CELEX: 32013R0051
Language: hr
Date: 2013-01-16 00:00:00
Title: Uredba Komisije (EU) br. 51/2013 od 16. siječnja 2013. o izmjeni Uredbe (EZ) br. 152/2009 o utvrđivanju metoda uzorkovanja i analize za službenu kontrolu hrane za životinje  Tekst značajan za EGP

03/Sv. 068
            
            
               HR
            
            
               Službeni list Europske unije
            
            
               296
            
         32013R0051
   
               L 020/33
            
            
               SLUŽBENI LIST EUROPSKE UNIJE
            
            
               16.01.2013.
            
         
      UREDBA KOMISIJE (EU) br. 51/2013
   od 16. siječnja 2013.
   o izmjeni Uredbe (EZ) br. 152/2009 o utvrđivanju metoda uzorkovanja i analize za službenu kontrolu hrane za životinje
   (Tekst značajan za EGP)
   EUROPSKA KOMISIJA,
   uzimajući u obzir Ugovor o funkcioniranju Europske unije,
   uzimajući u obzir Uredbu (EZ) br. 882/2004 Europskog parlamenta i Vijeća od 29. travnja 2004. o službenim kontrolama koje se provode radi provjere pridržavanja propisa o hrani i hrani za životinje te pravila o zdravlju i dobrobiti životinja (1), a posebno njezin članak 11. stavak 4.,
   budući da:
   
               (1)
            
            
               Članak 7. stavak 1. Uredbe (EZ) br. 999/2001 Europskog parlamenta i Vijeća od 22. svibnja 2001. o utvrđivanju pravila za sprečavanje, kontrolu i iskorjenjivanje određenih transmisivnih spongiformnih encefalopatija (2) određuje da je hranidba preživača bjelančevinama dobivenim od životinja zabranjena. Ta zabrana je proširena na životinje koje nisu preživači i ograničena u skladu s Prilogom IV. toj Uredbi u pogledu hranidbe tih životinja proizvodima životinjskog podrijetla.
            
         
               (2)
            
            
               Članak 11. stavak 1. Uredbe (EZ) br. 1069/2009 Europskog parlamenta i Vijeća od 21. listopada 2009. o utvrđivanju zdravstvenih pravila za nusproizvode životinjskog podrijetla i od njih dobivene proizvode koji nisu namijenjeni prehrani ljudi te o stavljanju izvan snage Uredbe (EZ) br. 1774/2002 (3), zabranjuje hranidbu kopnenih životinja određene vrste osim krznaša s prerađenim životinjskim bjelančevinama dobivenim od tijela ili dijelova tijela iste životinjske vrste, kao i hranidbu riba iz uzgoja s prerađenim životinjskim bjelančevinama dobivenim od tijela ili dijelova tijela ribe iz uzgoja iste vrste.
            
         
               (3)
            
            
               Uredba Komisije (EZ) br. 152/2009 od 27. siječnja 2009. o utvrđivanju metoda uzorkovanja i analize za službenu kontrolu hrane za životinje (4) utvrđuje u svom Prilogu VI. metode analize za određivanje sastojaka životinjskog podrijetla za službenu kontrolu hrane za životinje. Mikroskopska metoda, koja je trenutačno jedina validirana metoda za otkrivanje prisutnosti životinjskih bjelančevina u hrani za životinje, u stanju je razlikovati prisutnost sastojaka dobivenih od kopnenih životinja od prisutnosti sastojaka dobivenih od ribe, ali nije u stanju kvantificirati s dovoljnom razinom točnosti količinu životinjskih sastojaka prisutnih u hrani za životinje i stoga se ne može koristiti za ovu namjenu.
            
         
               (4)
            
            
               Novu metodu otkrivanja životinjskih sastojaka na temelju lančane reakcije polimerazom (PCR) validirao je referentni laboratorij EU-a za životinjske bjelančevine u hrani za životinje. Provedbena studija koju su organizirali nacionalni referentni laboratoriji država članica dokazala je da je nova metoda dovoljno robusna da bi bila korištena kao metoda službene kontrole u Uniji. Ova nova metoda je u stanju otkriti prisutnost životinjskih sastojaka u hrani za životinje i također je u stanju identificirati vrstu životinje od koje potječu ti sastojci. Uporaba ove nove metode u kombinaciji s mikroskopskom metodom, ili, ako je primjereno, umjesto nje, bila bi vrlo korisna za kontrolu pravilne provedbe zabrana hranidbe iz uredbi (EZ) br. 999/2001 i (EZ) br. 1069/2009.
            
