CELEX: 31972L0199
Language: pl
Date: 1972-04-27 00:00:00
Title: Trzecia Dyrektywa Komisji z dnia 27 kwietnia 1972 r. ustalająca wspólnotowe metody analiz do celów urzędowej kontroli pasz

Ważna informacja prawna

|

31972L0199

Dziennik Urzędowy L 123 , 29/05/1972 P. 0006 - 0034 Specjalne wydanie fińskie: Rozdział 3 Tom 4 P. 0184  Specjalne wydanie duńskie: Seria III Rozdział 1966-1972 P. 0071  Specjalne wydanie szwedzkie: Rozdział 3 Tom 4 P. 0184  Specjalne wydanie angielskie: Seria III Rozdział 1966-1972 P. 0074  Specjalne wydanie greckie: Rozdział 03 Tom 8 P. 0007  Specjalne wydanie hiszpańskie: Rozdział 03 Tom 6 P. 0008  Specjalne wydanie portugalskie Rozdział 03 Tom 6 P. 0008 

		Trzecia Dyrektywa Komisjiz dnia 27 kwietnia 1972 r.ustalająca wspólnotowe metody analiz do celów urzędowej kontroli pasz(72/199/EWG)KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,uwzględniając Traktat ustanawiający Europejską Wspólnotę Gospodarczą,uwzględniając dyrektywę Rady z dnia 20 lipca 1970 r. [1] w sprawie wprowadzenia wspólnotowych metod pobierania próbek i analizy do celów urzędowej kontroli pasz, w szczególności jej art. 2,a także mając na uwadze, co następuje:dyrektywa wymaga, aby urzędowa kontrola pasz była przeprowadzona z użyciem wspólnotowych metod pobierania próbek i analizy, w celu sprawdzenia zgodności z wymaganiami wynikającymi z przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych dotyczących jakości i składu pasz;dyrektywa Komisji nr 71/250/EWG z dnia 15 czerwca 1971 r. [2] i dyrektywa nr 71/393/EWG z dnia 18 listopada 1971 r. [3] ustaliły pewną liczbę wspólnotowych metod analizy. Biorąc pod uwagę postęp, jaki dokonał się w czasie później prowadzonych prac, powinien zostać przyjęty trzeci zestaw metod;środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Pasz,PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:Artykuł 1Państwa Członkowskie wymagają, aby analizy do celów urzędowej kontroli pasz w zakresie poziomu skrobi, surowych białek, surowych białek rozpuszczonych w pepsynie i kwasie solnym, wolnego i całkowitego gossypolu oraz aktywności pepsyny były przeprowadzone z użyciem metod opisanych w załączniku I do niniejszej dyrektywy.Przepisy ogólne wymienione w części 1 (wprowadzenie) Załącznika do pierwszej dyrektywy Komisji nr 71/250/EWG z dnia 15 czerwca 1971 r. ustanawiającej wspólnotowe metody analizy do celów urzędowej kontroli pasz stosuje się w odniesieniu do metod opisanych w załączniku I do niniejszej dyrektywy.Artykuł 2Państwa Członkowskie wymagają, aby analizy do celów urzędowej kontroli pasz w celu zidentyfikowania i wykrywania antybiotyków z grupy tetracyklin oraz w celu wykrycia poziomu chlorotetracykliny, oksytetracykliny, tetracykliny, oleandomycyny, tylozyny i wirginiamycyny w paszach były przeprowadzane z użyciem metod opisanych w załączniku II do niniejszej dyrektywy.Przepisy ogólne wymienione w części 1 (wprowadzenie) Załącznika do pierwszej dyrektywy Komisji 71/250/EWG z dnia 15 czerwca 1971 r., z wyjątkiem dotyczących przygotowania próbek do analizy, stosuje się w odniesieniu do metod opisanych w załączniku II do niniejszej dyrektywy.Artykuł 3Państwa Członkowskie wprowadzają w życie przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne niezbędne do wykonania niniejszej dyrektywy najpóźniej do dnia 1 lipca 1973 r. i niezwłocznie powiadamiają o tym Komisję.Artykuł 4Niniejsza dyrektywa skierowana jest do Państw Członkowskich.Sporządzono w Brukseli, dnia 27 kwietnia 1972 r.W imieniu KomisjiS.L. MansholtPrzewodniczący[1] Dz.U. L 170 z 3.8.1970, str. 2.[2] Dz.U. L 155 z 12.7.1971, str. 13.[3] Dz.U. L 279 z 20.12.1971, str. 7.--------------------------------------------------ZAŁĄCZNIK I1. OZNACZANIE SKROBIMetoda polarymetryczna1. Cel i zakresMetoda ta pozwala na oznaczenie w paszach poziomu skrobi i wielkocząsteczkowych produktów jej rozpadu, z wyjątkiem tych pasz, które zawierają płatki buraczane, masę buraczaną, suszone pędy nadziemne lub liście buraków, masę ziemniaczaną, suszone drożdże oraz produkty bogate w inulinę (płatki i mąkę słonecznika bulwiastego).2. ZasadaMetoda ta obejmuje dwa oznaczenia. W pierwszym podgrzana próbka traktowana jest rozcieńczonym kwasem solnym. Po sklarowaniu i przefiltrowaniu roztworu dokonuje się pomiaru jego skręcalności optycznej metodą polarymetryczną.W drugim oznaczeniu przeprowadza się ekstrakcję próbki 40-procentowym roztworem etanolu. Po zakwaszeniu filtratu kwasem solnym, sklarowaniu i przefiltrowaniu dokonuje się pomiaru skręcalności optycznej, tak samo jak w pierwszym oznaczeniu.Różnica pomiędzy dwoma pomiarami, pomnożona przez znany współczynnik, oznacza zawartość skrobi w próbce.3. Odczynniki3.1. 25-procentowy (w/w) roztwór kwasu solnego d: 1,1263.2. 1,128-procentowy (w/obj) kwas solnyStężenie kwasu musi być sprawdzone za pomocą miareczkowania 0,1 N roztworem wodorotlenku sodu w obecności 0,1-procentowego (w/obj) roztworu czerwieni metylowej w 94-procentowym (w/w) etanolu. 10 ml = 30,94 ml 0,1 N NaOH3.3. Roztwór Carreza I: rozpuścić w wodzie 21,9 g octanu cynku Zn(CH3COO)2 · 2H2O i 3g kwasu octowego lodowatego. Dopełnić wodą do objętości 100 ml.3.4. Roztwór Carreza II: rozpuścić w wodzie 10,6 g żelazocyjanku potasu K4[Fe(CN)6] · 3H2O. Dopełnić wodą do objętości 100 ml.3.5. 40-procentowy (obj/obj) roztwór etanolu, d: 0,948 w temperaturze 20 °C.4. Aparatura4.1. Kolba stożkowa o pojemności 250 ml ze standardowym szlifem szklanym i chłodnicą zwrotną.4.2. Polarymetr lub sacharymetr.5. Metoda5.1. Przygotowanie próbkiRozdrobnić próbkę, aż wszystkie cząstki będą mogły przejść przez sito o średnicy otworów 0,5 mm.5.2. Oznaczenie całkowitej skręcalności optycznej (+ lub -) (patrz: uwaga 7.1)Odważyć 2,5 g próbki z dokładnością do miligrama i umieścić w kolbie pomiarowej o pojemności 100 ml. Dodać 25 ml kwasu solnego (ppkt 3.2). Wytrząsać do otrzymania jednolitego roztworu próby, a następnie dodać kolejne 25 ml kwasu solnego (ppkt 3.2). Zanurzyć kolbę we wrzącej łaźni wodnej, silnie wytrząsając przez pierwsze 3 minuty, co zapobiega tworzeniu się skupień. Ilość wody w łaźni wodnej musi być wystarczająca, aby pozostała ona w stanie wrzenia, kiedy kolba zostanie do niej włożona. W czasie wytrząsania nie można wyjąć kolby z łaźni wodnej. Dokładnie po 15 minutach wyjąć kolbę z łaźni, dodać 30 ml zimnej wody i natychmiast schłodzić próbę do temperatury 20 °C.Dodać 5 ml roztworu Carreza I (ppkt 3.3) i wytrząsać przez minutę. Następnie dodać 5 ml roztworu Carreza II (ppkt 3.4) i znów wytrząsać przez minutę. Dopełnić wodą zawartość kolby do kreski, wymieszać i filtrować. Jeśli filtrat nie jest całkowicie przezroczysty (co zdarza się rzadko), powtórzyć oznaczenie, używając większych ilości roztworów Carreza I i II (na przykład po 10 ml każdego)Za pomocą polarymetru lub sacharymetru mierzyć skręcalność optyczną roztworu w rurce polarymetrycznej o długości 200 mm.5.3. Oznaczenie skręcalności optycznej (P′ lub S′) substancji rozpuszczalnych w 40-procentowym roztworze etanoluOdmierzyć 5 g badanej substancji z dokładnością do miligrama. Umieścić próbkę w kolbie pomiarowej o pojemności 100 ml i dodać około 80 ml etanolu (ppkt 3.5) (patrz: uwaga 7.2). Pozostawić kolbę na godzinę w temperaturze pokojowej. W międzyczasie sześciokrotnie silnie wytrząsnąć jej zawartość, tak aby badana substancja była dobrze wymieszana z etanolem. Dopełnić do kreski zawartość kolby etanolem (ppkt 3.5), wymieszać i filtrować.Odpipetować 50 ml filtratu (= 2,5g próbki) do kolby stożkowej o objętości 250 ml. Dodać 2,1 ml kwasu solnego (ppkt 3.1) i silnie wstrząsnąć. Zamocować chłodnicę zwrotną i zanurzyć kolbę we wrzącej łaźni wodnej. Dokładnie po 15 minutach wyjąć kolbę z łaźni, przenieść zawartość do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml, obmyć chłodną wodą i schłodzić do temperatury 20 °C.Sklarować roztwór, używając roztworów Carreza I (ppkt 3.3) i II (ppkt 3.4), dopełnić zawartość kolby wodą do objętości 100 ml, wymieszać, filtrować i mierzyć skręcalność optyczną tak samo, jak w ppkt 5.2 akapit drugi i trzeci.6. Obliczenie wynikówZawartość procentową skrobi ( %) w próbce oblicza się w następujący sposób:6.1. Pomiary przeprowadzone polarymetremprocentową skrobi =2000P - P′αD20°gdzie:P = całkowita skręcalność optyczna w stopniach kątowychP′ = skręcalność optyczna w stopniach kątowych substancji rozpuszczalnych w 40 % etanolu.αD20° + 185,9° : skrobia ryżowa+ 195,4° : skrobia ziemniaczana+ 184,6° : skrobia kukurydziana+ 182,7° : skrobia pszeniczna+ 181,5° : skrobia jęczmienna+ 181,3° : skrobia owsiana+ 184,0° : pozostałe rodzaje skrobi, jak również mieszanek skrobi w paszach wieloskładnikowych6.2. Pomiary przeprowadzone sacharymetremprocentową skrobi =·=26,6 NS - S′αD20°gdzie:S = całkowita skręcalność optyczna w stopniach sacharymetrycznych.S′ = skręcalność optyczna w stopniach sacharymetrycznych substancji rozpuszczalnych w 40-procentowym etanolu.N = waga w g) sacharozy w 100 ml wody wytrzymująca skręcalność optyczną 100° sacharymetrycznych podczas pomiaru rurką o grubości 200 mm.16,29 g dla sacharymetrów francuskich26,00 g dla sacharymetrów niemieckich20,00 g dla sacharymetrów mieszanychαD20° = szczególna skręcalność optyczna czystej skrobi (patrz. 6.1).6.3. PowtarzalnośćRóżnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbce nie może przekraczać 0,4 w wartości bezwzględnej dla zawartości skrobi niższej niż 40 % i 1,1 % w wartości względnej dla zawartości skrobi równej lub wyższej niż 40 %7. Uwagi7.1. Jeśli próbka zawiera więcej niż 6 % węglanów, obliczonych jako węglan wapnia, muszą one zostać związane poprzez dodanie odpowiedniej ilości rozcieńczonego kwasu siarkowego jeszcze przed przystąpieniem do oznaczania całkowitej skręcalności optycznej.7.2. W przypadku produktów o wysokiej zawartości laktozy, na przykład sproszkowanego mleka lub mleka odtłuszczonego, należy postępować w niżej opisany sposób: po dodaniu 80 ml etanolu (ppkt 3.5) nałożyć chłodnicę zwrotną na kolbę i zanurzyć ją na 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C. Pozostawić do wystygnięcia. Dalej postępować jak opisano w ppkt 5.3.2. OZNACZANIE SUROWYCH BIAŁEK1. Cel i zakresMetoda ta pozwala na oznaczenie w sposób tradycyjny surowych białek zawartych w paszach, na podstawie zawartości azotu. Oznaczenie przeprowadzane jest metodą Kjeldahla.2. ZasadaPróbkę poddaje się rozkładowi metodą spalania na mokro. Kwaśny roztwór neutralizowany jest roztworem wodorotlenku sodu. Uwolniony amoniak jest usuwany w procesie destylacji i zbierany w naczyniu zawierającym odmierzoną ilość kwasu siarkowego. Jego nadmiar miareczkuje się roztworem wodorotlenku sodu.3. Odczynniki3.1. Siarczan potasu (cz.d.a.)3.2. Katalizator: tlenek miedzi (II) (cz.d.a.) lub krystaliczny siarczan miedzi (II ) CuSO4 · 5H2O (cz.d.a.) lub rtęć albo tlenek rtęci(II) HgO (cz.d.a.)3.3. Granulowany cynk (cz.d.a.)3.4. Kwas siarkowy (cz.d.a.), D: 1,843.5. 0,1 N kwas siarkowy3.6. 0,5 N kwas siarkowy3.7. Wskaźnik - czerwień metylowa: rozpuścić 300 mg czerwieni metylowej w 100 ml 95-96-procentowego (obj) etanolu3.8. 40-procentowy (w/obj) roztwór wodorotlenku sodu3.9. 0,1 N roztwór wodorotlenku sodu3.10. 0,25 N roztwór wodorotlenku sodu3.11. Nasycony roztwór siarczku sodu (cz.d.a.)3.12. 8-procentowy (w/obj) roztwór tiosiarczanu sodu (Na2S2O3· 5H2O) (cz.d.a.)3.13. Pumeks granulowany, przemyty kwasem solnym i spopielony4. AparaturaAparat do ekstrakcji na ciepło i do destylacji metodą Kjeldahla (patrz uwaga 7.1)5. Metoda5.1. RozkładOdważyć 1g badanej substancji z dokładnością do miligrama i umieścić w kolbie aparatu do ekstrakcji na ciepło. Dodać 10 g siarczanu potasu (ppkt 3.1), odpowiednią ilość katalizatora (ppkt 3.2) (0,3–0,4 g tlenku miedzi lub 0,9–1,2 g siarczanu miedzi lub kroplę rtęci lub 0,6–0,7 g tlenku rtęci), 25 ml kwasu siarkowego (ppkt 3.4) i kilka granulek pumeksu (ppkt 3.13). Wymieszać. Kolbę lekko podgrzać, wstrząsając do czasu do czasu, dopóki mieszanina nie ulegnie zwęgleniu i nie zniknie piana. Następnie zwiększyć temperaturę, aż mieszanina zacznie silnie wrzeć. Ścianki naczynia nie mogą się przegrzać, a cząstki organiczne przyklejać się do nich. Kiedy roztwór stanie się przejrzysty i bezbarwny (lub lekko zielony w przypadku użycia katalizatora miedziowego), kontynuować gotowanie przez następną godzinę, a potem pozostawić do wystygnięcia.5.2. DestylacjaOstrożnie dodać 250–350 ml wody, przez chwilę mieszając, aż do całkowitego rozpuszczenia się siarczanów. Pozostawić do wystygnięcia. Dodać kilka granulek cynku (ppkt 3.3)Odmierzyć dokładnie 25 ml 0,1 N (ppkt 3.5) lub 0,5 N (ppkt 3.6) kwasu siarkowego (w zależności od przewidywanej zawartości azotu - patrz uwaga 7.2), umieścić go w odbieralniku aparatu do destylacji i dodać kilka kropli czerwieni metylowej (ppkt 3.7).Połączyć kolbę z chłodnicą aparatu do destylacji i zanurzyć koniec chłodnicy w cieczy znajdującej się w odbieralniku na głębokość przynajmniej 1 cm (patrz uwaga 7.3). Powoli wlać wkraplaczem 100 ml 40 -procentowego roztworu wodorotlenku sodu (ppkt 3.8). Jeśli użyty został katalizator rtęciowy, dodać 10 ml roztworu siarczku sodu (ppkt 3.11) lub też 25 ml tiosiarczanu sodu (ppkt 3.12).Podgrzać kolbę w taki sposób, aby średnio 150 ml cieczy oddestylowało w ciągu 15 minut. Pod koniec tego czasu sprawdzić odczyn uzyskanego destylatu za pomocą papierka lakmusowego. Jeśli odczyn jest zasadowy, kontynuować destylację. Przerwać proces, kiedy odczyn destylatu zmieni się na obojętny. W czasie destylacji uważnie obserwować barwę destylatu. Od czasu do czasu wstrząsać zawartością odbieralnika. Jeśli roztwór przybierze barwę żółtą, natychmiast dodać dokładnie odmierzoną objętość 0,1 N (ppkt 3.5) lub 0,5 N (ppkt 3.6) kwasu siarkowego.5.3. MiareczkowanieMiareczkować nadmiar kwasu siarkowego w odbieralniku roztworem 0,1 N (ppkt 3.9) lub 0,25 N (ppkt 3.10) wodorotlenku sodu w zależności od normalności użytego kwasu siarkowego. Miareczkowanie prowadzić do momentu, aż roztwór zmieni barwę na bladożółtą.5.4. Weryfikacja metodyAby ustalić, czy odczynniki są wolne od azotu, należy przeprowadzić próbę ślepą (destylację i miareczkowanie), bez dodawania badanej próby. Aby sprawdzić dokładność metody należy przeprowadzić analizę (rozkład, destylację i miareczkowanie) z wykorzystaniem 1,5–2,0 g acetylofenyloaminy (cz.d.a.) (temp. topnienia 114 °C; N: 10,36) w obecności 1 g sacharozy pozbawionej azotu. Na 1 g acetylofenyloaminy przypada 14,80 ml 0,5N kwasu siarkowego6. Obliczenie wynikówOznaczyć objętość użytego kwasu siarkowego. 1 ml 0,1 N kwasu odpowiada 1,4 mg azotu. Pomnożyć ilość azotu przez 6,25. Wyniki przedstawić jako zawartość procentową próbki.PowtarzalnośćRóżnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń przeprowadzonych dla tej samej próbki nie może przekraczać:- 0,2 w wartości bezwzględnej dla zawartości surowych białek niższej niż 20 %;- 1,0 % w wartości względnej dla zawartości nie niższej niż 20 % i nie wyższej niż 40 %- 0,4 w wartości bezwzględnej dla zawartości wyższej niż 40 %7. Uwagi7.1. Może być wykorzystywany typ aparatu wymagający przenoszenia badanej substancji z jednego naczynia do drugiego pomiędzy etapem ekstrakcji na ciepło i destylacji. Konieczne jest wtedy takie przenoszenie badanej substancji, aby nie wystąpiły straty.7.2. W przypadku produktów o niskiej zawartości azotu objętość 0,1 N kwasu siarkowego dodanego do odbieralnika może być zmniejszona do 10 lub 15 ml (uzupełniona wodą do objętości 25 ml).7.3. Jeśli odbieralnik aparatu destylacyjnego nie jest wyposażony we wkraplacz, należy dodać wodorotlenek sodu tuż przed przyłączeniem kolby do chłodnicy, wlewając go powoli po ściance chłodnicy w taki sposób, aby nie mieszał się z kwaśnym roztworem.3. OZNACZENIE SUROWYCH BIAŁEK ROZPUSZCZONYCH W PEPSYNIE I KWASIE SOLNYM1. Cel i zakresMetoda pozwala na oznaczenie frakcji surowych białek rozpuszczonych w pepsynie i kwasie solnym w określonych warunkach. Można ją stosować do badania wszystkich rodzajów pasz.2. ZasadaPróbkę ogrzewać przez 48 godzin w temperaturze 40 °C w roztworze chlorowodorku pepsyny. Zawiesinę filtruje się, a następnie oznacza zawartość azotu w filtracie, zgodnie z metodą opisaną dla oznaczenia tego pierwiastka w surowych białkach.3. Odczynniki3.1. Kwas solny, d: 1,1253.2. 0,075 N kwas solny3.3. 2.0 U/mg pepsyny. Aktywność enzymatyczna pepsyny jest oznaczana według metody zawartej w części czwartej tego załącznika i musi być wykonana zgodnie z zamieszczoną tam metodą.3.4. Około 0,2 % (w/obj) świeżo przygotowanego roztworu pepsyny w kwasie solnym (3:2); aktywność 400 U/l3.5. Emulsja zapobiegająca spienianiu (np. krzemionka)3.6. Wszystkie odczynniki wymienione w pkt 3 metody pozwalającej na oznaczenie surowych białek4. Aparatura4.1. Łaźnia wodna lub inkubator nastawiona na temperaturę 40 ± 1 °C4.2. Aparat Kjeldahla5. Metoda5.1. Przygotowanie roztworu (patrz uwaga 7.2)Odważyć 2 g próbki z dokładnością do miligrama i umieścić ją w kolbie z podziałką o pojemności 500 ml. Dodać 450 ml roztworu chlorowodorku pepsyny (ppkt 3.4), ogrzanego wcześniej do temperatury 40 °C. Wytrząsnąć, co zapobiegnie tworzeniu się skupień. Sprawdzić, czy odczyn zawiesiny jest niższy niż 1,7. Umieścić kolbę w łaźni wodnej lub inkubatorze (ppkt 4.1) i pozostawić na 48 godzin, wstrząsając po 8, 24 i 32 godzinach. Po 48 godzinach dodać 15 ml kwasu solnego (ppkt 3.1), schłodzić do temperatury 20 °C, dopełnić wodą do 500 ml i filtrować.5.2. Rozkład250 ml filtratu umieścić w kolbie aparatu do destylacji (ppkt 4.2). Dodać odczynniki niezbędne do przeprowadzenia reakcji wymienione w zdaniu drugim ppkt 5.1 metody oznaczania surowych białek. Wymieszać i doprowadzić do wrzenia. Jeśli pojawi się piana, dodać kilka kropli emulsji zapobiegającej spienianiu (ppkt 3.5). Gotować do momentu, aż prawie cała woda wyparuje. Obniżyć temperaturę i dokładnie usunąć resztki wody.Kiedy roztwór stanie się przezroczysty i bezbarwny (lub jasnozielony, w przypadku użycia katalizatora miedziowego), kontynuować gotowanie przez następną godzinę. Pozostawić do wystygnięcia.5.3. Destylacja i miareczkowaniePostępować według opisu z ppkt 5.2 i 5.3 metody oznaczania surowych białek.5.4. Próba ślepaPrzeprowadzić próbę ślepą, stosując tę sama procedurę, jak opisano powyżej, bez dodawania próbki.6. Obliczenie wynikówOdjąć objętość kwasu solnego użytego w próbie ślepej od objętości zużytej przy badaniu próbki. 1 ml 0,1 N kwasu solnego odpowiada 1,4 mg azotu.Pomnożyć ilość uzyskaną dla azotu przez współczynnik 6,25. Wyniki przedstawić jako zawartość procentową próbki.PowtarzalnośćRóżnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń prowadzonych dla tej samej próbki, nie może przekraczać:- 0,4 w wartości bezwzględnej dla zawartości niższej niż 20 %;- 2,0 % w wartości względnej dla zawartości nie niższej niż 20 % i nie wyższej niż 40 %;- 0,8 w wartości bezwzględnej dla zawartości wyższej niż 40 %7. Uwagi7.1. Wartości uzyskane przy zastosowaniu niniejszej metody nie mają bezpośredniego odniesienia do procesów rozkładu in vivo.7.2. Produkty o zawartości oleju lub tłuszczu przekraczającej 10 % muszą najpierw zostać poddane odtłuszczeniu przez ekstrakcję frakcją ropy naftowej (temp. wrzenia 40–60 °C)4. OZNACZENIE AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ PEPSYNY1. Cel i zakresMetoda ta pozwala na ustalenie enzymatycznej aktywności pepsyny wykorzystywanej w oznaczaniu surowych białek rozpuszczonych w pepsynie i kwasie solnym.2. ZasadaHemoglobina poddawana jest działaniu pepsyny w środowisku kwasu solnego w ściśle określonych warunkach. Frakcja niehydrolizujących białek jest wytrącana kwasem trichlorooctowym. Do filtratu dodawany jest wodorotlenek sodu i odczynnik Folina-Ciocalteu. Gęstość optyczną tego roztworu mierzy się przy długości fali 750 nm. Odpowiadającą mu ilość tyrozyny odczytuje się z krzywej wzorcowej.Definicja: Jednostka pepsyny jest to taka ilość enzymu, która w warunkach wymaganych przez metodę powoduje uwolnienie w ciągu minuty takiej ilości grup hydroksyarylowych, które wybarwione odczynnikiem Folina-Ciocalteu mają wartość absorpcji odpowiadającą gęstości optycznej 1 μmola tyrozyny poddanej takiej samej reakcji barwnej.3. Odczynniki3.1. 