa kyselost nebo zásaditost organického média. Organické médium může vyžadovat přidání vhodného pufru (hydrogenuhličitan sodný nebo dihydrogenfosforečnan draselný) v případě, že má nízkou kyselost nebo zásaditost, s cílem udržet pH v aerační nádobě v průběhu zkoušky na hodnotě přibližně 7,5 ± 0,5. V každém jednotlivém případě je nutné rozhodnout o množství pufru, které má být přidáno, a době jeho přidání. Ať už jsou směsi přidávány kontinuálně nebo přerušovaně, musí být hodnota DOC (nebo CHSK) ve směsi udržována na přibližně konstantní hodnotě, např. zředěním vodou.
                           
                        
                     Syntetická odpadní voda
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              V 1 litru vodovodní vody se rozpustí: pepton: 160 mg; masový extrakt: 110 mg; močovina, 30 mg; bezvodý hydrogenfosforečnan draselný (K2HPO4): 28 mg; chlorid sodný (NaCl): 7 mg; dihydrát chloridu vápenatého (CaCl2.2H2O): 4 mg; heptahydrát síranu hořečnatého (Mg2SO4.7H20): 2 mg. Tato syntetická odpadní voda (OECD médium) je modelovým příkladem a vykazuje průměrnou koncentraci DOC v přítoku přibližně 100 mg/l. Další možností je použít jiná složení o přibližně stejné koncentraci DOC, která se více blíží skutečnému složení odpadní vody. Je-li potřeba užít přítok s nižší koncentrací, ředí se syntetická odpadní voda vodovodní vodou například v poměru 1:1 na koncentraci přibližně 50 mg/l. Taková slabší koncentrace přítoku umožní lepší růst nitrifikačních organismů a tato úprava by měla být použita v případě, že je třeba zkoumat simulaci čistíren odpadních vod pracujících s nitrifikací. Tuto syntetickou odpadní vodu lze připravit v destilované vodě v koncentrované podobě a uchovávat při teplotě asi 1 °C po dobu až jednoho týdne. V případě potřeby lze zředit vodovodní vodou. (Toto médium je nevyhovující, např. koncentrace dusíku je velmi vysoká, obsah uhlíku je relativně nízký, avšak nebyla navržena žádná lepší varianta kromě přidání dalšího fosfátu jako pufru a více peptonu).
                           
                        
                     Splašková odpadní voda
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Použije se čerstvá odsazená odpadní voda odebíraná každý den z čistírny, která čistí převážně splaškové domovní odpadní vody. Odebírá se před primární sedimentací z přepadu mechanického stupně čistírny nebo z přítoku do čistírny pracující s aktivovaným kalem, a musí z ní být z větší části odstraněny hrubé částice. Odpadní voda může být uchovávána po několik dní (ale zpravidla ne déle než sedm dní) přibližně při 4 °C, pokud se prokáže, že hodnota DOC (nebo CHSK) se během uchovávání výrazně nesníží (tj. o více než 20 %). K zamezení poruchového provozu systému se před použitím adjustuje DOC (nebo CHSK) u každé nové šarže na příslušnou stálou koncentraci, např. zředěním vodovodní vodou.
                           
                        
                     Aktivovaný kal
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Pro inokulaci se odebere aktivovaný kal z aerační nádrže dobře pracující čistírny odpadních vod nebo z laboratorního modelu aktivace, který pracuje převážně se splaškovou odpadní vodou.
                           
                        
                     Zásobní roztoky zkoušené chemické látky
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              U chemikálií s dostatečnou rozpustností se připraví zásobní roztok zkoušené chemické látky vhodné koncentrace (např. 1 až 5 g/l) v deionizované vodě nebo v minerální složce syntetické odpadní vody (u nerozpustných a těkavých látek viz dodatek 5). V zásobním roztoku se stanoví DOC a celkový organický uhlík (TOC) a měření se u každé nové šarže zopakuje. Jestliže je rozdíl mezi DOC a TOC větší než 20 %, ověří se rozpustnost zkoušené chemické látky ve vodě. DOC nebo koncentrace zkoušené chemické látky stanovená v zásobním roztoku specifickou analýzou se porovná se jmenovitou hodnotou, aby se zjistilo, zda je analytická výtěžnost dostatečná (obvykle lze očekávat > 90 %). Zhodnotí se, zvláště u disperzí, zda může být DOC použit jako analytický ukazatel nebo zda lze použít jen analytickou techniku specifickou pro danou zkoušenou chemickou látku. Vzorky s disperzí je nutné odstředit. V každé nové šarži se stanoví hodnoty DOC, CHSK nebo zkoušené chemické látky pomocí specifické analýzy.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              V zásobním roztoku se stanoví hodnota pH. Extrémní hodnoty indikují, že přidání chemické látky může ovlivňovat hodnotu pH aktivovaného kalu ve zkušebním systému. V takovém případě se zásobní roztok neutralizuje na hodnotu pH 7 ± 0,5 malým objemem anorganické kyseliny nebo zásady. Nesmí však dojít k vysrážení zkoušené chemické látky.
                           
                        POSTUP
                  
                              33.
                           
                           
                              Tento postup platí pro zařízení s aktivovaným kalem. Pro zkoušku v modelu s porézní nádobou musí být mírně upraven.
                           
                        
                     Příprava inokula
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Zkušební zařízení se na počátku zkoušky inokuluje buď aktivovaným kalem, nebo inokulem s nízkou koncentrací mikroorganismů. Inokulum se provzdušňuje při pokojové teplotě až do doby použití a použije se během 24 h. V prvním případě se vzorek aktivovaného kalu odebere z aerační nádrže dobře pracující biologické čistírny odpadních vod nebo z laboratorního modelu aktivace, který pracuje převážně se splaškovou odpadní vodou. Při simulaci nitrifikačních podmínek se odebere kal z čistírny odpadních vod pracující s nitrifikací. Stanoví se koncentrace sušiny, a pokud je to nutné, koncentruje se kal usazováním tak, aby objem kalu přidávaný do zkušebního modelu byl co nejmenší. Počáteční koncentrace sušiny kalu musí být přibližně 2,5 g/l.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Ve druhém případě se jako inokulum použijí 2 ml/l až 10 ml/l odtoku z biologické čistírny splaškových odpadních vod. Aby se získalo dostatečné zastoupení různých bakteriálních druhů, je vhodné použít inokula z různých dalších zdrojů, například z povrchové vody. V takovém případě se aktivovaný kal vyvíjí a roste ve zkušebním modelu.
                           
                        
                     Dávkování organického média
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Je nutné zajistit důkladné vyčištění sběrných nádob na přítok a na odtok a trubek vedoucích z nádob na přítok a do nádob na odtok, aby se zabránilo růstu mikroorganismů na počátku zkoušky i v celém jejím průběhu. Zkušební zařízení se sestaví v místnosti s kontrolovanou teplotou (obvykle v rozmezí 20–25 °C) nebo se použije zkušební zařízení s vodním pláštěm. Připraví se dostatečný objem požadovaného organického média (odstavce 27–29). Nejprve se aerační a dosazovací nádrž naplní organickým médiem a potom se přidá inokulum (odstavce 34, 35). Intenzita provzdušňování se nastaví tak, aby byl kal udržován ve vznosu a v aerobním stavu. Potom se začne s dávkováním přítoku a recyklací usazeného kalu. Organické médium se dávkuje ze zásobních nádob do aeračních nádrží (odstavce 20, 21) zkušebního a kontrolního modelu a příslušné odtoky se shromažďují v obdobných zásobnících. Aby se dosáhlo obvyklé hydraulické doby zdržení 6 h, dávkuje se 0,5 litru organického média za 1 h. Pro potvrzení této rychlosti je nutno měřit dávkovaný denní objem organického média zjišťováním snížení objemu média v zásobnících. Pro stanovení účinků přerušovaného uvolňování a nárazového dávkování chemických látek by bylo nezbytné použít jiné způsoby dávkování
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Jestliže je organické médium připraveno k použití po dobu delší než 1 den, je nutné je ochladit přibližně na 4 °C, případně použít jinou vhodnou metodu ochrany proti růstu mikroorganismů a biologickému rozkladu mimo zkušební zařízení (odstavec 29). Jestliže se používá syntetická odpadní voda, je možné připravit a uchovat při teplotě přibližně 4 °C koncentrovaný zásobní roztok (např. odpovídající desetinásobku běžné koncentrace, odstavec 28). Tento zásobní roztok lze před použitím snadno zředit odpovídajícím objemem vodovodní vody; lze jej rovněž čerpat přímo a odpovídající objem vodovodní vody čerpat zvlášť.
                           
                        
                     Dávkování zkoušené chemické látky
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Příslušný objem zásobního roztoku zkoušené chemické látky (odstavec 31) se buď přidá do zásobní nádoby přítoku, nebo se dávkuje samostatným čerpadlem přímo do aerační nádrže. Obvyklá průměrná zkušební koncentrace v přítoku by se měla pohybovat mezi 10 mg/l až 20 mg/l DOC, nemá však být vyšší než 50 mg/l. Pokud je zkoušená chemická látka málo rozpustná ve vodě nebo se mohou projevit její toxické účinky, lze snížit koncentraci DOC na 5 mg/l nebo i níže, pouze však za předpokladu, že je k dispozici vhodná specifická analytická metoda a že je rovněž provedena (dispergované zkoušené chemické látky s malou rozpustností se mohou dávkovat zvláštními způsoby, viz dodatek 5).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Zkoušená chemická látka se začne přidávat až po dosažení ustáleného stavu systému, kdy dochází k účinnému odstraňování DOC z biologického média (účinnost kolem 80 %). Je nutno dbát na to, aby všechny modely před přidáním zkoušené chemické látky pracovaly se stejnou účinností; pokud tomu tak není, doporučuje se smíchat jednotlivé kaly a znovu rozdělit stejné objemy do jednotlivých modelů. Při použití inokula s (přibližně) 2,5 g/l (sušiny) aktivovaného kalu lze přidávat zkoušenou chemickou látku hned od počátku zkoušky vzhledem k tomu, že přímé přídavky rostoucích dávek zkoušené chemické látky od počátku zkoušky mohou mít tu výhodu, že aktivovaný kal se na tuto látku lépe adaptuje. Bez ohledu na způsob přidání zkoušené chemické látky se doporučuje měřit v pravidelných intervalech průtok a/nebo objem v zásobní nádobě.
                           
                        
                     Nakládání s aktivovaným kalem
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Koncentrace tuhých látek v aktivovaném kalu se během zkoušky obvykle ustaluje v rozsahu od 1 g/l do 3 g/l (sušiny) nezávisle na použitém inokulu a tato koncentrace závisí na jakosti a koncentraci organického média, na provozních podmínkách, na druhu přítomných mikroorganismů a na vlivu zkoušené chemické látky.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Buď se stanovuje koncentrace suspendovaných tuhých látek aktivovaného kalu v aeračních nádobách nejméně jednou týdně a odstraňuje se přebytečný kal tak, aby se koncentrace udržovala v rozsahu od 1 g/l do 3 g/l (sušiny), nebo se udržuje průměrné stáří kalu na konstantní hodnotě zpravidla v rozsahu od 6 dnů do 10 dnů. Pokud se například zvolí doba zdržení kalu 8 dnů, odstraní se denně 1/8 objemu aktivovaného kalu z aerační nádrže a odlije se. To se provádí denně, nebo nejlépe přerušovaným automatickým provozem čerpadla. Udržování koncentrace suspendovaných tuhých látek aktivovaného kalu na konstantní úrovni nebo v úzkém rozmezí neznamená udržování konstantní doby zdržení kalu (SRT), která je provozní proměnnou určující hodnotu koncentrace zkoušené chemické látky v odtoku.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Během zkoušky se nejméně jednou denně stírá kal ulpívající na stěnách aerační a dosazovací nádrže tak, aby došlo k jeho resuspenzi. Všechny trubky a potrubí se pravidelně kontrolují a čistí, aby se zabránilo růstu biofilmu. Usazený kal v dosazovací nádrži se vrací do aerační nádrže přednostně občasným čerpáním. V modelu s porézní nádobou neprobíhá recyklace, ale dříve, než objem v nádobě výrazně stoupne, je nutno zajistit vložení čistých vnitřních nádob (odstavec 21).
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              V Husmannově modelu může docházet ke špatnému usazování a ztrátám kalu v důsledku jeho špatné usaditelnosti. Tomu je možné zabránit použitím jednoho nebo více níže uvedených opatření, která se mají provádět paralelně jak ve zkušebním, tak v kontrolním modelu:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          v pravidelných intervalech (např. každý týden) může být přidáván čerstvý kal nebo flokulační činidlo (například 2 ml 50 g FeCl3 v 1 litru na nádobu), avšak je nutno dbát na to, aby FeCl3 nereagoval se zkoušenou chemickou látkou, ani ji nesrážel,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          mamutka může být nahrazena peristaltickým čerpadlem a recirkulace kalu upravena tak, aby přibližně odpovídala přítoku, což umožní vytvoření anaerobní zóny v usazeném kalu (geometrie mamutky omezuje minimální rychlost vracení kalu přibližně na dvanáctinásobek rychlosti přítoku),
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kal může být čerpán z dosazovací do aerační nádrže přerušovaně (např. 5 minut během 2,5 hodiny), aby se recirkuloval l litr až 1,5 litru kalu za hodinu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aby se zabránilo ztrátám kalu pěněním, lze dávkovat co nejmenší koncentrace netoxického odpěňovacího činidla (např. silikonového oleje),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vzduch může být přerušovaně v krátkých intervalech přiváděn do sedimentujícího kalu v dosazovací nádrži (např. po dobu 10 sekund každou hodinu),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      organické médium může být dávkováno do aerační nádrže přerušovaně (např. 3–10 minut během každé hodiny).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     Odběr vzorků a analýza
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              V pravidelných intervalech se měří koncentrace rozpuštěného kyslíku, teplota a hodnota pH aktivovaného kalu v aerační nádrži. Musí se zajistit vždy dostatečná koncentrace kyslíku (> 2 mg/l) a udržovat požadovaný rozsah teploty (obvykle od 20 °C do 25 °C). Hodnota pH se udržuje na 7,5 ± 0,5 dávkováním malých objemů anorganické zásady nebo kyseliny do aerační nádrže nebo do přítoku nebo zvýšením tlumivé kapacity organického média (viz odstavec 27). Při nitrifikaci dochází ke vzniku kyseliny, přičemž při oxidaci 1 mg N vznikne ekvivalent přibližně 7 mg CO3–. Četnost měření závisí na měřeném ukazateli a na stabilitě systému a může se pohybovat v denních nebo týdenních intervalech.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Změří se DOC nebo CHSK v přítocích kontrolní nádrže a zkušební nádrže (modelu). Změří se koncentrace zkoušené chemické látky v přítoku zkušebního modelu specifickou analýzou, případně se stanoví odhadem podle koncentrace zkoušené chemické látky v zásobním roztoku (odstavec 31), z použitého objemu a z množství odpadní vody dávkované do zkušebního zařízení. Aby se snížila variabilita údajů o koncentracích, doporučuje se koncentraci zkoušené chemické látky stanovit výpočtem.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Odebírají se vhodné objemy vzorků odtoku (např. 24h směsný vzorek) a filtrují se pomocí membrány o průměru pórů 0,45 μm nebo se odstřeďují při odstředivém zrychlení zhruba 40 000 m/s2 po dobu přibližně 15 min. Je-li filtrace obtížná, použije se odstřeďování. Pro zjištění úplného biologického rozkladu se stanovuje DOC nebo CHSK v každém vzorku nejméně dvakrát, a pokud je to nutné, zjišťuje se primární biologický rozklad specifickým stanovením zkoušené chemické látky.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Při použití CHSK mohou vzniknout analytické problémy při nízkých koncentracích, a proto se doporučuje používat CHSK jen při dostatečně vysokých hodnotách zkušební koncentrace (přibližně 30 mg/l). Jestliže se zkoušená chemická látka značně adsorbuje, doporučuje se, aby se množství adsorbované látky na kalu změřilo analytickou metodou specifickou pro danou zkoušenou chemickou látku.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Četnost odběru vzorků závisí na očekávané době trvání zkoušky. Doporučená četnost odběrů jsou tři vzorky za 1 týden. Jakmile modely pracují s dostatečnou účinností, pak po přídavku zkoušené chemické látky bývá adaptace a ustáleného stavu dosaženo po 1 týdnu až 6 týdnech provozu. Pro výpočet výsledku zkoušky se použije nejméně 15 platných hodnot získaných v ustáleném stavu (odstavec 59), která zpravidla trvá 3 týdny. Zkouška může být ukončena, jakmile bylo dosaženo dostatečného stupně odstranění (např. > 90 %) a je k dispozici těchto 15 hodnot, které představují analýzy provedené v jednotlivých pracovních dnech po dobu 3 týdnů. Doba zkoušky po přidání zkoušené chemické látky by obvykle neměla překročit 12 týdnů.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Jestliže dochází k nitrifikaci kalu a je-li potřeba zkoumat dopady zkoušené chemické látky na nitrifikaci, analyzují se vzorky z odtoku zkušebního i kontrolního modelu nejméně jednou týdně a stanoví se v nich amoniak a/nebo dusitan a dusičnan.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Všechny analýzy se provedou co nejdříve, zejména stanovení dusíku. Je-li nutné analýzy odložit, musí být vzorky uchovávány přibližně při 4 °C v temnu ve zcela naplněných a dobře uzavřených lahvičkách. Je-li zapotřebí uchovat vzorky déle než 48 h, konzervují se zmrazením, okyselením (např. přídavkem 10 ml/l roztoku kyseliny sírové koncentrace 400 g/l) popř. vhodnou toxickou látkou (např. přídavkem 20 ml/l roztoku chloridu rtuťnatého koncentrace 10 g/l). Ověří se, zda použitý způsob konzervace neovlivní výsledky analýzy.
                           
                        
                     Zkouška se spřaženým zařízením
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Jestliže se používá spřažené zařízení (dodatek 3), vymění se každý den stejné množství aktivovaného kalu (150 ml až 1 500 ml pro aerační nádrž objemu 3 l směsi) mezi aeračními nádržemi zkušebního a kontrolního modelu. Pokud se zkoušená chemická látka silně adsorbuje na kal, vymění se pouze supernatant v dosazovacích nádržích. V obou případech se pro výpočet výsledků zkoušky použije korekční faktor (odstavec 55).
                           
                        ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ
                  
                     Zpracování výsledků
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Stupeň odstranění zkoušené chemické látky v procentech DOC nebo CHSK pro každý časový odhad se vypočte podle rovnice:
                              
                                 
                              kde
                              
                                          Dt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          stupeň odstranění DOC nebo CHSK v čase t vyjádřený v procentech
                                       
                                    
                                          Cs
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          koncentrace DOC nebo CHSK zkoušené chemické látky v přítoku v mg/l, přednostně stanovená odhadem ze zásobního roztoku
                                       
                                    
                                          E
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          změřená koncentrace DOC nebo CHSK v odtoku ze zkušebního modelu v mg/l v čase t
                                       
                                    
                                          Eo
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          změřená koncentrace DOC nebo CHSK v odtoku z kontrolního modelu v mg/l v čase t
                                       
                                    
                        
                              53.
                           
                           
                              Stupeň odstranění organického média prostřednictvím DOC nebo CHSK v kontrolní jednotce je užitečnou informací k posouzení biodegradační aktivity aktivovaného kalu během zkoušky. Stupeň odstranění organického média se vypočte podle rovnice:
                              
                                 
                              kde
                              
                                          DB
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          stupeň odstranění organického média vyjádřený v procentech DOC nebo CHSK v kontrolním modelu v čase t
                                       
                                    
                                          CM
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          koncentrace DOC nebo CHSK organického média v přítoku do kontrolního modelu v mg/l
                                       
                                    Nepovinně se vypočte procento odstranění DOC nebo CHSK organického média a zkoušené chemické látky ve zkušebním zařízení podle rovnice:
                              
                                 
                              kde
                              
                                          DT
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          stupeň odstranění DOC nebo CHSK v celkovém přítoku do zkušebního modelu vyjádřený v procentech
                                       
                                    
                                          CT
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          DOC nebo CHSK v celkovém přítoku do zkušebního modelu nebo vypočtený na základě zásobních roztoků v mg/l
                                       
                                    
                        
                              54.
                           
                           
                              Stupeň odstranění zkoušené chemické látky stanovený specifickou analytickou metodou při každém hodnocení v čase se vypočte podle rovnice:
                              
                                 
                              kde
                              
                                          DST
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          stupeň primárního odstranění zkoušené chemické látky v čase t vyjádřený v procentech
                                       
                                    
                                          Si
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          změřená nebo vypočtená koncentrace zkoušené chemické látky v přítoku do zkušebního modelu v mg/l
                                       
                                    
                                          Se
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          změřená koncentrace zkoušené chemické látky v odtoku ze zkušebního modelu v mg/l v čase t
                                       
                                    
                        
                              55.
                           
                           
                              Jestliže se používá spřažené zařízení, upraví se ředění zkoušené chemické látky v aerační nádrži o výměnu kalu a použije se korekční faktor (viz dodatek 3). Jestliže je průměrná hydraulická doba zdržení 6 h a vymění se polovina objemu aktivovaného kalu v aeračních nádržích, je pro získání skutečného stupně odstranění zkoušené chemické látky Dtc nutné upravit stanovené denní hodnoty odstranění (Dt, odstavec 52) na základě rovnice:
                              
                                 
                           
                        
                     Vyjadřování výsledků zkoušky
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Do grafu se vynese procento odstranění Dt (nebo Dtc) a DST, pokud je k dispozici, v závislosti na čase (viz dodatek 2). Z tvaru této křivky odstranitelnosti zkoušené chemické látky (samostatně nebo jako DOC) lze vyvodit některé závěry o postupu odstraňování.
                           
                        
                     Adsorpce
                  
                  
                              57.
                           
                           
                              Je-li hned na počátku zkoušky pozorován vysoký stupeň odstranění DOC zkoušené chemické látky, je zkoušená chemická látka pravděpodobně odstraňována adsorpcí na sušině aktivovaného kalu. To je možné ověřit stanovením adsorbované zkoušené chemické látky specifickou analýzou. Není obvyklé, aby stupeň odstranění DOC adsorbovatelných chemických látek zůstával vysoký v celém průběhu zkoušky; vysoký stupeň odstranění je zpravidla pozorován na počátku zkoušky a později klesne na rovnovážnou hodnotu. Pokud ale adsorbovatelná zkoušená chemická látka byla schopna tak či onak způsobit aklimatizaci populace mikroorganismů, stupeň odstranění DOC zkoušené chemické látky by následně vzrostl a dosáhl vysoké hodnoty ve fázi prodlevy.
                           
                        
                     Lagová fáze
                  
                  
                              58.
                           
                           
                              Obdobně jako u statických screeningových zkoušek musí u řady zkoušených látek dříve, než proběhne úplný biologický rozklad, proběhnout lagová fáze. V lagové fázi dochází k aklimatizaci nebo adaptaci rozkládajících se baktérií, přičemž nedochází téměř k žádnému úbytku zkoušené chemické látky; následně dochází k počátečnímu růstu těchto baktérií. Tato fáze končí a má se za to, že začíná fáze rozkladu, po úbytku přibližně 10 % počátečního množství zkoušené chemické látky (po zohlednění adsorpce, pokud k ní dojde). Lagová fáze je často různě dlouhá a špatně reprodukovatelná.
                           
                        
                     Prodleva
                  
                  
                              59.
                           
                           
                              Fáze prodlevy křivky odstranitelnosti při kontinuální zkoušce je definována jako fáze, v níž dochází k maximálnímu rozkladu. Fáze prodlevy musí trvat nejméně 3 týdny a musí mít alespoň 15 změřených platných hodnot.
                           
                        
                     Průměrný stupeň odstranění zkoušené chemické látky
                  
                  
                              60.
                           
                           
                              Střední hodnota se vypočte z hodnot odstranění (Dt) zkoušené chemické látky ve fázi prodlevy. Po zaokrouhlení na nejbližší celé číslo (1 %) získáme stupeň odstranění zkoušené chemické látky. Doporučuje se rovněž vypočítat 95 % konfidenční interval této střední hodnoty.
                           
                        
                     Odstranění organického média
                  
                  
                              61.
                           
                           
                              Do grafu se vynese procento odstranění DOC nebo CHSK organického média v kontrolním zařízení (DB) v závislosti na čase. Průměrný stupeň odstranění se označí stejně jako u zkoušené chemické látky (odstavec 60).
                           
                        
                     Indikace biologické rozložitelnosti
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Jestliže se zkoušená chemická látka výrazně neadsorbuje na aktivovaném kalu a křivka odstranitelnosti vykazuje typický průběh biologického rozkladu s lagovou fází, fází rozkladu a fází prodlevy (odstavce 58, 59), lze změřené odstranění zkoušené chemické látky bezpečně přisoudit jejímu biologickému rozkladu. Dojde-li na počátku zkoušky k velkému odstranění, nemůže tato simulační zkouška rozlišit biologické a abiotické eliminační procesy. V takovém případě a také v jiných případech, kdy jsou pochybnosti o biologické rozložitelnosti (např. jestliže dochází ke stripování), se zjišťuje adsorpce zkoušené chemické látky nebo se provádějí další statické zkoušky biologické rozložitelnosti založené na ukazatelích jednoznačně indikujících biologické procesy. Takovými zkouškami jsou metoda zkoumání spotřeby kyslíku (kapitola C.4 D, E a F této přílohy (6)) nebo metoda stanovení uvolněného oxidu uhličitého (kapitola C.4 C této přílohy (6)) nebo metoda ISO Headspace (18) s využitím adaptovaného inokula ze simulační zkoušky. Pokud byly změřeny procentuální hodnoty jak odstranění DOC, tak odstranění konkrétních chemických látek, a existují-li mezi těmito hodnotami významné rozdíly (u DOC nižší hodnoty, u konkrétních látek vyšší), pak to naznačuje přítomnost organických meziproduktů v odpadních vodách, které mohou být obtížněji rozložitelné než výchozí chemická látka.
                           
                        
                     Platnost výsledků zkoušky
                  
                  
                              63.
                           
                           
                              Stanovením stupně biologického rozkladu organického média (odstavec 53) v kontrolním modelu se získají informace o normální biologické rozložitelnosti inokula. Zkouška se považuje za platnou, jestliže je v kontrolním modelu stupeň biologického rozkladu podle DOC nebo CHSK po 2 týdnech větší než 80 % a nebyly pozorovány žádné neobvyklé jevy.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Pokud byla užita snadno biologicky rozložitelná (referenční) chemická látka, měl by být stupeň biologického rozkladu (Dt, odstavec 52) > 90 %.
                           
                        
                              65.
                           
                           
                              Jestliže je zkouška provedena za nitrifikačních podmínek, měla by být průměrná odtoková koncentrace < 1 mg/l amoniakálního dusíku a < 2 mg/l dusitanového dusíku.
                           
                        
                              66.
                           
                           
                              Pokud tato kritéria (odstavce 63–65) nebyla splněna, je třeba zkoušku opakovat s použitím inokula z jiného zdroje, provést zkoušku referenční chemické látky a přezkoumat všechny experimentální postupy.
                           
                        
                     Protokol o zkoušce
                  
                  
                              67.
                           
                           
                              V protokolu o zkoušce musí být uvedeny tyto údaje:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkoušená chemická látka:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje nutné k identifikaci,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikální povaha a tam, kde je to podstatné, fyzikálně -chemické vlastnosti.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkušební podmínky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      typ zkušebního zařízení, jakákoli úprava za účelem zkoušek nerozpustných a těkavých látek,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      typ organického média,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podíl a charakter průmyslového odpadu obsaženého v odpadní vodě, jsou-li známy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inokulum, charakter a místo/místa odběru, koncentrace a jakákoli předúprava,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zásobní roztok zkoušené chemické látky: obsah DOC a TOC, způsob přípravy, jedná-li se o suspenzi, užitá zkušební koncentrace; pokud se tato koncentrace pohybuje mimo rozmezí 10–20 mg/l DOC, důvody, proč tomu tak je, metoda přidávání, datum prvního přidání, jakékoli změny,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      průměrné stáří kalu a průměrná hydraulická doba zdržení, metoda odtahu kalu, metody předcházející bytnění kalu, ztrátě kalu apod.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použité analytické metody,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zkušební teplota,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vlastnosti kalu, např. bytnění, kalový index (KI), koncentrace aktivovaného kalu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o odchylkách od normalizovaného postupu a o dalších okolnostech, které by mohly ovlivnit výsledky.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky zkoušky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      všechny změřené údaje (DOC, CHSK, specifické analýzy, hodnota pH, teplota, koncentrace kyslíku, suspendované tuhé látky a sloučeniny dusíky, pokud je to relevantní),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      všechny vypočtené hodnoty Dt (nebo Dtc), DB, DST v tabelované formě a křivky odstranitelnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o lagové fázi a fázi prodlevy, doba trvání zkoušky, stupeň odstranění zkoušené chemické látky a stupeň odstranění organického média v kontrolním modelu společně se statistickými informacemi a vyjádřením k biologické rozložitelnosti zkoušené chemické látky a platnosti zkoušky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      diskuse o výsledcích.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA:
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              Swisher RD (1987). „Surfactant Biodegradation“, 2nd Edn. Marcel Dekker Inc. New York, 1085 pp.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              German Government (1962). Ordinance of the degradability of detergents in washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No.49: 698–706.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Painter HA and King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing biodegradability. Technical Report No.70, Water Research Centre, Medmenham, UK.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Painter HA and King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. Res. 12: 909–915.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Eckenfelder, W.W (19) US EPA.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Kapitola C.4 této přílohy, Stanovení „snadné“ biologické rozložitelnosti.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              Kapitola C.12 této přílohy, Biologická rozložitelnost – modifikovaná zkouška SCAS.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              Kapitola C.19 této přílohy, Odhad adsorpčního koeficientu (K
                                    OU
                                 ) pro půdy a čistírenské kaly pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC).
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Gerike P and Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3:157–173.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and conclusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45–55.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Painter HA and Bealing D (1989). Experience and data from the OECD activated sludge simulation test. pp 113–138, In: Laboratory tests for simulation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              ISO 11733 (1995; přepracována v roce 2004). Stanovení odstranitelnosti a biologické rozložitelnosti organických látek ve vodním prostředí - simulační zkouška s aktivovaným kalem.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol. Deterg.: 33–48.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 (2): 340–343.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Gerike P, Fischer WK and Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753–758.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214–220.
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. Methods for the examination of waters and associated materials. pp. 91–98 ISBN 011 751661 9.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              ISO 14593 (1998). Jakost vod – Hodnocení úplné aerobní biologické rozložitelnosti organických látek ve vodním prostředí. Metoda stanovení anorganického uhlíku v těsně uzavřených lahvičkách.
                           
                        
                     Dodatek 1
                     
                        Obrázek 1
                     
                     
                        Zařízení použité pro posouzení biologické rozložitelnosti
                     
                     Husmannův model
                     
                        
                     
                                 A.
                              
                              
                                 zásobník
                              
                           
                                 B.
                              
                              
                                 dávkovací čerpadlo
                              
                           
                                 C.
                              
                              
                                 aerační nádrž (kapacita 3 l)
                              
                           
                                 D.
                              
                              
                                 sedimentační nádrž
                              
                           
                                 E.
                              
                              
                                 mamutka
                              
                           
                                 F.
                              
                              
                                 sběrná nádrž
                              
                           
                                 G.
                              
                              
                                 provzdušňovací zařízení (frita)
                              
                           
                                 H.
                              
                              
                                 průtokoměr vzduchu
                              
                           
                        Obrázek 2
                     
                     
                        Zařízení použité pro posouzení biologické rozložitelnosti
                     
                     Porézní nádoba
                     
                        
                     
                                 A.
                              
                              
                                 zásobník
                              
                           
                                 B.
                              
                              
                                 dávkovací čerpadlo
                              
                           
                                 C.
                              
                              
                                 porézní nádoba aerační nádrže
                              
                           
                                 D.
                              
                              
                                 vnější nepropustná nádoba
                              
                           
                                 E.
                              
                              
                                 sběrná nádrž
                              
                           
                                 F.
                              
                              
                                 difuzér
                              
                           
                                 G.
                              
                              
                                 průtokoměr vzduchu
                              
                           
                        Obrázek 3
                     
                     
                        Podrobný popis porézní nádoby třílitrové aerační nádrže
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatek 2
                     
                        Příklad křivky odstranitelnosti
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatek 3
                     [INFORMATIVNÍ]
                     ZKOUŠKA SE SPŘAŽENÝM ZAŘÍZENÍM
                     S cílem pokusit se vyrovnat mikrobiální populace v kalech ve zkušebním zařízení, do nějž je vpouštěna odpadní voda a zkoušená chemická látka, a v kontrolním zařízení, do nějž je vpouštěna pouze odpadní voda, byla zavedena denní výměna kalu (1). Tento postup byl nazván spřažením a metoda je známa jako zkouška se spřaženým zařízením. Spřažení bylo původně prováděno pomocí Husmannových modelů aktivovaného kalu, bylo však prováděno i s využitím modelů s porézní nádobou (2)(3). Nebyly zjištěny žádné významné rozdíly ve výsledcích mezi nespřaženými a spřaženými jednotkami bez ohledu na to, zda se jednalo o Husmannův model nebo model s porézní nádobou, takže vynaložení času a energie na spřažení zařízení by nepřineslo žádnou výhodu.
                     Výměna kalu může být zdánlivě příčinou značně vysokého stupně odstranění, protože část zkoušené chemické látky se přenáší do druhého modelu a koncentrace zkoušené chemické látky v odtoku ze zkušebního a kontrolního modelu se téměř vyrovná. Proto se používají korekční faktory, jejichž hodnota závisí na objemu vyměňované aktivační směsi a na průměrné hydraulické době zdržení. Podrobnosti pro výpočet byly zveřejněny (1).
                     Korigovaná hodnota stupně odstranění DOC nebo CHSK se vypočte podle obecné rovnice:
                     
                        
                     kde
                     
                                 Dtc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 korigovaný stupeň odstranění DOC nebo CHSK v procentech
                              
                           
                                 Dt
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 stanovený stupeň odstranění DOC nebo CHSK v procentech
                              
                           
                                 a
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 vyměněný podíl aktivační směsi mezi jednotkami aktivovaného kalu
                              
                           
                                 r
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 průměrná hydraulická doba zdržení v hodinách
                              
                           Jestliže se například vymění polovina objemu aeračních nádrží (a = 0,5) a průměrná hydraulická doba zdržení je 6 h, korekční vzorec je následující:
                     
                        
                     
                        LITERATURA:
                     
                     
                                 1)
                              
                              
                                 Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135.
                              
                           
                                 2)
                              
                              
                                 Painter HA, Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD Activated Sludge Simulation Test. pp. 113-138. In: Laboratory Tests for Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
                              
                           
                                 3)
                              
                              
                                 Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK.
                              
                           
                  
                     Dodatek 4
                     HODNOCENÍ INHIBICE AKTIVOVANÝM KALEM
                     
                        Postup podle zkoušených chemických látek
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Při simulační zkoušce nemusí dojít k rozkladu nebo odstranění chemické látky (nebo odpadní vody), která může mít dokonce inhibiční účinek na mikroorganismy v kalu. Jiné chemické látky se biologicky rozkládají v nízkých koncentracích, ale ve vyšší koncentraci působí inhibičně (hormeze). Inhibiční účinky mohou být zjištěny v dřívější fázi nebo mohou být stanoveny zkouškou toxicity s použitím obdobného nebo totožného inokula jako u simulační zkoušky (1). Jedná se o metodu inhibice spotřeby kyslíku (kapitola C.11 této přílohy (2) a ISO 8192(3)), nebo inhibice růstu organismů v kalu (ISO 15522 (4)).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 V simulační zkoušce se inhibice projeví rozdílem obsahu rozpuštěného organického uhlíku (DOC) nebo chemické spotřeby kyslíku CHSK mezi odtokem ze zkušební nádoby a odtokem z kontrolní nádoby, který bude větší než v případě DOC přidaného jako zkoušená chemická látka. Vyjádřeno jiným způsobem se procento odstranění DOC (a biochemická spotřeba kyslíku BSK, chemická spotřeba kyslíku CHSK a/nebo NH+
                                    4) ve zpracovávaném organickém médiu v důsledku přítomnosti zkoušené chemické látky sníží. Pokud k tomu dojde, měla by být zkouška opakována při postupném snižování koncentrace zkoušené chemické látky, dokud nebude dosaženo úrovně, při které nedojde k inhibici; potenciálně lze dále snižovat koncentraci až do doby, kdy bude zkoušená chemická látka biologicky rozložena. Nicméně pokud má zkoušená chemická látka (nebo odpadní voda) na tento proces negativní vliv ve všech zkoušených koncentracích, nasvědčuje to tomu, že tuto chemickou látku je obtížné až nemožné biologicky odstranit, ale může být vhodné opakovat zkoušku s aktivovaným kalem z jiného zdroje a/nebo vystavení kalu postupnější aklimatizaci.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Naopak pokud dojde při simulační zkoušce k bioeliminaci zkoušené chemické látky napoprvé, měla by být její koncentrace zvýšena, je-li cílem zjistit, zda by daná chemická látka mohla působit inhibičně.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Při snaze zjistit stupeň inhibice je třeba mít na paměti, že populace v aktivovaném kalu se může změnit, takže se v průběhu času u mikroorganismů může vyvinout tolerance vůči inhibující látce.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Výpočet stupně inhibice:
                                 Celkové procento úbytku Ro, BSK, DOC, CHSK atd., ve zkušebních a kontrolních zařízeních lze vypočítat na základě rovnice:
                                 
                                    
                                 kde:
                                 
                                             I
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentrace BSK, DOC, CHSK atd. v přítoku zkušebních nebo kontrolních nádob v mg/l
                                          
                                       
                                             E
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             příslušné koncentrace v odtoku v mg/l.
                                          
                                       I a E musí být korigovány o DOC v důsledku přítomnosti zkoušené chemické látky ve zkušebních zařízeních; v opačném případě budou výpočty procenta inhibice nesprávné.
                                 Stupeň inhibice způsobené přítomností zkoušené chemické látky lze vypočítat na základě rovnice:
                                 
                                    
                                 kde:
                                 
                                             Rc
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             procento úbytku v kontrolních nádobách
                                          
                                       
                                             Rt
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             procento úbytku ve zkušebních nádobách
                                          
                                       
                           
                        LITERATURA:
                     
                     
                                 1)
                              
                              
                                 Reynolds L et al. (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259.
                              
                           
                                 2)
                              
                              
                                 Kapitola C.11 této přílohy, Biologická rozložitelnost – Zkouška na inhibici dýchání aktivovaného kalu.
                              
                           
                                 3)
                              
                              
                                 ISO 8192 (2007) Jakost vod – Zkouška inhibice spotřeby kyslíku aktivovaným kalem při oxidaci uhlíkatých látek a amoniakálního dusíku.
                              
                           
                                 4)
                              
                              
                                 ISO 15522 (1999) Water Quality - Determination of the inhibitory effect of water constituents on activated sludge microorganisms.
                              
                           
                  
                     Dodatek 5
                     
                        Ve vodě těžko rozpustné zkoušené chemické látky – těkavé chemické látky
                     
                     
                        Ve vodě těžko rozpustné chemické látky
                     
                     Evidentně bylo zveřejněno jen málo zpráv o podrobení chemických látek těžko rozpustných a nerozpustných ve vodě zkouškám simulujícím čištění odpadních vod (1), (2), (3).
                     Neexistuje jednotná metoda dispergace zkoušené chemické látky, kterou by bylo možno použít pro všechny nerozpustné chemické látky. Jako vhodné pro pokus o dispergaci zkoušených látek při simulační zkoušce by se jevily dva ze čtyř typů metod popsaných v normě ISO 10634 (4); jedná se o použití emulgačního činidla a/nebo ultrazvukové energie. Měla by být stanovena stabilita výsledné disperze po dobu alespoň 24 h. Vhodně stabilizované disperze v neustále míchaných nádržích (odstavec 38) pak budou nadávkovány do aerační nádrže odděleně od splaškové (nebo syntetické) odpadní vody.
                     V případě stabilní disperze je nutno prozkoumat způsob stanovení zkoušené chemické látky v dispergované formě. Metoda DOC nebude pravděpodobně pro tento účel vhodná, takže bude třeba stanovit analytickou metodu specifickou pro zkoušenou chemickou látku, kterou bude možno použít pro odtok, tuhé látky v odtoku a aktivovaný kal. Následně se stanoví osud zkoušené chemické látky v simulaci procesu čištění aktivovaným kalem v pevné a kapalné fázi. To znamená, že bude stanovena „hmotnostní bilance“ za účelem rozhodnutí, zda došlo k biologickému rozkladu zkoušené chemické látky. To by však indikovalo pouze primární biologický rozklad. Pokus o prokázání úplného biologického rozkladu by měl proběhnout na základě respirometrické zkoušky na snadnou biologickou rozložitelnost (viz kapitola C.4 této přílohy (5) C, F nebo D), přičemž se jako inokulum použije kal vystavený zkoušené chemické látce při simulační zkoušce.
                     
                        Těkavé chemické látky
                     
                     Uplatnění simulace čištění odpadních vod na těkavé chemické látky je sporné a problematické. Obdobně jako u zkoušených látek špatně rozpustných ve vodě bylo publikováno jen velmi málo zpráv popisujících simulační zkoušky pomocí těkavých látek. Konvenční typ kompletního míchadla se upraví utěsněním aeračních a usazovacích nádrží, měřením a regulací průtoku vzduchu pomocí průtokoměrů a vypouštěním výstupního plynu přes zařízení na zachycování těkavých organických látek. V některých případech se použije k vypouštění výstupního plynu vývěva přes „studené“ zachycovací zařízení nebo přes čisticí zachycovací zařízení obsahující Tenax a silikagel pro analýzu pomocí plynové chromatografie. Přítomnost zkoušené chemické látky v zachycovacím zařízení lze stanovit analyticky.
                     Zkouška se provádí ve dvou částech. Zařízení jsou nejprve spuštěna bez kalu, přičemž se do aerační nádrže čerpá syntetická odpadní voda a zkoušená chemická látka. Vzorky přítoku, odtoku a výstupního plynu se po dobu několika dnů shromažďují a analyzují na zkoušenou chemickou látku. Ze shromážděných údajů lze vypočítat procentní podíl (Rvs) zkoušené chemické látky odstraněné ze systému.
                     Následně je provedena normální biologická zkouška (s kalem) za stejných provozních podmínek jako ve stripovací studii. Jsou provedena také měření DOC nebo CHSK s cílem zkontrolovat efektivní fungování zařízení. V první části zkoušky jsou prováděny příležitostné analýzy ke stanovení zkoušené chemické látky v přítoku, odtoku a výstupním plynu; po aklimatizaci se analýzy provádějí častěji. Opět platí, že z údajů v ustáleném stavu lze vypočítat procento odstranění zkoušené chemické látky z kapalné fáze všemi procesy (RT) (fyzikálními i biologickými) i podíl látek (RV), odstraněných ze systému.
                     Výpočet:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 V nebiologické zkoušce lze procentní podíl (RVP) zkušebního materiálu odstraněného ze systému vypočítat pomocí následující rovnice:
                                 kde
                                 
                                             RVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             odstranění zkoušené chemické látky těkáním (%),
                                          
                                       
                                             SVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             zkoušená chemická látka shromážděná v zařízení pro zachycování vyjádřená jako ekvivalentní koncentrace v kapalné fázi v mg/l,
                                          
                                       
                                             SIP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentrace zkoušené chemické látky v přítoku (mg/l).
                                          
                                       
                           
                                 b)
                              
                              
                                 V biologické zkoušce lze procentní podíl (RV) zkušebního materiálu odstraněného ze systému vypočítat pomocí následující rovnice:
                                 kde
                                 
                                             RV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             odstranění zkoušené chemické látky těkáním při biologické zkoušce (v %),
                                          
                                       
                                             SV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             zkoušená chemická látka shromážděná v zařízení pro zachycování při biologické zkoušce vyjádřená jako ekvivalentní koncentrace v kapalném přítoku v mg/l,
                                          
                                       
                                             SI
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentrace zkoušené chemické látky v přítoku v mg/l.
                                          
                                       
                           
                                 c)
                              
                              
                                 V biologické zkoušce se procento (RT) zkoušené chemické látky odstraněné všemi procesy vypočte pomocí následující rovnice:
                                 kde
                                 SE= koncentrace zkoušené chemické látky v (kapalném) odtoku v mg/l.
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 Procentní podíl (RBA) odstraněný biologickým rozkladem a adsorpcí lze tedy vypočítat na základě rovnice:
                                 Měly by být provedeny samostatné zkoušky s cílem zjistit, zda je zkoušená chemická látka adsorbována; pokud tomu tak je, lze provést další korekci.
                              
                           
                                 e)
                              
                              
                                 Srovnání mezi podílem zkoušené chemické látky odstraněné z biologických (Rv) a nebiologických (Rvp) zkoušených systémů naznačuje celkový dopad biologického čištění na emise zkoušené chemické látky do atmosféry.
                                 
