CELEX: 31999L0027
Language: el
Date: 1999-04-20 00:00:00
Title: Οδηγία 1999/27/ΕΚ της Επιτροπής, της 20ής Απριλίου 1999, σχετικά με την καθιέρωση κοινοτικών μεθόδων ανάλυσης για τον προσδιορισμό του αμπρολίου, του diclazuril και του carbadox σε ζωοτροφές και την τροποποίηση των οδηγιών 71/250/ΕΟΚ, 73/46/ΕΟΚ και την κατάργηση της οδηγίας 74/203/ΕΟΚ (Κείμενο που παρουσιάζει ενδιαφέρον για τον ΕΟΧ)

Avis juridique important

|

31999L0027

Οδηγία 1999/27/ΕΚ της Επιτροπής, της 20ής Απριλίου 1999, σχετικά με την καθιέρωση κοινοτικών μεθόδων ανάλυσης για τον προσδιορισμό του αμπρολίου, του diclazuril και του carbadox σε ζωοτροφές και την τροποποίηση των οδηγιών 71/250/ΕΟΚ, 73/46/ΕΟΚ και την κατάργηση της οδηγίας 74/203/ΕΟΚ (Κείμενο που παρουσιάζει ενδιαφέρον για τον ΕΟΧ)  

Επίσημη Εφημερίδα αριθ. L 118 της 06/05/1999 σ. 0036 - 0052

ΟΔΗΓΙΑ 1999/27/ΕΚ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣτης 20ής Απριλίου 1999σχετικά με την καθιέρωση κοινοτικών μεθόδων ανάλυσης για τον προσδιορισμό του αμπρολίου, του diclazuril και του carbadox σε ζωοτροφές και την τροποποίηση των οδηγιών 71/250/ΕΟΚ, 73/46/ΕΟΚ και την κατάργηση της οδηγίας 74/203/ΕΟΚ(Κείμενο που παρουσιάζει ενδιαφέρον για τον ΕΟΧ)Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,Έχοντας υπόψη:τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Κοινότητας,την οδηγία 70/373/ΕΟΚ του Συμβουλίου, της 20ής Ιουλίου 1970, περί εισαγωγής τρόπων λήψεως δειγμάτων και μεθόδων κοινοτικής αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών(1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την πράξη προσχώρησης της Αυστρίας, της Φινλανδίας και της Σουηδίας, και ιδίως το άρθρο 2,Εκτιμώντας:(1) ότι η οδηγία 70/373/ΕΟΚ ορίζει ότι οι επίσημοι έλεγχοι των ζωοτροφών που έχουν σκοπό να διαπιστώσουν την τήρηση των όρων που αναφέρονται στις νομοθετικές, κανονιστικές και διοικητικές διατάξεις που αφορούν την ποιότητα και τη σύνθεσή τους πρέπει να γίνονται σύμφωνα με κοινοτικούς τρόπους λήψεως δειγμάτων και μεθόδους αναλύσεως·(2) ότι η οδηγία 70/524/ΕΟΚ του Συμβουλίου, της 23ης Νοεμβρίου 1970, περί των προσθέτων υλών στη διατροφή των ζώων(2), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 45/1999 της Επιτροπής(3), ορίζει ότι εφόσον σε προμείγματα και ζωοτροφές έχει προστεθεί αμπρόλιο και diclazuril, στην επισήμανση πρέπει να αναφέρεται η περιεκτικότητά τους· ότι με τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 2788/98 της Επιτροπής, της 22ας Δεκεμβρίου 1998, περί τροποποιήσεως της οδηγίας 70/524/ΕΟΚ του Συμβουλίου όσον αφορά τις πρόσθετες ύλες στις ζωοτροφές, αναφορικώς με την ανάκληση της άδειας χρησιμοποίησης ορισμένων αυξητικών παραγόντων(4), ανεκλήθη η άδεια χρήσης του carbadox ως πρόσθετης ύλης στις ζωοτροφές, και είναι αναγκαίος επίσημος έλεγχος για ενδεχόμενη παράνομη χρήση απαγορευμένων ουσιών·(3) ότι πρέπει να καθιερωθούν κοινοτικές μέθοδοι ανάλυσης για τον έλεγχο αυτών των ουσιών·(4) ότι η πρώτη οδηγία 71/250/ΕΟΚ της Επιτροπής, της 15ης Ιουνίου 1971, περί καθορισμού κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο ζωοτροφών(5), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την οδηγία 98/54/ΕΚ(6), καθορίζει μεθόδους ανάλυσης για, μεταξύ άλλων, τον προσδιορισμό του σιναπέλαιου και της θεοβρωμίνης· ότι, υπό το φως των εξελίξεων των επιστημονικών και τεχνικών γνώσεων, οι περιγραφόμενες μέθοδοι δεν είναι πλέον έγκυρες για τον επιδιωκόμενο σκοπό τους· ότι, ως εκ τούτου, πρέπει να καταργηθούν αυτές οι μέθοδοι·(5) ότι η τέταρτη οδηγία 73/46/ΕΟΚ της Επιτροπής, της 5ης Δεκεμβρίου 1972, περί καθορισμού κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο ζωοτροφών(7), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την οδηγία 98/54/ΕΚ, καθορίζει μεθόδους ανάλυσης για, μεταξύ άλλων, τον προσδιορισμό της ρετινόλης (βιταμίνη Α)· ότι, υπό το φως των εξελίξεων των επιστημονικών και τεχνικών γνώσεων, η περιγραφόμενη μέθοδος δεν είναι πλέον έγκυρη για τον επιδιωκόμενο σκοπό· ότι, ως εκ τούτου, πρέπει να καταργηθεί η μέθοδος για τη ρετινόλη·(6) ότι η πέμπτη οδηγία 74/203/ΕΟΚ της Επιτροπής, της 25ης Μαρτίου 1974, περί καθορισμού κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών(8), όπως τροποποιήθηκε από την οδηγία 81/680/ΕΟΚ(9), καθορίζει μεθόδους αναλύσεως για τον προσδιορισμό του αμύλου και προϊόντων αποικοδόμησης του αμύλου μεγάλου μοριακού βάρους στις ζωοτροφές, οι οποίες περιέχουν τεμαχίδια, πούλπα, αποξηραμένα φύλλα ή "κορυφές" τεύτλων, πούλπα πατατών, αποξηραμένη ζύμη, προϊόντα πλούσια σε ινουλίνη ή υπόλοιπα τήξης λίπους, ethopabate, dinitolmide, νικαρβαζίνης και μεναδιόνης (βιταμίνη Κ3)· ότι, υπό το φως των εξελίξεων των επιστημονικών και τεχνικών γνώσεων, όλες οι μέθοδοι που περιγράφονται σε αυτήν την οδηγία δεν είναι πλέον έγκυρες για την επίτευξη του επιδιωκόμενου σκοπού· ότι, ως εκ τούτου, πρέπει να καταργηθεί η εν λόγω οδηγία·(7) ότι τα μέτρα που προβλέπονται στην παρούσα οδηγία είναι σύμφωνα με τη γνώμη της μόνιμης επιτροπής για τις ζωοτροφές,ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΟΔΗΓΙΑ:Άρθρο 1Τα κράτη μέλη προβλέπουν ώστε οι αναλύσεις για τον επίσημο έλεγχο της περιεκτικότητας των ζωοτροφών και των προμειγμάτων σε αμπρόλιο, diclazuril και carbadox να πραγματοποιούνται με τις μεθόδους που καθορίζονται στο παράρτημα.Άρθρο 2Η οδηγία 71/250/ΕΟΚ τροποποιείται ως εξής1. Στο άρθρο 1 διαγράφονται οι λέξεις "σιναπελαίου" και "θεοβρωμίνης".2. Διαγράφονται τα σημεία 8 και 13 του παραρτήματος.Άρθρο 3Η οδηγία 73/46/ΕΟΚ τροποποιείται ως εξής:1. Το άρθρο 2 διαγράφεται.2. Το παράρτημα ΙΙ διαγράφεται.Άρθρο 4Η πέμπτη οδηγία 74/203/ΕΟΚ καταργείται.Άρθρο 5Τα κράτη μέλη θέτουν σε ισχύ, το αργότερο μέχρι την 31η Οκτωβρίου 1999, τις νομοθετικές, κανονιστικές και διοικητικές διατάξεις που είναι αναγκαίες για τη συμμόρφωσή τους με την παρούσα οδηγία. Ενημερώνουν αμέσως σχετικά την Επιτροπή.Τα κράτη μέλη εφαρμόζουν τα μέτρα αυτά από την 1η Νοεμβρίου 1999.