CELEX: 32013R0051
Language: sl
Date: 2013-01-16 00:00:00
Title: Uredba Komisije (EU) št. 51/2013 z dne 16. januarja 2013 o spremembi Uredbe (ES) št. 152/2009 glede analitskih metod za določanje sestavin živalskega izvora za uradni nadzor krme  Besedilo velja za EGP

23.1.2013   
            
            
               SL
            
            
               Uradni list Evropske unije
            
            
               L 20/33
            
         
      UREDBA KOMISIJE (EU) št. 51/2013
   z dne 16. januarja 2013
   o spremembi Uredbe (ES) št. 152/2009 glede analitskih metod za določanje sestavin živalskega izvora za uradni nadzor krme
   (Besedilo velja za EGP)
   EVROPSKA KOMISIJA JE –
   ob upoštevanju Pogodbe o delovanju Evropske unije,
   ob upoštevanju Uredbe (ES) št. 882/2004 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 29. aprila 2004 o izvajanju uradnega nadzora, da se zagotovi preverjanje skladnosti z zakonodajo o krmi in živilih ter s pravili o zdravstvenem varstvu živali in zaščiti živali (1), ter zlasti člena 11(4) Uredbe,
   ob upoštevanju naslednjega:
   
               (1)
            
            
               Člen 7(1) Uredbe Evropskega parlamenta in Sveta (ES) št. 999/2001 z dne 22. maja 2001 o določitvi predpisov za preprečevanje, nadzor in izkoreninjenje nekaterih transmisivnih spongiformnih encefalopatij (2) določa, da je prepovedano krmljenje prežvekovalcev z beljakovinami, pridobljenimi iz živali. Navedena prepoved se razširi tudi na druge živali, razen prežvekovalcev, in se v zvezi s krmljenjem takih živali omeji na proizvode živalskega izvora v skladu s Prilogo IV k navedeni uredbi.
            
         
               (2)
            
            
               Člen 11(1) Uredbe (ES) št. 1069/2009 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 21. oktobra 2009 o določitvi zdravstvenih pravil za živalske stranske proizvode in pridobljene proizvode, ki niso namenjeni prehrani ljudi, ter razveljavitvi Uredbe (ES) št. 1774/2002 (3) prepoveduje krmljenje kopenskih živali določene vrste, razen kožuharjev, s predelanimi živalskimi beljakovinami, pridobljenimi iz teles ali delov teles živali iste živalske vrste, ter hranjenje gojenih rib s predelanimi živalskimi beljakovinami, pridobljenimi iz teles ali delov teles gojenih rib iste vrste.
            
         
               (3)
            
            
               Uredba Komisije (ES) št. 152/2009 z dne 27. januarja 2009 o določitvi metod vzorčenja in analitskih metod za uradni nadzor krme (4) v Prilogi VI določa analitske metode za določanje sestavin živalskega izvora pri uradnem nadzoru krme. Mikroskopska metoda, ki je trenutno edina metoda, validirana za ugotavljanje prisotnosti živalskih beljakovin v krmi, omogoča razlikovanje med sestavinami, pridobljenimi iz kopenskih živali, in sestavinami, pridobljenimi iz rib, vendar z njo ni možno z zadostno stopnjo natančnosti določiti količine živalskih sestavin v krmi, zato se ne sme uporabiti v ta namen.
            
         
               (4)
            
            
               Novo metodo za določanje živalskih sestavin, ki temelji na verižni reakciji s polimerazo (PCR), je validiral referenčni laboratorij EU za živalske beljakovine v krmi. Študija o izvajanju, v katero so bili vključeni nacionalni referenčni laboratoriji držav članic, je pokazala, da je nova metoda dovolj robustna, da se lahko uporablja kot uradna metoda nadzora v Uniji. S to novo metodo se lahko ugotovi prisotnost živalskih sestavin v krmi in določi, od katere živalske vrste izvirajo te sestavine. Uporaba te nove metode skupaj z mikroskopsko metodo ali, če je primerno, namesto nje bi bila zelo koristna za nadzor nad pravilnim izvajanjem prepovedi krmljenja iz uredb (ES) št. 999/2001 in (ES) št. 1069/2009.
            