         
               (5)
            
            
               Prilog VI. Uredbi (EZ) br. 152/2009 potrebno je stoga odgovarajuće zamijeniti.
            
         
               (6)
            
            
               Mjere predviđene u ovoj Uredbi u skladu su s mišljenjem Stalnog odbora za prehrambeni lanac i zdravlje životinja i nisu im se usprotivili ni Europski parlament ni Vijeće,
            
         DONIJELA JE OVU UREDBU:
   Članak 1.
   Prilog VI. Uredbi (EZ) br. 152/2009 zamjenjuje se tekstom iz Priloga ovoj Uredbi.
   Članak 2.
   Ova Uredba stupa na snagu dvadesetog dana od dana objave u Službenom listu Europske unije.
   
      Ova je Uredba u cijelosti obvezujuća i izravno se primjenjuje u svim državama članicama.
      Sastavljeno u Bruxellesu 16. siječnja 2013.
      
         
            Za Komisiju
         
         
            Predsjednik
         
         José Manuel BARROSO
         
      
   
   
      (1)  SL L 165, 30.4.2004., str. 1.
   
      (2)  SL L 147, 31.5.2001., str. 1.
   
      (3)  SL L 300, 14.11.2009., str. 1.
   
      (4)  SL L 54, 26.2.2009., str. 1.
   PRILOG
   
      
         „PRILOG VI.
         
            METODE ANALIZE ZA ODREĐIVANJE SASTOJAKA ŽIVOTINJSKOG PODRIJETLA ZA SLUŽBENU KONTROLU HRANE ZA ŽIVOTINJE
         
         1.   CILJ I PODRUČJE PRIMJENE
         Određivanje sastojaka životinjskog podrijetla u hrani za životinje provodi se svjetlosnom mikroskopijom ili lančanom reakcijom polimerazom (PCR) u skladu s odredbama iz ovog Priloga.
         Ove dvije metode omogućuju otkrivanje prisutnosti sastojaka životinjskog podrijetla u krmivima i krmnim smjesama. Međutim, one ne omogućavaju izračun količine takvih sastojaka u krmivima i krmnim smjesama. Obje metode imaju granicu detekcije ispod 0,1 % (m/m).
         PCR metoda omogućuje određivanje taksonomske skupine sastojaka životinjskog podrijetla prisutnih u krmivima i krmnim smjesama.
         Ove metode primjenjuju se pri kontroli provedbe zabrana iz članka 7. stavka 1. i Priloga IV. Uredbi (EZ) br. 999/2001 i iz članka 11. stavka 1. Uredbe (EZ) br. 1069/2009.
         Ovisno o vrsti hrane za životinje koja se ispituje, ove metode mogu se koristiti u okviru jednog jedinstvenog operativnog protokola bilo samostalno ili zajedno u skladu sa standardiziranim operativnim postupcima (SOP) koje je uspostavio referentni laboratorij EU-a za životinjske bjelančevine u hrani za životinje (EURL-AP) i objavio na svojim internetskim stranicama (1).
         2.   METODE
         2.1.   Svjetlosna mikroskopija
         
         2.1.1.   Načelo
         
         Sastojci životinjskog podrijetla koji mogu biti prisutni u krmivima i krmnim smjesama koji se šalju na analizu identificiraju se na temelju tipičnih i mikroskopski prepoznatljivih karakteristika kao što su mišićna vlakna i ostali dijelovi mesa, hrskavica, kosti, rogovi, dlaka, čekinje, krv, perje, ljuske jaja, riblje kosti i ljuske.
         2.1.2.   Reagensi i oprema
         
