CELEX: 31990R2676
Language: it
Date: 1990-09-17 00:00:00
Title: Regolamento (CEE) n. 2676/90 della Commissione, del 17 settembre 1990, che determina i metodi di analisi comunitari da utilizzare nel settore del vino

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31990R2676

Regolamento (CEE) n. 2676/90 della Commissione, del 17 settembre 1990, che determina i metodi di analisi comunitari da utilizzare nel settore del vino  

Gazzetta ufficiale n. L 272 del 03/10/1990 pag. 0001 - 0192 edizione speciale finlandese: capitolo 3 tomo 34 pag. 0005  edizione speciale svedese/ capitolo 3 tomo 34 pag. 0005 

Progetto di REGOLAMENTO  (CEE) N. 2676/90 DELLA  COMMISSIONE del 17 settembre 1990 che determina i metodi d'analisi comunitari da utilizzare nel settore del vino LA  COMMISSIONE  DELLE  COMUNITÀ  EUROPEE,   visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea,   visto il regolamento (CEE) n. 822/87 del Consiglio, del 16 marzo 1987, relativo all'organizzazione del mercato vitivinicolo (1), modificato dal regolamento (CEE) n. 1325/90 (2), in particolare l'articolo 74,   considerando che l'articolo 74, paragrafo 1 del regolamento (CEE) n. 822/87 prescrive l'adozione dei metodi di analisi che consentono di determinare la composizione dei prodotti di cui all'articolo 1 del regolamento in causa e definisce le norme che  consentono di stabilire se questi prodotti hanno subito dei trattamenti in violazione delle pratiche enologiche autorizzate;   considerando che, non avendo la Comunità fissato ancora i limiti quantitativi della presenza degli elementi che caratterizzano il ricorso a certe pratiche enologiche e le tabelle che consentono il confronto dei dati analitici, è opportuno autorizzare  gli Stati membri a determinare tali limiti;   considerando che l'articolo 13, paragrafo 1 del regolamento (CEE) n. 822/87 prevede un esame analitico riguardante come minimo i valori degli elementi caratteristici del v.q.p.r.d. in questione che figurano tra quelli enumerati nell'allegato del  regolamento stesso;   considerando che il controllo delle indicazioni figuranti nei documenti relativi ai prodotti in oggetto rende necessaria l'adozione di metodi d'analisi uniformi che permettano di ottenere dati precisi e comparabili; che tali metodi devono pertanto  essere obbligatori per ogni transazione commerciale ed ogni operazione di controllo; che, date le esigenze di controllo e le limitate possibilità del commercio, è tuttavia opportuno ammettere un numero limitato di procedimenti usuali che consentano una  determinazione rapida e sufficientemente sicura degli elementi ricercati;   considerando che è opportuno adottare, per quanto possibile, metodi che sono unanimemente riconosciuti, ad esempio i metodi sviluppati nell'ambito della Convenzione internazionale per l'unificazione dei metodi d'analisi e di apprezzamento dei vini del  1954 pubblicati dall'Ufficio internazionale della vigna e del vino nella Raccolta dei metodi internazionali d'analisi del vino;   considerando che il regolamento (CEE) n. 1108/82 (3) fissa alcuni metodi d'analisi comunitari applicabili nel settore del vino; che, tenuto conto del progresso scientifico, si è reso necessario sostituire con metodi più appropriati taluni metodi,  modificarne altri ed introdurne di nuovi, in particolare quelli approvati successivamente dall'Ufficio internazionale della vigna e del vino; che, a causa dell'elevato numero e della complessità di tali adattamenti, è opportuno raggruppare tutti i  metodi di analisi in un nuovo regolamento ed abrogare il regolamento (CEE) n. 1108/82;   considerando che, per assicurare la comparabilità dei risultati ottenuti applicando i metodi d'analisi di cui all'articolo 74 del regolamento (CEE)n. 822/87, è opportuno fare riferimento, per quanto concerne la ripetibilità e la riproducibilità di tali  risultati, alle definizioni fissate dall'Ufficio internazionale della vigna e del vino;   considerando che, per tenere conto del progresso scientifico e della dotazione dei laboratori ufficiali e per rendere il lavoro di tali laboratori più efficace e produttivo, è opportuno consentire l'applicazione dei metodi di analisi automatizzati a  talune condizioni; che è opportuno precisare che, in caso di controversie, i metodi automatizzati non possono sostituire i metodi di riferimento ed i metodi usuali;   considerando che i risultati di una misurazione di densità con il metodo automatizzato basato sul principio del risonatore di flessione sono, in quanto ad accuratezza, ripetibilità e riproducibilità, almeno pari ai risultati ottenuti con i metodi  descritti al punto 1 dell'allegato del presente regolamento per la misurazione della massa volumica o della densità relativa; che è quindi opportuno, ai sensi dell'articolo 74, paragrafo 3 del regolamento (CEE) n. 822/87, considerare detto   metodo automatizzato equivalente ai metodi di cui all'allegato del presente regolamento;   considerando che il modo di operare descritto al capitolo 25, punto 2.2.3.3.2 dell'allegato al presente regolamento per l'analisi del tenore di biossido di zolfo totale dei vini e dei mosti aventi un tenore presunto inferiore a 50 mg/l permette una  migliore estrazione di questa sostanza in rapporto al modo di operare descritto nel capitolo 13, punto 13.4 dell'allegato al regolamento (CEE) n. 1108/82; che in tal modo si ottengono tenori più elevati in biossido di zolfo totale che possono superare,  specialmente nel caso di alcuni succhi di uva il limite massimo prescritto; che, allo scopo di evitare difficoltà per lo smaltimento di succhi di uva, già elaborati al momento dell'entrata in vigore del presente regolamento ed in attesa che i processi  di elaborazione siano adattati per ottenere una desolfitazione più completa dei mosti muti di uva, è necessario permettere durante un periodo transitorio che il modo di operare descritto nel regolamento precitato sia ancora utilizzato;   considerando che le misure previste dal presente regolamento sono conformi al parere del comitato di gestione per i vini,   HA  ADOTTATO  IL  PRESENTE  REGOLAMENTO:     Articolo 1   1. I metodi d'analisi comunitari applicabili nel settore del vino che consentono, nelle transazioni commerciali e nelle operazioni di controllo:   - di stabilire la composizione dei prodotti di cui all'articolo 1 del regolamento (CEE) n. 822/87,   -di accertare se i prodotti di cui trattasi hanno subito trattamenti che contravvengono alle pratiche enologiche autorizzate,   sono quelli riportati nell'allegato del presente regolamento.   2. Per le sostanze per le quali sono stati fissati metodi di riferimento e metodi usuali, prevalgono i risultati ottenuti applicando i metodi di riferimento.   Articolo 2   Ai fini dell'applicazione del presente regolamento:   a) la ripetibilità rappresenta il valore al di sotto del quale è situato, con una probabilità specificata, il valore assoluto della differenza tra due singoli risultati ottenuti mediante misure effettuate nelle stesse condizioni (stesso operatore,  stesso apparecchio, stesso laboratorio e breve intervallo di tempo;   b) la riproducibilità rappresenta il valore al di sotto del quale è situato, con una probabilità specificata, il valore assoluto della differenza tra due singoli risultati ottenuti in condizioni diverse (operatori diversi, apparecchiature diverse e/o  laboratori diversi e/o tempi diversi).   Per «singolo risultato» si intende il valore ottenuto applicando una volta e completamente il metodo di analisi normalizzato su un solo campione.   In assenza di indicazioni la probabilità è del 95 %.   Articolo 3   1. Sotto la responsabilità del direttore del laboratorio, i metodi di analisi automatizzati sono ammessi a condizione che la ripetibilità e la riproducibilità dei risultati siano almeno equivalenti a quelle dei risultati ottenuti con i  metodi di analisi di cui all'allegato.   In caso di controversie, i metodi automatizzati non possono prevalere su quelli riportati in allegato.   2. Il metodo automatizzato per la misura della densità, basato sul principio della variazione della frequenza di oscillazione, è considerato equivalente ai metodi di cui al punto 1 dell'allegato del presente regolamento.   Articolo 4   Quando si fa riferimento all'acqua per le soluzioni, le diluizioni o i lavaggi, si intende sempre acqua distillata o acqua demineralizzata di purezza almeno equivalente. Tutti i prodotti chimici devono essere di purezza analitica, salvo  specificazioni diverse.   Articolo 5   Il regolamento (CEE) n. 1108/82 è abrogato.   Tuttavia l'articolo 1, paragrafo 4 del regolamento precitato resta applicabile fino al 31 dicembre 1990.   Articolo 6   Il presente regolamento entra in vigore il giorno della pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee.  Esso è applicabile a decorrere dal 1o ottobre 1990.   Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri.   Fatto a Bruxelles, il 17 settembre 1990.   Per la CommissioneRay MAC SHARRYMembro della Commissione    Nota: Le tabelle, i diagrammi e una parte delle figure riportati nell'allegato sono stati messi a disposizione della Commissione delle Comunità europee dall'Ufficio internazionale della vigna e del vino di Parigi.   (1)GU n. L 84 del 27. 3. 1987,pag. 1. (2)GU n. L 132 del 23. 5. 1990,pag. 19. (3)GU n. L 133 del 14. 5. 1982,pag. 1.    ALLEGATO   1. MASSA  VOLUMICA  A  20 °C  E  DENSITÀ  RELATIVA  A  20 °C 1. DEFINIZIONI   La massa volumica è il rapporto fra la massa di un certo volume di vino o di mosto a 20 °C e il volume stesso. Si esprime in grammi per millilitro ed il suo simbolo è r 20 °C.    La densità relativa a 20 °C o densità 20 °C/20 °C è il rapporto, espresso in numeri decimali, fra la massa di un certo volume di vino o di mosto a 20 °C e la massa dello stesso volume di acqua alla stessa temperatura.  Il suo simbolo è d20 °C20 °C2. PRINCIPIO  DEI  METODI   La massa volumica e la densità relativa a 20 °C vengono determinati sul campione di analisi:    - mediante picnometria: metodo di riferimento;    - mediante areometria o densimetria per mezzo della bilancia idrostatica: metodi usuali.    Osservazione:Per determinazioni molto precise, la massa volumica deve essere corretta dell'azione del biossido di zolfo:    r2 20 °C = r2 20 °C  0,0006 · Sr2 20 °C = massa volumica correttar2 20 °C = massa volumica osservataS = biossido di zolfo totale in g/l3. TRATTAMENTO  PRELIMINARE  DEL  CAMPIONE   Se il vino o il mosto contengono quantità notevoli di biossido di carbonio, eliminarne la maggior parte agitando 250 ml di campione in un pallone da 1 000 ml o filtrando sotto vuoto su 2 g di cotone collocato in un'allunga.4. METODO  DI  RIFERIMENTO  4.1. ApparecchiaturaMateriale d'uso comune in laboratorio, in particolare:   4.1.1. Picnometro  (1), in vetro pyrex da circa 100 ml provvisto di un termometro mobile con raccordo smerigliato, graduato in decimi di grado da 10 °C a 30 °C. Tale termometro deve essere controllato (fig. 1).     Fig. 1 Picnometro e relativo pallone tara     Detto picnometro porta un tubo laterale di 25 mm di lunghezza e di 1 mm al massimo di diametro interno, terminante con una parte conica smerigliata. Questo tubo laterale può essere chiuso da un «tappo ricevitore» costituito da un tubo conico  smerigliato terminante con una parte affilata. Questo tappo serve da camera di dilatazione.    Le due smerigliature dell'apparecchiatura devono essere realizzate con la massima cura.   4.1.2. Pallone tara avente lo stesso volume esterno del picnometro (a meno di circa 1 ml) e di massa uguale alla massa del picnometro pieno di un liquido di densità 1,01 (soluzione al 2 % m/v di cloruro di sodio).    Involucro coibentato che si adatta perfettamente al corpo del picnometro.   4.1.3. Bilancia a due piatti con portata di almeno 300 g e sensibilità di 0,1 mg, oppure bilancia monopiatto con portata di almeno 200 g e sensibilità di 0,1 mg.4.2. Taratura del picnometro   La taratura del picnometro comporta la determinazione delle seguenti caratteristiche:- tara a vuoto,- volume a 20 °C,- massa dell'acqua a 20 °C.4.2.1. Utilizzazione di una bilancia a due piatti   Una volta collocato il pallone tara sul piatto sinistro della bilancia ed il picnometro pulito ed asciutto munito del relativo «tappo ricevitore» sul piatto destro, raggiungere l'equilibrio ponendo accanto al picnometro i pesi necessari: p grammi.    Riempire con cura il picnometro con acqua distillata a temperatura ambiente ed immergere il termometro; asciugare con cura il picnometro e collocarlo nell'involucro coibentato; agitare capovolgendo finché la temperatura letta al termometro sia  costante. Portare il livello esattamente al bordo superiore del tubo laterale. Asciugare questo tubo ed applicare il «tappo ricevitore»; leggere la temperatura t °C con accuratezza ed effettuare l'eventuale correzione della scala del termometro. Pesare  il picnometro pieno d'acqua: sia p2 la massa in grammi che realizza l'equilibrio.    Calcoli (2)   Tara del picnometro vuoto:Tara a vuoto = p + mm = massa d'aria contenuta nel picnometrom = 0,0012 (p   p2)   Volume a 20 °C:V20 °C = (p + m   p2) · FtFt = fattore ricavato dalla tabella I per la temperatura t °CV20 °C deve essere noto con l'approssimazione di ± 0,001 ml   Massa in acqua a 20 °C:M20 °C = V20 °C· 0,9982030,998203 = massa volumica dell'acqua a 20 °C.  4.2.2. Utilizzazione di una bilancia monopiatto   Determinare:- la massa del picnometro pulito ed asciutto: P;- la massa del picnometro pieno d'acqua, a t °C: P1 seguendo le indicazioni di cui al punto 4.2.1;- la massa del pallone tara To.    Calcoli  (3):    Tara del picnometro vuoto:Tara a vuoto: P   mm = massa d'aria contenuta nel picnometrom = 0,0012 (P1   P)  Volume a 20 °CV20 °C = [P1   (P   m)] · FtFt = fattore ricavato nella tabella I in corrispondenza alla temperatura t °CIl volume a 20 °C deve essere noto con l'approssimazione di ± 0,001 ml.    Massa dell'acqua a 20 °C.M20 °C = V20 °C · 0,9982030,998203 = massa volumica dell'acqua a 20 °C.4.3. Modo di operare (3)  4.3.1. Utilizzazione di una bilancia a due piatti   Pesare il picnometro riempito con il campione preparato per l'analisi (3) secondo le indicazioni descritte al punto 4.2.1. Sia p" la massa in grammi che realizza l'equilibrio a t °C.    Massa del liquido contenuto nel picnometro = p + m   p".    Massa volumica apparente a t °C:   Calcolare la massa volumica a 20 °C con l'aiuto di una delle tabelle di correzione riportate di seguito, in funzione della natura del liquido studiato: vino secco (tabella II), mosto naturale o concentrato (tabella III), vino dolce (tabella IV).    Si esprime la densità 20 °C/20 °C del vino dividendo la massa volumica a 20 °C per 0,998203.4.3.2.Utilizzazione di una bilancia monopiatto    Pesare il pallone tara, sia T1 la sua massa.Calcolare dT = T1   T0.Massa del picnometro vuoto al momento della misurazione = P   m + dT.    Pesare il picnometro riempito con il campione preparato per l'analisi (3), seguendo le istruzioni riportate al punto 4.2.1. Sia P2 la massa misurata a t °C.     Massa del liquido contenuto nel picnometro a t °C = P2   (P   m + dT).    Massa volumica apparente a t °C:   Calcolare la massa volumica a 20 °C del liquido studiato (vino secco, mosto naturale e concentrato, vino dolce) con il procedimento indicato al punto 4.3.1.    La densità 20 °C/20 °C si ottiene dividendo la massa volumica a 20 °C per 0,998203.   4.3.3. Ripetibilità sulla massa volumica:- per i vini secchi e amabili: r = 0,00010;    - per i vini dolci: r = 0,00018.   4.3.4. Riproducibilità sulla massa volumica:- per i vini secchi e amabili: R = 0,00037;- per i vini dolci: R = 0,00045.5. METODI  USUALI  5.1.Areometro  5.1.1. Apparecchiatura  5.1.1.1. Areometro   Per quanto riguarda le dimensioni e le graduazioni, gli areometri devono soddisfare alle prescrizioni dell'ISO.    Essi debbono avere una carena cilindrica ed una cannello di sezione circolare di almeno 3 mm di diametro. Per i vini secchi, devono essere graduati da 0,983 a 1,003 in millesimi e quinti di millesimo. Ogni millesimo deve distare almeno 5 mm dal  millesimo successivo. Per la misura della densità dei vini dealcolizzati, dei vini dolci e dei mosti, si userà una serie di 5 areometri graduati rispettivamente da 1,000 a 1,030; 1,030 a 1,060; 1,060 a 1,090; 1,090 a 1,120; 1,120 a 1,150. Questi  apparecchi devono essere tarati in masse volumiche a 20 °C con divisioni almeno in millesimi e mezzi millesimi. Ogni millesimo deve inoltre distare almeno 3 mm dal millesimo successivo.    Questi areometri devono essere graduati in modo da essere letti alla «sommità del menisco». L'indicazione della graduazione in massa volumica a 20 °C o in densità relativa a 20 °C e della lettura al livello del menisco sarà riportata sia sulla scala  graduata, sia su una striscia di carta inclusa nella carena.    Questi apparecchi debbono essere controllati da un servizio ufficiale.   5.1.1.2. Termometro di precisione graduato almeno in 0,5 °C.   5.1.1.3. Provetta cilindrica di 36 mm di diametro interno e di 320 mm di altezza, mantenuta verticalmente mediante un supporto a viti calanti.5.1.2. Modo di operare   Tecnica  di  una  misurazione   Porre, nella provetta 5.1.1.3, 250 ml del campione preparato per l'analisi (3), introdurre l'areometro e il termometro. Effettuare la lettura sul termometro un minuto dopo aver agitato per realizzare l'equilibrio termico. Togliere il termometro e  leggere la massa volumica apparente a t °C sullo stelo dell'areometro dopo un minuto di riposo.     Correggere la massa volumica apparente letta a t °C dell'azione della temperatura mediante le tabelle: vini secchi (tabella V), mosti (tabella VI) e vini contenenti zucchero (tabella VII).    La densità 20 °C/20 °C si ottiene dividendo la massa volumica a 20 °C per 0,998203.5.2. Densimetria per mezzo della bilancia idrostatica  5.2.1. Apparecchiatura  5.2.1.1. Bilancia idrostatica   La bilancia idrostatica, con portata di almeno 100 g, deve essere sensibile a 1/10 di mg.    Sotto ciascun piatto è fissato un galleggiante in vetro pyrex di almeno 20 ml di volume. Questi due galleggianti identici sono sospesi con un filo di diametro inferiore o uguale a 0,1 mm.    Il galleggiante sospeso sotto il piatto di destra deve poter essere introdotto in una provetta cilindrica munita di un segno di livello. Questa provetta deve avere un diametro interno maggiore di almeno 6 mm di quello del galleggiante. Quest'ultimo  deve poter essere contenuto per intero nel volume della provetta situato al di sotto del segno di riferimento, mentre la superficie del liquido su cui va effettuata la misura deve essere attraversata soltanto dal filo di sospensione. La temperatura del  liquido contenuto nella provetta è misurata con un termometro graduato in quinti di grado.    Si può anche usare una bilancia idrostatica monopiatto.5.2.2.Modo di operare  5.2.2.1. Taratura  di  una  bilancia  idrostatica   Con i due galleggianti nell'aria, raggiungere l'equilibrio collocando sul piatto di destra i pesi di precisionep.    Riempire la provetta di acqua fino al segno di riferimento, leggere la temperatura t °C dopo agitazione e riposo di 2-3 minuti. Ristabilire l'equilibrio per mezzo di pesi di precisione collocati sul piatto di destra, siano p2 questi pesi.    Il volume del galleggiante a 20 °C:V20 °C = (p2   p) (F + 0,0012)F = fattore dato dalla tabella I alla temperatura t °C.  p e V20 °C sono le caratteristiche del galleggiante.5.2.2.2. Tecnica  di  misurazione   Immergere il galleggiante nella provetta riempita di vino (o di mosto) fino al segno di riferimento. Leggere la temperatura t °C del vino (o del mosto), siano:    p" i pesi di precisione necessari a ristabilire l'equilibrio   r t °C, la massa volumica apparente:Riportare questa massa volumica a 20 °C mediante una delle tabelle II, III o IV.  6. ESEMPIO  DI  CALCOLO  DELLA  MASSA  VOLUMICA  A  20 °C  E  DELLA  DENSITÀ  A  20 °C/20 °C  (METODO  DI  RIFERIMENTO)  6.1. Picnometria su bilancia a due piatti  6.1.1. Determinazione delle costanti del picnometro   1.Pesata del picnometro pulito ed asciutto:Tara = picnometro + p p = 104,9454 g 2. Pesata del picnometro pieno d'acqua alla temperatura t °C:Tara = picnometro + acqua + p2 p2 = 1,2396 g per t = 20,5 °C      3. Calcolo della massa d'aria contenuta nel picnometro:m = 0,0012 (p   p2) m = 0,0012 (104,9454   1,2396) m = 0,1244 g   4. Caratteristiche da tenere presenti:Tara del picnometro vuoto:  p + m p + m = 104,9454 + 0,1244 p + m = 105,0698 gVolume a 20 °C = (p + m   p2) · Ft °CF20,50 °C = 1,001900 V20 °C = (105,0698   1,2396) · 1,001900 V20 °C = 104,0275 mlMassa dell'acqua a 20 °C = V20 °C · 0,998203 M20 °C = 103,8405 g6.1.2. Determinazione della massa volumica a 20 °C e della densità 20 °C/20 °C di un vino secco:    p" = 1,2622 a 17,80 °Cr 17,80 °C = 0,99788 g/ml   La tabella II consente di calcolare r 20 °C a partire da r t °C mediante la relazione:   Per t = 17,80 °C e per un titolo alcolometrico di 11 % vol, si trova c = 0,546.2. Picnometria su bilancia monopiatto  6.2.1. Determinazioni delle costanti del picnometro  1. Pesata del picnometro pulito e asciuttoP = 67,7913 g    2. Pesata del picnometro pieno d'acqua alla temperatura t °CP1 = 169,2715 a 21,65 °C   3. Calcolo della massa d'aria contenuta nel picnometro:m = 0,0012 (P1 - P) m = 0,0012 × 101,4802 m = 0,1218 g   4. Caratteristiche da tenere presenti:Tara del picnometro vuoto: P- m P - m = 67,7913 - 0,1218 P - m = 67,6695 g Volume a 20 °C = [P1 - (P - m)] Ft ° C F21,65 °C = 1,002140 V20 °C = (169,2715 - 67,6695) × 1,002140V20 °C = 101,8194 ml Massa dell'acqua a 20 °C = V20 °C × 0,998203 M20 °C = 101,6364 g Massa del pallone tara: To To = 171, 9160 g.6.2.2. Determinazione della massa volumica a 20 °C e della densità 20 °C/20 °C di un vino secco:    T1 = 171,9178 g dT = 171,9178 - 171,9160 = 0,0018 g P - m + dT = 67,6695 + 0,0018 = 67,6713 g P2 = 169,2799 a 18 °Cr 18 °C = 0,99793 g/ml   La tabella II consente di calcolare r 20 °C a partire da r t °C mediante la relazione:   Per t = 18 °C con un titolo alcolometrico di 11 % vol, si trova c = 0,49     TABELLA  I  Fattori Fper i quali bisogna moltiplicare la massa dell'acqua contenuta nel picnometro in pyrex a t° per calcolare il volume del picnometro a 20 °C   TABELLA  II  Tabella delle correzioni c per la temperatura sulla massa volumica dei vini secchi e dei vini secchi privati dell'alcole misurata a t° con un picnometro in pyrex per ricondurre il risultato a 20 °C       TABELLA  III  Tabella delle correzioni c per la temperatura sulla massa volumica dei mosti naturali e dei mosti concentrati misurata a t° con un picnometro in pyrex per ricondurre il risultato a 20 °C     TABELLA  IV  Tabella delle correzioni c per la temperatura sulla massa volumica dei vini di 13 % vol o più contenenti zucchero residuo misurata con picnometro in pyrex a t° per ricondurre il risultato a 20 °C          TABELLA  V  Tabella delle correzioni c per la temperatura sulla massa volumica dei vini secchi e dei vini secchi privati dell'alcole misurata a t° mediante un areometro od un picnometro in vetro ordinario a t° per ricondurre il risultato a 20 °C       TABELLA  VI  Tabella delle correzioni c per la temperatura sulla massa volumica dei mosti naturali e dei mosti concentrati misurata a t° mediante un picnometro od un areometro in vetro ordinario per ricondurre il risultato a 20 °C       TABELLA  VII  Tabella delle correzioni c per la temperatura sulla massa volumica dei vini di 13 % vol o più contenenti zucchero residuo misurata mediante areometro o picnometro in vetro ordinario a t° per ricondurla a 20 °C            2. DETERMINAZIONE  DEL  TENORE  ZUCCHERINO  DEI  MOSTI,  DEI  MOSTI  CONCENTRATI  E  DEI  MOSTI  CONCENTRATI  RETTIFICATI  MEDIANTE  RIFRATTOMETRIA 1. PRINCIPIO  DEL  METODO   Si riporta l'indice di rifrazione a 20 °C, espresso in valore assoluto o in percento in massa di saccarosio, nella tabella corrispondente per ottenere il grado zuccherino in grammi/litro o in grammi per chilogrammo di mosto, di mosto concentrato e di  mosto concentrato rettificato.2. APPARECCHIATURA  2.1. Rifrattometro tipo Abbé   Il rifrattometro deve essere dotato di una scala che indichi:- la percentuale in massa di saccarosio con l'approssimazione dello 0,1 %- oppure gli indici di rifrazione con quattro cifre decimali.    Il rifrattometro deve essere provvisto di un termometro con una scala compresa almeno tra + 15 °C e + 25 °C e di un dispositivo di circolazione d'acqua che consenta di effettuare le misurazioni a una temperatura di 20 °C ± 5 °C.    Occorre seguire scrupolosamente le istruzioni per l'impiego dello strumento, in particolare per quanto riguarda la taratura e la sorgente luminosa.3. PREPARAZIONE  DEL  CAMPIONE  3.1. Mosti e mosti concentrati   Filtrare eventualmente i mosti con una garza asciutta piegata in quattro e, dopo aver eliminato le prime gocce di filtrato, effettuare la determinazione sul prodotto filtrato.3.2. Mosto concentrato rettificato   Utilizzare, a seconda della concentrazione, il mosto concentrato rettificato oppure la soluzione ottenuta portando a 500 g, con acqua, 200 g di mosto concentrato rettificato pesato accuratamente.4. MODO  DI  OPERARE   Portare il campione ad una temperatura prossima ai 20 °C. Deporre una piccola presa di campione sul prisma inferiore del rifrattometro, avendo cura che, pressando i prisma l'uno contro l'altro, il campione copra uniformemente la superficie del vetro,  ed effettuare la misura seguendo le istruzioni per l'uso dell'apparecchio in questione.    Leggere la percentuale in massa di saccarosio con la precisione dello 0,1 % oppure l'indice di rifrazione con 4 cifre decimali.    Effettuare almeno due determinazioni sullo stesso campione preparato. Rilevare la temperatura t °C.5. CALCOLI  5.1. Correzione di temperatura  5.1.1. Apparecchi graduati in % in massa di saccarosio: per la correzione della temperatura ricorrere alla tabella I.    5.1.2. Apparecchi graduati in indice di rifrazione: riportare l'indice misurato a t °C nella tabella II per ottenere (colonna 1) il corrispondente valore della percentuale in massa di saccarosio a t °C. Tale valore viene quindi corretto rispetto alla  temperatura ed espresso a 20 °C per mezzo della tabella I.5.2. Tenore zuccherino dei mosti e dei mosti concentrati   Riportare nella tabella II la percentuale in massa di saccarosio a 20 °C per ottenere il tenore zuccherino in grammi/litro e in grammi/chilogrammo. Il tenore zuccherino è espresso in zucchero invertito con una cifra decimale.5.3. Tenore zuccherino del  mosto concentrato rettificato   Riportare la percentuale in massa di saccarosio a 20 °C nella tabella III per ottenere il tenore zuccherino in grammi/litro e in grammi/chilogrammo. Il tenore zuccherino è espresso in zucchero invertito con una cifra decimale.    Se la misura è stata effettuata sul mosto concentrato rettificato diluito, moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione.5.4. Indice di rifrazione dei mosti, dei mosti concentrati e dei mosti concentrati rettificati   Riportare nella tabella II la percentuale in massa di saccarosio a 20 °C per ricavare l'indice di rifrazione a 20 °C. Tale valore è espresso con quattro cifre decimali.  TABELLA  I  Correzione da apportare nel caso in cui la percentuale in massa di saccarosio sia stata determinata a una temperatura diversa da 20 °C     Nota: Le variazioni di temperatura per rapportare a 20 °C non devono superare ± 5 °C.   TABELLA  II  La tabella riporta il tenore zuccherino  (4)  dei mosti e dei mosti concentrati espresso in grammi/litro e in grammi/chilogrammo, determinato per mezzo di un rifrattometro graduato in percentuale in massa di saccarosio a 20 °C o in indice di rifrazione a 20 °C. È anche riportata la massa volumica  a 20 °C.      TABELLA III  La tabella riporta il tenore zuccherino   (5)  dei mosti concentrati rettificati in grammi/litro e in grammi/chilogrammo, determinato per mezzo di un rifrattometro graduato in percentuale in massa di saccarosio a 20 °C oppure in indice di rifrazione a 20 °C. È anche riportata la massa volumica a 20  °C.     3. TITOLO  ALCOLOMETRICO  VOLUMICO 1. DEFINIZIONE   Il titolo alcolometrico volumico è uguale al numero di litri di etanolo contenuti in 100 l di vino. Detti volumi si intendono misurati alla temperatura di 20 °C. Il simbolo è «% vol».    Osservazione:Nel titolo alcolometrico oltre all'etanolo sono compresi i suoi omologhi e gli esteri etilici che passano nel distillato.2. PRINCIPIO  DEI  METODI  2.1. Distillazione del vino alcalinizzato con una sospensione di idrossido di calcio   Determinazione del titolo alcolometrico del distillato.   2.2. Metodo di riferimento: determinazione della massa volumica del distillato mediante picnometria.2.3. Metodi usuali  2.3.1. Determinazione del titolo alcolometrico del distillato per aerometria  2.3.2. Determinazione del titolo alcolometrico del distillato per densimetria mediante bilancia idrostatica  2.3.3. Determinazione del titolo alcolometrico del distillato mediante rifrattometria   Nota:Per esprimere il titolo alcolometrico partendo dalla massa volumica del distillato, utilizzare le tabelle pratiche I, II e III riportate nell'allegato II del presente capitolo. Queste sono state calcolate a partire dalla tabella alcolometrica  internazionale pubblicata nel 1972 dall'Organizzazione internazionale di metrologia legale nella raccomandazione n. 22 ed adottata dall'OIV (assemblea generale del 1974). Nella tabella I è riportata l'equazione generale che correla il titolo  alcolometrico volumico e la massa volumica delle miscele idroalcoliche in funzione della temperatura.3. DISTILLAZIONE  3.1. Apparecchiatura  3.1.1. Apparecchio di distillazione costituito da:- un pallone da 1 litro a smerigliatura normalizzata;- una colonna di rettifica alta circa 20 cm o qualsiasi altro dispositivo atto ad impedire il traseinamento;- una sorgente di calore; occorre  prevedere un opportuno dispositivo che impedisca la pirogenazione delle sostanze che compongono l'estratto;- un refrigerante terminante con un tubo affilato che porti il distillato nel fondo del pallone di raccolta tarato contenente alcuni millilitri di  acqua.   3.1.2. Dispositivo per l'estrazione in corrente di vapore costituita da:1. un generatore di vapore d'acqua;2. un gorgogliatore;3. una colonna di rettifica;4. un refrigerante.    Si può utilizzare qualunque modello di apparecchio di distillazione o di apparecchio di estrazione in corrente di vapore d'acqua a condizione che rispondano al saggio seguente: distillare 5 volte di seguito una miscela idroalcolica a 10 % vol. Dopo  l'ultima distillazione, il distillato deve presentare un titolo alcolometrico di almeno 9,9 % vol, vale a dire che nel corso di ciascuna distillazione non si deve perdere una quantità di alcool superiore a 0,02 % vol.3.2. Reattivi  3.2.1. Sospensione di idrossido di calcio 2 M   Si ottiene versando con cautela 1 l di acqua calda (60-70 °C) su 120 g di calce viva CaO.3.3. Preparazione del campione   I vini giovani o i vini spumanti devono essere preliminarmente privati della maggior parte del biossido di carbonio agitando 250-300 ml di vino in un pallone di 500 ml.3.4. Modo di operare   Prelevare mediante un pallone tarato 200 ml di vino.    Annotare la sua temperatura.    Versarli nel pallone dell'apparecchiatura di distillazione o nel gorgogliatore dell'apparecchio di estrazione in corrente di vapore d'acqua. Risciacquare quattro volte il pallone tarato con 5 ml di acqua che si aggiunge nel pallone o nel gorgogliatore.  Aggiungere 10 ml di idrossido di calcio (3.2.1) ed alcuni frammenti di materiale poroso inerte (pietra pomice) nel caso della distillazione.    Raccogliere il distillato nel pallone tarato da 200 ml che è stato utilizzato per misurare il vino.    Raccogliere, nel caso della distillazione, un volume uguale ai tre quarti circa del volume iniziale mentre, nel caso dell'estrazione in vapore d'acqua, raccogliere 198-199 ml di distillato. Portare a 200 millilitri con acqua distillata a una  temperatura uguale a quella iniziale, con l'approssimazione di ± 2 °C.    Mescolare con cautela.    AvvertenzaNel caso di vini particolarmente ricchi di ioni ammoniacali, ridistillare eventualmente il distillato nelle condizioni descritte precedentemente sostituendo la sospensione di idrossido di calcio con 1 ml di acido solforico al 10 % (v/v).4.  METODO  DI  RIFERIMENTO:    Determinazione del titolo alcolometrico del distillato per picnometria.4.1. Apparecchiatura  4.1.1. Utilizzare il picnometro tarato come riportato al capitolo «massa volumica».4.2. Modo di operare   Effettuare la determinazione della massa volumica apparente del distillato (3.4) a t °C come indicato nel capitolo 1 «Massa volumica» ai punti 4.3.1 e 4.3.2; sia rt °C tale massa volumica.4.3. Espressione dei risultati  4.3.1. Modo di calcolare   Esprimere il titolo alcolometrico a 20 °C mediante la tabella I. Nella tabella cercare sulla linea orizzontale corrispondente alla temperatura T intera immediatamente inferiore a t° la più piccola massa volumica superiore a rt. Utilizzare la differenza  tabulare letta sotto tale massa volumica per calcolare la massa volumicar alla temperatura intera considerata T.    Sulla riga di detta temperatura T, dalla massa volumica r2 della tabella immediatamente superiore a r si sottrae la massa volumica calcolata. Questa differenza va divisa per la differenza tabulare letta a destra della massa volumica r2. Il quoziente dà  la parte decimale del titolo alcolometrico, mentre la parte del grado stesso è indicata in testa alla colonna ove figura la massa volumica r2.    Nell'allegato del presente capitolo è illustrato un esempio di calcolo del titolo alcolometrico.    AvvertenzaPer tale correzione di temperatura, è stato elaborato un programma di calcolo che consente eventualmente di effettuarla automaticamente.4.3.2. Ripetibilità (r):    r = 0,10 % vol4.3.3. Riproducibilità (R):    R = 0,19 % vol5. METODI  USUALI  5.1. Areometria  5.1.1. Apparecchiatura  5.1.1.1. Alcolometro   L'alcolometro deve rispondere alle specifiche per gli apparecchi della classe I o della classe II definite nella raccomandazione internazionale n. 44 «Alcolometri e areometri per l'alcole» dell'OIML (Organizzazione internazionale di metrologia legale).    5.1.1.2. Termometro graduato in gradi e decimi di grado da 0 a 40 °C, controllato con l'approssimazione di 1/20 di grado.   5.1.1.3. Cilindro di 36 mm di diametro e 320 mm di altezza tenuto verticalmente mediante un supporto con viti calanti.5.1.2. Modo di operare   Versare il distillato (3.4) nel cilindro che va tenuto bene in posizione verticale. Introdurre il termometro e l'alcolometro. Effettuare la lettura della temperatura un minuto dopo aver agitato per ottenere uniformità di temperatura tra il cilindro, il  termometro, l'alcolometro e il distillato.    Estrarre il termometro e leggere il titolo alcolometrico apparente dopo un minuto di riposo. Effettuare almeno tre letture con l'ausilio di una lente d'ingrandimento. Il titolo apparente misurato a t °C sarà corretto dell'influenza della temperatura  mediante la tabella II.    È necessario che la tempertura del liquido sia poco diversa dalla temperatura ambiente (al massimo 5 °C di differenza).5.2. Densimetria mediante bilancia idrostatica  5.2.1. Apparecchiatura   Utilizzare la bilancia idrostatica come indicato al capitolo «Massa volumica».  5.2.2. Modo di operare   Procedere alla determinazione della massa volumica apparente a t °C del distillato come indicato al capitolo 1 «Massa volumica» al punto 5.2.2.5.2.3. Espressione dei risultati   Esprimere il titolo alcolometrico a 20 °C seguendo le indicazioni riportate al punto 4.3.1 per mezzo della tabella I, se il galleggiante è di pirex, o della tabella III se il galleggiante è di vetro ordinario.5.3. Rifrattometria  5.3.1. Apparecchiatura  5.3.1.1. Rifrattometro atto a misurare gli indici di rifrazione compresi tra 1,330 e 1,346.    A seconda del tipo di apparecchio, le misure vanno fatte:- a 20 °C, mediante l'uso di un dispositivo appropriato;- oppure alla temperatura ambiente t °C misurata per mezzo di un termometro con precisione di almeno 0,05 °C. L'apparecchio deve essere  corredato di una tabella di correzione della temperatura.5.3.2. Modo di operare   Effettuare la misura dell'indice di rifrazione sul distillato di vino (3.4) seguendo il modo di operare previsto per il tipo di apparecchio utilizzato.5.3.3.Espressione dei risultati   La tabella IV riporta il titolo alcolometrico corrispondente all'indice di rifrazione a 20 °C.    OsservazioneLa tabella IV dà la corrispondenza tra gli indici di rifrazione delle miscele idroalcoliche pure e quelle dei distillati di vino. Nel caso dei distillati di vino essa tiene conto delle impurezze del distillato (in prevalenza alcoli  superiori). La presenza di metanolo provoca una diminuzione dell'indice di rifrazione e quindi del titolo alcolometrico.   