CELEX: 31991D0479
Language: pt
Date: 1991-07-29 00:00:00
Title: 91/479/CEE: Decisão da Comissão, de 29 de Julho de 1991, relativa as condições sanitárias e a certificação sanitária para a importação de sémen congelado de bovino dos Estados Unidos da América

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31991D0479

91/479/CEE: Decisão da Comissão, de 29 de Julho de 1991, relativa as condições sanitárias e a certificação sanitária para a importação de sémen congelado de bovino dos Estados Unidos da América  

Jornal Oficial nº L 258 de 16/09/1991 p. 0001 - 0017

DECISÃO DA COMISSÃO de 29 de Julho de 1991 relativa às condições  sanitárias e à certificação sanitária para a importação de sémen congelado de bovino dos Estados  Unidos da América (91/479/CEE)A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS, Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia, Tendo em conta a Directiva 88/407/CEE do Conselho, de 14 de Junho de 1988, que fixa as exigências  de polícia sanitária aplicáveis às trocas comerciais intracomunitárias e às importações de sémen  congelado de animais da espécie bovina (1), com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva  90/425/CEE (2), e, nomeadamente, os seus artigos 10o e 11o, Considerando que os Estados Unidos da América constam da lista, estabelecida pela Decisão 90/14/CEE  da Comissão (3), de países terceiros a partir dos quais os Estados-membros autorizam a importação  de sémen congelado de animais domésticos da espécie bovina; Considerando que a situação sanitária nos Estados Unidos da América parece ser satisfatória e  controlada por serviços veterinários bem estruturados e organizados relativamente às doenças  transmissíveis pelo sémen; Considerando que as autoridades veterinárias competentes dos Estados Unidos da América confirmaram  que o país se encontra, há pelo menos doze meses, indemne de peste bovina, febre aftosa e  peripneumonia contagiosa bovina e que durante esse período não foram feitas vacinações contra essas  doenças; Considerando que as autoridades veterinárias competentes dos Estados Unidos da América se  comprometeram a notificar num prazo de 24 horas, por telex ou telefax, a Comissão das Comunidades  Europeias e os Estados-membros da ocorrência de quaisquer das referidas doenças, da febre catarral  ou da doença hemorrágica epizoótica, bem como de quaisquer alterações na política de vacinações  contra qualquer uma destas doenças, ou ainda, dentro de um determinado prazo, de quaisquer  propostas de alterações, nos Estados Unidos da América, sobre normas de importação relativas a  animais domésticos ou ao seu sémen ou embriões; Considerando que as autoridades veterinárias competentes dos Estados Unidos da América  apresentaram, relativamente à tuberculose e brucelose bovinas, garantias sanitárias equivalentes às  aplicáveis na Comunidade; Considerando que as autoridades veterinárias competentes dos Estados Unidos da América se  comprometem a controlar oficialmente a emissão de certificados prevista na presente decisão, bem  como a garantir que todos os certificados, derrogações e resultados laboratoriais relevantes em que  a certificação se possa ter baseado fiquem oficialmente arquivados durante, pelo menos, os doze  meses seguintes à data de expedição do sémen a que dizem respeito; Considerando que as autoridades veterinárias competentes dos Estados Unidos da América se  comprometem a aprovar oficialmente centros de colheita de sémen para a exportação de sémen de  bovino para a Comunidade Económica Europeia, em conformidade com o disposto no artigo 9o da  Directiva 88/407/CEE; Considerando que as autoridades veterinárias competentes dos Estados Unidos da América se  comprometem a determinar e comunicar imediatamente à Comissão das Comunidades Europeias as datas em  que, em cada centro autorizado de colheita de sémen, termine e recomece qualquer actividade das  espécies de culicóides transmissoras da febre catarral ou da doença hemorrágica epizoótica; Considerando que as condições sanitárias e a certificação veterinária devem ser adaptadas em função  da situação sanitária do país terceiro em questão; Considerando que as medidas previstas na presente decisão estão em conformidade com o parecer do  Comité Veterinário Permanente, ADOPTOU A PRESENTE DECISÃO: Artigo 1o 1. Os Estados-membros podem autorizar, até 31 de Dezembro de 1992, a importação, a partir dos  Estados Unidos da América, de sémen de bovino obtido de animais que tenham apresentado resultados  não negativos no teste da febre catarral ou no teste da doença hemorrágica epizoótica previsto no  anexo IA da presente decisão, mas devem fazê-lo em conformidade com as disposições dos anexos IIA e  IIB e garantir que tal sémen não entre no comércio intracomunitário. A Comissão deve reexaminar as  disposições do presente número antes da data acima indicada. 2. Os Estados-membros autorizam a importação, a partir dos Estados Unidos da América, de sémen de  bovino que satisfaça as condições estabelecidas no certificado do anexo IA e, se for caso disso, no  certificado do anexo IB da presente decisão. Artigo 2o Os Estados-membros são os destinatários da presente decisão. Feito em Bruxelas, em 29 de Julho de 1991. Pela Comissão Ray MAC SHARRY Membro da Comissão (1) JO n° L 194 de 22.7.1988, p. 10.  (2) JO n° L 224 de 18.8.1990, p. 29.  (3) JO n° L 8 de 11.1.1990, p. 71.   