CELEX: 31973L0046
Language: nl
Date: 1972-12-05 00:00:00
Title: Vierde Richtlijn 73/46/EEG van de Commissie van 5 december 1972 houdende vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van veevoeders

Avis juridique important

|

31973L0046

Vierde Richtlijn 73/46/EEG van de Commissie van 5 december 1972 houdende vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van veevoeders  

Publicatieblad Nr. L 083 van 30/03/1973 blz. 0021 - 0034 Bijzondere uitgave in het Fins: Hoofdstuk 3 Deel 5 blz. 0115  Bijzondere uitgave in het Grieks: Hoofdstuk 03 Deel 9 blz. 0114  Bijzondere uitgave in het Zweeds: Hoofdstuk 3 Deel 5 blz. 0115  Bijzondere uitgave in het Spaans: Hoofdstuk 03 Deel 6 blz. 0230  Bijzondere uitgave in het Portugees: Hoofdstuk 03 Deel 6 blz. 0230 

++++VIERDE RICHTLIJN VAN DE COMMISSIE  van 5 december 1972  houdende vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van veevoeders   ( 73/46/EEG )  DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN ,  Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische Gemeenschap ,  Gelet op de richtlijn van de Raad van 20 juli 1970 betreffende de invoering van gemeenschappelijke bemonsterings - en analysemethoden voor de officiële controle van veevoeders ( 1 ) , gewijzigd door de richtlijn nr . 72/275/EEG van 20 juli 1972 ( 2 ) , inzonderheid op artikel 2 ,  Overwegende dat bovenbedoelde richtlijn bepaalt dat de officiële controle van veevoeders , welke ertoe strekt na te gaan of aan de op grond van de wettelijke of bestuursrechtelijke bepalingen inzake de kwaliteit en de samenstelling van veevoeders gestelde eisen is voldaan , geschiedt volgens communautaire bemonsterings - en analysemethoden ;  Overwegende dat bij E.E.G . Richtlijnen nr . 71/250 , nr . 71/393 en nr . 72/199 van de Commissie van 15 juni 1971 ( 3 ) , 18 november 1971 ( 4 ) en 27 april 1972 ( 5 ) reeds een zeker aantal gemeenschappelijke analysemethoden is vastgelegd ; dat gezien de vorderingen welke de werkzaamheden sindsdien hebben gemaakt het dienstig is een vierde reeks methoden vast te stellen ;  Overwegende dat de in deze richtlijn vervatte maatregelen in overeenstemming zijn met het advies van het Permanent Comité voor veevoeders ,  HEEFT DE VOLGENDE RICHTLIJN VASTGESTELD :  Artikel 1  De Lid-Staten schrijven voor dat de analysen voor de officiële controle van veevoeders ten aanzien van het gehalte aan vocht in dierlijke en plantaardige vetten en oliën , en ten aanzien van het gehalte aan magnesium en ruwe celstof in veevoeders , geschieden volgens de in de bijlage I bij deze richtlijn omschreven methoden .  De algemene bepalingen welke vermeld staan in het deel 1 van de bijlage ( inleiding ) van de Eerste Richtlijn nr . 71/250/EEG van de Commissie van 15 juni 1971 , zijn toepasselijk op de methoden beschreven in de bijlage I van deze richtlijn .  Artikel 2  De Lid-Staten schrijven voor dat de analysen voor de officiële controle van veevoeders ten aanzien van hun gehalte aan retinol ( vitamine A ) , thiamine ( aneurine , vitamine B 1 ) en aan ascorbine - en dehydroascorbinezuren  ( vitamine C ) geschieden volgens de in bijlage II bij deze richtlijn omschreven methoden .  De algemene bepalingen van Deel I ( inleiding ) van de bijlage van de Eerste Richtlijn nr . 71/250/EEG van de Commissie van 15 juni 1971 zijn , met uitzondering van het deel betreffende de voorbereiding van het analysemonster , op de methoden beschreven in bijlage II , van deze richtlijn toepasselijk .  Artikel 3  De Lid-Staten doen uiterlijk op 1 januari 1974 de nodige wettelijke of bestuursrechtelijke bepalingen in werking treden ten einde hun wetgeving in overeenstemming te brengen met deze richtlijn . Zij stellen de Commissie onverwijld hiervan in kennis .  Artikel 4  Deze richtlijn is gericht tot de Lid-Staten .  Gedaan te Brussel , 5 december 1972 .  Voor de Commissie  De Voorzitter  S . L . MANSHOLT  ( 1 ) PB nr . L 170 van 3 . 8 . 1970 , blz . 2 .  ( 2 ) PB nr . L 171 van 29 . 7 . 1972 , blz . 39 .  ( 3 ) PB nr . L 155 van 12 . 7 . 1971 , blz . 13 .  ( 4 ) PB nr . L 279 van 20 . 12 . 1971 , blz . 7 .  ( 5 ) PB nr . L 123 van 29 . 5 . 1972 , blz . 6 .  BIJLAGE I  1 . BEPALING VAN VOCHT IN DIERLIJKE EN PLANTAARDIGE VETTEN EN OLIEN  1 . Doel en toepasbaarheid  Het voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan vocht , water en andere vluchtige stoffen in dierlijke en plantaardige vetten en oliën .  2 . Principe  Het monster wordt bij 103 * C gedroogd , totdat geen gewichtsverlies meer optreedt . Het gewichtsverlies wordt door weging bepaald .  3 . Apparatuur  3.1 . Schaal met vlakke bodem , van corrosiebestendig materiaal , doorsnede 8 à 9 cm , hoogte ca . 3 cm .  3.2 . Kwikthermometer met een versterkt reservoir en een expansieruimte , gecalibreerd van ongeveer 80 * C tot tenminste 110 * C , lengte ca . 10 cm .  3.3 . Zandbad of een electrische verwarmingsplaat .  3.4 . Exsiccator met een effectief droogmiddel .  3.5 . Analytische balans .  4 . Uitvoering  Breng ongeveer 20 g van het gehomogeniseerde monster , tot op 1 mg nauwkeurig gewogen , in de droge schaal  ( 3.1 ) , getarreerd met de thermometer ( 3.2 ) . Verhit op het zandbad of op de verwarmingsplaat ( 3.3 ) onder voortdurend roeren met de thermometer zodanig , dat na ongeveer 7 min . een temperatuur van 90 * C bereikt wordt .  