CELEX: 31991D0180
Language: sv
Date: 1991-02-14 00:00:00
Title: 91/180/EEG: Kommissionens beslut av den 14 februari 1991 om fastställande av vissa metoder för analys och provning av obehandlad och värmebehandlad mjölk

Avis juridique important

|

31991D0180

91/180/EEG: Kommissionens beslut av den 14 februari 1991 om fastställande av vissa metoder för analys och provning av obehandlad och värmebehandlad mjölk  

Europeiska gemenskapernas officiella tidning nr L 093 , 13/04/1991 s. 0001 - 0048 Finsk specialutgåva Område 3 Volym 37 s. 0012  Svensk specialutgåva Område 3 Volym 37 s. 0012 

KOMMISSIONENS BESLUT av den 14 februari 1991 om fastställande av vissa metoder för analys och provning av obehandlad och värmebehandlad mjölk (91/180/EEG)EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR FATTAT DETTA BESLUTmed beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekonomiska gemenskapen,med beaktande av rådets direktiv 85/397/EEG av den 5 augusti 1985 om frågor om livsmedelshygien och djurhälsa som påverkar handeln med värmebehandlad mjölk inom gemenskapen(1), senast ändrat genom direktiv 89/662/EEG(2), och särskilt artikel 10.2 i detta, ochmed beaktande av följande:Artikel 10.2 i direktiv 85/397/EEG föreskriver att kommissionen skall fastställa de metoder för analys och provning som skall användas för att övervaka att de standarder följs, som berör obehandlad mjölk och värmebehandlad mjölk.För obehandlad mjölk är det nödvändigt att fastställa metoder särskilt för plattspridning, cellräkning, bestämning av fryspunkt och förekomst av antibiotika.För pastöriserad mjölk är det nödvändigt att framför allt fastställa metoder för att bestämma frånvaro av patogener, antalet koliforma bakterier, plattspridning, frånvaro av fosfatas, förekomst av peroxidas, frånvaro av antibiotika samt fryspunkt.För steriliserad mjölk och mjölk behandlad med ultrahög temperatur (UHT-behandlad mjölk) är det nödvändigt att fastställa metoder framför allt för att bestämma plattspridningen och frånvaro av antibiotika.Av tekniska skäl är det lämpligt att som ett första steg fastställa standardmetoder för analys och provning för att säkerställa att vissa standarder följs. Det är framför allt nödvändigt att fortsätta att undersöka de förhållanden, under vilka rutiner, analysmetoder och provningsmetoder skall tillämpas. I avvaktan på resultaten från denna undersökning åligger det medlemsstaterna att använda lämpliga rutinmässiga metoder för att säkerställa att de standarder följs, som fastställs i direktiv 85/397/EEG.Bestämning av standardmetoder för analys och provning innefattar fastställande av de analysmetoder som skall användas och fastställande av exakta kriterier för att säkerställa en enhetlig tolkning av resultaten.De åtgärder som föreskrivs i detta beslut är förenliga med Ständiga veterinärkommitténs yttrande.HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.Artikel 1Följande standardmetoder skall användas för analys och provning av obehandlad mjölk:- Bestämning av fryspunkten.- Räkning av mikroorganismer - plattspridning vid 30 °C.- Räkning av somatiska celler.- Påvisande av antibiotika och sulfonamider.Artikel 2Följande standardmetoder skall användas för analys och provning av pastöriserad mjölk:- Bestämning av fryspunkten.- Bestämning av fosfatasaktiviteten.- Bestämning av peroxidasaktiviteten.- Räkning av mikroorganismer - plattspridning vid 30 °C.- Räkning av mikroorganismer - plattspridning vid 21 °C.- Räkning av koliforma bakterier - räkning av bakteriekolonier vid 30 °C.- Påvisning av antibiotika och sulfonamider.- Påvisning av patogena mikroorganismer.Artikel 3Följande standardmetoder skall användas för analys och provning av UHT-mjölk och steriliserad mjölk:- Räkning av mikroorganismer - plattspridning vid 30 °C.- Bestämning av fryspunkten.- Påvisning av antibiotika och sulfonamider.Artikel 4De standardmetoder för analys och provning samt de mätnoggrannhetskriterier som skall tillämpas och insamlingen av prover skall genomföras enligt föreskrifterna i bilaga 1.Artikel 5De standardmetoder för analys och provning som anges i artikel 1-3 är fastställda i bilaga 2.Artikel 6Detta beslut skall åter tas upp till behandling före den 31 december 1992 för att beakta den vetenskapliga och tekniska utvecklingen.Artikel 7Detta beslut riktar sig till medlemsstaterna.Utfärdat i Bryssel den 14 februari 1991.På kommissionens vägnarRay MAC SHARRYLedamot av kommissionen(1) EGT nr L 226, 24.8.1985, s. 13.(2) EGT nr L 395, 30.12.1989, s. 13.BILAGA 1INNEHÅLLSidI Allmänna bestämmelser ... 4II Provtagning av obehandlad och värmebehandlad mjölk ... 6I ALLMÄNNA BESTÄMMELSER1 InledningAllmänna bestämmelser för reagenser, utrustning, redovisning av resultat, mätnoggrannhet och provningsrapporter beskrivs. De behöriga myndigheterna i medlemsstaterna och de laboratorier som fått i uppdrag att genomföra provtagningen och provningen av mjölken skall följa de allmänna bestämmelserna.2 Reagenser2.1 Vatten2.1.1 Då vatten omnämns för lösnings-, utspädnings- eller sköljningsändamål skall destillerat vatten, avjoniserat vatten eller demineraliserat vatten med minst samma renhet användas om inte annat anges. För mikrobiologiska ändamål skall vattnet vara fritt från ämnen som skulle kunna påverka eller ha inflytande på tillväxten av mikroorganismer under provningsförhållanden.2.1.2 Om hänvisning görs till "lösning" eller "utspädning" utan ytterligare anvisningar avses "lösning i vatten" eller "utspädning med vatten".2.2 KemikalierAlla kemikalier som används skall vara av erkänd analysren kvalitet om inte annat anges.3 Utrustning3.1 Listor över utrustningDe utrustningslistor som lämnas för de olika standardmetoderna omfattar endast de artiklar som har en speciell användning eller artiklar med vissa specifikationer.3.2 AnalysvågMed analysvåg avses en våg som kan väga med en noggrannhet av 0,1 mg.4 Redovisning av resultat4.1 ResultatOm inte annat anges bör de resultat som anges i analysprotokollet vara det aritmetiska medelvärde som erhålls genom två prov som uppfyller det repeterbarhetskriterium (5.1) som anges för denna metod. Om repeterbarhetskriteriet inte uppfylls, skall provet upprepas eller resultatet förklaras ogiltigt.4.2 Beräkning av procenthaltOm inte annat anges skall resultatet beräknas som viktprocent av provet.5 Mätnoggrannhetskriterier: repeterbarhet och reproducerbarhet5.1 De mätnoggrannhetskriterier som anges i varje förfarande definieras på följande sätt:5.1.1 Repeterbarhet (r) är det värde, som ligger under den absoluta skillnaden mellan två enstaka provresultat, som erhållits med samma förfarande på identiskt provmaterial, under samma förhållanden (samma person som genomför provet, samma apparatur, samma laboratorium och med ett kort tidsintervall).5.1.2 Reproducerbarhet (R) är det värde, som ligger under den absoluta skillnaden mellan två enstaka provresultat, som erhållits med samma förfarande på identiskt provmaterial under olika förhållanden (olika personer som genomför provet, olika apparatur, olika laboratorier och/eller olika tidpunkt).5.1.3 Om inte annat angivits representerar de värden för repeterbarhets- och reproducerbarhetskriterierna i de aktuella bestämmelserna de intervall för en sannolikhetsnivå på 95 % som definierats av ISO 5725, andra upplagan 1986. De är beräknade ur resultaten av erkända försök, utförda i samarbete, som har använts för att utvärdera förfarandet. För en del av förfarandet har emellertid inte sådana gemensamma försök utförts. I detta fall har värdena för repeterbarhet och reproducerbarhet uppskattats.5.1.4 De gemensamma försök och studier som anges i 5.1.3 bör planeras och genomföras i enlighet med internationella riktlinjer.6 ProvningsrapportProvningsrapporten skall specificera den analysmetod som använts liksom de resultat som erhållits. Dessutom skall den ange alla detaljer om det använda förfarandet som inte är specificerade i analysmetoden eller som är tillägg, liksom alla andra omständigheter som kan ha påverkat de erhållna resultaten. Provningsrapporten skall ge alla upplysningar som behövs för fullständig identifiering av provet.II PROVTAGNING PÅ OBEHANDLAD OCH VÄRMEBEHANDLAD MJÖLK1 Omfattning och tillämpningsområdeDetta förfarande anger standardmetoden för provtagning av obehandlad och värmebehandlad mjölk. Förfarandena för provtagning och transport och lagring av prover är tillämpliga för obehandlad mjölk från producentens leveranser och för obehandlad och värmebehandlad mjölk i lager och transportbehållare.Förfarandena som anges i 2, 4.4, 5 och 6 är tillämpliga för provtagning på värmebehandlad mjölk avsedd för direkt konsumtion.2 AllmäntProvtagning på obehandlad och värmebehandlad mjölk i kannor, behållare osv. skall genomföras av erfaren personal som har fått lämplig utbildning före arbetet med att ta prov på mjölk.Om det anses lämpligt skall behöriga myndigheter eller provningslaboratorier undervisa provtagningspersonal i provtagningsteknik för att säkerställa att provet är representativt och överensstämmer med hela partiet.Om så anses lämpligt skall de behöriga myndigheterna eller provningslaboratoriet undervisa provtagningspersonalen om märkning av provet för att säkerställa att provets identitet är otvetydig.3 Provtagningsutrustning3.1 AllmäntProvtagningsutrustningen skall vara tillverkad av rostfritt stål eller annat lämpligt material med tillräcklig styrka och en konstruktion som är lämplig för det avsedda ändamålet (blandning, provtagning, osv.). Stavar och omrörare för blandning av vätskor i behållare skall ha tillräcklig yta för att åstadkomma en ordentlig blandning av produkten men utan att framkalla någon härsken smak. Skopor skall ha ett kraftigt handtag av tillräcklig längd för att möjliggöra provtagning på vilket djup som helst i behållaren. Skopans kapacitet skall inte vara mindre än 50 ml.Provkärl och förslutningar bör vara gjorda av glas, lämplig metall eller plast.De material som provtagningsutrustningen (inkl. kärl och förslutningsanordningar) är gjorda av, får inte orsaka någon förändring i provet som kan påverka undersökningarnas resultat. Alla ytor på provtagningsutrustning och provkärl skall vara rena och torra, släta och fria från sprickor och hörnen skall vara rundade.3.2 Provtagningsutrustning för mikrobiologisk undersökningProvtagningsutrustningen inkl. provkärl skall förutom de bestämmelser som anges i 3.1 vara sterila.Om samma provtagningsutrustning används för flera på varandra följande provtagningar, skall den rengöras och steriliseras efter varje provtagning i enlighet med instruktioner eller krav som är fastställda av provningslaboratoriet eller behörig myndighet och så att de successiva provens integritet bevaras.4 Provtagningsteknik4.1 AllmäntOberoende av de prov som skall utföras skall mjölken vara omsorgsfullt blandad före provtagningen, antingen genom manuell eller mekanisk blandning.Provet skall tas omedelbart efter blandningen medan mjölken fortfarande omrörs.När flera prover på mjölk i behållare tas samtidigt för olika prov, skall provet för mikrobiologisk undersökning tas först.Provets volym skall uppfylla provningskraven. Kapaciteten hos de provkärl som används skall vara sådan, att kärlen praktiskt taget fylls av provet och därmed medger korrekt blandning av innehållet före provningen samtidigt som kärning under transporten undviks.4.2 Manuell provtagning4.2.1 Provtagning från mjölkhinkar och kannorFör en omrörarstav upp och ner i hinken eller kannan för att erhålla en snabb omrörning och säkerställ att mjölken är väl blandad och att ingen grädde klibbar vid kannans hals. Ett prov som är representativt för hela partiet skall tas i enlighet med 4.2.4.4.2.2 Provtagning från kylda mjölktankar eller fat på bondgårdarRör om mjölken mekaniskt eller manuellt tills tillräcklig homogenisering erhålls.Om mjölkvolymen är sådan att den mekaniska omröraren inte kan blanda mjölken, genomförs manuell blandning.4.2.3 Provtagning från en vågskålDet är viktigt att mjölken när den hälls i en vågskål är tillfredsställande blandad. Det kan vara nödvändigt att använda ytterligare manuell eller mekanisk blandning för att säkerställa en jämn fördelning av fettet. När volymen hos det parti som skall tas prov på överstiger vågskålens kapacitet, skall ett prov som är representativt för hela partiet tas i enlighet med 4.2.4.4.2.4 Provtagning på ett uppdelat partiNär provtagning skall ske på ett parti mjölk som finns i mer än en behållare tas en representativ kvantitet från varje behållare och en anteckning görs om den kvantitet mjölk som varje prov härrör från. Om inte proven från varje behållare skall provas individuellt, blandas delar av dessa representativa prov i mängder, som är proportionella mot mängden i den behållare som varje prov tagits från. Efter blandning av de olika proven som är proportionella mot partierna tas prov(er) från den sammanslagna mängden.4.2.5 Provtagning från stora kärl - förrådsbehållare, tankar för järnvägstransport och tankar för landsvägstransport4.2.5.1 Blanda mjölken genom ett lämpligt förfarande före provtagningen.För att blanda innehållet i stora kärl eller förrådsbehållare, och i tankar för järnvägs- eller landsvägstransport rekommenderas användning av mekanisk omrörning (4.2.5.2).Omfattningen av blandningen skall motsvara den tidsperiod, under vilken mjölken varit i vila. Effektiviteten hos blandningsförfarandet som tillämpas under givna omständigheter skall visas vara tillräcklig för den aktuella analysens ändamål. Kriteriet på blandningens effektivitet påverkar särskilt likheten mellan analysresultat från prover tagna antingen från olika delar av partiet eller från behållarens utloppsventil i intervall under tömningen. Ett förfarande för blandning av mjölk skall anses effektivt om skillnaden i fettinnehåll mellan två prover som är tagna under dessa omständigheter är mindre än 0,1 %.I ett stort kärl med utloppsventil i bottnen kan det vid utloppet finnas en liten kvantitet mjölk, som inte ens efter blandning är representativ för hela innehållet. Därför bör prover företrädesvis tas genom en manlucka. Om provet tas från utloppsventilen måste tillräckligt mycket mjölk först rinna ut för att säkerställa att proverna är representativa för hela mängden.4.2.5.2 Blandningen av innehållen i stora kärl eller i förrådsbehållare, tankar för järnvägstransport och för vägtransport kan genomföras på följande sätt:- Genom en mekanisk omrörare som är inbyggd i tankarna och drivs av en elektrisk motor.