CELEX: 32000L0045
Language: nl
Date: 2000-07-06 00:00:00
Title: Richtlijn 2000/45/EG van de Commissie van 6 juli 2000 tot vaststelling van communautaire analysemethoden voor de bepaling van vitamine A, vitamine E en tryptofaan in diervoeders (Voor de EER relevante tekst)

Avis juridique important

|

32000L0045

Richtlijn 2000/45/EG van de Commissie van 6 juli 2000 tot vaststelling van communautaire analysemethoden voor de bepaling van vitamine A, vitamine E en tryptofaan in diervoeders (Voor de EER relevante tekst)  

Publicatieblad Nr. L 174 van 13/07/2000 blz. 0032 - 0050

Richtlijn 2000/45/EG van de Commissievan 6 juli 2000tot vaststelling van communautaire analysemethoden voor de bepaling van vitamine A, vitamine E en tryptofaan in diervoeders(Voor de EER relevante tekst)DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,Gelet op Richtlijn 70/373/EEG van de Raad van 20 juli 1970 betreffende de invoering van gemeenschappelijke bemonsterings- en analysemethoden voor de officiële controle van veevoeders(1), laatstelijk gewijzigd bij de Akte van Toetreding van Oostenrijk, Finland en Zweden(2), en met name op artikel 2,Overwegende hetgeen volgt:(1) Richtlijn 70/373/EEG bepaalt dat de officiële controle van veevoeders om na te gaan of is voldaan aan de eisen op grond van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen inzake de kwaliteit en de samenstelling van veevoeders, wordt uitgevoerd volgens communautaire bemonsterings- en analysemethoden.(2) Richtlijn 70/524/EEG van de Raad van 23 november 1970 betreffende toevoegingsmiddelen in de diervoeding(3), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EG) nr. 2439/1999 van de Commissie(4), bepaalt dat het gehalte aan vitamine A en vitamine E in de etikettering moet worden aangegeven, wanneer deze stoffen aan voormengsels en diervoeders worden toegevoegd.(3) Richtlijn 79/373/EEG van de Raad van 2 april 1979 betreffende de handel in mengvoeders(5), laatstelijk gewijzigd bij Richtlijn 2000/16/EG(6), en Richtlijn 93/74/EEG van de Raad van 13 september 1993 betreffende diervoeders met bijzonder voedingsdoel(7), laatstelijk gewijzigd bij Richtlijn 96/25/EG(8), bepalen dat aminozuren in de etikettreing van diervoeders moeten worden vermeld.(4) Er moeten derhalve communautaire analysemethoden worden vastgesteld voor de controle op bovengenoemde stoffen.(5) De in deze richtlijn vervatte maatregelen zijn in overeenstemming met het advies van het Permanent Comité voor veevoeder,HEEFT DE VOLGENDE RICHTLIJN VASTGESTELD:Artikel 1De lidstaten schrijven voor dat de analyses in het kader van de officiële controle van diervoeders en voormengsels op het gehalte aan vitamine A, vitamine E en tryptofaan worden uitgevoerd volgens de in de bijlage beschreven methoden.Artikel 2De lidstaten doen uiterlijk op 31 augustus 2000 de nodige wettelijke en bestuursrechteijke bepalingen in werking treden om aan de bepalingen van deze richtlijn te voldoen. Zij stellen de Commissie daarvan onmiddellijk in kennis.Zij passen de maatregelen toe met ingang van 1 september 2000.Wanneer de lidstaten deze bepalingen aannemen wordt in die bepalingen naar de onderhavige richtlijn verwezen of wordt hiernaar verwezen bij de officiële bekendmaking van die bepalingen. De regels voor deze verwijzing worden door de lidstaten vastgesteld.Artikel 3Deze richtlijn treedt in werking op de twintigste dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen.Artikel 4Deze richtlijn is gericht tot de lidstaten.Gedaan te Brussel, 6 juli 2000.Voor de CommissieDavid ByrneLid van de Commissie(1) PB L 170 van 3.8.1970, blz. 2.(2) PB C 241 van 29.8.1994, blz. 1.(3) PB L 270 van 14.12.1970, blz. 1.(4) PB L 297 van 18.11.1999, blz. 8.(5) PB L 86 van 6.4.1979, blz. 30.(6) PB L 105 van 3.5.2000, blz. 36.(7) PB L 237 van 22.9.1993, blz. 23.(8) PB L 125 van 23.5.1996, blz. 35.BIJLAGEDEEL ABEPALING VAN VITAMINE A1. Doel en toepassingsgebiedDeze methode dient voor de bepaling van vitamine A (retinol) in diervoeders en voormengsels. Onder vitamine A worden begrepen zuivere trans-retinylalcohol en de cis-isomeren daarvan die met behulp van deze methode worden bepaald. Het gehalte aan vitamine A wordt uitgedrukt in Internationale Eenheden (IU) per kg. Eén IU komt overeen met de werking van 0,300 μg zuivere trans-vitamine-A-alcohol of 0,344 μg zuiver trans-vitamine-A-acetaat of 0,550 μg zuiver trans-vitamine-A-palmitaat.De bepalingsgrens is 2000 IU vitamine A/kg.2. PrincipeHet monster wordt gehydrolyseerd met een ethanolische kaliumhydroxideoplossing en de vitamine A wordt geëxtraheerd in lichtpetroleum. Het oplosmiddel wordt verwijderd door verdamping en het residu wordt opgelost in methanol en, indien noodzakelijk, verdund tot de gewenste concentratie. Het gehalte aan vitamine A wordt bepaald met reversed-phase hogedrukvloeistofchromatografie (RP-HPLC) met UV- of fluorescentiedetectie. De chromatografische parameters worden zodanig gekozen dat er geen scheiding optreedt tussen de zuivere trans-vitamine-A-alcohol en de cis-isomeren ervan.3. Reagentia3.1. Ethanol, σ = 96 %3.2. Lichtpetroleum, kooktraject 40 °C-60 °C3.3. Methanol3.4. Kaliumhydroxideoplossing, β = 50 g/100 ml3.5. Natriumascorbaatoplossing, β = 10 g/100 ml (zie opmerkingen 7.7)3.6. Natriumsulfide, Na2S · x H2O (x = 7-9)3.6.1. Natriumsulfideoplossing, c = 0,5 mol/l in glycerol, β = 120 g/l (voor x = 9) (zie opmerkingen 7.8)3.7. Fenolftaleïneoplossing, β = 2 g/100 ml in ethanol (3.1)3.8. 