CELEX: 31973L0046
Language: el
Date: 1972-12-05 00:00:00
Title: Τετάρτη οδηγία 73/46/ΕΟΚ της Επιτροπής της 5ης Δεκεμβρίου 1972 περί καθορισμού κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών

Avis juridique important

|

31973L0046

Τετάρτη οδηγία 73/46/ΕΟΚ της Επιτροπής της 5ης Δεκεμβρίου 1972 περί καθορισμού κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών  

Επίσημη Εφημερίδα αριθ. L 083 της 30/03/1973 σ. 0021 - 0034 Φινλανδική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 3 τόμος 5 σ. 0115  Ελληνική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 03 τόμος 9 σ. 0114  Σουηδική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 3 τόμος 5 σ. 0115  Ισπανική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 03 τόμος 6 σ. 0230  Πορτογαλική ειδική έκδοση : Κεφάλαιο 03 τόμος 6 σ. 0230 

++++ΤΕΤΑΡΤΗ ΟΔΗΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ  της 5ης Δεκεμβρίου 1972  περί καθορισμού κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών  ( 73/46 / ΕΟΚ )  Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΙΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ ,  Εχοντας υπόψη :  τη συνθήκη περί ιδρύσεως της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινότητος ,  την οδηγία του Συμβουλίου της 20ης Ιουλίου 1970 περί εισαγωγής κοινοτικών τρόπων λήψεων δειγμάτων και μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών ( 1 ) , όπως τροποποιήθηκε με την οδηγία 72/275 / ΕΟΚ της 20ης Ιουλίου 1972 ( 2 ) , και ιδίως το άρθρο 2 ,  Εκτιμώντας :  ότι η ανωτέρω οδηγία προβλέπει ότι οι επίσημοι έλεγχοι των ζωοτροφών για να διαπιστωθεί αν οι όροι , οι οποίοι έχουν καθορισθεί δυνάμει νομοθετικών , κανονιστικών ή διοικητικών διατάξεων , για την ποιότητα και τη σύνθεση των ζωοτροφών τηρούνται κατά τους κοινοτικούς τρόπους λήψεως δειγμάτων και τις κοινοτικές μεθόδους αναλύσεως   ότι οι οδηγίες της Επιτροπής 71/250 / ΕΟΚ , 71/393 / ΕΟΚ και 72/199 / ΕΟΚ της 15ης Ιουνίου 1971 ( 3 ) , της 18ης Νοεμβρίου 1971 ( 4 ) και της 27ης Απριλίου 1972 ( 5 ) , έχουν ήδη καθορίσει ορισμένο αριθμό κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως  ότι η πρόοδος της εργασίας που έχει γίνει από τότε καθιστά αναγκαία την καθιέρωση τετάρτης σειράς μεθόδων   ότι τα προβλεπόμενα στην παρούσα οδηγία μέτρα είναι σύμφωνα με τη γνώμη της Μόνιμης Επιτροπής Ζωοτροφών ,  ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΟΔΗΓΙΑ :  Αρθρο 1  Τα Κράτη Μέλη καθορίζουν ότι οι αναλύσεις για τους επισήμους ελέγχους των ζωοτροφών σχετικά με τις περιεκτικότητες σε υγρασία των ζωικών και φυτικών λιπών και ελαίων , καθώς και τις περιεκτικότητες σε μαγνήσιο και σε ινώδεις ουσίες των ζωοτροφών διενεργούνται κατά τις μεθόδους οι οποίες περιγράφονται στο παράρτημα Ι της παρούσας οδηγίας .  Οι γενικές διατάξεις οι οποίες αναφέρονται στο μέρος Ι ( εισαγωγή ) του παραρτήματος της πρώτης οδηγίας της Επιτροπής 71/250 / ΕΟΚ της 15ης Ιουνίου 1971 , εφαρμόζονται στις μεθόδους οι οποίες περιγράφονται στο παράρτημα Ι της παρούσας οδηγίας .  Αρθρο 2  Τα Κράτη Μέλη καθορίζουν ότι οι αναλύσεις για τους επισήμους ελέγχους των ζωοτροφών σχετικά με τις περιεκτικότητες αυτών σε ρητινόλη ( βιταμίνη Α ) , θειαμίνη ( ανευρίνη , βιταμίνη Β1 ) , ασκορβικό οξύ και δεϋδρο - ασκορβικό οξύ ( βιταμίνη C ) , διενεργούνται κατά τις μεθόδους οι οποίες περιγράφονται στο παράρτημα ΙΙ της παρούσας οδηγίας .  Οι γενικές διατάξεις οι οποίες αναφέρονται στο μέρος Ι ( εισαγωγή ) του παραρτήματος της πρώτης οδηγίας της Επιτροπής 71/250 / ΕΟΚ της 15ης Ιουνίου 1971 , εκτός του μέρους το οποίο αναφέρεται στην προετοιμασία του προς ανάλυση δείγματος , εφαρμόζονται στις μεθόδους οι οποίες περιγράφονται στο παράρτημα ΙΙ της παρούσας οδηγίας .  Αρθρο 3  Τα Κράτη Μέλη θέτουν σε ισχύ την 1η Ιανουαρίου 1974 το αργότερο τις αναγκαίες νομοθετικές , κανονιστικές ή διοικητικές διατάξεις για να συμμορφωθούν με τις διατάξεις της παρούσας οδηγίας . Ενημερώνουν αμέσως περί αυτού την Επιτροπή .  Αρθρο 4  Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα Κράτη Μέλη .  Εγινε στις Βρυξέλλες , στις 5 Δεκεμβρίου 1972 .  Για την Επιτροπή  Ο Πρόεδρος  S.L . MANSHOLT  ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι  1 . ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΟΣ ΣΕ ΥΓΡΑΣΙΑ ΤΩΝ ΖΩΙΚΩΝ ΚΑΙ ΦΥΤΙΚΩΝ ΛΙΠΩΝ ΚΑΙ ΕΛΑΙΩΝ  1 . Αντικείμενο και τομέας εφαρμογής  Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της περιεκτικότητος σε υγρασία ( ύδωρ και άλλες πτητικές ουσίες ) των ζωικών και φυτικών λιπών και ελαίων .  2 . Αρχή  Το δείγμα υφίσταται ξήρανση σε 103 ° C μέχρι σταθερού βάρους . Η απώλεια βάρους προσδιορίζεται διά ζυγίσεως .  3 . Συσκευές  3 . 1 . Υποδοχέας ( κάψα ) επιπέδου πυθμένος από ανθεκτικό σε οξείδωση υλικό , διαμέτρου 8 έως 9 cm και ύψους περίπου 3 cm .  3 . 2 . Υδραργυρικό θερμόμετρο με ενισχυμένο βολβό και θάλαμο διαστολής στο άνω άκρο , διαβαθμισμένο μεταξύ 80 ° C περίπου έως 110 ° C τουλάχιστον , μήκους 10 cm περίπου .  3 . 3 . Αμμόλουτρο ή θερμαινόμενη ηλεκτρική πλάκα .  3 . 4 . Ξηραντήρας που περιέχει δραστικό αφυδατικό μέσο .  3 . 5 . Αναλυτικός ζυγός .  4 . Τρόπος εργασίας  Ζυγίζεται ποσότητα δείγματος 20 g περίπου , με προσέγγιση 1 mg , ομογενοποιείται εντός του ξηρού υποδοχέα ( 3.1 ) , του οποίου έχει ληφθεί το απόβαρο και ο οποίος περιέχει το θερμόμετρο ( 3.2 ) . Θερμαίνεται επί του αμμολούτρου ή επί της θερμαινομένης πλακός ( 3 . 3 ) , ανακινώντας σταθερά με το θερμόμετρο έτσι ώστε η θερμοκρασία να ανέλθει στους 90 ° C εντός 7 περίπου λεπτών .  Μειώνεται η ένταση της θερμάνσεως , ανάλογα με τη συχνότητα ανόδου των φυσαλλίδων από τον πυθμένα του υποδοχέα . Η θερμοκρασία δεν πρέπει να υπερβεί τους 105 ° C . Συνεχίζεται η ανακίνηση αποξύνοντας τον πυθμένα του υποδοχέα μέχρι να παύσουν να δημιουργούνται φυσαλλίδες .  Για να εξασφαλισθεί η πλήρης απομάκρυνση της υγρασίας , επαναλαμβάνεται πολλές φορές η θέρμανση στους 103 ° C ± 2 ° C , με ψύξη στους 93 ° C μεταξύ των διαδοχικών θερμάνσεων . Ακολούθως αφήνεται να ψυχθεί εντός του ξηραντήρος ( 3 . 