CELEX: 31978L0633
Language: ro
Date: 1978-06-15 00:00:00
Title: A opta directivă a Comisiei din 15 iunie 1978 de stabilire a metodelor comunitare de analiză pentru controlul oficial al furajelor

03/Volumul 03
            
               RO
            
               Jurnalul Ofícial al Uniunii Europene
            
               15
            31978L0633
               L 206/43
            
               JURNALUL OFÍCIAL AL UNIUNII EUROPENE
            
               
            
      A OPTA DIRECTIVĂ A COMISIEI
   din 15 iunie 1978de stabilire a metodelor comunitare de analiză pentru controlul oficial al furajelor(78/633/CEE)COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE,având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Economice Europene,având în vedere Directiva 70/373/CEE a Consiliului din 20 iulie 1970 privind introducerea modalităților de prelevare de probe și a metodelor comunitare de analiză pentru controlul oficial al furajelor (1), modificată ultima dată de Actul de aderare, în special articolul 2,întrucât directiva menționată impune realizarea controlului oficial al furajelor cu ajutorul modalităților de prelevare de probe și a metodelor comunitare de analiză în scopul verificării respectării cerințelor din cadrul dispozițiilor stabilite prin acte cu putere de lege sau acte administrative privind calitatea și compoziția furajelor;întrucât Directivele 71/250/CEE din 15 iunie 1971 (2), 71/393/CEE din 18 noiembrie 1971 (3), 72/199/CEE din 27 aprilie 1972 (4), 73/46/CEE din 5 decembrie 1972 (5), 74/203/CEE din 25 martie 1974 (6), 75/84/CEE din 20 decembrie 1974 (7) și 76/372/CEE din 1 martie 1976 (8) ale Comisiei au stabilit deja un număr de metode comunitare de analiză; întrucât progresul înregistrat până în prezent arată că este necesară adoptarea unui al optulea set de metode;întrucât măsurile prevăzute în prezenta directivă sunt conforme cu avizul Comitetului permanent pentru furaje,ADOPTĂ PREZENTA DIRECTIVĂ:Articolul 1(1)   Statele membre solicită realizarea analizelor pentru controalele oficiale ale furajelor cu privire la conținutul lor de bacitracin de zinc, flavofosfolipol, fier, cupru, magneziu și zinc în conformitate cu metodele descrise în anexa la prezenta directivă.(2)   Dispozițiile generale stabilite în partea I, „Introducere”, din anexa la prima Directivă 71/250/CEE, cu excepția părții referitoare la prepararea eșantionului care urmează să fie analizat, se aplică metodelor descrise în anexa la prezenta directivă.Articolul 2Statele membre pun în aplicare la 1 ianuarie 1979 actele cu putere de lege sau actele administrative necesare aducerii la îndeplinire a prezentei directive. Statele membre notifică de îndată Comisia cu privire la aceasta.Articolul 3Prezenta directivă se adresează statelor membre.
      Adoptată la Bruxelles, 15 iunie 1978.
      
         
            Pentru Comisie
         
         Finn GUNDELACH
         
         
            Vicepreședinte
         
      
   
      (1)  JO L 170, 3.8.1970, p. 2.
      (2)  JO L 155, 12.7.1971, p. 13.
      (3)  JO L 279, 20.12.1971, p. 7.
      (4)  JO L 123, 29.5.1972, p. 6.
      (5)  JO L 83, 30.3.1973, p. 21.
      (6)  JO L 108, 22.4.1974, p. 7.
      (7)  JO L 32, 5.2.1975, p. 26.
      (8)  JO L 102, 15.4.1976, p. 8.ANEXĂ1.   DETERMINAREA BACITRACINULUI DE ZINC PRIN DIFUZAREA ÎNTR-UN MEDIU AGAR1.   OBIECTIV ȘI DOMENIU DE APLICAREMetoda se folosește la determinarea bacitracinului de zinc din furaje, concentrate și preamestecuri. Limita inferioară de determinare este 5 mg/kg (5 ppm) (1). Metoda nu este valabilă în prezența substanțelor de interferență, în special a cantităților mari de cupru și acid ascorbic.2.   PRINCIPIUEșantionul se extrage la pH 2 cu un amestec de metanol/apă/acid clorhidric. Extractul se aduce la un pH de 6,5, concentrat (dacă este necesar) și diluat. Activitatea lui antibiotică se determină prin măsurarea difuzării de bacitracin de zinc într-un mediu agar inoculat cu Micrococcus luteus (Syn. M. flavus). Difuziunea este indicată de formarea unor zone de inhibare a microorganismelor. Diametrul acestor zone se consideră a fi direct proporțional cu logaritmul concentrației de antibiotice raportat la intervalul concentrațiilor de antibiotice folosite.3.   MICROORGANISM: MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 102403.1.   Menținerea culturii-mamăSe inoculează Micrococcus Luteus în lichidul agar din mediul de cultură (4.1). Se incubează timp de 24 ore la 30-37 °C, se păstrează într-un frigider la aproximativ 4 °C și se reinoculează o dată la două săptămâni în lichidul agar.3.2.   Prepararea suspensiei bacteriene (2)
   Se recoltează cultura dintr-un lichid agar preparat recent (3.1) cu 2-3 ml de soluție de clorură de sodiu (4.3). Se folosește suspensia pentru a inocula 250 ml de mediu de cultură (4.1) conținut într-un balon Roux și se incubează timp de 18-20 ore la 30-37 °C. Se recoltează cultura în 25 ml de soluție de clorură de sodiu (4.3) și se amestecă. Se diluează suspensia în proporție de o zecime cu soluție de clorură de sodiu (4.3). Transmisia ușoară a suspensiei trebuie să fie de aproximativ 75 %, măsurată la 650 mm într-o celulă de 1 cm în comparație cu soluția de clorură de sodiu (4.3).4.   MEDII DE CULTURĂ ȘI REACTIVI4.1.   Mediul de cultură (3)
   