         2.1.2.1.   Reagensi
         2.1.2.1.1.   Sredstvo za koncentriranje
         2.1.2.1.1.1.   Tetrakloretilen (gustoća 1,62)
         2.1.2.1.2.   Reagens za bojenje
         2.1.2.1.2.1.   Alizarin crvenilo (otopi se 2,5 ml 1M kloridne kiseline u 100 ml vode i toj se otopini doda 200 mg alizarin crvenila)
         2.1.2.1.3.   Sredstva za pripremu preparata
         2.1.2.1.3.1.   Lužina (NaOH 2,5 % w/v ili KOH 2,5 % w/v)
         2.1.2.1.3.2.   Glicerol (nerazrijeđen, viskoznost: 1 490 cP)
         2.1.2.1.3.3.   Norland ® Optical Adhesive 65 (viskoznost: 1 200 cP) ili smola s istovjetnim svojstvima za pripremu trajnih preparata
         2.1.2.1.4.   Sredstva za pripremu preparata s osobinama bojenja
         2.1.2.1.4.1.   Lugolova otopina (otopi se 2 g kalijevog jodida u 100 ml vode, zatim se uz često mućkanje doda 1 g joda)
         2.1.2.1.4.2.   Cistinski reagens (2 g olovnog acetata, 10 g NaOH/100 ml vode)
         2.1.2.1.4.3.   Fehlingov reagens (pripravi se prije uporabe od jednakih dijelova (1/1) osnovnih otopina A i B. Otopina A: 6,9 g bakrova (II) sulfata pentahidrata otopi se u 100 ml vode. Otopina B: 34,6 g kalij-natrijevog tartarata tetrahidrata i 12 g NaOH otopi se u 100 ml vode)
         2.1.2.1.4.4.   Tetrametilbenzidin/vodikov peroksid (otopi se 1 g 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) u 100 ml ledene octene kiseline i 150 ml vode. Prije uporabe izmiješaju se 4 dijela te TMB otopine s jednim dijelom 3 % vodikovoga peroksida)
         2.1.2.1.5.   Sredstva za ispiranje
         2.1.2.1.5.1.   Etanol ≥ 96 % (tehnički čist)
         2.1.2.1.5.2.   Aceton (tehnički čist)
         2.1.2.1.6.   Reagens za izbjeljivanje
         2.1.2.1.6.1.   Komercijalna otopina natrijevog hipoklorita (9 – 14 % aktivnog klora)
         2.1.2.2.   Oprema
         2.1.2.2.1.   Analitička vaga s preciznošću od 0,001 g
         2.1.2.2.2.   Pribor za mljevenje: mlin ili mužar
         2.1.2.2.3.   Sito s mrežicom kvadratnih očica širine 0,25 mm i 1 mm
         2.1.2.2.4.   Konusni stakleni lijevak za odjeljivanje zapremine 250 ml s teflonskim čepom ili čepom od brušenog stakla na dnu konusa. Promjer otvora čepa mora biti ≥ 4 mm. Umjesto toga se može upotrijebiti čaša s konusnim dnom za taloženje pod uvjetom da je laboratorij dokazao da su granice detekcije istovjetne onima kada se koristi konusni stakleni lijevak za odjeljivanje.
         
            Lijevak za odjeljivanje
         
         
            
         2.1.2.2.5.   Stereomikroskop koji obuhvaća barem konačni opseg povećanja od 6,5 × do 40 ×
         2.1.2.2.6.   Sastavljeni mikroskop koji obuhvaća barem konačni opseg povećanja od 100× do 400× s poljem za propušteno svjetlo. Mogu se dodatno koristiti polarizirano svjetlo i diferencijalni interferentni kontrast
         2.1.2.2.7.   Standardno laboratorijsko posuđe od stakla
         2.1.2.2.8.   Oprema za pripremu preparata: klasična mikroskopska stakalca, stakalca s udubinom, pokrovna stakalca (20 × 20 mm), pinceta, fina lopatica
         2.1.3.   Uzorkovanje i priprema uzorka
         