         
               (5)
            
            
               Prilogo VI k Uredbi (ES) št. 152/2009 bi bilo zato treba ustrezno spremeniti.
            
         
               (6)
            
            
               Ukrepi, predvideni s to uredbo, so v skladu z mnenjem Stalnega odbora za prehranjevalno verigo in zdravje živali, Evropski parlament in Svet pa jim nista nasprotovala –
            
         SPREJELA NASLEDNJO UREDBO:
   Člen 1
   Priloga VI k Uredbi (ES) št. 152/2009 se nadomesti z besedilom iz Priloge k tej uredbi.
   Člen 2
   Ta uredba začne veljati dvajseti dan po objavi v Uradnem listu Evropske unije.
   
      Ta uredba je v celoti zavezujoča in se neposredno uporablja v vseh državah članicah.
      V Bruslju, 16. januarja 2013
      
         
            Za Komisijo
         
         
            Predsednik
         
         José Manuel BARROSO
         
      
   
   
      (1)  UL L 165, 30.4.2004, str. 1.
   
      (2)  UL L 147, 31.5.2001, str. 1.
   
      (3)  UL L 300, 14.11.2009, str. 1.
   
      (4)  UL L 54, 26.2.2009, str. 1.
   
      PRILOGA
      
         
            „PRILOGA VI
            
               ANALITSKE METODE ZA DOLOČANJE SESTAVIN ŽIVALSKEGA IZVORA ZA URADNI NADZOR KRME
            
            1.   NAMEN IN PODROČJE UPORABE
            Sestavine živalskega izvora v krmi se določajo s svetlobno mikroskopijo ali verižno reakcijo s polimerazo (PCR) v skladu z določbami iz te priloge.
            Ti metodi omogočata ugotavljanje prisotnosti sestavin živalskega izvora v posamičnih krmilih in krmnih mešanicah, ne pa tudi njihove natančne količine v posamičnih krmilih in krmnih mešanicah. Meja zaznavnosti pri obeh metodah je pod 0,1 % (m/m).
            Metoda PCR omogoča določanje taksonomske skupine sestavin živalskega izvora, prisotnih v posamičnih krmilih in krmnih mešanicah.
            Ti metodi se uporabljata za nadzor izvajanja prepovedi iz člena 7(1) in Priloge IV k Uredbi (ES) št. 999/2001 ter iz člena 11(1) Uredbe (ES) št. 1069/2009.
            Glede na vrsto krme, ki se testira, se ti metodi lahko uporabita v okviru enega samega delovnega protokola bodisi samostojno ali skupaj v skladu s standardnimi operativnimi postopki (SOP), ki jih je določil in na svoji spletni strani (1) objavil referenčni laboratorij EU za živalske beljakovine v krmi (EURL-AP).
            2.   METODE
            2.1   Svetlobna mikroskopija
            
            2.1.1   Načelo
            
            Sestavine živalskega izvora, ki so lahko prisotne v posamičnih krmilih in krmnih mešanicah, poslanih v analizo, se določijo na podlagi tipičnih, mikroskopsko prepoznavnih značilnosti, kot so mišična vlakna in drugi mesni delci, hrustanec, kost, roževina, dlake, ščetine, kri, perje, jajčne lupine, ribje kosti in luskine).
            2.1.2   Reagenti in oprema
            