Όταν οι εν λόγω διατάξεις θεσπίζονται από τα κράτη μέλη, περιέχουν παραπομπή στην παρούσα οδηγία ή συνοδεύονται από σχετική παραπομπή κατά την επίσημη δημοσίευσή τους. Οι λεπτομέρειες της παραπομπής αυτής καθορίζονται από τα κράτη μέλη.Άρθρο 4Η παρούσα οδηγία αρχίζει να ισχύει την εικοστή ημέρα από τη δημοσίευσή της στην Επίσημη Εφημερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων.Άρθρο 5Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα κράτη μέλη.Βρυξέλλες, 20 Απριλίου 1999.Για την ΕπιτροπήFranz FISCHLERΜέλος της Επιτροπής(1) ΕΕ L 170 της 3.8.1970, σ. 2.(2) ΕΕ L 270 της 14.12.1970, σ. 1.(3) ΕΕ L 6 της 12.1.1999, σ. 3.(4) ΕΕ L 347 της 23.12.1998, σ. 31.(5) ΕΕ L 155 της 12.7.1971, σ. 13.(6) ΕΕ L 208 της 24.7.1998, σ. 49.(7) ΕΕ L 83 της 30.3.1973, σ. 21.(8) ΕΕ L 108 της 22.4.1974, σ. 7.(9) ΕΕ L 246 της 29.8.1981, σ. 32.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑΜΕΡΟΣ ΑΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΜΠΡΟΛΙΟΥΥδροχλωρικό άλας του χλωριούχου 1-[(4-αμινο-2-προπυλοπυρυριμιδιν-5-υλο)μεθυλο]-2-μεθυλο-πυριδινίου1. Σκοπός και πεδίο εφαρμογήςΗ παρούσα μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό του αμπρολίου σε ζωοτροφές και προμείγματα. Το όριο ανίχνευσης είναι 1 mg/kg, το όριο προσδιορισμού είναι 25 mg/kg.2. ΑρχήΤο δείγμα εκχυλίζεται με μείγμα μεθανόλης-νερού. Έπειτα από αραίωση με την κινητή φάση και διήθηση μέσω φίλτρου μεμβράνης, το περιεχόμενο αμπρόλιο προσδιορίζεται με κατιοανταλλακτική υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) με χρήση ανιχνευτή υπεριώδους.3. Αντιδραστήρια3.1. Μεθανόλη3.2. Ακετονιτρίλιο καθαρότητας HPLC3.3. Νερό καθαρότητας HPLC3.4. Διάλυμα δισόξινου φωσφορικού νατρίου, c = 0,1 mol/l13,80 g μονοένυδρου δισόξινου φωσφορικού νατρίου διαλύονται σε νερό (3.3) σε ογκομετρική φιάλη των 1000 ml, το διάλυμα συμπληρώνεται με νερό (3.3) μέχρι τη χαραγή και ανακινείται.3.5. Διάλυμα υπερχλωρικού νατρίου, c = 1,6 mol/l224,74 g μονοένυδρου υπερχλωρικού νατρίου διαλύονται σε νερό (3.3) σε ογκομετρική φιάλη των 1000 ml, το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με νερό (3.3) και ανακινείται.3.6. Κινητή φάση για την HPLC (βλέπε παρατήρηση 9.1).Μείγμα ακετονιτριλίου (3.2), διαλύματος δισόξινου φωσφορικού νατρίου (3.4) και διαλύματος υπερχλωρικού νατρίου (3.5), 450 + 450 + 100 (v+v+v). Πριν από τη χρήση, διηθείται διαμέσου διηθητικής μεμβράνης πάχους 0,22 μm (4.3) και το διάλυμα απαεριώνεται [π.χ. σε λουτρό υπερήχων (4.4) για 15 λεπτά τουλάχιστον].3.7. Πρότυπη ουσία: καθαρό αμπρόλιο, υδροχλωρικό άλας χλωριούχου 1-[(4-αμινο-2-προπυλοπυριμιδιν-5-υλο)μεθυλο]-2-μεθυλο-πυριδινίου, Ε 750 (βλέπε σημείο 9.2)3.7.1. Αρχικό πρότυπο διάλυμα αμπρολίου, 500 μg/mlΣε ογκομετρική σφαιρική φιάλη των 100 ml, ζυγίζονται με ακρίβεια 0,1 mg, 50 mg αμπρολίου (3.7), διαλύονται σέ 80 ml μεθανόλης (3.1) και η φιάλη τοποθετείται για 10 min σε λουτρό υπερήχων (4.4). Στη συνέχεια, το διάλυμα φέρεται σε θερμοκρασία δωματίου, συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με νερό και ανακινείται. Σε θερμοκρασία &lt;=4 °C το διάλυμα είναι σταθερό για ένα μήνα.3.7.2. Ενδιάμεσο πρότυπο διάλυμα αμπρολίου, 50 μg/ml5,0 ml του αρχικού πρότυπου διαλύματος (3.7.1) παραλαμβάνονται με σιφώνιο και φέρονται σε ογκομετρική φιάλη των 50 ml, το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με το διαλύτη εκχυλίσεως (3.8) και ανακινείται. Σε θερμοκρασία &lt;=4 °C το διάλυμα είναι σταθερό για ένα μήνα.3.7.3. Διαλύματα βαθμονόμησης0,5, 1,0 και 2,0 ml του ενδιαμέσου πρότυπου διαλύματος (3.7.2) μεταφέρονται σε μια σειρά ογκομετρικών φιαλών των 50 ml. Συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με την κινητή φάση (3.6) και ανακινούνται. Τα διαλύματα αυτά αντιστοιχούν σε 0,5, 1,0 και 2,0 μg αμπρολίου ανά ml αντιστοίχως. Τα διαλύματα αυτά πρέπει να ετοιμάζονται λίγο πριν να χρησιμοποιηθούν.3.8. Διαλύτης εκχυλίσεωςΜείγμα μεθανόλης (3.1)-νερού 2 + 1 (v+v)4. Συσκευές4.1. Εξοπλισμός HPLC με σύστημα εγχύσεως, κατάλληλο για έγχυση όγκων 100 μl4.1.1. Στήλη υγρής χρωματογραφίας 125 mm x 4 mm, κατιοανταλλακτικό υλικό πλήρωσης Nucleosil 10 SA, 10 μm, ή ισοδύναμη4.1.2. Ανιχνευτής UV με δυνατότητα ρύθμισης σε διάφορα μήκη κύματος ή με διάταξη διόδων4.2. Φίλτρο μεμβράνης, υλικό PTFE, 0,45 μm4.3. Φίλτρο μεμβράνης, 0,22 μm4.4. Λουτρό υπερήχων4.5. Συσκευή μηχανικής ανακίνησης ή μαγνητικός αναδευτήρας5. Διαδικασία5.1. Γενικά5.1.1. ΤυφλόΓια την εκτέλεση της δοκιμής ανάκτησης (5.1.2), θα πρέπει να διενεργείται ανάλυση τυφλού ώστε να ελέγχεται ότι δεν υπάρχει ούτε αμπρόλιο ούτε κάποια άλλη παρεμποδίζουσα ουσία. Το τυφλό δείγμα θα πρέπει να είναι παρόμοιου τύπου με εκείνον του δείγματος και δεν θα πρέπει να ανιχνεύονται σε αυτό αμπρόλιο ή άλλες παρεμποδίζουσες ουσίες.5.1.2. Δοκιμή ανάκτησης,Θα πρέπει να πραγματοποιείται δοκιμή ανάκτησης υποβάλλοντας σε ανάλυση τυφλό δείγμα εμπλουτισμένο με προσθήκη ποσότητας αμπρολίου, παρόμοιας με εκείνη που υπάρχει στο δείγμα. Για εμπλουτισμό μέχρι 100 mg/kg, 10,0 ml του αρχικού πρότυπου διαλύματος (3.7.1) μεταφέρονται σε κωνική φιάλη των 250 ml και το διάλυμα εξατμίζεται μέχρις όγκου περίπου 0,5 ml. Προστίθενται 50 g του τυφλού, αναμειγνύονται επισταμένως και αφήνονται για 10 λεπτά αναμειγνύοντας πάλι μερικές φορές πριν προχωρήσουμε στο στάδιο της εκχυλίσεως (5.2).Εναλλακτικώς, εφόσον δεν υπάρχει διαθέσιμο τυφλό παρόμοιου τύπου με το δείγμα (βλέπε σημείο 5.1.1 ), δοκιμή ανάκτησης μπορεί να γίνει μέσω της μεθόδου προσθήκης προτύπου. Στην περίπτωση αυτή, το προς ανάλυση δείγμα εμπλουτίζεται με ποσότητα αμπρολίου παρόμοια με εκείνη που υπάρχει ήδη στο δείγμα. Το δείγμα αυτό αναλύεται παράλληλα με το μη εμπλουτισμένο δείγμα και η ανάκτηση μπορεί να υπολογιστεί με αφαίρεση.5.2. Εκχύλιση5.2.1. Προμείγματα (περιεκτικότητα &lt;  1 % σε αμπρόλιο) και ζωοτροφέςΣε κωνική φιάλη των 500 ml, ζυγίζονται με ακρίβεια 0,01 g, 5-40 g του δείγματος ανάλογα με την περιεκτικότητα σε αμπρόλιο και προστίθενται 200 ml διαλύτη εκχυλίσεως (3.8). Η φιάλη τοποθετείται στο λουτρό υπερήχων (4.4) και αφήνεται για 15 λεπτά. Η φιάλη απομακρύνεται από το λουτρό και ανακινείται για 1 ώρα στο μηχανικό τάρακτρο ή αναδεύεται στο μαγνητικό αναδευτήρα (4.5). Κατάλληλη ποσότητα του εκχυλίσματος αραιώνεται με την κινητή φάση (3.6) μέχρι περιεκτικότητας σε αμπρόλιο 0,5-2 μg/ml και αναμειγνύεται (βλέπε σημείο 9.3). 