4 ) μέχρι θερμοκρασίας δωματίου και ζυγίζεται . Επαναλαμβάνεται η εργασία αυτή μέχρις ότου η απώλεια μάζας μεταξύ δύο διαδοχικών ζυγίσεων να μην υπερβαίνει τα 2 mg .  Σημείωση : Αύξηση της μάζας του δείγματος κατόπιν επανειλημμένων θερμάνσεων δείχνει οξείδωση του λίπους . Στην περίπτωση αυτή το αποτέλεσμα υπολογίζεται από τη ζύγιση η οποία διενεργείται αμέσως πριν αρχίσει να αυξάνεται η μάζα .  5 . Υπολογισμός των αποτελεσμάτων  Η επί τοις εκατό περιεκτικότητα σε υγρασία του δείγματος δίδεται από τον τύπο :  ( Μ1 - Μ2 )  100 / Μ0  όπου :  Μ0 = μάζα , σε γραμμάρια , της ποσότητος του δείγματος .  Μ1 = μάζα , σε γραμμάρια , του υποδοχέα και του περιεχομένου του πριν από τη θέρμανση .  Μ2 = μάζα , σε γραμμάρια , του υποδοχέα και του περιεχομένου μετά τη θέρμανση .  Αποτελέσματα μικρότερα των 0,05 % πρέπει να καταχωρούνται με την ένδειξη " μικρότερα των 0,05 % " .  Επαναληπτικότητα  Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παραλλήλων προσδιορισμών που έγιναν στο ίδιο δείγμα δεν πρέπει να υπερβαίνει το 0,05 % , σε απόλυτη τιμή .  2 . ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΜΑΓΝΗΣΙΟΥ  - με φασματοφωτομετρία ατομικής απορροφήσεως -  1 . Αντικείμενο και τομέας εφαρμογής  Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό του μαγνησίου στις ζωοτροφές . Ενδείκνυται ιδιαίτερα για τον προσδιορισμό των περιεκτικοτήτων σε μαγνήσιο που είναι μικρότερες του 5 % .  2 . Αρχή  Το δείγμα αποτεφρώνεται και διαλύεται μέσα σε αραιό υδροχλωρικό οξύ . Εφ ' όσον δεν περιέχει οργανικές ουσίες διαλύεται απευθείας μέσα σε αραιό υδροχλωρικό οξύ . Το διάλυμα αραιώνεται και η περιεκτικότητα σε μαγνήσιο προσδιορίζεται με φασματοφωτομετρία ατομικής απορροφήσεως στα 285,2 nm , διά συγκρίσεως με πρότυπα διαλύματα .  3 . Αντιδραστήρια  3 . 1 . Υδροχλωρικό οξύ p.a . d : 1,16 .  3 . 2 . Υδροχλωρικό οξύ p.a . d : 1,19 .  3 . 3 . Μαγνήσιο σε ταινία ή σε σύρμα ή θειικό μαγνήσιο MgSO4  7 H2O a.p . αποξηραμένο σε κενό , σε θερμοκρασία δωματίου .  3 . 4 . Διάλυμα άλατος στροντίου ( χλωριούχου ή νιτρικού ) 2,5 % ( w/v ) σε στρόντιο ( = 76,08 g SrCl2  6 H2O p.a . , ή 60  38 g Sr ( NO3 ) 2 p.a . ) .  3 . 5 . Πρότυπο διάλυμα μαγνησίου : ζυγίζεται 1 g μαγνησίου ( 3 . 3 ) , με προσέγγιση 1 mg αφού προηγουμένως απαλλαγεί προσεκτικά από το επίστρωμα του οξειδίου του , ή αντίστοιχη ποσότητα θειικού μαγνησίου ( 3 . 3 ) . Εισάγεται σε ογκομετρική φιάλη των 1 000 ml , προστίθενται 80 mg υδροχλωρικού οξέος ( 3 . 1 ) , αφήνεται να διαλυθεί και συμπληρώνεται μέχρι 1 000 ml , προστίθενται 80 mg υδροχλωρικού οξέος ( 3 . 1 ) , αφήνεται να διαλυθεί και συμπληρώνεται μέχρι 1 000 ml με ύδωρ . 1 ml διαλύματος αυτού περιέχει 1 000 mg μαγνησίου .  4 Συσκευές  4 . 1 . Χωνευτήρια αποτεφρώσεως από πλατίνα , χαλαζία ή πορσελάνη .  4 . 2 . Ηλεκτρικός κλίβανος με θερμοστάτη .  4 . 3 . Φασματοφωτόμετρο ατομικής απορροφήσεως .  5 . Τρόπος εργασίας  5 . 1 . Παρασκευή του διαλύματος του δείγματος  5 . 1 . 1 Ζωοτροφές αποτελούμενες αποκλειστικά από ανόργανες ουσίες  Ζυγίζονται 5 g δείγματος με προσέγγιση 1 mg και εισάγονται εντός ογκομετρικής φιάλης των 500 ml με 250 έως 300 ml ύδατος . Προστίθενται 40 ml υδροχλωρικού οξέος ( 3 . 1 ) , φέρεται σε βρασμό και διατηρείται το υγρό σε ήπιο βρασμό επί 30 λεπτά . Αφήνεται να ψυχθεί , συμληρώνεται ο όγκος με ύδωρ , ομογενοποιείται και διηθείται σε ξηρό υάλινο ποτήρι ζέσεως με ξηρό πτυχωτό ηθμό . Απορρίπτονται τα πρώτα 30 ml του διηθήματος . Παρουσία διοξειδίου του πυριτίου κατεργάζονται 5 g του δείγματος με επαρκή ποσότητα ( 15 μέχρι 30 ml ) υδροχλωρικού οξέος ( 3 . 2 ) και εξατμίζεται μέχρι ξηρού σε υδρόλουτρο . Συνεχίζεται η διαδικασία , όπως υποδεικνύεται στην 5 . 1 . 2 από την τρίτη φράση και μετέπειτα .  5 . 1 . 2 Ζωοτροφές αποτελούμενες κυρίως από ανόργανες ουσίες .  Ζυγίζονται 5 g δείγματος με προσέγγιση 1 mg εντός χωνευτηρίου και αποτεφρώνονται σε 550 ° C στον ηλεκτρικό κλίβανο , μέχρι να ληφθεί τέφρα απαλλαγμένη ανθρακωδών σωματιδίων . Για την απομάκρυνση του διοξειδίου του πυριτίου προστίθεται στην τέφρα επαρκής ποσότητα ( 15 μέχρι 30 ml ) υδροχλωρικού οξέος ( 3 . 2 ) και εξατμίζεται μέχρι ξηρού σε υδρόλουτρο . Αποξηραίνεται ακολούθως επί μία ώρα εντός πυριαντηρίου στους 105 ° C . Επαναλαμβάνεται η κατεργασία του υπολείμματος με 10 ml υδροχλωρικού οξέος ( 3 . 1 ) και μεταφέρεται με τη χρήση θερμού ύδατος εντός ογκομετρικής φιάλης των 500 ml . Φέρεται σε βρασμό , αφήνεται να ψυχθεί και συμπληρώνεται ο όγκος με ύδωρ . Ομογενοποιείται και διηθείται σε ξηρό υάλινο ποτήρι ζέσεως , με ξηρό πτυχωτό ηθμό . Απορρίπτονται τα πρώτα 30 ml του διηθήματος .  5 . 1 . 3 Ζωοτροφές αποτελούμενες κυρίως από οργανικές ουσίες .  Ζυγίζονται 5 g δείγματος με προσέγγιση 1 mg εντός χωνευτηρίου και αποτεφρώνονται στον κλίβανο , στους 550 ° C , μέχρι να ληφθεί τέφρα απαλλαγμένη ανθρακωδών σωματιδίων . Επαναλαμβάνεται η κατεργασία της τέφρας με 5 ml υδροχλωρικού οξέος ( 3 . 2 ) , εξατμίζεται μέχρι ξηρού σε υδρόλουτρο και ξηραίνεται ακολούθως επί μία ώρα εντός πυριαντηρίου στους 105 ° C , προς αδιαλυτοποίηση του διοξειδίου του πυριτίου . Επαναλαμβάνεται η κατεργασία του υπολείμματος με 5 mg υδροχλωρικού οξέος ( 3 . 1 ) , και μεταφέρεται με τη χρήση θερμού ύδατος εντός ογκομετρικής φιάλης των 250 ml , φέρεται σε βρασμό , αφήνεται να ψυχθεί και συμπληρούται ο όγκος με ύδωρ . Ομογενοποιείται και διηθείται σε ξηρό υάλινο ποτήρι ζέσεως  με ξηρό πτυχωτό ηθμό . Απορρίπτονται τα πρώτα 30 ml του διηθήματος .  5 . 2 Μέτρηση της ατομικής απορροφήσεως  Παρασκευάζονται , διά αραιώσεως του προτύπου διαλύματος ( 3 . 5 ) δι ' ύδατος , τουλάχιστον 5 διαλύματα αναφοράς με αυξανόμενες συγκεντρώσεις , που εκλέγονται συναρτήσει της βελτίστης ( optimum ) ζώνης μετρήσεων του φασματοφωτομέτρου . Προστίθενται σε κάθε διάλυμα 10 ml διαλύματος άλατος στροντίου ( 3 . 4 ) και ακολούθως συμπληρώνεται ο όγκος μέχρις 100 ml με ύδωρ . Αραιώνεται με ύδωρ μέρος της ποσότητος του ληφθέντος διηθήματος στην 5 . 1 . 1 , 5 . 1 . 2 ή 5 . 1 . 