Verminder de toevoer van warmte overeenkomstig de frekwentie waarmee gasbellen van de bodem van de schaal opstijgen . De temperatuur mag niet hoger komen dan 105 * C . Roer onder voortdurend schrapen over de bodem van de schaal tot de belvorming ophoudt .  Herhaal , om zeker te zijn dat al het vocht uitgedreven wordt , meerdere keren de verwarming tot 103 * C min of meer 2 * C en laat tussen twee opeenvolgende verhittingen afkoelen tot 93 * C . Laat vervolgens in de exsiccator afkoelen tot kamertemperatuur en weeg . Herhaal deze procedure totdat het gewichtsverlies tussen twee opeenvolgende wegingen niet meer bedraagt dan 2 mg .  N.B . Een gewichtsvermeerdering van het monster na herhaalde verwarming duidt op oxidatie van het vet . In dit geval maakt men bij de berekening gebruik van het resultaat van de weging die vlak voor de gewichtsvermeerdering gedaan werd .  5 . Berekening van de resultaten  Bereken het gehalte aan vocht in percenten van het monster uit de formule :   ( M1 - M2 ) * 100/M0  waarin :  M0 = gewicht van het monster ( in g )  M1 = gewicht van de schaal met inhoud voor verhitting ( in g )  M2 = gewicht van de schaal met inhoud na verhitting ( in g )  Resultaten beneden 0,05 % moeten aangegeven worden met " minder dan 0,05 % " .  Herhaalbaarheid  Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan 0,05 % absoluut .  2 . BEPALING VAN MAGNESIUM  door atoomabsorptiespektrofotometrie  1 . Doel en toepasbaarheid  Het voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan magnesium in veevoeders . Het is bijzonder geschikt voor de bepaling van magnesiumgehalten van minder dan 5 % .  2 . Principe  Het monster wordt verast en de as behandeld met zoutzuur . Indien het monster geen organische bestanddelen bevat , wordt het direct met zoutzuur behandeld . De oplossing wordt verdund en het magnesiumgehalte wordt bepaald door atoomabsorptiespektrofotometrie bij 285,2 nm , aan de hand van ijkoplossingen .  3 . Reagentie  3.1 . Zoutzuur p.a . , d = 1,16  3.2 . Zoutzuur p.a . , d = 1,19  3.3 . Magnesium of -draad of magnesiumsulfaat  ( Mg SO4 * 7H2O ) , p.a . onder vacuum gedroogd bij kamertemperatuur  3.4 . Strontiumzoutoplossing ( chloride of nitraat ) met 25 g strontium per 1 ( = 76,08 g SrCl2.6H2O p.a./1 of 60,38 g Sr ( NO3)2 p.a./1 . ) .  3.5 . Magnesiumstandaardoplossing : weeg af 1 g magnesium ( 3.3 ) tot op 1 mg nauwkeurig , nadat tevoren zorgvuldig het oxidelaagje is verwijderd , of een overeenkomstige hoeveelheid magnesiumsulfaat  ( 3.3 ) en breng dit in een maatkolf van 1 000 ml . Voeg toe 80 ml zoutzuur ( 3.1 ) , los het magnesium op en vul aan met water tot 1 000 ml . 1 ml van de verkregen oplossing bevat 1,000 mg magnesium .  4 . Apparatuur  4.1 . Verassingsschalen van platina , kwarts of porselein  4.2 . Elektrische moffeloven met thermostaat  4.3 . Atoomabsorptiespektrofotometer  5 . Uitvoering  5.1 . Bereiding van de analyseoplossing  5.1.1 . Veevoeders die uitsluitend uit minerale bestanddelen bestaan  Breng 5 g van het monster , tot op 1 mg nauwkeurig gewogen , in een maatkolf van 500 ml met 250 à 300 ml water . Voeg dan toe 40 ml zoutzuur ( 3.1 ) , breng aan de kook en laat gedurende ongeveer 30 min . zachtjes koken . Koel af , vul aan met water tot 500 ml , meng en filtreer over een droog vouwfilter in een droog bekerglas . Werp het eerste deel ( ongeveer 30 ml ) van het filtraat weg .  Bij aanwezigheid van kiezelzuur wordt 5 g van het monster met een voldoende hoeveelheid zoutzuur ( 3.2 )  ( 15 - 30 ml ) op een waterbad tot droog ingedampt . Handel verder als beschreven onder 5.1.2 .  5.1.2 . Veevoeders die voornamelijk uit minerale bestanddelen bestaan  Breng 5 g van het monster , tot op 1 mg nauwkeurig gewogen , in een verassingsschaal en veras in de moffeloven bij 550 * C , totdat as zonder kooldeeltjes wordt verkregen . Voor de scheiding van kiezelzuur wordt aan de as een voldoende hoeveelheid zoutzuur  ( 3.2 ) ( 15 - 30 ml ) toegevoegd en op het waterbad tot droog ingedampt . Droog vervolgens gedurende een uur in een droogstoof bij 105 * C . Het residu wordt in 10 ml zoutzuur ( 3.1 ) opgenomen en met warm water in een maatkolf van 500 ml overgespoeld . Kook gedurende korte tijd , na afkoelen wordt met water aangevuld , geschud en door een droog vouwfilter in een droog bekerglas gefiltreerd . De eerste 30 ml van het filtraat wordt verwijderd .  5.1.3 . Veevoeders die voornamelijk uit organische bestanddelen bestaan  Breng 5 g van het monster , tot op 1 mg nauwkeurig gewogen , in een verassingsschaal en veras in de moffeloven bij 550 * C , totdat as zonder kooldeeltjes wordt verkregen . Voeg toe 5 ml zoutzuur ( 3.2 ) , damp droog op een waterbad en laat vervolgens gedurende 1 h drogen bij 105 * C in een droogstoof om het kiezelzuur onoplosbaar te maken . Neem het residu hierna op in 5 ml zoutzuur ( 3.1 ) en breng met behulp van heet water over in een maatkolf van 250 ml . Kook even op en vul na afkoelen aan tot 250 ml met water . Meng en filtreer over een droog vouwfilter in een droog bekerglas . Werp het eerste deel ( ongeveer 30 ml ) van het filtraat weg .  5.2 . Meting van de atoomabsorptie  Bereid door verdunnen met water uit de magnesiumstandaardoplossing ( 3.5 ) tenminste 5 ijkoplossingen met toenemende concentraties . De concentraties van deze oplossingen zijn afhankelijk van het optimale meetbereik van de atoomabsorptiespektrofotometer . Voeg aan iedere ijkoplossing 10 ml strontiumzoutoplossing ( 3.4 ) toe en vul daarna met water aan tot 100 ml .  