CELEX: 31996D0240
Language: nl
Date: 1996-02-05 00:00:00
Title: 96/240/EG: Beschikking van de Commissie van 5 februari 1996 houdende wijziging van Beschikking 92/532/EEG tot vaststelling van de bemonsteringsschema's en de diagnostische methoden voor de opsporing en bevestiging van bepaalde visziekten (Voor de EER relevante tekst)

Avis juridique important

|

31996D0240

96/240/EG: Beschikking van de Commissie van 5 februari 1996 houdende wijziging van Beschikking 92/532/EEG tot vaststelling van de bemonsteringsschema's en de diagnostische methoden voor de opsporing en bevestiging van bepaalde visziekten (Voor de EER relevante tekst)  

Publicatieblad Nr. L 079 van 29/03/1996 blz. 0019 - 0028

BESCHIKKING VAN DE COMMISSIE van 5 februari 1996 houdende wijziging van Beschikking 92/532/EEG tot vaststelling van de bemonsteringsschema's en de diagnostische methoden voor de opsporing en bevestiging van bepaalde visziekten (Voor de EER relevante tekst) (96/240/EG) DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,Gelet op Richtlijn 91/67/EEG van de Raad van 28 januari 1991 inzake veterinairrechtelijke voorschriften voor het in de handel brengen van aquacultuurdieren en aquacultuurprodukten (1), laatstelijk gewijzigd bij Richtlijn 95/22/EG (2), en met name op artikel 15,Overwegende dat de bemonsteringsschema's en de diagnostische methoden voor de opsporing en bevestiging van bepaalde visziekten zijn vastgesteld bij Beschikking 92/532/EEG van de Commissie (3);Overwegende dat zich, sedert de vaststelling van die beschikking, op praktisch en op wetenschappelijk gebied bepaalde ontwikkelingen hebben voorgedaan ten gevolge waarvan de bemonsteringsschema's en de diagnostische methoden moeten worden aangepast;Overwegende dat die aanpassing betrekking heeft op de grootte van het monster, de te nemen monsters, het vervoer van de monsters en de methode voor isolatie van de eventueel in het monster aanwezige virussen;Overwegende dat het bij Besluit 81/651/EEG van de Commissie (4) ingestelde Wetenschappelijk Veterinair Comité is geraadpleegd;Overwegende dat de in deze beschikking vervatte maatregelen in overeenstemming zijn met het advies van het Permanent Veterinair Comité,HEEFT DE VOLGENDE BESCHIKKING GEGEVEN:Artikel 1 De bijlage bij Beschikking 92/532/EEG wordt vervangen door de bijlage bij deze beschikking.Artikel 2 Deze beschikking is gericht tot de Lid-Staten.Gedaan te Brussel, 5 februari 1996.Voor de CommissieFranz FISCHLERLid van de Commissie(1) PB nr. L 46 van 19. 2. 1991, blz. 1.(2) PB nr. L 243 van 11. 10. 1995, blz. 1.(3) PB nr. L 337 van 21. 11. 1992, blz. 18.(4) PB nr. L 233 van 19. 8. 1981, blz. 32.BIJLAGE DEEL I BEMONSTERINGS- EN TESTMETHODEN VOOR VHS- EN IHN-BEWAKING I. Bemonstering 1. BemonsteringsperiodeOp de bedrijven wordt ten minste tweemaal per jaar, namelijk in de periode van oktober tot en met juni of wanneer de watertemperatuur minder dan 14 °C bedraagt, een klinisch onderzoek verricht. Tussen twee onderzoeken moeten ten minste vier maanden verlopen. Alle produktie-eenheden (vijvers, tanks, aquaria, netkooien, enz.) worden onderzocht op de aanwezigheid van dode en zwakke vissen en van vissen met abnormaal gedrag. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de omgeving waar het water wegloopt (indien praktisch mogelijk) aangezien zwakke vissen meestal in die omgeving te vinden zijn wegens de stroming van het water.2. Selectie en verzameling van monsters30 tot 150 monsters van vis en/of ovariële vloeistof worden verzameld om te worden onderzocht overeenkomstig het bepaalde in tabel 1 A. Indien regenboogforel aanwezig is, moet het monster volledig uit die vissoort bestaan. Indien geen regenboogforel aanwezig is, moet het monster bestaan uit vissen van alle andere soorten die vatbaar zijn voor VHS en/of INH, volgens de lijst in bijlage A bij Richtlijn 91/67/EEG van de Raad inzake veterinairrechtelijke voorschriften voor het in de handel brengen van aquicultuurdieren en aquicultuurprodukten. De soorten moeten proportioneel in het monster vertegenwoordigd zijn. Tot halfweg de eerste controleperiode van vier jaar die voorafgaat aan het verwerven van de ziektevrije status, moet het monster bestaan uit 150 eenheden, teneinde te garanderen dat 95 % van alle virusdragers wordt opgespoord wanneer 2 % van de populatie drager is van het virus, behalve voor kwekerijen van zalmachtigen zonder ouderdieren in kustgebieden, waarvoor 30 monsters vereist zijn.In de laatste twee jaar van de controleperiode kan het aantal monsters tot 30 worden verminderd, teneinde te garanderen dat 95 % van alle virusdragers wordt opgespoord wanneer 10 % van de populatie drager is van het virus. In de daaropvolgende jaren (behoud van de ziektevrije status) kan eveneens worden volstaan met een uit 30 eenheden bestaand monster.Op een bedrijf waar aan de hand van bewijsstukken kan worden aangetoond dat het sedert ten minste vier jaar vrij is van VHS en INH (op basis van regelmatige officiële inspecties) mag voor de gehele duur van de eerste controleperiode van vier jaar met het kleinste monster worden gewerkt.Wanneer voor de visproduktie meer dan één waterbron wordt gebruikt, moet het monster, ongeacht of het 150 dan wel 30 eenheden telt, zo worden genomen dat alle waterbronnen vertegenwoordigd zijn. Wanneer de aanwezigheid wordt geconstateerd van zwakke vissen, vissen met abnormaal gedrag of pas gestorven vissen (nog niet in ontbinding), moeten bij voorkeur deze vissen in het monster worden opgenomen. Indien dergelijke vissen niet aanwezig zijn, moet het monster bestaan uit gezonde vissen met een normaal voorkomen en moet ervoor worden gezorgd dat alle onderdelen van het bedrijf en alle jaarklassen proportioneel in het monster vertegenwoordigd zijn.3. Voorbewerking en verzending van vismonstersVóór het vervoer naar het laboratorium worden bij de vissen met steriele scharen en pincetten stukjes weggenomen uit de te onderzoeken organen; deze stukjes worden in plastic buisjes gedaan die zijn gevuld met een transportmedium, d.i. een celkweekmedium met 10 % kalfsserum en antibiotica. Aanbevolen wordt een combinatie van 200 I. E. penicilline, 200 µg streptomycine en 200 µg kanamycine per ml, maar ook andere antibiotica die doeltreffend zijn gebleken, mogen worden gebruikt. Het te onderzoeken weefselmateriaal is afkomstig van de milt, de voornier en bovendien van het hart of de hersenen. In sommige gevallen moet ook ovariële vloeistof worden onderzocht (tabel 1).Ovariële vloeistof of stukjes organen van tien vissen (tabel 1) mogen tot een verzamelmonster worden samengebracht in één plastic buisje van 10 ml waarin zich 4 ml transportmedium bevindt. Ieder monster moet ten minste 0,5 g weefsel bevatten.De buisjes worden in geïsoleerde recipiënten (b.v. dikwandige polystyreendozen) geplaatst met voldoende ijs of "koelpatronen" om de monsters tijdens het vervoer naar het laboratorium koel (op een temperatuur tussen 0 en 5 °C) te houden. Bevriezing van de monsters moet worden vermeden. De temperatuur van het monster tijdens het vervoer mag nooit meer dan 10 °C bedragen en bij aankomst moet de transportdoos nog ijs