3 κατά τρόπο επιτρέποντα την επίτευξη συγκεντρώσεως μαγνησίου η οποία να ευρίσκεται μέσα στα όρια της συγκεντρώσεως των διαλυμάτων αναφοράς . Η συγκέντρωση του υδροχλωρικού οξέος του διαλύματος αυτού δεν πρέπει να υπερβαίνει το 0,4 Ν . Προστίθενται 10 ml διαλύματος άλατος στροντίου ( 3,4 ) και ακολούθως συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι 100 ml δι ' ύδατος . Μετράται η απορρόφηση του προς προσδιορισμό διαλύματος και των διαλυμάτων αναφοράς σε μήκος κύματος 285,2 nm .  6 . Υπολογισμός των αποτελεσμάτων  Η ποσότητα μαγνησίου του δείγματος υπολογίζεται από τα διαλύματα αναφοράς . Το αποτέλεσμα εκφράζεται επί τοις εκατό του δείγματος .  Επαναληπτικότητα  Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παραλλήλων προσδιορισμών που έγιναν στο ίδιο δείγμα δεν πρέπει να υπερβαίνει το 5 % , σε σχετική τιμή .  3 . ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΙΝΩΔΩΝ ΟΥΣΙΩΝ  1 . Αντικείμενο και τομέας εφαρμογής  Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό των εντός των ζωοτροφών οργανικών υλών , των ελευθέρων λιπών και αδιαλύτων σε όξινα ή αλκαλικά μέσα , που συμβατικά ονομάζονται ινώδεις ουσίες .  2 . Αρχή  Το δείγμα , ενδεχομένως απολιπανθέν , κατεργάζεται διαδοχικά με ζέοντα διαλύματα θειικού οξέος και υδροξειδίου του νατρίου καθορισμένης συγκεντρώσεως . Το υπόλειμμα διαχωρίζεται διά διηθήσεως παρουσία αμιάντου , εκπλύνεται , ξηραίνεται , ζυγίζεται και αποτεφρώνεται στους 900 ° C . Η απώλεια βάρους που προκύπτει από την αποτέφρωση αντιστοιχεί στις ινώδεις ουσίες του δείγματος .  3 . Αντιδραστήρια  3 . 1 Θειικό οξύ 0,26 Ν .  3 . 2 . Κατειργασμένος αμίαντος : προστίθενται σε χρησιμοποιουμένη μορφή αμιάντου για χωνευτήρια Gooch πενταπλάσιο του βάρους αυτού αραιό υδροχλωρικό οξύ ( 1 όγκος υδροχλωρικού οξέος , d : 1,19 + 3 όγκοι ύδατος ) . Βράζεται το μίγμα επί 45 λεπτά περίπου , αφήνεται να ψυχθεί και διηθείται σε χωνί διηθήσεως Buchner . Εκπλύνεται το υπόλειμμα πρώτα με ύδωρ , μέχρις εξαφανίσεως του υδροχλωρικού οξέος εντός του ύδατος εκπλύσεως και ακολούθως με ακετόνη ( 3 . 6 ) . Ξηραίνεται ο αμίαντος εντός πυριαντηρίου και ακολούθως πυρώνεται επί 2 ώρες σε 900 ° C . Αφήνεται να ψυχθεί και διατηρείται σε πωματισμένη φιάλη . Ο αμίαντος , κατειργασμένος κατ ' αυτό τον τρόπο δύναται να χρησιμοποιηθεί πολλές φορές . Αυτός πρέπει να ανταποκρίνεται στις προδιαγραφές οι οποίες δίδονται στο 5 . 1 αναφορικά με το τυφλό πείραμα .  3 . 3 . Αντιαφριτικό γαλάκτωμα ( σιλικόνη για παράδειγμα ) .  3 . 4 . Διάλυμα υδροξειδίου του καλίου 0,23 Ν .  3 . 5 . Υδροχλωρικό οξύ 0,5 Ν .  3 . 6 . Καθαρή ακετόνη .  3 . 7 . Καθαρός διαιθυλικός αιθέρας .  4 . Συσκευές  4 . 1 . Υάλινα ποτήρια ζέσεως των 600 ml τουλάχιστο , με χαραγή στο επίπεδο των 200 ml .  4 . 2 . Δίσκοι από πορσελάνη διαμέτρου 80 mm περίπου , πάχους 4 mm περίπου διάτρητοι με 32 περίπου οπές διαμέτρου 4 mm περίπου .  4 . 3 . Φιάλες κενού των 2 λίτρων περίπου μετά πώματος εκ καουτσούκ , με χαραγή στο επίπεδο των 800 ml και εφοδιασμένες με υάλινο χωνί διηθήσεως διαμέτρου 120 mm .  4 . 4 . Διηθητικές πλάκες διαμέτρου 40 mm περίπου , πάχους 4 mm περίπου , με επικλινή χείλη ώστε να εφαρμόζουν στον κώνο του χωνίου διηθήσεως ( 4 . 3 ) , διάτρητες με 16 περίπου οπές διαμέτρου 4 mm περίπου και καλυμμένες με μεταλλικό δικτυωτό πλέγμα μετ ' ανοιγμάτων πλευράς 1 mm περίπου . Οι πλάκες και τα μεταλλικά πλέγματα πρέπει να είναι αμετάβλητα σε οξέα και αλκάλια .  4 . 5 . Χωνευτήρια αποτεφρώσεως από πλατίνα ή από χαλαζία .  4 . 6 . Ηλεκτρικός κλίβανος με θερμοστάτη .  4 . 7 . Ξηραντήρας .  4 . 8 . Ηθμός από αμίαντο : Παρασκευάζεται αιώρημα 2 g αμιάντου ( 3.2 ) σε 100 ml ύδατος .  Διηθείται υπό κενό επί διηθητικής πλάκας καλυμμένης διά μεταλλικού πλέγματος ( 4 . 4 ) και φέρεται εντός του χωνίου διηθήσεως μίας φιάλης κενού ( 4 . 3 ) . Συλλέγεται το διήθημα και επαναλαμβάνεται η διήθησή του με το ίδιο φίλτρο διηθήσεως . Το διήθημα απορρίπτεται .  5 . Τρόπος εργασίας  Ζυγίζονται 3 g δείγματος , με προσέγγιση 1 mg και 2 g κατειργασμένου αμιάντου ( 3 . 2 ) , σε υάλινο ποτήρι ζέσεως ( 4 . 1 ) , προστίθενται 200 ml θειικού οξέος ( 3 . 1 ) και μερικές σταγόνες αντιαφριτικού γαλακτώματος ( 3 . 3 ) . Φέρεται ταχέως σε βρασμό και αφήνεται να βράσει επί 30 λεπτά ακριβώς . Για να διατηρηθεί ο όγκος σταθερός , καλύπτεται το υάλινο ποτήρι ζέσεως με μία ψυκτική διάταξη , όπως μία φιάλη στρογγυλού πυθμένος των 500 ml στην οποία κυκλοφορεί ψυχρό ύδωρ . Διακόπτεται ο βρασμός με την προσθήκη 50 ml περίπου ψυχρού ύδατος και διηθείται αμέσως υπό κενό με φίλτρο αμιάντου που έχει παρασκευασθεί όπως υποδεικνύεται στο 4 . 8 .  Εκπλύνεται το υπόλειμμα διά 5 δόσεων των 100 ml περίπου πολύ θερμού ύδατος ώστε να ληφθεί τελικά όγκος διηθήματος 800 ml . Μεταφέρεται το υπόλειμμα ποσοτικώς σε υάλινο ποτήρι ζέσεως ( 4 . 1 ) στο οποίο έχει προηγουμένως προστεθεί δίσκος πορσελάνης ( 4 . 2 ) προς ρύθμιση του βρασμού . Προστίθενται 200 ml διαλύματος υδροξειδίου του καλίου ( 3 . 4 ) . Φέρεται ταχέως σε βρασμό και αφήνεται να βράσει επί 30 λεπτά ακριβώς . Προστίθενται 50 ml περίπου ψυχρού ύδατος και διηθείται αμέσως υπό κενό με νέο φίλτρο αμιάντου που έχει παρασκευασθεί όπως υποδεικνύεται στο 4 . 8 . Εκπλύνεται το υπόλειμμα με πολύ ψυχρό ύδωρ μέχρις ουδετέρας αντιδράσεως του ύδατος εκπλύσεως ( δοκιμή με χάρτη ηλιοτροπίου ) , και ακολούθως 3 φορές με ακετόνη ( 3 . 6 ) ( συνολικά 100 ml ακετόνης περίπου ) .  Μεταφέρεται το υπόλειμμα ποσοτικώς εντός χωνευτηρίου ( 4 . 5 ) , τεμαχίζεται , εφ ' όσον παρίσταται ανάγκη , και ξηραίνεται σε πυριαντήριο στους 130 ° C μέχρι σταθερού βάρους . Ψύχεται στον ξηραντήρα και ζυγίζεται ταχέως . Εισάγεται ακολούθως το χωνευτήριο στον κλίβανο ( 4 . 6 ) και αφήνεται να αποτεφρωθή επί 30 λεπτά στους 900 ° C . Ψύχεται στον ξηραντήρα και ζυγίζεται ταχέως .  Διενεργείται τυφλό πείραμα εφαρμόζοντας τον ίδιο τρόπο εργασίας στον κατειργασμένο αμίαντο ( 3 . 2 ) , απουσία του δείγματος . Η απώλεια βάρους η οποία προκύπτει από την πύρωση των 6 g αμιάντου δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 10 mg .  6 . Υπολογισμός των αποτελεσμάτων  Η περιεκτικότητα σε ινώδεις ουσίες επί τοις εκατό του δείγματος δίδεται από τον τύπο :   ( α - β ) . 100 / 3  όπου :  α = απώλεια βάρους κατά την αποτέφρωση , κατά τη διάρκεια του προσδιορισμού .  β = απώλεια βάρους κατά την πύρωση , κατά τη διάρκεια του τυφλού πειράματος .  