CELEX: 31992L0095
Language: el
Date: 1992-11-09 00:00:00
Title: Οδηγία 92/95/ΕΟΚ της Επιτροπής της 9ης Νοεμβρίου 1992 για τροποποίηση του παραρτήματος της έβδομης οδηγίας 76/372/ΕΟΚ περί καθορισμού κοινοτικών μεθόδων ανάλυσης για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών

Avis juridique important

|

31992L0095

Οδηγία 92/95/ΕΟΚ της Επιτροπής της 9ης Νοεμβρίου 1992 για τροποποίηση του παραρτήματος της έβδομης οδηγίας 76/372/ΕΟΚ περί καθορισμού κοινοτικών μεθόδων ανάλυσης για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών  

Επίσημη Εφημερίδα αριθ. L 327 της 13/11/1992 σ. 0054 - 0062 Φινλανδική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 3 τόμος 45 σ. 0182  Σουηδική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 3 τόμος 45 σ. 0182 

ΟΔΗΓΙΑ 92/95/ΕΟΚ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ  της 9ης Νοεμβρίου 1992  για τροποποίηση του παραρτήματος της έβδομης οδηγίας 76/372/ΕΟΚ περί καθορισμού κοινοτικών μεθόδων ανάλυσης για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφώνΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,   Έχοντας υπόψη:  τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινότητας,  την οδηγία του Συμβουλίου 70/373/ΕΟΚ της 20ής Ιουλίου 1970 περί καθορισμού τρόπων δειγματοληψίας και κοινοτικών μεθόδων ανάλυσης για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών (1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία με τις πράξεις προσχώρησης του Βασιλείου της Ισπανίας  και της Πορτογαλικής Δημοκρατίας, και ιδίως το άρθρο 2,  Εκτιμώντας:  ότι στην έβδομη οδηγία 76/372/ΕΟΚ της 1ης Μαρτίου 1976 περί καθορισμού κοινοτικών μεθόδων ανάλυσης για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών (2), όπως τροποποιήθηκε από την οδηγία 81/680/ΕΟΚ (3), περιγράφονται οι μέθοδοι προσδιορισμού της αφλατοξίνης Β1-  ότι οι μέθοδοι αυτές πρέπει να παρακολουθούν την εξέλιξη των επιστημονικών και τεχνικών γνώσεων- ότι πρέπει κυρίως να επινοηθεί μέθοδος διά της οποίας να είναι δυνατόν να ελέγχονται τα ελάχιστα όρια αφλατοξίνης Β1 τα καθοριζόμενα στην οδηγία του  Συμβουλίου 74/63/ΕΟΚ της 17ης Δεκεμβρίου 1973 περί καθορισμού των ανωτάτων ορίων περιεκτικότητας για τις ανεπιθύμητες ουσίες και προϊόντα στις ζωοτροφές (4), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την οδηγία 91/132/ΕΟΚ (5)-  ότι πρέπει ακόμη να επινοηθεί μέθοδος διά της οποίας να είναι δυνατόν να προσδιορίζεται η αφλατοξίνη Β1 παρουσία παρεμβαλλομένων ουσιών οι οποίες παρεμποδίζουν τον προσδιορισμό (π.χ. πούλπα εσπεριδοειδών)-  ότι τα προβλεπόμενα στην παρούσα οδηγία μέτρα είναι σύμφωνα με τη γνώμη της Μόνιμης Επιτροπής Ζωοτροφών,  ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΟΔΗΓΙΑ:  Άρθρο 1  Το παράρτημα της οδηγίας 76/372/ΕΟΚ τροποποιείται σύμφωνα με το παράρτημα της παρούσας οδηγίας.  Άρθρο 2  Το αργότερο έως την 1η Οκτωβρίου 1993, τα κράτη μέλη θέτουν σε ισχύ τις νομοθετικές, κανονικές και διοικητικές διάταξεις που είναι αναγκαίες για τη συμμόρφωση προς τις διατάξεις της παρούσας οδηγίας, και ενημερώνουν αμέσως την Επιτροπή σχετικά.   Κατά τη θέσπισή τους ή κατά την επίσημη δημοσίευσή τους, οι εν λόγω διατάξεις συνοδεύονται από την παραπομπή προς την παρούσα οδηγία. Τα της παραπομπής αυτής θεσπίζονται από τα κράτη μέλη.  Άρθρο 3  Η παρούσα οδηγία απευθύνεται προς τα κράτη μέλη. Βρυξέλλες, 9 Νοεμβρίου 1992. Για την Επιτροπή  Ray MAC SHARRY  Μέλος της Επιτροπής   (1) ΕΕ αριθ. L 170 της 3. 8. 