            2.1.2.1   Reagenti
            2.1.2.1.1   Sredstvo za koncentriranje
            2.1.2.1.1.1   Tetrakloroetilen (specifična teža 1,62)
            2.1.2.1.2   Reagent za obarvanje
            2.1.2.1.2.1   Raztopina rdečega alizarina (2,5 ml 1M klorovodikove kisline se raztopi v 100 ml vode in tej raztopini se doda 200 mg rdečega alizarina.)
            2.1.2.1.3   Sredstva za pripravo preparatov
            2.1.2.1.3.1   Lug (NaOH 2,5 % m/v ali KOH 2,5 % m/v)
            2.1.2.1.3.2   Glicerol (nerazredčen, viskoznost: 1 490 cP)
            2.1.2.1.3.3   Norland Optical Adhesive 65® (viskoznost: 1 200 cP) ali smola z enakovrednimi lastnostmi za pripravo trajnih preparatov
            2.1.2.1.4   Sredstva za pripravo preparatov z lastnostmi obarvanja
            2.1.2.1.4.1   Lugolova raztopina (2 g kalijevega jodida se raztopi v 100 ml vode in med pogostim stresanjem se doda 1 g joda)
            2.1.2.1.4.2   Cistinski reagent (2 g svinčevega acetata, 10 g NaOH/100 ml vode)
            2.1.2.1.4.3   Fehlingov reagent (pripravi se pred uporabo iz enakih delov (1/1) osnovnih raztopin A in B. Raztopina A: 6,9 g bakrovega (II) sulfata pentahidrata se raztopi v 100 ml vode. Raztopina B: 34,6 g kalij-natrijevega tartrata tetrahidrata in 12 g NaOH se raztopi v 100 ml vode)
            2.1.2.1.4.4   Tetrametilbenzidin/vodikov peroksid (1 g 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) se raztopi v 100 ml ledocetne kisline in 150 ml vode. Pred uporabo se štirje deli te raztopine TMB zmešajo z enim delom 3 % vodikovega peroksida.)
            2.1.2.1.5   Sredstva za izpiranje
            2.1.2.1.5.1   Etanol ≥ 96 % (tehnično čist)
            2.1.2.1.5.2   Aceton (tehnično čist)
            2.1.2.1.6   Reagent za beljenje
            2.1.2.1.6.1   Komercialna raztopina natrijevega hipoklorita (9–14 % aktivnega klora)
            2.1.2.2   Oprema
            2.1.2.2.1   Analitska tehtnica, natančna na 0,001 g
            2.1.2.2.2   Oprema za mletje: mlin ali terilnica
            2.1.2.2.3   Siti z mrežico s kvadratnimi odprtinami širine 0,25 mm in 1 mm
            2.1.2.2.4   Konični stekleni lij ločnik s prostornino 250 ml in teflonskim petelinčkom ali petelinčkom iz brušenega stekla na dnu konusa. Premer odprtine petelinčka mora biti ≥ 4 mm. Namesto tega se lahko uporabi konična čaša za usedlino, če laboratorij dokaže, da je meja zaznavnosti enakovredna tisti pri uporabi koničnega steklenega lija ločnika.
            
               Lij ločnik
            
            
               
            2.1.2.2.5   Stereomikroskop, ki zajema vsaj končno območje povečave 6,5× do 40×.
            2.1.2.2.6   Sestavljeni mikroskop, ki zajema vsaj končno območje povečave 100× do 400× in ima svetlo polje za presevno osvetlitev. Dodatno se lahko uporabita polarizirana svetloba in diferenčni interferenčni kontrast.
            2.1.2.2.7   Standardna laboratorijska steklovina
            2.1.2.2.8   Oprema za pripravo preparata: klasična mikroskopska objektna stekelca, stekelca z vdolbino, krovna stekelca (20 × 20 mm), pincete, fina lopatica
            2.1.3   Vzorčenje in priprava vzorcev
            
