CELEX: 31977R0072
Language: es
Date: 1977-01-13 00:00:00
Title: Reglamento (CEE) n° 72/77 de la Comisión, de 13 de enero de 1977, por el que se modifica el Reglamento (CEE) n° 1470/68 relativo a la toma y reducción de muestras así como a la determinación del contenido en aceite, en impurezas y en humedad de las semillas oleaginosas

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31977R0072

Reglamento (CEE) n° 72/77 de la Comisión, de 13 de enero de 1977, por el que se modifica el Reglamento (CEE) n° 1470/68 relativo a la toma y reducción de muestras así como a la determinación del contenido en aceite, en impurezas y en humedad de las semillas oleaginosas  

Diario Oficial n° L 012 de 15/01/1977 p. 0011 - 0024 Edición especial en finés : Capítulo 3 Tomo 7 p. 0218  Edición especial griega: Capítulo 03 Tomo 16 p. 0215  Edición especial sueca: Capítulo 3 Tomo 7 p. 0218  Edición especial en español: Capítulo 03 Tomo 11 p. 0104  Edición especial en portugués: Capítulo 03 Tomo 11 p. 0104 

 REGLAMENTO ( CEE ) N º 72/77 DE LA COMISIÓN    de 13 de enero de 1977    por el que se modifica el Reglamento ( CEE )   n º 1470/68 relativo a la toma y reducción   de muestras así como a la determinación del   contenido en aceite , en impurezas y en humedad de   las semillas oleaginosas    LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,    Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad   Económica Europea ,    Visto el Reglamento n º 136/66/CEE del Consejo , de   22 de septiembre de 1966 , por el que se establece la   organización común de mercados en el sector de las   materias grasas (1) , modificado en último lugar por el   Reglamento ( CEE ) n º 1707/73 (2) y , en particular ,   en apartado 3 de su artículo 26 ,    Considerando que , para poder determinar con precisión ,   para las semillas de colza y de nabina , su contenido en   ácido erúcico es conveniente prever un método   adecuado ; que a este fin procede modificar el Reglamento   ( CEE ) n º 1470/68 de la Comisión de 23 de septiembre   de 1968 relativo a la toma y reducción de muestras así   como a la determinación del contenido en aceite , en   impurezas y en humedad de las semillas oleaginosas (3) ,   modificado en último lugar por el Reglamento ( CEE )   n º 3025/75 (4) ;    Considerando que las medidas previstas en el presente   Reglamento se ajustan al dictamen del Comité de gestión   de las materias grasas ,    HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO :    Artículo 1    Se añade al Reglamento ( CEE ) n º 1470/68 el   artículo 2 ter siguiente :     « La determinación del contenido en ácido erúcico   contemplada en el artículo 4 del Reglamento   n º 282/67/CEE se efectuará según el método definido   en el Anexo VI del presente Reglamento .    Se considerarán con el máximo contenido en ácido   erúcico contemplado en el primer guión del apartado 2   del artículo 3 del Reglamento n º 282/67/CEE las   semillas de colza y de nabina cuyo aceite extraído   con arreglo al método que figura en el título I del   Anexo VI contenga como máximo un 15,0 % de   ácido erúcico C22 calculado según el método que   figura en los títulos II y III del Anexo VI . »    Artículo 2    El Reglamento ( CEE ) n º 1470/68 se completa con el   Anexo VI , cuyo texto figura en el Anexo del presente   Reglamento .    Artículo 3    El presente Reglamento entrará en vigor el tercer día   siguiente al de su publicación en el Diario Oficial de las   Comunidades Europeas .    El presente Reglamento será obligatorio en todos   sus elementos y directamente aplicable en cada Estado   miembro .    Hecho en Bruselas , el 13 de enero de 1977 .    Por la Comisión    Finn GUNDELACH    Vicepresidente    (1) DO n º 172 de 30 . 9 . 1966 , p. 3025/66 .    (2) DO n º L 175 de 29 . 6 . 1973 , p. 5 .    (3) DO n º L 239 de 28 . 9 . 1968 , p. 2 .    (4) DO n º L 300 de 20 . 11 . 1975 , p. 5 .    ANEXO VI    MÉTODO DE ANÁLISIS COMUNITARIO QUE DEBERÁ   UTILIZARSE PARA LA DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO   EN ÁCIDO ERÚCICO , EN LO QUE SE REFIERE A LAS   SEMILLAS DE LAS QUE SE HAYAN HECHO CARGO LOS   ORGANISMOS DE INTERVENCIÓN    I . Preparación de las muestras .    II . Preparación de los ésteres metílicos de   ácidos grasos .    III . Cromatografía en fase gaseosa de los ésteres   metílicos de ácidos grasos .    I . PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS    1 . La toma de las muestras de semillas , la   reducción de las muestras para laboratorio   en muestras para análisis , la determinación   del contenido en aceite sobre el producto tal   como esté , se efectuarán según los métodos   definidos respectivamente en los Anexos I , II y V   del Reglamento ( CEE ) n º 1470/68 .    2 . Preparación de la muestra de aceite extraída   de las semillas que hayan sido objeto del muestreo .    2.1 . La muestra es fluída y está perfectamente   límpida :    antes de efectuar las tomas de muestras , se agitará   la muestra como medida de precaución .    2.2 . La muestra es fluída , pero turbia o   contiene un poso :    colocar la muestra en una estufa a 50 ° C .   Cuando la muestra alcance dicha temperatura ,   agitarla vigorosamente ; dejarla decantar . Filtrar   sobre papel en la estufa manteniendo la temperatura   a 30 ° C .    2.3 . La muestra está solidificada    colocarla en la estufa mantenida a una temperatura   10 ° C superior a la de la zona de fusión supuesta .   Actuar como en los puntos 2.1 ( si la muestra   fundida es límpida ) y 2.2 ( si la muestra   fundida es turbia o contiene un poso ) .    II . PREPARACIÓN DE LOS ÉSTERES METÍLICOS   DE ÁCIDOS GRASOS    1 . PREÁMBULO    Los presentes métodos tienen por objeto la   transformación de los cuerpos grasos de origen   animal y vegetal , así como la de los ácidos grasos   de cualquier origen , en ésteres metílicos de   ácidos grasos .    