CELEX: 31990L0676
Language: it
Date: 1990-12-13 00:00:00
Title: Direttiva 90/676/CEE del Consiglio, del 13 dicembre 1990, che modifica la direttiva 81/851/CEE per il ravvicinamento delle legislazioni degli Stati Membri relative ai medicinali veterinari

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31990L0676

Direttiva 90/676/CEE del Consiglio, del 13 dicembre 1990, che modifica la direttiva 81/851/CEE per il ravvicinamento delle legislazioni degli Stati Membri relative ai medicinali veterinari  

Gazzetta ufficiale n. L 373 del 31/12/1990 pag. 0015 - 0025 edizione speciale finlandese: capitolo 13 tomo 20 pag. 0044  edizione speciale svedese/ capitolo 13 tomo 20 pag. 0044 

 DIRETTIVA DEL CONSIGLIO    del 13 dicembre 1990    che modifica la direttiva 81/851/CEE per il   ravvicinamento delle legislazioni degli Stati   membri relative ai medicinali veterinari     ( 90/676/CEE )    IL CONSIGLIO DELLE COMUNITÀ EUROPEE ,    visto il trattato che istituisce la Comunità economica   europea , in particolare l'articolo 100 A ,    vista la proposta della Commissione (1) ,    in cooperazione con il Parlamento europeo (2) ,    visto il parere del Comitato economico e sociale (3) ,    considerando che l'articolo 23 , paragrafo 2 della   direttiva 81/851/CEE (4) prevede che la Commissione   presenti al Consiglio una proposta contenente tutte   le misure appropriate per eliminare gli ostacoli che   ancora si oppongono alla libera circolazione dei   medicinali veterinari al più tardi quattro anni   dopo il termine per la messa in atto di tale   direttiva ;    considerando che le direttive riguardanti il ravvicinamento   delle legislazioni relative ai medicinali veterinari vanno   adeguate al progresso scientifico e migliorate per tener   conto dell'esperienza compiuta nel tempo trascorso dalla   loro adozione ;    considerando che , ai fini della pubblica sanità e   della libera circolazione dei medicinali veterinari ,   occorre che le competenti autorità dispongano di   tutte le informazioni utili relative ai medicinali   veterinari autorizzati , sotto forma di   prospetti approvati delle caratteristiche di tali   prodotti ;    considerando che il ravvicinamento delle legislazioni   realizzato in questo ambito dev'essere tale da   consentire ad un medicinale veterinario prodotto   e commercializzato in uno Stato membro in base   a disposizioni armonizzate di essere ammesso   in un altro Stato membro tenendo debito conto   dell'autorizzazione iniziale , salvo che in casi   eccezionali deferiti per parere al comitato   per i medicinali veterinari istituito dalla   direttiva 81/851/CEE ;    considerando che deve essere migliorato il sistema dei   foglietti illustrativi che accompagnano i medicinali   veterinari ;    considerando che è opportuno precisare meglio i casi   in cui non occorre fornire i risultati di prove   farmacologiche e tossicologiche oppure cliniche   per ottenere l'autorizzazione di un medicinale   veterinario essenzialmente analogo ad un prodotto   innovativo , garantendo al contempo che le ditte   innovatrici non siano messe in posizione di svantaggio ;   che vi sono tuttavia ragioni d'interesse pubblico   per non ripetere senza un motivo inderogabile prove   svolte sugli animali ;    considerando che è opportuno mantenere in essere le   garanzie riguardanti la qualità dei medicinali   veterinari prodotti nella Comunità richiedendo il   rispetto dei principi della buona prassi di   fabbricazione per questi medicinali , a prescindere   dalla loro destinazione finale ;    considerando che la Commissione dovrebbe avere il potere di   definire nei dettagli i principi sopraddetti , in stretta   cooperazione con il comitato per l'adeguamento al progresso   tecnico delle direttive volte all'eliminazione degli ostacoli   tecnici agli scambi nel settore dei medicinali veterinari ,   istituito dall'articolo 2 ter della direttiva 81/852/CEE del   Consiglio , del 28 settembre 1981 , per il ravvicinamento   delle legislazioni degli Stati membri relative alle   norme e ai protocolli analitici , tossicofarmacologici e   clinici in materia di prove effettuate su medicinali   veterinari (5) , modificata dalla direttiva 87/20/CEE (6) ;    considerando che occorre provvedere affinché i paesi   terzi vengano meglio informati in merito alle   modalità d'impiego dei medicinali veterinari   all'interno degli Stati membri e della Comunità ;    considerando che è opportuno adottare anche provvedimenti   per garantire che i distributori di medicinali veterinari   siano autorizzati dagli Stati membri e tengano adeguati   registri ,    HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA :    Articolo 1    La direttiva 81/851/CEE è modificata come segue :    1 ) Il testo dell'articolo 1 , paragrafo 5 è   sostituito dal testo seguente :     « 5 . Gli Stati membri prendono tutte le misure   necessarie affinché solo le persone abilitate dalla   rispettiva normativa nazionale vigente detengano o   posseggano medicinali veterinari o sostanze in grado   di venire impiegate come medicinali veterinari che   abbiano proprietà anabolizzanti , antiinfettive ,   antiparassitarie , antinfiammatorie , ormonali o   psicotrope .    Gli Stati membri tengono un registo dei produttori e   dei distributori autorizzati a possedere sostanze attive   che possano essere utilizzate nella fabbricazione dei   medicinali veterinari e che abbiano le proprietà di cui al   primo comma . Queste persone devono registrare in   modo particolareggiato tutte le transazioni   commerciali riguardanti le sostanze che possono   venire impiegate per la fabbricazione di medicinali   veterinari e tenere tali registri a disposizione delle   competenti autorità a fini d'ispezione per almeno   tre anni .    Le modifiche da apportare all'elenco di sostanze di   cui al primo comma sono adottate secondo la procedura   prevista all'articolo 2 , lettera c ) della direttiva   81/852/CEE (*) , modificate dalla direttiva 87/20/CEE   (**) .    (*) GU n. L 317 del 6 . 11 . 1981 , pag. 16 .    (**) GU n. L 15 del 17 . 1 . 1987 , pag. 34 . »    2 ) All'articolo 2 , paragrafo 1 , è aggiunto il comma   seguente :     « La presente direttiva si applica ai medicinali   veterinari impiegati allo scopo di indurre   un'immunità attiva o passiva o di diagnosticare   la situazione immunitaria conformemente alia   direttiva 90/676/CEE (***) che estende il   campo di applicazione della presente direttiva .    (***) GU n. L 373 del 31 . 12 . 1990 , pag. 15 . »    3 ) L'articolo 2 , paragrafo 2 , secondo e   quarto trattino è soppresso .    4 ) Il testo dell'articolo 4 è sostituito dal   testo seguente :     « Articolo 4    1 . Nessun medicinale veterinario può essere   commercializzato in uno Stato membro senza preventiva   autorizzazione rilasciata dalle competenti autorità   dello Stato membro di cui trattasi .    Tuttavia , quando la situazione sanitaria lo richiede ,   uno Stato membro può autorizzare la commercializzazione   o la somministrazione agli animali di medicinali   veterinari autorizzati in un altro Stato membro   conformemente alla presente direttiva .    In caso di malattie epidemiche gravi , gli Stati membri   possono temporaneamente permettere l'impiego di   medicinali veterinari ad azione immunologica senza   preventiva autorizzazione di immissione sul mercato , in   assenza di medicinali appropriati e dopo aver informato   la Commissione delle condizioni di impiego   particolareggiate .    2 . Gli Stati membri non autorizzano la   commercializzazione di medicinali veterinari destinati   alla somministrazione ad animali di cui le carni   o i prodotti sono destinati al consumo umano ,   a meno che :    a ) l'impiego della sostanza o delle sostanze   farmacologicamente attive contenue nel medicinale   veterinario sia autorizzato in altri medicinali   veterinari nello Stato membro in questione alla data   di entrata in vigore del regolamento ( CEE )   n. 2377/90 del Consiglio , del 26 giugno 1990 ,   che stabilisce una procedura comunitaria per la   fissazione dei limiti massimi dei residui di   medicinali veterinari negli alimenti di origine   animale (*) ;    b ) la sostanza o le sostanze farmacologicamente attive   siano incluse negli allegati I , II o III del regolamento   precitato .    3 . Nessun medicinale veterinario può essere   somministrato agli animali se non è stata   rilasciata l'autorizzazione di cui al paragrafo 1 ,   salvo che si tratti delle prove di medicinali   veterinari di cui all'articolo 5 , secondo comma ,   punto 10 , accettate dalle competenti autorità   nazionali , previa notifica o autorizzazione   conformemente alla normativa nazionale vigente .    Gli Stati membri consentono la commercializzazione di   alimenti ottenuti da animali trattati nel corso delle   prove di cui sopra solo se hanno accertato che tali   alimenti non contengono residui che possono costituire   un rischio per la salute umana .    Fatte salve le norme comunitarie o nazionali più severe   riguardanti la fornitura dei medicinali veterinari e per   tutelare la salute dell'uomo e degli animali , è   richiesta una ricetta per fornire al pubblico i seguenti   medicinali veterinari :    a ) i medicinali la cui fornitura o utilizzazione è   soggeta a restrizioni ufficiali , quali :     - le restrizioni che risultano dall'applicazione   delle pertinenti convenzioni delle Nazioni Unite   contro il traffico illecito di stupefacenti e di   psicotropi ;     - le restrizioni risultanti dalla legislazione   comunitaria ;    b ) i medicinali per i quali il veterinario deve prendere   precauzioni particolari per evitare qualsiasi rischio   inutile per :     - la specie cui è destinato il farmaco ;     - la persona che somministra i medicinali agli   animali ;     - il consumatore di alimenti ottenuti dall'animale   trattato ;     - l'ambiente ;    c ) i medicinali destinati a trattamenti o a processi   patologici che richiedono precise diagnosi   preventive o dal cui uso possono derivare   conseguenze tali da rendere difficile o da ostacolare   ulteriori interventi diagnostici o terapeutici ;    d ) le formule magistrali destinate agli animali .    Inoltre , una ricetta è richiesta per i nuovi   medicinali veterinari contenenti un principio attivo   la cui utilizzazione nei medicinali veterinari è   autorizzata da meno cinque anni , a meno che , tenuto   como delle informazioni o dei dettagli forniti   dal richiedente o dell'esperienza acquisita mediante   l'utilizzazione del prodotto in pratica , le autorità   competenti non abbiano accertato che nessuno   dei criteri previsti al terzo comma , lettere   da a ) a d ) va applicato .    4 . Tuttavia , eccezionalmente , qualora non esistano   medicinali autorizzati per un determinato morbo , in   particolare al fine di evitare agli animali sofferenze   inaccettabili , gli Stati membri possono consentire che   sia somministrata , da un veterinario ovvero sotto la sua   diretta responsabilità , ad uno o a pochi animali di   un'azienda determinata (**) :    a ) un medicinale veterinario il cui impiego sia   autorizzato nello Stato membro interessato per un'altra   specie animale o per altri animali della stessa specie   ma per un'altra affezione , oppure    b ) in mancanza di tale medicinale , un medicinale il cui   impiego sull'uomo sia stato autorizzato nello Stato   membro interessato a norma della direttiva 65/65/CEE ,   oppure    c ) se il medicinale di cui alla lettera b ) non esiste ed   entro i limiti imposti dalla normativa dello Stato   membro in questione , un medicinale veterinario   preparato estemporaneamente da una persona   autorizzata all'uopo secondo la legislazione nazionale ,   conformemente alle indicazioni contenute in   una prescrizione veterinaria ,    e a condizione che il medicinale , se somministrato agli   animali la cui carne o i cui prodotti sono destinati al   consumo umano , contenga soltanto sostanze presenti   in un medicinale veterinario autorizzato per tali animali   nello Stato membro in questione e il veterinario   responsabile specifichi un appropriato tempo d'attesa per   questi animali per garantire che gli alimenti prodotti   con gli animali trattati non contengano residui nocivi   per i consumatori .    I tempi d'attesta specificati , a meno che non siano   indicati sul medicinale impiegato per le specie   interessate , non possono essere inferiori a :     - uova : 7 giorni ,     - latte : 7 giorni ,     - carni di pollame e mammiferi , inclusi grasso e   frattaglie : 28 giorni ,     - carni di pesce : 500 gradi/giorno .    Il veterinario tiene un'adeguata registrazione di tutte le   opportune informazioni - quali la data dell'esame   degli animali , l'identificazione del proprietario , il   numero di animali trattato , la diagnosi clinica , i   medicinali prescritti , le dosi somministrate , la durata   del trattamento ed i tempi d'attesa raccomandati . Egli   tiene questa documentazione a disposizione delle   autorità competenti a fini d'ispezione , per almeno   tre anni . Gli Stati membri possono estendere questo   obbligo ad animali diversi dagli animali di cui le carni   o i prodotti sono destinati al consumo umano .    5 . In deroga al paragrafo 3 , gli Stati membri   provvedono affinché i veterinari che prestano servizio   in un altro Stato membro possano recar seco e   somministrare agli animali quantitativi ridotti   di medicinali veterinari già preparati che non   superino il fabbisogno quotidiano , ad esclusione   tuttavia di quelli dotati d'azione immunologica ,   se tali medicinali non sono autorizzati   nello Stato membro il cui vengono prestati i servizi del   veterinario ( Stato membro ospitante ) , purché   ricorrano le seguenti condizioni :    a ) l'autorizzazione della commercializzazione di cui al   paragrafo 1 sia stata concessa dalle competenti   autorità dello Stato membro in cui il veterinario è   stabilito ;    b ) i medicinali veterinari siano trasportati dal   veterinario nell'imballaggio d'origine del   produttore ;    c ) i medicinali veterinari destinati alla   somministrazione ad animali da produzione alimentare abbiano   una composizione qualitativamente e quantitativamente   identica , in ordine ai principi attivi , a quella   dei prodotti il cui impiego è autorizzato a norma del   paragrafo 1 nello Stato membro ospitante ;    d ) il veterinario che presta servizio in un altro Stato   membro si tenga al corrente delle buone prassi   veterinarie seguite in detto Stato membro . Egli   provvede affinché sia rispettato il tempo di attesa   specificato sull'etichetta del medicinale veterinario ,   a meno che non si possa ragionevolmente ritenere   che egli sappia che , per osservare queste buone   prassi veterinarie , dovrebbe essere indicato un   tempo di attesa più lungo ;    e ) il veterinario non fornisca alcun medicinale   veterinario al proprietario od al custode degli animali   trattati nello Stato membro ospitante , a meno che   ciò non sia ammesso in forza della legislazione dello   Stato membro ospitante in questione ; in questo   caso fornisce il medicinale veterinario soltanto per   gli animali di cui si occupa e unicamente nelle   quantità minime necessarie per concludere il   trattamento degli animali in parola ;    f ) il veterinario sia tenuto a registrare in modo   dettagliato gli animali trattati , la diagnosi , i   medicinali veterinari somministrati , il loro   dosaggio , la durata del trattamento ed il tempo   d'attesa applicato . Queste registrazioni vanno tenute   a disposizione delle competenti autorità dello Stato   ospitante a fini d'ispezione per almeno tre anni ;    g ) la gamma e la quantità di medicinali veterinari   detenuti dal veterinario non superino quelle   generalmente necessarie per le esigenze quotidiane di   una buona prassi veterinaria .    (*) GU n. L 224 del 18 . 8 . 1990 , pag. 1 .    (**) L'espressione " ad uno o a pochi animali di   un'azienda determinata " comprende anche gli   animali di compagnia e deve essere interpretata in   maniera più elastica per le specie animali minori   od esotiche che non producono alimenti . »    5 ) Il testo dell'articolo 5 è sostituito dal   testo seguente :     « Articolo 5    Al fine di ottenere l'autorizzazione di cui   all'articolo 4 , il responsabile della commercializzazione   presenta domanda alle competenti autorità dello Stato   membro .    Detta domanda è corredata delle informazioni e dei   documenti seguenti :    1 ) nome o ragione sociale e domicilio o sede sociale   del responsabile della commercializzazione e ,   qualora non coincidano , del fabbricante o dei   fabbricanti interessati e delle località nelle quali ha   luogo l'attività produttiva ;    2 ) denominazione del medicinale veterinario   ( denominazione di fantasia , denominazione corrente ,   accompaganata o no da un marchio o dal nome del   fabbricante , o denominazione scientifica o formula ,   accompagnata o no da un marchio o dal nome del   fabbricante ) ;    3 ) composizione qualitativa e quantitativa di tutti i   componenti del medicinale veterinario in termini   usuali , escluse le formule chimiche grezze , unitamente   alla denominazione comune internazionale raccomandata   dall'Organizzazione mondiale della sanità , nel   caso in cui tale denominazione esista ;    4 ) descrizione del metodo di preparazione ;    5 ) indicazioni terapeutiche , controindicazioni ed   effetti collaterali ;    6 ) posologia per le diverse specie animali cui il   medicinale veterinario è destinato , forma farmaceutica ,   modo e via di somministrazione e durata limite di   utilizzazione ;    7 ) se del caso , spiegazioni sulle misure di   precauzione e di sicurezza da prendersi per il   magazzinaggio del prodotto , nel corso della   somministrazione ad animali e per l'eliminazione dei   rifiuti , unitamente ad un'indicazione dei rischi   potenziali che il prodotto presenta per l'ambiente e   per la salute dell'uomo , degli animali o delle piante ;    8 ) indicazione del tempo di attesa che deve   intercorrere tra l'ultima somministrazione del medicinale   veterinario all'animale nelle normali condizioni   d'impiego e l'ottenimento dei prodotti alimentari   dall'animale in questione , per garantire che detti   prodotti non contengano residui in quantità   superiori ai limiti massimi fissati . All'occorrenza ,   il richiedente propone e giustifica un livello limite   dei residui tale da poter essere ammesso negli   alimenti senza rischi per il consumatore , unitamente   a metodi di analisi di routine che possano essere   utilizzati dalle autorità competenti per   l'individuazione dei residui ;    9 ) descrizione dei metodi di controllo utilizzati dal   fabbricante ( analisi qualitativa e quantitativa dei   componenti e del prodotto finito ; prove specifiche ,   ad esemplo prove di sterilità ; ricerca delle   sostanze pirogene ; ricerca dei metalli pesanti ;   prove di stabilità ; prove biologiche e di tossicità ;   controlli dei prodotti intermedi della fabbricazione ) ;    10 ) risultati delle prove :     - fisico-chimiche , biologiche o microbiologiche ,     - tossicologiche e farmacologiche ,     - cliniche .    Tuttavia , fatta salva la normativa in materia   di tutela della proprietà industriale e commerciale :    a ) il richiedente non sarà tenuto a fornire il   risultato di prove tossicologiche , farmacologiche   e cliniche qualora possa dimostrare che :    i ) il medicinale veterinario in questione   risulta sostanzialmente analogo ad un prodotto   il cui impiego è autorizzato nello Stato membro   paese nel quale è stata presentata la richiesta   e che il responsabile della commercializzazione   del medicinale veterinario originale ha acconsentito   a che i riferimenti tossicologici , farmacologici   o clinici contenuti nel fascicolo relativo allo   stesso medicinale veterinario originale venissero   utilizzati anche nell'esame della richiesta in questione ;    ii ) ovvero , mediante riferimenti particolareggiati   alla letteratura scentifica presentata conformemente   all'articolo 1 , secondo comma della direttiva 81/852/CEE ,   modificata dalla direttiva 87/20/CEE , che il componente   od i componenti del medicinale veterinario in questione   hanno un impiego consolidato nella prassi farmaceutica ,   con un'efficacia riconosciuta ed un livello accettabile di   innocuità ;    iii ) ovvero che il medicinale veterinario è   essenzialmente analogo ad un prodotto autorizzato   secondo le disposizioni comunitarie in vigore   da almeno sei anni nella Comunità e commercializzato   nello Stato membro interessato dalla domanda .   Questo periodo è portato a dieci anni quando   si tratta di un medicinale di alta tecnologia   ai sensi della parte A dell'allegato alla direttiva   87/22/CEE (*) o di un medicinale ai sensi della parte B   dell'allegato a detta direttiva , il quale abbia seguito   la procedura prevista all'articolo 2 di quest'ultima .   Inoltre , uno Stato membro può altresì estendere questo   periodo a dieci anni con decisione unica concernente   tutti i prodotti immessi in commercio nel suo territorio   se ritiene che le esigenze della salute pubblica   lo richiedano . Gli Stati membri possono non applicare   il periodo di sei anni di cui sopra oltre la data   di scadenza di un brevetto che protegge il prodotto   originale ;    b ) nel caso di medicinali veterinari nuovi che   contengano componenti noti ma non ancora associati   a scopo terapeutico , vanno forniti i risultati   delle prove tossicologiche , farmacologiche e   cliniche riguardanti la combinazione in questione   ma non occorre fornire riferimenti riguardanti i   singoli componenti ;    11 ) un prospetto , conforme a quanto disposto   dall'articolo 5 bis , delle caratteristiche del prodotto ,   uno o più campioni o modelli del supporto di vendita   unitamente al foglietto illustrativo di cui all'articolo 48 ,   paragrafo 1 ;    12 ) un documento che dimostri che nel suo paese il   fabbricante è autorizzato a produrre medicinali   veterinari ;    13 ) qualsiasi autorizzazione alla commercializzazione   relativa al medicinale veterinario in questione   ottenuta in un altro Stato membro od in un paese   terzo , unitamente ad un elenco dei paesi nei , quali è   stata presentata una richiesta d'autorizzazione   alla commercializzazione e ad una illustrazione   dei motivi per cui uno Stato membro o paese terzo   abbia eventualmente negato il rilascio di detta   autorizzazione per il medicinale veterinario in questione ;    14 ) nel caso di medicinali contenenti nuovi principi   attivi che non sono citati negli allegati I , II o III del   regolamento ( CEE ) n. 2377/90 una copia dei   documenti presentati alla Commissione conformemente   all'allegato V di detto regolamento .    (*) GU n. 15 del 17 . 1 . 1987 , pag. 38 . »    6 ) È inserito l'articolo seguente :     « Articolo 5 bis    Il prospetto delle caratteristiche del prodotto di cui   all'articolo 5 , secondo comma , punto 2 , punto 11 ,   deve contenere le seguenti informazioni :    1 ) denominazione del medicinale veterinario ;    2 ) composizione qualitativa e quantitativa in termini   di principi attivi e componenti dell'eccipiente , la cui   conoscenza sia fondamentale per una corretta   somministrazione del medicinale . Qualora sia possibile ,   va utilizzata la denominazione internazionale   comune raccomandata dall'Organizzazione mondiale della   sanità ed in caso contrario la consueta denominazione   comune o la descrizione chimica ;    3 ) forma farmaceutica ;    4 ) proprietà farmacologiche e , se ed in quanto tali   informazioni risultino utili a fini terapeutici ,   particolari di natura farmacocinetica ;    5 ) particolari di natura clinica :    5.0 specie cui è destinato il farmaco ,    5.1 indicazioni per l'utilizzazione , con specificazione   delle specie cui si applicano ,    5.2 controindicazioni ,    5.3 effetti indesiderati ( frequenza e gravità ) ,    5.4 precauzioni speciali da prendere per l'impiego ,    5.5 impiego nel corso della gravidanza e   dell'allattamento ,    5.6 interazione con altri medicinali ed altre forme   d'interazione ,    5.7 posologia e metodo di somministrazione ,    5.8 dose eccessiva ( sintomi , procedura di emergenza   e antidoti ) ( se necessario )    5.9 avvertenze speciali per ciascuna delle specie   cui è destinato il farmaco ,    5.10 tempi d'attesa ,    5.11 precauzioni speciali che la persona che somministra   il prodotto agli animali deve prendere ;    6 ) particolari di natura farmaceutica :    6.1 incompatibilità ( gravi ) ,    6.2 durata limite per l'impiego , all'occorrenza   dopo la ricostituzione del prodotto e dopo che   il recipiente che lo contiene è stato aperto per   la prima volta ,    6.3 precauzione speciali da prendere per il   magazzinaggio ,    6.4 natura e contenuto del recipiente ,    6.5 nome o ragione sociale e domicilio o sede del   detentore dell'autorizzazione alla commercializzazione .    6.6 eventuali precauzioni speciali da prendere per   eliminare il prodotto inutilizzato o materiali di   rifiuto . »    7 ) È inserito l'articolo seguente :     « Articolo 5 ter    Quando viene rilasciata l'autorizzazione alla   commercializzazione di cui all'articolo 4 , paragrafo 1 ,   il responsabile dell'immissione in commercio del   prodotto in questione viene informato dalle competenti   autorità dello Stato membro interessato in merito al   prospetto da esse approvato delle caratteristiche del   prodotto . Le competenti autorità prendono tutte le misure   necessarie a garantire che le informazioni fornite nel   prospetto risultino conformi a quelle ammesse all'atto   di concedere l'autorizzazione alla commercializzazione   od in un momento successivo . »    8 ) Il testo dell'articolo 7 , ultima frase è   sostituito dal testo seguente :     « Le relazioni particolareggiate degli esperti fanno   parte della documentazione che il richiedente presenta   alle competenti autorità . Ogni relazione è   corredata di un breve curriculum vitae dell'esperto   che l'ha redatta . »    9 ) Il testo dell'articolo 9 , punto 2 è sostituito   dal testo seguente :     « 2 . possono sottoporre il medicinale , i suoi   principi attivi ed all'occorrenza prodotti intermedi   od altri componenti al controllo di un laboratorio   statale o di un laboratorio all'uopo designato   e si accertano che i metodi di controllo impiegati dal   fabbricante e descritti nella documentazione conformemente   all'articolo 5 , secondo comma , punto 9 , siano   soddisfacenti . »    10 ) All'articolo 9 è aggiunto il punto seguente :     « 4 . possono esigere che il richiedente presenti   sostanze in quantitativi necessari per controllare il   metodo analitico di rilevazione proposto dal   richiedente a norma dell'articolo 5 , secondo comma ,   punto 8 , e per applicarlo nelle prove di routine intese   a rilevare la presenza di residui dei medicinali   veterinari in questione . »    11 ) Il testo dell'articolo 14 è sostituito dal testo   seguente :     « Articolo 14    1 . Una volta che sia stata rilasciata   un'autorizzazione , il responsabile della commercializzazione   del prodotto deve , in relazione ai metodi di   controllo di cui all'articolo 5 , secondo comma ,   punto 9 , tenere conto del progresso tecnico e   scientifico ed introdurre qualsiasi modifica   che possa rivelarsi necessaria per consentire   di esaminare il medicinale veterinario con metodi   scientifici generalmente ammessi . Tali modifiche   deveno essere ammesse dalle competenti autorità   degli Stati membri interessati .    A richiesta delle autorità competenti , il responsabile   della commercializzazione procede anche al riesame   dei metodi analitici di rilevazione di cui   all'articolo 5 , secondo comma , punto 8 , e propone le   modificho eventualmente necessarie per tener conto del   progresso scientifico e tecnico .    2 . Il responsabile della commercializzazione   informa immediatamente le competenti autorità   di qualsiasi nuova informazione che possa comportare   modifiche delle informazioni e dei documenti di cui   all'articolo 5 ovvero del prospetto approvato delle   caratteristiche del prodotto di cui all'articolo 5 ter .   In particolare , il responsabile della commercializzazione   informa immediatamente le competenti autorità di   divieti o restrizioni imposte dalle competenti   autorità di uno qualsiasi dei paesi nei quali il   medicinale veterinario è commercializzato   e di qualsiasi reazione imprevista grave che si   verifichi negli animali o nell'uomo .    3 . Il responsabile della commercializzazione ha   l'obbligo di registrare tutti gli effetti indesiderati   che si verifichino nell'uomo o negli animali .   Le registrazioni suddette vanno conservate per almeno 5   anni e poste a disposizione delle competenti autorità   su loro richiesta .    4 . Il responsabile della commercializzazione   informa immediatamente le competenti autorità ,   onde ottenerne l'autorizzazione , in merito a qualsiasi   modifica che egli intenda apportare ai particolari   ed ai documenti di cui all'articolo 5 . »    12 ) Il testo dell'articolo 15 è sostituito dal testo   seguente :     « Articolo 15    L'autorizzazione è valida per un periodo di cinque   anni , rinnovabile di quinquennio in quinquennio , su   domanda del titolare presentata almeno tre mesi prima   della scadenza .    Tuttavia i medicinali che contengono sostanze attive   tra quelle figuranti nell'allegato III del regolamento   ( CEE ) n. 2377/90 sono autorizzati soltanto per il   periodo per cui è stato fissato un limite provvisorio ;   l'autorizzazione può essere rinnovata in caso di   proroga del limite provvisorio . »    13 ) Il capitolo IV della direttiva 81/851/CEE è   sostituito dal testo seguente :     « CAPITOLO IV    Comitato per i medicinali veterinari    Articolo 16    1 . Allo scopo di facilitare l'adozione da parte   degli Stati membri di un atteggiamento comune per   quanto concerne le decisioni di rilascio di   autorizzazione di immissione sul mercato e favorire così   la libera circolazione dei medicinali veterinari ,   è istituito un comitato per i medicinali   veterinari , in appresso denominato " comitato " ,   composto di rappresentanti degli Stati membri e   della Commissione .    2 . Il comitato , adito da uno Stato membro o dalla   Commissione , ha l'incarico di esaminare ,   conformemente agli articoli da 17 a 22 , i problemi   relativi all'applicazione degli articoli 11 , 36 e 49 .    3 . Il comitato stabilisce il proprio regolamento   interno , che viene pubblicato dalla Commissione .    Il regolamento interno prevede in particolare :     - la pubblicazione dei nomi e delle qualifiche dei   membri del comitato ;     - le opportune garanzie affinché i membri del   comitato compiano la loro missione con assoluta   imparzialità .    La Commissione tiene nei suoi locali un registro   soggetto ad ispezione pubblica , con l'inventario   di tutti gli interessi attraverso i quali i   membri del comitato e le persone che partecipano alle   discussioni sono legati all'industria farmaceutica .    Articolo 17    1 . Affinché si possa più facilmente ottenere   un'autorizzazione di immissione sul mercato in   almeno due altri Stati membri tenendo debitamente conto di   un'autorizzazione rilasciata in uno Stato membro ai sensi   dell'articolo 4 , il titolare di questa autorizzazione   può inoltrare presso le autorità competenti   degli Stati membri interessati una richiesta corredata   dei dati e documenti previsti agli articoli 5 ,   5 bis , e 5 ter .    Egli dichiara che tale fascicolo è identico a quello   accettato dal primo Stato membro , precisa le eventuali   aggiunte integrative che esso contiene e certifica che   tutti i fascicoli presentati nell'ambito di questa   procedura sono identici .    2 . Il titolare dell'autorizzazione di immissione sul   mercato avverte il comitato della richiesta ,   gli segnala gli Stati membri interessati e gli trasmette   copia dell'autorizzazione . Egli ne informa anche lo   Stato membro che gli ha rilasciato la prima   autorizzazione e gli trasmette le eventuali aggiunte   al fascicolo iniziale ; tale Stato può chiedere al   titolare tutte le informazioni e i documenti   che gli consentano di verificare l'identità dei   fascicoli presentati rispetto a quello sul quale esso ha   deliberato .    3 . Il titolare dell'autorizzazione d'immissione sul   mercato notifica al comitato le date di trasmissione   dei fascicoli agli Stati membri interessati ; tali   Stati accusano immediatamente ricevuta del fascicolo   al comitato e ai responsabili dell'immissione   sul mercato . Quando al comitato risulta che tutti gli   Stati membri interessati sono in possesso del fascicolo ,   esso informa senza indugio tutti gli Stati membri e il   richiedente della data alla quale l'ultimo Stato membro   interessato ha ricevuto il fascicolo . Gli   Stati membri interessati concedono un'autorizzazione   valida sul loro mercato , entro 120 giorni   a decorrere dalla data sopra indicata , tenendo   debitamente conto dell'autorizzazione rilasciata ai sensi   del paragrafo 1 oppure formulano un'opposizione motivata .    Articolo 18    1 . Qualora uno Stato membro ritenga di non poter   rilasciare l'autorizzazione di immissione sul mercato ,   esso trasmette al comitato e al responsabile   dell'immissione sul mercato della specialità   medicinale la sua opposizione motivata , conformemente   all'articolo 11 , entro i termini di cui all'articolo 17 ,   paragrafo 3 .    2 . Allo scadere del termine in questione si adisce il   comitato e si applica la procedura prevista agli   articoli 21 e 22 .    3 . Non appena riceve l'opposizione motivata di cui   al paragrafo 1 , il responsabile dell'immissione sul   mercato trasmette immediatamente al comitato una copia   delle informazioni e dei documenti di cui all'articolo 17 ,   paragrafo 1 .    Articolo 19    Quando un medicinale veterinario ha formato oggetto   di varie domande di autorizzazione all'immissione sul   mercato , presentate conformemente agli articoli 5 e 5   bis , e quando uno o più Stati membri hanno concesso   l'autorizzazione , mentre uno o più Stati membri   l'hanno rifiutata , uno degli Stati membri interessati   o la Commissione o il responsabile dell'immissione sul   mercato possono adire il comitato per applicare la procedura   di cui agli articoli 21 e 22 . Gli Stati membri   sono informati ogni volta che tale procedura venga   richiesta .    Altrettanto dicasi qualora uno o più Stati membri   abbiano sospeso o revocato un'autorizzazione all'immissione   sul mercato , mentre uno o più Stati membri non hanno   proceduto alla sospensione o revoca .    In entrambi i casi il responsabile dell'immissione   sul mercato della specialità medicinale viene   informato di un'eventuale decisione del comitato di applicare   la procedura prevista all'articolo 22 .    Articolo 20    In casi particolari che presentino un interesse   comunitario le autorità competenti degli Stati membri   possono adire il comitato prima di decidere in merito   a una domanda , sospensione o revoca di autorizzazione   all'immissione sul mercato .    Articolo 21    1 . Le competenti autorità redigono una relazione di   valutazione ed un commento del fascicolo sui risultati   delle prove analitiche , tossicofarmacologiche e cliniche   di qualsiasi medicinale veterinario contenente una   nuova sostanza attiva , che formi per la prima volta   oggetto di richieste di autorizzazione di immissione sul   mercato nello Stato membro interessato .    2 . Non appena ricevuta la notifica di cui   all'articolo 17 , le competenti autorità trasmettono   immediatamente agli altri Stato membri interessati   qualsiasi relazione di valutazione del medicinale   veterinario , accompagnata da un riassunto del fascicolo   relativo allo stesso . Tale relazione è trasmessa   anche al comitato , quando esso viene adito conformemente   all'articolo 18 .    Inoltre la relazione di valutazione è trasmessa   agli altri Stati membri interessati e al comitato , non   appena esso sia stato adito conformemente alla procedura   prevista all'articolo 19 . La relazione di valutazione ha   carattere riservato .    La relazione di cui sopra viene aggiornata dalle   competenti autorità , non appena esse siano   in possesso di informazioni importanti per valutare   l'equilibrio del rapporto efficacia/rischio .    Articolo 22    1 . Qualora venga fatto riferimento alla procedura   prevista dal presente articolo , il comitato delibera   ed emette un parere motivato entro 60 giorni a   decorrere dalla data in cui viene adito .    Nei casi previsti all'articolo 18 , il responsabile   dell'immissione sul mercato può , facendone richiesta ,   esporre le proprie ragioni oralmente o per iscritto   prima che il comitato emetta il proprio parere .   Il comitato può prolungare il termine di cui al primo comma   affinché il richiedente possa avere il tempo di   esporre le proprie ragioni oralmente o per iscritto .    Nel caso previsto all'articolo 19 , il responsabile   dell'immissione sul mercato può essere invitato   a esporre le sue ragioni oralmente o per iscritto .    2 . Il parere del comitato riguarda i motivi di   opposizione previsti all'articolo 18 , paragrafo 1   e i motivi per i quali l'autorizzazione di immissione   sul mercato è stata rifiutata , sospesa o   revocata , nei casi previsti all'articolo 19 .    Il comitato informa immediatamente lo Stato o gli Stati   membri interessati e il responsabile dell'immissione   sul mercato in merito al proprio parere o a quelli   dei propri membri in caso di pareri discordanti .    3 . Lo Stato o gli Stati membri interessati   si pronunciano sul seguito da dare al parere del   comitato entro un termine non superiore a 60 giorni a   decorrere dall'informazione di cui al paragrafo 2 .   Essi informano immediatamente il comitato della   loro decisione .    Articolo 23    La Commissione riferisce al Consiglio ogni due anni in   merito al funzionamento della procedura prevista nel   presente capitolo . »    14 ) Il testo dell'articolo 24 , paragrafo 1 è   sostituito dal testo seguente :     « 1 . Gli Stati membri prendono tutte le misure   opportune per garantire che la fabbricazione dei   medicinali veterinari sia subordinata al possesso   di un'autorizzazione . Tale autorizzazione alla   fabbricazione è prescritta anche nel caso in cui   medicinali veterinari fabbricati siano destinati   all'esportazione . »    15 ) All'articolo 24 , paragrafo 3 è   aggiunto il comma seguente :     « Gli Stati membri prendono tutte le opportune   misure per garantire che i medicinali veterinari   immessi nel loro territorio in provenienza da un paese   terzo e destinati ad un altro Stato membro siano muniti   di una copia dell'autorizzazione di cui al   paragrafo 1 . »    16 ) È inserito l'articolo seguente :     « Articolo 24 bis    Su richiesta del fabbricante , dell'esportatore o   delle autorità di un paese terzo importatore   gli Stati membri certificano che un fabbricante di   medicinali veterinari possiede l'autorizzazione di cui   all'articolo 24 . All'atto di rilasciare tali   certificati essi ottemperano alle seguenti condizioni :    1 ) gli Stati membri tengono conto delle disposizioni   amministrative vigenti dell'Organizzazione mondiale   della sanità ;    2 ) nel caso di medicinali veterinari destinati   all'esportazione che siano già autorizzati sul loro   territorio , gli Stati membri forniscono il   prospetto delle caratteristiche del prodotto   approvato conformemente all'articolo 5 ter o ,   in assenza di tale prospetto , un documento equivalente .    Qualora il fabbricante non sia in possesso di   un'autorizzazione alla commercializzazione , esso fornice   alle autorità competenti per il rilascio   del certificato di cui al primo comma una dichiarazione   che spieghi i motivi per cui un'autorizzazione alla   commercializzazione non è disponibile . »    17 ) All'articolo 27 sono inserite le   lettere seguenti :     « f ) ad uniformarsi al principio ed ai criteri   informatori della buona prassi di fabbricazione dei   medicinali stabiliti dalla legislazione comunitaria ;    g ) a registrare in modo particolareggiato tutti i   medicinali veterinari da esso forniti , compresi i   campioni , in conformità della legislazione del   paese della loro destinazione . Per ogni transazione   commerciale , a prescindere dal fatto che essa   comporti o no un pagamento , vanno registrate   almeno le seguenti informazioni :     - data ,     - nome del medicinale veterinario ,     - quantità fornita ,     - nome ed indirizzo del destinatario ,     - numero del lotto .    Queste registrazioni sono tenute a disposizione   delle competenti autorità a fini d'ispezione per   almeno tre anni . »    18 ) È inserito l'articolo seguente :     « Articolo 27 bis    I principi ed i criteri informatori della   buona prassi di fabbricazione per i medicinali cui si   fa riferimento nell'articolo 27 , lettera f ) , vanno   adottati sotto forma di direttiva indirizzata agli Stati   membri conformemente alla procedura prevista all'articolo 2   quater della direttiva 81/852/CEE , dopo aver preso   in considerazione la natura specifica dei medicinali   veterinari . La Commissione pubblica i principi   informatori particolareggiati , conformi a tali principi ,   e li rivede a seconda delle necessità per prendere   in considerazione il progresso scientifico e tecnico . »    19 ) Nell'articolo 34 :    a ) Il testo del primo comma è sostituito dal   testo seguente :     « Le autorità competenti dello Stato   membro interessato garantiscono , mediante   ispezioni ripetute , che siano osservate le   disposizioni di legge concernenti i medicinali   veterinari . »    b ) É aggiunto il comma seguente :     « Gli agenti che rappresentano l'autorità   competente riferiscono dopo ciascuna delle   ispezioni menzionate nel primo paragrafo in merito   all'osservanza da parte del fabbricante dei principi   e dei criteri informatori della bouna prassi   di fabricazione di cui all'articolo 27 bis . Il   fabbricante viene informato del contenuto di tali   rapporti . »    20 ) È aggiunto l'articolo seguente :     « Articolo 38 bis    Gli Stati membri adottano le opportune misure per   incoraggiare i veterinari e gli altri professionisti   interessati a riferire alle competenti autorità in   merito a qualsiasi effetto indesiderato dei medicinali   veterinari . »    21 ) L'articolo 39 è sostituito dal testo seguente :     « Articolo 39    Gli Stati membri prendono le opportune   disposizioni affinché le autorità competenti   interessate si comunichino reciprocamente le informazioni   atte segnatamente a garantire l'osservanza delle   prescrizioni necessarie per l'autorizzazione di cui   all'articolo 24 , paragrafo 1 o per l'autorizzazione   di immissione sul mercato , al fine di controllare che   siano rispettate le disposizioni del capitolo VIII .    Dietro richiesta motivata gli Stati membri trasmettono   immediatamente i rapporti menzionati all'articolo 34 ,   terzo comma alle competenti autorità di un altro   Stato membro . Qualora , dopo aver preso in esame i   rapporti , lo Stato membro che li riceve ritenga di non   poter accettare le conclusioni raggiunte dalle   competenti autorità dello Stato membro in cui il   rapporto è stato stilato , esso informa le competenti   autorità interessate dei propri motivi e ha la facoltà   di richiedere ulteriori informazioni . Gli Stati   membri interessati si sforzano di pervenire a un accordo .   Se necessario , in caso di gravi   divergenze di opinioni , la Commissione è   informata da uno degli Stati membri interessati . »    22 ) Il testo dell'articolo 42 è sostituito dal   testo seguente :     « Articolo 42    1 . Ogni Stato membro adotta tutte le opportune   disposizioni affinche le decisioni di autorizzazione   all'immissione in commercio , di rifiuto o di   revoca dell'autorizzazione all'immissione in commercio ,   di annullamento di una decisione di rifiuto o di revoca   dell'autorizzazione all'immissione in commercio , di   divieto di distribuzione , di ritiro dal mercato   e le loro motivazioni siano portate senza indugio   a conoscenza del comitato .    2 . Il responsabile della commercializzazione di un   medicinale veterinario è tenuto a comunicare   immediatamente agli Stati membri interessati qualunque   suo intervento volto a sospendere la commercializzazione   di un prodotto od a ritirarlo dal commercio , nonché   i motivi di tale azione qualora questa riguardi   l'efficacia del medicinale veterinario o la protezione   della pubblica sanità . Gli Stati membri provvedono   a che queste informazioni siano immediatamente portate   all'attenzione del comitato .    3 . Gli Stati membri provvedono affinché le   organizzazioni internazionali competenti in materia siano   informate immediatamente ed in modo adeguato circa   iniziative prese a norma dei paragrafi 1 e 2 che   siano tali da influenzare la tutela sanitaria in paesi   terzi e trasmettono al comitato una copia delle   informazioni fornite . »    23 ) L'articolo 43 , paragrafo 1 è cosi modificato :    a ) Il testo dei punti 1 e 2 è sostituito dal testo   seguente :     « 1 . la denominazione del medicinale veterinario ,   che puÒ essere una denominazione di fantasia o una   denominazione corrente accompagnata da un marchio o dal   nome del fabbricante , oppure una denominazione scientifica   o formula , accompagnata da un marchio o dal nome   del fabbricante .    Se la denominazione specifica di un medicionale   contenente solo una sostanza attiva è una   denominazione di fantasia , essa deve essere   accompagnata in modo chiaramente leggibile dalla   denominazione corrente internazionale   raccomandata dall'Organizzazione mondiale della   sanità o , in mancanza di essa , dalla consueta   denominazione corrente ;    2 . una dichiarazione dei principi attivi espressi   qualitativamente e quantitativamente per unità di   dosaggio oppure , a seconda della modalità di   somministrazione per un particolare peso o volume ,   utilizzando la denominazione corrente internazionale   raccomandata dall'Organizzazione mondiale della   sanità o , in assenza di essa , la consueta denominazione   comune ; » .    b ) Il testo dei punti 7 e 8 é sostituito   dal testo seguente :     « 7 . i tempi d'attesa , anche qualora essi   siano nulli , nel caso di medicinali veterinari   somministrati ad animali destinati alla produzione di   alimenti ;    8 . la data di scadenza in linguaggio corrente ; » .    c ) È inserito il punto seguente :     « 9 bis. Eventuali precauzioni speciali   da prendere per l'eliminazione del prodotto   inutilizzato o di materiali di scarto ; » .    24 ) Il testo dell'articolo 48 , primo comma   è sostituito dal testo seguente :     « L'inclusione di un foglietto illustrativo   nella confezione di medicinali veterinari è obbligatoria ,   a meno che tutte le informazioni prescritte dal   presente articolo figurino sul recipiente e sugli   imballaggi esterni . Gli Stati membri prendono tutte le   opportune misure per garantire che le informazioni   riportate sul foglietto illustrativo di un medicinale   veterinario interessato .   Il foglietto illustrativo deve essere   redatto nella lingua o nelle lingue ufficiali   dello Stato membro in cui il medicinale è   commercializzato . »    25 ) L'articolo 48 , secondo comma è così modificato :    a ) Il testo della lettera e ) è sostituito   dal testo seguente :     « e ) il tempo d'attesa , anche qualora esso   sia nullo , nel caso di medicinali veterinari   somministrati ed animali destinati alla produzione di   alimenti ; » .    b ) È aggiunta la lettera seguinte :     « h ) eventuali precauzioni speciali da prendere per   l'eliminazione del prodotto inutilizzato o di   materiali di scarto . » .    26 ) L'articolo 48 , ultimo comma è soppresso .    27 ) È inserito il capitolo seguente :     « CAPITOLO VIII bis   Distribuzione di medicinali veterinari    Articolo 50 bis    1 . Gli Stati membri prendono tutte le opportune   misure per garantire che il commercio all'ingrosso   di medicinali veterinari sia subordinato al possesso   di un'autorizzazione e che il periodo necessario   allo svolgimento della procedura per il rilascio   di tale autorizzazione non superi 90 giorni   decorrenti dalla data in cui le competenti autorità   ricevono la richiesta .    Ai fini della presente directiva , il commercio   all'ingrosso include l'acquisto , la vendita ,   l'importazione , l'esportazione o qualsiasi   altra transazione commerciale avente per oggetto   medicinali veterinari , a fini di lucro o meno ,   escludendo :     - la fornitura da parte di un fabbricante di   medicinali veterinari che egli stesso ha prodotto ;     - le forniture al dettaglio di medicinali veterinari   da parte di persone all'uopo autorizzate ai sensi   dell'articolo 50 ter .    Gli Stati membri possono inoltre escludere le forniture   di piccoli quantitativi di medicinali veterinari da   un dettagliante ad un altro .    2 . Per ottenere l'autorizzazione menzionata   nel paragrafo 1 , il richiedente deve disporre   di personale con competenze tecniche , di locali   e attrezzature idonei e sufficienti , rispondenti alle   prescrizioni di legge vigenti nello Stato membro   interessato in tema di magazzinaggio e manipolazione dei   prodotti in questione .    3 . Il detentore dell'autorizzazione menzionata   nel paragrafo 1 deve conservare una documentazione   particolareggiata , che contenga per ogni transazione   in entrata od uscita , almeno le seguenti informazioni :    a ) data ;    b ) identificazione precisa del medicinale veterinario ;    c ) numero del lotto di fabbricazione , data di scadenza ;    d ) quantità ricevuta o fornita ;    e ) nome ed indirizzo del fornitore o del destinatario .    Almeno una volta all'anno si esegue una verifica   particolareggiata , le forniture in entrata ed in uscita   vengono rapportate alle scorte detenute in quel momento   ed ogni discrepanza viene registrata .    Queste registrazioni sono tenute a disposizione   delle competenti autorità a fini di ispezione per   almeno tre anni .    4 . Gli Stati membri prendono tutte le opportune   misure per garantire che i grossisti forniscano i   medicinali veterinari soltanto a persone autorizzate   a svolgere attività di vendita al dettaglio conformemente   all'articolo 50 ter , ovvero ad altre persone   debitamente autorizzate a ricevere medicinali veterinari   dai grossisti .    Articolo 50 ter    1 . Gli Stati membri prendono tutte le opportune   misure per garantire che le vendite al dettaglio di   medicinali veterinari siano effettuate soltanto   da persone cui è consentito di svolgere tali operazioni   dalla legislazione dello Stato membro interessato .    2 . Ogni persona abilitata ai sensi del paragrafo 1 a   vendere prodotti veterinari deve tenere una documentazione   particolareggiata che contenga , per ogni transazione in   entrata od uscita , le seguenti informazioni :    a ) data ;    b ) identificazione precisa del medicinale   veterinario ;    c ) numero del lotto di fabbricazione ;    d ) quantità ricevuta o fornita ;    e ) nome ed indirizzo del fornitore o destinatario ;    f ) se del caso , nome ed indirizzo del veterinario   che ha prescritto il medicinale , nonché copia   della ricetta .    Almeno una volta all'anno si esegue una verifica   particolareggiata ; le forniture in entrata ed   uscita vengono rapportate alle scorte detenute in   quel momento ed ogni discrepanza viene registrata .    Queste registrazioni sono tenute a disposizione delle   competenti autorità a fini d'ispezione per almeno   tre anni .    3 . Gli Stati membri possono limitare la portata   delle prescrizioni di registrazione di cui al paragrafo 2 .   Tuttavia queste prescrizioni si applicano sempre in   caso di prodotti veterinari destinati ad   animali di cui le carni o i prodotti sono destinati al   consumo umano , ottenibili soltanto dietro presentazione   di una prescrizione veterinaria o nei confronti dei   quali va osservato un periodo di attesa .    4 . Al più tardi il 1 º gennaio 1992 , gli   Stati membri comunicano alla Commissione un elenco   dei medicinali veterinari disponibili e ottenibili   senza prescrizione .    Dopo aver preso atto della comunicazione degli   Stati membri la Commissione esamina se occorre   proporre adeguate misure per la redazione di un elenco   comunitario dei prodotti in questione .    Articolo 50 quater    Gli Stati membri si accertano che i proprietari   o i responsabili di animali destinati alla produzione   di alimenti possano giustificare l'acquisto , la   detenzione o la somministrazione di medicinali   veterinari contenenti le sostanze elencate nell'articolo 1 ,   paragrafo 5 ; gli Stati membri possono estendere questo   obbligo ad altri medicinali veterinari .    Segnatamente , essi possono esigere che sia tenuto   un registro contenente almeno le seguenti indicazioni :    a ) data ;    b ) identificazione del medicinale veterinario ;    c ) quantità ;    d ) nome e indirizzo del fornitore del medicinale ;    e ) identificazione degli animali sottoposti a   trattamento . »    Articolo 2    1 . Gli Stati membri prendono i provvedimenti   necessari per conformarsi alla presente direttiva entro   il 1 º gennaio 1992 . Essi ne informano immediatamente   la Commissione .    2 . In deroga al paragrafo 1 , gli Stati membri   prendono i provvedimenti necessari per conformarsi   all'articolo 27 , lettera f ) e all'articolo 34 ,   terzo comma , entro due anni dalla notifica della   direttiva di cui all'articolo 27 bis .    3 . Quando gli Stati membri adottano tali disposizioni ,   queste contengono un riferimento alla presente   direttiva o sono corredate da un siffatto riferimento   all'atto della pubblicazione ufficiale . Le modalità   di tale riferimento sono decise dagli Stati membri .    4 . Le richieste di autorizzazione alla   commercializzazione presentate a decorrere dalla data   di cui al paragrafo 1 devono essere conformi alla   presente direttiva .    5 . Entro quattro anni dalla data menzionata nel   paragrafo 1 , l'articolo 1 sarà all'occorrenza   progressivamente esteso ai medicinali veterinari   esistenti .    Articolo 3    Gli Stati membri sono destinatari della presente   direttiva .    Fatto a Bruxelles , addì 13 dicembre 1990 .    Per il Consiglio    Il Presidente    P. ROMITA    (*) GU n. L 224 del 18 . 8 . 1990 , pag. 1 .    (**) L'espressione " ad uno o a pochi animali di   un'azienda determinata " comprende anche gli   animali di compagnia e deve essere interpretata in   maniera più elastica per le specie animali   minori od esotiche che non producono alimenti . »    (1) GU n. C 61 del 10 . 3 . 1989 , pag. 11 e   GU n. C 131 del 30 . 5 . 1990 , pag. 16 .    (2) GU n. C 96 del 17 . 4 . 1990 , pag. 104 e decisione   del 21 novembre 1990 ( non ancora pubblicata   nella Gazzetta ufficiale ) .    (3) GU n. C 201 del 7 . 8 . 1989 , pag. 1 .    (4) GU n. L 317 del 6 . 11 . 1981 , pag. 1 .    (5) GU n. L 317 del 6 . 11 . 1981 , pag. 16 .    (6) GU n. L 15 del 17 . 1 . 1987 , pag. 34 .    