CELEX: 31976L0372
Language: it
Date: 1976-03-01 00:00:00
Title: Settima direttiva 76/372/CEE della Commissione, del 1ºmarzo 1976, che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali

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31976L0372

Settima direttiva 76/372/CEE della Commissione, del 1ºmarzo 1976, che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali  

Gazzetta ufficiale n. L 102 del 15/04/1976 pag. 0008 - 0018 edizione speciale finlandese: capitolo 3 tomo 7 pag. 0048  edizione speciale greca: capitolo 03 tomo 15 pag. 0031  edizione speciale svedese/ capitolo 3 tomo 7 pag. 0048  edizione speciale spagnola: capitolo 03 tomo 10 pag. 0044  edizione speciale portoghese: capitolo 03 tomo 10 pag. 0044 

++++SETTIMA DIRETTIVA DELLA COMMISSIONE  del 1° marzo 1976  che fissa i metodi d ' analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali  ( 76/372/CEE )  LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE ,  visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea ,  vista la direttiva del Consiglio , del 20 luglio 1970 , concernente l ' introduzione di modi di prelevamento dei campioni e di metodi d ' analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per gli animali ( 1 ) , modificata da ultimo dall ' atto di adesione ( 2 ) , in particolare l ' articolo 2 ,  considerando che la suddetta direttiva prevede che i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali destinati a constatare l ' osservanza delle condizioni prescritte in virtù delle disposizioni legislative , regolamentari o amministrative concernenti le qualità è la composizione degli alimenti per gli animali , siano effettuati secondo i modi di prelevamento di campioni ed i metodi di analisi comunitari ;  considerando che le direttive 71/250/CEE , 71/393/CEE , 72/199/CEE , 73/46/CEE , 74/203/CEE e 75/84/CEE della Commissione , rispettivamente del 15 giugno 1971 ( 3 ) , del 18 novembre 1971 ( 4 ) , del 27 aprile 1972 ( 5 ) , del 5 dicembre 1972 ( 6 ) , del 25 marzo 1974 ( 7 ) , e del 20 dicembre 1974 ( 8 ) , hanno già fissato un certo numero di metodi di analisi comunitari ; che , tenuto conto dello stato d ' avanzamento dei lavori sin qui effettuati , è necessario adottare una settima serie di metodi ;  considerando che le misure previste dalla presente direttiva sono conformi al parere del comitato permanente per gli alimenti per gli animali ,  HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA :  Articolo 1  Gli Stati membri prescrivono che le analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali , per quanto riguarda il loro contenuto in aflatossina B1 siano effettuato secondo i metodi descritti nell ' allegato della presente direttiva .  Le disposizioni generali di cui alla prima parte ( introduzione ) dell ' allegato della prima direttiva 71/250/CEE della Commissione , del 15 maggio 1971 , eccetto la parte relativa alla preparazione del campione da analizzare , si applicano ai metodi descritti nell ' allegato della presente direttiva .  Articolo 2  Gli Stati membri provvedono all ' entrata in vigore , non oltre il 1° ottobre 1976 , delle disposizioni legislative , regolamentari e amministrative necessarie per conformarsi alle disposizioni della presente direttiva e ne informano immediatamente la Commissione .  Articolo 3  Gli Stati membri sono destinati della presente direttiva .  Fatto a Bruxelles , il 1° marzo 1976  Per la Commissione  P.J . LARDINOIS  Membro della Commissione  ( 1 ) GU n . L 170 del 3 . 8 . 1970 , pag . 2 .  ( 2 ) GU n . L 73 del 27 . 3 . 1972 , pag . 14 .  ( 3 ) GU n . L 155 del 12 . 7 . 1971 , pag . 13 .  ( 4 ) GU n . L 279 del 20 . 12 . 1971 , pag . 7 .  ( 5 ) GU n . L 123 del 29 . 5 . 1972 , pag . 6 .  ( 6 ) GU n . L 83 del 30 . 3 . 1973 , pag . 21 .  ( 7 ) GU n . L 108 del 22 . 4 . 1974 , pag . 7 .  ( 8 ) GU n . L 32 del 5 . 2 . 1975 , pag . 26 .  ALLEGATO  DETERMINAZIONE DELL ' AFLATOSSINA B1  A . METODO PER CROMATOGRAFIA MONODIMENSIONALE SU STRATO SOTTILE  1 . Scopo e campo di applicazione  Il metodo consente di determinare il contenuto di aflatossina B1 dei seguenti alimenti : panelli di arachidi , di copra , di lino , di soia , di sesamo , di babassu e di germi di granturco , cereali e prodotti a base di cereali , farina di piselli , polpa e fecola di patate . Il limite inferiore di determinazione è di 0,01 mg/kg ( 10 ppb )  In presenza di sostanze interferenti che intralciano le determinazioni , occorre ricominciare l ' analisi secondo il metodo B ( cromatografia bidimensionale su strato sottile )  2 . Principio  Il campione e sottoposto ad estrazione con cloroformio . L ' estratto viene filtrato e un ' aliquota viene prelevata e purificata mediante cromatografia su colonna di gel di silice . L ' eluato viene evaporato e il residuo ripreso con un volume determinato di cloroformio o di una miscela di benzene e acetonitrile . Un ' aliquota della soluzione è sottoposta a cromatografia su strato sottile . La quantità di aflatossina B1 è determinata sotto irradiazione UV del cromatogramma , sia visualmente sia mediante fluorodensitometria , in rapporto a quantità note di aflatossina B1 .  L ' identità dell ' aflatossina B1 estratta dall ' alimento deve essere confermata con i procedimenti indicati  3 . Reattivi  Nota : Tutti i reattivi , in mancanza di altre indicazioni , devono essere del tipo « per analisi »  3.1 . Acetone  3.2 . Cloroformio , stabilizzato con 0,5 - 10 % di etanolo al 96 % ( v/v )  3.3 . n-Esano  3.4 . Metanolo  3.5 . Etere dietilico anidro , esente da perossidi  3.6 . Miscela di benzene e acetonitrile : 98/2 ( v/v )  3.7 . Miscela di cloroformio ( 3.2 ) e di metanolo ( 3.4 ) : 97/3 ( v/v )  3.8 . Gel di silice , per cromatografia su colonna , granulometria : 0,05/0,20 mm  3.9 . Cotone idrofilo , preventivamente sgrassato col cloroformio , o lana di vetro  3.10 . Solfato di sodio , anidro , granulato  3.11 . Gas inerte , ad esempio azoto  3.12 . Acido cloridrico 1 N  3.13 . Acido solforico al 50 % ( v/v )  3.14 . Terra di diatomee ( Hiflosupercel ) , lavata con acido  3.15 . Gel di silice G-HR o equivalente , per cromatografia su strato sottile  3.16 . Soluzione campione a 0,1 ug circa di aflatossina B1 per ml nel cloroformio ( 3.2 ) o nelle miscela benzene/acetonitrile ( 3.6 ) , preparata e controllata come indicato al punto 7  3.17 . Soluzione campione qualitativa a 0,1 ug circa di aflatossina B1 e B2 per ml nel cloroformio ( 3.2 ) o nella miscela benzene/acetonitrile ( 3.6 ) . Tali concentrazioni sono riferite a titolo indicativo . Devono essere adattate in modo da ottenere la stessa intensità di fluorescenza per le due aflatossine  3.18 . Solventi di sviluppo :  3.18.1 . Cloroformio ( 3.2 )/acetone ( 3.1 ) : 9/1 ( v/v ) , vaschetta non saturata  3.18.2 . Etere dietilico ( 3.5 )/metanolo ( 3.4 )/acqua : 96/3/1 ( v/v/v ) , vaschetta non saturata  3.18.3 . Etere dietilico ( 3.5 )/metanolo ( 3.4 )/acqua : 94/4,5/1,5 ( v/v/v ) , vaschetta saturata  3.18.4 . Cloroformio ( 3.2 )/metanolo ( 3.4 ) : 94/6 ( v/v ) , vaschetta saturata  3.18.5 . Cloroformio ( 3.2 )/metanolo ( 3.4 ) : 97/3 ( v/v ) , vaschetta saturata  4 . Apparecchiatura  4.1 . Tritarore mescolatore  4.2 . Scuotitore o agitatore magnetico  4.3 . Filtri a pieghe , Schleicher e Schuel , n . 