         2.1.3.1.   Uzorkovanje
         Koristi se reprezentativan uzorak koji je uzet u skladu s odredbama iz Priloga I.
         2.1.3.2.   Mjere predostrožnosti
         Kako bi se spriječila križna kontaminacija u laboratoriju, svu laboratorijsku opremu za višekratnu uporabu potrebno je pažljivo očistiti prije uporabe. Dijelove lijevka za odjeljivanje potrebno je prije čišćenja rastaviti. Dijelove lijevka za odjeljivanje i posuđe od stakla potrebno je prethodno oprati ručno, a zatim oprati u perilici posuđa. Sita se moraju očistiti četkom s tvrdim sintetičkim dlačicama. Preporuča se završno čišćenje sita acetonom i komprimiranim zrakom nakon prosijavanja masnog materijala, kao što je riblje brašno.
         2.1.3.3.   Priprema uzoraka osim masti i ulja
         2.1.3.3.1.   Sušenje uzorka: uzorci sa sadržajem vlage > 14 % moraju se osušiti prije rukovanja.
         2.1.3.3.2.   Prethodno prosijavanje uzorka: preporuča se da se hrana u peletima i zrnu prethodno prosije na 1 mm, a zatim se dobivene frakcije analiziraju kao odvojeni uzorci.
         2.1.3.3.3.   Razdioba uzorka u poduzroke i mljevenje: barem 50 g uzorka se razdijeli na poduzorke za analizu koji se zatim melju.
         2.1.3.3.4.   Ekstrakcija i priprema taloga: prenese se dio od 10 g (s preciznošću od 0,01 g) samljevenog poduzorka u lijevak za odjeljivanje ili čašu s konusnim dnom za taloženje i doda se 50 ml tetrakloretilena. Dio koji je prenesen u lijevak mora se ograničiti na 3 g u slučaju ribljeg brašna ili drugih čistih proizvoda životinjskog podrijetla, mineralnih sastojaka ili premiksa koji proizvode više od 10 % taloga. Mješavinu je potrebno snažno protresti tijekom najmanje 30 s i mora se oprezno dodati najmanje još 50 ml tetrakloretilena kako bi se isprale unutarnje stijenke lijevka i uklonile sve prianjajuće čestice. Tako dobivena mješavina se ostavi stajati najmanje 5 minuta prije odvajanja taloga otvaranjem čepa.
         Ako se koristi čaša s konusnim dnom za taloženje, mješavinu je potrebno snažno miješati najmanje 15 s, a sve prianjajuće čestice uz stijenke čaše potrebno je pažljivo isprati niz unutarnju površinu s najmanje 10 ml čistog tetrakloretilena. Mješavinu je potrebno ostaviti stajati tijekom 3 minute i zatim ponovo promiješati tijekom 15 sekundi, a sve čestice koje prianjaju uz stijenke čaše potrebno je pažljivo isprati niz unutarnju površinu s najmanje 10 ml čistog tetrakloretilena. Tako dobivena mješavina se ostavi stajati najmanje 5 minuta, zatim se tekuća frakcija odstrani i ukloni pažljivim dekantiranjem, vodeći računa da se niti malo taloga ne izgubi.
         Talog se osuši i zatim izvaže (s preciznošću od 0,001 g). Ako više od 5 % taloga sadrži čestice > 0,50 mm, mora se prosijati kroz sito 0,25 mm i dvije dobivene frakcije se ispituju.
         2.1.3.3.5.   Ekstrakcija i priprema flotata: nakon dobivanja taloga gore opisanom metodom, u lijevku za odvajanje moraju ostati dvije faze: tekuća koja se sastoji od tetrakloretilena i kruta koja se sastoji od plivajućeg materijala. Ta kruta faza je flotat koji se izolira tako da se tetrakloretilen u cijelosti odlije iz lijevka otvaranjem čepa. Okretanjem lijevka za odvajanje, flotat se prenese u veliku Petrijevu zdjelicu i posuši na zraku u digestoru. Ako se više od 5 % flotata sastoji od čestica > 0,50 mm, mora se prosijati kroz sito 0,25 mm i dvije dobivene frakcije se ispituju.
         2.1.3.3.6.   Priprema sirovine: pripremi se dio od najmanje 5 g samljevenog poduzorka. Ako se više od 5 % sirovine sastoji od čestica > 0,50 mm, mora se prosijati kroz sito 0,25 mm i dvije dobivene frakcije se ispituju.
         2.1.3.4.   Priprema uzoraka koji se sastoje od masti ili ulja
         Potrebno je slijediti sljedeći protokol za pripremu uzoraka koji se sastoje od masti ili ulja:
         
                     —
                  
                  
                     ako je mast u krutom stanju, zagrijava se u pećnici, dok ne postane tekuća,
                  
               
                     —
                  
                  
                     koristeći pipetu se prenese 40 ml masti ili ulja s dna uzorka u epruvetu za centrifugiranje,
                  
               
                     —
                  
                  
                     centrifugira se 10 minuta na 4 000 okr./min,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ako se mast skrutnula nakon centrifugiranja, zagrijava se u pećnici dok ne postane tekuća,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ponovo se centrifugira 5 minuta na 4 000 okr./min,
                  
               
                     —
                  
                  
                     malom žličicom ili spatulom se prenese polovica dekantirane nečistoće na mikroskopsko stakalce za identifikaciju. Kao sredstvo za pripremu preparata preporuča se glicerol,
                  
               
                     —
                  
                  
                     preostala nečistoća koristi se za pripremu taloga kako je opisano u točki 2.1.3.3.
                  