6. ESEMPIO  DI  CALCOLO  DEL  TITOLO  ALCOLOMETRICO  DI  UN  VINO  6.1.Picnometria su bilancia a due piatti  6.1.1. Le costanti del picnometro sono state determinate e calcolate come indicato al capitolo 1 «Massa volumica e densità relativa» (6.1.1).6.1.2. Pesata del picnometro pieno di distillatoEsempio numericot °C = 18,90 °C Tara = picnometro + distillato a t °C + p" t °C corretto = 18,70 °C p" =  2,8074 g p + m   p" = massa del distillato a t °C 105,0698   2,8074 = 102,2624 g   Massa volumica apparente a t °C 6.1.3. Calcolo del titolo alcolometrico          Riferirsi alla tabella delle masse volumiche apparenti delle miscele idro-alcoliche a diverse temperature, come indicato precedentemente Sulla riga 18 °C della tabella delle masse volumiche apparenti, la più piccola massa superiore alla massa osservata 0,983076 è 0,98398, nella colonna 11 %.  La massa volumica a 18 °C è:  (98307,6 + 0,7 × 22) 10 5 = 0,98323 0,98398   0,98323 = 0,00075.  La parte decimale del titolo alcolometrico è 75/114 = 0,65.  Il titolo alcolometrico è:  11,65 % vol.6.2. Picnometria su bilancia monopiatto  6.2.1. Le costanti del picnometro sono state determinate e calcolate al capitolo 1 «Massa volumica e densità relativa» (6.2.1).   6.2.2. Pesata del picnometro pieno di distillato   Peso del pallone tara al momento della determinazione (in grammi): T1 = 171,9178Picnometro pieno di distillato a 20,50 °C (in grammi): P2 = 167,8438Variazione della spinta dell'aria: dT = 171,9178   171,9160 = + 0,0018Massa del distillato a 20,50 °C: Lt = 167,8438   (67,6695 + 0,0018) = 100,1725Massa volumica apparente del distillato6.2.3. Calcolo del titolo alcolometrico          Riferirsi alla tabella delle masse volumiche apparenti delle miscele idro-alcoliche a diverse temperature, come indicato precedentemente Sulla riga 20 °C della tabella delle masse volumiche apparenti, la più piccola massa superiore alla massa osservata 0,983825 è 0,98471, nella colonna 10 %.  La massa volumica a 20 °C è:  (98382,5 + 0,50 × 24) 10 5 = 0,983945 0,98471   0,983945 = 0,000765.  La parte decimale del titolo alcolometrico è 76,5/119 = 0,64.  Il titolo alcolometrico è:  10,64 % vol.  FORMULA  PER  IL  CALCOLO  DELLE  TABELLE  ALCOLOMETRICHE  DELLE  MISCELE  DI  ALCOLE  ETILICO  ED  ACQUALa massa volumica «r», espressa in chilogrammi per metro cubo (kg/m³), di una miscela di alcole etilico e di acqua alla temperatura t, espressa in  gradi Celsius, è data dalla formula seguente in funzione:   - del titolo massico p espresso con un numero decimale (6);- della temperatura t espressa in gradi Celsius (E.I.P.T. 68);- dei coefficienti numerici riportati di seguito.La formula è valida per le temperature comprese tra  20 °C e +40 °C.  Coefficienti numerici della formula    TABELLA  I  TITOLO  ALCOLOMETRICO  INTERNAZIONALE  A  20 °CTabella delle masse volumiche apparenti di miscele idroalcoliche misurate con picnometro in vetro pyrex Masse volumiche a t° corrette della spinta dell'ariaTitolo alcolometrico volumico in % vol                              TABELLA  II  TITOLO  ALCOLOMETRICO  INTERNAZIONALE  A  20 °CTabella delle correzioni da apportare al titolo alcolometrico apparente per correggere l'influenza della temperaturaAggiungere o sottrarre al titolo alcolometrico apparente a t°C (alcolometro  in vetro ordinario) la correzione qui sotto indicata.        TABELLA  III  TITOLO  ALCOLOMETRICO  INTERNAZIONALE  A  20 °C   Tavola delle masse volumiche apparenti delle miscele idroalcolicheApparecchi in vetro ordinarioMasse volumiche a t°C, corrette della spinta dell'aria                     TABELLA  IV  Tabella di corrispondenza tra gli indici di rifrazione a 20 °C e i titoli alcolometrici a 20 °C delle miscele idroalcoliche pure e dei distillati      4. ESTRATTO  SECCO  TOTALE   Sostanze secche totali1. DEFINIZIONE   L'estratto secco totale o sostanze secche totali è costituito dall'insieme di tutte le sostanze che, in condizioni fisiche determinate, non volatilizzano. Queste condizioni fisiche debbono essere fissate in modo tale che le sostanze componenti tale  estratto subiscano il minimo di alterazione possibile.    L'estratto non riduttore è l'estratto secco totale dal quale sono stati detratti gli zuccheri totali.    L'estratto ridotto è l'estratto secco dal quale sono stati detratti gli zuccheri totali eccedenti 1 g/l, il solfato di potassio eccedente 1 g/l, il mannitolo, se presente, e tutte le sostanze chimiche eventualmente aggiunte al vino.    Il resto di estratto è l'estratto non riduttore dal quale è stata detratta l'acidità fissa, espressa in acido tartarico.    L'estratto è espresso in grammi per litro e dev'essere determinato con l'approssimazione di 0,5 g.2. PRINCIPIO  DEL  METODO   Metodo unico: metodo densimetrico.    L'estratto secco totale è calcolato indirettamente in base al valore della densità del mosto e, nel caso del vino, in base alla densità del vino dealcolizzato.    Questo estratto secco è espresso dalla quantità di saccarosio che, disciolta in una quantità d'acqua sufficiente ad avere un litro, dà una soluzione avente la stessa densità del mosto o del vino dealcolizzato. Questa quantità è fornita dalla tabella  I.3. MODO  DI  OPERARE   La densità relativa d2020 del «vino dealcolizzato» (dr) è calcolata con la formula:dr = dv   da + 1,000dove dv = densità relativa del vino a 20 °C (corretta per l'acidità volatile) (7) da = densità relativa a 20 °C della miscela idroalcolica avente lo  stesso titolo alcolometrico del vino   Il valore di dr può anche essere calcolato in base alle masse volumiche a 20 °C, rv del vino e ra della miscela idroalcolica allo stesso titolo alcolometrico, mediante la formula:dr = 1,0018 (rv   ra) + 1,000dove il coefficiente 1,0018 può praticamente  essere assimilato ad 1 allorché rv è inferiore ad 1,05, come avviene nella maggioranza dei casi.4. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI   Riportare la densità dr2020 del vino dealcolizzato o la densità d2020 del mosto nella tabella I per ricavare il peso dell'estratto secco totale in grammi per litro.    Il peso dell'estratto secco totale è espresso in g/l con una cifra decimale.   TABELLA I  per il calcolo del tenore in estratto secco totale (grammi per litro)  TABELLA  DI  INTERPOLAZIONE  5. ZUCCHERI  RIDUTTORI 1. DEFINIZIONE   Gli zuccheri riduttori sono costituiti dall'insieme degli zuccheri a funzione chetonica o aldeidica dosati in base alla loro azione riducente sulla soluzione cupro-alcalina.2. PRINCIPIO  DEI  METODI  2.1. Defecazione  2.1.1. Metodo di riferimento: passaggio del vino neutralizzato e dealcolizzato su una colonna scambiatrice di anioni sotto forma di acetato, dove i suoi anioni vengono scambiati con ioni acetici, e successiva defecazione con acetato neutro di piombo.   2.1.2. Metodi usuali: il vino viene trattato con uno dei seguenti reattivi:   2.1.2.1. Acetato neutro di piombo  2.1.2.2. Ferrocianuro II di zinco2.2. Dosaggio  2.2.1. Metodo unico: dopo aver fatto reagire il vino o il mosto defecati con una quantità determinata di soluzione cupro-alcalina, l'eccesso di ioni rameici viene dosato per iodometria.3. DEFECAZIONE   Il liquido nel quale vanno dosati gli zuccheri deve avere un contenuto in zuccheri compreso tra 0,5 e 5 g/l.    Se il vino è secco, bisogna evitare di diluirlo durante la defecazione; se è dolce, esso va diluito nel corso della defecazione, in modo da portare il contenuto in zuccheri entro i limiti indicati secondo la tabella seguente.                   DenominazioneContenuto in zuccheri, in grammi per litro, compreso fraMassa volumica compresa fraDiluizione da prevedere (%)Mosti e mistelle> 125> 1,0381Vini dolci, alcolizzati o meno25 e 1251,005 e 1,0384Vini amabili5 e 250,997 e 1,00520Vini secchi<   5<  0,997nessuna diluizione3.1. Metodo di riferimento  3.1.1. Reattivi  3.1.1.1. Soluzione di acido cloridrico (HCl), 1 M  3.1.1.2. Soluzione di idrossido di sodio (NaOH), 1 M  3.1.1.3. Soluzione di acido acetico (CH3COOH), 4 M  3.1.1.4. Soluzione di idrossido di sodio (NaOH), 2 M  3.1.1.5. Resina scambiatrice di anioni [tipo Dowex 3 (20 50 mesh) o resina equivalente] preparata nel modo seguente:    In fondo ad una buretta collocare un piccolo tampone di lana di vetro e 15 ml di resina scambiatrice di anioni (3.1.1.5).    Al momento della messa in funzione, sottoporre la resina a 2 cicli completi di rigenerazione con passaggi alternati di soluzioni M di acido cloridrico (3.1.1.1) e di idrossido di sodio (3.1.1.2). Dopo il lavaggio con 50 ml di acqua distillata, travasare  la resina in un becher, aggiungere 50 ml di una soluzione 4 M di acido acetico (3.1.1.3) ed agitare per 5 minuti Riempire nuovamente la buretta e far passare attraverso la colonna 100 ml di soluzione di acido acetico 4 M (3.1.1.3) (è preferibile  disporre di una riserva di resina conservata in un recipiente riempito con la soluzione 4 M di acido acetico). Lavare la colonna con acqua distillata sino a neutralità dell'effluente.    Rigenerazione della resina. Far passare 150 ml di una soluzione 2 M di idrossido di sodio per eliminare gli acidi e gran parte delle sostanze coloranti fissate sulla resina. Lavare con 100 ml d'acque. Far passare 100 ml di soluzione 4 M di acido  acetico. Lavare la colonna sino a neutralità dell'effluente.   3.1.1.6. Soluzione di acetato neutro di piombo (approssimativamente satura):Acetato neutro di piombo Pb (CH3COO)2 · 3 H2O 250 g Acqua molto calda q.b.a: 500 mlAgitare sino a dissoluzione.   3.1.1.7. Carbonato di calcio, Ca CO3.3.1.2. Modo di operare  3.1.2.1. Vini  secchi   Introdurre 50 ml di vino in un recipiente cilindrico del diametro di 10-12 cm circa ed addizionare ½ (n   0,5) ml di una soluzione M di idrossido di sodio (3.1.1.2) (dove n è il volume di una soluzione 0,1 M di idrossido di sodio impiegato per il  dosaggio dell'acidità totale su 10 ml di vino); evaporare su bagnomaria bollente con l'aiuto di un getto di aria calda sino a ridurre la quantità di liquido a circa 20 ml.    Fare defluire 3 ml di tale liquido ogni 2 minuti attraverso la colonna scambiatrice di anioni in forma di acetato (3.1.1.5). Raccogliere l'effluente in un matraccio tarato da 100 ml. Lavare sei volte il recipiente e la colonna con 10 ml di acqua  distillata, aggiungere agitando 2,5 ml di soluzione satura di acetato di piombo (3.1.1.6) e 0,5 g di carbonato di calcio (3.1.1.7); agitare a più riprese e lasciare riposare almeno 15 minuti; portare a volume con acqua. Filtrare.    1 ml di questo filtrato corrisponde a 0,5 ml di vino.   3.1.2.2. Mosti,  mistelle,  vini  dolci  e  vini  amabili   Si riportano a titolo indicativo alcune diluizioni.    1.Mosti e mistelleDiluire al 10 % il liquido da analizzare e prelevare 10 ml di tale diluizione.    2. Vini dolci, alcolizzati o meno, di massa volumica compresa tra 1,005 e 1,038. Prelevare 20 ml di liquido da analizzare previamente diluito al 20 %.    3. Vini amabili, di massa volumica compresa tra 0,997 e 1,005. Prelevare 20 ml di vino non diluito.Fare defluire il volume di vino o di mosto sopra indicato attraverso la colonna scambiatrice di anioni sotto forma di acetato nella misura di 3 ml ogni  due minuti. Raccogliere l'effluente in un pallone tarato da 100 ml, lavare la colonna con acqua fino ad ottenere 90 ml circa di effluente. Aggiungere 0,5 g di carbonato di calcio, 1 ml di una soluzione satura di acetato di piombo; agitare e lasciare  riposare per almeno 15 minuti agitando di tanto in tanto; portare a volume con acqua. Filtrare.     In questi casi:1) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,01 ml di mosto o di mistella,2) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,04 ml di vino dolce,3) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,20 ml di vino amabile.  3.2. Metodi usuali  3.2.1. Defecazione con acetato neutro di piombo  3.2.1.1. Reattivi   Soluzione di acetato neutro di piombo (approssimativamente satura) (vedi 3.1.1.6)Carbonato di calcio3.2.1.2. Modo  di  operare  3.2.1.2.1. Vini secchi   Introdurre 50 ml di vino in un pallone tarato da 100 ml; aggiungere ½ (n   0,5) ml di soluzione M di idrossido di sodio (3.1.1.2), dove n è il volume di soluzione 0,1 M utilizzato per dosare l'acidità totale di 10 ml di vino. Aggiungere agitando 2,5 ml  di soluzione satura di acetato di piombo (3.1.1.6) e 0,5 g di carbonato di calcio (3.1.1.7); agitare a più riprese e lasciare riposare per almeno 15 minuti; portare a volume con acqua. Filtrare.1 ml di filtrato corrisponde a 0,5 ml di vino.3.2.1.2.2.  Mosti, mistelle, vini dolci e vini amabili   In un pallone tarato da 100 ml, introdurre un volume di vino o di mosto o di mistella definito come segue (le diluizioni sono riportate a titolo indicativo):    1. Mosti e mistelle.Diluire al 10 % il liquido da analizzare; prelevare 10 ml di tale diluizione.    2. Vini dolci, alcolizzati o meno, di massa volumica compresa tra 1,005 e 1,038. Prelevare 20 ml del liquido da analizzare, previamente diluito al 20 %.    3. Vini amabili,di massa volumica compresa fra 0,997 e 1,005. Prelevare 20 ml di vino non diluito.Aggiungere 0,5 g di carbonato di calcio, circa 60 ml di acqua e 0,5 offure 1 o 2 ml di soluzione satura di acetato di piombo; agitare e lasciare riposare  per almeno 15 minuti agitando di tanto in tanto. Portare a volume con acqua. Filtrare.     In questi casi:1) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,01 ml di mosto o di mistella,2) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,004 ml di vino dolce,3) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,20 ml di vino pastoso.3.2.2. Defecazione con ferrocianuro di zinco   Questo procedimento di defecazione dovrà essere utilizzato soltanto per i vini bianchi, i vini dolci poco coloratie i mosti.3.2.2.1. Reattivi  3.2.2.1.1. Soluzione I di ferrocianuro (II) di potassio:  ferrocianuro di potassio [K4 Fe (CN)6 · 3 H2O]:   150 g Acqua q. b. a: 1 000 ml  3.2.2.1.2. Soluzione II di solfato di zinco:solfato di zinco (Zn SO4 · 7 H2O):   300 g acqua q. b. a: 1 000 ml 3.2.2.2. Modo  di  operare   Introdurre in un pallone tarato da 100 ml un volume di vino (o di mosto o di mistella) definito come segue, le diluizioni vengono date a titolo indicativo:    1) Mosti e mistelle.Diluire al 10 % il liquido da analizzare, prelevare 10 ml di tale diluizione.    2)Vini dolci, alcolizzati o meno, la cui massa volumica è compresa fra 1,005 e 1,038. Prelevare 20 ml di liquido da analizzare previamente diluito al 20 %.    3) Vini amabili, la cui massa volumica è compresa fra 0,997 e 1,005. Prelevare 20 ml di vino non diluito.    4) Vini secchi, prelevare 50 ml di vino non diluitoAggiungere 5 ml di soluzione I di ferrocianuro di potassio (3.2.2.1.1) e 5 ml di soluzione II di solfato di zinco (3.2.2.1.2). Mescolare. Portare a volume con acqua. Attendere 10 minuti e filtrare.     In questi casi:1) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,01 ml di mosto o di mistella,2) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,004 ml di vino dolce,3) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,20 ml di vino amabile,4) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,50 ml di vino secco.    4. DOSAGGIO  4.1.Reattivi  4.1.1. Soluzione cupro-alcalina:Solfato di rame puro (CuSO4 · 5 H2O):  25 g Acido citrico (C6 H8 O7 · H2O)  50 g Carbonato di sodio cristallizzato (Na2 CO3 · 10 H2O):  388 g Acqua q.b. a: 1 000 mlSciogliere il solfato di rame in 100 ml di acqua, l'acido citrico in 300 ml di acqua e il carbonato di sodio in 300-400 ml di acqua calda. Mescolare la soluzione di acido citrico e la soluzione di carbonato di sodio. Aggiungere  quindi la soluzione di solfato di rame e portare a 1 l.4.1.2.Soluzione di ioduro di potassio al 30 %:ioduro di potassio (KI):  30 g acqua q.b. a: 100 mlConservare in bottiglia di vetro scuro.4.1.3. Acido solforico al 25 %:Acido solforico (H2SO4) r20 = 1,84 g/ml:  25 g acqua q.b. a: 100 mlVersare l'acido nell'acqua, lasciare raffreddare e portare a 100 ml.4.1.4. Salda d'amido a 5 g/l:    Disperdere 5 g di amido in circa 500 ml di acqua. Portare a ebollizione agitando e mantenere l'ebollizione per 10 minuti; aggiungere 200 g di cloruro di sodio (NaCl) e, dopo il raffreddamento, portare a 1 l.- Tiosolfato di sodio, soluzione 0,1 M-  Soluzione di zucchero invertito di 5 g/l:  soluzione da utilizzare per verificare la tecnica di dosaggio.     In un pallone tarato da 200 ml introdurre:saccarosio (C12H22O11): 4,75 g acqua, circa: 100 ml acido cloridrico (HCl) (r20 = 1,16 1,19 g/ml):  5 mlImmergere il pallone in bagnomaria a 60 °C per il tempo sufficiente affinché la soluzione raggiunga la temperatura di 50 °C, da mantenere per 15 minuti. Lasciare quindi raffreddare il pallone  spontaneamente per 30 minuti immergendolo poi in un bagno di acqua fredda. Travasare quindi in un pallone tarato da 1 l e portare a volume; questa soluzione si mantiene per un mese. Al momento dell'impiego neutralizzare la quantità prelevata (tale  soluzione è approssimativamente 0,06 M acida), con una soluzione di idrossido di sodio.4.2. Modo di operare   In un pallone da 300 ml, introdurre 25 ml di soluzione cupro-alcalina, 15 ml di acqua e 10 ml di soluzione defecante. Questo volume di soluzione zuccherina non deve contenere più di 60 mg di zucchero invertito.    Aggiungere alcuni granuli di pietra pomice. Adattare al pallone un refrigerante a ricadere e portare ad ebollizione entro 2 minuti. Mantenere l'ebollizione per 10 minuti esatti.    Raffreddare immediatamente in corrente d'acqua fredda. Completato il raffreddamento aggiungere 10 ml di soluzione di ioduro di potassio al 30 % (4.1.2), 25 ml di acido solforico al 25 % (4.1.3) e 2 ml di salda d'amido (4. 1.4).    Titolare con la soluzione 0,1 M di tiosolfato di sodio (4.1.5). Sia n il numero di millilitri utilizzati.    Effettuare a parte una prova in bianco, sostituendo i 25 ml di soluzione zuccherina con 25 ml di acqua distillata. Sia n2 il volume di tiosolfato impiegato.4.3. Espressione dei risultati  4.3.1.Calcoli   La quantità di zucchero del rino , espressa in zucchero invertito, contenuta nel campione in esame, è riportata nella tabella seguente in funzione del numero (n2   n) di millilitri di tiosolfato utilizzati.    Esprimere il tenore di zucchero in grammi di zucchero invertito per litro con una cifra decimale, tenendo conto delle diluizioni effettuate nel corso della defecazione e del volume del di campione.4.3.2. Ripetibilità   r = 0,015 xixi = concentrazione di zucchero invertito in g/l del campione4.3.3. Riproducibilità   R = 0,058 xixi = concentrazione di zucchero invertito in g/l del campione         6. SACCAROSIO 1. PRINCIPIO  DEI  METODI   II. Metodo ri ricerca qualitativa per cromatografia su strato sottile. Il saccarosio è separato dagli altri zuccheri per cromatografia su strato sottile di cellulosa e rivelato per mezzo del reattivo urea-acido cloridrico in stufa a 105 °C.    II. Metodo di ricerca e di dosaggio per cromatografia liquida ad alta risoluzione. Il saccarosio viene separato su colonna di silice addizionata di alchilammina e rivelato per rifrattometria. Il dosaggio viene effettuato rispetto ad uno standard  esterno analizzato nelle stesse condizioni.    Osservazione:La genuinità di un mosto o di un vino può essere controllata con il metodo della RMN del deuterio descritta per la rivelazione dello zuccheraggio dei mosti, dei mosti concentrati, dei mosti concentrati rettificati e dei vini.Per la ricerca  ed il dosaggio del saccarosio può essere impiegato il metodo gascromatografico descritto nel capitolo 42, lettera f).2. METODO  DI  RICERCA  QUALITATIVA  PER  CROMATOGRAFIA  SU  STRATO  SOTTILE  2.1. Materiale  2.1.1. Lastre per cromatografia ricoperte di uno strato sottile di cellulosa.   2.1.2. Vasca cromatografica  2.1.3. Siringa micrometrica o micropipetta  2.1.4. Stufa termostatabile a 105 ± 2 °C2.2. Reattivi  2.2.1. Carbone decolorante  2.2.2. Fase mobile: cloruro di metilene   acido acetico (d20°   1,05 g/ml)   etanolo   metanolo   acqua (50 : 25 : 9 : 6 : 10)  2.2.3. RivelatoreUrea:  5 g Acido cloridrico 2 M:  20 ml Etanolo: 100 ml  2.2.4. Soluzione di riferimentoGlucosio:   35   g Fruttosio:   35   g Saccarosio:    0,5 g Acqua q.b. a: 1 000   ml2.3. Modo di operare  2.3.1. Preparazione del campione   Se il mosto o il vino è fortemente colorato, decolorarlo trattandolo con carbone attivo.    Nel caso di mosto concentrato rettificato, usare la soluzione avente un tenore zuccherino del 25 % (m/m) (25° Brix) preparata come indicato al capitolo «Determinazione del pH» al punto 4.1.2 e diluirla a un quarto portando da 25 ml a 100 ml con acqua  in pallone tarato.  2.3.2. Cromatogramma   A 2,5 cm dal bordo inferiore della lastra cromatografica deporre:- 10 µl del campione;- 10 µl della soluzione di riferimento.    Porre la lastra nella vasca per cromatografia satura dei vapori della fase mobile e lasciar migrare il solvente fino ad un centimetro dal bordo superiore. Togliere la lastra e asciugarla in corrente di aria calda. Ripetere due volte la migrazione  asciugando ogni volta la lastra. Polverizzare uniformemente sulla lastra 15 ml del rivelatore e porla in stufa a 105 °C per 5 minuti.2.4. Risultati   Il saccarosio ed il fruttosio danno macchie di colore blu intenso su fondo bianco; il glucosio dà una macchia verdastra meno intensa.3. METODO  DI  RICERCA  E  DI  DETERMINAZIONE  PER  CROMATOGRAFIA  LIQUIDA  AD  ALTA  RISOLUZIONE   Le condizioni cromatografiche sono date a titolo indicativo.3.1. Apparecchiatura  3.1.1. Cromatografo in fase liquida ad alta risoluzione corredato di:    1) un iniettore (loop) da 10 µl,2) un rivelatore, rifrattometro differenziale o rifrattometro interferometro,3) una colonna di silice con alchilammina legata (lunghezza 250 mm e diametro interno 4 mm),4) una precolonna riempita con la stessa fase,5) un  dispositivo per isolare o termostatare (30 °C) l'insieme precolonna-colonna,6) un registratore ed eventualmente un integratore,7) flusso della fase mobile: 1 ml/minuto.3.1.2. Dispositivo di filtrazione su membrana (0,45 µm)3.2. Reattivi  3.2.1. Acqua bidistillata  3.2.2. Acetonitrile (CH3 CN) di qualità HPLC  3.2.3. Fase mobile: acetonitrile-acqua, previamente filtrati su membrana (0,45 µm), (80 20 v/v)Detta fase mobile deve essere degassificata prima dell'uso.   3.2.4. Soluzione di riferimento: soluzione acquosa di saccarosio di 1,2 g/l. Filtrarla su membrana (0,45 µm).  3.3. Modo di operare  3.3.1. Preparazione del campione   - Per i vini e i mosti,  filtrare su membrana (0,45 µm).- Per i mosti concentrati rettificati, utilizzare la soluzione che si ottiene diluendo il mosto concentrato rettificato al 40 % m/v come indicato al capitolo«acidità totale» (5.1.2) e filtrarla su membrana (0,45 µm).3.3.2.  Determinazione cromatografica   Iniettare in fasi successive nel cromatografo 10 µl della soluzione di riferimento e 10 µl del campione preparato come indicato al punto 3.3.1.Ripetere le iniezioni nello stesso ordine.Registrare il cromatogramma.Il tempo di ritenzione del saccarosio è  di circa 10 minuti.3.4. Calcoli   Utilizzare per il calcolo la media delle due risposte ottenute per la soluzione di riferimento e per il campione.3.4.1.Per i vini e i mosti   Calcolare il tenore in g/l.3.4.2. Per i mosti concentrati ed i mosti concentrati rettificati   Sia C = g/l il tenore in saccarosio della soluzione del mosto concentrato rettificato al 40 % (m/v).    Tenore zuccherino in grammi per chilogrammo di mosto concentrato rettificato: 2,5 · C3.5. Espressione dei risultati   Il tenore in saccarosio si esprime con una cifra decimale in g/l nel caso dei vini, dei mosti e dei mosti concentrati rettificati nel caso dei mosti concentrati rettificati, in g/kg.     7. GLUCOSIO  E  FRUTTOSIO 1. DEFINIZIONE Il glucosio ed il fruttosio possono essere determinati singolarmente con un metodo enzimatico, al solo scopo di calcolare il rapporto glucosio/fruttosio.2. PRINCIPIO   Il glucosio e il fruttosio sono fosforilati con adenosina-trifosfato (ATP) con una reazione enzimatica catalizzata dall'esochinasi (HK) e danno glucosio-6-fosfato (G6P) e fruttosio-6-fosfato (F6P):    glucosio + ATP  G6P + ADP   fruttosio + ATP  F6P + ADP   In un primo tempo il glucosio-6-fosfato viene ossidato a gluconato-6-fosfato dal nicotinammide-adenina-dinucleotide-fosfato (NADP) in presenza dell'enzima glucosio-6-fosfato-deidrogenasi (G6PDH). La quantità di  nicotinammide-adenina-dinucleotide-fosfato ridotto (NADPH) che si forma corrisponde alla quantità di glucosio-6-fosfato e quindi a quella del glucosio.    G6P + NADP+  Gluconato-6-fosfato + NADPH + H+   Il nicotinammide-adenina-dinulceotide-fosfato ridotto si dosa per assorbimento a 340 nm.    Al termine di questa reazione, il fruttosio-6-fosfato viene trasformato dall'azione della fosfoglucosio-isomerasi (PGI) in glucosio-6-fosfato     Il glucosio-6-fosfato reagisce di nuovo con il nicotinammide-adenina-dinucleotide-fosfato per dare gluconato-6-fosfato e nicotinammide-adenina-dinucleotide-fosfato ridotto; questo viene quindi dosato.3. APPARECCHIATURA   - Spettrofotometro in grado di effettuare misurazioni a 340 nm, valore massimo di assorbimento del NADPH. Trattandosi di misure assolute (senza curva di taratura, ma con riferimento al coefficiente di estinzione del NADPH) le scale delle lunghezze  d'onda e delle assorbanze dell'apparecchio devono essere controllate.In mancanza di quest'apparecchiatura, utilizzare uno spettrofotometro a spettro discontinuo che consenta di effettuare le misure a 334 nm o a 365 nm.- Celle di vetro avente un cammino  ottico di 1 cm o celle monouso.- Pipette per prova enzimatica da 0,02- 0,05- 0,01- 0,2 ml.4. REATTIVI  4.1. Soluzione 1: tampone (trietanolammina 0,3 M; pH = 7,6; 4 · 10 3 M in Mg ++) sciogliere 11,2 g di cloridrato di trietanolammina (C2H5)3N · HCl) e 0,2 g di Mg SO4 · 7 H2O in 150 ml di acqua bidistillata, aggiungere circa 4 ml di soluzione 5 M di  idrossido di sodio (NaOH) per ottenere un pH uguale a 7,6 e portare a 200 ml.    Questa soluzione tampone può essere conservata a + 4 °C per quattro settimane.   4.2.Soluzione 2: soluzione di nicotinammide-adenina-dinucleotide-fosfato (circa 11,5 · 10 3 M): sciogliere 50 mg di nicotinammide-adenina-dinucleotide-fosfato bisodico in 5 ml di acqua bidistillata.     La soluzione si conserva a +4 °C per quattro settimane.   4.3. Soluzione 3: soluzione di adenosina-52-trifosfato (circa 81· 10 3M): sciogliere 250 mg di adenosina-52-trifosfato disodico e 250 mg di bicarbonato di sodio NaHCO3 in 5 ml di acqua bidistillata.    Questa soluzione si mantiene a + 4 °C per quattro settimane.   4.4. Soluzione 4: Esochinasi/glucosio-6-fosfato-deidrogenasi: miscelare 0,5 ml di esochinasi (2 mg di proteina/ml, cioè 280 U/ml) e 0,5 ml di glucosio-6-fosfato-deidrogenasi (1 mg di proteina per ml).    A + 4 °C la soluzione si conserva per un anno.   4.5 Soluzione 5:fosfoglucosio-isomerasi (2 mg di proteina per ml, cioè 700 U/ml). La sospensione viene utilizzata senza diluizione.    A + 4 °C circa la soluzione si conserva per un anno.    Nota:l'insieme dei reattivi per il dosaggio si trova pronto in commercio.5. MODO  DI  OPERARE  5.1. Preparazione del campione   Effettuare le seguenti diluizioni in funzione della quantità presunta di glucosio + fruttosio per litro:                    Misura a 340 e 334 nm365 nmDiluizione con acquaFattore F di diluizionefino a  0,4 g/l 0,8 g/l--fino a  4,0 g/l 8,0 g/l1+ 9  10fino a 10,0 g/l20,0 g/l1+ 24  25fino a 20,0 g/l40,0 g/l1+ 49  50fino a 40,0 g/l80,0 g/l1+ 99  100al di sopra di 40,0  g/l80,0 g/l1+9991 000 5.2. Dosaggio   Regolato lo spettrofotometro sulla lunghezza d'onda di 340 nm, effettuare le misure rispetto all'aria (senza la cella sul percorso ottico) o rispetto all'acqua.Temperatura 20-25 °C.In 2 celle aventi un cammino ottico di 1 cm, introdurre:     Prova in bianco CampioneSoluzione 1 (4.1) (portata a 20 °C) 2,50 ml 2,50 ml Soluzione 2 (4.2) 0,10 ml 0,10 ml Soluzione 3 (4.3) 0,10 ml 0,10 ml Campione da determinare  0,20 ml Acqua bidistillata 0,20 ml   Mescolare e dopo circa 3 minuti leggere l'assorbanza delle soluzioni (A1). Provocare la reazione aggiungendo:Soluzione 4 (4.4) 0,02 ml 0,02 ml   Mescolare; aspettare 15 minuti; effettuare la misura dell'assorbanza e verificare dopo 2 minuti che la reazione sia terminata (A2).    Aggiungere immediatamente:Soluzione 5 (4.5) 0,02 ml 0,02 ml    Mescolare; effettuare la lettura dopo 10 minuti; verificare l'arresto della reazione dopo 2 minuti (A3).    Determinare le differenze di assorbanza:A2   A1 che corrisponde al glucosio,A3   A2 che corrisponde al fruttosio,per la prova in bianco e per il campione.    Determinare la differenza di assorbanza tra la prova in bianco (DAT) ed il campione (DAD) e fissare:per il glucosio: DAG =DAC   DABper il fruttosio:DAF = DAC   DAB   Osservazione: il tempo necessario per l'azione degli enzimi può variare da un lotto all'altro. Qui sopra è riportato soltanto a titolo indicativo. Si raccomanda di determinarlo per ciascun lotto.5.3. Espressione dei risultati  5.3.1. Calcolo   La formula generale per il calcolo delle concentrazioni è la seguente:V = volume della soluzione impiegata per la prova (ml) v = volume del campione (ml) PM = massa molecolare della sostanza da dosare d = cammino ottico della cella (cm) e = coefficiente di assorbimento dell'NADPH a 340 nm = 6,3 (m mole 1 · l · cm 1) V = 2,92 ml per la determinazione del glucosio V = 2,94 ml per la determinazione del fruttosio v = 0,20 ml PM = 180 d = 1   Si ottiene:Per il glucosio: Cg/l = 0,417 · DAG Per il fruttosio: Cg/l = 0,420 · DAF   Se per preparare il campione, è stata effettuata una diluizione, moltiplicare il risultato per il fattore F.    Osservazione:Per misure effettuate alle lunghezze d'onda 334 o 365 nm si ottiene:- misura a 334 nm: e = 6,2 (m mole 1 · l · cm 1)per il glucosio: Cg/l = 0,425 · DAG per il fruttosio: Cg/l = 0,428 · DAF- misura a 365 nm: e = 3,4 (m mole 1 · l · cm 1)per il glucosio: Cg/l = 0,773 · DAG per il fruttosio: Cg/l = 0,778 · DAF5.3.2. Ripetibilità (r)   r = 0,056 xi5.3.3.Riproducibilità (R)   R = 0,12 + 0,076 xiPER LA CONTINUAZIONE DEL TESTO VEDI SOTTO NUMERO : 390R2676.1xi = tenore in glucosio o fruttosio in grammi per litro    8. RIVELAZIONE  DELL'AUMENTO  DEL  TITOLO  ALCOLOMETRICO  NATURALE  DEI  MOSTI  DI  UVE,  DEI  MOSTI  DI  UVE  CONCENTRATI , DEI  MOSTI  DI  UVE  CONCENTRATI  RETTIFICATI  E  DEI  VINI  MEDIANTE  LA  RISONANZA  MAGNETICA  NUCLEARE  DEL  DEUTERIO  (RMN  FINS/SNIF NMR) 1. DEFINIZIONE   Gli atomi di deuterio contenuti negli zuccheri e nell'acqua di un mosto di uva si ridistribuiscono dopo la fermentazione nelle molecole I, II, III e IV del vino:CH2D CH2 OH CH3 CHD OH I IICH3 CH2 OD HOD III IV   L'aggiunta di zuccheri esogeni (zuccheraggio a secco) prima della fermentazione del mosto si ripercuoterà sulla ridistribuzione del deuterio.    Rispetto ai valori dei parametri relativi ad un vino campione naturale della stessa regione, lo zuccheraggio con zucchero esogeno provocherà le seguenti variazioni:                            Parametri Vino(D/H)I(D/H)II(D/H)QWR- Naturale    - Arricchito      - zucchero di barbabietola      - zucchero di canna      - zucchero di mais       (D/H)I : rapporto isotopico nella molecola I(D/H)II : rapporto isotopico nella molecola II(D/H)QW : rapporto isotopico dell'acqua e del vino   R = 2(D/H)II/(D/H)I, esprime la distribuzione relativa del deuterio nelle molecole I e II; R viene direttamente misurato a partire dalle intensità h dei segnali e quindi R = 3hII/hI.    (D/H)I caratterizza soprattutto la specie vegetale che ha sintetizzato lo zucchero ed in misura minore la geografia del luogo di raccolta (natura dell'acqua impiegata per la fotosintesi).    (D/H)II rappresenta la climatologia del luogo di produzione delle uve (qualità dell'acqua piovana e condizioni meteorologiche) ed in misura minore, la concentrazione zuccherina del mosto iniziale.    (D/H)QW rappresenta la climatologia del luogo di produzione e la ricchezza in zucchero del mosto iniziale.2. PRINCIPIO   La determinazione dei parametri sopra definiti [(R, (D/H)I, (D/H)II)], è effettuata per RMN del deuterio sull'etanolo estratto dal vino o dai prodotti di fermentazione del mosto, del mosto concentrato, del mosto concentrato rettificato ottenuti in  determinate condizioni. Essa è eventualmente completata con la determinazione del rapporto isotopico dell'acqua estratta dal vino, (D/H)QW e del rapporto isotopico 13C/12C dell'etanolo.    In attesa della costituzione di una banca dati comunitaria:- nel caso dei vini i campioni prelevati per il controllo nelle zone di produzione devono essere accompagnati dal prelevamento di campioni testimoni naturali (almeno tre) della stessa origine  (luogo geografico e annata); tali prelevamenti vanno effettuati in tre esemplari;- nel caso dei mosti, dei mosti concentrati e dei mosti concentrati rettificati, i campioni testimoni (almeno 3) sono costituiti da mosti naturali della stessa origine  (luogo geografico e annata);     Per i controlli dei prodotti elaborati nel proprio territorio, in attesa della costituzione di una banca dati comunitaria, gli Stati membri possono in via transitoria utilizzare una banca dati nazionale.3. PREPARAZIONE  DEL  CAMPIONE  PER  L'ANALISI  3.1. Estrazione dell'etanolo e dell'acqua dal vino   Osservazione: Può essere utilizzata qualsiasi apparecchiatura per l'estrazione dell'etanolo a condizione che permetta di recuperare il 98-98,5 % dell'alcol del vino ottenendo un distillato che abbia un titolo compreso tra il 92 e il 93 % mas. (95 %  vol).3.1.1. Apparecchiature e reattivi   - Dispositivo per l'estrazione dell'etanolo (figura 1) comprendente:- riscaldatore semisferico elettrico con variatore di tensione- matraccio sferico da un litro con collo smerigliato- colonna Cadiot con asta rotante (mobile in teflon)- matracci conici  con collo smerigliato da 125 ml- bottiglie con tappodi di plastica da 125 e 60 ml- Reattivi per il dosaggio dell'acqua con la tecnica di Karl Fischer (ad esempio Merck 9241 e 9243)3.1.2. Modo di operare  3.1.2.1. Determinare il titolo alcolometrico del vino con l'approssimazione di 0,05 % vol.  Sia tv.3.1.2.2. Estrazione  dell'etanolo   Versare una presa di campione omogeneo di 500 ml di vino avente titolo alcolometrico tv nel pallone dell'apparecchiatura per la distillazione che abbia un tasso di riflusso costante di circa 0,9. Collocare un matraccio con smerigliatura da 125 ml,  preventivamente tarato, per la raccolta del distillato. Raccogliere il liquido che distilla tra 78,0 e 78,2 °C pari a circa 40-60 ml. Interrompere l'operazione per 5 minuti quando la temperatura supera i 78,5 °C.    Non appena la temperatura raggiunge nuovamente i 78 °C tornare a prelevare il distillato sino a 78,5 °C e ripetere tale operazione fino a quando la temperatura, dopo aver interrotto il prelievo ed aver fatto continuare l'operazione in circuito chiuso,  non decresce più. La distillazione completa dura circa 5 ore. Questo procedimento consente di recuperare il 98-98,5 % dell'alcool totale del vino, in un distillato al 92-93 % in massa (95 % vol), titolo per il quale sono state fissate le condizioni RMN  descritte al paragrafo 4.    Pesare l'etanolo estratto.    In un flacone da 60 ml conservare una parte (60 ml) omogenea delle code di distillazione, che rappresenta l'acqua del vino. Determinare eventualmente il suo rapporto isotopico.    Osservazione:se si dispone di uno spettrometro con sonda da 10 mm (vedi paragrafo 4), saramo sufficienti 300 ml di vino.3.1.2.3. Determinazione  del  titolo  alcolometrico  dell'alcol  estratto   Su un campione di circa 0,5 ml di alcol, di massa p esattamente nota, determinare il tenore in acqua con il metodo Karl Fischer e sia esso p2g.      Figura 1 - Dispositivo per l'estrazione dell'etanolo    Il titolo massico dell'etanolo è dato da3.2. Fermentazione dei mosti, dei mosti concentrati e dei mosti concentrati rettificati  3.2.1. Materiali e reattivi   - Acido tartarico- Bacto Yeast Nitrogen (Base without amino acids) DIFCO- Lieviti secchi attivi (Saccharomyces cerevisiae)    Se si conosce il rapporto isotopico dell'acqua del mosto, i lieviti possono essere preventivamente riattivati insemensandoli per 5 minuti in una piccola quantità di acqua tiepida non distillata (1 g in 50 ml), avente un rapporto isotopico vicino a  quello dell'acqua del mosto.    Quando non si conosce il rapporto isotopico dell'acqua del mosto, è preferibile insemensare direttamente.    La quantità di lieviti secchi da utilizzare è dell'ordine di 1 g, cioè circa 1010 cellule per 1 l di mosto.    Recipiente per la fermentazione da 1,5 l munito di un dispositivo che consenta di operare senza contatto con l'aria e di condensare i vapori di alcol in modo che durante la fermentazione non si abbia alcuna perdita di etanolo. La percentuale di  conversione degli zuccheri fermentescibili in etanolo deve essere superiore al 98 %.3.2.2. Modo di operare  3.2.2.1. Mosti   - Mosti freschiVersare un litro di mosto di cui sia stata previamente determinata la concentrazione in zuccheri fermentescibili, nel recipiente destinato alla fermentazione. Aggiungere 1 g di lieviti secchi precedentemente riattivati. Collocare il  dispositivo che consente di operare fuori dal contatto con l'aria. Effettuare la fermentazione ad una temperatura prossima a 20 °C sino all'esaurimento degli zuccheri. Dopo aver determinato il titolo alcolometrico del prodotto della fermentazione e  calcolato la percentuale di conversione degli zuccheri in alcol, centrifugare il liquido fermentato ottenuto e distillarlo per estrarre l'etanolo.    - Mosti mutizzati con anidride solforosaDesolfitare un volume di mosto di poco superiore ad un litro (1,2 l) per gorgogliamento di una corrente di azoto nel mosto riscaldato in bagnomaria a 70-80 °C in riflusso sino a quando il tenore di anidride  solforosa totale sia inferiore a 200 mg/l. Aver cura di non provocare alcuna concentrazione del mosto per evaporazione dell'acqua utilizzando un refrigerante efficace.Versare un litro di mosto desolfitato nel recipiente da fermentazione e continuare  come indicato per i mosti freschi.Osservazione:  Se per solfitare il mosto è stato impiegato del metabisolfito di potassio, prima del desolfitaggio occorre addizionare a quest'ultimo dell'acido solforico nella misura di 0,25 ml di acido solforico  concentrato (r20 = 1,84 g/ml) per grammo di metabisolfito impiegato in un litro di mosto.3.2.2.2. Mosti  concentrati   Nel recipiente di fermentazione versare un volume V ml di mosto concentrato contenente circa 170 g di zucchero. Completare il volume ad 1 l con (1 000   V) ml di acqua avente lo stesso rapporto isotopico dell'acqua del mosto naturale testimone.  Insemensare come indicato al punto 3.2.1. Aggiungere 3 grammi di Bacto Yeast Nitrogen (Base without amino acids DIFCO). Omogeneizzare e continuare come prima.3.2.2.3. Mosti  concentrati  rettificati   Procedere come descritto al punto 3.2.2.2 portando al volume di un litro con (1 000   V) ml di acqua avente lo stesso rapporto isotopico dell'acqua del mosto naturale testimone in cui sono stati sciolti 3 grammi di acido tartarico.    Osservazione:  Conservare 50 ml di campione di mosto, di mosto desolfitato, di mosto concentrato o di mosto concentrato rettificato per l'eventuale estrazione dell'acqua e la determinazione del suo rapporto isotopico (D/H)QW.L'estrazione dell'acqua dai  mosti potrà essere effettuata molto semplicemente per distillazione azeotropica con toluene.  3.3. Preparazione del campione di alcol per la misura RMN  3.3.1. Reattivi   N,N-tetrametilurea (TMU): utilizzare un campione di riferimento di TMU avente rapporto isotopico D/H conosciuto e controllato. Tale campione può essere fornito da:Direction générale Science, recherche et développement Bureau communautaire de référence Rue de la Loi 200 B-1049 Bruxelles3.3.2. Modo di operare   - Sonda RMN con diametro da 15 mm:Introdune in una bottiglia preventivamente tarata, 7 ml dell'alcol ottenuto al punto 3.1.2 e pesarli con l'approssimazione di 0,1 mg, sia mA la massa; introdurre quindi 3 ml dello standard interno (TMU) e pesare  nuovamente con l'approssimazione di 0,1 mg, sia mst la massa. Omogeneizzare la miscela per agitazione.    - Sonda RMN, diametro 10 mm:3,2 ml di alcol e 1,3 ml di TMU sono sufficienti.  A seconda del tipo di spettrometro e di sonda utilizzati (vedi paragrafo 4), aggiungere come sostanza di stabilizzazione del campo frequenza (lock) una quantità sufficiente di esafluorobenzene.                    SpettrometroSonda10 mm15 mm7,05 T150 µl200 µl9,4 T 35 µl 50 µl3.4. Preparazione del campione di acqua per la misurazione RMN, che servirà eventualmente a determinarne il suo rapporto isotopico.3.4.1. Reattivi   N,N-tetrametilurea (TMU): vedi 3.3.1  3.4.2. Modo di operare   Introdune in una bottiglia preventivamente tarata 3 ml di acqua ottenuta come al punto 3.1.2 o al punto 3.2 (Osservazione); pesare con l'approssimazione di 0,1 mg (m2E); aggiungere quindi 4 ml dello standard interno (TMU) e pesarlo con  l'approssimazione di 0,1 mg (m2st); omogeneizzare la miscela per agitazione.    Osservazione:  Se il laboratorio dispone di uno spettrometro di massa di rapporti isotopici, tale misura potrà essere effettuata su detto strumento in modo da alleggerire il carico dello spettrometro RMN. È in effetti necessario verificare il rapporto  TIV (5.2) per ciascuna serie di vini studiata.4. REGISTRAZIONE  DEGLI  SPETTRI RMN2H  DELL'ALCOL  E  DELL'ACQUA   Determinazione dei parametri isotopici4.1. Apparecchiatura   - Spettrometro RMN corredato di una sonda specifica «deuterio» regolata alla frequenza caratteristica o del campo (Bo ) (ad esempio, per Bo = 7,05 T, o = 46,05 MHz e per Bo = 9,4 T, o = 61,4 MHz), avente un canale di disaccoppiamento del protone (B2) e  un canale di stabilizzazione del campo frequenza (lock), alla frequenza del fluoro. La risoluzione, misurata sullo spettro, trasformato senza moltiplicazione esponenziale (cioè LB = O) (figura 2b) e espressa dall'ampiezza a metà altezza dei picchi  metile e metilene dell'etanolo e del picco metile del TMU, deve essere inferiore a 0,5 Hz. La sensibilità, misurata con un fattore di moltiplicazione esponenziale LB uguale a 2 (figura 2a), deve essere maggiore o uguale a 150 per il picco metile  dell'etanolo al 95 % in vol (93,5 % mas). In queste condizioni, l'intervallo fiduciale della misura dell'altezza del segnale, calcolato per una probabilità del 97,5 % (prova a un'ala) e per 10 ripetizioni dello spettro, è di 0,35 %.- Campionatore  automatico eventuale.- Software per l'elaborazione dei dati.- Tubi portacampione da 15 mm o da 10 mm a seconda del potere risolutivo dello spettrometro.4.2. Regolazione dello spettrometro e verifiche  4.2.1.Regolazione   Procedere alle normali regolazioni di omogeneità e di sensibilità seguendo le indicazioni del costruttore.4.2.2. Verifica della validità delle regolazioni   Utilizzare etanoli di riferimento, contrassegnati con le lettere C, V e B, che presentino una composizione isotopica diversa ma tarata con precisione. Siano C = alcol di canna da zucchero o di mais, V = alcol di vino e B = alcol di barbabietola. Tali  campioni sono forniti dal BCR (3.3.1).    Seguendo il procedimento di cui al punto 4.3, determinare i valori isotopici di questi alcol e trascriverli Cmis, Vmis, Bmis. (Vedi 5.3).    Confrontarli con i rispettivi valori di riferimento dati, contrassegnati da Cst, Bst, Vst (vedi 5.3).  Figura 2aSpettro RMN²H di un etanolo di vino con uno standard interno (TMU: N,N tetrametilurea)    Figura 2bSpettro²H dell'etanolo realizzato nelle stesse condizioni della figura 2a senza moltiplicazione esponenziale (LB=O)    Lo scarto tipo di ripetibilità ottenuto sulla media di 10 ripetizioni di ciascuno spettro deve essere inferiore a 0,01 per il rapporto R ed inferiore a 0,3 ppm per (D/H)I e per (D/H)II.    I valori medi ottenuti per i vari parametri isotopici [(R, (D/H)I, (D/H)II)] devono cadere nel corrispondente scarto tipo di ripetibilità dato, per tali parametri, per i tre alcol di riferimento, del BCR in caso contrario occorre effettuare nuovamente  la regolazione.4.3. Registrazione degli spettri RMN   Porre il campione di alcol preparato come in 3.3 (o quello di acqua preparato come in 3.4) in un tubo da 15 o da 10 mm e introdurlo nella sonda.    Gli spettri RMN devono essere ottenuti nelle seguenti condizioni:- la temperatura della sonda: (ad esempio 302 K) deve essere costante;- tempo di acquisizione di almeno 6,8 secondi per 1200 Hz di ampiezza spettrale (Memoria 16 K, cioè circa 20 ppm a  61,4 MHz, oppure circa 27 ppm a 46,1 MHz.);- impulso: 90 °;- regolare il termine di acquisizione; il suo valore deve essere dello stesso ordine di grandezza dei tempi di campionamento («dwell time»);- rivelazione in quadratura: fissare l'«offset» 01 tra  i segnali - OD - CHD per l'etanolo e tra i segnali HOD e TMU per l'acqua;- determinare il valore dell'«offset» di disaccoppiamento 02 utilizzando lo spettro protonico misurato dalla bobina di disaccoppiamento sullo stesso tubo. Si ottiene un buon  disaccoppiamento quando O2 si trova al centro dell'intervallo di frequenza esistente tra i gruppi CH3- e -CH2-. Utilizzare il disaccoppiamento a banda larga.    Effettuare per ciascuno spettro un numero di accumulazioni NS sufficiente ad ottenere il rapporto segnale/rumore dato al punto 4-1 e ripetere NE=10 volte tale serie di NS accumulazioni. I valori di NS dipendono dal tipo di spettrometro e di sonda  utilizzati (vedi 4) e si sceglierà ad esempio:               SpettrometroSonda10 mm15 mm7,05 TNS = 304NS = 2009,04 TNS = 200NS = 128 5. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI  5.1. Caso dell'etanolo   Per ciascuno dei 10 spettri determinare (vedi spettro RMN dell'etanolo, figura 2a):- CH3CHDO Hmst e mA (vedi 3.3.2)- tDm (vedi 3.1.2.3)- (D/H)st = rapporto isotopico dello standard interno (TMU) indicato sulla confezione fornita dal BCR.    L'utilizzazione dell'altezza dei segnali al posto delle superfici misurabili con minore precisione suppone larghezze uguali a metà altezza e questa è un'approssimazione ragionevole (figura 2 b).5.2. Caso dell'acqua   Quando il rapporto isotopico dell'acqua è determinato con l'RMN, partendo dalla miscela acqua-TMU, si usa la seguente relazione:dove- m2st et m2E vedi 3.4.2- (D/H)st = rapporto isotopico dello standard interno (TMU) indicato sulla confezione fornita  dal BCR  5.3. Per ciascuno dei parametri isotopici, calcolare la media di 10 determinazioni e l'intervallo fiduciale.    Un software opzionale (ad esempio RMN-FINS) adattabile all'elaboratore dello spettrometro consente di effettuare in linea tali calcoli.    Osservazione: Se, dopo la regolazione dello spettrometro, si ha uno scarto sistematico tra i valori medi ottenuti per le caratteristiche isotopiche degli alcoli di riferimento (4.2.2) e i valori indicati dal BCR, a meno dello scarto-tipo, si potrà  applicare la seguente correzione per ottenere il valore reale di un campione X qualsiasi.    L'interpolazione si effettuerà prendendo i valori dei campioni di riferimento immediatamente superiore e inferiore a quello del campione X.     Sia (D/H)iXmis il valore misurato e (D/H)iXcorr il valore corretto; si avrà:(D/H)iXcorr = (D/H)iBst + a [(D/H)iXmis   (D/H)iBmis]   dove   Esempio:Campioni di riferimento forniti e tarati dal BCR:(D/H)IVst = 102,0 ppm (D/H)IBst = 91,95 ppmCampioni di riferimento misurati dal laboratorio:(D/H)IVmis = 102,8 ppm (D/H)IBmis = 93,0 ppmCampione sospetto non corretto:(D/H)IXmis = 100,2 ppmSi  calcola a = 1,0255 e (D/H)IXcorr = 99,3 ppm6. INTERPRETAZIONE  DEI  RISULTATI   Confrontare il valore RX ottenuto per il rapporto R del campione sospetto con i rapporti ottenuti per i vini testimoni. Se il valore di RX si discosta di più di 2 scarti tipo dal valore medio RT ottenuto per i vini testimoni, vi è presunzione di  adulterazione.6.1. Aumento del titolo alcolometrico naturale con aggiunta di zucchero di barbabietola o di canna o con glucosio di mais  6.1.1. Vini   RX maggiore di RT: presunzione di addizione di zucchero di barbabietola.  RX inferiore a RT: presunzione di addizione di zucchero da canna o di zucchero da mais.Notare che (D/H)XII e (D/H)WQX sono aumentati.Esaminare (D/H)IX. Vi è presunzione di:- arricchimento con zucchero da barbabietola:(D/H)XII del campione sospetto è  inferiore a (D/H)IT, valore medio ottenuto con i campioni di riferimento, di oltre uno scarto tipo;- arricchimento con zucchero da canna o da mais:  (D/H)IX è maggiore di (D/H)IT, di oltre uno scarto tipo sulla misura.- Calcolo dell'arricchimento E, espresso in % in volume di etanolo:- Caso di arricchimento con zucchero di barbabietola:(D/H)IB = rapporto isotopico per il sito I dell'alcol d  barbabietola:  (D/H)IB = 92.5 (8)tV = titolo alcolometrico del vino analizzato (X)- Caso di arricchimento con zucchero di canna o di mais: (D/H)IC = rapporto isotopico per il sito I dell'alcol di canna da zucchero o di mais:  (D/H)IC = 110,5 (9)tV = titolo alcolometrico del vino analizzato (X)6.1.2. Mosti, mosti concentrati e mosti concentrati rettificati   I valori dei parametri isotopici dell'alcol estratto, come indicato al punto 3.1 del prodotto fermentato ottenuto (3.2) dal mosto, dal mosto concentrato e dal mosto concentrato rettificato, vengono esaminati secondo quanto prescritto in 6  «interpretazione dei risultati» (6.1.1) confrontandoli con l'alcol estratto dal prodotto di fermentazione dei mosti naturali testimoni.    L'arricchimento, E % vol, esprime il volume di alcol apportato al prodotto fermentato. Conoscendo l'eventuale diluizione effettuata prima della fermentazione (mosti concentrati e mosti concentrati rettificati) ammettendo che 16,83 g di zucchero danno  l'1 % vol di alcol, calcolare la quantità in massa di zucchero aggiunto per litro di mosto, di mosto concentrato o di mosto concentrato rettificato.6.2. Aumento del titolo alcolometrico naturale con l'aggiunta di una miscela di zucchero di barbabietola  e di zucchero di canna o di glucosio di mais   I rapporti istotopici (D/H)I e R risultano meno modificati che nel caso di arricchimento con un solo tipo di zucchero.    (D/H)II e (D/H)WQ risultano aumentati.La conferma di queste aggiunte può aversi determinando il rapporto 13C/12C dell'etanolo con lo spettrometria di massa; questo rapporto risulterà in tale caso aumentato.      9. CENERI 1. DEFINIZIONE   Con il termine ceneri si intende l'insieme dei prodotti ottenuti per incenerimento del residuo dell'evaporazione del vino, condotto in modo da ottenere la totalità dei cationi (ad esclusione dello ione ammonio) sotto forma di carbonati o di altri sali  minerali anidri.2. PRINCIPIO  DEL  METODO   Incenerimento dell'estratto del vino, effettuato fra 500 e 550 °C fino a combustione completa del carbonio.3. APPARECCHIATURA  3.1. Bagnomaria a 100 °C  3.2. Bilancia con sensibilità di un decimo di milligrammo  3.3. Piastra riscaldante o evaporatore all'infrarosso  3.4. Forno elettrico con termoregolatore  3.5. Essiccatore  3.6. Capsula in platino a fondo piano del diametro di 70 mm ed altezza di 25 mm4. MODO  DI  OPERARE   Versare 20 ml di vino nella capsula in platino previamente tarata (Po g). Fare evaporare su bagnomaria a 100 °C, scaldare il residuo sulla piastra riscaldante a 200 °C o sotto l'evaporatore all'infrarosso, fino a carbonizzazione. Quando non si ha più  emissione di vapore, porre la capsula nel forno elettrico portato alla temperatura di 525 ± 25 °C. Dopo 15 minuti di carbonizzazione, ritirare la capusla dal forno, aggiungere 5 ml di acqua distillata che vengono successivamente fatti evaporare sul  bagnomaria o sotto l'evaporatore all'infrarosso e riscaldare di nuovo a 525 °C per una decina di minuti.    Se la combustione delle particelle carboniose non è completa, ricominciare le operazioni di lavaggio delle particelle carboniose, di evaporazione dell'acqua e di incenerimento.    Per i vini ricchi di zucchero, conviene, precedentemente alla prima calcinazione, aggiungere all'estratto alcune gocce di olio vegetale puro per impedire che il contenuto trabocchi.    Dopo raffreddamento in essiccatore, pesare la capsula; sia P1g il peso.    Il peso delle ceneri corrispondente al campione prelevato per la prova (20 ml) è p = (P1   Po) g.5. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI  5.1. Metodo di calcolo   Il peso P delle ceneri epresso in grammi per litro con due cifre decimali sarà:P = 50 · p     10. ALCALINITÀ  DELLE  CENERI 1. DEFINIZIONE   Si denomina l'alcalinità delle ceneri la somma dei cationi, diversi dall'ammonio, combinati agli acidi organici del vino.2. PRINCIPIO  DEL  METODO   Titolazione in presenza di metilarancio delle ceneri solubilizzate a caldo con un eccesso noto di acido titolato.3. REATTIVI  E  MATERIALE  3.1. Soluzione 0,05 M di acido solforico (H2SO4) 3.2. Soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (NaOH)  3.3. Soluzioni in acqua distillata di metilarancio allo 0,1 %  3.4. Bagnomaria a 100 °C4. MODO  DI  OPERARE   Aggiungere nella capsula di platino contenente le ceneri di 20 ml di vino 10 ml di soluzione 0,05 M di acido solforico (3.1); porre la capsula su bagnomaria a 100 °C per 15 minuti circa, rompendo il residuo con l'aiuto di una bacchetta di vetro per  agevolare la dissoluzione. Aggiungere quindi due gocce di soluzione di metilarancio e titolare l'eccesso di acido solforico con la soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (3.2) fino a viraggio al giallo dell'indicatore.5. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI   Metodo di calcolo   L'alcalinità delle ceneri espressa in milliequivalenti per litro, con una cifra decimale sarà:    A = 5 (10   n)n = numero di millilitri di idrossido di sodio 0,1 M    11. CLORURI 1. PRINCIPIO  DEL  METODO   I cloruri vengono dosati direttamente nel vino mediante potenziometria facendo uso dell'elettrodo Ag/AgCl.2. APPARECCHIATURA  2.1. pH metro millivoltmetro graduato almeno di 2 in 2 mV  2.2. Agitatore magnetico  2.3. Elettrodo Ag/AgCl, con una soluzione satura di nitrato di potassio come elettrolita  2.4. Microburetta graduata a 1/100 di ml  2.5. Cronometro3. REATTIVI  3.1. Soluzione standard di cloruri: 2,1027 g di cloruro di potassio, KCl (massimo 0,005 % guadi Brix), essiccati prima dell'uso mediante conservazione per qualche giorno in un essiccatore, vengono sciolti in acqua distillata e portati al volume di 1  litro. 1 ml di questa soluzione contiene 1 mg di Cl .   3.2. Soluzione titolata di nitrato di argento: 4,7912 g di nitrato di argento, AgNO3, vengono sciolti e portati al volume di 1 litro in una soluzione alcolica al 10 % (v/v) : 1 ml di questa soluzione corrisponde a 1 mg di Cl .   3.3. Acido nitrico almeno al 65 % (r20 = 1,40 g/ml).4. MODO  DI  OPERARE  4.1. 5,0 ml di soluzione standard di cloruri vengono introdotti in un recipiente cilindrico di 150 ml sistemato su un agitatore magnetico, diluiti a 100 ml circa con acqua distillata ed acidificati con 1,0 ml di acido nitrico al 65 % minimo. Dopo  l'immersione dell'elettrodo, titolare aggiungendo con la microburetta la soluzione titolata di nitrato di argento, agitando moderatamente. Le aggiunte effettuate sono, all'inizio di 1,00 ml per i primi 4 ml, leggere i valori corrispondenti in millivolt.  Aggiungere poi i 2 ml successivi suddivisi in frazioni di 0,20 ml. Riprendere infine le aggiunte di 1 ml per volta, finché non saranno stati aggiunti in totale 10 ml. Dopo ciascuna aggiunta aspettare circa 30 secondi prima di effettuare la lettura dei  millivolt corrispondenti. Portare i valori ottenuti su carta millimetrata, in funzione dei millilitri di soluzione titolata corrispondenti e determinare il potenziale del punto di equivalenza in base al punto singolo della curva ottenuta.   4.2. In un recipiente cilindrico da 150 ml vengono introdotti 5 ml della soluzione standard di cloruri, nonché 95 ml di acqua distillata e 1 ml di acido nitrico al 65 % minimo. Immergere l'elettrodo e titolare agitando fino a ottenimento del potenziale  del punto di equivalenza. Questa determinazione viene ripetuta fino al raggiungimento di una buona concordanza tra i risultati. È necessario effettuare questo controllo prima di ciascuna serie di dosaggi dei cloruri nei campioni.   4.3. 50 ml di vino da analizzare vengono introdotti in un recipiente cilindrico da 150 ml. Aggiungere 50 ml di acqua distillata e 1 ml di acido nitrico di concentrazione non inferiore al 65 % e titolare secondo il procedimento indicato al punto 4.2.5.  ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI  5.1. Calcoli   Se n rappresenta il numero dei millilitri di soluzione titolata di nitrato d'argento, il tenore in cloruri del prodotto in esame è:     20 × n espresso in milligrammi di Cl per litro,0,5633 × n espresso in milliequivalenti per litro,32,9 × n espresso in milligrammi di cloruro di sodio per litro.5.2. Ripetibilità (r)   r = 1,2 mg di C1 per litror = 0,03 meq/lr = 2,0 mg NaCl/l5.3. Riproducibilità (R)   R = 4,1 mg di Cl per litroR = 0,12 meq/lR = 6,8 mg NaCl/l6. Osservazioni: Dosaggio molto preciso.    Si fa riferimento alla curva di titolazione completa ottenuta durante il dosaggio del prodotto in esame mediante la soluzione di nitrato di argento.    a) Versare 50 ml di vino da analizzare in un recipiente cilindrico da 150 ml. Aggiungere 50 ml di acqua distillata e 1 ml di acido nitrico ad una concentrazione non inferiore al 65 %. Titolare per mezzo della soluzione di nitrato di argento, procedendo  ad aggiunte di 0,5 ml per le quali si rileva il corrispondente potenziale in millivolt. Dedurre da questa prima titolazione il volume approssimativo di soluzione di nitrato di argento necessario.    b) Ricominciare il dosaggio nelle stesse condizioni. Procedere all'inizio ad aggiunte di 0,5 ml di soluzione titolante fino a che il volume aggiunto è inferiore di 1,52 ml al volume determinato in a). Procedere quindi ad aggiunte di 0,2 ml; continuare  le aggiunte al di là del punto di equivalenza approssimativamente individuato, in modo simmetrico, mediante aggiunta di 0,2 e poi di 0,5 ml.    Il punto finale del dosaggio ed il volume di soluzione di nitrato di argento esattamente consumato viene ottenuto:- tracciando la curva e determinando il punto di equivalenza, oppure- con il calcolo:dove:V = volume di soluzione titolata al punto di  equivalenzaV2 = volume di soluzione titolata prima del più grande salto di potenzialeDVi = volume costante delle frazioni di soluzione titolata aggiunte, ovvero 0,2 mlDDE1 = differenza di potenziale prima della più grande variazione di potenzialeDDE2 =  seconda differenza di potenziale dopo la più grande variazione di potenziale    Esempio:                 Volume di soluzione titolata di AgNO3Potenziale E in mVDifferenza DEDifferenza seconda DDE   0204     4  0,2208  0    4  0,4212  2    6  0,6218  0    6  0,8224  0    6  1,0230  2    8  1,2238  4   12  1,4250 10   22  1,6272 22   44  1,8316 10   34   2,0350  8   26  2,2376  6   20  2,4396     In questo esempio il punto finale della titolazione è situato tra 1,6 e 1,8 ml: perché è in questo intervallo che appare il più grande salto di potenziale (DE = 44 mV). Il volume di soluzione titolata di nitrato di argento consumato per dosare i  cloruri nella aliquota di sostanza da analizzare è il seguente:    12. SOLFATI 1. PRINCIPIO  DEI  METODI  1.1. Metodo di riferimento   Precipitazione del solfato di bario e pesata. Il fosfato di bario precipitato nelle stesse condizioni viene eliminato mediante lavaggio del precipitato con acido cloridrico.    Nel caso dei mosti o dei vini ricchi di anidride solforosa, è necessaria una desolfitazione preliminare mediante ebollizione al riparo dall'aria.1.2. Metodo rapido di prova   Classificazione dei vini in diverse categorie mediante un metodo detto dei limiti, basato sulla precipitazione del solfato di bario mediante una soluzione titolata di ione bario.2. METODO  DI  RIFERIMENTO  2.1. Reattivi  2.1.1. Acido cloridrico in soluzione 2 M.   2.1.2. Cloruro di bario in soluzione di 200 g/l di BaCl2, 2H2O.2.2. Modo di operare  2.2.1. Caso generale   In una provetta da centrifuga da 50 ml introdurre 40 ml di campione da analizzare; aggiungere 2 ml di acido cloridrico 2 M e 2 ml di soluzione di cloruro di bario di 200 g/l; agitare con una bacchetta di vetro; lavare la bacchetta con poca acqua  distillata e lasciare a riposo per 5 minuti. Centrifugare per 5 minuti, poi decantare con precauzione il liquido surnatante.    Lavare quindi il precipitato di solfato di bario procedendo come segue: aggiungere 10 ml di acido cloridrico 2 M, mettere il precipitato in sospensione e centrifugare per 5 minuti. Separare con precauzione il liquido surnatante. Ripetere due volte il  lavaggio del precipitato nelle stesse condizioni con 15 ml di acqua distillata ogni volta.    Travasare quantitativamente lavando con acqua distillata il precipitato in una capsula di platino tarata e sistemarla su un bagnomaria a 100 °C fino a evaporazione a secco. Il precipitato essiccato viene calcinato parecchie volte brevemente su fiamma  fino a ottenimento di un residuo bianco. Lasciar raffreddare in un essiccatore e pesare.    Sia m la massa in milligrammi di solfato di bario ottenuta.2.2.2. Caso particolare: mosti solfitati e vino a elevato tenore di anidride solforosa   Procedere in primo luogo all'eliminazione dell'anidride solforosa.    In una beuta da 500 ml munita di imbuto separatore e di tubo di scarico introdurre 25 ml d'acqua e 1 ml di acido cloridrico (r20 = 1,15   1,18 g/ml). Far bollire questa soluzione per eliminare l'aria e introdurre 100 ml di vino attraverso l'imbuto  separatore, mantenendo l'ebollizione. Continuare l'ebollizione finché il volume del liquido contenuto nella beuta viene ridotto a circa 75 ml e travasarlo quantitativamente, previo raffreddamento, in un matraccio tarato da 100 ml. Portare a volume con  acqua. Procedere al dosaggio dei solfati su un'aliquota di 40 ml, come indicato al punto 2.2.1.  2.3. Espressione dei risultati  2.3.1. Calcoli   Il tenore in solfati, espresso in milligrammi per litro di solfato di potassio, K2SO4 è di:18,67 × m   Il tenore del mosto o del vino in solfati viene espresso in milligrammi per litro di solfato di potassio, senza decimali.   2.3.2. Ripetibilità (r)   Fino a 1 000 mg/l: r = 27 mg/lAttorno a 1 500 mg/l: r = 41 mg/l  2.3.3. Riproducibilità (R)   Fino a 1 000 mg/l: R = 51 mg/lAttorno a 1 500 mg/l: R = 81 mg/l3. SAGGIO  RAPIDO  3.1. Reattivi  3.1.1. Soluzione titolata di cloruro di bario   2,804 g di cloruro di bario, BaCl2, 2H2O e 10 ml di acido cloridrico (r20 = 1,15   1,18 g/ml) vengono sciolti in una quantità d'acqua sufficiente a ottenere 1 l di soluzione, 1 ml di questa soluzione precipita un quantitativo di ioni solfato  equivalente a 2 mg di solfato di potassio.   3.1.2. Acido solforico (r20 = 1,84 g/ml) in soluzione diluita 1/10 (m/v)3.2. Modo di operare   In tre provette porre 10 ml di mosto o di vino; aggiungere al n. 1 : 3,5 ml, al n. 2 : 5 ml e al n. 3 : 10 ml della soluzione di cloruro di bario. Agitare e portare a ebollizione; lasciar riposare 1-2 h. Il liquido di ogni provetta, decantato, viene  filtrato e diviso in due porzioni. In una aggiungere qualche goccia della soluzione diluita di acido solforico, nell'altra aggiungere qualche goccia della soluzione di cloruro di bario. Esaminare ogni provetta e osservare la sua limpidezza o la sua  torbidità. L'interpretazione viene data nella tabella seguente.                     VinoCloruro di barioVino filtrato +acido solforico diluitosoluzione di cloruro di bario1a prova(ml)(ml)torbidolimpido103,5(meno di 0,7 g di K2SO4/l) limpido  torbido (oltre 0,7 g di K2SO4/l)2a prova105torbidolimpido(meno di 1 g di K2SO4/l) limpido  torbido (oltre 1 g di K2SO4/l)3a prova1010torbidolimpido(meno di 2 g di K2SO4/l) limpido  torbido (oltre 2 g di K2SO4/l)    13. ACIDITÀ  TOTALE 1. DEFINIZIONE   L'acidità totale è la somma delle acidità titolabili allorché si porta il pH a 7 per addizione di una soluzione alcalina titolata.    Il biossido di carbonio non è compreso nell'acidità totale.2. PRINCIPIO  DI  METODO   Titolazione potenziometrica o titolazione in presenza di blu di bromotimolo, come indicatore di fine reazione, per confronto con un campione colorato.3. REATTIVI  3.1. Soluzione tampone a pH 7,0:fosfato monopotassico KH2PO4: 107,3 g soluzione M di idrossido di sodio (NaOH): 500 ml acqua q.b. a: 1 000 ml   Le soluzioni tampone reperibili in commercio possono essere utilizzate.   3.2. Soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (NaOH).   3.3. Soluzione di blu di bromotimolo a 4 g/l.      Blu di bromotimolo (C27H28Br2O5S):4 gAlcool neutro a 96 % vol:  200 mlDopo aver solubilizzato aggiungere:Acqua esente da CO2:  200 mlSoluzione M di idrossido di sodioq.b. a colorazione blu-verde (pH = 7):   7,5 mlAcqua q.b. a:1 000 ml4.  APPARECCHIATURA  4.1. Pompa per vuoto ad acqua.   4.2. Beuta da vuoto da 500 ml.   4.3. Potenziometro con scala tarata in unità di pH e relativi elettrodi. L'elettrodo di vetro deve essere conservato in acqua distillata. L'elettrodo al calomelano-cloruro di potassio saturo deve essere conservato in una soluzione satura di cloruro di  potassio. Nella maggior parte dei casi si usa un elettrodo combinato; conservarlo in acqua distillata.   4.4. Recipiente cilindrico da 50 ml per i vini e da 100 ml per i mosti concentrati rettificati.5. MODO DI OPERARE  5.1. Preparazione del campione  5.1.1. Vini   Eliminazione del biossido di carbonio. Porre in una beuta da vuoto 50 ml di vino; agitare e fare contemporaneamente il vuoto mediante la pompa ad acqua. L'agitazione deve durare 1-2 minuti.  5.1.2. Mosti concentrati rettificati   Introdurre 200 g di mosto concentrato rettificato pesato esattamente, in un pallone tarato da 500 ml. Portare a volume con acqua. Omogeneizzare.5.2. Titolazione potenziometrica  5.2.1. Taratura del pHmetro   Si effettua a 20 °C seguendo le istruzioni date per l'apparecchio utilizzato con la soluzione tampone a pH 7 a 20 °C.5.2.2. Modo di operare   In un recipiente cilindrico (4.4) versare una quantità del campione preparato come descritto al punto 5.1 pari a 10 ml nel caso del vino ed a 50 ml nel caso del mosto concentrato rettificato. Aggiungere 10 ml circa di acqua distillata e aggiungere con  la buretta la soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (3.2) sino a portare il pH a 7 a 20 °C. L'addizione della soluzione alcalina deve essere effettuata lentamente sotto costante agitazione. Sia n il numero di ml di NaOH 0,1 M utilizzati.5.3. Titolazione  con indicatore (blu di bromotimolo)  5.3.1. Prova preliminare: fissazione dello standard di colorazione   Versare in un recipiente cilindrico (4.4) 25 ml di acqua distillata bollita, 1 ml di soluzione di blu di bromotimolo (3.3) e una quantità di campione preparato come descritto al punto 5.1 pari a 10 ml nel caso del vino ed a 50 ml nel caso del mosto  concentrato rettificato. Aggiungere la soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (3.2) sino ad ottenere una colorazione blu-verde. Aggiungere 5 ml della soluzione tampone a pH 7 (3.1).5.3.2. Dosaggio   Versare in un recipiente cilindrico (4.4) 30 ml di acqua distillata bollita, 1 ml di soluzione di blu di bromotimolo (3.3), un volume di campione, preparato come indicato al punto 5.1, da 10 ml nel caso del vino e da 50 ml nel caso di mosto concentrato  rettificato. Aggiungere la soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (3.2) sino ad ottenere una colorazione identica a quella ottenuta con il saggio preliminare (5.3.1). Sia n il numero di ml di soluzione di idrossido di sodio 0,1 M versati.6. ESPRESSIONE   DEL  RISULTATI  6.1. Metodo di calcolo  6.1.1. Vini   L'acidità totale, espressa in milliequivalenti per litro, sarà:    A = 10 n,il valore è dato con una cifra decimale.L'acidità toale, espressa in grammi di acido tartarico per litro, sarà:    A2 = 0,075 · A,il valore è dato con una cifra decimale.6.1.2. Mosti concentrati rettificati   - Acidità totale espressa in milliequivalenti per chilogrammo di mosto concentrato rettificato: a = 5 · n - Acidità totale espressa in milliequivalenti per chilogrammo di zuccheri totali:dove P = tenore percentuale (m/m) in zuccheri totali.  Il valore è dato con una cifra decimale.6.2. Ripetibilità (r): per la titolazione con l'indicatore   r = 0,9 meq/lr = 0,07 g di acido tartarico/l6.3. Riproducibilità (R): per la titolazione con l'indicatore (5.3)   Per i vini bianchi e rosati:R = 3,6 meq/lR = 0,3 g di acido tartarico/l   Per i vini rossi:R = 5,1 meq/lR = 0,4 g di acido tartarico/l    14. ACIDITÀ  VOLATILE 1. DEFINIZIONE   L'acidità volatile è costituita dagli acidi appartenenti alla serie acetica che si trovano nel vino allo stato libero o come sali.2. PRINCIPIO  DEL  METODO   Titolazione degli acidi volatili separati dal vino per trascinamento in corrente di vapore d'acqua e rettifica dei vapori.    Il vino viene prima liberato dal biossido di carbonio.    In queste condizioni occorre sottrarre dall'acidità del distillato l'acidità del biossido di zolfo libero e combinato che è stato distillato.    Occorre anche detrarre l'acidità dovuta all'acido sorbico eventualmente aggiunto al vino.    Nota: L'acido salicilico utilizzato in taluni paesi prima dell'analisi per stabilizzare i vini, si ritrova in parte nel distillato. È quindi necessario dosarlo e detrarlo dall'acidità volatile. Il metodo di dosaggio è riportato nel punto 7 al presente  capitolo.3. REATTIVI  3.1. Acido tartarico cristallizzato (C4H6O6)  3.2. Soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (NaOH)  3.3. Soluzione di fenolftaleina all'1 % in alcol neutro al 96 % vol  3.4. Acido cloridrico (r20 = 1,18   1,19 g/ml) diluito ¼ (v/v)  3.5. Soluzione 0,005 M di iodio (I2)  3.6. Ioduro di potassiocristallizzato (KI)  3.7. Salda di amido a 5 g/lDisperdere 5 g di amido in circa 500 ml di acqua. Portare all'ebollizione agitando e mantenerla per 10 minuti; aggiungere 200 g di cloruro di sodio. Dopo aver lasciato raffreddare portare a 1 l.   3.8. Soluzione satura di tetraborato di sodio (Na2B4O7, 10 H2O), cioè circa 55 g/l a 20 °C.4. APPARECCHIATURA  4.1. Apparecchio di distillazione in corrente di vapore di acqua composto da:1. un generatore di vapore d'acqua; il vapore d'acqua prodotto deve essere esente da biossido di carbonio;2. un gorgogliatore;3. una colonna di rettifica;4. un  refrigerante.L'apparecchio deve soddisfare alle condizioni definite dai seguenti tre saggi:a) Versare nel gorgogliatore 20 ml di acqua bollita; raccogliere 250 ml di distillato ed addizionarvi 0,1 ml di soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (3.2) e 2  gocce della soluzione di fenolftaleina (3.3); la colorazione rosa deve mantenersi stabile per almeno 10 secondi (vapore d'acqua esente da biossido di carbonio).b) Versare nel gorgogliatore 20 ml di una soluzione 0,1 M di acido acetico. Raccogliere 250  ml di distillato. Titolare con la soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (3.2). Il volume impiegato deve essere almeno pari a 19,9 ml (acido acetico trascinato D 99,5 %).c) Versare nel gorgogliatore 20 ml di una soluzione M di acido lattico. Raccogliere  250 ml di distillato e titolarne l'acidità con la soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (3.2).Il volume impiegato deve essere inferiore o uguale a 1,0 ml (acido lattico distillato d 0,5 %).Gli apparecchi o le tecniche che soddisfano a questi saggi sono  da considerare apparecchi o tecniche ufficiali internazionali.  4.2. Pompa per vuoto a caduta d'acqua.   4.3. Beuta da vuoto.5. MODO  DI  OPERARE  5.1. Preparazione del campione: eliminazione del biossido di carbonio.    Versare circa 50 ml di vino in una beuta da vuoto; agitare e creare contemporaneamente il vuoto per mezzo della pompa per vuoto a caduta d'acqua. L'agitazione deve durare 1 o 2 minuti.5.2. Trascinamento in corrente di vapore d'acqua   Versare nel gorgogliatore 20 ml di vino privato, come descritto al punto 5.1, del biossido di carbonio. Aggiungere circa 0,5 g di acido tartarico (3.1). Raccogliere almeno 250 ml di distillato.5.3. Titolazione   Titolare con la soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (3.2) in presenza di due gocce di soluzione di fenolftaleina (3.3), sia n il volume in ml impiegato.    Aggiungere 4 gocce di acido cloridrico diluito ¼ (3.4), 2 ml di salda di amido (3.7) ed alcuni cristalli di ioduro di potassio (3.6). Titolare il biossido di zolfo libero con la soluzione 0,005 M di iodio (3.5). Sia n2 il volume in ml impiegato.    Aggiungere la soluzione satura di tetraborato di sodio (3.8) sino al ritorno del colore rosa. Titolare il biossido di zolfo combinato con la soluzione 0,005 M di iodio (3.5). Sia n" il volume in ml impiegato.6. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI  6.1. Procedimento di calcolo   L'acidità volatile espressa in milliequivalenti per litro, con una cifra decimale, sarà:A = 5 (n   0,1 n2   0,05 n")   L'acidità volatile espressa in grammi di acido acetico per litro con due cifre decimali, sarà:0,300 (n   0,1 n2   0,05 n")6.2. Ripetibilità (r)   r = 0,7 meq/lr = 0,04 g di acido acetico/l6.3. Riproducibilità (R)   R = 1,3 meq/lR = 0,08 g di acido acetico/l 6.4. Vini addizionati di acido sorbico   Poiché con i primi 250 ml di distillato viene trascinato il 96 % dell'acido sorbico, occorre detrarre la sua acidità dall'acidità volatile tenendo conto che 100 mg di acido sorbico, corrispondono ad una acidità di 0,89 milliequivalenti o di 0,053 g di  acido acetico e conoscendo il tenore di acido sorbico (mg/l) determinato a parte.7. DETERMINAZIONE  DELL'ACIDO  SALICILICO  TRASCINATO  NEL  DISTILLATO  DELL'ACIDITÀ  VOLATILE  7.1. Principio   Una volta determinata l'acidità volatile ed effettuata la correzione per il biossido di zolfo, la presenza di acido salicilico è caratterizzata, dopo acidificazione, dalla colorazione violetta che si forma per addizione di un sale di ferro III.    La determinazione dell'acido salicilico trascinato nel distillato con l'acidità volatile, è effettuata su un secondo distillato avente lo stesso volume di quello su cui è stato effettuato il dosaggio dell'acidità volatile. In tale distillato, si  determina l'acido salicilico con un metodo colorimetrico per confronto. Lo si detrae quindi dall'acidità del distillato.7.2. Reattivi  7.2.1. Acido cloridrico (HCl) (r20 = 1,18   1,19 g/ml)  7.2.2. Tiosolfato di sodio (Na2S2O3; 5 H2O) in soluzione 0,1 M.   7.2.3. Soluzione di solfato ferrico ammonico [Fe2(SO4)3 · (NH4)2 SO4 · 24 H2O] al 10 % (m/v).   7.2.4. Soluzione di salicilato di sodio 0,01 MSoluzione contenente 1,60 g/l di salicilato di sodio (Na C7 H5 O3).7.3. Modo di operare  7.3.1. Caratterizzazione dell'acido salicilico nel distillato dell'acidità volatile   Subito dopo avere determinato l'acidità volatile ed averla corretta per il biossido di zolfo libero e combinato, aggiungere nella beuta 0,5 ml di acido cloridrico (7.2.1), 3 ml della soluzione 0,1 M di tiosolfato di sodio (7.2.2) ed 1 ml della  soluzione di solfato ferrico ammonico (7.2.3).    In presenza di acido salicilico si ha la formazione di una colorazione violetta.7.3.2. Dosaggio dell'acido salicilico   Nella beuta conica di cui al punto precedente segnare con un trattino di riferimento il volume del distillato. Svuotare e quindi lavare la beuta.    