CELEX: 32001D0183
Language: lt
Date: 982800000000
Title: 2001 m. vasario 22 d. Komisijos sprendimas, nustatantis mėginių ėmimo planus ir diagnostinius metodus, taikomus diagnozuoti ir patvirtinti tam tikras žuvų ligas, ir panaikinantis Sprendimą 92/532/EEB (pranešta dokumentu Nr. C(2001) 426)tekstas svarbus EEE

Svarbus teisinis pranešimas

|

32001D0183

2001 m. vasario 22 d. Komisijos sprendimas, nustatantis mėginių ėmimo planus ir diagnostinius metodus, taikomus diagnozuoti ir patvirtinti tam tikras žuvų ligas, ir panaikinantis Sprendimą 92/532/EEB (pranešta dokumentu Nr. C(2001) 426)tekstas svarbus EEE  

Oficialusis leidinys L 067 , 09/03/2001 p. 0065 - 0076 CS.ES skyrius 3 tomas 31 p. 409  - 420 ET.ES skyrius 3 tomas 31 p. 409  - 420 HU.ES skyrius 3 tomas 31 p. 409  - 420 LT.ES skyrius 3 tomas 31 p. 409  - 420 LV.ES skyrius 3 tomas 31 p. 409  - 420 MT.ES skyrius 3 tomas 31 p. 409  - 420 PL.ES skyrius 3 tomas 31 p. 409  - 420 SK.ES skyrius 3 tomas 31 p. 409  - 420 SL.ES skyrius 3 tomas 31 p. 409  - 420

		Komisijos sprendimas2001 m. vasario 22 d.nustatantis mėginių ėmimo planus ir diagnostinius metodus, taikomus diagnozuoti ir patvirtinti tam tikras žuvų ligas, ir panaikinantis Sprendimą 92/532/EEB(pranešta dokumentu Nr. C(2001) 426)(tekstas svarbus EEE)(2001/183/EB)EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA,atsižvelgdama į Europos bendrijos steigimo sutartį,atsižvelgdama į 1991 m. sausio 28 d. Direktyvą 91/67/EEB dėl gyvūnų sveikatos reikalavimų, reglamentuojanti akvakultūros gyvūnų ir jų produktų teikimą į rinką [1], su paskutiniais pakeitimais, padarytais Direktyva 98/45/EB [2], ypač į jos 15 straipsnį,kadangi:(1) Mėginių ėmimo planai ir diagnostikos metodai, taikomi aptikti ir patvirtinti tam tikras žuvų ligas, buvo nustatyti Komisijos sprendime 92/532/EEB [3] su pakeitimais, padarytais Komisijos sprendimu 96/240/EB [4].(2) Nuo to laiko, kai buvo priimtas Sprendimas 92/532/EEB, įvyko plėtra praktikos ir mokslo srityse, taip pat iš dalies buvo pakeista Direktyva 91/67/EEB. Todėl būtina atnaujinti mėginių ėmimo planus ir diagnostinius metodus.(3) Toks atnaujinimas yra susijęs su virusų, sukeliančių virusinę hemoraginę septicemiją (VHS) ir infekcinę hematopoetinę nekrozę (IHN), taip pat su pakeitimais, padarytais pagal paskutinius dalinius Direktyvos 91/67/EEB pakeitimus.(4) Buvo tartasi su Bendrijos etalonine žuvų ligų laboratorija, įsteigta Tarybos direktyva 93/53/EEB [5].(5) Mėginių ėmimo planai ir diagnozavimo metodai, taikomi aptikti ir patvirtinti tam tikras žuvų ligas, kurie buvo nustatyti Sprendimu 92/532/EEB, aiškumo dėlei turi būti panaikinti.(6) Šiame sprendime numatytos priemonės atitinka Veterinarijos nuolatinio komiteto nuomonę,PRIĖMĖ ŠĮ SPRENDIMĄ:1 straipsnisMėginių ėmimo planas ir diagnostiniai metodai, taikomi aptikti ir patvirtinti virusinę hemoraginę septicemiją (VHS) ir infekcinę hematopoetinę nekrozę (IHN) yra nustatyti priede.2 straipsnisŠiuo sprendimu panaikinamas Sprendimas 92/532/EEB.3 straipsnisŠis Sprendimas skirtas valstybėms narėms.Priimta Briuselyje, 2001 m. vasario 22 d.Komisijos varduDavid ByrneKomisijos narys[1] OL L 46, 1991 2 19, p. 1.[2] OL L 189, 1998 7 3, p. 12.[3] OL L 337, 1992 11 21, p. 18.[4] OL L 79, 1996 3 29, p. 19.[5] OL L 175, 1993 7 19, p. 23.--------------------------------------------------PRIEDASMĖGINIŲ ĖMIMO PLANAI IR DIAGNOSTINIAI METODAI, TAIKOMI APTIKTI IR PATVIRTINTI VIRUSINĘ HEMORAGINĘ SEPTICEMIJĄ (VHS) IR INFEKCINĘ HEMATOPOETINĘ NEKROZĘ (IHN)ĮVADASŠiame priede:a) numatytos mėginių ėmimo ir diagnostinių metodų, taikomų aptikti ir patvirtinti virusinę hemoraginę septicemiją (VHS) ir infekcinės hematopoetinė nekrozės (IHN) buvimą, rekomendacijos ir minimalūs reikalavimai;b) sujungiamos Direktyvos 91/67/EEB B ir C priedų nuostatos dėl patvirtintų zonų ir nepatvirtintose zonose esančių ūkių statuso patvirtinimo ir išlaikymo;c) išvardijamos nuostatos, taikomos tinkamai VHS ir IHN diagnozei atlikti ir oficialiam zonų ir nepatvirtintose zonose esančių ūkių statusui patvirtinti pagal Direktyvos 91/67/EEB 5 ir 6 straipsnius;d) yra tiesiogiai skirtas valdžios institucijoms, atsakingoms už VHS ir IHN kontrolę, taip pat laboratorijos personalui, atliekančiam su šiomis ligomis susijusius tyrimus. Todėl ypač pabrėžiama mėginių ėmimo tvarka, laboratorinių tyrimų principai ir jų taikymas bei jų metu gauti rezultatai, taip pat išsamūs laboratoriniai metodai. Tačiau tam tikrais atvejais laboratorija gali taikyti pakeistus, šiame priede apibūdintus tyrimus arba naudoti kitokius tyrimus, jeigu bus pasiektas lygiavertis jautrumas ir specifiškumas.I dalį sudaro VHS ir IHN priežiūrai taikomi mėginių ėmimo planai ir diagnostiniai metodai, siekiant gauti ir išlaikyti zonos arba nepatvirtintoje zonoje esančio ūkio statusą.II dalyje apibūdinama VHS ir IHN patvirtinimui taikoma diagnozavimo