Verdun met water een aliquot deel van het onder 5.1.1 , 5.1.2 of 5.1.3 verkregen filtraat , zodat een magnesiumconcentratie bereikt wordt , die binnen het concentratiegebied van de ijkoplossingen ligt . De zoutzuur concentratie van deze oplossing mag niet hoger zijn dan 0,4 N . Voeg 10 ml van het strontiumzoutoplossing ( 3.4 ) toe en vul daarna met water aan tot 100 ml .  Meet de atoomabsorptie van de ijkoplossingen en van de analyseoplossing bij een golflengte van 285,2 nm .  6 . Berekening van de resultaten  Bereken het gehalte aan magnesium met behulp van de ijkoplossingen . Druk het resultaat uit in percenten van het monster .  Herhaalbaarheid  Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan 5 % relatief .  3 . BEPALING VAN RUWE CELSTOF  1 . Doel en toepasbaarheid  Het voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan in zuur en loog onoplosbare , vetvrije organische bestanddelen in veevoeders , conventioneel aangeduid als ruwe celstof .  2 . Principe  Het eventueel ontvette monster wordt achtereenvolgens behandeld met een kokende oplossing van zwavelzuur en een kookende oplossing van kaliumhydroxide van vastgestelde sterktes . Het residu wordt over asbest gefiltreerd , uitgewassen , gedroogd , gewogen en bij 900 * C verast . Het gewichtsverlies als gevolg van de verassing komt overeen met de hoeveelheid ruwe celstof in het afgewogen analysemateriaal .  3 . Reagentia  3.1 . Zwavelzuur 0,26 N .  3.2 . Asbest , als volgt behandeld :  Meng het asbest voor Gooch-kroezen met ongeveer zijn 5-voudig gewicht aan verdund zoutzuur  ( 1 volume-deel zoutzuur , d = 1,19 + 3 volumedelen water ) . Kook het mengsel gedurende ongeveer 45 min . , laat afkoelen en filtreer over een Buechnertrechter . Was het residu met water , totdat het laatste waswater neutraal reageert en was na met aceton ( 3.6 ) . Droog het asbest in de droogstoof en gloei het vervolgens gedurende 2 h bij 900 * C . Bewaar het asbest na afkoelen in een goed gesloten fles . Het aldus behandelde asbest kan meerdere keren gebruikt worden . Het moet voldoen aan de eisen die onder 5.1 bij de blancoproef genoemd worden .  3.3 . Antischuimemulsie ( bv . siliconen )  3.4 . Kaliumhydroxideoplossing 0,23 N  3.5 . Zoutzuur 0,5 N  3.6 . Aceton , zuiver  3.7 . Diethylether , zuiver  4 . Apparatuur  4.1 . Bekerglazen van tenminste 600 ml , met een merkstreep bij 200 ml .  4.2 . Porseleinen schijven , doorsnede ca . 80 mm , dikte ca . 4 mm , voorzien van ongeveer 32 gaten met een doorsnede van ca . 4 mm .  4.3 . Afzuigkolven van ongeveer 2 l , met een merkstreep bij 800 ml en voorzien van een doorboorde rubberen stop en een glazen trechter met een doorsnede van 120 mm .  4.4 . Filterplaatjes , doorsnede ca . 40 mm , dikte ca . 4 mm , met een conische rand , passend in de trechter ( 4.3 ) , voorzien van ongeveer 16 gaten met een doorsnede van ca . 4 mm en overtrokken met een metalen gaas met een maaswijdte van ca . 1 mm . Filterplaatjes en gaas dienen bestendig te zijn tegen de inwerking van zuur en loog .  4.5 . Verassingsschalen van platina of kwarts .  4.6 . Elektrische moffeloven met thermostaat .  4.7 . Exsiccator .  4.8 . Asbestfilter : Suspendeer 2,0 g behandeld asbest ( 3.2 ) om 100 ml water en zuig af over een filterplaat , die bedekt is met een metalen gaas en die zich in de trechter van een afzuigkolf ( 4.3 ) bevindt . Filtreer het filtraat nogmaals over hetzelfde filter . Werp het laatste filtraat weg .  5 . Uitvoering  Weeg af 3 g van het monster , tot op 1 mg nauwkeurig en breng het samen met 2 g behandeld asbest ( 3.2 ) in een bekerglas ( 4.1 ) . Voeg toe 200 ml zwavelzuur ( 3.1 ) en enkele druppels antischuimemulsie ( 3.3 ) . Breng het geheel snel aan de kook en laat het gedurende precies 30 min . koken . Dek om het volume constant te houden , het bekerglas af met een koelsysteem bv . met een rondbodemkolf van 500 ml , waardoor koelwater geleid wordt . Onderbreek het koken door toevoegen van ca . 50 ml koud water en zuig onmiddellijk af over een asbestfilter , dat tevoren bereid is , zoals beschreven onder 4.8 .  Was het residu 5 maal met telkens ongeveer 100 ml heet water , zodat het eindvolume van het filtraat ongeveer 800 ml bedraagt . Breng vervolgens het residu kwantitatief terug in het bekerglas ( 4.1 ) , waarin tevoren een porseleinen schijf ( 4.2 ) is gebracht om koolvertraging te voorkomen . Voeg toe 200 ml kaliumhydroxideoplossing ( 3.4 ) , breng snel aan de kook en laat gedurende precies 30 min . koken . Voeg onmiddellijk hierna toe ca . 50 ml koud water en zuig af over een nieuw asbestfilter dat tevoren bereid is zoals beschreven onder 4.8 . Was het residu eerst met heet water , totdat het laatste waswater neutraal reageert ( controleer met lakmoespapier ) en vervolgens 3 maal met aceton  ( 3.6 ) ( totaal ongeveer 100 ml aceton ) .  Breng het residu kwantitatief over in een verassingsschaal ( 4.5 ) , spreid het indien nodig uit en droog bij 130 * C tot constant gewicht .  Laat afkoelen in de exsiccator en weeg snel . Gloei daarna de schaal met de inhoud in de moffeloven ( 4.6 ) gedurende 30 min . bij 900 * C . Laat afkoelen in de exsiccator en weeg snel .  