                                             
                                                Příklad:
                                             
                                          
                                          
                                             benzen
                                          
                                       doba zdržení kalu = 4 dny
                                 syntetická odpadní voda; doba zdržení = 8 h
                                 
                                             SIP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             SI = 150 mg/l
                                          
                                       
                                             SVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             150 mg/l (SEP = 0)
                                          
                                       
                                             SV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             22,5 mg/l
                                          
                                       
                                             SE
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             50 μg/l
                                          
                                       Platí tedy, že
                                 
                                             RVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             100 %, RV = 15 %
                                          
                                       
                                             RT
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             100 % a RBA = 85 %.
                                          
                                       Předpokládalo se, že benzen není absorbován na kal.
                              
                           
                        LITERATURA:
                     
                     
                                 1)
                              
                              
                                 Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939-854.
                              
                           
                                 2)
                              
                              
                                 Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.
                              
                           
                                 3)
                              
                              
                                 Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control Fed. 55: 97.
                              
                           
                                 4)
                              
                              
                                 ISO 10634 (1995) Jakost vod - Pokyny pro přípravu a zpracování ve vodě těžko rozpustných organických látek pro následující hodnocení jejich biologické rozložitelnosti ve vodním prostředí
                              
                           
                                 5)
                              
                              
                                 Kapitola C.4 této přílohy, Stanovení „snadné“ biologické rozložitelnosti.
                              
                           
                  
                     Dodatek 6
                     
                        Vliv doby zdržení kalu (SRT) na odstranitelnost chemických látek
                     
                     ÚVOD
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Metoda popsaná v hlavní části textu byla navržena ke zjištění, zda zkoušené chemické látky (zpravidla takové, o nichž je známo, že jsou biologicky rozložitelné, avšak nikoli snadno biologicky rozložitelné) podléhají biologickému rozkladu v mezích vyžadovaných v čistírnách odpadních vod. Výsledky jsou vyjadřovány v procentech úbytku a v procentech biologického rozkladu. Podmínky provozu jednotek aktivovaného kalu a volba přítoku dovolují spíše širší rozpětí koncentrací zkoušené chemické látky v odtoku. Zkoušky jsou prováděny pouze při jedné jmenovité koncentraci suspendovaných látek nebo při jedné jmenovité době zdržení kalu (SRT) a popsané režimy odtahování mohou způsobit při zkoušce značné kolísání doby zdržení kalu jak den ode dne, tak během dne.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 V této variantě (1), (2) je popsána metoda regulace doby zdržení kalu v mnohem užším rozmezí v průběhu každého 24hodinového období (obdobně jako ve větším měřítku), které může mít za následek ustálenější koncentraci zkoušené chemické látky v odtoku. Doporučuje se použít splaškovou odpadní vodu vzhledem k tomu, že vykazuje konzistentnější a vyšší procenta úbytku. Jsou rovněž zkoumány účinky řady hodnot doby zdržení kalu a v podrobnější studii mohou být stanoveny účinky rozmezí teplot na koncentraci chemické látky v odtoku.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Dosud neexistuje obecná shoda ohledně toho, které modely kinetiky působí při biologickém rozkladu chemických látek za podmínek panujících při čištění odpadních vod. Byl zvolen Monodův model růstu baktérií a využití substrátu (1), (2), který bude uplatněn na shromážděné údaje vzhledem k tomu, že tato metoda měla být použita pouze na chemické látky vyráběné ve velkých objemech, což má za následek koncentrace v odpadní vodě nad 1 mg/l. Platnost zjednodušeného modelu a užitých předpokladů byly stanoveny za použití řady alkoholethoxylátů s různým stupněm primární biologické rozložitelnosti (2), (3).
                                 
                                             
                                                Poznámka:
                                             
                                          
                                          
                                             Tato variantní metoda úzce sleduje většinu textu této zkušební metody C.10-A a níže jsou uvedeny pouze podrobnosti, které se od ní liší.
                                          
                                       
                           PODSTATA ZKOUŠKY
                     
                                 4.
                              
                              
                                 Zařízení s porézní nádobou s aktivovaným kalem, určená k (téměř) kontinuálnímu odtahu aktivační směsi umožňující velmi přesné řízení doby zdržení kalu (SRT nebo θs) jsou provozována v nespřaženém režimu pro řadu dob zdržení kalu a volitelně i pro řadu teplot. Obvyklá doba zdržení je 2 až 10 dnů při teplotě 5 až 20 °C. Odpadní voda, nejlépe splašková, a roztok zkoušené chemické látky se do zařízení dávkují odděleně takovou rychlostí, aby se dosáhlo požadované doby zdržení kalu (3–6 hodin) a požadované koncentrace zkoušené chemické látky v přítoku. Kontrolní zařízení se provozují paralelně bez zkoušené chemické látky za účelem srovnání.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Lze použít i jiné typy zařízení, ale je nutné věnovat velkou pozornost správné kontrole doby zdržení kalu. Například při použití zařízení obsahujících usazovací nádrže může být nezbytné zohlednit ztrátu tuhých látek odtokem čistírny. Měla by být přijata speciální opatření s cílem zabránit chybám v důsledku kolísání množství kalu v usazovací nádrži.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Zařízení se provozují při každé zvolené sérii podmínek až do ustáleného stavu a průměrná koncentrace zkoušené chemické látky a případně i DOC se pak stanovuje v odtoku po dobu přibližně tří týdnů. Kromě posouzení procenta úbytku zkoušené chemické látky a případně i DOC se vztah mezi podmínkami provozu čistíren a koncentrací zkoušené chemické látky v odtoku vyjadřuje v grafické formě. Výsledky jsou použitelné pro výpočet předběžných kinetických konstant a předpověď podmínek, za nichž lze zkoušenou chemickou látku čistit.
                              
                           INFORMACE O ZKOUŠENÉ CHEMICKÉ LÁTCE
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Použije se se kapitola C.10 A, odstavce 12 až 13.
                              
                           HODNOTY, PŘI NICHŽ VÝROBEK VYHOVUJE
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Použije se kapitola C.10 A, odstavce 14 až 15.
                              
                           REFERENČNÍ ZKOUŠENÁ CHEMICKÁ LÁTKA
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Použije se kapitola C.10 A, odstavec 16.
                              
                           REPRODUKOVATELNOST VÝSLEDKŮ zkoušek
                     
                                 10.
                              
                              
                                 Použije se kapitola C.10 A, odstavce 17 až 18.
                              
                           POPIS METODY
                     
                        Přístroje a pomůcky
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Vhodným zařízením je modifikovaný systém s porézní nádobou (dodatek 6.1). Skládá se z vnitřní nádoby (nebo vložky) vyrobené z porézního polypropylenu o síle stěn 3,2 mm, velikosti pórů přibližně 90 μm a s natupo svařenými spoji. (Vznikne tak pevnější zařízení, než je uvedeno v bodě 21 této kapitoly C.10 A) Porézní válec je vložen do vnější nádoby z nepropustného polyetylenu skládající se ze dvou částí: z kruhové základny, ve které jsou vyvrtány dva otvory pro přívod vzduchu a jeden pro odběr kalu, a z horního válce, který je přišroubován na základnu a má odtok umístěn tak, aby udržel daný objem (3 l) v porézní nádobě. Na jeden přívod vzduchu je napojena provzdušňovací krychlička a druhý konec přívodu vzduchu je otevřený a nastavený v pravém úhlu k provzdušňovacímu elementu základny. Toto uspořádání umožňuje potřebnou turbulenci, aby obsah nádoby byl dokonale promícháván a aby byla zajištěna koncentrace rozpuštěného kyslíku větší než 2 mg/l.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Odpovídající počet zařízení je udržován při kontrolované teplotě v rozmezí od 5 do 20 °C (±1 °C), a to buď ve vodní lázni nebo v místnosti s konstantní teplotou. Čerpadla musí dávkovat do aeračních nádob roztok zkoušené chemické látky požadovanou rychlostí 0–1,0 ml/min a usazené odpadní vody požadovanou rychlostí 0–25 ml/min a třetí čerpadlo musí odstraňovat odpadní kal z aeračních nádrží Potřebného velmi nízkého průtoku odpadního kalu je dosaženo pomocí čerpadla nastaveného na vyšší rychlost a spouštěného přerušovaně pomocí časového spínače, např. tak, že je v chodu po dobu 10 sekund za minutu, rychlost čerpadla je 3 ml/min a rychlost odtahování kalu 0,5 ml/min.
                              
                           
                        Filtrační přístroj nebo odstředivka
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Použije se kapitola C.10 A, odstavec 23.
                              
                           
                        Analytické vybavení
                     
                     
                                 14.
                              
                              
                                 Použije se kapitola C.10 A, odstavec 24.
                              
                           
                        Voda
                     
                     
                                 15.
                              
                              
                                 Použije se kapitola C.10 A, odstavce 25 až 26.
                              
                           
                        Organické médium
                     
                     
                                 16.
                              
                              
                                 Použije se kapitola C.10 A, odstavec 27.
                              
                           
                        Syntetická odpadní voda
                     
                     
                                 17.
                              
                              
                                 Použije se kapitola C.10 A, odstavec 28.
                              
                           
                        Splašková odpadní voda
                     
                     
                                 18.
                              
                              
                                 Použije se kapitola C.10 A, odstavec 29.
                              
                           
                        Aktivovaný kal
                     
                     
                                 19.
                              
                              
                                 Použije se kapitola C.10 A, odstavec 30.
                              
                           
                        Zásobní roztoky zkoušené chemické látky
                     
                     
                                 20.
                              
                              
                                 Použije se kapitola C.10 A, odstavce 31 až 32.
                              
                           POSTUP
                     
                        Příprava inokula
                     
                     
                                 21.
                              
                              
                                 Použije se pouze kapitola C.10 A, odstavec 34 – užití aktivovaného kalu (přibližně 2,5 g/l).
                              
                           
                        Počet zkušebních zařízení
                     
                     
                                 22.
                              
                              
                                 Pro jednoduchou zkoušku, tzn. k měření procenta úbytku, je zapotřebí pouze jedna hodnota doby zdržení kalu, avšak za účelem získání údajů potřebných pro výpočet předběžných kinetických konstant je potřeba 4 nebo 5 hodnot doby zdržení kalu. Obvykle se volí hodnoty mezi 2 a 10 dny. V praxi je vhodné provádět zkoušku zároveň za stejné teploty při čtyřech nebo pěti různých dobách zdržení kalu; při rozšířených studiích se užijí stejné hodnoty SRT, případně jiný rozsah hodnot, při jiných teplotách v rozsahu 5 až 20 °C. U primárního biologického rozkladu (hlavní využití) je vyžadována zpravidla pouze jedna jednotka na každou sérii podmínek. Pro úplnou biologickou rozložitelnost je však pro každou sérii podmínek zapotřebí kontrolní model, do kterého je vpouštěna odpadní voda, ale nikoli zkoušená chemická látka. Vychází-li se z toho, že v použité odpadní vodě je přítomna zkoušená chemická látka, bylo by při posuzování primárního biologického rozkladu nutné použít kontrolní zařízení a provést nezbytnou korekci výpočtů.
                              
                           
                        Dávkování organického média a zkoušené chemické látky
                     
                     
                                 23.
                              
                              
                                 Použije se kapitola C.10 A, odstavce 36 až 39, ale je nutné upozornit na to, že roztok zkoušené chemické látky je dávkován samostatně a že jsou užívány různé rychlosti odtahování kalu. Průtok přítoku, odtoku a odtah kalu se pravidelně sleduje, např. dvakrát denně, a pokud je to nutné, upravuje se v intervalu ±10 %. Pokud vzniknou u analytických metod problémy při použití splaškové odpadní vody, provede se zkouška se syntetickou odpadní vodou, ale je třeba zajistit, aby z různých médií vycházela srovnatelná kinetická data.
                              
                           
                        Nakládání s jednotkami na aktivovaný kal
                     
                     
                                 24.
                              
                              
                                 Použije se kapitola C.10 A, odstavce 40 až 43, ale doba zdržení kalu v kontrolním modelu pouze z hlediska „nepřetržitého“ odtahu kalu.
                              
                           
                        Odběr vzorků a analýza
                     
                     
                                 25.
                              
                              
                                 Použije se kapitola C.10 A, odstavce 44 až 50 s tou výjimkou, že musí být stanovena koncentrace zkoušené chemické látky, zatímco DOC může být stanoven volitelně; CHSK by se užívat neměl.
                              
                           ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ
                     
                        Zpracování výsledků
                     
                     
                                 26.
                              
                              
                                 Použije se kapitola C.10 A, odstavce 52 až 54.
                              
                           
                        Vyjadřování výsledků zkoušky
                     
                     
                                 27.
                              
                              
                                 Použije se kapitola C.10 A, odstavce 56 až 62.
                              
                           
                        Výpočet kinetických konstant
                     
                     
                                 28.
                              
                              
                                 Je realističtější uvádět průměrnou koncentraci zkoušené chemické látky v odtoku získanou po dosažení ustáleného stavu a popsat, jak se mění podle provozních podmínek čistírny, než uvádět procentuální primární biologický rozklad. To lze provést posouzením rovnice (6) v dodatku 6.2, z níž mohou vyplynout hodnoty KS, μm a θSC – kritická doba zdržení kalu.
                                 (Případně lze získat přibližné hodnoty KS a μm pomocí jednoduchého počítačového programu v souladu s teoretickou křivkou vypočtenou podle rovnice 2 (dodatek 6.2) na základě získaných experimentálních hodnot. I když žádný daný roztok nebude jedinečný, lze získat přiměřenou aproximaci KS a μm.)
                              
                           
                        Variabilita výsledků
                     
                     
                                 29.
                              
                              
                                 Je obecně známo, že získané hodnoty kinetických parametrů pro jednotlivé chemické látky jsou variabilní. Má se za to, že podmínky, za nichž byl kal vypěstován, jakož i podmínky převládající v použité zkoušce (stejně jako v odstavci 5 a v jiných zkouškách), mají velký vliv na výsledné hodnoty. Jedním aspektem této variability se zabýval Grady se svými spolupracovníky (4), který se domníval, že by se pro dvě extrémní podmínky představující hranice fyziologického stavu, jehož může kultura dosáhnout při kinetickém experimentu, měly užívat pojmy „existující“ a „podstatné“. Pokud se tento stav nesmí v průběhu zkoušky měnit, odrážejí hodnoty kinetických parametrů podmínky v prostředí, ze kterého byly mikroorganismy odebrány; tyto hodnoty se nazývají „existující“ nebo aktuálně existující. Na druhé straně, pokud podmínky zkoušky umožňují plný rozvoj systému syntetizujícího proteiny, který umožňuje maximální možnou míru růstu, nazývají se získané kinetické parametry „podstatnými“ a jsou závislé pouze na povaze substrátu a na druzích bakterií v kultuře. Jako vodítko může posloužit fakt, že existující hodnoty se získají udržováním nízkého poměru koncentrace substrátu a příslušných mikroorganismů (So/Xo), např. 0,025, a podstatné hodnoty vznikají, když je tento poměr vysoký, např. alespoň 20. V obou případech by se tedy hodnota So měla rovnat příslušné hodnotě Ks, polosaturační konstantě, nebo ji převyšovat.
                              
                           
                                 30.
                              
                              
                                 Variabilita a další aspekty kinetiky biologického rozkladu byly projednávány na nedávném workshopu SETAC (5). Z těchto vykazovaných a plánovaných studií by měl vyplynout jasnější pohled na kinetiku působící v čistírnách odpadních vod, který umožní lepší interpretaci stávajících údajů a návrh více relevantních podob budoucích zkušebních metod.
                              
                           
                        LITERATURA:
                     
                     
                                 1)
                              
                              
                                 Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol Deterg.: 33–48.
                              
                           
                                 2)
                              
                              
                                 Birch RR (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 340–343.
                              
                           
                                 3)
                              
                              
                                 Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411–422.
                              
                           
                                 4)
                              
                              
                                 Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic parameter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. Wat. Res., 30 (3): 742–748.
                              
                           
                                 5)
                              
                              
                                 Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4–6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
                              
                           
                  
                     Dodatek 6.1
                     
                        Porézní nádoba s kontrolou doby zdržení kalu
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatek 6.2
                     
                        Výpočet kinetických konstant
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Za předpokladu platnosti kinetiky dle Monoda a s přihlédnutím k hmotnostní bilanci aktivní sušiny kalu a substrátu v aktivačním systému (1) lze vyjádřit ustálený stav následujícími rovnicemi:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [1]
                                          
                                       nebo
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [2]
                                          
                                       kde:
                                 
                                             S1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentrace substrátu v odtoku (v mg/l)
                                          
                                       
                                             KS
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             půlrychlostní (saturační) konstanta, koncentrace, při které μ = μm/2 (mg/l)
                                          
                                       
                                             μ
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             specifická rychlost růstu (d–1)
                                          
                                       
                                             μm
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             maximální hodnota μm(d–1)
                                          
                                       
                                             Kd
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             specifická rozkladná konstanta aktivní sušiny kalu (d–1)
                                          
                                       
                                             θS
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             střední doba zdržení kalu, SRT (d)
                                          
                                       Přezkoumání této rovnice vede k následujícím závěrům:
                                 
                                             i)
                                          
                                          
                                             Koncentrace zkoušené chemické látky v odtoku nezávisí na koncentraci zkoušené chemické látky S0 v přítoku; z tohoto důvodu procento biologického rozkladu kolísá podle koncentrace zkoušené chemické látky S0 v přítoku.
                                          
                                       
                                             ii)
                                          
                                          
                                             Jediným technologickým parametrem ovlivňujícím hodnotu S1 je doba zdržení kalu θS.
                                          
                                       
                                             iii)
                                          
                                          
                                             Pro danou koncentraci zkoušené chemické látky S0 v přítoku existuje kritická doba zdržení kalu, která je popsána rovnicí:
                                             
                                                         
                                                            
                                                      
                                                      
                                                         [3]
                                                      
                                                   kde:
                                             θSC= kritická doba zdržení kalu; při nižší době budou příslušné organismy z čistírny vypláchnuty.
                                          
                                       
                                             iv)
                                          
                                          
                                             Vzhledem k tomu, že ostatní parametry v rovnici 2) jsou spojeny s kinetikou růstu, bude úroveň substrátu v odtoku pravděpodobně příznivě ovlivněna teplotou a kritické stáří biomasy, tj. doba zdržení kalu potřebná k dosažení určitého stupně rozkladu, se bude s poklesem teploty zvyšovat.
                                          
                                       
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Z hmotnostní bilance sušiny kalu v modelu s porézní nádobou a za předpokladu nízké koncentrace sušiny kalu X2 v odtoku z modelu v porovnání ke koncentraci sušiny kalu X1 v aerační nádrži je doba zdržení kalu
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [4]
                                          
                                       a
                                 
                                    
                                 kde:
                                 
                                             V
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             objem aerační nádrže v litrech
                                          
                                       
                                             X1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentrace sušiny kalu v aerační nádrži v mg/l
                                          
                                       
                                             X2
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentrace sušiny kalu v odtoku v mg/l
                                          
                                       
                                             Q0
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             průtok přítoku v litrech za den
                                          
                                       
                                             Q1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             průtok přebytečného kalu v litrech za den.
                                          
                                       Takže dobu zdržení kalu je možné řídit přednastaveným průtokem přebytečného kalu Q1.
                                 Závěry:
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Hlavním účelem této zkoušky je tedy předpovědět koncentraci zkoušené chemické látky v odtoku, a tudíž i v recipientu.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Kritickou dobu zdržení kalu θSC lze někdy snadno vyhodnotit vynesením S1 v závislosti na θS, například v křivce 3 na obrázku 1. Pokud tento způsob není možný, lze θSC vypočítat spolu s přibližnými hodnotami μm a KS vynesením S1 v závislosti na součinu S1•θS.
                                 Úpravou rovnice (1) se získá rovnice:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [5]
                                          
                                       Pokud je hodnota Kd nízká, potom výraz 1 + θs • Kd ~ 1 a rovnice [5] se zjednoduší na rovnici:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [6]
                                          
                                       Vynesením do grafu se získá přímka (viz obrázek 2) se směrnicí 1/μm a úsekem KS/μm. Přibližně platí rovněž θS ~1/μm.
                                 
                                    Obrázek 1
                                 
                                 
                                    Tři teploty; pět dob zdržení kalu
                                 
                                 
                                    
                                 
                                    Obrázek 2
                                 
                                 
                                    Regresní přímka doby zdržení kalu S1 jako funkce S1 (T = 5 °C)
                                 
                                 
                                    
                                 
                                    Slovníček:
                                 
                                 Koncentrace v odtoku:
                                 Křivka:
                              
                           
                  
                     Dodatek 7
                     ZKOUŠKA PŘI NÍZKÉM ROZMEZÍ KONCENTRACÍ (μg/l)
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Mnohé chemické látky jsou obvykle přítomny ve vodním prostředí, a to i v odpadních vodách, ve velmi nízkých koncentracích (μg/l). V takových koncentracích pravděpodobně neslouží jako primární substráty zajišťující růst, ale spíše se rozkládají jako „nerůstové“ sekundární substráty souběžně s různými přirozeně se vyskytujícími uhlíkatými látkami. V důsledku toho nelze pro rozklad těchto látek použít model popsaný v dodatku 6. Lze uplatnit celou řadu modelů a za podmínek převažujících v systémech čištění odpadních vod může současně fungovat více těchto modelů. K objasnění tohoto problému bude zapotřebí dalšího rozsáhlého výzkumu.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Do té doby se lze řídit postupem uvedeným v hlavním textu (kapitola C.10), avšak pouze pro primární biologickou rozložitelnost pomocí vhodně nízkých koncentrací (< 100 μg/l) a validovaných analytických postupů. Procento biologického rozkladu lze vypočítat (viz odst. 54 zkušební metody) za předpokladu, že jsou zohledněny abiotické procesy (adsorpce, těkavost atd.). Příkladem je studie Nyholma a spolupracovníků (1, 2), která užívá čtyřhodinový cyklus v systému plnění a odběru. Uvedli konstanty pseudoprvního řádu u 5 chemických látek přidávaných do syntetické odpadní vody v koncentraci 5 až 100 0 μg/l. (Pro úplnou biologickou rozložitelnost lze použít zkoušené chemické látky značené izotopem 14C. Popis tohoto postupu přesahuje rámec této zkušební metody, protože dosud neexistují dohodnuté postupy, přestože metoda navrhovaná pro ISO 14592 (3) obsahuje návod na používání látek značených izotopem 14C.
                              
                           
                        Zkouška SCAS
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Později byla navržena jednodušší dvoustupňová zkouška; (4, 5, 6); po semikontinuální metodě s aktivovaným kalem (SCAS) jsou provedeny krátkodobé kinetické zkoušky vzorků odebraných z modelů SCAS. Systém SCAS pracuje se známými objemy odtahování kalu (na rozdíl od původní zkušební metody C.12) a přidává se do něj modifikovaná syntetická odpadní voda dle OECD nebo splašková odpadní voda. Syntetická odpadní voda byla upravena (z důvodu změny hodnoty pH a nízké schopnosti usazování kalů) přídavkem fosfátu jako pufru, kvasnicového extraktu, chloridu železitého a solí stopových prvků a její CHSK byla zvýšena přibližně na 750 mg/l zvýšením koncentrace peptonu a masového extraktu. Zařízení byla provozována ve 24hodinovém cyklu: provzdušňování po dobu 23 hodin, odtah kalu, vypuštění supernatantu (z odtoku) s následným přídavkem syntetické odpadní vody a zkoušené chemické látky, a to až do 100 μg/l, (tj. ve zhruba stejné koncentraci jako při krátkodobé zkoušce). Jednou týdně bylo 10 % celkového kalu nahrazeno čerstvým kalem za účelem udržení rovnováhy mikrobiální populace.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Změří se koncentrace zkoušené chemické látky na začátku a ke konci provzdušňování a zkouška se provádí až do dosažení konstantního odstranění zkoušené chemické látky, což trvá od jednoho týdne do několika měsíců.
                              
                           
                        Krátkodobá zkouška
                     
                     
                                 5.
                              
                              
                                 Krátkodobá zkouška (např. 8 hodin) se používá k určení kinetické rychlostní konstanty (pseudo) prvního řádu rozkladu zkoušené chemické látky v aktivovaném kalu známého, ale různého původu a historie. Vzorky kalů se v průběhu aklimatizačního experimentu (odstavce 3, 4) odebírají zejména z reaktorů SCAS na konci provzdušňovacího období, kdy je koncentrace organického substrátu nízká. Kal může být pro srovnání odebrán také z paralelního modelu SCAS, který nebyl vystaven zkoušené látce. Směsi kalu a zkoušené chemické látky přidané ve dvou nebo více koncentracích v rozsahu 1–50 μg/l se provzdušní bez přídavku syntetické odpadní vody nebo jiného organického substrátu. Zkoušené chemické látky zbývající v roztoku se stanovují v pravidelných intervalech, např. každou hodinu v závislosti na rozložitelnosti dané chemické látky, ne však déle než po dobu 24 hodin. Vzorky se před provedením příslušné analýzy odstředí.
                              
                           
                        Výpočty
                     
                     
                                 6.
                              
                              
                                 Údaje z modelů SCAS se užívají pro výpočet procenta úbytku zkoušené chemické látky (odstavec 54). Je rovněž možné vypočítat průměrnou rychlostní konstantu K1 (normalizovanou na koncentraci nerozpuštěných látek) podle vzorce:
                                 
                                    
                                 kde:
                                 
                                             t
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             doba provzdušňování (23 h),
                                          
                                       
                                             Ce
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentrace na konci provzdušňovacího období v μg/l,
                                          
                                       
                                             Ci
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentrace na počátku provzdušňování v μg/l,
                                          
                                       
                                             SS
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentrace tuhých látek v aktivovaném kalu v g/l).
                                          
                                       
                           
                                 7.
                              
                              
                                 V krátkodobé zkoušce se do grafu vynese zbývající koncentrace log % v závislosti na čase a sklon počáteční části křivky (10–50 % rozklad) odpovídá K1, konstantě (pseudo) prvního řádu. Tato konstanta se normalizuje s ohledem na koncentraci sušiny kalu tak, že se sklon křivky vydělí koncentrací sušiny kalu. Uvedený výsledek musí rovněž obsahovat podrobnosti o počátečních koncentracích zkoušené chemické látky a nerozpuštěných látek, době zdržení kalu, množství a zdroji zapravovaného kalu a podrobnosti případné adaptace za přítomnosti zkoušené látky.
                              
                           
                        Variabilita výsledků
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Variabilita a další aspekty kinetiky biologického rozkladu byly projednávány na nedávném workshopu SETAC (7). Z těchto vykazovaných a plánovaných studií by měl vyplynout jasnější pohled na kinetiku působící v čistírnách odpadních vod, který umožní lepší interpretaci stávajících údajů a navržení více relevantních podob budoucích zkušebních metod.
                              
                           
                        LITERATURA:
                     
                     
                                 1)
                              
                              
                                 Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and Schultz B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339–353.
                              
                           
                                 2)
                              
                              
                                 Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993). Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505–1510.
                              
                           
                                 3)
                              
                              
                                 ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Water Quality - Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations in water.
                              
                           
                                 4)
                              
                              
                                 Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996). Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851–864.
                              
                           
                                 5)
                              
                              
                                 Berg UT and Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in semi-continuous activated sludge reactors with low (μg/l range) and standard (ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711–735.
                              
                           
                                 6)
                              
                              
                                 Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegradability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen.
                              
                           
                                 7)
                              
                              
                                 Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, SG. Feitjel, T. King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4-6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
                              
                           
                  
                     C.10-B:   Biofilmy
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Simulační zkoušky se zpravidla užívají u látek, které nevyhověly screeningové zkoušce na snadnou biologickou rozložitelnost (kapitola C.4 A až F této přílohy (9)), ale vyhověly zkoušce biologické rozložitelnosti. Výjimečně se simulační zkoušky použijí také pro chemické látky, o kterých je potřeba zjistit více informací, zejména pro velkotonážní chemické látky, a zpravidla se použije zkouška s aktivovaným kalem (C.10 A). V některých případech je však nutné získat specifické informace týkající se chování chemické látky při metodách čištění odpadních vod využívajících biofilmy; konkrétně se jedná o biologické perkolační nebo skrápěné filtry, rotační ponořené filtry a reaktory se vznášeným ložem. Pro splnění této potřeby byla vyvinuta různá zařízení.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Gerike a spolupracovníci (1) používali velké pilotní skrápěné filtry v režimu spřažení. Tyto filtry zabíraly mnoho místa a vyžadovaly relativně velké objemy odpadní vody nebo syntetické odpadní vody. Truesdale a spolupracovníci (2) popsali menší filtry (o průměru 6 stop × 6 palců), ve kterých se používala přírodní odpadní voda bez příměsi povrchově aktivních látek, avšak i ty vyžadovaly relativně velké objemy. K vytvoření „zralého“ biofilmu bylo zapotřebí až 14 týdnů a aklimatizace proběhla až po dalších 4–8 týdnech po prvním zavedení zkušební povrchově aktivní látky.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Baumann a spolupracovníci (3) vyvinuli mnohem menší filtr, který používal polyesterové „rouno“ předem namočené v aktivovaném kalu jako inertní médium na podporu růstu biofilmu. Zkoušená chemická látka byla užita jako jediný zdroj uhlíku a biologická rozložitelnost byla hodnocena na základě měření rozpuštěného organického uhlíku (DOC) v přítoku a odtoku a množství CO2 ve výstupním plynu.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Zcela jiný přístup použili Gloyna a spolupracovníci (4) kteří vynalezli rotační trubkový reaktor. Na vnitřním povrchu otáčející se trubky se vytvořil biofilm na známé ploše povrchu působením přítoku zavedeného do horního konce trubky skloněné pod malým úhlem k vodorovné rovině. Tento reaktor byl použit ke studiu biologické rozložitelnosti povrchově aktivních látek (5) i ke zkoumání optimální tloušťky biofilmu a difuze filmem (6). Uvedení posledně jmenovaní autoři tento reaktor dále vyvíjeli, včetně úpravy umožňující stanovit CO2 ve výstupním plynu.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Rotační trubkový reaktor byl přijat stálým výborem analytiků (Standing Committee of Analysts) (UK) jako standardní metoda stanovení jak biologické rozložitelnosti chemických látek (7), tak upravitelnosti a toxicity odpadních vod (8). Zde popsaná metoda je výhodná pro svou jednoduchost, kompaktnost, reprodukovatelnost a potřebu relativně malých objemů organického média.
                           
                        PODSTATA ZKOUŠKY
                  
                              6.
                           
                           
                              Syntetická odpadní voda nebo splašková odpadní voda a zkoušená chemická látka se ve směsi nebo samostatně aplikují na vnitřní povrch pomalu rotující šikmé trubky. Na tomto vnitřním povrchu se vytvoří vrstva mikroorganismů podobných mikroorganismům, které se vyskytují na médiích biologického filtru. Podmínky pro provoz reaktoru jsou zvoleny tak, aby umožňovaly odpovídající odstranění organických látek a v případě potřeby i oxidaci amonia.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Odpadní vody z trubky se shromažďují a před analýzou na rozpuštěný organický uhlík (DOC) a/nebo zkoušenou látku prostřednictvím specifické metody se buď usazují, a/nebo filtrují. Paralelně se za stejných podmínek provozují kontrolní zařízení bez zkoušené chemické látky za účelem srovnání. Předpokládá se, že rozdíl mezi koncentrací DOC nebo CHSK v odtoku ze zkušebního a kontrolního modelu pochází ze zkoušené chemické látky nebo jejích organických metabolitů. Tento rozdíl se porovná s koncentrací přidané zkoušené chemické látky (jako DOC) s cílem vypočítat odstranění zkoušené chemické látky.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Biologický rozklad lze zpravidla rozpoznat podle biologické adsorpce pečlivým prozkoumáním časové křivky odstranění. Potvrzení lze obvykle získat pomocí zkoušky snadné rozložitelnosti (spotřeba kyslíku nebo produkce oxidu uhličitého) s použitím aklimatizovaného inokula odebraného na konci zkoušky z reaktorů, do nichž je vpouštěna zkoušená chemická látka.
                           
                        INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE
                  
                              9.
                           
                           
                              Pro správnou interpretaci výsledků by měla být známa čistota zkoušené chemické látky, její rozpustnost ve vodě, těkavost a adsorpční vlastnosti.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              U těkavých a těžko rozpustných chemických látek nelze zpravidla zkoušku provést, pokud nebudou přijata zvláštní opatření (viz dodatek 5 ke kapitole C.10 A). Pro výpočet teoretických hodnot a/nebo ověření naměřených hodnot parametrů, např. teoretické spotřeby kyslíku (TSK) nebo (DOC), je rovněž nutno znát chemickou strukturu nebo alespoň empirický vzorec.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Pro volbu vhodných zkušebních koncentrací mohou být velmi užitečné informace o toxicitě zkoušené chemické látky vůči mikroorganismům (viz dodatek 4 ke kapitole C.10 A); tyto informace mohou být důležité pro správnou interpretaci nízkých hodnot biologického rozkladu.
                           
                        HODNOTY, PŘI NICHŽ VÝROBEK VYHOVUJE
                  
                              12.
                           
                           
                              Původně musel primární biologický rozklad povrchově aktivních látek před uvedením chemické látky na trh dosáhnout 80 % nebo více. Pokud není dosaženo hodnoty 80 %, lze použít tuto simulační (potvrzující) zkoušku a danou povrchově aktivní látku uvést na trh pouze za předpokladu odstranění více než 90 % dané chemické látky. Obecně se chemické látky neposuzují z hlediska vyhověla/nevyhověla a při přibližných výpočtech pravděpodobné koncentrace v životním prostředí, které se užívají při posuzování rizik plynoucích z chemických látek, lze použít získané hodnoty procenta úbytku. V řadě studií čistých chemických látek bylo zjištěno procento úbytku DOC > 90 % u více než tří čtvrtin a > 80 % u více než 90 % chemických látek, které nevykazují žádný významný stupeň biologické rozložitelnosti.
                           
                        REFERENČNÍ CHEMICKÉ LÁTKY
                  
                              13.
                           
                           
                              Aby bylo zajištěno správné provedení experimentálního postupu, je vhodné provádět občasné zkoušky látek, jejichž chování je známé. Tyto chemické látky zahrnují kyselinu adipovou, 2-fenyl fenol, 1-naftol, kyselinu difenovou a 1-naftoovou kyselinu.
                           
                        REPRODUKOVATELNOST VÝSLEDKŮ ZKOUŠKY
                  
                              14.
                           
                           
                              Laboratoř v UK zjistila, že relativní směrodatná odchylka v rámci zkoušek činí 3,5 % a mezi jednotlivými testy 5 % (7).
                           
                        POPIS METODY
                  
                     Přístroje a pomůcky
                  
                  
                     Rotační trubkové reaktory
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Zařízení (viz obr. 1 a 2 v dodatku 8) se skládá ze svazku akrylových trubek o délce 30,5 cm a vnitřním průměru 5 cm; trubky spočívají na kolech s gumovými pneumatikami zasazených do kovového nosného rámu. Každá trubka má vnější výčnělek o hloubce přibližně 0,5 cm, který ji drží na kolech; její vnitřní povrch je zdrsněn hrubou drátěnkou a na horním (přítočném) konci má 0,5 cm hluboký vnitřní výčnělek, který umožňuje udržení kapaliny. Trubky jsou skloněny pod úhlem přibližně jednoho stupně k vodorovné rovině, aby bylo dosaženo požadované doby kontaktu při aplikaci zkušebního média do čisté trubky. Kola opatřená gumovými pneumatikami se otáčejí pomocí pomalého motoru s proměnnými otáčkami. Teplota trubek je řízena instalací do místnosti s konstantní teplotou.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Uzavřením každého trubkového reaktoru do poněkud větší zkrácené trubky a zajištěním plynotěsnosti spojů lze plynný CO2 na výstupu sbírat do zásaditého roztoku za účelem následného měření (6).
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              V zásobníku o objemu 20 l (A) (viz obrázek 2) je uložena 24hodinová zásoba organického média pro každou trubku, případně s přidáním zkoušené chemické látky. Pokud je to nutné, lze roztok zkoušené chemické látky dávkovat odděleně. V dolní části každého zásobníku je výstup, který je připojen pomocí vhodného potrubí, např. ze silikonového kaučuku, přes peristaltické čerpadlo (B) ke skleněné nebo akrylové výstupní trubici, která v délce 2–4 cm ústí do vyššího (přítočného) konce nakloněné trubky (C). Odtok se nechá odkapat ze spodního konce nakloněné trubky a je shromažďován v jiném zásobníku (D). Odtok se před analýzou usazuje nebo filtruje.
                           
                        
                     Filtrační zařízení – odstředivka
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Přístroj pro membránovou filtraci s filtry vhodné velikosti pórů (jmenovitý průměr pórů 0,45 μm), které co nejméně adsorbují organické chemické látky nebo uvolňují organický uhlík. Pokud použité filtry uvolňují organický uhlík, promyjí se pečlivě horkou vodou, aby byl odstraněn vyluhovatelný organický uhlík. Lze použít rovněž odstředivku vhodnou pro odstřeďování při odstředivém zrychlení 40 000 m/s2.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Analyzátor pro stanovení:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          DOC/celkového organického uhlíku (TOC) nebo chemické spotřeby kyslíku (CHSK),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          podle potřeby specifické chemické analýzy (HPLC, GC atd.),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pH, teploty, kyselosti, zásaditosti,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          jestliže systém pracuje s nitrifikací, pak vybavení pro stanovení amoniakálního, dusitanového a dusičnanového dusíku.
                                       
                                    
                        
                     Voda
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Vodovodní voda s koncentrací DOC menší než 3 mg/l.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Destilovaná nebo deionizovaná voda s koncentrací DOC menší než 2 mg/l.
                           
                        
                     Organické médium
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Jako organické médium je přípustná syntetická odpadní voda, splašková odpadní voda nebo jejich směs. Bylo prokázáno, že použití samotné splaškové odpadní vody často vede k většímu procentu odstranění DOC (v zařízeních s aktivovaným kalem), a dokonce umožňuje odstranění některých chemických látek, které se při užití syntetické odpadní vody dle OECD biologicky nerozloží. Proto se doporučuje použití splaškové odpadní vody. Koncentrace DOC (nebo CHSK) se stanovuje v každé nové šarži organického média. Měla by být známa kyselost nebo zásaditost organického média. Organické médium může vyžadovat přidání vhodného pufru (hydrogenuhličitan sodný nebo dihydrogenfosforečnan draselný) v případě, že má nízkou kyselost nebo zásaditost, s cílem udržet pH v reaktoru v průběhu zkoušky na hodnotě přibližně 7,5 ± 0,5. V každém jednotlivém případě je nutno rozhodnout o množství pufru, které má být přidáno, a době jeho přidání.
                           
                        
                     Syntetická odpadní voda
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              V 1 litru vodovodní vody se rozpustí 160 mg peptonu, 110 mg masového výtažku, 30 mg močoviny, 28 mg bezvodého hydrogenfosforečnanu draselného (K2HPO4), 7 mg chloridu sodného (NaCl), 4 mg dihydrátu chloridu vápenatého (CaCl2.2H2O) a 2 mg heptahydrátu síranu hořečnatého (MgSO4.7H2O). Tato syntetická odpadní voda (OECD médium) je modelovým příkladem a vykazuje průměrnou koncentraci DOC v přítoku přibližně 100 mg/l. Další možností je použít jiná složení o přibližně stejné koncentraci DOC, která se více blíží skutečnému složení odpadní vody. Tuto syntetickou odpadní vodu lze připravit v destilované vodě v koncentrované podobě a uchovávat při teplotě asi 1 °C po dobu až jednoho týdne. V případě potřeby lze zředit vodovodní vodou. (Toto médium je nevyhovující, např. koncentrace dusíku je velmi vysoká, obsah uhlíku je relativně nízký, avšak nebyla navržena žádná lepší varianta kromě přidání dalšího fosfátu jako pufru a více peptonu).
                           
                        
                     Splašková odpadní voda
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Použije se čerstvá usazená odpadní voda odebíraná každý den z čistírny, která zpracovává převážně splaškové domovní odpadní vody. Odebírá se primární sedimentací z přepadu čistírny nebo z přítoku do čistírny pracující s aktivovaným kalem a musí z ní být z větší části odstraněny hrubé částice. Odpadní voda může být uchovávána po několik dní přibližně při 4 °C, pokud se prokáže, že hodnota DOC (nebo CHSK) se během uchovávání výrazně nesníží (tj. o více než 20 %). K zamezení poruchového provozu systému se před použitím upraví DOC (nebo CHSK) u každé nové šarže na příslušnou stálou koncentraci, např. zředěním vodovodní vodou.
                           
                        
                     Mazivo
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Na mazání válečků peristaltických čerpadel lze použít glycerol nebo olivový olej; obojí je vhodné pro použití na potrubí ze silikonové pryže.
                           
                        
                     Zásobní roztoky zkoušené chemické látky
                  
                  
                              26.
                           
                           
                              U chemických látek s dostatečnou rozpustností se připraví zásobní roztok zkoušené chemické látky vhodné koncentrace (např. 1 až 5 g/l) v deionizované vodě nebo v minerální složce syntetické odpadní vody. U nerozpustných látek viz dodatek 5 v kapitole C.10-A. Tato metoda není vhodná pro těkavé chemické látky bez úpravy trubkových reaktorů (odstavec 16). V zásobním roztoku se stanoví DOC a TOC a měření se u každé nové šarže zopakuje. Jestliže je rozdíl mezi DOC a TOC větší než 20 %, ověří se rozpustnost zkoušené chemické látky ve vodě. DOC nebo koncentrace zkoušené chemické látky stanovená v zásobním roztoku specifickou analýzou se porovná se jmenovitou hodnotou, aby se zjistilo, zda analytická výtěžnost je dostatečná (obvykle lze očekávat > 90 %). Zhodnotí se, zvláště u disperzí, zda DOC může být použit jako analytický ukazatel nebo zda lze použít jen analytickou techniku specifickou pro danou zkoušenou chemickou látku. Vzorky s disperzí je nutné odstředit. V každé nové šarži se stanoví hodnoty DOC, CHSK nebo zkoušené chemické látky pomocí specifické analýzy.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              V zásobním roztoku se stanoví hodnota pH. Extrémní hodnoty indikují, že přidání chemické látky může ovlivňovat hodnotu pH aktivovaného kalu ve zkušebním systému. V takovém případě se zásobní roztok neutralizuje na hodnotu pH 7 ± 0,5 malým objemem anorganické kyseliny nebo zásady. Nesmí však dojít k vysrážení zkoušené látky.
                           
                        POSTUP
                  
                     Příprava organického média pro dávkování
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Je nutné zajistit důkladné vyčištění sběrných nádob na přítok a na odtok a trubek vedoucích z nádob na přítok a do nádob na odtok, aby se zabránilo růstu mikroorganismů na počátku zkoušky i v celém jejím průběhu
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Syntetická odpadní voda (bod 23) se připravuje každý den čerstvá buď ze sušiny kalu, nebo z koncentrovaného zásobního roztoku odpovídajícím zředěním vodovodní vodou. Požadované množství se odměří ve válci a přidá se do čisté nádoby na přítok. V případě potřeby se do syntetické odpadní vody před zředěním rovněž přidá požadované množství zásobního roztoku zkoušené chemické látky nebo referenční chemické látky. Pokud je to výhodnější nebo nutné, aby se zabránilo ztrátám zkoušené chemické látky, připraví se odděleně zředěný roztok zkoušené chemické látky v oddělené nádrži a přidá se do nakloněných trubek prostřednictvím jiného dávkovacího čerpadla.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Lze rovněž (a přednostně) použít usazenou splaškovou odpadní vodu (odstavec 24), která je získávána čerstvě, pokud možno každý den.
                           
                        
                     Provoz rotačních trubkových reaktorů
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Pro posouzení jedné zkoušené chemické látky jsou zapotřebí dva identické trubkové reaktory, které se sestaví v místnosti s konstantní teplotou, zpravidla 22 ± 2 °C.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Peristaltická čerpadla se upraví tak, aby dávkovala do nakloněných trubek, které se otáčejí rychlostí 18 ± 2 ot/min, 250 ± 25 ml/h organického média (bez zkoušené chemické látky). Na trubky čerpadel se na počátku nanese mazivo (bod 25) a v průběhu zkoušky se bude pravidelně nanášet dále s cílem zajistit řádné fungování a delší životnost trubek.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Úhel sklonu trubek se nastaví vzhledem k horizontální rovině tak, aby se zajistila doba zdržení 125 ± 12,5 s přívodu v čisté trubce. Retenční čas se odhadne přidáním nebiologického markeru (např. NaCl, inertní barvivo) do přiváděného média; za průměrnou dobu zdržení se považuje čas potřebný k dosažení maximální koncentrace v odtoku (je-li dosaženo maximální tloušťky filmu, může se retenční čas zvýšit až na přibližně 30 min.).
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Bylo zjištěno, že při tomto průtoku, rychlosti a čase dochází k adekvátnímu odstranění (> 80 %) DOC (nebo CHSK) a vzniku nitrifikovaného odtoku. Pokud je odstranění nedostatečné nebo v případě, že je třeba simulovat výkon konkrétní čistírny odpadních vod, bude zapotřebí průtok změnit. Ve druhém z těchto případů je třeba upravit rychlost dávkování organického média, dokud výkon reaktoru nedosáhne stejného výkonu jako čistírna odpadních vod.
                           
                        
                     Inokulace
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Při použití syntetické odpadní vody může být pro zahájení růstu mikroorganismů dostatečná inokulace vzdušnou cestou, v jiných případech se však do přiváděného média po dobu 3 dnů přidává 1 ml/l odsazené odpadní vody.
                           