DIRETTIVA DELLA COMMISSIONE    del 18 novembre 1987    recante nono adeguamento al progresso tecnico   della direttiva 67/548/CEE del Consiglio concernente   il ravvicinamento delle disposizioni legislative ,   regolamentari ed amministrative relative alla   classificazione , all'imballaggio e all'etichettatura   delle sostanze pericolose     ( 87/302/CEE )    LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE ,    visto il trattato che istituisce la Comunità   economica europea ,    vista la direttiva 67/548/CEE del Consiglio , del   27 giugno 1967 , concernente il ravvicinamento   delle disposizioni legislative , regolamentari ed   amministrative relative alla classificazione ,   all'imballaggio e all'etichettatura delle sostanze   pericolose (1) , modificata per la sesta volta dalla   direttiva 79/831/CEE (2) , in particolare l'articolo 19 ,    considerando che l'articolo 3 , paragrafo 1 della   direttiva 67/548/CEE stabilisce che le proprietà   fisico-chimiche , la tossicità e l'ecotossicità   delle sostanze e dei preparati sono determinate   conformemente ai metodi previsti all'allegato V ;    considerando che l'articolo 3 , paragrafo 2 della   direttiva 67/548/CEE stabilisce che la valutazione   del pericolo di una sostanza o di un preparato   per l'ambiente , sia pure in forma potenziale , è   effettuata in funzione delle caratteristiche   enumerate negli allegati VII e VIII ;    considerando che l'allegato V introdotto dalla   direttiva 84/449/CEE della Commissione (3) comprende   attualmente soltanto i metodi di prova che corrispondono   alle caratteristiche enumerate nell'allegato   VII , e che è necessario quindi prevedere metodi di prova   corrispondenti alle caratteristiche enumerate   nell'allegato VIII ;    considerando che le disposizioni della presente   direttiva sono conformi al parere del comitato   per l'adeguamento al progresso tecnico delle direttive   sull'eliminazione degli ostacoli tecnici al   commercio di sostanze e preparati pericolosi ,    HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA :    Articolo 1    Il testo dell'allegato della presente direttiva è   aggiunto all'allegato V della direttiva 67/548/CEE .    Articolo 2    Gli Stati membri adottano e pubblicano , anteriormente   al 31 dicembre 1988 , le disposizioni necessarie   per conformarsi alla presente direttiva . Essi ne informano   immediatamente la Commissione .    Essi applicano le presenti disposizioni entro e non   oltre il 30 giugno 1989 .    Articolo 3    Gli Stati membri sono destinatari della   presente direttiva .    Fatto a Bruxelles , il 18 novembre 1987 .    Per la Commissione    Stanley CLINTON DAVIS    Membro della Commissione    (1) GU n. 196 del 16 . 8 . 1967 , pag. 1 .    (2) GU n. L 259 del 15 . 10 . 1979 , pag. 10 .    (3) GU n. L 251 del 19 . 9 . 1984 , pag. 1 .    ALLEGATO    I metodi di prova descritti servono alla determinazione   di alcune proprietà tossicologiche ed ecotossicologiche   enumerate nell'allegato VIII della direttiva 79/831/CEE   del Consiglio . Sono descritti i metodi di prova   adatti al livello 1 e al livello 2 dell'allegato VIII ,   ma le prove non sono suddivise in funzione dei diversi   livelli .    SOMMARIO     * Pagina *    PARTE B : Metodi per la determinazione della   tossicità * 4 *    Introduzione generale : parte B * 4 *    Saggio di tossicità orale subcronica : saggio con   somministrazione orale ripetuta di dosi per 90 giorni usando   specie di roditori * 8 *    Saggio di tossicità orale subcronica : saggio   con somministrazione orale ripetuta di dosi per   90 giorni usando specie di non roditori * 12 *    Saggio di tossicità cutanea subcronica : saggio con   somministrazione cutanea ripetuta di dosi per 90 giorni   usando specie di non roditori * 16 *    Saggio di tossicità subcronica inalatoria : saggio   con somministrazione inalatoria ripetuta di dosi per 90   giorni usando specie di non roditori * 20 *    Saggio di teratogenesi : roditori e non roditori * 24 *    Saggio di tossicità cronica * 27 *    Saggio di cancerogenesi * 32 *    Saggio combinato di tossicità   cronica/cancerogenesi * 37 *    Saggio di tossicità sulla riproduzione : una   generazione * 43 *    Saggio di tossicità sulla riproduzione : due   generazioni * 47 *    Tossicocinetica * 51 *    Saggio di mutagenesi e prescreening di   cancerogenesi : * 55 *     - Mutazione genica : Saccharomyces cerevisiae * 55 *     - Ricombinazione mitotica : Saccharomyces   cerevisiae * 58 *     - Cellule di mammiferi in vitro : saggio di   mutazione genica * 61 *     - Danno e riparazione del DNA : sintesi non programmata   del DNA e cellule di mammifero in vitro * 64 *     - Saggio degli scambi tra cromatidi fratelli   in vitro * 68 *     - Saggio dei letali recessivi legati al sesso :   Drosophila melanogaster * 71 *     - Saggio in vitro di trasformazione di cellulose   di mammifero in vitro * 73 *     - Saggio dei letali dominanti nei roditori * 76 *     - Analisi citogenetica delle cellule germinali :   mammiferi * 79 *     - Saggio delle macchie ( spot test ) : topi * 82 *     - Traslocazioni ereditabili : topo * 85 *    PARTE C : Metodi per la determinazione della   ecotossicità * 88 *    Introduzione generale : parte C * 88 *    Saggio di inibizione della crescita algale * 89 *    Tossicità per lombrichi : saggio su terreno   artificiale * 95 *    Biodegradazione : Zahn-Wellens test * 99 *    Biodegradazione : saggio di simulazione con   fanghi attivi * 106 *    Biodegradazione : fanghi attivi : saggio di inibizione   della respirazione * 118 *   PER LA CONTINUAZIONE DEL TESTO VEDI SOTTO NUMERO : 390L0676.1Biodegradazione : saggio SCAS modificato * 123 *    PARTE B : METODI PER LA DETERMINAZIONE DELLA TOSSICITÀ    INTRODUZIONE GENERALE : PARTE B    STUDI A LUNGO TERMINE    Studi cronici , subcronici e di cancerogenesi    Caratterizzazione della sostanza in esame e della   miscela usata per il trattamento    La composizione della sostanza in esame , incluse le   impurezze principali e le proprietà fisico-chimiche   pertinenti , compresa la stabilità , dovrebbe essere   nota prima dell'inizio di qualsiasi studio di tossicità .    Le proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame   forniscono informazioni importanti per la   scelta della via di somministrazione , la progettazione   degli studi subcronici , cronici e di cancerogenesi e del   trattamento e della conservazione della sostanza in esame .    Le informazioni sulla struttura chimica e le proprietà   fisico-chimiche possono anche fornire indicazioni   sulle caratteristiche di assorbimento attraverso la   via di somministrazione prevista e le possibilità   metaboliche e di distribuzione nel tessuto . Potrebbero   esservi anche informazioni sui parametri tossicocinetici   provenienti da studi di tossicità e di tossicocinetica   precedenti .    L'elaborazione di un metodo analitico per la   determinazione qualitativa e quantitativa della   sostanza in esame ( impurità di maggiore importanza   comprese quando possibile ) nel mezzo di dosaggio e nel   materiale biologico dovrebbe precedere l'inizio dello   studio .    Animali da laboratorio : scelta delle specie e del ceppo    Poiché è necessario che il trattamento degli   animali si estenda per buona parte della loro durata   di vita , gli studi tendono a limitarsi a specie   sperimentali a vita relativamente breve e di facile   mantenimento . È molto desiderabile conoscere   l'incidenza delle patologie spontanee e dei tumori   sul ceppo degli animali usati quando essi siano   mantenuti in condizioni analoghe .    I ceppi dovrebbero essere ben caratterizzati ed ese   ti da difetti congeniti interferenti . L'uso di ceppi   ottenuti con accoppiamento tra consanguinei o di ibridi   di tipo . I presenta alcuni vantaggi sotto questo   punto di vista ; ma ove siano disponibili sufficienti   dati di base su ceppi esogami , usando animali di colonie   chiuse , questi ultimi sono accettabili .    Cura degli animali , dieta e rifornimento d'acqua    I saggi e gli studi con animali verranno condotti   conformemente ai regolamenti nazionali e dovranno tener   conto dei principi umanitari e degli sviluppi   internazionali nel settore del benessere degli animali .    Per ottenere risultati significativi sono   necessari un controllo rigoroso delle condizioni   ambientali e delle tecniche adeguate di cura degli   animali . Fattori quali le condizioni di alloggiamento ,   le malattie intercorrenti , le terapie con   farmaci , le impurezze nella dieta , l'aria , l'acqua ,   le lettiere e gli impianti per la cura degli   animali in genere possono influire significativamente   sul risultato degli studi con dosi ripetute . In   generale , gli effetti degli sterilizzanti chimici   sullo studio dovrebbero essere noti .    La dieta dovrebbe rispondere a tutte le   esigenze nutrizionali della specie saggiata e   dovrebbe essere esente dalle impurità che   potrebbero influenzare il risultato della prova .   I roditori dovrebbero essere nutriti e abbeverati   ad libitum con alimenti sostituiti almeno ogni   settimana . Attualmente vengono utilizzati tre tipi   di diete : convenzionale , sintetica e varie diete   a formula aperta .    Qualunque sia la dieta scelta , i   fornitori devono accertare con controlli periodici   il valore nutritivo e il livello di contaminanti   nella dieta base , e fornire queste informazioni al   laboratorio con ciascun lotto di mangime . È   altamente desiderabile conoscere gli effetti del   regime dietetico sul metabolismo come pure lo   sviluppo dei tumori e la longevità degli animali .    Inoltre , le analisi di controllo della dieta   base possono essere effettuate dal laboratorio che   esegue le prove , sia per i componenti alimentari ,   sia per i contaminanti involontari , compresi i   carcinogeni . In tal caso i risultati delle analisi   dovrebbero essere tenuti e inclusi nella   relazione finale su ciascuna sostanza in esame .    I costituenti dietetici comuni che sono noti per   influenzare la carcinogenesi ( es. : antiossidanti ,   acidi grassi insaturi , selenio ) non dovrebbero essere   presenti in concentrazioni interferenti . L'impatto   potenziale di diversi contaminanti dietetici comuni   sulla valutazione della cancerogenicità implica   che particolare attenzione sia dedicata alla presenza ,   nella dieta , di residui di antiparassitari , di   componenti organo-clorurati , di idrocarburi policiclici   aromatici , di estrogeni , di metalli pesanti , di   nitrosammine e micotossine .    Quando la sostanza sperimentale viene somministrata   nell'acqua o negli alimenti , le prove di stabilità sono   essenziali . Prove di omogeneità e di stabilità   effettuate correttamente prima degli studi con dosi ripetute   dovrebbero essere usate per stabilire la frequenza   richiesta della preparazione della dieta e dei controlli .    Quando le diete sono sterilizzate , gli effetti di tali   procedimenti sulla sostanza in esame e sui constituenti   dietetici dovrebbero essere noti . Si dovrebbero apportare   le opportune rettifiche .    Durante le prove di cancerogenesi , i ricercatori   dovrebbero essere consapevoli dei contaminanti potenziali   dell'acqua usata . L'acqua approvata per il consumo   umano è generalmente soddisfacente e si dovrebbe   disporre di informazioni sulla sua composizione .    Vi può essere la necessità di variare la   concentrazione di una sostanza in esame nella dieta   con la crescita degli animali allo scopo di mantenere   una ingestione ragionevolmente costante della sostanza   in esame in relazione al peso corporeo degli animali .    Il valore nutritivo della dieta di controllo e di quella   in esame dovrebbe essere il più simile possibile . Di   conseguenza , il valore nutritivo di una sostanza in   esame mescolata nella dieta necessita di essere preso in   considerazione . L'esperienza suggerisce che fino ad un   massimo di 5 % di sostanze in esame non nutritive nella   dieta , interferenze significative con il valore nutritivo   della dieta sono improbabili .    1 . Studi inalatori    Non viene precisata nessuna prova limite perché non   è stato possibile definire un valore limite unico di   esposizione per inalazione .    2 . Studio di teratogenesi    Il metodo di prova è orientato principalmente verso   la somministrazione per via orale .    Alternativamente , altrevie possono essere utilizzate   a seconda delle proprietà fisiche della sostanza in   esame e della via probabile dell'esposizione umana . In   tali casi , il metodo di saggio dovrà essere   opportunamente adottato prendendo in considerazione gli   elementi appropriati del metodo di saggio a 28 giorni .    3 . Tossicocinetica    Gli studi tossicocinetici sono d'aiuto   nell'interpretazione e nella valutazione dei dati   di tossicità . Essi hanno segnatamente lo scopo di   chiarire aspetti particolari della tossicità della   sostanza chimica in esame , e i risultati possono   aiutare nella programmazione di ulteriori studi di   tossicità . Non si considera che sia necessario   determinare la totalità dei parametri in ciascun caso .   La sequenza completa degli studi tossicocinetici   ( assorbimento , escrezione , distribuzione e   metabolismo ) sarà necessaria soltanto in rari casi .   Per taluni composti potrebbero essere opportune   modifiche di detta sequenza , ovvero potrebbe essere   sufficiente uno studio con dose unica .    Definizioni    tossicocinetica : studio dell'assorbimento , della   distribuzione , del metabolismo e dell'escrezione   delle sostanze in esame .    assorbimento : processo o l'insieme di processi per   i quali una sostanza somministrata viene assorbita   dall'organismo .    escrezione : processo o l'insieme di processi per i   quali la sostanza somministrata e/o i suoi metaboliti   vengono eliminati dall'organismo .    distribuzione : processo o l'insieme di processi per   i quali la sostanza assorbita e/o i suoi metaboliti si   ripartiscono nell'organismo .    metabolismo : processo(i) per il quale la sostanza   somministrata viene strutturalmente modificata   nell'organismo mediante reazioni enzimatiche e non   enzimatiche .    4 . Studio acuto e subacuto su una seconda specie    Gli studi su una seconda specie hanno lo scopo di   fornire complementi alle conclusioni tratte dagli   studi sulla prima specie .    Negli eventuali studi su una seconda specie il metodo   di saggio già descritto può essere usato oppure   adattato per usare un numero minore di animali .    5 . Studi sulla fertilità    Nei casi per i quali occore un saggio sulla   riproduzione in tre generazioni , si può estendere il   metodo descritto per il saggio di riproduzione su due   generazioni in modo che esso comprende una terza   generazione .    6 . Studi sulla mutagenesi    Prove supplementari delle mutagenesi incluso prove di   screening delle cancerogenesi    Introduzione    La prima valutazione dell'attività mutagena di   una sostanza consiste nella ricerca di mutazioni geniche   ( puntiformi ) nei batteri e del danno cromosomico   nelle cellule dei mammiferi ( in vitro o in vivo ) ;   in precendenza sono stati descritti i metodi appropriati   per questa serie di prove di base . Questo capitolo   riguarda l'ulteriore ricerca necessaria per la   verifica e/o l'ampliamento dei risultati ottenuti   durante la serie di prove di base , che può essere   utilizzata per un certo numero di scopi :    1 ) per confermare i risultati della serie di prove di   base ;    2 ) per ricercare eventi genetici non studiati durante   la serie di prove di base ;    3 ) per iniziare o ampliare la ricerca in vivo .    Al tal uopo , la gamma delle prove descritte comprende   sistemi eucariotici sia in vitro sia in vivo e una   vasta serie di eventi genetici . Le prove forniscono   informazioni sulle mutazioni puntuali negli organismi   più complessi dei batteri utilizzati nella serie di   prove di base e ampliano le informazioni sulla capacità   di una sostanza di causare aberrazioni cromosomiche .    Vengono descritte anche le prove per eventi genetici   diversi dalle mutazioni puntiformi e dalle aberrazioni   cromosomiche , queste prove forniscono ulteriori   informazioni e possono essere appropriatamente utilizzate   negli schemi d'analisi .    In generale , allorquando si redige un programma   di ulteriore ricerca sulla mutagenicità , dovrebbero   essere fornite le relative informazioni addizionali   sul potenziale mutageno e/o cancerogeno di quella   sostanza .    Gli studi che potrebbero risultare adatti ad un caso   specifico dipendono da numerosi fattori , comprendenti   le caratteristiche chimiche e fisiche della sostanza ,   i risultati delle prove batteriologiche e   citogenetiche iniziali , il profilo metabolico della   sostanza , i risultati di altre ricerche tossicologiche   e l'impiego conosciuto della sostanza . A causa dei   numerosi fattori da prendere in considerazione , risulta   inappropriato uno schema rigido per la selezione   delle prove . Tuttavia , possono essere forniti alcuni   principi generali . Quando una prova risulta positiva   nel corso della ricerca di base , l'ulteriore ricerca   deve comprendere almeno una prova in grado di rivelare   lo stesso evento genetico . Quando entrambe le prove   della ricerca di base risultano negative , l'ulteriore   ricerca deve di norma comprendere una prova per le   mutazioni geniche ed una per le aberrazioni   cromosomiche . Sarà inoltre opportuno ottenere ulteriori   dati da prove indicatrici di effetti su   DNA ( elencate qui di seguito ) . I metodi da seguire   per questa ricerca vengono elencati qui di seguito   in funzione della loro risultante genetica principale .    Studio delle mutazioni geniche ( puntiformi )    Per ricercare ulteriormente la capacità di una   sostanza di causare mutazioni geniche ( puntiformi ) ,   può risultare adeguata una delle prove seguenti :    a ) ricerca di mutazioni in avanti o di ritorno   utilizzando microorganismi eucariotici ( Saccharomyces   cerevisiae ) ;    b ) prove in vitro per la ricerca di mutazioni in   avanti in cellule di mammifero ;    c ) prova dei letali recessivi legati al sesso in   Drosophila melanogaster ;    d ) prova in vivo di mutazioni in cellule   somatiche : prova delle macchie ( spot test ) nel topo .    Ricerca delle aberrazioni cromosomiche    Quando è necessario approfondire la capacità di   una sostanza a causare aberrazioni cromosomiche , può   essere effettuata una delle seguenti prove :    a ) studi citogentici in vivo nel mammifero .    Si dovrà includere l'analisi della metafase in vivo   delle cellule del midollo osseo nel caso in cui non   sia stata inclusa nella valutazione iniziale ( serie di   prove di base ) . Si potrà inoltre effettuare il   saggio citogenitico in vivo in cellule germinali ;    b ) studio citogenetico in vitro in cellule di   mammifero , se non è stato effettuato nel corso della   valutazione iniziale ;    c ) studio dei letali dominanti in roditori ;    d ) prova delle traslocazioni ereditarie nel topo .    Prove con indicatori per gli effetti sul DNA    Esistono metodi per la rilevazione di alcuni effetti   sul DNA , ma che non hanno conseguenze mutagene come   « evento finale » . Questi studi possono fornire   informazioni complementari a quelle ottenute dagli   studi sulla mutagenicità , che possono risultare   utili per l'interpretazione di tali studi . In caso   di necessità può risultare utile seguire uno dei   metodi seguenti , utilizzando microrganismi   eucariotici o cellule di mammiferi :    a ) ricombinazione mitotica in Saccharomyces   cerevisiae ;    b ) danno e riparazione del DNA - sintesi del DNA   non programmata - in celulle di mammifero ( in vitro ) ;    c ) scambi di cromatidi fratelli in celulle di   mammifero ( in vitro ) .    Altre prove con indicatore per la ricerca del   potenziale cancerogeno    Esistono prove per la ricerca della trasformazione   in vitro delle cellule dei mammiferi che misurano   la capacità di una sostanza di causare cambiamenti   morfologici e comportamentali in una coltura di   cellule . Si ritiene che ciò sia connesso con la   trasformazione maligna in vivo . Per la trasformazione   si può usare un certo numero di tipi diversi di   cellule e seguire criteri diversi .    Valutazione del rischio degli effetti ereditabili   nei mammiferi    Esistono metodi per misurare in mammiferi gli   effetti ereditabili , causati da mutazioni geniche   ( puntiformi ) , come la prova dei loci specifici   nel topo (1) , oppure per determinare le aberrazioni   cromosomiche , come la prova di traslocazioni   ereditarie nel topo .    Tali metodi possono essere eseguiti per la   valutazione del possibile rischio genetico di una   sostanza per l'uomo . Tuttavia , a causa della   complessità di queste prove e dell'elevato   numero di animali necessari , in particolare per la   prova dei loci specifici , occore un'ottima   giustificazione per intraprendere queste prove .    (1) La prova dei loci specifici nel topo   ( non descritta in questo documento ) può   essere utilizzata per misurare induzione di   mutazioni geniche in cellule germinali nella   prima generazione , dopo l'esposizione ad una   sostanza mutagena . Possono essere rilevate   e quantificate le alterazioni genetiche che portano   a cambiamenti nei prodotti genici che causano fenotipi   visibili .    SAGGIO DI TOSSICITÀ ORALE SUBCRONICA    SAGGIO CON SOMMINISTRAZIONE ORALE RIPETUTA DI DOSI   PER 90 GIORNI USANDO SPECIE DI RODITORI    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principi del metodo di saggio    La sostanza sperimentale viene somministrata   giornalmente , per via orale , in dosi scalari   a vari gruppi di animali da laboratorio ,   una dose per gruppo e per un periodo di 90 giorni .   Durante il periodo di somministrazione , gli animali   vengono giornalmente sottoposti ad osservazione   per individuare segni di tossicità . Gli animali   che muoiono durante la prova vengono sottoposti   a necroscopia ; alla conclusione del saggio anche   gli animali superstiti vengono sottoposti   a necroscopia .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni    Gli animali sono tenuti nelle condizioni sperimentali   di alloggiamento e nutrizione sperimentali per almeno   5 giorni prima dell'inizio del saggio . Prima   dell'esperimento , gli animali giovani e sani vengono   mischiati con metodo casuale ed assegnati ai   gruppi di trattamento e di controllo .    La sostanza in esame può essere somministrata   nella dieta , con sonda , in capsule o in acqua   potabile . Il dosaggio per tutti gli animali dovrebbe   essere fatto con lo stesso metodo durante   l'interno periodo dell'esperimento . Se un   veicolo od altri additivi sono utilizzati per   facilitare il dosaggio , essi non dovrebbero   notoriamente produrre effetti tossici . Se del   caso , si possono utilizzare i dati storici .    Condizioni sperimentali    Animali da esperimento    A meno che non vi siano controindicazioni , la   specie preferita è il ratto . Si dovrebbero   usare ceppi comunemente usati in laboratorio   di giovani animali sani ed il dosaggio dovrebbe   iniziare idealmente prima che i ratti abbiano   raggiunto le sei settimane di età ( comunque   non più di 8 settimane ) . All'inizio dello   studio , la variazione di peso degli animali   usati non dovrebbe superare il ± 20 % del   valore medio . Quando uno studio subcronico orale venga   intrapreso come preliminare ad uno studio a lungo   termine , si dovrebbe usare la stessa   specie e lo stesso ceppo in entrambi gli studi .    Numero e sesso    Per ciascun livello di dose si dovrebbero   utilizzare almeno 20 animali ( 10 maschi e   10 femmine ) . Le femmine dovrebbero essere   nullipare e non gravide . Qualora si preveda   di sacrificare ad intervalli alcuni   animali , il numero devrebbe essere aumentato del   numero di animali che si prevede di sacrificare   prima del completamento dello studio . Inoltre ,   un gruppo satellite di 20 animali ( 10 animali per   sesso ) può essere trattato con livelli di dose   elevati per 90 giorni e sottoposto ad osservazione   per l'individuazione della reversibilità ,   della persistenza o dell'insorgenza ritardata di   effetti tossici per 28 giorni dopo il trattamento .    Livelli di dose    Si dovrebbero usare almeno tre livelli di dose e   un controllo . Eccezion fatta per il trattamento con   la sostanza in esame , gli animali del gruppo di   controllo dovrebbero essere tenuti in modo identico   a quelli del gruppo trattato . Quando si utilizza   un veicolo per facilitare il dosaggio , ai controlli si   dovrebbe somministrare il veicolo , allo stesso   modo dei gruppi trattati ; gli animali di controllo   dovrebbero ricevere la stessa quantità di veicolo   di quella ricevuta dal gruppo trattato col livello   di dose più elevato . Il livello di dose più   elevato dovrebbe provocare effetti tossici ma   produrre pochi o nessun decesso . Il livello di   dose più basso non dovrebbe produrre effetti   tossici . Quando esista una valutazione utile   dell'esposizione umana , il livello più basso   dovrebbe superare detto valore .    Idealmente , il livello di dose intermedio dovrebbe   produrre effetti tossici osservabili minimi . Se viene   usata più di una dose intermedia , i livelli di   dose dovrebbero essere intervallati per produrre una   graduazione degli effetti tossici .    Nei gruppi trattati con livelli di dose bassi e   intermedi e nei controlli , l'incidenza degli eventi   letali dovrebbe essere bassa e tale da permettere una   valutazione significativa dei risultati .    Quando la sostanza in esame viene somministrata nella   dieta , si possono utilizzare sia una concentrazione   dietetica costante ( ppm o mg/kg di alimento )   oppure un livello di dose costante in termini di   peso corporeo degli animali ; l'alternativa usata deve   essere specificata . Per una sostanza somministrata   con sonda , la dose dovrebbe essere somministrata ogni   giorno allo stesso orario . I livelli di dose   dovrebbero essere adattati ad intervalli   ( settimanalmente o ogni due settimane ) per mantenere   un livello di dose constante in termini di peso   corporeo dell'animale .    Saggio limite    Se uno studio di 90 giorni , condotto   conformemente al metodo descritto sotto , ad un livello di   dose di 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno o ad un   livello di dose più elevato in relazione ad una   possibile esposizione umana ( quando questa sia nota ) non   produce evidenze di effetti tossici , ulteriori prove   possono essere considerate non necessarie . Per le   sostanze a bassa tossicità è importante   assicurarsi che , quando somministrate nella dieta ,   le quantità e le altre proprietà della sostanza   in esame di cui trattasi non interferiscano con le   esigenze nutrizionali normali .    Periodo di osservazione    Tutti gli animali dovrebbero essere quotidianamente   sottoposti ad osservazione e si dovrebbero registrare i   segni di tossicità inclusi il tempo di insorgenza ,   il grado e la durata . Si dovrebbero annotare anche il   tempo della morte e quello dell'insorgenza o della   scomparsa dei sintomi di tossicità .    Procedimento    Gli animali vengono trattati con la sostanza in   esame , idealmente sette giorni per settimana ,   per un periodo di 90 giorni . Gli animali appartenenti   ad ogni gruppo satellite previsto per ulteriori   osservazioni dovrebbero essere tenuti ancora 28 giorni   senza trattamento per individuare la guarigione oppure la   persistenza degli effetti tossici .    Le osservazi cliniche includeranno i cambiamenti della cute   e del pelo , degli occhi e delle mucose nonché del   sistema nervoso periferico , di quello respiratorio ,   circolatorio , dell'attività somatomotoria e del   quadro comportamentale . Si dovrebbe procedere   settimanalmente alla misurazione del consumo alimentare ( e   del consumo dell'acqua quando la sostanza in esame sia   somministrata in tale veicolo ) ed al peso degli   animali .    Un'osservazione regolare degli animali è necessaria   onde evitare per quanto possibile perdite di animali dallo   studio dovute a cause come cannibalismo , autolisi   dei tessuti o errata collocazione . Alla fine del   periodo di esposizione tutti gli animali sopravvissuti   saranno sottoposti ad autopsia ; gli animali moribondi   dovranno essere rimossi e sottoposti ad autopsia .    I seguenti esami vengono effettuati abitualmente per   tutti gli animali , compresi i controlli :    a ) l'esame oftalmoscopico , eseguito con un   oftalmoscopio o attrezzatura analoga idonea , dovrebbe   essere effettuato prima della somministrazione della   sostanza in esame e della conclusione dello studio ,   preferibilmente su tutti gli animali o perlomento su   quelli a cui viene somministrato il dosaggio elevato e   al gruppo di controllo . Se vengono individuati   cambiamenti agli occhi , tutti gli animali dovrebbero   essere esaminati ;    b ) alla fine del periodo di saggio , si dovrebbero   effettuare le seguenti analisi : ematologia ,   inclusi ematocrito , concentrazione di emoglobina ,   conteggio degli eritrociti , conteggio totale e   differenziale dei leucociti , una misurazione del   potenziale di coagulazione , quali il tempo di   coagulazione , il tempo di protrombina , il tempo   di tromboplastina o il conteggio delle piastrine ;    c ) la determinazione di biochimica clinica sul sangue   dovrebbe essere effettuata alla fine del periodo di   saggio . Le aree di saggio , ritenute opportune per   tutti gli studi sono : equilibrio degli elettroliti ,   metabolismo dei carboidrati , funzione epatica e   renale . La selezione delle prove specifiche sarà   determinata dalle osservazioni sul modo di azione   della sostanza . Si suggeriscono le seguenti   determinazioni : calcio , fosforo , cloruro , sodio ,   potassio , glucosio a digiuno ( con un periodo di   digiuno appropriato alla specie ) , glutamminico-piruvica   transaminasi serica (1) glutammico-ossalacetico   transaminasi serica (2) , ornitina decarbossilasi ,   gamma glutammil transpeptidase , azoto ureico ,   albumina , creatinina nel sangue , bilirubina totale   e misurazione delle proteine totali del siero . Altre   determinazioni che possono rendersi necessarie per una   valutazione tossicologica adeguata , includono :   analisi dei lipidi , ormoni , equilibrio acido/base ,   metaemoglobina , attività della colinesterasi .   Determinazioni biochimiche supplementari possono essere   usate , se del caso , per estendere la ricerca sugli   effetti osservati ;    d ) l'analisi delle urine non è richiesta   routinariamente , ma solo quando vi siano indicazioni   basate sulla tossicità prevista o osservata ;    Se i dati storici di base sono insufficienti , prima   di iniziare il dosaggio si dovrebbe prendere in   considerazione la determinazione dei parametri di   biochimica clinica .    Necroscopia macroscopica    Tutti gli animali dovrebbero essere sottoposti a   completa nescroscopia macroscopica che include l'esame   della superficie esterna del corpo , di tutti gli   orifizi e delle cavità craniche , toraciche e   addominali e dei loro contenuti . Il fegato , i reni ,   le ghiandole surrenali e i testicoli dovrebbero   essere pesati umidi , appena possibile dopo la   dissezione , per evitare l'essicamento . I seguenti   organi e tessuti dovrebbero essere conservati in mezzo   adatto per esami istopatologici futuri possibili :   tutte le lesioni macroscopiche , cervello - comprese   sezioni di midollo spinale/ponte , corteccia   cerebellare e corteccia cerebrale , pituitaria ,   tiroide/paratiroide , qualsiasi tessuto timico ,   trachea e polmoni , cuore , aorta , ( ghiandole   salivarie ) , milza , fegato , reni , ghiandole   surrenali , pancreas , gonadi , utero , ( organi   genitali accessori ) , ( pelle ) , esofago ,   stomaco , duodeno , digiuno , ileo , intestino cieco ,   colon , retto , vescica urinaria , linfonodi   rappresentativi , ( ghiandole mammarie femminili ) ,   ( muscolatura della coscia ) , nervo periferico ,   sterno con midollo osseo , ( occhi ) , ( femore -   compresa superficie articolare ) , ( midollo spinale a   tre livelli - cervicale , mediotoracico e lombare ) ,   e ( ghiandole lacrimali esorbitali ) .     ( I tessuti citati tra parentesi devono essere   esaminati solo se presentano sintomi di tossicità   o se vi siano indicazioni che sono l'organo-bersaglio   coinvolto ) .    Esame istopatologico    a ) L'esame istopatologico completo dovrebbe   essere effettuato sugli organi e sui tessuti degli   animali nei gruppi trattati col dosaggio più   elevato e nel gruppo di controllo ;    b ) tutte le lesioni macroscopiche dovrebbero essere   esaminate ;    c ) esame degli organi-bersaglio in altri gruppi   trattati con altre dosi ;    d ) i polmoni degli animali nei gruppi trattati   con dosaggi bassi ed intermedi dovrebbero essere   sottoposti ad esame istopatologico per l'individuazione   di infezioni , poiché ciò fornisce una valutazione   appropriata dello stato di salute degli animali .   Particolare attenzione dovrebbe inoltre essere   dedicata in questi gruppi all'esame istopatologico   del fegato e dei reni . Ulteriori esami istopatologici   di routine possono non essere richiesti per gli   animali di detti gruppi , ma devono sempre essere   effettuati sugli organi che presentano lesioni ,   nel gruppo trattato con la dose elevata ;    e ) quando si fa uso di un gruppo satellite , si   dovrebbe eseguire l'esame istopatologico dei tessuti e   degli organi che presentano lesioni nei gruppi trattati .    2 . DATI    I dati dovrebbero essere riassunti sotto forma di   tabelle , indicando per ogni gruppo di saggio il numero   di animali all'inizio della prova , il numero degli   animali che presentano lesioni e la percentuale degli   animali che presenta ciascun tipo di lesioni . I risultati   dovrebbero essere valutati con un metodo statistico   idoneo . Qualsiasi metodo statistico riconosciuto può   essere utilizzato .   3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare ,   se possibile :     - specie , ceppo , origine , condizioni ambientali ,   dieta ,     - condizione sperimentali ,     - livelli di dose ( v * colo compreso , se utilizzato )   e concentrazioni ,     - dati sulla risposta tossica per sesso e per dose ,     - livello senza effetto , quando possibile ,     - tempo della morte durante l'esperimento oppure   specificare se gli animali erano sopravvissuti alla   conclusione della prova ,     - descrizione degli effetti tossici o di altri effetti ,     - tempo di osservazione di ogni segno anomalo e   successivo decorso ,     - alimentazione e dati sul peso corporeo ,     - risultati oftalmologici ,     - analisi ematologiche usate e risultati completi ,     - analisi di biochimica clinica usati e risultati   completi ( compresi i risultati di ogni analisi delle   urine ) ,     - risultati nella necroscopia ,     - descrizione particolareggiata di tutti i risultati   istopatologici ,     - elaborazione statistica dei risultati , quando   possibile ,     - discussione dei risultati ,     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    (1) Ora nota come alanina aminotransferasi serica .    (2) Ora nota come aspartato aminotransferasi serica .    SAGGIO DI TOSSICITÀ ORALE SUBCRONICA    SAGGIO CON SOMMINISTRAZIONE ORALE RIPETUTA DI DOSI   PER 90 GIORNI USANDO SPECIE DI NON RODITORI    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principi del metodo di saggio    La sostanza sperimentale viene somministrata ogni   giorno , oralmente in dosi graduate , a diversi   gruppi di animali da esperimento ( non roditori ) ,   una dose per gruppo , per un periodo di 90 giorni .   Durante il periodo di somministrazione , gli animali   sono sottoposti giornalmente ad osservazione per   individuare i segni di tossicità . Gli animali che   muoiono durante la prova sono sottoposti a necroscopia ;   alla conclusione dell'esperimento anche gli animali   superstiti vengono sottoposti a necroscopia .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni    Gli animali sono tenuti nelle condizioni di   alloggiamento e di alimentazione per almeno cinque   giorni prima del saggio . Prima della prova , gli   animali giovani e sani sono mischiati con metodo   causale ed assegnati ai gruppi di trattamento e a   quello di controllo .    La sostanza in esame può essere somministrata nella   dieta oppure la somministrazione in capsule può essere   ritenuta più comoda . Altri mezzi di somministr * ne   orale possono essere utilizzati . Durante l'intero   periodo sperimentale , il dosaggio agli animali dovrà   essere fatto con lo stesso metodo . Se per facilitare   il dosaggio si utilizzano un veicolo o altri additivi ,   essi dovrebbero essere noti per non produrre effetti   tossici . Se del caso , si possono utilizzare i dati   storici .    Condizioni sperimentali    Animali da esperimento    La specie di non-roditori generalmente utilizzata   è il cane , di razza preferibilmente definita .   Altre specie di non-roditori possono essere   utilizzate . Si dovrebbe usare esemplari giovani e sani ,   e , nel caso del cane , il dosaggio dovrebbe   iniziare preferibilmente a 4-6 mesi e non più tardi   di 9 mesi di età . Quando venga intrapreso uno studio   di tossicità subcronica orale come preliminare ad uno   studio a lungo termine , si dobrebbe usare la stessa   specie e lo stesso ceppo in entrambi gli studi .    Numero e sesso    Per ciascun livello di dose si dovrebbero usare   almeno 8 animali ( 4 maschi e 4 femmine ) . Alla   conclusione dello studio , il numero di animali deve   essere tale da garantire una valutazione   significativa degli effetti tossici .    Livelli di dose    Si dovrebbero usare almeno tre livelli di dose e un   controllo . Eccezion fatta per il trattamento con la   sostanza in esame , gli animali nel gruppo di   controllo dovrebbero essere trattati in modo identico   ai soggetti dei gruppi trattati . Il livello di dose   più elevato dovrebbe provocare effetti tossici ma non   produrre decessi .    Il livello di dose più basso non dovrebbe produrre   alcuna evidenza di effetti tossici . Quando esiste una   valutazione utile della esposizione umana , il livello   di dose più basso dovrebbe superare detto valore .   Idealmente , il livello di dose medio dovrebbe produrre   effetti tossici osservabili minimi . Se viene usata   più di una dose intermedia , i livelli di dose dovrebbero   essere intervallati per produrre una graduazione degli   effetti tossici .    Nei gruppi a dosaggio basso ed intermedio e nei   controlli non si dovrebbero verificare decessi .    Per sostanze a bassa tossicità è importante   assicurarsi che , una volta somministrata nella dieta ,   le quantità della sostanza in esame non interferiscano   con la nutrizione normale .    Quando la sostanza in esame viene somministrata   nella dieta , si possono utilizzare sia una   concentrazione dietetica costante ( ppm o mg/kg di   alimento ) oppure un livello di dosse costante in   termini di peso corporeo degli animali ; l'alternativa   usata deve essere specificata . Quando somministrata   direttamente , per esempio in capsule , la dose deve   essere somministrata ogni giorno allo stesso orario   ed adattata a seconda della necessità a intervalli   settimanali per mantenere un livello di dose costante i   termini di peso corporeo degli animali . Quando uno   studio subcronico viene usato come premessa ad uno   studio a iungo termine , in entrambi gli studi si   dovrà usare una dieta analoga .    Saggio limite    Se uno studio di 90 giorni , condotto conformemente   al metodo descritto sotto , ad un livello di dose di   1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno o ad un livello di   dose più elevato in relazione ad una possibile   esposizione umana quando questa sia nota , non   produce evidenze di effetti tossici , ulteriori   prove possono essere considerate non necessarie .   Per le sostanze a bassa tossicità è importante   assicurarsi che , quando somministrate nella dieta ,   le quantità e le altre proprietà della sostanza   in esame di cui trattasi non interferiscano con le   esigenze nutrizionali normali .    Periodo di osservazione    Tutti gli animali dovrebbero essere osservati   giornalmente e si dovrebbero registrare eventuali regni   di tossicità , incluso il tempo di insorgenza , il   grado e la durata . Si dovranno annotare   anche il tempo della morte e quello dell'insorgenza   o della scomparsa dei segni di tossicità .    Procedimento    Gli animali vengono trattati con la sostanza in   esame , idealmente sette giorni per settimana , per   un periodo di 90 giorni . Tuttavia , sulla base   principalmente di considerazioni pratiche , quando   la sostanza vienne somministrata con modalità   diverse da quella dell'aggiunta nella dieta ,   viene considerato accettabile che il dosaggio sia   effettuato 5 giorni per settimana .    Le osservazioni dovrebbero includere , ma non   essere limitate ai cambiamenti della cute   e del pelo , degli occhi e delle mucose nonché del   sistema nervoso centrale ed autonomo , di quello   respiratorio e circolatorio , dell'attività   somatomotoria e del quadro comportamentale . Si   dovrebbe procedere settimanalmente alla misura del   consumo alimentare ( e del consumo dell'acqua   quando la sostanza in esame è somministrata in   tale veicolo ) e alla pesatura degli animali .    Un accurato esame clinico degli animali dovrebbe   essere eseguito quotidianamente con misure   appropriate per minimizzare la perdita di animali del   saggio . Alla fine del periodo di esposizione tutti   gli animali sopravvissuti sono sottoposti a necroscopia .   Gli animali moribondi dovrebbero essere rimossi e   sottoposti a necroscopia quando notati .    I seguenti esami vengono effettuati abitualmente   per tutti gli animali , compresi i controlli :    a ) l'esame oftalmoscopico , eseguito con un   oftalmoscopio o idonea attrezzatura analoga ,   dovrebbe essere effettuato prima della somministrazione   della sostanza in esame e alla conclusione dello   studio , preferibilmente su tutti gli animali ,   o perlomeno su quelli trattati con il dosaggio   più elevato e nel gruppo di controllo . Se   vengono individuati cambiamenti agli occhi ,   tutti gli animali dovranno essere esaminati ;    b ) all'inizio del saggio e , quindi , sia   ad intervalli mensili o alla metà del periodo   di saggio ed , infine , alla fine del saggio   si dovrebbero effettuare le seguenti analisi :   ematologia , incluso l'ematocrito , concentrazione di   emoglobina , conteggio degli eritrociti ,   conteggio totale e differenziale dei leucociti ,   misura del potenziale coagulante , quali il tempo   di coagulazione , il tempo di protrombina , il tempo   di tromboplastina o conteggio delle piastrine ;    c ) la determinazione della biochimica clinica   sul sangue dovrebbe essere effettuata all'inizio   del saggio e , quindi , sia ad intervalli mensili   o alla metà del periodo di saggio ed , infine ,   alle fine del saggio . Gli aspetti di saggio   ritenuti opportuni per tutti gli studi sono :   equilibrio degli elettroliti , metabolismo dei   carboidrati , funzione epatica e renale . La selezione   delle prove specifiche sarà determinata dalle   osservazioni sul modo di azione della sostanza .   Si suggerisce di determinare : calcio , fosforo ,   cloruro , sodio , potassio , glucosio a digiuno ( con   periodo di digiuno appropriato alla specie/ceppo ) ,   glutamminico-piruvica transaminasi serica (1) ,   glutammico-ossalacetico transaminasi serica (2) ,   ornitina decarbossilasi , gamma glutammil   transpeptidase , azoto ureico , albumina , creatinina   nel sangue , bilirubina totale e misura delle   proteine totali del siero . Altre determinazioni che   possono rendersi necessarie per una valutazione   tossicologica adeguata , includono : analisi dei   lipidi , ormoni , equilibrio acido/base , metaemoglobina ,   attività della colinesterasi . Determinazioni   biochimiche supplementari possono essere usate ,   se del caso , per estendere la ricerca sugli   effetti osservati . I non-roditori dovrebbero   essere tenuti a digiuno per un periodo di tempo   ( non più di 24 ore ) prima di prelevare i   campioni di sangue ;    d ) l'analisi delle urine non è richiesta   routinariamente , ma solo quando vi sia una indicazione   basata sulla tossicità prevista o osservata .    Necroscopia macroscopica    Tutti gli animali dovrebbero essere sottoposti   a necroscopia macroscopica completa , che   include l'esame della superficie esterna del corpo ,   di tutti gli orifizi e delle cavità cranica ,   toracica e addominale e dei loro contenuti . Il   fegato , i reni , le ghiandole surrenali , la   tiroide ( e le paratiroidi ) e i testicoli dovrebbero   essere pesati umidi , appena possibile dopo la dissezione ,   per evitare l'essiccamento . I seguenti organi e   tessuti dovrebbero essere conservati in un mezzo   adatto per futuri possibili esami istopatologici :   tutte le lesioni generali ; cervello - comprese   sezioni di midollo/ponte , corteccia cerebellare e   corteccia cerebrale , pituitaria , tiroide/paratiroide ,   qualsiasi tessuto timico , ( trachea ) , polmoni ,   cuore , aorta , ghiandole salivari , milza ,   fegato , reni , ghiandole surrenali , pancreas ,   gonadi , utero , ( organi genitali accessori ) , ( pelle ) ,   cistifellea , esofago , stomaco , duodeno ,   digiuno , ileo , intestino cieco , colon , retto ,   vescica , urinaria , linfonodi rappresentativi ,   ( ghiandole mammarie femminili ) , ( muscolatura   della coscia ) , nervo periferico ( occhi ) ,   sterno con midollo osseo , ( femore - compresa   superficie articolare ) e ( midolo spinale a tre   livelli - cervicale , emitoracico e lombare ) .   ( I tessuti citati tra parentesi devono essere   esaminati solo se presentano sintomi di tossicità   o se vi siano indicazioni che sono l'organo-bersaglio   coinvolto ) .    Esame istopatologico    Dovrebbe essere effettuato l'esame istopatologico   completo degli organi e dei tessuti degli animali   del gruppo trattato con la dose elevata e del gruppo   di controllo . Un ulteriore esame istopatologico   dovrebbe essere effettuato in gruppi trattati   con altre dosi sugli organi che presentano lesioni   nel gruppo trattato con la dose elevata o per le   quali le osservazioni cliniche indichino tale   esigenza .    2 . DATI    I dati dovrebbero essere riassunti sotto forma   di tabelle , indicando per ogni gruppo sperimentale   il numero di animali all'inizio della prova ,   il numero degli animali che presentano lesioni ,   i tipi di lesione e la percentuale degli animali   che presenta ciascun tipo di lesioni . I risultati   dovrebbero essere valutati con un metodo statistico   idoneo . Qualsiasi metodo statistico   riconosciuto può essere utilizzato .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare , se   possibile :     - specie , ceppo , origine , condizioni ambientali ,   dieta , ecc. ,     - condizione sperimentali ,     - livelli di dose ( veicolo compreso , se utilizzato )   e concentrazioni ,     - risposta tossica per sesso e per dose ,     - livello senza effetto , quando possibile ,     - tempo della morte durante lo studio , oppure   specificare se gli animali sono sopravvissuti fino   alla conclusione del saggio ,     - descrizione degli effetti tossici o di altri   effetti ( con particolare attenzione ai risultati   clinici ) ,     - tempo di osservazione di ogni segno anomalo e   successivo decorso ,     - dati di alimentazione sul peso corporeo ,     - risultati oftalmologici ,     - analisi ematologiche usate e risultati completi ,     - analisi di biochimica clinica usate e   risultati completi ( compresi i risultati di   qualsiasi analisi delle urine ) ,     - risultati della necroscopia ,     - una descrizione particolareggiata di tutti   i risultati istopatologici ,     - elaborazione statistica dei risultati ,   quando appropriata ,     - discussione dei risultati ,     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    (1) Ora nota come alanina aminotransferasi sercia .    (2) Ora nota come aspartato aminotransferasi serica .    SAGGIO DI TOSSICITÀ CUTANEA SUBCRONICA    SAGGIO CON SOMMINISTRAZIONE CUTANEA RIPETUTA DI DOSI   PER 90 GIORNI USANDO SPECIE DI RODITORI    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principi del metodo di saggio    La sostanza sperimentale viene applicata   quotidianamente alle cute in dosi scalari a vari   gruppi di animali da esperimento , una dose per   gruppo per un periodo di 90 giorni . Durante il periodo   di somministrazione , gli animali vengono giornalmente   sottoposti ad osservazione per individuare segni   di tossicità . Gli animali che muoiono durante il   saggio vengono sottoposti a necroscopia , ed alla   conclusione della prova anche gli animali superstiti   vengono sottoposti a necroscopia .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni    Gli animali sono tenuti nelle condizioni sperimentali   di alloggiamento ed alimentazione per almeno 5 giorni prima   dell'inizio del saggio . Prima dell'esperimento , gli animali   giovani e sani vengono mischiati con metodo casuale ed   assegnati ai gruppi di trattamento e di controllo .   Poco prima dell'inizio dell'esperimento gli animali   da trattare vengono tosati nella zona dorsale del tronco .   Si può usare la rasatura , ma questa dovrebbe   essere effettuata circa 24 ore prima del saggio .   La tosatura o la rasatura usualmente deve essere   ripetuta ad intervalli approssimativamente   settimanali .    Durante la tosatura o la rasatura del pelo , occore   fare attenzione a non scorticare la pelle . La   superficie corporea da trattare per l'applicazione   della sostanza in esame non dovrebbe essere inferiore   al 10 % del totale . Il peso dell'animale dovrebbe   essere preso in considerazione quando si decideno   le dimensioni delle superficie da liberare dal   pelo e dalla copertura . Quando si saggiano solidi ,   che possono essere polverizzati se del caso ,   la sostanza in esame dovrebbe essere umidificata   sufficientemente con l'acqua o , se necessario ,   con un veicolo adatto per assicurare un buon contatto   con la pelle . Le sostanze in esame liquide sono in   genere usate non diluite . L'applicazione quotidiana   si estenderà da 5 a 7 giorni per settimana .    Condizioni sperimentali    Animali da esperimento    Si possono utilizzare esemplari adulti di ratto ,   coniglio o cavia . Altre specie possono essere   utilizzate , ma il loro uso richiede una giustificazione .   All'inizio del saggio , la gamma di variazione   del peso dovrebbe essere ± 20 % del peso medio .   Quando uno studio di tossicità subcronica cutanea   viene condotto come preliminare ad uno studio a lungo   termine , in entrambi gli studi si dovrebbe usare   la stessa specie e lo stesso ceppo .    Numero e sesso    Per ciascun livello di dose si dovrebbero utilizzare   almeno 20 animali ( 10 maschi e 10 femmine ) con pelle   sana . Le femmine dovrebbero essere nullipare e non   gravide . Se si prevede di sacrificare ad intervalli   alcuni animali , il numero totale dovrebbe essere   aumentato del numero di animali che si prevede di   sacrificare prima del completamento dello studio .   Inoltre , un gruppo satellite di 20 animali   ( 10 animali per sesso ) può essere trattato con   il livello di dose elevato per 90 giorni e sottoposto   ad osservazione per l'individuazione della reversibilità ,   della persistenza o dell'insorgenza ritardata di   effetti tossici per 28 giorni dopo il trattamento .    Livelli di dose    Almeno tre livelli di dose con un controllo o   un controllo del veicolo , se si utilizza un   veicolo , sono richiesti . Il periodo di   esposizione dovrebbe essere di almeno 6 ore   al giorno . L'applicazione della sostanza in   esame dovrebbe essere eseguita ogni giorno alla   stessa ora e la quantità di sostanza applicata   dovrebbe essere aggiustata a intervalli   ( settimanali o bisettimanali ) per mantenere un livello   constante di dose in termini di peso corporeo dell'animale .   Eccezion fatta per il trattamento con la sostanza   in esame , gli animali nel gruppo di controllo   dovrebbero essere trattati in modo identico ai   soggetti dei gruppi trattati . Quando per facilitare   il dosaggio si usa un veicolo , il gruppo   di controllo del veicolo dovrebbe essere sottoposto a   dosaggio come i gruppi trattati , e ricevere la   stessa quantità che riceve il gruppo a livello   di dose più elevata . Il livello di dose più   elevato dovrebbe provocare effetti tossici ma   produrre pochi o nessun decesso . Il livello di   dose più basso non dovrebbe produrre effetti   tossici . Quando esista una valutazione utile di   esposizione umana , il livello più   basso dovrebbe superare questo valore .    Idealmente , il livello di dose intermedio   dovrebbe produrre effetti tossici osservabili minimi .   Se viene usata più di una dose intermedia ,   i livelli di dose dovrebbero essere intervallati   per produrre una graduazione degli effetti tossici .   Nei gruppi trattati con livello di dose basso ,   intermedio e nei controlli , l'incidenza delle morti   dovrà essere bassa e tale da permettere una   valutazione significativa dei risultati .    Se l'applicazione della sostanze in esame produce   irritazioni gravi della pelle , le concentrazioni   dovrebbero essere ridotte e ciò può provocare   una riduzione , o l'assenza , di altri effetti   tossici al livello di dose elevato . Se la pelle è   stata gravemente danneggiata , può rendersi   necessaria l'interruzione dello studio , Si procederà   quindi a un nuovo studio con concentrazione più basse .    Saggio limite    Se uno studio preliminare con livello di dose   di 1 000 mg/kg o un livello di dose più elevato   in relazione a una possibile esposizione umana ,   quando questa sia nota , non produce effetti   tossici , ulteriori prove possono non essere considerate   necessarie .    Periodo di osservazione    Gli animali da esperimento dovrebbero essere   osservati quotidianamente per individuare eventuali   segni di tossicità . Il tempo della morte e   quello dell'insorgenza o della scomparsa dei segni   di tossicità dovrebbero essere registrati .    Procedimento    Gli animali dovrebbero essere ingabbiati   individualmente e sottoposti a trattamento con la   sostanza in esame , idealmente 7 giorni per   settimana , per un periodo di 90 giorni .    Gli animali appartenenti a ciascun gruppo   satellite previsto per ulteriori osservazioni dovrebbero   essere mantenuti ancora per 28 giorni per   individuare i sintomi di guarigione oppure di   persistenza degli effetti tossici . Il tempo di   esposizione dovrebbe essere 6 ore/giorno .    La sostanza in esame dovrebbe essere applicata   uniformemente su un'area che è approssimativamente   il 10 % della superficie corporea totale . Con sostanze   molto tossiche , la superficie coperta può   essere inferiore , ma deve comunque essere   coperta da uno strato più sottile possibile .    Durante l'esposizione , la sostanza in esame viene   tenuta a contatto con la pelle da una fascia porosa   di garza e da un nastro non-irritante . La superficie   cutanea su cui è applicata la sostanza dovrebbe   essere coperta opportunamente in modo da   trattenere la fascia e la sostanza in esame ,   per evitare un eventuale ingestione da parte degli   animali della sostanza in esame . Si piò ricorrere   a mezzi per limitare i movimenti dell'animale ,   ma l'immobilizzazione completa non è un   metodo raccomandato .    Alla fine del periodo di esposizione , la   sostanza in esame residua dovrebbe essere rimossa ,   ove possibile , con l'uso di acqua o con qualche   altro metodo appropriato per pulire la pelle .    