CELEX: 32016D1840
Language: sl
Date: 2016-10-14 00:00:00
Title: Izvedbeni sklep Komisije (EU) 2016/1840 z dne 14. oktobra 2016 o spremembi Priloge IV k Direktivi Sveta 2009/156/ES glede metod za diagnosticiranje konjske kuge (notificirano pod dokumentarno številko C(2016) 6509) (Besedilo velja za EGP)

18.10.2016   
            
            
               SL
            
            
               Uradni list Evropske unije
            
            
               L 280/33
            
         IZVEDBENI SKLEP KOMISIJE (EU) 2016/1840
   z dne 14. oktobra 2016
   o spremembi Priloge IV k Direktivi Sveta 2009/156/ES glede metod za diagnosticiranje konjske kuge
   
      
         (notificirano pod dokumentarno številko C(2016) 6509)
      
   
   (Besedilo velja za EGP)
   EVROPSKA KOMISIJA JE –
   ob upoštevanju Pogodbe o delovanju Evropske unije,
   ob upoštevanju Direktive Sveta 2009/156/ES z dne 30. novembra 2009 o pogojih v zvezi z zdravstvenim varstvom živali, ki ureja premike in uvoz kopitarjev iz tretjih držav (1) ter zlasti člena 20 Direktive,
   ob upoštevanju naslednjega:
   
               (1)
            
            
               Priloga IV k Direktivi 2009/156/ES določa diagnostične metode za konjsko kugo, ki jih je treba uporabljati, kadar je potrebno, za testiranje enoprstih kopitarjev pred njihovim premikom znotraj Unije ali pri uvozu iz tretjih držav.
            
         
               (2)
            
            
               Od sprejetja Direktive 2009/156/ES so se izboljšale laboratorijske zmogljivosti za izvajanje naprednih, izredno občutljivih in učinkovitih testov za diagnostiko konjske kuge. Poleg tega je bilo poglavje v zvezi z diagnostiko konjske kuge v Priročniku diagnostičnih testov in cepiv za kopenske živali Svetovne organizacije za zdravje živali (OIE) (2) spremenjeno tako, da odraža navedeni razvoj.
            
         
               (3)
            
            
               Referenčni laboratorij Evropske unije za konjsko kugo (3) je v okviru svojega delovnega programa za leto 2014 je pripravil poročilo o tehnični oceni diagnostičnih metod iz Priloge IV k Direktivi 2009/156/ES. V oceni, ki je bila maja 2015 predložena Komisiji, je bilo navedeno, da kompetitivni encimski imunski test (ELISA) ni več na voljo, da indirektna ELISA sicer ni več v splošni rabi, bi pa se lahko zagotovila v 4–6 mesecih po zahtevi, ter da je blok ELISA na voljo na trgu in se pogosto uporablja za analizo vzorcev med preverjanjem usposobljenosti, ki jih organizira referenčni laboratorij Evropske unije za konjsko kugo.
            
         
               (4)
            
            
               Poleg tega poročilo poudarja, da imajo metode prepoznavanja nukleinske kisline s polimerazno verižno reakcijo z reverzno transkriptazo (RT-PCR) prednost pred serološkimi diagnostičnimi metodami, saj omogočajo odkrivanje bolezni v zgodnji fazi okužbe. Poleg tega večina nacionalnih referenčnih laboratorijev v državah članicah Evropske unije uporablja metode RT-PCR v realnem času, vključno za diagnosticiranje konjske kuge, ki po letnih preverjanjih usposobljenosti, izvedenih med letoma 2009 in 2014, dokazano ustrezajo namenu. V poročilu je tudi navedeno, da zunaj Unije obstajajo številni referenčni laboratoriji OIE in drugi laboratoriji s posebnim strokovnim znanjem o konjski kugi, ki izvajajo vsaj eno od metod RT-PCR v realnem času za določanja genoma virusa konjske kuge.
            