- Genom en propeller eller omrörare som drivs av en elektrisk motor och placeras i ett manhål med omröraren nedsänkt i mjölken.- När det gäller tankar för järnvägs- eller vägtransport genom rundpumpning av mjölken via överföringsslangen som är fäst vid tankens tömningspumpar och vars andra ände sticks ner i manluckan.- Genom ren, filtrerad, komprimerad luft. I det här fallet skall minsta möjliga lufttryck och luftvolym användas för att förhindra att härsken lukt uppstår.4.3 Automatisk eller halvautomatisk provtagningAutomatiska eller halvautomatiska provtagningsanordningar för provtagning av obehandlad mjölk från producenters leveranser kan användas i enlighet med anvisningar som ges av provningslaboratorium eller annan behörig myndighet.Sådan utrustning skall innan den används och med jämna mellanrum när den används genomgå lämpliga provningar som föreskrivs av den ansvariga myndigheten. Lämpligheten hos provtagningsförfarandena måste verifieras för att fastställa- minsta volym mjölk som kan ge en korrekt provtagning,- halten av den överförda mängden (som står i förhållande till provets minimivolym),- möjligheten att ta ett representativt prov på ett parti efter riktig omrörning.När automatiska eller halvautomatiska provtagningsutrustningar används kan den ansvariga, behöriga, nationella myndigheten föreskriva- den minimivolym av mjölk som proven skall tas från,- provets minimivolym,- den maximalt tillåtna överförda mängden,- vilka analyser som kan genomföras eller vilka försiktighetsåtgärder som skall vidtas.4.4 Provtagning av värmebehandlad mjölk för direkt konsumtion i detaljhandelsförpackningarProver på värmebehandlad mjölk för direkt konsumtion i detaljhandelsförpackningar skall utgöras av oöppnade förpackningar. Om möjligt skall proverna tas från förpackningsmaskinen eller kylrummet i mejeriet så snart som möjligt efter behandlingen. För pastöriserad mjölk skall detta ske samma dag som behandlingen genomförs.Proverna tas från varje typ av värmebehandlad mjölk (pastöriserad, UHT-behandlad och steriliserad) i ett antal som motsvarar de undersökningar som skall göras och i enlighet med anvisningar som fastställts av provningslaboratoriet eller annan behörig myndighet.5 Märkning av provetProvet skall märkas med en identifieringskod så att det är lätt att identifiera med användning av de anvisningar som givits av provningslaboratoriet eller behörig myndighet och på så sätt säkerställa provets identitet (se 2).6 Transport och förvaring av proverAnvisningar beträffande transportförhållanden, förvaring och tid mellan provtagning och analys av mjölk skall utfärdas av provningslaboratoriet, beroende på vilken typ av mjölk och vilka analysmetoder som skall användas. Anvisningarna skall fastställas i enlighet med den behöriga nationella myndighetens föreskrifter.I anvisningarna skall följande punkter innefattas:- Under transport och förvaring skall försiktighetsåtgärder vidtas för att förhindra att mjölken utsätts för förorenande lukter och för direkt solljus. Om det kärl som används för proverna är genomskinligt skall det förvaras i mörker.- Prover på obehandlad mjölk tagna för mikrobiologisk analys skall transporteras och förvaras mellan 0 °C och 4 °C. Tiden mellan provtagning och analys skall vara så kort som möjligt och får under inga omständigheter överstiga 36 timmar. Den behöriga myndigheten kan tillåta en förvaringstemperatur mellan 0 °C och 6 °C om tiden mellan provtagningen och analysen understiger 24 timmar.- Prover på pastöriserad mjölk tagna för mikrobiologisk analys skall transporteras och förvaras mellan 0 °C och 4 °C. Tiden mellan provtagning och analys skall vara så kort som möjligt och får under inga omständigheter överstiga 24 timmar.- Mjölkprover från annat än obehandlad mjölk och pastöriserad mjölk för mikrobiologiska analyser skall förvaras i laboratoriet under kyla och tiden mellan provtagning och analys skall vara så kort som möjligt.Speciella försiktighetsåtgärder för en del analyser anges under de olika metodbeskrivningarna.BILAGA 2INNEHÅLLSidI Bestämning av fryspunkt ... 10II Bestämning av fosfatasaktivitet ... 16III Bestämning av peroxidasaktivitet ... 19IV Räkning av mikroorganismer - plattspridning vid 30 °C ... 20V Räkning av mikroorganismer - plattspridning vid 21 °C ... 25VI Räkning av koliforma bakterier - koloniräkning vid 30 °C ... 29VII Räkning av somatiska celler ... 33VIII Påvisning av antibiotika och sulfonamider ... 39IX Påvisning av patogena mikroorganismer ... 48I BESTÄMNING AV FRYSPUNKT1 Omfattning och tillämpningsområdeDetta förfarande anger standardmetoden för bestämning av fryspunkten hos obehandlad, pastöriserad, UHT-behandlad och steriliserad helmjölk, delvis skummad mjölk och skummjölk med användning av en apparat (termistor-kryoskop), i vilken det termostatstyrda badet kyls genom elektrisk kylning och en termistorsond ersätter kvicksilvertermometern.Det finns två typer av instrument. Den första typen är ett instrument som söker den maximala fryspunkten vid en platå i nedkylningskurvan, medan den andra typen av kommersiella skäl är inställd för att efter en given tid avläsa början av frysningen. Eftersom fryspunktskurvor kan variera från en mjölk till en annan och mellan mjölk och de standardlösningar som används för kalibrering, kräver denna standardmetod användning av platåregistrerande instrument. Instrument med tidsinställning får användas för rutinanalyser.Fryspunkten kan användas för att uppskatta proportionen främmande vatten i mjölk, under förutsättning att surhetsgraden hos provet inte överstiger 0,18 g mjölksyra per 100 ml (se 7.4).2 DefinitionFryspunkten för mjölk: Det värde som erhålls när mätningen sker enligt det förfarande som beskrivs och som uttrycks i grader Celsius (°C).3 PrincipEn provmängd mjölk underkyls till lämplig temperatur beroende på instrumentet, och kristallisationen induceras genom mekanisk skakning som leder till att temperaturen snabbt stiger till en platå som motsvarar provets fryspunkt.Instrumentet kalibreras genom att det ställs in för att ge korrekt avläsning för två standardlösningar med användning av samma metod som för mjölkprover. Under dessa förhållanden ger platån fryspunkten hos mjölk i grader Celsius.4 Apparater och glasVanlig laboratorieutrustning och särskilt:4.1 KryoskopKryoskopet består av ett termostatstyrt kylbad, termistorsond (en motståndstermometer med halvledare) med tillhörande krets och en galvanometer eller ett avläsningsinstrument, omrörare och en anordning för initiering av frysningen samt provrör.4.1.1 KylbadTvå typer av kylbad kan användas.4.1.1.1 ImmersionstypEtt välisolerat bad som innehåller en lämplig kylvätska som omrörs så att temperaturskillnaden mellan två godtyckliga punkter i vätskan inte överstiger 0,2 °C. Temperaturen hos vätskan får inte variera mer än ± 0,5 °C från det nominella värde som anges av tillverkaren.Det är viktigt att vätskan i kylbadet hålls vid en konstant nivå. Hela ytan hos provröret under volymmärkningen skall täckas av kylvätska.4.1.1.2 CirkulationstypEn kontinuerlig ström av lämplig kylvätska pumpas runt provröret. Temperaturen i vätskan får inte variera mer än ± 0,5 °C från det nominella värde som anges av tillverkaren.En lämplig kylvätska är en 33-procentig (v/v) vattenlösning av etan-1,2-diol (etylenglykol).4.1.2 Termistor och tillhörande kretsTermistorn skall vara utförd som en glassond med en diameter som inte är större än 1,80 ± 0,2 mm och med en tråddiameter inte större än 0,31 mm. Tidskonstanten för termistorn skall vara mindre än 2 sekunder och värdet â (se anmärkning) skall vara högt. Arbetsspänningen, strömmen och förlustkonstanten bör vara sådana att termistortemperaturen inte höjs med mera än 0,0005 °C över sin omgivning vid - 0,512 °C. Den högsta tillåtna toleransen för resistansen skall vara ± 5 %.När sonden befinner sig i arbetsläge i kryoskopet skall glaskulans spets befinna sig axiellt i samma läge som provröret och vid en punkt 44,6 ± 0,1 mm under rörets övre kant (se fig sid 15). En mall skall finnas för att användaren skall kunna placera sonden i detta läge.Anmärkningâ definierar karaktäristiken resistans/temperatur hos termistorn enligt formeln:- >NUM>dR>DEN>dT × >NUM>1>DEN>R = >NUM>â>DEN>T²där:T är temperaturen i Kelvin,R är resistansen i ohm vid temperaturen T,- >NUM>dR>DEN>dT × >NUM>1>DEN>R är temperaturkoefficienten.â är en konstant som är beroende av det material som använts vid tillverkningen av termistorn. I praktiken rekommenderas ett värde större än 3 000.4.1.3 Mätning av avläsningsanordning4.1.3.1 MätprincipDe instrument som används skall arbeta enligt principen att söka den första platån på fryspunktskurvan. Platån är den del av kurvan, där temperaturen håller sig konstant inom ± 0,002 °C under minst 20 sekunder.4.1.3.2 Manuellt genomförandeTermistorns resistans skall balanseras med hjälp av en Wheatstonebrygga eller liknande anordning med användning av högkvalitativa, stabila resistorer, vars tolerans inte är större än ± 10 % och vars temperaturkoefficient inte överstiger 2 × 10-5 °C.Den variabla (balanserande) resistorn skall vara linjär över hela sitt område och får inte variera mer än 0,3 % av sitt maximivärde.Det skall finnas möjligheter att justera resistorerna för kalibreringsändamål.Mätinstrumentet skall vara graderat i steg som inte är större än 0,001 °C.4.1.3.3 Automatiskt genomförandeAvläsningsanordningen skall ha en upplösning på minst 0,001 °C inom området 0 till -1 °C.Stabiliteten hos avläsningsanordningen och den tillhörande kretsen skall vara sådan, att efter varandra följande indikeringar av samma temperatur inte varierar med mera än 0,001 °C.Kretsens linearitet skall vara sådan, att inget fel större än ± 0,001 °C införs vid något tillfälle inom området - 0,400 °C till - 0,600 °C när instrumentet hanteras korrekt.4.1.4 OmrörningstrådEn metalltråd som inte påverkas av mjölk och med en diameter mellan 1 och 1,5 mm används för att röra om provet.Omrörningstråden bör justeras med avseende på amplitud och skall monteras vertikalt med sin lägre ände i höjd med spetsen på termistorsonden. En tolerans av ca 1,5 mm ovanför eller under detta läge är tillåten.Omrörningstråden skall vibrera lateralt med tillräcklig amplitud som fastställs av tillverkaren (inte mindre än ± 1,5 mm) för att säkerställa att temperaturen i provet förblir likformig under bestämningen. Under det normala omrörningsförloppet får omrörartråden inte beröra termistorsonden eller rörets väggar vid något tillfälle.4.1.5 Anordning för initiering av frysningDetta kan vara vilken anordning som helst som när den är i användning omedelbart initierar frysning av provet, så att temperaturen hos provet stiger mot fryspunkten. Omrörartråden får användas för detta ändamål. Ett förfarande är att öka svängningsamplituden under en eller två sekunder så att omrörartråden slår emot provrörets vägg.4.1.6 ProvrörProvrören (se fig. 1) skall vara gjorda av glas och vara 50,8 ± 0,1 mm långa, 16,0 ± 0,1 mm i ytterdiameter och 13,5 ± 0,1 mm i innerdiameter. Väggtjockleken i hela röret skall inte variera med mera än 0,1 mm.Rören skall ha ett volymmärke 29,8 mm under den övre kanten (21 mm ovanför rörets botten) för att markera en provvolym på 2,5 ± 0,1 ml.4.1.7 Elektrisk matningMatningsspänningen skall vara stabiliserad antingen i apparaten eller externt, så att variationen inte överskrider ± 1 % av det nominella värdet när nätspänningen varierar med ± 6 %.4.2 Analysvåg4.3 Mätkolvar med ett märke, rymd 1 000 ml, klass A.4.4 Torkskåp, väl ventilerat, med möjlighet att hålla en konstant temperatur av 130 ± 1 °Cellerelektrisk ugn, väl ventilerad, med möjlighet att hålla en konstant temperatur på 300 ± 25 °C.4.5 Exsickator5 Reagenser5.1 Vatten destillerat i borosilikatglas, kokt och kylt till 20 ± 2 °C i kolv försedd med absorptionsrör för koldioxid.5.2 Natriumklorid, analysren kvalitet, finmald, torkad under fem timmar vid 300 ± 25 °C i elektrisk ugn eller alternativt torkad i ett torkskåp vid 130 ± 1 °C under minst 24 timmar och kyld till rumstemperatur i en effektiv exsickator.5.3 Beredning av standardlösningarVäg in en lämplig mängd (se tabell 1) torr natriumklorid (5.2) i ett vägglas. Lös den uppvägda mängden i destillerat vatten (5.1), överför lösningen kvantitativt till en 1 000 ml mätkolv med ett märke och späd till märket med vatten vid 20 ± 2 °C.Lagra vid ca 5 °C i väl förslutna polyetenflaskor med en rymd inte större än 250 ml och inte under längre tid än två månader.