ANEXO I A CERTIFICADO SANITÁRIO para a importação de sémen de bovino dos Estados Unidos  da América Certificado n°: . País de colheita: Estados Unidos da América Autoridade competente: United States Department of Agriculture - APHIS I. Identificação do sémen >POSIÇÃO NUMA TABELA>II. Origem do sémen > POSIÇÃO NUMA TABELA> III. Destino do sémen >POSIÇÃO NUMA TABELA>IV. Informações  sanitárias Eu, abaixo assinado, veterinário federal, declaro: 1. Que os Estados Unidos da América estiveram, por um período com início pelo menos doze meses  antes da primeira colheita do sémen acima descrito e com termo trinta dias após a última colheita  desse mesmo sémen, indemnes de peste bovina. 2. Que o centro autorizado de colheita de sémen em que o sémen acima descrito foi colhido: a) Está em conformidade com todas as disposições do presente número e, como tal, foi aprovado pelas  autoridades veterinárias federais dos Estados Unidos da América para a exportação de sémen de  bovino para a Comunidade Europeia; b) Está situado no centro de um círculo com um raio de 50 km em que, durante um período com início  pelo menos três meses antes da primeira colheita do sémen acima descrito e com termo trinta dias  após a última colheita desse mesmo sémen, não se registaram casos de febre aftosa, peripneumonia  contagiosa bovina ou estomatite vesiculosa; c) Esteve indemne, durante um período com início pelo menos três meses antes da primeira colheita  do sémen acima descrito e com termo trinta dias após a última colheita desse mesmo sémen, de febre  aftosa e brucelose; d) Esteve indemne, durante um período com início pelo menos trinta dias antes da primeira colheita  do sémen acima descrito e com termo trinta dias após a última colheita desse mesmo sémen, de raiva,  carbúnculo bacteriano, tuberculose, leucose bovina enzoótica ou de qualquer manifestação de  infecção com Trichomonas foetus, Campylobacter foetus, Leptospira canicola, Leptospira pomona,  Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo ou Leptospira icterohaemorrhagica; e) É inspeccionado por um veterinário federal pelo menos duas vezes por ano, sendo consideradas e  verificadas, aquando dessas inspecções, todas as questões relacionadas com as condições previstas  no presente certificado; f) Está sob a vigilância permanente de um veterinário do centro, de tal modo que: i) os animais só são admitidos com a autorização expressa do veterinário do centro, sendo  registadas todas as suas entradas e saídas, ii) é mantido um registo da raça, data de nascimento, identificação e história sanitária de todos  os animais da espécie bovina admitidos no centro, bem como de todas as despistagens efectuadas e  seus resultados e de todos os tratamentos realizados nos animais ali presentes, iii) é proibida a entrada de pessoas não autorizadas, devendo os visitantes devidamente autorizados  obedecer às condições impostas pelo veterinário do centro, iv) só é admitido pessoal tecnicamente competente, adequadamente preparado para utilizar os métodos  de desinfecção e as técnicas de higiene necessários para o controlo da disseminação das doenças; g) Só admite animais da espécie bovina, constituindo excepção outros animais domésticos  estritamente necessários para o funcionamento normal do centro, que podem ser admitidos desde que  não constituam risco de infecção para a espécie bovina e que satisfaçam as condições impostas pelo  veterinário do centro; h) Está construído de tal modo que: i) as instalações para os animais estão fisicamente separadas das instalações de tratamento e  armazenamento do sémen, que estão, por sua vez, separadas uma da outra, ii) tem uma unidade de isolamento para animais doentes, iii) tem uma instalação para a colheita de sémen com uma sala separada para a limpeza a desinfecção  ou esterilização do equipamento, iv) tem uma instalação de tratamento de sémen e uma instalação de armazenamento (que não têm  necessariamente que estar no mesmo local), v) é evitado qualquer contacto com animais que se encontrem no exterior, vi) pode, na sua totalidade, ser facilmente limpo e desinfectado, desde que, onde forem satisfeitas as condições acima indicadas, um centro autorizado de colheita de  sémen possa estar situado no mesmo local que outro ou outros centros de colheita de sémen. 3. Que os animais presentes no centro autorizado de colheita de sémen durante o período de colheita  e armazenamento do sémen acima descrito: a) Estavam no centro autorizado de colheita de sémen em, e estiveram continuamente desde, 1 de  Janeiro de 1990 e foram, desde a sua chegada, continuamente sujeitos a todos os testes descritos na  alínea d) do presente número com os resultados aí indicados, ou b) Foram transferidos de um centro autorizado de colheita de sémen sem terem contactado com animais  com um estatuto sanitário inferior e transportados, quando tal foi necessário, em veículos  rigorosamente limpos e desinfectados antes da utilização, ou c) Foram admitidos com a autorização do veterinário do centro e sem apresentarem sintomas clínicos  de doença, e que i) são provenientes de efectivos considerados indemnes de tuberculose pelas autoridades  veterinárias federais ou que estavam presentes em áreas consideradas indemnes de tuberculose  conforme definição das mesmas autoridades, não tendo pertencido em momento algum a efectivos de  estatuto inferior, ii) são provenientes de efectivos classificados como indemnes de brucelose pelas autoridades  veterinárias federais ou que estavam presentes em áreas classificadas como indemnes de brucelose ou  áreas da classe A conforme definição das mesmas autoridades, não tendo pertencido em momento algum  a efectivos de estatuto inferior, iii) - são provenientes de efectivos que, pelo menos nos últimos três anos, não manifestaram  nenhuns sinais de leucose bovina enzoótica, ou - foram paridos por vacas submetidas, nos trinta dias que antecederam a entrada das crias na  