         
               (5)
            
            
               Na skupni delavnici referenčnih laboratorijev Evropske unije za konjsko kugo/bolezen modrikastega jezika in nacionalnih referenčnih laboratorijev 24. in 25. novembra 2015 v Ascotu v Združenem kraljestvu so ti laboratoriji priporočili vključitev metod verižne reakcije s polimerazo z reverzno transkripcijo v realnem času (RRT-PCR) v Prilogo IV k Direktivi 2009/156/ES za določanje virusa konjske kuge.
            
         
               (6)
            
            
               Čeprav so vse razpoložljive metode RT-PCR v realnem času za določanje genoma virusa konjske kugo dovolj občutljive, laboratoriji najpogosteje uporabljajo postopek, ki so ga opisali Agüero in sod. (2008) (4). Metoda, ki so jo opisali Guthrie in sod. (2013) (5), je bila specifično zasnovana za zagotovitev, da se konji z območij tveganja za konjsko kugo lahko varno prevažajo po minimalni karantenski dobi, zahtevani v skladu z Zoosanitarnim kodeksom OIE za kopenske živali (6).
            
         
               (7)
            
            
               Zato je primerno v Prilogo IV k Direktivi 2009/156/ES vključiti metode za identifikacijo povzročitelja in za določanje protiteles kot dopolnilnih metod za hitro diagnosticiranje konjske kuge.
            
         
               (8)
            
            
               Prilogo IV k Direktivi 2009/156/ES bi bilo zato treba spremeniti s črtanjem kompetitivnega testa ELISA in posodobitvijo postopkov za indirektne in blok ELISA v skladu s poglavjem 2.5.1 Priročnika diagnostičnih testov in cepiv za kopenske živali OIE, izdaja 2016, ki temelji na različici, ki jo je maja 2012 (7) sprejela generalna skupščina delegatov OIE. Hkrati bi bilo treba v navedeno prilogo vključiti tudi postopka z RT-PCR v realnem času, kot so ju opisali Agüero in sod. (2008) ter Guthrie in sod. (2013), da se lahko navedeni testi za identifikacijo povzročitelja dajo na voljo za namene testiranja pred premikom.
            
         
               (9)
            
            
               Direktivo 2009/156/ES bi bilo zato treba ustrezno spremeniti.
            
         
               (10)
            
            
               Ukrepi iz tega sklepa so v skladu z mnenjem Stalnega odbora za rastline, živali, hrano in krmo –
            
         SPREJELA NASLEDNJI SKLEP:
   Člen 1
   Priloga IV k Direktivi 2009/156/ES se nadomesti z besedilom iz Priloge k temu sklepu.
   Člen 2
   Ta sklep je naslovljen na države članice.
   
      V Bruslju, 14. oktobra 2016
      
         
            Za Komisijo
         
         Vytenis ANDRIUKAITIS
         
            Član Komisije
         
      
   
   
      (1)  UL L 192, 23.7.2010, str. 1.
   
      (2)  http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.05.01_AHS.pdf
   
      (3)  Direktiva Sveta 92/35/EGS z dne 29. aprila 1992 o pravilih za obvladovanje in ukrepih za zatiranje konjske kuge (UL L 157, 10.6.1992, str. 19).
   
      (4)  Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. in Jimenez-Clavero A. (2008). Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus (Verižna reakcija s polimerazo s fluorogeno reverzno transkripcijo v realnem času za določanje virusa konjske kuge). J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325–328.
   
      (5)  Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus (Diagnostična natančnost dvojne kvantitativne verižne reakcije s polimerazo z reverzno transkripcijo v realnem času za določanje virusa konjske kuge). 2013;189(1):30–35.
   
      (6)  http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahc/current/chapitre_ahs.pdf
   
      (7)  Glej opombo 2.
   
