CELEX: 32018R0150
Language: bg
Date: 2018-01-30 00:00:00
Title: Регламент за изпълнение (ЕС) 2018/150 на Комисията от 30 януари 2018 година за изменение на Регламент за изпълнение (ЕС) 2016/1240 по отношение на методите за анализ и оценка на качеството на млякото и млечните продукти, отговарящи на условията за публична интервенция и помощ за частно складиране

31.1.2018   
            
            
               BG
            
            
               Официален вестник на Европейския съюз
            
            
               L 26/14
            
         РЕГЛАМЕНТ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ (ЕС) 2018/150 НА КОМИСИЯТА
   от 30 януари 2018 година
   за изменение на Регламент за изпълнение (ЕС) 2016/1240 по отношение на методите за анализ и оценка на качеството на млякото и млечните продукти, отговарящи на условията за публична интервенция и помощ за частно складиране
   ЕВРОПЕЙСКАТА КОМИСИЯ,
   като взе предвид Договора за функционирането на Европейския съюз,
   като взе предвид Регламент (ЕС) № 1306/2013 на Европейския парламент и на Съвета от 17 декември 2013 г. относно финансирането, управлението и мониторинга на общата селскостопанска политика и за отмяна на регламенти (ЕИО) № 352/78, (ЕО) № 165/94, (ЕО) № 2799/98, (ЕО) № 814/2000, (ЕО) № 1290/2005 и (ЕО) № 485/2008 на Съвета (1), и по-специално член 62, параграф 2, буква и) от него,
   като има предвид, че:
   
               (1)
            
            
               В Делегиран регламент (ЕС) 2016/1238 на Комисията (2) и Регламент за изпълнение (ЕС) 2016/1240 на Комисията (3) се определят правилата относно публичната интервенция и помощта за частно складиране. В Регламент (ЕО) № 273/2008 на Комисията (4) се определят методите, които следва да се прилагат за оценяване дали млякото и млечните продукти отговарят на изискванията за допустимост, установени в тези регламенти относно публичната интервенция и помощта за частно складиране.
            
         
               (2)
            
            
               Предвид техническия напредък в методиката, използвана за анализ и оценка на качеството на млякото и млечните продукти, следва да се направят съществени промени с цел опростяване и актуализиране на позоваванията на стандартите ISO. В интерес на яснотата и ефективността и предвид обхвата и техническото естество на измененията на разпоредбите на Регламент (ЕО) № 273/2008 съответните разпоредби на посочения регламент следва да бъдат включени в Регламент за изпълнение (ЕС) 2016/1240.
            
         
               (3)
            
            
               За да се гарантира единното спазване на новите стандарти и методи във всички държави членки, на лабораториите следва да се предостави достатъчно дълъг срок, за да могат да преразгледат процедурите и да приложат актуализираните методи.
            
         
               (4)
            
            
               Поради това Регламент за изпълнение (ЕС) 2016/1240 следва да бъде съответно изменен.
            
         
               (5)
            
            
               По съображения за правна сигурност Регламент (ЕО) № 273/2008 следва да бъде отменен.
            
         
               (6)
            
            
               Мерките, предвидени в настоящия регламент, са в съответствие със становището на Комитета за общата организация на селскостопанските пазари,
            
         ПРИЕ НАСТОЯЩИЯ РЕГЛАМЕНТ:
   Член 1
   Регламент за изпълнение (ЕС) 2016/1240 се изменя, както следва:
   
               1)
            
            
               Член 4 се изменя, както следва:
               
                           а)
                        
                        
                           параграф 1 се изменя, както следва:
                           
                                       i)
                                    
                                    
                                       буква г) се заменя със следното:
                                       
                                                   „г)
                                                
                                                
                                                   за масло: в части I и Ia от приложение IV към настоящия регламент;“
                                                
                                             
                                 
                                       ii)
                                    
                                    
                                       буква д) се заменя със следното:
                                       
                                                   „д)
                                                
                                                
                                                   за обезмаслено мляко на прах: в части I и Ia от приложение V към настоящия регламент.“;
                                                
                                             
                                 
                     
                           б)
                        
                        
                           параграф 2 се заменя със следното:
                           „2.   Методите, които се използват за определяне на качеството на допустимите за публична интервенция зърнени култури, масло и обезмаслено мляко на прах, посочени съответно в приложения I, IV и V, са установените с последните версии на съответните европейски или международни стандарти, според случая, които са в сила най-малко 6 месеца преди първия ден на периода на публична интервенция, определен в член 12 от Регламент (ЕС) № 1308/2013.“.
                        
                     
         
               2)
            
            
               Вмъква се следният член 60a:
               „Член 60a
               Специални разпоредби относно проверките, свързани с публичната интервенция и помощта за частно складиране за мляко и млечни продукти
               1.   Допустимостта на маслото, обезмасленото мляко на прах и сиренето за получаване на помощ за частно складиране се установява съгласно методите, определени съответно в приложения VI, VII и VIII.
               Тези методи се установяват въз основа на последните версии на съответните европейски или международни стандарти, според случая, които са в сила най-малко 6 месеца преди първия ден на периода на публична интервенция, определен в член 12 от Регламент (ЕС) № 1308/2013.
               2.   Резултатите от проверките, извършвани чрез прилагане на определените в настоящия регламент методи, се оценяват в съответствие с приложение IX.“
            
         
               3)
            
            
               Приложенията се изменят в съответствие с приложението към настоящия регламент.
            
         Член 2
   Регламент (ЕО) № 273/2008 се отменя.
   Член 3
   Настоящият регламент влиза в сила на седмия ден след деня на публикуването му в Официален вестник на Европейския съюз.
   
      Той е задължителен в своята цялост и се прилага пряко във всички държави членки.
      Съставено в Брюксел на 30 януари 2018 година.
      
         
            За Комисията
         
         
            Председател
         
         Jean-Claude JUNCKER
      
   
   
      (1)  ОВ L 347, 20.12.2013 г., стр. 549.
   
      (2)  Делегиран регламент (ЕС) 2016/1238 на Комисията от 18 май 2016 г. за допълнение на Регламент (ЕС) № 1308/2013 на Европейския парламент и на Съвета по отношение на публичната интервенция и помощта за частно складиране (ОВ L 206, 30.7.2016 г., стр. 15).
   
      (3)  Регламент за изпълнение (ЕС) 2016/1240 на Комисията от 18 май 2016 г. за определяне на правила за прилагането на Регламент (ЕС) № 1308/2013 на Европейския парламент и на Съвета по отношение на публичната интервенция и помощта за частно складиране (ОВ L 206, 30.7.2016 г., стр. 71).
   
      (4)  Регламент (ЕО) № 273/2008 на Комисията от 5 март 2008 г. за определяне на подробни правила за прилагане на Регламент (ЕО) № 1255/1999 на Съвета по отношение на методи за анализ и оценка на качеството на млякото и млечните продукти (ОВ L 88, 29.3.2008 г., стр. 1).
   
      ПРИЛОЖЕНИЕ
      Приложенията към Регламент за изпълнение (ЕС) 2016/1240 се изменят, както следва:
      
                  1)
               
               
                  Приложение IV се изменя, както следва:
                  
                              а)
                           
                           
                              в част I, точка 2 втора алинея се заменя със следното:
                              „Всяка проба трябва да бъде оценена индивидуално. Не се допуска повторно вземане на проби или повторно оценяване.“;
                           
                        
                              б)
                           
                           
                              добавя се следната част Ia:
                              „ЧАСТ Iа
                              
                                 Методи за анализ на безсолно масло за публична интервенция
                              
                              
                                          Параметър
                                       
                                       
                                          Метод
                                       
                                    
                                          Масленост (1)
                                          
                                       
                                       
                                          ISO 17189 или ISO 3727 част 3
                                       
                                    
                                          Вода
                                       
                                       
                                          ISO 3727, част 1
                                       
                                    
                                          Сух безмаслен остатък
                                       
                                       
                                          ISO 3727, част 2
                                       
                                    
                                          Киселинност на мазнината
                                       
                                       
                                          ISO 1740
                                       
                                    
                                          Пероксидно число
                                       
                                       
                                          ISO 3976
                                       
                                    
                                          Немлечни мазнини
                                       
                                       
                                          ISO 17678
                                       
                                    
                                          Органолептични свойства
                                       
                                       
                                          ISO 22935, части 2 и 3, както и таблицата с точкова оценка по-долу
                                       
                                    
                                 Таблица с точкова оценка
                              
                              
                                          Външен вид
                                       
                                       
                                          Консистенция
                                       
                                       
                                          Мирис и вкус
                                       
                                    
                                          Точки
                                       
                                       
                                          Бележки
                                       
                                       
                                          Точки
                                       
                                       
                                          Бележки
                                       
                                       
                                          Точки
                                       
                                       
                                          Бележки
                                       
                                    
                                          5
                                       
                                       
                                          
                                             Много добър
                                          
                                          Идеален тип
                                          Най-високо качество
                                          (еднакво сух)
                                       
                                       
                                          5
                                       
                                       
                                          
                                             Много добър
                                          
                                          Идеален тип
                                          Най-високо качество
                                          (еднакво лесно за мазане)
                                       
                                       
                                          5
                                       
                                       
                                          
                                             Много добър
                                          
                                          Идеален тип
                                          Най-високо качество
                                          (абсолютно чист, най-фин аромат)
                                       
                                    
                                          4
                                       
                                       
                                          
                                             Добър
                                          
                                          (без видими недостатъци)
                                       
                                       
                                          4
                                       
                                       
                                          
                                             Добър
                                          
                                          (без видими недостатъци)
                                       
                                       
                                          4
                                       
                                       
                                          
                                             Добър
                                          
                                          (без видими недостатъци)
                                       
                                    
                                          1, 2 или 3
                                       
                                       
                                          С какъвто и да е недостатък
                                       
                                       
                                          1, 2 или 3
                                       
                                       
                                          С какъвто и да е недостатък
                                       
                                       
                                          1, 2 или 3
                                       
                                       
                                          С какъвто и да е недостатък“
                                       
                                    
                        
            
                  2)
               
               
                  В приложение V се вмъква следната част Iа:
                  „ЧАСТ Iа
                  
                     Методи за анализ на обезмаслено мляко на прах за публична интервенция
                  
                  
                              Параметър
                           
                           
                              Метод
                           
                        
                              Белтък
                           
                           
                              ISO 8968, част 1
                           
                        
                              Масленост
                           
                           
                              ISO 1736
                           
                        
                              Вода
                           
                           
                              ISO 5537
                           
                        
                              Киселинност
                           
                           
                              ISO 6091
                           
                        
                              Лактати
                           
                           
                              ISO 8069
                           
                        
                              Тест за фосфатаза
                           
                           
                              ISO 11816, част 1
                           
                        
                              Индекс на неразтворимост
                           
                           
                              ISO 8156
                           
                        
                              Обгорели частички (2)
                              
                           
                           
                              ADPI (Американски институт по млечните продукти)
                           
                        
                              Микроорганизми
                           
                           
                              ISO 4833, част 1
                           
                        
                              Мътеница
                           
                           
                              Допълнение I
                           
                        
                              Сирищна суроватка (3)
                              
                           
                           
                              Допълнения II и III
                           
                        
                              Кисела суроватка (4)
                              
                           
                           
                              ISO 8069 или проверки на място
                           
                        
                              Сензорни проверки (5)
                              
                           
                           
                              ISO 22935, части 2 и 3
                           
                        
                     Допълнение I
                     
                        ОБЕЗМАСЛЕНО МЛЯКО НА ПРАХ: КОЛИЧЕСТВЕНО ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ФОСФАТИДИЛСЕРИН И ФОСФАТИДИЛЕТАНОЛАМИН
                     
                     
                        
                           Метод: HPLC с обърнати фази.
                        
