CELEX: 31973L0046
Language: es
Date: 1972-12-05 00:00:00
Title: Cuarta Directiva 73/46/CEE de la Comisión, de 5 de diciembre de 1972, por la que se determinan métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales

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31973L0046

Cuarta Directiva 73/46/CEE de la Comisión, de 5 de diciembre de 1972, por la que se determinan métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales  

Diario Oficial n° L 083 de 30/03/1973 p. 0021 - 0034 Edición especial en finés : Capítulo 3 Tomo 5 p. 0115  Edición especial griega: Capítulo 03 Tomo 9 p. 0114  Edición especial sueca: Capítulo 3 Tomo 5 p. 0115  Edición especial en español: Capítulo 03 Tomo 6 p. 0230  Edición especial en portugués: Capítulo 03 Tomo 6 p. 0230 

 CUARTA DIRECTIVA DE LA COMISIÓN    de 5 de diciembre de 1972    por la que se determinan métodos de análisis   comunitarios para el control oficial de los alimentos   para animales     ( 73/46/CEE )    LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,    Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad   Económica Europea ,    Vista la Directiva del Consejo , de 20 de julio de 1970 ,   relativa a la introducción de métodos de toma de   muestras y de análisis comunitarios para el control   oficial de los alimentos para animales (1) , modificada   por la Directiva 72/275/CEE de 20 de julio de 1972 (2) , y ,   en particular , su artículo 2 ,    Considerando que la Directiva antes mencionada prevé que   los controles oficiales de los alimentos para animales   dirigidos a comprobar si se respetan las condiciones   establecidas en virtud de las disposiciones legales ,   reglamentarias o administrativas referentes a la calidad y   a la composición de los mencionados alimentos se   efectúen según los métodos de toma de muestras y de   análisis comunitarios ;    Considerando que las Directivas n º 71/250/CEE ,   n º 71/393/CEE y n º 72/199/CEE de la Comisión , de   15 de junio de 1971 (3) , 18 de noviembre de 1971 (4) y 27   de abril de 1972 (5) , respectivamente , han establecido   ya determinados métodos de análisis comunitarios ;   que , habida cuenta del grado de avance de los trabajos   efectuados desde entonces , es conveniente establecer una   cuarta serie de métodos ;    Considerando que las medidas previstas en la presente   Directiva se ajustan al dictamen del Comité permanente   de la alimentación animal ;    HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA :    Artículo 1    Los Estados miembros dispondrán que los análisis para   los controles oficiales de los alimentos para animales , en   lo que se refiere a los contenidos en humedad de las   grasas y aceites animales y vegetales , así como a los   contenidos en magnesio y en celulosa bruta de los   alimentos , se efectuarán según los métodos descritos   en el Anexo I de la presente Directiva .    Se aplicará a los métodos descritos en el Anexo I de   la presente Directiva las disposiciones generales que   figuran en la Parte 1 ( introducción ) del Anexo de la   primera Directiva n º 71/250/CEE de la Comisión , de   15 de junio de 1971 .    Artículo 2    Los Estados miembros dispondrán que los análisis para   los controles oficiales de los alimentos para animales , en   lo que se refiere a sus contenidos en retinol ( vitamina   A ) , vitamina ( aneurina , vitamina B1 ) , ácido   ascórbico y deshidroascórbico ( vitamina C ) , se   efectuarán según los métodos descritos en el Anexo II   de la presente Directiva .    Se aplicará a los métodos descritos en el Anexo II de   la presente Directiva las disposiciones generales que   figuran en la Parte 1 ( Introducción ) del Anexo de   la primera Directiva n º 71/250/CEE de la Comisión , de   15 de junio de 1971 , con excepción de la parte relativa a   la preparación de la muestra para análisis .    Artículo 3    Los Estados miembros aplicarán a más tardar el 1 de   enero de 1974 , las disposiciones legales , reglamentarias o   administrativas necesarias para cumplir las disposiciones   de la presente Directiva . Informarán de ello   inmediatamente a la Comisión .    Artículo 4    Los destinatarios de la presente Directiva serán los   Estados miembros ,    Hecho en Bruselas , el 5 de diciembre de 1972 .    Por la Comisión    El Presidente    S. L. MANSHOLT    (1) DO n º L 170 de 3 . 8 . 1970 , p. 2 .    (2) DO n º L 171 de 29 . 7 . 1972 , p. 39 .    (3) DO n º L 155 de 12 . 7 . 1971 , p. 13 .    (4) DO n º L 279 de 20 . 12 . 1971 , p. 7 .    (5) DO n º L 123 de 29 . 5 . 1972 , p. 6 .    ANEXO I    1 . DETERMINACIÓN DE LA HUMEDAD EN LAS GRASAS   Y ACEITES ANIMALES Y VEGETALES    1 . Objetivo y campo de aplicación    El método permite determinar el contenido en   humedad ( agua y otras materias volátiles ) de las   grasas y aceites animales y vegetales .    2 . Principio    La muestra se somete a desecación a 103 ° C   hasta que cese la disminución de la masa . La parte   de masa se determina pro pesada .    3 . Equipo    3.1 . Recipiente de fondo plano , de material   resistente a la corrosión , diámetro : 8 a 9 cm   altura : 3 cm aproximadamente    3.2 . Termómetro de mercurio , de bulba   reforzada , y cámara de dilatación en la   extremidad superior , graduado de 80 ° C   aproximadamente a 110 ° C al menos , longitud : 10 cm   aproximadamente    3.3 . Baño de arena o placa calorífera eléctrica    3.4 . Desecador , conteniendo un deshidratante eficaz    3.5 . Balanza analítica    4 . Método operatorio    Pesar , con precisión de 1 mg , 20 g aproximadamente   de la muestra homogeneizada en el recipiente ( 3.1 )   seco y tarado , conteniendo el termómetro ( 3.2 ) .   Calentar sobre el baño de arena o la placa   calorífera ( 3.3 ) , agitando constantemente con   la ayuda de un termómetro , de forma que la   temperatura alcance 90 ° C en 7 minutos aproximadamente .    Reducir la intensidad del calentamiento siguiendo la   frecuencia con la que ascienden las burbujas desde el   fondo del recipiente . La temperatura no debe exceder   de 105 ° C . Continuar agitando , rozando el   fondo del recipiente , hasta que cese la formación   de burbujas .    