CELEX: 31991D0180
Language: da
Date: 1991-02-14 00:00:00
Title: 91/180/EØF: Kommissionens beslutning af 14. februar 1991 om visse analyse- og prøvemetoder for rå mælk og varmebehandlet mælk

Avis juridique important

|

31991D0180

91/180/EØF: Kommissionens beslutning af 14. februar 1991 om visse analyse- og prøvemetoder for rå mælk og varmebehandlet mælk  

EF-Tidende nr. L 093 af 13/04/1991 s. 0001 - 0048 den finske specialudgave: kapitel 3 bind 37 s. 0012  den svenske specialudgave: kapitel 3 bind 37 s. 0012 

KOMMISSIONENS BESLUTNINGaf 14. februar 1991om  visse analyse- og proevemetoder for raa maelk og varmebehandlet maelk(91/180/EOEF) KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKEFAELLESSKABER HAR -under henvisning til Traktaten om Oprettelse af  Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab, under henvisning til Raadets direktiv 85/397/EOEF af 5. august 1985 om sundhedsmaessige og  dyresundhedsmaessige problemer i forbindelse med handelen inden for Faellesskabet med varmebehandlet  maelk (1), senest aendret ved direktiv 89/662/EOEF (2), saerlig artikel 10, stk. 2, ogud fra foelgende  betragtninger: Ifoelge artikel 10, stk. 2, i direktiv 85/397/EOEF fastsaetter Kommissionen de analyse- og  proevemetoder, der skal benyttes til at kontrollere, om normerne for raa maelk og varmebehandlet maelk  overholdes; for raa maelk boer der fastsaettes metoder, hvorved kimtal, celletal, frysepunkt og tilstedevaerelse af  antibiotika kan bestemmes; for pasteuriseret maelk boer der fastsaettes metoder, hvorved fravaer af patogene kim, antal koliforme  bakterier, kimtal, fravaer af fosfatase, tilstedevaerelse af peroxidase, fravaer af antibiotika og  frysepunkt kan bestemmes; for steriliseret maelk og UHT-maelk boer der fastsaettes metoder, hvorved kimtal og fravaer af  antibiotika kan bestemmes; af tekniske aarsager boer der i foerste omfang fastsaettes referenceanalyse- og -proevemetoder med  henblik paa at sikre overholdelse af visse normer; det er isaer vigtigt at fortsaette med at undersoege  betingelserne for at bruge rutineanalyse- og -proevemetoder; indtil resultatet af denne undersoegelse  foreligger, paahviler det de kompetente myndigheder at drage omsorg for, at der bruges passende  rutinemetoder med henblik paa at sikre, at normerne i direktiv 85/397/EOEF overholdes; bestemmelsen af referenceanalyse- og -proevemetoder omfatter bestemmelse af analysemetoder og  fastsaettelse af paalidelighedskriterier for at sikre ensartet fortolkning af resultaterne; de i denne beslutning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den  Staaende Veterinaerkomité -VEDTAGET FOELGENDE BESLUTNING: Artikel  1Referencemetoderne for analyse og proevning af raa maelk er foelgende: - bestemmelse af frysepunkt- taelling af mirkoorganismer - kimtal ved 30 oC- taelling af somatiske  celler- paavisning af antibiotika og sulfamider. Artikel 2Referencemetoder for analyse og  proevning af pasteuriseret maelk er foelgende: - bestemmelse af frysepunkt- bestemmelse af fosfataseaktivitet- bestemmelse af  peroxidaseaktivitet- taelling af mikroorganismer - kimtal ved 30 oC- taelling af mikroorganismer -  kimtal ved 21 oC- taelling af koliforme bakterier - antal kolonier ved 30 oC- paavisning af  antibiotika og sulfamider- paavisning af patogene mikroorganismer. Artikel 3Referencemetoderne for analyse og proevning af UHT-maelk og steriliseret maelk er  foelgende: - bestemmelse af frysepunkt- taelling af mikroorganismer - kimtal ved 30 oC- paavisning af  antibiotika og sulfamider. Artikel 4Ivaerksaettelsen af referenceanalyse- og -proevemetoderne,  paalidelighedskriterierne og indsamlingen af proever foretages i henhold til bilag I. Artikel 5De i  artikel 1, 2 og 3 omhandlede referenceanalyse- og -proevemetoder er beskrevet i bilag II. Artikel 6Denne beslutning tages op til fornyet overvejelse inden den 31. december 1992 for at  tage hensyn til udviklingen i den videnskabelige og tekniske viden. Artikel 7Denne beslutning er  rettet til medlemsstaterne.Udfaerdiget i Bruxelles, den 14. februar 1991. Paa Kommissionens vegneRay MAC SHARRYMedlem af Kommissionen(1) EFT nr. L 226  af 24. 8. 1985, s. 13. (2) EFT nr. L 395 af 30. 12. 1989, s. 13.  BILAG I   INDHOLDSFORTEGNELSE SideII.  Generelle bestemmelser . 4II. Proeveudtagning af raa og varmebehandlet maelk . 6I. GENERELLE BESTEMMELSER1. IndledningDe generelle bestemmelser gaelder for reagenser, udstyr, angivelse af resultater,  noejagtighed og proeverapport. Medlemsstaternes kompetente myndigheder og de kontrollaboratorier, der  staar for proeveudtagning og kontrol af maelk, skal overholde de generelle bestemmelser. 2. Reagenser2.1. Vand2.1.1. Vand til oploesning, fortynding eller skylning skal, medmindre andet er angivet, vaere destilleret  vand, ionbyttet vand eller demineraliseret vand af mindst tilsvarende renhed. Til mikrobiologiske  formaal skal det vaere fri for stoffer, som kan paavirke vaeksten af mirkoorganismer ved proevens  udfoerelse. 2.1.2. Ved »oploesning« eller »fortynding« uden yderligere angivelse forstaas »oploesning i vand« eller  »fortynding med vand«. 2.2. KemikalierAlle anvendte kemikalier skal, medmindre andet er angivet, vaere af anerkendt  analysekvalitet for reagenser. 3. Udstyr3.1. Lister over udstyrListerne over udstyr i de forskellige referencemetoder indeholder kun elementer  med en saerlig anvendelse og elementer med bestemte specifikationer. 3.2. AnalysevaegtEn analysevaegt er en vaegt, der kan veje med en praecision paa 0,1 mg. 4. Angivelse af resultater4.1. ResultaterDet i analyserapporten angivne resultat skal, medmindre andet er angivet, vaere den  aritmetriske middelvaerdi af to proever, som opfylder det angivne repeterbarhedskriterium (5.1) for  den paagaeldende metode. Hvis repeterbarhedskriteriet ikke opfyldes, skal den paagaeldende proeve  gentages eller resultatet erklaeres ugyldigt. 4.2. ProcentberegningResultatet skal, medmindre andet er angivet, beregnes som en vaegtprocent af  proeven. 5. Noejagtighedskriterier: Repeterbarhed og reproducerbarhed5.1. Noejagtighedskriterierne for hver metode defineres som foelger: 5.1.1. Repeterbarhed (r) er den vaerdi, der ligger under den absolute forskel mellem to enkelte  proeveresultater, som er opnaaet ved samme metode paa identisk proevemateriale under samme betingelser  (samme operatoer, samme apparatur, samme laboratorium og med et kort tidsinterval). 5.1.2. Reproducerbarhed (R) er den vaerdi, der ligger under den absolutte forskel mellem to enkelte  proeveresultater, som er opnaaet ved samme metode paa identisk proevemateriale under forskellige  betingelser (forskellige operatoerer, forskelligt apparatur, forskellige laboratorier og/eller  forskelligt tidsinterval). 5.1.3. Vaerdierne for repeterbarheds- og reproducerbarhedskriterier anfoert i de relevante punkter for hver  metode udgoer de konfidensniveauintervaller paa 95 %, som er defineret i ISO 5725: 2. udgave 1986,  medmindre andet er angivet. De beregnes paa grundlag af resultaterne af anerkendte sammenlignende  proever, som er benyttet til at evaluere metoderne. Der er dog ikke gennemfoert sammenlignende proever  for visse af metoderne. I disse tilfaelde er repeterbarheds- og reproducerbarhedsvaerdierne anslaaet. 5.1.4. De sammenlignende proever og undersoegelser, der omhandles i punkt 5.1.3, skal planlaegges og udfoeres  i overensstemmelse med de internationale retningslinjer. 6. ProeverapportProeverapporten skal specificere den anvendte analysemetode samt de opnaaede resultater.  Den skal desuden oplyse eventuelle enkeltheder om anvendt metodik, som ikke er specificeret i  analysemetoden, eller som ikke er obligatoprisk, samt eventuelle andre omstaendigheder, som kan have  paavirket de opnaaede resultater. Proeverapporten skal indeholde alle noedvendige oplysninger til  fuldstaendig identifikation af proeven. II. PROEVEUDTAGNING AF RAA OG VARMEBEHANDLET MAELK1. Omfang og anvendelsesomraadeDette er en beskrivelse af referencemetoden til udtagning af proever af  raa og varmebehandlet maelk. Denne metode til udtagning, transport og opbevaring af proever gaelder for  raa maelk fra producentens maelkerum samt for raa og varmebehandlet maelk i lager- og transporttanke. De i punkt 2, 4.4, 5 og 6 anfoerte metoder gaelder for proeveudtagning af varmebehandlet maelk til  direkte konsum. 2. GenereltProeveudtagning af raa og varmebehandlet maelk i junger, tanke m.v. skal foretages af en  medarbejder, der er passende oplaert inden proeveudtagningen. Hvis det anses for noedvendigt, skal proeveudtagningspersonalet af de kompetente myndigheder eller  kontrollaboratoriet instrueres om proeveudtagningsteknik med henblik paa at sikre, at proeven er  repraesentativ for og i overensstemmelse med hele partiet. Hvis det anses for noedvendigt, skal proeveudtagningspersonalet af de kompetente myndigheder eller  kontrollaboratoriet instrueres om maerkning af proeven med henblik paa sikker identifikation af den. 3. Proeveudtagningsudstyr3.1. GenereltProeveudtagningsudstyret skal vaere af rustfrit staal eller andet egnet materiale af passende  styrke og med en til formaalet (blanding, proeveudtagning m.v.) egnet konstruktion. Roerestaenger eller  roerevaerker til blanding af vaesker i beholdere skal have et tilstraekkeligt omfang til at blande  produktet passende, uden at der udvikles harsk smag. OEser skal have et solidt haandtag, som er langt  nok til at muliggoere proeveudtagning paa en hvilken som helst dybde i beholderen. OEsens kapacitet  skal vaere mindst 50 ml. Proevebeholdere og lukkeanordninger skal vaere af glas, egnet metal eller plastik. Proeveudtagningsudstyrets (herunder beholdere og lukkeanordninger) konstruktionsmateriale maa ikke  foraarsage aendringer i proeven, som kan indvirke paa resultatet af undersoegelserne. Alle overflader paa  proeveudtagningsudstyr og -beholdere skal vaere rene, toerre, glatte og fri for spraekker; hjoerner skal  vaere afrundede. 3.2. Proeveudtagningsudstyr til mikrobiologisk undersoegelseProeveudtagningsudstyr, herunder beholdere,  skal ud over bestemmelserne i punkt 3.1 vaere sterile. Hvis det samme proeveudtagningsudstyr anvendes til flere proeveudtagninger, skal det efter hver  proeveudtagning rengoeres og steriliseres ifoelge de af kontrollaboratoriet eller den kompetente  myndighed givne anvisninger eller krav paa en saadan maade, at ingen proever forurenes af en  forudgaaende proeve. 4. Proeveudtagningsteknik4.1. GenereltUanset hvilken undersoegelse, der skal udfoeres, skal maelken enten manuelt eller mekanisk  blandes grundigt foer proeveudtagningen. Proeven udtages umiddelbart efter blandingen, mens maelken stadig er i bevaegelse. Naar der samtidig udtages flere proever af maelk i tanke til forskellige undersoegelser, skal proeven  til den mikrobiologiske undersoegelse udtages foerst. Proevens volumen skal vaere i overensstemmelse med kravene. De anvendte proevebeholdere skal have en  saadan kapacitet, at de naesten fyldes helt af proeven, saaledes at indholdet kan blandes ordentligt  inden undersoegelsen, samtidig med at der undgaas kaerning under transporten. 4.2. Manuel proeveudtagning4.2.1. Proeveudtagning fra maelkespande og- jungerFor at opnaa blanding bevaeges en roerestang hurtigt op og  ned i spanden eller jungen, saa det sikres, at maelken blandes ordentligt, og at der ikke haenger  floede fast ved jungens hals. Der skal udtages en repraesentativ proeve for hele partiet i  overensstemmelse med punkt 4.2.4. 4.2.2. Proeveudtagning fra gaardtankeMaelken omroeres mekanisk eller manuelt, indtil der opnaas tilstraekkelig  homogenitet. Hvis maelkemaengden er for lille til, at den mekaniske omroerer kan blande maelken, skal omroeringen ske  manuelt. 4.2.3. Proeveudtagning fra vejebeholderDet er vigtigt, at maelken er tilstraekkeligt blandet, naar den haeldes  over i en vejebeholder. Det kan vaere noedvendigt at omroere maelken yderligere enten manuelt eller  mekanisk for at sikre en jaevn fedtfordeling. Naar maelkemaengder, hvoraf der skal tages proeve,  overstiger vejebeholderens kapacitet, udtages en proeve, der er repraesentativ for hele partiet i  overensstemmelse med punkt 4.2.4. 4.2.4. Proeveudtagning af maelk, der er fordelt paa flere beholdereNaar der skal udtages proeve af maelk, der  er fordelt paa mere end én beholder, tages en repraesentativ maengde fra hver beholder, og det  noteres, hvor meget maelk de respektive proever er udtaget af. Medmindre proeverne fra hver beholder  skal undersoeges enkeltvis, blandes portioner af disse repraesentative maengder i forhold til maengden  i beholderen, hvorfra hver proeve er taget. Der udtages proeve(r) fra disse samlede forholdsmaessige  maengder efter blanding. 4.2.5. Proeveudtagning fra store beholdere, opbevarings-, jernbane- og lastvognstanke4.2.5.1. Maelken blandes efter en egnet metode foer proeveudtagningenDet anbefales at omroere maelken mekanisk  for at blande indholdet i store beholdere eller opbevarings-, jernbane- eller lastvognstanke  (4.2.5.2). Blandingstidens laengde skal vaere afpasset efter, hvor laenge maelken har vaeret i ro. Den  blandingsmetode, der anvendes under givne omstaendigheder, skal paavises at vaere egnet til den  planlagte analyse. Kriteriet for blandingseffektiviteten har saerlig betydning for ligheden mellem  analyseresultater fra proever, der er udtaget fra enten forskellige dele af partiet eller med  mellemrum fra tankens aabning under udstroemningen. En metode til blanding af maelk anses for at vaere  effektiv, hvis forskellen i fedtindholdet mellem to proever, der er udtaget under disse betingelser,  er under 0,1 %. I en stor beholder med aabning i bunden kan der ved aabningsstudsen vaere en lille maengde maelk, som  ikke er repraesentativ for hele indholdet, selv efter blanding. Proever skal derfor helst tages  gennem et mandehul. Hvis der tages proever fra aabningen, skal der udledes en tilstraekkelig maengde  maelk til at sikre, at proeverne er repraesentative for helheden. 