588 o equivalente , diametro 24 cm .  4.4 . Colonne per cromatografia , in vetro ( diametro interno : 22 mm , lunghezza : 300 mm ) , con rubinetto di teflon e serbatoio da 250 ml  4.5 . Evaporatore rotante sotto vuoto , provvisto di pallone e fondo rotondo da 500 ml  4.6 . Bente da 500 ml , a tappo smerigliato  4.7 . Apparecchiatura per cromatografia su strato sottile  4.8 . Lastre di vetro per cromatografia su strato sottile , 200 × 200 mm , preparate come segue ( le quantità indicate sono sufficienti per ricoprire cinque lastre ) : introdurre 30 g di gel di silice G-HR ( 3.15 ) in una beuta , aggiungere 60 ml di acqua , tappare e agitare per un minuto . Stendere la sospensione sulle lastre in modo da ottenere uno strato uniforme di 0,25 mm di spessore . Lasciar all ' aria e conservare in seguito in essiccatoio munito di gel di silice . Al momento dell ' uso , attivare le lastre ponendole per un ' ora nella stufa a 110° C  Le lastre in commercio pronte per l ' uso possono essere impiegate se danno risultati simili a quelli delle lastre preparate come sopra indicato  4.9 . Lampada UV a onde lunghe ( 360 mm ) . L ' intensità di irradiazione deve consentire di distinguere nettamente una macchia di 1,0 ng di aflatossina B1 su una lastra per cromatografia su strato sottile , ad una distanza di 10 cm dalla lampada  4.10 . Cilindri graduati da 10,0 ml con tappi in polietilene  4.11 . Spettrofotometro UV  4.12 . Fluorodensitometro ( eventualmente )  5 . Modo di operare  5.1 . . Preparazione dal campione ( vedi note , parte C , punto 1 )  Macinare il campione in modo che passi integralmente attraverso un setaccio a maglie di 1 mm ( conforme alla raccomandazione ISO R 565 )  5.2 . Estrazione  Introdurre 50,0 g del campione macinato e omogeneizzato in una beuta da 500 ml ( 4.6 ) . Aggiungere 25 g di terra di diatomee ( 3.14 ) , 25 ml di acqua e 250 ml di cloroformio ( 3.2 ) . Tappare la beuta , scuotere o agitare per 30 minuti con l ' apposito apparecchio ( 4.2 ) e filtrare con filtro a pieghe ( 4.3 ) . Eliminare i primi 10 ml di filtrato e raccogliere quindi 50 ml  5.3 . Purificazione su colonna  Munire di un tampone di cotone o di lana di vetro ( 3.9 ) l ' estremità inferiore di una colonna per cromatografia ( 4.4 ) , riempire di cloroformio ( 3.2 ) i due terzi della colonna e aggiungere 5 g di solfato di sodio ( 3.10 )  Controllare che la superficie superiore dello strato di solfato di sodio sia piana , quindi aggiungere un poco alla volta 10 g di gel di silice ( 3.8 ) . Scuotere la colonna con precauzione dopo ogni aggiunta per eliminare le bolle d ' aria . Lasciar depositare per 15 minuti e aggiungere quindi con precauzione 15 g di solfato di sodio ( 3.10 ) . Lasciar scendere il liquido fino a vicinanza immediata della superficie superiore dello strato di solfato di sodio  Mescolare i 50 ml di estratto raccolti al punto 5.2 con 100 ml di n-esano ( 3.3 ) e travasare quantitativamente la miscela nella colonna . Lasciare scendere il liquido sino alla superficie superiore dello strato di solfato di sodio . Eliminare il liquido defluito . Aggiungere quindi 100 ml di etere dietilico ( 3.5 ) e lasciare nuovamente scendere il liquido sino alla superficie superiore dello strato di solfato di sodio . Durante queste operazioni , controllare che i liquidi defluiscano ad un ritmo di 8/12 