                     
                     1.   ЦЕЛ И ПРИЛОЖНО ПОЛЕ
                     Методът описва процедура за количествено определяне на фосфатидилсерин (PS) и фосфатидилетаноламин (PE) в обезмаслено мляко на прах (ОМП) и е подходящ за откриване на сухо вещество на мътеница в ОМП.
                     2.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ
                     
                        Съдържание на PS и PE: масов процент на субстанцията, определена чрез използване на посочената тук процедура. Резултатът е изразен в милиграми фосфатидилетаноламин дипалмитоил (PEDP) на 100 g прах.
                     3.   ПРИНЦИП НА МЕТОДА
                     Извличане на аминофосфолипиди с метанол от възстановено мляко на прах. Определяне на PS и PE като o-фталдиалдехид (OPA) производни чрез HPLC с обърнати фази и флуоресцентно откриване. Определяне на количеството на PS и PE, съдържащи се в тестовата проба, чрез позоваване на стандартна проба, съдържаща познато количество PEDP.
                     4.   РЕАГЕНТИ
                     Всички реагенти трябва да бъдат с признато аналитично качество. Водата трябва да е дестилирана или с най-малко еквивалентна чистота, ако не е определено друго.
                     4.1.   Материал за стандарта: PEDP с чистота най-малко 99 %
                     
                     
                        Забележка: Стандартният материал трябва да бъде съхраняван при – 18 °C.
                     4.2.   Реагенти за стандартна проба и подготовка на тестовата проба
                     
                     4.2.1.   Метанол за HPLC
                     
                     4.2.2.   Хлороформ за HPLC
                     
                     4.2.3.   Триптамин-монохидрохлорид
                     
                     4.3.   Реагенти за o-фталдиалдехид дериватизация
                     
                     4.3.1.   Натриев хидроксид, 12 М воден разтвор
                     
                     4.3.2.   Борна киселина, 0,4 M воден разтвор, регулиран до pH 10,0 с натриев хидроксид (4.3.1)
                     
                     4.3.3.   2-меркаптоетанол
                     
                     4.3.4.   o-фталдиалдехид (OPA)
                     
                     4.4.   HPLC-елуиращи разтворители
                     
                     4.4.1.   Елуиращите разтворители трябва да бъдат приготвени, като се използват реагенти за HPLC.
                     
                     4.4.2.   Вода за HPLC
                     
                     4.4.3.   Метанол с тествана флуориметрична чистота
                     
                     4.4.4.   Тетрахидрофуран
                     
                     4.4.5.   Натриев дихидроген фосфат
                     
                     4.4.6.   Натриев ацетат
                     
                     4.4.7.   Оцетна киселина
                     
                     5.   АПАРАТУРА
                     5.1.   Аналитична везна, претегляща с точност 1 mg, с деления на 0,1 mg
                     
                     5.2.   Бехерови чаши с обем от 25 и 100 ml
                     
                     5.3.   Капкомери, с които могат да се подават 1 и 10 ml
                     
                     5.4.   Магнитна бъркалка
                     
                     5.5.   Градуирани капкомери, които могат да подават 0,2, 0,5 и 5 ml
                     
                     5.6.   Мерителни колби с обем от 10, 50 и 100 ml
                     
                     5.7.   Спринцовки с обем 20 и 100 μl
                     
                     5.8.   Ултразвукова баня
                     
                     5.9.   Центрофуга, работеща при 27 000 × g
                     
                     5.10.   Стъклени съдове с обем около 5 ml
                     
                     5.11.   Градуиран цилиндър с обем 25 ml
                     
                     5.12.   Измервател на pH с точност до 0,1 pH единици
                     
                     5.13.   Оборудване за HPLC
                     
                     5.13.1.   Градиентна помпена система с възможност да функционира с 1,0 ml/min при 200 bar
                     
                     5.13.2.   Автоматичен уред за вземане на проби с възможност за дериватизация
                     
                     5.13.3.   Колонен нагревател, който може да поддържа колоната на 30 °C ± 1 °C
                     
                     5.13.4.   Флуоресцентен детектор, работещ при 330 nm дължина на вълната при възбуждане и 440 nm дължината на вълната при емитиране.
                     
                     5.13.5.   Интегратор или софтуер за обработка на данни, с възможност за измерване на площи на пика
                     
                     5.13.6.   Колона LiChrospher® — 100 (250 × 4,6 mm) или еквивалентна колона, запълнена с октадецилсилан (C 18) с размер на частиците 5 μm
                     
                     6.   ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИ
                     Вземането на проби трябва да се извършва в съответствие със стандарт ISO 707.
                     7.   ПРОЦЕДУРА
                     7.1.   Приготвяне на вътрешния стандартен разтвор
                     
                     7.1.1.   30,0 ± 0,1 mg триптамин-монохидрохлорид (4.2.3) се претеглят в 100 ml мерителна колба (5.6) и се долива до белега с метанол (4.2.1).
                     
                     7.1.2.   Капва се 1 ml (5.3) от този разтвор в 10 ml мерителна колба (5.6) и се долива до белега с метанол (4.2.1), с оглед да се получи концентрация на триптамин от 0,15 mM.
                     
                     7.2.   Подготовка на разтвор на тестовата проба
                     
                     7.2.1.   Претегля се 1,000 ± 0,001 g от ОМП-пробата в 25 ml бехерова чаша (5.2). Добавят се 10 ml дестилирана вода при 40 °C ± 1 °C с капкомер (5.3) и се разбърква с магнитна бъркалка (5.4) за 30 минути, за да се разтворят всички бучки.
                     
                     7.2.2.   От възстановеното мляко се капват 0,2 ml (5.5) в 10 ml мерителна колба (5.6), добавят се 100 μl от 0,15 mM триптаминов разтвор (7.1) със спринцовка (5.7) и се долива до обема с метанол (4.2.1). Разбърква се внимателно с преобръщане и се извършва дисперсия с помощта на ултразвук (5.8) за 15 min.
                     
                     7.2.3.   Центрофугира се (5.9) при 27 000 g × g за 10 минути и супернатантът се събира в стъклен съд (5.10).
                     
                     
                        Забележка: Разтворът на тестовата проба следва да се съхранява при 4 °C, докато се извърши HPLC-анализ.
                     7.3.   Подготовка на външния стандартен разтвор
                     
                     7.3.1.   55,4 mg PEDP (4.1) се отмерват в 50 ml мерителна колба (5.6) и се добавят около 25 ml хлороформ (4.2.2), като се използва градуиран цилиндър (5.11). Затворената колба се загрява до 50 °C ± 1 °C и се разбърква внимателно, докато се разтвори PEDP. Колбата се охлажда до 20 °C, обемът се долива с метанол (4.2.1) и се разбърква с преобръщане.
                     
                     7.3.2.   Капва се 1 ml (5.3) от този разтвор в 100 ml мерителна колба (5.6) и се долива до обема с метанол (4.2.1). Капва се 1 ml (5.3) от този разтвор в 10 ml мерителна колба (5.6), добавят се 100 μl (5.7) от 0,15 mM триптаминов разтвор (7.1) и обемът се долива с метанол (4.2.1). Разбърква се с преобръщане.
                     
                     
                        Забележка: Разтворът на стандартната проба следва да се съхранява при 4 °C, докато се извърши HPLC-анализ.
                     7.4.   Подготовка на дериватизиращия реагент
                     
                     
                        В 10 ml мерителна колба (5.6) се отмерват 25,0 ± 0,1 mg OPA (4.3.4), добавя се 0,5 ml (5.5) метанол (4.2.1) и се разбърква внимателно, за да се разтвори OPA. Долива се до белега с разтвор на борна киселина (4.3.2) и се добавят 20 μl от 2-меркаптоетанол (4.3.3) със спринцовка (5.7).
                     
                     
                        Забележка: Дериватизиращият реагент следва да се съхранява при 4 °C в тъмен флакон; той е годен една седмица.
                     7.5.   Определяне чрез HPLC
                     
                     7.5.1.   Елуиращи разтворители (4.4)
                     
                     Разтворител А: Разтвор на 0,3 mM натриев дихидроген фосфат и разтвор на 3 mM натриев ацетат (регулиран до pH 6,5 ± 0,1 с оцетна киселина): метанол: тетрахидрофуран = 558:440:2 (v/v/v)
                     Разтворител Б: метанол
                     7.5.2.   Предложен елуиращ градиент:
                     
                     
                                 Време (min)
                              
                              
                                 Разтворител А (%)
                              
                              
                                 Разтворител Б (%)
                              
                              
                                 Дебит (ml/min)
                              
                           
                                 Първоначално
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 60
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 0,1
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 60
                              
                              
                                 0,1
                              
                           
                                 5,0
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 60
                              
                              
                                 0,1
                              
                           
                                 6,0
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 60
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 60
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 9,0
                              
                              
                                 36
                              
                              
                                 64
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 10,0
                              
                              
                                 20
                              
                              
                                 80
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 11,5
                              
                              
                                 16
                              
                              
                                 84
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 12,0
                              
                              
                                 16
                              
                              
                                 84
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 16,0
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                 90
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 19,0
                              
                              
                                 0
                              
                              
                                 100
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 20,0
                              
                              
                                 0
                              
                              
                                 100
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 21,0
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 60
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 29,0
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 60
                              
                              
                                 1,0
                              
                           
                                 30,0
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 60
                              
                              
                                 0
                              
                           
                        Забележка: Елуиращият градиент може да изисква лека модификация, с оглед да се постигне разделянето, показано на фигура 1.
                     Температура на колоната: 30 °C.
                     7.5.3.   Обем на впръскване: 50 μl дериватизиращ реагент и 50 μl разтвор на пробата
                     
                     7.5.4.   Балансиране на колоната
                     
                     При ежедневното пускане на системата колоната се промива със 100 % разтворител Б за 15 минути, след това се настройва на A:Б = 40:60 и се балансира при 1 ml/min за 15 минути. Чрез впръскването на метанол (4.2.1) се извършва празна серия.
                     
                        Забележка: Преди дългосрочно съхранение колоната се промива с метанол: хлороформ = 80:20 (v/v) в продължение на 30 минути.
                     7.5.5.   Определяне на съдържанието на PS + PE в тестовата проба
                     
                     7.5.6.   Извършва се последователността от хроматографски анализи, като времето от серия до серия се поддържа константно с оглед да се получат константни времена на задържане. Външният стандартен разтвор (7.3) се впръсква на всеки 5—10 разтвора на тестовите проби, за да може да се оцени факторът на сигнала.
                     
                     
                        Забележка: Колоната трябва да бъде почиствана чрез промиване със 100 % разтворител Б (7.5.1) за най-малко 30 минути на всеки 20—25 серии.
                     7.6.   Метод на интегриране
                     
                     7.6.1.   Пик на PEDP
                     
                     PEDP се елуира като един отделен пик. Площта на пика се определя чрез интегриране от впадина до впадина.
                     7.6.2.   Пик на триптамина
                     
                     Триптаминът се елуира като един отделен пик (фигура 1). Площта на пика се определя чрез интегриране от впадина до впадина.
                     7.6.3.   Групи на пикове PS и PE
                     
                     При описаните условия (фигура 1) PS се елуира като два основни частично неразделени пика, предшествани от по-малък пик. PE се елуира като три основни частично неразделени пика. Определя се цялата площ на всяка група пикове, като се очертава базовата линия, както е показано на фигура 1.
                     8.   ИЗЧИСЛЯВАНЕ И ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
                     Съдържанието на PS и PE в тестовата проба се изчислява, както следва:
                     C = 55,36 × ((A2)/(A1)) × ((T1)/(T2))
                     където:
                     
                                 C
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 съдържанието на PS или PE (mg/100 g прах) в тестовата проба
                              
                           
                                 А1
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 площ на пика на PEDP в разтвора на стандартната проба (7.3)
                              
                           
                                 А2
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 площ на пика на PS или PE в разтвора на тестовата проба (7.2)
                              
                           
                                 Т1
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 площ на пика на триптамин в разтвора на стандартната проба (7.3)
                              
                           
                                 Т2
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 площ на пика на триптамин в разтвора на тестовата проба (7.2).
                              