4.2.5.2. Blanding af indholdet i store beholdere eller opbevarings-, jernbane- eller lastvognstanke kan  udfoeres: - af en mekanisk omroerer, som er indbygget i tanken og drevet af en elektromotor- af en propel  eller omroerer drevet af en elektromotor og placeret paa mandehullet med omroereren nede i maelken- i  jernbane- eller lastvognstanke ved recirkulation af maelken gennem overfoerselsslangen, der er  fastgjort til laensepumperne og indfoert gennem mandehullet- af ren filtreret trykluft. I dette  tilfaelde skal der benyttes mindst muligt lufttryk for at forhindre udvikling af en harsk smag. 4.3. Automatisk eller halvautomatisk proeveudtagningAutomatiske eller halvautomatiske  proeveudtagningsinstrumenter til proeveudtagning af raa maelk fra leverandoeren kan benyttes i henhold  til kontrollaboratoriets eller anden kompetent myndigheds anvisninger. Saadant udstyr skal, inden det benyttes og regelmaessigt under brugen, gennemgaa relevante proever som  foreskrevet af den ansvarlige myndighed. Proeveudtagningsmetodernes egnethed skal bekraeftes med  henblik paa at fastlaegge: - minimumsvolumen af indsamlet maelk, hvoraf der maa udtages proever- eventuelt overslaeb (som er  afhaengigt af proevens minimumsvolumen)- muligheden for at opnaa en repraesentativ proeve af maelken  efter korrekt omroering. Til anvendelse af automatisk eller halvautomatisk proeveudtagningsudstyr kan den ansvarlige  kompetente nationale myndighed foreskrive: - minimumsvolumen af maelk, hvoraf der maa udtages proever- minimumsvolumen af proeven- maksimalt  overslaeb- hvilke analyser der kan udfoeres, og hvilke sikkerhedsforanstaltninger der skal traeffes. 4.4. Proeveudtagning af varmebehandlet maelk til direkte konsum i forbrugerpakningerProever af  varmebehandlet maelk til direkte konsum i forbrugerpakninger skal udtages af den komplette, ubrudte  pakning. Hvis det er muligt, udtages proeverne fra paafyldningsmaskinen i forarbejdningsvirksomheden  saa hurtigt som muligt efter fremstillingen. Med hensyn til pasteuriseret maelk skal udtagningen ske  paa fremstillingsdagen. Proeverne udtages fra hver type varmebehandlet maelk (pasteuriseret, UHT og steriliseret) i et antal,  som svarer til de undersoegelser, der skal foretages, og i overensstemmelse med kontrollaboratoriets  eller anden kompetent myndigheds anvisninger. 5. Identifikation af proevenProeven (se 2) skal maerkes med en identifikationskode, saaledes at den nemt  kan identificeres ved hjaelp af kontrollaboratoriets eller den kompetente myndigheds anvisninger. 6. Transport og opbevaring af proeverAnvisninger vedroerende transport, opbevaring og tidsinterval  mellem proeveudtagning og analyse af maelken udarbejdes af kontrollaboratoriet alt efter maelketype og  den analysemetode, der vil blive anvendt. Anvisningerne fastlaegges i forstaaelse med den kompetente  nationale myndighed. Anvisningerne omfatter foelgende punkter: - Under transport og opbevaring skal der traeffes sikkerhedsforanstaltninger for at hindre, at  maelken udsaettes for forurenende lugte og direkte sollys. Hvis der anvendes en gennemsigtig beholder  til proeverne, skal denne opbevares moerkt. - Proever af raa maelk, der er udtaget med henblik paa mikrobiologisk analyse, skal transporteres og  opbevares mellem 0 og 4 oC. Tidsintervallet mellem proeveudtagning og analyse skal vaere saa kort som  muligt og under alle omstaendigheder hoejst 36 timer. Den kompetente myndighed kan acceptere en  opbevaringstemperatur mellem 0 og 6 oC, hvis tidsintervallet mellem proeveudtagning og analyse hoejst  er 24 timer. - Proever af pasteuriseret maelk, der er udtaget med henblik paa mikrobiologisk analyse, skal  transporteres og opbevares mellem 0 og 4 oC. Tidsintervallet mellem proeveudtagning og analyse skal  vaere saa kort som muligt og under alle omstaendigheder hoejst 24 timer. - Proever af anden maelk end raa maelk og pasteuriseret maelk, der udtages med henblik paa mikrobiologisk  analyse, skal opbevares nedkoelet i laboratoriet, og tidsintervallet mellem proeveudtagning og  analyse skal vaere saa kort som muligt. Saerlige sikkerhedsforanstaltninger, der skal traeffes i forbindelse med visse former for analyse, er  angivet under de forskellige metoder.  BILAG II   INDHOLDSFORTEGNELSE SideI. Bestemmelse af frysepunkt . 10II. Bestemmelse af fosfataseaktivitet . 16III. Bestemmelse af peroxidaseaktivitet . 19IV. Taelling af mikroorganismer - Kimtal ved 30 oC . 20V. Taelling af mikroorganismer - Kimtal ved 21 oC . 25VI. Taelling af coliforme bakterier - Kolonier ved 30o C . 29VII. Taelling af somatiske celler . 33VIII. Paavisning af antibiotika og sulfonamider . 39IX. Paavisning af patogene mikroorganismer . 48I. BESTEMMELSE AF FRYSEPUNKT1. Omfang og anvendelsesomraadeDette er en beskrivelse af referencemetoden til bestemmelse af  frysepunktet for raa, pasteuriseret, UHT-behandlet og steriliseret soedmaelk, delvis skummetmaelk og  skummetmaelk ved hjaelp af et apparat (termistorkryoskop), hvori termostatvandbadet afkoeles  elektrisk, og hvor en termistorsonde erstatter kviksoelvtermometeret. Der findes to typer instrumenter. Det foerste er et instrument, som soeger det hoejeste frysepunkt paa  frysekurvens »plateau«, mens det andet instrument af kommercielle aarsager er indstillet til at  aflaese paa et bestemt punkt, efter at frysningen er begyndt. Da frysekurverne kan vaere forskellige  for forskellige typer maelk samt for maelk og standardoploesninger, som benyttes til kalibreringen,  kraever denne referencemetode brug af en plateausoeger. Fasttidsinstrumenter kan benyttes til  rutinemaalinger. Frysepunktet benyttes til at bestemme maengden af fremmed vand i maelken, forudsat at proevens  surhedsgrad ikke overstiger 0,18 g maelkesyre pr. 100 ml (jf. 7.4). 2. DefinitionMaelks frysepunkt: Vaerdien opnaas ved maaling i overensstemmelse med den beskrevne metodik  og udtrykkes i grader celcius (oC). 3. PrincipEn analyseproeve af maelk underafkoeles til den rette temperatur afhaengigt af instrumentet, og  krystalliseringen saettes i gang ved mekanisk vibration, som faar temperaturen til at stige hurtigt  til et plateau, som svarer til proevens frysepunkt. Instrumentet kalibreres ved justering til at vise korrekte aflaesninger for to standardoploesninger  ved samme metode som for maelkeproever. Under disse omstaendigheder viser plateauet maelkens frysepunkt  i grader celcius. 4. Apparatur og glasvarerSaedvanligt laboratorieudstyr og i saerdeleshed: 4.1. KryoskopKryoskopet bestaar af et termostatstyret koelebad, termistorsonde (et  halvleder-modstandstermometer) med tilknyttet kredsloeb og et galvanometer eller et display,  proeveomroerer og en indretning til at starte frysningen samt proeveglas. 4.1.1. KoelebadDer kan benyttes to typer koelebad. 4.1.1.1. NeddypningstypenEt velisoleret bad, der indeholder en egnet koelevaeske, som omroeres, saaledes at  temperaturforskellen mellem to vilkaarlige punkter i vaesken ikke overstiger 0,2 oC. Vaeskens  temperatur maa ikke svinge med mere end p 0,5 oC i forhold til den nominelle vaerdi, som er angivet  af fabrikanten. Det er vigtigt, at vaesken i koelebadet holdes paa et konstant niveau. Hele proeveglassets overflade  under volumenmaerket skal vaere daekket af koelevaeske. 4.1.1.2. CirkulationstypenEn stadig stroem af egnet koelevaeske cirkuleres i proeveglasset. Vaeskens temperatur  maa ikke svinge med mere end p 0,5 oC i forhold til den nominelle vaerdi, som er angivet af  fabrikanten. En egnet koelevaeske er en 33 % (v/v) vandig oploesning af etan 1,2 diol (etylenglykol). 4.1.2. Termistor og tilhoerende kredsloebTermistoren skal vaere af glassondetypen med en diameter paa hoejst  1,80 p 0,2 mm og med en kuglediameter paa hoejst 0,31 mm. Termistorens tidskonstant skal vaere paa  under to sekunder, og vaerdien af â (se NB) skal vaere hoej. Driftsspaendingen, stroem- og  stroemtabskonstanten skal sikre, at termistortemperaturen ikke haeves med mere end 0,0005 oC over  omgivelserne ved   0,512 oC. Maksimal tolerance paa modstanden skal vaere p 5 %. Naar sonden er i arbejdsstilling i kryptoskopet, skal spidsen af glasperlen ligge i proeveglassets  akse i et punkt, der er 44,6 p 0,1 mm under glassets kant (se figuren paa side 15). Brugeren skal  have en skabelon, saaledes at sonden kan placeres i denne position. NB: â definerer termistorens modstandstemperaturkarakteristik ved formlen:    d R  ×  R  =  T 2  ,   d Rd T×1R=âT²hvor: T   er temperaturen i kelvinR  er modstanden i ohm ved temperaturen T   d R  ×  R  =  er  temperaturkoefficienten   d Rd T×1R= er temperaturkoefficientenâ   er en konstant, som  afhaenger af det materiale, termistoren er lavet af. Der anbefales en vaerdi paa over 3 000. 4.1.3. Maale- og aflaesningsinstrument4.1.3.1. MaalingsprincipDet anvendte instrument skal fungere efter princippet for soegning af det foerste  »plateau« paa frysepunktskurven. Plateauet er den del af kurven, hvor temperaturen er konstant inden  for p 0,002 oC i mindst 20 sekunder. 4.1.3.2. Manuel betjeningTermistorens modstand afbalanceres ved hjaelp af en wheatstonebro eller et lignende  instrument, hvor der benyttes stabile modstande af hoejeste kvalitet, hvis tolerance ikke er stoerre  end p 10 %, og hvis temperaturkoefficient ikke overstiger 2 × 10 &  pr. grad celsius. Den variable (balance) modstand maa ikke afvige fra lineariteten i hele sin udstraekning med mere end  0,3 % af maksimumsvaerdien. Det skal vaere muligt at justere modstandene i kalibreringsoejemed. Maaleskalaen skal gradueres i intervaller paa ikke over 0,001 oC. 4.1.3.3. Automatisk betjeningMaaleinstrumentet skal have en aflaesningsnoejagtighed paa mindst 0,001 oC paa  skalaen 0 til   1 oC. Maaleinstrumentets og det tilhoerende kredsloebs stabilitet skal vaere af en saadan art, at paa hinanden  foelgende indikationer af den samme temperatur ikke svinger med mere end 0,001 oC. Kredsloebets linearitet skal vaere af en saadan art, at der ikke opstaar en fejl paa mere end p 0,001 oC  paa noget punkt inden for skalaen   0,400 oC til   0,600 oC, naar instrumentet betjenes korrekt. 4.1.4. RoeretraadDer benyttes en roeretraad af metal med en diameter paa 1-1,5 mm, som er inert over for maelk,  til at roere i analyseproeven. Roeretraadens amplitude skal kunne justeres, og den monteres vertikalt med den nederste ende paa  niveau med termistorsondens spids. En tolerance paa ca. 1,5 mm over eller under denne position er  tilladt. Roeretraaden skal vibrere lateralt med en tilstraekkelig amplitude angivet af fabrikanten (ikke under  p 1,5 mm) for at sikre, at temperaturen i analyseproeven forbliver ensartet under bestemmelsen. Paa  intet tidspunkt under den normale omroering maa roeretraaden ramme termistorsonden eller glassets vaeg. 4.1.5. Instrument til start af frysningDette kan vaere en vilkaarlig indretning, som straks, naar den  betjenes, starter frysning af proeven, saaledes at analyseproevens temperatur stiger mod frysepunktet.  Roeretraaden kan benyttes til dette formaal. En metode er at oege svingningsbredden i 1-2 sekunder,  saaledes at roeretraaden rammer proeveglassets vaeg. 4.1.6. ProeveglasProeveglassene (se fig. 1) skal vaere af glas og 50,8 p 0,1 mm lange, 16,0 p 0,1 mm i  udvendig diameter og 13,5 p 0,1 mm i indvendig diameter. Vaegtykkelsen i hele glasset maa ikke afvige  med mere end 0,1 mm. Glassene skal have et volumenmaerke 29,8 mm fra den oeverste kant (21 mm over glassets bund) for at  angive et proevevolumen paa 2,5 p 0,1 ml. 4.1.7. ElektricitetsforsyningSpaendingen skal stabiliseres enten i apparatet eller eksternt, saaledes at  svingningen ikke overstiger p 1 % af den nominelle vaerdi, naar forsyningen fra lysnettet svinger med  p 6 %. 4.2. Analysevaegt4.3. Maaleflasker med ét maerke, kapacitet 1 000 ml, klasse A. 4.4. Toerreovn, velventileret, som kan holde en temperatur paa 130 p 1 oCellerelektrisk ovn, ventileret,  som kan holde en temperatur paa 300 p 25 oC. 4.5. Ekssikkator5. Reagenser5.1. Borsilikatglasdestilleret vand, kogt og afkoelet til 20 p 2 oC i en kolbe med  kuldioxidabsorptionsroer. 5.2. Natriumklorid, analysereagenskvalitet, fintmalet, toerret i fem timer ved 300 p 25 oC i en ovn eller  alternativt toerret i en ovn ved 130 p 1 oC i mindst 24 timer og afkoelet til stuetemperatur i en  effektiv ekssikkator. 5.3. Fremstilling af standardoploesningerEt passende kvantum (se tabel 1) toer natriumklorid (5.2)  afvejes i en vejeflaske. Det oploeses i destilleret vand (5.1), overfoeres kvantitativt til en 1 000  ml maaleflaske med ét maerke og fortyndes til maerket med vand ved 20 p 2 oC. Opbevares ved ca. 5 oC i polyetylenflasker med taetsluttende laag med en kapacitet, der ikke  overstiger 250 ml, i hoejst to maaneder.>TABELPOSITION>Inden en standardoploesning benyttes, vendes  og drejes flasken forsigtigt flere gange, saa indholdet blandes grundigt. En standardoploesning maa paa  intet tidspunkt bevaeges saa kraftigt, at der kommer luft ind. Der udtages proever af en standardoploesning fra flasken ved overhaeldning af oploesning i et rent,  toert baegerglas, dvs. der maa aldrig benyttes pipetter til dette formaal. Der maa ikke bruges oploesninger fra flasker, der er mindre end kvart fyldte, og hvis de ikke er  konserveret med et fungicid (f.eks. tiomersaloploesning 10 g/l), maa de ikke benyttes, hvis de er  over to maaneder gamle. 6. Kalibrering af termistorkryoskopKryoskopet skal etableres saaledes, at temperaturen i den omgivende  luft ikke afviger mere end 1 oC fra den temperatur, hvor kalibreringen foretages. Kryoskopet maa  ikke udsaettes for sollys, traek eller temperaturer over 26-27 oC. Det maa kontrolleres, at kryoskopet fungerer tilfredsstillende ifoelge brugsanvisningen, og at der  taendes for det mindst 12 timer foer kalibreringen. Sondens position, roeretraadens amplitude samt  koelevaeskernes temperatur kontrolleres. Der vaelges to standardoploesninger (se tabel 1), som ligger taet op ad den forventede vaerdi af  frysepunktet for de maelkeproever, der skal kontrolleres. Forskellen mellem de to oploesningers  frysepunkt maa helst ikke vaere mindre end   0,100 oC. (I visse udformninger af de kryoskoper, der faas i handelen, er kredsloebet, som er forbundet med  termistoren, konstrueret, saa det balancerer ved et bestemt frysepunkt paa instrumentets maaleskala. I  saadanne tilfaelde lettes kalibreringen ved brug af en standardoploesning med dette frysepunkt som en  af kalibreringsoploesningerne, og fabrikanten skal angive denne vaerdi). 