5-10 ml του αραιωμένου αυτού διαλύματος διηθούνται διαμέσου μεμβράνης (4.2). Ακολουθεί προσδιορισμός με HPLC (5.3).5.2.2. Προμείγματα (περιεκτικότητα &gt;=1 % σε αμπρόλιο)Σε κωνική φιάλη των 500 ml ζυγίζονται με ακρίβεια 0,001 g, 1-4 g του προμείγματος ανάλογα με την περιεκτικότητα σε αμπρόλιο και προστίθενται 200 ml διαλύτη εκχυλίσεως (3.8). Η φιάλη τοποθετείται σε λουτρό υπερήχων (4.4) και αφήνεται για 15 λεπτά. Η φιάλη απομακρύνεται από το λουτρό και ανακινείται για 1 ώρα στο μηχανικό τάρακτρο ή αναδεύεται στο μαγνητικό αναδευτήρα (4.5). Κατάλληλη ποσότητα του εκχυλίσματος αραιώνεται με την κινητή φάση (3.6) μέχρι περιεκτικότητας σε αμπρόλιο 0,5--2 μg/ml και αναμειγνύεται. 5-10 ml του αραιωμένου αυτού διαλύματος διηθούνται διαμέσου μεμβράνης (4.2). Ακολουθεί προσδιορισμός με HPLC (5.3).5.3. Προσδιορισμός με HPLC5.3.1. ΠαράμετροιΠαρακάτω, δίδονται ενδεικτικά ορισμένες κατάλληλες συνθήκες. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και διαφορετικές συνθήκες εφόσον παρέχουν ισοδύναμα αποτελέσματα.>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>Ελέγχεται η σταθερότητα του χρωματογραφικού συστήματος, εγχύοντας μερικές φορές το διάλυμα βαθμονόμησης (3.7.3) που περιέχει 1,0 μg/ml, μέχρι να σταθεροποιηθούν τα ύψη των κορυφών και οι χρόνοι κατακράτησης.5.3.2. Καμπύλη αναφοράς,Κάθε διάλυμα βαθμονόμησης (3.7.3) εγχύεται μερικές φορές και προσδιορίζεται το μέσο ύψος (εμβαδόν) της κορυφής κάθε συγκέντρωσης. Χαράσσεται καμπύλη αναφοράς χρησιμοποιώντας ως τεταγμένες τα μέσα ύψη (εμβαδά) των κορυφών των διαλυμάτων βαθμονόμησης και ως τετμημένες τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις σε μg/ml.5.3.3. Διάλυμα δείγματος,Εγχύεται μερικές φορες το εκχύλισμα του δείγματος (5.2) χρησιμοποιώντας τον ίδιο όγκο με εκείνο των διαλυμάτων βαθμονόμησης και προσδιορίζεται το μέσο ύψος (εμβαδόν) των κορυφών του αμπρολίου.6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτωνΑπό το μέσο ύψος (εμβαδόν) των κορυφών του αμπρολίου του διαλύματος του δείγματος προσδιορίζεται η περιεκτικότητα στο διάλυμα του δείγματος σε μg/ml βάσει της καμπύλης αναφοράς (5.3.2).Η συγκέντρωση w σε mg/kg του αμπρολίου στο δείγμα δίδεται από τον ακόλουθο τύπο:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>[mg/kg]όπου:V= όγκος του διαλύτη εκχύλισης (3.8) σε ml σύμφωνα με το 5.2 (δηλαδή 200 ml),β= συγκέντρωση αμπρολίου στο εκχύλισμα δείγματος (5.2) σε μg/ml,f= συντελεστής αραιώσεως σύμφωνα με το 5.2,m= μάζα του δείγματος δοκιμής σε g.7. Επικύρωση των αποτελεσμάτων7.1. ΤαυτότηταΗ ταυτότητα της αναλυόμενης ουσίας μπορεί να ελεγχθεί με συγχρωματογραφία ή με τη βοήθεια ανιχνευτή διόδων με τον οποίο συγκρίνονται τα φάσματα του εκχυλίσματος (5.2) και του διαλύματος βαθμονόμησης (3.7.3) που περιέχει 2,0 μg/ml.7.1.1. ΣυγχρωματογραφίαΕκχύλισμα δείγματος (5.2) εμπλουτίζεται με προσθήκη κατάλληλης ποσότητας διαλύματος βαθμονόμησης (3.7.3). Η ποσότητα του προστιθέμενου αμπρολίου θα πρέπει να είναι παρόμοια με την ποσότητα του αμπρολίου που βρίσκεται στο εκχύλισμα.Λαμβάνοντας υπόψη τόσο την προστιθέμενη ποσότητα όσο και την αραίωση του εκχυλίσματος, μόνον το ύψος της κορυφής του αμπρολίου θα πρέπει να βρίσκεται αυξημένο. Το πλάτος της κορυφής, στα μισά του ύψους, πρέπει να είναι +- 10 % του αρχικού πλάτους της κορυφής του αμπρολίου του μη εμπλουτισμένου εκχυλίσματος.7.1.2. Ανίχνευση με διάταξη διόδωνΤα αποτελέσματα αξιολογούνται με τα ακόλουθα κριτήρια:α) Το μήκος κύματος της μέγιστης απορρόφησης των φασμάτων του δείγματος και του προτύπου, που καταγράφονται στο υψηλότερο σημείο της κορυφής στο χρωματογράφημα, πρέπει να είναι ίδια στα πλαίσια των περιθωρίων που δικαιολογούνται από την αναλυτική ικανότητα του συστήματος ανίχνευσης. Το περιθώριο αυτό στην ανίχνευση με διάταξη διόδων είναι συνήθως +- 2 nm.β) Μεταξύ 210 και 320 nm, τα φάσματα του δείγματος και του προτύπου που καταγράφονται στο υψηλότερο σημείο της κορυφής του χρωματογραφήματος, δεν πρέπει να διαφέρουν στα μέρη εκείνα του φάσματος που είναι στην περιοχή του 10-100 % της σχετικής απορρόφησης. Το κριτήριο αυτό εκπληρώνεται όταν εμφανίζονται τα ίδια μέγιστα και σε κανένα υπό παρατήρηση σημείο η απόκλιση μεταξύ των δύο φασμάτων δεν υπερβαίνει το 15 % της απορρόφησης της πρότυπης αναλυόμενης ουσίας.γ) Μεταξύ 210 και 320 nm, τα φάσματα του ανερχόμενου τμήματος, του υψηλότερου σημείου και του κατερχόμενου τμήματος της κορυφής του εκχυλίσματος του δείγματος δεν πρέπει να διαφέρουν μεταξύ τους στα μέρη εκείνα του φάσματος που είναι στην περιοχή του 10-100 % της σχετικής πυκνότητας. Το κριτήριο αυτό εκπληρώνεται όταν εμφανίζονται τα ίδια μέγιστα και όταν σε όλα τα υπό παρατήρηση σημεία η απόκλιση μεταξύ των φασμάτων δεν υπερβαίνει 15 % της απορρόφησης του φάσματος του υψηλότερου σημείου της κορυφής.Εφόσον ένα από αυτά τα κριτήρια δεν εκπληρώνεται, δεν θεωρείται επιβεβαιωμένη η παρουσία της αναλυόμενης ουσίας.7.2. ΕπαναληψιμότηταΗ διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παράλληλων προσδιορισμών που πραγματοποιούνται στο ίδιο δείγμα δεν πρέπει να υπερβαίνει- το 15 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή για περιεκτικότητες σε αμπρόλιο από 25 mg/kg έως 500 mg/kg,- τα 75 mg/kg για περιεκτικότητες σε αμπρόλιο μεταξύ 500 mg/kg και 1000 mg/kg,- το 7,5 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή για περιεκτικότητες σε αμπρόλιο άνω των 1000 mg/kg.7.3. ΑνάκτησηΣε εμπλουτισμένο (τυφλό) δείγια, η ανάκτηση θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 90 %.8. Αποτελέσματα διεργαστηριακής μελέτηςΠραγματοποιήθηκε διεργαστηριακή μελέτη στην οποία αναλύθηκαν τρεις πτηνοτροφές (δείγμα 1-3), μια ανόργανη (δείγμα 4) και ένα πρόμειγμα (δείγμα 