CELEX: 32009D0976
Language: ro
Date: 2009-12-15 00:00:00
Title: Decizia Comisiei din 15 decembrie 2009 de modificare a anexei D la Directiva 64/432/CEE a Consiliului în ceea ce privește testele de diagnostic pentru leucoza enzootică bovină [notificată cu numărul C(2009) 9951] (Text cu relevanță pentru SEE)

18.12.2009   
            
            
               RO
            
            
               Jurnalul Oficial al Uniunii Europene
            
            
               L 336/36
            
         
      DECIZIA COMISIEI
   
   din 15 decembrie 2009
   de modificare a anexei D la Directiva 64/432/CEE a Consiliului în ceea ce privește testele de diagnostic pentru leucoza enzootică bovină
   [notificată cu numărul C(2009) 9951]
   (Text cu relevanță pentru SEE)
   (2009/976/UE)
   COMISIA EUROPEANĂ,
   având în vedere Tratatul privind funcționarea Uniunii Europene,
   având în vedere Directiva 64/432/CEE a Consiliului din 26 iunie 1964 privind problemele de inspecție veterinară care afectează schimburile intracomunitare cu bovine și porcine (1), în special articolul 16 alineatul (2),
   întrucât:
   
               (1)
            
            
               Directiva 64/432/CEE se aplică comerțului interior din Uniunea Europeană cu bovine, iar capitolul II al anexei D la respectiva directivă stabilește teste de diagnostic pentru leucoza enzootică bovină (LEB) care trebuie utilizate pentru combaterea și eradicarea bolii, pentru supraveghere și monitorizare, precum și pentru stabilirea și menținerea unui statut al șeptelului ca fiind oficial indemn de leucoza enzootică bovină și a certificării necesare comerțului interior din Uniunea Europeană cu bovine.
            
         
               (2)
            
            
               Capitolul II din anexa D la Directiva 64/432/CEE prevede ca testele pentru LEB să fie efectuate fie cu ajutorul testului de imunodifuzie în gel de agar (AGID = agar gel immune-diffusion test) prin utilizarea unui antigen standardizat în raport cu serul standard oficial al CE (ser EI), fie printr-un test de imunoabsorbție legat cu enzimă (ELISA) standardizat în raport cu serul E4. Ambele seruri standard sunt furnizate de National Veterinary Institute, Technical University of Denmark (Institutul Național Veterinar, Universitatea Tehnică din Danemarca).
            
         
               (3)
            
            
               Un nou ser LEB standard (serul E05) a fost conceput recent de către laboratorul de referință al Organizației Mondiale pentru Sănătatea Animală (OIE) pentru leucoza enzootică bovină, în Germania (Friedrich-Loeffler-Institute), în colaborare cu laboratoarele de referință al OIE din Regatul Unit (Veterinary Laboratories Agency) și Polonia (National Veterinary Research Institute), după ce a fost supus unei testări interlaboratoare. Serul E05 a fost validat în raport cu serurile EI și E4 cu ajutorul diferitelor teste AGID și ELISA și, prin urmare, a fost inclus ca ser standard OIE acreditat în capitolul 2.4.11 secțiunea B punctul 2 din Manualul OIE de teste de diagnostic și vaccinuri pentru animale terestre, ediția a șasea, 2008. Acest ser este disponibil la laboratorul de referință al OIE pentru leucoza enzootică bovină, din Germania.
            
         
               (4)
            
            
               În plus, Institutul Național Veterinar din cadrul Universității Tehnice din Danemarca a informat Comisia că nu mai este în măsură să-și îndeplinească obligațiile privind furnizarea serului standard prevăzut, la momentul actual, în capitolul II din anexa D la Directiva 64/432/CEE.
            
         
               (5)
            
            
               Autoritățile competente germane și Friedrich-Loeffler-Institute au acceptat să furnizeze serul E05 care devine, în consecință, noul ser standard oficial al Uniunii Europene pentru leucoza enzootică bovină.
            
         
               (6)
            
            
               Prin urmare, Directiva 64/432/CEE ar trebui modificată în consecință.
            
         
               (7)
            
            
               Măsurile prevăzute în prezenta decizie sunt conforme cu avizul Comitetului permanent pentru lanțul alimentar și sănătatea animală,
            
         ADOPTĂ PREZENTA DECIZIE:
   Articolul 1
   Capitolul II al anexei D la Directiva 64/432/CEE se înlocuiește cu textul din anexa la prezenta decizie.
   Articolul 2
   Prezenta decizie se adresează statelor membre.
   
      Adoptată la Bruxelles, 15 decembrie 2009.
      