unidade de isolamento, a um teste serológico para a leucose bovina enzoótica realizado em  conformidade com o processo definido no anexo G da Directiva 64/432/CEE do Conselho, com resultados  negativos, ou - foram, ou nos trinta dias que antecederam a entrada na unidade de isolamento aprovada ou após  terem atingido dois anos de idade, sendo considerada a mais recente destas datas, submetidos, com  resultados negativos, a um teste serológico para a leucose bovina enzoótica realizado em  conformidade com o processo definido no anexo G da Directiva 64/432/CEE do Conselho, iv) foram, nos trinta dias que antecederam a entrada na unidade de isolamento aprovada, submetidos,  sempre com resultados negativos, a cada um dos seguintes testes: - uma prova de tuberculina em prega caudal do United States Department of Agriculture (USDA), - um teste serológico normalizado de aglutinação do USDA em tubo de ensaio para a brucelose  negativo a menos de 30 unidades internacionais (UI) de aglutinação por mililitro e um ensaio de  fixação do complemento com um título brucélico inferior a 20 unidades CEE por mililitro (20  unidades EFC), - um teste serológico para a leucose bovina enzoótica, efectuado em conformidade com o método  fixado no anexo G da Directiva 64/432/CEE, - um ensaio de seroneutralização ou uma prova Elisa para a rinotraqueíte infecciosa  bovina/vulvovaginite pustulosa infecciosa, - um ensaio de isolamento do vírus para a pesquisa da diarreia vírica dos bovinos em amostras de  sangue em culturas de células sensíveis posteriormente submetidas a um ensaio de pesquisa de  anticorpos por fluorescência ou ensaio imunoperoxidásico; se, quando deram entrada no centro, os  animais tinham idade inferior a seis meses, a prova foi adiada até terem atingido essa idade, e aos testes adiante indicados, sempre com resultados negativos, excepto quando o presente  certificado se aplicar a sémen colhido e expedido antes de 1 de Janeiro de 1993 e quando o  Estado-membro importador tenha indicado, por escrito, que aplica as condições previstas no n° 1 do  artigo 1o da Decisão 91/479/CEE da Comissão: - uma prova Elisa de bloqueio para a febre catarral utilizando um anticorpo monocional específico  de grupo, realizada em conformidade com o processo definido no anexo IVA da Decisão 91/479/CEE da  Comissão, -um ensaio de imunodifusão em ágar-gel para todos os serótipos da doença hemorrágica epizoótica que  ocorrem nos Estados Unidos da América, realizado em conformidade com o processo definido no anexo  IVB da Decisão 91/479/CEE da Comissão, desde que qualquer dos testes referidos tenha sido realizado enquanto os animais se encontravam na  unidade de isolamento oficialmente aprovada e que, no caso de terem surgido resultados que não  sejam negativos em qualquer dos testes para os quais o certificado exige um resultado negativo, se  considere que o período de isolamento de trinta dias para os outros animais da mesma unidade de  isolamento teve início somente após o animal afectado ter sido retirado da unidade e tendo, se for  o caso, sido reatribuído à unidade o estatuto de unidade indemne de tuberculose ou brucelose, v) que estiveram, após concluídos os testes de pré-isolamento descritos em iv), por um período de  pelo menos trinta dias, numa unidade de isolamento oficialmente aprovada situada, aquando da  chegada dos animais à unidade, no centro de um círculo com 10 km de raio em que não houve indícios  de casos de febre aftosa, peste bovina, peripneumonia contagiosa bovina ou estomatite vesiculosa,  estando o centro indemne, há pelo menos três meses, de febre aftosa e brucelose e, há pelo menos  trinta dias, de casos de raiva, carbúnculo, tuberculose e leucose bovina enzoótica, tendo sido  submetidos, sempre com resultados negativos, aos ensaios seguintes: - um teste serológico normalizado de aglutinação do USDA em tubo de ensaio para a brucelose  negativo a menos de 30 unidades internacionais (UI) de aglutinação por mililitro e uma prova de  fixação do complemento com um título brucélico inferior a 20 unidades CEE por mililitro (20  unidades EFC), - um ensaio de pesquisa de anticorpos por imunofluorescência ou uma cultura para detecção da  infecção pela Campylobacter foetus em amostras de colheita prepucial ou de lavagem vaginal, - um exame microscópico e uma cultura para pesquisa de Trichomonas foetus em amostras de colheita  prepucial ou de lavagem vaginal, - um ensaio de seroneutralização ou uma prova Elisa para a pesquisa do vírus da rinotraqueíte  infecciosa bovina/vulvovaginite pustulosa infecciosa, desde que, no caso de se terem obtido resultados que não sejam negativos, se considere que o  período de isolamento de trinta dias para os restantes animais teve início somente após o animal  afectado ter sido retirado da unidade e, quando for caso disso, que o estatuto de indemne de  brucelose da unidade tinha sido restabelecido, tendo os animais sido submetidos a um tratamento  contra a leptospirose compreendendo duas injecções de estreptomicina ou dihidrostreptomicina ou,  ainda, uma mistura das duas com um intervalo de 14 dias, na proporção de 25 mg por quilograma de  peso vivo; d) Foram submetidos, pelo menos uma vez por ano e sempre com resultados negativos, a cada um dos  seguintes testes: i) uma prova de tuberculina em prega caudal do USDA, ii) um teste serológico normalizado de aglutinação do USDA em tubo de ensaio para a brucelose  negativo a menos de 30 unidades internacionais (UI) de aglutinação por mililitro e um ensaio de  fixação do complemento com um título brucélico inferior a 20 unidades CEE por mililitro (20  unidades EFC), iii) um teste serológico para a leuxose bovina enzoótica, efectuado em conformidade com o método  fixado no anexo G da Directiva 64/432/CEE, iv) um ensaio de seroneutralização ou uma prova Elisa para a rinotraqueíte infecciosa  bovina/vulvovaginite, pustulosa infecciosa, desde que, no que diz respeito ao sémen colhido antes  de 31 de Dezembro de 1992 e quando tiver sido indicado por escrito pela autoridade competente do  Estado-membro importador só possa ser aceite sémen de touros com reacção positiva a qualquer destes  testes quando um isolamento do vírus e/ou o teste de inoculação para o complexo referido tenha tido  resultados negativos, tendo, neste caso, o teste sido realizado em ..............................  