0,2N kwas solny,3.2. 0,06N kwas solny,3.3. 0,025N kwas solny,3.4. 5-procentowy (w/obj) roztwór kwasu trichlorooctowego,3.5. 0,5N roztwór wodorotlenku sodu,3.6. Odczynnik Folina-Ciocalteu: umieścić 100 g tetraoksowolframinianu sodu (Na2WO4 · 2H2O), 25 g molibdenianu sodu (Na2MOO4 · 2H2O) i 700 ml wody w kolbie okrągłodennej o pojemności dwóch litrów z dopasowanym złączem szlifowym. Dodać 50 ml kwasu fosforowego (d: 1,71) i 100 ml stężonego kwasu solnego (d: 1,19). Do kolby podłączyć chłodnicę zwrotną. Doprowadzić roztwór do wrzenia. Gotować na małym ogniu przez 10 godzin. Pozostawić do wystygnięcia. Odłączyć chłodnicę, dodać 175 g siarczanu litu (Li2SO4 · 2H2O), 50 ml wody i 1 ml bromu. Gotować przez 15 minut w celu pozbycia się nadmiaru bromu.Pozostawić do wystygnięcia. Przenieść roztwór do kolby pomiarowej o pojemności 1litra. Dopełnić wodą, wymieszać i filtrować. Roztwór nie może mieć zielonego zabarwienia. Przed użyciem rozcieńczyć 1 objętość odczynnika z 2 objętościami wody.3.7. Roztwór hemoglobiny: odważyć ilość hemoglobiny (średnio 2 g substratu białkowego oznaczonego zgodnie z metodą Ansona), odpowiadającą 354 mg azotu [1] i umieścić w kolbie o pojemności 200 ml z dopasowanym złączem szlifowym. Dodać kilka kropli kwasu solnego (ppkt 3.2). Podłączyć kolbę do pompki próżniowej i wytrząsać, dopóki hemoglobina nie rozpuści się całkowicie. Odłączyć pompkę i nadal wytrząsając roztwór, dopełnić go kwasem solnym (ppkt 3.2) do objętości 100 ml. Przygotowywać bezpośrednio przed użyciem.3.8. Wzorcowy roztwór tyrozyny: rozpuścić 181,2 mg tyrozyny w kwasie solnym (ppkt 3.1). Dopełnić tym samym kwasem do objętości 1 litra (roztwór podstawowy). Pobrać 20,0 ml i rozcieńczyć do 100 ml kwasem solnym (ppkt 3.1). 1 ml tego roztworu zawiera 0,2 μmola tyrozyny.4. Aparatura4.1. Łaźnia wodna nastawiona na temperaturę 25 ± 1 °C, wyposażona w ultratermostat.4.2. Spektrofotometr4.3. Chronometr, dokładność: 1 sekunda4.4. Pehametr5. Metoda5.1. Przygotowanie roztworu (patrz: uwaga 7.1)Rozpuścić 150 mg pepsyny w 100 ml kwasu solnego (ppkt 3.2). Odpipetować 2 ml roztworu do kolby pomiarowej o pojemności 50 ml i dopełnić do kreski kwasem solnym (ppkt 3.3). Sprawdzić odczyn pehametrem. Powinien wynosić 1,6 ± 0,1. Zanurzyć kolbę w łaźni wodnej.5.2. HydrolizaDo probówki odpipetować 0,5 ml roztworu hemoglobiny (ppkt 3.7). Podgrzać do 25 °C w łaźni wodnej (ppkt 4.1). Dodać 1,0 ml roztworu pepsyny przygotowanego według przepisu w ppkt 5.1 i wymieszać szklaną bagietką, rozszerzoną na jednym końcu (około 10 ruchów do przodu i do tyłu). Pozostawić probówkę w łaźni wodnej, w temperaturze 25 stopni dokładnie na 10 minut, licząc od momentu dodania roztworu pepsyny (dokładnie kontrolować czas i temperaturę). Następnie dodać 10,0 ml roztworu kwasu trichlorooctowego (ppkt 3.4), ogrzanego uprzednio do temperatury 25 °C. Wymieszać i filtrować przez suchy filtr.5.3. Reakcja barwna i pomiar gęstości optycznejDo kolby stożkowej o pojemności 50 ml odpipetować 5,0 ml filtratu. Dodać 10,0 ml roztworu wodorotlenku sodu (ppkt 3.5) i wytrząsać. Nie przerywając wytrząsania dodać 3,0 ml rozcieńczonego odczynnika Folin-Ciocalteu (ppkt 3.6). Po 5–10 minutach mierzyć gęstość optyczna roztworu za pomocą spektrofotometru, przy długości fali 750 nm w kuwecie 1 cm, wobec wody.5.4. Próba ślepaDla każdego oznaczenia przeprowadzić następującą próbę ślepą:Do probówki odpipetować 0,5 ml roztworu hemoglobiny (ppkt 3.7). Ogrzewać w łaźni wodnej (ppkt 4.1) w temperaturze 25 °C. Dodać 10,0 ml roztworu kwasu trichlorooctowego (ppkt 3.4) podgrzanego uprzednio do tej samej temperatury. Wymieszać, a następnie dodać 1,0 ml roztworu pepsyny przygotowanego według przepisu w ppkt 5.1. Wymieszać szklaną bagietką. Pozostawić probówkę w łaźni wodnej (ppkt 4.1) na dokładnie 10 minut, w temperaturze 25 °C. Wymieszać i filtrować przez suchy filtr. Dalej postępować według przepisu z ppkt 5.35.5. Krzywa wzorcowaOdmierzyć do kolb stożkowych o pojemności 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml i 5,0 ml wzorcowego roztworu tyrozyny (ppkt 3.8), co odpowiada 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 i 1,0 μmola tyrozyny. Uzupełnić serię o roztwór porównawczy wolny od tyrozyny. Dopełnić kolby kwasem solnym (ppkt 3.1) do objętości 0,5 ml. Dodać 10,0 ml roztworu wodorotlenku sodu (ppkt 3.5), a następnie, cały czas wytrząsając - 3,0 ml rozcieńczonego roztworu odczynnika Folina-Ciocalteu (ppkt 3.6). Mierzyć gęstość optyczną, jak podano w ostatnim zdaniu ppkt 5.3. Wyznaczyć krzywą wzorcową, nanosząc na osie układu współrzędnych kolejne poziomy tyrozyny i odpowiadające im wartości gęstości optycznej.6. Obliczenie wynikówOdczytać na krzywej wzorcowej ilość tyrozyny, w mikromolach, odpowiadającą gęstości optycznej roztworu barwnika, korygowanego ślepą próbą.Aktywność pepsyny, w mikromolach tyrozyny, w mg i na minutę, w 25 °C, podaje się następującym równaniemjednostki na miligram=0,32 apw którym:a = ilość tyrozyny, w μmol, odczytana na krzywej wzorcowej;p = waga w mg ilości pepsyny dodanej w ppkt 5.2.7. Uwagi7.1. Ilość rozpuszczonej pepsyny musi być tak dobrana, aby podczas ostatecznego pomiaru fotometrycznego otrzymać gęstość optyczną wynoszącą 0,35 ± 0,0357.2. Dwie jednostki na miligram uzyskane za pomocą tej metody odpowiadają3,64 jednostki Ansona na miligram (μmol tyrozyny/mg/min przy temperaturze 35,5 °C) lub36400 jednostkom handlowym (przemysłowym) na gram (μmol tyrozyny/g/10 min w temperaturze 35,5 °C)5. OZNACZANIE WOLNEGO I CAŁKOWITEGO GOSSYPOLU1. Cel i zakresMetoda ta umożliwia oznaczenie poziomu wolnego gossypolu, całkowitego gossypolu i pokrewnych mu chemiczne substancji w nasionach bawełny, mące z nasion bawełny i wytłokach oraz w paszach mieszanych zawierających te substancje (gossypol wolny i całkowity) w ilości wyższej niż 20 ppm.2. ZasadaGossypol jest ekstrahowany w obecności 3-aminopropano-1-olu lub mieszaniny 2-propanolu i heksanu - w przypadku oznaczania jego wolnego związku - lub też w obecności dimetyloformamidu, gdy oznaczany jest poziom całkowitego gossypolu. Gossypol reaguje z aniliną tworząc gossypolo-dianilinę, której gęstość optyczna mierzona jest przy długości fali 440 nm.3. Odczynniki3.1. Mieszanina 2-propanolu i heksanu: zmieszać 60 części 2-propanolu (cz.d.a.) z 40 częściami n-heksanu3.2. Rozpuszczalnik A: do kolby pomiarowej o pojemności jednego litra wlać 500 ml mieszaniny 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1). Dodać 2 ml 3-aminopropan-1-olu, 8 ml kwasu octowego lodowatego i 50 ml wody. Dopełnić do kreski mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1). Odczynnik zachowuje stabilność przez tydzień.3.3. Rozpuszczalnik B: odpipetować 2 ml 3-aminopropano-1-olu i 10 ml kwasu octowego lodowatego do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml. Ochłodzić do temperatury pokojowej i dopełnić do kreski n,n-dimetyloformamidem. Odczynnik zachowuje stabilność przez tydzień.3.4. Anilina cz.d.a.: jeśli gęstość optyczna ślepej próby przekracza 0,022, poddać anilinę destylacji nad proszkiem cynkowym, odrzucając pierwsze i ostatnie 10 % frakcji destylatu. Przechowywać w lodówce, w butelce z brązowego szkła ze szczelnym szklanym korkiem. Odczynnik nadaje się do użytku przez kilka miesięcy.3.5. Wzorcowy roztwór gossypolu A: w kolbie pomiarowej o pojemności 250 ml umieścić 27,9 mg octanu gossypolu. Rozpuścić i dopełnić do kreski rozpuszczalnikiem A (ppkt 3.2). Odpipetować 50 ml roztworu do kolby pomiarowej o pojemności 250 ml i ponownie dopełnić do kreski rozpuszczalnikiem A (ppkt 3.2). Stężenie gossypolu w tym roztworze wynosi 0,02 mg/ml. Przed użyciem pozostawić na godzinę w temperaturze pokojowej.3.6. Wzorcowy roztwór gossypolu B: w kolbie pomiarowej o objętości 50 ml umieścić 27,9 g octanu gossypolu. Rozpuścić i dopełnić do kreski rozpuszczalnikiem B (ppkt 3.3). Stężenie gossypolu w tym roztworze wynosi 0,5 mg/ml.Wzorcowe roztwory gossypolu A i B zachowują stabilność przez 24 godziny, jeśli są chronione przed światłem.4. Aparatura4.1. Mikser (bęben obrotowy):około 35 obrotów/min4.2. Spektrofotometr5. Metoda5.1. Próbka badanaWielkość użytej w oznaczeniu próbki uzależniona jest od zakładanej zawartości gossypolu. Zalecana jest praca z możliwie niewielką próbką i relatywnie dużą objętościowo ilością filtratu. Pozwala to na otrzymanie wystarczającej ilości gossypolu do precyzyjnego oznaczenia fotometrycznego. W przypadku oznaczania wolnego gossypolu w nasionach bawełny, mące z nasion lub wytłokach, masa próbki nie powinna przekraczać 1 g. W przypadku mieszanek paszowych może wynosić ona 5 g. W większości przypadków wystarczy użyć 10 ml otrzymanego filtratu. Powinien on zawierać od 50 μg do 100 μg gossypolu. Przy oznaczaniu całkowitego gossypolu masa próbki powinna wynosić od 0,5 g do 5,0 g. 2 ml pobrane z uzyskanego