tvarka, jeigu dėl jų kyla įtarimų.III dalyje išvardyti kriterijai ir rekomendacijos, skirti oficialiai sveikatos tikrinimo programai, kurioje dokumentuojami paskutiniųjų metų duomenys apie tai, kad nebuvo VHS ir (arba) IHN atvejų.IV dalyje pateikiamos rekomendacijos dėl VHS ir IHN viruso titravimo atlikimo tvarkos, kad būtų galima patikrinti ląstelės kultūros imlumą infekcijai.Akronimai ir sutrumpinimai yra išvardyti V dalyje.I DALIS Mėginių ėmimo planai ir diagnostiniai metodai, taikomi VHS ir IHN priežiūrai, siekiant gauti ir išlaikyti zonos arba nepatvirtintoje zonoje esančio ūkio statusąI. Tyrimai ir mėginių ėmimas1. Bendrosios nuostatos dėl klinikinių sveikatos tikrinimų, mėginių rinkimo ir atrankos, taikomų zonoms arba nepatvirtintose zonose esantiems ūkiams, siekiant gauti arba išlaikyti patvirtintą VHS ir (arba) IHN statusąKlinikiniai sveikatos tikrinimai ir žuvų audinių bei kiaušidžių skysčio mėginių ėmimas, kurie turi būti atliekami zonose arba nepatvirtintose zonose esančiuose ūkiuose, siekiant gauti arba išlaikyti patvirtintą VHS ir (arba) IHN statusą pagal Direktyvos 91/67/EEB B ir C priedus, yra apibendrinti 1A, 1B ir 1C lentelėse. Papildoma išsami informacija yra pateikta I.I.2 – I.I.4 dalyse. 1A ir 1B lentelės netaikomos naujiems ūkiams ir ūkiams, kurie atnaujina savo veiklą su žuvimis, kiaušiniais arba gametomis, kurie gauti iš patvirtintos zonos arba iš patvirtinto ūkio, esančio nepatvirtintoje zonoje, jeigu jie atitinka Direktyvos 91/67/EEB C priedo I.A.6 dalies a punkte, I.A.6 dalies b punkte, II.A.3 dalies a punkte arba II.A.3 dalies b punkte nustatytus reikalavimus.Klinikiniai patikrinimai turi būti atliekami spalio–birželio mėnesiais ar kitu laikotarpiu, kai vandens temperatūra yra žemesnė nei 14 °C. Kai ūkiai kliniškai tikrinami du kartus per metus, tarp patikrinimų turi būti ne mažesnė kaip keturių mėnesių pertrauka. Visi vandens telkiniai (tvenkiniai, rezervuarai, žuvidės ir pan.) turi būti patikrinti, ar juose nėra negyvų, silpnų arba neįprastai besielgiančių žuvų. Ypatingai būtina apžiūrėti vandens ištekėjimo kanalus, kuriuose susirenka vandens srovės atneštos silpnos žuvys.Mėginiams imama žuvis atrenkama tokiu būdu.- Jei auginami vaivorykštiniai upėtakiai, mėginiams atrenkama tik šios rūšies žuvis. Jei vaivorykštiniai upėtakiai neauginami, mėginys gaunamas iš kitų auginamų žuvų, jeigu šios rūšys yra jautrios VHS ir (arba) IHN (kaip išvardyta Direktyvos 91/67/EEB A priede). Mėginyje kiekvienos rūšies turi būti proporcingai.- Jeigu žuvys auginamos daugiau nei viename vandens telkinyje, žuvų mėginys turi būti paimamas iš visų vandens telkinių.- Jeigu randama silpnų, neįprastai besielgiančių arba ką tik nugaišusių (nesuirusių) žuvų, pirmiausiai turi būti atrinktos šios žuvys. Jeigu tokių žuvų nėra, įprastai atrodančios, sveikos žuvys atrenkamos taip, kad į mėginį proporcingomis dalimis patektų žuvys iš visų ūkio vietų, taip pat ir iš visų klasių pagal metus.2. Konkrečios nuostatos, įskaitant mėginių ėmimą, zonų arba nepatvirtintose zonose esančių ūkių priežiūrai, siekiant gauti arba išlaikyti patvirtintą VHS ir (arba) IHN statusą1. Zona arba nepatvirtintoje zonoje esantis ūkis, kurį prižiūri oficialios tarnybos, gali gauti patvirtintą VHS ir (arba) IHN statusą, jeigu:a) A modelis – dvejų metų priežiūros programaJeigu ne mažiau kaip per dvejus metus neaptinkami jokie klinikiniai ar kitokie VHS ir (arba) IHN požymiai, visuose toje zonoje esančiuose ūkiuose arba bet kuriame nepatvirtintoje zonoje esančiame ūkyje, kurie turi būti patvirtinti, sveikatos tikrinimas turi būti atliekamas du kartus per metus dvejus metus. Per šį dvejų metų kontrolinį laikotarpį iki tol, kol įgyjamas patvirtintas statusas, neturi būti jokių klinikinių ar kitokių VHS ir (arba) IHN požymių, mėginiai imami, kad būtų patikrinti pagal 1A lentelę. Be to, mėginiai turi būti atrenkami, paruošiami ir patikrinami kaip apibūdinta I.I – I.IV dalyse, o laboratorinių tyrimų metu turi būti gauti neigiami VHS ir (arba) IHN rezultatai; arbab) B modelis – dvejų metų priežiūros programa su sumažintu mėginių dydžiuJei ne mažiau kaip per ketverius metus oficialioje sveikatos tikrinimo programoje užregistruojama, kad per pastaruosius metus nebuvo VHS ir (arba) IHN atvejų, visuose zonoje esančiuose ūkiuose arba bet kuriame nepatvirtintoje zonoje esančiame ūkyje, kurie turi būti patvirtinti, sveikatos tikrinimas turi būti atliekamas du kartus per metus dvejus metus. Per šį dvejų metų kontrolinį laikotarpį iki tol, kol įgyjamas patvirtintas statusas, neturi būti jokių klinikinių ar kitokių VHS ir (arba) IHN požymių, mėginiai imami, kad būtų patikrinti pagal 1B lentelę. Be to, mėginiai turi būti atrenkami, paruošiami ir patikrinami kaip apibūdinta I.I – I.IV dalyse, o laboratorinių patikrinimų metu turi būti gauti neigiami VHS ir (arba) IHN rezultatai. Kad oficialios tarnybos