CELEX: 32018R0150
Language: pt
Date: 2018-01-30 00:00:00
Title: Regulamento de Execução (UE) 2018/150 da Comissão, de 30 de janeiro de 2018, que altera o Regulamento (UE) 2016/1240 no respeitante aos métodos a utilizar para a análise e a avaliação da qualidade do leite e dos produtos lácteos elegíveis para intervenção pública e para a ajuda ao armazenamento privado

31.1.2018   
            
            
               PT
            
            
               Jornal Oficial da União Europeia
            
            
               L 26/14
            
         REGULAMENTO DE EXECUÇÃO (UE) 2018/150 DA COMISSÃO
   de 30 de janeiro de 2018
   que altera o Regulamento (UE) 2016/1240 no respeitante aos métodos a utilizar para a análise e a avaliação da qualidade do leite e dos produtos lácteos elegíveis para intervenção pública e para a ajuda ao armazenamento privado
   A COMISSÃO EUROPEIA,
   Tendo em conta o Tratado sobre o Funcionamento da União Europeia,
   Tendo em conta o Regulamento (UE) n.o 1306/2013 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 17 de dezembro de 2013, relativo ao financiamento, à gestão e ao acompanhamento da política agrícola comum e que revoga os Regulamentos (CEE) n.o 352/78, (CE) n.o 165/94, (CE) n.o 2799/98, (CE) n.o 814/2000, (CE) n.o 1290/2005 e (CE) n.o 485/2008 do Conselho (1), nomeadamente o artigo 62.o, n.o 2, alínea i),
   Considerando o seguinte:
   
               (1)
            
            
               O Regulamento Delegado (UE) 2016/1238 da Comissão (2) e o Regulamento de Execução (UE) 2016/1240 da Comissão (3) estabelecem as regras aplicáveis à intervenção pública e à ajuda ao armazenamento privado. O Regulamento (CE) n.o 273/2008 da Comissão (4) estabelece os métodos a aplicar para avaliar se o leite e os produtos lácteos cumprem os requisitos de elegibilidade estabelecidos nos referidos regulamentos para efeitos de intervenção pública e de ajuda ao armazenamento privado.
            
         
               (2)
            
            
               Tendo em conta os avanços técnicos nas metodologias utilizada para a análise e a avaliação da qualidade do leite e dos produtos lácteos, importa adotar alterações substanciais para simplificar e para providenciar referências atualizadas das normas ISO. Por uma questão de clareza e de eficiência, e tendo em conta o alcance e a natureza técnica das alterações às disposições do Regulamento (CE) n.o 273/2008, as disposições pertinentes desse regulamento devem ser inseridas no Regulamento de Execução (UE) 2016/1240.
            
         
               (3)
            
            
               De modo a garantir a observância uniforme dos novos métodos e regras em todos os Estados-Membros, os laboratórios devem dispor de um período suficiente para rever procedimentos e aplicar os métodos atualizados.
            
         
               (4)
            
            
               O Regulamento de Execução (UE) 2016/1240 deve, por conseguinte, ser alterado em conformidade.
            
         
               (5)
            
            
               No interesse da segurança jurídica, o Regulamento (CE) n.o 273/2008 deve ser revogado.
            
         
               (6)
            
            
               As medidas previstas no presente regulamento estão em conformidade com o parecer do Comité para a Organização Comum dos Mercados Agrícolas,
            
         ADOTOU O PRESENTE REGULAMENTO:
   Artigo 1.o
   
   O Regulamento de Execução (UE) 2016/1240 é alterado do seguinte modo:
   
               1)
            
            
               O artigo 4.o é alterado do seguinte modo:
               
                           a)
                        
                        
                           O n.o 1 é alterado do seguinte modo:
                           
                                       i)
                                    
                                    
                                       A alínea d) passa a ter a seguinte redação:
                                       
                                                   «d)
                                                
                                                
                                                   manteiga: anexo IV, parte I e parte I-A, do presente regulamento»;
                                                
                                             
                                 
                                       ii)
                                    
                                    
                                       A alínea e) passa a ter a seguinte redação:
                                       
                                                   «e)
                                                
                                                
                                                   leite em pó desnatado: anexo V, parte I e parte I-A, do presente regulamento»;
                                                
                                             
                                 
                     
                           b)
                        
                        
                           O n.o 2 passa a ter a seguinte redação:
                           «2.   Os métodos a utilizar para determinar a qualidade dos cereais, manteiga e leite em pó desnatado elegíveis para intervenção pública referidos nos anexos I, IV e V, respetivamente, são os métodos estabelecidos pela última versão das correspondentes normas europeias ou internacionais vigentes pelo menos 6 meses antes do primeiro dia do período de intervenção pública, tal como definido no artigo 12.o do Regulamento (UE) n.o 1308/2013.»
                        
                     
         
               2)
            
            
               É aditado um artigo 60.o-A com a seguinte redação:
               «Artigo 60.o-A
               Disposições específicas sobre os controlos relativos à intervenção pública e à ajuda ao armazenamento privado para o leite e os produtos lácteos
               1.   A elegibilidade da manteiga, do leite em pó desnatado e do queijo para beneficiarem de ajudas ao armazenamento privado deve ser determinada em conformidade com os métodos definidos nos anexos VI, VII e VIII, respetivamente.
               Esses métodos devem ser determinados com base na última versão das correspondentes normas europeias ou internacionais vigentes pelo menos 6 meses antes do primeiro dia do período de intervenção pública, tal como definido no artigo 12.o do Regulamento (UE) n.o 1308/2013.
               2.   Os resultados dos controlos efetuados por meio dos métodos previstos no presente regulamento devem ser avaliados de acordo com o anexo IX.»
            
         
               3)
            
            
               Os anexos são alterados em conformidade com o anexo do presente regulamento.
            
         Artigo 2.o
   
   O Regulamento (CE) n.o 273/2008 é revogado.
   Artigo 3.o
   
   O presente regulamento entra em vigor no sétimo dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial da União Europeia.
   
      O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e diretamente aplicável em todos os Estados-Membros.
      Feito em Bruxelas, em 30 de janeiro de 2018.
      
         
            Pela Comissão
         
         
            O Presidente
         
         Jean-Claude JUNCKER
      
   
   
      (1)  JO L 347 de 20.12.2013, p. 549.
   
      (2)  Regulamento Delegado (UE) 2016/1238 da Comissão, de 18 de maio de 2016, que complementa o Regulamento (UE) n.o 1308/2013 do Parlamento Europeu e do Conselho no que se refere à intervenção pública e à ajuda à armazenagem privada (JO L 206 de 30.7.2016, p. 15).
   
      (3)  Regulamento Delegado (UE) 2016/1240 da Comissão, de 18 de maio de 2016, que estabelece normas de execução do Regulamento (UE) n.o 1308/2013 do Parlamento Europeu e do Conselho no que se refere à intervenção pública e à ajuda ao armazenamento privado (JO L 206 de 30.7.2016, p. 71).
   
      (4)  Regulamento (CE) n.o 273/2008 da Comissão, de 5 de março de 2008, que estabelece normas de execução do Regulamento (CE) n.o 1255/1999 do Conselho no que respeita aos métodos a utilizar para a análise e a avaliação da qualidade do leite e dos produtos lácteos (JO L 88 de 29.3.2008, p. 1).
   
      ANEXO
      Os anexos do Regulamento de Execução (UE) 2016/1240 são alterados do seguinte modo:
      
                  1)
               
               
                  O anexo IV é alterado do seguinte modo:
                  
                              a)
                           
                           
                              Na parte I, ponto 2, o segundo parágrafo passa a ter a seguinte redação:
                              «Cada amostra deve ser examinada individualmente. Não é autorizada qualquer repetição da colheita de amostras ou sua reapreciação.»
                           
                        
                              b)
                           
                           
                              É aditada a seguinte parte I-A:
                              «PARTE I-A
                              
                                 Métodos de análise de manteiga sem sal para intervenção pública
                              
                              
                                          Parâmetro
                                       
                                       
                                          Método
                                       
                                    
                                          Matéria gorda (1)
                                          
                                       
                                       
                                          ISO 17189 ou ISO 3727, parte 3
                                       
                                    
                                          Humidade
                                       
                                       
                                          ISO 3727, parte 1
                                       
                                    
                                          Resíduo seco isento de matéria gorda
                                       
                                       
                                          ISO 3727, parte 2
                                       
                                    
                                          Acidez da matéria gorda
                                       
                                       
                                          ISO 1740
                                       
                                    
                                          Índice de peróxidos
                                       
                                       
                                          ISO 3976
                                       
                                    
                                          Matérias gordas não-lácteas
                                       
                                       
                                          ISO 17678
                                       
                                    
                                          Características organoléticas
                                       
                                       
                                          ISO 22935, partes 2 e 3, e tabela de pontuação seguinte.
                                       
                                    
                                 Quadro de classificação
                              
                              
                                          Aspeto
                                       
                                       
                                          Consistência
                                       
                                       
                                          Sabor e aroma
                                       
                                    
                                          Pontos
                                       
                                       
                                          Observações
                                       
                                       
                                          Pontos
                                       
                                       
                                          Observações
                                       
                                       
                                          Pontos
                                       
                                       
                                          Observações
                                       
                                    
                                          5
                                       
                                       
                                          
                                             Muito bom
                                          
                                          Tipo ideal
                                          Qualidade superior
                                          (sem humidade visível)
                                       
                                       
                                          5
                                       
                                       
                                          
                                             Muito boa
                                          
                                          Tipo ideal
                                          Qualidade superior
                                          (uniformemente barrável)
                                       
                                       
                                          5
                                       
                                       
                                          
                                             Muito bom
                                          
                                          Tipo ideal
                                          Qualidade superior
                                          (aroma absolutamente puro e perfeito)
                                       
                                    
                                          4
                                       
                                       
                                          
                                             Bom
                                          
                                          (sem defeitos evidentes)
                                       
                                       
                                          4
                                       
                                       
                                          
                                             Boa
                                          
                                          (sem defeitos evidentes)
                                       
                                       
                                          4
                                       
                                       
                                          
                                             Bom
                                          
                                          (sem defeitos evidentes)
                                       
                                    
                                          1, 2 ou 3
                                       
                                       
                                          Qualquer defeito
                                       
                                       
                                          1, 2 ou 3
                                       
                                       
                                          Qualquer defeito
                                       
                                       
                                          1, 2 ou 3
                                       
                                       
                                          Qualquer defeito»
                                       
                                    
                        
            
                  2)
               
               
                  Ao anexo V é aditada a seguinte parte I-A:
                  «PARTE I-A
                  
                     Métodos de análise de leite em pó desnatado para intervenção pública
                  
                  
                              Parâmetro
                           
                           
                              Método
                           
                        
                              Proteínas
                           
                           
                              ISO 8968, parte 1
                           
                        
                              Matéria gorda
                           
                           
                              ISO 1736
                           
                        
                              Humidade
                           
                           
                              ISO 5537
                           
                        
                              Acidez
                           
                           
                              ISO 6091
                           
                        
                              Lactatos
                           
                           
                              ISO 8069
                           
                        
                              Prova da fosfatase
                           
                           
                              ISO 11816, parte 1
                           
                        
                              Índice de insolubilidade
                           
                           
                              ISO 8156
                           
                        
                              Partículas queimadas (2)
                              
                           
                           
                              ADPI (American Dairy Products Institute)
                           
                        
                              Microrganismos
                           
                           
                              ISO 4833 parte 1
                           
                        
                              Leitelho
                           
                           
                              Apêndice I
                           
                        
                              Soro de coagulação (3)
                              
                           
                           
                              Apêndices II e III
                           
                        
                              Soro ácido (4)
                              
                           
                           
                              ISO 8069 ou inspeções no local
                           
                        
                              Exames organoléticos (5)
                              
                           
                           
                              ISO 22935, partes 2 e 3
                           
                        
                     Apêndice I
                     
                        LEITE EM PÓ DESNATADO: DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DA FOSFATIDILSERINA E DA FOSFATIDILETANOLAMINA
                     
