CELEX: 31973L0046
Language: it
Date: 1972-12-05 00:00:00
Title: Quarta direttiva 73/46/CEE della Commissione, del 5 dicembre 1972, che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali

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31973L0046

Quarta direttiva 73/46/CEE della Commissione, del 5 dicembre 1972, che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali  

Gazzetta ufficiale n. L 083 del 30/03/1973 pag. 0021 - 0034 edizione speciale finlandese: capitolo 3 tomo 5 pag. 0115  edizione speciale greca: capitolo 03 tomo 9 pag. 0114  edizione speciale svedese/ capitolo 3 tomo 5 pag. 0115  edizione speciale spagnola: capitolo 03 tomo 6 pag. 0230  edizione speciale portoghese: capitolo 03 tomo 6 pag. 0230 

++++( 1 ) GU n . L 170 del 3 . 8 . 1970 , pag . 2 .  ( 2 ) GU n . L 171 del 29 . 7 . 1972 , pag . 39 .  ( 3 ) GU n . L 155 del 12 . 7 . 1971 , pag . 13 .  ( 4 ) GU n . L 279 del 20 . 12 . 1971 , pag . 7 .  ( 5 ) GU n . L 123 del 29 . 5 . 1972 , pag . 6 .  ( 6 ) 1 UI = 0,3 * g di retinolo .  ( 7 ) Per gli alimenti d'allattamento e per i prodotti che possono agglomerarsio o rigonfiare , raddoppiare la quantità dei reattivi indicati in 5.2 , primo e secondo comma .  ( 8 ) L'aggiunta di ascorbato di sodio non è necessaria quando si esegue l'idrolisi in atmosfera di azoto .  ( 9 ) Il contenuto in carotene puo essere determinato misurando la densità ottica a 450 nm ; E 1 %/1 cm = 2600 .  COMMISSIONE  QUARTA DIRETTIVA DELLA COMMISSIONE  del 5 dicembre 1972  che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali  ( 73/46/CEE )  LA COMMISSIONE DELLE COMUNITA EUROPEE ,  visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea ,  vista la direttiva del Consiglio , del 20 luglio 1970 , concernente l'introduzione di modi di prelevamento dei campioni e di metodi d'analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per gli animali ( 1 ) , modificata dalla direttiva n . 72/275/CEE del 20 luglio 1972 ( 2 ) , in particolare l'articolo 2 ,  considerando che la suddetta direttiva prevede che i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali destinati a constatare l'osservanza delle condizioni prescritte in virtù delle disposizioni legislative , regolamentari o amministrative concernenti le qualità e la composizione degli alimenti per gli animali , siano effettuati secondo i modi di prelevamento di campioni ed i metodi di analisi comunitari ;  considerando che le direttive n . 71/250/CEE , n . 71/393/CEE e n . 72/199/CEE della Commissione , del 15 giugno 1971 ( 3 ) , del 18 novembre 1971 ( 4 ) e del 27 aprile 1972 ( 5 ) hanno già fissato un certo numero di metodi di analisi comunitari ; che , tenuto conto dello stato d'avanzamento dei lavori sin qui effettuati , è necessario adottare una quarta serie di metodi ;  considerando che le misure previste dalla presente direttiva sono conformi al parere del Comitato permanente degli alimenti per gli animali ,  HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA :  Articolo 1  Gli Stati membri prescrivono che le analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali , per quanto riguarda il contenuto in umidità dei grassi e degli oli animali e vegetali e per quanto riguarda i contenuti in magnesio e con cellulosa grezza degli alimenti , siano effettuate secondo i metodi descritti all'allegato I della presente direttiva .  Le disposizioni generali di cui alla prima parte ( introduzione ) dell'allegato della prima direttiva n . 71/250/CEE della Commissione , del 15 giugno 1971 , si applicano ai metodi descritti all'allegato I della presente direttiva .  Articolo 2  Gli Stati membri prescrivono che le analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali , per quanto riguarda il loro contenuto in retinolo ( vitamina A ) , tiamina ( aneurina , vitamina B1 ) , acidi ascorbico e deidroascorbico ( vitamina C ) , siano effetuate secondo i metodi descritti all'allegato II della presente direttiva .  Le disposizioni generali di cui alla prima parte ( introduzione ) dell'allegato della prima direttiva n . 71/250/CEE della Commissione , del 15 giugno 1971 , eccetto la parte relativa alla preparazione del campione da analizzare , si applicano ai metodi descritti all'allegato II della presente direttiva .  Articolo 3  Gli Stati membri mettono in vigore , non oltre il 1 * gennaio 1974 , le disposizioni legislative , regolamentari o amministrative necessarie per conformarsi alle disposizioni della presente direttiva e ne informano immediatamente la Commissione .  Articolo 4  Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva .  Fatto a Bruxelles , il 5 dicembre 1972 .  Per la Commissione  Il Presidente  S . L . MANSHOLT  ALLEGATO I  1 . DETERMINAZIONE DELL'UMIDITA NEI GRASSI E NEGLI OLI ANIMALI E VEGETALI  1 . Scopo e campo d'applicazione  Il metodo permette di determinare il contenuto in umidità ( acqua ed altre materie volatili ) dei grassi e degli oli animali e vegetali .  2 . Principio  Il campione viene sottoposto ad essiccazione a 103 * C fino a cessazione della diminuzione di massa . La perdita di massa viene determinata per pesata .  3 . Apparecchiatura  3.1 . Recipiente a fondo piano , di materiale resistente alla corrosione , diametro : da cm 8 a 9 , altezza : circa cm 3  3.2 . Termometro a mercurio con bulbo rinforzato e camera di espansione all'estremità superiore , graduato da circa 80 * C ad almeno 110 * C , lunghezza : circa cm 10 .  