Para garantizar la completa eliminación de la   humedad , repetir varias veces el calentamiento a   103 ° C más o menos 2 ° C , refrigerando a   93 ° C entre los sucesivos calentamientos .   Dejar refrigerar a continuación en el desecador   ( 3.4 ) hasta la temperatura ambiente y pesar . Repetir   esta operación hasta que la pérdida de masa entre   dos pesadas sucesivas no exceda en más de 2 mg .    N.B. Un aumento de la masa de la muestra después   de un calentamiento repetido indica una oxidación   de la grasa . En este caso , calcular el resultado   a partir de la pesada efectuada inmediatamente antes   del comienzo del aumento de masa .    5 . Cálculo de los resultados    El contenido en porcentaje de la muestra viene   dado por la fórmula :     ( M1 - M2 ) · 100/M0    en la que :    M0 = masa , en gramos , de la toma de muestra ,    M1 = masa , en gramos , del recipiente con su   contenido , antes de calentamiento ,    M2 = masa , en gramos , del recipiente con su   contenido , después del calentamiento .    Los resultados inferiores a 0,05 % deben referirse   por la mención « menos del 0,05 % » .    Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos determinaciones   paralelas efectuadas sobre una misma muestra   no debe exceder del 0,05 % en valor absoluto .    2 . DETERMINACIÓN DEL MAGNESIO     - por espectrofotometría de absorción atómica -    1 . Objetivo y ámbito de aplicación    El método permite determinar el magnesio en la   alimentación animal . Está especialmente indicado para   determinar los contenidos en magnesio inferiores al 5 % .    2 . Principio    La muestra se incinera y se pone en solución en el   ácido clorhídrico diluido . Si no contiene   sustancias orgánicas , se pone directamente en   solución en el ácido clorhídrico . La solución es   diluida y el contenido en magnesio se determina por   espectrofotometría de absorción atómica a 285,2 nm ,   por comparación con las soluciones de calibrado .    3 . Reactivos    3.1 . Acido clorhídrico p.a. , d : 1,16    3.2 . Acido clorhídrico p.a. , d : 1,19    3.3 . Magnesio , en cinta o hilo , o sulfato de   magnesio MgSO4 . 7H2 O p.a. secado en vacío a la   temperatura ambiente .    3.4 . Solución de sal de estroncio ( cloruro   o nitrato ) al 2,5 por ciento ( p/v ) de estroncio   ( = 76,08 g de SrCl2 . 6 H2O p.a./1 o 60,38 g de   Sr (NO3)2 p. a./1 )    3.5 . Solución de calibrado de magnesio :   pesar , con precisión de 1 mg , 1 g de magnesio   ( 3.3 ) , separando previamente y con cuidado de su   película de óxido , o una cantidad correspondiente   de sulfato de magnesio ( 3.3 ) , introducirlo en un   matriz aforado de 1 000 ml , añadir 80 ml de   ácido clorhídrico ( 3.1 ) , dejar disolver   y completar a 1 000 ml con agua , 1 ml de dicha   solución contiene 1 000 mg de magnesio    4 . Equipo    4.1 . Crusoles de incineración de platino ,   cuarzo o porcelana    4.2 . Horno de barro eléctrico , con termostato    4.3 . Espectrofotómetro de absorción atómica    5 . Método operatorio    5.1 . Puesta en solución    5.1.1 . Alimentos constituidos exclusivamente por   sustancias minerales    Pesar con precisión de 1 mg , 5 g de la muestra   e introducirlos en un matraz aforado de 500 ml con   250 a 300 ml de agua . Añadir 40 ml de ácido   clorhídrico ( 3.1 ) , llevar a ebullición   y mantener el líquido en ebullición lenta durante   30 minutos . Dejar refrigerar , completar el volumen   mediante agua , homogeneizar y filtrar en un vaso seco   a través de un filtro de pliegue seco . Rechazar   los 30 primeros ml del filtrado .    En presencia de silicio , tratar 5 g de la   muestra mediante una cantidad suficiente ( 15 a   30 ml ) de ácido clorhídrico ( 3.2 ) y evaporar   en seco sobre un baño de agua . Continuar tal   como se indica en 5.1.2 , a partir de la tercera frase .    5.1.2 . Alimentos constituidos esencialmente por   sustancias minerales    Pesar , con precisión de 1 mg , 5 mg de la   muestra en un crisol de incineración e incinerar a   550 ° C en el horno de barro hasta la obtención   de cenizas exentas de partículas carbónicas .   Para eliminar el silicio , añadir a las cenizas una   cantidad suficiente ( 15 a 30 ml ) de ácido   clorhídrico ( 3.2 ) y evaporar en seco sobre un   baño de agua . Secar a continuación durante   una hora en la estufa a 105 ° C . Volver a   tomar el residuo mediante 10 ml de ácido   clorhídrico ( 3.1 ) y transferir con la ayuda de   agua caliente a un matraz aforado de 500 ml . Llevar   a ebullición , dejar refrigerar y completar el volumen   mediante agua . Homogeneizar y filtrar en un vaso   seco a través de un filtro de pliegues seco .   Rechazar los 30 primeros ml del filtrado .    5.1.3 . Alimentos formados esencialmente por sustancias   orgánicas    Pesar , con precisión de 1 mg , 5 g de la muestra   en un crisol de incineración e incinerar en un   horno de barro , hasta la obtención de cenizas   exentas de partículas carbonosas . Recoger las   cenizas mediante 5 ml de ácido clorhídrico   ( 3.2 ) , evaporar en seco sobre un baño de agua y   secar a continuación durante una hora en la   estufa a 105 ° C , para insolubilizar el silicio .   Recoger el residuo mediante 5 ml de ácido clorhídrico   ( 3.1 ) , transvasar con ayuda de agua caliente   en un matraz aforado de 250 ml , llevar a ebullición ,   dejar refrigerar y completar el volumen mediante   agua . Homogeneizar y filtar en un vaso seco a   través de un filtro de pliegues seco . Rechazar   los 30 primeros milímetros del filtrado .    5.2 . Medición de la absorción atómica    Preparar , diluyendo la solución de calibrado ( 3.5 )   mediante agua , al menos 5 soluciones de referencia de   concentraciones crecientes , escogidas en función   de la zona de medida óptima del espectrofotómetro .   Añadir a cada solución 10 ml de solución de sal   de estroncio ( 3.4 ) y completar a continuación al   volumen de 100 ml mediante agua .    