2,5 p 0,1 ml af én standard pipetteres i et rent, toert proeveglas, og kryoskopet betjenes. NB: Proeveglassene, der benyttes under kalibreringen, skal vaere af samme type glas og vaskes og skylles  med demineraliseret vand paa samme tid som de glas, der benyttes til kontrol af maelkeproeverne.  Standardoploesningernes temperaturer skal svare til maelkeproevernes temperaturer. Kalibreringskontrollerne justeres ifoelge brugsanvisningen, indtil kryoskopmaalingen svarer til  standardoploesningens frysepunkt. Dette gentages med den anden standardoploesning, og der fortsaettes  med skiftevis den ene og den anden oploesning, indtil flere paa hinanden foelgende maalinger for hver  oploesning uden yderligere justering af kalibreringskontrollerne viser den korrekte vaerdi af hver  oploesnings frysepunkt. Kryoskopet er nu klar til brug og vil direkte uden nogen korrektion angive  maelkeproevens frysepunkt. 7. Forbehandling af proeven7.1. Om noedvendigt opbevares proever ved en temperatur paa 0-5 oC. 7.2. Synlige fremmedlegemer eller fast maelkefedt fra proeven fjernes eventuelt ved filtrering over i en  ren, toer beholder, og proeven blandes forsigtigt. Hvis der benyttes filter, skal det vaere inert over  for maelk, og det skal vaere effektivt, naar det benyttes ved laboratorietemperatur. 7.3. Maelken kan kontrolleres ved opbevaringstemperatur (0-5 oC) eller ved laboratorietemperatur straks  foer proevens paabegyndelse. Det er dog noedvendigt, at standardoploesningerne og maelkeproeverne har  samme temperatur ved brug. 7.4. Maelkens titrerbare surhedsgrad bestemmes saa sent som muligt foer frysepunktundersoegelsen. Proever med  en surhedsgrad paa over 0,18 g maelkesyre pr. 100 ml maelk kan ikke undersoeges. 7.5. UHT-behandlet og steriliseret maelk skal henstaa i mindst 20 minutter i en aaben beholder foer  undersoegelse. 8. Metodik8.1. Indledende kontrolDet kontrolleres, at koelevaeskens niveau og temperatur er i overensstemmelse med  brugsanvisningen, og om noedvendigt, at termistorsonden er i et tomt proeveglas i proevebroenden. Der  taendes for kryoskopet, og det kontrolleres, at koelevaesken omroeres eller cirkuleres korrekt. Naar  kryoskopet har vaeret taendt i mindst 12 timer, kontrolleres koelevaeskens temperatur og roeretraadens  position og amplitude. 8.2. RutinekalibreringskontrolFoer hver proeveraekke maales en standardnatriumkloridoploesnings frysepunkt  (f.eks. en oploesning med frysepunkt paa   0,512 oC), indtil to paa hinanden foelgende bestemmelser  ikke afviger med mere end 0,001 oC. Hvis middelvaerdien afviger med mere end 0,002 oC fra  standardoploesningens frysepunkt, rekalibreres kryoskopet som beskrevet i punkt 6. Hvis kryoskopet benyttes loebende, foretages rutinekalibreringskontrollen mindst én gang i timen ved  at foelge brugsanvisningen. 8.3. Bestemmelse af maelkens frysepunktMaelkeproeveflasken vendes og drejes forsigtigt flere gange for at  blande indholdet. En proeve maa paa intet tidspunkt bevaeges saa kraftigt, at der kommer luft ind. 2,5 p 0,1 ml af maelken pipetteres i et rent, toert proeveglas, og eventuelt overskud fjernes med en  pipette. Det kontrolleres, at sonden og roeretraaden er rene og toerre, eventuelt ved omhyggelig  aftoerring med en bloed, ren, fnugfri klud nedefra og opefter. Proeveglasset indsaettes i det kalibrerede kryoskop ifoelge brugsanvisningen. Maelken afkoeles, og  frysningen startes ved en af fabrikanten angivet temperatur p 0,1 oC. (Paa visse automatiske instrumenter kan denne temperatur iagttages paa den digitale display. Paa  manuelle instrumenter opnaas den noedvendige praecision ved at sikre, at frysningen starter, naar  galvanometret viser den rigtige temperatur). Hvis frysning af en eller anden grund startes foer eller efter den angivne temperatur, opgives  proeven, og der gentages med en anden maelkeportion. Hvis ogsaa den gentagne proeve fryser foer den  angivne temperatur, opvarmes endnu en proeveportion til 45 oC og holdes der i fem minutter, saa  krystallinsk fedt kan smelte. Den nedkoeles derefter til proevetemperaturen og undersoeges straks. Maelkens temperatur stiger  hurtigt, efter at frysningen starter, til en vaerdi, som forbliver praktisk taget konstant i nogen  tid, foer den falder igen. Frysepunktet svarer til den hoejeste temperatur, der er naaet i denne  periode, og denne vaerdi registreres. NB: Den tid, hvori temperaturen er konstant, og tidsintervallet mellem frysningens start og opnaaelse af  den hoejeste temperatur, varierer fra proeve til proeve og vil vaere betydeligt kortere for vand og  standardnatriumkloridoploesninger end for maelk. Det er vigtigt, at det er den hoejeste temperatur,  der registreres. Naar maalingen er afsluttet tilfredsstillende, fjernes glasset og skylles med vand, hvorefter  termistorsonden og roeretraaden aftoerres med en bloed, ren, fnugfri klud nedefra og opefter, og der  foretages en tilsvarende bestemmelse af en anden portion af maelkeproeven. Hvis forskellen mellem de konstaterede frysepunkter er stoerre end vaerdien af repeterbarheden (0,004  oC), foretages en dobbeltbestemmelse af en anden portion af proeven. Stemmer de to bestemmelser  overens ved naer 0,004 oC, registreres vaerdierne og benyttes til beregning af det endelige  resultat. 8.4. Afkoeling af sondeEfter brug af instrumentet placeres et tomt proeveglas i proevebroenden, og  betjeningshovedet nedsaenkes, saa sonden holdes afkoelet. (I visse udformninger af kryoskoper er dette  maaske ikke muligt. I saa fald er det vigtigt at kontrollere, at sonden er tilstraekkelig afkoelet, foer  der tages maalinger, f.eks. ved at foretage flere forsoegsbestemmelser, indtil der opnaas konsistente  maalinger). 9. Angivelse af resultater9.1. BeregningHvis kalibreringen bekraeftes efter rutinekalibreringskontrollen, beregnes middelvaerdierne  af de acceptable dobbeltfrysepunktsbestemmelser afrundet til tre decimaler. Hvis summen af to acceptable dobbeltbestemmelser er et ulige tal, afrundes middelvaerdien til det  naermeste lige tal som vist i foelgende eksempel:>TABELPOSITION>9.2. Noejagighed9.2.1. Repeterbarhed (r): 0,004o C. 9.2.2. Reproducerbarhed (R): 0,006o C.>START GRAFIK>Detailtegning af termistorkryoskop 4.1 (placering af  proeveglas i forhold til termistorkugle og roeretraad)<?aa1V><?aeRV3><?aeFN32,"SLUT GRAFIK>II.  BESTEMMELSE AF FOSFATASEAKTIVITET1. Omfang og anvendelsesomraadeDette er en beskrivelse af referencemetoden til bestemmelse af  fosfataseaktiviteten i pasteuriseret maelk. 2. Definition2.1. Fosfataseaktiviteten er et maal for maengden af aktiv, alkalisk fosfatase i produktet udtrykt som  maengden af fenol i mikrogram, der frigoeres af 1 ml af den pasteuriserede maelk under betingelser,  der er naevnt i metoden. 2.2. Maelk, hvis fosfataseaktivitet er under 4 ìg/ml, anses for at vaere fosfatasenegativ. 3. PrincipFosfataseaktiviteten bestemmes paa grundlag af maengden af fenol, der frigoeres fra det  dinatriumfenylfosfat, som tilsaettes proeven. Den frigjorte fenol reagerer med dibromkinonklorimid og  danner dibromindofenol (blaalig), som maales kolorimetrisk ved 610 nm. Der foretages en samenligning  med en proeve, hvor fosfataseenzymet er oedelagt. 4. Reagenser4.1. Bariumborathydroxid-buffer4.1.1. 50,0 g bariumhydroxid (Ba(OH)2 78H2O) oploeses i vand til hoejst 1 000 ml. 4.1.2. 22,0 g borsyre (H3BO3) oploeses i vand til hoejst 1 000 ml. 4.1.3. 500 ml af hver oploesning opvarmes til 50 oC, oploesningerne blandes, omroeres, afkoeles hurtigt til  ca. 20 oC, og om noedvendigt justeres pH-vaerdien til 10,6 p 0,1 ved tilsaetning af oploesning 4.1.1  eller 4.1.2. Oploesningen filtreres. Oploesningen opbevares i en beholder med taetsluttende laag. 4.1.4. Oploesningen fortyndes inden brug med en tilsvarende maengde vand. 4.2. Farveudviklingsbuffer6,0 g natriummetaborat (NaBO2) eller 12,6 g NaBO2 74H2O samt 20,0 g  natriumklorid (NaCl) oploeses i vand til hoejst 1 000 ml. 4.3. Farvefortyndingsbuffer10 ml af farveudviklings-bufferen (4.2) fortyndes med vand til 100 ml. 4.4. Buffersubstrat0,1 g fenolfrit dinatriumfenylfosfatdehydrat oploeses i 100 ml buffer (4.1.3) eller  0,5 g dinatriumfenylfosfat oploeses i 4,5 ml farveudviklings-buffer (4.2), to draaber BKK-oploesning  (4.6) tilsaettes, og oploesningen henstaar ved stuetemperatur i 30 minutter. Den saaledes dannede farve  ekstraheres med 2,5 ml butan-1-ol og henstaar, indtil butan-1-ol udskilles. Butan-1-ol fjernes og  kasseres. Denne ekstraktion gentages eventuelt. Oploesningen kan opbevares i koeleskab i et par doegn. Farven udvikles og reekstraheres foer brug.  Buffer-substratet fremstilles umiddelbart foer brug ved fortynding af 1 ml af denne oploesning til  100 ml med bariumborathydroxid-buffer (4.1.3). 4.5. Zink-kobber faeldningsmiddel3.0 g zinksulfat (ZnSO4,7H2O) og 0,6 g kobber (II) sulfat (CuSO4,5H2O)  oploeses i vand til 100 ml. 4.6. 2,6-dibromkinonklorimidoploesning (BKK-oploesning)40 p 1 mg 2,6-dibromkinonklorimidoploesning (BKK)  (C6H2Br2ClNO6) oploeses i 10 ml 96 % (v/v) ethanol. Oploesningen opbevares i en brun flaske i koeleskab. Den kasseres, hvis den misfarves eller er over  en maaned gammel. 4.7. Kobber (II) sulfatoploesning0,05 g kobber (II) sulfat (CuSO4 75H2O) oploeses i vand til 100 ml. 4.8. Standardfenoloploesninger4.8.1. 200 mg p 2 mg ren, vandfri fenol vejes og overfoeres til en 100 ml maaleflaske; der tilsaettes vand,  blandes og fyldes op til maerket. Denne stamoploesning forbliver stabil i flere maaneder, naar den  opbevares i koeleskab. 4.8.2. 10 ml stamoploesning fortyndes til 100 ml med vand og blandes. 1 ml indeholder 200ìg fenol. 5. Apparatur og glasvarerNB: a)  Alle glasvarer, propper og proeveudtagningsredskaber skal rengoeres omhyggeligt. Det anbefales at  skylle dem med nykogt, destilleret vand eller at dampe dem. b)  Visse typer plastikpropper kan give fenolforurening, og saadanne maa ikke benyttes. Saedvanligt laboratorieudstyr og i saerdeleshed: 5.1. Analysevaegt5.2. Vandbad, som kan holdes paa 37 p 1 oC. 5.3. Spektrofotometer, egnet til maalinger ved en boelgelaengde paa 610 nm. 5.4. Reagensglas, 16 eller 18 mm × 150 mm, helst gradueret ved 5 og 10 ml. 5.5. Pipetter5.6. Glastragte i passende stoerrelse, f.eks. med 5 cm diameter. 5.7. Foldefiltre paa mindst 9 cm i diameter til middel filtreringshastighed. 5.8. Maalekolber til fremstilling af standardoploesninger. 6. MetodikNB: a)  Man skal undgaa sollys under bestemmelsen. b)  Forurening med spor af spyt eller sved kan give falske positive resultater og skal undgaas. I  den forbindelse skal man vaere saerlig opmaerksom paa pipetteringer. 6.1. Forbehandling af proeven6.1.1. Analysen foretages umiddelbart efter proeveudtagning. Ellers opbevares proeven i koeleskab, dog hoejst  i to doegn. 6.2. Analyseproeve1 ml af proeven pipetteres over i hvert af to reagensglas (5.4). Et glas benyttes til  kontrol- eller blindproeve. 6.3. Bestemmelse6.3.1. Blindproeven opvarmes i to minutter i kogende vand. Reagensglasset og baegerglasset med kogende vand  tildaekkes med aluminiumsfolie for at sikre, at hele glasset opvarmes. Der afkoeles hurtigt til  stuetemperatur. 6.3.2. Blindproeven og proeven behandles paa samme maade i resten af processen. 10 ml buffersubstrat (4.4)  tilsaettes og der blandes. 6.3.3. Proeverne inkuberes straks i vandbadet (5.2) i 60 minutter, idet indholdet af og til blandes (mindst  fire gange). 6.3.4. Proeverne opvarmes i kogende vand i to minutter paa samme maade som anfoert under 6.3.1. De afkoeles  hurtigt til stuetemperatur. 6.3.5. 1 ml zink-kobber faeldningsmiddel (4.5) tilsaettes til hvert glas, og der blandes grundigt. 6.3.6. Proeverne filtreres gennem toert filtrerpapir. De foerste 2 ml kasseres. Eventuelt filtreres igen,  indtil filtratet er helt klart, og der opsamles 5 ml i et reagensglas. 6.3.7. 5 ml farveudviklingsbuffer (4.2) tilsaettes. 6.3.8. 0,1 ml BKK-oploesning (4.6) tilsaettes, der blandes, og man lader farven udvikle sig i 30 minutter  ved stuetemperatur. 6.3.9Absorbansen i forhold til kontrol- eller blindproeven maales i spektrofotometret (5.3) ved en  boelgelaengde paa 610 nm. 6.3.10. Bestemmelsen gentages med en passende fortynding af proeven, hvis absorbansen som maalt under 6.3.9  overstiger absorbansen af standardoploesningen, som indeholder 20 ìg fenol pr. glas som maalt i  6.4.4. Denne fortynding tilberedes ved blanding af et volumen af proeven med et passende volumen af  en del af den samme proeve forsigtigt opvarmet til kogepunktet for at inaktivere fosfatasen. 6.4. Udarbejdelse af kalibreringskurven6.4.1. Der laves en passende skala af fortyndede standarder med udgangspunkt i standardfenol (4.8.2)  indeholdende 0 (kontrol- eller blindproeve), 2, 5, 10 og 20 ìg fenol pr. milliliter, og der  pipetteres henholdsvis 1 ml vand og 1 ml af de fire standardfenoloploesninger over i hvert af de fem  reagensglas. 6.4.2. Til hvert reagensglas tilsaettes 1 ml kobber(II)sulfatoploesning (4,7), 5 ml farvefortyndingsbuffer  (4.3), 3 ml vand og 0,1 ml BKK-oploesning (4.6). Der blandes. 6.4.3. Man lader farven udvikle sig i 30 minutter ved stuetemperatur. 6.4.4. Absorbansen maales i forhold til kontrol- eller blindproeven i spektrofotometeret ved en boelgelaengde  paa 610 nm. 6.4.5. Paa grundlag af absorbansvaerdierne (6.4.4), som er opnaaet for hver maengde tilsat fenol (6.4.1),  beregnes regressionslinjen efter de mindste kvadraters metode. 7. Angivelse af resultater7.1. Beregning og formel7.1.1. Paa grundlag af absorbansmaalingen (6.3.9) beregnes maengden af fenol ved hjaelp af den opnaaede  regressionslinje (6.4.5). 