                     
                        
                           Método: HPLC com inversão de fases
                        
                     
                     1.   OBJETO E ÂMBITO DE APLICAÇÃO
                     O presente método descreve um procedimento para a determinação quantitativa de fosfatidilserina (PS) e de fosfatidiletanolamina (PE) no leite em pó desnatado, podendo ser utilizado para a deteção de sólidos de leitelho nesse leite em pó.
                     2.   DEFINIÇÃO
                     
                        Teor de PS+PE: fração mássica da substância, determinada pelo procedimento a seguir descrito. O resultado é expresso em miligramas de dipalmitato de fosfatidiletanolamina (PEDP) por 100 g de pó.
                     3.   PRINCÍPIO DO MÉTODO
                     Extração, em metanol, dos aminofosfolípidos do leite em pó reconstituído. Determinação da PS e da PE, na forma de derivados o-ftaldialdeídicos (OPA) por HPLC com inversão de fases e deteção por fluorescência. Quantificação do teor de PS e PE na amostra de ensaio em relação a uma amostra-padrão com uma quantidade conhecida de PEDP.
                     4.   REAGENTES
                     Todos os reagentes devem ser de grau analítico reconhecido. Salvo indicação em contrário, a água deve ser destilada ou de pureza pelo menos equivalente.
                     4.1.   Substância-padrão: PEDP com grau de pureza mínimo de 99 %
                     
                     
                        Nota: A substância-padrão deve ser armazenada a – 18 °C.
                     4.2.   Reagentes para a preparação da amostra-padrão e da amostra de ensaio
                     
                     4.2.1.   Metanol para HPLC
                     
                     4.2.2.   Clorofórmio para HPLC
                     
                     4.2.3.   Monocloridrato de triptamina
                     
                     4.3.   Reagentes para a preparação de derivados o-ftaldialdeídicos
                     
                     4.3.1.   Solução aquosa 12 M de hidróxido de sódio
                     
                     4.3.2.   Solução aquosa 0,4 M de ácido bórico, com o pH ajustado a 10,0 com hidróxido de sódio (4.3.1)
                     
                     4.3.3.   2-Mercaptoetanol
                     
                     4.3.4.   o-Ftaldialdeído (OPA)
                     
                     4.4.   Eluentes para a HPLC
                     
                     4.4.1.   Preparar os eluentes com reagentes para HPLC.
                     
                     4.4.2.   Água para HPLC
                     
                     4.4.3.   Metanol de pureza fluorimétrica comprovada
                     
                     4.4.4.   Tetra-hidrofurano
                     
                     4.4.5.   Di-hidrogenofosfato de sódio
                     
                     4.4.6.   Acetato de sódio
                     
                     4.4.7.   Ácido acético
                     
                     5.   EQUIPAMENTO
                     5.1.   Balança analítica capaz de pesar com a aproximação de 1 mg, com leitura das décimas de miligrama
                     
                     5.2.   Copos de 25 e de 100 ml
                     
                     5.3.   Pipetas de 1 ml e de 10 ml
                     
                     5.4.   Agitador magnético
                     
                     5.5.   Pipetas graduadas de 0,2 ml, 0,5 ml e 5 ml
                     
                     5.6.   Balões aferidos de 10 ml, 50 ml e 100 ml
                     
                     5.7.   Seringas de 20 μl e 100 μl
                     
                     5.8.   Banho de ultrassons
                     
                     5.9.   Centrifugadora capaz de atingir 27 000 g
                     
                     5.10.   Frascos de vidro de cerca de 5 ml
                     
                     5.11.   Proveta graduada de 25 ml
                     
                     5.12.   Medidor de pH, com a aproximação de 0,1 unidades de pH
                     
                     5.13.   Equipamento de HPLC
                     
                     5.13.1.   Sistema de bombagem de gradiente, regulável para 1,0 ml/min a 200 bar
                     
                     5.13.2.   Injetor automático, com possibilidade de derivação
                     
                     5.13.3.   Câmara aquecida, capaz de manter a coluna a 30 °C ± 1 °C
                     
                     5.13.4.   Detetor de fluorescência, regulável para um comprimento de onda de excitação de 330 nm e um comprimento de onda de emissão de 440 nm
                     
                     5.13.5.   Integrador ou programa informático de tratamento de dados para a determinação da área dos picos
                     
                     5.13.6.   Coluna LiChrospher® — 100 (250 mm × 4,6 mm) ou coluna equivalente, com enchimento de octadecilsilano (C 18) em partículas de 5 μm
                     
                     6.   AMOSTRAGEM
                     A colheita de amostras deve ser efetuada de acordo com a Norma ISO 707.
                     7.   PROCEDIMENTO
                     7.1.   Preparação da solução do padrão interno
                     
                     7.1.1.   Pesar 30,0 ± 0,1 mg de monocloridrato de triptamina (4.2.3) num balão aferido de 100 ml (5.6) e completar o volume até à marca com metanol (4.2.1).
                     
                     7.1.2.   Pipetar 1 ml (5.3) desta solução para um balão aferido de 10 ml (5.6) e completar o volume até à marca com metanol (4.2.1), de modo a obter a concentração de 0,15 mM de triptamina.
                     
                     7.2.   Preparação da solução da amostra para análise
                     
                     7.2.1.   Pesar 1,000 ± 0,001 g da amostra de leite em pó desnatado num frasco de 25 ml (5.2). Utilizando uma pipeta (5.3), adicionar 10 ml de água destilada a 40 °C ± 1 °C e agitar com um agitador magnético (5.4) durante 30 minutos, para dissolver eventuais grumos.
                     
                     7.2.2.   Pipetar 0,2 ml (5.5) do leite reconstituído para um balão aferido de 10 ml (5.6), adicionar 100 μl da solução 0,15 mM de triptamina (7.1) com uma seringa (5.7) e completar o volume até à marca com metanol (4.2.1). Misturar cuidadosamente, invertendo o balão, e tratar a amostra com ultrassons (5.8) durante 15 minutos.
                     
                     7.2.3.   Centrifugar (5.9) a 27 000 g durante 10 minutos e recolher o sobrenadante num frasco de vidro (5.10).
                     
                     
                        Nota: A solução da amostra para análise deve ser guardada a 4 °C até à análise por HPLC.
                     7.3.   Preparação da solução do padrão externo
                     
                     7.3.1.   Pesar 55,4 mg de PEDP (4.1) num balão aferido de 50 ml (5.6) e adicionar cerca de 25 ml de clorofórmio (4.2.2) utilizando uma proveta graduada (5.11). Aquecer o balão rolhado até à temperatura de 50 °C ± 1 °C e misturar cuidadosamente até o PEDP se dissolver. Arrefecer o balão até 20 °C, completar o volume até à marca com metanol (4.2.1) e misturar por inversão.
                     
                     7.3.2.   Pipetar 1 ml (5.3) desta solução para um balão aferido de 100 ml (5.6) e completar o volume até à marca com metanol (4.2.1). Pipetar 1 ml (5.3) desta solução para um balão aferido de 10 ml (5.6), adicionar 100 μl (5.7) da solução 0,15 mM de triptamina (7.1) e completar o volume até à marca com metanol (4.2.1). Misturar por inversão
                     
                     
                        Nota: A solução da amostra de referência deve ser guardada a 4 °C até à análise por HPLC.
                     7.4.   Preparação do reagente para a obtenção de derivados
                     
                     
                        Pesar 25,0 ± 0,1 mg de OPA (4.3.4) num balão aferido de 10 ml (5.6), adicionar 0,5 ml (5.5) de metanol (4.2.1) e misturar cuidadosamente para dissolver o OPA. Completar o volume com solução de ácido bórico (4.3.2) e adicionar 20 μl de 2-mercaptoetanol (4.3.3) com uma seringa (5.7).
                     
                     
                        Nota: Este reagente deve ser guardado a 4 °C num frasco de vidro castanho, mantendo-se estável durante uma semana.
                     7.5.   Determinação por HPLC
                     
                     7.5.1.   Eluentes (4.4)
                     
                     Eluente A: Solução 0,3 mM de di-hidrogenofosfato de sódio e 3 mM de acetato de sódio (pH ajustado a 6,5 ± 0,1 com ácido acético):metanol:tetra-hidrofurano = 558:440:2 (v/v/v)
                     Eluente B: metanol
                     7.5.2.   Gradiente de eluição sugerido:
                     
                     
                                 Tempo (min.)
                              
                              
                                 Eluente A (%)
                              
                              
                                 Eluente B (%)
                              
                              
                                 Caudal (ml/min)
                              
                           
                                 Inicial
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 60
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 0,1
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 60
                              
                              
                                 0,1
                              
                           
                                 5,0
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 60
                              
                              
                                 0,1
                              
                           
                                 6,0
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 60
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 60
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 9,0
                              
                              
                                 36
                              
                              
                                 64
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 10,0
                              
                              
                                 20
                              
                              
                                 80
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 11,5
                              
                              
                                 16
                              
                              
                                 84
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 12,0
                              
                              
                                 16
                              
                              
                                 84
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 16,0
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                 90
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 19,0
                              
                              
                                 0
                              
                              
                                 100
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 20,0
                              
                              
                                 0
                              
                              
                                 100
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 21,0
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 60
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 29,0
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 60
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 30,0
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 60
                              
                              
                                 0
                              
                           
                        Nota: Para conseguir a resolução da figura 1, pode ser necessário alterar ligeiramente o gradiente de eluição.
                     Temperatura da coluna: 30 °C.
                     7.5.3.   Volume a injetar: 50 μl do reagente para a obtenção de derivados e 50 μl da solução da amostra
                     
                     7.5.4.   Estabilização da coluna
                     
                     Diariamente, ao pôr o sistema em funcionamento, lavar a coluna com 100 % de eluente B durante 15 minutos; ajustar depois para uma proporção A:B = 40:60 e estabilizar a 1 ml/min durante 15 minutos. Fazer uma passagem em branco injetando metanol (4.2.1).
                     
                        Nota: Antes de uma paragem prolongada, lavar a coluna com uma mistura 80:20 (v/v) de metanol:clorofórmio durante 30 minutos.
                     7.5.5.   Determinação do teor de PS + PE na amostra para análise
                     
                     7.5.6.   Efetuar a sequência de análises cromatográficas mantendo um intervalo de tempo constante entre passagens, de modo a obter tempos de retenção constantes. Injetar a solução do padrão externo (7.3) entre cada 5-10 soluções da amostra a analisar, a fim de calcular o fator de resposta
                     
                     
                        Nota: A coluna deve ser limpa, efetuando uma lavagem com 100 % de eluente B (7.5.1) durante pelo menos 30 minutos, depois de cada 20-25 passagens.
                     7.6.   Modo de integração
                     
                     7.6.1.   Pico do PEDP
                     
                     A eluição do PEDP produz um único pico. Determinar a área do pico por integração entre o mínimo que precede o pico e o mínimo que se lhe segue.
                     7.6.2.   Pico da triptamina
                     
                     A eluição da triptamina produz um único pico (figura 1). Determinar a área do pico por integração entre o mínimo que precede o pico e o mínimo que se lhe segue.
                     7.6.3.   Grupos de picos da PS e da PE
                     
                     Nas condições descritas (figura 1), a eluição da PS produz dois picos principais, parcialmente sobrepostos, precedidos de um pico secundário. A eluição da PE produz 3 picos principais, parcialmente sobrepostos. Determinar a área total de cada grupo de picos, estabelecendo a linha de base conforme se indica na figura 1.
                     8.   CÁLCULO E APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS
                     Os teores de PS e PE da amostra para análise são calculados do seguinte modo:
                     C = 55,36 × ((A2)/(A1)) × ((T1)/(T2))
                     em que:
                     
                                 C
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 Teor de PS ou de PE (mg/100 g de pó) na amostra para análise;
                              
                           
                                 A1
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 Área do pico do PEDP da solução da amostra-padrão (7.3);
                              
                           
                                 A2
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 Área do pico da PS ou da PE da solução da amostra para análise (7.2);
                              
                           
                                 T1
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 Área do pico da triptamina da solução da amostra-padrão (7.3);
                              
                           
                                 T2
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 Área do pico da triptamina da solução da amostra para análise (7.2).
                              
