CELEX: 31992R3942
Language: nl
Date: 1992-12-22
Title: Verordening (EEG) nr. 3942/92 van de Commissie van 22 december 1992 houdende vaststelling van een referentiemethode voor de bepaling van sitosterol en stigmasterol in boterolie

Avis juridique important

|

31992R3942

Verordening (EEG) nr. 3942/92 van de Commissie van 22 december 1992 houdende vaststelling van een referentiemethode voor de bepaling van sitosterol en stigmasterol in boterolie  

Publicatieblad Nr. L 399 van 31/12/1992 blz. 0029 - 0038 Bijzondere uitgave in het Fins: Hoofdstuk 3 Deel 47 blz. 0149  Bijzondere uitgave in het Zweeds: Hoofdstuk 3 Deel 47 blz. 0149 

VERORDENING (EEG) Nr. 3942/92 VAN DE COMMISSIE van 22 december 1992 houdende vaststelling van een  referentiemethode voor de bepaling van sitosterol en stigmasterol in boterolieDE  COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN, Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische Gemeenschap, Gelet op Verordening (EEG) nr. 804/68 van de Raad van 27 juni 1968 houdende een gemeenschappelijke  ordening der markten in de sector melk en zuivelprodukten (1), laatstelijk gewijzigd bij  Verordening (EEG) nr. 2071/92 (2), met name op artikel 6, Overwegende dat overeenkomstig Verordening (EEG) nr. 3143/85 van de Commissie (3), laatstelijk  gewijzigd bij Verordening (EEG) nr. 1264/92 (4), met name de artikelen 5 en 6, aan boterolie  verklikstoffen moeten worden toegevoegd en de boterolie met verklikstoffen aan controle moet worden  onderworpen; Overwegende dat overeenkomstig Verordening (EEG) nr. 570/88 van de Commissie (5), laatstelijk  gewijzigd bij Verordening (EEG) nr. 124/92 (6), met name de artikelen 3 en 6, aan boterolie  verklikstoffen kunnen worden toegevoegd en de produkten met verklikstoffen aan controle moeten  worden onderworpen; Overwegende dat overeenkomstig Verordening (EEG) nr. 429/90 van de Commissie (7), laatstelijk  gewijzigd bij Verordening (EEG) nr. 1264/92, met name de artikelen 10 en 11, aan boterolie  verklikstoffen moeten worden toegevoegd en de boterolie met verklikstoffen aan controle moet worden  onderworpen; Overwegende dat strikte naleving van de bepalingen voor het gebruik van verklikstoffen in boterolie  essentieel is om frauduleus gebruik van gesubsidieerde boter te voorkomen; Overwegende dat het, gezien het belang van verklikstoffen voor een goede werking van de regelingen,  nodig is gemeenschappelijke in de hele Gemeenschap op dezelfde wijze toe te passen methoden vast te  stellen voor het opsporen van alle voor deze regelingen vereiste verklikstoffen; dat dit met name  een gelijke behandeling zou waarborgen van alle bedrijven die gebruik maken van deze regelingen en  een einde zou maken aan ongelijke concurrentievoorwaarden die thans het gevolg kunnen zijn van  verschillende analysemethoden; Overwegende dat het moeilijk is dergelijke referentiemethoden voor alle verklikstoffen tegelijk  vast te stellen; dat de vaststelling van een referentiemethode voor de bepaling van stigmasterol en  sitosterol in botervet een eerste stap in die richting is; Overwegende dat de in deze verordening vervatte maatregelen in overeenstemming zijn met het advies  van het Comité van beheer voor melk en zuivelprodukten, HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD: Artikel 1 Indien overeenkomstig