Sottoporre a distillazione in corrente di vapori d'acqua una nuova presa di campione da 20 ml di vino e raccogliere il distillato nella beuta riempiendola sino al trattino di riferimento. Aggiungere 0,3 ml di acido cloridrico (7.2.1) e 1 ml della  soluzione di solfato ferrico ammonico (7.2.3). Il contenuto della beuta assume una colorazione violetta.    Versare, in una beuta identica a quella recante la tacca di riferimento, acqua distillata sino a raggiungere lo stesso livello del distillato. Aggiungere 0,3 ml di acido cloridrico (7.2.1) e 1 ml di soluzione di solfato ferrico ammonico (7.2.3).  Aggiungere con una buretta la soluzione di salicilato di sodio 0,01 M (7.2.4) sino ad ottenere una colorazione violetta della stessa intensità di quella della beuta contenente il distillato di vino.    Sia n23 il numero di millilitri utilizzati.  7.4. Correzione dell'acidità volatile   Detrarre 0,1 · n23 ml dal volume di n ml di soluzione di idrossido di sodio 0,1 M impiegato per titolare l'acidità del distillato in sede di dosaggio dell'ecidità volatile.    15. ACIDITÀ  FISSA 1. PRINCIPIO   L'acidità fissa è determinata per differenza tra l'acidità totale e l'acidità volatile.2. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI   L'acidità fissa si esprime:- in milliequivalenti per litro,- in grammi di acido tartarico per litro.         16. ACIDO  TARTARICO 1. PRINCIPIO  DEI  METODI  1.1. Metodo di riferimento   L'acido tartarico, precipitato sotto forma di racemato di calcio, viene dosato per via ponderale. Tale dosaggio può essere completato da un dosaggio volumetrico di confronto. Le condizioni di precipitazione (pH, volume totale impiegato, concentrazioni  degli ioni precipitanti) sono tali che il racemato di calcio precipita completamente, mentre il tartrato di calcio levogiro D( ) rimane in soluzione.    Il vino, quando è stato addizionato di acido metatartarico che rende incompleta la precipitazione del racemato di calcio, dovrà essere previamente idrolizzato.1.2. Metodo usuale   L'acido tartarico, isolato mediante una colonna scambiatrice di anioni, è dosato colorimetricamente nell'eluato grazie alla colorazione rossa che dà con l'acido vanadico. Questo eluato contiene anche gli acidi lattico e malico, che non interferiscono  nell'analisi.2. METODO  DI  RIFERIMENTO  2.1. Metodo ponderale  2.1.1. Reattivi  2.1.1.1. Soluzione di acetato di calcio, contenente 10 g/l di calcio:  Carbonato di calcio (CaCO3):  25 gAcido acetico glaciale (CH3COOH) (r20 = 1,05 g/ml):  40 mlAcqua q.b. a.:1 000 l  2.1.1.2. Racemato di calcio cristallizzato: Ca C4O6H4: 4H2OIn un becher da 400 ml introdurre 20 ml di una soluzione di acido L(+) tartarico contenente 5 g/l, 20 ml di una soluzione di D( ) tartrato di ammonio a 6, 126 g/l e 6 ml della soluzione di  acetato di calcio contenente 10 g/l di calcio (2.1.1.1).Lasciar precipitare per due ore. Raccogliere il precipitato su un crogiuolo filtrante di porosità n. 4 e lavarlo in tre riprese con 30 ml circa di acqua distillata. Essiccare in stufa a 70 C fino a  peso costante. Con le quantità di reattivo adoperate si ottengono circa 340 mg di racemato di calcio cristallizzato.    Conservare in recipiente chiuso.    2.1.1.3. Soluzione precipitante (pH 4,75):- L'acido D( )tartarico: 122 mg- idrossido di ammonio (r20 = 0,97 g/ml)  diluita al 25% (v/v):  0,3 ml- soluzione di acetato di calcio contenente 10 g/l di calcio:  8,8 ml- acqua q.b. a:1 000 ml   Sciogliere l'acido D( ) tartarico e aggiungere l'idrossido di ammonio; portare il volume a 900 ml con acqua; aggiungere 8,8 ml di soluzione di acetato di calcio (2.1.1.1), agitare, aggiustare il pH a 4,75 con l'acido acetico. Portare a 1 litro.    Poiché il racemato di calcio è leggermente solubile in questo liquido, è opportuno aggiungere 5 mg/l di racemato di calcio, agitare per 12 ore e filtrare.2.1.2. Modo di operare  2.1.2.1. Vini non addizionati di acido metatartarico   In un becher da 600 ml, porre 500 ml di soluzione precipitante e 10 ml di vino. Mescolare e favorire la precipitazione sfregando le pareti del becher con l'estremità di una bacchetta di vetro. Lasciar precipitare per 12 ore (una notte).    Filtrare su crogiuolo filtrante di porositàn. 4, tarato e collocato su una beuta a vuoto pulita, facendo in modo che il liquido porti con sé il precipitato. Risciacquare col filtrato il recipiente di precipitazione, in maniera da raccogliere le ultime  particelle di precipitato.    Essiccare in stufa a 70 C fino a peso costante. Pesare: sia p il peso di racemato di calcio CaC4O6H4 cristallizzato con 4 molecole d'acqua.2.1.2.2. Vini addizionati di acido metatartarico   In caso di presenza effettiva o sospetta di acido metatartarico nel vino, procedere all'idrolisi di tale acido nelle condizioni seguenti:    In una beuta da 50 ml versare 10 ml di vino e 0,4 ml di acido acetico glaciale (CH3COOH, r20 = 1,05 g/ml). Chiudere la beuta con un tappo fornito di paraspruzzi e far bollire per 30 minuti. Dopo raffreddamento, travasare in un becher il liquido  contenuto nella beuta; risciacquare per due volte la beuta con 5 ml d'acqua e proseguire come indicato più sopra.    Nel calcolo finale, l'acido metatartarico viene computato come acido tartarico.2.1.3. Espressioni dei risultati   Una molecola di racemato di calcio corrisponde a mezza molecola di acido L(+)tartarico del vino.    La quantità di acido tartarico per litro di vino espressa in milliequivalenti con una cifra decimale, è uguale a: 384,5 p.    La quantità di acido tartarico per litro di vino, espressa con una cifra decimale in grammi di acido tartarico, è uguale a: 28,84p.    La quantità di acido tartarico per litro di vino, espressa con una cifra decimale in grammi di tartrato acido di potassio, è uguale a: 36,15 p.  2.2. Dosaggio volumetrico di confronto  2.2.1. Reattivi  2.2.1.1. Acido cloridrico (HCI) (r20 = 1,18 - 1,19 g/ml) diluito 1/5 (v/v)  2.2.1.2. Soluzione di EDTA 0,05 M:EDTA (sale disodico biidrato dell'acido etilendiamminotetracetico (C10H14N2O8Na2; 2H2O): 18,61 gAcqua distillata q.b. a:1 000 ml  2.2.1.3. Soluzione d'idrossido di sodio al 40 % (p/v):Idrossido di sodio (NaOH): 40 gAcqua distillata q.b. a: 100 ml2.2.1.4. Indicatore complessometrico all'acido calconcarbonico 1 % (m/m):Acido calconcarbonico o acido 2-idrossi-4-sulfo-1-naftilazo-3-naftoico (C21H14H2O7S, 3H2O): 1 gSolfato di sodio anidro (Na2SO4):100 g2.2.2. Modo di operare   Dopo pesata, rimettere il crogiuolo contenente il precipitato di racemato di calcio sulla beuta da vuoto e sciogliere il precipitato con 10 ml di acido cloridrico diluito (2.2.1.1). Lavare il crogiuolo filtrante con 50 ml di acqua distillata.    Aggiungere 5 ml di soluzione di idrossido di sodio al 40 % (2.2.1.3) e 30 mg circa di indicatore (2.2.1.4). Titolare con l'EDTA 0,05 M (2.2.1.2). Sia n il numero di ml impiegati.2.2.3. Espressione dei risultati   La quantità di acido tartarico per litro di vino espressa con una cifra decimale in milliequivalenti, è uguale a: 5 n.    La quantità di acido tartarico per litro di vino espressa con una cifra decimale, in grammi di acido tartarico, è uguale a: 0,375 n.    La quantità di acido tartarico per litro di vino espresso con una cifra decimale, in grammi di tartrato acido di potassio, è uguale a: 0,470 n.3. METODO  USUALE  3.1. Reattivi  3.1.1. Per il trattamento preliminare del vino  3.1.1.1. Acido acetico (CH3COOHr20 = 1,05 g/ml) diluito al 30 % (v/v).   3.1.1.2. Scambiatore di anioni di forte basicità (per esempio scambiatore di anioni III Merck 20-50 mesh) sotto forma di acetato. Preparare una sospensione dello scambiatore (100 g circa) in 200 ml di acido acetico al 30 % (3.1.1.1).     Lasciare in contatto per almeno 24 ore prima dell'utilizzazione. Conservare lo scambiatore in acido acetico al 30 % per dosaggi ulteriori.   3.1.1.3. Acido acetico CH3COOH (r20 = 1,05 g/ml) diluito allo 0,5 % (v/v).   3.1.1.4. Soluzione di solfato di sodio a 7,1 g per 100 ml.    Sciogliere 71 g di solfato di sodio (Na2SO4) anidro in acqua distillata e portare a 1 000 ml con acqua distillata.3.1.2. Per il dosaggio dell'acido tartarico  3.1.2.1. Soluzione di acetato di sodio (CH3COONa) al 27 % (m/v).    Sciogliere 270 g di acetato di sodio anidro, CH3COONa in acqua distillata e portare a 1 000 ml.   3.1.2.2. Reattivo vanadico:    Sciogliere 10 g di metavanadato di ammonio, (NH4VO3) in 150 ml di soluzione di idrossido di sodio 1 M (3.1.2.10). Travasare questa soluzione in un matraccio tarato da 500 ml, aggiungere 200 ml della soluzione di acetato di sodio al 27 % (3.1.2.1).  Portare a 500 ml con acqua distillata.   3.1.2.3. Soluzione di H2SO4 (1 M).   3.1.2.4. Soluzione di H2SO4 (0,5 M).   3.1.2.5. Soluzione di H2SO4 (0,05 M).   3.1.2.6. Soluzione di acido periodico (0,05 M).  In un matraccio tarato da 1 000 ml, introdurre 10,696 g di periodato di sodio, NaIO4, 50 ml di acido solforico 0,5 M (3.1.2.4) e portare a 1 000 ml con acqua distillata.   3.1.2.7. Soluzione di glicerolo al 10 % (m/v).    In un matraccio tarato da 100 ml, porre 10 g di glicerolo C3H8O3; portare a 100 ml con acqua distillata.   3.1.2.8. Soluzione di solfato di sodio a 7,1 g per 100 ml (vedi 3.1.1.4).   3.1.2.9. Soluzione di acido tartarico a 1 g/l.    Introdurre, in un matraccio tarato da 500 ml, 0,5 g di acido tartarico, 6,66 ml di soluzione di idrossido di sodio 1 M (3.1.2.10) e portare a 500 ml con la soluzione di solfato di sodio al 7,1 % (3.1.1.4).   3.1.2.10. Soluzione di idrossido di sodio, NaOH, 1 M.3.2. Apparecchiatura  3.2.1. Colonne di vetro lungo circa 300 mm e con diametro interno di 10-11 mm, munita di un rubinetto.   3.2.2. Spettrofotometro per misure di assorbanza a 490 nm corredato di celle a cammino ottico di 10 mm.3.3. Modo di operare  3.3.1. Preparazione della colonna scambiatrice di ioni   Porre nella colonna di vetro sopra il rubinetto (3.2.1), un tampone di lana di vetro e impregnarlo di acqua distillata. Versare nella colonna 10 ml della sospensione di scambia tore di ioni sotto forma di acetato (3.1.1.2). Lasciare decantare. Porre un  tampone di lana di vetro sulla superficie dello scambiatore depositato (in modo da evitare che durante gli ulteriori lavaggi lo scambiatore sia rimesso in sospensione).    Lo scambiatore deve essere usato una sola volta.3.3.2. Isolamento degli acidi organici   Con il rubinetto aperto, lasciare defluire la soluzione di acido acetico sino a circa 2-3 mm al di sopra del tampone di lana di vetro situato sopra lo scambiatore.    Aggiungere 10 ml di soluzione di acido acetico allo 0,5 % (3.1.1.3), lasciando quindi defluire il liquido sino allo stesso livello della precedente operazione. Ripetere il lavaggio altre 4 volte.    Dopo l'ultimo lavaggio, tenendo chiuso il rubinetto, versare sullo scambiatore 10 ml di vino o di mosto. Lasciare defluire il vino goccia a goccia (flusso medio di 1 goccia al secondo) e sospendere il deflusso immediatamente al di sopra dello  scambiatore. Aggiungere nuovamente nella colonna 10 ml di soluzione di acido acetico allo 0,5 % (3.1.1.3), lasciare defluire alla stessa velocità della precedente operazione e lavare ancora 7 volte utilizzando ogni volta 10 ml di acqua. All'ultimo  lavaggio, chiudere il rubinetto non appena il livello del liquido si trova poco al di sopra del tampone di lana di vetro superiore.    Eluire gli acidi fissati sullo scambiatore mediante la soluzione di solfato di sodio al 7,1 % (3.1.1.4); raccogliere l'eluato in un matraccio tarato da 100 ml riempiendolo sino al segno di riferimento.3.3.3. Dosaggio dell'acido tartarico  3.3.3.1. Vini non addizionati di acido metatartarico.    In due beute, a e b, introdurre 20 ml di eluato.    La beuta a serve per la determinazione mentre la beuta b nella quale l'acido tartarico viene distrutto per azione dell'acido periodico, serve per la prova in bianco.   Introdurre nella beuta a:- 2 ml di H2SO4 M (3.1.2.3),- 5 ml di H2SO4 0,05 M (3.1.2.5),- 1 ml di glicerolo al 10 % (3.1.2.7);    Introdurre nella beuta b:- 2 ml di H2SO4 M (3.1.2.3),- 5 ml di soluzione di acido periodico 0,05 M (3.1.2.6).    Aspettare 15 minuti; aggiungere: 1 ml di soluzione di glicerolo al 10 % (3.1.2.7) per distruggere l'eccesso di acido periodico.    Aspettare 2 minuti.    Versare quindi agitando, dapprima nella beuta b e subito dopo nella beuta a,5 ml di reattivo vanadico (3.1.2.2). Fare scattare immediatamente un cronometro e versare il contenuto delle beute a e bnelle celle dello spettrofotometro. Dopo 90 secondi  misurare l'assorbanza a 490 nm del liquido proveniente dalla beuta a(dosaggio) in confronto al bianco (beuta b).    Se l'eluato è troppo ricco in acido tartarico e l'assorbanza è quindi troppo elevata, diluirlo con la soluzione di solfato di sodio al 7,1 % e procedere alla misura della soluzione diluita.  3.3.3.2. Vini addizionati di acido metatartarico   Nel caso di un vino addizionato di acido metatartarico o che si sospetti tale, procedere all'idrolisi di tale acido come è indicato per il metodo di riferimento.    Dopo raffreddamento, versare il contenuto della beuta e le acque di lavaggio (2 volte 5 ml) in testa alla colonna dello scambiatore. Continuare come sopra descritto.    Nel risultato del dosaggio l'acido metatartarico è espresso come acido tartarico.3.3.4. Determinazione della curva di taratura   Versare 10, 20, 30, 40 e 50 ml della soluzione di acido tartarico a 1 g/l (3.1.2.9) nei palloni tarati da 100 ml e portare a volume con la soluzione di solfato di sodio al 7,1 %/100 ml (3.1.1.4). Le concentrazioni di queste soluzioni corrispondono ad  eluati di vini contenenti 1, 2, 3, 4 e 5 g di acido tartarico per litro.    Versare, in 2 beute a e b, 20 ml di queste soluzioni e continuare come descritto sopra per l'eluato di vino.    La rappresentazione grafica delle assorbanze di queste soluzioni in funzione del tenore in acido tartarico è una retta che si incurva leggermente in prossimità dello zero. Se occorre, disegnare con maggiore precisione questa parte della curva misurando  soluzioni a titolo esattamente noto inferiori a 1,0 g/l.3.3.5. Espressione dei risultati   Riportare l'assorbanza misurata per l'eluato sulla curva di taratura per ottenere il tenore in acido tartarico del vino espresso in grammi per litro con una cifra decimale.     17. ACIDO  CITRICO 1. PRINCIPIO  DEI  METODO   L'acido citrico viene trasformato in ossalacetato e acetato in una reazione catalizzata dalla citrato-liasi (CL):citrato  CL  ossalacetato + acetato   In presenza della malato-deidrogenasi (MDH) e della lattato-deidrogenasi (LDH), l'ossalacetato e il suo derivato di decarbossilazione, il piruvato, vengono ridotti dal nicotinammide - adenina-dinucleotide ridotto (NADH) a L-malato ed a  L-lattado:Ossalacetato + NADH + H+  MDH  L-malato + NAD+Piruvato + NADH + H+  LDH  L-lattato + NAD+   In queste reazioni, la quantità di NADH ossidato a NAD+ è proporzionale al citrato presente. L'ossidazione dell'NADH viene misurata dalla diminuzione della sua assorbanza alla lunghezza d'onda di 340 nm.2. REATTIVI  2.1. Tampone a pH 7,8 (glicilglicina 0,51 M; pH 7,8 Zn2+: 0,6 · 10 3 M):sciogliere in circa 70 ml di acqua bidistillata 7,13 g di glicilglicina;    portare il pH a 7,8 con circa 13 ml di soluzione di idrossido di sodio 5 M; addizionare 10 ml di soluzione di cloruro di zinco ZnCl2 80 mg/100 ml; portare a 100 ml con acqua bidistillata.   La soluzione rimane stabile a + 4 C per almeno 4 settimane.   2.2. Soluzione di nicotinammide-adenina-dinucleotide ridotto (NADH), circa 6 · 10 3 M, sciogliere 30 mg di NADH e 60 mg di NaHCO3 in 6 ml di acqua bidistillata.   2.3. Soluzione di malato deidrogenasi/lattato deidrogenasi (MDH/LDH) (0,5 mg MDH/ml; 2,5 mg/ml): miscelare 0,1 ml di MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml di soluzione di solfato di ammonio (3,2 M) l 0,5 ml di LDH (5 mg/ml). A 4 C questa sospensione si mantiene  stabile per almeno un anno.   2.4. Citrato-liasi CL (5 mg di proteina/ml): sciogliere in un ml di acqua ghiacciata 168 mg di liofilizzato. Alla temperatura di 4 C la soluzione si mantiene stabile per almeno una settimana e se congelata per almeno 4 settimane.    Prima del dosaggio si raccomanda di procedere alla verifica dell'attività dell'enzima.   2.5. Polivinilpolipirrolidone (PVPP)   Nota: L'insieme dei reattivi necessari per la determinazione si trova pronto in commercio.3. APPARECCHIATURA  3.1. Spettrofotometro in grado di effettuare misurazioni a 340 nm, massimo di assorbimento dell'NADH.    In alternativa si può usare, il fotometro a spettro discontinuo con lunghezza d'onda a 334 nm o a 365 nm. Poiché si tratta di misure assolute di assorbanza (senza curva di taratura ma con riferimento al coefficiente di estinzione del NADH), occorre  controllare le scale delle lunghezze d'onda e delle assorbanze dell'apparecchio.   3.2. Celle di vetro con cammino ottico di 1 cm o celle monouso.   3.3. Micropipette per il prelievo di volumi compresi tra 0,02 e 2 ml.  4. PREPARAZIONE  DEL  CAMPIONE   Il dosaggio del citrato si effettua in genere direttamente sul vino senza preventiva decolorazione o diluizione, a condizione che il tenore in acido citrico sia inferiore a 400 mg/l. In caso contrario diluire il vino in modo che la concentrazione in  citrato sia compresa tra 20 e 400 mg/l (quantità di citrato nella presa di campione compresa fra 5 µg e 80 µg).    Nel caso del vino rosso ricco di composti fenolici, si raccomanda di trattarlo preliminarmente con la PVPP:    mettere in sospensione nell'acqua 0,2 gr circa di PVPP, lasciare riposare per 15 minuti. Filtrare su filtro a pieghe.    Addizionare a 10 ml di vino versato in una beuta conica da 50 ml, il PVPP umido prelevato dal filtro con la spatola. Agitare per 2-3 minuti. Filtrare.5. MODO  DI  OPERARE   Regolato lo spettrofotometro sulla lunghezza d'onda di 340 nm, effettuare le misure di assorbanza in celle da 1 cm dopo aver aggiustato l'apparecchio allo zero di assorbanza contro aria (senza la cella sul percorso ottico).    Introdurre nelle celle da 1 cm:     bianco campionesoluzione 2.1 1,00 ml 1,00 mlsoluzione 2.2 0,10 ml 0,10 mlcampione -- 0,20 mlacqua bidistillata 2,00 ml 1,80 mlsoluzione 2.3 0,02 ml 0,02 ml  Mescolare; dopo circa 5 minuti leggere le assorbanze della soluzione del bianco e di quella del campione (A1).    Aggiungere:soluzione 2.4 0,02 ml 0,02 ml   Mescolare; attendere che la reazione abbia termine (circa 5 minuti) e leggere le assorbanze della soluzione del bianco e del campione (A2).    Determinare le differenze di assorbanza (A1   A2) del bianco e del campione.    Sottrarre la differenza delle assorbanze del bianco dalla differenza delle assorbanze del campione: DA = DAC   DAB   Nota: il tempo necessario per l'azione degli enzimi può variare da un lotto all'altro; qui viene dato soltanto a titolo indicativo. Se ne raccomanda la determinazione per ciascun lotto.6. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI   Il tenore in acido citrico è dato in mg per litro (mg/l) senza cifre decimali.6.1. Metodo di calcolo   La concentrazione in milligrammi per litro è data dalla seguente formula generale: dove:V = volume in ml della soluzione impiegata per la prova (in questo caso 3,14 ml)v = volume del campione in ml (in questo caso 0,2 ml)PM = peso molecolare della sostanza da dosare (in questo caso acido citrico anidro = 192,1)d = cammino ottico della  cella in cm (in questo caso 1 cm)e = coefficiente di assorbanza dell'NADH a 340 nm,e = 6,3 mmole 1 · l · cm 1.    Si ottiene:C = 479 · DA   Se per preparare il campione è stata effettuata una diluizione, moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione.    Nota:a 334 nm : C = 488 · DA (e = 6,2 mmole 1 · l · cm 1)a 365 nm : C = 887 · DA (e = 3,4 mmole 1 · l · cm 1)6.2. Ripetibilità (r)   Tenore in acido citrico inferiore a 400 mg/l: r = 14 mg/lTenore in acido citrico superiore a 400 mg/l: r = 28 mg/l6.3. Riproducibilità (R)   Tenore in acido citrico inferiore a 400 mg/l: R = 39 mg/lTenore in acido citrico superiore a 400 mg/l: R = 65 mg/l.      18. ACIDO  LATTICO 1. PRINCIPIO  DEI  METODO  1.1. Metodo di riferimento   L'acido lattico totale (L-lattato e D-lattato) viene ossidato, in presenza di nicotinammide-adenina-dinucleotide (NAD), a piruvato mediante una reazione catalizzata dalla L-lattato deidrogenasi (L-LDH) e dalla D-lattato deidrogenasi (D-LDH).    L'equilibrio della reazione è spostato verso il lattato. L'eliminazione del piruvato dal mezzo di reazione sposta l'equilibrio della reazione nel verso della formazione di piruvato. In presenza di L-glutammato, il piruvato è trasformato in L-alanina  con una reazione catalizzata dal glutammato-piruvato-transaminasi (GPT)(1) L-lattato + NAD+  piruvato + NADH + H+(2) D-lattato + NAD+  piruvato + NADH + H+(3) Piruvato + L-glutammato  L-alanina + a-chetoglutarato   La formazione di NADH, misurata dall'aumento di assorbanza alla lunghezza d'onda di 340 nm, è proporzionale alla quantità di lattato presente.    Nota:L'acido L-lattico può essere determinato singolarmente mediante le reazioni (1) e (3).    L'acido D-lattico può essere determinato singolarmente mediante le reazioni (2) e (3).1.2. Metodo usuale   L'acido lattico, separato su colonna di resina scambiatrice di anioni viene ossidato a etanale e dosato per colorimetria dopo reazione con nitroprussiato di sodio e piperidina.2. METODO  DI  RIFERIMENTO  2.1. Reattivi  2.1.1. Soluzione tampone a pH 10 (glicilglicina a 0,6 mole/l; L-glutammato a 0,1 mole/l).    Sciogliere in circa 50 ml di acqua bidistillata 4,75 g di glicilglicina, e 0,88 g di acido L-glutammico; portare a pH 10 con alcuni ml di soluzione di idrossido di sodio a 10 M e portare a 60 ml con acqua bidistillata.    Alla temperatura di 4 °C la soluzione si mantiene stabile per almeno 12 settimane.   2.1.2. Soluzione di nicotinammide-adenina-dinucleotide (NAD) a circa 40 · 10 3 M; sciogliere in 30 ml di acqua bidistillata 900 mg di NAD. Alla temperatura di 4 °C la soluzione si mantiene stabile per almeno 4 settimane.   2.1.3. Sospensione di glutammato-piruvato-transaminasi (GPT) a 20 mg/ml. Alla temperatura di 4 °C la sospensione si mantiene stabile per almeno 1 anno.   2.1.4. Sospensione di L-lattato-deidrogenasi (L-LDH) a 5 mg/ml. Alla temperatura di 4 °C la sospensione si mantiene stabile per almeno 1 anno.   2.1.5. Sospensione di D-lattato-deidrogenasi (D-LDH) a 5 mg/ml. Alla temperatura di 4 °C la sospensione si mantiene stabile per almeno 1 anno.    Prima del dosaggio si raccomanda di procedere alla verifica dell'attività dell'enzima.     Nota: Il complesso dei reattivi necessari è reperibile in commercio.2.2. Apparecchiatura  2.2.1. Spettrofotometro in grado di effettuare misurazioni a 340 nm, e massimo di assorbimento dell'NADH.    In alternativa può essere impiegato un fotometro a spettro discontinuo con lunghezza d'onda a 334 nm o a 365 nm.    Poiché si tratta di misurazioni assolute di assorbanza (senza curva di taratura, ma con riferimento al coefficiente di estinzione del NADH), occorre controllare le scale delle lunghezze d'onda e delle assorbanze dell'apparecchio.   2.2.2. Celle di vetro con cammino ottico da 1 cm o celle monouso.   2.2.3. Micropipette per il prelievo di volumi compresi tra 0,02 e 2 ml.2.3. Preparazione del campione   Evitare di toccare con le dita la parte di vetreria che viene a contatto con il mezzo di reazione in quanto ciò potrebbe apportare acido L-lattico che falserebbe il risultato.    Se la concentrazione in acido lattico è inferiore a 100 mg/l, il dosaggio del lattato si effettua in genere direttamente sul vino senza decolorazione preliminare e senza diluizione. Se la concentrazione in acido lattico è compresa tra:100 mg/l e 1 g/l,  diluire 1B10 con acqua bidistillata,1 g/l e 2,5 g/l, diluire 1B25 con acqua bidistillata,2,5 g/l e 5 g/l, diluire 1B50 con acqua bidistillata.2.4. Modo di operare  2.4.1.Dosaggio dell'acido lattico totale   Prima di procedere al dosaggio la soluzione tampone deve essere portata a 20-25 °C.    Regolato lo spettrofotometro sulla lunghezza d'onda di 340 nm, effettuare le misure di assorbanza nelle celle da 1 cm, aggiustando l'apparecchio allo zero di assorbanza contro aria (togliendo la cella dal percorso ottico) o contro acqua.    Introdurre nelle celle da 1 cm:     bianco campionesoluzione 2.2.1 1,00 ml 1,00 mlsoluzione 2.1.2 0,20 ml 0,20 mlacqua bidistillata 1,00 ml 0,80 mlsospensione 2.1.3 0,02 ml 0,02 mlcampione -- 0,20 ml   Mescolare mediante una bacchetta di vetro o di materiale sintetico provvista di una estremità appiattita; dopo circa 5 minuti misurare le assorbanze delle soluzioni del bianco e del campione (A1).    Aggiungere 0,02 ml di soluzione 2.1.4 e 0,05 ml di soluzione 2.1.5, omogeneizzare, attendere la fine della reazione circa 30 minuti misurare le assorbanze delle soluzioni del bianco e del campione (A2).    Determinare le differenze di assorbanza (A2   A1) del bianco e del campione.     Detrarre la differenza di assorbanza del bianco dalla differenza di assorbanza del campione:    DA = DAC   DAB2.4.2. Dosaggio dell'acido L-lattico e dell'acido D-lattico   Il dosaggio dell'acido L-lattico e D-lattico può essere realizzato singolarmente applicando il modo di operare indicato per l'acido lattico totale, ma operando come segue una volta determinato A1:    Aggiungere 0,02 ml di soluzione 2.1.4, omogeneizzare, aspettare la fine della reazione (circa 20 minuti) e misurare le assorbanze delle soluzioni del bianco e del campione (A2).    Aggiungere 0,05 ml di soluzione 2.1.5, omogeneizzare, attendere che la reazione abbia termine (30 minuti circa) e misurare le assorbanze delle soluzioni del bianco e del campione (A3).    Determinare le differenze di assorbanze (A2   A1) per l'acido L-lattico e (A3   A2) per l'acido D-lattico del bianco e del campione.    Detrarre la differenza di assorbanza del bianco dalla differenza di assorbanze del campione:    DA = DAC   DAB   Nota: Il tempo necessario per l'azione degli enzimi può variare da un lotto all'altro. Qui viene riportato soltanto a titolo indicativo. Se ne raccomanda la determinazione per ciascun lotto. Quando si dosa soltanto l'acido L-lattico, il tempo di  incubazione dopo l'addizione della L-lattato deidrogenasi può essere ridotto a 10 minuti.2.5. Espressione dei risultati   La concentrazione in acido lattico è espressa in grammi per litro (g/l) con una cifra decimale.2.5.1. Procedimento di calcolo   La concentrazione in grammi per litro si calcola mediante la formula generale:V = volume in ml della soluzione impiegata per la prova (V = 2,24 ml per l'acido L-lattico, V = 2,29 ml per l'acido D-lattico e per l'acido lattico totale)v = volume del  campione in ml (in questo caso 0,2 ml)PM = peso molecolare della sostanza da dosare (in questo caso acido DL lattico = 90,08)d = cammino ottico della cella in cm (in questo caso 1 cm)e = coefficiente di assorbanza dell'NADH a 340 nm,  e = 6,3 (mmole 1 · l · cm 1).2.5.1.1. Acido lattico totale e acido D-lattico  C = 0,164 · DA   Se per la preparazione del campione è stata effettuata una diluizione, moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione.    Avvertenza:Misura a 334 nm: C = 0,167 · DA (e = 6,2 mmole 1 · l · cm 1)Misura a 365 nm: C = 0,303 · DA (e = 3,4 mmole 1 · l · cm 1) 2.5.1.2. Acido L-lattico   C = 0,160 · DA   Se per la preparazione del campione è stata effettuata una diluizione, moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione.    Avvertenza:misura a 334 nm: C = 0,163 · DA (e = 6,2 mmole 1 · l · cm 1)misura a 365 nm: C = 0,297 · DA (e = 3,4 mmole 1 · l · cm 1)2.5.2. Ripetibilità (r)   r = 0,02 + 0,07 Xi g/l   Xi = concentrazione in acido lattico del campione espressa in grammi per litro2.5.3. Riproducibilità (R)   R = 0,05 + 0,125 Xi g/l   Xi = concentrazione in acido lattico del campione espressa in grammi per litro3. METODO  USUALE  3.1.1. Per il trattamento preliminare del vino   Fare riferimento al punto 3.1.1 del capitolo «acido tartarico», metodo usuale.3.1.2. Per il dosaggio dell'acido lattico  3.1.2.1. Soluzione 0,1 M di solfato di cerio IV in acido solforico 0,35 M.    Sciogliere a freddo 40,431 g di solfato di cerio IV Ce(SO4)2 · 4H2O, in 350 ml di una soluzione M di acido solforico titolata con esattezza (3.1.2.4). Portare a 1 000 ml con acqua distillata.   3.1.2.2. Soluzione di idrossido di sodio (NaOH) 2,5 M.   3.1.2.3. Soluzione di acetato di sodio a 270 g per litro (preparata con acetato di sodio secco CH3COONa).   3.1.2.4. Soluzione di acido solforico (H2SO4) 1 M.   3.1.2.5. Soluzione di nitroprussiato di sodio [Na2(Fe(CN)5NO) · 2H2O] al 2 % (m/v).    Conservare al buio in un flacone ben chiuso.  Periodo massimo di conservazione della soluzione: 8 giorni.   3.1.2.6. Soluzione di piperidina (C5H11N) al 10 % (v/v).   3.1.2.7. Soluzione di acido lattico M.    Diluire 100 ml di acido lattico (C3H6O3) in 400 ml di acqua. Versare questa soluzione in una capsula e riscaldarla in bagno di acqua bollente per ore 4 reintegrando ogni tanto il volume con acqua distillata. Dopo raffreddamento portare a un litro.  Titolare l'acido lattico su 10 ml di questa soluzione con una soluzione di idrossido di sodio M (3.1.2.8). Portare la soluzione a 1 M di acido lattico (90 g).   3.1.2.8. Soluzione di idrossido di sodio (NaOH) 1 M.  3.2. Apparecchiatura  3.2.1. Colonna in vetro di circa 300 mm di lunghezza e con diametro interno da 10-11 mm, provvista di un regolatore di flusso (rubinetto).   3.2.2. Bagnomarie regolato a 65 °C.   3.2.3. Spettrofotometro regolato alla lunghezza d'onda di 570 nm corredato di celle a cammino ottico da 1 cm.3.3. Modo di operare  3.3.1. Preparazione della colonna di scambiatori di ioni   Fare riferimento al punto 3.3.1 del capitolo «acido tartarico», metodo usuale.3.3.2. Isolamento degli acidi organici   Fare riferimento al punto 3.3.2 del capitolo «acido tartarico», metodo usuale.3.3.3. Dosaggio dell'acido lattico   Versare 10 ml di eluato in una provetta da 50 ml provvista di un tappo smerigliato, aggiungere 10 ml di soluzione di solfato di cerio (3.1.2.1). Agitare; mettere la provetta in bagnomaria termostatatato a 65 °C, per 10 minuti esatti. Al momento  dell'immersione sollevare per qualche secondo il tappo di vetro in modo da compensare la pressione dovuta al riscaldamento, chiudendo quindi ermeticamente la provetta in modo da evitare le perdite di etanale formatosi. Estrarre quindi il tubo dal bagno,  raffreddare in acqua corrente sino a una temperatura prossima ai 20 °C, aggiungere 5 ml della soluzione di idrossido di sodio 2,5 M (3.1.2.2), mescolare e filtrare.    Prelevare 15 ml di filtrato e versarli in una beuta da 50 ml, con tappo smerigliato, contenente una miscela omogenea di 5 ml di soluzione di acetato di sodio al 27 % (3.1.2.3) e di 2 ml di acido solforico M (3.1.2.4). Aggiungere 5 ml della soluzione di  nitroprussiato di sodio (3.1.2.5), mescolare, aggiungere quindi 5 ml della soluzione di piperidina (3.1.2.6), mescolare rapidamente e introdurre immediatamente la soluzione ottenuta nella cella dello spettrofotometro. Misurare la colorazione prodotta,  che varia dal verde al violetto, a 570 nm rispetto all'aria (senza cella nel cammino ottico); essa aumenta per poi diminuire rapidamente.    Seguire l'andamento dell'assorbanza corrispondente e scegliere come valore definitivo il suo valore massimo.    Se l'eluato è troppo ricco in acido lattico e l'assorbanza è troppo elevata, diluire l'eluato con la soluzione di solfato di sodio al 7,1 % (3.1.1) ed effettuare la misura sulla soluzione diluita.3.3.4. Determinazione della curva di taratura  Introdurre 10 ml della soluzione di acido lattico 1 M (3.1.2.7) e 10 ml di soluzione titolata di idrossido di sodio 1 M (3.1.2.8) in un matraccio tarato da 1 000 ml e portare a volume con la soluzione di solfato di sodio al 7,1 %. Prelevarne quindi, 5,  10, 15, 20 e 25 ml e versarli in palloni tarati da 100 ml. Portare a volume con la soluzione di solfato di sodio al 7,1 % (3.1.1). Prelevare 10 ml delle soluzioni così ottenute e determinare per ciascuna di esse il valore dell'assorbanza secondo il  procedimento descritto al punto 3.3.3 per l'eluato.    Queste soluzioni corrispondono agli eluati ottenuti da vini contenenti 0,45 - 0,9 - 1,35 - 1,80 e 2,25 g/l di acido lattico.    La rappresentazione grafica delle assorbanze di queste soluzioni in funzione del tenore in acido lattico è una retta.  3.4. Espressione dei risultati   Riportando sulla curva di taratura l'assorbanza misurata per l'eluato si ottiene il tenore in acido lattico del vino espresso in grammi per litro.    Tale tenore deve essere espresso con una cifra decimale.    Nota: i vini contenenti più di 250 mg/l di biossido di zolfo possono presentare una certa concentrazione di acido etanalsolfonico che viene computato come acido lattico. In questo caso bisogna correggere il risultato della determinazione con quello  ottenuto con la seguente operazione complementare: in una provetta con tappo smerigliato mescolare 15 ml di eluato con 5 ml di acetato di sodio al 27 % (3.1.2.3) e 2 ml di H2SO4 0,775 M (77,5 ml H2SO4 M portati a 100 ml con acqua distillata). Come nella  determinazione dell'acido lattico, si aggiungono quindi 5 ml di nitroprussiato di sodio al 2 % (3.1.2.5) e 5 ml di piperidina al 10 % (3.1.2.6). Dopo aver mescolato, misurare l'assorbanza nelle condizioni descritte per la determinazione dell'acido  lattico. Riportando tale valore dell'assorbanza sulla retta di taratura si ottiene il valore apparente B dell'acido lattico in grammi per litro dovuto all'acido etanalsolfonico. Se L' è il tenore apparente in acido lattico del vino espresso in grammi  per litro, il tenore effettivo L in acido lattico si ottiene con:    L = L'   B · 0,4 (g/l).     19. ACIDO  L-MALICO 1. PRINCIPIO  DEI  METODO   L'acido L-malico (L-malato) viene ossidato in presenza di nicotinammide-adenina-dinucleotide (NAD), a ossalacetato mediante una reazione catalizzata dalla L-malato-deidrogenasi (L-MDH).    L'equilibrio della reazione è spostato verso il malato. L'eliminazione dell'ossalacetato dal mezzo di reazione sposta l'equilibrio della reazione nel senso della formazione dell'ossalacetato. In presenza di L-glutammato, l'ossalacetato viene  trasformato in L-aspartato, mediante una reazione catalizzata dalla glutammato-ossalacelato-transaminasi (GOT).    (1) L-malato + NAD+  ossalacetato + NADH + H+   (2) Ossalacetato + L-glutammato  L-aspartato + a-chetoglutarato. PER LA CONTINUAZIONE DEL TESTO VEDI SOTTO NUMERO : 390R2676.2  La formazione di NADH misurata attraverso l'aumento di assorbanza alla lunghezza d'onda di 340 nm, è proporzionale alla quantità di L-malato presente.2. REATTIVI  2.1. Tampone a pH 10 (glicilglicina 0,60 M, L-glutammato 0,1 M)   Sciogliere in circa 50 ml di acqua bidistillata 4,75 g di glicilglicina e 0,88 g di acido L-glutammico; correggere il pH a 10 con circa 4,6 ml di soluzione di idrossido di sodio 10 M e portare a 60 ml con acqua bidistillata.Alla temperatura di 4 °C la  soluzione si mantiene stabile per almeno 12 settimane.   2.2. Soluzione di nicotinammide-adenina-dinucleotide (NAD), circa 47· 10 3 M: sciogliere in 12 ml di acqua bidistillata 420 mg di NAD. Alla temperatura di + 4 °C la soluzione si mantiene stabile per almeno 4 settimane.   2.3. Sospensione di glutammato-ossalacetato-transaminasi (GOT) a 2 mg/ml. Alla temperatura di + 4 °C la sospensione si mantiene stabile per almeno un anno.   2.4. Soluzione di L-malato-deidrogenasi (L-MDH) a 5 mg/ml. Alla temperatura di + 4 °C la soluzione si mantiene stabile per almeno un anno.    Osservazione: Il complesso dei reattivi necessari per il dosaggio è reperibile in commercio.3. APPARECCHIATURA  3.1. Spettrofotometro in grado di effettuare misurazioni a 340 nm, massimo di assorbimento dell'NADHIn alternativa può essere utilizzato un fotometro a spettro discontinuo con lunghezza d'onda a 334 nm o a 365 nm.    Poiché si tratta di misurazioni assolute di assorbanza (senza curva di taratura, ma riferite al coefficiente di estinzione dell'NADH), occorre controllare le scale delle lunghezze d'onda e delle assorbanze dell'apparecchio.   3.2. Celle di vetro con un cammino ottico di 1 cm o celle monouso.   3.3. Micropipette che consentano di prelevare volumi compresi tra 0,01 e 2 ml.4. PREPARAZIONE  DEL  CAMPIONE   In genere la determinazione dell'L-malato si effettua direttamente sul vino senza preventiva decolorazione e senza diluizione, a condizione che il tenore in acido L-malico sia    inferiore a 350 mg/l per misurazioni a 365 nm. In caso contrario, diluire il vino con acqua bidistillata in modo che la concentrazione in L-malato si porti fra 30 e 350 mg/l (quantità di L-malato nel campione di saggio compresa fra 3 e 35 µg).    Se la concentrazione di malato nel vino è inferiore a 30 mg/l, il volume della pesata può essere aumentato sino ad 1 ml. In questo caso ridurre il volume di acqua da aggiungere in modo da avere gli stessi volumi totali nelle due celle.5. MODO  DI   OPERARE   Con lo spettrofotometro regolato sulla lunghezza d'onda 340 nm, effettuare le misure di assorbanza nelle celle aventi un cammino ottico di 1 cm, aggiustando l'apparecchio allo zero di assorbanza contro aria (togliendo la cella dal percorso ottico) o  contro acqua.    