                           9.   PRECISÃO DO MÉTODO
                     
                        Nota: Os valores de repetibilidade foram calculados em conformidade com a norma internacional IDF (*).
                     9.1.   Repetibilidade
                     
                     O desvio-padrão relativo da repetibilidade, que exprime a variabilidade de resultados analíticos independentes obtidos pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento, nas mesmas condições, na análise da mesma amostra, num curto intervalo de tempo, não deve exceder 2 %. Se duas determinações forem obtidas nestas condições, a diferença relativa entre os dois resultados não deve exceder 6 % da média aritmética dos resultados.
                     9.2.   Reprodutibilidade
                     
                     Se forem efetuadas duas determinações por operadores de laboratórios diferentes, utilizando equipamento diferente, em condições diferentes, na análise da mesma amostra, a diferença relativa entre os dois resultados não deve exceder 11 % da média aritmética dos resultados.
                     10.   REFERÊNCIAS
                     10.1.   Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., «Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids». Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988).
                     
                     
                        Figura 1
                     
                     
                        Gráfico HPLC de derivados OPA da fosfatidilserina (PS) e da fosfatidiletanolamina (PE) presentes num extrato metanólico de leite em pó desnatado reconstituído. É indicado o modo de integração dos picos da PS, da PE e da triptamina (padrão interno)
                     
                     
                        
                  
                  
                     Apêndice II
                     
                        DETEÇÃO DE SORO DE COAGULAÇÃO NO LEITE EM PÓ DESNATADO DESTINADO À ARMAZENAGEM PÚBLICA ATRAVÉS DA DETERMINAÇÃO DOS CASEINOMACROPÉPTIDOS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC)
                     
                     1.   OBJETO E ÂMBITO DE APLICAÇÃO
                     O presente método permite detetar a presença de soro de coagulação no leite em pó desnatado destinado à armazenagem pública através da determinação dos caseinomacropéptidos.
                     2.   REFERÊNCIA
                     Norma internacional ISO 707 - Milk and Milk Products - Guidance on sampling.
                     3.   DEFINIÇÃO
                     O teor de sólidos de soro de coagulação é definido em percentagem mássica, determinada em função do teor de caseinomacropéptidos obtido pelo procedimento descrito.
                     4.   PRINCÍPIO
                     
                                 —
                              
                              
                                 Reconstituição do leite em pó desnatado e eliminação da matéria gorda e das proteínas com ácido tricloroacético, seguida de centrifugação ou filtração;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Determinação, por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), da quantidade de caseinomacropéptidos (CMP) presentes no sobrenadante;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Avaliação dos resultados obtidos para as amostras por comparação com amostras-padrão de leite em pó desnatado com ou sem adição de percentagens conhecidas de soro de coagulação em pó.
                              
                           5.   REAGENTES
                     Todos os reagentes devem ser de grau analítico reconhecido. A água utilizada deve ser destilada ou de pureza pelo menos equivalente.
                     5.1.   Solução de ácido tricloroacético
                     
                     Dissolver 240 g de ácido tricloroacético (CCl3COOH) em água e completar o volume até 1 000 ml. A solução deve apresentar-se límpida e incolor.
                     5.2.   Eluente, pH 6,0
                     
                     Dissolver 1,74 g de hidrogenofosfato dipotássico (K2HPO4), 12,37 g de di-hidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) e 21,41 g de sulfato de sódio (Na2SO4) em cerca de 700 ml de água. Se necessário, ajustar o pH a 6,0, utilizando uma solução de ácido fosfórico ou de hidróxido de potássio.
                     Completar o volume com água até 1 000 ml e homogeneizar.
                     
                        Nota: A composição do eluente pode ser adaptada de modo a corresponder à certificação dos padrões ou às recomendações do fabricante do enchimento da coluna.
                     Antes de o utilizar, filtrar o eluente através de um filtro de membrana com poros de 0,45 μm.
                     5.3.   Solução de lavagem das colunas
                     
                     Misturar um volume de acetonitrilo (CH3CN) com nove volumes de água. Antes de a utilizar, filtrar a mistura através de um filtro de membrana com poros de 0,45 μm.
                     
                        Nota: Pode ser utilizada qualquer outra solução de lavagem com efeito bactericida que não altere o poder de resolução das colunas.
                     5.4.   Amostras-padrão
                     
                     5.4.1.   Leite em pó desnatado que satisfaça as exigências do presente regulamento (i.e. [0])
                     
                     5.4.2.   Leite em pó desnatado idêntico, mas adulterado com 5 % (m/m) de soro de coagulação em pó de composição padrão (i.e. [5])
                     
                     6.   EQUIPAMENTO
                     6.1.   Balança analítica
                     
                     6.2.   Em opção, centrifugadora capaz de centrifugar a 2 200 g, dotada de tubos de centrifugação rolhados ou capsulados de cerca de 50 ml
                     
                     6.3.   Agitador mecânico
                     
                     6.4.   Agitador magnético
                     
                     6.5.   Funis de vidro, com cerca de 7 cm de diâmetro
                     
                     6.6.   Papel de filtro para filtração média, com cerca de 12,5 cm de diâmetro
                     
                     6.7.   Dispositivo de filtração de vidro, com filtro de membrana de 0,45 μm de diâmetro de poro
                     
                     6.8.   Pipetas graduadas de 10 ml (ISO 648, classe A, ou ISO/R 835) ou sistema que permita debitar 10,0 ml em dois minutos
                     
                     6.9.   Sistema que permita debitar 20,0 ml de água a cerca de 50 °C
                     
                     6.10.   Banho-maria termostático regulado para 25 °C ± 0,5 °C
                     
                     6.11.   Equipamento de HPLC, composto pelo seguinte:
                     
                     
                                 6.11.1.
                              
                              
                                 
                                    Bomba
                                 
                              
                           
                                 6.11.2.
                              
                              
                                 
                                    Injetor manual ou automático, com 15 a 30 μl de capacidade
                                 
                              
                           
                                 6.11.3.
                              
                              
                                 
                                    Duas colunas TSK 2 000-SW em série (comprimento de 30 cm, diâmetro interno de 0,75 cm) ou colunas equivalentes (por exemplo: coluna TSK 2 000-SWxl, coluna Agilent Technologies Zorbax GF 250) e uma pré-coluna (3 cm × 0,3 cm) com enchimento de I 125 ou de um material de eficácia equivalente.
                                 
                              
                           
                                 6.11.4.
                              
                              
                                 
                                    Câmara termostática para a coluna, regulada para 35 °C ± 1 °C
                                 
                              
                           
                                 6.11.5.
                              
                              
                                 
                                    Detetor UV de comprimento de onda variável, capaz de efetuar medições a 205 nm com a sensibilidade de 0,008 Å
                                 
                              
                           
                                 6.11.6.
                              
                              
                                 
                                    Integrador com possibilidade de integração entre mínimos consecutivos
                                 
                                 
                                    Nota: É possível trabalhar com colunas mantidas à temperatura ambiente, mas o seu poder de resolução é ligeiramente inferior. Nesse caso, as variações de temperatura ao longo de uma série de análises devem ser inferiores a ± 5 °C.
                              
                           7.   AMOSTRAGEM
                     7.1.   A colheita das amostras deve ser efetuada de acordo com a norma internacional ISO 707. Todavia, os Estados-Membros podem utilizar outro método de amostragem, desde que respeite os princípios da referida norma.
                     7.2.   Conservar as amostras em condições que evitem qualquer deterioração ou alteração de composição.
                     8.   PROCEDIMENTO
                     8.1.   Preparação da amostra para análise
                     
                     Colocar o leite em pó num recipiente de capacidade aproximadamente dupla do volume do pó, equipado com uma tampa hermética. Fechar de imediato o recipiente. Misturar bem o leite em pó, invertendo várias vezes o recipiente.
                     8.2.   Toma para análise
                     
                     Pesar 2,000 ± 0,001 g da amostra para análise num tubo de centrifugação (6.2) ou num balão rolhado adequado (50 ml).
                     8.3.   Eliminação da matéria gorda e das proteínas
                     
                     8.3.1.   Adicionar 20,0 ml de água quente (50 °C) à toma para análise. Dissolver o pó, agitando durante cinco minutos com um agitador mecânico (6.3). Colocar o tubo em banho-maria (6.10) e deixar estabilizar a 25 °C.
                     
                     8.3.2.   Adicionar, ao longo de dois minutos, 10,0 ml da solução de ácido tricloroacético (5.1), a cerca de 25 °C, agitando sempre vigorosamente com o agitador magnético (6.4). Colocar o tubo no banho-maria (6.10) e deixar em repouso durante 60 minutos.
                     
                     8.3.3.   Centrifugar (6.2) durante 10 minutos a 2 200 g ou filtrar através de papel de filtro (6.6), rejeitando os primeiros 5 ml de filtrado.
                     
                     8.4.   Determinação cromatográfica
                     
                     8.4.1.   Injetar 15 a 30 μl de sobrenadante ou filtrado (8.3.3), rigorosamente medidos, no aparelho de HPLC (6.11), com um caudal de 1,0 ml de eluente (5.2) por minuto.
                     
                     
                        Nota 1. Pode utilizar-se um caudal diferente, em função do diâmetro interno das colunas utilizadas ou das instruções do fabricante das colunas.
                     
                        Nota 2. A cada interrupção, lavar as colunas com água. Nunca deixar eluente (5.2) nas colunas.
                     Antes de qualquer interrupção superior a 24 horas, lavar as colunas com água e, em seguida, com a solução (5.3) durante, pelo menos, 3 horas, com um caudal de 0,2 ml por minuto.
                     8.4.2.   Os resultados da análise cromatográfica da amostra em análise [E] são obtidos sob a forma de um cromatograma, no qual cada pico é identificado pelo tempo de retenção respetivo, RT, do seguinte modo:
                     
                     
                                 Pico II:
                              
                              
                                 Segundo pico do cromatograma, com RT de cerca de 12,5 minutos.
                              
                           
                                 Pico III:
                              
                              
                                 Terceiro pico do cromatograma, correspondente aos caseínomacropéptidos (CMP), com RT de 15,5 minutos.
                              
                           A escolha da(s) coluna(s) pode influenciar consideravelmente o tempo de retenção dos diferentes picos.
                     O integrador (6.11.6) calcula automaticamente a área, A, de cada pico:
                     
                                 AII:
                              
                              
                                 área do pico II,
                              
                           
                                 AIII:
                              
                              
                                 área do pico III.
                              
                           É essencial examinar o aspeto de cada cromatograma antes de qualquer interpretação quantitativa, para detetar eventuais anomalias devidas a funcionamento deficiente do equipamento ou das colunas ou decorrentes da origem ou natureza da amostra analisada.
                     Em caso de dúvida, repetir a análise.
                     8.5.   Calibração
                     
                     8.5.1.   Aplicar às amostras-padrão (5.4) exatamente o procedimento descrito nos pontos 8.2 a 8.4.2.
                     
                     Utilizar soluções preparadas de fresco, já que os CMP se degradam em meio tricloroacético a 8 %. O seu teor diminui aproximadamente 0,2 % por hora, a 30 °C.
                     8.5.2.   Antes da determinação cromatográfica às amostras, condicionar as colunas através de injeções sucessivas de solução (8.5.1) da amostra-padrão (5.4.2) até a área e o tempo de retenção do pico correspondente aos CMP se tornarem constantes.
                     
                     8.5.3.   Determinar os fatores de resposta, R, injetando um volume de filtrados (8.5.1) idêntico ao utilizado para as amostras.
                     