Los ésteres metílicos así obtenidos podrán   utilizarse en diversos métodos que exijan una   transformación de este tipo : cromatografía en fase   gaseosa , cromatografía de capa fina ,   espectro-fotometría infrarroja , etc .    2 . ÁMBITO DE APLICACIÓN    Los métodos descritos se aplicarán a los   cuerpos grasos de origen animal y vegetal . Los   métodos descritos en el punto 3 son aplicables   a la preparación de los ésteres metílicos   en ácidos grasos que tengan 6 átomos de carbono   y más . En presencia de ácidos grasos C6 y C8 ,   y en el caso de la preparación de ésteres destinados   a la cromatografía en fase gaseosa , no se deberá   eliminar el disolvente de la solución de ésteres   metílicos .    El método general 3.1 puede proporcionar resultados   erróneos en caso de presencia :     - de compuestos de funciones oxigenadas secundarias   ( hidroxi , didroperoxi , ceto , epoxi ) ,     - de compuestos de funciones ciclopropánica y   ciclopropénica ,     - de compuestos pliinsaturados conjugados y de   los compuestos acetilénicos ,     - de ceras ,    y entonces será preferible utilizar uno de los   métodos descritos en el punto 3.2 . Sin embargo ,   los cuerpos grasos que contengan tales funciones en   proporciones muy débiles ( aceite de algodón por   ejemplo ) podrán ser analizados según el método 3.1 .    Los fosfolípidos podrán analizarse tras   saponificación y esterificación de los   ácidos grasos .    Lo insaponificable no se elimina y , si estuviera   presente en cantidad apreciable , puede interferir   en los análisis ulteriores ( nota 1 ) .    3 . MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE LOS ÉSTERES   METÍLICOS DE ÁCIDOS GRASOS QUE TENGAN 6 ÁTOMOS   DE CARBONO Y MÁS    En el punto 3.1 , se da un método general de   preparación de los ésteres metílicos utilizando   el trifluoruro de boro que deberá adoptarse con   carácter preferente . Por si no fuere posible utilizar   dicho método , se describen métodos alternativos   en el punto 3.2 .    3.1 . Método general utilizando el trifluoruro de boro    3.1.1 . Principio    Saponificación de los glicéridos , luego   liberación y esterificación de los ácidos grasos   en presencia de trifluoruro de boro .    3.1.2 . Material     - matraces de 50 a 100 ml de cuello esmerilado ,     - refrigerante derecho , de 20 a 30 cm de longitud   útil , con esmerilado adaptable al matraz ,     - regularizador de ebullición , exento de grasa ,     - tubo para burbujeo de nitrógeno ,     - pipeta graduada , de una capacidad al menos   igual a 10 ml , y perilla pará pipeta o pipeta   automática ,     - tubos de ensayo de tapón esmerilado ,     - ampollas de decantación de 250 ml.    3.1.3 . Reactivos     - solución metanólica de hidróxido de   sodio de alrededor de 0,5 N :    disolver 2 g de hidróxido de sodio en 100 ml   de metanol que no contenga más del 0,5 % ( m/m )   de agua . Cuando se deba utilizar la solución   durante un período de tiempo considerablemente largo ,   se formará un poco de carbonato de sodio ( precipitado   blanco ) ; éste no tendrá ninguna influencia sobre   la preparación de los ésteres metílicos ,     - solución metanólica de trifluoruro de boro ,   de contenido comprendido entre el 12 y 15 % ( m/m ) .   ( Existen soluciones al 14 y 50 % en el comercio )   ( nota 2 ) .    Advertencia : El trifluoruro de boro es un compuesto   tóxico . Por ello no se recomienda preparar uno   mismo la solución a partir de trifluoruro de boro   y de metanol ( nota 3 ) ,     - heptano , para cromatografía ( nota 2 , nota 4 ) ,     - éter de petróleo bidestilado ( Eb 40-60 ° C ) ,   índice de bromo inferior a 1 , exento de residuo , o   hexano ( nota 2 ) ,     - sulfato de sodio anhidro ,     - solución saturada de cloruro de sodio ,     - rojo de metilo , en solución al 0,1 % ( m/v )   en el etanol al 60 % ( v/v ) ,     - nitrógeno que contenga menos de 5 mg de oxígeno   por kg .    3.1.4 . Método operatorio    Las operaciones siguientes se efectuarán   preferentemente bajo una campana de gases a causa   de las propiedades tóxicas del trifluoruro de boro .   Todo el material de vidrio se lavará con agua   inmediatamente después de su empleo .    En presencia de aceites o de ácidos grasos que   contengan ácidos de más de dos dobles enlaces , se   recomienda eliminar el aire contenido en el metanol y   en el matraz por burbujeo de nitrógeno durante   algunos minutos .    Preparar la muestra de conformidad con « I .   Preparaciones de las muestras » .    No es necesaria una pesada exacta . La importancia   de la toma de muestras sólo ha de conocerse para   escoger el tamaño del matraz y las cantidades   de reactivos , según el siguiente cuadro :    Toma de muestras ( mg ) * Matraz ( ml ) * NaOH 0,5 N   ( ml ) * Solución metanólica de BF3 ( ml ) *    100-250 * 50 * 4 * 5 *    250-500 * 50 * 6 * 7 *    500-750 * 100 * 8 * 9 *    750-1 000 * 100 * 10 * 12 *    En caso en que los ésteres metílicos estén   destinados al análisis por cromatografía en fase   gaseosa , la toma de muestras será preferentemente   de alrededor de 350 mg . Si fuere más pequeña ,   convendrá tomar precauciones para que la muestra   tomada sea representativa ( nota 5 ) .    3.1.4.1 . Para los aceites y grasas    Introducir la toma de muestras preparada en el matraz .   Añadir la cantidad indicada de la solución   metanólica de hidróxido de sodio y un regularizador   de ebullición . Adaptar el refrigerante sobre el   matraz . Llevar a ebullición con reflujo hasta que   desaparezcan las gotitas de materia grasa ( esta   operación puede durar de cinco a diez minutos ,   pero , en algunos casos excepcionales , puede sobrepasar   los diez minutos ) .    