CELEX: 31992L0095
Language: pt
Date: 1992-11-09 00:00:00
Title: Directiva 92/95/CEE da Comissão, de 9 de Novembro de 1992, que altera o anexo da Sétima Directiva 76/372/CEE, que fixa os métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais

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31992L0095

Directiva 92/95/CEE da Comissão, de 9 de Novembro de 1992, que altera o anexo da Sétima Directiva 76/372/CEE, que fixa os métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais  

Jornal Oficial nº L 327 de 13/11/1992 p. 0054 - 0062 Edição especial finlandesa: Capítulo 3 Fascículo 45 p. 0182  Edição especial sueca: Capítulo 3 Fascículo 45 p. 0182 

DIRECTIVA 92/95/CEE DA COMISSÃO  de 9 de Novembro de 1992  que altera o anexo da Sétima Directiva 76/372/CEE, que fixa os métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animaisA COMISSÃO DAS COMUNIDADES  EUROPEIAS,  Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,  Tendo em conta a Directiva 70/373/CEE do Conselho, de 20 de Julho de 1970, relativa à introdução de métodos de colheita de amostras e de análises comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais (1), com a última redacção que lhe foi dada  pelos Actos de Adesão do Reino de Espanha e da República Portuguesa, e, nomeadamente, o seu artigo 2o,  Considerando que a Sétima Directiva 76/372/CEE da Comissão, de 1 de Março de 1976, que fixa os métodos de análises comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais (2), alterada pela Directiva 81/680/CEE (3), estabelece os métodos a  utilizar na dosagem da aflatoxina B1;  Considerando que é conveniente adaptar estes métodos à evolução dos conhecimentos científicos e técnicos; que, nomeadamente, é necessário dispor de um método que permita controlar os teores muito reduzidos da aflatoxina, fixados pela Directiva 74/63/CEE  do Conselho, de 17 de Dezembro de 1973, relativa à fixação de teores máximos em substâncias e produtos indesejáveis nos alimentos para animais (4), com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 91/132/CEE (5);  Considerando que é conveniente, além disso, dispor de um método que permita dosear a aflatoxina B1 em presença de produtos que, como no caso da polpa de citrinos, contenham substâncias de interferência;  Considerando que as medidas previstas na presente directiva estão em conformidade com o parecer do Comité permanente dos alimentos para animais,  ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:  Artigo 1o  O anexo da Directiva 76/372/CEE é alterado em conformidade com o anexo da presente directiva.  Artigo 2o  Os Estados-membros porão em vigor as disposições legislativas, regulamentares e administrativas necessárias para dar cumprimento ao disposto na presente directiva antes de 1 de Outubro de 1993. Do facto informarão imediatamente a Comissão.  Sempre que os Estados-membros adoptarem tais disposições, estas devem incluir uma referência à presente directiva ou ser acompanhadas dessa referência aquando da sua publicação oficial. As modalidades dessa referência serão adoptadas pelos  Estados-membros.  Artigo 3o  Os Estados-membros são os destinatários da presente directiva. Feito em Bruxelas, em 9 de Novembro de 1992. Pela Comissão  Ray MAC SHARRY  Membro da Comissão   (1) JO no L 170 de 3. 8. 1970, p. 2. (2) JO no L 102 de 15. 4. 1976, p. 8. (3) JO no L 246 de 29. 8. 1981, p. 32. (4) JO no L 38 de 11. 2. 1974, p. 31. (5) JO no L 66 de 13. 3. 1991, p. 16.    