3.3 . Bagno di sabbia o piastra elettrica riscaldante  3.4 . Essiccatore , contenente un efficace disidratante  3.5 . Bilancia analitica  4 . Modo di operare  Pesare , con l'approssimazione di mg 1 , circa g 20 del campione omogeneizzato nel recipiente ( 3.1 ) , essiccato e tarato , contenente il termometro ( 3.2 ) . Riscaldare sul bagno di sabbia o sulla piastra riscaldante ( 3.3 ) , agitando continuamente con il termometro , in modo da far salire la temperatura a 90 * C in circa 7 minuti .  Ridurre l'intensità del riscaldamento secondo la frequenza con la quale le bolle risalgono dal fondo del recipiente . La temperatura non deve superare i 105 * C . Continuare ad agitare raschiando il fondo del recipiente sino a quando non si formano più bolle .  Per assicurare l'eliminazione completa dell'umidità , riscaldare più volte a 103 * C pio meno 2 * C , raffreddando a 93 * C tra i riscaldamenti successivi . Lasciar quindi raffreddare nell'essiccatore ( 3.4 ) , sino a temperatura ambiente e pesare . Ripetere l'operazione fino a quando la perdita di massa tra due pesate successive non supera mg 2 .  N . B . Un aumento della massa del campione dopo i ripetuti riscaldamenti indica un'ossidazione del grasso . In questo caso , calcolare il risultato basandosi sulla pesata effettuata immediatamente prima che la massa abbia incominciato ad aumentare .  5 . Calcolo dei risultati  Il contenuto in umidità , in per cento del campione , è dato dalla seguente formula :  ( M1 - M2 ) * 100/Mo  in cui :  M0 = massa , in grammi , della quantità di prodotto sottoposta all'analisi  M1 = massa , in grammi , del recipiente con il suo contenuto prima del riscaldamento  M2 = massa , in grammi , del recipiente con il suo contenuto dopo il riscaldamento .  I risultati inferiori a 0,05 % debbono essere riportati con la dizione " meno di 0,05 % " .  Ripetibilità  La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele , effettuate sullo stesso campione , non deve oltrepassare 0,05 % in valore assoluto .  2 . DETERMINAZIONE DEL MAGNESIO  _ per spettrofotometria d'assorbimento atomico _  1 . Scopo e campo di applicazione  Il metodo permette di determinare il magnesio nei mangimi . Esso è particolarmente adatto per determinare i contenuti di magnesio inferiori al 5 % .  2 . Principio  Il campione viene incenerito e sciolto nell'acido cloridrico diluito . Se non contiene sostanze organiche , viene sciolto direttamente all'acido cloridrico diluito . La soluzione viene diluita e il contenuto di magnesio viene determinato con la spettrofotometria d'assorbimento atomico a 285,2 nm , per raffronto con soluzioni tipo .  3 . Reattivi  3.1 . Acido cloridrico p . a . , d : 1,16  3.2 . Acido cloridrico p . a . , d : 1,19  3.3 . Magnesio , in nastro o filo , o solfato di magnesio MgSO4 : 7H2O p . a . essiccato nel vuoto a temperatura ambiente  3.4 . Soluzione di sale di stronzio ( cloruro o nitrato ) al 2,5 % ( p/v ) di stronzio ( = 76,08 g di SrCl26 H2O p . a./1 o 60,38 g di Sr ( NO3 ) 2 p . a./1 ) .  3.5 . Soluzione tipo di magnesio : pesare , con la precisione di mg 1 , g 1 di magnesio ( 3.3 ) liberato con cura della pellicola di ossido od una quantità corrispondente di solfato di magnesio ( 3.3 ) , introdurlo in un pallone tarato da ml 1 000 , aggiungere ml 80 di acido cloridrico ( 3.1 ) , lasciare sciogliere e portare a ml 1 000 aggiungendo acqua ; ml 1 di tale soluzione contiene mg 1,000 di magnesio .  4 . Apparecchiatura  4.1 . Crogiolo da incenerimento di platino , quarzo o porcellana  4.2 . Forno elettrico a muffola , provvisto di termostato  4.3 . Spettrofotometro d'assorbimento atomico  5 . Modo di operare  5.1 Preparazione della soluzione  5.1.1 . Alimenti costituiti esclusivamente da sostanze minerali  Pesare , con l'approssimazione di mg 1 , g 5 del campione , introdurli in un pallone tarato da ml 500 con ml 250 a 300 d'acqua . Aggiungere ml 40 di acido cloridrico ( 3.1 ) . Portare ad ebollizione e lasciare bollire lentamente il liquido per 30 minuti . Lasciare raffreddare , portare a volume con acqua , mescolare e filtrare su filtro di carta a pieghe asciutto . Scartare i primi ml 30 di filtrato .  In presenza di silice trattare g 5 di campione con una quantità sufficiente ( ml 15 a 30 ) di acido cloridrico ( 3.2 ) ed evaporare a secco a bagnomaria . Proseguire come indicato in 5.1.2 a partire dal 3 * periodo .  5.1.2 . Alimenti costituiti essenzialmente da sostanze minerale  Pesare , con l'approssimazione di mg 1 , g 5 del campione in un crogiolo da incenerimento ed incenerire a 550 * C in un forno a muffola , sino ad ottenere ceneri esenti da particelle carboniose .  Per eliminare la silice , aggiungere alle ceneri una quantità sufficiente ( ml 15 a 30 ) di acido cloridrico ( 3.2 ) , ed evaporare a secco su bagnomaria . Essiccare poi per un'ora in stufa a 105 * C . Riprendere il residuo con ml 10 di acido cloridrico ( 3.1 ) e trasferire , mediante acqua calda , in pallone tarato da ml 500 . Portare all'ebollizione , lasciar raffreddare e portare a volume con acqua . Mescolare e filtrare su filtro di carta asciutto in un bicchiere asciutto . Scartare i primi ml 30 di filtrato .  5.1.3 . Alimenti costituiti essenzialmente da sostanze organiche  Pesare , con l'approssimazione di mg 1 , g 5 del campione in un crogiolo da incenerimento e incenerire a 550 * C in un forno a muffola , sino a ottenere ceneri esenti da particelle carboniose . Riprendere le ceneri con ml 5 di acido cloridrico ( 3.2 ) , evaporare a secco in bagno maria ed essiccare quindi per un'ora in una stufa a 105 * C per insolubilizzare la silice . Riprendere il residuo con ml 5 di acido cloridrico ( 3.1 ) , trasferire , con l'ausilio di acqua calda , in un pallone tarato da ml 250 , portare all'ebollizione , lasciar raffreddare e portare a volume con acqua . Mescolare e filtrare su filtro di carta asciutto in un bicchiere asciutto . Scartare i primi ml 30 di filtrato .  