CELEX: 32009R0152
Language: da
Date: 2009-01-27 00:00:00
Title: Kommissionens forordning (EF) nr152/2009 af 27. januar 2009 om prøveudtagnings- og analysemetoder til offentlig kontrol af foder (EØS-relevant tekst)

26.2.2009   
            
            
               DA
            
            
               Den Europæiske Unions Tidende
            
            
               L 54/1
            
         
      KOMMISSIONENS FORORDNING (EF) NR152/2009
   af 27. januar 2009
   om prøveudtagnings- og analysemetoder til offentlig kontrol af foder
   (EØS-relevant tekst)
   KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR —
   under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europæiske Fællesskab,
   under henvisning til Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 882/2004 af 29. april 2004 om offentlig kontrol med henblik på verifikation af, at foderstof- og fødevarelovgivningen samt dyresundheds- og dyrevelfærdsbestemmelserne overholdes (1), særlig artikel 11, stk. 4, litra a), b) og c), og
   ud fra følgende betragtninger:
   
               (1)
            
            
               Følgende retsakter blev vedtaget til gennemførelse af direktiv 70/373/EØF og gælder fortsat i henhold til artikel 61, stk. 2, i forordning (EF) nr. 882/2004:
               
                           —
                        
                        
                           Kommissionens første direktiv 71/250/EØF af 15. juni 1971 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol af foderstoffer (2)
                           
                        
                     
                           —
                        
                        
                           Kommissionens andet direktiv 71/393/EØF af 18. november 1971 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til officiel kontrol af foderstoffer (3)
                           
                        
                     
                           —
                        
                        
                           Kommissionens tredje direktiv 72/199/EØF af 27. april 1972 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til officiel kontrol af foderstoffer (4)
                           
                        
                     
                           —
                        
                        
                           Kommissionens fjerde direktiv 73/46/EØF af 5. december 1972 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til officiel kontrol af foderstoffer (5)
                           
                        
                     
                           —
                        
                        
                           Kommissionens første direktiv 76/371/EØF af 1. marts 1976 om fastsættelse af fællesskabsmåder for udtagning af prøver til den officielle kontrol med foderstoffer (6)
                           
                        
                     
                           —
                        
                        
                           Kommissionens syvende direktiv 76/372/EØF af 1. marts 1976 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer (7)
                           
                        
                     
                           —
                        
                        
                           Kommissionens ottende direktiv 78/633/EØF af 15. juni 1978 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer (8)
                           
                        
                     
                           —
                        
                        
                           Kommissionens niende direktiv 81/715/EØF af 31. juli 1981 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer (9)
                           
                        
                     
                           —
                        
                        
                           Kommissionens tiende direktiv 84/425/EØF af 25. juli 1984 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer (10)
                           
                        
                     
                           —
                        
                        
                           Kommissionens direktiv 86/174/EØF af 9. april 1986 om fastsættelse af metoden til beregning af næringsværdien i foderblanding til fjerkræ (11)
                           
                        
                     
                           —
                        
                        
                           Kommissionens ellevte direktiv 93/70/EØF af 28. juli 1993 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer (12)
                           
                        
                     
                           —
                        
                        
                           Kommissionens tolvte direktiv 93/117/EF af 17. december 1993 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer (13)
                           
                        
                     
                           —
                        
                        
                           Kommissionens direktiv 98/64/EF af 3. september 1998 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til bestemmelse af aminosyrer, råfedt og olaquindox i foderstoffer og om ændring af direktiv 71/393/EØF (14)
                           
                        
                     
                           —
                        
                        
                           Kommissionens direktiv 1999/27/EF af 20. april 1999 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til bestemmelse af amprolium, diclazuril og carbadox i foderstoffer og om ændring af direktiv 71/250/EØF og 73/46/EØF og ophævelse af direktiv 74/203/EØF (15)
                           
                        
                     
                           —
                        
                        
                           Kommissionens direktiv 1999/76/EF af 23. juli 1999 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til bestemmelse af lasalocid natrium i foderstoffer (16)
                           
                        
                     
                           —
                        
                        
                           Kommissionens direktiv 2000/45/EF af 6. juli 2000 om fællesskabsmetoder til bestemmelse af vitamin A, vitamin E og tryptophan i foderstoffer (17)
                           
                        
                     
                           —
                        
                        
                           Kommissionens direktiv 2002/70/EF af 26. juli 2002 om krav til bestemmelse af indholdet af dioxin og dioxinlignende PCB i foderstoffer (18)
                           
                        
                     
                           —
                        
                        
                           Kommissionens direktiv 2003/126/EF af 23. december 2003 om analysemetoder til bestemmelse af animalske bestanddele med henblik på officiel kontrol af foderstoffer (19).
                        
                     
         
               (2)
            
            
               Idet direktiv 70/373/EØF blev afløst af forordning (EF) nr. 882/2004/2004, bør gennemførelsesretsakterne til samme direktiv afløses af én enkelt forordning. Samtidig bør metoderne tilpasses den udvikling, der er sket på det videnskabelige og teknologiske område. Metoder, der ikke længere udfylder deres formål på tilfredsstillende vis, bør udgå. Det er hensigten, at prøveudtagningsbestemmelserne på et tidspunkt skal opdateres for at tage hensyn til den seneste udvikling inden for metoderne til produktion, opbevaring, transport og markedsføring af foder, men det vil for nuværende være mest hensigtsmæssigt at fastholde de eksisterende prøveudtagningsbestemmelser.
            
         
               (3)
            
            
               Direktiv 71/250/EØF, 71/393/EØF, 72/199/EØF, 73/46/EØF, 76/371/EØF, 76/372/EØF, 78/633/EØF, 81/715/EØF, 84/425/EØF, 86/174/EØF, 93/70/EØF, 93/117/EF, 98/64/EF, 1999/27/EF, 1999/76/EF, 2000/45/EF, 2002/70/EF og 2003/126/EF bør derfor ophæves.
            
         
               (4)
            
            
               Foranstaltningerne i denne forordning er i overensstemmelse med udtalelse fra Den Stående Komité for Fødevarekæden og Dyresundhed —
            
         UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING:
   Artikel 1
   Udtagning af prøver som led i den offentlige kontrol af foder, for så vidt angår bestemmelse af bestanddele, tilsætningsstoffer og uønskede stoffer, bortset fra rester af pesticider og mikroorganismer, foretages efter de metoder, der er beskrevet i bilag I.
   Artikel 2
   Klargøring af prøver til analyse og angivelse af resultater foretages efter de metoder, der er beskrevet i bilag II.
   Artikel 3
   Analyser som led i den offentlige kontrol af foder foretages efter de metoder, der er beskrevet i bilag III (Analysemetoder til kontrol af sammensætningen af fodermidler og foderblandinger), bilag IV (Analysemetoder til kontrol af indholdet af godkendte tilsætningsstoffer i foder), bilag V (Analysemetoder til kontrol for uønskede stoffer i foder) og bilag VI (Analysemetoder til bestemmelse af animalske bestanddele som led i den offentlige kontrol af foder).
   Artikel 4
   Næringsværdien af foderblandinger til fjerkræ beregnes som angivet i bilag VII.
   Artikel 5
   De i bilag VIII beskrevne analysemetoder til kontrol for ulovlig forekomst af fodertilsætningsstoffer, der ikke længere er tilladt, anvendes til verifikationsformål.
   Artikel 6
   Direktiv 71/250/EØF, 71/393/EØF, 72/199/EØF, 73/46/EØF, 76/371/EØF, 76/372/EØF, 78/633/EØF, 81/715/EØF, 84/425/EØF, 86/174/EØF, 93/70/EØF, 93/117/EF, 98/64/EF, 1999/27/EF, 1999/76/EF, 2000/45/EF, 2002/70/EF og 2003/126/EF ophæves.
   Henvisninger til de ophævede direktiver gælder som henvisninger til nærværende forordning og læses efter sammenligningstabellerne i bilag IX.
   Artikel 7
   Denne forordning træder i kraft på tyvendedagen efter offentliggørelsen i Den Europæiske Unions Tidende.
   Den anvendes fra den 26. august 2009
   
      Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i hver medlemsstat.
      Udfærdiget i Bruxelles, den 27. januar 2009.
      
         
            På Kommissionens vegne
         
         Androulla VASSILIOU
         
         
            Medlem af Kommissionen
         
      
   
   
      (1)  EUT L 165 af 30.4.2004, s. 1. Berigtiget i EUT L 191 af 28.5.2004, s. 1.
   
      (2)  EFT L 155 af 12.7.1971, s. 13.
   
      (3)  EFT L 279 af 20.12.1971, s. 7.
   
      (4)  EFT L 123 af 29.5.1972, s. 6.
   
      (5)  EFT L 83 af 30.3.1973, s. 21.
   
      (6)  EFT L 102 af 15.4.1976, s. 1.
   
      (7)  EFT L 102 af 15.4.1976, s. 8.
   
      (8)  EFT L 206 af 29.7.1978, s. 43.
   
      (9)  EFT L 257 af 10.9.1981, s. 38.
   
      (10)  EFT L 238 af 6.9.1984, s. 34.
   
      (11)  EFT L 130 af 16.5.1986, s. 53.
   
      (12)  EFT L 234 af 17.9.1993, s. 17.
   
      (13)  EFT L 329 af 30.12.1993, s. 54.
   
      (14)  EFT L 257 af 19.9.1998, s. 14.
   
      (15)  EFT L 118 af 6.5.1999, s. 36.
   
      (16)  EFT L 207 af 6.8.1999, s. 13.
   
      (17)  EFT L 174 af 13.7.2000, s. 32.
   
      (18)  EFT L 209 af 6.8.2002, s. 15.
   
      (19)  EUT L 339 af 24.12.2003, s. 78.
   
      BILAG I
      PRØVEUDTAGNINGSMETODER
      1.   FORMÅL OG ANVENDELSESOMRÅDE
      Prøver, der er bestemt til offentlig kontrol af foder, udtages i overensstemmelse med de nedenfor anførte metoder. De således fremkomne prøver betragtes som repræsentative for de partier, hvoraf prøverne er udtaget.
      2.   PRØVEUDTAGNINGSPERSONALE
      Prøverne skal udtages af personer, som er autoriseret hertil af medlemsstaterne.
      3.   DEFINITIONER
      Parti: En mængde af et produkt, som udgør en enhed, og som efter sine egenskaber må antages at være ensartet.
      Enkeltprøve: En mængde, som er udtaget på et enkelt sted i partiet.
      Samleprøve: Et samlet antal enkeltprøver, udtaget fra et og samme parti.
      Reduceret prøve: En repræsentativ del af en samleprøve, fremkommet ved reduktion af denne.
      Slutprøve: En del af den reducerede prøve eller af den homogeniserede samleprøve.
      4.   APPARATUR
      
                  4.1.
               
               
                  Det apparatur, der anvendes til prøveudtagning, skal være udført i materialer, der ikke kan forurene de produkter, der skal udtages prøver af. Medlemsstaterne kan officielt godkende sådant apparatur.
               
            4.2.   Anbefalet apparatur til udtagning af prøver af foder i fast form
      4.2.1.   Manuel prøveudtagning
      
                  4.2.1.1.
               
               
                  Skovl med flad bund og lodrette sider
               
            
                  4.2.1.2.
               
               
                  Prøveudtagningsspyd med lang spalte eller inddelt i kamre. Prøveudtagningsspyddets dimensioner skal være afpasset efter de forhold, hvorunder partiet befinder sig (beholderens dybde, sækkenes dimensioner osv.), og efter størrelsen af de partikler, foderet består af.
               
            4.2.2.   Mekanisk prøveudtagning
      Godkendt mekanisk apparatur kan anvendes til udtagning af prøver af foder i bevægelse.
      4.2.3.   Prøvedeler
      Til udtagning af enkeltprøver og til klargøring af reducerede prøver og slutprøver kan anvendes apparatur, der deler prøverne i tilnærmelsesvis lige store dele.
      5.   KVANTITATIVE KRAV
      
                  5.A.
               
               
                  Stoffer eller produkter, der er homogent fordelt i foderet
               
            
                  5.A.1.
               
               
                  
                     Parti
                  
                  Størrelsen af partiet skal være således, at der kan udtages prøver af alle de dele, som partiet består af
               
            
                  5.A.2.
               
               
                  
                     Enkeltprøver
                  
               
            
                  5.A.2.1.
               
               
                  Uemballeret foder:
               
               
                  Mindste antal enkeltprøver:
               
            
                  5.A.2.1.1.
               
               
                  partier med en vægt på højst 2,5 tons
               
               
                  7
               
            
                  5.A.2.1.2.
               
               
                  partier med en vægt på over 2,5 tons
               
               
                  kvadratroden af 20 gange det antal tons, partiet vejer (1), dog højst 40 enkeltprøver
               
            
                  5.A.2.2.
               
               
                  Emballeret foder:
               
               
                  Mindste antal pakninger, der skal udtages prøver af (2):
               
            
                  5.A.2.2.1.
               
               
                  Pakninger på over 1 kg:
               
            
                  5.A.2.2.1.1.
               
               
                  partier på 1-4 pakninger
               
               
                  samtlige pakninger
               
            
                  5.A.2.2.1.2.
               
               
                  partier på 5-16 pakninger
               
               
                  4
               
            
                  5.A.2.2.1.3.
               
               
                  partier på over 16 pakninger
               
               
                  kvadratroden af antallet af pakninger, som partiet udgøres af (1), dog højst 20 pakninger
               
            
                  5.A.2.2.2.
               
               
                  Pakninger på 1 kg og derunder:
               
               
                  4
               
            
                  5.A.2.3.
               
               
                  Flydende eller halvflydende foder:
               
               
                  Mindste antal beholdere, der skal udtages prøver af (2):
               
            
                  5.A.2.3.1.
               
               
                  Beholdere på over 1 liter:
               
            
                  5.A.2.3.1.1.
               
               
                  partier på 1-4 beholdere
               
               
                  samtlige beholdere
               
            
                  5.A.2.3.1.2.
               
               
                  partier på 5-16 beholdere
               
               
                  4
               
            
                  5.A.2.3.1.3.
               
               
                  partier på over 16 beholdere
               
               
                  kvadratroden af antallet af beholdere, som partiet udgøres af (1), dog højst 20 beholdere
               
            
                  5.A.2.3.2.
               
               
                  Beholdere på 1 liter og derunder
               
               
                  4
               
            
                  5.A.2.4.
               
               
                  Foderblokke og mineralske sliksten
               
               
                  Mindste antal blokke eller sliksten, der skal udtages prøver af (2):
                  én blok eller sliksten pr. parti på 25 enheder, dog højst 4 blokke eller sliksten
               
            
                  5.A.3.
               
               
                  
                     Samleprøve
                  
                  For hvert parti, der udtages prøver af, skal der foreligge en samleprøve. Den samlede mængde af de enkeltprøver, der udgør samleprøven, må ikke være mindre end følgende mængder:
               
            
                  5.A.3.1.
               
               
                  Uemballeret foder
               
               
                  4 kg
               
            
                  5.A.3.2.
               
               
                  Emballeret foder:
               
               
                   
               
            
                  5.A.3.2.1.
               
               
                  pakninger på over 1 kg
               
               
                  4 kg
               
            
                  5.A.3.2.2.
               
               
                  pakninger på 1 kg og derunder
               
               
                  vægten af indholdet af 4 originale pakninger
               
            
                  5.A.3.3.
               
               
                  Flydende eller halvflydende foder:
               
               
                   
               
            
                  5.A.3.3.1.
               
               
                  beholdere på over 1 liter
               
               
                  4 liter
               
            
                  5.A.3.3.2.
               
               
                  beholdere på 1 liter og derunder
               
               
                  volumenindholdet af 4 originale beholdere
               
            
                  5.A.3.4.
               
               
                  Foderblokke eller mineralske sliksten:
               
            
                  5.A.3.4.1.
               
               
                  med en stykvægt på over 1 kg
               
               
                  4 kg
               
            
                  5.A.3.4.2.
               
               
                  med en stykvægt på højst 1 kg
               
               
                  vægten af 4 originale blokke eller sliksten
               
            
                  5.A.4.
               
               
                  
                     Slutprøver
                  
                  Slutprøver udtages af samleprøven, om nødvendigt ved reduktion af denne. Der kræves analyse af mindst én slutprøve. Mængden af slutprøven, der skal analyseres, må ikke være mindre end:
               
            
                   
               
               
                  Foder i fast form
               
               
                  500 g
               
            
                   
               
               
                  Flydende eller halvflydende foder
               
               
                  500 ml
               
            
                  5.B.
               
               
                  Uønskede stoffer eller produkter, der sædvanligvis er inhomogent fordelt i foderet, som f.eks. aflatoxin, meldrøje, ricinus og crotalaria i fodermidler (3)
                  
               
            
                  5.B.1.
               
               
                  
                     Parti jf. 5.A.1
               
            
                  5.B.2.
               
               
                  
                     Enkeltprøver
                  
               
            
                  5.B.2.1.
               
               
                  Uemballeret foder: jf. 5.A.2.1
               
            
                  5.B.2.2.
               
               
                  Emballeret foder:
               
               
                  Mindste antal enkeltprøver:
               
            
                  5.B.2.2.1.
               
               
                  partier bestående af 1-4 pakninger
               
               
                  samtlige pakninger
               
            
                  5.B.2.2.2.
               
               
                  partier bestående af 5-16 pakninger
               
               
                  4
               
            
                  5.B.2.2.3.
               
               
                  partier bestående af over 16 pakninger
               
               
                  kvadratroden af antallet af pakninger, som partiet udgøres af (1), dog højst 40 pakninger
               
            
                  5.B.3.
               
               
                  
                     Samleprøver
                  
                  Antallet af samleprøver vil variere afhængigt af partiets størrelse. Minimumsantallet af samleprøver pr. parti er angivet nedenfor. Den samlede vægt af de enkeltprøver, der udgør den enkelte samleprøve, må ikke være mindre end 4 kg
               
            
                  5.B.3.1.
               
               
                  Uemballeret foder
               
               
                   
               
            
                   
               
               
                  Partiets vægt i tons:
               
               
                  Mindste antal samleprøver pr. parti:
               
            
                   
               
               
                  indtil 1
               
               
                  1
               
            
                   
               
               
                  over 1 og indtil 10
               
               
                  2
               
            
                   
               
               
                  over 10 og indtil 40
               
               
                  3
               
            
                   
               
               
                  over 40
               
               
                  4
               
            
                  5.B.3.2.
               
               
                  Emballeret foder
               
               
                   
               
            
                   
               
               
                  Partiets størrelse i antal pakninger:
               
               
                  Mindste antal samleprøver pr. parti:
               
            
                   
               
               
                  1-16
               
               
                  1
               
            
                   
               
               
                  17-200
               
               
                  2
               
            
                   
               
               
                  201-800
               
               
                  3
               
            
                   
               
               
                  over 800
               
               
                  4
               
            
                  5.B.4.
               
               
                  
                     Slutprøver
                  
                  Slutprøver udtages af den enkelte samleprøve ved reduktion af denne. Der kræves analyse af mindst én slutprøve pr. samleprøve. Vægten af slutprøven, der skal analyseres, må ikke være mindre end 500 g.
               
            6.   FREMGANGSMÅDE VED UDTAGNING, KLARGØRING OG EMBALLERING AF PRØVERNE
      6.1.   Generelt
      Prøverne skal udtages og klargøres så hurtigt som muligt under hensyntagen til de forholdsregler, som er nødvendige for at undgå, at produktet forandres eller forurenes. Instrumenter og også overflader og beholdere, som er beregnet til at rumme prøverne, skal være rene og tørre.
      6.2.   Enkeltprøver
      6.2.A.   Stoffer eller produkter, der er homogent fordelt i foderet
      Enkeltprøver skal udtages tilfældigt fra hele partiet og have omtrent samme vægt.
      6.2.A.1.   Uemballeret foder
      
      Der foretages en imaginær opdeling af partiet i et antal omtrent lige store dele. Der vælges ved tilfældig udvælgelse et antal dele svarende til det påkrævede antal enkeltprøver, jf. 5.A.2, og der udtages mindst én prøve fra hver af disse dele.
      Prøveudtagningen kan om nødvendigt foretages, mens partiet er i bevægelse (pålæsning eller aflæsning).
      6.2.A.2.   Emballeret foder
      
      Efter at det i 5.A.2 fastsatte antal pakninger til prøveudtagning er udvalgt, udtages en del af indholdet af hver pakning ved hjælp af spyd eller skovl. Om nødvendigt kan prøverne udtages, efter at pakningerne er tømt hver for sig. Eventuelle klumper findeles, om nødvendigt ved at udskille dem og derpå føre dem tilbage til prøven; dette gøres separat for hver enkelt samleprøve.
      6.2.A.3.   Flydende eller halvflydende foder, som er homogent eller kan gøres homogent
      
      Efter at det i 5.A.2 fastsatte antal beholdere til prøveudtagning er udvalgt, homogeniseres indholdet om nødvendigt, og der udtages en prøve fra hver beholder.
      Enkeltprøverne kan eventuelt udtages under aftapning af partiet.
      6.2.A.4.   Flydende eller halvflydende foder, som ikke kan gøres homogent
      
      Efter at det i 5.A.2 fastsatte antal beholdere til prøveudtagning er udvalgt, udtages prøver fra forskellige niveauer.
      Enkeltprøver kan ligeledes udtages, når partiet aftappes, men de første fraktioner kasseres.
      Under alle omstændigheder må den samlede udtagne mængde ikke være mindre end 10 liter.
      6.2.A.5.   Foderblokke og mineralske sliksten
      
      Efter at det i 5.A.2 fastsatte antal blokke eller sliksten til prøveudtagning er udvalgt, udtages en del af hver blok eller sliksten som prøve.
      6.2.B.   Uønskede stoffer eller produkter, der sædvanligvis er inhomogent fordelt i foderet, som f.eks. aflatoxin, meldrøje, ricinus og crotalaria i fodermidler
      Der foretages en imaginær opdeling af partiet i et antal omtrent lige store dele, svarende til det i 5.B.3 fastsatte antal samleprøver. Hvis dette antal overstiger én, fordeles det samlede antal af de i 5.B.2 fastsatte enkeltprøver nogenlunde ligeligt mellem de forskellige imaginære dele. Derpå udtages prøver af tilnærmelsesvis samme størrelse (4) på en sådan måde, at den samlede udtagne prøvemængde fra hver imaginær del ikke er mindre end de 4 kg, der er minimumskravet for hver samleprøve. Enkeltprøver udtaget fra forskellige symbolske opdelinger må ikke sammenblandes.
      6.3.   Klargøring af samleprøver
      6.3.A.   Stoffer eller produkter, der er homogent fordelt i foderet
      Enkeltprøverne sammenblandes, så de udgør en enkelt samleprøve.
      6.3.B.   Uønskede stoffer eller produkter, der sædvanligvis er inhomogent fordelt i foderet, som f.eks. aflatoxin, meldrøje, ricinus og crotalaria i fodermidler
      Enkeltprøverne fra hver del af partiet sammenblandes i det antal samleprøver, der er angivet i 5.B.3, idet hver samleprøves oprindelse omhyggeligt noteres.
      6.4.   Klargøring af slutprøver
      Hver samleprøve opblandes omhyggeligt for at opnå en homogen prøve (5). Om nødvendigt reduceres samleprøven til mindst 2 kg eller 2 liter enten ved anvendelse af en mekanisk eller automatisk prøvedeler eller ved firdeling (kvartning) (reduceret prøve).
      Der klargøres mindst tre slutprøver af tilnærmelsesvis samme vægt, som opfylder de kvantitative krav i 5.A.4/5.B.4. Hver prøve anbringes i en egnet beholder. Alle nødvendige forholdsregler tages for at undgå, at prøven forurenes eller forfalskes, eller at sammensætningen ændres under transport eller opbevaring.
      6.5.   Emballering af slutprøver
      Beholdere/pakninger plomberes og forsynes med etiketter (hele etiketten skal anbringes inden for plomben) på en sådan måde, at beholderne eller pakningerne ikke kan åbnes, uden at plomben beskadiges.
      7.   REGISTRERING AF PRØVEUDTAGNINGEN
      Der skal foretages en registrering af hver prøveudtagning, således at hvert parti utvetydigt kan identificeres.
      8.   PRØVERNES BESTEMMELSESSTED
      For hver samleprøve sendes mindst én slutprøve så hurtigt som muligt til det autoriserede analyselaboratorium sammen med de for analysen nødvendige oplysninger.
      
         (1)  Er den fremkomne størrelse ikke et helt tal, afrundes til nærmeste højere hele tal.
      
         (2)  For pakninger eller beholdere, hvis indhold ikke overstiger 1 kg eller 1 liter, og for blokke eller sliksten, der ikke vejer over 1 kg stykket, skal en enkeltprøve udgøres af indholdet af en original pakning eller beholder, en blok eller en sliksten.
      
         (3)  Det i punkt 5.A angivne gælder for kontrol med forekomst af aflatoxin, meldrøje, ricinus og crotalaria i fuldfoder og tilskudsfoder.
      
         (4)  For så vidt angår emballeret foder udtages en del af pakningernes indhold ved hjælp af spyd eller skovl, om nødvendigt efter at pakningerne er tømt hver for sig.
      
         (5)  Eventuelle klumper findeles, om nødvendigt ved at udskille dem og derpå føre dem tilbage til prøven; dette gøres separat for hver enkelt samleprøve.
   
   
      BILAG II
      ALMINDELIGE BESTEMMELSER VEDRØRENDE ANALYSEMETODER FOR FODER
      A.   KLARGØRING AF PRØVER TIL ANALYSE
      1.   Formål
      De nedenfor beskrevne fremgangsmåder omhandler klargøring til analyse af slutprøver, der efter udtagning sendes til kontrollaboratorierne i overensstemmelse med bilag I.
      Prøverne klargøres således, at de i overensstemmelse med analysemetoderne afvejede mængder er homogene og repræsentative for slutprøverne.
      2.   Forholdsregler
      Prøverne klargøres i overensstemmelse med de anvendte analysemetoder. Det er derfor uhyre vigtigt at sikre, at den prøveklargøringsprocedure, der følges, er optimal i forhold til den anvendte analysemetode.
      Alle nødvendige arbejdsgange udføres, så det så vidt muligt undgås at forurene prøven og ændre dens sammensætning.
      Formaling, blanding og sigtning gennemføres så hurtigt som muligt, og således at prøven udsættes mindst muligt for luft og lys. Der anvendes ikke kværne og andre formalingsapparater med væsentlig tilbøjelighed til at frembringe varme i prøven.
      Særligt varmefølsomt foder bør formales manuelt. Det sikres tillige, at apparaturet i sig selv ikke forurener med mikromineraler.
      Kan klargøringen ikke foretages uden væsentlige ændringer af prøvens vandindhold, bestemmes vandindholdet før og efter klargøringen efter den metode, der er fastsat i del A i bilag III.
      3.   Fremgangsmåde
      Prøven neddeles i passende delprøver til analyse og til referenceformål, idet der anvendes egnede neddelingsteknikker såsom brug af skovl, stationær neddeling eller rotationsneddeler. Neddeling efter keglemetoden og firdeling (kvartning) kan ikke anbefales, da disse metoder giver risiko for uhomogene delprøver. Prøven til referenceformål opbevares i en egnet, ren og tør beholder med lufttæt lukning, mens delprøverne til analyse på mindst 100 g klargøres som angivet nedenfor.
      3.1.   Foder, der kan formales direkte
      Medmindre andet er angivet, passeres hele prøven — om nødvendigt efter formaling — gennem en sigte med en kvadratisk maskevidde med 1 mm sider (som anbefalet i ISO R565). Undgå overdreven formaling.
      Den sigtede prøve blandes og opsamles i en egnet, ren og tør beholder med lufttæt lukning. Prøven blandes igen umiddelbart før afvejning til analyse.
      3.2.   Foder, der kan formales efter tørring
      Medmindre andet er angivet for analysemetoden, tørres prøven, så den får et vandindhold på 8–12 %, i overensstemmelse med den under punkt 4.3 i metoden til bestemmelse af vandindhold anførte fortørring (jf. del A i bilag III). Der fortsættes som beskrevet i punkt 3.1.
      3.3.   Flydende eller halvflydende foder
      Prøven opsamles i en ren, tør og egnet beholder med lufttæt lukning. Umiddelbart før afvejning af den mængde, der skal anvendes til analysen, blandes prøven omhyggeligt.
      3.4.   Andet foder
      Prøver, der ikke kan klargøres i overensstemmelse med en af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder, behandles på anden måde, så der skabes sikkerhed for, at de mængder, der afvejes til analyse, er homogene og repræsentative for slutprøverne.
      4.   Opbevaring af prøverne
      Prøverne skal opbevares ved en temperatur, der ikke ændrer deres sammensætning. Prøver, der skal benyttes til analyser af vitaminer eller særligt lysfølsomme stoffer, opbevares i beholdere af brunt glas.
      B.   KRAV TIL REAGENSER OG APPARATUR, DER ANVENDES I FORBINDELSE MED ANALYSEMETODERNE
      
                  1.
               
               
                  Medmindre andet er angivet for analysemetoderne, skal alle reagenser være af analysekvalitet (p.a.). Ved udførelse af en sporstofanalyse kontrolleres reagensernes renhed ved en blindprøve. Resultatet af blindprøven er afgørende for, om der kræves yderligere oprensning af reagenserne.
               
            
                  2.
               
               
                  Til alle former for fremstilling af opløsninger, fortynding, skylning eller vaskning, der er angivet i forbindelse med analysemetoderne, uden at opløsnings- eller fortyndingsmidlets art er omtalt, anvendes vand. Som generel regel gælder, at der anvendes demineraliseret eller destilleret vand. I særlige tilfælde, som angivet i de beskrevne analysemetoder, er det nødvendigt at underkaste vandet særlige oprensningsprocesser.
               
            
                  3.
               
               
                  Standardapparatur, der normalt findes på kontrollaboratorier, er ikke omtalt i forbindelse med analysemetoderne; derimod omtales specialinstrumenter og –udstyr samt instrumenter og udstyr, hvis brug der stilles særlige krav til. Instrumenter og apparatur skal være rene, især ved bestemmelse af meget små stofmængder.
               
            C.   ANVENDELSE AF ANALYSEMETODERNE OG ANGIVELSE AF RESULTATER
      1.   Ekstraktionsprocedure
      Der er flere metoder, der omfatter en specifik ekstraktionsprocedure. Som hovedregel kan der anvendes andre ekstraktionsprocedurer end den i metoden angivne, under forudsætning af at den anvendte ekstraktionsprocedure bevisligt frembyder en ekstraktionseffektivitet for den analyserede matrix, der svarer til effektiviteten af den i metoden omtalte fremgangsmåde.
      2.   Oprensningsprocedure
      Der er flere metoder, der omfatter en specifik oprensningsprocedure. Som hovedregel kan der anvendes andre oprensningsprocedurer end den i metoden angivne, under forudsætning af at den anvendte oprensningsprocedure bevisligt giver analyseresultater for den analyserede matrix, der svarer til de resultater, som opnås med den i metoden omtalte fremgangsmåde.
      3.   Indberetning af anvendt analysemetode
      Der er generelt fastsat én analysemetode til bestemmelse af hvert enkelt stof i foder. Såfremt der findes flere metoder, skal den af kontrollaboratoriet anvendte metode anføres i analyserapporten.
      4.   Antal bestemmelser
      Det i analyserapporten angivne resultat skal være gennemsnitsværdien af mindst to bestemmelser af tilfredsstillende repeterbarhed, som er udført på to særskilte portioner af prøven.
      I forbindelse med analyse af uønskede stoffer gælder det dog, at hvis resultatet af den første bestemmelse er væsentligt (> 50 %) lavere end den specifikation, der skal kontrolleres, er yderligere bestemmelser ikke påkrævet, såfremt der anvendes tilfredsstillende kvalitetsprocedurer.
      Ved kontrol af det angivne indhold af et stof eller en ingrediens gælder det, at hvis resultatet af den første bestemmelse bekræfter det angivne indhold, dvs. hvis analyseresultatet ligger inden for det acceptable variationsområde for det angivne indhold, er yderligere bestemmelser ikke påkrævet, såfremt der anvendes tilfredsstillende kvalitetsprocedurer.
      I visse tilfælde er det acceptable variationsområde fastsat i lovgivningen, som f.eks. i Rådets direktiv 79/373/EØF (1).
      5.   Indberetning af analyseresultater
      Analyseresultatet angives som anført i analysemetoden med et tilstrækkeligt antal betydende cifre og korrigeres om nødvendigt til samme vandindhold, som slutprøven havde før prøveklargøringen.
      6.   Måleusikkerhed og genfindingsprocent i forbindelse med analyse af uønskede stoffer
      For så vidt angår uønskede stoffer som omhandlet i Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2002/32/EF, herunder dioxiner og dioxinlignende PCB'er, anses et produkt til foderbrug for ikke at overholde det fastsatte maksimumsindhold, hvis analyseresultatet vurderes at overstige maksimumsindholdet under hensyntagen til den ekspanderede måleusikkerhed og korrektion for genfinding. Det vurderes, om maksimumsindholdet er overholdt, ved hjælp af den analyserede koncentration efter korrektion for genfinding og ekspanderet måleusikkerhed. Dette gælder kun i tilfælde, hvor analysemetoden tillader vurdering af måleusikkerheden og korrektion for genfinding (hvilket f.eks. ikke er tilfældet ved mikroskopering).
      Analyseresultatet skal indberettes som følger (hvis den anvendte analysemetode tillader vurdering af måleusikkerhed og genfindingsprocent):
      
                  a)
               
               
                  ved korrektion for genfinding den angivne genfindingsprocent. Ved en genfindingsprocent på 90–110 % er korrektion for genfinding ikke påkrævet
               
            
                  b)
               
               
                  som »x +/- U«, hvor x er analyseresultatet og U er den ekspanderede måleusikkerhed, idet der anvendes en dækningsfaktor på 2, hvilket giver et konfidensniveau på ca. 95 %.
               
            Analyseresultatet kan dog, hvis resultatet af analysen er væsentligt (> 50 %) lavere end den specifikation, der skal kontrolleres, hvis der anvendes tilfredsstillende kvalitetsprocedurer, og hvis analysen udelukkende har til formål at kontrollere, at gældende lovgivning er overholdt, indberettes uden korrektion for genfinding, ligesom det i sådanne tilfælde kan undlades at indberette genfindingsprocent og måleusikkerhed.
      
         (1)  EFT L 86 af 6.4.1979, s. 30.
   
   
      BILAG III
      ANALYSEMETODER TIL KONTROL AF SAMMENSÆTNINGEN AF FODERMIDLER OG FODERBLANDINGER
      A.   BESTEMMELSE AF VANDINDHOLD
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme vandindholdet i foder. For så vidt angår foder indeholdende flygtige stoffer, såsom organiske syrer, skal det bemærkes, at der sammen med vandindholdet også bestemmes betydelige mængder flygtige stoffer.
      Metoden er ikke beregnet på analyse af mejeriprodukter, der anvendes som fodermidler, analyse af mineralske stoffer og blandinger, der overvejende består af mineralske stoffer, analyse af animalsk og vegetabilsk fedt eller analyse af olieholdige frø og frugter.
      2.   Princip
      Prøven tørres under nærmere angivne betingelser, som er afhængige af foderets art. Vægttabet bestemmes ved vejning. For fast foder med højt vandindhold er yderligere fortørring nødvendig.
      3.   Apparatur
      
                  3.1.
               
               
                  Formalingsapparat udført i et materiale, der ikke er fugtabsorberende, og som er let at gøre rent, muliggør en hurtig og ensartet formaling uden mærkbar varmeudvikling, så vidt muligt forhindrer kontakt med den omgivende luft og opfylder kravene i punkt 4.1.1 og 4.1.2 (f. eks. mikrohammermøller, mikroformalingsapparater med vandkøling, demontable keglemøller, langsomtløbende keglemøller og tandskivemøller)
               
            
                  3.2.
               
               
                  Analysevægt med 1 mg aflæsningsnøjagtighed
               
            
                  3.3.
               
               
                  Tørre vejekar af korrosionsbestandigt metal eller glas med lufttæt lukning; nyttearealet skal være stort nok til, at prøven kan fordeles med ca. 0,3 g/cm2
                  
               
            
                  3.4.
               
               
                  Elektrisk opvarmet, temperaturreguleret tørreskab (± 2 oC), som sikrer hurtig regulering af temperaturen og med god ventilation (1).
               
            
                  3.5.
               
               
                  Elektrisk opvarmet justerbart vakuumtørreskab med oliepumpe, som enten er forsynet med en anordning til tilførsel af tørret varmluft eller med et tørremiddel (f.eks. calciumoxid)
               
            
                  3.6.
               
               
                  Ekssikkator med tyk, perforeret plade af metal eller porcelæn indeholdende et virksomt tørringsmiddel.
               
            4.   Fremgangsmåde
      
                  
                     NB
                  
               
               
                  De under dette punkt beskrevne arbejdsgange skal udføres straks efter åbningen af de pakninger, som indeholder prøverne. Analyserne skal foretages mindst to gange.
               
            4.1.   Klargøring
      4.1.1.   Foder, bortset fra det under punkt 4.1.2 og 4.1.3 nævnte
      
      Der udtages mindst 50 g af prøven, som — om nødvendigt — formales eller neddeles på fornøden vis for at undgå varierende fugtighedsgrader (se punkt 6).
      4.1.2.   Korn og gryn
      
      Der udtages mindst 50 g af prøven. Den formales, så kornstørrelsen ved sigtning med masker på 0,5 mm tillader passage af mindst 50 %, og at der ved sigtning med runde masker på 1 mm bliver højst 10 % tilbage.
      4.1.3.   Flydende eller grødagtigt foder; foder overvejende bestående af fedt
      
      Der udtages ca. 25 g af prøven, afvejet med 10 mg nøjagtighed, som blandes med en tilsvarende mængde vandfrit sand, afvejet med 10 mg nøjagtighed, indtil der fremkommer en homogen vare.
      4.2.   Tørring
      4.2.1.   Foder, bortset fra det under punkt 4.2.2 og 4.2.3 nævnte
      
      Et vejekar med låg (3.3) vejes med 1 mg nøjagtighed. Ca. 5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed i det tarerede kar og fordeles jævnt. Karret stilles efter aftagning af låget ind i et til 103 oC opvarmet tørreskab. For at temperaturen i tørreskabet ikke skal falde for stærkt, skal karret stilles hurtigt ind i skabet. Der tørres i 4 timer, idet tørringstiden regnes fra det tidspunkt, hvor temperaturen i tørreskabet atter er kommet op på 103 oC. Efter åbning af tørreskabet lukkes karret med låget, tages ud af skabet, henstilles til afkøling i 30-45 minutter i ekssikkatoren (3.6) og vejes derefter med 1 mg nøjagtighed.
      For prøver af foder overvejende bestående af fedt foretages yderligere en tørring på 30 minutter i tørreskabet ved 130 oC. Forskellen mellem de to vejeresultater må ikke overstige 0,1 % vandindhold.
      4.2.2.   Korn, mel, gryn og grutning
      
      Et vejekar med låg (3.3) vejes med 0,5 mg nøjagtighed. Ca. 5 g af den formalede prøve afvejes med 1 mg nøjagtighed i det tarerede kar og fordeles jævnt. Karret stilles efter aftagning af låget ind i et til 130 oC opvarmet tørreskab. For at temperaturen i tørreskabet ikke skal falde for stærkt, skal karret stilles hurtigt ind i skabet. Der tørres i 2 timer, idet tørringstiden regnes fra det tidspunkt, hvor temperaturen i tørreskabet atter er kommet op på 130 oC. Efter åbning af tørreskabet lukkes karret med låget, tages ud af skabet, henstilles til afkøling i 30–45 minutter i ekssikkatoren (3.6) og vejes derefter med 1 mg nøjagtighed.
      
                  4.2.3.
               
               
                  Foderblandinger indeholdende mere end 4 % saccharose eller lactose: fodermidler såsom johannesbrødskrå, hydrolyserede kornprodukter, maltspirer, sukkerroesnitter, fiskepressevand og sukker, samt foderblandinger med mere end 25 % mineralske salte inkl. krystalvand
                  Et vejekar med låg (3.3) vejes med 0,5 mg nøjagtighed. Ca. 5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed i det tarerede kar og fordeles jævnt. Karret stilles efter aftagning af låget ind i et til 80-85 oC opvarmet vakuumtørreskab (3.5). For at temperaturen i tørreskabet ikke skal falde for stærkt, skal karret stilles hurtigt ind i skabet.
                  Trykket indstilles til 100 torr, og prøven tørres i 4 timer ved dette tryk enten under tilførsel af varm, tør luft eller ved hjælp af et tørringsmiddel (ca. 300 g til 20 prøver). I sidstnævnte tilfælde afbrydes forbindelsen til vakuumpumpen, så snart det foreskrevne tryk er nået. Tørringstiden regnes fra det tidspunkt, hvor temperaturen i tørreskabet atter er kommet op på 80–85 oC. Efter tørringstidens udløb bringes tørreskabet forsigtigt op på atmosfærisk tryk. Efter åbning af tørreskabet lukkes karret straks med låget, tages ud af skabet, henstilles til afkøling i 30–45 minutter i ekssikkatoren (3.6) og vejes derefter med 1 mg nøjagtighed. Der tørres i yderligere 30 minutter under vakuum i tørreskabet ved 80–85 oC, og derefter vejes på ny. Forskellen mellem de to vejeresultater må ikke overstige 0,1 % vandindhold.
               
            4.3.   Fortørring
      4.3.1.   Foder, bortset fra det under punkt 4.3.2 nævnte
      
      Fast foder med højt vandindhold, og hvis formaling er vanskelig, skal fortørres som følger:
      50 g af den ikke-formalede prøve (om nødvendigt foretages en grov neddeling af presset eller klumpet foder) afvejes med 10 mg nøjagtighed i en egnet beholder (f. eks. en aluminiumskål på 20 × 12 cm med en kant på 0,5 cm). Der tørres i tørreskab ved 60-70 oC, indtil vandindholdet er reduceret til mellem 8 og 12 %. Beholderen tages ud af tørreskabet og henstilles utildækket til afkøling i laboratoriet i 1 time, hvorefter der vejes med 10 mg nøjagtighed. Alt efter foderets art foretages, som beskrevet i punkt 4.1.1, derefter straks en formaling, og der tørres som beskrevet i punkt 4.2.1 eller 4.2.3.
      4.3.2.   Korn
      
      Korn med et vandindhold på over 17 % skal fortørres som følger:
      50 g af de ikke-formalede korn afvejes med 10 mg nøjagtighed i en egnet beholder (f. eks. en aluminiumskål på 20 × 12 cm med en kant på 0,5 cm) og tørres i tørreskab i 5-7 minutter ved 130 oC, hvorefter prøven tages ud af tørreskabet. Prøven henstilles utildækket til afkøling i laboratoriet i 2 timer, hvorefter der vejes med 10 mg nøjagtighed. Straks efter formales som beskrevet i punkt 4.1.2 og tørres som beskrevet i punkt 4.2.2.
      5.   Beregning af resultater
      Prøvens vandindhold (X) i procent beregnes efter følgende formler:
      5.1.   Tørring uden fortørring
      
         
      hvor:
      
                  m
               
               
                  =
               
               
                  prøvens begyndelsesvægt i gram
               
            
                  m0
                  
               
               
                  =
               
               
                  den tørre prøves vægt i gram.
               
            5.2.   Tørring med fortørring
      
         
      hvor:
      
                  m
               
               
                  =
               
               
                  prøvens begyndelsesvægt i gram
               
            
                  m1
                  
               
               
                  =
               
               
                  prøvens vægt i gram efter fortørring
               
            
                  m2
                  
               
               
                  =
               
               
                  prøvens vægt i gram efter formaling
               
            
                  m0
                  
               
               
                  =
               
               
                  den tørre prøves vægt i gram.
               
            5.3.   Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 0,2 % vandindhold i absolut værdi.
      6.   Bemærkning
      Hvis det viser sig at være nødvendigt med formaling og der i den forbindelse må påregnes en ændring af materialets vandindhold, skal analyseresultaterne for foderets bestanddele korrigeres i overensstemmelse med originalprøvens vandindhold.
      B.   BESTEMMELSE AF VANDINDHOLDET I ANIMALSK OG VEGETABILSK FEDT
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme animalske og vegetabilske fedtstoffers og oliers vandindhold (vand og flygtige stoffer).
      2.   Princip
      Prøven tørres ved 103 °C, indtil vægten ikke mere formindskes (vægttabet mellem to på hinanden følgende vejninger må højst være på 1 mg). Vægttabet bestemmes ved vejning.
      3.   Apparatur
      
                  3.1.
               
               
                  Fladbundet beholder af korrosionsbestandigt materiale, diameter: 8-9 cm, højde: ca. 3 cm
               
            
                  3.2.
               
               
                  Termometer med forstærket kugle og udvidelsesrum i den øverste ende, inddelt i grader fra ca. 80 °C til mindst 110 °C, længde: ca. 10 cm
               
            
                  3.3.
               
               
                  Sandbad eller elektrisk varmeplade
               
            
                  3.4.
               
               
                  Ekssikkator indeholdende et effektivt tørremiddel
               
            
                  3.5.
               
               
                  Analysevægt.
               
            4.   Fremgangsmåde
      Ca. 20 g af den homogeniserede prøve afvejes med 1 mg nøjagtighed i den tørre, tarerede beholder (3.1), hvori termometret (3.2) er anbragt. Prøven opvarmes på sandbadet eller varmepladen (3.3) under stadig omrøring med termometret, så den når en temperatur på 90 °C i løbet af ca. 7 minutter.
      Varmen dæmpes efter den hyppighed, med hvilken boblerne stiger op fra beholderens bund. Temperaturen må ikke overstige 105 °C. Bliv ved med at røre og skrabe bunden, indtil der ikke dannes flere bobler.
      For at sikre, at fugtigheden helt er fjernet, gentages opvarmningen til 103 °C ± 2 ° flere gange, med afkøling til 93 °C mellem de på hinanden følgende opvarmninger. Derefter henstilles til afkøling til rumtemperatur i ekssikkatoren (3.4) og vejes. Denne proces gentages, indtil vægttabet mellem to afvejninger ikke overstiger 2 mg.
      
                  
                     NB
                  
               
               
                  Hvis prøvens vægt øges efter gentagne opvarmninger, er dette tegn på oxidering af fedtstoffet. I så fald beregnes resultatet af den afvejning, der er blevet foretaget, umiddelbart inden vægtforøgelsen begyndte.
               
            5.   Beregning af resultater
      Prøvens vandindhold (X) i procent beregnes efter følgende formel:
      
         
      hvor:
      
                  m
               
               
                  =
               
               
                  prøvens vægt i gram
               
            
                  m1
                  
               
               
                  =
               
               
                  beholderens og indholdets vægt i gram inden opvarmning
               
            
                  m2
                  
               
               
                  =
               
               
                  beholderens og indholdets vægt i gram efter opvarmning.
               
            Resultater på under 0,05 % opføres som »mindre end 0,05 %«.
      Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 0,05 % vandindhold i absolut værdi.
      C.   BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF RÅPROTEIN
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af råprotein i foder på basis af nitrogenindholdet (Kjeldahls metode).
      2.   Princip
      Prøven destrueres med svovlsyre under tilstedeværelse af en katalysator. Syreopløsningen gøres alkalisk med en natriumhydroxidopløsning. Ammoniakken destilleres og opsamles i en nøjagtigt afmålt mængde svovlsyre, idet den overskydende mængde svovlsyre titreres med en standardnatriumhydroxidopløsning.
      Alternativt destilleres den frigjorte ammoniak i et overskud af borsyreopløsning, hvorefter der titreres med en saltsyre- eller svovlsyreopløsning.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  Kaliumsulfat.
               
            
                  3.2.
               
               
                  Katalysator: kobber(II)oxid (CuO) eller kobber(II)sulfatpentahydrat (CuSO4 · 5H2O).
               
            
                  3.3.
               
               
                  Granuleret zink.
               
            
                  3.4.
               
               
                  Svovlsyre, ρ20 = 1,84 g/ml.
               
            
                  3.5.
               
               
                  Svovlsyre, standardopløsning, c(H2SO4) = 0,25 mol/liter.
               
            
                  3.6.
               
               
                  Svovlsyre, standardopløsning, c(H2SO4) = 0,10 mol/liter.
               
            
                  3.7.
               
               
                  Svovlsyre, standardopløsning, c(H2SO4) = 0,05 mol/liter.
               
            
                  3.8.
               
               
                  Indikator af methylrødt; 300 mg methylrødt opløses i 100 ml ethanol, σ = 95-96 % (v/v).
               
            
                  3.9.
               
               
                  Natriumhydroxidopløsning (teknisk kvalitet kan bruges), β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).
               
            
                  3.10.
               
               
                  Natriumhydroxid, standardopløsning, c(NaOH) = 0,25 mol/liter.
               
            
                  3.11.
               
               
                  Natriumhydroxid, standardopløsning, c(NaOH) = 0,10 mol/liter.
               
            
                  3.12.
               
               
                  Granuleret pimpsten, vasket i saltsyre og udglødet.
               
            
                  3.13.
               
               
                  Acetanilid (smeltepunkt = 114 oC, N-indhold = 10,36 %).
               
            
                  3.14.
               
               
                  Saccharose (nitrogenfri).
               
            
                  3.15.
               
               
                  Borsyre (H3BO3).
               
            
                  3.16.
               
               
                  Indikatoropløsning af methylrødt: 100 mg methylrødt opløses i 100 ml ethanol eller methanol.
               
            
                  3.17.
               
               
                  Opløsning af bromcresolgrønt: 100 mg bromcresolgrønt opløses i 100 ml ethanol eller methanol.
               
            
                  3.18.
               
               
                  Borsyreopløsning (10–40 g/liter, afhængigt af det anvendte apparatur)
                  Anvendes kolorimetrisk endpointbestemmelse, skal borsyreopløsningerne tilføres methylrødt- og bromcresolgrøntindikatorer. Fremstilles 1 liter borsyreopløsning, tilsættes der, inden tilpasning af volumen, 7 ml indikatoropløsning af methylrødt (3.16) og 10 ml opløsning af bromcresolgrønt (3.17).
                  Borsyreopløsningens pH-værdi vil kunne variere fra batch til batch afhængigt af vandet, der bruges. Det vil ofte være nødvendigt at justere med en lille mængde alkali for at opnå en positiv blindprøve.
                  
                              
                                 NB
                              
                           
                           
                              En god justering opnås normalt ved at tilsætte ca. 3–4 ml NaOH (3.11) til 1 liter borsyreopløsning på 10 g/liter. Opløsningen opbevares ved rumtemperatur og beskyttes under opbevaringen mod lys og ammoniakdampe.
                           
                        
            
                  3.19.
               
               
                  Standardsaltsyreopløsning, c(HCl) = 0,10 mol/liter.
                  
                              
                                 NB
                              
                           
                           
                              Der kan anvendes opløsninger i andre koncentrationer (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 og 3.19), forudsat at der korrigeres herfor i beregningerne. Koncentrationen skal altid angives med fire decimaler.
                           
                        
            4.   Apparatur
      Apparat egnet til destruktion, destillation og titrering efter Kjeldahls metode.
      5.   Fremgangsmåde
      5.1.   Destruktion
      1 g af prøven afvejes med 0,001 g nøjagtighed og overføres til destruktionskolben. Der tilsættes 15 g kaliumsulfat (3.1), en passende mængde katalysator (3.2) (0,3–0,4 g kobber(II)oxid eller 0,9–1,2 g kobber(II)sulfatpentahydrat), 25 ml svovlsyre (3.4) og eventuelt nogle få korn pimpsten (3.12) og blandes.
      Kolben opvarmes, forsigtigt i begyndelsen, og omrystes om nødvendigt af og til forsigtigt, indtil prøven er forkullet og skummet forsvundet. Derefter opvarmes kraftigere, indtil væsken koger jævnt. Opvarmningen er tilstrækkelig, hvis den kogende syre fortætter sig på kolbens væg. Det må forhindres, at siderne bliver overophedet, og at organiske partikler klæber til dem.
      Når opløsningen bliver klar og lysegrøn, fortsættes kogningen i yderligere to timer. Derefter henstilles kolben til afkøling.
      5.2.   Destillation
      Der tilsættes forsigtigt tilstrækkeligt vand til, at sulfaterne opløses fuldstændigt. Kolben henstår til afkøling, hvorefter der om nødvendigt tilsættes nogle få zinkkorn (3.3). Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.2.1 eller 5.2.2.
      5.2.1.   Destillation i svovlsyre
      
      I destillationsapparatets opsamlingskolbe anbringes en nøjagtigt afmålt mængde på 25 ml svovlsyre (3.5 eller 3.7) afhængigt af det formodede nitrogenindhold. Der tilsættes nogle få dråber indikator af methylrødt (3.8).
      Destruktionskolben forbindes med destillationsapparatets svaler, og svalerens nederste del nedsænkes i væsken i opsamlingskolben til en dybde af mindst 1 cm (se bemærkning 8.3). 100 ml natriumhydroxidopløsning (3.9) overføres forsigtigt til destruktionskolben, uden at der mistes ammoniak (se bemærkning 8.1). Kolben opvarmes, indtil ammoniakken er destilleret over.
      5.2.2.   Destillation i borsyre
      
      Foretages titreringen af destillatets ammoniakindhold manuelt, følges den nedenfor beskrevne fremgangsmåde. Er destillationsenheden fuldt automatiseret, så også titreringen af destillatets ammoniakindhold sker automatisk, følges brugsanvisningen til destillationsenheden.
      En opsamlingskolbe med 25-30 ml af borsyreopløsningen (3.18) anbringes under svalerens afløbsåbning, således at tilførselsrøret befinder sig under overfladen i den overskydende borsyreopløsning. Destillationsenheden indstilles til at give 50 ml natriumhydroxidopløsning (3.9). Destillationsenheden betjenes i overensstemmelse med brugsanvisningen, og den ammoniak, der er frigivet ved tilførslen af natriumhydroxidopløsningen, afdampes. Destillatet opsamles i forlaget med borsyre. Destillatmængden (dampdestillationstiden) afhænger af mængden af nitrogen i prøven. Brugsanvisningen følges.
      
                  
                     NB
                  
               
               
                  I en halvautomatisk destillationsenhed sker tilførslen af overskydende natriumhydroxid samt dampdestillationen automatisk.
               
            5.3.   Titrering
      Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.1 eller 5.3.2.
      5.3.1.   Svovlsyre
      
      Den overskydende svovlsyre i opsamlingskolben titreres med natriumhydroxidopløsning (3.10 eller 3.11) afhængigt af koncentrationen af den anvendte svovlsyre, indtil ækvivalenspunktet er nået.
      5.3.2.   Borsyre
      
      Med en burette titreres opsamlingskolbens indhold med standardsaltsyreopløsningen (3.19) eller med standardsvovlsyreopløsningen (3.6), og den anvendte titrantmængde aflæses.
      Anvendes kolorimetrisk endpointbestemmelse, er ækvivalenspunktet nået ved det første tegn på pinkfarvning af indholdet. Buretteaflæsningen anslås med 0,05 ml nøjagtighed. En oplyst magnetisk omrørerplade eller en fotometrisk detektor vil kunne lette visualiseringen af ækvivalenspunktet.
      Processen kan gøres automatisk ved anvendelse af en dampdestillationsenhed med automatisk titrering.
      Brugsanvisningen til den enkelte destillationsenhed eller destillationsenhed/titrator følges.
      