         
            Pentru Comisie
         
         Androulla VASSILIOU
         
         
            Membru al Comisiei
         
      
   
   
      (1)  JO 121, 29.7.1964, p. 1977/64.
   
      ANEXĂ
      Capitolul II al anexei D la Directiva 64/432/CEE se înlocuiește cu următorul text:
      
         „CAPITOLUL II
         
            TESTE PENTRU LEUCOZA ENZOOTICĂ BOVINĂ
         
         Testele pentru leucoza enzootică bovină se efectuează cu ajutorul testului de imunodifuzie în gel de agar (AGID) în condițiile descrise la secțiunile A și B sau printr-un test de imunoabsorbție legat cu enzimă (ELISA) în condițiile descrise la secțiunea C. Testul de imunodifuzie în gel de agar este rezervat testării probelor individuale de ser. În cazul în care rezultatele testelor fac obiectul unei contestații întemeiate, se efectuează un control complementar cu ajutorul unui test de imunodifuzie în gel de agar.
         Testele AGID și ELISA se standardizează în raport cu serul E05, serul standard oficial al UE, care va fi furnizat de:
         
                     Friedrich-Loeffler-Institut
                  
               
                     Federal Research Institute for Animal Health
                  
               
                     Laborator de referință al OIE pentru leucoza enzootică bovină (LEB)
                  
               
                     Südufer 10
                  
               
                     17493 Greifswald — Insel Riems
                  
               
                     Germania.
                  
               A.   Testul de imunodifuzie în gel de agar pentru leucoza enzootică bovină
         
         
                     1.
                  
                  
                     Antigenul care se utilizează în acest test conține glicoproteina virusului leucozei bovine. Antigenul este standardizat în raport cu serul E05.
                  
               
                     2.
                  
                  
                     Institutele de stat, laboratoarele naționale de referință sau institutele oficiale desemnate în conformitate cu articolul 6a pentru coordonarea standardelor și metodelor de diagnosticare în ceea ce privește testele de depistare a leucozei enzootice bovine sunt responsabile de calibrarea antigenului standard de lucru al laboratorului în raport cu serul E05.
                  
               
                     3.
                  
                  
                     Antigenii standard utilizați în laborator trebuie se trimit cel puțin o dată pe an institutelor de stat, laboratoarelor naționale de referință sau institutelor oficiale desemnate în conformitate cu articolul 6a, pentru testarea comparativă cu serul E05. În afara unei astfel de standardizări, antigenul utilizat poate fi calibrat în conformitate cu metoda descrisă în secțiunea B.
                  
               
                     4.
                  
                  
                     Testul folosește următorii reactivi:
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 antigen: antigenul conține glicoproteina specifică virusului leucozei enzootice bovine care a fost standardizat în raport cu serul E05;
                              
                           
                                 (b)
                              
                              
                                 serul de testat;
                              
                           
                                 (c)
                              
                              
                                 ser de control pozitiv cunoscut;
                              
                           
                                 (d)
                              
                              
                                 gel de agar:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             0,8 % agar;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             8,5 % NaCl;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tampon Tris 0,05 M, pH 7,2;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             15 ml din acest gel de agar se introduc într-o placă Petri cu diametrul de 85 mm, ceea ce determină o adâncime de 2,6 mm de agar.
                                          
                                       
                           
               
                     5.
                  
                  
                     Se realizează o configurație de testare din șapte godeuri uscate prin perforarea agarului până la fundul plăcii; această configurație constă într-un godeu central în jurul căruia se ordonează 6 godeuri dispuse în cerc.
                     Diametrul godeului central: 4 mm.
                     Diametrul godeurilor periferice: 6 mm.
                     Distanța între godeul central și cele periferice: 3 mm.
                  
               
                     6.
                  
                  
                     Godeul central se umple cu antigenul standard. Godeurile periferice 1 și 4 descrise la punctul 3 secțiunea B sunt umplute cu serul pozitiv cunoscut; godeurile 2, 3, 5 și 6 sunt umplute cu serul de testat. Godeurile se umplu până la dispariția meniscului.
                  
               
                     7.
                  
                  
                     Cantitățile obținute sunt următoarele:
                     
                                 —
                              
                              
                                 antigen: 32 μl;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ser de control: 73 μl;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ser de testat: 73 μl.
                              
                           
               
                     8.
                  
                  
                     Incubarea durează 72 de ore la temperatura ambiantă (20-27 °C) într-o incintă umedă închisă.
                  
               
                     9.
                  