1970, σ. 2. (2) ΕΕ αριθ. L 102 της 15. 4. 1976, σ. 8. (3) ΕΕ αριθ. L 246 της 29. 8. 1981, σ. 32. (4) ΕΕ αριθ. L 38 της 11. 2. 1974, σ. 31. (5) ΕΕ αριθ. L 66 της 13. 3. 1991, σ. 16.    ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ  Ι. Το κείμενο του σημείου 1 "Σκοπός και αντικείμενο" υπό το μέρος Α "Μέθοδος με μονοδιάστατη χρωματογραφία λεπτής στοιβάδος" αντικαθίσταται από το ακόλουθο κείμενο:  "1. Σκοπός και αντικείμενο  Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό του επιπέδου της αφλατοξίνης Β1 σε πρώτες ύλες και απλές ζωοτροφές. Η μέθοδος αυτή δεν μπορεί να εφαρμοστεί στην παρουσία στεμφύλων εσπεριδοειδών. Το κατώτερο όριο προσδιορισμού είναι 0,01 mg/kg (10 ppb).  Εφόσον υπάρχουν παρεμβαλλόμενες ουσίες οι οποίες παρεμποδίζουν τον προσδιορισμό, η ανάλυση επαναλαμβάνεται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Β (υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης)."  ΙΙ. Κάτω από το μέρος Β: "Δισδιάστατη χρωματογραφία λεπτής στοιβάδος" το κείμενο αντικαθίσταται από το ακόλουθο:  "Β. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΦΛΑΤΟΞΙΝΗΣ Β1. ΜΕΘΟΔΟΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ   1.  Σκοπός και αντικείμενο   Η μέθοδος αυτή είναι για τον προσδιορισμό αφλατοξίνης Β1 σε ζωοτροφές, συμπεριλαμβανομένων αυτών που περιέχουν στέμφυλα εσπεριδοειδών. Το κατώτερο όριο προσδιορισμού είναι 0,001 mg/kg (1 ppb).  2.  Αρχή   Το δείγμα  εκχυλίζεται με χλωροφόρμιο. Το εκχύλισμα διηθείται και μία υποπολλαπλάσια δόση καθαρίζεται μέσα στο φυσίγγιο Florisil, και ακολούθως μέσα από ένα φυσίγγιο C18. Ο τελικός διαχωρισμός και προσδιορισμός επιτυγχάνεται με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης  (HPLC) χρησιμοποιώντας μία C18 στήλη αντεστραμμένης φάσης, ακολουθούμενος από δημιουργία, μετά τη στήλη, παραγώγων με ιώδιο σε ύδωρ και ανίχνευση φθορισμού.   Σημείωση:   Οι μυκοτοξίνες είναι εξαιρετικά τοξικές ουσίες. Οι χειρισμοί πρέπει να εκτελούνται  σε ένα καθορισμένο απαγωγό. Ειδικές προφυλάξεις πρέπει να λαμβάνονται όταν οι τοξίνες ευρίσκονται σε ξηρή μορφή λόγω της ηλεκτροστατικής τους φύσης και της τάσης τους να διασκορπίζονται στους χώρους εργασίας.  3.  Αντιδραστήρια  3.1.  Χλωροφόρμιο,  σταθεροποιημένο με 0,5 έως 1,0 % κατά μάζα αιθανόλης. Βλέπε παρατήρηση 10.2.  3.2.  Μεθανόλη, βαθμού HPLC, για την παρασκευή του 3.6.  3.3.  Ακετόνη.  3.4.  Ακετονιτρίλιο, βαθμοί HPLC.  3.5.  Διαλύτες έκλουσης: παρασκευάζονται μία ημέρα πριν τη χρήση ή  απομακρύνεται ο αέρας από τους διαλύτες με υπερήχους.  3.5.1.  Μείγμα ακετόνης (3.3) και ύδατος, 98+2 (v+v).  3.5.2.  Μείγμα ύδατος και μεθανόλης (3.2), 80+20 (v+v).  3.5.3.  Μείγμα ύδατος και ακετόνης (3.3), 85+15 (v+v).  3.6.  Κινητή φάση για HPLC.    Μείγμα ύδατος μεθανόλης (3.2) και ακετονιτριλίου (3.4), 130+70+40 (v+v+v).   Σημείωση: Η σύνθεση των διαλυτών της κινητής φάσης ίσως χρειασθεί ρύθμιση εξαρτώμενη από τα χαρακτηριστικά της χρησιμοποιούμενης στήλης HPLC.  3.7.  Κορεσμένο διάλυμα ιωδίου:  Προστίθενται 2 g ιωδίου σε 400 ml ύδατος. Αναμειγνύονται επί τουλάχιστον 90 λεπτά και διηθούνται μέσα από ηθμό μεμβράνης (4.15). Το κορεσμένο διάλυμα προφυλάσσεται από το φως για να αποφευχθεί φωτοαποσύνθεση.  3.8.  Celite 545 εκπλυθέν με οξύ, ή  ισοδύναμο.  3.9.  Φυσίγγιο Florisil (Waters SEP-PAK), ή ισοδύναμο.  3.10.  Φυσίγγιο C18 (Waters SEP-PAK), ή ένα ισοδύναμο.  3.11.  Αδρανές αέριο παραδείγματος χάρη άζωτο.  3.12.  