galėtų pripažinti sveikatos tikrinimo programą dėl dokumentais pagrįsto VHS ir (arba) IHN nebuvimo, ji turi atitikti III dalyje išvardytus kriterijus.2. Specialiosios nuostatos dėl naujų ūkių ir ūkių, kurie atnaujina savo veiklą su žuvimis, kiaušiniais arba gametomis, gautais iš patvirtintos zonos arba iš nepatvirtintoje zonoje esančio patvirtinto ūkioNauji ūkiai ir ūkiai, kurie atnaujina savo veiklą su žuvimis, kiaušiniais arba gametomis, gautais iš patvirtintos zonos arba iš nepatvirtintoje zonoje esančio patvirtinto ūkio, gali įgyti statusą pagal Direktyvos 91/67/EEB C priedo I.A.6 dalies a/b punkto arba II.A.3 dalies a/b punkto reikalavimus. Atitinkamai pirmiau nurodytuose A ir B modeliuose nustatytos mėginių ėmimo nuostatos (I.I.2 dalies a punktas ir I.I.2 dalies b punktas) šiems ūkiams netaikomos.3. Priežiūros programa, siekiant išlaikyti patvirtintą VHS ir (arba) IHN statusąSiekiant išlaikyti zonos arba nepatvirtintoje zonoje esančio ūkio patvirtintą VHS ir (arba) IHN statusą, patikrinimai ir mėginių ėmimas ištyrimui turi būti atliekami pagal 1C lentelę. Mėginiai turi būti atrenkami, paruošiami ir ištiriami kaip apibūdinta I.I – I.IV dalyse, VHS ir (arba) IHN veiksnių laboratorinių tyrimų rezultatai turi būti neigiami.3. Žuvų mėginių paruošimas ir išgabenimasOrganų dalys, kurios turi būti ištirtos, prieš jas išgabenant arba perduodant į laboratoriją, iš žuvies išimami steriliais skrodimo įrankiais ir įdedami į sterilius plastikinius vamzdelius su gabenimo terpe, t. y. ląstelių kultūros terpė su 10 % veršelio serumu ir antibiotikais. Rekomenduojama į vieną mililitrą ląstelių terpės įdėti 200 TV penicilino, 200 μg streptomicino ir 200 μg kanamicino, bet galima naudoti ir kitus patvirtinto veiksmingumo antibiotikus. Audinių medžiaga, kuri turi būti ištirta, – tai blužnies, inkstų priekinės dalies bei, papildomai, širdies ar galvos smegenų mėginiai. Tam tikrais atvejais turi būti ištirtas kiaušidžių skystis (1A – C lentelės).Organų gabalėliai ar kiaušidžių skystis, kurie buvo surinkti iš ne daugiau kaip 10 žuvų (1A – C lentelės) gali būti sudėti viename steriliame vamzdelyje, kuriame yra ne mažiau kaip 4 ml gabenimo terpės ir kurie sudaro vieną bendrą mėginį. Kiekvieno mėginio audinių svoris turėtų būti mažiausiai 0,5 gramo (g).Vamzdeliai turėtų būti gabenami sudėti į izoliuotas talpyklas (pvz., polistirolo dėžes storomis sienelėmis), kuriose būtų pakankamai ledo arba "šaldymo blokų", kad būtų užtikrintas mėginių atšaldymas juos gabenant į laboratoriją. Mėginių negalima užšaldyti. Mėginio temperatūra gabenimo metu jokiu būdu neturėtų viršyti 10 °C, o gabenimo dėžėje, ją gavus, ledo vis dar turėtų būti arba vienas ar keli šaldymo blokai turėtų būti iš dalies arba visai užšalę.Virusologinis tyrimas turi būti pradedamas kuo greičiau ir ne vėliau kaip 48 valandos nuo mėginių paėmimo. Išskirtiniais atvejais [1] virusologinis tyrimas gali būti pradėtas vėliausiai per 72 valandas nuo medžiagos surinkimo, jeigu tirtina medžiaga yra apsaugota gabenimo terpe ir jeigu gabenimo metu sugebama laikytis temperatūros reikalavimų (I.I.3 dalies 3 punktas).Į laboratoriją galima siųsti visą žuvį, jeigu gabenimo metu sugebama laikytis temperatūros reikalavimų. Visa žuvis gali būti suvyniota į sugeriamą popierių, ir galiausiai turi būti gabenama plastikinėje dėžėje, kuri atšaldyta kaip buvo minėta. Gyva žuvis taip pat gali būti siunčiama.Visų rūšių pakavimas ir ženklinimas etiketėmis turi būti atliekami atitinkamai pagal esamus nacionalinius ir tarptautinius pervežimų norminius aktus.4. Papildomos diagnostinės medžiagos rinkimasPagal susitarimą su tyrimuose dalyvaujančia diagnostine laboratorija, kiti žuvų audiniai taip pat gali būti renkami ir paruošiami papildomam ištyrimui.II. Mėginių paruošimas virusologiniam tyrimui1. Užšaldymas išskirtiniais atvejaisJeigu kyla praktinių kliūčių (pvz., blogos oro sąlygos, nedarbo dienos, problemos laboratorijoje ir pan.), dėl kurių neįmanoma ląsteles inokuliuoti per 48 valandas nuo audinių mėginių paėmimo, leidžiama audinių mėginius užšaldyti ląstelių kultūros terpėje –20 °C ar žemesnėje temperatūroje, ir virusologinį tyrimą atlikti per 14 dienų. Tačiau audiniai turi būti užšaldomi ir atšildomi tik vieną kartą prieš tyrimą. Įrašuose turi būti išsami informacija apie kiekvieno audinių mėginių užšaldymo atvejo priežastį (pvz., audra, ląstelių linijų žūtis ir pan.)2. Organų homogenizavimasLaboratorijoje vamzdeliuose esantys audiniai turi būti visiškai homogenizuoti (smulkintuvu, maišytuvu arba grūstuvu ir piesta su steriliu smėliu) ir vėliau perkelti į pradinę audinių gabenimo terpę.Jeigu mėginį sudarė visa žuvis, trumpesnė nei 4 cm, organai turėtų būti susmulkinami steriliomis žirklėmis arba skalpeliu, prieš tai pašalinus kūno dalį, esančią už žarnos angos. Jeigu mėginį sudarė visa žuvis, kurios kūno ilgis nuo 4 iki 6 