                        
                     Měření
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              V pravidelných intervalech se kontroluje, zda se rychlost dávkování a rychlost rotace pohybují v požadovaných mezích. Měří se rovněž pH v odtoku, a to zejména tehdy, pokud se předpokládá nitrifikace.
                           
                        
                     Odběr vzorků a analýza
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Způsob, vzor a četnost odběru vzorků jsou vybrány tak, aby vyhovovaly účelu zkoušky. Odeberou se například jednorázové (nebo prosté) vzorky přítoku a odtoku, nebo se vzorky shromažďují po delší dobu, např. 3–6 hodin. V prvním období bez zkoušené chemické látky se odběr vzorků provádí dvakrát týdně. Vzorky se filtrují přes membrány nebo pomocí odstředivky při odstředivém zrychlení přibližně 40 000 m/s2 přibližně 15 min. (odstavec 18). Před membránovou filtrací může být nutné nechat vzorky usadit a/nebo je přefiltrovat přes hrubý filtr. Provedou se nejméně dvě souběžná stanovení DOC (nebo CHSK) a v případě potřeby i BSK, amoniakálního a dusičnanového/dusitanového dusíku.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Všechny analýzy by měly být provedeny co nejdříve po odběru a přípravě vzorků. Je-li třeba analýzy odložit, musí být vzorky uchovávány přibližně při 4 °C v temnu, ve zcela naplněných a dobře uzavřených lahvičkách. Je-li zapotřebí uchovat vzorky déle než 48 h, konzervují se zmrazením, okyselením nebo přidáním vhodné toxické chemické látky (např. přídavkem 20 ml/l roztoku chloridu rtuťnatého koncentrace 10 g/l). Ověří se, zda použitý způsob konzervace neovlivní výsledky analýzy.
                           
                        
                     Rozběhová fáze
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              V této fázi povrchový biofilm roste za účelem dosažení optimální tloušťky; tato fáze trvá obvykle asi 2 týdny, avšak neměla by být delší než šest týdnů. Odstranění (bod 44), DOC (nebo CHSK) se zvyšuje a dosahuje hodnoty fáze prodlevy. Když bylo dosaženo fáze prodlevy při obdobné hodnotě v obou trubkách, jedna z nich se vybere jako kontrolní po celý zbytek zkoušky, v jejímž průběhu by měla být její účinnost konzistentní.
                           
                        
                     Přidání zkoušené chemické látky
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              V této fázi se zkoušená látka přidá do druhého reaktoru v požadované koncentraci, obvykle 10–20 mg C/l. Do kontrolního reaktoru je i nadále čerpáno pouze organické médium.
                           
                        
                     Období aklimatizace
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              I nadále se dvakrát týdně provádějí analýzy na DOC (nebo CHSK), a pokud je potřeba posoudit primární biologickou rozložitelnost, změří se také koncentrace zkoušené chemické látky specifickou analýzou. Po prvním přídavku zkoušené chemické látky bývá adaptace dosaženo po 1 týdnu až 6 týdnech provozu (za zvláštních podmínek i po delší době). Když procento úbytku (odstavce 43–45), dosáhne maximální hodnoty, získá se 12–15 platných hodnot ve fázi prodlevy po dobu přibližně 3 týdnů za účelem vyhodnocení průměrného procenta úbytku. Zkouška se považuje za ukončenou, jakmile bylo dosaženo dostatečného stupně odstranění. Doba zkoušky po prvním přidání zkoušené chemické látky by obvykle neměla překročit 12 týdnů.
                           
                        
                     Odlučování filmu
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Náhlé odstranění velkého množství přebytečného filmu z trubek neboli odlučování probíhá v relativně pravidelných intervalech. Aby bylo zajištěno, že nebude ovlivněna srovnatelnost výsledků, je třeba při zkoušce nechat proběhnout alespoň dva kompletní cykly růstu a odlučování.
                           
                        ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ
                  
                     Zpracování výsledků
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Stupeň odstranění DOC (nebo CHSK) zkoušené chemické látky v procentech se pro každý časový odhad vypočte podle rovnice:
                              
                                 
                              kde:
                              
                                          Dt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          stupeň odstranění DOC (nebo CHSK) v čase t vyjádřený v procentech,
                                       
                                    
                                          Cs
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          koncentrace DOC (nebo CHSK) zkoušené chemické látky v přítoku, přednostně odhadnutá z koncentrace zásobního roztoku a přidaného objemu zkoušené chemické látky v mg/l,
                                       
                                    
                                          E
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          změřená koncentrace DOC nebo CHSK v odtoku ze zkušebního modelu v mg/l v čase t,
                                       
                                    
                                          Eo
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          změřená koncentrace DOC nebo CHSK v odtoku z kontrolního modelu v mg/l v čase t.
                                       
                                    Výpočet se opakuje pro referenční chemické látky, pokud jsou předmětem zkoušky.
                           
                        
                     Výkon kontrolního reaktoru
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Stupeň (DB) odstranění DOC (nebo CHSK) organického média v kontrolních reaktorech je užitečnou informací k posouzení biodegradační aktivity biofilmu během zkoušky. Stupeň odstranění organického média se vypočte podle rovnice:
                              
                                 
                              kde:
                              Cm= koncentrace DOC nebo CHSK organického média v přítoku do kontrolního modelu v mg/l.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Pokud je měřen stupeň odstranění zkoušené chemické látky (DST) stanovený specifickou analytickou metodou při každém hodnocení v čase, vypočte se podle rovnice:
                              
                                 
                              kde:
                              
                                          Si
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          změřená nebo přednostně odhadnutá koncentrace zkoušené chemické látky v přítoku do zkušebního modelu v mg/l,
                                       
                                    
                                          Se
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          změřená koncentrace zkoušené chemické látky v odtoku ze zkušebního modelu v mg/l v čase t.
                                       
                                    Pokud je na základě této analytické metody stanovena pozitivní hodnota neexponované odpadní vody odpovídající S
                                    c
                                  v mg/l, vypočte se úbytek v procentech (DSC) podle rovnice:
                              
                                 
                           
                        
                     Vyjadřování výsledků zkoušky
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Do grafu se vynese stupeň odstranění D
                                    t
                                  a DST (nebo DSC) vyjádřený v procentech, pokud je k dispozici, v závislosti na čase (viz dodatek 2 v kapitole C.10-A). Vypočte se průměrná hodnota (zaokrouhlená na nejbližší celé číslo) a standardní odchylka 12–15 hodnot pro DT (a pro DST, jsou-li k dispozici) získaných ve fázi prodlevy a vyjádřených stupněm odstranění zkoušené chemické látky v procentech. Z tvaru křivky odstranitelnosti lze vyvodit některé závěry o procesech odstranění.
                           
                        
                     Adsorpce
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Je-li hned na počátku zkoušky pozorován vysoký stupeň odstranění DOC zkoušené chemické látky, je zkoušená látka pravděpodobně odstraňována adsorpcí na biofilmu. To může být ověřitelné určením adsorbované zkoušené chemické látky na sušině odloučené z filmu. Není obvyklé, aby stupeň odstranění DOC zůstával vysoký v celém průběhu zkoušky; vysoký stupeň odstranění je zpravidla pozorován na počátku zkoušky, avšak pak postupně klesá na rovnovážnou hodnotu. Pokud by ale adsorbovaná zkoušená látka byla schopna způsobit aklimatizaci populace mikroorganismů, stupeň odstranění DOC zkoušené chemické látky by následně vzrostl a ve fázi prodlevy dosáhl vysoké hodnoty.
                           
                        
                     Lagová fáze
                  
                  
                              48.
                           
                           
                              Obdobně jako u statických metod i při řadě screeningových zkoušek musí u řady zkoušených chemických látek proběhnout lagová fáze dříve, než dojde k biologickému rozkladu. V lagové fázi dochází k aklimatizaci nebo adaptaci rozkládajících se baktérií, přičemž nedochází téměř k žádnému úbytku zkoušené chemické látky; následně dochází k počátečnímu růstu těchto bakterií. Tato fáze končí a fáze rozkladu konvenčně začíná po úbytku přibližně 10 % počátečního množství zkoušené chemické látky (po započítání případné adsorpce). Lagová fáze je často různě dlouhá a špatně reprodukovatelná.
                           
                        
                     Fáze prodlevy
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Fáze prodlevy křivky odstranitelnosti při kontinuální zkoušce je definována jako fáze, v níž dochází k maximálnímu rozkladu. Tato fáze musí trvat nejméně 3 týdny a musí z ní vzejít přibližně 12–15 změřených platných hodnot.
                           
                        
                     Průměrná hodnota stupně odstranění zkoušené chemické látky
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Průměrná hodnota se vypočte z hodnot odstranění Dt (a Dst, pokud je k dispozici) zkoušené chemické látky během fáze prodlevy. Po zaokrouhlení na nejbližší celé číslo (1 %) získáme stupeň odstranění zkoušené chemické látky. Doporučuje se rovněž vypočítat 95 % konfidenční interval této průměrné hodnoty. Podobným způsobem se vypočte průměrná hodnota stupně (DB) odstranění organického média v kontrolní nádobě.
                           
                        
                     Indikace biologické rozložitelnosti
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Jestliže se zkoušená látka výrazně neadsorbuje na biofilmu a křivka odstranitelnosti vykazuje typický průběh biologického rozkladu s lagovou fází, fází rozkladu a fází prodlevy (odstavce 48, 49), lze bezpečně přisoudit změřené odstranění zkoušené chemické látky jejímu biologickému rozkladu. Dojde-li na počátku zkoušky k velkému odstranění, nemůže tato simulační zkouška rozlišit biologické a abiotické eliminační procesy. V takovém případě a také v jiných případech, kdy jsou pochybnosti o biologické rozložitelnosti (např. jestliže dochází ke stripování), se zjišťuje adsorpce zkoušené chemické látky na vzorcích filmu nebo se provedou další statické (screeningové) zkoušky biologické rozložitelnosti založené na ukazatelích jednoznačně indikujících biologické procesy, jako je metoda stanovení spotřebou kyslíku (kapitola C.4 této přílohy D, E a F) (9) nebo zkouška, která měří produkci CO2 (viz kapitola C.4-C této přílohy nebo metoda Headspace) (10); jako inokulum se použije adaptovaný biofilm z příslušného reaktoru.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Pokud bylo změřeno odstraňování DOC a odstraňování konkrétní chemické látky, signalizují významné procentuální rozdíly (v případě první hodnoty jsou nižší než druhé) v odstranění látek přítomnost organických meziproduktů v odtoku, které mohou být obtížněji rozložitelné; ty je nutno prozkoumat.
                           
                        
                     Platnost výsledků zkoušky
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Zkouška se považuje za platnou, jestliže je v kontrolním modelu stupeň biologického rozkladu (DB) podle DOC (nebo CHSK) po 2 týdnech větší než 80 % a nebyly pozorovány žádné neobvyklé jevy.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Pokud byla předmětem zkoušky snadno biologicky rozložitelná (referenční) látka, měl by být stupeň biologického rozkladu > 90 % a rozdíl mezi duplicitními hodnotami by neměl být větší než 5 %. Pokud nebyla tato dvě kritéria splněna, je třeba přezkoumat experimentální postupy a/nebo získat splaškovou odpadní vodu z jiného zdroje.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Obdobně by se rozdíly mezi hodnotami biologického rozkladu z duplicitních modelů (pokud byly použity) pracujících se zkoušenou chemickou látkou neměly lišit o více než 5 %. Pokud není toto kritérium splněno, ale míra úbytku je vysoká, pokračuje se v analýze po dobu dalších tří týdnů. Pokud je míra úbytku nízká, přezkoumají se inhibiční účinky zkoušené chemické látky, pokud nejsou známy, a zkouška se opakuje s nižší koncentrací zkoušené chemické látky, pokud je to možné.
                           
                        
                     Protokol o zkoušce
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              V protokolu o zkoušce musí být uvedeny tyto údaje:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkoušená látka:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje nutné k identifikaci,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikální povaha a popřípadě fyzikálně-chemické vlastnosti.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkušební podmínky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      jakékoli modifikace zkušebního systému zejména v případě, že jsou zkoušce podrobeny nerozpustné nebo těkavé chemické látky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      typ organického média,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podíl a charakter průmyslových odpadů obsažených v odpadní vodě, jsou-li užívány a jsou-li známy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda inokulace,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      obsah – DOC (rozpuštěného organického uhlíku) a TOC (celkového organického uhlíku) v zásobním roztoku zkoušené chemické látky, způsob přípravy, jedná-li se o suspenzi, použitá (použité) zkušební koncentrace, případné odůvodnění, pokud se obsah DOC pohybuje mimo rozmezí 10–20 mg/l, metoda přidání, datum prvního přidání, veškeré změny koncentrace,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      průměrná hydraulická doba zdržení (bez nárůstu), rychlost otáčení trubky; pokud možno přibližný úhel sklonu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobnosti o odlučování, čas a intenzita,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zkušební teplota a rozsah,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použité analytické metody.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky zkoušky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      všechny změřené údaje (DOC, CHSK, specifické analýzy, hodnota pH, teplota a dusíkaté látky, pokud je to relevantní),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      všechny vypočtené hodnoty Dt (nebo Dtc), DB, Ds v tabelované formě a křivky odstranitelnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o lagové fázi a fázi prodlevy, doba trvání zkoušky, stupeň odstranění zkoušené chemické látky, referenční chemické látky (pokud byla předmětem zkoušky) a stupeň odstranění organického média (v kontrolním modelu) společně se statistickými informacemi a vyjádřením k biologické rozložitelnosti zkoušené chemické látky a platnosti zkoušky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      diskuse o výsledcích.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA:
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. Res. 14: 753-758.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441-444.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214–220.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355-1357.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional trickling filter. JAOCS 43: 92-94.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865-881.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, London.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Kapitola C.4 této přílohy, Stanovení „snadné“ biologické rozložitelnosti A–F.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              ISO 14593 (1998). Jakost vod - Hodnocení úplné aerobní biologické rozložitelnosti organických látek ve vodním prostředí. Metoda stanovení anorganického uhlíku v těsně uzavřených lahvičkách.
                           
                        
                     Dodatek 8
                     
                        Obrázek 1
                     
                     
                        Rotační trubky
                     
                     
                        
                     
                        Slovníček
                     
                     Půdorysný pohled
                     Pohled A/B
                     Hnací kola
                     Volnoběžná kola
                     Hnací motor
                     Redukční převodovka
                     Vnitřní příruba
                     Sklopný mechanismus
                     Pohon kuželových ozubených kol
                     
                        Obrázek 2
                     
                     
                        Graf toku
                     
                     
                        
                     A: zásobník
                     B: peristaltické čerpadlo
                     C: rotační trubka
                     D: zásobník na výtok
                     
                        DEFINICE:
                     
                     Zkoušená látka: jakákoliv látka nebo směs testovaná pomocí této zkušební metody.
                     Chemické látky: „Je třeba poznamenat, že pojem „chemická látka“ je obecně užíván v dohodách UNCED i v navazujících dokumentech a zahrnuje látky, výrobky, směsi, přípravky nebo jakékoliv jiné termíny, které lze použít ve stávajících systémech pro označení pokrytí.“
                  “
            
                  10)
               
               
                  Doplňují se kapitoly C.27, C.28, C.29 a C.30, které znějí:
                  „C.27   TEST TOXICITY NA CHIRONOMIDAE V SYSTÉMU SEDIMENT-VODA ZA POUŽITÍ OBOHACENÉHO SEDIMENTU
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda odpovídá pokynu OECD pro zkoušení (TG) 218 (2004). Tato zkušební metoda je určena k posouzení účinků dlouhodobé expozice larev sladkovodních pakomárů Chironomus sp. žijících v sedimentu chemickým látkám. Je založena na stávajících protokolech o zkoušce toxicity pro Chironomus riparius a Chironomus tentans, která byla vyvinuta v Evropě (1, 2, 3) a v Severní Americe (4, 5, 6, 7, 8) a ověřována v mezilaboratorních porovnávacích zkouškách (1, 6, 9). Lze užít rovněž další dobře zdokumentované druhy pakomárů, jako například Chironomus yoshimatsui (10, 11).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Scénář expozice užitý při této zkušební metodě je vmíchání zkoušené látky do sedimentu. Výběr vhodného scénáře expozice závisí na zamýšleném použití testu. Účelem scénáře vmíchání látky do sedimentu je simulovat nahromaděné množství chemických látek přetrvávajících v sedimentu. Tento systém expozice zahrnuje vmíchání látky do sedimentu ve zkušebním systému sediment–voda.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Látky, které je třeba testovat z hlediska organismů žijících v sedimentu, v této složce obvykle přetrvávají po dlouhá časová období. Expozici organismů žijících v sedimentu lze zajistit celou řadou možných cest. Relativní význam jednotlivých cest, jimiž dochází k expozici, a doba nezbytná k tomu, aby každá z nich přispěla k celkovým toxickým účinkům, jsou závislé na fyzikálně chemických vlastnostech dotčené chemické látky. V případě silně adsorbujících látek (např. log Kow > 5) nebo pro chemické látky s kovalentní vazbou na sediment může být významnou expoziční cestou požití kontaminované potravy. Aby nedošlo k podcenění toxicity vysoce lipofilních látek, lze zvážit užití potravy přidané do sedimentu před aplikací zkoušené chemické látky. Aby bylo možné zohlednit všechny potenciální způsoby expozice, zaměřuje se tato zkušební metoda na dlouhodobou expozici. Délka trvání zkoušky se pohybuje v rozmezí 20–28 dní pro C. riparius and C. yoshimatsui a 28–65 dní pro C. tentans. Pokud jsou pro konkrétní účel, například pro studium účinků nestabilní chemické látky, potřebné krátkodobé údaje, mohou být další duplikátní vzorky po deseti dnech odstraněny.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Měřené výsledné účinky se rovnají celkovému počtu vylíhlých dospělců a času do vylíhnutí. Pokud jsou nezbytné další krátkodobé údaje, doporučuje se provádět měření přežití a růstu larev až po uplynutí desetidenního období, podle potřeby s využitím dalších duplikátních vzorků.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Doporučuje se použití sedimentu doplněného přísadami. Přísadami doplněný sediment má několik výhod oproti přírodním sedimentům:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          jeho experimentální variabilita je snížena, protože tvoří reprodukovatelnou „standardizovanou matrici“ a je eliminována potřeba hledat zdroje nekontaminovaného čistého sedimentu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          zkoušky lze zahájit kdykoliv, aniž by bylo nutno čelit sezonním výkyvům zkušebního sedimentu, a sediment není třeba předem upravit, aby se z něj odstranili původní živočichové; užití přísadami doplněného sedimentu také snižuje náklady spojené s terénním shromažďováním dostatečného množství sedimentu pro rutinní testování,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          užití přísadami doplněného sedimentu umožňuje porovnání toxicity a odpovídající řazení látek.
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.
                           
                        PODSTATA ZKOUŠKY
                  
                              7.
                           
                           
                              Larvy pakomárů v prvním instaru jsou vystaveny koncentračnímu rozmezí zkoušené chemické látky v systému sediment–voda. Zkoušená látka se vmíchá do sedimentu a následně jsou do zkušebních kádinek se stabilizovanou koncentrací sedimentu a vody nasazeny larvy prvního instaru. Na konci zkoušky se měří rychlost líhnutí a vývoje pakomárů. V případě potřeby lze po 10 dnech měřit rovněž přežití larev a jejich hmotnost (v případě potřeby lze použít další duplikátní vzorky). Tyto údaje se analyzují buď pomocí regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která by způsobila x% snížení líhnutí nebo přežití či růstu larev (např. EC15, EC50, atd.), nebo s využitím testování statistických hypotéz pro stanovení NOEC/LOEC. Posledně uvedená metoda vyžaduje srovnání hodnoty účinku s kontrolními hodnotami pomocí statistických testů.
                           
                        INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE
                  
                              8.
                           
                           
                              Měla by být známa rozpustnost zkoušené chemické látky ve vodě, její tlak par, naměřená nebo vypočtená distribuce v sedimentu a stabilita ve vodě a sedimentu. Měla by být k dispozici spolehlivá analytická metoda pro kvantitativní stanovení zkoušené chemické látky ve vodě nad sedimentem, kapilární vodě a v sedimentu, a to se známou a doloženou přesností a mezí stanovitelnosti. Užitečné informace zahrnují strukturní vzorec a čistotu zkoušené chemické látky. Užitečnou informací je rovněž chemický osud zkoušené chemické látky (např. zánik, abiotický a biotický rozklad atd.). Další návod pro zkoušení látek s fyzikálně chemickými vlastnostmi, které činí jejich zkoušení obtížné, je uveden v položce seznamu literatury (12).
                           
                        REFERENČNÍ CHEMICKÉ LÁTKY
                  
                              9.
                           
                           
                              Referenční chemické látky mohou být pravidelně kontrolovány pro ověření, že zkušební podmínky a protokol o zkoušce jsou spolehlivé. Příkladem referenčních toxických látek úspěšně použitých v mezilaboratorních zkouškách a validačních studiích jsou lindan, trifluralin, pentachlorfenol, chlorid kademnatý a chlorid draselný (1, 2, 5, 6, 13).
                           
                        PLATNOST ZKOUŠKY
                  
                              10.
                           
                           
                              Aby byla zkouška platná, měly by být splněny tyto podmínky:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          vylíhnutí v kontrolních nádobách musí být na konci zkoušky nejméně 70 % (1, 6),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          k líhnutí dospělců C. riparius a C. yoshimatsui v kontrolních nádobách by mělo dojít mezi 12. a 23. dnem po jejich zavedení do nádob; pro C. tentans je nutná doba 20–65 dnů,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          na konci zkoušky se v každé nádobě změří pH a koncentrace rozpuštěného kyslíku. Koncentrace kyslíku by měla činit alespoň 60 procent hodnoty nasycení vzduchem (ASV) při použité teplotě a pH vody nad sedimentem by se mělo ve všech zkušebních nádobách pohybovat v rozmezí pH 6–9,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          teplota vody by se neměla lišit o více než ± 1,0 °C. Teplota vody může být řízena v izotermální místnosti a v tomto případě by měla být teplota v místnosti ve vhodném časovém intervalu potvrzována.
                                       
                                    
                        POPIS METODY
                  
                     Zkušební nádoby
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Studie se provádí ve skleněných 600ml kádinkách o průměru 8 cm. Vhodné jsou i jiné nádoby, ale měly by zaručit odpovídající hloubku vody nad sedimentem a sedimentu. Plocha sedimentu by měla být dostatečná, aby poskytovala 2 až 3 cm2 na larvu. Poměr hloubky sedimentu k hloubce vody nad sedimentem by měl být 1:4. Zkušební nádoby a další aparatura, která přichází do styku se zkušebním systémem, by měly být celé zhotoveny ze skla nebo z jiného chemicky inertního materiálu (např. z teflonu).
                           
                        
                     Výběr druhů
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Při zkoušce má být přednostně užito druhu Chironomus riparius. Vhodný je i druh Chironomus tentans, avšak hůře se s ním manipuluje a vyžaduje i delší trvání zkoušky. Lze užít rovněž druh Chironomus yohimatsui. Podrobnosti o kultivačních metodách pro druh Chironomus riparius jsou uvedeny v dodatku 2. Informace o kultivačních podmínkách jsou k dispozici také pro jiné druhy, tj. Chironomus tentans (4) a Chironomus yoshimatsui (11). Identifikace druhu musí být potvrzena před zkouškou, ale není vyžadována před každou zkouškou, pokud organismy pocházejí z domácí kultury.
                           
                        
                     Sediment
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Při zkoušce se doporučuje přednostně užívat přísadami doplněný sediment (nazývaný rovněž rekonstituovaný, artificiální nebo syntetický sediment). Pokud se však použije přírodní sediment, je potřeba ho charakterizovat (alespoň pH, obsah organického uhlíku a doporučuje se i stanovení dalších parametrů, jako je poměr C/N a zrnitost), a měl by být prost veškerého znečištění a dalších organismů, které by mohly pakomárům konkurovat nebo je konzumovat. Doporučuje se také přírodní sediment před použitím při zkoušce toxicity pro pakomáry kondicionovat po dobu sedmi dnů za stejných podmínek, které převládají v následující zkoušce. Pro použití v této zkoušce se doporučuje následující přísadami doplněný sediment založený na umělé půdě užité při zkušební metodě C.8 (14) (1, 15, 16):
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          4–5 % (sušiny) rašeliny s pH co nejblíže 5,5 až 6,0; je důležité, aby byla ve formě prášku, jemně namletá (velikost částic ≤ 1 mm) a sušená výhradně na vzduchu;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          20 % (sušiny) kaolinitického jílu (pokud možno s více než 30 % kaolinitu);
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          75–76 % (sušiny) křemenného písku (měl by převažovat jemný písek s více než 50 % částic velikosti 50 až 200 μm);
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          přidá se deionizovaná voda s cílem dosáhnout 30–50 % vlhkosti v konečné směsi;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          přidá se chemicky čistý uhličitan vápenatý (CaCO3) pro úpravu pH konečné směsi sedimentu na pH 7,0 ± 0,5. Obsah organického uhlíku v konečné směsi by měl být 2 % (± 0,5 %) a je třeba jej upravit použitím vhodného množství rašeliny a písku v souladu s písm. a) a c).
                                       
                                    
                        
                              14.
                           
                           
                              Rašelina, kaolinitický jíl a písek by měly pocházet ze známého zdroje. Jednotlivé složky sedimentu by měly být kontrolovány z hlediska nepřítomnosti chemické kontaminace (např. těžké kovy, chlorované organické sloučeniny, organofosforové sloučeniny atd.). Příklad přípravy přísadami doplněného sedimentu je popsán v dodatku 3. Přijatelné je i míchání suchých složek, pokud se prokáže, že po přidání vody nad sedimentem nedochází k separaci složek sedimentu (např. plovoucí částice rašeliny) a že rašelina nebo sediment jsou dostatečně kondicionovány.
                           
                        
                     Voda
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Pro tuto zkoušku je vhodná jakákoli voda, která vyhovuje chemickým charakteristikám přípustné ředicí vody uvedeným v dodatcích 2 a 4. Jakákoli vhodná voda, přírodní voda (povrchová nebo podzemní), rekonstituovaná voda (viz příloha 2) nebo odchlorovaná vodovodní voda je přijatelná jako kultivační a zkušební voda, pokud v ní pakomáři přežijí po dobu kultivace a zkoušení bez známek stresu. Na začátku zkoušky by se hodnota pH zkušební vody měla pohybovat mezi 6 a 9 a její celková tvrdost by neměla být vyšší než 400 mg/l CaCO3. V případě, že je podezření na interakci mezi ionty způsobujícími tvrdost vody a zkoušenou látkou, měla by však být použita voda nižší tvrdosti (a proto v této situaci nelze použít Elendtovo médium M4). V průběhu celé studie by měl být užíván stejný typ vody. Charakteristiky jakosti vody uvedené v dodatku 4 by měly být měřeny nejméně dvakrát ročně, nebo pokud existuje podezření, že mohlo dojít k podstatné změně těchto vlastností.
                           
                        
                     Zásobní roztoky – obohacené sedimenty
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Obohacené sedimenty zvolené koncentrace se obvykle připraví přidáním roztoku zkoušené chemické látky přímo do sedimentu. Zásobní roztok zkoušené chemické látky rozpuštěné v deionizované vodě se smísí s přísadami doplněným sedimentem pomocí krouživé míchačky, míchačky krmiv nebo ručním smícháním. Je-li zkoušená látka špatně rozpustná ve vodě, může být rozpuštěna v co nejmenším objemu vhodného organického rozpouštědla (např. hexanu, acetonu nebo chloroformu). Tento roztok se pak smísí s 10 g jemného křemičitého písku na jednu zkušební nádobu. Rozpouštědlo se nechá odpařit a musí být zcela odstraněno z písku, písek se pak smísí s vhodným množstvím usazenin na jednotlivé zkušební kádinky. K rozpuštění, dispergaci nebo emulgaci zkoušené chemické látky mohou být použita pouze činidla, která snadno vytěkají. Je třeba mít na paměti, že při přípravě sedimentu je nutno zohlednit písek ze zkoušené chemické látky a směsi písku (tj. při přípravě sedimentu by proto mělo být použito menší množství písku). Je třeba dbát, aby zkoušená látka přidaná do sedimentu byla v sedimentu důkladně a rovnoměrně rozložena. Pokud je to nutné, lze analyzovat dílčí vzorky za účelem stanovení stupně homogenity.
                           
                        USPOŘÁDÁNÍ ZKOUŠKY
                  
                              17.
                           
                           
                              Uspořádáním zkoušky se rozumí výběr počtu zkušebních koncentrací a jejich odstupňování, počet nádrží pro každou koncentraci a počet larev v nádrži. Jsou popsána uspořádání pro odhad koncentrace vyvolávající účinek EC, pro odhad NOEC a pro provedení limitní zkoušky.
                           
                        
                     Uspořádání pro regresní analýzu
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Koncentrace použité ve zkoušce musí v každém případě pokrývat koncentraci vyvolávající účinek (např. EC15, EC50) a rozsah koncentrací, při nichž dochází k účinku, který je předmětem zájmu. Obecně platí, že přesnost, a zejména platnost, s níž lze provést odhady koncentrace vyvolávající účinek (ECx), se zvýší, pokud se daná koncentrace vyvolávající účinek nachází v rozmezí zkoušených koncentrací. Je třeba se vyhnout extrapolaci hluboko pod nejnižší pozitivní koncentrací nebo přesahující nejvyšší koncentraci. Předběžná orientační zkouška je užitečná pro výběr rozsahu koncentrací, které mají být použity (viz odstavec 27).
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              V případě, že ECx je třeba odhadnout, je třeba zkoušku provést alespoň v pěti koncentracích a třech opakováních pro každou koncentraci. V každém případě je vhodné, aby byly užity dostatečné zkušební koncentrace umožňující dobrý odhad modelu. Faktor mezi koncentracemi nesmí být větší než 2 (výjimku lze učinit v případech, kdy má křivka závislosti odezvy na dávce malý sklon). Počet opakování při každé expozici lze snížit, pokud se zvýší počet zkušebních koncentrací s různými odezvami. Zvýšení počtu opakování nebo snížení velikosti zkušebních koncentrací obvykle vede k zúžení intervalu spolehlivosti zkoušky. Pro odhad desetidenního přežití a růstu larev jsou nutná další opakování.
                           
                        
                     Uspořádání odhadu NOEC/LOEC
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Pro odhad LOEC nebo NOEC se použije pět zkušebních koncentrací s nejméně čtyřmi opakováními a faktor mezi koncentracemi by neměl být vyšší než 2. Počet opakování by měl být dostatečný, aby zajistil odpovídající statistickou významnost, s jakou má být rozeznán 20 % rozdíl oproti kontrolnímu vzorku na 5 % hladině významnosti (p = 0,05). Pro rychlost vývoje je zpravidla vhodné použít analýzu rozptylu (ANOVA) jako například Dunnettův nebo Williamsův test (17, 18, 19, 20). Pro procento vylíhlých jedinců lze použít Cochranův-Armitageův test, Fisherův exaktní test (s Bonferroniho korekcí) nebo Mantelův-Haenszelův test.
                           
                        
                     Limitní zkouška
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Limitní zkouška může být provedena (jedna zkušební koncentrace a kontrola), pokud nebyl zjištěn žádný dopad při předběžné orientační zkoušce. Účelem limitní zkoušky je provést zkoušku při dostatečně vysoké koncentraci umožňující osobám s rozhodovací pravomocí vyloučit možné toxické účinky zkoušené chemické látky a limit je stanoven v takové koncentraci, jejíž výskyt se v žádném případě nepředpokládá. Doporučená koncentrace je 1 000 mg/kg (sušiny). Obvykle je pro expozici i kontrolu zapotřebí alespoň šesti opakování. Počet opakování by měl být dostatečný, aby zajistil odpovídající statistickou významnost, s jakou má být rozeznán 20 % rozdíl oproti kontrolnímu vzorku na 5 % hladině významnosti (p = 0,05). S metrickou reakcí (rychlost vývoje a hmotnost), je t-test vhodnou statistickou metodou, pokud údaje splňují požadavky tohoto testu (normalita, homogenní rozptyly). Pokud tyto požadavky splněny nejsou, lze použít t-test nestejných rozptylů nebo neparametrický test, jako je například Wilcoxon-Mann-Whitneyův test. Pro procento vylíhlých jedinců je vhodný Fisherův exaktní test.
                           
                        POSTUP
                  
                     Podmínky expozice
                  
                  
                     Příprava systému obohacený sediment–voda
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Pro aplikaci zkoušené chemické látky se doporučuje postup vmíchání popsaný ve zkušební metodě C.8: Toxicita pro žížaly (14). Obohacené sedimenty se umístí do nádob a přidá se voda nad sediment tak, aby vznikl objemový poměr vody a sedimentu 1:4 (viz odstavce 11 a 15). Hloubka vrstvy sedimentu by se měla pohybovat v rozmezí od 1,5 do 3 cm. Aby se zabránilo oddělení složek sedimentu a resuspenzi jemného materiálu v průběhu přidávání zkušební vody ve vodním sloupci, lze sediment přikrýt plastovým diskem, na který se voda nalije, a disk se bezprostředně poté vyjme. Mohou být vhodná i jiná zařízení.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Zkušební nádoby se přikryjí (například skleněnými víčky). Pokud je to nutné, v průběhu studie se hladina vody doplní na původní objem s cílem kompenzovat odpařování vody. K tomuto účelu by měla být použita destilovaná nebo deionizovaná voda, aby se zabránilo hromadění solí.
                           
                        
                     Stabilizace
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Jakmile je připraven obohacený sediment s vodou nad sedimentem, je žádoucí umožnit rozdělení zkoušené chemické látky z vodné fáze do sedimentu (3, 4, 6, 13). To by se mělo provádět pokud možno za stejných podmínek z hlediska teploty a provzdušňování, které byly použity při zkoušce. Vhodná rovnovážná doba je specifická pro konkrétní sediment a chemickou látku a může se pohybovat v řádu hodin až dní, zřídka až několika týdnů (4–5 týdnů). Vzhledem k tomu, že tato doba by umožnila rozklad mnoha chemických látek, není očekávána rovnováha, ale doporučuje se doba do ustavení rovnováhy v trvání 48 hodin. Na konci této další doby do ustavení rovnováhy by měla být změřena koncentrace zkoušené chemické látky ve vodě nad sedimentem, v kapilární vodě a v sedimentu, a to nejméně při nejvyšší koncentraci a při jedné nižší koncentraci (viz odstavec 38). Tato analytická stanovení zkoušené chemické látky umožňují výpočet hmotnostní bilance a vyjádření výsledků na základě naměřených koncentrací.
                           
                        
                     Přidání zkušebních organismů
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Čtyři až pět dnů před přidáním zkušebních organismů do zkušebních nádob by měly být z kultur odebrány shluky vajíček a umístěny do malých nádob do kultivačního média. Lze použít starší médium ze zásobní kultury nebo čerstvě připravené médium. Pokud je použito čerstvé médium, mělo by být do kultivačního média přidáno malé množství potravy, např. zelené řasy a/nebo několik kapek filtrátu z jemně mleté suspenze vločkového krmiva pro ryby (viz dodatek 2). Měly by být použity pouze čerstvě nakladené shluky vajíček. Za normálních okolností se larvy začínají líhnout několik dní po nakladení vajíček (2 až 3 dny u Chironomus riparius při 20 °C a 1 až 4 dny u Chironomus tentans při 23 °C a Chironomus yoshimatui při 25 °C) a během larválního vývoje se vystřídají čtyři instary, z nichž každý trvá 4–8 dnů. Při zkoušce se použijí larvy prvního instarového stadia (2–3 nebo 1–4 dnů po vylíhnutí). Instar pakomárů lze případně zkontrolovat pomocí šířky hlavové kapsuly (6).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Dvacet larev prvního instaru se pomocí pipety bez špičky náhodně rozdělí do jednotlivých zkušebních nádob obsahujících obohacený sediment a vodu. Provzdušňování vody je nutné ukončit při přidání larev do zkušebních nádob a znovu ho zahájit nejdříve po uplynutí dalších 24 hodin po přidání larev (viz odstavce 25 a 32). Podle použitého uspořádání zkoušky (viz odstavce 19 a 20) je počet larev užitý na jednu koncentraci minimálně 60 pro odhad koncentrace vyvolávající účinek a 80 pro stanovení NOEC.
                           
                        
                     Zkušební koncentrace
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Orientační zkouška může být užitečná pro stanovení rozsahu koncentrací pro vlastní zkoušku. K tomuto účelu jsou pakomáři exponováni řadě široce odstupňovaných koncentrací zkoušené chemické látky. S cílem zajistit stejnou hustotu povrchu na jednoho pakomára, která má být užita pro vlastní zkoušku, se pakomáři vystaví jednotlivým koncentracím zkoušené chemické látky po dobu, která umožňuje odhad vhodných zkušebních koncentrací; opakování nejsou vyžadována.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Zkušební koncentrace pro vlastní zkoušku jsou stanoveny podle výsledku zjištění předběžné orientační zkoušky. Mělo by být vybráno a použito nejméně pět koncentrací v souladu s popisem uvedeným v odstavcích 18 až 20.
                           
                        
                     Kontroly
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Při zkoušce se použijí kontrolní nádoby bez zkoušené chemické látky, avšak obsahující sediment, s příslušným počtem opakování (viz odstavce 19–20). Pokud bylo pro aplikaci zkoušené chemické látky použito rozpouštědlo (viz odstavec 16), bude přidána kontrola rozpouštědla v sedimentu.
                           
                        
                     Zkušební zařízení
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Užívají se statické systémy. Ve výjimečných případech, jako například tehdy, pokud je specifikace kvality vody nevhodná pro růst zkušebního organismu nebo ovlivňuje chemickou rovnováhu (např. přílišný pokles úrovně rozpuštěného kyslíku, přílišné zvýšení koncentrace exkrementů nebo výluh minerálů ze sedimentů, který ovlivňuje pH a/nebo tvrdost vody) lze použít semistatické nebo průtokové systémy s přerušovanou nebo kontinuální obnovou vody nad sedimentem. Zpravidla však budou postačující a vhodnější jiné metody zvýšení jakosti vody nad sedimentem, jako je například provzdušňování.
                           
                        
                     Krmení
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Larvy je třeba krmit optimálně denně nebo nejméně třikrát týdně. Jako dostatečná dávka pro mladé larvy po dobu prvních 10 dnů se jeví krmivo pro ryby (suspenze ve vodě nebo jemně rozmělněné krmivo, např. Tetra-Min nebo Tetra-Phyll, viz podrobnosti v dodatku 2) v množství 0,25 až 0,5 mg (0,35 až 0,5 mg pro C. yoshimatui) na larvu za den. Starší larvy mohou potřebovat o něco větší množství potravy: po zbývající dobu zkoušky by mělo dostačovat 0,5–1 mg na larvu denně. U všech expozic by se měl snížit přísun potravy a mělo by se kontrolovat, zda dochází k růstu plísní nebo je pozorována mortalita. Pokud není možné růst plísní zastavit, je nutno zkoušku opakovat. Při testování silně adsorbujících látek (např. log Kow > 5) nebo látek s kovalentní vazbou na sediment lze dávku potravy nezbytnou pro zajištění přežití a přirozeného růstu organismů přidat do přísadami doplněného sedimentu před fází stabilizace. V takovém případě je nutno místo krmiva pro ryby použít rostlinný materiál, například přídavek 0,5 % (sušiny) jemně mletých listů např. kopřivy dvoudomé (Urtica dioica), morušovníku bílého (Morus alba), jetele plazivého (Trifolium repens), špenátu setého (Spinacia oleracea) nebo jiného rostlinného materiálu (Cerophylu nebo alfa-celulózy).
                           
                        
                     Inkubační podmínky
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Voda nad sedimentem ve zkušebních nádobách se mírně provzdušňuje v optimálním případě 24 hodin po přidání larev a je sledována po celou dobu zkoušky (je třeba dbát, aby koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesla pod 60 procent ASV). Provzdušňování se provádí pomocí skleněné Pasteurovy pipety upevněné 2–3 cm nad vrstvou sedimentu (tj. jedna nebo několik bublin/s). Při zkoušení těkavých chemických látek lze zvolit možnost systém sediment-voda neprovzdušňovat.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Zkouška se provádí při konstantní teplotě 20 °C (± 2 °C). Doporučená teplota pro C. tentans je 23 °C a pro C. yoshimatui 25 °C (± 2 °C). Fotoperioda je 16 hodin a intenzita světla by měla být 500 až 1 000 lux.
                           
                        
                     Trvání expozice
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Expozice je zahájena přidáním larev do obohacených a kontrolních nádob. Maximální délka trvání expozice je 28 dnů pro C. riparius a C. yoshimatsui a 65 dnů pro C. tentans. Pokud se pakomáři vylíhnou dříve, lze zkoušku ukončit po uplynutí nejméně pěti dnů od vylíhnutí posledního dospělce v kontrolní nádobě.
                           
                        
                     Pozorování
                  
                  
                     Líhnutí
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Určí se čas potřebný pro vývoj a celkový počet plně vylíhlých samců a samic pakomárů. Samce lze snadno rozlišit podle vějířovitých tykadel.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Zkušební nádoby se kontrolují alespoň třikrát týdně s cílem vizuálně posoudit jakékoli neobvyklé chování (např. opouštění sedimentu, neobvyklé plavání) ve srovnání s kontrolními nádobami. Během období předpokládaného líhnutí je nutné denně počítat vylíhlé pakomáry. Pohlaví a počet plně vylíhlých pakomárů se denně zaznamenávají. Po identifikaci se pakomáři z nádob odstraní. Veškeré shluky vajíček nakladené před ukončením testu se zaznamenají a pak se odstraní, aby se zabránilo opětovnému zavlečení larev do sedimentu. Zaznamená se rovněž počet viditelných kukel, které se dosud nevylíhly. Pokyny pro měření líhnutí jsou uvedeny v dodatku 5.
                           
                        
                     Růst a přežívání
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Pokud je nutné uvést údaje o desetidenním přežití a růstu larev, je třeba na počátku zkoušky přidat další zkušební nádoby tak, aby je bylo možné následně použít. Sediment z těchto dalších nádob se proseje za použití síta o velikosti 250 μm, které udrží larvy. Kritéria uhynutí jsou nepohyblivost nebo nedostatečná reakce na mechanické podněty. Larvy, které nejsou nalezeny, by měly být rovněž považovány za uhynulé (larvy uhynulé na počátku zkoušky mohly být již rozloženy mikroby). Stanoví se hmotnost sušiny (prosté popelovin) larev, které přežily, na zkušební nádobu a vypočte se průměrná individuální hmotnost sušiny na nádobu. Je vhodné určit, do kterého instaru přežívající larvy patří, pomocí změření šířky hlavové kapsuly každého jedince.
                           
                        
                     Analytická měření
                  
                  
                     Koncentrace zkoušené chemické látky
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Před zahájením zkoušky (tj. přidáním larev), se alespoň z jedné nádoby na každou expozici odstraní souhrnné vzorky sedimentu za účelem analytického stanovení koncentrace zkoušené chemické látky v sedimentu. Doporučuje se, aby byly analyzovány minimálně vzorky vody nad sedimentem, kapilární vody a sedimentu na počátku (viz bod 24) a na konci zkoušky při nejvyšší koncentraci a jedné nižší koncentraci. Tato stanovení koncentrace zkoušené chemické látky poskytují informace o chování/distribuci zkoušené chemické látky v systému voda–sediment.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Při provádění průběžných měření (např. 7. den) a v případě, že jsou pro analýzu zapotřebí rozsáhlé vzorky, které nelze ze zkušebních nádob odebrat bez dopadu na zkušební systém, je potřeba provést analytická stanovení na vzorcích z dalších zkušebních nádob, s nimiž bylo zacházeno stejným způsobem (včetně přítomnosti zkušebních organismů), ale nebyly použity pro biologická pozorování.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Doporučeným postupem izolace intersticiální vody je odstřeďování např. při 10 000 g a 4 °C po dobu 30 minut. Neadsorbuje-li se však zkoušená látka prokazatelně na filtry, je přijatelná i filtrace. V některých případech může být nemožné provést analýzu koncentrací v kapilární vodě vzhledem k tomu, že vzorek je příliš malý.
                           
                        
                     Fyzikálně-chemické parametry
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              pH a teplotu ve zkušebních nádobách je nutno měřit vhodným způsobem (viz odstavec 10). Tvrdost a obsah amoniaku by měly být měřeny v kontrolních nádobách a v jedné zkušební nádobě při nejvyšší koncentraci na počátku zkoušky a na jejím konci.
                           