      PRILOGA
      
         
            „PRILOGA IV
            
               KONJSKA KUGA
            
            
               DIAGNOSTIKA
            
            DEL A
            Serološki testi
            V nadaljevanju opisana serološka metoda so encimski imunski testi (testi ELISA) na podlagi točke 2 oddelka B poglavja 2.5.1 Priročnika diagnostičnih testov in cepiv za kopenske živali, izdaja 2016, ki jo je maja 2012 sprejela generalna skupščina delegatov OIE.
            Virusni protein VP7 je glavni imunodominantni antigen virusa konjske kuge (VKK) in je prisoten v vseh devetih serotipih VKK. Rekombinantni proteini VKK-VP7 so dokazano stabilni, neškodljivi in primerni za uporabo kot antigeni pri postopkih ELISA za določanje protiteles proti VKK z visoko stopnjo občutljivosti in specifičnosti (Laviada in sod., 1992b (1); Maree in Paweska, 2005). Indirektna ELISA in blok ELISA sta dva testa ELISA na VKK-VP7 za serološko diagnostiko konjske kuge.
            1.   Indirektna ELISA za določanje protiteles proti virusu konjske kuge (VKK)
            
            Konjugat, ki se uporablja pri tej metodi, je konjugat med hrenovo peroksidazo in anti-konjskimi gama globulini, ki reagira s serumom konj, mul in oslov. Metoda, ki jo opisujeta Maree & Paweska (2005) (2), uporablja protein G kot konjugat, ki reagira s serumom zeber.
            Antigen lahko zagotovi laboratorij Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA), Španija, v 4 do 6 mesecih po zahtevi.
            1.1   Postopek testa
            
            1.1.1   Trdna faza
            
                     
                        1.1.1.1
                     
                     
                        V ELISA plošče nanesemo rekombinantni VKK-4-VP7, razredčen v karbonatnem/bikarbonatnem pufru, pH 9,6. Plošče inkubiramo čez noč pri 4 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.1.2
                     
                     
                        Plošče petkrat speremo z destilirano vodo, ki vsebuje 0,01 % (volumski delež) Tween 20 (spiralna raztopina). S ploščo nežno potolčemo po vpojnem materialu, da odstranimo ostanke spiralne tekočine.
                     
                  
                     
                        1.1.1.3
                     
                     
                        Plošče blokiramo s fosfatnim pufrom (PBS) pH 7,2 + 5 % (utežni delež) posnetega mleka v prahu (Nestlé Dry Skim MilkTM), 200 μl/vdolbinico, za 1 uro pri 37 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.1.4
                     
                     
                        Odstranimo pufer za blokiranje in nežno potolčemo s ploščo po vpojnem materialu.
                     
                  1.1.2   Preiskovani vzorci
            
                     
                        1.1.2.1
                     
                     
                        Serumski vzorci, pozitivni in negativni kontrolni serum se redčijo 1: 25 v PBS + 5 % (utežni delež) posnetega mleka + 0,05 % (volumski delež) Tween 20, 100 μl na vdolbinico. Inkubiramo 1 uro pri 37 °C.
                        Za titracijo pripravimo serije dvakratnih razredčin od 1: 25 (100 μl/vdolbinico), en vzorec seruma na stolpec plošče, isto naredimo s pozitivnim in negativnim kontrolnim serumom. Inkubiramo 1 uro pri 37 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.2.2
                     
                     
                        Plošče petkrat speremo z destilirano vodo, ki vsebuje 0,01 % (volumski delež) Tween 20 (spiralna raztopina). S ploščo nežno potolčemo po vpojnem materialu, da odstranimo ostanke spiralne tekočine.
                     
                  1.1.3   Konjugat
            
                     
                        1.1.3.1
                     
                     
                        V vdolbinice dodamo po 100 μl anti-konjskih gama globulinov, označenih s hrenovo peroksidazo (HRP), razredčenih v PBS + 5 % mleka + 0,05 % Tween 20, pH 7,2. Inkubiramo 1 uro pri 37 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.3.2
                     
                     
                        Plošče petkrat speremo z destilirano vodo, ki vsebuje 0,01 % (volumski delež) Tween 20 (spiralna raztopina). S ploščo nežno potolčemo po vpojnem materialu, da odstranimo ostanke spiralne tekočine.
                     