>Plats för tabell>Innan en standardlösning används, vänds och roteras flaskan flera gånger för att innehållet skall blandas omsorgsfullt. Standardlösningen får inte vid något tillfälle skakas våldsamt så att luft tas upp av lösningen.Prover av en standardlösning skall tas från flaskan genom att lösningen hälls i en ren torr bägare, dvs. pipetter bör aldrig användas för detta ändamål.Lösningar från flaskor som är mindre än en fjärdedel får inte användas, och om lösningarna inte konserverats med en fungicid (t.ex. tiomersallösning 10 g/l) bör de inte användas om de är äldre än två månader.6 Kalibrering av termistorkryoskopetKryoskopet måste placeras så att temperaturen i den omgivande luften inte varierar mer än 1 °C från den temperatur, vid vilken kalibreringen utförs. Kryoskopet får inte utsättas för solljus eller drag och rumstemperaturer över 26-27 °C.Se till att kryoskopet är väl funktionsdugligt i enlighet med tillverkarens anvisningar och har varit inkopplat under minst 12 timmar före kalibreringen. Kontrollera sondens läge, amplituden hos omrörartråden och temperaturen hos kylvätskorna.Välj två standardlösningar (se tabell 1 ovan) som nära inringar det förväntade värdet för fryspunkten hos de mjölkprover som skall provas. Skillnaden i fryspunkter mellan de två lösningarna skall helst inte vara mindre än - 0,100 °C.(I en del konstruktioner hos för närvarande tillgängliga kryoskop är den krets som är förbunden med termistorn konstruerad för att vara balanserad vid ett specifikt värde för fryspunkten inom instrumentets mätområde. I sådana fall underlättas kalibreringsförfarandet vid användning av en standardlösning, som har denna fryspunkt som en av kalibreringslösningarna, och tillverkaren skall ange detta värde.)Pipettera ner 2,5 ± 0,1 ml av en standardlösning i ett rent torrt provrör och starta kryoskopet.AnmärkningDe provrör som används under kalibreringen bör vara tillverkade av samma glastyp samt diskade och sköljda med demineraliserat vatten samtidigt med dem som skall användas för undersökning av mjölkproverna. Temperaturerna hos standardlösningarna bör vara desamma som mjölkprovernas temperatur.Justera de kalibreringsinställningar som anges av tillverkaren tills kryoskopavläsningen motsvarar fryspunkten hos standardlösningen. Upprepa förfarandet med den andra standardlösningen och fortsätt omväxlande på detta sätt tills på varandra följande avläsningar för varje lösning ger korrekt värde för fryspunkten av vardera lösningen utan att ytterligare justering av kalibreringsanordningarna behövs. Kryoskopet är sedan klart för användning och kommer att direkt indikera fryspunkten hos mjölkprovet utan att någon korrektion behöver göras.7 Provberedning7.1 Förvara proverna om så behövs vid en temperatur mellan 0 och 5 °C.7.2 Tag bort alla synliga främmande föremål eller fast smörfett från provet, om så behövs genom att filtrera det ner i ett rent torrt kärl och blanda provet försiktigt. Om ett filter används skall detta vara inert mot mjölk och vara effektivt när det används vid laboratorietemperatur.7.3 Mjölken kan provas när den befinner sig vid lagringstemperatur (mellan 0 och 5 °C) eller kan få uppnå laboratorietemperatur omedelbart innan proven påbörjas. Det är emellertid nödvändigt att standardlösningarna och mjölkproverna har samma temperatur när de används.7.4 Bestäm den titrerbara surhetsgraden hos mjölken så noggrant som möjligt samtidigt med fryspunktsprovet. Prover med en surhetsgrad överstigande 0,18 g mjölksyra per 100 ml mjölk kan inte undersökas.7.5 UHT-behandlad och steriliserad mjölk skall stå minst 20 minuter i ett öppet kärl före undersökningen.8 Förfarande8.1 Förberedande kontrollerKontrollera att nivån och temperaturen hos kylvätskan överensstämmer med tillverkarens anvisningar och om så är lämpligt att termistorsonden befinner sig i ett tomt provrör i provkällan. Koppla in kryoskopet och säkerställ att kylvätskan rörs om ordentligt eller pumpas runt beroende på vilken typ som används. När kryoskopet har varit inkopplat i minst 12 timmar kontrolleras temperaturen i kylvätskan och läget och vibrationsamplituden hos omrörartråden.8.2 Rutinkontroll av kalibreringFöre varje provning mäts fryspunkten hos en standardlösning av natriumklorid (t.ex. en lösning med fryspunkten - 0,512 °C) tills två på varandra följande bestämningar inte skiljer sig åt med mer än 0,001 °C. Om medelvärdet av dessa värden skiljer sig från fryspunkten hos standardlösningen med mera än 0,002 °C, skall kryoskopet omkalibreras som beskrivs i punkt 6.Om kryoskopet är i kontinuerlig drift genomförs rutinkontroll av kalibreringen minst en gång i timmen. Tillverkarens anvisningar skall beaktas.8.3 Bestämning av fryspunkten hos mjölkVänd och rotera flaskan med mjölkprov försiktigt flera gånger för att blanda innehållet. Provet får inte omskakas så våldsamt att luft tas upp av provet.Pipettera av 2,5 ± 0,1 ml av mjölken i ett rent, torrt provrör och tag bort eventuellt överskott med en pipett. Se till att sonden och omrörartråden är rena och torra och torka om så behövs av dem omsorgsfullt med en mjuk, ren luddfri duk nedifrån och uppåt.Sätt in provröret i det kalibrerade kryoskopet enligt tillverkarens anvisningar. Mjölken kommer att kylas och frysning initieras vid en temperatur som angivits av tillverkaren inom 0,1 °C.(På en del automatiska instrument anges denna temperatur på en digital display, på manuella instrument åstadkoms den nödvändiga exaktheten genom att det säkerställs att frysningen börjar när galvanometerns visare eller hårkors överensstämmer med det rätta märket.)Om frysningen av någon anledning initieras före eller efter det angivna temperaturområdet avbryts provet och upprepas med ett annat prov av mjölken. Om det nya provet också fryser före den angivna temperaturen, skall ytterligare en del av provet värmas upp till 45 °C och hållas vid denna temperatur i fem minuter för att kristallinskt fett skall smälta.Kyl sedan ner provet igen till provtemperatur och genomför provet omedelbart. Temperaturen hos mjölken kommer efter initiering av frysningen att snabbt stiga till ett värde som kommer att förbli praktiskt taget konstant under någon tid innan det faller igen. Fryspunkten motsvarar den högsta temperatur som uppnås under denna period, och detta värde skall registreras.AnmärkningDen tid under vilken temperaturen förblir konstant och tidsintervallet mellan initieringen av frysningen och uppnåendet av den högsta temperaturen kommer att vara olika från prov till prov och kommer att vara påtagligt kortare för vatten och standardlösningar av natriumklorid än för mjölk. Det är viktigt att det är den högsta temperaturen som registreras.När mätningen har genomförts på ett tillfredsställande sätt, tas provröret bort. Skölj med vatten och torka sedan termistorsonden med en mjuk, ren, luddfri duk nedifrån och uppåt och genomför ytterligare en bestämning med en annan del av mjölkprovet.Om skillnaden mellan de fryspunkter som erhålls är större än repetitionsvärdet (0,004 °C), genomförs ytterligare en bestämning på en annan del av provet. Under förutsättning att de två bestämningarna överensstämmer inom 0,004 °C skall värdena registreras och användas för att beräkna slutresultatet.8.4 Kylning av sondenEfter användning av instrumentet placeras ett tomt provrör i provkällan och huvudet sänks ned för att hålla sonden kall. (Med vissa typer av kryoskop är detta omöjligt och i sådana fall är det viktigt att säkerställa att sonden är tillräckligt kyld innan några mätningar genomförs, t.ex. genom att göra flera blindprov tills överensstämmande resultat erhålls.)9 Redovisning av resultat9.1 BeräkningOm, sedan rutinkontrollen av kalibreringen genomförts, kalibreringen är bekräftad, beräknas medelvärdet av de godkända fryspunktsvärden, som erhållits och avrundats till tre decimaler.Om summan av två godkända dubbelvärden är ett udda tal skall medelvärdet rundas av till närmaste jämna värde som visas i följande exempel:>Plats för tabell>9.2 Mätnoggrannhet9.2.1 Repeterbarhet (r): 0,004 °C.9.2.2 Reproducerbarhet (R): 0,006 °C.>Hänvisning till >II BESTÄMNING AV FOSFATASAKTIVITETEN1 Omfattning och tillämpningsområdeDetta förfarande anger standardmetoden för bestämning av fosfatasaktiviteten i pastöriserad mjölk.2 Definition2.1 Fosfatasaktiviteten är ett mått på den mängd aktiva alkaliska fosfataser som finns närvarande i produkten, uttryckt som kvantitet fenol i mikrogram som under de förhållanden som anges i förfarandet frigjorts av 1 ml av den pastöriserade mjölken.2.2 All mjölk vars fosfatasaktivitet är under 4 ìg/ml anses vara fosfatasnegativ.3 PrincipFosfatasaktiviteten utvärderas från mängden fenol som frigörs ur det dinatriumfenylfosfat som tillsätts till provet. Den frigjorda fenolen reagerar med dibromkinonklorimid och bildar dibromindofenol (blåaktig till färgen), som mäts kolorimetriskt vid 610 nm. En jämförelse görs med ett prov där fosfatasenzymet har blivit förstört.4 Reagenser4.1 Bariumborathydroxidbuffert4.1.1 Lös 50,0 g bariumhydroxid [Ba(OH)2 × 8H2O] i vatten och späd till 1 000 ml.4.1.2 Lös 22,0 g borsyra (H3BO3) i vatten och späd till 1 000 ml.4.1.3 Värm 500 ml av vardera lösningen till 50 °C, blanda lösningarna, rör om, kyl snabbt till ca 20 °C och justera pH om så behövs till 10,6 ± 0,1 genom tillsats av lösning 4.1.1 eller 4.1.2. Filtrera. Förvara lösningen i ett väl förslutet kärl.4.1.4 Späd lösningen före användning med lika stor volym vatten.4.2 FärgframkallningsbuffertLös 6,0 g natriummetaborat (NaBO2) eller 12,6 g (NaBO2 × 4H2O) och 20,0 g natriumklorid (NaCl) i vatten och späd till 1 000 ml.4.3 FärgutspädningsbuffertSpäd 10 ml av färgframkallningsbufferten (4.2) till 100 ml med vatten.4.4 BuffertsubstratLös 0,1 g fenolfritt dinatriumfenylfosfatdehydrat i 100 ml buffert (4.1.3) eller lös 0,5 g dinatriumfenylfosfat i 4,5 ml av färgframkallningsbufferten (4.2), tillsätt två droppar BQC-lösning (4.6) och låt stå i rumstemperatur i 30 minuter. Extrahera den bildade färgen med 2,5 ml butan-1-ol och låt stå tills butan-1-olen har separerat. Tag bort butan-1-olen och kasta bort den. Upprepa extraktionen om så behövs.Lösningen kan förvaras i kylskåp under ett par dagar. Framkalla färgen och upprepa extraktionen före användning. Bered buffertsubstratet omedelbart före användning genom att späda ut 1 ml av denna lösning till 100 ml med bariumborathydroxidbufferten (4.1.3).4.5 Zink-koppar-fällningsmedelLös 3,0 g zinksulfat (ZnSO4, 7H2O) och 0,6 g koppar(II)sulfat (CuSO4, 5H2O) i vatten och späd till 100 ml.4.6 2,6-dibromkinonklorimid-lösning (BQC-lösning)Lös 40 ± 1 mg 2,6-dibromkinonklorimid (BQC) (C6H2Br2ClNO6) i 10 ml 96-procentig etanol (volymprocent).Förvara lösningen i mörk flaska i kylskåp. Kasta lösningen om den är missfärgad eller mer än en månad gammal.4.7 Koppar(II)sulfat-lösningLös 0,05 g koppar(II)sulfat (CuSO4, 5H2O) i vatten och späd till 100 ml.4.8 Fenolstandardlösningar4.8.1 Väg in 200 ± 2 mg ren vattenfri fenol och överför den invägda mängden till en 100 ml mätkolv. Tillsätt vatten, blanda och späd till märket. Denna stamlösning är stabil under flera månader om den förvaras i kylskåp.4.8.2 Späd 10 ml av stamlösningen till 100 ml med vatten och blanda. En ml innehåller 200 ìg fenol.5 Apparater och glasAnmärkningara) Alla glas, proppar och provtagningsredskap måste vara omsorgsfullt rengjorda. Att skölja dem med nykokt destillerat vatten eller att rengöra dem med ångbad rekommenderas.b) Vissa typer av plastproppar kan orsaka fenolkontamination och får därför inte användas.Vanlig laboratorieutrustning och särskilt följande:5.1 Analysvåg5.2 Vattenbad som skall kunna hålla temperaturen 37 ± 1°C.5.3 Spektrofotometer lämplig för avläsning vid en våglängd av 610 nm.5.4 Provrör, 16 eller 18 mm × 150 mm, helst graderade vid 5 och 10 ml.5.5 Pipetter5.6 Glastrattar av lämplig storlek, t.ex. 5 cm diameter.5.7 Vikta filter, minst 9 cm i diameter för medelsnabb filtrering.5.8 Mätkolvar för beredning av standardlösningar.6 FörfarandeAnmärkningara) Undvik inverkan av direkt solljus under bestämningen.b) Förorening med spår av saliv eller svett kan ge falska positiva resultat och måste undvikas. I detta hänseende skall speciell uppmärksamhet ägnas åt pipetteringsförfarandet.6.1 Provberedning6.1.1 Genomför analysen direkt efter provtagningen. Förvara i annat fall provet i kylskåp, men inte under längre tid än två dagar.6.2 ProvmängdPipettera 1 ml av provet i vardera av två provrör (5.4) varvid det ena provröret används som kontroll eller blindprov.6.3 Bestämning6.3.1 Värm blindprovet i två minuter i kokande vatten. Täck provröret och bägaren med kokande vatten med aluminiumfolie för att säkerställa att hela provröret blir upphettat. Kyl snabbt till rumstemperatur.6.3.2 Behandla blindprovet och provet på samma sätt under resten av förfarandet. Tillsätt 10 ml av buffertsubstratet (4.4) och blanda.6.3.3 Placera omedelbart proven i vattenbad (5.2) i 60 minuter och rör om innehållet med jämna mellanrum (minst fyra gånger).6.3.4 Värm i kokande vatten under två minuter på samma sätt som under 6.3.1. Kyl snabbt till rumstemperatur.6.3.5 Tillsätt 1 ml av zink-koppar-fällningsmedlet (4.5) till varje provrör och blanda omsorgsfullt.6.3.6 Filtrera genom torrt filtrerpapper. Kasta de första två ml, filtrera igen om så behövs tills filtratet är helt klart och samla upp 5 ml i ett provrör.6.3.7 Tillsätt 5 ml av färgframkallningsbufferten (4.2).6.3.8 Tillsätt 0,1 ml av BQC-lösningen (4.6), blanda och låt färgen utvecklas i 30 minuter vid rumstemperatur.6.3.9 Mät absorptionen mot kontrollprovet eller blindprovet i spektrofotometern (5.3) vid våglängden 610 nm.6.3.10 Upprepa bestämningen med en lämplig spädning av provet om den absorption som mätts enligt 6.3.9 överskrider absorptionen för standarden, som innehåller 20 ìg fenol per rör enligt mätningen under 6.4.4. Bered denna spädning genom att blanda en volym av provet med en lämplig volym av en del av samma prov, som försiktigt uppvärmts till kokning för att inaktivera fosfatasen.6.4 Iordningsställande av kalibreringskurva6.4.1 Gör i ordning en lämplig serie med utspädda standardlösningar med utgångspunkt från standardfenollösning (4.8.2). Dessa lösningar skall innehåll 0 (blindlösning), 2, 5, 10 och 20 ìg fenol per ml. Pipettera av 1 ml vatten och 1 ml respektive av de fyra fenolstandardlösningarna i de fem provrören.6.4.2 Tillsätt till varje provrör 1 ml koppar(II)sulfatlösning (4.7), 5 ml av färgutspädningsbufferten (4.3), 3 ml vatten och 0,1 ml av BQC-lösningen (4.6) och blanda.6.4.3 Låt färgen utvecklas i 30 minuter vid rumstemperatur.6.4.4 Mät absorptionen mot blindprovet i en spektrometer vid våglängden 610 nm (5.3).6.4.5 Från de absorptionsvärden (6.4.4) som erhållits för varje kvantitet av fenol som tillsatts (6.4.1) beräknas regressionslinjen genom minsta kvadratmetoden.7 Redovisning av resultat7.1 Beräkning och formler7.1.1 Beräkna ur absorptionsavläsningen (6.3.9) kvantiteten fenol med användning av den erhållna regressionslinjen (6.4.5).7.1.2 Beräkna fosfatasaktiviteten uttryckt som ìg fenol per ml i den pastöriserade mjölken enligt följande formel:Fosfatasaktiviteten = 2,4 × A × Ddär>Plats för tabell>Faktorn 2,4 är utspädningsfaktorn (>NUM>5/>DEN>12 av 1 ml prov) - se 6.2. i samband med 6.3.2, 6.3.5 och 6.3.6.7.2 Mätnoggrannhet7.2.1 Repeterbarhet (r): 2 ìg fenol/ml.7.2.2 Reproducerbarhet (R): 3 (preliminärt) ìg fenol/ml.7.2.3 Om en utspädning används enligt 6.3.10 är gränsen som anges i 7.2.1 och 7.2.2 hänförd till de resultat som erhållits med det utspädda provet.III BESTÄMNING AV PEROXIDASAKTIVITETEN1 Omfattning och tillämpningsområdeDet här förfarandet anger standardmetoden för bestämning av förekomsten av eller frånvaron av peroxidasenzym i mjölk som en kontroll av pastöriseringen.2 DefinitionPeroxidaspositiv reaktion:Om mjölken är korrekt pastöriserad kommer en blå färg att uppträda inom 30 sekunder efter blandning.Peroxidasnegativ reaktion:Ingen färg kommer att uppträda inom 30 sekunder efter blandning.3 PrincipPeroxidasenzymet sönderdelar väteperoxid. Det atomära syre som frigörs oxiderar det färglösa 1,4-fenylendiaminet till den violetta indofenolen (Storchs prov). Färgintensiteten är proportionell mot enzymets koncentration.4 Reagenser4.1 Lösning av 1,4-fenylendiaminLös 2 g 1,4-fenylendiamin (C6H8N2) i varmt (50 °C) vatten och späd till 100 ml. Förvara lösningen i en mörkbrun flaska med glaspropp och placera den på en kall och mörk plats. Efter beredning bildar en lösning av 1,4-fenylendiamin en fällning inom en eller två dagar. Den måste då kastas bort.4.2 Lösning av väteperoxidSpäd 9 ml 30-procentig väteperoxid med vatten till 100 ml. För att stabilisera lösningen tillsätts 1 ml koncentrerad svavelsyra per liter lösning.Väteperoxidlösningen är stabil i en månad om den förvaras på ett kallt, mörkt ställe och i en flaska med glaspropp som förhindrar kontakt med organiska ämnen.5 Förfarande5.1 Överför 5 ml av mjölkprovet till ett rent provrör med lämplig förslutning.5.2 Tillsätt 5 ml av 1,4-fenylendiaminlösningen (4.1).5.3 Tillsätt 2 droppar väteperoxidlösning (4.2).5.4 Betrakta den färg som uppkommer inom 30 sekunder efter blandningen. Om den blå färgen uppträder senare än 30 sekunder efter tillsatsen av reagensen, är reaktionen inte entydig.IV RÄKNING AV MIKROORGANISMER - PLATTSPRIDNING VID 30 °C1 Omfattning och tillämpningsområdeDetta förfarande anger standardmetoden för räkning av mikroorganismer genom räkning av kolonier vid 30 °C. Förfarandet används för obehandlad mjölk och pastöriserad mjölk samt för UHT-behandlad och steriliserad mjölk med förinkubation vid 30 °C i 15 dagar.2 DefinitionBeteckningen mikroorganismer har här följande betydelse: Organismer som bildar kolonier som kan räknas när de inkuberas aerobt under de beskrivna förhållandena.3 PrincipEn definierad volym av mjölkprovet blandas med substratet i petriskålar och inkuberas vid 30 °C i 72 timmar. Kolonierna räknas och antalet mikroorganismer per 1 ml obehandlad eller pastöriserad mjölk eller per 0,1 ml förinkuberad UHT-behandlad eller steriliserad mjölk beräknas.4 Apparater och glasVanlig laboratorieutrustning och särskilt följande:4.1 Apparater4.1.1 Varmluftsugn som kan hålla en temperatur av 170-175 °C.4.1.2 Autoklav som arbetar vid en temperatur av 121 ± 1 °C.4.1.3 Inkubationsskåp som kan hålla en temperatur av 30 ± 1 °C på alla ställen i skåpet.4.1.4 pH-meter med temperaturkompensation, med en mätnoggrannhet på ± 0,1 pH-enhet.4.1.5 Vattenbad som kan hålla en temperatur av 45 ± 1 °C.4.1.6 Lupp med en förstoring av 2-4 gånger.4.1.7 Lupp med en förstoring av 8-10 gånger.4.1.8 Trådräknare4.1.9 Blandare som kan blanda 1 ml av mjölkprovet eller decimal utspädning med 9 ml utspädningsmedel och arbeta enligt principen om excentrisk rotation av innehållet i provrör.4.2 Glas4.2.1 Provrör med lämpliga förslutningar och tillräcklig rymd för att kunna innehålla 10 ml av den ursprungliga spädningen eller ytterligare decimala spädningar med tillräckligt utrymme för blandning.4.2.2 Kolvar med en rymd av 150 till 250 ml eller provrör med cirka 20 ml volym för förvaring av substrat.4.2.3 Pipetter (med bomullspropp) av glas eller sterilt syntetmaterial med hel spets med en nominell volym av 1 ml och med en diameter på utloppet av 1,75-3 mm.4.2.4 Petriskålar av klart, ofärgat glas eller sterilt syntetmaterial, där den nedre skålen skall ha en inre diameter av cirka 90-100 mm. Det inre djupet skall vara minst 10 mm. Bottnen får inte ha några oregelbundenheter, som kan påverka räkningen av kolonier.4.2.5 Sterilisering av glasGlas skall steriliseras med en av följande metoder:a) genom att hållas vid 170 till 175 °C under minst en timme i en varmluftsugn (4.1.1),b) genom att hållas vid 121 ± 1 °C i minst 20 minuter i en autoklav (4.1.2).I autoklaven skall tillses att tillräcklig genomträngning av ånga erhålls - t.ex. om utrustningen steriliseras i behållare får dessa t.ex. inte vara alltför väl stängda och kolvar och flaskor bör ha lösa lock.Glas som steriliserats i autoklav skall torkas genom att ångan ventileras bort.Pipetter skall steriliseras i varmluftsugn (4.1.1).5 Substrat - agar för plattspridning5.1 Sammansättning:>Plats för tabell>Skummjölkspulvret skall vara fritt från inhibitorämnen. Detta skall säkerställas genom jämförande prover med användning av skummjölkpulver som är känt för att vara fritt från inhibitorämnen.BeredningSlamma upp och lös komponenterna i följande ordning: Jästextrakt, trypton, glykos och slutligen skummjölkspulver i vatten. Förloppet påskyndas om uppslamningen upphettas. Tillsätt agar och upphetta till kokning och rör kontinuerligt tills agarn är helt löst eller ångkoka i 30 minuter.Filtrera om så behövs genom filtrerpapper.Kontrollera pH med en pH-meter (4.1.4) och justera om så behövs pH så att det efter sterilisering ligger mellan 6,9 ± 0,1 vid 25 °C genom att använda en lösning (minst 0,1 mol per liter) av natriumhydroxid eller saltsyra.5.2 Fördelning, sterilisering och lagring av substratFördela substratet (5.1) i mängder om 100 till 150 ml i kolvar eller 12 till 15 ml i provrör (4.2.2). Förslut kolvarna och rören.Sterilisera i autoklav (4.1.2) vid 121 ± 1 °C under 15 minuter.Kontrollera pH i substratet.Om substratet inte skall användas omedelbart, skall det förvaras på mörk plats vid en temperatur mellan 1 och 5 °C under högst 1 månad efter tillredningen.5.3 Torrsubstrat som handelsvaraSubstratet (5.1) kan framställas av i handeln förekommande torrsubstrat. Följ tillverkarens anvisningar men tillsätt skummjölkspulvret före upplösningen, om inte detta ingår som en komponent.Justera pH till 6,9 ± 0,1 vid 25 °C som beskrivs i 5.1 och fördela, sterilisera och lagra substratet som beskrivs i 5.2.6 Utspädningsmedel6.1 Pepton/saltlösningSammansättning>Plats för tabell>BeredningLös komponenterna i vatten och värm om så behövs.Kontrollera pH med en pH-meter (4.1.4). Om så behövs justera pH så att det efter steriliseringen ligger på 7,0 ± 0,1 vid 25 °C genom att använda en lösning (minst 0,1 mol per liter) av natriumhydroxid eller saltsyra.6.2 Fördelning, sterilisering och lagring av utspädningsmedelFördela utspädningsmedlet (6.1) i provrör (4.2.1) i sådana mängder att varje provrör efter sterilisering innehåller 9,0 ± 0,2 ml utspädningsmedel. Förslut provrören.Sterilisera i autoklav (4.1.2) vid 121 ± 1°C i 15 minuter.Kontrollera pH i utspädningsmedlet.Om utspädningsmedlet inte skall användas omedelbart, skall det förvaras på en mörk plats vid en temperatur mellan 1 och 5 °C under högst en månad efter tillredningen.6.3 Torra utspädningsmedel i handelnUtspädningsmedlet (6.1) kan framställas av tabletter eller pulver som finns i handeln. Följ tillverkarens anvisningar. Justera pH som beskrivs i 6.1 och fördela, sterilisera och lagra utspädningsmedlen som beskrivits i 6.2.7 Förfarande7.1 Smältning av substratInnan den mikrobiologiska undersökningen börjar, skall tillräcklig mängd av substratet snabbt smältas och substratet hållas vid en temperatur på 45 ± 1°C i vattenbad (4.1.5).7.2 Beredning av mjölkprovetBlanda mjölkprovet omsorgsfullt så att mikroorganismerna fördelas så jämnt som möjligt genom att snabbt vända kärlet med mjölkprovet 25 gånger. Skumning bör undvikas eller också måste skummet få tillfälle att försvinna. Tiden mellan blandning och uttagning av provmängden bör inte överstiga 3 minuter.7.3 Beredning av primär utspädning (10-1) (obehandlad och pastöriserad mjölk)Överför med hjälp av en steril pipett (4.2.3) 1 ml av provet (7.2) på obehandlad mjölk eller pastöriserad mjölk till 9 ml av utspädningsmedlet (6.1) och undvik kontakt mellan pipetten och utspädningsmedlet. Temperaturen hos utspädningsmedlet skall vara ungefär densamma som mjölkprovets temperatur. Blanda denna primära utspädning omsorgsfullt i blandaren (4.1.9) under 5-10 sekunder.En primär utspädning på 10-1 erhålls på så sätt.7.4 Beredning av ytterligare decimala utspädningar (obehandlad och pastöriserad mjölk)Överför med hjälp av en steril pipett (4.2.3) 1 ml av den primära utspädningen (7.3) till 9 ml av utspädningsmedlet (6.1) enligt anvisningarna i 7.3.På så sätt erhålls en utspädning på 10-2.Upprepa dessa förfaranden för att erhålla ytterligare decimala utspädningar tills lämpligt antal av mikroorganismer kan förväntas (8.1.1).7.5 Inokulering i petriskålar7.5.1 Obehandlad mjölk: Överför med en steril pipett (4.2.3) 1 ml av provet och/eller den lämpliga decimala spädningen till en skål (4.2.4). Minst två spädningar måste undersökas. Gör i ordning en skål för varje vald utspädning som är lämplig (8.1.1).7.5.2 Pastöriserad mjölk: Överför med en steril pipett (4.2.3) 1 ml av provet och/eller en lämplig decimal utspädning till en skål (4.2.4). Minst två utspädningar måste undersökas. Iordningställ två skålar för varje spädning som valts som lämplig (8.1.1).7.5.3 UHT-behandlad och steriliserad mjölk (undersökt efter förinkubation under 15 dagar vid 30 °C - direktivets bilaga A, avsnitt 7, punkt 5).