bevatten.Met het virologisch onderzoek moet zo snel mogelijk worden begonnen en in elk geval uiterlijk 48 uur na de bemonstering of, in uitzonderlijke gevallen, uiterlijk 72 uur na de bemonstering indien het voor onderzoek verzamelde materiaal met een transportmedium is beschermd en aan de voor het vervoer geldende temperatuurvoorschriften kan worden voldaan (punt 1.1.3, derde alinea).De vis mag ook in zijn geheel naar het laboratorium worden verzonden indien tijdens het vervoer aan de temperatuurvoorschriften kan worden voldaan. Hele vis mag in absorberend papier worden gewikkeld en zo in een plastic zak verpakt, waarbij koeling als hierboven omschreven vereist ist. De vis mag ook levend worden verzonden.4. Verzamelen van extra diagnostisch materiaalOvereenkomstig de met het betrokken diagnostisch laboratorium gemaakte afspraken kan van de vissen nog ander weefselmateriaal worden genomen en voor verder onderzoek worden voorbewerkt.II. Voorbewerking van de monsters voor virologisch onderzoek 1. Homogeniseren van de organenIn het laboratorium wordt de inhoud van de buisjes volledig gehomogeniseerd (met een stomacher, een mixer of een vijzel en stamper) en het homogenaat wordt vervolgens gesuspendeerd in het oorspronkelijke transportmedium. Als het monster bestaat uit hele vis die minder dan 6 cm lang is, wordt de vis, nadat het stuk achter de anus is verwijderd, met een steriele schaar in kleine stukken geknipt die vervolgens worden gehomogeniseerd zoals hierboven beschreven en in het transportmedium worden gesuspendeerd. De uiteindelijke verhouding tussen het weefselmateriaal en het transportmedium moet 1: 10 bedragen.2. Centrifugeren van het homogenaatHet homogenaat wordt gecentrifugeerd in een op 2 tot 5 °C gekoelde centrifuge bij 2 000 tot 4 000 g gedurende 15 minuten; het supernatant wordt voor onderzoek verzameld en met antibiotica - b.v. 1 mg gentamicine/ml - behandeld hetzij gedurende 4 uur bij 15 °C, hetzij een hele nacht bij 4 °C.Als het monster in het transportmedium (d.i. in contact met antibiotica) is vervoerd, hoeft het supernatant niet meer met antibiotica te worden behandeld.Door de behandeling met antibiotica wordt bacteriële verontreiniging van de monsters tegengegaan en wordt filtratie door membraanfilters overbodig.Indien het verzamelde supernatant binnen 48 uur na de verzameling wordt opgeslagen bij -80 °C, mag het nog slechts één keer voor virologisch onderzoek worden ontdooid en gebruikt.Indien zich praktische problemen voordoen (b.v. defecte incubator, problemen met celcultures, enz.) waardoor het onmogelijk wordt de cellen te inoculeren binnen 48 uur nadat de weefselmonsters zijn verzameld, mag het supernatant bij -80 °C worden ingevroren en mag het virologisch onderzoek alsnog in de daaropvolgende 14 dagen worden verricht.Voordat de cellen worden geïnoculeerd, wordt het supernatant gemengd met gelijke delen van een adequate verdunning van een mengsel van antisera tegen inheemse serotypes van het IPN-virus; dit mengsel wordt dan geïncubeerd gedurende ten minste één uur bij 15 °C of gedurende ten hoogste 18 uur bij 4 °C. De titer van het antiserum, bepaald met behulp van een 50 %-plaque neutralisatietest, moet ten minste 1: 2000 bedragen.Alle inocula worden met een antiserum tegen het IPN-virus (in sommige delen van Europa wordt dit virus gevonden bij 50 % van de vismonsters) behandeld om te vermijden dat het IPN-virus CPE doet ontstaan in de geënte celcultures. Door deze behandeling wordt de duur van het virologisch onderzoek ingekort en vermindert het aantal gevallen waarin