2-propanol3.9. Mobiele fase voor HPLC: mengsel van methanol (3.3) en water, bijv. 980 + 20 (v + v). De exacte verhouding wordt bepaald door de eigenschappen van de gebruikte kolom.3.10. Stikstof, zuurstofvrij3.11. Zuiver trans-vitamine-A-acetaat, extra gezuiverd, van gecertificeerde werking, bijv. 2,80 x 106 IU/g3.11.1. Stockoplossing van zuiver trans-vitamine-A-acetaat: weeg op 0,1 mg nauwkeurig 50 mg vitamine-A-acetaat (3.11) af in een maatkolf van 100 ml. Los op in 2-propanol (3.8) en vul met hetzelfde oplosmiddel aan tot de maatstreep. De nominale concentratie van deze oplossing is 1400 IU vitamine A per ml. Het exacte gehalte dient te worden bepaald volgens 5.6.3.1.3.12. Zuiver trans-vitamine-A-palmitaat, extra gezuiverd, van gecertificeerde werking, bijv. 1,80 x 106 IU/g3.12.1. Stockoplossing van zuiver trans-vitamine-A-palmitaat: weeg op 0,1 mg nauwkeurig 80 mg vitamine-A-palmitaat (3.12) af in een maatkolf van 100 ml. Los op in 2-propanol (3.8) en vul met hetzelfde oplosmiddel aan tot de maatstreep. De nominale concentratie van deze oplossing is 1400 IU vitamine A per ml. Het exacte gehalte dient te worden bepaald volgens 5.6.3.2.3.13. 2,6-di-tert-butyl-4-methylfenol (BHT) (zie opmerkingen: 7.5)4. Apparatuur4.1. Rotatievacuümverdamper4.2. Bruin glaswerk4.2.1. Maatkolven of erlenmeyers, 500 ml, met houders van geslepen glas4.2.2. Maatkolven met stoppen van geslepen glas en een smalle hals, 10, 25, 100 en 500 ml4.2.3. Scheitrechters, 1000 ml, met stoppen van geslepen glas4.2.4. Peervormige maatkolven, 250 ml, met houders van geslepen glas4.3. Allihn-condensor, huislengte 300 mm, met verbindingsstuk van geslepen glas en adapter voor gasaanvoerleiding4.4. Geplooid filtreerpapier voor fasescheiding, diameter 185 mm (bijv. Schleicher &  Schuell 597 HY 1/2)4.5. HPLC-apparatuur met injectiesysteem4.5.1. Vloeistofchromatografiekolom, 250 mm x 4 mm, C18, vulling van 5 of 10 μm, of een soortgelijke kolom (prestatiecriterium: slechts één piek voor alle retinolisomeren onder de HPLC-condities)4.5.2. UV- of fluorescentiedetector met variabele golflengte4.6. Spectrofotometer met kwartscellen van 10 mm4.7. Waterbad met magneetroerder4.8. Extractieapparatuur (zie figuur 1) bestaande uit:4.8.1. Glazen cilinder met een inhoud van 1 l, voorzien van een hals en stop van geslepen glas4.8.2. Inzetstuk van geslepen glas, voorzien van een zijarm en een verstelbare buis door het midden. De verstelbare buis moet een U-vormig benedenuiteinde hebben en een uitstroomopening aan het andere uiteinde, zodat de bovenste vloeistoflaag in de cilinder kan overlopen naar een scheitrechter.5. WerkwijzeNB:Vitamine A is gevoelig voor (UV-)licht en oxidatie. Alle bewerkingen moeten plaatsvinden buiten de invloed van licht (met behulp van bruin glaswerk of glaswerk dat is beschermd met aluminiumfolie) en zuurstof (spoelen met stikstof). Tijdens de extractie dient lucht boven de vloeistof te worden vervangen door stikstof (voorkom overdruk door de stop af en toe even los te maken).5.1. Bereiding van het monsterMaal het monster zo fijn dat het een zeef met mazen van 1 mm kan passeren, en zorg dat er geen hitte vrijkomt. Het malen dient onmiddellijk voorafgaand aan het wegen en verzepen te geschieden, daar er anders vitamine-A-verliezen kunnen optreden.5.2. VerzepingWeeg, afhankelijk van het vitamine-A-gehalte, op 0,01 g nauwkeurig 2 g à 25 g van het monster af in een maatkolf of erlenmeyer van 500 ml (4.2.1). Voeg daar achtereenvolgens al roerend 130 ml ethanol (3.1), circa 100 mg BHT (3.13), 2 ml natriumascorbaatoplossing (3.5) en 2 ml natriumsulfideoplossing (3.6) aan toe. Sluit een condensor (4.3) aan op de maatkolf en dompel de maatkolf in een waterbad met magneetroerder (4.7). Breng het mengsel aan de kook en laat het vijf minuten terugvloeien. Voeg daarna 25 ml kaliumhydroxideoplossing (3.4) toe via de condensor (4.3) en laat het mengsel nog eens 25 minuten terugvloeien, al roerend onder een trage stikstofstroom. Spoel vervolgens de condensor met circa 20 ml water en laat de inhoud van de maatkolf afkoelen tot kamertemperatuur.5.3. ExtractieGiet de verzepingsoplossing al spoelend met in totaal 250 ml water kwantitatief over in een scheitrechter van 1000 ml (4.2.3) of in de extractieapparatuur (4.8). Spoel de verzepingsmaatkolf achtereenvolgens met 25 ml ethanol (3.1) en 100 ml lichtpetroleum (3.2) en giet het uitspoelsel over in de scheitrechter of de extractieapparatuur. De verhouding van water en ethanol in de gecombineerde oplossingen dient ongeveer 2:1 te zijn. Schud het mengsel krachtig gedurende twee minuten en laat het daarna twee minuten staan om het te laten bezinken.5.3.1. Extractie met behulp van een scheitrechter (4.2.3)Breng na scheiding van de lagen (zie opmerking 7.3) de lichtpetroleum over in een andere scheitrechter (4.2.3). Herhaal deze extractie tweemaal met 100 ml lichtpetroleum (3.2) en tweemaal met 50 ml lichtpetroleum (3.2).Was de gecombineerde extracten tweemaal in de scheitrechter onder voorzichtig schudden (om de vorming van emulsies tegen te gaan) met hoeveelheden van 100 ml water en vervolgens onder herhaaldelijk schudden met telkens nieuwe hoeveelheden van 100 ml water, totdat het water kleurloos blijft bij toevoeging van fenolftaleïneoplossing (3.7) (viermaal wassen is gewoonlijk voldoende). Filtreer het gewassen extract door een droog vouwfilter voor fasescheiding (4.4) in een maatkolf van 500 ml (4.2.2) om eventueel aanhangend water te verwijderen. Spoel de scheitrechter en het filter met 50 ml lichtpetroleum (3.2), vul tot de maatstreep aan met lichtpetroleum (3.2) en meng goed.5.3.2. Extractie met behulp van extractieapparatuur (4.8)Vervang na scheiding van de lagen (zie opmerking 7.3) de stop van de glazen cilinder (4.8.1) door het inzetstuk van