Πρότυπο διάλυμα αφλατοξίνης Β1 σε χλωροφόρμιο, συγκέντρωσης 10 μg/ml. Η  συγκέντρωση του διαλύματος ελέγχεται ως εξής: Προσδιορίζεται με το φασματοφωτόμετρο (4.23) το φάσμα απορρόφησης του ανωτέρω διαλύματος μεταξύ 330 και 370 nm. Μετράται η απορρόφηση (Α) στο μέγιστο πλησίον των 363 nm. Η συγκέντρωση αφλατοξίνης Β1 σε  μικρογραμμάρια ανά χιλιοστόλιτρο διαλύματος υπολογίζεται από τη σχέση:  Συγκέντρωση (μg/ml) =  312 x Α x 1 000   22 300  = 13,991 x Α  3.12.1.  Μητρικό πρότυπο διάλυμα αφλατοξίνης Β1 σε χλωροφόρμιο.   2,5 ml του προτύπου διαλύματος αφλατοξίνης Β1 (3.12) μεταφέρονται ποσοτικά σε ογκομετρική φιάλη των 50 ml και ο όγκος συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με χλωροφόρμιο  (3.1). Το διάλυμα αυτό διατηρείται σε δροσερό μέρος (4 oC) στο σκοτάδι, καλά σφραγισμένο και τυλιγμένο σε αλουμινόχαρτο.  3.13.  Βαθμονομικά διαλύματα αφλατοξίνης Β1 για HPLC.   Σημείωση: Προς παρασκευή αυτών των διαλυμάτων χρησιμοποιούνται γυάλινα  σκεύη εκπλυθέντα με οξύ (βλέπε 4, όργανα).  3.13.1.  Διάλυμα βαθμονόμησης 4 ng/ml.   Η ογκομετρική φιάλη με μητρικό διάλυμα (3.12.1), αφήνεται να ζεσταθεί σε θερμοκρασία δωματίου μέσα στο αλουμινόχαρτο (λίγες ώρες). Μεταφέρονται 400 μl του μητρικού  διαλύματος (200 ng αφλατοξίνης Β1) μέσα σε ογκομετρική φιάλη των 50 ml, και το διάλυμα εξατμίζεται μέχρι ξηρού σε ρεύμα αδρανούς αερίου (3.11).   Το αποκτηθέν ίζημα διαλύεται σε περίπου 20 ml νερού/ακετόνης (3.5.3), ο όγκος συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή  με νερό/ακετόνη (3.5.3) και αναμιγνύεται καλά.  3.13.2.  Διάλυμα βαθμονόμησης 3 ng/ml.   Αραιώνονται 7,5 ml του διαλύματος βαθμονόμησης των 4 ng/ml (3.13.1) στα 10 ml με μείγμα ύδατος ακετόνης (3.5.3), και αναμιγνύονται καλά.  3.13.3.  Διάλυμα  βαθμονόμησης 2 ng/ml.   Μεταφέρονται ποσοτικά 25 ml του διαλύματος βαθμονόμησης (3.13.1) σε μια ογκομετρική φιάλη των 50 ml, συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με μείγμα ύδατος/ακετόνης (3.5.3) και αναμειγνύονται καλά.   Το διάλυμα αυτό επίσης  χρησιμοποιείται για επαναλαμβανόμενη έγχυση κατά τη διάρκεια της HPLC, και αναφέρεται περαιτέρω ως το πρότυπο αναφοράς.  3.13.4.  Διάλυμα βαθμονόμησης 1 ng/ml.   Μεταφέρονται ποσοτικά 2,5 ml του διαλύματος βαθμονόμησης των 4 ng/ml (3.13.1) σε μια  ογκομετρική φιάλη των 10 ml, συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με μείγμα ύδατος/ακετόνης (3.5.3), και αναμειγνύονται καλά.  3.14.  Φιαλίδιο περιέχον μείγμα αλφατοξινών Β1, Β2, G1 και G2, συγκεντρώσεων, κατά προσέγγιση, 1, 0,5, 1 και 0,5 μg/ml, αντίστοιχα,  σε 1 ml χλωροφόρμιου.  3.14.1.  Δοκιμαστικό διάλυμα χρωματογραφίας.   Το περιεχόμενο του φιαλιδίου (3.14) μεταφέρονται μέσα σε δοκιμαστικό σωλήνα με γυάλινο πώμα ή φιαλίδιο με βιδωτό πώμα. Μεταφέρονται 40 μl του διαλύματος αυτού μέσα ή σε δοκιμαστικό  σωλήνα με γυάλινο πώμα (4.22) (εκπλυθέντα με οξύ). Το χλωροφόρμιο εξατμίζεται σε ρεύμα αδρανούς αερίου (3.11) και ακολουθεί επαναδιάλυση σε 10 ml μείγματος ύδατος/ακετόνης (3.5.3).  3.15.  Αντιδραστήρια για δοκιμή επιβεβαίωσης (6).  3.15.1.  Κορεσμένο  διάλυμα NaCl.  3.15.2.  Θειικό νάτριο, άνυδρο, κοκκώδες.  4.  Όργανα   Προσοχή: Η χρήση γυάλινων σκευών, μη εκπλυθέντων με οξύ, για υδατικά διαλύματα αφλατοξίνης, μπορεί να προκαλέσει απώλεια αλφατοξινών. Πρέπει να λαμβάνεται ιδιαίτερη μέριμνα με τα  καινούργια γυάλινα σκεύη και γυάλινα σκεύη μιας χρήσεως, όπως αυτοδειγματοληπτικά φιαλίδια και σιφώνια Pasteur. Επομένως, εργαστηριακός εξοπλισμός ερχόμενος σε επαφή με υδατικά διαλύματα αφλατοξινών πρέπει να βυθίζεται σε αραιό οξύ (π.