cm, turėtų būti surenkami visi vidaus organai, įskaitant inkstus. Jeigu mėginį sudaro visa žuvis, ilgesnė negu 6 cm, audinių mėginiai turėtų būti imami kaip apibūdinta I.I.3 dalyje. Audinių mėginiai turėtų būti susmulkinami steriliomis žirklėmis arba skalpeliu ir homogenizuojami kaip apibūdinta pirmiau bei suspenduojami gabenimo terpėje.Galutinis audinio ir audinių terpės santykis, kuris nustatomas laboratorijoje, turi būti 1:10.3. Homogenato centrifugavimasHomogenatas yra centrifuguojamas 15 min. šaldomoje centrifugoje, esant 2000–4000 × g, 2 °C – 5 °C temperatūroje. Atlikus centrifugavimą, supernatantas yra nupilamas ir 4 val. laikomas 15 °C arba 4 °C per naktį, įdedama antibiotikų, pvz., šiame etape naudinga naudoti 1 mg/ml gentamicino.Tuo atveju, kai mėginiai gabenami gabenimo terpėje (t. y. su antibiotikais), antibiotikų į supernatantą pridėti nebūtina.Poveikio antibiotikais tikslas yra kontroliuoti mėginių taršą bakterijomis, tuomet nereikia filtruoti membraniniais filtrais.Jei surinktas supernatantas yra laikomas – 80 °C temperatūroje 48 valandas po mėginių ėmimo, jis virusologiniam tyrimui gali būti panaudotas tik vieną kartą.Jei dėl techninių problemų (pvz., sugedo inkubatorius, nepakanka ląstelių kultūrų ir pan.) per 48 val. po mėginių surinkimo neįmanoma atlikti tyrimų, galima supernatantą užšaldyti iki –80 °C ir atlikti virusologinius tyrimus per 14 dienų.Prieš užkrečiant ląsteles, supernatantas lygiomis dalimis sumaišomas su infekcinės kasos nekrozės viruso vietinių padermių tinkamai atskiestu antiserumu ir inkubuojamas mažiausiai vieną valandą 15 °C arba ne ilgiau kaip 18 val. 4 °C temperatūroje. Antiserumo titras turi būti ne mažesnis kaip 1/2000 50 % neutralizacijos testo ploto.Viso užkrato apdorojimas infekcinio kasos nekrozės viruso antiserumu (viruso, kuris tam tikrose Europos dalyse pasireiškia 50 % žuvų mėginių), tikslas apsaugoti ląsteles nuo citopatinio poveikio, kurį sukelia infekcinės kasos nekrozės virusas besidauginančiose užkrėstų ląstelių kultūrose. Tokiu būdu sutrumpėja virusologinio tyrimo trukmė bei klaidingų dėl infekcinio kasos nekrozės viruso citopatinio poveikio virusologinių tyrimų skaičius.Tais atvejais, kai mėginiai pristatomi iš ūkių, kurie neapimti infekcinės kasos nekrozės, supernatanto apdorojimas infekcinės kasos nekrozės antiserumu nėra būtinas.III. Virusologinis tyrimas1. Ląstelių kultūros ir terpėsBF-2 arba RTG-2 ir arba EPC ar FMH ląstelės yra auginamos joms tinkamose 20 % terpėse 30 °C temperatūroje, pvz.: Eagle MEM terpėje (arba jos modifikuotoje terpėje), į ją pridedant 10 % galvijų vaisiaus serumo ir standartinę antibiotikų dozę.Jei ląstelės yra auginamos sandariuose indeliuose, rekomenduojama terpei pašarminti įdedant natrio bikarbonato. Jei ląstelės yra auginamos atviruose induose, į terpę pridedama Tris-HCl (23 mM) ir natrio bikarbonato (6 mM). Terpės pH turi būti 7,6 ± 0,2.Ląstelių kultūros, kurios turi būti naudojamos audinių medžiagoms užkrėsti, turėtų būti naujos (ne senesnės kaip 4–48 val) ir užkrėtimo metu aktyvios augimo fazės (nepilnai padengę plokštelę).2. Ląstelių kultūros inokuliavimasLąstelės užkrečiamos dviejų skirtingų praskiedimų, antibiotikais apdorotų organų suspensija, pvz., pirminio bei antrinio praskiedimų santykiu 1:10 organų suspensija, galutinis audinių praskiedimas ląstelių kultūroje atitinkamai gaunamas 1:100 ir 1:1000 (kad būtų išvengta homologinės interferencijos). Mažiausiai dvi ląstelių linijos turi būti užkrėstos (žr. I.III.1 dalį). Užkrato ir ląstelių terpės apimties santykis turėtų būti maždaug 1:10.Kiekvienam praskiedimui bei ląstelių linijai reikalingas minimalus 2 cm2 ląstelių augimo plotas, kuris prilygsta vienam 24 duobučių laboratorinės plokštelės šulinėliui. Patariama naudoti ląstelių auginimo padėklus, nors tinka ir kiti dideli auginimo paviršiai.3. Ląstelių kultūrų inkubavimasUžkrėstos ląstelių kultūros yra inkubuojamos 15 °C temperatūroje 7–10 dienų. Jeigu ląstelių terpės spalva pasikeičia iš raudonos į geltoną, rodydama terpės parūgštėjimą, turi būti atliekamas pH suderinimas su steriliu natrio karbonato tirpalu arba lygiavertėmis medžiagomis, kad būtų užtikrintas ląstelės jautrumas viruso infekcijai.Ne rečiau kaip kas šešis mėnesius arba kai įtariamas ląstelių imlumo sumažėjimas, turi būti atliktas sušaldytų atsargų titravimas, kad būtų įvertintas ląstelių kultūrų imlumas užkratui. Rekomenduojama titravimo metodika pateikta IV dalyje.4. MikroskopijaUžkrėstos ląstelių kultūros (mažiausiai tris kartus per savaitę) turi būti tiriamos mikroskopu, 40–150 kartų padidinimu, siekiant nustatyti citopatinį poveikį. Pastebėjus citopatinį poveikį, viruso identifikacija turi būti pradėta nedelsiant pagal I.IV dalį.5. SubkultivavimasJeigu CPE po pirminio 7–10 dienų inkubavimo užkrėtimo neišsivystė, atliekamas subkultivavimas su naujų ląstelių kultūromis, panaudojant