               Peptonă de esență
            
               6,0 g
            
               Triptonă
            
               4,0 g
            
               Extract de drojdie
            
               3,0 g
            
               Extract de carne
            
               1,5 g
            
               Glucoză
            
               1,0 g
            
               Agar
            
               15,0 g
            
               Apă
            
               1 000 ml
            
               pH 6,5-6,6 (după sterilizare)
            
                
            4.2.   Mediul de analiză (3)
   
               Triptonă
            
               10,0 g
            
               Extract de drojdie
            
               3,0 g
            
               Extract de carne
            
               1,5 g
            
               Glucoză
            
               1,0 g
            
               Agar
            
               20,0 g
            
               Tween 80
            
               1 ml
            
               Apă
            
               1 000 ml
            
               pH 6,5 (după sterilizare)
            
                
            4.3.   Soluție de clorură de sodiu 0,8 % (p/v): se dizolvă 8 g de clorură de sodiu p.a. în apă și se diluează până la 1 000 ml; se sterilizează.4.4.   Amestec de metanol, pur/apă/acid clorhidric p.a. (d: 1,18 la 1,19): 80/17,5/2,5 (v/v/v).4.5.   Soluție tampon fosfată, pH 6,5Fosfat acid de potasiu K2HPO4 p.a. (22,15 g).Fosfat diacid de potasiu KH2PO4 p.a. (27,85 g).Apă până la 1 000 ml.4.6.   Acid clorhidric p.a. (d: 1,18 până la 1,19).4.7.   Acid clorhidric p.a. (0,1 N).4.8.   Soluție 1 N de hidroxid de sodiu p.a.4.9.   Soluție violetă de Bromocresol de 0,04 % (p/v): se dizolvă 0,1 g de Bromocresol violet în 18,5 ml de soluție 0,01 N de hidroxid de sodiu. Se completează până la 250 ml cu apă și se amestecă.4.10.   Substanța standard: bacitracin de zinc cu activitate cunoscută (în u.i.).5.   SOLUȚII STANDARDSe cântărește o cantitate de bacitracin de zinc standard (4.10) corespunzătoare la 1 050 u.i. (conform activității indicate). Se adaugă 5 ml de acid clorhidric de 0,1 N (4.7) și se lasă să stea timp de 15 minute. Se adaugă 30 ml de apă, se ajustează pH-ul la 4,5 cu soluție tampon fosfată cu pH-ul de 6,5 (4.5) (aproximativ 4 ml), se completează până la de 50 ml cu apă și se amestecă bine (1 ml = 21 u.i.).Din această soluție se prepară, prin diluare succesivă cu soluție tampon fosfată cu pH-ul de 6,5 (4.5), următoarele soluții:
               S8
               
            
               0,42
            
               u.i./ml
            
               S4
               
            
               0,21
            
               u.i./ml
            
               S2
               
            
               0,105
            
               u.i./ml
            
               S1
               
            
               0,0525
            
               u.i./ml
            6.   PREPARAREA EXTRACTULUI6.1.   Extracția6.1.1.   Concentrate, preamestecuri și alimente mineraleSe cântărește o cantitate de eșantion de 2,0-5,0 g, se adaugă 30 ml de amestec (4.4) și se agită scurt. Se verifică dacă pH-ul este de aproximativ 2. Se agită timp de 10 minute, se adaugă 30 ml de soluție tampon fosfată cu pH-ul de 6,5 (4.5) și se agită timp de 15 minute. Se diluează cu soluție tampon fosfată (4.5) pentru a obține un conținut de bacitracin de zinc estimat de 0,42 u.i./ml (= U8).6.1.2.   Concentrate de proteineSe cântărește o cantitate de eșantion de 10,0 g, se adaugă 50 ml de amestec (4.4) și se agită scurt. Se verifică dacă pH-ul este de aproximativ 2. Se agită timp de 10 minute, se adaugă 50 ml de soluție tampon fosfată cu pH-ul de 6,5 (4.5) și se agită timp de 15 minute. Se diluează cu soluție tampon fosfată (4.5) pentru a obține un conținut de bacitracin de zinc estimat de 0,42 u.i./ml (= U8).6.1.3.   Alte alimenteSe cântărește o cantitate de eșantion de 10,0 g (20,0 g pentru un conținut estimat de bacitracin de zinc 5 mg/kg), se adaugă 25 ml de amestec (4.4) și se omogenizează timp de aproximativ 10 minute. Se adaugă 25 ml de soluție tampon fosfată cu pH-ul 6,5 (4.5), se agită timp de 15 minute și se centrifughează. Se iau 20 ml de soluție supernatantă și se ajustează pH-ul până la 6,5 cu ajutorul soluției de hidroxid de sodiu cu 1 N (4.8) cu soluție violetă de bromocresol (4.9) ca indicator. Se evaporă până la aproximativ 4 ml într-un evaporator rotativ la o temperatură care nu depășește 35 °C. Se diluează reziduul cu apă pentru a obține un conținut estimat de bacitracin de zinc de 0,42 u.i./ml (= U8).6.2.   Soluții de analizăDin soluția U8 se prepară soluțiile U4 (conținut estimat: 0,21 u.i./ml), U2 (conținut estimat: 0,105 u.i./ml) și U1 (conținut estimat: 0,0525 u.i./ml) prin diluare succesivă (1 + 1) cu soluție tampon fosfată (4.5).7.   PROCEDURA DE ANALIZĂ7.1.   Inocularea mediului de analizăSe inoculează mediul de analiză (4.2) cu suspensie bacteriană (3.2) la aproximativ 50 °C. Prin încercări preliminare pe plăci cu mediu de analiză (4.2) se determină cantitatea de suspensie bacteriană necesară pentru a obține cele mai mari și mai clare zone de inhibare cu concentrații diferite de bacitracin de zinc.7.2.   Prepararea plăcilorDifuzarea prin agar este realizată în plăci cu cele patru concentrații de soluții standard (S8, S4, S2, S1) și cele patru concentrații de soluții de analiză (U8, U4, U2, U1). Aceste patru concentrații de extract și standard trebuie să fie plasate, neapărat, în fiecare placă. În acest scop, se selectează plăci suficient de mari pentru a permite formarea a cel puțin opt orificii cu diametrul de 10-13 mm și cu o distanță de cel puțin 30 mm între centrele realizate în mediu agar. Testul poate fi realizat pe plăci formate dintr-o foaie de sticlă cu o folie de aluminiu sau cu un inel de plastic plasat deasupra, cu diametrul de 200 mm și înălțimea de 20 mm.Se toarnă pe plăci o cantitate de mediu (4.2), inoculată ca la punctul 7.1 pentru a forma un strat de aproximativ 2 mm grosime (50 ml pentru o placă cu diametrul de 200 mm). Se lasă să se stabilizeze, se realizează orificiile și se pun în ele volume de soluții standard și de analiză măsurate cu precizie (între 0,10 și 0,15 ml per orificiu, în funcție de diametru).Se aplică fiecare concentrație de cel puțin patru ori astfel încât fiecare determinare să fie supusă unei evaluări a 32 de zone de inhibare.7.3.   IncubațiaSe incubează plăcile timp de 16-18 ore la 28-30 °C.8.   EVALUARESe măsoară diametrul zonelor de inhibare cu aproximație de 0,1 mm. Se înregistrează valorile medii ale măsurătorilor pentru fiecare concentrație de hârtie milimetrică semilogaritmică indicând logaritmul concentrațiilor în raport cu diametrele zonelor de inhibare. Se trasează liniile „optime” ale soluției standard și ale extractului, ca în exemplul arătat în continuare.Se determină punctul „optim” pentru cel mai scăzut nivel standard (SL) folosind formula:
               (a)
            