χ. θειικό οξύ, 2  mol/l) επί αρκετές ώρες, μετά να εκπλύεται καλά με απεσταγμένο νερό για να απομακρυνθούν όλα τα ίχνη οξέος (π.χ. τρεις φορές, έλεγχος με πεχαμετρικό χάρτη). Πρακτικά, αυτή η μεταχείριση απαιτείται για τη φιάλη στρογγυλού πυθμένα (4.4), τις ογκομετρικές  φιάλες, ογκομετρικούς κυλίνδρους, φιαλίδια ή σωλήνες που χρησιμοποιούνται για διαλύματα βαθμονόμησης και τελικά εκχυλίσματα (κυρίως φιαλίδια αυτόματου δειγματολίπτη) και σιφώνια Pasteur εάν αυτά χρησιμοποιούνται για μεταφορά διαλυμάτων βαθμονόμησης ή  εκχυλισμάτων.  4.1.  Μύλος άλεσης - αναμείκτης.  4.2.  Κόσκινο μεγέθους ανοίγματος 1,0 mm (ISO R 565).  4.3.  Μηχανικός αναδευτήρας.  4.4.  Περιστροφικός εξατμιστής κενού, εξοπλισμένος με φιάλη στρογγυλού πυθμένα των 150 έως 250 ml.  4.5.  Υγρός  χρωματογράφος υψηλής απόδοσης, εγχυτής με βρόγχο κατάλληλο για την έγχυση 250 μl. Βλέπε οδηγίες κατασκευαστού για μερική ή ολική πλήρωση βρόγχου.  4.6.  Αναλυτική στήλη HPLC, γέμιση C18 των 3 μm ή 5 μm.  4.7.  Αντλία απηλλαγμένη παλμών για τροφοδοσία  του αντιδραστήριου ιωδίου μετά τη στήλη.  4.8.  Valco μηδενικού όγκου Τ, ανοξείδωτου χάλυβα (1/16" x0,75 mm).  4.9.  Σπείραμα αντίδρασης τεφλόν ή ανοξείδωτος χάλυβας. Οι διαστάσεις 3 000 x 0,5 mm έως 5 000 x 0,5 mm έχουν βρεθεί να είναι κατάληλες σε  συνδυασμό με στήλες HPLC των 5 μm ή 3 μm.  4.10.  Θερμοστατικά ελεγχόμενο υδρόλουτρο, ρυθμισμένο στους 60o C, ικανό για ρύθμιση της θερμοκρασίας με ακρίβεια καλύτερη του 0,1o C.  4.11.  Ανιχνευτής φθορισμού, ικανός να δίνει μήκη κύματος διέγερσης στα  365 nm περίπου και εκπομπής στα 435 nm (Για όργανο διήθησης: μήκος κύματος εκπομής > 400 nm). Πρέπει να είναι δυνατή ανίχνευση τουλάχιστον 0,05 ng αλφατοξίνης Β1. Μπορεί να συσταθεί κάποια οπίσθια πίεση (παραδείγματος χάρη περιοριστής ή σπείραμα από  τεφλόν ή ανοξείδωτου χάλυβα, συνδεδεμένο με την εξαγωγή του ανιχνευτή), προς καταστολή φυσαλίδων αέρα στην κυψελίδα ροής.  4.12.  Καταγραφέας ταινίας χάρτου.  4.13.  Ηλεκτρονικός ολοκληρωτής (προαιρετικός).  4.14.  Πτυχωτός διηθητικός χάρτης 24 cm,  Macherey-Nagel 617 1/4 ή ισοδύναμος.  4.15.  Ηθμός μεμβράνης Millipore με μέγεθος πόρων 0,45 μm, Millipore HAWP. 04700 ή ισοδύναμος.  4.16.  Κωνική φιάλη των 500 ml, με γυάλινο πώμα.  4.17.  Γυάλινη στήλη (εσωτερική διάμετρος περίπου 1 cm, μήκους  περίπου 30 cm) εξοπλισμένη με άκρη Luer.  4.18.  Στρόφιγγα Luer ανθεκτική στο χλωροφόρμιο (παραδείγματος χάρη Bio-rad 7328017, Analytichem A1 6078, J. T. Baker 4514 ή ισοδύναμη).  4.19.  Χημικοανθεκτική σύριγγα, Luer 10 ml σύνδεσμος.  4.20.  Σύριγγα  κατάλληλη για HPLC ένεση 250 μl (βλέπε 4.5).  4.21.  Μικροσύριγγα των 100 μl για παρασκευή των διαλυμάτων βαθμονόμησης (ελέγχεται ώστε η ακρίβεια να είναι εντός του 2 %, κατά τη ζύγιση).  4.22.  Βαθμονομημένοι υάλινοι σωλήνες των 10 ml, με γυάλινο πώμα.   4.23.  Φασματοφωτόμετρο, κατάλληλο για μετρήσεις στην υπεριώδη περιοχή του φάσματος.  4.24.  Εξοπλισμός για δοκιμή επιβεβαίωσης (6).  4.24.1.  Χοάνη διαχωρισμού των 100 ml, εκπλυθείσα με οξύ, στρόφιγγα από τεφλόν.  4.24.2.  Συγκρότημα θέρμανσης στους  40-50o C.  5.  Εκτέλεση  5.1.  Προετοιμασία του δείγματος   Το δείγμα αλέθεται έτσι ώστε να περνά μέσα από το κόσκινο (4.2).  5.2.  Αναλυτική δόση   Ζυγίζονται 50,0 g του προετοιμασμένου δείγματος προς ανάλυση μέσα στην κωνική φιάλη (4.16).  5.3.   