Επαναληπτικότητα  Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παραλλήλων προσδιορισμών που έγιναν στο ίδιο δείγμα δεν πρέπει να υπερβαίνει το :  0,3 σε απόλυτη τιμή , για περιεκτικότητες σε ινώδεις ουσίες μικρότερες του 10 %   3 % σε σχετική τιμή , για περιεκτικότητες σε ινώδεις ουσίες ίσες ή υψηλότερες του 10 % .  7 . Παρατηρήσεις  7 . 1 . Οι ζωοτροφές που περιέχουν περισσότερο του 10 % λιπαρές ουσίες πρέπει να απολιπαίνονται προ της αναλύσεως με διαιθυλικό αιθέρα . Προς τούτο , ποσότητα του δείγματος ( 3 g ζυγισμένα με προσέγγιση 1 mg ) φέρεται επί ηθμού αμιάντου ( 4 . 8 ) . Καλύπτεται 3 φορές με 50 ml περίπου αιθέρος ( 3 . 7 ) και διηθείται κάθε φορά υπό κενό προσεκτικά . Μεταφέρεται ποσοτικώς η ποσότητα του απολιπανθέντος δείγματος , καθώς και ο αμίαντος σε υάλινο ποτήρι ζέσεως ( 4 . 1 ) και συνεχίζεται η ανάλυση όπως υποδεικνύεται στο 5 .  7 . 2 . Οι ζωοτροφές που περιέχουν λιπαρές ουσίες οι οποίες δεν είναι δυνατό να εκχυλισθούν αμέσως πρέπει να απολιπαίνονται όπως υποδεικνύεται στο 7 . 1 και να υφίστανται επί πλέον , μία νέα απολίπανση αφού εκπλυθεί το υπόλειμμα εκ της οξίνου κατεργασίας .  Προς τούτο εκπλύνεται το υπόλειμμα από την κατεργασία αυτή τρεις φορές με ακετόνη ( 3 . 6 ) ( εν όλω 100 ml ) , και ακολούθως τρεις φορές με 50 ml αιθέρος ( 3 . 7 ) , την κάθε φορά . Μεταφέρεται κατόπιν το υπόλειμμα ποσοτικώς σε υάλινο ποτήρι ζέσεως ( 4 . 1 ) και συνεχίζεται η ανάλυση όπως υποδεικνύεται στο 5 δεύτερη παράγραφος ( κατεργασία με διάλυμα υδροξειδίου του καλίου ) .  7 . 3 . Στην περίπτωση των πλουσίων σε ασβέστιο ζωοτροφών ( περισσότερο του 2 % σε ασβέστιο ) , η ποσότητα του δείγματος ( 3 g ζυγισμένα με προσέγγιση 1 mg ) φέρεται σε υάλινο ποτήρι ζέσεως ( 4 . 1 ) με 100 ml υδροχλωρικού οξέος 0,5 Ν ( 3 . 5 ) και αφήνεται σε ηρεμία εν ψυχρώ επί 5 λεπτά . Διηθείται αμέσως και εκπλύνεται με ψυχρό ύδωρ . Ως βοηθητικό της διηθήσεως χρησιμοποιούνται τα 2 g αμιάντου τα οποία προβλέπονται για το βρασμό με θειικό οξύ . Αν η διήθηση αποδεικνύεται δύσκολη , αραιώνεται το αιώρημα με ακετόνη . Συνεχίζεται ακολούθως η διαδικασία όπως υποδεικνύεται στο 5 .  ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ  1 . ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΡΗΤΙΝΟΛΗΣ ( RETINOL ) ( ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ Α )  1 . Αντικείμενο και τομέας εφαρμογής  Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της ρητινόλης ( Retinol ) ( Βιταμίνη Α ) εντός των ζωοτροφών , των συμπυκνωμάτων και των προμιγμάτων . Το κατώτατο όριο του προσδιορισμού είναι 10 000 IU/kg για ζωοτροφές εντόνως κεχρωσμένες και 4 000 IU/kg για τα λοιπά προϊόντα ( 6 ) . Τα προϊόντα κατατάσσονται σε δύο ομάδες , αναλόγως της υποτιθεμένης περιεκτικότητος αυτών σε ρητινόλη :  Ομάδα Α : Περιεκτικότητες μικρότερες των 200 000 IU/kg   Ομάδα Β : Περιεκτικότητες ίσες ή υψηλότερες των 200 000 IU/kg .  2 . Αρχή  Το δείγμα υφίσταται υδρόλυση εν θερμώ με διάλυμα υδροξειδίου του καλίου εντός αιθανολικού μέσου και παρουσία αντιοξειδωτικού μέσου ή σε ατμόσφαιρα αζώτου . Το μίγμα υπόκειται σε εκχύλιση με 1,2 - διχλωροαιθάνιο . Το εκχύλισμα εξατμίζεται εν ξηρώ και επαναλαμβάνεται η επεξεργασία με πετρελαϊκό αιθέρα . Το διάλυμα χρωματογραφείται επί στήλης οξειδίου του αργιλίου ( για τα προϊόντα της ομάδος Β , η χρωματογραφία απαιτείται μόνο σε ορισμένες περιπτώσεις ) . Για τα προϊόντα της ομάδος Α , η ρητινόλη προσδιορίζεται με φασματοφωτομέτρηση σε 610 nm κατόπιν της αναπτύξεως εγχρώμου συμπλόκου κατά την αντίδραση του Carr - Price . Για τα προϊόντα της ομάδος Β με φασματοφωτομέτρηση στο UV σε 325 nm .  3 . Αντιδραστήρια  α ) χρησιμοποιούμενα για ανάλυση προϊόντων των ομάδων Α και Β .  3 . 1 . Αιθανόλη 96 % ( κ.ο . ) .  3 . 2 . Διάλυμα 10 % ( κ.ο . ) ασκορβικού νατρίου a.p, ή  3 . 3 . Καθαρισμένο άζωτο .  3 . 4 . Διάλυμα 50 % ( κ.ο . ) υδροξειδίου του καλίου a.p .  3 . 5 . Διάλυμα υδροξειδίου του καλίου 1 N a.p .  3 . 6 . Διάλυμα υδροξειδίου του καλίου 0,5 N a.p .  3 . 7 . 1,2 - διχλωραιθάνιο a.p .  3 . 8 . Πετρελαϊκός αιθέρας , σημείο ζέσεως : 30 - 50 ° C . Εφ ' όσον παρίσταται ανάγκη , καθαρίζεται ως ακολούθως : Ανακινούνται 1 000 ml πετρελαϊκού αιθέρα με δόσεις 20 ml πυκνού θειικού οξέος μέχρι του σημείου κατά το οποίο το οξύ παραμένει άχρουν . Απομακρύνεται το οξύ και εκπλύνεται ο αιθέρας διαδοχικά με 500 ml ύδατος , δύο φορές με 250 ml διαλύματος 10 % υδροξειδίου του νατρίου και τρεις φορές με 500 ml ύδατος . Απομακρύνεται η υδατική στιβάδα , ξηραίνεται ο αιθέρας επί μία ώρα επί ενεργού άνθρακος και ανύδρου θειικού νατρίου , διηθείται και αποστάζεται .  3 . 9 . Οξείδιο του αργιλίου , τυποποιημένο κατά Brockmann : πυρώνεται επί 8 ώρες σε 750 ° C , ψύχεται σε ξηραντήρα και διατηρείται σε υάλινη φιάλη φαιού χρώματος μετά εσμυρισμένου πώματος . Πριν χρησιμοποιηθεί σε χρωματογραφία υγραίνεται ως ακολούθως : Εισάγονται σε υάλινη φιάλη φαιού χρώματος 10 g οξειδίου του αργιλίου και 0,7 ml ύδατος , η φιάλη πωματίζεται ερμητικά , επαναθερμαίνεται επί 5 λεπτά εντός ζέοντος υδρολούτρου με ισχυρή ανακίνηση . Αφήνεται να ψυχθεί ενώ ανακινείται . Ελέγχεται η δραστικότητα του παρασκευασθέντος κατ ' αυτόν τον τρόπον οξειδίου του αργιλίου διά της αναλύσεως κατά 5 . 3 και 5 . 4 γνωστής ποσότητος προτύπου ρητινόλης ( 3 . 17 ) .  3 . 10 Βασικό οξείδιο του αργιλίου , βαθμός δραστικότητος 1 .  3 . 11 . Καθαρός διαιθυλικός αιθέρας : απομακρύνονται τα υπεροξείδια και τα ίχνη ύδατος με χρωματογραφία επί στήλης βασικού οξειδίου του αργιλίου ( 3 . 10 ) ( 25 g οξειδίου του αργιλίου σε 250 ml αιθέρα ) .  3 . 12 . Διαλύματα πετρελαϊκού αιθέρος ( 3 . 8 ) σε 4 , 8 , 12 , 16 και 20 % ( ο.ο . ) αιθέρος ( 3 . 11 ) .  3 . 13 . Διάλυμα θειούχου νατρίου 0,5 mole εντός γλυκερίνης 70 % ( ο.ο . ) παρασκευασθέν εκ θειούχου νατρίου a.p .  β ) χρησιμοποιούμενα αποκλειστικά για ανάλυση προϊόντων της ομάδος Α  3 . 14 Κρυσταλλώσιμο βενζόλιο a.p .  3 . 15 . Χλωροφόρμιο a.p . : απομακρύνεται η αιθανόλη , το φωσγένιο και τα ίχνη ύδατος με χρωματογραφία στήλης βασικού οξειδίου του αργιλίου ( 3 . 