               
                  
            Se determină punctul „optim” pentru cel mai ridicat nivel standard (SH) folosind formula:
               (b)
            
               
                  
            În același mod se determină punctele „optime” pentru nivelul cel mai scăzut de extract (UL) și cel mai ridicat de extract (UH), înlocuind U1, U2, U4 și U8 cu S1, S2, S4 și S8 în formulele menționate anterior.Valorile SL și SH se înregistrează pe aceeași hârtie milimetrică și se unesc pentru a obține linia „optimă” pentru soluția standard. În același mod se înregistrează UL și UH și se unesc pentru a obține linia „optimă” pentru extract.În absența oricărei interfețe, liniile trebuie să fie paralele. Pentru scopuri practice, liniile pot fi considerate paralele dacă valorile (SH-SL) și (UH-UL) nu diferă cu mai mult de 10 % din valoarea medie a acestora.În cazul în care liniile nu sunt paralele, fie U1 și S1, fie U8 și S8 se înlătură și SL, SH, UL și UH calculate folosind formule alternative, pentru a obține linii alternative „optime”:
               (a′)
            
               
                  
            sau
               (b′)
            
               
                  
            sauși în același mod pentru UL și UH. Liniile alternative „optime” se verifică pentru paralelism ca mai înainte. Se menționează în raportul final că rezultatul a fost calculat pe trei niveluri.
      În cazul în care liniile sunt considerate paralele, se calculează logaritmul activității relative (log. A) folosind una din următoarele formule.Pentru patru nivele
               (c)
            
               
                  
            Pentru trei nivele
               (d)
            
               
                  
            sau
               (d′)
            
               
                  
            Activitatea efectivă = activitatea presupusă × activitatea relativă.
      În cazul în care liniile nu sunt considerate a fi paralele, se repetă determinarea. Dacă paralelismul nu este încă obținut, se calculează logaritmul activității relative (log. A) folosind formula (c). Totuși, rezultatul obținut trebuie să fie considerat aproximativ și acest lucru se menționează în raportul final.9.   REPETABILITATEDiferența dintre rezultatele a două determinări realizate pe același eșantion, de către același analist, nu trebuie să depășească:20 % raportat la valoarea cea mai mare pentru conținutul de bacitracin de zinc între 5 și 25 mg/kg;5 mg/kg, în valoare absolută, pentru un conținut mai mare de 25 și până la 50 mg/kg;10 % raportat la valoarea cea mai mare pentru conținut peste 50 mg/kg.2.   DETERMINAREA FLAVOFOSFOLIPOLULUI PRIN DIFUZAREA ÎNTR-UN MEDIU AGAR1.   OBIECTIV ȘI DOMENIU DE APLICAREMetoda se folosește pentru determinarea flavofosfolipolului din furaje, concentrate și preamestecuri. Limita inferioară de determinare este 1 mg/kg (1 ppm).2.   PRINCIPIUEșantionul este extras cu metanol diluat prin încălzire sub reflux. După centrifugare, extractul este purificat (dacă este necesar) prin tratare cu rășini cu transfer de ioni și diluată. Activitatea sa antibiotică se determină prin măsurarea difuzării de flavofosfolipol într-un mediu agar inoculat cu Staphylococcus aureus. Difuzarea este indicată de formarea de zone de inhibare a microorganismului. Diametrul acestor zone este considerat ca fiind direct proporțional cu logaritmul concentrației de antibiotice raportat la intervalul de concentrații de antibiotice folosite.3.   MICROORGANISM: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P3.1.   Menținerea culturii-mamăSe inoculează Staphylococcus Aureus în lichidul agar din mediul de cultură (4.1). Se incubează timp de 24 de ore la 37 °C, se păstrează într-un frigider la aproximativ 4 °C și se reinoculează în fiecare lună în lichid agar.3.2.   Prepararea suspensiei bacteriene (4)
   Se păstrează două eprubete ce conțin cultură-mamă (3.1) și se reinoculează săptămânal. Se incubează timp de 24 ore la 37 °C și se păstrează într-un frigider la aproximativ 4 °C.Cu 24 de ore înainte de analiză, se inoculează cu această cultură două până la patru eprubete ce conțin mediu de cultură (4.1). Se incubează timp de 16-18 ore la 37 °C. Se realizează o suspensie a culturii în soluție de clorură de sodiu (4.3). Transmisia ușoară a suspensiei trebuie să fie de aproximativ 40 %, măsurată la 578 nm într-o celulă de 1 cm în comparație cu soluția de clorură de sodiu (4.3).4.   MEDII DE CULTURĂ ȘI REACTIVI4.1.   Mediul de cultură (5)
   