Överför med en steril pipett (4.2.3) 0,1 ml av mjölkprovet (7.2) till en skål (4.2.4). Iordningställ två skålar.7.6 HällningHäll 15 till 18 ml av substratet (7.1) i varje inokulerad skål.Blanda omedelbart genom att rotera petriskålen tillräckligt för att få jämnt fördelade kolonier efter inkubation.Tiden mellan slutet av beredningen av mjölkprovet och blandningen skall, beroende på slaget av mjölk, provdel eller utspädning med substrat, inte överstiga 15 minuter.Låt blandningen i skålen stelna på en ren, sval, horisontell yta.7.7 Inkubation i petriskålarPlacera skålarna i inkubationsskåpet (4.1.3). Låt skålarna stå upp och nedvända. Trava inte mer än sex skålar på höjden. Travarna med skålar skall vara skilda från varandra och från väggarna och taket i skåpet.Inkubation vid 30 ± 1°C under 72 ± 2 timmar.7.8 Räkning av kolonierRäkna kolonierna i de petriskålar som inte innehåller mera än 300 kolonier.Undersök skålarna i dämpad belysning. För att underlätta räkningen kan en lämplig lupp (4.1.6) och/eller en trådräknare 4.1.8 användas. Undvik att av misstag räkna partiklar från fällningar i skålarna som kolonier. Undersök omsorgsfullt tvivelaktiga föremål med hjälp av en lupp med högre förstoring (4.1.7) om så behövs för att skilja kolonier från främmande föremål.Utbredda kolonier betraktas som enstaka kolonier. Om mindre än ¼ av skålen är övervuxen med utbredda kolonier, räknas kolonierna i den andra delen av skålen och motsvarande antal beräknas för hela skålen. Om mera än ¼ av skålen är övervuxen av utbredda kolonier förkastas provet.8 Beräkning och presentation av resultat8.1 Obehandlad och pastöriserad mjölk8.1.1 Använd räkningen från alla skålar som innehåller mellan 10 och 300 kolonier (se 8.1.3 och 8.1.4).8.1.2 Antalet mikroorganismer per 1 ml obehandlad eller pastöriserad mjölk erhålls genom följande formel:>NUM>Ó C>DEN>(n1 + 0,1n2)ddär>Plats för tabell>Räkningen ger två signifikanta tal. När siffran som skall rundas av är en femma, avrundas så, att siffran omedelbart till vänster blir jämn.Exempel (pastöriserad mjölk):Utspädning 10-2: 278 och 290 kolonierUtspädning 10-3: 33 och 28 kolonierAntal per ml = >NUM>278 + 290 + 33 + 28>DEN>(2 × 0,1 × 2) 10- 2= >NUM>629>DEN>0,022= 28 590= 29 000= 2,9 × 104.8.1.3 Om det endast finns räkningar som är mindre än 10 rapporteras mikroorganismer per ml som "mindre än 10 × d per ml", där "d" är motsvarigheten till den lägsta utspädningsfaktorn.8.1.4 Om det endast finns räkningar som överstiger 300 kolonier men räkningen ändå kan genomföras beräknas en uppskattad räkning och multipliceras med motsvarigheten till denna utspädningsfaktor. Resultatet rapporteras som "uppskattat antal mikroorganismer per ml".8.2 UHT-behandlad och steriliserad mjölkPlattspridning vid mer än 10 kolonier vid 0,1 ml skall anses inte längre uppfylla de krav som ställs i direktiv 85/397/EEG.9 MätnoggrannhetResultaten från internationellt accepterade samarbetsförsök finns ännu inte tillgängliga.V RÄKNING AV MIKROORGANISMER - PLATTSPRIDNING VID 21 °C1 Omfattning och tillämpningsområdeDetta förfarande anger standardmetoden för räkning av mikroorganismer genom räkning av kolonier vid 21 °C i pastöriserad mjölk efter inkubation av mjölken vid 6 °C under 5 dagar för att bestämma föroreningen hos den pastöriserade mjölken med avseende på psykotropiska mikroorganismer som kan föröka sig i mjölk vid 6 °C.2 DefinitionBeteckningen mikroorganismer innebär här följande: Organismer som bildar kolonier som kan räknas när de inkuberas aerobt under de beskrivna förhållandena.3 PrincipDen pastöriserade mjölken inkuberas vid 6 °C i fem dygn. En definierad volym av mjölkprovet blandas med substratet i petriskålar och inkuberas vid 21°C i 25 timmar. Kolonierna räknas och antalet mikroorganismer per 1 ml av den pastöriserade mjölken beräknas.4 Apparater och glasVanlig laboratorieutrustning och särskilt följande:4.1 Apparater4.1.1 Varmluftsugn som kan hålla en temperatur av 170-175 °C.4.1.2 Autoklav som arbetar vid en temperatur av 121 ± 1°C.4.1.3 Inkubationsskåp som kan hålla följande temperaturer:a) 6 ± 0,2 °Cb) 21 ± 1 °Cpå alla ställen i skåpen.4.1.4 pH-meter med temperaturkompensation, med en noggrannhet på ± 0,1 pH-enhet.4.1.5 Vattenbad som kan hålla en temperatur av 45 ± 1°C.4.1.6 Lupp med en förstoring av 2-4 gånger.4.1.7 Lupp med en förstoring av 8-10 gånger.4.1.8 Trådräknare4.1.9 Blandare som kan blanda 1 ml av mjölkprovet eller en decimal utspädning av detta med 9 ml utspädningsmedel och arbeta enligt principen om excentrisk rotation av innehållet i provrör.4.2 Glas4.2.1 Provrör med lämpliga förslutningar och tillräcklig rymd för att kunna innehålla 10 ml av den ursprungliga spädningen eller av ytterligare decimala spädningar samt tillräckligt utrymme för blandning av innehållet.4.2.2 Kolvar med en rymd av 150 till 250 ml eller provrör med cirka 20 ml volym för förvaring av substrat.4.2.3 Pipetter (med bomullspropp) av glas eller sterilt syntetmaterial med hel spets med en nominell volym av 1 ml och med en diameter på utloppet av 1,75-3 mm.4.2.4 Petriskålar av klart, ofärgat glas eller sterilt syntetmaterial, där den nedre skålen skall ha en inre diameter av cirka 90-100 mm. Det inre djupet skall vara minst 10 mm. Bottnen får inte ha några oregelbundenheter, som kan påverka räkningen av kolonier.4.2.5 Sterilisering av glasGlas skall steriliseras med en av följande metoder:a) genom att hållas vid 170 till 175 °C under minst en timma i en varmluftsugn (4.1.1),b) genom att hållas vid 121 ± 1°C i minst 20 minuter i en autoklav (4.1.2).I autoklaven skall tillses att tillräcklig genomträngning av ånga erhålls - om utrustningen t.ex. steriliseras i behållare får dessa inte vara alltför väl stängda och kolvar och flaskor bör ha lösa lock.Glas som steriliserats i autoklav bör torkas genom att ångan ventileras bort.Pipetter skall steriliseras i varmluftsugn (4.1.1).5 Substrat - agar för plattspridning5.1 Sammansättning>Plats för tabell>Skummjölkspulvret skall vara fritt från inhibitorämnen. Detta bör kontrolleras genom jämförande prover med användning av mjölkpulver som är känt för att vara fritt från inhibitorämnen.BeredningSlamma upp och lös komponenterna i följande ordning: Jästextrakt, trypton, glykos och slutligen skummjölkspulver i vatten. Upphettning av uppslamningen påskyndar förloppet. Tillsätt agar och upphetta till kokning under ständig omrörning tills agarn är helt löst eller ångkoka i 30 minuter.Filtrera om så behövs genom filtrerpapper.Kontrollera pH med en pH-meter (4.1.4) och justera om så behövs pH så att det efter sterilisering ligger mellan 6,9 ± 0,1 vid 25 °C med hjälp av en lösning (minst 0,1 mol per liter) av natriumhydroxid eller saltsyra.5.2 Fördelning, sterilisering och lagring av substratFördela substratet (5.1) i mängder om 100 till 150 ml i kolvar eller 12 till 15 ml i provrör (4.2.2). Förslut kolvarna och rören.Sterilisera i autoklav (4.1.2) vid 121 ± 1°C under 15 minuter.Kontrollera pH i substratet.Om substratet inte skall användas omedelbart, skall det förvaras på mörk plats vid en temperatur mellan 1 och 5 °C under högst 1 månad efter beredningen.5.3 Torrsubstrat som handelsvaraSubstratet (5.1) kan framställas från i handeln förekommande torrsubstrat. Följ tillverkarens anvisningar men tillsätt skummjölkspulvret före upplösningen om inte detta ingår som en komponent.Justera pH till 6,9 ± 0,1 vid 25 °C som beskrivs i 5.1 och fördela, sterilisera och lagra substratet som beskrivs i 5.2.6 Utspädningsmedel6.1 Pepton/saltlösningSammansättning>Plats för tabell>BeredningLös komponenterna i vatten och värm om så behövs.Kontrollera pH med en pH-meter (4.1.4). Om så behövs justera pH så att det efter steriliseringen ligger på 7,0 ± 0,1 vid 25 °C med hjälp av en lösning (minst 0,1 mol per liter) av natriumhydroxid eller saltsyra.6.2 Fördelning, sterilisering och lagring av utspädningsmedelFördela utspädningsmedlet (6.1) i provrör (4.2.1) i sådana mängder att varje provrör efter sterilisering innehåller 9,0 ± 0,2 ml utspädningsmedel. Förslut provrören.Sterilisera i autoklav (4.1.2) vid 121 ± 1°C i 15 minuter.Kontrollera pH i utspädningsmedlet.Om utspädningsmedlet inte skall användas omedelbart, förvaras det på en mörk plats vid en temperatur mellan 1 och 5 °C under högst en månad efter beredningen.6.3 Torra utspädningsmedel i handelnUtspädningsmedlet (6.1) kan framställas av tabletter eller pulver som finns i handeln. Följ tillverkarens anvisningar. Justera pH som beskrivs i 6.1 och fördela, sterilisera och lagra utspädningsmedlen som beskrivs i 6.2.7 Förfarande7.1 Smältning av substratInnan den mikrobiologiska undersökningen börjar, smältes tillräcklig mängd av substratet snabbt och substratet hålls vid en temperatur på 45 ± 1°C i vattenbad (4.1.5).7.2 Beredning av mjölkprovet7.2.1 Placera en oöppnad förpackning pastöriserad mjölk, eller om detta är omöjligt, ett representativt prov om minst 100 ml i ett inkubationsskåp (4.1.3 a) vid 6 ± 0,5 °C under 120 ± 2 timmar.7.2.2 Blanda mjölkprovet efter inkubationen omsorgsfullt så att mikroorganismerna fördelas så jämnt som möjligt genom att snabbt vända kärlet med mjölkprovet 25 gånger. Skumning bör undvikas eller också måste skummet få tillfälle att försvinna. Tiden mellan blandning och uttagning av provmängden bör inte överstiga tre minuter.7.3 Beredning av primär utspädning (10-1)Överför med hjälp av en steril pipett (4.2.3) 1 ml av provet (7.2.2) till 9 ml av utspädningsmedlet (6.1) och undvik kontakt mellan pipetten och utspädningsmedlet. Temperaturen hos utspädningsmedlet skall vara ungefär densamma som mjölkprovets temperatur. Blanda denna primära utspädning omsorgsfullt i blandaren (4.1.9) under 5-10 sekunder.En primär utspädning på 10-1 erhålls på så sätt.7.4 Beredning av ytterligare decimala utspädningarÖverför med hjälp av en steril pipett (4.2.3) 1 ml av den primära utspädningen (7.3) till 9 ml av utspädningsmedlet (6.1) enligt anvisningarna i 7.3.På så sätt erhålls en utspädning 10-2.Upprepa dessa förfaranden för att erhålla ytterligare decimala utspädningar tills lämpligt antal av mikroorganismer kan förväntas (8.1).7.5 Inokulering i petriskålarÖverför med en steril pipett (4.2.3) 1 ml av provet och/eller den lämpliga decimala spädningen till en skål (4.2.4). Minst två spädningar måste undersökas. Iordningställ två skålar för varje vald utspädning som är lämplig (8.1).7.6 HällningHäll 15 till 18 ml av substratet (7.1) i varje inokulerad skål.Blanda omedelbart genom att rotera petriskålen tillräckligt för att få jämnt fördelade kolonier efter inkubation.Tiden mellan slutet av beredningen av mjölkprovet och blandningen av spädningen med substratet skall inte överstiga 15 minuter.Låt blandningen i skålen stelna på en ren, sval, horisontell yta.7.7 Inkubation i petriskålarPlacera skålarna i inkubationsskåpet (4.1.3b). Låt skålarna stå upp och nedvända. Trava inte mer än sex skålar på höjden. Travarna med skålar skall vara skilda från varandra och från väggarna och taket i skåpet.Inkubation vid 21 ± 1°C under 25 timmar.7.8 Räkning av kolonierRäkna kolonierna i de petriskålar som inte innehåller mera än 300 kolonier.Undersök skålarna i dämpad belysning. För att underlätta räkningen kan en lämplig lupp (4.1.6) och/eller en trådräknare (4.1.8) användas. Undvik att av misstag räkna partiklar från fällningar i skålarna som kolonier. Undersök omsorgsfullt tvivelaktiga föremål med hjälp av en lupp med högre förstoring (4.1.7), om så behövs, för att skilja kolonier från främmande föremål.Utbredda kolonier betraktas som enstaka kolonier. Om mindre än ¼ av skålen är övervuxen med utbredda kolonier, räknas kolonierna i den andra delen av skålen och beräknas motsvarande antal för hela skålen. Om mera än ¼ av skålen är övervuxen av utbredda kolonier förkastas provet.8 Beräkning och presentation av resultat8.1 Använd räkningen från alla skålar som innehåller mellan 10 och 300 kolonier (se 8.3 och 8.4).8.2 Antalet mikroorganismer per 1 ml pastöriserad mjölk erhålls genom följande formel:>NUM>Ó C>DEN>(n1 + 0,1n2)ddär>Plats för tabell>Räkningen ges till två signifikanta tal. När den siffra som skall rundas av är en femma, avrundas så, att siffran omedelbart till vänster blir jämn.Exempel (pastöriserad mjölk):Utspädning 10-2: 278 och 290 kolonierUtspädning 10-3: 33 och 28 kolonierAntal per ml = >NUM>278 + 290 + 33 + 28>DEN>(2 × 0,1 × 2) 10- 2= >NUM>629>DEN>0,022= 28 590= 29 000= 2,9 × 104.8.3 Om det endast finns räkningar som är mindre än 10 rapporteras det antal mikroorganismer per ml som "mindre än 10 × d per ml", där "d" motsvarar den lägsta utspädningsfaktorn.8.4 Om det endast finns räkningar som överstiger 300 kolonier men räkningen ändå kan genomföras beräknas en uppskattad räkning och multipliceras med motsvarigheten till utspädningsfaktorn. Resultatet rapporteras som "uppskattat antal mikroorganismer per ml".9 MätnoggrannhetResultat från internationellt accepterade samarbetsförsök finns ännu inte tillgängliga.VI RÄKNING AV KOLIFORMA BAKTERIER - RÄKNING AV KOLONIER VID 30 °C1 Omfattning och tillämpningsområdeDetta förfarande anger standardmetoden för räkning av koliforma bakterier i pastöriserad mjölk genom räkning av kolonier vid 30 °C.2 DefinitionBeteckningen "koliforma bakterier" används för bakterier som vid 30 °C bildar typiska eller icke-typiska kolonier som förjäser laktos med avgivande av gas under de förhållanden som beskrivs.3 PrincipEn definierad volym av mjölkprovet blandas med substratet i petriskålar och inkuberas vid 30 °C i 24 timmar. De typiska kolonierna räknas och om nödvändigt fastställs identiteten hos de icke-typiska kolonierna genom prov på förmågan att förjäsa laktos. Antalet koliforma bakterier per 1 ml av den pastöriserade mjölken beräknas sedan.4 Apparater och glasVanlig laboratorieutrustning och särskilt:4.1 Apparater4.1.1 Varmluftsugn som kan hålla en temperatur av 170-175 °C.4.1.2 Autoklav som arbetar vid en temperatur av 121 ± 1 °C.4.1.3 Inkubationsskåp som kan hålla en temperatur på 30 ± 1 °C på alla ställen i skåpet.4.1.4 pH-meter med temperaturkompensation, med en noggrannhet på ± 0,1 pH-enhet.4.1.5 Vattenbad som kan hålla en temperatur av 45 ± 1 °C.4.1.6 Tråd av platina-iridium eller kromnickel.4.2 Glas4.2.1 Provrör med lämpliga förslutningar och med en rymd av 20 ml för att kunna innehålla verifikationssubstratet (5.2) och Durhamrör av lämplig storlek för att kunna användas tillsammans med provrören.4.2.2 Kolvar med en rymd av 150 till 250 ml för förvaring av fast, selektivt substrat (5.1).4.2.3 Pipetter (med bomullspropp) av glas eller sterilt syntetmaterial med hel spets och med en nominell volym av 1-10 ml och med en diameter på utloppet av 1,75-3 mm.4.2.4 Petriskålar av klart, ofärgat glas eller sterilt syntetmaterial, där den nedre skålen skall ha en inre diameter av cirka 90-100 mm. Det inre djupet skall vara minst 10 mm. Bottnen får inte ha några oregelbundenheter, som kan påverka räkningen av kolonier.4.2.5 Sterilisering