filtratu będą zawierać od 40 μg do 200 μg gossypolu.Analizę należy prowadzić w temperaturze pokojowej (około 20 °C).5.2. Oznaczanie wolnego gossypoluW kolbie o pojemności 250 ml ze szlifowaną szyjką umieścić badaną próbkę. Dno kolby powinno być wysypane pokruszonym szkłem. Za pomocą pipety dodać 50 ml rozpuszczalnika A (ppkt 3.2), zamknąć kolbę i mieszać przez godzinę w mikserze. Filtrować przez suchy filtr i zebrać filtrat w małej kolbie ze szlifowaną szyjką. W czasie filtrowania przykryć lejek szkiełkiem zegarkowym. Do dwóch kolb pomiarowych o pojemności 25 ml każda (A i B), odpipetować identyczną objętość filtratu zawierającą od 50 μg do 100 μg gossypolu. Jeśli to konieczne dopełnić do objętości 10 ml rozpuszczalnikiem A (ppkt 3.2). Następnie dopełnić zawartość kolby A do kreski mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1). Ta mieszanina będzie roztworem porównawczym względem którego będą dokonywane pomiary.Do kolejnych dwóch kolb pomiarowych (C i D) o pojemności 25 ml każda odpipetować 10 ml rozpuszczalnika A (ppkt 3.2). Roztwór w kolbie C dopełnić do kreski mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1). Ten roztwór zostanie wykorzystany jako roztwór porównawczy względem której zostanie dokonany pomiar próby ślepej.Do kolb D i B dodać po 2 ml aniliny (ppkt 3.4). Ogrzewać przez 30 minut we wrzącej łaźni wodnej, aby pojawiło się zabarwienie. Kolby schłodzić do temperatury pokojowej, dopełnić do kreski mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1), wymieszać i pozostawić na godzinę.Oznaczyć gęstość optyczną próby ślepej D, prowadząc pomiar względem roztworu odniesienia C oraz gęstość optyczną roztworu B, dokonując pomiaru względem roztworu odniesienia A. Długość fali 440 nm w kuwecie szklanej 1cm.Odjąć wynik gęstości optycznej uzyskany z próby D od wyniku gęstości optycznej uzyskanego z próby B (= skorygowana gęstość optyczna). Korzystając z tej wartości, wyliczyć zawartość wolnego gossypolu, jak wskazano w pkt 6.5.3. Oznaczenie całkowitego gossypoluW kolbie pomiarowej o pojemności 50 ml umieścić próbkę zawierającą od 1 mg do 5 mg gossypolu. Dodać 10 ml rozpuszczalnika B (ppkt 3.3). W tym samym czasie przygotować próbę ślepą, umieszczając 10 ml rozpuszczalnika B (ppkt 3.3) w drugiej kolbie pomiarowej o pojemności 50 ml. Podgrzewać obydwie kolby przez 30 minut we wrzącej łaźni wodnej. Schłodzić do temperatury pokojowej i dopełnić zawartość każdej z kolb do kreski mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1). Wymieszać i pozostawić na 10–15 minut. Następnie filtrować i zebrać filtrat do dwóch kolb ze szlifowanymi szyjkami.Do dwóch kolb pomiarowych o pojemności 25 ml odpipetować po 2 ml filtratu uzyskanego z próbki. Do dwóch innych kolb pomiarowych o pojemności 25 ml odpipetować po 2 ml filtratu z próby ślepej. Zawartość jednej kolby z każdej pary dopełnić do kreski mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1) - ich zawartość będzie roztworem porównawczym.Do pozostałych dwóch kolb dodać po 2 ml aniliny (ppkt 3.4). Podgrzać przez 30 minut we wrzącej łaźni wodnej, do pojawienia się zabarwienia. Ochłodzić do temperatury pokojowej, dopełnić do 25 ml mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1), wymieszać i odstawić na godzinę.Oznaczyć gęstość optyczną tak, jak opisano dla wolnego gossypolu w ppkt 5.2. Korzystając z otrzymanych wartości, obliczyć całkowitą zawartość gossypolu, jak wskazano w pkt 6.6. Obliczenie wynikówObliczenia wyników można dokonać albo za pomocą gęstości optycznej (ppkt 6.1), albo odnosząc się do krzywej wzorcowej (ppkt 6.2).6.1. Obliczanie za pomocą szczególnej gęstości optycznejW warunkach opisanych szczególne gęstości optyczne są następujące:Wolny gossypol: | E 1 %1 cm = 625 |Całkowity gossypol: | E 1 %1 cm = 600 |Zawartość gossypolu wolnego lub całkowitego w próbce wyraża się następującym równaniem:gossypol % =E· p · aW którym:E = gęstość optyczna skorygowana, określona jak w ppkt 5.2,p = pobieranie próbki w g,a = podzielnik filtratu w ml.6.2. Za pomocą krzywej wzorcowej6.2.1. Wolny gossypolPrzygotować 2 serie w 5 kolbach pomiarowych o pojemności 25 ml. W każdej serii wprowadzić pipetą do kolb pomiarowych odpowiednio wielkości 2,0 – 4,0 – 6,0 – 8,0 i 10,0 ml roztworu wzorcowego A gossypolu (ppkt 3.5). Dopełnić objętości do 10 ml za pomocą rozpuszczalnika A (ppkt 3.2). Dopełnić każdą serię próbką w kolbie pomiarowej o pojemności 25 ml zawierającą jedynie 10 ml rozpuszczalnika A (ppkt 3.2).Dopełnić do 25 ml objętość kolb pomiarowych pierwszej serii (włącznie z próbką) mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1) (seria odniesienia).Dodać 2 ml aniliny (ppkt 3.4) w każdej kolbie drugiej serii (włącznie z próbką). Podgrzewać przez 30 minut we wrzącej łaźni wodnej, aby pojawiło się zabarwienie. Schłodzić do temperatury pokojowej i dopełnić do kreski mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1), wymieszać i pozostawić na 1 godzinę (seria wzorca).Oznaczyć w warunkach określonych w ppkt 5.2 gęstość optyczną roztworów serii wzorca przez porównanie z odpowiadającymi roztworami serii odniesienia. Na papierze milimetrowym wyznaczyć krzywą wzorcową nanosząc gęstości optyczne względem ilości gossypolu (w μg).6.2.2. Całkowity gossypolPrzygotować 6 kolb pomiarowych o pojemności 50 ml. W pierwszej kolbie umieścić 10 ml rozpuszczalnika B (ppkt 3.3), a w pozostałych odpowiednio 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 i 10,0 ml roztworu wzorcowego B gossypolu (ppkt 3.6). Dopełnić zawartość każdej kolby do 10 ml rozpuszczalnikiem B (ppkt 3.3). Podgrzewać przez 30 minut we wrzącej łaźni wodnej. Schłodzić do temperatury pokojowej i dopełnić do kreski mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1) i wymieszać.Umieścić 2,0 ml tych roztworów odpowiednio w dwóch seriach 6 kolb pomiarowych o pojemności 25 ml. Dopełnić do 25 ml zawartość kolb pomiarowych pierwszej serii mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1) (seria odniesienia).Dodać 2 ml aniliny (ppkt 3.4) w każdej kolbie drugiej serii. Podgrzewać przez 30 minut we wrzącej łaźni wodnej. Schłodzić do temperatury pokojowej i dopełnić do kreski mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1), wymieszać i pozostawić na 1 godzinę (seria wzorca).Oznaczyć w warunkach określonych w ppkt 5.2 gęstość optyczną roztworów serii wzorca przez porównanie z odpowiadającymi roztworami serii odniesienia. Na papierze milimetrowym wyznaczyć krzywą wzorcową nanosząc gęstości optyczne względem ilości gossypolu (w μg).6.3. PowtarzalnośćRóżnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń prowadzonych dla tej samej próbki nie może przekraczać:- 15 %, w wartości względnej, dla zawartości gossypolu niższej niż 500 ppm,- 75 ppm, w wartości bezwzględnej, dla zawartości między 500 a 750 ppm,- 10 %, w wartości względnej, dla zawartości wyższej niż 750 ppm.[1] Obliczyć zawartość azotu mikrometodą Kjeldahla (zawartość teoretyczna: 17,7 % azotu).--------------------------------------------------ZAŁĄCZNIK II1. OZNACZANIE I WYKRYWANIE ANTYBIOTYKÓW Z GRUPY TETRACYKLIN1. Cel i zakresMetoda ta pozwala na oznaczanie i wykrywanie antybiotyków z grupy tetracyklin w paszach zawierających przynajmniej 0,1 ppm antybiotyków, a także w koncentratach i premiksach.2. Zasada działania metodyPróbka poddana zostaje procesowi ekstrakcji mieszaniną metanolu i kwasu solnego. Ekstrakt i roztwory odniesienia poddaje się rozdziałowi metodą bibułowej chromatografii wstępującej. Antybiotyki są wykrywane i identyfikowane poprzez porównanie ich wartości współczynnika Rf (odległość od czoła rozpuszczalnika) z wartościami uzyskanymi dla roztworów wzorcowych, lub też poprzez badanie ich fluorescencji w ultrafiolecie (wysoka zawartość antybiotyków), bądź na drodze oceny mikrobiologicznej - na żelu agarowym szczepionym koloniami B. cereus.3. Odczynniki i pożywka3.1. Roztwór buforowy, pH 3,5Jednowodzian kwasu cytrynowego (cz.d.a.) | 10,256 g |Wodorofosforan sodu Na2HPO4 · 2H2O (cz.d.a.) | 7,45 g |Aceton (cz.d.a.) | 300 ml |Woda destylowana - dopełnić do objętości | 1000 ml |3.2. Roztwór buforu fosforanowegoDiwodorofosforan potasu KH2PO4 (cz.d.a.) | 130,86 g |Wodorofosforan sodu Na2HPO4 · 2H2O (cz.d.a.) | 6,947 g |Woda destylowana - dopełnić do objętości | 1000 ml |Eluent I: | Wymieszać czysty nitrometan, czysty chloroform i 1,3-dichloropropan-2-ol w stosunku objętościowym 20:10:1,5. Przygotować bezpośrednio przed użyciem. |Eluent II: | Wymieszać czysty nitrometan, chloroform i 2-pikolinę w stosunku objętościowym 20:10:3. Przygotować bezpośrednio przed użyciem. |3.3. 3.4. 3.5. Mieszanina czystego metanolu i kwasu solnego (d: 1,19) w stosunku objętościowym 98:23.6. 0,1 N kwas solny3.7. Amoniak (d: 0,91)3.8. Wzorce: chlorotetracyklina, oksytetracyklina, tetracyklina3.9. Drobnoustroje B. cereus ATCC nr 11778Przechowywanie szczepu macierzystego, przygotowanie zawiesiny zarodników i zaszczepienie ich na pożywce należy przeprowadzić zgodnie z opisem znajdującym się w ppkt 3.1 i 3.2 metody oznaczania zawartości chlorotetracykliny, oksytetracykliny i tetracykliny przez dyfuzję w agarze, opisanej w części 2 niniejszego załącznika.3.10. Pożywka [1]Glukoza | 1 g |Pepton trypsynowy | 10 g |Wyciąg mięsny | 1,5 g |Wyciąg drożdżowy | 3,0 g |Agar | 20 g |Woda destylowana - dopełnić do objętości | 1000 ml |Przed użyciem doprowadzić do pH 5,83.11. 