               Peptonă din carne
            
               6,0 g
            
               Triptonă
            
               4,0 g
            
               Extract de drojdie
            
               3,0 g
            
               Extract de carne
            
               1,5 g
            
               Glucoză
            
               1,0 g
            
               Agar
            
               15,0 g
            
               Apă
            
               1 000 ml
            
               pH 6,5 (după sterilizare)
            
                
            4.2.   Mediul de analiză4.2.1.   Stratul de bază (6)
   
               Peptonă din carne
            
               6,0 g
            
               Extract de drojdie
            
               3,0 g
            
               Extract de carne
            
               1,5 g
            
               Agar
            
               10,0 g
            
               Apă
            
               1 000 ml
            
               pH 6,5 (după sterilizare)
            
                
            4.2.2.   Stratul de sămânțăCa la punctul 4.1, cu adaos de 2,0 g emulsie antispongioasă de silicon (7).4.3.   Soluție de clorură de sodiu 0,4 % (p/v): se dizolvă 4 g de clorură de sodiu p.a. în apă și se diluează până la 1 000 ml; se sterilizează.4.4.   Metanol, pur.4.5.   Metanol 50 % (v/v): se diluează 500 ml de metanol (4.4) cu 500 ml de apă.4.6.   Metanol 80 % (v/v): se diluează 800 ml de metanol (4.4) cu 200 ml de apă.4.7.   Tri (hidroximetil) aminometan p.a.4.8.   Soluție metanolică de clorură de potasiu 1,5 % (p/v): se dizolvă 1,5 g de clorură de potasiu p.a. în 20 ml de apă, se completează până la 100 ml cu metanol (4.4).4.9.   Agentul de transfer de cationi: Dowex 50 × W 8, 20 până la 50 ochiuri, formă de Na (cat. Serva Nr. 41600) sau echivalentul.4.10.   Agentul de transfer de anioni: Dowex 1 × 2, 50 până la 100 ochiuri, formă de Cl (cat. Serva Nr. 41010) sau echivalentul. Înainte de utilizare, se păstrează timp de 12-14 ore în metanol 80 % (4.6).4.11.   Vată de sticlă.4.12.   Hârtie indicator de pH (pH de la 6,6 la 8,1).4.13.   Acid ascorbic.4.14.   Substanță standard: flavofosfolipol cu activitate cunoscută.5.   APARATURĂ5.1.   Tub de sticlă pentru cromatografie, cu diametrul intern: 9 mm, lungimea: 150-200 mm, prevăzut cu un robinet de închidere la partea îngustă a capătului inferior și o îmbinare de sticlă șlefuită [pentru a se conecta cu pâlnia de picurare (5.2.)] la capătul superior.5.2.   Pâlnie de picurare de 250 ml, prevăzută cu un robinet de închidere și cu o îmbinare de sticlă șlefuită.5.3.   Balon conic de 250 ml cu îmbinare de sticlă șlefuită.5.4.   Condensator de reflux cu îmbinare de sticlă șlefuită.6.   SOLUȚII STANDARDSe dizolvă o cantitate de substanță standard cântărită cu precizie (4.14) în metanol 50 % (4.5) și se diluează pentru a obține o soluție-mamă conținând 100 µg flavofosfolipol pe mililitru. Păstrată în baloane închise la 4 °C, această soluție este stabilă până la două luni.Din această soluție-mamă se prepară, prin diluare succesivă cu metanol 50 % (4.5), următoarele soluții:
               S8
               