ANEXO  I. Na parte A, « Método por cromatografia monodimensional em camada fina », o ponto 1, « Finalidade e campo de aplicação », passa a ter a seguinte redacção:  « 1. Objectivo e campo de aplicação  O método permite determinar o teor de aflatoxina B1 das matérias-primas e dos alimentos simples, no entanto, não se aplica a polpa de citrinos. O limite inferior de determinação é de 0,01 mg/kg (10 ppb).  Na presença de substâncias de interferência que dificultem as determinações, é necessário recomeçar a análise em conformidade com o método descrito na parte B, "Determinação de aflatoxina B1, por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC)". »  II. A parte B, « Método por cromatografia bidimensional em camada fina », passa a ter a seguinte redacção:  « B. DETERMINAÇÃO DE AFLATOXINA B1 POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUÇÃO (HPLC)   1.  Objectivo e campo de aplicação   O método permite determinar o teor de aflatoxina B1 em alimentos para animais, incluindo aqueles que contenham polpa de citrinos. O limite inferior de determinação é de 0,001 mg/kg (1 ppb).  2.  Resumo do  processo   O método é baseado na separação por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC), com detecção de fluorescência. A amostra é extraída com clorofórmio, sendo o extracto sujeito a filtração. Purifica-se uma alíquota, por um cartucho de  Florisil seguido de um outro de C18. Para a separação final e doseamento recorre-se a uma coluna de HPLC de fase inversa, derivatização post coluna com uma solução aquosa de iodo e detecção por fluorescência.   Nota   As micotoxinas são substâncias  extremamente tóxicas, pelo que a sua manipulação deve ser efectuada em hottes. Devem ser tomadas precauções especiais quando as micotoxinas se apresentam sob forma liofilizada porque, pela sua natureza electrostática, têm tendência para dispersão nas  áreas de trabalho.  3.  Reagentes e auxiliares  3.1.  Clorofórmio, estabilizado com 0,5 a 1,0 % de etanol (m/m). Ver ponto 10.2.  3.2.  Metanol, para HPLC, para preparação de 3.6.  3.3.  Acetona.  3.4.  Acetonitrilo, para HPLC.  3.5.  Solventes de  eluição: preparar um dia antes de utilização ou proceder à remoção do ar por meio de ultra-sons.  3.5.1.  Mistura acetona (ponto 3.3) e água (98+2) (v+v).  3.5.2.  Mistura água e metanol (ponto 3.2) (80+20) (v+v).  3.5.3.  Mistura água e acetona (ponto  3.3) (85+15) (v+v).  3.6.  Fase móvel para HPLC:   Mistura água, metanol (ponto 3.2) e acetonitrilo (ponto 3.4) (130+70+40) (v+v+v).   Nota   A composição dos solventes a utilizar na fase móvel poderá requerer ajustamentos, de acordo com o tipo de  coluna utilizada em HPLC.  3.7.  Solução aquosa saturada de iodo: adicionar 2 g de iodo a 400 ml de água. Dissolver sob agitação, durante pelo menos 90 minutos e filtrar com o auxílio de um filtro tipo Millipore (ponto 4.15). Proteger a solução da luz,  de modo a evitar processos de fotodegradação.  3.8.  Celite 545 lavada com ácido, ou equivalente.  3.9.  Cartucho de Florisil (Waters SEP-PAK), ou equivalente.  3.10.  Cartucho de C18 (Waters SEP-PAK), ou equivalente.  3.11.  Gás inerte, por exemplo,  azoto.  3.12.  Solução-padrão de aflotoxina B1, em clorofórmio, concentração 10 mg/ml. Verificar a concentração da solução do seguinte modo: traçar o espectro de absorção da solução entre 330 e 370 nm, por meio de um espectrofotómetro (ponto 4.23).  Medir a absorvência (A) a um máximo de 363 nm. Calcular a concentração de aflatoxina B1, expressa em microgramas por mililitro da solução, através da fórmula:  Concentração (mg/ml) =  312 × A × 1000   22 300  = 13,991 × A  3.12.1.  Solução-mae da solução-padrão de aflotoxina B1, em clorofórmio.   