               2.1.3.5.   Uporaba reagensa za bojanje
         Kako bi se olakšala pravilna identifikacija sastojaka životinjskog podrijetla, subjekt može koristiti reagense za bojanje tijekom pripreme uzorka u skladu sa smjernicama koje je izdao EURL-AP i objavio na svojoj internetskoj stranici.
         Ako se koristi otopina Alizarin crvenila za bojanje taloga primjenjuje se sljedeći protokol:
         
                     —
                  
                  
                     osušeni talog se prenese u staklenu epruvetu i dvaput ispere s približno 5 ml etanola (svaki se put koristi vrtložna miješalica tijekom 30 s, a otapalo se ostavi stajati približno 1 minutu i 30 s i zatim odlije),
                  
               
                     —
                  
                  
                     talog se izbijeli dodavanjem najmanje 1 ml otopine natrijevog hipoklorita. Reakcija se razvija 10 minuta. Epruveta se napuni vodom, talog se ostavi stajati 2 - 3 minute, a voda i suspendirane čestice se pažljivo odliju,
                  
               
                     —
                  
                  
                     talog se dvaput ispere s 10 ml vode (koristi se vrtložna miješalica 30 s, ostavi se istaložiti i svaki se put odlije voda),
                  
               
                     —
                  
                  
                     doda se 2 - 10 kapi otopine Alizarin crvenila i smjesa se promućka u vrtložnoj miješalici. Trajanje reakcije je 30 sekundi i obojeni talog se dvaput ispere s približno 5 ml etanola, zatim jedanput acetonom (svaki se put koristi vrtložna miješalica 30 s, a otapalo se ostavi stajati približno 1 minutu i zatim odlije),
                  
               
                     —
                  
                  
                     obojeni talog se osuši.
                  
               2.1.4.   Mikroskopski pregled
         
         2.1.4.1.   Priprema preparata
         Mikroskopski preparat se priprema od taloga i, ovisno o odabiru subjekta, od flotata ili sirovine. Ako se tijekom pripreme preparata koristilo prosijavanje, pripremaju se obje dobivene frakcije (fina i gruba). Pokusni dijelovi frakcija naneseni na stakalca reprezentativni su za čitavu frakciju.
         Potrebno je pripremiti dovoljan broj preparata kako bi se osigurala provedba čitavog ispitnog protokola koji je određen u točki 2.1.4.2.
         Mikroskopski preparati se pripremaju s odgovarajućim sredstvom za pripremu preparata u skladu sa SOP-om koji je odredio EURL-AP i objavio na svojoj internetskoj stranici. Preparate je potrebno pokriti pokrovnim stakalcima.
         2.1.4.2.   Protokoli pregleda za određivanje životinjskih čestica u krmnim smjesama i krmivima
         Pripremljeni mikroskopski preparati se pregledavaju u skladu s protokolima pregleda prikazanim u dijagramu 1 za krmne smjese i krmiva osim za čisto riblje brašno ili u dijagramu 2 za čisto riblje brašno.
         Mikroskopski pregledi će se provesti koristeći sastavljeni mikroskop na talogu i zavisno o odabiru subjekta bilo na flotatu ili na sirovini. Uz sastavljeni mikroskop može se koristiti i stereomikroskop za grube frakcije. Svaki preparat se u potpunosti pregledava pod različitim povećanjima.
         Minimalni broj preparata koji će se pregledati tijekom svakog koraka protokola pregleda mora se striktno poštovati, osim ako nije moguće korištenjem čitavog materijala iz frakcije postići utvrđeni broj preparata. Pri svakom određivanju pregledava se najviše 6 preparata.
         Za lakšu identifikaciju vrste i podrijetla čestica subjekt može koristiti podupiruće alate kao što su sustavi za potporu pri odlučivanju, slikovne knjižnice i referentne uzorke.
         