                  
                     Testul se citește după 24 de ore, apoi după 48 de ore, dar nu se poate obține niciun rezultat final înainte de 72 de ore:
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 un ser de testat este pozitiv în cazul în care formează o curbă de precipitare specifică cu antigenul virusului leucozei bovine (LEB) și în cazul în care formează o curbă care coincide cu cea a serului de control;
                              
                           
                                 (b)
                              
                              
                                 un ser de testat este negativ în cazul în care nu formează o curbă de precipitare specifică cu antigenul virusului leucozei bovine și în cazul în care nu modifică curba serului de control;
                              
                           
                                 (c)
                              
                              
                                 reacția nu este concludentă în cazul în care:
                                 
                                             (i)
                                          
                                          
                                             modifică curba serului de control spre godeul antigenului virusului leucozei bovine fără să formeze o curbă de precipitare cu antigenul vizibilă; sau
                                          
                                       
                                             (ii)
                                          
                                          
                                             în cazul în care nu este posibilă interpretarea pozitivă sau negativă.
                                          
                                       
                           Pentru reacțiile neconcludente, se poate repeta testul și se poate utiliza ser concentrat.
                  
               
                     10.
                  
                  
                     Poate fi utilizată orice altă configurație sau orice altă dispunere a godeurilor, cu condiția ca serul E05 diluat la 1:10 cu un ser negativ să poată fi identificat ca fiind pozitiv.
                  
               B.   Metodă de standardizare a antigenului
         
         
                     1.
                  
                  
                     Soluții și materiale necesare:
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 40 ml de gel de agaroză 1,6 % într-un tampon Tris 0,05 M/HCl, pH 7,2 cu NaCl 85 %;
                              
                           
                                 (b)
                              
                              
                                 15 ml ser pozitiv pentru leucoză bovină care nu are alți anticorpi decât împotriva glicoproteinelor virusului leucozei bovine, diluat 1:10 într-un tampon Tris 0,05 M/HCl, pH 7,2 cu NaCl 8,5 %;
                              
                           
                                 (c)
                              
                              
                                 15 ml de ser pozitiv pentru leucoză bovină care nu are alți anticorpi decât împotriva glicoproteinelor virusului leucozei bovine, diluat 1:5 într-un tampon Tris 0,05 M/HCl, pH 7,2 cu NaCl 8,5 %;
                              
                           
                                 (d)
                              
                              
                                 patru plăci Petri din material plastic, cu un diametru de 85 mm;
                              
                           
                                 (e)
                              
                              
                                 un poanson cu diametrul de 4-6 mm;
                              
                           
                                 (f)
                              
                              
                                 un antigen de referință;
                              
                           
                                 (g)
                              
                              
                                 antigenul de standardizat;
                              
                           
                                 (h)
                              
                              
                                 o baie de apă (56 °C).
                              
                           
               
                     2.
                  
                  
                     Procedură:
                     Agaroza (1,6 %) se dizolvă în soluția tampon Tris/HCl încălzind cu grijă până la 100 °C. Se utilizează baia de apă la 56 °C timp de aproximativ o oră. Se adaugă soluțiile de ser pozitiv pentru leucoză bovină în baia de apă la 56 °C.
                     Se amestecă apoi 15 ml din soluția de agaroză la 56 °C cu 15 ml de ser pozitiv pentru leucoză bovină (1:10), se agită rapid și se varsă în două plăci Petri, câte 15 ml în fiecare cutie. Se reîncep operațiunile descrise anterior cu serul leucozei bovine diluat 1:5.
                     Atunci când agaroza s-a întărit, se fac găurile în felul următor:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 
                                    
                              
                           
                                 
                                    
                              
                              
                                 
                                    
                              
                           
               
                     3.
                  
                  
                     Adăugare de antigen:
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 plăcile Petri nr. 1 și 3:
                                 
                                             (i)
                                          
                                          
                                             godeul A – antigen de referință, nediluat;
                                          
                                       
                                             (ii)
                                          
                                          
                                             godeul B – antigen de referință, diluat 1:2;
                                          
                                       
                                             (iii)
                                          
                                          
                                             godeurile C și E – antigene de referință;
                                          
                                       
                                             (iv)
                                          
                                          
                                             godeul D – antigen de testat, nediluat;
                                          
                                       
                           
                                 (b)
                              
                              
                                 plăcile Petri nr. 2 și 4:
                                 
                                             (i)
                                          
                                          
                                             godeul A – antigen de testat, nediluat;
                                          
                                       
                                             (ii)
                                          
                                          
                                             godeul B – antigen de testat, diluat 1:2;
                                          
                                       
                                             (iii)
                                          
                                          
                                             godeul C – antigen de testat, diluat 1:4;
                                          
                                       
                                             (iv)
                                          
                                          
                                             godeul D – antigen de testat, diluat 1:8.
                                          
                                       
                           
               
                     4.
                  