5.2 Misura dell'assorbimento atomico  Preparare almeno 5 soluzioni di riferimento a concentrazioni crescenti , scelte in funzione della zona di misurazione optimum dello spettrofotometro , diluendo con acqua la soluzione campione ( 3.5 ) . Aggiungere a ciascuna soluzione ml 10 di soluzione di sale di stronzio ( 3.4 ) e completare quindi il volume a ml 100 mediante aggiunta d'acqua .  Diluire con acqua una parte del filtrato ottenuto in 5.1.1 , 5.1.2 o in 5.1.3 in modo da ottenere una concentrazione di magnesio compresa fra i limiti di concentrazione delle soluzioni di riferimento . La concentrazione di acido cloridrico di questa soluzione non deve essere superiore a 0,4 N . Aggiungere ml 10 di soluzione di sale di stronzio ( 3.4 ) e completare quindi il volume a ml 100 mediante aggiunta d'acqua .  Misurare l'assobimento della soluzione da determinare e delle soluzioni di riferimento alla lunghezza d'onda di 285,2 nm .  6 . Calcolo dei risultati  Determinare la quantità di magnesio del campione riferendosi alle soluzioni campione . Esprimere il risultato in percento del campione .  Ripetibilità  La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele effettuate su di uno stesso campione non deve essere superiore al 5 % , in valore relativo .  3 . DETERMINAZIONE DELLA CELLULOSA GREZZA  1 . Scopo e campo d'applicazione  Il metodo permette di determinare nei mangimi le materie organiche , esenti da grasso , insolubili in ambiente acido e in ambiente alcalino , convenzionalmente designate con il nome di cellulosa grezza .  2 . Principio  Il campione , eventualmente sgrassato , è trattato successivamente con soluzioni bollenti di acido solforico e di idrossido di potassio di concentrazioni determinate . Il residuo è separato per filtrazione su amianto , lavato , essiccato , pesato e calcinato a 900 * C . La perdita di peso conseguente alla calcinazione corrisponde alla cellulosa grezza della quantità di prodotto sottoposta all'analisi .  3 . Reattivi  3.1 . Acido solforico p . a . 0,26 N  3.2 . Amianto trattato : aggiungere ad amianto per crogiolo di Gooch circa cinque volte il suo peso di acido cloridrico diluito ( un volume di acido cloridrico , d : 1,19 , più tre volumi d'acqua ) . Far bollire la miscela per circa 45 minuti , lasciar raffreddare , filtrare su imbuto di Buechner . Lavare il residuo prima con acqua , fino all'eliminazione dell'acido cloridrico nelle acque di lavaggio , e poi con acetone ( 3.6 ) . Essiccare l'amianto nella stufa e calcinarlo quindi per due ore a 900 * C . Lasciar raffreddare e conservare in bottiglia chiusa . L'amianto cosi trattato puo essere utilizzato più di una volta . Esso deve essere conforme alle prescrizioni di cui al punto 5.1 per quanto riguarda la prova in bianco .  3.3 . Emulsione antischiuma ( per esempio silicone )  3.4 . Soluzione d'idrossido di potassio p . a . 0,23 N  3.5 . Acido cloridrico 0,5 N  3.6 . Acetone puro  3.7 . Etere dietilico puro  4 . Apparecchiatura  4.1 . Becher da almeno ml 600 , graduato a ml 200  4.2 . Dischi di porcellana del diametro di circa mm 80 e dello spessore di circa mm 4 , con circa 32 fori dal diametro di circa mm 4 ciascuno .  4.3 . Beute da vuoto da circa 1 2 , con tappo di gomma , graduate in corrispondenza di ml 800 e provviste di un imbuto di vetro del diametro di mm 120 .  4.4 . Piastre filtranti del diametro di circa mm 40 e dello spessore di circa mm 4 , con bordo obliquo adattato al cono dell'imbuto ( 4.3 ) , con 16 fori di circa mm 4 di diametro ciascuno e ricoperte da una griglia metallica a maglio di circa mm 1 di lato . Le piastre e le griglie metalliche non debbono alterarsi per azione degli acidi o degli alcali .  4.5 . Crogioli di platino o di quarzo per incenerimento  4.6 . Forno elettrico a muffola , con termostato .  4.7 . Essiccatore  4.8 . Filtro di amianto  Mettere in sospensione g 2,0 di amianto ( 3.2 ) in ml 100 d'acqua . Filtrare sotto vuoto su una piastra filtrante ricoperta da una griglia metallica ( 4.4 ) posta nell'imbuto di una beuta da vuoto ( 4.3 ) . Raccogliere il filtrato e filtrarlo nuovamente con lo stesso filtro . Eliminare il filtrato .  5 . Modo di operare  Pesare , con l'approssimazione di mg 1 , g 3 di campione e g 2 di amianto trattato ( 3.2 ) in un becher ( 4.1 ) , aggiungere ml 200 di acido solforico ( 3.1 ) e qualche goccia di emulsione antischiuma ( 3.3 ) . Portare rapidamente all'ebollizione e lasciare bollire per 30 minuti esatti . Per mantenere costante il volume , coprire il becher con un dispositivo raffreddante , per esempio un pallone a fondo rotondo da ml 500 a circolazione di acqua fredda . Interrompere l'ebollizione aggiungendo circa ml 50 d'acqua fredda e filtrare immediatamente sotto vuoto su un filtro di amianto già preparato comme indicato in 4.8 .  Lavare il residuo con 5 parti da circa ml 100 di aqua molto calda per ottenere un volume finale di filtrato di ml 800 . Travasare tutto il residuo nel becher ( 4.1 ) , nel quale è già stato collocato un disco di porcellana ( 4.2 ) per rendere regolare l'ebollizione . Aggiungere ml 200 di soluzione di idrossido di potassio ( 3.4 ) . Portare rapidamente all'ebollizione e lasciar bollire per 30 minuti esatti . Aggiungere circa ml 50 d'acqua fredda e filtrare immediatamente sotto vuoto su un nuovo filtro di amianto già preparato come indicato sub 4.8 . Lavare il residuo con acqua molto calda fino a neutralità delle acque di lavaggio ( saggio su tornasole ) ; lavare quindi tre volte con acetone ( 3.6 ) ( complessivamente , circa ml 100 ) .  Trasferire quantitativamente il residuo in un crogiuolo per incenerimento ( 4.5 ) , sminuzzarlo _ se necessario _ ed essiccare nella stufa a 130 * C fino a peso costante .  