Εκχύλιση   Προστίθενται 25 g Celite (3.8), 250 ml χλωροφόρμιου (3.1) και 25 ml νερού. Η φιάλη πωματίζεται και ανακινείται επί 30 λεπτά σε μηχανικό αναδευτήρα (4.3). Γίνεται διήθηση μέσα από πτυχωτό διηθητικό χάρτη (4.14). Συλλέγονται 50 ml του  διηθήματος. Εάν είναι απαραίτητο, λαμβάνεται ένα ορισμένο μέρος του διηθήματος και αραιώνεται στα 50 ml με χλωροφόρμιο, ώστε η συγκέντρωση της αφλατοξίνης Β1 να μη είναι μεγαλύτερη από 4 ng/ml.  5.4.  Καθαρισμός (η διαδικασία πρέπει να εκτελείται χωρίς  σημαντικές διακοπές).   Προσοχή:   - Το εργαστήριο, στο οποίο γίνονται οι αναλύσεις, να προστατεύεται επαρκώς από το φυσικό φως. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί αποτελεσματικά χρησιμοποιώντας:  (1) Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. and Paulsch, W.E. (1991). Food Additives and Contaminants 8, 17-29.  (2) ISO 3534-1977.  (3) ΕΕ αριθ. L 351 της 2. 12. 1989, σ. 39.     1) απορροφητικό φύλλο για το υπεριώδες πάνω στα παράθυρα σε συνδυασμό με χαμηλό φωτισμό (όχι άμεσο ηλιακό φως),   2) κουρτίνες ή στορ σε συνδυασμό με τεχνητό φως (είναι αποδεκτοί σωλήνες φθορισμού)-   - πρέπει να προστατεύονται όσο το δυνατόν  περισσότερο από το φως διαλύματα περιέχοντα αφλατοξίνη (φύλαξη στο σκοτάδι, χρήση αλουμινόχαρτου).  5.4.1.  Καθαρισμός μέσα από Florisil SEP-PAK  5.4.1.1.  Προετοιμασία της διάταξης στήλης-φυσίγγιου   Προσαρμόζεται στρόφιγγα (4.18) στο βραχύτερο  στέλεχος φυσίγγιου Florisil (3.9) (βλέπε σχήμα 1). Το φυσίγγιο εκπλύεται και απομακρύνεται ο αέρας λαμβάνοντας 10 ml χλωροφόρμιου (3.1) και διοχετεύοντας ταχέως 8 ml χλωροφόρμιου από τη στρόφιγγα μέσα από το φυσίγγιο με μία σύριγγα (4.19). Προσαρμόζεται  το μακρύτερο στέλεχος του φυσίγγιου σε γυάλινη στήλη (4.17) και διοχετεύονται τα εναπομένοντα 2 ml χλωροφόρμιου μέσα από το φυσίγγιο στη στήλη. Κλείνεται η στρόφιγγα. Απομακρύνεται η σύριγγα.  5.4.1.2.  Καθαρισμός   Το συλλεχθέν στην 5.3 διήθημα  προστίθεται στη διάταξη στήλης-φυσίγγιου και αποστραγγίζεται με την επίδραση της βαρύτητας. Εκπλύεται με 5 ml χλωροφόρμιου (3.1), ακολουθούμενα από 20 ml μεθανόλης (3.2). Τα εκπλύματα απορρίπτονται. Κατά τη διάρκεια αυτών των ενεργειών, εξασφαλίζεται  ότι δεν θα στεγνώσει η διάταξη στήλης-φυσίγγιου.   Η αφλατοξίνη Β1 εκλούεται με 40 ml του μείγματος ακετόνης/ύδατος (3.5.1), και το σύνολο του εκλούσματος συλλέγεται στη φιάλη στρογγυλού πυθμένα των 150 ml του περιστρεφόμενου εξατμιστή (4.4). Το  έκλουσμα συμπυκνώνεται επί του περιστρεφόμενου εξατμιστή στους 40-50 oC, έως ότου σταματήσει να αποστάζεται η ακετόνη (προσοχή: περίπου 0,5 ml υγρού παραμένουν στη φιάλη στο σημείο αυτό. Πειράματα έχουν δείξει ότι περαιτέρω εξάτμιση δεν βλάπτει και ότι  όταν απομένουν 0,5 ml υγρού, δεν υπάρχει σημαντική ποσότητα ακετόνης. Υπολείμματα ακετόνης μπορεί να οδηγήσουν σε απώλειες Β1 στο φυσίγγιο C18). Προστίθεται 1 ml μεθανόλης (3.2), η φιάλη στροβιλίζεται για να διαλυθεί η αφλατοξίνη Β1 στα τοιχώματα της  φιάλης, προστίθενται 4 ml ύδατος και αναμειγνύονται. Αποσυνδέεται και απορρίπτεται η φύσιγγα. Η γυάλινη στήλη εκπλύεται με νερό και διατηρείται για το βήμα καθαρισμού μέσα από C18.  5.4.2.  Καθορισμός μέσα από C18 SEP-PAK  5.4.2.1.  Προετοιμασία της  διάταξης στήλης-φυσίγγιου   Προσαρμόζεται στρόφιγγα (4.18) στο βραχύτερο άκρο του φυσίγγιου C18 (3.10) (βλέπε σχήμα 1). Το φυσίγγιο γεμίζεται και τυχόν αέρας απομακρύνεται με ταχεία διοχέτευση 10 ml μεθανόλης (3.2) από τη στρόφιγγα μέσα από το φυσίγγιο  με μία σύριγγα (4.19) (φυσαλίδες αέρα μέσα από το φυσίγγιο φαίνονται σαν ανοικτόχρωμα σημάδια στο διαφορετικά φαιόχρωμο υπόβαθρο). Λαμβάνονται 10 ml ύδατος, και διοχετεύονται 8 ml μέσα από το φυσίγγιο. (Αποφεύγεται η εισαγωγή αέρα στο φυσίγγιο κατά την  αλλαγή από μεθανόλη σε νερό). Το μακρύτερο στέλεχος του φυσίγγιου προσαρμόζεται σε γυάλινη στήλη (4.17) και διοχετεύονται τα εναπομείναντα 2 ml ύδατος μέσα από το φυσίγγιο στη στήλη. Κλείνεται η στρόφιγγα. Απομακρύνεται η σύριγγα.  