Verricht op gelijke wijze een blancobepaling met het behandelde asbest ( 3.2 ) , doch zonder analysemateriaal . Het gewichtsverlies na het gloeien mag bij gebruik van 6 g asbest niet groter zijn dan 10 mg .  6 . Berekening van de resultaten  Bereken het gehalte aan ruwe celstof in percenten van het monster uit de formule :   ( a - b ) * 100/3  waarin :  a = gloeiverlies bij de proef  b = gloeiverlies bij de blancoproef  Herhaalbaarheid  Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan :  0,3 % absoluut bij gehalten aan ruwe celstof van minder dan 10 %  3 % relatief bij gehalten aan ruwe celstof van 10 % of meer .  7 . Opmerkingen  7.1 . Veevoeders met een vetgehalte van meer dan 10 % moeten voor de analyse met behulp van diethylether ontvet worden . Breng hiertoe 3 g van het monster , tot op 1 mg nauwkeurig gewogen , op een asbestfilter  ( 4.8 ) . Voeg 3 maal ongeveer 50 ml diethylether ( 3.7 ) toe en zuig de ether telkens voorzichtig af . Breng het ontvette monster en het asbest kwantitatief over in een bekerglas ( 4.1 ) en voer de analyse uit zoals beschreven onder 5 .  7.2 . Veevoeders , die niet direct extraheerbare vetten bevatten moeten ontvet worden zoals beschreven onder 7.1 en na het wassen van het residu van de zure hydrolyse opnieuw ontvet worden . Was hiertoe het residu van de zure hydrolyse 3 maal met aceton ( 3.6 ) ( totaal 100 ml ) en vervolgens 3 maal met 50 ml diethylether ( 3.7 ) . Breng het residu kwantitatief over in een bekerglas ( 4.1 ) en voer de analyse verder uit zoals beschreven onder 5 2e alinea  ( behandeling met kaliumhydroxideoplossing ) .  7.3 . Veevoeders met een hoog gehalte aan calcium  ( meer dan 2 % Ca ) worden als volgt behandeld . Breng 3 g van het monster , tot op 1 mg nauwkeurig gewogen , in een bekerglas ( 4.1 ) met 100 ml koud 0,5 N zoutzuur ( 3.5 ) en laat gedurende 5 min . staan . Filtreer meteen en was uit met koud water . Maak hierbij gebruik van het asbest , dat oorspronkelijk bestemd was als filtreerhulpmiddel bij de behandeling met zwavelzuur . Wanneer zich moeilijkheden voordoen bij het filtreren , verdun dan de suspensie met aceton . Handel verder als beschreven onder 5 .  BIJLAGE II  1 . BEPALING VAN RETINOL ( VITAMINE A )  1 . Doel en toepassingsgebied  Met behulp van deze methode is het mogelijk retinol  ( vitamine A ) te bepalen in veevoeders , concentraten en voormengsels . De ondergrens voor de bepaling ligt bij 10 000 IE/kg bij pigmentrijke veevoeders en 4 000 IE/kg bij alle andere veevoeders ( 1 ) . Al naar gelang van het veronderstelde gehalte aan retinol worden de produkten verdeeld in twee groepen .  Groep A : gehalten van minder dan 200 000 IE/kg ,  Groep B : gehalten gelijk aan of hoger dan 200 000 IE/kg .  2 . Principe  Het monster wordt in een oplossing van kaliumhydroxyde onder toevoeging van ethanol , in aanwezigheid van een antioxydant of onder stikstofatmosfeer warm gehydroliseerd . Het mengsel wordt geëxtraheerd met 1,2-dichloorethaan , het extract wordt tot droog ingedampt en opgenomen in petroleumether . De aldus verkregen oplossing wordt gechromatografeerd aan een kolom van aluminiumoxide ( voor de produkten van groep B is de chromatografie slechts in bepaalde gevallen vereist ) . Het retinol wordt in produkten die vallen onder groep A ( na ontwikkelen van een gekleurd complex volgens de Carr-Price reactie ) fotometrisch bepaald bij 610 nm , in producten van groep B spectrofotometrisch bij 325 nm .  3 . Reagentia  a ) voor de analyse van de produkten van groepen A en B  3.1 . Ethanol 96 % ( v/v )  3.2 . natriumascorbaatoplossing 10 % ( g/v ) p.a . , of  3.3 . gezuiverde stikstof  3.4 . kaliumhydroxide-oplossing 50 % ( g/v ) p.a .  3.5 . kaliumhydroxide-oplossing 1 N  3.6 . kaliumhydroxide-oplossing 0,5 N  3.7 . 1,2-dichloorethaan p.a .  3.8 . petroleumether , kookpunt 30 - 35 * C . Zuiver indien nodig de petroleumether op de volgende wijze : schud 1 000 ml petroleumether zoveel maal met porties van 20 ml geconcentreerd zwavelzuur tot het zuur kleurloos blijft . Verwijder het zuur en was achtereenvolgens de petroleumether eenmaal met 500 ml water , tweemaal met 250 ml natriumhydroxide-oplossing 10 % en driemaal met 500 ml water . Verwijder de waterlaag , droog de petroleumether gedurende een uur op actieve kool en watervrij natriumsulfaat , filtreer en destilleer ;  3.9 . aluminiumoxide , gestandaardiseerd volgens Brockmann : verhit gedurende 8 uur op 750 * C , koel af in een exsiccator en bewaar in een bruine fles met ingeslepen stop . voor het gebruik bij de chromatografie wordt als volgt bevochtigd : meng in een fles van bruin glas 10 g aluminiumoxide met 0,7 ml water , sluit de fles hermetisch , verwarm gedurende 5 min . onder krachtig schudden in een kokend waterbad , koel daarna af onder schudden . De activiteit van het bereide aluminiumoxide wordt gecontroleerd door analyse volgens 5.3 en 5.4 aan de hand van een bekende hoeveelheid retinolstandaard  ( 3.17 ) ;  3.10 . basisch aluminiumoxide , activiteitsgraad I ;  3.11 . diethylether , zuiver . Verwijder peroxiden en sporen water door chromatografie aan een kolom van basisch aluminiumoxide ( 3.10 ) ( 25 g aluminiumoxide voor circa 250 ml diethylether ) ;  3.12 . oplossingen van diethylether ( 3.11 ) 4 , 8 , 12 , 16 en 20 % ( v/v ) in petroleumether  ( 3.8 ) ;  3.13 . natriumsulfide-oplossing 0,5 M in glycerine 70 % ( v/v ) bereid op basis van natriumsulfide p.a .  