            Dijagram 1
         
         
            Protokol pregleda za otkrivanje životinjskih čestica u krmnim smjesama i krmivima osim ribljeg brašna
         
         
            
         
            Dijagram 2
         
         
            Protokol pregleda za otkrivanje životinjskih čestica u ribljem brašnu
         
         
            
         2.1.4.3.   Broj određivanja
         Ako nakon prvog određivanja provedenog u skladu s protokolom pregleda propisanog u dijagramu 1 odnosno u dijagramu 2 nije otkrivena niti jedna životinjska čestica danog podrijetla (tj. od kopnenih životinja ili ribe), nije potrebno dodatno određivanje, a o rezultatima analize je potrebno izvijestiti korištenjem terminologije iz točke 2.1.5.1.
         Ako nakon prvog određivanja provedenog u skladu s protokolom pregleda propisanog u dijagramu 1 odnosno u dijagramu 2, ukupan broj otkrivenih životinjskih čestica danog podrijetla (tj. od kopnenih životinja ili ribe) iznosi od 1 do 5, provodi se drugo određivanje na novom poduzorku od 50 g. Ako nakon drugog određivanja ukupan broj otkrivenih životinjskih čestica danog podrijetla iznosi od 0 do 5, o rezultatima analize je potrebno izvijestiti korištenjem terminologije iz točke 2.1.5.2., ili se provodi treće određivanje na novom poduzorku od 50 g. Ipak, ako je nakon prvog i drugog određivanja zbroj otkrivenih čestica danog podrijetla veći od 15, dodatno određivanje nije potrebno, a o rezultatima je potrebno izravno izvijestiti korištenjem terminologije iz točke 2.1.5.3. Ako je nakon trećeg određivanja zbroj otkrivenih životinjskih čestica danog podrijetla veći od 15, o rezultatima analize potrebno je izvijestiti korištenjem terminologije iz točke 2.1.5.3. Inače je o rezultatima analize potrebno izvijestiti korištenjem terminologije iz točke 2.1.5.2.
         Ako je nakon prvog određivanja provedenog u skladu s protokolima pregleda propisanim u dijagramu 1 odnosno u dijagramu 2, otkriveno više od 5 životinjskih čestica danog podrijetla (tj. od kopnenih životinja ili ribe), o rezultatima analize potrebno je izvijestiti korištenjem terminologije iz točke 2.1.5.3.
         2.1.5.   Prikaz rezultata
         
         Pri izvještavanju o rezultatima, laboratorij mora navesti na kojoj vrsti materijala je provedena analiza (talog, flotat ili sirovina) i koliko je određivanja provedeno.
         Laboratorijsko izvješće mora sadržavati barem informacije o prisutnosti sastojaka podrijetlom od kopnenih životinja ili ribe.
         O različitim slučajevima se izvještava na sljedeće načine.
         2.1.5.1.   Nije otkrivena nijedna čestica danog podrijetla:
         
                     —
                  
                  
                     koliko je moguće utvrditi iz pregleda svjetlosnim mikroskopom, u dostavljenom uzorku nije utvrđena prisutnost čestica podrijetlom od kopnenih životinja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     koliko je moguće utvrditi iz pregleda svjetlosnim mikroskopom, u dostavljenom uzorku nije utvrđena prisutnost čestica podrijetlom od ribe.
                  
               2.1.5.2.   Prosječno je otkriveno između 1 i 5 životinjskih čestica danog podrijetla:
         
                     —
                  
                  
                     koliko je moguće utvrditi iz pregleda svjetlosnim mikroskopom, prosječno nije otkriveno više od 5 čestica podrijetlom od kopnenih životinja u dostavljenom uzorku. Čestice su identificirane kao … [kosti, hrskavica, mišić, dlaka, rogovi…]. Ova niska razina prisutnosti, koja je ispod granice detekcije mikroskopskom metodom znači da se ne može isključiti rizik od lažno pozitivnog rezultata.
                  
               Ili, ako je primjereno:
         
                     —
                  
                  
                     koliko je moguće utvrditi iz pregleda svjetlosnim mikroskopom, prosječno nije otkriveno više od 5 čestica podrijetlom od ribe u dostavljenom uzorku. Čestice su identificirane kao … [riblje kosti, riblje ljuske, hrskavica, mišić, otolit, škrge…]. Ova niska razina prisutnosti, koja je ispod granice detekcije mikroskopskom metodom znači da se ne može isključiti rizik od lažno pozitivnog rezultata.
                  