                  1.1.4   Kromogen/substrat
            
                     
                        1.1.4.1
                     
                     
                        V vdolbinice dodamo po 200 μl raztopine kromogena/substrata (10 ml 80,6 mM DMAB (dimetil aminobezaldehid) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metil-2-benzo-tiazolin hidrazon hidroklorid) + 5 μl H2O2).
                        Razvijanje barve se ustavi z dodatkom 50 μl 3N H2SO4 po približno 5 do 10 minutah (preden se začne barvati negativna kontrola).
                        Lahko se uporabijo tudi drugi kromogeni, kot so ABTS (2,2′-azino-bis-[3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina]), TMB (tetra-metil benzidin) ali OPD (orto-fenildiamin).
                     
                  
                     
                        1.1.4.2
                     
                     
                        Plošče odčitamo pri 600 nm (ali 620 nm).
                     
                  1.2   Interpretacija rezultatov
            
            
                     
                        1.2.1
                     
                     
                        Izračunamo mejno vrednost, tako da vrednosti negativne kontrole dodamo 0,06 (0,06 je standardna deviacija, dobljena s skupino 30 negativnih serumov).
                     
                  
                     
                        1.2.2
                     
                     
                        Preiskovani vzorci, ki dajo vrednosti absorbance nižje od mejne vrednosti, se smatrajo kot negativni.
                     
                  
                     
                        1.2.3
                     
                     
                        Preiskovani vzorci, ki dajo vrednosti absorbance višje od mejne vrednosti + 0,15, se obravnavajo kot pozitivni.
                     
                  
                     
                        1.2.4
                     
                     
                        Preiskovani vzorci, ki dajo vmesne vrednosti absorbance, se štejejo za neopredeljive,zato je potrebno za potrditev rezultata uporabiti drugo metodo.
                     
                  2.   Blok ELISA za določanje protiteles proti virusu konjske kuge (VKK)
            
            Kompetitivni blok ELISA je namenjen določanju specifičnih protiteles proti VKK v serumu katere koli vrste enoprstih kopitarjev, tj. konjev, oslov, zeber in njihovih križancev, in preprečuje težave s specifičnostjo, ki se občasno pojavlja pri uporabi indirektne ELISA.
            Princip testa je blokiranje reakcije med rekombinantnim proteinom VP7, absorbiranim na ploščo ELISA, in z konjugiranim specifičnim monoklonskim protitelesom VKK-VP7 (Mpt). Protitelesa v preiskovanem serumu bodo preprečila reakcijo med antigenom in Mpt, kar bo povzročilo manjšo intenziteto obarvanja. Ker je Mpt prav tako usmerjeno proti VP7, je test visoko občutljiv in specifičen.
            Kompetitivni blok ELISA je na voljo na trgu.
            2.1   Postopek testa
            
            2.1.1   Trdna faza
            
                     
                        2.1.1.1
                     
                     
                        V ELISA plošče nanesemo 50–100 ng rekombinantnega VKK-4-VP7, razredčenega v karbonatnem/bikarbonatnem pufru, pH 9,6. Inkubiramo čez noč pri 4 °C.
                     
                  
                     
                        2.1.1.2
                     
                     
                        Plošče trikrat speremo s fosfatnim pufrom (PBS) 0,1×, ki vsebuje 0,135 M NaCl in 0,05 % (volumski delež) Tween 20 (PBST). S ploščo nežno potolčemo po vpojnem materialu, da odstranimo ostanke spiralne tekočine.
                     
                  2.1.2   Preiskovani vzorci in kontrole
            
                     
                        2.1.2.1
                     
                     
                        Preiskovani serumski vzorci ter pozitivni in negativni kontrolni serum se redčijo 1: 5 v razredčilu, ki vsebuje 0,35 M NaCl, 0,05 % (volumski delež), Tween 20 in 0,1 % Kathon, 100 μl na vdolbinico. Inkubiramo 1 uro pri 37 °C.
                        Za titracijo pripravimo serije dvakratnih razredčin preiskovanih serumov od 1: 10 do 1: 280 preko osmih vdolbinic (100 μl/vdolbinico), en vzorec seruma na stolpec plošče, isto naredimo s pozitivnim in negativnim kontrolnim serumom. Inkubiramo 1 uro pri 37 °C.
                     