geslepen glas (4.8.2) en plaats het U-vormige benedenuiteinde van de verstelbare buis zodanig dat het zich juist boven het niveau van het scheidingsvlak bevindt. Breng, onder toepassing van druk uit een stikstofleiding op de zijarm, de bovenste laag lichtpetroleum over in een scheitrechter van 1000 ml (4.2.3). Voeg 100 ml lichtpetroleum (3.2) toe aan de glazen cilinder, doe de stop erop en schud goed. Wacht tot de lagen zijn gescheiden en breng de bovenste laag over in de scheitrechter zoals beschreven. Herhaal de extractieprocedure nog eens met 100 ml lichtpetroleum (3.2) en daarna tweemaal met hoeveelheden van telkens 50 ml lichtpetroleum (3.2) en breng de lagen lichtpetroleum over in de scheitrechter.Was de gecombineerde lichtpetroleumextracten zoals beschreven in 5.3.1 en ga verder te werk zoals daar beschreven.5.4. Bereiding van de monsteroplossing voor HPLCPipetteer een fractie van de lichtpetroleumoplossing (uit 5.3.1 of 5.3.2) in een peervormige maatkolf van 250 ml (4.2.4). Damp het oplosmiddel in tot het bijna droog is met de rotatievacuümverdamper (4.1) bij gereduceerde druk en een badtemperatuur van hoogstens 40 °C. Herstel de atmosferische druk door toevoer van stikstof (3.10) en verwijder de maatkolf uit de rotatievacuümverdamper. Verwijder het resterende oplosmiddel met een stikstofstroom (3.10) en los het residu onmiddellijk op in een bekend volume (10-100 ml) methanol (3.3) (de concentratie vitamine A dient in het gebied van 5 IU/ml tot 30 IU/ml te liggen).5.5. HPLC-bepalingVitamine A wordt afgescheiden in een C18 reversed-phase kolom (4.5.1) en de concentratie wordt gemeten door middel van een UV-detector (325 nm) of fluorescentiedetector (excitatie: 325 nm, emissie: 475 nm) (4.5.2).Injecteer een fractie (bijv. 20 μl) van de oplossing in methanol die is verkregen in 5.4 en elueer met de mobiele fase (3.9). Bereken de gemiddelde piekhoogte (-oppervlakte) van diverse injecties van dezelfde monsteroplossing en de gemiddelde piekhoogte (-oppervlakte) van diverse injecties van de ijkoplossingen (5.6.2).HPLC-conditiesDe volgende condities worden als leidraad aangegeven; andere parameters mogen worden gebruikt op voorwaarde dat vergelijkbare resultaten worden verkregen.>RUIMTE VOOR DE TABEL>5.6. IJking5.6.1. Bereiding van de standaard-werkoplossingenPipetteer 20 ml van de vitamine-A-acetaat-stockoplossing (3.11.1) of 20 ml van de vitamine-A-palmitaat-stockoplossing (3.12.1) in een maatkolf of erlenmeyer van 500 ml (4.2.1) en hydrolyseer zoals beschreven onder 5.2, echter zonder toevoeging van BHT. Extraheer vervolgens met lichtpetroleum (3.2) volgens 5.3 en vul tot 500 ml aan met lichtpetroleum (3.2). Damp 100 ml van dit extract in tot het bijna droog is met de rotatievacuümverdamper (zie 5.4), verwijder het resterende oplosmiddel met een stikstofstroom (3.10) en los het residu opnieuw op in 10,0 ml methanol (3.3). De nominale concentratie van deze oplossing is 560 IU vitamine A per ml. Het exacte gehalte dient te worden bepaald volgens 5.6.3.3. De standaard-werkoplossing moet vóór gebruik vers worden bereid.Pipetteer 2,0 ml van deze standaard-werkoplossing in een maatkolf van 20 ml, vul tot de maatstreep aan met methanol (3.3) en meng. De nominale concentratie van deze verdunde standaard-werkoplossing is 56 IU vitamine A per ml.5.6.2. Bereiding van de ijkoplossingen en tekenen van de ijklijnBreng 1,0, 2,0, 5,0 en 10,0 ml van de verdunde standaard-werkoplossing over in een reeks maatkolven van 20 ml, vul tot de maatstreep aan met methanol (3.3) en meng. De nominale concentraties van deze oplossingen zijn 2,8, 5,6, 14,0 en 28,0 IU vitamine A per ml.Injecteer diverse malen 20 μl van iedere ijkoplossing en bepaal de gemiddelde piekhoogten (-oppervlakten). Maak met de gemiddelde piekhoogten (-oppervlakten) een ijklijn, rekening houdend met de resultaten van de UV-controle (5.6.3.3).5.6.3. UV-standaardisatie van de standaardoplossingen5.6.3.1. Vitamine-A-acetaat-stockoplossingPipetteer 2,0 ml van de vitamine-A-acetaat-stockoplossing (3.11.1) in een maatkolf van 50 ml (4.2.2) en vul tot de maatstreep aan met 2-propanol (3.8). De nominale concentratie van deze oplossing is 56 IU vitamine A per ml. Pipetteer 3,0 ml van deze verdunde vitamine-A-acetaatoplossing in een maatkolf van 25 ml en vul tot de maatstreep aan met 2-propanol (3.8). De nominale concentratie van deze oplossing is 6,72 IU vitamine A per ml. Meet het UV-spectrum van deze oplossing tegen 2-propanol (3.8) in de spectrofotometer (4.6) tussen 300 nm en 400 nm. Het extinctiemaximum moet tussen 325 nm en 327 nm liggen.Berekening van het vitamine-A-gehalte:>PIC FILE= "L_2000174NL.003601.EPS">5.6.3.2. Vitamine-A-palmitaat-stockoplossingPipetteer 2,0 ml van de vitamine-A-palmitaat-stockoplossing (3.12.1) in een maatkolf van 50 ml (4.2.2) en vul tot de maatstreep aan met 2-propanol (3.8). De nominale concentratie van deze oplossing is 56 IU vitamine A per ml. Pipetteer 3,0 ml van deze verdunde vitamine-A-palmitaatoplossing in een maatkolf van 25 ml en vul tot de maatstreep aan met 2-propanol (3.8). De nominale concentratie van deze oplossing is 6,72 IU vitamine A per ml. Meet het UV-spectrum van deze oplossing tegen 2-propanol (3.8) in de spectrofotometer (4.6) tussen 300 nm en 400 nm. Het extinctiemaximum moet tussen 325 nm en 327 nm liggen.Berekening van het vitamine-A-gehalte:>PIC FILE= "L_2000174NL.003602.EPS">5.6.3.3. Vitamine-A-standaard-werkoplossingPipetteer 3,0 ml van de onverdunde vitamine-A-standaard-werkoplossing die is bereid volgens 5.6.1 in een maatkolf van 50 ml (4.2.2) en vul tot de maatstreep aan met 2-propanol (3.8). Pipetteer 