                           9.   ТОЧНОСТ НА ПРОЦЕДУРАТА
                     
                        Забележка: Стойностите за повторяемост бяха изчислени в съответствие с международен стандарт IDF (*).
                     9.1.   Повторяемост
                     
                     Относителното стандартно отклонение на повторяемостта, което изразява варирането на резултатите от независим аналитичен анализ, получени от същия оператор чрез използване на същата апаратура и при същите условия върху същия тестов материал и в кратък период от време, не трябва да надвишава относителната стойност от 2 %. Ако при тези условия са получени две определяния, относителната разлика между двата резултата не трябва да бъде по-голяма от 6 % от средноаритметичната стойност на резултатите.
                     9.2.   Възпроизводимост
                     
                     Ако са направени две определяния от оператори в различни лаборатории чрез използване на различна апаратура, при различни условия за анализа на същия тестов материал, относителната разлика между двата резултата не трябва да бъде по-голяма от 11 % от средноаритметичната стойност на резултатите.
                     10.   ЗА СПРАВКА
                     10.1.   Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., ‘Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids’ (Откриване на сухо вещество на мътеница в обезмаслено мляко на прах чрез HPLC-определяне на количеството на аминофосфолипиди). Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988).
                     
                     
                        Фигура 1
                     
                     
                        HPLC-модели на OPA-производни на фосфатидилсерин (PS) и фосфатидилетаноламин (РЕ) в метанолов екстракт от възстановено обезмаслено мляко на прах. Представен е методът на интегриране за пиковете на PS, РЕ и триптамин (вътрешен стандарт)
                     
                     
                        
                  
                  
                     Допълнение II
                     
                        ОТКРИВАНЕ НА СИРИЩНА СУРОВАТКА В ОБЕЗМАСЛЕНО МЛЯКО НА ПРАХ, ПРЕДНАЗНАЧЕНО ЗА ОБЩЕСТВЕНО СКЛАДИРАНЕ, ЧРЕЗ ОПРЕДЕЛЯНЕТО НА КАЗЕИНОМАКРОПЕПТИДИ ЧРЕЗ ВИСОКОЕФЕКТИВНА ТЕЧНА ХРОМАТОГРАФИЯ (HPLC)
                     
                     1.   ОБХВАТ И ПРИЛОЖНО ПОЛЕ
                     Този метод позволява откриването на сирищна суроватка в обезмаслено мляко на прах, предназначено за публично складиране, чрез определянето на казеиномакропептиди.
                     2.   ЗА СПРАВКА
                     Международен стандарт ISO 707 — Мляко и млечни продукти. Указания за вземане на проби
                     3.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ
                     Съдържанието на сухо вещество на сирищна суроватка се дефинира като процент от масата, както е определено от казеиномакропептидното съдържание чрез описаната процедура.
                     4.   ПРИНЦИП
                     
                                 —
                              
                              
                                 Възстановяване на обезмасленото мляко на прах, отстраняване на мазнините и протеините с трихлорооцетна киселина, последвано от центрофугиране или филтриране.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Определяне на количеството казеиномакропептиди (CMP) в супернатанта чрез високоефективна течна хроматография (HPLC).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Оценка на получения резултат за пробите чрез позоваване на стандартните проби, съдържащи обезмаслено мляко на прах със или без прибавяне на известен процент суроватка на прах.
                              
                           5.   РЕАКТИВИ
                     Всички реагенти трябва да бъдат с признато аналитично качество. Използваната вода трябва да е дестилирана или да е с еквивалентна степен на чистота.
                     5.1.   Разтвор на трихлорооцетна киселина
                     
                     240 g трихлорооцетна киселина (CCl3COOH) се разтварят във вода и се долива до 1 000 ml. Разтворът трябва да бъде прозрачен и безцветен.
                     5.2.   Елуентен разтвор, pH 6,0
                     
                     1,74 g дикалиев хидроген фосфат (K2HPO4), 12,37 g калиев дихидроген фосфат (KH2PO4) и 21,41 g натриев сулфат (Na2SO4) се разтварят в около 700 ml вода. Регулира се, ако е необходимо, до pH 6,0, като се използва разтвор на фосфорна киселина или калиев хидроксид.
                     Долива се до 1 000 ml с вода и се хомогенизира.
                     
                        Забележка: Съставът на елуента може да се актуализира така, че да съответства със сертификата на стандартите или с препоръките на производителя на пълнежа на колоната.
                     Елуентният разтвор се филтрира, преди да се използва, през мембранен филтър с 0,45 μm диаметър на порите.
                     5.3.   Промиващ разтворител
                     
                     Един обем ацетонитрил (CH3CN) се смесва с девет обема вода. Преди да се използва, сместа се филтрира през мембранен филтър с 0,45 μm диаметър на порите.
                     
                        Забележка: Може да бъде използван всеки друг промиващ разтворител с бактерициден ефект, който не уврежда ефективността на разделянето в колоната.
                     5.4.   Стандартни проби
                     
                     5.4.1.   Обезмаслено мляко на прах, което изпълнява изискванията на настоящия регламент (т.e. [0])
                     
                     5.4.2.   Същото обезмаслено мляко на прах, подправено с 5 % (m/m) сирищна суроватка на прах със стандартен състав (т.e. [5]).
                     
                     6.   АПАРАТУРА
                     6.1.   Аналитична везна
                     
                     6.2.   Незадължително: центрофуга, която може да достигне центробежна сила от 2 000 g, снабдена със запушени центрофужни епруветки с капацитет около 50 ml
                     
                     6.3.   Механичен шейкър
                     
                     6.4.   Магнитна бъркалка
                     
                     6.5.   Стъклени фунии с диаметър около 7 cm
                     
                     6.6.   Филтърна хартия, средно филтриране, диаметър около 12,5 cm
                     
                     6.7.   Стъклено оборудване за филтриране с мембранен филтър с диаметър на порите 0,45 μm
                     
                     6.8.   Градуирани пипети, които позволяват подаване на 10 ml (ISO 648, клас A, или ISO/R 835), или система, която може да подаде 10,0 ml за две минути
                     
                     6.9.   Система за подаване, която може да подаде 20,0 ml вода при приблизително 50 °C
                     
                     6.10.   Термостатна водна баня, регулирана на 25 ± 0,5 °C
                     
                     6.11.   Оборудване за HPLC, състоящо се от:
                     
                     
                                 6.11.1.
                              
                              
                                 
                                    Помпа
                                 
                              
                           
                                 6.11.2.
                              
                              
                                 
                                    Инжектор, ръчен или автоматичен, с капацитет от 15 до 30 μl
                                 
                              
                           
                                 6.11.3.
                              
                              
                                 
                                    Две последователно свързани колони TSK 2 000-SW (дължина 30 cm, вътрешен диаметър 0,75 cm) или еквивалентни колони (например единична TSK 2 000-SWxl, единична Agilent Technologies Zorbax GF 250) и предколона (3 cm × 0,3 cm), запълнена с I 125 или материал с еквивалентна ефективност
                                 
                              
                           
                                 6.11.4.
                              
                              
                                 
                                    Термостатична колонна пещ, програмирана на 35 ± 1 °C
                                 
                              
                           
                                 6.11.5.
                              
                              
                                 
                                    UV детектор с променлива дължина на вълните, позволяващ измервания при 205 nm, с чувствителност от 0,008 Å
                                 
                              
                           
                                 6.11.6.
                              
                              
                                 
                                    Интегратор с възможност за интеграция от впадина до впадина
                                 
                                 
                                    Забележка: Възможно е да се работи с колони, държани при стайна температура, но тяхната ефективност на разделяне е малко по-ниска. В този случай в рамките на една аналитична серия температурата би следвало да варира с по-малко от ± 5 °C.
                              
                           7.   ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИ
                     7.1.   Пробите се вземат в съответствие с процедурата, определена в Международен стандарт ISO 707. Държавите членки обаче може да използват друг метод за вземане на проби, при условие че той е в съответствие с принципите на гореупоменатия стандарт.
                     7.2.   Пробата се съхранява при условия, които изключват всякакво увреждане или промяна на състава.
                     8.   ПРОЦЕДУРА
                     8.1.   Подготовка на тестовата проба
                     
                     Млякото на прах се прехвърля в съд, снабден с уплътнен капак, и с вместимост, която е около два пъти обема на праха. Съдът се затваря веднага. Млечният прах се смесва добре чрез многократно обръщане на съда.
                     8.2.   Маса на пробата за анализ
                     
                     Претеглят се 2,000 ± 0,001 g от пробата за анализ в центрофужна епруветка (6.2) или подходяща запушена колба (50 ml).
                     8.3.   Отстраняване на мазнината и протеините
                     
                     8.3.1.   Към тестовата доза се прибавят 20,0 ml топла вода (50 °C). Прахът се разтваря чрез разклащане за пет минути при използването на механичен шейкър (6.3). Епруветката се поставя във водната баня (6.10) и се оставя да се темперира до 25 °C.
                     
                     8.3.2.   Прибавят се 10,0 ml разтвор на трихлорооцетна киселина (5.1.) с температура около 25 °C за две минути, като същевременно се разбърква енергично с магнитната бъркалка (6.4). Епруветката се поставя във водната баня (6.10) и се оставя за 60 минути.
                     
                     8.3.3.   Центрофугира се (6.2) в продължение на 10 минути при 2 200 g или се филтрира през хартия (6.6), като се изхвърлят първите 5 ml филтрат.
                     
                     8.4.   Хроматографски анализ
                     
                     8.4.1.   От 15 до 30 μl точно измерен супернатант или филтрат (8.3.3) се впръскват в апарат за HPLC (6.11), който работи при дебит 1,0 ml елуентен разтвор (5.2) на минута.
                     
                     
                        Забележка 1: Може да се използва и друг дебит в зависимост от вътрешния диаметър на използваните колони или указанията на производителя на колоните.
                     
                        Забележка 2: Колоните се изплакват с вода при всяко прекъсване. Елуентният разтвор (5.2) никога не се оставя в тях.
                     Преди всяко прекъсване за повече от 24 часа колоните се изплакват с вода, след това се измиват с разтвор (5.3) за най-малко три часа при дебит 0,2 ml на минута.
                     8.4.2.   Резултатите от хроматографския анализ на тестовата проба [E] се получават под формата на хроматограма, в която всеки пик е показан чрез времето му на задържане RT, както следва:
                     
                     
                                 Пик II:
                              
                              
                                 Вторият пик на хроматограмата с RT от около 12,5 минути.
                              
                           
                                 Пик III:
                              
                              
                                 Третият пик на хроматограмата, съответстващ на CMP, с RT от 15,5 минути.
                              
                           Изборът на колоните може съществено да повлияе на времето на задържане на отделните пикове.
                     Интеграторът (6.11.6) автоматично изчислява площта A на всеки пик:
                     
                                 AII:
                              
                              
                                 площ на пик II,
                              
                           
                                 AIII:
                              
                              
                                 площ на пик III.
                              
                           Съществено е да се изследва вида на всяка хроматограма преди количественото тълкуване, за да се открият всякакви отклонения, които се дължат или на неправилното функциониране на апаратурата, или на колоните, или на произхода и естеството на анализираната проба.
                     Анализът се повтаря, ако има съмнения.
                     8.5.   Калибриране
                     
                     8.5.1.   Процедурата, описана в точки 8.2—8.4.2, се прилага с точност за стандартните проби (5.4).
                     
                     Използват се прясно приготвени разтвори, тъй като CMP се разрушават в 8 %-на трихлорооцетна среда. Загубата се оценява на 0,2 % на час при 30 °C.
                     8.5.2.   Преди хроматографския анализ на пробите колоните се подготвят чрез многократно впръскване на стандартната проба (5.4.2) в разтвора (8.5.1), докато площта и времето на задържане на пика, съответстващ на CMP, станат постоянни.
                     
                     8.5.3.   Определят се факторите на сигнала R чрез впръскване на същия обем филтрати (8.5.1), какъвто е използван за пробите.
                     