5). Τα αποτελέσματα δίδονται στον ακόλουθο πίνακα:>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>L: αριθμός εργαστηρίων,n: αριθμός μεμονωμένων τιμών,sr: τυπική απόκλιση επαναληψιμότητας,CVr: συντελεστής διακύμανσης επαναληψιμότητας,sR: τυπική απόκλιση αναπαραγωγιμότητας,CVR: συντελεστής διακύμανσης αναπαραγωγιμότητας,9. Παρατηρήσεις9.1. Εάν το δείγμα περιέχει θειαμίνη, η κορυφή της θειαμίνης στο χρωματογράφημα εμφανίζεται λίγο πριν από την κορυφή του αμπρολίου. Σύμφωνα με την παρούσα μέθοδο, το αμπρόλιο και η θειαμίνη πρέπει να διαχωρίζονται. Εάν το αμπρόλιο και η θειαμίνη δεν διαχωρίζονται από τη στήλη (4.1.1) που χρησιμοποιείται στην παρούσα μέθοδο, ένα μέρος του ακετονιτριλίου της κινητής φάσης (3.6) μέχρι 50 % πρέπει να αντικαθίσταται από μεθανόλη.9.2. Σύμφωνα με την Βρετανική Φαρμακοποιία, το φάσμα διαλύματος αμπρολίου (c = 0.02 mol/l) σε υδροχλωρικό οξύ (c = 0.1 mol/l) εμφανίζει μέγιστα στα 246 nm και 262 nm. H απορρόφηση ανέρχεται σε 0,84 στα 246 nm και 0,80 στα 262 nm.9.3. Το εκχύλισμα πρέπει να αραιώνεται πάντοτε με την κινητή φάση διότι διαφορετικά ο χρόνος κατακράτησης της κορυφής του αμπρολίου μπορεί να μετατοπιστεί σημαντικά λόγω μεταβολών της ιονικής ισχύος.ΜΕΡΟΣ ΒΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ DICLAZURIL(+)-4-χλωροφαινυλο[2,6-διχλωρο-4-(2,3,4,5-τετραϋδρο-3,5-διοξο-1,2,4-τριαζιν-2-υλο) φαινυλ]ακετονιτρίλιο.1. Σκοπός και πεδίο εφαρμογήςΗ μέθοδος αποσκοπεί στον προσδιορισμό του diclazuril σε ζωοτροφές και προμείγματα. Το όριο ανίχνευσης είναι 0,1 mg/kg, το όριο προσδιορισμού είναι 0,5 mg/kg.2. ΑρχήΈπειτα από προσθήκη εσωτερικού προτύπου, το δείγμα εκχυλίζεται με οξινισμένη μεθανόλη. Στις ζωοτροφές, κατάλληλη ποσότητα του εκχυλίσματος καθαρίζεται σε φυσίγγιο εκχυλίσεως στερεάς φάσεως C 18. Το diclazuril εκλούεται από το φυσίγγιο με μείγμα οξινισμένης μεθανόλης και νερού. Έπειτα από εξάτμιση, το υπόλειμμα διαλύεται σε DMF/νερό. Στα προμείγματα, το εκχύλισμα εξατμίζεται και το υπόλειμμα διαλύεται σε DMF/νερό. Η περιεκτικότητα σε diclazuril προσδιορίζεται με υγρή χρωματογραφία υψηλής αποδόσεως (HPLC) ανάστροφης φάσης τριών διαλυμάτων βαθμωτής έκλουσης με χρήση ανιχνευτή UV.3. Αντιδράστήρια3.1. Νερό καθαρότητας HPLC3.2. Οξικό αμμώνιο3.3. Όξινο θειικό τετραβουτυλαμμώνιο (TBHS)3.4. Ακετονιτρίλιο καθαρότητας HPLC3.5. Μεθανόλη καθαρότητας HPLC3.6. Ν,Ν-διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF)3.7. Υδροχλωρικό οξύ, ρ20= 1,19 g/ml3.8. Πρότυπη ουσία: diclazuril ΙΙ-24: (+)-4-χλωροφαινυλο[2,6-διχλωρο-4-(2,3,4,5τετραϋδρο-3,5-διοξο-1,2,4-τριαζιν-2-υλο) φαινυλ] ακετονιτρίλιο εγγυημένης καθαρότητας, Ε771.3.8.1. Αρχικό πρότυπο διάλυμα diclazuril, 500 μg/mlΣε ογκομετρική φιάλη των 50 ml ζυγίζονται με ακρίβεια 0,1 mg, 25 mg πρότυπης ουσίας diclazuril (3.8). Διαλύονται σε DMF (3.6), συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με DMF (3.6) και αναμειγνύονται. Η φιάλη περιτυλίσσεται με φύλλο αλουμινίου ή χρησιμοποιείται σκουρόχρωμη φιάλη και φυλάσσεται στο ψυγείο. Σε θερμοκρασία &lt;= 4 °C το διάλυμα είναι σταθερό για ένα μήνα.3.8.2. Πρότυπο διάλυμα diclazuril, 50 μg/ml5,00 ml του αρχικού πρότυπου διαλύματος (3.8.1.) μεταφέρονται σε ογκομετρική φιάλη των 50 ml, το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με DMF (3.6) και αναμειγνύεται. Η φιάλη περιτυλίσσεται με φύλλο αλουμινίου ή χρησιμοποιείται σκουρόχρωμη φιάλη και φυλάσσεται στο ψυγείο. Σε θερμοκρασία &lt;=4 °C το διάλυμα είναι σταθερό για 1 μήνα.3.9. Ουσία εσωτερικού προτύπου: 2,6 διχλωρο-α-(4-χλωροφαινυλο)-4-(4,5 διυδρο-3,5-διοξο-1,2,4-τριαζιν-2(3Η)-υλο)α-μεθυλοβενζολο-ακετονιτρίλιο3.9.1. Αρχικό διάλυμα εσωτερικού προτύπου, 500 μg/mlΣε ογκομετρική φιάλη των 50 ml ζυγίζονται με ακρίβεια 0,1 mg, 25 mg ουσίας εσωτερικού προτύπου (3.9). Διαλύονται σε DMF (3.6), συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με DMF (3.6) και αναμειγνύονται. Η φιάλη περιτυλίσσεται με φύλλο αλουμινίου ή χρησιμοποιείται σκουρόχρωμη φιάλη και φυλάσσεται στο ψυγείο. Σε θερμοκρασία &lt;= 4 °C το διάλυμα είναι σταθερό για ένα μήνα.3.9.2. Διάλυμα εσωτερικού προτύπου, 50 μg/ml5,00 ml του αρχικού διαλύματος εσωτερικού προτύπου (3.9.1.) μεταφέρονται σε ογκομετρική φιάλη των 50 ml, το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με DMF (3.6) και αναμειγνύεται. Η φιάλη περιτυλίσσεται με φύλλο αλουμινίου ή χρησιμοποιείται σκουρόχρωμη φιάλη και φυλάσσεται στο ψυγείο. Σε θερμοκρασία &lt;= 4 °C το διάλυμα είναι σταθερό για ένα μήνα.3.9.3. Διάλυμα εσωτερικού προτύπου για προμείγματα, p/1000 mg/ml (p = ονομαστική περιεκτικότητα diclazuril στο πρόμειγμα σε mg/kg)Σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml ζυγίζονται με ακρίβεια 0,1 mg ρ/10 mg της ουσίας εσωτερικού προτύπου, διαλύονται σε DMF (3.6) σε λουτρό υπερήχων (4.6), το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με DMF και αναμειγνύεται. Η φιάλη περιτυλίσσεται με φύλλο αλουμινίου ή χρησιμοποιείται σκουρόχρωμη φιάλη και φυλάσσεται στο ψυγείο. Σε θερμοκρασία &lt;=4 °C το διάλυμα είναι σταθερό για ένα μήνα.3.10. Διάλυμα βαθμονόμησης, 2 μg/ml2,00 ml πρότυπου διαλύματος diclazuril (3.8.2) και 2,00 ml διαλύματος εσωτερικού προτύπου (3.9.2) μεταφέρονται με σιφώνιο σε ογκομετρική φιάλη των 50 ml. Προστίθενται 16 ml DMF (3.6), το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με νερό και αναμειγνύεται. Το διάλυμα αυτό πρέπει να παρασκευάζεται λίγο πριν να χρησιμοποιηθεί.3.11. Στήλη εκχύλισης στερεάς φάσεως C 18, π.χ. Bond Elut, μέγεθος: 1 cc, προσροφητική μάζα: 100 mg.3.12. Διαλύτης εκχυλίσεως: οξινισμένη μεθανόλη5,0 ml υδροχλωρικού όξέος (3.7) φέρονται με σιφώνιο σε 1000 ml μεθανόλης (3.5), και αναμειγνύονται.3.13. Κινητή φάση για HPLCΥγρό εκλούσεως Α: διάλυμα οξικού αμμωνίου-όξινου θειικού τετραβουτυλαμμωνίου3.13.1. 