7.1.2. Fosfataseaktiviteten beregnes som mikrogram fenol pr. milliliter af den pasteuriserede maelk ved  foelgende formel: Fosfataseaktivitet = 2,4 × A × DhvorAer maengden af fenol i mikrogram opnaaet under 7.1.1Der  fortyndingsfaktoren for fortyndingen i henhold til 6.3.10 (hvor der ikke sker fortynding, er D =  1). Faktoren 2,4 er fortyndningsfaktoren (¹/12 af 1 ml proeve) - se 6.2 i forbindelse med 6.3.2, 6.3.5  og 6.3.6. 7.2. Noejagtighed7.2.1. Repeterbarhed (r): 2ìg fenol/ml. 7.2.2. Reproducerbarhed (R): 3 ìg (foreloebig) fenol/ml. 7.2.3. Hvis en fortynding anvendes ifoelge 6.3.10, henviser den i 7.2.1 og 7.2.2 naevnte graense til de  resultater, der er opnaaet med den fortyndede proeve. III. BESTEMMELSE AF PEROXIDASEAKTIVITET1. Omfang og anvendelsesomraadeDette er en beskrivelse af referencemetoden til bestemmelse af  tilstedevaerelse eller fravaer af peroxidaseenzym i maelk til kontrol med pasteuriseringen. 2. DefinitionPeroxidase-positiv reaktionHvis maelken er korrekt pasteuriseret, farves den blaa senest  30 sekunder efter iblandingen. Peroxidase-negativ reaktionDer sker ikke nogen blaafarvning inden for 30 sekunder efter  blandingen. 3. PrincipPeroxidaseenzymet nedbryder brintoverilte. Den frigjorte atomare ilt oxiderer det farveloese  1,4-fenylendiamin til det violette indofenol (Storchs proeve). Farveintensiteten er proportional med  enzymets koncentration. 4. Reagenser4.1. Oploesning af 1,4-fenylendiamin2 g 1,4-fenylendiamin (C6H8N2) oploeses i varmt vand (50 oC) til et  volumen paa 100 ml. Oploesningen opbevares koeligt og moerkt i en moerkebrun flaske med glasprop. En  1,4-fenylendiaminoploesning danner bundfald i loebet af et til to doegn. Den skal saa kasseres. 4.2. Brintoverilteoploesning9 ml brintoverilte 30 % fortyndes i vand til et volumen paa 100 ml. 1 ml  koncentreret svovlsyre pr. liter oploesning tilsaettes til stabilisering. Brintoverilteoploesningen er stabil i en maaned, hvis den opbevares koeligt og moerkt i en flaske med  glasprop, saa den ikke kommer i kontakt med organiske forbindelser. 5. Metodik5.1. 5 ml af maelkeproeven overfoeres til et rent reagensglas med passende lukning. 5.2. 5 ml 1,4-fenylendiaminoploesning (4.1) tilsaettes. 5.3. To draaber brintoverilteoploesning (4.2) tilsaettes. 5.4. Man maa holde oeje med farvereaktionen inden for 30 sekunder efter blanding. Hvis den blaa farve  fremkommer over 30 sekunder efter tilsaetning af reagenserne, er reaktionen uspecifik. IV. TAELLING AF MIKROORGANISMER - KIMTAL VED 30 oC1. Omfang og anvendelsesomraadeDette er en beskrivelse af referencemetoden til taelling af  mikroorganismer ved hjaelp af en kolonitaellingsteknik ved 30 oC. Denne metode er anvendelig for raa og pasteuriseret maelk samt for UHT-behandlet og steriliseret  maelk, der er forinkubereret ved 30 oC i 15 doegn. 2. DefinitionVed »mikroorganismer« forstaas organismer, som danner taellelige kolonier, naar de  inkuberes aerobt under de beskrevne betingelser. 3. PrincipEn defineret maengde af maelkeproeven blandes med naeringssubstratet i petriskaale og inkuberes  ved 30 oC i 72 timer. Kolonierne taelles, og antallet af mikroorganismer pr. 1 ml raa eller  pasteuriseret maelk eller pr. 0,1 ml forinkubereret UHT-behandlet eller steriliseret maelk beregnes. 4. Apparatur og glasvarerSaedvanligt laboratorieudstyr og i saerdeleshed: 4.1. Apparater4.1.1. Varmluftsovn, der kan fungere ved 170-175 oC. 4.1.2. Autoklave, der kan fungere ved 121 p 1 oC. 4.1.3. Varmeskab, der overalt kan holde en temperatur paa 30 p 1 oC. 4.1.4. pH-meter med en noejagtighed paa p 0,1 pH-enhed med temperaturkompensation. 4.1.5. Vandbad, der kan holde en temperatur paa 45 p 1 oC. 4.1.6. Lup, 2-4 gange forstoerrelse. 4.1.7. Lup, 8-10 gange forstoerrelse. 4.1.8. Taelleinstrument4.1.9. Mixer, der kan blande 1 ml maelkeproeve eller tifoldsfortynding med 9 ml fortyndingsvaeske, og som  fungerer efter princippet for excentrisk rotation af indholdet i reagensglasset. 4.2. Glasvarer4.2.1. Reagensglas med passende lukkeanordninger og tilstraekkelig kapacitet til at indeholde 10 ml af den  primaere fortynding eller af yderligere tifoldsfortyndinger, idet der samtidig skal vaere plads nok  til at blande. 4.2.2. Flasker med en kapacitet paa 150-250 ml eller glas med en kapacitet paa ca. 20 ml til opbevaring af  naeringssubstratet. 4.2.3. Pipetter (med vatprop) af glas eller sterilt, syntetisk materiale med ubeskadiget spids og en  nominel kapacitet paa 1 ml samt en aabning med en diameter paa 1,75-3 mm. 4.2.4. Petriskaale af klart, ufarvet glas eller sterilt, syntetisk materiale. Den nederste skaal med en  indvendig diameter paa ca. 90-100 mm. Den indvendige dybde skal vaere mindst 10 mm. Bunden skal vaere  uden ujaevnheder, som forstyrrer taellingen af kolonier. 4.2.5. Sterilisation af glasvarerGlasvarer steriliseres ved en af foelgende metoder: a)  henstand ved 170-175 oC i mindst en time i varmluftsovn (4.1.1)b)  henstand ved 121 p 1 oC i  mindst 20 minutter i autoklave (4.1.2). Det skal sikres, at der sker tilstraekkelig gennemtraengning af damp i autoklaven; hvis udstyret  f.eks. steriliseres i beholdere, skal disse ikke lukkes taet, og flasker skal have loestsiddende  laag. Glasvarer, som steriliseres i autoklaven, toerres ved dampventilation. Pipetter steriliseres i en varmluftsovn (4.1.1). 5. Dyrkningssubstrat - Milk plate count agar5.1. SammensaetningGaerekstrakt2,5 gTrypton5,0 gGlukose D(+) eller dextrose1,0  gSkummetmaelkspulver1,0 gAgar10-15 g (afhaengigt af den anvendte agars gelatineringsevne)Vand1  000 ml. Skummetmaelkspulveret skal vaere frit for haemmende stoffer. Dette skal sikres ved sammenlignende  undersoegelser, hvor der anvendes skummetmaelkspulver, som ikke indeholder haemmende stoffer. Fremstilling: Bestanddelene opslaemmes og oploeses i vand i foelgende raekkefoelge: gaerekstrakt, trypton, glukose og  endelig skummetmaelkspulver. Opvarmning af opslaemningen fremmer denne proces. Agaren tilsaettes, og  der opvarmes til kogepunktet under stadig omroering, eller i stroemmende vanddamp i ca. 30 minutter  indtil agaren er fuldstaendig oploest. Eventuelt filtreres gennem filtrerpapir. pH-vaerdien kontrolleres med et pH-meter (4.1.4) og justeres eventuelt, saaledes at den efter  sterilisation er 6,9 p 0,1 ved 25 oC, idet der benyttes en oploesning (mindst 0,1 mol/l) af  natriumhydroxid eller saltsyre. 5.2. Fordeling, sterilisation og opbevaring af naeringssubstratSubstratet (5.1) fordeles i portioner af  100-150 ml i flasker eller 12-15 ml i glas (4.2.2). Kolberne og glassene tilproppes. Der steriliseres i autoklave (4.1.2) ved 121 p 1 oC i 15 minutter. Substratets pH kontrolleres. Hvis substratet ikke skal bruges med det samme, opbevares det moerkt ved en temperatur paa 1-5 oC i  hoejst en maaned efter fremstillingen. 5.3. Dehydreret naeringssubstrat - kommercielt tilgaengeligtNaeringssubstratet (5.1) kan fremstilles af  dehydreret substrat. Brugsanvisningen foelges, men skummetmaelkspulveret tilsaettes inden oploesning,  hvis det ikke er en bestanddel. pH-vaerdien justeres til 6,9 p 0,1 ved 25 oC som beskrevet i 5.1, og substratet fordeles,  steriliseres og opbevares som beskrevet i 5.2. 6. Fortyndingsvaeske6.1Pepton-/saltoploesning: Sammensaetning: Pepton1,0 gNatriumklorid (NaCl)8,5 gVand1 000 ml. FremstillingBestanddelene oploeses i vand, og hvis noedvendigt foretages opvarmning. pH-vaerdien kontrolleres med et pH-meter (4.1.4) og justeres eventuelt, saaledes at den efter  sterilisation er 7,0 p 0,1 ved 25 p 0,1 oC, idet der benyttes en oploesning (mindst 0,1 mol/l) af  natriumhydroxid eller saltsyre. 6.2. Fordeling, sterilisation og opbevaring at fortyndingsvaeskeFortyndingsvaesken (6.1) fordeles i  reagensglas (4.2.1) i portioner, saaledes at hvert glas efter sterilisation indeholder 9,0 p 0,2 ml  foryndingsvaeske. Glassene tilproppes. Der steriliseres i autoklaven (4.1.2) ved 121 p 1 oC i 15 minutter. Fortyndingsvaeskens pH-vaerdi  kontrolleres. Hvis fortyndingsvaesken ikke skal bruges med det samme, opbevares den moerkt ved en temperatur paa 1-5  oC i hoejst en maaned efter fremstillingen. 6.3. Dehydreret fortyndingsvaeske - kommercielt tilgaengeligFortyndingsvaesken (6.1) kan fremstilles af  tabletter eller pulvere, som faas i dehydreret form. Brugsanvisningen foelges. pH-vaerdien justeres  som beskrevet i 6.1 og fortyndingsvaeskerne fordeles, steriliseres og opbevares som beskrevet i  6.2. 7. Metodik7.1. Smeltning af substratetInden den mikrobiologiske undersoegelse smeltes den noedvendige maengde  substrat hurtigt i vandbad (4.1.5) og substratet tempereres til 45 p 1 oC i vandbad (4.1.5). 7.2. Forbehandling af maelkeproevenMaelkeproeven blandes grundigt, saaledes at mirkoorganismerne er fordelt  saa jaevnt som muligt, ved at bunden paa maelkeproevebeholderen hurtigt vendes i vejret 25 gange. Undgaa  skumdannelse eller lad skummet laegge sig. Intervallet mellem blanding og udtagning af analyseproever  maa ikke vaere over 3 minutter. 7.3. Fremstilling af primaerfortyndingen (10 ;) (raa og pasteuriseret maelk)Med en steril pipette (4.2.3)  overfoeres 1 ml af proeven (7.2) med raa maelk eller pasteuriseret maelk til 9 ml fortyndingsvaeske  (6.1). Man maa undgaa kontakt mellem pipetten og fortyndingsvaesken. Fortyndingsvaeskens temperatur  skal vaere omtrent den samme som maelkeproevens. Denne primaerfortynding blandes omhyggeligt i mixeren  (4.1.9) i 5-10 sekunder. Der opnaas saaledes en primaerfortynding paa 10 ;. 7.4. Fremstilling af yderligere tifoldsfortyndinger (raa og pasteuriseret maelk)Med en steril pipette  (4.2.3) overfoeres 1 ml af primaerfortyndingen (7.3) til 9 ml fortyndingsvaeske (6.1) efter  angivelserne i punkt 7.3. Der opnaas saaledes en fortynding paa 10 $. Dette gentages for at opnaa yderligere tifoldsfortyndinger, indtil det rette antal mikroorganismer  forventes opnaaet (8.1.1). 7.5. Podning i petriskaalene7.5.1. Raa maelk: Med en steril pipette (4.2.3) overfoeres 1 ml af proeven og/eller en passende  tifoldsfortynding til en skaal (4.2.4). Der skal undersoeges mindst to fortyndinger. Der tilberedes  en skaal med hver valgt fortynding (8.1.1). 7.5.2. Pasteuriseret maelk: Med en steril pipette (4.2.3) overfoeres 1 ml af proeven og/eller en passende  tifoldsfortynding til en skaal (4.2.4). Der skal undersoeges mindst to fortyndinger. Der tilberedes  to skaale af hver valgt fortynding (8.1.1). 7.5.3. UHT-behandlet og steriliseret maelk (undersoegt efter inkubation i 15 dage ved 30 oC - Direktiv  85/397/EOEF, bilag A, kapitel VII, punkt 5): Med en steril pipette (4.2.3) overfoeres 0,1 ml af maelkeproeven (7.2) til en skaal (4.2.4). Der  tilberedes to skaale. 7.6. OphaeldningCa. 15-18 ml af substratet (7.1) ophaeldes i hver podet skaal. Straks efter ophaeldningen blandes der ved drejning af petriskaalen tilstraekkeligt til at opnaa jaevnt  dispergerende kolonier efter inkubation. Der maa hoejst gaa 15 minutter mellem afslutningen af fremstillingen af maelkeproeven og, alt efter  maelketype, blandingen af analyseproeven eller fortyndingen med substratet. Man lader substratet stoerkne paa en ren, koelig, vandret flade. 7.7. Inkubation af petriskaaleSkaalene stilles i varmeskabet (4.1.3). De inkuberes med laagene nedad. Der  maa ikke stilles mere end seks oven paa hinanden. Stakkene af skaale maa ikke roere hinanden eller  varmeskabets sider. Der inkuberes ved 30 p 1 oC i 72 p 2 timer. 7.8. Taelling af kolonierKolonierne i de petriskaale, der indeholder hoejst 300 kolonier, taelles. Skaalene undersoeges i daempet belysning. Der kan for at lette taellingen benyttes en egnet lup (4.1.6)  og/eller et taelleinstrument (4.1.8). Bundfaldspartikler i skaalene maa ikke forveksles med  enkeltkolonier. Tvivlsobjekter undersoeges omhyggeligt med en kraftigere lup (4.1.7), naar det er  noedvendigt for at skelne kolonier fra fremmede stoffer. Spredningskolonier betragtes som enkeltkolonier. Hvis mindre end en fjerdedel af skaalen er  overgroet med spredningskolonier, taelles kolonierne paa den del af skaalen, som ikke er beroert, og  det tilsvarende tal beregnes for hele skaalen. Hvis mere end en fjerdedel af skaalen er overgroet med  spredningskolonier, kasseres skaalen. 8. Beregning og angivelse af resultater8.1. Raa og pasteuriseret maelk8.1.1. Der bruges tal fra alle skaale, som indeholder 10-300 kolonier (se 8.1.3 og 8.1.4). 8.1.2.Antallet af mikroorganismer pr. 1 ml raa eller pasteuriseret maelk angives ved formlen:  (n1 + 0,1 n2) d  Ó C(n1 + 0,1 n2) dhvorÓ Cer summen af kolonier talt som i 8.1.1(n1 + 0,1  n2) dsvarer til volumen af den talte proeve, hvor: n1er antallet af skaale, der er talt i foerste fortyndingn2er antallet af skaale, der er talt i  anden fortyndingder fortyndingsfaktoren, som laa til grund for de foerste taellinger. Tallet afrundes til to betydende cifre. Naar cifret, der skal afrundes, er 5, afrundes det, saaledes  at tallet umiddelbart til venstre er lige. Eksempel (pasteuriseret maelk): Fortynding 10 2: 278 og 290 kolonierFortynding 10 3:  33 og  28 kolonierAntal/ml =  278 + 290 +  33 + 28  Antal/ml=278 + 290 +33 + 28(2 + 0,1 × 2) 10 2Antal/ml =  0,022  =6290,022=28  590=29 000=2,9 × 10%. 8.1.3. Hvis der kun er tal paa under 10, registreres antallet af mikroorganismer pr. ml som »mindre end 10  × d pr. ml«, hvor »d« er det reciprokke tal til den laveste fortyndingsfaktor. 8.1.4. Hvis der kun er tal paa over 300, men taelling er mulig, beregnes et skoennet tal paa grundlag af skaale  med de tal, der kommer naermest paa 300 kolonier, og dette ganges med det reciprokke tal til  fortyndingsfaktoren. Resultatet registreres som »skoennet antal mikroorganismer pr. ml«. 