                  
                     NB
                  
               
               
                  Anvendes et automatisk titreringssystem, begynder titreringen umiddelbart efter, at destillationen er begyndt, og borsyreopløsningen på 1 % (3.18) anvendes.
                  Gøres der brug af en fuldautomatisk destillationsenhed, kan den automatiske titrering af ammoniakken også foretages med endpointbestemmelse, idet der så anvendes et potentiometrisk pH-system.
                  I dette tilfælde anvendes en automatisk titrator med pH-meter. pH-metret skal være korrekt kalibreret i området pH 4-pH 7 i overensstemmelse med almindelige laboratorie-pH-kalibreringsprocedurer.
                  pH-titreringsækvivalenspunktet nås ved en pH-værdi på 4,6, som er det sted på titreringskurven, hvor hældningen er stejlest.
               
            5.4.   Blindprøve
      For at sikre, at reagenserne er nitrogenfrie, foretages der en blindprøve (destruktion, destillation og titrering) ved brug af 1 g saccharose (3.14) i stedet for prøven.
      6.   Beregning af resultater
      Beregningerne foretages som beskrevet i punkt 6.1 eller 6.2.
      6.1.   Titreringsberegning, jf. 5.3.1
      Indholdet af råprotein, udtrykt i vægtprocent, beregnes efter følgende formel:
      
         
      hvor:
      
                  Vo
                  
               
               
                  =
               
               
                  mængde (ml) NaOH (3.10 eller 3.11) forbrugt i blindprøven
               
            
                  V1
                  
               
               
                  =
               
               
                  mængde (ml) NaOH (3.10 eller 3.11) forbrugt ved titreringen af prøven
               
            
                  c
               
               
                  =
               
               
                  koncentration (mol/liter) af natriumhydroxid (3.10 eller 3.11)
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  prøvens vægt i gram.
               
            6.2.   Titreringsberegning, jf. 5.3.2
      6.2.1.   Titrering med saltsyre
      
      Indholdet af råprotein, udtrykt i vægtprocent, beregnes efter følgende formel:
      
         
      hvor:
      
                  m
               
               
                  =
               
               
                  testportionens vægt i gram
               
            
                  c
               
               
                  =
               
               
                  koncentration (mol/liter) af standardsaltsyreopløsningen (3.19)
               
            
                  V0
                  
               
               
                  =
               
               
                  mængde (ml) saltsyre anvendt i blindprøven
               
            
                  V1
                  
               
               
                  =
               
               
                  mængde (ml) saltsyre anvendt i testportionen.
               
            6.2.2.   Titrering med svovlsyre
      
      Indholdet af råprotein, udtrykt i vægtprocent, beregnes efter følgende formel:
      
         
      hvor:
      
                  m
               
               
                  =
               
               
                  testportionens vægt i gram
               
            
                  c
               
               
                  =
               
               
                  koncentration (mol/liter) af standardsvovlsyreopløsningen (3.6)
               
            
                  V0
                  
               
               
                  =
               
               
                  mængde (ml) svovlsyre (3.6) anvendt i blindprøven
               
            
                  V1
                  
               
               
                  =
               
               
                  mængde (ml) svovlsyre (3.6) anvendt i testportionen.
               
            7.   Kontrol af metoden
      7.1.   Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige:
      
                  —
               
               
                  0,2 % i absolut værdi for råproteinindhold på under 20 %
               
            
                  —
               
               
                  1,0 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for råproteinindhold på 20–40 %
               
            
                  —
               
               
                  0,4 % i absolut værdi for råproteinindhold på over 40 %.
               
            7.2.   Nøjagtighed
      Analysen (destruktion, destillation og titrering) foretages på 1,5–2,0 g acetanilid (3.13) under tilstedeværelse af 1 g saccharose (3.14). 1 g acetanilid kræver 14,80 ml svovlsyre (3.5). Genfindingsprocenten skal være mindst 99 %.
      8.   Bemærkninger
      
                  8.1.
               
               
                  Apparaturet kan være manuelt, halvautomatisk eller automatisk. Hvis apparaturet kræver overførsel mellem destruktions- og destillationstrinet, skal sådan overførsel kunne ske uden tab. Hvis destillationsapparatets kolbe ikke har skilletragt, tilsættes natriumhydroxiden, lige inden kolben forbindes med svaleren, idet væsken hældes langsomt ned langs siden.
               
            
                  8.2.
               
               
                  Hvis destruktionsproduktet størkner, gentages bestemmelsen med brug af en større mængde svovlsyre (3.4) end angivet ovenfor.
               
            
                  8.3.
               
               
                  For produkter med lavt nitrogenindhold kan mængden af svovlsyre (3.7), der skal bruges i opsamlingskolben, om nødvendigt mindskes til 10 eller 15 ml og fyldes op med vand til 25 ml.
               
            
                  8.4.
               
               
                  Til rutineanalyser kan der anvendes alternative analysemetoder til bestemmelse af råprotein, men Kjeldahls metode som beskrevet her i del C er referencemetoden. Det skal for hver enkelt matrix godtgøres, at de resultater, der opnås med den alternative metode (f.eks. DUMAS), svarer til dem, der opnås med referencemetoden. Eftersom resultaterne, der opnås med en alternativ metode, kan afvige en smule fra de resultater, der opnås med referencemetoden, selv efter ækvivalenskontrol, er det nødvendigt i analyserapporten at angive, hvilken analysemetode der er anvendt til bestemmelse af råprotein.
               
            D.   BESTEMMELSE AF URINSTOF
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af urinstof i foder.
      2.   Princip
      Prøven opslæmmes i vand under tilsætning af et klaringsmiddel. Suspensionen filtreres. Filtratets indhold af urinstof bestemmes, efter tilsætning af 4-dimethylaminobenzaldehyd (4-DMAB), ved måling af ekstinktionen ved en bølgelængde på 420 nm.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  4-Dimethylaminobenzaldehydopløsning: 1,6 g 4-DMAB opløses i 100 ml 96 % ethanol, og der tilsættes 10 ml saltsyre (ρ20 = 1,19 g/ml). Dette reagens kan højst holde sig i to uger.
               
            
                  3.2.
               
               
                  Carrez-reagens I: 21,9 g zinkacetat, Zn(CH3COO)2 · 2H2O, og 3 g iseddike opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.
               
            
                  3.3.
               
               
                  Carrez-reagens II: 10,6 g kaliumferrocyanid, K4Fe(CN)6 · 3H2O, opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.
               
            
                  3.4.
               
               
                  Aktivt kul, der ikke absorberer urinstoffet (skal kontrolleres).
               
            
                  3.5.
               
               
                  Urinstof, 0,1 % opløsning (w/v).
               
            4.   Apparatur
      
                  4.1.
               
               
                  Mekanisk rysteapparat: ca. 35–40 omdrejninger i minuttet
               
            
                  4.2.
               
               
                  Reagensglas: 160 × 16 mm, med slibprop
               
            
                  4.3.
               
               
                  Spektrofotometer.
               
            5.   Fremgangsmåde
      5.1.   Analyse af prøven
      2 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed og kommes sammen med 1 g aktivt kul (3.4) i en 500 ml målekolbe. Der tilsættes 400 ml vand og 5 ml Carrez-reagens I (3.2) og blandes i ca. 30 sekunder, hvorefter der tilsættes 5 ml Carrez-reagens II (3.3). Væsken blandes i 30 minutter i rysteapparatet. Der fyldes op med vand til mærket, omrystes og filtreres.
      5 ml af de klare og farveløse filtrater udtages med pipette og hældes i reagensglassene med slibprop, hvorefter der tilsættes 5 ml 4-DMAB-opløsning (3.1) og blandes. Glassene anbringes i vandbad ved 20 oC (+/- 4 oC). Efter 15 minutter måles ekstinktionen i prøveopløsningen i spektrofotometret ved 420 nm ved sammenligning med reagensernes blindprøveopløsning.
      5.2.   Kalibreringskurve
      Der udtages volumener på 1, 2, 4, 5 og 10 ml af urinstofopløsningen (3.5), disse hældes i 100 ml målekolber, og der fyldes op med vand til mærket. Der udtages 5 ml af hver opløsning, hver af dem tilsættes 5 ml 4-DMAB-opløsning (3.1), der homogeniseres, og ekstinktionen måles, som angivet ovenfor, ved sammenligning med en kontrolopløsning, som indeholder 5 ml 4-DMAB og 5 ml vand uden urinstof. Kalibreringskurven tegnes.
      6.   Beregning af resultater
      Bestem mængden af urinstof i prøven ved benyttelse af kalibreringskurven.
      Resultatet angives i procent af prøven.
      7.   Bemærkninger
      
                  7.1.
               
               
                  Hvis indholdet af urinstof er større end 3 %, reduceres analyseprøven til 1 gram, eller den oprindelige opløsning fortyndes så meget, at der ikke er mere end 50 mg urinstof i 500 ml.
               
            
                  7.2.
               
               
                  Hvis indholdet af urinstof er ringe, forøges prøvens volumen i det omfang, filtratet vedbliver at være klart og farveløst.
               
            
                  7.3.
               
               
                  Hvis prøven indeholder simple kvælstofforbindelser, som for eksempel aminosyrer, foretages målingen af ekstinktionen ved 435 nm.
               
            E.   BESTEMMELSE AF FLYGTIGE KVÆLSTOFHOLDIGE BASER
      I.   BESTEMMELSE VED MIKRODIFFUSION
      1.   Formål og anvendelsesområde
      
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af flygtige kvælstofholdige baser, udtrykt som ammoniak, i foder.
      2.   Princip
      
      Prøven ekstraheres med vand, og opløsningen klares og filtreres. De flygtige kvælstofholdige baser udskilles efter tilsætning af kaliumcarbonatopløsning ved mikrodiffusion, opfanges i en borsyreopløsning og titreres med svovlsyre.
      3.   Reagenser
      
      
                  3.1.
               
               
                  Trichloreddikesyre, 20 % opløsning (w/v).
               
            
                  3.2.
               
               
                  Indikator: 33 mg bromcresolgrønt og 65 mg methylrødt opløses i 100 ml ethanol 95–96 % (v/v).
               
            
                  3.3.
               
               
                  Borsyreopløsning: 10 g borsyre opløses i en 1 liter målekolbe indeholdende 200 ml ethanol 95–96 % (v/v) og 700 ml vand. 10 ml af indikatoren (3.2) tilsættes. Opløsningen blandes og bringes om nødvendigt under tilsætning af natriumhydroxidopløsning til at antage en lyserød farve. 1 ml af denne opløsning kan binde op til 300 μg NH3.
               
            
                  3.4.
               
               
                  Mættet kaliumcarbonatopløsning: 100 g kaliumcarbonat opløses i 100 ml kogende vand. Efter afkøling filtreres opløsningen.
               
            
                  3.5.
               
               
                  Svovlsyre, 0,01 mol/liter.
               
            4.   Apparatur
      
      
                  4.1.
               
               
                  Mekanisk rysteapparat: ca. 35–40 omdrejninger i minuttet
               
            
                  4.2.
               
               
                  Conwayskåle (se skitse) af glas eller plastic
               
            
                  4.3.
               
               
                  Mikroburetter inddelt i 1/100 ml.
               
            5.   Fremgangsmåde
      
      10 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed, kommes sammen med 100 ml vand i en 200 ml målekolbe og blandes eller omrystes i 30 minutter i rysteapparatet. Der tilsættes 50 ml trichloreddikesyreopløsning (3.1), fyldes op med vand til mærket, omrystes kraftigt og filtreres gennem et foldefilter.
      1 ml borsyreopløsning (3.3) afpipetteres i Conwayskålens midte, hvorefter 1 ml af prøvefiltratet overføres til skålens ring. Skålen tildækkes delvist med det let indfedtede låg. 1 ml af den mættede kaliumcarbonatopløsning (3.4) kommes hurtigt ned i ringen, og skålen lukkes, så den er lufttæt. Skålen drejes forsigtigt i vandret stilling, så de to reagenser blandes. Der inkuberes i mindst 4 timer ved rumtemperatur eller i 1 time ved 40 oC.
      De i borsyreopløsningen indeholdte flygtige baser titreres derefter med svovlsyre (3.5) ved anvendelse af en mikroburette (4.3).
      På samme måde udføres en blindprøve under udeladelse af analyseprøven.
      6.   Beregning af resultater
      
      1 ml 0,01 mol/liter svovlsyre svarer til 0,34 mg ammoniak.
      Resultatet angives i procent af prøven.
      Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige:
      
                  —
               
               
                  10 % i relativ værdi ved indhold på mindre end 1,0 % ammoniak
               
            
                  —
               
               
                  0,1 % i absolut værdi ved indhold på 1,0 % ammoniak og derover.
               
            7.   Bemærkning
      
      Har prøven et indhold på mere end 0,6 % ammoniak, fortyndes det oprindelige filtrat.
      
         
      II.   BESTEMMELSE VED DESTILLATION
      1.   Formål og anvendelsesområde
      
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af flygtige kvælstofholdige baser, udtrykt som ammoniak, i fiskemel, som praktisk talt ikke indeholder urinstof. Metoden anvendes kun ved indhold på mindre end 0,25 % ammoniak.
      2.   Princip
      
      Prøven ekstraheres med vand, og opløsningen klares og filtreres. De flygtige kvælstofholdige baser udskilles efter tilsætning af magnesiumoxid ved kogetemperatur og opfanges i en bestemt mængde svovlsyre, idet den overskydende mængde svovlsyre tilbagetitreres med en natriumhydroxidopløsning.
      3.   Reagenser
      
      
                  3.1.
               
               
                  Trichloreddikesyre, 20 % opløsning (w/v)
               
            
                  3.2.
               
               
                  Magnesiumoxid
               
            
                  3.3.
               
               
                  Skumdæmpende emulsion (f.eks. silikone)
               
            
                  3.4.
               
               
                  Svovlsyre, 0,05 mol/liter
               
            
                  3.5.
               
               
                  Natriumhydroxidopløsning, 0,1 mol/liter
               
            
                  3.6.
               
               
                  Methylrødtopløsning, 0,3 % i 95–96 % (v/v) ethanol.
               
            4.   Apparatur
      
      
                  4.1.
               
               
                  Mekanisk rysteapparat: ca. 35–40 omdrejninger i minuttet
               
            
                  4.2.
               
               
                  Destillationsapparatur af Kjeldahl-typen.
               
            5.   Fremgangsmåde
      
      10 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed og kommes sammen med 100 ml vand i en 200 ml målekolbe og blandes eller omrystes i 30 minutter i rysteapparatet. Der tilsættes 50 ml trichloreddikesyreopløsning (3.1), fyldes op med vand til mærket, omrystes kraftigt og filtreres gennem et foldefilter.
      Afhængigt af det formodede indhold af flygtige kvælstofholdige baser udtages en mængde af det klare filtrat (normalt 100 ml). Det fortyndes til 200 ml, og der tilsættes 2 g magnesiumoxid (3.2) samt nogle få dråber skumdæmpende emulsion (3.3). Opløsningen skal reagere alkalisk over for lakmuspapir; i modsat fald tilsættes yderligere magnesiumoxid (3.2). Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.2 og 5.3 for analysemetoden til bestemmelse af indholdet af råprotein (del C i dette bilag).
      På samme måde udføres en blindprøve under udeladelse af analyseprøven.
      6.   Beregning af resultater
      
      1 ml 0,05 mol/liter svovlsyre svarer til 1,7 mg ammoniak.
      Resultatet angives i procent af prøven.
      Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 10 % ammoniak i relativ værdi.
      F.   BESTEMMELSE AF AMINOSYRER (BORTSET FRA TRYPTOPHAN)
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af frie (syntetiske og naturlige) og totale (peptidbundne og frie) aminosyrer i foder ved brug af en aminosyreanalysator. Metoden kan anvendes til følgende aminosyrer: cyst(e)in, methionin, lysin, threonin, alanin, arginin, asparaginsyre, glutaminsyre, glycin, histidin, isoleucin, leucin, phenylalanin, prolin, serin, tyrosin og valin.
      Metoden skelner ikke mellem salte af aminosyrer og kan ikke differentiere mellem D- og L-former af aminosyrer. Den er ikke anvendelig til bestemmelse af tryptophan- eller hydroxyanaloger af aminosyrer.
      2.   Princip
      2.1.   Frie aminosyrer
      Frie aminosyrer ekstraheres med fortyndet saltsyre. Kvælstofholdige makromolekyler, der ekstraheres samtidig, udfældes med sulfosalicylsyre og fjernes ved filtrering. Den filtrerede opløsnings pH-værdi justeres til 2,20. Aminosyrerne adskilles ved ionbytningskromatografi og bestemmes ved reaktion med ninhydrin ved fotometrisk påvisning ved 570 nm.
      2.2.   Totale aminosyrer
      Den valgte metode afhænger af de aminosyrer, der skal undersøges. Cyst(e)in og methionin skal oxideres til henholdsvis cysteinsyre og methioninsulfon inden hydrolyse. Tyrosin skal bestemmes i hydrolysater af uoxiderede prøver. Alle de øvrige aminosyrer, der er nævnt i punkt 1, kan bestemmes i enten den oxiderede eller den uoxiderede prøve.
      Oxidering sker ved 0 oC med en phenolholdig permyresyre. Overskydende oxideringsreagens destrueres med natriumdisulfit. Den oxiderede eller uoxiderede prøve hydrolyseres med saltsyre (3.20) i 23 timer. Hydrolysatets pH-værdi justeres til 2,20. Aminosyrerne adskilles ved ionbytningskromatografi og bestemmes ved reaktion med ninhydrin ved fotometrisk påvisning ved 570 nm (440 nm for prolin).
      3.   Reagenser
      Der skal anvendes dobbeltdestilleret vand eller vand af tilsvarende kvalitet (ledningsevne: < 10 μS).
      
                  3.1.
               
               
                  Hydrogenperoxid, w (w/v) = 30 %.
               
            
                  3.2.
               
               
                  Myresyre, w (w/v) = 98–100 %.
               
            
                  3.3.
               
               
                  Phenol.
               
            
                  3.4.
               
               
                  Natriumdisulfit.
               
            
                  3.5.
               
               
                  Natriumhydroxid.
               
            
                  3.6.
               
               
                  5-Sulfosalicylsyre-dihydrat.
               
            
                  3.7.
               
               
                  Saltsyre, massefylde: ca. 1,18 g/ml.
               
            
                  3.8.
               
               
                  Tri-natriumcitrat-dihydrat.
               
            
                  3.9.
               
               
                  2,2'-Thiodiethanol (thiodiglycol).
               
            
                  3.10.
               
               
                  Natriumchlorid.
               
            
                  3.11.
               
               
                  Ninhydrin.
               
            
                  3.12.
               
               
                  Petroleumsether, kogepunktsinterval: 40–60 oC.
               
            
                  3.13.
               
               
                  Norleucin eller anden forbindelse, der er egnet til brug som intern standard.
               
            
                  3.14.
               
               
                  Nitrogengas (< 10 ppm oxygen).
               
            
                  3.15.
               
               
                  1-Octanol.
               
            
                  3.16.
               
               
                  Aminosyrer
               
            
                  3.16.1.
               
               
                  Standardstoffer som anført i punkt 1. Rene forbindelser, der ikke indeholder krystalvand. Tørres under vakuum over P205 eller H2SO4 i 1 uge inden brug.
               
            
                  3.16.2.
               
               
                  Cysteinsyre.
               
            
                  3.16.3.
               
               
                  Methioninsulfon.
               
            
                  3.17.
               
               
                  Natriumhydroxidopløsning, c = 7,5 mol/liter:
                  300 g NaOH (3.5) opløses i vand, og der fyldes op til 1 liter.
               
            
                  3.18.
               
               
                  Natriumhydroxidopløsning, c = 1 mol/liter:
                  40 g NaOH (3.5) opløses i vand, og der fyldes op til 1 liter.
               
            
                  3.19.
               
               
                  Phenolholdig myresyreopløsning:
                  889 g myresyre (3.2) blandes med 111 g vand, og der tilsættes 4,73 g phenol (3.3).
               
            
                  3.20.
               
               
                  Hydrolyseblanding, c = 6 mol HCl/liter indeholdende 1 g phenol/liter:
                  Der tilsættes 1 g phenol (3.3) til 492 ml HCl (3.7) og fyldes op med vand til 1 liter.
               
            
                  3.21.
               
               
                  Ekstraktionsopløsning, c = 0,1 mol HCl/liter indeholdende 2 % thiodiglycol: 8,2 ml HCl (3.7) opløses i ca. 900 ml vand, hvorefter der tilsættes 20 ml thiodiglycol (3.9) og fyldes op med vand til 1 liter (3.7 og 3.9 må ikke blandes direkte).
               
            
                  3.22.
               
               
                  5-Sulfosalicylsyreopløsning, ß = 6 %:
                  60 g 5-sulfosalicylsyre (3.6) opløses i vand, og der fyldes op med vand til 1 liter.
               
            
                  3.23.
               
               
                  Oxideringsreagens (permyresyre-phenol):
                  0,5 ml hydrogenperoxid (3.1) blandes med 4,5 ml phenolholdig myresyreopløsning (3.19) i et lille bægerglas. Inkuberes ved 20–30 oC i 1 time for at danne permyresyre. Herefter afkøles opløsningen i isbad (15 minutter), inden den tilsættes prøven.
                  Advarsel: Undgå kontakt med huden, og bær beskyttelsesbeklædning.
               
            
                  3.24.
               
               
                  Citratbuffer, c = 0,2 mol Na+/liter, pH 2,20:
                  19,61 g natriumcitrat (3.8), 5 ml thiodiglycol (3.9), 1 g phenol (3.3) og 16,50 ml HCl (3.7) opløses i ca. 800 ml vand. pH justeres til 2,20. Der fyldes op med vand til 1 liter.
               
            
                  3.25.
               
               
                  Elueringsbuffere fremstillet ifølge betingelserne for den benyttede analysator (4.9).
               
            
                  3.26.
               
               
                  Ninhydrinreagens fremstillet ifølge betingelserne for den benyttede analysator (4.9).
               
            
                  3.27.
               
               
                  Standardopløsninger af aminosyrer. Opløsningerne opbevares ved < 5 oC.
               
            
                  3.27.1.
               
               
                  Standardstamopløsning af aminosyrer (3.16.1)
                  c = 2,5 μmol/ml af hver i saltsyre.
                  Kan fås i handelen.
               
            
                  3.27.2.
               
               
                  Standardstamopløsning af cysteinsyre og methioninsulfon, c = 1,25 μmol/ml
                  0,2115 g cysteinsyre (3.16.2) og 0,2265 g methioninsulfon (3.16.3) opløses i citratbuffer (3.24) i en 1 liter målekolbe, og der fyldes op til mærket med citratbuffer. Opløsningen opbevares ved < 5 oC i højst 12 måneder. Denne opløsning benyttes ikke, hvis standardstamopløsningen (3.27.1) indeholder cysteinsyre og methioninsulfon.
               
            
                  3.27.3.
               
               
                  Standardstamopløsning af den interne standard, f.eks. norleucin, c = 20 μmol/ml
                  0,6560 g norleucin (3.13) opløses i citratbuffer (3.24) i en målekolbe, og der fyldes op med citratbuffer til 250 ml. Opløsningen opbevares ved < 5 oC i højst 6 måneder.
               
            
                  3.27.4.
               
               
                  Kalibreringsopløsning af standardaminosyrer til brug med hydrolysater, c = 5 nmol/50 μl cysteinsyre og methioninsulfon og c = 10 nmol/50 μl af de øvrige aminosyrer. 2,2 g natriumchlorid (3.10) opløses i et 100 ml bægerglas med 30 ml citratbuffer (3.24). Der tilsættes 4,00 ml standardstamopløsning af aminosyrer (3.27.1), 4,00 ml standardstamopløsning af cysteinsyre og methioninsulfon (3.27.2) og, hvis benyttet, 0,50 ml standardstamopløsning af intern standard (3.27.3). pH justeres til 2,20 med natriumhydroxid (3.18).
                  Opløsningen overføres kvantitativt til en 50 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med citratbuffer (3.24) og blandes.
                  Opløsningen opbevares ved < 5 oC i højst 3 måneder.
                  Se også bemærkning 9.1.
               
            
                  3.27.5.
               
               
                  Kalibreringsopløsning af standardaminosyrer til brug med hydrolysater fremstillet under punkt 5.3.3.1 og til brug med ekstrakter (5.2). Kalibreringsopløsningen fremstilles efter punkt 3.27.4, men der tilsættes ikke natriumchlorid.
                  Opløsningen opbevares ved < 5 oC i højst 3 måneder.
               
            4.   Apparatur
      
                  4.1.
               
               
                  100 eller 250 ml rundbundet kolbe med tilbagesvaler.
               
            
                  4.2.
               
               
                  100 ml borsilikatglasflaske med skruelåg forsynet med gummi/teflonpakning (f.eks. Duran, Schott) til brug i tørreskab.
               
            
                  4.3.
               
               
                  Tørreskab med motordreven ventilation og temperaturindstilling med en nøjagtighed på ± 2 oC.
               
            
                  4.4.
               
               
                  pH-meter (aflæsning med tre decimaler).
               
            
                  4.5.
               
               
                  Membranfilter (0,22 μm).
               
            
                  4.6.
               
               
                  Centrifuge.
               
            
                  4.7.
               
               
                  Rotationsvakuumfordamper.
               
            
                  4.8.
               
               
                  Mekanisk rysteapparat eller magnetomrører.
               
            
                  4.9.
               
               
                  Aminosyreanalysator eller HPLC-udstyr med ionbyttekolonne, anordning til ninhydrin-postkolonne-derivatisering og fotometrisk detektor.
                  Kolonnen pakkes med sulfoneret polystyrenresin, der kan adskille aminosyrerne fra hinanden og fra andre ninhydrinpositive stoffer. Pumperne til buffer- og ninhydrinopløsningen skal i den tid, der omfatter såvel standardkalibreringskørslen som prøveanalysen, have en flowstabilitet på ±0,5 %.
                  Nogle aminosyreanalysatorer kan benyttes, hvor hydrolysatet har en natriumkoncentration på c = 0,8 mol/liter og indeholder den resterende myresyre fra oxideringstrinnet. Andre analysatorer giver ikke tilfredsstillende adskillelse af visse aminosyrer, hvis hydrolysatet indeholder overskydende myresyre og/eller høje natriumionkoncentrationer. I så fald reduceres syrevolumen ved inddampning til ca. 5 ml efter hydrolysen og inden pH-justeringen. Inddampningen foretages under vakuum ved højst 40 oC.
               
            5.   Fremgangsmåde
      5.1.   Klargøring af prøven
      Prøven formales, så den kan passere gennem en 0,5 mm sigte. Meget fugtige prøver skal inden formalingen enten lufttørres ved højst 50 oC eller frysetørres. Prøver med et højt fedtindhold ekstraheres med petroleumsether (3.12) inden formaling.
      5.2.   Bestemmelse af frie aminosyrer i foder og forblandinger
      En passende mængde (1–5 g) af den klargjorte prøve (5.1) afvejes med en nøjagtighed på 0,2 mg i en konisk kolbe, og der tilsættes 100,0 ml ekstraktionsopløsning (3.21). Blandingen rystes i 60 minutter på mekanisk rysteapparat eller magnetomrører (4.8). Efter henstand og bundfældning afpipetteres 10,0 ml af supernatanten i et 100 ml bægerglas.
      Der tilsættes 5,0 ml sulfosalicylsyreopløsning (3.22) under omrøring, og der omrøres fortsat med magnetomrører i 5 minutter. Supernatanten filtreres eller centrifugeres for at fjerne eventuelt bundfald. 10,0 ml af den klarede opløsning kommes i et 100 ml bægerglas, og pH justeres til 2,20 med natriumhydroxidopløsning (3.18). Opløsningen overføres med citratbuffer (3.24) til en målekolbe af passende størrelse, og der fyldes op til mærket med citratbufferopløsningen (3.24).
      Hvis der bruges en intern standard, tilsættes 1,00 ml intern standard (3.27.3) for hver 100 ml slutopløsning, og der fyldes op til mærket med bufferopløsningen (3.24).
      Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4.
      Hvis ekstraktet ikke kromatograferes samme dag, skal det opbevares ved < 5 oC.
      5.3.   Bestemmelse af totale aminosyrer
      5.3.1.   Oxidering
      
      0,1–1 g af den klargjorte prøve (5.1) afvejes med en nøjagtighed på 0,2 mg i:
      
                  —
               
               
                  en 100 ml rundbundet kolbe (4.1) til åben hydrolyse (5.3.2.3), eller
               
            
                  —
               
               
                  en 250 ml rundbundet kolbe (4.1), hvis der kræves en lav natriumkoncentration (5.3.3.1), eller
               
            
                  —
               
               
                  en 100 ml flaske med skruelåg (4.2) til lukket hydrolyse (5.3.2.4).
               
            Den afvejede prøveportion skal have et kvælstofindhold på ca. 10 mg og et vandindhold på højst 100 mg.
      Kolben/flasken anbringes i isbad og nedkøles til 0 oC, hvorefter der tilsættes 5 ml oxideringsblanding (3.23) og omrøres ved hjælp af en glasspatel med bøjet spids. Kolben/flasken, der indeholder spatelen, lukkes med lufttæt film. Isbadet med den lukkede beholder anbringes i et køleskab ved 0 oC og henstår i 16 timer. Efter 16 timer tages det ud af køleskabet, og det overskydende oxideringsreagens destrueres ved tilsætning af 0,84 g natriumdisulfit (3.4).
      Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.2.1.
      5.3.2.   Hydrolyse
      
      5.3.2.1.   Hydrolyse af oxiderede prøver
      
      Den oxiderede prøve (5.3.1) tilsættes 25 ml hydrolyseblanding (3.20). Alle prøverester, der måtte sidde fast på beholderen og spatelen, skal omhyggeligt vaskes ned.
      Alt efter den benyttede hydrolysemetode fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4.
      5.3.2.2.   Hydrolyse af uoxiderede prøver
      
      0,1–1 g af den klargjorte prøve (5.1) afvejes med en nøjagtighed på 0,2 mg i en 100 ml eller 250 ml rundbundet kolbe (4.1) eller en 100 ml flaske med skruelåg (4.2). Den afvejede prøveportion skal have et kvælstofindhold på ca. 10 mg. Der tilsættes forsigtigt 25 ml hydrolyseblanding (3.20), som blandes med prøven. Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4.
      5.3.2.3.   Åben hydrolyse
      
      Der tilsættes tre glasperler til blandingen i kolben (klargjort som beskrevet i punkt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2). Den opvarmes til kogning og holdes under konstant kogning med tilbagesvaler i 23 timer. Efter afslutning af hydrolysen skylles tilbagesvaleren med 5 ml citratbuffer (3.24). Kolben aftages og afkøles i isbad.
      Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.3.
      5.3.2.4.   Lukket hydrolyse
      
      Flasken med blandingen klargjort som beskrevet i punkt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2 anbringes i et tørreskab (4.3) ved 110 oC. For at forhindre trykopbygning (på grund af udvikling af gasser) og undgå eksplosion lægges skruelåget i den første time løst på flasken. Flasken må ikke lukkes med skruelåget. Efter en times forløb lukkes flasken med skruelåget og henstår i tørreskabet (4.3) i 23 timer. Efter afslutning af hydrolysen tages flasken ud af tørreskabet, skruelåget åbnes forsigtigt, og kolben anbringes i isbad, hvor den henstår til afkøling.
      Alt efter metoden for justering af pH-værdien (5.3.3) overføres kolbens indhold kvantitativt med citratbuffer (3.24) til et 250 ml bægerglas eller til en 250 ml rundbundet kolbe.
      Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.3.
      5.3.3.   Justering af pH-værdien
      
      Alt efter aminosyreanalysatorens (4.9) natriumtolerance foretages justeringen af pH-værdien som beskrevet i punkt 5.3.3.1 eller 5.3.3.2.
      5.3.3.1.   
            For kromatografisystemer (4.9), der kræver en lav natrium-koncentration:
      
      Det er tilrådeligt at bruge en intern standardstamopløsning (3.27.3), hvis der benyttes aminosyreanalysatorer, der kræver en lav natriumkoncentration (hvor syreindholdet skal reduceres).
      I så fald tilsættes 2,00 ml af den interne standardstamopløsning (3.27.3) til hydrolysatet før inddampningen.
      Der tilsættes 2 dråber 1-octanol (3.15) til det efter punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4 frembragte hydrolysat.
      Volumen reduceres ved hjælp af rotationsfordamperen (4.7) til 5–10 ml under vakuum ved 40 oC. Hvis volumen ved et uheld reduceres til under 5 ml, kasseres hydrolysatet, og analysen gentages.
      pH justeres til 2,20 med natriumhydroxidopløsning (3.18), og der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.4.
      5.3.3.2.   
            For andre aminosyreanalysatorer (4.9)
         :
      Det efter 5.3.2.3 eller 5.3.2.4 frembragte hydrolysat neutraliseres delvis ved under omrøring at tilsætte 17 ml natriumhydroxidopløsning (3.17), samtidig med at temperaturen holdes under 40 oC.
      pH justeres til 2,20 med natriumhydroxidopløsning (3.17 og 3.18) ved rumtemperatur. Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.4.
      5.3.4.   Prøveopløsning til kromatografi
      
      Hydrolysatet (5.3.3.1 eller 5.3.3.2) justeret til en pH-værdi på 2,20 overføres med citratbuffer (3.24) kvantitativt til en 200 ml målekolbe, og der fyldes op til mærket med buffer (3.24).
      Hvis en intern standard anvendes, og denne ikke allerede er tilsat, tilsættes der 2,00 ml intern standard (3.27.3) og fyldes op til mærket med citratbuffer (3.24). Der blandes omhyggeligt.
      Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4.
      Hvis prøveopløsningen ikke kromatograferes samme dag, skal den opbevares ved < 5 oC.
      5.4.   Kromatografi
      Inden kromatografi opvarmes ekstraktet (5.2) eller hydrolysatet (5.3.4) til rumtemperatur. Blandingen rystes, og en passende mængde filtreres gennem et 0,22 μm membranfilter (4.5). Der foretages ionbytningskromatografi af den fremstillede klarede opløsning ved brug af en aminosyreanalysator (4.9).
      Indsprøjtningen kan foretages manuelt eller automatisk. Hovedsagen er, at der altid tilsættes samme mængde opløsning ±0,5 % til kolonnen til analyse af standardopløsninger og prøveopløsninger, undtagen i tilfælde, hvor der bruges en intern standard. Forholdet mellem natrium og aminosyre i standard- og prøveopløsningerne skal være så ens som muligt.
      Kalibreringshyppigheden afhænger normalt af stabiliteten af ninhydrinreagenset og det anvendte analysatorsystem. Standard- eller prøveopløsningen fortyndes med citratbuffer (3.24), således at der for standarden fremkommer et topareal på 30–200 % af arealet af toppene for aminosyrerne i prøveopløsningen.
      Kromatografien af aminosyrerne vil variere lidt afhængigt af den anvendte type analysator og kolonnematerialet. Systemet skal kunne adskille aminosyrerne fuldstændigt fra hinanden og fra øvrige ninhydrinpositive stoffer. Kromatografisystemet skal i sit arbejdsområde give lineært respons på ændringer i mængderne af aminosyrer, der tilsættes kolonnen.
      Hvis der analyseres en ækvimolær opløsning (af de aminosyrer, der skal bestemmes), skal der ved kromatografien opnås nedenstående forhold mellem dal og tophøjde. Den ækvimolære opløsning skal indeholde mindst 30 % af den største mængde af hver aminosyre, der kan måles præcist med aminosyreanalysatoren (4.9).
      Ved adskillelsen af threonin og serin må forholdet mellem dal og tophøjde for den laveste af de to sammenhængende aminosyretoppe ikke være større end 2:10. (Hvis der kun bestemmes cyst(e)in, methionin, threonin og lysin, vil utilstrækkelig adskillelse fra nabotoppe indvirke uheldigt på bestemmelsen.) For alle øvrige aminosyrer skal adskillelsen være bedre end 1:10.
      Systemet skal sikre, at lysin adskilles fra artefakter fra andre lysinlignende stoffer og ornithin.
      6.   Beregning af resultater
      Arealet af toppene i prøve- og standardopløsningerne måles for hver enkelt aminosyre, og mængden (X) beregnes i gram aminosyre pr. kg prøve:
      
         
      Ved anvendelse af en intern standard multipliceres med: 
      
                  A
               
               
                  =
               
               
                  topareal for hydrolysat eller ekstrakt
               
            
                  B
               
               
                  =
               
               
                  topareal for standardkalibreringsopløsning
               
            
                  C
               
               
                  =
               
               
                  topareal for intern standard i hydrolysat eller ekstrakt
               
            
                  D
               
               
                  =
               
               
                  topareal for intern standard, standardkalibreringsopløsning
               
            
                  M
               
               
                  =
               
               
                  molarvægt af den aminosyre, der skal bestemmes
               
            
                  c
               
               
                  =
               
               
                  standardopløsningens koncentration i μmol/ml
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  prøvens vægt i gram (korrigeret til oprindelig vægt hvis tørret eller affedtet)
               
            
                  V
               
               
                  =
               
               
                  ml totalhydrolysat (5.3.4) eller ml beregnet total fortyndingsvolumen af ekstraktet (6.1).
               
            Såvel cystin som cystein bestemmes som cysteinsyre i hydrolysater af den oxiderede prøve, men beregnes som cystin (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) ved anvendelse af M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).
      Methionin bestemmes som methioninsulfon i hydrolysater af den oxiderede prøve, men beregnes som methionin ved anvendelse af M af methionin (149,21 g/mol).
      Tilsat fri methionin bestemmes efter ekstraktion som methionin, hvorved der benyttes samme M til beregningen.
      
                  6.1.
               
               
                  Totale fortyndingsvolumen af ekstrakter (F) til bestemmelse af frie aminosyrer (5.2) beregnes som følger:
                  
                              V
                           
                           
                              =
                           
                           
                              slutekstraktets volumen.
                           
                        
            7.   Evaluering af metoden
      Metoden er blevet afprøvet ved en international ringanalyse i 1990 med anvendelse af fire forskellige typer foder (svinefoderblanding, slagtefjerkræblanding, proteinkoncentrat og en forblanding). Resultaterne af middel- og standardafvigelse efter fjernelse af outliers er vist i tabellerne under dette punkt:
      Middelværdi i g/kg
      
                  Referencemateriale
               
               
                  Aminosyre
               
            
                  Threonin
               
               
                  Cyst(e)in
               
               
                  Methionin
               
               
                  Lysin
               
            
                  Svinefoderblanding
               
               
                  6,94
                  n = 15
               
               
                  3,01
                  n = 17
               
               
                  3,27
                  n = 17
               
               
                  9,55
                  n = 13
               
            
                  Slagtefjerkræblanding
               
               
                  9,31
                  n = 16
               
               
                  3,92
                  n = 18
               
               
                  5,08
                  n = 18
               
               
                  13,93
                  n = 16
               
            
                  Proteinkoncentrat
               
               
                  22,32
                  n = 16
               
               
                  5,06
                  n = 17
               
               
                  12,01
                  n = 17
               
               
                  47,74
                  n = 15
               
            
                  Forblanding
               
               
                  58,42
                  n = 16
               
               
                  —
               
               
                  90,21
                  n = 16
               
               
                  98,03
                  n = 16
               
            
                  
                              n
                           
                           
                              =
                           
                           
                              antal deltagende laboratorier.
                           
                        
            7.1.   Repeterbarhed
      Repeterbarheden for de undersøgte aminosyrer udtrykt som »standardafvigelse inden for laboratorier« for de ovennævnte prøver er gengivet i nedenstående tabel.
      Standardafvigelse inden for laboratorier (Sr) i g/kg
      
                  Referencemateriale
               
               
                  Aminosyre
               
            
                  Threonin
               
               
                  Cyst(e)in
               
               
                  Methionin
               
               
                  Lysin
               
            
                  Svinefoderblanding
               
               
                  0,13
                  n = 15
               
               
                  0,10
                  n = 17
               
               
                  0,11
                  n = 17
               
               
                  0,26
                  n = 13
               
            
                  Slagtefjerkræblanding
               
               
                  0,20
                  n = 16
               
               
                  0,11
                  n = 18
               
               
                  0,16
                  n = 18
               
               
                  0,28
                  n = 16
               
            
                  Proteinkoncentrat
               
               
                  0,48
                  n = 16
               
               
                  0,13
                  n = 17
               
               
                  0,27
                  n = 17
               
               
                  0,99
                  n = 15
               
            
                  Forblanding
               
               
                  1,30
                  n= 16
               
               
                  —
               
               
                  2,19
                  n = 16
               
               
                  2,06
                  n = 16
               
            
                  
                              n
                           
                           
                              =
                           
                           
                              antal deltagende laboratorier.
                           
                        
            
         
      Variationskoefficient ( %) for standardafvigelsen inden for laboratorier (Sr)
      
                  Referencemateriale
               
               
                  Aminosyre
               
            
                  Threonin
               
               
                  Cyst(e)in
               
               
                  Methionin
               
               
                  Lysin
               
            
                  Svinefoderblanding
               
               
                  1,9
                  n = 15
               
               
                  3,3
                  n = 17
               
               
                  3,4
                  n = 17
               
               
                  2,8
                  n = 13
               
            
                  Slagtefjerkræblanding
               
               
                  2,1
                  n = 16
               
               
                  2,8
                  n = 18
               
               
                  3,1
                  n = 18
               
               
                  2,1
                  n = 16
               
            
                  Proteinkoncentrat
               
               
                  2,7
                  n = 16
               
               
                  2,6
                  n = 17
               
               
                  2,2
                  n = 17
               
               
                  2,4
                  n = 15
               
            
                  Forblanding
               
               
                  2,2
                  n= 16
               
               
                  —
               
               
                  2,4
                  n = 16
               
               
                  2,1
                  n = 16
               
            
                  
                              n
                           
                           
                              =
                           
                           
                              antal deltagende laboratorier.
                           
                        
            7.2   Reproducerbarhed
      Resultaterne af standardafvigelse mellem laboratorier for ovennævnte undersøgelser er vist i nedenstående skema.
      Standardafvigelse mellem laboratorier (SR) i g/kg
      
                  Referencemateriale
               
               
                  Aminosyre
               
            
                  Threonin
               
               
                  Cyst(e)in
               
               
                  Methionin
               
               
                  Lysin
               
            
                  Svinefoderblanding
               
               
                  0,28
                  n = 15
               
               
                  0,30
                  n = 17
               
               
                  0,23
                  n = 17
               
               
                  0,30
                  n = 13
               
            
                  Slagtefjerkræblanding
               
               
                  0,48
                  n = 16
               
               
                  0,34
                  n = 18
               
               
                  0,55
                  n = 18
               
               
                  0,75
                  n = 16
               
            
                  Proteinkoncentrat
               
               
                  0,85
                  n = 16
               
               
                  0,62
                  n = 17
               
               
                  1,57
                  n = 17
               
               
                  1,24
                  n = 15
               
            
                  Forblanding
               
               
                  2,49
                  n= 16
               
               
                  —
               
               
                  6,20
                  n = 16
               
               
                  6,62
                  n = 16
               
            
                  
                              n
                           
                           
                              =
                           
                           
                              antal deltagende laboratorier.
                           
                        
            
         
      Variationskoefficient ( %) for standardafvigelsen mellem laboratorier (SR)
      
                  Referencemateriale
               
               
                  Aminosyre
               
            
                  Threonin
               
               
                  Cyst(e)in
               
               
                  Methionin
               
               
                  Lysin
               
            
                  Svinefoderblanding
               
               
                  4,1
                  n = 15
               
               
                  9,9
                  n = 17
               
               
                  7,0
                  n = 17
               
               
                  3,2
                  n = 13
               
            
                  Slagtefjerkræblanding
               
               
                  5,2
                  n = 16
               
               
                  8,8
                  n = 18
               
               
                  10,9
                  n = 18
               
               
                  5,4
                  n = 16
               
            
                  Proteinkoncentrat
               
               
                  3,8
                  n = 16
               
               
                  12,3
                  n = 17
               
               
                  13,0
                  n = 17
               
               
                  3,0
                  n = 15
               
            
                  Forblanding
               
               
                  4,3
                  n= 16
               
               
                  —
               
               
                  6,9
                  n = 16
               
               
                  6,7
                  n = 16
               
            
                  
                              n
                           
                           
                              =
                           
                           
                              antal deltagende laboratorier.
                           
                        
            8.   Anvendelse af referencematerialer
      Det undersøges, om metoden er brugt korrekt, ved at foretage gentagne målinger af certificerede referencematerialer, når sådanne forefindes. Det anbefales at kalibrere med certificeret aminosyrekalibreringsopløsning.
      9.   Bemærkninger
      
                  9.1.
               
               
                  På grund af forskelle mellem aminosyreanalysatorer skal slutkoncentrationerne af kalibreringsopløsningerne af standardaminosyrerne (se punkt 3.27.4 og 3.27.5) og hydrolysatet (se punkt 5.3.4) betragtes som en retningslinje.
                  Apparatets lineære responsskala skal kontrolleres for alle aminosyrer.
                  Standardopløsningen fortyndes med citratbuffer for at opnå toparealer midt på skalaen.
               
            
                  9.2.
               
               
                  Hvis der anvendes HPLC-udstyr til at analysere hydrolysaterne, skal kørselsbetingelserne optimeres i henhold til fabrikantens anbefaling.
               
            
                  9.3.
               
               
                  Hvis metoden anvendes på foder, der indeholder mere end 1 % chlorid (koncentrat, mineralfoder, fodertilskud), vil der kunne ske en undervurdering af methionin, og der skal foretages en særlig behandling.
               
            G.   BESTEMMELSE AF TRYPTOPHAN
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme det samlede indhold af tryptophan (totaltryptophan) og frit tryptophan i foder. Der differentieres ikke mellem D- og L-former.
      2.   Princip
      Til bestemmelse af totaltryptophan hydrolyseres prøven i basisk miljø i en mættet bariumhydroxidopløsning og holdes opvarmet til 110 oC i 20 timer. Efter hydrolysen tilsættes der intern standard.
      Til bestemmelse af frit tryptophan ekstraheres prøven i svagt sur væske under tilstedeværelse af intern standard.
      Tryptophanet og den interne standard i hydrolysatet eller i ekstraktet bestemmes ved HPLC med fluorescensdetektor.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  Der benyttes dobbeltdestilleret vand eller vand af tilsvarende kvalitet (ledningsevne: < 10 μS/cm).
               
            
                  3.2.
               
               
                  Standardstof: tryptophan (renhedsgrad/indhold ≥ 99 %), tørret i vakuum over phosphorpentoxid.
               
            
                  3.3.
               
               
                  Internt standardstof: α-methyltryptophan (renhedsgrad/indhold ≥ 99 %), tørret i vakuum over phosphorpentoxid.
               
            
                  3.4.
               
               
                  Bariumhydroxidoctahydrat (man skal passe på ikke at udsætte Ba(OH)2.8H2O for meget for luft, da der ellers dannes BaCO3, som kan interferere med bestemmelsen) (se bemærkning 9.3).
               
            
                  3.5.
               
               
                  Natriumhydroxid.
               
            
                  3.6.
               
               
                  Orthophosphorsyre, w (w/w) = 85 %.
               
            
                  3.7.
               
               
                  Saltsyre, ρ20 = 1,19 g/ml.
               
            
                  3.8.
               
               
                  Methanol, svarende til HPLC-kvalitet.
               
            
                  3.9.
               
               
                  Petroleumsether, kogepunktsinterval: 40–60 oC.
               
            
                  3.10.
               
               
                  Natriumhydroxidopløsning, c = 1 mol/liter: 40,0 g NaOH (3.5) opløses i vand, og der fyldes op med vand (3.1) til 1 liter.
               
            
                  3.11.
               
               
                  Saltsyre, c = 6 mol/liter:
                  492 ml saltsyre (3.7) fortyndes til 1 liter med vand.
               
            
                  3.12.
               
               
                  Saltsyre, c = 1 mol/liter:
                  82 ml saltsyre (3.7) fortyndes til 1 liter med vand.
               
            
                  3.13.
               
               
                  Saltsyre, c = 0,1 mol/liter:
                  8,2 ml saltsyre (3.7) fortyndes til 1 liter med vand.
               
            
                  3.14.
               
               
                  Orthophosphorsyre, c = 0,5 mol/liter:
                  34 ml orthophosphorsyre (3.6) fortyndes til 1 liter med vand (3.1).
               
            
                  3.15.
               
               
                  Koncentreret opløsning af tryptophan (3.2), c = 2,50 μmol/ml:
                  I en 500 ml målekolbe opløses 0,2553 g tryptophan (3.2) i saltsyre (3.13), og der fyldes op til mærket med saltsyre (3.13). Opløsningen opbevares ved - 18 oC i højst 4 uger.
               
            
                  3.16.
               
               
                  Koncentreret opløsning af intern standard, c = 2,5 μmol/ml:
                  I en 500 ml målekolbe opløses 0,2728 g α-methyltryptophan (3.3) i saltsyre (3.13), og der fyldes op til mærket med saltsyre (3.13). Opløsningen opbevares ved - 18 oC i højst 4 uger.
               
            
                  3.17.
               
               
                  Standardkalibreringsopløsning af tryptophan og intern standard:
                  2,00 ml koncentreret opløsning af tryptophan (3.15) og 2,00 ml koncentreret opløsning af intern standard (α-methyltryptophan) (3.16) fortyndes med vand (3.1) og methanol (3.8) til omtrent samme volumen og omtrent samme methanolkoncentration (10–30 %) som det færdige hydrolysat.
                  Opløsningen skal fremstilles umiddelbart før brugen.
                  Der sørges for beskyttelse mod direkte sollys under fremstillingen.
               
            
                  3.18.
               
               
                  Eddikesyre.
               
            
                  3.19.
               
               
                  1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol.
               
            
                  3.20.
               
               
                  Ethanolamin, w (w/w) > 98 %.
               
            
                  3.21.
               
               
                  Opløsning af 1 g 1,1,1-trichlor-2-methyl-2-propanol (3.19) i 100 ml methanol (3.8).
               
            
                  3.22.
               
               
                  Mobil fase til HPLC: 3,00 g eddikesyre (3.18) + 900 ml vand (3.1) +50,0 ml af opløsningen (3.21) af 1,1,1-trichlor-2-methyl-2-propanol (3.19) i methanol (3.8) (1 g pr. 100 ml). pH justeres til 5,00 med ethanolamin (3.20). Der fyldes op med vand (3.1) til 1 000 ml.
               
            4.   Apparatur
      
                  4.1.
               
               
                  HPLC-udstyr med spektrofluorometrisk detektor
               
            
                  4.2.
               
               
                  HPLC-kolonne, 125 mm × 4 mm, C18, 3 μm pakkemateriale, eller tilsvarende
               
            
                  4.3.
               
               
                  pH-meter
               
            
                  4.4.
               
               
                  Polypropylenflaske, 125 ml, med vid hals og skruelåg
               
            
                  4.5.
               
               
                  Membranfilter, 0,45 μm
               
            
                  4.6.
               
               
                  Autoklav, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar
               
            
                  4.7.
               
               
                  Mekanisk rysteapparat eller magnetomrører
               
            
                  4.8.
               
               
                  Vortex-blander.
               
            5.   Fremgangsmåde
      5.1.   Klargøring af prøver
      Prøven formales, så den kan passere gennem en 0,5 mm sigte. Meget fugtige prøver skal inden formalingen enten lufttørres ved højst 50 oC eller frysetørres. Prøver med et højt fedtindhold ekstraheres med petroleumsether (3.9) inden formaling.
      5.2.   Bestemmelse af frit tryptophan (ekstrakt)
      En passende mængde (1–5 g) af den klargjorte prøve (5.1) afvejes med en nøjagtighed på 1 mg i en konisk kolbe. Der tilsættes 100,0 ml saltsyre (3.13) og 5,00 ml koncentreret opløsning af intern standard (3.16). Der omrystes eller blandes i 60 minutter på mekanisk rysteapparat eller magnetomrører (4.7). Efter henstand og bundfældning afpipetteres 10,0 ml af supernatanten i et bægerglas. Der tilsættes 5 ml orthophosphorsyre (3.14). pH justeres til 3 med natriumhydroxid (3.10). Der tilsættes så meget methanol (3.8), at slutkoncentrationen af methanol bliver 10–30 %. Opløsningen overføres til en målekolbe af passende størrelse og fortyndes med vand til et volumen, der passer til kromatografien (ca. samme volumen som standardkalibreringsopløsningen (3.17)).
      Nogle få ml af opløsningen filtreres gennem et 0,45 μm membranfilter (4.5), inden den indsprøjtes på HPLC-kolonnen. Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4.
      Standardopløsninger og ekstrakter beskyttes mod direkte sollys. Hvis ekstrakterne ikke kan analyseres samme dag, kan de opbevares ved 5 oC i højst 3 dage.
      5.3.   Bestemmelse af totaltryptophan (hydrolysat)
      Med en nøjagtighed på 0,2 mg afvejes 0,1–1 g af den klargjorte prøve (5.1) i polypropylenflasken (4.4). Den afvejede prøveportion skal have et kvælstofindhold på ca. 10 mg. Der tilsættes 8,4 g bariumhydroxidoctahydrat (3.4) og 10 ml vand. Der blandes på vortex-blander (4.8) eller magnetomrører (4.7). Den teflonbelagte magnetpind efterlades i blandingen. Flaskens vægge skylles med 4 ml vand. Skruelåget skrues løst på flasken, der sættes ind i autoklaven (4.6) med kogende vand i 30–60 minutter. Autoklaven lukkes, og der autoklaveres ved 110 (± 2) oC i 20 timer.
      Temperaturen i autoklaven sænkes til lige under 100 oC, inden den åbnes. For at undgå udkrystallisering af Ba(OH)2 · 8H2O tilsættes der til den varme blanding 30 ml stuevarmt vand. Der omrystes eller omrøres forsigtigt og tilsættes 2,00 ml koncentreret intern standardopløsning (α-methyltryptophan) (3.16). Flasken afkøles i vand/isbad i 15 minutter.
      Derefter tilsættes 5 ml orthophosphorsyre (3.14). Medens flasken stadig står i kølebadet, neutraliseres der med saltsyre (3.11) under omrøring, og pH justeres til 3,0 med saltsyre (3.12). Der tilsættes så meget methanol, at slutkoncentrationen af methanol bliver 10–30 %. Opløsningen overføres til en målekolbe af passende størrelse og fortyndes med vand til et volumen, der passer til kromatografien (f.eks. 100 ml). Der må ikke ske udfældning under methanoltilsætningen.
      Nogle få ml af opløsningen filtreres gennem et 0,45 μm membranfilter (4.5), inden den indsprøjtes på HPLC-kolonnen. Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4.
      Standardopløsninger og hydrolysater beskyttes mod direkte sollys. Hvis hydrolysaterne ikke kan analyseres samme dag, kan de opbevares ved 5 oC i højst 3 dage.
      5.4.   HPLC-bestemmelse
      Nedenstående betingelser for isokratisk eluering er vejledende; andre betingelser kan benyttes, forudsat at de giver tilsvarende resultater (se også bemærkning 9.1 og 9.2).
      
                  HPLC-kolonne (4.2):
               
               
                  125 mm × 4 mm, C18, 3 pakkemateriale, μm eller tilsvarende
               
            
                  Kolonnetemperatur:
               
               
                  Rumtemperatur
               
            
                  Mobil fase (3.22):
               
               
                  3,00 g eddikesyre (3.18) + 900 ml vand (3.1) +50,0 ml af opløsningen (3.21) af 1,1,1-trichlor- 2-methyl-2-propanol (3.19) i methanol (3.8) (1 g pr. 100 ml). pH justeres til 5,00 med ethanolamin (3.20). Der fyldes op med vand (3.1) til 1 000 ml
               
            
                  Flow:
               
               
                  1 ml/minuttet
               
            
                  Total gennemløbstid:
               
               
                  ca. 34 minutter
               
            
                  Detektionsbølgelængde:
               
               
                  excitation: 280 nm, emission: 356 nm
               
            
                  Injektionsvolumen:
               
               
                  20 μl.
               