                        ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ
                  
                     Zpracování výsledků
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Účelem této zkoušky je stanovit účinek zkoušené chemické látky na rychlost vývoje a celkový počet plně vylíhlých samců a samic, pakomárů nebo v případě desetidenní zkoušky účinky na přežití a hmotnost larev. Pokud nejsou k dispozici žádné údaje o statistických rozdílech citlivosti mezi oběma pohlavími, lze výsledky pro samce a pro samice sloučit pro účely statistické analýzy. Rozdíly v citlivosti mezi pohlavími lze statisticky posoudit např. pomocí tabulkového χ2 – r × 2 testu. Je-li vyžadováno stanovení přežití larev a průměru individuální sušiny na jednu nádobu, je nutno tak učinit po 10 dnech.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Koncentrace s pozorovanými účinky vyjádřené a vztažené k sušině se vypočtou přednostně na základě naměřených koncentrací sedimentu na počátku zkoušky (viz odstavec 38).
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Pro výpočet bodového odhadu EC50 nebo jakékoli jiné hodnoty ECx lze jako skutečné opakování použít statistiku na jednu nádobu. Při výpočtu intervalu spolehlivosti pro každý ECx je nutno zohlednit variabilitu mezi jednotlivými nádobami, případně prokázat, že tato variabilita je tak nízká, že ji lze ignorovat. Je-li u modelu užita metoda nejmenších čtverců, je nutné u statistik jednotlivých nádob uplatnit transformaci za účelem homogenity rozptylu. Hodnoty ECx je však třeba vypočítat až poté, co je reakce převedena zpět na původní hodnotu.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Pokud je cílem statistické analýzy stanovení hodnoty NOEC/LOEC testováním hypotéz, je nutno vzít v úvahu variabilitu mezi nádobami, například pomocí analýzy rozptylu ANOVA. Případně mohou být vhodnější robustnější testy (21) v případě, že dojde k porušení předpokladů obvykle užitých při analýze ANOVA.
                           
                        
                     Procento vylíhlých jedinců
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Procenta vylíhlých jedinců jsou binární údaje a lze je analyzovat s použitím postupně klesajícího Cochranova-Armitageova testu, který předpokládá monotónní odezvu na dávku, a údaje jsou konzistentní s tímto očekáváním. V opačném případě lze použít Fisherův exaktní test nebo Mantelův-Haenszelův test s Bonferroniho-Holmovou korekcí p-hodnot. Pokud existují důkazy o větší variabilitě mezi replikacemi ve stejné koncentraci, pak by binomické rozdělení (často uváděné jako „extra-binomická“ variabilita) nasvědčovalo tomu, že je nutno použít robustní Cochranův-Armitageův test nebo Fisherův exaktní test, jak je navrhováno v odstavci (21).
                              Určí se součet pakomárů vylíhlých v jedné nádobě ne a vydělí se počtem vložených larev na:
                              
                                 
                              kde:
                              
                                          ER
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          procento vylíhlých jedinců,
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          počet pakomárů vylíhlých v nádobě,
                                       
                                    
                                          na
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          počet larev nasazených do nádoby.
                                       
                                    
                        
                              47.
                           
                           
                              Nejvhodnější alternativou pro rozsáhlé vzorky s extra binomickou variací je pojmout procento vylíhlých jedinců jako kontinuální odezvu a použít postupy, jako je například Williamsův test, pokud existuje předpoklad monotónní odezvy na dávku a je konzistentní s těmito daty ER. V případě nemonotónní odezvy by byl vhodný Dunnettův test. Rozsáhlý vzorek je zde definován situací, při níž jak počet vylíhlých jedinců, tak počet nevylíhlých jedinců přesáhnou v jednom duplikátním vzorku (nádobě) hodnotu pět.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Při použití metody ANOVA je nutno hodnoty ER nejprve transformovat (například druhou odmocninou funkce arcsin) nebo transformací podle Freemana-Tukeyho s cílem získat přibližné normální rozdělení údajů a vyrovnat odchylky. Při použití absolutních frekvencí lze použít test dle Cochrana-Armitage, Fisherův exaktní test (s Bonferroniho korekcí), nebo Mantelův-Haenszelův test. Transformace funkcí √arcsin se vypočte pomocí převrácené hodnoty sinu (sin–1) z odmocniny ER.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Pro procento vylíhlých jedinců se hodnoty ECx vypočtou pomocí regresní analýzy (nebo např. pomocí modelu probit (22), logit, Weibull, vhodného komerčního softwaru atd.). V případě selhání regresní analýzy (např. v případě méně než dvou koncentrací s parciálními odezvami) se použijí další neparametrické metody, jako je například klouzavý průměr nebo prostá interpolace.
                           
                        
                     Rychlost vývoje
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Průměrná doba vývoje představuje průměrné časové rozpětí mezi nasazením larev (den 0 zkoušky) a vylíhnutím experimentální kohorty pakomárů. (Pro výpočet skutečné doby vývoje by mělo být zohledněno stáří larev v okamžiku nasazení. Rychlost vývoje je převrácenou hodnotou doby vývoje (jednotka: 1/den) a představuje tu část larválního vývoje, která se odehraje za den. Rychlost vývoje je z hlediska hodnocení těchto studií toxicity sedimentů preferována před dobou vývoje vzhledem k její nižší variabilitě, vyšší homogenitě a vyšší blízkosti normálnímu rozdělení. Z tohoto důvodu mohou být použity silné parametrické zkušební postupy pro rychlost vývoje spíše než pro dobu vývoje. Pro rychlost vývoje jako kontinuální odezvu lze hodnoty ECx stanovit odhadem pomocí regresní analýzy (např. (23), (24)).
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              U následujících statistických testů se má za to, že počet pakomárů pozorovaných v inspekčním dni × se vylíhl v průměru časového intervalu mezi dnem x a dnem x – l (l = délka intervalu mezi pozorováními, obvykle 1 den). Průměrná rychlost vývoje na nádobu (x) se vypočte podle vzorce:
                              
                                 
                              kde:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          střední rychlost vývoje v kádince,
                                       
                                    
                                          i
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          index intervalu mezi pozorováními,
                                       
                                    
                                          m
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          počet všech intervalů mezi pozorováními,
                                       
                                    
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          počet vylíhlých jedinců během daného intervalu i mezi pozorováními,
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          počet vylíhlých jedinců celkem na konci pokusu ,
                                       
                                    
                                          x
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          rychlost vývoje larev vylíhlých v intervalu i,
                                       
                                    
                                 
                              kde:
                              
                                          deni
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          den pozorování (ve dnech od aplikace),
                                       
                                    
                                          li
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          délka intervalu mezi pozorováními (ve dnech, obvykle 1 den).
                                       
                                    
                        
                     Protokol o zkoušce
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Protokol o zkoušce musí obsahovat minimálně tyto údaje:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkoušená látka:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikální povahu a případně fyzikláně-chemické vlastnosti (rozpustnost ve vodě, tlak par, rozdělovací koeficient v půdě (případně v sedimentu), stabilita ve vodě atd.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      chemické identifikační údaje (obecný název, chemický název, strukturní vzorec, číslo CAS atd.) včetně čistoty a analytické metody pro kvantitativní stanovení zkoušené látky.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovací druh:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      užitá pokusná zvířata: druh, vědecký název, zdroj organismů a podmínky množení,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informace o nakládání se shluky vajíček a s larvami,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stáří testovaných zvířat po nasazení do zkušebních nádob.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkušební podmínky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použitý sediment, tj. přírodní nebo přísadami doplněný sediment,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      u přírodního sedimentu lokalita a popis místa odběru sedimentu, pokud možno včetně dřívější kontaminace, charakteristiky: pH, obsah organického uhlíku, poměr C/N a zrnitost (je-li to vhodné),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      příprava přísadami doplněného sedimentu: složky a charakteristiky (obsah organického uhlíku, pH, vlhkost, atd. na začátku zkoušky),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      příprava zkušební vody (pokud se používá rekonstituovaná voda) a její charakteristiky (koncentrace kyslíku, pH, vodivost, tvrdost, atd. na začátku zkoušky),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hloubka sedimentu a vody nad sedimentem,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      objem vody nad sedimentem a kapilární vody, hmotnost vlhkého sedimentu s kapilární vodou a bez ní,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zkušební nádoby (materiál a rozměry),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      způsob vmíchávání do sedimentu, použité zkušební koncentrace, počet duplikátních vzorků a případné použití rozpouštědla,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stabilizace rovnovážné fáze obohaceného systému sediment/voda: trvání a podmínky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inkubační podmínky: teplota, cyklus a intenzita světla, provzdušňování (frekvence a intenzita),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobnější informace o krmení včetně typu krmiva, přípravy, množství a režimu krmení.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominální zkušební koncentrace, naměřené zkušební koncentrace a výsledky všech analýz pro stanovení koncentrace zkoušené chemické látky ve zkušební nádobě,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      jakost vody ve zkušebních nádobách, tj. pH, teplota, rozpuštěný kyslík, tvrdost a amoniak,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      případné nahrazování odpařené zkušební vody,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet vylíhlých samců a samic pakomárů na nádobu za den,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet larev, z nichž se nevylíhli dospělci, na nádobu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      průměrná individuální hmotnost sušiny larev na nádobu a případně na instar,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      procento vylíhlých jedinců na duplikátní vzorek a zkušební koncentraci (směsný vzorek samců a samic pakomárů),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      průměrná rychlost vývoje plně vylíhlých pakomárů na duplikátní vzorek a aplikované množství (směsný vzorek samců a samic pakomárů),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odhady koncových bodů toxicity, např. ECx (a související intervaly spolehlivosti), NOEC a/nebo LOEC a statistické metody použité k jejich stanovení,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      diskuse o výsledcích včetně případného vlivu na výsledek zkoušky v důsledku odchylek od této zkušební metody.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA:
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. Prosinec 1997.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Zkušební metoda C.8 této přílohy, Toxicita pro žížaly.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303.
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096–1121.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482–491.
                           
                        
                              19)
                           
                           
                              Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103–117.
                           
                        
                              20)
                           
                           
                              Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531.
                           
                        
                              21)
                           
                           
                              Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577–585.
                           
                        
                              22)
                           
                           
                              Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.
                           
                        
                              23)
                           
                           
                              Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494.
                           
                        
                              24)
                           
                           
                              Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312.
                           
                        
                     Dodatek 1
                     DEFINICE
                     Pro účely této zkušební metody se použijí tyto definice:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Přísadami doplněný sediment nebo rekonstituovaný, umělý nebo syntetický sediment je směs materiálů užitá k napodobení fyzických složek přírodního sedimentu.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Voda nad sedimentem je voda nacházející se nad sedimentem ve zkušební nádobě.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Intersticiální voda nebo kapilární voda je voda zabírající prostor mezi sedimentem a částicemi půdy.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Obohacený sediment je sediment, do něhož byla přidána zkoušená látka.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Zkoušená chemická látka: jakákoli látka nebo směs testovaná pomocí této zkušební metody.
                              
                           
                  
                     Dodatek 2
                     
                        Doporučení pro kultivaci kultury Chironomus riparius
                        
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Larvy rodu Chironomus lze chovat v krystalizačních miskách nebo ve větších nádobách. Jemný křemičitý písek se rozprostře po dně nádoby v tenké vrstvě silné 5 až 10 mm. Bylo prokázáno, že substrátem vhodným jako podklad je také křemelina (např. Merck, čl. 8117), (dostačující je tenčí vrstva silná jen několik málo mm). Následně se přidá několikacentimetrová vrstva vhodné vody. Objem vody by se měl podle potřeby doplňovat s cílem nahradit ztráty vzniklé odpařováním a zabránit vysychání. Vodu lze v případě potřeby vyměnit. Je třeba zajistit mírné provzdušňování. Nádoby, v nichž jsou larvy chovány, by měly být umístěny ve vhodné kleci, která zabrání úniku líhnoucích se dospělců. Tato klec by měla být dostatečně velká, aby umožňovala rojení vylíhlých dospělců, jinak by nemuselo dojít k jejich páření (minimum je přibližně 30 × 30 × 30 cm).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Klece by měly být umístěny při pokojové teplotě nebo v místnosti s konstantní teplotou 20 ± 2 °C s fotoperiodou 16 hodin světlo (intenzity přibližně 1 000 lux) a 8 hodin tma. Bylo zjištěno, že vzdušná vlhkost nižší než 60 % RH může bránit rozmnožování.
                              
                           
                        Ředicí voda
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Lze použít jakoukoli vhodnou přírodní nebo syntetickou vodu. Zpravidla se užívá studniční voda, odchlorovaná vodovodní voda a umělá média (např. Elendtovo médium „M4“ nebo „M7“, viz níže). Vodu je před použitím nutno provzdušnit. Je-li to nutné, lze kultivační vodu obnovit opatrným odlitím nebo odčerpáním použité vody z kultivačních nádob tak, aby nedošlo k poškození schránek larev.
                              
                           
                        Krmení larev
                     
                     
                                 4.
                              
                              
                                 Larvy rodu Chironomus se krmí vločkovým krmivem pro ryby (TetraMin(®, Tetra Phyll® nebo jiná podobná značka patentovaného krmiva pro ryby), v množství přibližně 250 mg na nádobu a den. Potravu lze aplikovat v podobě suchého mletého prášku nebo v podobě suspenze ve vodě: 1,0 g vločkového krmiva se přidá do 20 ml ředicí vody a vytvoří se homogenní směs. Tento přípravek lze dodávat v množství přibližně 5 ml na nádobu na den (před použitím protřepat). Starším larvám lze přidat více krmiva.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Krmení se upraví podle kvality vody. V případě, že se kultivační médium „zakalí“, je třeba krmnou dávku snížit. Přidávání potravy je nutno pečlivě sledovat. Příliš malé množství krmiva způsobí, že larvy opouštějí sediment a vznášejí se ve vodním sloupci, a příliš mnoho krmiva způsobí zvýšenou mikrobiální činnost a pokles koncentrace kyslíku. Obojí může způsobit snížení rychlosti růstu.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Do nových kultivačních nádob mohou být přidány i buňky zelených řas (např. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris).
                              
                           
                        Krmení vylíhlých dospělců
                     
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Někteří experimentátoři se domnívají, že jako potrava vylíhlých dospělců může sloužit vata namočená do nasyceného roztoku sacharózy.
                              
                           
                        Líhnutí
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Dospělci se začnou v chovných nádobách líhnout při teplotě 20 ± 2 °C přibližně po 13–15 dnech. Samce lze snadno rozlišit podle vějířovitých tykadel.
                              
                           
                        Shluky vajíček
                     
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Jakmile se ve snubní komůrce nacházejí dospělci, je třeba třikrát týdně kontrolovat všechny reprodukční nádoby, zda se v nich nacházejí shluky vajíček spojené želatinózní hmotou. Pokud se zde shluky vajíček nacházejí, je nutno je opatrně odstranit a přemístit do malé misky obsahující vzorek chovného vodního prostředí. Shluky vajíček se užijí pro založení nové nádoby s kulturou (např. 2–4 shluky vajíček na nádobu) nebo se užijí pro zkoušky toxicity.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Larvy prvního instarového stadia by se měly vylíhnout za 2–3 dny.
                              
                           
                        Zakládání nových kultivačních nádob
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Jakmile jsou kultury založeny, mělo by být možné zakládat nové nádoby s kulturami larev jednou týdně nebo méně často v závislosti na zkušebních požadavcích a odstraňovat starší nádoby po vylíhnutí dospělců. Pomocí tohoto systému se zajistí pravidelné dodávky dospělců s minimální potřebou dohledu.
                              
                           
                        Příprava zkušebních roztoků „M4“ a „M7“
                     
                     
                                 12.
                              
                              
                                 Elendt (1990) popsal médium „M4“. Médium „M7“ se připraví obdobně jako médium „M4“ s výjimkou látek uvedených v tabulce 1, u nichž jsou koncentrace u „M7“ čtyřikrát nižší než u „M4“. Připravuje se publikace o médiu „M7“ (Elendt, osobní sdělení). Podle Elendta a Biase (1990) by se zkušební roztok neměl připravovat pro koncentrace NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 a K2HPO4 vzhledem k tomu, že nejsou pro přípravu zásobních roztoků vyhovující.
                              
                           
                        Příprava média „M7“
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Každý zásobní roztok (I) se připraví samostatně a z těchto zásobních roztoků (I) se pak připraví kombinovaný zásobní roztok (II) (viz tabulka 1). Médium „M7“ se připraví přidáním 50 ml kombinovaného zásobního roztoku (II) a množství zásobního roztoku jednotlivých makroživin, které jsou uvedeny v tabulce 2, do 1 litru deionizované vody. Připraví se vitaminový zásobní roztok přidáním tří vitaminů do deionizované vody, jak je uvedeno v tabulce 3, a 0,1 ml kombinovaného vitaminového zásobního roztoku se přidá do výsledného média „M7“ krátce před použitím. (Vitaminový zásobní roztok se uskladňuje zmrazený v malých alikvotních dílech.) Médium se provzdušní a stabilizuje.
                              
                           
                        LITERATURA:
                     
                     BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.
                     
                        Tabulka 1
                     
                     
                        Zásobní roztoky stopových prvků pro médium M4 a M7
                     
                     
                                 Zásobní roztoky (I)
                              
                              
                                 Množství (mg) doplněné na 1 litr deionizované vody
                              
                              
                                 Kombinovaný zásobní roztok (II) se připraví smícháním následujících množství (v ml) zásobních roztoků (I) a doplněním na 1 litr deionizované vody
                              
                              
                                 Konečné koncentrace ve zkušebním roztoku (mg/l)
                              
                           
                                 M4
                              
                              
                                 M7
                              
                              
                                 M4
                              
                              
                                 M7
                              
                           
                                 H3BO3
                                     (15)
                                 
                              
                              
                                 57 190
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 2,86
                              
                              
                                 0,715
                              
                           
                                 MnCl2 · 4 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 7 210
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,361
                              
                              
                                 0,090
                              
                           
                                 LiCl (15)
                                 
                              
                              
                                 6 120
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,306
                              
                              
                                 0,077
                              
                           
                                 RbCl (15)
                                 
                              
                              
                                 1 420
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,071
                              
                              
                                 0,018
                              
                           
                                 SrCl2 · 6 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 3 040
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,152
                              
                              
                                 0,038
                              
                           
                                 NaBr (15)
                                 
                              
                              
                                 320
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,016
                              
                              
                                 0,004
                              
                           
                                 Na2MoO4 · 2 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 1 260
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,063
                              
                              
                                 0,016
                              
                           
                                 CuCl2 · 2 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 335
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,017
                              
                              
                                 0,004
                              
                           
                                 ZnCl2
                                 
                              
                              
                                 260
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,013
                              
                              
                                 0,013
                              
                           
                                 CaCl2 · 6 H2O
                              
                              
                                 200
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,010
                              
                              
                                 0,010
                              
                           
                                 KI
                              
                              
                                 65
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,0033
                              
                              
                                 0,0033
                              
                           
                                 Na2SeO3
                                 
                              
                              
                                 43,8
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,0022
                              
                              
                                 0,0022
                              
                           
                                 NH4VO3
                                 
                              
                              
                                 11,5
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,00058
                              
                              
                                 0,00058
                              
                           
                                 Na2EDTA · 2 H2O (15)
                                     (16)
                                 
                              
                              
                                 5 000
                              
                              
                                 20,0
                              
                              
                                 5,0
                              
                              
                                 2,5
                              
                              
                                 0,625
                              
                           
                                 FeSO4 · 7 H2O (15)
                                     (16)
                                 
                              
                              
                                 1 991
                              
                              
                                 20,0
                              
                              
                                 5,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,249
                              
                           
                        
                     
                        Tabulka 2
                     
                     
                        Zásobní roztoky makroživin pro médium M4 a M7
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 Množství doplněné na 1 litr deionizované vody
                                 (mg)
                              
                              
                                 Množství zásobních roztoků makroživin přidané za účelem přípravy média M4 a M7
                                 (ml/l)
                              
                              
                                 Konečné koncentrace ve zkušebním roztoku M4 a M7
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 CaCl2 · 2 H2O
                              
                              
                                 293 800
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 293,8
                              
                           
                                 MgSO4 · 7 H2O
                              
                              
                                 246 600
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                 123,3
                              
                           
                                 KCl
                              
                              
                                 58 000
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 5,8
                              
                           
                                 NaHCO3
                                 
                              
                              
                                 64 800
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 64,8
                              
                           
                                 NaSiO3 · 9 H2O
                              
                              
                                 50 000
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                 10,0
                              
                           
                                 NaNO3
                                 
                              
                              
                                 2 740
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,274
                              
                           
                                 KH2PO4
                                 
                              
                              
                                 1 430
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,143
                              
                           
                                 K2HPO4
                                 
                              
                              
                                 1 840
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,184
                              
                           
                        
                     
                        Tabulka 3
                     
                     
                        Vitaminový zásobní roztok pro médium M4 a M7. Všechny tři vitaminové roztoky se smísí do jediného vitaminového zásobního roztoku
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 Množství doplněné na 1 litr deionizované vody
                                 (mg)
                              
                              
                                 Množství vitaminového zásobního roztoku přidané za účelem přípravy média M4 a M7
                                 (ml/l)
                              
                              
                                 Konečné koncentrace ve zkušebním roztoku M4 a M7
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 Thiaminhydrochlorid
                              
                              
                                 750
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,075
                              
                           
                                 Kyanokobalamin (B12)
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,0010
                              
                           
                                 Biotin
                              
                              
                                 7,5
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,00075
                              
                           
                        LITERATURA:
                     
                     Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25–33.
                     Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157–1167.
                  
                  
                     Dodatek 3
                     PŘÍPRAVA PŘÍSADAMI DOPLNĚNÉHO SEDIMENTU
                     
                        Složení sedimentu
                     
                     Složení přísadami doplněného sedimentu by mělo být následující:
                     
                                 Složka
                              
                              
                                 Charakteristika
                              
                              
                                 % sušiny
                                 sedimentu
                              
                           
                                 Rašelina:
                              
                              
                                 rašelina mechu Sphagnum s pH co nejblíže 5,5 až 6,0, bez viditelných zbytků rostlin a jemně mletá (velikost částic ≤ 1 mm) a vysušená na vzduchu
                              
                              
                                 4–5
                              
                           
                                 Křemičitý písek
                              
                              
                                 velikost zrn: > 50 % částic musí být v rozpětí 50–200 μm
                              
                              
                                 75–76
                              
                           
                                 Kaolinitický jíl
                              
                              
                                 obsah kaolinitu ≥ 30 %
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                 Organický uhlík
                              
                              
                                 upraven přidáním rašeliny a písku
                              
                              
                                 2 (± 0,5)
                              
                           
                                 Uhličitan vápenatý
                              
                              
                                 CaCO3, práškový, chemicky čistý
                              
                              
                                 0,05–0,1
                              
                           
                                 Voda
                              
                              
                                 vodivost ≤ 10 μS/cm
                              
                              
                                 30–50
                              
                           
                        Příprava
                     
                     Rašelina se usuší na vzduchu a rozemele se na jemný prášek. Připraví se suspenze požadovaného množství rašelinného prášku v deionizované vodě s použitím vysoce výkonného homogenizačního zařízení. pH této suspenze se upraví na 5,5 ± 0,5 pomocí CaCO3. Suspenze se kondicionuje po dobu nejméně dvou dní za mírného promíchávání při 20 ±2° C za účelem stabilizace pH a vytvoření stabilní mikrobiální složky. Poté se opět změří pH, které by se mělo rovnat 6,0 ± 0,5. Pak se suspenze rašeliny smísí s ostatními složkami (písek a kaolín) a s deionizovanou vodou s cílem získat homogenní sediment s obsahem vody v rozmezí 30–50 procent sušiny sedimentu. Znovu se změří pH konečné směsi a v případě nutnosti je opět upraveno pomocí CaCO3 na hodnotu 6,5 až 7,5. Odeberou se vzorky sedimentu pro stanovení obsahu sušiny a obsahu organického uhlíku. Následně se doporučuje před použitím pro zkoušku toxicity pro pakomáry přísadami doplněný sediment kondicionovat po dobu sedmi dnů za stejných podmínek, které převládají v následné zkoušce.
                     
                        Skladování
                     
                     Suché složky pro přípravu umělého sedimentu lze skladovat na suchém a chladném místě při pokojové teplotě. Přísadami doplněný (mokrý) sediment by neměl být před použitím ve zkoušce skladován. Měl by být použit ihned po uplynutí sedmidenního období kondicionování, kterým končí jeho příprava.
                     
                        LITERATURA:
                     
                     Kapitola C.8 této přílohy. Toxicita pro žížaly.
                     Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10–20.
                  
                  
                     Dodatek 4
                     
                        Chemické charakteristiky přípustné ředicí vody
                     
                     
                                 Látka
                              
                              
                                 Koncentrace
                              
                           
                                 Částice tuhé
                              
                              
                                 < 20 mg/l
                              
                           
                                 Celkový obsah organického uhlíku
                              
                              
                                 < 2 mg/l
                              
                           
                                 Neionizovaný amoniak
                              
                              
                                 < 1 μg/l
                              
                           
                                 Tvrdost jako CaCO3
                                 
                              
                              
                                 < 400 mg/l (17)
                                 
                              
                           
                                 Zbytkový chlor
                              
                              
                                 < 10 μg/l
                              
                           
                                 Celkové organické fosforové pesticidy
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Celkové organické chlorové pesticidy a polychlorované bifenyly
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Celkový organický chlor
                              
                              
                                 < 25 ng/l
                              
                           
                  
                     Dodatek 5
                     
                        Pokyny pro monitorování líhnutí larev pakomárů
                     
                     Na zkušební kádinky jsou umístěny výletové pasti. Tyto pasti jsou potřebné od 20. dne až do konce zkoušky. Níže je nakreslen příklad používané pasti:
                     
                        
                     A: nylonová síťka
                     B: plastový kryt
                     C: kádinka bez zobáčku
                     D: otvory na výměnu vody
                     E: voda
                     F: sediment
                  
                  C.28   TEST TOXICITY NA CHIRONOMIDAE V SYSTÉMU SEDIMENT–VODA ZA POUŽITÍ OBOHACENÉ VODY
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda odpovídá pokynu OECD pro zkoušení (TG) 219 (2004). Tato zkušební metoda je určena k posouzení účinků dlouhodobé expozice larev sladkovodních pakomárů Chironomus sp. žijících v sedimentu chemickým látkám. Je založena především na pokynu BBA s užitím zkušebního systému sediment-voda s umělou půdou a scénáře expozice vodního sloupce (1). Zohledňuje rovněž stávající protokoly o zkouškách toxicity pro Chironomus riparius a Chironomus tentans, které byly vyvinuty v Evropě a Severní Americe a (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) a zkoušeny v mezilaboratorních porovnávacích zkouškách (1, 6, 9). Lze užít rovněž další dobře zdokumentované druhy pakomárů, jako například Chironomus yoshimatsui (10, 11).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Scénář expozice užitý při této zkušební metodě spočívá v obohacení vody. Výběr vhodného scénáře expozice závisí na zamýšleném použití testu. Účelem scénáře expozice vody, který zahrnuje obohacení vodního sloupce, je simulovat rozprášení pesticidního postřiku a zahrnuje počáteční maximální koncentrace v kapilární vodě. Je vhodný také pro jiné druhy expozic (včetně úniků chemikálií) s výjimkou akumulačních procesů, jejichž délka přesahuje trvání zkušebního období.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Látky, které je třeba testovat z hlediska organismů žijících v sedimentu, v této složce obvykle přetrvávají po dlouhá časová období. Expozici organismů žijících v sedimentu lze zajistit celou řadou možných cest. Relativní význam jednotlivých cest, jimiž dochází k expozici, a doba nezbytná k tomu, aby každá z nich přispěla k celkovým toxickým účinkům, je závislá na fyzikálně chemických vlastnostech dotčené chemické látky. V případě silně adsorbujících látek (např. log Kow > 5) nebo pro chemické látky s kovalentní vazbou na sediment může být významnou expoziční cestou požití kontaminované potravy. Aby nedošlo k podcenění toxicity vysoce lipofilních látek, lze zvážit užití potravy přidané do sedimentu před aplikací zkoušené chemické látky. Aby bylo možné zohlednit všechny potenciální způsoby expozice, zaměřuje se tato zkušební metoda na dlouhodobou expozici. Délka trvání zkoušky se pohybuje v rozmezí 20–28 dní pro C. riparius and C. yoshimatsui a 28–65 dní pro C. tentans. Pokud jsou pro konkrétní účel, například pro studium účinků nestabilní chemické látky, potřebné krátkodobé údaje, mohou být další duplikátní vzorky po deseti dnech odstraněny.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Měřené výsledné účinky se rovnají celkovému počtu vylíhlých dospělců a času do vylíhnutí. Pokud jsou nezbytné další krátkodobé údaje, doporučuje se provádět měření přežití a růstu larev až po uplynutí desetidenního období, podle potřeby s využitím dalších duplikátních vzorků.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Doporučuje se použití přísadami doplněného sedimentu. Přísadami doplněný sediment má několik výhod oproti přírodním sedimentům:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          jeho experimentální variabilita je snížena, protože tvoří reprodukovatelnou „standardizovanou matrici“, a odpadá potřeba hledat zdroje nekontaminovaného čistého sedimentu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          zkoušky lze zahájit kdykoliv, aniž by bylo nutné čelit sezónním výkyvům zkušebního sedimentu, a sediment není třeba předem upravit s cílem odstranit původní živočichy; užití přísadami doplněného sedimentu také snižuje náklady spojené s terénním shromažďováním dostatečného množství sedimentu pro rutinní testování,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          užití přísadami doplněného sedimentu umožňuje porovnání toxicity a odpovídající řazení látek; údaje o toxicitě ze zkoušek s přírodními a umělými sedimenty byly pro více látek porovnatelné (2).
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.
                           
                        PODSTATA ZKOUŠKY
                  
                              7.
                           
                           
                              Larvy pakomárů jsou během prvního instaru vystaveny koncentračnímu rozmezí zkoušené chemické látky v systému sediment-voda. Zkouška začíná tím, že se larvy prvního instaru nasadí do zkušebních kádinek obsahujících systém sediment-voda a voda se následně obohatí zkoušenou látkou. Na konci zkoušky se měří počet vylíhnutí a rychlost vývoje pakomárů. V případě potřeby lze po 10 dnech měřit rovněž přežití larev a jejich hmotnost (v případě potřeby lze použít další duplikátní vzorky). Tyto údaje se analyzují buď pomocí regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která by způsobila x% snížení líhnutí nebo přežití či růstu larev (např. EC15, EC50, atd.), nebo s využitím testování statistických hypotéz pro stanovení NOEC/LOEC. Posledně uvedená metoda vyžaduje srovnání hodnoty účinku s kontrolními hodnotami pomocí statistických testů.
                           
                        INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE
                  
                              8.
                           
                           
                              Měla by být známa rozpustnost zkoušené chemické látky ve vodě, její tlak par, naměřená nebo vypočtená distribuce v sedimentu a stabilita ve vodě a sedimentu. Měla by být k dispozici spolehlivá analytická metoda pro kvantitativní stanovení zkoušené chemické látky ve vodě nad sedimentem, kapilární vodě a v sedimentu, a to se známou a doloženou přesností a mezí stanovitelnosti. Užitečné informace zahrnují strukturní vzorec a čistotu zkoušené chemické látky. Užitečnou informací je rovněž chemický osud zkoušené chemické látky (např. zánik, abiotický a biotický rozklad atd.) Další návod pro zkoušení látek s fyzikálně chemickými vlastnostmi, které činí jejich zkoušení obtížné, je uveden v odstavci (12).
                           
                        REFERENČNÍ CHEMICKÉ LÁTKY
                  
                              9.
                           
                           
                              Referenční chemické látky mohou být pravidelně kontrolovány pro ověření, že zkušební podmínky a protokol o zkoušce jsou spolehlivé. Příkladem referenčních toxických látek úspěšně použitých v mezilaboratorních zkouškách a validačních studiích jsou lindan, trifluralin, pentachlorfenol, chlorid kademnatý a chlorid draselný (1, 2, 5, 6, 13).
                           
                        PLATNOST ZKOUŠKY
                  
                              10.
                           
                           
                              Aby byla zkouška platná, měly by být splněny tyto podmínky:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          vylíhnutí v kontrolních nádobách musí být na konci zkoušky nejméně 70 % (1, 6),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          k líhnutí dospělců C. riparius and C. yoshimatsui v kontrolních nádobách by mělo dojít mezi 12. a 23. dnem po jejich zavedení do nádob; pro C. tentans je nutná doba 20–65 dnů,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          na konci zkoušky se v každé nádobě změří pH a koncentrace rozpuštěného kyslíku. Koncentrace kyslíku by měla činit alespoň 60 procent hodnoty nasycení vzduchem (ASV), při použité teplotě, a pH vody nad sedimentem by se mělo ve všech zkušebních nádobách pohybovat v rozmezí pH 6–9,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          teplota vody by se neměla lišit o více než ± 1,0 °C. Teplota vody může být řízena v izotermální místnosti a v tomto případě by měla být teplota v místnosti ve vhodném časovém intervalu potvrzována.
                                       
                                    
                        POPIS METODY
                  
                     Zkušební nádoby
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Studie se provádí ve skleněných 600ml kádinkách o průměru 8 cm. Vhodné jsou i jiné nádoby, ale měly by zaručit odpovídající hloubku vody nad sedimentem a sedimentu. Plocha sedimentu by měla být dostatečná, aby poskytovala 2 až 3 cm2 na larvu. Poměr hloubky sedimentu k hloubce vody nad sedimentem by měl být 1:4. Zkušební nádoby a další aparatura, která přichází do styku se zkušebním systémem, by měly být celé zhotoveny ze skla nebo z jiného chemicky inertního materiálu (např. z teflonu).
                           
                        
                     Výběr druhů
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Při zkoušce má být přednostně užito druhu Chironomus riparius. Vhodný je i druh Chironomus tentans, avšak hůře se s ním manipuluje a vyžaduje i delší trvání zkoušky. Lze užít rovněž druh Chironomus yohimatsui. Podrobnosti o kultivačních metodách pro druh Chironomus riparius jsou uvedeny v dodatku 2. Informace o kultivačních podmínkách jsou k dispozici také pro jiné druhy, tj. Chironomus tentans (4) a Chironomus yoshimatsui (11). Identifikace druhu musí být potvrzena před zkouškou, ale není vyžadována před každou zkouškou, pokud organismy pocházejí z domácí kultury.
                           
                        
                     Sediment
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Doporučuje se přednostně užívat přísadami doplněný sediment (nazývaný rovněž rekonstituovaný, umělý nebo syntetický sediment). Pokud se však použije přírodní sediment, je potřeba ho charakterizovat (alespoň pH, obsah organického uhlíku a doporučuje se i stanovení dalších parametrů, jako je poměr C/N a zrnitost) a měl by být prost veškerého znečištění a dalších organismů, které by mohly pakomárům konkurovat nebo je konzumovat. Doporučuje se také přírodní sediment před použitím při zkoušce toxicity pro pakomáry kondicionovat po dobu sedmi dnů za stejných podmínek, které převládají v následující zkoušce. Pro použití v této zkoušce se doporučuje následující přísadami doplněný sediment založený na umělé půdě užité při zkušební metodě C.8 (14) (1, 15, 16):
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          4–5 % (sušiny) rašeliny s pH co nejblíže 5,5 až 6,0; ve formě prášku, jemně namletá (velikost částic ≤ 1 mm) a vysušená výhradně na vzduchu;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          20 % (sušiny) kaolinitického jílu (pokud možno s více než 30 % kaolinitu);
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          75–76 % (sušiny) křemenného písku (měl by převažovat jemný písek s více než 50 % částic velikosti 50 až 200 μm);
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          přidá se deionizovaná voda s cílem dosáhnout 30–50 % vlhkosti v konečné směsi;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          přidá se chemicky čistý uhličitan vápenatý (CaCO3) pro úpravu pH konečné směsi sedimentu na pH 7,0 ± 0,5;
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          obsah organického uhlíku v konečné směsi by měl být 2 % (± 0,5 %) a je třeba jej upravit použitím vhodného množství rašeliny a písku v souladu s písm. a) a c).
                                       
                                    
                        
                              14.
                           
                           
                              Rašelina, kaolinitický jíl a písek by měly pocházet ze známého zdroje. Jednotlivé složky sedimentu by měly být kontrolovány z hlediska nepřítomnosti chemické kontaminace (např. těžké kovy, chlorované organické sloučeniny, organofosforové sloučeniny atd.). Příklad přípravy přísadami doplněného sedimentu je popsán v dodatku 3. Přijatelné je i míchání suchých složek, pokud se prokáže, že po přidání vody nad sedimentem nedochází k separaci složek sedimentu (např. vyplavování částic rašeliny) a že rašelina nebo sediment jsou dostatečně kondicionovány.
                           
                        
                     Voda
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Pro tuto zkoušku je vhodná jakákoli voda, která vyhovuje chemickým charakteristikám přípustné ředicí vody uvedeným v dodatcích 2 a 4. Jakákoli vhodná voda, přírodní voda (povrchová nebo podzemní), rekonstituovaná voda (viz příloha 2) nebo odchlorovaná vodovodní voda je přijatelná jako kultivační a zkušební voda, pokud v ní pakomáři přežijí po dobu kultivace a zkoušení bez známek stresu. Na začátku zkoušky by se hodnota pH zkušební vody měla pohybovat mezi 6 a 9 a její celková tvrdost by neměla být vyšší než 400 mg/l CaCO3. V případě, že je podezření na interakci mezi ionty způsobujícími tvrdost vody a zkoušenou látkou, měla by však být použita voda nižší tvrdosti (a proto se v této situaci nesmí použít Elendtovo médium M4). V průběhu celé studie by měl být užíván stejný typ vody. Charakteristiky jakosti vody uvedené v dodatku 4 by měly být měřeny nejméně dvakrát ročně, nebo pokud existuje podezření, že mohlo dojít k podstatné změně těchto vlastností.
                           
                        
                     Zásobní roztoky – obohacená voda
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Zkušební koncentrace se vypočtou na základě koncentrace vodního sloupce, tj. vody nad sedimentem. Zkušební roztoky zvolené koncentrace jsou obvykle připraveny ředěním zásobního roztoku. Zásobní roztoky by měly být připraveny přednostně rozpuštěním zkoušené látky ve zřeďovací vodě. Použití rozpouštědel nebo dispergátorů může být v některých případech pro vytvoření zásobního roztoku o vhodné koncentraci nezbytné. Ke vhodným rozpouštědlům patří aceton, ethanol, methanol, ethylenglykol-monoethylether, ethylenglykol-dimethylether, dimethylformamid a triethylenglykol. Disperzní činidla, která mohou být použita, jsou Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % methylcelulosa a HCO-40. Koncentrace solubilizačního činidla v konečném zkušebním médiu by měla být minimální (tj. ≤ 0,1 ml/l) a měla by být u všech expozic stejná. Je-li použito solubilizační činidlo, nesmí mít významné účinky na přežití ani viditelné nepříznivé účinky na larvy Chironomidae, což musí být prokázáno na kontrolní skupině vystavené pouze rozpouštědlu. Měla by však být vynaložena maximální snaha takové chemické látky nepoužívat.
                           
                        USPOŘÁDÁNÍ ZKOUŠKY
                  
                              17.
                           
                           
                              Uspořádáním zkoušky se rozumí výběr počtu zkušebních koncentrací a jejich odstupňování, počet nádrží pro každou koncentraci a počet larev v nádrži. Jsou popsána uspořádání pro odhad koncentrace vyvolávající účinek EC, odhad NOEC a pro provedení limitní zkoušky. Regresní analýze se dává přednost před testováním hypotéz.
                           
                        
                     Uspořádání pro regresní analýzu
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Koncentrace použité ve zkoušce musí v každém případě pokrývat koncentraci vyvolávající účinek (např. EC15, EC50) a rozsah koncentrací, při nichž dochází k účinku, který je předmětem zájmu. Obecně platí, že přesnost, a zejména platnost, s níž lze provést odhady koncentrace vyvolávající účinek (ECx), se zvýší, pokud se daná koncentrace vyvolávající účinek nachází v rozmezí zkoušených koncentrací. Je třeba se vyhnout extrapolaci hluboko pod nejnižší pozitivní koncentrací nebo přesahující nejvyšší koncentraci. Předběžná orientační zkouška je užitečná pro výběr rozsahu koncentrací, které mají být použity (viz odstavec 27).
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              V případě, že ECx je třeba odhadnout, je třeba zkoušku provést alespoň v pěti koncentracích a třech opakováních pro každou koncentraci. V každém případě je vhodné, aby byly užity dostatečné zkušební koncentrace umožňující dobrý odhad modelu. Faktor mezi koncentracemi nesmí být větší než 2 (výjimku lze učinit v případech, kdy má křivka závislosti odezvy na dávce malý sklon). Počet opakování při každé expozici lze snížit, pokud se zvýší počet zkušebních koncentrací s různými odezvami. Zvýšení počtu opakování nebo zúžení rozsahu zkušebních koncentrací obvykle vede k zúžení intervalu spolehlivosti zkoušky. Pro odhad desetidenního přežití a růstu larev jsou nutná další opakování.
                           
                        
                     Uspořádání odhadu NOEC/LOEC
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Pro odhad LOEC/NOEC se použije pět zkušebních koncentrací s nejméně čtyřmi opakováními a faktor mezi koncentracemi by neměl být vyšší než 2. Počet opakování by měl být dostatečný, aby zajistil odpovídající statistickou významnost, s jakou má být rozeznán 20 % rozdíl oproti kontrolnímu vzorku na 5 % hladině významnosti (p = 0,05). Pro rychlost vývoje je zpravidla vhodné použít analýzu rozptylu (ANOVA), jako například Dunnettův nebo Williamsův test (17, 18, 19, 20). Pro procento vylíhlých jedinců lze použít Cochranův-Armitageův test, Fisherův exaktní test (s Bonferroniho korekcí) nebo Mantelův-Haenszelův test.
                           
                        
                     Limitní zkouška
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Limitní zkouška může být provedena (jedna zkušební koncentrace a kontrola), pokud nebyl zjištěn žádný dopad při předběžné orientační zkoušce. Účelem limitní zkoušky je určit, že hodnota toxicity zkoušené látky je vyšší než zkoušený koncentrační limit. V této zkušební metodě nelze navrhnout doporučenou koncentraci: její stanovení je ponecháno na úsudku osob s rozhodovací pravomocí. Obvykle je pro expozici i kontrolu zapotřebí alespoň šesti opakování. Počet opakování by měl být dostatečný, aby zajistil odpovídající statistickou významnost, s jakou má být rozeznán 20 % rozdíl oproti kontrolnímu vzorku na 5 % hladině významnosti (p = 0,05). S metrickou reakcí (rychlost vývoje a hmotnost), je t-test vhodnou statistickou metodou, pokud údaje splňují požadavky tohoto testu (normalita, homogenní rozptyly). Pokud tyto požadavky splněny nejsou, lze použít t-test nestejných rozptylů nebo neparametrický test, jako je například Wilcoxon-Mann-Whitneyův test. Pro procento vylíhlých jedinců je vhodný Fisherův exaktní test.
                           
                        POSTUP
                  
                     Podmínky expozice
                  
                  
                     Příprava systému obohacená voda–sediment
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Do zkušebních nádob se přidá vhodné množství přísadami doplněného sedimentu (viz odstavce 13–14 a dodatek 3) tak, aby tvořil vrstvu o hloubce nejméně 1,5 cm. Přidá se voda do hloubky 6 cm (viz odstavec 15). Poměr vrstvy sedimentu a hloubky vody by neměl překročit 1:4 a vrstva sedimentu by neměla být hlubší než 3 cm. Systém sediment–voda se před přidáním zkušebních organismů (viz odstavec 14 a dodatek 3). mírně provzdušňuje po dobu sedmi týdnů. Aby se zabránilo oddělení složek sedimentu a resuspenzi jemného materiálu v průběhu přidávání zkušební vody ve vodním sloupci, lze sediment přikrýt plastovým diskem, na který se voda nalije a disk se bezprostředně poté vyjme. Mohou být vhodná i jiná zařízení.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Zkušební nádoby se přikryjí (například skleněnými víčky). Pokud je to nutné, v průběhu studie se hladina vody doplní na původní objem s cílem kompenzovat odpařování vody. K tomuto účelu by měla být použita destilovaná nebo deionizovaná voda, aby se zabránilo hromadění solí.
                           
                        
                     Přidání zkušebních organismů
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Čtyři až pět dnů před přidáním zkušebních organismů do zkušebních nádob by měly být z kultur odebrány shluky vajíček a umístěny do malých nádob do kultivačního média. Lze použít starší médium ze zásobní kultury nebo čerstvě připravené médium. Pokud je použito čerstvé médium, mělo by být do kultivačního média přidáno malé množství potravy, např. zelené řasy a/nebo několik kapek filtrátu z jemně mleté suspenze vločkového krmiva pro ryby (viz dodatek 2). Měly by být použity pouze čerstvě nakladené shluky vajíček. Za normálních okolností se larvy začínají líhnout několik dní po nakladení vajíček (2 až 3 dny u Chironomus riparius při 20 °C a 1 až 4 dny u Chironomus tentans při 23 °C a Chironomus yoshimatui při 25 °C) a během larválního vývoje se vystřídají čtyři instary, z nichž každý trvá 4–8 dnů. Při zkoušce se použijí larvy prvního instaru (2–3 nebo 1–4 dnů po vylíhnutí). Instar pakomárů lze případně zkontrolovat pomocí šířky hlavové kapsuly (6).
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Dvacet larev prvního instaru se pomocí pipety bez špičky náhodně rozdělí do jednotlivých zkušebních nádob obsahujících obohacený sediment a vodu. Provzdušňování vody je nutno ukončit při přidání larev do zkušebních nádob a znovu ho zahájit nejdříve po uplynutí dalších 24 hodin po přidání larev (viz odstavce 25 a 32). Podle užitého uspořádání zkoušky (viz odstavce 19 a 20) je počet larev užitý na jednu koncentraci minimálně 60 pro odhad koncentrace vyvolávající účinek a 80 pro stanovení NOEC.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Dvacet čtyři hodin po přidání larev se zkoušená látka vmísí do sloupce vody nad sedimentem a znovu se zavede mírné provzdušňování. Pod hladinou vody se pomocí pipety aplikují malé objemy roztoků zkoušené látky. Voda nad sedimentem se poté opatrně promíchá, aby se nerozrušil sediment.
                           