                  
                     
                        2.1.2.2
                     
                     
                        Plošče petkrat speremo s fosfatnim pufrom (PBS) 0,1×, ki vsebuje 0,135 M NaCl in 0,05 % (volumski delež) Tween 20 (PBST). S ploščo nežno potolčemo po vpojnem materialu, da odstranimo ostanke spiralne tekočine.
                     
                  2.1.3   Konjugat
            
                     
                        2.1.3.1
                     
                     
                        V vdolbinice dodamo po 100 μl anti-VP7 Mpt, označenega s hrenovo peroksidazo. Pred tem je bilo to Mpt razredčeno na 1/5 000–1/15 000 v 1/1 raztopini stabilizatorja StabiliZyme Select® (SurModics. Referenca: SZ03) v destilirani vodi. Inkubiramo 30 minut pri 37 °C.
                     
                  
                     
                        2.1.3.2
                     
                     
                        Plošče petkrat speremo s fosfatnim pufrom (PBS) 0,1×, ki vsebuje 0,135 M NaCl in 0,05 % (volumski delež) Tween 20 (PBST). S ploščo nežno potolčemo po vpojnem materialu, da odstranimo ostanke spiralne tekočine.
                     
                  2.1.4   Kromogen/substrat
            V vdolbinice dodamo po 100 μl raztopine kromogena/substrata, tj. 1 ml ABTS (2,2′-azino-bis-[3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina]) in 5 mg/ml + 9 ml substratnega pufra (0,1 M fosfatno-citratni pufer s pH 4, ki vsebuje 0,03 % H2O2) ter inkubiramo 10 minut pri sobni temperaturi. Razvoj barve se ustavi z dodatkom 100 μl 2 % (utežni delež) SDS (natrijev dodecil sulfat) v vdolbinico.
            2.1.5   Odčitavanje
            V ELISA čitalcu odčitamo pri 405 nm.
            2.2   Interpretacija rezultatov
            
            
                     
                        2.2.1
                     
                     
                        Odstotek blokiranja (OB) v vsakem vzorcu določimo z uporabo naslednje enačbe, pri čemer „Pt“ pomeni protitelesa:
                        
                           
                     
                  
                     
                        2.2.2
                     
                     
                        Vzorce, ki kažejo vrednost OB več kot 50 %, je treba obravnavati kot pozitivne na protitelesa proti VKK.
                     
                  
                     
                        2.2.3
                     
                     
                        Vzorce, ki kažejo vrednost OB manj kot 45 %, je treba obravnavati kot negativne na protitelesa proti VKK.
                     
                  
                     
                        2.2.4
                     
                     
                        Vzorce, ki kažejo vrednost OB med 45 % in 50 %, je treba obravnavati kot neopredeljive in jih je treba ponovno testirati. Če je rezultat ponovno neopredeljiv, je treba živali ponovno testirati z vzorci, ki se ne odvzamejo prej kot dva tedna po odvzemu vzorca, ki je bil obravnavan kot neopredeljiv.
                     
                  DEL B
            Identifikacija povzročitelja
            Verižna reakcija s polimerazo z reverzno transkripcijo v realnem času (rRT-PCR)
            Testi za identifikacijo povzročitelja na osnovi metod z uporabo nukleinske kisline morajo zaznati referenčne seve iz devetih serotipov VKK.
            Metoda, opisana v točki 2.1, temelji na točki 1.2 oddelka B poglavja 2.5.1 Priročnika diagnostičnih testov in cepiv za kopenske živali, izdaja 2016, ki jo je maja 2012 sprejela generalna skupščina delegatov OIE.
            Katera koli metoda RT-PCR za določanje, uporabljena pri testiranju vzorcev krvi ali vranice v okviru Direktive 2009/156/ES, mora biti enako ali bolj občutljiva od metod iz točke 2.
            Referenčne seve inaktiviranih virusov serotipov 1 do 9 je mogoče pridobiti od referenčnega laboratorija Evropske unije ali referenčnega laboratorija OIE za konjsko kugo, Algete, Španija.
            1.   Ekstrakcija virusne RNK
            
            Za zagotovitev dobre reakcije je treba iz vzorca ekstrahirati RNK VKK visoke kakovosti. Ekstrakcija nukleinskih kislin iz kliničnih vzorcev se lahko izvaja z vrsto notranjih in komercialno dostopnih metod.
            Komercialni kompleti uporabljajo različne pristope za izolacijo RNK. Večina temelji na enem izmed naslednjih postopkov:
            
                        —
                     
                     
                        ekstrakcija nukleinskih kislin s fenol-kloroformom,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        adsorpcija nukleinskih kislin na filtrirni sistem,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        adsorpcija nukleinskih kislin na sistem z magnetnimi nizi.
                     