av glasGlas skall steriliseras med en av följande metoder:a) genom att hållas vid 170 till 175 °C under minst en timma i en varmluftsugn (4.1.1),b) genom att hållas vid 121 ± 1 °C i minst 20 minuter i en autoklav (4.1.2).I autoklaven skall tillses att tillräcklig genomträngning av ånga erhålls - t.ex. om utrustningen steriliseras i behållare får dessa inte vara alltför väl stängda och kolvar och flaskor bör ha lösa lock.Glas som steriliserats i autoklav bör torkas genom att ångan ventileras bort.Pipetter skall steriliseras i varmluftsugn (4.1.1).5 Substrat5.1 Rödagar VRBL (violet red bile lactose). Fast selektivt substrat.Sammansättning:>Plats för tabell>Beredning:Slamma upp och lös komponenterna i vatten och låt stå i flera minuter. Blanda sedan kraftigt.Kontrollera pH med en pH-meter (4.1.4) och om så behövs justera pH så att det efter kokning ligger vid 7,4 ± 0,1 vid 25 °C med hjälp av en lösning (minst 0,1 mol per liter) av natriumhydroxid eller saltsyra.Upphetta snabbt till kokning och snurra då och då på bägaren. Överför omedelbart lösningen i portioner om 100-150 ml till sterila kolvar (4.2.2). Temperera substratet i vattenbad (4.1.5) vid 45 ± 1 °C.Substratets sterilitet bör kontrolleras vid användningstillfället (se 6.4).Använd substratet inom tre timmar efter beredningen.5.2 Briljantgrön laktosbuljong. Verifieringssubstrat.Sammansättning:>Plats för tabell>Beredning:Lös komponenterna i vatten under kokning.Kontrollera pH med en pH-meter (4.1.4) och om så behövs justera pH så att det efter sterilisering ligger vid 7,2 ± 0,1 vid 25 °C med hjälp av en lösning (minst 0,1 mol per liter) av natriumhydroxid eller saltsyra.Fördela substratet i portioner om 10 ml i provrör (4.2.1) som innehåller Durhamrör. Förslut provrören.Sterilisera i autoklav (4.1.2) vid 121 ± 1°C i 15 minuter.Durhamrören får inte innehålla luftbubblor efter steriliseringen.Kontrollera substratets pH.Om substratet inte skall användas omedelbart, lagras det på ett mörkt ställe vid 0-5 °C under högst en månad efter beredningen.5.3 Torrsubstrat som handelsvaraKultursubstraten (5.1, 5.2) kan framställas från i handeln förekommande torrsubstrat. Följ tillverkarens anvisningar. Justera pH och fördela, koka eller sterilisera och lagra substratet som beskrivs i 5.1 och 5.2.6 Förfarande6.1 SubstratetAnvänd substratet (VRBL-agar) som beskrivits i 5.1.6.2 Beredning av mjölkprovetBlanda mjölkprovet omsorgsfullt så att mikroorganismerna fördelas så jämnt som möjligt genom att snabbt vända upp och ned på behållaren med mjölkprovet 25 gånger. Skumning bör undvikas eller också måste skummet få försvinna. Tiden mellan blandning och uttagning av provet bör inte överskrida tre minuter.6.3 Inokulering av petriskålar3 ml av mjölkprovet (6.2) inokuleras genom överföring med hjälp av en steril pipett (4.2.3) 1 ml av mjölkprovet i vardera av tre skålar (4.2.4).6.4 HällningHäll cirka 12 ml VRBL-agar (6.1) i varje inokulerad skål.Blanda omedelbart efter överföringen genom att snurra petriskålen tillräckligt för att erhålla jämnt fördelade kolonier efter inkubationen.Tiden mellan slutet av beredningen av mjölkprovet och blandningen av provportionen med substratet skall inte överstiga 15 minuter.Gör i ordning en icke inokulerad skål för kontroll av steriliteten med 12 ml av samma VRBL-agar som använts för de inokulerade skålarna.Låt innehållet stelna i skålen på en ren, kall, horisontell yta tills substratet har satt sig.När fullständig stelning inträtt hälls minst 4 ml VRBL-agar (6.1) på ytan av det inokulerade substratet.Låt stelna.6.5 Inkubation av petriskålarPlacera skålarna i inkubationsskåpet (4.1.3). Inkubera skålarna upp och nedvända. Trava inte skålarna mera än sex i höjdled. Travarna med skålar skall vara skilda från varandra och från väggarna och taket i inkubationsskåpet.Inkubation vid 30 ± 1°C i 24 ± 2 timmar.6.6 Räkning av kolonier6.6.1 Räkna kolonierna i de petriskålar som inte innehåller mer än 150 kolonier. Räkna de mörkröda kolonierna som har en diameter på minst 0,5 mm med eller utan omkringliggande fällning, som är typisk för koliforma bakterier.6.6.2 Om alla eller en del kolonier har icke typiska särdrag (t.ex. skiljer sig i fråga om färg, storlek eller i bildande av fällning från typiska kolonier) utförs ett verifikationsprov (6.7).6.7 VerifikationsprovUtför ett verifikationsprov vid de indikationer som angetts i 6.6.2 på ett lämpligt antal (t.ex. 3-5) icke typiska kolonier genom inokulering i rör med briljantgrön laktosbuljong (5.2) med hjälp av en tråd (4.1.6). Inkubera rören vid 30 ± 1°C i 24 ± 2 timmar.Betrakta kolonier som avger gas i Durhamröret som verifierade koliforma bakterier.7 Redovisning av resultat7.1 Använd räkningar (se 7.4) från skålar som inte innehåller mer än 150 kolonier.7.2 Om ett verifieringsprov utförs, beräkna antalet kolonier av koliforma bakterier från procenten verifierade koliforma kolonier.7.3 Antalet koliforma bakterier per 1 ml pastöriserad mjölk erhålls genom formeln:>NUM>Ó C>DEN>ndär:>Plats för tabell>Räkningen avrundas till två signifikanta siffror, när det finns mer än 100 kolonier. När siffran som skall avrundas är fem, runda av så att siffran omedelbart till vänster blir jämn.Om det bara finns räkningar som överstiger 150 kolonier, rapportera resultatet som "uppskattat antal koliforma bakterier per 1 ml".8 MätnoggrannhetResultat från internationellt godtagna samarbetsförsök finns inte tillgängliga.VII RÄKNING AV SOMATISKA CELLERDetta förfarande anger två metoder som standardmetoder för räkning av somatiska celler:A. MikroskopmetodenB. Den fluoro-opto-elektroniska metodenA. Mikroskopmetoden1 Omfattning och tillämpningsområdeDetta förfarande anger standardmetoden för räkning av somatiska celler i obehandlad mjölk.Detta förfarande anger metoden för räkning av antalet celler i ett mjölkprov för att kalibrera och kontrollera exaktheten hos den fluoro-opto-elektroniska metoden (se B.1).2 DefinitionI detta förfarande avses med somatiska celler de celler, t.ex. vita blodkroppar och epitelceller, vars kärnor kan ges en markant färg med metylenblått.3 Princip0,01 ml mjölk stryks ut på en yta av 1 cm² på ett objektglas. Filmen torkas och färgas. Räkningen utförs med hjälp av ett mikroskop. Det antal somatiska celler som räknas inom ett definierat område multipliceras med arbetsfaktorn så att antalet celler/ml erhålls.4 ReagenserAnalysrena kemikalier skall användas.FärglösningSammansättning:>Plats för tabell>VarningTetrakloretan är giftigt. Om det används skall beredning och användning genomföras i dragskåp.Beredning:Blanda etanolen och 1,1,1-trikloretan eller tetrakloretan i en flaska och värm i vattenbad till 60-70°C. Tillsätt metylenblått, blanda noga, kyl i kylskåp till 4 °C i 12 till 24 timmar och tillsätt isättika. Filtrera genom ett filter med porstorlek 10-12 mikron eller mindre och förvara färglösningen i en lufttät flaska. Om partiklar eller sediment bildas filtreras lösningen på nytt före användning.5 Apparater och glas5.1 Mikroskop med 500 till 1 000 gångers förstoring.5.2 Mikrospruta, 0,01 ml med en noggrannhet på ± 2 % eller bättre.5.3 Objektglas med en area av 20 mm × 5 mm markerad för filmen eller ett standardobjektglas och en mall på 20 mm × 5 mm för filmen.5.4 Plan värmeplatta (30 till 50 °C) för torkning av objektglasen.5.5 Fläkt (hårtork) för torkning av filmen.5.6 Vattenbad som kan hålla 30-40 °C för uppvärmning av mjölkprovet.5.7 Korsbord med mikrometer, med delning 0,01 mm.6 Förfarande6.1 MjölkprovMjölkprovet måste provas inom sex timmar efter provtagningen. Under lagringen får provets temperatur inte överstiga 6 °C. Provet får inte frysa.6.2 Beredning av provet i laboratorietVärm provet i vattenbad (5.6) till 30-40 °C. Blanda sedan omsorgsfullt. Kyl sedan till den temperatur vid vilken mikrosprutan (5.2) har kalibrerats, t.ex. 20 °C.6.3 Förbehandling av objektglasenRengör objektglasen (5.3), t.ex. med etanol, torka med dammfritt papper, håll dem i låga och kyl dem. Förvara dem i en låda för att undvika damm.6.4 Beredning av filmenTag 0,01 ml mjölk från provet som beretts enligt ovan med hjälp av en mikrospruta (5.2). Rengör noga utsidan av sprutan som kommit i kontakt med mjölken. Håll sprutan mot objektglaset (5.3). Rita först upp konturen av ytan (20 mm × 5 mm). Fyll sedan ytan så jämnt som möjligt. Torka filmen på en plan värmeplatta (5.4) tills den är helt torr.Minst två filmer från varje mjölkprov skall beredas och undersökas.6.5 Färgning av filmernaSänk ner objektglaset i färglösningen (4) i 10 minuter. Torka och använd fläkt (5.5) om så behövs. Doppa filmerna i kranvatten tills all överflödig färg har tvättats bort. Torka sedan igen och förvara så att filmerna skyddas mot damm.6.6 Kalibrering av det mikroskopiska områdetBestäm med hjälp av korsbordsskalorna (5.7) det mikroskopiska områdets storlek beroende på vilken förstoring som valts (500 till 1 000 gånger).7 Räkning och beräkning7.1 Räkning av cellernaAnvänd ett mikroskop (5.1). I stället för att räkna cellerna, räknas endast cellkärnorna. Dessa är lätt igenkännliga och för räkningen bör minst hälften av kärnorna vara synliga i det mikroskopiska området. Räkna band eller fält tvärs över den mellersta tredjedelen av filmen. (Undvik att enbart räkna band eller fält på de yttre delarna av filmen). Att filmerna är noggrant beredda och resultaten därigenom också tillförlitliga skall kontrolleras minst en gång i månaden genom att olika delar av filmen räknas. Räkningen kan också genomföras genom räkning av mikroskopiska områden, utspridda i ett system så att alla delar av filmen är lika representerade.7.2 Minsta antal celler som skall räknasEftersom mikroskopräkning av somatiska celler också kan användas för standardisering av automatiska och mekaniska räknemetoder, får variationskoefficienten för räkning på identiska prover inte vara högre än variationskoefficienten för elektroniska instrument. Variationskoefficienten för ett mjölkprov som innehåller 400 000-600 000 celler/ml bör inte överstiga 5 %.Det antal somatiska celler som skall räknas i varje prov måste enligt karakteristiken för Poisson-fördelningen vara minst 400 för att uppfylla detta krav på repeterbarhet.Poisson-fördelningen förutsätter attM = V = s²därM är medelvärdetV är variationenoch s är standardavvikelsen.Variationskoefficienten är:>Hänvisning till >M (medel) anger antalet partiklar (celler) som har räknats (t.ex. 400 för CV = 5 %).7.3 Beräkning av arbetsfaktornOm 0,01 ml mjölk används beräknas arbetsfaktorn enligt 7.3.1 eller 7.3.2.7.3.1 Räkning av band tvärs över filmenLängden på de band som skall räknas är 5 mm vardera. Bredden på ett band motsvarar det mikroskopiska områdets diameter som det fastställts med hjälp av korsbordets mikrometerskalor (5.7).Arbetsfaktor = >NUM>20 × 100>DEN>d × bdär>Plats för tabell>7.3.2 Räkning av mikroskopiska områden på den mellersta tredjedelen av filmen eller med rutnät>Hänvisning till >där>Plats för tabell>7.4 Beräkning av cellinnehålletFör att erhålla antalet celler per ml mjölk multipliceras antalet räknade somatiska celler (7.1 och 7.2) med arbetsfaktorn (7.3).7.5 MätnoggrannhetVariationskoefficienten (se 7.2) får inte överstiga 5 %.Resultat från internationellt godkända samarbetsförsök finns inte tillgängliga.B. Fluoro-opto-elektronisk metod1 Omfattning och tillämpningsområdeDetta förfarande anger den standardmetod som efter vederbörlig kalibrering (se A.1) kan användas för räkning av somatiska celler i obehandlad mjölk - med eller utan kemisk konservering.2 DefinitionI detta förfarande avses med somatiska celler partiklar som har en minimiintensitet av fluorescens, beroende på färgning av DNA i de somatiska cellernas kärnor.3 PrincipEn del av provet (t.ex. 0,2 ml) blandas noga med buffertlösning och fluorescenslösning. En del av denna blandning överförs sedan i form av en tunn film till en roterande skiva, som tjänstgör som objektglas för mikroskopet.Varje cell ger upphov till en elektrisk puls som förstärks och registreras. Antalet somatiska celler skrivs ut som tusental per ml.4 ReagenserAnalysrena kemikalier skall användas såvida inte annat anges. Vatten bör antingen vara destillerat eller avjoniserat eller ha motsvarande renhet.4.1 BuffertlösningSammansättning:>Plats för tabell>Beredning:De enskilda komponenterna blandas. Förvaras lufttätt i högst sju dagar.4.2 Fluorescenslösning (stamlösning)Sammansättning:>Plats för tabell>Beredning:Etidiumbromid löses upp i vatten. Förvaras högst två månader i ljustät och lufttät flaska.4.3 Fluorescenslösning (brukslösning)20 ml av stamlösningen (4.2) blandas med buffertlösningen (4.1) till mängden 1 000 ml. Brukslösningen bör inte användas under längre tid än sju dagar.4.4 RengöringslösningSammansättning:>Plats för tabell>Beredning:De olika komponenterna blandas. Bör inte lagras i mer än 30 dagar.5 Apparater och glas5.1 Räkneinstrument, som fungerar enligt den fluorescens-optiska principen.AnmärkningInstrumentet skall kalibreras före användning. Förhållandet mellan volymen på de partiklar som skall räknas och den tröskelnivå ovanför vilken räkningarna utförs är därigenom fastställd. Kalibrering av apparaturen utförs i enlighet med tillverkarens anvisningar med användning av prover vars cellinnehåll har bestämts genom mikroskopmetoden (A).5.2 Vattenbad med cirkulation som kan hålla 40 ± 1 °C.5.3 Provrör med lämplig förslutning, rymd ca. 15 ml.6 Mjölkprov6.1 Provet skall lagras vid låg temperatur i ett provrör (5.3). Om provet inte är kemiskt konserverat bör det inte räknas inom de första 24 timmarna efter mjölkningen, eftersom räkningarna kommer att ge för låga värden. Lagringstemperaturen får inte överstiga 6 °C.6.2 KonserveringKemisk konservering skall genomföras inom 24 timmar. Konserveringen skall genomföras så snart som möjligt efter provtagningen.6.2.1 Kemisk konservering av provet kan åstadkommas genom tillsats av ett av följande konserveringsmedel:- Ortoborsyra:Den slutliga koncentrationen av ortoborsyra i provet skall inte överstiga >NUM>0,6 g/>DEN>100 ml. Ett på så sätt konserverat prov kan lagras i upp till ytterligare 24 timmar vid 6-12 °C.