Transferir de um modo quantitativo, 2,5 ml da solução-padrão (ponto 3.12) para um balão volumétrico de 50 ml, perfazendo com clorofórmio (ponto 3.1), até  ao traço de referência. Homogeneizar. Conservar o balão hermeticamente fechado, envolvido em folha de alumínio, em local fresco (4 °C) e ao abrigo da luz.  3.13.  Soluções de calibração de aflatoxina B1 para HPLC.   Nota   Na preparação das soluções  utilizar material de vidro lavado com ácido (ver ponto 4, Equipamento).  3.13.1.  Solução de calibração de 4 ng/ml.   Deixar estabilizar, à temperatura ambiente, o balão que contém a solução-mae (ponto 3.12.1), envolvido na folha de alumínio, durante  algumas horas. Transferir 400 ml da solução-mae (200 ng de aflatoxina B1) para um balão volumétrico de 50 ml, evaporando à secura sob uma corrente de gás inerte (ponto 3.11). Dissolver o resíduo obtido com cerca de 20 ml da mistura água/acetona (ponto  3.5.3), completando até ao traço de referência com a mesma solução. Homogeneizar.  3.13.2.  Solução de calibração de 3 ng/ml.   Transferir quantitativamente 7,5 ml da solução de calibração (ponto 3.13.1) para um balão volumétrico de 10 ml e perfazer até  ao traço de referência com a mistura água/acetona (ponto 3.5.3). Homogeneizar.  3.13.3.  Solução de calibração, de 2 ng/ml.   Transferir quantitativamente 25 ml da solução da calibração (ponto 3.13.1) para um balão volumétrico de 50 ml e perfazer até ao  traço de referência com a mistura água/acetona (ponto 3.5.3). Homogeneizar.   Esta solução deverá também ser utilizada para injecção repetida durante o processo HPLC, sendo adiante designada por padrão de referência (ponto 5.5).  3.13.4.  Solução de  calibração de 1 ng/ml.   Transferir quantitativamente 2,5 ml da solução de calibração (ponto 3.13.1) para um balão volumétrico de 10 ml e perfazer até ao traço de referência com a mistura água/acetona (ponto 3.5.3). Homogeneizar.  3.14.  Balão contendo  uma mistura de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 de concentrações aproximadas 1, 0,5, 1 e 0,5 mg/ml, respectivamente, em 1 ml de clorofórmio.  3.14.1.  Solução para ensaio cromotográfico.   Transferir o conteúdo do balão (ponto 3.14) para um tubo de ensaio de  vidro munido de rolha, ou para um frasco pequeno com tampa de rosca. Transferir 40 ml desta solução para um tubo de vidro de 10 ml, munido de rolha (lavado com ácido) (ponto 4.22). Evaporar o clorofórmio sob corrente de gás inerte (ponto 3.11) e  dissolver de novo, em 10 ml de mistura de água/acetona (ponto 3.5.3). Poderá haver necessidade de guardar em local fresco e escuro, 6 a 8 horas, até dissolução completa.  3.15.  Reagentes para o ensaio de confirmação (ponto 6).  3.15.1.  Solução aquosa  saturada da NaCI.  3.15.2.  Sulfato de sódio anidro, granulado.  4.  Aparelhos e utensílios   Atenção: o uso de material de vidro que não tenha sido lavado previamente com ácido, para as soluções aquosas de aflatoxinas, pode ocasionar perdas. Deverão  tomar-se cuidados especiais com o uso de material de vidro novo e material de vidro não reutilizável tal como frascos de auto-amostragem e pipetas Pasteur. Assim, todo o material de vidro que tenha contacto com soluções aquosas de aflatoxinas deve ser  imerso em ácido (por exemplo, ácido sulfúrico, C = 2 mol/l) durante algumas horas e, posteriormente, bem lavado com água destilada, de modo a remover quaisquer vestígios de ácido (por exemplo, três vezes, verificando com papel indicador). Na prática,  este tratado torna-se necessário para o balão de fundo redondo (ponto 4.4), balões volumétricos, provetas, frascos ou tubos utilizados para as soluções de calibração e para os extractos finais (particularmente os fracos de auto-amostragem), bem como as  pipetas Pasteur eventualmente usadas para a transferência das soluções de calibração ou dos extractos.  