CELEX: 31976L0372
Language: el
Date: 1976-03-01 00:00:00
Title: Έβδομη οδηγία 76/372/ΕΟΚ της Επιτροπής της 1ης Μαρτίου 1976 περί καθορισμού των κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών

Avis juridique important

|

31976L0372

Έβδομη οδηγία 76/372/ΕΟΚ της Επιτροπής της 1ης Μαρτίου 1976 περί καθορισμού των κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών  

Επίσημη Εφημερίδα αριθ. L 102 της 15/04/1976 σ. 0008 - 0018 Φινλανδική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 3 τόμος 7 σ. 0048  Ελληνική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 03 τόμος 15 σ. 0031  Σουηδική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 3 τόμος 7 σ. 0048  Ισπανική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 03 τόμος 10 σ. 0044  Πορτογαλική ειδική έκδοση : Κεφάλαιο 03 τόμος 10 σ. 0044 

ΕΒΔΟΜΗ ΟΔΗΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ της 1ης Μαρτίου 1976 περί καθορισμού των κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφώνΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ Έχοντας υπόψη:  τη συνθήκη περί ιδρύσεως της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινότητος,  την οδηγία του Συμβουλίου της 20ης Ιουλίου 1970 περί εισαγωγής κοινοτικών τρόπων λήψεως δειγμάτων και μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών (1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία με την πράξη προσχωρήσεως (2), και ιδίως με το άρθρο 2,  Εκτιμώντας:  ότι η παραπάνω οδηγία προβλέπει ότι οι επίσημοι έλεγχοι των ζωοτροφών για τη διαπίστωση του γεγονότος αν τηρούνται οι όροι που καθορίζονται δυνάμει των νομοθετικών, κανονιστικών και διοικητικών διατάξεων, οι οποίες αφορούν την ποιότητα και τη σύνθεση  των ζωοοτροφών, πραγματοποιούνται σύμφωνα με τους κοινοτικούς τρόπους λήψεως δειγμάτων και τις κοινοτικές μεθόδους αναλύσεως- ότι οι οδηγίες 71/250/ΕΟΚ, 71/393/ΕΟΚ, 72/199/ΕΟΚ, 73/46/ΕΟΚ, 74/203/ΕΟΚ και 75/84/ΕΟΚ της Επιτροπής της 15ης Ιουνίου 1971 (3), 18ης Νοεμβρίου 1971 (4), 27ης Απριλίου 1972 (5), 5ηςΔεκεμβρίου 1972 (6), 25ης Μαρτίου 1974 (7) και 20ης Δεκεμβρίου 1974 (8)  έχουν ήδη καθορίσει έναν ορισμένο αριθμό κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως- ότι λαμβανομένου υπόψη του βαθμού προόδου των πραγματοποιηθεισών από τότε εργασιών πρέπει να θεσπισθεί μία εβδόμη σειρά μεθόδων- ότι τα προβλεπόμενα στην παρούσα οδηγία μέτρα είναι σύμφωνα με τη γνώμη της Μόνιμης Επιτροπής Ζωοτροφών,  ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΟΔΗΓΙΑ:   Άρθρο 1  Τα Κράτη Μέλη ορίζουν ότι οι αναλύσεις για τους επισήμους ελέγχους των ζωοτροφών, σε ό,τι αφορά την περιεκτικότητά τους σε αφλατοξίνη B 1, πραγματοποιούνται σύμφωνα με τις μεθόδους που περιγράφονται στο παράρτημα της παρούσας οδηγίας.  Οι γενικές διατάξεις που εμφαίνονται στο τμήμα 1 (εισαγωγή) του παραρτήματος της πρώτης οδηγίας 71/250/ΕΟΚ της Επιτροπής της 15ης Ιουνίου 1971, με εξαίρεση το τμήμα το οποίο αφορά την παρασκευή του δείγματος για ανάλυση, εφαρμόζονται στις μεθόδους που  περιγράφονται στο παράρτημα της παρούσας οδηγίας.   Άρθρο 2  Τα Κράτη Μέλη θέτουν σε ισχύ το αργότερο την 1η Οκτωβρίου 1976 τις νομοθετικές, κανονιστικές και διοικητικές διατάξεις που είναι αναγκαίες για να συμμορφωθούν με τις διατάξεις της παρούσας οδηγίας. Ενημερώνουν αμέσως περί αυτού την Επιτροπή.   Άρθρο 3  Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα Κράτη Μέλη.  Έγινε στις Βρυξέλλες, την 1η Μαρτίου 1976.  Για την Επιτροπή P. J. LARDINOIS Μέλος της Επιτροπής  (1) ΕΕ αριθ. Ν 170 της 3.8.1970, σ. 2.  (2) ΕΕ αριθ. Ν 73 της 27.3.1972, σ. 14.  (3) ΕΕ αριθ. Ν 155 της 12.7.1971, σ. 13.  (4) ΕΕ αριθ. Ν 279 της 20.12.1971, σ. 7.  (5) ΕΕ αριθ. Ν 123 της 29.5.1972, σ. 6.  (6) ΕΕ αριθ. Ν 83 της 30.3.1973, σ. 21.  (7) ΕΕ αριθ. Ν 108 της 22.4.1974, σ. 7.  (8) ΕΕ αριθ. Ν 32 της 5.2.1975, σ. 26.      ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ   ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΑΦΛΑΤΟΞΙΝΗΣ B1  Α. ΜΕΘΟΔΟΣ ΜΕ ΜΟΝΟΔΙΑΣΤΑΤΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΟΙΒΑΔΟΣ 1. Αντικείμενο και τομέας εφαρμογής Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της περιεκτικότητος σε αφλατοξίνη B1 των ακολούθων τροφών: πλακούντων αραχίδος, κοκκοκαρύου (Copra), λινού, σόγιας, σησάμου, φοινικοκαρύου (Babassu) και σπερμάτων αραβοσίτου, δημητριακών και προϊόντων αλεύρου πίσσου,  πούλπας και αλεύρου γεωμήλων. Το κατώτερο όριο της δόσεως είναι 0,01 mg/kg (10 p.p.b.) Εφ' όσον υπάρχουν παρεμβαλλόμενες ουσίες οι οποίες παρεμποδίζουν τον προσδιορισμό της περιεκτικότητος, πρέπει να αρχίσει εκ νέου η ανάλυση σύμφωνα με τη μέθοδο B (χρωματογραφία λεπτής στοιβάδος, δύο διαστάσεων).  2. Αρχή Το δείγμα εκχυλίζεται με χλωροφόρμιο. Το εκχύλισμα διηθείται, λαμβάνεται κατάλληλη ποσότητα από αυτό και καθαρίζεται με χρωματογραφία σε στήλη silica gel. Το προϊόν της εκλούσεως εξατμίζεται και το υπόλειμμα λαμβάνεται εκ νέου με έναν καθορισμένο όγκο  χλωροφορμίου ή μίγματος βενζολίου και ακετονιτριλίου. Κατάλληλη ποσότητα του διαλύματος αυτού υποβάλλεται σε χρωματογραφία λεπτής στοιβάδος. Η ποσότητα της αφλατοξίνης B1 προσδιορίζεται από την υπεριώδη ακτινοβολία του χρωματογραφήματος είτε οπτικά είτε  με φθοριοπυκνομετρία δια συγκρίσεως με γνωστές ποσότητες προτύπου αφλατοξίνης B1. Η ταυτότητα της αφλατοξίνης B1 που εξάγεται από την τροφή πρέπει να επιβεβαιούται διά των ενδεδειγμένων μεθόδων.  3. Αντιδραστήρια ΝΒ: Όλα τα αντιδραστήρια είναι ποιότητος "για ανάλυση" εφ' όσον δεν δίδεται καμία άλλη οδηγία.  3.1. Ακετόνη.  3.2. Χλωροφόρμιο, σταθεροποιηθέν με 0,5 μέχρι 1,0% αιθανόλη 96% (όγκος/όγκο).  3.3. η-Εξάνιο.  3.4. Μεθανόλη.  3.5. Άνυδρος διαιθυλικός αιθέρας, απηλλαγμένος υπεροξειδίων.  3.6. Μίγμα βενζολίου και ακετονιτριλίου: 98/2 (όγκος/όγκο).  3.7. Μίγμα χλωροφορμίου (3.2) και μεθανόλης (3.4): 97/3 (όγκος/όγκο).  3.8. Silica gel για χρωματογραφία σε στήλη κοκκομετρικής συνθέσεως: 0,05 μέχρι 0,20 mm.  3.9. Υδρόφιλος βάμβαξ που έχει απολιπανθεί προηγουμένως με χλωροφόρμιο ή υαλοβάμβαξ.  3.10. Θειικό νάτριο, άνυδρο, σε κόκκους 3.11. Αδρανές αέριο, για παράδειγμα άζωτο.  3.12. Υδροχλωρικό οξύ 1 N.  3.13. Θειικό οξύ 50% (όγκος/όγκο).  3.14. Γη διατόμων (hyflosupercel), εκπλυθείσα με οξύ.  3.15. Silica gel G-HR ή ισοδύναμο, για χρωματογραφία λεπτής στοιβάδος.  3.16. Πρότυπο διάλυμα (διάλυμα αναφοράς) 0,1 μg περίπου αφλατοξίνης B1 ανά χιλιοστόλιστρο σε χλωροφόρμιο (3.2) ή σε μίγμα βενζολίου/ακετονιτριλίου (3,6), παρασκευαζόμενο και ελεγχόμενο όπως ορίζεται στο σημείο 7.  3.17. Πρότυπο ποιοτικό διάλυμα 0,1 μg περίπου αφλατοξινών B1 και B2 ανά χιλιοστόλιτρο σε χλωροφόρμιο (3.2) ή σε μίγμα βενζολίου/ακετονιτριλίου (3.6). Οι πυκνότητες αυτές δίδονται ενδεικτικά. Πρέπει να ρυθμισθούν ώστε να ληφθεί η αυτή ένταση φθορισμού  για τις δύο αφλατοξίνες.  3.18. Διαλυτές αναπτύξεως:  3.18.1. Χλωροφόρμιο (3.2)/ακετόνη (3.1): 9/1 (όγκος/όγκο), δοχείο μετά μη κεκορεσμένης ατμοσφαίρας- 3.18.2. Διαιθυλικός αιθέρας (3.5)/μεθανόλη (3.4)/ύδωρ: 96/3/1 (όγκος/όγκο/όγκο), δοχείο μετά μη κεκορεσμένης ατμοσφαίρας- 3.18.3 Διαθυλικός αιθέρας (3.5)/μεθανόλη (3.4) /ύδωρ: 94/4,5/1,5 (όγκος/όγκο/όγκο), δοχείο μετά κεκορεσμένης ατομοσφαίρας- 3.18.4 Χλωροφόρμιο (3.2)/μεθανόλη (3.4): 94/6 (όγκος/όγκο), δοχείο με κεκορεσμένη ατμόσφαιρα- 3.18.5. Χλωροφόρμιο (3.2)/μεθανόλη (3.4): 97/3 (όγκος/όγκο), δοχείο με κεκορεσμένη ατμόσφαιρα.  4. Συσκευές 4.1. Συνθλίπτης   αναμίκτης.  4.2. Συσκευή αναδεύσεως ή μαγνητικός αναδευτήρας.  