                     9.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
                     9.1.   Метод на изчисление и формули
                     
                     9.1.1.   Изчисляване на факторите на сигнала R:
                     
                     
                                 Пик II:
                              
                              
                                 RII = 100/(AII[0])
                              
                           където:
                     
                                 RII
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 факторите на сигнала на пиковете II,
                              
                           
                                 AII [0]
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 площите на пиковете II на стандартната проба [0], получени в 8.5.3.
                              
                           
                                 Пик III:
                              
                              
                                 RIII = W/(AIII[5] – AIII[0])
                              
                           където:
                     
                                 RIII
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 Факторът на сигнала на пик III,
                              
                           
                                 AIII [0] и AIII [5]
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 площите на пиковете III на стандартните проби [0] и [5], получени съответно в 8.5.3,
                              
                           
                                 W
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 количеството суроватка в стандартната проба [5], т.e. 5.
                              
                           9.1.2.   Изчисляване на относителната площ на пиковете в пробата [E]
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 SII[E] = RII × AII[E]
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 SIII[E] = RIII × AIII[E]
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 SIV[E] = RIV × AIV[E]
                              
                           където:
                     
                                 SII [E], SIII [E], SIV [E]
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 относителните площи, съответно на пикове II, III и IV на пробата [E],
                              
                           
                                 AII [E], AIII [E]
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 площите съответно на пикове II и III на проба [E], получени в 8.4.2,
                              
                           
                                 RII, RIII
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 факторите на сигнала, изчислени в 9.1.1.
                              
                           9.1.3.   Изчисляване на относителното време на задържане на пик III на проба [E]:
                     
                     RRTIII[E] = (RTIII[E])/(RTIII[5])
                     където:
                     
                                 RRTIII [E]
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 относителното време на задържане на пик III на проба [E],
                              
                           
                                 RTIII [E]
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 времето на задържане на пик III на проба [E], получено в 8.4.2,
                              
                           
                                 RTIII [5]
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 времето на задържане на пик III на контролната проба [5], получено в 8.5.3.
                              
                           9.1.4.   Експериментите показаха, че има линейна връзка между относителното време на задържане на пик III, т.e. RRTIII [E], и процента на прибавена суроватка на прах до 10 %
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 RRTIII [E] е < 1,000, когато съдържанието на суроватка е > 5 %,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 RRTIII [E] е ≥ 1,000, когато съдържанието на суроватка е ≤ 5 %.
                              
                           Допустимата неопределеност за стойностите на RRTIII е ± 0,002.
                     Обикновено стойността на RRTIII [0] се отклонява малко от 1,034. В зависимост от състоянието на колоните стойността може да се доближава до 1,000, но трябва винаги да бъде по-голяма.
                     9.2.   Изчисляване на процента на сирищна суроватка на прах в пробата:
                     
                     W = SIII[E] – [1,3 + (SIII[0] – 0, 9)]
                     където:
                     
                                 W
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 процент (m/m) сирищна суроватка в пробата [E];
                              
                           
                                 SIII [E]
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 относителната площ на пик III на тестова проба [E], получена както в 9.1.2;
                              
                           
                                 1,3
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 представлява относителната средна площ на пик III, изразена в грамове сирищна суроватка за 100 g, определена в неподправено обезмаслено мляко на прах от различен произход. Тази цифра бе получена експериментално;
                              
                           
                                 SIII [0]
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 представлява относителната площ на пик III, която е равна на RIII × AIII [0]. Тези стойности са получени съответно в 9.1.1 и в 8.5.3;
                              
                           
                                 (SIII [0] – 0,9)
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 представлява корекцията, която следва да бъде направена спрямо относителната средна площ 1,3, когато SIII [0] не е равно на 0,9. За експеримента относителната средна площ на пик III на контролната проба [0] е 0,9.
                              
                           9.3.   Точност на процедурата
                     
                     9.3.1.   Повторяемост
                     
                     Разликата между резултатите от две определяния, извършени едновременно или едно след друго от същия анализатор и при използване на същата апаратура върху идентичен тестов материал, не трябва да надвишава 0,2 % m/m.
                     9.3.2.   Възпроизводимост
                     
                     Разликата между два отделни и независими резултата, получени в две различни лаборатории върху идентичен тестов материал, не трябва да надвишава 0,4 % m/m.
                     9.4.   Тълкуване
                     
                     9.4.1.   Приема се, че липсва суроватка, ако относителната площ на пик III, SIII [E], изразена в грамове сирищна суроватка за 100 g продукт, е ≤ 2,0 + (SIII [0] – 0,9),
                     
                     където:
                     
                                 2,0
                              
                              
                                 е допустимата максимална стойност за относителната площ на пик III, като се вземат предвид относителната средна площ на пик III, т.e. 1,3, неопределеността поради вариациите в състава на обезмасленото мляко на прах и възпроизводимостта на метода (9.3.2),
                              
                           
                                 (SIII [0] – 0,9)
                              
                              
                                 е корекцията, която следва да бъде направена, когато площта SIII [0] е различна от 0,9 (вж. 9.2).
                              
                           9.4.2.   Ако относителната площ на пик III, SIII [E], е > 2,0 + (SIII [0] – 0,9) и относителната площ на пик II, SII [E], ≤ 160, съдържанието на сирищна суроватка се определя, както е посочено в точка 9.2.
                     
                     9.4.3.   Ако относителната площ на пик III, SIII [E], е > 2,0 + (SIII [0] – 0,9) и относителната площ на пик II, SII [E], ≤ 160, се определя общото съдържание на протеин (P %); след това се изследват графики 1 и 2.
                     
                     9.4.3.1.   Данните, получени след анализа на пробите на неподправено обезмаслено мляко на прах с високо общо съдържание на протеин, са събрани в графики 1 и 2.
                     
                     Непрекъснатата линия представлява линейна регресия, чиито коефициенти са изчислени чрез метода на най-малките квадрати.
                     Пунктираната права линия определя горната граница на относителната площ на пик III с вероятност, че няма да се надвишава в 90 % от случаите.
                     Уравненията за пунктираните прави линии на графики 1 и 2 са:
                     
                                 SIII = 0,376 P % – 10,7
                              
                              
                                 (графика 1),
                              
                           
                                 SIII = 0,0123 SII [E] + 0,93
                              
                              
                                 (графика 2),
                              
                           където съответно:
                     
                                 SIII
                                 
                              
                              
                                 е относителната площ на пик III, изчислена или съобразно общото съдържание на протеин, или съобразно относителната площ на пик SII [E],
                              
                           
                                 P %
                              
                              
                                 е общото тегловно съдържание на протеин, изразено като процент,
                              
                           
                                 SII [E]
                              
                              
                                 е относителната площ на пробата, изчислена в точка 9.1.2.
                              
                           Тези уравнения са еквивалентни по стойност на 1,3, посочено в точка 9.2.
                     Разликата (T1 и T2) между установената относителна площ SIII [E] и относителната площ SIII се изразява чрез следното: T1 = SIII[E] – [(0,376 P% – 10,7) + (SIII[0] – 0,9)]T2 = SIII[E] – [(0,0123 SII[E] + 0,93) + (SIII[0] – 0,9)].
                     
                                 Ако T1 и/или T2
                                 
                              
                              
                                 са по-малки или равни на нула, не може да бъде определено присъствието на сирищна суроватка.
                              
                           
                                 Ако T1 и T2
                                 
                              
                              
                                 са по-големи от нула, има наличие на сирищна суроватка.
                              
                           Съдържанието на сирищна суроватка се изчислява по следната формула: W = T2 + 0,91
                     където:
                     0,91 е разстоянието на вертикалната ос между непрекъснатата и пунктираната прави линии.
                     
                        
                  
                  
                     Допълнение III
                     
                        ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СУХО ВЕЩЕСТВО НА СИРИЩНА СУРОВАТКА В ОБЕЗМАСЛЕНО МЛЯКО НА ПРАХ
                     
                     1.   ЦЕЛ: ОТКРИВАНЕ НА ПРИБАВЯНЕТО НА СУХО ВЕЩЕСТВО НА СИРИЩНА СУРОВАТКА КЪМ ОБЕЗМАСЛЕНО МЛЯКО НА ПРАХ
                     2.   ЗА СПРАВКА: МЕЖДУНАРОДЕН СТАНДАРТ ISO 707
                     3.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ
                     Съдържанието на сухо вещество на сирищна суроватка се дефинира като масовата концентрация от казеиномакропептидното съдържание, определена чрез описаната процедура.
                     4.   ПРИНЦИП
                     Пробите се анализират за казеиномакропептид A с високоефективна течна хроматография с обърнати фази (процедура за HPLC). Оценката на резултата се получава чрез позоваване на стандартни проби, съдържащи обезмаслено мляко на прах със или без известен процент суроватка на прах. Резултатите, които са по-високи от 1 % (m/m), показват наличие на сухо вещество на сирищна суроватка.
                     5.   РЕАГЕНТИ
                     Всички реагенти трябва да бъдат с признато аналитично качество. Използваната вода трябва да е дестилирана или да е с еквивалентна степен на чистота. Ацетонитрилът следва да бъде със спектроскопично качество или с HPLC-качество.
                     5.1.   Разтвор на трихлорооцетна киселина
                     
                     240 g трихлорооцетна киселина (CCl3COOH) се разтварят във вода и се долива до 1 000 ml. Разтворът трябва да бъде прозрачен и безцветен.
                     5.2.   Елуенти A и Б
                     
                     Eлуент A: 150 ml ацетонитрил (CH3CN), 20 ml изопропанол (CH3CHOHCH3) и 1,00 ml трифлуорооцетна киселина (TFA, CF3COOH) се поставят в 1 000 ml измерителна колба. Долива се до 1 000 ml с вода.
                     Елуент Б: 550 ml ацетонитрил, 20 ml изопропанол и 1,00 ml TFA се поставят в 1 000 ml измерителна колба. Долива се до 1 000 ml с вода. Елуентният разтвор се филтрира, преди да се използва, през мембранен филтър с 0,45 μm диаметър на порите.
                     5.3.   Съхранение на колоната
                     
                     След анализа колоната се изплаква с елуент Б (чрез градиент) и впоследствие се изплаква с ацетонитрил (чрез градиент за 30 минути). Колоната се съхранява в ацетонитрил.
                     5.4.   Стандартни проби
                     
                     5.4.1.   Обезмаслено мляко на прах, което изпълнява изискванията за публично складиране (т. e. [0]).
                     
                     5.4.2.   Същото обезмаслено мляко на прах, подправено с 5 % (m/m) сирищна суроватка на прах със стандартен състав (т.e. [5]).
                     
                     5.4.3.   Същото обезмаслено мляко на прах, подправено с 50 % (m/m) сирищна суроватка на прах със стандартен състав (т.e. [50]).
                     
                     6.   АПАРАТУРА
                     6.1.   Аналитични везни
                     
                     6.2.   Незадължително: центрофуга, която може да достигне центробежна сила от 2 200 g, снабдена със запушени центрофужни епруветки с капацитет около 50 ml
                     
                     6.3.   Механичен шейкър
                     
                     6.4.   Магнитна бъркалка
                     
                     6.5.   Стъклени фунии с диаметър около 7 cm
                     
                     6.6.   Филтърна хартия, средно филтриране, диаметър около 12,5 cm
                     
                     6.7.   Стъклено оборудване за филтриране с мембранен филтър с диаметър на порите 0,45 μm
                     
                     6.8.   Градуирани капкомери, които позволяват подаване на 10 ml (ISO 648, клас A, или ISO/R 835), или система, която може да подаде 10,0 ml за две минути.
                     
                     6.9.   Система за подаване, която може да подаде 20,0 ml вода при приблизително 50 °C
                     
                     6.10.   Термостатна водна баня, регулирана на 25 ± 0,5 °C
                     
                     6.11.   Оборудване за HPLC, състоящо се от:
                     
                     
                                 6.11.1.
                              