ląstelių sritį, panašią į pirminę kultūrą.Praėjus 7–10 dienų po užkrėtimo, sudaromas pagal ląstelių liniją bendras visų kultūrų šulinėlių terpės mėginys (supernatantas). Neatskiestos ir atskiestos santykiu 1:10 (galutiniai supernatanto atskiedimai 1:10 ir 1:100) homologinių ląstelių kultūros užkrečiamos gautu bendru mėginiu, kaip nurodyta I.III.2 dalyje. Arba atsitiktinai parinkti mėginiai, turintys savo sudėtyje 10 % pirminės ląstelių kultūros, yra tiesiogiai įdedami į šulinėlį, kuriame yra jauna ląstelių kultūra. Prieš užkrėtimą gali būti atliekama išankstinė inkubacija su infekcinės kasos nekrozės virusu atskiestu antiserumu, kaip nurodyta I.II.3 dalyje.Užkrėstos kultūros yra inkubuojamos 7–10 dienų 15 °C temperatūroje ir tiriamos kaip nurodyta I.III.4 dalyje.Jei toksinis citopatinis poveikis pasireiškia per pirmas tris inkubacijos dienas, šiame etape galima atlikti subkultivavimą, tačiau tuo atveju ląstelės turi būti inkubuojamos septynias dienas ir vėl subkultivuojamos septynias dienas. Jei toksinis citopatinis poveikis pasireiškia po trijų inkubavimo dienų, ląstelės gali būti užkrečiamos dar kartą ir inkubuojamos 14 dienų, skaičiuojant nuo pirminės inkubacijos pradžios. Per paskutines septynias inkubacijos dienas negali būti toksiškumo požymių.Jeigu nustatomas bakterinis užterštumas, nežiūrint į tai, kad naudoti antibiotikai, prieš subkultivavimą ląstelių kultūra centrifuguojama (esant 2000–4000 × g) 15–30 min. 2–5 °C temperatūroje ir (arba) filtruojama per 0, 45 μm filtrą (nedidelio molekulinio svorio baltymus prijungianti membrana). Be to, subkultivavimo procedūros turi būti tokios pačios, kaip toksinio citopatinio poveikio atveju.IV. Viruso identifikavimas1. Viruso identifikavimo tyrimaiNustačius citopatinį poveikį ląstelių kultūroje, terpė (supernatantas) yra tiriama taikant vieną arba daugiau metodų: neutralizavimą, IF, ELISA. Jei šiais tyrimais per vieną savaitę nebuvo galima identifikuoti viruso, mėginys siunčiamas į nacionalinę etaloninę laboratoriją arba į ES etaloninę žuvų ligų laboratoriją, kad nedelsiant būtų atliktas identifikavimas.2. NeutralizavimasCentrifuguojant (2000–4000 ×g) ar filtruojant per 0, 45 μm membraninį filtrą, surenkantį mažo molekulinio svorio baltymus, gautas supernatantas ląstelių terpėje praskiedžiamas santykiu 1:100 ir 1:10000.Dviejų praskiestų supernatantų mėginiai yra sumaišomi ir inkubuojami 60 min. 15 °C temperatūroje lygiomis dalimis su šiais reagentais, kiekvienu iš jų atskirai:- serumu, turinčiu specifinių antikūnų nuo VHS viruso, praskiedimas santykiu 1:50 [2],- serumu, turinčiu specifinių antikūnų nuo IHN viruso, praskiedimas santykiu 1:50 [3],- antiserumo bendru mėginiu, turinčiu specifinių antikūnų nuo vietinės kilmės IKNV, praskiedimas santykiu 1:50 [4],- tiktai terpe (teigiama kontrolė).Mažiausiai dvi ląstelių kultūros yra užkrečiamos 50 μl kiekvieno viruso supernatanto serumo mišiniu ir inkubuojamos 15 °C temperatūroje. CPE poveikis kontroliuojamas, kaip nurodyta I.III.4 dalyje.Kai kurių VHS viruso štamų negalima identifikuoti neutralizacijos tyrimais. Tokios padermės turi būti identifikuojamos taikant IF arba ELISA metodus.Gali būti taikomi ir kiti patvirtinto veiksmingo neutralizavimo tyrimai.3. IFKad būtų galima identifikuoti kiekvieną viruso izoliatą, ne mažiau kaip aštuoni dengiamieji stikleliai padengiami ląstelėmis taip, kad jos nuo inkubacijos pradžios praėjus 24 val. ištisai dengtų 60–90 % ploto. Geriausiai tam tinka EPC ląstelės, nes jos tvirčiausiai prisitvirtina prie stiklo paviršiaus, bet taip pat galima naudoti ir kitas ląstelių linijas, pvz., BF-2, RTG-2 ar FHM.Ląstelėms prisitvirtinus ant stiklo paviršiaus (paprastai praėjus vienai valandai) arba ląstelių kultūras inkubavus 24 val., ląstelių kultūra užkrečiama tiriamu virusu. Keturios ląstelių kultūros užkrečiamos santykiu 1:10, o kitos keturios santykiu 1:1000. Jos inkubuojamos 15 °C temperatūroje 20–30 valandų.Atlikus inkubavimą, ląstelių kultūros yra du kartus skalaujamos Eagle MEM terpe, kurioje nėra serumo, fiksuojamos ledo šaltumo 80 % acetonu ir dažomos dvisluoksniu IFAT metodu. Pirmasis reagento sluoksnis yra kontrolinės kokybės polikloniniai ar monokloniniai antikūnai. Antrasis reagento sluoksnis yra pirmojo sluoksnio imunoglobulinų antiserumas, konjuguotas fluoro chromu. Visuose tirtuose antiserumuose turi būti nudažomos ne mažiau kaip viena didelės dozės kultūra ir viena mažos dozės kultūra. Atliekamame tyrime būtina turėti teigiamą ir neigiamą kontrolinį mėginius. Rekomenduojama naudoti tokius fluoro chromus kaip FITC arba TRITC.Dažytos ląstelių kultūros apdorojamos glicerolio druska. Tiriamos ultravioletiniu (UV) mikroskopu. Tam naudojamas 10 ar 12 kartų didinantis okuliaras ir 25 ar 40 kartų didinantis objektyvas, kurio apertūros skaičius atitinkamai > 0,7 ir > 1,3.Pirmiau nurodytas IF metodas yra pateiktas kaip pavyzdys. Galima taikyti ir kitus patvirtinto veiksmingumo IF metodus (atsižvelgiant į ląstelių kultūras, fiksavimą ir kontrolinės kokybės antikūnus).4. ELISALaboratorinės plokštelės šulinėliai yra padengiami rekomenduojamomis išgrynintų kontrolinės kokybės imunoglobulinų frakcijomis, inkubuojama per naktį.