            
               0,2
            
               µg/ml
            
               S4
               
            
               0,1
            
               µg/ml
            
               S2
               
            
               0,05
            
               µg/ml
            
               S1
               
            
               0,025
            
               µg/ml
            7.   PREPARAREA EXTRACTULUI7.1.   Extracția7.1.1.   Concentrate, preamestecuri și alimenteSe cântărește o cantitate de eșantion de 2,0-5,0 g și se adaugă aproximativ 150 mg de acid ascorbic (4.13). Se omogenizează cu 150 ml de metanol 50 % (4.5) într-un balon conic (5.3) și se ajustează pH-ul la 8,1-8,2 cu aproximativ 400 mg de tri (hidroximetil) aminometan (4.7). Se verifică pH-ul cu hârtia indicator (4.12). Se lasă să se stabilizeze timp de 15 minute, apoi se reajustează pH-ul la 8,1-8,2 cu tri (hidroximetil) aminometan (4.7) și se fierbe timp de 10 minute sub reflux (5.4), amestecând constant. Se lasă să se răcească, se centrifughează amestecul și se decantează extractul.7.1.2.   Alte alimenteSe cântărește o cantitate de eșantion de 5,0-30,0 g care conține cel puțin 30 μg flavofosfolipol. Se omogenizează cu 150 ml de metanol 50 % (4.5) într-un balon conic (5.3) și se ajustează pH-ul la 8,1-8,2 cu aproximativ 400 mg de tri (hidroximetil) aminometan (4.7). Se verifică pH-ul cu hârtie indicator (4.12). Se lasă să se stabilizeze timp de 15 minute, apoi se reajustează pH-ul la 8,1-8,2 cu tri (hidroximetil) aminometan (4.7) și se fierbe timp de 10 minute sub reflux (5.4), amestecând constant. Se lasă să se răcească, se centrifughează amestecul și se decantează extractul.7.2.   Purificarea (această etapă poate fi omisă pentru concentrate, preamestecuri și alimente minerale)Se amestecă 110 ml de extract cu 11 g de agent de transfer de cationi (4.9), se fierbe timp de un minut sub reflux (5.4), amestecând constant. Se separă agentul de transfer de cationi prin centrifugare sau filtrare. Se amestecă 100 ml de extract cu 150 ml de metanol (4.4) și se păstrează soluția timp de 12-15 ore la 4 °C. Se filtrează masa floculentă, cât timp este rece.Se introduce un tampon de vată de sticlă (4.11) la capătul inferior al tubului de sticlă (5.1), se toarnă în tub 5 ml de agent de transfer de anioni (4.10) și se spală coloana cu 100 ml de metanol 80 % (4.6). Folosind pâlnia (5.2), se transferă în coloană un volum de filtrat de cel puțin 100 ml care se estimează să conțină 16 µg de flavofosfolipol (200 ml pentru un eșantion de furaje de 30 g la 1 ppm). Dacă este necesar, înainte de transferul în coloană, se diluează filtratul cu metanol 80 % (4.6) pentru a obține un conținut estimat de flavofosfolipol de 16 µg/100ml. Se ajustează debitul la aproximativ 2 ml/minut. Se îndepărtează efluentul. Apoi se spală coloana cu 50 ml de metanol 80 % (4.6) și se îndepărtează efluentul.Se diluează flavofosfolipolul cu soluție metanolică de clorură de potasiu (4.8), păstrând debitul la aproximativ 2 ml/minut. Se colectează 50 ml de eluat într-un balon gradat, se adaugă 30 ml de apă și se amestecă. Această soluție trebuie să aibă un conținut de flavofosfolipol de 0,2 µg/ml (= U8).7.3.   Soluții de analizăDacă este necesar (adică atunci când etapa de purificare a fost omisă), se diluează extractul obținut la punctul 7.1.1 cu metanol 50 % (4.5) pentru a obține un conținut estimat de flavofosfolipol de 0,2 µg/ml (= U8).Din soluția U8 se prepară soluțiile U4 (conținut estimat: 0,1 µg/ml), U2 (conținut estimat: 0,05 µg/ml) și U1 (conținut estimat: 0,025 µg/ml) prin diluare succesivă (1 + 1) cu metanol 50 % (4.5).8.   PROCEDURA DE ANALIZĂ8.1.   Inocularea mediului de analizăSe inoculează mediul de analiză (4.2.2) cu suspensia bacteriană (3.2) la aproximativ 50 °C. Prin încercări preliminare pe plăcile cu mediu de analiză (4.2.2) se determină cantitatea de suspensie bacteriană necesară pentru a forma cele mai mari și mai clare zone de inhibare cu diferite concentrații de flavofosfolipol (aproximativ 30 ml/litru).8.2.   Prepararea plăcilorDifuzarea prin agar este realizată în plăci cu cele patru concentrații de soluții standard (S8, S4, S2, S1) și cele patru concentrații de soluții de analiză (U8, U4, U2, U1). Aceste patru concentrații de extract și standard trebuie să fie plasate, neapărat, în fiecare placă. În acest scop, se selectează plăci suficient de mari pentru a permite formarea a cel puțin opt orificii cu diametrul de 10-13 mm și cu o distanță de cel puțin 30 mm între centrele realizate în mediu agar. Testul poate fi realizat pe plăci formate dintr-o foaie de sticlă cu o folie de aluminiu sau cu un inel de plastic plasat deasupra, cu diametrul de 200 mm și înălțimea de 20 mm.Se toarnă pe plăci o cantitate de mediu (4.2.1) pentru a forma un strat de aproximativ 1,5 mm grosime (45 ml pentru o placă cu diametrul de 200 mm). Se lasă să se stabilizeze și se pune peste strat o cantitate de mediu (4.2.2) inoculat ca la punctul 8.1 pentru a obține un strat de 1 mm grosime (30 ml pentru o placă cu diametru de 200 mm). Se lasă să se stabilizeze din nou, se realizează orificiile și se pun în ele volume de soluții standard și de analiză măsurate cu precizie (între 0,10 și 0,15 ml per orificiu, în funcție de diametru).Se aplică fiecare concentrație de cel puțin patru ori astfel încât fiecare determinare să fie supusă unei evaluări a 32 de zone de inhibare.8.3.   IncubareSe incubează plăcile timp de 16-18 ore la o temperatură de 28-30 °C.9.   EVALUARESe măsoară diametrul zonelor de inhibare cu aproximație de 0,1 mm. Se înregistrează valorile medii ale măsurătorilor pentru fiecare concentrație de hârtie milimetrică semilogaritmică indicând logaritmul concentrațiilor în raport cu diametrele zonelor de inhibare. Se trasează liniile „optime” ale soluției standard și ale extractului, ca în exemplul menționat în continuare.Se determină punctul „optim” pentru cel mai scăzut nivel standard (SL) folosind formula:
               (a)
            
               
                  
            
               (b)
            
               
                  
            În același mod se determină punctele „optime” pentru nivelul cel mai scăzut de extract (UL) și nivelul cel mai ridicat de extract (UH), înlocuind U1, U2, U4 și U8 cu S1, S2, S4 și S8 în formulele menționate anterior.Valorile SL și SH se înregistrează pe aceeași hârtie milimetrică și se unesc pentru a obține linia „optimă” pentru soluția standard. În același mod se înregistrează UL și UH și se unesc pentru a obține linia „optimă” pentru extract.În absența oricărei interfețe liniile trebuie să fie paralele. Pentru scopuri practice, liniile pot fi considerate paralele dacă valorile (SH-SL) și (UH-UL) nu diferă cu mai mult de 10 % din valoarea medie a acestora.În cazul în care liniile nu sunt paralele, fie U1 și S1, fie U8 și S8 se elimină și SL, SH, UL și UH calculate folosind formule alternative, pentru a obține linii alternative „optime”:
               (a′)
            
               
                  
            sau
               (b′)
            
               
                  
            sauși în același mod pentru UL și UH. Liniile alternative „optime” se verifică pentru paralelism ca mai înainte. Se menționează în raportul final că rezultatul a fost calculat pe trei niveluri.
      Atunci când liniile sunt considerate paralele, se calculează logaritmul activității relative (log. A) folosind una din următoarele formule.Pentru patru nivele
               (c)
            
               
                  
            Pentru trei nivele
               (d)
            
               
                  
            sau
               (d′)
            
               
                  