b ) alleen voor de analyse van de produkten van groep A  3.14 . benzeen p.a . , kristalliseerbaar ;  3.15 . chloroform p.a . Verwijder ethanol , fosgeen en sporen water door chromatograferen aan een kolom van basisch aluminiumoxide ( 3.10 ) ( 50 g aluminiumoxide voor circa 200 ml chloroform ; het verdient aanbeveling de eerste 50 ml eluaat nogmaals over dezelfde kolom te reinigen ) ;  3.16 . reagens volgens Carr-Price : schud ongeveer 25 g antimoniumtrichloride p.a . ( te bewaren in exsiccator ) met 100 ml chloroform ( 3.15 ) totdat de oplossing verzadigd is . Een geringe neerslag van antimoniumtrichloride is niet hinderlijk . Voeg toe 2 ml azijnzuuranhydride p.a . Bewaar in een bruine fles met ingeslepen stop in de ijskast . Het reagens is gedurende meerdere weken houdbaar ;  3.17 . Retinol-standaard , spectrofotometrisch bepaald .  c ) alleen voor de analyse van de produkten van groep B  3.18 . Isopropanol , voor chromatografie .  4 . Apparatuur  4.1 . Waterbad  4.2 . Vacuumrotatieverdamper met ronde kolven van verschillende inhoud  4.3 . Chromatografiebuizen van glas ( lengte 300 mm , binnendoorsnede circa 13 mm )  4.4 . Spectrofotometer met cuvetten van 10 mm optische weglengte ( van kwarts van de metingen in het UV bereik )  4.5 . UV-lamp , 365 mm .  5 . Uitvoering  N.B . Alle werkzaamheden dienen te worden verricht in diffus daglicht , eventueel in apparatuur van bruin glas .  5.1 . Af te wegen hoeveelheid monster  Weeg , afhankelijk van het te verwachten gehalte aan vitamine A , van het fijngemaakte monster een hoeveelheid af als volgt :  0,1 tot 1,0 g voor concentraten ( gehalten boven 20 000 IE/g ) ;  3,0 tot 5,0 g voor voormengsels ( gehalten tussen 400 en 20 000 IE/g ) ;  10 tot 20 g voor minerale mengsels ;  30 g voor de producten van groep A .  Breng de afgewogen hoeveelheid direct over in een kolf met ingeslepen stop .  5.2 . Hydrolyse en extractie ( 2 )  Voeg achtereenvolgens toe 40 ml ethanol ( 3.1 ) , 2 ml natriumascorbaat-oplossing ( 3.2 ) ( 2 ) en 10 ml kaliumhydroxide-oplossing ( 3.4 ) en 2 ml natriumsulfide-oplossing ( 3.13 ) . Verwarm gedurende 30 min . bij 70 - 80 * C onder terugvloeikoeling en koel vervolgens in stromend water . Voeg toe 50 ml ethanol  ( 3.1 ) en pipetteer hierbij 100 ml 1,2-dichloorethaan  ( 3.7 ) . Schud krachtig en decanteer de bovenstaande vloeistof in een scheitrechter . Voeg toe 150 ml kaliumhydroxide-oplossing ( 3.5 ) , schud gedurende 10 sec . Laat na scheiding der lagen de dichloorethaanfase ( onderlaag ) in een scheitrechter af , voeg 40 ml kaliumhydroxide-oplossing ( 3.6 ) toe , schud gedurende 10 sec . en wacht tot de vloeistoffasen zich gescheiden hebben . Laat de dichloorethaanfase in een scheitrechter af en was 6 tot 8 maal met steeds 40 ml water tot alkali-vrij  ( tegen fenolftaleïen ) . Zonder de dichloorethaanfase af en verwijder er de laatste sporen water uit met strookjes filtreerpapier . Damp een aliquot deel van de dichloorethaan-oplossing onder vacuum op een waterbad van 40 * C in tot droog . Neem het residu snel op in 5 ml petroleumether ( 3.8 ) .  Voor de produkten van groep A , chromatografeer als aangegeven onder 5.3.1 .  Voor de produkten van groep B , breng de oplossing over in een maatkolf van 50 ml , vul aan met petroleumether ( 3.8 ) homogeniseer en meet de extinctie volgens 5.4.2 .  5.3 . Chromatografie  5.3.1 . Produkten van groep A  Vul een chromatografiebuis ( 4.3 ) tot een hoogte van 200 mm met aluminiumoxide ( 3.9 ) dat vooraf is doordrenkt met petroleumether ( 3.8 ) . Breng de volgens 5.2 verkregen oplossing in de buis en voeg onmiddellijk 20 ml petroleumether ( 3.8 ) toe . Elueer achtereenvolgens met porties van 10 ml van de oplossingen 4 , 8 , 12 , 16 en 20 % diethylether ( 3.12 ) in petroleumether . Regel de druppelsnelheid tot 2 à 3 druppels per sec . door zwak vacuum of overdruk toe te passen .  Bij de chromatografie wordt de caroteenfractie ( 4 ) het eerst geëlueerd . De retinolfractie wordt in het algemeen geëlueerd door de 20 % diethylether-oplossing in petroleumether ( 3.12 ) . De elutie wordt in UV-licht gecontroleerd ( korte belichting van de kolom met behulp van een kwiklamp ) . De fluorescerende band van de retinol is duidelijk gescheiden van de daaropvolgende geelgekleurde xantofylbanden . Vang de fractie van het eluaat die de retinol bevat op in een erlenmeyer .  5.3.2 . Produkten van de groep B  De chromatografie moet alleen worden uitgevoerd in het geval dat de resultaten van de metingen van de extinctie volgens 5.4.2 niet beantwoorden aan het gestelde onder 5.4.2 .  Indien het nodig blijkt te chromatograferen wordt een aliquot deel van de onder 5.2 verkregen petroleumetheroplossing , dat ca . 500 IE retinol bevat op de chromatografiekolom gebracht . Het chromatograferen gebeurt vervolgens als beschreven onder 5.3.1 .  5.4 . Meting van de extinctie  5.4.1 . Produkten van groep A  Damp het onder 5.3.1 verkregen retinol-eluaat in tot droog onder vacuum . Neem het residu op in 2 ml benzeen ( 3.14 ) . Pipetteer van deze oplossing 0,3 ml en voeg 3 ml van het reagens volgens Carr-Price  ( 3.16 ) toe . De kleur slaat om naar blauw . Meet de extinctie van de vloeistof precies 30 sec . na het begin van de reactie met behulp van de spectrofotometer bij 610 nm . Het gehalte aan retinol wordt berekend aan de hand van een ijkkurve die wordt opgesteld door benzeenoplossingen met toenemende concentraties van de retinol-standaard te behandelen met het reagens volgens Carr-Price ( 2 tot 16 IE retinol-standaard ( 3.17 ) per 0,3 ml benzeen  ( 3.14 ) + 3 ml reagens volgens Carr-Price ( 3.16 ) ) . De ijkkurve moet regelmatig en met korte tussenpozen worden gecontroleerd met behulp van de standaard en van een vers bereide oplossing van het reagens volgens Carr-Price .  