Tutti gli animali dovrebbero essere quotidianamente   sottoposti a osservazione e si dovrebbe registrare   i segni di tossicità , incluso il tempo d'insorgenza ,   l'intensità e la durata . Le osservazioni   collaterali dovrebbero includere i cambiamenti   della cute e del pelo , degli occhi e delle   mucose , nonché del sistema nervoso   centrale e autonomo , del sistema respiratorio   e circolatorio , dell'attività somatomotoria   e del quadro comportamentale . Si dovrebbe procedere   settimanalmente alla misura del consumo alimentare   e alla pesatura degli animali . L'osservazione   regolare degli animali è necessaria per   assicurarsi che gli stessi non siano   persi a causa di cannibalismo , autolisi dei   tessuti o smarrimento . Alla fine del periodo   di studio tutti gli animali sopravvissuti dei   gruppi di trattamento non satelliti sono   sottoposti a necroscopia . Gli animali moribondi   dovrebbero essere rimossi e sottoposti a   necroscopia .    I seguenti esami vengono effettuati abitualmente per   tutti gli animali , compresi i controlli :    a ) l'esame oftalmoscopico , eseguito con un   oftalmoscopio o attrezzatura analoga , dovrebbe essere   effettuato prima della somministrazione della sostanza   sperimentale e alla conclusione dello studio ,   preferibilmente su tutti gli animali , o perlomeno   su quelli a cui vengono somministrati il dosaggio   elevato , e infine al gruppo di controllo . Se vengono   individuati cambiamenti negli occhi , tutti gli animali   dovrebbero essere esaminati ;    b ) alla fine del periodo di saggio , si   dovrebbero effettuare le seguenti analisi :   ematologia , incluso ematocrito , concentrazione   di emoglobina degli eritrociti , conteggio totale e   differenziale dei leucociti , misurazione del   potenziale di coagulazione , quale il tempo di   coagulazione , il tempo di protrombina , il tempo   di tromboplastina o il conteggio delle piastrine ;    c ) la determinazione della biochimica clinica sul   sangue dovrebbe essere effettuata alla fine del   periodo di saggio . Le aree di studio , ritenute   opportune per tutti gli studii sono : equilibrio   degli elettroliti , metabolismo dei carboidrati ,   funzione epatica e renale . La selezione di prove   spcifiche sarà determinata dalle osservazioni sul   modo di azione della sostanza . Si suggerisce di   determinare : calcio , fosforo , cloruro , sodio ,   potassio , glucosio a digiuno ( con periodo   di digiuno appropriato alla specie ) ,   glutamminico-piruvica transaminasi serica (1) ,   glutammico-ossalacetico transaminasi serica (2) ,   ornitina decarbossilasi , gamma glutammil transpeptidase ,   azoto ureico , albumina , creatinina ematica ,   bilirubina totale e proteine totali del siero .   Altre determinazioni che possono rendersi   necessarie per una valutazione tossicologica adeguata ,   includono : analisi dei lipidi , ormoni ,   equilibrio acido/base , metaemoglobina , attività   della colinesterasi . Determinazioni biochimiche   supplementari possono essere usate , se   necessarie , per estendere la ricerca di effetti   osservati ;    d ) l'analisi delle urine non è richiesta   routinariamente , ma solo quando vi sia   una indicazione basata sulla tossicità prevista   o osservata . Se i dati storici di base sono   insufficienti , prima di iniziare il dosaggio si dovrebbe   prendere in considerazione la determinazione dei   parametri ematologici e di biochimica clinica .    Necroscopia macroscopica    Tutti gli animali dovrebbero essere sottoposti a   necroscopia macroscopica completa , che include l'esame   della superficie esterna del corpo , di tutti gli   orifizi e delle cavità cranica , toracica   e addominale e dei loro contenuti . Il fegato , i reni ,   le ghiandole surrenali e i testicoli devono   essere pesati umidi , appena possibile   dopo la dissezione , per evitare l'essiccamento .   I seguenti organi e tessuti dovrebbero essere   conservati in mezzo adatto per possibili esami   istopatologici futuri : tutte le lesioni   macroscopiche ; cervello - comprese sezioni di   midollo/ponte , corteccia cerebellare e corteccia   cerebrale , pituitaria , tiroide/paratiroide ,   qualsiasi tessuto timico , ( trachea ) ,   polmoni , cuore , aorta , ghiandole salivari ,   fegato , milza , reni , ghiandole surrenali ,   pancreas , gonadi , utero , organi genitali   accessori , cistifellea ( se esiste ) , esofago ,   stomaco , duodeno , digiuno , ileo , intestino cieco ,   colon , retto , vescica urinaria , linfonodi   rappresentativi , ( ghiandole mammarie femminili ) ,   ( muscolatura della coscia ) , nervo periferico   ( occhi ) , ( sterno con midollo osseo ) ,   ( femore - compresa superficie articolare ) ,   ( midollo spinale a tre livelli - cervicale ,   emitoracico e lombare ) e ( ghiandole lacrimali   esorbitali ) . ( I tessuti citati tra parentesi   devono essere esaminati solo se presentano sintomi   di tossicità o se vi siano indicazioni che sono   l'organo-bersaglio coinvolto ) .    Esame istopatologico    a ) L'esame istopatologico completo dovrebbe   essere effettuato sulla cute normale e sulla cute   trattata , e sugli organi e tessuti degli animali   nel gruppo trattato con dosaggio elevato e nel   gruppo di controllo ;    b ) tutte le lesioni macroscopiche dovrebbero essere   esaminate ;    c ) gli organi-bersaglio dovrebbero essere   esaminati anche nei gruppi trattati con altre dosi ;    d ) quando si usano i ratti , si dovrebbe   eseguire l'esame istopatologico dei polmoni   degli animali dei gruppi trattati con dosaggi   bassi e intermedi per l'individuazione di infezioni   poiché ciò fornisce una valutazione appropriata   dello stato di salute degli animali . Ulteriori esami   istopatologici di routine possono non essere   richiesti per gli animali di questi gruppi , ma   devono sempre essere effettuati sugli organi   che presentano lesioni nel gruppo trattato con dosi   elevate ;    e ) quando si fa uso di un gruppo satellite , si   dovrebbe eseguire l'esame istopatologico dei   tessuti e degli organi che presentano lesioni   in altri gruppi trattati .    2 . DATI    I dati dovrebbero essere riassunti sotto forma   di tabelle , indicando per ogni gruppo sperimentale   il numero di animali all'inizio del saggio , il   numero di animali che presentano lesioni , il   tipo di lesioni e la percentuale degli animali   che presentano ciascun tipo di lesione . I risultati   dovrebbero essere valutati con un metodo   statistico appropriato . Qualsiasi metodo statistico   riconosciuto può essere utilizzato .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare , se   possibile :     - specie , ceppo , origine , condizioni   ambientali , dieta ,     - condizione sperimentali ,     - livello di dose ( veícolo compreso ,   se utilizzato ) e concentrazioni ,     - dati sulla risposta tossica per sesso   e per dose ,     - livello senza effetto , quando possibile ,     - tempo della morte ( durante l'esperimento )   oppure specificare se gli animali sono sopravvissuti   fino alla conclusione della prova ,     - descrizione degli effetti tossici o di altri   effetti ,     - tempo di osservazione di ogni segno   anormale e successivo decorso ,     - dati di alimentazione e sul peso corporeo ,     - risultati oftalmologici ,     - analisi ematologiche usate e risultati   completi ,     - analisi di biochimica clinica usati e   risultati completi ( compresi i risultati   dell'analisi delle urine ) ,     - risultati della necroscopia ,     - descrizione particolareggiata di tutti di   risultati istopatologici ,     - elaborazione statistica dei risultati , quando   possibile ,     - discussione dei risultati ,     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    SAGGIO DI TOSSICITÀ SUBCRONICA INALATORIA    SAGGIO CON SOMMINISTRAZIONE INALATORIA RIPETUTA   DI DOSI PER 90 GIORNI USANDO SPECIE DI RODITORI    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principi del metodo di saggio   Diversi gruppi di animali da esperimento sono   esposti quotidianamente per un periodo definito   alla sostanza in esame in concentrazioni   graduate , utilizzando una concentrazione per gruppo ,   per un periodo di 90 giorni . Quando si utilizza un   veicolo per contribuire a generare una concentrazione   appropriata della sostanza in esame nell'atmosfera ,   si dovrebbe utilizzare un gruppo di controllo   per il veicolo . Durante il periodo di somministrazione ,   gli animali vengono giornalmente sottoposti ad   osservazione per individuare segni di tossicità . Gli   animali che muoiono durante il saggio sono sottoposti   a necroscopia ; alla conclusione del saggio anche   gli animali superstiti vengono sottoposti a   necroscopia .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni    Gli animali sono tenuti nelle condizioni   di alloggiamento e di alimentazione sperimentali   per almeno cinque giorni prima dell'inizio   della prova . Prima del saggio , animali giovani   e sani sono mischiati con metodo casuale ed   assegnati ai gruppi di trattamento e di controllo .    Se necessario , un veicolo adatto può essere   aggiunto alla sostanza in esame per contribuire   a generare una concentrazione appropriati della   sostanza nell'atmosfera . Se un veicolo o altri   additivi vengono utilizzati per facilitare   il dosaggio , essi dovrebbero essere noti per   non produrre effetti tossici . Se del caso ,   i dati storici possono essere usati .    Condizioni sperimentali    Animali sperimentali    A meno che vi siano controindicazioni , la specie   preferita è il ratto . Si dovrebbero usare   animali sani giovani di ceppi comunemente usati in   laboratorio . All'inizio dello studio la gamma di   varazione del peso degli animali usati   non dovrebbe essere superiore al ± 20 % del peso   medio . Quando venga intrapreso uno studio   subcronico per inalazione come preliminare ad   uno studio a lungo termine , in entrambi gli studi   si dovrebbe usare la stessa specie e stesso ceppo .    Numero e sesso    Per ciascuna concentrazione di esposizione si   dovrebbero utilizare almeno 20 animali ( 10 femmine   e 10 maschi ) . Le femmine dovrebbero essere nullipare   e non gravide . Se ni prevede di sacrificare ad   intervalli alcuni animali il numero dovrebbe essere   aumentato del numero di animali che si prevede di   sacrificare prima del completamento dello studio .   Inoltre , un gruppo satellite di 20 animali   ( 10 animali per sesso ) può essere trattato   con il livello di dose elevato per 90 giorni e   sottoposto ad osservazione per l'individuazione   della reversibilità , della persistenza o   dell'insorganza ritardata di effetti tossici per   28 giorni dopo il trattamento .    Concentrazione di esposizione    Sono richieste almeno tre concentrazioni , con   un controllo o un controllo del veicolo ( che corrisponde   alla concentrazione del veicolo al livello più elevato )   se si utilizza un veicolo . Eccezion fatta per il   trattamento con la sostanza in esame , gli animali nel   gruppo di controllo dovrebbero essere trattati in modo   identico agli animali dei gruppi . La concentrazione   più elevata dovrebbe provocare effetti tossici   ma nessuna o poche morti . Quando esista una   valutazione utile dell'esposizione umana , la   concentrazione più bassa dovrebbe superare detto   valore . Idealmente la concentrazione media dovrebbe   produrre effetti tossici osservabili minimi . Se   viene usata più di una concentrazione intermedia le   concentrazioni dovrebbero essere intervallate   per produrre una graduazione di effetti tossici .    Nei gruppi trattati con concentrazioni basse ed   intermedie e nei controlli , l'incidenza delle   morti dovrebbe essere bassa per permettere una   valutazione significativa dei risultati .    Tempo di esposizione    La durata dell'esposizione quotidiana dovrebbe   essere di 6 ore , dopo la stabilizzazione delle   concentrazione delle camere di inalazione . Altri   tempi di esposizione possono essere usati per   esigenze specifiche .    Attrezzatura    Gli esperimenti sugli animali dovrebbero essere   effettuati in apparecchiatura per inalazione   progettata per sostenere una corrente dinamica d'aria   con almeno 12 cambiamenti d'aria l'ora , per assicurare   un tenore di ossigeno adeguato e un'atmosfera di   esposizione a distribuzione uniforme . Quando si usa   una camera di inalazione la progettazione dovrebbe essere   tale da evitare l'affollamento degli animali e di   aumentare al massimo la loro esposizione per inalazione   alla sostanza in esame . Di massima , per assicurare   la stabilità dell'atmosfera della camera , il   « volume » totale degli animali di saggio non   dovrebbe superare il 5 % del volume della camera di   prova . Si può usare il sistema di esposizione   oro-nasale , della testa soltanto o del corpo intero ;   i primi due sistemi ridurranno al massimo   l'assorbimento da altre vie .    Periodo di osservazione    Gli animali sperimentali dovrebbero quotidianamente   essere sottoposti ad osservazione per individuare i   segni di tossicità durante l'interno periodo di   trattamento e di recupero . Si dovrebbe registrare   anche il tempo della morte e quello dell'insorgenza   o della scomparsa dei segni di tossicità .    Procedimento    Gli animali vengono esposti alla sostanza in   esame 5-7 giorni per settimana , per un periodo di   90 giorni . Gli animali appartenenti ai gruppi   satelliti previsti per ulteriori osservazioni   dovrebbero essere tenuti ancora per 28 giorni senza   trattamento per individuare la guarigione o la   persistenza degli effetti tossici . La temperatura   durante la prova dovrebbe essere mantenuta a 22 ° C   ( ± 3 ° C ) . Idealmente , l'umidità relativa   dovrà essere mantenuta tra il 30 % ed il 70 % ,   ma in certi casi ( ad esempio , saggi di aerosols )   ciò potrebbe non essere possibile . Il cibo e l'acqua   non dovrebbero essere somministrati durante l'esposizione .    Si dovrebbe usare un sistema dinamico con un idoneo   sistema di controllo analitico della concentrazione .   Per stabilire le opportune concentrazioni di   esposizione si raccomanda di effettuare una prova .   Il flusso d'aria dovrebbe essere regolato in modo   da garantire che le condizioni nella camera   d'esposizione siano omogenee . Il sistema dovrebbe   garantire che condizioni stabili di esposizione   siano realizzate il più rapidamente possibile .    Si dovrebbero misurare e controllare :    a ) la velocità della corrente d'aria ( in continuo ) ;    b ) la concentrazione reale della sostanza in   esame misurata nella zona di respirazione . Durante   il periodo di esposizione quotidiana , la concentrazione   non dovrebbe subire variazioni più del ± 15 %   del valore medio . Tuttavia , nel caso delle polveri   e degli aerosols questo livello di controllo potrebbe   non essere realizzabile e un più vasto intervallo   sarebbe quindi accettabile . Durante tutto il periodo   dello studio la concentrazione giornaliera dovrebbe   essere tenuta costante nei limiti del possibile .   Durante la messa a punto del sistema di generazione   si dovrebbe eseguire l'analisi delle dimensioni e delle   particelle per stabilire la stabilità delle   concentrazioni di aerosol . Durante l'esposizione ,   le analisi dovrebbero essere effettuate con la   necessaria frequenza per determinare l'uniformità   di distribuzione delle dimensioni delle particelle ;    c ) temperatura ed umidità ;    d ) durante e dopo l'esposizione le osservazioni   sono effettuate e registrate sistematicamente ; per ogni   animale si dovrebbero tenere registri individuali .   Tutti gli animali dovrebbero essere osservati   quotidianamente e si dovrebbero registrare i segni   di tossicità , incluso il tempo di insorgenza ,   il grado e la durata . Le osservazioni collaterali   dovrebbero includere i cambiamenti della cute e del   pelo , degli occhi e delle mucose nonché del   sistema nervoso centrale ed autonomo , di quello   respiratorio e circolatorio , dell'attività   somatomotoria e del quadro comportamentale . Si   dovrebbe procedere settimanalmente alla misura del   consumo alimentare ed alla pesatura degli animali .   L'osservazione regolare degli animali è necessaria   per assicurare che gli stessi non siano persi per   lo studio a causa di cannibalismo , autolisi dei   tessuti o smarrimento . Alla fine del periodo di   studio tutti gli animali sopravvisuti sono sottoposti   a necroscopia . Gli animali moribondi dovrebbero   essere rimossi e sottoposti a necroscopia , quando notati .    I seguenti esami vengono effettuati abitualmente   per tutti gli animali , compresi i controlli :    a ) l'esame oftalmoscopico , eseguito con un   oftalmoscopio o idonea attrezzatura analoga ,   dovrebbe essere effettuato prima dell'esposizione   alla sostanza in esame e alla conclusione dello studio ,   preferibilmente su tutti gli animali o perlomeno su   quelli cui viene somministrato il dosaggio elevato   e al gruppo di controllo . Se vengono individuati   cambiamenti agli occhi tutti gli animali dovrebbero   essere esaminati ;    b ) alla fine del periodo di saggio , si dovrebbero   effettuare le seguenti analisi : ematologia , incluso   ematocrito , concentrazione di emoglobina , conteggio   degli eritrociti , conteggio totale e differenziale   dei leucociti , misura del potenziale di coagulazione ,   quale il tempo di coagulazione , il tempo di   protrombina , il tempo di tromboplastina o conteggio   delle piastrine ;    c ) la determinazione della biochimica clinica sul   sangue dovrebbe essere effettuata alla fine del   periodo di saggio . Le aree di saggio che sono considerate   opportune per tutti gli studi sono : equilibrio degli   elettroliti , metabolismo dei carboidrati , funzione   epatica e renale . La selezione delle prove specifiche   sarà determinata dalle osservazioni sul modo di   azione della sostanza . Si suggerisce di determinare :   calcio , fosforo , cloruro , sodio , potassio , glucosio   a digiuno ( con periodo di digiuno appropriato   alla specie ) , glutamminico-piruvico transaminasi   serica (1) , glutammino-ossalacetico transaminasi   serica (2) , ornitina decarbossilasi , gamma glutammil   transpeptidase , azoto ureico , albumina , creatinina   nel sangue , bilirubina totale e misurazione delle   proteine totali del siero . Altre determinazioni che   possono rendersi necessarie per una valutazione   tossicologica adeguata , includono : analisi dei lipidi ,   ormoni , equilibrio acido/base , metaemoglobina ,   attività della colinesterasi . Determinazione   biochimiche supplementari possono essere usate ,   se necessario , per estendere la ricerca sugli effetti   osservati ;    d ) l'analisi delle urine non è richiesta   routinariamente , ma solo quando vi siano indicazioni   basate sulla tossicità prevista o osservata .    Se i dati storici di base sono insufficienti ,   prima di iniziare il dosaggio si dovrebbe prendere   in considerazione la determinazione dei parametri   ematologici e di biochimica clinica .    Necroscopia macroscopica    Tutti gli animali dovrebbero essere sottoposti a   necroscopia macroscopica completa , che include l'esame   della superficie esterna del corpo , di tutti gli   orifizi e delle cavità cranica , toracica e addominale   e dei loro contenuti . Il fegato , i reni , le ghiandole   surrenali e i testicoli dovranno essere pesati umidi ,   appena possibile dopo la dissezione , per evitare   l'essiccamento . I seguenti organi e tessuti   dovrebbero essere conservati in mezzo adatto per   possibili esami istopatologici futuri : tutte le   lesioni generali , polmoni - che dovrebbero essere   rimossi intatti , pesati e trattati con un fissativo   adatto per garantire che la struttura polmonare   rimanga intatta ( la perfusione con fissativo è   considerata un procedimento efficace ) , tessuti   rinofaringei , cervello - comprese sezioni di   midollo/ponte , corteccia cerebellare e corteccia   cerebrale , pituitaria , tiroide/paratiroide ,   qualsiasi tessuto timico , trachea e polmoni , cuore ,   aorta , ghiandole salivari , milza , fegato ,   reni , ghiandole surrenali , pancreas , gonadi , utero ,   ( organi genitali accessori ) , ( pelle ) , cistifellea   ( se presente ) , esofago , stomaco , duodeno ,   digiuno , ileo , intestino cieco , colon , retto ,   vescica urinaria , linfonodi rappresentativi ,   ( ghiandole mammarie femminili ) , ( muscolatura   della coscia ) , nervo periferico ( occhi ) ,   sterno con midollo osseo , ( femore - compresa   superficie articolare ) , ( midollo spinale a tre livelli -   cervicale , emitoracico e lombare ) , e ( ghiandole   lacrimali esorbitali ) . ( I tessuti citati tra   parentesi devono essere esaminati solo se presentano   segni di tossicità o se vi siano indicazioni che sono   l'organo-bersaglio coinvolto ) .    Esame istopatologico    a ) L'esame istopatologico completo dovrebbe essere   effettuato sulle vie respiratorie e su altri organi   e tessuti di tutti gli animali nel gruppo trattato   con dosaggio elevato e nel gruppo di controllo ;    b ) tutte le lesioni macroscopiche dovrebbero essere   esaminate ;    c ) gli organi-bersaglio in gruppi trattati con altre   dosi dovrebbero essere esaminati ;    d ) i polmoni degli animali nei gruppi trattati   con dosaggio basso ed intermedio dovrebbero essere   sottoposti ad esame istopatologico per l'individuazione   di infezioni , poiché ciò fornisce una valutazione   appropriata dello stato di salute degli animali .   Ulteriori esami istopatologici di routine possono   non essere richiesti per gli animali di questi   gruppi , ma devono sempre essere effettuati sugli   organi che presentano lesioni nel gruppo trattato con   dose elevata ;    e ) quando si fa uso di gruppo satellite , si   dovrebbe eseguire l'esame istopatologico degli stessi   tessuti e degli organi che presentano effetti in altri   gruppi trattati .    2 . DATI    I dati dovrebbero essere riassunti sotto forma   di tabelle , indicando per ogni gruppo di saggio il   numero di animali all'inizio del saggio , il numero   degli animali che presentano lesioni , i tipi di   lesione e la percentuale degli animali che presenta   ciascun tipo di lesioni . I risultati dovrebbero essere   valutati con un metodo statistico idoneo . Qualsiasi   metodo statistico riconosciuto può essere utilizzato .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare , se   possibile :     - specie , ceppo , origine , condizioni ambientali ,   dieta ;     - condizioni sperimentali :    descrizione dell'apparecchiatura di esposizione inclusi   progettazione , tipo , dimensioni , generatore dell'aria ,   sistema di generazione delle particelle e degli   aerosols , metodo di condizionamento dell'aria ,   trattamento dell'aria di scarico e metodo di   alloggiamento degli animali in una camera di saggio ,   quando questa sia usata . L'attrezzatura per la misura   della temperatura , dell'umidità e , se del caso ,   della stabilità delle concentrazioni di aerosol o delle   dimensioni delle particelle dovrebbe essere descrita ;    dati di esposizione : i dati dovrebbero essere   tabulati presentati con valorí medi e una misura della   variabilità ( per esempio deviazione standard )   e dovrebbero includere :    a ) velocità del flusso dell'aria attraverso   l'attrezzatura per l'inalazione ,    b ) temperatura ed umidità dell'aria ,    c ) concentrazioni nominali ( quantità totale   della sostanza in esame immessa nell'apparecchiatura per   l'inalazione , divisa per il volume dell'aria ) ,    d ) natura del veicolo , se usato ,    e ) concentrazione reali nella zona di respirazione ,    f ) dimensioni delle particelle mediane ( se del   caso ) :     - dati sulla risposta tossica per sesso e per   concentrazione ;     - livello senza effetto , quando possibile ;     - tempo della morte ( durante l'esperimento )   oppure specificare se gli animali sono sopravvissuti   fino alle conclusione della prova ;     - descrizione degli effetti tossici o di altri   effetti ;     - tempo di osservazione di ogni segno anomalo e   successivo decorso ;     - dati di alimentazione sul peso corporeo ;     - risultati oftalmologici ;  - prove ematologiche usate e risultati completi ;   PER LA CONTINUAZIONE DEL TESTO VEDI SOTTO NUMERO : 390L0676.2- prove di biochimica clinica usate e risultati   ( compresi i risultati dell'analisi delle urine ) ;     - risultati della necroscopia ;     - descrizione particolareggiata di tutti i   risultati istopatologici ;     - elaborazione statistica dei risultati ,   quando possibile ;     - discussione dei risultati ;     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    (1) Ora nota come alanina aminotransferasi serica .    (2) Ora nota come aspartato aminotransferasi serica .    SAGGIO DI TERATOGENESI : RODITORI E NON-RODITORI    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principi del metodo di saggio    La sostanza sperimentale viene somministrata in   dosi o concentrazioni graduate , per almeno quella   parte della gravidanza che copre il periodo   dell'organogenesi , a diversi gruppi di animali   sperimentali gravidi , una dose per gruppo . Poco   prima della data prevista del parto l'animali viene   ucciso , l'utero tolto ed il contenuto esaminato   Questo metodo sperimentale copre la embriotossicità   e la fetotossicità .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni    Le giovani femmine vergini adulte in buona salute ,   di età e dimensioni comparabili , vengono acclimatate   in condizioni di laboratorio per almeno 5 giorni   prima dello studio ; vengono poi accoppiate con   maschi di comprovata fertilità . Le femmine   inseminate vengono randomizzate ed assegnate ai   gruppi di trattamento . L'accoppiamento può avvenire   naturalmente o tramite inseminazione artificiale .   La sostanza da saggiare viene somministrata ogni   giorno alle femmine , immediatamente dopo l'impianto   e durante l'intero periodo dell'organogenesi . Un   giorno prima del termine , i feti vengono asportati   con isterectomia ed esaminati per determinare eventuali   anomalie viscerali o scheletriche , includenti   ossificazione ritardata , ritardo della crescita   ed emorragie intestinali .    Condizioni sperimentali    Animali da laboratorio    La specie generalmente usate sono il ratto ,   il topo , il criceto ed il coniglio . Le specie   preferite sono il ratto ed il coniglio . Sarà   opportuno usare ceppi generalmente utilizzati   in laboratorio . Il ceppo non dovrà essere a bassa   fecondità e dovrà essere caratterizzato per la   sua risposta ai teratogeni . Gli animali dovranno   essere ingabbiati individualmente .    Numero e sesso    Per ogni livello di dose si richiedono almeno   20 femmine di ratto , di topo o di criceto gravide ,   oppure 12 coniglie . L'obiettivo è di assicurare   un numero sufficiente di parti per permettere una   valutazione del potenziale teratogeno della sostanza .    Livelli di dose    Si richiedono almeno 3 gruppi di dosaggio e un gruppo   di controllo . Quando la sostanza da saggiare è   somministrata in un veicolo , si richiede anche   un gruppo di controllo del veicolo . Se si utilizza   un veicolo , le sue proprietà tossicologiche   dovranno essere note ; esso non dovrà essere   teratogeno né avere effetti sulla riproduzione .   Ad eccezione del trattamento con la sostanza da   saggiare , gli animali nel gruppo di controllo dovranno   essere trattati in modo identico agli animali del   gruppo trattato . A meno che non sia limitato dalla   natura fisico/chimica o dalle proprietà biologiche   della sostanza , il livello più elevato di dose   dovrà idealmente indurre una certa tossicità   materna evidente , quale una leggera perdita del peso ,   ma non più del 10 % di morti . Il livello basso di   dose non dovrà indurre effetti osservabili   attribuibili alla sostanza da saggiare . La dose   intermedia dovrà essere intervallata geometricamente   tra i livelli di dose elevati e quelli bassi .    Prova limite    Nel caso di sostanza a bassa tossicità , se un   livello di dose di almeno 1 000 mg/kg non produce   sintomi di embriotossicità o di teratogenicità ,   prove con altri livelli di dose possono essere   considerate superflue .    Tempo di esposizione    Il giorno 0 nella prova è il giorno in cui sono   osservati ( se possibile ) il tappo vaginale e/o   lo sperma . Il periodo in cui si somministra la   dose dovrebbe riguardare il periodo principale   dell'organogenesi . Per il ratto ed il topo , questo   può essere compreso fra il 6 ° e il 15 °   giorno ; tra il 6 ° e il 14 ° per il criceto ,   e per il coniglio tra il 6 ° e il 18 ° . Se il   giorno 0 è quello in cui si è osservato   l'accoppiamento o l'inseminazione artificiale ,   ai tempi di cui sopra si dovrà aggiungere 1 giorno .   Alternativamente , il periodo del dosaggio può   essere esteso approssimativamente di 1 giorno prima   della data prevista per il parto .    Periodo di osservazione    Un accurato esame clinico dovrà essere fatto almeno   una volta al giorno . Osservazioni supplementari   dovranno avvenire quotidianamente , con azioni   appropriate prese per minimizzare la perdita di   animali durante l'esperimento .    Procedimento    La sostanza da saggiare è somministrata oralmente ,   con sonda .    La sostanza da saggiare dovrà essere   somministrata approssimativamente ogni giorno alla   stessa ora .    Agli animali la laboratorio di sesso femminile   viene somministrata ogni giorno la sostanza da   saggiare , durante il periodo prescritto . La dose   può essere basata sul peso delle femmine   all'inizio della somministrazione della sostanze , o ,   alternativamente , in vista del rapido aumento di   peso che ha luogo durante la gravidanza , gli animali   possono essere pesati periodicamente , ed il dosaggio   basato sulla determinazione più recente del peso .   I sintomi di tossicità dovranno essere registrati   al momento dell'osservazione , insieme con la data di   inizio , il grado e la durata . Le femmine che   minacciano l'aborto o il parto prematuro dovranno   essere sacrificate e sottoposte ad esame   macroscopico accurato . Il periodo di osservazione   post-trattamento dovrà continuare fino a circa un   giorno prima del termine ; l'obiettivo è di coprire   la maggior parte del periodo di gravidanza ,   ma di evitare eventuali complicazioni di interpretazione   dei risultati che potrebbero sorgere in seguito alle   nascite naturali . Le osservazioni parallele   includeranno , ma con si limiteranno a : modificazione   della cute e del pelo , degli occhi e delle mucose ,   nonché del sistema nervoso centrale ed autonomo ,   di quello respiratorio e circolatorio , dell'attività   somatomotoria e del modello comportamentale . Si   dovrebbe procedere settimanalmente alla misura del   consumo alimentare e alla pesatura degli animali .    Necroscopia macroscopica    Alla morte , durante , o alla fine dello studio ,   l'animale dovrà essere sottoposto ad esame   macroscopico per identificare tutte le anomalie   strutturali o le modificazioni patologiche che hanno   potuto influenzare la gravidanza . Immediatamente   dopo la morte , l'utero dovrà essere tolto ed   il contenuto esaminato per eventuale constatazione di   morte dell'embrione o del feto e del numero di feti vivi .   In genere , è possibile stimare la data di morte   nell'utero , quando questa si è verificata . Nei   ratti e nei conigli è possibile determinare il   numero dei corpi lutei .    Si determinerà il sesso dei feti , si eseguirà   la relativa pesatura individuale con registrazione   e derivazione del peso fetale medio . Dopo la   rimozione ogni feto dovrà essere esaminato   esternamente . Per i ratti , i topi e i criceti ,   la metà di ogni figliata dovrà essere preparata   per l'osservazione di anomalie scheletriche , e la   parte rimanente di ogni figliata verrà preparata per   l'osservazione di anomalie o sintomi di eventuale   disfacimento tissulare usando metodi appropriati .   Per i conigli , ogni feto verrà esaminato con   accurata dissezione per il riscontro di anomalie   viscerali e di anomalie scheletriche .    2 . DATI    I dati devono essere riassunti sotto forma di tabelle ,   indicando per ogni gruppo sperimentale il numero di   animali all'inizio della prova , il numero di quelli   divenuti gravidi , il numero e le percentuali dei feti   vivi e dei feti che presentano anomalie scheletriche   o disfacimento tissulare nonché la loro relazione   con figliate specifiche . I risultati devono essere   valutati con un metodo statistico idoneo . Qualsiasi   metodo statistico riconosciuto può essere utilizzato .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare ,   se possibile :     - specie , ceppo , origine , condizioni ambientali ,   dieta , ecc. ,     - condizioni sperimentali ,     - livelli di dose ( veicolo compreso , se   utilizzato ) e concentrazioni ,     - dati sulla risposta tossica per dose ,     - livello senza effetto ( quando possibile ) ,     - registrazione della data della morte durante   lo studio oppure specificare se gli animali sono   sopravvissuti fino aila conclusione della prova ,     - descrizione degli effetti tossici o di altri   effetti ,     - registrazione della data di osservazione di   ogni sintomo anomalo e successivo decorso ,     - dati sulla alimentazione e sul peso corporeo ,     - durata della gravidanza e dati sulle figliate   ( inclusi dati storici ) ,     - dati fetali ( vivi/morti , sesso , anomalie   dei tessuti mollí e anomalie scheletriche ) ,     - dati sulla figliata ( vivi/morti , sesso , anomalie   dei tessuti molli e anomalie scheletriche ) ,     - elaborazione statistica dei risultati quando   possibile ,     - discussione dei risultati ,     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    SAGGIO DI TOSSICITÀ CRONICA    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principio del metodo di saggio    La sostanza in esame è somministrata normalmente   7 giorni per settimana , per una via opportuna ,   a diversi gruppi di animali sperimentali , una dose per   gruppo , per la maggior parte della loro durata di   vita . Durante e dopo l'esposizione alla sostanza in   esame , gli animali sperimentali sono sottoposti   ad osservazione quotidianamente per individuare   segni di tossicità .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni    Gli animali sono tenuti nelle condizioni di   alloggiamento e nutrizione sperimentali per almeno 5   giorni prima dell'inizio del saggio . Prima   dell'esperimento , gli animali giovani e sani vengono   mescolati con metodo casuale ed assegnati a gruppi   di trattamento e di controllo .    Condizioni di saggio    Animali da laboratorio    La specie preferita è il ratto . Sulla base dei   risultati di studi precedentemente effettuati , altre   specie ( roditori o non-roditori ) possono essere   utilizzate . Si dovrebbero usare i ceppi di   laboratorio generalmente utilizzati di giovani   animali sani ed il dosaggio dovrebbe iniziare non appena   possibile dopo lo svezzamento .    All'inizio dello studio , la variazione di peso   negli animali usati non dovrebbe superare il ± 20 %   del valore medio . Quando venga intrapreso uno   studio di tossicità subcronica orale come preliminare   ad uno studio a lungo termine , si dovrebbe usare   la stessa specie e lo stesso ceppo in entrambi gli studi .    Numero e sesso    Per ciascun livello di dose si dovrebbero utilizzare ,   per i roditori , almeno 40 animali ( 20 maschi e 20   femmine ) e un gruppo di controllo parallelo . Le   femmine dovrebbero essere nullipare e non gravide .   Se si prevede di sacrificare alcuni animali ,   il loro numero dovrà essere aumentato del numero   di animali che si prevede di sacrificare prima del   completamento dello studio .    Per i non-roditori un numero inferiore di animali ,   almeno 4 per sesso e per gruppo , è accettabile .    Livelli di dose e frequenza dell'esposizione    Si dovrebbero utilizzare almeno tre livelli di   dose oltre al gruppo di controllo . Il livello di   dose più elevato dovrebbe provocare sintomi   precisi di tossicità senza causare eccessiva   mortalità . Il livello di dose più basso non   dovrebbe produrre alcuna evidenza di tossicità .    La dose ( le dosi ) intermedia(e) dovrebbe(ro)   essere fissata(e) in un intervallo intermedio tra le dosi   elevate e quelle basse .    Nella scelta dei livelli di dose si dovrebbe tener   conto dei dati ottenuti da precedenti saggi e   studi di tossicità .    Normalmente , la frequenza dell'esposizione è   quotidiana . Se la sostanza chimica viene somministrata   in acqua potabile o mescolata nella dieta , essa   dovrebbe essere continuamente disponibile .    Controlli    Si dovrebbe usare un gruppo di controllo parallelo   identico sotto tutti i punti di vista ai gruppi   esposti , eccezion fatta per l'esposizione alla   sostanza in esame .    In circostanze specifiche , come in studi di   inalazione che richiedono l'uso di aerosol o di un   emulsionante ad attività biologica non caratterizzata   in studi orali , si dovrebbe usare anche un gruppo di   controllo negativo parallelo . In gruppo di controllo   negativo riceve lo stesso trattamento degli altri   gruppi di animali sperimentali , eccettuato il fatto   che gli animali non sono esposti alla sostanza   sperimentale né ad alcun veicolo .    Vie di somministrazione    Le due vie principali di somministrazione sono   quella orale e quella inalatoria . La scelta della via di   somministrazione dipende dalle caratteristiche   fisiche e chimiche della sostanza in esame e della   via probabile di esposizione dell'uomo .    L'uso della via cutanea presenta considerevoli   problemi pratici . La tossicità sistematica cronica   derivante dall'assorbimento percutaneo può essere   arguita normalmente dai risultati dell'altra prova   orale e dalla conoscenza dell'entità dell'assorbimento   percutaneo derivata dalle prove di tossicità   percutanea .    Studi orali    Ove la sostanza in esame sia assorbita dal   tratto gastro-intestinale , e se la via orale   è una via di esposizione degli esseri umani , la   via orale di somministrazione è quella preferita ,   a meno che non vi siano controindicazioni . Gli   animali possono ricevere la sostanza in esame nella   loro dieta , sciolta in acqua potabile , o in capsula .   Idealmente , dovrebbe essere usato un dosaggio   giornaliero , sette giorni per settimana , perché un   dosaggio di cinque giorni/settimana potrebbe provocare   un recupero o una tossicità da privazione nel periodo   di mancato dosaggio , influenzando così il risultato   e la valutazione successiva . Tuttavia , sulla base   principalmente di considerazioni pratiche , il   dosaggio su una base di cinque giorni/settimana è   considerato accettabile .    Studi di inalazione    Poiché gli studi sull'inalazione offrono problemi   tecnici di maggior complessità delle altre vie di   somministrazione , vengono qui fornite indicazioni   più particolareggiate su questo modo di   somministrazione . Dovrebbe essere notato che   l'installazione endotracheale può costituire   un'alternativa valida in situazioni specifiche .    Le esposizioni a lungo termine sono di solito   modellate sulla esposizione umana prevista , che prevede   per gli animali un'esposizione quotidiana di 6 ore   dopo equilibrazione delle concentrazioni nella camera ,   per 5 giorni/settimana ( esposizione intermittente ) ,   o su un'esposizione ambientale possibile , con 22-24 ore di   esposizione/giorno , 7 giorni/settimana ( esposizione   continua ) , con circa un'ora/giorno per nutrire gli   animali allo stesso orario e per la manutenzione della   camera .    In entrambi i casi , gli animali sono di olito   esposti a concentrazioni fisse delle sostanze in   esame . Una differenza importante da considerare tra   l'esposizione intermittente e quella continua è che ,   con la prima , vi è un periodo di 17-18 ore in cui   gli animali possono riprendersi dagli effetti di ogni   esposizione quotidiana , e un periodo di recupero   ancora più lungo durante i fine settimana .    La scelta dell'esposizione intermittente o continua   dipende dagli obiettivi dello studio e   dall'esposizione umana che deve essere simulata .   Tuttavia , certe difficoltà tecniche devono essere   considerate . Per esempio , i vantaggi dell'esposizione   continua per simulare le condizioni ambientali possono   essere controbilanciati dalla necessità di   nutrire e abbeverare gli animali durante l'esposizione , o   di disporre di aerosol di tipo più complicato   ( e affidabile ) e di sistemi di generazione di   vapore e di controllo .    Camere di esposizione    Gli animali dovrebbero essere sottoposti a   sperimentazione in camere di inalazione progettate   per sostenere un flusso dinamico con almeno 12   cambiamenti d'aria/ora , per assicurare un tenore di   ossigeno adeguato e un'atmosfera di esposizione   uniforme . Le camere di esposizione e di controllo   dovrebbero essere identiche nella costruzione e nella   progettazione , per poter assicurare condizioni di   esposizione comparabili sotto tutti gli aspetti ,   eccezion fatta per l'esposizione alle sostanze in esame .   Nella camera viene generalmente mantenuta una leggera   depressione per impedire la fuoriuscita delle sostanze   in esame nella zona circostante . Nelle camere si   dovrebbe ridurre al minimo l'affollamento degli   animali . Come regola generale , al fine di assicurare   la stabilità dell'atmosfera della camera , il   « volume » totale degli animali di saggio non   dovrebbe superare il 5 % del volume della camera .    Si dovrebbero eseguire le misure o i controlli   sottoelencati :    i ) Flusso dell'aria : la velocità del flusso   d'aria attraverso la camera dovrebbe essere controllata   preferibilmente in modo continuo .    ii ) Concentrazione : durante il periodo di esposizione   quotidiana , la concentrazione della sostanza in esame   non dovrebbe variare di più o meno il 15 % del   valore medio .    iii ) Temperatura ed umidità : per i roditori   la temperatura dovrebbe essere mantenuta sui   22 ° C ( ± 2 ° C ) , e l'umidità all'interno   della camera al 30-70 % , eccetto quando l'acqua   è usata per mantenere in sospensione la   sostanza di prova nell'atmosfera della camera .   Preferibilmente entrambe dovrebbero essere controllate in   continuo .    iv ) Misura delle dimensioni delle particelle :   la distribuzione delle dimensioni delle particelle dovrebbe   essere determinata sulle atmosfere di camere che   contengano aerosol liquidi o solidi . Le particelle   contenute negli aerosol dovrebbero avere dimensioni tali   da essere inalabili dall'animale da laboratorio usato .   I campioni di atmosfera dovrebbero essere prelevati   a livello della zona di respirazione degli animali .   Il campione d'aria dovrebbe essere rappresentativo   della distribuzione delle particelle a cui gli animali   sono esposti e dovrebbe rappresentare , su una base   gravimetrica , tutto l'aerosol sospeso anche quando   gran parte di esso non è respirabile . Le   analisi della grandezza delle particelle dovrebbero   essere effettuate spesso durante la messa a punto   del sistema di generazione per assicurare la stabilità   dell'aerosol e , in seguito , quando si ritenga   necessario , durante le esposizioni , per determinare   in modo adeguato l'uniformità della distribuzione   delle particelle a cui gli animali sono stati esposti .    Durata dello studio    La durata del periodo di somministrazione dovrebbe   essere di almeno 12 mesi .    Procedimento    Osservazioni    Un accurato esame clinico dovrebbe essere eseguito   almeno quotidianamente . Oltre alle osservazioni   supplementari , si dovrebbero adottare le misure   appropriate per ridurre al massimo la perdita di   animali ad esempio necroscopia o refrigerazione degli   animali trovati morti e isolamento o sacrificio degli   animali deboli o moribondi . Si dovrebbero eseguire   accurate osservazioni per individuare l'insorgere   e la progressione di tutti gli effetti tossici e per   ridurre al massimo le perdite dovute a malattia , ad   autolisi , o a cannibalismo .    I segni clinici , comprese le alterazioni oculari   e neurologiche nonché la mortalità , dovrebbero   essere registrati per tutti gli animali . Si   dovrebbero registrare il tempo di insorgenza e la   progressione delle condizioni tossiche , compresi i   tumori sospetti .    Una registrazione individuale del peso corporeo   di tutti gli animali dovrebbe essere effettuata una volta per   settimana , durante le prime 13 settimane del periodo   di saggio ed almeno una volta ogni 4 settimane in   seguito . La quantità di cibo ingerita dovrebbe   essere determinata settimanalmente durante le prime   13 settimane dello studio , e poi a intervalli di   circa tre mesi , a meno che lo stato di salute o le   variazioni del peso corporeo non impongano altre   soluzioni .    Esame ematologico    L'esame ematologico ( ad esempio : contenuto di   emoglobina , volume delle cellule ammassate , eritrociti   totali , leucociti totali , piastrine , o altre   misure di potenziale di coagulazione ) dovrebbe   essere eseguito dopo 3 mesi , 6 mesi e quindi a   intervalli di circa 6 mesi , ed alia conclusione dello   studio , su campioni di sangue raccolti da tutti i   non-roditori e da 10 ratti per sesso di tutti i gruppi .   Se possibile , questi prelievi dovrebbero essere   effettuati ogni volta sugli stessi ratti . Inoltre ,   si dovrebbe raccogliere un campione prima   dell'esperimento dai non-roditori .    Se le osservazioni cliniche indicano un   deterioramento nella salute degli animali durante lo   studio , si dovrebbe eseguire un conteggio differenziale   ematico dei suddetti animali .    Un conteggio differenziale ematico viene eseguito   sui campioni provenienti dagli animali del gruppo   a dosaggio più elevato e dai controlli . I   conteggi differenziali ematici sono eseguiti per il   gruppo seguente ( o i gruppi seguenti ) trattato   con dosaggio inferiore , soltanto se vi sono   discordanze importanti tra il gruppo trattato con   dosaggio più elevato ed i controlli , o se vi sono   indicazioni derivanti dai risultati dall'esame   patologico .    Analisi delle urine    Per l'analisi si dovrebbero prelevare campioni di   urina da tutti i non-roditori e da 10 ratti per sesso   di tutti i gruppi , se possibile dagli   stessi ratti ed agli stessi intervalli dell'esame   ematologico . Le seguenti determinazioni dovrebbero   essere effettuate o sui singoli animali o su una   miscela dei campioni per sesso e per gruppo di roditori :     - aspetto : volume e densità per i singoli animali ;     - proteine , glucosio , chetoni , sangue   occulto ( semiquantitativamente ) ;     - microscopia del sedimento ( semiquantitativamente ) .    Chimica clinica    Approssimativamente a intervalli di 6 mesi ,   ed alla conclusione del saggio , si prelevano   campioni di sangue per le determinazioni di   chimica clinica da tutti i non-roditori e da   10 ratti/sesso di tutti i gruppi , se possibile   dagli stessi ratti a ogni intervallo . Inoltre si   dovrebbe prelevare un campione prima   dell'esperimento dai non-roditori . Da questi   campioni viene preparato il plasma e vengono   eseguite le seguenti analisi :     - concentrazione delle proteine totali ;     - concentrazione dell'albumina ;     - saggio di funzionalità epatica ( quali   attività fosfatasi alcalina , glutammico-piruvico   transaminasi (1) e transminasi glutammico-ossalacetica   (2) , glutammil transpeptidasi , ornitina decarbossilasi ) ;     - metabolismo dei caboidrati , quali glucosio   ematico a digiuno ;     - saggi di funcionalità renale , quali azoto   ureico ematico .    Necroscopia macroscopica    È necessario un esame necroscopico completo   di tutti gli animali , compresi quelli morti   durante l'esperimento o uccisi perché   moribondi . Prima del sacrificio da tutti gli animali   si dovrebbero prelevare campioni di sangue per i   conteggi differenziali ematici . Tutte le   lesioni macroscopiche visibili , i tumori o le lesioni   sospette quali tumori dovrebbero essere conservate .   Si dovrebbe cercare di correlare le osservazioni   macroscopiche con i risultati degli esami microscopici .    Tutti gli organi e i tessuti dovrebbero essere   conservati per l'esame istopatologico . Questo   di solito riguarda i seguenti organi e tessuti :   cervello (3) ( midollo/ponte , corteccia cereballare ,   corteccia cerebrale ) , pituitaria , tiroide ( compresa   paratiroide ) , timo , polmoni ( trachea compresa ) ,   cuore , aorta , ghiandole salivarie , fegato (3) ,   milza , reni (3) , ghiandole surrenali (3) , esofago ,   stomaco , duodeno , digiuno , ileo , intestino cieco ,   colon , retto , utero , vescica urinaria ,   linfonodi , pancreas , gonadi (3) , organi genitali   accessori , ghiandole mammarie femminili , pelle ,   muscolatura , nervo periferico , midollo spinale   ( cervicale , toracico , lombare ) , sterno con   midollo osseo e femore ( articolazione compresa )   e occhi . L'insufflazione dei polmoni e della   vescica urinaria con un fissativo è il modo ottimale   di conservare questi tessuti ; l'insufflazione dei   polmoni negli studi di inalazione è essenziale   per eseguire un esame istopatologico appropriato .   Negli studi speciali , quali quelli di inalazione ,   si studieranno l'intero tratto respiratorio   compreso naso , faringe e laringe .    Se si eseguono altri esami clinici , le informazioni   ottenute da questi dovranno essere disponibili   prima dell'esame microscopico , perché esse possono   fornire indicazioni significative al patologo .    Istopatologia    Tutte le alterazioni visibili , in particolare   i tumori ed altre lesioni che si verificano in   qualsiasi organo , dovrebbero essere esaminati   microscopicamente . Inoltre si raccomandano le   seguenti procedure :    a ) esame microscopico di tutti gli organi e   tessuti conservati , con descrizione completa   di tutte le lesioni riscontrate in :    1 . tutti gli animali che sono morti durante   lo studio , e    2 . tutti quelli dei gruppi trattati con la   dose elevata e controlli . Questi organi ,   prelevati da 10 animali per sesso e per gruppo   per i roditori e da tutti i non-roditori , più   tiroide ( con paratiroide ) per tutti i non-roditori ,   dovrebbero essere pesati ;    b ) gli organi o i tessuti che mostrano anomalie   causate , o possibilmente causate dalla sostanza   in esame , vengono esaminati anche negli animali   appartenenti ai gruppi trattati con le dosi   più basse ;    c ) se il risultato dell'esperimento evidenzia   una riduzione sostanziale della longevità normale   degli animali o induzione di effetti in grado   di influire sulla risposta tossica , gli animali   del gruppo trattato con livello di dose   immediatamente inferiore dovrebbero essere   esaminati come sopra descritto ;    d ) informazioni sull'incidenza di lesioni normalmente   riscontrate nel ceppo degli animali usati ,   nelle stesse condizioni di laboratorio ossia i   dati storici dei controlli sono indispensabili   per valutare correttamente l'importanza dei   mutamenti osservati negli animali trattati .    2 . DATI    I dati dovrebbero essere riassunti sotto forma   di tabelle , indicando per ogni gruppo di saggio   il numero di animali all'inizio del saggio ,   il numero degli animali che presenta lesioni e   la percentuale degli animali che presenta ciascun   tipo di lesione . I risultati dovrebbero essere   valutati con un metodo statistico idoneo .   Qualsiasi metodo statistico riconosciuto può   essere utilizzato .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare ,   se possibile :     - specie , ceppo , origine , condizioni   ambientali , dieta :     - condizioni sperimentali :    descrizione dell'apparecchiatura per l'esposizione ,   inclusi : progettazione , tipo , dimensioni , fonte   dell'aria , sistema per generare particelle e aerosol ,   metodo di condizionamento dell'aria , trattamento   dell'aria di scarico e metodo di alloggiamento   degli animali in una camera di saggio , quando   questa è utilizzata . L'attrezzatura per   misurare la temperatura , l'umidità e , se del   caso , la stabilità di concentrazione degli aerosol   o la dimensione delle particelle dovrebbe essere   descritta ;    dati di esposizione : dovrebbero essere presentati   in forma tabulare con i valori medi e una misura   della variabilità ( per esempio : deviazione   standard ) e dovrebbero includere :    a ) portate dell'aria attraverso l'attrezzatura   di inalazione ,    b ) temperatura ed umidità dell'aria ,    c ) concentrazioni nominali ( quantità totale   della sostanza in esame immessa nell'attrezzatura   di inalazione divisa per il volume dell'aria ) ,    d ) natura del veicolo , se usato ,    e ) concentrazioni reali nella zona sperimentale   di respirazione ,    f ) dimensioni delle particelle medianti ( se del   caso ) ;     - livelli di dose ( incluso il veicolo , se   usato ) e le concentrazioni ;     - dati relativi agli effetti tossici per sesso   e dose ;     - livello senza effetti ;     - tempo di eventi letali durante lo studio o   se gli animali erano vivi al completamento del saggio ;     - descrizione degli effetti tossici e di altri   effetti ;     - registrazione della data di osservazione di   ogni sintomo anomalo e successivo decorso ;     - dati di alimentazione e di peso corporeo ;     - risultati oftalmologici ;     - prove ematologiche usate e risultati completi ;     - saggi di biochimica clinica usati e risultati   completi ( compresi i risultati dell'analisi delle   urine ) ;     - risuitati della necroscopia ;     - descrizione particolareggiata di tutti i   risultati istopatologici ;     - elaborazione statistica dei risultati , quando   possibile ;     - discussione dei risultati ;     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    (1) Ora nota come alanino-amminotransferasi serica .    (2) Ora nota come aspartato-amminotransferasi serica .    (3) Questi organi , prelevati da 10 animali per   sesso e per gruppo per i roditori e da tutti i   non-roditori , più tiroide ( con paratiroidi )   per tutti i non roditori , dovrebbero essere pesati .    SAGGIO DI CANCEROGENESI    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principio del metodo di saggio    La sostanza da saggiare è somministrata   normalmente 7 giorni per settimana , tramite via   appropriata , a diversi gruppi di animali sperimentali ,   una dose per gruppo , per la maggior parte della   loro durata di vita . Durante e dopo l'esposizione   alla sostanza , gli animalí verranno sottoposti   giornalmente ad osservazione per individuare i   sintomi della tossicità , in particolare lo   sviluppo dei tumori .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni    Gli animali sono tenuti nell'allogio sperimentale   e nutriti per almeno 5 giorni prima dell'inizio   della prova . Prima dell'esperimento , gli animali   giovani e sani vengono randomizzati ed   assegnati a gruppi stabiliti .    Animali da laboratorio    La specie preferita è il ratto . Sulla base   dei risultati di studi precedentemente intrapresi ,   altre specie ( roditori o non-roditori ) possono   essere utilizzate . Sarà opportuno usare ceppi   di giovani animali sani generalmente utilizzati   in laboratorio e il dosaggio dovrà iniziare   non appena possibile dopo lo svezzamento .   All'inizio dello studio , la variazione di peso   degli animali usati non dovrà superare più   o meno 20 % del valore medio . Quando vengano   intrapresi studi di subcronicità orale come   preliminari ad uno studio a lungo termine , si   dovranno usare le stesse specie in entrambi gli   studi .    Numero e sesso    Si utilizzerano animali di entrambi i sessi .    La somministrazione del dosaggio ai roditori   dovrà cominiciare non appena possibile dopo   lo svezzamento .    Nel caso di roditori si utilizzeranno almeno   100 animali ( 50 maschi e 50 femmine ) per ogni   livello di dose e gruppo di controllo parallelo .   