Añadir a la mezcla en ebullición , por la parte   superior del refrigerante y utilizando la pipeta   graduada con la pera para pipeta o la pipeta automática ,   la cantidad indicada de la solución metanólica de   trifluoruro de boro . Continuar la ebullición durante   dos minutos .    Añadir a la mezcla hirviendo 2 a 5 ml de heptano   ( nota 4 ) por la parte superior del refrigerante   ( la cantidad de heptano no tiene importancia en la   reacción ) y continuar la ebullición durante   un minuto .    Quitar la fuente de calor del matraz , y después   el refrigerante . Añadir algunos ml de la solución   saturada de cloruro de sodio y agitar suavemente el   matraz varias veces por rotación .    Continuar añadiendo solución saturada de cloruro   de sodio para llevar el nivel del líquido al cuello   del matraz . Trasladar alrededor de 1 ml de la capa   superior ( solución heptánica ) a un tubo de   ensayo esmerilado y añadir la cantidad de sulfato   de sodio anhidro necesaria para eliminar los restos   de agua . En el caso de una toma de muestras de 350 mg ,   la solución obtenida contendrá alrededor del 5   al 10 % de ésteres metílicos y podrá inyectarse   directamente en la columna de cromatografía en fase   gaseosa . En los otros casos , diluir la solución   heptánica para obtener una concentración del 5   al 10 % en ésteres metílicos ( nota 6 ) .    Para obtener la totalidad de los ésteres secos ,   trasladar la solución salina y la fase heptánica   a una ampolla de decantación de 250 ml . Decantar .   Extraer la solución salina con 50 ml de éter   de petróleo ( Eb 40-60 ° C ) o de hexano .    Repetir una segunda vez esta extracción . Reunir   la fase heptánica y los dos extractos y lavarlos   con porciones de 20 ml de agua hasta la desaparición   de la acidez ( indicador : rojo de metilo ) . Secar   con sulfato de sodio anhidro y evaporar el disolvente   al baño maría bajo corriente de nitrógeno   ( nota 6 , nota 7 ) . Para tomas de muestras inferiores   a 500 mg , es preferible reducir proporcionalmente los   volúmenes de disolvente y de agua .    3.1.4.2 . Para los ácidos grasos    Si la muestra está constituida únicamente por   ácidos grasos , no se efectúa la saponificación .    Introducir la cantidad deseada de ácidos grasos   preparados en el matraz . Añadir la cantidad   indicada de la solución metanólica de trifluoruro   de boro . Llevar a ebullición durante dos minutos .   Proceder a continuación como se indica en el   punto 3.1.4.1 a partir de : « Añadir a la mezcla   hirviendo ... »    3.2 . Métodos alternativos no utilizando el   trifluoruro de boro    3.2.1 . Para los cuerpos grasos neutros ( IA < 2 )    3.2.1.1 . Principio    Metanólisis de los glicéridos en medio alcalino .    3.2.1.2 . Material     - agitador que permita una agitación rápida y   dispositivo de calentamiento apropiado ( por ejemplo ,   agitador magnético calentador ) ,     - frasco cónico o matraz de 100 ml de cuello   esmerilado ,     - tubo para burbujeo de nitrógeno ,     - refrigerante que se adapte sobre el frasco   cónico o el matraz ,     - regularizador de ebullición , exento de grasa ,     - ampollas de decantación de 125 ml ,     - frasco cónico , de boca estrecha , de 50 ml .    3.2.1.3 . Reactivos     - metanol que no contenga más de 0,5 % ( m/m )   de agua ,     - solución metanólica de hidróxido de potasio   de alrededor de 1 N :    disolver 5,6 g de hidróxido de potasio en 100 ml   de metanol que no contenga más del 0,5 % ( m/m )   de agua ,     - heptano para cromatografía ( nota 2 , nota 4 ) ,     - sulfato de sodio anhidro ,     - nitrógeno que contenga menos de 5 mg de   oxígeno por kg .    3.2.1.4 . Método operatorio    En presencia de aceites que contengan ácidos de más   de 2 dobles enlaces , es recomendable eliminar el aire   contenido en el metanol y en el matraz mediante burbujeo   de nitrógeno durante algunos minutos .    Preparar la muestra de conformidad con « I .   Preparaciones de las muestras » .    En un frasco cónico o un matraz de 100 ml ,   introducir alrededor de 4 g ( nota 5 ) de cuerpo   graso preparado . Añadir alrededor de 40 ml de metanol ,   0,5 ml de la solución de hidróxido de potasio y   un regularizador de ebullición . Poner bajo   refrigerante a reflujo , agitar y llevar a ebullición .   La solución debe hacerse límpida . La reacción   estará prácticamente terminada al cabo de cinco   a diez minutos . En caso de aceites del tipo « aceite   de ricino » , la limpidez no será el criterio de   reacción ( nota 8 ) .    Refrigerar bajo corriente de agua y trasvasar a una   ampolla de decantación de 125 ml . Enjuagar el   frasco o el matraz con 20 ml de heptano ( nota 4 ) y   verterlos en la ampolla .    Añadir alrededor de 40 ml de agua , agitar y   dejar decantar . Los ésteres se reunirán en la   fase heptánica superior . Agotar la fase acuosa una   segunda vez con 20 ml de heptano . Reunir los dos   extractos y lavarlos dos veces con 20 ml de agua .   Después de la decantación , secar sobre sulfato de   sodio anhidro la solución de ésteres , filtrar   sobre algodón y evaporar el disolvente , si fuera   necesario , hasta 20 ml en baño de agua hirviendo   burbujeando nitrógeno en un frasco cónico de 50 ml   ( nota 6 , nota 7 ) .    3.2.2 . Para los cuerpos grasos ácidos ( IA > 2 ) y   los ácidos grasos    3.2.2.1 . Principio    Para los cuerpos grasos ácidos , neutralización   de los ácidos grasos libres , metanólisis alcalina   de los glicéridos , y después esterificación   de los ácidos grasos en medio ácido .    Para los ácidos grasos , esterificación en medio   ácido .    