                     9.   APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS
                     9.1.   Modo de cálculo e fórmulas
                     
                     9.1.1.   Cálculo dos fatores de resposta, R:
                     
                     
                                 Pico II:
                              
                              
                                 RII = 100/(AII[0])
                              
                           em que:
                     
                                 RII
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 fator de resposta do pico II,
                              
                           
                                 AII [0]
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 área do pico II da amostra-padrão [0] obtida em 8.5.3;
                              
                           
                                 Pico III:
                              
                              
                                 RIII = W/(AIII [5] – AIII [0])
                              
                           em que:
                     
                                 RIII
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 fator de resposta do pico III,
                              
                           
                                 AIII [0] e AIII [5]
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 áreas dos picos III das amostras-padrão [0] e [5], respetivamente, obtidas em 8.5.3,
                              
                           
                                 W
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 quantidade de soro de coagulação presente na amostra-padrão [5], ou seja, 5.
                              
                           9.1.2.   Cálculo da área relativa dos picos da amostra [E]
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 SII[E] = RII × AII[E],
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 SIII[E] = RIII × AIII[E],
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 SIV[E] = RIV × AIV[E];
                              
                           em que:
                     
                                 SII [E], SIII [E], SIV [E]
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 áreas relativas dos picos II, III e IV, respetivamente, da amostra [E];
                              
                           
                                 AII [E], AIII [E]
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 áreas dos picos II e III, respetivamente, da amostra [E] obtidas em 8.4.2;
                              
                           
                                 RII, RIII
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 fatores de resposta calculados em 9.1.1.
                              
                           9.1.3.   Cálculo do tempo de retenção relativo do pico III da amostra [E]:
                     
                     RRTIII[E] = (RTIII[E])/(RTIII[5])
                     em que:
                     
                                 RRTIII [E]
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 tempo de retenção relativo do pico III da amostra [E];
                              
                           
                                 RTIII [E]
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 tempo de retenção do pico III da amostra [E] obtido em 8.4.2;
                              
                           
                                 RTIII [5]
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 tempo de retenção do pico III da amostra-padrão [5] obtido em 8.5.3.
                              
                           9.1.4.   Foi experimentalmente demonstrado que existe uma relação linear entre o tempo de retenção relativo do pico III, RRTIII [E], e a percentagem de soro em pó adicionado, até 10 %.
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 O RRTIII [E] é < 1,000 quando o teor de soro é > 5 %;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 O RRTIII [E] é ≥ 1,000 quando o teor de soro é ≤ 5 %.
                              
                           O grau de incerteza admitido nos valores RRTIII é de ± 0,002.
                     Normalmente, o valor de RRTIII [0] difere pouco de 1,034. Consoante o estado das colunas, pode aproximar-se de 1,000, mas deve ser sempre superior a esse valor.
                     9.2.   Cálculo da percentagem de soro de coagulação em pó da amostra:
                     
                     W = SIII[E] – [1,3 + (SIII[0] – 0,9)]
                     em que:
                     
                                 W
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 percentagem (m/m) de soro de coagulação presente na amostra [E];
                              
                           
                                 SIII [E]
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 área relativa do pico III da amostra em análise [E], obtida em 9.1.2;
                              
                           
                                 1,3
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 área relativa média do pico III, expressa em gramas de soro de coagulação por 100 g, determinada com leites em pó desnatados não-adulterados de origens diversas; este valor foi obtido experimentalmente;
                              
                           
                                 SIII [0]
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 área relativa do pico III, igual a RIII × AIII [0]; valores obtidos em 9.1.1 e 8.5.3, respetivamente;
                              
                           
                                 (SIII [0] – 0,9)
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 correção a introduzir na área relativa média 1,3 quando o valor SIII [0] não for igual a 0,9; experimentalmente, a área relativa média do pico III da amostra-padrão [0] é 0,9.
                              
                           9.3.   Precisão do método
                     
                     9.3.1.   Repetibilidade
                     
                     A diferença entre os resultados de duas determinações efetuadas simultaneamente ou com um curto intervalo de tempo, pelo mesmo analista, utilizando o mesmo equipamento, a matérias de ensaio idênticas, não deve exceder 0,2 % (m/m).
                     9.3.2.   Reprodutibilidade
                     
                     A diferença entre dois resultados independentes, obtidos em dois laboratórios diferentes com matérias de ensaio idênticas, não deve exceder 0,4 % (m/m).
                     9.4.   Interpretação
                     
                     9.4.1.   Concluir pela ausência de soro se a área relativa do pico III, SIII [E], expressa em gramas de soro de coagulação por 100 g de produto, for ≤ 2,0 + (SIII[0] – 0,9),
                     
                     em que:
                     
                                 2,0
                              
                              
                                 valor máximo admitido para a área relativa do pico III, tomando em consideração a área relativa média do pico III (1,3), a incerteza devida às variações de composição do leite em pó desnatado e a reprodutibilidade do método (9.3.2);
                              
                           
                                 (SIII [0] – 0,9)
                              
                              
                                 correção a introduzir quando a área SIII [0] for diferente de 0,9 (ver o ponto 9.2).
                              
                           9.4.2.   Se a área relativa do pico III, SIII [E], for > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) e a área relativa do pico II, SII [E], for ≤ 160, determinar o teor de soro de coagulação segundo as indicações do ponto 9.2.
                     
                     9.4.3.   Se a área relativa do pico III, SIII [E], for > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) e a área relativa do pico II, SII [E], for ≤ 160, determinar o teor de proteínas totais (P%); examinar depois os gráficos 1 e 2.
                     
                     9.4.3.1.   Os dados obtidos após análise de amostras de leites em pó desnatados não-adulterados, com teores de proteínas totais elevados, representam-se nos gráficos 1 e 2.
                     
                     A reta a cheio representa a regressão linear, cujos coeficientes foram calculados pelo método dos mínimos quadrados.
                     A reta a tracejado fixa o limite superior da área relativa do pico III, com uma probabilidade de 90 % de não ser ultrapassado.
                     As equações das retas a tracejado dos gráficos 1 e 2 são as seguintes:
                     
                                 SIII = 0,376 P % – 10,7
                              
                              
                                 (gráfico 1),
                              
                           
                                 SIII = 0,0123 SII [E] + 0,93
                              
                              
                                 (gráfico 2),
                              
                           em que:
                     
                                 SIII
                                 
                              
                              
                                 área relativa do pico III, calculada em função do teor de proteínas totais ou da área relativa de pico SII [E];
                              
                           
                                 P %
                              
                              
                                 teor de proteínas totais expresso em percentagem mássica,
                              
                           
                                 SII [E]
                              
                              
                                 área relativa da amostra, calculada no ponto 9.1.2.
                              
                           Estas equações são equivalentes ao valor 1,3 referido no ponto 9.2.
                     A diferença (T1 e T2) entre a área relativa SIII [E] observada e a área relativa SIII é dada pelas seguintes expressões: T1 = SIII[E] – [(0,376 P % – 10,7) + (SIII[0] – 0,9)]; T2 = SIII[E] – [(0,0123 SII[E] + 0,93) + (SIII[0] – 0,9)].
                     
                                 Se T1 e/ou T2
                                 
                              
                              
                                 forem iguais ou inferiores a zero, não se pode concluir pela presença ou não de soro de coagulação.
                              
                           
                                 Se T1 e/ou T2
                                 
                              
                              
                                 forem superiores a zero, fica comprovada a presença de soro de coagulação.
                              
                           O teor de soro de coagulação presente é calculado por meio da seguinte equação: W = T2 + 0,91
                     em que:
                     0,91 representa a diferença entre as retas a cheio e a tracejado, medida no eixo vertical.
                     
                        
                  
                  
                     Apêndice III
                     
                        DETEÇÃO DE SÓLIDOS DE SORO DE COAGULAÇÃO EM LEITE EM PÓ DESNATADO
                     
                     1.   OBJECTO: DETEÇÃO DA ADIÇÃO DE SÓLIDOS DE SORO DE COAGULAÇÃO A LEITE EM PÓ DESNATADO.
                     2.   REFERÊNCIAS: NORMA INTERNACIONAL ISO 707.
                     3.   DEFINIÇÃO
                     O teor de sólidos de soro de coagulação é definido em percentagem mássica, determinada em função do teor de caseinomacropéptidos obtido pelo procedimento descrito.
                     4.   PRINCÍPIO
                     As amostras são analisadas para deteção de caseinomacropéptidos A por um método de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com inversão de fases. A avaliação dos resultados obtidos é feita por comparação com amostras-padrão de leite em pó desnatado com e sem uma percentagem conhecida de soro de coagulação em pó. Qualquer resultado superior a 1 % (m/m) revela a presença de sólidos de soro de coagulação.
                     5.   REAGENTES
                     Todos os reagentes devem ser de grau analítico reconhecido. A água utilizada deve ser destilada ou de pureza pelo menos equivalente. O acetonitrilo deve ser de qualidade para espectroscopia ou para HPLC.
                     5.1.   Solução de ácido tricloroacético
                     
                     Dissolver 240 g de ácido tricloroacético (CCl3COOH) em água e completar o volume até 1 000 ml. A solução deve apresentar-se límpida e incolor.
                     5.2.   Eluentes A e B
                     
                     Eluente A: misturar 150 ml de acetonitrilo (CH3CN), 20 ml de isopropanol (CH3CHOHCH3) e 1,00 ml de ácido trifluoroacético (TFA, CF3COOH) num balão aferido de 1 000 ml. Completar o volume com água.
                     Eluente B: misturar 550 ml de acetonitrilo, 20 ml de isopropanol e 1,00 ml de TFA num balão aferido de 1 000 ml. Completar o volume com água. Antes de o utilizar, filtrar o eluente através de um filtro de membrana com poros de 0,45 μm.
                     5.3.   Conservação da coluna
                     
                     Após as análises, lavar a coluna com o líquido B (aumentando o caudal gradualmente) e, a seguir, com acetonitrilo (aumentando o caudal gradualmente durante 30 minutos). A coluna é conservada em acetonitrilo.
                     5.4.   Amostras-padrão
                     
                     5.4.1.   Leite em pó desnatado que satisfaça as exigências aplicáveis à armazenagem pública (i.e. [0]).
                     
                     5.4.2.   Leite em pó desnatado idêntico, mas adulterado com 5 % (m/m) de soro de coagulação em pó de composição padrão (i.e. [5]).
                     
                     5.4.3.   Leite em pó desnatado idêntico, mas adulterado com 50 % (m/m) de soro de coagulação em pó de composição padrão (i.e. [50]).
                     
                     6.   EQUIPAMENTO
                     6.1.   Balança analítica
                     
                     6.2.   Em opção, centrifugadora capaz de centrifugar a 2 200 g, dotada de tubos de centrifugação rolhados ou capsulados de cerca de 50 ml
                     
                     6.3.   Agitador mecânico
                     
                     6.4.   Agitador magnético
                     
                     6.5.   Funis de vidro, com cerca de 7 cm de diâmetro
                     
                     6.6.   Papel de filtro para filtração média, com cerca de 12,5 cm de diâmetro
                     
                     6.7.   Dispositivo de filtração de vidro com filtro de membrana de 0,45 μm de diâmetro de poro
                     
                     6.8.   Pipetas graduadas de 10 ml (ISO 648, classe A, ou ISO/R 835) ou sistema que permita debitar 10,0 ml em dois minutos
                     
                     6.9.   Sistema que permita debitar 20,0 ml de água a cerca de 50 °C
                     
                     6.10.   Banho-maria termostático regulado para 25 °C ± 0,5 °C
                     
                     6.11.   Equipamento de HPLC, composto por:
                     
                     
                                 6.11.1.
                              
                              
                                 
                                    Sistema de bombagem de gradiente binário
                                 
                              
                           
                                 6.11.2.
                              
                              
                                 
                                    Injetor manual ou automático, com 100 μl de capacidade
                                 
                              
                           
                                 6.11.3.
                              
                              
                                 
                                    Coluna Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (comprimento de 25 cm, diâmetro interno de 0,46 cm) ou coluna equivalente de inversão de fases, com enchimento de sílica de poros largos
                                 
                              
                           
                                 6.11.4.
                              