ml al minuto e che la colonna non rimanga asciutta . Eliminare i liquidi defluiti . Eluire quindi con 150 ml della miscela/metanolo ( 3.7 ) e raccogliere tutto l ' eluato  Evaporare l ' eluato quasi a secco , in corrente di gas inerte ( 3.11 ) e ad una temperatura non superiore a 50° C , con l ' evaporatore rotante sotto vuoto ( 4.5 ) . Portare quantitativamente il residuo , usando il cloroformio ( 3.2 ) o la miscela benzene/acetonitrile ( 3.6 ) , in un cilindro graduato da 10,0 ml ( 4.10 ) . Concentrare la soluzione in corrente di gas inerte ( 3.11 ) e portare quindi il volume a 2,0 ml con cloroformio ( 3.2 ) o con la miscela benzene/acetonitrile ( 3.6 )  5.4 . Cromatografia su strato sottile  Deporre sotto forma di punti su una lastra per cromatografia su strato sottile ( 4.8 ) , a 2 cm dal bordo inferiore e ad intervalli di 2 cm , i volumi sotto indicati della soluzione campione e dell ' estratto :  - 10 , 15 , 20 , 30 e 40 ( ... ) della soluzione campione di aflatossina B1 ( 3.16 )  - 10 ( ... ) dell ' estratto ottenuto al punto 5.3 e , in sovrapposizione sullo stesso punto , 20 ( ... ) della soluzio ( 3.16 )  - 10 e 20 ( ... ) dell ' estratto ottenuto al punto 5.3  Sviluppare il cromatogramma al riparo dalla luce , impiegando uno dei solventi di sviluppo ( 3.18 ) . La scelta del solvente deve essere stabilita preventivamente , deponendo sulla lastra 25 ( ... ) della soluzione campione qualitativa ( 3.17 ) a accertando che , all ' atto dello sviluppo , le aflatossine B1 e B2 siano completamente separate  Lasciar evaporare i solventi al riparo dalla luce ed irradiare quindi con la luce UV , collocando la lastra a 10 cm della lampada ( 4.9 ) . Le macchie di aflatossina B1 danno una fluorescenza blu  5.5 . Determinazioni quantitative  Procedere alle determinazioni , sia visu intente sia mediante fluorodensitometria , come sotto indicato  5.5.1 . Misurazioni visuali  Determinare la quantità di aflatossina B1 dell ' estratto confrontando l ' intensità di fluorescenza delle macchie dell ' estratto con quella delle macchie della soluzione campione . Interpolare se necessario . La fluorescenza ottenuta con la sovrapposizione dell ' estratto della soluzione campione deve essere più forte di quella dei 10 ( ... ) di estratto e deve dar luogo alla percezione di una sola macchia . Se l ' intensità di fluorescenza data dai 10 ( ... ) di estratto è più forte di quella dei 40 ( ... ) di soluzione campione , diluire l ' estratto 10 o 100 volte con la miscela benzene/acetonitrile ( 3.6 ) prima di sottoporlo ad una nuova cromatografia su strato sottile  5.5.2 . Misurazioni mediante fluorodensitometria  Misurare l ' intensità di fluorescenza delle macchie di aflatossina B1 con il fluorodensitometro ( 4.12 ) , utilizzando una lunghezza d ' onda di eccitazione di 365 mm ed una lunghezza d ' onda di emissione di 443 mm . Determinare la quantità di aflatossina B1 dei depositi dell ' estratto confrontando le intensità di fluorescenza delle macchie dell ' estratto e della soluzione campione  5.6 . Conferma dell ' identità dell ' aflatossina B1  Confermare l ' identità dell ' aflatossina B1 dell ' estratto con i seguenti procedimenti :  5.6.1 . Trattamento con acido solforico  Polverizzare acido solforico ( 3.13 ) sul cromatogramma ottenuto al punto 5.4 . La fluorescenza delle macchie di aflatossina B1 deve volgere dal blu al giallo sotto irradiazione UV  5.6.2 . Cromatografia bidimensionale implicante la formazione di aflatossina B1 - emiacetale ( aflatossina Bza )  NB : Le operazioni