5.4.2.2.  Καθαρισμός    Το συλλεχθέν στην 5.4.1.2 εκχύλισμα μεταφέρεται ποσοτικά στη γυάλινη στήλη (4.17), εκπλύοντας τη φιάλη δύο φορές με 5 ml μείγματος νερού/μεθανόλης (3.5.2) και αποστραγγίζοντας με την επίδραση της βαρύτητας. Κατά τη διάρκεια αυτών των ενεργειών,  εξασφαλίζεται ότι δεν θα στεγνώσει η διάταξη στήλης-φυσίγγιου. (Όταν αναπτύσσονται φυσαλίδες αέρα στη σύσφιξη κοντά στο φυσίγγιο, διακόπτεται η ροή και πωματίζεται η κορυφή της γυάλινης στήλης, για να απομακρυνθούν οι φυσαλίδες αέρα. Μετά συνεχίζουμε).  Γίνεται έκλουση με 25 ml μείγματος ύδατος/μεθανόλης. Τα εκλούσματα απορρίπτονται. Η αφλατοξίνη Β1 εκλούεται με 50 ml ύδατος/ακετόνης (3.5.3) και το σύνολο του εκλούσματος συλλέγεται σε μία ογκομετρική φιάλη 50 ml. Ο όγκος συμπληρώνεται στα 50 ml ύδατος  και αναμειγνύεται: το προκύπτον αναλυτικό διάλυμα χρησιμοποιείται για χρωματογραφία (5.5).   Προσοχή: Κανονικά δεν χρειάζεται διήθηση του τελικού εκχυλίσματος πριν από HPLC. Εάν κριθεί απαραίτητο, δεν πρέπει να χρησιμοποιηθούν ηθμοί από κυτταρίνη,  επειδή μπορεί να οδηγήσουν σε απώλειες αφλατοξίνης Β1. Ηθμοί από teflon είναι αποδεκτοί.  5.5.  Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης   (Βλέπε σχήμα 2 συναρμολόγηση του οργάνου). Αφήνεται επαρκής χρόνος για προθέρμανση και σταθεροποίηση των οργάνων πριν  από τη χρήση.   Σημείωση 1:   Οι ταχύτητες ροής που δίνονται για την κινητή φάση και το αντιδραστήριο μετά τη στήλη είναι μόνο ενδεικτικές. Μπορεί να χρειαστεί να προσαρμοστούν ανάλογα με τα χαρακτηριστικά της στήλης HPLC .   Σημείωση 2:   Η απόκριση  του ανιχνευτή στην αφλατοξίνη εξαρτάται από τη θερμοκρασία, επομένως πρέπει να γίνεται διόρθωση για μετατόπιση (βλέπε σχήμα 3). Εγχέοντας μία προκαθορισμένη ποσότητα πρότυπου αναφοράς αφλατοξίνης Β1 (3.13.3), σε τακτικά διαστήματα (παραδείγματος χάρη  κάθε τρίτη έγχυση), οι τιμές κορυφής της αφλατοξίνης Β1 μεταξύ αυτών των πρότυπων αναφοράς μπορούν να διορθωθούν χρησιμοποιώντας τη μέση απόκριση, εφόσον η διαφορά μεταξύ των αποκρίσεων διαδοχικών πρότυπων αναφοράς είναι πολύ μικρή (<  10 %). Επομένως  οι εγχύσεις πρέπει να γίνονται χωρίς διακοπές. Εάν χρειάζεται διακοπή, η τελευταία έγχυση πριν από τη διακοπή και η πρώτη μετά τη διακοπή πρέπει να είναι το πρότυπο αναφοράς (3.13.3). Επειδή η καμπύλη βαθμονόμησης είναι γραμμική και διέρχεται μέσα από  την αρχή, οι ποσότητες αφλατοξίνης Β1 στα εκχυλίσματα του δείγματος προσδιορίζονται άμεσα με αναφορά στα παρακείμενα πρότυπα.  5.5.1.  Ρυθμίσεις αντλίας HPLC   Η αντλία HPLC (4.5) ρυθμίζεται να δίνει ροή 0,5 ή 0,3 ml/λεπτό για στήλη HPLC των 5μm ή των 3  μm (4.6) αντίστοιχα χρησιμοποιώντας κινητή φάση (3.6).  5.5.2.  Ρυθμίσεις αντλίας μετά τη στήλη   Η αντλία (4.7) ρυθμίζεται να δίνει ροή 0,2-0,4 ml/λεπτό του κορεσμένου υδατικού διαλύματος ιωδίου (3.7). Ως γενικός κανόνας: ροές περίπου 0,4 ή 0,2  ml/λεπτό συνιστώνται σε συνδυασμό με ροές 0,5 και 0,3 ml/λεπτό αντίστοιχα της κινητής φάσης (3.6).  5.5.3.  Ανιχνευτής φθορισμού   Ο ανιχνευτής φθορισμού (4.11) ρυθμίζεται σε διέγερση = 365 nm και εκπομπή = 435 nm (όργανο διήθησης: > 400 nm). Ο μειωτής  του ανιχνευτή ρυθμίζεται ώστε να αποκτά περίπου 80 % της πλήρους κλίμακας εκτροπής της γραφίδας του καταγραφέα για 1 ng αφλατοξίνης Β1.  