                              
                                 
                                    Câmara termostática para a coluna, regulada para 35 °C ± 1 °C
                                 
                              
                           
                                 6.11.5.
                              
                              
                                 
                                    Detetor UV de comprimento de onda variável, capaz de efetuar medições a 210 nm (se necessário, pode ser utilizado um comprimento de onda superior, até 220 nm) com a sensibilidade de 0,02 Å
                                 
                              
                           
                                 6.11.6.
                              
                              
                                 
                                    Integrador com possibilidade de integração em relação à linha de base comum ou entre mínimos consecutivos
                                 
                                 
                                    Nota: É possível trabalhar com colunas à temperatura ambiente, desde que esta não varie mais de 1 °C; caso contrário, registam-se demasiadas variações do tempo de retenção dos CMPA.
                              
                           7.   AMOSTRAGEM
                     7.1.   A colheita das amostras deve ser efetuada de acordo com a norma internacional ISO 707. Todavia, os Estados-Membros podem utilizar outro método de amostragem, desde que respeite os princípios da referida norma.
                     
                     7.2.   Conservar as amostras em condições que evitem qualquer deterioração ou alteração de composição.
                     
                     8.   PROCEDIMENTO
                     8.1.   Preparação da amostra para análise
                     
                     Colocar o leite em pó num recipiente de capacidade aproximadamente dupla do volume do pó, equipado com uma tampa hermética. Fechar de imediato o recipiente. Misturar bem o leite em pó, invertendo várias vezes o recipiente.
                     8.2.   Toma para análise
                     
                     Pesar 2,00 ± 0,001 g da amostra para análise num tubo de centrifugação (6.2) ou num balão rolhado adequado (50 ml).
                     
                        Nota: No caso das misturas, pesar uma quantidade da amostra para análise que corresponda a 2,00 g de amostra sem matérias gordas.
                     8.3.   Eliminação da matéria gorda e das proteínas
                     
                     8.3.1.   Adicionar 20,0 ml de água quente (50 °C) à toma para análise. Dissolver o pó, agitando durante cinco minutos com um agitador mecânico (6.3). Colocar o tubo em banho-maria (6.10) e deixar estabilizar a 25 °C.
                     
                     8.3.2.   Adicionar, ao longo de 2 minutos, de forma constante, 10,0 ml da solução de ácido tricloroacético, a cerca de 25 °C (5.1), agitando sempre vigorosamente com o agitador magnético (6.4). Colocar o tubo no banho-maria (6.10) e deixar em repouso durante 60 minutos
                     
                     8.3.3.   Centrifugar (6.2) durante 10 minutos a 2 200 g ou filtrar através de papel de filtro (6.6), rejeitando os primeiros 5 ml de filtrado.
                     
                     8.4.   Determinação cromatográfica
                     
                     8.4.1.   O método HPLC com inversão de fases exclui a possibilidade de resultados falsamente positivos devido à presença de leitelho ácido em pó.
                     
                     8.4.2.   Antes de se proceder à análise HPLC com inversão de fases, devem ser otimizadas as condições de gradiente. No caso dos sistemas de gradiente com um volume morto de cerca de 6 ml (volume a partir do ponto em que os solventes se juntam até ao volume da ansa do injetor, inclusive), o tempo de retenção ótimo para os CMPA é de 26 ± 2 minutos. Os sistemas de gradiente com menos volume morto (por exemplo: 2 ml) devem utilizar 22 minutos como tempo de retenção ótimo.
                     
                     Tomar as soluções de amostras-padrão (5.4) sem e com 50 % de soro de coagulação.
                     Injetar 100 μl do sobrenadante ou filtrado (8.3.3) no aparelho de HPLC, que deve funcionar nas condições de gradiente de aferição indicadas no quadro 1.
                     
                        Quadro 1
                     
                     
                        Condições de gradiente de aferição para otimização da cromatografia
                     
                     
                                 Tempo
                                 (minutos)
                              
                              
                                 Caudal
                                 (ml/minuto)
                              
                              
                                 % A
                              
                              
                                 % B
                              
                              
                                 Curva
                              
                           
                                 Inicial
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 90
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                 *
                              
                           
                                 27
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 60
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 linear
                              
                           
                                 32
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                 90
                              
                              
                                 linear
                              
                           
                                 37
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                 90
                              
                              
                                 linear
                              
                           
                                 42
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 90
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                 linear
                              
                           A comparação dos dois cromatogramas deve revelar a localização do pico dos CMPΑ.
                     Utilizando a fórmula a seguir indicada, pode calcular-se a composição inicial do solvente a utilizar para o gradiente normal (ver 8.4.3): % B = 10 – 2,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) × 30 / 27 %; B = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) × 1,11.
                     em que:
                     
                                 RTcmpA
                                 
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 tempo de retenção dos CMPΑ com o gradiente de aferição;
                              
                           
                                 10
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 % B inicial no gradiente de aferição;
                              
                           
                                 2,5
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 % B no ponto médio menos % B inicial no gradiente normal;
                              
                           
                                 13,5
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 tempo médio no gradiente de aferição;
                              
                           
                                 26
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 tempo de retenção pretendido dos CMPΑ;
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 razão entre os declives do gradiente de aferição e do gradiente normal;
                              
                           
                                 30
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 % B inicial menos % B após 27 minutos no gradiente de aferição;
                              
                           
                                 27
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 tempo decorrido do gradiente de aferição.
                              
                           8.4.3.   Toma das soluções das amostras para análise
                     
                     Injetar 100 μl de sobrenadante ou filtrado (8.3.3), medidos rigorosamente, no aparelho de HPLC, com um caudal de 1,0 ml de eluente (5.2) por minuto.
                     A composição do eluente no início da análise é obtida aplicando o ponto 8.4.2. Normalmente, será próxima de A:B = 76:24 (5.2). Imediatamente após a injeção, dá-se início a um gradiente linear, de modo a atingir uma percentagem de B 5 % mais elevada após 27 minutos. Em seguida, dá-se início a um novo gradiente linear, para levar a composição do eluente a 90 % de B em cinco minutos. Esta composição é mantida durante cinco minutos, voltando depois a mudar em cinco minutos, através de um gradiente linear, para a composição inicial. A injeção seguinte, que depende do volume interno do sistema de bombagem, pode ser feita 15 minutos após a obtenção das condições iniciais.
                     
                        Nota 1. O tempo de retenção dos CMPA deve ser de 26 ± 2 minutos. Esse tempo de retenção pode ser conseguido adaptando as condições iniciais e finais do primeiro gradiente. Todavia, a diferença entre a% de B nas condições iniciais e finais do primeiro gradiente deve manter-se em 5 % de B.
                     
                        Nota 2. Os eluentes devem ser suficientemente desgaseificados e permanecer nesse estado. Tal é essencial para o funcionamento adequado do sistema de bombagem em gradiente. O desvio-padrão do tempo de retenção do pico dos CMPA deve ser inferior a 0,1 minutos (n =10).
                     
                        Nota 3. Após cada cinco amostras, deve voltar a ser injetada a amostra de referência (5), que será utilizada para calcular um novo fator de resposta, R (9.1.1).
                     8.4.4.   Os resultados da análise cromatográfica da amostra em análise (E) são obtidos sob a forma de um cromatograma, no qual o pico dos CMPA é identificado pelo seu tempo de retenção de cerca de 26 minutos.
                     
                     O integrador (6.11.6) calcula automaticamente a altura, H, do pico dos CMPA. Em todos os cromatogramas, deve ser verificada a localização da linha de base. Deve repetir-se a análise ou a integração se a linha de base estiver incorretamente localizada.
                     
                        Nota: Se o pico dos CMPA estiver suficientemente separado dos outros picos, deve aplicar-se uma integração entre mínimos consecutivos na linha de base; caso contrário, utilizar a projeção perpendicular sobre uma linha de base comum, que deverá ter início perto do pico dos CMPA (e, portanto, não em t = 0 min!). Utilizar o mesmo tipo de integração para as amostras e para o padrão e, caso se recorra a uma linha de base comum, verificar a sua aplicabilidade às amostras e ao padrão.
                     É essencial examinar o aspeto de cada cromatograma antes de qualquer interpretação quantitativa, para detetar eventuais anomalias devidas a funcionamento deficiente do equipamento ou da coluna ou decorrentes da origem ou natureza da amostra analisada. Em caso de dúvida, repetir a análise.
                     8.5.   Calibração
                     
                     8.5.1.   Aplicar às amostras-padrão (5.4.1 e 5.4.2) exatamente o procedimento descrito nos pontos 8.2 a 8.4.4. Utilizar soluções preparadas de fresco, já que os CMP se degradam, à temperatura ambiente, em meio de ácido tricloroacético a 8 %. A 4 °C, a solução mantém-se estável durante 24 horas. No caso de séries longas de análises, é desejável a utilização de um recipiente arrefecido para amostras no injetor automático.
                     
                     
                        Nota: O ponto 8.4.2. pode ser suprimido se a% de B nas condições iniciais for conhecida de análises anteriores.
                     O cromatograma da amostra de referência [5] deve ser idêntico à figura. 1. Nesta figura, o pico dos CMPA é precedido por dois pequenos picos. É essencial obter uma separação semelhante.
                     8.5.2.   Antes da determinação cromatográfica às amostras, injetar 100 μl da amostra-padrão sem soro de coagulação [0] (5.4.1).
                     
                     O cromatograma não deve apresentar nenhum pico com o mesmo tempo de retenção que o pico dos CMPA.
                     8.5.3.   Determinar os fatores de resposta, R, injetando um volume de filtrados (8.5.1) idêntico ao utilizado para as amostras
                     
                     9.   APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS
                     9.1.   Modo de cálculo e fórmulas
                     
                     9.1.1.   Cálculo do fator de resposta R:
                     
                     Pico dos CMPA: R = W/H
                     em que:
                     
                                 R
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 fator de resposta do pico dos CMPA;
                              
                           
                                 H
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 altura do pico dos CMPA;
                              
                           
                                 W
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 quantidade de soro na amostra-padrão [5].
                              
                           9.2.   Cálculo da percentagem dE soro de coagulação em pó da amostra
                     
                     W(E) = R × H(E)
                     em que:
                     
                                 W(E)
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 percentagem (m/m) de soro de coagulação presente na amostra (E);
                              
                           
                                 R
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 fator de resposta do pico dos CMPA (9.1.1);
                              
                           
                                 H(E)
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 altura do pico dos CMPA da amostra (E).
                              
                           Se W(E) for superior a 1 % e a diferença entre o tempo de retenção e o da amostra-padrão [5] for inferior a 0,2 minutos, conclui-se pela presença de sólidos de soro de coagulação.
                     9.3.   Precisão do método
                     
                     9.3.1.   Repetibilidade
                     
                     A diferença entre os resultados de duas determinações efetuadas simultaneamente ou com um curto intervalo de tempo, pelo mesmo analista, utilizando o mesmo equipamento, a matérias de ensaio idênticas, não deve exceder 0,2 % (m/m).
                     9.3.2.   Reprodutibilidade
                     
                     Não determinada.
                     9.3.3.   Linearidade
                     
                     Entre 0 % e 16 % de soro de coagulação, deve ser obtida uma relação linear com um coeficiente de correlação superior a 0,99.
                     9.4.   Interpretação
                     
                     O limite de 1 % a inclui incerteza associada à reprodutibilidade.
                     
                        Figura 1
                     
                     
                        Padrão Ni-4.6
                     
                     
                        
                  
                  
                              (*)
                           
                           
                              Norma internacional IDF 135B/1991. Milk and milk products. Precision charachteristics of analytical methods. Outline of collaborative study procedure.»
                           