10 ) ( 50 g οξειδίου του αργιλίου σε 200 ml χλωροφορμίου ) . Ενδείκνυται να χρωματογραφούνται για δεύτερη φορά τα 50 πρώτα ml .  3 . 16 . Αντιδραστήριο Carr - Price : ανακινούνται 25 g περίπου τριχλωριούχου αντιμονίου a.p . ( διατηρημένου σε ξηραντήρα ) με 100 ml χλωροφορμίου ( 3 . 15 ) μέχρι κορεσμού του διαλύματος . Ελαφρά απόθεση τριχλωριούχου αντιμονίου δεν ενοχλεί . Προστίθενται 2 ml οξικού ανυδρίτου a.p . Διατηρείται σε ψυγείο μέσα σε υάλινη φιάλη φαιού χρώματος με εσμυρισμένο πώμα . Διάρκεια διατηρήσεως : πολλές εβδομάδες .  3 . 17 . Πρότυπος ρητινόλη , ελεγχόμενη με φασματοφωτομέτρηση .  γ ) χρησιμοποιούμενα αποκλειστικά για ανάλυση προϊόντων της ομάδος Β  3 . 18 . Ισοπροπανόλη χρωματογραφίας .  4 . Συσκευές  4 . 1 . Υδρόλουτρο  4 . 2 . Περιστροφική συσκευή εξατμίσεως σε κενό με σφαιρικές φιάλες διαφόρου χωρητικότητος .  4 . 3 . Υάλινοι σωλήνες χρωματογραφίας ( μήκος : 300 mm  εσωτερική διάμετρος : 13 mm περίπου ) .  4 . 4 . Φασματοφωτόμετρο με κυψελίδες 10 mm πάχους ( από χαλαζία για μετρήσεις σε UV ) .  4 . 5 . Λαμπτήρες UV , 365 nm .  5 . Τρόπος εργασίας  Σημείωση : Ολες οι εργασίες πρέπει να διενεργούνται μακριά από το ελεύθερο φως , ενδεχομένως σε χώρο εφοδιασμένο με φαιά ύαλο .  5 . 1 Ποσότητα δείγματος  Λαμβάνεται ποσότητα δείγματος , λεπτοτεμαχισμένη , αναλογική της υποτιθεμένης περιεκτικότητος σε βιταμίνη Α , ως εξής :  0,1 έως 1 g για συμπυκνώματα ζωοτροφών ( περιεκτικότητες ανώτερες των 20 000 / g )   3,0 έως 5,0 g , για προμίγματα ( περιεκτικότητα κυμαινόμενη μεταξύ 400 και 20 000 IU / g )   10 έως 20 g για ανόργανα μίγματα   30 g για προϊόντα της ομάδος Α .  Εισάγεται αμέσως η ποσότητα του δείγματος σε φιάλη 500 ml με εσμυρισμένο πώμα .  5 . 2 Υδρόλυση και εκχύλιση ( 7 )  Προστίθενται διαδοχικά στην ποσότητα του δείγματος 40 ml αιθανόλης ( 3 . 1 ) , 2 ml διαλύματος ασκορβικού νατρίου ( 3 . 2 ) , ( 8 ) 10 ml διαλύματος υδροξειδίου του καλίου ( 3 . 4 ) και 2 ml διαλύματος θειούχου νατρίου ( 3 . 13 ) .  Θερμαίνεται επί 30 λεπτά σε 70 - 80 ° C σε κάθετο ψυκτήρα και αφήνεται ακολούθως να ψυχθεί σε ρεύμα ύδατος . Προστίθενται 50 ml αιθανόλης ( 3 . 1 ) και 100 ml ( λαμβανόμενα με σιφώνιο ) 1,2 - διχλωραιθανίου ( 3 . 7 ) . Ανακινείται ισχυρά και εκχύνεται το επιπλέον υγρό εντός διαχωριστική χοάνης . Προστίθενται στη διαχωριστική χοάνη 150 ml διαλύματος υδροξειδίου του καλίου ( 3 . 5 ) , ανακινείται επί 10 δευτερόλεπτα και αφήνεται σε ηρεμία μέχρι διαχωρισμού των στιβάδων . Συλλέγεται η στιβάς διχλωραιθανίου ( κατωτέρα στιβάς ) εντός διαχωριστικής χοάνης , προστίθενται 40 ml διαλύματος υδροξειδίου του καλίου ( 3 . 6 ) , ανακινείται επί 10 δευτερόλεπτα και αφήνεται σε ηρεμία μέχρι διαχωρισμού των στιβάδων . Συλλέγεται η στιβάς διχλωραιθανίου σε διαχωριστική χοάνη και εκπλύνεται 6 έως 8 φορές με δόσεις 40 ml ύδατος , μέχρις εξαφανίσεως του αλκάλεως ( δοκιμασία φαινολοφθαλεϊνης ) . Συλλέγεται η στιβάς διχλωραιθανίου και απομακρύνονται τα τελευταία ίχνη ύδατος με λωρίδες διηθητικού χάρτου .  Εξατμίζεται εν ξηρώ μέρος της ποσότητος του διαλύματος σε κενό και επί υδρολούτρου σε θερμοκρασία 40 ° C . Κατεργάζεται ταχέως το υπόλειμμα με 5 ml πετρελαϊκού αιθέρα ( 3 . 8 ) .  Για τα προϊόντα της ομάδος Α διενεργείται χρωματογραφία όπως υποδεικνύεται στο 5 . 3 . 1 .  Για τα προϊόντα της ομάδος Β , μεταφέρεται το διάλυμα σε ογκομετρική φιάλη των 50 ml , συμπληρώνεται ο όγκος με πετρελαϊκό αιθέρα ( 3 . 8 ) , ομογενοποιείται και μετράται η οπτική πυκνότητα όπως αναφέρεται στο 5 . 4 . 2 .  5 . 3 .  Χρωματογραφία  5 . 3 . 1 Προϊόντα της ομάδος Α  Σωλήνας χρωματογραφίας ( 4 . 3 ) πληρούται μέχρις ύψους 200 mm με οξείδιο του αργιλίου ( 3 . 9 ) , προηγουμένως εμποτισμένου με πετρελαϊκό αιθέρα ( 3 . 8 ) . Εισάγεται εντός του σωλήνα το ληφθέν στο 5 . 2 διάλυμα και προστίθενται αμέσως 20 ml πετρελαϊκού αιθέρα ( 3 . 8 ) . Εκλούεται διαδοχικά με δόσεις των 10 ml διαλυμάτων πετρελαϊκού αιθέρα σε 4 , 8 , 12 , 16 και 20 % αιθέρα ( 3 . 12 ) υπό πίεση ή μερικό κενό , ενώ η ταχύτητα ροής είναι 2 έως 3 σταγόνες ανά δευτερόλεπτο .  Αρχικά εκλούεται το καροτένιο ( 9 ) . Η ρητινόλη εκλούεται γενικώς με διάλυμα πετρελαϊκού αιθέρα σε 20 % αιθέρα ( 3 . 12 ) . Η έκλουση ελέγχεται με λαμπτήρα UV ( βραχεία ακτινοβολία της στήλης με λαμπτήρα υδραργύρου ) . Η ζώνη φθορισμού της ρητινόλης διαχωρίζεται ευκρινώς από τις κίτρινες ζώνες της ξανθοφύλλης οι οποίες την ακολουθούν . Συλλέγεται το κλάσμα της εκλούσεως το οποίο περιέχει τη ρητινόλη σε κωνική φιάλη Erlenmeyer .  5 . 3 . 2 Προϊόντα της ομάδος Β  Χρωματογραφία πρέπει να διενεργείται μόνον εφ ' όσον οι μετρήσεις της οπτικής πυκνότητος οι οποίες ελήφθησαν στο 5 . 4 . 2 δεν είναι σύμφωνες προς τις προδιαγραφές οι οποίες υποδεικνύονται στο 5 . 4 . 2 .  Εάν η χρωματογραφία αποδειχθεί απαραίτητη , εισάγεται εντός της χρωματογραφικής στήλης μέρος της ποσότητος του διαλύματος εντός πετρελαϊκού αιθέρα που έχει ληφθεί στο 5 . 2 , και περιέχει περίπου 500 IU ρητινόλης και χρωματογραφείται όπως υποδεικνύεται στο 5 . 3 . 1 .  5 . 4 Μέτρηση της οπτικής πυκνότητος  5 . 4 . 1 Προϊόντα της ομάδος Α  Εξατμίζεται εν ψυχρώ και υπό κενό η διάλυση που περιέχει τη ρητινόλη , η ληφθείσα στο 5 . 3 . 1 . Επαναλαμβάνεται η επεξεργασία του υπολείμματος με 2 ml βενζολίου ( 3 . 14 ) . Λαμβάνονται 0,3 ml του διαλύματος αυτού και προστίθενται 3 ml αντιδραστηρίου Carr - Price ( 3 . 16 ) . Αναπτύσσεται κυανούς χρωματισμός . Μετράται η οπτική πυκνότητα στο φασματοφωτόμετρο σε 610 nm , 30 δευτερόλεπτα ακριβώς μετά την έναρξη της αντιδράσεως . Προσδιορίζεται η περιεκτικότητα σε ρητινόλη με την αναφορά σε πρότυπο καμπύλη η οποία ελήφθη από διαλύματα βενζολίου αυξανομένων συγκεντρώσεων σε πρότυπο ρητινόλη κατειργασμένα με το αντιδραστήριο Carr - Price ( 2 έως 16 IU προτύπου βιταμίνης Α ( 3 . 17 ) με 0,3 ml βενζολίου ( 3 . 14 ) + 3 ml αντιδραστηρίου Carr - Price ( 3 . 16 ) . Η πρότυπος καμπύλη πρέπει να ελέγχεται κανονικά και τακτικά με τη χρήση του προτύπου και εντός προσφάτως παρασκευασθέντος διαλύματος αντιδραστηρίου Carr - Price .  5 . 4 . 2 Προϊόντα της ομάδας Β  Λαμβάνεται μέρος της ποσότητος του διαλύματος σε πετρελαϊκό αιθέρα το οποίο ελήφθη στο 5 . 