                  
                     Instrucțiuni suplimentare:
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 experimentul se efectuează cu două grade de diluție a serului (1:5 și 1:10) pentru a obține precipitare optimă;
                              
                           
                                 (b)
                              
                              
                                 în cazul în care diametrul de precipitare este prea mic pentru fiecare dintre cele două grade de diluție, serul se va dilua suplimentar;
                              
                           
                                 (c)
                              
                              
                                 în cazul în care diametrul de precipitare este prea mare pentru două grade de diluție și este imprecis delimitabil, se alege un grad de diluție mai scăzut pentru ser;
                              
                           
                                 (d)
                              
                              
                                 concentrația finală a agarozei este de 0,8 %; cea a serului, de 5 %, respectiv 10 %;
                              
                           
                                 (e)
                              
                              
                                 se notează diametrele măsurate în sistemul de coordonate următor. Diluția de lucru este cea în care se înregistrează același diametru pentru antigenul de testat și pentru antigenul de referință.
                              
                           
                        
                  
               C.   Test de imunoabsorbție legat cu enzimă (ELISA) pentru depistarea leucozei enzootice bovine
         
         
                     1.
                  
                  
                     Se utilizează următoarele materiale și reactivi:
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 microplăci pentru faza solidă, tăvițe sau orice altă fază solidă;
                              
                           
                                 (b)
                              
                              
                                 antigenul se fixează pe faza solidă cu sau fără ajutorul anticorpilor de captare policloni sau monocloni. În cazul în care antigenul este asociat direct fazei solide, toate probele supuse examenului care prezintă o reacție pozitivă trebuie reexaminate în raport cu antigenul de control. Acesta trebuie să fie identic cu antigenul examinat, cu excepția absenței antigenilor LEB. În cazul în care anticorpii de captare sunt asociați fazei solide, anticorpii nu reacționează cu alți antigeni decât cu antigenii LEB;
                              
                           
                                 (c)
                              
                              
                                 lichidul biologic de examinat;
                              
                           
                                 (d)
                              
                              
                                 controalele pozitive și negative corespunzătoare;
                              
                           
                                 (e)
                              
                              
                                 conjugatul;
                              
                           
                                 (f)
                              
                              
                                 un substrat adaptat enzimei utilizate;
                              
                           
                                 (g)
                              
                              
                                 o soluție de stopare, în cazul în care este necesar;
                              
                           
                                 (h)
                              
                              
                                 soluții pentru diluarea probelor examinate, prepararea reactivilor și spălare;
                              
                           
                                 (i)
                              
                              
                                 un sistem de citire corespunzător substratului utilizat.
                              
                           
               
                     2.
                  
                  
                     Standardizarea și sensibilitatea testului
                     Sensibilitatea testului ELISA are un astfel de nivel încât serul E05 se consemnează ca reacție pozitivă atunci când este diluat de 10 ori (probe de ser) sau de 250 de ori (probe de lapte) mai mult decât diluția obținută de la probe individuale puse în comun. La testele în care probele (ser și lapte) sunt examinate individual, serul E05 diluat 1:10 (ser negativ) sau 1:250 (lapte negativ) se consemnează ca reacție pozitivă atunci când este examinat în aceeași diluție de testare ca cea utilizată pentru testele individuale. Institutele menționate la punctul 2 secțiunea A sunt responsabile de controlul calității metodei ELISA, în special pentru a determina, pentru fiecare lot de producție, numărul de eșantioane de pus în comun în funcție de rezultatul obținut pentru serul E05.
                  
               
                     3.
                  
                  
                     Condițiile de utilizare a testului ELISA pentru depistarea leucozei enzootice bovine:
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 testele ELISA pot fi utilizate pe probe de ser sau lapte;
                              
                           
                                 (b)
                              
                              
                                 dacă testele ELISA sunt utilizate în scopuri de certificare în conformitate cu articolul 6 alineatul (2) litera (c) sau pentru stabilirea și menținerea unui statut al șeptelului în conformitate cu anexa D partea I, amestecul probelor de ser sau lapte se realizează astfel încât probele prelevate în vederea examinării să poată fi raportate fără echivoc la animale individuale de la care provine serul sau laptele inclus în amestec. Orice test de confirmare este efectuat pe probele recoltate de la animale individuale;
                              
                           
                                 (c)
                              
                              
                                 în cazul în care testele ELISA sunt utilizate pe o probă de lapte vrac, această probă se prelevează din laptele provenind dintr-un șeptel care cuprinde cel puțin 30 % vaci de lapte în lactație. Orice test de confirmare trebuie se efectuează pe probele de ser sau lapte recoltate de la animale individuale.”