Diluir mediante agua una parte alícuota   del filtrado obtenido en 5.1.1 , 5.1.2 o 5.1.3   de forma que se obtenga una concentración en   magnesio comprendida en los límites de concentración   de las soluciones de referencia . La concentración   en ácido clorhídrico de dicha solución no   debe exceder de 0,4 N . Añadir 10 ml de solución   de sal de estroncio ( 3.4 ) y completar a   continuación al volumen a 100 ml mediante agua .    Medir la absorción de la solución que haya   de determinarse y de las soluciones de referencia   mediante la longitud de onda de 285,2 nm .    6 . Cálculos de los resultados    Calcular la cantidad de magnesio de la muestra   a partir de las soluciones de referencia . Expresar   el resultado en porcentaje de la muestra .    Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos   determinaciones paralelas efectuadas sobre la   misma muestra no debe exceder del 5 por ciento en   valor relativo .    3 . DETERMINACIÓN DE LA CELULOSA BRUTA    1 . Objetivo y campo de aplicación    El método permite determinar , en la alimentación   animal , las materias orgánicas exentas de grasas   e insolubles en medio ácido y en medio alcalino ,   convencionalmente designadas bajo el nombre de   celulosa bruta .    2 . Principio    La muestra , en su caso desgrasada se trata   sucesivamente mediante soluciones en ebullición de   ácido sulfúrico y de hidróxido de potasio   de concentraciones determinadas . El residuo se separa   pro filtración sobre amianto , se lava , se seca ,   se pesa y se calcina a 900 ° C . La pérdida de peso   resultante de la calcinación corresponde a la celulosa   bruta de la toma de muestras .    3 . Reactivos    3.1 . Acido sulfúrico 0,26 N    3.2 . Amianto tratado : añadir a un amianto para   crisol de Gooch alrededor de cinco veces su peso de   ácido clorhídrico diluido ( 1 vol. de ácido   clorhídrico , de d : 1,19 + 3 vol. de agua ) . Hacer   hervir la mezcla durante 45 minutos aproximadamente ,   dejar refrigerar , filtrar sobre embudo Buechner .   Lavar el residuo primero con agua , hasta la   desaparición de ácido clorhídrico en las aguas   de lavado , y a continuación a la acetona ( 3.6 ) .   Secar el amianto en la estufa y calcinarla después   durante 2 h a 900 ° C . Dejar refrigerar y   conservar en un frasco tapado . El amianto tratado   de esta forma puede ser utilizado varias veces .   Debe responder a las disposiciones dadas en 5.1 a   propósito de la prueba en blanco .    3.3 . Emulsión de antiespuma ( silicona , por ej. )    3.4 . Solución de hidróxido de potasio 0,23 N    3.5 . Acido clorhídrico 0,5 N    3.6 . Acetona , pura    3.7 . Eter dietílico , puro    4 . Equipo    4.1 . Vasos de 600 ml al menos , marcados con   puntos de referencia al nivel de 200 ml    4.2 . Discos de porcelana , diámetro : 80 mm   aproximadamente , espesador : 4 mm aproximadamente ,   perforados por 32 agujeros de 4 mm aproximadamente   de diámetro    4.3 . Matraces de vacío de 2 l aproximadamente ,   de tapón de caucho , marcados con puntos de referencia   al nivel de los 800 ml y provistos de un embudo de   cristal de 120 mm de diámetro    4.4 . Placas filtrantes , diámetro 40 mm   aproximadamente , espesor : 4 mm aproximadamente ,   con el borde oblícuo adaptado al cono del embudo ( 4.3 )   perforados por alrededor de 16 agujeros de 4 mm   aproximadamente de diámetro y recubiertos por una   red metálica de mallas de 1 mm aproximadamente de   lado . Las placas y rejas metálicas deben ser   inalterables a los ácidos y a los alcalinos    4.5 . Crisoles de incineración de platino o de cuarzo    4.6 . Horno de barro eléctrico , con termostato    4.7 . Desecador    4.8 . Filtro de amianto : poner en suspensión 2 g de   amianto ( 3.2 ) en 100 ml de agua . Filtra en vacío   sobre una placa filtrante recubierta de una reja   metálica ( 4.4 ) y situada en el embudo de un matraz   de vacío ( 4.3 ) . Recoger el filtrado y filtrar de   nuevo sobre el mismo filtro . Eliminar el filtrado    5 . Método operatorio    Pesar 3 g de la muestra , con precisión de 1 mg ,   y 2 g de amianto tratado ( 3.2 ) en un vaso ( 4.1 ) ,   añadir 200 ml de ácido sulfúrico ( 3.1 ) y algunas   gotas de emulsión de anatiespuma ( 3.3 ) . Llevar   rápidamente a ebullición y dejar hervir durante   30 minutos exactamente . Para mantener el volumen   constante , cubrir el vaso con un dispositivo refrigerador ,   tal como un matraz de fondo redondo de 500 ml sometido   a una circulación de aire frío . Interrumpir la   ebullición añadiendo 50 ml aproximadamente de agua   fría y filtrar inmediatamente en vacío sobre un   filtro de amianto previamente preparado como se indica   en 4.8 .    Lavar el residuo mediante 5 porciones de 100 ml   aproximadamente de agua muy caliente para obtener un   volumen final de filtrado de 800 ml . Transferir   cuantitativamente el residuo en un vaso ( 4.1 )   previamente provisto de un disco de porcelana ( 4.2 )   para regularizar la ebullición . Añadir 200 ml de   solución de hidróxido de potasio ( 3.4 ) . Llevar   rápidamente a ebullición y dejar hervir durante   30 minutos exactamente . Añadir 50 ml aproximadamente   de agua fría y filtrar inmediatamente en vacío   sobre un nuevo filtro de amianto previamente preparado   como se indica en 4.8 . Lavar el residuo con ayuda de   agua muy caliente hasta neutralidad de las aguas de   lavado ( prueba con papel de tornasol ) , después   en tres ocasiones mediante la acetona ( 3.6 )   ( en total 100 ml aproximadamente de acetona ) .    Transferir cuantitativamente el residuo a un crisol   de incineración ( 4.5 ) , dilacerarlo , si fuera   necesario , y secar en la estufa a 130 ° C hasta   peso constante .    Dejar refrigerar en desecador y pesar rápidamente .   Introducir a continuación el crisol en el horno de   barro ( 4.6 ) y dejar calcinar durante 30 minutos a   900 ° C . Dejar refrigerar en desecador y pesar   rápidamente .    