Introdurre nelle celle da 1 cm:     Bianco CampioneSoluzione 2.1 1,00 ml 1,00 mlSoluzione 2.2 0,20 ml 0,20 mlAcqua distillata 1,00 ml 0,90 mlSospensione 2.3 0,01 ml 0,01 mlCampione -- 0,10 ml   Mescolare. Dopo circa 3 minuti, misurare le assorbanze delle soluzioni del bianco e del campione da dosare (A1).    Aggiungere:Soluzione 2.4 0,01 ml 0,01 ml   Mescolare. Attendere la fine della reazione (circa 5-10 minuti) e misurare le assorbanze delle soluzioni del bianco e del campione (A2).    Determinare le differenze delle assorbanze (A2   A1) del bianco e del campione.    Detrarre la differenza delle assorbanze del bianco dalla differenza delle assorbanze del campione.    DA = DAC   DAB   Osservazione: Il tempo necessario per l'azione degli enzimi può variare da un lotto all'altro. Quello sopra riportato è dato soltanto a titolo indicativo. Si raccomanda di determinarlo per ciascun lotto.6. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI   La concentrazione in acido L-malico è espressa in grammi per litro (g/l) con una cifra decimale.6.1.Metodo di calcolo   La concentrazione in grammi per litro è calcolata con la formula generale:V = volume in ml della soluzione impiegata per la prova (in questo caso 2,22 ml)v = volume del campione in ml (in questo caso 0,1 ml)PM = peso molecolare della sostanza da dosare  (in questo caso acido L-malico = 134,09)d = cammino ottico della cella in cm (in questo caso 1 cm) e = coefficiente di assorbanza del NADH: a 340 nme = 6,3 mmole 1 · l · cm 1   Per il L-malato si ottiene:C = 0,473 · DA g/l.    Se per la preparazione del campione è stata effettuata una diluizione, moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione.    Nota:misura a 334 nm C = 0,482 × DA misura a 365 nm C = 0,876 × DA6.2. Ripetibilità (r)   r = 0,03 + 0,034 xi xi = concentrazione in acido malico del campione espressa in g/l.6.3. Riproducibilità (R)   R = 0,05 + 0,071 xi xi = concentrazione in acido malico del campione in g/l.      20. ACIDO  D-MALICO (metodo enzimatico)   TEST  COMBINATO  PER  30  DETERMINAZIONI  CIRCA1. PRINCIPIO  DEI  METODO   In presenza di D-malato-deidrogenasiedecarbossilasi (D-MDH) l'acido D-malico (D-malato) viene ossidato ad ossalacetato dalla nicotinammide-adenina-dinucleotide (NAD). L'ossalacetato formato è trasformato in piruvato e acido carbonico.    D-malato + NAD+  + piruvato + CO2 + NADH + H+   La formazione del NADH, misurata attraverso l'aumento dell'assorbanza alla lunghezza d'onda di 334, 340 o 365 nm, è proporzionale alla quantità del D-malato presente.2. COMPOSIZIONE  DEL  KIT   a) Flacone n. 1 contenente circa 30 ml di soluzione di tampone Hepes 4-(2 idrossietil)-1 piperazinetan-acido solforico, pH = 9,0 e stabilizzatori.b) Flacone n. 2 contenente circa 210 mg di NAD liofilizzato.c) Tre flaconi n. 3 contenenti D-MDH  liofilizzato, 8 U circa per ciascuno.2.1. Preparazione delle soluzioni  2.1.1. Utilizzare il contenuto del flacone 2.a) senza diluizione. Termostatare la soluzione a 20-25 °C prima dell'uso.   2.1.2. Sciogliere il contenuto del flacone 2.b) in 4 ml di acqua bidistillata.   2.1.3. Sciogliere il contenuto di uno dei flaconi 2.c) in 0,6 ml di acqua bidistillata. Termostatare la soluzione a 20-25 ° C prima dell'uso.2.2. Stabilità delle soluzioni   Il contenuto del flacone 2.1.1 si conserva a+4 °C per almeno un anno.    La soluzione 2.1.2 si conserva per circa tre settimane a+4 °C e per due mesi a  20 °C.La soluzione 2.1.3 si conserva per cinque giorni a+4 °C.3. APPARECCHIATURA  3.1. Spettrofotometro in grado di effettuare misurazioni a 340 nm, massimo di assorbimento del NADH e del NADPH.In alternativa può essere utilizzato un fotometro a spettro discontinuo con lunghezza d'onda a 334 nm o a 365 nm.   3.2. Celle di vetro con cammino ottico di 1 cm o celle monouso.   3.3. Micropipette che consentano di prelevare volumi compresi tra 0,01 e 2 ml.4. PREPARAZIONE  DEL  CAMPIONE   La quantità di D-malato nella cella deve essere compresa tra 2 µg e 50 µg. Diluire pertanto il campione in modo tale che la concentrazione in malato sia compresa tra 0,02 e 0,5 g/l, rispettivamente 0,02 e 0,3 g/l. Se la differenza di assorbanza DA è  minore di 0,100 la quantità di campione può essere aumentata sino a 1,80 ml, riducendo il volume di acqua da aggiungere in modo tale che i volumi totali siano uguali nelle due celle (bianco e campione).  5. MODO  DI  OPERARE   Temperatura: 20-25 °CVolume del saggio: 2,95 ml   Effettuare le misure contro aria (senza cella sul cammino ottico) o contro acqua.                        Introdurre nelle celle:BiancoCampioneSoluzione 2.1.11,00 ml1,00 mlSoluzione 2.1.20,10 ml0,10 mlAcqua bidistillata1,80 ml1,70 mlCampione 0,10 mlMescolare - Dopo 6 minuti leggere le assorbanze delle soluzioni (A1). Innestare la reazione  aggiungendo:Soluzione 2.1.30,05 ml0,05 mlMescolare. Alla fine della reazione (circa 20 minuti) leggere le assorbanze delle soluzioni (A2).   Determinare le differenze di assorbanza (A2-A1) per le soluzioni del bianco e del campione. Detrarre la differenza di assorbanza del bianco da quella del campione.D A = D AC   D AB6. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI   La concentrazione in acido D-malico è data in grammi per litro (g/l) con una cifra decimale.6.1. Calcolo   La formula generale per il calcolo delle concentrazioni è la seguente:dove:V = volume del saggio (ml)v = volume del campione (ml)PM = peso molecolare della sostanza da dosared = cammino ottico della cella (cm)e = coefficiente di assorbanza del NADH:    Hg 340 nm = 6,3 (mmol 1 · l · cm 1)Hg 334 nm = 6,18 (mmol 1 · l · cm 1)Hg 365 nm = 3,4 (mmol 1 · l · cm 1)   Per il D-malato si ottiene:Se nella preparazione del campione è stata effettuata una diluizione, moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione F.  6.2. Ripetibilità (r)   r = 0,05 xi6.3. Riproducibilità (R)   R = 0,1 × xi xi = concentrazione in acido D-malico in gr/l.     21. ACIDO  MALICO  TOTALE METODO  USUALE1. PRINCIPIO  DEI  METODO   L'acido malico separato per mezzo di una colonna scambiatrice di anioni viene dosato colorimetricamente nell'eluato utilizzando la colorazione gialla che si ottiene per azione dell'acido solforico al 96 % e dell'acido cromotropico. Le sostanze  contenute nell'eluato che interferiscono in questa reazione, contrariamente all'acido malico, reagiscono con l'acido solforico all'86 % e l'acido cromotropico.Per eliminare quindi questa interferenza è sufficiente sottrarre dall'assorbanza ottenuta dopo  reazione con acido cromotropico ed acido solforico al 96 % l'assorbanza ottenuta dopo reazione con acido cromotropico ed acido solforico all'86 %.2. APPARECCHIATURA  2.1. Colonna di vetro lunga circa 250 mm e con diametro interno di 35 mm, munita di rubinetto.   2.2. Colonna di vetro lunga circa 300 mm e con diametro interno di 10-11 mm, munita di rubinetto.   2.3. Bagnomaria a 100 °C.   2.4. Spettrofotometro che permetta di eseguire misure di assorbanza alla lunghezza d'onda di 420 nm con celle di 10 mm di cammino ottico.3. REATTIVI  3.1. Scambiatore di anioni di forte basicità (per esempio Merck III).   3.2. Idrossido di sodio al 5 % (m/v).   3.3. Acido acetico al 30 % (m/v).   3.4. Acido acetico allo 0,5 % (m/v).   3.5. Soluzione di solfato di sodio (Na2SO4) al 10 % (m/v).   3.6. Acido solforico concentrato al 95-97 % (m/m).   3.7. Acido solforico all'86 % (m/m).   3.8. Soluzione di acido cromotropico al 5 % (m/v).    Da preparare volta per volta prima di ogni dosaggio sciogliendo 500 mg di cromatropato di sodio (C10H6Na2O8S2 · 2 H2O) in 10 ml di acqua distillata.   3.9. Soluzione di acido DL - malico di 0,5 g/l.    Sciogliere 250 mg di acido malico (C4H6O5) nella soluzione di solfato di sodio al 10 % (3.5) e portare a 500 ml con la stessa soluzione.4. MODO  DI  OPERARE  4.1. Preparazione dello scambiatore di ioni   Porre nella colonna di vetro 35 × 250 mm, al di sopra del rubinetto, un tampone di lana di vetro impregnato di acqua distillata. Versare nella colonna lo scambiatore di ioni in sospensione in acqua lasciando uno spazio libero di circa 50 mm al di sopra  della superficie dello scambiatore.Dopo lavaggio con 1 000 ml di acqua distillata, riempire la colonna con la soluzione di idrossido di sodio al 5 %, lasciare percolare il liquido sino a circa 2-3 mm al di sopra della superficie dello scambiatore di  ioni, ripetere ancora per due volte questa operazione e lasciare in contatto per un'ora. Lavare la colonna con 1 000 ml di acqua distillata, riempire quindi la colonna con la soluzione di acido acetico al 30 %, lasciar percolare il liquido sino a 2-3 mm  circa al di sopra della superficie dello scambiatore di ioni.Ripetere questa operazione per due volte e lasciare in contatto per almeno ventiquattro ore prima dell'uso. Conservare lo scambiatore di ioni in acido acetico al 30 % per i successivi  dosaggi.4.2. Preparazione della colonna a scambiatore ionico   Porre nella colonna di vetro 11 × 300 mm, al di sopra del rubinetto, un tampone di lana di vetro. Versare nella colonna lo scambiatore di ioni preparato come descritto in 4.1 per un'altezza di 10 cm. Con il rubinetto aperto lasciare percolare la  soluzione di acido acetico al 30 % sino a circa 2-3 mm al di sopra della superficie della resina. Lavare quindi con 50 ml della soluzione di acido acetico allo 0,5 %.4.3. Isolamento dell'acido DL-malico   Versare sulla resina preparata come descritto in 4.2 10 ml di vino o di mosto.Lasciare percolare il vino, goccia a goccia (una goccia al secondo circa), sino a circa 2-3 mm al di sopra della superficie della resina. Lavare la colonna prima con 50 ml  circa della soluzione di acido acetico allo 0,5 % e dopo con circa 50 ml di acqua distillata; lasciare percolare queste soluzioni con la stessa velocità del vino.    Eluire gli acidi fissati sulla resina a scambio ionico per mezzo della soluzione di solfato di sodio al 10 % con la stessa velocità delle operazioni precedenti (1 goccia al secondo), raccogliere l'eluato in un pallone tarato da 100 ml sino al segno di  taratura.    La resina può essere rigenerata come descritto in 4.1.4.4. Dosaggio dell'acido malico   In due provette a tappo smerigliato, a bocca larga, da 30 ml, «A» e «B», introdurre 1,0 ml di eluato e 1,0 ml della soluzione di acido cromotropico al 5 %. Nella provetta «A» aggiungere 10,0 ml di acido solforico all'86 % (bianco) e nella provetta «B»  10,0 ml di acido solforico al 96 % (campione). Tappare ed agitare per ottenere una perfetta omogeneità senza bagnare la parte smerigliata. Porre le due provette per 10 minuti esatti nel bagno maria portato preventivamente a ebollizione vivace. Far  raffreddare le provette a 20 °C al buio.Esattamente dopo 90 minuti dall'inizio del raffreddamento misurare l'assorbanza della provetta «B» contro il bianco (provetta «A») alla lunghezza d'onda di 420 nm nelle celle da 10 mm di cammino ottico.4.5.  Curva  di taratura   In palloncini tarati da 50 ml versare 5 - 10 - 15 e 20 ml della soluzione di acido malico di 0,5 g/l; portare a segno con la soluzione di solfato di sodio al 10 %.    Le soluzioni così ottenute corrispondono ad eluati ottenuti a partire da vini contenenti 0,5 - 1,0 - 1,5 e 2,0 g di acido DL-malico per litro.    Continuare come indicato in 4.4.    I valori dell'assorbanza ottenuti con queste soluzioni, riportati in funzione dei tenori in acido malico corrispondenti, si allineano su una retta passante per l'origine.    Poiché l'intensità della colorazione è notevolmente influenzata dalla concentrazione dell'acido solforico, è necessario controllare la curva di taratura per almeno un punto per ogni serie di misure per mettere in evidenza una eventuale variazione della  concentrazione dell'acido solforico.  5. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI   Riportare l'assorbanza misurata per l'eluato sulla curva di taratura per ottenere il tenore in acido DL-malico in grammi per litro con une divra decimale. Ripetibilità   tenore <  2 g/l : r = 0,1 g/ltenore > 2 g/l : r = 0,2 g/l Riproducibilità   R = 0,3 g/l    22. ACIDO  SORBICO 1. PRINCIPIO  DEI  METODI  1.1. Metodo di dosaggio per spettrofotometria di assorbimento nell'ultravioletto   L'acido sorbico (acido 2,4 esadienoico trans, trans) estratto per distillazione in corrente di vapor d'acqua, viene dosato nel distillato del vino per spettrofotometria di assorbimento nell'ultravioletto. Le sostanze che interferiscono sulla misura  dell'assorbimento nell'ultravioletto vengono eliminate per evaporazione a secco dell'aliquota di distillato prelevata, leggermente alcalinizzata con una soluzione di idrossido di calcio. I tenori inferiori a 20 mg/l devono essere confermati per  cromatografia su strato sottile (sensibilità: 1 mg/l).1.2. Metodo di dosaggio per gascromatografia   L'acido sorbico estratto con etere etilico è dosato per cromatografia in fase gassosa in presenza di uno standard interno.1.3. Metodo di ricerca di tracce per cromatografia su strato sottile   L'acido sorbico, estratto con etere etilico, viene preparato per cromatografia su strato sottile. Se ne determina quindi semiquantitativamente la concentrazione.2. METODO  DI  DOSAGGIO  PER  SPETTROFOTOMETRIA  DI  ASSORBIMENTO  NELL'ULTRAVIOLETTO  2.1.Reattivi  2.1.1. Acido tartarico, C4H6O6, cristallizzato.   2.1.2. Soluzione d'idrossido di calcio, Ca (OH)2 circa 0,02 M.   2.1.3. Soluzione di riferimento di acido sorbico a 20 mg per litro.    Sciogliere 20 mg di acido sorbico, C6H8O2, in 2 ml circa di soluzione 0,1 M di idrossido di sodio. Versarli in un pallone tarato da 1 000 ml e portare a volume con acqua. Si possono anche sciogliere 26,8 mg di sorbato di potassio, C6H7KO2, in acqua e  portarli a 1 000 ml con acqua.2.2. Apparecchiatura  2.2.1. Apparecchio di distillazione in corrente di vapore d'acqua (vedi «Acidità volatile»).   2.2.2. Bagnomaria a 100 °C.   2.2.3. Spettrofotometro regolato a 256 nm con celle in quarzo a cammino ottico da 1 cm.2.3. Modo di operare  2.3.1. Distillazione   Versare nel gorgogliatore dell'apparecchio di distillazione in corrente di vapore 10 ml di vino, aggiungere 1-2 g di acido tartarico (2.1.1). Raccogliere 250 ml di distillato.2.3.2. Curva di taratura   Preparare, per diluizione con acqua della soluzione di riferimento (2.1.3), quattro soluzioni di riferimento aventi rispettivamente concentrazione di 0,5 - 1 - 2,5 e 5 mg di acido sorbico per litro; misurare con lo spettrofotometro le rispettive  assorbanze a 256 nm, rispetto all'acqua distillata. Tracciare la curva delle variazioni dell'assorbanza in funzione della concentrazione delle soluzioni. La variazione è lineare.2.3.3. Dosaggio   Porre 5 ml di distillato in una capsula di 55 mm di diametro; aggiungere 1 ml di soluzione di idrossido di calcio (2.1.2). Portare a secco su bagnomaria bollente.    Riprendere il residuo con alcuni millilitri di acqua distillata, versare quantitativamente in un matraccio tarato da 20 ml e portare a volume con le acque di lavaggio. Misurare con uno spettrofotometro l'assorbanza a 256 nm rispetto a una soluzione in  bianco ottenuta per diluizione con acqua a 20 ml di 1 ml di soluzione di idrossido di calcio (2.1.2).    Portare il valore dell'assorbanza misurato sulla retta di taratura e determinare la concentrazione C dellasoluzione in acido sorbico.    Osservazione:  Nella pratica corrente l'evaporazione a secco può essere trascurata. Effettuare direttamente la misura dell'assorbanza sul distillato diluito 1:4 contro acqua distillata.2.4.Espressione dei risultati  2.4.1. Calcolo   La concentrazione in acido sorbico del vino espressa in milligrammi per litro è uguale a:100 × C   dove C = concentrazione in acido sorbico della soluzione analizzata per spettrofotometria, espressa in milligrammi per litro.3. METODO  DI  DOSAGGIO  PER  CROMATOGRAFIA  IN  FASE  GASSOSA  3.1. Reattivi  3.1.1. Etere etilico, (C2H5)2O, distillato al momento dell'impiego.   3.1.2. Soluzione dello standard interno: soluzione di 1 g per litro di acido undecanoico, C11H22O2, in etanolo al 95 % (vol.).  3.1.3. Soluzione di acido solforico, H2SO4 (r20° = 1,84 g/ml), diluito a 1/3 (v/v).3.2. Apparecchiatura  3.2.1. Gascromatografo corredato da un rivelatore a ionizzazione di fiamma e da una colonna in acciaio inossidabile (4 m × 1/8 di pollice) trattata preliminarmente con dimetildiclorosilano e riempita con una fase stazionaria costituita da una miscela di  dietilenglicol succinato (5 %) e di acido fosforico (1 %) (DEGS - H3PO4) o da una miscela di dietilenglicol adipato (7 %) e di acido fosforico (1 %) (DEGA - H3PO4) fissato su Gaschrom Q 80 - 100 mesh. Per il trattamento con il dimetilclorosilano (DMDCS)  far passare nella colonna una soluzione in toluene di DMDCS al 2-3 %. Lavare immediatamente la colonna con metanolo, far passare una corrente di azoto, poi esoano e nuovamente corrente di azoto. Quindi riempire la colonna.    Condizioni operative:Temperatura del forno: 175 °C.Temperatura dell'iniettore e del rivelatore: 230 °C.  Gas vettore: azoto (flusso 20 ml/minuto).   3.2.2. Microsiringa da 10 microlitri graduata in 0,1 microlitri.    Osservazione: Altri tipi di colonne possono ugualmente permettere una buona separazione, in particolare la colonna capillare (FFAP, per esempio).    Il modo di operare descritto di seguito è dato a titolo di esempio.3.3. Modo di operare  3.3.1. Preparazione del campione da analizzare   In una provetta in vetro da circa 40 ml, dotata di tappo smerigliato, introdurre 20 ml di vino, aggiungere 2 ml di soluzione di standard interno (3.1.2) e 1 ml di soluzione diluita di acido solforico (3.1.3).    Dopo aver agitato capovolgendo più volte, aggiungere al contenuto della provetta 10 ml di etere etilico (3.1.1). Estrarre l'acido sorbico agitando la provetta per 5 minuti. Lasciare decantare.3.3.2. Preparazione della soluzione di riferimento   Scegliere un vino il cui estratto in etere etilico dia un cromatogramma che non presenti alcun picco con tempo di ritenzione dell'acido sorbico; aggiungere a questo vino 100 mg/l di acido sorbico. Trattare 20 ml del campione così ottenuto secondo il  modo di operare descritto al punto 3.3.1.3.3.3. Cromatografia   Iniettare successivamente nel cromatografo con una microsiringa 2 µl della fase eterea ottenuta al punto 3.3.2 e 2 µl della fase eterea ottenuta al punto 3.3.1.    Registrare i rispettivi cromatogrammi; verificare che i rispettivi tempi di ritenzione dell'acido sorbico e dello standard interno siano identici. Misurare l'altezza (o la superficie) di ciascuno dei picchi ottenuti.3.4. Espressione dei risultati  3.4.1. Calcolo   La concentrazione in acido sorbico del vino analizzato, espressa in milligrammi per litro, è uguale a:H = altezza del picco dell'acido sorbico nella soluzione di riferimento. h = altezza del picco dell'acido sorbico nel campione da analizzare.I =  altezza del picco dello standard interno nella soluzione di riferimento.i = altezza del picco dello standard interno nel campione da analizzare.    Nota:la concentrazione in acido sorbico può essere determinata nello stesso modo prendendo in considerazione la misura della superficie dei rispettivi picchi.4. METODO  DI  RICERCA  DI  TRACCE  DI  ACIDO  SORBICO  MEDIANTE  CROMATOGRAFIA  SU  STRATO   SOTTILE  4.1. Reattivi  4.1.1. Etere etilico, (C2H5)2O.    4.1.2. Soluzione acquosa di acido solforico, H2SO4 (r 20 = 1,84 g/ml) diluito a 1/3 (v/v).   4.1.3. Soluzione di riferimento di acido sorbico in una miscela idroetanolica al 10 % di etanolo (vol.): 20 mg/l circa.   4.1.4. Fase mobile: esano - pentano - acido acetico (20:20:3) (C6H14   C5H12   CH3COOH) (r 20 = 1,05 g/ml).4.2. Apparecchiatura  4.2.1. Lastre per cromatografia su strato sottile, pronte per l'uso, da 20×20 cm ricoperte con gel di poliammide (spessore: 0,15 mm) addizionato di un indicatore di fluorescenza.   4.2.2. Camera cromatografica per strato sottile.   4.2.3. Micropipetta o microsiringa che consenta di depositare volumi da 5 µl con la precisione di ± 0,1 µl.   4.2.4. Lampada a raggi ultravioletti (254 nm).4.3. Modo di operare  4.3.1. Preparazione del campione da analizzare   Versare in una provetta da circa 25 ml, provvista di tappo smerigliato, 10 ml di vino, aggiungere 1 ml di soluzione di acido solforico diluito (4.1.2) e 5 ml di etere etilico (4.1.1). Agitare capovolgendo più volte. Lasciare decantare.4.3.2.  Preparazione delle soluzioni diluite di riferimento   Preparare, per diluizione della soluzione 4.1.3, cinque soluzioni diluite di riferimento contenenti rispettivamente 2-4-6-8 e 10 mg di acido sorbico per litro.4.3.3. Cromatografia   Con una microsiringa o una micropipetta deporre, a 2 cm dal bordo inferiore della lastra, 5 µl della fase eterea ottenuta al punto 4.3.1 e 5 µl di ciascuna delle soluzioni diluite di riferimento (4.3.2), distanziando i depositi tra di loro di 2 cm.    Versare la fase mobile (4.1.4) nella camera cromatografica sino a raggiungere un'altezza di circa 0,5 cm e lasciare che l'atmosfera della camera si saturi dei vapori dei solventi. Introdurre la lastra nella vaschetta. Lasciare sviluppare il  cromatogramma per 12-15 cm (la durata dello sviluppo è di circa 30 minuti). Asciugare la lastra in corrente di aria fredda. Esaminare il cromatogramma sotto luce ultravioletta a 254 nm.    La macchie relative all'acido sorbico hanno una colorazione viola scuro sul fondo giallo fluorescente della lastra.4.4.Espressione dei risultati   Il confronto fra le intensità della macchia del campione da analizzare e quella delle macchie delle soluzioni di riferimento consente di valutare semiquantitativamente la concentrazione in acido sorbico fra 2 e 10 mg per litro. Per determinare una  concentrazione uguale a 1 mg per litro occorrerà un deposito di 10 µl di soluzione del campione da analizzare, mentre per determinare concentrazioni superiori a 10 mg per litro il volume del deposito della soluzione da analizzare dovrà essere inferiore  a 5 µl (da misurare con una microsiringa).     23. ACIDO L-ASCORBICO 1. PRINCIPIO  DEI  METODI   I metodi proposti consentono di dosare l'acido L-ascorbico e l'acido deidroascorbico presenti nei vini o nei mosti.1.1. Metodo di riferimento (fluorimetrico)   L'acido L-ascorbico è ossidato ad acido deidroascorbico con l'impiego del carbone attivo. Tale composto per reazione con l'ortofenilendiammina (O.P.D.A.) forma un composto fluorescente. Un bianco in presenza di acido borico consente di determinare la  fluorescenza parassita (per formazione di un complesso acido borico- acido deidroascorbico) e di sottrarla quindi dal dosaggio fluorimetrico.1.2. Metodo usuale (colorimetrico)   L'acido L-ascorbico viene ossidato con iodio in acido deidroascorbico, composto che viene quindi precipitato dalla 2,4 dinitrofenilidrazina come bis (2,4-dinitrofenilidrazone). Dopo separazione per cromatografia su strato sottile e solubilizzazione in  ambiente acetico, questo composto di colorazione rossa viene dosato per spettrofotometria a 500 nm.2. METODO  DI  RIFERIMENTO  (METODO  FLUORIMETRICO)  2.1. Reattivi  2.1.1. Soluzione di dicloridrato di orto-fenilendiammina (C6H10Cl2N2) a 0,02 g per 100 ml, preparati al momento.   2.1.2. Soluzione di acetato di sodio triidrato (CH3COONa 3H2O), a 500 g/l.   2.1.3. Soluzione mista di acido borico e di acetato di sodio.Sciogliere 3 g di acido borico, H3BO3, in 100 ml di soluzione di acetato di sodio (2.1.2). Questa soluzione deve essere preparata al momento dell'uso.   2.1.4. Soluzione di acido acetico glaciale, (CH3COOH (r20 = 1,05 g/ml) diluito al 56 % (v/v) a pH 1,2 circa.   2.1.5. Soluzione di riferimento di acido L-ascorbico da 1 g per litro.Sciogliere immediatamente prima dell'impiego 50 mg di acido L-ascorbico, C6H8O6, previamente disidratato in un essiccatore al riparo dalla luce, in 50 ml di soluzione di acido acetico  (2.1.4).   2.1.6. Carbone attivo molto puro per analisi (10)Porre, in una beuta da 2 l, 100 g di carbone attivo, aggiungere 500 ml di una soluzione di acido cloridrico, (HCl) (r20 = 1,19 g/ml) al 10 % (v/v). Portare a ebollizione, filtrare su filtro in vetro  sinterizzato di porosità 3. Raccogliere il carbone così trattato in una beuta da 2 l, aggiungere 1 l di acqua, agitare e filtrare su filtro di vetro sinterizzato di porosità 3. Ripetere due volte l'operazione. Porre il residuo in una stufa regolata a  115 ± 5 °C per 12 ore (ad esempio una notte).2.2. Apparecchiatura  2.2.1. Fluorimetro. Utilizzare uno spettrofluorimetro dotato di una lampada a spettro continuo regolandolo sulla potenza minima della lampada. Le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione ottimali per la prova saranno determinate previamente e in  funzione dell'apparecchio impiegato. A titolo indicativo la lunghezza d'onda di eccitazione si situa intorno ai 350 nm, e la lunghezza d'onda di emissione intorno ai 430 nm. Celle di 1 cm di cammino ottico.    2.2.2. Filtro in vetro sinterizzato di porosità 3.   2.2.3. Provette (diametro 7 10 mm).   2.2.4. Agitatore per provette.2.3. Modo di operare  2.3.1. Preparazione del campione di vino o di mosto   Prelevare un volume di vino o di mosto e diluirlo a 100 ml in un matraccio tarato con la soluzione di acido acetico al 56 % (2.1.4), in modo da ottenere una soluzione la cui concentrazione in acido L-ascorbico sia compresa fra 0 e 60 mg/l. Agitare per  omogeneizzare il contenuto del matraccio tarato. Aggiungere 2 g di carbone attivo (2.1.6) e lasciare a contatto per 15 minuti agitando di tanto in tanto. Filtrare su carta da filtro ordinaria eliminando i primi millilitri di filtrato. In due matracci  tarati da 100 ml introdurre, in uno, 5 ml della soluzione mista di acido barico e di acetato di sodio (2.1.3) (testimone), nell'altro, 5 ml della soluzione di acetato di sodio (2.1.2) (campione). Lasciare a contatto per 15 minuti agitando di tanto in  tanto, e completare a 100 ml con acqua distillata.    Prelevare 2 ml del contenuto di ciascun matraccio, aggiungere 5 ml di soluzione di orto-fenilendiammina (2.1.1), agitare; lasciare sviluppare la reazione per 30 minuti in assenza di luce ed effettuare quindi la misura allo spettrofluorimetro.2.3.2.  Curva di taratura   In tre matracci tarati da 100 ml porre rispettivamente 2, 4, 6 ml della soluzione di riferimento di acido L-ascorbico (2.1.5), completare a 100 ml con la soluzione di acido acetico (2.1.4), agitando per omogeneizzare. Le soluzioni di riferimento  preparate contengono rispettivamente 2-4-6 mg/100 ml.    Aggiungere 2 g di carbone attivo (2.1.6) in ciascuno dei matracci e lasciare a contatto per 15 minuti agitando di tanto in tanto. Filtrare su carta da filtro ordinaria eliminando i primi millilitri. Introdurre rispettivamente 5 ml di ciascuno dei  filtrati raccolti nei tre matracci da 100 ml (prima serie), ripetere l'operazione con un seconda serie di tre matracci tarati. Aggiungere in ciascuno dei matracci della prima serie (corrispondenti al testimone) 5 ml di soluzione mista di acido borico e  acetato di sodio (2.1.3) e in ciascun matraccio della seconda serie 5 ml di soluzione di acetato di sodio (2.1.2).    Lasciare a contatto per 15 minuti agitando di tanto in tanto, e completare a 100 ml con acqua distillata. Prelevare 2 ml del contenuto di ciascuno dei matracci, aggiungere 5 ml di soluzione di ortofenilendiammina (2.1.1), agitare, lasciare sviluppare  la reazione per 30 minuti in assenza di luce ed effettuare quindi la misura allo spettrofluorimetro.2.3.3. Determinazione fluorimetrica   Regolare per ciascuna soluzione della curva di taratura e per la soluzione del dosaggio lo zero della scala delle misure sul bianco corrispondente. Effettuare quindi la misurazione dell'intensità della fluorescenza per ogni soluzione della serie a  titolo noto e della serie del campione per il dosaggio.    Tracciare la curva di taratura; essa deve risultare lineare e passare per l'origine degli assi. Riportare su tale retta il valore relativo al dosaggio e sottrarre il tenore C in acido L-ascorbico + acido deidroascorbico della soluzione  analizzata.2.3.4. Espressione dei risultati   La concentrazione del vino in acido L-ascorbico + acido deidroascorbico espressa in milligrammi per litro sarà:C · F    F = fattore di diluizione.3. METODO  USUALE (COLORIMETRICO)  3.1. Reattivi  3.1.1. Soluzione di acido metafosforico al 30 % (m/v).Prelevare 30 g di acido metafosforico, (HPO3)n previamente macinato in un mortaio. Lavare rapidamente per immersione e agitando in acqua distillata. Sciogliere l'acido lavato in acqua distillata  agitando in un matraccio tarato da 100 ml, portare al volume; la soluzione ottenuta ha una concentrazione di circa il 30 % (m/v) in acido metafosforico.   3.1.2. Soluzione di acido metafosforico al 3 % (m/v), preparata al momento dell'uso diluendo 1 : 10 la soluzione 3.1.1 con acqua distillata.   3.1.3. Soluzione di acido metafosforico all' 1 % (m/v) preparata al momento dell'uso diluendo 1 : 30 la soluzione 3.1.1 con acqua distillata.   3.1.4. Sospensione di poliammide Mettere in sospensione 10 g di polvere di poliammide per cromatografia in 60 ml di acqua distillata e lasciare in contatto per 2 ore. La quantità preparata è sufficiente per 4 determinazioni.   3.1.5. Tiourea (H2NCSNH2).   3.1.6. Soluzione di iodio (I2) 0,05 M.   3.1.7. Soluzione di 2,4-dinitrofenilidrazina al 6 % (m/v). Mettere in sospensione 6 g di 2,4-dinitrofenilidrazina (C6H6N4O4) in 50 ml di acido acetico glaciale (r20 = 1,05 g/ml), aggiungere 50 ml di acido solforico (r20 = 1,84 g/ml) e agitare per  sciogliere la 2,4-dinitrofenilidrazina.   3.1.8. Acetato di etile (C4H8O2) addizionato del 2 % (v/v) di acido acetico glaciale (3.1.12).   3.1.9. Cloroformio (CHCl3).   3.1.10. Soluzione acquosa di amido allo 0,5 % (m/v).     3.1.11. Fase mobile:acetato di etile50 vol.cloroformio60 vol.acido acetico 5 vol.    Prima dell'impiego lasciare riposare la miscela solvente per 12 ore.   3.1.12. Acido acetico glaciale (CH3COOH) (r20 = 1,05 g/ml).   3.1.13. Soluzione di acido L-ascorbico a 0,1 g per 100 ml di soluzione di acido metafosforico all' 1 % (3.1.3).3.2. Apparecchiatura  3.2.1. Centrifuga da laboratorio e relativi tubi da 50 ml di capacità provvisti di tappo smerigliato.   3.2.2. Bagnomaria termostatato tra 5 e 10 °C.   3.2.3. Bagnomaria termostatato a 20 °C.   3.2.4. Lastre per cromatografia su strato sottile pronte all'uso, da 20 × 20 cm, ricoperte con gel di silice G (spessore 0,25 o 0,3 mm).    3.2.5. Camera cromatografica.   3.2.6. Micropipetta che consenta di dosare volumi da 0,2 ml.   3.2.7. Spettrofotometro per misure di assorbanza a 500 nm corredato di celle a cammino ottico da 1 cm.3.3. Modo di operare  3.3.1. Ossidazione dell'acido L-ascorbico in acido deidroascorbico   Versare 50 ml di vino in un matraccio tarato da 100 ml, aggiungere 15 ml di sospensione di poliammide (3.1.4) e portare a volume con la soluzione di acido metafosforico al 3 % (3.1.2). Lasciare riposare 1 ora, agitando spesso. Filtrare su filtro a  pieghe. Mettere 20 ml di filtrato in un tubo da centrifuga, aggiungere 1 ml di soluzione 0,05 M di iodio (3.1.6). Omogeneizzare il contenuto agitando il tubo da centrifuga tappato e dopo 1 minuto ridurre l'eccesso di iodio aggiungendo 25 mg circa di  tiourea.3.3.2. Formazione ed estrazione del bis (2,4-dinitrofenilidrazone) dell'acido dichetogulonico   Mettere la provetta in un bagno d'acqua a temperatura compresa fra 5 e 10 °C; aggiungere 4 ml di soluzione di 2,4-dinitrofenilidrazina (3.1.7). Omogeneizzare il contenuto del tubo, evitando di bagnare il tappo di vetro. Conservare poi il tubo ben  chiuso in un bagno d'acqua a 20 °C per circa 16 ore (una nottata, per esempio).  Aggiungere nel tubo da centrifuga 15 ml di acetato di etile (3.1.8), chiudere il tubo e agitare per 30 secondi. Centrifugare poi per 5 minuti applicando una forza centrifuga di 350-400 g. Prelevare con una pipetta 10 ml dell'acetato di etile utilizzato  per l'estrazione e versarli in una beuta con tappo smerigliato. Aggiungere al contenuto del tubo da centrifuga 5 ml di acetato di etile (3.1.8). Tappare il tubo. Agitare per 30 secondi e centrifugare quindi per 5 minuti alla stessa velocità. Prelevare 5  ml dell'acetato di etile utilizzato per l'estrazione ed aggiungerlo alla soluzione della prima estrazione nella beuta. Omogeneizzare la miscela agitando.3.3.3. Separazione del bis (2.4-dinitrofenilidrazone) per cromatografia: da effettuare entro 2 ore  dall'estrazione (3.3.2).    Lasciando un margine di 2 cm nella parte inferiore ed in quella laterale della lastra, depositare su tutta la linea di partenza 0,2 ml dell'estratto in acetato di etile. Versare la fase mobile (3.1.11) nella vasea per un'altezza di 1 cm e lasciare che  l'ambiente si saturi di vapori dei solventi. Introdurre quindi la lastra, lasciare migrare il solvente sino al bordo superiore, e farla quindi asciugare per un'ora sotto cappa ventilata. Grattare con una spatola, perpendicolarmente alla direzione di  migrazione, la zona di colorazione rossa (caratteristica del 2,4-dinitrofenilidrazone). Raccogliere la polvere ottenuta su un foglio di carta lucida e trasferirla quantitativamente in una beuta con tappo smerigliato, aggiungendo 4 ml di acido acetico  (3.1.12). Lasciare riposare per 30 minuti, agitando spesso. Filtrare su carta da filtro a pieghe direttamente nella cella dello spettrofotometro (3.2.7). Il filtrato ottenuto dev'essere limpido. Regolare lo zero della scala delle assorbanze a 500 nm con  l'acido acetico (3.1.12) e misurare l'assorbanza della soluzione.3.3.4. Curva di taratura   Versare in 3 palloni tarati da 100 ml rispettivamente 5-10 e 15 ml di soluzione di acido L-ascorbico (3.1.1.3) e portare a volume con la soluzione di acido metafosforico all' 1 % (3.1.3). Le soluzioni ottenute hanno una concentrazione in acido  ascorbico rispettivamente di 50-100 e 150 mg/litro.    Su 50 ml di ciascuna di queste soluzioni seguire il modo di operare descritto ai punti 3.3.1, 3.3.2 e 3.3.3. Tracciare la curva di taratura che deve essere una retta e deve passare per l'origine.3.3.5. Espressione dei risultati   La concentrazione del vino in acido L-ascorbico + acido deidroascorbico si esprime in milligrammi per litro.  3.3.5.1. Calcolo   Riportare sulla retta di taratura il valore dell'assorbanza misurata al punto 3.3.3 e ricavare il valore della concentrazione in acido L-ascorbico + acido deidroascorbico della soluzione analizzata.    NB: Se la concentrazione in acido L-ascorbico + acido deidroascorbico è superiore a 150 mg/l, ridurre il volume della presa di campione a 25-20 o 10 ml di vino, moltiplicando il risultato ottenuto per il fattore di diluizione F.     24. pH 1. PRINCIPIO   Misura della differenza di potenziale fra due elettrodi immersi nel liquido in esame. Uno degli elettrodi ha un potenziale che è una funzione definita del pH del liquido, mentre l'altro ha un potenziale fisso e noto e costituisce l'elettrodo di  riferimento.2. APPARECCHIATURA  2.1. pHmetro a scala graduata in unità pH in modo da consentire delle misurazioni con un'approssimazione di almeno 0,05 unità.   2.2. Elettrodi.   2.2.1. Elettrodi in vetro, da conservare in acqua distillata.   2.2.2. Elettrodi di riferimento a calomelano e cloruro di potassio saturo, conservati in una soluzione satura di cloruro di potassio.   2.2.3. Oppure un elettrodo combinato da conservare in acqua distillata.3. REATTIVI  3.1. Soluzioni tampone:   3.1.1. Soluzione satura di tartrato acido di potassio. Soluzione contenente almeno 5,7 g/l di tartrato acido di potassio (C4H5KO6) a 20 °C. Tale soluzione può conservarsi fino a 2 mesi in presenza di 0,1 g di timolo per 200 ml.    pH   3,57 a 20 °CpH   3,56 a 25 °CpH   3,55 a 30 °C  3.1.2. Soluzione 0,05 M di ftalato acido di potassio. Soluzione contenente 10,211 g/l di ftalato acido di potassio (C8H5KO4) a 20 °C.  (Tempo massimo di conservazione: 2 mesi).pH   3,999 a 15 °CpH   4,003 a 20 °CpH   4,008 a 25 °CpH   4,015 a 30 °C  3.1.3. Soluzione contenente:    Fosfato monopotassico, KH2PO43,402 gFosfato dipotassico, K2HPO44,354 gAcqua q.b.a.1    l (Tempo massimo di conservazione: 2 mesi)pH   6,90 a 15 °CpH   6,88 a 20 °CpH   6,86 a 25 °CpH   6,85 a 30 °C   NB:  Possono essere impiegate anche le soluzioni tampone di riferimento reperibili in commercio.  4. MODO  DI  OPERARE  4.1. Preparazione del campione per l'analisi  4.1.1. Mosto e vino   Operare direttamente sul mosto o sul vino.4.1.2. Mosto concentrato rettificato   Diluire il mosto concentrato rettificato con acqua per ottenere una concentrazione di 25 ± 0,5 % (m/m) in zuccheri totali (25 °Brix).    Se P è il tenore percentuale (m/m) in zuccheri totali del mosto concentrato rettificato, pesare una quantità uguale a:e completare a 100 g con acqua. L'acqua utilizzata deve avere una conduttività inferiore a 2 microsiemens per centimetro.4.2.  Azzeramento dell'apparecchio   Prima di effettuare le misurazioni occorre azzerare l'apparecchio, seguendo le indicazioni date per l'apparecchio utilizzato.4.3. Taratura del pHmetro   La taratura si effettua a 20 °C seguendo le indicazioni date per l'apparecchio utilizzato con le soluzioni tampone a pH 6,88 e 3,57 a 20 °C. Utilizzare la soluzione tampone a pH 4,00 a 20 °C per controllare la calibratura della scala.4.4. Misura   Immergere l'elettrodo nel campione da analizzare la cui temperatura dev'essere compresa fra 20 e 25 °C e il più possibile vicina a 20 °C. Leggere direttamente sulla scala il valore del pH.    Effettuare almeno due determinazioni sullo stesso campione.    Prendere come risultato la media aritmetica delle due determinazioni.5. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI   Il pH del mosto, del vino o della soluzione al 25 % (m/m) (25 °Brix) del mosto concentrato rettificato è espressa con 2 cifre decimali.     25. ANIDRIDE  SOLFOROSA 1. DEFINIZIONE   Si chiama anidride solforosa l'anidride solforosa presente nel mosto o nel vino nelle forme seguenti: H2SO3, HSO3 , il cui equilibrio dipende dal pH e dalla temperatura:H2SO3  H+ + HSO3H2SO3 rappresenta l'anidride solforosa molecolare.    Si chiama anidride solforosa totale l'insieme delle varie forme di anidride solforosa presenti nel vino allo stato libero o combinato.2. ANIDRIDE  SOLFOROSA  LIBERA  E  TOTALE  2.1. Principio dei metodi  2.1.1. Metodo di riferimento  2.1.1.1. Vini  e  mosti   L'anidride solforosa viene trascinata da una corrente di aria o di azoto e viene fisatta ed ossidata per gorgogliamento in una soluzione diluita neutra di perossido di idrogeno. L'acido solforico formato viene dosato con una soluzione titolata di  idrossido di sodio. L'anidride solforosa libera viene estratta dal vino per trascinamento a freddo (10 °C).  L'anidride solforosa totale viene estratta dal vino per trascinamento a caldo (100 °C circa).2.1.1.2. Mosti  concentrati  rettificati   L'anidride solforosa totale è estratta per trascinamento a caldo (circa 100 °C) del mosto rettificato concentrato previamente diluito.2.1.2. Metodo rapido (vini e mosti)   L'anidride solforosa libera viene dosata mediante titolazione iodometrica diretta.    Si dosa quindi l'anidride solforosa combinata mediante titolazione iodometrica effettuata dopo idrolisi alcalina. Sommandola all'anidride solforosa libera, si ottiene l'anidride solforosa totale.2.2. Metodo di riferimento  2.2.1. Apparecchiatura  2.2.1.1. L'apparecchio utilizzato deve essere conforme allo schema qui riportato, in particolare per quanto riguarda il refrigerante.      Fig. 1Le dimensioni sono riportate in millimetri. I diametri interni dei 4 tubi concentrici che costituiscono il refrigerante sono: 45, 34, 27 e 10 mm.     Il tubo di adduzione del gas nel gorgogliatore«B» termina con una sferetta dal diametro di 1 cm portante sulla circonferenza massima orizzontale 20 fori del diametro di 0,2 mm. Esso può ugualmente terminare con una piastra di vetro sinterizzato che  assicuri la formazione di un elevato numero di bolle molto piccole che consentano di realizzare un buon contatto fra le fasi gassose e liquide.    Il flusso di gas attraverso l'apparecchio deve essere di circa 40 l/h. La bottiglia posta a destra dell'apparecchio ha lo scopo di limitare al valore di 20-30 cm di acqua la depressione prodotta dalla pompa a caduta d'acqua. Per poter regolare tale  depressione in modo da avere un flusso corretto, è opportuno inserire fra il gorgogliatore e la bottiglia un flussimetro a tubo semicapillare.   2.2.1.2. Microburetta2.2.2. Reattivi  2.2.2.1. Acido fosforico all'85 % (H3PO4) (r20 = 1,71 g/ml).   2.2.2.2. Soluzione di perossido di idrogeno a 9,1 g di H2O2/l (3 volumi).   2.2.2.3. Reattivo indicatore:   rosso di metile100 mgblu di metilene 50 mgalcol a 50 % vol.100 ml  2.2.2.4. Soluzione di idrossido di sodio (NaOH), 0,01 M.   2.2.3. Modo di operare  2.2.3.1. Dosaggio  dell'anidride  solforosa  libera   Prima del dosaggio il vino deve essere mantenuto per due giorni a 20 °C in una bottiglia piena e tappata.- Porre nel gorgogliatore «B» da 2 a 3 ml di soluzione di perossido di idrogeno (2.2.2.2) 2 gocce di indicatore; neutralizzare quindi la soluzione  di perossido di idrogeno con una soluzione 0,01 M di idrossido di sodio (2.2.2.4). Collegare il gorgogliatore all'apparecchiatura.- Nel pallone «A» da 250 ml dell'apparecchio di distillazione introdurre 50 ml di campione e 15 ml di acido fosforico  (2.2.2.1). Collegare il pallone.Fare quindi gorgogliare l'aria (o l'azoto) per 15 minuti. L'anidride solforosa libera trascinata viene ossidata ad acido solforico. Togliere il gorgogliatore dell'apparecchio e titolare l'acido formatosi con la soluzione  di idrossido di sodio 0,01 M (2.2.2.4). Sia n il numero di ml utilizzati.2.2.3.2. Espressione  dei  risultati   L'anidride solforosa libera è espressa in mg/l senza decimali.   2.2.3.2.1. Calcolo   Anidride solforosa libera in mg/l: 6,4 n.2.2.3.3. Dosaggio  dell'anidride  solforosa  totale  2.2.3.3.1. Per i mosti concentrati rettificati, utilizzare la soluzione ottenuta diluendo il campione per l'analisi al 40 % (m/v) come indicato al punto 5.1.2 del capitolo «Acidità totale». Introdurre nel pallone «A» da 250 ml dell'apparecchio, 50 ml di  tale soluzione e 5 ml di acido fosforico (2.2.2.1). Collegare il pallone con l'apparecchiatura.   2.2.3.3.2. Vini e mosti    Tenore presunto del campioned 50 mg/l di SO2 totale. Versare nel pallone «A» da 250 ml dell'apparecchio, 50 ml di campione e 15 ml di acido fosforico (2.2.2.1). Collegare il pallone con l'apparecchiatura.    Tuttavia, sino al 31 dicembre 1992 al più tardi, per determinare il tenore in anidride solforosa dei succhi d'uva si usano 5 ml di acido fosforico (2.2.2.1) diluiti al 25 % (m/v).   2.2.3.3.3. Tenore presunto del campione D 50 mg/l di SO2 totale. Versare nel pallone «A» da 100 ml dell'apparecchio 20 ml di campione e 5 ml di acido fosforico (2.2.2.1). Collegare il pallone con l'apparecchiatura.    Porre nel gorgogliatore «B» 2×3 ml di soluzione di perossido di idrogeno (2.2.2.2), neutralizzarla come sopra e portare il vino contenuto nel pallone «A» ad ebollizione per mezzo di una piccola fiamma alta 4-5 cm che deve lambire direttamente il fondo  del pallone. Per evitare la piroscissione delle sostanze estrattive del vino sulle pareti del pallone, posarlo, anziché su una rete metallica, su un disco provvisto di un foro del diametro di 30 mm.    Mantenere l'ebollizione durante il passaggio della corrente d'aria (o di azoto). Entro 15 minuti l'anidride solforosa totale viene estratta ed ossidata. Dosare quindi l'acido solforico formatosi con la soluzione 0,01 M di idrossido di sodio (2.2.2.4).  Sia n il numero di ml utilizzati.2.2.3.4. Espressione  dei  risultati   L'anidride solforosa totale è espressa in milligrammi/litro (mg/l) o in milligrammi/chilogrammo (mg/kg) di zuccheri totali senza cifre decimali.   2.2.4.2.1. Calcolo   Vini e mostiAnidride solforosa totale in mg/l:- Campioni poveri di anidride solforosa (quantità di campione analizzata 50 ml):  6,4 · n- Altri campioni (quantità di campione analizzata 20 ml):  16· n   Mosti concentrati rettificatiAnidride solforosa in milligrammi per chilo di zuccheri totali (quantità di campione analizzato preparato come in 2.2.3.3.1, 50 ml):P = tenore percentuale (m/m) in zuccheri totali.   2.2.3.4.2. Ripetibilità (r)Tenore <  50 mg/l (presa di campione 50 ml), r = 1 mg/lTenore > 50 mg/l (presa di campione 20 ml), r = 6 mg/l  2.2.3.2.3. RiproducibilitàTenore <  50 mg/l (presa di campione 50 ml), R = 9 mg/lTenore > 50 mg/l (presa di campione 20 ml), R = 15 mg/l2.3. Metodo rapido di prova  2.3.1. Reattivi  2.3.1.1. EDTA (Complexon III): sale bisodico dell'acido etilendiamminotetracetico (C10H14N2Na2O8 · 2H2O).    2.3.1.2. Soluzione 4 M di idrossido di sodio NaOH (160 g/l).   2.3.1.3. Soluzione di acido solforico H2SO4 (r20 = 1,84 g/ml) al 10 % (v/v).   2.3.1.4. Salda d'amido soluzione a 5 g/l.    Disperdere 5 g di amido in circa 500 ml di acqua. Portare ad ebollizione agitando e mantenerla per 10 minuti; aggiungere 200 g di cloruro di sodio (NaCl) e dopo raffreddamento portare a 1 litro.   2.3.1.5. Soluzione 0,025 M di iodio (I2)2.3.2. Materiale  2.3.2.1. Beuta da 500 ml.   2.3.2.2. Buretta.   2.3.2.3. Pipette da 1, 2, 5 e 50 ml.2.3.3. Modo di operare  2.3.3.1. Anidride  solforosa  libera   In una beuta da 500 ml, versare:- 50 ml di vino-  5 ml di salda d'amido (2.3.1.4)- 30 mg di EDTA (2.3.1.1)-  3 ml di H2SO4 al 10 % (2.3.1.3)   Titolare immediatamente con la soluzione 0,025 M di iodio (2.3.1.5) sino a quando la colorazione blu persiste nettamente per 10-15 secondi. Sia n ml il volume di iodio utilizzato.2.3.3.2. Anidride  solforosa  combinata   Aggiungere 8 ml di soluzione 4 M di idrossido di sodio (2.3.1.2), agitare una sola volta e lasciare a contatto per 5 minuti. Versare in un sol colpo, agitando energicamente, il contenuto di un piccolo becher nel quale siano stati posti 10 ml di acido  solforico al 10 % (2.3.1.3). Titolare immediatamente con la soluzione 0,025 M di iodio (2.3.1.5). Sia n2 il volume di iodio impiegato.    Aggiungere 20 ml di soluzione 4 M di idrossido di sodio (2.3.1.2), e lasciare a contatto per cinque minuti dopo aver agitato una sola volta. Diluire con 200 ml di acqua molto fredda.    Agitando energicamente aggiungere, versando in un sol colpo da un becher riempito precedentemente, 30 ml di acido solforico al 10 % (2.3.1.3). Titolare con la soluzione 0,025 M di iodio (2.3.1.5) l'anidride solforosa liberata; sia n" il volume di iodio  impiegato.2.3.4. Espressione dei risultati  2.3.4.1. Calcolo   Anidride solforosa libera in milligrammi per litro: 32 n.Anidride solforosa totale in mg/l: 32 (n + n2 + n").    Osservazioni:1) Per i vini rossi poveri in SO2 è opportuno impiegare iodio con una molarità inferiore a 0,025 M (per esempio: 0,01 M). In tal caso sostituire nelle formule sopra riportate il coefficiente 32 con 12,8.  2) Per i vini rossi, torna utile illuminare il vino dal basso con un fascio di luce gialla ottenuta mediante una lampada elettrica comune e una soluzione di cromato di potassio oppure mediante una lampada a vapori di sodio. La trasparenza del vino, che  diviene opaco appena raggiunto il viraggio della salda d'amido, va osservata in una camera oscura.3) Quando la quantità di anidride solforosa trovata è prossima o superiore al limite legale, è opportuno dosare l'anidride solforosa totale con il metodo  di riferimento.4) Quando interessa particolarmente il dosaggio dell'anidride solforosa, questo verrà convenzionalmente determinato su un campione mantenuto per due giorni al riparo dall'aria e alla temperatura di 20 °C prima dell'analisi, che sarà  eseguita anch'essa a tale temperatura.5) Poiché alcune sostanze vengono ossidate dallo iodio in ambiente acido, per un dosaggio più preciso occorre valutare la quantità di iodio consumata da tali sostanze. A tale scopo, prima di effettuare la  titolazione con lo iodio, occorre combinare l'anidride solforosa libera con un eccesso di aldeide acetica o propionica. In una beuta da 300 ml aggiungere a 50 ml di vino 5 ml di soluzione di aldeide acetica (C2H4O) a 7 g/l oppure 5 ml di una soluzione  di aldeide propionica (C3H6O) a 10 g/l.Chiudere con un tappo e lasciare riposare per almeno 30 minuti. Aggiungere 3 ml di acido solforico al 10 % (2.3.1.3) e la soluzione 0,025 M di iodio (2.3.1.5) in quantità sufficiente per ottenere il viraggio della  salda di amido. Sia n4 il volume di iodio impiegato. Questo valore deve essere detratto da n (SO2 libera) e da n + n2 + n" (SO2 totale).In genere, il valore di n4 è basso: 0,2-0,3 ml di iodio 0,025 M. Se il vino è stato addizionato di acido ascorbico,  n4 risulta molto più elevato e si può, almeno approssimativamente, misurare la quantità di questo prodotto mediante il valore di n4, sapendo che 1 ml di iodio 0,025 M ossida 4,4 mg di acido ascorbico. Attraverso la misura di n4, si possono così  riconoscere senza difficoltà i vini che sono stati addizionati di acido ascorbico in quantità superiore a 20 mg/l, sempre che questo non si sia trasformato in prodotti di ossidazione.3. ANIDRIDE  SOLFOROSA  MOLECOLARE  3.1. Principio del metodo   La percentuale di anidride solforosa molecolare, H2SO3, nell'anidride solforosa libera viene valutata in funzione del pH, del titolo alcolometrico e della temperatura.    Per una data temperatura e un dato titolo alcolometrico:H2SO3  H+ + HSO3i = forza ionica.A e B = coefficienti che variano con la temperatura e con il titolo alcolometrico.KT = costante termodinamica di dissociazione; il valore di pkT è dato nella  tabella 1 in funzione del titolo alcolometrico e della temperatura.KM = costante mista di dissociazione.    Attribuendo alla forza ionica i il valore medio 0,038, la tabella 2 dà i valori di pkM in funzione della temperatura e del titolo alcolometrico.    Il tenore in anidride solforosa molecolare ottenuto dalla relazione (1) è dato nella tabella 3 in funzione del pH, della temperatura e del titolo alcolometrico.3.2. Calcolo   Conoscendo il pH del vino ed il relativo titolo alcolometrico, la percentuale di anidride solforosa molecolare per una data temperatura t °C, è data nella tabella 3; sia X %.     Tenore in anidride solforosa molecolare espresso in mg/l:X · CC = tenore in anidride solforosa libera espresso in mg/l.       TABELLA 1Valore della costante termodinamica pKT  TABELLA 2Valore della costante mista pKM (I = 0,038)   TABELLA 3Anidride solforosa molecolare in percentuale di anidride solforosa libera (I = 0,038)   TABELLA  3 (continuazione)Anidride solforosa molecolare in percentuale di anidride solforosa libera (I = 0,038)     26. SODIO 1. PRINCIPIO  DEI  METODI  1.1. Metodo di riferimento: Spettrofotometria di assorbimento atomico   Il sodio viene dosato direttamente nel vino per spettrofotometria di assorbimento atomico dopo addizione di un tampone spettrale di cloruro di cesio per evitare la ionizzazione del sodio.1.2. Metodo usuale: Fotometria di fiamma   Il sodio viene dosato direttamente nel vino diluito al 10 % mediante fotometria di fiamma.2. METODO  DI  RIFERIMENTO  2.1. Reattivi  2.1.1. Soluzione di sodio di 1 g per litro   Utilizzare una soluzione standard di sodio di 1 g/l del tipo in commercio. Questa soluzione può essere preparata sciogliendo 2,542 g di cloruro di sodio NaCl essiccato, in acqua distillata e portando il volume ad un litro.    Conservare questa soluzione in una bottiglia di polietilene.2.1.2. Soluzione modello:   Acido citrico C6H8O7 · H2O 3,5 gSaccarosio C12H22O11 1,5 gGlicerolo C3H8O3 5,0 gCloruro di calcio anidro Ca Cl2 50 mgCloruro di magnesio anidro Mg Cl2 50 mgAlcol assoluto C2H5OH 50 mlAcqua q.b. a500 ml2.1.3. Soluzione di cloruro di cesio al 5 % in  cesio   Sciogliere 6,330 g di cloruro di cesio CsCl in 100 ml di acqua distillata.2.2. Apparecchiatura  2.2.1. Spettrofotometro di assorbimento atomico. Gas di alimentazione del bruciatore: aria e acetilene.   2.2.2. Lampada a catodo cavo al sodio.2.3. Modo di operare  2.3.1. Preparazione del campione   Prelevare 2,5 ml di vino versandoli in un pallone tarato da 50 ml; aggiungere 1 ml di soluzione di cloruro di cesio (2.1.3) e portare a volume con acqua distillata.  2.3.2. Taratura   Versare in una serie di palloni tarati da 100 ml 5,0 ml di soluzione modello; aggiungere in ciascuno di essi rispettivamente 0 - 2,5 - 5 - 7,5 - 10 ml della soluzione di sodio a 1 g/l (2.1.1), previamente diluita 1/100; aggiungere in tutti i recipienti  2 ml della soluzione di cloruro di cesio (2.1.3) e completare a 100 ml con acqua distillata.    Le soluzioni di taratura preparate hanno una concentrazione rispettivamente di 0 - 0,25 - 0,50 - 0,75 - 1,00 mg di sodio per litro e contengono 1 g di cesio per litro. Queste soluzioni devono essere conservate in bottiglie di polietilene.2.3.3.  Dosaggio   Regolare la lunghezza d'onda a 589,0 nm. Regolare lo zero della scala delle assorbanze con la soluzione modello contenente 1 g di cesio per litro (2.3.2). Aspirare direttamente il vino diluito nel bruciatore dello spettrofotometro, quindi  successivamente le soluzioni di taratura (2.3.2). Leggere le assorbanze, effettuare le determinazioni in doppio.2.4. Espressione dei risultati  2.4.1. Calcolo   Tracciare la curva dell'assorbanza in funzione della concentrazione di sodio delle soluzioni di taratura.    Riportare il valore medio delle assorbanze ottenute per il campione su tale curva e determinare la concentrazione C di sodio in milligrammi per litro.    La concentrazione di sodio espressa in milligrammi per litro di vino, senza cifre decimali, sarà:20· C2.4.2. Ripetibilità (r)   r = 1 + 0,024 Xi mg/ldove Xi = concentrazione in sodio del campione espressa in mg/l.2.4.3. Riproducibilità (R)   R = 2,5 + 0,05 Xi mg/ldove Xi = concentrazione in sodio del campione espressa in mg/l.3. METODO  USUALE  3.1. Reattivi  3.1.1. Soluzione di riferimento di sodio a 20 mg per litro    Alcool assoluto (C2H5OH)  10   mlAcido citrico (C6H8O7, H2O)  700   mgSaccarosio (C12H22O11)  300   mgGlicerolo (C3H8O3)1 000   mgTartrato acido di potassio (C4H5KO6)  481,3  mgCloruro di calcio anidro (Ca Cl2)  10   mgCloruro di magnesio anidro (Mg  Cl2)  10   mgCloruro di sodio seccato (NaCl)  50,84 mgAcqua q.b. a   1   l 3.1.2. Soluzione di diluizione.   Alcool assoluto (C2H5OH)  10   mlAcido citrico (C6H8O7 · H2O)  700   mgSaccarosio (C12H22O11)  300   mgGlicerolo (C3H8O3)1 000   mgTartrato acido di potassio (C4H5KO6)  481,3  mgCloruro di calcio anidro (Ca Cl2)  10   mgCloruro di magnesio anidro (Mg  Cl2)  10   mgAcqua q.b. a   1   l    Per prepare le soluzioni 3.1.1 e 3.1.2 sciogliere il tartrato acido di potassio in circa 500 ml di acqua distillata molto calda, mescolare la soluzione con gli altri componenti precedentemente sciolti in 400 ml di acqua distillata e completare ad 1  litro.    Aggiungere alle soluzioni 2 gocce di isotiocianato di allile e conservarle in bottiglie in polietilene.3.2. Apparecchiatura  3.2.1. Fotometro a fiamma alimentato con miscela aria/butano.3.3. Modo di operare  3.3.1. Taratura   In cinque palloni tarati da 100 ml versare 5 - 10 - 15 - 20 - 25 ml della soluzione di sodio a 20 mg/l (3.1.1) e completare a 100 ml con la soluzione di diluizione (3.1.2). Le soluzioni ottenute contengono rispettivamente 1 - 2 - 3 - 4 - 5 mg di sodio  per litro.3.3.2. Dosaggio   Effettuare le misure a 589,0 nm. Regolare il 100 % di trasmissione con acqua distillata. Aspirare direttamente nel bruciatore del fotometro una dopo l'altra la serie di soluzioni di taratura (3.3.1), quindi il vino diluito al 10 % con acqua distillata  e rilevare le percentuali di trasmissione. Se necessario, diluire il vino già diluito al 10 %, con la soluzione di diluizione (3.1.2).3.4. Espressione dei risultati  3.4.1. Calcolo   Tracciare la curva delle variazioni della percentuale di trasmissione in funzione della concentrazione di sodio delle soluzioni di taratura. Riportare il valore della trasmissione ottenuta per il campione di vino diluito su tale curva e ricavare la  concentrazione C in sodio. La concentrazione in milligrammi di sodio per litro, senza cifre decimali è data da:C · FF = fattore di diluizione3.4.2. Ripetibilità (r)   (tranne i vini liquorosi) r = 1,4 mg/lvini liquorosi: r = 2,0 mg/l3.4.3. Riproducibilità (R)   R = 4,7 + 0,008 Xi mg/lXi = concentrazione in sodio del campione espressa in mg/l.     27. POTASSIO 1. PRINCIPIO  DEI  METODI  1.1. Metodo di riferimento   Il potassio viene dosato direttamente nel vino diluito per spettrofotometria di assorbimento atomico dopo addizione di un tampone spettrale di cloruro di cesio per evitare la ionizzazione del potassio.1.2. Metodo usuale   Il potassio viene dosato direttamente nel vino diluito per fotometria di fiamma.2. METODO  DI  RIFERIMENTO  2.1. Reattivi  2.1.1. Soluzione di potassio di 1 g per litro   Usare una soluzione standard di potassio di 1 g/l del tipo in commercio. Questa soluzione può essere preparata sciogliendo 4,813 g di tartrato acido di potassio (C4H5KO6) in acqua distillata e portando il volume ad un litro.   2.1.2. Soluzione modello:   Acido citrico (C6H8O7 · H2O) 3,5 gSaccarosio (C12H22O11) 1,5 gGlicerolo (C3H8O3) 5,0 gCloruro di calcio anidro (Ca Cl2) 50  mgCloruro di magnesio anidro (Mg Cl2) 50  mgAlcol assoluto (C2H5OH) 50  mlAcqua q b. a500  ml2.1.3. Soluzione di cloruro di cesio  al 5 % in cesio   Sciogliere 6,330 g di cloruro di cesio CSCl in 100 ml di acqua distillata.2.2. Apparecchiatura  2.2.1. Spettrofotometro di assorbimento atomico. Gas di alimentazione del bruciatore: aria e acetilene.   2.2.2. Lampada a catodo cavo al potassio.2.3. Modo di operare  2.3.1. Preparazione del campione   Prelevare 2,5 ml di vino (previamente diluito al 10 %), versarli in un pallone tarato da 50 ml; aggiungere 1 ml di soluzione di cloruro di cesio (2.1.3) e portare a volume con acqua distillata.2.3.2. Taratura   Versare in una serie di palloni tarati da 100 ml 5 ml di soluzione modello (2.1.2); aggiungere rispettivamente 0 - 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 ml della soluzione di potassio di 1 g/l (2.1.1) (previamente diluita al 10 %); aggiungere in tutti i palloni 2 ml  della soluzione di cloruro di cesio (2.1.3) e portare il volume a 100 ml con acqua distillata. Le soluzioni di taratura preparate hanno un titolo rispettivamente di 0 - 2 - 4 - 6 - 8 mg di potassio per litro e contengono 1 g di cesio per litro; vanno  conservate in flaconi di polietilene.2.3.3. Dosaggio   Regolare la lunghezza d'onda a 769,9 nm. Regolare lo zero della scala delle assorbanze con la soluzione modello contenente 1 g di cesio per litro (2.3.2). Aspirare direttamente il vino diluito (2.3.1) nel bruciatore dello spettrofotometro, quindi  successivamente le soluzioni di taratura (2.3.2). Leggere le assorbanze, effettuare le determinazioni in doppio.2.4. Espressione dei risultati  2.4.1. Calcolo   Tracciare la curva di variazione dell'assorbanza in funzione della concentrazione di potassio delle soluzioni di taratura. Riportare il valore medio delle assorbanze ottenute per il campione di vino diluito su tale curva e determinare la concentrazione  C di potassio in milligrammi per litro.    La concentrazione di potassio espressa in milligrammi per litro di vino, è data da: F · C dove F = fattore di diluizione (in questo caso 200)2.4.2. Ripetibilità (r)r = 35 mg/l 2.4.3. Riproducibilità (R)R = 66 mg/l2.4.4. Altre espressioni dei risultati   - in milliequivalenti per litro: 0,0256 · F · C- in tartrato acido di potassio in milligrammi per litro: 4,813 · F · C3. METODO  USUALE: SPETTROFOTOMETRIA  DI  FIAMMA  3.1. Reattivi  3.1.1. Soluzione di riferimento di potassio di 100 mg per litro  Alcool assoluto (C2H5OH)  10 mlAcido citrico (C6H8O7, H2O)  700 mgSaccarosio (C12H22O11)  300 mgGlicerolo (C3H8O3)1 000 mgCloruro di sodio (NaCl)  50,8 mgCloruro di calcio anidro (Ca Cl2)  10 mgCloruro di magnesio anidro (Mg Cl2)  10 mgTartrato acido di  potassio essiccato (C4H5KO6)  481,3 mgAcqua q.b. a1 000  ml   Per preparare questa soluzione sciogliere il tartrato acido di potassio in circa 500 ml di acqua distillata molto calda, mescolare la soluzione con gli altri componenti precedentemente sciolti in 400 ml di acqua distillata e completare ad 1 litro.  3.1.2. Soluzione di diluizione  Alcool assoluto (C2H5OH)  10 mlAcido citrico (C6H8O7· H2O)  700 mgSaccarosio (C12H22O11)  300 mgGlicerolo (C3H8O3)1 000 mgCloruro di sodio (NaCl)  50,8 mgCloruro di calcio anidro (Ca Cl2)  10 mgCloruro di magnesio anidro (MgCl2)  10 mgAcido tartarico  (C4H6O6)  383 mgAcqua q.b. a1 000 ml   Aggiungere alle soluzioni 2 gocce di isotiocianato di allile e conservarle in flaconi di polietilene.3.2. Apparecchiatura  3.2.1. Fotometro a fiamma alimentato con miscela aria/butano.3.3. Modo di operare  3.3.1. Taratura   In quattro palloni tarati da 100 ml versare 25 - 50 - 75 - 100 ml della soluzione di riferimento (3.1.1) e completare a 100 ml con la soluzione di diluizione (3.1.2). Le soluzioni ottenute contengono rispettivamente 25 - 50 - 75 - 100 mg per litro di  potassio.3.3.2. Dosaggio   Effettuare le letture a 766 nm. Regolare il 100 % di trasmissione con acqua distillata. Aspirare direttamente nel bruciatore del fotometro una dopo l'altra la serie di soluzioni di taratura (3.3.1), quindi il vino diluito al 10 % con acqua distillata e  rilevare le percentuali di trasmissione. Se necessario, diluire nuovamente il vino già diluito al 10 %, con la soluzione di diluizione (3.1.2).3.4. Espressione dei risultati  3.4.1. Calcolo   Tracciare la curva di variazione delle percentuali di trasmissione in funzione della concentrazione di potassio delle soluzioni di taratura. Riportare il valore della trasmissione ottenuta per il campione di vino diluito su tale curva e determinare la  concentrazione C in potassio. La concentrazione in milligrammi di potassio per litro, senza cifre decimali, è data da:C · Fdove F = fattore di diluizione3.4.2. Ripetibilità (r)   r = 17 mg/l.3.4.3. Riproducibilità (R)   R = 66 mg/l.  3.4.4. Altre espressioni dei risultati:    - in milliequivalenti per litro: 0,0256 · F · C- in tartrato acido di potassio in milligrammi per litro: 4,813 · F· C.     28. MAGNESIO 1. PRINCIPIO   Il magnesio viene dosato direttamente nel vino opportunamente diluito mediante spettrofotometria di assorbimento atomico.2. REAGENTI  2.1. Soluzione di taratura concentrata di magnesio di 1 g/l.    Utilizzare una soluzione standard di 1 g/l magnesio reperibile in commercio. Tale soluzione può essere preparata sciogliendo 8,3646 g di cloruro di magnesio (MgCl2, 6 H2O) in acqua distillata e portando il volume ad 1 litro.2.2. Soluzione di taratura  diluita: 5 mg di magnesio per litro.    Osservazione: Conservare le soluzioni di taratura di magnesio in flaconi in polietilene.3. APPARECCHIATURA  3.1. Spettrofotometro di assorbimento atomico dotato di un bruciatore alimentato con aria e acetilene.   3.2. Lampada a catodo cavo al magnesio.4. MODO  DI  OPERARE  4.1. Preparazione del campione   Diluire il vino all' 1 % con acqua distillata.4.2. Taratura   In una serie di palloni tarati da 100 ml, versare 5 - 10 - 15 - 20 ml della soluzione 2.2 e completare a 100 ml con acqua distillata. Le soluzioni ottenute contengono rispettivamente 0,25 - 0,50 - 0,75 - 1 mg di magnesio per litro. Conservarle in  flaconi di polietilene.4.3. Dosaggio   Selezionare la lunghezza d'onda a 285 nm. Regolare lo zero della scala delle assorbanze con acqua distillata. Aspirare direttamente il vino diluito nel bruciatore dello spettrofotometro ripetendo quindi l'operazione con le varie soluzioni di taratura  preparate al punto 4.2. Rilevare le assorbanze; effettuare le determinazioni in doppio.5. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI  5.1. Calcolo   Tracciare la curva di variazione dell'assorbanza in funzione della concentrazione in magnesio delle soluzioni di taratura.    Riportare il valore medio delle assorbanze ottenute per il campione di vino diluito su detta curva e determinare la concentrazione C di magnesio.     La concentrazione di magnesio espressa in milligrammi per litro di vino senza cifre decimali è data da:100 · C5.2. Ripetibilità (r)   r = 3 mg/l5.3. Riproducibilità (R)   R = 8 mg/l    29. CALCIO 1. PRINCIPIO   Il calcio viene dosato direttamente nel vino opportunamente diluito mediante spettrofotometria di assorbimento atomico dopo addizione di un tampone spettrale.2. REAGENTI  2.1. Soluzione di taratura a 1 g di calcio per litro.    Utilizzare una soluzione standard di calcio reperibile in commercio, di un g/l. Tale soluzione può essere preparata sciogliendo 2,5 g di carbonato di calcio, CA CO3, nella quantità di HCL al 10 % (v/v) sufficiente a scioglierla, portando quindi il  volume ad 1 l con acqua distillata.2.2. Soluzione di taratura diluita a 50 mg di calcio per litro.    Osservazione: conservare le soluzioni di taratura di calcio in flaconi di polietilene.2.3.Soluzione di cloruro di lantanio di 50 g/l in lantanio.    Sciogliere 13,369 g di cloruro di lantanio (La Cl3 · 7 H2O) in acqua distillata; aggiungere 1 ml di HCl diluito al 10 % (v/v) e portare il volume a 100 ml.3. APPARECCHIATURA  3.1. Spettrofotometro di assorbimento atomico dotato di un bruciatore alimentato con aria/acetilene.   3.2. Lampada a catodo cavo al calcio.4. MODO  DI  OPERARE  4.1. Preparazione del campione   In un pallone da 20 ml versare 1 ml di vino, 2 ml di soluzione 2.3 e portare a volume con acqua distillata. Il titolo in lantanio del vino diluito al 5 % è di 5 g/l.    Osservazione:Per i vini dolci, è sufficiente la concentrazione di 5 g di lantanio per litro a condizione che la diluizione porti il tenore in zuccheri a meno di 2,5 g/l. Per concentrazioni in zuccheri superiori occorre portare il tenore in lantanio a  10 g/l.4.2. Taratura   Porre in cinque palloni tarati da 100 ml rispettivamente 0 - 5 - 10 - 15 - e 20 ml della soluzione 2.2; aggiungere in tutti i palloni 10 ml della soluzione 2.3 e portare il volume a 100 ml con acqua distillata. Le soluzioni di taratura così preparate  contengono rispettivamente 0 - 2,5 - 5 - 7,5 e 10 mg di calcio per litro e 5 g di lantanio per litro. Conservare queste soluzioni in flaconi di polietilene.4.3. Dosaggio   Selezionare la lunghezza d'onda di 422,7 nm. Regolare lo zero della scala delle assorbanze con la soluzione contenente 5 g di lantanio per litro (4.2). Aspirare direttamente il vino diluito nel bruciatore dello spettrofotometro e quindi, una dopo  l'altra, le soluzioni di taratura preparate al punto 4.2. Rilevare le assorbanze. Effettuare le determinazioni in doppio.  5. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI  5.1. Calcolo   Tracciare la curva di variazione dell'assorbanza in funzione della concentrazione in calcio delle soluzioni di taratura.    Riportare il valore medio delle assorbanze ottenute per il campione di vino diluito su tale curva e determinare la concentrazione C di calcio. La concentrazione in calcio, espressa in mg/l di vino mediante numeri interi, è data da:20 · C5.2.  Ripetibilità (r)   tenore <  60 mg/l : r = 2,7 mg/ltenore > 60 mg/l : r = 4 mg/l5.3. Riproducibilità (R)   R = 0,114 xi   0,5Xi = concentrazione in mg/l del campione.     30. FERRO 1. PRINCIPIO  DEL  METODI   Metodo di riferimento   Il ferro viene dosato direttamente per spettrofotometria di assorbimento atomico previa opportuna diluizione del vino ed eliminazione dell'alcool. Metodo usuale   Dopo mineralizzazione del vino mediante perossido di idrogeno, il ferro III viene portato allo stato di ferro II e viene quindi dosato grazie alla colorazione rossa che dà con l'ortofenantrolina.2. METODO  DI  RIFERIMENTO  2.1. Reattivi  2.1.1. Soluzione di taratura concentrata di ferro III di 1 g/l.    Utilizzare una soluzione standard del tipo in commercio di 1 g /l. Tale soluzione può essere preparata sciogliendo 8,6341 g di solfato ferrico ammonico [FeNH4(SO4)2 · 12H2O] in acqua distillata leggermente acidificata con acido cloridrico M e portando  il volume ad 1 l.   2.1.2. Soluzione di taratura diluita di ferro di 100 mg/l.2.2. Apparecchiatura  2.2.1. Evaporatore rotante con bagnomaria termoregolato.   2.2.2. Spettrofotometro di assorbimento atomico dotato di un bruciatore alimentato con aria/acetilene.   2.2.3. Lampada a catodo cavo al ferro.2.3. Modo di operare  2.3.1. Preparazione del campione   Eliminare l'alcol del vino per concentrazione del suo volume a circa la metà mediante un evaporatore rotativo (50-60 °C). Riportare al volume iniziale con acqua distillata.    Prima del dosaggio effettuare, se necessario, una diluizione.2.3.2. Taratura   In cinque palloni tarati da 100 ml, porre 1 - 2 - 3 - 4 - 5 ml della soluzione di ferro di 100 mg/l (2.1.2) e portare a 100 ml con acqua distillata. Le soluzioni preparate contengono rispettivamente 1 - 2 - 3 - 4 - 5 mg di ferro per litro.    Conservare queste soluzioni in flaconi di polietilene.2.3.3. Dosaggio   Regolare la lunghezza d'onda a 248,3 nm. Regolare lo zero della scala delle assorbanze con l'acqua distillata. Aspirare direttamente nel bruciatore dello spettrofotometro il campione diluito e quindi le varie soluzioni di taratura preparate al punto  2.3.2. Leggere le assorbanze. Effettuare le determinazioni in doppio.   2.4. Espressione dei risultati  2.4.1. Calcolo   Tracciare la curva di variazione dell'assorbanza in funzione della concentrazione in ferro delle soluzioni di taratura. Riportare il valore medio delle assorbanze ottenute per il campione di vino diluito su tale curva e determinare la concentrazione in  ferro C.    La concentrazione in ferro espressa in mg/l di vino, con una cifra decimale, è data da:C · FF = fattore di diluizione3. METODO  USUALE  3.1. Reattivi  3.1.1. Soluzione di perossido di idrogeno (H2O2) al 30 % (m/v) esente da ferro.   3.1.2. Soluzione 1 M di acido cloridrico (HCl) esente da ferro.   3.1.3. Idrossido di ammonio (NH4OH) (r20 = 0,92 g/ml).   3.1.4. Pietra pomice trattata con acido cloridrico bollente diluito 1:2 e lavata con acqua distillata.   3.1.5. Soluzione di idrochinone (C6H6O2) al 2,5 %, acidificata con 1 ml di acido solforico (r20 = 1,84 g/ml) per 100 ml di soluzione. Conservare tale soluzione in frigorifero in flacone giallo e sostituirla non appena si riscontri la minima traccia di  imbrunimento.   3.1.6. Soluzione di solfito di sodio (Na2SO3) al 20 %, preparata con solfito di sodio e anidro.   3.1.7. Soluzione di ortofenantrolina (C12H8N2. H2O) allo 0,5 % in alcool al 96 % vol.   3.1.8. Soluzione di acetato di ammonio (CH3 COONH4) al 20 % (m/v).   3.1.9. Soluzione di ferro III di 1 g/l di ferro. Utilizzare una soluzione standard disponibile in commercio. Questa soluzione può essere preparata sciogliendo 8,6341 g di solfato ferrico ammonico [NH4Fe(SO4)2 · 12H2O] in 100 ml di soluzione 1M di acido  cloridrico (3.1.2) e portando il volume ad 1 litro con la soluzione 1M di acido cloridrico (3.1.2).   3.1.10. Soluzione di taratura diluita di ferro di 100 mg/l.3.2. Apparecchiatura  3.2.1. Pallone di Kjeldahl da 100 ml.   3.2.2. Spettrofotometro in grado di effettuare misurazioni a 508 nm.3.3. Modo di operare  3.3.1. Mineralizzazione  3.3.1.1. Vino con tenore in zuccheri inferiore a 50 g/l:    Introdurre in un pallone di Kjeldahl 25 ml di vino, 10 ml di soluzione di perossido di idrogeno (3.1.1) ed alcuni granuli di pietra pomice (3.1.4). Concentrare il liquido sino ad un volume di 2-3 ml.     Dopo il raffreddamento, aggiungere al residuo ottenuto, senza bagnare le pareti del pallone, la quantità di idrossido di ammonio (3.1.3) necessaria per alcalinizzare l'ambiente e per precipitare gli idrossidi.    Dopo il raffreddamento, addizionare al liquido alcalino la quantità di soluzione M di acido cloridrico (3.1.2) necessaria a sciogliere il precipitato degli idrossidi e travasare quindi la soluzione ottenuta in una pallone tarato da 100 ml. Lavare  quindi il pallone di Kjeldahl con la soluzione M di acido cloridrico (3.1.2) e portare il volume a 100 ml con la stessa soluzione.3.3.1.2.Mosti e vini il cui tenore in zuccheri è superiore a 50 g/l:   3.3.1.2.1. Tenore in zuccheri compreso tra 50 e 200 g/l:trattare 25 ml del campione di mosto o di vino con 20 ml di soluzione di perossido d'idrogeno (3.1.1).Continuare come descritto in 3.3.1.1.   3.3.1.2.2. Tenore in zuccheri superiore a 200 g/l:trattare i campioni di mosto o di vino secondo il modo di operare 3.3.1.2.1, previa diluizione ad 1/2 o anche ad 1/4.3.3.2. Prova in bianco   Effettuare una prova in bianco con acqua distillata utilizzando lo stesso volume di perossido di idrogeno (3.1.1) utilizzato per la mineralizzazione e seguendo il procedimento descritto al punto 3.3.1.1.3.3.3. Dosaggio   Prelevare 20 ml della soluzione cloridrica del prodotto di mineralizzazione del campione (3.3.1.1) e 20 ml della soluzione cloridrica «prova in bianco» (3.3.2), versandoli in 2 palloni tarati da 50 ml. Aggiungere in ciascun pallone 2 ml della soluzione  di idrochinone (3.1.5), 2 ml della soluzione di solfito (3.1.6) ed 1 ml della soluzione di ortofenantrolina (3.1.7). Lasciare riposare per 15 minuti, per favorire la riduzione da ferro III a ferro II. Aggiungere 10 ml della soluzione di acetato di  ammonio (3.1.8), portare il volume a 50 ml con acqua distillata ed agitare i due palloni tarati. Misurare l'assorbanza della soluzione da dosare a 508 nm regolando lo zero della scala delle assorbanze con la soluzione della prova in bianco.3.3.4.  Taratura   Porre in quattro palloni tarati da 50 ml 0,5 - 1 - 1,5 - 2 ml della soluzione a 100 mg/l di ferro (3.1.10) e 20 ml di acqua distillata; procedere quindi secondo il modo di operare descritto al punto 3.3.3. Queste soluzioni corrispondono rispettivamente  a 50 - 100 - 150 - 200 microgrammi di ferro.3.4. Espressione dei risultati  3.4.1. Calcolo   Tracciare la curva delle variazioni dell'assorbanza in funzione della concentrazione in ferro delle soluzioni di taratura. Riportare l'assorbanza ottenuta per la soluzione da esaminare e determinare la concentrazione di ferro C presente in 20 ml della  soluzione cloridrica di mineralizzazione, corrispondenti a 5 ml del campione da analizzare.    La concentrazione del ferro in mg/l di vino, espressa con una cifra decimale, è data da:200 · C   Se il vino (o il mosto) è stato diluito, la concentrazione del ferro espressa in mg/l con una cifra decimale, è data da:200 · C · FF = fattore di diluizione.     31. RAME 1. PRINCIPIO  DEL  METODO   È basato sull'impiego della spettrofotometria di assorbimento atomico.2. APPARECCHIATURA  2.1. Capsula di platino.   2.2. Spettrofotometro di assorbimento atomico.   2.3. Lampada a catodo cavo al rame.   2.4. Gas di alimentazione: aria acetiline o protossido di azoto/acetilene.3. REATTIVI  3.1. Rame metallo.   3.2. Acido nitrico concentrato (HNO3) 65 % (r20 = 1,38 g/ml).   3.3. Acido nitrico diluito 1/2 (v/v).   