3.2.2.2 . Material     - agitador que permita una agitación rápida y   dispositivo de calentamiento apropiado ( por ejemplo ,   agitador magnético calentador ) ,     - frasco cónico o matraz de 250 ml de cuello   esmerilado ,     - tubo para burbujeo de nitrógeno ,     - refrigerante que se adapte sobre el frasco cónico   o el matraz ,     - regularizador de ebullición , exento de grasa ,     - ampollas de decantación de 250 ml ,     - frasco cónico , de boca estrecha , de 100 ml .    3.2.2.3 . Reactivos     - solución de metilato de sodio obtenida   disolviendo 1 g de sodio en 100 ml de metanol que   no contenga más de 0,5 % ( m/m ) de agua ,     - solución metanólica de ácido clorhídrico   anhidro de alrededor de 1 N ( ver advertencias 3.2.2.6   a ) y b ) ) ,     - heptano para cromatografía ( nota 2 , nota 4 ) ,     - sulfato de sodio anhidro ,     - nitrógeno que contenga menos de 5 mg de   oxígeno por kg .    3.2.2.4 . Método operatorio para los cuerpos grasos   ácidos ( IA > 2 )    En presencia de aceites que contengan ácidos de   más de 2 dobles enlaces , es recomendable eliminar   el aire contenido en el metanol y en el matraz mediante   burbujeo de nitrógeno durante algunos minutos .    Preparar la muestra de conformidad con « I .   Preparaciones de las muestras » .    En un frasco cónico o un matraz de 250 ml ,   introducir alrededor de 4 g ( nota 5 ) de cuerpo graso   preparado .    Añadir 40 ml de la solución de metilato de sodio   ( ver observación 3.2.2.6 c ) ) . Poner bajo   refrigerante a reflujo , agitar y llevar a ebullición .   La solución debe hacerse límpida , lo que se   produce generalmente al cabo de una decena de minutos .   La reacción estará prácticamente finalizada   después de quince minutos .    Introducir a continuación en el frasco o en el   matraz al menos 50 ml de la solución clorhídrica ,   luego llevarla de nuevo a ebullición durante   diez minutos ( ver advertencia 3.2.2.6 d ) ) .    Refrigerar bajo corriente de agua , añadir a   continuación en el frasco o en el matraz 100 ml   de agua , verter luego la mezcla en una ampolla   de decantación de 250 ml y añadir 30 ml de   heptano ( ver nota 4 ) . Agitarla vigorosamente   y dejarla decantar hasta una separación completa   de las dos fases . Recoger la fase heptánica .   Agotar la fase acuosa una segunda vez mediante   30 ml de heptano . Reunir los dos extractos   heptánicos y lavarlos varias veces con agua hasta   la neutralidad . Después de la decantación ,   secar sobre sulfato de sodio . Filtrar sobre   algodón y evaporar el disolvente , si fuera necesario ,   hasta 20 ml de baño de agua hirviendo burbujeando   nitrógeno en un frasco cónico de 100 ml ( nota 6 ,   nota 7 ) .    3.2.2.5 . Método operatorio para los ácidos   grasos    Para los ácidos grasos , será conveniente utilizar   el método operatorio simplificado siguiente :    En presencia de ácidos grasos que contengan   ácidos de más de 2 dobles enlaces , es recomendable   eliminar el aire contenido en el metanol y en el   matraz burbujeando nitrógeno durante algunos minutos .    Preparar la muestra , de conformidad con « I .   Preparaciones de las muestras » .    En un frasco cónico o un matraz de 250 ml ,   introducir alrededor de 4 g ( nota 5 ) de cuerpo   graso preparado .    Introducir 50 ml de la solución clorhídrica y   un regulador de ebullición , adaptar el refrigerante ,   después llevar a ebullición durante diez minutos .    Refrigerar bajo corriente de agua , añadir   a continuación en el frasco o en el matraz 100 ml   de agua , luego verter la mezcla en una ampolla   de decantación de 250 ml y añadir 30 ml de   heptano ( nota 4 ) . Agitarla vigorosamente y   dejarla decantar hasta una separación completa   de las dos fases . Trasegar la fase acuosa y   agotarla una segunda vez mediante 30 ml de heptano .   Reunir los dos extractos heptánicos y lavarlos   varias veces con agua hasta la neutralidad .   Después de la decantación , secar sobre sulfato   de sodio . Filtrar sobre algodón y evaporar hasta   20 ml el disolvente en baño de agua hirviendo   burbujeando nitrógeno en un frasco cónico de   100 ml ( nota 6 , nota 7 ) .    3.2.2.6 . Observaciones    a ) En el laboratorio es fácil preparar pequeñas   cantidades de ácido clorhídrico gaseoso anhidro   por simple desplazamiento de su solución comercial   ( d = 1,18 ) añadiéndole poco a poco ácido   sulfúrico concentrado ( d = 1,84 ) . El gas que   se desprenda será simplemente secado mediante   burbujeo en el ácido sulfúrico .    Al ser el metanol muy ávido de gas clorhídrico ,   será recomendable tomar todas las precauciones   de utilización para la disolución , por ejemplo :   efectuar la introducción del gas con la ayuda   de un pequeño embudo invertido que llegue hasta   la superficie del nivel del metanol . Es posible ,   además , preparar de antemano cantidades importantes   de soluciones metanólicas clorhídricas que se   conservan perfectamente en frascos esmerilados   mantenidos en la oscuridad .    b ) Es posible utilizar ácido sulfúrico   metanólico de alrededor de 1 N en lugar de ácido   clorhídrico metanólico , pero la duración   de la esterificación deberá ser de 20 minutos   como mínimo y los precipitados de sulfato de   sodio entorpecen la ebullición e imponen la   filtración o el empleo de un agitador magnético .    c ) Antes de la introducción de la toma de   muestras , también es posible verter 40 ml de   metanol y añadir 0,4 g de sodio , lo que supone una   solución de metilato de socio preparada y   administrada al momento .    d ) En caso de materias grasas muy ácidas , se   produce , habida cuenta de la cantidad relativamente   importante de metilato de sodio , una precipitación   de cloruro de sodio que puede provocar algunos   sobresaltos en el curso de la ebullición que   sigue . Es posible filtrar dicho precipitado , pero   ello no es necesario generalmente debido a la   breve duración del calentamiento preconizado .    