respectievelijk artikel 6 van Verordening (EEG)  nr. 3143/85, artikel 6 van Verordening (EEG) nr. 570/88 of artikel 11 van Verordening (EEG) nr.  429/90 het gehalte aan stigmasterol in boterolie moet worden bepaald, wordt de in de bijlage  gespecificeerde referentieanalysemethode gebruikt. De referentiemethode wordt ook gebruikt, indien  overeenkomstig artikel 6 van Verordening (EEG) nr. 570/88 het gehalte aan â-sitosterol in boterolie  moet worden bepaald. De toevoeging van verklikstoffen aan boterolie is op correcte wijze gebeurd, indien de verkregen  resultaten in overeenstemming zijn met de onder punt 8 van deze bijlage gespecificeerde eisen. Artikel 2 Deze verordening treedt in werking op de derde dag volgende op die van haar  bekendmaking in het Publikatieblad van de Europese Gemeenschappen. Zij is van toepassing met ingang van 1 februari 1993. Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks  toepasselijk in elke Lid-Staat. Gedaan te Brussel, 22 december 1992. Voor de Commissie Ray MAC SHARRY Lid van de Commissie    (1) PB nr. L 148 van 28. 6. 1968, blz. 13.  (2) PB nr. L 215 van 30. 7. 1992, blz. 64.  (3) PB nr. L 298 van 12. 11. 1985, blz. 9.  (4) PB nr. L 135 van 19. 5. 1992, blz. 5.  (5) PB nr. L 55 van 1. 3. 1988, blz. 31.  (6) PB nr. L 14 van 21. 1. 1992, blz. 28.  (7) PB nr. L 45 van 21. 2. 1990, blz. 8.   BIJLAGE BEPALING VAN SITOSTEROL OF STIGMASTEROL IN BOTEROLIE MET BEHULP VAN CAPILLAIRE  GASCHROMATOGRAFIE 1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED In deze methode wordt een werkwijze beschreven voor de kwantitatieve bepaling van sitosterol of  stigmasterol in boterolie. Onder sitosterol wordt verstaan de totale hoeveelheid â-sitosterol en  22-dihydro-â-sitosterol; overige sitosterolen gelden als te verwaarlozen. De methode is van  toepassing op monsters die krachtens de Verordeningen (EEG) nr. 3143/85, (EEG) nr. 570/88 en (EEG)  nr. 429/90 worden ontvangen. 2. PRINCIPE De boterolie wordt verzeept met ethanolische kaliumhydroxide-oplossing, waarna de onverzeepbare  bestanddelen worden geëxtraheerd met diethylether. De sterolen worden omgezet in trimethylsilylethers en met behulp van capillaire gaschromatografie  kwantitatief bepaald, waarbij betulinol als interne standaard wordt gebruikt. 3. APPARATUUR 3.1. Kolf, 150 ml, voorzien van een refluxkoeler met slijpstukken. 3.2. Scheitrechters, 500 ml. 3.3. Kolven, 250 ml. 3.4. Tegendrukscheitrechters, 250 ml, of soortgelijke apparatuur voor het opvangen van gebruikte  diethylether. 3.5. Glazen kolom, 350 mm × 20 mm, met een filterplaat van gesinterd glas. 3.6. Waterbad of verwarmingsmantel. 3.7. Reactieflesjes, 2 ml. 3.8. Gaschromatograaf, geschikt voor het werken met een capillaire kolom, bestaande uit: 3.8.1. een oven waarmee de kolommen op de gewenste temperatuur kunnen worden gehouden met een  nauwkeurigheid van ± 1 °C; 3.8.2. een injector met regelbare temperatuur; 3.8.3. een vlamionisatiedetector met elektronische versterker; 3.8.4. Elektronische rekenapparatuur (integrator), geschikt voor gebruik met een elektronische  versterker (3.8.3). 3.9. Een fused-silica capillaire kolom, inwendig gecoat met BP1 of equivalent met een uniforme  dikte van 0,25 ìm; met deze kolom moet resolutie van de trimethylsilyl-derivaten van lanosterol en  sitosterol mogelijk zijn; hiervoor kan een BP1-kolom met een lengte van 12 m en een inwendige  diameter van 0,2 mm worden gebruikt. 