no laboratório .............................., v) um ensaio de pesquisa de anticorpos por imunofluorescência ou uma cultura para detecção da  infecção pelo Campylobacter foetus em amostras de colheita prepucial ou lavagem vaginal, não sendo,  porém, nenhum destes testes necessário no caso de animais que não estejam a ser utilizados para a  produção de sémen, desde que o teste seja realizado antes de a produção de sémen ser reiniciada, vi) um teste serológico para os serótipos canicola, pomona, grippotyphosa, hardjo e  icterohaemorrhagica da Leptospira, e aos testes adiante indicados pelo menos duas vezes por ano e sempre com resultados negativos,  excepto quando o presente certificado se aplicar a sémen colhido e expedido antes de 1 de Janeiro  de 1993 e quando a autoridade veterinária do Estado-membro importador tenha indicado, por escrito,  que aplica as condições previstas no n° 1 do artigo 1o da Decisão 91/479/CEE da Comissão: i) uma prova Elisa de bloqueio para a febre catarral utilizando um anticorpo monocional específico  de grupo, realizada em conformidade com o processo definido no anexo IVA da Decisão 91/479/CEE da  Comissão, ii) um ensaio de imunodifusão em ágar-gel para todos os serótipos da doença hemorrágica epizoótica  que ocorram nos Estados Unidos da América, realizado em conformidade com o processo definido no  anexo IVB da Decisão 91/479/CEE da Comissão, tendo todos os testes acima referidos (com excepção da prova da tuberculina) sido realizados num  laboratório aprovado para esse fim pela autoridade veterinária federal dos Estados Unidos da  América. 4. Que o sémen acima descrito: -está classificado como indemne de febre catarral conforme definido no anexo IIA da Decisão  91/479/CEE da Comissão e, nomeadamente, o seu n° 5 (*), ou - está classificado como tendo sido testado para a febre catarral conforme definido no anexo IIB da  Decisão 91/479/CEE da Comissão e, nomeadamente, o seu n° 2, e quando a autoridade veterinária do  Estado-membro importador tenha indicado, por escrito, que aplica as condições previstas no n° 1 do  artigo 1o da Decisão 91/479/CEE da Comissão (*), (*) Riscar o que não interessa. e a) Foi colhido num centro autorizado de colheita de sémen, sem recurso à electro-ejaculação ou a  técnicas de electro-estimulação, de animais: i) que permaneceram continuamente no território dos Estados Unidos da América durante um período  com início pelo menos seis meses antes da primeira colheita do sémen referido e com termo na data  da sua expedição, ii) que, contrariamente ao estabelecido numa derrogação concedida nos termos da alínea d),  subalínea iv), do n° 3 do presente anexo ou no n° 1 do artigo 1o da Decisão 91/479/CEE da Comissão  não apresentaram resultados positivos em nenhum dos testes referidos no presente certificado, iii) que não foram, enquanto no centro autorizado de colheita de sémen, autorizados a efectuar a  cobrição natural, iv) que permaneceram num centro autorizado de colheita de sémen por um período contínuo de pelo  menos trinta dias antes da colheita, v) que não apresentavam, na altura, sinais clínicos de doença; b) Foi tratado num centro autorizado de colheita de sémen: i) no qual, durante a colheita de sémen acima descrita, só foi tratado sémen de animais em centros  autorizados ou de animais com o mesmo estatuto sanitário que os dos centros autorizados, desde que,  neste último caso, tal tratamento tenha sido feito com equipamento separado e em momentos  diferentes do tratamento do sémen dos centros autorizados e que a unidade de tratamento tenha sido  cuidadosamente limpa e desinfectada antes de ser novamente utilizada para o tratamento do sémen de  animais em centros autorizados, ii) em condições de higiene rigorosa, tendo todos os materiais e equipamento que contactaram com os  animais dadores ou o sémen sido cuidadosamente desinfectados ou esterilizados, conforme o caso,  antes da utilização, iii) com utilização de aditivos ou diluentes em que todos os produtos de origem animal foram  provenientes de fontes que não constituíam risco sanitário ou que foram tratadas antes da  utilização de modo a evitar tal risco; c) Foi protegido pela adição dos antibióticos seguintes, nas quantidades necessárias para obtenção  das concentrações indicadas na diluição final de sémen: não inferior a: - 500 unidades internacionais (UI) por ml de estreptomicina, - 500 unidades internacionais (UI) por ml de penicilina, - 150 ìg por ml de lincomicina, - 300 ìg por ml de espectinomicina, e mantido, imediatamente a seguir, a uma temperatura não inferior a 5 °C (41 °F) por um período não  inferior a 45 minutos, ou não inferior a: -  50 ìg por ml de tilosina, - 250 ìg por ml de gentamicina, - 150 ìg por ml de lincomicina, - 300 ìg por ml de espectinomicina, sendo o contacto entre o antibiótico e o sémen não diluído mantido durante pelo menos três minutos  à temperatura a que foram misturados e o sémen e a fracção não glicérica do diluente