            6.   Beregning af resultater
      Mængden af tryptophan (X) beregnes i gram pr. 100 g prøve:
      
         
      
                  A
               
               
                  =
               
               
                  topareal for intern standard, standardkalibreringsopløsning (3.17)
               
            
                  B
               
               
                  =
               
               
                  topareal for tryptophan, ekstrakt (5.2) eller hydrolysat (5.3)
               
            
                  V1
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumen i ml (2 ml) af den mængde koncentreret tryptophanopløsning (3.15), der er tilsat til kalibreringsopløsningen (3.17)
               
            
                  c
               
               
                  =
               
               
                  koncentration i μmol/ml (= 2,50) af den koncentrerede tryptophanopløsning (3.15), der er tilsat til kalibreringsopløsningen (3.17)
               
            
                  V2
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumen i ml af den mængde koncentreret opløsning af intern standard (3.16), der er tilsat til ekstraktet (5.2) (= 5,00 ml) eller til hydrolysatet (5.3) (= 2,00 ml)
               
            
                  C
               
               
                  =
               
               
                  topareal for intern standard, ekstrakt (5.2) eller hydrolysat (5.3)
               
            
                  D
               
               
                  =
               
               
                  topareal for tryptophan, standardkalibreringsopløsning (3.17)
               
            
                  V3
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumen i ml (= 2,00 ml) af den mængde koncentreret opløsning af intern standard (3.16), der er tilsat til standardkalibreringsopløsningen (3.17)
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  prøvens vægt i gram (korrigeret til oprindelig vægt, hvis den er tørret og/eller affedtet)
               
            
                  M
               
               
                  =
               
               
                  tryptophans molarvægt (= 204,23 g/mol).
               
            7.   Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 10 % i relativ værdi (af det højeste resultat).
      8.   Resultater af ringanalyse
      Der er gennemført en EF-ringanalyse (4. ringanalyse), hvor 3 prøver blev analyseret i op til 12 laboratorier med henblik på certificering af hydrolysemetoden. Der blev foretaget 5-dobbelt bestemmelse på hver prøve. Resultaterne er vist i nedenstående tabel:
      
                   
               
               
                  Prøve 1
                  Svinefoder
               
               
                  Prøve 2
                  Svinefoder suppleret med L-tryptophan
               
               
                  Prøve 3
                  Foderkoncentrat til svin
               
            
                  L
               
               
                  12
               
               
                  12
               
               
                  12
               
            
                  n
               
               
                  50
               
               
                  55
               
               
                  50
               
            
                  Middelværdi [g/kg]
               
               
                  2,42
               
               
                  3,40
               
               
                  4,22
               
            
                  sr [g/kg]
               
               
                  0,05
               
               
                  0,05
               
               
                  0,08
               
            
                  r [g/kg]
               
               
                  0,14
               
               
                  0,14
               
               
                  0,22
               
            
                  CVr [%]
               
               
                  1,9
               
               
                  1,6
               
               
                  1,9
               
            
                  SR [g/kg]
               
               
                  0,15
               
               
                  0,20
               
               
                  0,09
               
            
                  R [g/kg]
               
               
                  0,42
               
               
                  0,56
               
               
                  0,25
               
            
                  CVR [%]
               
               
                  6,3
               
               
                  6,0
               
               
                  2,2
               
            
                  L
               
               
                  =
               
               
                  antal laboratorier, der har indleveret resultater
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  antal enkeltværdier efter fjernelse af outliers (Cochran-Dixon outlier-test)
               
            
                  sr
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for repeterbarhed
               
            
                  SR
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for reproducerbarhed
               
            
                  r
               
               
                  =
               
               
                  repeterbarhed
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  reproducerbarhed
               
            
                  CVr
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for repeterbarhed, %
               
            
                  CVR
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for reproducerbarhed, %.
               
            Der er også gennemført en EF-ringanalyse (3. ringanalyse), hvor 2 prøver blev analyseret i op til 13 laboratorier med henblik på certificering af metoden til ekstraktion af frit tryptophan. Der blev foretaget 5-dobbelt bestemmelse på hver prøve. Resultaterne er vist i nedenstående tabel:
      
                   
               
               
                  Prøve 4
                  Blanding af soja og hvede
               
               
                  Prøve 5
                  Blanding af soja og hvede (= prøve 4) med tilsætning af tryptophan (0,457 g/kg)
               
            
                  L
               
               
                  12
               
               
                  12
               
            
                  n
               
               
                  55
               
               
                  60
               
            
                  Middelværdi [g/kg]
               
               
                  0,391
               
               
                  0,931
               
            
                  sr [g/kg]
               
               
                  0,005
               
               
                  0,012
               
            
                  r [g/kg]
               
               
                  0,014
               
               
                  0,034
               
            
                  CVr [%]
               
               
                  1,34
               
               
                  1,34
               
            
                  SR [g/kg]
               
               
                  0,018
               
               
                  0,048
               
            
                  R [g/kg]
               
               
                  0,050
               
               
                  0,134
               
            
                  CVR [%]
               
               
                  4,71
               
               
                  5,11
               
            
                  L
               
               
                  =
               
               
                  antal laboratorier, der har indleveret resultater
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  antal enkeltværdier efter fjernelse af outliers (Cochran-Dixon outlier-test)
               
            
                  sr
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for repeterbarhed
               
            
                  SR
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for reproducerbarhed
               
            
                  r
               
               
                  =
               
               
                  repeterbarhed
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  reproducerbarhed
               
            
                  CVr
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for repeterbarhed, %
               
            
                  CVR
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for reproducerbarhed, %.
               
            Der er gennemført endnu en EF-ringanalyse, hvor 4 prøver blev analyseret i op til 7 laboratorier med henblik på certificering af tryptophan med hensyn til hydrolyse. Resultaterne er vist herunder. Der blev foretaget 5-dobbelt bestemmelse på hver prøve.
      
                   
               
               
                  Prøve 1
                  Svinefoderblanding
                  (CRM 117)
               
               
                  Prøve 2
                  Fiskemel med lavt fedtindhold
                  (CRM 118)
               
               
                  Prøve 3
                  Sojamel
                  (CRM 119)
               
               
                  Prøve 4
                  Skummetmælkspulver
                  (CRM 120)
               
            
                  L
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  7
               
            
                  n
               
               
                  25
               
               
                  30
               
               
                  30
               
               
                  30
               
            
                  Middelværdi [g/kg]
               
               
                  2,064
               
               
                  8,801
               
               
                  6,882
               
               
                  5,236
               
            
                  Sr [g/kg]
               
               
                  0,021
               
               
                  0,101
               
               
                  0,089
               
               
                  0,040
               
            
                  r [g/kg]
               
               
                  0,059
               
               
                  0,283
               
               
                  0,249
               
               
                  0,112
               
            
                  CVr [%]
               
               
                  1,04
               
               
                  1,15
               
               
                  1,30
               
               
                  0,76
               
            
                  SR [g/kg]
               
               
                  0,031
               
               
                  0,413
               
               
                  0,283
               
               
                  0,221
               
            
                  R [g/kg]
               
               
                  0,087
               
               
                  1,156
               
               
                  0,792
               
               
                  0,619
               
            
                  CVR [%]
               
               
                  1,48
               
               
                  4,69
               
               
                  4,11
               
               
                  4,22
               
            
                  L
               
               
                  =
               
               
                  antal laboratorier, der har indleveret resultater
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  antal enkeltværdier efter fjernelse af outliers (Cochran-Dixon outlier-test)
               
            
                  sr
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for repeterbarhed
               
            
                  SR
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for reproducerbarhed
               
            
                  r
               
               
                  =
               
               
                  repeterbarhed
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  reproducerbarhed
               
            
                  CVr
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for repeterbarhed, %
               
            
                  CVR
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for reproducerbarhed, %.
               
            9.   Bemærkninger
      
                  9.1.
               
               
                  Nedenstående særlige kromatograferingsbetingelser kan give bedre adskillelse af tryptophan og α-methyltryptophan.
                  Isokratisk eluering efterfulgt af gradientrensning af kolonnen som følger:
                  
                              HPLC-kolonne:
                           
                           
                              125 mm × 4 mm, C18, 5 μm pakkemateriale, eller tilsvarende
                           
                        
                              Kolonnetemperatur:
                           
                           
                              32 oC
                           
                        
                              Mobil fase:
                           
                           
                              A: 0,01 mol/liter KH2PO4/methanol, 95 + 5 (v + v)
                              B: methanol
                           
                        
                              Gradientprogram:
                           
                           
                              0 minutter
                           
                           
                              100 % A
                           
                           
                              0 % B
                           
                        
                               
                           
                           
                              15 minutter
                           
                           
                              100 % A
                           
                           
                              0 % B
                           
                        
                               
                           
                           
                              17 minutter
                           
                           
                              60 % A
                           
                           
                              40 % B
                           
                        
                               
                           
                           
                              19 minutter
                           
                           
                              60 % A
                           
                           
                              40 % B
                           
                        
                               
                           
                           
                              21 minutter
                           
                           
                              100 % A
                           
                           
                              0 % B
                           
                        
                               
                           
                           
                              33 minutter
                           
                           
                              100 % A
                           
                           
                              0 % B
                           
                        
                              Flow:
                           
                           
                              1,2 ml/minuttet
                           
                        
                              Total gennemløbstid:
                           
                           
                              ca. 33 minutter.
                           
                        
            
                  9.2.
               
               
                  Kromatograferingen varierer, alt efter hvilken type HPLC og kolonnemateriale der benyttes. Der skal vælges et system, der giver adskillelse til basislinjen mellem tryptophan og den interne standard. Det er desuden vigtigt, at nedbrydningsprodukter adskilles helt fra tryptophan og den interne standard. Der køres hydrolysater uden intern standard for at kontrollere, at der ikke ligger urenheder på basislinjen under den interne standard. Det er vigtigt, at gennemløbstiden er lang nok til, at alle nedbrydningsprodukter elueres, da toppe med lang elueringstid ellers kan interferere i efterfølgende kromatograferinger.
                  Kromatografisystemet skal i sit arbejdsområde give lineært respons. Det lineære respons kontrolleres med konstant (dvs. den normale) koncentration af intern standard og varierende koncentrationer af tryptophan. Det er vigtigt, at både toppen for tryptophan og toppen for intern standard ligger inden for HPLC/fluorescenssystemets lineære område. Hvis blot en af toppene er enten for lille eller for stor, gentages analysen med en anden prøvestørrelse og/eller et andet slutvolumen.
               
            
                  9.3.
               
               
                  Bariumhydroxid
                  Bariumhydroxid bliver med tiden vanskeligere at opløse. Det medfører, at opløsningen til HPLC-bestemmelse bliver uklar, hvilket kan betyde, at resultaterne for tryptophan bliver for lave.
               
            H.   BESTEMMELSE AF RÅFEDT
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode anvendes til bestemmelse af råfedtindholdet i foder. Den er ikke beregnet til analyse af olieholdige frø og frugter.
      Anvendelsen af de to fremgangsmåder, der er beskrevet nedenfor, afhænger af arten og sammensætningen af foderet og af grunden til, at analysen gennemføres.
      1.1.   Metode A — Råfedt, som kan ekstraheres direkte
      Denne metode anvendes til vegetabilske fodermidler med undtagelse af dem, der er medtaget under metode B.
      1.2.   Metode B — Råfedt i alt
      Denne metode anvendes til animalske fodermidler samt til alle foderblandinger. Den skal anvendes til alle materialer, hvorfra råfedt ikke kan ekstraheres fuldstændigt uden forudgående hydrolyse, såsom gluten, gær, kartoffelproteiner og produkter, der underkastes processer som ekstrudering, omdannelse til flager og opvarmning.
      1.3.   Fortolkning af resultater
      I samtlige tilfælde, hvor der opnås et højere resultat ved anvendelse af metode B end ved metode A, skal de resultater, der er opnået ved metode B, accepteres som den sande værdi.
      2.   Princip
      2.1.   Metode A
      Prøven ekstraheres med petroleumsether. Opløsningsmidlet afdampes, og remanensen tørres og vejes.
      2.2.   Metode B
      Prøven behandles med saltsyre under opvarmning. Blandingen afkøles og filtreres. Den vaskede og tørrede remanens behandles herefter som beskrevet under metode A.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  Petroleumsether, kogepunktsinterval: 40–60 oC. Bromtallet skal være under 1, og inddampningsresten under 2 mg/100 ml
               
            
                  3.2.
               
               
                  Natriumsulfat, vandfrit
               
            
                  3.3.
               
               
                  Saltsyre, c = 3 mol/liter
               
            
                  3.4.
               
               
                  Filtreringsmiddel, f.eks. kiselgur, Hyflo-supercel.
               
            4.   Apparatur
      
                  4.1.
               
               
                  Ekstraktionsapparat. Dersom apparatet er udstyret med et hævertrør (Soxhlet-apparat), indstilles varmekilden, så der sker ca. 10 tømninger i timen; dersom apparatet ikke er udstyret med hævertrør, skal tilbageløbet være på ca. 10 ml i minuttet.
               
            
                  4.2.
               
               
                  Ekstraktionshætter skal være fri for stof, der er opløseligt i petroleumsether, og skal have en porøsitet i overensstemmelse med kravene under 4.1.
               
            
                  4.3.
               
               
                  Tørreskab, enten et vakuumtørreskab indstillet til 75 oC ± 3 oC eller et tørreskab med luftcirkulation indstillet til 100 oC ± 3 oC.
               
            5.   Fremgangsmåde
      5.1.   Metode A (se punkt 8.1)
      5 g af prøven afvejes med en nøjagtighed på 1 mg, overføres til en ekstraktionshætte (4.2) og tildækkes med en affedtet vatprop.
      Hætten anbringes i et ekstraktionsapparat (4.1), og der ekstraheres i 6 timer med petroleumsether (3.1). Petroleumsetherekstraktet opsamles i en tør, tareret kolbe indeholdende stykker af pimpsten (2).
      Opløsningsmidlet afdampes. Remanensen tørres derpå i kolben i 1 1/2 time i tørreskab (4.3). Efter afkøling i ekssikkator vejes remanensen. Der tørres i yderligere 30 minutter for at sikre, at fedtets vægt forbliver konstant (vægttabet mellem to på hinanden følgende vejninger må højst være på 1 mg).
      5.2.   Metode B
      2,5 g af prøven afvejes med en nøjagtighed på 1 mg (se punkt 8.2) og overføres til et 400 ml bægerglas eller en 300 ml konisk kolbe, hvorefter der tilsættes 100 ml saltsyre (3.3) og stykker af pimpsten. Bægerglasset tildækkes med et urglas, eller hvis der anvendes en konisk kolbe, forsynes denne med en tilbagesvaler. Blandingen bringes til let kogning over en svag flamme eller på varmeplade i ca. 1 time. Materialet skal forhindres i at sætte sig fast på beholderens sider.
      Beholderen afkøles, og der tilsættes så meget filtreringsmiddel (3.4), at der ikke opstår noget fedttab ved filtreringen. Der filtreres gennem et fugtigt, fedtfrit dobbelt filtrerpapir. Remanensen vaskes med koldt vand, indtil filtratet er neutralt. Det kontrolleres, at filtratet ikke indeholder fedt. Tilstedeværelse af fedt viser, at der inden hydrolysen skal foretages en ekstraktion af prøven med petroleumsether ved anvendelse af metode A.
      Det dobbelte filtrerpapir med remanensen lægges på et urglas og tørres i tørreskab (4.3) ved 100 oC ± 3 oC i 1 ½ time.
      Det dobbelte filtrerpapir med den tørre remanens anbringes i ekstraktionshætte (4.2) og tildækkes med en affedtet vatprop. Hætten anbringes i et ekstraktionsapparat (4.1), hvorefter der fortsættes som beskrevet i punkt 5.1, andet og tredje afsnit.
      6.   Angivelse af resultater
      Remanensens vægt angives i procent af prøven.
      7.   Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført af den samme person på den samme prøve må ikke overstige:
      
                  —
               
               
                  0,2 % i absolut værdi for råfedtindhold på under 5 %
               
            
                  —
               
               
                  4,0 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for indhold på 5–10 %
               
            
                  —
               
               
                  0,4 % i absolut værdi for indhold på over 10 %.
               
            8.   Bemærkninger
      
                  8.1.
               
               
                  For produkter med højt fedtindhold, som er vanskelige at formale, eller som ikke egner sig til udtagning af en reduceret homogen prøve, anvendes følgende fremgangsmåde:
                  20 g af prøven afvejes med en nøjagtighed på 1 mg og blandes med mindst 10 g vandfrit natriumsulfat (3.2). Derpå ekstraheres med petroleumsether (3.1) som angivet under punkt 5.1. Det herved opsamlede ekstrakt tilsættes petroleumsether (3.1) ad 500 ml, og blandingen rystes. Af opløsningen udtages 50 ml, som hældes i en lille, tør, tareret kolbe indeholdende stykker af pimpsten. Opløsningsmidlet afdampes; derpå tørres og fortsættes som beskrevet i punkt 5.1, sidste afsnit.
                  Ekstraktionsresten i hætten befries for opløsningsmidlet og formales til en kornstørrelse på 1 mm, hvorefter den hældes tilbage i ekstraktionshætten (der tilsættes ikke natriumsulfat); derpå fortsættes som beskrevet i punkt 5.1, andet og tredje afsnit.
                  Fedtindholdet beregnes som en procentdel af prøven ved anvendelse af nedenstående formel:
                  (10m1 + m2) × 5
                  hvor:
                  
                              m1
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              vægt i gram af remanensen efter den første ekstraktion (den alikvote del af ekstraktet)
                           
                        
                              m2
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              vægt i gram af remanensen efter den anden ekstraktion.
                           
                        
            
                  8.2.
               
               
                  For produkter med lavt fedtindhold kan der anvendes en afvejning på 5 g.
               
            
                  8.3.
               
               
                  Foder med højt vandindhold til selskabsdyr vil det kunne være nødvendigt at blande med vandfrit natriumsulfat forud for hydrolyse og ekstraktion som ved metode B.
               
            
                  8.4.
               
               
                  I punkt 5.2 vil det kunne være mere effektivt at anvende varmt vand i stedet for koldt vand til vaskning af remanensen efter filtrering.
               
            
                  8.5.
               
               
                  Det kan for visse typer foder være nødvendigt at forlænge tørringstiden på 1 ½ time. Overdreven tørring undgås, da en sådan kan føre til lave resultater. En mikrobølgeovn kan også anvendes.
               
            
                  8.6.
               
               
                  Præekstraktion ved metode A forud for hydrolyse og reekstraktion ved metode B anbefales, hvis råfedtindholdet er højere end 15 %. Dette afhænger til en vis grad af arten af foderet og af arten af fedtet i foderet.
               
            I.   BESTEMMELSE AF TRÆSTOF
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af fedtfri organiske stoffer i foder, som er uopløselige i fortyndede syre- og baseopløsninger, og som normalt betegnes som træstof.
      2.   Princip
      Prøven, der om nødvendigt er affedtet, behandles i kogende opløsninger af først svovlsyre og derefter kaliumhydroxid i bestemte koncentrationer. Remanensen adskilles ved filtrering i en glasfilterdigel, hvorefter det vaskes, tørres, vejes og foraskes ved 475–500 oC. Vægttabet ved foraskningen svarer til træstofindholdet i prøven.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  Svovlsyre, c = 0,13 mol/liter
               
            
                  3.2.
               
               
                  Skumdæmpende middel (f.eks. n-octanol)
               
            
                  3.3.
               
               
                  Filtreringshjælpemiddel (Celite 545 el. lign.) opvarmet til 500 oC i 4 timer (8.6)
               
            
                  3.4.
               
               
                  Acetone
               
            
                  3.5.
               
               
                  Petroleumsether, kogepunktsinterval: 40–60 oC
               
            
                  3.6.
               
               
                  Saltsyre, c = 0,5 mol/liter
               
            
                  3.7.
               
               
                  Kaliumhydroxidopløsning, c = 0,23 mol/liter.
               
            4.   Apparatur
      
                  4.1.
               
               
                  Varmeenhed til kogning med svovlsyre og kaliumhydroxid med holder til filterdiglen (4.2) og afgangsrør med hane til væskeafløb samt vakuumpumpe, eventuelt med trykluft. Enheden forvarmes før daglig brug med kogende vand i 5 minutter.
               
            
                  4.2.
               
               
                  Glasfilterdigel med filterplade af sintret glas, porestørrelse: 40–90 μm. Inden den første gang tages i anvendelse, opvarmes den i nogle få minutter til 500 oC og afkøles (8.6).
               
            
                  4.3.
               
               
                  Kogecylinder på mindst 270 ml med tilbagesvaler.
               
            
                  4.4.
               
               
                  Tørreskab med termostat.
               
            
                  4.5.
               
               
                  Muffelovn med termostat.
               
            
                  4.6.
               
               
                  Ekstraktionsapparat med holder til filterdiglen (4.2) og afgangsrør med hane til væskeafløb samt vakuumpumpe.
               
            
                  4.7.
               
               
                  Forbindelsesringe til samling af varmeenhed (4.1), filterdigel (4.2) og kogecylinder (4.3) og til samling af koldekstraktionsapparat (4.6) og filterdigel.
               
            5.   Fremgangsmåde
      I glasfilterdiglen (4.2) afvejes med 1 mg nøjagtighed 1 g af den klargjorte prøve (se bemærkning 8.1, 8.2 og 8.3), og der tilsættes 1 g filtreringshjælpemiddel (3.3).
      Varmeenheden (4.1) og filterdiglen (4.2) samles. Kogecylinderen (4.3) forbindes til diglen. 150 ml svovlsyre (3.1), der er opvarmet til kogepunktet, overføres til kogecylinderen, og om nødvendigt tilsættes nogle få dråber skumdæmpende middel (3.2).
      Væsken opvarmes til kogepunktet i løbet af 5 ± 2 minutter og koges livligt i nøjagtig 30 minutter.
      Afgangshanen (4.1) åbnes, og svovlsyren filtreres under vakuum gennem filterdiglen. Remanensen på filterdiglen vaskes under vakuum tre gange med 30 ml kogende vand hver gang. Filtret med remanensen suges tørt efter hver vask.
      Afgangshanen lukkes, og 150 ml kogende kaliumhydroxidopløsning (3.7) overføres til kogecylinderen. Der tilsættes nogle få dråber skumdæmpende middel (3.2). Væsken opvarmes til kogepunktet i løbet af 5 ± 2 minutter og koges livligt i nøjagtig 30 minutter. Remanensen filtreres og vaskes på samme måde som efter behandling med svovlsyre.
      Efter den sidste vask suges bundfaldet tørt, og diglen med indhold forbindes til koldekstraktionsapparatet (4.6). Remanensen i diglen vaskes under vakuum tre gange med 25 ml acetone (3.4) hver gang og suges tørt efter hver vask.
      Filterdiglen med indhold tørres i tørreskabet ved 130 oC indtil konstant vægt. Efter hver tørring afkøles diglen i en ekssikkator og vejes straks. Herefter anbringes den i muffelovnen, og indholdet foraskes ved 475–500 oC i mindst 30 minutter. Dette gentages indtil konstant vægt (vægttabet mellem to på hinanden følgende vejninger må højst være på 2 mg).
      Efter hver foraskning afkøles diglen først i ovnen og derefter i ekssikkatoren, inden den vejes.
      Der foretages en blindprøve uden prøve. Vægttabet ved foraskningen må ikke overstige 4 mg.
      6.   Beregning af resultater
      Træstofindholdet som procent af prøven beregnes efter følgende formel:
      
         
      hvor:
      
                  m
               
               
                  =
               
               
                  prøvens vægt i gram
               
            
                  m0
                  
               
               
                  =
               
               
                  vægttabet i gram efter foraskning under bestemmelsen
               
            
                  m1
                  
               
               
                  =
               
               
                  vægttabet i gram ved foraskning af remanensen af blindprøven.
               
            7.   Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige:
      
                  —
               
               
                  0,6 % i absolut værdi for træstofindhold på under 10 %
               
            
                  —
               
               
                  6 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for træstofindhold på 10 % og derover.
               
            8.   Bemærkninger
      
                  8.1.
               
               
                  Foder, der indeholder over 10 % råfedt, skal affedtes med petroleumsether (3.5) inden analysen. Filterdiglen (4.2) med indhold forbindes med koldekstraktionsapparatet (4.6) og vaskes under vakuum tre gange med 30 ml petroleumsether hver gang. Prøven suges tør, og diglen med indhold forbindes til varmeenheden (4.1). Derefter fortsættes som beskrevet i punkt 5.
               
            
                  8.2.
               
               
                  Foder, der indeholder fedt, som ikke kan ekstraheres direkte med petroleumsether (3.5), skal affedtes som beskrevet i punkt 8.1 og efter kogning med syre affedtes endnu en gang. Efter kogning med syre og efterfølgende vask forbindes diglen med indhold til koldekstraktionsapparatet (4.6) og vaskes tre gange med 30 ml acetone efterfulgt af tre gange vask med 30 ml petroleumsether. Filtret suges tørt, og analysen fortsættes som beskrevet i punkt 5 med behandlingen med kaliumhydroxid.
               
            
                  8.3.
               
               
                  Hvis foderet indeholder over 5 % carbonater, udtrykt som calciumcarbonat, forbindes diglen (4.2) med den afvejede prøve til varmeenheden (4.1). Prøven vaskes tre gange med 30 ml saltsyre (3.6). Efter hver tilsætning skal prøven henstå i ca. 1 minut, inden den filtreres. Der vaskes én gang med 30 ml vand, hvorefter der fortsættes som beskrevet i punkt 5.
               
            
                  8.4.
               
               
                  Hvis der anvendes apparatur i form af et stativ (flere digler forbundet med samme varmeenhed), må der aldrig foretages to enkeltbestemmelser af samme analyseprøve i samme prøverække.
               
            
                  8.5.
               
               
                  Hvis det efter kogning viser sig vanskeligt at filtrere syre- og baseopløsningerne, føres der trykluft gennem varmeenhedens afgangsrør, hvorefter filtreringen fortsættes.
               
            
                  8.6.
               
               
                  Udglødningstemperaturen må ikke være over 500 oC, hvilket skal sikre, at diglerne af sintret glas holder længst muligt. Der drages omsorg for at undgå store temperaturudsving under opvarmning og afkøling.
               
            J.   BESTEMMELSE AF SUKKER
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af reducerende sukker og totalsukker efter invertering, udtrykt som glucose eller, ved omregning med faktoren 0,95, som saccharose. Metoden finder anvendelse på foderblandinger. Der er fastsat særlige metoder for andre typer foder. Om nødvendigt bestemmes lactosen særskilt, idet der tages hensyn hertil ved beregningen af resultaterne.
      2.   Princip
      Sukkeret opløses i fortyndet ethanol; opløsningen klares ved hjælp af Carrez-reagens I og II. Efter afdampning af ethanol foretages bestemmelserne før og efter inverteringen efter Luff-Schoorl-metoden.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  Ethanolopløsning, 40 % (v/v), massefylde: 0,948 g/ml ved 20 oC, neutraliseret til phenolphthalein.
               
            
                  3.2.
               
               
                  Carrez-reagens I: 21,9 g zinkacetat, Zn(CH3COO)2·2H2O, og 3 g iseddike opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.
               
            
                  3.3.
               
               
                  Carrez-reagens II: 10,6 g kaliumferrocyanid, K4Fe(CN)6 · 3H2O, opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.
               
            
                  3.4.
               
               
                  Methylorange, 0,1 % opløsning (w/v).
               
            
                  3.5.
               
               
                  Saltsyre, 4 mol/liter.
               
            
                  3.6.
               
               
                  Saltsyre, 0,1 mol/liter.
               
            
                  3.7.
               
               
                  Natriumhydroxidopløsning, 0,1 mol/liter.
               
            
                  3.8.
               
               
                  Luff-Schoorl-reagens:
                  Under forsigtig omrøring hældes citronsyreopløsningen (3.8.2) over i natriumcarbonatopløsningen (3.8.3). Kobbersulfatopløsningen (3.8.1) tilsættes, og der fyldes op med vand til 1 liter. Det henstår natten over og filtreres.
                  Koncentrationen af det således opnåede reagens kontrolleres (Cu 0,05 mol/liter; Na2CO3 1 mol/liter) (se punkt 5.4, sidste afsnit). Opløsningens pH-værdi skal være ca. 9,4.
               
            
                  3.8.1.
               
               
                  Kobbersulfatopløsning: 25 g kobbersulfat, CuSO4 · 5H2O, frit for jern, opløses i 100 ml vand.
               
            
                  3.8.2.
               
               
                  Citronsyreopløsning: 50 g citronsyre, C6H8O7.H2O, opløses i 50 ml vand.
               
            
                  3.8.3.
               
               
                  Natriumcarbonatopløsning: 143,8 g vandfrit natriumcarbonat opløses i ca. 300 ml varmt vand. Opløsningen henstilles til afkøling.
               
            
                  3.9.
               
               
                  Natriumthiosulfatopløsning, 0,1 mol/liter.
               
            
                  3.10.
               
               
                  Stivelsesopløsning: 5 g opløselig stivelse tilsættes 30 ml vand og opblandes i 1 liter kogende vand. Der koges i 3 minutter, henstilles til afkøling og tilsættes eventuelt 10 mg kviksølviodid som konserveringsmiddel.
               
            
                  3.11.
               
               
                  Svovlsyre, 3 mol/liter.
               
            
                  3.12.
               
               
                  Kaliumiodid, 30 % opløsning (w/v).
               
            
                  3.13.
               
               
                  Granuleret pimpsten udkogt i saltsyre, vasket med vand og tørret.
               
            
                  3.14.
               
               
                  3-methylbutan-l-ol.
               
            4.   Apparatur
      Mekanisk rysteapparat: ca. 35–40 omdrejninger i minuttet.
      5.   Fremgangsmåde
      5.1.   Ekstraktion af prøven
      2,5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed og hældes i en 250 ml målekolbe. Der tilsættes 200 ml ethanol (3.1) og blandes i 1 time i rysteapparatet. Der tilsættes 5 ml Carrez-reagens I (3.2) og omrøres i ca. 30 sekunder. Derefter tilsættes 5 ml Carrez-reagens II (3.3) og omrøres på ny i 1 minut. Der fyldes op til mærket med ethanol (3.1), hvorefter der homogeniseres og filtreres. 200 ml af filtratet udtages og inddampes til ca. halvdelen af volumenet, hvorved størstedelen af ethanolen fordamper. Fordampningsresten overføres kvantitativt ved hjælp af varmt vand til en 200 ml målekolbe og afkøles, der fyldes op til mærket med vand og homogeniseres, og om nødvendigt filtreres. Denne opløsning benyttes til bestemmelse af reducerende sukker samt, efter invertering, af totalsukker.
      5.2.   Bestemmelse af reducerende sukker
      Med pipette udtages højst 25 ml af opløsningen indeholdende under 60 mg reducerende sukker, udtrykt som glucose. Om nødvendigt fyldes op med destilleret vand til 25 ml, og indholdet af reducerende sukker bestemmes efter Luff-Schoorl-metoden. Resultatet angives i procent glucose.
      5.3.   Bestemmelse af totalsukker efter invertering
      Med pipette udtages 50 ml opløsning, som overføres til en 100 ml målekolbe. Der tilsættes nogle få dråber methylorangeopløsning (3.4) og derefter, forsigtigt og under stadig omrøring, saltsyre (3.5), indtil der sker et tydeligt omslag til rødt. Der tilsættes 15 ml saltsyre (3.6), og kolben anbringes på vandbad i stærk kogning og efterlades der i 30 minutter. Der afkøles hurtigt til ca. 20 oC og tilsættes 15 ml natriumhydroxidopløsning (3.7). Der fyldes op med vand til 100 ml og homogeniseres. Der udtages en mængde, der ikke overstiger 25 ml, og som indeholder mindre end 60 mg reducerende sukker, udtrykt som glucose. Om nødvendigt fyldes op med destilleret vand til 25 ml, og indholdet af reducerende sukker bestemmes efter Luff-Schoorl-metoden. Resultatet angives i procent glucose eller, ved multiplikation med faktoren 0,95, saccharose.
      5.4.   Titrering efter Luff-Schoorl-metoden
      Med pipette udtages 25 ml af Luff-Schoorl-reagenset (3.8), som overføres til en 300 ml erlenmeyerkolbe; der tilsættes nøjagtig 25 ml af den klarede sukkeropløsning. Der tilsættes 2 korn pimpsten (3.13) og opvarmes under omrystning med hånden over en fri flamme af middelhøjde, og væsken bringes i kog på ca. 2 minutter. Erlenmeyerkolben anbringes umiddelbart derefter på en metaltrådsdug, som er forsynet med et asbesttrådnet med et hul på ca. 6 cm i diameter, hvorunder man i forvejen har tændt en flamme. Denne skal være afpasset således, at alene erlenmeyerkolbens bund opvarmes. Kolben forbindes med en tilbagesvaler. Væsken koges i nøjagtig 10 minutter og afkøles straks derefter ved hjælp af koldt vand, hvorpå der efter ca. 5 minutters forløb titreres som følger:
      Der tilsættes 10 ml kaliumiodidopløsning (3.12) og straks derefter (forsigtigt på grund af risikoen for dannelse af skum i stor mængde) 25 ml svovlsyre (3.11). Der titreres så med natriumthiosulfatopløsning (3.9), indtil der viser sig en matgul farve, hvorefter der tilsættes stivelse (3.10) som indikator, og titreringen færdiggøres.
      Den samme titrering foretages med en nøjagtigt afmålt blanding af 25 ml Luff-Schoorl-reagens (3.8) og 25 ml vand, efter at der er tilsat 10 ml kaliumiodidopløsning (3.12) og 25 ml svovlsyre (3.11), dog uden at bringe den i kog.
      6.   Beregning af resultater
      Ved hjælp af tabellen beregnes den mængde glucose i mg, der svarer til forskellen mellem resultaterne af de to titreringer, udtrykt i mg natriumthiosulfat 0,1 mol/liter. Resultatet angives i procent af prøven.
      7.   Specielle fremgangsmåder
      
                  7.1.
               
               
                  For så vidt angår foder med et højt melasseindhold og andet lidet homogent foder afvejes 20 g, som anbringes i en 1 liter målekolbe med 500 ml vand. Blandes i 1 time i rysteapparatet og klares ved hjælp af Carrez-reagens I (3.2) og II (3.3), som beskrevet i punkt 5.1, idet der dog benyttes en fire gange større mængde af hvert reagens. Der fyldes op til mærket med 80 % ethanol (v/v).
                  Derefter homogeniseres og filtreres. Ethanolen afdampes som beskrevet i punkt 5.1. Findes der ikke dekstrineret stivelse, fyldes der op med destilleret vand.
               
            
                  7.2.
               
               
                  For så vidt angår melasse og fodermidler med et højt indhold af sukker, men praktisk talt ingen stivelse (johannesbrød, tørrede sukkerroesnitter osv.) afvejes 5 g i en 250 ml målekolbe, hvorefter der tilsættes 200 ml destilleret vand og blandes i 1 time eller mere, om nødvendigt, i rysteapparatet. Blandingen klares ved hjælp af Carrez-reagens I (3.2) og II (3.3), som beskrevet i punkt 5.1. Der fyldes op til mærket med koldt vand, homogeniseres og filtreres. Til bestemmelse af totalsukker benyttes fremgangsmåden, der er beskrevet under punkt 5.3.
               
            8.   Bemærkninger
      
                  8.1.
               
               
                  Det anbefales at tilsætte ca. 1 ml 3-methylbutan-l-ol (3.14) (uden hensyntagen til volumenet) før kogning med Luff-Schoorl-reagenset for at undgå skumdannelse.
               
            
                  8.2.
               
               
                  Forskellen mellem indholdet af totalsukker efter invertering, udtrykt som glucose, og indholdet af reducerende sukker, udtrykt som glucose, giver, multipliceret med 0,95, procentindholdet af saccharose.
               
            
                  8.3.
               
               
                  Til bestemmelse af indholdet af reducerende sukker, med undtagelse af lactose, kan der anvendes to metoder:
               
            
                  8.3.1.
               
               
                  For at foretage en omtrentlig beregning multipliceres med 0,675 det ved en separat bestemmelse konstaterede indhold af lactose, og det fundne resultat trækkes fra indholdet af reducerende sukker.
               
            
                  8.3.2.
               
               
                  For at foretage en præcis beregning af det reducerende sukker, med undtagelse af lactosen, er det nødvendigt at lægge den samme analyseprøve til grund ved de to definitive bestemmelser. Den ene analyse udføres på en del af opløsningen, der opnås efter punkt 5.1, den anden på en del af opløsningen, der opnås ved bestemmelsen af lactose efter den hertil fastlagte metode (efter gæring af de andre sukkerarter og klaring).
                  I begge tilfælde bestemmes det tilstedeværende indhold af sukker efter Luff-Schoorl-metoden og beregnes i mg glucose. De to værdier trækkes fra hinanden, og forskellen angives i procent af prøven.
                  Eksempel
                  De to udtagne volumener svarer for hver bestemmelse til en analyseprøve på 250 mg.
                  I det første tilfælde forbruges der 17 ml natriumthiosulfatopløsning 0,1 mol/liter, hvad der svarer til 44,2 mg glucose; i det andet tilfælde forbruges der 11 ml, hvad der svarer til 27,6 mg glucose.
                  Forskellen andrager 16,6 mg glucose.
                  Indholdet af reducerende sukker (uden lactose) beregnet som glucose er altså:
                  
                     
               
            Tabel over værdierne for 25 ml Luff-Schoorl-reagens
      ml Na2S2O30,1 mol/liter, 2 minutters opvarmning, 10 minutters kogning
      
                  Na2S2O3
                  
                  0,1 mol/liter
               
               
                  Glucose, fructose, inverteret sukker
                  C6H12O6
                  
               
               
                  Lactose
                  C12H22O11
                  
               
               
                  Maltose
                  C12H22O11
                  
               
               
                  Na2S2O3
                  
                  0,1 mol/liter
               
            
                  ml
               
               
                  mg
               
               
                  forskel
               
               
                  mg
               
               
                  forskel
               
               
                  mg
               
               
                  forskel
               
               
                  ml
               
            
                  1
                  2
                  3
                  4
                  5
                  6
                  7
                  8
                  9
                  10
                  11
                  12
                  13
                  14
                  15
                  16
                  17
                  18
                  19
                  20
                  21
                  22
                  23
               
               
                  2,4
                  4,8
                  7,2
                  9,7
                  12,2
                  14,7
                  17,2
                  19,8
                  22,4
                  25,0
                  27,6
                  30,3
                  33,0
                  35,7
                  38,5
                  41,3
                  44,2
                  47,1
                  50,0
                  53,0
                  56,0
                  59,1
                  62,2
               
               
                  2,4
                  2,4
                  2,5
                  2,5
                  2,5
                  2,5
                  2,6
                  2,6
                  2,6
                  2,6
                  2,7
                  2,7
                  2,7
                  2,8
                  2,8
                  2,9
                  2,9
                  2,9
                  3,0
                  3,0
                  3,1
                  3,1
               
               
                  3,6
                  7,3
                  11,0
                  14,7
                  18,4
                  22,1
                  25,8
                  29,5
                  33,2
                  37,0
                  40,8
                  44,6
                  48,4
                  52,2
                  56,0
                  59,9
                  63,8
                  67,7
                  71,7
                  75,7
                  79,8
                  83,9
                  88,0
               
               
                  3,7
                  3,7
                  3,7
                  3,7
                  3,7
                  3,7
                  3,7
                  3,7
                  3,8
                  3,8
                  3,8
                  3,8
                  3,8
                  3,8
                  3,9
                  3,9
                  3,9
                  4,0
                  4,0
                  4,1
                  4,1
                  4,1
               
               
                  3,9
                  7,8
                  11,7
                  15,6
                  19,6
                  23,5
                  27,5
                  31,5
                  35,5
                  39,5
                  43,5
                  47,5
                  51,6
                  55,7
                  59,8
                  63,9
                  68,0
                  72,2
                  76,5
                  80,9
                  85,4
                  90,0
                  94,6
               
               
                  3,9
                  3,9
                  3,9
                  4,0
                  3,9
                  4,0
                  4,0
                  4,0
                  4,0
                  4,0
                  4,0
                  4,1
                  4,1
                  4,1
                  4,1
                  4,1
                  4,2
                  4,3
                  4,4
                  4,5
                  4,6
                  4,6
               
               
                  1
                  2
                  3
                  4
                  5
                  6
                  7
                  8
                  9
                  10
                  11
                  12
                  13
                  14
                  15
                  16
                  17
                  18
                  19
                  20
                  21
                  22
                  23
               
            K.   BESTEMMELSE AF LACTOSE
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Metoden gør det muligt at bestemme indholdet af lactose i foder, der indeholder mere end 0,5 % heraf.
      2.   Princip
      Sukkeret opløses i vand. Opløsningen underkastes en gæring med Saccharomyces cerevisiae, som ikke angriber lactosen. Efter klaring og filtrering bestemmes filtratets lactoseindhold efter Luff-Schoorl-metoden.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  
                     Saccharomyces cerevisiae-opslæmning: 25 g frisk gær opslæmmes i 100 ml vand. Suspensionen kan holde sig i højst 1 uge i køleskab.
               
            
                  3.2.
               
               
                  Carrez-reagens I: 21,9 g zinkacetat, Zn (CH3COO)2.2H2O, og 3 g iseddike opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.
               
            
                  3.3.
               
               
                  Carrez-reagens II: 10,6 g kaliumferrocyanid, K4Fe(CN)6.3H2O, opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.
               
            
                  3.4.
               
               
                  Luff-Schoorl-reagens:
                  Under forsigtig omrøring hældes citronsyreopløsningen (3.4.2) over i natriumcarbonatopløsningen (3.4.3). Kobbersulfatopløsningen (3.4.1) tilsættes, og der fyldes op med vand til 1 liter. Det henstår natten over og filtreres. Koncentrationen af det således opnåede reagens kontrolleres (Cu 0,05 mol/liter; Na2CO3 1 mol/liter). Opløsningens pH-værdi skal være ca. 9,4.
               
            
                  3.4.1.
               
               
                  Kobbersulfatopløsning: 25 g kobbersulfat, CuSO4.5H2O, frit for jern, opløses i 100 ml vand.
               
            
                  3.4.2.
               
               
                  Citronsyreopløsning: 50 g citronsyre, C6H8O7.H2O, opløses i 50 ml vand.
               
            
                  3.4.3.
               
               
                  Natriumcarbonatopløsning: 143,8 g vandfrit natriumcarbonat opløses i ca. 300 ml varmt vand. Opløsningen henstilles til afkøling.
               
            
                  3.5.
               
               
                  Granuleret pimpsten udkogt i saltsyre, vasket med vand og tørret.
               
            
                  3.6.
               
               
                  Kaliumiodid, 30 % opløsning (w/v).
               
            
                  3.7.
               
               
                  Svovlsyre, 3 mol/liter.
               
            
                  3.8.
               
               
                  Natriumthiosulfatopløsning, 0,1 mol/liter.
               
            
                  3.9.
               
               
                  Stivelsesopløsning: 5 g opløselig stivelse tilsættes 30 ml vand og opblandes i 1 liter kogende vand. Der koges i 3 minutter, henstilles til afkøling og tilsættes eventuelt 10 mg kviksølviodid som konserveringsmiddel.
               
            4.   Apparatur
      Vandbad forsynet med termostat, indstillet til 38–40 oC.
      5.   Fremgangsmåde
      1 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed, og denne portion anbringes i en 100 ml målekolbe. Der tilsættes 25–30 ml vand. Kolben opvarmes i 30 minutter i kogende vandbad, hvorefter der afkøles til ca. 35 oC. Der tilsættes 5 ml gærsuspension (3.1) og homogeniseres. Kolben henstår i 2 timer i vandbad ved en temperatur på 38–40 oC. Afkøles derpå til ca. 20 oC.
      Der tilsættes 2,5 ml Carrez-reagens I (3.2), og blandingen rystes i 30 sekunder; dernæst tilsættes 2,5 ml Carrez-reagens II (3.3), og der rystes på ny i 30 sekunder. Der fyldes op med vand til 100 ml, blandes og filtreres. Med pipette udtages en mængde filtrat, der ikke overstiger 25 ml, og som så vidt muligt indeholder 40–80 mg lactose, og dette overføres til en 300 ml erlenmeyerkolbe. Om nødvendigt fyldes op med vand til 25 ml.
      På samme måde udføres en blindprøve med 5 ml gærsuspension (3.1). Lactoseindholdet bestemmes efter Luff-Schoorl-metoden som følger: Der tilsættes nøjagtig 25 ml Luff-Schoorl-reagens (3.4) og 2 korn pimpsten (3.5). Der opvarmes under omrystning med hånden over en fri flamme af middelhøjde, og væsken bringes i kog på ca. 2 minutter. Erlenmeyerkolben anbringes umiddelbart derefter på en metaltrådsdug, som er forsynet med et asbesttrådnet med et hul på ca. 6 cm i diameter, hvorunder man i forvejen har tændt en flamme. Denne skal være afpasset således, at alene erlenmeyerkolbens bund opvarmes. Kolben forbindes med en tilbagesvaler. Væsken koges i nøjagtig 10 minutter. Derpå afkøles der straks ved hjælp af koldt vand, og efter ca. 5 minutters forløb titreres der som følger:
      Der tilsættes 10 ml kaliumiodidopløsning (3.6) og straks derefter (forsigtigt på grund af risikoen for dannelse af skum i stor mængde) 25 ml svovlsyre (3.7). Der titreres så med natriumthiosulfatopløsning (3.8), indtil der viser sig en matgul farve, hvorefter der tilsættes stivelse (3.9) som indikator, og titreringen færdiggøres.
      Den samme titrering foretages med en nøjagtigt afmålt blanding af 25 ml Luff-Schoorl-reagens (3.4) og 25 ml vand, efter at der er tilsat 10 ml kaliumiodidopløsning (3.6) og 25 ml svovlsyre (3.7), dog uden at bringe den i kog.
      6.   Beregning af resultater
      Ved hjælp af nedenstående tabel beregnes den mængde lactose i mg, der svarer til forskellen mellem resultaterne af de to titreringer, udtrykt i ml natriumthiosulfatopløsning 0,1 mol/liter.
      Resultatet for vandfri lactose angives i procent af prøven.
      7.   Bemærkning
      Til produkter, der indeholder mere end 40 % gæringsdygtigt sukker, skal der benyttes mere end 5 ml gærsuspension (3.1).
      Tabel over værdierne for 25 ml Luff-Schoorl-reagens
      ml Na2S2O30,1 mol/liter, 2 minutters opvarmning, 10 minutters kogning
      
                  Na2S2O3
                  
                  0,1 mol/liter
               
               
                  Glucose, fructose, inverteret sukker
                  C6H12O6
                  
               
               
                  Lactose
                  C12H22O11
                  
               
               
                  Maltose
                  C12H22O11
                  
               
               
                  Na2S2O3
                  
                  0,1 mol/liter
               
            
                  ml
               
               
                  mg
               
               
                  forskel
               
               
                  mg
               
               
                  forskel
               
               
                  mg
               
               
                  forskel
               
               
                  ml
               
            
                  1
                  2
                  3
                  4
                  5
                  6
                  7
                  8
                  9
                  10
                  11
                  12
                  13
                  14
                  15
                  16
                  17
                  18
                  19
                  20
                  21
                  22
                  23
               
               
                  2,4
                  4,8
                  7,2
                  9,7
                  12,2
                  14,7
                  17,2
                  19,8
                  22,4
                  25,0
                  27,6
                  30,3
                  33,0
                  35,7
                  38,5
                  41,3
                  44,2
                  47,1
                  50,0
                  53,0
                  56,0
                  59,1
                  62,2
               
               
                  2,4
                  2,4
                  2,5
                  2,5
                  2,5
                  2,5
                  2,6
                  2,6
                  2,6
                  2,6
                  2,7
                  2,7
                  2,7
                  2,8
                  2,8
                  2,9
                  2,9
                  2,9
                  3,0
                  3,0
                  3,1
                  3,1
               
               
                  3,6
                  7,3
                  11,0
                  14,7
                  18,4
                  22,1
                  25,8
                  29,5
                  33,2
                  37,0
                  40,8
                  44,6
                  48,4
                  52,2
                  56,0
                  59,9
                  63,8
                  67,7
                  71,7
                  75,7
                  79,8
                  83,9
                  88,0
               
               
                  3,7
                  3,7
                  3,7
                  3,7
                  3,7
                  3,7
                  3,7
                  3,7
                  3,8
                  3,8
                  3,8
                  3,8
                  3,8
                  3,8
                  3,9
                  3,9
                  3,9
                  4,0
                  4,0
                  4,1
                  4,1
                  4,1
               
               
                  3,9
                  7,8
                  11,7
                  15,6
                  19,6
                  23,5
                  27,5
                  31,5
                  35,5
                  39,5
                  43,5
                  47,5
                  51,6
                  55,7
                  59,8
                  63,9
                  68,0
                  72,2
                  76,5
                  80,9
                  85,4
                  90,0
                  94,6
               
               
                  3,9
                  3,9
                  3,9
                  4,0
                  3,9
                  4,0
                  4,0
                  4,0
                  4,0
                  4,0
                  4,0
                  4,1
                  4,1
                  4,1
                  4,1
                  4,1
                  4,2
                  4,3
                  4,4
                  4,5
                  4,6
                  4,6
               
               
                  1
                  2
                  3
                  4
                  5
                  6
                  7
                  8
                  9
                  10
                  11
                  12
                  13
                  14
                  15
                  16
                  17
                  18
                  19
                  20
                  21
                  22
                  23
               
            L.   BESTEMMELSE AF STIVELSE
      POLARIMETRISK METODE
      1.   Formål og anvendelsesområde
      
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af stivelse og nedbrydningsprodukter heraf med høj molekylvægt i foder til kontrol af, om reglerne vedrørende angivelse af energiværdien (jf. bilag VII) og direktiv 96/25/EF (3) er overholdt.
      2.   Princip
      
      Metoden er baseret på dobbeltbestemmelse. Ved den første bestemmelse behandles prøven med fortyndet saltsyre. Efter klaring og filtrering måles opløsningens optiske drejning polarimetrisk.
      Ved den anden bestemmelse ekstraheres prøven med 40 % ethanol. Efter behandling af filtratet med saltsyre klares og filtreres, og den optiske drejning måles under samme betingelser som ved den første bestemmelse.
      Forskellen mellem de to målinger, multipliceret med en kendt faktor, giver prøvens stivelsesindhold.
      3.   Reagenser
      
      
                  3.1.
               
               
                  Saltsyre, 25 % opløsning (w/w), massefylde: 1,126 g/ml.
               
            
                  3.2.
               
               
                  Saltsyre, 1,13 % opløsning (w/v)
                  Koncentrationen skal kontrolleres ved titrering med 0,1 mol/liter natriumhydroxidopløsning under tilstedeværelse af 0,1 % (w/v) methylrødt i 94 % (v/v) ethanol. Til neutralisering af 10 ml kræves der 30,94 ml NaOH 0,1 mol/liter.
               
            
                  3.3.
               
               
                  Carrez-reagens I: 21,9 g zinkacetat, Zn (CH3COO)2.2H2O, og 3 g iseddike opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.
               
            
                  3.4.
               
               
                  Carrez-reagens II: 10,6 g kaliumferrocyanid, K4Fe(CN)6.3H2O, opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.
               
            
                  3.5.
               
               
                  Ethanol, 40 % opløsning (v/v), massefylde: 0,948 g/ml ved 20 oC.
               
            4.   Apparatur
      
      
                  4.1.
               
               
                  250 ml erlenmeyerkolbe med standardslibhals og tilbagesvaler
               
            
                  4.2.
               
               
                  Polarimeter eller saccharimeter.
               
            5.   Fremgangsmåde
      
      5.1.   Klargøring af prøven
      Prøven formales, så den kan passere fuldstændigt gennem en sigte med 0,5 mm runde masker.
      5.2.   Bestemmelse af den totale optiske drejning (P eller S) (se bemærkning 7.1)
      2,5 g af den formalede prøve afvejes med 1 mg nøjagtighed i en 100 ml målekolbe, og der tilsættes 25 ml saltsyre (3.2). Kolben rystes, indtil prøvematerialet er jævnt fordelt, og der tilsættes yderligere 25 ml saltsyre (3.2). Derefter nedsænkes kolben i et kogende vandbad. I de første 3 minutter rystes kolben kraftigt og med regelmæssige mellemrum for at forhindre klumpdannelse. Vandmængden i vandbadet skal være tilstrækkelig til fortsat at holde vandet i kog, når kolben nedsænkes. Under omrystningen må kolben ikke tages op af vandbadet. Efter nøjagtig 15 minutter tages kolben op af vandbadet, hvorefter der tilsættes 30 ml koldt vand og straks afkøles til 20 oC.
      Der tilsættes 5 ml Carrez-reagens I (3.3) og omrystes i ca. 30 sekunder. Derpå tilsættes 5 ml Carrez-reagens II (3.4), og der omrystes atter i ca. 30 sekunder. Der fyldes op med vand til mærket, blandes og filtreres: Hvis filtratet ikke er fuldstændig klart, hvilket sjældent forekommer, skal bestemmelsen gentages med en større mængde Carrez-reagens I og II, f.eks. 10 ml.
      Opløsningens optiske drejning måles i et 200 mm rør med et polarimeter eller et saccharimeter.
      5.3.   Bestemmelse af den optiske drejning (P' eller S') for de i 40 % ethanol opløselige stoffer
      5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed i en 100 ml målekolbe, og der tilsættes ca. 80 ml ethanol (3.5) (se bemærkning 7.2). Kolben henstår i 1 time ved rumtemperatur. I dette tidsrum rystes kolben kraftigt seks gange, så prøvematerialet blandes omhyggeligt med ethanolen. Der fyldes op med ethanol (3.5) til mærket, blandes og filtreres.
      50 ml af filtratet (svarende til 2,5 g af prøven) afpipetteres i en 250 ml erlenmeyerkolbe, og der tilsættes 2,1 ml saltsyre (3.1). Kolben rystes kraftigt, sluttes til en tilbagesvaler og nedsænkes i et bad med kogende vand. Efter nøjagtig 15 minutter tages erlenmeyerkolben op af vandbadet, og indholdet skylles over i en 100 ml målekolbe med en lille mængde koldt vand og afkøles til 20 oC.
      Derpå klares med Carrez-reagens I (3.3) og II (3.4), fyldes op med vand til mærket, blandes og filtreres, og den optiske drejning måles som beskrevet i punkt 5.2, andet og tredje afsnit.
      6.   Beregning af resultater
      
      Indholdet af stivelse ( %) beregnes som følger:
      6.1.   Polarimetriske målinger
      
         
      
                  P
               
               
                  =
               
               
                  total optisk drejning i cirkelgrader
               
            
                  P'
               
               
                  =
               
               
                  optisk drejning i cirkelgrader af de i 40 % (v/v) ethanol opløselige stoffer
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  den rene stivelses specifikke optiske drejning. Til denne faktor D anvendes følgende generelt accepterede værdier:
                  
                              + 185,9o:
                           
                           
                              risstivelse
                           
                        
                              + 185,7o:
                           
                           
                              kartoffelstivelse
                           
                        
                              + 184,6o:
                           
                           
                              majsstivelse
                           
                        
                              + 182,7o:
                           
                           
                              hvedestivelse
                           
                        
                              + 181,5o:
                           
                           
                              bygstivelse
                           
                        
                              + 181,3o:
                           
                           
                              havrestivelse
                           
                        
                              + 184,0o:
                           
                           
                              andre typer stivelse og stivelsesblandinger i foderblandinger
                           
                        
            6.2.   Saccharimetriske målinger
      
      
         
      
                  S
               
               
                  =
               
               
                  total optisk drejning i saccharimetergrader
               
            
                  S'
               
               
                  =
               
               
                  optisk drejning i saccharimetergrader af de i 40 % (v/v) ethanol opløselige stoffer
               
            
                  N
               
               
                  =
               
               
                  saccharosens vægt i gram i 100 ml vand ved en vejlængde på 200 mm, som giver en optisk drejning på 100 saccharimetergrader. Denne vægt varierer alt efter saccharimetertype:
                  16,29 g for franske saccharimetre
                  26,00 g for tyske saccharimetre
                  20,00 g for blandede saccharimetre.
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  den rene stivelses specifikke optiske drejning (se punkt 6.1).
               