5.4.2 . Produkten van groep B  Pipetteer een aliquot deel van de oplossing in petroleumether , verkregen volgens 5.2 dat ongeveer 200 IE retinol bevat . Damp in tot droog onder vacuum en neem het residu op in 25 ml isopropanol ( 3.18 ) . Meet met behulp van de spectrofotometer de extinctie bij 325 , 310 en 334 nm . Het gehalte aan retinol van de oplossing wordt berekend als volgt :  E325 * 18,30 = IE retinol/ml  De verhouding van de extincties  E310 : E325 en E334 : E325  moet echter bij benadering 6 : 7 = 0,857 zijn .  Indien een van deze verhoudingen aanmerkelijk afwijkt van deze waarde ( < 0,830 of > 0,880 ) dan moet de meting van de extincties worden voorafgegaan door een chromatografie volgens de onder 5.3.2 aangegeven werkwijze . Indien uit de meting van de extincties na chromatograferen blijkt dat de bovengenoemde verhoudingen nog steeds aanmerkelijk afwijken van de waarde 0,857 ( < 0,830 of > 0,880 ) dan moet de bepaling worden uitgevoerd volgens de werkwijze die is aangegeven voor de produkten van groep A .  6 . Berekening van de resultaten  Het gehalte aan retinol van het monster wordt berekend op grond van de hoeveelheid afgewogen materiaal en an de verdunningen die in de loop van de analyse zijn uitgevoerd . Het resultaat wordt uitgedrukt in IE retinol per kg .  Herhaalbaarheid  Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud aan hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan :   - 20 % relatief voor gehalten aan retinol beneden 75 000 IE/kg ,   - 15 000 IE absoluut voor gehalten tussen 75 000 en 150 000 IE/kg ,   - 10 % relatief voor gehalten tussen 150 000 en 250 000 IE/kg ,   - 25 000 IE absoluut voor gehalten tussen 250 000 en 500 000 IE/kg ,   - 5 % relatief voor gehalten boven 500 000 IE/kg .  2 . BEPALING VAN THIAMINE ( ANEURINE , VITAMINE B1 )  1 . Doel en toepassingsgebied  Met behulp van deze methode is het mogelijk thiamine  ( aneurine , vitamine B1 ) te bepalen in veevoeders , concentraten en voormengsels . De ondergrens van de bepaling ligt bij 5 dpm .  2 . Principe  Het monster wordt behandeld met warm verdund zwavelzuur en vervolgens langs enzymatische weg gehydroliseerd . De verkregen oplossing wordt in alkalisch milieu geoxideerd . Het gevormde thiochroom wordt met isobutanol geextraheerd en fluorimetrisch bepaald .  3 . Reagentia  3.1 . Thiamine-standaardoplossing 100 mg/ml : Los op 112,3 zuiver thiaminehydrochloride die van tevoren onder vacuum tot constant gewicht gedroogd is , in 1 000 ml zwavelzuur oplossing 0,2 N ( 3.2 ) . Deze oplossing kan , mits koel en onder uitsluiting van licht , gedurende een maand bewaard worden .  3.2 . Zwavelzuuroplossing 0,2 N  3.3 . Natriummetabisulfiet , Na2S2O5 , zuiver  3.4 . Kaliumhexacyanoferraat ( III ) oplossing 20 % ( g/v ) p.a .  3.5 . Kaliumhydroxyde-oplossing 25 % ( g/v ) p.a .  3.6 . Oxidatie-mengsel : meng 2 ml kaliumhexacyanoferraat  ( III ) oplossing ( 3.4 ) met 48 ml kaliumhydroxide-oplossing ( 3.5 ) . Dit mengsel is niet langer dan 4 uur bruikbaar .  3.7 . Isobutanol p.a .  3.8 . Natriumacetaatoplossing 2,5 N  3.9 . Multi-enzymepreparaat dat protease , fosfatase en amylase bevat ( bijvoorbeeld Clarase )  3.10 . Ethanol 96 % ( v/v ) .  4 . Apparatuur  4.1 . Waterbad  4.2 . Centrifuge ( 3 500 omw/min ) met buizen van 30 tot 50 ml met ingeslepen stoppen .  4.3 . Fluorimeter .  5 . Uitvoering  5.1 . Enzymatische hydrolise  Breng in twee maatkolven A en B van 250 ml gelijke hoeveelheden van het fijn gemaakte monster , die ongeveer 100 mg thiamine bevatten . Voeg toe in beide kolven 125 ml zwavelzuur ( 3.2 ) . Pipetteer alleen in kolf A , 1 ml van de standaardoplossing ( interne standaard ) .  Schud de kolven krachtig . Verwarm gedurende 15 min . in een kokend waterbad , schud nu en dan . Laat tot ca 45 * C afkoelen . Voeg dan toe in elke kolf 20 ml natriumacetaatoplossing ( 3.8 ) en 0,5 g multi-enzymepreparaat ( 3.9 ) . Laat 20 min . bij kamertemperatuur staan . Voeg toe 20 ml natriumacetaatoplossing ( 3.8 ) , vul aan met water , homogeniseer en filtreer . Vang de filtraten A en B op nadat de eerste 15 ml verwijderd zijn . Bereid hierna de volgende oplossingen .  5.1.1 . Blanco-oplossing T  Pipetteer 5 ml van filtraat A in een centrifugebuis  ( 4.2 ) . Voeg toe ongeveer 10 mg natriumbisulfiet  ( 3.3 ) . Plaats daarna het buisje gedurende 15 min . in een kokend waterbad . Koel daarna af tot kamertemperatuur .  5.1.2 . Oplossingen A ( interne standaard ) en B  ( monster )  Pipetteer 5 ml van filtraat A in een centrifugebuis  ( 4.2 ) en 5 ml van filtraat B in een andere centrifugebuis ( 4.2 ) .  5.2 . Oxidatie  Voeg toe aan ieder van de oplossingen T , A en B 5 ml van het oxidatiemengsel ( 3.6 ) en na één min 10 ml isobutanol ( 3.7 ) . Sluit de buizen af en schud krachtig gedurende 5 sec Laat gedurende een min . staan en centrifugeer om de lagen te scheiden . Pipetteer vervolgens uit iedere centrifugebuis 5 ml van de bovenstaande isobutanolfase in een kolfje van 25 ml , vul aan met ethanol ( 3.10 ) en homogeniseer ( extrakten , T , A en B ) .  