Šulinėlius praplovus PBS-Tween-20 buferiniu tirpalu, tiriamas dvikartinio arba keturkartinio praskiedimo virusas įdedamas laipsniškai į laboratorinės plokštelės šulinėlius ir inkubuojamas 60 minučių 37 °C temperatūroje. Atlikus praplovimą PBS-Tween-20 buferiniu tirpalu, pridedama biotinizuotų antikūnų, turinčių savybę specifiškai reaguoti su įdubimuose jau esančiais antikūnais, ir inkubuojama 60 minučių 20 °C temperatūroje. Atlikus kitą praplovimą PBS-Tween-20 buferiniu tirpalu, pridedama HRP (krienų peroksidazė) konjuguoto streptavidino ir inkubuojama vieną valandą 20 °C temperatūroje. Atlikus paskutinį praplovimą, kad prijungtas fermentas taptų matomas, pridedama imunofermentinės analizės substratų (IFA ar kitos metodikos).Biotinu-avidinu pagrįstas ELISA variantas yra pateiktas kaip pavyzdys. Vietoj jo gali būti taikomi kiti patvirtinto veiksmingumo ELISA variantai.1A LENTELĖDvejų metų laikotarpiui sudaryta patikrinimų ir mėginių ėmimo schema zonoms ir ūkiams, esantiems nepatvirtintose zonose, siekiantiems VHS ir (arba) IHN statuso patvirtinimo(pagal Direktyvos 91/67/EEB B ir C priedus bei šio priedo I dalyje išvardytas nuostatas)Didžiausias žuvų skaičius bendrame mėginyje yra 10.[5] [6] [7] [8]| Klinikinių patikrinimų skaičius per metus | Laboratorinių tyrimų skaičius per metus | [5]Laboratoriniai tyrimai virusui nustatyti |Auginamų žuvų skaičius | Veislei auginamų žuvų skaičius (kiaušidžių skystis) |Kontinentinės zonos ir ūkiaia)Ūkiai, auginantys žuvis veisimui | 2 | 2 | 120 (pirmas patikrinimas) [6] 150 (antras patikrinimas) | 30 (pirmas patikrinimas) [7] 0 (antras patikrinimas) |b)Ūkiai, auginantys tik žuvis veisimui | 2 | 1 | 0 | 150 (pirmas ar antras patikrinimai) [7] |c)Ūkiai, neauginantys žuvų veisimui | 2 | 2 | 150 (pirmas ir antras patikrinimai) | 0 |Pakrantės zonos ir ūkiaia)Ūkiai, auginantys žuvis veisimui | 2 | 2 | 120 (pirmas patikrinimas) 150 (antras patikrinimas) | 30 (pirmas patikrinimas) [7] 0 (antras patikrinimas) |b)Lašišinių žuvų ūkiai, neauginantys žuvų veisimui | 2 | 2 | 30 (pirmas ir antras patikrinimai) [8] | 0 |c)Ūkiai, neauginantys lašišinių žuvų veisimui | 2 | 2 | 150 (pirmas ir antras patikrinimai) | 0 |1B LENTELĖDvejų metų laikotarpiui sudaryta patikrinimų ir mėginių ėmimo schema, siekiant VHS ir (arba) IHN statuso patvirtinimo zonoms ir ūkiams, esantiems nepatvirtintose zonose, esant oficialiai pripažintiems dokumentams, patvirtinantiems, jog nebūta šių ligų atvejų(pagal Direktyvos 91/67/EEB B ir C priedus bei šio priedo I ir III dalyse išvardytas nuostatas)Didžiausias žuvų skaičius bendrame mėginyje yra 10.[9] [10] [11]| Klinikinių patikrinimų skaičius per metus | Laboratorinių tyrimų skaičius per metus | [9]Laboratoriniai tyrimai virusui nustatyti |Auginamų žuvų skaičius | Veislei auginamų žuvų skaičius (kiaušidžių skystis) |Kontinentinės zonos ir ūkiaia)Ūkiai, auginantys žuvis veisimui | 2 | 2 | 0 (pirmas patikrinimas) [9] 30 (antras patikrinimas) | 30 (pirmas patikrinimas) [10] 0 (antras patikrinimas) |b)Ūkiai, auginantys tik žuvis veisimui | 2 | 1 | 0 | 30 (pirmas ar antras patikrinimai) [10] |c)Ūkiai, neauginantys žuvų veisimui | 2 | 2 | 30 (pirmas ir antras patikrinimai) | 0 |Pakrantės zonos ir ūkiaia)Ūkiai, auginantys žuvis veisimui | 2 | 2 | 0 (pirmas patikrinimas) 30 (antras patikrinimas) | 30 (pirmas patikrinimas) [10] 0 (antras patikrinimas) |b)Lašišinių žuvų ūkiai, neauginantys žuvų veisimui | 2 | 2 | 30 (pirmas ir antras patikrinimai) [11] | 0 |c)Ūkiai, neauginantys lašišinių žuvų veisimui | 2 | 2 | 30 (pirmas ir antras patikrinimai) | 0 |1C LENTELĖTyrimų ir mėginių ėmimo schema zonoms ir ūkiams, esantiems nepatvirtintose zonose, siekiantiems išlaikyti VHS ir (arba) IHN zonos ar ūkio statusą(pagal Direktyvos 91/67/EEB B ir C priedus bei šio priedo I dalyje išvardytas nuostatas)Didžiausias žuvų skaičius bendrame mėginyje yra 10.