5 g οξικού αμμωνίου (3.2) και 3,4 g TBHS (3.3) διαλύονται σε 1000 ml νερού (3.1) και αναμειγνύονται.3.13.2. Υγρό εκλούσεως Β: ακετονιτρίλιο (3.4)3.13.3. Υγρό εκλούσεως Γ: μεθανόλη (3.5)4. Συσκευές4.1. Συσκευή μηχανικής ανακίνησης.4.2. Εξοπλισμός HPLC με σύστημα τριών διαλυτών βαθμωτής έκλουσης.4.2.1. Στήλη υγρής χρωματογραφίας, Hypersil ODS, 3 μm, 100 mm x 4,6 mm ή ισοδύναμη.4.2.2. Ανιχνευτής UV με δυνατότητα ρύθμισης σε διάφορα μήκη κύματος ή με διάταξη διόδων,4.3. Περιστροφικός εξατμιστήρας κενού.4.4. Φίλτρο μεμβράνης, 0,45 μm.4.5. Πολλαπλή κενού (vacuum manifold).4.6. Λουτρό υπερήχων.5. Διαδικασία5.1. Γενικά5.1.1. ΤυφλόΘα πρέπει να διενεργείται ανάλυση τυφλού ώστε να ελέγχεται ότι δεν υπάρχει ούτε diclazuril ούτε κάποια άλλη παρεμποδίζουσα ουσία. Το τυφλό δείγμα θα πρέπει να είναι παρόμοιου τύπου με εκείνον του δείγματος και δεν θα πρέπει να ανιχνεύονται σε αυτό diclazuril ή άλλες παρεμποδίζουσες ουσίες.5.1.2. Δοκιμή ανάκτησηςΘα πρέπει να πραγματοποιείται δοκιμή ανάκτησης υποβάλλοντας σε ανάλυση τυφλό δείγμα εμπλουτισμένο με προσθήκη μιας ποσότητας diclazuril, παρόμοιας με εκείνη που υπάρχει στο δείγμα. Για εμπλουτισμό μέχρι 1 mg/kg, 0,1 ml του αρχικού πρότυπου διαλύματος (3.8.1) προστίθενται 50 g του τυφλού, αναμειγνύονται επισταμένως και αφήνονται για 10 λεπτά αναμειγνύοντας πάλι μερικές φορές πριν προχωρήσουμε στο στάδιο της εκχυλίσεως (5.2).Εναλλακτικώς, εφόσον δεν υπάρχει διαθέσιμο τυφλό παρόμοιου τύπου με το δείγμα (βλέπε 5.1.1 ), δοκιμή ανάκτησης μπορεί να γίνει μέσω της μεθόδου προσθήκης προτύπου. Στην περίπτωση αυτή, το προς ανάλυση δείγμα εμπλουτίζεται με ποσότητα diclazuril παρόμοια με εκείνη που υπάρχει ήδη στο δείγμα. Το δείγμα αυτό αναλύεται παράλληλα με το μη εμπλουτισμένο δείγμα και η ανάκτηση μπορεί να υπολογιστεί με αφαίρεση.5.2. Εκχύλιση5.2.1. ΖωοτροφέςΖυγίζονται με ακρίβεια 0,01 g περίπου 50 g του δείγματος. Μεταφέρονται σε κωνική φιάλη των 500 ml, προστίθενται 1,00 ml διαλύματος εσωτερικού προτύπου (3.9.2) και 200 ml διαλύτη εκχυλίσεως (3.12) και η φιάλη πωματίζεται. Το μείγμα ανακινείται σε συσκευή μηχανικής ανακίνησης (4.1) καθ' όλη τη διάρκεια της νύκτας. Αφήνεται σε ηρεμία για 10 λεπτά. Ποσότητα 20 ml του υπερκείμενου υγρού μεταφέρεται σε κατάλληλο γυάλινο δοχείο και αραιώνεται με 20 ml νερό. Το διάλυμα αυτό μεταφέρεται σε φυσίγγιο εκχυλίσεως (3.11), και διέρχεται με εφαρμογή κενού (4.5). Η στήλη (3.11 ) εκπλένεται με 25 ml μείγματος διαλύτη εκχυλίσεως (3.12) και νερού, 65 + 35 (V + V). Τα συλλεγόμενα κλάσματα απορρίπτονται και οι απομένουσες ουσίες εκλούονται με 25 ml μείγματος διαλύτη εκχυλίσεως (3.12) και νερού, 80 + 20 (V + V). Το κλάσμα αυτό εξατμίζεται μέχρι ξηρού σχεδόν με τη βοήθεια του περιστροφικού εξατμιστήρα (4.3) στους 60 °C. Το υπόλειμμα διαλύεται σε 1,0 ml DMF (3.6), προστίθεται 1,5 ml νερό (3.1) και αναμειγνύονται. Ακολουθεί διήθηση μέσω μεμβράνης (4.4) και κατόπιν ο προσδιορισμός με HPLC (5.3).5.2.2. ΠρομείγματαΖυγίζεται με ακρίβεια 0,001 g περίπου 1 g του δείγματος. Μεταφέρεται σε κωνική φιάλη των 500 ml, προστίθεται 1,00 ml διαλύματος εσωτερικού προτύπου (3.9.3), 200 ml διαλύτη εκχυλίσεως (3.12) και η φιάλη πωματίζεται. Το μείγμα ανακινείται όλη τη νύκτα στο τάρακτρο (4.1). Αφήνεται να κατακαθίσει για 10 λεπτά. Ποσότητα 10000/p ml (p=ονομαστική περιεκτικότητα του diclazuril στο πρόμειγμα σε mg/kg) του υπερκειμένου υγρού μεταφέρεται σε φιάλη στρογγυλού πυθμένα με κατάλληλο μέγεθος. Το διάλυμα εξατμίζεται μέχρι ξηρού υπό ελαττωμένη πίεση στους 60 °C με τη βοήθεια περιστροφικού εξατμιστήρα (4.3). Το υπόλειμμα αναδιαλύεται σε 10,0 ml DMF (3.6), προστίθενται 15,0 ml νερό (3.1) και αναμειγνύονται. Ακολουθεί ο προσδιορισμός με HPLC (5.3).5.3. Προσδιορισμός με HPLC5.3.1. ΠαράμετροιΠαρακάτω, δίδονται ενδεικτικά ορισμένες κατάλληλες συνθήκες. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και διαφορετικές συνθήκες εφόσον παρέχουν ισοδύναμα αποτελέσματα.>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>Ελέγχεται η σταθερότητα του χρωματογραφικού συστήματος, εγχύοντας μερικές φορές το διάλυμα βαθμονόμησης (3.10) που περιέχει 2 μg/ml, μέχρι να σταθεροποιηθούν τα ύψη των κορυφών και οι χρόνοι κατακράτησης.5.3.2. Διάλυμα βαθμονόμησηςΕγχύονται μερικές φορές 20 μl του διαλύματος βαθμονόμησης (3.10) και προσδιορίζεται το μέσο ύψος (εμβαδόν) των κορυφών του diclazuril και του εσωτερικού προτύπου.5.3.3. Διάλυμα δείγματοςΕγχύονται μερικές φορές 20 μl του διαλύματος δείγματος (5.2.1 ή 5.2.2) και προσδιορίζεται το μέσο ύψος (εμβαδόν) των κορυφών του diclazuril και του εσωτερικού προτύπου.6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων6.1. ΖωοτροφέςΗ περιεκτικότητα του δείγματος σε diclazuril w (mg/kg) δίδεται από τον ακόλουθο τύπο:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>[mg/kg]όπου:hd,s= ύψος (εμβαδόν) κορυφής του diclazuril στο διάλυμα δείγματος (5.2.1),hi,s= ύψος (εμβαδόν) κορυφής του εσωτερικού προτύπου στο διάλυμα δείγματος (5.2.1),hd,c= ύψος (εμβαδόν) κορυφής του diclazuril στο διάλυμα βαθμονόμησης (3.10),hi,c= ύψος (εμβαδόν) κορυφής του εσωτερικού προτύπου στο διάλυμα βαθμονόμησης (3.10),βd,c= συγκέντρωση του diclazuril στο διάλυμα βαθμονόμησης σε μg/ml (3.10),m= μάζα του προς δοκιμή δείγματος σε g,V= όγκος του εκχυλίσματος δείγματος σύμφωνα με το 5.2.1 (δηλαδή 2,5 ml).6.2. Προμείγματα:Η περιεκτικότητα του δείγματος σε diclazuril w (mg/kg) δίδεται από τον ακόλουθο τύπο:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>[mg/kg]όπου:hd,c= ύψος (εμβαδόν) κορυφής του diclazuril στο διάλυμα βαθμονόμησης (3.10),hi,c= ύψος (εμβαδόν) κορυφής του εσωτερικού προτύπου στο διάλυμα βαθμονόμησης (3.10),hd,s= ύψος (εμβαδόν) κορυφής του diclazuril στο διάλυμα βαθμονόμησης (5.2.2),hi,s= ύψος (εμβαδόν) κορυφής του εσωτερικού προτύπου στο διάλυμα δείγματος (5.2.2),βd,c= συγκέντρωση του diclazuril στο διάλυμα βαθμονόμησης (3.10)m= μάζα του προς δοκιμή δείγματος σε g,V= όγκος του εκχυλίσματος δείγματος σύμφωνα με το 5.2.2 (δηλαδή 25 ml),p= ονομαστική συγκέντρωση του diclazuril σε mg/kg στο πρόμειγμα.7. Επικύρωση των αποτελεσμάτων7.1. ΤαυτότηταΗ ταυτότητα της αναλυόμενης ουσίας μπορεί να ελεγχθεί με συγχρωματογραφία ή με τη βοήθεια ανιχνευτή διόδων με τον οποίο συγκρίνονται τα φάσματα του εκχυλίσματος (5.2.1 ή 5.2.2) και του διαλύματος βαθμονόμησης (3.10).7.1.1. ΣυγχρωματογραφίαΕκχύλισμα δείγματος (5.2.1 ή 5.2.2) εμπλουτίζεται με προσθήκη κατάλληλης ποσότητας διαλύματος βαθμονόμησης (3.10). Η ποσότητα του προστιθέμενου diclazuril θα πρέπει να είναι παρόμοια με την ποσότητα του diclazuril που βρίσκεται στο εκχύλισμα.