4.3. Πτυχωτός ηθμός Schleicher και Schuell αριθ. 588 ή παρόμοιος, διαμέτρου: 24 cm.  4.4. Υάλινοι σωλήνες χρωματογραφίας (εσωτερικής διαμέτρου: 22 mm μήκους:  300 mm), μετά κρουνού από πλαστική ύλη τεφλόν και δεξαμενή 250 ml.  4.5. Περιστροφική συσκευή εξατμίσεως σε κενό με σφαιρική φιάλη ζέσεως σφαιρικού πυθμένος 500 ml.  4.6. Κωνικές φιάλες των 500 ml με εσμυρισμένο πώμα.  4.7. Συσκευές για χρωματογραφία λεπτής στοιβάδος.  4.8. Υάλινες πλάκες για χρωματογραφία λεπτής στοιβάδος 200 x 200 mm, παρασκευαζόμενες ως ακολούθως (οι υποδεικνυόμενες ποσότητες αρκούν για την κάλυψη 5 πλακών): εισάγονται 30 g silica gel G-HR (3.15) σε μία κωνική φιάλη, προστίθενται 60 ml ύδατος, η  φιάλη πωματίζεται και αναταράσσεται επί ένα λεπτό. Το εναιώρημα κατανέμεται στις πλάκες έτσι ώστε να δημιουργηθεί μία ομοιόρμορφη στοιβάδα πάχους 0,25 mm. Αφήνεται να αποξηρανθεί στον αέρα και διατηρείται κατόπιν σε ξηραντήρα εφοδιασμένο με silica gel.  Κατά τη στιγμή της χρήσεως οι πλάκες αναζωογονούνται διά τοποθετήσεως επί 1 ώρα σε κλίβανο και σε θερμοκρασία 110 oC.  Οι πλάκες που είναι έτοιμες για χρήση είναι κατάλληλες εφ' όσον δίνουν αποτελέσματα παρόμοια με εκείνα των πλακών που έχουν παρασκευασθεί όπως αναφέρθηκε παραπάνω.  4.9. Λαμπτήρας υπεριώδης μακρών κυμάτων (360 nm). Η ένταση της ακτινοβολίας πρέπει να επιτρέπει να διακρίνεται ακόμη καθαρά μία κηλίδα 1,0 ng αφλατοξίνης B1 σε πλάκα χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδος από μία απόσταση 10 cm από τον λαμπτήρα.  4.10 Σωλήνες των 10 ml, βαθμολογημένοι, με πώμα από πολυαιθυλένιο.  4.11 Φασματοφωτόμετρο UV.  4.12. Φθοριοπυκνόμετρο (ενδεχομένως).  5. Τρόπος εργασίας 5.1. Παρασκευή του δείγματος (βλέπε παρατηρήσεις, τμήμα Γ, σημείο 1).  Το δείγμα κονιοποιείται κατά τρόπο ώστε να διέρχεται ολόκληρο από κόσκινο, με άνοιγμα οπών του δικτυωτού 1 mm (σύμφωνα με τη σύσταση ISO R 565).  5.2. Εκχύλιση 50,0 g δείγματος λεπτοαλεσθέντος και ομογενοποιηθέντος εισάγονται σε μία κωνική φιάλη των 500 ml (4.6.). Προστίθενται 25 g γης διατόμων (3.14), 25 ml ύδατος και 250 ml χλωροφορμίου (3.2). Η φιάλη πωματίζεται, αναδεύεται ή αναταράσσεται επί 30 λεπτά με  τη βοήθεια της συσκευής (4.2) και διηθείται σε πτυχωτό ηθμό (4.3). Τα πρώτα 10 ml του διηθήματος απορρίπτονται και συλλέγονται κατόπιν 50 ml.  5.3. Καθαρισμός σε στήλη Το κατώτερο άκρο ενός σωλήνα χρωματογραφίας (4.4) εφοδιάζεται με πώμα από βάμβακα ή υαλοβάμβακα (3.9), πληρούνται τα δύο τρίτα του σωλήνα με χλωροφόρμιο (3.2) και προστίθενται 5 g θειικού νατρίου (3.10).  Εξακριβώνεται ότι η επάνω επιφάνεια της στοιβάδος του θειικού νατρίου είναι επίπεδη και κατόπιν προστίθενται σε μικρές δόσεις 10 g silica gel (3.8). Ανακινείται με προσοχή μετά από κάθε προσθήκη για να αποβληθούν οι φυσαλίδες του αέρα. Αφήνεται να  κατακαθίσει επί 15 λεπτά και προστίθενται στη συνέχεια με προσοχή 15 g θειικού νατρίου (3.10). Αφήνεται να κατέλθει το υγρό στην άμεσο προσέγγιση της επάνω επιφανείας της στοιβάδος του θειικού νατρίου.  Αναμιγνύονται τα ληφθέντα, στο 5.2, 50 ml εκχυλίσματος με 100 ml n-εξανίου (3.3) και μεταγγίζεται ποσοτικώς το μίγμα στη στήλη. Αφήνεται να κατέλθει το υγρό μέχρι την επάνω επιφάνεια της στοιβάδας του θειικού νατρίου. Απορρίπτεται το υγρό που έχει  χυθεί. Προστίθενται στη συνέχεια 100 ml διαιθυλικού αιθέρα (3.5) και αφήνεται πάλι να κατέλθει το υγρό μέχρι την επάνω επιφάνεια της σοιβάδος του θειικού νατρίου. Κατά τη διάρκεια των εργασιών αυτών λαμβάνεται μέριμνα ώστε η ταχύτητα της ροής να είναι  από 8 μέχρι 12 ml ανά λεπτό και η στήλη να μην αποξηρανθεί. Απορρίπτονται τα υγρά που έχουν χυθεί. Εκλούεται στη συνέχεια με 150 ml μίγματος χλωροφορμίου/μεθανόλης (3.7) και λαμβάνεται το σύνολο του προϊόντος εκλούσεως.  