                              
                                 
                                    Бинарна помпена система за градиентна работа
                                 
                              
                           
                                 6.11.2.
                              
                              
                                 
                                    Ръчен или автоматичен инжектор с капацитет 100 μl
                                 
                              
                           
                                 6.11.3.
                              
                              
                                 
                                    Колона Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (дължина 25 cm, 0,46 cm вътрешен диаметър) или еквивалентна широка кварцова колона с обърната фаза
                                 
                              
                           
                                 6.11.4.
                              
                              
                                 
                                    Термостатична колонна пещ, програмирана на 35 ± 1 °C
                                 
                              
                           
                                 6.11.5.
                              
                              
                                 
                                    UV детектор с променлива дължина на вълните, позволяващ измервания при 210 nm (ако е необходимо, може да бъде използвана по-голяма дължина на вълните до 220 nm), с чувствителност от 0,02 Å
                                 
                              
                           
                                 6.11.6.
                              
                              
                                 
                                    Интегратор с възможност за настройка на интегрирането по обща базова линия или от впадина до впадина
                                 
                                 
                                    Забележка: Използването на колоната при стайна температура е възможно, при условие че стайната температура не се отклонява повече от 1 °C, в противен случай се получава прекалено голямо вариране във времето на задържане на CMPA.
                              
                           7.   ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИ
                     7.1.   Пробите се вземат в съответствие с процедурата, определена в Международен стандарт ISO 707. Държавите членки обаче може да използват друг метод за вземане на проби, при условие че той е в съответствие с принципите на гореупоменатия стандарт.
                     
                     7.2.   Пробата се съхранява при условия, които изключват всякакво увреждане или промяна на състава.
                     
                     8.   ПРОЦЕДУРА
                     8.1.   Подготовка на тестовата проба
                     
                     Млякото на прах се прехвърля в съд, снабден с уплътнен капак, и с вместимост, която е около два пъти обема на праха. Съдът се затваря веднага. Млечният прах се смесва добре чрез многократно обръщане на съда.
                     8.2.   Маса на пробата за анализ
                     
                     Претеглят се 2,00 ± 0,001 g от пробата за анализ в центрофужна епруветка (6.2) или подходяща запушена колба (50 ml).
                     
                        Забележка: Когато се анализират смеси, се претегля такова количество от тестовата проба, че обезмаслената част от пробата да съответства на 2,00 g.
                     8.3.   Отстраняване на мазнината и протеините
                     
                     8.3.1.   Към тестовата доза се прибавят 20,0 ml топла вода (50 °C). Прахът се разтваря чрез разклащане за пет минути при използването на механичен шейкър (6.3). Епруветката се поставя във водната баня (6.10) и се оставя да се темперира до 25 °C.
                     
                     8.3.2.   Прибавят се 10,0 ml разтвор на трихлорооцетна киселина с температура около 25 °C (5.1) постоянно за две минути, като същевременно се разбърква енергично с магнитната бъркалка (6.4). Епруветката се поставя във водната баня (6.10) и се оставя за 60 минути.
                     
                     8.3.3.   Центрофугират се (6.2) 2 200 g в продължение на 10 минути или се филтрират през хартия (6.6), като първите 5 ml филтрат се изхвърлят.
                     
                     8.4.   Хроматографски анализ
                     
                     8.4.1.   HPLC-методът с обърната фаза изключва възможността да има фалшиви положителни резултати, дължащи се на наличието на кисела мътеница на прах.
                     
                     8.4.2.   Преди извършването на HPLC анализа с обърната фаза условията на градиента следва да бъдат оптимизирани. Времето на задържане от 26 ± 2 минути за CMP Α е оптимално за системите с градиент с мъртъв обем от около 6 ml (обем от точката, в която разредителите се събират, до обема на пръстена на инжектора включително). Системите с градиент с по-малък мъртъв обем (напр. 2 ml) следва да използват 22 минути като оптимално време за задържане.
                     
                     Вземат се разтвори от стандартните проби (5.4) без и със 50 % сирищна суроватка.
                     100 μl супернатант или филтрат (8.3.3) се впръсква в апарата за HPLC, който функционира при условията на тестовия градиент, дадени в таблица 1.
                     
                        Таблица 1
                     
                     
                        Условия на тестовия градиент за оптимизиране на хроматографията
                     
                     
                                 Време
                                 (min)
                              
                              
                                 Дебит
                                 (ml/min)
                              
                              
                                 % A
                              
                              
                                 % Б
                              
                              
                                 Крива
                              
                           
                                 Първоначално
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 90
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                 *
                              
                           
                                 27
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 60
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 линейна
                              
                           
                                 32
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                 90
                              
                              
                                 линейна
                              
                           
                                 37
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                 90
                              
                              
                                 линейна
                              
                           
                                 42
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 90
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                 линейна
                              
                           Сравнението на двете хроматограми следва да разкрива мястото на пика на GMPA.
                     Чрез използване на формулата, дадена по-долу, може да бъде изчислен първоначалният състав на разредителя, който ще се използва за нормалния градиент (вж. 8.4.3): % Б = 10 – 2,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) * 30 / 27 % Б = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) * 1,11
                     където:
                     
                                 RTcmpA
                                 
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 времето на задържане на CMPΑ в тестовия градиент
                              
                           
                                 10
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 първоначалният % Б на тестовия градиент
                              
                           
                                 2,5
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 % Б на половината време минус % Б първоначално в нормалния градиент
                              
                           
                                 13,5
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 половината време на тестовия градиент
                              
                           
                                 26
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 изисквано време на задържане на CMPΑ
                                 
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 съотношение на наклоните на тестовия и нормалния градиент
                              
                           
                                 30
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 % Б първоначално минус % Б при 27 минути в тестовия градиент
                              
                           
                                 27
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 време на преминаване на тестовия градиент.
                              
                           8.4.3.   Анализ на разтвори на тестовите проби
                     
                     Впръскват се 100 μl точно измерен супернатант или филтрат (8.3.3) в апарата за HPLC, който работи при дебит 1,0 ml елуентен разтвор (5.2) в минута.
                     Съставът на елуента в началото на анализа се получава съгласно 8.4.2. Той обичайно е близък до A:Б = 76:24 (5.2). Непосредствено след впръскването се стартира линеен градиент, което води до 5 % по-висок процент на Б след 27 минути. След това се стартира линеен градиент, с който съставът на елуента става 90 % Б за пет минути. Този състав се поддържа пет минути, след което съставът се променя чрез линеен градиент за пет минути към първоначалния състав. В зависимост от вътрешния обем на помпената система следващото впръскване може да бъде направено 15 минути след постигането на първоначалните условия.
                     
                        Забележка 1. Времето на задържане на CMPA следва да бъде 26 ± 2 минути. Това може да бъде постигнато чрез вариране на изходните и крайните условия на първия градиент. Разликата обаче в % Б за изходните и крайните условия на първия градиент трябва да остане 5 % Б.
                     
                        Забележка 2. Елуентите следва да бъдат дегазирани в достатъчна степен и да се запазят такива. Това е от основна важност за доброто функциониране на помпената система за градиента. Стандартното отклонение за времето на задържане на пика CMPA трябва да бъде по-малко от 0,1 минути (n = 10).
                     
                        Забележка 3. Референтната проба [5] трябва да бъде впръсквана на всеки пет проби и използвана за изчисляване на нов фактор на сигнала R (9.1.1).
                     8.4.4.   Резултатите от хроматографския анализ на тестовата проба (E) се получават под формата на хроматограма, в която пикът CMPA се идентифицира чрез времето си на задържане от около 26 минути.
                     
                     Интеграторът (6.11.6) автоматично изчислява височината H на пика CMPA. Във всяка хроматограма следва да се проверява мястото на базовата линия. Анализът или интегрирането трябва да бъдат повторени, ако базовата линия е определена неправилно.
                     
                        Забележка: Ако пикът на CMPA е достатъчно отделен от други пикове, следва да се използва базовата линия от впадина до впадина; в противен случай се използват перпендикулярните проекции върху обща базова линия, която би трябвало да започва близо до пика на CMPA (следователно не при t = 0 min!). За стандартния разтвор и за пробите се използва един и същ тип интегриране, а при обща базова линия се проверява нейната съгласуваност за пробите и стандартния разтвор.
                     Съществено е да се изследва видът на всяка хроматограма преди количественото тълкуване, за да се открият всякакви отклонения, които се дължат или на неправилното функциониране на апаратурата, или на колоната, или на произхода и естеството на анализираната проба. Анализът се повтаря, ако има съмнения.
                     8.5.   Калибриране
                     
                     8.5.1.   Процедурата, описана в точки 8.2—8.4.4, се прилага с точност за стандартните проби (5.4.1—5.4.2). Използват се прясно приготвени разтвори, тъй като CMP се разрушават в 8 %-на трихлорооцетна среда при стайна температура. При 4 °C разтворът остава стабилен за 24 часа. В случай на дълги аналитични серии е желателно в автоматичния инжектор да се използва охладена подложка за проби.
                     
                     
                        Забележка: 8.4.2. може да бъде пропусната, ако % Б при първоначалните условия е известен от предходни анализи.
                     Хроматограмата на референтната проба [5] следва да е аналогична с представеното на фигура 1. На тази фигура пикът на CMPA се предхожда от два малки пика. Важно е да се получи подобно разделяне.
                     8.5.2.   Преди хроматографския анализ на пробите се впръскват 100 μl стандартна проба без сирищна суроватка [0] (5.4.1).
                     
                     Хроматограмата не следва да показва пик във времето на задържане на пика CMPA.
                     8.5.3.   Определят се факторите на сигнала R чрез впръскване на същия обем от филтрата (8.5.1), какъвто е използван за пробите.
                     
                     9.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
                     9.1.   Метод на изчисление и формули
                     
                     9.1.1.   Изчисляване на фактора на сигнала R:
                     
                     Пик на CMPA: R = W/H
                     където:
                     
                                 R
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 фактор на сигнала на пика на CMPA
                                 
                              
                           
                                 H
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 височина на пика на CMPA
                                 
                              
                           
                                 W
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 количество суроватка в стандартната проба [5].
                              
                           9.2.   Изчисляване на процента на сирищна суроватка на прах в пробата
                     
                     W(E) = R × H(E)
                     където:
                     
                                 W(E)
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 процент (m/m) сирищна суроватка в пробата (E),
                              
                           
                                 R
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 фактор на сигнала на пика на CMPA (9.1.1)
                              
                           
                                 H(E)
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 височина на пика на CMPA на пробата (E)
                              
                           Ако W(E) надвишава 1 % и разликата между времето на задържане и това на стандартната проба [5] е по-малка от 0,2 минути, тогава има наличие на сухо вещество на сирищна суроватка.
                     9.3.   Точност на процедурата
                     
                     9.3.1.   Повторяемост
                     
                     Разликата между резултатите от две определяния, извършени едновременно или едно след друго от същия анализатор и при използване на същата апаратура върху идентичен тестов материал, не трябва да надвишава 0,2 % m/m.
                     9.3.2.   Възпроизводимост
                     
                     Не е определена.
                     9.3.3.   Линейност
                     
                     От 0 до 16 % сирищна суроватка трябва да даде линейна зависимост с коефициент на корелация > 0,99.
                     9.4.   Тълкуване
                     
                     Границата от 1 % включва неопределеността, свързана с възпроизводимостта.
                     