sotto descritte devono essere effettuate seguendo lo schema riprodotto nella figura 3  5.6.2.1 . Applicazione delle soluzioni  Tracciare su una lastra ( 4.8 ) due rette parallele a due lati contigui ( a distanza di 6 cm da tali lati ) , destinate a delimitare la migrazione dei fronti dei solventi . Deporre sulla lastra , con pipette capillari o con microsiringhe , le soluzioni sotto indicate :  - nel punto A : un volume di estratto purificato del campione ottenuto al punto 5.3 , contenente circa 2,5 nanogrammi di aflatossina B1  - nei punti B e C : 25 ( ... ) della soluzione campione ( 3.16 )  5.6.2.2 . Sviluppo  Sviluppare il cromatogramma nella direzione 1 usando il solvente di sviluppo ( 3.18.1 ) ( strato di 1 cm in vaschetta non saturata ) , al riparo dalla luce , finchù il fronte del solvente non raggiunga la linea di delimitazione . Ritirare la lastra dalla vaschetta e lasciarla asciugare per 5 minuti al riparo dalla luce e a temperatura ambiente . Polverizzare quindi acido cloridrico ( 3.12 ) su una stiscia di 2,5 cm di altezza che copra i punti A e B ( tratteggiata nella figura 3 ) sino ad imbrunimento , proteggendo il resto della lastra con un vetro . Lasciar reagire per 10 minuti allo scuro ed asciugare con una corrente d ' aria a temperatura ambiente  Sviluppare quindi il cromatogramma nella direzione II usando il solvente di sviluppo ( 3.18.1 ) ( strato di 1 cm in vaschetta non saturata ) , al riparo dalla luce , finche il fronte del solvente non raggiunga la linea di delimitazione . Ritirare la lastra dalla vaschetta e lasciarla asciugare a temperatura ambiente  5.6.2.3 . Interpretazione del cromatogramma  Esaminare il cromatogramma sotto la lampada UV ( 4.9 ) e verificare le osservazioni seguenti :  a ) Apparizione di una macchia fluorescente blu di aflatossina B1 proveniente dalla soluzione campione deposta nel punto C ( migrazione nella direzione 1 )  b ) Apparizione di una macchia fluorescente blu di aflatossina B1 ( che non ha reagito con l ' acido cloridrico ) e di una macchia fluorescente blu più intensa di aflatossina B1 emiacetale proveniente dalla soluzione campione deposta nel punto B ( migrazione nella direzione II )  c ) Apparizione di macchie simili a quelle descritte al punto b ) , provenienti dall ' estratto di campione deposto nel punto A . La posizione di tali macchie e definita dalla distanza di migrazione dell ' aflatossina B1 a partire dal punto A nella direzione I ( distanza uguale a quella percorse dalla soluzione campione deposta nel punto C ) , seguita dalle distanze di migrazione percorse nella direzione II dall ' aflatossina B1 ( che non ha reagito con l ' acido cloridrico ) e dell ' aflatossina B1-emiacetale ( distanze uguali a quelle percorse dalla soluzione campione deposta nel punto B ) . Le intensità di fluorescenza delle macchie di emiacetale proveniente dall ' estratto e della soluzione campione deposta nel punto B dovrebbero corrispondere  6 . Calcolo dei risultati  6.1 . Partendo da misurazioni visuali  Il contenuto in microgrammi di aflatossina B1 per kg di campione ( ppb ) è dato dalla formula  S . Y . V / W . X  dove :  Y e X sono rispettivamente i volumi in microlitri della soluzione campione di aflatossina B1 ( 3.16 ) e dell ' estratto , aventi analoga intensità di fluorescenza :  S = concentrazione in microgrammi di aflatossina B1 per ml della soluzione campione ( 3.16 )  V volume finale dell ' estratto in microlitri , tenuto conto delle eventuali diluizioni  W = peso in grammi della quantità di sostanza sottoposta