3.10. Injectiespuit, van ten hoogste 1 ìl, geschikt voor de injector (3.8.2). 4. REAGENTIA Alle reagentia moeten p.a. zijn. Het gebruikte water dient gedestilleerd water of water van  gelijkwaardige zuiverheid te zijn. 4.1. Ethanol, minimaal 95 % zuiver. 4.2. Kaliumhydroxide, oplossing van 60 %. Los 600 g kaliumhydroxide (minimaal 85 %) op in water en  vul met water aan tot 1 liter. 4.3. Betulinol, minimaal 99 % zuiver. 4.3.1. Interne standaard: oplossingen van betulinol in diethylether (4.4). 4.3.1.1. de concentratie van de betulinol-oplossing voor de bepaling van sitosterol moet 1,0 mg/ml  zijn. 4.3.1.2. de concentratie van de betulinol-oplossing voor de bepaling van stigmasterol moet 0,4  mg/ml zijn. 4.4. Diethylether, p.a. (peroxide- en restvrij). 4.5. Natriumsulfaat, watervrij, 2 uur gedroogd bij 102 °C. 4.6. Silyleringsreagens, b.v. TRI-SIL (verkrijgbaar bij Pierce Chemical Co, Cat. nr. 49001) of  gelijkwaardig. (WAARSCHUWING: TRI-SIL is ontvlambaar, toxisch, bijtend en mogelijkerwijs  carcinogeen. Het laboratoriumpersoneel moet op de hoogte zijn van de veiligheidsvoorschriften voor  de TRI-SIL en de nodige voorzorgsmaatregelen nemen.) 4.7. Lanosterol. 4.8. Sitosterol, bekende zuiverheid (P) minimaal 90 %. Opmerking 1: De zuiverheid van het voor de ijking gebruikte standaardmateriaal moet volgens de  interne normalisatiemethode worden bepaald. Neem aan dat alle in het monster aanwezige sterolen in  het chromatogram voorkomen, dat het totale piekoppervlak overeenkomt met 100 % van de  sterol-bestanddelen en dat de detector voor alle sterolen dezelfde respons geeft. Controleer of het  systeem op het bij de analyse gebruikte concentratiebereik lineair is. 4.8.1. Sitosterol-standaardoplossing: bereid een oplossing die, tot op 0,001 mg/ml nauwkeurig,  ongeveer 0,5 mg/ml (W1) sitosterol (4.8) in diethylether (4.4) bevat. 4.9. Stigmasterol, bekende zuiverheid (P) minimaal 90 %. 4.9.1. Stigmasterol-standaardoplossing: bereid een oplossing die, tot op 0,001 mg/ml nauwkeurig,  ongeveer 0,2 mg/ml (W1) stigmasterol (4.9) in diethylether (4.4) bevat. 4.10. Mengsel voor controle van de resolutie: bereid een oplossing die 0,05 mg/ml lanosterol (4.7)  en 0,5 mg/ml sitosterol (4.8) in diethylether (4.4) bevat. 5. WERKWIJZE 5.1. Bereiding van de standaardoplossingen voor chromatografie: de interne standaardoplossing  (4.3.1) moet op hetzelfde moment aan de desbetreffende standaardoplossing met sterolen en aan het  verzeepte monster (5.2.2) worden toegevoegd. 5.1.1. Standaardoplossing sitosterol voor chromatografie: breng 1 ml van de standaardoplossing  sitosterol (4.8.1) in elk van twee reactieflesjes (3.7) en verdamp de diethylether met een  stikstofstroom. Voeg 1 ml interne standaardoplossing (4.3.1.1) toe en verdamp de diethylether met  een stikstofstroom. 5.1.2. Standaardoplossing stigmaterol voor chromatografie: breng 1 ml van de standaardoplossing  stigmasterol (4.9.1) in elk van de twee reactieflesjes (3.7) en verdamp de diethylether met een  stikstofstroom. Voeg 1 ml interne standaardoplossing (4.3.1.2) toe en verdamp de diethylether met  een stikstofstroom. 5.2. Bereiding van de onverzeepbare bestanddelen. 5.2.1. Weeg tot op 1 mg nauwkeurig ongeveer 1 g boterolie (W2) af in een kolf van 150 ml (3.1).  