3.4. Soluzione di rame a 1 g/l   Utilizzare una soluzione standard di rame del tipo in commercio. Questa soluzione può essere preparata pesando 1,000 g di rame metallico e trasferendo quantitativamente in un matraccio tarato da 1 000 ml. Aggiungere acido nitrico diluito 1/2 (3.3)  nella quantità esattamente necessaria a sciogliere il metallo e quindi 10 ml di acido nitrico concentrato (3.2); portare infine a volume con acqua bidistillata.3.5. Soluzione di rame a 100 mg/l   Prelevare 10 ml della soluzione 3.4 e versarli in un pallone tarato da 100 ml portando a volume con acqua bidistillata.4. PROCEDIMENTO  4.1. Preparazione del campione e dosaggio del rame   Se occorre preparare una diluizione appropriata con acqua bidistillata.4.2. Taratura   Prelevare 0,5 - 1 - 2 ml della soluzione 3.5 (100 mg di rame per litro), porli in matracci tarati da 100 ml portando a volume con acqua bidistillata; le soluzioni ottenute contengono rispettivamente 0,5 - 1 - 2 mg/l di rame.4.3. Dosaggio   Selezionare la lunghezza d'onda a 324,8 nm, regolare lo zero della scala delle assorbanze con acqua bidistillata. Aspirare direttamente il campione diluito nel bruciatore dello spettrofotometro e dopo, una dopo l'altra, le soluzioni di taratura  preparate in 4.2. Leggere le assorbanze. Effettuare le determinazioni in doppio.  5. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI  5.1.  Calcolo   Tracciare la curva di variazione dell'assorbanza in funzione della concentrazione in rame delle soluzioni di taratura.    Riportare il valore dell'assorbanza letta per il campione di vino diluito sulla curva di taratura e rilevare la concentrazione C in mg/l.    Se F è fattore di diluizione, il tenore in rame del vino, espresso in milligrammi per litro con due cifre decimali è: F · C PER LA CONTINUAZIONE DEL TESTO VEDI SOTTO NUMERO : 390R2676.3Osservazioni:a) Le soluzioni per la costruzione della curva di taratura e le diluizioni del campione devono comunque essere scelte sia in funzione della sensibilità dell'apparecchiatura usata che della concentrazione del metallo presente nel campione.     b) Per concentrazioni molto basse di rame nel campione in esame operare nel modo seguente: porre 100 ml del campione in una capsula di platino, evaporare su bagnomaria a 100°C fino a consistenza sciropposa, aggiungere goccia a goccia 2,5 ml di acido  nitrico concentrato (3.2) cercando di coprire tutto il fondo della capsula. Procedere cautamente all'incenerimento del residuo su piastra riscaldante elettrica oppure su piccola fiamma; introdurre quindi la capsula in forno a muffola regolato alla  temperatura di 500 ° ± 25 °C, lasciandola per circa un'ora. Dopo raffreddamento umettare le ceneri con 1 ml di acido nitrico concentrato (3.2), spappolandole con una bacchetta di vetro; evaporare e carbonizzare nuovamente con le stesse modalità. Portare  nuovamente la capsula in muffola per 15 minuti; ripetere almeno tre volte il trattamento con acido nitrico concentrato (3.2). Solubilizzare le ceneri aggiungendo nella capsula 1 ml di acido nitrico concentrato (3.2) e 2 ml di acqua bidistillata;  travasare in un matraccio tarato da 10 ml. Lavare tre volte la capsula con 2 ml per volta di acqua bidistillata, portare infine a volume con acqua bidistillata.     32. CADMIO 1. PRINCIPIO  DEL  METODO   Il cadmio viene dosato direttamente nel vino mediante spettrofotometria di assorbimento atomico senza fiamma.2. APPARECCHIATURA   Tutta la vetreria dev'essere preliminarmente lavata con acido nitrico concentrato caldo (70-80 °C) e sciacquata con acqua bidistillata.   2.1. Spettrofotometro ad assorbimento atomico provvisto di un forno a grafite, di un correttore di rumori di fondo e di un registratore multipotenziometrico.   2.2. Lampada a catodo cavo al cadmio.   2.3. Micropipette di 5 µl munite di ghiere speciali per misure di assorbimento atomico.3. REATTIVI   L'acqua usata deve essere acqua bidistillata in un apparecchio di vetro borosilicato oppure acqua di purezza equivalente. Tutti i reattivi devono essere di purezza analitica riconosciuta e in particolare esenti da cadmio.   3.1. Acido fosforico all'85 % (r20 = 1,71 g/ml).   3.2. Soluzione di acido fosforico ottenuta portando 8 ml di acido fosforico a 100 ml con acqua.   3.3. Soluzione 0,02 M di sale bisodico dell'acido etilendiamminotetracetico (EDTA).   3.4. Soluzione tampone a pH 9, ottenuta sciogliendo, in un pallone tarato da 100 ml, 5,4 g di cloruro di ammonio in qualche millilitro d'acqua, aggiungendo 35 ml di soluzione di idrossido di ammonio (r20 = 0,92 g/ml) diluita al 25 % (v/v) e portando a  volume con acqua.   3.5. Nero eriocromo T: diluizione solida all'1 % (m/m) in cloruro di sodio.3.6. Solfato di cadmio (3CdSO4 · 8H2O).    Il titolo del solfato di cadmio dev'essere verificato operando come segue:pesare esattamente 102,6 mg del campione di solfato di cadmio, immetterlo quantitativamente in un becher con acqua, agitare fino a scioglimento; aggiungere 5 ml di soluzione  tampone a pH 9 e circa 20 mg di nero eriocromo T. Titolare con soluzione di EDTA finché l'indicatore vira al blu.    Il volume di EDTA utilizzato deve essere pari a 20 ml; se esso varia di poco, correggere in conseguenza l'aliquota di solfato di cadmio pesata utilizzata per la preparazione della soluzione di riferimento.3.7.Soluzione di riferimento di cadmio di 1 g  per litro.    Usare una soluzione standard esistente in commercio. Questa soluzione può essere ottenuta sciogliendo 2,2820 g di solfato di cadmio in acqua e portando il volume a 1 litro. Conservare la soluzione in un flacone di vetro borosilicato a tappo  smerigliato.4. MODO  DI  OPERARE  4.1. Preparazione del campione   Diluire il vino 1:2 (v/v) con la soluzione di acido fosforico.  4.2. Preparazione delle soluzioni della curva di taratura   Partendo dalla soluzione di riferimento di cadmio preparare mediante diluizioni successive soluzioni contenenti rispettivamente 2,5 - 5 - 10 - 15 microgrammi di cadmio per litro.4.3. Determinazione  4.3.1. Programma del forno (proposto a titolo indicativo):    Essiccazione a 100 °C per 30 secondi.Mineralizzazione a 900 °C per 20 secondi.Atomizzazione a 2 250 °C per 2-3 secondi.Erogazione di azoto (gas di lavaggio): 6 litri/minuto.    NB: Alla fine dell'operazione, portare la temperatura fino a 2 700 °C per depurare il forno.4.3.2. Misure di assorbimento atomico  Selezionare la lunghezza d'onda a 228,8 nm. Regolare lo zero della scala delle assorbanze con acqua bidistillata. Iniettare nel forno, mediante micropipetta, per tre volte, 5 µl di ciascuna delle soluzioni della gamma di taratura e della soluzione del  campione da analizzare. Registrare le assorbanze misurate. Calcolare il valore medio dell'assorbanza partendo dai risultati relativi alle tre iniezioni.5. ESPRESSIONE DEI RISULTATI  5.1. Modo di calcolo  Tracciare la curva delle variazioni dell'assorbanza in funzione delle concentrazioni di cadmio delle soluzioni della gamma di taratura. La variazione è lineare. Riportare il valore medio dell'assorbanza della soluzione del campione sulla retta di  taratura, dedurne la concentrazione C in cadmio. La concentrazione in cadmio espressa in microgrammi per litro di vino è pari a:2 · C    33. ARGENTO 1. PRINCIPIO  DEL  METODO   È basato sull'impiego della spettrofotometria di assorbimento atomico previa mineralizzazione del campione.2. APPARECCHIATURA  2.1. Capsula di platino.   2.2. Bagnomaria termostato a 100 °C.   2.3. Muffola regolata a 500-525 °C.   2.4. Spettrofotometro di assorbimento atomico.   2.5. Lampada a catodo cavo ad argento.   2.6. Gas di alimentazione: aria acetilene.3. REATTIVI  3.1. Nitrato d'argento (AgNO3).   3.2. Acido nitrico concentrato (HNO3) 65 % (r20 = 1,38 g/ml).   3.3. Acido nitrico diluito 1B10 (v/v).3.4. Soluzione d'argento di 1 g/l.    Usare una soluzione standard di argento del tipo in commercio.Tale soluzione può essere preparata sciogliendo 1,575 g di nitrato d'argento in acido nitrico diluito e completando il volume a 1 000 ml con acido nitrico diluito.3.5. Soluzione d'argento a  10 mg/l.    Diluire 10 ml della soluzione 3.4 a 1 000 ml con acido nitrico diluito.4. PROCEDIMENTO  4.1. Preparazione del campione   Porre 20 ml del campione in capsula di platino, evaporare a secco su bagnomaria bollente a 100 °C. Incenerire in muffola fino a ceneri bianche a 500-525 °C. Riprendere le ceneri con 1 ml di acido nitrico concentrato (3.2), evaporare a bagnomaria a 100  °C, ripetere l'aggiunta di 1 ml di acido nitrico (3.2) e l'evaporazione. Aggiungere 5 ml di acido nitrico diluito (3.3) e scaldare leggermente sino a dissoluzione.4.2. Taratura   Una serie di matracci tarati da 100 ml si pongono 2 - 4 - 6 - 8 - 10 e 20 ml di soluzione 3.5 d'argento di 10 mg/l, si porta a volume con acido nitrico diluito (3.3). Tali soluzioni contengono 0,20 - 0,40 - 0,60 - 0,80 - 1,0 e 2,0 mg/l d'argento.4.3.  Dosaggio   Selezionare la lunghezza d'onda a 328,1 nm. Regolare lo zero della scala delle assorbanze con l'acido nitrico diluito 3.3. Aspirare direttamente nel bruciatore dello spettrofotometro la soluzione del campione ottenuta in 4.1 e dopo, successivamente, le  soluzioni di taratura. Leggere le assorbanze. Effettuare le determinazioni in doppio.5. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI5.1. Calcolo   Tracciare la curva della variazione dell'assorbanza in funzione della concentrazione in argento delle soluzioni di taratura.    Riportare il valore dell'assorbanza letto per il dosaggio (4.1) sulla curva di taratura e ricavare la concentrazione C in mg/l.    Il tenore in argento del vino, espresso in milligrammi per litro, espresso con due cifre decimali, è dato da: 0,25 C.    Osservazione: Le soluzioni di riferimento per la determinazione della curva di taratura, la quantità di campione prelevato e il volume finale di liquido possono essere modificati in funzione della sensibilità dell'apparecchiatura usata.     34. ZINCO 1. PRINCIPIO   Lo zinco viene dosato direttamente nel vino dealcolizzato mediante spettrofotometria di assorbimento atomico.2. REATTIVI   L'acqua impiegata deve essere acqua bidistillata in un apparecchio in vetro borosilicato oppure acqua di purezza equivalente.   2.1. Soluzione di taratura di zinco ad 1 g/l.    Utilizzare una soluzione standard di zinco del tipo in commercio. Tale soluzione può essere preparata sciogliendo 4,3975 g di solfato di zinco (Zn SO4 · 7 H2O) in acqua e portando il volume ad un litro.   2.2. Soluzione standard diluita di zinco a 100 mg/l.3. APPARECCHIATURA  3.1. Evaporatore rotante con bagnomaria termostatato.   3.2. Spettrofotometro di assorbimento atomico con un bruciatore alimentato ad aria/acetilene.   3.3. Lampada a catodo cavo allo zinco.4. MODO  DI  OPERARE  4.1.Preparazione del campione   Eliminare l'alcol riducendo a metà 100 ml di vino posti in un evaporatore rotativo (temperatura: 50-60 °C). Riportare al volume iniziale di 100 ml con acqua bidistillata.4.2. TARATURA   In quattro palloni tarati da 100 ml, porre 0,5 - 1 - 1,5 - 2 ml della soluzione di zinco a 100 mg/l (2.2) e portare al segno di taratura con acqua bidistillata. Le soluzioni di taratura corrispondono rispettivamente a 0,5 - 1 - 1,5· 2 mg di zinco per  litro.4.3. Dosaggio   Regolare la lunghezza d'onda a 213,9 nm. Regolare lo zero della scala delle assorbanze con acqua bidistillata. Aspirare direttamente nel bruciatore dello spettrofotometro il vino e quindi le varie soluzioni di taratura. Leggere le assorbanze.  Effettuare le determinazioni in doppio.5. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI  5.1. Calcolo   Tracciare la curva di variazione dell'assorbanza in funzione della concentrazione in zinco delle soluzioni di taratura. Riportare il valore medio delle assorbanze ottenute per il vino e determinare la concentrazione di zinco in milligrammi per litro di  vino con una cifra decimale.     35. PIOMBO 1. PRINCIPIO  DEL  METODO   Il piombo viene dosato direttamente nel vino mediante spettrofotometria di assorbimento atomico senza fiamma.2. APPARECCHIATURA   Tutta la vetreria dev'essere preliminarmente lavata con acido nitrico concentrato caldo (70-80 °C) e sciacquata con acqua bidistillata.   2.1. Spettrofotometro di assorbimento atomico provvisto di forno a grafite, di correttore di assorbimento non specifico e di registratore multipotenziometrico.   2.2. Lampada a catodo cavo al piombo.   2.3. Micropipette da 5 µl munite di ghiere speciali per misure di assorbimento atomico.3. REATTIVI   Tutti i reattivi devono essere di purezza analitica riconosciuta e in particolare devono essere esenti da piombo. L'acqua utilizzata deve essere acqua bidistillata in un apparecchio di vetro borosilicato o acqua di purezza equivalente.   3.1. Acido fosforico all'85 % (r20 = 1,71 g/ml)  3.2. Soluzione di acido fosforico ottenuta portando 8 ml di acido fosforico a 100 ml con acqua  3.3. Acido nitrico (r20 = 1,38 g/ml)  3.4. Soluzione di piombo da 1 g per litro   Usare una soluzione standard del commercio. Questa soluzione può essere ottenuta sciogliendo 1,600 g di nitrato di piombo II Pb (NO3)2, in acido nitrico diluito all'1 % (v/v) e portando al volume di 1 litro. Conservare la soluzione in un flacone di  vetro borosilicato a tappo smerigliato.4. MODO  DI  OPERARE  4.1. Preparazione del campione   Diluire il vino 1:2 oppure 1:3 con la soluzione di acido fosforico (3.2) secondo la concentrazione presunta di piombo.4.2. Preparazione delle soluzioni di taratura   A partire dalla soluzione di riferimento di piombo 3.4, preparare, mediante diluizioni successive con acqua bidistillata, soluzioni contenenti rispettivamente 25-50-100-150 microgrammi di piombo per litro.4.3. Determinazione  4.3.1. Programma del forno (proposto a titolo indicativo):    Essiccazione a 100 °C per 30 secondi.Mineralizzazione a 900 °C per 20 secondi.  Atomizzazione a 2 250 °C per 2-3 secondi.Flusso di azoto (gas di lavaggio): 6 litri/minuto.    NB: Alla fine dell'operazione portare la temperatura fino a 2 700 °C, onde pulire il forno.4.3.2. Misure   Selezionare la lunghezza d'onda di 217 nm. Regolare lo zero della scala delle assorbanze con acqua bidistillata. Iniettare nel forno programmato, mediante una micropipetta, per tre volte, 5 µl di ciascuna delle soluzioni di taratura e della soluzione  del campione da analizzare. Registrare le assorbanze misurate. Calcolare il valore dell'assorbanza partendo dai risultati relativi alle tre iniezioni.5. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI  5.1. Calcolo   Tracciare la curva delle variazioni dell'assorbanza in funzione delle concentrazioni di piombo delle soluzioni di taratura. La variazione è lineare. Riportare il valore medio dell'assorbanza della soluzione del campione sulla retta di taratura e  ricavare la concentrazione C in piombo. La concentrazione di piombo espressa in microgrammi per litro di vino è pari a:C × Fdove:F = fattore di diluizione    36. FLUORURI 1. PRINCIPIO   Il tenore di fluoruri del vino, addizionato di una soluzione tampone, viene determinato mediante un elettrodo specifico a membrana solida. Il potenziale misurato è proporzionale al logaritmo dell'attività degli ioni fluoruro nel mezzo studiato  conformemente alla relazione:E = Eo ± S log aFdove:E = potenziale dell'elettrodo ionico specifico misurato rispetto all'elettrodo di riferimento nel mezzo studiato.Eo = potenziale standard della cella di misura.S = fattore di Nernst, a 25 °C il fattore  di Nernst teorico è uguale a 59,2 mV.aF= attività degli ioni fluoruro nella soluzione studiata.2. APPARECCHIATURA  2.1. Elettrodo a membrana cristallina specifico dello ione fluoro.   2.2. Elettrodo di riferimento (calomelano oppure Ag/AgCl).   2.3. Millivoltmetro (pHmetro con una graduazione in millivolt), precisione 0,1 mV.   2.4. Agitatore magnetico con piastra isolante per proteggere la soluzione analizzata dal calore del motore. Cilindro agitatore ricoperto di plastica (polietilene o materiale equivalente).   2.5. Becher in plastica, da 30 o da 50 ml e flaconi di plastica (polietilene o materiale equivalente).   2.6. Pipette di precisione (pipette graduate in microlitri o qualsiasi altra pipetta equivalente).3. REATTIVI  3.1. Soluzione madre di fluoruro a 1 g/l   Utilizzare una soluzione standard del commercio a 1 g/l. Questa soluzione può essere preparata sciogliendo 2,210 g di fluoruro di sodio (essiccato 3-4 ore a 105 °C) in acqua distillata. Portare al volume di 1 000 ml con acqua distillata. La soluzione  viene conservata in un flacone di plastica.   3.2. Soluzioni standard di fluoruro di concentrazione appropriata vengono preparate mediante diluizione della soluzione madre con acqua distillata e conservate in flaconi di plastica. Le soluzioni standard il cui tenore di fluoruro è dell'ordine del  mg/l devono essere preparate estemporaneamente.   3.3. Soluzione tampone pH 5,5   A 10 g di acido cicloesandiammino (1,2) tetracetico (CDTA) viene aggiunta acqua (circa 50 ml); aggiungere una soluzione contenente 58 g di cloruro di sodio e 29,4 g di citrato trisodico in 700 ml di acqua distillata. Il CDTA viene sciolto aggiungendo  una soluzione di idrossido di sodio al 32 % (m/v) (circa 6 ml).  Aggiungere infine 57 ml di acido acetico (r20 = 1,05 g/ml) e portare il pH a 5,5 con la soluzione di idrossido di sodio al 32 % (circa 45 ml). Lasciar raffreddare e portare al volume di un litro con acqua distillata.  4. MODO  DI  OPERARE   Osservazione preliminare:È necessario controllare che tutte le soluzioni conservino, durante la misurazione, una temperatura di 25 ± 1 °C (uno scarto di ± 1 °C provoca una modifica di circa ± 0,2 mV).4.1. Metodo diretto   In un becher di plastica introdurre un volume definito di vino e un volume uguale di soluzione tampone.    La soluzione viene agitata in modo omogeneo e moderato. Quando l'apparecchio indicatore è stabile (la stabilità viene ottenuta allorché il potenziale varia al massimo di 0,2-0,3 mV/3 minuti), leggere il valore del potenziale in mV.4.2. Metodo delle  aggiunte   Senza interrompere l'agitazione, il mezzo studiato viene addizionato, mediante pipetta di precisione, di un volume noto di soluzione standard di fluoruro. Quando l'apparecchio indicatore è stabile, leggere il valore del potenziale in mV.    Scegliere la concentrazione della soluzione standard aggiunta come segue:a) raddoppiare o triplicare la concentrazione in fluoruro del mezzo studiato;b) il volume del mezzo studiato deve restare praticamente costante (aumento del volume d 1 %).    La condizione b) semplifica i calcoli (vedi 5).    La concentrazione approssimativa del mezzo studiato viene letta su una retta di taratura tracciata in coordinate semilogaritmiche con soluzioni standard contenenti 0,1 - 0,2 - 0,5 - 1,0 - 2,0 mg/l di fluoruri.    Osservazione: se la concentrazione approssimativa del mezzo studiato supera il campo di concentrazione delle soluzioni standard, diluire il campione.    Esempio:Sia 0,25 mg/l F- il tenore approssimativo del mezzo studiato (volume 20 ml); la concentrazione deve essere maggiorata di 0,25 mg/l. A questo scopo aggiungere, ad esempio alla soluzione, con la pipetta di precisione appropriata, 0,20 ml (= 1 %)  di una soluzione standard contenente 25 mg/l F- oppure 0,050 ml di una soluzione standard da 100 mg/l F-.5. CALCOLI   Il tenore di fluoruri del mezzo studiato, espresso in mg/l, si ottiene con la formula seguente:dove:CF = concentrazione in fluoruro del mezzo studiato (mg/l).Ca = concentrazione del fluoruro aggiunto (mg/l) nel mezzo studiato (Va).Vo = volume iniziale  del mezzo studiato prima dell'aggiunta (ml).Va = volume della soluzione aggiunta (ml).DE = differenza tra i potenziali E1 ed E2 ottenuti ai punti 4.1 e 4.2 (mV).S = fattore di Nernst della soluzione in esame.    Se Va è molto vicino a Vo (vedi 4.2) la formula si semplifica e diventa:  Il valore ottenuto deve essere moltiplicato per il fattore di diluizione derivante dall'aggiunta del tampone.        37. ANIDRIDE  CARBONICA 1.PRINCIPIO  DEI  METODI  1.1. Metodo di riferimento  1.1.1. Vini tranquilli (sovrappressione CO2 d 0,5 · 105 Pa) (11)   ll volume di vino prelevato dal campione, portato a temperatura prossima a O °C, viene versato in un eccesso di soluzione titolata di idrossido di sodio, sufficiente a portare il pH a 10-11. Si titola con una soluzione acida in presenza di anidrasi  carbonica. ll contenuto in CO2 viene ricavato dal volume di soluzione acida impiegato per passare da pH 8,6 (forma bicarbonato) a pH 4,0 (acido carbonico). Una titolazione di riferimento, effettuata nelle stesse condizioni sul vino privato di CO2,  permette di tener conto del volume di soluzione di idrossido di sodio consumato dagli acidi del vino.1.1.2. Vini frizzanti e spumanti   ll campione di vino da analizzare viene portato a temperatura prossima al suo punto di congelamento. Dopo prelevamento di un dato volume, destinato a servire da riferimento dopo eliminazione di CO2, si alcalinizza il resto della bottiglia per fissare  tutta l'anidride carbonica sotto forma di Na2CO3. Si titola con una soluzione acida in presenza di anidrasi carbonica. ll tenore di CO2 viene ricavato dal volume di soluzione acida impiegata per passare da pH 8,6 (forma bicarbonato) a pH 4,0 (acido  carbonico). Una titolazione di riferimento, effettuata nelle stesse condizioni sul vino privato di CO2, permette di tener conto del volume di soluzione di idrossido di sodio consumata dagli acidi del vino.1.2. Metodo usuale: vini frizzanti e spumanti   Metodo manometrico: misurazione della sovrappressione dell'anidride carbonica direttamente nella bottiglia mediante un afrometro.2. METODO  DI  RIFERIMENTO  2.1. Vini tranquilli (sovrappressione dell'anidride carbonica d 0,5 · 105 Pa).2.1.1. Apparecchiatura  2.1.1.1. Agitatore magnetico.   2.1.1.2. pHmetro2.1.2. Reattivi  2.1.2.1. Soluzione titolata di idrossido di sodio (NaOH), 0,1 M.   2.1.2.2. Soluzione titolata di acido solforico (H2SO4), 0,05 M.   2.1.2.3. Soluzione di anidrasi carbonica, a 1 g/l.2.1.3. Modo di operare   Raffreddare a temperatura prossima a O °C tanto il campione di vino quanto la pipetta da 10 ml destinata al suo prelevamento.   Versare in un becher da 100 ml 25 ml di soluzione d'idrossido di sodio (2.1.2.1); aggiungere due gocce di soluzione acquosa di anidrasi carbonica (2.1.2.3). Introdurre 10 ml di vino mediante la pipetta raffreddata a 0 °C.     Porre il becher sull'agitatore magnetico, collocare l'elettrodo e la barretta magnetica e procedere ad agitazione moderata.    Quando il liquido è tornato a temperatura ambiente, titolare lentamente con la soluzione di acido solforico (2.1.2.2) fino a pH 8,6.    Continuare l'aggiunta di acido solforico (2.1.2.2) fino a pH 4,0. Sia n ml il volume utilizzato per passare dal pH 8,6 a 4,0.    Procedere quindi all'eliminazione della CO2 su 50 ml di vino circa, agitando sotto vuoto per tre minuti e riscaldando il recipiente in bagnomaria a 25 °C circa.    Ripetere su 10 ml di vino privato di CO2 le operazioni sopra descritte: sia n ml il volume utilizzato.2.1.4. Espressione dei risultati   1 ml di soluzione titolata di idrossido di sodio 0,1 M corrisponde a 4,4 mg di CO2.    La quantità di CO2, espressa in g per litro di vino, è data dall'espressione:0,44 (n - n).Essa si esprime con due cifre decimali.    Osservazione: Nel caso dei vini a basso contenuto di CO2 (CO2 <  1 g/l), l'aggiunta di anidrasi carbonica per catalizzare l'idratazione di CO2 non è necessaria.2.2. Vini frizzanti e spumanti  2.2.1. Apparecchiatura  2.2.1.1. Agitatore magnetico.   2.2.1.2. pHmetro.2.2.2. Reattivi  2.2.2.1. Soluzione di idrossido di sodio (NaOH), al 50 % (m/m).   2.2.2.2. Soluzione titolata di acido solforico (H2SO4), 0,05 M.   2.2.2.3. Soluzione di anidrasi carbonica a 1 g/l.2.2.3 Modo di operare   Sulla bottiglia di vino da analizzare, tracciare un segno di riferimento al livello del riempimento e raffreddare fino a congelamento incipiente.    Lasciare che la bottiglia si riscaldi leggermente, agitando di continuo, fino a scomparsa dei cristalli di ghiaccio.    Stappare rapidamente, e mettere da parte, in un cilindro graduato, da 45 a 50 ml di vino, che serviranno al dosaggio di riferimento. ll volume esatto (v ml) di questo prelievo sarà determinato leggendolo sul cilindro, dopo il suo ritorno alla  temperatura ambiente.    Appena effettuato il prelevamento, aggiungere 20 ml di soluzione di idrossido di sodio (2.2.2.1) nella bottiglia se questa ha una capacità di 750 ml.    Attendere che il vino sia tornato a temperatura ambiente.     In un becher da 100 ml, introdurre 30 ml di acqua distillata bollita e due gocce della soluzione di anidrasi carboncia (2.2.2.3). Aggiungere 10 ml di vino alcalinizzato.    Porre il becher sull'agitatore magnetico, introdurre l'elettrodo e la barretta magnetica e procedere ad agitazione moderata.    Titolare lentamente con la soluzione di acido solforico (2.2.2.2) fino a pH 8,6.    Proseguire la titolazione con acido solforico (2.2.2.2) fino a pH 4,0. Sia n ml il volume utilizzato fra pH 8,6 e 4,0.    Procedere quindi all'eliminazione della CO2 dai v ml di vino messi da parte per il dosaggio di riferimento, agitando sotto vuoto per tre minuti e riscaldando il recipiente su bagnomaria a 25°C circa. Introdurre 10 ml di vino privato di CO2 in 30 ml di  acqua distillata bollita e aggiungere 2 - 3 gocce di soluzione di idrossido di sodio (2.2.2.1) per portare il pH a 10 - 11. Operare poi nel modo più sopra descritto. Siano n' i ml di acido solforico 0,05 M impiegati.2.2.4. Espressione dei risultati   1 ml della soluzione di acido solforico 0,05 M corrisponde a 4,4 mg di CO2.    Vuotare la bottiglia del vino alcalinizzato in essa contenuto e determinare con l'approssimazione di 1 ml il volume iniziale del vino riempiendola con acqua fino al segno di riferimento: sia V ml.    La quantità di CO2, espressa in g per litro di vino, è data dall'espressione:   ed è espressa con due cifre decimali.2.3. Calcolo della sovrappressione   La sovrappressione a 20 °C, Paph20 espressa in pascals, è data dalla formuladove:Q = tenore di CO2 in g/l di vinoA = titolo alcolometrico del vino a 20 °CS  = tenore in zuccheri in g/l di vinoPatm = pressione atmosferica espressa in pascals3. METODO   USUALE  (VINI  FRIZZANTI  E  VINI  SPUMANTI)  3.1. Apparecchiatura  3.1.1. Afrometro   Lo strumento che consente di misurare la sovrappressione nelle bottiglie di vini frizzanti o spumanti si chiama afrometro. La sua forma è diversa a seconda della chiusura della bottiglia (capsula metallica, tappo a corona, tappo in sughero o in  plastica, vedi figure 1 e 2).    L'apparecchio è graduato in pascal (abbreviazione Pa) (12). È più pratico usare come unità il 10 5 pascal (10 5 Pa) o il kilopascal (kPa).     Esistono diverse classi di afrometro. La classe di un manometro è la precisione della lettura rispetto al fondo scala espressa in percentuale (esempio manometro 1 000 kPa classe 1, significa pressione di utilizzazione massima 1 000 kPa, lettura a ± 10  kPa). Per misure di precisione si raccomanda la classe 1.    Gli afrometri devono essere verificati con regolarità (almeno una volta all'anno).3.2. Modo di operare   La misura deve essere effettuata su bottiglie la cui temperatura sia stabilizzata da almeno 24 ore.    Dopo aver forato la capsula o il tappo, per effettuare la lettura occorre agitare vigorosamente la bottiglia sino ad ottenere una pressione costante.      Figura 1: Afrometro per capsuleFigura 2: Afrometro per tappi 3.3. Espressione dei risultati   La sovrappressione a 20 °C (Paph20) è espressa in pascal (Pa) o in Kilopascal (kPa).    Essa deve essere coerente con la precisione del manometro (esempio: 6,3 105 Pa oppure 630 kPa e non 6,33 105 Pa o 633 kPa per un manometro di classe 1 e fondo scala 1 000 kPa).    Quando la temperatura a cui si effettua la misura è diversa da 20 °C, per riportarla a 20 °C è opportuno effettuare una correzione moltiplicando il valore della pressione misurata per il coefficienteche si ricava dalla tabella 1.4. RELAZIONE  TRA  LA   PRESSIONE  E  LA  QUANTITÀ DI  BIOSSIDO  DI  CARBONIO  CONTENUTO  IN  UN  VINO  SPUMANTE  (13)   A partire dal valore della sovrappressione a 20 °C (Paph20), si calcola la pressione assoluta a 20 °C (Pabs20) con la formula:Pabs20 = Patm + Paph20    dove Patm è la pressione atmosferica espressa in pascal.    La quantità di anidride carbonica contenuta in un vino è data dalle seguenti relazioni:- in litri di CO2 per litro di vino:0,987 · 10 5 Pabs20 (0,86   0,01A) (1   0,00144 S)- in grammi di CO2 per litro di vino:1,951 · 10 5 Pabs20 (0,86   0,01A) (1    0,00144 S) in cui:A è il titolo alcolometrico del vino a 20 °C.S è il tenore in zuccheri del vino, espresso in grammi per litro.   TABELLA  1Rapporto tra la sovrappressione Paph20 di un vino frizzante o spumante a 20 °C e la sovrappressione Papht a una temperatura t     38. DERIVATI  CIANICI 1. PRINCIPIO  DEI  METODI  1.1. Metodo rapido di saggio: controllo dei vini trattati con ferrocianuro di potassio (esacianofenato II di potassio).    Verifica dell'assenza di precipitato di ferrocianuro II ferrico III in sospensione nel deposito.    Verifica dell'assenza di formazione di ferrocianuro (II) ferrico (III) per aggiunta di un sale ferrico al vino acidificato.   Verifica della presenza di ferro precipitandolo per addizione al vino acidulato di una miscela di ferro e ferricianuro alcalini.1.2. Metodo usuale   Dosaggio argentimetrico dell'acido cianidrico totale liberato per idrolisi acida e separato per distillazione.2. METODO  RAPIDO  DI  CONTROLLO  Controllo dei vini trattati con ferrocianuro di potassio.2.1.Apparecchiatura   Occorre avere a disposizione una delle seguenti apparecchiature:   2.1.1. Centrifuga che consenta di applicare una forza centrifuga di 1 200-1 500 g.   2.1.2. Dispositivo di filtrazione su filtro a membrana e filtri a membrana (diametro dei pori 0,45 µm).2.2. Reattivi  2.2.1. Acido cloridrico diluito 1/2 (v/v) ottenuto per diluizione di acido cloridrico, HCl, (r20 = 1,18-1,19 g/ml) esente da ferro.   2.2.2. Soluzione di solfato ferrico ammonico, Fe2(SO4)3 · (NH4)2SO4· 24H2O, al 15 % (m/v).   2.2.3. Soluzione di ferrocianuro di potassio, K4[Fe(CN6)]. 3H2O, al 10 % (m/v).   2.2.4. Soluzione di ferrocianuro di potassio, K3[Fe(CN)6], al 10 % (m/v). Da preparare al momento dell'uso.2.3. Modo di operare  2.3.1. Ricerca delle tracce di ferrocianuroferrico in sospensione   Dopo aver agitato il campione, versare 20 ml di vino in un tubo da centrifuga conica da 30 ml; aggiungere 1 ml di acido cloridrico (2.2.1). Centrifugare per 15 minuti oppure filtrare su filtro a membrana (diametro dei pori 0,45µm). Il centrifugato o il  filtro deve essere completamente privo di particelle blu.2.3.2. Ricerca di tracce di ioni ferrocianuro in soluzione   Aggiungere al surnatante o al filtrato ottenuto dal saggio 2.3.1 una goccia di una soluzione di solfato ferrico ammonico (2.2.2). Dopo aver agitato e fatto riposare per almeno 24 ore, centrifugare per 15 minuti o filtrare su filtro a membrana (diametro  dei pori 0,45µm). Il centrifugato o il filtro deve essere completamente privo di particelle blu di ferrocianuroferrico.2.3.3. Verifica della presenza di ioni ferro nel vino   Versare in una provetta 20 ml di vino, 1 ml di acido cloridrico (2.2.1), una goccia di una soluzione di ferrocianuro di potassio (2.2.3) e una goccia di una soluzione di ferrocianuro di potassio (2.2.4). Entro 30 minuti si deve manifestare una  colorazione o un precipitato di colore blu. Dopo centrifugazione o filtrazione su filtro a membrana (diametro dei pori 0,45µm) seguita da lavaggio del filtro 2 volte con 5 ml di acqua, nel tubo da centrifuga o sul filtro a membrana si deve osservare un  deposito di colore blu.3. METODO  USUALE  3.1. Apparecchiatura  3.1.1. Apparecchiatura di distillazione, costituita da un pallone a fondo rotondo da 500 ml collegato mediante un tubo munito di smeriglio, all'estremità superiore di un refrigerante, tenuto in posizione verticale, la cui lunghezza è di almeno 350 mm.    L'estremità inferiore del refrigerante ha un'allunga terminante con una parte affilata che porta il distillato in fondo a un pallone da 50 ml completamente immerso in acqua gelata.   3.1.2. Bagnomaria termostatato a 100 °C, riscaldato elettricamente.3.2. Reattivi  3.2.1. Acido solforico diluito 1/5 (v/v).    Mescolare con prudenza 200 ml di acido solforico, H2SO4 (r20 =1,84 g/ml a una quantità di acqua sufficiente ad ottenere 1 litro di soluzione).   3.2.2. Cloruro rameico cristallizzato, CuCl2 · 2H2O.   3.2.3. Soluzione di rosso fenolo.    Sciogliere 0,05 g di rosso fenolo in 1,4 ml di una soluzione 0,1 M di idrossido di sodio; portare la soluzione a 1 000 ml.   3.2.4. Soluzione di ioduro di potassio.    Sciogliere 250 g di ioduro di potassio, KI, in una quantità di acqua sufficiente ad ottenere 1 litro di soluzione.   3.2.5. Soluzione 0,001 M di nitrato di argento.    Diluire 10 ml di una soluzione 0,1 M di nitrato di argento, AgNo3, a 1 000 ml dopo avere aggiunto 0,5 ml di acido nitrico concentrato (HNO3, r20 = 1,40  g/ml).   3.2.6. Soluzione di idrossido di sodio 1 M esente da ferro.3.3. Modo di operare   Introdurre 100 ml di vino filtrato (o non filtrato se si vuole dosare anche l'acido cianidrico contenuto nell'eventuale intorbidamento blu), aggiungere circa 5 mg di cloruro rameico (3.2.2) e 10 ml di acido solforico diluito (3.2.1). Nel pallone di  raccolta porre 5 ml di soluzione di idrossido di sodio (3.2.6). Distillare sino a riempire il pallone da 50 ml.    Versare il distillato in un becher da 400 ml posto in bagnomaria a 100 °C e per accelerare l'evaporazione, dirigere sulla superficie del liquido alcalino una corrente d'aria fredda abbastanza forte prodotta da una soffieria. Occorre ridurre il volume a  5 7 ml, operazione che richiede 30 minuti circa (non ridurre mai il volume a meno di 5 ml).    Se occorre, filtrare la soluzione raffreddata raccogliendo il filtrato in una provetta del diametro di 20 mm e della lunghezza di 180 mm oppure travasarla direttamente nella provetta. Lavare il becher ed eventualmente il filtro con alcuni millilitri di  acqua che saranno poi aggiunti nella provetta.    La provetta viene messa su un fondo nero e illuminata lateralmente con un fascio di luce bianca. Il liquido deve essere perfettamente limpido (14).    Aggiungere 2 gocce di soluzione di rosso fenolo (3.2.3) per sensibilizzare il viraggio (15) ed una goccia di soluzione di ioduro di potassio (3.2.4). Titolare con la soluzione 0,001 M di nitrato d'argento (3.2.5) fino ad ottenere intorbidamento debole,  ma stabile. Sia n il volume di soluzione necessario ad ottenere questo risultato.    Preparare una provetta analoga con 5 ml di soluzione di idrossido di sodio (3.2.6), 2 gocce di soluzione di rosso fenolo (3.2.3) (15), una goccia di soluzione di ioduro di potassio (3.2.4) e acqua in quantità sufficiente per ottenere un volume di  liquido identico al precedente. Aggiungere la soluzione 0,001 M di nitrato di argento (3.2.5) in modo da ottenere lo stesso intorbidamento. Sia n' il volume usato (16).3.4. Espressione dei risultati   1 ml di soluzione 0,001 M di nitrato di argento corrisponde a 54 µg di acido cianidrico (HCN).    La quantità di acido cianidrico totale contenuta in 1 l di vino, espressa in milligrammi è: 0,54 (n - n2). Essa viene espressa con due cifre decimali.    Considerare significativi, circa la presenza di composti cianidrici nel vino, solo i saggi per i quali n - n2 è superiore a 0,5 ml.    Quando n - n2 è superiore a 10 ml, ripetere tutte le operazioni usando una soluzione 0,01 M di nitrato di argento.     39. ISOSOLFOCIANATO  DI  ALLILE 1. PRINCIPIO  DEL  METODO   L'isosolfocianato di allile, eventualmente presente nel vino, viene raccolto per distillazione ed individuato per via gascromatografica.2. REATTIVI  2.1. Etanolo assoluto.   2.2. Soluzione standard: soluzione in alcool assoluto di isosolfocianato di allile contenente 15 mg/l di principio attivo.   2.3. Miscela frigorifera costituita da etanolo e ghiaccio secco (temperatura  60 °C).3. APPARECCHIATURA  3.1. Apparecchiatura da distillazione in corrente di azoto come da figura.   3.2. Mantello riscaldante termoregolabile.   3.3. Flussimetro.   3.4. Gascromatografo con rivelatore spettrofotometrico di fiamma munito di filtro selettivo per composti solforati (l = 394 nm) o altro rivelatore adatto a tale determinazione.   3.5. Colonne cromatografiche in acciaio inossidabile, diametro interno 3 mm, lunghezza 3 m, riempite con carbowax 20 M al 10 % su cromosorb WHP 80-100 mesh.   3.6. Microsiringhe da 10 µl.4. MODO  DI  OPERARE   Prelevare 2 l di vino e porli nel pallone da distillazione. Introdurre pochi ml di etanolo (2.1) nei due tubi di raccolta fino a completa immersione della parte porosa per la dispersione dei gas. Raffreddare esternamente i due tubi con la miscela  frigorifera. Collegare il pallone ai tubi di raccolta ed iniziare l'immissione nell'apparecchio di un flusso di azoto di circa 3 l l'ora. Riscaldare il vino a 80 °C regolando opportunamente la temperatura del mantello termoregolabile e raccogliere  complessivamente 45-50 ml di distillato.    Stabilizzare il gascromatografo; a tal fine sono consigliate le seguenti condizioni operative:- temperatura dell'iniettore 200 °C,- temperatura della colonna 130 °C,- gas di trasporto elio con un flusso di 20 ml al minuto.    Introdurre con l'apposita microsiringa una quantità di soluzione standard tale che il picco corrispondente all'isosolfocianato di allile possa essere agevolmente individuato sul gascromatogramma.    Iniettare quindi un'aliquota del distillato e controllare se in corrispondenza del tempo di ritenzione dell'isosolfocianato di allile si ha comparsa di picchi.    