Εξατμίζεται αυτό μέχρι ξηρού, περίπου σε ρεύμα αδρανούς αερίου (3.11) και σε θερμοκρασία που να μην υπερβαίνει τους 50o Κελσίου, με τη βοήθεια μιάς περιστροφικής συσκευής εξατμίσεως σε κενό (4.5). Το υπόλειμμα φέρεται ποσοτικώς με τη βοήθεια  χλωροφορμίου (3.2) ή μίγματος βενζολίου/ακετονιτριλίου (3.6) σε ένα σωλήνα των 10 ml (4.10). Συμπυκνώνεται το διάλυμα σε ρεύμα αδρανούς αερίου (3.11) και κατόπιν φέρεται ο όγκος στα 2 ml με τη βοήθεια χλωροφορμίου (3.2) ή μίγματος  βενζολίου/ακετονιτριλίου (3.6).  5.4. Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδος Εναποτίθενται ακριβώς σε μία πλάκα χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδος (4.8), σε απόσταση 2 cm από το κάτω άκρο και σε διαστήματα 2 cm οι παρακάτω αναφερόμενοι όγκοι του προτύπου διαλύματος και του εκχυλίσματος:  - 10, 15, 20, 30 και 40 μl προτύπου διαλύματος αφλατοξίνης B1 (3.16)- - 10 μl εκ του εκχυλίσματος που λαμβάνεται στο 5.3 και, τοποθετούμενα επάνω στα προηγούμενα στο ίδιο σημείο, 20 μl προτύπου διαλύματος (3.16)- - 10 και 20 μl εκ του εκυλίσματος που λαμβάνεται στο 5.3.  Αναπτύσσεται το χρωματογράφημα μακριά από το φως με τη βοήθεια ενός διαλύτου αναπτύξεως (3.18). Η επιλογή του διαλύτου πρέπει να γίνεται προηγουμένως με την εναπόθεση στην πλάκα 25 μl εκ του ποιοτικού προτύπου διαλύματος (3.17) και εξασφαλίζεται ότι  κατά την ανάπτυξη οι αφλατοξίνες B1 και B2 είναι εντελώς διαχωρισμένες.  Αφήνονται οι διαλύτες να εξατμισθούν μακριά από το φως και ακτινοβολούνται κατόπιν με υπεριώδες φως, αφού τοποθετηθεί η πλάκα σε απόσταση 10 cm από το λαμπτήρα (4.9). Οι κηλίδες της αφλατοξίνης B1 δίνουν γαλάζιο φθορισμό.  5.5. Ποσοτικοί προσδιορισμοί Οι ποσοτικοί προσδιορισμοί διενεργούνται είτε οπτικά είτε με φθοριοπυκνόμετρο όπως αναφέρεται παρακάτω.  5.5.1. Οπτικές μετρήσεις Προσδιορίζεται η ποσότητα της αφλατοξίνης B1 του εκχυλίσματος διά συγκρίσεως της εντάσεως του φθορισμού της κηλίδος με εκείνη των κηλίδων του προτύπου διαλύματος. Παρεμβάλλεται αν είναι αναγκαίο. Ο φθορισμός που δημιουργείται με την εναπόθεση του  εκχυλίσματος επάνω στο πρότυπο διάλυμα πρέπει να είναι περισσότερο ισχυρός από εκείνον των 10 μl εκχυλίσματος και δεν πρέπει να γίνεται αισθητή παρά μόνο μία κηλίδα. Αν η ένταση του φθορισμού που δημιουργείται από τα 10 μl εκχυλίσματος είναι ισχυρότερη  από εκείνη των 40 μl του προτύπου διαλύματος, το εκχύλισμα διαλύεται 10 ή 100 φορές με χλωροφόρμιο (32) ή με μίγμα βενζολίου/ακετονιτριλίου (3.6) πριν υποβληθεί σε νέα χρωματογραφία λεπτής στοιβάδος.  5.5.2. Μετρήσεις με φθοριοπυκνόμετρο Μετράται η ένταση του φθορισμού των κηλίδων της αφλατοξίνης B1 στο φθοριοπυκνόμετρο (4.12) χρησιμοποιουμένου ενός μήκους κύματος διεγέρσεως της τάξεως των 365 nm και ενός μήκους κύματος εκπομπής της τάξεως των 443 nm. Προσδιορίζονται οι ποσότητες της  αφλατοξίνης B1 των αποθεμάτων του εκχυλίσματος διά συγκρίσεως των εντάσεων του φθορισμού των κηλίδων του εκχυλίσματος και του προτύπου διαλύματος.  5.6. Επιβεβαίωση της ταυτότητος της αφλατοξίνης B1 Επιβεβαιούται η ταυτότητα της αφλατοξίνης B1 του εκχυλίσματος με τις παρακάτω μεθόδους.  5.6.1. Επεξεργασία με θειικό οξύ Ψεκάζεται θειικό οξύ (3.13) στο χρωματογράφημα που έχει ληφθεί στο 5.4. Ο φθορισμός των κηλίδων της αφλατοξίνης B1 πρέπει να μεταβάλλει χρώμα από το γαλάζιο μέχρι το κίτρινο με υπεριώδη ακτινοβολία.  5.6.2. Χρωματογραφία δύο διαστάσεων περιλαμβάνουσα το σχηματισμό αφλατοξίνης B1   ημιακετάλης (hemiacetal) (αφλατοξίνη Β2α) ΝΒ: Οι εργασίες οι οποίες περιγράφονται παρακάτω πρέπει να πραγματοποιούνται σύμφωνα με το σχήμα που παρουσιάζεται στην εικόνα 3.  5.6.2.1. Εναπόθεση των διαλυμάτων Χαράσσονται σε μιά πλάκα (4.8) δύο ευθείες παράλληλοι σε δύο γειτονικές πλευρές (σε απόσταση 6 cm από τις πλευρές αυτές) οι οποίες προορίζονται να οριοθετήσουν τη μετατόπιση των μετώπων των διαλυτών. Εναποτίθενται σε μια πλάκα με τη βοήθεια τριχοειδών  σιφωνίων ή μικροσυρίγγων τα διαλύματα που αναφέρονται παρακάτω:  - στο σημείο Α: όγκος καθαρισμένου εκχυλίσματος του δείγματος του παραχθέντος στο 5.3, που περιέχει περίπου 2,5 νανογραμμάρια αφλατοξίνης B1- - στα σημεία Β και Γ: 25 μl του προτύπου διαλύματος (3.16).  