Voeg 50 ml ethanol (4.1) en 10 ml kaliumhydroxide-oplossing (4.2) toe. Bevestig de refluxkoeler,  verwarm tot ongeveer 75 °C en handhaaf deze temperatuur gedurende 30 minuten. Verwijder de koeler  en laat de kolf afkoelen tot kamertemperatuur. 5.2.2. Voeg 1,0 ml interne standaardoplossing toe (4.3.1.1 als sitosterol wordt bepaald of 4.3.1.2  als stigmasterol wordt bepaald). Meng zorgvuldig en breng de inhoud van de kolf kwantitatief over  in een scheitrechter van 500 ml (3.2), waarna de kolf achtereenvolgens wordt gewassen met 50 ml  water en 250 ml diethylether (4.4) Schud de scheitrechter krachtig gedurende 2 minuten en wacht tot  de fasen gescheiden zijn. Laat de waterige onderlaag weglopen en was de etherlaag door viermaal te  schudden met 100 ml water. Opmerking 2: Om emulsievorming te voorkomen moet het wassen met water de eerste twee maal  voorzichtig gebeuren (tienmaal omkeren). De derde maal kan gedurende 30 seconden krachtig worden  geschud. Indien er een emulsie ontstaat, kan deze worden afgebroken door 5-10 ml ethanol toe te  voegen. Indien ethanol wordt toegevoegd, moet er nog eens tweemaal krachtig met water worden  gewassen. 5.2.3. Laat de heldere zeepvrije etherlaag door een glazen kolom (3.5) met 30 g watervrij  natriumsulfaat (4.5) lopen. Vang de ether op in een kolf van 250 ml (3.3). Voeg een kooksteentje  toe en damp de oplossing vrijwei droog op een waterbad of met een verwarmingsmantel. Zorg er  daarbij voor dat het verdampte oplosmiddel wordt opgevangen. Opmerking 3: Als de vloeistof bij een te hoge temperatuur volledig wordt ingedampt, is het mogelijk  dat er ook sterolen verloren gaan. 5.3. Bereiding van de trimethylsilylethers 5.3.1. Breng de in de kolf resterende etheroplossing over in een reactieflesje van 2 ml (3.7) met 2  ml diethylether en verdamp de ether met een stikstofstroom. Was de kolf tweemaal als volgt: breng 2  ml diethylether in de kolf, breng deze over naar het reactieflesje en verdamp de ether met  stikstof. 5.3.2. Silyleer het monster door 1 ml TRI-SIL (4.6) toe te voegen. Sluit het vat af en schud  krachtig om de sterolen op te lossen. Verwarm, als de sterolen niet volledig oplossen, tot 65 70  °C. Laat de oplossing gedurende ten minste 5 minuten staan alvorens deze in de gaschromatograaf te  injecteren. Silyleer de standaarden (5.1.1 of 5.1.2) en het mengsel om de resolutie te controleren  (4.10) op dezelfde manier als de monsters. Opmerking 4: Het silyleren moet in een watervrije omgeving gebeuren. Wanneer betulinol onvolledig  is gesilyleerd, verschijnt er vlak bij de betulinol-piek een tweede piek. Het silyleringsproces wordt gestoord door de aawezigheid van ethanol in de oplossing, die een  gevolg kan zijn van onvoldoende wassen na de extractie. Indien dit probleem aanhoudt, was dan na de  extractie een vijfde maal, waarbij gedurende 30 seconden krachtig wordt geschud. 