4.1.  Triturador/misturador.  4.2.  Crivo com malha de 1,0 mm (ISO R 565).  4.3.  Agitador mecânico.  4.4.  Evaporador rotativo de vácuo, equipado  com um balão de fundo redondo de capacidade compreendida entre 150 e 250 ml.  4.5.  Aparelho para cromatografia líquida de alta resolução, equipado com injector apropriado para injecções de 250 ml. Ver instruções do fabricante para enchimento total ou  parcial do loop.  4.6.  Coluna analítica para HPLC, com enchimento de C18 de 3 mm - 5 mm de partícula.  4.7.  Bomba pneumática para o débito do reagente do iodo, post coluna.  4.8.  Unta em T de volume morto nulo, em aço inoxidável (1/16" × 0,75 mm).   4.9.  Reactor em espiral de teflon ou aço inoxidável. As dimensões compreendidas entre 3 000 × 0,5 mm e 5 000 × 0,5 mm têm-se revelado apropriadas para combinação com colunas de HPLC de partículas de 5 mm ou 3 mm.  4.10.  Banho equipado com controlo  termostático, ajustado para 60 °C, susceptível de regular a temperatura com uma precisão de ± 0,1 °C.  4.11.  Detector de fluorescência, susceptível de fornecer um comprimento de onda de excitação da ordem de 365 nm e um comprimento de onda de emissão  da ordem de 435 nm (no caso de aparelhos com filtro, o comprimento de onda de emissão deverá ser superior a 400 nm). Deverá ser possível a detecção de quantidades de aflatoxina B1 da ordem de 0,05 ng.   Com vista a eliminar eventuais bolhas de ar  presentes na célula, poderá ser necessário utilizar uma certa contra-pressão (por exemplo, através da ligação de uma válvula ou espiral de teflon ou de aço inoxidável, à saída do detector).  4.12.  Registador contínuo.  4.13.  Integrador electrónico  (opcional).  4.14.  Papel de filtro plissado, diâmetro: 24 cm. Macherey-Nagel 617 1/4, ou equivalente.  4.15.  Filtro de membrana de porosidade 0,45 mm. Millipore HAWP 04700 ou equivalente.  4.16.  Erlenmeyer de 500 ml, munido de rolha de vidro.  4.17.   Coluna de vidro (diâmetro interno aproximado 1 cm, comprimento aproximado 30 cm), equipada com uma ponta Luer.  4.18.  Torneira Luer de nylon resistente ao clorofórmio (Bio-rad 7328017, Analytichem A1 6078, J.T. Baker 4514 ou equivalente).  4.19.   Seringa Luer de 10 ml, resistente ao ataque químico.  4.20.  Seringa apropriada para HPLC, para injecções de 250 ml (ver ponto 4.5).  4.21.  Microsseringa de 100 ml, para preparação das soluções de calibração (verificar, por pesagem, que a precisão é  da ordem de 2 %).  4.22.  Tubos de vidro de 10 ml, munidos de rolha.  4.23.  Espectrofotómetro apropriado para determinações na zona do UV.  4.24.  Equipamento para o ensaio de confirmação (ponto 6).  4.24.1.  Ampola de decantação de 100 ml, com  torneira de teflon, lavada com ácido.  4.24.2.  Unidade de aquecimento 40-50 °C.  5.  Técnica  5.1.  Preparação da amostra para análise   Triturar a amostra de modo a que esta passe pelo crivo (ponto 4.2).  5.2.  Toma para análise   Pesar para um  Erlenmeyer (ponto 4.16) 50 g da amostra previamente preparada.  5.3.  Extracção   Adicionar 25 g de Celite (ponto 3.8), 250 ml de clorofórmio (ponto 3.1) e 25 ml de água à amostra (ponto 5.2). Rolhar o Erlenmeyer e agitar durante 30 minutos com o  auxílio de um agitador mecânico (ponto 4.3). Filtrar através de filtro plissado (ponto 4.14), recolhendo 50 ml de filtrado. Se necessário tomar uma alíquota do filtrado e diluir para 50 ml em clorofórmio, de modo a que a concentração de aflatoxina B1  não seja superior a 4 ng/ml.  5.4.  