                        
            
                  3)
               
               
                  São aditados os seguintes anexos:
                  «
                  
                     ANEXO VI
                     
                        Métodos de análise de manteiga em armazenamento privado
                     
                     
                                 Parâmetro
                              
                              
                                 Método
                              
                           
                                 Matéria gorda (6)
                                 
                              
                              
                                 ISO 17189 ou ISO 3727, parte 3
                              
                           
                                 Humidade
                              
                              
                                 ISO 3727, parte 1
                              
                           
                                 Resíduo seco isento de matéria gorda (exceto sal)
                              
                              
                                 ISO 3727, parte 2
                              
                           
                                 Sal
                              
                              
                                 ISO 15648
                              
                           
                  
                     ANEXO VII
                     
                        Métodos de análise de leite em pó desnatado em armazenamento privado
                     
                     
                                 Parâmetro
                              
                              
                                 Método
                              
                           
                                 Matéria gorda
                              
                              
                                 ISO 1736
                              
                           
                                 Proteínas
                              
                              
                                 ISO 8968, parte 1
                              
                           
                                 Humidade
                              
                              
                                 ISO 5537
                              
                           
                  
                     ANEXO VIII
                     
                        Métodos de análise de queijo em armazenamento privado
                     
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 O método de análise descrito no apêndice é utilizado para garantir que o queijo que deve ser produzido exclusivamente com leite de ovelha, leite de cabra ou leite de búfala, ou com misturas de leites de ovelha, cabra e búfala, não contém caseína de leite de vaca.
                                 Considera-se que se encontra presente caseína de leite de vaca se o teor de caseína de leite de vaca da amostra analisada for igual ou superior ao teor da amostra de referência com 1 % de leite de vaca, conforme é descrito no apêndice.
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Podem ser utilizados outros métodos de deteção de caseína de leite de vaca nos queijos referidos no n.o 1, nas seguintes condições:
                                 
                                             a)
                                          
                                          
                                             O limite de deteção é, no máximo, de 0,5 %; e
                                          
                                       
                                             b)
                                          
                                          
                                             Não se observam falsos resultados positivos; e
                                          
                                       
                                             c)
                                          
                                          
                                             A caseína de leite de vaca é detetável com a sensibilidade requerida, mesmo após longos períodos de cura, como pode acontecer nas condições habituais de comercialização.
                                          
                                       Caso alguma das condições acima referidas não seja satisfeita, deve ser usado o método descrito no apêndice.
                              
                           
                  
                     Apêndice
                     
                        MÉTODO PARA A DETEÇÃO DE LEITE DE VACA E DE CASEINATOS PROVENIENTES DE LEITE DE VACA EM QUEIJOS DE LEITE DE OVELHA, LEITE DE CABRA OU LEITE DE BÚFALA OU DE MISTURAS DE LEITES DE OVELHA, CABRA E BÚFALA
                     
                     1.   OBJETO
                     Deteção de leite de vaca e de caseinatos provenientes de leite de vaca em queijos produzidos com leite de ovelha, leite de cabra e leite de búfala ou com misturas de leites de ovelha, cabra e búfala, por focagem isoelétrica das γ-caseínas após plasminólise.
                     2.   ÂMBITO DE APLICAÇÃO
                     Este método é adequado para uma deteção sensível e específica de leite de vaca cru ou tratado termicamente e de caseinatos provenientes desses leites de vaca em queijos frescos ou curados produzidos com leite de ovelha, leite de cabra ou leite de búfala ou com misturas de leites de ovelha, cabra e búfala. Não é adequado para a deteção de leite e queijo adulterados com concentrados proteicos de soro de leite de vaca tratados termicamente.
                     3.   PRINCÍPIO DO MÉTODO
                     3.1.   Isolamento das caseínas do queijo e dos padrões de referência.
                     
                     3.2.   Dissolução das caseínas isoladas e clivagem pela plasmina (EC 3.4.21.7).
                     
                     3.3.   Focagem isoelétrica das caseínas tratadas com plasmina, na presença de ureia, e coloração das proteínas.
                     
                     3.4.   Avaliação das bandas coradas de γ3-caseína e de γ2-caseína (indício da presença de leite de vaca) por comparação entre as bandas correspondentes à amostra e as bandas dos padrões de referência com 0 % e 1 % de leite de vaca obtidas no mesmo gel.
                     
                     4.   REAGENTES
                     Salvo indicação em contrário, devem ser utilizados reagentes de grau analítico. A água deve ser bidestilada ou de pureza equivalente.
                     
                        Nota: As especificações a seguir descritas aplicam-se a géis de poliacrilamida com ureia, de dimensões 265 mm × 125 mm × 0,25 mm, preparados em laboratório. Caso sejam utilizadas outras dimensões e tipos de gel, poderá ser necessário ajustar as condições de separação.
                     
                        
                           Focagem isoelétrica
                        
                     
                     4.1.   Reagentes para a produção de géis de poliacrilamida com ureia
                     
                     4.1.1.   Solução de reserva de gel
                     
                     Dissolver:
                     
                                  
                              
                              
                                 4,85 g de acrilamida,
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,15 g de N,N′-metileno-bis-acrilamida (BIS),
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 48,05 g de ureia e
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 15,00 g de glicerol (87 % m/m)
                              
                           em água e completar o volume até 100 ml. Guardar no frigorífico, em recipiente de vidro de cor âmbar.
                     
                        Nota: Em vez das quantidades indicadas das acrilamidas neurotóxicas, pode ser preferível utilizar uma solução disponível no comércio de acrilamida e BIS, previamente misturadas. Caso essa solução contenha 30 % (m/v) de acrilamida e 0,8 % (m/v) de BIS, deve ser utilizado na formulação um volume de 16,2 ml, em vez das quantidades indicadas. A solução de reserva pode ser guardada durante um período máximo de 10 dias. Se a sua condutividade for superior a 5 μS, proceder a uma desionização, por agitação com 2 g de Amberlite MB-3 durante 30 minutos, seguida de filtração através de uma membrana de 0,45 μm.
                     4.1.2.   Solução de gel
                     
                     Preparar uma solução de gel misturando os aditivos e os anfólitos (*) com a solução de reserva de gel (ver o ponto 4.1.1):
                     
                                  
                              
                              
                                 9,0 ml de solução de reserva,
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 24 mg de β-alanina,
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 500 μl de anfólitos de pH 3,5-9,5,
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 250 μl de anfólitos de pH 5-7,
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 250 μl de anfólitos de pH 6-8.
                              
                           Misturar a solução de gel e desgaseificar durante 2 a 3 minutos num banho de ultrassons ou sob vácuo.
                     
                        Nota: Preparar a solução de gel imediatamente antes da sua utilização (ver 6.2).
                     4.1.3.   Soluções catalisadoras
                     
                     4.1.3.1.   N,N,N′,N′-tetrametiletilenodiamina (TEMED).
                     4.1.3.2.   Solução de persulfato de amónio (PER) a 40 % (m/v):
                     Dissolver 800 mg de PER em água e completar o volume até 2 ml.
                     
                        Nota: Utilizar sempre solução de PER preparada de fresco.
                     4.2.   Fluido de contacto
                     
                     Querosene ou parafina líquida.
                     4.3.   Solução anódica
                     
                     Dissolver 5,77 g de ácido fosfórico (85 % m/m) em água e diluir até 100 ml.
                     4.4.   Solução catódica
                     
                     Dissolver 2,00 g de hidróxido de sódio em água e diluir até 100 ml com água.
                     
                        
                           Preparação da amostra
                        
                     
                     4.5.   Reagentes para isolamento das proteínas
                     
                     4.5.1.   Ácido acético diluído (25,0 ml de ácido acético glacial, diluído com água até 100 ml).
                     
                     4.5.2.   Diclorometano.
                     
                     4.5.3.   Acetona.
                     
                     4.6.   Solução-tampão para dissolução das proteínas
                     
                     Dissolver
                     
                                  
                              
                              
                                 5,75 g de glicerol (87 % m/m),
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 24,03 g de ureia
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 e 250 mg de ditiotreitol
                              
                           em água e completar o volume até 50 ml.
                     
                        Nota: Guardar no frigorífico durante um período máximo de uma semana.
                     4.7.   Reagentes para clivagem das caseínas pela plasmina
                     
                     4.7.1.   Solução-tampão de carbonato de amónio
                     
                     Titular, até pH 8, uma solução 0,2 mol/1 de hidrogenocarbonato de amónio (1,58 g/100 ml de água) contendo 0,05 mol/l de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 1,46 g/100 ml) com uma solução 0,2 mol/l de carbonato de amónio (1,92 g/100 ml de água) contendo 0,05 mol/l de EDTA.
                     4.7.2.   Plasmina de bovino (EC 3.4.21.7), com atividade de, pelo menos, 5 U/ml.
                     
                     4.7.3.   Solução de ácido ε-aminocapróico para inibição enzimática
                     
                     Dissolver 2,624 g de ácido ε-aminocapróico (ácido 6-amino-n-hexanóico) em 100 ml de etanol a 40 % (v/v).
                     4.8.   Padrões
                     
                     4.8.1.   Estão disponíveis no Instituto de Materiais e Medidas de Referência da Comissão, B-2440 Geel, Bélgica, padrões de referência certificados de uma mistura de leites desnatados coalhados de ovelha e de cabra com 0 % e 1 % de leite de vaca.
                     
                     4.8.2.   Preparação de padrões laboratoriais provisórios de leite de búfala coalhado com 0 % e 1 % de leite de vaca
                     
                     Os leites desnatados são preparados por centrifugação de leite cru a granel, de búfala ou de vaca, a 37 °C e 2 500 g durante 20 minutos. Após arrefecimento rápido do tubo e do seu conteúdo para 6-8 °C, remover completamente a camada superior de matéria gorda. Para a preparação do padrão a 1 %, adicionar 5,00 ml de leite de vaca desnatado a 495 ml de leite de búfala desnatado, num copo de 1 l, e ajustar o pH a 6,4 com ácido láctico diluído (10 % m/v). Ajustar a temperatura a 35 °C e adicionar 100 μl de coalho de vitelo (atividade do coalho 1:10 000, c. 3 000 U/ml), agitar durante um minuto e deixar o copo coberto com uma folha de alumínio, a 35 °C, durante uma hora, a fim de permitir a coagulação. Depois da coagulação, liofiliza-se todo o leite coalhado sem homogeneização ou escorrimento prévios do soro. Em seguida, mói-se finamente o leite liofilizado, a fim de produzir um pó homogéneo. Para a preparação do padrão a 0 %, proceder do mesmo modo, com leite desnatado de búfala puro. Os padrões devem ser conservados a – 20 °C.
                     
                        Nota: Antes da preparação dos padrões, é aconselhável verificar a pureza do leite de búfala, por focagem isoelétrica das caseínas tratadas com plasmina.
                     
                        
                           Reagentes para coloração das proteínas
                        
                     
                     4.9.   Fixador
                     
                     Dissolver 150 g de ácido tricloroacético em água e completar o volume até 1 000 ml.
                     4.10.   Solução de descoloração
                     
                     Misturar 500 ml de metanol e 200 ml de ácido acético glacial e completar o volume até 2 000 ml com água destilada.
                     
                        Nota: Preparar solução de descoloração fresca todos os dias. Esta pode ser facilmente preparada misturando volumes iguais de soluções de reserva de metanol a 50 % (v/v) e de ácido acético glacial a 20 % (v/v).
                     4.11.   Soluções de coloração
                     
                     4.11.1.   Solução de coloração de reserva 1
                     
                     Dissolver 3,0 g de Coomassie Brilliant Blue g 250 (Color Index 42655) em 1 000 ml de metanol a 90 % (v/v), utilizando um agitador magnético (aproximadamente 45 minutos) e filtrar através de dois filtros de pregas de velocidade média.
                     4.11.2.   Solução de coloração de reserva 2
                     
                     Dissolver 5,0 g de sulfato de cobre penta-hidratado em 1 000 ml de ácido acético a 20 % (v/v).
                     4.11.3.   Solução de coloração de trabalho
                     
                     Misturar 125 ml de cada solução de reserva (4.11.1 e 4.11.2) imediatamente antes da coloração.
                     