5.3 . Meting van de intensiteit van de fluorescentie  Voer de metingen uit bij de golflengte waarbij de fluorimeter de grootste uitslag geeft voor thiochroom . Bestraal bij ongeveer 365 nm . Meet nadat het instrument met behulp van het extract TC op nul ingesteld is , de intensiteit van de fluorescentie van de extracten A en B .  6 . Berekening van de resultaten  Het gehalte aan thiamine van het monster in mg/kg wordt berekend met behulp van de volgende formule :  d * b / ( a - b ) c  waarin :  a = intensiteit van de fluorescentie van het extract A ( interne standaard )  b = intensiteit van de fluorescentie van het extract B ( monster )  c = afgewogen hoeveelheid van het monster in g  d = hoeveelheid thiamine in mg toegevoegd aan het monster ( interne standaard )  Herhaalbaarheid  Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan :  10 % relatief voor gehalten van minder dan 500 dpm en5 % relatief voor gehalten van 500 dpm en hoger .  3 . BEPALING VAN ASCORBINEZUUR EN DESHYDROASCORBINEZUUR  ( VITAMINE C )  1 . Doel en toepasbaarheid  Met behulp van deze methode is het mogelijk het totaal aan ascorbinezuur en dehydroascorbinezuur ( vitamine C ) te bepalen in veevoeders , concentraten en voormengsels . De ondergrens van de bepaling ligt bij 5 dpm . Al naar gelang van het vermoedelijke gehalte aan vitamine C worden de produkten onderverdeeld in twee groepen :  Groep A : gehalten van lager dan 10 g/kg ,  Groep B : gehalten gelijk aan of hoger dan 10 g/kg .  2 . Principe  Het monster wordt gesuspendeerd in een verdunde metafosforzuuroplossing en geëxtraheerd met chloroform . De waterfase wordt behandeld met 2,6-dichloorfenolindofenoloplossing om ascorbinezuur om te zetten in dehydroascorbinezuur , daarna wordt 2,4-dinitrofenylhydrazine-oplossing toegevoegd . Het hydrazon dat hierbij ontstaat wordt geëxtraheerd met een mengsel van ethylacetaat , ijsazijn en aceton . De oplossing wordt gechromatografeerd op een silicagelkolom , het eluaat wordt drooggedampt en het residu opgelost in verdund zwavelzuur . De extinctie van de oplossing wordt fotometrisch bepaald bij 509 nm .  Bij produkten van de groep A wordt het eluaat van de kolomchromatografie - ten einde het hydrazon te isoleren - aan een dunnelaagchromatografie onderworpen .  3 . Reagentia  3.1 . L-Ascorbinezuur-standaardoplossing 0,05 % :  Los 50 mg L-Ascorbinezuur p.a . op in ca 20 ml metafosforzuuroplossing ( 3.2 ) , vul aan tot 100 ml . Bereid deze oplossing onmiddellijk voor gebruik .  3.2 . Metafosforzuuroplossing 10 % ( g/v ) :  Maak 200 g metafosforzuur fijn in een mortier , los op in water en vul aan tot 2 000 ml .  Bewaar deze oplossing bij een temperatuur van 4 * C . Zij is een week bruikbaar .  3.3 . Chloroform p.a .  3.4 . 2,6-Dichloorfenolindofenoloplossing 0,5 %  ( g/v ) . Ga uit van het p.a . reagens en bereid direct voor het gebruik .  3.5 . Filtreerhulpmiddel ( S . en S nr . 121 of gelijkwaardig )  3.6 . 2,4-Dinitrofenylhydrazine-oplossing 2 %  ( g/v ) : los op 2 g 2,4-dinitrofenylhydrazine in 100 ml zwavelzuuroplossing ( vul 25 ml zwavelzuur p.a .  ( d : 1,84 ) met water aan tot 100 ml ) . Deze oplossing is , mits koel bewaard , een week bruikbaar .  3.7 . Stikstof of  3.8 . Kooldioxide  3.9 . Mengsel van ethylacetaat p.a./ijsazijn/aceton p.a . : 96:2:2 ( v/v/v )  3.10 . Mengsel van dichloormethaan p.a./ijsazijn : 97:3 ( v/v )  3.11 . Silicagel , deeltjesgrootte : 0,05 tot 0,2 mm  3.12 . Silicagel H , volgens Stahl , voor dunnelaagchromatografie  3.13 . Verdund zwavelzuur : Breng 105 ml in een maatkolf van 200 ml , vul aan met zwavelzuur p.a .  ( d : 1,84 )  3.14 . Loopvloeistof voor de dunnelaagchromatografie :  Meng 75 ml diethylether p.a . met 25 ml ethylacetaat p.a . 4,0 ml ijsazijn 96 % p.a . ( g/v ) . Bereid dit loopmiddel opnieuw na twee of driemalig gebruik .  4 . Apparatuur  4.1 . Waterbad , met ultrathermostaat , ingesteld op 20 * C .  4.2 . Centrifuge ( 3 500 omw/min ) , met buizen van 40 à 50 ml die voorzien zijn van ingeslepen stoppen .  4.3 . Vacuum rotatieverdamper , met bijbehorende kolven van 250 ml .  4.4 . Glazen chromatografiebuizen ( lengte : 100 mm , binnendiameter : 20 mm ) , voorzien van plaat van gesinterd glas ( bijv . Allihn-buizen ) .  4.5 . Spectrofotometer of filterfotometer met kuvetten van 10 mm optimale weglengte .  4.6 . Apparatuur voor dunnelaagchromatografie , waaronder silicagelplaten met laagdikte van het silicagel H ( 3.12 ) van 0,5 à 0,6 mm ( fabriekmatig gemaakte platen zijn geschikt ) . De platen worden 2,5 à 3 uur bij 120 à 130 * C in de droogstof gedroogd en na afkoelen ten minste 24 uur voor het gebruik in een exsiccator bewaard .  4.7 . Droogstoof , ingesteld op 120 à 130 * C .  5 . Uitvoering  5.1 . Extractie  Breng in twee maatkolven A en B van 250 ml met ingeslepen stoppen gelijke hoeveelheden van het fijngemaakte monster die circa 200 mg vitamine C bevatten . Voeg toe aan kolf A 0,4 ml van de standaardoplossing  ( 3.1 ) en meng door licht te schudden ( interne standaard ) . Voeg toe aan beide kolven 30 ml chloroform ( 3.3 ) en 25 ml van de metafosforzuuroplossing  ( 3.2 ) van 4 * C . Schud een korte tijd en laat de kolven gedurende 10 à 15 min . staan . Voeg aan beide kolven 25 ml water toe en schud , na afsluiten , vervolgens gedurende 10 sec . Laat vervolgens 10 à 15 min . staan in het waterbad ( 4.1 ) . Centrifugeer ten einde de waterige fase van de chloroformfase te scheiden . De waterige extracten A ( interne standaard ) en B worden beiden als volgt behandeld .  