het ontstaan van CPE als indicator voor de aanwezigheid van VHS- of IHN-virus zou moeten worden aangemerkt.Als de monsters afkomstig zijn van produktie-eenheden die als vrij van IPN worden beschouwd, is het niet verplicht de inocula met antiserum tegen het IPN-virus te behandelen.III. Virologisch onderzoek 1. Celcultures en groeimediaBF-2- of RTG-2-cellen en EPC- of FHM-cellen worden bij 20 tot 30 °C gekweekt in een adequaat medium, bijvoorbeeld Eagle's MEM (of varianten daarvan) waaraan 10 % foetaal runderserum en de normale concentraties antibiotica zijn toegevoegd.Voor celcultures in gesloten recipiënten verdient het aanbeveling het medium te bufferen met bicarbonaat. Voor celcultures in open recipiënten mag het medium worden gebufferd met Tris-HCl (23 mM) en Na-bicarbonaat (6 mM). De pH dient de waarde 7,6 zo dicht mogelijk te benaderen.Alleen jonge (4 tot 48 uur oude) celcultures in actieve groei (niet-confluent) mogen met weefselmateriaal worden geënt.2. Enten van celculturesDe met antibiotica behandelde orgaansuspensie wordt op de celcultures geënt in twee verdunningen, namelijk de primaire verdunning en een verdunning 1: 10 daarvan, zodat de uiteindelijke verdunning van het weefselmateriaal in het celkweekmedium 1: 100, respectievelijk 1: 1 000 bedraagt (teneinde homologe interferentie te voorkomen). Ten minste twee cellijnen moeten worden geïnoculeerd (zie punt III.1). De verhouding tussen de hoeveelheid inoculum en het volume van het celkweekmedium moet ongeveer 1: 10 bedragen.Voor iedere verdunning en iedere cellijn moet een celoppervlak van ten minste 2 cm² worden gebruikt, wat overeenstemt met één putje van een celkweekplaat met 24 putjes. Het gebruik van celkweekplaten wordt aanbevolen, maar andere recipiënten met ongeveer dezelfde of grotere oppervlakken voor celgroei mogen ook worden aangewend.3. Bebroeden van celculturesDe geënte celcultures worden gedurende zeven tot tien dagen bij 15 °C bebroed. Wanneer de kleur van het celkweekmedium van rood naar geel omslaat, wat wijst op de verzuring van het medium, moet de pH worden bijgesteld met een steriele bicarbonaatoplossing of een stof met dezelfde werking, om ervoor te zorgen dat de cellen gevoelig blijven voor virusinfectie.Om de gevoeligheid van de celcultures voor infectie te verifiëren, wordt om de zes maanden een titratie uitgevoerd met VHSV en IHNV uit de ingevroren voorraad.4. Microscopische waarnemingenDagelijks worden de geënte celcultures op de aanwezigheid van CPE gecontroleerd onder een microscoop met vergroting 40 ×. Wanneer duidelijk een CPE wordt geconstateerd, wordt onmiddellijk begonnen met de identificatie van het virus overeenkomstig punt IV.5. VoortkweekAls na de eerste incubatie gedurende zeven tot tien dagen geen CPE is waargenomen, wordt voortgekweekt op verse celcultures met ongeveer hetzelfde celoppervlak als de primaire cultuur.Zeven tot tien dagen na enting worden gelijke hoeveelheden van het medium (supernatant) van alle cultures/putjes van de primaire cultuur naar cellijn samengevoegd. Die mengsels worden vervolgens, overeenkomstig het bepaalde in punt I.III.2, geënt op homologe celcultures, onverdund en in een verdunning 1: 10 (wat resulteerde in uiteindelijke verdunningen van het supernatant van 1: 10, respectievelijk 1: 100). Vóór de inoculatie mag een pre-incubatie van alle verdunningen met het antiserum tegen IPN-virus in een adequate verdunning worden toegepast overeenkomstig punt I.II.2.De geënte cultures worden daarna gedurende zeven tot tien dagen bebroed bij 15 °C en gecontroleerd overeenkomstig