5,0 ml van deze oplossing in een maatkolf van 25 ml en vul tot de maatstreep aan met 2-propanol (3.8). De nominale concentratie van deze oplossing is 6,72 IU vitamine A per ml. Meet het UV-spectrum van deze oplossing tegen 2-propanol (3.8) in de spectrofotometer (4.6) tussen 300 nm en 400 nm. Het extinctiemaximum moet tussen 325 nm en 327 nm liggen.Berekening van het vitamine-A-gehalte:>PIC FILE= "L_2000174NL.003603.EPS">6. Berekening van de resultatenBepaal de concentratie van de monsteroplossing in IU/ml uit de gemiddelde hoogte (oppervlakte) van de vitamine-A-pieken van de monsteroplossing op basis van de ijklijn (5.6.2).Het vitamine-A-gehalte w in IU/kg van het monster wordt verkregen met behulp van onderstaande formule:>PIC FILE= "L_2000174NL.003701.EPS">waarin:β= vitamine-A-concentratie van de monsteroplossing (5.4) in IU/mlV1= volume van de monsteroplossing (5.4) in mlV2= volume van de in 5.4 genomen fractie in mlm= massa van het monster in g7. Opmerkingen7.1. Voor monsters met een lage vitamine-A-concentratie kan het dienstig zijn de lichtpetroleumextracten van twee verzepingsfracties (gewogen hoeveelheid: 25 g) voor de HPLC-bepaling te combineren tot één monsteroplossing.7.2. Het gewicht van het monster voor de analyse mag niet meer dan 2 g vet bevatten.7.3. Als er geen fasescheiding optreedt, voeg dan circa 10 ml ethanol (3.1) toe om de emulsie te breken.7.4. Met levertraan en andere zuivere vetten dient de verzepingstijd te worden verlengd tot 45-60 minuten.7.5. In plaats van BHT mag ook hydrochinon worden gebruikt.7.6. Met behulp van een normale-fasekolom is de scheiding van retinolisomeren mogelijk.7.7. In plaats van natriumascorbaatoplossing mag ook circa 150 mg ascorbinezuur worden gebruikt.7.8. In plaats van natriumsulfideoplossing mag ook circa 50 mg EDTA worden gebruikt.8. HerhaalbaarheidHet verschil tussen de resultaten van twee parallelle, op hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen mag niet meer dan 15 % van het hoogste resultaat bedragen.9. Resultaten van een ringonderzoek(1)>RUIMTE VOOR DE TABEL>Figuur 1: Extractieapparatuur (4.8)>PIC FILE= "L_2000174NL.003801.EPS">Deel BBEPALING VAN VITAMINE E1. Doel en toepassingsgebiedDeze methode dient voor de bepaling van vitamine E in diervoeders en voormengsels. Het gehalte aan vitamine E wordt uitgedrukt in mg DL-α-tocoferolacetaat per kg. 1 mg DL-α-tocoferolacetaat komt overeen met 0,91 mg DL-α-tocoferol (vitamine E).De bepalingsgrens is 2 mg vitamine E/kg.2. PrincipeHet monster wordt gehydrolyseerd met een ethanolische kaliumhydroxideoplossing en de vitamine E wordt geëxtraheerd in lichtpetroleum. Het oplosmiddel wordt verwijderd door verdamping en het residu wordt opgelost in methanol en, indien noodzakelijk, verdund tot de gewenste concentratie. Het gehalte aan vitamine E wordt bepaald door reversed-phase hogedrukvloeistofchromatografie (RP-HPLC) met fluorescentie- of UV-detectie.3. Reagentia3.1. Ethanol, σ = 96 %3.2. Lichtpetroleum, kooktraject 40 °C-60 °C3.3. Methanol3.4. Kaliumhydroxideoplossing, β = 50 g/100 ml3.5. Natriumascorbaatoplossing, β = 10 g/100 ml (zie opmerkingen 7.7)3.6. Natriumsulfide, Na2S · x H2O (x = 7-9)3.6.1. Natriumsulfideoplossing, c = 0,5 mol/l in glycerol, β = 120 g/l (voor x = 9) (zie opmerkingen 7.8)3.7. Fenolftaleïneoplossing, β = 2 g/100 ml in ethanol (3.1)3.8. Mobiele fase voor HPLC: mengsel van methanol (3.3) en water, bijv. 980 + 20 (v + v). De exacte verhouding wordt bepaald door de eigenschappen van de gebruikte kolom.3.9. Stikstof, zuurstofvrij3.10. DL-α-tocoferolacetaat, extra gezuiverd, van gecertificeerde werking3.10.1. Stockoplossing van DL-α-tocoferolacetaat: weeg op 0,1 mg nauwkeurig 100 mg DL-α-tocoferolacetaat (3.10) af in een maatkolf van 100 ml. Los op in ethanol (3.1) en vul met hetzelfde oplosmiddel aan tot de maatstreep. 1 ml van deze oplossing bevat 1 mg DL-α-tocoferolacetaat. (UV-controle: zie 5.6.1.3; stabilisatie: zie opmerkingen 7.4).3.11. DL-α-tocoferol, extra gezuiverd, van gecertificeerde werking3.11.1. Weeg op 0,1 mg nauwkeurig 100 mg DL-α-tocoferol (3.10) af in een maatkolf van 100 ml. Los op in ethanol (3.1) en vul met hetzelfde oplosmiddel aan tot de maatstreep. 1 ml van deze oplossing bevat 1 mg DL-α-tocoferol. (UV-controle: zie 5.6.2.3; stabilisatie: zie opmerkingen 7.4).3.12. 2,6-di-tert-butyl-4-methylfenol (BHT) (zie opmerkingen: 7.5)4. Apparatuur4.1. Rotatievacuümverdamper4.2. Bruin glaswerk4.2.1. Maatkolven of erlenmeyers, 500 ml, met houders van geslepen glas4.2.2. Maatkolven met stoppen van geslepen glas en een smalle hals, 10, 25, 100 en 500 ml4.2.3. Scheitrechters, 1000 ml, met stoppen van geslepen glas4.2.4. Peervormige maatkolven, 250 ml, met houders van geslepen glas4.3. Allihn-condensor, huislengte 300 mm, met verbindingsstuk van geslepen glas en adapter voor gasaanvoerleiding4.4. Geplooid filtreerpapier voor fasescheiding, diameter 185 mm (bijv. Schleicher &  Schuell 597 HY 1/2)4.5. HPLC-apparatuur met injectiesysteem4.5.1. Vloeistofchromatografiekolom, 250 mm x 4 mm, C18, 5 of 10 μm vulling, of een soortgelijke kolom4.5.2. Fluorescentie- of UV-detector met variabele golflengte4.6. Spectrofotometer met kwartscellen van 10 mm4.7. Waterbad met magneetroerder4.8. Extractieapparatuur (zie figuur 1) bestaande uit:4.8.1. Glazen cilinder met een inhoud van 1 l, voorzien van een hals en stop van geslepen glas4.8.2. Inzetstuk van geslepen glas, voorzien van een zijarm en een verstelbare buis door het midden. De verstelbare buis moet een U-vormig benedenuiteinde hebben en een uitstroomopening aan het andere uiteinde, zodat de bovenste