               U slučaju prethodnog prosijavanja uzorka, u laboratorijskom izvješću mora biti navedeno u kojoj frakciji (prosijana frakcija, peletirana frakcija ili zrna) su bile otkrivene životinjske čestice, jer otkrivanje životinjskih čestica samo u prosijanoj frakciji može biti znak okolišnog zagađenja.
         2.1.5.3.   Prosječno je otkriveno više od 5 životinjskih čestica danog podrijetla:
         
                     —
                  
                  
                     koliko je moguće utvrditi iz pregleda svjetlosnim mikroskopom, prosječno je otkriveno više od 5 čestica podrijetlom od kopnenih životinja u dostavljenom uzorku. Čestice su identificirane kao … [kosti, hrskavica, mišić, dlaka, rogovi…].
                  
               Ili, ako je primjereno:
         
                     —
                  
                  
                     koliko je moguće utvrditi iz pregleda svjetlosnim mikroskopom, prosječno je otkriveno više od 5 čestica podrijetlom od ribe u dostavljenom uzorku. Čestice su identificirane kao … [riblje kosti, riblje ljuske, hrskavica, mišić, otolit, škrge…].
                  
               U slučaju prethodnog prosijavanja uzorka, u laboratorijskom izvješću mora biti navedeno u kojoj frakciji (prosijana frakcija, peletirana frakcija ili zrna) su bile otkrivene životinjske čestice, jer otkrivanje životinjskih čestica samo u prosijanoj frakciji može biti znak okolišnog zagađenja.
         2.2.   PCR
         
         2.2.1.   Načelo
         
         Fragmenti deoksiribonukleinske kiseline (DNK) životinjskog podrijetla koji mogu biti prisutni u krmivima i krmnim smjesama otkrivaju se tehnikom genskog umnožavanja putem PCR-a koja cilja DNK sekvence značajne za vrstu.
         PCR metoda zahtijeva najprije ekstrakciju DNK-a. Umnožavanje se vrši kasnije na tako dobivenom DNK ekstraktu kako bi se otkrila ciljana životinjska vrsta.
         2.2.2.   Reagensi i oprema
         
         2.2.2.1   Reagensi
         2.2.2.1.1.   Reagensi za ekstrakciju DNK-a
         Upotrebljavaju se samo reagensi koje je odobrio EURL-AP i objavio na svojoj internetskoj stranici.
         2.2.2.1.2.   Reagensi za umnožavanje genskog materijala
         2.2.2.1.2.1.   Početnice i sonde
         Upotrebljavaju se samo početnice i sonde sa sekvencama oligonukleotida koje je validirao EURL-AP i objavio na svojoj internetskoj stranici (2).
         2.2.2.1.2.2.   Glavna mješavina (Master mix)
         Upotrebljavaju se samo otopine glavne mješavine koje ne sadrže reagense koji bi mogli prouzročiti lažne rezultate zbog prisutnosti životinjskog DNK-a (3).
         2.2.2.1.2.3.   Reagensi za dekontaminaciju
         2.2.2.1.2.3.1.   Otopina kloridne kiseline (0,1 N)
         2.2.2.1.2.3.2.   Izbjeljivač (otopina natrijevog hipoklorita s 0,15 % aktivnog klora)
         2.2.2.1.2.3.3.   Nehrđajući reagensi za dekontaminaciju skupih uređaja kao što su analitičke vage (npr. DNA EraseTM proizvođača MP Biomedicals)
         2.2.2.2.   Oprema
         2.2.2.2.1.   Analitička vaga s preciznošću od 0,001 g
         2.2.2.2.2.   Pribor za mljevenje
         2.2.2.2.3.   Uređaj za PCR (Thermocycler) koji omogućava PCR u stvarnom vremenu
         2.2.2.2.4.   Mikrocentrifuga za mikroepruvete
         2.2.2.2.5.   Komplet mikropipeta koje omogućavaju pipetiranje od 1 μl do 1 000 μl
         2.2.2.2.6.   Standardna plastična oprema za mikrobiologiju: mikroepruvete za mikrocentrifugu, plastični nastavci s filtrima za mikropipete, odgovarajuće pločice za uređaj za PCR (thermocycler).
         2.2.2.2.7.   Hladnjaci za skladištenje uzoraka i reagensa
         2.2.3.   Uzorkovanje i priprema uzorka
         