            Activitatea efectivă = activitatea estimată × activitatea relativă
      În cazul în care liniile nu sunt considerate a fi paralele, se repetă determinarea. Dacă paralelismul nu este încă obținut, se calculează logaritmul activității relative (log. A) folosind formula (c). Totuși, rezultatul obținut se consideră aproximativ și acest lucru se menționează în raportul final.10.   REPETABILITATEDiferența dintre rezultatele celor două determinări realizate pe același eșantion de același analist nu trebuie să depășească:0,5 mg/kg, în valoare absolută, pentru conținutul de flavofosfolipol de la 1 la 2 mg/kg;25 % raportat la valoarea cea mai ridicată pentru un conținut de la 2 la 10 mg/kg;20 % raportat la valoarea cea mai ridicată pentru un conținut de la 10 la 25 mg/kg;5 mg/kg, în valoare absolută, pentru un conținut de la 25 la 50 mg/kg;10 % raportat la valoarea cea mai ridicată pentru un conținut de peste 50 mg/kg.3.   DETERMINAREA ELEMENTELOR DE DETECTARE FIER, CUPRU, MANGAN ȘI ZINC1.   OBIECTIV ȘI DOMENIU DE APLICAREMetoda permite determinarea elementelor de detectare fier, cupru, mangan și zinc din furaje. Limitele inferioare de determinare sunt:
                
            
               fier (Fe): 20 mg/kg
            
                
            
               cupru (Cu): 10 mg/kg
            
                
            
               mangan (Mn): 20 mg/kg
            
                
            
               zinc (Zn): 20 mg/kg
            2.   PRINCIPIUEșantionul este pus în soluție de acid clorhidric după distrugerea materiei organice, dacă aceasta este prezentă. Se determină elementele fier, cupru, mangan și zinc, după o diluare corespunzătoare, cu ajutorul spectrometriei de absorbție atomică.3.   REACTIVIComentarii introductivePentru prepararea reactivilor și a soluțiilor analitice se folosește apă fără cationii care urmează să fie determinați, obținută fie prin distilarea dublă a apei într-o sticlă borosilicată sau un distilator de cuarț, fie prin dublu tratament cu rășină schimbătoare de ioni.Reactivii trebuie să fie cel puțin de grad analitic (p.a.). Detașarea de elementul care urmează să fie determinat trebuie verificată într-un experiment martor. Dacă este necesar, reactivii trebuie să fie în continuare purificați.În locul soluțiilor standard descrise anterior pot fi folosite soluțiile standard din comerț, cu condiția ca ele să fie garantate și verificate înainte de utilizare.3.1.   Acid clorhidric p.a. (d: 1,19).3.2.   Acid clorhidric p.a. (6 N).3.3.   Acid clorhidric p.a. (0,5 N).3.4.   Acid fluorhidric 38-40 % (v/v) cu un conținut de fier de mai puțin de 1 mg Fe/litru și un reziduu după evaporare de mai puțin de 10 mg (cum ar fi sulfatul)/litru.3.5.   Acid sulfuric p.a. (d: 1,84).3.6.   Peroxid de hidrogen p.a. [aproximativ 100 volume de oxigen (30 % în greutate)].Soluție standard de fier de lucru (1 000 µg Fe/ml) preparată după cum urmează: se dizolvă 1 g de sârmă de fier p.a. în 200 ml de acid clorhidric 6 N (3.2), se adaugă 16 ml de peroxid de hidrogen (3.6) și se completează până la un litru de apă.3.7.1.   Soluție standard de fier de lucru (100 µg Fe/ml) preparată prin diluarea soluției standard (3.7) cu apă 1 + 9.Soluție standard de cupru (1 000 µg Cu/ml) preparată după cum urmează: se dizolvă 1 g de praf de cupru (p.a.) în 25 ml de acid clorhidric 6 N (3.2), se adaugă 5 ml de peroxid de hidrogen (3.6) și se completează până la un litru de apă.3.8.1.   Soluție standard de cupru de lucru (10 µg/ml) preparată prin diluarea soluției standard (3.8) 1 + 9 cu apă și apoi prin diluarea soluției rezultate cu apă 1 + 9.Soluție standard de mangan (1 000 µg Mn/ml) preparată după cum urmează: se dizolvă 1 g de praf de mangan (p.a.) în 25 ml de acid clorhidric 6 N (3.2) și se completează până la un litru de apă.3.9.1.   Soluția standard de mangan de lucru (10 µg Mn/ml) preparată prin diluarea soluției standard (3.9) 1 + 9 cu apă și apoi prin diluarea soluției rezultate cu apă 1 + 9.Soluție standard de zinc (1 000 µg Zn/ml) preparată după cum urmează: se dizolvă 1 g de zinc sub formă de fâșii sau bucăți (p.a.) în 25 ml de acid clorhidric 6 N (3.2) și se completează până la un litru de apă.3.10.1.   Soluția standard de zinc de lucru (10 µg Zn/ml) preparată prin diluarea soluției standard (3.10) 1 + 9 cu apă și apoi prin diluarea soluției rezultate cu apă 1 + 9.3.11.   Soluție de clorură de lantan preparată după cum urmează: se dizolvă 12 g de oxid de lantan în 150 ml de apă, se adaugă 100 ml de acid clorhidric 6 N (3.2) și se completează până la un litru de apă.4.   APARATURĂ4.1.   Cuptor închis cu reglare de temperatură și aparat de înregistrare.4.2.   Sticlăria trebuie să fie de tip borosilicat rezistent și se recomandă folosirea aparatelor rezervate exclusiv pentru determinarea oligoelementelor.4.3.   Creuzet din platină și (opțional) creuzet din cuarț.4.4.   Spectrofotometru de absorbție atomică care îndeplinește cerințele metodei cu privire la sensibilitatea și precizia din intervalul necesar.5.   PROCEDURA5.1.   Eșantioanele care conțin materie organică5.1.1.   Arderea și prepararea soluției pentru analiză (8)
   
               (i)
            