Far raffreddare in essiccatore e pesare rapidamente . Introdurre quindi il crogiolo nel forno a muffola ( 4.6 ) e lasciar calcinare per 30 minuti a 900 * C . Far raffreddare nell'essiccatore e pesare rapidamente .  Eseguire con lo stesso procedimento una prova in bianco con l'amianto trattato ( 3.2 ) , senza campione . La perdita di peso conseguente alla calcinazione dei g 6 d'amianto non deve essere superiore a mg 10 .  6 . Calcolo dei risultati  Il contenuto in cellulosa grezza , in percento del campione , è dato dalla formula : ( a _ b ) . 100/3  in cui :  a = perdita di peso conseguente alla calcinazione , nella determinazione ,  b = perdita di peso conseguente alla calcinazione , nella prova in bianco .  Ripetibilità  La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele eseguite sullo stesso campione non deve superare :  0,3 in valore assoluto , per i contenuti di cellulosa grezza inferiori al 10 % ; 3 % in valore relativo per i contenuti di cellulosa grezze uguali o superiori al 10 % .  7 . Osservazioni  7.1 . Gli alimenti che contengono più del 10 % di materie grasse debbono essere sgrassati prima dell'analisi con etere dietilico . A tale scopo , collocare il saggio ( g 3 pesati con l'approssimazione di mg 1 ) su un filtro d'amianto ( 4.8 ) . Coprire 3 volte con circa ml 50 di etere dietilico ( 3.7 ) e filtrare ogni volta sotto vuoto con precauzione . Travasare tutto il saggio e l'amianto in un becher ( 4.1 ) e proseguire l'analisi come indicato in 5 .  7.2 . Gli alimenti che contengono materie grasse non direttamente estraibili debbono essere sgrassati una prima volta come indicato sub 7.1 ed una seconda volta dopo il lavaggio del residuo dell'attacco acido .  A questo scopo , lavare tre volte il residuo di questo attacco con acetone ( 3.6 ) ( complessivamente ml 100 ) , quindi altre tre volte con ml 50 di etere di etilico ( 3.7 ) . Versare quindi tutti i residui in un becher ( 4.1 ) e proseguire l'analisi come indicato in 5 , secondo capoverso ( trattamento con la soluzione di idrossido di potassio ) .  7.3 . Nel caso di alimenti ricchi di calcio ( più del 2 % di calcio ) versare il saggio ( g 3 pesati con l'approssimazione di mg 1 ) in un becher ( 4.1 ) contenente ml 100 di acido cloridrico 0,5 N ( 3.5 ) e lasciare riposare a freddo per 5 minuti . Filtrare immediatamente e lavare con acqua fredda . Utilizzare come adiuvante di filtrazione i g 2,0 di amianto previsti per l'ebollizione con l'acido solforico . Se la filtrazione risulta difficile , diluire la sospensione con acetone . Procedere quindi come indicato in 5 .  ALLEGATO II  1 . DETERMINAZIONE DEL RETINOLO ( VITAMINA A )  1 . Scopo e campo di applicazione  Il metodo permette di determinare il contenuto di retinolo ( vitamina A ) nei mangimi , nei concentrati e nelle premiscele . Il limite inferiore di determinazione è 10 000 UI/kg per gli alimenti fortemente pigmentati , e di 4 000 UI/kg per gli altri prodotti ( 6 ) . I prodotti sono suddivisi in due gruppi a seconda del loro presunto contenuto in retinolo :  Gruppo A : contenuto inferiore a 200 000 UI/kg  Gruppo B : contenuto uguale o superiore a 200 000 UI/kg  2 . Principio  Il campione viene idrolizzato a caldo con una soluzione di idrossido di potassio in mezzo etanolico ed in presenza di una sostanza antiossidante o in atmosfera di azoto . La miscela è estratta con 1,2-dicloroetano . L'estratto è evaporato a secco e ripreso con etere di petrolio . La soluzione viene cromatografata su colonna di ossido di alluminio ( per i prodotti di cui al gruppo B la cromatografia è necessaria solo in alcuni casi ) . Il retinolo è determinato per spettrofotometria a 610 nm dopo la formazione di un complesso colorato con la reazione di Carr-Price , nel caso dei prodotti di cui al gruppo A ; per spettrofotometria nell'UV a 325 nm per quelli del gruppo B .  3 . Reattivi  a ) impiegati per l'analisi dei prodotti di cui ai gruppi A e B  3.1 . Etanolo al 96 % ( v/v )  3.2 . Soluzione al 10 % ( p/v ) di ascorbato di sodio p . a . oppure  3.3 . Azoto , purificato  3.4 . Soluzione al 50 % ( p/v ) di idrossido di potassio p . a .  3.5 . Soluzione di idrossido di potassio 1 N  3.6 . Soluzione di idrossido di potassio 0,5 N  3.7 . 1,2-dicloroetano p . a .  3.8 . Etere di petrolio , puro , punto di ebollizione 30 _ 50 * C . Se del caso , purificarlo nel seguente modo . Sbattere ml 1 000 di etere di petrolio ogni volta con ml 20 di acido solforico concentrato , fino a che l'acido resta incolore . Eliminare l'acido e lavare l'etere successivamente con ml 500 di acqua , due volte con ml 250 di una soluzione al 10 % di idrossido di sodio e tre volte con ml 500 di acqua . Eliminare la fase acquosa , essiccare l'etere per un'ora su carbone attivo e solfato di sodio anidro , filtrare e distillare .  3.9 . Ossido di alluminio standardizzato secondo Brockmann : calcinare per 8 ore a 750 * C , raffreddare in essiccatore e conservare in flacone di vetro scuro , con tappo smerigliato . Prima di utilizzarlo per la cromatografia , inumidirlo nel seguente modo : si introducono in una beuta di vetro scuro g 10 di ossido di alluminio e ml 0,7 di acqua , si chiude ermeticamente e si scalda per 5 minuti a bagnomaria bollente agitando di tanto in tanto energicamente . Lasciare raffreddare , agitando . Verificare l'attività dell'ossido di alluminio cosi preparato sottoponendo all'analisi secondo 5.3 e 5.4 una quantità nota ( 500 UI ) di retinolo tipo ( 3.17 ) .  3.10 . Ossido di alluminio basico , I grado di attività .  3.11 . Etere etilico , puro . Eliminare i perossidi e le tracce di acqua a mezzo di cromatografia su colonna di ossido di alluminio basico ( 3.10 ) ( g 25 di ossido di alluminio per ml 250 di etere etilico ) .  