punt III.4.Indien een toxisch CPE wordt waargenomen in de eerste drie dagen van de bebroeding, mag in dat stadium worden voortgekweekt, maar de cellen moeten dan gedurende zeven dagen worden bebroed en nogmaals worden voortgekweekt en gedurende zeven dagen bebroed. Indien na drie dagen een toxisch CPE wordt waargenomen, mogen de cellen nog een keer worden gepasseerd en bebroed zodat in totaal ook 14 dagen zijn verstreken sedert de primaire bebroeding. In de laatste zeven dagen van de bebroeding zou geen toxiciteit mogen worden waargenomen.IV. Virusidentificatie 1. VirusidentificatietestsWanneer in een cultuur CPE wordt geconstateerd, wordt het medium (supernatant) verzameld en onderzocht met behulp van één of meer van de volgende technieken: neutralisatie, immunofluorescentie (IF), enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Indien met de tests het virus niet binnen een week met zekerheid kan worden geïdentificeerd, wordt het virus naar een nationaal referentielaboratorium voor visziekten of naar het communautair referentielaboratorium voor visziekten verzonden voor onmiddellijke identificatie.Voor virusidentificatie mogen uitsluitend immunoreagentia van de referentiekwaliteit worden gebruikt die bovendien, qua titer en specificiteit, zijn goedgekeurd door het nationaal referentielaboratorium voor visziekten.2. NeutralisatieDe cellen worden uit het verzamelde medium verwijderd door centrifugeren (2 000 tot 4 000 g) of door membraanfiltrering (0,45 µm) en vervolgens wordt het medium verdund in celkweekmedium tot een verhouding 1: 100 en 1: 10 000.Aan gelijke hoeveelheden van de verdunningen wordt telkens een zelfde hoeveelheid van elk van de onderstaande reagentia toegevoegd en deze mengsels worden vervolgens 60 minuten bij 15 °C bebroed:>RUIMTE VOOR DE TABEL>Ten minste twee celculturen worden geënt met 50 µl van iedere virus-serumcombinatie en vervolgens bebroed bij 15 °C. De ontwikkeling van CPE wordt gecontroleerd overeenkomstig punt III.4.Andere neutralisatietests die doelmatig zijn gebleken, mogen eveneens worden gebruikt.3. Immunofluorescentie (IF)Voor ieder te identificeren virusisolaat worden EPC-cellen aangebracht op ten minste acht dekglaasjes (of soortgelijke dragers) in een zodanige verhouding dat na 24 uur groei er een confluentie optreedt van 60 tot 90 %. Gekozen is voor EPC-cellen omdat zij zich stevig aan glas hechten.Wanneer de cellen zich aan het glas hebben gehecht (ongeveer 1 uur na het aanbrengen), of na incubatie van de cultures gedurende ten hoogste 24 uur, worden zij geïnoculeerd met het te identificeren virus. Vier cultures worden geënt in een v/v-verhouding van 1: 10 en vier cultures in een verhouding 1: 100.20 tot 30 uur na inoculatie worden de cultures tweemaal gewassen in Eagle's MEM zonder serum, gefixeerd met aceton en vervolgens gemerkt met behulp van een dubbelelaag-IF. De eerste laag reagens bestaat uit poly- of monoclonale antilichamen van referentiekwaliteit. De tweede laag reagens is een conjugaat van FITC en antiserum gericht tegen het immunoglobuline van de eerste laag. Voor ieder te testen antiserum worden ten minste één cultuur die is geïnoculeerd in een sterkere concentratie, en één cultuur die is geïnoculeerd in een zwakkere concentratie, gemerkt. In de test moeten ook de nodige negatieve en positieve controles worden opgenomen.Aan de gemerkte cultures wordt glycerol-fysiologisch zout toegevoegd. De cultures worden onderzocht onder invallend UV-licht. Daarbij wordt gebruik gemaakt van een oculair met vergroting 10 × of 12 × en van een objectief met vergroting 25 × of 40 × en met een diafragma &gt; 0,7, respectievelijk &gt; 1,3.Sommige stammen van het Egtved-virus reageren bij IF hevig op antiserum tegen de referentiestam F 1, hoewel zij geen reactie geven in neutralisatietests.De bovenstaande IF-techniek wordt alleen gegeven als voorbeeld. Andere IF-technieken (van referentiekwaliteit qua celcultures, fixatie en antilichamen) die doeltreffend zijn gebleken, mogen eveneens worden gebruikt.4. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)Putjes in microtiterplaten (b.v. Nunc-immunoplaten, Maxisorp, Nunc, Denemarken) worden gedurende één nacht gecoat met aanbevolen verdunningen van proteïne-A-gezuiverde immunoglobulinefracties van antistoffen van referentiekwaliteit.Na wassen van de putjes met PBS-Tween-20 buffer wordt het te identificeren virus in de putjes gebracht in verdunningstappen van twee of vier en 60 minuten bij 37 °C geplaatst om het virus te laten reageren met de antistoffen die voor coating zijn gebruikt. Nadat de platen opnieuw zijn gewassen met PBS-Tween-20 buffer worden gebiotiniseerde antistoffen met een specificiteit die overeenstemt met die van de voor coating gebruikte antistoffen, toegevoegd en wordt het geheel met het oog op binding gedurende 60 minuten bij 20 °C geplaatst. Vervolgens worden de platen opnieuw gewassen zoals hierboven beschreven en wordt een conjugaat van HRP met streptavidine toegevoegd en gedurende één uur bij 20 °C geplaatst om te reageren. Na een laatste wasbeurt wordt het gebonden enzym zichtbaar gemaakt met de normaal bij de ELISA-techniek gebruikte substraten (OPD, enz.).De hierboven beschreven ELISA op basis van biotine-avidine is slechts een voorbeeld. Varianten zijn toegestaan voor zover zij doelmatig zijn gebleken.>RUIMTE VOOR DE TABEL>>RUIMTE VOOR DE TABEL>>RUIMTE VOOR DE TABEL>DEEL II DIAGNOSTISCHE PROCEDURES VOOR DE BEVESTIGING VAN IHN EN VHS BIJ VERMOEDELIJKE UITBRAKEN De diagnose van IHN en VHS kan worden gesteld met behulp van een van de volgende technieken:- A. Conventionele virusisolatie gevolgd door serologische virusidentificatie- B. Virusisolatie en gelijktijdige serologische virusidentificatie- C. Andere diagnosetechnieken (IF, ELISA).Wanneer de diagnose van IHN en VHS voor de eerste keer moet worden gesteld op bedrijven in erkende gebieden, mag techniek C nooit alleen worden gebruikt; in dat geval moet ook gebruik worden gemaakt van techniek A of B.Het voor virologisch onderzoek bestemde weefselmateriaal mag in sommige gevallen vergezeld gaan van extra materiaal voor bacteriologisch, parasitologisch, histologisch of ander onderzoek, met het oog op het stellen van een differentiële diagnose. Dat materiaal moet worden verzameld volgens de procedures die zijn beschreven door het Internationaal Bureau voor Besmettelijke Veeziekten (OIE).II.A. Conventionele virusisolatie gevolgd door serologische virusidentificatie II.A.I.1. Selectie van monstersTen minste tien vissen met typische symptomen van IHN of VHS moeten voor onderzoek worden geselecteerd.II.A.I.2. Voorbewerking en verzending van vismonstersZie I.I.3.II.A.I.3. Verzamelen van extra diagnostisch materiaalZie I.I.4.II.A.II Voorbewerking van monsters voor virologisch onderzoekZie I.II.II.A.III Virologisch onderzoekZie I.III, met dien verstande dat voor inoculatie van het weefselmateriaal gebruik mag worden gemaakt van BF-2 of RTG-2 cellen en EPC of FHM-cellen.II.A.IV VirusidentificatieZie I.IV.II.B. Virusisolatie en gelijktijdige serologische virusidentificatie II.B.I.1. Selectie van monstersZie II.A.I.1.II.B.I.2. Voorbewerking