Efectuar una prueba en blanco aplicando el mismo   método operatorio al amianto tratado ( 3.2 ) , en   ausencia de la muestra . La pérdida de peso resultante   de la calcinación de los 6 g de amianto no debe ser   superior a 10 mg .    6 . Cálculo de los resultados    El contenido en celulosa bruta en porcentaje de   la muestra lo da la fórmula :     ( ( a - b ) · 100/3 )    en la que :    a = pérdida de peso en la calcinación , cuando   la determinación ,    b = pérdida de peso en la calcinación , cuando   la prueba en blanco .    Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos terminaciones   paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe   exceder de :    0,3 en valor absoluto , para los contenidos en   celulosa bruta inferiores al 10 % ;    3 % , en valor relativo , para los contenidos en   celulosa bruto iguales o superiores al 10 % .    7 . Observaciones    7.1 . Los alimentos que contengan más del 10 % de   materias grasas deben ser desgrasados previamente   la análisis mediante éter dietílico . Con tal fin ,   situar la toma de muestras ( 3 g pesados con precisión   de 1 mg ) sobre un filtro de amianto ( 4.8 ) . Cubrir   3 veces con aproximadamente 50 ml de éter dietílico   ( 3.7 ) y filtrar cada vez en vacío con precaución .   Transvasar cuantitativamente la toma de muestras   desgrasada y el amianto a un vaso ( 4.1 ) y continuar   el análisis como se indica en 5 .    7.2 . Los alimentos que contengan materias grasas   no directamente extraibles deben ser desgrasados ,   como se indica en 7.1 , y sometidos , además , a un   nuevo desgrasado tras el lavado del residuo del   ataque ácido .    Con tal fin , lavar el residuo de dicho ataque tres   veces con acetona ( 3.6 ) ( en total 100 ml , luego   3 veces 50 ml de éter dietílico ( 3.7 ) . Transvasar   a continuación cuantitativamente el residuo a un vaso   ( 4.1 ) y continuar el análisis como se indica en el   5 º apartado segundo ( tratamiento por la solución de   hidróxido de potasio ) .    7.3 . En el caso de alimentos ricos en calcio   ( más de 2 % de calcio ) , colocar la toma muestra   ( 3 g pesados con precisión de 1 mg ) en un vaso   ( 4.1 ) con 100 ml de ácido clorhídrico 0,5 N   ( 3.5 ) y dejar reposar en frío durante 5 minutos .   Filtrar inmediatamente y lavar con agua fría .   Utilizar como adyuvante de filtración los 2 g de amianto   previstos para la ebullición con el ácido sulfúrico .   Si la filtración se mostrara como difícil , diluir   la suspensión con acetona . Proceder seguidamente como   se indica en 5 .    ANEXO II    1 . DETERMINACIÓN DEL RETINOL ( VITAMINA A )    1 . Objetivo y campo de aplicación    El método permite determinar el retinol ( vitamina A )   en los alimentos , los concentrados y los premezclas .   El límite inferior de la determinación es de   10 000 UI/kg para los alimentos altamente pigmentados   y de 4 000 UI/kg para el resto de los productos (1) .   Los productos se clasificarán aquí en dos grupos ,   según su contenido supuesto en retinol :    Grupo A : contenido inferiores a 200 000 UI/kg ,    Grupo B : contenidos iguales o superiores a 200 000 UI/kg .    2 . Principio    La muestra se hidroliza en caliente mediante una   solución de hidróxido de potasio en medio etanólico   y en presencia de un antioxidante o en atmósfera de   nitrógeno . La mezcla se somete a la extracción por   1,2-dicloretano . El extracto se evapora en seco y se   recoge por el éter de petróleo . La solución se   cromatografía sobre columna de óxido de aluminio   ( para los productos del grupo B , la cromatografía   sólo se requiere en determinados casos ) . El retinol   se determina mediante espectrofotometría a 610 nm   tras el desarrollo de un complejo coloreado según la   reacción de Carr-Price , en el caso de los productos   del grupo A ; por espectrofotometría en l'UV a 325 nm   en el caso de los productos del grupo B .    3 . Reactivos    a ) empleados para el análisis de los productos   de los grupos A y B    3.1 . Etanol al 96 % ( v/v )    3.2 . Solución al 10 % ( p/v ) de ascorbato de   sodio p.a. , o    3.3 . Azote , purificado    3.4 . Solución al 50 % ( p/v ) de hidróxido   de potasio p.a.    3.5 . Solución de hidróxido de potasio 1 N    3.6 . Solución de hidróxido de potasio 0,5 N    3.7 . 1,2-dicloretano p.a.    3.8 . Eter de petróleo , puro , ebullición   30-50 ° C . Si fuera necesario , purificar como se   indica . Agitar 1 000 ml de éter de petróleo con   porciones de 20 ml ácido sulfúrico concentrado hasta   que el ácido se mantenga incoloro . Eliminar el ácido   y lavar el éter sucesivamente con 500 ml de agua ,   dos veces con 250 ml de una solución al 10 % de   hidróxido de sodio y tres veces 500 ml de agua .   Eliminar la capa acuosa , secar el éter durante 1 hora   sobre carbón activo y sulfato de sodio de aluminio ,   filtrar y destilar .    3.9 . Oxido de aluminio , estandarizado según   Brockmann : calcinar durante 8 h a 750 ° C ,   refrigerar en desecador y conservar en frasco de cristal   marrón , de tapón esmerilado . Antes del empleo en   cromatografía , humedecer como se indica : introducir   en un frasco de cristal marrón 10 g de óxido de   aluminio y 0,7 ml de agua , tapar herméticamente ,   volver a calentar durante 5 minutos en un baño de agua   hirviendo siempre con energía . Dejar refrigerar   agitándolo . Comprobar la actividad del óxido de   aluminio así preparado sometiendo al análisis   según 5.3 y 5.4 una cantidad conocida de retinol de   calibrado patrón muestra ( 3.17 )    3.10 . Oxido de aluminio básico , grado de actividad I    3.11 . Eter dietílico , puro . Eliminar los peróxidos   y los restos de agua mediante cromatografía sobre   columna de óxido de aluminio básico ( 3.10 )   ( 25 g de óxido de aluminio para 250 ml de éter   dietílico )    3.12 . Soluciones de éter de petróleo ( 3.8 ) al   4 , 8 , 12 , 16 y 20 % ( v/v ) de éter dietílico ( 3.11 )    3.13 . Solución de sulfuro de sodio 0,5 moles en   la glicerina al 70 % ( v/v ) preparada a partir del   sulfuro de sodio p.a.    b ) utilizados exclusivamente para el análisis   de los productos del grupo A    3.14 . Benceno p.a. , cristalizable    3.15 . Cloroformo p.a. Eliminar el etanol , el   fosgeno y los restos de agua mediante cromatografía   sobre columna de óxido de aluminio básico ( 3.10 )   ( 50 g de óxido de aluminio para 200 ml de cloroformo )   conviene cromatografiar una segunda vez los 50 primeros ml   del eluido )    3.16 . Reactivo según Carr-Price . Agitar 25 g   aproximadamente de tricloruro de antimonio p.a.   ( conservado en desecador ) con 100 ml de cloroformo   ( 3.15 ) hasta la saturación de la solución . Un   paso débil de tricloruro no estorba . Añadir 2 ml de   anhídrido acético p.a. Conservar en el frigorífico   en un frasco de cristal marrón con tapón esmerilado .   Período de conservación : varias semanas    3.17 . Retinol de muestra patrón , controlado por   espectrofotometría    c ) utilizados exclusivamente para el análisis   de los productos del grupo B    3.18 . Isopropanol , para cromatografía    4 . Equipo    4.1 . Baño de agua    4.2 . Aparato rotativo de evaporación en vacío ,   con matraces redondos de diferentes capacidades    4.3 . Tubos para cromatografía , de cristal   ( longitud : 300 mm , diámetro interior : 13 mm   aproximadamente )    4.4 . Espectrofotómetro con cubetas de 10 mm de   espesor ( de cuarzo para mediciones en l'UV )    4.5 . Lámpara UV , 365 nm    5 . Método operatorio    N.B. Las manipulaciones no deben hacerse bajo la luz   directa , si fuera necesario en un aparato de cristal   marrón    5.1 . Toma de muestras    Efectuar una toma de muestras de la muestra finamente   dividida , proporcional al contenido supuesto en   vitamina A , o sea :    0,1 a 1,0 g para las concentraciones ( contenidos   superiores a 20 000 UI/kg ) ,    3,0 a 5,0 g para las premezclas ( contenidos comprendidos   entre 400 y 20 000 UI/g ,    10 a 20 sg para las mezclas minerales ,    30 g para los productos del grupo A .    Introducir inmediatamente la toma de muestras en un   matraz de 500 ml de tapón esmerilado .    5.2 . Hidrólisis y extracción (2)    Añadir sucesivamente a la toma de muestras 40 ml   de etanol ( 3.1 . ) , 2 ml de solución de ascorbato   de sodio ( 3.2 ) (3) , 10 ml de solución de hidróxido   de potasio ( 3.4 . ) y 2 ml de solución de sulfuro de   sodio ( 3.13 ) .    Calentar durante 30 minutos a 70-80 ° C bajo   refrigerante de reflujo y dejar refrigerar a continuación   bajo corriente de agua . Añadir 50 ml de etanol   ( 3.1 ) y 100 ml ( tomados con la pipeta ) de   1,2-dicloretano ( 3.7 ) . Agitar enérgicamente y   de cantar el líquido sobrenadante en una ampolla de   decantación . Añadir en la ampolla 150 ml de   solución de hidróxido de potasio ( 3.5 ) , agitar   durante 10 segundos y dejar reposar hasta la separación   de las fases . Recoger la fase de dicloretánica   ( fase inferior ) en una ampolla de decantación ,   añadir 40 ml de solución de hidróxido de potasio   ( 3.6 ) , agitar durante 10 segundos y dejar reposar   hasta la separación de las fases . Recoger la fase   dicloretánica en una ampolla de decantación y   lavar 6 a 8 veces con ayuda de porciones de 40 ml de   agua , hasta la ausencia de álcali ( prueba de   fenoltaleina ) . Recoger la fase dicloretánica y   eliminar los últimos restos de agua con ayuda de bandas   de papel filtro .    Evaporar en seco una parte alícuota de la solución ,   en vacío y sobre baño de agua a la temperatura   de 40 ° C . Recoger rápidamente el residuo con   5 ml de éter de petróleo ( 3.8 ) .    Para los productos del grupo A , cromatografiar como   se indica en 5.3.1 .    Para los productos del grupo B , transvesar la   solución a un matraz aforado de 50 ml , completar al   volumen con éter de petróleo ( 3.8 ) homogeneizar   y medir la densidad óptica como se indica en 5.4.2 .    5.3 . Cromatografía    5.3.1 . Productos del grupo A    Llenar un tubo para cromatografía ( 4.3 . ) , hasta   una , altura de 200 mm , de óxido de aluminio ( 3.9 )   previamente impregnado de éter de petróleo ( 3.8 ) .   Introducir en el tubo la solución en 5.2 y añadir   inmediatamente 20 ml de éter de petróleo ( 3.8 ) .   Eluir sucesivamente por porciones de 10 ml de las   soluciones de éter de petróleo al 4 , 8 , 12 , 16 y   20 por ciento de éter dietílico ( 3.12 ) , en   vacio parcial o bajo presión , la velocidad de   salida habrá de ser de 2 a 3 gotas por segundo .    El caroteno se eluirá en primer lugar (4) . El   retinol se eluye generalmente por la solución de   éter de petróleo al 20 por ciento de éter   dietílico ( 3.12 ) . La elusión se controla bajo   luz UV ( breve irradiación de la columna por una   lámpara de mercurio ) . La banda fluorescente del   retinol se separa netamente de las bandas amarillas   de xantófila que la siguen . Recoger la fracción   del eluido que contiene el retinol en un erlenmeyer .    5.3.2 . Productos del grupo B    La cromatografía sólo debe efectuarse cuando   las mediciones de la densidad óptica obtenidas   en 5.4.2 no sean conformes con las disposiciones   indicadas en 5.4.2 .    Si se hiciese patente la cromatografía , introducir   en la columna cromatográfica una parte alícuota   de la solución en el éter de petróleo obtenido   en 5.2 , con un contenido de aproximadamente 500 UI de   retinol , y cromatografiar como se indica en 5.3.1 .    5.4 . Medición de la densidad óptica    5.4.1 . Productos del grupo A    Evaporar en seco , en vacío , el eluado que contiene   el retinol , obtenido en 5.3.1 . Recoger el residuo   con 2 ml de benceno ( 3.14 ) . Tomar 0,3 ml de dicha   solución y añadir 3 ml del reactivo según   Carr-Price ( 3.16 ) . Se desarrolla una coloración   azul . Medir la densidad óptica mediante el   espectrómetro a 610 nm , 30 segundos exactamente   después del principio de reacción . Determinar el   contenido en retinol , refiriéndose a una curva de   calibrado obtenida a partir de soluciones bencénicas   de concentraciones crecientes en retinol de patrón   tratados con el reactivo según Carr-Price [ de 2   a 16 UI de vitamina A de patrón ( 3.17 ) con 0,3 ml de   benceno ( 3.14 ) + 3 ml de reactivo según Carr-Price   ( 3.16 ) ] . La curva de calibrado debe controlarse   regularmente y durante breves intervalos de tiempo   con la ayuda de la muestra y de una solución recién   preparada del reactivo según Carr-Price .    