[12] [13] [14]| Klinikinių patikrinimų skaičius per metus | [12]Laboratoriniai tyrimai virusui nustatyti |Auginamų žuvų skaičius | Veisimui auginamų žuvų skaičius |Kontinentinės zonos ir ūkiaia)Ūkiai, auginantys žuvis veisimui | 2 | 20 (pirmas ir antras patikrinimai) | 10 (pirmas ar antras patikrinimai) [13] |b)Tik veislinių žuvų ūkiai | 2 | 0 | 30 (pirmas ar antras patikrinimai) [13] |c)Ūkiai, neauginantys žuvų veisimui | 2 | 30 | 0 |Pakrantės zonos ir ūkiaia)Ūkiai, auginantys žuvis veisimui | 2 | 20 (pirmas ir antras patikrinimai) | 10 (pirmas patikrinimas) [13] |b)Ūkiai, neauginantys žuvų veisimui | 1 | 30 [14] | 0 |II DALIS Diagnostiniai tyrimai patvirtinant VHS ir IHN įtariamus protrūkiusVHS ir IHN nustatyti yra taikomas vienas arba daugiau išvardytų metodų:- A. įprastinis viruso išskyrimas bei paskesnis serologinis viruso identifikavimas,- B. viruso išskyrimas tuo pat metu atliekant serologinį viruso identifikavimą,- C. kiti diagnozavimo metodai (netiesioginė imunofluorescencija, IFA).Pirmojo VHS ir (arba) IHN atvejo patvirtinimui patvirtintose zonose esančiuose ūkiuose neturi būti taikomas tik C metodas. Taip pat turi būti taikomas arba A, arba B metodas.Kartais be virusologiniam tyrimui skirtų audinių, nustatant diferencinę diagnozę, mėginius galima pristatyti bakteriologiniam, parazitologiniam, histologiniam ar kitiems tyrimams.A. Viruso išskyrimas bei paskesnis serologinis identifikavimasI.1. Mėginių atrankaTyrimui turi būti atrenkama ne mažiau kaip 10 žuvų, kurios turi būdingus IHN ar VHS požymius.I.2. Žuvų mėginių paruošimas ir išsiuntimasKaip nurodyta I.I.3 dalyjeI.3. Papildomos medžiagos diagnozavimui surinkimasKaip nurodyta I.I.4 dalyje.II. Mėginių paruošimas virusologiniam tyrimuiKaip nurodyta I.II dalyje.III. Virusologinis tyrimasKaip nurodyta I.III dalyje.IV. Viruso identifikavimasKaip nurodyta I.IV dalyje.B. Viruso iškyrimas tuo pačiu metu atliekant serologinį viruso identifikavimąI.1. Mėginių atrankaKaip nurodyta II.A.I.1 dalyje.I.2. Mėginių paruošimas ir išsiuntimasKaip nurodyta I.I.3 dalyje.I.3. Mėginių surinkimas papildomam diagnozavimuiKaip nurodyta I.I.4 dalyje.II.1. Organų homogenizavimasKaip nurodyta I.II.2 dalyje.II.2. Homogenatų centrifugavimasHomogenatas centrifuguojamas šaldomoje centrifugoje 2–5 °C temperatūroje, esant 2000–4000 × g, 15 minučių, supernatantas surenkamas ir pridėjus antibiotikų, pvz., 1 mg/ml gentamicino, laikomas 4 val. 15 °C temperatūroje arba filtruojamas per membraną (0,45 μm), surenkančią mažo molekulinio svorio baltymus.II.3. Supernatanto apdorojimas diagnostiniu antiserumuAntibiotikais apdorota arba perfiltruota organų suspensija atskiedžiama santykiu 1:10 ir 1:1000 ląstelių kultūros terpe, skiedimai sumaišomi lygiomis dalimis su I.IV.2 dalyje nurodytais reagentais, inkubuojami 60 min. 15 °C temperatūroje.III.1. Ląstelių kultūros ir terpėsKaip nurodyta I.III.1 dalyje.III.2. Ląstelių kultūrų inokuliavimasNe mažiau kaip dvi kiekvienos ląstelių linijos ląstelių kultūros užkrečiamos 50 μl kiekvieno viruso serumo mišiniu (kuris paruoštas pagal II.B.II.3 dalį).III.3. Ląstelių kultūrų inkubavimasKaip nurodyta I.III.I dalyje.III.4. MikroskopijaUžkrėstos ląstelių kultūros kasdien yra tiriamos mikroskopu, didinančiu 40–150 kartų, siekiant nustatyti citopatinį poveikį. Jeigu serumas apsaugo nuo citopatinio poveikio, galima manyti, kad virusas identifikuotas.Jeigu nė vienas iš antiserumų neapsaugo nuo citopatinio poveikio, viruso identifikavimas turi būti atliekamas pagal I.IV dalį.III.5. SubkultivavimasJei citopatinis poveikis pasireiškia praėjus 7–10 dienų, subkultivuojamos tos kultūros, kurios buvo užkrėstos supernatantu ir ląstelių terpe (II.B.II.3 dalis) pagal I.III.5 dalį.C. Kiti diagnostiniai metodaiSupernatantas, paruoštas kaip nurodyta I.II.2 dalyje, gali būti tiriamas IFA arba netiesioginės fluorescencijos metodais atitinkamai pagal I.IV.3 dalį arba pagal I.IV.4 dalį. Šie greitieji metodai turi būti papildomi virusologiniu ištyrimu pagal A arba B metodą praėjus 48 valandoms nuo mėginio paėmimo, jeigu:a) gautas neigiamas rezultatas;b) gautas teigiamas rezultatas, kai patvirtintoje zonoje nustatomas pirmas IHN ar VHS atvejis.Audinių mėginiai gali būti tiriami ir atvirkštinės transkriptazinės polimerazinės grandinės reakcija, imunofluorescencijos ar formaline fiksuotų šaldomuoju mikrotomu suspaustų audinių metodu. Tokiais atvejais visada būtina ląstelių kultūras užkrėsti nefiksuota tiriama medžiaga.III DALIS Dokumentais pagrįsti duomenys apie VHS ir (arba) IHN neapimtas patvirtintas zonas arba nepatvirtintose zonose esančius ūkiusOficialios sveikatos tikrinimo programos kriterijai ir gairės1. Sveikatos tikrinimo programa gali būti pradėta tik:- oficialiai patvirtinus pripažintą VHS ir (arba) IHN likvidavimo programą, įskaitant visų ūkyje esančių žuvų likvidavimą, valymą, dezinfekavimą ir pūdymą prieš papildant ūkį žuvimis iš patvirtintų ūkių, arba- žuvų ūkiuose, kuriuose neturima duomenų apie VHS arba IHN infekciją.2. Sveikatos tikrinimo programa turi remtis klinikinių patikrinimų ir laboratorinių tyrimų rezultatais.3. Į šią programą turi būti įtraukti du klinikiniai ūkio patikrinimai, atliekami kasmet pagal I dalyje pateiktas gaires.4. Ne rečiau kaip vieno patikrinimo per metus metu iš kiekvieno ūkio turėtų būti paimta 30 žuvų ir (arba) kiaušidžių skysčio mėginių. Mėginiai atrenkami, paruošiami bei ištiriami pagal I, II ir IV dalis.5. Sveikatos tikrinimo programa vykdoma ne trumpiau kaip ketverius metus visuose patvirtintoje zonoje esančiuose ūkiuose