                        Фигура 1
                     
                     
                        Ni—4.6 стандарт
                     
                     
                        
                  
                  
                              (*)
                           
                           
                              Международен IDF стандарт 135B/1991 Мляко и млечни продукти. Характеристики за точност на аналитичните методи. Описание на процедурата за съвместни изследвания.“
                           
                        
            
                  3)
               
               
                  Добавят се следните приложения:
                  „
                  
                     ПРИЛОЖЕНИЕ VI
                     
                        Методи за анализ на масло за частно складиране
                     
                     
                                 Параметър
                              
                              
                                 Метод
                              
                           
                                 Масленост (6)
                                 
                              
                              
                                 ISO 17189 или ISO 3727 част 3
                              
                           
                                 Вода
                              
                              
                                 ISO 3727, част 1
                              
                           
                                 Сух безмаслен остатък (с изключение на сол)
                              
                              
                                 ISO 3727, част 2
                              
                           
                                 Сол
                              
                              
                                 ISO 15648
                              
                           
                  
                     ПРИЛОЖЕНИЕ VII
                     
                        Методи за анализ на обезмаслено мляко на прах за частно складиране
                     
                     
                                 Параметър
                              
                              
                                 Метод
                              
                           
                                 Мазнина
                              
                              
                                 ISO 1736
                              
                           
                                 Белтък
                              
                              
                                 ISO 8968, част 1
                              
                           
                                 Вода
                              
                              
                                 ISO 5537
                              
                           
                  
                     ПРИЛОЖЕНИЕ VIII
                     
                        Методи за анализ на сирена за частно складиране
                     
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Методът за анализ, определен в допълнението, се използва, за да се гарантира, че сирене, което е произведено изключително от овче мляко, козе мляко или биволско мляко, или смес от овче, козе и биволско мляко, не съдържа казеин от краве мляко.
                                 Счита се, че е налице казеин от краве мляко, ако съдържанието на казеин от краве мляко в анализираната проба е равно или е по-голямо от съдържанието в референтната проба, съдържаща 1 % краве мляко, както е описано в допълнението.
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Методите за откриване на казеин от краве мляко в сирената, посочени в параграф 1, могат да бъдат използвани, при условие че:
                                 
                                             а)
                                          
                                          
                                             границата на откриване е максимум 0,5 %, и
                                          
                                       
                                             б)
                                          
                                          
                                             няма фалшиви положителни резултати, и
                                          
                                       
                                             в)
                                          
                                          
                                             казеинът от краве мляко може да се открие посредством необходимата чувствителност, дори и след дълги периоди на узряване, които могат да възникват при обичайни търговски условия.
                                          
                                       Ако някое от горните изисквания не е спазено, следва да се използват методите, определени в допълнението.
                              
                           
                  
                     Допълнение
                     
                        МЕТОД ЗА ОТКРИВАНЕ НА КРАВЕ МЛЯКО И КАЗЕИНАТИ В СИРЕНА ОТ ОВЧЕ МЛЯКО, КОЗЕ МЛЯКО ИЛИ БИВОЛСКО МЛЯКО, ИЛИ СМЕСИ ОТ ОВЧЕ, КОЗЕ И БИВОЛСКО МЛЯКО
                     
                     1.   ОБХВАТ
                     Откриване на краве мляко и казеинати в сирена, произведени от овче мляко, козе мляко, биволско мляко, или смеси от овче, козе и биволско мляко, чрез изоелектрическо фокусиране на γ-казеини след плазминолиза.
                     2.   ПРИЛОЖНО ПОЛЕ
                     Методът е подходящ за чувствително и специфично откриване на натурално и топлинно обработвано краве мляко и казеинати в пресни и узрели сирена, произведени от овче мляко, козе мляко, биволско мляко, или смеси от овче, козе и биволско мляко. Той не е подходящ за откриване на подправяне на мляко и сирене чрез топлинно обработени концентрати на суроватъчен протеин от краве мляко.
                     3.   ПРИНЦИП НА МЕТОДА
                     3.1.   Изолиране на казеини от сирене и от референтните проби.
                     
                     3.2.   Разтваряне на изолираните казеини и разграждане чрез плазмин (EC.3.4.21.7).
                     
                     3.3.   Изоелектрическо фокусиране на обработени с плазмин казеини в присъствието на уреа и оцветяване на протеините.
                     
                     3.4.   Оценка на оцветените γ3 и γ2-ивици на казеин (доказателство за краве мляко) чрез сравняване на получените от пробата ивици с тези, които са получени в същия гел от референтните проби, съдържащи 0 % и 1 % краве мляко.
                     
                     4.   РЕАГЕНТИ
                     Ако не е посочено друго, трябва да бъдат използвани химикали с аналитично качество. Водата трябва да е двойно дестилирана или с еквивалента степен на чистота.
                     
                        Забележка: Указанията по-долу се прилагат за лаборатория, която е подготвила полиакриламидни гелове, съдържащи уреа, с размери 265 × 125 × 0,25 mm. Когато се използват други размери и типове гел, може да е необходимо коригиране на условията за отделяне.
                     
                        
                           Изоелектрическо фокусиране
                        
                     
                     4.1.   Реагенти за получаване на полиакриламидни гелове, съдържащи уреа
                     
                     4.1.1.   Основен разтвор на гел
                     
                     Разтварят се:
                     
                                  
                              
                              
                                 4,85 g акриламид
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,15 g N, N′-метиленбисакриламид (BIS)
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 48,05 g уреа
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 15,00 g глицерин (87 % w/w)
                              
                           във вода, допълва се до 100 ml и се съхранява в бутилка от кафяво стъкло в хладилник.
                     
                        Забележка: Вместо цитираните определени дози невротоксични акриламиди може да се използва готов разтвор акриламид/BIS, наличен в търговската мрежа. Когато такъв разтвор съдържа 30 % w/v акриламид и 0,8 % w/v BIS, вместо определените дози за сместа трябва да бъде използван обем от 16,2 ml. Годността на основния разтвор е максимум 10 дни; ако неговата проводимост е повече от 5 μS, той се дейонизира чрез разклащане с 2 g Амберлит MB-3 за 30 минути, след това се филтрира през мембрана от 0,45 μm.
                     4.1.2.   Разтвор на гел
                     
                     Приготвя се разтвор на гел чрез смесване на добавките и амфолити (*) с основния разтвор на гел (виж 4.1.1).
                     
                                  
                              
                              
                                 9,0 ml основен разтвор
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 24 mg β-аланин
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 500 μl амфолит pH 3,5—9,5
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 250 μl амфолит pH 5—7
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 250 μl амфолит pH 6—8
                              
                           Разтворът на гел се смесва и се дегазира за две до три минути в ултразвукова баня или във вакуум.
                     
                        Забележка: Разтворът на гел се приготвя непосредствено преди изливането му (вж. 6.2).
                     4.1.3.   Катализаторни разтвори
                     
                     4.1.3.1.   N, N, N′ N′ — тетраметилетилендиамин (Temed)
                     4.1.3.2.   40 % w/v амониев персулфат (PER):
                     800 mg PER се разтварят във вода и се долива до 2 ml
                     
                        Забележка: Винаги се използва прясно приготвен разтвор на PER.
                     4.2.   Контактна течност
                     
                     Керосин или течен парафин
                     4.3.   Aноден разтвор
                     
                     5,77 g фосфорна киселина (85 % w/w) се разтваря във вода и се разрежда до 100 ml.
                     4.4.   Катоден разтвор
                     
                     2,00 g натриев хидроксид се разтваря във вода и се разрежда до 100 ml с вода.
                     
                        
                           Подготовка на пробите
                        
                     
                     4.5.   Реагенти за изолиране на протеин
                     
                     4.5.1.   Разредена оцетна киселина (25,0 ml ледена оцетна киселина с добавена вода до 100 ml)
                     
                     4.5.2.   Дихлорометан
                     
                     4.5.3.   Ацетон
                     
                     4.6.   Буфер за разтваряне на протеин
                     
                     Разтварят се:
                     
                                  
                              
                              
                                 5,75 g глицерин (87 % w/w)
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 24,03 g уреа
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 250 mg дитиотрейтол
                              
                           във вода и се долива до 50 ml.
                     
                        Забележка: Съхранява се в хладилник, максимална годност — една седмица.
                     4.7.   Реагенти за разграждане на казеини чрез плазмин
                     
                     4.7.1.   Буфер — амониев карбонат
                     
                     0,2 mol/l разтвор на амониев бикарбонат (1,58 g/100 ml вода), съдържащ 0,05 mol/l етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA, 1,46 g/100 ml), се титрува с 0,2 mol/l разтвор на амониев кaрбонат (1,92 g/100 ml вода), съдържащ 0,05 mol/l EDTA, до pH 8.
                     4.7.2.   Говежди плазмин (EC. 3.4.21.7) с активност най-малко 5 U/ml
                     
                     4.7.3.   Разтвор на ε-аминокапронова киселина за инхибиране на ензими
                     
                     2,624 g ε-аминокапронова киселина (6 амино-n-хексанова киселина) се разтварят в 100 ml 40 % (v/v) етанол.
                     4.8.   Стандартни проби
                     
                     4.8.1.   Сертифицирани референтни стандартни проби от смес от подсирени овче и козе обезмаслено мляко, съдържащи 0 % и 1 % краве мляко, могат да се намерят от Института за референтни материали и метрология на Комисията, B-2440 Гил, Белгия.
                     
                     4.8.2.   Подготовка на вътрешни лабораторни стандартни проби от подсирено биволско мляко, съдържащо 0 % и 1 % краве мляко
                     
                     Обезмасленото мляко се приготвя чрез центрофугиране на сурово непакетирано биволско или краве мляко при 37 °C (2 500 g, 20 минути). След бързо охлаждане на съда и съдържанието му до 6—8 °C, горният слой мазнина се отстранява напълно. За подготовката на 1 %-на стандартна проба към 495 ml биволско обезмаслено мляко се добавя 5,00 ml краве обезмаслено мляко в 1 l бехерова чаша и се постига pH 6,4 чрез прибавяне на разредена млечна киселина (10 % w/v). Температурата се довежда до 35 °C и се прибавят 100 μl телешко сирище (активност 1: 10 000, около 3 000 U/ml), разклаща се за 1 минута и бехеровата чаша се оставя покрита с алуминиево фолио при 35 °C за един час, за да може съдържанието да се съсири. След образуването на съсирека цялото подсирено мляко се суши чрез сублимиране без предварително хомогенизиране или отцеждане на суроватката. След сушенето чрез сублимиране то се смила ситно на хомогенен прах. За подготовката на 0 %-ната стандартна проба се извършва същата процедура с използване на натурално биволско обезмаслено мляко. Стандартните проби трябва да бъдат съхранявани при – 20 °C.
                     
                        Забележка: Препоръчително е да се проверява чистотата на биволското мляко чрез изоелектрическо фокусиране на третираните с плазмин казеини преди подготовката на стандартните проби.
                     
                        
                           Реагенти за оцветяване на протеин
                        
                     
                     4.9.   Фиксатор
                     
                     150 g трихлорооцетна киселина се разтварят във вода и се долива до 1 000 ml.
                     4.10.   Обезцветяващ разтвор
                     
                     500 ml метанол и 200 ml ледена оцетна киселина се разреждат до 2 000 ml с дестилирана вода.
                     
                        Забележка: Всеки ден се приготвя пресен обезцветяващ разтвор; той може да бъде приготвен чрез смесване на равни обеми основни разтвори на 50 % (v/v) метанол и 20 % (v/v) ледена оцетна киселина.
                     4.11.   Оцветяващи разтвори
                     
                     4.11.1.   Оцветяващ разтвор (основен разтвор 1)
                     
                     3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) се разтваря в 1 000 ml 90 % (v/v) метанол, като се използва магнитна бъркалка (приблизително 45 минути), филтрира се през два нагънати филтъра със средна скорост.
                     4.11.2.   Оцветяващ разтвор (основен разтвор 2)
                     
                     5,0 g меден сулфат пентахидрат се разтваря в 1 000 ml 20 % (v/v) оцетна киселина.
                     4.11.3.   Оцветяващ разтвор (работен разтвор)
                     
                     Смесват се по 125 ml от всеки от основните разтвори (4.11.1, 4.11.2) непосредствено преди оцветяването.
                     