Le femmine devono essere nullipare e non gravide .   Se si prevede di sacrificare ad intervalli   alcuni animali , il numero dovrà essere   aumentato del numero di animali che si prevede   di sacrificare prima del completamento dello studio .    Livelli di dose e frequenza dell'esposizione    Si dovranno usare almeno tre livelli di dose   oltre a un gruppo di controllo parallelo . Il   livello di dose più elevato dovra essere tale   da provocare sintomi di tossicità minimi , quali   una leggera diminuzione dell'aumento del peso   corporeo ( meno di 10 % ) , senza alterare sostanzialmente   la durata normale di vita per effetti diversi da   quelli dei tumori .    La dose più bassa non dovrà interferire   con la crescita , lo sviluppo , e la longevità   normali dell'animale né produrre sintomi di   tossicità . In generale , essa non dovrà   essere inferiore al 10 % della dose più elevata .    La ( le ) dose(i) intermedia(e) dovrà essere   stabilita mediamente tra le dosi elevate e quelle   basse .    La scelta dei livelli di dose dovrà prendere   in considerazione i dati delle prove e degli   studi precedenti di tossicità .    Se il prodotto chimico è somministrato in acqua   potabile o mescolato nella dieta , esso   dovrà essere continuamente disponibile .    Controlli    Si userà il gruppo di controllo parallelo ,   che è identico sotto ogni aspetto ai gruppi esposti   eccezion fatta per l'esposizione alla sostanza   in esame .    In circostanze specifiche , quali ad esempio gli   studi di inalazione comportanti impiego di   aerosol o gli studi sulla tossicità orale che   contemplano l'uso di un emulsionante ad attività   biologica atipica , si utilizzerà un gruppo di   controllo supplementare non esposto al veicolo .    Vie di somministrazione    Le tre vie principali di somministrazione sono :   orale , cutanea e per inalazione . La scelta   della via di semministrazione dipende dalle   caratteristiche fisiche e chimiche della   sostanza da saggiare e dalla via che caratterizza   l'esposizione degli esseri umani .    Saggio per via orale    Se la sostanza da saggiare è assorbita dal   tratto gastrointestinale , e se la via orale è   una via di esposizione degli esseri umani ,   verrà preferita la via orale di somministrazione ,   a meno che non vi siano controindicazioni . Gli   animali dovranno ricevere la sostanza da saggiare   nella loro dieta , sciolta in acqua potabile ,   o in capsula .    Il dosaggio ideale dovrebbe essere un dosaggio   quotidiano sulla base di sette giorni/settimana ,   perché il dosaggio di cinque giorni/settimana   permette il recupero o la perdita di tossicità   nel periodo di mancato dosaggio , influenzando   così i risultati e la valutazione succesiva .   Tuttavia , principalmente sulla base di considerazioni   pratiche , il dosaggio di cinque giorni/settimana   è considerato accettabile .    Saggio per via cutanea    L'esposizione cutanea per spennellamento della   pelle può essere scelta per simulare una via   principale di esposizione umana e come sistema   modello per induzione di lesioni cutanee .    Saggio per via inalatoria    Poiché gli esperimenti di inalazione presentano   problemi tecnici di maggior complessità delle   altre vie di somministrazione , si forniscono in   questa sede indicazioni particolareggiate su   questo modo di somministrazione . Da notare inoltre   che l'installazione endotracheale può costituire   un'alternativa valida in situazioni specifiche .    Le esposizioni a lungo termine sono di solito   modellate sui tipi di esposizione umana e   sottopongono gli animali ad un'esposizione quotidiana   di 6 ore dopo livellamento delle concentrazioni   della camera , per 5 giorni/settimana ( esposizione   intermittente ) o , per un'esposizione ambientale   possibile , con 22-24 ore di esposizione/giorno ,   7 giorni/settimana ( esposizione continua ) , con   circa un'ora per nutrire gli animali in orari   simili ogni giorno e per il mantenimento delle   camere . In entrambi i casi , gli animali di solito   sono esposti ad una concentrazione fissa di   sostanza da saggiare . Una differenza notevole   da considerare tra l'esposizione intermittente e   quella continua è costituita dal fatto che con   la prima vi è un periodo di 17-18 ore in cui gli   animali possono riprendersi dagli effetti di   ogni esposizione , e un periodo ancora più lungo   di recupero a fine settimana .    La scelta dell'esposizione intermittente o   continua dipende dagli obiettivi dello studio e   dall'esposizione umana da simulare . Tuttavia ,   occorrerà considerare alcune difficoltà   tecniche . Per esempio , i vantaggi dell'esposizione   continua per la simulazione delle condizioni   ambientali possono essere compensati dalla   necessità di abbeverare o nutrire gli animali   durante l'esposizione , e dall'esigenza di usare   aerosol più complicati ( e affidabili ) , di   generare il vapore e di usare techniche di controllo .    Camere di esposizione    Gli animali dovranno essere sottoposti a prove   in camere di inalazione progettate per sostenere   un flusso dinamico di almeno 12 cambiamenti   d'aria/ora , per assicurare un tenore di ossigeno   adeguato e un'atmosfera ugualmente distribuita .   Le camere di esposizione e di controllo dovranno   avere costruzioni e progettazioni identiche per   assicurare condizioni di esposizione comparabili   sotto tutti gli aspetti , eccezion fatta per le   esposizioni alle sostanze da saggiare . Una   leggera pressione negativa dentro la camera   viene generalmente mantenuta per impedire perdite   della sostanza sperimentale nella zona circostante .   Nelle camere si dovrà ridurre al massimo   l'affollamento degli animali sperimentali . Come   regola generale per assicurare la stabilità   dell'atmosfera della camera , il « volume »   totale degli animali sperimentali non dovrà   superare il 5 % del volume della camera .    Si effettueranno le seguenti misurazioni o   controlli :    i ) Corrente d'aria : la portata d'aria   attraverso la camera dovrà essere controllata   preferibilmente in continuo .    ii ) Concentrazione : durante il periodo di esposizione   quotidiana , la concentrazione non dovrà variare   di più del ± 15 % dal valore medio . Per la   durata totale dello studio , le concentrazioni   giornaliere dovranno essere tenute costanti nella   misura del possibile .    iii ) Temperatura ed umidità : per i roditori ,   la temperatura dovrà essere mantenuta a 22 ° C   ( ± 2 ° C ) e l'umidità all'interno della   camera al 30-70 % , eccetto quando l'acqua è   usata per mantenere in sospensione la sostanza   sperimentale nell'atmosfera della camera . Entrambe   dovranno essere controllate preferibilmente in   continuo .    iv ) Misurazioni delle dimensioni delle particelle :   occorrerà effettuare una determinazione della   distribuzione dimensionale delle particelle   nell'atmosfera delle camere in cui si usino aerosol   liquidi o solidi . Le particelle degli aerosol   dovranno essere di dimensioni respirabili per gli   animali sperimentali usati . I campioni delle atmosfere   della camera saranno prelevati nell'area di respirazione   degli animali . Il campione dell'aria sarà   rappresentativo della distribuzione delle particelle   a cui gli animali sono esposti e dovrà rappresentare ,   su una base gravimetrica , tutto l'aerosol sospeso   anche quando gran parte dello stesso non è   respirabile . Le analisi granulometriche dovranno   essere effettuate di frequente durante la messa a   punto del sistema di generazione per assicurare   la stabilità dell'aerosol e , in seguito ,   durante le esposizioni , solo quando necessario ,   a seconda dei bisogni , per determinare l'uniformità   di distribuzione delle particelle a cui gli animali   sono stati esposti .    Durata dello studio    La durata di un test di cancerogenesi copre la parte   principale della durata normale di vita degli   animali sperimentali . La conclusione dello studio   sarà dopo 18 mesi per i topi ed i criceti , e   dopo 24 mesi per i ratti ; tuttavia , per certi   ceppi di animali con maggior longevità e tasso   poco elevato di tumori spontanei , la conclusione   dovrebbe essere dopo 24 mesi per i topi ed i criceti   e dopo 30 mesi per i ratti . Alternativamente ,   la conclusione di un tale studio esteso è   accettabile quando la percentuale di superstiti   nel gruppo a livello di dose più basso o nel   gruppo di controllo raggiunge il 25 % . Allo scopo   di terminare lo studio in cui si manifesti una   differenza evidente nella risposta , determinata   dal sesso , ciascun sesso dovrà essere considerato   come un esperimento distinto . Quando solo il gruppo   a dose elevata muore prematuramente per ovvie   ragioni di tossicità , questa ragione non deve   determinare la conclusione dell'esperimento a meno   che le manifestazioni tossiche non causino   problemi negli altri gruppi . Perché un risultato   sperimentale negativo sia accettabile , non piú   del 10 % di animali di qualsiasi gruppo deve essere   perso a causa di autolisi , cannibalismo o altri   problemi , e il tasso di sopravvivenza di tutti i   gruppi non deve essere inferiore al 50 % a 18 mesi   per i topi ed i criceti e a 24 mesi per i ratti .    Procedimento    Osservazioni    Le osservazioni parallele includeranno modificazioni   della cute e del pelo , degli occhi e delle mucose   nonche del sistema nervoso centrale ed autonomo ,   di quello respiratorio e circolatorio , dell'attività   somatomotoria e del modello comportamentale .    L'osservazione regolare degli animali è   necessaria per assicurarsi che gli stessi siano   conservati il più possibile per lo studio e   non persi a causa di cannibalismo , autolisi dei   tessuti o smarrimento . Gli animali moribondi   verranno rimossi e sottoposti a necroscopia .    Per tutti gli animali si annoteranno i sintomi   clinici e la mortalità . Si dedicherà   speciale attenzione all'insorgenza dei tumori ;   si registrerà la data di inizio , la posizione ,   le dimensioni , l'aspetto e la progressione   di ogni tumore grossolanamente visibile o palpabile .    Si procederà settimanalmente alla misurazione   del consumo alimentare ( e del consumo dell'acqua   quando la sostanza sperimentale è somministrata   in acqua potabile ) durante le prime 13 settimane   dello studio e successivamente a intervalli di   circa tre mesi a meno che i cambiamenti dello   stato di salute o del peso corporeo non impongano   altre soluzioni .    Il peso corporeo dovrà essere registrato   individualmente per tutti gli animali una volta   per settimana durante le prime 13 settimane   del periodo di prova ed almeno una volta ogni   4 settimane in seguito .    Esami clinici    Ematologia   Se le osservazioni parallele evidenziano un   deterioramento nella salute degli animali durante   lo studio , si eseguirà un conteggio   differenziale del sangue degli animali colpiti .    Dopo 12 mesi , 18 mesi e prima del sacrificio ,   si farà uno striscio del sangue di tutti   gli animali . Un conteggio differenziale del sangue   sarà eseguito sui campioni ottenuti dagli animali   nel gruppo a dosaggio più elevato e nei controlli .   Se i suddetti dati , e in particolare quelli ottenuti   prima del sacrificio , o i dati dall'esame patologico   ne indicano l'esigenza , si eseguirà il conteggio   differenziale del sangue anche per il gruppo(i) trattato   con dosaggio immediatamente inferiore .   Esame autoptico di base    L'esame autoptico di base completo dovrà essere   eseguito su tutti gli animali , compresi quelli che   sono morti durante l'esperimento e quelli moribondi .   Si conserveranno tutti i tumori o le lesioni visibili   o sospette .    I seguenti organi e tessuti dovranno essere   conservati in mezzo adatto per esami istopatologici futuri   possibili : tutte le lesioni generali , cervello -   comprese sezioni di midollo/ponte , corteccia   cerebellare e corteccia cerebrale , pituitaria ,   tiroide/paratiroide , qualsiasi tessuto timico ,   trachea e polmoni , cuore , aorta , ghiandole   salivarie , milza , fegato , reni , ghiandole   surrenali , pancreas , gonadi , utero , organi   genitali accessori , pelle , esofago , stomaco ,   duodeno , digiuno , ileo , intestino cieco , colon ,   retto , vescica urinaria , linfonodi rappresentativi ,   ghiandole mammarie femminili , muscolatura   della coscia , nervo periferico , sterno   con midollo osseo , femore - compresa superficie articolare ,   midollo spinale a tre livelli - cervicale ,   mediotovacico e lombare , occhi e ghiandole   lacrimali esorbitali .    Sebbene l'insufflazione dei polmoni e della vescica   urinaria con un fissativo sia il modo ostimale   di conservare questi tessuti , l'insufflazione   dei polmoni negli studi di inalazione è un   requisito necessario per l'esecuzione dell'esame   istopatologico appropriato . Negli studi di inalazione ,   si conserverà tutto il tratto respiratorio , comprese   le cavità nasali , le faringi e le laringi .    Esame istopatologico    a ) Esame istopatologico completo degli organi   e dei tessuti di tutti gli animali che muoiono o   vengono sacrificati durante la prova e di tutti   gli animali nei gruppi trattati con dose elevata e   nei controlli .    b ) Esame dei tumori o lesioni grossolane   visibili o sospette in tutti i gruppi .    c ) Se nei gruppi trattati con dosaggio elevato e   nei gruppi di controllo si riscontra una differenza   significativa nell'incidenza di lesioni neoplastiche ,   si eseguirà l'esame istopatologico di quell'organo   o tessuto specifico negli altri gruppi .    d ) Se il tasso di sopravvivenza nel gruppo trattato   con dosi elevate è significativamente inferiore a   quello del gruppo di controllo , il gruppo   trattato con dosaggio immediatamente inferiore   dovrà essere sottoposto ad esame completo .    e ) Se nel gruppo trattato con dosi elevate si   riscontra induzione di tossicità o altri effetti   che potrebbero influire sulla risposta neoplastica ,   si effettuerà un esame completo del gruppo   trattato con il dosaggio immediatamente inferiore .    2 . DATI    I dati dovranno essere riassunti sotto forma   di tabella , indicando per ogni gruppo sperimentale   il numero di animali all'inizio della prova , il numero   di animali che presentano tumori scoperti durante   l'esperimento , la data di individuazione ed il   numero di animali in cui si sono riscontrati tumori   dopo l'uccisione . I risultati debbono essere   valutati con un metodo statistico idoneo . Qualsiasi   metodo statistico riconosciuto può essere utilizzato .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare , se   possibile :     - specie , ceppo , origine , condizioni ambientali ,   dieta , ecc. ;     - condizioni sperimentali    descrizione dell'apparecchiatura di esposizione ,   includente :    progettazione , tipo , dimensioni , fonte di aria ,   sistema per generare particelle ed aerosol , metodo di   condizionamento dell'aria , trattamento dell'aria   di scarico , metodo di alloggiamento degli animali   in una camera sperimentale quando questo sistema   venga utilizzato . Descrizione del dispositivo per   misurare la temperatura , l'umidità e , se del caso ,   la stabilità delle concentrazioni di aerosol o le   dimensioni delle particelle .    Dati di esposizione : questi dovranno essere   presentati in forma di tabelle con indicazione dei   valori medi e una misura della variabilità   ( ad esempio : deviazione standard ) e includeranno :    a ) portata dell'aria attraverso l'attrezzatura   di inalazione ,    b ) temperatura ed umidità dell'aria ,    c ) concentrazioni nominali ( quantità totale della   sostanza sperimentale immessa nell'attrezzatura di   inalazione divisa per il volume dell'aria ) ,    d ) natura del veicolo , se usato ,    e ) concentrazioni reali nella zona sperimentale di   respirazione ,    f ) dimensioni delle particelle medianti ( se del   caso ) :     - livelli di dose ( veicolo compreso , se   utilizzato ) e concentrazioni ;     - dati di incidenza del tumore secondo il sesso ,   la dose e il tipo di tumore ;     - registrazione della data della morte ( durante   l'esperimento ) oppure specificare se gli animali   sono sopravvissuti fino alla conclusione della   prova ;     - dati sulla risposta tossica per sesso e per dose ;     - descrizione degli effetti tossici o di altri   effetti ;     - registrazione della data di osservazione di   ogni sintomo anomalo e del decorso succesivo ;     - alimentazione e dati sul peso corporeo ;     - risultati dell'esame ematologico ;     - risultati dell'autopsia ;     - descrizione particolareggiata di tutti i risultati   istopatologici ;     - elaborazione statistica dei risultati con descrizione   dei metodi impiegati ;     - discussione dei risultati ;     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    SAGGIO COMBINATO DI TOSSICITÀ CRONICA / CANCEROGENESI    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principio del metodo di saggio    L'obiettivo di un saggio combinato di   tossicità cronica/cancerogenesi è quello   di determinare gli effetti cronici e cancerogeni di   una sostanza di una specie di mammifero in seguito a   esposizione prolungata .    Per questo scopo , uno studio di cancerogenesi   è integrato con almeno un gruppo satellite trattato   e un gruppo satellite di controllo . La dose usata per il   gruppo satellite a dose elevata può essere più   alta di quella usata per il gruppo a dose elevata   nello studio di cancerogenesi . Nello studio di   cancerogenesi , gli animali sono esaminati per la   tossicità in generale come pure per la risposta   cancerogena . Gli animali nel gruppo satellite trattato   sono esaminati per la tossicità in generale .    La sostanza in esame è somministrata normalmente 7   giorni per settimana , per una via di somministrazione   appropriata , a diversi gruppi di animali da esperimento ,   una dose per gruppo , per la maggior parte della loro vita .   Durante e dopo l'esposizione alla sostanza in esame ,   gli animali da esperimento vengono osservati ogni giorno   per individuare i segni di tossicità e lo sviluppo di   tumori .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Gli animali sono tenuti nelle condizioni di alloggio   e di alimentazione del saggio per almeno 5 giorni prima   dell'inizio della prova . Prima dell'esperimento ,   gli animali giovani e sani vengono mescolati con   metodo casuale ed assegnati a gruppi .    Animali da esperimento    La specie preferita è il ratto . Sulla base   dei risultati di studi precedentemente svolti ,   altre specie ( roditori o non-roditori ) possono   essere utilizzate . Si dovrebbero usare i ceppi di   animali giovani sani generalmente usati in laboratorio e   il dosaggio dovrebbe cominiciare non appena   possibile dopo lo svezzamento .    All'inizio dello studio , la variazione del peso   degli animali usati non dovrebbe superare il ± 20 %   del valore medio . Quando venga intrapreso uno studio   subcronico orale come preliminare ad uno studio a lungo   termine , si dovrebbe usare la stessa specie e lo   stesso ceppo in entrambi gli studi .    Numero e sesso    Per i roditori si dovrebbero usare almeno 100 animali   ( 50 maschi e 50 femmine ) per ciascun livello di dose   e un gruppo di controllo parallelo . Le femmine   dovranno essere nullipare e non gravide . Se si   prevedono sacrifici intermedi , il numero dovrebbe essere   aumentato del numero di animali che si prevede di   sacrificare prima del completamento dello studio .    Il(i) gruppo(i) satellite(i) trattato(i) per la   valutazione di patologie diverse dai tumori   dovrebbe essere composto da 20 animali di ciascun sesso ,   mentre il gruppo di controllo satellite dovrà   contenere 10 animali di ciascun sesso .    Livelli di dose e frequenza di esposizione    Per gli scopi delle prove di cancerogenesi si   dovrebbero usare almeno tre livelli di dose   oltre ad un gruppo di controllo parallelo .   Il livello di dose più elevato dovrebbe   produrre sintomi minimi di tossicità ,   quale un leggero calo dell'aumento del peso   corporeo ( meno del 10 % ) , senza alterare   sostanzialmente la durata normale di vita a   causa di effetti diversi dai tumori .    Il livello di dose più basso non dovrebbe   interferire con la crescita normale , lo   sviluppo e la longevità dell'animale , né   produrre alcuna indicazione di tossicità . Questa   dose , in genere , non dovrebbe essere inferiore al   10 % della dose elevata . La(e) dose(i) intermedia(e)   dovrebbe(ro) essere fisata(e) in un intervallo   medio compreso fra la dose elevata a quella bassa .   La selezione dei livelli di dose dovrebbe tener   conto dei datí derivati dai saggi e dagli studi di   tossicità precedenti . Per le finalità del saggio   di tossicità cronica , nel saggio vengono   inclusi gruppi trattati aggiuntivi e un gruppo   di controllo satellite parallelo . La dose   elevata per il trattamento degli animali del gruppo   satellite dovrà essere tale da produrre evidenti   segni di tossicità .    La frequenza dell'esposizione è normalmente   quotidiana . Se la sostanza chimica è somministrata   nell'acqua da bere o mescolata nella dieta ,   queste dovrebbero essere continuamente disponibili .    Controlli    Si dovrebbe usare un gruppo parallelo , identico   sotto tutti gli aspetti ai gruppi trattati , fatta   eccezione per l'esposizione alla sostanza in esame .    In circostanze speciali , quali gli studi di   inalazione comportanti l'uso di aerosol o di un   emulsionante con attività biologica non   caratterizzata mediante studi di tossicità   orale , si dovrebbe utilizzare un gruppo di controllo   complementare non esposto al veicolo .    Vie di somministrazione    Le tre vie principali di somministrazione sono :   orale , cutanea e per inalazione . La scelta   della via di somministrazione è funzione   delle caratteristiche chimico-fisiche della   sostanza in esame e della più probabile via di   esposizione degli esseri umani .    Saggi per via orale    Quando la sostanza in esame è assorbita dal   tratto gastrointestinale e l'ingestione è   una via di esposizione per gli esseri umani ,   si preferisce la via orale di somministrazione   a meno che vi siano controindicazioni . Gli animali   possono ricevere la sostanza in esame nella loro   dieta , sciolta nell'acqua potabile , o somministrata   in capsula .    Idealmente , si dovrebbe usare un dosaggio   quotidiano sulla base di sette giorni per   settimana , perché il dosaggio di   cinque giorni per settimana potrebbe permettere   il recupero o una tossicità da privazione nel   periodo di mancato dosaggio influenzando così i risultati   e la valutazione successiva . Tuttavia ,   principalmente sulla base di considerazioni pratiche ,   un dosaggio sulla base di cinque giorni per   settimana è considerato accettabile .    Saggi per via cutanea    L'esposizione cutanea con spennellatura della   pelle può essere scelta per simulare una   principale via di esposizione umana e come sistema   modello per induzione di lesioni cutanee .    Saggi per via inalatoria    Poiché i saggi inalatori presentano problemi   tecnici di maggior complessità delle altre   vie di somministrazione , si forniscono in questa   sede indicazioni più particolareggiate su   questo modo di somministrazione . Da notare inoltre   che l'instillazione endotracheale può costituire   un'alternativa valida in situazioni specifiche .    Le esposizioni a lungo termine sono di solito   modellate su esposizione umana prevista sottoponendo   gli animali ad un'esposizione quotidíana di 6 ore   dopo equilibrazione delle concentrazioni della camera ,   per 5 giorni/settimana ( esposizione intermittente )   o ad un'esposizione ambientale possibile , con 22-24 ore   di esposizione/giorno , 7 giorni per settimana   ( esposizione continua ) , con circa un'ora   per nutrire gli animali allo stesso orario e per la   manutenzione della camera . In entrambi i casi , gli   animali di solito sono esposti a concentrazioni   fisse delle sostanze in esame . Una differenza   notevole da considerare tra l'esposizione intermittente   e quella continua è costituita dal fatto che con la   prima vi è un periodo di 17-18 ore in cui gli   animali possono riprendersi dagli effetti di   ogni esposizione quotidiana , e un periodo ancora   più lungo di ricupero durante i fine settimana .    La scelta dell'esposizione intermittente o continua   dipende dagli obiettivi dello studio e   dall'esposizione umana da simulare . Tuttavia ,   ocorrerà considerare alcune difficoltà tecniche .   Per esempio , i vantaggi dell'esposizione continua   per la simulazione delle condizioni ambientali possono   essere controbilanciati dalla necessità di   abbeverare o nutrire gli animali durante   l'esposizione , e dall'esigenza di usare aerosol   più complicati ( e affidabili ) e di sistemi   di generazione del vapore e di controllo .    Camere di esposizione    Gli animali dovrebbero essere sottoposti a   sperimentazione in camere di inalazione progettate   per sostenere un flusso dinamico di almeno 12   cambiamenti d'aria/ora , per assicurare un tenore   di ossigeno adeguato e un'atmosfera di esposizione   uniforme . Le camere di esposizione e di controllo   dovrebbero essere identiche nella costruzione e   progettazione per assicurare condizioni di   esposizione comparabili sotto tutti gli aspetti ,   eccezion fatta per le esposizioni alle sostanze in   esame . Una leggera depressione viene generalmente   mantenuta dentro la camera per impedire perdite della   sostanza in esame nella zona circostante . Nelle   camere si dovrebbe ridurre al massimo   l'affollamento degli animali di saggio . Come regola   generale per assicurare la stabilità dell'atmosfera   della camera , il « volume » totale degli animali   di saggio non dovrebbe superare il 5 % del volume della   camera .    Si dovrebbero effettuare le seguenti misurazioni   o controlli :    i ) Flusso dell'aria : la velocità del flusso   dell'aria attraverso la camera dovrebbe essere   controllata preferibilmente in modo continuo .    ii ) Concentrazione : durante il periodo di   esposizione quotidiana , la concentrazione non   dovrebbe variare più del ± 15 % dal valore   medio . Per la durata totale dello studio , le   concentrazioni giornaliere dovranno essere tenute   costanti nella misura del possibile .    iii ) Temperatura ed umidità : per i roditori , la   temperatura dovrà essere mantenuta a 22 ° C   ( ± 2 ° C ) e l'umidità all'interno della   camera al 30-70 % , eccetto quando l'acqua è   usata per mantenere in sospensione la sostanza   sperimentale nell'atmosfera della camera . Entrambe   dovrebbero essere controllate preferibilmente in   continuo .    iv ) Misura delle dimensioni delle particelle :   la distribuzione delle dimensioni delle particelle   dovrebbe essere determinata sulle atmosfere di camere   che contengono aerosol liquidi o solidi . Le   particelle contenute negli aerosol dovrebbero avere   dimensioni tali da essere inalabili dall'animale da   laboratorio usato . I campioni di atmosfera   dovrebbero essere prelevati a livello della zona di   respirazione degli animali . Il campione d'aria   dovrebbe essere rappresentativo della distribuzione   delle particelle a cui gli animali sono esposti e   dovrebbe rappresentare , su una base gravimetrica ,   tutto l'aerosol sospeso anche quando gran parte di esso   non è respirabile . Le analisi della grandezza   delle particelle dovrebbero essere effettuate spesso   durante la messa a punto del sistema di generazione   per assicurare la stabilità dell'aerosol e , in   seguito , quando si ritenga necessario , durante le   esposizioni , per determinare in modo adeguato   l'uniformità della distribuzione delle particelle   a cui gli animali sono stati esposti .    Durata dello studio    La durata della parte del saggio relativa alla   cancerogenesi comprende la maggior parte della vita   normale degli animali di saggio . La conclusione del   saggio dovrebbe essere a 18 mesi per i topi ed i   criceti e dopo 24 mesi per i ratti ; tuttavia , per   certi ceppi di animali con maggior longevità e/o   tasso poco elevato di tumori spontanei , la   conclusione dovrebbe essere dopo 24 mesi per i topi   ed i criceti e dopo 30 mesi per i ratti .   Alternativamente , la conclusione di un tale studio   esteso è accettabile quando la percentuale di   superstiti nel gruppo a livello di dose più   basso o nel gruppo di controllo raggiunge il 25 % .   Quando si conclude uno studio in cui si manifesti una   differenza evidente nella risposta determinata del   sesso , ciascun sesso dovrebbe essere considerato   separatamente . Quando solo il gruppo a dose elevata muore   prematuramente per ovvie ragioni di tossicità ,   ciò non deve necessariamente determinare la   conclusione dell'esperimento purche le manifestazioni   tossiche non causino problemi negli altri   gruppi . Perché un risultato sperimentale negativo   sia accettabile , non più del 10 % di animali di   qualsiasi gruppo può essere perso nell'esperimento   a causa di autolisi , cannibalismo o altri problemi ,   e il tasso di sopravvivenza di tutti i gruppi non   deve essere inferiore al 50 % a 18 mesi per i   topi ed i criceti e a 24 mesi per i ratti .    I gruppi satelliti di 20 animali ( per sesso )   sottoposti a dosaggio e i 10 animali ( per sesso )   di controllo associati , usati per la prova di   tossicità cronica , dovrebbero essere mantenuti   ai fini dello studio per almeno 12 mesi . Questi   animali dovrebbero essere destinati al sacrificio   ai fini di un esame della patologia connessa con la   sostanza sperimentale non complicata da mutamenti   geriatrici .    Procedimento    Osservazioni    Quotidianamente si dovrebbero effettuare   osservazioni cliniche che includeranno i mutamenti   della cute e del pelo , degli occhi e delle   membrane mucose nonché del sistema nervoso centrale   ed autonomo , di quello respiratorio e circolatorio ,   dell'attività somatomotoria e del modello   comportamentale .    Un esame clinico dovrebbe essere effettuato a   intervalli appropriati sugli animali del(dei)   gruppo(i) satellite(i) trattato(i) .    Osservazioni regolari degli animali sono   necessarie per assicurarsi , per quanto possibile ,   che gli stessi non siano persi dallo studio a cause   quali cannibalismo , autolisi dei tessuti o   smarrimento . Gli animali moribondi dovrebbero   essere rimossi e sottoposti a necroscopia .    Per tutti gli animali si dovrebbero registrare i   segni clinici , inclusi i mutamenti neurologici ed   oculari nonché la mortalità . Si deve dedicare   particolare attenzione allo sviluppo dei tumori ;   il momento di insorgenza e la progressione delle   condizioni tossiche dovrebbero essere registrati .    Si dovrebbe procedere settimanalmente alla   misurazione del consumo alimentare ( e del consumo   dell'acqua quando la sostanza in esame è   somministrata in tale veicolo ) durante le prime 13   settimane dello studio e poi a intervalli di circa   tre mesi a meno che i mutamenti dello stato di salute   o del peso corporeo non impongano altre soluzioni .    Il peso corporeo dovrebbe essere registrato   individualmente per tutti gli animali una volta per   settimana durante le prime 13 settimane del periodo   di saggio ed almeno una volta ogni 4 settimane in   seguito .    Esami clinici    Ematologia    L'esame ematologico ( ad esempio : contenuto   dell'emoglobina , volume delle cellule impaccate ,   globuli rossi totali , globuli bianchi totali ,   piastrine o altre misure del potenziale di   coagulazione ) dovrebbe essere eseguito dopo 3 mesi ,   6 mesi ed approssimativamente a intervalli successivi   di 6 mesi ed alla conclusione , sui campioni di sangue   raccolti da 10 ratti per sesso di tutti i gruppi .   Se possibile , i campioni dovrebbero essere prelevati   dagli stessi ratti a ogni intervallo .    Se le osservazioni cliniche suggeriscono un   peggioramento nella salute degli animali durante lo   studio , si dovrebbe eseguire un conteggio differenziale   ematico degli animali colpiti .    Un conteggio differenziale ematico viene eseguito   sui campioni provenienti dagli animali appartenenti al   gruppo a più elevato dosaggio e nei controlli .   I conteggi differenziali del sangue sono eseguiti   sul gruppo(i) a dosaggio inferiore immediatamente   successivo soltanto se si riscontra una discrepanza   notevole tra il gruppo a dosaggio più elevato ed i   controlli , o se i risultati dell'esame patologico   ne indicano l'esigenza .    Analisi delle urine    Si dovrebbero raccogliere per analisi i campioni   di urina di 10 ratti per sesso per tutti i gruppi ,   se possibile agli stessi intervalli dell'esame   ematologico . Le seguenti determinazioni   dovrebbero essere fatte o a partire dai diversi animali   o su un campione miscelato sesso/gruppo per i   roditori :     - aspetto : volume e densità per i singoli animali ;     - proteina , glucosio , chetoni , sangue occulto   ( semiquantitativamente ) ;     - microscopia del deposito ( semiquantitativamente ) .    Chimica clinica    Approssimativamente a intervalli di 6 mesi , ed alla   conclusione , si prelevano campioni di sangue per le   misure di chimica clinica da tutti i non-roditori e   da 10 ratti per sesso di tutti i gruppi , se   possibile dagli stessi ratti a ogni intervallo .   Inoltre , si dovrebbe prelevare un campione prima   del saggio dai non-roditori . Il plasma viene   preparato da questi campioni e vengono fatte le   seguenti determinazioni :     - concentrazione proteina totale ;     - concentrazione dell'albumina ;     - saggi di funzionalità epatica ( come attività   fosfatasi alcalina , glutammico-piruvico-transaminasi   (1) , glutammico-ossalacetico-transaminasi (2) )   gamma-glutamil transpeptidasi , ornitina   decarbossilasi ;     - metabolismo dei carboidrati , come glucosio   ematico a digiuno ;     - saggi di funzionalità renale come azoto ureico .    Necroscopia macroscopica    Tutti gli animali dovrebbero essere sottoposti   ad esame necroscopico completo , compresi quelli che   sono morti durante l'esperimento a quelli   sacrificati perché moribondi . Prima del   sacrificio si dovrebbero prelevare campioni   di sangue da tutti gli animali per i conteggi   differenziali ematici . Si dovrebbero conservare   tutte le lesioni e i tumori grossolanamente visibili   o sospetti . Si dovrebbe cercare di correlare le   osservazioni macroscopiche con i risultati   microscopici .    Tutti gli organi e i tessuti dovrebbero essere   conservati per l'esame istopatologico . Questo di   solito riguarda i seguenti organi e tessuti :   cervello (3) ( midollo/ponte , corteccia cerebellare ,   corteccia cerebrale ) , pituitaria , tiroide ( compresa   paratiroide ) , timo , polmoni ( trachea compresa ) ,   cuore , aorta , ghiandole salivari , fegato (3) ,   milza , reni (3) ghiandole surrenali (3) ,   esofago , stomaco , duodeno , digiuno , ileo ,   intestino cieco , colon , retto , utero ,   vescica urinaria , linfonodi , pancreas , gonadi (3) ,   organi genitali accessori , ghiandole   mammarie femminili , pelle , muscolatura , nervo   periferico , midollo spinale ( cervicale , toracico ,   lombare ) , sterno con midollo osseo e femore   ( articolazione compresa ) e occhi . Sebbene   l'insufflazione dei polmoni e della vescica   urinaria con un fissativo sia il modo ottimale   di conservare questi tessuti , l'insufflazione dei   polmoni negli studi di inalazione è un requisito   essenziale per l'esame istopatologico appropriato .   In studi speciali come quelli dell'inalazione , si   dovrebbero studiare tutte le vie respiratorie ,   compreso naso , faringe e laringe .    Se si eseguono altri esami clinici , le   informazioni ottenute con queste procedure dovrebbero   essere rese disponibili prima dell'esame   microscopico , perché possono fornire indicazioni   significative al patologo .    Istopatologia    Per la parte di saggio riguardante la tossicità   cronica    Esame particolareggiato da effettuarsi su tutti gli   organi conservati di tutti gli animali appartenenti   al gruppo satellite trattato con dose elevata e al   gruppo di controllo . Quando si riscontra una   patologia correlata con la sostanza in esame nel   gruppo satellite trattato con dose elevata , gli   organi-bersaglio di tutti gli altri animali in un   qualsiasi altro gruppo satellite trattato dovrebbero   essere sottoposti ad esame istologico completo e   particolareggiato insieme con quelli dei gruppi   trattati nella parte di cancerogenesi dello studio   alla sua conclusione .    Per la parte di saggio riguardante la cancerogenesi    a ) L'esame istopatologico completo dovrebbe essere   effettuato sugli organi e tessuti di tutti gli   animali che muoiono o che vengono uccisi durante   la prova e di tutti gli animali dei gruppi   trattati con dose elevata e del gruppo di controllo ;    b ) tutti i tumori visibili macroscopicamente o   le lesioni sospette di essere di origine   tumorali , che si riscontrano in qualsiasi organo   di tutti i gruppi di animali dovrebbero essere   esaminati microscopicamente ;    c ) se si riscontra una differenza significativa   nell'incidenza delle lesioni neoplastiche nei   gruppi di controllo e in quello trattato con   dose elevata , si dovrebbe effettuare l'esame   istopatologico su quel particolare organo o   tessuto , negli altri gruppi ;    d ) se la sopravvivenza nel gruppo trattato con dose   elevata è significativamente inferiore a quella   del gruppo di controllo , si dovrebbe effettuare un   esame completo del gruppo trattato con il   dosaggio immediatamente inferiore ;    e ) quando si riscontra un'evidenza nel gruppo a   dosaggio elevato di induzione di effetti tossici o   altri effetti che potrebbero influire su una   risposta neoplastica , si dovrebbe procedere ad un   esame completo del gruppo trattato con il dosaggio   immediatamente inferiore .    2 . DATI    I dati dovrebbero essere riassunti sotto forma di   tabella , indicando per ogni gruppo di saggio il   numero di animali all'inizio della prova , il   numero di animali che presentano tumori o effetti tossici   riscontrati durante il saggio , il tempo di   individuazione ed il numero di animali in cui   sono stati individuati tumori dopo il   sacrificio . I risultati dovrebbero essere   valutati con un metodo statistico appropriato .   Qualsiasi metodo statistico riconosciuto può   essere utilizzato .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare , se   possibile :     - specie , ceppo , origine , condizioni ambientali ,   dieta , ecc. ;     - condizioni sperimentali :    descrizione dell'apparecchiatura di esposizione ,   includente :    progettazione , tipo , dimensioni , sorgente d'aria ,   sistema per generare particelle ed aerosol ,   metodo di condizionamento dell'aria , trattamento   dell'aria di scarico , metodo di alloggiamento   degli animali in una camera di saggio quando questa   venga utilizzata . Il dispositivo per misurare   la temperatura , l'umidità e , se del   caso , la stabilità delle concentrazioni di   aerosol o le dimensioni delle particelle .    dati di esposizione :    questi dovranno essere presentati in forma   tabulare con indicazione dei valori medi e una misura   della variabilità ( ad esempio : deviazione   standard ) ed includere :    a ) velocità dei flussi dell'aria attraverso   l'attrezzatura di inalazione ,    b ) temperature ed umidità dell'aria ,    c ) concentrazioni nominali ( quantità totale   della sostanza di saggio immessa nell'attrezzatura   di inalazione divisa per il volume dell'aria ) ,    d ) natura di veicolo , se usato ,    e ) concentrazioni reali nella zona sperimentale   di respirazione ,    f ) dimensioni mediane delle particelle ( se   del caso ) ;     - livelli di dose ( veicolo compreso , se   utilizzato ) e concentrazioni ;     - dati di incidenza dei tumori secondo il sesso ,   la dose e il tipo di tumore ;     - registrazione del tempo degli eventi letali   ( durante l'esperimento ) oppure specificare se gli   animali siano sopravvissuti fino alla conclusione   del saggio , incluso gruppo satellite ;     - dati sulla risposta tossica per sesso e per dose ;     - descrizione degli effetti tossici o di altri   effetti ;     - registrazione della data di osservazione di ogni   sintomo anomalo e del decorso successivo ;     - risultati oftalmologici ;     - dati su alimentazione e peso corporeo ;     - risultati dell'esame ematologico ;     - risultati degli esami di biochimica clinica   ( inclusa qualsiasi analisi delle urine ) ;     - risultati dell'esame necroscopico ;     - descrizione particolareggiata di tutti i   risultati istopatologici ;     - elaborazione statistica dei risultati con   descrizione dei metodi impiegati ;     - discussione dei risultati ;     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    (1) Ora noto come alanina aminotransferasi serica .    (2) Ora nota come aspartato aminotransferasi serica .    (3) Questi organi , provenienti da 10 animali per   sesso e per gruppo ( per i roditori ) dovrebbero   essere pesati .    SAGGIO DI TOSSICITÀ SULLA RIPRODUZIONE : UNA   GENERAZIONE    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanza di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principi del metodo di saggio    La sostanza sperimentale è somministrata in dosi   graduate a diversi gruppi di animali maschi e femmine .   I maschi dovrebbero essere sottoposti a dosaggio   durante la crescita e per almeno un ciclo spermatogenico   completo ( approssimativamente 56 giorni per il topo   e 70 giorni per il ratto ) per provocare qualsiasi   tipo di effetto avverso da parte della sostanza   di saggio sulla spermatogenesi .    Le femmine della generazione P dovrebbero essere   sottoposte a dosaggio per almeno due cicli estrali   completi per suscitare qualsiasi tipo di effetto   contrario della sostanza in esame sull'estro .   Gli animali sono poi accoppiati . La sostanza in esame   viene somministrata ad entrambi i sessi durante il   periodo di accoppiamento ed in seguito soltanto alle   femmine durante la gravidanza e per la durata del   periodo di allattamento . Per la somministrazione   della sostanza in esame per via inalatoria , il   metodo richiederà modifiche .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno ,    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni    Prima del saggio gli animali giovani e sani sono   mescolati con metodo casuale ed assegnati ai gruppi   trattati e di controllo . Gli animali sone tenuti nelle   condizioni sperimentali di alloggiamento e nutrizione   per almeno 5 giorni prima dell'inizio della prova .   Si raccomanda di somministrare la sostanza in esame   nella dieta o nell'acqua da bere . Sono accettabili   anche altre vie di somministrazione . Il dosaggio per   tutti gli animali dovrebbe essere fatto con lo stesso   metodo durante l'appropriato periodo dell'esperimento .   Se un veicolo od altri additivi sono utilizzati per   facilitare il dosaggio , essi non dovranno notoriamente   produrre effetti tossici . Il dosaggio dovrà essere   fatto su una base di sette giorni per settimane    Animali da esperimento    Scelta della specie    Il ratto o il topo sono le specie preferite . Si   dovrebbero utilizzare animali sani , non sottoposti   in precedenza a esperimenti . Non si dovrebbero   utilizzare ceppi a bassa fecondità . Gli animali di   saggio dovrebbero essere caratterizzati quanto alle   specie , al ceppo , al sesso , al peso e all'età .    Per una valutazione adeguata della fertilità ,   si dovrebbero studiare sia i maschi sia le femmine .   Tutti gli animali per il saggio e i controlli dovrebbero   essere svezzati prima dell'inizio del dosaggio .    Numero e sesso    Ogni gruppo trattato e di controllo dovrebbe contenere   un numero sufficiente di animali per avere circa   20 femmine incinte prossime a partorire o quasi al termine   della gravidanza .    L'objettivo è di avere sufficienti gravidanze e   figliate per assicurare una valutazione significativa   del potenziale della sostanza di influire negativamente   sulla fertilità , sulla gravidanza e sul comportamento   materno negli animali della generazione P , e sul   lattante , sulla crescita e sullo sviluppo della figliata   F1 dal concepimento allo svezzamento .    Condizioni di saggio    Il cibo e l'acqua dovrebbero essere forniti ad   libitum . Nell'imminenza del parto , le femmine   incinte dovrebbero essere messe in gabbie separate o   in gabbie apposite per il parto e possono essere   rifornite di materiale per la costruzione della tana .    Livelli di dose    Si dovrebbero usare almeno tre gruppi di trattamento   e un gruppo di controllo . Se si usa un veicolo per la   somministrazione della sostanza in esame , il gruppo   di controllo dovrebbe ricevere il veicolo al livello   di dose più alto usato . Se una sostanza in esame   provoca una riduzione dell'ingestione o dell'utilizzazione   della dieta , si potrebbe considerare necessario l'uso   di un gruppo di controllo parallelo . Idealmente , a   meno che non sia limitato dalla natura fisico/chimica o   dagli effetti biologici della sostanza in esame , il   livello di dose più elevato dovrebbe indurre   effetti tossici , ma non mortalità nei genitori P .   La(e) dose(i) intermedia(e) dovrebbe indurre effetti   tossici minimi attribuibili alla sostanza in esame e la   dose più bassa non dovrebbe indurre alcun effetto   osservabile sui genitori o sulla prole . Quando   somministrato con sonda o in capsula , il dosaggio   di ogni animale dovrebbe essere basato sul peso   corporeo del singolo animale e regolato settimanalmente   per tener conto dei cambiamenti del peso corporeo .   Per le femmine gravide , i dosaggi possono essere   basati sul peso corporeo nel giorno 0 o al 6 ° giorno   di gravidanza .    Saggio limite    Nel caso di sostanze a bassa tossicità , se un   livello di dose di almeno 1 000 mg/kg non produce   evidenza di interferenza con la funzione riproduttiva ,   studi con altri livelli di dose possono essere   considerati non necessari . Se uno studio preliminare   con un livello di dose elevato , con evidenza   precisa di tossicità materna , non evidenzia   effetti avversi sulla fertilità , studi con altri   livelli di dose possono essere considerati non necessari .    Svolgimento del saggio    Programmi sperimentali    Il dosaggio giornaliero dei genitori maschi P   dovrebbe cominciare a circa cinque-nove settimane di   età , dopo svezzamento e acclimatazione per almeno   5 giorni . Nei ratti , il dosaggio viene continuato per   dieci settimane prima del periodo di accoppiamento ( per   i topi , otto settimane ) . I maschi dovrebbero essere   sacrificati ed esaminati sia alla fine del periodo   di accoppiamento oppure , alternativamente , essi   possono essere mantenuti con la dieta sperimentale   per la possibile produzione di una seconda figliata   e dovrebbero essere sacrificati un po' prima della   fine dello studio . Per le femmine genitrici P il   dosaggio dovrebbe cominciare dopo almeno 5 giorni di   acclimatazione e continuare per almeno due settimane   prima dell'accoppiamento di tre settimane ,   la gravidanza e fino allo svezzamento della prole   F1 . Si dovrebbe dare attenzione a modifiche del   programma di dosaggio sulla base di altre informazioni   disponibili sulla sostanza in esame , quali l'induzione   del suo metabolismo o bioaccumulazione .    Procedura di accoppiamento    Negli studi degli effetti tossici sulla   riproduzione si possono usare i seguenti sistemi di   accoppiamento : 1:1 ( un maschio e una femmina ) ,   oppure 1:2 ( un maschio e due femmine ) .    Usando il sistema di accoppiamento 1:1 si dovrebbe   mettere una femmina con lo stesso maschio finché   la femmina non rimanga gravida o finché non siano   trascorse tre settimane . Ogni mattina le femmine   dovrebbero essere esaminate per la presenza di sperma   o di tappi vaginali . Il giorno 0 di gravidanza è   definito come il giorno in cui si trova un tappo   vaginale oppure lo sperma .    Le coppie che non riescono ad accoppiarsi dovrebbero   essere studiate per determinare la causa della sterilità   apparente . Questo può comportare procedure quali ,   ad esempio , quella di fornire opportunità   supplementari di accoppiamento con altri maschi o   femmine provati , esame microscopico degli organi   riproduttori , e esame del ciclo estrale o della   spermatogenesi .    Dimensioni della figliata    Gli animali sottoposti a dosaggio durante lo studio   di fertilità vengono lasciati partorire normalmente   ed allevare liberamente la prole fino alla fase   di svezzamento .    Se si effettua una standardizzazione si suggerisce   la seguente procedura . Tra il 1 ° ed il 4 ° giorno   dopo la nascita , la dimensione di ogni figliata   può essere regolata eliminando i piccoli in più ,   in modo da avere , nella misura del possibile , quattro   maschi e quattro femmine per figliata .    Ogni volta che il numero di maschi o di femmine non   permette di avere quattro animali di ogni sesso per   figliata , è accettabile una regolazione parziale   ( per esempio , cinque maschi e tre femmine ) . La   standardizzazione non è applicabile alle figliate   di meno di otto piccoli .    Osservazioni    Durante tutto il periodo di saggio , ogni animale   dovrebbe essere sottoposto ad osservazione almeno una   volta al giorno . Si dovrebbero registrare tutte le   variazioni comportamentali pertinenti , i segni di   parto difficile o prolungato , e tutti i sintomi di   tossicità , compresa la mortalità . Nei periodi   precedenti e durante l'accoppiamento , il consumo   alimentare può essere misurato quotidianamente .   Dopo il parto e durante l'allattamento , le misurazioni   del consumo di alimento ( e del consumo dell'acqua   quando la sostanza sperimentale è somministrata in   acqua potabile ) dovrebbero essere effettuate nello   stesso giorno della pesatura delle figliate . I maschi   e le femmine P dovrebbero essere pesati nel primo   giorno del dosaggio e in seguito settimanalmente . Queste   osservazioni dovrebbero essere registrate individualmente   per ogni animale adulto .    La durata della gestazione dovrebbe essere calcolata   dal giorno 0 di gravidanza . Ogni figliata dovrebbe   essere esaminata non appena possibile dopo il parto per   stabilire il numero ed il sesso dei piccolo , dei   nati morti , dei nati vivi e la presenza di grosse   anomalie .    I piccolo morti e quelli sacrificati al 4 ° giorno   dovrebbero essere conservati e studiati per la   constatazione di possibili difetti .    I piccoli vivi dovrebbero essere contati e le figliate   pesate al mattino dopo la nascita , al 4 ° giorno e al   7 ° e settimanalmente fino alla conclusione dello   studio , quando gli animali dovrebbero essere pesati   individualmente . Le anomalie fisiche o comportamentali   osservate nei ceppi o nella prole dovrebbero essere   registrate .    Patologia    Necroscopia    Al momento del sacrificio o della morte durante lo   studio , gli animali della generazione P dovrebbero   essere esaminati macroscopicamente per l'individuazione   di tutte le anomalie strutturali o mutamenti patologici ,   prestando particolare attenzione agli organi del sistema   riproduttivo . I piccolo morti o moribondi dovrebbero   essere esaminati per individuare eventuali difetti .    Istopatologia    Le ovaie , l'utero , il collo dell'utero , la vagina ,   i testicoli , l'epididimo , le vescichette seminali ,   la prostata , la ghiandola della coagulazione , la   ghiandola pituitaria e l'organo(i)-bersaglio di tutti   gli animali P dovrebbero essere conservati per l'esame   microscopico . Nel caso in cui questi organi non siano   stati esaminati in altri studi con dosi multiple ,   essi dovrebbero essere esaminati microscopicamente in   tutti gli animali dei gruppi trattati con dose   elevata e di controllo e negli animali che muoiono   durante l'esperimento , quando fattibile .    Gli organi di questi animali che mostrano anomalie   dovrebbero quindi essere esaminati in tutti gli altri   animali P . In questi casi , si dovrebbe eseguire   l'esame microscopico di tutti i tessuti che mostrano   alterazioni patologiche macroscopiche . Come suggerito per   le procedure di accoppiamento , gli organi riproduttivi   degli animali sospetti di sterilità possono   essere sottoposti all'esame microscopico .    2 . DATI    I dati possono essere riassunti sotto forma di   tabella , indicando per ogni gruppo sperimentale il   numero di animali all'inizio del saggio , il numero   di maschi fertili , il numero di femmine incinte ,   i tipi di cambiamenti e la percentuale degli animali   che mostrano ciascun tipo di cambiamento . Quando   possibile , i risultati numerici dovrebbero essere   valutati con un metodo statistico idoneo . Qualsiasi   metodo statistico generalmente riconosciuto può   essere utilizzato .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare , se   possibile :     - specie/ceppo usato ,     - dati sulla risposta tossica per sesso e per dose ,   compresa la fertilità , la gestazione normale   e la vitalità .     - tempo di morte durante lo studio o , se gli animali   sono sopravvissuti fino al tempo previsto per il   sacrificio , alla conclusione dello studio ,     - tabella indicante i pesi di ogni figliata , il   peso medio dei piccoli ed i pesi individuali dei   piccoli a termine ,     - effetti tossici o altri effetti sulla   riproduzione , sulla prole , sulla crescita   postnatale ,     - data di osservazione di ogni segno anomalo e   decorso successivo ,     - dati sul peso corporeo degli animali P ,     - risultati della microscopia ,     - descrizione particolareggiata di tutti i risultati   degli esami microscopici ,     - elaborazione statistica dei risultati , quando   appropriata ,     - discussione dei risultati ,     - interpretazione de risultati .    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    SAGGIO DI TOSSICITÀ SULLA RIPRODUZIONE : DUE   GENERAZIONI    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principi del metodo di saggio   PER LA CONTINUAZIONE DEL TESTO VEDI SOTTO NUMERO : 390L0676.3La sostanza in esame é somministrata in dosi   graduate a diversi gruppi di animali maschi e   femmine . I maschi della generazione P   dovrebbero essere sottoposti a dosaggio durante   la crescita per almeno un ciclo spermatogenico   completo ( approssimativamente 56 giorni nel topo   * 70 giorni nel ratto ) affinché la sostanza in esame   provochi ogni effetto contrario sulla spermatogenes .    Le femmine della generazione P dovrebbero e   sere dosate per almeno due cicli estrali completi   perché la sostanza in esame provochi ogni effetto   contrario sull'estro . Allo svezzamento ,   la somministrazione della sostanza viene continuata   sulla prole F1 durante la crescita fino all'età   adulta , durante l'accoppiamento e la produzione di   una generazione F2 , e finché la generazione F2   sia svezzata . Per la somministrazione per inalazione   della sostanza sperimentale , il metodo richiederà   modifiche .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni    Prima della prova , gli animali sani sono mescolati   con metodo casuale ed assegnati ai gruppi trattati   e di controllo . Gli animali genitori P sono   tenuti nelle condizioni sperimentali di   alloggiamento e nutrizione per almeno 5 giorni   prima della prova . Si raccomanda di somministrare   la sostanza in esame nella dieta o nell'acqua   da bere . Sono accettabili anche altre vie di   somministrazione . Tutti gli animali dovrebbero   essere dosati con lo stesso metodo durante l'intero   periodo sperimentale . Se un veicolo od altri   additivi sono utilizzati per facilitare il   dosaggio , essi non dovrebbereo notoriamente   produrre effetti tossici . Il dosaggio   dovrebbe essere effettuato su una base di sette   giorni per settimana .    