                        
                     Zkušební koncentrace
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Orientační zkouška může být užitečná pro stanovení rozsahu koncentrací pro vlastní zkoušku. K tomuto účelu jsou pakomáři exponováni řadě široce odstupňovaných koncentrací zkoušené chemické látky. S cílem zajistit stejnou hustotu povrchu na jednoho pakomára, která má být užita pro vlastní zkoušku, se pakomáři vystaví jednotlivým koncentracím zkoušené chemické látky po dobu, která umožňuje odhad vhodných zkušebních koncentrací; opakování nejsou vyžadována.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Zkušební koncentrace pro vlastní zkoušku jsou stanoveny podle výsledku zjištění předběžné orientační zkoušky. Mělo by být vybráno a použito nejméně pět koncentrací v souladu s popisem uvedeným v odstavcích 18 až 20.
                           
                        
                     Kontroly
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Při zkoušce se použijí kontrolní nádoby bez zkoušené chemické látky, avšak obsahující sediment s příslušným počtem opakování (viz odstavce 19–20). Pokud bylo pro aplikaci zkoušené chemické látky použito rozpouštědlo (viz odstavec 16), bude přidána kontrola rozpouštědla v sedimentu.
                           
                        
                     Zkušební zařízení
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Užívají se statické systémy. Ve výjimečných případech, jako například tehdy, pokud je specifikace kvality vody nevhodná pro růst zkušebního organismu nebo ovlivňuje chemickou rovnováhu (např. přílišný pokles úrovně rozpuštěného kyslíku, přílišné zvýšení koncentrace exkrementů nebo výluh minerálů ze sedimentů, který ovlivňuje pH a/nebo tvrdost vody), lze použít semistatické nebo průtokové systémy s přerušovanou nebo kontinuální obnovou vody nad sedimentem. Zpravidla však budou postačující a vhodnější jiné metody zvýšení kvality vody nad sedimentem, jako je například provzdušňování.
                           
                        
                     Potrava
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Larvy je třeba krmit optimálně denně nebo nejméně třikrát týdně. Jako dostatečná dávka pro mladé larvy po dobu prvních 10 dnů se jeví krmivo pro ryby (suspenze ve vodě nebo jemně rozmělněné krmivo, např. Tetra-Min nebo Tetra-Phyll, viz podrobnosti v dodatku 2) v množství 0,25 až 0,5 mg (0,35 až 0,5 mg pro C. yoshimatui)) na larvu za den. Starší larvy mohou potřebovat o něco větší množství potravy: po zbývající dobu zkoušky by mělo dostačovat 0,5–1 mg na larvu denně. Pokud dojde v kontrolních skupinách k růstu plísní nebo je u nich zjištěna mortalita, je nutné přísun potravy u všech expozic snížit a kontrolovat. Pokud není možné růst plísní zastavit, je nutné zkoušku opakovat. Při testování silně adsorbujících látek (např. log Kow > 5), nebo látek s kovalentní vazbou na sediment lze dávku potravy nezbytnou pro zajištění přežití a přirozeného růstu organismů přidat do přísadami doplněného sedimentu před fází stabilizace. V takovém případě je nutno místo krmiva pro ryby použít rostlinný materiál, například přídavek 0,5 % (sušiny) jemně mletých listů např. kopřivy dvoudomé (Urtica dioica), morušovníku bílého (Morus alba), jetele plazivého (Trifolium repens), špenátu setého (Spinacia oleracea) nebo jiného rostlinného materiálu (Cerophylu nebo alfa-celulózy).
                           
                        
                     Inkubační podmínky
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Voda nad sedimentem ve zkušebních nádobách se mírně provzdušňuje v optimálním případě 24 hodin po přidání larev a je sledována po celou dobu zkoušky (je třeba dbát, aby koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesla pod 60 % ASV). Provzdušňování se provádí pomocí skleněné Pasteurovy pipety upevněné 2–3 cm nad vrstvou sedimentu (tj. jedna nebo několik bublin/s). Při zkoušení těkavých chemických látek je možné zvolit možnost systém sediment–voda neprovzdušňovat.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Zkouška se provádí při konstantní teplotě 20 °C (± 2 °C). Doporučená teplota pro C. tentans je 23 °C a pro C. yoshimatui 25 °C (± 2 °C). Fotoperioda je 16 hodin a intenzita světla by měla být 500 až 1 000 lux.
                           
                        
                     Trvání expozice
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Expozice je zahájena přidáním larev do obohacených a kontrolních nádob. Maximální délka trvání expozice je 28 dnů pro C. riparius a C. yoshimatsui a 65 dnů pro C. tentans. Pokud se pakomáři vylíhnou dříve, lze zkoušku ukončit po uplynutí nejméně pěti dnů od vylíhnutí posledního dospělce v kontrolní nádobě.
                           
                        POZOROVÁNÍ
                  
                     Líhnutí
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Určí se čas potřebný pro vývoj a celkový počet plně vylíhlých samců a samic pakomárů. Samce lze snadno rozlišit podle vějířovitých tykadel.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Zkušební nádoby se kontrolují alespoň třikrát týdně s cílem vizuálně posoudit jakékoli neobvyklé chování (např. opouštění sedimentu, neobvyklé plavání), ve srovnání s kontrolními nádobami. Během období předpokládaného líhnutí je nutné denně počítat vylíhlé pakomáry. Pohlaví a počet plně vylíhlých pakomárů se denně zaznamenávají. Po identifikaci se pakomáři z nádob odstraní. Veškeré shluky vajíček nakladené před ukončením testu se zaznamenají a pak se odstraní, aby se zabránilo opětovnému zavlečení larev do sedimentu. Zaznamená se rovněž počet viditelných kukel, které se dosud nevylíhly. Pokyny pro měření líhnutí jsou uvedeny v dodatku 5.
                           
                        
                     Růst a přežívání
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Pokud je nutné uvést údaje o desetidenním přežití a růstu larev, je třeba na počátku zkoušky přidat další zkušební nádoby tak, aby je bylo možné následně použít. Sediment z těchto dalších nádob se proseje za použití síta o velikosti 250 μm, které udrží larvy. Kritéria uhynutí jsou nepohyblivost nebo nedostatečná reakce na mechanické podněty. Larvy, které nejsou nalezeny, by měly být rovněž považovány za uhynulé (larvy uhynulé na počátku zkoušky mohly být již rozloženy mikroby). Stanoví se váha sušiny (prosté popelovin) larev, které přežily, na zkušební nádobu a vypočte se průměrná individuální hmotnost sušiny na nádobu. Je vhodné určit, do kterého instaru přežívající larvy patří; tohoto cíle lze dosáhnout pomocí změření šířky hlavové kapsuly každého jedince.
                           
                        
                     Analytická měření
                  
                  
                     Koncentrace zkoušené chemické látky
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Musí být analyzovány minimálně vzorky vody nad sedimentem, kapilární vody a sedimentu na počátku (nejlépe hodinu po aplikaci zkoušené látky) a na konci zkoušky při nejvyšší koncentraci a jedné nižší koncentraci. Tato stanovení koncentrace zkoušené chemické látky poskytují informace o chování/distribuci zkoušené chemické látky v systému voda/sediment. Odběr vzorků sedimentu při zahájení zkoušky může ovlivnit zkušební systém (může dojít k odstranění zkušebních larev), a měly by proto být užity další zkušební nádoby k provedení analytického stanovení koncentrace na počátku zkoušky a v jejím průběhu, pokud je to vhodné (viz odstavec 39). Měření v sedimentu nemusí být nutná, pokud distribuce zkoušené látky mezi vodou a sedimentem byla jasně stanovena studií voda/sediment za srovnatelných podmínek (např. poměr sedimentu k vodě, typ aplikace, obsah organického uhlíku v sedimentu).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Při provádění průběžných měření (např. 7. den), a v případě, že jsou pro analýzu zapotřebí rozsáhlé vzorky, které nelze ze zkušebních nádob odebrat bez dopadu na zkušební systém, je potřeba provést analytická stanovení na vzorcích z dalších zkušebních nádob, s nimiž bylo zacházeno stejným způsobem (včetně přítomnosti zkušebních organismů), ale nebyly použity pro biologická pozorování.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Doporučeným postupem izolace intersticiální vody je odstřeďování např. při odstředivé síle 10 000 g a 4 °C po dobu 30 minut. Neadsorbuje-li se však zkoušená látka prokazatelně na filtry, je přijatelná i filtrace. V některých případech může být nemožné provést analýzu koncentrací v kapilární vodě vzhledem k tomu, že vzorek je příliš malý.
                           
                        
                     Fyzikálně-chemické parametry
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              pH a rozpuštěný kyslík ve zkušební vodě a teplotu ve zkušebních nádobách je nutno měřit vhodným způsobem (viz odstavec 10). Tvrdost a obsah amoniaku by měly být měřeny v kontrolních nádobách a v jedné zkušební nádobě při nejvyšší koncentraci na počátku zkoušky a na jejím konci.
                           
                        ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ
                  
                     Zpracování výsledků
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Účelem této zkoušky je stanovit účinek zkoušené chemické látky na rychlost vývoje a celkový počet plně vylíhlých samců a samic pakomárů, nebo v případě desetidenní zkoušky účinky na přežití a hmotnost larev. Pokud nejsou k dispozici žádné údaje o statistických rozdílech citlivosti mezi oběma pohlavími, lze výsledky pro samce a pro samice sloučit pro účely statistické analýzy. Rozdíly v citlivosti mezi pohlavími lze statisticky posoudit např. pomocí χ2 – r × 2 tabulkového testu. Je-li vyžadováno stanovení přežití larev a průměru individuální sušiny na jednu nádobu, je nutné tak učinit po 10 dnech.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Koncentrace s pozorovanými účinky vyjádřené jako koncentrace ve vodě nad sedimentem se vypočtou přednostně na základě naměřených koncentrací na počátku zkoušky (viz bod 38).
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Pro výpočet bodového odhadu EC50 nebo jakékoli jiné hodnoty ECx lze jako skutečné opakování použít statistiku na jednu nádobu. Při výpočtu intervalu spolehlivosti pro každý ECx je nutno zohlednit variabilitu mezi jednotlivými nádobami, případně prokázat, že tato variabilita je tak nízká, že ji lze ignorovat. Je-li u modelu užita metoda nejmenších čtverců, je nutné u statistik jednotlivých nádob uplatnit transformaci za účelem homogenity rozptylu. Hodnoty ECx je však třeba vypočítat až poté, co je reakce převedena zpět na původní hodnotu.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Pokud je cílem statistické analýzy stanovení hodnoty NOEC/LOEC testováním hypotéz, je nutné vzít v úvahu variabilitu mezi nádobami, například pomocí analýzy rozptylu ANOVA. Případně mohou být vhodnější robustnější testy (21) v případě, že dojde k porušení předpokladů obvykle užitých při analýze ANOVA.
                           
                        
                     Procento vylíhlých jedinců
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Procento vylíhlých jedinců jsou kvantové údaje a lze je analyzovat s použitím postupně klesajícího Cochranova-Armitageova testu, který předpokládá monotónní odezvu na dávku, a tato data jsou konzistentní s tímto očekáváním. V opačném případě lze použít Fisherův exaktní test nebo Mantelův-Haenszelův test s Bonferroniho-Holmovou korekcí hodnot p. Pokud existují důkazy o větší variabilitě mezi replikacemi ve stejné koncentraci, pak by binomické rozdělení (často uváděné jako „extra-binomická“ variabilita) nasvědčovala tomu, že je nutno použít robustní Cochranův-Armitageův test nebo Fisherův exaktní test, jak je navrhováno v odstavci (21).
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Určí se součet pakomárů vylíhlých v jedné nádobě ne a vydělí se počtem vložených larev na:
                              
                                 
                              kde:
                              
                                          ER
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          procento vylíhlých jedinců,
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          počet pakomárů vylíhlých v nádobě,
                                       
                                    
                                          na
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          počet larev nasazených do nádoby.
                                       
                                    
                        
                              48.
                           
                           
                              Nejvhodnější alternativou pro rozsáhlé vzorky s extra binomickou variací je pojmout procento vylíhlých jedinců jako kontinuální odezvu a použít postupy, jako je například Williamsův test, pokud existuje předpoklad monotónní odezvy na dávku a je konzistentní s těmito daty ER. V případě nemonotónní odezvy by byl vhodný Dunnettův test. Rozsáhlý vzorek je zde definován situací, při níž jak počet vylíhlých jedinců, tak počet nevylíhlých jedinců přesáhnou v jednom duplikátním vzorku (nádobě) hodnotu pět.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Při použití metody ANOVA je nutno hodnoty ER nejprve transformovat (například druhou odmocninou arcsinu) nebo transformací podle Freemana-Tukeyho s cílem získat přibližné normální rozdělení údajů a vyrovnat odchylky. Při použití absolutních frekvencí lze použít test dle Cochrana-Armitage, Fisherův exaktní test (s Bonferroniho korekcí) nebo Mantelův-Haenszelův test. Transformace funkcí rovnou √arcsin se vypočte pomocí převrácené hodnoty sinu (sin–1) z odmocniny ER.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Pro procento vylíhlých jedinců se hodnoty ECx vypočtou pomocí regresní analýzy (nebo např. pomocí modelu probit, (22), logit, Weibull, vhodného komerčního softwaru atd.). V případě selhání regresní analýzy (např. v případě méně než dvou koncentrací s parciálními odezvami) se použijí další neparametrické metody, jako je například klouzavý průměr nebo prostá interpolace.
                           
                        
                     Rychlost vývoje
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Průměrná doba vývoje představuje průměrné časové rozpětí mezi nasazením larev (den 0 zkoušky) a vylíhnutím experimentální kohorty pakomárů. (Pro výpočet skutečné doby vývoje by mělo být zohledněno stáří larev v okamžiku nasazení. Rychlost vývoje je převrácenou hodnotou doby vývoje (jednotka: 1/den) a představuje část larválního vývoje, která se odehraje za den. Rychlost vývoje je z hlediska hodnocení těchto studií toxicity sedimentů preferována před dobou vývoje vzhledem k její nižší variabilitě, vyšší homogenitě a větší blízkosti normálnímu rozdělení. Z tohoto důvodu mohou být použity silné parametrické zkušební postupy pro rychlost vývoje, a ne pro dobu vývoje. Pro rychlost vývoje jako kontinuální odezvu lze hodnoty ECx stanovit odhadem pomocí regresní analýzy (např. (23), (24).)
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              U následujících statistických testů se má za to, že počet pakomárů pozorovaných v inspekčním dni x se vylíhl v průměru časového intervalu mezi dnem x a dnem x – l (l = délka intervalu mezi pozorováními, obvykle 1 den). Průměrná rychlost vývoje na nádobu (x) se vypočte podle vzorce:
                              
                                 
                              kde:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          střední rychlost vývoje v kádince,
                                       
                                    
                                          i
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          index intervalu mezi pozorováními,
                                       
                                    
                                          m
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          maximální počet všech intervalů mezi pozorováními,
                                       
                                    
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          počet vylíhlých jedinců během daného intervalu mezi pozorováními i,
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          celkový počet vylíhlých jedinců celkem na konci pokusu ()
                                       
                                    
                                          xi
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          rychlost vývoje pakomárů vylíhlých v intervalu i,
                                       
                                    
                                 
                              kde:
                              
                                          deni
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          den pozorování (ve dnech od aplikace),
                                       
                                    
                                          li
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          délka intervalu i mezi pozorováními (ve dnech, obvykle 1 den).
                                       
                                    
                        
                     Protokol o zkoušce
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Protokol o zkoušce musí obsahovat minimálně tyto údaje:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkoušená látka:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikální povahu a případně fyzikálně-chemické vlastnosti (rozpustnost ve vodě, tlak par, rozdělovací koeficient v půdě (případně v sedimentu), stabilita ve vodě, atd.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      chemické identifikační údaje (obecný název, chemický název, strukturní vzorec, číslo CAS atd.) včetně čistoty a analytické metody pro kvantitativní stanovení zkoušené látky.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovací druh:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      užitá pokusná zvířata: druh, vědecký název, zdroj organismů a podmínky množení,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informace o nakládání se shluky vajíček a s larvami,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stáří testovaných zvířat po nasazení do zkušebních nádob.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkušební podmínky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použitý sediment, tj. přírodní nebo přísadami doplněný sediment,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      u přírodního sedimentu lokalita a popis místa odběru sedimentu, pokud možno včetně dřívější kontaminace, charakteristiky: pH, obsah organického uhlíku, poměr C/N a zrnitost (je-li to vhodné),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      příprava přísadami doplněného sedimentu: složky a charakteristiky (obsah organického uhlíku, pH, vlhkost, atd. na začátku zkoušky),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      příprava zkušební vody (pokud se používá rekonstituovaná voda) a její charakteristiky (koncentrace kyslíku, pH, vodivost, tvrdost, atd. na začátku zkoušky),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hloubka sedimentu a vody nad sedimentem,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      objem vody nad sedimentem a kapilární vody, hmotnost vlhkého sedimentu s kapilární vodou a bez ní,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zkušební nádoby (materiál a rozměry),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda přípravy zásobních roztoků a zkušební koncentrace,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aplikace zkoušené látky, použité zkušební koncentrace, počet duplikátních vzorků a případné použití rozpouštědla,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inkubační podmínky: teplota, cyklus a intenzita světla, provzdušňování (frekvence a intenzita),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné informace o krmení včetně typu krmiva, přípravy, množství a režimu krmení.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominální zkušební koncentrace, naměřené zkušební koncentrace a výsledky všech analýz pro stanovení koncentrace zkoušené chemické látky ve zkušební nádobě,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kvalita vody ve zkušebních nádobách, tj. pH, teplota, rozpuštěný kyslík, tvrdost a amoniak,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      případné nahrazování odpařené zkušební vody,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet vylíhlých samců a samic pakomárů na nádobu a na den,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet larev, z nichž se nevylíhli dospělci, na nádobu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      průměrná individuální hmotnost sušiny larev na nádobu a případně na instar,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      procento vylíhlých jedinců na duplikátní vzorek a zkušební koncentraci (směsný vzorek samců a samic pakomárů),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      průměrná rychlost vývoje plně vylíhlých pakomárů na duplikátní vzorek a aplikované množství (směsný vzorek samců a samic pakomárů),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odhady koncových bodů toxicity, např. ECx (a související intervaly spolehlivosti), NOEC a/nebo LOEC a statistické metody použité k jejich stanovení,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      diskuse o výsledcích včetně případného vlivu na výsledek zkoušky v důsledku odchylek od této zkušební metody.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA:
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Kapitola C.8 této přílohy, Toxicita pro žížaly,
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303.
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096–1121.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491.
                           
                        
                              19)
                           
                           
                              Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117.
                           
                        
                              20)
                           
                           
                              Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510–531.
                           
                        
                              21)
                           
                           
                              Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48:577–585.
                           
                        
                              22)
                           
                           
                              Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.
                           
                        
                              23)
                           
                           
                              Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485–1494.
                           
                        
                              24)
                           
                           
                              Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312.
                           
                        
                     Dodatek 1
                     DEFINICE
                     Pro účely této metody se použijí tyto definice:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Přísadami doplněný sediment nebo rekonstituovaný, umělý nebo syntetický sediment je směs materiálů užitá k napodobení fyzických složek přírodního sedimentu.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Voda nad sedimentem je voda nacházející se nad sedimentem ve zkušební nádobě.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Intersticiální voda nebo kapilární voda je voda zabírající prostor mezi sedimentem a částicemi půdy.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Obohacená voda je zkušební voda, do níž byla přidána zkoušená látka.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Zkoušená chemická látka: jakákoli látka nebo směs testovaná pomocí této zkušební metody.
                              
                           
                  
                     Dodatek 2
                     
                        Doporučení pro kultivaci kultury Chironomus riparius
                        
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Larvy rodu Chironomus lze chovat v krystalizačních miskách nebo ve větších nádobách. Jemný křemičitý písek se rozprostře po dně nádoby v tenké vrstvě silné 5 až 10 mm. Bylo prokázáno, že substrátem vhodným jako podklad je také křemelina (např. Merck, čl. 8117), (dostačující je tenčí vrstva silná jen několik málo mm). Následně se přidá několikacentimetrová vrstva vhodné vody. Objem vody by se měl podle potřeby doplňovat s cílem nahradit ztráty vzniklé odpařováním a zabránit vysychání. Vodu lze v případě potřeby vyměnit. Je třeba zajistit mírné provzdušňování. Nádoby, v nichž jsou larvy chovány, by měly být umístěny ve vhodné kleci, která zabrání úniku líhnoucích se dospělců. Tato klec by měla být dostatečně velká, aby umožňovala rojení vylíhlých dospělců, jinak by nemuselo dojít k jejich páření (minimum je přibližně 30×30×30 cm).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Klece by měly být umístěny při pokojové teplotě nebo v místnosti s konstantní teplotou 20 ± 2 °C s fotoperiodou 16 hodin světlo (intenzity přibližně 1 000 lux) a 8 hodin tma. Bylo zjištěno, že vzdušná vlhkost nižší než 60 % RH může bránit rozmnožování.
                              
                           
                        Ředicí voda
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Lze použít jakoukoli vhodnou přírodní nebo syntetickou vodu. Zpravidla se užívá studniční voda, odchlorovaná vodovodní voda a umělá média (např. Elendtovo médium „M4“ nebo „M7“, viz níže). Vodu je před použitím nutno provzdušnit. Je-li to nutné, lze kultivační vodu obnovit opatrným odlitím nebo odčerpáním použité vody z kultivačních nádob tak, aby nedošlo k poškození schránek larev.
                              
                           
                        Krmení larev
                     
                     
                                 4.
                              
                              
                                 Larvy rodu Chironomus by se měly krmit vločkovým krmivem pro ryby (TetraMin(®, Tetra Phyll® nebo jiná podobná značka patentovaného krmiva pro ryby), v množství přibližně 250 mg na nádobu a den. Potravu lze aplikovat v podobě suchého mletého prášku nebo v podobě suspenze ve vodě: 1,0 g vločkového krmiva se přidá do 20 ml ředicí vody a vytvoří se homogenní směs. Tento přípravek lze dodávat rychlostí přibližně 5 ml na nádobu na den (před použitím protřepat). Starším larvám lze přidat více krmiva.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Krmení se upraví podle kvality vody. V případě, že se kultivační médium „zakalí“, je třeba krmnou dávku snížit. Přidávání potravy je nutno pečlivě sledovat. Příliš malé množství krmiva způsobí, že larvy opouštějí sediment a vznášejí se ve vodním sloupci, a příliš mnoho krmiva způsobí zvýšenou mikrobiální činnost a pokles koncentrace kyslíku. Obojí může způsobit snížení rychlosti růstu.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Do nových kultivačních nádob mohou být přidány i buňky zelených řas (např. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris).
                              
                           
                        Krmení vylíhlých dospělců
                     
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Někteří experimentátoři se domnívají, že jako potrava vylíhlých dospělců může sloužit vata namočená do nasyceného roztoku sacharózy.
                              
                           
                        Líhnutí
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Dospělci se začnou v chovných nádobách líhnout při teplotě 20 ± 2 °C přibližně po 13–15 dnech. Samce lze snadno rozlišit podle vějířovitých tykadel.
                              
                           
                        Shluky vajíček
                     
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Jakmile se ve snubní komůrce nacházejí dospělci, je třeba třikrát týdně kontrolovat všechny reprodukční nádoby, zda se v nich nacházejí shluky vajíček spojené želatinózní hmotou. Pokud se zde shluky vajíček nacházejí, je nutno je opatrně odstranit a přemístit do malé misky obsahující vzorek chovného vodního prostředí. Shluky vajíček se užijí pro založení nové nádoby s kulturou (např. 2–4 shluky vajíček na nádobu) nebo se užijí pro zkoušky toxicity.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Larvy prvního instarového stadia by se měly vylíhnout za 2–3 dny.
                              
                           
                        Zakládání nových kultivačních nádob
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Jakmile jsou kultury založeny, mělo by být možné zakládat nové nádoby s kulturami larev jednou týdně nebo méně často v závislosti na zkušebních požadavcích a odstraňovat starší nádoby po vylíhnutí dospělců. Pomocí tohoto systému se zajistí pravidelné dodávky dospělců s minimální potřebou dohledu.
                              
                           
                        Příprava zkušebních roztoků „M4“ a „M7“
                     
                     
                                 12.
                              
                              
                                 Elendt (1990) popsal médium „M4“. Médium „M7“ se připraví obdobně jako médium „M4“ s výjimkou látek uvedených v tabulce 1, u nichž jsou koncentrace u „M7“ čtyřikrát nižší než u „M4“. Připravuje se publikace o médiu „M7“ (Elendt, osobní sdělení). Podle Elendta a Biase (1990) by se zkušební roztok neměl připravovat pro koncentrace NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 a K2HPO4 vzhledem k tomu, že nejsou pro přípravu zásobních roztoků vyhovující.
                              
                           
                        Příprava média „M7“
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Každý zásobní roztok (I) se připraví samostatně a z těchto zásobních roztoků (I) se pak připraví kombinovaný zásobní roztok (II) (viz tabulka 1). Médium „M7“ se připraví přidáním 50 ml kombinovaného zásobního roztoku (II) a množství zásobního roztoku jednotlivých makroživin, které jsou uvedeny v tabulce 2, do 1 litru deionizované vody. Připraví se vitaminový zásobní roztok přidáním tří vitaminů do deionizované vody, jak je uvedeno v tabulce 3, a 0,1 ml kombinovaného vitaminového zásobního roztoku se přidá do výsledného média „M7“ krátce před použitím. (Vitaminový zásobní roztok se uskladňuje zmrazený v malých alikvotních dílech.) Médium se provzdušní a stabilizuje.
                                 
                                    Tabulka 1
                                 
                                 
                                    Zásobní roztoky stopových prvků pro médium M4 a M7
                                 
                                 
                                             Zásobní roztoky (I)
                                          
                                          
                                             Množství (mg) doplněné na 1 litr deionizované vody
                                          
                                          
                                             Kombinovaný zásobní roztok (II) se připraví smícháním následujících množství (v ml) zásobních roztoků (I) a doplněním na 1 litr deionizované vody
                                          
                                          
                                             Konečné koncentrace ve zkušebním roztoku (mg/l)
                                          
                                       
                                             M4
                                          
                                          
                                             M7
                                          
                                          
                                             M4
                                          
                                          
                                             M7
                                          
                                       
                                             H3BO3
                                                 (18)
                                             
                                          
                                          
                                             57 190
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             2,86
                                          
                                          
                                             0,715
                                          
                                       
                                             MnCl2 · 4 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             7 210
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,361
                                          
                                          
                                             0,090
                                          
                                       
                                             LiCl (18)
                                             
                                          
                                          
                                             6 120
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,306
                                          
                                          
                                             0,077
                                          
                                       
                                             RbCl (18)
                                             
                                          
                                          
                                             1 420
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,071
                                          
                                          
                                             0,018
                                          
                                       
                                             SrCl2 · 6 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             3 040
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,152
                                          
                                          
                                             0,038
                                          
                                       
                                             NaBr (18)
                                             
                                          
                                          
                                             320
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,016
                                          
                                          
                                             0,004
                                          
                                       
                                             Na2MoO4 · 2 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             1 260
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,063
                                          
                                          
                                             0,016
                                          
                                       
                                             CuCl2 · 2 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             335
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,017
                                          
                                          
                                             0,004
                                          
                                       
                                             ZnCl2
                                             
                                          
                                          
                                             260
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,013
                                          
                                          
                                             0,013
                                          
                                       
                                             CaCl2 · 6 H2O
                                          
                                          
                                             200
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,010
                                          
                                          
                                             0,010
                                          
                                       
                                             KI
                                          
                                          
                                             65
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,0033
                                          
                                          
                                             0,0033
                                          
                                       
                                             Na2SeO3
                                             
                                          
                                          
                                             43,8
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,0022
                                          
                                          
                                             0,0022
                                          
                                       
                                             NH4VO3
                                             
                                          
                                          
                                             11,5
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,00058
                                          
                                          
                                             0,00058
                                          
                                       
                                             Na2EDTA · 2 H2O (18)
                                                 (19)
                                             
                                          
                                          
                                             5 000
                                          
                                          
                                             20,0
                                          
                                          
                                             5,0
                                          
                                          
                                             2,5
                                          
                                          
                                             0,625
                                          
                                       
                                             FeSO4 · 7 H2O (18)
                                                 (19)
                                             
                                          
                                          
                                             1 991
                                          
                                          
                                             20,0
                                          
                                          
                                             5,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,249
                                          
                                       
                                    Tabulka 2
                                 
                                 
                                    Zásobní roztoky makroživin pro médium M4 a M7
                                 
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Množství doplněné na 1 litr deionizované vody
                                             (mg)
                                          
                                          
                                             Množství zásobních roztoků makroživin přidané za účelem přípravy média M4 a M7
                                             (ml/l)
                                          
                                          
                                             Konečné koncentrace ve zkušebním roztoku M4 a M7
                                             (mg/l)
                                          
                                       
                                             CaCl2 · 2 H2O
                                          
                                          
                                             293 800
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             293,8
                                          
                                       
                                             MgSO4 · 7 H2O
                                          
                                          
                                             246 600
                                          
                                          
                                             0,5
                                          
                                          
                                             123,3
                                          
                                       
                                             KCl
                                          
                                          
                                             58 000
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             5,8
                                          
                                       
                                             NaHCO3
                                             
                                          
                                          
                                             64 800
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             64,8
                                          
                                       
                                             NaSiO3 · 9 H2O
                                          
                                          
                                             50 000
                                          
                                          
                                             0,2
                                          
                                          
                                             10,0
                                          
                                       
                                             NaNO3
                                             
                                          
                                          
                                             2 740
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,274
                                          
                                       
                                             KH2PO4
                                             
                                          
                                          
                                             1 430
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,143
                                          
                                       
                                             K2HPO4
                                             
                                          
                                          
                                             1 840
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,184
                                          
                                       
                                    Tabulka 3
                                 
                                 
                                    Vitaminový zásobní roztok pro médium M4 a M7
                                 
                                 Všechny tři vitaminové roztoky se smísí do jediného vitaminového zásobního roztoku.
                                 
                                    
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Množství doplněné na 1 litr deionizované vody
                                             (mg)
                                          
                                          
                                             Množství vitaminového zásobního roztoku přidané za účelem přípravy média M4 a M7
                                             (ml/l)
                                          
                                          
                                             Konečné koncentrace ve zkušebním roztoku M4 a M7
                                             (mg/l)
                                          
                                       
                                             Thiaminhydrochlorid
                                          
                                          
                                             750
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,075
                                          
                                       
                                             Kyanokobalamin (B12)
                                          
                                          
                                             10
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,0010
                                          
                                       
                                             Biotin
                                          
                                          
                                             7,5
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,00075
                                          
                                       
                           
                        LITERATURA:
                     
                     BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.
                     Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33.
                     Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167.
                  
                  
                     Dodatek 3
                     PŘÍPRAVA PŘÍSADAMI DOPLNĚNÉHO SEDIMENTU
                     
                        Složení sedimentu
                     
                     Složení přísadami doplněného sedimentu by mělo být následující:
                     
                                 Složka
                              
                              
                                 Charakteristika
                              
                              
                                 % sušiny
                                 sedimentu
                              
                           
                                 Rašelina:
                              
                              
                                 rašelina mechu Sphagnum s pH co nejblíže 5,5 až 6,0, bez viditelných zbytků rostlin a jemně mletá (velikost částic ≤ 1 mm) a vysušená na vzduchu
                              
                              
                                 4–5
                              
                           
                                 Křemičitý písek
                              
                              
                                 velikost zrn: > 50 % částic musí být v rozpětí 50–200 μm
                              
                              
                                 75–76
                              
                           
                                 Kaolinitický jíl
                              
                              
                                 obsah kaolinitu≥ 30 %
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                 Organický uhlík
                              
                              
                                 upraven přidáním rašeliny a písku
                              
                              
                                 2 (± 0,5)
                              
                           
                                 Uhličitan vápenatý
                              
                              
                                 CaCO3, práškový, chemicky čistý
                              
                              
                                 0,05–0,1
                              
                           
                                 Voda
                              
                              
                                 vodivost ≤ 10 μS/cm
                              
                              
                                 30–50
                              
                           
                        Příprava
                     
                     Rašelina se usuší na vzduchu a rozemele se na jemný prášek. Připraví se suspenze požadovaného množství rašelinného prášku v deionizované vodě s použitím vysoce výkonného homogenizačního zařízení. pH této suspenze se upraví na 5,5 ± 0,5 pomocí CaCO3. Suspenze se kondicionuje po dobu nejméně dvou dní za mírného promíchávání při 20 ± 2 °C za účelem stabilizace pH a vytvoření stabilní mikrobiální složky. Poté se opět změří pH, které by se mělo rovnat 6,0 ± 0,5. Pak se suspenze rašeliny smísí s ostatními složkami (písek a kaolín) a s deionizovanou vodou s cílem získat homogenní sediment s obsahem vody v rozmezí 30–50 procent sušiny sedimentu. Znovu se změří pH konečné směsi a v případě nutnosti je opět upraveno pomocí CaCO3 na hodnotu 6,5 až 7,5. Odeberou se vzorky sedimentu pro stanovení obsahu sušiny a obsahu organického uhlíku. Následně se doporučuje před použitím pro zkoušku toxicity pro pakomáry přísadami doplněný sediment kondicionovat po dobu sedmi dnů za stejných podmínek, které převládají v následné zkoušce.
                     
                        Skladování
                     
                     Suché složky pro přípravu umělého sedimentu lze skladovat na suchém a chladném místě při pokojové teplotě. Přísadami doplněný (mokrý) sediment by neměl být před použitím ve zkoušce skladován. Měl by být použit ihned po uplynutí sedmidenního období kondicionování, kterým končí jeho příprava.
                     
                        LITERATURA:
                     
                     Kapitola C.8 této přílohy. Toxicita pro žížaly.
                     Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10–20.
                  
                  
                     Dodatek 4
                     
                        Chemické charakteristiky přípustné ředicí vody
                     
                     
                                 Látka
                              
                              
                                 Koncentrace
                              
                           
                                 Částice tuhé
                              
                              
                                 < 20 mg/l
                              
                           
                                 Celkový obsah organického uhlíku
                              
                              
                                 < 2 mg/l
                              
                           
                                 Neionizovaný amoniak
                              
                              
                                 < 1 μg/l
                              
                           
                                 Tvrdost jako CaCO3
                                 
                              
                              
                                 < 400 mg/l (20)
                                 
                              
                           
                                 Zbytkový chlor
                              
                              
                                 < 10 μg/l
                              
                           
                                 Celkové organické fosforové pesticidy
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Celkové organické chlorové pesticidy a polychlorované bifenyly
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Celkový organický chlor
                              
                              
                                 < 25 ng/l
                              
                           
                  
                     Dodatek 5
                     
                        Pokyny pro monitorování líhnutí larev pakomárů
                     
                     Na zkušební kádinky jsou umístěny výletové pasti. Tyto pasti jsou potřebné od 20. dne až do konce zkoušky. Níže je nakreslen příklad používané pasti:
                     
                        
                     
                                 A
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 nylonová síťka
                              
                           
                                 B
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 plastový kryt
                              
                           
                                 C
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 kádinka bez zobáčku
                              
                           
                                 D
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 otvory na výměnu vody
                              
                           
                                 E
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 voda
                              
                           
                                 F
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 sediment
                              
                           
                  C.29   HODNOCENÍ SNADNÉ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – UVOLŇOVÁNÍ CO2 V TĚSNĚ UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH (HEADSPACE TEST)
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda odpovídá pokynu OECD pro zkoušení (TG) 310 (2006). Tato zkušební metoda je screeningovou metodou pro hodnocení snadné biologické rozložitelnosti chemických látek a poskytuje obdobné informace jako šest zkušebních metod popsaných v kapitole C.4 této přílohy A až F. Proto lze chemickou látku, která v této zkušební metodě vykazuje pozitivní výsledky, považovat za snadno biologicky rozložitelnou a v důsledku toho rychle rozložitelnou v prostředí.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Dobře vyzkoušená metoda uvolňování oxidu uhličitého (CO2) (1), která je založena na původní Sturmově zkoušce (2) hodnocení biologické rozložitelnosti organických chemických látek měřením emisí oxidu uhličitého produkovaného mikrobiální činností, je zpravidla první možností testování špatně rozpustných a silně absorbujících chemických látek. Je užívána rovněž v případě rozpustných (avšak nikoli těkavých) látek, protože uvolňování oxidu uhličitého řada odborníků považuje za jediný nepochybný důkaz mikrobiální aktivity. Odstranění rozpuštěného organického uhlíku se může uskutečnit fyzikálně-chemickými procesy – adsorpcí, vypařováním, srážením, hydrolýzou, ale je spotřebováván i mikrobiální činností a při řadě nebiologických reakcí; jen vzácně vzniká CO2 z organických sloučenin abioticky. V původní a modifikované Sturmově zkoušce (1, 2) se odstraní CO2 z kapalné fáze do absorpčních nádob probubláváním (tj. bublající vzduch upravený na odstraňování CO2 prostřednictvím kapalného prostředí), zatímco v Larsonově verzi (3, 4) se CO2 přenáší z reakční nádoby do absorbérů proháněním vzduchu bez CO2 přes plynnou fázi, a navíc neustálým třepáním zkušební nádobou. Pouze v Larsonově modifikaci se reakční nádobou třepe; míchání je určeno pouze pro nerozpustné látky podle normy ISO 9439 (5) a v originální americké verzi (6), které obě uvádějí probublávání, a nikoli nahrazování plynné fáze. V jiné oficiální metodě US EPA (7) založené na Gledhillově metodě (8) se třesená reakční nádoba uzavře před atmosférou a vytvořený CO2 se shromažďuje ve vnitřním zásaditém zařízení pro zachycování přímo z plynné fáze, stejně jako v klasických Warburg/Barcroftových respirometrických baňkách.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              U anorganického uhlíku (IC) však bylo prokázáno, že se při použití standardní modifikované Sturmovy zkoušky u řady chemických látek hromadí v médiu (9). Při rozkladu 20 mg C/l anilinu byla zjištěna koncentrace IC až 8 mg/l. To znamená, že zachycování CO2 v zásaditém zařízení pro zachycování neposkytovalo věrný obraz o množství CO2 vyprodukovaného mikrobiologicky v mezičasech během rozkladu. V důsledku této skutečnosti nebude specifikace, že > 60 % teoretické maximální produkce CO2 (TCO2) se musí shromáždit v průběhu „10denního období rozkladu“ (10 dnů, které následují bezprostředně po dosažení 10 % rozkladu), aby bylo možno zkoušenou chemickou látku klasifikovat jako snadno biologicky rozložitelnou, dodržena u některých chemických látek, které by byly takto klasifikovány pomocí odstranění rozpuštěného organického uhlíku (DOC).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Když má procento rozkladu nižší než předpokládanou hodnotu, je možné, že dochází k hromadění IC ve zkušebním roztoku. V takovém případě lze rozložitelnost odhadnout pomocí ostatních zkoušek snadné biologické rozložitelnosti.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Další nedostatky Sturmovy metodiky (těžkopádná, časově náročná, náchylnější k experimentálním chybám a nepoužitelná pro těkavé chemické látky) již dříve podnítily snahu hledat jinou než Gledhillovu techniku využívající těsně uzavřené nádoby, která by nebyla založena na průtoku plynu. (10, 11). Boatman a spolupracovníci (12) přezkoumali již existující metody a přijali metodu systému těsně uzavřených lahviček, v nichž se CO2 uvolňuje do plynné fáze na konci inkubace po okyselení média. Obsah CO2 byl měřen pomocí plynové chromatografie (analýza GC)/IC) ve vzorcích automaticky odebíraných z plynné fáze, avšak nebyl zohledněn rozpuštěný anorganický uhlík (DIC) v kapalné fázi. Rovněž použité nádobky byly velmi malé (20 ml) a obsahovaly pouze 10 ml média, což bylo příčinou problémů, např. při přidávání množství nerozpustných zkoušených chemických látek, které nutně muselo být jen velmi malé, případně vzhledem k přítomnosti nedostatečného nebo nulového množství mikroorganismů schopných rozložit zkoušené chemické látky v inokulovaném médiu.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Tyto obtíže překonaly nezávislé studie Struijse a Stoltenkampa (13) a Birche a Fletchera (14), přičemž poslední z uvedených byli inspirováni svými zkušenostmi se zařízením používaným při zkoušce anaerobního biologického rozkladu (15). Při užití původní metody (13) se měří CO2 v plynné fázi po okyselení a ustavení rovnováhy, zatímco ve druhém případě (14) se měřil DIC v plynné i v kapalné fázi bez expozice; přes 90 % vytvořeného IC se nacházelo v kapalné fázi. Obě metody mají oproti Sturmově zkoušce výhodu v tom, že zkušební systém byl kompaktnější a lépe ovladatelný, lze v něm zkoušet těkavé chemické látky a lze se vyhnout zpoždění při měření vyprodukovaného CO2.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Oba tyto přístupy byly spojeny v normě ISO upravující CO2„headspace“ metodu (16), která byla zkoušena v mezilaboratorních porovnávacích zkouškách (17), a tato norma tvoří základ této zkušební metody. Oba uvedené přístupy byly použity rovněž v metodě US EPA (18). Jsou doporučovány dvě metody měření CO2, a to měření CO2 v plynné fázi po okyselení (13) a IC v kapalné fázi po přídavku nadbytku zásady. Druhou metodu zavedl Peterson při mezilaboratorní porovnávací zkoušce CONCAWE (19) této headspace metody upravené tak, aby měřila vlastní biologickou rozložitelnost. Do této zkušební metody byly začleněny změny provedené při přepracování těchto metod z roku 1992 (20) v kapitole C.4 této přílohy o snadné biologické rozložitelnosti, takže podmínky (médium, trvání apod.) jsou jinak stejné jako podmínky v přepracované Sturmově zkoušce (20). Birch a Fletcher (14) ukázali, že pomocí této headspace zkoušky byly získány velmi podobné výsledky jako u stejných chemických látek v mezilaboratorní porovnávací zkoušce přepracovaných zkušebních metod OECD (21).
                           
                        PODSTATA ZKOUŠKY
                  
                              8.
                           
                           
                              Zkoušená látka se zpravidla v koncentraci 20 mg C/l jako jediný zdroj uhlíku a energie inkubuje v pufru – médiu vytvořeném z minerálních solí, které je inokulováno směsnou kulturou mikroorganismů. Zkouška se provádí v těsně uzavřených nádobách s určitým volným objemem vzduchu pod víčkem, který představuje rezervoár kyslíku pro aerobní biologický rozklad. Uvolňování CO2 v důsledku úplného aerobního biologického rozkladu zkoušené chemické látky se stanoví měřením produkce IC ve zkušebních nádobách, která je větší než produkce slepým stanovením u nádob obsahujících pouze inokulované médium. Stupeň biologického rozkladu se vyjadřuje v procentech teoretické maximální produkce anorganického uhlíku (ThIC), vztažené k množství zkoušené chemické látky (jako je například organický uhlík) přidané na začátku zkoušky.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              U zkoušených látek lze stanovit také úbytek DOC a/nebo rozsah primárního biologického rozkladu nebo zkoušené chemické látky (20).
                           
                        INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE
                  
                              10.
                           
                           
                              Pro výpočet procenta rozkladu musí být znám obsah organického uhlíku (% w/w) ve zkoušené chemické látce, a to buď na základě její chemické struktury, nebo na základě měření. U těkavých zkoušených látek je pro stanovení vhodného poměru mezi plynnou a kapalnou fází vhodné použít změřenou nebo vypočítanou Henryho konstantu. Informace o toxicitě zkoušené látky pro mikroorganismy jsou užitečné při výběru vhodné zkušební koncentrace a při interpretaci výsledků, které ukazují na špatnou biologickou rozložitelnost; doporučuje se zahrnout kontrolu inhibice s výjimkou případů, kdy je známo, že zkoušená látka nepůsobí inhibičně na mikrobiální aktivity (viz odstavec 24).
                           
                        VHODNOST ZKUŠEBNÍ METODY
                  
                              11.
                           
                           
                              Zkoušku lze použít pro zkoušené chemické látky, které jsou rozpustné ve vodě, i pro nerozpustné zkoušené chemické látky, avšak je nezbytné, aby se zkoušená chemická látka dobře rozptýlila. Při použití doporučeného poměru 1:2 mezi plynnou a kapalnou fází lze zkoušet těkavé chemické látky s Henryho konstantou do 50 Pa.m3.mol–1 vzhledem k tomu, že podíl zkoušené chemické látky v plynné fázi nepřesáhne 1 % (13). Při zkoušení chemických látek, které jsou méně stálé, lze použít menší objem plynné fáze, avšak jejich biologická dostupnost může být omezující, zejména v případě, že jsou špatně rozpustné ve vodě. Uživatelé však musí zajistit, aby poměr mezi plynnou a kapalnou fází a koncentrace zkoušené chemické látky byly takové, aby zajišťovaly dostatečnou koncentraci kyslíku v plynné fázi pro úplný aerobní biologický rozklad (např. je nutné se vyvarovat použití vysokých koncentrací substrátu a malého objemu plynné fáze). Pokyny týkající se této problematiky lze nalézt v bodech (13, 23).
                           