               Se introduc 5-10 grame de eșantion cântărit cu aproximație de 0,2 mg într-un creuzet de cuarț sau platină (4.3) [a se vedea nota (b)], se usucă într-un cuptor la 105 °C și se introduce creuzetul în cuptorul închis rece (4.1). Se închide cuptorul [a se vedea nota (c)] și se mărește treptat temperatura până la 450-475 °C, în aproximativ 90 minute. Se menține temperatura timp de 4-16 ore (de exemplu peste noapte) pentru a îndepărta materialul carbonic și apoi se deschide cuptorul și lasă să se răcească [a se vedea nota (d)].
               Se spală creuzetul cu o cantitate totală de aproximativ 5 ml de acid clorhidric (3.1) și se adaugă acesta din urmă încet și cu grijă în paharul de laborator (poate determina o reacție puternică din cauza formării de CO2). Se adaugă acid clorhidric (3.1), picătură cu picătură, agitându-se până se oprește efervescența. Se evaporă până la uscare, agitându-se din când în când cu o baghetă de sticlă.
               Se adaugă 15 ml de acid clorhidric 6 N (3.2) la reziduu, apoi aproximativ 120 ml apă. Se amestecă cu o baghetă de sticlă, care trebuie lăsată în paharul de laborator, și se acoperă paharul cu o sticlă de ceas. Se aduce ușor la punctul de fierbere și se menține la punctul de fierbere până când cenușa nu mai este dizolvată. Se filtrează cu hârtia de filtru fără cenușă și se colectează filtratul într-un balon gradat de 250 ml. Se spală paharul de laborator și se filtrează cu 5 ml de acid clorhidric 6 N fierbinte (3.2) și de două ori cu apă fiartă. Se umple balonul gradat cu apă până la marcaj (concentrația de acid clorhidric de 0,5 N).
            
               (ii)
            
               Dacă reziduul din filtru este negru (carbon), se așează la loc în cuptor și se arde din nou la 450-475 °C. Această ardere, care necesită numai câteva ore (aproximativ 3-5 ore), este completă când cenușa este albă sau aproape albă. Se dizolvă reziduul cu aproximativ 2 ml de acid clorhidric (3.1), se evaporă până la uscare și se adaugă 5 ml de acid clorhidric 6 N (3.2). Se încălzește, se filtrează soluția în balonul gradat și se umple cu apă până la marcaj (concentrația HCl de aproximativ 0,5 N).
            Note:
               (a)
            
               La determinarea oligoelementelor este important să se observe cu atenție riscurile de contaminare, în special cu zinc, cupru și fier. Din acest motiv, echipamentul folosit la prepararea eșantioanelor nu trebuie să conțină aceste metale.
               Pentru reducerea riscului general de contaminare se lucrează într-o atmosferă fără praf, cu echipament curățat cu mare atenție și cu sticlărie spălată cu grijă. Determinarea zincului este în mod special sensibilă la multe tipuri de contaminare, de exemplu pentru sticlărie, reactivi, praf etc.
            
               (b)
            
               Greutatea eșantionului care urmează să fie ars este calculată din cantitatea de elemente de detectare din furaje în raport cu sensibilitatea spectrofotometrului folosit. Pentru anumite tipuri de furaje, sărace în elemente de detectare, poate fi necesară pornirea de la un eșantion de 10-20 g și completarea soluției finale până la numai 100 ml.
            
               (c)
            
               Arderea trebuie efectuată într-un cuptor închis fără injectare de aer sau oxigen.
            
               (d)
            
               Temperatura indicată de pirometru nu trebuie să depășească 475 °C.
            5.1.2.   Determinarea spectrofotometrică5.1.2.1.   Prepararea soluțiilor de calibrarePentru fiecare dintre elementele care urmează să fie determinate se prepară din soluțiile standard de lucru date la punctele 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 și 3.10.1 un interval de soluții de calibrare, fiecare soluție de calibrare conținând o concentrație de HCl de aproximativ 0,5 N și (în cazul fierului, manganului și zincului) o concentrație de clorură de lantan echivalentă cu 0,1 % (p/v). Concentrațiile de elemente de detectare selectate trebuie să se situeze în intervalul sensibilității spectrofotometrului folosit. Tabelele prezentate în continuare indică, de exemplu, compozițiile intervalelor tipice ale soluțiilor de calibrare; în funcție, totuși, de tipul și sensibilitatea spectrofotometrului folosit poate fi necesar să se selecteze alte concentrații.Fier
               μg Fe/ml
            
               0
            
               0,5
            
               1
            
               2
            
               3
            
               4
            
               5
            
               ml soluție standard de lucru (3.7.1)
            
                
            
                
            
                
            
                
            
                
            
                
            
                
            
               (1 ml = 100 μg Fe)
            
               0
            
               0,5
            
               1
            
               2
            
               3
            
               4
            
               5
            
               + ml de HCl 6 N (3.2)
            
               7
            
               7
            
               7
            
               7
            
               7
            
               7
            
               7
            
               + 10 ml de soluție de clorură de lantan (3.11) și se completează până la 100 ml cu apă.
            
      Cupru
               μg Cu/ml
            
               0
            
               0,1
            
               0,2
            
               0,4
            
               0,6
            
               0,8
            
               0,1
            
               ml soluție standard de lucru (3.8.1)
            
                
            
                
            
                
            
                
            
                
            
                
            
                
            
               (1 ml = 100 μg Cu)
            
               0
            
               1
            
               2
            
               4
            
               6
            
               8
            
               10
            
               + ml HCl 6 N (3.2)
            
               8
            
               8
            
               8
            
               8
            
               8
            
               8
            
               8
            
               Se completează până la 100 ml cu apă.
            
      Mangan
               μg Mn/ml
            
               0
            
               0,1
            
               0,2
            
               0,4
            
               0,6
            
               0,8
            
               1,0
            
               ml soluție standard de lucru (3.9.1)
            
                
            
                
            
                
            
                
            
                
            
                
            
                
            
               (1 ml = 10 μg Mn)
            
               0
            
               1
            
               2
            
               4
            
               6
            
               8
            
               10
            
               + ml de HCl 6 N (3.2)
            
               7
            
               7
            
               7
            
               7
            
               7
            
               7
            
               7
            
               + 10 ml de soluție de clorură de lantan (3.11) și se completează până la 100 ml cu apă.
            