5.6.2.2. Ανάπτυξη Αναπτύσσεται το χρωματογράφημα προς την κατεύθυνση I με τη βοήθεια του διαλύτου αναπτύξεως (3.18.1) (στοιβάδα 1 cm μέσα σε δοχείο με μη κεκορεσμένη ατμόσφαιρα) μακριά από το φως μέχρις ότου το μέτωπο του διαλύτου έλθει σε επαφή με τη γραμμή  οριοθετήσεως.  Αποσύρεται η πλάκα από το δοχείο και αφήνεται να ξηρανθεί επί πέντε λεπτά μακριά από το φως και στη θερμοκρασία του περιβάλλοντος. Ψεκάζεται στη συνέχεια με υδροχλωρικό οξύ (3.12) σε μία λωρίδα ύψους 2,5 cm η οποία καλύπτει τα σημεία Α και Β  (παρουσιάζεται με τις γραμμωτές σκιές στην εικόνα 3) μέχρις ότου το χρώμα γίνει σκοτεινό, προστατευομένου του υπολοίπου της πλακός με ένα φύλλο από γυαλί. Αφήνεται να αντιδράσει για δέκα λεπτά στο σκοτάδι και ξηραίνεται σε ρεύμα αέρος στη θερμοκρασία  του περιβάλλοντος.  Αναπτύσσεται στη συνέχεια το χρωματογράφημα προς την κατεύθυνση II με τη βοήθεια του διαλύτου αναπτύξεως (3.18.1) (στοιβάδα 1 cm μέσα σε δοχείο με μη κεκορεσμένη ατμόσφαιρα) μακριά από το φως, μέχρις ότου το μέτωπο του διαλύτου προσεγγίσει τη γραμμή  οριοθετήσεως. Αφαιρείται η πλάκα από το δοχείο και αφήνεται να ξηρανθεί στη θερμοκρασία του περιβάλλοντος.  5.6.2.3. Ερμηνεία του χρωματογραφήματος Εξετάζεται το χρωματογράφημα σε υπεριώδες φως (4.9) και εξακριβώνονται οι παρατηρήσεις που αναφέρονται παρακάτω:  α) Εμφάνιση μιας φθοριζούσης γαλάζιας κηλίδος αφλατοξίνης B1 προερχομένης από το πρότυπο διάλυμα που έχει εναποτεθεί στο Γ (μετατόπιση προς την κατεύθυνση I).  β) Εμφάνιση μιας φθοριζούσης γαλάζιας κηλίδος αφλατοξίνης B1 (η οποία δεν αντέδρασε με το υδροχλωρικό οξύ) και μιας εντονοτέρας φθοριζούσης γαλάζιας κηλίδος αφλατοξίνης B1 ημιακετάλης (hemiacetal), προερχομένης από το πρότυπο διάλυμα που έχει εναποτεθεί  στο Β (μετατόπιση προς την κατεύθυνση II).  γ) Εμφάνιση κηλίδων παρομοίων προς εκείνες που αναφέρονται στην περίπτωση β) οι οποίες προέρχονται από το εκχύλισμα του δείγματος που έχει εναποτεθεί στο Α. Η θέση των κηλίδων αυτών ορίζεται από την απόσταση μετατοπίσεως της αφλατοξίνης B1 από το σημείο  Α προς την κατεύθυνση I (η ίδια απόσταση με εκείνη που έχει διανυθεί από το πρότυπο που έχει εναποτεθεί στο Γ) ακολουθούμενη από τις αποστάσεις μετατοπίσεως που έχουν διανυθεί στην κατεύθυνση ΙΙ από τη αφλατοξίνη B1 (η οποία δεν αντέδρασε με το  υδροχλωρικό οξύ) και από την αφλατοξίνη B1 ημιακετάλη (hemiacetal) (οι αυτές αποστάσεις μ' εκείνες που έχουν διανυθεί από το πρότυπο που έχει εναποτεθεί στο Β). Οι εντάσεις φθορισμού των κηλίδων της ημιακετάλης που προέρχονται από το εκχύλισμα και το  πρότυπο διάλυμα που έχει εναποτεθεί στο Β πρέπει να ανταποκρίνονται μεταξύ τους.  6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων 6.1. Από τις οπτικές μετρήσεις Η περιεκτικότητα σε μικρογραμμάρια της αφλατοξίνης B1 ανά χιλιόγραμμο δείγματος (ppb) δίδεται από τον τύπο:   στον οποίο:  Y και X είναι αντιστοίχως οι όγκοι σε μικρολίτρα του προτύπου διαλύματος αφλατοξίνης B1 (3.16) και του εκχυλίσματος το οποίο έχει μία παρομοία ένταση φθορισμού- S = συγκέντρωση σε μικρογραμμάρια αφλατοξίνης B1 ανά χιλιοστόλιτρο του προτύπου διαλύματος (3.16)- V = τελικός όγκος του εκχυλίσματος σε μικρολίτρα, υπολογιζομένων των ενδεχομένων διαλύσεων- W = βάρος σε γραμμάρια του ληφθέντος δείγματος που αντιστοιχεί στον όγκο του εκχυλίσματος ο οποίος υποβλήθηκε σε καθαρισμό σε στήλη.  