Animali da esperimento : scelta della specie    Il ratto o il topo sono le specie preferite .   Si dovrebbero usare animali sani P , non   sottoposti a esperimenti in precedenza . Non   si dovrebbero usare ceppi a bassa fecondità . Gli   animali da laboratorio dovrebbero essere caratterizzati   quanto alla specie , al ceppo , al sesso ,   al peso e/o all'età .    Per un'adeguata valutazione della fertilità ,   si dovrebbero studiare sia i maschi che le femmine .   Tutti gli animali del gruppo di saggio e   di quello di controllo dovrebbero essere svezzati   prima dell'inizio del dosaggio .    Numero e sesso    Ogni gruppo di saggio e di controllo dovrebbe   contenere un numero sufficiente di animali perché   vi siano circa 20 femmine incinte o al termine della   gravidanza . L'obiettivo è di avere sufficienti   gravidanze e prole per assicurare una valutazione   significativa del potenziale della sostanza di   influire negativamente sulla fertilità , sulla   gravidanza , sul comportamento materno e sul lattante ,   sulla crescita e sullo sviluppo della prole F1 , dal   concepimento alla maturità , e lo sviluppo della loro   prole F2 fino allo svezzamento .    Condizioni sperimentali    Il cibo e l'acqua dovrebbero essere forniti   ad libitum . Nell'imminenza del parto , le   femmine incinte dovrebbero essere messe in   gabbie separate o in gabbie apposite per il   parto e possono essere rifornite di materiale   per la costruzione della tana .    Livelli di dose    Si dovrebbero usare almeno tre gruppi di   trattamento e un gruppo di controllo . Se si usa un   veicolo per la somministrazione della sostanza in   esame , il gruppo di controllo dovrebbe ricevere il   veicolo al livello di dose più elevato usato .   Se una sostanza in esame produce una riduzione   dell'ingestione o dell'utilizzazione della   dieta , si potrebbe considerare necessario l'uso   di un gruppo di controllo parallelo . Idealmente ,   a meno che non sia limitato dalla natura   fisico/chimica o dagli effetti biologici della   sostanza in esame , il livello di dose più   elevato dovrebbe indurre effetti tossici , ma   non mortalità nei genitori P . La dose(i)   intermedia(e) dovrebbe(ro) indurre effetti tossici   minimi attribuibili alla sostanza di saggio e la   dose più bassa non dovrebbe indurre effetti   contrari osservabili sui genitori o sulla prole .   Quando somministrato con sonda o in capsula ,   il dosaggio di ogni animale dovrebbe essere   basato sul peso corporeo del singolo animale   e regolato settimanalmente per tener conto dei   cambiamenti del peso corporeo . Per le femmine   gravide , i dosaggi possono essere basati sul   peso corporeo al giorno 0 o al 6 ° giorno di   gravidanza , se lo si desidera .    Saggio limite    Nel caso di sostanze e bassa tossicità ,   se un livello di dose di almeno 1 000 mg/kg non   produce sintomi di interferenza con la   funzione riproduttiva , studi con altri livelli   di dose possono essere considerati non necessari .   Se uno studio preliminare con un livello di dose   elevato , con evidenza precisa di tossicità materna ,   non evidenzia effetti avversi sulla fertilità ,   studi con altri livelli di dose possono essere   considerati non necessari .    Svolgimento del saggio    Programmi sperimentali    Il dosaggio giornaliero dei genitori maschi P   dovrebbe cominciare a circa cinque-nove   settimane di età , dopo svezzamento e acclimatazione   per almeno 5 giorni . Nei ratti , il dosaggio   viene continuato per dieci settimane prima del   periodo di accoppiamento ( per i topi , otto   settimane ) . I maschi dovrebbero essere sacrificati   ed esaminati sia alla fine del periodo di   accoppiamento oppure , alternativamente , essi possono   essere mantenuti con la dieta sperimentale per la   possibile produzione di una seconda figliata   e dovrebbero essere sacrificati ed esaminati un po   prima della fine dello studio . Per le femmine   genitrici P il dosaggio dovrebbe cominciare dopo   almeno 5 giorni di acclimatazione e continuare per   almeno due settimane prima dell'accoppiamento .   Il dosaggio giornaliero delle femmine P   dovrebbe continuare durante il periodo di   accoppiamento di tre settimane , la gravidanza   e fino allo svezzamento della prole F1 . Si dovrebbe   porre attenzione a modifiche del programma   di dosaggio sulla base ni altre informazioni   disponibili sulla sostanza in esame , quali   l'induzione del suo metabolismo o bioaccumulatione .    Il dosaggio degli animali F1 comincia allo   svezzamento e termina quando essi vengono sacrificati .    Procedura di accoppiamento    Negli studi degli effetti tossici sulla   riproduzione si possono usare i seguenti sistemi di   accoppiamento : 1:1 ( un maschio e una femmina ) , oppure   1:2 ( un maschio e due femmine ) .    Usando il sistema di accoppiamento 1:1 si dovrebbe   mettere una femmina con lo stesso maschio finché   la femmina non rimanga gravida o finché non   siano trascorse tre settimane . Ogni mattina le   femmine dovrebbero essere esaminate per la   presenza di sperma o di tappi vaginali . Il giorno   0 di gravidanza è definito come il   giorno in cui si trova un tappo vaginale oppure lo   sperma .    Tenendo conto della spermatogenesi , la prole F1   non dovrebbe essere accoppiata fino   all'età di almeno 11 settimane per i topi , e   di 13 settimane per i ratti . Per l'accoppiamento   della prole F1 , un maschio ed una femmina   sono scelti con metodo casuale tra ogni   figliata per accoppiamento incrociato con un   animale di un'altra figliata dello stesso gruppo di   dosaggio , per produrre la generazione F2 . I maschi   e le femmine F1 non scelti per l'accoppiamento   sono sacrificati allo svezzamento .    Le coppie che non riescono ad accoppiarsi dovrebbero   essere studiate per determinare la causa della sterilità   apparente . Questo può comportare procedure quali ,   ad esempio , quella di fornire opportunità   supplementari di accoppiamento con altri maschi   o femmine provati , esame microscopico degli   organi riproduttivi , e esame del ciclo estrale   o della spermatogenesi .    Dimensioni della figliata    Gli animali sottoposti a dosaggio durante lo   studio di fertilità vengono lasciati partorire   normalmente ed allevare liberamente la prole fino   alla fase di svezzamento .    Se si effettua una standardizzazione , si   suggerisce la seguente procedura . Tra il 1 º ed   il 4 º giorno dopo la nascita , la dimensione di   ogni figliata può essere regolata eliminando   i piccoli in più , in modo da avere , nella misura   del possibile quattro maschi e quattro femmine per   figliata .    Ogni volta che il numero di maschi o di   femmine non permette di avere quattro animali di   ogni sesso per figliata , è accettabile una   regolazione parziale ( per esempio , cinque maschi   e tre femmine ) . La normalizzazione non è   applicabile alle figliate di meno di otto piccoli .   La standardizzazione delle figliate F2 è condotta   nello stesso modo .    Osservazioni    Durante tutto il periodo di saggio , ogni animale   dovrebbe essere sottoposto ad osservazione almeno una   volta al giorno . Si dovrebbero registrare tutte le   variazioni comportamentali pertinenti , i segni   di parto difficile o prolungato , e tutti sintomi   di tossicità , compresa la mortalità . Nei   periodi precedenti e durante l'accoppiamento ,   il consumo alimentare può essere misurato   settimanalmente . A scelta , il consumo alimentare   durante la gravidanza potrà essere misurato   ogni giorno . Dopo il parto e durante la   lattazione , le misurazioni del consumo di alimento   dovrebbero essere effettuate nello stesso giorno   della pesatura delle figliate . Gli animali   genitori ( P ed F1 ) dovrebbero essere pesati nel primo   giorno del dosaggio e in seguito settimanalmente .   Queste osservazioni dovrebbero essere registrate   individualmente per ogni animale adulto .    La durata della gestazione dovrebbe essere   calcolata dal giorno 0 di gravidanza . Ogni figliata   dovrebbe essere esaminata non appena possibile   dopo il parto per stabilire il numero ed il sesso dei   piccoli , dei nati morti , dei nati vivi e la   presenza di grosse anomalie . I piccoli morti e quelli   sacrificati al 4 º giorno dovrebbe essere conservati   per la constatazione di possibili difetti .    Si dovrebbero contare i nati vivi e procedere   alla pesatura delle figliate il mattino dopo la   nascita , poi il 4 º e il 7 º giorno e   quindi settimanalmente fino al termine dell'esperimento   quando gli animali dovrebbero essere pesati   individualmente . Si dovrebbero registrare le   anomalie comportamentali delle genitrici e della prole .    Patologia    Necroscopia    Tutti gli animali adulti P ed F1 dovrebbero   essere sacrificati quando non più necessari   per valutare gli effetti riproduttivi . La prole F1   non selezionata per l'accoppiamento e tutta la prole   F2 dovrebbe essere sacrificata una volta svezzata .    Al momento del sacrificio o della morte durante   lo studio , tutti gli animali genitori ( P ed F1 )   dovrebbero essere esaminati microscopicamente   per l'individuazione di tutte le anomalie   strutturali o le mutazioni patologiche ,   dedicando particolare attenzione agli organi del sistema   riproduttivo . I piccoli morti o moribondi dovrebbero   essere esaminati per individuare eventuali anomalie .    Istopatologia    Le ovaie , l'utero , il collo dell'utero , la   vagina , í testicoli , l'epididimo , le vescichette   seminali , la prostata , la ghiandola della   coagulazione , la ghiandola pituitaria e   l'organo(i)-bersaglio di tutti gli animali P dovrebbero   essere conservati per l'esame microscopico . Nel   caso in cui questi organi non siano stati esaminati   in altri studi con dosi multiple , essi dovrebbero   essere esaminati microscopicamente in tutti gli   animali dei gruppi trattati con dose elevata e   di controllo e negli animali che muoiono durante   l'esperimento , quando fattibile . Gli organi che   mostrano anomalie in questi animali dovrebbero   quindi essere esaminati in tutti gli altri   gruppi di dose . In questi casi , si dovrebbe   eseguire l'esame microscopico di tutti i tessuti che   mostrano alterazioni patologische macroscopiche .   Come suggerito per le procedure di accoppiamento ,   gli organi riproduttivi degli animali sospetti di   sterilità possono essere sottoposti all'esame   microscopico .    2 . DATI    Elaborazione dei risultati    I dati possono essere riassunti sotto forma di   tabella , indicando per ogni gruppo sperimentale   il numero di animli all'inizio del saggio ,   il numero di animali gravidi , i tipi di cambiamenti   e la percentuale degli animali che mostrano ciascun   tipo di cambiamento .    Quando possibile , i risultati numerici dovrebbero   essere valutati con un metodo statistico idoneo .   Qualsiasi metodo statistico generalmente accettato   può essere utilizzato .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare , se   possibile :     - specie/ceppo usato ,     - dati sulla risposta tossica per sesso e per   dose , inclusi gli indici di fertilità , gestazione   e vitalità ,     - tempo di morte durante lo studio o se gli animali   sono sopravvissuti fino alla conclusione dello   studio ,     - tabella indicante i pesi di ogni figliata ,   il peso medio dei piccoli ed i pesi individuali dei   piccoli a termine ,     - effetti tossici o altri effetti sulla   riproduzione , sulla prole , sulla crescita   postnatale ,     - data di osservazione di ogni segno anomalo   e decorso successivo ,     - dati sul peso corporeo degli animali P e F1 ,     - risultati della microscopia ,     - descrizione particolareggiata di tutti i   risultati degli esami microscopici ,     - elaborazione statistica dei risultati , quando   appropriata ,     - discussione dei risultati ,     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    TOSSICOCINETICA    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principi del metodo di saggio    Si somministra la sostanza in esame per una via   appropriata . In relazione agli obiettivi dello studio ,   la sostanza può essere somministrata , in   dose singola o in dosi ripetute nel corso di periodi di   tempo definiti , a uno o più gruppi di animali da   esperimento . Successivamente , in relazione al   tipo di studio effettuato , si determinano la   sostanza e/oi suoi metaboliti nei fluidi corporei   e nei tessuti e/o negli escreti .    Gli studi possono essere effettuati con forme   « non marcate » o « marcate » delle sostanze   in esame . Quando è fatto uso di un marcatore   è opportuno che esso sia collocato nella sostanza   in maniera tale da fornire la maggior quantità   possibile di informazioni sul destino del   composto .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni    Si acclimatano alle condizioni del laboratorio   per almeno cinque giorni prima del saggio   animali adulti sani e giovani . Prima del saggio   gli animali vengono mischiati con metodo casuale ed   assegnati ai gruppi destinati ai   trattamenti . In situazioni speciali possono   essere usati animali molto giovani , femmine   gravide o pretrattati .    Condizioni sperimentali    Animali da esperimento    Gli studi tossicocinetici possono essere   effettuati su una o più specie animali   appropriate , e dovrebbero tenere conto delle   specie usate o che si pensa di usare per altri   studi tossicologici sulla medesima sostanza in   esame . Quando in un saggio si fa uso di ratti , la   variazione del peso corporeo non dovrebbe essere   maggiore del ± 20 % del peso medio .    Numero e sesso   Per gli studi di assorbimento e di escrezione   sarebbe opportuno che in ciascun gruppo di dose vi   siano inizialmente quattro animali . Una preferenza per   l'uno o l'altro sesso non è imperativa , ma in determinate   circostanze può essere necessario studiare entrambi   i sessi . Se vi sono differenze di risposta secondo   i sessi , quattro individui per sesso   dovrebbero essere sottoposti al saggio . Nel caso   di studi su animali diversi dai roditori può   essere usato un numero minore di individui .    Quando si studia la distribuzione nei tessuti ,   la grandezza del gruppo iniziale dovrebbe tenere   conto sia del numero degli animali da sacrificare   in ciascuna fase che del numero delle fasi da   considerare .    Negli studi del metabolismo le dimensioni del   gruppo sono in relazione con le esigenze specifiche   dello studio . Per gli studi con dosi multiple e in   fasi multiple , le dimensioni del gruppo dovrebbero   tenere conto del numero sia delle fasi che dei   sacrifici in programma , e in ogni caso il gruppo non   deve comprendre meno di due animali . Le   dimensioni del gruppo dovrebbero essere sufficienti   per fornire una caratterizzazione accettabile   dell'assorbimento , del plateau e della deplezione   ( a seconda del caso considerato ) della sostanza   in esame e/o dei suoi metaboliti .    Livelli di dosaggio    Nel caso della somministrazione in un'unica dose   almeno due livelli di dosaggio dovrebbero essere   usati . Vi dovrebbero essere una dose bassa ,   alla quale non si osservano effetti tossici , e una   dose elevata , alla quale vi possono essere   cambiamenti dei parametri tossicocinetici o   si manifestano effetti tossici .    Nel caso della somministrazione di dosi ripetute   la dose bassa è normalmente sufficiente , ma in   determinate circostanze può essere necessaria anche   una dose alta .    Vie di somministrazione    Gli studi tossicocinetici dovrebbero essere   effettuati facendo uso della stessa via e , se del   caso , dello stesso veicolo usato , o che si   pensa di usare negli altri studi di tossicità .   La sostanza in esame è normalmente somministrata   per via orale mediante sonda gastrica o nella dieta ,   o è applicata alla cute , o somministrata per   inalazione per periodi di tempo definiti a gruppi   di animali da esperimento . Per la determinazione   dell'assorbimento relativo per altre vie   può essere utile la somministrazione della   sostanza in esame per via endovenosa . Entro breve   tempo della somministrazione endovenosa di una   sostanza è inoltre possibile ottenere utili   informazioni sul suo profilo di distribuzione .    Si dovrebbe tener presente la possibilità di   un'interferenza fra il veicolo e la sostanza in esame .   Si dovrebbe fare attenzione alle differenze di   assorbimento fra la somministrazione delle sostanza   in esame per sonda gastrica e rispettivamente   nell'alimentazione , ed all'esigenza di una   determinazione precisa della dose , specialmente   quando la sostanza in esame viene somministrata con   la dieta .    Periodo di osservazione    Tutti gli animali dovrebbero essere osservati   quotidianamente , e dovrebbe essere presa nota di   tutti i segni di tossicità e degli altri elementi   clinici rilevanti , ivi compresi il momento   dell'insorgenza , il grado e la durata .    Procedimento    Dopo la pesatura degli animali di saggio si   somministra per una via appropriata la sostanza in   esame . Se lo si considera importante , gli   animali possono essere tenuti a digiuno prima   della somministrazione della sostanza in esame .    Assorbimento    La velocità e l'entità dell'assorbimento della   sostanza somministrata possono essere valutate   secondo diversi metodi , con o senza gruppi di   riferimento (1) , ad esempio :     - attraverso la determinazione della quantità   della sostanza in esame e/o dei suol metaboliti   negli escreti , quali l'urina , la bile , le feci   e l'aria inspirata , e della quantità che rimane   nella carcassa ;     - attraverso il raffronto della risposta biologica   ( ad esempio negli studi della tossicità acuta )   fra i gruppi sottoposti al saggio e i gruppi di   controllo e/o di riferimento ;     - attraverso il raffronto della quantità di   sostanza e/o di metabolita escreta per via renale   nei gruppi sottoposti al saggio e in gruppi di   riferimento ;     - attraverso la determinazione dell'area al di   sotto della curva del livello plasmatico in funzione   del tempo della sostanza in esame e/o dei suoi   metaboliti , e attraverso il raffronto con i dati   di un gruppo di riferimento .    Distribuzione    Sono attualmente disponibili due procedure che   possono essere usate insieme o separatamente per le   analisi dei profili di distribuzione :     - un'utile informazione qualitativa si ottiene   facendo uso di tecniche autoradiografiche su tutto   il corpo ;     - un'informazione quantitativa si ottiene   sacrificando gli animali a intervalli diversi dopo   l'esposizione e determinando la concentrazione   e la quantità della sostanza in esame e/o dei   suoi metaboliti nei tessuti e negli organi .    Escrezione    Negli studi di escrezione si raccolgono l'urina ,   le feci e l'aria espirata e , in determinate   circostanze , la bile . La quantità della sostanza in   esame e/o dei suoi metaboliti dovrebbe essere   misurata in detti escreti ad intervalli diversi   dopo l'esposizione , fino a che sia stato escreto   intorno al 95 % della dose somministrata , ovvero   per sette giorni , secondo la condizione che si   verifica per prima .    In casi speciali può essere necessario considerare   l'escrezione della sostanza in esame nel latte degli   animali da esperimento che allattano i piccoli .    Metabolismo    Per determinare l'estensione e il profilo del   metabolismo si dovrebbero analizzare campioni   biologici secondo tecniche appropriate . Se vi è   la necessità di dare risposta a quesiti derivanti   da studi tossicologici precedenti si dovrebbero   chiarire le strutture dei metaboliti e proporre   vie metaboliche appropriate . Per ottenere informazioni   sulle vie metaboliche può essere proficuo effettuare   studi in vitro .    Ulteriori informazioni sulle relazioni fra il   metabolismo e la tossicità possono essere   ottenute da studi biochimici , quali la determinazione   degli effetti sui sistemi di enzimi metabolizzanti ,   sulla deplezione dei composti sulfidrilici   endogeni non proteici e sull'unione della sostanza   con macromolecole .    2 . DATI    In relazione al tipo di studio effettuato i dati   dovrebbero essere riassunti in forma di tabella   integrata se del caso da rappresentazioni grafiche .   Per ciascun gruppo di saggio dovrebbero essere poste   in evidenza , in tutti i casi in cui ciò è   possibile , le variazioni medie e statistiche delle   misurazioni in relazione al tempo , al dosaggio ,   ai tessuti e agli organi . L'entità dell'assorbimento   e la quantità e la velocità dell'escrezione   dovrebbero essere determinate con metodi   appropriati . Quando si effettuano studi del   metabolismo , la struttura dei metaboliti identificati   dovrebbe essere data e le possibili vie metaboliche   presentate .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare , se   possibile :     - specie , ceppo , provenienza , condizioni   ambientali , dieta ,     - caratterizzazione di eventuali materiali   marcati ,     - livelli di dosaggio e intervalli usati ,     - via o vie di somministrazione ed ogni veicolo   usato ,     - effetti tossici ed altri effetti osservati ,     - metodi per la determinazione della sostanza in   esame e/o dei suoi metaboliti nei campioni biologici ,   ivi compresa l'aria espirata ,     - presentazione in forma tabulare delle   misurazioni per sesso , dose regime , tempo ,   tessuti ed organi ,     - presentazione dell'entità dell'assorbimento   e dell'escrezione nel tempo ,     - metodi per la caratterizzazione e l'identificazione   di metaboliti nei campioni biologici ,     - metodi per le misurazioni biochimiche concernenti   il metabolismo ,     - vie proposte per il metabolismo ,     - discussione dei risultati ,     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valutazione e interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    (1) In questo metodo un gruppo di riferimento è   un gruppo nel quale la sostanza in esame è   somministrata per un'altra via che permette la   disponibilità completa della dose .    SAGGIO DI MUTAGENESI E PRESCREENING DI CANCEROGENESI    MUTAZIONE GENICA : SACCHAROMYCES CEREVISIAE    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principi del metodo di saggio    Per misurare l'induzione di mutazioni geniche   indotte da agenti chimici , con e senza attivazione   metabolica , può essere fatto uso di una varietà   di ceppi aploidi e diploidi del lievito   Saccharomyces cerevisiae .    Sono stati utilizzati sistemi di mutazione in   avanti in ceppi aploidi , come la misura della   mutazione da mutanti rossi , richiedenti adenina   ( ade-1 , ade-2 ) , a doppi mutanti bianchi   richiedenti adenina ; e sistemi selettivi come   l'induzione della resistenza alla canavanina .    Il sistema di retromutazione più largamente   convalidato comporta l'uso del ceppo aploide XV 185-14C   che porta le mutazioni di tipo « senza senso »   ( ochre ) ade 2-1 , arg 4-17 , lys 1-1 e trp 5-48 ,   le quali possono essere revertite da mutageni   che inducono sostituzioni di base nel sito specifico   o mutazioni che sopprimono « ochre » . Il ceppo XV   185-14C porta altresì il marcatore his 1 - 7 ,   mutazione di tipo « senso shagliato »   revertita principalmente da mutazioni nel secondo   sito , e il marcatore hom 3 - 10 che viene revertito   da mutageni che inducono mutazioni del tipo   « inserzione-delezione » .    Fra i ceppi diploidi del S. cerevisiae il solo   largamente convalidato è il ceppo D7 , omozigote   per ilv 1-92 .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparati    È opportuno preparare le soluzioni delle sostanze   in esame e dei composti di controllo o di riferimento ,   servendosi di un veicolo appropriato , al momento   dell'effettuazione del test . Con i composti   organici non solubili in acqua si devono usare   soluzioni di solventi organici quali l'etanolo ,   l'acetone e il dimetilsolfossido ( DMSO ) a non più del   2 % in volume ( v/v ) . La concentrazione finale del   solvente non dovrebbe influenzare in modo significativo   la vitalità cellulare e le caratteristiche di   crescita .    Attivazione metabolica    Le cellule vanno esposte alle sostanze in esame sia   in presenza che in assenza di un sistema appropriato   di attivazione metabolica esogena .    Il sistema più comunemente usato è una frazione   postmitocondriale integrata con cofattori ,   ottenuta dai fegati di roditori pretrattati con   agenti che inducono enzimi . Per l'attivazione   metabolica può essere appropriato anche l'uso   di altre specie , di altri tessuti , di altre   frazioni postmitocondriali o di altri procedimenti .    Condizioni di effettuazione del saggio    Ceppi    I ceppi più largamente usati negli studi sulle   mutazioni geniche sono il ceppo aploide XV 185-14C e il   ceppo diploide D7 . Possono essere appropriati anche   altri ceppi .    Terreni di coltura    Per la determinazione della sopravvivenza delle   cellule e del numero dei mutanti è fatto uso di   terreni di coltura appropriati .    Uso di controlli negativi e positivi    È opportuno procedere in parallelo a controlli   positivi , non trattati e con il solo solvente .   Per ciascun evento genetico specifico vanno usate   appropriate sostanze di controllo positivo .    Concentrazioni    Occorre far uso di almeno 5 concentrazioni   adeguatamente intervallate della sostanza   in esame . Per le sostanze tossiche la concentrazione   più elevata usata nel test non deve ridurre   la sopravvivenza a meno del 5-10 % . Le   sostanze relativamente insolubili in acqua vanno saggiate   fino al loro limite di solubilità secondo procedimenti   appropriati . Per le sostanze non tossiche   completamente solubili in acqua la concentrazione   massima va determinata caso per caso .    Condizioni di incubazione    Le piastre vengono incubate per 4-7 giorni   a temperatura da 28 ° a 30 ° C nell'oscurità .    Frequenze delle mutazioni spontanee    È opportuno usare subcolture con frequenze   delle mutazioni spontanee entro i limiti   accettati come normali .    Numero delle repliche    Per la determinazione dei prototrofi che si   inducono per mutazione genica e della sopravvivenza   cellulare è opportuno fare uso di almeno tre   piastre di replica per concentrazione .   Nel caso di esperimenti nei quali si usino marcatori   a bassa frequenza di mutazione , quali hom 3-10 ,   per poter ottenere dati aventi rilevanza statistica   è necessario aumentare il numero delle piastre .    Procedimento    Il trattamento dei ceppi di S. cerevisiae viene   normalmente effettuato secondo un procedimento di test   in sospensione liquida con impiego di cellule   quiescenti o in crescita . Gli esperimenti   iniziali dovrebbero essere condotti su cellule   in crescita . Si espongono alla sostanza in   esame per una durata fino a 18 ore a temperatura da   28 ° a 37 ° C e in agitazione 1-5 X 10 7 cellule/ml ;   in casi opportuni , nel con o del trattamento   si aggiunge una quantità adeguata di un sistema   di attivazione metabolica . Al termine del   trattamento si procede alla centrifugazione ed   al lavaggio delle cellule ed alla loro semina su   un terreno di coltura appropriato . Dopo incubazione   si analizzano le piastre per la determinazione   della sopravvivenza e dell'induzione della   mutazione genica .    Se il primo esperimento è negativo il secondo   esperimento dovrebbe essere condotto su cellule   quiescenti ; se il primo esperimento è positivo ,   viene confermato in un appropriato esperimento   indipendente .    2 . DATI    I dati devono essere presentati in forma di   tabelle , con indicazione del numero delle colonie   contate , del numero di mutanti della sopravvivenza   e della frequenza dei mutanti . Tutti i risultati   devono essere confermati in un esperimento   indipendente . I dati devono essere stabiliti   secondo metodi statistici appropriati .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare ,   se possibile :     - ceppo usato ,     - condizioni di effettuazione del test :   cellule in fase stazionaria o in crescita , composizione   dei terreni , temperatura e durata dell'incubazione ,   sistemi di attivazione metabolica ,     - condizioni del trattamento : livelli di esposizione ,   procedimento e durata del trattamento , temperatura di   trattamento , controlli positivi e negativi ,     - numero delle colonie contate , numero di mutanti ,   sopravvivenza e frequenza dei mutanti , relazione   dose/risposta se disponibile , valutazione   statistica dei dati ,     - discussione dei risultati ,     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    RICOMBINAZIONE MITOTICA : SACCHAROMYCES CEREVISIAE    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principi del metodo di saggio    La ricombinazione mitotica in Saccharomyces   cerevisiae può essere rilevata fra geni ( o in   linea più generale fra un gene e il suo   centromero ) e all'interno dei geni . La prima   delle due eventualità è denominata   crossing-over mitotico e genera prodotti reciproci ,   mentre la seconda eventualità è per lo più   non reciproca ed è denominata conversione   genica . Il crossing-over viene generalmente   determinato mediante la produzione di   colonie o settori recessivi omozigoti in un ceppo   eterozigote , mentre la conversione genica viene   determinata attraverso la produzione di revertanti   prototrofici in un ceppo auxotrofico eteroallelomorfo   portante due diversi alleli del medesimo gene .   I ceppi più comunemente usati per la rilevazione   della conversione genica mitotica sono i ceppi D4   ( eteroallelomorfo in ade 2 e trp 5 ) , D7   ( eteroallelomorfo in trp 5 ) , BZ34 ( eteroallelomorfo   in arg 4 ) e JD1 ( eteroallelomorfo in his 4 e   trp 5 ) . Il crossing-over mitotico producente   settori omozigoti di colore rosso e rosa può   essere determinato nel ceppo D5 o in D7 ( che misura   anche la conversione genica mitotica e la retromutazione   in ilv 1-92 ) , essendo entrambi i ceppi eteroallelomorfi   per alleli complementanti di ade 2 .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni    È opportuno preparare le soluzioni della   sostanza in esame e dei composti di controllo o di   riferimento , facendo uso di un solvente   appropriato , al momento di procedere all'effettuazione   del test . Con i composti organici non solubili in   acqua è opportuno usare solventi organici come   l'etanolo , l'acetone e il dimetilsolfossido ( DMSO )   a non più del 2 % ( v/v ) . La concentrazione   finale del solvente non dovrebbe alterare   significativamente la vitalità cellulare e le   caratteristiche di crescita .    Attivazione metabolica    Le cellule devono essere esposte alle sostanze   in esame sin in presenza che in assenza di un   sistema appropriato di attivazione metabolica   esogena . Il sistema più comunemente usato   è una frazione postmitocondriale supplementare   con cofattori e ottenuta dai fegati di roditori   pretrattati con agenti che inducono enzimi . Per   l'attivazione metabolica può essere appropriato   anche l'impiego di altre specie , di altri tessuti ,   di altre frazioni postmitocondriali o di altri   procedimenti .    Condizioni sperimentali    Ceppi    I ceppi più frequentemente usati sono i ceppi   diploidi D4 , D5 , D7 , e JD1 . Può essere   appropriato anche l'impiego di altri ceppi .    Terreni di coltura    Per la determinazione della sopravvivenza e della   frequenza della ricombinazione mitotica si devono   usare terreni di coltura appropriati .    Uso di controlli negativi e positivi    È opportuno effettuare in parallelo controlli   positivi , controlli non trattati o trattati con   solo solvente . Per ciascun tipo specifico di   ricombinazione devono essere usate le appropriate   sostanze di controllo positivo .    Concentrazioni    È opportuno fare uso di almeno cinque concentrazioni   della sostanza in esame adeguatamente intervallate .   Tra i fattori da prendere in considerazione vi sono   la citotossicità e la solubilità . La   concentrazione più bassa non deve produrre   alcun effetto sulla vitalità cellulare . Per le   sostanze tossiche , la più alta concentrazione   saggiata non deve ridurre la sopravvivenza a meno   del 5-10 % . Le sostanze relativamente insolubili   in acqua devono essere saggiate fino al loro   limite di solubilità secondo procedimenti appropriati . Per   le sostanze non tossiche altamente solubili in acqua   la concentrazione massima del test va determinata   caso per caso .    Le cellule possono essere esposte alle sostanze   in esame in fase stazionaria o in fase di   crescita per periodi fino a 18 ore . Nel caso di   tempi di trattamento prolungati occorre tuttavia   accertare mediante esame microscopico che nelle   culture non vi sia formazione di spore , la cui   presenza invaliderebbe il test .    Condizioni di incubazione    Le piastre vengono incubate nell'oscurità   per 4-7 giorni a temperatura da 28 ° a 30 ° C .   Le piastre usate per l'analisi dei settori   omozigoti di colore rosso e roseo derivanti dal   crossing-over mitotico vanno tuttavia   tenute in frigorifero ( 4 ° C ) per un altro ciclo   di uno o due giorni prima dell'analisi , per dare tempo   allo sviluppo del pigmento nelle colonie   ricombinanti .    Frequenze della ricombinazione mitotica spontanea    È opportuno usare subcolture con frequenze di   ricombinazione mitotica spontanea entro i limiti   accettati come normali .    Numero delle repliche    Per la determinazione dei prototrofi prodotti   della conversione genica mitotica e per quella della   sopravvivenza è opportuno fare uso di un minimo   di tre piastre di replica per concentrazione . Nella   determinazione della omozigosi recessiva derivante   dal crossing-over mitotico il numero delle piastre   va aumentato in modo da ottenere un numero   adeguato di colonie .    Procedimento    Il trattamento dei ceppi di S. cerevisiae viene   normalmente effettuato in un procedimento di test   in sospensione liquida con cellule in fase stazionaria   o in fase di crescita . Esperimenti iniziali dovrebbero   essere condotti su cellule in fase di crescita . Si   espongono alla sostanza in esame per una durata   fino a 18 ore a temperatura da 28 ° a 37 ° C   con scuotimento 1 - 5 × 10 7 cellule/ml ;   nel corso del trattamento , nei casi opportuni si   aggiunge una quantità adeguata di un sistema   di attivazione metabolica . Al termine del trattamento   si procede alla centrifugazione ed al lavaggio   delle cellule ed alla loro semina su un terreno   di coltura appropriato . Dopo l'incubazione   si analizzano le piastre per la determinazione della   sopravvivenza e dell'induzione della ricombinazione   mitotica .    Se il primo esperimento è negativo il secondo   dovrebbe essere eseguito su cellule quiescenti ;   se il primo esperimento è positivo , il secondo   viene confermato in un esperimento indipendente   appropriato .    2 . DATI    I dati devono essere presentati in forma di tabelle ,   con indicazione del numero dei ricombinanti , della   sopravvivenza e della frequenza dei ricombinanti .    Tutti i risultati devono essere confermati in un   esperimento indipendente . I dati vanno stabiliti per   valutazione secondo metodi statistici appropriati .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare ,   se possibile :     - ceppo usato ,     - condizioni di effettuazione del test :   cellule in fase stazionaria o di crescita , composizione   dei terreni , temperatura e durata dell'incubazione ,   sistemi di attivazione metabolica ,     - condizioni del trattamento : concentrazione di   esposizione , procedimento e durata del trattamento ,   temperatura di trattamento , controlli positivi e   negativi ,     - numero di colonie contate , numero dei ricombinanti ,   frequenza della sopravvivenza e della ricombinazione ,   relazione dose/risposta se possibile , valutazione   statistica dei dati ,     - discussione dei risultati ,     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    CELLULE DI MAMMIFERI IN VITRO : SAGGIO DI MUTAZIONE GENICA    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .   1.4 . Principi del metodo di saggio    Per la rilevazione di mutazioni indotte da sostanze   chimiche può essere fatto uso di sistemi   di coltura di cellule di mammiferi . Fra i tipi   di cellule più largamente usati figurano   le cellule di linfoma di topo L5178V e le linee CHO e   V-79 di cellule di hamster cinese . In queste   linee cellulari i sistemi più comunemente usati   misurano mutazioni nei loci della timidina chinasi   ( TK ) , della ipoxantina guanina fosforibosil   transferasi ( HPRT ) (1) e della Na + /K + ATPase .   I sistemi di mutazioni della TK e della HPRT evidenziano   mutazioni del tipo « sostituzione di base » ,   mutazioni del tipo « inserzione-delezione »   e piccole delezioni ; il sistema Na + /K + segnala   soltanto mutazioni del tipo « sostituzione di base » .    Le cellule deficienti di timidina kinasi ( TK ) ,   a causa della mutazione in avanti TK + - TK , sono   resistenti alla bromodeossiuridina ( BrdU ) , alla   fluorodeossiuridina ( FdU ) e alla trifluoroamidina   ( TFT ) , non essendo detti antimetaboliti incorporati   in nucleotidi cellulari dalla timidina chinasi del   sistema enzimatico « di recupero » ; i nucleotidi   occorrenti per il metabolismo cellulare sono   ottenuti unicamente dalla sintesi de novo . In   presenza di timidina chinasi la BrdU , la FdU e la TFT   sono per contro incorporate nei nucleotidi , con   conseguente inibizione del metabolismo cellulare   e della citotossicità . Le cellule   mutanti sono cosi in grado di proliferare in   presenza di BrdU , FdU o di TFT , mentre la cellule   normali , che somengono timidina chinasi , non lo   possono fare .    Analogamente le cellule con insufficienza di HPRT   sono selezionate per resistenza alla ss-azaguanina   ( AG ) o alla 6-tioguanina ( TG ) . Le cellule con   alterazione della Na + /K + ATPase sono selezionate   per resistenza alla ouabaina .    Per la determinazione della citotossicità si   misura l'effetto della sostanza in esame sulla capacità   di formazione di colonie ( efficienza di   clonaggio ) o sui tassi di crescita delle colture .   La determinazione della frequenza dei mutanti si   effettua a sua volta seminando numeri noti di   cellule in un terreno contenente l'agente selettivo   per individuare le cellule mutanti , e in un terreno   senza agente selettivo per determinare l'efficienza   di clonaggio . Dopo un appropriato periodo di   incubazione si contano le colonie . Le frequenze   dei mutanti si calcolano in base al numero delle   colonie di mutanti con la correzione relativa   all'efficienza di clonaggio delle cellule .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni    Cellule    Per il tipo di determinazione qui considerato   è disponibile tutta una serie di linee cellulari .   Esse comprendono dei subcloni di cellule L5178Y ,   CHO o di cellule V-79 delle quali sono state   dimostrate la sensibilità agli agenti mutageni   chimici , l'elevata efficienza di clonaggio e la   bassa frequenza di mutazioni spontance .   Le cellule possono essere controllate periodicamente   per quel che riguarda la stabilità dei cariotipo ,   ed è comunque opportuno accertare l'assenza in esse di   contaminazione da micoplasma . È possibile usare   anche altri tipi di cellule , a condizione   che ne sia pienamente documentata la validità   per la determinazione delle mutazioni geniche indotte   chimicamente .    Terreni di coltura    È necessario valersi di terreni di coltura   e di condizioni di incubazione ( temperatura ,   recipienti di coltura , concentrazioni di CO2 ,   umidità , ecc ) appropriati . I terreni e i   sieri vanno scelti in relazione ai sistemi selettivi e al   tipo di cellule usati nella determinazione .    Sostanza in esame    Le sostanze in esame possono essere preparate   in terreni di coltura ovvero disciolte o poste   in sospensione in veicoli appropriati prima del   trattamento delle cellule . La concentrazione finale   del veicolo nel sistema di coltura non deve influire   sulla vitalità delle cellule o sul loro tasso di   crescita .    Attivazione metabolica    È opportuno esporre le cellule alla sostanza in esame   sia in presenza che in assenza di un sistema esogeno di   attivazione metabolica dei mammiferi . Alternativamente ,   quando si fa uso di tipi di cellule con attività   metabolica endogena è opportuno che l'entità   e la natura di detta attività siano conosciute   como appropriate alla classe clinica che si sta   esaminando .    Condizioni sperimentali    Uso di controlli positivi e negativi    È opportuno includere in ciascun esperimento   dei controlli positivi , valendosi sia di un composto   ad azione diretta che di un composto per il quale   occorre attivazione metabolica ; è altresì   opportuno effettuare un controllo negativo ( del   veicolo ) .    Quali esempi di sostanze che si prestano ad essere   usate come controlli positivi si possono citare le   seguenti :     - composti ad azione diretta :     - etilmetansulfonato ,     - icantone ,     - composti ad azione indiretta :     - 2-acetilaminofluorene ,     - 7 , 12-dimetilbenzantracene ,     - N-nitrosodimetilamina .    Se del caso , si può ancora aggiungere un ulteriore   controllo positivo della medesima classe chimica della   sostanza in esame .    Concentrazioni    È opportuno fare uso di diverse concentrazioni   della sostanza in esame . Dette concentrazioni   devono produrre un effetto tossico proporzionale   alle concentrazioni stesse , nel senso che la   concentrazione più elevata dà luogo ad un   livello ridotto di sopravvivenza , mentre alla   concentrazione più bassa la sopravvivenza è   approssimativamente dello stesso ordine che nel controllo   negativo . Le sostanze relativamente insolubili   in acqua vanno saggiate fino al loro limite di   solubilità secondo procedure appropriate . Per le   sostanze non tossiche completamente solubili in   acqua la concentrazione più elevata della sostanza   all'esame va determinata caso per caso .    Procedimento    Il numero delle cellule usate per le varie colture   deve essere in relazione con la frequenza   delle mutazioni spontanee ; un criterio di carattere   generale consiste nell'usare un numero di cellule   vitali pari al decuplo dell'inverso delle   frequenze delle mutazioni spontanee .    Le cellule vanno esposte all'effetto   delle sostanze per una durata adeguata ; nella   maggior parte dei casi è efficace un'esposizione   da 2 a 5 ore . Le cellule che non hanno un'attività   metabolica endoge la sufficiente devono di   preferenza essere esposte alla sostanza in esame sia in   presenza che in assenza di un appropriato sistema di   attivazione metabolica . Al termine del periodo   di esposizione le cellule vengono lavate da ogni   traccia della sostanza in esame e poste in coltura   per la determinazione dell'efficienza di clonaggio e   per consentire l'espressione del fenotipo mutante .    Al termine del periodo di espressione , che deve essere   sufficientemente lungo per rendere possibile un'espressione   fenotipica pressocché ottimale dei mutanti indotti ,   le cellule vengono coltivate in un mezzo rispettivamente   con e senza agenti selettivi per la determinazione   del numero dei mutanti e dell'efficienza di clonaggio .    Tutti i risultati vengono confermati in un esperimento   indipendente .    2 . DATI    I dati devono essere presentati in forma di tabelle .   Devono essere presentati i conteggi delle singole   piastre , per la sostanza in esame e per il controllo ,   sia per l'induzione delle mutazioni che per la   sopravvivenza . Devono altresì essere indicati   il numero medio delle colonie per piastra e la   deviazione standard . La frequenza delle mutazioni va   espressa quale numero dei mutanti in relazione   al numero delle cellule sopravvissute . La sopravvivenza   e l'efficienza di clonaggio sono espresse in forma di   percentuale del livello del controllo . I dati   devono essere valutati secondo metodi statistici   appropriati .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare , se   possibile :     - tipo di cellule usate , numero delle colture di   cellule , metodi per il mantenimento delle colture   di cellule ,     - condizioni di effettuazione del test : composizione   dei terreni , concentrazione di CO2 , concentrazione   della sostanza in esame , solvente usato , temperatura   di incubazione , tempo di incubazione , durata del   periodo di espressione ( se necessario , con   indicazione del numero delle cellule seminate ,   delle subcolture e dello schema di mantenimento ) ,   durata del trattamento , densità delle cellule   durante il trattamento , tipo di sistema di attivazione   metabolica dei mammiferi usato , controlli positivi   e negativi , agente selettivo usato ,     - ragioni della selezione delle dosi ,     - metodo usato per il conteggio delle cellule   vitali e delle cellule mutanti ,     - valutazione statistica ,     - discussione dei risultati ,     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valurazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    (1) Gia HGPRT .    DANNO E RIPARAZIONE DEL DNA : SINTESI NON PROGRAMMATA   DEL DNA - CELLULE DI MAMMIFERO IN VITRO    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principi del metodo di saggio    Il test della sintesi non programmata del DNA -   Unscheduled DNA Syntesis ( UDS ) - misura la sintesi di   riparazione del DNA dopo l'escissione e la rimozione   di un tratto di DNA contenente la zona del danno   indotto da agenti chimici e fisici . Il test   si basa sull'incorparazione di timidina marcata   con tritio ( 3H-TdR ) nel DNA di cellule di   mammiferi che non si trovano nella fase S del ciclo   cellulare . L'assunzione di 3H-TdR può   essere determinata per autoradiografia oppure   mediante conteggio per scintillazione in fase   liquida - liquid scintillation counting ( LSC )   - del DNA dalle cellule trattate . Le cellule di   mammiferi in coltura , salvo nel caso che si   faccia uso di epatociti primari di topo , vengone   trattate con l'agente all'esame con e senza   un sistema di attivazione metabolica esogena .   La UDS può essere misurata anche in sistemi in vivo .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni    Le sostanze in esame e quelle di controllo o di   riferimento vanno preparate in terreno di crescita   ovvero disciolte o poste in sospensione in veicoli   appropriati e poi ancora diluite in terreno di   crescita prima di essere utilizzate per il test .   La concentrazione finale del veicolo non deve produrre   alcun effetto sulla vitalità delle cellule .    Nel test possono essere utilizzate colture   primarie di epatociti di ratto , di linfociti umani   o di linee cellulari stabilizzate ( ad esempio   fibroblasti diploidi umani ) .    È opportuno esporre le cellule alla sostanza   in esame sia in presenza che in assenza di un   sistema appropriato di attivazione metabolica .    Condizioni sperimentali    Numero di colture    Sono necessarie almeno due colture di cellule per   l'autoradiografia e sei colture ( o meno , se giustificato   scientificamente ) per le determinazioni LSC e UDS   per ogni punto sperimentale .    Uso di controlli negatívi e positivi    È opportuno includere in ciascun esperimento   controlli simultanei positivi e negativi ( non   trattati e/o del solo veicolo ) , con e senza   attivazione metabolica .    Esempli di controlli positivi per il test su epatociti   di ratto sono il 7,12-DMBA ( 7,12-dimetilbenzatracene )   e il 2-AAF ( 2-acetilaminofluorene ) . Nel   caso delle linee cellulari stabilizzate un   esempio di controllo positivo sia per le determinazioni   autoradiografiche che per le determinazioni LSC   effettuate senza attivazione metabolica è la   4-NQO ( 4-nitrochinolina-N-ossido ) ; la   N-dimetilnitrosamina è a sua volta un esempio di   composto per controllo positivo quando sia fatto uso di   sistemi di attivazione metabolica .    Concentrazioni    È opportuno fare uso di concentrazioni multiple   della sostanza in esame in una gamma adeguata   ai fini della determinazione della risposta .   La concentrazione più elevata deve dar luogo   a qualche effetto citotossico . I composti   relativamente insolubili in acqua vanno saggiati fino   al loro limite di solubilità . Per le sostanze non   tossiche altamente solubili in acqua la concentrazione   massima della sostanza in esame va determinata caso per   caso .    Cellule    Per il mantenimento delle colture è opportuno fare uso   di terreni di crescita , di concentrazioni di CO2   e di condizioni di temperatura e di umidità   appropriate . Le linee cellulari stabilizzate devono essere   controllate periodicamente per escludere la presenza   di contaminazione da micoplasma .    Attivazione metabolica    Con le colture primarie di epatociti non si fa   uso di sistemi di attivazione metabolica .   Le linee cellulari stabilizzate ed i linfociti   vengono esposti alla sostanza in esame sia in presenza   che in assenza di un sistema appropriato di   attivazione metabolica .    Procedimento    Preparazione delle colture    La linee cellulari stabilizzate vengono generate da   coltura stock ( ad esempio per tripsinizzazione   o mediante separazione per scuotimento ) , seminate   in recipienti di coltura a densità appropriata   ed incubate a 37 ° C .    Colture a breve termine di epatociti di ratto   vengono preparate dando modo a epatociti dissociati   di fresco in un terreno appropriato di attaccarsi alia   superficie di crescita . Le colture di linfociti umani   vengono preparate secondo tecniche appropriate .    Trattamento delle colture con la sostanza in esame    Epatociti primari di ratto    Gli epatociti di ratto isolati di fresco vengono   trattati con la sostanza in esame in un terreno   contenente 3H-TdR per una durata appropriata .   Al termine del periodo di trattamento le cellule   vanno tolte mediante filtraggio dal terreno ,   risciacquate , fissate ed essiccate . I vetrini   vanno immersi in emulsione autoradiografica   ( alternativamente si possono usare pellicole   adatte ) , esposti , sviluppati , colorati ed enumerati .    Linee cellulari stabilizzate e linfociti    Tecniche autoradiografiche : Le colture di cellule   vengono esposte alla sostanza in esame per una durata   appropriata e successivamente trattate con   3H-TdR . La durata sarà determinata dalla   natura della sostanza , dall'attività del sistema   metabolizzante e dal tipo delle cellule .   Per rilevare il valore massimo di UDS , è opportuno   aggiungere 3H-TdR contemporaneamente alla sostanza   all'esame , ovvero entro pochi minuti dall'esposizione   alla sostanza stessa . La scelta fra i suddetti   due procedimenti sarà fatta in relazione alla   possibilità di interazioni fra la sostanza   all'esame e 3H-TdR .    Al fine di poter distinguere fra UDS e la replicazione   semi-conservativa di DNA si può inibire quest'ultima ,   ad esempio facendo uso di un terreno deficiente   di arginina , a basso contenuto di siero o con   idrossiurea nel mezzo di coltura .    Misure LSC di UDS : Prima del trattamento con   la sostanza in esame è opportuno bloccare   nel modo che si è descritto sopra l'entrada   delle cellule nella fase S . Le cellule   vengono poi esposte alla sostanza in esame nel modo che   si è descritto per l'autoradiografia . Al termine   del periodo di incubazione si estrae il DNA dalle cellule   e si determinano il contenuto totale di DNA e la   misura della incorporazione di 3H-TdR .    Occorre rilevare che quando si fa uso delle techniche   sopra descritte di linfociti umani , la soppressione   della replicazione semi-conservativa di DNA   non è necessaria in colture non stimolate .    Analisi    Determinazioni autoradiografiche    Nella determinazione di UDS nelle cellule in coltura   non si contano i nuclei in fase S . É opportuno   contare almeno 50 cellule per concentrazione .   Le lastrine vanno codificate prima del conteggio . È   opportuno contare su ciascuna piastrina diversi campi   a caso interamente separati tra loro . Per la   determinazione della quantità di incorporazione   di 3H-TdR nel citoplasma è bene contare nel   citoplasma di ciascuna cellula conteggiata tre aree   delle dimensioni del nucleo .    Determinazioni LSC    Nelle determinazioni LSC UDS occorre fare uso di un   numero adeguato di colture per ogni concentrazione e   per i controlli .    Tutti i risultati dovrebbero essere confermati in un   esperimento indipendente .    2 . DATI    I dati devono essere presentati in forma di tabelle .    2.1 . Determinazioni autoradiografiche    Della entità dell'incorporazione di 3H-TdR nel   citoplasma e del numero dei granuli osservati nel   nucleo delle cellule va presa nota separatamente .    Per descrivere la distribuzione dell'entità   dell'incorporazione di 3H-TdR nel citoplasma e del   numero dei granuli per nucleo può essere fatto   riferimento alla media , alla mediana ed al modo .    2.2 . Determinazioni LSC    Per le determinazioni LSC , l'incorporazione   di 3H-TdR va indicata in termini di dpm/µg di DNA .   Il valore medio di dpm/µg di DNA on la deviazione   standard può essere usato per descrivere la   distribuzione della incorporazione .    I dati devono essere valutati secondo metodi statistici   appropriati .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare , se   possibile :     - cellule usate , densità e numero dei passagi al   momento del trattamento , numero delle colture di   cellule ,     - metodi usati per il mantenimento delle colture   di cellule , con indicazione del terreno , della   temperatura e della concentrazione di CO2 ,     - sostanza in esame , veicolo , concentrazioni e   ragioni della scelta delle concentrazioni usate nella   determinazione ,     - dettagli riguardanti i sistemi di attivazione   metabolica ,     - programmi di trattamento ,     - controlli positivi e negativi ,     - tecnica autoradiografica usata ,     - procedimenti usati per bloccare l'entrata   delle cellule nella fase S ,     - procedimenti usati per l'estrazione di DNA e per   la determinazione del contenuto totale di DNA nelle   determinazioni LSC ,     - relazione dose-risposta se del caso ,     - valutazione statistica ,     - discussione dei risultati ,     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    SAGGIO DEGLI SCAMBI TRA CROMATIDI FRATELLI IN VITRO    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principi del metodo di saggio    Quello degli scambi tra cromatidi fratelli - Sister   chromatid exchange ( SEC ) - è un test a breve   termine per la rilevazione degli scambi reciproci di   DNA fra due cromatidi fratelli di un cromosoma in   duplicazione . Gli SCE rappresentano l'interscambio di   prodotti della replicazione di DNA in corrispondenza   di loci apparentemente omologhi . Il processo di   scambio comporta presumibilmente la rottura e la   riunione di DNA , ma sulla sua base molecolare   non si conosce in realtà molto . La rilevazione   degli SCE richiede qualche mezzo per marcare in modo   differenziale i cromatidi fratelli , e questo può   essere ottenuto mediante incorporazione di   bromodeossiuridina ( BrdU ) nel DNA cromosomico   per due cicli cellulari .    