5.4. Gaschromatografie 5.4.1. Keuze van de werkomstandigheden: Volg voor de instelling van de gaschromatograaf de instructies van de fabrikant op. Voor de werkomstandigheden gelden de volgende richtlijnen: - kolomtemperatuur: 265 °C - injectortemperatuur: 280 °C - detectortemperatuur: 300 °C - stroomsnelheid draaggas: 0,6 ml/minuut - waterstofdruk: 84 kPa - luchtdruk: 155 kPa - splitverhouding: van 10:1 tot 50:1; de splitverhouding moet volgens de instructies van de  fabrikant worden geoptimaliseerd en vervolgens moet worden gecontroleerd of de respons van de  detector op het gebruikte concentratiebereik lineair is. Opmerking 5: Het is vooral belangrijk dat de liner van de injector regelmatig wordt schoongemaakt. - geúnjecteerde hoeveelheid: 1 ìl TMSE-oplossing Laat het systeem equilibreren en begin niet met de analyse voordat de respons voldoende stabiel  is. Stel de omstandigheden, die afhankelijk van de kenmerken van de kolom en de gaschromatograaf zijn,  zodanig in, dat er chromatogrammen worden verkregen die aan de volgende eisen voldoen: - de resolutie tussen de sitosterol-piek en de lanosterol-piek moet afdoende zijn. Bij een  gesilyleerd mengsel voor controle op de resolutie (4.10) moet een soortgelijk chromatogram worden  verkregen als in figuur 1 is weergegeven - voor onderstaande sterolen moet ongeveer de daarbij vermelde relatieve retentietijd worden  verkregen: Cholesterol: 1,0 Stigmasterol: 1,3 Sitosterol: 1,5 Betulinol: 2,5 - de retentietijd voor betulinol moet ongeveer 24 minuten zijn. 5.4.2. Analyse Injecteer 1 ìl gesilyleerde standaardoplossing (stigmasterol of sitosterol) en stel de  kalibratieparameters van de integrator in. Injecteer 1 ìl gesilyleerde standaardoplossing om de responsfactor in vergelijking met betulinol te  bepalen. Injecteer 1 ìl gesilyleerde monsteroplossing en meet de piekoppervlakken. Voor en na elke  chromatografische reeks moet er 1 ìl standaardoplossing worden geúnjecteerd. Als leidraad kan  worden gesteld dat vóór en na elke reeks van 6 monsteroplossingen, de standaardoplossing wordt  geúnjecteerd. Opmerking 6: Bij de integratie van de stigmasterol-piek moet ook het oppervlak van eventuele  staarten, zoals aangegeven bij de punten 1, 2 en 3 in figuur 2b, worden meegerekend. Wanneer de totale hoeveelheid sitosterol wordt bepaald, moet bij de integratie van de  sitosterol-piek ook het oppervlak van de piek van 22-dihydro-â-sitosterol (stigmastanol), dat vlak  na sitosterol elueert, worden meegerekend. 6. BEREKENING VAN DE RESULTATEN 6.1. Bepaal het oppervlak van de sterol-pieken en de betulinol-pieken bij de standaardoplossingen  voor en na een reeks en bereken R1: R1 = Gemiddeld betulinol-piekoppervlak in standaardoplossing Gemiddeld sterol-piekoppervlak in  standaardoplossing Bepaal het oppervlak van de sterol-piek (stigmasterol of sitosterol en de betulinol-piek in de  monsteroplossing en bereken R2: R2 = Betulinol-piekoppervlak in monsteroplossing Sterol-piekoppervlak in monsteroplossing W1 = sterolconcentratie van de standaard in de standaardoplossing 4.8.1 of 4.9.1) in mg/ml W2 = gewicht van het monster (5.2.1) in g P = zuiverheid van de standaard-sterol (4.8 of 4.9) Sterolgehalte van het monster (mg/kg) = R2 R1  × W1 W2  × P × 10. 7. NAUWKEURIGHEID VAN DE METHODE 7.1. Herhaalbaarheid 7.1.1. Stigmasterol Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, binnen een zo kort mogelijke tijd uitgevoerd  door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 10,2  mg/kg. 7.1.2. Sitosterol Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, binnen een zo kort mogelijke tijd uitgevoerd  door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 3,6 %  van het gemiddelde van de bepalingen. 