5.5.4.  Εγχυτής   Για όλα τα διαλύματα, εγχέονται ποσότητες των 250 μl, ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή  του εγχυτήρα.  5.5.5.  Έλεγχος χρωματογραφικού διαχωρισμού   Εγχέεται το αρωματικό δοκιμαστικό διάλυμα (3.14.1). Οι κοιλότητες πρέπει να είναι λιγότερες από 5 % του συνόλου των υψών κορυφών των παρακειμένων κορυφών.  5.5.6.  Έλεγχος της σταθερότητας του  συστήματος   Πριν από κάθε σειρά αναλύσεων, εγχέεται επανειλημένα το πρότυπο αναφοράς (3.14.3), έως ότου επιτευχθούν σταθερές περιοχές κορυφών (Σημείωση: αποκρίσεις κορυφών για αφλατοξίνη Β1 μεταξύ διαδοχικών εγχύσεων πρέπει να διαφέρουν λιγότερο από 6  %). Προχωρούμε χωρίς καθυστέρηση στον έλεγχο της γραμμικότητας (5.5.7).  5.5.7.  Έλεγχος γραμμικότητας   Τα διαλύματα βαθμονόμησης αφλατοξίνης Β1 (3.13.1 έως 3.13.4) εγχέονται. Σε κάθε τρίτη έγχυση χρησιμοποιείται το πρότυπο αναφοράς (3.13.3), για  διόρθωση της μετατόπισης της απόκρισης (Σημείωση: αποκρίσεις κορυφών για το πρότυπο αναφοράς πρέπει να διαφέρουν λιγότερο από 10 % μέσα σε 90 λεπτά). Γίνεται διόρθωση για μετατόπιση σύμφωνα με τη σχέση στην 7. Το διάγραμμα βαθμονόμησης πρέπει να είναι  γραμμικό και να διέρχεται από την αρχή, με τυπικό σφάλμα 2Χ ως προς Υ. Οι ευρισκόμενες τιμές πρέπει να διαφέρουν λιγότερο από 3 % από τις ονομαστικές τιμές. Εάν εκπληρώνονται οι προϋποθέσεις, συνεχίζουμε χωρίς καθυστέρηση. Εάν όχι, πριν συνεχίσουμε  αναγνωρίζονται και διορθώνονται οι πηγές του προβλήματος.  5.5.8.  Έγχυση εκχυλισμάτων δείγματος   Εγχύονται τα καθαρισμένα εκχυλίσματα δείγματος (5.4.2.2). Μετά από κάθε δύο εκχυλίσματα δείγματος, επαναλαμβάνεται η έγχυση του πρότυπου αναφοράς (3.13.3)  σύμφωνα με την ακόλουθη σειρά: πρότυπο αναφοράς, εκχύλισμα, εκχύλισμα, πρότυπο αναφοράς, εκχύλισμα, εκχύλισμα, πρότυπο αναφοράς κ.λπ.  6.  Δοκιμή επιβεβαίωσης  6.1.  Περαιτέρω επεξεργασία του εκχυλίσματος (5.4.2.2)   Προστίθενται 5 ml διαλύματος NaCl  (3.15.1) στο τελικό εκχύλισμα που αποκτήθηκε στην 5.4.2.2. Γίνεται εκχύλιση τρεις φορές με 2 ml χλωροφόρμιου (3.1) επί ένα λεπτό, χρησιμοποιώντας τη χοάνη διαχωρισμού (4.24.1).   Το συλλεχθέν εκχύλισμα χλωροφόρμιου εκχύεται σε περίπου 1 g θειικού  νατρίου (3.15.2) μέσα σε δοκιμαστικό σωλήνα των 10 ml. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί μικρή χοάνη διαμέτρου 4 cm με κομμάτι ακατέργαστου βάμβακα στη σύσφιξη, καλυμμένο με περίπου 1 g θειικού νατρίου.   Η στοιβάδα του θειικού νατρίου εκπλύεται με λίγα ml  χλωροφόρμιου και συλλέγεται το έκπλυμα στον ίδιο δοκιμαστικό σωλήνα. Το εκχύλισμα χλωροφόρμιου εξατμίζεται μέχρι ξηρού στον ίδιο δοκιμαστικό σωλήνα χρησιμοποιώντας το συγκρότημα θέρμανσης (4.24.2) και επαναδιαλύουμε σε 1 ml χλωροφόρμιου.  6.2.   Παρασκευή παραγώγου και χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας   Βλέπε οδηγία 76/372/ΕΟΚ του Συμβουλίου παράρτημα, μέθοδος Α, σημείο 5.6.2.  7.  