                        Nota: A solução de coloração deve ser preparada no dia da utilização.
                     5.   EQUIPAMENTO
                     5.1.   Placas de vidro (265 mm × 125 mm × 4 mm); rolo de borracha (largura 15 cm); mesa de nivelamento.
                     
                     5.2.   Folha de suporte do gel (265 mm × 125 mm).
                     
                     5.3.   Folha de cobertura (280 mm × 125 mm). Colar uma faixa de fita adesiva (280 mm × 6 mm × 0,25 mm) em cada uma das margens mais longas (ver a figura1).
                     
                     5.4.   Câmara de eletrofocagem com placa de arrefecimento (por exemplo, 265 mm × 125 mm) e alimentação elétrica adequada (≥ 2,5 kV) ou aparelho automático de eletroforese.
                     
                     5.5.   Crióstato de circulação, termostatizado a 12 °C ± 0,5 °C.
                     
                     5.6.   Centrifugadora regulável a 3 000 g.
                     
                     5.7.   Elétrodos de fita (≥ 265 mm de comprimento).
                     
                     5.8.   Frascos conta-gotas de plástico para as soluções anódica e catódica.
                     
                     5.9.   Aplicadores de amostra (10 mm × 5 mm, viscose ou papel de filtro com baixa adsorção de proteínas).
                     
                     5.10.   Tinas de aço inoxidável ou de vidro para coloração e descoloração (por exemplo, tabuleiros de instrumentos com 280 mm × 150 mm).
                     
                     5.12.   Homogeneizador de varinha, regulável (varinha com 10 mm de diâmetro); gama de velocidades de 8 000 rpm a 20 000 rpm.
                     
                     5.13.   Agitador magnético.
                     
                     5.14.   Banho de ultrassons.
                     
                     5.15.   Soldador de folhas.
                     
                     5.16.   Micropipetas de 25 μl.
                     
                     5.17.   Concentrador de vácuo ou liofilizador.
                     
                     5.18.   Banho-maria termostático, regulável a 35 °C e 40 °C ± 1 °C, com agitador.
                     
                     5.19.   Densitómetro, com leitura a λ = 634 nm.
                     
                     6.   PROCEDIMENTO
                     6.1.   Preparação da amostra
                     
                     6.1.1.   Isolamento das caseínas
                     
                     Pesar a quantidade correspondente a 5 g de matéria seca de queijo ou dos padrões de referência para um tubo de centrifugação de 100 ml, adicionar 60 ml de água destilada e homogeneizar com um homogeneizador de varinha (8 000 rpm a 10 000 rpm). Ajustar o pH a 4,6 com ácido acético diluído (4.5.1) e centrifugar (cinco minutos a 3 000 g). Decantar a matéria gorda e o soro, homogeneizar o resíduo a 20 000 rpm em 40 ml de água destilada, ajustada a pH 4,5 com ácido acético diluído (4.5.1), adicionar 20 ml de diclorometano (4.5.2), homogeneizar novamente e centrifugar (cinco minutos a 3 000 g). Retirar com uma espátula a camada de caseína que se encontra entre as fases aquosa e orgânica (ver a figura 2) e decantar ambas as fases. Homogeneizar de novo a caseína em 40 ml de água destilada (ver acima) e 20 ml de diclorometano (4.5.2) e centrifugar. Repetir este processo até que ambas as fases extraídas se apresentem incolores (duas a três vezes). Homogeneizar o resíduo proteico com 50 ml de acetona (5.3) e filtrar através de papel de filtro com pregas de velocidade média. Lavar o resíduo retido no filtro com duas porções sucessivas de 25 ml de acetona e secar ao ar ou numa corrente de azoto. Em seguida, pulverizar finamente num almofariz.
                     
                        Nota: Os isolados de caseína secos devem ser conservados a – 20 °C.
                     6.1.2.   Clivagem pela plasmina das β-caseínas, para intensificação das γ-caseínas
                     
                     Suspender 25 mg de caseínas isoladas (6.1.1) em 0,5 ml de tampão de carbonato de amónio (4.7.1) e homogeneizar durante 20 minutos, por exemplo com ultrassons. Aquecer a 40 °C e adicionar 10 μl de plasmina (4.7.2), misturar e incubar durante 1 hora a 40 °C, com agitação contínua. A fim de inibir as enzimas, adicionar 20 μl de solução de ácido ε-aminocapróico (4.7.3) e, seguidamente, 200 mg de ureia sólida e 2 mg de ditiotreitol.
                     
                        Nota: Para obter mais simetria nas bandas de caseína focadas, é aconselhável liofilizar a solução depois de adicionar o ácido ε-aminocaproico e dissolver em seguida os resíduos em 0,5 ml de solução-tampão para dissolução das proteínas (4.6).
                     6.2.   Preparação dos géis de poliacrilamida com ureia
                     
                     Com a ajuda de algumas gotas de água, estender com o rolo a folha de suporte de gel (5.2) numa placa de vidro (5.1) e retirar toda a água remanescente com um toalhete ou um lenço de papel. Estender, da mesma forma, a folha de cobertura (5.3) com separadores (0,25 mm) noutra placa de vidro. Colocar a placa horizontalmente numa mesa de nivelamento.
                     Adicionar 10 μl da solução TEMED (4.1.3.1) à solução de gel preparada e desgaseificada (4.1.2), agitar e adicionar 10 μl de solução PER (4.1.3.2), misturar bem e deitar imediatamente, de maneira uniforme, no centro da folha de cobertura. Colocar uma extremidade da placa de suporte do gel (folha virada para baixo) sobre a placa de cobertura e rebatê-la lentamente, de modo a que se forme um filme de gel entre as folhas, distribuído regularmente e sem bolhas de ar (figura 3). Com cuidado, rebater completamente a placa de suporte do gel, utilizando uma espátula fina, e colocar por cima mais três placas de vidro, que servirão de pesos. Depois de terminada a polimerização (cerca de 60 minutos), retirar o gel polimerizado para a placa de suporte do gel juntamente com a folha de cobertura, inclinando as placas de vidro. Limpar cuidadosamente o reverso da placa de suporte do gel, para remover os resíduos de gel e de ureia. Enrolar a «sanduíche de gel» de modo a formar um tubo revestido de filme, soldar e guardar no frigorífico (no máximo seis semanas).
                     
                        Nota: A folha de cobertura com os separadores pode ser reutilizada. O gel de poliacrilamida pode ser cortado em dimensões mais pequenas, cuja utilização é recomendada quando se disponha de poucas amostras ou se se utilizar um aparelho automático de eletroforese (dois géis, dimensão 4,5 cm × 5 cm).
                     6.3.   Focagem isoelétrica
                     
                     Ligar o termóstato de arrefecimento a 12 °C. Limpar o reverso da folha de suporte do gel com querosene e, em seguida, deitar algumas gotas de querosene (4.2) no centro do bloco de arrefecimento. Aplicar a sanduíche de gel, desenrolando-a com o lado de suporte para baixo, tendo o cuidado de evitar bolhas de ar. Limpar qualquer excesso de querosene e retirar a folha de cobertura. Impregnar os elétrodos de fita com as soluções anódica e catódica (4.3, 4.4), cortá-los ao comprimento do gel e colocá-los nas posições previstas (a distância entre os elétrodos deve ser de 9,5 cm).
                     
                        
                           Condições da focagem isoelétrica:
                        
                     
                     6.3.1.   Formato do gel: 265 mm × 125 mm × 0,25 mm
                     
                     
                                 Etapa
                              
                              
                                 Tempo
                                 (min.)
                              
                              
                                 Tensão
                                 (V)
                              
                              
                                 Corrente
                                 (mA)
                              
                              
                                 Potência
                                 (W)
                              
                              
                                 Volt.hora
                                 (Vh)
                              
                           
                                 
                                             1.
                                          
                                          
                                             Pré-focagem
                                          
                                       
                              
                                 30
                              
                              
                                 máximo
                                 2 500 
                              
                              
                                 máximo
                                 15
                              
                              
                                 4, constante
                              
                              
                                 cerca de 300
                              
                           
                                 
                                             2.
                                          
                                          
                                             Focagem da amostra (7)
                                             
                                          
                                       
                              
                                 60
                              
                              
                                 máximo
                                 2 500 
                              
                              
                                 máximo
                                 15
                              
                              
                                 4, constante
                              
                              
                                 cerca de 1 000 
                              
                           
                                 
                                             3.
                                          
                                          
                                             Focagem final
                                          
                                       
                              
                                 60
                              
                              
                                 máximo
                                 2 500 
                              
                              
                                 máximo
                                 5
                              
                              
                                 máximo
                                 20
                              
                              
                                 cerca de 3 000 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 máximo
                                 2 500 
                              
                              
                                 máximo
                                 6
                              
                              
                                 máximo
                                 20
                              
                              
                                 cerca de 3 000 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 30
                              
                              
                                 máximo
                                 2 500 
                              
                              
                                 máximo
                                 7
                              
                              
                                 máximo
                                 25
                              
                              
                                 cerca de 3 000 
                              
                           
                        Nota: Se a espessura ou largura dos géis forem alteradas, os valores da corrente elétrica e da potência terão de ser devidamente adaptados (duplicar os valores da corrente elétrica e da potência se for utilizado um gel de 265 mm × 125 mm × 0,5 mm).
                     6.3.2.   Exemplo de um programa de tensão para um aparelho automático de eletroforese (dois géis de 5,0 cm × 4,5 cm), com elétrodos sem fitas aplicados diretamente no gel
                     
                     
                                 Etapa
                              
                              
                                 Tensão
                              
                              
                                 Corrente
                              
                              
                                 Potência
                              
                              
                                 Temperatura
                              
                              
                                 Volt.hora
                              
                           
                                 
                                             1.
                                          
                                          
                                             Pré-focagem
                                          
                                       
                              
                                 1 000  V
                              
                              
                                 10,0 mA
                              
                              
                                 3,5 W
                              
                              
                                 8 °C
                              
                              
                                 85 Vh
                              
                           
                                 
                                             2.
                                          
                                          
                                             Focagem da amostra
                                          
                                       
                              
                                 250 V
                              
                              
                                 5,0 mA
                              
                              
                                 2,5 W
                              
                              
                                 8 °C
                              
                              
                                 30 Vh
                              
                           
                                 
                                             3.
                                          
                                          
                                             Focagem
                                          
                                       
                              
                                 1 200  V
                              
                              
                                 10,0 mA
                              
                              
                                 3,5 W
                              
                              
                                 8 °C
                              
                              
                                 80 Vh
                              
                           
                                 
                                             4.
                                          
                                          
                                             Focagem
                                          
                                       
                              
                                 1 500  V
                              
                              
                                 5,0 mA
                              
                              
                                 7,0 W
                              
                              
                                 8 °C
                              
                              
                                 570 Vh
                              
                           Colocar o aplicador de amostras na etapa 2 a 0 Vh.
                     Retirar o aplicador de amostras na etapa 2 a 30 Vh.
                     6.4.   Coloração das proteínas
                     
                     6.4.1.   Fixação das proteínas
                     
                     Retirar os elétrodos de fitas imediatamente após desligar a corrente e colocar logo o gel numa tina de coloração/descoloração cheia com 200 ml de fixador (4.9); deixar imerso durante 15 minutos, agitando continuamente.
                     6.4.2.   Lavagem e coloração da placa de gel
                     
                     Escorrer todo o fixador e lavar a placa de gel duas vezes, durante 30 segundos de cada vez, com 100 ml da solução de descoloração (4.10). Escorrer a solução de descoloração e encher a tina com 250 ml de solução de coloração (4.11.3); deixar corar durante 45 minutos, agitando suavemente.
                     6.4.3.   Descoloração da placa de gel
                     
                     Escorrer a solução de coloração, lavar a placa de gel duas vezes, com 100 ml de solução de descoloração (4.10) de cada vez, e, em seguida, agitar durante 15 minutos com 200 ml de solução de descoloração, repetindo a etapa da descoloração pelo menos duas ou três vezes, até que o fundo esteja claro e incolor. Lavar a placa de gel com água destilada (2 × 2 minutos) e secar ao ar (duas a três horas) ou com um secador de cabelo (10 a 15 minutos).
                     