mantidos a uma  temperatura não inferior a 5 °C (41 °F) durante pelo menos duas horas; d) Foi colocado em recipientes individuais (palhetas) com a indicação da data de colheita, da raça  e identificação do animal dador e a identificação do centro autorizado de colheita, podendo essa  informação, na totalidade ou em parte, ser marcada em código, desde que uma chave de tal código  tenha sido colocada à disposição da autoridade competente do Estado-membro importador e desde que  haja uma correspondência clara entre as indicações de cada palheta e a identificação contida neste  certificado; e) Foi armazenado, em recipientes cuidadosamente limpos e desinfectados ou esterilizados, conforme  o caso, antes do uso e utilizando agentes criogénicos que não foram anteriormente usados para  nenhum outro produto de origem animal, no centro autorizado de colheita de sémen, sob a supervisão  do veterinário do centro e por um período não inferior a trinta dias antes da expedição; f) Não foi exportado após obtenção de resultados positivos em nenhum animal do centro, excepto nos  testes da febre catarral ou da doença hemorrágica epizoótica, em conformidade com o previsto no n°  1 do artigo 1o da Decisão 91/479/CEE da Comissão, ou no teste da rinotraqueíte infecciosa  bovina/vulvovaginite pustulosa infecciosa, conforme previsto numa derrogação concedida nos termos  da alínea d), subalínea iv), do n° 3 do presente anexo e antes de o estatuto sanitário do centro  ter sido restabelecido; g) Expedido em recipientes cuidadosamente limpos e desinfectados ou esterilizados, conforme o caso,  antes do uso e utilizando agentes criogénicos que não foram anteriormente usados para nenhum outro  produto de origem animal, tendo os recipentes sido selados sob a supervisão do veterinário federal  antes de serem expedidos do centro autorizado de colheita de sémen. >POSIÇÃO NUMA TABELA>  ANEXO I B CERTIFICADO SUPLEMENTAR para a transferência de sémen de um contentor para  outro, para expedição para a Comunidade Económica Europeia a partir dos Estados Unidos da América  Eu, abaixo assinado, veterinário oficial, declaro que o sémen a que os certificados e selos abaixo  indicados se referem foi transferido, num centro autorizado de colheita de sémen e sob a minha  supervisão directa, dos contentores em que foi recebido, cujos selos estavam intactos, para o  contentor em que vai ser expedido para a Comunidade Económica Europeia. >POSIÇÃO NUMA TABELA> ANEXO II A Processo para a classificação como isento de febre catarral de sémen de  bovino destinado à exportação para a Comunidade Económica Europeia a partir dos Estados Unidos da  América 1. Todos os animais da espécie bovina no centro autorizado de colheita de sémen são  submetidos, antes da entrada no centro e a intervalos de seis meses daí em diante, a uma prova  Elisa de bloqueio para os anticorpos do vírus da febre catarral e a um ensaio de imunodifusão em  ágar-gel para todas as variedades do vírus da doença hemorrágica epizoótica conhecidas nos Estados  Unidos da América, de acordo com os protocolos estabelecidos no anexo IV. 2. Um animal que apresente resultados negativos aquando da última realização dos testes referidos  no n° 1 é definido, para efeitos da presente decisão, como seronegativo relativamente à febre  catarral a não ser que, ou até que, o seu sangue ou sémen apresentem resultados positivos para  qualquer dos testes referidos no presente anexo ou no anexo III. 3. O período isento de vectores relativamente a um centro autorizado de colheita de sémen é  definido, para efeitos da presente decisão, como o período com início vinte e um dias após a data,  determinada pelo United States Department of Agriculture e comunicada imediatamente aos  responsáveis pelo centro autorizado de colheita de sémen em causa e à Comissão das Comunidades  Europeias, em que cessa, na região em que o centro está localizado, toda a actividade das espécies  de culicóides capazes de transmitir o vírus da febre catarral ou da doença hemorrágica epizoótica,  e com termo vinte e um dias antes da data, determinada e comunicada do mesmo modo, em que a  actividade de culicóides tem novamente início. 4. O período de colheita de sémen, relativamente à colheita de sémen para exportação para a  Comunidade, é definido, para efeitos da presente decisão, como um período não superior a três  semanas durante o qual esse sémen é colhido. Se o período efectivo durante o qual esse sémen é  colhido for superior a três semanas, esse período é dividido em dois ou mais períodos de colheita,  dos quais nenhum é superior a três semanas e sendo cada um considerado como um período separado de  colheita no que diz respeito à realização dos ensaios e processos relacionados com a febre catarral  e a doença hemorrágica epizoótica referidos na presente decisão. 5. Todo o sémen abrangido por qualquer das categorias a seguir descritas é classificado como isento  de febre catarral para efeitos da sua exportação para a Comunidade Europeia: a) Sémen colhido durante o período isento de vectores de um touro seronegativo relativamente à  febre catarral, quando uma amostra de sangue do animal em questão, colhida vinte e um dias após o  termo do período de colheita do sémen, foi submetida, com resultado negativo, a um ensaio Elisa  para os anticorpos do vírus da febre catarral e a um ensaio de imunodifusão em ágar-gel para os  anticorpos de todos os serótipos do vírus da doença hemorrágica epizoótica cuja ocorrência nos  Estados Unidos da América é conhecida, de acordo com os protocolos estabelecidos no anexo IV; b) Sémen colhido fora do período isento de vectores de um touro seronegativo, quando uma amostra de  sangue do animal em questão, colhida vinte e um dias após o termo do período de colheita do sémen,  foi submetida, com resultado negativo, a um ensaio Elisa para os anticorpos do vírus da febre  catarral e a um ensaio de imunodifusão em ágar-gel para anticorpos de todos os serótipos do vírus  da doença hemorrágica epizoótica cuja ocorrência nos Estados Unidos da América é conhecida, de  acordo com os protocolos estabelecidos no anexo IV, e quando amostras de sangue retiradas ao touro  nas datas de colheita do sémen destinado à exportação foram submetidas, com resultados negativos,  ao processo para isolamento do vírus descrito no anexo III.  