Λαμβάνοντας υπόψη τόσο την προστιθέμενη ποσότητα όσο και την αραίωση του εκχυλίσματος, μόνον το ύψος της κορυφής του diclazuril και της κορυφής του εσωτερικού προτύπου θα πρέπει να βρίσκεται αυξημένο. Το πλάτος της κορυφής, στα μισά του ύψους, πρέπει να είναι +- 10 % του αρχικού πλάτους της κορυφής του diclazuril ή της κορυφής του εσωτερικού προτύπου του μη εμπλουτισμένου εκχυλίσματος δείγματος.7.1.2. Ανίχνευση με διάταξη διόδωνΤα αποτελέσματα αξιολογούνται με τα ακόλουθα κριτήρια:α) Το μήκος κύματος της μέγιστης απορρόφησης των φασμάτων του δείγματος και του προτύπου, που καταγράφονται στο υψηλότερο σημείο της κορυφής στο χρωματογράφημα, πρέπει να είναι ίδια στα πλαίσια των περιθωρίων που δικαιολογούνται από την αναλυτική ισχύ του συστήματος ανίχνευσης. Το περιθώριο αυτό στην ανίχνευση με διάταξη διόδων είναι συνήθως +-2 nm.β) Μεταξύ 230 και 320 nm, τα φάσματα του δείγματος και του προτύπου που καταγράφονται στο υψηλότερο σημείο της κορυφής του χρωματογραφήματος, δεν πρέπει να διαφέρουν στα μέρη εκείνα του φάσματος που είναι στην περιοχή του 10-100 % της σχετικής απορρόφησης. Το κριτήριο αυτό εκπληρώνεται όταν εμφανίζονται τα ίδια μέγιστα και σε κανένα υπό παρατήρηση σημείο η απόκλιση μεταξύ των δύο φασμάτων δεν υπερβαίνει το 15 % της απορρόφησης της πρότυπης αναλυόμενης ουσίας.γ) Μεταξύ 230 και 320 nm, τα φάσματα του ανερχόμενου τμήματος, του υψηλότερου σημείου και του κατερχόμενου τμήματος της κορυφής του εκχυλίσματος του δείγματος δεν πρέπει να δαφέρουν μεταξύ τους στα μέρη εκείνα του φάσματος που είναι στην περιοχή του 10-100 % της σχετικής πυκνότητας. Το κριτήριο αυτό εκπληρώνεται όταν εμφανίζονται τα ίδια μέγιστα και όταν σε όλα τα υπό παρατήρηση σημεία η απόκλιση μεταξύ των φασμάτων δεν υπερβαίνει 15 % της απορρόφησης του φάσματος του υψηλότερου σημείου της κορυφής.Εφόσον ένα από αυτά τα κριτήρια δεν εκπληρώνεται, δεν θεωρείται επιβεβαιωμένη η παρουσία της αναλυόμενης ουσίας.7.2. ΕπαναληψιμότηταΗ διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παράλληλων προσδιορισμών που πραγματοποιούνται στο ίδιο δείγμα δεν πρέπει να υπερβαίνει:- το 30 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή για περιεκτικότητες σε diclazuril από 0,5 mg/kg έως 2,5 mg/kg- τα 0,75 mg/kg για περιεκτικότητες σε diclazuril μεταξύ 2,5 mg/kg και 5 mg/kg- το 15 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή για περιεκτικότητες σε diclazuril άνω των 5 mg/kg.7.3. ΑνάκτησηΣε εμπλουτισμένο (τυφλό) δείγμα, η ανάκτηση θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 80 %.8. Αποτελέσματα διεργαστηριακής μελέτηςΠραγματοποιήθηκε διεργαστηριακή μελέτη στην οποία αναλύθηκαν 5 δείγματα από 11 εργαστήρια. Τα δείγματα αυτά συνίσταντο από δύο προμείγματα: το ένα αναμείχθηκε με οργανικό υλικό (Ο 100) και το άλλο με ανόργανο υλικό (Α 100). Η θεωρητική περιεκτικότητα είναι 100 mg diclazuril ανά kg. Οι τρεις μεικτές πτηνοτροφές παρασκευάστηκαν από τρεις διαφορετικούς παραγωγούς (NL) (L1/Ζ1/Κ1). Η θεωρητική περιεκτικότητα είναι 1 mg diclazuril ανά kg. Οι οδηγίες προς τα εργαστήρια ήταν να αναλύσουν κάθε δείγμα μια φορά ή εις διπλούν. (Για περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά μ' αυτή τη διεργαστηριακή μελέτη βλέπε Journal of AOAC International, τόμος 77, αριθ. 6 1994, σ. 1359-1361). Τα αποτελέσματα δίδονται στον ακόλουθο πίνακα:>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>L: αριθμός εργαστηρίων,n: αριθμός μεμονωμένων τιμών,sr: τυπική απόκλιση επαναληψιμότητας,CVr: συντελεστής διακύμανσης επαναληψιμότητας,SR: τυπική απόκλιση αναπαραγωγικότητας,CVR: συντελεστής διακύμανσης αναπαραγωγικότητας.9. ΠαρατηρήσειςΗ απόκριση του diclazuril πρέπει να έχει καταδειχθεί προηγουμένως ότι είναι γραμμική στην περιοχή των μετρουμένων συγκεντρώσεων.ΜΕΡΟΣ ΓΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ CARBADOXΜέθυλο 3-(2-κινοξαλινυλομεθυλενο)καρβαζικό Ν1, Ν4-διοξείδιο1. Σκοπός και πεδίο εφαρμογήςΗ παρούσα μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό του carbadox σε ζωοτροφές, προμείγματα και παρασκευάσματα. Το όριο ανίχνευσης είναι 1 mg/kg, το όριο προσδιορισμού είναι 10 mg/kg.2. ΑρχήΤο δείγμα αναμιγνύεται με νερό και εκχυλίζεται με μεθανόλη-ακετονιτρίλιο. Στις ζωοτροφές, κατάλληλη ποσότητα του διηθημένου εκχυλίσματος υποβάλλεται σε καθαρισμό σε στήλη οξειδίου του αργιλίου. Στα προμείγματα και παρασκευάσματα, ποσότητα του διηθημένου εκχυλίσματος αραιώνεται σε κατάλληλη συγκέντρωση με νερό, μεθανόλη και ακετονιτρίλιο. Η περιεκτικότητα του carbadox προσδιορίζεται με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) ανάστροφης φάσης με χρήση ανιχνευτή UV.3. Αντιδραστήρια3.1. Μεθανόλη3.2. Ακετονιτρίλιο καθαρότητας HPLC3.3. Οξικό οξύ, w = 100 %3.4. Οξείδιο αργιλίου: ουδέτερο, βαθμός δραστικότητας Ι3.5. Μεθανόλη-ακετονιτρίλιο 1 + 1 (V + V)500 ml μεθανόλης (3.1) αναμειγνύεται με 500 ml ακετονιτριλίου (3.2).3.6. Οξικό οξύ, σ = 10 %10 ml οξικού οξέος (3.3) αραιώνονται μέχρι τα 100 ml με νερό.3.7. Οξικό νάτριο, CH3COONa3.8. Νερό καθαρότητας HPLC3.9. Οξικό ρυθμιστικό διάλυμα, c = 0,01 mol/l, pH = 6,00,82 g οξικού νατρίου (3.7) διαλύονται σε 700 ml νερό (3.8) και ρυθμίζεται το pH στο 6,0 με οξικό οξύ (3.6). Το διάλυμα μεταφέρεται σε ογκομετρική φιάλη των 1000 ml, συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με νερό (3.8) και αναμειγνύεται.3.10. Κινητή φάση για HPLC825 ml οξικού ρυθμιστικού διαλύματος (3.9) αναμειγνύονται με 175 ml ακετονιτριλίου (3.2). Ακολουθεί διήθηση μέσω φίλτρου 0,22 μm (4.5) και απαερίωση του διαλύματος (π.