Colture in vitro di cellule di mammiferi vengono   esposte alla sostanza in esame con e senza un   sistema esogeno di attivazione metabolica dei   mammiferi , se appropriato , e poste in coltura per   due cicli di replicazione in terreno contenente   BrdU . Dopo un trattamento con un inibitore del fuso   ( ad esempio la colchicina ) per accumulare cellule   in uno stadio di mitosi di tipo metafasico   ( c-metafase ) , le cellule vengono raccolte e si   procede alle preparazioni cromosomiche .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni     - Nel saggio si possono usare colture primarie   ( linfociti umani ) o linee cellulari stabilizzate   ( ad esempio cellule di ovario di hamster cinese ) .   Le linee cellulari devono essere controllate per   escludere la presenza di contaminazione da Mycoplasma .     - Vanno usati terreni di coltura e condizioni di   incubazione ( temperatura , recipienti di coltura ,   concentrazione di CO2 ed umidità ) appropriati .     - Le sostanze in esame possono essere preparate   in terreni di coltura ovvero disciolte o poste   in sospensione in veicoli appropriati prima del   trattamento delle cellule . La concentrazione finale   dei veicoli nei sistemi di coltura non deve   influire in maniera significativa sulla vitalità o sul   tasso di crescita delle cellule , ed è parallelamente   opportuno verificare la frequenza degli SCE per mezzo   di un controllo con solvente .     - È opportuno esporre la cellule alla sostanza in   esame sia in presenza che in assenza di un sistema   esogeno di attivazione metabolica di mammiferi .   Alternativamente , ove si faccia uso di tipi di   cellule con attività metabolica endogena ,   l'intensità e la natura dell'attività devono   essere appropriate per la classe chimica   sottoposta all'esame .    Condizioni sperimentali    Numero di colture    Per ciascun punto sperimentale dovrebbero essere   usate colture almeno in duplicato .    Uso di controlli positivi e negativi    È opportuno includere in ciascun esperimento dei   controlli positivi , facendo uso sia di un composto   ad azione diretta che di un composto richiedente   attivazione metabolica , ed è opportuno anche   effettuare un controllo del veicolo .    Quali esempi di sostanze che si prestano ad essere   usate come controlli positivi si possono citare :     - come composto ad azione diretta :     - l'etilmetansulfonato ,     - come composto ad azione indiretta :     - la ciclofosfamide .    Se del caso , può essere incluso nell'esperimento   un controllo positivo supplementare della medesima   classe chimica della sostanza in esame .    Concentrazioni    È opportuno fare uso di almeno tre concentrazioni   adeguatamente intervallate della sostanza in   esame . La concentrazione più elevata deve   dar luogo ad un effetto tossico significativo , ma   deve ancora consentire il verificarsi di una   replicazione adeguata delle cellule . Le sostanze   relativamente insolubili in acqua vanno saggiate   fino al loro limite di solubilità secondo procedimenti   appropriati . Per le sostanze non tossiche altamente   solubili in acqua la concentrazione massima della   sostanza in esame va determinata caso per caso .    Procedimento    Preparazione delle colture    Linee cellulari stabilizzate vengono generate da   colture stock ( ad esempio per tripsinizzazione o   mediante distacco per scuotimento ) , seminate in   recipienti di coltura a densità appropriata ed   incubate a 37 ° C . Nel caso di coltura monostrato ,   il numero delle cellule per ogni recipiente di   coltura va regolato in modo che le colture non   siano confluenti in misura molto maggiore del 50 % al   momento della raccolta . Alternativamente , le cellule   possono essere usate in forma di coltura in sospensiore .   Le colture di linfociti umani sono ottenute da sangue   eparinizzato secondo techniche appropriate ed   incubate a 37 ° C .    Trattamento    Vengono esposte alla sostanza in esame per una durata   adeguata cellule in uno stadio di crescita esponenziale ;   nella maggior parte dei casi può essere efficace una   durata da una a due ore , ma la durata del trattamento   può in taluni casi essere prolungata fino a due cicli   cellulari completi . Le cellule non aventi una   sufficiente attività metabolica endogena   vanno esposte alla sostanza in esame sia in presenza   che in assenza di un sistema appropriato di   attivazione metabolica . Al termine del periodo di   esposizione I cellule vengono lavate da ogni   traccia della sostanza in esame e coltivate per due cicli   di replicazione in presenza di BrdU . In un procedimento   alternativo si possono esporre le cellule   contemporaneamente alla sostanza in esame e al   BrdU per la durata completa di coltura di due cicli   cellulari . Le colture di linfociti umani vengono   trattate mentre si trovano in condizione semisincrona .   Le cellule vengono analizzate alle loro seconda   divisione dopo il trattamento , per assicurarsi che   siano state esposte alla sostanza negli stadi più   sensibili del ciclo cellulare . Tutte le colture alle   quali si aggiunge BrdU , vanno manipolate nell'oscurità   o in luce attenuata di lampade ad incandescenza fino   al momento della raccolta delle cellule , allo   scopo di ridurre per quanto possible la fotolisi del   DNA contenente BrdU .    Raccolta delle cellule    Le colture di cellule vengono trattate con un inibitore   del fuso ( ad esempio colchicina ) da 1 a 4 ore prima   della raccolta . Ciascuna coltura viene raccolta   e trattata separatamente per la preparazione   dei cromosomi .    Preparazione e colorazione dei cromosomi    I preparati di cromosomi vengono ottenuti secondo   le techniche citogenetiche correnti . La colorazione   dei vetrini per l'evidenziazione degli SCE può   essere effettuata secondo diverse techniche ( ad   esempio con il metodo della fluorescenza più   Giemsa ) .    Analisi    Il numero di cellule analizzate deve essere basato   sulla frequenza spontanea di controllo degli SCE .   Normalmente si analizzano per gli SCE almeno 25 metafasi   ben spaziate per coltura . I vetrini vengono   codificati prima dell'analisi . Nei linfociti   umani si analizzano soltanto metafasi contenenti   46 centromeri . Nelle linee cellulari stabilizzate si   analizzano a loro volta soltanto metafasi contenenti   ± 2 centromeri del numero modale . È opportuno   indicare se il salto di marcatura a livello del   centromero viene o non viene conteggiato come SCE .   I risultati dovrebbero essere confermati in un   esperimento indipendente .    2 . DATI    I dati devono essere presentati in forma di   tabelle . Il numero degli SCE per metafase e il   numero degli SCE per cromosoma vanno indicati   separatamente per tutte le colture trattate e   quelle di controllo . I dati devono essere definiti   secondo metodi statistici appropriati .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare ,   se possibile :     - cellule usate , metodi di mantenimento della   coltura cellulare ,     - condizioni sperimentali : composizione dei mezzi ,   concentrazione di CO2 , concentrazione della sostanza   all'esame , veicolo usato , temperatura di incubazione ,   tempo di trattamento , inibitore del fuso usato , sua   concentrazione e durata del trattamento connesso ,   tipo di sistema di attivazione di mammiferi usato ,   controlli positivi e negativi ,     - numero di colture di cellule per punto sperimentale ,     - dettagli della tecnica usata per la preparazione   delle lastrine ,     - numero delle metafasi analizzate ( indicazione   separata dei dati per ciascuna coltura ) ,     - numero medio di SCE per cellula e per cromosoma   ( indicazione separata dei dati per ciascuna coltura ) ,     - criteri per il riscontro degli SCE ,     - criteri di selezione delle dosi ,     - relazione dose/risposta se del caso ,     - valutazione statistica ,     - discussione dei risultati ,     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    SAGGIO DEI LETALI RECESSIVI LEGATI AL SESSO :   DROSOPHILA MELANOGASTER    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principi del metodo di saggio    Il saggio dei letali recessivi legati al sesso -   sex-linked recessive lethal ( SLRL ) - nel quale   è fatto uso della Drosophila melanogaster , permette   di rilevare l'induzione sia di mutazioni puntiformi   che di piccole delezioni nella linea germinale   dell'insetto . Si tratta di un saggio capace di   rivelare mutazioni in circa 800 loci sul cromosoma X ;   questa cifra rappresenta circa 1,80 % di tutti i loci   del cromosoma X ; quest'ultimo rappresenta a sua volta   circa un quinto dell'intero genoma aploide .    Le mutazioni nel cromosoma X nella D , melanogaster   sono espresse fenotipicamente nei maschi portanti il gene   mutante . Quando la mutazione è letale nella condizione   emizigote , la sua presenza si desume dall'assenza   di una delle due classi di discendenza maschile   che sono normalmente prodotte da una femmina   eterozigote . Il saggio SLRL si basa sulla   disponibilità di cromosomi specificamente marcati .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni    Ceppi    Possono essere usati maschi di un ceppo ben definito   di tipo selvatico e femmine del ceppo Muller-5 .   Possono altreí essere usati altri ceppi di femmine   marcate in modo appropriato con cromosomi X multipli   invertiti .    Sostanza in esame    Le sostanze in esame vanno disciolte in acqua .   Le sostanze non solubili in acqua possono essere   disciolte o poste in sospensione in solventi   appropriati ( ad esempio una miscela di etanolo e   Tween-60 o 80 ) , e successivamente diluite in acqua   o in soluzione salina prima della somministrazione .   È opportuno evitare quale solvente il dimetilsolfossido   ( DMSO ) .    Numero di animali    Il saggio va programmato con una sensibilità   ed una potenza predeterminati . Sul numero di cromosomi   trattati che devono essere analizzati influirà   fortemente la frequenza delle mutazioni spontanee   osservata nel controllo appropriato .    Vie di somministrazione    L'esposizione può essere orale , per iniezione   o per esposizione a gas o a vapori . La somministrazione   della sostanza in esame può essere fatta in forma   di soluzione zuccherina . Se necessario , le sostanze   possono essere disciolte in soluzione di NaCl allo   0,7 % ed iniettate nel torace o nell'addome .    Uso di controlli negativi e positivi    È opportuno includere nell'esperimento controlli   negativi ( del solvente ) e positivi . Ove tuttavia   siano disponibili appropriati dati storici di controllo   del laboratorio , non sono necessari controlli   concomitanti .    Concentrazioni    È opportuno fare uso di tre concentrazioni .   Per una valutazione preliminare può essere fatto   uso di una sola concentrazione della sostanza   in esame , che può essere quella massima tollerata   o quella che da luogo ad una qualche indicazione   di tossicità . Per le sostanze non tossiche è   opportuno adottare l'esposizione alla concentrazione   massima praticabile .    Procedimento    Maschi di tipo selvatico ( di età da 3 a 5 giorni )   vengono trattati con la sostanza in esame e accoppiati   individualmente con un numero maggiore di femmine   vergini dello stock Muller-5 o di altro stock marcato in   maniera appropriata ( con cromosomi X multipli   invertiti ) . Le femmine vengono sostituite con vergini   fresche ogni due , tre giorni così da coprire l'intero   ciclo delle cellule germinali . Sulla prole di dette   femmine viene effettuata l'analisi degli effetti   letali corrispondenti agli effetti sullo sperma maturo ,   sugli spermatidi di stadio medio o avanzato ,   sugli spermatidi precoci , sugli spermaticiti e sugli   spermatogoni al momento del trattamento .    Le femmine eterozigoti F1 degli incroci di cui   sopra sono fatte accoppiare individualmente ( ossia   in ragione di una femmina per bottiglietta ) con i loro   fratelli . Nella generazione F2 si procede su ciascuna   coltura all'analisi dell'assenza di maschi del tipo   selvatico . Se da una femmina F1 appare essere   derivata una coltura portante un letale nel cromosoma X   dei genitori ( ossia se non si osservano maschi con   il cromosoma trattato ) si devono mettere alla prova   figlie di quella femmina con il medesimo genotipo per   stabilire se la letalità si ripete nella generazione   successiva .    2 . DATI    I dati devono essere disposti in forma di tabelle   con indicazione del numero de cromosomi X saggiati ,   del numero dei maschi non fertili e del numero dei   cromosomi letali per ciascuna concentrazione di   esposizione e per ciascun periodo di accoppiamento   per i singoli maschi trattati . Deve essere riportato   per ciascun maschio il numero degli aggregati di differenti   dimensioni . I risultati del test devono essere   confermati in un esperimento a parte .    Per la valutazione del saggio dei letali recessivi   legati al sesso deve essere fatto uso di metodi   statistici appropriati . L'agglomerazione di   letali recessivi aventi origine da un medesimo maschio   dev'essere considerata e valutata secondo criteri   statistici appropriati .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare , se   possibile :     - stock : stock o ceppi di Drosophila usati ,   età degli insetti , numero dei maschi trattati ,   numero dei maschi sterili , numero di colture F2   costituite , umero di colture F2 senza progenie ,   numero di cromosomi portanti un letale individuati per   ciascuno stadio delle cellule germinali ,     - criteri per la definizione delle dimensioni   dei gruppi trattati ,     - condizioni di effettuazione dei saggio ;   descrizione dettagliata dei programmi di trattamento   e di campionatura , livelli di esposizione , dati   della tossicità , controlli negativi ( del solvente )   e positivi , se del caso ,     - criteri per il riscontro delle mutazioni letali ,     - relazione esposizione/effetto se del caso ,     - valutazione statistica ,     - discussione dei risultati ,     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    SAGGIO IN VITRO DI TRASFORMAZIONE DI CELLULE DI   MAMMIFERO   1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principi del metodo di saggio    Per la rilevazione di cambiamenti fenotipici   in vitro indotti da sostanze chimiche associate con una   trasformazione maligna in vivo può essere fatto uso   di sistemi di coltura di cellule di mammiferi . Fra   le cellule più largamente usate figurano le cellule   C3H10T½ , 3T3 , SHE , le cellule di ratto Fisher ; i   saggi si fondano su cambiamenti della morfologia   cellulare , sulla formazione di foci e sulla perdita   della dipendenza da ancoraggio in agar semisolido .   Esistono anche altri sistemi meno largamente usati   i quali mettono in luce altri tipi di cambiamenti   fisiologici o morfologici nelle cellule successivamente   all'esposizione a sostanze chimiche carcinogene .   Nessune degli eventi finali dei test in vitro ha   un legame meccanicistico accertato con il cancro .   Alcuni fra i saggi sono in grado di evidenziare agenti   promotori dei tumori . La citotossicità può essere   determinata attraverso la misura dell'effetto   della sostanza in esame sulla capacità di formazione   di colonie ( efficienza di clonaggio ) o sul tasso   di crescita delle colture . La misurazione della   citotossicità ha lo scopo di stabilire se l'esposizione   alla sostanza in esame abbia avuto carattere rilevante   dal punto di vista tossicologico , ma non può essere   usata per calcolare la frequenza della transformazione in   tutti i saggi poiché alcuni di essi possono comportare   un'incubazione prolungate e/o un ripiastramento   delle cellule .    1.5 . Criteri qualitativi   Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni    Cellule   PER LA CONTINUAZIONE DEL TESTO VEDI SOTTO NUMERO : 390L0676.4E disponibile tutta una varietà di linee   cellulari o di cellule primarie , in relazione al   saggio di trasformazione che si intende effettuare .   Il ricercatore deve accertarsi che nel saggio che si   sta effettuando le cellule presentino dopo esposizione   a carcinogeni noti l'appropriato cambiamento fenotipico ,   e che il saggio nel suo laboratorio sia di provata e   documentata validità e attendibilità .    Terreni di coltura    Devono essere usati terreni di coltura e condizioni   sperimentali appropriati per il saggio di trasformazione   che si effettua .    Sostanza in esame    Le sostanze in esame possono essere preparate   in mezzi di coltura ovvero disciolte o poste in   sospensione in veicoli appropriati , prima del   trattamento delle cellule . La concentrazione finale   del veicolo nel sistema di coltura non deve influire   sulla vitalità o sul tasso di crescita delle   cellule né sull'incidenza della trasformazione .    Attivazione metabolica    Le cellule vanno esposte alla sostanza in esame   sia in presenza che in assenza di un sistema esogeno di   attivazione metabolica dei mammiferi . Alternativamente ,   quando sia fatto uso di tipi di cellule che possiedono   un'attività metabolica endogena deve essere accertato   che la natura dell'attività stessa sia appropriata   per la classe chimica sottoposta all'esame .    Condizioni sperimental :    Uso di controlli positivi e negativi    È opportuno includere in ciascun esperimento   dei controlli positivi , con impiego sia di un   composto ad azione diretta che di un composto   richiedente attivazione metabolica ; è altresì   opportuno fare uso di un controllo negativo ( del   solvente ) .    Quali esempi di sostanze che si prestano ad essere   usate come controlli positivi si possono citare :     - sostanze ad azione diretta :     - etilmetansulfonato ,     - ss-propiolattone ;     - composti richiedenti un'attivazione metabolica :     - 2-acetilaminofluorene ,     - 4-dimetilaminoazobenzene ,     - 7,12-dimetilbenzantracene .    Se del caso , è opportuno includere un controllo   positivo supplementare della medesima classe chimica del   composto in esame .    Concentrazioni    È opportuno usare varie concentrazioni della   sostanza in esame . Dette concentrazioni devono   dar luogo ad un effetto tossico correlato con   la concentrazione , nel senso che la concentrazione   più elevata produce un livello ridotto di sopravvivenza ,   mentre alla concentrazione più bassa la sopravvivenza   è approssimativamente dello stesso ordine che nel   controllo negativo . Le sostanze relativamente   insolubili in acqua vanno saggiate fino al loro limite   di solubilità secondo procedure appropriate . Per le   sostanze non tossiche altamente solubili in acqua la   concentrazione massima della sostanza va determinata   caso per caso .    Procedimento    L'esposizione delle cellule deve avere una durata   appropriata in relazione al sistema di saggio   adottato , e questo , quando l'esposizione è   prolungata , può comportare un ridosaggio con   cambio del mezzo e , se necessario , con miscela   di attivazione metabolica fresca . Le cellule   non aventi un attività metabolica endogena   sufficiente vanno esposte alla sostanza in   esame sia in presenza che in assenza di un   sistema di attivazione metabolica appropriato . Al   termine del periodo di esposizione le cellule   vengono lavate da ogni traccia della sostanza   in esame e coltivate in condizioni appropriate   per la comparsa del fenotipo trasformato che si sta   studiando , e viene infine determinata l'incidenza   della trasformazione . Tutti i risultati devono essere   confermati in un esperimento indipendente .    2 . DATI    I dati vanno presentati in forma di tabella e possono   assumere forme diverse a seconda del tipo di determinazione   effettuato , ad esempio numero di foci o di colonie   per piastre , piastre positive o numero delle   cellule trasformate . La sopravvivenza va espressa   quale percentuale dei livelli di controllo , e la   frequenza della trasformazione sotto forma del   numero di trasformanti in relazione al numero dei   sopravvissuti . I dati devono essere valutati secondo   metodi statistici appropriati .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare , se   possibile :     - tipo di cellule usato , numero delle colture   cellulari , metodi di mantenimento delle colture ,     - condizioni di effettuazione del saggio ,   concentrazione della sostanza in esame , veicolo usato ,   temperatura di incubazione , durata dell'incubazione ,   durata e frequenza del trattamento , densità delle   cellule durante il trattamento , tipo di sistema   di attivazione metabolica esogena usato , controlli   positivi e negativi , specificazione del feno *   studiato , sistema selettivo usato ( se del caso ) ,   criteri per la scelta delle dosi ,     - metodo seguito per l'enumerazione delle cellule   vitali e delle cellule trasformate ,     - valutazione statistica ,     - discussione dei risultati ,     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    SAGGIO DEI LETALI DOMINANTI NEI RODITORI    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principi del metodo di saggio    Gli effetti dei letali dominanti provocano la   morte dell'embrione o del feto . L'induzione di letali   dominanti per effetto dell'esposizione ad una   sostanza chimica indica che la sostanza in causa   ha attaccato il tessuto germinale della specie   all'esame . È generalmente ammesso che i letali   dominanti sono dovuti a un danno cromosomico   ( anomalie strutturali e numeriche ) . La morte   dell'embrione in femmine trattate può altresi   essere il risultato di effetti tossici .    Come criterio generale si espongono animali maschi   al composto in esame e si accoppiano i medesimi con   femmine vergini non trattate . I diversi scadi   delle cellule germinali possono essere saggiati separatamente   mediante l'osservanza di intervalli in successione   negli accoppiamenti . L'aumento degli impianti   morti per femmina nel gruppo trattato in confronto   con gli impianti morti per femmina nel gruppo di   controllo rispecchia la perdita successiva   all'impianto . La perdita anteriore all'impianto   può essere stimata sulla base di conteggi dei   corpi lutei oppure attraverso il raffronto del   totale degli impianti per femmina nel gruppo   trattato e in quello di controllo . L'effetto   letale dominante complessivo è rappresentato dalla   somma della perdita anteriore e successiva   all'impianto . Il calcolo dell'effetto letale   dominante complessivo si basa sul raffronto fra   gli impianti vivi per femmina nel gruppo trattato   e gli impianti vivi per femmina nel gruppo di controllo .   Una riduzione del numero di impianti a determinati   intervalli può essere il risultato dell'uccisione   di cellule ( vale a dire , di spermatociti e/o di   spermagoni ) .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni    In tutti i casi in cui ciò sia possibile ,   le sostanze in esame vanno disciolte o poste in   sospensione in soluzione salina isotonica . Le sostanze   non solubili in acqua possono essere disciolte o   sospese in solventi appropriati . Il so * usato   non deve né interferire con la sostanza in   esame né produrre effetti tossici . È opportuno   fare uso * preparazioni fresche della sostanza   in esame .    Condizioni sperimentali    Vie di somministrazione    Il composto in esame va in generale somministrato   una sola volta . Sulla base di informazioni   tossicologiche può essere adottato un programma   di trattamento ripetuto . Le vie di somministrazione   correnti sono l'intubazione orale e l'iniezione   intraperitoneale . Possono altresi essere   appropriate altre vie di somministrazione .    Animali da esperimento    Quali specie da sottoporre al saggio sono   raccomandati i ratti o i topi . Animali sani nella   piena maturità sessuale vengono randomizzati   ed assegnati al gruppo per il trattamento e al gruppo   di controllo .    Numero e sesso    Occorre fare uso di un numero adeguato di maschi   trattati in modo da tener conto della variazione   spontanea del carattere biologico di cui si effettua   la valutazione . Il numero scelto deve essere   basato sulla sensibilità di rilevazione e sul   valore di significatività determinati in precedenza .   Ad esempio , in un esperimento tipico , il numero   dei maschi per ciascun gruppo/dose deve essere   sufficiente per dare da 30 a 50 femmine gravide per   ogni intervallo di accoppiamento .    Uso di controlli negativi e positivi    È opportuno in linea generale includere in ciascun   esperimento dei controlli simultanei positivi e   negativi ( del veicolo ) . Quando siano disponibili   risultati accettabili di controlli positivi   relativi ad esperimenti effettuati di recente nel   medesimo laboratorio , al posto di un controllo   positivo simultaneo può essere fatto uso di detti   risultati .    Le sostanze per i controlli positivi vanno usate   a dosi opportunamente basse ( ad esempio MMS ,   intraperitoneale , a 10 mg/kg ) allo scopo di   dimostrare la sensibilità del saggio .    Livelli delle dosi    Di norma va fatto uso di tre livelli di dosaggio .   La dose più alta deve produrre segni di tossicità   o di riduzione della fertilità negli animali   trattati . In taluni casi può essere sufficiente   un solo livello elevato di dosaggio .    Saggio del limite    Le sostanze non tossiche vanno saggiate a 5 g/kg   con una sola somministrazione o a 1 g/kg/giorno con   somministrazione ripetuta .    Procedimento    Sono possibili vari schemi di trattamento . Il tipo   di trattamento più largamente usato è quello   della somministrazione singola della sostanza in   esame . Possono essere applicati anche altri   schemi di trattamento .    I singoli maschi vengono accoppiati in successione   con una o due femmine vergini non trattate ad   intervalli appropriati dopo il trattamento .   Le femmine vanno lasciate con i maschi almeno per la   durata di un ciclo di estro o fino a che sia   avvenuto l'accoppiamento , da determinare in base   alla presenza di sperma nella vagina o di un tappo   vaginale .    Il numero degli accoppiamenti successivi al   trattamento è determinato in base al programma   di trattamento e deve essere tale che vengano   esaminati dopo il trattamento tutti gli stadi   delle cellule germinali .    Le femmine vengono sacrificate nella seconda   metà del periodo di gravidanza , e si procede   all'esame del contenuto uterino per la   determinazione del numero degli impianti morti   e viventi . Si possono anche esaminare le ovaie   per determinare il numero dei corpi lutei .    2 . DATI    I dati devono essere disposti in forma di tabelle   con indicazione del numero dei maschi , del   numero delle femmine gravide e del numero delle   femmine non gravide . I risultati di ciascun   accoppiamento , con indicazione dell'identità   dei singoli soggetti maschi e femmine , vanno   riportati individualmente . Per ciascuna femmina va   indicata la settimana di accoppiamento , e per i   maschi il livello di dosaggio , nonché rispettivamente   le frequenze degli impianti vivi e degli impianti   morti . Il calcolo dell'effetto complessivo   letale dominante si basa sul raffronto fra gli   impianti vivi per femmina nel gruppo sottoposto   al saggio e gli impianti vivi per femmina nel   gruppo di controllo . Il rapporto fra gli impianti   morti e quelli vivi del gruppo trattato posto a   raffronto con il rapporto corrispondente del gruppo   di controllo viene analizzato ai fini   dell'indicazione della perdita successiva   all'impianto .    Se i dati sono registrati come morti precoci e   morti tardive , cio deve risultare dalle tabelle .   Se la perdita anteriore all'impiantazione e stimata ,   ne deve essere dato ragguaglio . La perdita anteriore   all'impianto può essere calcolata come   discrepanza fra il numero dei corpi lutei e il   numero degli impianti , ovvero come   riduzione del numero medio di impianti per utero in   confronto con gli accoppiamenti di controllo . I   dati vengono valutati secondo metodi statistici   appropriati .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare ,   se possibile :     - specie , ceppo , età e peso degli   animali usati , numero degli animali dell'uno   e dell'altro sesso nei gruppi sottoposti   al saggio e nei gruppi di controllo ,     - sostanza in esame , solvente , livelli di   dosaggio saggiati e ragioni della scelta delle   dosi , controlli negativi e positivi , dati della   tossicità ,     - via e durata dell'esposizione ,     - ordine degli accoppiamenti ,     - metodo usato per stabilire l'avvenuto accoppiamento ,     - metodo del sacrificio ,     - criteri per l'analisi dei letali dominanti ,     - relazione dose/risposta , se del caso ,     - valutazione statistica ,     - discussione dei risultati ,     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    ANALISI CITOGENETICA DELLE CELLULE GERMINALI :   MAMMIFERI    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principi del metodo di saggio    Il saggio dell'analisi citogenetica in vivo qui   considerato permette di rilevare aberrazioni   strutturali dei cromosomi negli spermatogoni .   Esso consiste in un'analisi delle mitosi degli   spermatogoni per aberrazioni di tipo cromatidico   e di tipo cromosomico .    Il saggio fa uso di preparati di testicoli   di mammiferi esposti alle sostanze in esame per   vie appropriate e sacrificati ad intervalli   diversi . Prima di essere sacrificati gli animali   sono altresì trattati con inibitori del fuso quali   la colchicina in modo da far accumulare cellule   ad uno stadio della mitosi di tipo metafasico   ( c-metafase ) . Si producono preparati cromosomici   essicati all'aria , che vengono colorati ed   analizzati al microscopio .    Utili informazioni supplementari possono essere   fornite dall'analisi degli spermatociti allo   stadio di diacinesi/metafase I per formazioni   multivalenti da traslocazione dopo trattamento   delle cellule staminali .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni    Le sostanze in esame vengono disciolte in soluzione   salina isotonica . Le sostanze non solubili vengono   disciolte o poste in sospensione in un solvente   appropriato . Si devono usare soluzioni del composto   in esame preparate di fresco . Se si fa uso di un   solvente per facilitare il dosaggio , esso non deve   interferire con la sostanza in esame né produrre   effetti tossici .    Vie di somministrazione    I composti in esame vanno in genere somministrati   una sola volta . Sulla base di informazioni tossicologiche   può essere adottato un programma di trattamento   ripetuto . Il trattamento ripetuto può tuttavia   essere applicato soltanto se il composto in   esame non presenta effetti citotossici nella   differenziazione degli spermatogoni .    Le vie di somministrazione correnti sono la via   orale e l'iniezione intraperitoneale . Possono altresì   essere appropriate altre vie di somministrazione .    Animali da esperimento    È per lo più fatto uso di topi e di hamster   cinesi . Può tuttavia essere impiegata qualsiasi   altra specie di mammiferi .    Vengono utilizzati maschi sessualmente maturi ,   che sono assegnati a caso ai gruppi per il trattamento   ed ai gruppi di controllo .    Numero degli animali    Si devono usare almeno 5 maschi per ciascun   gruppo trattato e per ciascun gruppo di controllo .    Uso di controlli negativi e positivi    In linea generale è opportuno includere in ciascun   esperimento dei controlli simultanei positivi e   negativi ( del solvente ) .    Le sostanze per i controlli positivi vanno usate   in dose opportunamente bassa ( ad esempio la mitomicina   C , intraperitoneale , a 0,3 mg/kg ) in modo da   dimostrare la sensibilità del saggio .    Livelli di dose    Si fa uso di una sola dose del composto in esame ,   scegliendo a questo fine la dose massima tollerata   ovvero quella che produce qualche indicazione di   citotossicità . Se la dose iniziale uccide un   gran numero di cellule , si deve usare una seconda   dose più bassa che presenti citotossicità . Nei   casi in cui è necessario stabilire una relazione   dose/risposta , sono richieste almeno tre dosi   ( ad esempio per confermare una risposta positiva   debole ) . Le sostanze non tossiche vanno saggiate   alla dose praticabile più elevata sia per la   somministrazione singola che per la somministrazione   ripetuta .    Procedimento    Gli animali vengono in generale trattati con il   composto in esame un'unica volta . Per il gruppo   con la dose più elevata sono usati tre intervalli   di campionamento dopo il trattamento . L'intervallo   per il campionamento centrale è di 24 ore .   Poiché il composto in esame può influire sulla   cinetica del ciclo cellulare , si applicano un primo   intervallo per la campionatura ed uno successivo   adeguatamente spaziati in un lasso di tempo da   6 a 48 ore . Per i livelli di dosaggio supplementari   i campioni vanno presi all'intervallo specificamente   sensibile ovvero , quando questo non sia noto ,   24 ore dopo il trattamento .    Nel caso di un programma di trattamento ripetuto ,   può essere fatto uso di dosaggi ripetuti , e in   tal caso i campioni vanno presi da 6 a 24 ore dopo   l'ultimo trattamento . Un singolo tempo di   campionamento può essere usato se giustificato   scientificamente .    Preparazione del testicolo    Per l'analisi della mitosi degli spermatogoni si   inietta agli animali per via intraperitoneale una   dose adeguata di un inibitore del fuso come la   colchicina . Gli animali vengono poi sacrificati   ad un intervallo appropriato dopo il trattamento .   Per i topi detto intervallo varia da 3 a 5 ore ,   mentre per gli hamster cinesi possono essere   necessarie più di 5 ore .    È fatto uso della tecnica di essiccazione all'aria .   Per specie diverse possono rendersi necessarie   modifiche del procedimento standard . Si   ottengono sospensioni di cellule che vengono   trattate con soluzione ipotonica e fissate .   Le cellule vengono stese su vetrini e colorate . I vetrini   vengono codificati prima dell'analisi microscopica .    Analisi    Per la ricerca delle aberrazioni strutturali dei   cromosomi si analizzano almeno 100 metafasi mitotiche   largamente disperse con il numero completo di   centromeri . In aggiunta a ciò si può determinare   il rapporto fra le mitosi degli spermatogoni e la   prima e la seconda metafase meiotica in un   campione complessivo di 100 cellule in divisione per   animale per mettere in luce un eventuale effetto   citotossico .    2 . DATI    I dati vengono presentati in forma di tabelle .   Per ogni animale trattato e di controllo tutti i   tipi di aberrazioni vengono elencati separatamente .   È inclusa l'indicazione del numero totale di   cellule analizzate e del numero totale di   cellule aberranti per gruppo . Vengono date per   tutti i parametri le medie e la deviazione standard .   Si riporta infine in forma di tabelle il rapporto   medio fra la mitosi degli spermatogoni e la prima e la   seconda metafase meiotica per ciascun gruppo trattato   e ciascun gruppo di controllo . I dati vengono   valutati secondo metodi statistici appropriati .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare , se   possibile :     - specie e ceppo di animali maschi , età e peso   degli animali ,     - numero di animali per ciascun gruppo trattato   e ciascun gruppo di controllo ,     - condizione di effettuazione del saggio ,   descrizione particolareggiata del trattamento ,   livelli di dosaggio , solventi , inibitore del   fuso usato ,     - numero delle cellule analizzate per animale   in ciascun gruppo ,     - tipi e numero di aberrazioni separatamente   per ciascun animale trattato e ciascun animale   di controllo ,     - valutazione statistica ,     - discussione dei risultati ,     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    SAGGIO DELLE MACCHIE ( SPOT TEST ) : TOPI    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principi del metodo di saggio    Quello qui considerato è un saggio in vivo nei   topi , nel quale vengono esposti alle sostanze   chimiche degli embrioni in corso di sviluppo .   Le cellule-bersaglio negli embrioni in corso di   sviluppo sono i melanoblasti e i geni-bersaglio   sono quelli che governano la pigmentazione del   pelame dell'animale . Gli embrioni in corso di   sviluppo sono eterozigoti per una serie di detti   geni della colorazione del mantello . Una mutazione   nell'allele dominante di un gene di questo tipo in un   melanoblasto , o la sua perdita ( tramite diversi   eventi genetici ) ha come risultato l'espressione   del fenotipo recessivo nelle sue cellule discendenti ,   constituita da una macchia di colore cambiato nel   mantello del topo risultante . Si riporta quindi il   numero della prole con dette macchie o mutazioni ,   e se ne raffronta la frequenza con quella riscontrata   nella prole risultante da embrioni trattati soltanto   con il solvente . Il saggio delle macchie ( Spot   test ) nei topi rivela presunte mutazioni somatiche   nelle cellule fetali .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni    Quando ciò è possibile , le sostanze in esame   vengono disciolte o poste in sospensione in soluzione   salina isotonica . Le sostanze non solubili in acqua   vengono disciolte o poste in sospensione in solventi   appropriati . Il solvente usato non deve interferire   con la sostanza in esame né produrre effetti   tossici . È opportuno usare preparazioni fresche   della sostanza in esame .    Animali da esperimento    Si accoppiano topi del ceppo T ( nonagouti , a/a ;   chinchilla , pink eye , c ch p/c ch p ; brown ,   b/b ; dilute , short ear , d se/d se ; piebald   spotting , s/s ) con il ceppo HT ( pallid ,   nonagouti , brachypody , pa a bp/pa a bp ; leaden   fuzzy , ln fz/ln fz ; pearl pe/pe ) o con C57 BL   ( nonagouti , a/a ) . Possono essere usati anche   altri incroci appropriati , ad esempio fra NMRI   ( nonagouti , a/a ; albino , c/c ) e DBA   ( nonagouti , a/a ; brown , b/b ; dilute d/d ) ,   a condizione che producano prole nonagouti .    Numero e sesso    Viene trattato un numero di femmine gravide   sufficiente per ottenere un numero appropriato di prole   sopravvivente per ciascun livello di dosaggio   usato . Le dimensioni appropriate del campione sono   determinate dal numero delle macchie osservate nei   topi trattati e dalla scala dei dati di controllo .   Un risultato negativo è accettabile soltanto   quando si siano riscontrati almeno 300 figli di   femmine trattate con la dose più alta .    Controlli positivi e negativi    È opportuno che siano disponibili dati di   controllo simultanei ottenuti su topi trattati   soltanto con il solvente ( controlli negativi ) .   Eventuali dati storici di controllo del   medesimo laboratorio possono essere messi insieme con i   dati di controllo nuovi in modo da accrescere la   sensibilità del saggio , a condizione che essi   siano omogenei . Se non si rileva alcuna   mutagenicità per la sostanza in esame , dovrebbero   essere disponibili dati di controllo positivo   ottenuti di recente nel medesimo laboratorio in   seguito a trattamento con una sostanza della quale   sono noti gli effetti di mutagenicità con questo   saggio .    Vie di somministrazione    Le vie abituali di somministrazione sono   l'intubazione orale e l'iniezione intraperitoneale   delle femmine gravide . Nei casi in cui ciò possa   essere appropriato , si fa uso anche del   trattamento per inalazione o di altre vie di   comministrazione .    Livelli di dose    Si fa uso di almeno due livelli di dose , con uno   dei livelli che dà luogo a segni di tossicità o   ad una riduzione delle proporzioni della figliata .   Per le sostanze non tossiche è opportuno ricorrere   all'esposizione alla dose massima praticabile .    Procedimento    Viene di norma praticato un unico trattamento nel   giorno 8 , 9 o 10 di gravidanza , contando come   giorno 1 quello in cui si è osservato per la   prima volta il tappo vaginale . Detti giorni   corrispondono a 7,25 , 8,25 e 9,25 giorni dopo   il concepimento . Possono essere praticati   trattamenti successivi nel corso di detti giorni .    Analisi    La prole viene codificata e nel periodo fra tre o   quattro settimane dopo la nascita si effettua su di   essa l'analisi delle macchie pigmentale . Si   distinguono tre categorie di macchie :    a ) macchie bianche a distanza fino a 5 mm dalla   linea ventrale mediana , che si presume derivino   dall'uccisione di cellule ( WMVS ) ,    b ) macchie gialle di tipo aguti , associate con   le mammelle , gli organi genitali , le zone della   gola , delle ascelle e dell'inguine e la parte   mediana della fronte , che si presume derivino da   difettoso differenziamento ( MDS ) ,    c ) macchie pigmentate e bianche distribuite in   disordine sul manto , che si presume derivino da   mutazioni somatiche ( RS ) .    Devono essere osservate tutte e tre le categorie ,   ma ha rilevanza genetica soltanto l'ultima , RS .   Eventuali problemi per quel che riguarda la   distinzione fra MDS e RS possono essere risolti   mediante microscopia fluorescente di peli presi   come campione .    Va presa nota di evidenti anomalie morfologiche   grossolane della prole .    2 . DATI    I dati vengono presentati sotto forma del numero   totale dei discendenti esaminati e del numero dei   discendenti che hanno una o più macchie da   mutazione somatica presunta . I dati relativi ai   trattamenti ed al controllo negativo vengono   posti a raffronto secondo metodi statistici   appropriati . I dati sono anche presentati su base per   prole .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare ,   se possibile :     - ceppi usati nell'incrocio ,     - numero di femmine gravide nei gruppi trattati   e nei gruppi di controllo ,     - dimensioni medie delle figliate nei gruppi   trattati ed in quelli di controllo alla nascita   ed allo svezzamento ,     - livelli di dose della sostanza in esame ,     - solvente usato ,     - giorno di gravidanza al quale è stato praticato   il trattamento ,     - vie di somministrazione del trattamento ,     - numero complessivo dei discendenti esaminati ,   e numero dei discendenti con WMVS , MDS e RS nei   gruppi trattati e in quelli di controllo ,     - anomalie morfologiche groscolane ,     - relazione dose/risposte di RS quando ciò sia   possibile ,     - valutazione statistica ,     - discussione dei risultati ,     - interpretazione dei risultati ,    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    TRASLOCAZIONI EREDITABILI : TOPO    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Vedi introduzione generale , parte B .    1.2 . Definizioni    Vedi introduzione generale , parte B .    1.3 . Sostanze di riferimento    Nessuna .    1.4 . Principi del metodo di saggio    Il saggio delle traslocazioni ereditabili nel topo   rivela cambiamenti strutturali e numerici dei   cromosomi nelle cellule germinali di mammiferi quali   sono recuperate nella progenie della prima generazione .   I tipi di mutazioni cromosomiche sono delle   traslocazioni reciproche e , se è compresa progenie   femminile , la perdita del cromosoma X . I   portatori di traslocazione e le femmine XO presentano   fertilità ridotta e di ciò è fatto uso per la   selezione di progenie F1 per l'analisi citogenetica .   Taluni tipi di traslocazioni ( autosoma-X e   tipo c-t ) provocano sterilità completa . Le   traslocazioni sono citogeneticamente osservabili   in cellule meiotiche alla diacinesi della   metafase I di individui di sesso maschile , che   sono o maschi F1 o figli di femmine F1 . Le femmine   XO sono identificate citogeneticamente dalla   presenza di 39 cromosomi soltanto nelle mitosi   del midollo osseo .    1.5 . Criteri qualitativi    Nessuno .    1.6 . Descrizione del metodo di saggio    Preparazioni    Le sostanze chimiche in esame vengono disciolte   in soluzione salina isotonica . Se insolubili esse   vengono disciolte o poste in sospensione in solventi   appropriati . È fatto uso di soluzioni della   sostanza in esame preparate di fresco .    Se si fa uso di un solvente per facilitare   il dosaggio , esso non deve interferire con il   composto in esame né dar luogo ad effetti tossici .    Vie di somministrazione    Le vie di somministrazione sono solitamente   l'intubazione orale o l'iniezione intraperitoneale .   Possono essere appropriate altre vie di somministrazione .    Animali da esperimento    Per la facilità della riproduzione e della   verifica citologica , gli esperimenti in questione   vengono effettuati sui topi . Non è necessario   alcun ceppo di topi specifico . Tuttavia ,   nell'effettuazione di prove riguardanti la fertilità   è opportuno che le dimensioni medie della   figliata del ceppo usato siano di più di 8 neonati   e siano inoltre relativamente costanti . Sono usati   animali sani sessualmente maturi .    Numero di animali    Il numero degli animali occorrenti dipende dalla   frequenza delle traslocazioni spontanee , e dal tasso   minimo di induzione necessario per un risultato   positivo . Il saggio si effetua normalmente mediante   analisi della progenie maschile F1 . É opportuno   esaminare almeno 500 capi di progenie maschile F1   per ciascun gruppo/dose . Se si include progenie   femminile F1 , occorrono 300 maschi e 300 femmine .    Uso di controlli negativi e positivi    Dovrebbero essere disponibili dati adeguati   di controllo , derivati da controlli simultanei o   storici . Qualora siano disponibili dati   accettabili di controllo positivo da esperimenti   condotti di recente nello stesso laboratorio , questi   risultati possono essere usati in luogo del   controllo positivo simultaneo .    Livelli di dose    Si sperimenta un solo livello di dose , ossia   solitamente la dose più alta associata con la   produzione dei minimi effetti tossici , ma senza   che sia influenzato il comportamento riproduttivo   o la sopravvivenza . Per stabilire una relazione   dose/risposta sono necessarie due dosi supplementari   più basse . Per le sostanze non tossiche è   opportuno adottare un'esposizione alla dose   massima praticabile .    Procedimento    Trattamento e accoppiamento    Sono possibili due schemi di trattamento . Nello   schema più largamente usato è praticata   un'unica somministrazione della sostanza in esame .   Si può tuttavia procedere anche all'applicazione   della sostanza in esame 7 giorni per settimana per   35 giorni . Il numero degli accoppiamenti successivi   al trattamento è determinato dal programma di   trattamento adottato , e deve essere stabilito   in modo che siano considerati tutti gli stadi delle   cellule germinali trattate . Al termine del periodo di   accoppiamento , le femmine vengono tenute in   gabbie individuali . Quando le femmine partoriscono ,   si prende nota della data , del numero e del sesso   della progenie . Tutta la progenie maschile   viene svezzata , mentre tutta la progenie femminile   viene scartata , salvo nel caso che la si includa   nell'esperimento .    Controllo della eterozigosi di traslocazione    É praticatol'uno o l'altro di due metodi   possibili :     - analisi della fertilità della progenie F1   e successiva verifica degli eventuali portatori   di traslocazione mediante analisi citogenetica ;     - analisi citogenetica di tutta la progenie maschile   F1 senza selezione preliminare mediante analisi   della fertilità .    a ) Analisi della fertilità    La diminuzione della fertilità di un individuo   F1 può essere stabilita attraverso l'osservazione   delle dimensioni della figliata e/o dell'analisi   del contenuto uterino delle femmine accoppiate .    Devono essere stabiliti dei criteri specifici   per la determinazine della fertilità normale e   della fertilità diminuita nel ceppo di topi usato .    Osservazione dell'entità delle figliate : i   maschi F1 da sottoporre al saggio vengono posti   in gabbia individualmente con femmine del   medesimo esperimento o della colonia . Le gabbie   vengono ispezionate giornalmente a partire da   18 giorni dopo l'accoppiamento . Viene presa   nota alla nascita dell'entità della figliata e   del sesso dalla progenie F2 e le figliate vengono   successivamente scartate . Se si sottopone al saggio   la progenie femminile F1 , si tiene la progenie   F2 di piccole figliate per un'ulteriore sperimentazione .   Le portatrici femmine di traslocazioni sono   verificate mediante analisi citogenetica di una   traslocazione in uno qualsiasi dei loro discendenti   maschi . Le femmine XO si riconoscono dal   cambiamento del rapporto fra i sessi nella loro   progeni ( maschi/femmine da 1:1 a 1:2 ) . In un   procedimento in serie si escludono gli animali F1   normali da sperimentazioni ulteriori se la prima   figliata F2 raggiunge o supera un valore normale   predeterminato , altrimenti si osserva una seconda   o una terza figliata F2 . Gli animali F1 che non   possono essere classificati come normali dopo   l'osservazione di un numero di figliate F2 fino a   tre vengono saggiati ulteriormente mediante l'analisi   del contenuto uterino delle femmine con essi accoppiate ,   oppure sono direttamente sottoposti all'analisi   citogenetica .    Analisi del contenuto uterino : la diminuzione   dell'entità delle figliate nei portatori di   traslocazioni è dovuta a morte dell'embrione , e   di conseguenza un numero elevato di impianti   morti è indicativo della presenza di una   traslocazione nell'animale all'esame . I maschi F1   da sottoporre al saggio vengono accoppiati con due ,   tre femmine ciascuno . Il concepimento viene determinato   mediante ispezione giornaliera per l'osservazione   di tappi vaginali fra le 8 e le 10 animeridiane .   Le femmine vengono uccise da 14 a 16 giorni dopo   e viene presa nota degli impianti sia vivi che   morti nei loro uteri .    b ) Analisi citogenetica    Si allestiscono preparati di testicoli con la   tecnica dell'essiccazione in aria . I portatori   di traslocazioni sono identificati in base alla   presenza di configurazioni multivalenti alla diacinesi   di metafasi I degli spermatociti primari .   L'osservazione di almeno due cellule con associazione   multivalente costituisce la prova occorrente che   l'animale sottoposto al saggio è un portatore di   traslocazione .    Se non si è proceduto ad alcuna selezione   nell'allevamento , sono esaminati citogeneticamente   tutti i maschi F1 . Deve essere riscontrato al   microscopio un minimo di 25 diacinesi metafasi   I per maschio . Per i maschi F1 con testicoli   piccoli e con degradazione meiotica prima della   diacinesi e per le femmine F1 sospette di   XO è necessario l'esame delle metafasi mitotiche ,   degli spermatogoni o del midollo osseo . La   presenza di un cromosoma insolitamente lungo e/o   corto in ognuna di 10 cellule è il segno di   una traslocazione particolare sterile del maschio   ( tipo c-t ) . Talune traslocazioni di autosoma X   che provocano la sterilità del maschio possono   essere identificate soltanto raggruppando l'analisi   dei cromosomi mitotici . La presenza di 39 cromosomi   nella totalità di 10 mitosi è il segno di   una condizione di XO in una femmina .    2 . DATI   I dati sono presentati in forma di tabelle .   Sono riportati l'entità media delle figliate   e il rapporto fra i sessi dagli accoppiamenti dei   genitori alla nascita e allo svezzamento per   ciascun intervallo di accoppiamento .    Per la valutazione della fertilità degli   animali F1 sono presentate le entità medie delle   figliate di tutti gli accoppiamenti normali e le   entità delle figliate singole dei portatori   di traslocazioni F1 . Per l'analisi del contenuto   uterino è dato ragguagho del numero medio   degli impianti vivi e morti degli accopiamenti   normali e del numero individuale degli impianti   vivi e morti per ciascun accoppiamento di   portatori di traslocazione F1 .    Per l'analisi citogenetica della diacinesi   metafase I sono elencati per ciascun portatore   di traslocazione il numero di tipi di configurazioni   multivalenti ed il numero totale delle cellule .    Per gli individui F1 sterili sono riportati   il numero totale degli accoppiamenti e la durata   del periodo di accoppiamento . Sono forniti   i pesi dei testicoli e dettagli delle analisi   citogenetiche .    Per le femmine XO sono riportati l'entità   media delle figliate , il rapporto fra i sessi   della progenie F2 e i risultati dell'analisi   citogenetica .    Se possibile i portatori di traslocazioni   vengono preselezionati per mezzo di analisi della   fertilità ; le tabelle devono in tal caso recare   l'indicazione del numero di soggetti così   selezionati che sono risultati eterozigoti   di traslocazione confermati .    Sono parimenti riportati i dati dei controlli   negativi e degli esperimenti di controllo positivo .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare , se   possibile :     - ceppo dei topi , età degli animali , pesi   degli animali trattati ,     - numero di animali genitori dell'uno   e dell'altro sesso nei gruppi sottoposti al saggio   e nei gruppi di controllo ,     - condizioni di effettuazione del saggio ,   descrizione particolareggiata del trattamento , livelli   di dosaggio , solventi , programmi di accoppiamento ,     - numero e sesso dei piccoli nati per femmina ,   numero e sesso dei piccoli allevati per l'analisi   della traslocazione ,     - tempo e criteri dell'analisi della traslocazione ,     - numero e descrizione particolareggiata dei   portatori di traslocazioni ivi compresi i dati   riguardanti la procreazione e i dati sul contenuto   uterino , se del caso ,     - procedimenti citogenetici e dettagli delle   analisi microscopiche , di preferenza con   illustrazioni ,     - valutazione statistica ,     - discussione dei risultati ,     - interpretazione dei risultati .    3.2 . Valutazione ed interpretazione    Vedi introduzione generale , parte B .    4 . RIFERIMENTI    Vedi introduzione generale , parte B .    PARTE C : METODI PER LA DETERMINAZIONE DELLA   ECOTOSSICITÀ    INTRODUZIONE GENERALE : PARTE C    I metodi di prova di seguito descritti servono alla   determinazione di alcune proprietà ecotossicologiche   enumerate nell'allegato VIII della direttiva   79/831/CEE . Il notificatore deve tener presente   che i metodi per la determinazione delle seguenti   proprietà previste al livello 1 dell'allegato   VIII non sono inclusi nel testo :     - studio di tossicità prolungata sulla Daphnia   magna ,     - prova su una pianta superiore ,     - studio di tossicità prolungata su un pesce ,     - prova di accumulazione in una specie .    Quando opportuni metodi di prova per la determinazione   di queste proprietà saranno ultimati , saranno   pubblicati sotto forma di un ulteriore adeguamento   al progresso tecnico . Nel frattempo il   notificatore deve applicare metodi opportuni ,   internazionalmente riconosciuti , che devono essere   specificati all'autorità competente .    SAGGIO DI IN BIZIGNE DELLA CRESCITA ALGALE    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Il presente saggio ha lo scopo di determinare   gli effetti di una sostanza sulla crescita di   una specie di alghe verdi unicellulari .    Saggi relativamente brevi consentono di valutare   gli effetti su diverse generazioni . Questo metodo   può essere adatto per varie specie di alghe   unicellulari , nel qual caso il metodo seguito   deve essere descritto nella relazione .    Il presente metodo si applica soprattutto a   sostanze idrosolubili che , nelle condizioni   sperimentali del saggio , hanno tendenza a restare   nella fase acquosa .    Per sostanze con limitata solubilità nel   mezzo utilizzato per il saggio , non è a volte   possibile determinare quantitativamente la EC50   ( vedi , più avanti , le definizioni ) .    Il metodo può essere usato per quelle sostanze   che non interferiscono direttamente con la   misurazione della crescita delle alghe .    