6.2. Από τις μετρήσεις με φθοριοπυκνόμετρο Η περιεκτικότητα σε μικρογραμμάρια αφλατοξίνης B1 ανά χιλιόγραμμο δείγμαγος (ppb) δίδεται από τον τύπο:   στον οποίο:  Y = όγκος σε μικρολίτρα του εκχυλίσματος που έχει εναποτεθεί στην πλάκα (10 ή 20 μ1)- S = ποσότητα σε νανογραμμάρια αφλατοξίνης B1 του αποθέματος του εκχυλίσματος (υπολογιζομένου του όγκου Y), υπολογιζομένη από τους προσδιορισμούς- V = τελικός όγκος του εκχυλίσματος σε μικρολίτρα, λαμβανομένων υπόψη των ενδεχομένων διαλύσεων- W = βάρος σε γραμμάρια του ληφθέντος δείγματος που αντιστοιχεί στον όγκο του εκχυλίσματος ο οποίος υποβλήθηκε σε καθαρισμό σε στήλη.  7. Προετοιμασία και έλεγχος του διαλύματος (3.16) 7.1. Προσδιορισμός της συγκεντρώσεως της αφλατοξίνης B1 Παρασκευάζεται ένα πρότυπο διάλυμα αφλατοξίνης B1 σε χλωροφόρμιο (3.2) ή σε μίγμα βενζολίου/ακετονιτριλίου (3.6), του οποίου η συγκέντρωση είναι από 8 μέχρι 10 μικρογραμμάρια ανά χιλιοστόλιτρο. Ρυθμίζεται το φάσμα απορροφήσεως μεταξύ 330 και 370 nm με  τη βοήθεια του φασματοφωτομέτρου (4.11).  Αυξάνεται η οπτική πυκνότητα (Α) σε 363 nm στην περίπτωση του διαλύματος του χλωροφορμίου- σε 348 nm στην περίπτωση του διαλύματος σε μίγμα βενζολίου/ακετονιτριλίου.  Υπολογίζεται η συγκέντρωση σε μικρογραμμάρια αφλατοξίνης B1 ανά χιλιοστόλιτρο διαλύματος από τους παρακάτω τύπους:   για το διάλυμα χλωροφορμίου-  για το διάλυμα σε μίγμα βενζολίου/ακετονιτριλίου.  Διενεργούνται μακράν του φωτός οι απαραίτητες διαλύσεις για να ληφθεί το πρότυπο διάλυμα εργασίας, του οποίου η συγκέντρωση σε αφλατοξίνη B1 είναι περίπου 0,1 μικρογραμμάρια ανά χιλιοστόλιτρο. Διατηρούμενο το διάλυμα αυτό σε θερμοκρασία 4 oC παραμένει  σταθερό για δύο εβδομάδες.  7.2. Έλεγχος χρωματογραφικής καθαρότητος Εναποτίθενται σε μία πλάκα (4.8) 5 μl προτύπου διαλύματος 8 10 μg αφλατοξίνης B 1 ανά χιλιοστόλιτρο (βλέπε 7.1.). Αναπτύσσεται το χρωματογράφημα όπως αναφέρεται στο 5.4. Σε υπεριώδες φως ο φθορισμός δεν πρέπει να επιτρέπει να γίνεται αισθητή παρά μόνο  μία κηλίδα και κανένας φθορισμός δεν πρέπει να γίνεται αισθητός στη ζώνη του αρχικού αποθέματος.  8. Επαναληπτικότητα Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων των δύο παραλλήλων προσδιορισμών που πραγματοποιούνται στο ίδιο δείγμα από τον ίδιο εργαστηριακό υπάλληλο (υπεύθυνο για την ανάλυση) δεν πρέπει να υπερβαίνει:  - το 25% εκ του πλέον υψηλού αποτελέσματος για τις περιεκτικότητες σε αφλατοξίνη B1 από 10 μέχρι 20 μg/kg- - 5 μg σε απόλυτη τιμή, για περιεκτικότητες από 20 έως 50 μg/kg- - 10% εκ του πλέον υψηλού αποτελέσματος για τις περιεκτικότητες που είναι ανώτερες των 50 μg/kg.  9. Αναπαραγωγικότητα Βλέπε "Παρατηρήσεις", τμήμα Γ, σημείο 2.  Β. ΜΕΘΟΔΟΣ ΜΕ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΟΙΒΑΔΟΣ, ΔΥΟ ΔΙΑΣΤΑΣΕΩΝ 1. Αντικείμενο και τομέας εφαρμογής Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της περιεκτικότητος σε αφλατοξίνη B1 των ζωοτροφών οι οποίες δεν εμπίπτουν στον τομέα εφαρμογής της μεθόδου Α. Το κατώτερο όριο προσδιορισμού της δόσεως είναι 0,01 mg/kg (10 ppb). Η μέθοδος δεν εφαρμόζεται στις  ζωοτροφές οι οποίες περιέχουν πούλπα εσπεριδοειδών 2. Αρχή Το δείγμα εκχυλίζεται με χλωροφόρμιο. Το εκχύλισμα διηθείται, κατάλληλη ποσότητα λαμβάνεται και καθαρίζεται με χρωματογραφία σε στήλη silica gel. Το προϊόν της εκλούσεως εξατμίζεται και το υπόλειμμα λαμβάνεται πάλι με έναν καθορισμένο όγκο χλωροφορμίου  ή μίγματος βενζολίου και ακετονιτριλίου. Κατάλληλη ποσότητα αυτού του διαλύματος υποβάλλεται σε χρωματογραφία δύο διαστάσεων λεπτής στοιβάδος. Η ποσότητα της αφλατοξίνης B1 προσδιορίζεται με την υπεριώδη ακτινοβολία του χρωματογραφήματος είτε οπτικά  είτε με φθοριοπυκνομετρία, διά συγκρίσεως με γνωστές ποσότητες προτύπου αφλατοξίνης B1. Η ταυτότητα της αφλατοξίνης B1 που εξάγεται από την τροφή πρέπει να επιβεβαιώνεται με τις ενδεδειγμένες μεθόδους.  3. Αντιδραστήρια ΝΒ: Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι ποιότητος "για ανάλυση" εφ' όσον δεν δίδεται καμιά άλλη οδηγία.  