8.2. UHT-behandlet og steriliseret maelkKimtal paa over 10 kolonier pr. 0,1 ml anses for ikke laengere at  opfylde kravene i direktiv 85/397/EOEF. 9. NoejagtighedDer foreligger endnu ikke resultater af internationalt godkendte sammenlignende  undersoegelser. V. TAELLING AF MIKROORGANISMER - KIMTAL VED 21 oC1. Omfang og anvendelsesomraadeDette er en beskrivelse af referencemetoden til optaelling af  mikroorganismer ved en kolonitaellingsteknik ved 21 oC paa pasteuriseret maelk efter inkubation af  maelken ved 6 oC i fem dage for at bestemme graden af kontaminering af den pasteuriserede maelk med  psykrotrofe mikroorganismer, der kan formere sig i maelk ved 6 oC. 2. DefinitionVed »mikroorganismer« forstaas organismer, der danner taellelige kolonier, naar de  inkuberes aerobt under de beskrevne betingelser. 3. PrincipDen pasteuriserede maelk inkuberes ved 6 oC i fem doegn. En defineret maengde af maelkeproeven  blandes med naeringssubstratet i petriskaale og inkuberes ved 21 oC i 25 timer. Kolonierne optaelles,  og antallet af mikroorganismer pr. 1 ml pasteuriseret maelk beregnes. 4. Apparatur og glasvarerSaedvanligt laboratorieudstyr og i saerdeleshed: 4.1. Apparatur4.1.1. Varmluftsovn, der kan fungere ved 170-175 oC. 4.1.2. Autoklave, der kan fungere ved 121 p 1 oC. 4.1.3. Varmeskab, der overalt kan holde en temperatur paaa)  6 p 0,2 oCb)  21 p 1 oC. 4.1.4. pH-meter med en noejagtighed paa p 0,1 pH-enhed, med temperaturkompensation. 4.1.5. Vandbad, der kan holde en temperatur paa 45 p 1 oC. 4.1.6. Lup, 2-4 gange forstoerrelse. 4.1.7. Lup, 8-10 gange forstoerrelse. 4.1.8. Taelleinstrument. 4.1.9. Mixer, der kan blande 1 ml af maelkeproeven eller tifoldsfortyndingen med 9 ml fortyndingsvaeske og  fungere efter princippet for ekscentrisk rotation af indholdet i reagensglasset. 4.2. Glasvarer4.2.1. Reagensglas med passende lukkeanordninger og tilstraekkelig kapacitet til at indeholde 10 ml af  primaerfortyndingen eller yderligere tifoldsfortyndinger, idet der samtidig skal vaere plads nok til  blanding. 4.2.2. Flasker med en kapacitet paa 150-200 ml eller glas med en kapacitet paa ca. 20 ml til  naeringssubstratet. 4.2.3. Pipetter (med vatprop) af glas eller sterilt, syntetisk materiale med ubeskadiget spids og en  nominel kapacitet paa 1 ml samt en aabning med en diameter paa 1,75-3 mm. 4.2.4. Petriskaale af klart, ufarvet glas eller sterilt, syntetisk materiale, hvor den nederste skaal har en  indvendig diameter paa ca. 90-100 mm. Den indvendige dybde skal vaere mindst 10 mm. Bunden skal vaere  fri for ujaevnheder, som forstyrrer taellingen af kolonier. 4.2.5. Sterilisation af glasvarerGlasvarer steriliseres ved en af foelgende metoder: a)  henstand ved 170-175 oC i mindst en time i varmluftsovn (4.1.1)b)  henstand ved 121 p 1 oC i  mindst 20 minutter i autoklave (4.1.2). Det skal sikres, at der sker tilstraekkelig gennemtraengning af damp i autoklaven; hvis udstyret  f.eks. steriliseres i beholdere, skal disse ikke lukkes taet, og kolber skal have loestsiddende laag. Glasvarer, der er steriliseret i autoklaven, toerres ved dampventilation. Pipetter steriliseres i varmluftsovn (4.1.1). 5. Dyrkningssubstrat - Milk plate count agar5.1. SammensaetningGaerekstrakt2,5 gTrypton5,0 gGlukose D(+) eller dextrose1,0  gSkummetmaelkspulver1,0 gAgar10-15 g, afhaengigt af den anvendte agars gelateringsevneVand1 000  ml. Skummetmaelkspulveret skal vaere frit for haemmende stoffer. Dette skal verificeres ved sammenlignende  undersoegelser, hvor der anvendes skummetmaelkspulver, som ikke indeholder haemmende stoffer. FremstillingBestanddele opslaemmes og oploeses i vandet i foelgende raekkefoelge: gaerekstrakt, trypton,  glukose og endelig skummetmaelkspulver i vandet. Opvarmning af opslaemningen fremmer denne proces.  Agaren tilsaettes, og der opvarmes til kogepunktet under stadig omroering, eller i stroemmende  vanddamp i ca. 30 minutter indtil agaren er fuldstaendig oploest. Eventuelt filtreres gennem filtrerpapir. pH-vaerdien kontrolleres med et pH-meter (4.1.4) og justeres eventuelt, saaledes at den efter  sterilisation er 6,9 p 0,1 ved 25 oC, idet der benyttes en oploesning (mindst 0,1 mol/l) af  natriumhydroxid eller saltsyre. 5.2. Fordeling, sterilisation og opbevaring af naeringssubstratSubstratet (5.1) fordeles i portioner paa  100-150 ml i flasker eller 12-15 ml i glas (4.2.2). Kolberne og glassene tilproppes. Der steriliseres i autoklaven (4.1.2) ved 121 p 1 oC i 15 minutter. Substratets pH kontrolleres. Hvis substratet ikke skal bruges med det samme, opbevares det moerkt ved en temperatur paa 1-5 oC i  hoejst en maaned efter fremstillingen. 5.3. Dehydreret naeringssubstrat - kommercielt tilgaengeligtNaeringssubstratet (5.1) kan fremstilles af  dehydreret substrat. Brugsanvisningen foelges, men skummetmaelkspulveret tilsaettes inden oploesning,  hvis det ikke er en bestanddel. pH-vaerdien justeres til 6,9 p 0,1 ved 25 oC som beskrevet i 5.1 og naeringssubstratet fordeles,  steriliseres og opbevares som beskrevet i 5.2. 6. Fortyndingsvaeske6.1. Pepton-/saltoploesningSammensaetningPepton1,0 gNatriumklorid (NaCl)8,5 gVand1 000  mlFremstillingBestanddele oploeses i vand, og hvis noedvendigt foretages opvarmning. pH-vaerdien kontrolleres med et pH-meter (4.1.4) og justeres eventuelt, saaledes at den efter  sterilisation er 7,0 p 0,1 ved 25 p 1 oC, idet der benyttes en oploesning (mindst 0,1 mol/l) af  natriumhydroxid eller saltsyre. 6.2. Ophaeldning, sterilisation og opbevaring af fortyndingsvaeskerFortyndingsvaesken (6.1) fordeles i  reagensglas (4.2.1) i en saadan maengde, at hvert glas efter sterilisation indeholder 9,0 p 0,2 ml  fortyndingsvaeske. Glassene tilproppes. Der steriliseres i autoklaven (4.1.2) ved 121 p 1 oC i 15 minutter. Fortyndingsvaeskens pH-vaerdi kontrolleres. Hvis fortyndingsvaesken ikke skal bruges med det samme, opbevares den moerkt ved en temperatur paa 1-5  oC i hoejst en maaned efter fremstillingen. 6.3. Dehydreret fortyndingsvaeske - kommercielt tilgaengeligFortyndingsvaesken (6.1) kan fremstilles af  tabletter eller pulvere, som faas i dehydreret form. Brugsanvisningen foelges. pH-vaerdien justeres  som beskrevet i 6.1, og fortyndingsvaeskerne fordeles, steriliseres og opbevares som beskrevet i  6.2. 7. Metodik7.1. Smeltning af substratetInden den mikrobiologiske undersoegelse smeltes den noedvendige maengde  substrat hurtigt. Substratet tempereres til 45 p 1 oC i vandbad (4.1.5). 7.2. Forbehandling af maelkeproeven7.2.1.Pasteuriseret maelk inkuberes i uaabnet emballage eller, hvis dette ikke kan lade sig goere, inkuberes  en repraesentativ proeve paa mindst 100 ml i 120 p 2 timer ved 6 p 0,5 oC i varmeskab (4.1.3.a)). 7.2.2. Efter inkubationen blandes maelkeproeven grundigt, saaledes at mirkoorganismerne er fordelt saa jaevnt  som muligt, ved at bunden paa maelkeproevebeholderen vendes hurtigt i vejret 25 gange. Undgaa  skumdannelse, eller lad skummet laegge sig. Intervallet mellem blanding og udtagning af  analyseproeven maa ikke vaere paa over tre minutter. 7.3. Fremstilling af primaerfortyndingen (10 ;)Med en steril pipette (4.2.3) overfoeres 1 ml af proeven  (7.2.2) til 9 ml fortyndingsvaeske (6.1). Kontakt mellem pipetten og fortyndingsvaesken undgaas.  Fortyndingsvaeskens temperatur skal vaere omtrent den samme som maelkeproevens. Denne primaerfortynding  blandes omhyggeligt i mixeren (4.1.9) i 5-10 sekunder. Der opnaas saaledes en primaerfortynding paa 10 ;. 7.4. Fremstilling af yderligere tifoldsfortyndingerMed en steril pipette (4.2.3) overfoeres 1 ml af  primaerfortyndingen (7.3) til 9 ml fortyndingsvaeske (6.1) efter angivelse i punkt 7.3. Der opnaas saaledes en fortynding paa 10 $. Dette gentages for at opnaa yderligere tifoldsfortyndinger, indtil det rette antal mikroorganismer  kan forventes opnaaet (8.1). 7.5. Podning i petriskaaleneMed en steril pipette (4.2.3) overfoeres 1 ml af proeven og/eller en passende  tifoldsfortynding til en skaal (4.2.4). Der skal undersoeges mindst to fortyndinger. Der laves en  skaal med hver valgt fortynding (8.1). 7.6. OphaeldningCa. 15-18 ml af substratet (7.1) ophaeldes i hver podet skaal. Straks efter ophaeldningen blandes ved drejning af petriskaalen tilstraekkeligt til at opnaa jaevnt  dispergerede kolonier efter inkubation. Der maa hoejst gaa 15 minutter mellem afslutningen af fremstillingen af maelkeproeven og blandingen af  fortyndingen med substratet. Man lader det stoerkne paa en ren, koelig, vandret flade. 7.7. Inkubation af petriskaaleSkaalene stilles i varmeskabet (4.1.3.b)). Skaalene inkuberes med laagene  nedad. Der maa ikke stilles mere end seks skaale oven paa hinanden. Stakkene af skaale maa ikke roere  hinanden eller varmeskabets sider. Der inkuberes ved 21 p 1 oC i 25 timer. 7.8. Taelling af kolonierKolonierne i de petriskaale, der indeholder hoejst 300 kolonier, taelles. Skaalene undersoeges i daempet belysning. Der kan for at lette taellingen benyttes en egnet lup (4.1.6)  og/eller et taelleinstrument (4.1.8). Bundfaldspartikler i skaalene maa ikke forveksles med  enkeltkolonier. Tvivlsobjekter undersoeges omhyggeligt med en staerkere lup (4.1.7), naar det er  noedvendigt for at skelne kolonier fra fremmede stoffer. Spredningskolonier betragtes som enkeltkolonier. Hvis mindre end en fjerdedel af skaalen er  overgroet med spredningskolonier, taelles kolonierne paa den del af skaalen, som ikke er beroert, og  det tilsvarende tal beregnes for hele skaalen. Hvis mere end en fjerdedel af skaalen er overgroet med  spredningskolonier, kasseres skaalen. 8. Beregning og angivelse af resultater8.1. Der bruges tal fra alle skaale, som indeholder 10-300 kolonier (se 8.3 og 8.4). 8.2. Antallet af mikroorganismer pr. 1 ml pasteuriseret maelk angives ved formlen:  (n1 + 0,1 n2) d  Ó C(n1 + 0,1 n2) dhvorÓ Cer summen af kolonier optalt som i 8.1.1(n1 + 0,1  n2) dsvarer til volumen af den talte proeve, hvor: n1er antallet af skaale, der er talt i foerste fortyndingn2er antallet af skaale, der er talt i  anden fortynding, der fortyndingsfaktoren, som laa til grund for de foerste taellinger. Tallet afrundes til to signifikante cifre. Naar cifret, der skal afrundes, er 5, afrundes det,  saaledes at tallet umiddelbart til venstre er lige. EksempelFortynding 10 2: 278 og 290 kolonierFortynding 10 3:  33 og  28 kolonierAntal/ml =  278  + 290 + 33 + 28  Antal/ml=278 + 290 +33 + 28(2 + 0,1 × 2) 10 2Antal/ml =  0,022   =6290,022=28 590=29 000=2,9 × 10%. 8.3. Hvis der kun er tal paa under 10, registreres antallet af mikroorganismer pr. ml som »mindre end10  × d pr. ml«, hvor »d« er det reciprokke tal til den laveste fortyndingsfaktor. 8.4. Hvis der kun er tal paa over 300, men taelling er mulig, beregnes et skoennet tal paa grundlag af skaale  med de tal, der kommer naermest paa 300 kolonier, og dette ganges med det reciprokke tal til  fortyndingsfaktoren. Resultatet registreres som »skoennet antal mikroorganismer pr. ml«. 9. NoejagtighedDer foreligger ingen resultater af internationalt godkendte sammenlignende  undersoegelser. VI. TAELLING AF COLIFORME BAKTERIER VED 30 oC1. Omfang og anvendelsesomraadeDette er en beskrivelse af referencemetoden til taelling af coliforme  bakterier i pasteuriseret maelk ved en kolonitaellingsteknik ved 30 oC. 2. DefinitionVed »coliforme bakterier« forstaas bakterier, som ved 30 oC danner karakteristiske  kolonier eller ukarakteristiske kolonier, der kan forgaere laktose under luftudvikling under de  beskrevne betingelser. 3.PrincipEn defineret maengde af maelkeproeven blandes med naeringssubstratet i petriskaale og inkuberes  ved 30 oC i 24 timer. Karakteristiske kolonier optaelles, og eventuelt ukarakteristiske koloniers  identitet bekraeftes ved kontrol af evnen til at forgaere laktose. Antallet af coliforme bakterier  pr. 1 ml pasteuriseret maelk beregnes derefter. 4. Apparatur og glasvarerSaedvanligt laboratorieudstyr og i saerdeleshed: 4.1. Apparatur4.1.1. Varmluftsovn, som kan fugere ved 170-175 oC. 4.1.2. Autoklave, der kan fungere ved 121 p 1 oC. 4.1.3. Varmeskab, der overalt kan holde en temperatur paa 30 p 1 oC. 4.1.4. pH-meter med en noejagtighed paa p 0,1 pH-enhed, med temperaturkompensation. 4.1.5. Vandbad, der kan holde en temperatur paa 45 p 1 oC. 4.1.6. Podenaal af platiniridium eller nikkelkrom. 4.2. Glasvarer4.2.1. Reagensglas med passende lukkeanordninger og en kapacitet paa 20 ml til verifikationssubstratet  (5.2) og durhamroer i passende dimensioner til brug sammen med reagensglassene4.2.2. Flasker med en kapacitet paa 150-200 ml til det faste, selektive substrat (5.1)4.2.3. Pipetter (med vatprop) af glas eller sterilt, syntetisk materiale med ubeskadiget spids og en  nominel kapacitet paa 1-10 ml samt en aabning paa 1,75-3 mm4.2.4. Petriskaale af klart, ufarvet glas eller sterilt, syntetisk materiale, hvor den nederste skaal har en  indvendig diameter paa ca. 90-100 mm. Den indvendige dybde skal vaere mindst 10 mm. Bunden skal vaere  fri for ujaevnheder, som kan forstyrre taellingen af kolonier. 4.2.5. Sterilisation af glasvarerGlasvarer steriliseres ved en af foelgende metoder: a)  henstand ved 170-175 oC i mindst en time i varmluftsovn (4.1.1)b)  henstand ved 121 p 1 oC i  mindst 20 minutter i autoklave (4.1.2). Det skal sikres, at der sker tilstraekkelig gennemtraengning af damp i autoklaven; hvis udstyret  f.eks. steriliseres i beholdere, skal disse ikke lukkes taet, og kolber skal have loestsiddende laag. Glasvarer, der er steriliseret i autoklaven, toerres ved dampventilation. Pipetter steriliseres i varmluftsovn (4.1.1). 5. Naeringssubstrater5.1. Roed-violet galdelaktose agar (RVG agar). Fast, selektivt substrat. SammensaetningPepton7 gGaerekstrakt3 gLaktose (C12H22O11 7H2O)10 gNatriumklorid (NaCl)5  gGaldesalte1,5 gNeutralroedt0,03 gKrystalviolet10-15 g (afhaengigt af den anvendte  gelatineringsevne)Vand1 000 ml. FremstillingBestanddele opslaemmes og oploeses i vandet, og man lader det henstaa i flere minutter.  Derefter blandes kraftigt. pH-vaerdien kontrolleres med en pH-maaler (4.1.4) og justeres eventuelt, saaledes at den efter kogning  er 7,4 p 0,1 ved 25 oC, idet der benyttes en oploesning (mindst 0,1 mol/l) af natriumhydroxid eller  saltsyre. Substratet opvarmes til kogepunktet, skvulpes af og til og fordeles straks i portioner paa 100-150  ml i sterile flasker (4.2.2). Substratet tempereres i vandbad (4.1.5) ved 45 p 1 oC. Substratets sterilitet skal kontrolleres paa anvendelsestidspunktet (se 6.4). Substratet skal bruges inden tre timer efter fremstillingen. 