Per l'esecuzione del saggio potrebbero essere   utili le seguenti informazioni :     - idrosolubilità ,     - tensione di vapore ,     - formula di struttura ,     - grado di purezza della sostanza ,     - stabilità chimica in acqua ed alla luce ,     - metodi di analisi per la determinazione   quantitativa della sostanza in acqua ,     - valore del pK a ,     - coefficiente di ripartizione n-ottanolo/acqua ,     - risultati di un saggio di rapida biodegradabilità .    1.2 . Definizioni e unità    Concentrazione cellulare : il numero di cellule per ml .    Crescita : l'incremento della concentrazione   cellulare nel periodo del saggio .    Velocità di crescita : l'incremento della   concentrazione cellulare per unità di tempo .    EC50 : in questo metodo , la concentrazione   di sostanza in esame che produce un abbassamento   del 50 % della crescita o della velocità di   crescita rispetto al controllo .    NOEC ( concentrazione priva di effetti osservati ) :   in questo metodo , la più elevata concentrazione   saggiata alla quale il parametro(i)   misurato(i) non mostra(no) , alcuna inibizione   significativa della crescita , rispetto ai valori del   controllo .    1.3 . Sostanze di riferimento    Per evidenziare eventuali condizioni di saggio   non soddisfacenti si può saggiare , come mezzo ,   una sostanza di riferimento . In tal caso i risultati   andrebbero riportati nella relazione . Come   sostanza di riferimento si può usare il   dicromato di potassio .    1.4 . Principio del metodo    Colture di selezionate alghe verdi , nella fase   di crescita esponenziale , vengono esposte a   diverse concentrazioni della sostanza in esame   per un periodo di tempo corrispondente a varie   generazioni ed in condizioni ben definite . Si   determina quindi l'inibizione della crescita   rispetto ad una coltura di controllo durante un   periodo stabilito .    1.5 . Criteri di qualità    1.5.1 . Condizioni per la validità del saggio    La concentrazione cellulare nelle colture di   controllo dovrebbe subire , entro tre giorni ,   un incremento di un fattore non inferiore a 16 .    La scomparsa della sostanza in esame dall'acqua ,   per trasferimento nella biomassa , non invalida   necessariamente il saggio .    1.6 . Procedimento    1.6.1 . Preparazioni    1.6.1.1 . Attrezzatura e materiali     - Normale attezzatura da laboratorio .     - Beute da saggio di determinato volume   ( per esempio , se il volume della soluzione in   esame è di 100 ml , sono adatte beute da 250 ml ) .     - Attrezzatura per colture : armadio o camera   in cui sia possibile mantenere una temperatura   compresa fra 21 e 25 ° C , costante entro ± 2 ° C   e che sia illuminata in modo uniforme e continuo   nella regione spettrale compresa fra 400 e 700 nm .   ( si raccomanda un flusso quantico compreso   entro ± 20 % di 0,72 × 10 20 fotoni/m² s .   Questo flusso quantico è pari a 120 µE/m²s e   può essere ottenuto con comuni lampade   fluorescenti del tipo bianco ( luce-temperatura   di circa 4 200 K ) che producono circa 8 000 lux   misurati con un collettore sferico ) .     - Apparecchiatura per determinare le concentrazioni   cellulari ( per esempio , contatore elettronico   di particelle , microscopio con camera di conteggio ,   fluorimetro , spettofotometro , colorimetro ) .    Nota : Quando si usa uno spettrofotometro ,   per effetuare misure attendibili a basse   concentrazioni cellulari , può essere   necessario impiegare cuvette con cammino ottico di   almeno 4 cm .    1.6.1.2 . Soluzione di coltura per le alghe    Si raccomandano le seguenti soluzioni :    NH4Cl : 15 mg/l    MgCl2.6H2O : 12 mg/l    CaCl2.2H2O : 18 mg/l    MgSO4.7H2O : 15 mg/l    KH2PO4 : 1,6 mg/l    FeCl3.6H2O : 0,08 mg/l    Na2EDTA.2H2O : 0,1 mg/l    H3BO3 : 0,185 mg/l    MnCl2.4H2O : 0,415 mg/l    ZnCl2 : 3 × 10 -3 mg/l    CoCl2.6H2O : 1,5 × 10 -3 mg/l    CuCl2.2H2O : 10 -5 mg/l    Na2MoO4.2H2O : 7 × 10 -3 mg/l    NaHCO3 : 50 mg/l    Raggiunto l'equilibrio con l'aria , tale soluzione   ha un pH di circa 8 .    La raccomandazione precedente non escluse   l'impiego di altre soluzione a condizione , comunique ,   che siano rispettati i seguenti limiti per   i componenti essenziali :    P : * 0,7 mg/l    N : * 10 mg/l    sostanze chelanti : * 10 -3 mmol/l    durezza ( Ca + Mg ) : * 0,6 mmol/l    Le soluzion raccomandate e quelle riportate   in bibliografia , punto 1 ) , rispondono a questi   requisiti .    1.6.1.3 . Organismi per l'esperimento    Selezione delle specie    Si consiglia di usare una specie di alghe verdi   a rapido accrescimento adatta alla coltura e ai   saggi . Si ritengono idonee le seguenti specie :     - Selenastrum capricornutum ATCC 22662 ;     - Scenedesmus subspicatus 86.81 SAG ;     - Chlorella vulgaris CCAP 211/11b .    Se si usano altre specie , se ne dovrebbe riportare   il ceppo di appartenenza .    1.6.1.4 . Programmazione del saggio    Concentrazione cellulare iniziale    Si raccomanda che la concentrazione cellulare   iniziale nelle colture per il saggio sia di   circa 10 4 cellule/ml per Selenastrum capricornutum   e Scenedesmus subspicatus . Se si impiegano   altre specie , la biomassa dovrebbe essere simile .    Concentrazioni della sostanza in esame    L'intervallo di concentrazioni in cui   possono verificarsi effetti tossici , viene   determinato in base ai risultati dei saggi orientativi .   Per il saggio si dovrebbero scegliere almeno   cinque concentrazioni distribuite con   progressione geometrica . La concentrazione   più bassa saggiata non dovrebbe provocare   effetti sull'accrescimento delle alghe . La più   alta concentrazione saggiata dovrebbe inibire   l'accrescimento di almeno il 50 % rispetto al   controllo e , di preferenza , arrestarlo   completamente .    Repliche e controlli    La programmazione del saggio dovrebbe prevedere   preferibilmente tre prove per ciascuna concentrazione   in esame e , idealmente , un numero doppio di   controlli . Se la programmazione del saggio è   giustificata la si può modificare aumentando   il numero di concentrazioni e riducendo il numero   di repliche per concentrazione .    Se si usa un solvente per sciogliere la sostanza   in esame , la programmazione del saggio dovrebbe   includere dei controlli supplementari contenenti   il solvente alle più alte concentrazioni fra   quelle impiegate nelle colture saggiate .    1.6.2 . Esecuzione del saggio    Questo paragrafo contiene le istruzioni per   l'esecuzione del saggio di sostanze facilmente   solubili , scarsamente solubili nonché   di sostanze volatili .    1.6.2.1 . Saggio per sostanze facilmente   solubili in acqua    Le colture per il saggio , contenenti le   concentrazioni stabilite della sostanza da esaminare   e le quantità fissate dell'inoculo di alghe , si   preparano per diluizione di aliquote delle soluzioni   madri della sostanza in esame e della sospensione   di alghe ; per le diluizioni si utilizza il filtrato   della soluzione di coltura delle alghe ( 1.6.1.2 ) .    Si agitano le beute di coltura e si collocano   nell'apparecchiatura di coltura . Durante il saggio   è necessario mantenere le alghe in   sospensione e facilitare l'eliminazione di CO2 .   A tal fine si può usare un sistema a scuotimento ,   agitazione o areazione . Le colture dovrebbero   essere mantenute ad una temperatura compresa fra   21 e 25 ° C , controllata nell'intervallo   di ± 2 ° C .    La concentrazione cellulare in ciascuna beuta va   determinata almeno dopo 24 , 48 e 72 ore dall'inizio   del saggio . Per la determinazione del fondo quando   si usano contatori di particelle , e per il bianco ,   quando si impiegano spettrofotometri , si utilizza   il filtrato della soluzione di coltura delle   alghe ( 1.6.1.2 ) .    La misurazione del pH si effettua all'inizio   del saggio e dopo 72 ore . Normalmente , durante   il saggio , il pH delle soluzioni non dovrebbe   variare più di una unità di pH .    1.6.2.2 . Saggio di sostanze con scarsa   solubilità in acqua    Quando la solubilità della sostanza da esaminare   è dell'ordine di grandezza della più elevata   concentrazione impiegata nel saggio , per preparare   le soluzioni da esaminare sono necessarie soltanto   piccole modifiche al procedimento precedente .   Come soluzione madre della sostanza in esame si   può usare una soluzione satura . Un altro   accorgimento consiste nello sciogliere nella soluzione   di coltura la sostanza in esame alla concentrazione   voluta , prima dell'introduzione della sospensione di   alghe .    Le soluzioni madri delle sostanze scarsamente   solubili in acqua possono essere preparate per   dispersione meccanica o con l'impiego di « veicoli »   scarsa tossicità per le alghe come : solventi organici ,   emulsionanti o disperdenti . Quando si impiega   un « veicolo » la sua concentrazione non   dovrebbe superare i 100 mg/l e , nella programmazione   del saggio , vanno previsti controlli supplementari   per quelle soluzioni per le quali il veicolo è   addizionato alla più alta concentrazione   presente nelle soluzioni da esaminare .    1.6.2.3 . Saggio per sostanze volatili    A tutt'oggi non esiste alcun metodo di   saggio , che sia generalmente accettato , per   saggiare sostanze volatili . Se è noto che una   sostanza ha tendenza ad evaporare , si possono   impiegare beute chiuse con accresciuto spazio di testa .    Sono state proposte delle varianti a questo   metodo [ vedi bibliografia , punto 1 ) ] . Si   dovrebbe cercare di determinare la quantità di   sostanza che resta in soluzione e porre la massima   cautela nell'interpretazione dei risultati dei   saggi effettuati con sostanze volatili in sistemi   chiusi .    2 . DATI E VALUTAZIONE    Le concentrazioni cellulari misurate nelle colture   per il saggio e nei controlli vengono raccolte in   una tabella assieme alle concentrazioni della   sostanza in esame ed ai tempi di misurazione .   Per tracciare le curve di crescita si riporta in   un grafico il valore medio della concentrazione   cellulare per ogni concentrazione della sostanza   esaminata e per i controlli in funzione del tempo .    Per determinare la relazione concentrazione/effetto   della sostanza in esame si dovrebbero usare i due   procedimenti che seguono .    2.1 . Confronto delle aree sotto le curve   di crescita    L'area al di sotto delle curve di crescita può   essere calcolata con la formula seguente :    A = ( N1 - N0 ) /2 × t1 + ( N1 + N2 - 2N0 ) /2 ×   ( t2 - t1 ) + ( N (n-1) + N n - 2 N0 ) /2 ×   ( t n - t (n-1) )    dove :    A = area    N0 = numero nominale di cellule/ml al tempo t0    N1 = numero misurato di cellule/ml al tempo t1 ,    N n = numero misurato di cellule/ml al tempo t n ,    t1 = tempo della prima determinazione dopo   l'inizio del saggio    t n = tempo dell'ennesima determinazione dopo   l'inizio del saggio    L'inibizione percentuale della crescita delle   cellule per ogni concentrazione della sostanza in   esame ( I A ) è calcolata come differenza fra   l'area sottostante la curva di crescita del   controllo ( A c ) e quella sottostante la curva   di crescita corrispondente a ciascuna concentrazione   della sostanza in esame ( A t ) :    I A = ( A c - A t ) /A c × 100    Si riportano i valori di I A su carta   semilogaritmica o su carta semilogaritmica   probit in frunzione delle concentrazioni   corrispondenti . Se i punti graficati , osservati   ad occhio nudo , sono allineati secondo una   retta , si traccia la retta oppure se si può   assumere una distribuzione log-normale dei valori   si traccia la retta di regressione lineare .    Un valore di EC50 si ricava dall'intersezione   della retta ( di regressione ) con la parallela   all'ascissa tracciata per I A = 50 % . Per indicare   senza ambiguità che tale valore è stato   determinato con questo metodo di calcolo si propone   l'uso del simbolo E b C50 . In relazione a questo   metodo che prescrive misurazioni 24 , 48 e 72 ore ,   il simbolo diventa E b C50 ( 0-72 h ) . Altri   valori di EC , ad esempio E b C10 , possono   anche essere ottenuti dal grafico I A « versus »   logaritmo della concentrazione .    2.2 . Confronto delle velocità di accrescimento    La velocità di crescita specifica media ( µ )   per colture ad accrescimento esponenziale può   essere calcolata come     µ = ( I n N n - I n N1 ) / ( t n - t1 )    In alternativa si può ricavare la velocità   di crescita specifica media dalla pendenza della   retta di regressione di un diagramma che riporta   In N in funzione del tempo .    Per ciascuna concentrazione della sostanza in   esame , si traccia il grafico della riduzione   percentuale della velocità di crescita specifica   media rispetto al valore del controllo , in funzione   del logaritmo della concentrazione . Da questo   grafico si può leggere la loro EC50 . Per   indicare espiicitamente la EC50 ricavata con   questo metodo , si propone l'uso del simbolo E r C50 .   Vanno indicati i tempi di misurazione , per   esempio se il valore si riferisce a tempi di   osservazione a 24 e 48 ore , il simbolo diventa   E r C50 ( 24 - 48 h ) .    Nota : La velocità di crescita specifica è una   grandezza logaritmica e , a piccole variazioni   di questa possono corrispondere elevate variazioni   della biomassa . I valori di E b C ed E r C non sono   perciò confrontabili numericamente .    3 . RELAZIONE    Nella relazione sul saggio devono figurare , se   possibile :     - Sostanza in esame : dati di identificazione   chimica .     - Organismi per il saggio : origine , coltura di   laboratorio , numero del ceppo , metodo di coltura .     - Condizioni del saggio :     - data di inizio e fina del saggio e sua durata ;     - temperatura ;     - composizione del mezzo ;     - apparecchiatura per la coltivazione ;     - pH delle soluzioni all'inizio ed alla fine della   prova ( se si è osservata una deviazione del pH   superiore all'unità se ne dovrebbe fornire una   spiegazione ) ;     - veicolo e metodo usati per solubilizzare la   sostanza in esame e concentrazione del veicolo   nelle soluzioni per la prova ;     - intensità e qualità della luce ;     - concentrazioni saggiate ( misurate o nominali ) .     - Risultati :     - concentrazione cellulare per ciacuna beuta   a ogni punto di misurazione e metodo di misura della   concentrazione cellulare ;     - valori medi delle concentrazioni cellulari ;     - curve di crescita ;     - rappresentazione grafica della relazione   concentrazione/effetto ;     - valori della EC e metodo di calcolo ;     - NOEC ;     - altri effetti osservati .    4 . BIBLIOGRAFIA     ( 1 ) OCSE , Parigi 1981 , Linea guida 201 ,   decisione C(81) 30 def. del Consiglio .     ( 2 ) Umweltbundesamt , Berlino 1984 ,   Verfahrensvorschlag « Hemmung der Zellvermehrung   bei der Gruenalge Scenedesmus subspicatus » ,   in : Rudolph/Boje : OEkotoxikologie , ecomed ,   Landsberg , 1986 .    Appendice    ESEMPIO DI PROCEDIMENTO PER LA COLTURA DELLE ALGHE    Osservazioni generali    Scopo della coltura effettuata con il seguente   procedimento è ottenere colture di alghe per   saggi di tossicità .    Si dovrebbero impiegare metodi idonei a garantire   che le colture di alghe non siano contaminate   da batteri ( ISO 4833 ) . È perferibile usare colture   axeniche ma è essenziale che esse siano   costituite da una sola specie di alghe .    Tutte le operazioni andrebbero effettuate in   condizioni sterili per evitare contaminazioni da batteri   o da altre alghe .    Attrezzatura e materiali    Vedere il paragrafo 1.6.1 : Preparazioni ed organismi   per il saggio .    Procedimenti per realizzare le colture di alghe    Preparazione delle soluzioni nutritive ( mezzi )    Tutti sali nutritivi del mezzo vengono   preparati sottoforma di soluzioni concentrate   madri e conservate al buio e al freddo . La loro   sterilizzazione è effettuata per filtrazione o in   autoclave .    Si prepara il mezzo addizionando l'esatta   quantità di soluzione madre ad acqua distillata   sterile , avendo cura di evitare le infezioni .   Per ottenete mezzi solidi si aggiunge lo 0,8 % di agar .    Coltura madre    Le colture madri sono piccole colture di alghe   regolarmente trasferite nel mezzo fresco per   essere utilizzate come materiale di partenza per il   saggio . Se le colture non sono impiegate con   regolarità , esse vengono seminate in provette   di agar a becco di clarino . Queste vengono   trasferite nel mezzo fresco almeno una volta ogni   due mesi .    Le colture madri vengono coltivate in beute   coniche contenenti il mezzo appropriato   ( volume di circa 100 ml ) . Quando le alghe sono   incubate a 20 ° C con illuminazione continua ,   è necessario un trasferimento settimanale .    Durante il trasferimento una quantità della   « vecchia » coltura viene trasferita con delle   pipette sterili in una beuta contenente mezzo   fresco , in modo che , per le specie a rapida   crescita , la concentrazione iniziale sia circa   100 volte inferiore a quella della vecchia coltura .    La velocità di crescita di una specie può   essere ricavato dalla curva di crescita . Se   questa è nota è possibile stimare la densità   alla quale si dovrebbe trasferire la coltura nel   nuovo mezzo . Ciò deve essere fatto prima che   la coltura raggiunga lo stadio di morte .    Coltura preliminare    La coltura preliminare serve a fornire una dose   di alghe per l'inoculazione di colture per   saggi . La coltura preliminare viene incubata nelle   condizioni sperimentali ed usata mentre sta ancora   crescendo esponenzialmente , di solito dopo un   periodo di incubazione di circa tre giorni . Le colture   di alghe che contengono cellule deformate o   anormali vanno scartate .    TOSSICITÀ PER I LOMBRICHI    SAGGIO SU TERRENO ARTIFICIALE    1 . METODO    1.1 . Introduzione    In questo saggio di laboratorio la sostanza   in esame viene aggiunta ad un terreno artificiale   dove si pongono i lombrichi per quattordici   giorni . Dopo tale periodo ( facoltativamente dopo   sette giorni ) si esamina l'effetto letale   della sostanza sui lombrichi . Il saggio fornisce un   metodo di valutazione , a termine relativamente breve ,   dell'effetto sui lombrichi di sostanze chimiche assunte   per via cutanea e alimentare .    1.2 . Definizioni e unità    LC50 : concentrazione di una sostanza capace di   uccidere il 50 % degli animali in esame entro il   periodo del saggio .    1.3 . Sostanza di riferimento    Una sostanza di riferimento viene usata   periodicamente per dimostrare che la sensibilità del   sistema ( di saggio ) non è cambiata in modo   significativo .    Come sostanza di riferimento si raccomanda   cloroacetammide di grado analitico .    1.4 . Principio del saggio   Il terreno è un elemento variabile ; si usa   pertanto , per questo saggio , un terreno fertile   artificiale definito accuratamente . Lombrichi   adulti della specie Eisenia foetida ( vedi nota   in appendice ) vengono tenuti in un   determinato terreno artificiale , trattato con   diverse concentrazioni della sostanza in   esame . Quattordici giorni ( facoltativamente   sette giorni ) dopo l'inizio della prova , si   sparge il contenuto dei recipienti su un   vassoio e per ciascuna concentrazione si   contano i lombrichi sopravvissuti .    1.5 . Criteri di qualità    Il saggio è programmato in modo da essere il   più possibile riproducibile per quanto   concerne il substrato e gli organismi in esame .   Alla fine del saggio , la mortalità fra gli animali   di controllo non deve superare il 10 % ,   altrimenti la prova non è valida .    1.6 . Descrizione del metodo    1.6.1 . Materiali    1.6.1.1 . Substrato per il saggio    Come substrato di base per il saggio si usa   un ben determinato terreno artificiale .    a ) Substrato di base ( percentuali espresse in peso   secco )     - 10 % di torba di stagno ( con pH più   vicino possibile a 5,5-6,0 , priva di residui   visibili di piante e finemente macinata ) :     - 20 % di argilla caolinica preferibilmente con   più del 50 % di caolinite ;     - circa 69 % di sabbia quarzosa industriale ( sabbia   a grana prevalentemente fine con oltre il 50 % dei   granuli di dimensioni comprese fra 0,05 e 0,2 mm ) .   Qualora la sostanza in esame non possa   essere sufficientemente dispersa in acqua , per   ogni recipiente ( di saggio ) andrebbero messi da   parte 10 g di tale sabbia da mescolare successivamente con   la sostanza stessa ;     - circa 1 % di carbonato di calcio ( CaCO3 ) in   polvere , chimicamente puro , aggiunto per   portare il pH a 6,0 ± 0,5 .    b ) Substrato per il saggio    Il substrato per il saggio contiene il   substrato di base , la sostanza in esame e acqua   deionizzata .    Il contenuto in acqua è circa dal 25 al   42 % del peso secco del substrato di base .    Il contenuto in acqua del substrato si determina   per essiccamento di un campione fino a peso   costante , a 105 ° C . Il criterio base è che   il terreno artificiale deve essere addizionato   con acqua fino al punto in cui non vi sia acqua   stagnante . Nel mescolare si dovrebbe fare attenzione   ad ottenere una distribuzione uniforme della   sostanza in esame e del substrato . Il procedimento   seguito per addizionare la sostanza in esame al   substrato deve essere riportato .    c ) Substrato di controllo    Il substrato di controllo contiene il   substrato di base e l'acqua . Se si usa un additivo ,   un ulteriore controllo dovrebbe contenere la stessa   quantità di additivo .    1.6.1.2 . Recipienti per il saggio    Recipienti di vetro della capacià di circa un litro   ( adeguatamente coperti con coperchi di plastica ,   piatti o con una pellico * plastica muniti   di fori di ventilazione ) vengono riempiti , sia per   il saggio che per il controllo , con una quantità   di substrato umido equivalente a 500 g di peso secco   di substrato .    1.6.2 . Condizioni della prova    I recipienti dovrebbero essere tenuti in camere   climatizzate a 20 ° C ( ± 2 ° C ) ed illuminate in   continuazione . L'intensità luminosa dovrebbere essere   compressa fra 400 e 800 lux .    La durata della prova è di quattordici giorni ,   ma è facoltativo fare una prima determinazione   della mortalità a sette giorni dall'inizio del   saggio .    1.6.3 . Procedimento del saggio    Concentrazioni del saggio    Le concentrazioni della sostanza in esame sono   espresse in peso della sostanza per peso secco del   substrato di base ( mg/kg ) .    Saggio orientativo    L'intervallo delle concentrazioni che   causano una mortalità variabile fra lo 0 ed il   100 % può essere determinato con un saggio orientativo   che fornisca informazioni sull'intervallo di   concentrazioni da impiegare nel saggio definitivo .    Si dovrebbe esaminare la sostanza alle seguenti   concentrazioni : 1 000 , 100 , 10 , 1 , 0,1 mg di   sostanza/kg di substrato in esame ( peso secco ) .    Se si deve effettuare un saggio definitivo   completo , per ogni prova orientativa e per il   controllo non trattato , potrebbe essere   sufficiente un gruppo di dieci lombrichi per ciascuna   concentrazione .    Saggio definitivo    I risultati del saggio orientativo vengono impiegati   per scegliere almeno 5 concentrazioni in serie   geometrica , che causino una mortalità variabile   fra lo 0 ed il 100 % e che differiscano fra loro   per un fattore costante non superiore a 1,8 .    Con questa serie di concentrazioni , il saggio   dovrebbe consentire una stima la più precisa   possibile del valore della LC50 e dei suoi limiti   di confidenza .    Nella prova definitiva si usano almeno quattro   gruppi di saggio per concentrazione e quattro per   controlli non trattati , ciascuno con dieci   lombrichi . I risultati ottenuti con questi gruppi   saggiati in replicato vengono espressi con il valore   medio e con la deviazione standard relativa .    Quando due concentrazioni consecutive , nel   rapporto 1,8 , danno una mortalità pari allo   0 ed al 100 % , questi due valori sono sufficienti   ad indicare l'intervallo entro il quale è compresa   la LC50 .    Miscela del substrato di base per il saggio e della   sostanza in esame    Se possibile , il substrato per il saggio dovrebbe   essere preparato senza alcun additivo che non sia acqua .   Subito prima dell'inizio del saggio , si mescola con   il substrato di base , oppure vi si sparge sopra   uniformemente , con uno spruzzatore da cromatografia   o dispositivo similare , un'emulsione o dispersione   in acqua deionizzata o in altro solvente della   sostanza da esaminare .    Se insolubile in acqua , la sostanza in esame   può essere disciolta nel minor volume possibile di   un idoneo solvente organico ( per esempio esano ,   acetone , cloroformio ) .    Per solubilizzare , disperdere o emulsionare la   sostanza in esame , si possono impiegare soltanto   agenti che volatilizzano rapidamente . Prima dell'uso   occorre ventilare il substrato per il saggio . Si   deve aggiungere una quantità di acqua pari a quella   evaporata . Il controllo dovrebbe contenere la   stessa quantità di tutti gli additivi .    Se la sostanza in esame non è solubile ,   disperdibile o emulsionabile in solventi organici ,   10 g di una miscela costituita da sabbia fine   quarzosa e dalla quantità di sostanza in esame   necessaria per trattare 500 g di peso secco di   terreno artificiale , vengono mescolate con   490 g di peso secco del substrato per il saggio .    Per ciascun gruppo di saggio , si riempie ogni   recipiente di vetro con una quantità di substrato   umido equivalente a 500 g di peso secco , e sulla   superficie del substrato si collocano 10 lombrichi   precedentemente condizionati per 24 ore in un simile   substrato umido e quindi lavati rapidamente ed   asciugati dell'acqua in eccesso per assorbimento   su carta da filtro .    I recipienti vengono coperti con coperchi , piatti   o pellicole di plastica perforati per impedire   l'essiccamento del substrato e sono mantenuti   nelle condizioni sperimentali per quattordici giorni .    Le valutazioni andrebbero effettuate quattordici   giorni ( facoltativamente sette giorni ) dopo l'inizio   del saggio . Si sparge il substrato su un piatto di vetro   o di acciaio inossidabile . Si esaminano i   lombrichi e si determina il numero di quelli   sopravvissuti . I lombrichi sono considerati morti   se non reagiscono ad un leggero stimolo meccanico   sull'estremità anteriore .    Se l'esame è effettuato dopo sette giorni , il   recipiente è riempito di nuovo con lo stesso   substrato ed i lombrichi sopravvissuti vengono collocati   sulla sua superficie .    1.6.4 . Organismi per il saggio    Gli organismi per il saggio dovrebbero   essere individui adulti di Eisenia foetida ( vedi   la nota dell'allegato ) ( di almeno due mesi con   clitella ) del peso umido di 300-600 mg . ( Per il   metodo di allevamento vedi allegato ) .    2 . DATI    2.1 . Trattamento e valutazione dei risultati    Si riportano le concentrazioni della sostanza   esaminata con le rispettive percentuali di lombrichi   morti .    Quando i dati sono affidabili si dovrebbero   determinare il valore della LC50 e i limiti di   confidenza ( P = 0,05 ) utilizzando metodi standard   ( Litchfield e Wilcoxon , 1949 o un metodo   equivalente ) . Il valore della LC50 dovrebbe essere   espresso in mg di sostanza in esame per kg di   substrato per il saggio ( peso secco ) .    Nei casi in cui la pendenza della curva di   concentrazione sia troppo elevata per consentire il   calcolo della LC50 , è suficiente una stima   grafica di tale valore .   PER LA CONTINUAZIONE DEL TESTO VEDI SOTTO NUMERO : 390L0676.5Quando due concentrazioni consecutive , nel   rapporto di 1,8 , danno mortalità pari allo 0 % ed al   100 % , questi due valori sono sufficienti per indicare   l'intervallo entro il quale è situata la LC50 .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare ,   se possibile :     - la dichierazione che la prova è stata eseguita   conformemente ai criteri di qualità sopra riportati ,     - il saggio effettuato ( saggio orientativo e/o   saggio definitivo ) ,     - l'esatta descrizione delle condizioni in cui è   stato effettuato il saggio o la dichiarazione che il   saggio è stato condotto conformemente al metodo ,   qualsiasi modifica del procedimento deve essere   riportata ,     - l'esatta descrizione del procedimento   seguito per mescolare la sostanza in esame con il   substrato di base ,     - informazioni sugli organismi impiegati per il   saggio ( specie , età , media ed intervallo di   variazione del peso , condizioni di mantenimento   e di allevamento fornitore ) ,     - il metodo seguito per la determinazione della LC50 ,     - i risultati del saggio comprensivi di tutti   i dati utilizzati ,     - la descrizione dei sintomi e dei cambiamenti   osservati nel comportamento degli organismi per il   saggio ,     - la mortalità nei controlli ,     - la LC50 oppure la più elevata concentrazione saggiata   che non provoca mortalità e la più bassa   concentrazione saggiata che provoca il 100 % di   mortalità , a quattordici giorni ( facoltativamente   a sette giorni ) dopo l'inizio della prova ,     - il grafico della curva concentrazione/risposta ,     - i risultati ottenuti con la sostanza di   riferimento , specificando se siano stati ottenuti in   associazione con il saggio in questione o da precedenti   saggi di controllo di qualità .    4 . BIBLIOGRAFIA     ( 1 ) OCSE , Parigi 1981 , Linea Guida 207 ,   decisione C(81) 30 def. del Consiglio .     ( 2 ) Edwards , C. A. e Lofty , 1977 , Biology   of Earthworms , Londra : Chapman and Hall , 331 pagine .     ( 3 ) Bouche , M. B. , 1972 , Lombriciens de   France , Écologie et Systématique , Institut   National de la Recherche Agronomique , 671 pagine .     ( 4 ) Litchfield , J. T. e Wilcoxon , F. , A simplified   method of evaluating dose-effect experiments.   J. Pharm. Exp. Therap. , vol. 96 , pagine 99 .     ( 5 ) Commissione delle Comunità europee   1983 , Development of a standardized laboratory   method for assessing the toxicity of chemical substances   to earthworms . Report EUR 8714 EN .     ( 6 ) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt   fuer Land- und Forstwirtschaft , Berlino 1984 ,   Verfahrensvorschlag « Toxizitaetstest am   Regenwurm Eisenia foetida in kuenstlichem Boden » ,   in : Rudolph/Boje : OEkotoxikologie , ecomed ,   Landsberg , 1986 .    Appendice    Allevamento e mantenimento dei lombrichi prima   del saggio    Per l'allevamento si pongono gli animali , da   30 a 50 lombrichi adulti , in una scatola di   allevamento con substrato fresco e si rimuovono   dopo 14 giorni . Questi animali possono essere   utilizzati per ulteriori gruppi di allevamento . I   lombrichi nati dalle zooteche vengono impiegati per i   saggi quando sono maturi ( nelle condizioni prescitte ,   dopo 2-3 mesi ) .    Condizioni di allevamento e mantenimento    Camera climatizzata : temperatura di 20 ° C   ( ± 2 ° C ) , di preferenza iluminata ininterrottamente   ( intensitè da 400 a 800 lux ) .    Scatole di allevamento : idonei contenitori poco   profondi del volume da 10 a 20 litri .    Substrato :    Eisenia foetida può essere allevata in diversi   escrementi animali . Come terreno per l'allevamento si   raccormanda l'uso di una miscela costituita   dal 50 % in volume di torba e dal 50 % di sterco   di mucca o di cavallo . Il terreno dovrebbe   avere un pH di circa 6-7 ( corretto con carbonato   di calcio ) ed una bassa conduttività ionica   ( meno di 6 mmhos o 0,5 % di concentrazione salina ) .    Il substrato dovrebbe essere umido ma non troppo   bagnato .    Oltre al metodo sopra esposto si possono impiegare   con buoni risultati anche altri procedimenti .    Nota : Esistono due varietà di Eisenia foetida   che alcuni tassonomi hanno separato in specie   ( Bouché , 1972 ) . Queste sono morfologicamente   simili ma una , la Eisenia foetida foetida , ha delle   tipiche strisce o fasce trasversali sui segmenti   mentre l'altra , la Eisenia foetida andrei , ne   è priva ed ha un colore rossiccio screziato . Ove   possibile si dovrebbe usare la Eisenia foetida   andrei . Se è disponibile la metodologia necessaria ,   si possono usare altre specie .    BIODEGRADAZIONE    ZAHN-WELLENS TEST    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Il metodo è destinato a valutare la potenziale   biodegradabilità ultima (1) delle sostanze organiche   idrosolubili e non volatili esposte a concentrazioni   relativamente elevate di microorganismi nel corso di   un saggio statico .    Può verificarsi un assorbimento chimico-fisico della   sostanza in esame sui solidi sospesi ; di ciò si dovrà   tener conto nell'interpretare i risultati ( vedi   punto 3.2 ) .    Le sostanze da studiare vengono impiegate a concentrazioni   corrispondenti a valori del DOC compresi fra 50 e 400 mg/l   o a valori del COD compresi fra 100 e 1 000 mg/l   ( DOC = carbonio organico disciolto ; COD =   domanda chimica di ossigeno ) . Dette concentrazioni ,   relativamente elevate , hanno il vantaggio   dell'attendibilità analitica . I composti dotati di   proprietà tossiche possono ritardare o inibire il   processo di degradazione .    In questo metodo , la misura della concentrazione   del carbonio organico disciolto o la richiesta   chimica di ossigeno vengono impiegate per valutare la   biodegradazione ultima della sostanza in esame .    L'impiego simultaneo di un metodo di analisi specifico   può permettere di valutare la biodegradazione   primaria della sostanza ( modifica della struttura   chimica della sostanza in esame ) .    Il metodo può essere applicato soltanto all'esame   di quelle sostanze organiche le quali , alle concentrazioni   impiegate per la prova :     - sono solubili in acqua nelle condizioni   sperimentali ;     - hanno una tensione di vapore trascurabile nelle   condizioni sperimentali ;     - non esercitano effetti inibitori sui batteri ;     - sono assorbite soltanto in misura limitata nel   sistema sperimentale ;     - non vanno perdute per effetto della formazione   di schiume nella soluzione in esame .    La disponibilità di dati sulle proporzioni relative   dei principali componenti del materiale da esaminare   sarà utile per interpretare i risultati ,   particolarmente nei casi in cui i risultati sono   bassi o trascurabili .    Per poter interpretare i risultati più bassi e per   poter scegliere le opportune concentrazioni   sperimentali sarà altresì utile disporre di dati   sulla tossicità della sostanza nei confronti dei   microorganismi .    1.2 . Definizioni ed unità    Il livello di degradazione raggiunto alla fine   dell'esperimento , denominato « biodegradabilità   nel Zahn-Wellens Test » , è dato dall'espressione :    D T ( % ) = [ 1 - ( C T - C B ) / ( C A - C BA ) ]   × 100    D T = biodegradazione ( % ) al tempo T    C A = valori del DOC ( o del COD ) della miscela   in esame , espressi in mg/l e misurati tre ore dopo   l'inizio della prova ( DOC = carbonio organico   disciolto , COD = domanda chimica di ossigeno )    C T = valori del DOC o del COD nella miscela in   esame al momento del prelievo ( mg/l )    C B = valori del DOC o del COD relativi al « bianco »   al momento del prelievo ( mg/l )    C BA = valori del DOC o del COD del « bianco » ,   misurati tre ore dopo l'inizio della prova ( mg/l )    L'entità della degradazione dev'essere arrotondata   all'unità percentuale .    La degradazione percentuale si esprime come eliminazione   percentuale del DOC ( o del COD ) della sostanza   sperimentata .    La differenza tra il valore misurato dopo tre ore e   il valore calcolato , o preferibilmente misurato   inizialmente , può fornire informazioni utili in   merito all'eliminazione della sostanza ( vedi punto 3.2 :   « Interpretazione dei risultati » ) .    1.3 . Sostanze di riferimento    In taluni casi , quando vengono studiate sostanze   nuove , può essere utile l'impiego di sostanze di   riferimento . Tuttavia , non possono ancora essere   raccomandate specifiche sostanze di riferimento .    1.4 . Principio del metodo    In un recipiente di vetro da 1 a 4 litri , provvisto   di agitatore e aereatore , vengono introdotti   contemporaneamente il fango attivo , le sostanze   nutritive minerali e il materiale da esaminare , quale   unica fonte di carbonio , in soluzione acquosa .   La miscela viene agitata ed aereata alla temperatura di   20-25 ° C , sotto illuminazione diffusa o in camera   oscura per la durata massima di 28 giorni . Il processo di   degradazione viene seguito mediante determinazione dei   valori del COD o del DOC nella soluzione filtrata ,   eseguita giornalmente o comunque ad intervalli   appropriati e regolari . Il raporto fra il DOC ( o il   COD ) eliminato dopo ciascun intervallo ed il valore   a tre ore dall'inizio viene espresso come biodegradazione   percentuale e serve per misurare l'entità della   degradazione in quel momento . Diagrammando tale valore   in funzione del tempo si costruisce la curva di   biodegradazione . Impiegando un metodo analitico   specifico è possibile misurare le variazioni di   concentrazione della sostanza in esame dovute alla   biodegradazione ( biodegradabilità primaria ) .    1.5 . Criteri di qualità    Prove d'intercalibrazione tra laboratori hanno   dimostrato che la riproducibilità di questo   metodo è soddisfacente .    La sensibilità del metodo è determinata principalmente   dalla variabilità del « bianco » e , in misura   minore , dalla precisione con cui è possibile   determinare il carbonio organico disciolto e la quantità   del composto da esaminare contenuto nel mezzo .    1.6 . Descrizione del metodo    1.6.1 . Preparazioni    1.6.1.1 . Reattivi     - Acqua per il saggio : acqua potabile a contenuto   di carbonio organico inferiore a 5 mg/l . La   concentrazione globale degli ioni calcio e magnesio   non deve superare 2,7 mmol/l ; in caso contrario   sarà necessaria un'opportuna diluizione con acqua   delonizzata o distillata     - Acido solforico , p.a. , 50 g/l     - Soluzione di idrossido di sodio , p.a. ,   40 g/l     - Soluzione nutritiva minerale : sciogliere in   1 litro d'acqua deionizzata :    cloruroammonico , NH4Cl , p.a. 38,5 g    ortofosfato monosodico diidrato NaH2PO4.2H2O ,   p.a. 33,4 g    ortofosfato monopotassico , KH2PO4 , p.a. 8,5 g    ortofosfato dipotassico , K2HPO4 , p.a. 21,75 g    La miscela serve contemporaneamente da sostanza   nutritiva e da tampone .    1.6.1.2 . Apparecchiatura    Recipienti cilindrici di vetro , del volume   da 1 a 4 litri    Dispositivo di agitazione . L'agitatore vero e   proprio , di vetro o metallo , dev'essere sostenuto   da un albero adatto e deve girare a 5-10 cm   circa dal fondo del recipiente . Si può anche   impiegare un agitatore magnetico , con barretta da   7 a 10 cm di lunghezza    Tubo di vetro , del diametro interno di 2-4 mm , per   l'introduzione dell'aria . L'apertura del tubo deve   trovarsi a 1 cm circa sopra il fondo del recipiente    Centrifuga ( 3 550 giri circa )    pH-metro    Misuratore dell'ossigeno disciolto    Fultri di carta    Apparecchiatura per filtrazione su membrana    Filtri a membrana , porosità 0,45 µm .   I filtri a membrana sono adatti solo a condizione che   non cedano carbonio organico e non assorbano la   sostanza durante la filtrazione    Apparecchiatura analitica per la determinazione del   contenuto in carbonio organico e della domanda   chimica di ossigeno    1.6.1.3 . Preparazione dell'inoculo    Lavare il fango attivo proveniente da un impianto   di trattamento biologico centrifugando o lasciando   sedimentare ripetutamente con l'acqua per il   saggio ( vedi sopra ) .    Il fango attivo deve trovarsi in idonee condizioni .   Esso può essere prelevato da un implanto di trattamento   di acque di scarico in buone condizioni di   funzionamento . Per ottenere il maggior numero   possibile di specie o ceppi differenti di batteri è   preferibile mescolare gli inoculi provenienti da   varie fonti ( per esempio : vari impianti di   trattamento , estratti di suoli , acque di fiume ,   ecc. ) . La miscela deve essere trattata come   descritto sopra .    Per controllare l'attività del fango attivo vedi   oltre il paragrafo « Controllo funzionale » .    1.6.1.4 . Preparazione delle soluzioni da esaminare    Nel recipiente per il saggio , introdurre 500 ml   dell'acqua per il saggio , insieme alla soluzione   nutritiva minerale in quantità pari a 2,5 ml/l e al   fango attivo in quantità corrispondente a 0,2-1,0 g/l   di materiale secco nella miscela finale . Aggiungere   la soluzione madre della sostanza da esaminare   in quantità tale da ottenere un DOC da 50 a   400 mg/l nella miscela finale . I corrispondenti valori   del COD saranno da 100 a 1 000 mg/l . Portare con   l'acqua di cui sopra al volume totale da 1 a 4 litri .   Il volume totale da scegliere dipende dal numero   dei campioni da prelevare per le determinazioni   del DOC o del COD , nonché dai volumi necessari   per il procedimento analitico .    Normalmente , un volume di 2 litri può essere   considerato soddisfacente .    Per ciascuna serie di saggi va preparato almeno   un recipiente di controllo ( bianco ) : esso deve   contenere soltanto il fango attivo e la soluzione   nutritiva minerale portata allo stesso volume   totale dei recipienti per il saggio .    1.6.2 . Esecuzione del saggio    Si agita il contenuto dei recipienti per il saggio   con agitatori magnetici od a spirale , sotto   illuminazione diffusa o in camera oscura e alla   temperatura di 20-25 ° C . L'aerazione dev'essere   ottenuta insufflando aria compressa purificata   facendola passare attraverso un tampone di cotone e ,   se necessario , una bottiglia di lavaggio . Si farà   in modo che il fango non si depositi e che la   concentrazione dell'ossigeno non scenda al di   sotto di 2 mg/l .    Il valore del pH deve essere controllato ad intervalli   regolari ( ad esempio quotidianamente ) e regolato   se necessario sul valore di 7-8 .    Le perdite dovute all'evaporazione andranno compensate   immediatamente prima di ogni prelievo aggiungendo   acqua deionizzata o distillata nelle quantità   richieste . Sarà particolarmente utile segnare il   livello del liquido sul recipiente prima di avviare   la prova . Dopo ogni campionamento ( in assenza di aerazione   e agitazione ) si apporranno nuovi contrassegni .   I primi campioni dovranno sempre essere prelevati tre   ore dopo l'inizio della prova per verificare se ha   luogo un assorbimento del materiale in esame   da parte del fango attivo .    L'eliminazione della sostanza in esame dev'essere   seguita mediante determinazioni del DOC e del COD ,   effettuate quotidianamente o ad intervalli comunque   regolari . I campioni prelevati dal recipiente di   saggio e dal « bianco » devono essere filtrati   su carta accuratamente lavata . I primi 5 ml del   filtrato della soluzione devono essere scartati .   I fanghi difficilmente filtrabili possono essere   eliminati in precedenza centrifugando per 10 minuti .   Le determinazioni del COD e del DOC devono essere   effettuate almeno in doppio . L'esperimento deve   proseguire per la durata di 28 giorni .    Nota : I campioni che rimangono torbidi devono essere   filtrati attraverso filtri a membrana . Questi ultimi   non devono cedere od assorbire materiale organico .    Controllo funzionale del fango attivo    In parallelo a ciascuna serie di esperimenti ,   deve essere saggiata una sostanza nota , destinata   a controllare la capacità funzionale del fango   attivo . A questo scopo si è mostrato utile il   glicoldietilenico .    Adattamento    Qualora si eseguano analisi ad intervalli relativamente   brevi ( ad esempio quotidianamente ) , l'adattamento   può essere chiaramente controllato dalla curva   di degradazione ( vedi figura 2 ) . Il saggio ,   pertanto , non deve essere avviato immediatamente   prima dell'interruzione di fine settimana .    Qualora l'adattamento si verifichi verso la fine   del periodo di saggio , il saggio stesso può essere   prolungato fino al momento in cui la degradazione   è terminata .    Nota : Se è necessaria una conoscenza più   vasta del comportamento dei fanghi adattati , lo   stesso fango attivo deve essere posto nuovamente a   contatto con lo stesso materiale di prova , procedendo   come segue :    arrestare l'agitatore e l'aeratore e lasciar   sedimentare il fango attivo ; eliminare il surnatante ,   riempire fino a 2 litri con acqua per il saggio , agitare   per 15 minuti e lasciare nuovamente sedimentare ;   eliminare nuovamente il surnatante e impiegare il   fango rimanente per ripetere il saggio con gli stessi   materiali conformemente a quanto indicato ai   precedenti punti 1.6.1.4 e 1.6.2 . Il fango attivo   può essere isolato anche per centrifugazione anziché   per sedimentazione .    Il fango adattato può essere mescolato con fango   fresco , fino ad una quantità totale di 0,2-1 g di   sostanza secca per litro .    Mezzi analitici    Normalmente i campioni vengono filtrati attraverso   un filtro di carta accuratamente lavato ( per il   lavaggio , impiegare acqua deionizzata ) .    I campioni che restano torbidi devono essere   filtrati con filtri a membrana ( 0,45 µm ) .    La concentrazione del DOC dev'essere determinata   in doppio sul campione filtrato ( scartando i primi 5 ml )   con apparecchiatura per la determinazione del TOC .   Se il filtrato non può essere analizzato lo stesso   giorno , esso va conservato in frigorifero fino   al giorno successivo . Una conservazione più   lunga non è da raccomandarsi .    La concentrazione del COD va determinata sul campione   filtrato con il procedimento analitico descritto nel   riferimento ( bibliografico 2 ) .    2 . DATI E VALUTAZIONE    Le concentrazioni del DOC e del COD devono essere   determinate almeno in doppio in ogni campione   secondo quanto indicato al punto 1.6.2 . La   degradazione al momento T viene calcolata mediante   la formula riportata ( insieme alle definizioni )   al punto 1.2 .    La misura della degradazione dev'essere arrotondata   all'unità percentuale . L'entità della   degradazione raggiunta , alla fine dell'esperimento   viene definita come « biodegradabilità   secondo Zahn-Wellens » .    Nota : Qualora la degradazione completa venga raggiunta   prima che il tempo necessario per il saggio sia   terminato e questo risultato sia confermato da una seconda   analisi effettuata il giorno successivo , il saggio   può essere considerato concluso .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare ,   se possibile :     - la concentrazione iniziale della sostanza ,     - tutte le altre informazioni e risultati sperimentali   concernenti la sostanza esaminata , la sostanza   di riferimento ( se impiegata ) e il « bianco » ,     - la concentrazione dopo tre ore ,     - la curva di biodegradazione con la relativa   descrizione ,     - la data e la località di prelievo dei   microorganismi usati per l'esperimento , lo stato di   adattamento , la concentrazione impiegata , ecc .     - le giustificazioni scientifiche per qualsiasi   modifica apportata al procedimento sperimentale .    3.2 . Interpretazione dei risultati    La rimozione del DOC ( o del COD ) che si verifica   gradualmente entro giorni o settimane indica che   la sostanza in esame sta subendo biodegradazione .    In taluni casi può comunque entrare in gioco   l'assorbimento chimico-fisico , denotato dal fatto   che la scomparsa si verifica in modo completo o   parziale fin dall'inizio , entro le prime tre ore   e che la differenza di risposta tra i surnatanti   del controllo e del saggio rimane a livelli   inaspettatamente bassi .    Se si vuole distinguere fra la biodegradazione   ( o biodegradazione parziale ) e l'assorbimento ,   sono necessari ulteriori saggi .    Ciò può essere fatto in numerosi modi , ma il   metodo più convincente consiste nell'impiegare il   surnatante quale inoculo in una prova del dossier   di base ( preferibilmente un saggio respirometrico ) .    Le sostanze che , nel corso di questo saggio ,   mostrano un'elevata eliminazione del DOC ( o del COD )   non dovuta ad assorbimento devono essere considerate   potenzialmente biodegradabili . Una rimozione parziale ,   non dovuta ad assorbimento indica che il prodotto   chimico è soggetto almeno in parte alla   biodegradazione .    Una rimozione bassa o nulla del DOC ( o del COD )   può essere dovuta all'inibizione dei microorganismi   da parte delle sostanze in esame : ciò può anche   essere rivelato dalla lisi e dalla perdita di fango ,   accompagnata dalla formazione di surnatanti torbidi .   In questo caso il saggio deve essere ripetuto   impiegando la sostanza in esame a concentrazione   minore .    L'impiego di un metodo di analisi specifico per la   sostanza in esame o della sostanza marcata con 14C   può consentire una maggiore sensibilità . Nel   caso di composto marcato al 14C , il recupero di 14CO2   confermerà che la biodegradazione è avvenuta .    Quando i risultati sono espressi in termini di   biodegradazione primaria , dovrà essere fornita ,   possibilmente , una spiegazione della modifica di   struttura chimica che conduce alla diminuzione   di risposta della sostanza in esame .    Si deve dimostrare la validità del metodo analitico e   fornire la risposta ottenuta sul « bianco » .    4 . BIBLIOGRAFIA     ( 1 ) OCSE , Parigi 1981 , Linea Guida 302 B ,   decisione C(81) 30 def. del Consiglio .     ( 2 ) Allegato V C.9 Degradazione : Domanda chimica   di ossigeno ; direttiva 84/449/CEE della Commissione ,   Gazzetta ufficiale delle Comunità europee n. L   251 del 19 settembre 1984 .    (1) I termini « ultima » e « primaria » ,   riferiti alla biodegradazione , sono traduzioni dei   termini inglesi « ultimate » e « primary » ,   rispettivamente .    Appendice    ESEMPIO DI VALUTAZIONE    Composto organico : * acido 4-etossibenzoico *    Concentrazione teorica della sostanza : * 600 mg/l *    DOC teorico : * 390 mg/l *    Inoculo : * impianto di trattamento delle acque   fognarie di ... *    Concentrazione * 1 g di sostanza secca *    Stato di adattamento * non adattato *    Analisi : * determinazione DOC *    Quantità del campione * 3 ml *    Sostanza di controllo * glicoldietilenico *    Tossicità del composto * nessun effetto tossico   al di sotto di 1 000 mg/l ( metodo utilizzato :   saggio in tubi di fermentazione ) *    Tempi di analisi * Sostanza di riferimento *   Sostanza in esame *     * Bianco DOC (1) mg/l * DOC (1) mg/l * DOC netto   mg/l * Degradazione % * DOC (1) mg/l * DOC netto   mg/l * Degradazione % *    0 * - * - * 300,0 * - * - * 390,0 * - *    3 ore * 4,0 * 298,0 * 294,0 * 2 * 371,6 * 367,6 * 6 *    1 giorno * 6,1 * 288,3 * 282,2 * 6 * 373,3 * 367,2 * 6 *    2 giorni * 5,0 * 281,2 * 276,2 * 8 * 360,0 * 355,0 * 9 *    5 giorni * 6,3 * 270,5 * 264,2 * 12 * 193,8 * 187,5 * 52 *    6 giorni * 7,4 * 253,3 * 245,9 * 18 * 143,9 * 136,5 * 65 *    7 giorni * 11,3 * 212,5 * 201,2 * 33 * 104,5 * 93,2 * 76 *    8 giorni * 7,8 * 142,5 * 134,7 * 55 * 58,9 * 51,1 * 87 *    9 giorni * 7,0 * 35,0 * 28,0 * 91 * 18,1 * 11,1 * 97 *    10 giorni * 18,0 * 37,0 * 19,0 * 94 * 20,0 * 2,0 * 99 *    (1) Valore medio di tre determinazioni .    Figura 1    Esempio di curve di biodegradazione : v. G.U.    Figura 2    Esempio di adattamento dei fanghi : v. G.U.    BIODEGRADAZIONE    SAGGIO DI SIMULAZIONE CON FANGHI ATTIVI    1 . METODO    1.1 . Introduzione    1.1.1 . Osservazioni generali    Il metodo può essere applicato esclusivamente   a quelle sostanze organiche che , alle concentrazioni   impiegate per il saggio :     - sono solubili in acqua nella misura necessaria   per la preparazione delle soluzioni per il saggio ,     - hanno , nelle condizioni del saggio , una tensione   di vapore trascurabile ,     - non esercitano effetti inibitori sui batteri .    La disponibilità di dati sulle proporzioni   relative dei principali componenti del prodotto   da esaminare sarà utile per interpretare   i risultati ottenuti , in particolare in quei casi in   cui i valori trovati sono bassi o non significativi .    È auspicabile poter disporre di dati sulla   tossicità della sostanza nei confronti dei   microorganismi per l'interpretazione di eventuali   bassi valorí e per la scelta delle concentrazioni   sperimentali appropriate .    1.1.2 . Determinazione della biodegradabilità   ultima ( analisi DOC/COD ) (1)    Scopo del metodo è la determinazione   della biodegradabilità ultima mediante misura   della rimozione della sostanza e di qualsiasi   metabolita in un impianto modello a fanghi attivi ,   ad una concentrazione > 12 mg DOC/l ( o a circa 40 mg   COD/l ) . Sembrano ottimali 20 mg DOC/l ( DOC = carbonio   organico disciolto/litro ; COD = domanda chimica di   ossigeno ) .    Si deve determinare il contenuto di carbonio   organico ( o la domanda chimica di ossigeno )   del materiale in esame .    1.1.3 . Determinazione della biodegradabilità   primaria ( analisi specifica ) (1)    Scopo del metodo è la determinazione della   biodegradabilità primaria di una sostanza in   un impianto pilota a fanghi attivi , a una   concentrazione di circa 20 mg/l , con l'impiego di   un metodo analitico specifico ( se il metodo analitico   e la tossicità della sostanza lo consentono ,   si può usare una concentrazione piò   bassa o più elevata ) . Questo consente la valutazione   della biodegradabilità primaria della sostanza   ( modifica della struttura chimica della sostanza   in esame ) .    Il metodo non è destinato alla determinazione   della mineralizzazione della sostanza esaminata .    Per la determinazione de sostanza esaminata ocorre   disporre di un metodo analitico adeguato .    1.2 . Definizioni e unità    1.2.1 . Analisi DOC/COD    Il grado di rimozione della sostanza è dato   da :    DR = ( T - ( E - E O ) ) /T × 100 % [ 1 a ) ]    dove :    DR = grado di rimozione percentuale del DOC   ( o del COD ) relativo alla sostanza in esame entro   il tempo medio di ritenzione fissato    T = concentrazione della sostanza in esame   nell'affluente in mg DOC/litro ( o mg COD/litro )    E = concentrazione del DOC ( o del COD ) nell'effluente   dell'unità per il saggio in mg DOC/litro ( o mg   COD/litro )    E O = concentrazione del DOC ( o del COD )   nell'effleuente dell'unità per il « bianco »   in mg DOC/litro ( o mg COD/litro )    La degradazione si definisce come la rimozione   percentuale di DOC ( o di COD ) , nel tempo di   ritenzione fissato , relativo alla sostanza in esame .    1.2.2 . Analisi specifica    L'eliminazione percentuale della sostanza   esaminata dalla fase acquosa ( R W ) , nel   tempo medio di ritenzione fissato , si ricava da :    R W = ( C I - C O ) /C I × 100 % [ 1 b ) ]    dove :    C I = concentrazione della sostanza nell'effluente   dell'unità per il saggio ( mg di sostanza/litro ,   determinata con l'analisi specifica )    C O = concentrazione della sostenza nell'effluente   dell'unità per il saggio ( mg di sostanza/litro ,   determinata con l'analisi specifica )    1.3 . Sostanze di riferimento    In alcuni casi , quando si esamina una nuova   sostanza , possono essere utili delle sostanze   di riferimento ; ciò monostante , non è   attualmente possibile indicare sostanze di   riferimento specifiche .    1.4 . Principio del metodo    Per la determinazione della biodegradabilità   ultima si fanno funzionare in parallelo   due unità pilota a fanghi attivi ( saggio di   conferma dell'OCSE o unità a vaso poroso ) . La sostanza   in esame viene addizionata all'affluente   ( liquame sintetico o domestico ) di una delle   unità , mentre l'altra riceve soltanto   liquame . Per la determinazione della biodegradazione   primaria con l'analisi specifica dell'affluente   e dell'effluente si impiega soltanto una unità .    