ANEXO II B Processo para a classificação como testado para a febre catarral de sémen de  bovino destinado à exportação para a Comunidade Económica Europeia a partir dos Estados Unidos da  América 1. São aplicáveis as definições constantes do anexo IIA. 2. Todo o sémen abrangido por qualquer das categorias a seguir descritas é classificado como  testado para a febre catarral para efeitos da sua exportação para a Comunidade Europeia: a) Sémen colhido durante o período isento de vectores de um animal que não é seronegativo  relativamente à febre catarral, quando a comparação de uma amostra de sangue colhida no início do  período isento de vectores com uma amostra colhida vinte e um dias após o termo do período de  colheita de sémen não indica ter havido nem seroconversão nem um aumento de quatro vezes ou mais no  nível dos anticorpos neutralizadores do soro de nenhum dos serótipos do vírus da febre catarral ou  do vírus da doença hemorrágica enzoótica cuja ocorrência nos Estados Unidos da América é conhecida  e quando amostras de sangue retiradas ao animal nas datas de colheita do sémen destinado à  exportação para a Comunidade foram submetidas, com resultados negativos, ao processo para  isolamento do vírus descrito no anexo III; b) Sémen colhido em qualquer altura do ano de um animal que não é seronegativo, quando a comparação  de uma amostra de sangue colhida no início do período de colheita de sémen com uma amostra colhida  vinte e um dias após o termo do mesmo período não indica ter havido nem seróconversão nem um  aumento de quatro vezes ou mais no nível dos anticorpos neutralizadores do soro de nenhum dos  serótipos do vírus da febre catarral ou da doença hemorrágica enzoótica cuja ocorrência nos Estados  Unidos da América é conhecida, e quando amostras de sangue retiradas ao animal nas datas de  colheita do sémen destinado à exportação foram submetidas, com resultados negativos, ao processo  para isolamento do vírus descrito no anexo III. 3. A certificação do sémen testado para a febre catarral e do sémen definido como isento de febre  catarral deve ser feita separadamente em conformidade com o previsto no anexo IIA.  ANEXO III Processo de isolamento do vírus para detecção do vírus da febre catarral em  sangue em relação com a exportação de sémen de bovino para a Comunidade Económica Europeia a partir  dos Estados Unidos da América 1. O sangue é retirado ao touro no dia de realização de cada  colheita de sémen destinado à exportação (normalmente duas vezes por semana) e inoculado num  período não superior a quarenta e oito horas após a colheita, por via subcutânea e intradérmica,  numa ovelha classificada como seronegativa através da realização, antes da inoculação, de uma prova  Elisa de bloqueio. 2. O sangue para o isolamento do vírus é retirado duas vezes semana à ovelha durante um período de  três semanas com início no dia da primeira inoculação referida no n° 1. 3. O sangue retirado ao touro e à ovelha é inoculado, num período não superior a quarenta e oito  horas após a colheita, em, pelo menos, seis ovos de galinha com embriões de 11 dias. 4. Se após sete dias os embriões não tiverem morrido, ou se a sua morte ocorrer até dois dias  depois da inoculação sem apresentarem lesões específicas, o teste é considerado negativo. 5. O material de qualquer embrião que morra entre o segundo e o sétimo dia é posto em incubação em  ovos de galinha com embriões de 11 dias, utilizando pelo menos seis ovos por embrião morto. 6. Se a incubação do material de um embrião morto tiver como resultado, a nível dos embriões, uma  mortalidade de 50 % ou mais, o teste é considerado positivo. Após a sua adaptação à cultura de  células, o serótipo do(s) vírus é determinado a fim de confirmar a presença do vírus da febre  catarral. 7. O soro é retirado ao touro duas vezes por semana e à ovelha uma vez por semana durante um  período de três semanas e é submetido à prova Elisa de bloqueio descrita no anexo IVA, a um ensaio  de seroneutralização para os anticorpos do vírus da febre catarral, ao ensaio de imunodifusão em  ágar-gel descrito no anexo IVB e a um ensaio de seroneutralização para os anticorpos do vírus da  doença hemorrágica epizoótica. 8. A ovelha é novamente submetida a uma prova Elisa de bloqueio vinte e um dias após a última  inoculação do sangue do touro. 9. A seroconversão ou um aumento de quatro vezes ou mais no título de anticorpos no touro ou na  ovelha indica a existência de uma infecção nesse momento ou de uma infecção recente e o ensaio é  considerado positivo. 10. Os testes serológicos são realizados simultaneamente em todas as amostras no final do período  de colheita. 11. O sémen só pode ser exportado após conclusão, com resultados negativos, de todos os testes.  