5.4.2 . Productos del grupo B    Tomar la parte alícuota de la solución en el éter   de petróleo obtenido en 5.2 , con un contenido   aproximado de 200 UI de retinol . Evaporar en seco ,   en vacío , y recoger el residuo con 25 ml de   isopropanol ( 3.18 ) . Medir la densidad óptica   con el espectrofotómetro a 325 , 310 y 334 nm .   El máximo de absorción se sitúa a 325 nm . El   contenido en retino A de la solución se calcula   tal como sigue :    E325 . 18,30 = UI de retinol    Sin embargo , las relaciones de las densidades ópticas    E310 : E325 y E334 : E325    deben ser de 6 : 7 = 0,857 .    Cuando una de dichas relaciones se separe sensiblemente   de dicho valor ( < 0,830 u > 0,880 ) , la medición   de las densidades ópticas debe precederse por una   cromatografía , según el procedimiento indicado   en 5.3.2 . Si la medición de las densidades ópticas   efectuada tras la cromatografía indica que las   relaciones antes mencionadas se separan todavía   de forma sensible del valor 0,857 ( < 0,830 ó > 0,880 ) ,   la determinación debe efectuarse según el   procedimiento indicado para los productos del grupo A .    6 . Cálculo de los resultados    Calcular el contenido en retinol de la muestra   teniendo en cuenta el peso de la toma muestras y   de las diluciones efectuadas a lo largo del análisis .   Expresar el resultado en UI de retinol por kg .    Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos determinaciones   paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe   exceder :     - del 20 % , en valor relativo , para los contenidos   en retinol inferiores a 75 000 UI/kg ,     - de 15 000 UI para los contenidos comprendidos entre   75 000 y 150 000 UI/kg ,     - del 10 % , en valor relativo , para los contenidos   comprendidos entre 150 000 y 250 000 UI/kg ,     - de 25 000 UI para los contenidos comprendidos entre   250 000 y 500 000 UI/kg ,     - del 5 % , en valor relativo , para los contenidos   superiores a 500 000 UI/kg .    2 . DETERMINACIÓN DE LA TIAMINA ( ANEURINA ,   VITAMINA B1 )    1 . Objetivo y campo de aplicación    El método permite determinar la tiamina ( aneurina ,   vitamina B1 ) en los alimentos , los concentrados y   las premezclas . El límite interior de la determinación   es de 5 ppm .    2 . Principio    La muestra se trata en caliente con ácido sulfúrico   diluido e hidrolizado a continuación por vía   enzimática . La solución obtenida se somete a una   oxidación alcalina . El tiocromo formado se extrae por   el isobutanol y se determina por fluorimetría .    3 . Reactivos    3.1 . Solución de patrón de tiamina a 100 mg/ml :   disolver 112,3 mg de clorhidrato de tiacina muy puro ,   previamente desecado en vacío hasta llegar a peso   constante , en 1 000 ml de ácido sulfúrico 0,2 N   ( 3.2 ) . En frío y en la oscuridad , dicha solución   se mantiene estable durante un mes .    3.2 . Acido sulfúrico 0,2 N    3.3 . Metabisulfito de sodio , Na2S2O3 , puro    3.4 . Solución al 20 % ( p/v ) de ferricianuro de   potasio p.a.    3.5 . Solución al 25 por ciento ( p/v ) de hidróxido   de potasio p.a.    3.6 . Mezcla oxidante : mezclar 2 ml de solución   de ferricianuro de potasio ( 3.4 ) con 48 ml de solución   de hidróxido de potasio ( 3.5 ) . Dicha mezcla no se   conserva más de 4 horas    3.7 . Isobutanol , p.a.    3.8 . Solución de acetato de sodio 2,5 N    3.9 . Preparación multienzimática con contenido   en proteasa , fosfatasa y amilasa ( por ejemplo clorasa )    3.10 . Etanol de 96 % ( v/v )    4 . Equipo    4.1 . Baño de agua    4.2 . Centrifugadora ( 3 500 t/m ) con tubos de   30 a 50 ml , provistos de tapones esmerilados    4.3 . Fluorímetro    5 . Método operatorio    5.1 . Hidrólisis enzimática    Introducir en dos matraces aforados A y B de 250 ml unas   cantidades idénticas de la muestra finamente dividida ,   con un contenido de 100 mg aproximadamente de tiamina   y 125 ml de ácido sulfúrico ( 3.2 ) . Añadir   además , en el matraz A solamente , 1,0 ml de solución   de muestra ( 3.1 ) ( muestra interna ) .    Agitar vigorosamente , llevar a los matraces sobre   un baño de agua hirviendo y mantenerlos allí durante   15 minutos agitándolo de vez en cuando . Dejar   refrigerar hasta 45 ° C aproximadamente . Añadir en   cada matraz 20 ml de solución de acetato de sodio   ( 3.8 ) y 0,5 g de preparación multienzimática   ( 3.9 ) , dejar reposar a continuación durante 20 minutos   a la temperatura ambiente . Añadir 20 ml de solución   de acetato de sodio ( 3.8 ) , completar al volumen de   agua , homogeneizar y filtrar . Recoger los filtrados A   y B tras haber eliminado de ellos los 15 primeros ml .   Preparar las soluciones siguientes .    5.1.1 . Solución testigo T    Introducir en un tubo de centrifugar ( 4.2 ) , 5 ml   de filtrado A y 10 mg aproximadamente de metabisulfito   de sodio ( 3.3 ) . Sumergir el tubo durante 15 minutos   en un baño de agua hirviendo y dejar a continuación   refrigerar hasta la temperatura ambiente .    5.1.2 . Soluciones A ( patrón interno ) y B ( muestra )    Introducir 5 ml del filtrado A en un tubo de centrifugar   ( 4.2 ) y 5 ml de filtrado B en otro tubo de centrifugar   ( 4.2 ) .    5.2 . Oxidación    Añadir a las soluciones T , A y B 5 ml de la mezcla   oxidante ( 3.6 ) y , tras un minuto , 10 ml de isobutanol   ( 3.7 ) . Tapar los tubos y agitar vigorosamente durante   5 segundos . Dejar reposar durante un minuto y centrifugar   para separar las fases . Tomar en cada tubo 5 ml de la   fase isobutanólica sobrenadante , introducirlos   respectivamente en matraces aforados de 25 ml , completar   al volumen con etanol ( 3.10 ) y homogeneizar   ( = extractos T , A y B ) .    