5.2. Brillantgroent laktosegalde bouillon. Verifikationssubstrat. SammensaetningPepton10 gLaktose (C12H22O11 7H2O)10 gDehydreret oksegalde20  gBrillantgroent0,0133 gVand1 000 ml. FremstillingBestanddelene oploeses i vandet ved kogning. pH-vaerdien kontrolleres med et pH-meter (4.1.4) og justeres eventuelt, saaledes at den efter  sterilisation er 7,2 p 0,1 ved 25 oC, idet der benyttes en oploesning (mindst 0,1 mol/l) af  natriumhydroxid eller saltsyre. Substratet doseres i portioner paa 10 ml i reagensglas, hvori der er anbragt durhamroer med bunden  opad (4.2.1). Glassene tilproppes. Reagensglassene steriliseres i autoklaven (4.1.2) ved 121 p 1 oC i 15 minutter. Durhamroerene maa ikke indeholde luftbobler efter sterilisationen. Substratets pH kontrolleres. Hvis substratet ikke skal bruges straks, skal det opbevares moerkt ved en temperatur paa 1-5 oC i  hoejst en maaned efter fremstillingen. 5.3. Dehydreret naeringssubstrat - kommercielt tilgaengeligtNaeringssubstratet (5.1, 5.2) kan fremstilles  af substrater, som faas i dehydreret form. Brugsanvisningen foelges. pH-vaerdien justeres og doseres,  koges eller steriliseres og opbevares som beskrevet i 5.1 og 5.2. 6. Metodik6.1. SubstratSubstratet (RVG agar) som beskrevet i 5.1 benyttes. 6.2. Forbehandling af maelkeproevenMaelkeproeven blandes grundigt, saaledes at mikroorganismerne fordeles saa  jaevnt som muligt ved at bunden paa maelkeproevebeholderen hurtigt vendes i vejret 25 gange. Undgaa  skumdannelse eller lad skummet laegge sig. Intervallet mellem blanding og udtagning af analyseproeven  maa ikke overskride tre minutter. 6.3. Podning i petriskaalene3 ml af maelkeproeven (6.2) udsaas ved overfoersel med en steril pipette (4.2.3)  af 1 ml af maelkeproeven til hver af de tre skaale (4.2.4). 6.4. OphaeldningRVG agar (6.1) ophaeldes i hver podet skaal i portioner paa ca. 12 ml. Straks efter ophaeldningen blandes der ved drejning af petriskaalen tilstraekkeligt til, at kolonierne  fordeles jaevnt efter inkubation. Der maa hoejst gaa 15 minutter mellem afslutningen af forbehandlingen af maelkeproeven og blandingen af  analyseproeven med substratet. Til kontrol af steriliteten overfoeres 12 ml af den RVG agar, der blev brugt til de podede skaale,  til en upodet skaal. Substratet skal stoerkne paa en ren, koelig, vandret flade, indtil det er stivnet. Efter fuldstaendig stoerkning haeldes der mindst 4 ml RGV agar (6.1) ud paa det podede substrats  overflade. Man lader det stoerkne. 6.5. Inkubation af petriskaaleSkaalene stille i varmeskabet (4.1.3). Skaalene inkuberes med laagene nedad.  Der maa ikke saettes mere end seks oven paa hinanden. Stakke af skaale maa ikke roere hinanden eller  varmeskabets sider. Der inkuberes ved 30 p 1 oC i 24 p 2 timer. 6.6. Taelling af kolonier6.6.1. Kolonierne i de petriskaale, der indeholder hoejst 150 kolonier, taelles. De moerkeroede kolonier med en  diameter paa mindst 0,5 mm med eller uden omgivende praecipitation, som er karakteristisk for  coliforme bakterier, taelles. 6.6.2. Hvis alle kolonierne eller nogle af dem har et ukarakteristisk udseende (f.eks. adskiller sig fra  typiske kolonier i farve, stoerrelse eller dannelse af praecipitat), udfoeres en verifikationsproeve  (6.7). 6.7. VerifikationsproeveEfter anvisningerne i 6.6.2 foretages en verifikationsproeve paa et passende antal  (f.eks. 3 til 5) ukarakteristiske kolonier ved podning i glas med brillantgroent laktosegalde  bouillon (5.2) med en podenaal (4.1.6). Glassene inkuberes ved 30 p 1 oC i 24 p 2 timer. Kolonier, som producerer luft i durhamroerene, betragtes som verificerede bakteriekolonier. 7. Beregning og angivelse af resultater7.1. Til taellingen benyttes (se 7.4) skaale, som indeholder hoejst 150 kolonier. 7.2. Hvis der benyttes en verifikationsproeve, beregnes antallet af kolonier af coliforme bakterier paa  grundlag af procentdelen af verificerede coliforme bakterier. 7.3. Antallet af coliforme bakterier pr. 1 ml pasteuriseret maelk angives ved formlen:  Ó C  , S Cn hvorS C = er det samlede antal kolonier af coliforme bakterier (7.1 i forbindelse med  7.2), som er fundet ved undersoegelse af maelkeproeven (3 ml). n=er antallet af ml i den undersoegte proeve (6.3.1) (3 ml). Tallet afrundes til to signifikante cifre, hvis der er over 100 kolonier. Naar cifret, der skal  afrundes, er 5, afrundes det, saaledes at tallet umiddelbart til venstre er lige. Hvis der kun er tal paa over 150 kolonier, registreres resultatet som »Skoennet antal coliforme  bakterier pr. 1 ml«. 8. NoejagtighedDer foreligger ingen resultater af internationale sammenlignende proever. VII. TAELLING AF SOMATISKE CELLERDette er en beskrivelse af to metoder som referencemetoder til  taelling af somatiske celler: A.  MikroskopmetodenB.  Den fluoro-opto-elektroniske metodeA. Mikroskopmetode1. Omfang og anvendelsesomraadeDette er en beskrivelse af referencemetoden til taelling af somatiske  celler i raa maelk. Dette er en beskrivelse af metoden til taelling af antallet af celler i maelkeproever med henblik paa  kalibrering og kontrol af noejagtigheden af den fluoro-opto-elektroniske metode (se B.1). 2. DefinitionVed somatiske celler forstaas her de celler, f.eks. leukocytter og epitelceller, hvis  kerner kan farves tydeligt med metylenblaat. 3. Princip0,01 ml maelk spredes over 1 cm$ af et objektglas. Filmen toerres og farves. Taelling  foretagesunder mikroskop. Antallet af somatiske celler, som er talt i et defineret omraade, ganges  med arbejdsfaktoren for at opnaa antallet af celler/ml. 4. ReagenserDer skal anvendes kemikalier af analysekvalitet. FarveoploesningSammensaetningMetylenblaat0,6 gEthanol - 99 %54,0 ml1,1,1-trikloretan eller  tetrakloretan40,0 mlIseddikesyre6,0 mlAdvarselTetrakloretan er giftigt. Hvis det benyttes,  skal fremstillingen og paafoeringen ske i et stinkskab. FremstillingEthanol og 1,1,1-trikloretan eller tetrakloretan blandes i en flaske og opvarmes i  vandbad til 60 til 70 oC. Metylenblaat tilsaettes. Der blandes omhyggeligt, afkoeles i koeleskab til 4  oC i 12 til 24 timer og tilsaettes iseddikesyre. Der filtreres gennem et filter med en porestoerrelse  paa 10 til 12 mikrometer eller derunder, og farveoploesningsvaesken opbevares i en lufttaet flaske.  Hvis der dannes partikler eller sediment, filtreres den igen inden brug. 5. Apparatur og glasvarer5.1. Mikroskop med en forstoerrelse paa 500 til 1 000 gange. 5.2. Mikrosproejte, 0,01 ml med en noejagtighed paa p 2 % eller bedre. 5.3. Objektglas med et areal paa 20 mm × 5 mm afmaerket til filmen eller et standardobjektglas og en  skabelon paa 20 mm × 5 mm til filmen. 5.4. Plan varmeplade (30 til 50 oC) til toerring af objektglassene. 5.5. Blaeser (haartoerrer) til toerring af filmen. 5.6. Vandbad, som kan fungere ved 30 til 40 oC til opvarmning af maelkeproeven. 5.7. Mikrometerobjektglas opdelt i 0,01 mm. 6. Metodik6.1. MaelkeproeverMaelkeproeven skal undersoeges inden seks timer efter proeveudtagningen. Under opbevaringen  maa proevens temperatur ikke overstige 6 oC. Frysning skal undgaas. 6.2. Fremstilling af proeven i laboratorietProeven opvarmes i vandbad (5.6) til 30 til 40 oC; den blandes  omhyggeligt. Der afkoeles til den temperatur, hvortil mikrosproejten (5.2) er kalibreret, f.eks. 20  oC. 6.3. Forbehandling af objektglasseneObjektglassene (5.3) rengoeres, f.eks. med ethanol, toerres med  stoevfrit papir, flamberes og afkoeles. Opbevares i kasse, saa stoev undgaas. 6.4. Fremstilling af film0,01 ml maelk fra proeven, der er behandlet som ovenfor, udtages med en  mikrosproejte (5.2). Ydersiden af sproejten, der er i kontakt med maelken, rengoeres omhyggeligt.  Sproejten anbringes paa objektglasset (5.3), efter at konturen af feltet (20 mm × 5 mm) er tegnet.  Derefter udfyldes feltet saa jaevnt som muligt. Filmen toerres paa en plan varmeplade (5.4), indtil den  er helt toer. Mindst to film skal behandles og undersoeges for hver maelkeproeve. 6.5. Farvning af filmFilmen dyppes i farveoploesning (4) i 10 minutter. Filment toerres og eventuelt  afsluttes med blaeseren (5.5). Filmen dyppes i postevand, indtil al overskudsfarve er skyllet vaek.  Derefter toerres igen, og filmen opbevares, saa den ikke udsaettes for stoev. 6.6. Kalibrering af mikroskopets synsfeltMikroskopfeltets diameter bestemmes med  mikrometerobjektglasset som funktion af den valgte forstoerrelse (500 til 1 000 gange). 7. Taelling og beregning7.1. Taelling af cellerDer benyttes et mikroskop (5.1). I stedet for at taelle celler taelles kun  cellekerner. Disse er tydeligt genkendelige, og med henblik paa taellingen skal mindst halvdelen af  kernen vaere synlig i mikroskopifeltet. Der taelles striber eller felter hen over den midterste  tredjedel af filmen. Det undgaas at taelle striber eller felter, som udelukkende er valgt fra  perifere omraader af filmene. Den omhyggelige behandling af filmene og resultaternes deraf foelgende  paalidelighed skal kontrolleres mindst en gang om maaneden ved taelling af forskellige dele af filmen.  Taellingen kan ogsaa foretages ved taelling af mirkoskopifelter, der er spredt paa en saadan maade, at  alle dele af filmen er ligeligt repraesenteret. 7.2. Det minimale antal celler, der skal taellesDa mikroskopisk taelling af somatiske celler ogsaa kan  benyttes til standardisering af automatiske og mekaniserede taellingsmetoder, maa  variationskoefficienten for taellinger af identiske proever ikke vaere stoerre end for elektroniske  instrumenter. Variationskoefficienten for en maelkeproeve, der indeholder 400 000 til 600 000  celler/ml, maa ikke overstige 5 %. Antallet af somatiske celler, der skal taelles i hver proeve, skal ifoelge Poisson-fordelingens  karakteristika vaere mindst 400, for at denne repeterbarhed opnaas. Poisson-fordelingen forudsaetter, atM = V = s$hvorM er middelvaerdienVer variantenogser  standardafvigelsen. Variationskoefficienten (VK) erVK =  s × 100 %  eller VK =  100 %  eller VK =  100 %  VK =s ×  100 %Meller VK =100 %seller VK =100 %wM-M (middel) angiver antallet af partikler (celler),  som er optalt (dvs. 400 for VK = 5 %). 7.3. Beregning af arbejdsfaktorenArbejdsfaktoren beregnes ifoelge 7.3.1 eller 7.3.2 ved brug af 0,01 ml  maelk. 7.3.1Taelling af baelter paa tvaers af filmenBaelterne, der skal taelles, er hver isaer 5 mm lange.  Baelternes bredde svarer til mikroskopifeltets diameter som bestemt af mikrometerobjektglasset  (5.7). Arbejdsfaktor =  20× 100  Arbejdsfaktor =20 × 100d × bhvord = er mikroskopifeltets diameter i  millimeterb= er antallet af baelter, der er fuldstaendig optalt. 7.3.2. Taelling af mikroskopifelter i den midterste tredjedel af filmen eller med et gitterArbejdsfaktor =   20 × 5 × 100  =  12 732  Arbejdsfaktor =20 × 5 × 100Ð × d² × s4=12 732d² × shvord = er  mikroskopifeltets diameter i mm som bestemt af mikrometerobjektglasset (5.7)s= er antallet af  optalte felter. 7.4. Beregning af celletalAntallet af optalte somatiske celler (7.1 og 7.2) ganges med arbejdsfaktoren  (7.3) for at give antallet af celler pr. ml maelk. 7.5. NoejagtighedVariationskoefficienten (se 7.2) maa ikke overstige 5 %. Der foreligger ikke nogen resultater af internationale sammenlignende proever. B.  Fluoro-opto-elektronisk metode1. Omfang og anvendelsesomraadeDette er en beskrivelse af referencemetoden, som efter korrekt  kalibrering (se A.1) kan benyttes til taelling af somatiske celler i raa maelk - med eller uden kemisk  konservering. 2. DefinitionVed somatiske celler forstaas her partikler med en minimumsfluorescensstyrke som foelge af  farvningen af de somatiske cellekerners DNA. 3. PrincipEn del af proeven (f.eks. 0,2 ml) blandes grundigt med bufferoploesning og  fluorescensoploesning. En del af denne blanding overfoeres derefter i form af en tynd film til en  roterende disk, der fungerer som objektplan for mikroskopet. Hver celle producerer en elektrisk impuls, som forstaerkes og registreres. Antallet af somatiske  celler udskrives i tusinde pr. ml. 4. ReagenserDer skal benyttes kemikalier af analysekvalitet, medmindre andet er angivet. Vandet skal  enten vaere destilleret eller ionbyttet eller af tilsvarende renhed. 4.1. BufferoploesningSammensaetningKaliumhydrogenftalat51,0 gKaliumhydroxid13,75  gPolyethylenglykol-mono-p-(1,1,3,3-tetrametylbutyl)-fenyl-aeter(f.eks. Triton X-100), 1 % (V/W)10  mlpH 5,7 - 5,9. Destilleret vand tilsaettes til 10 000 ml. FremstillingDe enkelte bestanddele blandes. Opbevares lufttaet i hoejst syv dage. 4.2. Fluorescensoploesning (stamoploesning)SammensaetningEtidiumbromid1,0 gVand til 1 000 ml. FremstillingEtidiumbromid oploeses i vand. Opbevares i lys- og lufttaet flaske i hoejst to maaneder. 4.3. Fluorescensoploesning (arbejdsoploesning)20 ml af stamoploesningen (4.2) blandes med  bufferoploesningen (4.1) til 1 000 ml. Arbejdsoploesningen maa ikke benyttes i mere end syv doegn. 4.4. RengoeringsoploesningSammensaetningBufferoploesning (4,1)10  mlPolyetylenglykol-mono-p-(1,1,3,3-tetrametylbutyl)-fenyl-aeter(f.eks. Triton X-100), 1  volumenprocent10 mlAmmoniak, 25 volumenprocent25 mlDestilleret vand tilsaettes til 10 000 ml. FremstillingDe enkelte bestanddele blandes. Opbevares i hoejst 30 dage. 5. Apparatur og glasvarer5.1. Taellingsinstrument, der arbejder efter det fluorescensoptiske princip. NB: Instrumentet skal kalibreres inden brug. Forholdet mellem volumen af de partikler, der skaltaelles,  og graensevaerdien, over hvilken taellingerne foretages, bestemmes. Kalibrering af apparatet sker  ifoelge brugsanvisningen ved brug af proever, hvis celleindhold er bestemt ved mikroskopimetoden. 