ANEXO IV A Protocolo para uma prova de imunoabsorção enzimática de bloqueio ou  competitiva utilizando um anticorpo monoclonal específico de grupo para a detecção dos anticorpos  do vírus da febre catarral PROVA ELISA COMPETITIVA UTILIZANDO O ANTICORPO MONOCLONAL 3-17-A3 A prova Elisa competitiva realizada com o anticorpo monoclonal 3-17-A3 permite detectar anticorpos  de todos os serotipos conhecidos do vírus da febre catarral (VFC). O fundamento da prova é a interrupção da reacção entre o antigénio do VFC e um anticorpo monoclonal  específico de grupo (3-17-A3) por adição de soro de ensaio a diferentes diluições. Os anticorpos de  VFC presentes no soro de ensaio bloqueiam a reactividade do anticorpo monoclonal (AMC), o que  origina uma redução do desenvolvimento esperado da cor resultante da adição de substrato  enzimático. Material e reagentes: 1. Placas de microtítulo de fundo plano. 2. Antigénio: preparado como anteriormente descrito. 3. Tampão de bloqueio: 5 % (p/v) pó de leite seco «Marvel», 0,1 % (v/v) Tween-20 (fornecido em  xarope monolaurato de polioxietileno sorbitol) em sistema tampão fosfatado (STF). 4. Anticorpo monoclonal (AMC): 3-17-A3 (fornecido na forma de sobrenadante da cultura de tecidos de  hibridoma), armazenado a  20 °C ou liofilizado, diluído a 1/50 com um tampão de bloqueio antes da  utilização, dirigido contra o polipeptido p7 específico do grupo. 5. Conjugado: globulina de coelho anti-rato (adsorvida e eluída), conjugada com peroxidase de  rábano silvestre e mantida ao abrigo da luz a 4 °C. 6. Substrato e cromogénio: 0,2 g de ortofenileno diamina (OFD) dissolvidos num tampão que consiste  em 2,553 g de ácido cítrico e 4,574 g de hidrogenortofosfato dissódico perfazendo até 500 ml com  água destilada, dividido em alíquotas de 25 ml e mantido ao abrigo da luz a  20 °C ; imediatamento  antes da utilização, são adicionados 12 ìl/25 ml de peróxido de hidrogénio (30 % p/v). Manipular cuidadosamente o OFD - utilizar luvas de borracha - suspeita de efeito mutagénico 7. Ácido sulfúrico 1 molar: 26,6 ml de ácido, adicionados a 473,4 ml de água destilada. Não esquecer - adicionar sempre o ácido à água, nunca a água ao ácido. 8. Agitador orbital. 9. Leitor de placa Elisa (a prova pode ser lida visualmente). Formato de ensaio >POSIÇÃO NUMA TABELA>Protocolo de ensaio Controlo em branco A faixa 1, de A a H, representa um controlo em branco que compreende o antigénio do VFC e um  conjugado. Pode ser utilizado para aferir o leitor Elisa. Controlo do AMC A faixa 2, de A a H, representa o controlo do AMC e compreende o antigénio do VFC, o AMC e o  conjugado. Trata-se de um controlo negativo. A média dos valores da densidade óptica desta faixa de  controlo corresponde ao valor de inibição de 0 %. Controlo positivo A faixa 3, de A a H, representa o controlo positivo. Compreende o antigénio do VFC, as diluições de  anti-soro positivo do VFC, o AMC e o conjugado. Trata-se de um indicador de que o ensaio está a  decorrer com normalidade, devendo ser obtidos, de ensaio para ensaio, níveis de inibição  equivalentes. Soros de ensaio No formato de ensaio atrás indicado podem ser ensaiados 18 soros às diluições de 1/2, 1/4, 1/8 e  1/16. Obter-se-ão, desta forma, informações relativas ao título do anticorpo nos soros a ensaiar. A  gama de diluições poderia ser alargada para obter títulos finais de diluição do soro. Por outro  lado, para estudos serológicos em grande escala, o soro pode ser ensaiado a uma único diluição  (1/4) ou a duas diluições (1/2 e 1/4) como prova rápida de controlo. Técnica 1. Diluir o antigénio do VFC à concentração pré-titulada em STF. Proceder à dissociação  ultra-sónica para dispersar os agregados do vírus (não dispondo do aparelho necessário, pipetar  vigorosamente) e adicionar 50 ìl a todas as cavidades de placa Elisa. Bater ligeiramente nos bordos  da placa para dispersar o antigénio. 2. Incubar a 37 °C durante 60 minutos num agitador orbital. Lavar as placas passando-as três vezes  por água e esvaziando as cavidades com STF não estéril e secar com um papel absorvente. 3. Adicionar 50 ìl de tampão de bloqueio por cavidade. Adicionar os soros de ensaio e um soro  positivo às cavidades adequadas e diluir o conteúdo da placa com a ajuda de uma pipeta de canais  múltiplos. Não adicionar soro nem ao controlo em branco nem ao controlo do AMC. 4. Imediatamente após a adição dos soros de ensaio, diluir o AMC em tampão de bloqueio (a uma  diluição pré-titulada) e adicionar 50 ìl a todas as cavidades da placa, excepto ao controlo em  branco. 5. Incubar 37 °C durante 60 minutos num agitator orbital. Lavar três vezes com STF e secar com um  papel absorvente. 6. Diluir o concentrado de coelho anti-rato a 1/5000 num tampão de bloqueio e adicionar 50 ìl a  todas as cavidades da placa. 7. Incubar 37 °C durante 60 minutos num agitador orbital. Lavar três vezes com STF e secar com um  papel absorvente. 8. Descongelar o OFD e imediatamente antes da utilização adicionar 12 ìl de peróxido de hidrogénio  a 30 % por cada 25 ml de OFD. Adicionar 50 ìl a todas as cavidades da placa. Aguardar que a cor se  desenvolva durante aproximadamente 10 minutos e parar a reacção com ácido sulfúrico 1 molar (50 ìl  por cavidade). A cor deve-se desenvolver nas cavidades de controlo AMC e nas cavidades que contêm  soros sem anticorpos do VFC. 9. Examinar e registar as placas, ou visualmente ou com recurso a um leitor espectrofotométrico. Análise dos resultados Calcular o valor médio da densidade óptica (DO) a partir dos controlos AMC. Esse valor representa o  valor de inibição de 0 %. Os valores da densidade óptica dos soros a testar são expressos em  valores de inibição percentuais e calculados por meio da fórmula seguinte: Valores de inibição percentuais = 100    DO na ausência do soro de ensaio  DO na presença do soro  de ensaio  × 100. Os valores de inibição superiores a 40 % para uma diluição do soro a 1/4 são considerados  positivos. A leitura visual é possível visto uma inibição de 40 % ser o mais baixo valor facilmente  visível a olho nu. Preparação do antigénio do VFC para o método Elisa 1. Lavar três vezes dez roux de células BHK-21 confluentes com um meio «Eagle» isento de soro e  infectar com o serótipo 1 do vírus da febre catarral num meio «Eagle» isento de soro. 2. Incubar a 37 °C e examinar diariamente o efeito citopatogénico (ECP). 