                  Primer notranje ekstrakcije RNK je naveden spodaj:
            
                        1.1
                     
                     
                        1 g vzorca tkiva homogeniziramo v 1 ml denaturirane raztopine (4 M gvanidinijev tiocianat, 25 mM natrijev citrat, 0,1 M 2-merkaptoetanol, 0,5 % sarkozil).
                     
                  
                        1.2
                     
                     
                        Po centrifugiranju supernatantu dodamo 1 μg RNK kvasovk, 0,1 ml 2 M natrijevega acetata s pH 4, 1 ml fenola in 0,2 ml alkoholne mešanice kloroforma/izoamila (49/1).
                     
                  
                        1.3
                     
                     
                        Suspenzijo temeljito pretresemo in pustimo 15 minut hladiti na ledu.
                     
                  
                        1.4
                     
                     
                        Po centrifugiranju RNK, prisotno v vodni fazi, ekstrahiramo s fenolom, precipitiramo z etanolom in ponovno suspendiramo v sterilni vodi.
                     
                  2.   Postopek RT-PCR v realnem času
            
            2.1   RT-PCR v realnem času, specifična za skupino, po Agüero in sod., 2008
                (3)
            
            Ta RT-PCR v realnem času, specifična za skupino, cilja VKK-VP7 in lahko določi vse znane serotipe VKK in seve, ki trenutno krožijo. Nacionalni referenčni laboratoriji držav članic Evropske unije, ki so sodelovali v letnih preskusih usposobljenosti, ki jih je v obdobju 2009–2015 organiziral referenčni laboratorij Evropske unije, so navedli, da je zagotovil zelo dobre rezultate. Poleg tega je bil ta protokol na podlagi krožnega testa, organiziranega leta 2015 v okviru mreže referenčnih laboratorijev OIE, v primerjavi z ostalimi uvrščen zelo visoko.
            Zaporedja začetnih oligonukleotidov in sonde za določanje virusov vrste VKK:
            
                        —
                     
                     
                        smiselni začetni oligonukleotid
                     
                     
                        5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        protismiselni začetni oligonukleotid
                     
                     
                        5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        sonda MGB-TaqMan
                     
                     
                        5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
                     
                  
                        2.1.1
                     
                     
                        Osnovno koncentracijo začetnega oligonukleotida razredčimo na delovno koncentracijo 8 μM („delovna raztopina začetnega oligonukleotida 8 μM“), sonda pa se razredči na delovno koncentracijo 50 μM („delovna raztopina sonde 50 μM“). Načrt testne plošče je treba zasnovati in naložiti v programsko opremo za PCR v realnem času. Z uporabo načrta kot vodila dodamo 2,5 μl vsake 8 μM delovne raztopine začetnega oligonukleotida v vsako vdolbinico, ki bo vsebovala vzorce RNK ter pozitivne in/ali negativne kontrole (končna koncentracija sonde bo 1 μM v 20 μl mešanice RT-PCR. Ploščo shranimo na ledu.
                     
                  
                        2.1.2
                     
                     
                        2 μl izolirane RNK (preiskovani vzorci in pozitivna kontrola) ali 2 μl RNaz proste vode iz kontrol z negativno reakcijo zmešamo s smiselnimi in protismiselnimi začetnimi oligonukleotidi. To mešanico denaturiramo s segrevanjem pri 95 °C za 5 minut, čemur sledi hitro hlajenje z ledom za najmanj 5 minut.
                     