                        Забележка: Оцветяващият разтвор следва да бъде приготвен в деня, в който се използва.
                     5.   ОБОРУДВАНЕ
                     5.1.   Стъклени плочи (265 × 125 × 4 mm); каучукова ролка (ширина 15 cm); нивелирна маса
                     
                     5.2.   Лист носител на гел (265 × 125 mm)
                     
                     5.3.   Покривен лист (280 × 125 mm). По двете му дължини отстрани се поставя самозалепваща лента (280 × 6 × 0,25 mm) (вж. фигура 1)
                     
                     5.4.   Камера за електрофокусиране с охлаждаща плоча (напр. 265 × 125 mm) и подходящо електрическо захранване (≥ 2,5 kV) или автоматично устройство за електрофореза
                     
                     5.5.   Криостат с циркулация, термостатно контролиран на 12 ± 0,5 °C
                     
                     5.6.   Центрофуга, регулируема за 3 000g
                     
                     5.7.   Електродни ленти (с дължина ≥ 265 mm)
                     
                     5.8.   Пластмасови флакони за капене на анодните и катодните разтвори
                     
                     5.9.   Апликатори за проби (10 × 5 mm, вискозна филтърна хартия или филтърна хартия с ниска абсорбция на протеин)
                     
                     5.10.   Съдове от неръждаема стомана или от стъкло за оцветяване и обезцветяване (напр. 280 × 150 mm таблички за инструменти)
                     
                     5.12.   Регулируем хомогенизатор (с диаметър на оста 10 mm), от 8 000 до 20 000 об./мин.
                     
                     5.13.   Магнитна бъркалка
                     
                     5.14.   Ултразвукова баня
                     
                     5.15.   Апарат за залепване на листовете
                     
                     5.16.   25 μl микро-капкомери
                     
                     5.17.   Вакуумен концентратор или сушилня чрез сублимиране
                     
                     5.18.   Термостатично контролирана водна баня, регулируема за 35 и за 40 ± 1 °C с възможност за разбъркване
                     
                     5.19.   Денсиметър, четящ при λ = 634 nm
                     
                     6.   ПРОЦЕДУРА
                     6.1.   Подготовка на пробите
                     
                     6.1.1.   Изолиране на казеини
                     
                     Количество, еквивалентно на 5 g сухо вещество сирене, или референтните стандартни проби се претеглят в 100 ml центрофужна епруветка, прибавя се 60 ml дестилирана вода и се хомогенизира с хомогенизатор (от 8 000 до 10 000 об./мин). Регулира се до pH 4,6 с разредена оцетна киселина (4.5.1) и се центрофугира (5 минути, 3 000 g). Мазнината и суроватката се отделят, утайката се хомогенизира при 20 000 об./мин в 40 ml дестилирана вода, регулирана до pH 4,5 с разредена оцетна киселина (4.5.1), добавят се 20 ml дихлорометан (4.5.2), отново се хомогенизира и се центрофугира (5 минути, 3 000 g). Казеиновият слой, който се намира между водната и органичната фази (вж. фигура 2), се отстранява със шпатула и двете фази се отделят. Казеинът се хомогенизира отново в 40 ml дестилирана вода (виж по-горе) и 20 ml дихлорометан (4.5.2) и се центрофугира. Тази процедура се повтаря, докато двете фази на екстракцията останат безцветни (от два до три пъти). Утайката от протеин се хомогенизира с 50 ml ацетон (4.5.3) и се филтрира през нагъната филтърна хартия със средна скорост. Утайката върху филтъра се измива с две отделни части от 25 ml ацетон и се оставя да се изсуши на въздух или в струя азот, след което се стрива на фин прах в хаван.
                     Забележка: Сухият изолиран казеин следва да бъде съхраняван при – 20 °C.
                     6.1.2.   Разграждане чрез плазмин на β-казеини за интензифициране на γ-казеини
                     
                     25 mg изолирани казеини (6.1.1) се разпръскват в 0,5 ml буфер с амониев карбонат (4.7.1) и се хомогенизират за 20 минути, например чрез обработка с ултразвук. Подгрява се до 40 °C и се добавя 10 μl плазмин (4.7.2), смесва се и се инкубира за един час при 40 °C с непрекъснато разклащане. За да се инхибира ензимът, се добавя 20 μl разтвор на ε-аминокапронова киселина (4.7.3), след това се добавят 200 mg твърда уреа и 2 mg дитиотрейтол.
                     
                        Забележка: За да се получи по-голяма симетрия на фокусираните казеинови ивици е препоръчително разтворът да се изсуши чрез сублимиране след добавянето на ε-аминокапронова киселина, като след това утайките се разредят в 0,5 ml буфер за разтваряне на протеин (4.6).
                     6.2.   Приготвяне на полиакриламидни гелове, съдържащи уреа
                     
                     С помощта на няколко капки вода листът носител на гел (5.2) се разстила върху стъклена плоча (5.1), като излизащата навън вода се отстранява с хартиена салфетка. По същия начин покривният лист (5.3) с ограничители (0,25 mm) се разстила върху друга стъклена плоча. Плочата се поставя хоризонтално върху нивелирна маса.
                     Към приготвения и с отстранен въздух разтвор на гел (4.1.2) се добавят 10 μl Temed (4.1.3.1), разклаща се и се добавят 10 μl разтвор на PER (4.1.3.2), внимателно се смесва и веднага се излива равномерно в центъра на покривния лист. Единият край на плочата с носителя на гела (с листа надолу) се поставя върху плочата с покривния лист и плочата се сваля бавно надолу, така че между листовете да се образува и разстеле равномерно филм от гел, без да се образуват мехурчета (фигура 3). Плочата с носителя на гела се оставя внимателно да легне напълно с помощта на тънка шпатула и върху нея се поставят още три стъклени плочи за тежест. След завършването на полимеризацията (около 60 минути) полимеризираният гел върху плочата носител на гела и върху покривния лист се изважда чрез разделяне на стъклените плочи. Обратната страна на листа носител се почиства внимателно, за да се отстранят остатъците от гела и уреата. „Гел-сандвичът“ се навива и залепва на тръбичка и се съхранява в хладилник (максимум шест седмици).
                     
                        Забележка: Покривният лист с ограничителите може да бъде използван повторно. Полиакриламидният гел може да бъде нарязан на по-малки части, което е препоръчително, когато има няколко проби или ако се използва автоматично устройство за електрофореза (два гела, с размер 4,5 × 5 сm).
                     6.3.   Изоелектрическо фокусиране
                     
                     Охлаждащият термостат се настройва на 12 °C. Обратната страна на листа носител на гел се избърсва с керосин, след това в центъра на охлаждащия блок се капват няколко капки керосин (4.2.). След това „гел-сандвичът“ се разстила върху него със страната на носителя надолу, като се внимава да не се образуват мехурчета. Излишният керосин се избърсва и покривният лист се отстранява. Електродните ленти се напояват с електродните разтвори (4.3, 4.4), изрязват се до дължината на гела и се поставят на предвидените места (разстояние на електродите 9,5 cm).
                     
                        
                           Условия за изоелектрическо фокусиране:
                        
                     
                     6.3.1.   Размер на гела 265 × 125 × 0,25 mm
                     
                     
                                 Стъпка
                              
                              
                                 Време
                                 (min.)
                              
                              
                                 Електрическо напрежение
                                 (V)
                              
                              
                                 Електрически ток
                                 (mA)
                              
                              
                                 Мощност
                                 (W)
                              
                              
                                 Волт-часове
                                 (Vh)
                              
                           
                                 
                                             1.
                                          
                                          
                                             Предварително фокусиране
                                          
                                       
                              
                                 30
                              
                              
                                 максимум
                                 2 500 
                              
                              
                                 максимум
                                 15
                              
                              
                                 постоянна 4
                              
                              
                                 ок. 300
                              
                           
                                 
                                             2.
                                          
                                          
                                             Фокусиране на пробата (7)
                                             
                                          
                                       
                              
                                 60
                              
                              
                                 максимум
                                 2 500 
                              
                              
                                 максимум
                                 15
                              
                              
                                 постоянна 4
                              
                              
                                 ок. 1 000 
                              
                           
                                 
                                             3.
                                          
                                          
                                             Окончателно фокусиране
                                          
                                       
                              
                                 60
                              
                              
                                 максимум
                                 2 500 
                              
                              
                                 максимум
                                 5
                              
                              
                                 максимум
                                 20
                              
                              
                                 ок. 3 000 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 40
                              
                              
                                 максимум
                                 2 500 
                              
                              
                                 максимум
                                 6
                              
                              
                                 максимум
                                 20
                              
                              
                                 ок. 3 000 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 30
                              
                              
                                 максимум
                                 2 500 
                              
                              
                                 максимум
                                 7
                              
                              
                                 максимум
                                 25
                              
                              
                                 ок. 3 000 
                              
                           
                        Забележка: Ако плътността или ширината на геловете се променят, стойностите за електрически ток и мощност следва да се адаптират по подходящ начин (напр. удвояване на стойностите за електрически ток и за мощност, ако се използва гел с размери 265 × 125 × 0,5 mm).
                     6.3.2.   Пример за програмиране на автоматично устройство за електрофореза (2 гела с размери 5,0 × 4,5 cm); електродите без ленти се поставят направо върху гела
                     
                     
                                 Стъпка
                              
                              
                                 Електрическо напрежение
                              
                              
                                 Електрически ток
                              
                              
                                 Мощност
                              
                              
                                 Температура
                              
                              
                                 Волт-часове
                              
                           
                                 
                                             1.
                                          
                                          
                                             Предварително фокусиране
                                          
                                       
                              
                                 1 000  V
                              
                              
                                 10,0 mA
                              
                              
                                 3,5 W
                              
                              
                                 8 °C
                              
                              
                                 85 Vh
                              
                           
                                 
                                             2.
                                          
                                          
                                             Фокусиране на пробата
                                          
                                       
                              
                                 250 V
                              
                              
                                 5,0 mA
                              
                              
                                 2,5 W
                              
                              
                                 8 °C
                              
                              
                                 30 Vh
                              
                           
                                 
                                             3.
                                          
                                          
                                             Фокусиране
                                          
                                       
                              
                                 1 200  V
                              
                              
                                 10,0 mA
                              
                              
                                 3,5 W
                              
                              
                                 8 °C
                              
                              
                                 80 Vh
                              
                           
                                 
                                             4.
                                          
                                          
                                             Фокусиране
                                          
                                       
                              
                                 1 500  V
                              
                              
                                 5,0 mA
                              
                              
                                 7,0 W
                              
                              
                                 8 °C
                              
                              
                                 570 Vh
                              
                           В стъпка 2 апликаторът на пробата се поставя на 0 Vh.
                     В стъпка 2 апликаторът на пробата се отстранява при 30 Vh.
                     6.4.   Оцветяване на протеин
                     
                     6.4.1.   Фиксиране на протеин
                     
                     Електродните ленти се отстраняват веднага след изключване на захранването и гелът незабавно се поставя в съд за оцветяване/обезцветяване, пълен с 200 ml фиксатор (4.9); оставя се за 15 минути, като непрекъснато се разклаща.
                     6.4.2.   Измиване и оцветяване на плочата с гел
                     
                     Фиксаторът се отцежда внимателно и плочата с гел се измива два пъти за по 30 секунди, всеки път със 100 ml обезцветяващ разтвор (4.10). Обезцветяващият разтвор се излива и съдът се пълни с 250 ml оцветяващ разтвор (4.11.3); оставя се да се оцвети за 45 минути с леко разклащане.
                     6.4.3.   Обезцветяване на плочата с гел
                     
                     Оцветяващият разтвор се излива, плочата с гел се измива два пъти, като всеки път се използва по 100 ml обезцветяващ разтвор (4.10), след това се разклаща с 200 ml обезцветяващ разтвор за 15 минути и обезцветяването се повтаря най-малко два или три пъти, докато основата стане чиста и безцветна. След това плочата с гел се изплаква с дестилирана вода (2 × 2 минути) и се изсушава на въздух (от 2 до 3 часа) или със сешоар (от 10 до 15 минути).
                     
                        Забележка 1: Фиксирането, измиването, оцветяването и обезцветяването се извършват при 20 °C. Да не се използват високи температури.
                     