Purificação da amostra (as operações devem efectuar-se sem interrupções significativas).   Cuidados a ter:   - proteger convenientemente as salas de trabalho onde são efectuadas as análises da luz do dia. Isto pode  ser conseguido, usando:  (1) Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. and Paulsch, W.E. (1991). Food Additives and Contaminants 8, 17-29.  (2) ISO 3534-1977  (3) JO no L 351 van 2. 12. 1989, p. 39.      1. Janelas com filtros de radiação UV em associação com luz difusa (evitar luz solar directa);   2. Cortinas ou persianas em associação com luz artificial (os tubos de fluorescência são aceitáveis),   - proteger o mais possível da luz as soluções  que contêm aflatoxinas (armazenar em local escuro e envolver em folha de alumínio).  5.4.1.  Purificação por cartucho de Florisil.  5.4.1.1.  Preparação do sistema coluna-cartucho.   Adaptar uma torneira (ponto 4.18) à extremidade mais curta do cartucho  de Florisil (ponto 3.9) (ver figura 1). Lavar o cartucho: utilizando uma seringa de 10 ml (ponto 4.19), efectuar uma toma de 10 ml de clorofórmio (ponto 3.1) e proceder à remoção do ar, mediante a injecção pela torneira de 8 ml de clorofórmio, fazendo-o  passar rapidamente através do cartucho. Ligar a extremidade mais longa do cartucho a uma coluna de vidro (ponto 4.17) e fazer passar os restantes 2 ml de clorofórmio para a coluna, através do cartucho. Fechar a torneira e remover a seringa.  5.4.1.2.   Purificação.   Introduzir o filtrado recolhido no ponto 5.3 no conjunto coluna-cartucho de Florisil e fazer escoar por acção da gravidade. Lavar com 5 ml de clorofórmio (ponto 3.1), seguidos de 20 ml de metanol (ponto 3.2). Desprezar os eluídos.  Durante a execução destas operações, assegurar que o sistema coluna-cartucho não seque.   Eluir a aflatoxina B1 com 40 ml de mistura acetona/água (ponto 3.5.1), recolhendo a totalidade de eluído no balão de fundo redondo do evaporador rotativo (ponto  4.4). Concentrar o eluído no evaporador rotativo, a 40 ° - 50 °C, até terminar a destilação da acetona (nota: nesta altura, permanecem no balão cerca de 0,5 ml de líquido. A experiência tem revelado que o prosseguimento da evaporação não prejudica o  processo e que a quantidade de acetona presente em 0,5 ml de líquido não é significativa. Resíduos de acetona eventualmente presentes poderiam originar perdas de aflatoxina B1 no cartucho de C18). Juntar 1 ml de metanol (ponto 3.2), agitar o balão, com  vista a dissolver os resíduos de aflatoxina B1, presentes nas paredes, e adicionar 4 ml de água, agitando. Desligar e eliminar o cartucho de Florisil. Lavar a coluna com água e guardá-la para o processo de purificação com C18.  5.4.2.  Purificação por  cartucho de C18  5.4.2.1.  Preparação do sistema coluna-cartucho   Adaptar uma torneira (ponto 4.18) à extremidade mais curta de um cartucho de C18 (ponto 3.10) (ver figura 1). Com o auxílio de uma seringa (ponto 4.19), remover o ar do cartucho,  mediante a injecção rápida pela torneira de 10 ml de metanol (ponto 3.2) (as bolhas de ar no interior do invólucro são visíveis sob a forma de pontos luminosos num fundo acinzentado). Proceder à toma de 10 ml de água numa outra seringa e fazer passar 8  ml através do cartucho (evitar a introdução de ar no mesmo, durante a mudança do metanol para a água). Adaptar a extremidade mais longa do cartucho à coluna de vidro (ponto 4.17) e fazer passar os restantes 2 ml para a coluna, através do cartucho.  Fechar a torneira e remover a seringa.  5.4.2.2.  