2 , περιέχον περίπου 200 IU ρητινόλης . Εξατμίζεται εν ξηρώ και εν κενώ και επαναλαμβάνεται η κατεργασία του υπολείμματος με 25 ml ισοπροπανόλης ( 3 . 18 ) . Μετράται η οπτική πυκνότητα στο φασματοφωτόμετρο σε 325 , 310 και 334 nm . Το μέγιστο της απορροφήσεως κείται στα 325 nm . Η περιεκτικότητα του διαλύματος σε ρητινόλη Α υπολογίζεται ως ακολούθως :  Ε 325 18,30 = IU ρητινόλης  Εν τούτοις , οι σχέσεις των οπτικών πυκνοτήτων  Ε 310 : Ε 325 και Ε 334 : Ε 325  πρέπει να είναι 6 : 7 = 0,857  Εάν μία των σχέσεων τούτων αποκλίνει ουσιωδώς από την τιμή αυτή ( < 0.830 ή > 0,880 ) , πρέπει να προηγείται της μετρήσεως των οπτικών πυκνοτήτων χρωματογραφία κατά τη μέθοδο που υποδεικνύεται στο 5 . 3 . 2 . Εάν η μέτρηση των οπτικών πυκνοτήτων η οποία διενεργείται μετά από τη χρωματογραφία δείχνει ότι οι ανωτέρω αναφερόμενες σχέσεις αποκλίνουν ακόμη ουσιωδώς από την τιμή 0.857 ( < 0,830 ή > 0,880 ) , ο προσδιορισμός πρέπει να διενεργηθεί κατά τη μέθοδο που υποδεικνύεται για τα προϊόντα της ομάδος Α .  6 . Υπολογισμός των αποτελεσμάτων  Η περιεκτικότητα σε ρητινόλη του δείγματος υπολογίζεται με βάση το βάρος της ποσότητος του δείγματος και των διενεργουμένων αραιώσεων κατά τη διάρκεια της αναλύσεως . Το αποτέλεσμα εκφράζεται σε IU ρητινόλης ανά χιλιόγραμμο .  Επαναληπτικότητα  Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παραλλήλων προσδιορισμών που έγιναν στο ίδιο δείγμα δεν πρέπει να υπερβαίνει το :  - 20 % σε σχετική τιμή για περιεκτικότητες σε ρητινόλη μικρότερες των 75 000 IU/kg   - 15 000 IU για περιεκτικότητες που κυμαίνονται μεταξύ 75 000 και 150 000 IU/kg   - 10 % σε σχετική τιμή για περιεκτικότητες που κυμαίνονται μεταξύ 150 000 και 250 000 IU/kg   - 250 000 IU για περιεκτικότητες που κυμαίνονται μεταξύ 25 000 και 50 000 IU/kg   - 5 % σε σχετική τιμή για περιεκτικότητες ανώτερες των 500 000 IU/kg .  2 . ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΘΕΙΑΜΙΝΗΣ ( ΑΝΕΥΡΙΝΗΣ , ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ Β1 )  1 . Αντικείμενο και τομέας εφαρμογής .  Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της θειαμίνης ( ανευρίνης , βιταμίνης Β1 ) εντός των ζωοτροφών , των συμπυκνωμάτων ζωοτροφών και των προμιγμάτων . Το κατώτερο όριο του προσδιορισμού είναι 5 ppm .  2 . Αρχή  Το δείγμα κατεργάζεται εν θερμώ με αραιό θειικό οξύ και ακολούθως υδρολύεται διά της ενζυματικής οδού . Το διάλυμα το οποίο λαμβάνεται υποβάλλεται σε αλκαλική οξείδωση . Το σχηματιζόμενο θειόχρωμα εκχυλίζεται με ισοβουτανόλη και προσδιορίζεται διά φθοριομετρίας .  3 . Αντιδραστήρια  3 . 1 . Πρότυπο διάλυμα θειαμίνης σε 100 μg / ml : Διαλύονται 112,3 mg πολύ καθαρής υδροχλωρικής θειαμίνης , ξηρανθείσης προηγουμένως εν κενώ μέχρι σταθερού βάρους , εντός 1 000 ml θειικού οξέος 0,2 Ν ( 3 . 2 ) . Το διάλυμα τούτο διατηρούμενο σε ψυχρό και σκοτεινό μέρος , παραμένει σταθερό επί ένα μήνα .  3 . 2 . Θειικό οξύ 0,2 Ν .  3 . 3 . Καθαρό πυροθειώδες νάτριο , Na2S2O5 .  3 . 4 . Διάλυμα 20 % ( κ.ο ) σιδηροκυανιούχου καλίου a.p .  3 . 5 . Διάλυμα 25 % ( κ.ο ) υδροξειδίου του καλίου a.p .  3 . 6 . Οξειδωτικό μίγμα : Αναμιγνύονται 2 ml διαλύματος σιδηροκυανιούχου καλίου ( 3 . 4 ) με 48 ml διαλύματος υδροξειδίου του καλίου  ( 3 . 5 ) . Το μίγμα αυτό δεν διατηρείται πέραν των τεσσάρων ωρών .  3 . 7 . Ισοβουτανόλη a.p .  3 . 8 . Διάλυμα οξικού νατρίου 2,5 Ν .  3 . 9 . Πολυενζυματικό παρασκεύασμα περιέχον πρωτεάση , φωσφατάση και αμυλάση ( π.χ . clarase ) .  3 . 10 . Αιθανόλη 96 % ( κ.ο . )  Συσκευές  4 . 1 . Υδρόλουτρο .  4 . 2 . Φυγόκεντρος ( 3 500 στροφών ανά λεπτό ) με σωλήνες των 30 έως 50 ml εφοδιασμένους με εσμυρισμένα πώματα .  4 . 3 . Φθοριόμετρο .  5 . Τρόπος εργασίας  5 . 1 . Ενζυματική υδρόλυση  Εισάγονται εντός δύο ογκομετρικών φιαλών Α και Β των 250 ml ίσες ποσότητες λεπτοτεμαχισμένου δείγματος , περιέχουσες 100 μg περίπου θειαμίνης και 125 ml θειικού οξέος ( 3 . 2 ) . Προστίθεται επί πλέον , μόνο στη φιάλη Α 1,0 ml προτύπου διαλύματος ( 3 . 1 ) ( εσωτερικό πρότυπο ) .  Ανακινούνται ισχυρά , φέρονται οι φιάλες επί ζέοντος υδρολούτρου και παραμένουν εκεί επί 15 λεπτά ανακινώντας από καιρού σε καιρό . Αφήνονται να ψυχθούν μέχρι τους 45 ° C περίπου . Προστίθενται σε κάθε φιάλη 20 ml διαλύματος οξικού νατρίου ( 3 . 8 ) και 0,5 g πολυενζυματικού παρασκευάσματος ( 3 . 9 ) και αφήνονται ακολούθως σε ηρεμία επί 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου . Προστίθενται 20 ml διαλύματος οξικού νατρίου ( 3 . 8 ) , συμπληρούται ο όγκος με ύδωρ , ομογενοποιείται και διηθείται . Συλλέγονται τα διηθήματα Α και Β κατόπιν απορρίψεως των 15 αρχικών ml . Παρασκευάζονται τα κάτωθι διαλύματα :  5 . 1 . 1 . Διάλυμα μάρτυς Τ  Εισάγονται σε σωλήνα φυγοκεντρήσεως ( 4 . 2 ) 5 ml διηθήματος Α και 10 mg περίπου πυροθειώδους νατρίου ( 3 . 3 ) . Εμβαπτίζεται ο σωλήνας επί 15 λεπτά εντός ζέοντος υδρολούτρου και αφήνεται ακολούθως να ψυχθεί σε θερμοκρασία δωματίου .  5 . 1 . 2 . Διάλυμα Α ( εσωτερικού προτύπου ) και Β ( δείγματος )  Εισάγονται 5 ml του διηθήματος Α εντός σωλήνος φυγοκεντρήσεως ( 4 . 2 ) και 5 ml του διηθήματος Β εντός ετέρου σωλήνος φυγοκεντρήσεως ( 4 . 2 ) .  5 . 2 . Οξείδωση  Προστίθενται στα διαλύματα Τ , Α και Β , 5 ml οξειδωτικού μίγματος ( 3 . 6 ) και μετά πάροδο ενός λεπτού 10 ml ισοβουτανόλης ( 3 . 7 ) . Πωματίζονται οι σωλήνες και ανακινούνται ισχυρά επί 5 δευτερόλεπτα . Αφήνονται σε ηρεμία επί ένα λεπτό και φυγοκεντρούνται προς διαχωρισμό των στιβάδων . Λαμβάνονται εντός εκάστου σωλήνος 5 ml εκ της υπερκειμένης στιβάδος ισοβουτανόλης , εισάγονται ακολούθως εντός ογκομετρικών φιαλών των 25 ml , συμπληρούται ο όγκος με αιθανόλη ( 3 . 10 ) και ομογενοποιούνται ( = εκχυλίσματα Τ , Α και Β ) .  5 . 3 . Μέτρηση του φθορισμού  Οι μετρήσεις διενεργούνται σε μήκος κύματος στο οποίο το φθοριόμετρο δίδει μία βέλτιστη απάντηση στο φθορισμό του θειοχρώματος . Η ακτινοβολία πραγματοποιείται σε 365 nm περίπου .  Ρυθμίζεται το όργανο στο μηδέν με τη χρήση του εκχυλίσματος Τ . Μετράται η ένταση φθορισμού των εκχυλισμάτων Α και Β .  