5.2 . Oxidatie  Pipetteer 40 ml van de volgens 5.1 verkregen bovenstaande , enigszins troebele oplossing in een reageerbuis met ingeslepen stop . Voeg toe 0,5 à 1 ml van de 2,6-dichloorfenolindofenoloplossing ( 3.4 ) en meng . De vloeistof is dan rood gekleurd en moet ten minste 15 min roodgekleurd blijven . Voeg daarna toe ca . 300 mg filtreerhulpmiddel ( 3.5 ) , schud en filtreer over een droog vouwfilter . Het filtraat hoeft niet helder te zijn .  5.3 . Reactie met 2.4-dinitrofenylhydrazine en extractie van het hydrazon  Pipetteer 10 ml van het volgens 5.2 verkregen filtraat in een centrifugebuis ( 4.2 ) , voeg toe 2 ml 2,4-dinitrofenylhydrazine-oplossing ( 3.6 ) en meng . Spoel de buis even met stikstof ( 3.7 ) of koolzuur ( 3.8 ) , sluit de buis af en plaats hem gedurende 15 uur in het waterbad ( 4.1 ) .  Voeg daarna toe 3 ml water , 20 ml van het mengsel van ethylacetaat , ijsazijn en aceton ( 3.9 ) en ca . 800 mg van het filtreerhulpmiddel ( 3.5 ) . Sluit de buis af , schud krachtig gedurende 30 sec . en centrifugeer . Pipetteer 15 ml van de heldere bovenstaande fase in een indampkolf en damp in een rotatieverdamper ( 4.3 ) onder verminderde druk tot een olieachtig residu in . Neem dit op onder verwarming bij 50 * C in 2 ml van het mengsel van ethylacetaat , ijsazijn en aceton ( 3.9 ) .  Laat afkoelen en voeg toe 10 ml van het mengsel van dichloormethaan en ijsazijn ( 3.10 ) en homogeniseer .  5.4 . Kolomchromatografie  Vul een chromatografiebuis ( 4.4 ) tot een hoogte van 30 mm met het mengsel van dichloormethaan en ijsazijn ( 3.10 ) . Suspendeer door krachtig schudden 5 g silicagel in 30 ml van het mengsel van dichloormethaan en ijsazijn ( 3.10 ) . Giet de suspensie in de buis , laat bezinken en verdicht het silicagel door toepassing van een geringe stikstof ( 3.7 ) - overdruk .  Breng de volgens 5.3 verkregen oplossing op de kolom , spoel de kolf na met een kleine hoeveelheid van het mengsel van dichloormethaan en ijsazijn ( 3.10 ) , breng over op de kolom en vul de buis met hetzelfde mengsel  ( 3.10 ) en was zolang ( 3 à 4 maal met ca . 5 ml ) tot het eluaat kleurloos is . Verwijder de geelgekleurde fractie .  Elueer de roodachtig gekleurde band bovenaan de kolom met het mengsel van ethylacetaat , ijsazijn en aceton ( 3.9 ) , van het eluaat op en damp dit vervolgens tot droog in .  5.4.1 . Voor de produkten van groep A ( vitamine C-gehalten van minder dan 10 g/kg )  Los het residu op in 2,0 ml van het mengsel van ethylacetaat , ijsazijn en aceton ( 3.9 ) en voer onmiddellijk de dunnelaagchromatografie uit als beschreven onder 5.5 .  5.4.2 . Voor produkten van groep B ( vitamine C-gehalten gelijk aan of hoger dan 10 g/kg )  Neem het olie-achtige residu op in 4,0 ml verdund zwavelzuur ( 3.13 ) en schud krachtig ten einde het residu volledig op te lossen . De meting van de extinctie vindt plaats zoals aangegeven onder 5.6 .  5.5 . Dunnelaagchromatografie  Voor het onderstaande in tweevond uit . Breng 0,5 ml van de oplossing verkregen volgens 5.4.1 , streepvormig op de plaat voor dunnelaagchromatografie ( 4.6 ) aan . Chromatografeer vervolgens met behulp van de loopvloeistof ( 3.14 ) in een kamer , die van tevoren tot verzadiging gebracht is , gedurende ten minste 20 min totdat een goede scheiding van het rosegekleurde hydrazon bereikt is . Laat de plaat aan de lucht droog worden . Baken de rosa band af , krab hem met een spatel af en breng het poeder kwantitatief in een chromatografiebuis ( 4.4 ) over .  Elueer achtereenvolgens eenmaal met 2 ml en tweemaal met 1,5 ml van het mengsel van ethylacetaat , ijsazijn en aceton ( 3.9 ) . Vang het eluaat op in een kleine kolf ( de laatste fractie moet kleurloos zijn ) . Damp in tot droog , neem het olieachtige residu op in 4,0 ml verdund zwavelzuur ( 3.13 ) , schud krachtig ten einde het residu geheel op te lossen en meet vervolgens de extinctie .  5.6 . Meting van de extinctie  Bepaal de extinctie fotometrisch bij 509 nm 20 à 30 min . na het in oplossing brengen van het residu in zwavelzuur . Voer de meting uit tegen verdund zwavelzuur ( 3.13 ) .  5.7 . Blanco  Als blanco bepaling wordt de gehele analyse uitgevoerd zonder monster .  6 . Berekening van de resultaten  Bereken het gehalte aan vitamine C in het monster , uitgedrukt in g/kg , aan de hand van de volgende formule :   ( c - a ) * 2 / ( b - c ) * 10 d  waarin :  a = extinctie van de blanco  b = extinctie van de interne standaardoplossing  c = extinctie van de monsteroplossing  d = gewicht van het afgewogen monster in grammen .  Herhaalbaarheid  Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan :  10 % relatief bij gehalten van minder dan 10 g/kg  5 % relatief bij gehalten van 10 g/kg of hoger .  ( 1 ) 1 IE = 0,3 mg retinol .  ( 2 ) Verdubbel voor kunstmelkpoeder of andere produkten die neiging vertonen tot klontvorming of zwelling , de hoeveelheden reagentia onder 5.2 , eerste en tweede alinea .  ( 3 ) De toevoering van natriumascorbaat kan achterwege blijven wanneer de hydrolyse plaats vindt onder stikstofatmosfeer .  ( 4 ) Het caroteengehalte kan worden bepaald door meting van de extinctie bij 450 nm ; E 1 % /1 cm = 2 600 .