Si misurano le concentrazioni di DOC ( o di COD )   negli effluenti , oppure si determinano   con l'analisi specifica le concentrazioni della   sostanza .    Il DOC dovuto alla sostanza in esame non viene   misurato ma soltanto specificato . Quando si effettuano   le misurazioni del DOC ( e del COD ) , si assume che   la differenza fra le concentrazioni medie degli   effluenti del saggio e del controllo sia dovuta   alla sostanza in esame non degradata .    Quando vengono effettuate analisi specifiche   è possibile misurare la variazione della   concentrazione della sostanza in esame   ( biodegradazione primaria ) .    Si possono fare funzionare le unità seguendo   il « sistema delle unità accoppiate » , con il   procedimento della transinoculazione .    1.5 . Criteri di qualità    La concentrazione di partenza della sostanza   dipende dal tipo di analisi effettuata e dalle sue   limitazioni .    1.6 . Descrizione del metodo    1.6.1 . Preparazione    1.6.1.1 . Apparecchiatura    A parte il caso delle analisi specifiche , è   necessaria una coppia di unità dello stesso   tipo . Possono essere impiegati due sistemi :    Saggio di conferma OCSE    L'apparecchiatura ( allegato I ) è costituita   da un serbatoio ( A ) per il liquame sintetico ,   da una pompa di dosaggio ( B ) , da una vasca   di aerazione ( C ) , da un sedimentatore ( D ) ,   una pompa ad aria compressa ( E ) per riciclare i   fanghi attivi e una vasca ( F ) per raccogliere   l'effluente trattato .    I serbatoi ( A ) e ( F ) devono essere di vetro   o di idoneo materiale plastico , e della   capacità di almeno 24 litri . La pompa ( B )   alimenta con un flusso costante di liquame   sintetico la vasca di aerazione ; si può   impiegare qualsiasi sistema idoneo purché sia in   grado di assicurare il flusso e la concentrazione di   alimentazione .    Durante il normale funzionamento , l'altezza   del sedimentatore ( D ) è fissata in modo che   il volume della soluzione chiarificata contenuto   nella vasca di aerazione sia di tre litri .   Un diffusore di materiale sinterizzato ( G )   è sospeso nel recipiente ( C ) al vertice del cono .   La quantità di aria insufflata attraverso   l'aeratore può essere determinata con un   flussometro . La pompa ad aria compressa ( E )   è regolata in modo che il fango attivo sia   riciclato con continuità e regolarità   dal sedimentatore al recipiente di aerazione ( C ) .     « Vaso poroso »    Il vaso poroso è realizzato con fogli di polietilene   poroso ( spessore 2 mm , dimensione massima   dei pori 95 µm ) a forma cilindrica del   diametro di 14 cm e con una base conica a 45 °   ( figure 1 e 2 dell'allegato II ) . Il vaso poroso è   contenuto in un recipiente impermeabile di plastica   idonea del diametro di 15 cm , con una luce   sulla parte cilindrica ad una altezza di 17,2 cm   che determina il volume ( tre litri ) del vaso .   Nella parte superiore del recipiente interno si   trova un anello rigido di sostegno in plastica   idonea in modo da avere un'intercapedine di efflusso   di 0,5 cm fra il recipiente interno e quello esterno .    I vasi porosi possono essere montati sul fondo   di un bagnomaria controllato termostaticamente .   Alla base del recipiente interno , dove sono collocati   idonei diffusori , si ha un'alimentazione di aria .    I recipienti ( A ) ed ( E ) debbono essere di vetro   o di plastica idonea ed avere una capacità   di almeno 24 litri . La pompa ( B ) alimenta ,   con un flusso costante di liquame sintetico ,   il recipiente di aerazione ; si può impiegare   qualsiasi sistema atto ad assicurare il flusso e la   concentrazione di alimentazione .    Sono necessari dei vasi porosi interni di   riserva per sostituire quelli che possono   ostruirsi durante l'uso ; i vasi ostruiti vengono   puliti mediante immersione per 24 ore in una   soluzione di ipoclorito seguita da un lavaggio   accurato con acqua di rubinetto .    1.6.1.2 . Filtrazione    Apparecchiatura per filtrazione su membrana e   membrane filtranti con pori da 0,45 µm . Le   membrane filtranti sono adatte soltanto se non cedono   carbonio organico e non assorbono la sostanza   durante la filtrazione .    1.6.1.3 . Liquame    Si possono impiegare sia un'idonea alimentazione   sintetica , sia liquame domestico .    Esempio di alimentazione sintetica    Sciogliere in un litro di acqua dirubinetto   i seguenti composti :    Peptone : 160 mg    Estratto di carne : 110 mg    Urea : 30 mg    NaCl : 7 mg    CaCl2 2H2O : 4 mg    MgSO4 7H2O : 2 mg    K2HPO4 : 28 mg    Liquame domestico    Dovrebbe essere raccolto fresco ogni giorno   dallo stramazzo della vasca di sedimentazione   primaria di un impianto che tratta in prevalenza   liquami domestici .    1.6.1.4 . Soluzione madre della sostanza in esame    Si dovrebbe preparare una soluzione della sostanza   in esame , ad esempio all'1 % , da aggiungere   nell'unità di prova . È necessario fissare   la concentrazione della sostanza in modo tale   che si conosca il volume necessario per ottenere la   concentrazione di prova da addizionare al liquame   o direttamente nell'unità per mezzo di una seconda   pompa .    1.6.1.5 . Inoculo    Osservazione : Usando liquami domestici , sarebbe   superfluo l'impiego di un inoculo a bassa concentrazione   batterica , ma si possono usare fanghi attivi .   Possono essere usati svariati inoculi , se ne   danno tre esempi adatti :    a ) Inoculo da effluente secondario    Si dovrebbe ricavare l'inoculo da un effluente   secondario di buona qualità raccolto da un   impianto che tratta in prevalenza liquami domestici .   Nel periodo compreso fra il campionamento e   l'impiego , l'effluente deve essere tenuto   in condizioni aerobie . Per preparare l'inoculo ,   si filtra il campione su filtro a elevata porosità ,   scartando i primi 200 ml . Il filtrato è mantenuto   in condizioni aerobie sino al momento dell'uso .   L'inoculo deve essere impiegato il giorno stesso   del prelievo . Per l'inoculazione occorre   impiegarne almeno 3 ml .    b ) Inoculo composito    Inoculo da un effluente secondario :    vedi descrizione precedente .    Inoculo da terreno :    si sospendono 100 grammi di terreno ( fertile ,   non sterile ) in 1 000 ml di acqua potabile   esente da cloro ( terreni con un contenuto eccessivo   di argilla , sabbia o humus non sono adatti ) .   Dopo agitazione , si lascia riposare la sospensione   per 30 minuti . Si filtra il surnatante su carta   a elevata porosità , scartando i primi 200 ml .   Si sottopone immediatamente il filtrato ad aerazione   prolungandola fino al momento dell'uso . L'inoculo   deve essere utilizzato il giorno stesso del prelievo .    Inoculo da acque superficiali :    un altro inoculo parziale può ottenersi da acque   superficiali semiputride ( mesosaprobiche ) . Si   filtra il campione su carta ad elevata porosità ,   scartando i primi 200 ml . Si mantiene in condizioni   aerobie fino al momento dell'impiego . L'inoculo   va utilizzato il giorno stesso del prelievo .    Si mettono insieme i volumi dei tre campioni   parziali di inoculo , si mescolano bene e si   preleva dal miscuglio ottenuto l'inoculo finale .   Per l'inoculazione occorre che esso sia di   almeno 3 ml .    c ) Inoculo da un fango attivo    Si può usare come inoculo un volume ( non   più di tre litri ) di fango attivo ( contenuto in   solidi sospesi fino a 2,5 g/l ) prelevato dalla   vasca di aerazione di un impianto che tratta   prevalentemente liquami domestici .    1.6.2 . Procedimento    Il saggio viene eseguito a temperatura ambiente ;   questa dovrebbe essere mantenuta fra 18 e 25 ° C .    Se è il caso , il saggio può essere condotto a   una temperatura più bassa ( fino a 10 ° C ) :   se la sostanza viene degradata , allora non   occorrono , di solito , altre operazioni . In caso   contrario il saggio deve essere condotto ad una   temperatura costante compresa fra 18 e 25 ° C .    1.6.2.1 . Periodo di avviamento :   formazione/stabilizzazione del fango delle unità    Il periodo di formazione/stabilizzazione del fango   è il periodo necessario perché la concentrazione   dei solidi sospesi del fango attivo ed il funzionamento   delle unità pervengano allo stato di regime nelle   condizioni operative volute .    Il periodo di avviamento è quello che va   dall'istante in cui la sostanza in esame è   aggiunta per la prima volta fino all'istante   in cui la sua rimozione si stabilizza ( valore   relativamente costante ) . Questo periodo non deve   superare le sei settimane .    Il periodo di valutazione é di tre settimane a   partire dall'istante in cui la rimozione della   sostanza in esame raggiunge un valore relativamente   costante che è di solito elevato . Per tutte le   sostanze che , nelle prime sei settimane ,   mostrano una degradazione limitata o nulla , si   prendono , come periodo di valutazione , le   successive tre settimane .    All'inizio si riempie la ( le ) unità   necessaria(e) per una prova con l'inoculo mescolato   con l'affluente .    Si mettono allora in funzione l'aeratore [ nel   caso della unità del saggio di conferma OCSE   la pompa ad aria compressa ( E ) ] ed il   meccanismo di dosaggio ( B ) .    L'affluente , privo della sostanza da esaminare ,   deve attraversare il recipiente di aerazione ( C )   alla velocità di 1 l/h oppure 0,5 l/h ; ciò   comporta un tempo medio di ritenzione di tre o di   sei ore .    La velocità di aerazione dovrebbe essere   regolata in modo che il contenuto del recipiente   ( C ) sia manenuto costantemente in sospensione   ed il volume di ossigeno disciolto sia di almeno 2 mg/l .    Va evitata , con mezzi adeguati , la formazione   di schiuma . Non si devono usare agenti antiseniumogeni   che inibiscano il fango attivo .    Il fango accumulatosi nella parte superiore del   recipiente di aerazione ( C ) [ per le unità   del saggio di conferma OCSE alla base del recipiente   di sedimentazione ( D ) e nel circuito di circolazione ]   deve essere riportato nella soluzione chiarificata almeno   una volta al giorno con l'uso di una spazzola o di   qualche altro mezzo appropriato .    Quando il fango ha difficoltà a sedimentare ,   se ne può aumentare la densità aggiungendo   delle porzioni di 2 ml di una soluzione al 5 % di   cloruro ferrico e ripetendo l'operazione quando   necessario .    Si raccoglie l'effluente nel recipiente ( E o F )   per 20-24 ore e si preleva un campione dopo   un'accurata miscelazione . Il recipiente ( E o F )   deve essere pulito molto bene .    Per poter determinare e controllare l'efficienza del   processo , si misurano almeno due volte alla settimana   la domanda chimica di ossigeno ( COD ) o il carbonio   organico disciolto ( DOC ) del filtrato dell'effluente   raccoltosi , come pure del filtrato dell'affluente   ( usando una membrana con pori di 0,45 µm e   scartando i primi 20 ml circa di filtrato ) .    La riduzione del COD o DOC dovrebbe annullarsi   quando si ottiene una degradazione giornaliera   abbastanza regolare .    Due volte alla settimana si dovrebbe determinare   la quantità ( in g/l ) di sostanza secca del fango   attivo nel recipiente di aerazione . Le unità   possono funzionare in due modi : o due volte per   settimana si determina la quantità di sostanza   secca presente nel fango attivo e se essa supera i   2,5 g/l si deve togliere quella in eccesso ; oppure si   eliminano giornalmente da ciascun vaso 500 ml di   soluzione mista per avere un tempo di ritenzione   medio del fango di 6 giorni .    Quando i parametri misurati e calcolati   [ efficienza del processo ( nella rimozione   COD o DOC ) , concentrazione del fango , capacità   di sedimentazione del fango , torbidità degli   effluenti , ecc. ] delle due unità sono   sufficientemente stazionari , la sostanza in esame   può essere introdotta nell'affluente di una delle   unità , secondo il punto 1.6.2.2 .    In alternativa , la sostanza in esame può   essere introdotta all'inizio del periodo di   formazione del fango , specialmente quando come   inoculo si aggiunge fango .    1.6.2.2 . Procedimento    Si mantengono le condizioni di funzionamento del   periodo di avviamento e si aggiunge   all'affluente dell'unità di prova una quantità   sufficiente ( circa l'1 % ) di soluzione madre del   prodotto in esame , in modo da ottenere nel liquame   la concentrazione voluta del prodotto ( circa   10-20 mg DOC/l o 40 mg COD/l ) . Ciò si può   effettuare o miscelando giornalmente il liquame   con la soluzione madre , oppure con un sistema   separato di pompaggio . Detta concentrazione può   essere raggiunta progressivamente . Se non si hanno   effetti tossici della sostanza in esame sul fango   attivo , possono essere provate anche concentrazioni   più elevate .    L'unità « in bianco » è alimentata   soltanto con l'affluente senza aggiunta di sostanze .   Per l'analisi si prendono adeguate quantità di   effluenti e si filtrano con filtri a membrana   ( 0,45 µm ) scartando i primi 20 ml ( circa ) di   filtrato .    I campioni filtrati devono essere analizzati   il giorno stesso , in caso contrario vanno   opportunamente conservati , per esempio mediante   l'aggiunta di 0,05 ml di una soluzione all'1 %   di cloruro mercurico ( HgCl2 ) per ogni 10 ml di   campione filtrato , oppure mantenendoli alla   temperatura da 2 a 4 ° C per 24 ore al massimo ,   oppure al di sotto di - 18 ° C per periodi più   lunghi .    Il periodo di sperimentazione , a partire   dall'aggiunta della sostanza in esame , non dovrebbe   superare le sei settimane ed il periodo di valutazione   dovrebbe durare almeno tre settimane ; per il   calcolo del risultato finale dovrebbero postersi   effettuare da 14 a 20 determinazioni .    Processo a unità accoppiate    L'accoppiamento delle unità si ottiene   scambiando , una volta al giorno , fra le due unità ,   1,5 litri di soluzione chiarificata ( fango incluso )   proveniente dalle vasche di aerazione del fango   attivo . Nel caso di prodotti in esame fortemente   assorbenti , si prelevano dalle vasche di sedimentazione   1,5 litri del solo liquido surnatante e si versano   nella vasca di fango attivo dell'altra unità .    1.6.2.3 . Analisi    Per seguire il comportamento della sostanza si   possono effettuare due tipi di analisi :     - DOC e COD :    le concentrazioni di DOC sono determinate in doppio   con l'analizzatore di carbonio e quelle di COD   ( assieme o in alternativa ) col sistema indicato   nel riferimento bibliografico ( 2 ) ;     - analisi specifica :    le concentrazioni della sostanza esaminata si   determinano con un metodo analitico idoneo . Se   possibile , si dovrebbe effettuare una determinazione   specifica della sostanza assorbita sul fango .    2 . DATI E VALUTAZIONE    2.1 . Processo ad unità accoppiate    Quando si impiega il « processo ad unità   accoppiate » , il grado giornaliero di rimozione DR   viene calcolato come indicato al punto 1.2.1 . Il   valore DR viene quindi corretto in DRc , per tener   conto del trasferimento di sostanza dovuto al   procedimento di transinoculazione , mediante l'equazione   ( 2 ) e l'equazione ( 3 ) per tempi medi di ritenzione   rispettivamente di tre e di sei ore .    DRc = 8/7 DR - 100/7 [ 2 ]    DRc = 4/3 DR - 100/3 [ 3 ]    Si calcola la media della serie di valori di   DRc ed inoltre la deviazione standard con l'equazione   [ 4 ]    S DRc = * S n (i = 1) (DRc - DRci)²/ ( n - 1 ) [ 4 ]    dove :    S DRc = deviazione standard della serie di valori   di DRc    DRc = media dei valori di DRc    n = numero di determinazioni    Si eliminano i valori anomali della serie di DRc   secondo un opportuno procedimento statistico , ad   esempio Nalimov ( 6 ) , con un livello di probabilità   del 95 % e si ricalcolano la media e la deviazione   standard della serie di DRc priva di valori anomali   ( outliers ) .    Si calcola quindi il risultato finale con   l'equiazione ( 5 ) :    DRc = DRc × t n - 1 ; a/ * n S DRc [ 5 ]    dove :    t n - 1 ; a = valore tabulato di t per n coppie   di valori di E ed E O e l'intervallo fiduciario P   ( P = 1 - a ) è stimato al 95 % ( 1 )    Il risultato viene espresso come media con limiti   di tolleranza al 95 % , relativa deviazione standard   e numero di dati della serie DRc priva di   « outliers » e numero di valori anormali ,   ad esempio :    DRc = 98,6 ± 2,3 % della rimozione del DOC    s = 4,65 % della rimozione del DOC    n = 18    x = numero degli « outliers »    2.2 . Processo ad unità non accoppiate    Il funzionamento delle unità può essere   verificato come segue :    percentuale di rimozione del COD o del DOC =   ( COD o DOC del liquame - COD o DOC dell'effluente ) /COD   o DOC del liquame × 100    Questa rimozione giornaliera può essere   riportata in grafico per evidenziare eventuali   andamenti , per esempio , verso l'acclimatazione .    2.2.1 . Determinazioni attraverso il COD/DOC    Il grado giornaliero di rimozione DR è calcolato   come indicato al punto 1.2.1 .    Si calcola la media della serie di valori DR ed   inoltre la sua deviazione standard con l'equazione :    S DR = * S n (i = 1) (DR - DRi)²/ ( n - 1 ) [ 6 ]    dove :    S DR = deviazione standard della serie di valori   di DR i    DR = media dei valori DR i    n = numero delle determinazioni    Si eliminano gli « outliers » della serie di   DR secondo un opportuno procedimento statistico ,   ad esempio Nalimov ( 6 ) , con un livello di   probabilità del 95 % e si ricalcolano la media   e la deviazione standard della serie di DR cosi   epurata .    Il risultato finale è quindi calcolato con   l'equazione :    DR = DR ± t n - 1 ; a/ * n S DR [ 7 ]    dove :    t n - 1 ; a = valore tabulato di t per n coppie   di valori di E ed E O e l'intervallo fiduciario P   ( P = 1 - a ) dove P è stimato al 95 % ( 1 )    Come risultato vengono presi la media , con limiti   di tolleranza ad un livello di probabilità del   95 % , la relativa deviazione standard , il numero   di dati della serie DR epurata ed il numero di   valore anomali , ad esempio :    DR = ( 98,6 ± 2,3 % ) della rimozione del DOC    s = 4,65 % della rimozione del DOC    n = 18    x = numero di « outliers »    2.2.2 . Determinazione attraverso l'analisi specifica    La percentuale di eliminazione della sostanza in   esame dalla fase acquosa ( R w ) è calcolata come   indicato al punto 1.2.2 .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare ,   se possibile :     - la scheda fornita nell'allegato III , che   mostra le condizioni operative del saggio ,     - l'apparecchiatura scelta ( prova di conferma OCSE   o vaso poroso ) ,     - il procedimento scelto : unità accoppiate o meno ,     - il liquame impiegato : sintetico o domestico   ( nel caso di liquame domestico , data e provenienza del   campione ) ,     - tipo di inoculo , con data e provenienza del campione ,     - una descrizione del metodo analitico , se sono   state effettuate analisi specifiche ,     - grafico della rimozione di COD o DOC in funzione   del tempo , comprensivo dei periodi di avviamento   e di valutazione ,     - recupero analitico della sostanza in esame   come COD o DOC nella soluzione madre ,     - nel caso siano state effettuate analisi specifiche ,   grafico della rimozione percentuale della sostanza   esaminata dalla fase acquosa in funzione del tempo   ( periodo di avviamento e di valutazione ) ,     - la rimozione media di DOC , COD o della   sostanza in esame e la deviazione standard sono calcolate   dai risultati del periodo di valutazione , cioè   quando si ha una rimozione stazionaria della sostanza   in esame o un periodo di funzionamento a regime ,     - grafico della concentrazione del fango attivo   in funzione del tempo ,     - osservazioni riguardanti il fango attivo ( scarto   di fanghi in eccesso , presenza di rigonfiamenti ,   FeCl3 , ecc. ) ,     - concentrazione della sostanza usata nel saggio ,     - tutti i risultati relativi all'analisi fatta   sul fango ,     - tutti i dati ed i risultati sperimentali relativi   alla sostanza in esame e a quella di riferimento ,   se impiegata , motivazioni scientifiche per eventuali   modifiche nel procedimento .    3.2 . Interpretazione dei risultati    Una bassa rimozione della sostanza esaminata dalla   fase acquosa può essere dovuta all'inibizione dei   microorganismi da parte della sostanza in esame .   Ciò può anche essere evidenziato da lisi e   perdita di fango , che produce un surnatante torbido   e da un abbassamento dell'efficienza di rimozione   COD ( o DOC ) dell'impianto pilota .    A volte può svolgere un ruolo l'assorbimento   fisico-chimico . Le differenze fra l'azione biologica   sulla molecola e l'assorbimento chimico-fisico   possono essere rivelati da un'analisi condotta sul   fango dopo un adeguato desorbimento .    Se si deve fare la distinzione fra biodegradazione   ( o parziale biodegradazione ) ed assorbimento ,   sono necessarie ulteriori prove . Ciò si può   effettuare in diversi modi , ma il più convincente è   usare il surnatante come inoculo in un saggio del   dossier di base ( preferibilmente un saggio   respirometrico ) .    Se si osservano elevate rimozioni DOC o COD , ciò   è dovuto alla biodegradazione , mentre a base   rimozioni la biodegradazione non si può distinguere   dall'eliminazione . Ad esempio , se un composto solubile   manifesta una elevata costante di assorbimento del   98 % ed il tasso di eliminazione giornaliero del   surplus di fango è del 10 % , è possibile   un'eliminazione sino al 40 % ; con un tasso di   eliminazione del surplus di fango del 30 % , l'eliminazione   dovuta all'assorbimento ed alla rimozione attraverso   il surplus di fango può arrivare fino al 65 % ( 4 ) .    Quando si effettuano analisi specifiche , occorrerebbe   fare attenzione alla relazione fra la struttura della   sostanza e l'analisi specifica impiegata . In questo   caso il fenomeno osservato non può essere interpretato   come una mineralizzazione della sostanza .    4 . BIBLIOGRAFIA     ( 1 ) OCSE , Parigi 1981 , Linea Guida 303 A ,   decisione C(81) 30 def. del Consiglio .     ( 2 ) Allegato V C. 9 : Degradation - Chemical   Oxygen Demand , direttiva 84/449/CEE della Commissione ;   Gazzetta ufficiale delle Comunità europee n. L 251   del 19 settembre 1984 .     ( 3 ) Painter , H. A. , King , E. F. , WRC   Porous-Pot method for assessing biodegradability .   Technical Report TR70 , giugno 1978 , Water Research   Center , Regno Unito .     ( 4 ) Wierich , P. , Gerike , P. , « The   fate of soluble , recalcitrant , and adsorbing   compounds in activated sludge plants » ,   Ecotoxicology and Environmental Safety , Vol. 5 ,   n. 2 , giugno 1981 , pagine da 161 a 171 .     ( 5 ) Direttive 82/242/CEE e 82/243/CEE del Consiglio   ( Gazzetta ufficiale delle Comunità europee n. L 109   del 22 aprile 1982 ) , modificate delle direttive   73/404/CEE e 73/405/CEE del Consiglio ; Biodegradability   of detergents , Gazzetta ufficiale delle Comunità   europee n. L 347 del 17 dicembre 1973 .   ( 6 ) Streuli , H. , Fehlerhafte Interpretation   und Anwendung von Ausreissertests , insbesondere   bei Ringversuchen zur UEberpruefung analytischer-chemischer   Untersuchungsmethoden , Fesenius-Zeitschrift fuer   Analytische Chemie , 303 ( 1980 ) pagine da 406 a 408 .    (1) I termini « ultima » e « primaria » ,   riferiti alla biodegradazione , sono traduzioni   dei termini inglesi « ultimate » e « primary » ,   rispettivamente .    Appendice 1    Figura 1 : v. G.U.    Figura 2 : v. G.U.    Appendice 2    Figura 1    Attrezzatura per la determinazione della   biodegradabilità : v. G.U.    Appendice 3    Condizioni operative per la prova di simulazione   con fanghi attivi    Controllo in ciascun gruppo    Attrezzatura    di conterma OCSE ...    vaso poroso ...    Funzionamento    singola unità ...    unità accoppiate ...    unità non accoppiate ...    Transinoculazione    nessuna ...    fango attivo ...    surnatante ...    Tempo medio di ritenzione    tre ore ...    sei ore ...    Base nutritiva    liquame domestico ...    liquame sintetico ...    Inoculo    effluente secondario ...    composito ...    fango attivo ...    Addizione del materiale da esaminare    dall'avviamento ...    addizione graduale ...    a formazione del fango avvenuta ...    Analisi    specifica ...    COD ...    DOC ...    BIODEGRADAZIONE    FANGHI ATTIVI : SAGGIO DI INIBIZIONE DELLA RESPIRAZIONE    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Con il metodo qui descritto si valuta l'effetto   della sostanza in esame sui microorganismi misurando   la velocità di respirazione in determinate condizioni   alla presenza di diverse concentrazioni della sostanza   stessa .    Il metodo ha lo scopo di fornire un procedimento   rapido di « screening » per l'identificazione   delle sostanze che possono avere effetti nocivi   sugli impianti di trattamento batterico aerobio e   per indicare le concentrazioni della sostanza in   esame , che non provocano effetti inibitori , da   usare nei saggi di biodegradabilità .    Si può fare precedere la prova definitiva da   una prova orientativa che consenta di avere delle   informazioni sull'intervallo di concentrazioni da   usare nel saggio .    Nel programma del saggio vengono inclusi due   controlli senza la sostanza da esaminare , da utilizzare   uno all'inizio e l'altro alla fine della serie di   saggi . Ciascun gruppo di fanghi attivi dovrebbe   essere anche controllato con una sostanza di riferimento .    Il presente metodo si applica più facilmente   a quelle sostanze che grazie alla loro idrosolubilità   ed alla loro bassa volatilità , permangano   prevalentemente in acqua .    Per le sostanze che hanno invece una limitata   solubilità nei mezzi di trattamento , più non   essere possibile determinare la EC50 .    Quando la sostanza in esame ha tendenza a disaccoppiare   la fosforilazione ossidativa , i risultati basati   sull'assunzione di ossigeno possono condurre ad   errate conclusioni .    Per eseguire il saggio è utile disporre delle   seguenti informazioni :     - idrosolubilità ,     - tensione di vapore ,     - formula di struttura ,     - grado di purezza della sostanza in esame .    Raccomandazione :    i fanghi attivi possono contenere organismi   potenzialmente patogeni e dovrebbero perciò essere   maneggiati con cautela .    1.2 . Definizioni e unità    La velocità di respirazione è il consumo   di ossigeno da parte di microrganismi del fango   aerobio di acque reflue ed è espresso generalmente   in mg di O2 per mg di fango per ora .    Per calcolare l'effetto inibitorio della sostanza   in esame ad una data concentrazione , la velocità   di respirazione si esprime come percentuale della   media delle velocità di respirazione dei due controlli :     ( 1 - 2 Rs/Rc1 + Rc2 ) × 100 = percentuale di   inibizione    dove :    Rs = velocità di consumo di ossigeno alla   concentrazione saggiata della sostanza in esame    Rc1 = velocità di consumo di ossigeno nel   controllo 1 ,    Rc2 = velocità di consumo di ossigeno nel controllo 2 .    EC50 è , in questo metodo , la concentrazione   della sostanza in esame alla quale la velocità   di respirazione risulta pari al 50 % di quella   rilevata nel controllo nelle condizioni qui descritte .    1.3 . Sostanze di riferimento    Per controllare che la sensibilità del fango sia   normale si raccomanda di usare come sostanza di   riferimento il 3,5-diclorofenolo , noto come inibitore   della respirazione , e di sottoporlo a determinazione   della EC50 in ciascun gruppo di fanghi attivi .    1.4 . Principio del metodo    La velocità di respirazione di un fango attivo ,   alimentato con una quantità standard di liquame   sintetico , è misurato dopo un tempo di contatto   di 30 minuti o/e di 3 ore . Si misura anche la   velocità di respirazione dello stesso fango attivo   in presenza di diverse concentrazioni della sostanza   in esame in condizioni per il resto identiche .   L'effetto inibitorio della sostanza in esame ad una   data concentrazione è espresso come percentuale   delle velocità medie di respirazione dei due controlli .   Dalle determinazioni a diverse concentrazioni si   calcola un valore della EC50 .    1.5 . Criteri di qualità    I risultati del saggio sono validi se :     - la velocità di respirazione dei controlli   differiscono entro il 15 % ;     - la EC50 ( 30 minuti e/o 3 ore ) del 3,5-diclorofenolo   cade nell'intervalo accettato compreso fra 5 e 30 mg/l .    1.6 . Descrizione del metodo    1.6.1 . Reagenti    1.6.1.1 . Soluzioni della sostanza in esame    Le soluzioni della sostanza in esame vengono   preparate all'inizio dello studio impiegando una   soluzione madre . Se si segue il procedimento di   cui sotto , è opportuno che la concentrazione   della soluzione madre sia di 0,5 g/l .    1.6.1.2 . Soluzione della sostanza de riferimento    Si può preparare ad esempio una soluzione di   3,5-diclorofenolo sciogliendone 0,5 g in 10 ml di   NaOH 1M , diluendo quindi con acqua distillata sino   a circa 30 ml , addizionando ( mentre si agita )   H2SO4 0,5M sino al punto di precipitazione incipiente -   occorreranno circa 8 ml di H2SO4 0,5M - e diluendo   infine la miscela con acqua distillata sino al volume   di 1 litro . Il pH dovrebbe allora avere un valore   compreso fra 7 e 8 .    1.6.1.3 . Liquame sintetico    Una alimentazione di liquame sintetico si ottiene   sciogliendo in un litro di acqua le seguenti sostanze   nelle quantità precisate :     - 16 g di peptone ,     - 11 g di estratto di carne ,     - 3 g di urea ,     - 0,7 g di NaCl ,     - 0,4 g di CaCl2 2H2O ,     - 0,2 g di MgSO4 7H2O ,     - 2,8 g di K2HPO4 .    Nota 1 : Questo liquame sintetico è 100 volte   più concentrato di quello descritto in OECD Technical   Report , « Metodo proposto per la determinazione   della biodegradabilità dei tensioattivi impiegati   nei detersivi sintetici » ( 11 giugno 1976 ) ,   con l'aggiunta di fosfato acido di potassio .    Nota 2 : La soluzione preparata , se non viene   utilizzata subito , dovrà essere conservata al buio   a temperature comprese tra 0 ° C e 4 ° C per   non oltre una settimana , in condizioni tali da non   subire alterazioni nella composizione . Inoltre ,   prima della conservazione la soluzione potrà   essere sterilizzata oppure si potranno aggiungere   il peptone e l'estratto di carne solo poco prima   di effettuare l'analisi . Prima dell'uso la soluzione   dovrà essere agitata ed il suo pH dovrà essere corretto .    1.6.2 . Apparecchiatura    Apparecchiatura di misurazione : non è importante   che l'apparecchio abbia una forma precisa . Comunque ,   la bottiglia di misurazione dovrebbe essere completamente   piena e la sonda dovrebbe aderire ermeticamente al   collo .    É necessaria la normale dotazione di laboratorio   ed in particolare :     - apparecchio di misurazione ,     - sistema di aerazione ,     - elettrodo per pH e relativa apparecchiatura   di misurazione ,     - elettrodo ad ossigeno .    1.6.3 . Preparazione dell'inoculo    Come inoculo batterico per il saggio si impiega   fango attivo proveniente da un impianto di trattamento   di liquami prevalentemente domestici .    Se necessario , al ritorno in laboratorio , si   possono rimuovere le particelle grossolane mediante   sedimentazione per un breve periodo ad esempio per   15 minuti , e , quindi , decantare , per l'uso , lo   strato superficiale contenente le particelle solide   più piccole . In alternativa il fango può essere   miscelato per pochi secondi con un agitatore .    Inoltre , ove si presume la presenza di materiali   inibenti , il fango dovrebbe essere lavato con acqua   di rubinetto o con soluzione isotonica . Dopo   centrifugazione si decanta il surnatante ( questo   procedimento si ripete per tre volte ) .    Una piccola quantità di fango umido viene pesata ,   essiccata e ripesata . In questo modo si può calcolare   la quantità di fango umido da sospendere in acqua   per ottenere un fango attivo con una quantità di   solidi sospesi nel liquido chiarificato compresa   tra 2 e 4 gr/l . Questa quantità dà una concentrazione   compresa tra 0,8 e 1,6 g/l nel mezzo utilizzato   per il saggio , se si segue la procedura raccomandata   più sotto .    Se il fango non può essere utilizzato il giorno   stesso del prelievo , ad ogni litro del fango attivo   preparato come sopra si aggiungono 50 ml di liquame   sintetico ; il fango viene quindi aerato per tutta   la notte a 20 ° C ( ± 2 ° C ) . L'aerazione   viene mantenuta anche durante la giornata in attesa   dell'uso prima del quale si controlla e , se necessario ,   si tampona il pH fra 6 e 8 . I solidi sospesi nel   liquido chiarificato si dovrebbero determinare come   descritto nel precedente paragrafo .    Se si deve impiegare lo stesso gruppo di fanghi   nei giorni successivi ( quatro giorni al massimo ) , alla   fine di ogni giornata di lavoro occorrerà aggiungere   altri 50 ml di liquame sintetico , per litro di fango .    1.6.4 . Esecuzione del saggio    Durata/tempo di contatto : 30 minuti e/o 3 ore ,   sotto aerazione ;    Acqua : acqua potabile ( se necessario declorata ) ;    Alimentazione di aria : aria pulita , esente   da oli ; flusso da 0,5 a 1 l/min ;    Apparecchiatura di misurazione : bottiglia a fondo   piatto del tipo della bottiglia per la determinazione   del BOD ;    Ossimetro : idoneo elettrodo ad ossigeno con registratore ;    Soluzione nutritiva : liquame sintetico ( vedi sopra ) ;    Sostanza in esame : la soluzione in esame è   preparata in concomitanza all'inizio del saggio ;    Sostanza di riferimento : ad esempio 3,5-diclorofenolo   ( almeno tre concentrazioni ) ;    Controlli : campioni inoculati esenti dalla sostanza   in esame ;    Temperatura : 20 ° C ( ± 2 ° C ) .    Si descrive in seguito un procedimento sperimentale   che può essere seguito sia per la sostanza in   esame che per quella di riferimento durante il periodo   di contatto di tre ore .    Occorrono diversi recipienti ( ad esempio becher   da 1 litro ) . Si dovrebbe impiegare una serie di   almeno cinque concentrazioni che differiscano tra   di loro di un fattore costante di preferenza non   superiore a 3,2 .    Al tempo « 0 » , si portano 16 ml di liquame   sintetico a 300 ml con acqua . Si aggiungono 200 ml   di inoculo batterico e si versa la miscela totale   ( 500 ml ) in un primo recipiente ( primo controllo C1 ) .    Í recipienti in esame dovrebbero essere aerati   continuativamente in modo da impedire che il livello   di O2 disciolto scenda al di sotto di 2,5 ml/l ed in   modo che , subito prima di misurare la velocità   di respirazione , la concentrazione di O2 sia almeno   uguale a 6,5 mg/l .    Al tempo « 15 minuti » ( 15 minuti è un   intervallo arbitrario ma adeguato ) si ripete la   stessa operazione salvo che 100 ml della soluzione   madre della sostanza in esame vengono aggiunti ai   16 ml di liquame sintetico prima di addizionare   l'acqua sino a 300 ml e l'inoculo batterico sino   al volume di 500 ml . Questa miscela viene quindi   versata in un secondo recipiente ed aerata come   sopra . Si ripete questo procedimento ad intervalli   di 15 minuti con differenti volumi della soluzione   madre della sostanza in esame , in modo da disporre   di una serie di recipienti contenenti diverse   concentrazioni della sostanza in esame . Infine si   prepara un secondo controllo ( C2 ) .    Dopo tre ore si determina il pH e si versa   un'aliquota ben miscelata del contenuto del primo   recipiente nell'apparecchio di misurazione e si   misura la velocità di respirazione per un tempo   fino a 10 minuti .    Questa determinazione viene ripetuta sul contenuto   di ciascun recipiente ad intervalli di 15 minuti ,   in modo che il tempo di contatto per ogni   recipiente sia di tre ore .    La sostanza di riferimento viene saggiata   nello stesso modo su ciascun gruppo di inoculi   batterici .    Quando si devono effettuare misurazioni dopo   30 minuti di contatto , ocorre un procedimento   diverso ( ad esempio con più di un ossimetro ) .    Se si richiede la misura del consumo di ossigeno ,   si preparano altre bottiglie contenenti la sostanza   in esame , il liquame sintetico ed acqua ma non   fango attivo .    Il consumo di ossigeno si misura e registra   dopo un periodo di aerazione di 30 minuti e/o   3 ore ( tempo di contatto ) .    2 . DATI E VALUTAZIONE    La velocità di respirazione si calcola dal   tracciato del registratore nell'intervallo che va da   circa 2,5 a 6,5 mg O2/l , oppure , se la velocità   di respirazione è bassa , per un periodo di   10 minuti . Il tratto di curva di respirazione   in cui si misura la velocità di respirazione   dovrebbe essere lineare .   Se le velocità di respirazione dei due   controlli differiscono tra loro di più del 15 %   o se la EC50 ( 30 minuti e/o 3 ore ) della sostanza   di riferimento non cade nell'intervallo ammesso   ( da 5 a 30 mg/l per il 3,5-diclorofenolo ) ,   la prova non è valida e deve essere ripetuta .    Per ogni concentrazione in esame si calcola   la percentuale di inibizione ( vedi paragrafo 1.2 ) .   Quest'ultima viene riportata in grafico , su   carta lognormale ( o logprobit ) , in funzione   della concentrazione e si ricava un valore di   EC50 .    Usando procedimenti standard si possono determinare   i limiti di confidenza al 95 % per i valori della EC50 .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare ,   se possibile :     - Sostanza in esame : dati di identificazione   chimica .     - Sistema di saggio : origine , concentrazione   ed eventuali trattamenti preliminari del fango   attivo .     - Condizioni del saggio :     - pH della miscela in esame prima di determinare   la respirazione ;     - temperatura ;     - durata ;     - sostanza di riferimento e relativa EC50 misurata ;     - eventuale assunzione abiotica di ossigeno .     - Risultati :     - tutti i dati misurati ;     - curva di inibizione e metodo per il calcolo   della EC50 .     - EC50 e , se possibile , limiti di confidenza   al 95 % , EC20 ed EC80 .     - tutte le osservazioni e le eventuali deviazioni   dal presente metodo che potrebbero aver condizionato   il risultato .    3.2 . Interpretazione dei dati    Dal momento che le complesse interazioni che   si hanno nell'ambiente non possono essere fedelmente   riprodotte in un saggio di laboratorio , il   valore della EC50 dovrebbe essere considerato   semplicemente come una indicazione della probabile   tossicità della sostanza in esame per il fango   attivo usato nel trattamento dei liquami o per i   microorganismi delle acque reflue .    Inoltre , le sostanze in esame aventi effetto   inibitorio sull'ossidazione dell'ammoniaca possono   anche causare curve di inibizione atipiche .   Di conseguenza tali curve dovranno essere interpretate   con cautela .    4 . BIBLIOGRAFIA     ( 1 ) International Standard ISO/8192 - 1986 .     ( 2 ) Broecker , B. e Zahn , R. , Water   Research 11 , ( 1977 ) , pagina 165 .     ( 3 ) Brown , D. , Hitz , H. R. e Schaefer ,   L. , Chemosphere 10 , ( 1981 ) , pagina 245 .     ( 4 ) ETAD ( Ecological and Toxicological   Association of Dyestuffs Manufacturing Industries )   Recommended Method N. 103 , descritto anche in :     ( 5 ) Robra , B. , Wasser/Abwasser 117 ,   ( 1976 ) , pagina 80 .     ( 6 ) Schefer , W. , Textilveredelung 6 ,   ( 1977 ) , pagina 247 .     ( 7 ) OCSE , Parigi 1981 , Linea Guida 209 ,   decisione C(81) 30 def. del Consiglio .    BIODEGRADAZIONE    SAGGIO SCAS MODIFICATO    1 . METODO    1.1 . Introduzione    Scopo del metodo è quello di valutare la   potenziale biodegradabilità ultima di sostanze   organiche solubili in acqua e non volabili ,   esposte per un lungo periodo a concentrazioni   relativamente elevate di microorganismi . La   vitalità dei microorganismi viene mantenuta per   tutto il periodo aggiungendo giornalmente liquami   decantati . ( Per l'intervallo di fine settimana ,   i liquami possono essere conservati a   4 ° C . In alternativa si può usare il   liquame sintetico del saggio di conferma OCSE . )    Nell l'interpretazione dei risultati occorre   tenere conto dell'eventuale assorbimento   fisico-chimico della sostanza in esame sui   solidi in sospensione ( vedi paragrafo 3.2 ) .    A causa del lungo periodo di ritenzione della   fase liquida ( 36 ore ) e dell'aggiunta ,   intermittente di nutrienti , la prova non   riproduce le stesse condizioni che si hanno in un   impianto per il trattamento dei liquami . I   risultati ottenuti con diverse sostanze indicano   che il sistema ha un elevato potenziale di   biodegradazione .    Le condizioni sperimentali sono estremamente   favorevoli alla selezione e/o all'adattamento   di microorganismi capaci di degradare il composto   in esame ( si può seguire questo procedimento   anche per produrre inoculi acclimatati da   utilizzare in altri saggi ) .    Nel presente metodo la biodegradabilità ultima   delle sostanze in esame viene determinata   attraverso la misura della concentrazione del   carbonio organico disciolto ( DOC ) ( è   preferibile determinare il DOC dopo acidificazione   e depurazione anziché dalla differenza   C totale - C inorganico ) .    L'impiego simultaneo di un metodo analitico   specifico consente di determinare la degradazione   primaria della sostanza ( modifica della   struttura chimica della sostanza in esame ) .    Il metodo può essere applicato soltanto alle   sostanze organiche che alle concentrazioni impiegate   per il saggio :     - sono solubili in acqua ( almeno 20 mg/l   di carbonio organico disciolto ) ,     - hanno una tensione di vapore trascurabile ,     - non esercitano effetti inibitori sui batteri ,     - non vengono assorbite in modo significativo   dal sistema sperimentale ,     - non vengono sottratte alla soluzione in   esame mediante formazione di schiume .    Occorre determinare il contenuto di carbonio   organico della sostanza in esame .    Per l'interpretazione dei risultati ottenuti ,   in particolare nei casi in cui i valori siano   bassi o trascurabili , sarà utile disporre di   informazioni sulle proporzioni relative dei   principali componenti della sostanza in esame .    Per l'interpretazione di eventuali valori   bassi e per la scelta di una concentrazione   adeguata al saggio , può essere utile disporre   di informazioni sulla tossicità della sostanza   per i microorganismi .    1.2 . Definizioni e unità    C T = concentrazione della sostanza in   esame espressa come carbonio organico presente   o addizionato al liquame sedimentato all'inizio   del periodo di aerazione ( mg/l )    C t = concentrazione del carbonio organico   disciolto rinvenuto nel surnatante del saggio   alla fine del periodo di aerazione ( mg/l )    C c = concentrazione del carbonio organico   disciolto rinvenuto nel surnatante del controllo   alla fine del periodo di aerazione ( mg/l )    Nel presente metodo la biodegradazione è   definita come eliminazione del carbonio organico .   La biodegradazione può essere espressa come :    1 ) la rimozione percentuale D da della sostanza   aggiunta giornalmente :    D da = ( C T - ( C t - C c ) ) /C T × 100   [ 1 ]    dove :    D da = degradazione/aggiunta giornaliera .    2 ) la rimozione percentuale D ssd di sostanza   rispetto a quella presente all'inizio di ogni   giorno :    D ssd = ( 2 C T + C ti - C ci - 3C t ( i + 1 ) +   3C c ( i + 1 ) ) / ( 2C T + C ti - C ci ) × 100   [ 2 a ) ]     = ( 2C T - 2C ( C t - C c ) ) / ( 2C T +   ( C t - C c ) × 100 [ 2 b ) ]    dove :    D ssd = degradazione/sostanza iniziale   giornaliera .    Gli indici i e ( i + 1 ) si riferiscono al giorno   in cui si effettua la misurazione . L'equazione   ( 2 a ) è consigliata se il DOC dell'effluente   varia giornalmente mentre l'equazione ( 2 b )   pùo essere usata quando il DOC dell'effluente   rimane relativamente costante da un giorno   all'altro .    1.3 . Sostanze di riferimento    In alcuni casi quando si esamina una nuova   sostanza , possono essere utili delle sostanze   di riferimento ; ciò nonostante non si propogono   qui sostanze di riferimento specifiche .    Nell'allegato I vengono forniti dati relativi   a numerosi composti analizzati in un saggio   interlaboratorio soprattutto per consentire di   tanto in tanto la calibrazione del metodo e per   rendere possibile il confronto dei risultati   quando se ne adotta un altro .    1.4 . Principio del metodo    I fanghi attivi provenienti da un impianto   di trattamento dei liquami vengono posti in   una unità semicontinua per fanghi attivi   ( SCAS ) . Si aggiungono il composto in esame e   liquame domestico sedimentato ; si effettua   l'aerazione della miscela per 23 ore . Quindi   si interrompe l'aerazione , si lasciano   decantare i fanghi e si rimouve il surnatante .    I fanghi che rimangono nella camera di aerazione   vengono quindi mescolati con un'altra aliquota   del composto in esame e del liquame , e si ripete   il ciclo .    La biodegradazione si ricava determinando la   quantità di carbonio organico disciolto nel surnatante .   Tale valore viene confrontato con quello trovato   nel surnatante del controllo contenente   soltanto liquame decantato .    Se si utilizza un metodo analitico specifico   si possono determinare le variazioni di concentrazione   della sostanza in esame dovute alla   biodegradazione ( biodegradabilità primaria ) .    1.5 . Criteri di qualità    La riproducibilità di questo metodo basato   sulla rimozione di carbonio organico disciolto   non è stata ancora dimostrata . ( Se si prende   in considerazione la biodegradazione primaria   si ottengono dati molto precisi per sostanze   che siano estesamente degradate . )    La sensibilità del metodo dipende soprattutto dalla   variabilità del bianco ed in minormisura dalla   precisione della determinazione del carbonio organico   disciolto e dalla quantità del composto in esame   presente nel liquido all'inizio di ogni ciclo .    1.6 . Descrizione del metodo    1.6.1 . Preparazioni    Per ciascuna sostanza in esame e per i controlli si   collega un numero sufficiente di unità di aerazione   pulite ( in alternativa si può usare l'unità   originale per il saggio SCAS'da 1,5 litri ) con i tubi   di presa dell'aria ( figura 1 ) . L'aria compressa   inviata nelle unità di saggio , purificata con un   filtro di cotone grezzo , deve essere esente da   carbonio organico e satura di acqua per ridurre le   perdite per evaporazìone .    Da un impianto di trattamento a fanghi attivi adibito   prevalentemente a liquami domestici si preleva un   campione di liquido chiarificato , contente da 1 a 4 g/l   di solidi sospesi . Per ciascuna unità di aerazione   occorrono circa 150 ml di liquido chiarificato .    Si preparano con acqua distillata le soluzioni   madri della sostanza in esame ; di solito è   richiesta una concentrazione di 400 mg/l di   carbonio organico che , se non ha luogo   biodegradazione , corrisponde ad una concentrazione   di sostanza in esame pari a 20 mg/l di carbonio   all'inizio di ogni ciclo di aerazione .    Se la tossicità per i microorganismi lo consente   si possono avere concentrazioni più elevate .   Si misura la concentrazione di carbonio organico   nelle soluzioni madri .    1.6.2 . Condizioni del saggio    Il saggio va effettuato da 20 a 25 ° C . Si   utilizza un'elevata concentrazione di microorganismi   aerobici ( da 1 a 4 g/l di solidi sospesi ) ed il   periodo di ritenzione effettivo è di 36 ore . In   genere , otto ore dopo l'avvio di ciascun ciclo di   aerazione , il carbonio organico contenuto nei   liquami immessi è ampiamente ossidato . Dopo ha inizio   la respirazione endogena del fango che si manterrà   per tutto il rimanente periodo di aerazione , durante   il quale il solo substrato disponible è la sostanza   in esame a meno che non venga anch'essa metabolizzata   rapidamente . Questi fattori , unitamente alla   reinoculazione giornaliera del sistema ( vedi   paragrafo 1.4 ) , nel caso in cui si usino   come mezzo liquami domestici , crea condizioni   estremamente favorevoli sia per l'acclimatazione ,   sia per ottenere elevati valori di biodegradazione .    1.6.3 . Esecuzione del saggio    Si preleva un campione del liquido chiarificato da un   idoneo impianto a fanghi attivi per il trattamento   di liquami in prevalenza domestici oppure da un   impianto di laboratorio e si mantiene in condizioni   aerobiche sino all'impiego in laboratorio . Si   riempie ciascuna unità di aerazione e l'unità   di controllo con 150 ml ( se si utilizza   l'unità originale per il saggio SCAS ,   moltiplicare i volumi per 10 ) di liquido   chiarificato e si avvia l'aerazione . Dopo 23 ore si   interrompe l'aerazione e si lasciano decantare   i fanghi per 45 minuti . Si apre , a turno ,   il rubinetto di ogni recipiente e si prelevano   aliquote da 100 ml di surnatante . Si prepara ,   immediatamente prima dell'impiego , un campione di   liquami domestici decantati e se ne aggiungono   100 ml ai fango cherimane in ciascuna unità di   aerazione . Si avvia nuovamente l'aerazione . A questo   punto non si aggiunge la sostanza da esaminare e si   alimentano giornalmente le unità con liquami   domestici fino a quando si forma per decantazione   un surnatante chiaro . In genere questa fase   richiede al massimo due settimane e nel   frattempo il carbonio organico disciolto nel   surnatante raggiunge alla fine di ogni ciclo di   aerazione un valore costante .    Terminata questa fase , i singoli fanghi   sedimentati vengono mescolati tra loro e 50 ml di   tale miscela vengono introdotti in ciascuna   unità .    95 ml di liquame sedimentato e 5 ml di acqua   vengono aggiunti all'unità di controllo , e 95 ml   di liquame sedimentato più 5 ml della soluzione madre   della sostanza in esame ( 400 mg/l ) vengono   aggiunti alle unità di saggio . Si riavvia l'aerazione   e si protrae per 23 ore . Si lascinano quindi   sedimentare i fanghi per 45 minuti , si preleva   il surnatante e se ne analizza il contenuto di   carbonio organico disciolto .    Le suddette operazioni di riempimento e di   prelievo , vengono ripetute ogni giorno per tutta   la durata del saggio .    Prima della sedimentazione può essere necessario   pulire le pareti delle unità per evitare che si   accumulino solidi al di sopra del livello del liquido .   Per evitare contaminazioni incrociate si utilizza un   raschiatore o una spazzola diversa per ciascuna   unità .    Idealmente , il carbonio organico disciolto nei   surnatanti dovrebbe essere determinato ogni   giorno anche se si può consentire una minore   frequenza delle analisi . Prima delle analisi i liquidi   vengono filtrati mediante filtri a membrana con   pori da 0,45 µm lavati oppure vengono centrifugati .   Il filtri a membrana sono idonei se durante la   filtrazione non liberano carbonio organico né   assorbono la sostanza in esame . Nella centrifuga   la temperatura del campione non deve superare   i 40 gradi centrigradi .    La durata del saggio per i composti che   mostrano una biodegradazione limitata o nulla   non è fissata , ma l'esperienza suggerisce che la   durata dovrebbe essere , in generale , di almeno   12 settimane , ma non più lunga di 26 settimane .    2 . DATI E VALUTAZIONE    I valori del carbonio organico disciolto rilevati nei   surnatanti delle unità di saggio e delle unità di   controllo vengono riportati in grafico in funzione del   tempo .    Con il procedere della biodegradazione i valori   determinati nel saggio si avvicinano a quelli   del controllo . Quando la differenza tra i due livelli si   mantiene costante per oltre tre misurazioni   consecutive , si esegue un numero di ulteriori   misurazioni , tale da effettuare una elaborazione statistica   dei dati e da calcolare la biodegradazione   percentuale subita dalla sostanza in esame ( D da   oppure D ssd , vedi paragrafo 1.2 ) .    3 . RELAZIONE    3.1 . Relazione sul saggio    Nella relazione sul saggio devono figurare ,   se possibile :     - tutte le informazioni sul tipo di liquame ,   sul tipo di unità usata e sui risultati sperimentali   concernenti le sostanze esaminate , la sostanza   di riferimento , se usata , ed il bianco ,     - la temperatura ,     - la curva di rimozione , nonché descrizione   e metodo di calcolo relativi ( vedi paragrafo 1.2 ) ,     - date e luogo di prelievo dei fanghi   attivi e del liquame , stato di adattamento ,   concentrazione , ecc. ,     - motivazioni scientifiche di eventuali modifiche   del procedimento ,     - firma e data .    3.2 . Interpretazioni dei risultati    Dato che le sostanze esaminate con il presente   metodo non sono facilmente biodegradabili , qualsiasi   rimozione del DOC imputabile esclusivamente alla   biodegradazione avviene in genere gradualmente nel   corso di giorni o settimane , ad eccezione di quei   casi in cui avviene una improvvisa acclimatazione   indicata da una brusca scomparsa che si verifica   dopo alcune settimane .    In ogni caso l'assorbimento chimico-fisico può   a volte giocare un ruolo importante ; ciò si verifica   quando all'inizio della prova si riscontra   una parziale o completa rimozione del DOC aggiunto .   Ciò che accade successivamente , dipende da   fattori quali il grado di assorbimento e la   concentrazione di solidi sospesi nell'effluente   di scarico . Di solito la differenza tra   concentrazione del DOC nel controllo e nei   surnatanti del saggio aumenta gradualmente rispetto   al basso valore iniziale e tale differenza si mantiene   quindi al nuovo valore per il resto della prova a meno   che non si verifichi l'acclimatazione .    Se si vuole distinguere nel grafico la biodegradazione   ( o la parziale biodegradazione ) dall'assorbimento ,   sono necessari ulteriori saggi . Questi possono   essere effettuati in diversi modi : il più convincente   è quello di usare il surnatante o i fanghi   come inoculo in un saggio del dossier di base   ( preferibilmente il saggio respirometrico ) .    Le sostanze che in questo saggio mostrano un'elevata   rimozione del DOC , non dovuta ad assorbimento , devono   essere considerate potenzialmente biodegradabili .   Un'eliminazione parziale non dovuta ad assorbimento indica   che la sostanza è almeno in parte biodegradabile .    Valori bassi o nulli di rimozione del DOC possono   essere dovuti ad un effetto inibente della sostanza   in esame sui microorganismi , il che può anche   essere evidenziato da lisi o da riduzione dei fanghi   con formazione di surnatanti torbidi . Il saggio deve   essere ripetuto a concentrazione più bassa della   sostanza in esame .    Il ricorso a un metodo analitico specifico o alla   marcatura della sostanza in esame con il 14C   può permettere una maggiore sensibilità . Nel caso   di composti marcati con 14C lo sviluppo di 14CO2   confermerà che la biodegradazione ha avuto luogo .    Quando i risultati vengono presentati anche come   biodegradazione primaria occorre dare , se possibile ,   una spiegazione del cambiamento di struttura   chimica che causa la diminuzione di risposta della   sostanza in esame .    Si deve dimostrare la validità del metodo   analitico e riportare la risposta fornita dal bianco .    4 . BIBLIOGRAFIA     ( 1 ) OCSE , Parigi 1981 , Linea Guida 302 B ,   decisione C(81) 30 def. del Consiglio .    Appendice 1    Saggio SCAS : Esempio di risultati    Sostanza * C T ( mg/l ) * C t - C c ( mg/l ) *   Biodegradazione percentuale D da * Durata del saggio   ( giorni ) *    4-acetil aminobenzen sulfonato * 17,2 * 2,0 * 85 *   40 *    Tetrapropilene benzen sulfonato * 17,3 * 8,4 * 51,4 * 40 *    4-nitrofenolo * 16,9 * 0,8 * 95,3 * 40 *    Glicol dietilenico * 16,5 * 0,2 * 98,8 * 40 *    Anilina * 16,9 * 1,7 * 95,9 * 40 *    Ciclopentano tetra carbossilato * 17,9 * 3,2 * 81,1 * 120 *    Appendice 2    Esempio di apparecchiatura per il saggio    Figura 1 : v. G.U.