      Zinc
               μg Zn/ml
            
               0
            
               0,05
            
               0,1
            
               0,2
            
               0,4
            
               0,6
            
               0,8
            
               ml soluție standard de lucru (3.10.1)
            
                
            
                
            
                
            
                
            
                
            
                
            
                
            
               (1 ml = 10 μg Zn)
            
               0
            
               0,5
            
               1
            
               2
            
               4
            
               6
            
               8
            
               + ml de HCl 6 N (3.2)
            
               7
            
               7
            
               7
            
               7
            
               7
            
               7
            
               7
            
               + 10 ml de soluție de clorură de lantan (3.11) și se completează până la 100 ml apă.
            5.1.2.2.   Prepararea soluției pentru analizăPentru determinarea cuprului, soluția preparată la punctul 5.1.1 poate fi, în mod normal, folosită direct. Dacă este necesar să se obțină concentrația din intervalul soluțiilor de calibrare, o cotă-parte poate fi picurată într-un balon gradat de 100 ml și completată până la marcaj cu acid clorhidric 0,5 N (3.3).Pentru determinarea fierului, manganului și zincului se picură o cotă-parte din soluția preparată la punctul 5.1.1 într-un balon gradat de 100 ml, se adaugă 10 ml de soluție de clorură de lantan (3.11) și se completează până la marcaj cu acid clorhidric 0,5 N (3.3) (a se vedea și punctul 8 „Observații”).5.1.2.3.   Experiment martorExperimentul martor trebuie să includă toate etapele prevăzute în procedură, cu excepția faptului că materialul de eșantion este omis.Soluția de calibrare „0” nu trebuie să fie folosită ca martor.5.1.2.4.   Măsurarea absorbției atomiceSe măsoară absorbția atomică a soluțiilor de calibrare și a soluției care urmează să fie analizată folosind o flacără de oxidare a acetilenei în aer, la următoarele lungimi de undă:
                
            
               Fe: 248,3 nm
            
                
            
               Cu: 324,8 nm
            
                
            
               Mn: 279,5 nm
            
                
            
               Zn: 213,8 nm
            Fiecare măsurătoare se realizează de patru ori.5.2.   Furajele mineraleDacă eșantionul nu conține materie organică, arderea prealabilă nu este necesară. Se procedează conform descrierii de la punctul 5.1.1 (i), începând de la al doilea paragraf. Evaporarea cu acid fluorhidric poate fi omisă.6.   CALCULAREA REZULTATELORFolosind o curbă de calibrare, se calculează concentrația de elemente de detectare în soluția care urmează să fie analizată și se exprimă rezultatul în mg de elemente de detectare pe kg de eșantion (ppm).7.   REPETABILITATEDiferența dintre rezultatele celor două determinări paralele efectuate pe același eșantion de către același analist nu trebuie să depășească:
               —
            
               5 mg/kg, în valoare absolută, pentru conținutul de oligoelemente în cauză până la 50 mg/kg;
            
               —
            
               10 % din cel mai ridicat rezultat pentru un conținut de elemente de detectare în cauză de la 50 până la 100 mg/kg;
            
               —
            
               10 % mg/kg, în valoare absolută, pentru un conținut de elemente de detectare în cauză de la 100 până la 200 mg/kg;
            
               —
            
               5 % din cel mai ridicat rezultat pentru un conținut de elemente de detectare în cauză de peste 200 mg/kg.
            8.   OBSERVAȚIEPrezența cantităților mari de fosfați poate interfera cu determinarea fierului, manganului și zincului. O astfel de interferență trebuie să fie corectată prin adăugarea de soluție de clorură de lantan (3.11). Dacă, totuși, în eșantion raportul de greutate este> 2, adăugarea de soluție de clorură de lantan (3.11) în soluția de analiză și în soluțiile de calibrare poate fi omisă.
      (1)  1 mg de furaje cu bacitracin de zinc este echivalent cu 42 unități internaționale (u.i.).
      (2)  Se pot folosi alte metode dacă s-a stabilit că produc suspensii bacteriene similare.
      (3)  Se poate folosi orice mediu de cultură din comerț care are o compoziție similară și dă aceleași rezultate.
      (4)  Se pot folosi și alte metode dacă s-a stabilit că determină suspensii bacteriene similare.
      (5)  Se poate folosi orice mediu de cultură din comerț care are o compoziție asemănătoare și dă aceleași rezultate, de exemplu mediu antibiotic oxoid 1 (CM 327) cu adaos de agar oxoid nr. 3 (L 13).
      (6)  Se poate folosi orice mediu de cultură din comerț care are o compoziție asemănătoare și produce aceleași rezultate, de exemplu mediu antibiotic oxoid 2 (CM 335) cu adaos de agar oxoid nr. 3 (L 13).
      (7)  e.g. SE 2 din Chimia Wacker GmbH, München.
      (8)  Nutrețul verde (proaspăt sau uscat) poate conține cantități mari de silice vegetală, care pot reține elemente de detectare și trebuie să fie îndepărtate. Pentru eșantioanele din aceste furaje trebuie, prin urmare, să se respecte următoarea procedură modificată.Se realizează operația 5.1.1. (i) până la filtrare. Se spală de două ori cu apă hârtia de filtru ce conține reziduuri insolubile și se introduce într-un creuzet de platină (4.3). Se arde în cuptor închis (4.1) la o temperatura sub 550 °C până când tot materialul carbonat dispare complet. Se lasă să se răcească, se adaugă câteva picături de apă, apoi 10-15 ml de acid fluorhidric (3.4) și se evaporă până la uscare la aproximativ 150 °C. Dacă rămâne silice în reziduuri se dizolvă din nou în câțiva mililitri de acid fluorhidric (3.4) și se evaporă până la uscare. Se adaugă 5 picături de acid sulfuric (3.5) și se încălzește până când nu se mai elimină vapori albi. După adăugarea a 5 ml de acid clorhidric 6 N (3.2) și a aproximativ 30 ml de apă, se încălzește, se filtrează soluția într-un balon gradat de 250 ml și se completează până la marcaj cu apă (concentrație de HCl de aproximativ 0.5 N). Se continuă apoi determinarea de la punctul 5.1.3.