χ. με υπερήχους για 10 λεπτά).3.11. Πρότυπη ουσίαΚαθαρό carbadox: Μέθυλο 3-(2-κινοξαλινυλομεθυλενο)καρβαζικό Ν1,Ν4-διοξείδιο, Ε 8503.11.1. Αρχικό πρότυπο διάλυμα carbadox, 100 μg/ml (βλέπε σημείο 5. Διαδικασία)Σε ογκομετρική φιάλη των 250 ml ζυγίζονται με ακρίβεια 0,.1 mg, 25 mg πρότυπης ουσίας carbadox (3.11). Διαλύονται σε μεθανόλη-ακετονιτρίλιο (3.5) με εφαρμογή υπερήχων (4.7). Μετά τους υπερήχους, το διάλυμα φέρεται σε θερμοκρασία δωματίου, συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με μεθανόλη-ακετονιτρίλιο (3.5) και αναμειγνύεται. Η φιάλη περιτυλίσσεται με φύλλο αλουμινίου ή χρησιμοποιείται σκουρόχρωμη φιάλη και φυλάσσεται στο ψυγείο. Το διάλυμα αυτό είναι σταθερό για ένα μήνα σε θερμοκρασία +- 4 °C.3.11.2. Διαλύματα βαθμονόμησης2,0, 5,0, 10,0, και 20,0 ml του αρχικού προτύπου διαλύματος (3.11.1) μεταφέρονται σε μια σειρά ογκομετρικών φιαλών των 100 ml. Προστίθενται 30 ml νερό, συπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με μεθανόλη-ακετονιτρίλιο (3.5) και αναμειγνύονται. Η φιάλη περιτυλίσσεται με φύλλο αλουμινίου. Τα διαλύματα αυτά αντιστοιχούν σε 2,0, 5,0, 10,0 και 20,0 μg/ml carbadox αντίστοιχα. Τα διαλύματα βαθμονόμησης πρέπει να ετοιμάζονται λίγο πριν να χρησιμοποιηθούν.Σημείωση:Για τον προσδιορισμό carbadox σε ζωοτροφές που περιέχουν λιγότερο από 10 mg/kg, πρέπει να παρασκευάζονται διαλύματα βαθμονόμησης με συγκέντρωση κάτω 2,0 μg/ml.3.12. Μείγμα νερού-[μεθανόλης-ακετονιτριλίου] (3.5), 300 + 700 (V + V)300 ml νερό αναμειγνύονται με 700 ml του μείγματος μεθανόλης-ακετονιτριλίου (3.5).4. Συσκευές4.1. Συσκευή μηχανικής ανακίνησης ή μαγνητικός αναδευτήρας4.2. Ηθμός υαλοϊνών (Whatman GF/Α ή ισοδύναμος)4.3. Γυάλινη στήλη (μήκος 300 έως 400 mm, εσωτερική διάμετρος περίπου 10 mm) με εσμυρισμένη απόληξη σύνδεσης και βαλβίδα εξαγωγής.Σημείωση:Μπορεί να χρησιμοποιηθεί και γυάλινη στήλη εφοδιασμένη με στρόφιγγα ή γυάλινη στήλη που στενεύει στο άκρο της. Στην περίπτωση αυτή, στο κάτω άκρο εισάγεται μικρή ποσότητα υαλοβάμβακα και πιέζεται προς τα κάτω με μια γυάλινη ράβδο.4.4. Εξοπλισμός HPLC με σύστημα εγχύσεως, κατάλληλο για έγχυση όγκων 20 μ14.4.1. Στήλη υγρής χρωματογραφίας: 300 mm x 4 mm, C18, 10 μm ή ισοδύναμη4.4.2. Ανιχνευτής UV με δυνατότητα ρύθμισης σε διάφορα μήκη κύματος ή με διάταξη διόδων κατάλληλος για περιοχή μηκών κύματος 225 έως 400 nm4.5. Φίλτρο μεμβράνης, 0,22 μm4.6. Φίλτρο μεμβράνης, 0,45 μm4.7. Λουτρό υπερήχων5. ΔιαδικασίαΣημείωση:Το carbadox είναι ευαίσθητο στο φως. Όλες οι εργασίες πρέπει να γίντονται σε ημίφως ή να χρησιμοποιούνται υάλινα σκεύη σκουρόχρωμα ή τυλιγμένα με φύλλο αλουμινίου.5.1. Γενικά5.1.1. ΤυφλόΓια την εκτέλεση της δοκιμής ανάκτησης (5.1.2), θα πρέπει να διενεργείται ανάλυση τυφλού ώστε να ελέγχεται ότι δεν υπάρχει ούτε carbadox ούτε κάποια άλλη παρεμποδίζουσα ουσία. Το τυφλό δείγμα θα πρέπει να είναι παρόμοιου τύπου με εκείνον του δείγματος και δεν θα πρέπει να ανιχνεύονται σε αυτό carbadox ή άλλες παρεμποδίζουσες ουσίες.5.1.2. Δοκιμή ανάκτησηςΠρέπει να πραγματοποιείται δοκιμή ανάκτησης υποβάλλοντας σε ανάλυση τυφλό δείγμα (5.1.1) εμπλουτισμένο με προσθήκη μιας ποσότητας carbadox, παρόμοιας με εκείνη που υπάρχει στο δείγμα. Για εμπλουτισμό 50 mg/kg, 5,0 ml του αρχικού πρότυπου διαλύματος (3.11.1) μεταφέρονται σε κωνική φιάλη των 200 ml και το διάλυμα εξατμίζεται μέχρις όγκου περίπου 0,5 ml σε ρεύμα αζώτου. Προστίθενται 10 g του τυφλού, αναμειγνύονται και περιμένουμε για 10 λεπτά πριν προχωρήσουμε στο στάδιο της εκχυλίσεως (5.2).Εναλλακτικώς, εφόσον δεν υπάρχει διαθέσιμο τυφλό παρόμοιου τύπου με το δείγμα (βλέπε σημείο 5.1.1), δοκιμή ανάκτησης μπορεί να γίνει μέσω της μεθόδου προσθήκης προτύπου. Στην περίπτωση αυτή, το προς ανάλυση δείγμα εμπλουτίζεται με ποσότητα carbadox παρόμοια με εκείνη που υπάρχει ήδη στο δείγμα. Το δείγμα αυτό αναλύεται παράλληλα με το μη εμπλουτισμένο δείγμα και η ανάκτηση μπορεί να υπολογιστεί με αφαίρεση.5.2. Εκχύλιση5.2.1. ΖωοτροφέςΖυγίζονται με ακρίβεια 0,01 g, περίπου 10 g του δείγματος και μεταφέρονται σε κωνική φιάλη των 200 ml. Προστίθενται 15,0 ml νερό, αναμειγνύονται και αφήνονται σε ηρεμία για 5 λεπτά. Προστίθενται 35,0 ml μεθανόλης-ακετονιτριλίου (3.5), η φιάλη πωματίζεται και ανακινείται για 30 λεπτά σε συσκευή μηχανικής ανακίνησης ή αναδεύεται με το μαγνητικό αναδευτήρα. Το διάλυμα διηθείται μέσω ηθμού υαλοϊνών (4.2). Το εν λόγω διάλυμα κρατιέται για το στάδιο καθαρισμού (5.3).5.2.2. Προμείγματα (0,1-2,0 %)Ζυγίζονται με ακρίβεια 0.001 g, περίπου 1 g του μη αλεσμένου δείγματος και μεταφέρονται σε κωνική φιάλη των 200 ml. Προστίθενται 15,0 ml νερό, αναμειγνύονται και αφήνονται σε ηρεμία για 5 λεπτά. Προστίθενται 35.0 ml μεθανόλης-ακετονιτριλίου (3.5), η φιάλη πωματίζεται και ανακινείται για 30 λεπτά σε συσκευή μηχανικής ανακίνησης ή αναδεύεται με το μαγνητικό αναδευτήρα (4.1). Το διάλυμα διηθείται μέσω ηθμού υαλοϊνών (4.2). Κατάλληλη ποσότητα διηθήματος μεταφέρεται με σιφώνιο σε ογκομετρική φιάλη των 50 ml. Προστίθενται 15,0 ml νερό, συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με μεθανόλη-ακετονιτρίλιο (3.5) και αναμειγνύονται. Η συγκέντρωση του carbadox στο τελικό διάλυμα θα πρέπει να είναι περίπου 10 μg/ml. Κατάλληλη ποσότητα διηθείται μέσω φίλτρου 0,45 μm (4.6). Ακολουθεί προσδιορισμός με HPLC (5.4).5.2.3. Παρασκευάσματα ( &gt; 2 %),Ζυγίζονται με ακρίβεια 0,001 g, περίπου 0,2 g του μη αλεσμένου δείγματος και μεταφέρονται σε κωνική φιάλη των 250 ml. Προστίθενται 45,0 ml νερό, αναμειγνύονται και αφήνονται σε ηρεμία για 5 λεπτά. Προστίθενται 105,0 ml μεθανόλης-ακετονιτριλίου (3.5), η φιάλη πωματίζεται και το περιεχόμενο ομοιογενοποιείται. Το δείγμα υποβάλλεται για 15 λεπτά σε επεξεργασία με υπερήχους (4.7) και ακολουθεί ανακίνηση ή ανάδευση για 15 λεπτά (4.1). Το διάλυμα διηθείται μέσω ηθμού υαλοϊνών (4.2). Κατάλληλη ποσότητα του διηθήματος αραιώνεται με μείγμα νερού-μεθανόλης ακετονιτριλίου (3.12) μέχρι τελικής συγκεντρώσεως carbadox 10-15 μg/ml (για παρασκεύασμα 10 %, ο συντελεστής αραιώσεως είναι 10). Κατάλληλη ποσότητα διηθείται μέσω φίλτρου 0,45 μm filter (4.6). Ακολουθεί ο προσδιορισμός με HPLC (5.4).5.3. Καθαρισμός5.3.1. Ετοιμασία της στήλης οξειδίου του αργιλίουΖυγίζονται 4 g οξειδίου του αργιλίου (3.4) και μεταφέρονται στη γυάλινη στήλη (4.3).5.3.2. Καθαρισμός δείγματος15 ml του διηθημένου εκχυλίσματος (5.2.1) μεταγγίζονται στη στήλη του οξειδίου του αργιλίου και τα πρώτα 2 ml του εκλούσματος απορρίπτονται. Τα επόμενα 5 ml συλλέγονται και κατάλληλη ποσότητα διηθείται διαμέσου φίλτρου 0,45 μm (4.6). Ακολουθεί ο προσδιορισμός με HPLC (5.4).5.4. Προσδιορισμός με HPLC5.4.1. ΠαράμετροιΠαρακάτω, δίδονται ενδεικτικά ορισμένες κατάλληλες συνθήκες. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και διαφορετικές συνθήκες εφόσον παρέχουν ισοδύναμα αποτελέσματα:>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>Ελέγχεται η σταθερότητα του χρωματογραφικού συστήματος, εγχύοντας μερικές φορές το διάλυμα βαθμονόμησης (3.11.2) που περιέχει 5,0 μg/ml, μέχρι να σταθεροποιηθούν τα ύψη των κορυφών και οι χρόνοι κατακράτησης.5.4.2. Καμπύλη αναφοράςΚάθε διάλυμα βαθμονόμησης (3.11.2) εγχύεται μερικές φορές και μετρώνται τα ύψη (εμβαδά) των κορυφών για κάθε συγκέντρωση. Χαράσσεται καμπύλη αναφοράς χρησιμοποιώντας ως τεταγμένες τα μέσα ύψη (εμβαδά) των κορυφών των διαλυμάτων βαθμονόμησης και ως τετμημένες τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις σε μg/ml.5.4.3. Διάλυμα δείγματοςΕγχύεται μερικές φορές το εκχύλισμα δείγματος [(5.3.2) για ζωοτροφές, (5.2.2) για προμείγματα και (5.2.3) για παρασκευάσματα] και προσδιορίζεται το μέσο ύψος (εμβαδόν) των κορυφών του carbadox.6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτωνΑπό το μέσο ύψος (εμβαδόν) των κορυφών του carbadox του διαλύματος του δείγματος προσδιορίζεται η περιεκτικότητα στο διάλυμα του δείγματος σε μg/ml βάσει της καμπύλης αναφοράς (5.4.2).6.1. ΖωοτροφέςΗ περιεκτικότητα w (mg/kg) του carbadox στο δείγμα δίδεται από τον ακόλουθο τύπο:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>[mg/kg]όπου:β= συγκέντρωση του carbadox στο εκχύλισμα δείγματος (5.3.2.) σε μg/ml,V1= όγκος εκχυλίσεως ml (δηλαδή 50),m= μάζα της προς δοκιμή ποσότητας σε g.6.2. Προμείγματα και παρασκευάσματαΗ περιεκτικότητα w (mg/kg) του carbadox στο δείγμα δίδεται από τον ακόλουθο τύπο:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>[mg/kg]όπου:β= συγκέντρωση του carbadox στο εκχύλισμα δείγματος (5.2.2. ή 5.2.3.) σε μg/ml,V2= όγκος εκχυλίσεως σε ml δηλαδή για προμείγματα, 150 για παρασκεύασματα),f= συντελεστής αραίωσης σύμφωνα με το 5.2.2 (προμείγματα) ή 5.2.3. (παρασκεύασματα),m= μάζα της προς δοκιμή ποσότητας σε g.7. Επικύρωση των αποτελεσμάτων7.1. ΤαυτότηταΗ ταυτότητα της αναλυόμενης ουσίας μπορεί να ελεγχθεί με συγχρωματογραφία ή με τη βοήθεια ανιχνευτή διόδων με τον οποίο συγκρίνονται τα φάσματα του εκχυλίσματος δείγματος και του διαλύματος βαθμονόμησης (3.11.2) που περιέχει 10,0 μg/ml.7.1.1. ΣυγχρωματογραφίαΕκχύλισμα δείγματος εμπλουτίζεται με προσθήκη κατάλληλης ποσότητας διαλύματος βαθμονόμησης (3.11.2). Η ποσότητα του προστιθέμενου carbadox θα πρέπει να είναι παρόμοια με την εκτιμώμενη ποσότητα carbadox στο εκχύλισμα.Λαμβάνοντας υπόψη τόσο την προστιθέμενη ποσότητα όσο και την αραίωση του εκχυλίσματος, μόνον το ύψος της κορυφής του carbadox θα πρέπει να βρίσκεται αυξημένο. Το πλάτος της κορυφής, στα μισά του ύψους, πρέπει να είναι 10 % του αρχικού πλάτους.7.1.2. Ανίχνευση με διάταξη διόδωνΤα αποτελέσματα αξιολογούνται με τα ακόλουθα κριτήρια:α) Το μήκος κύματος της μέγιστης απορρόφησης των φασμάτων του δείγματος και του προτύπου, που καταγράφονται στο υψηλότερο σημείο της κορυφής στο χρωματογράφημα, πρέπει να είναι ίδια στα πλαίσια των περιθωρίων που δικαιολογούνται από την αναλυτική ικανότητα του συστήματος ανίχνευσης. Το περιθώριο αυτό στην ανίχνευση με διάταξη διόδων είναι συνήθως +- 2 nm,β) Μεταξύ 225 και 400 nm, τα φάσματα του δείγματος και του προτύπου που καταγράφονται στο υψηλότερο σημείο της κορυφής του χρωματογραφήματος, δεν πρέπει να διαφέρουν στα μέρη εκείνα του φάσματος που είναι στην περιοχή του 10-100 % της σχετικής απορρόφησης. Το κριτήριο αυτό εκπληρώνεται όταν εμφανίζονται τα ίδια μέγιστα και σε κανένα υπό παρατήρηση σημείο η απόκλιση μεταξύ των δύο φασμάτων δεν υπερβαίνει το 15 % της απορρόφησης της πρότυπης αναλυόμενης ουσίας,γ) Μεταξύ 225 και 400 nm, τα φάσματα του ανερχόμενου τμήματος, του υψηλότερου σημείου και του κατερχόμενου τμήματος της κορυφής του εκχυλίσματος του δείγματος δεν πρέπει να διαφέρουν μεταξύ τους στα μέρη εκείνα του φάσματος που είναι στην περιοχή του 10-100 % της σχετικής πυκνότητας. Το κριτήριο αυτό εκπληρώνεται όταν εμφανίζονται τα ίδια μέγιστα και όταν σε όλα τα υπό παρατήρηση σημεία η απόκλιση μεταξύ των φασμάτων δεν υπερβαίνει 15 % της απορρόφησης του φάσματος του υψηλότερου σημείου της κορυφής.Εφόσον ένα από αυτά τα κριτήρια δεν εκπληρώνεται, δεν θεωρείται επιβεβαιωμένη η παρουσία της αναλυόμενης ουσίας.7.2. ΕπαναληψιμότηταΓια περιεκτικότητες 10 mg/kg και άνω. Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παράλληλων προσδιορισμών που πραγματοποιούνται στο ίδιο δείγμα δεν πρέπει να υπερβαίνει το 15 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή.7.3. ΑνάκτησηΣε εμπλουτισμενο (τυφλό) δείγμα, η ανάκτηση θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 90 %.8. Αποτελέσματα διεργαστηριακής μελέτηςΠραγματοποιήθηκε διεργαστηριακή μελέτη στην οποία αναλύθηκαν 6 ζωοτροφές, 4 προμείγματα και 3 παρασκευάσματα από 8 εργαστήρια. Σε κάθε δείγμα έγιναν δύο αναλύσεις (Για περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με τη διεργαστηριακή μελέτη, βλ. Journal of AOAC, τόμος 71, 1988, σ. 484-490). Τα αποτελέσματα (με εξαίρεση τα εκτός ορίων εκτρεπόμενα) εμφαίνονται κατωτέρω:L: αριθμός εργαστηρίων,n: αριθμός μεμονωμένων τιμών,sr: τυπική απόκλιση επαναληψιμότητας,CVr: συντελεστής διακύμανσης επαναληψιμότητας,SR: τυπική απόκλιση αναπαραγωγικότητας,CVR: συντελεστής διακύμανσης αναπαραγωγιμότητας.>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>