en verzending van vismonstersZie I.I.3.II.B.I.3. Verzamelen van extra diagnostisch materiaalZie I.I.4.II.B.II.1. Homogeniseren van de organenZie I.II.1.II.B.II.2. Centrifugeren van het homogenaatZie I.II.2.II.B.II.3. Behandeling van het supernatant met diagnostische antiseraDe suspensie van het antibioticum en de tegen IPN behandelde organen wordt verdund in de verhoudingen 1: 10 en 1: 10 000 in een celkweekmedium; deze hoeveelheid wordt in gelijke delen verdeeld en die delen worden gemengd met een gelijk deel van de in punt I.IV.2 genoemde reagentia en gedurende 60 minuten bij 15 °C bebroed.II.B.III.1. Celcultures en groeimediaBF-2- of RTG-2-cellen en EPC- of FHM-cellen worden gekweekt bij 20 tot 30 °C in een adequaat medium, b.v. Eagle's MEM (of varianten daarvan) waarvan 10 % foetaal runderserum en de normale concentraties antibiotica zijn toegevoegd.Voor cultures in gesloten recipiënten wordt het medium bij voorkeur gebufferd met bicarbonaat. Bij celcultures in open recipiënten mag het medium worden gebufferd met Tris-HCl (23 mM) en natriumbicarbonaat (6 mM). De pH ligt zo dicht mogelijk bij 7,6.Alleen jonge (4 tot 48 uur oude) celcultures in actieve groei (niet-confluent) mogen met weefselmateriaal worden geënt.II.B.III.2. Enten van celculturesVoor elk virus-serummengsel (bereid overeenkomstig punt II.B.II.3) worden ten minste twee celcultures per cellijn geïnoculeerd met telkens 50 µl.II.B.III.3. Bebroeden van celculturesZie I.III.3.II.B.III.4. Microscopische waarnemingenDagelijks worden de geënte celcultures op de aanwezigheid van CPE gecontroleerd onder een miscroscoop met vergroting 40 ×. Indien CPE wordt verhinderd door een van de gebruikte antisera, kan worden aangenomen dat het virus daardoor is geïdentificeerd.Indien CPE niet door een van de antisera wordt verhinderd, dient het virus te worden geïdentificeerd overeenkomstig het bepaalde in punt I.IV.II.B.III.5. VoortkweekAls na zeven dagen geen CPE is waargenomen, wordt voortgekweekt op cultures die zijn geënt met supernatant en groeimedium (II.B.II.3) overeenkomstig punt I.III.5.II.C. Andere diagnosetechnieken IF of ELISA wordt overeenkomstig het bepaalde in punt II.A.IV.3, respectievelijk II.A.IV.4 uitgevoerd op overeenkomstig II.A.II.2 voorbewerkt supernatant. Deze snelle technieken moeten binnen 48 uur na bemonstering met een virologisch onderzoek overeenkomstig het bepaalde in punt A of B worden aangevuld indien:a) een negatief resultaat werd verkregen,ofb) een positief resultaat werd verkregen uitgaande van monsters van een eerste uitbraak van IHN of VHS in een erkend gebied.Op weefselmateriaal mogen andere diagnosetechnieken worden toegepast, bijvoorbeeld IF op vriescoupes of immunohistochemische tests op in formaline gefixeerd weefselmateriaal. Deze technieken moeten steeds vergezeld gaan van inoculatie van niet-gefixeerd weefselmateriaal op celcultures.AFKORTINGEN BF-2 Bluegill fibroblast (cellijn)CPE Cytopathogeen effectELISA Enzyme Linked Immunosorbent AssayEPC Epithelioma papulosum cyprini (cellijn)FHM Fathead minnow (cellijn)FITC Fluoresceïne isothiocyanaatHRP MierikswortelperoxidaseIF ImmunofluorescentieIIFT Indirecte immunofluorescentietestIHN(V) Infectieuze hematopoïetische necrose (virus)IPN(V) Infectieuze pancreatische necrose (virus)MEM Minimum Essential MediumOPD OrthofenyleendiaminePBS Phosphate Buffered Saline (met fosfaat gebufferde zoutoplossing)RTG-2 Rainbow trout gonad (cellijn)Tris-HCl Tris (hydroxymethyl) aminometaan-HClVHS(V) Virale hemorragische septikemie (virus)(1*) Klinische onderzoeken.