3.12 . Soluzioni di etere di petrolio ( 3.8 ) al 4 % , 8 % , 12 % , 16 % e 20 % di etere etilico ( 3.11 ) .  3.13 . Soluzione di solfuro di sodio 0,5 M in glicerina al 70 % ( v/v ) , preparata a partire da solfuro di sodio p . a .  b ) impiegati esclusivamente per l'analisi dei prodotti del gruppo A  3.14 . Benzene p . a . , cristallizzabile  3.15 . Cloroformio p . a . Eliminare l'etanolo , il fosgene e le tracce di acqua a mezzo di cromatografia su colonna di ossido di alluminio basico ( 3.10 ) ( g 50 di ossido di alluminio per ml 200 di cloroformio ; conviene cromatografare una seconda volta i primi ml 50 di eluato ) .  3.16 . Reattivo di Carr-Price : agitare g 25 circa di tricloruro di antimonio p . a . ( conservato in essiccatore ) con ml 100 di cloroformio ( 3.15 ) fino a saturazione della soluzione . Un modico deposito di tricloruro di antimonio non disturba . Aggiungere ml 2 di anidride acetica p . a . Conservare in una bottiglia di vetro scuro con tappo smerigliato , in frigorifero . Si conserva per parecchie settimane .  3.17 . Retinolo tipo controllato spettrofotometricamente .  c ) impiegati esclusivamente per l'analisi dei prodotti del gruppo B  3.18 . Isopropanolo , per cromatografia  4 . Apparecchiatura  4.1 . Bagnomaria  4.2 . Apparecchio rotativo per evaporazione sotto vuoto provvisto di palloni di differenti capacità  4.3 . Colonne da cromatografia , in vetro ( lunghezza : mm 300 , diametro interno : circa mm 13 )  4.4 . Spettrofotometro con vaschette da mm 10 ( di quarzo nel caso di misure nell'UV )  4.5 . Lampada UV ; 365 nm  5 . Modo di operare  N . B . Tutte le operazioni debbono essere fatte in assenza d luce diretta ed impiegando vetreria scura  5.1 . Entità del campione  Prelevare una quantità di campione finemente macinato proporzionale al presunto contenuto in vitamina A , e cioè :  g 0,1-1,0 per i concentrati ( contenuti superiori a 20 000 UI/g ) ;  g 3,0-5,0 per le premiscele ( contenuti compresi tra 400 e 20 000 UI/g ) ;  g 10-20 per le miscele minerali ;  g 30 per i prodotti di cui al gruppo A .  Introdurre immediatamente la quantità di sostanze da sottoporre ad analisi in un pallone da ml 500 a collo smerigliato .  5.2 . Idrolisi ed estrazione ( 7 )  Aggiungere successivamente alla quantità di sostanza da sottoporre ad analisi ml 40 di etanolo ( 3.1 ) , ml 2 della soluzione di ascorbato di sodio ( 3.2 ) ( 8 ) , ml 10 della soluzione di idrossido di potassio ( 3.4 ) e ml 2 della soluzione di solfuro di sodio ( 3.13 ) . Scaldare il pallone , innestato su un refrigerante a ricadere , per 30 min a 70-80 * C , raffreddandolo poi sotto acqua corrente . Aggiungere ml 50 di etanolo ( 3.1 ) e ml 100 ( prelevato con pipetta tarata ) di 1,2-dicloroetano ( 3.7 ) . Agitare energicamente e travasare poi il supernatante in un imbuto separatore . Aggiungere , nell'imbuto separatore , ml 150 della soluzione di idrossido di potassio ( 3.5 ) , agitare per 10 secondi e lasciare riposare fino alla separazione delle fasi . Raccogliere la fase dicloroetanica ( fase inferiore ) in un altro imbuto separatore , aggiungere ml 40 della soluzione di idrossido di potassio ( 3.6 ) , agitare per 10 secondi e lasciare riposare fino alla separazione delle fasi . Raccogliere la fase dicloroetanica in imbuto separatore e lavarla 6-8 volte con ml 40 di acqua per volta , fino alla scomparsa della reazione alcalina ( saggio alla fenolftaleina ) . Raccogliere la fase dicloroetanica ed eliminare le ultime tracce di acqua a mezzo di strisce di carta da filtro .  Evaporare a secco una parte aliquota della soluzione , su bagnomaria alla temperatura di 40 * C e sotto vuoto . Riprendere rapidamente il residuo con ml 5 di etere di petrolio ( 3.8 ) .  Per i prodotti di cui al gruppo A cromatografare come descritto al punto 5.3.1 .  Per i prodotti di cui al gruppo B , trasferire la soluzione in un pallone tarato da ml 50 , portare a volume con etere di petrolio ( 3.8 ) , omogeneizzare e misurare la densità ottica come indicato al punto 5.4.2 .  5.3 . Cromatografia  5.3.1 . Prodotti appartenenti al gruppo A  Riempire un tubo per cromatografia ( 4.3 ) , fino all'altezza di mm 200 , di g 10 di ossido di alluminio , preparato secondo ( 3.9 ) , precedentemente impregnato con etere di petrolio ( 3.8 ) . Introdurre nella colonna la soluzione ottenuta in 5.2 e aggiungere immediatamente ml 20 di etere di petrolio ( 3.8 ) . Eluire successivamente con aliquote di ml 10 delle soluzioni di etere di petrolio al 4 % , 8 % , 12 % , 16 % e 20 % di etere etilico ( 3.12 ) , sotto vuoto parziale o sotto pressione in modo che la velocità di eluizione sia di 2 a 3 gocce al secondo .  Il carotene è eluito per primo ( 9 ) . Il retinolo è generalmente eluito a mezzo della soluzione di etere di petrolio al 20 % di etere etilico ( 3.12 ) . L'eluizione viene controllata in luce ultravioletta ( irradiando per brevissimo tempo la colonna con una lampada a mercurio ) . La banda fluorescente del retinolo è nettamente distinta dalle bande gialle che la seguono e che sono le xantofille . Raccogliere la frazione di eluato che contiene il retinolo in una erlenmeyer .  5.3.2 . Prodotti appartenenti al gruppo B  La cromatografia viene effettuata solo se le misure della densità ottica ottenute secondo 5.4.2 non sono conformi alle prescrizioni indicate in 5.4.2 .  Se è necessaria la cromatografia , introdurre nella colonna cromatografica una parte aliquota della soluzione in etere di petrolio ottenuta in 5.2 , contenente all'incirca 500 UI di retinolo e cromatografare nel modo indicato in 5.3.1 .  