3.1. Ακετόνη.  3.2. Χλωροφόρμιο σταθεροποιηθέν με 0,5 μέχρι 1,0% αιθανόλης 96% (όγκος/όγκο).  3.3. η-Εξάνιο.  3.4. Μεθανόλη.  3.5. Άνυδρος διαιθυλικός αιθέρας απηλλαγμένος υπεροξειδίων.  3.6. Μίγμα βενζολίου και ακετονιτριλίου- 98/2 (όγκος/όγκο).  3.7. Μίγμα χλωροφορμίου (3.2) και μεθανόλης (3.4): 97/3 (όγκος/όγκο).  3.8. Silica gel για χρωματογραφία σε στήλη, κοκκομετρικής συνθέσεως: 0,05 μέχρι 0,20 mm.  3.9. Υδρόφιλος βάμβαξ, ο οποίος έχει προηγουμένως εκχυλισθεί με χλωροφόρμιο, ή υαλοβάμβαξ.  3.10. Άνυδρο θειικό νάτριο σε κόκκους.  3.11. Αδρανές αέριο, για παράδειγμα άζωτο.  3.12 Υδροχλωρικό οξύ 1 Ν.  3.13. Γη διατόμων (hyflosupercel) εκπλυθείσα με οξύ.  3.14. Silica gel G-HR ή ισοδύναμο για χρωματογραφία λεπτής στοιβάδος.  3.15. Διαλύτες αναπτύξεως.  3.15.1. Διαιθυλικός αιθέρας (3.5)/μεθανόλη (3.4)/ύδωρ: 94/4,5/1,5 (όγκος/όγκο/όγκο), δοχείο μετά κεκορεσμένης ατμοσφαίρας.  3.15.2 Χλωροφόρμιο (3.2)/ακετόνη (3.1): 9/1 (όγκος/όγκο), δοχείο με μη κεκορεσμένη ατμόσφαιρα.  3.16 Πρότυπο διάλυμα (διάλυμα αναφοράς) περίπου 0,1 μικρογραμμαρίου αφλατοξίνης B1 ανά χιλιοστόλιτρο σε χλωροφόρμιο (3.2) ή μέσα σε μίγμα βενζολίου/ακετονιτριλίου (3.6), παρασκευασθέν και ελεχθέν κατά το σημείο 7 της μεθόδου Α.  4. Συσκευές Βλέπε σημείο 4 της μεθόδου Α.  5. Τρόπος εργασίας  "" ID="1">5.1 Παρασκευή του δείγματος> ID="2" ASSV="3" ACCV="3.1.2">Βλέπε σημεία 5.1, 5.2 και 5.3 της μεθόδου Α."> ID="1">5.2 Εκχύλιση"> ID="1">5.3 Καθαρισμός σε στήλη"> 5.4 Χρωματογραφία δύο διαστάσεων λεπτής στοιβάδος 5.4.1. Εφαρμογή των διαλυμάτων (ακολουθείται το σχήμα το οποίο παρουσιάζεται στην εικόνα 1) Χαράσσονται σε μια πλάκα (4.8.) δύο ευθείες παράλληλες σε δύο γειτονικές πλευρές (σε αποστάσεις αντιστοίχως 5 και 6 cm από τις πλευρές αυτών) οι οποίες προορίζονται να οριοθετήσουν τη μετατόπιση των μετώπων των διαλυτών. Εναποτίθενται στην πλάκα με τη  βοήθεια τριχοειδών σιφωνίων ή μικροσυρίγγων τα διαλύματα τα οποία αναφέρονται παρακάτω:  - στο σημείο Α, 20 μl εκ του καθαρισθέντος εκχυλίσματος του δείγματος, παραχθέντος στο 5.3- - στο σημείο Β, 20 μl εκ του προτύπου διαλύματος (3.16)- - στο σημείο Γ, 10 μl εκ του προτύπου διαλύματος (3.16)- - στο σημείο Δ, 20 μl εκ του προτύπου διαλύματος (3.16)- - στο σημείο Ε, 40 μl εκ του προτύπου διαλύματος (3.16).  Ξηραίνεται με τη βοήθεια ελαφρού ρεύματος αέρος ή αδρανούς αερίου (3.11). Οι παραγόμενες κηλίδες πρέπει να έχουν διάμετρο 5 mm περίπου.  5.4.2. Ανάπτυξη (ακολουθείται το σχήμα το οποίο παρουσιάζεται στην εικόνα 1) Αναπτύσσεται το χρωματογράφημα προς την κατεύθυνση I με τη βοήθεια του διαλύτου αναπτύξεως (3.15.1) (στοιβάς 1 cm μέσα σε δοχείο με κεκορεσμένη ατμόσφαιρα) μακριά του φωτός, μέχρις ότου το μέτωπο του διαλύτου έλθει σε επαφή με τη γραμμή οριοθετήσεως.  Αφαιρείται η πλάκα από το δοχείο και αφήνεται να ξηρανθεί για δεκαπέντε λεπτά τουλάχιστο μακριά του φωτός και στη θερμοκρασία του περιβάλλοντος.  Αναπτύσσεται στη συνέχεια το χρωματογράφημα στην κατεύθυνση II με τη βοήθεια του διαλύτου αναπτύξεως (3.15.2) (στοιβάς 1 cm μέσα σε δοχείο με μη κεκορεσμένη ατμόσφαιρα) μακριά του φωτός, μέχρις ότου το μέτωπο του διαλύτου έλθει σε επαφή με τη γραμμή  οριοθετήσεως. Αποσύρεται η πλάκα από το δοχείο και αφήνεται να ξηρανθεί μακριά του φωτός και στη θερμοκρασία του περιβάλλοντος.  