0,1-procentowy (w/obj) roztwór chlorku 2,3,5-trifenylotetrazolu i 5-procentowy (w/obj) roztwór glukozy4. Aparatura4.1. Aparat do chromatografii bibułowej wstępującej (wysokość papieru 25 cm). Papier Schleiter i Schuell (2040B lub 2043B) albo jego odpowiednik4.2. Wirówka4.3. Cieplarka nastawiona na temperaturę 30 °C4.4. Lampa UV do wykrywania fluorescencji4.5. Płytki szklane 20x30 cm do metody mikrobiologicznej5. Roztwory wzorcowe5.1. Roztwór podstawowyUżywając kwasu solnego (ppkt 3.6) przygotować roztwory substancji podstawowych (ppkt 3.8) o stężeniach chlorotetracykliny-HCl, oksytetracykliny-HCl i tetracykliny-HCl odpowiadających 500 μg na ml.5.2. Roztwory odniesienia do wykrywania substancji za pomocą lampy UVRozcieńczyć roztwory (ppkt 5.1) buforem fosforanowym (ppkt 3.2), aby otrzymać roztwory o stężeniach chlorotetracykliny-HCl, oksytetracykliny-HCl i tetracykliny-HCl odpowiadających 100 μg na ml.5.3. Roztwory odniesienia do wykrywania substancji metodą mikrobiologicznąRozcieńczyć roztwory (ppkt 5.1) buforem fosforanowym (ppkt 3.2) aby otrzymać roztwory o stężeniach chlorotetracykliny-HCl, oksytetracykliny-HCl i tetracykliny-HCl odpowiadających 5 μg na ml.6. EkstrakcjaJeśli zakładana zawartość antybiotyków jest mniejsza niż 10 ppm, można wykorzystać do analizy wymieszaną próbkę bądź najbardziej drobnoziarnistą frakcję uzyskaną przez przesianie próbki, ponieważ antybiotyki występują głównie w tej właśnie frakcjiPrzygotować zawiesinę próbki w mieszaninie (ppkt 3.5) i odwirować. Zebrać ciecz sklarowaną nad osadem, aby używać go w stanie nierozcieńczonym lub, jeśli konieczne, rozcieńczyć mieszaniną (ppkt 3.5) dla uzyskania stężeń antybiotyków około 100 μg na ml (ppkt 6.1) i 5 μg na ml (ppkt 6.2).7. Wykrywanie i identyfikacja7.1. ChromatografiaZanurzyć papier chromatograficzny w buforze o pH 3,5 (ppkt 3.1). Odcisnąć nadmiar cieczy między dwiema kartkami bibuły filtracyjnej. Nanieść po 0,01 ml roztworów wzorcowych (ppkt 5.2 i 5.3) oraz ekstraktu (ppkt 6.1 i 6.2). Aby rozdział przebiegał prawidłowo, papier musi mieć odpowiednią wilgotność. Jeśli trzeba, można zostawić go na chwilę, aby podsechł.Rozwijanie chromatografii wstępującej. W przypadku korzystania z metody mikrobiologicznej przy wykrywaniu antybiotyków, używać eluentu I (ppkt 3.3). Przy wykrywaniu metodą fluorescencji w świetle UV używać eluentu II (ppkt 3.4). Kiedy czoło rozpuszczalnika znajdzie się na wysokości 15–20 cm (mniej więcej po 1,5 godziny) zakończyć proces chromatografii i wysuszyć papier.7.2. Wykrywanie za pomocą lampy UVJeśli poziom antybiotyków jest wyższy niż 1 μg na cm2, na chromatogramie poddanym działaniu rozpylonego amoniaku (ppkt 3.7) w świetle lampy UV (ppkt 4.4) pojawią się świecące, złotożółte plamy.7.3. Wykrywanie za pomocą metody mikrobiologicznejPożywkę (ppkt 3.10), szczepioną kulturami B. cereus (ppkt 3.9) wylać na szklane płytki (ppkt 4.5) i na pożywce umieścić papier. Po 5 minutach zdjąć papier i umieścić go w innym miejscu na pożywce, gdzie pozostanie przez okres inkubacji. Inkubować całą noc w cieplarce ustawionej na temperaturę 30 °C. O obecności antybiotyku z grupy tetracyklin świadczy jasna, martwa strefa na mętnej pożywce w której rozwijają się bakterie.Aby utrwalić chromatogram, należy po inkubacji spryskać papier roztworem (ppkt 3.11)7.4. IdentyfikacjaNiżej podano względne współczynniki Rf dla antybiotyków z grupy tetracyklin. Mogą one zmieniać się nieznacznie w zależności od jakości papieru i stopnia jego nawilżenia:chlorotetracyklina (CTC): | 0,60 |tetracyklina (TC): | 0,40 |oksytetracyklina (OTC): | 0,20 |4-epi-CTC: | 0,15 |4-epi-TC: | 0,13 |4-epi-OTC: | 0,10 |Związki "epi" mają aktywność antybiotyczną niższą niż związki normalne.2. OZNACZANIE CHLOROTETRACYKLINY, OKSYTETRACYKLINY I TETRACYKLINYA. PRZEZ DYFUZJĘ W AGARZE1. Cel i zakresMetoda ta pozwala na oznaczenie poziomów chlorotetracykliny (CTC), oksytetracykliny (OTC) i tetracykliny (TC) w paszach, koncentratach i premiksach, gdzie są one obecne w ilości wyższej niż 5 ppm. Zawartość niższa niż 5 ppm może być oznaczona przez graficzną interpolację.2. ZasadaW przypadku zawartości antybiotyków niższej lub równej 50 ppm przeprowadza się ekstrakcję próbki rozcieńczonym amidem kwasu mrówkowego (formamidem). Dla zawartości wyższej niż 50 ppm ekstrakcję prowadzi się mieszaniną acetonu, wody i kwasu solnego w celu oznaczenia CTC lub mieszaniną metanolu i kwasu solnego w celu oznaczenia OTC i TC.Ekstrakty rozcieńcza się, a aktywność antybiotyczną oznacza, mierząc dyfuzję CTC, OTC lub TC w agarze szczepionym B. cereus. Przebieg procesu dyfuzji jest widoczny dzięki powstaniu stref inhibicji w ośrodku zakażonym drobnoustrojami. Średnica strefy inhibicji jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyku.3. Drobnoustroje B. cereus, ATCC nr 117783.1. Szczep macierzystyZaszczepić B. cereus na agarze z pożywką (ppkt 4.1) umieszczonym w skośnie ustawionej probówce, wolnym od błękitu metylenowego i kwasu borowego. Inkubować przez noc w temperaturze około 30 °C. Przechowywać w lodówce. Ponownie szczepić agar co 14 dni.3.2. Przygotowanie zawiesiny zarodnikówZebrać kolonie bakterii z agaru (ppkt 3.1), używając 2–3 ml roztworu soli fizjologicznej. Tą zawiesiną zaszczepić 300 ml pożywki (ppkt 4.1) wolnej od błękitu metylenowego i kwasu borowego, umieszczonej w kolbie Roux. Stężenie agaru wynosi 3 %-4 %. Inkubować przez 3–5 dni w temperaturze 28–30 °C. Po sprawdzeniu zarodnikowania pod mikroskopem zebrać zarodniki do 15 ml etanolu (ppkt 4.6). Zawiesinę wymieszać. Można przechowywać ją w lodówce ponad 5 miesięcy.Przeprowadzić wstępne badania na płytkach z pożywką (ppkt 4.1). Pozwolą one na ustalenie ilości zawiesiny zarodników niezbędnej do zaszczepienia pożywki przeznaczonej do oznaczeń, która, dla różnych stężeń antybiotyków, da największą możliwą strefę inhibicji. Ilość zawiesiny wynosi zwykle 0,2–0,3 ml na 1000 ml. Pożywkę należy zaszczepiać zarodnikami w temperaturze 50–60 °C.4. Pożywki i odczynniki4.1. Pożywka podstawowa do oznaczeń [2]Glukoza | 1 g |Pepton trypsynowy | 10 g |Wyciąg mięsny | 1,5 g |Wyciąg drożdżowy | 3 g |Agar – zależnie od jakości | 10–20 g |"TWEEN 80" | 1 ml |Bufor fosforanowy o pH 5,5 (ppkt 4.2) | 10 ml |5-procentowy (w/obj) kwas borowy | 15 ml |0,5-procentowy roztwór błękitu metylenowego w etanolu | 4 ml |Woda destylowana - dopełnić do objętości | 1000 ml |Przed użyciem doprowadzić odczyn do 5,84.2. Bufor fosforanowy, pH 5,5Diwodorofosforan potasu KH2PO4 (cz.d.a.) | 130,86 g |Wodorofosforan sodu Na2HPO4· 2H2O (cz.d.a.) | 6,947 g |Woda destylowana - dopełnić do objętości | 1000 ml |4.3. Bufor fosforanowy, pH 5,5, rozcieńczony 1:104.4. Bufor fosforanowy, pH 8Diwodorofosforan potasu KH2PO4 (cz.d.a.) | 1,407 g |Wodorofosforan sodu Na2HPO4 · 2H2O (cz.d.a.) | 57,539 g |Woda destylowana - dopełnić do objętości | 1000 ml |4.5. Sterylny roztwór soli fizjologicznej4.6. 20-procentowy etanol4.7. 0,1 N kwas solny4.8. 70-procentowy (obj/obj) formamid: przygotować bezpośrednio przed użyciem. Doprowadzić do pH 4,5 stosując 2N kwas siarkowy4.9. Mieszanina czystego acetonu, wody i kwasu solnego (d: 1,19) w stosunku objętościowym 65:33:24.10. Mieszanina czystego metanolu, kwasu solnego (d: 1,19) w stosunku objętościowym 98:24.11. Substancje podstawowe: CTC, OTC i TC, których aktywność wyrażona jest w chlorowodorku5. Roztwory wzorcowe5.1. ChlorotetracyklinaUżywając kwasu solnego (ppkt 4.7), przygotować z roztworu wzorcowego (ppkt 4.11) roztwór podstawowy o stężeniu chlorotetracykliny-HCl odpowiadającym 500 μg na ml. Roztwór można przechowywać w lodówce przez tydzień.Z roztworu podstawowego przygotować wzorcowy roztwór roboczy S8 o stężeniu chlorotetracykliny-HCl odpowiadającym 0,2 μg na ml. Rozcieńczać, używając roztworu buforowego o pH 5,5, rozcieńczonego 1:10 (ppkt 4.3), do którego dodano 0,01 % czerń amidową [3].Używając buforu (ppkt 4.3) przygotować kolejne roztwory o następujących stężeniach:S4 | 0,1 | μg/ml |S2 | 0,05 | μg/ml |S1 | 0,025 | μg/ml |5.2. OksytetracyklinaPostępować tak samo, jak w ppkt 5.1. Przygotować z roztworu podstawowego o stężeniu oksytetracykliny-HCl odpowiadającym 400 μg na ml wzorcowy roztwór roboczy S8 zawierający 1,6 μg/ml oksytetracykliny-HCl oraz kolejne roztwory o następujących stężeniach:S4 | 0,8 | μg/ml |S2 | 0,4 | μg/ml |S1 | 0,2 | μg/ml |5.3. TetracyklinaPostępować tak samo, jak w ppkt 5.1. Przygotować z roztworu podstawowego o stężeniu tetracykliny-HCl odpowiadającym 500 μg na ml roztwór roboczy S8 zawierający 1,0 μg/ml tetracykliny-HCl oraz kolejne roztwory o następujących stężeniach:S4 | 0,5 | μg/ml |S2 | 0,25 | μg/ml |S1 | 0,125 | μg/ml |6. Ekstrakcja6.1. Zawartość równa 50 ppm lub mniejszaDo badanej próbki dodać formamid (ppkt 4.8) w ilości podanej w tabeli znajdującej się poniżej. Wytrząsać przez 30 minut na platformie wytrząsającej i natychmiast rozcieńczyć buforem fosforanowym (ppkt 4.3) zgodnie ze wskazówkami podanymi w tabeli poniżej, aby otrzymać stężenie U8. Stężenie formamidu w tym roztworze nie może przekraczać 40 %.Wirować lub dekantować dla otrzymania przejrzystego roztworu. Używając buforu fosforanowego (ppkt 4.3), przygotować stężenia U4, U2 i U1 przez stopniowe rozcieńczanie (1 + 1).Antybiotyk | CTC | OTC | TC || | | | | |Przypuszczalna zawartość w ppm | 10 | 50 | 10 | 50 | 10 | 50 |Pobranie próbki w g | 10 | 10 | 24 | 9,6 | 20 | 10 |Formamid w ml (ppkt 4.8) | 100 | 100 | 80 | 100 | 80 | 100 |bufor fosforanowy w ml | rozcieńczonyw stosunku 1:5 [4] | rozcieńczonyw stosunku 1:25 [5] | 70 | 200 | 120 | rozcieńczonyw stosunku 1:5 [4] |Stężenie U8 w μg/ml | 0,2 | 0,2 | 1,6 | 1,6 | 1,0 | 1,0 |6.2. Zawartość wyższa niż 50 ppm6.2.1. ChlorotetracyklinaDo badanej próbki o wadze 2–10 g, w zależności od przewidywanej zawartości antybiotyku lub ilości podanej przez producenta analizowanej substancji, dodać w stosunku do jej objętości 20 razy tyle mieszaniny (ppkt 4.9). Wytrząsać przez 30 minut na platformie wytrząsającej. W