4 . MÉTODOS PARTICULARES DE PREPARACIÓN DE   LOS ÉSTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GRASOS DE   4 ÁTOMOS DE CARBONO Y MÁS    4.1 . Principio    Los ésteres metílicos se obtienen por reacción   de los cuerpos grasos con una solución metanólica   de hidróxido de potasio en un estado intermedio   antes de que tenga lugar la saponificación .    4.2 . Ambito de aplicación    El método está destinado principalmente a la   preparación de los ésteres metílicos que deban   ser analizados por cromatografía en fase gaseosa .   El método no es aplicable a los cuerpos grasos   ácidos ( índice de acidez < 2 ) .    4.3 . Material     - tubos de ensayo de tapón esmerilado de alrededor   de 20 ml ,     - matraces aforados de 50 y 100 ml ,     - pipetas graduadas de 1 ml ( o más ) ,     - probetas graduadas de 10 ml .    4.4 . Reactivos     - solución metanólica de hidróxido de   potasio de alrededor de 2 N :    disolver 11,2 g de hidróxido de potasio en   100 ml de metanol que no contenga más de un 0,5 %   ( m/m ) de agua ,     - heptano para cromatografía ( nota 2 , nota 4 ) ,     - solución de referencia I : en un matraz   aforado de 50 ml , pesar , con precisión de 0,1 mg ,   1 g de pentanoato de metilo y enrasar con el heptano .     - solución de referencia II : en un matraz   aforado de 100 ml , pesar , con precisión de   0,1 mg , 200 mg de pentanoato de metilo y enrasar   con el heptano .    4.5 . Método operatorio    Si fuera necesaria la dosificación ulterior del   ácido butírico por cromatografía en fase   gaseosa , será conveniente utilizar una solución   de referencia : solución de referencia I si   el contenido supuesto en ácido butírico fuera   superior al 1 % ; solución de referencia II si   dicho contenido fuera inferior al 1 % .    En caso de que se requiera la determinación de   la composición en ácidos grasos por cromatografía   en fase gaseosa , no será necesario utilizar una   solución de referencia .    Preparar la muestra de conformidad con « I .   Preparaciones de las muestras » .    En un tubo de ensayo de tapón esmerilado de   alrededor de 20 ml , pesar , con precisión de   1 mg , 1 g de la muestra preparada . Añadir 10 ml   de heptano medidos con la probeta graduada . Con una   pipeta graduada , añadir 1,0 ml de la solución de   referencia conveniente .    Nota : Cuando no se requiera la dosificación de   ácido butírico , no será necesario pesar la   muestra con precisión de 1 mg ni añadir la   solución de referencia .    Añadir 0,5 ml de la solución metanólica de   hidróxido de potasio de alrededor de 2 N y mezclar   el contenido del tubo de ensayo mediante balanceos   hasta que dicho contenido se haga claro . Ello   exige alrededor de veinte segundos . Casi inmediatamente   después de esta clarificación , la solución se   enturbiará de nuevo , a consecuencia de la   separación de la glicerina . Se produce asimismo   la decantación de la glicerina .    Decantar la capa superior que contiene los ésteres   metílicos .    5 . NOTAS    1 . Si entorpeciera lo insaponificable , se diluirá   con agua la solución obtenida después de la   saponificación y se eliminará lo insaponificable   mediante extracción por óxido dietílico ,   hexano o éter de petróleo en las condiciones   acostumbradas .    Acidificar la solución jabonosa acuosa , y separar   los ácidos grasos . Preparar sus ésteres metílicos   según los procedimientos 3.1.4.2 ó 3.2.3.5 .    2 . Durante la cromatografía en fase gaseosa de   los ésteres metílicos , algunos reactivos y   en especial las soluciones metanólicas de trifluoruro   de boro pueden llevar a la aparición de picos   parásitos ( en la región C20C22 para las soluciones   metanólicas de trifluoruro de boro ) . Como   consecuencia , cada nuevo lote de reactivo deberá   someterse a prueba preparando ésteres metílicos   del ácido oleico puro y después cromatografiándoles .   Si apareciera un pico parásito , deberá eliminarse   el reactivo utilizado .    Los distintos reactivos no deben dar el pico que   interfiera con los de los ésteres metílicos de   ácidos grasos en el curso de la cromatografía en   fase gaseosa .    3 . Si fuera absolutamente indispensable preparar   una solución metanólica de trifluoruro de boro ,   a partir de trifluoruro de boro gaseoso , operar como   sigue : Tarar un matraz de dos litros que contenga   un litro de metanol . Refrigerar en un baño de agua   helada . Estando todavía el matraz en el baño ,   burbujear con BF3 procedente de una botella de gas   por medio de un tubo de vidrio en el metanol hasta   la absorción de 125 g , operando bajo una campana   de gases . Hacer pasar la corriente de BF3 al tubo   de vidrio antes de sumergirlo en el metanol y hasta   que sea retirado , para evitar cualquier vuelta de   líquido al sistema descompresor de gas . El gas ,   al escaparse demasiado rápidamente , no debería   dar como resultado pequeñas nubes de humo blanco .   El reactivo permanece estable durante dos años .    4 . El heptano ( mezcla de isómetos C7 puros   sometida a prueba por cromatografía en fase gaseosa )   puede sustituirse por hexano en ausencia de ácidos   grasos de 20 átomos de carbono y más .    5 . Si no se dispusiera de la masa de toma de   muestras prevista , ésta podrá ser reducida hasta   10 mg e incluso hasta menos , siempre que disminuyan   proporcionalmente los volúmenes de reactivos y   la capacidad del equipo .    6 . Los ésteres metílicos deberán ser   analizados preferentemente lo más rápidamente posible .   