                        Nota 1: Proceder à fixação, lavagem, coloração e descoloração a 20 °C. Não o fazer a temperaturas elevadas.
                     
                        Nota 2: No caso de se preferir uma coloração pela prata, de maior sensibilidade (por exemplo Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, código n.o 17-1150-01), as amostras de caseína tratadas com plasmina terão de ser diluídas a 5 mg/ml.
                     7.   AVALIAÇÃO
                     A avaliação é efetuada por comparação das bandas proteicas da amostra desconhecida com as bandas dos padrões de referência no mesmo gel. A deteção de leite de vaca em queijos produzidos com leite de ovelha, leite de cabra ou leite de búfala ou com misturas de leites de ovelha, cabra e búfala é efetuada através da γ3-caseína e da γ2-caseína, cujos pontos isoelétricos se situam entre pH 6,5 e pH 7,5 (figuras 4a, 4b e 5). O limite de deteção é inferior a 0,5 %.
                     7.1.   Avaliação visual
                     
                     Para a avaliação visual da quantidade de leite de vaca, é aconselhável ajustar as concentrações das amostras e dos padrões de modo a obter o mesmo nível de intensidade da γ2-caseína e da γ3-caseína de ovelha (E), cabra (G) e/ou búfala (B) (ver «γ2 E,G,B» e «γ3 E,G,B» nas figuras 4a, 4b e 5). Em seguida, a quantidade de leite de vaca (inferior, igual ou superior a 1 %) na amostra desconhecida poderá ser diretamente avaliada por comparação da intensidade da γ3-caseína e da γ2-caseína (ver «γ3 C» e «γ2 C» nas figuras 4a, 4b e 5) com as intensidades correspondentes dos padrões de referência (ovelha, cabra) ou padrões laboratoriais provisórios (búfala) a 0 % e 1 %.
                     7.2.   Avaliação densitométrica
                     
                     Se possível, determinar por densitometria (5.19) a razão entre as áreas dos picos da γ2-caseína e da γ3-caseína bovinas e as áreas dos picos da γ2-caseína e da γ3-caseína de ovelha, de cabra e/ou de búfala (ver figura 5). Comparar o valor obtido com a razão das áreas dos picos da γ2-caseína e da γ3-caseína dos padrões de referência (ovelha, cabra) ou padrões laboratoriais provisórios (búfala) a 1 % analisados no mesmo gel.
                     
                        Nota: O método estará a funcionar satisfatoriamente caso exista um sinal positivo claro da γ2-caseína e da γ3-caseína bovinas no padrão de referência a 1 %, mas não no padrão de referência a 0 %. Caso contrário, otimizar os procedimentos, seguindo rigorosamente a descrição do método.
                     Considera-se uma amostra positiva se tanto a γ2-caseína como a γ3-caseína bovinas, ou as razões correspondentes de áreas de picos, forem iguais ou superiores aos níveis do padrão de referência a 1 %.
                     8.   REFERÊNCIAS
                     
                        Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).
                     
                     
                        Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).
                     
                     
                        Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. in Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp. 389-393, Bode-Verlag, München (1989).
                     
                     
                        Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).
                     
                     
                        Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).
                     
                     
                        Figura 1
                     
                     
                        Representação esquemática da folha de cobertura
                     
                     
                        
                     
                        Figura 2
                     
                     
                        Camada de caseína a flutuar entre as fases aquosa e orgânica, após centrifugação
                     
                     
                        
                     
                        Figura 3
                     
                     
                        Técnica de rebatimento para distribuição de géis ultrafinos de poliacrilamida
                     
                     
                        
                     a = fita separadora (0,25 mm); b = folha de cobertura (5.3); c, e = placas de vidro (5.1); d = solução de gel (4.1.2); f = folha de suporte de gel (5.2).
                     
                        Figura 4a
                     
                     
                        Focagem isoelétrica de caseínas provenientes de queijo produzido com leites de ovelha e de cabra com diferentes quantidades de leite de vaca, após tratamento com plasmina
                     
                     
                        
                     % CM = percentagem de leite de vaca; C = vaca; E = ovelha; G = cabra.
                     Apresenta-se a metade superior do gel da focagem isoelétrica.
                     
                        Figura 4b
                     
                     
                        Focagem isoelétrica de caseínas provenientes de queijos produzidos com misturas de leites de ovelha, cabra e búfala, com diferentes quantidades de leite de vaca, após tratamento com plasmina
                     
                     
                        
                     % CM = percentagem de leite de vaca; 1 + = amostra com 1 % de leite de vaca e com adição de caseína bovina pura a meio do percurso; C = vaca; E = ovelha; G = cabra; B = búfala.
                     Apresenta-se a distância de separação total do gel da focagem isoelétrica.
                     
                        Figura 5
                     
                     
                        Sobreposição de densitogramas de padrões (STD) e de amostras de queijos produzidos com misturas de leites de ovelha e de cabra, após focagem isoelétrica
                     
                     
                        
                     a, b = padrões com 0 % e 1 % de leite de vaca; c-g = amostras de queijo com 0 %, 1 %, 2 %, 3 % e 7 % de leite de vaca; C = vaca; E = ovelha; G = cabra.
                     Varreu-se a metade superior do gel da focagem isoelétrica a λ = 634 nm.
                  
                  
                     ANEXO IX
                     
                        Avaliação das análises
                     
                     1.   Garantia da qualidade
                     
                     As análises devem ser realizadas por laboratórios designados em conformidade com o artigo 12.o do Regulamento (CE) n.o 882/2004 (**), ou designados pelas autoridades competentes do Estado-Membro.
                     2.   Amostragem e contestação dos resultados das análises
                     
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 A amostragem deve ser efetuada em conformidade com a regulamentação pertinente para o produto em causa. Na ausência de disposições expressamente previstas, aplicam-se as disposições da norma ISO 707, Leite e produtos lácteos — Orientações para a amostragem.
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Os relatórios laboratoriais dos resultados analíticos devem incluir elementos suficientes para a avaliação dos resultados em conformidade com o apêndice.
                              
                           
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Para a realização das análises previstas pela legislação da UE, devem colher-se amostras em duplicado.
                              
                           
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Se houver um diferendo quanto aos resultados, o organismo pagador deve providenciar a repetição da análise necessária do produto em causa, sendo os custos desta suportados pela parte vencida.
                                 A análise acima referida só será efetuada se existirem duplicados selados das amostras do produto que tenham sido guardados de forma adequada pela autoridade competente. O fabricante deve enviar um pedido para efetuar a análise ao organismo pagador no prazo de 7 dias úteis, a contar da notificação dos resultados da primeira análise. O organismo pagador deve efetuar a segunda análise no prazo de 21 dias úteis, a contar da receção do pedido.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 O resultado da segunda análise é definitivo.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Se o fabricante conseguir provar, nos cinco dias úteis seguintes à colheita das amostras, que esta não foi efetuada corretamente, procede-se a nova colheita da amostra, na medida do possível. Caso não seja possível colher novas amostras, a remessa deve ser aceite.
                              
                           
                  
                     Apêndice
                     
                        Avaliação da conformidade de uma remessa com os limites legais
                     
                     1.   Princípio
                     
                     Sempre que a legislação atinente à intervenção pública e ao armazenamento privado estabeleça procedimentos de amostragem pormenorizados, aplicar-se-ão esses procedimentos. Nos restantes casos, utiliza-se uma amostra com, pelo menos, três unidades de amostragem, retiradas de forma aleatória da remessa submetida a controlo. Pode ser preparada uma amostra composta. O resultado obtido deve ser comparado com os limites legais através do cálculo de um intervalo de confiança a 95 %, equivalente ao dobro do desvio-padrão, em que o desvio-padrão em causa dependerá: 1) de o método ter sido validado através de cooperação internacional, tendo sido estabelecidos valores para σr e σR, ou 2) caso o método de validação tenha sido desenvolvido internamente, da reprodutibilidade interna calculada. Esse intervalo de confiança corresponde então à incerteza do resultado decorrente do processo de medição.
                     2.   Método validado através de cooperação internacional
                     
                     Neste caso, terão sido estabelecidos o desvio-padrão da repetibilidade, σr, e o desvio-padrão da reprodutibilidade, σR, e o laboratório poderá demonstrar a conformidade com as características de desempenho do método validado.
                     Calcular a média aritmética, , das n medições repetidas.
                     Calcular a incerteza expandida, (k = 2), de  através da seguinte fórmula:
                     
                        
                     Se o resultado final da medição, x, for calculado utilizando uma fórmula com a forma x = y
                        1 + y
                        2, x = y
                        1 – y
                        2, x = y
                        1 · y
                        2 ou x = y
                        1/y
                        2, devem seguir-se os procedimentos habituais para a combinação dos desvios-padrão nesses casos.
                     A remessa será considerada não-conforme com o limite legal máximo, UL, quando:
                     
                        ;
                     caso contrário, será considerada em conformidade com o UL.
                     A remessa será considerada não-conforme com o limite legal mínimo, LL, quando:
                     
                        ;
                     caso contrário, será considerada em conformidade com o LL.
                     3.   Validação interna e cálculo do desvio-padrão da reprodutibilidade interna
                     
                     Se forem utilizados métodos diferentes dos especificados no presente regulamento cujo grau de precisão não tenha sido medido, deve proceder-se a uma validação interna. O desvio-padrão da repetibilidade interna, sir, e o desvio-padrão da reprodutibilidade interna, si
                        
                           R
                        , serão então utilizados em vez de σr e σ
                           R
                        , respetivamente, nas fórmulas de cálculo da incerteza expandida, U.
                     As regras a seguir para determinar a conformidade com o limite legal são as estabelecidas no ponto 1. Contudo, se uma remessa for considerada não-conforme com o limite legal, as medições terão de ser repetidas, utilizando o método especificado no presente regulamento, avaliando-se em seguida o resultado em conformidade com o ponto 1.
                  
                  
                              (*)
                           
                           
                              Os produtos Ampholine® de pH 3,5-9,5 (Pharmacia) e Resolyte® de pH 5-7 e pH 6-8 (BDH, Merck) mostraram-se especialmente adequados à obtenção da necessária separação das γ-caseínas.
                           
                        
                              (**)
                           
                           
                              Regulamento (CE) n.o 882/2004 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 29 de abril de 2004, relativo aos controlos oficiais realizados para assegurar a verificação do cumprimento da legislação relativa aos alimentos para animais e aos géneros alimentícios e das normas relativas à saúde e ao bem-estar dos animais (JO L 165 de 30.4.2004, p. 1).
                           
                        »
               
            
         (1)  O método a aplicar deve ser aprovado pelo organismo pagador.
      
         (2)  A análise de partículas queimadas pode ou não ser realizada de forma sistemática. No entanto, devem realizar-se essas análises sempre que não se efetuem exames organoléticos.
      
         (3)  O método a aplicar deve ser aprovado pelo organismo pagador (um método ou ambos).
      
         (4)  O método a aplicar deve ser aprovado pelo organismo pagador.
      
         (5)  Devem ser efetuados exames organoléticos se tal for considerado necessário após uma análise de riscos aprovada pelo organismo pagador.
      
         (6)  O método a aplicar deve ser aprovado pelo organismo pagador.
      
         (7)  Aplicação da amostra: Depois da pré-focagem (etapa 1), pipetar 18 μl da amostra e das soluções-padrão para os aplicadores de amostra (10 mm × 5 mm), colocá-los sobre o gel com intervalos de 1 mm entre cada aplicador e a uma distância de 5 mm do ânodo, no sentido longitudinal, e pressionar ligeiramente. Proceder à focagem nas condições acima descritas e remover cuidadosamente os aplicadores de amostra passados os 60 minutos de focagem da amostra.