ad analisi , corrispondente al volume di estratto sottoposto a purificazione su colonna  6.2 . partendo da misurazioni fluorodensitometriche  Il contenuto in microgrammi di aflatossina B1 per kg di campione ( ppb ) è dato dalla formula  S . V / W . Y  dove :  Y volume in microlitri dell ' estratto deposto sulla lastra ( 10 o 20 ... )  S quantità in nanogrammi d ' aflatossina B1 del deposito dell ' estratto ( tenuto conto del volume Y )  , dedotta dalle determinazioni  V volume finale dell ' estratto in microlitri , tenuto conto delle eventuali diluizioni  W peso in grammi della quantita di sostanza sottoposta ad analisi , corrispondente al volume di estratto sottoposto a purificazione su colonna  7 . Preparazione e controllo della soluzione campione ( 3.16 )  7.1 . Determinazione della concentrazione in aflatossina B1  Preparare una soluzione campione di aflatossina B1 nel cloroformio ( 3.2 ) o nella miscela benzene acetonitrile ( 3.6 ) , con concentrazione di 8/10 ( ... ) per ml . Determinare lo spettro di assorbimento tra 330 e 370 nm mediante lo spettrofotometro ( 4.11 )  Rilevare la densità ottica ( A ) a 363 nm nel caso di soluzione cloroformica ; a 348 nm nel caso di soluzione nella miscela benzene/acetonitrile  Calcolare la concentrazione in microgrammi di aflatossina B1 per ml di soluzione , partendo dalle seguenti formule :  3.12 . A . 1000 / 20 600 per la soluzione cloroformica  3.12 . A . 1000 / 19 800 per la soluzione nella miscela benzene/acetonitrile  Effettuare al riparo dalla luce le opportune diluizioni per ottenere una soluzione campione di lavoro con concentrazione in aflatossina B1 di circa 0,1 ( ... ) per ml . Conservata nel refrigeratore a 4° C , questa soluzione rimane stabile per due settimane  7.1 . Controllo della purezza cromatografica  Deporre su una lastra ( 4.8 ) 5 ( ... ) della soluzione campione a 8 - 10 ( ... ) di aflatossina B1 per ml ( 7.1 ) . Sviluppare il cromatogramma come indicato al punto 5.4 . Sotto la luce UV , la fluorescenza deve dar luogo alla percezione di una sola macchia e non deve percepirsi alcuna fluorescenza nella zona del deposito originale  8 . Ripetibilità  La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione dallo stesso analista non dovrebbe superare :  - 25 % del risultato più elevato per i contenuti in aflatossina B1 da 10 a 20 ( ... ) / kg  - 5 ( ... ) , in valore assoluto , per i contenuti superiori a 20 e compresi fino a 50 ( ... ) / kg  - 10 % del risultato più elevato per i contenuti superiori a 50 ( ... ) / kg  9 . Riproducibilità  Vedi note , parte C , punto 2 .  B . METODO PER CROMATOGRAFIA BIDIMENSIONALE SU STRATO SOTTILE  1 . Scopo e campo d ' applicazione  Il metodo consente di determinare il contenuto di aflatossina B1 degli alimenti per gli animali non rientranti nel campo d ' applicazione del metodo A . Il limite inferiore di determinazione è di 0,01 mg/kg ( 10 ppb ) . Questo metodo non si applica agli alimenti contenenti polpe di agrumi  2 . Principio  Il campione è sottoposto ad estrazione con cloroformio . L ' estratto viene filtrato ; un ' aliquota viene prelevata e purificata mediante cromatografia su colonna di gel di silice . L ' eluato viene evaporato o il residuo è ripreso con un volume determinato di cloroformio o di una miscela di benzene e acetonitrile . Un ' aliquota della soluzione e sottoposta a cromatografia bidimensionale su strato sottile . La quantità di aflatossina B1 è determinata sotto irradiazione UV del cromatogramma , sia visualmente sia mediante fluorodensitometria , in rapporto a quantità note di aflatossina B1 .  