5.3 . Medición de la fluorescencia    Efectuar las mediciones a la longitud de onda para   lo cual da el fluorímetro una respuesta óptima a   la fluorescencia del tiocromo . Irradiar a 365 nm   aproximadamente .    Ajustar el instrumento a cero con ayuda del extracto T .   Medir la intensidad de la fluorescencia de los extractos A   y B .    6 . Cálculo de los resultados    El contenido en mg de tiamina por kg de muestra viene   dado por la fórmula :     ( d · b ) / ( a - b ) c    en la cual :    a = intensidad de la fluorescencia del extracto A   ( patrón interno )    b = intensidad de la fluorescencia del extracto B   ( muestra )   c = peso de la toma de muestrasen g    d = cantidad de tiamina en mg añadida a la toma   de muestras ( patrón interno ) .    Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos determinaciones   paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe   exceder :    del 10 % en valor relativo , para los contenidos   inferiores a 500 ppm y    5 % en valor relativo , para los contenidos iguales   o superiores a 500 ppm .    3 . DETERMINACIÓN DEL ÁCIDO ASCÓRBICO Y DEL   ÁCIDO DESHIDROASCÓRBICO ( VITAMINA C )    1 . Objetivo y campo de aplicación    El método permite determinar la suma de los ácidos   ascórbicos y deshidroascórbico ( vitamina C ) en   los alimentos , los concentrados y las premezclas .   El límite inferior de la determinación es de 5 ppm .   Los productos se clasificarán aquí en dos grupos ,   según su supuesto contenido en vitamina C :    Grupo A : contenidos inferiores a 10 g/kg    Grupo B : contenidos iguales o superiores a 10 g/kg .    2 . Principio    La muestra , puesta en suspensión en una solución   diluida de ácido metafosfórico , se somete a la   extracción mediante cloroformo . La fase acuosa se   trata mediante una solución de 2,6-diclorofenol-indofenol ,   para transformar el ácido ascórbico en ácido   deshidroascórbico , y a continuación mediante una   solución de 2,4-dinitrofenilhidracina . La hidrazona   formada se extrae mediante una mezcla de acetato de   etilo , de ácido acético glacial o de acetona .   La solución se cromatografía sobre una columna de   gel de silicio , el eludido se evapora en seco y el   residuo se disuelve en el ácido sulfúrico diluido .   La densidad óptica de la solución se mide mediante   el fotómetro de 509 nm .    Para productos del grupo A , el eluido , salido de   la cromatografía sobre columna , está sometido ,   además , a una cromatografía sobre capa delgada   para aislar la hidrazona .    3 . Reactivos    3.1 . Solución patrón al 0,05 por ciento de   ácido L-ascórbico : disolver 50 mg de ácido   L-ascórbico p.a. en 20 ml aproximadamente de solución   de ácido metafosfórico ( 3.2 ) y completar a 100 ml   con agua . Preparar inmediatamente antes de su empleo    3.2 . Solución al 10 % ( p/v ) de ácido   metafosfórico : disolver en el agua 200 g de ácido   metafosfórico p.a. , triturados en un mortero y completar   a 2 000 ml con agua . Conservar a 4 ° C . Renovar después   de una semana    3.3 . Cloroformo p.a.    3.4 . Solución al 0,5 % ( p/v ) de   2,6-diclorofenol-indofenol p.a. Preparar inmediatamente   antes de su empleo    3.5 . Auxiliar de filtración ( S. y S. n º 121   o equivalente )    3.6 . Solución ácida al 2 % ( p/v ) de   2,4-dinitrofenilhidracina : disolver 2 g de   2,4-dinitrofenilhidracina en 100 ml de ácido sulfúrico   diluido ( 25 ml de ácido sulfúrico p.a. , d :   1,84 , diluidos en 100 ml por el agua ) . En frío ,   dicha solución se conserva durante una semana    3.7 . Nitrógeno , o    3.8 . Anhídrido carbónico    3.9 . Mezcla de acetato de etilo p.a./ácido   acético glacial/acetona p.a. : 96/2/2 en vol    3.10 . Mezcla de diclorometano p.a./ácido acético   glacial : 97/3 en vol    3.11 . Gel de silicio , granulometría : 0,05 a 0,2 mm    3.12 . Gel de silicio H , según Stahl , para   cromatografía en capa delgada    3.13 . Acido sulfúrico diluido : introducir 105 ml   de agua en un matraz aforado de 200 ml , completar al   volumen mediante ácido sulfúrico p.a. , d : 1,84    3.14 . Disolvente de elución para cromatografía   en capa delgada : mezclar 75 ml de éter dietílico   p.a. , 25 ml de acetato de etilo pa y 4,0 ml de ácido   acético al 96 % ( p/v ) p.a . Renovar después de   2 o 3 cromatografías    4 . Equipo    4.1 . Baño de agua regulado a 20 ° C por el   ultratermostato    4.2 . Centrifugadora ( 3 500 t/m ) con tubos de   40 a 50 ml , provistos de tapones esmerilados .    4.3 . Aparato rotativo , de evaporación en vacío ,   con matraces de 250 ml    4.4 . Tubos para cromatografía , de cristal   ( magnitud : 100 mm , diámetro interior : 20 mm ) ,   con placa de vidrio poroso ( por ejemplo tubos de Allihn )    4.5 . Espectrofotometría o calorímetro de filtros ,   con cubetas de 10 mm de espesor    4.6 . Equipo para cromatografía en capa fina ,   con placas de gel de silicio ( 3.12 ) , espesor de   capa : 0,5 a 0,6 mm ( conviene emplear placas preparadas   para su utilización ) . Secar las placas durante 2,30 h   a 3 h en la estufa a 120-130 ° C . Dejar refrigerar   y conservar a continuación en desecador durante una   hora al menos antes del empleo    4.7 . Estufa , regulada a 120-130 ° C .    5 . Método operatorio    5.1 . Extracción    Introducir en dos matraces aforados , A y B , de   250 ml de tapón esmerilado , unas cantidades idénticas   de la muestra dividida finamente , con un contenido   de 200 mg aproximadamente de vitamina C . Añadir ,   en el matraz A sólo , 0,4 ml de solución patrón   ( 3.1 ) y homogeneizar sacudiendo ligeramente ( patrón   interno ) .    Añadir en cada matraz 30 ml de cloroformo ( 3.3 )   y 25 ml de solución de ácido metafosfórico ( 3.2 )   a 40 ° C . Agitar brevemente y dejar reposar a   continuación durante 10 o 15 minutos . Añadir 25 ml   de agua , tapar los matraces , agitar vigorosamente   durante 10 segundos y dejar reposar 10 a 15 minutos en   el baño de agua ( 4.1 ) . Centrifugar para separar   la fase acuosa de la fase clorofórmica . Proseguir   las operaciones simultáneamente sobre los extractos   acuosos A ( patrón interno ) y B , como se indica a   continuación .    