            6.3.   Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ved indhold på under 40 % stivelse ikke overstige 0,4 % i absolut værdi og ved indhold på 40 % og derover ikke overstige 1 % i relativ værdi.
      7.   Bemærkninger
      
      
                  7.1.
               
               
                  Hvis prøven indeholder over 6 % carbonater, beregnet som calciumcarbonat, skal de destrueres med den nøjagtige mængde fortyndet svovlsyre inden bestemmelsen af den totale optiske drejning.
               
            
                  7.2.
               
               
                  For produkter med højt lactoseindhold, f.eks. mælkeserum i pulverform eller skummetmælkspulver, anvendes efter tilsætning af 80 ml ethanol (3.5) følgende fremgangsmåde: Kolben tilsluttes en tilbagesvaler og nedsænkes i et vandbad på 50 oC i 30 minutter. Efter afkøling fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.
               
            
                  7.3.
               
               
                  Ved tilstedeværelse i foder i større mængde kan følgende fodermidler interferere ved bestemmelse af stivelsesindholdet efter den polarimetriske metode, som derved kan give forkerte resultater:
                  
                              —
                           
                           
                              (sukker)roeprodukter, såsom ekstraherede (sukker)roesnitter, (sukker)roemelasse, ekstraherede (sukker)roesnitter tilsat melasse, (sukker)roevinasse, (roe)sukker
                           
                        
                              —
                           
                           
                              citruskvas
                           
                        
                              —
                           
                           
                              hørfrø, hørfrøkage, hørfrøskrå
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rapsfrø, rapskage, rapsskrå, rapsskaller
                           
                        
                              —
                           
                           
                              solsikkefrø, solsikkeskrå, solsikkeskrå, delvis afskallet
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kokoskage, kokosskrå
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kartoffelkvas
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tørret gær
                           
                        
                              —
                           
                           
                              produkter med stort inulinindhold (f.eks. snitter og skrå af jordskokker)
                           
                        
                              —
                           
                           
                              grever.
                           
                        
            M.   BESTEMMELSE AF RÅASKE
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af råaske i foder.
      2.   Princip
      Prøven foraskes ved 550 oC; remanensen vejes.
      3.   Reagenser
      Ammoniumnitrat, 20 % opløsning (w/v).
      4.   Apparatur
      
                  4.1.
               
               
                  Varmeplade
               
            
                  4.2.
               
               
                  Elektrisk muffelovn med termostat
               
            
                  4.3.
               
               
                  Foraskningsdigler af kvarts, porcelæn eller platin, rektangulære (ca. 60 × 40 × 25 mm) eller runde (diameter: 60–75 mm, højde: 20–40 mm).
               
            5.   Fremgangsmåde
      Ca. 5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed (2,5 g for produkter, der har tendens til at svulme op) i en foraskningsdigel, der i forvejen er opvarmet til 550 oC, afkølet og tareret. Diglen anbringes på varmepladen og opvarmes gradvist, indtil stoffet forkuller. Der foraskes som beskrevet i punkt 5.1 eller 5.2.
      
                  5.1.
               
               
                  Diglen stilles ind i den kalibrerede muffelovn, der er indstillet på 550 oC. Den henstår ved denne temperatur, indtil der fås hvid, lysegrå eller rødlig aske, der tilsyneladende er fri for kulpartikler. Diglen anbringes i en ekssikkator, henstilles til afkøling og vejes med det samme.
               
            
                  5.2.
               
               
                  Diglen stilles ind i den kalibrerede muffelovn, der er indstillet på 550 oC. Der foraskes i 3 timer. Diglen anbringes i en ekssikkator, henstilles til afkøling og vejes med det samme. Der foraskes i yderligere 30 minutter for at sikre, at askens vægt forbliver konstant (vægttabet mellem to på hinanden følgende vejninger må højst være på 1 mg).
               
            6.   Beregning af resultater
      Vægten af remanensen beregnes, idet taraen trækkes fra.
      Resultatet angives i procent af prøven.
      7.   Bemærkninger
      
                  7.1.
               
               
                  Asken af de stoffer, der er vanskelige at foraske, skal underkastes en første foraskning på mindst 3 timer, afkøles og tilsættes nogle få dråber 20 % ammoniumnitratopløsning eller vand (dog forsigtigt for at undgå, at asken spredes eller danner klumper). Foraskningen fortsættes efter tørring i tørreskab. Gentag processen, indtil foraskningen er fuldstændig.
               
            
                  7.2.
               
               
                  For stoffer, der ikke kan behandles efter den i punkt 7.1. beskrevne metode, benyttes følgende fremgangsmåde: Efter 3 timers foraskning bringes asken ved hjælp af varmt vand over på et lille askefrit filter. Filtret med indhold foraskes i den oprindelige digel. Filtratet anbringes i den afkølede digel, inddampes til tørhed, foraskes og vejes.
               
            
                  7.3.
               
               
                  Når det drejer sig om fedtstoffer, afvejes med størst mulig nøjagtighed en prøve på 25 g i en digel af passende størrelse. Prøven forkulles ved at antænde stoffet ved hjælp af en lunte af askefrit filtrerpapir. Fugtes efter forbrændingen med den mindste mængde vand, der er nødvendig. Tørres og foraskes som beskrevet i punkt 5.
               
            N.   BESTEMMELSE AF ASKE UOPLØSELIG I SALTSYRE
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet i foder af mineralske bestanddele, som er uopløselige i saltsyre. Der er fastsat to fremgangsmåder alt afhængigt af prøvens art.
      
                  1.1.
               
               
                  
                     Fremgangsmåde A: finder anvendelse på organiske fodermidler og på de fleste typer foderblandinger.
               
            
                  1.2.
               
               
                  
                     Fremgangsmåde B: finder anvendelse på mineralstoffer og mineralstofblandinger såvel som på foderblandinger, hvis indhold af aske uopløselig i saltsyre, bestemt efter fremgangsmåde A, er større end 1 %.
               
            2.   Princip
      
                  2.1.
               
               
                  
                     Fremgangsmåde A: Prøven foraskes, asken koges med saltsyre, og den uopløselige remanens frafiltreres og vejes.
               
            
                  2.2.
               
               
                  
                     Fremgangsmåde B: Prøven behandles med saltsyre. Opløsningen filtreres, remanensen foraskes, og den fundne aske behandles som beskrevet under fremgangsmåde A.
               
            3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  Saltsyre, 3 mol/liter
               
            
                  3.2.
               
               
                  Trichloreddikesyre, 20 % opløsning (w/v)
               
            
                  3.3.
               
               
                  Trichloreddikesyre, 1 % opløsning (w/v).
               
            4.   Apparatur
      
                  4.1.
               
               
                  Varmeplade
               
            
                  4.2.
               
               
                  Elektrisk muffelovn med termostat
               
            
                  4.3.
               
               
                  Foraskningsdigler af kvarts, porcelæn eller platin, rektangulære (ca. 60 × 40 × 25 mm) eller runde (diameter: 60–75 mm, højde: 20–40 mm).
               
            5.   Fremgangsmåde
      5.1.   Fremgangsmåde A
      Prøven foraskes efter den fremgangsmåde, der er beskrevet for bestemmelse af råaske. Man kan også benytte den aske, der opnås ved denne bestemmelse.
      Asken anbringes i et 250–400 ml bægerglas med 75 ml saltsyre (3.1). Væsken bringes forsigtigt til kogning og koges sagte i 15 minutter. Den varme opløsning filtreres gennem et askefrit filtrerpapir, og remanensen vaskes med varmt vand, indtil den sure reaktion forsvinder. Filtret med remanensen tørres, og der foraskes i en tareret digel ved en temperatur på mindst 550 oC og højst 700 oC. Afkøles i en ekssikkator og vejes.
      5.2.   Fremgangsmåde B
      5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed i et 250–400 ml bægerglas. Der tilsættes 25 ml vand og derefter 25 ml saltsyre (3.1), blandes og ventes, indtil opbrusningen ophører. Der tilsættes yderligere 50 ml saltsyre (3.1). Det afventes, at en eventuel luftudvikling er overstået, hvorefter bægerglasset anbringes på kogende vandbad og efterlades dér i 30 minutter eller mere, om nødvendigt, så eventuelt forekommende stivelse hydrolyseres fuldstændigt. Der varmfiltreres gennem et askefrit filter, og filtret vaskes med 50 ml varmt vand (se punkt 7, »Bemærkning«). Filtret med remanensen anbringes i en foraskningsdigel, og der tørres og foraskes ved en temperatur på mindst 550 oC og højst 700 oC. Asken anbringes i et 250–400 ml bægerglas med 75 ml saltsyre (3.1). Derefter fortsættes som beskrevet i punkt 5, andet afsnit.
      6.   Beregning af resultater
      Vægten af remanensen beregnes, idet taraen trækkes fra. Resultatet angives i procent af prøven.
      7.   Bemærkning
      Hvis filtreringen viser sig vanskelig, gentages bestemmelsen, idet de 50 ml saltsyre (3.1) erstattes med 50 ml trichloreddikesyreopløsning på 20 % (3.2), og idet filtret vaskes med en varm trichloreddikesyreopløsning på 1 % (3.3).
      O.   BESTEMMELSE AF CARBONATER
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af carbonater, der normalt udtrykkes som calciumcarbonat, i de fleste foderstoffer.
      I visse tilfælde (f.eks. ferrocarbonat) må der dog anvendes en særlig metode.
      2.   Princip
      Carbonaterne spaltes med saltsyre; den frigjorte kuldioxid opsamles i et måleglas, og dens volumen sammenlignes med det volumen, der under de samme betingelser frigøres af en bekendt mængde calciumcarbonat.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  Saltsyre, massefylde: 1,10 g/ml
               
            
                  3.2.
               
               
                  Calciumcarbonat
               
            
                  3.3.
               
               
                  Svovlsyre ca. 0,05 mol/liter, farvet med methylrødt.
               
            4.   Apparatur
      Scheibler-Dietrich-apparat (se skitse) eller tilsvarende apparat.
      5.   Fremgangsmåde
      Alt efter prøvens carbonatindhold afvejes en prøve som angivet nedenfor:
      
                  —
               
               
                  0,5 g for produkter, der indeholder 50–100 % carbonater, udtrykt som calciumcarbonat
               
            
                  —
               
               
                  1 g for produkter, der indeholder 40–50 % carbonater, udtrykt som calciumcarbonat
               
            
                  —
               
               
                  2–3 g for øvrige produkter.
               
            Prøven anbringes i apparatets specialflaske (4), der er forsynet med et lille rør af brudsikkert materiale, som indeholder 10 ml saltsyre (3.1), og flasken forbindes med apparatet. Tregangshanen (5) drejes, således at røret (1) står i forbindelse med luften udenfor. Ved hjælp af det bevægelige rør (2), som er fyldt med farvet svovlsyre (3.3) og forbundet med det gradinddelte rør (1), bringes væskens niveau til nulpunktet på skalaen. Hanen (5) drejes, således at rørene (1) og (3) kommer i forbindelse med hinanden, og det kontrolleres, at væskeniveauet er på nulpunktet.
      Saltsyren (3.1) lades langsomt flyde hen over prøven, idet flasken (4) hældes. Trykket udlignes ved at sænke røret (2). Flasken (4) rystes, indtil kuldioxidudviklingen er helt ophørt.
      Trykket genoprettes ved at føre væsken tilbage til det samme niveau i rørene (1) og (2). Der aflæses efter få minutters forløb, når volumenet er blevet konstant.
      Under de samme betingelser udføres et sammenlignende forsøg med 0,5 g calciumcarbonat (3.2).
      6.   Beregning af resultater
      Indholdet af carbonater, udtrykt som calciumcarbonat, beregnes efter følgende formel:
      
         
      hvor:
      
                  X
               
               
                  =
               
               
                  % (w/w) carbonater i prøven, udtrykt som calciumcarbonat
               
            
                  V
               
               
                  =
               
               
                  ml CO2 frigjort af prøven
               
            
                  V1
                  
               
               
                  =
               
               
                  ml CO2 frigjort af 0,5 g CaCO3
                  
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  prøvens vægt i gram.
               
            7.   Bemærkninger
      
                  7.1.
               
               
                  Når prøven vejer mere end 2 g, fyldes der forinden 15 ml destilleret vand i flasken (4), og indholdet blandes, før forsøget påbegyndes. Der benyttes samme vandvolumen til det sammenlignende forsøg.
               
            
                  7.2.
               
               
                  Anvendes et apparat med et andet volumen end Scheibler-Dietrich-apparatet, må man afpasse analyseprøven, sammenligningsmængden og resultatberegningen herefter.
                  
                     
               
            P.   BESTEMMELSE AF TOTALPHOSPHOR
      FOTOMETRISK METODE
      1.   Formål og anvendelsesområde
      
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af totalphosphor i foder. Metoden er specielt egnet til undersøgelse af foder med et ringe phosphorindhold. I bestemte tilfælde (phosphorrige produkter) kan der anvendes en gravimetrisk metode.
      2.   Princip
      
      Prøven destrueres enten ved forbrænding (når der er tale om organisk foder) eller ved syreoplukning (mineralske stoffer og flydende foder) og opløses i syre. Opløsningen behandles med vanadatmolybdatreagenset. Ekstinktionen af den gulfarvede opløsning måles ved 430 nm i spektrofotometret.
      3.   Reagenser
      
      
                  3.1.
               
               
                  Calciumcarbonat.
               
            
                  3.2.
               
               
                  Saltsyre, ρ20 = 1,10 g/ml (ca. 6 mol/liter).
               
            
                  3.3.
               
               
                  Salpetersyre, ρ20 = 1,045 g/ml.
               
            
                  3.4.
               
               
                  Salpetersyre, ρ20 = 1,38–1,42 g/ml.
               
            
                  3.5.
               
               
                  Svovlsyre, ρ20 = 1,84 g/ml.
               
            
                  3.6.
               
               
                  Vanadatmolybdatreagens: 200 ml ammoniumheptamolybdatopløsning (3.6.1) blandes med 200 ml ammoniummonovandatopløsning (3.6.2) og 134 ml salpetersyre (3.4) i en 1 liter målekolbe, hvorefter der fyldes op med vand til mærket.
               
            
                  3.6.1.
               
               
                  Ammoniumheptamolybdatopløsning: 100 g ammoniumheptamolybdat, (NH4) 6Mo7O24.4H2O, opløses i varmt vand. Der tilsættes 10 ml ammoniakvand (massefylde: 0,91 g/ml) og fyldes op med vand til 1 liter.
               
            
                  3.6.2.
               
               
                  Ammoniummonovanadatopløsning: 2,35 g ammoniummonovanadat, NH4VO3, opløses i 400 ml varmt vand. 20 ml fortyndet salpetersyre (7 ml HNO3 (3.4) + 13 ml H2O) tilsættes langsomt under stadig omrøring, og der fyldes op med vand til 1 liter.
               
            
                  3.7.
               
               
                  Standardphosphoropløsning på 1 mg pr. ml: 4,387 g kaliumdihydrogenphosphat, KH2PO4, opløses i vand, og der fyldes op med vand til 1 liter.
               
            4.   Apparatur
      
      
                  4.1.
               
               
                  Foraskningsdigler af kvarts, porcelæn eller platin
               
            
                  4.2.
               
               
                  Elektrisk muffelovn med termostat indstillet på 550 oC
               
            
                  4.3.
               
               
                  250 ml Kjeldahlkolbe
               
            
                  4.4.
               
               
                  Målekolber og mikromålepipetter
               
            
                  4.5.
               
               
                  Spektrofotometer
               
            
                  4.6.
               
               
                  Reagensglas, ca. 16 mm diameter med NS 14,5; rumindhold: 25–30 ml.
               
            5.   Fremgangsmåde
      
      5.1.   Fremstilling af opløsningen
      Alt efter prøvens art fremstilles opløsningen som beskrevet i punkt 5.1.1 eller 5.1.2.
      5.1.1.   Normal metode
      
      1 g eller mere af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed og hældes i en Kjeldahlkolbe. Der tilsættes 20 ml svovlsyre (3.5), hvorefter der omrystes for at gennemvæde materialet med syren og for at forhindre, at materialet sætter sig fast på kolbens inderside. Derpå opvarmes blandingen og holdes i kog i 10 minutter. Efter en let afkøling tilsættes der 2 ml salpetersyre (3.4); der opvarmes svagt og afkøles atter noget. Herefter tilsættes på ny lidt salpetersyre (3.4) og opvarmes til kogetemperatur, og dette gentages, indtil opløsningen er farveløs. Derpå afkøles der; der tilsættes lidt vand, og væsken overføres kvantitativt til en 500 ml målekolbe ved skylning af Kjeldahlkolben med varmt vand. Efter afkøling fyldes der op med vand til mærket, homogeniseres og filtreres.
      5.1.2.   Metode for prøver, der indeholder organiske stoffer, men er fri for calcium- og magnesium-dihydrogenphosphater
      
      Ca. 2,5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed i en foraskningsdigel og blandes omhyggeligt med 1 g calciumcarbonat (3.1). I muffelovnen foraskes der ved 550 oC, indtil asken er hvid eller grå (små mængder kul er ikke et problem). Asken overføres til et 250 ml bægerglas. Der tilsættes 20 ml vand og saltsyre (3.2), indtil opbrusningen ophører. Der tilsættes yderligere 10 ml saltsyre (3.2). Derpå anbringes bægerglasset på sandbad, og der inddampes til fuldstændig tørhed for at gøre kiselsyren uopløselig. Remanensen opløses i 10 ml salpetersyre (3.3) og opvarmes til kogetemperatur i 5 minutter på sandbad eller varmeplade, idet remanensen dog ikke skal tørre helt. Væsken overføres til en 500 ml målekolbe, idet bægerglasset gentagne gange skylles med varmt vand. Efter afkøling fyldes der op med vand til mærket, homogeniseres og filtreres.
      5.2.   Udvikling af farvningen og måling af ekstinktionen
      En alikvot del af det efter 5.1.1 eller 5.1.2 udvundne filtrat fortyndes for at få en koncentration af phosphor på højst 40 μg/ml. 10 ml af denne opløsning overføres til et reagensglas (4.6), og der tilsættes 10 ml vanadatmolybdatreagens (3.6). Blandingen homogeniseres og henstår i mindst 10 minutter ved 20 oC. Derpå måles ekstinktionen i spektrofotometret ved 430 nm i forhold til en opløsning af 10 ml vand og 10 ml vanadatmolybdatreagens (3.6).
      5.3.   Kalibreringskurve
      Af standardopløsningen (3.7) fremstilles opløsninger, der indeholder henholdsvis 5, 10, 20, 30 og 40 μg phosphor pr. ml. Til hver 10 ml af disse opløsninger tilsættes 10 ml vanadatmolybdatreagens (3.6). Der homogeniseres, og blandingen henstår i mindst 10 minutter ved 20 oC. Derpå måles ekstinktionen under de ovenfor i punkt 5.2 beskrevne betingelser. Kalibreringskurven tegnes, idet ekstinktionsværdierne indtegnes op ad ordinaten, og den tilsvarende phosphormængde ud ad abscissen. Kurven er lineær for phosphorkoncentrationer på 0–40 μg/ml.
      6.   Beregning af resultater
      
      Indholdet af phosphor i prøven bestemmes ved benyttelse af kalibreringskurven.
      Resultatet angives i procent af prøven.
      Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige:
      
                  —
               
               
                  3 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for phosphorindhold på mindre end 5 %
               
            
                  —
               
               
                  0,15 % i absolut værdi for phosphorindhold på 5 % og derover.
               
            Q.   BESTEMMELSE AF CHLOR AF CHLORIDER
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af chlor af vandopløselige chlorider, der normalt udtrykkes som natriumchlorid. Den kan anvendes på alt foder.
      2.   Princip
      Chloriderne opløses i vand. Dersom produktet indeholder organisk stof, foretages en klaring. Opløsningen gøres let sur ved tilsætning af salpetersyre, og chloriderne bundfældes i form af sølvchlorid ved hjælp af en sølvnitratopløsning. Overskuddet af sølvnitrat titreres med en ammoniumthiocyanatopløsning efter Volhards metode.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  Ammoniumthiocyanatopløsning, 0,1 mol/liter.
               
            
                  3.2.
               
               
                  Sølvnitratopløsning, 0,1 mol/liter.
               
            
                  3.3.
               
               
                  Mættet ammoniumferrisulfatopløsning (NH4)Fe(SO4)2.
               
            
                  3.4.
               
               
                  Salpetersyre, massefylde: 1,38 g/ml.
               
            
                  3.5.
               
               
                  Diethylether.
               
            
                  3.6.
               
               
                  Acetone.
               
            
                  3.7.
               
               
                  Carrez-reagens I: 21,9 g zinkacetat, Zn (CH3COO)2·2H2O, og 3 g iseddike opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.
               
            
                  3.8.
               
               
                  Carrez-reagens II: 10,6 g kaliumferrocyanid, K4Fe(CN)6 · 3H2O, opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.
               
            
                  3.9.
               
               
                  Aktivt kul, chloridfrit og ikke-chloridadsorberende.
               
            4.   Apparatur
      Mekanisk rysteapparat: ca. 35–40 omdrejninger i minuttet.
      5.   Fremgangsmåde
      5.1.   Fremstilling af opløsningen
      Alt efter prøvens art fremstilles en opløsning som beskrevet i punkt 5.1.1., 5.1.2 eller 5.1.3.
      Der udføres til sammenligning en blindprøve uden analyseprøven.
      5.1.1.   Prøver uden organisk stof
      
      Der afvejes med 1 mg nøjagtighed en analyseprøve på ikke mere end 10 g, der ikke indeholder mere end 3 g chlor i form af chlorider, og denne anbringes i en 500 ml målekolbe med 400 ml vand på ca. 20 oC. Væsken blandes i 30 minutter i rysteapparatet, og der fyldes op til mærket, homogeniseres og filtreres.
      5.1.2.   Prøver, der indeholder organisk stof, med undtagelse af de i punkt 5.1.3. anførte
      
      Ca. 5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed og anbringes med 1 g aktivt kul i en 500 ml målekolbe. Der tilsættes 400 ml vand på ca. 20 oC og 5 ml Carrez-reagens I (3.7), omrøres i 30 sekunder og tilsættes derefter 5 ml Carrez-reagens II (3.8). Væsken blandes i 30 minutter i rysteapparatet, og der fyldes op til mærket, homogeniseres og filtreres.
      5.1.3.   Bagt foder, hørfrøkager og hørfrøskrå, produkter med et stort indhold af hørfrøskrå og andre produkter med et stort indhold af planteslim eller af kolloidale stoffer (f.eks. forklistret stivelse)
      
      Opløsningen fremstilles som beskrevet i punkt 5.1.2, men filtreres ikke. Opløsningen dekanteres (om nødvendigt centrifugeres), med pipette udtages 100 ml af supernatanten, og dette overføres til en 200 ml målekolbe. Der blandes med acetone (3.6) og fyldes op til mærket med denne opløsningsvæske, hvorefter der homogeniseres og filtreres.
      5.2.   Titrering
      Med pipette overføres til en erlenmeyerkolbe 25–100 ml af filtratet (alt efter det formodede chlorindhold), der er opnået efter punkt 5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3. Den alikvote mængde må ikke indeholde mere end 150 mg klor (Cl). Om nødvendigt fortyndes med vand op til mindst 50 ml, hvorefter der tilsættes 5 ml salpetersyre (3.4), 20 ml mættet ammoniumferrisulfatopløsning (3.3) og 2 dråber ammoniumthiocyanatopløsning (3.1), som påfyldes ved hjælp af en burette, der er fyldt til nulpunktstregen. Dernæst påfyldes ved hjælp af en burette sølvnitratopløsningen (3.2), således at der opnås et overskud på 5 ml. Der tilsættes 5 ml diethylether (3.5) og omrystes kraftigt for at sikre fuldstændig udfældning. Overskuddet af sølvnitrat titreres med ammoniumthiocyanatopløsning (3.1), indtil omslaget til den brunrøde farve har holdt sig i 1 minut.
      6.   Beregning af resultater
      Mængden af chlor (X), udtrykt i % natriumchlorid, beregnes efter følgende formel:
      
         
      hvor:
      
                  V1
                  
               
               
                  =
               
               
                  tilsatte ml sølvnitratopløsning 0,1 mol/liter
               
            
                  V2
                  
               
               
                  =
               
               
                  ml ammoniumthiocyanatopløsning 0,1 mol/liter, forbrugt ved titreringen
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  prøvens vægt.
               
            Hvis blindprøven viser et forbrug af sølvnitratopløsning 0,1 mol/liter, trækkes denne værdi fra volumenet (V1 - V2).
      7.   Bemærkninger
      
                  7.1.
               
               
                  Titreringen kan også foregå ved potentiometri.
               
            
                  7.2.
               
               
                  For meget fedtholdige produkter foretages der en forudgående affedtning med diethylether eller petroleumsether.
               
            
                  7.3.
               
               
                  For så vidt angår fiskemel kan titreringen foretages efter Mohrs metode.
               
            
         (1)  Til tørring af korn, mel, gryn og grutning skal tørreskabet have en sådan varmekapacitet, at det, når det er indstillet på en temperatur på 131 oC, igen når op på denne temperatur på mindre end 45 minutter, efter at det maksimale antal prøver, som skal tørres samtidig, er sat ind i skabet. Ventilationen skal være af en sådan beskaffenhed, at hvis samtlige prøver af blød hvede, som skabet kan rumme, tørres samtidig i to timer, må resultaterne sammenlignet med de efter 4 timers tørring opnåede resultater højst afvige med 0,15 %.
      
         (2)  Såfremt fedtet senere skal undersøges kvalitativt, erstattes pimpstensstykkerne af glaskugler.
      
         (3)  EFT L 125 af 23.5.1996, s. 35.
   
   
      BILAG IV
      ANALYSEMETODER TIL KONTROL AF INDHOLDET AF GODKENDTE TILSÆTNINGSSTOFFER I FODER
      A.   BESTEMMELSE AF VITAMIN A
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af vitamin A (retinol) i foder og forblandinger. Ved vitamin A forstås all-trans-retinylalkohol og dens cis-isomerer, som bestemmes ved denne metode. Indholdet af vitamin A udtrykkes i internationale enheder (IU) pr. kg. En IU svarer til aktiviteten af 0,300 μg all-trans-vitamin A-alkohol eller 0,344 μg all-trans-vitamin A-acetat eller 0,550 μg all-trans-vitamin A-palmitat.
      Bestemmelsesgrænsen er 2 000 IU vitamin A pr. kg.
      2.   Princip
      Prøven hydrolyseres med kaliumhydroxid opløst i ethanol, og vitamin A ekstraheres med petroleumsether. Opløsningsmidlet fjernes ved inddampning, og remanensen opløses i methanol og fortyndes om nødvendigt til den ønskede koncentration. Vitamin A-indholdet bestemmes ved omvendt-fase-HPLC med anvendelse af UV- eller fluorescensdetektor. Kromatograferingsparametrene vælges således, at all-trans-vitamin A-alkohol og dens cis-isomerer ikke adskilles.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  Ethanol, σ = 96 %.
               
            
                  3.2.
               
               
                  Petroleumsether, kogepunktsinterval: 40–60 oC.
               
            
                  3.3.
               
               
                  Methanol.
               
            
                  3.4.
               
               
                  Kaliumhydroxidopløsning, c = 50 g/100 ml.
               
            
                  3.5.
               
               
                  Natriumascorbatopløsning, c = 10 g/100 ml (se bemærkning 7.7).
               
            
                  3.6.
               
               
                  Natriumsulfid, Na2S· x H2O (x = 7–9).
               
            
                  3.6.1.
               
               
                  Natriumsulfidopløsning, c = 0,5 mol/liter i glycerol, β = 120 g/liter (for x = 9) (se bemærkning 7.8).
               
            
                  3.7.
               
               
                  Phenolphthaleinopløsning, c = 2 g/100 ml i ethanol (3.1).
               
            
                  3.8.
               
               
                  2-Propanol.
               
            
                  3.9.
               
               
                  Mobil fase til HPLC: blanding af methanol (3,3) og vand, f.eks. 980 + 20 (v + v). Det nøjagtige forhold bestemmes af den anvendte kolonnes egenskaber.
               
            
                  3.10.
               
               
                  Nitrogen, oxygenfrit.
               
            
                  3.11.
               
               
                  All-trans-vitamin A-acetat, ekstra rent, med certificeret aktivitet, f.eks. 2,80 × 106 IU/g.
               
            
                  3.11.1.
               
               
                  Stamopløsning af all-trans-vitamin A-acetat: Der afvejes med 0,1 mg nøjagtighed 50 mg vitamin A-acetat (3.11) i en 100 ml målekolbe. Efter opløsning i 2-propanol (3.8) fyldes der op til mærket med samme opløsningsmiddel. Denne opløsning har en nominel koncentration på 1 400 IU vitamin A pr. ml. Det nøjagtige indhold bestemmes efter punkt 5.6.3.1.
               
            
                  3.12.
               
               
                  All-trans-vitamin A-palmitat, ekstra rent, med certificeret aktivitet, f.eks. 1,80 × 106 IU/g.
               
            
                  3.12.1.
               
               
                  Stamopløsning af all-trans-vitamin A-palmitat: Der afvejes med 0,1 mg nøjagtighed 80 mg vitamin A-palmitat (3.12) i en 100 ml målekolbe. Efter opløsning i 2-propanol (3.8) fyldes der op til mærket med samme opløsningsmiddel. Denne opløsning har en nominel koncentration på 1 400 IU vitamin A pr. ml. Det nøjagtige indhold bestemmes efter punkt 5.6.3.2.
               
            
                  3.13.
               
               
                  2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) (se bemærkning 7.5).
               
            4.   Apparatur
      
                  4.1.
               
               
                  Rotationsfordamper
               
            
                  4.2.
               
               
                  Udstyr af brunt glas
               
            
                  4.2.1.
               
               
                  Fladbundede eller koniske kolber, 500 ml, med slib
               
            
                  4.2.2.
               
               
                  Målekolber med slibprop og tynd hals, 10, 25, 100 og 500 ml
               
            
                  4.2.3.
               
               
                  Skilletragte, koniske, 1 000 ml, med slibprop
               
            
                  4.2.4.
               
               
                  Pærekolber, 250 ml, med slib
               
            
                  4.3.
               
               
                  Allihn-svaler, kappelængde 300 mm, med slibhals, med adapter til gastilførsel
               
            
                  4.4.
               
               
                  Foldefiltrerpapir til faseseparation, diameter: 185 mm (f.eks. Schleicher & Schüll 597 HY 1/2)
               
            
                  4.5.
               
               
                  HPLC-udstyr med injektionssystem
               
            
                  4.5.1.
               
               
                  HPLC-kolonne, 250 mm × 4 mm, C18, 5 eller 10 μm pakkemateriale, eller tilsvarende (præstationskriterium: kun én top for alle retinolisomerer under HPLC-betingelserne)
               
            
                  4.5.2.
               
               
                  UV- eller fluorescensdetektor, med variabel bølgelængde
               
            
                  4.6.
               
               
                  Spektrofotometer med 10 mm kvartskuvetter
               
            
                  4.7.
               
               
                  Vandbad med magnetomrører
               
            
                  4.8.
               
               
                  Ekstraktionsapparat (se figur 1) bestående af følgende:
               
            
                  4.8.1.
               
               
                  Cylinderglas på 1 liter med slibhals og -prop
               
            
                  4.8.2.
               
               
                  Slibindsats med sidearm og justerbart rør, der er ført igennem midten. Det justerbare rør skal være U-formet i den nedre ende og være tilspidset i den anden ende, således at det øverste væskelag i glasset kan overføres til en skilletragt.
               
            5.   Fremgangsmåde
      
                  
                     NB
                  
               
               
                  Vitamin A er følsomt over for lys (UV) og oxidering. Alt arbejde udføres afskærmet mod lys (udstyr af brunt glas eller glasudstyr omviklet med aluminiumfolie) og oxygen (skylning med nitrogen). Under ekstraktionen udskiftes luften over væsken med nitrogen (overtryk udlignes ved jævnligt at lette på proppen).
               
            5.1.   Klargøring af prøven
      Prøven formales, så den kan passere gennem en sigte med 1 mm maskevidde, men varmeudvikling skal undgås. Formalingen foretages umiddelbart før afvejning og forsæbning, da der ellers kan gå vitamin A tabt.
      5.2.   Forsæbning
      Afhængigt af vitamin A-indholdet afvejes der med en nøjagtighed på 1 mg 2–25 g af prøven i en 500 ml fladbundet eller konisk kolbe (4.2.1). Der tilsættes under forsigtig blanding i rækkefølge 130 ml ethanol (3.1), ca. 100 mg BHT (3.13), 2 ml natriumascorbatopløsning (3.5) og 2 ml natriumsulfidopløsning (3.6). Der sættes en svaler på kolben, som anbringes i vandbad med magnetomrører (4.7). Der opvarmes til kogning og koges med tilbagesvaling i 5 minutter. Dernæst tilsættes der 25 ml kaliumhydroxidopløsning (3.4) gennem svaleren (4.3), og der koges med tilbagesvaling i endnu 25 minutter under omrøring og under langsom nitrogengennemstrømning. Svaleren skylles med ca. 20 ml vand, og kolbens indhold afkøles til rumtemperatur.
      5.3.   Ekstraktion
      Forsæbningsopløsningen overføres kvantitativt til en 1 000 ml skilletragt (4.2.3) eller ekstraktionsapparatet (4.8) ved skylning med i alt 250 ml vand. Derefter skylles forsæbningskolben først med 25 ml ethanol (3.1) og dernæst med 100 ml petroleumsether (3.2), idet skyllevæskerne overføres til skilletragten eller ekstraktionsapparatet. Forholdet mellem vand og ethanol i den samlede væskemængde skal være ca. 2:1. Der omrystes kraftigt i 2 minutter, og blandingen henstår til adskillelse i 2 minutter.
      5.3.1.   Ekstraktion med skilletragt (4.2.3)
      
      Når væsken er skilt i to lag (se bemærkning 7.3), overføres petroleumsetherlaget til en anden skilletragt (4.2.3). Ekstraktionen gentages to gange med 100 ml petroleumsether (3.2) og derefter to gange med 50 ml petroleumsether (3.2).
      De samlede ekstrakter i skilletragten vaskes to gange med 100 ml vand hver gang (ved forsigtig omdrejning, så der ikke dannes emulsion) og derefter flere gange ved rystning med 100 ml vand, indtil vandet ikke farves ved tilsætning af phenolphthaleinopløsning (3.7) (fire gange er normalt tilstrækkeligt). Det vaskede ekstrakt filtreres over i en 500 ml målekolbe (4.2.2) gennem et tørt foldefilter til faseseparation (4.4), således at eventuelt opslæmmet vand fjernes. Skilletragten og filtret skylles med 50 ml petroleumsether (3.2), og der fyldes op til mærket med petroleumsether (3.2) og blandes omhyggeligt.
      5.3.2.   Ekstraktion med ekstraktionsapparat (4.8)
      
      Når væsken er skilt i to lag (se bemærkning 7.3), udskiftes cylinderglassets (4.8.1) prop med slibindsatsen (4.8.2), og den nederste, U-formede del af det justerbare rør anbringes, så dets munding er lige over skillefladen. Ved at sætte nitrogentryk på sidearmen overføres det lette lag af petroleumsether til en 1 000 ml skilletragt (4.2.3). Der tilsættes 100 ml petroleumsether (3.2) til cylinderglasset, og det tilproppes og rystes omhyggeligt. Når væsken er skilt i to lag, overføres det lette lag til skilletragten som før. Ekstraktionen gentages med endnu 100 ml petroleumsether (3.2) og dernæst med 2 portioner 50 ml petroleumsether (3.2), og alle lagene af petroleumsether overføres til skilletragten.
      De samlede petroleumsetherekstrakter i skilletragten vaskes som beskrevet i punkt 5.3.1, og der fortsættes som beskrevet der.
      5.4.   Fremstilling af prøveopløsning til HPLC-analyse
      En alikvot mængde af petroleumsetherekstraktet (fra 5.3.1 eller 5.3.2) afpipetteres i en 250 ml pærekolbe (4.2.4). Der inddampes til næsten tørhed på rotationsfordamper (4.1) under reduceret tryk med en vandbadstemperatur på højst 40 oC. Trykket udlignes til atmosfæretryk, ved at der ledes nitrogen (3.10) ind i kolben, og kolben fjernes fra rotationsfordamperen. Resterende opløsningsmiddel fjernes under en nitrogenstrøm (3.10), og remanensen opløses straks i en kendt mængde (10–100 ml) methanol (3.3) (vitamin A-koncentrationen skal ligge i intervallet 5–30 IU/ml).
      5.5.   HPLC-bestemmelse
      Separationen af vitamin A finder sted på en C18-kolonne med omvendt fase (4.5.1), og koncentrationen måles med en UV-detektor (325 nm) eller en fluorescensdetektor (excitation: 325 nm, emission: 475 nm) (4.5.2).
      Der indsprøjtes en alikvot mængde (f.eks. 20 μl) af methanolopløsningen fra punkt 5.4, og der elueres med den mobile fase (3.9). Middeltophøjden (-arealet) for flere indsprøjtninger af samme prøveopløsning og middeltophøjderne (-arealerne) for flere indsprøjtninger af kalibreringsopløsningerne (5.6.2) beregnes.
      
         HPLC-betingelser
      
      Nedenstående betingelser er vejledende; andre betingelser kan benyttes, forudsat at de giver tilsvarende resultater.
      
                  HPLC-kolonne (4.5.1):
               
               
                  250 mm × 4 mm, C18, 5 eller 10 μm pakkemateriale, eller tilsvarende
               
            
                  Mobil fase (3.9):
               
               
                  blanding af methanol (3.3) og vand, f.eks. 980 + 20 (v + v)
               
            
                  Flow:
               
               
                  1–2 ml/minuttet
               
            
                  Detektor (4.5.2):
               
               
                  UV-detektor (325 nm) eller fluorescensdetektor
                  (excitation: 325 nm/emission: 475 nm).
               
            5.6.   Kalibrering
      5.6.1.   Fremstilling af arbejdsstandardopløsninger
      
      20 ml stamopløsning af vitamin A-acetat (3.11.1) eller vitamin A-palmitat (3.12.1) afpipetteres i en 500 ml fladbundet eller konisk kolbe (4.2.1), og der hydrolyseres som beskrevet i punkt 5.2, dog uden tilsætning af BHT. Derefter ekstraheres der med petroleumsether (3.2) som beskrevet i punkt 5.3 og fyldes op til 500 ml med petroleumsether (3.2). 100 ml af denne opløsning inddampes til næsten tørhed på rotationsfordamper (se punkt 5.4), resterende opløsningsmiddel fjernes under en nitrogenstrøm (3.10), og remanensen opløses i 10,0 ml methanol (3.3). Opløsningens nominelle vitamin A-koncentration er 560 IU pr. ml. Det nøjagtige indhold bestemmes efter punkt 5.6.3.3. Arbejdsstandardopløsningen skal fremstilles umiddelbart før brugen.
      Der afpipetteres 2,0 ml af denne arbejdsstandardopløsning i en 20 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med methanol (3.3) og blandes. Denne fortyndede arbejdsstandardopløsning har en nominel vitamin A-koncentration på 56 IU pr. ml.
      5.6.2.   Fremstilling af kalibreringsopløsninger og kalibreringskurve
      
      Henholdsvis 1,0, 2,0, 5,0 og 10,0 ml af den fortyndede arbejdsstandardopløsning overføres til hver sin 20 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med methanol (3.3) og blandes. Opløsningernes nominelle vitamin A-koncentration er 2,8, 5,6, 14,0 og 28,0 IU pr. ml.
      Der indsprøjtes 20 μl af hver kalibreringsopløsning flere gange, og middeltophøjderne (-arealerne) bestemmes. Kalibreringskurven tegnes ved hjælp af middeltophøjderne (-arealerne) under hensyntagen til resultaterne af UV-kontrollen (5.6.3.3).
      5.6.3.   UV-indstilling af standardopløsningerne
      
      5.6.3.1.   
            Stamopløsning af vitamin A-acetat
         
      
      Der afpipetteres 2,0 ml stamopløsning af vitamin A-acetat (3.11.1) i en 50 ml målekolbe (4.2.2), hvorefter der fyldes op til mærket med 2-propanol (3.8). Opløsningens nominelle vitamin A-koncentration er 56 IU pr. ml. Der afpipetteres 3,0 ml af denne fortyndede opløsning af vitamin A-acetat i en 25 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med 2-propanol (3.8). Opløsningens nominelle vitamin A-koncentration er 6,72 IU pr. ml. Opløsningens UV-spektrum i området 300–400 nm måles mod 2-propanol (3.8) i spektrofotometret (4.6). Ekstinktionsmaksimum skal ligge mellem 325 nm og 327 nm.
      Indholdet af vitamin A beregnes efter følgende formel:
      IU vitamin A/ml = E326 × 19,0
      ( for vitamin A-acetat = 1 530 ved 326 nm i 2-propanol)
      5.6.3.2.   
            Stamopløsning af vitamin A-palmitat
         
      
      Der afpipetteres 2,0 ml stamopløsning af vitamin A-palmitat (3.12.1) i en 50 ml målekolbe (4.2.2), hvorefter der fyldes op til mærket med 2-propanol (3.8). Opløsningens nominelle vitamin A-koncentration er 56 IU pr. ml. Der afpipetteres 3,0 ml af denne fortyndede opløsning af vitamin A-palmitat i en 25 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med 2-propanol (3.8). Opløsningens nominelle vitamin A-koncentration er 6,72 IU pr. ml. Opløsningens UV-spektrum i området 300–400 nm måles mod 2-propanol (3.8) i spektrofotometret (4.6). Ekstinktionsmaksimum skal ligge mellem 325 nm og 327 nm.
      Indholdet af vitamin A beregnes efter følgende formel:
      IU vitamin A/ml = E326 × 19,0
      ( for vitamin A-palmitat = 957 ved 326 nm i 2-propanol)
      5.6.3.3.   
            Arbejdsstandardopløsning af vitamin A
         
      
      Der afpipetteres 3,0 ml af den ufortyndede arbejdsstandardopløsning af vitamin A som fremstillet under punkt 5.6.1 i en 50 ml målekolbe (4.2.2), hvorefter der fyldes op til mærket med 2-propanol (3.8). Der afpipetteres 5,0 ml af denne opløsning i en 25 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med 2-propanol (3.8). Opløsningens nominelle vitamin A-koncentration er 6,72 IU pr. ml. Opløsningens UV-spektrum i området 300–400 nm måles mod 2-propanol (3.8) i spektrofotometret (4.6). Ekstinktionsmaksimum skal ligge mellem 325 nm og 327 nm.
      Indholdet af vitamin A beregnes efter følgende formel:
      IU vitamin A/ml = E325 × 18,3
      ( for vitamin A-alkohol = 1 821 ved 325 nm i 2-propanol)
      6.   Beregning af resultater
      Ud fra middelhøjden (-arealet) af prøveopløsningens vitamin A-toppe bestemmes koncentrationen i prøveopløsningen i IU/ml ved benyttelse af kalibreringskurven (5.6.2).
      Indholdet w af vitamin A i IU pr. kg prøve beregnes efter følgende formel:
      
          [UI/kg]
      hvor:
      
                  c
               
               
                  =
               
               
                  vitamin A-koncentrationen i prøveopløsningen (5.4) i IU/ml
               
            
                  V1
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumen af prøveopløsning (5.4) i ml
               
            
                  V2
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumen af den i 5.4 udtagne alikvot i ml
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  testportionens vægt i gram.
               
            7.   Bemærkninger
      
                  7.1.
               
               
                  For prøver med lav vitamin A-koncentration kan man med fordel samle petroleumsetherekstrakterne fra to forsæbningsportioner (afvejet mængde: 25 g) i én prøveopløsning til HPLC-bestemmelse.
               
            
                  7.2.
               
               
                  Den prøve, der tages ud til analyse, må ikke indeholde mere end 2 g fedtstof.
               
            
                  7.3.
               
               
                  Hvis faserne ikke skiller, kan der tilsættes ca. 10 ml ethanol (3.1) for at bryde emulsionen.
               
            
                  7.4.
               
               
                  Med torskeleverolie og andre rene fedtstoffer skal forsæbningstiden øges til 45–60 minutter.
               
            
                  7.5.
               
               
                  Der kan anvendes hydroquinon i stedet for BHT.
               
            
                  7.6.
               
               
                  Ved brug af en normal-fase-kolonne er det muligt at adskille retinolisomererne. I så fald er det dog ved beregningerne nødvendigt at lægge højderne (arealerne) af samtlige cis- og trans-isomerers toppe sammen.
               
            
                  7.7.
               
               
                  Der kan anvendes ca. 150 mg ascorbinsyre i stedet for natriumascorbatopløsning.
               
            
                  7.8.
               
               
                  Der kan anvendes ca. 50 mg EDTA i stedet for natriumsulfidopløsning.
               
            
                  7.9.
               
               
                  Ved analyse af vitamin A i mælkeerstatninger skal især følgende tages i betragtning:
                  
                              —
                           
                           
                              Ved forsæbning (5.2): Det kan på grund af fedtmængden i prøven være nødvendigt at øge mængden af kaliumhydroxidopløsning (3.4).
                           
                        
                              —
                           
                           
                              Ved ekstraktion (5.3): Det kan på grund af dannelse af emulsioner være nødvendigt at justere forholdet på 2:1 mellem vand og ethanol.
                           
                        Det kontrolleres med en genfindingstest på yderligere en testportion, at den anvendte analysemetode giver pålidelige resultater for denne matrix (mælkeerstatning). Er genfindingsprocenten lavere end 80 %, korrigeres analyseresultatet for genfinding.
               
            8.   Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 15 % i relativ værdi (af det højeste resultat).
      9.   Resultater af ringanalyse
             (1)
         
      
      
                   
               
               
                  Forblanding
               
               
                  Forblandet foder
               
               
                  Mineralkoncentrat
               
               
                  Proteinfoder
               
               
                  Foder til smågrise
               
            
                  L
               
               
                  13
               
               
                  12
               
               
                  13
               
               
                  12
               
               
                  13
               
            
                  n
               
               
                  48
               
               
                  45
               
               
                  47
               
               
                  46
               
               
                  49
               
            
                  Middelværdi [IU/kg]
               
               
                  17,02 × 106
                  
               
               
                  1,21 × 106
                  
               
               
                  537 100
               
               
                  151 800
               
               
                  18 070
               
            
                  Sr [IU/kg]
               
               
                  0,51 × 106
                  
               
               
                  0,039 × 106
                  
               
               
                  22 080
               
               
                  12 280
               
               
                  682
               
            
                  r [IU/kg]
               
               
                  1,43 × 106
                  
               
               
                  0,109 × 106
                  
               
               
                  61 824
               
               
                  34 384
               
               
                  1 910
               
            
                  CVr [ %]
               
               
                  3,0
               
               
                  3,5
               
               
                  4,1
               
               
                  8,1
               
               
                  3,8
               
            
                  SR [IU/kg]
               
               
                  1,36 × 106
                  
               
               
                  0,069 × 106
                  
               
               
                  46 300
               
               
                  23 060
               
               
                  3 614
               
            
                  R [IU/kg]
               
               
                  3,81 × 106
                  
               
               
                  0,193 × 106
                  
               
               
                  129 640
               
               
                  64 568
               
               
                  10 119
               
            
                  CVR [ %]
               
               
                  8,0
               
               
                  6,2
               
               
                  8,6
               
               
                  15
               
               
                  20
               
            
                  L
               
               
                  =
               
               
                  antal laboratorier
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  antal enkeltværdier
               
            
                  Sr
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for repeterbarhed
               
            
                  SR
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for reproducerbarhed
               
            
                  r
               
               
                  =
               
               
                  repeterbarhed
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  reproducerbarhed
               
            
                  CVr
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for repeterbarhed
               
            
                  CVR
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for reproducerbarhed
               
            
         
      B.   BESTEMMELSE AF VITAMIN E
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af vitamin E i foder og forblandinger. Indholdet af vitamin E udtrykkes i mg DL-α -tocopherolacetat pr. kg. 1 mg DL-α-tocopherolacetat svarer til 0,91 mg DL-α-tocopherol (vitamin E).
      Bestemmelsesgrænsen er 2 mg vitamin E pr. kg. Denne bestemmelsesgrænse er kun realistisk ved brug af fluorescensdetektor. Ved brug af UV-detektor er bestemmelsesgrænsen 10 mg/kg.
      2.   Princip
      Prøven hydrolyseres med kaliumhydroxid opløst i ethanol, og vitamin E ekstraheres med petroleumsether. Opløsningsmidlet fjernes ved inddampning, og remanensen opløses i methanol og fortyndes om nødvendigt til den ønskede koncentration. Vitamin E-indholdet bestemmes ved omvendt-fase-HPLC med anvendelse af UV- eller fluorescensdetektor.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  Ethanol, σ = 96 %.
               
            
                  3.2.
               
               
                  Petroleumsether, kogepunktsinterval: 40–60 oC.
               
            
                  3.3.
               
               
                  Methanol.
               
            
                  3.4.
               
               
                  Kaliumhydroxidopløsning, c = 50 g/100 ml.
               
            
                  3.5.
               
               
                  Natriumascorbatopløsning, c = 10 g/100 ml (se bemærkning 7.7).
               
            
                  3.6.
               
               
                  Natriumsulfid, Na2S· x H2O (x = 7–9).
               
            
                  3.6.1.
               
               
                  Natriumsulfidopløsning, c = 0,5 mol/liter i glycerol, β = 120 g/liter (for x = 9) (se bemærkning 7.8).
               
            
                  3.7.
               
               
                  Phenolphthaleinopløsning, c = 2 g/100 ml i ethanol (3.1).
               
            
                  3.8.
               
               
                  Mobil fase til HPLC: blanding af methanol (3.3) og vand, f.eks. 980 + 20 (v + v). Det nøjagtige forhold bestemmes af den anvendte kolonnes egenskaber.
               
            
                  3.9.
               
               
                  Nitrogen, oxygenfrit.
               
            
                  3.10.
               
               
                  DL-α-tocopherolacetat, ekstra rent, med certificeret aktivitet.
               
            
                  3.10.1.
               
               
                  Stamopløsning af DL-α-tocopherolacetat: Der afvejes med 0,1 mg nøjagtighed 100 mg DL-α-tocopherolacetat (3.10) i en 100 ml målekolbe. Efter opløsning i ethanol (3.1) fyldes der op til mærket med samme opløsningsmiddel. 1 ml af denne opløsning indeholder 1 mg DL-α-tocopherolacetat (UV-kontrol, se punkt 5.6.1.3; stabilisering, se bemærkning 7.4.).
               
            
                  3.11.
               
               
                  DL-α-tocopherol, ekstra rent, med certificeret aktivitet
               
            
                  3.11.1.
               
               
                  Stamopløsning af DL-α-tocopherol: Der afvejes med 0,1 mg nøjagtighed 100 mg DL-α-tocopherol (3.11) i en 100 ml målekolbe. Efter opløsning i ethanol (3.1) fyldes der op til mærket med samme opløsningsmiddel. 1 ml af denne opløsning indeholder 1 mg DL-α-tocopherol (UV-kontrol, se punkt 5.6.2.3; stabilisering, se bemærkning 7.4).
               
            
                  3.12.
               
               
                  2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) (se bemærkning 7.5).
               
            4.   Apparatur
      
                  4.1.
               
               
                  Rotationsfordamper
               
            
                  4.2.
               
               
                  Udstyr af brunt glas
               
            
                  4.2.1.
               
               
                  Fladbundede eller koniske kolber, 500 ml, med slib
               
            
                  4.2.2.
               
               
                  Målekolber med slibprop og tynd hals, 10, 25, 100 og 500 ml
               
            
                  4.2.3.
               
               
                  Skilletragte, koniske, 1 000 ml, med slibprop
               
            
                  4.2.4.
               
               
                  Pærekolber, 250 ml, med slib
               
            
                  4.3.
               
               
                  Allihn-svaler, kappelængde 300 mm, med slibhals, med adapter til gastilførsel
               
            
                  4.4.
               
               
                  Foldefiltrerpapir til faseseparation, diameter: 185 mm (f.eks. Schleicher & Schüll 597 HY 1/2)
               
            
                  4.5.
               
               
                  HPLC-udstyr med injektionssystem
               
            
                  4.5.1.
               
               
                  HPLC-kolonne, 250 mm × 4 mm, C18, 5 eller 10 μm pakkemateriale, eller tilsvarende
               
            
                  4.5.2.
               
               
                  UV- eller fluorescensdetektor, med variabel bølgelængde
               
            
                  4.6.
               
               
                  Spektrofotometer med 10 mm kvartskuvetter
               
            
                  4.7.
               
               
                  Vandbad med magnetomrører
               
            
                  4.8.
               
               
                  Ekstraktionsapparat (se figur 1) bestående af følgende:
               
            
                  4.8.1.
               
               
                  Cylinderglas på 1 liter med slibhals og -prop
               
            
                  4.8.2.
               
               
                  Slibindsats med sidearm og justerbart rør, der er ført igennem midten. Det justerbare rør skal være U-formet i den nedre ende og være tilspidset i den anden ende, således at det øverste væskelag i glasset kan overføres til en skilletragt.
               
            5.   Fremgangsmåde
      
                  
                     NB
                  
               
               
                  Vitamin E er følsomt over for lys (UV) og oxidering. Alt arbejde udføres afskærmet mod lys (udstyr af brunt glas eller glasudstyr omviklet med aluminiumfolie) og oxygen (skylning med nitrogen). Under ekstraktionen udskiftes luften over væsken med nitrogen (overtryk udlignes ved jævnligt at lette på proppen).
               