                  
                        2.1.3
                     
                     
                        Ustrezno količino glavne mešanice za enostopenjsko RT-PCR v realnem času za število vzorcev, ki jih testiramo, pripravimo po navodilih proizvajalca. V vsako vdolbinico, ki vsebuje vzorce RNK, dodamo po 0,1μl delovne raztopine sonde 50 μM (končna koncentracija sonde bo 0,25 μM v vsaki vdolbinici, ki vsebuje vzorce RNK). 13 μl glavne mešanice za enostopenjsko RT-PCR v realnem času dodamo v vsako vdolbinico na PCR plošči, ki vsebuje denaturirane začetne oligonukleotide in RNK.
                     
                  
                        2.1.4
                     
                     
                        Ploščo postavimo v termopomnoževalnik v realnem času, programiran za reverzno transkripcijo in amplifikacijo/fluorescenčno detekcijo cDNK. Pogoji amplifikacije vključujejo prvi korak z reverzno transkripcijo pri 48 °C za 25 minut, čemur sledi 10 minut pri 95 °C („vroč zagon“) in 40 ciklov po 15 sekund pri 95 °C, 35 sekund pri 55 °C in 30 sekund pri 72 °C (ali 40 ciklov po 2 sekundi pri 97 °C in 30 sekund pri 55 °C, če se uporabijo reagenti in termopomnoževalnik, ki omogočajo hitre reakcije). Podatke o fluorescenci pridobimo ob koncu koraka pri 55 °C.
                     
                  
                        2.1.5
                     
                     
                        Test ni veljaven, če pridobimo atipične krivulje amplifikacije, in ga je treba ponoviti.
                        Vzorce štejemo za pozitivne, če je vrednost Ct (številka cikla, pri katerem fluorescenca, ki nastane pri reakciji, seka fluorescenčne prage) enaka ali nižja od določenega praga Ct (35) v 40 ciklih PCR (Ct ≤ 35).
                        Vzorce štejemo za neopredeljive, če je vrednost Ct višja od določenega praga Ct (35) v 40 ciklih PCR (CT > 35).
                        Vzorce štejemo za negativne, če pridobimo horizontalno krivuljo amplifikacije, ki ne seka linije praga v 40 ciklih PCR.
                     
                  2.2   RT-PCR v realnem času, specifična za skupino, po Guthrie in sod., 2013
                (4)
            
            RT-PCR v realnem času z uporabo sond za prenos energije fluroescenčne resonance je namenjena določanju nukleinske kisline VKK.
            Opisana RT-PCR za VKK je bila zasnovana z uporabo zaporedij iz različnih sevov VKK, ki trenutno krožijo na terenu (Quan in sod., 2010 (5)). Vključuje tudi lastniški sintetični test za zunanji nadzor za preverjanje pravilnega delovanja sestavnih elementov testa.
            Kompleti za enostopenjsko PCR v realnem času so na voljo na trgu. Spodaj so opisani nekateri osnovni koraki, kot so jih opisali Guthrie in sod. (2013), ki se lahko spreminjajo glede na posebne lokalne zahteve/zahteve za posamezni primer ter uporabljene komplete in opremo.
            Zaporedja začetnih oligonukleotidov in sonde za določanje virusov vrste VKK:
            
                        —
                     
                     
                        smiselni začetni oligonukleotid
                     
                     
                        5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        protismiselni začetni oligonukleotid
                     
                     
                        5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        sonda MGB-TaqMan
                     
                     
                        5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′
                     
                  
                        2.2.1
                     
                     
                        Osnovne raztopine začetnih oligonukeotidov in sonde se pripravijo v 25× koncentraciji pri 5 μΜ za smiselne in protismiselne začetne oligonukleotide ter pri 3 μΜ za sondo. Načrt testne plošče je treba zasnovati in naložiti v programsko opremo za PCR v realnem času. Z uporabo načrta kot vodila dodamo v ustrezne vdolbinice plošče po razporeditvi 5 μl vzorcev RNK, vključno s preiskovanimi vzorci ter pozitivnimi in negativnimi kontrolami.
                     