                        REFERENČNÍ CHEMICKÉ LÁTKY
                  
                              12.
                           
                           
                              Za účelem kontroly zkušebního postupu by měla být současně zkoušena referenční látka známé biologické rozložitelnosti. Za tímto účelem lze použít anilin, benzoát sodný nebo ethylenglykol pro zkoušení chemických látek rozpustných ve vodě a oktan-1-ol pro špatně rozpustné zkoušené chemické látky (13). Biologický rozklad těchto látek musí do 14 dnů dosáhnout > 60 % ThIC.
                           
                        REPRODUKOVATELNOST
                  
                              13.
                           
                           
                              V mezilaboratorní porovnávací zkoušce této metody dle ISO (17), byly při dodržení doporučených podmínek včetně koncentrace zkoušené chemické látky 20 mg C/l dosaženy tyto výsledky:
                              
                                          Zkoušená chemická látka
                                       
                                       
                                          Průměrné procento biologického rozkladu
                                          (28 d)
                                       
                                       
                                          Variační koeficient
                                          (%)
                                       
                                       
                                          Počet laboratoří
                                       
                                    
                                          Anilin
                                       
                                       
                                          90
                                       
                                       
                                          16
                                       
                                       
                                          17
                                       
                                    
                                          Oktan-1-ol
                                       
                                       
                                          85
                                       
                                       
                                          12
                                       
                                       
                                          14
                                       
                                    Mezilaboratorní variabilita (reprodukovatelnost) byla u anilinu nízká, přičemž variační koeficient téměř u všech zkoušek nepřesáhl 5 %. V obou případech, kdy byla reprodukovatelnost nižší, byla vyšší variabilita pravděpodobně důsledkem vysoké produkce IC u slepého stanovení. Reprodukovatelnost u oktan-1-olu byla nižší, přesto však byla u 79 % zkoušek nižší než 10 %. Tato větší variabilita v rámci zkoušek může být způsobena chybami v dávkování vzhledem k tomu, že do pevně uzavřených zkušebních lahviček je nutno vstříknout malý objem (3–4 μl) oktan-1-olu. Vyšších variačních koeficientů by bylo dosaženo při použití nižších koncentrací zkoušené chemické látky, a to zejména v koncentracích nižších než 10 mg C/l. Tomu by bylo možné částečně předejít snížením koncentrace celkového anorganického uhlíku (TIC) v inokulu.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              V mezilaboratorní porovnávací zkoušce EU (24) byly z pěti povrchově aktivních látek přidaných na 10 mg C/l získány tyto výsledky:
                              
                                          Zkoušená chemická látka
                                       
                                       
                                          Průměrné procento biologického rozkladu
                                          (28 d)
                                       
                                       
                                          Variační koeficient
                                          (%)
                                       
                                       
                                          Počet laboratoří
                                       
                                    
                                          Tetrapropylen
                                          Benzensulfonát
                                       
                                       
                                          17
                                       
                                       
                                          45
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Di-iso-oktylsulfo-sukcinát
                                          (aniontový)
                                       
                                       
                                          72
                                       
                                       
                                          22
                                       
                                       
                                          9
                                       
                                    
                                          Hexadecyl-trimethyl (21)
                                          
                                          Chlorid amonný
                                          (kationtový)
                                       
                                       
                                          75
                                       
                                       
                                          13
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Iso-nonylfenol -(ethoxylát)9
                                             
                                          
                                          (neiontový)
                                       
                                       
                                          41
                                       
                                       
                                          32
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Kokamidopropyl
                                          Dimethylhydroxy
                                          sulfobetain
                                          (amfoterní)
                                       
                                       
                                          60
                                       
                                       
                                          23
                                       
                                       
                                          11
                                       
                                    Výsledky ukazují, že obecně platí, že variabilita byla vyšší u hůře rozložených povrchově aktivních látek. Variabilita v rámci zkoušky byla u více než 90 % případů nižší než 15 %, přičemž nejvyšší dosáhla 30–40 %.
                              
                                          POZNÁMKA:
                                       
                                       
                                          Většina povrchově aktivních látek nejsou jednotlivé molekuly, ale jedná se o směsi izomerů, homology atd., které se rozkládají po různých charakteristických lagových fázích a podle různých kinetických rychlostních konstant vedoucích k „rozostření“ zeslabených křivek, takže 60 % hodnoty „vyhověla“ nelze dosáhnout v rámci „10denního období rozkladu“, i kdyby každá jednotlivá molekula dosáhla hodnoty > 60 % během 10 dnů, pokud by byla testována samostatně. Obdobně je tomu při použití jiných komplexních směsí.
                                       
                                    
                        POPIS METODY
                  
                     Přístroje a pomůcky
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Obvyklé laboratorní vybavení a dále:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          skleněné lahvičky na sérum, těsně uzavřené pryžovým septem z butylkaučuku s hliníkovými lemovacími uzávěry. Doporučená velikost je „125 ml“, která má celkový objem asi 160 ml (v tomto případě by mělo být známo, že objem každé láhve je 160 ± 1 ml). Menší nádobu lze použít tehdy, pokud výsledky splňují podmínky uvedené v odstavcích 66 a 67;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          analyzátor uhlíku nebo jiný přístroj (například plynový chromatograf) ke stanovení anorganického uhlíku;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          stříkačky s vysokou přesností pro plynné a vodné vzorky;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          orbitální třepačka v termostatovaném prostředí;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          zásoba vzduchu bez CO2 – lze ji připravit proháněním vzduchu přes granule natronového vápna nebo použitím plynné směsi 80 % N2 a 20 % O2 (nepovinné) (viz odstavec 28);
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          zařízení pro filtraci s membránovými filtry porozity 0,20 až 0,45 μm (nepovinné);
                                       
                                    
                                          g)
                                       
                                       
                                          analyzátor organického uhlíku (nepovinné).
                                       
                                    
                        
                     Činidla
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Používají se pouze chemikálie zaručené analytické jakosti.
                           
                        
                     Voda
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Měla by se používat destilovaná nebo deionizovaná voda s celkovým obsahem organického uhlíku ≤ 1 mg/l. To představuje ≤ 5 % z počáteční hodnoty organického uhlíku vneseného doporučenou dávkou zkoušené chemické látky.
                           
                        
                     Zásobní roztoky pro médium s minerálními solemi
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Zásobní roztoky a médium s minerálními solemi jsou obdobné jako u zkoušek „snadné biologické rozložitelnosti“ podle ISO 14593 (16) a C.4 (20). Použití vyšší koncentrace chloridu amonného (2,0 g/l místo 0,5 g/l) by mělo být nutné jen ve velmi výjimečných případech, např. tehdy, pokud je koncentrace zkoušené chemické látky > 40 mg C/l. Zásobní roztoky by měly být skladovány v chladničce a zlikvidovány po šesti měsících, nebo dříve, pokud dochází k tvorbě sraženin nebo růstu mikroorganismů. Připraví se tyto zásobní roztoky:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          Bezvodý dihydrogenfosforečnan draselný (KH2PO4) 8,50 g
                                          Bezvodý hydrogenfosforečnan draselný (K2HPO4) 21,75 g
                                          Dihydrát hydrogenfosforečnanu sodného (Na2HPO4.2H2O) 33,40 g
                                          Chlorid amonný(NH4Cl) 0,50 g
                                          Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. pH tohoto roztoku musí být 7,4 (± 0,2). Pokud tomu tak není, připraví se nový roztok.
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          Dihydrát chloridu vápenatého (CaCl2.2H2O) 36,40 g
                                          Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          Heptahydrát síranu hořečnatého (MgSO4.7H2O) 22,50 g
                                          Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          Hexahydrát chloridu železitého (FeCl3.6H20) 0,25 g
                                          Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr a přidá se kapka koncentrované kyseliny chlorovodíkové.
                                       
                                    
                        
                     Příprava minerálního média
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Smísí se 10 ml roztoku a) s přibližně 800 ml vody (odstavec 17), přidá se po 1 ml roztoků b), c) a d) a doplní se vodou na 1 litr (odstavec 17).
                           
                        
                     Další činidla
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Koncentrovaná kyselina orthofosforečná (H3PO4) (> 85 % hmotnosti na objem).
                           
                        
                     Roztok hydroxidu sodného 7M
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              V litru vody se rozpustí 280 g hydroxidu sodného (NaOH) (odstavec 17). Stanoví se koncentrace DIC tohoto roztoku a tato hodnota se bere v úvahu při výpočtu výsledku zkoušky (viz odstavce 55 a 61), zejména ve světle kritéria validity v odstavci 66 b). Pokud je koncentrace DIC příliš vysoká, použije se čerstvě připravený roztok.
                           
                        
                     Zkoušená látka
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Připraví se zásobní roztok zkoušené chemické látky dostatečně rozpustné ve vodě (odstavec 17) nebo ve zkušebním médiu (odstavec 19) v koncentraci optimálně stonásobně vyšší, než bude výsledná koncentrace při zkoušce; může být nutné upravit pH zásobního roztoku. Zásobní roztok se přidá do minerálního média tak, aby konečná koncentrace organického uhlíku byla 2 až 40 mg C/l, optimálně 20 mg C/l. Při použití nižších koncentrací může dojít k omezení výsledné přesnosti. Rozpustné i nerozpustné kapalné chemické látky mohou být do nádob dávkovány přímo stříkačkami s vysokou přesností. Málo rozpustné a nerozpustné zkoušené chemické látky mohou vyžadovat speciální zacházení (25). Lze použít následující postupy:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          přímý přídavek známých odvážených množství;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          dispergace ultrazvukem před přidáním;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          dispergace za přídavku emulgačních činidel, která bude nezbytná pro zjištění, zda mají inhibiční nebo stimulační účinky na mikrobiální aktivitu před přidáním;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          adsorpce kapalných zkoušených chemických látek nebo roztoku ve vhodném těkavém rozpouštědle, na inertním nosiči nebo prostředí (např. filtr ze skleněných vláken) s následným odpařením rozpouštědla, pokud bylo použito, a přímé přidání známého množství;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          přidání známého množství roztoku zkoušené chemické látky v lehce těkavém rozpouštědle do prázdné zkušební nádoby a následné odpaření rozpouštědla.
                                       
                                    Prostředky nebo rozpouštědla užitá v písmenech c), d) a e) musí být testovány na případné stimulační nebo inhibiční účinky na mikrobiální aktivitu (viz odstavec 42 (b)).
                           
                        
                     Referenční chemická látka
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Připraví se zásobní roztok (rozpustné) referenční chemické látky ve vodě (odstavec 17) v koncentraci optimálně stonásobně vyšší než bude výsledná koncentrace (20 mg C/l) při zkoušce.
                           
                        
                     Kontrola inhibice
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              U zkoušených chemických látek často nedochází k významnému rozkladu za podmínek užitých při stanovení snadného biologického rozkladu. Jednou z možných příčin je to, že zkoušená látka působí inhibičně na inokulum v koncentraci užité při zkoušce. Do zkoušky může být zahrnuta kontrola inhibice s cílem usnadnit (zpětnou) identifikaci inhibice jako možné příčiny nebo přispívajícího faktoru. Kontrola inhibice může rovněž vyloučit takové interference a prokázat, že nulový nebo jen mírný rozklad je důsledkem výhradně nedostatečné náklonnosti k mikrobiologickému napadení za podmínek zkoušky. Pro získání informací o toxicitě zkoušené chemické látky pro (aerobní) mikroorganismy se připraví roztok ve zkušebním médiu obsahujícím zkoušenou látku a referenční chemickou látku (bod 19) obsahující stejnou koncentraci jak zkoušené chemické látky, tak referenční chemické látky (viz odstavec 22 a 23).
                           
                        
                     Inokulum
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod (nechlorovaných), z povrchových vod a půd nebo z jejich směsi (20). Aktivita zdroje z hlediska biologického rozkladu se ověří referenční látkou. Bez ohledu na zdroj by v případě, že se postup má užít jako zkouška na snadnou biologickou rozložitelnost, neměly použít mikroorganismy, které byly již dříve vystaveny působení zkoušené chemické látky.
                              
                                          
                                             Upozornění:
                                          
                                       
                                       
                                          Aktivovaný kal, odpadní voda a splašková voda obsahují patogenní organismy a je nutno s nimi zacházet s opatrností.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              Na základě zkušeností se optimálním objemem inokula rozumí:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          objem, který vykazuje dostatečnou aktivitu k biologickému rozkladu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          objem, který rozkládá referenční látku v dohodnuté procentuální míře (viz odstavec 66)
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          objem obsahující 102 až 105 kolonie tvořících jednotek v 1 ml konečné směsi,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          objem, který obvykle poskytuje koncentraci sušiny aktivovaného kalu ve výsledné směsi 4 mg/l (koncentrace až do 30 mg/l jsou možné, mohou však významně ovlivnit produkci CO2 slepého stanovení (26),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          objem, který poskytuje koncentraci rozpuštěného organického uhlíku v inokulu menší než 10 % počáteční koncentrace organického uhlíku v přidané zkoušené látce,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          obecně objem 1–10 ml inokula na litr zkoušeného roztoku.
                                       
                                    
                        
                     Aktivovaný kal
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Odebere se čerstvý vzorek aktivovaného kalu z aerační nádrže čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. Pokud je to nutné, odstraní se hrubé částice filtrací sítem (např. s velikostí ok 1 mm2) a kal se udržuje za aerobních podmínek.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Kal se může po odstranění hrubých částic také usadit nebo odstředit (např. 1 100 × g po dobu 10 minut). Kapalná fáze nad usazeninou se odstraní. Kal lze promýt minerálním roztokem. Koncentrovaný kal se suspenduje v minerálním médiu na koncentraci 3–5 g suspendovaných tuhých látek na litr. Následně se kal před použitím provzdušňuje.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Kal by měl být odebrán z dobře fungující konvenční čistírny. Je-li nutné odebrat kal z čistírny s vysokým výkonem, nebo předpokládá-li se, že kal obsahuje inhibitory, je třeba jej promýt. Po důkladném promíchání se kal nechá usadit nebo se odstředí, kapalina nad usazeninou se odstraní a promytý kal se opět suspenduje v nové dávce minerálního média. Tento postup se opakuje, dokud se kal nepovažuje za prostý přebytečného substrátu nebo inhibitoru.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Po opakovaném suspendování nebo z neupravovaného kalu se těsně před použitím odebere vzorek pro stanovení hmotnosti sušiny suspendovaných tuhých látek.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Další možností je homogenizace aktivovaného kalu (3–5 g suspendovaných látek v litru). Kal se 2 minuty rozmělňuje v mixeru Waring při střední rychlosti. Rozmělněný kal se nechá 30 minut (popřípadě déle) usazovat a kapalina se dekantuje pro použití jako inokulum v koncentraci 10 ml/l minerálního média.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Aby se ještě dále snížila hodnota slepého stanovení CO2, může být kal před použitím aklimatizován provzdušňováním přes noc vzduchem bez obsahu CO2. Jako inokulum se při této zkoušce použije koncentrace sušiny aktivovaného kalu 4 mg/l.
                           
                        
                     Inokulum z druhého stupně čistírny odpadních vod
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              Inokulum lze získat rovněž z výstupu druhého stupně čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody. Tento vzorek se udržuje v aerobních podmínkách a používá se v den odběru nebo podle potřeby po aklimatizaci. Z odtoku se odstraní větší částice filtrací přes hrubý filtr a změří se hodnota pH.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Filtrát se za účelem snížení obsahu IC provzdušňuje vzduchem bez CO2 (odstavec 15-e) po dobu 1 h, přičemž se hodnota pH udržuje na 6,5 kyselinou fosforečnou (odstavec 20). Potom se hodnota pH upraví na původní hodnotu hydroxidem sodným (odstavec 21) a nakonec se vzorek ponechá v klidu po dobu 1 h a vhodný objem kapalné fáze se použije pro inokulaci. Tento postup snižuje obsah IC inokula. Jestliže se například použije jako inokulum maximálně 100 ml filtrovaného provzdušněného odtoku na 1 litr, mělo by se při slepém stanovení množství vznikajícího IC pohybovat v rozmezí od 0,4 do 1,3 mg/l (14), což představuje 2–6,5 % zkoušené chemické látky C při 20 mg C/l a 4–13 % při 10 mg C/l.
                           
                        
                     Povrchové vody
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Odebere se vzorek vhodné povrchové vody. Vzorek se uchovává za aerobních podmínek a použije se v den odběru. Podle potřeby se vzorek koncentruje filtrací nebo odstředěním. Objem inokula, které má být použito v jednotlivých zkušebních nádobách, by měl splňovat kritéria uvedená v odstavci 26.
                           
                        
                     Půdy
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Odebere se vzorek vhodné půdy do maximální hloubky 20 cm pod povrchem. Ze vzorku půdy se nejprve odstraní kameny, zbytky rostlin a bezobratlých a půda se následně proseje přes síto o velikosti oka 2 mm (v případě, že vzorek je příliš mokrý na to, aby ho bylo možné prosít okamžitě, částečně se usuší na vzduchu pro usnadnění prosévání). Vzorek se uchová v aerobních podmínkách a musí být použit v týž den, kdy byl odebrán. (Je-li vzorek přepravován ve volně uzavřeném černém polyethylenovém sáčku, lze jej v tomto sáčku skladovat při 2 až 4 °C po dobu až jednoho měsíce.)
                           
                        
                     Aklimatizace inokula
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Inokulum lze aklimatizovat pro experimentální podmínky, ale nikoli předběžně adaptovat na zkoušenou chemickou látku. Aklimatizace může snížit uvolňování CO2 ve slepých pokusech. Aklimatizace spočívá v aeraci aktivovaného kalu po jeho rozpuštění ve zkušebním médiu na 30 mg/l vlhkým vzduchem bez obsahu CO2 po dobu 5 až 7 dnů při zkušební teplotě.
                           
                        POSTUP ZKOUŠKY
                  
                     Počet lahviček
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Počet potřebných zkušebních lahviček (odstavec 15-a) závisí na četnosti analýz a na trvání testu.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Doporučuje se provést analýzu lahviček třikrát po uplynutí dostatečného počtu časových intervalů tak, aby bylo možno identifikovat desetidenní období rozkladu. Na konci zkoušky se rovněž analyzuje nejméně pět zkušebních lahviček (odstavec 15 písm. a)) ze sady a), b) a c) (viz odstavec 42) s cílem umožnit výpočet 95 % intervalů spolehlivosti pro průměrnou hodnotu biologického rozkladu v procentech.
                           
                        
                     Inokulované médium
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Inokulum se používá v koncentraci sušiny v aktivovaném kalu 4 mg/l. Dostatečně inokulované médium se připraví bezprostředně před použitím například přidáním 2 ml vhodně upraveného aktivovaného kalu (odstavce 27 až 32) na 2 000 mg/l na 1 litr média s minerálními solemi (odstavec 19). Při použití výstupu z druhého stupně čistírny odpadních vod se přidá až 100 ml odtoku (odstavec 33) do 900 ml média s minerálními solemi (odstavec 19) a zředí se médiem na 1 litr.
                           
                        
                     Příprava lahviček
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Alikvotní díly inokulovaného média se rozdělí do duplikátních lahviček tak, aby se poměr mezi plynnou a kapalnou fází rovnal 1:2 (přidá se např. 107 ml do lahviček o kapacitě 160 ml). Lze použít i jiné poměry, ale je nutno dbát upozornění uvedeného v odstavci 11. Při použití jednoho i druhého typu inokula je nutno zajistit, aby bylo inokulované médium odpovídajícím způsobem promícháno s cílem zajistit jeho rovnoměrné rozdělení do zkušebních lahviček.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Připraví se sady lahviček (odstavec 15a), které budou obsahovat:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          zkušební nádoby (označené FT), obsahující zkoušenou chemickou látku;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          nádoby pro slepé stanovení (označené FB) obsahující jen zkušební médium a inokulum; je nutné přidat rovněž veškeré chemické látky, rozpouštědla, činidla nebo filtry ze skelných vláken užívané k zavedení zkoušené chemické látky do zkušebních nádob;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          nádoby pro kontrolu postupu (označené FC), obsahující referenční chemickou látku;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          podle potřeby nádoby pro kontrolu možného inhibičního vlivu zkoušené chemické látky (označené FI) obsahující zkoušenou chemickou látku a referenční chemickou látku ve stejné koncentraci (odstavec 24) jako v lahvích FT (zkoušená látka) a FC, (referenční látka);
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          nádoby pro kontrolu případného biotického rozkladu (označeného FS), jako v bodě a) plus 50 mg/l HgCl2, nebo sterilizované jiným způsobem (např. v autoklávu).
                                       
                                    
                        
                              43.
                           
                           
                              Ve vodě rozpustné zkoušené chemické látky a referenční chemické látky se přidají jako vodné zásobní roztoky (odstavce 22, 23 a 24) tak, aby výsledná koncentrace byla 10 až 20 mg C/l.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Nerozpustné zkoušené chemické látky a nerozpustné referenční chemické látky se přidávají do lahviček celou řadou různých způsobů (viz odstavec 22a-e) v závislosti na povaze zkoušené látky, a to buď před přidáním inokulovaného média, nebo po něm v závislosti na metodě expozice zkoušené chemické látky. Pokud se užije některý z postupů uvedených v odstavci 22a-e, bude se slepými lahvičkami FB (odstavec 42b) zacházeno podobným způsobem, avšak bez přidání zkoušené chemické látky nebo referenční chemické látky.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Těkavé zkoušené chemické látky je třeba vstříknout do uzavřených lahviček (bod 47) s použitím injekční mikrostříkačky. Dávka se vypočítá ze vstříknutého objemu a z hustoty zkoušené chemické látky.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Potom se v případě potřeby do nádob přidá voda tak, aby objem kapaliny byl ve všech nádobách stejný. Poměr mezi plynnou a kapalnou fází (obvykle 1:2) a koncentrace zkoušené látky musí zajistit dostatečnou koncentraci kyslíku v plynné fázi pro úplný biologický rozklad.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Všechny lahve se poté těsně uzavřou, například pryžovými septy z butylkaučuku a hliníkovými lemovacími uzávěry. V této fázi jsou přidány těkavé zkoušené chemické látky (bod 45). Pokud má být sledován pokles koncentrace DOC ve zkušebním roztoku a provedeny analýzy počáteční koncentrace IC v čase nula (sterilní kontroly, bod 42e) nebo jiné determinanty, příslušný vzorek se odstraní ze zkušební nádoby. Zkušební nádoba a její obsah jsou pak vyřazeny.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Těsně uzavřené lahvičky se umístí na orbitální třepačku (odstavec 15d) při rychlosti zajišťující dostatečné promíchání obsahu zkušebních nádob a v suspenzi (např. 150 až 200 otáček za minutu), a jsou inkubovány v temnu při teplotě 20 °C ± 1 °C.
                           
                        
                     Odběr vzorků
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Vzorec odběru vzorků závisí na trvání lagové fáze a na kinetické rychlosti biologického rozkladu zkoušené chemické látky. Vybrané nádoby se analyzují v den vzorkování, ale nejméně jednou za týden nebo častěji (např. dvakrát týdně), jestliže se požaduje celková křivka biologické rozložitelnosti. Z třepačky se odstraní potřebný počet opakovaných vzorků odpovídajících FT, FB a FC a pokud byly nasazeny také FI a FS (viz odstavec 42). Zkouška musí obvykle probíhat 28 dní. Zkouška může být ukončena před uplynutím 28 dní, jestliže z křivky biologické rozložitelnosti vyplývá, že prodlevy bylo dosaženo již dříve. Odeberou se vzorky pro analýzu z pěti lahví rezervovaných pro 28. den zkoušky a výsledky se použijí k výpočtu mezí spolehlivosti nebo variačního koeficientu procenta biologického rozkladu. Z lahviček představujících kontrolní vzorky pro inhibici a abiotický rozklad nemusí být vzorky odebírány tak často jako z ostatních lahviček; postačí odběr v 1. den a v 28. den.
                           
                        
                     Analýza anorganického uhlíku (IC)
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Produkce CO2 v lahvičkách se stanoví měřením zvýšení koncentrace anorganického uhlíku (IC) v průběhu inkubace. Existují dvě doporučené metody stanovení množství IC vznikajícího během zkoušky, které jsou popsány bezprostředně níže. Tyto metody mohou poskytovat poněkud odlišné výsledky, a proto by během zkoušky měla být používána jen jedna z nich.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Metoda a) se doporučuje v případě, že médium pravděpodobně obsahuje zbytky například skleněného filtračního papíru a/nebo nerozpustné zkoušené chemické látky. Pokud není k dispozici analyzátor uhlíku, lze tuto analýzu provést pomocí plynového chromatografu. Je důležité, aby láhve měly při analýze plynu v plynné fázi zkušební teplotu nebo se jí alespoň blížily. Metoda b) může být jednodušší pro laboratoře, které užívají pro měření IC analyzátory uhlíku. Je důležité, aby roztok hydroxidu sodného (odstavec 21), který slouží k přeměně CO2 na uhličitan, byl buď čerstvě připravený, nebo byl znám jeho obsah IC, aby jej bylo možno zohlednit při výpočtu výsledků zkoušek (viz odstavec 66-b).
                           
                        
                     Metoda a):   okyselení na hodnotu pH < 3
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Před analýzou každé šarže se analyzátor uhlíku kalibruje vhodným IC standardem (např. dusíkem s hmotnostním podílem CO2 1 %). Septem se vstříkne do každé zkušební nádoby koncentrovaná kyselina fosforečná (odstavec 20), aby se hodnota pH média snížila na < 3 (přidá se například 1 ml kyseliny na každých 107 ml zkušebního média). Potom se nádoby znovu umístí na třepačku. Po 1 h třepání při zkušební teplotě se nádoby sejmou z třepačky a z každé zkušební nádoby se odebere alikvotní podíl (např. 1 ml) plynné fáze a vstříkne se do analyzátoru uhlíku. Zaznamenají se naměřené koncentrace IC (v mg C na litr plynu).
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Podstata této metody spočívá v tom, že po okyselení na pH < 3 a po dosažení rovnováhy při 20 °C je rovnovážná konstanta pro distribuci CO2 mezi kapalnou a plynnou fází ve zkušebních nádobách rovna 1,0, pokud je měřena jako koncentrace (13). To by mělo být nejméně jednou ověřeno pro zkušební systém následujícím způsobem:
                              Připraví se zkušební nádoby obsahující roztok bezvodého uhličitanu sodného (Na2CO3) ve vodě prosté CO2 o koncentracích odpovídajících 5 a 10 mg IC na litr, přičemž voda prostá CO2 se připraví okyselením vody na pH 6,5 koncentrovanou kyselinou orthofosforečnou (odstavec 20), kterou se přes noc prohání vzduch prostý CO2 a nakonec se pH sníží přidáním zásady na neutrální hodnotu. Zajistí se, aby poměr mezi plynnou a kapalnou fází byl stejný jako při vlastní zkoušce (např. 1:2). Obsah v nádobách se okyselí a po dosažení rovnováhy, jak je uvedeno v odstavci 52, se stanoví koncentrace IC v plynné i kapalné fázi. Ověří se, zda v rámci experimentální chyby jsou obě koncentrace stejné. V případě, že tomu tak není, experimentátor by měl uvedené postupy přehodnotit. Tuto kontrolu distribuce IC mezi plynnou a kapalnou fází není nutné provádět vždy při provedení testu; lze ji provádět nejspíše při provádění kalibrace.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Jestliže má být stanoven úbytek DOC (platí pouze pro vodou rozpustné zkoušené chemické látky), odeberou se vzorky kapalné fáze ze samostatných (neokyselených) nádob, filtrují se membránovým filtrem a vstříknou do DOC analyzátoru. Tyto nádoby lze podle potřeby užít pro další analýzy s cílem stanovit primární biologický rozklad.
                           
                        
                     Metoda b):   přeměna CO2 na uhličitany
                  
                  
                              55.
                           
                           
                              Před analýzou každé šarže se analyzátor IC kalibruje na vhodný standard – například roztokem hydrogenuhličitanu sodného (NaHCO3) ve vodě prosté CO2 (viz odstavec 53) v koncentračním rozsahu IC od 0 mg/l do 20 mg/l. Septem se do každé zkušební lahvičky vstříkne 1 ml roztoku hydroxidu sodného (7M, odstavec 21) (např. 1 ml do 107 ml média) a nádobami se třepe při zkušební teplotě po dobu 1 h. Tentýž roztok NaOH se použije pro všechny lahvičky užité v daném dni, avšak není nutno jej užívat při každém odběru vzorků v průběhu zkoušky. Jestliže jsou při všech odběrech vzorků požadovány absolutní slepé hodnoty IC, bude stanovení IC v roztoku NaOH požadováno při každém jeho použití. Nádoby se sejmou z třepačky a nechají se odsadit. Z každé nádoby se stříkačkou odebere vhodný objem kapalné fáze (např. od 50 μl do 1 000 μl). Vzorky se vstříknou do analyzátoru IC a zaznamenají se koncentrace IC. Je třeba zajistit, aby užívaný analyzátor byl řádně vybaven ke zpracování zásaditých vzorků vytvořených v rámci této metody.
                           
                        
                              56.
                           
                           
                              Podstata této metody spočívá v tom, že po přídavku zásady a třepání je koncentrace IC v plynné fázi zanedbatelná. To by mělo být ověřeno pro zkušební systém nejméně jednou s použitím standardů IC, přidáním zásady a ustálením a změřením koncentrace IC v plynné i kapalné fázi (viz odstavec 53). Koncentrace v plynné fázi by se měla blížit nule. Tuto kontrolu na téměř kompletní absorpci CO2 není nutno provádět při každé zkoušce.
                           
                        
                              57.
                           
                           
                              Jestliže má být stanoven úbytek DOC (platí pouze pro vodou rozpustné zkoušené chemické látky), odeberou se vzorky kapalné fáze ze samostatných nádob (které neobsahují přidanou zásadu), filtrují se membránovým filtrem a vstříknou do DOC analyzátoru. Tyto nádoby lze podle potřeby užít pro další analýzy s cílem stanovit primární biologickou rozložitelnost.
                           
                        ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ
                  
                     Výpočet výsledků
                  
                  
                              58.
                           
                           
                              Za předpokladu 100 % mineralizace zkoušené chemické látky na CO2 se teoretická produkce anorganického uhlíku (ThIC), která je větší než produkovaná slepým stanovením, rovná množství celkového organického uhlíku (TOC) přidaného do každé zkušební nádoby na začátku zkoušky, takže:
                              
                                 
                              Celkový objem anorganického uhlíku (TIC) v každé zkušební nádobě je:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          rovnice [1]
                                       
                                    kde:
                              
                                          VL
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          objem kapaliny v láhvi (v litrech),
                                       
                                    
                                          CL
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          koncentrace IC v kapalné fázi (v mg uhlíku na 1 litr kapalné fáze),
                                       
                                    
                                          VH
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          objem plynné fáze (v litrech),
                                       
                                    
                                          CL
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          koncentrace IC v plynné fázi (v mg uhlíku na 1 litr plynné fáze).
                                       
                                    Výpočet TIC pro tyto dvě analytické metody užívané ke stanovení IC při této zkoušce je popsán níže v odstavcích 60 a 61. Procento biologického rozkladu (% D) se pro každý případ vypočte podle:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          Rovnice [2]
                                       
                                    kde:
                              
                                          TICt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          TIC ve zkušební nádobě v čase t v miligramech,
                                       
                                    
                                          TICb
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          průměrná hodnota TIC v nádobách pro slepé stanovení v čase t v miligramech,
                                       
                                    
                                          TOC
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          TOC původně přidaný do zkušební nádoby v miligramech.
                                       
                                    Procento biologického rozkladu % D se vypočte ve zkušebních nádobách (FT), referenčních nádobách (FC) a nádobách pro kontrolu inhibice z příslušného množství TIC produkovaného při každé době odběru vzorku (pokud byly zařazeny).
                           
                        
                              59.
                           
                           
                              Jestliže došlo během zkušební doby k významnému vzrůstu TIC sterilních kontrol (FS), pak lze dospět k závěru, že došlo k abiotickému rozkladu zkoušené chemické látky a tuto skutečnost je třeba zohlednit ve výpočtu D v rovnici [2].
                           
                        
                     Okyselení na hodnotu pH < 3
                  
                  
                              60.
                           
                           Vzhledem k tomu, že okyselení na hodnotu pH < 3 a ustálení má za následek dosažení rovnováhy mezi koncentrací TIC v kapalné a plynné fázi, stačí měřit jen koncentraci IC v plynné fázi. Proto je v rovnici [1] 
                                 , kde VB = je objem lahve se sérovým uzávěrem.
                        
                     Přeměna CO2 na uhličitany
                  
                  
                              61.
                           
                           Při této metodě se výpočty provádějí, jak je popsáno v rovnici [1], avšak zanedbatelný obsah IC v plynné fázi se nebere v úvahu, to znamená, že 
                                 , a 
                                 .
                        
                     Vyjadřování výsledků
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Křivka biologického rozkladu se získá vynesením závislosti procenta biologického rozkladu D na čase inkubace, a pokud možno se vyznačí také lagová fáze, doba biologického rozkladu, 10denní období rozkladu a prodleva, tj. fáze, v níž bylo dosaženo maximálního rozkladu a v níž se vyrovnala křivka biologického rozkladu. Jestliže se pro dvě souběžná stanovení ve zkušebních nádobách FT (rozdíl menší než 20 %) získají srovnatelné výsledky, vynesou se do grafů průměrné hodnoty (viz dodatek 2, obr. 1); v opačném případě se vynesou křivky pro každou nádobu zvlášť. Zjistí se průměrná hodnota biologického rozkladu v procentech v prodlevě nebo se odhadne nejvyšší hodnota (například když křivka v prodlevě klesá), ale je důležité stanovit, že v tomto druhém případě se nejedná o odlehlou hodnotu. Tento maximální stupeň biologického rozkladu se v protokolu o zkoušce uvede jako „stupeň biologického rozkladu zkoušené chemické látky“. Jestliže počet zkušebních nádob nebyl dostatečný pro odhad prodlevy, použijí se údaje změřené poslední den zkoušky a vypočte se průměrná hodnota. Tato poslední hodnota, průměr pěti opakovaných zkoušek, slouží jako indikátor přesnosti, s nímž bylo stanoveno procento biologického rozkladu. Uvede se rovněž hodnota získaná na konci 10denního období rozkladu.
                           
                        
                              63.
                           
                           
                              Stejným způsobem se vynese křivka biologického rozkladu pro referenční látku FC, a pokud byla provedena, i pro závislost abiotické eliminace FS a kontroly inhibice FI.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Zaznamená se produkce TIC při slepém stanovení (FB) a v nádobách pro kontrolu abiotické eliminace (FS), pokud byly tyto nádoby zařazeny do zkoušky.
                           
                        
                              65.
                           
                           
                              Vypočte se D pro nádoby FI na základě teoretické produkce IC předpokládané pouze na základě referenční složky směsi. Jestliže je 28. den [(DFC
                                  (22) – DFI
                                  (23))/DFC] × 100 > 25 %, lze předpokládat, se zkoušená chemická látka působí inhibičně na aktivitu inokula, a to může být důsledkem nízkých hodnot DFT získaných za podmínek zkoušky. V tomto případě by mohla být zkouška opakována s nižší zkušební koncentrací, a pokud možno se snížením DIC v inokulu a TIC vytvořeného ve slepých kontrolních nádobách vzhledem k tomu, že nižší koncentrace jinak sníží přesnost této metody. V úvahu přichází i použití jiného inokula. Jestliže v nádobě FS (abiotické) byl pozorován významný nárůst (> 10 %) množství TIC, mohou přicházet v úvahu procesy abiotického rozkladu.
                           
                        
                     Platnost výsledků
                  
                  
                              66.
                           
                           
                              Zkouška se považuje za platnou, jestliže:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          průměrné procento rozkladu v nádobách FC s referenční látkou je po 14 dnech inkubace > 60 % a
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          průměrná produkce TIC při slepých stanoveních FB na konci zkoušky je > 3 mg C/l.
                                       
                                    Pokud není těchto limitů dosaženo, měla by se zkouška opakovat s inokulem z jiného zdroje, případně by měl být přezkoumán užitý postup. Pokud je například problémem vysoká produkce IC při slepých stanoveních, je nutno opakovat postup uvedený v odstavcích 27 až 32.
                           
                        
                              67.
                           
                           
                              Pokud zkoušená látka nedosáhne 60 % ThIC a bylo prokázáno, že není inhibující (odstavec 65), lze zkoušku opakovat s vyšší koncentrací inokula (až 30 mg/l aktivovaného kalu a 100 ml odtoku/l) nebo s inokuly z jiných zdrojů, zejména tehdy, pokud byl rozklad v rozmezí 20 až 60 %.
                           
                        
                     Interpretace výsledků
                  
                  
                              68.
                           
                           
                              Biologický rozklad > 60 % ThIC v rámci 10denního období rozkladu v této zkoušce prokazuje, že zkoušená chemická látka je snadno biologicky rozložitelná v aerobních podmínkách.
                           
                        
                              69.
                           
                           
                              Pokud není dosaženo vyhovující hodnoty 60 % ThIC, určí se hodnota pH v médiích v lahvičkách, které nebyly upraveny kyselinou ani zásadou; hodnota menší než 6,5 by mohla znamenat, že došlo k nitrifikaci. V takovém případě se zkouška opakuje s roztokem pufru o vyšší koncentraci.
                           
                        
                     Protokol o zkoušce
                  
                  
                              70.
                           
                           
                              Sestaví se tabulka % D pro každou zkušební nádobu (FT), referenční nádobu (FC) a nádobu pro kontrolu inhibice (FI), pokud byly zařazeny do vzorku, pro každý den odběru vzorku. Pokud jsou získány srovnatelné výsledky pro duplikátní vzorky, vynese se křivka průměrných hodnot % D v reálném čase. Zaznamená se množství TIC ve slepých (FB) a sterilních kontrolách (FS) DOC a/nebo jiné determinanty a jejich procento úbytku.
                           
                        
                              71.
                           
                           
                              Určí se průměrná hodnota procenta D ve fázi prodlevy, nebo se použije nejvyšší hodnota, pokud křivka biologického rozkladu ve fázi prodlevy klesá, a tato skutečnost se uvede jako „stupeň biologického rozkladu zkoušené chemické látky“. Je důležité zajistit, aby v tomto druhém případě nejvyšší hodnota nebyla hodnotou odlehlou.
                           
                        
                              72.
                           
                           
                              Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto údaje:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkoušená chemická látka:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      obecný název, chemický název, číslo CAS, strukturní vzorec a relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      čistota zkoušené látky (obsah nečistot).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkušební podmínky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odkaz na tuto zkušební metodu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popis užitého zkušebního systému (např. objem nádoby, poměr mezi plynnou a kapalnou fází, metoda míchání atd.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aplikace zkoušené chemické látky a referenční chemické látky do zkušebního systému: užitá zkušební koncentrace a množství uhlíku dávkovaného do jednotlivých zkušebních nádob; jakékoli užití rozpouštědla,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobnosti o použitém inokulu, jakákoli adaptace a aklimatizace,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      teplota inkubace,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      validace principu analýzy IC,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hlavní charakteristika použitého analyzátoru IC (a jakýchkoli dalších použitých analytických metod),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet duplikátních vzorků.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nezpracovaná data a vypočtené hodnoty biologického rozkladu v tabelární formě,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      graf závislosti procenta rozkladu na čase u zkoušených a referenčních chemických látek, lagová fáze, fáze rozkladu, 10denní období rozkladu a směrnice,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      procento úbytku ve fázi prodlevy, na konci zkoušky a po uplynutí 10denního období rozkladu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odůvodnění případného odmítnutí výsledků zkoušky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      jakékoli další skutečnosti, které jsou důležité pro užitý postup,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      diskuse o výsledcích.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA:
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              Kapitola C.4 této přílohy – Stanovení „snadné“ biologické rozložitelnosti – Zkouška na uvolňování CO2 (metoda C.4-C).
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 159–167.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153–1161.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195–1210.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              ISO 9439 (1990; přepracována v roce 1999). Jakost vod – Hodnocení úplné biologické rozložitelnosti organických látek ve vodném prostředí – Metoda stanovení uvolněného oxidu uhličitého (Sturm).
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922–929.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801–812.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181–185.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). Appl. Env. Microbiol. 35: 51–53.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233–243.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204–211.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 23: 507–524.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust H, and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19: 1527–1550.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              ISO 14593, (1999) Jakost vod – Hodnocení úplné aerobní biologické rozložitelnosti organických látek ve vodním prostředí – Metoda stanovení anorganického uhlíku v těsně uzavřených lahvičkách (C02 headspace metoda).
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              Battersby NS (1997). The ISO headspace C02 biodegradation test, Chemosphere 34: 1813–1822.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835,3120. Sealed vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance, Washington, DC.
                           
                        
                              19)
                           
                           
                              Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR and Starkey M (1999). An „inherent“ biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219–3235.
                           
                        
                              20)
                           
                           
                              Kapitola C.4 této přílohy – Stanovení „snadné“ biologické rozložitelnosti.
                           
                        
                              21)
                           
                           
                              OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris.
                           
                        
                              22)
                           
                           
                              Kapitola C.11 této přílohy – Zkouška na inhibici dýchání aktivovaného kalu.
                           
                        
                              23)
                           
                           
                              Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319–327.
                           
                        
                              24)
                           
                           
                              EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO2 method: application to surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.
                           
                        
                              25)
                           
                           
                              ISO 10634 (1996) Jakost vod – Pokyny pro přípravu a zpracování ve vodě těžko rozpustných organických látek pro následující hodnocení jejich biologické rozložitelnosti ve vodním prostředí.
                           
                        
                     Dodatek 1
                     ZKRATKY A DEFINICE
                     IC: Anorganický uhlík (Inorganic carbon).
                     TCO2: Teoretický oxid uhličitý (theoretical carbon dioxide, ThCO2) (mg) je množství oxidu uhličitého, které by mělo vzniknout ze známého nebo změřeného obsahu uhlíku ve zkoušené chemické látce za předpokladu její úplné mineralizace; vyjadřuje se rovněž v mg oxidu uhličitého uvolněného z 1 mg zkoušené látky.
                     DOC: Rozpuštěný organický uhlík (dissolved organic carbon) je celkový organický uhlík, který je přítomný v roztoku nebo projde přes filtr o velikosti pórů 0,45 μm nebo zůstane v supernatantu po odstřeďování po dobu 15 minut při odstředivém zrychlení 40 000 m/s–2 (což odpovídá odstředivé síle přibližně 4 000 g)
                     DIC: Rozpuštěný anorganický uhlík.
                     ThIC: Teoretická produkce anorganického uhlíku.
                     TIC: Celkový anorganický uhlík.
                     Snadno biologicky rozložitelná: je dohodnutá klasifikace chemických látek, které prošly určitými screeningovými zkouškami úplné biologické rozložitelnosti; tyto zkoušky jsou tak přísné, že lze předpokládat, že se látky budou ve vodném prostředí za aerobních podmínek rychle a úplně biologicky rozkládat.
                     10denní období rozkladu: je 10 dnů, které následují bezprostředně po dosažení 10 % biologického rozkladu.
                     Biologická rozložitelnost: je klasifikace chemických látek, pro něž existuje nepochybný důkaz o jejich biologické rozložitelnosti (primární nebo konečné) v kterékoli uznávané zkoušce biologické rozložitelnosti.
                     Úplný aerobní biologický rozklad: je stupeň rozkladu zkoušené látky dosažený po jejím úplném zužitkování mikroorganismy, vedoucí k produkci oxidu uhličitého, vody, minerálních solí a nové mikrobiální buněčné hmoty (biomasy).
                     Mineralizace: Mineralizace je úplný rozklad organické látky na CO2 a H2O za aerobních podmínek a na CH4, CO2 a H2O za anaerobních podmínek.
                     Lagová fáze: Čas od začátku zkoušky až do doby dosažení aklimatizace a/nebo adaptace rozkládajících se mikroorganismů a vzrůstu stupně biologického rozkladu zkoušené chemické látky nebo organické chemické látky na detekovatelnou úroveň (např. 10 % maxima teoretického biologického rozkladu nebo nižší v závislosti na přesnosti techniky měření).
                     Doba rozkladu: Doba od konce lagové fáze až do doby, kdy bylo dosaženo 90 % maximálního stupně biologického rozkladu.
                     Prodleva (plato): Prodleva je fáze, kdy bylo dosaženo maximálního rozkladu a křivka biologického rozkladu se ustálila.
                     Zkoušená chemická látka: Jakákoliv látka nebo směs testovaná pomocí této zkušební metody.
                  