Si fuera necesario , la solución heptánica que   contenga los ésteres metílicos podrá conservarse   bajo gas inerte y en el refrigerador . Para un   almacenamiento de larga duración , será deseable   proteger los ésteres metílicos contra la   auto-oxidación por adición a la solución de un   antioxidante en una concentración que no interfiera   en los análisis ulteriores , por ejemplo un 0,005 %   ( m/v ) de BHT ( di t.butil-2-6 metil-4 fenol ) .   Si fuera necesario , los ésteres metílicos secos   y sin disolvente podrán , en su caso , conservarse   24 horas bajo gas inerte en el refrigerador , o más   tiempo en tubo sellado en vacío en el congelador .    7 . Existe un riesgo de perder una parte de los   ésteres metílicos más volátiles si la   eliminación del disolvente se prolongara o si la   corriente de nitrógeno fuera demasiado vigorosa .    Para la espectrofotometría infrarroja , dicha   eliminación del disolvente deberá ser lo más   completa posible . Para la cromatolografía en fase   gaseosa , es deseable no expulsar el disolvente .    8 . En el caso de aceite del tipo de aceite de   ricino , la limpidez no será criterio de reacción .    III . CROMATOGRAFÍA EN FASE GASEOSA DE LOS ÉSTERES   METÍLICOS DE ÁCIDOS GRASOS    1 . PREÁMBULO    El presente método tiene por objeto dar las   líneas directrices básicas para la determinación   por cromatografía en fase gaseosa de la composición   cualitativa y cuantitativa de una mezcla de ésteres   metílicos de ácidos grasos obtenida según el   título II . Los ácidos grasos polimerizados no   son analizables por este método .    Las indicaciones aportadas se refieren a los equipos   normales de cromatografía en fase gaseosa con   columna de relleno y detector de ionización de llama   ( nota 1 ) .    2 . MATERIAL    2.1 . Aparato de cromatografía en fase gaseosa    Cualquier equipo que permita alcanzar el grado de   eficacia y la resolución tal como se definen en el   punto 4.1.2 es conveniente .    2.1.1 . Dispositivo de inyección    El dispositivo de inyección deberá tener el   volumen muerto más débil posible . Salvo   imposibilidad material , se le llevará a una   temperatura superior en 25 a 50 ° C a la de la   columna .    2.1.2 . Horno    El horno deberá ser capaz de llevar las columnas   a una temperatura de al menos 220 ° C y de mantener   la temperatura escogida con precisión de 1 ° C .    En caso de utilización de condiciones programadas ,   se aconseja escoger un apartado de doble columna .    2.1.3 . Columna    2.1.3.1 . Tubo    Tubo de material inerte respecto a las materias   que deban analizarse : cristal o , en su defecto ,   acero inoxidable ( nota 2 ) .    Longitud : de 1 a 3 m . Se utilizará una columna   relativamente corta en los casos en que estén   presentes los ácidos grasos de cadena larga   ( > C20 ) .    En los casos de determinación de los ácidos en   C4 y C6 , se recomienda utilizar una columna de 2 m .    Diámetro interior : de 2 a 4 mm .    2.1.3.2 . Relleno    Soporte : Tierra de diatomeas lavada con ácidos   y silanizada , o cualquier otro soporte inerte   que sea conveniente , con un estrecho intervalo de   granulometría ( 25 mm entre 125 y 200 mm ) ,   estando ligado el valor medio al diámetro interior   y a la longitud de la columna .    Fase estacionaria : fase polar de tipo poliéster   ( por ejemplo polisicinato de dietilenoglicol ,   polisucinato de butanediol , poliadipato de etilenoglicol ,   etc. ) o cualquier otra fase que responda a las   exigencias citadas a continuación ( por ejemplo   cianosiliconas , etc. ) . El coeficiente de   impregnación estará comprendido entre el 5 y 20 % .   Para determinadas separaciones podrán utilizarse   fases apolares .    2.1.3.3 . Envasado    Después de haber desconectado , si fuera posible ,   la columna del detector , poner el horno del aparato   a 10 ° C por encima de la temperatura de trabajo y   mantener la columna que acabe de ser preparada bajo   una corriente de gas inerte de 20 a 60 ml/min   durante al menos dieciséis horas a dicha temperatura ,   después durante dos horas a 195 ° C .    2.1.4 . Detector    El detector deberá preferentemente ser adecuado   para llegar a una temperatura superior a la de la   columna .    Los detalles operatorios dados a continuación   se refieren al empleo de un detector de ionización de   llama ( nota 1 ) .    2.2 . Jeringa    Jeringa de 10 ml como máximo , dividida en décimas   de ml .    2.3 . Aparato registrador    Cuando se utilice la curva registrada para calcular   la composición de la mezcla analizada , el aparato   registrador deberá ser un aparato electrónico   de gran precisión compatible con el equipo utilizado :     - velocidad de respuesta inferior a 1,5 seg ,   preferentemente a 1 seg ( la velocidad de respuesta   es el tiempo necesario para que la pluma del aparato   registrador vaya del 0 al 90 % al producirse la   introducción momentánea de una señal del 100 % ,     - anchura del papel : 25 cm como mínimo ,     - velocidad de desenrollamiento del papel :   25 a 150 cm/h .    2.4 . Integrador o calculador ( opcional )    El empleo de un integrador electrónico o de   un calculador permite un cálculo rápido y preciso .   Este cálculo deberá suministrar una respuesta   lineal , tener una sensibilidad suficiente y la   corrección de la desviación de la línea de   base deberá ser satisfactoria .    3 . REACTIVOS     - gas vector : gas inerte ( nitrógeno , helio ,   argón , etc. ) muy bien desecado y conteniendo   menos de 10 ppm de oxígeno ,     - gases auxiliares : hidrógeno al 99,9 % como   mínimo que no contenga productos orgánicos , aire   u oxígeno que no contenga productos orgánicos ,     - productos de graduación : mezcla de ésteres   metílicos o ésteres metílicos de un aceite de   composición conocida , a ser posible parecida a la   de los cuerpos grasos que deban analizarse .    