5.2. Vandbad med circulation, der kan fungere ved 40 p 1 oC. 5.3. Reagensglas med passende lukkeanordning, ca. 15 ml. 6. Maelkeproever6.1. Proeven skal opbevares ved lav temperatur i et proeveglas (5.3). Hvis proeven ikke er konserveret  kemisk, boer den ikke taelles inden for de foerste 24 timer efter udmalkning, da tallene saa vil vaere  for lave. Opbevaringstemperaturen maa ikke overstige 6 oC. 6.2. KonserveringKemisk konservering skal foretages inden 24 timer. Konservering skal ske snarest  muligt efter proeveudtagningen. 6.2.1. Kemisk konservering af proeven kan ske ved tilsaetning af et af foelgende konserveringsmidler: - ortoborsyreDen endelige koncentration af ortoborsyre i proeven maa ikke overstige 0,6 g/100 ml.  Sadanne konserverede proever kan opbevares i yderligere 24 timer ved 6 til 12 oC-  kaliumdikromatDen endelige koncentration af kaliumdikromat maa ikke overstige 0,2 g/100 ml. Saadanne  konserverede proever kan opbevares i yderligere 72 timer ved 6 til 12 oC- natriumazidProeven kan  konserveres med natriumazid til en endelig koncentration paa 0,024 g/100 ml, forudsat at proeverne  afkoeles til 6 til 12 oC straks efter proeveudtagning og taelles inden for 48 timer efter  proeveudtagningen- bronopolProeverne kan konserveres med bronopol til en endelig koncentration paa  0,05 g/100 ml, forudsat at proeverne afkoeles til 6 til 12 oC umiddelbart efter proeveudtagning og  taelles inden for 72 timer efter proeveudtagningen. 6.2.2. Proever, der allerede er konserveret med ortoborsyre, kan konserveres i yderligere 48 timer med  kaliumdikromat. NB: Der skal tages hensyn til lokale bestemmelser vedroerende udledning af spildevand i forbindelse med  proever, der konserveres med kaliumdikromat. 7. Metodik7.1. Forbehandling af proeverneMaelkeproever, der skal undersoeges, skal opbevares i mindst 24 timer ved  ca. 2 til 6 oC efter udlagringen. Det anbefales ikke at foretage celletaelling uden forbehandling paa  malkedagen, da resultaterne kan vaere for lave. Hvis det er noedvendigt at foretage taelling af  saadanne proever, skal de forbehandles i mindst tre timer med kaliumdikromat (se 6.2.1). 7.2. ForbehandlingDen forbehandlede proeve (se 7.1) eller den ubehandlede proeve, som er mindst et doegn  gammel, opvarmes i vandbad (5.2) til ca. 40 oC. Proeven opbevares derefter ved stuetemperatur,  indtil taellingen foretages. 7.3. Taelling af cellerTaelling skal udfoeres ved hjaelp af taellingsinstrument (5.1) inden 15 minutter  efter afslutningen af opvarmningen (se 7.2). Umiddelbart inden taelling skal proeverne blandes  grundigt, saa der opnaas en saa ensartet fordeling af de somatiske celler som muligt. Yderligere fortynding og behandling af proeverne sker automatisk i instrumentet. 8. NoejagtighedDer foreligger ingen tal for repeterbarhed (r) og reproducerbarhed (R) fra  internationale sammenlignende proever. I fremtiden vil der blive givet noejagtighedsdata. Der kan paa grundlag af de data, der foreligger paa nationalt plan, foretages foelgende skoen: Celletaellingsniveau mellem 400 000 og 500 000/ml- standardafvigelse for repeterbarhed: sr = 20 000 celler/ml(svarende til en variationskoefficient paa 5 % - 4 %)- standardafvigelse for  reproducerbarhed: sR = 40 000 celler/ml(svarende til en variationskoefficient paa 10 % - 8 %. 9. NoejagtighedskontrolNoejagtidhedskontrol udfoeres ved brug af proever med et kendt celletal (P)  bestemt ved mikroskopitaellinger af celler paa et nationalt referencelaboratorium. VIII. PAAVISNING AF ANTIBIOTIKA OG SULFONAMIDEROMFANG OG ANVENDELSESOMRAADEDette er en  beskrivelse af referencemetoden til paavisning af antibiotika og sulfonamider i raa maelk og  varmebehandlet maelk. Referencemetoden omfatter: A. Kvalitativ metodeDenne metode er den indledende undersoegelse, hvormed maelkeproever, der  indeholder antibiotika, herunder sulfonamider, udvaelges. Den beskrevne metoden er en af en raekke  lignende metoder, som i princippet alle benytter Bacillus stearothermophilus var. calidolactis ATCC  10149 som testorganisme. Metoden er valgt som vaerende repraesentiv for disse proever. B. Metode til bekraeftelse og identifikation af penicillinDenne metode skal benyttes til  bekraeftelse af den kvalitative metode, identificering af penicillin og bestemmelse af  penicillinkoncentrationen. A. Kvalitativ metode1. Omfang og anvendelsesomraadeDette er en beskrivelse af den kvalitative paavisning af antibiotika og  sulfonamider i raa og varmebehandlet maelk, naar indholdet overskrider de graenser, som er angivet i  tabellen:>TABELPOSITION>2. DefinitionMaelken indeholder antibiotika eller sulfonamider, naar substratets farve ikke aendres (se  7.1). 3. PrincipTil en agargel, der indeholder pH-indikator og sporer af Bacillus stearothermophilus var.  colidolactis ATCC 10149 (se 5.4.1), som har en god alsidig foelsomhed, og som er saerligt foelsom over  for haemning med penicillin, tilsaettes en maelkeproeve sammen med naeringsstoffer. Ved inkubation, der  resulterer i organismens normale vaekst og syreproduktion, aendres pH-indikatorfarven fra violet til  gul. Tilstedevaerelsen af stoffer i maelken, som virker haemmende paa organismens vaekst, faar  pH-indikatorfarven til at forblive violet. 4. Apparatur og glasvarerSaedvanligt laboratorieudstyr og i saerdeleshed: 4.1. Apparatur4.1.1. Varmeskab, der kan holde en temperatur paa 64 oC p 1 oC. 4.1.2. Vandbad, der kan holde en temperatur paa 64 oC p 1 oC. 4.1.3. Stativ til glas eller ampuller. 4.1.4. Pipette med engangsspidser til proeveudtagning og dosering af 0,1 ml. 4.1.5. Tang eller pincet4.1.6. Varmluftsovn, der kan holde en temperatur paa 170 til 175 oC. 4.1.7. Autoklave, der kan holde en temperatur paa 121 p 1 oC. 4.1.8. pH-meter4.2. Glasvarer4.2.1. Proeveflasker med passende lukkeanordninger. NB: Visse gummipropper kan afsaette haemmende stoffer paa flaskehalsen. 4.2.2. Petriskaale af klart, ufarvet glas eller sterilt, syntetisk materiale med flad bund af ensartet  tykkelse, mindste indvendige diameter ca. 140 mm. 4.2.3. Flasker med en kapacitet paa 250 ml. 4.2.4. Pipetter (med vatprop) af glas eller sterilt, syntetisk materiale med en nominel kapacitet paa 1 ml  og 10 ml. 4.2.5. Glasspatler4.2.6. Glas eller ampuller, indvendig diameter ca. 8 mm, med kapsel eller prop. 4.2.7. Sterilisation af glasvarerGlasvarer steriliseres ved en af foelgende metoder: a)  henstand ved 170 til 175 oC i mindst en time i varmluftsovn (4.1.6)b)  henstand ved 121 p 1 oC  i mindst 20 minutter i autoklave (4.1.7). Det skal sikres, at der sker tilstraekkelig gennemtraengning af damp i autoklaven; hvis udstyret  f.eks. steriliseres i beholdere, skal disse ikke lukkes taet, og kolber og flasker skal have  loestsiddende laag. Glasvarer, der er steriliseret i autoklaven, toerres ved dampventilation. Pipetter steriliseres i en varmluftsovn. 5. Substrater, oploesninger, testorganismeSubstraternes bestanddele skal vaere egnede til  bakteriologiske formaal. Det anvendte vand skal vaere glasdestilleret eller demineraliseret med  mindst tilsvarende renhed. Det maa ikke indeholde stoffer, som virker haemmende paa testorganismen. 5.1. Substrater5.1.1. NaeringsagarSammensaetningGaerekstrakt2 gPepton5 gKoedekstrakt1 gNatriumklorid5 gAgar10 til  15 gVand1 000 mlFremstillingBestanddelene oploeses i vand. Der opvarmes til kogning med  lejlighedsvis skvulpning. pH indstilles, saa der opnaas en vaerdi paa 7,4 p 0,1 ved 25 oC efter  sterilisation. Til fremstilling af skraasubstrat tilsaettes henholdvis 10 ml i proeveglas eller 100 ml i flasker. Substratet steriliseres ved 121 p 1 oC i 15 minuter. 5.1.2. AgarsubstratSammensaetningNatriumklorid2 gAgar15 gVand1 000 mlTrimethoprimoploesning eller  tetroxoprimoploesning (se 5.1.3) (1)10 mlFremstillingAlle bestanddele bortset fra trimethoprim-  eller tetroxoprimoploesningen oploeses i vand. Der opvarmes til kogning med lejlighedsvis skvulpning.  Trimethoprim- eller tetroxoprimoploesningen tilsaettes, og der steriliseres ved 121 p 1 oC i 15  minutter; pH indstilles, saa der opnaas en vaerdi paa 7,0 p 0,1 ved 25 oC efter sterilisation. 5.1.3. Trimethoprim- eller tetroxoprimoploesningSammensaetningTrimethoprim5 mgeller tetroxoprim30  mgEthanol, 96 %5 ml/30 mlVandad 1 000 mlFremstillingTrimethoprim eller tetroxoprim oploeses i  ethanol (5 eller 30 ml) og fortyndes med vand. 5.1.4. NaeringsstofSammensaetningGaerekstrakt0,75 mgGlukose5,0 mgOploeselig stivelse8,0  mgBromkresolpurpur0,025 gVandad 50 mlFremstillingBestanddelene oploeses i vand, evt. under  opvarmning, og der sterilfiltreres. Naeringsstoffet faas i handelen som tabletter. 5.2. Standardpenicillinoploesninger5.2.1. Der fremstilles en penicillinoploesning paa 60 ìg/ml (= 100 IE/ml) ved oploesning af krystallinsk  natrium- eller kaliumbenzylpenicillin i sterilt destilleret vand i en steril flaske med  hensigtsmaessigt lukke. 5.2.2. Der fremstilles en arbejdsoploesning af penicillin ved tilsaetning af 1,25 ml af  penicillinoploesningen (5.2.1) til sterilt, destilleret vand til 1 000 ml. Denne arbejdsoploesning  indeholder 0,075 ìg/ml (= 0,125 IE/ml). 5.2.3. Der fremstilles 75 ml standardpenicillinoploesning indeholdende 0,004 ìg/ml (= 0,0067 IE/ml)  penicillin ved tilsaetning af 71 ml inhibitorfri maelk (5.3) til 4 ml af arbejdspenicillinoploesningen  (5.2.2), der blandes. 13. 4. 91De Europaeiske Faellesskabers Tidende5.2.4. De i 5.2.1 til 5.2.3 naevnte penicillinoploesninger skal fremstilles den dag, proeven udfoeres. 5.3. Inhibitorfri maelkTil kontrol fremstilles inhibitorfri maelk ved genfortynding (10 % m/v) af  skummetmaelkspulver, som tidligere er proevet og fundet frit for haemmende stoffer, i sterilt,  destilleret vand. Alternativt kan en tilstraekkelig stor maengde frisk maelk, som er proevet og fundet  fri for haemmende stoffer, doseres i flasker, opvarmes en time ved 100 oC og derefter opbevares i  koeleskab ved 0 til 6 oC i hoejst en uge. 5.4. Testorganisme5.4.1. Som testorganisme benyttes Bacillus stearothermophilus var. calidolactis stamme ATCC 10149. Stammen  er identisk med C 953. 5.4.2. Der fremstilles en stamkultur til vedligeholdelse af testkulturen. Testkulturen opbevares paa et  skraasubstrat af naeringsagar (5.1.1). Skraaagarsubstratet stregpodes paa overfladen ved brug af en  podeskaal med testkulturen og inkuberes earobt i 48 timer ved 63 p 1 oC. Efter inkubationen  forsegles glasset med en steril gummiprop. Denne stamkultur kan opbevares i flere maaneder i  koeleskab ved 0 til 5 oC. 5.5. Testkultur (sporeopslaemning)5.5.1. 20 ml af den smeltede naeringsagar (5.1.1) overfoeres aseptisk til en steril petriskaal (4.2.2) og  afkoeles til stuetemperatur. 5.5.2. Med en steril pipette (4.2.4) overfoeres 5 ml sterilt, destilleret vand til et glas med stamkultur  (5.4.2), og sporerne skylles af skraaagarsubstratet med en steril podenaal. Denne sporeopslaemning  skal opbevares ved 0 til 5 oC og benyttes inden for 36 timer. 5.5.3. Med en steril pipette (4.2.4) overfoeres 0,5 ml af sporeopslaemningen (5.5.2) til en agarplade  (5.5.1), og podestoffet spredes grundigt over hele overfladen med en boejet glasstang. Der inkuberes  ved 63 p 1 oC (4.1.1) i 16 til 18 timer. Naar der benyttes en stamkultur (5.4.2) eller en kultur, som er over 36 timer gammel, skal podning  foretages mindst to gange med et interval paa hoejst 36 timer. 5.5.4Med en steril pipette (4.2.4) overfoeres 10 ml destilleret vand til agarpladen (5.5.3), og med  en glasstav bringes sporer, der flyder paa overfladen, ned i vaesken. Sporeopslaemningen overfoeres til en flaske (4.2.3), der indeholder 250 ml sterilt, destilleret vand.  Flasken lukkes og rystes grundigt. Kulturer, som ikke skal podes umiddelbart, opbevares i koeleskab  ved 0 til 6 oC. 5.5.5. Sporeopslaemningen (5.5.4) skal praestere et levedygtigt kimtal paa 5 til 10 millioner pr. ml paa PCA  inkuberet ved 63 p 1 oC i 16 til 18 timer. Sporeopslaemningen skal vaere ensartet uklar, og hvis der  er fnugdannelse eller bundfald, skal den kasseres, og der fremstilles en ny opslaemning fra  stamkulturen (5.4.2). 5.6. Fremstilling af reagensglas/ampuller5.6.1. Agarsubstratet (5.1.2) smeltes og afkoeles til 55 oC. 5.6.2. 1 del frisk sporeopslaemning (5.5.4) tilsaettes til 5 dele agarsubstrat (5.6.1) i et glas eller en  flaske, og der blandes grundigt. 5.6.3. 0,3 ml af det podede substrat (5.6.2) beregnet til at danne et 5 mm tykt lag overfoeres til et  sterilt glas eller ampul (4.2.6), og der lukkes med en prop, kapsel eller ved smeltning af spidsen.  Disse reagensglas/ampuller afkoeles i lodret stilling, saa naeringssubstratet stoerkner, og det henstaar  derpaa i mindst 12 timer. 5.6.4. Reagensglassene/ampullerne kan bruges samme dag, men de kan opbevares i flere maaneder, forudsat at  de afkoeles umiddelbart efter fremstillingen og opbevares ved 0 til 6 oC. 6. Metodik6.1. Proeverne kontrolleres saa hurtigt som muligt og helst inden 24 timer efter proeveudtagningen, idet de  i mellemtiden holdes ved en temperatur paa 0 til 5 oC. Hvis det ikke er muligt at kontrollere  proeverne inden 24 timer, skal de opbevares i dybfryser (  30 til   15 oC) for at reducere  inaktiveringen af penicillinet til et minimum. 6.2. Hvert glas/ampul (5.6) identificeres tydeligt og paa en maade, saa det ikke kan slettes. Kapslen eller  proppen fjernes. Det antal, der er noedvendigt til undersoegelse af proeverne og kontrollerne (5.2 og  5.3), anbringes i et egnet stativ (4.1.3). 6.3. 50 ìl af naeringsstoffet som beskrevet i 5.1.4 tilsaettes til hvert glas/ampul. 6.4. Maelkeproeven blandes grundigt, og med sproejten (4.1.4) overfoeres 0,1 ml til det tilsvarende maerkede  glas/ampul. Der bruges en ren engangsspids til hver proeve, der skal overfoeres. 6.5. Metoden i 6.4 gentages, idet der benyttes standardpenicillinoploesning indeholdende 0,004 ìg/ml (=  0,0067 IE/ml) penicillin i stedet for maelkeproeven (5.2.3). 6.6. Metoden i 6.4 gentages, idet den inhibitorfri kontrolmaelk (5.3) benyttes i stedet for maelkeproeven. 6.7. Glassene/ampullerne lukkes, og stativet med glassene/ampullerne anbringes i vandbad ved 63 p 1 oC  (4.1.2) i mindst 2 1/2 til 2 3/4 timer. 6.8. Stativet med glassene/ampullerne fjernes fra vandbadet. 