- Kaliumbikromat:Den slutliga koncentrationen av kaliumbikromat får inte överstiga >NUM>0,2 g/>DEN>100 ml. Ett på så sätt konserverat prov kan lagras i upp till ytterligare 72 timmar vid 6-12 °C.- Natriumazid:Proverna kan konserveras med natriumazid till en slutlig natriumazidkoncentration av >NUM>0,024 g/>DEN>100 ml under förutsättning att provet kyls till 6-12 °C omedelbart efter provtagningen och räknas inom 48 timmar efter provtagningen.- Bronopol:Provet kan konserveras med bronopol till en slutlig koncentration av >NUM>0,05 g/>DEN>100 ml under förutsättning att provet kyls till 6-12 °C omedelbart efter provtagningen och räknas inom 72 timmar efter provtagningen.6.2.2 Ett prov som redan konserverats med ortoborsyra kan konserveras 48 timmar med hjälp av kaliumbikromat.AnmärkningLokala villkor i fråga om utsläpp av vätskor skall iakttas för prover konserverade med kaliumbikromat.7 Förfarande7.1 Förbehandling av provetDen mjölk som skall undersökas skall lagras efter mjölkningen i minst 24 timmar vid ungefär 2-6 °C. Räkning av proverna under mjölkningsdagen är inte tillrådlig utan förbehandling, eftersom resultaten kan bli för låga. Om räkningen av ett sådant prov måste utföras, skall provet förbehandlas i minst tre timmar med kaliumbikromat. (se 6.2.1)7.2 BeredningDet förbehandlade provet (se 7.1) eller det obehandlade provet som är minst ett dygn gammalt värms upp i vattenbad (5.2) till ungefär 40 °C. Provet lagras sedan vid rumstemperatur tills räkningarna genomförs.7.3 CellräkningRäkningen skall genomföras med hjälp av räkneinstrumentet (5.1) inom 15 minuter efter det att uppvärmningen (se 7.2) har avslutats. Omedelbart före räkningen skall provet blandas grundligt så att fördelningen av de somatiska cellerna blir så homogen som möjligt.Ytterligare utspädning och beredning av provet skall ske automatiskt i instrumentet.8 MätnoggrannhetUppgifter om repeterbarhet (r) och reproducerbarhet (R) från försök som genomförts i internationellt samarbete finns inte tillgängliga. I framtiden kommer precisionsdata att fastställas.Tillgängliga data på nationell nivå medger följande uppskattning:Cellräkningsnivå mellan 400 000 och 500 000/ml- standardavvikelse för repeterbarhet:sr = 20 000 celler/ml(motsvarande en variationskoefficient på 5-4 %)- standardavvikelse för reproducerbarhet:sR = 40 000 celler/ml(motsvarande en variationskoefficient på 10-8 %).9 NoggrannhetskontrollKontroll av noggrannheten genomförs med hjälp av prover med kända cellhalter, som bestämts genom mikroskopisk cellräkning i ett nationellt standardlaboratorium.VIII PÅVISANDE AV ANTIBIOTIKA OCH SULFONAMIDEROMFATTNING OCH TILLÄMPNINGSOMRÅDEDetta förfarande anger standardmetoden för påvisande av antibiotika och sulfonamider i obehandlad mjölk och värmebehandlad mjölk.Standardmetoden innefattar:A. Kvalitativ metodDenna metod är det inledande förfarande, vid vilket mjölkprover som innehåller antibiotika inklusive sulfonamider väljs ut. Det beskrivna förfarandet är en av ett antal liknande metoder, som alla använder Bacillus stearothermophilus, var. calidolactis, ATCC 10149 som provorganism. Metoden har valts såsom representativ för dessa provningar.B. Metod för verifiering och identifiering av penicillinDenna metod måste användas för att verifiera resultaten av den kvalitativa undersökningen A, för att identifiera penicillin och för att bestämma koncentrationen av penicillin.A. Kvalitativ metod1 Omfattning och användningsområdeMetoden anger det kvalitativa påvisandet av antibiotika och sulfonamider i obehandlad och värmebehandlad mjölk utanför de gränser som anges i nedanstående tabell.>Plats för tabell>2 DefinitionMjölken innehåller antibiotika eller sulfonamider om färgen på substratet inte ändras (se 7.1).3 PrincipEtt mjölkprov tillsätts, tillsammans med näringsämnen, till en agargel som innehåller pH-indikator och sporer av Bacillus stearothermophilus, var. calidolactis ATCC 10149 (se 5.4.1), som har en god allmän känslighet och är särskilt känslig för inhibition genom penicillin. Inkubation som leder till normal tillväxt och syraproduktion av organismen får pH-indikatorn att ändra färg från purpurrött till gult. Närvaro i mjölken av ämnen som verkar hämmande på organismens tillväxt får pH-indikatorns färg att förbli purpurröd.4 Apparater och glasVanlig laboratorieutrustning och särskilt:4.1 Apparater4.1.1 Inkubationsskåp som kan hålla en temperatur på 64 ± 1°C.4.1.2 Vattenbad som kan hålla 64 ± 1°C.4.1.3 Ställ för provrör eller ampuller.4.1.4 Pipett med engångsspetsar, lämplig för provtagning och uppmätning av 0,1 ml.4.1.5 Tång eller pincett.4.1.6 Varmluftsugn som kan hålla 170-175 °C.4.1.7 Autoklav som kan arbeta vid 121 ± 1°C.4.1.8 pH-meter.4.2 Glas4.2.1 Provflaskor med lämpliga förslutningar.AnmärkningVissa gummiproppar kan avge hämmande ämnen i flaskhalsen.4.2.2 Petriskålar av klart, ofärgat glas eller sterilt syntetmaterial med flat botten av enhetlig tjocklek och en minsta innerdiameter på ungefär 140 mm.4.2.3 Flaskor med en rymd av 250 ml.4.2.4 Pipetter (med bomullspropp) av glas eller sterilt syntetmaterial med en nominell volym av 1 ml och 10 ml.4.2.5 Glasspatlar4.2.6 Provrör eller ampuller med en innerdiameter på ungefär 8 mm, med lock eller proppar.4.2.7 Sterilisering av glasGlas bör steriliseras genom någon av följande metoder:a) Genom att i minst en timme hållas i en varmluftsugn (4.1.6) vid 170 till 175 °C.b) Genom att i minst 20 minuter hållas i en autoklav (4.1.7) vid 121 ± 1 °C.I autoklaven bör en tillräcklig genomströmning av ånga noga säkerställas, t.ex. om utrustningen steriliseras i behållare. Dessa bör inte vara tätt förslutna. Kolvar och flaskor bör ha lösa lock.Glas som steriliserats i autoklaven bör torkas genom att ångan ventileras bort.Pipetter skall steriliseras i varmluftsugn.5 Substrat, lösningar, provorganismSubstratens ingredienser skall vara lämpliga för bakteriologiska ändamål. Det vatten som används skall vara destillerat i glas eller vara demineraliserat vatten av minst samma renhet. Det skall inte innehålla ämnen som verkar hämmande på provorganismen.5.1 Substrat5.1.1 NäringsagarSammansättning:>Plats för tabell>Beredning:Lös upp komponenterna i vatten. Koka upp och rotera kärlet då och då. Justera pH-värdet så att det efter sterilisering är 7,4 ± 0,1 vid 25 °C.För över portioner om 10 ml till provrör för att göra agarsnedsubstrat eller volymer om 100 ml i flaskor.Sterilisera vid 121 ± 1 °C i 15 minuter.5.1.2 AgarsubstratSammansättning:>Plats för tabell>Beredning:Lös upp ingredienserna utom trimetoprim eller tetroxoprim i vatten. Koka upp och snurra kärlet då och då. Tillsätt trimetoprim eller tetroxoprim och sterilisera vid 121 ± 1 °C i 15 minuter. Ställ in pH-värdet så att det efter steriliseringen är 7,0 ± 0,1 vid 25 °C.5.1.3 Trimetoprim- eller tetroxoprimlösningSammansättning:>Plats för tabell>Beredning:Lös upp trimetoprim eller tetroxoprim i etanol (5 eller 30 ml) och späd med vatten.5.1.4 NäringslösningSammansättning:>Plats för tabell>Beredning:Lös upp näringsämnena och indikatorn i vattnet, om så behövs under uppvärmning, sterilisera genom filtrering. Näringsämnet finns i handeln i tablettform.5.2 Standardlösningar av penicillin5.2.1 Bered en penicillinlösning på 60 ìg = (100 IE/ml) genom att lösa kristallinskt natrium- eller kaliumbensylpenicillin i sterilt destillerat vatten i en lämplig steril flaska försedd med propp.5.2.2 Bered en brukslösning av penicillin genom att späda 1,25 ml av penicillinlösningen (5.2.1) till 1 000 ml med sterilt destillerat vatten. Denna brukslösning innehåller 0,075 ìg (= 0,125 IE/ml).5.2.3 Bered 75 ml av en standardlösning av penicillin innehållande 0,004 ìg/ml (= 0,0067 IE/ml) genom att tillsätta 71 ml inhibitorfri mjölk (5.3) till 4 ml av brukslösningen av penicillin (5.2.2) och blanda.5.2.4 De penicillinlösningar som anges i 5.2.1-5.2.3 skall beredas samma dag som provet genomförs.5.3 Inhibitorfri mjölkBered för kontroll en inhibitorfri mjölk genom att slamma upp skummjölkspulver (10 % m/v) som tidigare provats och befunnits vara fritt från inhibitorämnen, i sterilt destillerat vatten. En annan möjlighet är att använda en tillräcklig mängd obehandlad oförpackad mjölk som provats och befunnits vara fri från inhibitorämnen och som hällts upp i flaskor, upphettats i en timme vid 100 °C och sedan förvarats i kylskåp vid 0 till 6 °C i högst en vecka.5.4 Provorganism5.4.1 Bacillus stearothermophilus var. calidolactus stam ATCC 10149. Stammen är identisk med C 953.5.4.2 Bered en stamkultur för underhåll av provkulturen. Provkulturen bevaras på ett snedsubstrat av näringsagar (5.1.1). Agarsubstratet inokuleras genom att provkulturen stryks ut på ytan med hjälp av en steril trådögla och inkuberas aerobt i 48 timmar vid 63 ± 1 °C. Efter inkubationen förseglas provröret med en steril gummipropp. Den stamkultur som på så sätt erhållits kan förvaras i flera månader i kylskåp vid 5 °C.5.5 Provkultur (sporsuspension)5.5.1 20 ml näringsagar (5.1.1) överförs aseptiskt till en steril petriskål (4.2.2) och kyls till rumstemperatur.5.5.2 Överför med en steril pipett (4.2.4) 5 ml sterilt destillerat vatten till ett provrör med stamkultur (5.4.2) och tvätta bort sporerna från agarytan med hjälp av en steril ögla. Denna sporsuspension skall förvaras vid 5 °C och skall användas inom 36 timmar.5.5.3 Överför med en steril pipett (4.2.4) 0,5 ml av sporsuspensionen (5.5.2) till en odlingsplatta (5.5.1) och stryk ut inokulatet noggrant över hela ytan med en böjd glasstav. Inkubera vid 63 ± 1 °C (4.1.1) i 16 till 18 timmar.Vid användning av en stamkultur (5.4.2) eller en kultur som är mer än 36 timmar gammal, bör omodlingen utföras minst två gånger med högst 36 timmars mellanrum.5.5.4 Överför med en steril pipett (4.2.4) 10 ml destillerat vatten till odlingsplattan (5.5.3) och flytta sporer från ytan till suspensionen med hjälp av en glasstav.Överför sporsuspensionen till en flaska (4.2.3) som innehåller 250 ml sterilt destillerat vatten. Tillslut flaskan och skaka grundligt. Kulturer som inte genast skall omodlas bör lagras i kylskåp vid 0 till 6 °C.5.5.5 Sporsuspensionen skall ha en livskraftig kolonistam mellan 5 och 10 miljoner per ml på plattspridningsagarsubstrat inkuberat vid 63 ± 1 °C i 16 till 18 timmar. Sporsuspensionen skall vara likformigt grumlig och om den innehåller en flockig fällning eller ett sediment bör den kastas och en ny suspension beredas utifrån stamkulturen (5.4.2).5.6 Förbehandling av provrör/ampuller5.6.1 Smält agarsubstratet (5.1.2) och kyl det till 55 °C.5.6.2 Tillsätt en del nygjord sporsuspension (5.5.4) till fem delar agarsubstrat (5.6.1) i ett provrör eller en flaska och blanda omsorgsfullt.5.6.3 Överför 0,3 ml av det inokulerade substratet (5.6.2) som beräknas ge ett 5 mm tjockt lager till ett sterilt provrör eller en steril ampull (4.2.6) och förslut med en propp eller ett lock eller genom att smälta spetsen. Låt provrören/ampullerna svalna i upprätt läge, låt substratet stelna och låt det sedan stå i minst 12 timmar.5.6.4 Provrören/ampullerna kan användas samma dag, men de kan förvaras i flera månader under förutsättning att de kyls omedelbart efter beredningen och förvaras vid 0 till 6 °C.6 Förfarande6.1 Prover bör undersökas så snart som möjligt och helst inom 24 timmar efter provtagningen. Tills provningen genomförs skall proverna förvaras vid en temperatur av mellan 0 och 5 °C. Om det inte är möjligt att undersöka proverna inom 24 timmar bör de bevaras i frys (- 30 till - 15 °C) för att i största möjliga utsträckning förhindra att penicillin görs overksamt.6.2 Märk varje provrör/ampull (5.6) tydligt och så att märkningen inte kan utplånas. Avlägsna locket eller proppen. Placera det antal som behövs för proverna och kontrollerna (5.2 och 5.3) i ett lämpligt ställ (4.1.3).6.3 Tillsätt 50 mikroliter av det näringsämne som anges i 5.1.4 till varje provrör/ampull.6.4 Blanda mjölkprovet grundligt och överför med sprutan (4.l.4) 0,1 ml till provröret/ampullen med motsvarande märkning. Använd en ren engångsspets för varje prov som skall överföras.6.5 Upprepa det förfarande som beskrivs i 6.4 med dubbelprov och använd standardpenicillinlösningen som innehåller 0,004 ìg/ml (= 0,0067 IE/ml) i stället för mjölkprovet (5.2.3).6.6 Upprepa förfarandet i 6.4 med dubbelprov och använd den inhibitorfria kontrollmjölken (5.3) i stället för mjölkprovet.6.7 Tillslut provrören/ampullerna och placera stället som innehåller provrören/ampullerna i ett vattenbad vid 63 ± 1°C (4.1.2) i minst 2 ½ upp till 2 ¾ timma.6.8 Lyft upp stället med provrören/ampullerna ur vattenbadet.6.9 Undersök färgen på provsubstratet (se 7).7 Tolkning av resultaten7.1 En