            5.1.   Klargøring af prøven
      Prøven formales, så den kan passere gennem en sigte med 1 mm maskevidde, men varmeudvikling skal undgås. Formalingen foretages umiddelbart før afvejning og forsæbning, da der ellers kan gå vitamin E tabt.
      5.2.   Forsæbning
      Afhængigt af vitamin E-indholdet afvejes der med en nøjagtighed på 0,01 g 2–25 g af prøven i en 500 ml fladbundet eller konisk kolbe (4.2.1). Der tilsættes under forsigtig blanding i rækkefølge 130 ml ethanol (3.1), ca. 100 mg BHT (3.12), 2 ml natriumascorbatopløsning (3.5) og 2 ml natriumsulfidopløsning (3.6). Der sættes en svaler på kolben, som anbringes i vandbad med magnetomrører (4.7). Der opvarmes til kogning og koges med tilbagesvaling i 5 minutter. Dernæst tilsættes der 25 ml kaliumhydroxidopløsning (3.4) gennem svaleren (4.3), og der koges med tilbagesvaling i endnu 25 minutter under omrøring og under langsom nitrogengennemstrømning. Svaleren skylles med ca. 20 ml vand, og kolbens indhold afkøles til rumtemperatur.
      5.3.   Ekstraktion
      Forsæbningsopløsningen overføres kvantitativt til en 1 000 ml skilletragt (4.2.3) eller ekstraktionsapparatet (4.8) ved skylning med i alt 250 ml vand. Derefter skylles forsæbningskolben først med 25 ml ethanol (3.1) og dernæst med 100 ml petroleumsether (3.2), idet skyllevæskerne overføres til skilletragten eller ekstraktionsapparatet. Forholdet mellem vand og ethanol i den samlede væskemængde skal være ca. 2:1. Der omrystes kraftigt i 2 minutter, og blandingen henstår til adskillelse i 2 minutter.
      5.3.1.   Ekstraktion med skilletragt (4.2.3)
      
      Når væsken er skilt i to lag (se bemærkning 7.3), overføres petroleumsetherlaget til en anden skilletragt (4.2.3). Ekstraktionen gentages to gange med 100 ml petroleumsether (3.2) og derefter to gange med 50 ml petroleumsether (3.2).
      De samlede ekstrakter i skilletragten vaskes to gange med 100 ml vand hver gang (ved forsigtig omdrejning, så der ikke dannes emulsion) og derefter flere gange ved rystning med 100 ml vand, indtil vandet ikke farves ved tilsætning af phenolphthaleinopløsning (3.7) (fire gange er normalt tilstrækkeligt). Det vaskede ekstrakt filtreres over i en 500 ml målekolbe (4.2.2) gennem et tørt foldefilter til faseseparation (4.4), således at eventuelt opslæmmet vand fjernes. Skilletragten og filtret skylles med 50 ml petroleumsether (3.2), og der fyldes op til mærket med petroleumsether (3.2) og blandes omhyggeligt.
      5.3.2.   
            Ekstraktion med ekstraktionsapparat (4.8)
         
      
      Når væsken er skilt i to lag (se bemærkning 7.3), udskiftes cylinderglassets (4.8.1) prop med slibindsatsen (4.8.2), og den nederste, U-formede del af det justerbare rør anbringes, så dets munding er lige over skillefladen. Ved at sætte nitrogentryk på sidearmen overføres det lette lag af petroleumsether til en 1 000 ml skilletragt (4.2.3). Der tilsættes 100 ml petroleumsether (3.2) til cylinderglasset, og det tilproppes og rystes omhyggeligt. Når væsken er skilt i to lag, overføres det lette lag til skilletragten som før. Ekstraktionen gentages med endnu 100 ml petroleumsether (3.2) og dernæst med 2 portioner 50 ml petroleumsether (3.2), og alle lagene af petroleumsether overføres til skilletragten.
      De samlede petroleumsetherekstrakter i skilletragten vaskes som beskrevet i punkt 5.3.1, og der fortsættes som beskrevet der.
      5.4.   Fremstilling af prøveopløsning til HPLC-analyse
      En alikvot mængde af petroleumsetherekstraktet (fra 5.3.1 eller 5.3.2) afpipetteres i en 250 ml pærekolbe (4.2.4). Der inddampes til næsten tørhed på rotationsfordamper (4.1) under reduceret tryk med en vandbadstemperatur på højst 40 oC. Trykket udlignes til atmosfæretryk, ved at der ledes nitrogen (3.9) ind i kolben, og kolben fjernes fra rotationsfordamperen. Resterende opløsningsmiddel fjernes under en nitrogenstrøm (3.9), og remanensen opløses straks i en kendt mængde (10–100 ml) methanol (3.3) (koncentrationen af DL-α-tocopherol skal ligge i intervallet 5–30 μg/ml).
      5.5.   HPLC-bestemmelse
      Separationen af vitamin E finder sted på en C18-kolonne med omvendt fase (4.5.1), og koncentrationen måles med en UV-detektor (292 nm) eller en fluorescensdetektor (excitation: 295 nm, emission: 330 nm) (4.5.2).
      Der indsprøjtes en alikvot mængde (f.eks. 20 μl) af methanolopløsningen fra punkt 5.4, og der elueres med den mobile fase (3.8). Middeltophøjderne (-arealerne) for flere indsprøjtninger af samme prøveopløsning og middeltophøjderne (-arealerne) for flere indsprøjtninger af kalibreringsopløsningerne (5.6.2) beregnes.
      
         HPLC-betingelser
      
      Nedenstående betingelser er vejledende; andre betingelser kan benyttes, forudsat at de giver tilsvarende resultater.
      
                  HPLC-kolonne (4.5.1):
               
               
                  250 mm × 4 mm, C18, 5 eller 10 μm pakkemateriale, eller tilsvarende
               
            
                  Mobil fase (3.8):
               
               
                  blanding af methanol (3.3) og vand, f.eks. 980 + 20 (v + v)
               
            
                  Flow:
               
               
                  1–2 ml/minuttet
               
            
                  Detektor (4.5.2):
               
               
                  fluorescensdetektor (excitation:
                  295 nm/emission: 330 nm) eller UV detektor (292 nm)
               
            5.6.   Kalibrering (DL-α-tocopherolacetat eller DL-α-tocopherol)
      5.6.1.   DL-α-tocopherolacetatstandard
      
      5.6.1.1.   
            Fremstilling af arbejdsstandardopløsning
         
      
      25 ml stamopløsning af DL-α-tocopherolacetat (3.10.1) afpipetteres i en 500 ml fladbundet eller konisk kolbe (4.2.1), og der hydrolyseres som beskrevet i punkt 5.2. Derefter ekstraheres der med petroleumsether (3.2) som beskrevet i punkt 5.3 og fortyndes til 500 ml med petroleumsether. 25 ml af denne opløsning inddampes til næsten tørhed på rotationsfordamper (se punkt 5.4), resterende opløsningsmiddel fjernes under en nitrogenstrøm (3.9), og remanensen opløses i 25,0 ml methanol (3.3). Opløsningens nominelle koncentration er 45,5 μg DL-α-tocopherol pr. ml svarende til 50 μg DL-α-tocopherolacetat pr. ml. Arbejdsstandardopløsningen skal fremstilles umiddelbart før brugen.
      5.6.1.2.   
            Fremstilling af kalibreringsopløsninger og kalibreringskurve
         
      
      Henholdsvis 1,0, 2,0, 4,0 og 10,0 ml af arbejdsstandardopløsningen overføres til hver sin 20 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med methanol (3.3) og blandes. Opløsningernes nominelle koncentration er 2,5, 5,0, 10,0 og 25,0 μg DL-α-tocopherolacetat pr. ml, dvs. 2,28, 4,55, 9,10 og 22,8 μg DL-α-tocopherol pr. ml.
      Der indsprøjtes 20 μl af hver kalibreringsopløsning flere gange, og middeltophøjderne (-arealerne) bestemmes. Kalibreringskurven tegnes ved hjælp af middeltophøjderne (-arealerne).
      5.6.1.3.   
            UV-indstilling af stamopløsningen af DL-α-tocopherolacetat (3.10.1)
         
      
      5,0 ml af stamopløsningen af DL-α-tocopherolacetat (3.10.1) fortyndes til 25,0 ml med ethanol, og opløsningens UV-spektrum i området 250–320 nm måles mod ethanol (3.1) i spektrofotometret (4.6).
      Absorptionsmaksimum skal ligge ved 284 nm:
      
         43,6 ved 284 nm i ethanol
      Ved denne fortynding skal der opnås en ekstinktionsværdi på 0,84–0,88.
      5.6.2.   DL-α-tocopherolstandard
      
      5.6.2.1.   
            Fremstilling af arbejdsstandardopløsning
         
      
      Der afpipetteres 2 ml stamopløsning af DL-α-tocopherol (3.11.1) i en 50 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med methanol (3.3). Opløsningens nominelle koncentration er 40 μg DL-α-tocopherol pr. ml svarende til 44,0 μg DL-α-tocopherolacetat pr. ml. Arbejdsstandardopløsningen skal fremstilles umiddelbart før brugen.
      5.6.2.2.   
            Fremstilling af kalibreringsopløsninger og kalibreringskurve
         
      
      Henholdsvis 1,0, 2,0, 4,0 og 10,0 ml af arbejdsstandardopløsningen overføres til hver sin 20 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med methanol (3.3) og blandes. Opløsningernes nominelle koncentration er 2,0, 4,0, 8,0 og 20,0 μg DL-α-tocopherol pr. ml, dvs. 2,20, 4,40, 8,79 og 22,0 μg DL-α-tocopherolacetat pr. ml.
      Der indsprøjtes 20 μl af hver kalibreringsopløsning flere gange, og middeltophøjderne (-arealerne) bestemmes. Kalibreringskurven tegnes ved hjælp af middeltophøjderne (-arealerne).
      5.6.2.3.   
            UV-indstilling af stamopløsningen af DL-α-tocopherol (3.11.1)
         
      
      2,0 ml af stamopløsningen af DL-α-tocopherol (3.11.1) fortyndes til 25,0 ml med ethanol, og opløsningens UV-spektrum i området 250-320 nm måles mod ethanol (3.1) i spektrofotometret (4.6). Absorptionsmaksimum skal ligge ved 292 nm:
      
          = 75,8 ved 292 nm i ethanol
      Ved denne fortynding skal der opnås en ekstinktionsværdi på 0,6.
      6.   Beregning af resultater
      Ud fra middelhøjden (-arealet) af prøveopløsningens vitamin E-toppe bestemmes koncentrationen i prøveopløsningen i μg/ml (beregnet som α-tocopherolacetat) ved benyttelse af kalibreringskurven (5.6.1.2 eller 5.6.2.2).
      Indholdet w af vitamin E i mg/kg for prøven beregnes efter følgende formel:
      
          [mg/kg]
      hvor:
      
                  c
               
               
                  =
               
               
                  vitamin E-koncentration (som α-tocopherolacetat) i prøveopløsningen (5.4) i μg/ml
               
            
                  V1
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumen af prøveopløsning (5.4) i ml
               
            
                  V2
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumen af den i 5.4 udtagne alikvot i ml
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  testportionens vægt i gram.
               
            7.   Bemærkninger
      
                  7.1.
               
               
                  For prøver med lav vitamin E-koncentration kan man med fordel samle petroleumsetherekstrakterne fra to forsæbningsportioner (afvejet mængde: 25 g) i én prøveopløsning til HPLC-bestemmelse.
               
            
                  7.2.
               
               
                  Den prøve, der tages ud til analyse, må ikke indeholde mere end 2 g fedtstof.
               
            
                  7.3.
               
               
                  Hvis faserne ikke skiller, kan der tilsættes ca. 10 ml ethanol (3.1) for at bryde emulsionen.
               
            
                  7.4.
               
               
                  Efter spektrofotometrisk måling af opløsningen af DL-α-tocopherolacetat eller DL-α-tocopherol ifølge henholdsvis 5.6.1.3 og 5.6.2.3 tilsættes der ca. 10 mg BHT (3.12) til opløsningen (3.10.1 eller 3.10.2), hvorefter den opbevares i køleskab (højst 4 uger).
               
            
                  7.5.
               
               
                  Der kan anvendes hydroquinon i stedet for BHT.
               
            
                  7.6.
               
               
                  Ved brug af en normal-fase-kolonne er det muligt at adskille α-, β-, γ- og δ-tocopherol.
               
            
                  7.7.
               
               
                  Der kan anvendes ca. 150 mg ascorbinsyre i stedet for natriumascorbatopløsning.
               
            
                  7.8.
               
               
                  Der kan anvendes ca. 50 mg EDTA i stedet for natriumsulfidopløsning.
               
            
                  7.9.
               
               
                  Vitamin E-acetat hydrolyserer meget hurtigt i basisk miljø og er derfor yderst følsomt over for oxidering, navnlig under tilstedeværelse af mikromineraler såsom jern eller kobber. Bestemmelse af vitamin E i forblandinger i mængder på over 5 000 mg/kg vil kunne resultere i nedbrydning af vitamin E. HPLC-bestemmelse med enzymatisk behandling af vitamin E-indholdet, hvor alkalisk forsæbning udelades, er derfor at anbefale i verifikationsøjemed.
               
            8.   Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 15 % i relativ værdi (af det højeste resultat).
      9.   Resultater af ringanalyse
             (2)
         
      
      
                   
               
               
                  Forblanding
               
               
                  Forblandet foder
               
               
                  Mineralkoncentrat
               
               
                  Proteinfoder
               
               
                  Foder til smågrise
               
            
                  L
               
               
                  12
               
               
                  12
               
               
                  12
               
               
                  12
               
               
                  12
               
            
                  n
               
               
                  48
               
               
                  48
               
               
                  48
               
               
                  48
               
               
                  48
               
            
                  Middelværdi [mg/kg]
               
               
                  17 380
               
               
                  1 187
               
               
                  926
               
               
                  315
               
               
                  61,3
               
            
                  sr [mg/kg]
               
               
                  384
               
               
                  45,3
               
               
                  25,2
               
               
                  13,0
               
               
                  2,3
               
            
                  r [mg/kg]
               
               
                  1 075
               
               
                  126,8
               
               
                  70,6
               
               
                  36,4
               
               
                  6,4
               
            
                  CVr [%]
               
               
                  2,2
               
               
                  3,8
               
               
                  2,7
               
               
                  4,1
               
               
                  3,8
               
            
                  sR mg/kg]
               
               
                  830
               
               
                  65,0
               
               
                  55,5
               
               
                  18,9
               
               
                  7,8
               
            
                  SR [mg/kg]
               
               
                  2 324
               
               
                  182,0
               
               
                  155,4
               
               
                  52,9
               
               
                  21,8
               
            
                  CVR [%]
               
               
                  4,8
               
               
                  5,5
               
               
                  6,0
               
               
                  6,0
               
               
                  12,7
               
            
                  L
               
               
                  =
               
               
                  antal laboratorier
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  antal enkeltværdier
               
            
                  sr
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for repeterbarhed
               
            
                  SR
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for reproducerbarhed
               
            
                  r
               
               
                  =
               
               
                  repeterbarhed
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  reproducerbarhed
               
            
                  CVr
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for repeterbarhed
               
            
                  CVR
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for reproducerbarhed
               
            
         
      C.   BESTEMMELSE AF MIKROMINERALERNE JERN, KOBBER, MANGAN OG ZINK
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme mikromineralerne jern, kobber, mangan og zink i foder. Bestemmelsesgrænserne er:
      
                  —
               
               
                  jern (Fe): 20 mg/kg
               
            
                  —
               
               
                  kobber (Cu): 10 mg/kg
               
            
                  —
               
               
                  mangan (Mn): 20 mg/kg
               
            
                  —
               
               
                  zink (Zn): 20 mg/kg.
               
            2.   Princip
      Prøven opløses i saltsyre, efter at eventuelt organisk stof er destrueret. Jern, kobber, mangan og zink bestemmes efter en passende fortynding ved anvendelse af atomabsorptionsspektrofotometri.
      3.   Reagenser
      Indledning
      Ved fremstillingen af reagenser og analyseopløsninger anvendes vand, som ikke indeholder de kationer, der skal bestemmes. Vandet renses enten ved en dobbelt destillation af vandet i et borsilikat- eller kvartsdestillationsapparat eller ved dobbelt behandling på ionbytter.
      Reagenserne skal mindst være af analysekvalitet. Fravær af de mineraler, som skal bestemmes, kontrolleres ved blindbestemmelse. Om nødvendigt oprenses reagenserne yderligere.
      I stedet for stamopløsninger, som beskrevet nedenfor, kan kommercielle stamopløsninger anvendes, på betingelse af at de kontrolleres før brug.
      
                  3.1.
               
               
                  Saltsyre, massefylde: 1,19 g/ml.
               
            
                  3.2.
               
               
                  Saltsyre, 6 mol/liter.
               
            
                  3.3.
               
               
                  Saltsyre, 0,5 mol/liter.
               
            
                  3.4.
               
               
                  Flussyre 38–40 % (v/v) med et indhold af jern (Fe) på mindre end 1 mg/liter og med en inddampningsrest på mindre end 10 mg (som sulfat)/liter.
               
            
                  3.5.
               
               
                  Svovlsyre, massefylde: 1,84 g/ml.
               
            
                  3.6.
               
               
                  Hydrogenperoxid, ca. 100 vol. oxygen (30 vægtprocent).
               
            
                  3.7.
               
               
                  Standardjernopløsning (1 000 μg Fe/ml) fremstilles som følger (fås en tilsvarende opløsning i handelen, kan denne anvendes): 1 g jerntråd opløses i 200 ml 6 mol/liter saltsyre (3.2), hvorefter der tilsættes 16 ml hydrogenperoxid (3.6) og fyldes op med vand til 1 liter.
               
            
                  3.7.1.
               
               
                  Arbejdsstandardjernopløsning (100 μg Fe/ml) fremstilles ved at fortynde 1 del standardopløsning (3.7) med 9 dele vand.
               
            
                  3.8.
               
               
                  Standardkobberopløsning (1 000 μg Cu/ml) fremstilles som følger (fås en tilsvarende opløsning i handelen, kan denne anvendes):
                  
                              —
                           
                           
                              1 g kobber i pulverform opløses i 25 ml 6 mol/liter saltsyre (3.2), hvorefter der tilsættes 5 ml hydrogenperoxid (3.6) og fyldes op med vand til 1 liter.
                           
                        
            
                  3.8.1.
               
               
                  Arbejdsstandardkobberopløsning (10 μg Cu/ml) fremstilles ved at fortynde 1 del stamopløsning (3.8) med 9 dele vand og derefter fortynde 1 del af den således opnåede opløsning med 9 dele vand.
               
            
                  3.9.
               
               
                  Standardmanganopløsning (1 000 μg Mn/ml) fremstilles som følger (fås en tilsvarende opløsning i handelen, kan denne anvendes):
                  
                              —
                           
                           
                              1 g mangan i pulverform opløses i 25 ml 6 mol/liter saltsyre (3.2), og der fyldes op til 1 liter med vand.
                           
                        
            
                  3.9.1.
               
               
                  Arbejdsstandardmanganopløsning (10 μg Mn/ml) fremstilles ved at fortynde 1 del stamopløsning (3.9) med 9 dele vand og derefter fortynde 1 del af den således opnåede opløsning med 9 dele vand.
               
            
                  3.10.
               
               
                  Standardzinkopløsning (1 000 μg Zn/ml) fremstilles som følger (fås en tilsvarende opløsning i handelen, kan denne anvendes):
                  
                              —
                           
                           
                              1 g zink i bånd eller bladform opløses i 25 ml 6 mol/liter saltsyre (3.2), og der fyldes op med vand til 1 liter.
                           
                        
            
                  3.10.1.
               
               
                  Arbejdsstandardzinkopløsning (10 μg Zn/ml) fremstilles ved at fortynde 1 del stamopløsning (3.10) med 9 dele vand og derefter fortynde 1 del af den således opnåede opløsning med 9 dele vand.
               
            
                  3.11.
               
               
                  Lanthanchloridopløsning: 12 g lanthanoxid opløses i 150 ml vand, hvorefter der tilsættes 100 ml 6 mol/liter saltsyre (3.2) og fyldes op med vand til 1 liter.
               
            4.   Apparatur
      
                  4.1.
               
               
                  Muffelovn med temperaturregulering og helst pyrometer.
               
            
                  4.2.
               
               
                  Glasudstyr skal være af modstandsdygtigt borsilikat, og det anbefales, at det pågældende apparatur udelukkende anvendes til bestemmelse af mikromineraler.
               
            
                  4.3.
               
               
                  Atomabsorptionsspektrofotometer, som opfylder de relevante metodekrav med hensyn til følsomhed og nøjagtighed i det krævede område.
               
            5.   Fremgangsmåde
             (3)
         
      
      5.1.   Prøver indeholdende organisk stof
      5.1.1.   Foraskning og fremstilling af prøveopløsningen til analyse
          (4)
      
      
                  5.1.1.1.
               
               
                  5–10 g af prøven afvejes med 0,2 mg nøjagtighed i en kvarts- eller platindigel (se bemærkning b)), prøven tørres i tørreskab ved 105 oC, og diglen anbringes i en kold muffelovn (4.1). Ovnen lukkes (se bemærkning c)), og temperaturen øges gradvis til 450–475 oC i løbet af ca. 90 minutter. Denne temperatur holdes i 4–16 timer (f.eks. natten over) for at fjerne kulstofholdigt materiale, hvorefter ovnen åbnes til afkøling (se bemærkning d)).
                  Asken fugtes med vand og overføres til et 250 ml bægerglas. Diglen skylles med i alt ca. 5 ml saltsyre (3.1), som overføres langsomt og omhyggeligt til bægerglasset (en voldsom reaktion kan forekomme på grund af dannelse af CO2). Der tilsættes saltsyre (3.1) dråbevis under omrøring, indtil enhver opbrusning er ophørt. Der inddampes til tørhed under lejlighedsvis omrøring med en glasspatel.
                  Der tilsættes først 15 ml 6 mol/liter saltsyre (3.2) og dernæst 120 ml vand til remanensen. Der omrøres med glasspatelen, som skal forblive i bægerglasset, og dette tildækkes med et urglas. Indholdet bringes til svag kogning og holdes på kogepunktet, indtil der tilsyneladende ikke opløses mere aske. Der filtreres gennem et askefrit filtrerpapir over i en 250 ml målekolbe. Bægerglasset vaskes, og der filtreres med 5 ml varm 6 mol/liter saltsyre (3.2) samt to gange med kogende vand. Målekolben fyldes op til mærket med vand (HCl-koncentration: ca. 0,5 mol/liter).
               
            
                  5.1.1.2.
               
               
                  Hvis remanensen på filtret er sort (kulstof), sættes den tilbage i ovnen, og der foraskes igen ved 450–475 oC. Denne foraskning, som kun kræver nogle få timer (ca. 3–5 timer), er gennemført, når asken er hvid eller næsten hvid. Remanensen opløses i ca. 2 ml saltsyre (3.1) og inddampes til tørhed, hvorefter der tilsættes 5 ml 6 mol/liter saltsyre (3.2). Der opvarmes, opløsningen filtreres over i målekolben, og der fyldes op til mærket med vand (ca. 0,5 mol/liter HCl-koncentration).
                  Bemærkninger:
                  
                              a)
                           
                           
                              Ved bestemmelse af mikromineraler er det vigtigt at være opmærksom på risikoen for forurening især med zink, kobber og jern. Derfor skal det udstyr, som anvendes til klargøring af prøverne, være fri for disse metaller.
                              For at mindske den almindelige forureningsrisiko arbejdes i en støvfri atmosfære med pinligt rent udstyr og omhyggeligt afvaskede glasvarer. Bestemmelsen af zink er særligt følsom over for mange typer forurening, f.eks. fra glas, reagenser, støv osv.
                           
                        
                              b)
                           
                           
                              Vægten af den prøve, der skal foraskes, beregnes ud fra det omtrentlige forventede indhold af mikromineraler i foderet i relation til det anvendte spektrofotometers følsomhed. For visse typer foder, hvis mikromineralindhold er lavt, kan det være nødvendigt at starte med en prøve på 10–20 g og begrænse den endelige opløsning til kun 100 ml.
                           
                        
                              c)
                           
                           
                              Foraskning skal udføres i en lukket ovn uden gennemblæsning med luft eller oxygen.
                           
                        
                              d)
                           
                           
                              Pyrometrets temperaturudvisning må ikke overstige 475 oC.
                           
                        
            5.1.2.   Spektrofotometrisk bestemmelse
      
      5.1.2.1.   
            Fremstilling af kalibreringsopløsninger
         
      
      For hvert af de grundstoffer, som skal bestemmes, skal der ud fra arbejdsstandardopløsningerne 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 og 3.10.1 fremstilles en række kalibreringsopløsninger, hver med en HCl-koncentration på ca. 0,5 mol/liter og (for så vidt angår jern, mangan og zink) en lanthanchloridkoncentration svarende til 0,1 % La (w/v).
      De valgte koncentrationer for mikromineraler skal ligge inden for det anvendte spektrofotometers følsomhedsområde. Som eksempler er i tabellerne nedenfor angivet sammensætningen af typiske rækker af kalibreringsopløsninger. Afhængigt af spektrofotometret og dets følsomhed kan det dog være nødvendigt at vælge andre koncentrationer
      Jern
      
                  μg Fe/ml
               
               
                  0
               
               
                  0,5
               
               
                  1
               
               
                  2
               
               
                  3
               
               
                  4
               
               
                  5
               
            
                  ml arbejdsstandardopløsning (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe)
               
               
                  0
               
               
                  0,5
               
               
                  1
               
               
                  2
               
               
                  3
               
               
                  4
               
               
                  5
               
            
                  ml HCl (3.2)
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  7
               
            
                  + 10 ml lanthanchloridopløsning (3.11) — der fyldes op med vand til 100 ml
               
            Kobber
      
                  μg Cu/ml
               
               
                  0
               
               
                  0,1
               
               
                  0,2
               
               
                  0,4
               
               
                  0,6
               
               
                  0,8
               
               
                  1,0
               
            
                  ml arbejdsstandardopløsning (3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu)
               
               
                  0
               
               
                  1
               
               
                  2
               
               
                  4
               
               
                  6
               
               
                  8
               
               
                  10
               
            
                  ml HCl (3.2)
               
               
                  8
               
               
                  8
               
               
                  8
               
               
                  8
               
               
                  8
               
               
                  8
               
               
                  8
               
            Mangan
      
                  μg Mn/ml
               
               
                  0
               
               
                  0,1
               
               
                  0,2
               
               
                  0,4
               
               
                  0,6
               
               
                  0,8
               
               
                  1,0
               
            
                  ml arbejdsstandardopløsning (3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn)
               
               
                  0
               
               
                  1
               
               
                  2
               
               
                  4
               
               
                  6
               
               
                  8
               
               
                  10
               
            
                  ml HCl (3.2)
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  7
               
            
                  + 10 ml lanthanchloridopløsning (3.11) — der fyldes op med vand til 100 ml
               
            Zink
      
                  μg Zn/ml
               
               
                  0
               
               
                  0,05
               
               
                  0,1
               
               
                  0,2
               
               
                  0,4
               
               
                  0,6
               
               
                  0,8
               
            
                  ml arbejdsstandardopløsning (3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn)
               
               
                  0
               
               
                  0,5
               
               
                  1
               
               
                  2
               
               
                  4
               
               
                  6
               
               
                  8
               
            
                  ml HCl (3.2)
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  7
               
            
                  + 10 ml lanthanchloridopløsning (3.11) — der fyldes op med vand til 100 ml
               
            5.1.2.2.   
            Fremstilling af prøveopløsning til analyse
         
      
      Til bestemmelse af kobber kan den opløsning, som er fremstillet efter punkt 5.1.1, normalt anvendes direkte. Hvis det er nødvendigt for at bringe dens koncentration ind i kalibreringsopløsningernes område, kan en alikvot mængde afpipetteres i en 100 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med 0,5 mol/liter saltsyre (3.3).
      Til bestemmelse af jern, mangan og zink afpipetteres en alikvot mængde af den efter punkt 5.1.1 fremstillede opløsning i en 100 ml målekolbe, der tilsættes 10 ml lanthanchloridopløsning (3.11), og der fyldes op til mærket med 0,5 mol/liter saltsyre (3.3). (se også punkt 8, »Bemærkning«).
      5.1.2.3.   
            Blindbestemmelse
         
      
      Blindbestemmelsen skal indeholde alle trinene under fremgangsmåden, blot skal prøvematerialet udelades. Kalibreringsopløsning »0« må ikke anvendes som blind.
      5.1.2.4.   
            Måling af atomabsorption
         
      
      Atomabsorptionen for kalibreringsopløsningerne og den opløsning, der skal analyseres, måles ved anvendelse af en oxiderende luftacetylenflamme ved følgende bølgelængder:
      
                   
               
               
                  Fe: 248,3 nm
               
            
                   
               
               
                  Cu: 324,8 nm
               
            
                   
               
               
                  Mn: 279,5 nm
               
            
                   
               
               
                  Zn: 213,8 nm
               
            Hver af målingerne gentages fire gange.
      5.2.   Mineralfoder
      Hvis prøven ikke indeholder organisk materiale, er forudgående foraskning unødvendig. Fremgangsmåden i punkt 5.1.1.1 følges, idet der startes fra andet afsnit. Fordampning i tilstedeværelse af flussyre kan udelades.
      6.   Beregning af resultater
      Ved anvendelse af en kalibreringskurve beregnes koncentrationen af mikromineralet i den opløsning, som skal analyseres, og resultatet angives i mg mikromineral pr. kg prøve (ppm).
      7.   Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført af den samme person på den samme prøve må ikke overstige:
      
                  —
               
               
                  5 mg/kg i absolut værdi for indhold af det pågældende mikromineral på op til 50 mg/kg
               
            
                  —
               
               
                  10 % af det højeste resultat for indhold af det pågældende mikromineral på 50–100 mg/kg
               
            
                  —
               
               
                  10 mg/kg i absolut værdi for indhold af det pågældende mikromineral på 100–200 mg/kg;
               
            
                  —
               
               
                  5 % af det højeste resultat for indhold af det pågældende mikromineral på over 200 mg/kg.
               
            8.   Bemærkning
      Tilstedeværelse af store mængder phosphater kan interferere på bestemmelsen af jern, mangan og zink. En sådan interferens skal korrigeres gennem tilsætning af lanthanchloridopløsning (3.11). Hvis imidlertid vægtforholdet Ca + Mg/P er > 2 i prøven, kan tilsætning af lanthanchlorid (3.11) til den opløsning, der skal analyseres, og til kalibreringsopløsningerne udelades.
      D.   BESTEMMELSE AF HALOFUGINON
      
         DL-trans-7-brom-6-chlor-3-[3-(3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl]-quinazolin-4(3H)-on-hydrobromid
      
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af halofuginon i foder. Bestemmelsesgrænsen er 1 mg/kg.
      2.   Princip
      Efter behandling med varmt vand ekstraheres halofuginon som fri base med ethylacetat og separeres derefter som hydrochlorid over i en vandig syreopløsning. Ekstraktet oprenses ved ionbytningskromatografi. Indholdet af halofuginon bestemmes ved omvendt fase-HPLC med anvendelse af UV-detektor.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  Acetonitril, svarende til HPLC-kvalitet.
               
            
                  3.2.
               
               
                  Amberlit XAD-2-resin.
               
            
                  3.3.
               
               
                  Ammoniumacetat.
               
            
                  3.4.
               
               
                  Ethylacetat.
               
            
                  3.5.
               
               
                  Iseddike.
               
            
                  3.6.
               
               
                  Halofuginonstandardstof (DL-trans-7-brom-6-chlor-3-[3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl]-quinazolin-4-(3H)-on-hydrobromid, E 764).
               
            
                  3.6.1.
               
               
                  Halofuginonstandardstamopløsning, 100 μg/ml
                  50 mg halofuginon (3.6) afvejes med 0,1 mg nøjagtighed i en 500 ml målekolbe og opløses i ammoniumacetatbufferopløsning (3.18), hvorefter der fyldes op med bufferopløsning til mærket og blandes. Denne opløsning er stabil i tre uger ved 5 oC ved opbevaring i mørke.
               
            
                  3.6.2.
               
               
                  Kalibreringsopløsninger
                  Henholdsvis 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 og 6,0 ml af standardstamopløsningen (3.6.1) overføres til hver sin 100 ml målekolbe. Der fyldes op til mærket med mobil fase (3.21) og blandes. Disse opløsninger har en koncentration på henholdsvis 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 og 6,0 μg/ml halofuginon. Disse opløsninger skal fremstilles umiddelbart før brugen.
               
            
                  3.7.
               
               
                  Saltsyre, ρ20 = ca. 1,16 g/ml.
               
            
                  3.8.
               
               
                  Methanol.
               
            
                  3.9.
               
               
                  Sølvnitrat.
               
            
                  3.10.
               
               
                  Natriumascorbat.
               
            
                  3.11.
               
               
                  Natriumcarbonat.
               
            
                  3.12.
               
               
                  Natriumchlorid.
               
            
                  3.13.
               
               
                  EDTA (dinatriumethylendiamintetraacetat).
               
            
                  3.14.
               
               
                  Vand, svarende til HPLC-kvalitet.
               
            
                  3.15.
               
               
                  Natriumcarbonatopløsning, c = 10 g/100 ml.
               
            
                  3.16.
               
               
                  Saltmættet natriumcarbonatopløsning, c = 5 g/100 ml
                  50 g natriumcarbonat (3.11) opløses i vand og fortyndes til 1 liter, hvorefter der tilsættes natriumchlorid (3.12), indtil opløsningen er mættet.
               
            
                  3.17.
               
               
                  Saltsyre, ca. 0,1 mol/liter
                  10 ml HCI (3.7) fortyndes med vand til 1 liter.
               
            
                  3.18.
               
               
                  Ammoniumacetatbufferopløsning, ca. 0,25 mol/liter
                  19,3 g ammoniumacetat (3.3) og 30 ml eddikesyre (3.5) opløses i vand (3.14) og fortyndes til 1 liter.
               
            
                  3.19.
               
               
                  Amberlit XAD-2-resin-materiale
                  En passende mængde amberlit (3.2) vaskes med vand, til alle chloridioner er fjernet, således som det viser sig ved kontrol med sølvnitrat (3.20) på den kasserede, vandige fase. Resinet vaskes derefter med 50 ml methanol (3.8), methanolen kasseres, og resinet opbevares under frisk methanol.
               
            
                  3.20.
               
               
                  Sølvnitratopløsning, ca. 0,1 mol/liter
                  0,17 g sølvnitrat (3.9) opløses i 10 ml vand.
               
            
                  3.21.
               
               
                  Mobil fase til HPLC
                  500 ml acetonitril (3.1) blandes med 300 ml ammoniumacetatbufferopløsning (3.18) og 1 200 ml vand (3.14). pH justeres til 4,3 med eddikesyre (3.5). Der filtreres gennem et 0,22 μm filter (4.8), og opløsningen afgasses (f.eks. ved ultralydsbehandling i 10 minutter). Denne opløsning er stabil i en måned, hvis den opbevares mørkt i en lukket beholder.
               
            4.   Apparatur
      
                  4.1.
               
               
                  Ultralydsbad
               
            
                  4.2.
               
               
                  Rotationsfordamper
               
            
                  4.3.
               
               
                  Centrifuge
               
            
                  4.4.
               
               
                  HPLC-udstyr med ultraviolet detektor med variabel bølgelængde eller med diodearraydetektor
               
            
                  4.4.1.
               
               
                  HPLC-kolonne, 300 mm × 4 mm, C18, 10 μm pakkemateriale, eller tilsvarende
               
            
                  4.5.
               
               
                  Glaskolonne (300 mm × 10 mm) med filter af sintret glas og stophane
               
            
                  4.6.
               
               
                  Glasfiberfiltre, diameter: 150 mm
               
            
                  4.7.
               
               
                  Membranfiltre, 0,45 μm
               
            
                  4.8.
               
               
                  Membranfiltre, 0,22 μm.
               
            5.   Fremgangsmåde
      
                  
                     NB
                  
               
               
                  Halofuginon er som fri base ustabilt i alkaliske opløsninger og ethylacetatopløsninger. Må ikke henstå i ethylacetat i over 30 minutter.
               
            5.1.   Generelt
      
                  5.1.1.
               
               
                  Der analyseres en blindprøve for at kontrollere, at hverken halofuginon eller interfererende stoffer er til stede.
               
            
                  5.1.2.
               
               
                  Der udføres en genfindingstest ved at analysere blindprøven, som er blevet spiket ved tilsætning af en mængde halofuginon svarende til den, der er til stede i prøven. For at nå op på et niveau på 3 mg/kg tilsættes 300 μl af standardstamopløsningen (3.6.1) til 10 g blindprøve. Der blandes og ventes i 10 minutter, inden der fortsættes med ekstraktion (5.2).
                  
                              
                                 NB
                              
                           
                           
                              Til denne metode anvendes en blindprøve af samme type som analyseprøven, og som ved analyse viser sig ikke at indeholde halofuginon.
                           
                        
            5.2.   Ekstraktion
      10 g af den klargjorte prøve afvejes med en nøjagtighed på 0,1 g i et 200 ml centrifugeglas, hvorefter der tilsættes 0,5 g natriumascorbat (3.10), 0,5 g EDTA (3.13) og 20 ml vand og blandes. Centrifugeglasset anbringes i vandbad (80 oC) i 5 minutter. Efter afkøling til rumtemperatur tilsættes 20 ml natriumcarbonatopløsning (3.15) og blandes. Der tilsættes straks 100 ml ethylacetat (3.4), og glasset rystes kraftigt i hånden i 15 sekunder. Derefter anbringes glasset i 3 minutter i ultralydsbadet (4.1), og proppen løsnes. Der centrifugeres i 2 minutter, og ethylacetatfasen hældes gennem et glasfiberfilter (4.6) over i en 500 ml skilletragt. Ekstraktionen af prøven gentages med en ny portion på 100 ml ethylacetat. De samlede ekstrakter vaskes i 1 minut med 50 ml saltmættet natriumcarbonatopløsning (3.16), og den vandige fase kasseres.
      Den organiske fase ekstraheres i 1 minut med 50 ml saltsyre (3.17). Den nederste syrefase aftappes i en 250 ml skilletragt. Den organiske fase ekstraheres igen i 1,5 minutter med yderligere 50 ml saltsyre og blandes med det første ekstrakt. De samlede syreekstrakter vaskes ved omrystning i ca. 10 sekunder med 10 ml ethylacetat (3.4).
      Den vandige fase overføres kvantitativt til en 250 ml rundbundet kolbe, og den organiske fase kasseres. Al den resterende ethylacetat inddampes fra syreopløsningen ved brug af en rotationsfordamper (4.2). Vandbadets temperatur må ikke være over 40 oC. Under et vakuum på ca. 25 mbar vil al den resterende ethylacetat blive fjernet i løbet af 5 minutter ved 38 oC.
      5.3.   Oprensning
      5.3.1.   Klargøring af amberlitkolonnen
      
      Der klargøres en XAD-2-kolonne for hvert prøveekstrakt. 10 g behandlet amberlit (3.19) overføres med methanol (3.8) til en glaskolonne (4.5). Der anbringes en lille tot glasuld på toppen af resinkolonnen. Methanolen aftappes fra kolonnen, og resinet vaskes med 100 ml vand, idet der standses, når væsken når toppen af resinkolonnen. Kolonnen henstår for at komme i ligevægt i 10 minutter inden brug. Man må aldrig lade kolonnen løbe tør.
      5.3.2.   Oprensning af prøven
      
      Ekstraktet (5.2) overføres kvantitativt til den klargjorte amberlitkolonne (5.3.1), og der elueres; eluatet kasseres. Elueringshastigheden må ikke være over 20 ml/minuttet. Den rundbundede kolbe skylles med 20 ml saltsyre (3.17), som derefter benyttes til at rense resinkolonnen. Eventuelt resterende syreopløsning fjernes med luft. Skyllevæskerne kasseres. 100 ml methanol (3.8) tilsættes til kolonnen, og 5–10 ml elueres; eluatet opsamles i en 250 ml rundbundet kolbe. Den resterende methanol henstår i 10 minutter for at komme i ligevægt med resinkolonnen, og elueringen fortsættes ved en hastighed på ikke over 20 ml/minuttet; eluatet opsamles i samme rundbundede kolbe. Methanolen inddampes på rotationsfordamperen (4.2); vandbadets temperatur må ikke være på over 40 oC. Remanensen overføres kvantitativt til en 10 ml målekolbe ved brug af den mobile fase (3.21). Der fyldes op til mærket med mobil fase og blandes. En alikvot mængde filtreres gennem et membranfilter (4.7). Denne opløsning gemmes til HPLC-bestemmelsen (5.4).
      5.4.   HPLC-bestemmelse
      5.4.1.   Parametre
      
      Nedenstående betingelser er vejledende; andre betingelser kan benyttes, forudsat at de giver tilsvarende resultater.
      HPLC-kolonne (4.4.1)
      Mobil fase til HPLC (3.21)
      Flow: 1,5–2 ml/minuttet
      Detektionsbølgelængde: 243 nm
      Injektionsvolumen: 40–100 μl.
      Kromatografisystemets stabilitet kontrolleres, ved at der flere gange indsprøjtes kalibreringsopløsning (3.6.2) med 3,0 μg/ml, indtil der opnås konstante tophøjder (/-arealer) og retentionstider.
      5.4.2.   Kalibreringskurve
      
      Hver kalibreringsopløsning (3.6.2) indsprøjtes flere gange, og højden af toppene (arealerne) bestemmes for hver koncentration. Der tegnes en kalibreringskurve med kalibreringsopløsningernes middeltophøjder eller -arealer som ordinat og de tilsvarende koncentrationer i μg/ml som abscisse.
      5.4.3.   Prøveopløsning
      
      Prøveekstraktet (5.3.2) indsprøjtes flere gange, idet der benyttes samme mængde som til kalibreringsopløsningerne, og middeltophøjden (-arealet) af halofuginontoppene bestemmes.
      6.   Beregning af resultater
      Ud fra middelhøjden (-arealet) af prøveopløsningens halofuginontoppe bestemmes koncentrationen i prøveopløsningen i μg/ml ved benyttelse af kalibreringskurven (5.4.2).
      Prøvens indhold af halofuginon w (mg/kg) beregnes efter følgende formel:
      
         
      hvor:
      
                  c
               
               
                  =
               
               
                  prøveopløsningens halofuginonkoncentration i μg/ml
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  testportionens vægt i gram.
               
            7.   Validering af resultater
      7.1.   Identitet
      Analyttens identitet kan bekræftes ved ko-kromatografi eller ved at benytte en diodearraydetektor, hvormed spektrene for prøveekstraktet og kalibreringsopløsningen (3.6.2) indeholdende 6,0 μg/ml sammenlignes.
      7.1.1.   Ko-kromatografi
      
      Et prøveekstrakt spikes ved tilsætning af en passende mængde kalibreringsopløsning (3.6.2). Den tilsatte mængde halofuginon skal svare til den skønnede mængde halofuginon, der er fundet i prøveekstraktet.
      Kun højden af halufuginontoppen må være blevet øget, efter at der er taget hensyn til både den tilsatte mængde og fortyndingen af ekstraktet. Toppens bredde skal i den halve højde ligge inden for ± 10 % af den oprindelige bredde.
      7.1.2.   Diodearraydetektion
      
      Resultaterne vurderes i overensstemmelse med følgende kriterier:
      
                  a)
               
               
                  Den maksimale absorptionsbølgelængde for prøvens og standardens spektre, målt ved toppens spids på kromatogrammet, skal være den samme inden for en margin, der afhænger af detektionssystemets opløsningsevne. For diodearraydetektion ligger denne typisk inden for ± 2 nm.
               
            
                  b)
               
               
                  Mellem 225 og 300 nm må prøvens og standardens spektre registreret ved toppens spids på kromatogrammet ikke være forskellige fra hinanden i de dele af spektret, der ligger inden for 10–100 % relativ absorbans. Dette kriterium er opfyldt, når de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem de to spektre i intet observeret punkt overstiger 15 % af standardanalyttens absorbans.
               
            
                  c)
               
               
                  Mellem 225 og 300 nm må spektrene ved toppens forside, spids og bagside frembragt med prøveekstraktet ikke være forskellige fra hinanden i de dele af spektret, der ligger inden for 10–100 % relativ absorbans. Dette kriterium er opfyldt, når de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem spektrene i intet observeret punkt overstiger 15 % af spektrets absorbans i spidsen.
               
            Hvis et af disse kriterier ikke er opfyldt, er analyttens tilstedeværelse ikke bekræftet.
      7.2.   Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må højst være på 0,5 mg/kg for halofuginonindhold på op til 3 mg/kg.
      7.3.   Genfinding
      For den spikede blindprøve skal genfindingen være mindst 80 %.
      8.   Resultater af ringanalyse
      Der er gennemført en ringanalyse (5) hvor 3 prøver blev analyseret af 8 laboratorier.
      Resultater
      
                   
               
               
                  Prøve A
                  (blind)
                  ved modtagelse
               
               
                  Prøve B (mel)
               
               
                  Prøve C (piller)
               
            
                   
               
               
                   
               
               
                  ved modtagelse
               
               
                  efter 2 måneder
               
               
                  ved modtagelse
               
               
                  efter 2 måneder
               
            
                  Middelværdi [mg/kg]
               
               
                  ND
               
               
                  2,80
               
               
                  2,42
               
               
                  2,89
               
               
                  2,45
               
            
                  SR [mg/kg]
               
               
                  —
               
               
                  0,45
               
               
                  0,43
               
               
                  0,40
               
               
                  0,42
               
            
                  CVR [ %]
               
               
                  —
               
               
                  16
               
               
                  18
               
               
                  14
               
               
                  17
               
            
                  Genf. [ %]
               
               
                   
               
               
                  86
               
               
                  74
               
               
                  88
               
               
                  75
               
            
                  ND
               
               
                  =
               
               
                  ikke påvist
               
            
                  SR
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for reproducerbarhed
               
            
                  CVR
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for reproducerbarhed ( %)
               
            
                  Genf.
               
               
                  =
               
               
                  genfinding ( %).
               
            E.   BESTEMMELSE AF ROBENIDIN
      1,3-Bis[(4-chlorbenzyliden)amino]guanidinhydrochlorid
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af robenidin i foder. Bestemmelsesgrænsen er 5 mg/kg.
      2.   Princip
      Prøven ekstraheres med sur methanol. Ekstraktet tørres, og en alikvot mængde oprenses på en aluminiumoxidkolonne. Robenidinet elueres fra kolonnen med methanol og koncentreres, og rumfanget øges i passende grad ved tilsætning af mobil fase. Indholdet af robenidin bestemmes ved omvendt-fase-HPLC med anvendelse af UV-detektor.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  Methanol.
               
            
                  3.2.
               
               
                  Sur methanol
                  4,0 ml saltsyre (ρ20 = 1,18 g/ml) overføres til en 500 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med methanol (3.1) og blandes. Denne opløsning skal fremstilles umiddelbart før brugen.
               
            
                  3.3.
               
               
                  Acetonitril, svarende til HPLC-kvalitet
               
            
                  3.4.
               
               
                  Molekylsi
                  Type 3A, 8–12 mesh (1,6–2,5 mm kugler, krystallinsk aluminiumsilikat, porediameter: 0,3 mm).
               
            
                  3.5.
               
               
                  Aluminiumoxid, sur, aktivitetskvalitet I til søjlekromatografi
                  100 g aluminiumoxid overføres til en egnet beholder, og der tilsættes 2,0 ml vand. Beholderen tilproppes og rystes i ca. 20 minutter. Væsken opbevares i en godt tilproppet beholder.
               
            
                  3.6.
               
               
                  Kaliumdihydrogenphosphatopløsning, c = 0,025 mol/liter
                  3,40 g kaliumdihydrogenphosphat opløses i vand (HPLC-kvalitet) i en 1 000 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket og blandes.
               
            
                  3.7.
               
               
                  Dinatriumhydrogenphosphatopløsning, c = 0,025 mol/liter
                  3,55 g vandfrit (eller 4,45 g dihydrat eller 8,95 g dodecahydrat) dinatriumhydrogenphosphat opløses i vand (svarende til HPLC-kvalitet) i en 1 000 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket og blandes.
               
            
                  3.8.
               
               
                  Mobil fase til HPLC
                  Følgende reagenser blandes:
                  
                               
                           
                           
                              650 ml acetonitril (3.3)
                           
                        
                               
                           
                           
                              250 ml vand (svarende til HPLC-kvalitet)
                           
                        
                               
                           
                           
                              50 ml kaliumdihydrogenphosphatopløsning (3.6)
                           
                        
                               
                           
                           
                              50 ml dinatriumhydrogenphosphatopløsning (3.7).
                           
                        Der filtreres gennem et 0,22 μm filter (4.6), og opløsningen afgasses (f.eks. ved ultralydsbehandling i 10 minutter).
               
            
                  3.9.
               
               
                  Standardstof
                  Rent robenidin: 1,3-bis[(4-chlorbenzyliden)amino)] guanidinhydrochlorid.
               
            
                  3.9.1.
               
               
                  Robenidinstandardstamopløsning: 300 μg/ml
                  30 mg robenidinstandardstof (3.9) afvejes med en nøjagtighed på 0,1 mg og opløses i sur methanol (3.2) i en 100 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med samme opløsningsmiddel og blandes. Kolben omvikles med aluminiumfolie og opbevares i mørke.
               
            
                  3.9.2.
               
               
                  Robenidinstandardmellemopløsning: 12 μg/ml
                  10,0 ml af standardstamopløsningen (3.9.1) overføres til en 250 ml målekolbe, hvorefter der fyldes til mærket med mobil fase (3.8) og blandes. Kolben omvikles med aluminiumfolie og opbevares i mørke.
               
            
                  3.9.3.
               
               
                  Kalibreringsopløsninger
                  Henholdsvis 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 og 25,0 ml af standardmellemopløsningen (3.9.2) overføres til hver sin 50 ml målekolbe. Der fyldes op til mærket med mobil fase (3.8) og blandes. Disse opløsninger svarer til henholdsvis 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 og 6,0 μg/ml robenidin. Disse opløsninger skal fremstilles umiddelbart før brugen.
               
            
                  3.10.
               
               
                  Vand, svarende til HPLC-kvalitet.
               
            4.   Apparatur
      
                  4.1.
               
               
                  Glaskolonne
                  Fremstillet af brunt glas og forsynet med stophane og med en kapacitet på ca. 150 ml, indvendig diameter: 10–15 mm, længde: 250 mm.
               
            
                  4.2.
               
               
                  Mekanisk rysteapparat eller magnetomrører
               
            
                  4.3.
               
               
                  Rotationsfordamper
               
            
                  4.4.
               
               
                  HPLC-udstyr med ultraviolet detektor med variabel bølgelængde eller med diodearraydetektor, som arbejder i området fra 250 til 400 nm
               
            
                  4.4.1.
               
               
                  HPLC-kolonne: 300 mm × 4 mm, C18, 10 μm pakkemateriale, eller tilsvarende
               
            
                  4.5.
               
               
                  Glasfiberfiltrerpapir (Whatman GF/A eller tilsvarende)
               
            
                  4.6.
               
               
                  Membranfiltre, 0,22 μm
               
            
                  4.7.
               
               
                  Membranfiltre, 0,45 μm.
               
            5.   Fremgangsmåde
      
                  
                     NB
                  
               
               
                  Robenidin er lysfølsomt. Der anvendes udstyr af brunt glas i alle arbejdsgange.
               
            5.1.   Generelt
      
                  5.1.1.
               
               
                  Der analyseres en blindprøve for at kontrollere, at hverken robenidin eller interfererende stoffer er til stede.
               
            
                  5.1.2.
               
               
                  Der udføres en genfindingstest ved at analysere blindprøven (5.1.1), som er blevet spiket ved tilsætning af en mængde robenidin svarende til den, der er til stede i prøven. For at nå op på et niveau på 60 mg/kg overføres 3,0 ml af standardstamopløsningen (3.9.1) til en 250 ml konisk kolbe. Opløsningen inddampes til ca. 0,5 ml i en nitrogenstrøm. Der tilsættes 15 g af blindprøven, blandes og ventes i 10 minutter, inden der fortsættes med ekstraktion (5.2).
                  
                              
                                 NB
                              
                           
                           
                              Til denne metode anvendes en blindprøve af samme type som analyseprøven, og som ved analyse viser sig ikke at indeholde robenidin.
                           
                        
            5.2.   Ekstraktion
      Ca. 15 g af den klargjorte prøve afvejes med en nøjagtighed på 0,01 g, overføres til en 250 ml konisk kolbe og tilsættes 100,0 ml sur methanol (3.2), hvorefter kolben tilproppes og rystes i 1 time på rysteapparatet (4.2). Opløsningen filtreres gennem et glasfiberfiltrerpapir (4.5), og hele filtratet opsamles i en 150 ml konisk kolbe. Der tilsættes 7,5 mg molekylsi (3.4), tilproppes og omrystes i 5 minutter. Derefter filtreres omgående gennem et glasfiberfiltrerpapir. Denne opløsning anvendes til oprensningsprocessen (5.3).
      5.3.   Oprensning
      5.3.1.   Klargøring af aluminiumoxidkolonnen
      
      En lille prop af glasuld anbringes i den nedre ende af en glaskolonne (4.1) og skubbes helt ned med en glasstang. 11,0 g af den klargjorte aluminiumoxid (3.5) afvejes og overføres til kolonnen. Eksponeringen for luft begrænses mest muligt på dette stadium. Der bankes let på kolonnens nederste ende for at få aluminiumoxiden til at sætte sig.
      5.3.2.   Prøveoprensning
      
      Med pipette overføres 5,0 ml af det under (5.2) fremstillede prøveekstrakt til kolonnen. Man holder spidsen af pipetten nær kolonnevæggen og lader opløsningen absorbere af aluminiumoxiden. Robenidinet elueres fra kolonnen under anvendelse af 100 ml methanol (3.1) med en gennemstrømningshastighed på 2–3 ml/minuttet, og eluatet opsamles i en 250 ml rundbundet kolbe. Methanolopløsningen inddampes til tørhed under reduceret tryk ved 40 oC ved hjælp af en rotationsfordamper (4.3). Remanensen opløses i 3–4 ml mobil fase (3.8) og overføres kvantitativt til en 10 ml målekolbe. Kolben skylles med flere portioner på 1–2 ml mobil fase, som overføres til målekolben. Der fyldes op til mærket med samme opløsningsmiddel og blandes. En alikvot mængde filtreres gennem et 0,45 μm membranfilter (4.7). Denne opløsning gemmes til HPLC-bestemmelsen (5.4).
      5.4.   HPLC-bestemmelse
      5.4.1.   Parametre
      
      Følgende betingelser er vejledende; andre betingelser kan benyttes, forudsat at de giver tilsvarende resultater:
      HPLC-kolonne (4.4.1)
      Mobil fase til HPLC (3.8)
      Flow: 1,5–2 ml/minuttet
      Detektorbølgelængde: 317 nm
      Injektionsvolumen: 20–50 μl.
      Kromatografisystemets stabilitet kontrolleres, ved at der flere gange indsprøjtes kalibreringsopløsning (3.9.3) med 3,6 μg/ml, indtil der opnås konstante tophøjder og retentionstider.
      5.4.2.   Kalibreringskurve
      
      Hver kalibreringsopløsning (3.9.3) indsprøjtes flere gange, og højden af toppene (arealerne) bestemmes for hver koncentration. Der tegnes en kalibreringskurve med kalibreringsopløsningernes middeltophøjder eller -arealer som ordinat og de tilsvarende koncentrationer i μg/ml som abscisse.
      5.4.3.   Prøveopløsning
      
      Prøveekstraktet (5.3.2) indsprøjtes flere gange, idet der benyttes samme mængde som til kalibreringsopløsningerne, og middeltophøjden (-arealet) af robenidintoppene bestemmes.
      6.   Beregning af resultater
      Ud fra middelhøjden (-arealet) af prøveopløsningens robenidintoppe bestemmes koncentrationen i prøveopløsningen i μg/ml ved benyttelse af kalibreringskurven (5.4.2).
      Prøvens indhold af robenidin w (mg/kg) beregnes efter ved følgende formel:
      
         
      hvor:
      
                  c
               
               
                  =
               
               
                  prøveopløsningens robenidinkoncentration i μg/ml
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  testportionens vægt i gram.
               