5.4 . Misure della densità ottica  5.4.1 . Prodotti appartenenti al gruppo A  Portare a secco sotto vuoro l'eluato contenente il retinolo , ottenuto in 5.3.1 . Riprendere il residuo con ml 2 di benzene ( 3.14 ) . Prelevare ml 0,3 di questa soluzione ed aggiungervi ml 3 del reattivo di Carr-Price ( 3.16 ) . Si sviluppa una colorazione blu . Misurare la densità ottica allo spettrofotometro a 610 nm , esattamente 30 secondi dopo l'inizio della reazione . Determinare il contenuto in retinolo riferendosi ad una curva di taratura ottenuta a partire da soluzioni benzeniche di retinolo tipo a concentrazioni crescenti trattate con il reattivo di Carr-Price ( da 2 a 16 UI di retinolo tipo ( 3.17 ) in ml 0,3 di benzene ( 3.14 ) + ml 3 di reattivo di Carr-Price ( 3.16 ) . La curva di taratura deve essere periodicamente ricontrollata sulla scorta dello standard e della soluzione del reattivo di Carr-Price preparato di fresco .  5.4.2 . Prodotti appartenenti al gruppo B  Prelevare una parte aliquota della soluzione in etere di petrolio ottenuta in 5.2 e contenente all'incirca 200 UI di retinolo . Portare a secco sotto vuoto e riprendere il residuo con ml 25 di isopropanolo ( 3.18 ) . Misurarne la densità ottica allo spettrofotometro a 325 , 310 e 334 nm . Il massimo di assorbimento è a 325 nm . Il contenuto in retinolo della soluzione viene calcolato nel seguente modo :  E325 18,30 = UI di vitamina A/ml  I rapporti tra le densità ottiche  E310 : E325 ed E334 : E325  debbono essere di 6 : 7 = 0,857 .  Se uno di questi rapporti si scosta sensibilmente da questo valore ( * 0,830 o * 0,880 ) , la determinazione delle densità ottiche deve essere preceduta dalla cromatografia secondo le modalità indicate in 5.3.2 . Se la misura delle densità ottiche effettuata dopo cromatografia fa rilevare che i rapporti sopraddetti si scostano ancora sensibilimente dal valore di 0,857 ( * 0,830 o * 0,880 ) la determinazione deve essere effettuata seguendo il procedimento previsto per i prodotti del gruppo A .  6 . Calcolo del risultato  Calcolare il contenuto in retinolo del campione tenendo conto del peso della sostanza sottoposta ad analisi e delle diluizioni effettuate nel corso della analisi . Esprimere i risultati in UI di retinolo per kg .  Ripetibilità  La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare :  _ 20 % , in valore relativo , per i contenuti inferiori a 75 000 UI/kg ;  _ 15 000 UI per i contenuti compresi tra 75 000 e 150 000 UI/kg ;  _ 10 % , in valore relativo , per i contenuti compresi tra 150 000 e 250 000 UI/kg ;  _ 25 000 UI per i contenuti compresi tra 250 000 e 500 000 UI/kg ;  _ 5 % , in valore relativo , per i contenuti che superano le 500 000 UI/kg .  2 . DETERMINAZIONE DELLA TIAMINA ( ANEURINA , VITAMINA B1 )  1 . Scopo e campo di applicazione  Il metodo permette di determinare il contenuto in tiamina ( aneurina , vitamina B1 ) dei mangimi , dei concentrati e delle premiscele . Il limite inferiore della determinazione è di 5 ppm .  2 . Principio  Il campione viene trattato a caldo con acido solforico diluito e poi idrolizzato per via enzimatica . La soluzione ottenuta è sottoposta ad ossidazione alcalina . Il tiocromo che cosi si forma è estratto con isobutanolo e determinato per fluorimetria .  3 . Reattivi  3.1 . Soluzione tipo di tiamina a 100 ug/ml : sciogliere mg 112,3 di cloridrato di tiamina purissimo , precedentemente seccato sotto vuoto fino a peso costante , in ml 1000 di acido solforico 0,2 N ( 3.2 ) . Al freddo e lontano dalla luce diretta questa soluzione si conserva per un mese .  3.2 . Acido solforico 0,2 N  3.3 . Disolfito di sodio , puro  3.4 . Soluzione al 20 % ( p/v ) di ferricianuro di potassio p . a .  3.5 . Soluzione al 25 % ( p/v ) di idrossido di potassio p . a .  3.6 . Miscela ossidante : mescolare ml 2 della soluzione di ferricianuro di potassio ( 3.4 ) a ml 48 della soluzione di idrossido di potassio ( 3.5 ) . Questa miscela non si conserva più di 4 ore .  3.7 . Isobutanolo , p . a .  3.8 . Soluzione di acetato di sodio p . a . 2,5 N  3.9 . Preparazione multienzimatica contenente proteasi , fosfatasi e amilasi ( per esempio , clarasi )  3.10 . Etanolo al 96 % ( v/v )  4 . Apparecchiatura  4.1 . Bagnomaria  4.2 . Centrifuga ( 3 500 giri/min ) con tubi di ml 30-50 di capacità , provvisti di tappo smerigliato  4.3 . Fluorimetro  5 . Modo di operare  5.1 . Idrolisi enzimatica  Mettere in due palloni tarati da ml 250 e denominati A e B una medesima quantità di materiale prelevato dal campione finemente macinato e contenenti circa ug 100 di tiamina ; aggiungere ml 125 di acido solforico ( 3.2 ) . Al solo pallone A aggiungere , inoltre , ml 1 della soluzione tipo ( 3.1 ) ( tipo interno ) .  Agitare energicamente , porre i palloni in un bagnomaria bollente e tenerveli per 15 minuti agitandoli di tanto in tanto . Lasciare raffreddare fino a 45 * C circa . Aggiungere in ogni pallone ml 20 della soluzione di acetato di sodio ( 3.8 ) e g 0,5 della preparazione multienzimatica ( 3.9 ) ; lasciare riposare per 20 minuti a temperatura ambiente . Aggiungere ml 20 della soluzione di acetato di sodio ( 3.8 ) , portare a volume con acqua , omogeneizzare e filtrare . Raccogliere i filtrari A e B dopo averne scortato i primi ml 15 . Preparare le seguenti soluzioni .  5.1.1 . Soluzione tipo T  Porre in un tubo da centrifuga ( 4.2 . ) ml 5 del filtrato A e mg 10 circa di disolfito di sodio ( 3.3 . ) . Immergere il tubo in un bagnomaria bollente per 15 minuti e lasciarlo poi raffreddare fino a temperatura ambiente .  5.1.2 . Soluzioni A ( tipo interno ) e B ( campione )  Introdurre in un tubo da centrifuga ( 4.2 ) ml 5 del filtrato A ed in altro tubo ( 4.2 ) ml 5 del filtrato B .  