czasie ekstrakcji pH musi być niższe niż 3. Jeśli okaże się to niezbędne, doprowadzić roztwór do pożądanego odczynu (używając 10-procentowego kwasu octowego). Z roztworu pobrać część ekstraktu i doprowadzić pH do 5,5, używając buforu o pH 8 (ppkt 4.4). Jako wskaźnik zastosować zieleń bromokrezolową (zmiana barwy z żółtej na niebieską). Aby otrzymać stężenie U8 (ppkt 6.1) rozcieńczyć, używając buforu fosforanowego o pH 5,5, rozcieńczonego w stosunku 1:10 (ppkt 4.3).Następnie używając buforu fosforanowego (ppkt 4.3), przygotować roztwory U4, U2 i U1 przez stopniowe rozcieńczanie (1 + 1).6.2.2. Oksytetracyklina i tetracyklinaPostępować jak opisano w ppkt 6.2.1, używając mieszaniny (ppkt 4.10) zamiast mieszaniny (ppkt 4.9)7. Metoda oznaczania7.1. Szczepienie pożywkiSzczepić odżywkę (ppkt 4.1) zawiesiną zarodników (ppkt 3.2) w temperaturze 50–60 °C.7.2. Przygotowanie tacekDyfuzja w agarze odbywa się na tackach z użyciem czterech stężeń roztworu wzorcowego (S8, S4, S2, S1) i czterech stężeń ekstraktu badanej próbki (U8, U4, U2, U1). Na każdej tacce muszą znaleźć się cztery stężenia roztworu wzorcowego i ekstraktu.Należy wybrać tacki, które będą wystarczająco duże, aby zmieściło się na nich przynajmniej 8 otworów o średnicy 10–13 mm, wykonanych w agarze. Obliczyć ilość zaszczepionej pożywki (ppkt 7.1) potrzebną do jednolitego pokrycia tacki warstwą o grubości około 2 mm. Badanie najlepiej prowadzić na tackach złożonych ze szklanych płytek zaopatrzonych w idealnie dopasowany aluminiowy lub plastikowy pierścień o średnicy 200 mm i wysokości 20 mm.Odpipetować do każdego otworu dokładnie odmierzoną ilość (między 0,10 a 0,15 ml) roztworu antybiotyku, w zależności od średnicy otworu.Dla każdej próbki powtarzać dyfuzję przynajmniej 4 razy z każdym ze stężeń, tak aby każde oznaczenie było wypadkową wyników uzyskanych z 32 stref inhibicji.7.3. InkubacjaInkubować tacki przez około 18 godzin w temperaturze 28–30 °C.8. OcenaZmierzyć średnicę każdej ze stref inhibicji, najlepiej metodą rzutowania. Nanieść wyniki na papier półlogarytmiczny, zaznaczając na układzie współrzędnych logarytmy kolejnych stężeń i odpowiadające im średnice strefy inhibicji. Wyznaczyć krzywe dla roztworu wzorcowego i dla ekstraktu. Krzywe nie powinny w żadnym punkcie stykać się ze sobą, muszą przebiegać równolegle.Logarytm aktywności względnej oblicza się stosując następujący wzór:· 0,602U+ U+ S+ S-U-U-S-S2Aktywność rzeczywista = aktywność przypuszczalna x aktywność względna.9. PowtarzalnośćRóżnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń przeprowadzonych dla tej samej próbki nie może przekraczać 10 % w wartości względnej.B. TURBIDYMETRIA1. Cel i zakresMetoda ta pozwala na oznaczenie poziomów chlorotetracykliny (CTC), oksytetracykliny (OTC) i tetracykliny (TC), kiedy stężenia tych antybiotyków przekraczają 1g/kg i nie występują substancje, których obecność mogłaby wpłynąć na odczyt wyników. Metoda ta jest szybsza niż wcześniej opisana dyfuzja w agarze.2. ZasadaOznaczanie zawartości CTC odbywa się na drodze ekstrakcji z użyciem mieszaniny acetonu, wody i kwasu solnego. Oznaczenie zawartości OTC i TC odbywa się poprzez ekstrakcję z użyciem mieszaniny metanolu i kwasu solnego.Ekstrakty są następnie rozcieńczane, a obecność antybiotyków oznaczana jest przez pomiar transmitancji światła pożywki, która została zaszczepiona bakteriami gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus) i do której dodano antybiotyk. Wartość transmitancji światła zależy od stężenia antybiotyku.3. Drobnoustroje: gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus) K 141 [6]3.1. Szczep macierzystyZaszczepić S. aureus na pożywce (ppkt 4.1), do której dodano 1,5 %-3 % agaru (w zależności od jakości), umieszczonej w skośnie ustawionej probówce. Inkubować przez noc w temperaturze około 37 °C. Przechowywać w lodówce. Ponownie szczepić agar co 4 tygodnie. W tym samym czasie przygotować podkultury do użytku laboratoryjnego.3.2. Przygotowanie zawiesiny do szczepienia24 godziny przed użyciem zaszczepić ponownie agar podkulturą i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Zawiesić wszystkie kultury znajdujące się w probówce z agarem w 2 ml pożywki (ppkt 4.1), a następnie przenieść zawiesinę w sterylnych warunkach do około 100 ml tej samej pożywki (ppkt 4.1). Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, dopóki wzrost szczepów nie wejdzie w fazę logarytmiczną (godzina 30 minut do dwóch godzin)4. Pożywka i odczynniki4.1. Pożywka podstawowa do oznaczeń [7]Pepton | 5 g |Wyciąg drożdżowy | 1,5 g |Wyciąg mięsny | 1,5 g |Chlorek sodu | 3,5 g |Glukoza | 1,0 g |Diwodorofosforan potasu KH2PO4 (cz.d.a.) | 1,32 g |Wodorofosforan potasu K2HPO4 (cz.d.a.) | 3,68 g |Woda destylowana - do dopełnienia do objętości | 1000 ml |Odczyn po sterylizacji: 6,8–7,04.2. Bufor fosforanowy, pH 4,5Diwodorofosforan potasu KH2PO4 (cz.d.a.) | 13,6 g |Woda destylowana - do uzupełnienia do objętości | 1000 ml |4.3. 0,1 N kwas solny4.4. Mieszanina czystego acetonu, wody i kwasu solnego (d: 1,19) w stosunku objętościowym 65/33/24.5. Mieszanina czystego metanolu i kwasu solnego (d: 1,19) w stosunku objętościowym 98/24.6. Okołodziesięcioprocentowy (w/obj) roztwór formaldehydu4.7. Substancje podstawowe: CTC, OTC, TC, których aktywność wyrażona jest w chlorowodorku.5. Roztwory wzorcoweUżywając kwasu solnego (ppkt 4.3), przygotować z substancji podstawowych (ppkt 4.7) roztwór podstawowy o stężeniach CTC-HCl, OTC-HCl i TC-HCl odpowiadających 400 μg do 500 μg na ml. Roztwór można przechowywać w lodówce do tygodnia.6. Ekstrakcja6.1. ChlorotetracyklinaUmieścić 1 g do 2 g badanej substancji w kolbie pomiarowej o pojemności 200 ml lub 250 ml. Dodać około 100 ml mieszaniny (ppkt 4.4) i wytrząsać przez 30 minut na platformie wytrząsającej. Dopełnić do kreski buforem fosforanowym o pH 4,5 (ppkt 4.2). Wymieszać i odstawić.6.2. Oksytetracyklina i tetracyklinaUmieścić 1 g do 2 g badanej substancji w kolbie pomiarowej o pojemności 200 ml lub 250 ml. Dodać około 100 ml mieszaniny (ppkt 4.5) i wytrząsać przez 30 minut na platformie wytrząsającej. Dopełnić do kreski buforem fosforanowym o pH 4,5 (ppkt 4.2). Wymieszać i odstawić.7. Oznaczenie metody7.1. Przygotowanie serii wzorców i ekstraktuRozcieńczyć roztwór wzorcowy (pkt 5) i ekstrakt (pkt 6) buforem fosforanowym o pH 4,5 (ppkt 4.2) dla otrzymania serii stężeń. Dla każdego oznaczenia wyznaczyć krzywą wzorcową z odpowiedniego stężenia, korzystając z przynajmniej dwóch wartości powiązanych z ekstraktem. Rozcieńczenia powinny zostać dobrane w zależności od warunków, w których rosną bakterie. Warunki te mogą zmieniać się w zależności od laboratorium. Ogólny sposób postępowania przedstawia się następująco:7.1.1. ChlorotetracyklinaRozcieńczyć roztwór wzorcowy (pkt 5) buforem fosforanowym (ppkt 4.2), aby otrzymać roztwór roboczy o stężeniu CTC-HCl odpowiadającym 0,2 μg na mg. Następnie, używając buforu fosforanowego (ppkt 4.2), przygotować w probówkach 6 rozcieńczeń, każde w dwóch powtórzeniach.Roztwór wzorcowy roboczy w ml | Bufor fosforanowy w ml (ppkt 4.2) | Stężenie w CTT – HCl (μg/ml) |0,7 | 0,3 | 0,14 |0,6 | 0,4 | 0,12 |0,55 | 0,45 | 0,11 |0,45 | 0,55 | 0,09 |0,4 | 0,6 | 0,08 |0,3 | 0,7 | 0,06 |Rozcieńczyć ekstrakt (ppkt 6.1) buforem fosforanowym (ppkt 4.2) do otrzymania zakładanego stężenia CTC-HCl wynoszącego 0,12 μg/ml. Po 1 ml tego roztworu umieścić w dwóch probówkach. W kolejnych dwóch probówkach umieścić 0,75 ml (= 0,09 μg) roztworu. Dopełnić je buforem fosforanowym (ppkt 4.2) do całkowitej objętości 1 ml.7.1.2. Oksytetracyklina i tetracyklinaRozcieńczyć roztwór wzorcowy (pkt 5) buforem fosforanowym (ppkt 4.2), aby otrzymać roztwór roboczy o stężeniu OTC-HCl i TC-HCl odpowiadającym 0,6 μg na mg. Następnie, używając buforu fosforanowego (ppkt 4.2), przygotować w probówkach 7 rozcieńczeń, każde w dwóch powtórzeniach.Roztwór wzorcowy roboczy w ml | Bufor fosforanowy w ml (ppkt 4.2) | Stężenie w CTT – HCl (μg/ml) |0,9 | 0,1 | 0,54 |0,8 | 0,2 | 0,48 |0,7 | 0,3 | 0,42 |0,6 | 0,4 | 0,36 |0,4 | 0,6 | 0,24 |0,3 | 0,7 | 0,18 |0,2 | 0,8 | 0,12 |Rozcieńczyć ekstrakt (ppkt 6.2) buforem fosforanowym (ppkt 4.2) do otrzymania zakładanego stężenia OTC-HCl lub TC-HCl wynoszącego 0,48 μg/ml. Po 1 ml tego roztworu umieścić w dwóch probówkach. W kolejnych dwóch probówkach umieścić 0,5 ml (= 0,24 μg) roztworu. Dopełnić je buforem fosforanowym (ppkt 4.2) do całkowitej objętości 1 ml.7.2. Zaszczepienie pożywkiZaszczepić pożywkę podstawową do wykonywania oznaczeń (ppkt 4.1) zawiesiną (ppkt 3.2), tak aby transmitancja światła mierzona przy długości fali 590 nm wynosiła 85 % dla kuwety 5 cm lub 92 % dla kuwety 2 cm. Ustawić aparat tak, aby transmitancja niezaszczepionej pożywki wynosiła 100 %.7.3. PosiewUmieścić po 9 ml zaszczepionej pożywki (ppkt 7.2) w każdej probówce (ppkt 7.1.1 lub 7.1.2). Przy napełnianiu probówek należy pracować w czystości, choć sterylne warunki nie są wymagane.7.4. InkubacjaInkubację należy prowadzić w łaźni wodnej z mieszadłem, utrzymującym temperaturę na stałym poziomie 37 ± 0,1 °C. Czas inkubacji (2,5 godziny do 3 godzin) powinien być tak dobrany, aby możliwe było wykreślenie krzywych transmitancji nadających się do wykonania dokładnego pomiaru. Zatrzymać wzrost bakterii, szybko wstrzykując po 1 ml formaldehydu (ppkt 4.6) do każdej probówki.7.5. Pomiar wzrostuDokonać pomiaru transmitancji przy długości fali 590 nm. Fotometr wyskalować w taki sposób, aby transmitancja najbardziej przejrzystego roztworu wzorcowego wynosiła 100 % (co odpowiada najwyższemu stężeniu antybiotyków). Ponieważ różne probówki wykazują niewielkie różnice zmętnienia, należy korzystać z kuwet 2 