L ' identità dell 'aflatossina B1 estratta dall ' alimento deve essere confermata con il procedimento indicato .  3 . Reattivi  NB : Tutti i reattivi , in mancanza di altre indicazioni , devono essere del tipo « per analisi »  3.1 . Acetone  3.2 . Cloroformio , stabilizzato con 0,5 / 1,0 % di etanolo al 96 % ( v/v )  3.3 . n-Esano  3.4 . Metanolo  3.5 . Etere dietilico anidro , esente da perossidi  3.6 . Miscela di benzene e acetonitrile : 98/2 ( v/v )  3.7 . Miscela di cloroformio ( 3.2 ) e di metanolo ( 3.4 ) : 97/3 ( v/v )  3.8 . Gel di silice , per cromatografia su colonna , granulometria : 0,05 / 0,20 mm .  3.9 . Cotone idrofilo , preventivamente sgrassato con cloroformio , o lana di vetro  3.10 . Solfato di sodio , anidro , granulato  3.11 . Gas inerte , ad esempio azoto  3.12 . Acido cloridrico 1 N  3.13 . Terra di diatomee ( Hiflosupercel ) , lavata con acido  3.14 . Gel di silice G/HR o equivalente , per cromatografia su strato sottile  3.15 . Solventi di sviluppo :  3.15.1 . Etere dietilico ( 3.5)/metanolo ( 3.4)/acqua : 94/4,5/1,5 ( v/v/v ) vaschetta saturata  3.15.2 . Cloroformio ( 3.2 ) / acetone ( 3.1 ) : 9/1 ( v/v ) , vaschetta non saturata  3.16 . Soluzione campione a 0,1 ( ... ) circa di aflatossina B1 per ml nel cloroformio ( 3.2 ) o nella miscela benzene/acetonitrile ( 3.6 ) , preparata e controllata come indicato al punto 7 del metodo A  4 . Apparecchiatura  Vedi punto 4 del metodo A  5 . Modo di operare  5.1 . Preparazione del campione } vedi punti 5.1 , 5.2 e 5.3 del metodo A  5.2 . Estrazione  5.3 . Purificazione su colonna  5.4 . Cromatografia bidimensionale su strato sottile  5.4.1 . Applicazione delle soluzioni ( seguire lo schema riprodotto nella figura 1 ) Tracciare su una lastra ( 4.8 ) due rette parallele a due a due lati contigui ( a distanza di rispettivamente 5 e 6 cm da tali lati ) , destinate a delimitare le migrazione dei fronti dei solventi . Deporre sulla lastra , con pipette capillari o con microsiringhe , le soluzioni sottoindicate :  - nel punto A , 20 ( ... ) dell ' estratto purificato del campione , ottenuto al punto 5.3  - nel punto B , 20 ( ... ) della soluzione campione ( 3.16 )  - nel punto C , 10 ( ... ) della soluzione campione ( 3.16 )  - nel punto D , 20 ( ... ) della soluzione campione ( 3.16 )  - nel punto E , 40 ( ... ) della soluzione campione ( 3.16 )  Asciugare in leggera corrente d ' aria o di gas inerte ( 3.11 ) . Le macchie ottenute devono avere un diametro di circa 5 mm  5.4.2 . Sviluppo ( seguire lo schema riprodotto nella figura 1 )  Sviluppare il cromatografia nella direzione I usando il solvente di sviluppo ( 3.15.1 ) ( strato di 1 cm in vaschetta saturata ) , al riparo dalla luce , finchù il fronte del solvente non raggiunga la linea di delimitazione . Ritirare la lastra dalla vaschetta e lasciar per 15 minuti al riparo dalla luce e a temperatura ambiente  Sviluppare quindi il cromatogramma nella direzione II usando il solvente di sviluppo ( 3.15.2 ) ( strato di 1 cm in vaschetta non saturata ) , al riparo dalla luce , finchù il fronte del solvente non raggiunga la linea di limitazione . Ritirare la lastra dalla vaschetta e lasciar asciugare a temperatura ambiente  5.4.3 . Interpretazione del cromatogramma ( seguire lo schema riprodotto nella figura 2 )  Irradiare il cromatogramma con luce UV collocando la lastra a 10 cm dalla lampada ( 4.9 ) . Localizzare la posizione delle macchie di fluorescenza blu B , C , D ed E di aflatossina B1 