            7.   Validering af resultater
      7.1.   Identitet
      Analyttens identitet kan bekræftes ved ko-kromatografi eller ved at benytte en diodearraydetektor, hvormed spektrene for prøveekstraktet og kalibreringsopløsningen (3.9.3) indeholdende 6 μg/ml sammenlignes.
      7.1.1.   Ko-kromatografi
      
      Et prøveekstrakt spikes ved tilsætning af en passende mængde kalibreringsopløsning (3.9.3). Den tilsatte mængde robenidin skal svare til den skønnede mængde robenidin, der er fundet i prøveekstraktet.
      Kun højden af robenidintoppen må være blevet øget, efter at der er taget hensyn til både den tilsatte mængde og fortyndingen af ekstraktet. Toppens bredde skal i den halve højde ligge inden for ca. 10 % af den oprindelige bredde.
      7.1.2.   Diodearraydetektion
      
      Resultaterne vurderes i overensstemmelse med følgende kriterier:
      
                  a)
               
               
                  Den maksimale absorptionsbølgelængde for prøvens og standardens spektre, målt ved toppens spids på kromatogrammet, skal være den samme inden for en margin, der afhænger af detektionssystemets opløsningsevne. Ved diodearraydetektion er den typisk ca. 2 nm.
               
            
                  b)
               
               
                  Mellem 250 og 400 nm må prøvens og standardens spektre registreret ved toppens spids på kromatogrammet ikke være forskellige fra hinanden i de dele af spektret, der ligger inden for 10–100 % relativ absorbans. Dette kriterium er opfyldt, når de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem de to spektre i intet observeret punkt overstiger 15 % af standardanalyttens absorbans.
               
            
                  c)
               
               
                  Mellem 250 og 400 nm må spektrene ved toppens forside, spids og bagside frembragt med prøveekstraktet ikke være forskellige fra hinanden i de dele af spektret, der ligger inden for 10–100 % relativ absorbans. Dette kriterium er opfyldt, når de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem spektrene i intet observeret punkt overstiger 15 % af spektrets absorbans i spidsen.
               
            Hvis et af disse kriterier ikke er opfyldt, er analyttens tilstedeværelse ikke bekræftet.
      7.2.   Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 10 % af det højeste resultat for robenidinindhold på over 15 mg/kg.
      7.3.   Genfinding
      For den spikede blindprøve skal genfindingen være mindst 85 %.
      8.   Resultater af ringanalyse
      Der er gennemført en EF-ringanalyse, hvor 4 prøver af fjerkræ- og kaninfoder i form af mel eller piller blev analyseret af 12 laboratorier. Der blev foretaget dobbeltanalyse af hver prøve. Resultaterne er vist i nedenstående skema:
      
                   
               
               
                  Fjerkræ
               
               
                  Kaniner
               
            
                   
               
               
                  Mel
               
               
                  Piller
               
               
                  Mel
               
               
                  Piller
               
            
                  Middelværdi [mg/kg]
               
               
                  27,00
               
               
                  27,99
               
               
                  43,6
               
               
                  40,1
               
            
                  sr [mg/kg]
               
               
                  1,46
               
               
                  1,26
               
               
                  1,44
               
               
                  1,66
               
            
                  CVr [%]
               
               
                  5,4
               
               
                  4,5
               
               
                  3,3
               
               
                  4,1
               
            
                  SR [mg/kg]
               
               
                  4,36
               
               
                  3,36
               
               
                  4,61
               
               
                  3,91
               
            
                  CVR [%]
               
               
                  16,1
               
               
                  12,0
               
               
                  10,6
               
               
                  9,7
               
            
                  Genfinding [%]
               
               
                  90,0
               
               
                  93,3
               
               
                  87,2
               
               
                  80,2
               
            
                  sr
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for repeterbarhed
               
            
                  CVr
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for repeterbarhed, %
               
            
                  SR
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for reproducerbarhed
               
            
                  CVR
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for reproducerbarhed, %.
               
            F.   BESTEMMELSE AF DICLAZURIL
      
         2,6-Chlor-alpha-(4-chlorphenyl)-4-[4,5-dihydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2(3H)-yl]-benzenacetonitril
      
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af diclazuril i foder og forblandinger. Detektionsgrænsen er 0,1 mg/kg, og bestemmelsesgrænsen er 0,5 mg/kg.
      2.   Princip
      Efter tilsætning af en intern standard ekstraheres prøven med sur methanol. For foders vedkommende oprenses en alikvot del af ekstraktet på en C18-fastfase-ekstraktionspatron. Diclazuril elueres fra patronen med en blanding af sur methanol og vand. Efter inddampning opløses remanensen i DMF/vand. For forblandingers vedkommende inddampes ekstraktet, og remanensen opløses i DMF/vand. Indholdet af diclazuril bestemmes ved ternær gradient-HPLC i omvendt fase med anvendelse af UV-detektor.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  Vand, svarende til HPLC-kvalitet.
               
            
                  3.2.
               
               
                  Ammoniumacetat.
               
            
                  3.3.
               
               
                  Tetrabutylammoniumhydrogensulfat (TBHS).
               
            
                  3.4.
               
               
                  Acetonitril, svarende til HPLC-kvalitet.
               
            
                  3.5.
               
               
                  Methanol, svarende til HPLC-kvalitet.
               
            
                  3.6.
               
               
                  N, N-Dimethylformamid (DMF).
               
            
                  3.7.
               
               
                  Saltsyre, ρ20 = 1,19 g/ml.
               
            
                  3.8.
               
               
                  Standardstof: diclazuril II-24: 2,6-chlor-alpha-(4-chlorphenyl)-4-[4,5-dihydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2(3H)-yl)-benzenacetonitril med garanteret renhed, E 771.
               
            
                  3.8.1.
               
               
                  Diclazurilstandardstamopløsning, 500 μg/ml
                  Med en nøjagtighed på 0,1 mg afvejes 25 mg diclazurilstandardstof (3.8) i en 50 ml målekolbe. Der opløses i DMF (3.6), fyldes op til mærket med DMF (3.6) og blandes. Kolben omvikles med aluminiumfolie, eller der anvendes en brun kolbe, og opløsningen opbevares i køleskab. Opløsningen er stabil i en måned ved en temperatur på ≤ 4 oC.
               
            
                  3.8.2.
               
               
                  Diclazurilstandardopløsning, 50 μg/ml
                  Der overføres 5,00 ml af standardstamopløsningen (3.8.1) til en 50 ml målekolbe, fyldes op til mærket med DMF (3.6) og blandes. Kolben omvikles med aluminiumfolie, eller der anvendes en brun kolbe, og opløsningen opbevares i køleskab. Opløsningen er stabil i en måned ved en temperatur på ≤ 4 oC.
               
            
                  3.9.
               
               
                  Internt standardstof: 2,6-dichlor-α-(4-chlorphenyl)-4-(4,5-dihydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-(3H)-yl)-α-methylbenzenacetonitril.
               
            
                  3.9.1.
               
               
                  Intern standardstamopløsning, 500 μg/ml
                  Med en nøjagtighed på 0,1 mg afvejes 25 mg internt standardstof (3.9) i en 50 ml målekolbe. Der opløses i DMF (3.6), fyldes op til mærket med DMF (3.6) og blandes. Kolben omvikles med aluminiumfolie, eller der anvendes en brun kolbe, og opløsningen opbevares i køleskab. Opløsningen er stabil i en måned ved en temperatur på ≤ 4 oC.
               
            
                  3.9.2.
               
               
                  Intern standardopløsning, 50 μg/ml
                  Der overføres 5,00 ml af den interne standardstamopløsning (3.9.1) til en 50 ml målekolbe, fyldes op til mærket med DMF (3.6) og blandes. Kolben omvikles med aluminiumfolie, eller der anvendes en brun kolbe, og opløsningen opbevares i køleskab. Opløsningen er stabil i en måned ved en temperatur på ≤ 4 oC.
               
            
                  3.9.3.
               
               
                  Intern standardopløsning for forblandinger, p/1 000 mg/ml
                  (p = nominelt indhold af diclazuril i forblandingen i mg/kg)
                  Med en nøjagtighed på 0,1 mg afvejes p/10 mg af det interne standardstof i en 100 ml målekolbe. Der opløses i DMF (3.6) i et ultralydsbad (4.6), fyldes op til mærket med DMF og blandes. Kolben omvikles med aluminiumfolie, eller der anvendes en brun kolbe, og kolben opbevares i køleskab. Opløsningen er stabil i en måned ved en temperatur på ≤ 4 oC.
               
            
                  3.10.
               
               
                  Kalibreringsopløsning, 2 μg/ml
                  Der afpipetteres 2,00 ml diclazurilstandardopløsning (3.8.2) og 2,00 ml intern standardopløsning (3.9.2) i en 50 ml målekolbe. Der tilsættes 16 ml DMF (3.6), fyldes op til mærket med vand og blandes. Opløsningen skal fremstilles umiddelbart før brugen.
               
            
                  3.11.
               
               
                  C18-fastfase-ekstraktionspatron, f.eks. Bond Elut, størrelse: 1 cm3, sorbentmasse: 100 mg.
               
            
                  3.12.
               
               
                  Ekstraktionsopløsningsmiddel: sur methanol
                  Der afpipetteres 5,0 ml saltsyre (3.7) i 1 000 ml methanol (3.5) og blandes.
               
            
                  3.13.
               
               
                  Mobil fase til HPLC
               
            
                  3.13.1.
               
               
                  Eluent A: ammoniumacetat-tetrabutylammoniumhydrogensulfat-opløsning
                  Der opløses 5 g ammoniumacetat (3.2) og 3,4 g TBHS (3.3) i 1 000 ml vand (3.1) og blandes.
               
            
                  3.13.2.
               
               
                  Eluent B: acetonitril (3.4).
               
            
                  3.13.3.
               
               
                  Eluent C: methanol (3.5).
               
            4.   Apparatur
      
                  4.1.
               
               
                  Mekanisk rysteapparat
               
            
                  4.2.
               
               
                  Udstyr til ternær gradient-HPLC
               
            
                  4.2.1.
               
               
                  HPLC-kolonne, Hypersil ODS, 3 μm pakkemateriale, 100 mm x 4,6 mm, eller tilsvarende
               
            
                  4.2.2.
               
               
                  UV-detektor med variabel bølgelængde eller diodearraydetektor
               
            
                  4.3.
               
               
                  Rotationsfordamper
               
            
                  4.4.
               
               
                  Membranfilter, 0,45 μm
               
            
                  4.5.
               
               
                  Vakuummanifold
               
            
                  4.6.
               
               
                  Ultralydsbad.
               
            5.   Fremgangsmåde
      5.1.   Generelt
      5.1.1.   Blindprøve
      
      Der analyseres en blindprøve for at kontrollere, at hverken diclazuril eller interfererende stoffer er til stede. Blindprøven skal være af samme type som den prøve, der skal undersøges, og ved analyse må diclazuril eller interfererende stoffer ikke påvises.
      5.1.2.   Genfindingstest
      
      Der udføres en genfindingstest ved at analysere blindprøven, som er blevet spiket ved tilsætning af en mængde diclazuril svarende til den, der er til stede i prøven. For at nå op på et niveau på 1 mg/kg tilsættes der 0,1 ml af standardstamopløsningen (3.8.1) til 50 g af en blindprøve, der blandes omhyggeligt, og efter henstand i 10 minutter blandes igen flere gange, før man går videre (5.2).
      Hvis der ikke er en blindprøve af samme type som analyseprøven til rådighed (se punkt 5.1.1), kan der alternativt udføres en genfindingstest ved hjælp af standardtilsætningsmetoden. I dette tilfælde spikes den prøve, der skal analyseres, ved tilsætning af en mængde diclazuril svarende til den, der allerede er til stede i prøven. Denne prøve analyseres sammen med den ikke-spikede prøve, og genfindingen kan beregnes ved subtraktion.
      5.2.   Ekstraktion
      5.2.1.   Foder
      
      Med en nøjagtighed på 0,01 g afvejes der ca. 50 g prøve. Det overføres til en 500 ml konisk kolbe, der tilsættes 1,00 ml intern standardopløsning (3.9.2) og 200 ml ekstraktionsopløsningsmiddel (3.12), og kolben tilproppes. Blandingen rystes natten over på rysteapparatet (4.1). Henstilles til bundfældning i 10 minutter. En 20 ml alikvot af supernatanten overføres til en egnet glasbeholder og fortyndes med 20 ml vand. Denne opløsning overføres til en ekstraktionspatron (3.11) og ledes igennem ved hjælp af vakuum (4.5). Patronen vaskes med 25 ml af en blanding af ekstraktionsopløsningsmiddel (3.12) og vand, 65 + 35 (v + v). De opsamlede fraktioner kasseres, og forbindelserne elueres med 25 ml af en blanding af ekstraktionsopløsningsmiddel (3.12) og vand, 80 + 20 (v + v). Denne fraktion inddampes, indtil den netop når tørhed, ved hjælp af rotationsfordamperen (4.3) ved 60 oC. Remanensen opløses i 1,0 ml DMF (3.6), og der tilsættes 1,5 ml vand (3.1) og blandes. Der filtreres gennem et membranfilter (4.4). Der fortsættes med HPLC-bestemmelse (5.3).
      5.2.2.   Forblandinger
      
      Med en nøjagtighed på 0,001 g afvejes der ca. 1 g prøve. Den overføres til en 500 ml konisk kolbe, der tilsættes 1,00 ml intern standardopløsning (3.9.3) og 200 ml ekstraktionsopløsningsmiddel (3.12), og kolben tilproppes. Blandingen rystes natten over på rysteapparatet (4.1). Henstilles til bundfældning i 10 minutter. En alikvot på 10 000/p ml (p = nominelt indhold af diclazuril i forblandingen i mg/kg) af supernatanten overføres til en rundbundet kolbe af passende størrelse. Der inddampes, indtil den netop når tørhed, under reduceret tryk ved hjælp af rotationsfordamperen (4.3) ved 60 oC. Remanensen opløses i 10,0 ml DMF (3.6), og der tilsættes 15,0 ml vand (3.1) og blandes. Der fortsættes med HPLC-bestemmelse (5.3).
      5.3.   HPLC-bestemmelse
      5.3.1.   Parametre
      
      Nedenstående betingelser er vejledende; andre betingelser kan benyttes, forudsat at de giver tilsvarende resultater.
      
                  HPLC-kolonne (4.2.1):
               
               
                  Hypersil ODS, 100 mm × 4,6 mm, 3 μm pakkemateriale, eller tilsvarende
               
               
                   
               
            
                  Mobil fase:
               
               
                  Eluent A (3.13.1):
               
               
                  Vandig opløsning af ammoniumacetat og tetrabutylammoniumhydrogen-sulfat
               
            
                   
               
               
                  Eluent B (3.13.2):
               
               
                  acetonitril
               
            
                   
               
               
                  Eluent C (3.13.3):
               
               
                  methanol
               
            
                  Elueringsmåde:
               
               
                  
                              —
                           
                           
                              lineær gradient
                           
                        
                              —
                           
                           
                              startbetingelser: A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V)
                           
                        
                              —
                           
                           
                              efter 10 minutters gradienteluering — i 30 minutter til: A + B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V).
                           
                        Der skylles med B i 10 minutter
               
            
                  Flow:
               
               
                  1,5 — 2 ml/minuttet
               
               
                   
               
            
                  Injektionsvolumen:
               
               
                  20 μl
               
               
                   
               
            
                  Detektorbølgelængde:
               
               
                  280 nm.
               
               
                   
               
            Kromatografisystemets stabilitet kontrolleres, ved at der flere gange indsprøjtes kalibreringsopløsning (3.10) med 2,0 μg/ml, indtil der opnås konstante tophøjder og retentionstider.
      5.3.2.   Kalibreringsopløsning
      
      Der indsprøjtes 20 μl af kalibreringsopløsningen (3.10) flere gange, og middeltophøjden (-arealet) af toppene for diclazuril og intern standard bestemmes.
      5.3.3.   Prøveopløsning
      
      Der indsprøjtes 20 μl af prøveopløsningen (5.2.1. eller 5.2.2) flere gange, og middeltophøjden (-arealet) af toppene for diclazuril og intern standard bestemmes.
      6.   Beregning af resultater
      6.1.   Foder
      Diclazurilindholdet w (mg/kg) i prøven beregnes efter følgende formel:
      
          [mg/kg]
      hvor:
      
                  hd, s
                  
               
               
                  =
               
               
                  tophøjde (-areal) for diclazuril i prøveopløsningen (5.2.1)
               
            
                  hi, s
                  
               
               
                  =
               
               
                  tophøjde (-areal) for den interne standard i prøveopløsningen (5.2.1)
               
            
                  hd, c
                  
               
               
                  =
               
               
                  tophøjde (-areal) for diclazuril i kalibreringsopløsningen (3.10)
               
            
                  hi, c
                  
               
               
                  =
               
               
                  tophøjde (-areal) for den interne standard i kalibreringsopløsningen (3.10)
               
            
                  cd, c
                  
               
               
                  =
               
               
                  kalibreringsopløsningens diclazurilkoncentration i μg/ml (3.10)
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  testportionens vægt i gram
               
            
                  V
               
               
                  =
               
               
                  prøveekstraktets volumen ifølge 5.2.1 (dvs. 2,5 ml).
               
            6.2.   Forblandinger
      Diclazurilindholdet w (mg/kg) i prøven beregnes efter følgende formel:
      
          [mg/kg]
      hvor:
      
                  hd, c
                  
               
               
                  =
               
               
                  tophøjde (-areal) for diclazuril i kalibreringsopløsningen (3.10)
               
            
                  hi, c
                  
               
               
                  =
               
               
                  tophøjde (-areal) for den interne standard i kalibreringsopløsningen (3.10)
               
            
                  hd, s
                  
               
               
                  =
               
               
                  tophøjde (-areal) for diclazuril i prøveopløsningen (5.2.2)
               
            
                  hi, s
                  
               
               
                  =
               
               
                  tophøjde (-areal) for den interne standard i prøveopløsningen (5.2.2)
               
            
                  cd, c
                  
               
               
                  =
               
               
                  kalibreringsopløsningens diclazurilkoncentration i μg/ml (3.10)
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  testportionens vægt i gram
               
            
                  V
               
               
                  =
               
               
                  prøveekstraktets volumen ifølge 5.2.2 (dvs. 25 ml)
               
            
                  p
               
               
                  =
               
               
                  nominelt indhold af diclazuril i forblandingen i mg/kg.
               
            7.   Validering af resultater
      7.1.   Identitet
      Analyttens identitet kan bekræftes ved ko-kromatografi eller ved at benytte en diodearraydetektor, hvormed spektrene for prøveekstraktet (5.2.1 eller 5.2.2) og kalibreringsopløsningen (3.10) sammenlignes.
      7.1.1.   Ko-kromatografi
      
      Et prøveekstrakt (5.2.1 eller 5.2.2) spikes ved tilsætning af en passende mængde kalibreringsopløsning (3.10). Den tilsatte mængde diclazuril skal svare til den mængde diclazuril, der er fundet i prøveekstraktet.
      Kun højden af diclazuriltoppen og intern standard-toppen må være blevet øget, efter at der er taget hensyn til både den tilsatte mængde og fortyndingen af ekstraktet. Toppens bredde skal i den halve højde ligge inden for ± 10 % af den oprindelige bredde af diclazuriltoppen eller intern standard-toppen for det ikke-spikede prøveekstrakt.
      7.1.2.   Diodearraydetektion
      
      Resultaterne vurderes i overensstemmelse med følgende kriterier:
      
                  a)
               
               
                  Den maksimale absorptionsbølgelængde for prøvens og standardens spektre, målt ved toppens spids på kromatogrammet, skal være den samme inden for en margin, der afhænger af detektionssystemets opløsningsevne. For diodearraydetektion ligger denne typisk inden for ± 2 nm.
               
            
                  b)
               
               
                  Mellem 230 og 320 nm må prøvens og standardens spektre registreret ved toppens spids på kromatogrammet ikke være forskellige fra hinanden i de dele af spektret, der ligger inden for 10–100 % relativ absorbans. Dette kriterium er opfyldt, når de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem de to spektre i intet observeret punkt overstiger 15 % af standardanalyttens absorbans.
               
            
                  c)
               
               
                  Mellem 230 og 320 nm må spektrene ved toppens forside, spids og bagside frembragt med prøveekstraktet ikke være forskellige fra hinanden i de dele af spektret, der ligger inden for 10–100 % relativ absorbans. Dette kriterium er opfyldt, når de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem de to spektre i intet observeret punkt overstiger 15 % af absorbansen for spektret i toppens spids.
               
            Hvis et af disse kriterier ikke er opfyldt, er analyttens tilstedeværelse ikke bekræftet.
      7.2.   Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige:
      
                  —
               
               
                  30 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for diclazurilindhold på 0,5–2,5 mg/kg
               
            
                  —
               
               
                  0,75 mg/kg for diclazurilindhold på 2,5–5 mg/kg
               
            
                  —
               
               
                  15 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for diclazurilindhold på mere end 5 mg/kg.
               
            7.3.   Genfinding
      For en spiket (blind)prøve skal genfindingen være mindst 80 %.
      8.   Resultater af ringanalyse
      Der er gennemført en ringanalyse, hvor 5 prøver blev analyseret af 11 laboratorier. Disse prøver bestod af to forblandinger; den ene var blandet med en organisk matrix (O 100), og den anden med en uorganisk matrix (A 100). Det teoretiske indhold var 100 mg diclazuril pr. kg. De tre blandede kyllingefoderstoffer var fremstillet af 3 forskellige producenter (NL) (Ll/Z1/K1). Det teoretiske indhold var 1 mg diclazuril pr. kg. Laboratorierne blev instrueret om at analysere hver af prøverne én gang eller som dobbeltbestemmelse (Journal of AOAC International, bind 77, nr. 6, 1994, s. 1359–1361, indeholder nærmere oplysninger om denne ringprøve). Resultaterne er vist i nedenstående tabel:
      
                   
               
               
                  Prøve 1
                  A 100
               
               
                  Prøve 2
                  O 100
               
               
                  Prøve 3
                  L1
               
               
                  Prøve 4
                  Z1
               
               
                  Prøve 5
                  K1
               
            
                  L
               
               
                  11
               
               
                  11
               
               
                  11
               
               
                  11
               
               
                  6
               
            
                  n
               
               
                  19
               
               
                  18
               
               
                  19
               
               
                  19
               
               
                  12
               
            
                  Middelværdi
               
               
                  100,8
               
               
                  103,5
               
               
                  0,89
               
               
                  1,15
               
               
                  0,89
               
            
                  Sr (mg/kg)
               
               
                  5,88
               
               
                  7,64
               
               
                  0,15
               
               
                  0,02
               
               
                  0,03
               
            
                  CVr ( %)
               
               
                  5,83
               
               
                  7,38
               
               
                  17,32
               
               
                  1,92
               
               
                  3,34
               
            
                  SR (mg/kg)
               
               
                  7,59
               
               
                  7,64
               
               
                  0,17
               
               
                  0,11
               
               
                  0,12
               
            
                  CVR ( %)
               
               
                  7,53
               
               
                  7,38
               
               
                  18,61
               
               
                  9,67
               
               
                  13,65
               
            
                  Nominelt indhold (mg/kg)
               
               
                  100
               
               
                  100
               
               
                  1
               
               
                  1
               
               
                  1
               
            
                  L
               
               
                  =
               
               
                  antal laboratorier
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  antal enkeltværdier
               
            
                  Sr
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for repeterbarhed
               
            
                  CVr
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for repeterbarhed
               
            
                  SR
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for reproducerbarhed
               
            
                  CVR
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for reproducerbarhed.
               
            9.   Bemærkninger
      Diclazurilresponset skal tidligere være påvist at være lineær i de koncentrationsområder, hvori der måles.
      G.   BESTEMMELSE AF LASALOCIDNATRIUM
      
         Natriumsalt af en monocarboxylsyrepolyether, der dannes af Streptomyces lasaliensis
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af lasalocidnatrium i foder og forblandinger. Detektionsgrænsen er 5 mg/kg, og bestemmelsesgrænsen er 10 mg/kg.
      2.   Princip
      Lasalocidnatrium ekstraheres af prøven i sur methanol og bestemmes ved omvendt fase-HPLC med anvendelse af spektrofluorometrisk detektor.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4).
               
            
                  3.2.
               
               
                  Orthophosphorsyre, w (w/w) = 85 %.
               
            
                  3.3.
               
               
                  Orthophosphorsyreopløsning, c = 20 %
                  23,5 ml ortophosphorsyre (3.2) fortyndes med vand til 100 ml.
               
            
                  3.4.
               
               
                  6-Methyl-2-heptylamin(1,5-dimethylhexylamin), w (w/w) = 99 %.
               
            
                  3.5.
               
               
                  Methanol, svarende til HPLC-kvalitet.
               
            
                  3.6.
               
               
                  Saltsyre, massefylde: 1,19 g/ml.
               
            
                  3.7.
               
               
                  Phosphatbufferopløsning, c = 0,01 mol/liter
                  1,36 g KH2PO4 (3.1) opløses i 500 ml vand (3.11), og der tilsættes 3,5 ml orthophosphorsyre (3.2) og 10,0 ml 6-methyl-2-heptylamin (3.4). pH-værdien justeres til 4,0 med orthophosphorsyreopløsning (3.3), og der fortyndes til 1 000 ml med vand (3.11).
               
            
                  3.8.
               
               
                  Sur methanol
                  Der overføres 5,0 ml saltsyre (3.6) til en 1 000 ml målekolbe, fyldes op til mærket med methanol (3.5) og blandes. Opløsningen skal fremstilles umiddelbart før brugen.
               
            
                  3.9.
               
               
                  Mobil fase til HPLC, phosphatbuffermethanolopløsning 5 + 95, (V + V)
                  5 ml phosphatbufferopløsning (3.7) blandes med 95 ml methanol (3.5).
               
            
                  3.10.
               
               
                  Lasalocidnatriumstandardstof med garanteret renhed, C34H53O8Na (natriumsalt af en monocarboxylsyrepolyether, der dannes af Streptomyces lasaliensis), E 763.
               
            
                  3.10.1.
               
               
                  Lasalocidnatriumstandardstamopløsning, 500 μg/ml
                  50 mg lasalocidnatrium (3.10) afvejes med en nøjagtighed på 0,1 mg i en 100 ml målekolbe og opløses i sur methanol (3.8), og der fyldes op til mærket med samme opløsningsmiddel og blandes. Denne opløsning skal fremstilles umiddelbart før brugen.
               
            
                  3.10.2.
               
               
                  Lasalocidnatriumstandardmellemopløsning, 50 μg/ml
                  Der afpipetteres 10,0 ml standardstamopløsning (3.10.1) i en 100 ml målekolbe, fyldes op til mærket med sur methanol (3.8) og blandes. Opløsningen skal fremstilles umiddelbart før brugen.
               
            
                  3.10.3.
               
               
                  Kalibreringsopløsninger
                  Henholdsvis 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 og 10,0 ml af standardmellemopløsningen (3.10.2) overføres til hver sin 50 ml målekolbe. Der fyldes op til mærket med sur methanol (3.8) og blandes. Disse opløsninger svarer til henholdsvis 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 og 10,0 μg lasalocidnatrium pr. ml. Disse opløsninger skal fremstilles umiddelbart før brugen.
               
            
                  3.11.
               
               
                  Vand, svarende til HPLC-kvalitet.
               
            4.   Apparatur
      
                  4.1.
               
               
                  Ultralydsbad (eller vandbad med rysteanordning) med temperaturkontrol
               
            
                  4.2.
               
               
                  Membranfiltre, 0,45 μm
               
            
                  4.3.
               
               
                  HPLC-udstyr med injektionssystem, egnet til injektionsvolumener på 20 μl
               
            
                  4.3.1.
               
               
                  HPLC-kolonne, 125 mm x 4 mm, omvendt-fase-C18, 5 μm pakkemateriale, eller tilsvarende
               
            
                  4.3.2.
               
               
                  Spektrofluorometer med variabel indstilling af excitations- og emissionsbølgelængden.
               
            5.   Fremgangsmåde
      5.1.   Generelt
      5.1.1.   Blindprøve
      
      Til gennemførelse af genfindingstesten (5.1.2) analyseres en blindprøve for at kontrollere, at hverken lasalocidnatrium eller interfererende stoffer er til stede. Blindprøven skal være af samme type som den prøve, der skal undersøges, og ved analyse må lasalocidnatrium eller interfererende stoffer ikke påvises.
      5.1.2.   Genfindingstest
      
      Der udføres en genfindingstest ved at analysere blindprøven, som er blevet spiket ved tilsætning af en mængde lasalocidnatrium svarende til den, der er til stede i prøven. For at nå op på et niveau på 100 mg/kg overføres der 10,0 ml standardstamopløsning (3.10.1) til en 250 ml konisk kolbe, og opløsningen inddampes til ca. 0,5 ml. Der tilsættes 50 g af blindprøven og blandes omhyggeligt, og efter henstand i 10 minutter blandes der på ny flere gange, inden der fortsættes med ekstraktion (5.2).
      Hvis der ikke er en blindprøve af samme type som analyseprøven til rådighed (se punkt 5.1.1), kan der alternativt udføres en genfindingstest ved hjælp af standardtilsætningsmetoden. I dette tilfælde spikes den prøve, der skal analyseres, ved tilsætning af en mængde lasalocidnatrium svarende til den, der allerede er til stede i prøven. Denne prøve analyseres sammen med den ikke-spikede prøve, og genfindingen beregnes ved subtraktion.
      5.2.   Ekstraktion
      5.2.1.   Foder
      
      Med en nøjagtighed på 0,01 g afvejes 5–10 g af prøven i en 250 ml konisk kolbe med prop. Der tilsættes 100,0 ml sur methanol (3.8) med pipette. Proppen sættes løst på, og der omrystes forsigtigt, så prøven opslæmmes. Kolben anbringes i ultralydsbad (4.1) ved ca. 40 oC i 20 minutter, hvorefter den fjernes og afkøles til rumtemperatur. Kolben henstår i ca. 1 time, indtil opslæmningen har bundfældet sig, hvorpå en alikvot mængde filtreres gennem et 0,45 μm membranfilter (4.2) ned i en egnet beholder. Der fortsættes med HPLC-bestemmelse (5.3).
      5.2.2.   Forblandinger
      
      Med en nøjagtighed på 0,001 g afvejes ca. 2 g af den ikke-formalede forblanding i en 250 ml målekolbe. Der tilsættes 100,0 ml sur methanol (3.8) og omrystes forsigtigt, så prøven opslæmmes. Kolben med indhold anbringes i ultralydsbad (4.1) ved ca. 40 oC i 20 minutter, hvorefter den fjernes og afkøles til rumtemperatur. Der fortyndes op til mærket med sur methanol (3.8) og blandes omhyggeligt. Kolben henstår i 1 time, indtil opslæmningen har bundfældet sig, hvorpå en alikvot mængde filtreres gennem et 0,45 μm membranfilter (4.2). En passende mængde af det klare filtrat fortyndes med sur methanol (3.8), så der fremkommer en endelig prøveopløsning, som indeholder ca. 4 μg/ml lasalocidnatrium. Der fortsættes med HPLC-bestemmelse (5.3).
      5.3.   HPLC-bestemmelse
      5.3.1.   Parametre
      
      Nedenstående betingelser er vejledende; andre betingelser kan benyttes, forudsat at de giver tilsvarende resultater.
      
                  HPLC-kolonne (4.3.1):
               
               
                  125 mm × 4 mm, omvendt-fase-C18, 5 μm pakkemateriale, eller tilsvarende
               
            
                  Mobil fase (3.9):
               
               
                  Blanding af phosphatbufferopløsning (3.7) og methanol (3.5), 5 + 95 (v + v)
               
            
                  Flow :
               
               
                  1,2 ml/minuttet
               
            
                  Detektionsbølgelængde:
               
               
                   
               
            
                  Excitation:
               
               
                  310 nm
               
            
                  Emission:
               
               
                  419 nm
               
            
                  Injektionsvolumen:
               
               
                  20 μl.
               
            Kromatografisystemets stabilitet kontrolleres, ved at der flere gange indsprøjtes kalibreringsopløsning (3.10.3) med 4,0 μg/ml, indtil der opnås konstante tophøjder (/-arealer) og retentionstider.
      5.3.2.   Kalibreringskurve
      
      Hver kalibreringsopløsning (3.10.3) indsprøjtes flere gange, og middeltophøjderne (-arealerne) bestemmes for hver koncentration. Der tegnes en kalibreringskurve med middeltophøjderne (-arealerne) som ordinat og de tilsvarende koncentrationer i μg/ml som abscisse.
      5.3.3.   Prøveopløsning
      
      Prøveekstrakterne fra 5.2.1 eller 5.2.2 indsprøjtes flere gange, idet der benyttes samme mængde som til kalibreringsopløsningerne, og middeltophøjderne (-arealerne) for lasalocidnatriumtoppene bestemmes.
      6.   Beregning af resultater
      Ud fra middeltophøjden (-arealet), der er frembragt ved indsprøjtning af prøveopløsningen (5.3.3), bestemmes koncentrationen af lasalocidnatrium (μg/ml) ved benyttelse af kalibreringskurven.
      6.1.   Foder
      Indholdet af lasalocidnatrium w (mg/kg) i prøven beregnes efter følgende formel:
      
          [mg/kg]
      hvor:
      
                  c
               
               
                  =
               
               
                  lasalocidnatriumkoncentrationen i prøveopløsningen (5.2.1) i μg/ml
               
            
                  V1
                  
               
               
                  =
               
               
                  prøveekstraktets volumen ifølge 5.2.1 i ml (dvs. 100)
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  testportionens vægt i gram.
               
            6.2.   Forblandinger
      Indholdet af lasalocidnatrium w (mg/kg) i prøven beregnes efter følgende formel:
      
          [mg/kg]
      hvor:
      
                  c
               
               
                  =
               
               
                  lasalocidnatriumkoncentrationen i prøveopløsningen (5.2.2) i μg/ml
               
            
                  V2
                  
               
               
                  =
               
               
                  prøveekstraktets volumen ifølge 5.2.2 i ml (dvs. 250)
               
            
                  f
               
               
                  =
               
               
                  fortyndingsfaktor ifølge 5.2.2
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  testportionens vægt i gram.
               
            7.   Validering af resultater
      7.1.   Identitet
      Metoder baseret på spektrofluorometri er mindre udsatte for interferens end metoder, hvor der anvendes UV-detektion. Analyttens identitet kan bekræftes ved ko-kromatografi.
      7.1.1.   Ko-kromatografi
      
      Et prøveekstrakt (5.2.1 eller 5.2.2) spikes ved tilsætning af en passende mængde kalibreringsopløsning (3.10.3). Den tilsatte mængde lasalocidnatrium skal svare til den mængde lasalocidnatrium, der er fundet i prøveekstraktet. Kun højden af lasalocidnatriumtoppen må være blevet øget, efter at der er taget hensyn til både den tilsatte mængde lasalocidnatrium og fortyndingen af ekstraktet. Toppens bredde skal i den halve højde ligge inden for ± 10 % af bredden af den oprindelige top for det ikke-spikede prøveekstrakt.
      7.2.   Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige:
      
                  —
               
               
                  15 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for lasalocidnatriumindhold på 30–100 mg/kg
               
            
                  —
               
               
                  15 mg/kg for lasalocidnatriumindhold på 100–200 mg/kg
               
            
                  —
               
               
                  7,5 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for lasalocidnatriumindhold på over 200 mg/kg.
               
            7.3.   Genfinding
      For den spikede foder(blind)prøve skal genfindingen være mindst 80 %. For de spikede forblandingprøver skal genfindingen være mindst 90 %.
      8.   Resultater af ringanalyse
      Der er gennemført en ringanalyse (6), hvor 2 forblandinger (prøve 1 og 2) og 5 foderstoffer (prøve 3–7) blev analyseret af 12 laboratorier. Der blev foretaget dobbeltanalyse af hver prøve. Resultaterne er vist i nedenstående tabel:
      
                   
               
               
                  Prøve 1
                  Forblanding (kyllinger)
               
               
                  Prøve 2
                  Forblanding (kalkuner)
               
               
                  Prøve 3
                  Kalkunpellets
               
               
                  Prøve 4
                  Kyllingegranulat
               
               
                  Prøve 5
                  Kalkunfoder
               
               
                  Prøve 6
                  Kyllingefoder A
               
               
                  Prøve 7
                  Kyllingefoder B
               
            
                  L
               
               
                  12
               
               
                  12
               
               
                  12
               
               
                  12
               
               
                  12
               
               
                  12
               
               
                  12
               
            
                  n
               
               
                  23
               
               
                  23
               
               
                  23
               
               
                  23
               
               
                  23
               
               
                  23
               
               
                  23
               
            
                  Middelværdi [mg/kg]
               
               
                  5 050
               
               
                  16 200
               
               
                  76,5
               
               
                  78,4
               
               
                  92,9
               
               
                  48,3
               
               
                  32,6
               
            
                  Sr [mg/kg]
               
               
                  107
               
               
                  408
               
               
                  1,71
               
               
                  2,23
               
               
                  2,27
               
               
                  1,93
               
               
                  1,75
               
            
                  CVr [ %]
               
               
                  2,12
               
               
                  2,52
               
               
                  2,24
               
               
                  2,84
               
               
                  2,44
               
               
                  4,00
               
               
                  5,37
               
            
                  SR [mg/kg]
               
               
                  286
               
               
                  883
               
               
                  3,85
               
               
                  7,32
               
               
                  5,29
               
               
                  3,47
               
               
                  3,49
               
            
                  CVR [ %]
               
               
                  5,66
               
               
                  5,45
               
               
                  5,03
               
               
                  9,34
               
               
                  5,69
               
               
                  7,18
               
               
                  10,70
               
            
                  Nominelt indhold [mg/kg]
               
               
                  5 000 (7)
                  
               
               
                  16 000 (7)
                  
               
               
                  80 (7)
                  
               
               
                  105 (7)
                  
               
               
                  120 (7)
                  
               
               
                  50 (8)
                  
               
               
                  35 (8)
                  
               
            
                  L
               
               
                  =
               
               
                  antal laboratorier
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  antal enkeltværdier
               
            
                  Sr
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for repeterbarhed
               
            
                  SR
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for reproducerbarhed
               
            
                  CVr
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for repeterbarhed, %
               
            
                  CVR
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for reproducerbarhed, %.
               
            
         (1)  Udført af arbejdsgruppen for foder under Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).
      
         (2)  Udført af arbejdsgruppen for foder under Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).
      
         (3)  Der kan også anvendes andre destruktionsmetoder, forudsat at de bevisligt giver tilsvarende resultater (som f.eks. mikrobølgedestruktion).
      
         (4)  Grøntfoder (frisk eller tørret) indeholder ofte store mængder vegetabilsk silicium, som kan binde mikromineraler og derfor må fjernes. Til prøver af denne type foder skal derfor følgende ændrede fremgangsmåde anvendes. Det under punkt 5.1.1.1 beskrevne udføres indtil filtreringen. Filtrerpapiret indeholdende den uopløselige remanens vaskes 2 gange med kogende vand og anbringes i en kvarts- eller platindigel. Der foraskes i muffelovn (4.1) ved en temperatur på under 550 °C, indtil alt kulstofholdigt materiale er forsvundet fuldstændig. Efter afkøling tilsættes nogle få dråber vand og derefter 10-15 ml flussyre (3.4), og der inddampes til tørhed ved ca. 150 °C. Hvis der stadig er silicium i inddampningsresten, genopløses denne i nogle få ml flussyre (3.4) og inddampes til tørhed. Der tilsættes 5 dråber svovlsyre (3.5) og opvarmes, indtil der ikke mere afgives hvide dampe. Efter tilsætning af 5 ml 6 mol/liter saltsyre (3.2) og ca. 30 ml vand opvarmes opløsningen; derefter filtreres denne ned i en 250 ml målekolbe, og der fyldes op med vand til mærket (HCl-koncentration ca. 0,5 mol/l). Bestemmelsen fortsættes derefter fra punkt 5.1.2.
      
         (5)  The Analyst 108, 1983, s. 1252-1256.
      
         (6)  Analyst, 1995, 120, s. 2175–2180.
      
         (7)  Indhold oplyst af fabrikanten.
      
         (8)  Foder tilberedt på laboratoriet.
   
   
      BILAG V
      ANALYSEMETODER TIL KONTROL FOR UØNSKEDE STOFFER I FODER
      A.   BESTEMMELSE AF FRI GOSSYPOL OG TOTALGOSSYPOL
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af fri gossypol, totalgossypol og kemisk nært beslægtede substanser i frø, mel og kager af bomuldsfrø samt i foderblandinger indeholdende disse fodermidler, hvis indholdet af fri gossypol, totalgossypol og kemisk nært beslægtede stoffer er på over 20 mg/kg.
      2.   Princip
      Gossypol ekstraheres under tilstedeværelse af 3-amino-1-propanol, enten med en blanding af propan-2-ol og hexan til bestemmelse af fri gossypol eller med dimethylformamid til bestemmelse af totalgossypol, og omsættes med anilin til gossypol-dianilin, hvis ekstinktion måles ved 440 nm.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  Propan-2-ol-hexan-blanding: 60 volumendele propan-2-ol blandes med 40 volumendele n-hexan.
               
            
                  3.2.
               
               
                  Opløsningsmiddel A: I en 1 liter målekolbe fyldes der ca. 500 ml propan-2-ol-hexan-blanding (3.1), 2 ml 3-amino-1-propanol, 8 ml iseddike og 50 ml vand, og der fyldes op med propan-2-ol-hexan-blanding (3.1) til mærket. Dette reagens er stabilt i 1 uge.
               
            
                  3.3.
               
               
                  Opløsningsmiddel B: I en 100 ml målekolbe afpipetteres 2 ml 3-amino-1-propanol og 10 ml iseddike, hvorefter der afkøles til rumtemperatur og fyldes op med N, N-dimethylformamid til mærket. Dette reagens er stabilt i 1 uge.
               
            
                  3.4.
               
               
                  Anilin: Såfremt ekstinktionen i blindprøven er større end 0,022, destilleres anilinen over zinkstøv, idet de første og sidste 10 % af destillatet kasseres. I køleskab er dette reagens ved opbevaring i vel tillukket, brunt glas holdbart i flere måneder.
               
            
                  3.5.
               
               
                  Standardgossypolopløsning A: I en 250 ml målekolbe opløses 27,9 mg gossypolacetat med opløsningsmiddel A (3.2), og der fyldes op til mærket med dette. 50 ml af denne opløsning afpipetteres i en 250 ml målekolbe og der fyldes op til mærket med opløsningsmiddel A. Gossypolkoncentrationen i denne opløsning er 0,02 mg/ml. Før brugen henstår denne opløsning i 1 time ved rumtemperatur.
               
            
                  3.6.
               
               
                  Standardgossypolopløsning B: I en 50 ml målekolbe opløses 27,9 mg gossypolacetat i opløsningsmiddel B (3.3), og der fyldes op til mærket med dette. Gossypolkoncentrationen i denne opløsning er 0,5 mg/ml.
                  Standardgossypolopløsning A og B er stabile i 24 timer, såfremt de beskyttes mod lys.
               
            4.   Apparatur
      
                  4.1.
               
               
                  Mekanisk rysteapparat: ca. 35 omdrejninger i minuttet
               
            
                  4.2.
               
               
                  Spektrofotometer.
               
            5.   Fremgangsmåde
      5.1.   Afvejning af prøven
      
      Størrelsen af den afvejede stofmængde afhænger af det formodede indhold af gossypol i prøven. Det er fordelagtigt at arbejde med en lille afvejning og med en relativt stor alikvot del af filtratet for at få en tilstrækkelig mængde gossypol til en nøjagtig fotometrisk måling. Til bestemmelse af fri gossypol i frø, mel og kager af bomuldsfrø må afvejningen ikke være på mere end 1 g, medens den for foderblandinger kan være på op til 5 g. En alikvot del af filtratet på 10 ml er i de fleste tilfælde passende; den skal indeholde 50–100 μg gossypol. Til bestemmelse af totalgossypol skal afvejningen ligge på 0,5–5 g, således at der i en alikvot del af filtratet på 2 ml vil være et indhold på 40–200 μg gossypol.
      
         Analyser udføres ved en rumtemperatur på ca. 20 oC.
      
      5.2.   Bestemmelse af fri gossypol
      
      Den afvejede stofmængde anbringes i en 250 ml kolbe med slibhals, hvis bund er dækket med knust glas. 50 ml af opløsningsmiddel A (3.2) tilsættes med pipette, kolben lukkes, og der blandes i 1 time i rysteapparat. Derpå filtreres gennem et tørt filter, og filtratet opsamles i en lille kolbe med slibhals. Under filtreringen tildækkes tragten med et urglas.
      Lige store alikvote dele af filtratet indeholdende 50–100 μg gossypol afpipetteres i to 25 ml målekolber (A og B). Eventuelt fyldes op med opløsningsmiddel A (3.2) til 10 ml. Derpå suppleres indholdet af kolben A med propan-2-ol-hexan-blandingen (3.1) til mærket. Denne opløsning anvendes som referenceopløsning ved målingen af prøveopløsningen.
      10 ml opløsningsmiddel A (3.2) afpipetteres i to andre 25 ml målekolber (C og D). Indholdet i kolben (C) suppleres med propan-2-ol-hexan-blandingen (3.1) til mærket. Denne opløsning anvendes som referenceopløsning ved målingen af blindprøveopløsningen.
      Hver af målekolberne (D) og (B) tilsættes 2 ml anilin (3.4). Der opvarmes i 30 minutter på kogende vandbad til udvikling af farvningen. Derefter afkøles til rumtemperatur, fortyndes med propan-2-ol-hexan-blandingen (3.1) til mærket og homogeniseres, hvorefter det hele henstår i 1 time.
      Derpå måles i spektrofotometret ved 440 nm i glaskuvetter på 1 cm tykkelse blindprøveopløsningens (D) ekstinktion i forhold til referenceopløsningen (C) og prøveopløsningens (B) ekstinktion i forhold til referenceopløsningen (A).
      Ekstinktionen af blindprøveopløsningen trækkes fra ekstinktionen af prøveopløsningen (= korrigeret ekstinktion). På basis af den fundne værdi beregnes indholdet af fri gossypol som beskrevet i punkt 6.
      5.3.   Bestemmelse af totalgossypol
      
      En afvejet stofmængde indeholdende 1–5 mg gossypol kommes i en 50 ml målekolbe; derpå tilsættes 10 ml af opløsningsmidlet B (3.3). Samtidig klargøres en blindprøve, idet 10 ml af opløsningsmidlet B (3.3) kommes i en anden 50 ml målekolbe. Begge målekolber opvarmes i 30 minutter på kogende vandbad, og der afkøles til rumtemperatur. Kolbernes indhold fortyndes med propan-2-ol-hexan-blandingen (3.1) til mærket, homogeniseres og henstår i 10–15 minutter. Derpå filtreres, og filtratet opsamles i kolber med slibhals.
      Der afpipetteres 2 ml af prøvefiltratet i hver af to 25 ml målekolber og 2 ml af filtratet fra blindprøven i hver af to andre 25 ml målekolber. En kolbe i hver række fyldes op med propan-2-ol-hexan-blandingen (3.1) til 25 ml. Disse opløsninger anvendes som referenceopløsninger.
      Hver af de to andre målekolber tilsættes 2 ml anilin (3.4). Der opvarmes i 30 minutter på kogende vandbad til udvikling af farvningen. Derefter afkøles til rumtemperatur, fortyndes med propan-2-ol-hexan-blandingen (3.1) til 25 ml og homogeniseres, hvorefter det hele henstår i 1 time.
      Ekstinktionen måles som beskrevet i punkt 5.2 for fri gossypol. På basis af den fundne værdi beregnes indholdet af totalgossypol som beskrevet i punkt 6.
      6.   Beregning af resultater
      Beregningen af resultaterne kan foretages på basis af den specifikke ekstinktion (6.1) eller ved benyttelse af en kalibreringskurve (6.2).
      6.1.   På basis af den specifikke ekstinktion
      
      Den specifikke ekstinktion er under de angivne betingelser som følger:
      
                  Fri gossypol:
               
               
                  
                     
               
            
                  Totalgossypol:
               
               
                  
                     
               
            Indholdet af fri gossypol eller totalgossypol i prøven beregnes efter følgende formel:
      
         
      hvor:
      
                  E
               
               
                  =
               
               
                  korrigeret ekstinktion, som bestemt under punkt 5.2
               
            
                  p
               
               
                  =
               
               
                  afvejet stofmængde i gram
               
            
                  a
               
               
                  =
               
               
                  alikvot del af filtratet i ml.
               
            6.2.   Ved hjælp af en kalibreringskurve
      
      6.2.1.   Fri gossypol
      
      Der klargøres 2 rækker med hver fem 25 ml målekolber. I begge rækker afpipetteres 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 og 10,0 ml af standardgossypolopløsningen A (3.5), og rumfanget suppleres til 10 ml med opløsningsmidlet A (3.2). I hver række stilles en 25 ml målekolbe, som kun indeholder 10 ml af opløsningsmidlet A (3.2) (blindprøve).
      Kolberne i den første række, inklusive blindprøven, fyldes op med propan-2-ol-hexan-blandingen (3.1) til 25 ml (referencerækken).
      Hver af kolberne i den anden række, inklusive blindprøven, tilsættes 2 ml anilin (3.4). Der opvarmes i 30 minutter på kogende vandbad til udvikling af farvningen. Derefter afkøles til rumtemperatur, fortyndes med propan-2-ol-hexan-blandingen (3.1) til mærket og homogeniseres, hvorefter det hele henstår i 1 time (standardrækken).
      Under de i 5.2 beskrevne betingelser måles ekstinktionen af standardrækkeopløsningerne ved sammenligning med de tilsvarende opløsninger i referencerækken. Kalibreringskurven tegnes, idet ekstinktionsværdierne og gossypolmængderne (i μg) indtegnes over for hinanden.
      6.2.2.   Totalgossypol
      
      Der klargøres seks 50 ml målekolber. I den første afpipetteres 10 ml af opløsningsmidlet B (3.3), og i de øvrige henholdsvis 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 og 10,0 ml af gossypolstandardopløsningen B (3.6). Indholdet i hver af kolberne suppleres med opløsningsmidlet B (3.3) til 10 ml, opvarmes i 30 minutter i kogende vandbad, afkøles til rumtemperatur, fortyndes med propan-2-ol-hexan-blandingen (3.1) til mærket og homogeniseres.
      I to rækker med seks 25 ml målekolber afpipetteres i hver 2,0 ml af denne opløsning. Kolberne i den første række fyldes op med propan-2-ol-hexan-blandingen (3.1) til 25 ml (referencerækken).
      I hver af kolberne i den anden række kommes 2 ml anilin (3.4). Der opvarmes i 30 minutter i kogende vandbad. Derefter afkøles til rumtemperatur, fortyndes med propan-2-ol-hexan-blandingen (3.1) til mærket og homogeniseres, hvorefter det hele henstår i 1 time (standardrækken).
      Under de i 5.2 beskrevne betingelser måles ekstinktionen af standardrækkeopløsningerne ved sammenligning med de tilsvarende opløsninger i referencerækken. Kalibreringskurven tegnes, idet ekstinktionsværdierne og gossypolmængderne (i μg) indtegnes over for hinanden.
      6.3.   Repeterbarhed
      
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige:
      
                  —
               
               
                  15 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for gossypolindhold på mindre end 500 ppm
               
            
                  —
               
               
                  75 ppm i absolut værdi for gossypolindhold på 500–750 ppm
               
            
                  —
               
               
                  10 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for gossypolindhold på over 750 ppm.
               
            B.   BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF DIOXINER (PCDD/PCDF) OG DIOXINLIGNENDE PCB'er
      I.   PRØVEUDTAGNINGSMETODER OG FORTOLKNING AF ANALYSERESULTATER
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Prøver til offentlig kontrol af indholdet af dioxiner (polychlorerede dibenzo-p-dioxiner (PCDD) og polychlorerede dibenzofuraner (PCDF)) og dioxinlignende polychlorerede biphenyler (PCB'er) (1) i foder udtages som beskrevet i bilag I. De kvantitative krav i forbindelse med kontrol af stoffer og produkter, der er homogent fordelt i foderet, jf. punkt 5.A i bilag I, skal overholdes. De derved fremkomne samleprøver betragtes som repræsentative for de partier eller delpartier, de er udtaget fra. På grundlag af det indhold, der er konstateret i laboratorieprøverne, fastslås det, om de i Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2002/32/EF (2) 2) fastsatte maksimalgrænseværdier er overholdt.
      2.   Varepartiets eller varedelpartiets overensstemmelse med kravene
      Partiet godkendes, hvis resultatet af en enkelt analyse ikke overstiger den grænseværdi, der er fastsat i direktiv 2002/32/EF, idet der tages hensyn til måleusikkerheden.
      Partiet overholder ikke den grænseværdi, der er fastsat i direktiv 2002/32/EF, hvis den øvre koncentration (3), analyseresultatet viser, bekræftet ved endnu en analyse (4), uden tvivl overstiger grænseværdien, idet der tages hensyn til måleusikkerheden.
      Der kan tages hensyn til måleusikkerheden på en af følgende måder:
      
                  —
               
               
                  ved at beregne den ekspanderede usikkerhed, idet der anvendes en dækningsfaktor på 2, hvilket giver et konfidensniveau på ca. 95 %. Et parti opfylder ikke kravene, hvis den målte værdi minus U ligger over grænseværdien. Hvis dioxiner og dioxinlignende PCB'er bestemmes separat, anvendes summen af den anslåede ekspanderede usikkerhed for de separate analyseresultater vedrørende dioxiner og dioxinlignende PCB'er som summen af dioxiner og dioxinlignende PCB'er
               
            
                  —
               
               
                  ved at fastlægge beslutningsgrænsen (CCα) i overensstemmelse med Kommissionens beslutning 2002/657/EF (5) (punkt 3.1.2.5 i bilaget — for stoffer, for hvilke der er fastsat et tilladt niveau). Et parti opfylder ikke kravene, hvis den målte værdi er mindre end eller lig med CCα.
               
            Disse fortolkningsregler gælder for analyseresultater af prøver udtaget ved offentlig kontrol. De berører ikke medlemsstaternes ret til at anvende nationale regler i forbindelse med analyser til kontraprøver eller referenceformål.
      II.   KLARGØRING AF PRØVER OG KRAV TIL ANALYSEMETODER, DER ANVENDES VED OFFENTLIG KONTROL AF INDHOLDET AF DIOXINER (PCDD/PCDF) OG DIOXINLIGNENDE PCB'er
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Nedenstående krav gælder, når fodermidler og foder analyseres med henblik på bestemmelse af indholdet af dioxiner (polychlorerede dibenzo-p-dioxiner (PCDD) og polychlorerede dibenzofuraner (PCDF)) og dioxinlignende PCB'er.
      Indholdet af dioxiner i foder kan overvåges på grundlag af en strategi, der omfatter en screeningsmetode med henblik på at udvælge stikprøver med indhold af dioxiner og dioxinlignende PCB'er, der ligger mindre end 25 % under eller ligger over det relevante niveau. Stikprøvernes dioxinindhold skal bestemmes/bekræftes efter en verifikationsmetode.
      Screeningsmetoder er metoder, der anvendes til at påvise tilstedeværelsen af dioxiner og dioxinlignende PCB'er på det relevante niveau. Disse metoder har en høj produktivitet og anvendes til at undersøge store mængder prøver for eventuelle positive resultater. De skal især forhindre falsk negative resultater.
      Verifikationsmetoder er metoder, der giver fuldstændig eller supplerende information, så dioxiner og dioxinlignende PCB'er kan identificeres og bestemmes entydigt på det relevante niveau.
      2.   Baggrund
      Fordi miljøprøver og biologiske prøver (inkl. prøver af fodermidler/foder) generelt indeholder komplekse blandinger af forskellige dioxinkongenere, er begrebet toksicitetsækvivalensfaktor (TEF) blevet udviklet for at lette risikovurderingen. Sådanne TEF'er er blevet fastsat for at udtrykke koncentrationer af blandinger af 2,3,7,8-substituerede PCDD'er og PCDF'er og nogle non-ortho- og mono-ortho-chlorsubstituerede PCB'er med dioxinlignende aktivitet i toksicitetsækvivalenter (TEQ) af 2,3,7,8-TCDD. Koncentrationerne af de enkelte stoffer i en given prøve ganges med deres respektive TEF, og summen heraf giver den samlede koncentration af dioxinlignende forbindelser udtrykt i TEQ.
      Den accepterede specifikke bestemmelsesgrænse for en enkelt kongener er i denne forordnings forstand koncentrationen af en analyt i det prøveekstrakt, som giver et instrumentrespons for de to forskellige ioner, der skal undersøges, med et signal-støj-forhold på 3:1 for det mindst følsomme signal, og som opfylder basiskravene, f.eks. retentionstid og isotopforhold ifølge bestemmelsesproceduren, der er beskrevet i EPA-metode 1613, revision B.
      3.   Krav til kvalitetssikring, som skal overholdes ved prøveklargøring
      De almindelige bestemmelser om klargøring af prøver til analyser i bilag II anvendes.
      Desuden skal følgende krav overholdes:
      
                  —
               
               
                  Prøverne skal opbevares og transporteres i beholdere af glas, aluminium, polypropylen eller polyethylen. Spor af papirstøv skal fjernes fra prøvebeholderen. Glasgenstande skylles med opløsningsmidler, der forinden er blevet kontrolleret for dioxinforekomst.
               