cm, a najlepiej 5 cm.8. Obliczenie wynikówNa papierze milimetrowym wyznaczyć krzywą wzorcową, nanosząc na układzie współrzędnych stężenia antybiotyku i odpowiadające im wartości transmitancji. Nanieść na krzywą wartości transmitancji ekstraktu. Wyznaczyć zawartość antybiotyku w próbce.9. PowtarzalnośćRóżnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń przeprowadzonych dla tej samej próbki nie może przekraczać 10 % wartościach względnych.3. OZNACZENIE OLEANDOMYCYNY— przez dyfuzję w agarze —1. Cel i zakresTa metoda pozwala na oznaczenie, nawet w obecności tetracyklin, zawartości oleandomycyny w paszach, koncentratach i premiksach, przy jej zawartości wyższej niż 0,5 ppm.2. ZasadaPróbka jest poddana ekstrakcji roztworem hydroksymetyloaminometanu w metanolu. Po odwirowaniu ekstrakt zostaje rozcieńczony, a aktywność oleandomycyny oznaczona na drodze dyfuzji w pożywce agarowej zaszczepionej bakterią B. cereus. O procesie dyfuzji informuje powstanie stref inhibicji w pożywce zawierającej drobnoustroje. Średnica stref inhibicji jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyku.3. Drobnoustroje: B. cereus K 250 TR [8] odporne na tetracykliny3.1. Szczep macierzystyZaszczepić B. cereus na agarze z pożywką (ppkt 4.1), do której dodano oksytetracykliny w ilości 100 μg na 5 ml pożywki, umieszczonym w skośnie ustawionej probówce. Inkubować przez noc w temperaturze około 30 °C. Przechowywać w lodówce. Ponownie zaszczepiać agar co 4 tygodnie.3.2. Przygotowanie zawiesiny zarodnikówZebrać kolonie bakterii z agaru (ppkt 3.1), używając 3 ml roztworu soli fizjologicznej (ppkt 4.3). Tą zawiesiną zaszczepić 300 ml pożywki (ppkt 4.1) zmieszanej z agarem (stężenie agaru 3 %-4 %) i umieszczonej w kolbie Roux. Inkubować przez 3–5 dni w temperaturze 28–30 °C. Po sprawdzeniu zarodnikowania pod mikroskopem, zebrać zarodniki do 15 ml etanolu (ppkt 4.4). Zawiesinę wymieszać. Można przechowywać ją w lodówce przez 5 miesięcy lub dłużej.Przeprowadzić wstępne badania na płytkach z pożywką do oznaczeń (ppkt 4.2). Pozwolą one na ustalenie ilości zawiesiny zarodników niezbędnej do zaszczepienia która, dla różnych stężeń antybiotyku, da największą możliwą strefę inhibicji. Ilość zawiesiny wynosi zwykle 0,1–0,2 ml na 1000 ml. Pożywkę należy zaszczepiać zarodnikami w temperaturze 60 °C.4. Pożywka i odczynniki4.1. Pożywka dla szczepu macierzystego [9]Glukoza | 1 g |Pepton trypsynowy | 10 g |Ekstrakt mięsny | 1,5 g |Ekstrakt drożdżowy | 3 g |Agar - w zależności od jakości | 10 g do 20 g |Woda destylowana do uzupełnienia objętości do | 1000 ml |Przed użyciem doprowadzić pH do wartości 6,54.2. Podstawowa pożywka do oznaczeń [10]Pożywka (ppkt 4.1) o odczynie doprowadzonym do 8,84.3. Sterylny roztwór soli fizjologicznej4.4. 20-procentowy (obj/obj) etanol4.5. Czysty metanol4.6. 0,5-procentowy (w/obj) roztwór hydroksymetyloaminometanu (cz.d.a.)4.7. Roztwór do ekstrakcjiCzysty metanol | 50 ml |Woda destylowana | 50 ml |Hydroksymetyloaminometan (cz.d.a.) | 0,5 g |4.8. Roztwór wzorcowy: oleandomycyna o znanej aktywności5. Roztwór wzorcowyRozpuścić pewną ilość wzorca (ppkt 4.8) w 5 ml metanolu (ppkt 4.5) i rozcieńczyć roztworem (ppkt 4.6) do otrzymania stężenia oleandomycyny wynoszącego 100 μg/ml.Z otrzymanego roztworu podstawowego przygotować roztwór roboczy S8 zawierający 0,1 μg oleandomycyny na ml, rozcieńczając roztworem (ppkt 4.6). Następnie, używając roztworu (ppkt 4.6), przygotować kolejne roztwory (1 + 1) o następujących stężeniach:S4 | 0,05 | μg/ml |S2 | 0,025 | μg/ml |S1 | 0,0125 | μg/ml |6. EkstrakcjaW zależności od przewidywanej zawartości oleandomycyny przygotować próbkę o masie od 2 g do 10 g. Dodać 100 ml roztworu (ppkt 4.7) i wytrząsać przez 30 minut na platformie wytrząsającej.Odwirować. Pobrać część cieczy sklarowanej nad osadem i rozcieńczyć go roztworem (ppkt 4.6) dla otrzymania przypuszczalnego stężenia oleandomycyny wynoszącego 0,1 μg/ml (U8). Następnie przygotować stężenia U4, U2 i U1, przez stopniowe rozcieńczanie (1 + 1) roztworem (ppkt 4.6).7. Metoda oznaczania7.1. Szczepienie pożywkiSzczepić pożywkę do oznaczeń (ppkt 4.2) zawiesiną zarodników (ppkt 3.2) w temperaturze 60 °C.7.2. Przygotowanie tacekDyfuzja w agarze odbywa się na tackach z użyciem czterech stężeń roztworu wzorcowego (S8, S4, S2, S1) i czterech stężeń ekstraktu badanej próbki (U8, U4, U2, U1). Na każdej tacce muszą znaleźć się cztery stężenia roztworu wzorcowego i ekstraktu.Należy wybrać tacki, które będą wystarczająco duże, aby zmieściło się na nich przynajmniej 8 otworów o średnicy 10–13 mm wykonanych w agarze. Obliczyć ilość zaszczepionej pożywki (ppkt 7.1) potrzebną do jednolitego pokrycia tacki warstwą o grubości około 2 mm. Badanie najlepiej prowadzić na tackach złożonych ze szklanych płytek zaopatrzonych w idealnie dopasowany aluminiowy lub plastikowy pierścień o średnicy 200 mm i wysokości 20 mm.Odpipetować do każdego otworu dokładnie odmierzoną ilość (między 0,10 ml a 0,15 ml) roztworu antybiotyku, w zależności od średnicy otworu.Dla każdej próbki powtarzać dyfuzję przynajmniej 4 razy z każdym ze stężeń, tak aby każde oznaczenie było wypadkową wyników uzyskanych z 32 stref inhibicji.7.3. InkubacjaInkubować tacki przez około 18 godzin w temperaturze 28–30 °C.8. OcenaZmierzyć średnicę każdej ze stref inhibicji, najlepiej metodą rzutowania. Nanieść wyniki na papier półlogarytmiczny, zaznaczając na układzie współrzędnych logarytmy kolejnych stężeń i odpowiadające im średnice strefy inhibicji. Wyznaczyć krzywe dla roztworu wzorcowego i dla ekstraktu. Krzywe nie powinny w żadnym punkcie stykać się ze sobą, muszą przebiegać równolegle.Logarytm aktywności względnej oblicza się stosując następujący wzór:· 0,602U+ U+ S+ S-U-U-S-S2Aktywność rzeczywista = aktywność przypuszczalna x aktywność względna.9. PowtarzalnośćRóżnica między wynikami dwóch równoległych pomiarów przeprowadzonych dla tej samej próbki nie może przekraczać 10 % w wartości względnej.4. OZNACZENIE TYLOZYNY— przez dyfuzję w agarze —1. Cel i zakresMetoda ta pozwala na oznaczenie zawartości tylozyny w paszach, koncentratach i premiksach, przy jej zawartości wyższej niż 2,0 ppm.2. ZasadaPróbka jest rozpuszczana w buforze fosforanowym o pH 8, ogrzanym do temperatury 80 °C, a następnie ekstrahowana metanolem i odwirowywana. Po odwirowaniu ekstrakt zostaje rozcieńczony, a aktywność tylozyny oznaczona na drodze dyfuzji w pożywce agarowej zaszczepionej bakterią Sarcina lutea. O procesie dyfuzji informuje powstanie stref inhibicji w pożywce zawierającej drobnoustroje. Średnica stref inhibicji jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyku.3. Drobnoustroje: Sarcina lutea ATTC nr 93413.1. Szczep macierzystyZaszczepić Sarcina lutea na agarze z pożywką (ppkt 4.1), w skośnie ustawionej probówce i doprowadzonego do pH 7,0. Inkubować przez noc w temperaturze około 35 °C. Przechowywać w lodówce. Ponownie szczepić agar co miesiąc.3.2. Przygotowanie zawiesiny bakteriiZebrać kolonie bakterii z ostatnio szczepionego agaru (ppkt 3.1), używając 2 ml-3 ml roztworu soli fizjologicznej (ppkt 4.4). Tą zawiesiną zaszczepić 250 ml pożywki (ppkt 4.1) umieszczonej w kolbie Roux i doprowadzonej do pH 7,0. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 35 °C. Następnie zebrać bakterie do 25 ml roztworu soli fizjologicznej (ppkt 4.4). Wymieszać i rozcieńczyć do uzyskania roztworu wykazującego transmitancję światła 75 % przy długości fali 650 nm.Zawiesina przechowywana w lodówce zachowuje trwałość przez okres jednego tygodnia.Przeprowadzić wstępne badania na płytkach z pożywką (ppkt 4.1). Pozwolą one na ustalenie ilości zawiesiny bakterii niezbędnej do zaszczepienia pożywki do oznaczeń, która, dla różnych stężeń antybiotyku, da największą możliwą strefę inhibicji. Pożywkę należy szczepić zarodnikami w temperaturze 48–50 °C.4. Pożywka i odczynniki4.1. Pożywka podstawowa dla oznaczeń [11]Glukoza | 1 g |Pepton trypsynowy | 10 g |Ekstrakt mięsny | 1,5 g |Ekstrakt drożdżowy | 3 g |Agar - w zależności od jakości | 10 g do 20 g |Woda destylowana do uzupełnienia objętości do | 1000 ml |Przed użyciem doprowadzić pH do wartości 7,0, co jest potrzebne do przygotowania szczepu macierzystego i zawiesiny bakterii. Pożywka przeznaczona do przeprowadzenia oznaczenia musi mieć odczyn wynoszący 8,0.4.2. Bufor fosforanowy, pH 8Diwodorofosforan potasu KH2PO4 (cz.d.a.) | 0,523 g |Wodorofosforan potasu K2HPO4 (cz.d.a.) | 16,730 g |Woda destylowana - dopełnić do objętości | 1000 ml |4.3. Bufor fosforanowy, pH 7Diwodorofosforan potasu KH2PO4 (cz.d.a.) | 5,5 g |Wodorofosforan potasu K2HPO4 (cz.d.a.) | 13,6 g |Woda destylowana - dopełnić do objętości | 1000 ml |4.4. Sterylny roztwór soli fizjologicznej4.5. Czysty metanol4.6. 