Purificação   Transferir quantitativamente para a coluna (ponto 4.17) o extracto recolhido no ponto 5.4.1.2 e lavar o balão com duas porções de 5 ml de mistura água/metanol (ponto 3.5.2), deixando escoar  por acção da gravidade. Durante a execução destas operações, evitar a secagem do sistema coluna-cartucho (se ocorrer a formação de bolhas de ar no estreitamento próximo do cartucho interromper o fluxo e bater levemente no topo da coluna, de forma a  eliminá-las, retomando em seguida as operações). Eluir com 25 ml de mistura água/metanol (ponto 3.5.2), desprezando o eluído. Eluir a aflatoxina B1 com 50 ml de mistura água/acetona (ponto 3.5.3) e recolher a totalidade do eluído num balão volumétrico  de 50 ml. Completar até ao traço de referência com água e homogeneizar; a solução resultante é utilizada no ensaio cromatográfico (ponto 5.5).   Atenção: Em geral, não é necessário filtrar o extracto final antes do processo de HPLC. Se, contudo, se  verificar a necessidade de tal operação, dever-se-á evitar o uso de filtros à base de celulose, susceptíveis de ocasionar perdas de aflatoxina B1. Poder-se-ao utilizar filtros de teflão.  5.5.  Cromatografia líquida de alta resolução.   (Ver a figura 2  para a montagem do equipamento). Prever o tempo suficiente para permitir o condicionamento e a estabilização dos aparelhos, antes do uso.   Nota 1   Os valores indicados para os fluxos do solvente e do reagente post coluna são fornecidos a título  meramente indicativo, podendo necessitar de ajustamentos, em função das características da coluna, de HPLC.   Nota 2   A eficiência da resposta do detector para as aflatoxinas depende da temperatura, razão pela qual se deve efectuar a compensação do  desvio (ver figura 3), através da injecção de uma quantidade fixa de padrão de referência de aflatoxina B1 (ponto 3.13.3), com intervalos regulares (por exemplo, de três em três injecções). Os valores dos picos de aflatoxina B1 entre estes padrões de  referência podem ser corrigidos, usando o valor médio das respostas, desde que a diferença observada entre os valores dos picos das respostas consecutivas, correspondentes aos padrões de referência, seja reduzida (< 10 %). Por tal facto, devem-se  efectuar as injecções ininterruptamente. Se for necessário proceder a uma interrupção, a última injecção anterior e a primeira injecção posterior a esta deverão ser de padrão de referência (ponto 3.13.3). Na medida em que a curva de calibração se  apresenta sob a forma de uma recta que passa pela origem, a determinação das quantidades de aflatoxina B1 nos extractos da amostra efectua-se directamente por referência aos padrões adjacentes.  5.5.1.  Regulação da bomba de HPLC   Regular a bomba do  aparelho de HPLC (ponto 4.5) de modo a obter um fluxo de 0,5 ou 0,3 ml/min, para uma coluna de HPLC de 5 mm ou 3 mm de partícula (ponto 4.6) respectivamente, utilizando a fase móvel (ponto 3.6).  5.5.2.  Regulação da bomba para a reacção post coluna    Regular a bomba (ponto 4.7) de modo a obter um fluxo de 0,2-0,4 ml/min de solução aquosa saturada de iodo (ponto 3.7). A título indicativo: é aconselhável a utilização de fluxos da ordem de 0,4 ou 0,2 ml/min, associados a fluxos da fase móvel (ponto  3.6) de 0,5 ml/min e 0,3 ml/min, respectivamente.  5.5.3.  Detector de fluorescência   Regular o detector de fluorescência (ponto 4.11), para um comprimento de onda de excitação de 365 nm e um comprimento de onda de emissão de 435 nm (no caso de  aparelhos com filtro: superior a 400 nm). Ajustar o atenuador de modo a obter, para 1 ng de aflatoxina B1, uma deflexão da caneta do registador de cerca de 80 % da escala total.  