            
                  —
               
               
                  Der foretages en blindprøveanalyse ved at gennemføre hele analyseproceduren, blot med udeladelse af prøven.
               
            
                  —
               
               
                  Vægten af den prøve, der anvendes til ekstraktionen, skal være tilstrækkelig til at opfylde følsomhedskravene.
               
            4.   Laboratoriekrav
      
                  —
               
               
                  Laboratorierne skal dokumentere en metodes præstation inden for det relevante niveaus interval, f.eks. 0,5, 1 og 2 gange det relevante niveau med en acceptabel variationskoefficient for gentagne analyser. Se nærmere om godkendelseskriterierne i punkt 5.
               
            
                  —
               
               
                  Bestemmelsesgrænsen for en verifikationsmetode skal ligge inden for ca. en femtedel af det relevante niveau, så det sikres, at der tages højde for acceptable variationskoefficienter inden for det relevante niveaus interval.
               
            
                  —
               
               
                  Som interne kvalitetskontrolforanstaltninger gennemføres der regelmæssig blindprøvekontrol og standardtilsætningsforsøg eller analyse af kontrolstikprøver (om muligt med certificeret referencemateriale).
               
            
                  —
               
               
                  Vellykket deltagelse i sammenlignende laboratorieprøvninger, hvor laboratoriets præstationer vurderes, er den måde, som kompetence vedrørende specifikke analyser bedst kan godtgøres på. Vellykket deltagelse i sammenlignende laboratorieprøvninger vedrørende f.eks. jord- og spildevandsprøver er imidlertid ikke nødvendigvis noget bevis for, at laboratoriet også har kompetence vedrørende prøver af fødevarer eller foder, som har et lavere forureningsniveau. Løbende deltagelse i sammenlignende laboratorieprøvninger vedrørende bestemmelse af dioxiner og dioxinlignende PCB'er i de relevante foder/fødevarematrixer er derfor obligatorisk.
               
            
                  —
               
               
                  Laboratorier skal være godkendt af et anerkendt organ, der fungerer i overensstemmelse med ISO-vejledning 58, for at sikre, at de anvender analysekvalitetssikring. Laboratorier skal være godkendt ifølge ISO/IEC/17025-standarden.
               
            5.   Krav til procedurer for analyse af dioxiner og dioxinlignende PCB'er
      Grundlæggende krav med henblik på godkendelse af analyseprocedurer
      
                  —
               
               
                  
                     Høj følsomhed og lave detektionsgrænser. For PCDD'er og PCDF'er skal de påviselige mængder befinde sig i pikogram TEQ-intervallet (10 -12 g) på grund af visse af disse forbindelsers ekstremt høje toksicitet. Det er kendt, at PCB'er forekommer i højere niveauer end PCDD'er og PCDF'er. For de fleste PCB-kongenere er det tilstrækkeligt med en følsomhed i nanogram-intervallet (10 -9 g). Til måling af mere toksiske dioxinlignende PCB-kongenere (især non-ortho-substituerede kongenere) skal den samme følsomhed som for PCDD'er og PCDF'er dog opnås.
               
            
                  —
               
               
                  
                     Høj selektivitet (specificitet). PCDD'er, PCDF'er og dioxinlignende PCB'er skal kunne skelnes fra en lang række andre ledsagestoffer, der er fremkommet ved ekstraktionen, og som muligvis er interfererende forbindelser i koncentrationer, der er op til mange gange højere end analyttens. For gaskromatografi/massespektrometri-(GC/MS)-metoders vedkommende skal der kunne skelnes mellem forskellige kongenere, f.eks. mellem toksiske kongenere (f.eks. de 17 2,3,7,8-substituerede PCDD'er og PCDF'er og dioxinlignende PCB'er) og andre kongenere. Bioassays skal kunne bestemme TEQ-værdier selektivt som summen af PCDD'er, PCDF'er og dioxinlignende PCB'er.
               
            
                  —
               
               
                  
                     Høj nøjagtighed (korrekthed og præcision). Bestemmelsen skal give et gyldigt og pålideligt skøn over den korrekte koncentration i en prøve. Høj nøjagtighed (målingens nøjagtighed: graden af overensstemmelse mellem måleresultatet og den målte genstands korrekte eller tillagte værdi) er nødvendig for at undgå, at et resultat af en analyse afvises på grundlag af lav pålidelighed af TEQ-skønnet. Nøjagtighed udtrykkes som korrekthed (forskellen mellem den målte middelværdi for en analyt i et certificeret materiale og dens certificerede værdi, udtrykt i procent af den certificerede værdi) og præcision (RSDR, relativ standardafvigelse beregnet ud fra resultater, der er fremkommet under reproducerbarhedsforhold).
               
            Screeningsmetoder kan omfatte GC/MS-analysemetoder og bioassays, og verifikationsmetoder er gaskromatografi med høj opløsningsevne/massespektrometri med høj opløsningsevne (HRGC/HRMS).
      Følgende kriterier skal overholdes i forhold til den samlede TEQ-værdi:
      
                   
               
               
                  Screeningsmetoder
               
               
                  Verifikationsmetoder
               
            
                  Falsk negativ-andel
               
               
                  < 1 %
               
               
                   
               
            
                  Korrekthed
               
               
                   
               
               
                  - 20 % to + 20 %
               
            
                  Præcision — RSDR
                  
               
               
                  < 30 %
               
               
                  < 15 %
               
            6.   Specifikke krav, som GC/MS-metoder skal opfylde med henblik på screening eller verifikation
      
                  —
               
               
                  For at validere analyseproceduren tilsættes 13C-mærkede 2,3,7,8-chlorsubstituerede interne PCDD/F-standarder og 13C-mærkede interne dioxinlignende PCB-standarder helt i begyndelse af analysen, dvs. inden ekstraktion. Mindst én af disse kongenere for hver af de tetra- til octa-chlorerede homologe grupper af PCDD/F og mindst én kongener for hver af de homologe grupper af dioxinlignende PCB'er skal tilsættes. (Alternativt tilsættes mindst én kongener for hver massespektrometrisk udvalgt ionregistreringsfunktion, der anvendes til overvågning af PCDD/F og dioxinlignende PCB'er). Det bedste er dog — navnlig ved verifikationsmetoder — at anvende alle 17 13C-mærkede 2,3,7,8-substituerede interne PCDD/F-standarder og alle 12 13C-mærkede interne dioxinlignende PCB-standarder.
               
            
                  —
               
               
                  Ligeledes bestemmes der relative reaktionsfaktorer for de kongenere, som der ikke tilsættes en 13C-mærket analog for, ved hjælp af relevante kalibreringsopløsninger.
               
            
                  —
               
               
                  For vegetabilsk foder og animalsk foder, der indeholder under 10 % fedt, er det obligatorisk at tilsætte interne standarder inden ekstraktionen. For animalsk foder, der indeholder over 10 % fedt, kan de interne standarder tilsættes enten før ekstraktionen eller efter fedtekstraktionen. Der foretages en hensigtsmæssig validering af ekstraktionseffektiviteten, afhængigt af den fase, hvor de interne standarder indføres, og af, om resultaterne er produktbaserede eller fedtbaserede.
               
            
                  —
               
               
                  Inden GC/MS-analyse skal der tilsættes en eller to genfindingsstandarder (surrogat).
               
            
                  —
               
               
                  Det er nødvendigt med genfindingskontrol. Niveauet for genfinding for de enkelte interne standarder i verifikationsmetoder skal ligge mellem 60 og 120 %. Lavere eller højere genfinding for enkeltkongenere, navnlig for visse hepta- og octa-chlorerede dibenzodioxiner og dibenzofuraner, kan accepteres, på betingelse af at deres bidrag til TEQ-værdien ikke udgør mere end 10 % af den samlede TEQ-værdi (baseret på summen af PCDD/F og dioxinlignende PCB'er). Niveauet for genfinding ved screeningsmetoder skal ligge mellem 30 og 140 %.
               
            
                  —
               
               
                  Der gennemføres separation af dioxiner fra interfererende chlorerede forbindelser som f.eks. ikke-dioxinlignende PCB'er og chlorerede diphenylethere ved hjælp af egnede kromatografiske metoder (helst med florisil-, alumina- og/eller carbonkolonne).
               
            
                  —
               
               
                  Det er tilstrækkeligt med gaskromatografisk separation af isomerer (< 25 % topafstand mellem 1,2,3,4,7,8-HxCDF og 1,2,3,6,7,8-HxCDF).
               
            
                  —
               
               
                  Bestemmelse foretages ved hjælp af EPA-metode 1613, revision B: »Tetra-through octa-chlorinated dioxins and furans by isotope dilution HRGC/HRMS«, eller en anden metode, der opfylder tilsvarende krav.
               
            
                  —
               
               
                  Forskellen mellem øvre og nedre niveau må ikke overstige 20 % for foder med en dioxinforurening, der ligger på eller over grænseværdien. For foder med en forurening, der ligger et godt stykke under grænseværdien, kan der være en difference på 25–40 %.
               
            7.   Screeningsanalysemetoder
      7.1.   Indledning
      I forbindelse med screeningsmetoden kan der anvendes forskellige analysefremgangsmåder: ren screening eller en kvantitativ indfaldsvinkel.
      
         Screening alene
      
      Prøvernes reaktion sammenlignes med reaktionen for en referenceprøve, som ligger på det relevante niveau. Prøver med en reaktion, der ligger under referenceprøvens, erklæres negative, mens dem med en højere reaktion formodes at være positive. Krav:
      
                  —
               
               
                  Hver analyserække skal omfatte en blindprøve og referenceprøve(r), som ekstraheres og analyseres samtidig under identiske betingelser. Referenceprøven skal udvise en klart kraftigere reaktion end en blindprøve.
               
            
                  —
               
               
                  Der anvendes ekstra referenceprøver på 0,5 og 2 gange det relevante niveau for at vise analysens præstation inden for det interval, der er relevant for kontrollen af det relevante niveau.
               
            
                  —
               
               
                  Når andre matrixer analyseres, skal referenceprøvens/-prøvernes egnethed godtgøres, helst ved at inddrage prøver, som HRGC/HRMS har vist har et TEQ-niveau, der nogenlunde svarer til referenceprøvens, eller i en blindprøve tilsat standard op til det pågældende niveau.
               
            
                  —
               
               
                  Da interne standarder ikke kan anvendes i bioassays, er repeterbarhedsanalyser meget vigtige for at tilvejebringe oplysninger om standardafvigelsen inden for en og samme analyserække. Variationskoefficienterne skal ligge under 30 %.
               
            
                  —
               
               
                  For bioassays vedkommende fastlægges målforbindelser, mulige interferenser og højeste tolererede værdier for blindprøver.
               
            
         Kvantitativ indfaldsvinkel
      
      Den kvantitative metode forudsætter standardfortyndingsrækker, dobbelt eller tredobbelt oprensning og måling samt blindprøve- og genfindingskontrol. Resultatet kan udtrykkes som TEQ, idet det antages, at de forbindelser, der afføder signalet, er i overensstemmelse med TEQ-princippet. Det kan ske ved at anvende TCDD (eller en dioxin- eller furan- eller dioxinlignende PCB-standardblanding) til at frembringe en kalibreringskurve til beregning af TEQ-niveauet i ekstraktet og dermed i prøven. Derefter foretages korrektion for det TEQ-niveau, der er beregnet for en blindprøve (for at tage urenheder fra de anvendte opløsningsmidler og kemikalier i betragtning), og genfinding (som beregnes ud fra TEQ-niveauet i en kvalitetskontrolprøve, der ca. ligger på det relevante niveau). Det er vigtigt at bemærke, at en del af det genfindingstab, der tilsyneladende viser sig, kan skyldes matrixvirkninger og/eller forskelle mellem TEF-værdierne i de pågældende bioassays og de officielle TEF-værdier, som WHO har fastsat.
      7.2.   Krav til screeningsanalysemetoder
      
                  —
               
               
                  GC/MS-analysemetoder og bioassays kan anvendes til screening. For GC/MS-metoder anvendes kravene i punkt 6. Der er fastsat specifikke krav til cellebaserede bioassays i punkt 7.3 og til analysekitbaserede bioassays i punkt 7.4.
               
            
                  —
               
               
                  Det er nødvendigt med oplysninger om antallet af falsk positive og falsk negative resultater fra en stor mængde stikprøver, der ligger under og over grænseværdierne eller indsatsgrænserne, i sammenligning med TEQ-indholdet som bestemt ved en verifikationsmetode. Den faktiske andel af falsk negative prøver skal ligge under 1 %. Andelen af falsk positive prøver skal være tilstrækkeligt lav til, at screening med fordel kan anvendes.
               
            
                  —
               
               
                  Positive resultater skal altid bekræftes ved hjælp af en verifikationsmetode (HRGC/HRMS). Prøver inden for et stort TEQ-interval bekræftes endvidere ved HRGC/HRMS (ca. 2-10 % af de negative prøver). Der forelægges oplysninger om overensstemmelsesgraden mellem bioassay- og HRGC/HRMS-resultater.
               
            7.3.   Specifikke krav til cellebaserede bioassays
      
                  —
               
               
                  Når der gennemføres et bioassay, kræves der ved hver analyse en referencekoncentrationsrække af TCDD eller en dioxin/furan-blanding (fuld dosis-respons-kurve med R2 > 0,95). Til screeningsformål kan der dog anvendes en udvidet lavniveaukurve til analyse af prøver med lavt indhold.
               
            
                  —
               
               
                  Der anvendes en TCDD-referencekoncentration (på ca. 3 gange bestemmelsesgrænsen) på et kvalitetskontrolskema til resultatet af bioassayet over et konstant tidsrum. Et alternativ kunne være en referenceprøves relative reaktion i sammenligning med TCDD-kalibreringslinjen, da cellernes reaktion kan påvirkes af mange faktorer.
               
            
                  —
               
               
                  Kvalitetskontrolkort (QC) for hver type referencemateriale registreres og kontrolleres for at sikre, at resultatet er i overensstemmelse med de fastsatte retningslinjer.
               
            
                  —
               
               
                  Navnlig med henblik på kvantitative beregninger skal induktionen af den anvendte prøveopløsning ligge inden for den lineære del af reaktionskurven. Prøver, der ligger over reaktionskurvens lineære del, skal fortyndes og analyseres igen. Derfor anbefales det at analysere mindst 3 eller flere opløsninger på én gang.
               
            
                  —
               
               
                  Standardafvigelsen må ikke udgøre over 15 % i tredobbelt bestemmelse for hver prøveopløsning og ikke over 30 % mellem tre indbyrdes uafhængige forsøg.
               
            
                  —
               
               
                  Detektionsgrænsen kan sættes til tre gange standardafvigelsen i forhold til blindprøven af opløsningsmiddel eller til baggrundsreaktionen. Man kan også anvende en reaktion, der ligger over baggrunden (induktionsfaktor fem gange blindprøven af opløsningsmiddel), beregnet ud fra dagens kalibreringskurve. Bestemmelsesgrænsen kan sættes til fem til seks gange standardafvigelsen i forhold til blindprøven af opløsningsmiddel eller til baggrundsreaktionen, eller man kan anvende en reaktion, der ligger klart over baggrunden (induktionsfaktor ti gange blindprøven af opløsningsmiddel), beregnet ud fra dagens kalibreringskurve.
               
            7.4.   Specifikke krav til analysekitbaserede bioassays
      
                  —
               
               
                  Det skal sikres, at de analysekitbaserede bioassays er tilstrækkeligt følsomme og pålidelige til, at de kan anvendes til foder.
               
            
                  —
               
               
                  Producentens vejledning om prøveklargøring og analyser skal følges.
               
            
                  —
               
               
                  Der anvendes ikke analysekit, hvis udløbsdato er overskredet.
               
            
                  —
               
               
                  Der anvendes ikke materialer eller bestanddele, der er beregnet til at blive anvendt sammen med andre kit.
               
            
                  —
               
               
                  Analysekit opbevares inden for det interval, der er angivet for opbevaringstemperatur, og anvendes ved den angivne anvendelsestemperatur.
               
            
                  —
               
               
                  Detektionsgrænsen for immunassays bestemmes som tre gange standardafvigelsen baseret på tidobbelt analyse af blindprøven divideret med hældningsværdien af den lineære regressionsligning.
               
            
                  —
               
               
                  Der anvendes referencestandarder til analyser i laboratoriet for at sikre, at reaktionen på standarden ligger inden for et acceptabelt interval.
               
            8.   Indberetning af resultater
      Så vidt den anvendte analyseprocedure tillader det, skal analyseresultaterne omfatte værdierne for de enkelte PCDD/F- og PCB-kongenere og indberettes som nedre koncentrationer, øvre koncentrationer og middelkoncentrationer, med henblik på at registreringen af resultater omfatter så mange oplysninger som muligt, så resultaterne kan fortolkes i overensstemmelse med specifikke krav.
      Rapporten skal også oplyse om prøvens fedtindhold og om, hvilken metode der er anvendt til fedtekstraktion.
      Tallene for genfinding af de enkelte interne standarder skal stilles til rådighed, hvis genfindingen ligger uden for det interval, der er angivet i punkt 6, hvis grænseværdierne er overskredet, og i øvrige tilfælde efter anmodning.
      Da der skal tages hensyn til måleusikkerheden, når det afgøres, om en prøve opfylder kravene, skal denne parameter ligeledes være tilgængelig. Analyseresultaterne indberettes som x +/- U, hvor x er analyseresultatet og U er den ekspanderede måleusikkerhed, idet der anvendes en dækningsfaktor på 2, hvilket giver et konfidensniveau på ca. 95 %. Hvis dioxiner og dioxinlignende PCB'er bestemmes separat, anvendes summen af den anslåede ekspanderede usikkerhed for de separate analyseresultater vedrørende dioxiner og dioxinlignende PCB'er som summen af dioxiner og dioxinlignende PCB'er
      Hvis der ville tages hensyn til måleusikkerheden ved at anvende en CCα (se beskrivelsen i afsnit I, punkt 2, i nærværende del B), indberettes denne parameter.
      
         (1)  Skema over TEF (= toksicitetsækvivalensfaktorer) for dioxiner, furaner og dioxinlignende PCB'er
      
                  Kongener
               
               
                  TEF-værdi
               
               
                  Kongener
               
               
                  TEF-værdi
               
            
                  
                     
                        Dibenzo-p-dioxiner (»PCDD«)
                     
                  
               
               
                   
               
               
                  »Dioxin-lignende« PCB'er:
                  
               
               
                   
               
            
                  2,3,7,8-TCDD
               
               
                  1
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  1,2,3,7,8-PeCDD
               
               
                  1
               
               
                  
                     
                        Non-ortho-PCB'er
                     
                  
               
               
                   
               
            
                  1,2,3,4,7,8-HxCDD
               
               
                  0,1
               
               
                  PCB 77
               
               
                  0,0001
               
            
                  1,2,3,6,7,8-HxCDD
               
               
                  0,1
               
               
                  PCB 81
               
               
                  0,0001
               
            
                  1,2,3,7,8,9-HxCDD
               
               
                  0,1
               
               
                  PCB 126
               
               
                  0,1
               
            
                  1,2,3,4,6,7,8-HpCDD
               
               
                  0,01
               
               
                  PCB 169
               
               
                  0,01
               
            
                  OCDD
               
               
                  0,0001
               
               
                  
                     
                        Mono-ortho-PCB'er
                     
                  
               
               
                   
               
            
                   
               
               
                   
               
               
                  PCB 105
               
               
                  0,0001
               
            
                  
                     
                        Dibenzofuraner (»PCDF«)
                     
                  
               
               
                   
               
               
                  PCB 114
               
               
                  0,0005
               
            
                  2,3,7,8-TCDF
               
               
                  0,1
               
               
                  PCB 118
               
               
                  0,0001
               
            
                  1,2,3,7,8-PeCDF
               
               
                  0,05
               
               
                  PCB 123
               
               
                  0,0001
               
            
                  2,3,4,7,8-PeCDF
               
               
                  0,5
               
               
                  PCB 156
               
               
                  0,0005
               
            
                  1,2,3,4,7,8-HxCDF
               
               
                  0,1
               
               
                  PCB 157
               
               
                  0,0005
               
            
                  1,2,3,6,7,8-HxCDF
               
               
                  0,1
               
               
                  PCB 167
               
               
                  0,00001
               
            
                  1,2,3,7,8,9-HxCDF
               
               
                  0,1
               
               
                  PCB 189
               
               
                  0,0001
               
            
                  2,3,4,6,7,8-HxCDF
               
               
                  0,1
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  1,2,3,4,6,7,8-HpCDF
               
               
                  0,01
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  1,2,3,4,7,8,9-HpCDF
               
               
                  0,01
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  OCDF
               
               
                  0,0001
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Anvendte forkortelser: »T« = tetra; »Pe« = penta; »Hx« = hexa; »Hp« = hepta; »O« = octa; »CDD« = chlordibenzo-p-dioxin; »CDF« = chlordibenzofuran; »CB« = chlorbiphenyl.
               
            
         (2)  EFT L 140 af 30.5.2002, s. 10.
      
         (3)  »Øvre koncentration« betyder, at hver ikke-bestemt kongeners bidrag til toksicitetsækvivalenten (TEQ) anses for værende lig med bestemmelsesgrænsen.
      »Nedre koncentration« betyder, at hver ikke-bestemt kongeners bidrag til TEQ anses for værende nul.
      »Middelkoncentration« betyder, at hver ikke-bestemt kongeners bidrag til TEQ anses for værende lig med halvdelen af bestemmelsesgrænsen.
      
         (4)  En sådan ekstra analyse er nødvendig for at udelukke muligheden for intern krydskontaminering eller utilsigtet sammenblanding af prøver. Den første analyse, hvor der tages hensyn til måleusikkerheden, anvendes til at verificere, om kravene er opfyldt.
      Hvis analysen gennemføres i forbindelse med en hændelse med dioxinforurening, kan bekræftelse ved en ekstra analyse undlades, såfremt de prøver, der er udtaget til analyse, ved hjælp af sporbarhed kan relateres til dioxinforureningshændelsen.
      
         (5)  EFT L 221 af 17.8.2002, s. 8.
   
   
      BILAG VI
      ANALYSEMETODER TIL BESTEMMELSE AF ANIMALSKE BESTANDDELE SOM LED I DEN OFFENTLIGE KONTROL AF FODER
      Betingelser for påvisning af, identificering af eller skøn over indhold af animalske bestanddele i foder ved mikroskopi
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Disse betingelser anvendes ved påvisning af indhold af animalske bestanddele (defineret som produkter fra forarbejdning af kroppe og kropsdele af pattedyr, fjerkræ og fisk) i foder ved hjælp af mikroskopi inden for rammerne af det samordnede kontrolprogram på foderstofområdet i henhold til Europa-Paræamentets og Rådets forordning (EF) nr. 882/2004 (1). Forudsat at metoderne i dette bilag bruges i forbindelse med alle officielle prøver, kan der foretages endnu en prøve ved at anvende varierende eller alternative metoder for at forbedre påvisningen af visse typer animalske bestanddele eller yderligere specificere de animalske bestanddeles oprindelse. Endvidere kan der anvendes en varierende protokol ved undersøgelse af visse særlige animalske bestanddele, som f.eks. plasma eller knogler i talg (se også punkt 9), hvis disse analyser foretages som supplement til analyserne i det samordnede kontrolprogram.
      2.   Følsomhed
      Afhængigt af arten af de animalske bestanddele kan der påvises meget små mængder (< 0,1 %) i foder.
      3.   Princip
      En repræsentativ prøve, der er udtaget i overensstemmelse med bilag I, og som har gennemgået en passende klargøring, anvendes til identificeringen. Følgende protokol egner sig til håndtering af foder med lavt vandindhold. Foder med et vandindhold på over 14 % skal tørres (kondenseres) inden håndteringen. Særligt foder eller særlige fodermidler (f.eks. fedtstoffer og olier) skal behandles på en speciel måde (se punkt 9). Animalske bestanddele identificeres ud fra typiske kendetegn, der kan identificeres ved mikroskopi (bl.a. muskelfibre og andre kødpartikler, brusk, knogler, horn, hår, børster, fjer, æggeskaller, fiskeben og skæl). Identificeringen skal foretages både på sigtefraktionen (6.1) og det koncentrerede sediment (6.2) af prøven.
      4.   Reagenser
      4.1.   Immersionsvæsker
      
                  4.1.1.
               
               
                  Chloralhydrat (vandigt, 60 % w/v)
               
            
                  4.1.2.
               
               
                  Lud (NaOH 2,5 % w/v eller KOH 2,5 % w/v) for sigtefraktioner
               
            
                  4.1.3.
               
               
                  Paraffinolie eller glycerol (viskositet: 68-81) for mikroskopiobservationer i sedimentet.
               
            4.2.   Skyllevæsker
      
                  4.2.1.
               
               
                  Alkohol, 96 %
               
            
                  4.2.2.
               
               
                  Acetone.
               
            4.3.   Koncentreringsmiddel
      
                  4.3.1.
               
               
                  Tetrachlorethylen (massefylde: 1,62).
               
            4.4.   Farvningsreagenser
      
                  4.4.1.
               
               
                  Iod/kaliumiodidopløsning (2 g kaliumiodid opløses i 100 ml vand, og der tilsættes 1 g iod under hyppig omrystning)
               
            
                  4.4.2.
               
               
                  Alizarinrødtopløsning (2,5 ml 1M saltsyre fortyndes i 100 ml vand, og der tilsættes 200 mg alizarinrødt til opløsningen)
               
            
                  4.4.3.
               
               
                  Cystinreagens (2 g blyacetat og 10 g NaOH i 100 ml H2O)
               
            
                  4.4.4.
               
               
                  Iod/kaliumiodidopløsning (opløst i 70 % ethanol).
               
            4.5.   Blegemiddel
      
                  4.5.1.
               
               
                  Natriumhypochloritopløsning, som fås i handelen (9,6 % aktivt chlor).
               
            5.   Udstyr og hjælpemidler
      
                  5.1.
               
               
                  Analysevægt (nøjagtighed 0,01 g, undtagen for koncentreret sediment: 0,001 g)
               
            
                  5.2.
               
               
                  Formalingsudstyr (mølle eller morter, specielt til foder indeholdende > 15 % fedt i analyse)
               
            
                  5.3.
               
               
                  Sigte med kvadratiske masker med en kvadratisk maskevidde på højst 0,50 mm
               
            
                  5.4.
               
               
                  Skilletragt eller glasbæger med konisk bund
               
            
                  5.5.
               
               
                  Stereomikroskop (mindst 40' forstørrelse)
               
            
                  5.6.
               
               
                  Sammensat mikroskop (mindst 400' forstørrelse) med lystransmission eller polariseret lys
               
            
                  5.7.
               
               
                  Standardlaboratorieglasudstyr
                  Alt udstyr rengøres omhyggeligt. Skilletragte og glasudstyr rengøres i en vaskemaskine. Sigter rengøres ved brug af en børste med stive børster.
               
            6.   Fremgangsmåde
      Foder i pilleform kan sigtes på forhånd, hvis begge fraktioner analyseres som separate prøver.
      En prøve på mindst 50 g skal behandles (om nødvendigt formales forsigtigt ved hjælp af passende formalingsudstyr (5.2) for at opnå en passende struktur). Fra det formalede materiale udtages to repræsentative portioner, én på mindst 5 g til sigtefraktionering (6.1) og én på mindst 5 g til sedimentkoncentrering (6.2). Det anbefales at benytte farvning med farvningsreagenser (6.3) til identifikation.
      Til angivelse af det animalske proteins art eller partiklernes oprindelse kan anvendes et beslutningsstøttesystem, som f.eks. ARIES, og referenceprøver kan dokumenteres.
      6.1.   Identifikation af animalske bestanddele i sigtefraktionerne
      Mindst 5 g prøve deles i to fraktioner ved sigtning (5.3).
      Fraktionen (fraktionerne) med store partikler (eller en repræsentativ del deraf) spredes ud i et tyndt lag på et passende underlag og screenes systematisk for animalske bestanddele under stereomikroskop ved forskellige forstørrelser (5.5).
      Objektglas med fraktionen (fraktionerne) med fine partikler screenes systematisk for animalske bestanddele under sammensat mikroskop ved forskellige forstørrelser (5.6).
      6.2.   Identifikation af animalske bestanddele i koncentreret sediment
      En prøve på mindst 5 g afvejes med en nøjagtighed på 0,01 g i en skilletragt eller et bægerglas med konisk bund og behandles med mindst 50 ml tetrachlorethylen (4.3.1). Blandingen rystes/omrøres flere gange.
      
                  —
               
               
                  Hvis der anvendes en lukket skilletragt, skal sedimentet henstå tilstrækkelig længe (mindst 3 minutter), før sedimentet skilles fra. Der omrystes på ny, og sedimentet henstår igen i mindst 3 minutter. Sedimentet skilles igen fra.
               
            
                  —
               
               
                  Anvendes der et åbent glasbæger, skal sedimentet henstå i mindst 5 minutter, før sedimentet skilles fra.
               
            Hele sedimentet tørres og vejes med en nøjagtighed på 0,001 g. Vejning er kun påkrævet, hvis der skal foretages et skøn over indholdet. Hvis sedimentet består af mange store partikler, kan det deles i to fraktioner ved sigtning (5.3). Det tørrede sediment undersøges for knoglebestanddele under stereomikroskop (5.5) og sammensat mikroskop (5.6).
      6.3.   Brug af immersionsvæsker og farvningsreagenser
      Identifikation af animalske bestanddele ved mikroskopi kan lettes ved brug af specielle immersionsvæsker og farvningsreagenser.
      
         Chloralhydrat (4.1.1): Ved forsigtig opvarmning ses cellestrukturerne tydeligere, da stivelseskorn gelatinerer, og uønsket celleindhold fjernes.
      
         Lud (4.1.2): Enten natriumhydroxid eller kaliumhydroxid renser fodermaterialet og gør det nemmere at påvise muskelfibre, hår og andre keratinholdige strukturer.
      
         Paraffinolie og glycerol (4.1.3): Knoglebestanddele kan tydeligt identificeres i denne immersionsvæske, da de fleste benhuler forbliver luftfyldte og fremtræder som sorte huller med en størrelse på ca. 5–15 μm.
      
         Iod/kaliumiodidopløsning (4.4.1): Benyttes til påvisning af stivelse (blåviolet farve) og protein (orangegul farve). Kan eventuelt fortyndes.
      
         Alizarinrødtopløsning (4.4.2): Rød/pink-farvning af knogler, fiskeben og skæl. Inden sedimentet tørres (se afsnit 6.2), hældes det samlede sediment i et reagensglas og skylles to gange med ca. 5 ml alkohol (4.2.1) (der anvendes vortex-apparat, opløsningsmidlet skal henstå i ca. et minut, så det bundfælder sig, før det hældes fra). Inden anvendelsen af dette farvningsreagens skal sedimentet bleges ved tilsætning af mindst 1 ml natriumhypochloritopløsning (4.5.1). Lad reaktionen fortsætte i 10 minutter. Røret fyldes med vand, sedimentet henstår i 2-3 minutter, og vandet og de opslæmmede partikler hældes fra. Sedimentet renses yderligere to gange med ca. 10 ml vand (der anvendes vortex-apparat, lad henstå, og hæld hver gang vandet fra). Der tilsættes 2-10 eller flere dråber (afhængigt af restmængden) alizarinrødtopløsning. Blandingen rystes, og reaktionen skal have lov at finde sted nogle få sekunder. Det farvede sediment renses to gange med ca. 5 ml alkohol (4.2.1) efterfulgt af én skylning med acetone (4.2.2) (der anvendes vortex, opløsningsmidlet skal henstå ca. 1 minut, så det bundfælder sig, før det hældes fra). Sedimentet er nu klar til tørring.
      
         Cystinreagens (4.4.3): Cystinholdige bestanddele (hår, fjer mv.) farves brunsorte ved forsigtig opvarmning.
      6.4.   Undersøgelse af foder, der kan indeholde fiskemel
      Mindst ét objektglas fra den fine sigtefraktion og fra sedimentets fine fraktion undersøges i sammensat mikroskop (se afsnit 6.1 og 6.2).
      Hvis det af mærkningen fremgår, at ingredienserne omfatter fiskemel, eller hvis der er mistanke om tilstedeværelse af fiskemel, eller hvis der påvises fiskemel i den første undersøgelse, undersøges mindst to yderligere objektglas med den fine sigtefraktion fra den oprindelige prøve og den samlede sedimentfraktion.
      7.   Beregning og bedømmelse
      Medlemsstaterne sørger for, at de procedurer, der er beskrevet i dette punkt, anvendes, når der foretages en officiel analyse med henblik på at foretage skøn over mængden (og ikke kun tilstedeværelsen) af animalske bestanddele.
      Der kan kun foretages beregning, hvis de animalske bestanddele indeholder knoglefragmenter.
      Knoglefragmenter af varmblodede landdyr (pattedyr og fugle) kan i mikroskoppræparatet skelnes fra forskellige typer fiskeben ved hjælp af de typiske benhuler. Skønnet over andelen af animalske bestanddele i prøvematerialet foretages på grundlag af:
      
                  —
               
               
                  den skønnede andel (vægtprocent) af knoglefragmenter i det koncentrerede sediment, og
               
            
                  —
               
               
                  knogleandelen (vægtprocent) af de animalske bestanddele.
               
            Skønnet skal baseres på mindst 3 (om muligt) præparater og mindst 5 felter pr. præparat. I foderblandinger indeholder det koncentrerede sediment som hovedregel ikke blot knogle- og fiskebensfragmenter fra landdyr, men også andre partikler med høj massefylde, f.eks. mineraler, sand og forveddede plantedele.
      7.1.   Skønnet tal for procentdelen af knoglefragmenter
      % knoglefragmenter fra landdyr = (S × c)/W
      % fiskebens- og skælfragmenter = (S × d)/W
      
                  (S =
               
               
                  vægten af sediment (mg), c = korrektionsfaktor ( %) for den skønnede andel af landdyrknogler i sedimentet, d = korrektionsfaktor ( %) for den skønnede andel af fiskebens- og skælfragmenter i sedimentet, W = vægten af prøvemateriale til sedimenteringen (mg)).
               
            7.2.   Skønnet værdi for animalske bestanddele
      Andelen af knogler i animalske produkter kan variere betragteligt. (I benmel er knogle/benandelen ca. 50–60 %, og i kødmel ca. 20–30 %; i fiskemel varierer indholdet af ben og skæl med melets kategori og oprindelse, men er normalt ca. 10–20 %).
      Hvis det vides, hvilken type dyremel der er til stede i prøven, kan en skønsmæssig beregning af indholdet foretages således:
      Skønnet indhold af bestanddele af landdyrprodukter ( %) = (S × c)/(W × f) × 100
      Skønnet indhold af bestanddele af fiskeprodukter ( %) = (S × c)/(W × f) × 100
      
                  (S =
               
               
                  vægten af sediment (mg), c = korrektionsfaktor ( %) for den skønnede andel af knoglebestanddele fra landdyr i sedimentet, d = korrektionsfaktor ( %) for den skønnede andel af fiskebens- og skælfragmenter i sedimentet, f = korrektionsfaktor for knogle/benandelen af de animalske bestanddele i den undersøgte prøve, W = vægten af prøvemateriale til sedimenteringen (mg)).
               
            8.   Angivelse af undersøgelsens resultat
      Rapporten skal mindst indeholde oplysninger om tilstedeværelsen af bestanddele fra landdyr og fra fiskemel. De forskellige tilfælde afrapporteres på følgende måde:
      
                  8.1.
               
               
                  For så vidt angår tilstedeværelse af bestanddele fra landdyr:
                  
                              —
                           
                           
                              Der har ved mikroskopi ikke kunnet iagttages bestanddele fra landdyr i den forelagte prøve
                              eller
                           
                        
                              —
                           
                           
                              Der har ved mikroskopi kunnet iagttages bestanddele fra landdyr i den forelagte prøve.
                           
                        
            
                  8.2.
               
               
                  For så vidt angår tilstedeværelse af fiskemel:
                  
                              —
                           
                           
                              Der har ved mikroskopi ikke kunnet iagttages bestanddele fra fisk i den forelagte prøve
                              eller
                           
                        
                              —
                           
                           
                              Der har ved mikroskopi kunnet iagttages bestanddele fra fisk i den forelagte prøve.
                           
                        Hvis der findes bestanddele fra fisk eller landdyr, kan rapporten med undersøgelsens resultater desuden eventuelt indeholde et skøn over indholdet af påviste bestanddele (x %, < 0,1 %, 0,1–0,5 %, 0,5–5 % eller > 5 %) samt eventuelt en yderligere specificering af typen af landdyr, hvis det er muligt, og af de identificerede animalske bestanddele (muskelfibre, brusk, knogler, horn, hår, børster, fjer, blod, æggeskaller, fiskeben og skæl).
                  Hvis der foretages et skøn over indholdet af animalske ingredienser, anføres den anvendte korrektionsfaktor f.
                  Hvis der er påvist knoglebestanddele fra landdyr, skal der i rapporten anføres følgende:
                  »Det kan ikke udelukkes, at ovennævnte bestanddele hidrører fra pattedyr.«
                  Dette er ikke nødvendigt, hvis knoglefragmenterne fra landdyr er blevet specificeret som fragmenter fra fjerkræ eller pattedyr.
               
            9.   Fakultativ protokol for analyse af fedt eller olie
      Følgende protokol kan anvendes ved analyse af fedt eller olie:
      
                  —
               
               
                  Fedt i fast form opvarmes, f.eks. i mikrobølgeovn, indtil det er blevet flydende.
               
            
                  —
               
               
                  Med pipette overføres 40 ml fedt fra bunden af prøven til et centrifugerør.
               
            
                  —
               
               
                  Der centrifugeres i 10 minutter ved 4 000 omdrejninger i minuttet.
               
            
                  —
               
               
                  Hvis fedtet efter centrifugering er fast, opvarmes det på ny i tørreskab, indtil det er blevet flydende. Der centrifugeres endnu en gang ved 4 000 omdrejninger i 5 minutter.
               
            
                  —
               
               
                  Halvdelen af de dekanterede urenheder overføres med en lille ske eller spatel til en lille petriskål eller et objektglas med henblik på identificering af eventuelt indhold af animalske bestanddele ved mikroskopi (kødfibre, fjer, knoglefragmenter …). Det anbefales at bruge paraffinolie eller glycerol som immersionsvæske ved mikroskopien.
               
            
                  —
               
               
                  De resterende urenheder anvendes til sedimentering som beskrevet i punkt 6.2.
               
            
         (1)  EUT L 165 af 30.4.2004, s. 1. Berigtiget i EUT L 191 af 28.5.2004, s. 1.
   
   
      BILAG VII
      METODE TIL BEREGNING AF NÆRINGSVÆRDIEN AF FODER TIL FJERKRÆ
      1.   Beregningsmetode og angivelse af næringsværdi
      Næringsværdien i foderblandinger til fjerkræ beregnes efter nedenstående formel ud fra procentsatserne for visse bestanddele i foderet. Denne værdi udtrykkes i megajoule (MJ) omsættelig energi (ME), korrigeret for nitrogen, pr. kg foderblanding:
      MJ/kg ME = 0,1551 × % råprotein +0,3431 × % råfedt +0,1669 × % stivelse +0,1301 × % totalsukker (udtrykt som saccharose).
      2.   Tolerancer for de angivne værdier
      Hvis der i forbindelse med den offentlige kontrol konstateres en afvigelse (øget eller reduceret næringsværdi af foderet) mellem kontrollens resultat og den angivne næringsværdi, kan en mindstetolerance på 0,4 MJ/kg ME tillades.
      3.   Angivelse af resultater
      Det resultat, der opnås ved ovenstående formel, angives med en decimal.
      4.   Prøveudtagning og analyse
      Udtagningen af prøver af foderblandingen og bestemmelsen af indholdet af bestanddele som angivet i beregningsmetoden foretages i overensstemmelse med Fællesskabets prøveudtagnings- og analysemetoder som led i den offentlige kontrol med foder.
      Følgende metoder anvendes:
      
                  —
               
               
                  Til bestemmelse af indholdet af råfedt: metode B under den i del H i bilag III beskrevne metode til bestemmelse af råfedt
               
            
                  —
               
               
                  Til bestemmelse af indholdet af stivelse: den polarimetriske metode som beskrevet i del L i bilag III.
               
            
   
      BILAG VIII
      ANALYSEMETODER TIL KONTROL FOR ULOVLIG FOREKOMST AF FODERTILSÆTNINGSSTOFFER, DER IKKE LÆNGERE ER TILLADT
      
         Vigtigt:Der kan anvendes mere følsomme analysemetoder til påvisning af ulovlig forekomst i foder af tilsætningsstoffer, der ikke længere er tilladt, end dem, der er beskrevet i dette bilag.De i dette bilag beskrevne analysemetoder anvendes til verifikationsformål.
      
      A.   BESTEMMELSE AF METHYLBENZOQUAT
      
         7-Benzyloxy-6-Butyl-3-Methoxycarbonyl-4-Quinolon
      
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af methylbenzoquat i foder. Bestemmelsesgrænsen er 1 mg/kg.
      2.   Princip
      Methylbenzoquat ekstraheres fra prøven med en opløsning af methansulfonsyre i methanol. Ekstraktet oprenses med dichlormethan, ved ionbytningskromatografi og derefter igen med dichlormethan. Methylbenzoquatindholdet bestemmes ved omvendt fase-HPLC med anvendelse af UV-detektor.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  Dichlormethan.
               
            
                  3.2.
               
               
                  Methanol, svarende til HPLC-kvalitet.
               
            
                  3.3.
               
               
                  Mobil fase til HPLC
                  Blanding af methanol (3.2) og vand (svarende til HPLC-kvalitet), 75 + 25 (v + v)
                  Der filtreres gennem et 0,22 μm filter (4.5), og opløsningen afgasses (f.eks. ved ultralydsbehandling i 10 minutter).
               
            
                  3.4.
               
               
                  Methansulfonsyreopløsning, c = 2 %
                  20,0 ml methansulfonsyre fortyndes til 1 000 ml med methanol (3.2).
               
            
                  3.5.
               
               
                  Saltsyreopløsning, c = 10 %
                  100 ml saltsyre (ρ20 = 1,18 g/ml) fortyndes til 1 000 ml med vand.
               
            
                  3.6.
               
               
                  Kationbytterresin Amberlite CG-120 (Na), 100–200 mesh
                  Resinet forbehandles inden brug. 100 g resin opslæmmes med 500 ml saltsyreopløsning (3.5) og opvarmes på varmeplade til kogning under stadig omrøring. Opslæmningen henstår til afkøling, og syren dekanteres fra. Derefter filtreres gennem et filtrerpapir under vakuum. Resinet vaskes to gange med vand i portioner på 500 ml og derefter med 250 ml methanol (3.2). Resinet skylles med yderligere 250 ml methanol og tørres, ved at der sendes luft gennem filterkagen. Det tørrede resin opbevares i en tilproppet flaske.
               
            
                  3.7.
               
               
                  Standardstof: ren methylbenzoquat (7-benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-quinolon)
               
            
                  3.7.1.
               
               
                  Methylbenzoquatstandardstamopløsning, 500 μg/ml
                  Med en nøjagtighed på 0,1 mg afvejes 50 mg standard (3.7), som opløses i methansulfonsyreopløsning (3.4) i en 100 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket og blandes.
               
            
                  3.7.2.
               
               
                  Methylbenzoquatstandardmellemopløsning, 50 μg/ml
                  5,0 ml af methylbenzoquatstandardstamopløsningen (3.7.1) overføres til en 50 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med methanol (3.2) og blandes.
               
            
                  3.7.3.
               
               
                  Kalibreringsopløsninger
                  Henholdsvis 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 og 5,0 ml af methylbenzoquatstandardmellemopløsningen (3.7.2) overføres til hver sin 25 ml målekolbe. Der fyldes op til mærket med mobil fase (3.3) og blandes. Disse opløsninger har en koncentration på henholdsvis 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 og 10,0 μg/ml methylbenzoquat. Disse opløsninger skal fremstilles umiddelbart før brugen.
               
            4.   Apparatur
      
                  4.1.
               
               
                  Mekanisk rysteapparat
               
            
                  4.2.
               
               
                  Rotationsfordamper
               
            
                  4.3.
               
               
                  Glaskolonne (250 mm × 15 mm), forsynet med stophane og med en kapacitet på ca. 200 ml
               
            
                  4.4.
               
               
                  HPLC-udstyr med ultraviolet detektor med variabel bølgelængde eller med diodearraydetektor
               
            
                  4.4.1.
               
               
                  HPLC-kolonne: 300 mm × 4 mm, C18, 10 μm pakkemateriale, eller tilsvarende
               
            
                  4.5.
               
               
                  Membranfiltre, 0,22 μm
               
            
                  4.6.
               
               
                  Membranfiltre, 0,45 μm.
               
            5.   Fremgangsmåde
      5.1.   Generelt
      
                  5.1.1.
               
               
                  Der analyseres en blindprøve for at kontrollere, at hverken methylbenzoquat eller interfererende stoffer er til stede.
               
            
                  5.1.2.
               
               
                  Der udføres en genfindingstest ved at analysere blindprøven, som er blevet spiket ved tilsætning af en mængde methylbenzoquat svarende til den, der er til stede i prøven. For at nå op på et niveau på 15 mg/kg tilsættes 600 μl af standardstamopløsningen (3.7.1) til 20 g blindprøve. Der blandes og ventes i 10 minutter, inden der fortsættes med ekstraktion (5.2).
                  
                              
                                 NB
                              
                           
                           
                              :
                           
                           
                              Til denne metode anvendes en blindprøve af samme type som analyseprøven, og som ved analyse viser sig ikke at indeholde methylbenzoquat.
                           
                        
            5.2.   Ekstraktion
      Ca. 20 g af den klargjorte prøve afvejes med en nøjagtighed på 0,01 g og overføres til en 250 ml konisk kolbe. Der tilsættes 100,0 ml methanolsulfonsyreopløsning (3.4) og omrystes mekanisk (4.1) i 30 minutter. Opløsningen filtreres gennem filtrerpapir, og filtratet gemmes til væske-væskefordelingen (5.3).
      5.3.   Væske-væskefordeling
      25,0 ml af det under (5.2) opnåede filtrat overføres til en 500 ml skilletragt indeholdende 100 ml saltsyreopløsning (3.5). Der tilsættes 100 ml dichlormethan (3.1) til tragten og omrystes i 1 minut. Efter at de to lag har fået tid til at skilles, aftappes det nederste lag (dichlormethan) i en 500 ml rundbundet kolbe. Ekstraktionen af den vandige fase gentages med yderligere to portioner dichlormethan på hver 40 ml, og disse ekstrakter kombineres med det første ekstrakt i den rundbundede kolbe. Dichlormethanekstraktet inddampes til tørhed på rotationsfordamperen (4.2) ved 40 oC under reduceret tryk. Remanensen opløses i 20–25 ml methanol (3.2), hvorefter kolben tilproppes, og hele ekstraktet gemmes til ionbytningskromatografi (5.4).
      5.4.   Ionbytningskromatografi
      5.4.1.   Klargøring af kationbytterkolonnen
      
      En prop af glasuld anbringes i den nedre ende af en glaskolonne (4.3). Der klargøres en opslæmning på 5,0 g af det behandlede kationbytterresin (3.6) med 50 ml saltsyre (3.5), som hældes i glaskolonnen, hvorefter man lader den få tid til at sætte sig. Den overskydende syre lades løbe ud, indtil den står lige over resinoverfladen, og kolonnen vaskes med vand, indtil vaskevandet er neutralt over for lakmuspapir. 50 ml methanol (3.2) overføres til kolonnen og lades sive ned til resinoverfladen.
      5.4.2.   Søjlekromatografi
      
      Det under (5.3) opnåede ekstrakt overføres forsigtigt til kolonnen med pipette. Den rundbundede kolbe skylles med to portioner på 5-10 ml methanol (3.2), og disse skyllevæsker overføres til kolonnen. Ekstraktet lades løbe ned til resinoverfladen, og kolonnen vaskes med 50 ml methanol, idet det sikres, at gennemstrømningshastigheden ikke overstiger 5 ml pr. minut. Den udstrømmende væske kasseres. Methylbenzoquatet elueres fra kolonnen under anvendelse af 150 ml methansulfonsyreopløsning (3.4), og eluatet fra kolonnen opsamles i en 250 ml konisk kolbe.
      5.5.   Væske-væskefordeling
      Det under (5.4.2) opnåede eluat overføres til en 1 liter skilletragt. Den koniske kolbe skylles med 5–10 ml methanol (3.2), og skyllevæskerne kombineres med indholdet i skilletragten. Der tilsættes 300 ml saltsyreopløsning (3.5) og 130 ml dichlormethan (3.1) og omrystes i 1 minut. Efter at de to faser har fået tid til at skilles, aftappes det nederste (dichlormethan) lag i en 500 ml rundbundet kolbe. Ekstraktionen af den vandige fase gentages med yderligere to portioner dichlormethan på hver 70 ml, og disse ekstrakter kombineres med det første ekstrakt i den rundbundede kolbe.
      Dichlormethanekstraktet inddampes til tørhed på rotationsfordamperen (4.2) ved 40 oC under reduceret tryk. Remanensen opløses i kolben med ca. 5 ml methanol (3.2), og denne opløsning overføres kvantitativt til en 10 ml målekolbe. Den rundbundede kolbe skylles med yderligere to portioner methanol på hver 1–2 ml, som overføres til målekolben. Der fyldes op til mærket med methanol og blandes. En alikvot mængde filtreres gennem et membranfilter (4.6). Denne opløsning gemmes til HPLC-bestemmelsen (5.6).
      5.6.   HPLC-bestemmelse
      5.6.1.   Parametre
      
      Følgende betingelser er vejledende; andre betingelser kan benyttes, forudsat at de giver tilsvarende resultater.
      
                  —
               
               
                  HPLC-kolonne (4.4.1)
               
            
                  —
               
               
                  Mobil fase til HPLC: blanding af methanol og vand (3.3)
               
            
                  —
               
               
                  Flow: 1–1,5 ml/minuttet
               
            
                  —
               
               
                  Detektionsbølgelængde: 265 nm
               
            
                  —
               
               
                  Injektionsvolumen: 20–50 μl.
               
            Kromatografisystemets stabilitet kontrolleres, ved at der flere gange indsprøjtes kalibreringsopløsning (3.7.3) med 4 μg/ml, indtil der opnås konstante tophøjder eller -arealer og retentionstider.
      5.6.2.   Kalibreringskurve
      
      Hver kalibreringsopløsning (3.7.3) indsprøjtes flere gange, og højden af toppene (arealerne) bestemmes for hver koncentration. Der tegnes en kalibreringskurve med kalibreringsopløsningernes middeltophøjder eller -arealer som ordinat og de tilsvarende koncentrationer i μg/ml som abscisse.
      5.6.3.   Prøveopløsning
      
      Prøveekstraktet (5.5) indsprøjtes flere gange, idet der benyttes samme mængde som til kalibreringsopløsningerne, og middeltophøjden (-arealet) af methylbenzoquattoppene bestemmes.
      6.   Beregning af resultater
      Ud fra middelhøjden (-arealet) af prøveopløsningens methylbenzoquattoppe bestemmes koncentrationen i prøveopløsningen i μg/ml ved benyttelse af kalibreringskurven (5.6.2).
      Prøvens indhold af methylbenzoquat w (mg/kg) beregnes efter følgende formel:
      
         
      hvor:
      
                  c
               
               
                  =
               
               
                  prøveopløsningens methylbenzoquatkoncentration i g/ml
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  testportionens vægt i gram.
               
            7.   Validering af resultater
      7.1.   Identitet
      Analyttens identitet kan bekræftes ved ko-kromatografi eller ved at benytte en diodearraydetektor, hvormed spektrene for prøveekstraktet og kalibreringsopløsningen (3.7.3) indeholdende 10 μg/ml sammenlignes.
      7.1.1.   Ko-kromatografi
      
      Et prøveekstrakt spikes ved tilsætning af en passende mængde standardmellemopløsning (3.7.2). Den tilsatte mængde methylbenzoquat skal svare til den skønnede mængde methylbenzoquat i prøveekstraktet.
      Kun højden af methylbenzoquattoppen må være blevet øget, efter at der er taget hensyn til både den tilsatte mængde og fortyndingen af ekstraktet. Toppens bredde skal i den halve højde ligge inden for ca. 10 % af den oprindelige bredde.
      7.1.2.   Diodearraydetektion
      
      Resultaterne vurderes i overensstemmelse med følgende kriterier:
      
                  a)
               
               
                  Den maksimale absorptionsbølgelængde for prøvens og standardens spektre, målt ved toppens spids på kromatogrammet, skal være den samme inden for en margin, der afhænger af detektionssystemets opløsningsevne. Ved diodearraydetektion er den typisk ca. 2 nm.
               
            
                  b)
               
               
                  Mellem 220 og 350 nm må prøvens og standardens spektre registreret ved toppens spids på kromatogrammet ikke være forskellige fra hinanden i de dele af spektret, der ligger inden for 10–100 % relativ absorbans. Dette kriterium er opfyldt, når de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem de to spektre i intet observeret punkt overstiger 15 % af standardanalyttens absorbans.
               
            
                  c)
               
               
                  Mellem 220 og 350 nm må spektrene ved toppens forside, spids og bagside frembragt med prøveekstraktet ikke være forskellige fra hinanden i de dele af spektret, der ligger inden for 10–100 % relativ absorbans. Dette kriterium er opfyldt, når de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem spektrene i intet observeret punkt overstiger 15 % af spektrets absorbans i spidsen.
               
            Hvis et af disse kriterier ikke er opfyldt, er analyttens tilstedeværelse ikke bekræftet.
      7.2.   Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige: 10 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for methylbenzoquatindhold på 4–20 mg/kg.
      7.3.   Genfinding
      For den spikede blindprøve skal genfindingen være mindst 90 %.
      8.   Resultater af ringanalyse
      5 prøver blev analyseret af 10 laboratorier. Der blev foretaget dobbeltanalyse af hver prøve.
      