                  
                     Dodatek 2
                     
                        Příklad křivky biologického rozkladu
                     
                     
                        Obrázek 1
                     
                     
                        Biologický rozklad oktan-1-olu CO2 headspace metodou
                     
                     
                        
                     Slovníček
                     Biologický rozklad:
                     Fáze rozkladu:
                     Maximální stupeň biologického rozkladu:
                     Fáze prodlevy (plato):
                     10denní období rozkladu:
                     Čas průběhu zkoušky (dny):
                  
                  C. 30   BIOAKUMULACE U TERESTRICKÝCH MÁLOŠTĚTINATCŮ
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Tato zkušební metoda odpovídá pokynu OECD pro zkoušení (TG) 317 (2010). Ze zkušebních metod týkajících se rozpadu v životním prostředí byly v roce 1996 publikovány Bioakumulace: Průtoková zkouška na rybách (kapitola C.13 této přílohy (49)) a v roce 2008 Bioakumulace u bentických máloštětinatců žijících v sedimentu (53). Extrapolovat údaje o bioakumulaci ve vodním prostředí na suchozemské organismy, jako jsou žížaly, je obtížné až nemožné. Pro stanovení bioakumulace chemických látek v půdě se v současné době užívají modelové výpočty založené na lipofilitě zkoušené chemické látky, např. (14, 37), jako např. v technických pokynech EU (19). Potřeba zkušební metody specifické pro určité prostředí již byla vyřešena, např. (55). Tato metoda je zvláště důležitá pro posouzení druhotné otravy v terestrických potravních řetězcích (4). Několik vnitrostátních zkušebních metod řeší problém bioakumulace u jiných organismů než u ryb, např. (2) a (72). Jednu z metod měření bioakumulace z kontaminovaných půd v žížalách (Eisenia fetida, Savigny) a kroužkovcích vyvinula Americká společnost pro zkoušení a materiály (3). Mezinárodně uznávaná metoda pro stanovení bioakumulace v obohacené půdě zlepší posuzování rizik, která představují chemické látky pro terestrické ekosystémy, např. (25, 29).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Půdu přijímající bezobratlí jsou exponováni chemickým látkám vázaným v půdě. Mezi tyto živočichy patří terestričtí máloštětinatci, kteří hrají významnou úlohu ve struktuře a funkci půdy (15), (20). Terestičtí máloštětinatci žijí v půdě a částečně na jejím povrchu (zejména ve vrstvě L) a často reprezentují nejpočetnější druh, pokud jde o biomasu (54). Jelikož tito živočichové víří půdu a slouží jako potrava, mohou mít silný vliv na biologickou dostupnost látek pro jiné organismy, jako jsou bezobratlí (např. draví roztoči a brouci, např. (64)) nebo dravci (např. lišky a racci) z řad obratlovců (18, 62). Některé druhy terestrických máloštětinatců, kteří jsou v současné době využíváni pro ekotoxikologické zkoušky, jsou popsány v dodatku 5.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Řadu podstatných a užitečných údajů pro provedení této zkušební metody bioakumulace v půdě poskytuje dokument „ASTM Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity or Bioaccumulation Tests with the Lumbricid Earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid Potworm Enchytraeus albidus“ 3). Dalšími dokumenty, na které tato zkušební metoda odkazuje, je kapitola C.13 této přílohy Bioakumulace: Průtoková zkouška na rybách (49) a OECD TG 315: Bioakumulace u bentických máloštětinatců žijících v sedimentu (53). Významným zdrojem informací pro tuto zkušební metodu jsou rovněž praktické zkušenosti se studiemi bioakumulace v půdě a publikovaná literatura, např. (1, 5, 11, 12, 28, 40, 43, 45, 57, 59, 76, 78, 79).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Tato metoda je vhodná zejména pro testování stabilních, neutrálních organických chemických látek, které mají tendenci k adsorpci na půdu. Touto zkušební metodou lze rovněž testovat bioakumulaci s půdou spjatých stabilních organokovových sloučenin. Lze ji použít i pro kovy a jiné stopové prvky.
                           
                        PŘEDPOKLADY
                  
                              5.
                           
                           
                              Zkoušky pro měření bioakumulace chemické látky v pozemních máloštětinatcích byly provedeny s těžkými kovy (viz např. (63)) a persistentními organickými chemickými látkami, jejichž hodnoty log Kow se pohybují mezi 3,0 a 6,0 např. (40). Tyto zkoušky lze použít také pro:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          chemické látky, které mají log Kow vyšší než 6,0 (superhydrofobní chemické látky),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          chemické látky, které patří do kategorie organických látek, o nichž je známo, že mají potenciál bioakumulace v živých organismech, např. povrchově aktivní nebo vysoce adsorpční chemické látky,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          chemické látky, které vykazují potenciál pro bioakumulaci na základě strukturálních prvků, např. analogy chemické látky se známým bioakumulačním potenciálem, a
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kovy.
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              Informace o zkoušené chemické látce, jako je obecný název, chemický název, (optimálně název podle IUPAC), strukturní vzorec, registrační číslo CAS, čistota, bezpečnostní opatření, vhodné podmínky skladování a analytické metody, by měly být získány před zahájením studie. Kromě toho by měly být známy tyto údaje:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          rozpustnost ve vodě;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          rozdělovací koeficient oktanol-voda Kow;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          rozdělovací koeficient půda-voda vyjádřený jako Koc;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          tlak par;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          rozložitelnost (např. v půdě, ve vodě);
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          známé metabolity.
                                       
                                    
                        
                              7.
                           
                           
                              Lze použít radioizotopově značené i neznačené zkoušené chemické látky. Pro usnadnění analýzy se však doporučuje použít radiotopově značenou zkoušenou chemickou látku. Rozhodnutí bude záviset na mezích stanovitelnosti nebo na požadavku na měření výchozí zkoušené chemické látky a metabolitů. Je-li použita radioizotopově značená zkoušená látka a měří-li se celkový obsah radioaktivního zbytku, je pro výpočet bioakumulačního faktoru (BAF) výchozí chemické látky a příslušných půdních metabolitů (viz odstavec 50) důležité, aby radioizotopově značené zbytky v půdě i ve zkušebních organismech a testovací organismy byly charakterizovány procentem výchozí zkoušené chemické látky a značené nevýchozí chemické látky, např. ve vzorcích odebraných v ustáleném stavu nebo na konci fáze příjmu. U měření radioaktivně neznačené organické zkoušené látky nebo kovů může být nutné popsanou metodu upravit například tak, aby vzniklo dostatečné množství biomasy. Měří-li se celkový obsah radioaktivního zbytku (počítáním scintilací v roztoku například po extrakci, spálení nebo solubilizaci tkáně), je hodnota bioakumulačního faktoru založena na výchozí zkoušené chemické látce a na metabolitech. Výpočet BAF by měl být přednostně založen na koncentraci výchozí zkoušené chemické látky v organismech a na celkovém objemu radioaktivních zbytků. Následně by měl být na základě BAF vypočten akumulační faktor sediment-biota (BSAF) normalizovaný na obsah lipidů v červech a obsah organického uhlíku (OC) v půdě z důvodů srovnatelnosti mezi výsledky různých bioakumulačních zkoušek.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Měla by být známa toxicita zkoušené látky pro druh použitý při zkoušce, například koncentrace vyvolávající účinek (ECx) nebo letální koncentrace (LCx) po dobu fáze příjmu (např. (19)). Zvolená koncentrace zkoušené látky by měla v optimálním případě být na úrovni 1 % její asymptotické hodnoty akutní LC50 a měla by být nejméně desetkrát vyšší než je mez detekce této látky v půdě při použité analytické metodě. Pokud je to možné, měla by být dána přednost hodnotám toxicity odvozeným z dlouhodobých studií o subletálních koncových bodech (51, 52). Pokud tyto údaje nejsou k dispozici, poskytne užitečné informace zkouška akutní toxicity (viz např. (23)).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              K dispozici musí být vhodná analytická metoda o známé správnosti, přesnosti a citlivosti pro kvantitativní stanovení chemické látky ve zkušebních roztocích, v půdě a v biologickém materiálu a dále podrobnosti o přípravě a uchovávání vzorků a materiálové bezpečnostní listy. Měly by být také známy meze stanovitelnosti zkoušené látky jak v půdě, tak v tkáních červů. Je-li použita zkoušená látka značená 14C, měla by být známá specifická radioaktivita ((tj. Bq/mol) a aktivita nečistot vyjádřená v procentech. Specifická radioaktivita zkoušené chemické látky by měla být dostatečně vysoká, aby umožňovala analýzu a použité zkušební koncentrace by neměly vyvolávat toxické účinky.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Zkoušku je možno provést s umělou půdou nebo s přírodními půdami. U přírodních půd je před zahájením zkoušky třeba znát informace o vlastnosti užité přírodní půdy, jako je například původ půdy nebo jejích složek, pH, obsah organického uhlíku, distribuce částic (procento písku, prachu a jílu) a vodní kapacita (WHC) (3, 48).
                           
                        PODSTATA ZKOUŠKY
                  
                              11.
                           
                           
                              Mezi parametry, které charakterizují bioakumulaci zkoušené chemické látky, patří bioakumulační faktor (BAF), rychlostní konstanta příjmu (ks) a rychlostní konstanta vylučování (ke). Definice jsou uvedeny v dodatku 1.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Zkouška se skládá ze dvou fází: fáze příjmu (expozice) a vylučovací (poexpoziční) fáze. Ve fázi příjmu jsou paralelní vzorky červů vystaveny působení půdy, která byla obohacena zkoušenou chemickou látkou. Zároveň se zkušebními organismy je za stejných podmínek, ale bez zkoušené chemické látky držena kontrolní skupina červů. Měří se hmotnost po vysušení a obsah lipidů ve zkušebních organismech. To lze provést pomocí červů v kontrolní skupině. Analytické hodnoty pozadí (slepé) lze získat analýzou vzorků červů z kontrolní skupiny a půdy. Ve fázi vylučování jsou červi přemístěni do půdy bez zkoušené chemické látky. Fáze vylučování je nutná vždy s výjimkou případů zanedbatelné absorpce zkoušené chemické látky v průběhu fáze expozice. Fáze vylučování poskytuje informace o míře vylučování testované látky zkušebními organismy (např. (27)). Pokud nebylo ve fázi příjmu dosaženo ustáleného stavu, mělo by být stanovení kinetických parametrů – kinetického bioakumulačního faktoru BAFK a rychlostní konstanty (rychlostních konstant) příjmu a vylučování – založeno v optimálním případě na současném proložení výsledků fáze příjmu a fáze vyprázdnění. Koncentrace zkoušené látky v červech a na nich je sledována v průběhu obou fází zkoušky.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Během fáze příjmu se provádí měření v době odběru vzorků po dobu až 14 dnů (roupice) nebo 21 dnů (žížaly), dokud není dosaženo ustáleného stavu (11, 12, 67). Ustálený stav nastává, jestliže vynesení koncentrace červů v čase je rovnoběžné s časovou osou a tři po sobě jdoucí analýzy koncentrací provedené na vzorcích odebraných nejméně v dvoudenních intervalech se vzájemně neliší o více než ± 20 % na základě statistických srovnání (např. analýza rozptylu, regresní analýza).
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Fáze vylučování spočívá v přenesení zkušebních organismů do nádob, které obsahují stejný substrát bez obsahu zkoušené chemické látky. V průběhu fáze vyprázdnění se měření provádějí v době odběru vzorků po dobu až 14 dnů (roupice) nebo 21 dnů (žížaly), pokud již dříve nebylo analyticky stanoveno 90 % snížení reziduí zkoušené chemické látky v červech. Koncentrace zkoušené chemické látky v červech na konci fáze vyprázdnění se uvede jako neodstraněná rezidua. Bioakumulační faktor ustáleného stavu (BAFSS) se optimálně vypočte jako poměr koncentrace v červech (Ca) a v půdě (Cs) ve zřetelném ustáleném stavu, a jako kinetický bioakumulační faktor BAFK, tj. poměr rychlostní konstanty příjmu z půdy (ks) a rychlostní konstanty vylučování (ke) (definice viz dodatek 1) za předpokladu kinetiky prvního řádu (výpočty viz dodatek 2). Pokud kinetiku prvního řádu zjevně nelze použít, měly by být použity jiné modely.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Rychlostní konstanta příjmu, rychlostní konstanta (nebo konstanty, jsou-li použity složitější modely) vylučování, kinetický bioakumulační faktor (BAFK) a, je-li to možné, intervaly spolehlivosti každého z těchto parametrů se vypočítají z modelových rovnic za použití počítače (návod viz dodatek 2). Oprávněnost jakéhokoli modelu lze určit např. z korelačního koeficientu nebo z koeficientu determinace (koeficienty, jejichž hodnota se blíží jedné, indikují oprávněnost), nebo na základě druhé mocniny chí (χ2). Také velikost standardní odchylky nebo intervalu spolehlivosti kolem odhadovaných parametrů mohou svědčit o oprávněnosti modelu.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Ke snížení rozptylu výsledků zkoušek pro zkoušené chemické látky s vysokou lipofilností by měly být bioakumulační faktory vyjádřeny ve vztahu k obsahu lipidů a obsahu organického uhlíku (kg organického uhlíku v půdě (OC) na kg lipidů v červech). Tento přístup je založen na skutečnosti, že u některých skupin chemických látek existuje jasný vztah mezi potenciálem bioakumulace a lipofilností, což je široce používáno v případě ryb (47). Existuje vztah mezi obsahem lipidů v rybách a bioakumulací těchto chemických látek. U bentických organismů byly zjištěny podobné korelace např. (30, 44). Obdobně byla tato korelace prokázána u terestrických máloštětinatců, např. (5, 6, 7, 14). Pokud je k dispozici dostatečné množství tkání červů, lze stanovit obsah lipidů u pokusných živočichů na stejném biologickém materiálu, který byl použit ke stanovení koncentrace zkoušené chemické látky. Ke stanovení obsahu lipidů lze použít rovněž kontrolní živočichy.
                           
                        PLATNOST ZKOUŠKY
                  
                              17.
                           
                           
                              Má-li být zkouška platná, musí být při kontrole i expozici splněny následující podmínky:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Celková úmrtnost ve fázi příjmu a ve fázi vyprázdnění nesmí na konci zkoušky překročit 10 % (žížaly) nebo 20 % (roupice) z celkového počtu vložených červů.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Průměrná ztráta hmotnosti u Eisenia fetida a Eisenia andrei měřená na konci fáze příjmu a na konci fáze vylučování by neměla přesáhnout 20 % v porovnání s původní čerstvou hmotností (f.w.) na začátku každé fáze.
                                       
                                    
                        POPIS METODY
                  
                     Testovací druh
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Pro zkoušky bioakumulace se doporučuje používat několik druhů terestrických máloštětinatců. Nejběžněji používané druhy Eisenia fetida nebo Eisenia Andrei (Lumbricidae) nebo Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus, nebo Enchytraeus luxuriosus (Enchytraeidae)) jsou popsány v dodatku 5.
                           
                        
                     Přístroje a pomůcky
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              U všech částí zařízení je třeba se vyhýbat použití materiálů, které se mohou rozpouštět, adsorbovat zkoušenou chemickou látku nebo vyluhovat jiné chemické látky a mají nepříznivý účinek na pokusné živočichy. Lze použít standardní pravoúhlé nebo válcové nádrže vyrobené z chemicky inertního materiálu a mající vhodný objem s ohledem na náplň, tj. počet zkušebních červů. Veškeré vybavení, které se dostane do styku se zkušebním médiem, může být vyrobeno z korozivzdorné oceli, plastu nebo skla. Zkušební nádoby by měly být vhodným způsobem zakryty, aby se zabránilo úniku červů, přičemž je nutné zajistit dostatečný přívod vzduchu. Pro látky s vysokými adsorpčními koeficienty, jako jsou syntetické pyrethroidy, může být nutné použít silanizované sklo. V těchto případech musí být zařízení po použití zlikvidováno (49). U radioaktivně značených zkoušených látek a těkavých chemických látek je nutné zabránit jejich úniku. Je nutno použít lapače (např. skleněné promývačky plynu) obsahující vhodný absorbent schopný udržet zbytky odpařující se ze zkušebních nádob.
                           
                        
                     Půda
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Zkušební půda by měla mít takovou kvalitu, která umožní přežití zkušebních organismů, a pokud možno jejich reprodukci po dobu aklimatizace a v průběhu fází zkoušky, aniž by vykazovaly abnormální vzhled nebo chování. Červi by se měli zavrtat do půdy.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Jako zkušební substrát se doporučuje užít umělou půdu popsanou v kapitole C.8 této přílohy (48). Příprava umělé půdy pro použití při zkouškách bioakumulace a doporučení pro skladování umělé půdy jsou uvedeny v příloze 4. Umělou půdu vysušenou na vzduchu lze uchovávat při pokojové teplotě až do použití.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Jako zkušební a/nebo kultivační půdu však lze použít i přírodní půdu z neznečištěných lokalit. Přírodní půdy by měly být charakterizovány alespoň podle původu (místa odběru), pH, obsahu organického uhlíku, distribuce částic (procento písku, prachu a jílu), maximální vodní kapacity (WHCmax) a procenta obsahu vody (3). Užitečné informace by měla poskytnout analýza půdy nebo jejích složek na mikroskopické znečišťující látky před použitím. Pokud se využívá zemědělská půda z pole, neměla by být ošetřena přípravky na ochranu rostlin ani hnojem od exponovaných zvířat jako hnojivem po dobu nejméně jednoho roku a organickými hnojivy po dobu nejméně šesti měsíců před odběrem vzorku (50). Postupy manipulace s přírodními půdami před použitím při ekotoxikologických laboratorních zkouškách na máloštětinatcích jsou popsány v bodě (3). U přírodní půdy by doba skladování v laboratoři měla být co nejkratší.
                           
                        
                     Aplikace zkoušené chemické látky
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Zkoušená chemická látka se přidá do půdy. Měly by být vzaty v úvahu fyzikálně-chemické vlastnosti zkoušené chemické látky. Ve vodě rozpustná zkoušená chemická látka by měla být před smísením s půdou zcela rozpuštěna ve vodě. Doporučený postup vmíchávání těžko rozpustných zkoušených chemických látek zahrnuje obalení jedné nebo více složek (umělé) půdy zkoušenou chemickou látkou. Například křemenný písek nebo jeho část se ponoří do roztoku zkoušené chemické látky ve vhodném organickém rozpouštědle, které se pak pomalu odpaří do sucha. Obalenou frakci lze následně promíchat s vlhkou půdou. Hlavní výhodou tohoto postupu je, že se do půdy nevpravují žádná rozpouštědla. Je-li použita přírodní půda, lze zkoušenou chemickou látku přidat vmícháním části půdy vysušené na vzduchu, jak bylo popsáno výše u umělé půdy, nebo vmícháním zkoušené chemické látky do vlhké půdy s následným odpařováním, pokud bylo použito solubilizační činidlo. Obecně platí, že je třeba pokud možno se vyhnout kontaktu vlhké půdy s rozpouštědly. Je třeba zvážit následující skutečnosti (3):
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Užije-li se jiné rozpouštědlo než voda, mělo by být takové, aby bylo mísitelné s vodou a/nebo odbouratelné (například odpařením) tak, že v půdě zůstane jen zkoušená chemická látka.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Použije-li se kontrola rozpouštědla, není nutno provést negativní kontrolu. Kontrola rozpouštědla by měla obsahovat nejvyšší koncentraci rozpouštědla přidávaného do půdy a mělo by při ní být užito rozpouštědla ze stejné šarže, která byla použita pro zásobní roztok. Hlavním kritériem pro výběr vhodného solubilizačního činidla by měla být toxicita a těkavost rozpouštědla a rozpustnost zkoušené látky ve zvoleném rozpouštědle.
                                       
                                    
                        
                              24.
                           
                           
                              Pro chemické látky, které jsou obtížně rozpustné ve vodě a v organických rozpouštědlech, lze smísit 2,0–2,5 g jemně rozemletého křemenného písku na zkušební nádobu, např. pomocí třecí misky a tloučku s takovým množstvím zkoušené látky, aby bylo dosaženo požadované zkušební koncentrace. Tato směs křemenného písku a zkoušené chemické látky se přidá do navlhčené půdy a důkladně se promíchá s příslušným množstvím deionizované vody, aby bylo dosaženo požadované vlhkosti. Konečná směs se rozdělí do zkušebních nádob. Tento postup se opakuje pro každou zkušební koncentraci a připraví se také příslušná kontrola s 2,0–2,5 g jemně rozemletého křemenného písku na zkušební nádobu.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Po vmíchání by měla být stanovena koncentrace zkoušené látky v půdě. Před vložením zkušebních organismů je třeba ověřit homogenní distribuci zkoušené chemické látky v půdě. Měla by být uvedena metoda vmíchání a důvody pro výběr konkrétní metody vmíchání (24).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Rovnováha mezi půdou a fází kapilární vody by měla být v ideálním případě nastolena před přidáním organismů; doporučuje se doba čtyř dnů při teplotě 20 °C. Pro řadu organických chemických látek těžko rozpustných ve vodě se doba potřebná k dosažení skutečné rovnováhy mezi adsorbovanou a rozpuštěnou frakcí počítá ve dnech nebo v měsících. V závislosti na účelu studie, například když je potřeba napodobit podmínky okolního prostředí, může obohacená půda „zrát“ i déle, například u kovů po dobu tří týdnů při teplotě 20 °C (22).
                           
                        
                     Kultivace zkušebních organismů
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Červi by měli být v optimálním případě nepřetržitě udržováni v laboratorních podmínkách. Pokyny týkající se metod laboratorní kultury pro Eisenia fetida, Eisenia Andrei a roupice jsou uvedeny v příloze 5 (viz také (48, 51, 52)).
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Červi použití při zkouškách nesmí vykazovat pozorovatelné nemoci, abnormality a parazity.
                           
                        PROVEDENÍ ZKOUŠKY
                  
                              29.
                           
                           
                              Zkušební organismy se exponují zkoušené látce během fáze příjmu. Fáze příjmu by měla trvat 14 dnů (roupice) nebo 21 dnů (žížaly), pokud není prokázáno, že bylo dosaženo ustáleného stavu.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Ve fázi vylučování se červi přenesou do půdy bez zkoušené látky. První vzorek by měl být odebrán 4–24 hodin po zahájení fáze vylučování. Příklady harmonogramů odběru vzorků pro jedenadvacetidenní fázi příjmu a jedenadvacetidenní fázi vylučování jsou uvedeny v dodatku 3.
                           
                        
                     Zkušební organismy
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Řada druhů terestrických roupic má jen velmi nízkou individuální hmotnost (např. 5–10 mg hmotnosti ve vlhkém stavu na jedince u Enchytraeus albidus a ještě méně u Enchytraeus crypticus či Enchytraeus luxuriosus); aby bylo možné provést vážení a chemickou analýzu, může být nezbytné sdružovat červy v paralelních zkušebních nádobách (tj. k získání jednoho analytického výsledku tkáně se použijí všichni červi v paralelní nádobě). Do každé paralelní nádoby se vloží 20 jednotlivých roupic a použijí se nejméně tři paralelní nádoby. V případě, že jsou meze stanovitelnosti zkoušené látky příliš vysoké, může být potřeba více červů. U zkušebních druhů s vyšší individuální hmotnosti (Eisenia fetida a Eisenia Andrei) lze použít paralelní nádoby obsahující pouze jednoho jedince.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Žížaly použité ke zkoušce by měly mít podobnou hmotnost (např. Eisenia fetida a Eisenia Andrei by měly mít individuální hmotnost 250–600 mg). Roupice např. Enchytraeus albidus) by měly být přibližně 1 cm dlouhé. Všichni červi užití pro konkrétní zkoušku musí pocházet ze stejného zdroje a mělo by se jednat o dospělé jedince s opaskem (viz příloha 5). Vzhledem k tomu, že hmotnost a stáří živočicha může mít vliv na hodnoty BAF (např. z důvodu různého obsahu lipidů a/nebo přítomnosti vajíček), měly by být tyto parametry přesně zaznamenány a zohledněny při interpretaci výsledků. Kromě toho mohou být v průběhu doby expozice vyprodukovány kokony, což rovněž ovlivní hodnoty BAF. Doporučuje se zvážit před zkouškou dílčí vzorek zkoušených červů s cílem odhadnout střední hmotnost ve vlhkém a v suchém stavu.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Volí se vysoký poměr množství půdy k počtu červů, aby se minimalizovalo snížení koncentrace zkoušené chemické látky v půdě v průběhu fáze příjmu. V případě Eisenia fetida a Eisenia Andrei se doporučuje minimální množství 50 g suché hmotnosti (d.w.) půdy na jednoho červa a v případě roupic minimálně 10–20 g suché hmotnosti půdy na zkušební nádobu. Nádoby by měly obsahovat vrstvu půdy o tloušťce 2–3 cm (roupice) nebo 4–5 cm (žížaly).
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Červi použití ke zkoušce se vyjmou z kultury (např. roupice pomocí klenotnické pinzety). Dospělí jedinci se přenesou na neexponovanou zkušební půdu za účelem aklimatizace a krmí se (viz odstavec 36). V případě, že se zkušební podmínky liší od kultivačních podmínek, měla by pro přizpůsobení červů zkušebním podmínkám postačovat aklimatizační fáze v trvání 24 až 72 hodin. Po aklimatizaci se žížaly omyjí přenesením do skleněných misek (např. Petriho misek), které obsahují čistou vodu, a následně se před přidáním do zkušební půdy zváží. Před zvážením se z červů odstraní přebytečná voda jemným oklepáním o okraj misky nebo opatrným osušením do sucha pomocí lehce navlhčeného papírového ručníku.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Zavrtávání zkušebních organismů by mělo být sledováno a zaznamenáváno. Při zkouškách s žížalami se jedinci (v kontrolních i exponovaných nádobách), běžně zavrtají do půdy do několika hodin; tuto skutečnost je nutno zkontrolovat nejpozději do 24 hodin po vložení červů do zkušebních nádob. V případě, že se žížaly nezavrtají do půdy (např. více než 10 % v době přesahující polovinu fáze příjmu), znamená to, že buď nejsou vytvořeny vhodné zkušební podmínky, nebo zkušební organismy nejsou zdravé. V takovém případě je nutno zkoušku ukončit a opakovat. Roupice žijí hlavně v intersticiálních pórech v půdě a jejich integument je často v kontaktu s okolním substrátem jen částečně; expozice zavrtávajících se a nezavrtávajících se roupic se považuje za rovnocennou a nezavrtávání roupic nemusí nutně vyžadovat opakování zkoušky.
                           
                        
                     Krmení
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Krmení by se mělo předpokládat při použití půdy s nízkým celkovým obsahem organického uhlíku. Při použití umělé půdy se doporučuje týdenní frekvence krmení (tj. červi by měli být krmeni jednou týdně) 7 mg sušeného hnoje na gram suché hmotnosti půdy pro žížaly a týdenní frekvence 2–2,5 mg mletých ovesných vloček na gram suché hmotnosti půdy pro roupice (11). První krmná dávka se smíchá s půdou bezprostředně před přidáním zkušebních organismů. Optimálně by měl být užíván stejný typ krmiva jako v kulturách (viz dodatek 5).
                           
                        
                     Světlo a teplota
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Zkouška se provede za řízených světelných podmínek v prostorách, kde jsou umístěny zkušební nádoby, nejlépe 16 h světlo / 8 h tma, optimálně při intenzitě osvětlení 400 lux až 800 lux (3). Zkušební teplota by se měla udržovat na 20 ± 2 °C po celou dobu zkoušky.
                           
                        
                     Zkušební koncentrace
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Použije se jedna koncentrace. Situace, kdy je vyžadována (jsou vyžadovány) další koncentrace, by měly být zdůvodněny. Pokud se toxicita (ECx) zkoušené chemické látky blíží mezi detekce analytické metody, doporučuje se užití zkoušené látky značené radioizotopy s vysokou specifickou radioaktivitou. Pro kovy by její koncentrace měla být vyšší než koncentrace v pozadí ve tkáních a v půdě.
                           
                        
                     Paralelní vzorky
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Pro kinetická měření (ve fázi příjmu a vylučování) je minimální počet exponovaných paralelních nádob tři na jeden odběr. Celkový počet připravených paralelních nádob by měl být dostatečný k pokrytí všech odběrů ve fázi příjmu i vylučování.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Pro biologická pozorování a měření (např. poměr hmotnosti ve vlhkém stavu a suché hmotnosti, obsah lipidů) a pro analýzu koncentrací v pozadí v červech a půdě je zapotřebí nejméně 12 paralelních nádob negativních kontrol (čtyři vzorky odebrané na začátku a čtyři na konci fáze příjmu a čtyři na konci fáze vylučování) v případě, že není použito jiné rozpouštědlo než voda. Pokud bylo pro aplikaci zkoušené chemické látky užito jakékoli solubilizační činidlo, měly by být kromě exponovaných paralelních nádob připraveny i kontroly rozpouštědla (ze čtyř paralelních nádob by měly být odebrány vzorky na začátku, ze čtyř na konci fáze příjmu a ze čtyř na konci fáze vylučování), které budou obsahovat všechny složky s výjimkou zkoušené látky. V tomto případě je možno použít další čtyři paralelní nádoby jako negativní kontroly (bez rozpouštědla) za účelem volitelného odběru vzorků na konci fáze příjmu. Tyto paralelní nádoby lze biologicky srovnat s kontrolou rozpouštědla s cílem získat informace o možném vlivu rozpouštědla na zkušební organismy. Doporučuje se použít dostatečný počet dalších rezervních paralelních nádob (např. osm) pro expozici a kontrolu.
                           
                        
                     Četnost měření kvality půdy
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Na počátku a na konci fáze příjmu a fáze vyprázdnění se změří pH půdy, vlhkost půdy a teplota (kontinuálně) ve zkušební místnosti. Jednou týdně by se měla kontrolovat vlhkost půdy zvážením zkušebních nádob a porovnáním jejich skutečné hmotnosti s počáteční hmotností na začátku zkoušky. Ztráty vody by měly být kompenzovány přidáním deionizované vody.
                           
                        
                     Odběr vzorků a analýza červů a půdy
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Příklad harmonogramu fází příjmu a vylučování u bioakumulačních zkoušek na žížalách a roupicích je uveden v dodatku 3.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Vzorky půdy ze zkušebních nádob pro stanovení koncentrace zkoušené chemické látky se odebírají před vložením červů, během fáze příjmu a během fáze vylučování. Během zkoušky se stanoví koncentrace zkoušené chemické látky v červech a v půdě. Obecně platí, že se měří celkové koncentrace v půdě. Nepovinně lze měřit koncentrace v kapilární vodě, a v takovém případě je před zahájením studie nutno uvést zdůvodnění a vhodné metody, které jsou zahrnuty také do zprávy.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Vzorky z červů a půdy se odebírají nejméně šestkrát během fáze příjmu a fáze vylučování. V případě, že se prokáže stabilita zkoušené chemické látky, lze počet analýz půdy snížit. Doporučuje se analyzovat nejméně tři paralelní vzorky na začátku a na konci fáze příjmu. V případě, že se koncentrace v půdě měřená na konci fáze příjmu liší od počáteční koncentrace o více než 30 %, měly by být analyzovány i vzorky půdy odebrané v jiných termínech.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Červi v dané paralelní nádobě se vyjmou z půdy při každém odběru (např. rozprostřením půdy z paralelní nádoby na mělkou podložku a vyjmutím červů pomocí měkké klenotnické pinzety) a rychle se opláchnou vodou na mělké skleněné nebo ocelové podložce. Odstraní se přebytečná voda (viz bod 34). Červi se opatrně přenesou do předem zvážené nádoby a okamžitě se zváží, včetně střevního obsahu.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Žížalám (Eisenia sp.) by pak mělo být umožněno přes noc vyprázdnit střeva např. na vlhkém filtračním papíru v přikryté Petriho misce (viz bod 34). Po vyprázdnění by měla být stanovena hmotnost červů za účelem posouzení možného úbytku biomasy během zkoušky (viz kritéria platnosti v bodě 17). Vážení a analýza tkání u roupic se provádí bez vyprázdnění, které by bylo technicky obtížné vzhledem k malé velikosti těchto červů. Po konečném určení hmotnosti by měli být červi okamžitě usmrceni nejvhodnější metodou (např. pomocí tekutého dusíku nebo zmrazením při teplotách pod –18 °C).
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              V průběhu fáze vylučování nahradí červi kontaminovaný střevní obsah čistou zeminou. To znamená, že měření u nevyprázdněných červů (v tomto kontextu roupic), kde byly odebrány vzorky bezprostředně před fází vylučování, obsahují kontaminovanou půdu ze střeva. U vodních máloštětinatců se předpokládá, že po počátečních 4–24 hodinách vylučovací fáze je již většina kontaminovaného obsahu střeva nahrazena čistým sedimentem, např. (46). Obdobné výsledky jsou uváděny u žížal v případě studií o hromadění radioaktivně značeného kadmia a zinku (78). U nevyprázdněných roupic lze koncentraci tohoto prvního vzorku vylučovací fáze považovat za koncentraci v tkáni po vyprázdnění střeva. Pro zohlednění naředění koncentrace zkoušené látky nekontaminovanou půdou v průběhu fáze vylučování lze odhadnout hmotnost střevního obsahu z poměru hmotnosti červa ve vlhkém stavu a hmotnosti popela po spálení červa, případně z poměru suché hmotnosti červa a hmotnosti popela po spálení červa.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Vzorky půdy a červů se pokud možno analyzují ihned po vyjmutí (tj. do 1–2 dnů) s cílem předejít rozkladu nebo jiným ztrátám a výpočet přibližné rychlosti příjmu a vylučování se doporučuje provést ještě v průběhu zkoušky. Neprovede-li se analýza okamžitě, vzorky se vhodným způsobem uchovají, např. hlubokým zmrazením (≤ –18 °C).
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Je třeba zkontrolovat, že přesnost a reprodukovatelnost chemické analýzy a rovněž výtěžek zkoušené látky jak z půdy, tak ze vzorků červů jsou pro danou analytickou metodu dostatečné; uvádí se rovněž účinnost extrakce, mez detekce (LOD) a mez kvantifikace (LOQ). Stejně tak je třeba zkontrolovat, zda se zkoušená chemická látka nevyskytuje v kontrolních nádobách v koncentracích vyšších než koncentrace v pozadí. Pokud je koncentrace zkoušené chemické látky ve zkušebním organismu u kontrolní skupiny červů Ca > 0, měla by být zahrnuta do výpočtu kinetických parametrů (viz dodatek 2). Všechny vzorky by měly být v průběhu celé zkoušky zpracovávány tak, aby se minimalizovala kontaminace a ztráty (např. v důsledku adsorpce zkoušené chemické látky odběrným zařízením).
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Jsou-li použity zkušební chemické látky značené radioizotopy, je možné provést analýzu pro výchozí látku i s metabolity. Kvantifikace výchozí zkušební chemické látky a metabolitů v ustáleném stavu nebo na konci fáze příjmu poskytuje důležité informace. Následně by měla být provedena separace, aby mohla být výchozí látka analyzována samostatně. Pokud obsah radioaktivity v jednotlivých metabolitech přesáhne 10 % celkové radioaktivity v analyzovaném vzorku (vzorcích), doporučuje se stanovit i tyto metabolity.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Měl by být zaznamenán a hlášen celkový vývin a vývin zkoušené látky v červech, v půdě a případně i v lapačích obsahujících absorbenty k zachycení odpařené zkoušené chemické látky.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              U roupic, které jsou menší než žížaly, je přijatelné sdružování jedinců odebraných jako vzorek z dané zkušební nádoby. Pokud sdružování znamená redukci počtu paralelních nádob, omezuje to statistické postupy, které lze na údaje aplikovat. Pokud je vyžadován určitý statistický postup a statistická váha, měl by být ve zkoušce nasazen přiměřený počet paralelních zkušebních nádob vyhovující požadovanému sdružování, postupu a statistické váze.
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Doporučuje se, aby byla hodnota BAF vyjádřena jako funkce celkové suché hmotnosti, a bude-li to vyžadováno (např. u vysoce hydrofobních chemických látek), také jako funkce obsahu lipidů. Pro stanovení obsahu lipidů by měla být použita vhodná metoda (pro tento účel by měly být přizpůsobeny některé již existující metody – např. (31), (58). yto metody využívají extrakci pomocí chloroformu/methanolu. Aby se zabránilo používání chlorovaných rozpouštědel, měla by však být použita modifikace Bligh/Dyerovy metody (9) uvedené v odstavci (17). Vzhledem k tomu, že různé metody nemusí poskytovat stejné hodnoty (10), je důležité uvést podrobnosti o použité metodě. Je-li to možné, tj. pokud je k dispozici dostatečné množství tkáně červů, měla by být analýza lipidů provedena optimálně na stejném vzorku extraktu, který byl užit pro analýzu zkoušené chemické látky, neboť lipidy musí být často z extraktu před chromatografickou analýzou odstraněny. Pro stanovení obsahu lipidů lze použít rovněž kontrolní živočichy a tento obsah lze pak použít k normalizaci hodnot BAF. Tento druhý postup snižuje kontaminaci zařízení zkoušenou chemickou látkou.
                           
                        ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ
                  
                     Zpracování výsledků
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              Křivka příjmu zkoušené látky se sestrojí vynesením její koncentrace v červech nebo na nich v průběhu fáze příjmu proti času v lineárním měřítku. Dosáhla-li křivka fáze plató čili ustáleného stavu (viz definice v dodatku 1), vypočítá se hodnota bioakumulačního faktoru v ustáleném stavu BAFSS z poměru:
                              
                                 
                              Ca je koncentrace zkoušené chemické látky ve zkušebním organismu,
                              Cs je koncentrace zkoušené chemické látky v půdě.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Není-li dosaženo ustáleného stavu, měla by být místo hodnoty BAFSS vypočtena hodnota BAFK na základě rychlostních konstant, jak je popsáno níže:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Stanoví se akumulační faktor (BAFK) jako poměr ks/ke.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Rychlost příjmu a vylučování se optimálně vypočtou současně (viz rovnice 11 v dodatku 2).
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Rychlostní konstanta vylučování (ke) se obvykle stanoví z křivky vylučování (tj. grafu poklesu koncentrace zkoušené chemické látky v červech v průběhu fáze vylučování). Následně se vypočte rychlostní konstanta příjmu pomocí hodnoty ke a hodnoty Ca, odvozené z křivky příjmu (popis těchto metod viz dodatek 2). Upřednostňovanou metodou pro získání hodnoty BAFK a rychlostních konstant ks a ke je metoda nelineárního odhadu parametrů s využitím počítače. Není-li zjevně křivka vylučování křivkou prvního řádu, měly by být použity složitější modely.
                                       
                                    
                        
                     Protokol o zkoušce
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Protokol o zkoušce by měl obsahovat tyto informace:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkoušená látka:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      veškeré dostupné informace o akutní nebo dlouhodobé toxicitě (např. ECx, LCx“ NOEC) zkoušené chemické látky pro půdní máloštětinatce,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      čistotu, fyzikální povahu a fyzikálně-chemické vlastnosti, např. log Kow, rozpustnost ve vodě,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      chemické identifikační údaje; zdroj zkoušené položky, identifikaci a koncentraci případného použitého rozpouštědla,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      v případě značení radioaktivními izotopy jejich přesnou polohu, specifickou radioaktivitu a radiochemickou čistotu.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovací druh:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vědecký název, kmen, zdroj, případné předběžné ošetření, aklimatizace, stáří, rozmezí velikostí atd.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zkušební podmínky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použitý zkušební postup,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      typ a charakteristiky použitého osvětlení a fotoperioda (fotoperiody),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uspořádání zkoušky (např. počet a velikost zkušebních nádob, hmotnost půdy a tloušťka půdní vrstvy, počet paralelních nádob, počet červů v jedné paralelní nádobě, počet zkušebních koncentrací, délka fází příjmu a vylučování, četnost odběru vzorků),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdůvodnění výběru materiálu zkušební nádoby,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda přípravy a aplikace zkoušené položky a důvody pro výběr konkrétní metody,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominální zkušební koncentrace, střední hodnoty naměřených koncentrací ve zkušebních nádobách, jejich směrodatné odchylky a metody, jimiž byly tyto hodnoty získány,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj složek umělé půdy nebo – v případě užití přírodního média – původ půdy, popis jakékoli předchozí úpravy, výsledky kontrol (přežití, vývoj biomasy, reprodukce), charakteristika půdy, (pH, obsah celkového organického uhlíku, distribuce částic (procento písku, prachu a jílu), procento obsahu vody WHCmax na začátku a na konci zkoušky a jiná provedená měření),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné informace o expozici vzorků půdy a červů včetně podrobností o přípravě, uchovávání, postupech vmíchávání, extrakci a analytických postupech (a přesnosti), pokud jde o zkoušenou látku v červech a půdě, obsah lipidů (je-li měřen) a výtěžky zkoušené položky.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      úhyn kontrolních červů a červů v každé zkušební nádobě a jakékoli pozorované neobvyklé chování (např. snaha uniknout z půdy, nerozmnožování v bioakumulačních zkouškách na roupicích),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      poměr suché hmotnosti půdy a zkušebních organismů k jejich hmotnosti ve vlhkém stavu (užitečné pro normalizaci),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hmotnost červů ve vlhkém stavu při každém odběru; u žížal vlhká hmotnost na začátku zkoušky a po každém odběru před pročištěním střev a po něm,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      obsah lipidů ve zkoušených organismech (je-li stanoven),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      křivky kinetiky příjmu a vylučování zkoušené chemické látky červy a doba dosažení ustáleného stavu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hodnoty Ca a Cs (popřípadě se směrodatnými odchylkami a rozpětím) pro všechny odběry (hodnota Ca se vyjadřuje v g/kg vlhké a suché hmotnosti celého těla, hodnota Cs se vyjadřuje v g/kg vlhké a suché hmotnosti půdy). Pokud je vyžadován akumulační faktor biota-půda (BSAF) (například pro porovnání výsledků dvou nebo více zkoušek provedených s živočichy s odlišným obsahem lipidů), lze navíc vyjádřit i hodnotu Ca jako g/kg obsahu lipidů v organismu a hodnotu Cs jako g/kg organického uhlíku (OC) v půdě.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dodatečně lze uvést i BAF (vyjádřený v kg půdy na·kg červů), rychlostní konstantu příjmu půdy ks (vyjádřenou v g půdy na kg červů za den) a rychlostní konstantu vylučování ke (vyjádřenou v číselné hodnotě za den); BSAF (vyjádřený v kg organického půdního uhlíku na kg obsahu lipidů v červech),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      měří-li se, procentuální podíl výchozí chemické látky, metabolitů a vázaných reziduí (tj. procentní podíl zkoušené chemické látky, který nelze extrahovat běžnými metodami extrakce) zjištěný v půdě a ve zkoušených živočiších,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metody užívané pro statistické analýzy dat.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Vyhodnocení výsledků
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      soulad výsledků s kritérii validity uvedenými v odstavci 17,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      neočekávané nebo neobvyklé výsledky, např. neúplné odstranění zkoušené látky z pokusných zvířat.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA:
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane (γ-HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1688-00a.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid potworm Enchytraeus albidus. ASTM International, E1676-04: 26 pp.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger G (2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): Bioaccumulation - New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235–276.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93–99.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & Hermens J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 154–165.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel C (1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei). Ecotox. Environ. Safety 31: 185–191.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              Bell AW (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902: 1–13.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Bligh EG and Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911–917.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, 671 p.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P (2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes Enchytraeus luxuriosus and Enchytraeus albidus (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). Hydrobiologia 463: 185–196.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Conder JM and Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm Eisenia fetida. J. Soils Sediments 3: 13–20.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Connell DW and Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to Earthworm System. Chemosphere 20: 91–100.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37: 2-29.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              Didden W (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd., The Netherlands, pp. 555–576.
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing Programme.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, Bachmann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 140–145.
                           
                        
                              19)
                           
                           
                              Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 ze dne 18. prosince 2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek, o zřízení Evropské agentury pro chemické látky, o změně směrnice 1999/45/ES a o zrušení nařízení Rady (EHS) č. 793/93, nařízení Komise (ES) č. 1488/94, směrnice Rady 76/769/EHS a směrnic Komise 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES, Úř. věst. L 396, 30.12.2006, s. 1.
                           
                        
                              20)
                           
                           
                              Edwards CA and Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. Third Edition, Chapman & Hall, London, 426 pp.
                           
                        
                              21)
                           
                           
                              OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
                           
                        
                              22)
                           
                           
                              Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th and Römbke J (2009). Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: 149 pp. Ke stažení na adrese: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
                           
                        
                              23)
                           
                           
                              Elmegaard N and Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: 57 pp.
                           
                        
                              24)
                           
                           
                              Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.
                           
                        
                              25)
                           
                           
                              EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195–208.
                           
                        
                              26)
                           
                           
                              Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk assessment? Chemosphere 32: 1897–1905.
                           
                        
                              27)
                           
                           
                              Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumulation. Chemosphere 29: 1501–1514.
                           
                        
                              28)
                           
                           
                              Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Dichlorprop) beim Regenwurm Lumbricus rubellus (Oligochaeta, Lumbricidae). Dissertation University Mainz, 156 pp.
                           
                        
                              29)
                           
                           
                              Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF - Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 78–84.
                           
                        
                              30)
                           
                           
                              Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225–1231.
                           
                        
                              31)
                           
                           
                              Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099–1105.
                           
                        
                              32)
                           
                           
                              Hawker DW and Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701–707.
                           
                        
                              33)
                           
                           
                              Hund-Rinke K and Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sediments 1: 15–20.
                           
                        
                              34)
                           
                           
                              Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59–81.
                           
                        
                              35)
                           
                           
                              ISO 11268-2 (1998) Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction.
                           
                        
                              36)
                           
                           
                              Jaenike J (1982). „Eisenia foetida“ is two biological species. Megadrilogica 4: 6–8.
                           
                        
                              37)
                           
                           
                              Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080–2090.
                           