6 . Υπολογισμός των αποτελεσμάτων  Η περιεκτικότητα της θειαμίνης σε mg ανά χιλιόγραμμο δείγματος δίδεται από τον τύπο :  δ X β / ( α - β ) γ  όπου :  α = ένταση φθορισμού του εκχυλίσματος Α ( εσωτερικού προτύπου )   β = ένταση φθορισμού του εκχυλίσματος Β ( δείγματος )   γ = βάρος της ποσότητος του δείγματος σε γραμμάρια   δ = ποσότητα θειαμίνης σε mg η οποία προστίθεται στην ποσότητα του δείγματος ( εσωτερικού προτύπου )   Επαναληπτικότητα  Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παραλλήλων προσδιορισμών που έγιναν ίδιο δείγμα δεν πρέπει να υπερβαίνει το :  10 % σε σχετική τιμή , για περιεκτικότητες μικρότερες των 500 ppm , και  5 % σε σχετική τιμή , για περιεκτικότητες ίσες ή μεγαλύτερες των 500 ppm .  3 . ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΣΚΟΡΒΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΔΕΥΔΡΟ-ΑΣΚΟΡΒΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ( ΒΙΤΑΜΙΝΗ C )  1 . Αντικείμενο και τομέας εφαρμογής  Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της συνολικής ποσότητος του ασκορβικού και του δεϋδρο - ασκορβικού οξέoς ( βιταμίνη C ) εντός των ζωοτροφών , των συμπυκνωμάτων ζωοτροφών και των προμιγμάτων . Το κατώτατο όριο του προσδιορισμού είναι 5 ppm . Τα προϊόντα κατατασσονται σε δύο ομάδες , αναλόγως της υποτιθέμενης περιεκτικότητος αυτών σε βιταμίνη C :  Ομάδα Α : περιεκτικότητες μικρότερες των 10 g/kg   Ομάδα Β : περιεκτικότητες ίσες ή υψηλότερες των 10 g/kg .  2 . Αρχή  Το δείγμα , αφού τεθεί σε αιώρηση εντός αραιού διαλύματος μεταφωσφορικού οξέος , υπόκειται σε εκχύλιση με χλωροφόρμιο . Η υδατική στιβάδα κατεργάζεται με διάλυμα 2 , 6 - διχλωροφαινόλης - ινδοφαινόλης , προς μετατροπή του ασκορβικού οξέος σε δεϋδρο - ασκορβικό οξύ και ακολούθως με διάλυμα 2 , 4 - δινιτροφαινυλυδραζίνης . Η σχηματιζόμενη υδραζόνη εκχυλίζεται με διάλυμα οξικού αιθυλεστέρος , ανύδρου οξικού οξέος ( glacial ) και ακετόνης . Το διάλυμα χρωματογραφείται σε στήλη silicagel , η διάλυση εξατμίζεται μέχρι ξηρού και το υπόλειμμα διαλύεται σε αραιό θειικό οξύ . Η οπτική πυκνότητα του διαλύματος μετράται με φωτόμετρο σε 509 nm .  Για τα προϊόντα της ομάδος Α , η διάλυση , η προερχόμενη από χρωματογραφία σε στήλη υπόκειται επί πλέον σε χρωματογραφία λεπτής στιβάδος για την απομόνωση της υδραζόνης .  3 . Αντιδραστήρια  3 . 1 . Πρότυπο διάλυμα 0,05 % L - ασκορβικού οξέος : διαλύονται 50 mg L - ασκορβικού οξέος a.p . εντός 20 ml περίπου διαλύματος μεταφωσφορικού οξέος ( 3 . 2 ) και συμπληρούται έως 100 ml με ύδωρ . Παρασκευάζεται αμέσως προ της χρήσεως .  3 . 2 . Διάλυμα 10 % ( κ.ο . ) μεταφωσφορικού οξέος : διαλύονται εντός ύδατος 200 g μεταφωσφορικού οξέος a.p . , κονιοποιημένου σε ιγδίο και συμπληρούται έως 2 000 ml με ύδωρ . Διατηρείται σε 4 ° C . Ανανεούται μετά από παρέλευση μιας εβδομάδος .  3 . 3 Χλωροφόρμιο a.p .  3 . 4 . Διάλυμα 0,5 % ( κ.ο . ) 2,6 - διχλωροφαινόλης - ινδοφαινόλης a.p . Παρασκευάζεται αμέσως προ της χρήσεως .  3 . 5 . Βοηθητικό διηθήσεως ( S και S . αριθ . 121 ή ισοδύναμο ) .  3 . 6 . Οξινο διάλυμα 2 % ( κ.ο ) 2,4 - δινιτροφαινυλυδραζίνης : διαλύονται 2 g 2,4 - δινιτροφαινυλυδραζίνης εντός 100 ml αραιού θειικού οξέος ( 25 ml θειικού οξέος a.p . , d : 1,84 , αραιωμένο σε 100 ml με ύδωρ ) . Το διάλυμα αυτό , σε ψυχρό μέρος διατηρείται επί μία εβδομάδα .  3 . 7 . Αζωτο , ή  3 . 8 . Διοξείδιο του άνθρακος .  3 . 9 . Μίγμα οξικού αιθυλεστέρα a.p. / ανύδρου οξικού οξέος ( glacial ) / ακετόνης a.p . : 96/2/2 κατ ' όγκον .  3 . 10 Μίγμα διχλωρομεθανίου a.p. / ανύδρου οξικού οξέος ( glacial ) : 97/3 κατ ' όγκον .  3 . 11 . Silicagel μέγεθος κόκκων : 0,05 έως 0,2 mm .  3 . 12 . Silicagel H , κατά Stahl , δια χρωματογραφία λεπτής στιβάδος .  3 . 13 . Αραιό θειικό οξύ : εισάγονται 105 ml ύδατος εντός ογκομετρικής φιάλης των 200 ml , συμπληρούται ο όγκος διά θειικού οξέος a.p . , d : 1,84 .  3 . 14 . Διαλύτης εκλούσεως για χρωματογραφία λεπτής στιβάδος : αναμιγνύονται 75 ml αιθέρα a.p . , 25 ml , οξικού αιθυλεστέρα a.p . και 4,0 ml οξικού οξέος 96 % ( κ.ο . ) a.p . Ανανεούται μετά από 2 έως 3 χρωματογραφίες .  4 . Συσκευές  4 . 1 . Υδρόλουτρο ρυθμισμένο στους 20 ° C με υπερθερμοστάτη .  4 . 2 . Φυγοκεντρική συσκευή ( 3 500 t / m ) με σωλήνες των 40 έως 50 ml , εφοδιασμένους με εσμυρισμένα πώματα .  4 . 3 . Περιστροφική συσκευή εξατμίσεως εν κενώ μετά φιαλών των 250 ml .  4 . 4 . Υάλινοι σωλήνες χρωματογραφίας ( μήκος : 100 mm , εσωτερική διάμετρος : 20 mm ) μετά πλακός εκ πεφρυγμένης υάλου ( π.χ . σωλήνες Allihn ) .  4 . 5 . Φασματοφωτόμετρο ή χρωματόμετρο με φίλτρα και με κυψελίδες 10 mm πάχους .  4 . 6 . Συσκευή για χρωματογραφία λεπτής στιβάδος , με πλάκες silicagel ( 3 . 12 ) , πάχος στιβάδος 0,5 έως 0,6 mm ( ενδείκνυνται οι έτοιμες προς χρήση πλάκες ) . Ξηραίνονται οι πλάκες επί 2 ώρες και 30 λεπτά έως 3 ώρες εντός πυριαντηρίου στους 120 - 130 ° C . Αφήνονται να ψυχθούν και διατηρούνται ακολούθως σε ξηραντήρα τουλάχιστον επί 24 ώρες προ της χρήσεως .  4 . 7 . Πυριαντήριο ρυθμισμένο στους 120 - 130 ° C .  5 . Τρόπος εργασίας  5 . 1 . Εκχύλιση  Εισάγονται εντός δύο ογκομετρικών φιαλών Α και Β , των 250 ml μετά εσμυρισμένων πωμάτων , ίσες ποσότητες λεπτοτεμαχισμένου δείγματος , που περιέχουν 200 mg περίπου βιταμίνης C .  Προστίθενται μόνον στη φιάλη Α , 0,4 ml προτύπου διαλύματος ( 3 . 1 ) και ομογενοποιούνται ανακινώντας ελαφρώς ( εσωτερικό πρότυπο ) .  Προστίθενται μέσα σε κάθε φιάλη 30 ml χλωροφορμίου ( 3 . 3 ) και 25 ml διαλύματος μεταφωσφορικού οξέος ( 3 . 2 ) σε θερμοκρασία 4 ° C . Ανακινούνται επ ' ολίγον και αφήνονται ακολούθως σε ηρεμία επί 10 έως 15 λεπτά . Προστίθενται 25 ml ύδατος , πωματίζονται οι φιάλες , ανακινούνται ισχυρά επί 10 δευτερόλεπτα και αφήνονται σε ηρεμία επί 10 έως 15 λεπτά εντός υδρολούτρου ( 4 . 1 ) . Φυγοκεντρούνται για διαχωρισμό της υδατικής στιβάδος από τη στιβάδα χλωροφορμίου . Οι εργασίες , όπως υποδεικνύονται ανωτέρω , διενεργούνται συγχρόνως επί των υδατικών εκχυλισμάτων Α ( εσωτερικό πρότυπο ) και Β .  5 . 2 . Οξείδωση  Λαμβάνονται δια σιφωνίου 40 ml από την υπερκείμενη υδατική στιβάδα ( ελαφρώς θολή ) που ελήφθη στο 5 . 1 , εισάγονται εντός σωλήνα αντιδράσεως με εσμυρισμένο πώμα , προστίθενται 0,5 έως 1 ml διαλύματος 2,6 - διχλωροφαινόλης - ινδοφαινόλης ( 3 . 