         2.2.3.1.   Uzorkovanje
         Koristi se reprezentativan uzorak uzet u skladu s odredbama iz Priloga I.
         2.2.3.2.   Priprema uzorka
         Pri pripremi laboratorijskih uzoraka do ekstrakcije DNK-a potrebno je poštovati zahtjeve iz Priloga II. Od najmanje 50 g uzorka se napravi poduzorak za analizu, koji se zatim samelje.
         Priprema uzorka mora se provesti u drugom prostoru od onih koji se koriste za ekstrakciju DNK-a i umnožavanje genskog materijala u skladu sa standardom ISO 24276.
         Pripreme se dva testna uzorka od najmanje 100 mg svaki.
         2.2.4.   Ekstrakcija DNK-a
         
         Ekstrakcija DNK-a provodi se na svakom pripremljenom testnom uzorku koristeći SOP koji je uspostavio EURL-AP i objavio na svojoj internetskoj stranici.
         Za svaku seriju ekstrakcije DNK-a pripremaju se dva kontrolna uzorka kako je opisano u ISO standardu 24276:
         
                     —
                  
                  
                     slijepi kontrolni uzorak ekstrakcije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pozitivni kontrolni uzorak ekstrakcije DNK-a.
                  
               2.2.5.   Umnožavanje genskog materijala
         
         Genski materijal se umnožava koristeći metode validirane za svaku vrstu koja zahtijeva identifikaciju. Te metode su propisane u SOP koji je uspostavio EURL-AP i objavio na svojoj internetskoj stranici. Svaki ekstrakt DNK-a se analizira u najmanje dva različita razrjeđenja kako bi se ocijenila inhibicija.
         Za svaku ciljanu vrstu pripremaju se dva kontrolna uzorka koja se umnažaju kako je opisano u ISO standardu 24276:
         
                     —
                  
                  
                     pozitivni kontrolni uzorak s ciljanim DNK-om se upotrijebi za svaku pločicu ili seriju analiza PCR,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kontrolni uzorak reagensa za umnožavanje (zove se također kontrolni uzorak bez matrice) se upotrijebi za svaku pločicu ili seriju analiza PCR.
                  
               2.2.6.   Tumačenje i prikaz rezultata
         
         U izvješću o rezultatima laboratorij mora navesti najmanje masu upotrijebljenog testnog uzorka, korištene tehnike za ekstrakciju, broj provedenih određivanja i granicu detekcije metode.
         Rezultati se ne smiju tumačiti i priopćavati ako pozitivni kontrolni uzorak ekstrakcije DNK-a i pozitivni kontrolni uzorak s ciljanim DNK-om ne omogućavaju određivanje ciljane vrste pri analizi, dok je rezultat kontrolnog uzorka reagensa za umnožavanje negativan.
         U slučaju da rezultati dvaju testnih uzoraka nisu dosljedni, potrebno je ponoviti barem korak genskog umnožavanja. Ako laboratorij sumnja da razlog za nesukladnost mogu biti ekstrakti DNK-a, provodi se nova ekstrakcija DNK-a i umnažanje genskog materijala prije tumačenja rezultata.
         Konačni prikaz rezultata mora se temeljiti na integraciji i tumačenju rezultata dvaju testnih uzoraka u skladu sa SOP-om koji je uspostavio EURL-AP i objavio na svojoj internetskoj stranici.
         2.2.6.1.   Negativni rezultat
         O negativnom rezultatu se izvještava na sljedeći način:
         U dostavljenom uzorku nije bio otkriven ni jedan DNK iz X (X je životinjska vrsta ili skupina životinjskih vrsta koja je predmet ispitivanja).
         2.2.6.2.   Pozitivni rezultat
         O pozitivnom rezultatu se izvještava na sljedeći način:
         DNK iz X je otkriven u dostavljenom uzorku (X je životinjska vrsta ili skupina životinjskih vrsta koja je predmet ispitivanja).”
      
   
   
      (1)  http://eurl.craw.eu/
   
      (2)  Popis ovih početica i sondi za svaku ciljanu životinjsku vrstu dostupan je na internetskoj stranici EURL-AP-a.
   
      (3)  Primjeri glavnih mješavina koje su funkcionalne dostupni su na internetskoj stranici EURL-AP-a.