                  
                        2.2.2
                     
                     
                        RNK denaturiramo s segrevanjem pri 95 °C za 5 minut, čemur sledi hitro hlajenje z ledom za najmanj 3 minut.
                     
                  
                        2.2.3
                     
                     
                        Ustrezno količino glavne mešanice za enostopenjsko RT-PCR v realnem času za število vzorcev, ki jih testiramo, pripravimo po navodilih proizvajalca. 1 μl 25× osnovne raztopine začetnih oligonukleotidov in sonde (iz točke 2.2.1 zgoraj) vključimo v glavno mešanico, da dobimo končno koncentracijo v vsaki vdolbinici 200 nM za vsak začetni oligonukleotid in 120 nM za vsako sondo. 20 μl glavne mešanice dodamo v vsako vdolbinico na plošči PCR, ki vsebuje denaturirano RNK.
                     
                  
                        2.2.4
                     
                     
                        Ploščo postavimo v termopomnoževalnik v realnem času, programiran za reverzno transkripcijo in amplifikacijo/fluorescenčno detekcijo cDNK, kot to predlagajo proizvajalci. Pogoji amplifikacije vključujejo na primer prvi korak z reverzno transkripcijo pri 48 °C za 10 minut, čemur sledi 10 minut pri 95 °C in 40 ciklov po 15 sekund pri 95 °C ter 45 sekund pri 60 °C.
                     
                  
                        2.2.5
                     
                     
                        Vzorce štejemo za pozitivne, če normirana fluorescenca pri testu RT-PCR za VKK preseže prag 0,1 pred 36. ciklom PCR pri vseh ponovitvah vzorca.
                        Vzorce štejemo za neopredeljive, če normirana fluorescenca pri testu RT-PCR za VKK preseže prag 0,1 med 36. in 40. ciklom PCR pri kateri koli od ponovitev vzorca.
                        Vzorce štejemo za negativne, če normirana fluorescenca pri testu RT-PCR za VKK ne preseže praga 0,1 pred 40. ciklom PCR pri vseh ponovitvah vzorca in če normirana fluorescenca pri lastniškem sintetičnem testu za zunanji nadzor preseže prag 0,1 pred 33. ciklom PCR.“
                     
                  
      
      
         (1)  Laviada M.D., Roy P. in Sanchez-Vizcaino J.M (1992b). Adaptation and evaluation of an indirect ELISA and inmunoblotting test for African horse sickness antibody detection (Prilagajanje in ocena indirektne ELISA in testa imunoblot za določanje protiteles proti virusu konjske kuge.) V: Bluetongue, African Horse Sickness and Related Orbiviruses: Proceedings of the Second International Symposium. Walton T.E. & Osburn B.l., Eds. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 646–650.
      
         (2)  Maree S. in Paweska J.T. (2005). Preparation of recombinant African horse sickness virus VP7 antigen via a simple method and validation of a VP7-based indirect ELISA for the detection of group-specific IgG antibodies in horse sera (Priprava rekombinantnega antigena VKK-VP7 s preprosto metodo in potrjevanje indirektne ELISA na podlagi VP7 za določanje skupinsko specifičnih protiteles IgG v serumih konjev). J. Virol. Methods, 125 (1), 55–65.
      
         (3)  Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. in Jimenez-Clavero A. (2008). Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus (Verižna reakcija s polimerazo s fluorogeno reverzno transkripcijo v realnem času za določanje virusa konjske kuge). J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325–328.
      
         (4)  Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus (Diagnostična natančnost dvojne kvantitativne verižne reakcije s polimerazo z reverzno transkripcijo v realnem času za določanje virusa konjske kuge). Journal of Virological Methods. 2013;189(1):30–5
      
         (5)  Quan, M., Lourens, C.W., MacLachlan, N.J., Gardner, I.A., Guthrie, A.J., 2010. Development and optimisation of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay targeting the VP7 and NS2 genes of African horse sickness virus (Razvoj in optimizacija dvojne kvantitativne PCR z reverzno transkripcijo v realnem času, ki cilja gene VKK za VP7 in NS2). J. Virol. Methods 167, 45–52.