5.5.4.  Injector   Injectar, para todas as soluções, quantidades da ordem  de 250 ml, procedendo de acordo com as instruções do fabricante do injector.  5.5.5.  Verificação da separação cromatográfica   Injectar a solução para ensaio cromatográfico (ponto 3.14.1). As inflexões observadas na curva registada deverão ser  inferiores a 5 % da soma das alturas dos picos adjacentes.  5.5.6.  Verificação da estabilidade do sistema   Antes da cada série de análises, proceder à injecção repetida de padrão de referência (ponto 3.13.3), até obtenção de picos com áreas estáveis  (nota: os picos produzidos pela aflatoxina B1 não deverão apresentar, em injecções consecutivas, diferenças superiores a 6 %). Proceder de imediato à verificação da linearidade (ponto 5.5.7).  5.5.7.  Verificação de linearidade   Injectar as soluções de  calibração de aflatoxina B1 (ponto 3.13.1 a 3.13.4). Utilizar em cada terceira injecção o padrão de referência (ponto 3.13.3), para correcção do desvio das respostas (nota: os picos relativos ao padrão de referência não deverão apresentar diferenças  superiores a 10 % em 90 minutos). Corrigir o desvio de acordo com a fórmula indicada no ponto 7. O gráfico de calibração deve apresentar a forma de uma recta que passa pela origem, com um erro padrão inferior a duas vezes o valor estimado de Y. Os  valores encontrados não deverão diferir em mais de 3 % dos valores nominais. Se os requisitos forem satisfeitos, prosseguir de imediato. No caso contrário, identificar e corrigir as causas do problema, antes de continuar o processo.  5.5.8.  Injecção  dos extractos da amostra   Injectar os extractos da amostra purificada (ponto 5.4.2.2). Após cada série de dois extractos da amostra, repetir a injecção do padrão de referência (ponto 3.13.3), de acordo com a ordem seguinte: padrão de referência,  extracto, extracto, padrão de referência, extracto, extracto, padrão de referência, etc.  6.  Ensaio de confirmação  6.1.  Tratamento subsequente do extracto (ponto 5.4.2.2)   Juntar 5 ml de solução de NaCI (ponto 3.15.1) ao extracto final obtido no  ponto 5.4.2.2. Extrair três vezes com 2 ml de clorofórmio ((ponto 3.1) durante um minuto, por recurso à ampola de decantação (ponto 4.24.1). Verter os extractos de clorofórmio recolhidos e combinados, numa proveta de 10 ml, através de cerca de 1 g de  sulfato de sódio (ponto 3.15.2). Poder-se-á usar um funil de pequenas dimensões (diâmetro de 4 cm), colocando na parte inferior um pedaço de algodão coberto com cerca de 1 g de sulfato de sódio (ponto 3.15.2).   Lavar a camada de sulfato com alguns  mililitros de clorofórmio, recolhendo na mesma proveta ou ampola. Evaporar à secura o extracto de clorofórmio na proveta, por recurso à unidade de aquecimento (ponto 4.24.2), redissolvendo-o em 1 ml de clorofórmio.  6.2.  Preparação do derivado e  cromatografia em camada fina   Ver Directiva 76/372/CEE do Conselho, anexo, método A, ponto 5.6.2.  7.  Cálculo e resultados   Calcular o teor de aflatoxina B1 presente na amostra, expresso em mg/kg, por recurso à fórmula seguinte:  Teor de aflatoxina  B1 em mg/kg =  m × Ve x t   Vm × M × Vf  Vc  na qual:   m =  quantidade de aflatoxina B1, em expressa em ng, representada pelo pico B1 da amostra, calculada do modo que se segue:    m =  P (amostra)   P (st1) + P (st2)  × 2 r (st)  sendo:   P (amostra) =  área do pico correspondente à aflatoxina B1 na amostra.  B (st1) =  área do pico correspondente à aflatoxina B1 no padrão de referência precedente (ponto 3.13.3).  