6.9. Testsubstratets farve (se 7) iagttages. 7. Fortolkning af resultater7.1. Purpurfarvning af testsubstratet i en maelkeproeve eller kontrolglassene/-ampullerne viser, at proeven  indeholder antibiotika eller sulfonamider paa eller omkring det »helt positive niveau«, der er  anfoert i tabellen paa side 39. Farven paa glassene/ampullerne med standardpenicillinoploesning (6.5)  skal forblive purpur for at vise, at proevesubstratet er tilstraekkeligt foelsomt. 7.2. Purpurfarvning af en del af det faste proevesubstrat eller uregelmaessig farvning i et af  maelkeproeveglassene/-ampullerne viser, at der forekommer haemmende stoffer mellem de niveauer, der er  anfoert i tabellen paa side 39. 7.3. Gulfarvning af det faste proevesubstrat i en af maelkeproeverne eller kontrolglassene/-ampullerne  angiver, at der ikke er stoffer, der virker haemmende paa testorganismen. 7.4. Hvis der sker purpurfarvning i alle de afproevede glas/ampuller, herunder negativkontrollen,  indeholder glassene/ampullerne ikke levedygtige sporer, og proeverne skal kontrolleres igen med  nyfremstillet proevemateriale. 8. Verifikation af resultater8.1. Alle proever verificeres som beskrevet i 7.1 og 7.2 ifoelge »Metode B«. Hvis det er noedvendigt at opbevare maelkeproever inden verifikationen, skal de dybfryses for at undgaa  nedbrydning af antibiotika. B. Metode til verifikation af penicillin og bestemmelse af koncentration1. Verifikationsundersoegelsens omfang og anvendelsesomraadeDette er en beskrivelse af  verifikationsundersoegelsen for penicillin og andre antibiotika end penicillin samt metoden til  bestemmelse af penicillinkoncentrationen i maelkeproever med positiv (A.7.1) eller usikker reaktion  (A.7.2). Forskellige antibiotikas foelsomhed over for metodenSe A.1. 2. Definition2.1. Maelkeproeven indeholder antibiotika, herunder sulfonamider, naar proeven ved den beskrevne metode  giver en klar haemningszone paa mindst 2 mm rundt om disken. 2.2. Hvis en proeve, der indeholder antibiotika, herunder sulfonamider (se 2.1), og hvortil der er tilsat  penicillinase (betalaktamase), ikke giver en klar zone eller en klar zone med en mindre diameter  end uden penicillinase, er det haemmende stof enten penicillin eller baade penicillin og et andet  antibiotikum, herunder sulfonamider. 2.3. Hvis zonen ikke neutraliseres af penicillinase (2.2), er det haemmende stof i maelkeproeven andre  antibiotika end penicillin, men det kan vaere en anden restkoncentration (se direktiv 85/397/EOEF,  bilag A, kapitel VI, A.1.f) og 2.b)). Nogle af de semisyntetiske penicilliner, f.eks. natriumcloxacillin, inaktiveres ikke eller kun  delvis af penicillinase eller er helt modstandsdygtige og identificeres derfor ikke som penicillin  (se 7.3). 3. PrincipEn absorberende papirdisk impraegneret med maelken, der skal undersoeges, anbringes paa  overfladen af et agarsubstrat, som er podet med Bacillus stearothermophilus var. calidolactis.  Inkubation, der resulterer i organismens normale vaekst, goer agaren grumset. Tilstedevaerelse i  maelken af stoffer, som virker haemmende paa organismernes vaekst, angives af en klar zone rundt om  disken. Denne klare zones stoerrelse afhaenger bl.a. af koncentrationen og typen af haemmende stof i  maelken. 4. Apparatur, glasvarer og udstyr4.1. Apparatur4.1.1. Se A.4.1. 4.1.2. Vandbad, der kan holde en temperatur paa 80 p 1 oC. 4.2. GlasvarerSe A.4.2. 4.3. Papirdisk, inhibitorfri, diameter 9 til 13 mm, med en kapacitet paa omkring 130 mg (skala 60 til 180  mg) maelk (helst opbevaret i ekssikkator). 5. Substrater, standardoploesninger, penicillinaseoploesning, reagenser, testorganisme m.v. Bestanddelene i substratet skal vaere egnet til de bakteriologiske formaal, Det anvendte vand skal  vaere glasdestilleret eller demineraliseret til mindst tilsvarende renhed. Det maa ikke indeholde  stoffer, som virker haemmende paa testorganismer. 5.1. Substrater5.1.1. Naeringsagar (A.5.1.1)5.1.2. Testsubstrat til paavisning af haemmende stofferSammensaetningGaerekstrakt2,5 gTrypton5  gGlukose1 gTrimethoprim- eller textroxoprimoploesning (A.5.1.3)10 mlAgar10 til 15 g (afhaengig  af gelatineringsevnen)Vand1 000 mlFremstillingDe faste bestanddele oploeses fuldstaendigt i vand  ved opvarmning og omroering, inden trimethoprim- eller tetroxoprimoploesningen tilsaettes. Naar  trimethoprim- eller tetroxoprimoploesningen er tilsat, skal pH-vaerdien justeres, saaledes at den  efter sterilisationen er 8,0 p 0,1 ved 25 oC. Substratet steriliseres i 15 minutter ved 121 p 1  oC. 5.2. Standardpenicillinoploesninger i maelkSe A.5.2. Til kvantitativ bestemmelse af de haemmende stoffer (8) fremstilles standardpenicillinoploesninger i  inhibitorfri maelk (A.5.3) med foelgende koncentrationer: a)  0,004 ìg/ml (0,0067 IE/ml)b)0,006 ìg/ml (0,01 IE/ml)c)0,03 ìg/ml (0,05 IE/ml)d)0,06 ìg/ml  (0,1 IE/ml). 5.3. Penicillinoploesning5.3.1. En tilstraekkelig maengde penicillinase (betalaktamase) oploeses i sterilt, destilleret vand, saa der  opnaas en koncentration paa 1 000 enheder/ml. Denne oploesning kan opbevares ved 0 til 5 oC i indtil  fire uger, helst fordelt i smaa portioner. NB: Der findes ingen ensartet international standard for penicillinase. Med henblik paa denne metode  forudsaettes det, at 10 enheder penicillinase er tilstraekkeligt til at inaktivere 0,6 ìg (= 1 IE)  penicillin. For penicillinase af ukendt styrke vil det vaere noedvendigt at kontrollere, om denne  forudsaetning er opfyldt. Ellers er det noedvendigt at aendre koncentrationen af  penicillinaseoploesningen tilsvarende. 5.3.2. I stedet for penicillinaseoploesningen kan der benyttes disks med penicillinase, der faas i handelen,  hvis disse efter en kontrolmetode findes at indeholde en passende maengde penicillinase. 5.4. TestorganismeSe A.5.4. 5.5. Testkultur (sporeopslaemning)Se A.5.5. 5.6. Fremstilling af testplader5.6.1. Testsubstratet smeltes til paavisning af haemmende stoffer (5.1.2) og afkoeles til 55 oC. 5.6.2. 1 del frisk sporeopslaemning (5.5) tilsaettes til saa mange dele af testsubstratet til paavisning af  haemmende stoffer (5.1.2), som giver en passende kolonitaethed i det podede testsubstrat, og der  blandes grundigt. 5.6.3. Det podede testsubstrat (5.6.2) overfoeres til en steril petriskaal (A.4.2.2), som i forvejen er  opvarmet til 55 oC, saa der opnaas et lag paa 0,6 til 0,8 mm tykkelse. For en petriskaal med en  indvendig diameter paa 140 mm skal der ca. 15 ml proevesubstrat til en tykkelse paa 0,8 mm. 5.6.4. Petriskaalene overfoeres til en kold, vandret flade, som tidligere er kontrolleret med en libelle,  laagene fjernes, og man lader agarsubstratet stoerkne. Naar substratet er stoerknet, saettes laagene paa  skaalene, som derefter vendes om for at reducere kondensering paa agarsubstratets overflade. 5.6.5. De saaledes fremstillede testplader boer benyttes samme dag, men de kan opbevares i indtil to uger,  forudsat at de anbringes i en forseglet plasticpose ved 5 oC umiddelbart efter fremstillingen. 5.6.6. Bunden af testpladen maerkes med henblik paa identifikation af proeverne. 6. Metodik6.1. Fremstilling af proeve6.1.1. Proever, som giver positive eller usikre resultater ved »Metode A« (A.7.1 og A.7.2), skal undersoeges  igen, identificeres og kvantificeres som penicillin. 6.1.2. Maelkeproeverne opvarmes til 80 p 1 oC i 10 minutter, saa paavirkninger fra termolabile, uspecifikke  inhibitorer undgaas. 6.1.3. Efter grundig blanding overfoeres ca. 10 ml af den opvarmede maelkeproeve til en egnet, steril flaske  med bred aabning, Ca. 0,4 ml af penicillinaseoploesningen (5.3) tilsaettes maelken, og der blandes  grundigt. 6.2. Paavisning af inhibitorer6.2.1. En papirdisk (4.3) dyppes i maelkeproeven (6.1.2) med en ren, toer pincet. Eventuel overskydende maelk  fjernes ved at disken stryges langs randen af proeveflasken. Disken anbringes fladt paa testpladen  (5.6) og presses forsigtigt ned mod overfladen med pincetten. 6.2.2. Der skal vaere mindst 20 mm mellem disks, der er fremstillet med de forskellige maelkeproever, ligesom  disse skal anbringes mindst 10 mm fra kanten. 6.2.3. Til kontrol af foelsomheden skal disks (4.3), der er dyppet i standardpenicillinoploesninger  (5.2.a)), anbringes vilkaarligt mellem maelkeproevediskene, saa de udgoer mindst 2 % af  maelkeproevediskene, og der benyttes mindst fem standarddisks for hver undersoegelse. 6.2.4. Naar alle disks er anbragt vilkaarligt paa agarsubstratet og er identificeret, vendes pladerne om og  inkuberes ved 63 p 1 oC i 2,5 til 5 timer. 6.2.5. Efter inkubationen undersoeges pladerne foran en egnet lyskilde for klare haemningszoner rundt om  papirdiskene. De klare zoner maales. 6.2.6. Der skal vaere zoner paa mindst 2 mm rundt om diskene, der indeholder standardpenicillinoploesningen  (6.2.3). 6.2.7. Tilstedevaerelsen af klare zoner, der er mindst lige saa brede som i 6.2.6, rundt om diskene med  maelkeproeven indikerer stoffer, der virker haemmende paa testorganismen. 6.3. Identifikation og kvantificering af det haemmende stof6.3.1. Metode 6.2.1 udfoeres igen paa den opvarmede maelkeproeve (6.1.2) og paa proeven, som er behandlet med  penicillinase (6.1.3). I stedet for at tilsaette penicillinase til 10 ml af maelkeproeven kan en  fremstillet penicillinasedisk (5.3.2) dyppes i denne proeve og anbringes paa testpladen. 6.3.2. Metode 6.2.1 udfoeres igen for hver standardpenicillinoploesning naevnt i 5.2.a) til d). 6.3.3. Gennemsnitsdiameteren paa de klare haemningszoner for maelkeproeven og for penicillinasekontrollen samt  for standardpenicillinoploesningerne bestemmes. 7. Fortolkning af resultater (se 2)7.1. Hvis der ikke er en klar zone rundt om disken med penicillinasekontrollen, men der er en klar zone  rundt om disken med maelkeproeven, som er lige saa stor eller stoerre end zonen rundt om disken med  standardpenicillinoploesningen (5.2.a)), svarer det haemmende stof i maelkeproeven til en  natrium-(kalium)-benzyl-penicillinkoncentration paa mindst 0,004 ìg/ml. 7.2. Hvis gennemsnitsdiameteren paa den klare zone rundt om disken med penicillinase svarer til  gennemsnitsdiameteren paa den klare zone rundt om disken med maelkeproeven, indeholder maelken haemmende  stoffer, som ikke kan inaktiveres med de penicillinasekoncentrationer, der benyttes ved denne  metode. 7.3. Hvis gennemsnitsdiameteren paa den klare zone rundt om disken med penicillinase er mindre end  gennemsnitsdiameteren paa den klare zone rundt om disken med maelkeproeven, som er opvarmet ifoelge  6.1.2, indeholder maelkeproeven penicillin samt andre antibiotika, herunder sulfonamider, end  penicillin eller semisyntetisk penicillin, som ikke kan identificeres med den  penicillinasekoncentration, der benyttes ved denne metode. Syntetiske penicilliner, f.eks.  natriumcloxacillin, inaktiveres maaske ikke af penicillinase under undersoegelsesbetingelserne og kan  derfor klassificeres som andre inhibitorer end penicillin. NB: Andre haemmende stoffer end penicillin kan eventuelt identificeres ved egnede metoder. 8. Bestemmelse af penicillinindholdet8.1. Penicillinindholdet kan bestemmes enten ved tegning af en standardkurve eller ved beregningpaa  grundlag af de zonestoerrelser, der er opnaaet med standardpenicillinoploesningerne (5.2.a)til d)). 8.2. Tegning af en standardkurveDa der er lineaer korrelation mellem 1 og 10 af  penicillinkoncentrationen og haemningszonernes diameter, kan standardkurven tegnes paa  semilogaritmisk papir med penicillinkoncentrationerne som den logaritmiske ordinat og  haemningszonerne som abscissen. Haemningszonerne beregnes som gennemsnit af dobbeltproeverne.  Haemningszonernes diameter plottes i forhold til standardpenicillinkoncentrationerne, og  standardkurven tegnes. 8.3. BeregningPenicillinkoncentrationerne i maelkeproeven kan beregnes paa grundlag af deres zonediameter  ved hjaelp af ligningen eller standardkurven. For at opnaa en noejagtig bestemmelse skal  haemningszonernes radius vaere mindst to gange og hoejst fem gange stoerre end diskenes radius. 9. Angivelse af resultater9.1. Resultaterne udtrykkes som penicillinindhold lig med eller over 0,004 ìg/ml (eller ved angivelse af  den bestemte koncentration) eller som indhold af andre inhibitorer end penicillin. 9.2. Repeterbarhed (r) og reproducerbarhed (R)Der findes ingen tal, og de ville ikke give mening, da  der benyttes en standard til sammenligning. IX. PAAVISNING AF PATOGENE MIKROORGANISMER1. Omfang og anvendelsesomraadeI henhold til kravet i direktiv 85/397/EOEF, bilag A, kapitel VII, punkt  2, beskrives her de forskrifter, der skal foelges, naar pasteuriseret maelk kontrolleres for patogene  mikroorganismer. 2. DefinitionDer skal undersoeges for de bakteriearter, som hyppigst fremkalder levnedsmiddelbaarne  sygdomme. Pasteurisering er en sikkerhedsforanstaltning mod tilstedevaerelse af ikke-termoresistente patogene  kim i maelk. Hvis normerne, der er fastlagt i direktiv 85/397/EOEF, bilag A, kapitel VII, punkt 2,  for kimtal ved 30 oC og 21 oC, fosfatase og coliforme bakterier, opfyldes, er en saerlig proeve for  patogene kim kun noedvendig i tilfaelde af mistanke om, at maelken har forbindelse med tilfaelde af  madforgiftning. 3. MetodikUndersoegelsesmetoder og -hyppighed skal fastlaegges af den nationale myndighed paa en saadan  maade, at det bliver muligt at udstede hygiejnecertifikater vedroerende varmebehandlet maelk med  henblik paa handel inden for Faellesskabet. Til paavisning af patogene mikroorganismer gaelder  eventuelle internationalt godkendte kriterier og metoder. 4. ResultatrapportFor hver undersoegt patogen mikroorganisme skal resultatet angives paa foelgende  maade: Antal pr. ml maelk eller »Tilstedevaerelse« eller »Manglende tilstedevaerelse« i den maengde  pasteuriseret maelk, der kraeves til den anvendte metode. Rapporten skal klart beskrive den anvendte  metode. (1) Patentlovgivningen omhandlende brug af dyrkningsmedia med indhold af ante-fetal  bestanddele skal tages i betragtning. Nr. L 93/42