                        Забележка 2: Ако се предпочита по-чувствително сребърно оцветяване (напр. кит за сребърно оцветяване, протеин, Pharmacia Biotech, код No 17-1150-01), пробите от казеин, третирани с плазмин, следва да бъдат разредени до 5 mg/ml.
                     7.   ОЦЕНКА
                     Оценяването се извършва чрез сравняване на ивиците на протеините в непознатата проба с референтни проби върху същия гел. Откриването на краве мляко в сирена, произведени от овче мляко, козе мляко, биволско мляко, или смеси от овче, козе и биволско мляко, се извършва чрез γ3- и γ2-казеини, чийто обхват на изоелектрически точки е между pH 6,5 и pH 7,5 (фигури 4 a и б, фигура 5). Границата на откриване е по-ниска от 0,5 %.
                     7.1.   Визуална оценка
                     
                     За визуална оценка на количеството краве мляко се препоръчва да се адаптират концентрациите на пробите и стандартите за получаване на същото ниво на интензивност на овчи, кози и/или биволски γ2- и γ3-казеини (виж „γ2 E,G,B“ и „γ3 E,G,B“ на фигури 4 a и б и фигура 5). След това количеството на кравето мляко (по-малко от, равно на или по-голямо от 1 %) в непознатата проба може да бъде оценявано директно чрез сравняване на интензитета на крави γ3- и γ2-казеини (виж „γ3 C“ и „γ2 C“ на фигури 4 a и б и фигура 5) с тези на 0 % и 1 % референтни стандарти (овчи, кози) или вътрешнолабораторни стандарти (биволски).
                     7.2.   Денсиметрична оценка
                     
                     Ако е приложимо, за определянето на съотношението на площта на пика на крави спрямо овчи, кози и/или биволски γ2- и γ3-казеини (вж. фигура 5) се използва денсиметър (5.19). Тази стойност се сравнява със съотношението на площта на пика на γ2- и γ3-казеини от 1 % референтния стандарт (овчи, кози) или вътрешнолабораторен стандарт (биволски), анализирани върху същия гел.
                     
                        Забележка: Методът функционира задоволително, ако има ясен положителен сигнал за двата крави γ2- и γ3-казеина в 1 % референтния стандарт, но не и в 0 % референтния стандарт. Ако няма, процедурата се оптимизира, като точно се спазват детайлите на метода.
                     Пробата се оценява като положителна, ако двата крави γ2- и γ3-казеина или съответните съотношения на площта на пиковете са равни или по-големи от нивото на 1 % референтен стандарт.
                     8.   ЗА СПРАВКА
                     
                        Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. (Използване на плазмин за увеличаване на чувствителността на откриване на краве мляко в овче и/или козе сирене с изоелектрическо фокусиране с гел на γ2-казеини). Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990 г.).
                     
                     
                        Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting (Контролен метод за откриване на краве мляко в овче и биволско сирене чрез използване на имуноблотинг). Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995 г.).
                     
                     
                        Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier (Чувствително откриване на краве мляко в овче и козе мляко и сирене чрез амфолит-носител и амфолит-носител/неутрализиран pH градиент — изоелектрическо фокусиране на γ-казеини с помощта на плазмин като индикаторен фермент) в: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.), стр 389—393, Bode-Verlag, München (1989 г.).
                     
                     
                        Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen (Откриване на краве мляко в овче и козе мляко и сирене чрез изоелектрическо фокусиране в полиакриламидни гелове, съдържащи уреа). Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).
                     
                     
                        Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films (Изоелектрическо фокусиране със свръхтънък слой в 50-100 μm полиакриламидни гелове върху силанизирани стъклени съдове или полиестерни филми). Electrophoresis 1, 43-56 (1980 г.).
                     
                     
                        Фигура 1
                     
                     
                        Схематично представяне на покривния лист
                     
                     
                        
                     
                        Фигура 2
                     
                     
                        Слой казеин между водната и органичната фази след центрофугиране
                     
                     
                        
                     
                        Фигура 3
                     
                     
                        Техника на захлупване за изливане на свръхтънки полиакриламидни гелове
                     
                     
                        
                     a = разделителна лента (0,25 mm); b = покривен лист (5.3); c, e = стъклени плочи (5.1); d = разтвор на гел (4.1.2); f = лист носител на гел (5.2)
                     
                        Фигура 4a
                     
                     
                        Изоелектрическо фокусиране на третирани с плазмин казеини от сирене, произведено от овче и от козе мляко и съдържащо различни количества краве мляко
                     
                     
                        
                     % CM = процент краве мляко, C = краве, E = овче, G = козе
                     Показана е горната половина на гел IEF.
                     
                        Фигура 4б
                     
                     
                        Изоелектрическо фокусиране на третирани с плазмин казеини от сирене, произведено от смеси от овче, козе и биволско мляко и съдържащо различни количества краве мляко
                     
                     
                        
                     % CM = процент краве мляко; 1 + = проба, съдържаща 1 % краве мляко и прибавен чист крави казеин в средата на пътеката. C = краве, E = овче, G = козе, B = биволско
                     Показано е общото разстояние на разделяне на гела IEF.
                     
                        Фигура 5
                     
                     
                        Поредица денситограми на стандартните проби (STD) и пробите сирене, произведено от смес от овче и козе мляко, след изоелектрическо фокусиране
                     
                     
                        
                     a,b = стандартни проби, съдържащи 0 и 1 % краве мляко; c-g = проби сирене, съдържащи 0, 1, 2, 3 и 7 % краве мляко. C = краве, E = овче, G = козе.
                     Сканирана е горната половина от гела IEF при λ = 634 nm.
                  
                  
                     ПРИЛОЖЕНИЕ IX
                     
                        Оценка на анализите
                     
                     1.   Осигуряване на качеството
                     
                     Анализите се извършват от лаборатории, определени в съответствие с член 12 от Регламент (ЕО) № 882/2004 (**), или определени от компетентните органи на държавата членка.
                     2.   Вземане на проби и оспорвания на резултатите от анализите
                     
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Вземането на проби трябва да се извършва съгласно съответната правна уредба за разглеждания продукт. Ако не са изрично предвидени разпоредби относно вземането на проби, се прилагат разпоредбите, определени в стандарта ISO 707 — Мляко и млечни продукти. Указания за вземане на проби.
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Лабораторните отчети за резултатите от анализа трябва да съдържат достатъчно информация, за да може да се извърши оценка на резултатите в съответствие с допълнението.
                              
                           
                              
                                 3.
                              
                              
                                 За анализите, които се изискват съгласно правилата на Съюза, трябва да бъдат вземани двойни проби.
                              
                           
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Ако възникне спор във връзка с резултатите, разплащателната агенция трябва да изисква необходимият анализ на съответния продукт да бъде проведен отново, като разходите се поемат от губещата страна.
                                 Горепосоченият анализ се извършва, при условие че са налични запечатани дублиращи проби от продукта, които се съхраняват по подходящ начин от компетентния орган. В рамките на 7 работни дни от съобщаването на резултатите от първия анализ производителят изпраща искане до разплащателната агенция за извършване на анализ. Разплащателната агенция извършва анализа в рамките на 21 работни дни след получаване на искането.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Резултатът от повторния анализ е окончателен.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Ако производителят може да докаже в рамките на пет работни дни от вземането на пробата, че процедурата по вземането на пробата не е извършена коректно, вземането на пробата трябва да бъде повторено, когато това е възможно. Ако вземането на пробата не може да бъде повторено, партидата трябва да бъде приета.
                              
                           
                  
                     Допълнение
                     
                        Оценка на съответствието на дадена партида със законно установените гранични стойности
                     
                     1.   Принцип
                     
                     В случаите, в които законодателството относно публичната интервенция и помощта за частно складиране предвижда подробни процедури за вземане на проби, се следват тези процедури. Във всички останали случаи се използва проба от най-малко три единични проби, взети на случаен принцип от партидата, подлежаща на контрол. Възможно е подготвянето на съставна проба. Полученият резултат се сравнява със законно установените гранични стойности чрез изчисляване на 95 % доверителен интервал като 2 х стандартно отклонение, където съответното стандартно отклонение зависи от това дали: 1. методът е валидиран посредством международно сътрудничество със стойности за σr и σR, или 2. в случай на вътрешно валидиране, е била изчислена вътрешната възпроизводимост. Този доверителен интервал в такъв случай ще се равнява на неопределеността на резултата при измерването.
                     2.   Методът е валидиран посредством международно сътрудничество
                     
                     В такъв случай стандартното отклонение на повторяемостта σr и стандартното отклонение на възпроизводимостта σR са установени и лабораторията може да докаже, че се спазват работните характеристики на валидирания метод.
                     Изчислява се средноаритметичната стойност  на n пъти повторените измервания.
                     Изчислява се разширената неопределеност (k = 2) за  с формулата
                     
                        
                     Ако крайният резултат x от измерването се изчислява с използването на формула от вида:, x = y
                        1 + y
                        2, x = y
                        1 – y
                        2, x = y
                        1 · y
                        2 или x = y
                        1/y
                        2, трябва да се спазват обичайните процедури за съчетаване на стандартни отклонения в подобни случаи.
                     Партидата се преценява като несъответстваща с горната законно установена гранична стойност UL, ако
                     
                        ;
                     в противен случай се преценява като съответстваща на UL.
                     Партидата се преценява като несъответстваща с долната законно установена гранична стойност LL, ако
                     
                        ;
                     в противен случай се преценява като съответстваща на LL.
                     3.   Вътрешно валидиране с изчисляване на стандартното отклонение на вътрешната възпроизводимост
                     
                     В случаите, когато се използват методи, непосочени в настоящия регламент, и не са били въведени измервания за точност, се извършва вътрешно валидиране. Във формулите за изчисляване на разширената неопределеност U се използват стандартното отклонение на вътрешната повторяемост σir и стандартното отклонение на вътрешната възпроизводимост σi
                        
                           R
                         вместо съответно σr и σ
                           R
                        .
                     Правилата, които трябва да се следват, за да се установи спазването на законно установените гранични стойности, са посочени в точка 1. Ако обаче партидата се прецени като несъответстваща със законно установената гранична стойност, измерванията се повтарят с метода, посочен в настоящия регламент, и резултатът се оценява съгласно точка 1.
                  
                  
                              (*)
                           
                           
                              Продуктите Ampholine® pH 3,5—9,5 (Pharmacia), както и Resolyte® pH 5—7, съответно pH 6—8 (BDH, Merck), се оказват особено подходящи за получаване на исканото отделяне на γ-казеини.
                           
                        
                              (**)
                           
                           
                              Регламент (ЕО) № 882/2004 г. на Европейския парламент и на Съвета от 29 април 2004 г. относно официалния контрол, провеждан с цел осигуряване на проверка на съответствието със законодателството в областта на фуражите и храните и правилата за опазване здравето на животните и хуманното отношение към животните (ОВ L 165, 30.4.2004 г., стр. 1).
                           
                        “
               
            
         (1)  Методът, който ще бъде използван, се одобрява от разплащателната агенция.
      
         (2)  Анализите на обгорели частички може да се извършват систематично. Те обаче се извършват винаги, когато не се провеждат сензорни проверки.
      
         (3)  Методът, който ще бъде използван, се одобрява от разплащателната агенция (един или двата метода).
      
         (4)  Методът, който ще бъде използван, се одобрява от разплащателната агенция.
      
         (5)  Сензорни проверки се извършват, когато това се счита за необходимо след анализ на риска, одобрен от разплащателната агенция.
      
         (6)  Методът, който ще бъде използван, се одобрява от разплащателната агенция.
      
         (7)  Поставяне на пробата: след предварителното фокусиране (стъпка 1) върху апликаторите на проби (10 × 5 mm) се капват 18 μl от пробата и от стандартните разтвори, поставят се върху гела на разстояние 1 mm един от друг и на 5 mm надлъжно от анода и се притискат леко. Извършва се фокусирането при горните условия, като апликаторите на проби се отстраняват внимателно след 60 минути фокусиране.