                   
               
               
                  Blind
               
               
                  Mel 1
               
               
                  Piller 1
               
               
                  Mel 2
               
               
                  Piller 2
               
            
                  Middelværdi [mg/kg]
               
               
                  IP
               
               
                  4,50
               
               
                  4,50
               
               
                  8,90
               
               
                  8,70
               
            
                  Sr [mg/kg]
               
               
                  —
               
               
                  0,30
               
               
                  0,20
               
               
                  0,60
               
               
                  0,50
               
            
                  CVr [ %]
               
               
                  —
               
               
                  6,70
               
               
                  4,40
               
               
                  6,70
               
               
                  5,70
               
            
                  SR [mg/kg]
               
               
                  —
               
               
                  0,40
               
               
                  0,50
               
               
                  0,90
               
               
                  1,00
               
            
                  CVR [ %]
               
               
                  —
               
               
                  8,90
               
               
                  11,10
               
               
                  10,10
               
               
                  11,50
               
            
                  Genfinding [ %]
               
               
                  —
               
               
                  92,00
               
               
                  93,00
               
               
                  92,00
               
               
                  89,00
               
            
                  IP
               
               
                  =
               
               
                  Ikke påvist
               
            
                  Sr
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for repeterbarhed
               
            
                  CVr
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for repeterbarhed, %
               
            
                  SR
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for reproducerbarhed
               
            
                  CVR
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for reproducerbarhed, %.
               
            B.   BESTEMMELSE AF OLAQUINDOX
      
         2-[N-2'-(hydroxyethyl)carbamoyl]-3-methylquinoxalin-N
         
            1
         
         ,N
         
            4
         
         -dioxid
      
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af olaquindox i foder. Bestemmelsesgrænsen er 5 mg/kg.
      2.   Princip
      Prøven ekstraheres med en blanding af vand og methanol. Indholdet af olaquindox bestemmes ved omvendt fase-HPLC med anvendelse af UV detektor.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  Methanol.
               
            
                  3.2.
               
               
                  Methanol, svarende til HPLC-kvalitet.
               
            
                  3.3.
               
               
                  Vand, svarende til HPLC-kvalitet.
               
            
                  3.4.
               
               
                  Mobil fase til HPLC
                  Blanding af vand (3.3) og methanol (3.2), 900 + 100 (V + Vv).
               
            
                  3.5.
               
               
                  Standardstof: rent olaquindox 2-[N-2'-(hydroxyethyl)carbamoyl]-3-methylquinoxalin-N1,N4-dioxid, E 851.
               
            
                  3.5.1.
               
               
                  Olaquindoxstandardstamopløsning, 250 μg/ml
                  Med en nøjagtighed på 0,1 mg afvejes 50 mg olaquindox (3.5) i en 200 ml målekolbe, og der tilsættes ca. 190 ml vand. Derefter anbringes kolben i 20 minutter i et ultralydsbad (4.1). Efter ultralydsbehandlingen bringes opløsningen til rumtemperatur, hvorefter der fyldes op til mærket med vand og blandes. Kolben omvikles med aluminiumfolie og opbevares i køleskab. Fremstilles hver måned.
               
            
                  3.5.2.
               
               
                  Olaquindoxstandardmellemopløsning, 25 μg/ml
                  10,0 ml af standardstamopløsningen (3.5.1) overføres til en 100 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med den mobile fase (3.4) og blandes. Kolben omvikles med aluminiumfolie og opbevares i køleskab. Fremstilles dagligt.
               
            
                  3.5.3.
               
               
                  Kalibreringsopløsninger
                  Henholdsvis 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 15,0 og 20,0 ml af standardmellemopløsningen (3.5.2) overføres til hver sin 50 ml målekolbe. Der fyldes op til mærket med mobil fase (3.4) og blandes. Kolberne omvikles med aluminiumfolie. Disse opløsninger svarer til henholdsvis 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 og 10,0 μg olaquindox pr. ml.
                  Fremstilles dagligt.
               
            4.   Apparatur
      
                  4.1.
               
               
                  Ultralydsbad
               
            
                  4.2.
               
               
                  Mekanisk rysteapparat
               
            
                  4.3.
               
               
                  HPLC-udstyr med ultraviolet detektor med variabel bølgelængde eller med diodearraydetektor
               
            
                  4.3.1.
               
               
                  HPLC-kolonne, 250 mm × 4 mm, C18, 10 μm pakkemateriale, eller tilsvarende
               
            
                  4.4.
               
               
                  Membranfiltre, 0,45 μm.
               
            5.   Fremgangsmåde
      
                  
                     NB
                  
               
               
                  Olaquindox er lysfølsomt. Alle procedurer udføres i dæmpet belysning eller under anvendelse af udstyr af brunt glas.
               
            5.1.   Generelt
      
                  5.1.1.
               
               
                  Der analyseres en blindprøve for at kontrollere, at hverken olaquindox eller interfererende stoffer er til stede.
               
            
                  5.1.2.
               
               
                  Der udføres en genfindingstest ved at analysere blindprøven, som er blevet spiket ved tilsætning af en mængde olaquindox svarende til den, der er til stede i prøven. For at nå op på et niveau på 50 mg/kg overføres 10,0 ml af standardstamopløsningen (3.5.1) til en 250 ml konisk kolbe, hvorefter opløsningen inddampes til ca. 0,5 ml. Der tilsættes 50 g af blindprøven og blandes omhyggeligt, og efter henstand i 10 minutter blandes der på ny flere gange, inden der fortsættes med ekstraktion (5.2).
                  
                              
                                 NB
                              
                           
                           
                              Til denne metode anvendes en blindprøve af samme type som analyseprøven, og som ved analyse viser sig ikke at indeholde olaquindox.
                           
                        
            5.2.   Ekstraktion
      Med en nøjagtighed på 0,01 g afvejes der ca. 50 g af prøven, som overføres til en 1 000 ml konisk kolbe, hvorefter der tilsættes 100 ml methanol (3.1), og kolben anbringes i 5 minutter i ultralydsbad (4.1). Der tilsættes 410 ml vand, og kolben anbringes i ultralydsbad i yderligere 15 minutter. Derefter fjernes kolben fra ultralydsbadet og rystes i 30 minutter på rysteapparatet (4.2), og indholdet filtreres gennem et foldet filter. 10,0 ml af filtratet overføres til en 20 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med vand og blandes. En alikvot mængde filtreres gennem et membranfilter (4.4) (se bemærkning, punkt 9). Der fortsættes med HPLC-bestemmelse (5.3).
      5.3.   HPLC-bestemmelse
      5.3.1.   Parametre
      
      Nedenstående betingelser er vejledende; andre betingelser kan benyttes, forudsat at de giver tilsvarende resultater.
      
                  Analysekolonne (4.3.1)
               
               
                   
               
            
                  Mobil fase (3.4):
               
               
                  Blanding af vand (3.3) og methanol (3.2), 900 + 100 (V + V)
               
            
                  Flow:
               
               
                  1,5–2 ml/minuttet
               
            
                  Detektionsbølgelængde:
               
               
                  380 nm
               
            
                  Injektionsvolumen:
               
               
                  20–100 μl.
               
            Kromatografisystemets stabilitet kontrolleres, ved at der flere gange indsprøjtes kalibreringsopløsning (3.5.3) med 2,5 μg/ml, indtil der opnås konstante tophøjder og retentionstider.
      5.3.2.   Kalibreringskurve
      
      Hver kalibreringsopløsning (3.5.3) indsprøjtes flere gange, og middeltophøjderne (-arealerne) bestemmes for hver koncentration. Der tegnes en kalibreringskurve med kalibreringsopløsningernes middeltophøjder (-arealer) som ordinat og de tilsvarende koncentrationer i μg/ml som abscisse.
      5.3.3.   Prøveopløsning
      
      Prøveekstraktet (5.2) indsprøjtes flere gange, idet der benyttes samme mængde som til kalibreringsopløsningerne, og middeltophøjden (-arealet) af olaquindoxtoppene bestemmes.
      6.   Beregning af resultater
      Ud fra middelhøjden (-arealet) af olaquindoxtoppene i prøveopløsningen bestemmes koncentrationen i prøveopløsningen i μg/ml ved benyttelse af kalibreringskurven (5.3.2).
      Olaquindoxindholdet w i mg/kg for prøven beregnes efter følgende formel:
      
         
      hvor:
      
                  c
               
               
                  =
               
               
                  olaquindoxkoncentrationen i prøveekstraktet (5.2) i μg/ml
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  testportionens vægt i gram (5.2).
               
            7.   Validering af resultater
      7.1.   Identitet
      Analyttens identitet kan bekræftes ved ko-kromatografi eller ved at benytte en diodearraydetektor, hvormed spektrene for prøveekstraktet (5.2) og kalibreringsopløsningen (3.5.3) indeholdende 5,0 μg/ml sammenlignes.
      7.1.1.   Ko-kromatografi
      
      Et prøveekstrakt (5.2) spikes ved tilsætning af en passende mængde kalibreringsopløsning (3.5.3). Den tilsatte mængde olaquindox skal svare til den mængde olaquindox, der er fundet i prøveekstraktet.
      Kun højden af olaquindoxtoppen må være blevet øget, efter at der er taget hensyn til både den tilsatte mængde og fortyndingen af ekstraktet. Toppens bredde skal i den halve højde ligge inden for ± 10 % af den oprindelige bredde af olaquindoxtoppen for det ikke-spikede prøveekstrakt.
      7.1.2.   Diodearraydetektion
      
      Resultaterne vurderes i overensstemmelse med følgende kriterier:
      
                  a)
               
               
                  Den maksimale absorptionsbølgelængde for prøvens og standardens spektre, målt ved toppens spids på kromatogrammet, skal være den samme inden for en margin, der afhænger af detektionssystemets opløsningsevne. For diodearraydetektion ligger denne typisk inden for ± 2 nm.
               
            
                  b)
               
               
                  Mellem 220 og 400 nm må prøvens og standardens spektre registreret ved toppens spids på kromatogrammet ikke være forskellige fra hinanden i de dele af spektret, der ligger inden for 10–100 % relativ absorbans. Dette kriterium er opfyldt, når de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem de to spektre i intet observeret punkt overstiger 15 % af standardanalyttens absorbans.
               
            
                  c)
               
               
                  Mellem 220 og 400 nm må spektrene ved toppens forside, spids og bagside frembragt med prøveekstraktet ikke være forskellige fra hinanden i de dele af spektret, der ligger inden for 10–100 % relativ absorbans. Dette kriterium er opfyldt, når de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem de to spektre i intet observeret punkt overstiger 15 % af absorbansen for spektret i toppens spids.
               
            Hvis et af disse kriterier ikke er opfyldt, er analyttens tilstedeværelse ikke bekræftet.
      7.2.   Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 15 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for olaquindoxindhold på 10–200 mg/kg.
      7.3.   Genfinding
      For den spikede blindprøve skal genfindingen være mindst 90 %.
      8.   Resultater af ringanalyse
      Der er gennemført en EF-ringanalyse, hvor 4 prøver af foder til smågrise, herunder en blindprøve, blev analyseret i op til 13 laboratorier. Resultaterne er vist herunder:
      
                   
               
               
                  Prøve 1
               
               
                  Prøve 2
               
               
                  Prøve 3
               
               
                  Prøve 4
               
            
                  L
               
               
                  13
               
               
                  10
               
               
                  11
               
               
                  11
               
            
                  n
               
               
                  40
               
               
                  40
               
               
                  44
               
               
                  44
               
            
                  Middelværdi [mg/kg]
               
               
                  —
               
               
                  14,6
               
               
                  48,0
               
               
                  95,4
               
            
                  Sr [mg/kg]
               
               
                  —
               
               
                  0,82
               
               
                  2,05
               
               
                  6,36
               
            
                  SR [mg/kg]
               
               
                  —
               
               
                  1,62
               
               
                  4,28
               
               
                  8,42
               
            
                  CVr [ %]
               
               
                  —
               
               
                  5,6
               
               
                  4,3
               
               
                  6,7
               
            
                  CVR [ %]
               
               
                  —
               
               
                  11,1
               
               
                  8,9
               
               
                  8,8
               
            
                  Nominelt indhold
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  [mg/kg]
               
               
                  —
               
               
                  15
               
               
                  50
               
               
                  100
               
            
                  Genfinding ( %)
               
               
                  —
               
               
                  97,3
               
               
                  96,0
               
               
                  95,4
               
            
                  L
               
               
                  =
               
               
                  antal laboratorier
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  antal enkeltværdier
               
            
                  Sr
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for repeterbarhed
               
            
                  SR
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for reproducerbarhed
               
            
                  CVr
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for repeterbarhed
               
            
                  CVR
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for reproducerbarhed.
               
            9.   Bemærkning
      Selv om metoden ikke er valideret for foder med et olaquindoxindhold på over 100 mg/kg, er det muligt at opnå tilfredsstillende resultater ved at reducere prøvemængden og/eller fortynde ekstraktet (5.2) for at opnå en koncentration inden for kalibreringskurven (5.3.2).
      C.   BESTEMMELSE AF AMPROLIUM
      
         1-[(4-amino-2-propyl-5-pyrimidinyl)methyl]-2-picoliniumchloridhydrochlorid
      
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af amprolium i foder og forblandinger. Detektionsgrænsen er 1 mg/kg, og bestemmelsesgrænsen er 5 mg/kg.
      2.   Princip
      Prøven ekstraheres med en methanol-vand-blanding. Efter fortynding med den mobile fase og membranfiltrering bestemmes indholdet af amprolium ved kationbytter-HPLC med anvendelse af UV-detektor.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  Methanol.
               
            
                  3.2.
               
               
                  Acetonitril, svarende til HPLC-kvalitet.
               
            
                  3.3.
               
               
                  Vand, svarende til HPLC-kvalitet.
               
            
                  3.4.
               
               
                  Natriumdihydrogenphosphatopløsning, c = 0,1 mol/liter
                  13,80 g natriumdihydrogenphosphatmonohydrat opløses i vand (3.3) i en 1 000 ml målekolbe; der fyldes op til mærket med vand (3.3) og blandes.
               
            
                  3.5.
               
               
                  Natriumperchloratopløsning, c =1,6 mol/liter
                  224,74 g natriumperchloratmonohydrat opløses i vand (3.3) i en 1 000 ml målekolbe; der fyldes op til mærket med vand (3.3) og blandes.
               
            
                  3.6.
               
               
                  Mobil fase til HPLC (se bemærkning 9.1)
                  Blanding af acetonitril (3.2), natriumdihydrogenphosphatopløsning (3.4) og natriumperchloratopløsning (3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v). Før anvendelse filtreres der gennem et 0,22 μm membranfilter (4.3), og opløsningen afgasses (f.eks. i ultralydsbad (4.4) i mindst 15 minutter).
               
            
                  3.7.
               
               
                  Standardstof: rent amprolium, 1-[(4-amino-2-propylpyrimidin-5-yl)methyl]-2-methylpyridiniumchloridhydrochlorid, E 750 (se punkt 9.2).
               
            
                  3.7.1.
               
               
                  Amproliumstandardstamopløsning, 500 μg/ml
                  50 mg amprolium (3.7) afvejes med en nøjagtighed på 0,1 mg i en 100 ml målekolbe og opløses i 80 ml methanol (3.1), og kolben anbringes i 10 minutter i ultralydsbad (4.4). Efter ultralydsbehandlingen bringes opløsningen til rumtemperatur, hvorefter der fyldes op til mærket med vand og blandes. Opløsningen er stabil i en måned ved en temperatur på ≤ 4 oC.
               
            
                  3.7.2.
               
               
                  Amproliumstandardmellemopløsning, 50 μg/ml
                  5,0 ml af standardstamopløsningen (3.7.1) afpipetteres i en 50 ml målekolbe, og der fyldes op til mærket med ekstraktionsopløsningsmidlet (3.8) og blandes. Opløsningen er stabil i en måned ved en temperatur på ≤ 4 oC.
               
            
                  3.7.3.
               
               
                  Kalibreringsopløsninger
                  Henholdsvis 0,5, 1,0 og 2,0 ml af standardmellemopløsningen (3.7.2) overføres til hver sin 50 ml målekolbe. Der fyldes op til mærket med mobil fase (3.6) og blandes. Disse opløsninger svarer til henholdsvis 0,5, 1,0 og 2,0 μg amprolium pr. ml. Disse opløsninger skal fremstilles umiddelbart før brugen.
               
            
                  3.8.
               
               
                  Ekstraktionsopløsningsmiddel
                  Blanding af methanol (3.1) og vand, 2 + 1 (v + v).
               
            4.   Apparatur
      
                  4.1.
               
               
                  HPLC-udstyr med injektionssystem, egnet til injektionsvolumener på 100 μl
               
            
                  4.1.1.
               
               
                  HPLC-kolonne, 125 mm x 4 mm, kationbytter Nucleosil 10 SA, 5 eller 10 μm pakkemateriale, eller tilsvarende
               
            
                  4.1.2.
               
               
                  UV-detektor med variabel bølgelængde eller diodearraydetektor
               
            
                  4.2.
               
               
                  Membranfilter, PTFE-, 0,45 μm
               
            
                  4.3.
               
               
                  Membranfilter, 0,22 μm
               
            
                  4.4.
               
               
                  Ultralydsbad
               
            
                  4.5.
               
               
                  Mekanisk rysteapparat eller magnetomrører.
               
            5.   Fremgangsmåde
      5.1.   Generelt
      5.1.1.   Blindprøve
      
      Til gennemførelse af genfindingstesten (5.l.2) analyseres en blindprøve for at kontrollere, at hverken amprolium eller interfererende stoffer er til stede. Blindprøven skal være af samme type som den prøve, der skal undersøges, og ved analyse må amprolium eller interfererende stoffer ikke påvises.
      5.1.2.   Genfindingstest
      
      Der udføres en genfindingstest ved at analysere blindprøven, som er blevet spiket ved tilsætning af en mængde amprolium svarende til den, der er til stede i prøven. For at nå op på et niveau på 100 mg/kg overføres der 10,0 ml standardstamopløsning (3.7.1) til en 250 ml konisk kolbe, og opløsningen inddampes til ca. 0,5 ml. Der tilsættes 50 g af blindprøven og blandes omhyggeligt, og efter henstand i 10 minutter blandes der på ny flere gange, inden der fortsættes med ekstraktion (5.2).
      Hvis der ikke er en blindprøve af samme type som analyseprøven til rådighed (se punkt 5.1.1), kan der alternativt udføres en genfindingstest ved hjælp af standardtilsætningsmetoden. I dette tilfælde spikes den prøve, der skal analyseres, ved tilsætning af en mængde amprolium svarende til den, der allerede er til stede i prøven. Denne prøve analyseres sammen med den ikke-spikede prøve, og genfindingen kan beregnes ved subtraktion.
      5.2.   Ekstraktion
      5.2.1.   Forblandinger (indhold på < 1 % amprolium) og foder
      
      Med en nøjagtighed på 0,01 g afvejes der 5–40 g af prøven, afhængigt af amproliumindholdet, i en 500 ml konisk kolbe, og der tilsættes 200 ml ekstraktionsopløsningsmiddel (3.8). Kolben anbringes i ultralydsbad (4.4) og henstår i 15 minutter. Kolben fjernes fra ultralydsbadet og rystes i 1 time på rysteapparatet eller omrøres på magnetomrøreren (4.5). En alikvot mængde af ekstraktet fortyndes med den mobile fase (3.6) til et amproliumindhold på 0,5–2 μg/ml og blandes (se bemærkning 9.3). 5–10 ml af denne fortyndede opløsning filtreres på et membranfilter (4.2). Der fortsættes med HPLC-bestemmelse (5.3).
      5.2.2.   Forblandinger (indhold på ≥ 1 % amprolium)
      
      Med en nøjagtighed på 0,001 g afvejes 1–4 g af forblandingen, afhængigt af amproliumindholdet, i en 500 ml konisk kolbe, og der tilsættes 200 ml ekstraktionsopløsningsmiddel (3.8). Kolben anbringes i ultralydsbad (4.4) og henstår i 15 minutter. Kolben fjernes fra ultralydsbadet og rystes i 1 time på rysteapparatet eller omrøres på magnetomrøreren (4.5). En alikvot mængde af ekstraktet fortyndes med den mobile fase (3.6) til et amproliumindhold på 0,5–2 μg/ml og blandes. 5–10 ml af denne fortyndede opløsning filtreres på et membranfilter (4.2). Der fortsættes med HPLC-bestemmelse (5.3).
      5.3.   HPLC-bestemmelse
      5.3.1.   Parametre
      
      Nedenstående betingelser er vejledende; andre betingelser kan benyttes, forudsat at de giver tilsvarende resultater.
      
                   
               
               
                   
               
            
                  HPLC-kolonne (4.1.1):
               
               
                  125 mm × 4 mm, kationbytter Nucleosil 10 SA, 5 eller 10 μm pakkemateriale, eller tilsvarende
               
            
                  Mobil fase (3.6):
               
               
                  Blanding af acetonitril (3.2), natriumdihydrogenphosphatopløsning (3.4) og natriumperchloratopløsning (3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v).
               
            
                  Flow :
               
               
                  0,7–1 ml/minuttet
               
            
                  Detektionsbølgelængde:
               
               
                  264 nm
               
            
                  Injektionsvolumen:
               
               
                  100 μl.
               
            Kromatografisystemets stabilitet kontrolleres, ved at der flere gange indsprøjtes kalibreringsopløsning (3.7.3) med 1,0 μg/ml, indtil der opnås konstante tophøjder og retentionstider.
      5.3.2.   Kalibreringskurve
      
      Hver kalibreringsopløsning (3.7.3) indsprøjtes flere gange, og middeltophøjderne (-arealerne) bestemmes for hver koncentration. Der tegnes en kalibreringskurve med kalibreringsopløsningernes middeltophøjder (-arealer) som ordinat og de tilsvarende koncentrationer i μg/ml som abscisse.
      5.3.3.   Prøveopløsning
      
      Prøveekstraktet (5.2) indsprøjtes flere gange, idet der benyttes samme mængde som til kalibreringsopløsningerne, og middeltophøjden (-arealet) af amproliumtoppene bestemmes.
      6.   Beregning af resultater
      Ud fra middelhøjden (-arealet) af prøveopløsningens amproliumtoppe bestemmes koncentrationen i prøveopløsningen i μg/ml ved benyttelse af kalibreringskurven (5.3.2).
      Amproliumindholdet w i mg/kg for prøven er givet ved følgende formel:
      
          [mg/kg]
      hvor:
      
                  V
               
               
                  =
               
               
                  volumen ekstraktionsopløsningsmiddel (3.8) i ml ifølge 5.2 (dvs. 200 ml)
               
            
                  c
               
               
                  =
               
               
                  amproliumkoncentrationen i prøveekstraktet (5.2) i μg/ml
               
            
                  f
               
               
                  =
               
               
                  fortyndingsfaktor ifølge 5.2
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  testportionens vægt i gram.
               
            7.   Validering af resultater
      7.1.   Identitet
      Analyttens identitet kan bekræftes ved ko-kromatografi eller ved at benytte en diodearraydetektor, hvormed spektrene for prøveekstraktet (5.2) og kalibreringsopløsningen (3.7.3) indeholdende 2,0 μg/ml sammenlignes.
      7.1.1.   Ko-kromatografi
      
      Et prøveekstrakt (5.2) spikes ved tilsætning af en passende mængde kalibreringsopløsning (3.7.3). Den tilsatte mængde amprolium skal svare til den mængde amprolium, der er fundet i prøveekstraktet.
      Kun højden af amproliumtoppen må være blevet øget, efter at der er taget hensyn til både den tilsatte mængde og fortyndingen af ekstraktet. Toppens bredde skal i den halve højde ligge inden for ± 10 % af den oprindelige bredde af amproliumtoppen for det ikke-spikede prøveekstrakt.
      7.1.2.   Diodearraydetektion
      
      Resultaterne vurderes i overensstemmelse med følgende kriterier:
      
                  a)
               
               
                  Den maksimale absorptionsbølgelængde for prøvens og standardens spektre, målt ved toppens spids på kromatogrammet, skal være den samme inden for en margin, der afhænger af detektionssystemets opløsningsevne. For diodearraydetektion ligger denne typisk inden for ± 2 nm.
               
            
                  b)
               
               
                  Mellem 210 og 320 nm må prøvens og standardens spektre registreret ved toppens spids på kromatogrammet ikke være forskellige fra hinanden i de dele af spektret, der ligger inden for 10–100 % relativ absorbans. Dette kriterium er opfyldt, når de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem de to spektre i intet observeret punkt overstiger 15 % af standardanalyttens absorbans.
               
            
                  c)
               
               
                  Mellem 210 og 320 nm må spektrene ved toppens forside, spids og bagside frembragt med prøveekstraktet ikke være forskellige fra hinanden i de dele af spektret, der ligger inden for 10–100 % relativ absorbans. Dette kriterium er opfyldt, når de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem de to spektre i intet observeret punkt overstiger 15 % af absorbansen for spektret i toppens spids.
               
            Hvis et af disse kriterier ikke er opfyldt, er analyttens tilstedeværelse ikke bekræftet.
      7.2.   Repeterbarhed
      Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige:
      
                  —
               
               
                  15 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for amproliumindhold på 25–500 mg/kg
               
            
                  —
               
               
                  75 mg/kg for amproliumindhold på 500–1 000 mg/kg
               
            
                  —
               
               
                  7,5 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for amproliumindhold på mere end 1 000 mg/kg.
               
            7.3.   Genfinding
      For en spiket (blind)prøve skal genfindingen være mindst 90 %.
      8.   Resultater af ringanalyse
      Der er gennemført en ringanalyse, hvor 3 kyllingefoderstoffer (prøve 1–3), 1 mineralfoder (prøve 4) og 1 forblanding (prøve 5) blev analyseret. Resultaterne er vist i nedenstående tabel:
      
                   
               
               
                  Prøve 1 (blindprøve)
               
               
                  Prøve 2
               
               
                  Prøve 3
               
               
                  Prøve 4
               
               
                  Prøve 5
               
            
                  L
               
               
                  14
               
               
                  14
               
               
                  14
               
               
                  14
               
               
                  15
               
            
                  n
               
               
                  56
               
               
                  56
               
               
                  56
               
               
                  56
               
               
                  60
               
            
                  Middelværdi [mg/kg]
               
               
                  —
               
               
                  45,5
               
               
                  188
               
               
                  5 129
               
               
                  25 140
               
            
                  Sr [mg/kg]
               
               
                  —
               
               
                  2,26
               
               
                  3,57
               
               
                  178
               
               
                  550
               
            
                  CVr [ %]
               
               
                  —
               
               
                  4,95
               
               
                  1,90
               
               
                  3,46
               
               
                  2,20
               
            
                  SR [mg/kg]
               
               
                  —
               
               
                  2,95
               
               
                  11,8
               
               
                  266
               
               
                  760
               
            
                  CVR [ %]
               
               
                  —
               
               
                  6,47
               
               
                  6,27
               
               
                  5,19
               
               
                  3,00
               
            
                  Nominelt indhold [mg/kg]
               
               
                  —
               
               
                  50
               
               
                  200
               
               
                  5 000
               
               
                  25 000
               
            
                  L
               
               
                  =
               
               
                  antal laboratorier
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  antal enkeltværdier
               
            
                  Sr
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for repeterbarhed
               
            
                  CVr
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for repeterbarhed
               
            
                  SR
                  
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for reproducerbarhed
               
            
                  CVR
                  
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for reproducerbarhed.
               
            9.   Bemærkninger
      
                  9.1.
               
               
                  Hvis prøven indeholder thiamin, forekommer thiamintoppen i kromatogrammet kort før amproliumtoppen. Ved at følge denne metode skal amprolium og thiamin adskilles. Hvis amprolium og thiamin ikke adskilles med den kolonne (4.1.1), der anvendes i denne metode, erstattes op til 50 % af acetonitrildelen af den mobile fase (3.6) med methanol.
               
            
                  9.2.
               
               
                  Ifølge British Pharmacopoeia viser spektret for en amproliumopløsning (c = 0,02 mol/liter) i saltsyre (c = 0,1 mol/liter) maksima ved 246 nm og 262 nm. Absorbansen skal være 0,84 ved 246 nm og 0,80 ved 262 nm.
               
            
                  9.3.
               
               
                  Ekstraktet skal altid fortyndes med den mobile fase, da retentionstiden for amproliumtoppen ellers kan forskydes væsentligt på grund af ændringer i ionstyrken.
               
            D.   BESTEMMELSE AF CARBADOX
      
         Methyl-3-(2-quinoxalinylmethylen)carbazat-N
         
            1
         
         ,N
         
            4
         
         -dioxid
      
      1.   Formål og anvendelsesområde
      Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af carbadox i foder, forblandinger og tilberedninger. Detektionsgrænsen er 1 mg/kg, og bestemmelsesgrænsen er 5 mg/kg.
      2.   Princip
      Prøven bringes i ligevægt med vand og ekstraheres med methanol-acetonitril. For foders vedkommende oprenses en alikvot mængde af det filtrerede ekstrakt på en aluminiumoxidkolonne. For forblandingers og tilberedningers vedkommende fortyndes en alikvot mængde af det filtrerede ekstrakt til en passende koncentration med vand, methanol og acetonitril. Indholdet af carbadox bestemmes ved omvendt fase-HPLC med anvendelse af UV-detektor.
      3.   Reagenser
      
                  3.1.
               
               
                  Methanol.
               
            
                  3.2.
               
               
                  Acetonitril, svarende til HPLC-kvalitet.
               
            
                  3.3.
               
               
                  Eddikesyre, w = 100 %.
               
            
                  3.4.
               
               
                  Aluminiumoxid: neutral, aktivitetskvalitet I.
               
            
                  3.5.
               
               
                  Methanol-acetonitril, 1 + 1 (v + v)
                  500 ml methanol (3.1) blandes med 500 ml acetonitril (3.2).
               
            
                  3.6.
               
               
                  Eddikesyre, σ = 10 %
                  10 ml eddikesyre (3.3) fortyndes til 100 ml med vand.
               
            
                  3.7.
               
               
                  Natriumacetat.
               
            
                  3.8.
               
               
                  Vand, svarende til HPLC-kvalitet.
               
            
                  3.9.
               
               
                  Acetatbufferopløsning, c = 0,01 mol/liter, pH = 6,0
                  0,82 g natriumacetat (3.7) opløses i 700 ml vand (3.8), og pH justeres til 6,0 med eddikesyre (3.6). Opløsningen overføres til en 1 000 ml målekolbe, og der fyldes op til mærket med vand (3.8) og blandes.
               
            
                  3.10.
               
               
                  Mobil fase til HPLC
                  825 ml acetatbufferopløsning (3.9) blandes med 175 ml acetonitril (3.2).
                  Der filtreres gennem et 0,22 μm filter (4.5), og opløsningen afgasses (f.eks. ved ultralydsbehandling i 10 minutter).
               
            
                  3.11.
               
               
                  Standardstof
                  Rent carbadox: Methyl-3-(2-quinoxalinylmethylen)carbazat-N1,N4-dioxid, E 850
               
            
                  3.11.1.
               
               
                  Carbadoxstandardstamopløsning, 100 μg/ml (se bemærkning under punkt 5, »Fremgangsmåde«)
                  25 mg carbadoxstandardstof (3.11) afvejes med en nøjagtighed på 0,1 mg i en 250 ml målekolbe og opløses i methanol-acetonitril (3.5) ved ultralydsbehandling (4.7). Efter ultralydsbehandlingen bringes opløsningen til rumtemperatur, hvorefter der fyldes op til mærket med methanol-acetonitril (3.5) og blandes. Kolben omvikles med aluminiumfolie, eller der anvendes brunt glasudstyr, og opløsningen opbevares i køleskab. Opløsningen er stabil i en måned ved en temperatur på ≤ 4 oC.
               
            
                  3.11.2.
               
               
                  Kalibreringsopløsninger
                  Henholdsvis 2,0, 5,0, 10,0 og 20,0 ml af standardstamopløsningen (3.11.1) overføres til hver sin 100 ml målekolbe. Der tilsættes 30 ml vand, fyldes op til mærket med methanol-acetonitril (3.5) og blandes. Kolberne omvikles med aluminiumfolie. Disse opløsninger svarer til henholdsvis 2,0, 5,0, 10,0 og 20,0 μg/ml carbadox.
                  Kalibreringsopløsninger skal fremstilles umiddelbart før brugen.
                  
                              
                                 NB
                              
                           
                           
                              Til bestemmelse af carbadox i foder, som indeholder mindre end 10 mg/kg, skal der fremstilles kalibreringsopløsninger med en koncentration på under 2,0 μg/ml.
                           
                        
            
                  3.12.
               
               
                  Blanding af vand og methanol-acetonitril (3.5), 300 + 700 (v + v)
                  300 ml vand blandes med 700 ml af methanol-acetonitril-blandingen (3.5).
               
            4.   Apparatur
      
                  4.1.
               
               
                  Mekanisk rysteapparat eller magnetomrører.
               
            
                  4.2.
               
               
                  Glasfiberfiltrerpapir (Whatman GF/A eller tilsvarende).
               
            
                  4.3.
               
               
                  Glaskolonne (længde 300–400 mm, indvendig diameter ca. 10 mm) med sintret glasfritte og aftapningsventil.
                  
                              
                                 NB
                              
                           
                           
                              Der kan også anvendes en glaskolonne med stophane eller en glaskolonne med en tilspidset ende; i dette tilfælde anbringes en lille prop af glasuld i den nedre ende og skubbes helt ned med en glasstav.
                           
                        
            
                  4.4.
               
               
                  HPLC-udstyr med injektionssystem, egnet til injektionsvolumener på 20 μl.
               
            
                  4.4.1.
               
               
                  HPLC-kolonne, 300 mm × 4 mm, C18, 10 μm pakkemateriale, eller tilsvarende.
               
            
                  4.4.2.
               
               
                  UV-detektor med variabel bølgelængde eller diodearraydetektor, som arbejder i området fra 225 til 400 nm.
               
            
                  4.5.
               
               
                  Membranfilter, 0,22 μm.
               
            
                  4.6.
               
               
                  Membranfilter, 0,45 μm.
               
            
                  4.7.
               
               
                  Ultralydsbad.
               
            5.   Fremgangsmåde
      
                  
                     NB
                  
               
               
                  Carbadox er lysfølsomt. Alle procedurer udføres i dæmpet belysning eller under anvendelse af brunt glasudstyr eller glasudstyr omviklet med aluminiumfolie.
               
            5.1.   Generelt
      5.1.1.   Blindprøve
      
      Til gennemførelse af genfindingstesten (5.1.2) analyseres en blindprøve for at kontrollere, at hverken carbadox eller interfererende stoffer er til stede. Blindprøven skal være af samme type som den prøve, der skal undersøges, og ved analyse må carbadox eller interfererende stoffer ikke påvises.
      5.1.2.   Genfindingstest
      
      Der udføres en genfindingstest ved at analysere blindprøven (5.1.1), som er blevet spiket ved tilsætning af en mængde carbadox svarende til den, der er til stede i prøven. For at nå op på et niveau på 50 mg/kg overføres 5,0 ml af standardstamopløsningen (3.11.1) til en 200 ml konisk kolbe. Opløsningen inddampes til ca. 0,5 ml i en nitrogenstrøm. Der tilsættes 10 g af blindprøven, blandes og ventes i 10 minutter, inden der fortsættes med ekstraktion (5.2).
      Hvis der ikke er en blindprøve af samme type som analyseprøven til rådighed (se punkt 5.1.1), kan der alternativt udføres en genfindingstest ved hjælp af standardtilsætningsmetoden. I dette tilfælde spikes prøven ved tilsætning af en mængde carbadox svarende til den, der allerede er til stede i prøven. Denne prøve analyseres sammen med den ikke-spikede prøve, og genfindingen kan beregnes ved subtraktion.
      5.2.   Ekstraktion
      5.2.1.   Foder
      
      Med en nøjagtighed på 0,01 g afvejes 10 g af prøven, som overføres til en 200 ml konisk kolbe. Der tilsættes 15,0 ml vand og blandes, og blandingen henstår i 5 minutter for at komme i ligevægt. Der tilsættes 35,0 ml methanol-acetonitril (3.5), tilproppes og omrystes i 30 minutter på rysteapparatet eller omrøres på magnetomrøreren (4.1). Opløsningen filtreres gennem et glasfiberfiltrerpapir (4.2). Denne opløsning anvendes til oprensningsprocessen (5.3).
      5.2.2.   Forblandinger (0,1–2,0 %)
      
      Med en nøjagtighed på 0,001 g afvejes 1 g af den ikke-formalede prøve, som overføres til en 200 ml konisk kolbe. Der tilsættes 15,0 ml vand og blandes, og blandingen henstår i 5 minutter for at komme i ligevægt. Der tilsættes 35,0 ml methanol-acetonitril (3.5), tilproppes og omrystes i 30 minutter på rysteapparatet eller omrøres på magnetomrøreren (4.1). Opløsningen filtreres gennem et glasfiberfiltrerpapir (4.2).
      En alikvot mængde af filtratet afpipetteres i en 50 ml målekolbe. Der tilsættes 15,0 ml vand, fyldes op til mærket med methanol-acetonitril (3.5) og blandes. Carbadoxkoncentrationen i den endelige opløsning skal være cirka 10 μg/ml. En alikvot mængde filtreres gennem et 0,45 μm filter (4.6).
      Der fortsættes med HPLC-bestemmelse (5.4).
      5.2.3.   Tilberedninger (> 2 %)
      
      Med en nøjagtighed på 0,001 g afvejes 0,2 g af den ikke-formalede prøve, som overføres til en 250 ml konisk kolbe. Der tilsættes 45,0 ml vand og blandes, og blandingen henstår i 5 minutter for at komme i ligevægt. Der tilsættes 105,0 ml methanol-acetonitril (3.5), tilproppes og homogeniseres. Prøven lydbehandles (4.7) i 15 minutter efterfulgt af omrystning eller omrøring i 15 minutter (4.1). Opløsningen filtreres gennem et glasfiberfiltrerpapir (4.2).
      En alikvot mængde af filtratet fortyndes med blandingen af vand og methanol-acetonitril (3.12) til en endelig carbadoxkoncentration på 10-15 μg/ml (for en 10 % tilberedning er fortyndingsfaktoren 10). En alikvot mængde filtreres gennem et 0,45 μm filter (4.6).
      Der fortsættes med HPLC-bestemmelse (5.4).
      5.3.   Oprensning
      5.3.1.   Klargøring af aluminiumoxidkolonnen
      
      Der afvejes 4 g aluminiumoxid (3.4), som overføres til glaskolonnen (4.3).
      5.3.2.   Prøveoprensning
      
      Der sættes 15 ml af den filtrerede ekstrakt (5.2.1) på aluminiumoxidsøjlen, og de første 2 ml eluat kasseres. De næste 5 ml opsamles, og en alikvot mængde filtreres gennem et 0,45 μm filter (4.6).
      Der fortsættes med HPLC-bestemmelse (5.4).
      5.4.   HPLC-bestemmelse
      5.4.1.   Parametre
      
      Følgende betingelser er vejledende; andre betingelser kan benyttes, forudsat at de giver tilsvarende resultater:
      
                   
               
               
                   
               
            
                  HPLC-kolonne (4.1.1):
               
               
                  300 mm × 4 mm, C18, 10 μmpakkemateriale, eller tilsvarende
               
            
                  Mobil fase (3.10):
               
               
                  Blanding af acetatbufferopløsning (3.9) og acetonitril (3.2), 825 + 175 (v + v)
               
            
                  Flow:
               
               
                  1,5–2 ml/minuttet
               
            
                  Detektionsbølgelængde:
               
               
                  365 nm
               
            
                  Injektionsvolumen:
               
               
                  20 μl.
               
            Kromatografisystemets stabilitet kontrolleres, ved at der flere gange indsprøjtes kalibreringsopløsning (3.11.2) med 5,0 μg/ml, indtil der opnås konstante tophøjder (-arealer) og retentionstider.
      5.4.2.   Kalibreringskurve
      
      Hver kalibreringsopløsning (3.11.2) indsprøjtes flere gange, og tophøjderne (-arealerne) bestemmes for hver koncentration. Der tegnes en kalibreringskurve med kalibreringsopløsningernes middeltophøjder eller -arealer som ordinat og de tilsvarende koncentrationer i μg/ml som abscisse.
      5.4.3.   Prøveopløsning
      
      Prøveekstraktet ((5.3.2) for foder, (5.2.2) for forblandinger og (5.2.3) for tilberedninger) indsprøjtes flere gange, og middeltophøjden (-arealet) for carbadoxtoppene bestemmes.
      6.   Beregning af resultater
      Ud fra middelhøjden (-arealet) af prøveopløsningens carbadoxtoppe bestemmes carbadoxkoncentrationen i prøveopløsningen i μg/ml ved benyttelse af kalibreringskurven (5.4.2).
      6.1.   Foder
      Indholdet af carbadox w (mg/kg) i prøven beregnes efter følgende formel:
      
          [mg/kg]
      hvor:
      
                  c
               
               
                  =
               
               
                  carbadoxkoncentrationen i prøveekstraktet (5.3.2) i μg/ml
               
            
                  V1
                  
               
               
                  =
               
               
                  ekstraktionsvolumen i ml (dvs. 50)
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  testportionens vægt i gram.
               
            6.2.   Forblandinger og tilberedninger
      Indholdet af carbadox w (mg/kg) i prøven beregnes efter følgende formel:
      
          [mg/kg]
      hvor:
      
                  c
               
               
                  =
               
               
                  carbadoxkoncentrationen i prøveekstraktet (5.2.2 eller 5.2.3) i μg/ml
               
            
                  V2
                  
               
               
                  =
               
               
                  ekstraktionsvolumen i ml (dvs. 50 for forblandinger; 150 for tilberedninger)
               
            
                  f
               
               
                  =
               
               
                  fortyndingsfaktor ifølge 5.2.2 (forblandinger) eller 5.2.3 (tilberedninger)
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  testportionens vægt i gram.
               
            7.   Validering af resultater
      7.1.   Identitet
      Analyttens identitet kan bekræftes ved ko-kromatografi eller ved at benytte en diodearraydetektor, hvormed spektrene for prøveekstraktet og kalibreringsopløsningen (3.11.2) indeholdende 10,0 μg/ml sammenlignes.
      7.1.1.   Ko-kromatografi
      
      Et prøveekstrakt spikes ved tilsætning af en passende mængde kalibreringsopløsning (3.11.2). Den tilsatte mængde carbadox skal svare til den skønnede mængde carbadox, der er fundet i prøveekstraktet.
      Kun højden af carbadoxtoppen må være blevet øget, efter at der er taget hensyn til både den tilsatte mængde og fortyndingen af ekstraktet. Toppens bredde skal i den halve højde ligge inden for ca. 10 % af den oprindelige bredde.
      7.1.2.   Diodearraydetektion
      
      Resultaterne vurderes i overensstemmelse med følgende kriterier:
      
                  a)
               
               
                  Den maksimale absorptionsbølgelængde for prøvens og standardens spektre, målt ved toppens spids på kromatogrammet, skal være den samme inden for en margin, der afhænger af detektionssystemets opløsningsevne. For diodearraydetektion ligger denne typisk inden for ± 2 nm.
               
            
                  b)
               
               
                  Mellem 225 og 400 nm må prøvens og standardens spektre registreret ved toppens spids på kromatogrammet ikke være forskellige fra hinanden i de dele af spektret, der ligger inden for 10–100 % relativ absorbans. Dette kriterium er opfyldt, når de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem de to spektre i intet observeret punkt overstiger 15 % af standardanalyttens absorbans.
               
            
                  c)
               
               
                  Mellem 225 og 400 nm må spektrene ved toppens forside, spids og bagside frembragt med prøveekstraktet ikke være forskellige fra hinanden i de dele af spektret, der ligger inden for 10-100 % relativ absorbans. Dette kriterium er opfyldt, når de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem spektrene i intet observeret punkt overstiger 15 % af spektrets absorbans i spidsen.
               
            Hvis et af disse kriterier ikke er opfyldt, er analyttens tilstedeværelse ikke bekræftet.
      7.2.   Repeterbarhed
      For indhold på 10 mg/kg og derover må forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve ikke overstige 15 % i relativ værdi (af det højeste resultat).
      7.3.   Genfinding
      For en spiket (blind)prøve skal genfindingen være mindst 90 %.
      8.   Resultater af ringanalyse
      Der er gennemført en ringanalyse, hvor 6 foderstoffer, 4 forblandinger og 3 tilberedninger blev analyseret af 8 laboratorier. Der blev foretaget dobbeltanalyse af hver prøve (Journal of the AOAC, bind 71, 1988, s. 484–490, indeholder nærmere oplysninger om denne ringanalyse). Resultaterne (ekskl. outliers) er vist nedenfor:
      Skema 1
      Resultater fra ringanalysen af foder
      
                   
               
               
                  Prøve 1
               
               
                  Prøve 2
               
               
                  Prøve 3
               
               
                  Prøve 4
               
               
                  Prøve 5
               
               
                  Prøve 6
               
            
                  L
               
               
                  8
               
               
                  8
               
               
                  8
               
               
                  8
               
               
                  8
               
               
                  8
               
            
                  n
               
               
                  15
               
               
                  14
               
               
                  15
               
               
                  15
               
               
                  15
               
               
                  15
               
            
                  Middelværdi (mg/kg)
               
               
                  50,0
               
               
                  47,6
               
               
                  48,2
               
               
                  49,7
               
               
                  46,9
               
               
                  49,7
               
            
                  Sr (mg/kg)
               
               
                  2,90
               
               
                  2,69
               
               
                  1,38
               
               
                  1,55
               
               
                  1,52
               
               
                  2,12
               
            
                  CVr ( %)
               
               
                  5,8
               
               
                  5,6
               
               
                  2,9
               
               
                  3,1
               
               
                  3,2
               
               
                  4,3
               
            
                  SR (mg/kg)
               
               
                  3,92
               
               
                  4,13
               
               
                  2,23
               
               
                  2,58
               
               
                  2,26
               
               
                  2,44
               
            
                  CVR ( %)
               
               
                  7,8
               
               
                  8,7
               
               
                  4,6
               
               
                  5,2
               
               
                  4,8
               
               
                  4,9
               
            
                  Nominelt indhold (mg/kg)
               
               
                  50,0
               
               
                  50,0
               
               
                  50,0
               
               
                  50,0
               
               
                  50,0
               
               
                  50,0
               
            
         
      Skema 2
      Resultater fra ringanalysen af forblandinger og tilberedninger
      
                   
               
               
                  Forblandinger
               
               
                  Tilberedninger
               
            
                  A
               
               
                  B
               
               
                  C
               
               
                  D
               
               
                  A
               
               
                  B
               
               
                  C
               
            
                  L
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  7
               
               
                  8
               
               
                  8
               
               
                  8
               
            
                  n
               
               
                  14
               
               
                  14
               
               
                  14
               
               
                  14
               
               
                  16
               
               
                  16
               
               
                  16
               
            
                  Middelværdi (g/kg)
               
               
                  8,89
               
               
                  9,29
               
               
                  9,21
               
               
                  8,76
               
               
                  94,6
               
               
                  98,1
               
               
                  104
               
            
                  Sr (g/kg)
               
               
                  0,37
               
               
                  0,28
               
               
                  0,28
               
               
                  0,44
               
               
                  4,1
               
               
                  5,1
               
               
                  7,7
               
            
                  CVr ( %)
               
               
                  4,2
               
               
                  3,0
               
               
                  3,0
               
               
                  5,0
               
               
                  4,3
               
               
                  5,2
               
               
                  7,4
               
            
                  SR (g/kg)
               
               
                  0,37
               
               
                  0,28
               
               
                  0,40
               
               
                  0,55
               
               
                  5,4
               
               
                  6,4
               
               
                  7,7
               
            
                  CVR ( %)
               
               
                  4,2
               
               
                  3,0
               
               
                  4,3
               
               
                  6,3
               
               
                  5,7
               
               
                  6,5
               
               
                  7,4
               
            
                  Nominelt indhold (g/kg)
               
               
                  10,0
               
               
                  10,0
               
               
                  10,0
               
               
                  10,0
               
               
                  100
               
               
                  100
               
               
                  100
               
            
                  L
               
               
                  =
               
               
                  antal laboratorier
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  antal enkeltværdier
               
            
                  Sr
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for repeterbarhed
               
            
                  CVr
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for repeterbarhed
               
            
                  SR
               
               
                  =
               
               
                  standardafvigelse for reproducerbarhed
               
            
                  CVR
               
               
                  =
               
               
                  variationskoefficient for reproducerbarhed.
               
            
   
      BILAG IX
      SAMMENLIGNINGSTABELLER, JF. ARTIKEL 6
      1.   Direktiv 71/250/EØF
      
                  Direktiv 71/250/EØF
               
               
                  Denne forordning
               
            
                  Artikel 1, stk. 1
               
               
                  Artikel 3
               
            
                  Artikel 1, stk. 2
               
               
                  Artikel 2
               
            
                  Artikel 2
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 3
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget, del 1
               
               
                  Bilag II
               
            
                  Bilaget, del 2
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget, del 3
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget, del 4
               
               
                  Bilag III, del O
               
            
                  Bilaget, del 5
               
               
                  Bilag III, del M
               
            
                  Bilaget, del 6
               
               
                  Bilag III, del N
               
            
                  Bilaget, del 7
               
               
                  Bilag III, del Q
               
            
                  Bilaget, del 9
               
               
                  Bilag III, del K
               
            
                  Bilaget, del 10
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget, del 11
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget, del 12
               
               
                  Bilag III, del J
               
            
                  Bilaget, del 14
               
               
                  Bilag III, del D
               
            
                  Bilaget, del 16
               
               
                  —
               
            2.   Direktiv 71/393/EØF
      
                  Direktiv 71/393/EØF
               
               
                  Denne forordning
               
            
                  Artikel 1
               
               
                  Artikel 3
               
            
                  Artikel 2
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 3
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget, del I
               
               
                  Bilag III, del A
               
            
                  Bilaget, del II
               
               
                  Bilag III, del E
               
            
                  Bilaget, del III
               
               
                  Bilag III, del P
               
            
                  Bilaget, del IV
               
               
                  Bilag III, del H
               
            3.   Direktiv 72/199/EØF
      
                  Direktiv 72/199/EØF
               
               
                  Denne forordning
               
            
                  Artikel 1
               
               
                  Artikel 3
               
            
                  Artikel 2
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 3
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 4
               
               
                  —
               
            
                  Bilag I, del 1
               
               
                  Bilag III, del L
               
            
                  Bilag I, del 2
               
               
                  Bilag III, del C
               
            
                  Bilag I, del 3
               
               
                  —
               
            
                  Bilag I, del 4
               
               
                  —
               
            
                  Bilag I, del 5
               
               
                  Bilag V, del A
               
            
                  Bilag II
               
               
                  —
               
            4.   Direktiv 73/46/EØF
      
                  Direktiv 73/46/EØF
               
               
                  Denne forordning
               
            
                  Artikel 1
               
               
                  Artikel 3
               
            
                  Artikel 3
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 4
               
               
                  —
               
            
                  Bilag I, del 1
               
               
                  Bilag III, del B
               
            
                  Bilag I, del 2
               
               
                  —
               
            
                  Bilag I, del 3
               
               
                  Bilag III, del I
               
            5.   Direktiv 76/371/EØF
      
                  Direktiv 76/371/EØF
               
               
                  Denne forordning
               
            
                  Artikel 1
               
               
                  Artikel 1
               
            
                  Artikel 2
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 3
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget
               
               
                  Bilag I
               
            6.   Direktiv 76/372/EØF
      
                  Direktiv 76/372/EØF
               
               
                  Denne forordning
               
            
                  Artikel 1
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 2
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 3
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget
               
               
                  —
               
            7.   Direktiv 78/633/EØF
      
                  Direktiv 78/633/EØF
               
               
                  Denne forordning
               
            
                  Artikel 1
               
               
                  Artikel 3
               
            
                  Artikel 2
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 3
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget, del 1
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget, del 2
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget, del 3
               
               
                  Bilag IV, del C
               
            8.   Direktiv 81/715/EØF
      
                  Direktiv 81/715/EØF
               
               
                  Denne forordning
               
            
                  Artikel 1
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 2
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 3
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget
               
               
                  —
               
            9.   Direktiv 84/425/EØF
      
                  Direktiv 84/425/EØF
               
               
                  Denne forordning
               
            
                  Artikel 1
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 2
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 3
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget
               
               
                  —
               
            10.   Direktiv 86/174/EØF
      
                  Direktiv 86/174/EØF
               
               
                  Denne forordning
               
            
                  Artikel 1
               
               
                  Artikel 4
               
            
                  Artikel 2
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 3
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget
               
               
                  Bilag VII
               
            11.   Direktiv 93/70/EØF
      
                  Direktiv 93/70/EØF
               
               
                  Denne forordning
               
            
                  Artikel 1
               
               
                  Artikel 3
               
            
                  Artikel 2
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 3
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget
               
               
                  Bilag IV, del D
               
            12.   Direktiv 93/117/EF
      
                  Direktiv 93/117/EF
               
               
                  Denne forordning
               
            
                  Artikel 1
               
               
                  Artikel 3 og 5
               
            
                  Artikel 2
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 3
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget, del 1
               
               
                  Bilag IV, del E
               
            
                  Bilaget, del 2
               
               
                  Bilag VIII, del A
               
            13.   Direktiv 98/64/EF
      
                  Direktiv 98/64/EF
               
               
                  Denne forordning
               
            
                  Artikel 1
               
               
                  Artikel 3 og 5
               
            
                  Artikel 2
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 3
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 4
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget, del A
               
               
                  Bilag III, del F
               
            
                  Bilaget, del C
               
               
                  Bilag VIII, del B
               
            14.   Direktiv 1999/27/EF
      
                  Direktiv 1999/27/EF
               
               
                  Denne forordning
               
            
                  Artikel 1
               
               
                  Artikel 3 og 5
               
            
                  Artikel 2
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 3
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 4
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 5
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 6
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 7
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget, del A
               
               
                  Bilag VIII, del C
               
            
                  Bilaget, del B
               
               
                  Bilag IV, del F
               
            
                  Bilaget, del C
               
               
                  Bilag VIII, del D
               
            15.   Direktiv 1999/76/EF
      
                  Direktiv 1999/76/EF
               
               
                  Denne forordning
               
            
                  Artikel 1
               
               
                  Artikel 3
               
            
                  Artikel 2
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 3
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 4
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget
               
               
                  Bilag IV, del G
               
            16.   Direktiv 2000/45/EF
      
                  Direktiv 2000/45/EF
               
               
                  Denne forordning
               
            
                  Artikel 1
               
               
                  Artikel 3
               
            
                  Artikel 2
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 3
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 4
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget, del A
               
               
                  Bilag IV, del A
               
            
                  Bilaget, del B
               
               
                  Bilag IV, del B
               
            
                  Bilaget, del C
               
               
                  Bilag III, del G
               
            17.   Direktiv 2002/70/EF
      
                  Direktiv 2002/70/EF
               
               
                  Denne forordning
               
            
                  Artikel 1
               
               
                  Artikel 1
               
            
                  Artikel 2
               
               
                  Artikel 2 og 3
               
            
                  Artikel 3
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 4
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 5
               
               
                  —
               
            
                  Bilag I
               
               
                  Bilag I og bilag V, del B, afsnit I
               
            
                  Bilag II
               
               
                  Bilag II og bilag V, del B, afsnit II
               
            18.   Direktiv 2003/126/EF
      
                  Direktiv 2003/126/EF
               
               
                  Denne forordning
               
            
                  Artikel 1
               
               
                  Artikel 3
               
            
                  Artikel 2
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 3
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 4
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 5
               
               
                  —
               
            
                  Artikel 6
               
               
                  —
               
            
                  Bilaget
               
               
                  Bilag VI