P (st2) =  área do pico  correspondente à aflatoxina B1 no padrão de referência seguinte (ponto 3.13.3).  r (st) =  quantidade de aflatoxina B1, no padrão de referência (ponto 3.13.3) injectado, expressa em ng.  Vm =  volume do extracto de amostra injectado, expresso em ml.  Ve  x t =  volume final do extracto de amostra, expresso em mililitros, tendo em atenção qualquer diluição que tenha sido efectuada (ver ponto 5.3).  M =  massa da amostra, expressa em gramas.  Vf =  volume de filtrado transferido para o cartucho de  Florisil (ponto 5.4.1.2), expresso em mililitros.  Vc =  volume de clorofórmio utilizado para a extracção da amostra, expresso em mililitros.   Seguindo o procedimento descrito no presente método, a fórmula referida reduz-se a:   teor de aflatoxina B1,  em mg/kg = 20 × m.  7.1.  O cálculo dos resultados pode-se também fazer por recurso à medida da altura dos picos.  8.  Repetibilidade:   ver ponto 10.1.  9.  Reprodutibilidade:   ver ponto 10.1.  10.  Observações  10.1.  Precisão   Um estudo  interlaboratorial (1), efectuado à escala internacional com alimentos compostos para animais, forneceu, no que respeita à repetibilidade e à reprodutibilidade, os resultados que se apresentam no quadro 1. O termo repetibilidade (r) aqui utilizado  define-se como a razão máxima que, com uma probabilidade de 95 %, não é significativa na comparação de dois valores obtidos para a mesma amostra, no mesmo laboratório e nas mesmas condições. O termo reprodutibilidade (R) é definido de um modo análogo,  no que se refere à comparação de dois laboratórios diferentes. Em conformidade com a norma ISO 3534-1977, no ponto 2.35 (2) e a Decisão 89/610/CEE da Comissão (3), os valors de r e R encontram-se também indicados no quadro 1 sob a forma de coeficientes  de variação.   Quadro 1   Repetibilidade (r) e reprodutibilidade (R), expressas sob a forma de razões e respectivos coeficientes de variação   (15 laboratórios)        Nível  r  R  CVr (*)  CVR        (mg/kg)    (%)  (%)        8 &  14  1,4  1,7  11  18          (*) CV = coeficiente de variação   10.2.  Estabilização do clorofórmio (ponto 3.1)   As características de adsorção do cartucho de Florisil podem-se alterar se o elemento estabilizador for outro que não o etanol. Isto deve ser verificado de  acordo com o ponto 10.3, sempre que o clorofórmio descrito não for o disponível.  10.3.  Exactidão   A aplicação correcta do método deve ser verificada através de determinações em duplicado, efectuadas com materiais de referência garantidos. Na ausência  destes, a eficiência do método deverá ser verificada através de ensaios de recuperação, efectuados com amostras em branco. A diferença entre a média e o valor real, expressa em percentagem do valor real, dever-se-á situar entre os limites   20 % a + 10  %.   Figura 1: sistema coluna-cartucho    1. Fase móvel  2. Bamba  3. Injector  4. Pré-coluna  5. Coluna analítica par HPLC  6. Solução saturada de iodo  7. Bomba para o reagente pós-coluna  8. Junta em T  9. Banho com controlo termostático  10. Reactor em espiral  11. Detector de fluorescência  12. Válvula reguladora de pressão  13. Esgoto  14. Registador/integrador   Figura 2: diagrama do sistema de cromatografia líquida, com derivatização pós-coluna   Resposta     média dos padrões  de referência        tempo  padrão de referência  extracto (ou calibrador)  extracto (ou calibrador)  padrão de referência  extracto (ou calibrador)   Figura 3: compensação do desvio relativo à resposta da aflatoxina B1 por injecção do padrão de  referência (ponto 3.13.3), a intervalos de tempo regulares »