provenienti dalla soluzione campione e tracciare due rette immaginarie passanti per tali macchie e perpendicolari alle direzioni di sviluppo . Il punto d ' intersezione B di tali rette rappresenta la posizione nella quale si dovrebbe trovare la macchia di aflatossina B1 proveniente dall ' estratto del campione deposto nel punto A ( figura 1 ) . La posizione effettiva di questa di questa macchia può comunque trovarsi in un punto Q situato all ' intersezione di due rette immaginarie formanti tra loro un angolo di circa 100° e passanti rispettivamente per le macchie B e C . Determinare la quantità di aflatossina B1 dell ' estratto del campione come indicato al punto 5.5  5.4.4 . Cromatografia complementare  Tracciare su una nuova lastra ( 4.8 ) due rette parallele e due lati contigui , come indicato nello schema riprodotto nella figura 1 , a deporre nel punto A ( figura 1 ) 20 ( ... ) dell ' estratto purificato del campione ottenuto 5.3 e , in sovrapposizione , 20 ( ... ) della soluzione campione ( 3.16 ) . Sviluppare come indicato al punto 5.4.2 . Irradiare il cromatogramma con la luce UV ( 4.9 ) e verificare che  - le macchie di aflatossina B1 dell ' estratto e della soluzione campione si sovrapongano  - la fluorescenza di questa macchia sia più intensa di quella della macchia di aflatossina B1 sviluppata nel punto Q della prima lastra  5.5 . Determinazione quantitative  Procedere alla determinazioni sia visualmente sia mediante fluorodensitometria come sotto indicato  5.5.1 . Misurazioni visuali  Determinare la quantità di aflatossina B1 dell ' estratto confrontando l ' intensità di fluorescenza della macchia dell ' estratto con quella delle macchie C , D e E dalla soluzione campione . Interpolare se necessario . Se l ' intensità di fluorescenza data dai 20 ( ... ) di estratto è più forte di quella dei 40 ( ... ) di soluzione campione , diluire l ' estratto 10 o 100 volte con cloroformio ( 3.2 ) o con la miscela di benzene/acetonitrile ( 3.6 ) prima di sottoporlo ad una nuova cromatografia su strato sottile  Misurazioni mediante fluorodensitometria  Misurare l ' intensità di fluorescenza delle macchie di aflatossina B1 con il fluorodensitometro ( 4.12 ) , utilizzando una lunghezza d ' onda di eccitazione di 365 nm e una lunghezza d ' onda di emissione di 443 nm  Determinare la quantità di aflatossina B1 del deposito dell 'estratto confrontando le intensità di fluorescenza delle macchie dell ' estratto con quelle delle macchie C , D ed E della soluzione campione  5.6 . Conferma dell ' identità dell ' aflatossina B1  Vedi punto 5.6 del metodo A  6 . Calcolo dei risultati  Vedi punto 6 del metodo A  7 . Ripetibilità  Vedi punto 8 del metodo A  8 . Riproducibilità  Vedi note , parte C , punto 2  C . NOTE SUI METODI A E B  1 . Sgrassatura  I campioni contenenti più del 5 % di sostanze grasse devono essere sgrassati con etere di petrolio ( p.e . 40 - 60° ) dopo la preparazione del campione indicata al punto 5.1 . In questi casi , i risultati devono essere riferiti al peso del campione non sgrassato  2 . Riproducibilità dei risultati  La riproducibilità dei risultati , cioè la variazione tra i risultati ottenuti da due o più laboratori relativi allo stesso campione , e stata valutata a :  ± 50 % del valore medio dei risultati per i valori medi in aflatossina B1 da 10 a 20 ( ... ) / kg  ± 10 ( ... ) / kg del valore medio per i valori medi superiori a 20 e compresi fino a 50 ( ... ) / kg  ± 20 % del valore medio per i valori medi superiori a 50 ( ... ) / kg  sedile : vedi G.U .