Υπολογισμός αποτελεσμάτων   Η περιεκτικότητα σε αφλατοξίνη Β1 (μg/kg) που υπάρχει στο δείγμα υπολογίζεται  χρησιμοποιώντας τη σχέση:  Περιεκτικότητα αφλατοξίνης Β1 σε μg/kg =  m x Ve x t   Vm x M x Vf  Vc  όπου:   m =  ποσότητα αφλατοξίνης Β1, σε ng, αντιπροσωπευόμενη από την κορυφή Β1 του δείγματος, υπολογιζόμενη ως εξής:    m =  P (δείγμα)   P (st1) + P (st2)  x 2 r (st)  P (δείγμα) =  εμβαδόν κορυφής αφλατοξίνης Β1 του δείγματος  P (st1) =  εμβαδόν κορυφής αφλατοξίνης Β1 στο προηγούμενο πρότυπο αναφοράς (3.13.3)  P (st2) =  εμβαδόν κορυφής αφλατοξίνης Β1 στο επόμενο πρότυπο αναφοράς  (3.13.3)  r (st) =  εγχυθείσα ποσότητα προτύπου αναφοράς (3.13.3) σε ng  Vm =  όγκος του εγχυθέντος εκχυλίσματος του δείγματος, σε ml  Ve x t =  τελικός όγκος εκχυλίσματος δείγματος, ml, λαμβάνοντας υπόψη κάθε αραίωση που έγινε (5.3)  Μ =  μάζα  δείγματος σε g  Vf =  όγκος διηθήματος μεταφερθέντος στο φυσίγγιο Florisil (5.4.1.2) σε ml  Vc =  ποσότητα χλωροφόρμιου που χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση του δείγματος, ml   Εάν η μέθοδος ακολουθήθηκε όπως σε αυτή την πρότυπη περιγραφή, η σχέση  μειώνεται στην:   Περιεκτικότητα σε αφλατοξίνη Β1, σε μg/kg = 20 x m.  7.1.  Οι υπολογισμοί των αποτελεσμάτων μπορεί να γίνουν επίσης με μέτρηση ύψους κορυφών.  8.  Επαναληπτικότητα   Βλέπε το σημείο 10.1.  9.  Αναπαραγωγικότητα   Βλέπε το σημείο 10.1.   10.  Παρατηρήσεις  10.1.  Ακρίβεια (Precision)   Μία μελέτη συνεργασίας, εκτελεσθείσα σε παγκόσμιο επίπεδο σε σύνθετες ζωοτροφές, έδωσε τα προαναφερόμενα στον πίνακα 1 αποτελέσματα (1) επαναληπτικότητας και αναπαραγωγιμότητας. Ο όρος επαναληπτικότητα  (r) χρησιμοποιούμενος εδώ ορίζεται ως ο υψηλότερος λόγος που δεν είναι σημαντικός σε επίπεδο πιθανότητας 95 %, για σύγκριση δύο μετρήσεων στο ίδιο δείγμα στο ίδιο εργαστήριο κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Ο όρος αναπαραγωγιμότητα (R) ορίζεται όμοια για  σύγκριση δύο διαφορετικών εργαστηρίων. Σύμφωνα με την ISO 3534-1977, 2.35 (2) και την απόφαση 89/610/ΕΟΚ της Επιτροπής (3), οι r και R δίνονται επίσης στον πίνακα 1 σε όρους συντελεστών διακύμανσης.   Πίνακας 1   Επαναληπτικότητα (r) και  αναπαραγωγιμότητα (R) εκφρασμένες ως λόγοι και αντίστοιχοι συντελεστές διακύμανσης   (15 εργαστήρια)        Teneur  r  R  CVr (*)  CVR (*)        (μg/kg)    (%)  (%)        8 & 14  1,4  1,7  11  18         (*) CV = συντελεστής διακύμανσης   10.2.   Σταθεροποίηση του χλωροφόρμιου (3.1)   Τα χαρακτηριστικά απορρόφησης του φυσιγγίου Florisil μπορεί να αλλάζουν εάν χρησιμοποιούνται σταθεροποιητές εκτός της ανθανόλης. Αυτό μπορεί να επαληθευτεί σύμφωνα με το σημείο 10.3 όπου το περιγραφόμενο  χλωροφόρμιο δεν είναι διαθέσιμο.  10.3.  Ακρίβεια (Exactitude)   Η ορθή εφαρμογή της μεθόδου πρέπει να πιστοποιείται παίρνοντας επαναλαμβανόμενες μετρήσεις σε πιστοποιημένα υλικά αναφοράς. Εάν αυτά δεν είναι διαθέσιμα, η απόδοση της μεθόδου πρέπει να  πιστοποιηθεί με πειράματα επαναπόκτησης σε λευκά δείγματα- η απόκλιση από το μέσο της πραγματικής τιμής, εκφρασμένη ως ποσοστό επί της πραγματικής τιμής, δεν πρέπει να κείται εκτός των ορίων του  20 % έως +10 %.   Σχήμα 1: Διάταξη στήλης-φυσιγγίου    1.  Κινητή φάση  2. Αντλία  3. Βαλβίδα έκχυσης  4. Στήλη ασφαλείας  5. Αναλυτική στήλη HPLC  6. Κορεσμένο διάλυμα ιωδίου  7. Αντλία αντιδραστηρίου  8. Σύνδεσμος Τ  9. Θερμοστατικά ελεγχόμενο λουτρό  10. Σπείραμα αντίδρασης  11. Ανιχνευτής φθορισμού  12. Περιοριστής  13. Απόρριμμα  14. Καταγραφέας/ολοκληρωτής ταινίας χάρτου   Σχήμα 2: Διάγραμμα ροής του συστήματος LC με δημιουργία παραγώγου με ιώδιο μετά τη στήλη   Απόκριση     Μέση τιμή παραπλήσιων  προτύπων διαλύματος αναφοράς        Χρόνος  Πρότυπο διάλυμα αναφοράς  Εκχύλισμα (ή βαθμονομητής)  Εκχύλισμα (ή βαθμονομητής)  Πρότυπο διάλυμα αναφοράς  Εκχύλισμα (ή βαθμονο- μητής)   Σχήμα 3: Διόρθωση για μετατόπιση απόκρισης αφλατοξίνης Β1 με έγχυση  πρότυπου αναφοράς (3.13.3) σε τακτικά διαστήματα"