vloeistoflaag in de cilinder kan overlopen naar een scheitrechter.5. WerkwijzeNB:Vitamine E is gevoelig voor (UV-)licht en oxidatie. Alle bewerkingen moeten plaatsvinden buiten de invloed van licht (met behulp van bruin glaswerk of glaswerk dat is beschermd met aluminiumfolie) en zuurstof (spoelen met stikstof. Tijdens de extractie dient de lucht boven de vloeistof te worden vervangen door stikstof (voorkom overdruk door de stop af en toe even los te maken).5.1. Bereiding van het monsterMaal het monster zo fijn dat het een zeef met mazen van 1 mm kan passeren, en zorg dat er geen hitte vrijkomt. Het malen dient onmiddellijk voorafgaand aan het wegen en verzepen te geschieden, daar er anders vitamine-E-verliezen kunnen optreden.5.2. VerzepingWeeg, afhankelijk van het vitamine-E-gehalte, op 0,01 g nauwkeurig 2 g à 25 g van het monster af in een maatkolf of erlenmeyer van 500 ml (4.2.1). Voeg daar achtereenvolgens al roerend 130 ml ethanol (3.1), circa 100 mg BHT (3.12), 2 ml natriumascorbaatoplossing (3.5) en 2 ml natriumsulfideoplossing (3.6) aan toe. Sluit een condensor (4.3) aan op de maatkolf en dompel de maatkolf in een waterbad met magneetroerder (4.7). Breng het mengsel aan de kook en laat het vijf minuten terugvloeien. Voeg daarna 25 ml kaliumhydroxideoplossing (3.4) toe via de condensor (4.3) en laat het mengsel nog eens 25 minuten terugvloeien, al roerend onder een trage stikstofstroom. Spoel vervolgens de condensor met circa 20 ml water en laat de inhoud van de maatkolf afkoelen tot kamertemperatuur.5.3. ExtractieGiet de verzepingsoplossing al spoelend met in totaal 250 ml water kwantitatief over in een scheitrechter van 1000 ml (4.2.3) of in de extractieapparatuur (4.8). Spoel de verzepingsmaatkolf achtereenvolgens met 25 ml ethanol (3.1) en 100 ml lichtpetroleum (3.2) en giet het uitspoelsel over in de scheitrechter of de extractieapparatuur. De verhouding van water en ethanol in de gecombineerde oplossingen dient ongeveer 2:1 te zijn. Schud het mengsel krachtig gedurende twee minuten en laat het daarna twee minuten staan om het te laten bezinken.5.3.1. Extractie met behulp van een scheitrechter (4.2.3)Breng na scheiding van de lagen (zie opmerking 7.3) de lichtpetroleum over in een andere scheitrechter (4.2.3). Herhaal deze extractie tweemaal met 100 ml lichtpetroleum (3.2) en tweemaal met 50 ml lichtpetroleum (3.2).Was de gecombineerde extracten tweemaal in de scheitrechter onder voorzichtig schudden (om de vorming van emulsies tegen te gaan) met hoeveelheden van 100 ml water en vervolgens onder herhaaldelijk schudden met telkens nieuwe hoeveelheden van 100 ml water, totdat het water kleurloos blijft bij toevoeging van fenolftaleïneoplossing (3.7) (viermaal wassen is gewoonlijk voldoende). Filtreer het gewassen extract door een droog vouwfilter voor fasescheiding (4.4) in een maatkolf van 500 ml (4.2.2) om eventueel aanhangend water te verwijderen. Spoel de scheitrechter en het filter met 50 ml lichtpetroleum (3.2), vul tot de maatstreep aan met lichtpetroleum (3.2) en meng goed.5.3.2. Extractie met behulp van extractieapparatuur (4.8)Vervang na scheiding van de lagen (zie opmerking 7.3) de stop van de glazen cilinder (4.8.1) door het inzetstuk van geslepen glas (4.8.2) en plaats het U-vormige benedenuiteinde van de verstelbare buis zodanig dat het zich juist boven het niveau van het scheidingsvlak bevindt. Breng, onder toepassing van druk uit een stikstofleiding op de zijarm, de bovenste laag lichtpetroleum over in een scheitrechter van 1000 ml (4.2.3). Voeg 100 ml lichtpetroleum (3.2) toe aan de glazen cilinder, doe de stop erop en schud goed. Wacht tot de lagen zijn gescheiden en breng de bovenste laag over in de scheitrechter zoals beschreven. Herhaal de extractieprocedure nog eens met 100 ml lichtpetroleum (3.2), daarna nog tweemaal met telkens 50 ml lichtpetroleum (3.2) en breng de lagen lichtpetroleum over in de scheitrechter.Was de gecombineerde lichtpetroleumextracten zoals beschreven in 5.3.1 en ga verder te werk zoals daar beschreven.5.4. Bereiding van de monsteroplossing voor HPLCPipetteer een fractie van de lichtpetroleumoplossing (uit 5.3.1 of 5.3.2) in een peervormige maatkolf van 250 ml (4.2.4). Damp het oplosmiddel in tot het bijna droog is met de rotatievacuümverdamper (4.1) bij gereduceerde druk en een badtemperatuur van hoogstens 40 °C. Herstel de atmosferische druk door toevoer van stikstof (3.9) en verwijder de maatkolf uit de rotatievacuümverdamper. Verwijder het resterende oplosmiddel met een stikstofstroom (3.9) en los het residu onmiddellijk op in een bekend volume (10-100 ml) methanol (3.3) (de concentratie DL-α-tocoferol dient in het gebied van 5 μg/ml tot 30 μg/ml te liggen).5.5. HPLC-bepalingVitamine E wordt afgescheiden in een C18 reversed-phase kolom (4.5.1) en de concentratie wordt gemeten door middel van een fluorescentiedetector (excitatie: 295 nm, emissie: 330 nm) of een UV-detector (292 nm) (4.5.2).Injecteer een fractie (bijv. 20 μl) van de oplossing in methanol die is verkregen in 5.4 en elueer met de mobiele fase (3.8). Bereken de gemiddelde piekhoogte (-oppervlakte) van diverse injecties van dezelfde monsteroplossing en de gemiddelde piekhoogte (-oppervlakte) van diverse injecties van de ijkoplossingen (5.6.2).HPLC-conditiesDe volgende condities worden als leidraad aangegeven; andere parameters mogen worden gebruikt op voorwaarde dat vergelijkbare resultaten worden verkregen.