40-procentowy (obj/obj) roztwór metanolu4.7. Mieszanina buforu fosforanowego (ppkt 4.2) i czystego metanolu, w stosunku objętościowym 60/404.8. Substancja podstawowa: tylozyna o znanej aktywności5. Roztwory wzorcoweSuszyć substancję podstawową (ppkt 4.8) przez 3 godziny w temperaturze 60 °C w piecu próżniowym (ciśnienie 5 mm słupa rtęci). Odważyć do kolby pomiarowej 10–50 mg. Rozpuścić w 5 ml metanolu (ppkt 4.5) i dopełnić buforem fosforanowym o pH 7 (ppkt 4.3) do takiej objętości, aby otrzymać roztwór o stężeniu tylozyny wynoszącym 1000 μg/ml.Z otrzymanego roztworu podstawowego przygotować roztwór roboczy S8 zawierający 2,0 μg tylozyny/ml, rozcieńczając roztworem (ppkt 4.7).Następnie, używając roztworu (ppkt 4.7), przygotować kolejne roztwory (1 + 1) o następujących stężeniach:S4 | 1,0 | μg/ml |S2 | 0,5 | μg/ml |S1 | 0,25 | μg/ml |6. EkstrakcjaW przypadku koncentratu przygotować próbkę o wadzie 10 g, w przypadku premiksu lub paszy - masa próbki powinna wynosić 20 g. Dodać 60 ml buforu fosforanowego o pH 8,0 (ppkt 4.2), ogrzanego do temperatury 80 °C i mieszać przez 2 minuty (używając kuchennego miksera lub innego, podobnego urządzenia).Po wymieszaniu pozostawić na 10 minut. Dodać 40 ml metanolu (ppkt 4.5) i mieszać kolejne 5 minut. Zawiesinę odwirować i część cieczy sklarowanej nad osadem rozcieńczyć mieszaniną (ppkt 4.7) w celu otrzymania przypuszczalnego stężenia tylozyny wynoszącego 2,0 μg/ml (U8). Następnie przygotować stężenia U4, U2 i U1, przez stopniowe rozcieńczanie (1 + 1) roztworem (ppkt 4.7).Dla stężeń niższych niż 10 ppm całkowicie odparować ekstrakt na wyparce obrotowej w temperaturze 35 °C, a następnie rozpuścić pozostałości w 40-procentowym metanolu (ppkt 4.6)7. Metoda oznaczania7.1. Szczepienie pożywkiSzczepić pożywkę do oznaczeń (ppkt 4.1), doprowadzoną do pH 8, zawiesiną bakterii (ppkt 3.2) w temperaturze 48–50 °C.7.2. Przygotowanie tacekDyfuzja w agarze odbywa się na tackach z użyciem czterech stężeń roztworu wzorcowego (S8, S4, S2, S1) i czterech stężeń ekstraktu badanej próbki (U8, U4, U2, U1). Na każdej tacce muszą znaleźć się 4 stężenia roztworu wzorcowego i ekstraktu.Należy wybrać tacki, które będą wystarczająco duże, aby zmieściło się na nich przynajmniej 8 otworów o średnicy 10–13 mm wykonanych w agarze. Obliczyć ilość zaszczepionej pożywki (ppkt 7.1) potrzebną do jednolitego pokrycia tacki warstwą o grubości około 2 mm. Badanie najlepiej prowadzić na tackach złożonych ze szklanych płytek zaopatrzonych w idealnie dopasowany aluminiowy lub plastikowy pierścień o średnicy 200 mm i wysokości 20 mm.Odpipetować do każdego otworu dokładnie odmierzoną ilość (między 0,10 ml a 0,15 ml) roztworu antybiotyku, w zależności od średnicy otworu.Dla każdej próbki powtarzać dyfuzję przynajmniej 4 razy z każdym ze stężeń, tak aby każde oznaczenie było wypadkową wyników uzyskanych z 32 stref inhibicji.7.3. InkubacjaInkubować tacki przez noc w temperaturze 35–37 °C.8. OcenaZmierzyć średnicę każdej ze stref inhibicji, najlepiej metodą rzutowania. Nanieść wyniki na papier półlogarytmiczny, zaznaczając na układzie współrzędnych logarytmy stężeń i odpowiadające im średnice stref inhibicji. Wyznaczyć linie dla roztworu wzorcowego i dla ekstraktu. Linie nie powinny w żadnym punkcie stykać się ze sobą, muszą przebiegać równolegle.Logarytm aktywności względnej oblicza się stosując następujący wzór:· 0,602U+ U+ S+ S-U-U-S-S2Aktywność rzeczywista = aktywność przypuszczalna x aktywność względna.9. PowtarzalnośćRóżnica między wynikami dwóch równoległych pomiarów przeprowadzonych dla tej samej próbki nie może przekraczać 10 % w wartości względnej.5. OZNACZENIE WIRGINIAMYCYNYprzez dyfuzję w agarze -1. Cel i zakresMetoda ta pozwala na oznaczenie zawartości wirginiamycyny w paszach, koncentratach i premiksach, przy jej zawartości wyższej niż 2,0 ppm.2. ZasadaPróbka jest ekstrahowana roztworem "TWEEN 80" w metanolu. Po odwirowaniu i filtrowaniu ekstrakt zostaje rozcieńczony, a aktywność wirginiamycyny oznaczona na drodze dyfuzji w pożywce agarowej zaszczepionej bakterią Sarcina lutea. O procesie dyfuzji informuje powstanie stref inhibicji w pożywce zawierającej drobnoustroje. Średnica stref inhibicji jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyku.3. Drobnoustroje: Sarcina lutea ATTC nr 93413.1. Szczep macierzystyZaszczepić Sarcina lutea na agarze z pożywką (ppkt 4.1), w skośnie ustawionej probówce. Inkubować przez noc w temperaturze około 35 °C. Przechowywać w lodówce. Ponownie zaszczepiać agar co 14 dni.3.2. Przygotowanie zawiesiny bakteriiZebrać kolonie bakterii z ostatnio szczepionego agaru (ppkt 3.1) używając 2–3 ml roztworu soli fizjologicznej (ppkt 4.3). Tą zawiesiną zaszczepić 250 ml pożywki (ppkt 4.1) umieszczonej w kolbie Roux. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 35 °C. Następnie zebrać bakterie do 25 ml roztworu soli fizjologicznej (ppkt 4.3) i wymieszać rozcieńczyć do uzyskania roztworu wykazującego transmitancję światła 75 % przy długości fali 650 nm. Zawiesina przechowywana w lodówce zachowuje trwałość przez okres jednego tygodnia.Przeprowadzić wstępne badania na płytkach z pożywką (ppkt 4.1). Pozwolą one na ustalenie ilości zawiesiny bakterii niezbędnej do zaszczepienia pożywki do oznaczeń która, dla różnych stężeń antybiotyku, da największą możliwą strefę inhibicji. Pożywkę należy zaszczepiać zarodnikami w temperaturze 48–50 °C.4. Pożywka i odczynniki4.1. Pożywka podstawowa dla oznaczeń [12]Glukoza | 1 g |Pepton trypsynowy | 10 g |Ekstrakt mięsny | 1,5 g |Ekstrakt drożdżowy | 3 g |Agar - w zależności od jakości | 10 g do 20 g |Woda destylowana do uzupełnienia objętości do | 1000 ml |Przed użyciem doprowadzić pH do wartości 6,54.2. Bufor fosforanowy, pH 6,0Diwodorofosforan potasu KH2PO4 (cz.d.a.) | 8,0 g |Wodorofosforan potasu K2HPO4 (cz.d.a.) | 2,0 g |Woda destylowana - dopełnić do objętości | 1000 ml |4.3. Sterylny roztwór soli fizjologicznej4.4. Czysty metanol4.5. Mieszanina buforu fosforanowego (ppkt 4.2) i czystego metanolu, w stosunku objętościowym 80/204.6. 0,5 % (w/obj) roztwór "TWEEN 80" w metanolu4.7. Substancja podstawowa: wirginiamycyna o znanej aktywności5. Roztwory wzorcoweRozpuścić substancję wzorcową (ppkt 4.7) w metanolu, aby otrzymać roztwór o stężeniu wirginiamycyny wynoszącym 800 μg/ml. Z otrzymanego roztworu podstawowego przygotować roztwór roboczy S8 zawierający 1,0 μg wirginiamycyny/ml, rozcieńczając roztworem (ppkt 4.5). Następnie, używając roztworu (ppkt 4.5), przygotować kolejne roztwory (1 + 1) o następujących stężeniach:S4 | 0,5 | μg/ml |S2 | 0,25 | μg/ml |S1 | 0,125 | μg/ml |6. Ekstrakcja6.1. Produkty o stężeniu wirginiamycyny do 50 ppmOdważyć 10–20 g badanej substancji. Dodać do odważki 100 ml roztworu (ppkt 4.6) i wytrząsać 30 minut na platformie wytrząsającej. Odwirować lub filtrować. Pobrać 20 ml klarownego roztworu (cieczy sklarowanej nad osadem lub filtratu) i odparować na wyparce obrotowej do całkowitego wyschnięcia. Pozostałości rozpuścić w 20 ml lub więcej mieszaniny (ppkt 4.5), w celu otrzymania przypuszczalnego stężenia wirginiamycyny wynoszącego 1 μg/ml (U8). Następnie przygotować stężenia U4, U2, i U1, przez stopniowe rozcieńczanie (1 + 1) roztworem (ppkt 4.5).6.2. Produkty o stężeniu wirginiamycyny wyższym niż 50 ppmOdważyć 1–10 g badanej substancji. Dodać do odważki 100 ml roztworu (ppkt 4.6) i wytrząsać 30 minut na platformie wytrząsającej. Odwirować lub filtrować. Rozcieńczyć mieszaniną (ppkt 4.5), w celu otrzymania przypuszczalnego stężenia wirginiamycyny wynoszącego 1 μg/ml (U8). Następnie przygotować stężenia U4, U2, i U1, jak opisano w ppkt 6.1.7. Metoda oznaczania7.1. Szczepienie pożywkiSzczepić pożywkę do oznaczeń (ppkt 4.1) zawiesiną bakterii (ppkt 3.2) w temperaturze 48–50 °C.7.2. Przygotowanie tacekDyfuzja w agarze odbywa się na tackach z użyciem czterech stężeń roztworu wzorcowego (S8, S4, S2, S1) i czterech stężeń ekstraktu badanej próbki (U8, U4, U2, U1). Na każdej tacce muszą znaleźć się cztery stężenia roztworu wzorcowego i ekstraktu.Należy wybrać tacki, które będą wystarczająco duże, aby zmieściło się na nich przynajmniej 8 otworów o średnicy 10–13 mm wykonanych w agarze. Obliczyć ilość zaszczepionej pożywki (ppkt 7.1) potrzebną do jednolitego pokrycia tacki warstwą o grubości około 2 mm. Badanie najlepiej prowadzić na tackach złożonych ze szklanych płytek zaopatrzonych w idealnie dopasowany aluminiowy lub plastikowy pierścień o średnicy 200 mm i wysokości 20 mm.Odpipetować do każdego otworu dokładnie odmierzoną ilość (między 0,10 ml a 0,15 ml) roztworu antybiotyku, w zależności od średnicy otworu.Dla każdej próbki powtarzać dyfuzję przynajmniej 4 razy z każdym ze stężeń, tak aby każde oznaczenie było wypadkową wyników uzyskanych z 32 stref inhibicji7.3. InkubacjaInkubować tacki przez 18 godzin w temperaturze 28–30 °C.8. OcenaZmierzyć średnicę każdej ze stref inhibicji, najlepiej metodą rzutowania. Nanieść wyniki na papier półlogarytmiczny, zaznaczając na układzie współrzędnych logarytmy kolejnych stężeń i odpowiadające im średnice stref inhibicji. Wyznaczyć krzywe dla roztworu wzorcowego i dla ekstraktu. Krzywe nie powinny w żadnym punkcie stykać się ze sobą, muszą przebiegać równolegle.Logarytm aktywności względnej oblicza się stosując następujący wzór:· 0,602U+ U+ S+ S-U-U-S-S2Aktywność rzeczywista = aktywność przypuszczalna x aktywność względna.9. PowtarzalnośćRóżnica między wynikami dwóch równoległych pomiarów przeprowadzonych dla tej samej próbki nie może przekraczać 10 % w wartościach względnych.[1] Do oznaczeń można wykorzystać każdy rodzaj pożywki dostępny w handlu, pozwalający na uzyskanie takich samych wyników.[2] Do oznaczeń można wykorzystać każdy rodzaj pożywki dostępny w handlu, pozwalający na uzyskanie takich samych wyników.[3] Czerni amidowej używa się, aby strefy inhibicji roztworów wzorcowych były lepiej widoczne (błękitne pierścienie).[6] Ten szczep, wyizolowany przez Lufę i Kiela, namnaża się znacznie szybciej niż S. aureus ATTC 6538 P.[7] Do oznaczeń można wykorzystać każdy rodzaj pożywki dostępny w handlu, pozwalający na uzyskanie takich samych wyników.[8] Szczep wyizolowany przez Lufę i Kiela.[9] Do oznaczeń można wykorzystać każdy rodzaj pożywki dostępny w handlu, pozwalający na uzyskanie takich samych wyników.[10] Do oznaczeń można wykorzystać każdy rodzaj pożywki dostępny w handlu, pozwalający na uzyskanie takich samych wyników.[11] Szczep wyizolowany przez Lufę i Kiela.[12] Do oznaczeń można wykorzystać każdy rodzaj pożywki dostępny w handlu, pozwalający na uzyskanie takich samych wyników.--------------------------------------------------