Nelle condizioni adottate nella prova, non vi sono normalmente composti naturali del vino interferenti in corrispondenza del tempo di ritenzione della sostanza ricercata.    Apparecchiatura di distillazione in corrente di azoto     40. CARATTERISTICHE  CROMATICHE 1. VINI  E  MOSTI  1.1. Definizione   Per caratteristiche cromatiche di un vino si intende la luminosità e la cromaticità.    La luminosità corrisponde alla trasmittanza. Essa varia in modo inversamente proporzionale all'intensità del colore del vino.    La cromaticità corrisponde alla lunghezza d'onda dominante (che caratterizza la tonalità) e alla purezza.    Convenzionalmente e per motivi pratici, le caratteristiche cromatiche dei vini rossi e rosati vengono dichiarate mediante l'intensità del colore e la tonalità, secondo un procedimento adottato come metodousuale.1.2. Principio dei metodi  1.2.1. Metodo di riferimento   Metodo spettrofotometrico che permette il calcolo dei valori tristimolari e dei coefficienti tricromatici necessari alla specificazione del colore nei termini definiti dalla «Commission Internationale de l'Eclairage (CIE)».1.2.2. Metodo usuale  (applicabile ai vini rossi e rosati)   Metodo spettrofotometrico in cui le caratteristiche cromatiche sono espresse convenzionalmente come segue:    L'intensità è data dalla somma delle assorbanze alle lunghezze d'onda di 420, 520 e 620 nm lette con celle da 1 cm di cammino ottico.    La tonalità del colore è espressa dal rapporto tra l'assorbanza a 420 nm e l'assorbanza a 520 nm.1.3. Metodo di riferimento  1.3.1. Apparecchiatura  1.3.1.1. Spettrofotometro in grado di effettuare misurazioni comprese tra 300 e 700 nm.   1.3.1.2. Celle di vetro, disponibili a coppie, con cammino ottico b pari a 0,1 - 0,2 - 0,5 - 1 - 2 e 4 cm.1.3.2. Modo di operare  1.3.2.1. Preparazione del campione.    Se il vino è torbido, occorre chiarificarlo per centrifugazione.    I vini giovani o spumanti, devono essere liberati dalla maggior parte della loro anidride carbonica mediante agitazione sotto vuoto.1.3.2.2. Misure   Il cammino ottico b delle celle impiegate deve essere scelto in modo che l'assorbanza misurata sia compresa tra 0,3 e 0,7.   A titolo indicativo si consiglia di utilizzare celle da 2 cm (o 4 cm) di cammino ottico per i vini bianchi, 1 cm per i vini rosati e 0,1 (o 0,2 cm) per i vini rossi.    Effettuare le misure spettrofotometriche prendendo come liquido di riferimento, per regolare lo zero della scala delle assorbanze alle lunghezze d'onda 445, 495, 550 e 625 nm, l'acqua distillata posta in una cella avente lo stesso cammino ottico b.    Rilevare per il cammino ottico b le quattro assorbanze ottenute per il vino; siano A445, A495, A550, A625 (con 3 decimali).1.3.3. Calcoli   Rilevare le trasmittanze (T %) corrispondenti riportando i valori delle assorbanze per b cm di cammino ottico sulla tabella I; siano: T445, T495, T550, T625.    - Calcolare i valori tristimolari X, Y e Z, espressi in frazioni decimali:X = 0,42 · T625 + 0,35 · T550 + 0,21 · T445Y = 0,20 · T625 + 0,63 · T550 + 0,17 · T495Z = 0,24 · T495 + 0,94 · T445- Calcolare le coordinate del colore x e y:1.3.4. Espressione  dei risultati  1.3.4.1. La luminosità relativa è data dal valore di Y espresso in percentuale. (Per il nero Y % = 0, per l'incolore Y % = 100).   1.3.4.2. La cromaticità è espressa dalla lunghezza d'onda dominante e dalla purezza. Queste si determinano ricorrendo al diagramma cromatico, che rappresenta il locus di tutti i colori dello spettro, riportato in figura 1. In esso il punto zero  corrisponde alla sorgente di luce bianca impiegata, rappresentata dalla illuminante standard C di coordinate xO = 0,3101 e yO = 0,3163, che rappresenta la luce del giorno mediamente chiara. - Lunghezza d'onda dominante.Tracciare sul diagramma il punto C  di coordinate x ed y. Se il punto C cade all'esterno del triangolo AOB, tracciare prolungandola, la retta che unisce il punto O con il punto C; questa interseca il locus di cui sopra in un punto S che corrisponde alla lunghezza d'onda dominante.Nel caso  in cui il punto C cade all'interno del triangolo AOB, tracciare la retta da C ad O; essa intersecherà il locus in un punto che corrisponde alla lunghezza d'onda del colore complementare del vino. Tale lunghezza d'onda è espressa con il relativo valore  seguito dalla lettera C.- Purezza.Quando il punto C cada all'esterno del triangolo AOB, la purezza è espressa in percentuale dal rapporto:Quando il punto C cada all'interno del triangolo AOC, la purezza è espressa in percentuale dal rapporto: (17)  dove il punto P è il punto d'intersezione della retta OC con la linea delle porpore.Se si conoscono x ed y, la purezza è anche data direttamente dai diagrammi cromatici (figure 2, 3, 4, 5 e 6).   1.3.4.3. Risultati.    La luminosità, la cromaticità (espressa dalla lunghezza d'onda dominante) e la purezza definiscono in modo completo il colore di un vino.    Queste devono essere indicate sul certificato di analisi con il valore del cammino ottico su cui sono state effettuate le misure.4. METODO  USUALE  1.4.1. Apparecchiatura  1.4.1.1. Spettrofotometro in grado di effettuare misurazioni comprese tra 300 e 700 nm.   1.4.1.2. Celle di vetro disponibili in coppia, con cammino ottico b pari a 0,1 - 0,2 - 0,5 e 1 cm.1.4.2. Trattamento preliminare del campione   Se il vino è torbido, chiarificarlo per centrifugazione.    I vini giovani o spumanti devono essere liberati dalla maggior parte dell' anidride carbonica, agitando sotto vuoto.1.4.3. Modo di operare   Il cammino ottico b della cella di misura deve essere scelto in modo che l'assorbanza A sia compresa tra 0,3 e 0,7.    Effettuare le misure spettrofotometriche, per poter regolatore lo zero della scala delle assorbanze dell'apparecchio alle lunghezze d'onda 420, 520 e 620 nm, utilizzando come liquido di riferimento acqua distillata posta in una cella con lo stesso  cammino ottico b.1.4.4. Espressione dei risultati  1.4.4.1. Calcoli.    Calcolare, per 1 cm di cammino ottico, le assorbanze relative alle tre lunghezze d'onda dividendo per b, espresso in centimetri, le assorbanze rilevate. Siano A420, A520, A620.    L'intensità è convenzionalmente data da:I = A420 + A520 + A620Essa viene espressa con tre cifre decimali.    La tonalità è data per convenzione da:Essa viene espressa con tre cifre decimali.   TABELLA I   Trasformazione delle assorbanze in trasmittanze (T %)   Modalità di impiego:Leggere la prima cifra decimale del valore dell'assorbanza nella colonna verticale 1 e la seconda cifra decimale nella riga orizzontale 2.    Leggere il numero in corrispondenza della loro intersezione. Per ottenere la trasmittanza, dividere tale valore per 10 se l'assorbanza è inferiore a 1, per 100 se è compresa tra 1 e 2, per 1 000 se è compresa tra 2 e 3.    Avvertenza: Il valore riportato in ciascuna casella in alto a destra consente di tener conto per interpolazione della terza cifra decimale del valore dell'assorbanza.      Esempio: Assorbanza 0,47 1,47 2,47 3,47T % 33,9 % 3,4 % 0,3 % 0 %Le trasmittanze T % vengono espresse a meno dello 0,1 %.     Figura 1Diagramma di cromaticità rappresentante il locus di tutti i colori dello spettro.     Figura 2Diagramma di cromaticità per i vini rosso vivo e i vini rosso mattone.     Figura 3Diagramma di cromaticità per i vini rosso vivo e i vini rosso mattone.     Figura 4Diagramma di cromaticità per i vini rosso vivo e i vini rosso porpora.     Figura 5Diagramma di cromaticità per i vini rosso vivo e i vini rosso porpora.    Figura 6Diagramma di cromaticità per i vini rosso mattone e i vini rosso porpora.  2. MOSTI  CONCENTRATI  RETTIFICATI  2.1. Principio   Misurazione dell'assorbanza, a 425 nm sotto spessore di 1 cm, del mosto concentrato rettificato la cui concentrazione in zuccheri è stata portata al 25 % (m/m) (25 ° Brix).2.2. Apparecchiatura  2.2.1. Spettrofotometro che consenta di effettuare misure fra 300 e 700 nm.   2.2.2. Celle di vetro, a cammino ottico da 1 cm.   2.2.3. Filtro a membrana con porosità di 0,45 mm.2.3. Modo di operare  2.3.1. Preparazione del campione   Utilizzare la soluzione il cui titolo in zuccheri è del 25 % (m/m) (25 ° Brix) preparata secondo le indicazioni del punto 4.1.2 del capitolo «pH». Filtrarla su filtro a membrana di porosità 0,45 mm.2.3.2. Determinazione dell'assorbanza   Regolare l'assorbanza zero alla lunghezza d'onda 425 nm su una cella di cammino ottico da 1 cm contenente acqua distillata.    Rilevare l'assorbanza A, a questa lunghezza d'onda, della soluzione al 25 % in zuccheri (25 ° Brix), ottenuta al punto 2.3.1, posta in una cella a cammino ottico da 1 cm.2.4. Espressione dei risultati   L'assorbanza a 425 nm del mosto concentrato rettificato in soluzione al 25 % (m/m) in zuccheri (25 ° Brix) è espressa con due cifre decimali.     41. INDICE  DI  FOLIN-CIOCALTEU 1. DEFINIZIONE   L'indice di Folin-Ciocalteu è il risultato che si ottiene applicando il metodo seguente.2. PRINCIPIO   L'insieme dei composti fenolici del vino viene ossidato dal reattivo di Folin-Ciocalteu. Questo è costituito da una miscela di acido fosfotungstico (H3PW12O40) e di acido fosfomolibdico (H3PMo12O40) che si riduce, con l'ossidazione dei fenoli, a una  miscela di ossidi blu di tungsteno (W8O23) e di molibdeno (Mo8O23).    La colorazione blu prodotta ha un assorbimento massimo intorno a 750 nm. Essa è proporzionale al tenore in composti fenolici.3. REATTIVI   I reattivi devono essere di qualità analitica. L'acqua utilizzata deve essere distillata o avere purezza equivalente.3.1. Reattivo di Folin-Ciocalteu   Questo reattivo si trova in commercio pronto per l'uso. Può essere preparato nel modo seguente: sciogliere 100 g tungstato di sodio (Na2WO4 · 2H2O) e 25 g di molibdato di sodio (NaMoO4 · 2H2O) in 700 ml di acqua distillata; aggiungere 50 ml di acido  fosforico all '85 % (r20 = 1,71 g/ml) e 100 ml di acido cloridrico concentrato (r20 = 1,19 g/ml). Portare ad ebollizione in riflusso per 10 ore, aggiungere quindi 150 g di solfato di litio (Li2SO4 · H2O), alcune gocce di bromo e portare nuovamente  all'ebollizione per 15 minuti. Raffreddare e portare ad 1 l con acqua distillata.   3.2. Soluzione al 20 % (m/v) di carbonato di sodio (Na2CO3) anidro.4. APPARECCHIATURA   Comune dotazione di laboratorio, in particolare:   4.1. Palloni tarati da 100 ml.   4.2. Spettrofotometro con lunghezza d'onda a 750 nm.5. MODO  DI  OPERARE  5.1. Vini rossi   In un pallone tarato da 100 ml (4.1), versare nell'ordine: 1 ml di vino diluito al 20 %50 ml di acqua distillata 5 ml di reattivo di Folin-Ciocalteu (3.1)20 ml di soluzione di carbonato di sodio (3.2).    Portare a 100 ml con acqua distillata.    Agitare per omogeneizzare. Attendere 30 minuti che la reazione sia completa. Determinare l'assorbanza a 750 nm per 1 cm rispetto al riferimento preparato con acqua distillata al posto del vino.    Se l'assorbanza letta non ha un valore prossimo a 0,3, è opportuno ricominciare il procedimento, modificando la diluizione del vino in modo da ottenere tale assorbanza.  5.2. Vini bianchi   Operare nelle stesse condizioni, su 1 ml di vino non diluito.5.3. Mosti concentrati rettificati  5.3.1. Preparazione del campione   Utilizzare la soluzione il cui tenore in zuccheri è del 25 % (m/m) (25 ° Brix) preparata secondo le indicazioni del punto 4.1.2, del capitolo «pH».5.3.2. Misura   Operare come descritto nel caso dei vini rossi (5.1) su 5 ml di campione preparato come in 5.3.1 e misurare l'assorbanza rispetto a un bianco preparato con 5 ml di una soluzione al 25 % (m/m) di zucchero invertito.6. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI  6.1. Calcolo   Esprimere il risultato sotto forma di un indice ottenuto moltiplicando l'assorbanza per 100, nel caso dei vini rossi diluiti al 20 % (o per il fattore corrispondente alla diluizione operata) e per 20 nel caso dei vini bianchi. Nel caso dei mosti  concentrati rettificati l'assorbanza deve essere moltiplicata per 16.6.2. Ripetibilità   La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate simultaneamente o rapidamente l'una dopo l'altra dallo stesso analista, non deve essere superiore a 1.    Una buona ripetibilità dei risultati dipende dall'impiego rigorosamente corretto dell'apparecchiatura (palloni tarati e celle).     42. METODI  DI  ANALISI  PARTICOLARI  PER  MOSTI  CONCENTRATI  RETTIFICATI a) CATIONI  TOTALI  1. PRINCIPIO   Si tratta la presa di campione con uno scambiatore di cationi fortemente acido. I cationi vengono scambiati con l'H+ e vengono espressi per differenza tra l'acidità totale dell'effluente e quella della presa di campione.2. APPARECCHIATURA  2.1. Colonna in vetro della lunghezza di circa 300 mm e di 10-11 mm di diametro interno, provvista di un rubinetto.   2.2. pHmetro graduato almeno in decimi di unità pH.   2.3. Elettrodi.- Elettrodo in vetro, da conservare in acqua distillata,- Elettrodo di riferimento al calomelano-cloruro di potassio saturo, da conservare in soluzione satura di cloruro di potassio,- oppure elettrodo combinato da conservare in acqua  distillata.3. REATTIVI  3.1. Scambiatore di cationi fortemente acido, nella forma H +. Prima di utilizzarla far gonfiare la resina immergendola in acqua per una notte.   3.2. Soluzione 0,1 M di idrossido di sodio.   3.3. Indicatore di pH (di carta).4. MODO  DI  OPERARE  4.1. Preparazione del campione   Utilizzare la soluzione ottenuta diluendo il mosto concentrato rettificato al 40 % (m/v) come indicato al punto 5.1.2 del capitolo «Acidità totale».4.2. Preparazione della colonna scambiatrice di ioni   Introdurre nella colonna circa 10 ml di scambiatore di ioni preventivamente gonfieto nella forma H+; lavare la colonna con acqua distillata sino ad eliminazione dell'acidità controllata mediante l'indicatore di carta.4.3. Scambio di ioni   Fare passare attraverso la colonna, alla velocità di una goccia al secondo, 100 ml della soluzione di mosto concentrato rettificato preparata secondo le indicazioni del punto 4.1. Raccogliere l'effluente in un becher. Lavare la colonna con 50 ml di  acqua distillata. Titolare l'acidità dell'effluente (comprese le acque di lavaggio) con la soluzione 0,1 M di idrossido di sodio sino ad ottenere un pH 7 a 20 °C. Il liquido alcalino va aggiunto lentamente agitando in continuazione la soluzione. Sia n  ml il volume di soluzione 0,1 M di idrossido di sodio impiegato.5. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI   I cationi totali vengono espressi in milliequivalenti per chilo di zuccheri totali con una cifra decimale.  5.1. Calcoli   - Acidità dell'effluente espressa in milliequivalenti per chilo di mosto concentrato rettificato:E = 2,5 · n- Acidità totale del mosto concentrato rettificato in milliequivalenti per chilo (vedi «Acidità totale», punto 6.1.2): a.- Cationi totali in  milliequivalenti per chilo di zuccheri totali: P = Tenore percentuale (m/m) in zuccheri totali.b) CONDUTTIVITÀ  1. PRINCIPIO   Misura della conduttività elettrica di una colonna di liquido delimitata da due elettrodi di platino paralleli fra di loro, che costituiscono uno dei lati di un ponte di Wheatstone.    La conduttività varia con la temperatura ed è espressa a 20 °C.2. APPARECCHIATURA  2.1. Conduttimetro per misure di conduttività tra 1 e 1 000 microsiemens per cm.   2.2. Bagnomaria in grado di portare la temperatura dei campioni da analizzare a circa 20 °C (20 ± 2 °C).3. REATTIVI  3.1. Acqua demineralizzata la cui conduttività specifica sia inferiore a 2 microsiemens per cm a 20 °C.   3.2. Soluzione di cloruro di potassio di riferimento.    Sciogliere 0,581 g di cloruro di potassio, KCl, previamente essiccato fino a massa costante alla temperatura di 105 °C, in acqua demineralizzata (3.1). Portare a un litro con acqua demineralizzata (3.1). Tale soluzione ha una conduttività di 1 000  microsiemens per cm a 20 °C. Può essere conservata per non più di 3 mesi.4. MODO  DI  OPERARE  4.1. Preparazione del campione   Utilizzare la soluzione il cui tenore in zuccheri totali è del 25 % (m/m) (25 ° Brix) come indicato al capitolo «pH», al punto 4.1.2.4.2. Determinazione della conduttività   Portare il campione da analizzare a 20 °C per immersione in un bagno d'acqua. Controllare la temperatura con l'approssimazione di 0,1 °C.    Lavare due volte la cella di misura del conduttimetro con la soluzione da esaminare.    Misurare la conduttività espressa in microsiemens per cm.  5. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI   Per la soluzione al 25 % (m/m) (25 ° Brix) del mosto concentrato rettificato, la conduttività è espressa in microsiemens per cm (µS cm 1) a 20 °C, senza cifre decimali.5.1. Calcolo   Se l'apparecchio non è dotato di un compensatore di temperatura, correggere la conduttività misurata mediante la tabella I. Se la temperatura è inferiore a 20 °C, aggiungere la correzione; se la temperatura è superiore a 20 °C, sottrarre la correzione.   TABELLA  I   Correzione della conduttività per temperature diverse da 20 °C, microsiemens cm 1                     ConduttivitàTemperature20,2 19,820,4 19,620,6 19,420,819,221,0 19,021,2 18,821,4 18,621,6 18,421,8 18,222,0 (¹) 18,0 (²) 0000 0 0 0 0 0 0 0 50001 1 1 1 1 2 2 2100011 2 2 3 3 3 4 4150112 3 3 4 5 5 6 7200123 3 4 5 6 7 8 9250123 4 6 7 8 91011300134 5 7 8 9111213350135 6 8 911121415400235 7 91112141618450236 8101214161820500247  91113151820225502571012141719222460035811131618212426(¹) Sottrarre la correzione.  (²) Aggiungere la correzione.c) IDROSSIMETILFURFURALE  1. PRINCIPIO  DEI  METODI  1.1. Metodo colorimetrico   Le aldeidi derivate dal furano, di cui l'idrossimetilfurfurale è la principale, reagiscono con l'acido barbiturico e la paratoluidina per dare un composto rosso che viene dosato per colorimetria a 550 nm.1.2. Metodo per cromatografia liquida ad alta  risoluzione (HPLC)   Separazione su colonna in fase inversa e determinazione a 280 nm.2. METODO  COLORIMETRICO  2.1. Apparecchiatura  2.1.1. Spettrofotometro per misure comprese fra 300 e 700 nm.   2.1.2. Celle in vetro, a cammino ottico da 1 cm.  2.2.Reattivi  2.2.1. Acido barbiturico in soluzione allo 0,5 % (m/v).    Sciogliere 500 mg di acido barbiturico, C4O3N2H4, in acqua distillata riscaldando leggermente in bagnomaria a 100 °; portare a 100 ml con acqua distillata. La soluzione può essere conservata per circa una settimana.2.2.2. Paratoluidina in soluzione al  10 % (m/v).    10 g di paratoluidina, C6H4(CH3)NH2 vengono posti in un pallone tarato da 100 ml, aggiungere 50 ml di isopropanolo, CH3CH(OH)CH3, e 10 ml di acido acetico glaciale, CH3COOH, (r20 = 1,05 g/ml); completare a 100 ml con isopropanolo. Questa soluzione  dev'essere rinnovata ogni giorno.2.2.3. Etanale (CH3CHO) in soluzione acquosa all'1 % (m/v). Da preparare al momento dell'uso.2.2.4. Idrossimetilfurfurale, C6O3H6, in soluzione acquosa di 1 g/l.  Preparare per diluizioni successive delle soluzione contenenti 5 - 10 - 20 - 30 e 40 mg/l. La soluzione a 1 g/l e le relative diluizioni devono essere preparate al momento dell'uso.2.3. Modo di operare  2.3.1. Preparazione del campione   Utilizzare la soluzione ottenuta diluendo il mosto concentrato rettificato al 40 % (m/v) come indicato al punto 5.1.2 del capitolo «Acidità totale». Effettuare il dosaggio su 2 ml di tale soluzione.2.3.2. Dosaggio colorimetrico   Porre in 2 flaconi a e b da 25 ml tappati a smeriglio, 2 ml di campione preparato come indicato al 2.3.1. Aggiungere in ciascun flacone 5 ml di soluzione di paratoluidina (2.2.2); mescolare. Aggiungere nel flacone b(bianco) 1 ml di acqua distillata e  nel flacone a (campione), 1 ml di soluzione di acido barbiturico (2.2.1). Agitare per omogeneizzare. Travasare il contenuto dei flaconi nelle celle dello spettrofotometro a cammino ottico da 1 cm. Dopo aver regolato lo zero della scala delle assorbanze  sul contenuto del flacone balla lunghezza d'onda di 550 nm, osservare la variazione dell'assorbanza del contenuto del flacone a rilevandone il valore massimo A raggiunto nell'intervallo tra 2 e 5 minuti.    I campioni in cui il tenore in idrossimetilfurfurale è superiore ai 30 mg/l devono essere diluiti prima dell'analisi.2.3.3.Determinazione della curva di taratura   Porre, in una serie di due flaconi a e b da 25 ml, 2 ml di ciascuna delle soluzioni di idrometilfurfurale da 5 - 10 - 20 - 30 e 40 mg/l (2.2.4) e trattarli come descritto al punto 2.3.2.    La rappresentazione grafica delle assorbanze in funzione della concentrazione in mg/l dell'idrossimetilfurfurale nelle soluzioni di riferimento è una retta passante per l'origine.2.4. Espressione dei risultati   La concentrazione in idrossimetilfurfurale dei mosti concentrati rettificati è espressa in milligrammi per chilogrammo di zuccheri totali.  2.4.1. Calcolo   La concentrazione C mg/l in idrossimetifurfurale del campione da analizzare si ottiene riportando sulla curva di taratura l'assorbanza A determinata per detto campione.    Concentrazione di idrossimetilfurfurale in milligrammi per chilogrammo di zuccheri totali:P = tenore percentuale in zuccheri totali del mosto concentrato rettificato.   3. METODO  PER  CROMATOGRAFIA  LIQUIDA  AD  ALTA  RISOLUZIONE  3.1. Apparecchiatura  3.1.1. Cromatografo in fase liquida ad alta risoluzione completa di:    - un iniettore a volume variabile (loop) da 5 o 10 µl,- un rivelatore, spettrofotometro per effettuare misure a 280 nm,- una colonna di silice legata con octadecile (ad esempio: Bondapak C18 - Corasil, Waters Ass.),- un registratore, eventualmente un  integratore.Flusso della fase mobile: 1,5 ml/minuto.3.1.2. Dispositivo di filtrazione su membrana (0,45 µm)  3.2. Reattivi  3.2.1. Acqua bidistillata.   3.2.2. Metanolo, CH3OH, distillato o di qualità HPLC.   3.2.3. Acido acetico, CH3COOH (r20 = 1,05 g/ml).   3.2.4. Fase mobile: acqua- metanolo (3.2.2) - acido acetico (3.2.3) previamente filtrati su membrana (0,45 µm), (40- 9- 1 v/v).    Detta fase mobile dev'essere preparata ogni giorno e degassata prima dell'uso.   3.2.5. Soluzione di riferimento di idrossimetilfurfurale a 25 mg/l (m/v).    Versare in un pallone tarato da 100 ml, 25 g pesati esattamente di idrossimetilfurfurale (C6H3O6) e portare a volume con metanolo (3.2.2). Diluire la soluzione al 10 % con metanolo (3.2.2) e filtrarla su membrana (0,45 µm).    Questa soluzione, mantenuta in frigorifero in un flacone di vetro imbrunito e chiuso ermeticamente, si conserva per 2-3 mesi.3.3. Modo di operare  3.3.1. Preparazione del campione   Utilizzare la soluzione ottenuta diluendo il mosto concentrato rettificato al 40 % (m/v) come indicato al capitolo «Acidità totale», punto 5.1.2, filtrata su membrana (0,45 µm).  3.3.2. Determinazione cromatografica   Iniettare nel cromatografo 5 (o 10) µl del campione preparato come indicato al punto 3.3.1 e 5 (o 10) µl della soluzione di riferimento di idrossimetilfurfurale (3.2.5). Registrare il cromatogramma.    Il tempo di ritenzione dell'idrossimetilfurfurale è circa 6-7 minuti.3.4. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI   Il tenore in idrossimetilfurfurale dei mosti concentrati rettificati si esprime in milligrammi per chilogrammo di zuccheri totali.3.4.1. Calcolo   Sia C mg/l, il tenore in idrossimetilfurfurale della soluzione di mosto concentrato rettificato al 40 % (m/v).    Concentrazione dell'idrossimetilfurfurale in milligrammi per chilogrammo di zuccheri totali:P = tenore percentuale (m/m) in zuccheri totali del mosto concentrato retttificato.d) METALLI  PESANTI  1. PRINCIPI  I. Metodo rapido di valutazione dei metalli pesanti.    Nei mosti concentrati rettificati opportunamente diluiti i metalli pesanti sono messi in evidenza dalla colorazione dovuta alla formazione di solfuri. La loro valutazione è effettuata per confronto con una soluzione di riferimento di piombo  corrispondente al tenore massimo ammissibile.II. Determinazione del tenore di piombo per spettrofotometria di assorbimento atomico.    Il chelato formato dal piombo con il pirrolidinditiocarbammato di ammonio viene estratto con il metilisobutilchetone di cui si misura l'assorbanza a 283,3 nm. Si determina quindi il tenore in piombo con il metodo delle aggiunte.2. METODO  RAPIDO  DI   VALUTAZIONE  DEI  METALLI  PESANTI  2.1. Reattivi  2.1.1. Acido cloridrico al 70 % (m/v).    Prelevare 70 g di acido cloridrico, (HCl) (r20 = 1,16   1,19 g/ml) e portare a 100 ml con acqua.2.1.2. Acido cloridrico diluito al 20 % (m/v).    Prelevare 20 g di acido cloridrico, (HCl) (r20 = 1,16   1,19 g/ml) e completare a 100 ml con acqua.2.1.3. Ammoniaca diluita.    Prelevare 14 g di ammoniaca, NH3 (r20 = 0,931   0,934 g/ml) e portare a 100 ml con acqua.  2.1.4. Soluzione tampone a pH 3,5.    Sciogliere 25 g di acetato di ammonio, (CH3COONH4), in 25 ml di acqua ed aggiungere 38 ml di acido cloridrico diluito (2.1.1). Se occorre, aggiustare il pH con l'acido cloridrico diluito (2.1.2) o con ammoniaca diluita (2.1.3) e portare a 100 ml con  acqua.2.1.5. Soluzione di tioacetammide, (C2H5NS), al 4 % (m/v).   2.1.6. Soluzione di glicerolo (C3H8O3) all '85 % (m/v).(nD20° = 1,449   1,455).2.1.7. Reattivo alla tioacetammide   Aggiungere a 0,2 ml di soluzione di tioacetammide (2.1.5), 1 ml della miscela ottenuta con 5 ml di acqua, 15 ml di idrossido di in soluzione sodio 1 M e 20 ml di glicerolo (2.1.6). Riscaldare in bagnomaria a 100 °C per 20 secondi. Preparare al momento  dell'uso.2.1.8. Soluzione di piombo a 0,002 g/l.    Preparare una soluzione a 1 g/l piombo sciogliendo in acqua 0,400 g di nitrato di piombo, Pb (NO3)2, e portare a 250 ml con acqua. Al momento dell'impiego diluire questa soluzione al 2 q (v/v) con acqua in modo da ottenere la soluzione a 0,002 g/l.2.2.  Modo di operare   Diluire 10 g del campione di mosto concentrato rettificato in 10 ml di acqua. Aggiungere 2 ml di soluzione tampone a pH 3,5 (2.1.4); mescolare. Aggiungere 1,2 ml di reattivo alla tioacetammide (2.1.7). Mescolare immediatamente. Preparare la soluzione  di confronto nelle stesse condizioni utilizzando 10 ml di soluzione a 0,002 g/l di piombo (2.1.8).    Dopo 2 minuti l'eventuale colorazione bruna della soluzione di mosto concentrato rettificato non deve essere più intensa di quella della soluzione di confronto.2.3. Calcolo   Il saggio, nelle condizioni descritte, corrisponde ad un tenore massimo ammissibile di metalli pesanti, espresso come piombo, di 2 mg/kg di mosto concentrato rettificato.3. DETERMINAZIONE  DEL  TENORE  DI  PIOMBO  PER  SPETTROFOTOMETRIA  DI   ASSORBIMENTO  ATOMICO  3.1. Apparecchiatura  3.1.1. Spettrofotometro di assorbimento atomico completo di bruciatore alimentato con aria-acetilene.   3.1.2. Lampada a catodo cavo al piombo.3.2. Reattivi  3.2.1. Acido acetico diluito.    Prelevare 12 g di acido acetico glaciale (r20 = 1,05 g/ml) e completare a 100 ml con acqua.   3.2.2. Soluzione di pirrolidinditiocarbammato di ammonio, C5H12N2S2, all' 1 % (m/v).   3.2.3. Metilisobutilchetone, (CH3)2CHCH2COCH3.    3.2.4. Soluzione di piombo allo 0,010 g/l. Diluire all' 1 % (v/v) la soluzione di piombo a 1 g/l (2.1.8).3.3. Modo di operare  3.3.1. Soluzione da esaminare   Diluire 10 g di mosto concentrato rettificato in una miscela a parti uguali di acido acetico diluito (3.2.1) e di acqua e portare a 100 ml con tale miscela.    Aggiungere 2 ml di soluzione di pirrolidinditiocarbammato di ammonio (3.2.2) e 10 ml di metilisobutilchetone (3.2.3). Agitare al riparo dalla luce diretta per 30 secondi. Fare separare i due strati. Utilizzare lo strato di metilsobutilchetone.3.3.2.  Soluzione di riferimento   Preparare tre soluzioni di riferimento contenenti oltre ai 10 g di mosto concentrato rettificato, rispettivamente 1, 2 e 3 ml della soluzione di piombo a 0,010 g/l (3.2.4). Trattarle come la soluzione in esame.3.3.3. Bianco   Preparare un bianco procedendo nelle stesse condizioni descritte al punto 3.3.1 per la soluzione da esaminare ma senza aggiungere il mosto concentrato rettificato.3.3.4. Determinazione   Selezionare la lunghezza d'onda 283,3 nm.    Polverizzare nella fiamma il metilisobutilchetone proveniente dal saggio in bianco e regolare l'assorbanza zero.    Operando sugli estratti determinare le assorbanze corrispondenti alla soluzione in esame ed alle soluzioni di riferimento.3.4. Espressione dei risultati   Esprimere il tenore di piombo in milligrammi per chilogrammo di mosto concentrato rettificato con una cifra decimale.3.4.1. Calcolo   Tracciare la curva che rappresenta la variazione delle assorbanze in funzione della concentrazione di piombo addizionato alle soluzioni di riferimento, ponendo la concentrazione della soluzione da esaminare uguale a zero.    Estrapolare la retta di congiunzione dei punti sino ad incontrare l'asse delle concentrazioni dal lato negativo. La distanza di questo punto dall'origine rappresenta la concentrazione in piombo della soluzione da esaminare.e) DETERMINAZIONE  CHIMICA   DELL'ETANOLO   Questo metodo di dosaggio è utilizzato per la determinazione del titolo alcolometrico dei liquidi leggermente alcolici quali i mosti, i mosti concentrati, i mosti concentrati rettificati.  1. PRINCIPIO   Distillazione semplice del liquido. Ossidazione dell'etanolo del distillato mediante bicromato di potassio. Titolazione dell'eccesso di bicromato con una soluzione di ferro II.2. APPARECCHIATURA  2.1. Utilizzare l'apparecchio di distillazione descritto al punto 3.2. del capitolo «Titolo alcolometrico».3. REATTIVI  3.1. Soluzione di bicromato di potassio   Sciogliere 33,600 g di bicromato di potassio (K2Cr2O7) nella quantità di acqua sufficiente ad ottenere 1 l a 20 °C.    Un millilitro di questa soluzione ossida 7,8924 mg di alcool.3.2. Soluzione di solfato di ferro II e di ammonio   Sciogliere 135 g di solfato di ferro II e di ammonio, FeSO4, (NH4)2SO4 · 6 H2O in acqua, aggiungere 20 ml di acido solforico concentrato, H2SO4 (r20 = 1,84 g/ml), portare ad 1 l con acqua. Questa soluzione, appena preparata, corrisponde all'incirca a  metà del suo volume di soluzione di bicromato. In seguito si ossida lentamente.3.3. Soluzione di permanganato di potassio   Sciogliere 1,088 g di permanganato di potassio, KMnO4, in una quantità di acqua sufficiente per 1 litro.3.4.Acido solforico diluito ½ (v/v)   Aggiungere a 500 ml di acqua lentamente ed agitando 500 ml di acido solforico, H2SO4 (r20 = 1,84 g/ml).3.5. Reattivo all'ortofenantrolina ferrosa   Sciogliere 0,695 g di solfato ferroso (FeSO4 · 7H2O) in 100 ml di acqua, aggiungere 1,485 g di monoidrato di orto-fenantrolina (C12H8N2 · H2O). Riscaldare per favorire la dissoluzione. Questa soluzione, di colore rosso vivo, si conserva molto bene.4.  MODO  DI  OPERARE  4.1. Distillazione   Versare nel pallone di distillazione 100 g del mosto concentrato rettificato e 100 ml di acqua. Raccogliere il distillato in un pallone tarato da 100 ml e portare a volume con acqua.4.2. Ossidazione   In una beuta con tappo smerigliato da 300 ml il cui collo termini con una svasatura in modo da poter sciacquare il collo stesso senza perdite, versare 20 ml di soluzione titolata di bicromato di potassio (3.1), 20 ml di acido solforico diluito ½ (v/v)  (3.4) e agitare. Aggiungere 20 ml di distillato. Tappare la beuta, agitare e lasciare trascorrere almeno 30 minuti agitando di tanto in tanto (beuta «campione»).  4.3. Titolazione   Titolare l'eccesso di bicromato con la soluzione di solfato di ferro II e ammonio (3.2) dopo aver aggiunto 4 gocce di reattivo all'ortofenantrolina (3.5). Arrestare la titolazione quando la colorazione passa dall'azzurro verde al marrone.    Per individuare con maggiore precisione il punto di viraggio, ritornare dal marrone all'azzurro-verde con la soluzione di permanganato di potassio (3.3). Sottrarre un decimo del volume impiegato di questa soluzione dal volume della soluzione di solfato  di ferro II impiegato, sia n tale differenza.    Ripetere lo stesso procedimento titolando in una beuta identica alla precedente le stesse quantità di reattivi sostituendo i 20 ml di distillato con 20 ml di acqua (beuta «bianco»). Sia n2 la differenza.5. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI   L'etanolo è espresso in grammi per chilogrammo di zuccheri totali con una cifra decimale.   5.1. Calcolo   n2 ml di soluzione ferrosa riducono 20 ml di soluzione di bicromato che ossidano 157,85 mg di etanolo puro.    Un millilitro di soluzione di ferro II ha lo stesso potere riducente di:n2   n ml di soluzione di ferro II hanno lo stesso potere riducente di:Etanolo in g/kg di mosto concentrato rettificato:Etanolo in g/kg di zuccheri totali:dove P = tenore  percentuale (m/m) in zuccheri totali.f) MESO-INOSITOLO,  SCILLO-INOSITOLO  E  SACCAROSIO  1. PRINCIPIO  DEL  METODO   Cromatografia in fase gassosa di derivati silanizzati.  2. REAGENTI  2.1. Standard interno: xilitolo (soluzione acquosa di circa 10 g/l aggiunta di una punta di spatola di sodio azide)  2.2. Bistrimetilsililtrifluoroacetamide - BSTFA - (C8H18F3NOSi2)  2.3. Trimetilclorosilano (C3H9ClSi)  2.4. Piridina p. a. (C5H5N)  2.5. Meso-inositolo (C6H12O6)3. APPARECCHIATURA  3.1. Gascromatografo dotato di:   3.2. Colonna capillare (per esempio in silice fusa, OV 1, spessore del film di 0,15 µ, lunghezza di 25 m e diametro interno di 0,3 mm).    Condizioni di lavoro: fase di trasporto: idrogeno o elio- flusso del gas di trasporto: circa 2 ml/minuto,- temperatura dell'iniettore e del rivelatore: 300 °C,- programmazione di temperatura: 1 minuto a 160 °C, 4 °C/minuto fino a 260 °C, isoterma a 260  °C per 15 minuti,- rapporto di splittaggio: circa 1 a 20.   3.3. Integratore.   3.4. Siringa micrometrica da 10 µl.   3.5. Micropipette da 50, 100 e 200 µl.   3.6. Fiale da 2 ml con tappo teflonato.   3.7. Stufa.4. MODO  DI  OPERARE   Circa 5 g di MCR, esattamente pesati in un matraccio da 50 ml sono aggiunti di 1 ml di soluzione standard di xilitolo (2.1) e portati a volume con acqua. Dopo omogeneizzazione del campione si prelevano 100 µl di soluzione che si pongono in fiala (3.6)  e si portano a secchezza sotto leggera corrente d'aria, previa eventuale aggiunta di 100 µl di etanolo assoluto per facilitare l'evaporazione.    Il residuo si scioglie accuratamente in 100 µl di piridina (2.4), si aggiungono 100 µl di bis-trimetilsililtrifluoroacetamide (2.2) e 10 µl di trimetilclorosilano (2.3), si sigilla la fiala con tappo teflonato e si pone in stufa a 60 °C per un'ora.    Si prelevano 0,5 µl del limpido iniettando ad ago vuoto e caldo con lo splittaggio sopraindicato.5. CALCOLO  DEI  FATTORI  DI  RISPOSTA  5.1. Si prepara una soluzione contenente:glucosio 60 g/l, fruttosio 60 g/l, meso-inositolo 1 g/l e saccarosio 1 g/l.Si pesano 5 g di detta soluzione e si procede come al punto 4. Si calcolano dal cromatogramma ottenuto i fattori di risposta del  meso-inositolo e del saccarosio rispetto allo xilitolo.  Per lo scillo-inositolo, non disponibile in commercio, che ha un tempo di ritenzione compreso fra l'ultimo picco delle forme anomeriche del glucosio e quello del meso-inositolo (vedi figura allegata), si usa lo stesso fattore di risposta ottenuto per il  meso-inositolo.6. ESPRESSIONE  DEI  RISULTATI  6.1. Il meso-inositolo e lo scillo-inositolo si esprimono in mg/kg di zuccheri totali. Il saccarosio si esprime in g/kg di mosto.     Figura: Cromatogramma in fase gassosa del meso-inositolo, dello scillo-inositolo e del saccarosio.  (1)Si può usare qualsiasi picnometro avente caratteristiche equivalenti. (2)Al punto 6 del presente capitolo si riporta un esempio numerico. (3)Al punto 6 del presente capitolo si riporta un esempio numerico. (4)Il tenore in zucchero è  espresso come zucchero invertito. (5)Il tenore in zucchero è espresso come zucchero invertito. (6)Esempio: per un titolo massico del 12 %: p = 0,12. (7)Prima di effettuare questo calcolo, la densità relativa (o la massa volumica) del vino, misurata nel  modo sopra indicato, dev'essere corretta dall'azione dell'acidità volatile secondo la formula:  dv = d2020   0,0000086 a oppure rv = r20   0,0000086 a nella quale a rappresenta la quantità di acidità volatile espressa in milliequivalenti per litro. (8)Questi valori sono dati in attesa della costituzione di una banca dati comunitaria. (9)Questi relazi sono dati in ottese della costituzione di una banca  dati comunitaria. (10)Una delle denominazioni commerciali è «norite». (11)105 pascal (Pa) = 1 bar. (12)1 pascal (Pa) = 1 N/m² = 10 5 bar. (13)Si trascurano gli altri gas (O2, N2, ecc.), presenti in quantità troppo piccole per avere un'influenza sulla  sovrappressione. (14)Alcuni vini (liquorosi, ecc.) danno un distillato non limpido anche se filtrato. Occorre allora metterlo in un pallone da distillazione da 200 ml e portario a 30 ml con acqua e distillarlo ancora alcalino gettando i primi 15 ml  circa di distillato. Raffreddare, acidificare con circa 5 ml di acido solforico diluito e riprendere la distillazione raccogliendo il distillato su 5 ml di soluzione M di idrossido di sodio. Distillare circa 5 ml di liquido che allora sarà limpido.  (15)Questa aggiunta è facoltativa. Alcuni osservano meglio la comparsa dell'intorbidamento in una soluzione rosa che in una incolore. (16)n' è uguale a 0,05 o 0,1 ml se il volume d'acqua impiegato è inferiore a 10 ml. Perché il viraggio sia sensibile  occorre un volume quanto più piccolo possibile, per cui occorre evitare ogni possibile causa di diluizione durante l'operazione principale. (17)Tale distanza va misurate nel verso OC.