4 . MÉTODO OPERATORIO    4.1 . Reglaje del aparato    4.1.1 . Determinación de las condiciones óptimas   de trabajo    Para escoger las condiciones de trabajo , deberán   tenerse en cuenta las siguientes variables :     - longitud y diámetro de la columna ,     - naturaleza y cantidad de la fase estacionaria ,     - temperatura de la columna ,     - caudal del gas vector ,     - resolución deseada ,     - importancia de la toma de muestras ,     - duración del análisis .   La importancia de la toma de muestras será   escogida de forma tal que el conjunto   detector-electrómetro suministre una respuesta   lineal . En general , los siguientes valores serán los   que den los resultados deseados , a saber número de   platos teóricos para el estearato de metilo al   menos igual a 2 000 y elución de éste en   aproximadamente quince minutos .    Diámetro interior de la columna * Velocidad del   gas vector *    2 mm * 15-25 ml/min *    3 mm * 20-40 ml/min *    4 mm * 40-60 ml/min *    Concentración de la fase estacionaria * Temperatura *    5 % * 175 ° C *    10 % * 180 ° C *    15 % * 185 ° C *    20 % * 185 ° C *    Cuando el aparato lo permita , estará el   inyector a una temperatura cercana a los 200 ° C y   el detector a una temperatura igual o superior a la   de la columna .    El caudal de hidrógeno del detector de   ionización de llama es , en general , de cerca de   la mitad del gas vector y de oxígeno es de 5 a 10   veces el del hidrógeno .    4.1.2 . Determinación de la eficacia de la   resolución    Efectuar el análisis de una mezcla de estearato   y de oleato de metilo en proporciones sensiblemente   equivalentes ( por ejemplo , ésteres metílicos   de manteca de cacao ) . La importancia de la toma   de muestras , la temperatura de la columna y el   caudal del gas vector se escogerán de manera que el   máximo del pico de estearato de metilo se   registre alrededor de 15 minutos después del pico   del disolvente y que dicho pico corresponda   aproximadamente a los tres cuartos de la escala total .    Calcular el número de platos teóricos   n ( eficacia ) mediante la fórmula :    n = 16 ( dR1/o1 ) ²    y la resolución R por la fórmula :    R = 2 D/ ( o1 + o2 )    donde    dR1 es la distancia de retención en mm   medida a partir de la introducción hasta el   máximo relativo del pico del estearato de metilo ,    o1 y o2 son las anchuras en mm de los picos del   estearato y del oleato de metilo medidas entre los   puntos de inflexión de la curva ,    D es la distancia entre los máximos relativos   de los picos del estearato y del oleato de   metilo : ver : D.O .    Las condiciones de operación que se tomarán   en consideración serán las que den un número   de platos teóricos para el estearato de metilo   al menos igual a 2 000 y una resolución de al menos   1,25 . Deberán , además , ser tales que el   ácido linolénico ( C 18:3 ) sea separado de los   ácidos aráquico ( C20:0 ) y gadoleico ( C20:1 1 ) .    4.2 . Análisis    La toma de muestras será de 0,1 a 2 ml de la   solución heptánica de los ésteres metílicos   obtenida según el título II . En los casos de   ésteres exentos de disolventes , hacer una   solución al 10 % aproximadamente en el heptano e   inyectar de 0,1 a 1 ml de ésta .    Para la búsqueda de componentes presentes en   trazas , esta toma de muestras podrá aumentarse   ( hasta 10 veces ) ; en los casos habituales , las   condiciones de operación serán las determinadas   en el punto 4.1.1 . Sin embargo , será posible   operar con una temperatura de columna más baja   en el caso en que sea necesario dosificar ácidos   grasos inferiores a C12 , o más elevada en el   caso en que fuera necesario dosificar ácidos grasos   superiores a C20 .    En su caso , es posible operar a una temperatura   programada en los dos casos precedentes . Por ejemplo ,   si la muestra contuviera ésteres metílicos de   ácidos grasos de menos de 12 átomos de carbono ,   inyectar la muestra de 100 ° C ( o a 50-60 ° C   si el ácido butírico estuviera presente ) y   programar inmediatamente a 4-8 ° C/min hasta la   temperatura óptima .    En determinados casos , podrán combinarse los   dos procedimientos : después del período de   programación de temperatura , continuar la   elución a temperatura constante hasta la elución   de todos los constituyentes . Si el aparato no pudiera   trabajar a temperatura programada , operar a dos   temperaturas fijadas entre 100 y 195 ° C .    Si fuera necesario , se recomienda hacer un   análisis sobre dos fases fijas de polaridades   diferentes para comprobar la ausencia de picos   ocultos , por ejemplo para los aceites de pescado   o en caso de la presencia simultánea C18:3 y   C20:3 y de C18:3 y de C18:2 conjugados .    5 . EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS    5.1 . Análisis cualitativo    En condiciones de operación idénticas a las   del ensayo , analizar la mezcla testigo , de   composición conocida , y determinar las   distancias de retención ( o los tiempos de retención )   para los ácidos grasos constitutivos . Trazar las   curvas que den el logaritmo de la distancia de   retención ( o del tiempo de retención ) en función   del número de átomos de carbono ; en condiciones   isotermas y para los ésteres de cadena recta y un   índice de insaturación fijado , dichas curvas trazadas   sobre papel semilogarítmico deberán ser rectas   notablemente paralelas .    Para la prueba , identificar los picos remitiéndose   a dichas rectas , si fuera necesario interpolando .    Deberán evitarse las condiciones operativas   en las que existan « picos ocultos » , o sea que dos   constituyentes no puedan distinguirse como consecuencia   de una resolución insuficiente .    