5.4.3. Ερμηνεία του χρωματογραφήματος (ακολουθείται το σχήμα το οποίο παρουσιάζεται στην εικόνα 2) Ακτινοβολείται το χρωματογράφημα με υπεριώδες φως τοποθετώντας την πλάκα σε απόσταση 10 cm από τον λαμπτήρα (4.9). Εντοπίζεται η θέση των κηλίδων του γαλάζιου φθορισμού Β, Γ, Δ και Ε της αφλατοξίνης B1 που προέρχονται από το πρότυπο διάλυμα και  χαράσσονται δύο υποθετικές ευθείες οι οποίες διέρχονται από αυτές τις κηλίδες και είναι κάθετες προς τις κατευθύνσεις εμφανίσεως. Το σημείο τομής P των ευθειών αυτών είναι η θέση στην οποία θα έπρεπε να βρίσκεται η κηλίδα της αφλατοξίνης B1 η οποία  προέρχεται από το εκχύλισμα του δείγματος που τοποθετείται στο Α (εικόνα 1). Εν τούτοις, η πραγματική θέση αυτής της κηλίδος μπορεί να ευρεθεί σε ένα σημείο Q, ευρισκόμενο στην τομή των δύο υποθετικών ευθειών οι οποίες σχηματίζουν μεταξύ τους μία γωνία  100 μοιρών περίπου και οι οποίες διέρχονται αντιστοίχως από τις κηλίδες Β και Γ. Καθορίζεται, όπως αναφέρεται στο 5.5, η ποσότητα αφλατοξίνης B1 του εκχυλίσματος του δείγματος.  5.4.4. Συμπληρωματική χρωματογραφία Χαράσσονται σε μία πλάκα (4.8) δύο παράλληλες ευθείες σε δύο γειτονικές πλευρές, όπως φαίνεται στο σχήμα της εικόνας 1 και εναποτίθενται στο σημείο Α (βλέπε εικόνα 1) 20 μl καθαρισθέντος εκχυλίσματος δείγματος παραγομένου στο 5.3 και πάνω από αυτά 20 μl  προτύπου διαλύματος (3.16). Αναπτύσσεται όπως αναφέρεται στο 5.4.2. Ακτινοβολείται το χρωματογράφημα με υπεριώδες φως (4.9) και εξακριβώνεται ότι:  - οι κηλίδες της αφλατοξίνης B1 του εκχυλίσματος και του προτύπου διαλύματος υπερκάθηνται η μια της άλλης,  - ο φθορισμός αυτής της κηλίδος είναι πλέον έντονος από εκείνον της κηλίδος της αφλατοξίνης B1 που αναπτύσσεται στο σημείο Q της πρώτης πλάκας.  5.5. Ποσοτικοί προσδιορισμοί Διενεργούνται οι προσδιορισμοί είτε οπτικά είτε με φθοριοπυκνομετρία όπως φαίνεται παρακάτω.  5.5.1. Οπτικές μετρήσεις Προσδιορίζεται η ποσότητα της αφλατοξίνης B1 του εκχυλίσματος διά συγκρίσεως της εντάσεως του φθορισμού της κηλίδος του εκχυλίσματος με εκείνην των κηλίδων Γ, Δ και Ε του προτύπου διαλύματος. Παρεμβάλλεται αν είναι αναγκαίο. Αν η ένταση του φθορισμού  που προκαλείται από τα 20 μl του εκχυλίσματος είναι περισσότερο έντονη από εκείνη των 40 μl του προτύπου διαλύματος, διαλύεται το εκχύλισμα 10 ή 100 φορές σε χλωροφόρμιο (3.2.) ή σε μίγμα βενζολίου/ακετονιτριλίου (3.6) πριν υποβληθεί σε μία νέα  χρωματογραφία λεπτής στοιβάδος.  5.5.2. Μετρήσεις με φθοριοπυκνομετρία Μετράται η ένταση του φθορισμού των κηλίδων της αφλατοξίνης B1 με το φθοριοπυκνόμετρο (4.12) χρησιμοποιουμένου ενός μήκους κύματος διεγέρσεως της τάξεως των 365 nm και ενός μήκους κύματος εκπομπής της τάξεως των 443 nm.  Προσδιορίζεται η ποσότητα της αφλατοξίνης B1 του αποθέματος του εκχυλίσματος διά συγκρίσεως της εντάσεως του φθορισμού της κηλίδος του εκχυλίσματος με εκείνη των κηλίδων Γ, Δ και Ε του προτύπου διαλύματος.  5.6. Επιβεβαίωση της ταυτότητος της αφλατοξίνης B1 Βλέπε σημείο 5.6 της μεθόδου Α.  6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων Βλέπε σημείο 6 της μεθόδου Α.  7. Επαναληπτικότητα Βλέπε σημείο 8 της μεθόδου Α.  8. Αναπαραγωγικότητα Βλέπε "Παρατηρήσεις", τμήμα Γ, σημείο 2.  Γ. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ ΠΟΥ ΑΦΟΡΟΥΝ ΤΙΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ Α ΚΑΙ Β 1. Απομάκρυνση λιπών Τα δείγματα τα οποία περιέχουν περισσότερο από 5 τοις εκατό λιπαρές ουσίες πρέπει να απολιπαίνονται με πετρελαϊκό αιθέρα (eb. 40 60o Κελσίου) μετά την παρασκευή που εμφαίνεται στο 5.1.  Στις περιπτώσεις αυτές τα αποτελέσματα της αναλύσεως πρέπει να ανάγονται στο βάρος του μη απολιπανθέντος δείγματος.  2. Αναπαραγωγικότητα των αποτελεσμάτων Η αναπαραγωγικότητα των αποτελεσμάτων, δηλαδή η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων που έχουν ληφθεί σε δύο ή περισσότερα εργαστήρια για το ίδιο δείγμα έχει εκτιμηθεί σε:  +- 50 τοις εκατό της μέσης τιμής των αποτελεσμάτων για μέσες τιμές σε αφλατοξίνη B1 από 10 μέχρι 20 μg/kg- +- 10 μg/kg από τη μέση τιμή για μέσες τιμές από 20 μέχρι 50 μg/kg- +- 20 τοις εκατό της μέσης τιμής για μέσες τιμές που είναι ανώτερες των 50 μg/kg.   Προσάρτημα στο παράρτημα