rödfärgning av provsubstratet i ett mjölkprov eller i ett kontrollprovrör/ampull tyder på att proven innehåller antibiotika eller sulfonamider vid eller omkring den "helt positiva" nivå som anges i tabellen på sidan 39. Färgningen i provrören/ampullerna med standardpenicillinlösning (6.5) skall förbli röd för att visa att provsubstratet är tillräckligt känsligt.7.2 En rödfärgning av endast en del av provsubstratet eller en oregelbunden färgning i något av mjölkproverna eller kontrollprovrören/ampullerna tyder på att det förekommer hämmande ämnen mellan de nivåer som är angivna i tabellen på sidan 39.7.3 En gulfärgning av provsubstratet i ett mjölkprov eller ett kontrollprovrör/ampull tyder på frånvaro av ämnen som verkar inhiberande på provorganismen.7.4 Om det finns en rödfärgning i alla provrör/ampuller, inklusive i det negativa kontrollprovet, innehåller provröret/ampullerna inte livskraftiga sporer och proverna bör då göras om med provmaterial som beretts på nytt.8 Verifiering av resultaten8.1 Verifiera alla prover med de reaktioner som beskrivs i 7.1 och 7.2 enligt "metod B". Om mjölkprover måste lagras före verifieringen, skall de djupfrysas för att förhindra nedbrytning av antibiotika.B. Förfarande för verifiering av penicillin och bestämning av koncentration1 Räckvidd och tillämpningsområdeFörfarandet beskriver verifikationsprovet för penicillin eller antibiotika förutom penicillin och förfarande för bestämning av penicillinkoncentrationen i mjölkprover med positiv (A.7.1) eller tvivelaktig reaktion (A.7.2).Känslighet hos olika antibiotika för förfarandet.Se A.1.2 Definition2.1 Mjölkprovet innehåller antibiotika inklusive sulfonamid när provet genom det beskrivna förfarandet ger en klar inhiberingszon på minst 2 mm runt plattan.2.2 Om ett prov som innehåller antibiotika inklusive sulfonamid (2.1) och till vilket penicillinas (betalactamase) har tillsatts inte ger någon klar zon eller en klar zon som har mindre diameter än utan penicillinas är inhibitorämnet antingen penicillin eller både penicillin och någon annan antibiotika inklusive sulfonamider.2.3 Om zonen inte aktiveras av penicillinas (2.2) är inhibitorämnet i mjölkprovet inte penicillin men kan vara en annan rest (se kapitel VI A1f och 2b i bilaga A till direktiv 85/397/EEG).En del av de halvsyntetiska penicillinerna, t.ex. natriumcloxacillin, är inte eller är endast delvis inaktiverade av penicillinas eller helt resistenta och identifieras därför inte som penicillin (se 7.3).3 PrincipEn skiva av absorberande papper som är impregnerad med mjölken som skall undersökas placeras på ytan på ett agarsubstrat som är inokulerat med Bacillus stearothermophilus, var. calidolactis. Inkubation som resulterar i normal tillväxt av organismen gör att agarn blir grumlig. Närvaron i mjölk av ämnen som är inhibitorer för organismens tillväxt indikeras av en klar zon runt skivan. Storleken hos den klara zonen beror bl.a. på koncentrationen och typen av inhibitorämnen i mjölken.4 Apparater, glas och utrustning4.1 Apparater4.1.1 Se A.4.1.4.1.2 Vattenbad som kan hållas vid 80° ± 1 °C.4.2 GlasSe A.4.2.4.3 Pappersskivor, inihibitorfria med diametern 9-13 mm, som kan suga upp ca 130 mg mjölk (lagras företrädesvis i en exsickator).5 Substrat, standardlösningar, penicillinaslösning, reagenser, provorganismer osv.Ingredienserna i substratet måste vara lämpliga för bakteriologiska ändamål. Det vatten som användes måste vara destillerat i glas eller demineraliserat till minst samma renhet. Det får inte innehålla substanser som kan vara inhibitorer för provorganismen.5.1 Substrat5.1.1 Näringsagar (A.5.1.1)5.1.2 Provsubstrat för påvisande av inhibitorämnenSammansättning>Plats för tabell>BeredningDe fasta komponenterna löses helt i vatten genom upphettning och omrörning innan trimetoprim- eller tetroxoprimlösning tillsätts. Sedan trimetoprim- eller tetroxoprimlösning tillsatts måste pH ställas in så att det efter sterilisering kommer att ligga på 8,0 + 0,1 vid 25 °C. Substratet steriliseras i 15 minuter vid 121 ± 1 °C.5.2 Standardpenicillinlösningar i mjölkSe A.5.2.För den kvantitativa bestämningen av inhibitorämnen (8) tillreds standardpenicillinlösningar i inhibitorfri mjölk (A.5.3) i följande koncentrationer:a) 0,004 g/ml (0,0067 IE/ml)b) 0,006 g/ml (0,01 IE/ml)c) 0,03 g/ml (0,05 IE/ml)d) 0,06 g/ml (0,1 IE/ml).5.3 Penicillinaslösning5.3.1 Lös upp en tillräcklig mängd penicillinas (betalactamas) i sterilt destillerat vatten så att en koncentration av 1 000 enheter/ml erhålls. Denna lösning som lämpligen delas upp i små portioner kan lagras vid 0-5 °C upp till fyra veckor.Anmärkning:Det finns ingen enhetlig internationell standard för penicillinas. Då det här förfarandet tillämpas antas att 10 enheter penicillinas kommer att vara tillräckligt för att inaktivera 0,6 ìg (1 IE) penicillin. När det gäller partier av penicillinas av okänd styrka är det nödvändigt att kontrollera om detta antagande är giltigt. I annat fall är det nödvändigt att ändra koncentrationen på penicillinaslösningen i motsvarande grad.5.3.2 I stället för penicillinaslösning kan i handeln tillgängliga skivor som är preparerade med penicillinas användas om de efter en undersökningsprocedur befinnes innehålla en lämplig mängd penicillinas.5.4 ProvorganismSe A.5.4.5.5 Provkultur (sporsuspension)Se A.5.5.5.6 Beredning av provplattorna5.6.1 Smält provsubstratet för påvisning av inhibitorämnen (5.1.2) och kyl till 55 °C.5.6.2 I en flaska tillsätts en del färsk sporsuspension (5.5) till så många delar av provsubstratet för påvisande av inhibitorämnen (5.1.2) som ger en lämplig täthet av kolonier i det inokulerade provsubstratet och blanda omsorgsfullt.5.6.3 Överför det inokulerade provsubstratet som tidigare uppvärmts till 55 °C (5.6.2) till en steril petriskål (A.4.2.2) så att det blir ett lager som är 0,6 till 0,8 mm tjockt. Till en petriskål med 140 mm innerdiameter behövs ca 15 ml provsubstrat för att få en tjocklek av 0,8 mm.5.6.4 Placera petriskålarna på en kall horisontell yta som tidigare vägts av med vattenpass, ta bort locken och låt agarsubstratet stelna. När substratet har stelnat sätts locken på skålarna igen och dessa vänds sedan för att minska kondens på agarsubstratets yta.5.6.5 Provplattorna som preparerats på detta sätt skall helst användas samma dag, men de kan bevaras upp till 2 veckor under förutsättning att de placeras i en polyetenpåse som svetsas igen omedelbart efter det att de iordningställts och att denna påse sedan förvaras vid 5 °C.5.6.6 För att kunna identifiera proverna märks botten på provplattorna.6 Förfarande6.1 Provberedning6.1.1 Prover som ger positiva eller tvivelaktiga resultat med "metod A" (A.7.1 och A.7.2) måste provas igen, identifieras och kvantifieras som penicillin.6.1.2 Till att börja med upphettas dessa mjölkprover till 80 ± 1°C i 10 minuter för att undvika påverkan från termolabila, ickespecifika inhibitorer.6.1.3 Efter omsorgsfull blandning överförs ca 10 ml av det upphettade mjölkprovet till en lämplig, steril, vidhalsad flaska. Ca 0,4 ml av penicillinaslösningen (5.3) tillsätts till mjölken varefter det hela blandas omsorgsfullt.6.2 Påvisning av inhibitorer6.2.1 Doppa en pappersskiva (4.3) i mjölkprovet (6.1.2) med hjälp av en torr pincett. Ta bort överflödig mjölk genom att föra pappersskivan längs sidan av provflaskan. Placera skivan platt på en yta på provplattan (5.6) och pressa försiktigt ner den med pincetten.6.2.2 Skivorna som är preparerade med de olika mjölkproverna måste placeras minst 20 mm från varandra och minst 10 mm från kanten.6.2.3 För att kontrollera känsligheten placeras skivor (4.3) som är doppade i standardpenicillinlösning (5.2 a) slumpvis mellan mjölkprovskivorna i en mängd som är minst 2 % av antalet mjölkprovskivor varvid minst fem standardskivor bör användas under varje prov.6.2.4 När alla skivorna placerats slumpmässigt på agarsubstratet och har identifierats vänds plattorna och inkuberas vid 63 ± 1°C i 2,5 till 5 timmar.6.2.5 Efter inkubationen undersöks plattorna framför en lämplig ljuskälla för att se om det finns klara inhiberingszoner runt pappersskivorna. De klara zonerna mäts.6.2.6 Zonerna runt skivorna som innehåller penicillinstandardlösning (6.2.3) måste vara minst 2 mm.6.2.7 Klara zoner runt skivorna som innehåller mjölkprovet av minst samma storlek eller större än de som beskrivs i 6.2.6 visar att ämnen inhiberar provorganismen.6.3 Identifiering och kvantifiering av inhibitorämnena6.3.1 Förfarandet enligt 6.2.1 genomförs som dubbelprov på det upphettade mjölkprovet (6.1.2) och på det prov som behandlats med penicillinas (6.1.3). I stället för att tillsätta penicillinas till 10 ml av mjölkprovet kan en preparerad penicillinasskiva (5.3.2) doppas i provet och placeras på provplattan.6.3.2 Förfarandet i 6.2.1 genomförs som dubbelprov för var och en av de standardpenicillinlösningar som anges i 5.2a-d.6.3.3 Den genomsnittliga diametern för de klara inhibitorzonerna för mjölkprovet och för penicillinaskontrollprovet samt för standardpenicillinlösningarna bör bestämmas.7 Tolkning av resultaten (se 2.)7.1 Om det inte finns någon klar zon runt skivan som innehåller kontrollprovet med penicillinas men det finns en klar zon runt skivan som innehåller mjölkprovet, lika stor eller större än zonen runt skivan som innehåller standardpenicillinlösning (5.2a) motsvarar inhibitorämnet i mjölkprovet en natrium-(kalium)-benzyl-penicillinkoncentration på minst 0,004 ìg/ml.7.2 Om den genomsnittliga diametern hos den klara zonen runt skivan som innehåller penicillinas är lika stor som den genomsnittliga diametern för den klara zonen runt skivan som innehåller mjölkprovet innehåller mjölken inhibitorämnen som är omöjliga att inaktivera med den penicillinaskoncentration som använts i det här förfarandet.7.3 Om den genomsnittliga diametern hos den klara zonen runt skivan som innehåller penicillinas är mindre än den genomsnittliga diametern för den klara zonen runt skivan med mjölkprovet som är upphettat i enlighet med 6.1.2 innehåller mjölkprovet penicillin tillsammans med andra antibiotika inklusive sulfonamider förutom penicillin eller halvsyntetiskt penicillin som inte kan identifieras genom penicillinaskoncentrationen som använts i det här förfarandet. Syntetiska penicilliner som natriumcloxacillin, får inte inaktiveras av penicillinas under provförhållandena och får därför klassificeras som andra inhibitorer än penicillin.AnmärkningInhibitorämnen andra än penicillin får om så erfordras identifieras med lämpliga förfaranden.8 Bestämning av penicillinhalten8.1 Bestämning av penicillinhalten kan genomföras antingen efter det att en standardkurva ritats upp eller genom beräkning ur de zonstorlekar som erhållits med standardpenicillinlösning i mjölk (5.2a-d).8.2 Uppritning av en standardkurvaEftersom det finns ett lineärt samband mellan 10-logaritmen för penicillinkoncentrationen och diametern på inhibitorzonerna kan standardkurvan ritas upp på ett halvlogaritmiskt papper med penicillinkoncentrationerna som logaritmisk ordinata och inhibitorzonerna som abskissa. Inhibitorzonerna beräknas som medeltalet av dubbelprov. Diametrarna på inhibitorzonerna ritas in i diagram mot standardpenicillinkoncentrationerna och därefter ritas standardkurvan upp.8.3 BeräkningPenicillinkoncentrationerna i mjölkprovet kan beräknas ur zondiametrarna med användning av ekvationen eller standardkurvan. För en noggrann analys bör radien på inhibitorzonerna vara minst två gånger större och högst fem gånger större än skivornas radie.9 Redovisning av resultat9.1 Resultaten uttrycks som halt av penicillin lika med eller större än 0,004 ìg/ml (eller genom att ange den bestämda koncentrationen) eller som halt av inhibitorer andra än penicillin.9.2 Repeterbarhet (r) och reproducerbarhet (R)Siffror finns inte tillgängliga och är inte meningsfulla eftersom en standard finns inkluderad för jämförelse.IX PÅVISNING AV PATOGENA MIKROORGANISMER1. Omfattning och tillämpningsområdeI enlighet med kraven i kapitel VII.2 i bilaga A till direktiv 85/397/EEG ger detta förfarande anvisningar som skall följas för att kontrollera pastöriserad mjölk med avseende på patogena mikroorganismer.2. DefinitionUndersökning måste göras med avseende på bakterietyper som vanligen är inblandade vid sjukdomar orsakade av livsmedel.Pastörisering är en behandling som skyddar mot närvaro av icke-termoresistenta patogener i mjölk. Om de standarder som fastställts i kapitel VII.2 i bilaga A till direktivet för plattspridning vid 30 °C och 21°C uppfyllts för koliforma bakterier och fosfatas är det endast nödvändigt att genomföra ett speciellt prov för påvisning av patogener om det finns misstanke att mjölken har samband med en matförgiftningsepidemi.3. FörfarandeFörfaranden och frekvens för undersökningar måste fastställas av nationella myndigheter på ett sätt som gör det möjligt att utfärda hälsocertifikat för värmebehandlad mjölk för handel inom gemenskapen. För påvisning av patogena mikroorganismer tillämpas de kriterier och förfaranden som är internationellt godtagna om sådana finns tillgängliga.4. ResultatrapportFör varje patogen mikroorganism som undersökts skall resultatet uttryckas på följande sätt:Antal per ml mjölk eller "närvaro" eller "frånvaro" i den volym av pastöriserad mjölk som krävs för det förfarande som använts.Rapporten skall klart beskriva det förfarande som använts.