>RUIMTE VOOR DE TABEL>5.6. IJking (DL-α-tocoferolacetaat of DL-α-tocoferol)5.6.1. Standaard-DL-α-tocoferolacetaat5.6.1.1. Bereiding van de standaard-werkoplossingPipetteer 25 ml van de DL-α-tocoferolacetaat-stockoplossing (3.10.1) in een maatkolf of erlenmeyer van 500 ml (4.2.1) en hydrolyseer zoals beschreven onder 5.2. Extraheer vervolgens met lichtpetroleum (3.2) volgens 5.3 en vul tot 500 ml aan met lichtpetroleum. Damp 25 ml van dit extract in tot het bijna droog is met de rotatievacuümverdamper (zie 5.4), verwijder het resterende oplosmiddel met een stikstofstroom (3.9) en los het residu opnieuw op in 25,0 ml methanol (3.3). De nominale concentratie van deze oplossing is 45,5 μg DL-α-tocoferol per ml, overeenkomend met 50 μg DL-α-tocoferolacetaat per ml. De standaard-werkoplossing moet vóór gebruik vers worden bereid.5.6.1.2. Bereiding van de ijkoplossingen en tekenen van de ijklijnBreng 1,0, 2,0, 4,0 en 10,0 ml van de standaard-werkoplossing over in een reeks maatkolven van 20 ml, vul tot de maatstreep aan met methanol (3.3) en meng. De nominale concentraties van deze oplossingen zijn 2,5, 5,0, 10,0 en 25,0 μg/ml DL-α-tocoferolacetaat, d.w.z. 2,28, 4,55, 9,10 μg/ml en 22,8 μg/ml DL-α-tocoferol.Injecteer diverse malen 20 μl van iedere ijkoplossing en bepaal de gemiddelde piekhoogten (-oppervlakten). Maak met behulp van de gemiddelde piekhoogten (-oppervlakten) een ijklijn.5.6.1.3. UV-standaardisatie van de DL-α-tocoferolacetaat-stockoplossing (3.10.1)Verdun 5,0 ml van de DL-α-tocoferolacetaat-stockoplossing (3.10.1) tot 25,0 ml met ethanol en meet het UV-spectrum van deze oplossing tegen ethanol (3.1) in de spectrofotometer (4.6) tussen 250 nm en 320 nm.Het absorptiemaximum dient bij 284 nm te liggen:>PIC FILE= "L_2000174NL.004201.EPS">Bij deze verdunning dient een extinctiewaarde van 0,84 tot 0,88 te worden verkregen.5.6.2. Standaard-DL-α-tocoferol5.6.2.1. Bereiding van de standaard-werkoplossingPipetteer 2 ml van de DL-α-tocoferol-stockoplossing (3.11.1) in een maatkolf van 50 ml, los op in methanol (3.3) en vul tot de maatstreep aan met methanol. De nominale concentratie van deze oplossing is 40 μg DL-α-tocoferol per ml, overeenkomend met 44,0 μg DL-α-tocoferolacetaat per ml. De standaard-werkoplossing moet vóór gebruik vers worden bereid.5.6.2.2. Bereiding van de ijkoplossingen en tekenen van de ijklijnBreng 1,0, 2,0, 4,0 en 10,0 ml van de standaard-werkoplossing over in een reeks maatkolven van 20 ml, vul tot de maatstreep aan met methanol (3.3) en meng. De nominale concentraties van deze oplossingen zijn 2,0, 4,0, 8,0 en 20,0 μg/ml DL-α-tocoferol, d.w.z. 2,20, 4,40, 8,79 μg/ml en 22,0 μg/ml DL-α-tocoferolacetaat.Injecteer diverse malen 20 μl van iedere ijkoplossing en bepaal de gemiddelde piekhoogten (-oppervlakten). Teken met behulp van de gemiddelde piekhoogten (-oppervlakten) een ijklijn.5.6.2.3. UV-standaardisatie van de DL-α-tocoferol-stockoplossing (3.11.1)Verdun 2,0 ml van de DL-α-tocoferol-stockoplossing (3.11.1) tot 25,0 ml met ethanol en meet het UV-spectrum van deze oplossing tegen ethanol (3.1) in de spectrofotometer (4.6) tussen 250 nm en 320 nm. Het absorptiemaximum dient bij 292 nm te liggen:>PIC FILE= "L_2000174NL.004202.EPS">Bij deze verdunning dient een extinctiewaarde van 0,6 te worden verkregen.6. Berekening van de resultatenBepaal de concentratie van de monsteroplossing in μg/ml uit de gemiddelde hoogte (oppervlakte) van de vitamine-E-pieken van de monsteroplossing (berekend als α-tocoferolacetaat) op basis van de ijklijn (5.6.1.2 of 5.6.2.2).Het vitamine-E-gehalte w in mg/kg van het monster wordt verkregen met behulp van onderstaande formule:>PIC FILE= "L_2000174NL.004203.EPS">waarin:β= vitamine-E-concentratie van de monsteroplossing (5.4) in μg/mlV1= volume van de monsteroplossing (5.4) in mlV2= volume van de in 5.4 genomen fractie in mlm= massa van het monster in g7. Opmerkingen7.1. Voor monsters met een lage vitamine-E-concentratie kan het dienstig zijn de lichtpetroleumextracten van twee verzepingsfracties (gewogen hoeveelheid: 25 g) voor de HPLC-bepaling te combineren tot één monsteroplossing.7.2. Het gewicht van het monster voor de analyse mag niet meer dan 2 g vet bevatten.7.3. Als er geen fasescheiding optreedt, voeg dan circa 10 ml ethanol (3.1) toe om de emulsie te breken.7.4. Voeg na de spectrofotometrische meting van de DL-α-tocoferolacetaat respectievelijk DL-α-tocoferoloplossing volgens 5.6.1.3 of 5.6.2.3 circa 10 mg BHT (3.12) aan de oplossing (3.10.1 of 3.10.2) toe en bewaar de oplossing in een koelkast (maximale houdbaarheid: vier weken).7.5. In plaats van BHT mag ook hydrochinon worden gebruikt.7.6. Met een normale-fasekolom is het mogelijk α-, β-, χ- en δ-tocoferol van elkaar te scheiden.7.7. In plaats van natriumascorbaatoplossing mag ook circa 150 mg ascorbinezuur worden gebruikt.7.8. In plaats van natriumsulfideoplossing mag ook circa 50 mg EDTA worden gebruikt.8. HerhaalbaarheidHet verschil tussen de resultaten van twee parallelle, op hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen mag niet meer dan 15 % van het hoogste resultaat bedragen.9. Resultaten van een ringonderzoek(2)>RUIMTE VOOR DE TABEL>Figuur 1: Extractieapparatuur (4.8)>PIC FILE= "L_2000174NL.004401.EPS">DEEL CBEPALING VAN TRYPTOFAAN1. Doel en toepassingsgebiedDe methode dient voor de bepaling van de totale hoeveelheid tryptofaan en de hoeveelheid vrij tryptofaan in diervoeders. Ze maakt geen onderscheid tussen de D- en de L-vorm.2. PrincipeVoor de bepaling van de totale hoeveelheid tryptofaan wordt het monster onder basische condities gehydrolyseerd met een verzadigde bariumhydroxideoplossing en gedurende 20 uur tot 110 °C verhit. Na de hydrolyse wordt er een interne standaard toegevoegd.Voor de bepaling van de hoeveelheid vrij tryptofaan