5.2 . Ossidazione  Aggiungere alle soluzioni T , A e B ml 5 della miscela ossidante ( 3.6 ) , dopo un minuto , ml 10 di isobutanolo ( 3.7 ) . Tappare i tubi e agitare energicamente per 5 secondi . Lasciare riposare per un minuto e centrifugare per separare le fasi . Prelevare da ogni tubo ml 5 della fase superiore isobutanolica , introdurli rispettivamente in altrettanti palloni tarati da ml 25 , portare a volume con etanolo ( 3.10 ) ed omogeneizzare ( = estratti T , A e B ) .  5.3 . Misurazione della fluorescenza  Effettuare le misure alla lunghezza d'onda alla quale il fluorimetro dà una risposta ottimale alla fluorescenza del tiocromo . Irradiare a circa 365 nm . Azzerare lo strumento con l'estratto T . Misurare la intensità della fluorescenza degli estratti A e B .  6 . Calcolo del risultato  Il contenuto in ug di tiamina per kg di campione è dato dalla fomula :  dove  a = intensità della fluorescenza dell'estratto A ( tipo interno )  b = intensità della fluorescenza dell'estratto B ( campione )c = peso in g delle quantità di sostanza sottoposte all'analisi  d = quantità di tiamina , in ug , aggiunta alla quantità di sostanza sottoposta all'analisi ( tipo interno )  Ripetibilità  La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare :  _ 10 % , in valore relativo , per i contenuti inferiori a 500 mg/kg  _ 5 % , in valore relativo , per i contenuti uguali o superiori a 500 mg/kg .  3 . DETERMINAZIONE DELL'ACIDO ASCORBICO E DELL'ACIDO DEIDROASCORBICO ( VITAMINA C )  1 . Scopo e campo di applicazione  Il metodo permette di determinare la somma degli acidi ascorbico e deidroascorbico ( vitamina C ) nei mangimi , nei concentrati e nelle premiscele . Il limite inferiore della determinazione è di 5 ppm . I prodotti sono suddivisi in due gruppi a seconda del loro presunto contenuto in vitamina C :  Gruppo A : contenuto inferiore a g 10/kg  Gruppo B : contenuto uguale o superiore a g 10/kg  2 . Principio  Il campione , posto in sospensione in una soluzione diluita di acido metafosforico , è estratto con cloroformio . La fase acquosa viene trattata con una soluzione di 2,6-diclorofenol-indofenolo , per trasformare l'acido ascorbico in acido deidroascorbico , e poi con una soluzione di 2,4-dinitrofenilidrazina . L'idrazone che si forma è estratto con una miscela di acetato di etile , acido acetico glaciale e acetone . La soluzione viene cromatografata su colonna di gel di silice , l'eluato è evaporato a secco ed il residuo viene disciolto in acido solforico diluito . La densità ottica della soluzione viene determinata con il fotometro a 509 nm .  Per i prodotti del gruppo A , l'eluato , ottenuto per cromatografia su colonna , viene inoltre cromatografato su strato sottile per isolare l'idrazone .  3 . Reattivi  3.1 . Soluzione tipo allo 0,05 % di acido L-ascorbico : sciogliere mg 50 di acido L-ascorbico p . a . in circa ml 20 della soluzione di acido metafosforico ( 3.2 ) e portare a ml 100 con acqua . Da prepararsi al momento dell'uso .  3.2 . Soluzioni al 10 % ( p/v ) di acido metafosforico : sciogliere in acqua g 200 di acido metafosforico p . a . , sminuzzati in mortaio , e portare a ml 2000 con acqua . Conserva al 4 * C . Stabile per una settimana .  3.3 . Cloroformio p . a .  3.4 . Soluzione allo 0,5 % ( p/v ) di 2,6-diclorofenol-indofenolo p.a . Da prepararsi al momento dell'uso  3.5 . Coadiuvanti per la filtrazione ( S . ed S . n . 121 analoghi )  3.6 . Soluzione acida al 2 % ( p/v ) di 2,4-dinitrofenilidrazina : sciogliere g 2 di 2,4-dinitrofenilidrazina in ml 100 di acido solforico diluito ( ml 25 di acido solforico p . a . , d : 1,84 , portati a ml 10 con acqua ) . A freddo questa soluzione si conserva una settimana .  3.7 . Azoto oppure  3.8 . Anidride carbonica , in bombole  3.9 . Miscela di acetato di etile p . a./acido acetico glaciale/acetone p . a . 96/2/2 in volume  3.10 . Miscela di diclorometano p . a./acido acetico glaciale : 97 /* 3 in volume  3.11 . Gel di silice , granulometria : mm 0,05-0,2  3.12 . Gel di silice H , secondo Stahl , per cromatografia su strato sottile  3.13 . Acido solforico diluito : porre ml 105 di acqua in un pallone tarato da ml 200 e portare a volume con acido solforico p . a . , d : 1,84  3.14 . Solvente di eluizione per cromatografia su strato sottile : miscelare ml 75 di etere etilico p . a . , ml 25 di acetato di etile p . a . e ml 4,0 di acido acetico al 96 % ( p/v ) . Rinnovarlo dopo 2-3 cromatografie .  4 . Apparecchiatura  4.1 . Bagno termostatico regolato a + 20 * C  4.2 . Centrifuga ( g/m 3 500 ) con tubi di ml 40-50 di capacità , provvisti di tappo smerigliato  4.3 . Apparecchio rotativo per evaporazione sotto vuoto provvisto di palloni da ml 250 .  4.4 . Colonne da cromatografia , in vetro ( altezza : mm 100 , diametro interno mm 20 ) provviste di setto poroso in vetro ( ad esempio tubi di Allihn )  4.5 . Spettrofotometro o colorimetro a filtri , con vaschette di mm 10 di spessore ,  4.6 . Apparecchiatura per cromatografia su strato sottile , con lastre di gel di silice ( 3.12 ) spessore dello strato mm 0,5-0,6 ( vanno bene le lastre pronte per l'impiego ) . Seccare le lastre per 2h30-3 ore in stufa a 120-130 * C .  Lasciare raffreddare e conservare poi in essiccatore almeno 24 ore prima di utilizzarle .  4.7 . Stufa a secco regolata a 120-130 * C .  5 . Modo di procedere  5.1 . Estrazione  Introdurre in due palloni tarati A e B da ml 250 , provvisti di tappo smerigliato , quantità identiche di campione finemente macinato , contenenti circa 200 *g di vitamina C . Aggiungere solo nel pallone A ml 0,4 della soluzione tipo di vitamina C ( 3.1 ) ed omogeneizzare scuotendo leggermente ( tipo interno ) .  