3. Quando o ECP se tornar manifesto em 80 a 90 % da camada de células de cada roux, recolher o  vírus por agitação destacando as células aderentes ao vidro. 4. Centrifugar a 2 000 a 3 000 rpm (rotações por minuto) para agregar as células. 5. Deitar fora a fracção sobrenadante e colocar novamente as células em suspensão em  aproximadamente 30 ml de STF que contenha 1 % de «sarkosyl» e 2 ml de fluoreto de  fenolmetilsulfonil (lise). Isto pode provocar uma gelificação das células, podendo ser adicionado  mais lise para reduzir esse efeito. NB: o fluoreto de fenolmetilsulfonil é uma substância perigosa - manipular com muito cuidado. 6. Proceder à dissociação das células durante 60 segundos utilizando uma sonda ultra-sónica a uma  amplitude de 30 mícrons. 7. Centrifugar a 10 000 rpm durante 10 minutos. 8. Reservar a fracção sobrenadante a +4 °C e colocar o agregado de células remanescente em 10 a 20  ml de lise. 9. Proceder à dissociação ultra-sónica e clarificar, reservando a fracção sobrenadante em cada  fase, num total de três vezes. 10. Reunir as fracções sobrenadantes e centrifugar a 24 000 rpm durante 120 minutos a uma  temperatura de +4 °C sobre uma almofada de 5 ml de sucrose a 40 % (p/v em STF) utilizando tubos de  centrifugação Beckmann de 30 ml e um rotor SW 28. 11. Eliminar a fracção sobrenadante, escorrer cuidadosamente os tubos e suspender novamente o  agregado em STF por dissociação ultra-sónica. Reservar o antigénio em alíquotas a  70 °C. Titulação do antigénio do VFC para o método Elisa A titulação do antigénio da febre catarral para o método Elisa é feita pelo método indirecto Elisa.  Titulação de diluições a 1/2 do antigénio relativamente a uma diluição constante (1/50) de  anticorpo monoclonal 3-17-A3. O protocolo é o seguinte: Técnica 1. Diluir o antigénio do VFC em STF ao longo de uma placa de microtítulo numa série de diluições a  1/2 (50 ìl/cavidade) utilizando uma pipeta de canais múltiplos. 2. Incubar durante uma hora a 37 °C num agitator orbital. 3. Lavar três vezes as placas com STF. 4. Adicionar 50 ìl de anticorpo monoclonal 3-17-A3 (diluído a 1/50) a cada uma das cavidades da  placa de microtítulo. 5. Incubar durante uma hora a 37 °C num agitator orbital. 6. Lavar três vezes as placas com STF. 7. Adicionar 50 ìl de globulina de coelho anti-rato conjugada com peroxidase de rábano silvestre,  diluída numa concentração pré-titulada óptima, a cada cavidade da placa de microtítulo. 8. Incubar durante uma hora a 37 °C com um agitador orbital. 9. Adicionar um substrato e um cromogénio como indicado atrás. Parar a reacção após 10 minutos por  meio da adição de ácido sulfúrico 1 molar (50 ìl por cavidade). No ensaio competitivo o anticorpo monoclonal deve encontrar-se em excesso, devendo por essa razão  ser escolhida uma diluição de antigénio que se encontre na curva de titulação (e não na zona de  planalto) que resulte numa densidade óptica de aproximadamente 0,8 após 10 minutos.  ANEXO IV B Protocolo para uma prova de imunodifusão em ágar-gel para detecção dos  anticorpos da doença hemorrágica epizoótica A prova de imunodifusão em ágar-gel é realizada de  acordo com o protocolo seguinte: Material e reagentes Antigénio Preparar o antigénio, precipitando num sistema de cultura de células compatível com a multiplicação  rápida uma estirpe de referência do vírus da febre catarral. São recomendadas as células BHK ou  Vero. O antigénio está presente no fluido sobrenadante no termo do crescimento do vírus, mas, para  ser eficaz, a sua concentração deve ser 50 a 100 vezes superior. Esta concentração obtém-se através  de qualquer método padrão de concentração de proteínas; o vírus do antigénio pode ser inactivado  por meio da adição de 0,3 % (v/v) de beta-propiolactono. Soro de controlo positivo conhecido Utilizando o soro internacional de referência e antigénio, é produzido um soro-tipo nacional,  padronizado para obtenção de uma proporção óptima relativamente ao soro internacional de  referência, liofilizado e utilizado como o soro de controlo conhecido em cada ensaio.Soro de ensaio Técnica Deitar agarose a 1 % preparada num tampão de borato ou de barbitol de sódio, com um pH entre 8,5 e  9,0 numa placa de Petri a uma profundidade mínima de 3,0 mm. Cria-se no ágar uma estrutura de sete cavidades isentas de humidade, cada uma com 5,0 mm de  diâmetro. A estrutura consiste numa cavidade central e seis cavidades dispostas num círculo com um  raio de 3 mm: >INÍCIO DE GRÁFICO>1 6    2 × 5    3 4 >FIM DE GRÁFICO> Preencher a cavidade central com o antigénio padrão. As cavidades circundantes 2, 4 e 6 são  preenchidas com soro positivo e as 1, 3 e 5 com o soro de ensaio. O sistema é colocado em incubação durante um período que pode ir até 72 horas à temperatura  ambiente numa câmara húmida fechada. Interpretação Um soro de ensaio é positivo caso resulte na formação de uma linha de precipitina específica com o  antigénio e numa linha de identidade total com o soro de controlo. O soro de ensaio é negativo caso  se não forme uma linha específica e caso não deforme a linha correspondente ao soro de controlo. As  placas de Petri devem ser examinadas contra um fundo escuro e com uma iluminação indirecta.