wordt het monster onder licht zure condities geëxtraheerd in aanwezigheid van een interne standaard.Het tryptofaan en de interne standaard in het hydrolysaat of extract worden bepaald door HPLC met fluorescentiedetectie.3. Reagentia3.1. Er dient dubbel gedestilleerd water of water van soortgelijke kwaliteit te worden gebruikt (conductiviteit &lt;  10 ìS/cm).3.2. Standaardstof: tryptofaan (zuiverheid/gehalte &gt;= 99 %), gedroogd onder vacuüm boven fosforpentoxide3.3. Interne-standaardstof: α-methyl-tryptofaan (zuiverheid/gehalte &gt;= 99 %), gedroogd onder vacuüm boven fosforpentoxide3.4. Bariumhydroxide (octahydraat) (er dient op te worden toegezien dat Ba(OH)2.8 H2O niet langdurig aan lucht wordt blootgesteld om de vorming van BaCO3 te voorkomen; dit zou de bepaling kunnen verstoren) (zie opmerking 9.3)3.5. Natriumhydroxide3.6. Orthofosforzuur, w = 85 %3.7. Zoutzuur, p20 = 1,19 g/ml3.8. Methanol, HPLC-kwaliteit3.9. Lichtpetroleum, kooktraject 40-60 °C.3.10. Natriumhydroxideoplossing, c = 1 mol/l:Los 40,0 g NaOH (3.5) op in water en vul met water aan tot 1 liter (3.1).3.11. Zoutzuur, c = 6 mol/l:Neem 492 ml HCl (3.7) en vul met water aan tot 1 liter.3.12. Zoutzuur, c = 1 mol/l:Neem 82 ml HCl (3.7) en vul met water aan tot 1 liter.3.13. Zoutzuur, c = 0,1 mol/l:Neem 8,2 ml HCl (3.7) en vul met water aan tot 1 liter.3.14. Orthofosforzuur, c = 0,5 mol/l:Neem 34 ml orthofosforzuur (3.6) en vul met water aan tot 1 liter (3.1).3.15. Geconcentreerde oplossing van tryptofaan (3.2), c = 2,50 μmol/ml:Los 0,2553 g tryptofaan (3.2) in een volumetrische maatkolf van 500 ml op in zoutzuur (3.13) en vul tot de maatstreep aan met zoutzuur (3.13). Gedurende maximaal vier weken bewaren bij - 18 °C.3.16. Geconcentreerde interne-standaardoplossing, c = 2,50 μmol/ml:Los 0,2728 g α-methyl-tryptofaan (3.3) in een volumetrische maatkolf van 500 ml op in zoutzuur (3.13) en vul tot de maatstreep aan met zoutzuur (3.13). Gedurende maximaal vier weken bewaren bij - 18 °C.3.17. IJk-standaardoplossing tryptofaan en interne standaard:Neem 2,00 ml geconcentreerde tryptofaanoplossing (3.15) en 2,00 ml geconcentreerde interne-standaardoplossing (α-methyl-tryptofaanoplossing) (3.16). Verdun met water (3.1) en methanol (3.8) tot ongeveer hetzelfde volume en ongeveer dezelfde methanolconcentratie (10-30 %) als het eindhydrolysaat.Deze oplossing moet vóór gebruik vers worden bereid.Bescherm tijdens de bereiding tegen direct zonlicht.3.18. Azijnzuur3.19. 1,1,1-trichloor-2-methyl-2-propanol3.20. Ethanolamine  &gt; 98 %3.21. Oplossing van 1g 1,1,1-trichloor-2-methyl-2-propanol (3.19) in 100 ml methanol (3.8)3.22. Mobiele fase voor HPLC: 3,00 g azijnzuur (3.18) + 900 ml water (3.1) + 50,0 ml oplossing (3.21) van 1,1,1-trichloor-2-methyl-2-propanol (3.19) in methanol (3.8) (1g/100 ml). Breng de pH op 5,00 met behulp van ethanolamine (3.20). Vul tot 1000 ml aan met water (3.11).4. Apparatuur4.1. HPLC-apparatuur met een spectrofluorimetrische detector4.2. HPLC-kolom, 125 mm x 4 mm, C18, 3 μm vulling, of een soortgelijke kolom4.3. pH-meter4.4. Polypropyleenmaatkolf, inhoud 125 ml, met brede hals en schroefdop4.5. Membraanfilter, 0,45 μm4.6. Drukvat, 110 (+- 2) °C, 1,4 (+- 0,1) bar4.7. Mechanisch schudapparaat of magneetroerder4.8. Wervelmenger5. Werkwijze5.1. Bereiding van monstersHet monster wordt gemalen tot het een zeef van 0,5 mm kan passeren. Monsters met een hoge vochtigheidsgraad moeten ofwel aan lucht met een temperatuur van hoogstens 50 °C worden gedroogd, ofwel voorafgaand aan het malen worden gevriesdroogd. Monsters met een hoog vetgehalte dienen voorafgaand aan het malen te worden geëxtraheerd met lichtpetroleum (3.9).5.2. Bepaling van de hoeveelheid vrij tryptofaan (extract)Weeg op 1 mg nauwkeurig een geschikte hoeveelheid (1 à 5 g) van het bereide monster (5.1) af in een erlenmeyer. Voeg 100,0 ml zoutzuur, c = 0,1 mol/l (3.13) en 5,00 ml geconcentreerde interne-standaardoplossing (3.16) toe. Schud of meng gedurende 60 minuten met behulp van een mechanisch schudapparaat of een magneetroerder (4.7). Laat het bezinksel neerslaan en pipetteer 10,0 ml van de bovenstaande oplossing in een bekerglas. Voeg 5 ml orthofosforzuur, c = 0,5 mol/l (3.14) toe. Breng de pH op 3 met behulp van natriumhydroxide, c = 1,0 mol/l (3.10). Voeg voldoende methanol (3.8) toe om een methanolconcentratie tussen 10 en 30 % in het eindvolume te verkrijgen. Breng over in een volumetrische maatkolf met een geschikte inhoud en verdun met water tot een volume dat is vereist voor de chromatografie (bij benadering hetzelfde volume als de ijk-standaardoplossing (3.17)).Filtreer een paar ml van de oplossing door een membraanfilter van 0,45 μm (4.5) vóór injectie in de HPLC-kolom. Ga verder met de chromatografiestap volgens 5.4.Bescherm de standaardoplossing en extracten tegen direct zonlicht. Als het niet mogelijk is de extracten dezelfde dag te analyseren, kunnen ze gedurende maximaal drie dagen bij 5 °C worden bewaard.5.3. Bepaling van de totale hoeveelheid tryptofaan (hydrolysaat)Weeg op 0,2 mg nauwkeurig 0,1 à 1 g van het bereide monster (5.1) af in de polypropyleenmaatkolf (4.4). De gewogen monsterfractie dient een stikstofgehalte van ongeveer 10 mg te hebben. Voeg 8,4 g bariumhydroxide (octahydraat) (3.4) en 10 ml water toe. Meng in een wervelmenger (4.8) of magneetroerder (4.7). Laat de magneet met tefloncoating in het mengsel zitten. Was de wanden van het vat met 4 ml water. Plaats de schroefdop erop en sluit de maatkolf losjes. Breng over in een drukvat (4.6) met kokend water en laat het geheel 30-60 minuten stomen. Sluit het drukvat en laat het gedurende 