                        
                              38)
                           
                           
                              Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in Eisenia andrei (Oligochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953–961.
                           
                        
                              39)
                           
                           
                              Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, DeJong A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms (Eisenia andrei, Oligochaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 767–775.
                           
                        
                              40)
                           
                           
                              Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm, Eisenia andrei (Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399–3404.
                           
                        
                              41)
                           
                           
                              Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305–312.
                           
                        
                              42)
                           
                           
                              Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217–232.
                           
                        
                              43)
                           
                           
                              Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von 14C-Hexachlorbenzol und 14C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University München, 137 pp.
                           
                        
                              44)
                           
                           
                              Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23: 588–595.
                           
                        
                              45)
                           
                           
                              Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accumulation in Lumbricus rubellus under laboratory conditions compared with accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17–26.
                           
                        
                              46)
                           
                           
                              Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegates. Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244–1249.
                           
                        
                              47)
                           
                           
                              Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumulation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
                           
                        
                              48)
                           
                           
                              Kapitola C.8 této přílohy - Toxicita pro žížaly.
                           
                        
                              49)
                           
                           
                              Kapitola C.13 této přílohy - Bioakumulace: průtoková zkouška na rybách.
                           
                        
                              50)
                           
                           
                              Kapitola C.21 této přílohy - Půdní mikroorganismy: zkouška na transformaci dusíku.
                           
                        
                              51)
                           
                           
                              OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
                           
                        
                              52)
                           
                           
                              OECD (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia Andrei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
                           
                        
                              53)
                           
                           
                              OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
                           
                        
                              54)
                           
                           
                              Petersen H and Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287-388.
                           
                        
                              55)
                           
                           
                              Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. In: Handbook Ecotoxicology Vol. 1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378–396.
                           
                        
                              56)
                           
                           
                              Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser-Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77–81.
                           
                        
                              57)
                           
                           
                              Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm Eisenia fetida. RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.
                           
                        
                              58)
                           
                           
                              Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ.Toxicol. Chem. 10: 1431–1436.
                           
                        
                              59)
                           
                           
                              Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S.
                           
                        
                              60)
                           
                           
                              Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 pp.
                           
                        
                              61)
                           
                           
                              Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105–129.
                           
                        
                              62)
                           
                           
                              Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107–127.
                           
                        
                              63)
                           
                           
                              Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110–2120.
                           
                        
                              64)
                           
                           
                              Schlosser H-J and Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 413–433.
                           
                        
                              65)
                           
                           
                              Schmelz R and Collado R (1999). Enchytraeus luxuriosus sp. nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 57: 93–100.
                           
                        
                              66)
                           
                           
                              Sims R W and Gerard BM (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.
                           
                        
                              67)
                           
                           
                              Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557–2563.
                           
                        
                              68)
                           
                           
                              Spacie A and Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309–320.
                           
                        
                              69)
                           
                           
                              Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scroggins RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxicology. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac Press, Pensacola, 67–81.
                           
                        
                              70)
                           
                           
                              Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM (2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta. Environ. Toxicol. Chemistry 22: 1167–1171.
                           
                        
                              71)
                           
                           
                              UBA (Umweltbundesamt, 1991). Bioakkumulation - Bewertungskonzept und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.
                           
                        
                              72)
                           
                           
                              US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, MN, March 2000.
                           
                        
                              73)
                           
                           
                              Van Brummelen TC and Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: 277–285.
                           
                        
                              74)
                           
                           
                              Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the toxicity of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earthworms (Ed. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB).
                           
                        
                              75)
                           
                           
                              Van Gestel CA and Ma W-C (1990). An approach to quantitative structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. Chemosphere 21: 1023–1033.
                           
                        
                              76)
                           
                           
                              Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil invertebrates. Environmental Pollution 136: 409–417.
                           
                        
                              77)
                           
                           
                              Venter JM and Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm Eisenia fetida (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161–165.
                           
                        
                              78)
                           
                           
                              Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm Lumbricus rubellus exposed to contaminated floodplain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843–1851.
                           
                        
                              79)
                           
                           
                              Widianarko B and Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402–406.
                           
                        
                     Dodatek 1
                     DEFINICE
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bioakumulace je nárůst koncentrace zkoušené chemické látky v organismu nebo na něm vzhledem ke koncentraci zkoušené chemické látky v okolním médiu. Bioakumulace je výsledkem biokoncentračních a bioobohacovacích procesů (viz níže).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Biokoncentrace je nárůst koncentrace zkoušené chemické látky v organismu nebo na něm příjmem zkoušené chemické látky výhradně z okolního média (tj. povrchem těla a ingescí půdy) vzhledem ke koncentraci zkoušené chemické látky v okolním médiu.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bioobohacování je nárůst koncentrace zkoušené chemické látky v organismu nebo na něm hlavně příjmem kontaminované potravy nebo kořisti vzhledem ke koncentraci zkoušené chemické látky v této potravě nebo kořisti. Bioobohacování může vést k přestupu nebo akumulaci zkoušené látky v potravních řetězcích.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Vylučování zkoušené chemické látky je úbytek této chemické látky z tkáně zkoušeného organismu na základě aktivních nebo pasivních procesů, ke kterému dochází nezávisle na přítomnosti nebo nepřítomnosti zkoušené položky v okolním médiu.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bioakumulační faktor (BAF) je koncentrace zkoušené látky ve zkoušeném organismu nebo na něm (Ca v g/kg suché hmotnosti červů) dělená koncentrací chemikálie v okolním médiu (Cs jako g/kg suché hmotnosti půdy), a to kdykoliv ve fázi příjmu při této bioakumulační zkoušce. Jednotkou BAF je kg půdy·na kg červů.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bioakumulační faktor v ustáleném stavu (BAFSS) je BAF v ustáleném stavu a po dlouhou dobu se výrazně nemění; koncentrace zkoušené látky v okolním médiu (Cs jako g/kg suché hmotnosti půdy) je po tuto dobu konstantní.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Biokoncentrační faktory vypočtené přímo z poměru rychlostní konstanty příjmu z půdy a rychlostní konstanty vylučování (ks a ke, viz níže) se nazývají kinetický bioakumulační faktor (BAFK).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Akumulační faktor biota-půda (BSAF) je koncentrace zkoušené látky ve zkoušeném organismu nebo na něm normalizovaná na lipidy, dělená koncentrací zkoušené látky v půdě v ustáleném stavu normalizované na organický uhlík. Ca se pak vyjádří jako g/kg obsahu lipidů v organismu a Cs jako g/kg obsahu organických látek v půdě; jednotkami BSAF jsou kg OC na·kg lipidů.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Plató nebo ustálený stav je definován jako rovnováha mezi procesem příjmu a vylučování, k němuž dochází při fázi expozice současně. Ustáleného stavu je dosaženo tehdy, je-li při grafickém znázornění křivka časové závislosti BAF rovnoběžná s časovou osou a tři po sobě jdoucí analýzy BAF vzorků odebraných v intervalech alespoň dvou dnů se neliší více než o ±20 % a není-li mezi těmito třemi dobami odběru žádný statisticky významný rozdíl. V případě zkoušených látek, jejichž příjem probíhá pomalu, jsou vhodnější sedmidenní intervaly (49).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rozdělovací koeficient organický uhlík/voda (Koc) je rovnovážný poměr mezi koncentrací chemické látky ve/na frakci organického uhlíku v půdě a koncentrace chemické látky ve vodě.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rozdělovací koeficient n-oktanol/voda (Kow) je rovnovážný poměr mezi rozpustností chemické látky v n-oktanolu a ve vodě (někdy se označuje také jako Pow). Logaritmus hodnoty Kow (log Kow) se používá jako ukazatel potenciálu chemikálie bioakumulovat se ve vodních organismech.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Expozice nebo fáze příjmu je časový úsek, během něhož jsou zkoušené organismy vystaveny působení zkoušené chemické látky.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rychlostní konstanta příjmu z půdy (ks) je číselná hodnota definující rychlost nárůstu koncentrace zkoušené položky ve zkoušených organismech nebo na nich v důsledku příjmu z půdní fáze. ks se vyjadřuje v g půdy na kg červů za den.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Vylučovací fáze je časový úsek po přemístění zkušebních organismů z kontaminovaného média do média, které zkoušenou látku neobsahuje, během něhož se studuje vylučování chemické látky ze zkušebních organismů (nebo její čistý úbytek v nich).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rychlostní konstanta vylučování (ke) je číselná hodnota definující rychlost poklesu koncentrace zkoušené látky ve zkoušeném organismu nebo na něm po přemístění zkoušených organismů z média obsahujícího zkoušenou látku do média, které neobsahuje chemické látky; ke je vyjádřeno jako číselná hodnota za den.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Zkoušená chemická látka: jakákoliv látka nebo směs testovaná pomocí této zkušební metody.
                              
                           
                  
                     Dodatek 2
                     
                        Výpočet parametrů příjmu a vylučování
                     
                     Hlavním koncovým bodem bioakumulační zkoušky je bioakumulační faktor BAF. Měřený BAF lze vypočítat tak, že se koncentrace ve zkušebním organismu Ca, vydělí koncentrací v půdě Cs v ustáleném stavu. Pokud není ustáleného stavu dosaženo během fáze příjmu, vypočte se BAFK z rychlostních konstant místo BAFSS. Je však třeba zaznamenat, zda je BAF založen na koncentracích v ustáleném stavu či nikoli.
                     Obvyklou metodou pro získání hodnoty kinetického bioakumulačního faktoru (BAFK), rychlostní konstanty příjmu (ks) a rychlostní konstanty vylučování (ke) jsou metody nelineárního odhadu parametrů s využitím počítače, např. na základě modelů popsaných v odstavci (68). Na základě souboru po sobě jdoucích údajů o koncentracích a modelových rovnic:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [rovnice 1]
                              
                           nebo
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 [rovnice 2]
                              
                           kde:
                     
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 koncentrace chemické látky v červech [g/kg hmotnosti ve vlhkém stavu nebo suché hmotnosti],
                              
                           
                                 ks
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 rychlostní konstanta příjmu v tkáni [g půdy na kg červů za den],
                              
                           
                                 Cs
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 koncentrace chemické látky v půdě [g/kg hmotnosti ve vlhkém stavu nebo suché hmotnosti],
                              
                           
                                 ke
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 rychlostní konstanta vylučování [1/d],
                              
                           
                                 tc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 čas konce fáze příjmu.
                              
                           Tyto počítačové programy vypočtou hodnoty BAFK, ks a ke.
                     V případě, že se koncentrace neexponovaných červů například v den 0 významně liší od nuly (k tomu může dojít například v případě kovů), měla by být tato koncentrace v pozadí (Ca,0) zahrnuta do uvedených rovnic takto:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [rovnice 3]
                              
                           a
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 [rovnice 4]
                              
                           V případech, kdy dojde v průběhu času během fáze příjmu k významnému poklesu koncentrace zkoušené chemické látky v půdě lze použít následující modely, např. (67, 79):
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [rovnice 5]
                              
                           kde:
                     
                                 Cs
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 koncentrace chemické látky v půdě [g/kg hmotnosti ve vlhkém stavu nebo suché hmotnosti],
                              
                           
                                 k0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 rychlostní konstanta rozkladu v půdě [1/d],
                              
                           
                                 C0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 počáteční koncentrace chemické látky v půdě [g/kg hmotnosti ve vlhkém stavu nebo suché hmotnosti].
                              
                           
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [rovnice 6]
                              
                           
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 [rovnice 7]
                              
                           kde:
                     
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 koncentrace chemické látky v červech [g na kg hmotnosti ve vlhkém stavu nebo suché hmotnosti],
                              
                           
                                 ks
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 rychlostní konstanta příjmu v tkáni [g půdy na kg červů za den],
                              
                           
                                 k0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 rychlostní konstanta rozkladu v půdě [1/d],
                              
                           
                                 ke
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 rychlostní konstanta vylučování [1/d],
                              
                           
                                 tc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 čas konce fáze příjmu.
                              
                           Když je během fáze příjmu dosaženo ustáleného stavu (tj. t = ∞), rovnice 1
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [rovnice 1]
                              
                           může být zjednodušena na rovnici:
                     
                        
                     nebo
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [rovnice 8]
                              
                           Pak ks/ke x Cs je přiblížením ke koncentraci zkoušené látky ve tkáni červů v ustáleném stavu (Ca,ss).
                     Akumulační faktor biota-půda (BSAF) lze vypočítat následovně:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [rovnice 9]
                              
                           kde foc je frakcí organického uhlíku v půdě a flip je frakcí lipidů v červech, obojí v optimálním případě stanoveno na vzorcích odebraných při zkoušce buď na základě hmotnosti po vysušení (foc) nebo živé váhy (flip).
                     Kinetiku vylučování lze modelovat pomocí dat z fáze vylučování za použití níže uvedené modelové rovnice a metody nelineárního odhadu parametrů s využitím počítače. Pokud data vynesená do grafu proti času indikují konstantní exponenciální pokles koncentrace zkoušené látky u zvířat, lze použít k popisu časového průběhu vylučování model s jedním kompartmentem (rovnice 9).
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [rovnice 10]
                              
                           Procesy vylučování se někdy jeví jako dvoufázové, neboť vykazují rychlý pokles Ca během raných fází, který se v pozdějších fázích vylučování změní na pomalejší úbytek zkoušených látek, např. (27) (68). Tyto dvě fáze mohou být interpretovány na základě předpokladu, že v organismu existují dva různé kompartmenty, z nichž dochází k úbytku zkoušené látky odlišnou rychlostí. V těchto případech je nutno studovat specifickou literaturu, např. (38, 39, 40, 78).
                     Pomocí výše uvedených modelových rovnic lze rovněž zároveň vypočítat kinetické parametry (ks a ke) uplatněním modelu kinetiky prvního řádu na všechna data z fáze příjmu a z fáze vylučování současně. Popis metody, která by mohla umožnit takovýto kombinovaný výpočet rychlostních konstant příjmu a vylučování, lze nalézt v odkazech (41, 73 a 70).
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [rovnice 11]
                              
                           
                                 
                                    Poznámka:
                                 
                              
                              
                                 Pokud se parametry příjmu a vylučování odhadují současně z kombinovaných dat o příjmu a vylučování, je hodnota „m“ uvedená v rovnici 11 deskriptorem, který umožňuje počítačovému programu přiřadit dílčí členy rovnice datovým sadám příslušné fáze a provést správné vyhodnocení (m = 1 pro fázi příjmu, m = 2 pro fázi vylučování).
                              
                           Tyto modelové rovnice je však nutno užívat obezřetně, zvláště v případě změn biologické dostupnosti zkoušené chemické látky nebo (bio) rozkladu, k nimž dojde během zkoušky (viz např. (79)).
                  
                  
                     Dodatek 3
                     PŘÍKLADY HARMONOGRAMŮ ZKOUŠEK BIOAKUMULACE V PŮDĚ
                     
                        Zkouška na žížalách
                     
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Fáze příjmu s 8 daty odběrů vzorků užitými pro výpočet kinetiky
                                 
                                             Den
                                          
                                          
                                             Činnost
                                          
                                       
                                             – 6
                                          
                                          
                                             kondicionování připravené půdy po dobu 48 hodin
                                          
                                       
                                             – 4
                                          
                                          
                                             vmíchání roztoku zkoušené chemické látky do půdní frakce, odpaření případného rozpouštědla, promísení půdních složek, rozdělení půdy do zkušebních nádob, ustavování rovnováhy při zkušebních podmínkách po dobu 4 dnů (3 týdny u půdy obohacené kovem)
                                          
                                       
                                             – 3 až – 1
                                          
                                          
                                             oddělení zkušebních organismů z kultury za účelem aklimatizace; příprava a zvlhčení půdních složek,
                                          
                                       
                                             0
                                          
                                          
                                             měření teploty a pH půdy, odstraňování vzorků půdy ze zkušebních nádob a kontrola rozpouštědel pro stanovení koncentrace zkoušené chemické látky, doplnění krmné dávky, zvážení a náhodné rozdělení červů do zkušebních nádob, zachování dostatečných dílčích vzorků červů pro stanovení analytických hodnot pozadí, hmotnosti ve vlhkém stavu a suché hmotnosti a obsahu lipidů, zvážení všech zkušebních nádob za účelem kontroly vlhkosti půdy, kontrola přívodu vzduchu, pokud je užit uzavřený zkušební systém
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             kontrola přívodu vzduchu, zaznamenání chování červů a teploty, odebrání vzorků půdy a červů za účelem stanovení koncentrace zkoušené položky
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             stejný jako 1. den
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             kontrola přívodu vzduchu, chování červů a teploty
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             stejný jako 1. den
                                          
                                       
                                             5–6
                                          
                                          
                                             stejný jako 3. den
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             stejný jako 1. den; doplnění krmné dávky, kontrola vlhkosti půdy převážením zkušebních nádob a doplnění odpařené vody
                                          
                                       
                                             8–9
                                          
                                          
                                             stejný jako 3. den
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             stejný jako 1. den
                                          
                                       
                                             11–13
                                          
                                          
                                             stejný jako 3. den
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             stejný jako 1. den; doplnění krmné dávky, kontrola vlhkosti půdy převážením zkušebních nádob a doplnění odpařené vody
                                          
                                       
                                             15–16
                                          
                                          
                                             stejný jako 3. den
                                          
                                       
                                             17
                                          
                                          
                                             stejný jako 1. den
                                          
                                       
                                             18–20
                                          
                                          
                                             stejný jako 3. den
                                          
                                       
                                             21
                                          
                                          
                                             stejný jako 1 den; měření teploty a pH půdy, kontrola vlhkosti půdy převážením zkušebních nádob, ukončení fáze příjmu, přenesení červů ze zbývajících exponovaných paralelních nádob do nádob obsahujících čistou půdu pro fázi eliminace (bez vyprázdnění střev), odběr vzorků půdy a červů z rozpouštědlové kontroly
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             adaptační činnosti (fáze ustavování rovnováhy) by měly být naplánovány s ohledem na vlastnosti zkoušené chemické látky
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             činnosti popsané pro 3. den by se měly provádět denně (alespoň v pracovní dny).
                                          
                                       
                           
                                 b)
                              
                              
                                 Fáze vylučování
                                 
                                             Den
                                          
                                          
                                             Činnost
                                          
                                       
                                             – 6
                                          
                                          
                                             příprava a zvlhčení půdních složek, kondicionování připravené půdy po dobu 48 hodin
                                          
                                       
                                             – 4
                                          
                                          
                                             smísení půdních složek, rozdělení půdy do zkušebních nádob, inkubace při zkušebních podmínkách po dobu 4 dnů
                                          
                                       
                                             0 (konec fáze příjmu)
                                          
                                          
                                             měření teploty a pH půdy, vážení a náhodné rozdělení červů do zkušebních nádob, doplnění krmné dávky, přemístění červů ze zbývajících exponovaných paralelních vzorků do nádob obsahujících čistou půdu, odebrání vzorků půdy a červů po 4–6 hodinách za účelem stanovení koncentrace zkoušené chemické látky
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             kontrola přívodu vzduchu, zaznamenání chování červů a teploty, odebrání vzorků půdy a červů za účelem stanovení koncentrace zkoušené chemické látky
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             stejný jako 1. den
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             kontrola přívodu vzduchu, chování červů a teploty
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             stejný jako 1. den
                                          
                                       
                                             5–6
                                          
                                          
                                             stejný jako 3. den
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             stejný jako 1. den; doplnění krmné dávky, kontrola vlhkosti půdy převážením zkušebních nádob a doplnění odpařené vody
                                          
                                       
                                             8–9
                                          
                                          
                                             stejný jako 3. den
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             stejný jako 1. den
                                          
                                       
                                             11–13
                                          
                                          
                                             stejný jako 3. den
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             stejný jako 1. den; doplnění krmné dávky, kontrola vlhkosti půdy převážením zkušebních nádob a doplnění odpařené vody
                                          
                                       
                                             15–16
                                          
                                          
                                             stejný jako 3. den
                                          
                                       
                                             17
                                          
                                          
                                             stejný jako 1. den
                                          
                                       
                                             18–20
                                          
                                          
                                             stejný jako 3. den
                                          
                                       
                                             21
                                          
                                          
                                             stejný jako 1. den; měření teploty a pH půdy; kontrola vlhkosti půdy převážením zkušebních nádob; odběr vzorků půdy a červů z kontrol rozpouštědla
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             příprava půdy před zahájením fáze vylučování by měla být provedena stejným způsobem jako před fází příjmu.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             činnosti popsané pro 3. den by se měly provádět denně (alespoň v pracovní dny)
                                          
                                       
                           
                        Zkouška na roupicích
                     
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Fáze příjmu s 8 daty odběrů vzorků užitými pro výpočet kinetiky
                                 
                                             Den
                                          
                                          
                                             Činnost
                                          
                                       
                                             – 6
                                          
                                          
                                             kondicionování připravené půdy po dobu 48 hodin
                                          
                                       
                                             – 4
                                          
                                          
                                             vmíchání roztoku zkoušené chemické látky do půdní frakce, odpaření případného rozpouštědla, promísení půdních složek, rozdělení půdy do zkušebních nádob, ustavování rovnováhy při zkušebních podmínkách po dobu 4 dnů (3 týdny u půdy obohacené kovem)
                                          
                                       
                                             – 3 až – 1
                                          
                                          
                                             oddělení zkušebních organismů z kultury za účelem aklimatizace; příprava a zvlhčení půdních složek
                                          
                                       
                                             0
                                          
                                          
                                             měření teploty a pH půdy, odstraňování vzorků půdy ze zkušebních nádob a kontrola rozpouštědel pro stanovení koncentrace zkoušené chemické látky, doplnění krmné dávky do půdy, zvážení a náhodné rozdělení červů do zkušebních nádob, zachování dostatečných dílčích vzorků červů pro stanovení analytických hodnot pozadí, hmotnosti ve vlhkém stavu a suché hmotnosti a obsahu lipidů, zvážení všech zkušebních nádob za účelem kontroly vlhkosti půdy, kontrola přívodu vzduchu, pokud je užit uzavřený zkušební systém
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             kontrola přívodu vzduchu, zaznamenání chování červů a teploty, odebrání vzorků půdy a červů za účelem stanovení koncentrace zkoušené položky
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             stejný jako 1. den
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             kontrola přívodu vzduchu, zaznamenání chování červů a teploty
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             stejný jako 1. den
                                          
                                       
                                             5–6
                                          
                                          
                                             stejný jako 3. den
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             stejný jako 1. den; doplnění krmné dávky do půdy, kontrola vlhkosti půdy převážením zkušebních nádob a doplnění odpařené vody
                                          
                                       
                                             9
                                          
                                          
                                             stejný jako 1. den
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             stejný jako 3. den
                                          
                                       
                                             11
                                          
                                          
                                             stejný jako 1. den
                                          
                                       
                                             12–13
                                          
                                          
                                             stejný jako 3. den
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             stejný jako 1. den; doplnění krmné dávky do půdy, měření teploty a pH půdy, kontrola vlhkosti půdy převážením zkušebních nádob, ukončení fáze příjmu, přenesení červů ze zbývajících exponovaných paralelních nádob do nádob obsahujících čistou půdu pro fázi vylučování (bez vyprázdnění střev), odběr vzorků půdy a červů z rozpouštědlové kontroly
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             adaptační činnosti (fáze ustavování rovnováhy) by měly být naplánovány s ohledem na vlastnosti zkoušené chemické látky
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             činnosti popsané pro 3. den by se měly provádět denně (alespoň v pracovní dny)
                                          
                                       
                           
                  
                     Dodatek 4
                     
                        Umělá půda – doporučení pro přípravu a skladování
                     
                     Vzhledem k tomu, že přírodní půda z určitého zdroje nemusí být k dispozici po celý rok a zkoušku mohou ovlivnit původní organismy i přítomnost mikroskopických znečišťujících látek, doporučuje se použít při této zkoušce umělý substrát, umělou půdu podle kapitoly C.8 této přílohy – Toxicita pro žížaly (48). V této půdě může přežít, růst a rozmnožovat se více zkušebních testovacích druhů a je zajištěna maximální standardizace i zkušební a kultivační podmínky srovnatelné vnitrolaboratorně i mezilaboratorně.
                     Složky půdy
                     
                                 Rašelina:
                              
                              
                                 10 %
                              
                              
                                 Sfagnová rašelina v souladu se směrnicí OECD č. 207 (48);
                              
                           
                                 Křemenný písek:
                              
                              
                                 70 %
                              
                              
                                 Průmyslový křemenný písek (vysušený na vzduchu); velikost částic: více než 50 % částic by se měla pohybovat v rozpětí 50–200 μm, ale všechny částice by měly být ≤ 2 mm
                              
                           
                                 Kaolinitický jíl
                              
                              
                                 20 %
                              
                              
                                 Obsah kaolinitu ≥ 30 %
                              
                           
                                 Uhličitan vápenatý
                              
                              
                                 ≤ 1 %
                              
                              
                                 CaCO3, práškový, chemicky čistý
                              
                           Obsah organického uhlíku v umělé půdě lze podle potřeby snížit například snížením obsahu rašeliny na 4–5 % suché půdy a odpovídajícím zvýšením obsahu písku. Takovým snížením obsahu organického uhlíku se může snížit schopnost adsorpce zkoušené chemické látky (organický uhlík), do půdy a dostupnost zkoušené chemické látky pro červy se může zvýšit (74). Bylo prokázáno, že Enchytraeus albidus a Eisenia fetida mohou splnit kritéria validity pro reprodukci při testování v polních půdách s nižším obsahem organického uhlíku, např. 2,7 % (33), (61), a dle zkušenosti toho lze dosáhnout i v umělé půdě s 5 % obsahem rašeliny.
                     
                        Příprava
                     
                     Suché složky půdy se důkladně promísí (např. ve velké laboratorní míchačce). To by mělo být provedeno přibližně týden před zahájením zkoušky. Smíchané suché složky půdy by se měly navlhčit deionizovanou vodou minimálně 48 hodin před aplikací zkoušené chemické látky, aby se vyrovnala/stabilizovala kyselost. Hodnota pH se měří po smíchání půdy s roztokem 1M KCl v poměru 1:5. Pokud není hodnota pH v požadovaném rozsahu (6,0 ± 0,5), musí se do půdy přidat dostatečné množství CaCO3 nebo se musí připravit nová šarže půdy.
                     Maximální vodní kapacita (WHC) v umělé půdě se stanoví v souladu s normou ISO 11268-2 (35). Nejméně dva dny před započetím zkoušky se suchá umělá půda zvlhčí přídavkem dostatečného množství deionizované nebo rekonstituované vody, aby bylo dosaženo přibližně poloviny výsledného obsahu vody. Výsledný obsah vody by se měl rovnat 40 % až 60 % maximální vodní kapacity. Na začátku zkoušky se navlhčená půda rozdělí do tolika dávek, kolik je zkušebních koncentrací a kontrol při zkoušce, a obsah vlhkosti se upraví na 40–60 % WHCmax pomocí roztoku zkoušené chemické látky a/nebo přidáním deionizované nebo rekonstituované vody. Obsah vlhkosti se stanoví na začátku a na konci zkoušky (při 105 °C). Měl by optimálně vyhovovat potřebám jednotlivých druhů (obsah vlhkosti lze rovněž ověřit lehkým stlačením rukou a mezi prsty by se měly objevit pouze malé kapičky vody).
                     
                        Uchovávání
                     
                     Suché složky umělé půdy mohou být uchovávány při pokojové teplotě až do použití. Připravenou předvlhčenou půdu lze skladovat v chladu po dobu až tří dnů před vmícháním; je třeba dbát na minimalizaci odpařování vody. Půda obohacená zkoušenou látkou by měla být použita bezprostředně, pokud nejsou k dispozici informace o tom, že tuto určitou půdu lze skladovat bez vlivu na toxicitu a biologickou dostupnost zkoušené chemické látky. Vzorky obohacené půdy pak mohou být uchovány za podmínek doporučených pro konkrétní zkoušenou látku až do provedení analýzy.
                  
                  
                     Dodatek 5
                     
                        Druhy terestrických máloštětinatců doporučené pro zkoušky bioakumulace z půdy
                     
                     
                        Žížaly
                     
                     Doporučeným zkušebním druhem je Eisenia fetida (Savigny 1826), patřící do čeledi Lumbricidae. Od roku 1972 je rozdělen do dvou poddruhů (Eisenia fetida and Eisenia andrei (10)). Podle Jaenikeho (36) se jedná o samostatné oddělené druhy. Eisenia fetida je snadno rozpoznatelná podle jasně žlutých pruhů na článcích, zatímco Eisenia andrei má jednolitou tmavě červenou barvu. Oba druhy pravděpodobně pocházejí z černomořské oblasti a dnes jsou rozšířeny po celém světě, zejména v antropogenně modifikovaných přírodních stanovištích, jako jsou hromady kompostu. Oba tyto druhy lze použít pro ekotoxikologické zkoušky i pro zkoušky bioakumulace.
                     
                        Eisenia fetida a Eisenia andrei jsou komerčně dostupné, např. jako rybí návnada Ve srovnání s jinými druhy z čeledi žížalovitých mají krátký životní cyklus, dosahují dospělosti za přibližně 2–3 měsíce (při pokojové teplotě). Jejich optimální teplota je přibližně 20 až 24 °C. Dávají přednost relativně vlhkým substrátům s téměř neutrálním pH a vysokým obsahem organických látek. Vzhledem k široce rozšířenému využívání těchto druhů ve standardizovaných ekotoxikologických zkouškách po dobu již asi 25 let je jejich kultivace dobře zavedena (48, 77).
                     Oba druhy lze chovat v celé řadě zvířecích exkrementů. Chovné médium, které doporučuje ISO (35) je 50:50 směs koňského nebo hovězího hnoje a rašeliny. Médium musí mít pH asi 6 až 7 (upraví se uhličitanem vápenatým) a nízkou iontovou vodivost (méně než 6 mS/cm nebo koncentraci solí nižší než 0,5 %), a nemělo by být příliš znečištěno amoniakem nebo zvířecí močí Lze použít rovněž komerční zahradní zeminu bez přísad nebo umělou půdu podle OECD (48), nebo jejich směs v poměru 50:50. Substrát musí být vlhký, ale ne příliš mokrý. Jako chovné nádoby jsou vhodné nádoby o objemu 10 až 50 litrů.
                     Pro získání červů standardního stáří a hmotnosti je nejlépe založit kulturu se zámotky. Dospělí červi se proto vloží do chovné nádoby obsahující čerstvý substrát umožňující vytvoření zámotků. Praktické zkušenosti ukázaly, že k dobrým hodnotám reprodukce vede hustota populace přibližně 100 dospělých červů na 1 kg substrátu (hmotnost ve vlhkém stavu). Po 28 dnech se dospělí červi vyjmou. Žížaly vylíhlé ze zámotků se použijí ke zkoušení poté, co dospějí (nejméně po dvou, ale po méně než dvanácti měsících).
                     Červy výše popsaných druhů lze považovat za zdravé, pokud se v substrátu pohybují, nepokoušejí se ze substrátu uniknout a nepřetržitě se rozmnožují. Velmi pomalý pohyb nebo žlutý zadní konec v případě Eisenia fetida) svědčí o vyčerpání substrátu. V takovém případě se doporučuje použít čerstvý substrát a/nebo snížit počet živočichů v nádobě.
                     
                        Další vybrané odkazy
                     
                     Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean Soc. London, 6: 1-58.
                     Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1-81.
                     Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
                     Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. Oikos 28: 49-55.
                     Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 180-201.
                     Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. London 31: 1-171.
                     Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm Ecology - from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331–338 pp.
                     
                        Roupice
                     
                     Doporučovaným zkušebním druhem je Enchytraeus albidus Henle 1837 (roupice bělavá). Enchytraeus albidus je jeden z největších druhů roupic (měří až 15 mm) z čeledi Enchytraeidae, řádu Oligochaeta, kmene Annelida a je celosvětově rozšířen, např. (8). Enchytraeus albidus lze nalézt v mořském, sladkovodním a suchozemském prostředí, zejména v rozkládajícím se organickém materiálu (chaluhách, kompostu) a pouze zřídkakdy na loukách (42). Tato široká ekologická tolerance a některé morfologické proměny naznačují, že tento druh může tvořit několik ras.
                     
                        Enchytraeus albidus lze získat komerčně, protože se prodává jako krmivo pro ryby. Mělo by se ověřit, zda není kultura kontaminována jinými, obvykle menšími druhy (60). Pokud se znečištění objeví, omyjí se všechny roupice vodou v Petriho misce. Pomocí stereomikroskopu se následně vyberou velké dospělé exempláře Enchytraeus albidus jako počátek nové kultury. Všechny ostatní roupice se vyřadí. Tato roupice má krátký životní cyklus: dospělosti dosahuje mezi 33 dny (při 18 °C) až 74 dny (při 12 °C). Pro zkoušku mohou být použity pouze kultury, které byly bez problémů udržovány v laboratorních podmínkách minimálně 5 týdnů (jeden generační cyklus).
                     Jako zkušební organismy jsou vhodné i další druhy rodu Enchytraeus, zejména Enchytraeus luxuriosus. Tento druh je skutečným obyvatelem půdy, který byl nově popsán v (65). Pokud se použijí jiné druhy Enchytraeus, musí být jasně identifikovány a musí být logicky zdůvodněna volba druhu.
                     
                        Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe 1992) je druh, který náleží ke stejné skupině jako Enchytraeus luxuriosus. Dosud nebylo s jistotou zjištěno, zda existuje ve volné přírodě, neboť byl popsán pouze v kulturách žížal a hromadách kompostu (Römbke 2003). Jeho původní ekologické požadavky proto nejsou známy. Nedávné laboratorní studie různých polních půd však potvrdily, že tento druh má širokou toleranci k vlastnostem půdy, jako je pH a struktura (Jänsch et al. 2005). Vzhledem k jednoduchosti jeho chovu a postupu zkoušení se v posledních letech tento druh velmi často používá při ekotoxikologických studiích, např. Kuperman et al. 2003). Avšak malá velikost (3–12 mm; v průměru 7 mm (Westheide & Müller 1996), je důvodem obtížnější manipulace s ním než s Enchytraeus albidus. Je-li použit tento druh namísto druhu Enchytraeus albidus, lze použít menší zkušební nádobu, není to však povinností. Navíc je potřeba vzít v úvahu, že tento druh se velmi rychle rozmnožuje – doba jeho reprodukce je kratší než 20 dnů při teplotě 20 ± 2 °C (Achazi et al. 1999) a při vyšších teplotách ještě kratší.
                     Enchytraeidae druhu Enchytraeus albidus (právě tak jako jiné druhy Enchytraeus sp.) je možno chovat ve velkých plastových boxech (např. 30×60×10 cm nebo 20×12×8 cm, který je vhodnější pro pěstování menších červů) naplněných směsí umělé půdy a komerčně dostupné přírodní neznečištěné zahradní půdy. Kompostovaný materiál by se neměl používat, protože by mohl obsahovat toxické chemické látky, jakými jsou těžké kovy. Před použitím by měla být z chovné půdy odstraněna veškerá fauna trojnásobným hlubokým zmrazením. Je možné použít také neznečištěnou umělou půdu, ale ve srovnání s míchanými substráty by reprodukce mohla být pomalejší. Substrát by měl mít pH 6,0 ± 0,5. Kultura se udržuje v inkubátoru ve tmě při teplotě 15 ± 2 °C. V každém případě by teplota neměla být vyšší než 23 °C. Umělá/přírodní půda by měla být vlhká, ale ne mokrá. Pokud se půda jemně stlačí rukou, měly by se objevit pouze malé kapičky vody. V každém případě by se mělo zabránit vzniku anaerobních podmínek (např. pokud se použije víčko, mělo by mít dostatečný počet otvorů, který umožní dostatečnou výměnu vzduchu). Chovný substrát by měl být jednou týdně provzdušňován opatrným promícháváním.
                     Roupice se krmí nejméně jednou týdně ad libitum ovesnými vločkami, které se umístí do dutiny na povrchy půdy a přikryjí se půdou. Pokud v nádobě zbude potrava od posledního krmení, mělo by se dodávané množství potravy odpovídajícím způsobem upravit. Pokud na zbylé potravě rostou plísně, měla by se nahradit novou dávkou ovesných vloček. Pro stimulaci reprodukce se do ovesných vloček může každé dva týdny přidat komerčně dostupný proteinový prášek s příměsí vitaminů. Po třech měsících se živočichové přemístí do čerstvě připravené kultury nebo chovného substrátu. Ovesné vločky, které se uchovávají v utěsněných nádobách, by se měly před použitím autoklávovat nebo zahřát, aby se zabránilo infikování roztoči (např. Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) nebo dravými roztoči (např. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina). Po dezinfekci se potrava rozdrtí, takže ji lze snadno rozsypat po povrchu půdy. Dalším možným zdrojem potravy jsou pekařské kvasnice nebo krmení pro ryby TetraMin®.
                     Obecně jsou podmínky pro kultivaci dostatečné, pokud se roupice nepokoušejí uniknout ze substrátu, pohybují se půdou rychle, povrch jejich těla je lesklý bez ulpělých částic půdy, mají víceméně bělavé zabarvení a jsou viditelné roupice různého stáří. Roupice lze považovat za zdravé, pokud se nepřetržitě rozmnožují.
                     
                        Další vybrané odkazy
                     
                     Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117–126.
                     Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51–83.
                     Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651–656.
                     Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. Pedobiologia 47: 607–616.
                     Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479–488.
                     Westheide W and Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263–267.
                  “
            
         (1)  Tyto informace jsou poskytovány pouze pro potřebu uživatelů. Mohou se použít i jiné rovnocenné počítačové programy, pokud lze prokázat, že vedou ke stejným výsledkům.
      
         (2)  Nejsou-li k dispozici žádné informace o citlivosti jednotlivých pohlaví, použijí se potkani obou pohlaví, tj. 1 zvíře od každého pohlaví pro každou koncentraci. Pokud ze stávajících informací vyplývá, nebo pokud vyjde najevo během tohoto expozičního cyklu, že je jedno pohlaví citlivější, použije se během následujících zkoušek deset zvířat citlivějšího pohlaví (dvě zvířata pro každou koncentraci / časový bod) na každé úrovni koncentrace..
      
         (3)  Používá-li se nařízení (ES) č. 1272/2008, činí mezní koncentrace pro plyny 20 000 ppm, pro páry 20 mg/l a pro aerosoly 5 mg/l. V případě očekávané toxicity nebo na základě výsledků orientační studie by se měly zvolit nižší počáteční koncentrace. Pro regulační nebo vědecké účely se mohou použít vyšší koncentrace.
      
         (4)  V ideálním případě by se mělo s expozicí zvířat další úrovni koncentrace vyčkat, dokud není dostatečná jistota, že dříve exponovaná zvířata přežila. To umožní vedoucímu studie upravit cílovou koncentraci a doby expozice pro další expoziční cyklus.
      
         (5)  Minimální dávka (koncentrace × čas), která vedla k mortalitě v průběhu zkoušky při počáteční koncentraci (první expoziční cyklus) se použije jako vodítko pro stanovení další kombinace koncentrace a dob expozice. Koncentrace se obvykle sníží na polovinu (1/2L) a zvířata se vystaví koncentraci v novém časovém rozmezí s kratším krokem s použitím geometrického dělení dob expozice faktorem 1,4 (√2; viz odkaz 11), které je rozloženo kolem doby odpovídající minimální úrovni letální dávky (čas × koncentrace) pozorované během první expozice. Na tomto obrázku (obrázek 1) byla mortalita při expozičním cyklu I poprvé pozorována při 15 minutách; doby expozice během expozičního cyklu II jsou proto rozmístěny okolo 30 minut a činí 15, 21 30, 42 a 60 min. Po prvních dvou expozicích se důrazně doporučuje vynést údaje do grafu podobně jako na výše uvedeném obrázku a zkontrolovat, zda má vztah mezi koncentrací a časem úhel 45 stupňů (n = 1) nebo zda je vztah mezi koncentrací–časem–odezvou méně strmý (např. n = 2) nebo strmější (např. n = 0,8). V posledně jmenovaném případě se důrazně doporučuje upravit příslušným způsobem další koncentrace a doby trvání expozice.
      
         (6)  V určitých případech může být nutné zvýšit koncentraci (2L) v novém časovém rozmezí s ještě kratším krokem s použitím geometrického dělení dob expozice faktorem 1,4 (√2), které je rozloženo kolem doby odpovídající minimální úrovni letální koncentrace pozorované během první expozice. Minimální doba expozice by měla být pokud možno delší než 5 minut, maximální doba expozice by neměla přesáhnout 8 hodin.
      
         (7)  Pro řadu vyšetření séra a plazmy, zejména na glukózu, by bylo vhodné ponechat zvířata nalačno přes noc. Hlavním důvodem je, že u nehladovějících zvířat je vyšší variabilita výsledků, která by mohla maskovat jemné změny a ztížit interpretaci. Na druhé straně může mít hladovění přes noc vliv na celkový metabolismus zvířat a může narušit každodenní expozici zkoušené chemické látce, zejména ve studiích s podáváním látky v krmivu. Pokud se krev odebírá nalačno, měla by se klinická biochemická vyšetření provést až po pozorování funkčních poruch ve 4. týdnu studie.
      
         (8)  Dlouhé období lačnění může zkreslit výsledky měření glukózy u exponovaných zvířat oproti zvířatům kontrolním. Vedoucí studie by proto měl určit, zda je vhodné, aby zvířata lačnila. Používá-li se období lačnění, mělo by být vhodné pro daný použitý druh. U potkana to může být 16 h (lačnění přes noc). Stanovení glukózy nalačno lze provést po lačnění přes noc během posledního týdne expozice nebo po lačnění přes noc před pitvou (v tomto případě se provede společně se všemi ostatními klinickými patologickými parametry).
      
         (9)  Protože dlouhé období lačnění může zkreslit výsledky měření glukózy u exponovaných zvířat oproti zvířatům kontrolním, měl by vedoucí studie určit, zda je vhodné, aby zvířata lačnila. Používá-li se období lačnění, mělo by být vhodné pro daný použitý druh. U potkana to může být 16 h (lačnění přes noc). Stanovení glukózy nalačno lze provést po lačnění přes noc během posledního týdne expozice nebo po lačnění přes noc před pitvou (v tomto případě se provede společně se všemi ostatními klinickými patologickými parametry).
      
         (10)  Pro řadu stanovení v séru a plazmě, zejména pro glukózu, je vhodné ponechat zvířata nalačno přes noc. Hlavním důvodem je, že u nehladovějících zvířat je vyšší variabilita výsledků, která by mohla maskovat jemné změny a ztížit interpretaci. Je však nutno upozornit, že hladovění přes noc může mít vliv na celkový metabolismus zvířat a může narušit každodenní expozici zkoušené chemické látce, zejména ve studiích s podáváním látky v krmivu. Všechna zvířata by se měla vyšetřovat ve stejném fyziologickém stavu, a proto by se měla podrobná nebo neurologická vyšetření raději naplánovat na jiný den než odběr vzorků pro klinická biochemická vyšetření.
      
         (11)  Vyhodnocení žíravosti by se měla zakládat na odborném posudku s použitím např. těchto podkladů: zkušenosti u člověka a zvířat, stávající (in vitro) údaje, např. kapitola B.40 (10), B.40 bis (11) této přílohy nebo OECD TG 435 (12), hodnoty pH, informace o podobných chemických látkách nebo jakékoli jiné relevantní údaje.
      
         (12)  V následujících tabulkách je uveden odkaz na GHS (globálně harmonizovaný systém klasifikace a označování chemických látek). V EU mu odpovídá nařízení (ES) č. 1272/2008. V případě akutní inhalační toxicity nařízení (ES) č. 1272/2008 (9) nezavádí kategorii 5.
      
         (13)  V následujících tabulkách je uveden odkaz na GHS (globálně harmonizovaný systém klasifikace a označování chemických látek). V EU mu odpovídá nařízení (ES) č. 1272/2008. V případě akutní inhalační toxicity nařízení (ES) č. 1272/2008 (9) nezavádí kategorii 5.
      
         (14)  V následujících tabulkách je uveden odkaz na GHS (globálně harmonizovaný systém klasifikace a označování chemických látek). V EU mu odpovídá nařízení (ES) č. 1272/2008. V případě akutní inhalační toxicity nařízení (ES) č. 1272/2008 (9) nezavádí kategorii 5.
      
         (15)  Tyto chemické látky se u M4 a M7 liší, jak je uvedeno výše.
      
         (16)  Tyto roztoky se připravují samostatně, spojí se a ihned se zpracují v autoklávu.
      
         (17)  Je však třeba poznamenat, že v případě, že je podezření na interakci mezi ionty způsobujícími tvrdost vody a zkoušenou látkou, by měla být použita voda nižší tvrdosti (a proto v této situaci nesmí být použito Elendtovo médium M4).
      
         (18)  Tyto chemické látky se u M4 a M7 liší, jak je uvedeno výše.
      
         (19)  Tyto roztoky se připravují samostatně, spojí se a ihned se zpracují v autoklávu.
      
         (20)  Je však třeba poznamenat, že v případě, že je podezření na interakci mezi ionty způsobujícími tvrdost vod a zkoušenou látkou, by měla být použita voda nižší tvrdosti (a proto se v této situaci nesmí použít Elendtovo médium M4).
      
         (21)  Pro neutralizaci toxicity byl přidán SiO2.
      
         (22)  Procento rozkladu v nádobách FC obsahujících referenční látku.
      
         (23)  Procento rozkladu v nádobách FI.