Aggiungere in ogni pallone ml 30 di cloroformio ( 3.3 ) e ml 25 della soluzione di acido metafosforico ( 3.2 ) a 4 * C . Agitare brevemente e lasciare poi riposare per 10-15 minuti . Aggiungere ml 25 di acqua , tappare bene i palloni , agitare energicamente per 10 secondi e lasciare riposare per 10-15 minuti nel bagno termostatico ( 4.1 ) . Centrifugare per separare la fase acquosa da quella cloroformica . Proseguire le operazioni simultaneamente sugli estratti acquosi A ( tipo interno ) e B , come descritto qui di seguito .  5.2 . Ossidazione  Prelevare con una pipetta tarata ml 40 della soluzione acquosa sovrastante ( leggermente torbida ) ottenuta in 5.1 , introdurla in un provettone a tappo smerigliato , aggiungervi ml 0,5-1 della soluzione di 2,6-diclorofenolindofenolo ( 3.4 ) e mescolare . Si forma una colorazione rossa , che deve persistere almeno 15 minuti . Aggiungere poi mg 300 circa di coadiuvante della filtrazione ( 3.5 ) , agitare e filtrare su un filtro a pieghe asciutto . Il filtrato puo non essere limpido .  5.3 . Reazione con la 2,4-dinitrofenilidrazina ed estrazione dell'idrazone  Prelevare con una pipetta tarata ml 10 del filtrato ottenuto in 5.2 , introdurli in un tubo da centrifuga ( 4.2 ) , aggiungere ml 2 della soluzione di 2,4-dinitrofenilidrazina ( 3.6 ) e mescolare . Fare passare rapidamente nel tubo una corrente di azoto ( 3.7 ) o di anidride carbonica ( 3.8 ) , tappare il tubo ed immergerlo per circa 15 ore ( una notte ) nel bagno termostatico ( 4.1 ) .  Aggiungere poi ml 3 di acqua , ml 20 della miscela acetato di etile/acido acetico glaciale/acetone ( 3.9 ) e mg 800 circa di coadiuvante della filtrazione ( 3.5 ) .  Tappare il tubo , agitare energicamente per 30 secondi e centrifugare . Introdure ml 15 della fase superiore in un pallone da evaporazione ed evaporare a pressione ridotta nell'evaporatore rotativo ( 4.3 ) , fino ad ottenere un residuo oleoso . Sciogliere il residuo in ml 2 della miscela acetato di etile/acido acetico glaciale/acetone ( 3.9 ) riscaldando a 50 * C ; lasciare raffreddare , aggiungere ml 10 della miscela diclorometano/acido acetico glaciale ( 3.10 ) e mescolare .  5.4 . Cromatografia su colonna  Riempire una colonna per cromatografia ( 4.4 ) , fino all'altezza di mm 30 , di miscela diclorometano/acido acetico glaciale ( 3.10 ) . Mettere in sospensione ( agitando energicamente ) in ml 30 della miscela diclorometano/acido acetico glaciale ( 3.10 ) g 5 di gel di silice ( 3.11 ) ; versare la sospensione nella colonna . Lasciare depositare e assestare poi sotto debole pressione di azoto ( 3.7 ) .  Versare nella colonna la soluzione ottenuta in 5.3 , lavare il pallone con una piccola quantità della miscela diclorometano/acido acetico glaciale ( 3.10 ) e versare nella colonna ; riempire poi quest'ultima con la miscela ( 3.10 ) e proseguire il lavaggio della colonna con la stessa miscela ( 3-4 aliquote di ml 5 circa ) fino ad ottenere un eluato incolore . Eliminare la frazione di eluato colorata in giallo .  Eluire la zona rossastra che sta in testa alla colonna con la miscela acetato di etile/acido acetico glaciale/acetone ( 3.9 ) , raccogliere l'eluato ed evaporarlo a secco .  5.4.1 . Per i prodotti del gruppo A ( contenuti in vitamina C inferiori a g 10/kg ) , sciogliere il residuo in ml 2 della miscela acetato di etile/acido acetico glaciale/acetone ( 3.9 ) e procedere immediatamente alla cromatografia su strato sottile come descritto in 5.5 .  5.4.2 . Per i prodotti del gruppo B ( contenuti in vitamina C uguali o superiori a g 10/kg ) , riprendere il residuo oleoso con ml 4,0 di acido solforico diluito ( 3.13 ) , agitare energicamente per scioglierlo completamente e provvedere alla misurazione della densità ottica come descritto in 5.6 .  5.5 . Cromatografia su strato sottile  Effettuare in doppio le operazioni indicate qui appresso . Deporre sulla lastra ( 4.6 ) sotto forma lineare ml 0,5 della soluzione ottenuta in 5.4.1 . Sviluppare per 20 minuti almeno col solvente di eluizione ( 3.14 ) , in vaschetta saturata , fino alla separazione netta della zona dell'idrazone colorato in rosa . Lasciare asciugare all'aria . Delimitare la zona rosa , raschiarla con una spatola e trasferire quantitativamente la massa polverulenta in una colonna per cromatografia ( 4.4 ) .  Eluire successivamente una volta con ml 2 e 2 volte con ml 1,5 della miscela acetato di etile/acido acetico glaciale/acetone ( 3.9 ) . Raccogliere l'eluato in un piccolo pallone ( l'ultima frazione deve essere incolore ) . Evaporare a secco , riprendere il residuo oleoso con ml 4,0 di acido solforico diluito ( 3.13 ) , agitare energicamente per sciogliere completamente il residuo e procedere alla misurazione della densità ottica .  5.6 . Misura della densità ottica  Misurare la densità ottica con il fotometro a 509 nm , 20-30 minuti dopo aver sciolto il residuo in acido solforico . Effettuare le misure in raffronto con l'acido solforico diluito ( 3.13 ) .  5.7 . Prova in bianco  Eseguire una prova in bianco applicando lo stesso modo di operare , in assenza del campione .  6 . Calcolo del risultato  Il contenuto in g di vitamina C per kg di campione è dato dalla formula : d . b / ( a - b ) c ( c - a ) per 2 / ( b - c ) per 10d  dove  a = densità ottica del bianco  b = densità ottica della soluzione del tipo interno  c = densità ottica della soluzione in esame  d = peso in g della quantità di sostanza sottoposta ad analisi .  Ripetibilità  La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non debbono superare :  _ 10 % , in valore relativo , per i contenuti in vitamina C inferiori a g 10 per kg :  _ 5 % , in valore relativo , per i contenuti uguali o superiori a g 10/kg .