7.2. Reproduceerbaarheid 7.2.1 Stigmasterol Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, uitgevoerd door personen in verschillende  laboratoria met verschillende apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 25,3  mg/kg. 7.2.2. Sitosterol Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, uitgevoerd door personen in verschillende  laboratoria met verschillende apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 8,9 % van  het gemiddelde van de bepalingen. 7.3. Herkomst van de precisiegegevens De precisiegegevens zijn vastgesteld op basis van een experiment dat in 1991 in negen laboratoria  werd uitgevoerd met zes monsters (drie blinde duplo's) voor stigmasterol en zes monsters (drie  blinde duplo's) voor sitosterol. 8. TOLERANTIEGRENZEN 8.1. Om de homogeniteit te controleren moeten er van het produkt met verklikstoffen drie monsters  worden genomen. 8.2. Stigmasterol 8.2.1. Het bijmengingsgehalte voor stigmasterol bedraagt 150 g met een zuiverheid van ten minste 95  % per ton boterolie, d.w.z. 142,5 mg/kg, of 170 g met een zuiverheid van ten minste 85 % per ton  boterolie, d.w.z. 144,5 mg/kg. 8.2.2. Uitgaande van het kritische verschil - Critical Difference - bij een waarschijnlijkheid van  95 % (CrD95) mag het gemiddelde van de drie resultaten niet lager zijn dan: 128,3 mg/kg voor bijmenging van 95 % zuiver stigmasterol, en 130,3 mg/kg voor bijmenging van 85 % zuiver stigmasterol. 8.2.3. Bovendien wordt de laagste bij analyse van het produkt verkregen uitkomst gebruikt om de  homogeniteit van de verdeling van de verklikstof na te gaan. Dit wordt gedaan door vergelijking met  de volgende grenswaarden: - 120,4 mg/kg (95 % van het minimum-bijmengingsgehalte voor 95 % zuiver stigmasterol, op basis van  één monster CrD95); - 122,3 mg/kg (95 % van het minimum-bijmengingsgehalte voor 85 % zuiver stigmasterol, op basis van  één monster CrD95); - 99,0 mg/kg (80 % van het minimum-bijmengingsgehalte voor 95 % zuiver stigmasterol, op basis van  één monster CrD95); - 100,6 mg/kg (80 % van het minimum-bijmengingsgehalte voor 85 % zuiver stigmasterol, op basis van  één monster CrD95); De concentratie van de verklikstof in het monster dat het laagste resultaat oplevert, wordt  gebruikt in combinatie met interpolatie tussen 120,4 mg/kg en 99,0 mg/kg, respectievelijk 122,3  mg/kg en 100,6 mg/kg. 8.3. Sitosterol 8.3.1. Het bijmengingsgehalte voor sitosterol bedraagt 600 g ten minste 90 % zuiver sitosterol per  ton boterolie, d.w.z. 540 mg/kg. 8.3.2. Uitgaande van CrD95 mag het gemiddelde van de drie resultaten niet lager zijn dan 513,0  mg/kg. 8.3.3. Bovendien wordt de laagste bij analyse van het produkt verkregen uitkomst gebruikt om de  homogeniteit van de verdeling van de verklikstof na te gaan. Dat wordt gedaan door vergelijking met  de volgende grenswaarden: - 484,4 mg/kg (95 % van het minimum-bijmengingsgehalte voor 90 % zuiver stigmasterol, op basis van  één monster CrD95); - 403,4 mg/kg (80 % van het minimum-bijmengingsgehalte voor 90 % zuiver stigmasterol, op basis van  één monster CrD95). De concentratie van de verklikstof in het monster dat het laagste resultaat oplevert, wordt  gebruikt in combinatie met interpolatie tussen 484,4 mg/kg en 403,4 mg/kg. >BEGIN VAN DE GRAFIEK> >EIND VAN DE GRAFIEK>>BEGIN VAN DE GRAFIEK> >EIND VAN DE GRAFIEK>>BEGIN  VAN DE GRAFIEK> >EIND VAN DE GRAFIEK>