4 ) και ομογενοποιούνται . Σχηματίζεται ερυθρός χρωματισμός ο οποίος πρέπει να διατηρηθεί επί 15 λεπτά τουλάχιστον . Προστίθενται ακολούθως 300 mg βοηθητικού διηθήσεως ( 3 . 5 ) , ανακινείται και διηθείται δια ξηρού πτυχωτού φίλτρου . Το διήθημα δεν πρέπει υποχρεωτικά να είναι διαυγές .  5 . 3 . Αντίδραση με 2,4 - δινιτροφαινυλυδραζίνη και εκχύλιση της υδραζόνης  Λαμβάνονται δια σιφωνίου 10 ml εκ του διηθήματος που ελήφθη στο 5 . 2 , εισάγονται εντός σωλήνα φυγοκεντρήσεως ( 4 . 2 ) , προστίθενται 2 ml διαλύματος 2,4 - δινιτριφαινυλυδραζίνης ( 3 . 6 ) και ομογενοποιούνται . Διοχετεύεται ταχέως εντός του σωλήνα ρεύμα αζώτου ( 3 . 7 ) ή διοξειδίου του άνθρακος ( 3 . 8 ) , πωματίζεται ο σωλήνας και εμβαπτίζεται επί 15 ώρες περίπου ( μία νύκτα ) εντός υδρολούτρου ( 4 . 1 ) .  Προστίθενται ακολούθως 3 ml ύδατος , 20 ml μίγματος οξικού αιθυλεστέρα / ανύδρου οξικού οξέος ( glacial ) / ακετόνης ( 3 . 9 ) και 800 mg περίπου βοηθητικού διηθήσεως ( 3 . 5 ) . Πωματίζεται ο σωλήνας , ανακινείται ισχυρά επί 30 δευτερόλεπτα και φυγοκεντρείται . Εισάγονται 15 ml από την υπερκείμενη στιβάδα εντός φιάλης εξατμίσεως και εξατμίζονται υπό μειωμένη πίεση εντός της περιστροφικής συσκευής εξατμίσεως ( 4 . 3 ) μέχρι λήψεως ελαιώδους υπολείμματος . Διαλύεται το υπόλειμμα εντός 2 ml μίγματος οξικού αιθυλεστέρα / ανύδρου οξικού οξέος / ακετόνης ( 3 . 9 ) επαναθερμαίνοντας έως 50 ° C , αφήνεται να ψυχθεί , προστίθενται 10 ml μίγματος διχλωρομεθανίου / ανύδρου οξικού οξέος ( 3 . 10 ) και ομογενοποιούνται .  5 . 4 . Χρωματογραφίας στήλης  Σωλήνας χρωματογραφίας ( 4 . 4 ) πληρούται μέχρις ύψους 30 mm με μίγμα διχλωρομεθανίου / ανύδρου οξικού οξέος ( 3 . 10 ) . Φέρεται σε αιώρηση ( ανακινώντας ισχυρά ) 5 g silicagel ( 3 . 11 ) εντός 30 ml μίγματος διχλωρομεθανίου / ανύδρου οξικού οξέος ( 3 . 10 ) και προστίθενται το αιώρημα εντός του σωλήνα . Αφήνεται να καθιζάνει και συμπιέζεται ακολούθως υπό ελαφρά πίεση αζώτου ( 3 . 7 ) . Προστίθεται εντός του σωλήνα το ληφθέν διάλυμα στο 5 . 3 , εκπλύνεται η φιάλη με μικρή ποσότητα μίγματος διχλωρομεθανίου / ανύδρου οξικού οξέος ( 3 . 10 ) και μεταφέρεται εντός του σωλήνα , πληρούται ακολούθως αυτός με το μίγμα ( 3 . 10 ) και συνεχίζεται η έκπλυση της στήλης με το ίδιο μίγμα ( 3 έως 4 δόσεις των 5 ml περίπου ) μέχρι λήψεως άχροης διαλύσεως . Απορρίπτεται το μέρος της διαλύσεως το οποίο είναι χρωματισμένο κίτρινο .  Διαλύεται η ερυθρωπή ζώνη στην κορυφή της στήλης δια μίγματος οξικού αιθυλεστέρα / ανύδρου οξικού οξέος / ακετόνης ( 3 . 9 ) , συλλέγεται η διάλυση και εξατμίζεται εν ξηρώ .  5 . 4 . 1 . Για τα προϊόντα της ομάδος Α ( περιεκτικοτήτων σε βιταμίνη C μικροτέρων των 10 g/kg ) διαλύεται το υπόλειμμα εντός 2,0 ml μίγματος οξικού αιθυλεστέρα / ανύδρου οξικού οξέος / ακετόνης ( 3 . 9 ) και διενεργείται αμέσως χρωματογραφία λεπτής στιβάδος όπως υποδεικνύεται στο 5 . 5 .  5 . 4 . 2 . Για τα προϊόντα της ομάδος Β ( περιεκτικοτήτων σε βιταμίνη C ίσων ή υψηλοτέρων των 10 g/kg ) , επαναλαμβάνεται η κατεργασία του ελαιώδους υπολείμματος δια 4,0 ml αραιού θεικού οξέος ( 3 . 13 ) , ανακινείται ισχυρώς ώστε να διαλυθεί πλήρως το υπόλειμμα και μετράται η οπτική πυκνότητα όπως υποδεικνύεται στο 5 . 6 .  5 . 5 . Χρωματογραφία λεπτής στιβάδος .  Οι κατωτέρω υποδεικνυόμενες εργασίες πραγματοποιούνται εις διπλούν . Εναποτίθενται υπό μορφή γραμμής επί της πλάκας για χρωματογραφία λεπτής στιβάδος ( 4 . 6 ) 0,5 ml διαλύματος το οποίο ελήφθη στο 5 . 4 . 1 . Εμφανίζεται επί 20 λεπτά τουλάχιστον με τον διαλύτη εκλούσεως ( 3 . 14 ) , εντός κεκορεσμένης δεξαμενής , μέχρι πλήρους διαχωρισμού της ροδόχροης ζώνης υδραζόνης . Αφήνεται να ξηρανθεί η πλάκα στον αέρα . Οριοθετείται η ροδόχροη ζώνη , αποξέεται με σπάτουλα και η κονιοποιημένη μάζα μεταφέρεται ποσοτικώς εντός σωλήνα χρωματογραφίας ( 4 . 4 ) .  Διαλύεται διαδοχικά μία φορά δια 2 ml και δύο φορές δια 1,5 ml μίγματος οξικού αιθυλεστέρα / ανύδρου οξεικού οξέος / ακετόνης ( 3 . 9 ) . Συλλέγεται η διάλυση εντός μικρής φιάλης ( το τελευταίο μέρος πρέπει να είναι άχρουν ) . Εξατμίζεται μέχρι ξηρού , επαναλαμβάνεται η κατεργασία του ελαιώδους υπολείμματος με 4,0 ml αραιού θειικού οξέος ( 3 . 13 ) , ανακινείται ισχυρά προς πλήρη διάλυση του υπολείμματος και μετράται η οπτική πυκνότητα .  5 . 6 . Μέτρηση της οπτικής πυκνότητος .  Μετράται η οπτική πυκνότητα με φωτόμετρο σε 509 nm , 20 έως 30 λεπτά μετά τη διάλυση του υπολείμματος με θειικό οξύ . Οι μετρήσεις διενεργούνται δια συγκρίσεως με αραιό θειικό οξύ ( 3 . 13 ) .  5 . 7 . Τυφλό πείραμα .  Διενεργείται τυφλό πείραμα ακολουθώντας τον ίδιο τρόπο εργασία απουσία δείγματος .  6 . Υπολογισμός των αποτελεσμάτων  Η περιεκτικότητα σε g βιταμίνης C ανά kg δείγματος δίδεται από τον τύπο :  ( γ - α ) X 2 / ( β - γ ) X 10δ  όπου :  α = οπτική πυκνότητα του τυφλού διαλύματος   β = οπτική πυκνότητα του προτύπου εσωτερικού διαλύματος   γ = οπτική πυκνότητα του διαλύματος του δείγματος   δ = βάρος σε γραμμάρια της ποσότητος του δείγματος .  Επαναληπτικότητα  Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παραλλήλων προσδιορισμών που έγιναν στο ίδιο δείγμα δεν πρέπει να υπερβαίνει :  το 10 % σε σχετική τιμή , για περιεκτικότητες σε βιταμίνη C μικρότερες των 10 g/kg και  5 % σε σχετική τιμή , για περιεκτικότητες ίσες ή υψηλότερες των 10 g/kg .  Σημείωση : a.p . = " για ανάλυση " ή χημικώς καθαρό .  ( 1 ) ΕΕ αριθ . Ν 170 της 3.8.1970 , σ . 2 .  ( 2 ) ΕΕ αριθ . Ν 171 της 29.7.1972 , σ . 39 .  ( 3 ) ΕΕ αριθ . Ν 155 της 12.7.1971 , σ . 13 .  ( 4 ) ΕΕ αριθ . Ν 279 της 20.12.1971 , σ . 7 .  ( 5 ) ΕΕ αριθ . Ν 123 της 29.5.1972 , σ . 6 .  ( 6 ) IU = 0,3 μg ρητινόλης  ( 7 ) Για υποκατάστατα γάλακτος και προϊόντα που έχουν τάση να σχηματίζουν συσσωματώματα ή να διογκώνονται διπλασιάζεται η ποσότητα των αντιδραστηρίων των υποδεικνυομένων στο 5 . 2 πρώτη και δεύτερη παράγραφος .  ( 8 ) Η προσθήκη ασκορβικού νατρίου δεν είναι απαραίτητη όταν η υδρόλυση διενεργείται σε ατμόσφαιρα αζώτου .  ( 9 ) Η περιεκτικότητα σε καροτένιο δύναται να προσδιορισθεί με μέτρηση της οπτικής πυκνότητος σε 450 nm :  Ε 1 % / 1 cm = 2 600