5.2 . Oxidación    Tomar con la pipeta 40 ml de la solución acuosa   sobrenadante ( ligeramente turbia ) obtenida en 5.1 ,   introducirlos en un tubo de reacción de tapón   esmerilado , añadir 0,5 a 1 ml de solución de   2,6-diclorofenol-indofenol ( 3.4 ) y homogeneizar . Se   forma una coloración roja que debe persistir 15 minutos   al menos . Añadir a continuación 300 mg aproximadamente   de auxiliar de filtración ( 3.5 ) , agitar y filtrar   sobre un filtro de pliegues seco . El filtrado no   debe ser límpido necesariamente .    5.3 . Reacción con la 2,4-dinitrofenilhidracina   y extracción del hidrazono    Tomar con la pipeta 40 ml del filtrado obtenido en   5.2 , introducirlos en un tubo de centrifugar ( 4.2 ) ,   añadir 2 ml de solución de 2,4-dinitrofenilhidracina   ( 3.6 ) y homogeneizar . Hacer pasar rápidamente   una corriente de nitrógeno ( 3.7 ) o de ácido   carbónico ( 3.8 ) , tapar el tubo y sumergirlo durante   15 horas alrededor ( una noche ) en el baño de agua   ( 4.1 ) . Añadir a continuación 3 ml de agua ,   20 ml de la mezcla acetato de etilo/ácido acético   glacial/acetona ( 3.9 ) y 800 mg aproximadamente de   auxiliar de filtración ( 3.5 ) . Tapar el tubo ,   agitar vigorosamente durante 30 segundos y centrifugar .   Introducir 15 ml de la fase sobrenadante en un matraz   de evaporación y evaporar bajo presión reducida en   el evaporador rotativo ( 4.3 ) hasta obtención de   un residuo aceitoso . Disolver el residuo en 2 ml de   la mezcla acetato de etilo/ácido acético glacial/acetona   ( 3.9 ) volviendo a calentar a 30 ° C , dejar refrigerar ,   añadir 10 ml de la mezcla diclorometano/ácido acético   glacial ( 3.10 ) y homogeneizar .    5.4 . Cromatografía sobre columna    Llenar un tubo para cromatografía ( 4.4 ) hasta   una altura de 30 mm , de la mezcla diclorometano/ácido   acético glacial ( 3.10 ) . Poner en suspensión   ( agitando vigorosamente ) 5 g de gel de silicio ( 3.11 )   a 30 ml de la mezcla diclovometano/ácido acético   glacial ( 3.10 ) , verter la suspensión en el tubo .   Dejar que se deposite y agitarlo después bajo una   débil presión de nitrógeno ( 3.7 ) .    Transvasar al tubo la solución obtenida en 5.3 ,   lavar el matraz con una pequeña cantidad de la   mezcla diclorometano/ácido gloacial ( 3.10 ) y   transvasar al tubo , rellenar éste a continuación   con la mezcla ( 3.10 ) y proseguir el lavado de la columna   con la misma mezcla ( 3 a 4 porciones de 5 ml   aproximadamente ) hasta la obtención de un eluido   incoloro . Eliminar la fracción del eluido coloreado   en amarillo .    Eluir la zona rojiza en la cabeza de la columna mediante   la mezcla acetato de tilo/ácido acético glacial/acetona   ( 3.9 ) , recoger el eluido y evaporarlo en seco .    5.4.1 . Para los productos del grupo A ( contenidos   en vitamina C inferiores a 10 g/kg ) disolver el   residuo en 2,0 ml de la mezcla acetato de etilo/ácido   acético glacial/acetona ( 3.9 ) y proceder inmediatamente   a la cromatografía en capa fina como se indica en   el punto 5.5 .    5.4.2 . Para los productos del grupo B ( contenidos   en vitamina C iguales o superiores a 10 g/kg ) ,   recoger el residuo aceitoso con 4,0 ml de ácido   sulfúrico diluido ( 3.13 ) , agitar vigorosamente   para disolver completamente el residuo y proceder a   la medición de la densidad óptica indicada en 5.6 .    5.5 . Cromatografía en capa fina    Efectuar las operaciones indicadas a continuación   por duplicado . Dejar que se deposite en forma de marca   sobre la plaza de cromatografía en capa fina ( 4.6 )   0,5 ml de solución obtenida en 5.4.1 . Desarrollar   durante 20 minutos como mínimo en el ácido del   disolvente de elución ( 3.14 ) , en cubeta saturada ,   hasta la separación clara de la zona del hidrozono   de color rosa . Dejar secar al aire . Delimitar la   zona rosa , rasparla con una espátula y transvasar   cuantitativamente la masa pulverizada a un tubo para   cromatografía ( 4.4 ) .    Eluir sucesivamente una vez mediante 2 ml y dos veces   mediante 1,5 ml de la mezcla acetato de etilo/ácido   acético glacial/acetona ( 3.9 ) . Recoger el eluido en un   pequeño matraz ( la última fracción   debe ser incolora ) . Evaporar en seco ,   recoger el residuo aceitoso mediante   4,0 ml de ácido sulfúrico diluido ( 3.13 ) , agitar   vigorosamente para disolver completamente el residuo   y proceder a la medición de la densidad óptica .    5.6 . Medición de la densidad óptica    Medir la densidad óptica mediante el fotómetro   a 509 nm , 20 o 30 minutos después de haberse puesto   en solución el residuo en el ácido sulfúrico .   Efectuar las mediciones por comparación con el ácido   sulfúrico diluido ( 3.13 ) .    5.7 . Prueba en blanco    Efectuar una prueba en blanco aplicando el mismo   método operatorio no existiendo muestra .    6 . Cálculo de los resultados    El contenido en g de vitamina C por kg de muestra   está dado por la fórmula :     ( c - a ) · 2/ ( b - c ) · 10 d    en la que :    a = densidad óptica del blanco    b = densidad óptica de la solución del patrón   interno    c = densidad óptica de la solución de la muestra    d = peso en gramos de la toma de muestras    Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos determinaciones   paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe   exceder del 10 % en valor relativo , para los contenidos   en vitamina C inferiores a 10 g/kg y del 5 % en valor   relativo , para todos los contenidos iguales o superiores   a 10 g/kg .    (1) 1 UI = 0,3 mg de retinol .    (2) Para los alimentos de lantancia y los productos   que tienen tendencia a aglomerarse o a hincharse ,   duplicar la cantidad de reactivos indicados en 5.2   primer y segundo párrafo .    (3) La adición de ascorbato de sodio no es necesaria   cuando la hidrólisis se efectúe en atmósfera   de nitrógeno .    (4) El contenido de caroteno puede determinarse   por la medida de la densidad óptica a 450 nm ;   E 1 % /1 cm = 2 600 .