arba (nepatvirtintoje zonoje esančiame) ūkyje, kuris turi būti patvirtintas.6. Kad programa būtų oficialiai patvirtinta, neturi būti nustatyta nė vieno VHS ar IHN atvejo (tikrinant kliniškai ar atliekant virusologinį tyrimą).IV DALIS Titravimo atlikimo tvarka, patikrinant ląstelių kultūrų imlumą infekcijaiToliau pateikiama I.III.3 dalyje nurodyta rekomenduojama titravimo atlikimo tvarka.Tyrimui turėtų būti naudojamos ne mažiau kaip du VHS viruso ir vienas IHN virusoizoliatai. Izoliatai turėtų būti pagrindinės virusų grupės, nustatytos ES zonoje, pvz., VHSV atveju viena patogeninis izoliatas, kuris išskirtas gėlavandeniam vaivorykštiniam upėtakiui, ir vienas jūrinis izoliatas, patogeniškas otui, ir IHNV atveju vienas patogeninis štamas vaivorykštiniam upėtakiui, kuris nustatytas Europoje. Turėtų būti naudojami žinomi izoliatai, išskirti valstybėse narėse. Kontrolinius izoliatus galima gauti ES etaloninėje žuvų ligų laboratorijoje.VHS virusai su mažu ląstelių kultūrų skaičiumi yra dauginami BF-2 arba RTG-2 ląstelių kultūrose, o IHN virusai dauginami EPC arba FHM ląstelių kultūrose. Ląstelių kultūros terpė savo sudėtyje turėtų turėti ne mažiau kaip 10 % serumo. Inokuliavimui naudojamas mažas MOI (< 1).Gavus bendrą citopatinį poveikį, virusas koncentruojamas centrifuguojant ląstelių supernatantą 15 min., esant 2000 × g, arba filtruojamas per 0,45 μm filtrą ir išpilstomas į etiketėmis paženklintus kriostatinius mėgintuvėlius. Virusas laikomas –80 °C temperatūroje.Praėjus savaitei po užšaldymo, trys kiekvienos padermės viruso buteliukai atšildomi šaltame vandenyje, ir laipsniškai titruojant tiriamas citopatinis poveikis ląstelių kultūroje. Ne rečiau kaip kas šešis mėnesius ar įtarus, kad ląstelių linijos imlumas sumažėjo, atliekamas kiekvieno viruso izoliato titravimas.Titravimo tvarka turi būti išsamiai aprašyta, ir kiekvieną kartą turi būti laikomasi tos pačios tvarkos.Titravimui turėtų būti naudojamos ne mažiau kaip šešios kiekvieno praskiedimo virusų padermės. Gauti titrai yra lyginami su prieš tai gautais titrais. Jei bent vieno iš trijų titruojamų virusų padermių titras sumažėja 2 log arba daugiau, palyginus su pirminiais titrais, tokios ląstelių linijos turėtų būti nebenaudojamos kontrolei.Jeigu laboratorijoje laikomos skirtingos ląstelių linijos, kiekviena iš jų turėtų būti tikrinama atskirai.Duomenys turėtų būti saugomi ne mažiau kaip 10 metų.V DALIS Akronimai ir santrumposBF-2  Mėlynojo mailiaus žiaunos (ląstelių linija)CPE  Citopatinis efektasCRL  Bendrijos kontrolinė žuvų ligų laboratorijaELISA  Imunofermentinė analizėEPC  Epitelinė papiloma (ląstelės linija)FHM  Aukšlių ląstelių linijaFITC  Fluoresceino izotiocianatasHepes  N-2-hidroeksietilpiperazanas-N’-2-etano sulfonrūgštisHRP  Krienų peroksidazėIF  ImunofluorescencijaIFAt  Netiesioginės fluorescencijos antikūno tyrimasIHN(V)  Infekcinė hematopoetinė nekrozė (virusas)IPN  Infekcinė kasos nekrozė (virusas)MEM  Minimali pagrindinė terpėMOI  Infekcijos pasikartojamumas (infekcinio viruso dalelių skaičiaus koeficientas, pridedamas prie kultūroje esančių ląstelių skaičiausOPD  Ortofenileno diaminasPBS  Fosfato buferinis fiziologinis tirpalasRTG-2  Vaivorykštinių upėtakių lytinės liaukos (ląstelių linija)RT-PCR  Atvirkštinės transkriptazinės polimerazinės grandinės reakcijaTris-HCl  Tri (hidroksimetil) aminometanas – HClTRITC  Tetrametilrodamino izocianatasVHS(V)  Virusinė hemoraginė septikemija (virusas)[1] Išskirtiniais atvejais, t. y. kai žuvis surinkta labai atokiose vietose, kai nėra galimybių ją išsiųsti kiekvieną dieną.[2] Arba, kaip apibrėžta etaloninės laboratorijos, atsižvelgiant į galimą antiserumo citotoksiškumą.[3] Arba, kaip apibrėžta etaloninės laboratorijos, atsižvelgiant į galimą antiserumo citotoksiškumą.[4] Arba, kaip apibrėžta etaloninės laboratorijos, atsižvelgiant į galimą antiserumo citotoksiškumą.[5] Jei laikomasi II.1, I.I.2.1.b ir III dalių reikalavimų, mėginių skaičius gali būti mažesnis nei numatyta 1B lentelėje.[6] Klinikiniai patikrinimai.[7] Išimtiniais atvejais, kai neįmanoma paimti kiaušidžių skysčio, gali būti paimti organų mėginiai.[8] Jei žuvys perkeltos iš gėlo į sūrų vandenį, mėginiai imami ne anksčiau kaip po trijų savaičių.[9] Klinikiniai patikrinimai.[10] Išimtiniais atvejais, kai neįmanoma paimti kiaušidžių skysčio, gali būti paimti organų mėginiai.[11] Žuvis perkėlus iš gėlo į sūrų vandenį, mėginiai turi būti imami ne anksčiau kaip po trijų savaičių.[12] Patvirtintose zonose mėginiai imami rotacijos principu iš 50 % ūkių. Iš nepatvirtintoje zonoje esančių patvirtintų ūkių mėginiai imami kasmet.[13] Išimtiniais atvejais, kai neįmanoma paimti kiaušidžių skysčio, gali būti paimti organų mėginiai.[14] Žuvis perkėlus iš gėlo į sūrų vandenį, mėginiai turi būti imami ne anksčiau kaip po trijų savaičių.--------------------------------------------------