20 uur dicht bij 110 (+- 2) °C.Breng de temperatuur terug tot iets onder 100 °C alvorens het drukvat te openen. Voeg 30 ml water op kamertemperatuur toe aan het warme mengsel om uitkristalliseren van Ba(OH)2.8 H2O tegen te gaan. Schud of roer voorzichtig. Voeg 2,00 ml geconcentreerde interne-standaardoplossing (α-methyl-tryptofaanoplossing) (3.16) toe. Laat de vaten gedurende 15 minuten in een water/ijsbad afkoelen.Voeg vervolgens 5 ml orthofosforzuur, c = 0,5 mol/l (3.14) toe. Laat het vat in het koelbad, neutraliseer al roerend met HCl, c = 6 mol/l (3.11) en breng de pH op 3,0 met behulp van HCl, c = 1 mol/l (3.12). Voeg voldoende methanol toe om een methanolconcentratie tussen 10 en 30 % in het eindvolume te verkrijgen. Breng over in een volumetrische maatkolf met een geschikte inhoud en verdun met water tot het bepaalde volume dat vereist is voor de chromatografie (bijv. 100 ml). Toevoeging van methanol zou geen bezinksel mogen veroorzaken.Filtreer een paar ml van de oplossing door een membraanfilter van 0,45 μm (4.5) vóór injectie in de HPLC-kolom. Ga verder met de chromatografiestap volgens 5.4.Bescherm de standaardoplossing en de hydrolysaten tegen direct zonlicht. Als het niet mogelijk is de hydrolysaten dezelfde dag te analyseren, kunnen ze gedurende maximaal 3 dagen bij 5 °C worden bewaard.5.4. HPLC-bepalingDe volgende condities voor isocratische elutie worden als leidraad aangegeven; er mogen andere parameters worden gebruikt op voorwaarde dat hiermee vergelijkbare resultaten worden verkregen (zie ook de opmerkingen 9.1 en 9.2):>RUIMTE VOOR DE TABEL>6. Berekening van de resultaten>PIC FILE= "L_2000174NL.004701.EPS">A= piekoppervlakte van interne standaard, ijk-standaardoplossing (3.17)B= piekoppervlakte van tryptofaan, extract (5.2) of hydrolysaat (5.3)C= volume in ml (2 ml) van geconcentreerde tryptofaanoplossing (3.15) toegevoegd aan de ijkoplossing (3.17)D= concentratie in μmol/ml (= 2,50) van geconcentreerde tryptofaanoplossing (3.15) toegevoegd aan de ijkoplossing (3.17)E= volume in ml van geconcentreerde interne-standaardoplossing (3.16) toegevoegd aan de extractie (5.2) (= 5,00 ml) of aan het hydrolysaat (5.3) (= 2,00 ml)F= piekoppervlakte van interne standaard, extract (5.2) of hydrolysaat (5.3)G= piekoppervlakte van tryptofaan, ijk-standaardoplossing (3.17)H= volume in ml (= 2,00 ml) van geconcentreerde interne-standaardoplossing (3.16) toegevoegd aan de ijk-standaardoplossing (3.17)W= monstergewicht in g (gecorrigeerd tot het oorspronkelijke gewicht indien gedroogd en/of ontvet)MW= molecuulgewicht van tryptofaan (= 204,23)7. HerhaalbaarheidHet verschil tussen de resultaten van twee parallelle, op hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen mag niet meer dan 10 % van het hoogste resultaat bedragen.8. Resultaten van een ringonderzoekIn EG-verband is een ringonderzoek verricht (de vierde vergelijkende studie) waarbij drie monsters werden geanalyseerd door maximaal twaalf laboratoria om de hydrolysemethode te certificeren. De analyses werden voor elk monster vijfmaal herhaald. De resultaten staan in de volgende tabel:>RUIMTE VOOR DE TABEL>Bij een ander ringonderzoek in EG-verband (de derde vergelijkende studie) werden twee monsters geanalyseerd door maximaal 13 laboratoria om de methode voor extractie van vrij tryptofaan te certificeren. De analyses werden voor elk monster vijfmaal herhaald. De resultaten staan in de volgende tabel:>RUIMTE VOOR DE TABEL>Bij een ander ringonderzoek in EG-verband werden vier monsters geanalyseerd door maximaal zeven laboratoria met als doel een tryptofaancertificatie voor hydrolyse. De resultaten staan in onderstaande tabel. De analyses werden voor elk monster vijfmaal herhaald.>RUIMTE VOOR DE TABEL>9. Opmerkingen9.1. Onder de volgende speciale chromatografische condities kan een betere scheiding tussen tryptofaan en α-methyl-tryptofaan worden verkregen.>RUIMTE VOOR DE TABEL>9.2. De chromatografie varieert afhankelijk van het type HPLC en kolomvullingsmateriaal. Met het gekozen systeem moet een basislijnscheiding tussen het tryptofaan en de interne standaard tot stand gebracht kunnen worden. Verder is het van belang dat afbraakproducten goed worden gescheiden van het tryptofaan en de interne standaard. Hydrolysaten zonder interne standaard dienen te worden gebruikt om de basislijn onder de interne standaard te controleren op verontreinigingen. Het is van belang dat de uitvoeringstijd lang genoeg is voor de elutie van alle afbraakproducten, daar anders traag eluerende pieken de volgende chromatografische bepalingen kunnen verstoren.Binnen het bewerkingsgebied dient het chromatografische systeem een lineaire respons te geven. De lineaire respons dient te worden gemeten bij een constante (de normale) concentratie van de interne standaard en bij verschillende tryptofaanconcentraties. Het is van belang dat de piekgrootte zowel voor het tryptofaan als voor de interne standaard binnen het lineaire gebied van het HPLC/fluorescentiesysteem liggen. Als de piek(en) van het tryptofaan en/of de interne standaard te klein of te groot is (zijn), dient de analyse te worden herhaald met een andere monstergrootte en/of een gewijzigd eindvolume.9.3. BariumhydroxideDe oplosbaarheid van bariumhydroxide neemt mettertijd steeds verder af. Dit resulteert in een troebele oplossing voor de HPLC-bepaling, die lage waarden voor tryptofaan kan opleveren.(1) Uitgevoerd door de Werkgroep Diervoeders van het Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).(2) Uitgevoerd door de Werkgroep Diervoeders van het Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).