5.2 . Análisis cuantitativo    5.2.1 . Determinación de la composición    Utilizar el método de normalización interna   ( salvo excepciones ) , o sea admitir que la totalidad   de los constituyentes presentes en la muestra   está representada sobre el cromatograma , y por   tanto que la suma de las áreas de los picos   representa el 100 % de los constituyentes ( elución   total ) .    Si el equipo incluye un integrador , utilizar   las cifras suministradas por él . En caso contrario ,   determinar el área de cada pico por triangulación   multiplicando la altura de éste por su anchura a media   altura , considerando , si fuera necesario , las   diversas atenuaciones utilizadas en el curso del registro .    5.2.1.1 . Caso general    A falta de constituyentes importantes inferiores   a C8 , calcular el contenido en constituyente , expresado   en porcentaje en ésteres metílicos , determinando   el porcentaje representado por el área del pico   correspondiente con respecto a la suma de la   totalidad de los picos :     % ( m/m ) del compuesto i expresado en ésteres   metílicos = A i/SA i por 100    A i = área del pico correspondiente del compuesto i ;    SA i = suma de las áreas de la totalidad de los   picos .    5.2.1.2 . Empleo de 105 factores de correción    En algunos casos , en especial en presencia de ácidos   inferiores a C8 o de ácidos de funciones secundarias   y cuando se utilicen detectores de conductibilidad   térmica , procederá utilizar factores de corrección   para convertir los porcentajes de las áreas   de los picos en porcentajes en masa de los constituyentes .    Determinar los factores de correción con la   ayuda de un cromatograma obtenido a partir de una   mezcla testigo de ésteres metílicos de composición   exactamente conocida en condiciones operativas idénticas   a las de la prueba .    Para dicha mezcla testigo :     % ( m/m ) del compuesto i = B i/SB i por 100    B i = masa del compuesto i en la mezcla testigo ,    SB i = suma de las masas de los distintos   constituyentes de la mezcla testigo .    El cromatograma obtenido a partir de la mezcla   testigo permite calcular :     % ( área/área ) del compuesto i = C i/SC i por 100    C i = área del pico correspondiente al   compuesto i ,    SC i = suma de las áreas de la totalidad de los picos .    de donde :    factor de corrección K i = B i por SC i/C i por SB i    Habitualmente , los factores de corrección se   reducen a K16 = 1 y de los factores relativos se   convierten en :    K i = K i/K16    Para la muestra , el contenido en cada constituyente   está dado por % ( m/m ) del compuesto i expresado   en ésteres metílicos     = ( K' i por A i ) / ( S(K' i por A i ) por 100    5.2.1.3 . Empleo de un patrón interno    En determinados casos ( en especial , dosificación   de los ácidos C4 y C6 y dosificación de los   ácidos en caso de que todos los ácidos grasos   no estén eluidos ) procederá utilizar un patrón   interno ( respectivamente C8 y C13 o C17 ) y , a   continuación , determinar el factor de corrección   del patrón interno .    porcentaje ( m/m ) del compuesto i expresado en   ésteres metílicos = ( m s por K' i por A i ) / ( m por   K' s por A s ) por 100    m s = masa del patrón interno en mg ,    m = masa de la muestra en mg ,    K s = factor de corrección del patrón interno ,    A s = área del pico correspondiente al patrón interno ,    A z = área del pico correspondiente al compuesto i .    5.2.2 . Expresión de los resultados    Dar el resultado con :    3 cifras significativas por encima del 10 % ,    2 cifras significativas entre el 1 y el 10 % ,    1 cifra significativa por debajo del 1 % ,    o sea en cada caso con una cifra después de la coma .    5.2.3 . Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos   determinaciones efectuadas el mismo día , con el   mismo aparato , por la misma persona y sobre los   mismos ésteres y para los constituyentes   presentes en más del 5 % no deberá exceder en   valor relativo del 3 % del valor determinado , con un   máximo absoluto del 1 % . Para los constituyentes   presentes en menos del 5 % , la repetibilidad se hace   rápidamente menos buena , en valor relativo ,   a medida que el contenido disminuye .    5.2.4 . Reproductibilidad    La diferencia entre los resultados obtenidos   en dos laboratorios diferentes para los constituyentes   presentes en más del 5 % no deberá exceder en   valor relativo del 10 % del valor determinado , con   un máximo absoluto del 3 % . Para los constituyentes   presentes en menos del 5 % , la reproductibilidad   se hace rápidamente menos buena , en valor relativo ,   a medida que disminuye el contenido .    6 . NOTAS    1 . Podrá emplearse un aparato de cromatografía   en fase gaseosa con un detector de conductibilidad térmica   ( catarómetro ) . Las condiciones descritas se   modificarán entonces de la siguiente manera :     - tubo : longitud 2 a 4 m - diámetro interior : 4 mm     - soporte : granulometría entre 160 y 200 mm     - índice de impregnación : del 15 al 20 %     - gas vector : helio , o en su defecto hidrógeno ,   con un contenido en oxígeno tan débil como sea posible     - ningún gas auxiliar     - temperatura del inyector : 40 a 60 ° C superior   a la de la columna     - temperatura de la columna : de 180 ° C a 200 ° C     - caudal del gas vector : generalmente comprendido   entre 60 y 80 ml/min     - cantidades inyectadas : generalmente entre 0,5 y 2 ml    Para el análisis cuantitativo , tomar en   consideración los factores de corrección definidos en   el punto 5.2.1.2 .    2 . Si estuvieran presentes constituyentes poliinsaturados   de más de 3 dobles enlaces , un tubo de acero inoxidable   podría provocar su descomposición .