            2.1.3.1   Vzorčenje
            Uporabi se reprezentativni vzorec, ki je bil odvzet v skladu z določbami iz Priloge I.
            2.1.3.2   Previdnostni ukrepi
            Za preprečitev navzkrižnega onesnaženja je treba laboratorijsko opremo za večkratno uporabo temeljito očistiti pred uporabo. Dele lija ločnika je treba pred čiščenjem razstaviti. Sestavine lija ločnika in vso drugo steklovino je treba najprej očistiti ročno in nato še v pomivalnem stroju. Sita je treba očistiti s krtačo s trdimi sintetičnimi ščetinami. Končno čiščenje sit z acetonom in stisnjenim zrakom se priporoča po sejanju mastnega materiala, kot je ribja moka.
            2.1.3.3   Priprava vzorcev, razen vzorcev, ki vsebujejo maščobe ali olja
            2.1.3.3.1   Sušenje vzorca: vzorci z vsebnostjo vlage več kot 14 % se pred obdelavo posušijo.
            2.1.3.3.2   Predhodno presejanje vzorca: priporoča se, da se krma v briketih in zrnu predhodno preseje na 1 mm, nato pa se dobljeni frakciji analizirata kot ločena vzorca.
            2.1.3.3.3   Podvzorčenje in mletje: iz najmanj 50 g vzorca se pripravi podvzorec za analizo, ki se nato zmelje.
            2.1.3.3.4   Ekstrakcija in priprava usedline: 10-gramski vzorec (na 0,01 g natančno) iz zmletega podvzorca se prenese v lij ločnik ali konično čašo za usedlino in se mu doda 50 ml tetrakloroetilena. Vzorec, ki se prenese v lij, tehta največ 3 g, kadar vzorec tvorijo ribja moka ali drugi čisti živalski proizvodi, mineralne sestavine ali premiksi, ki tvorijo več kot 10 % usedline. Mešanica naj se močno stresa vsaj 30 sekund in nato previdno doda še najmanj 50 ml tetrakloroetilena med spiranjem notranje površine lija za odstranitev vseh pritrjenih delcev. Tako dobljena mešanica se pusti stati vsaj 5 minut, nato se usedlino loči z odprtjem petelinčka.
            Če se uporabi konična čaša za usedlino, se mešanica močno meša vsaj 15 sekund in vsi delci, ki se držijo čaše, se skrbno sperejo po notranji površini z najmanj 10 ml čistega tetrakloroetilena. Mešanica se pusti stati 3 minute in nato se ponovno meša 15 sekund, vsi delci, ki se držijo čaše, pa se skrbno sperejo po notranji površini z najmanj 10 ml čistega tetrakloroetilena. Tako dobljena mešanica se pusti stati vsaj 5 minut, nato se tekoča frakcija pazljivo dekantira in zavrže, da se usedlina v celoti ohrani.
            Usedlina se posuši in nato stehta (na 0,001 g natančno). Če več kot 5 % usedline sestavljajo delci velikosti > 0,50 mm, se preseje skozi sito 0,25 mm, tako pridobljeni frakciji se nato analizirata.
            2.1.3.3.5   Ekstrakcija in priprava flotata: po pridobitvi usedline z opisano metodo ostaneta v liju ločniku dve fazi: tekoča faza, ki jo tvori tetrakloroetilen, in trdna faza, ki jo tvori plavajoči material. Ta trdna faza je flotat, ki se izolira tako, da se tetrakloroetilen v celoti odlije iz lija z odprtjem petelinčka. Z obrnitvijo lija ločnika na glavo se flotat prenese v veliko petrijevko in posuši na zraku v digestoriju. Če več kot 5 % flotata sestavljajo delci velikosti > 0,50 mm, se preseje skozi sito 0,25 mm, tako pridobljeni frakciji se nato analizirata.
            2.1.3.3.6   Priprava osnovnega materiala: pripravi se vzorec iz najmanj 5 g zmletega podvzorca. Če več kot 5 % materiala sestavljajo delci velikosti > 0,50 mm, se preseje skozi sito 0,25 mm, tako pridobljeni frakciji se nato analizirata.
            2.1.3.4   Priprava vzorcev, ki vsebujejo maščobe ali olja
            Za pripravo vzorcev, ki vsebujejo maščobe ali olja, se uporabi naslednji protokol:
            
                        —
                     
                     
                        če je maščoba trdna, se segreje v pečici, dokler ne postane tekoča,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        40 ml maščobe ali olja z dna vzorca se odpipetira v centrifugirko,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        centrifugira se 10 minut pri 4 000 obr./min.,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        če je maščoba po centrifugiranju trdna, se segreje v pečici, dokler ne postane tekoča,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        ponovno se centrifugira 5 minut pri 4 000 obr./min.,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        z majhno žličko ali lopatico se polovica dekantirane nečistoče prenese na mikroskopska objektna stekelca za pregled, kot sredstvo za pripravo preparata pa se priporoča glicerol,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        preostale nečistoče se uporabijo za pripravo usedline, kot je opisano v točki 2.1.3.3.
                     
                  2.1.3.5   Uporaba reagentov za obarvanje
            Da se omogoči pravilna identifikacija sestavin živalskega izvora, lahko izvajalec med pripravo vzorca uporabi reagente za obarvanje v skladu s smernicami, ki jih je izdal in na svoji spletni strani objavil EURL-AP.
            Če se za barvanje usedline uporabi raztopina rdečega alizarina, se uporabi naslednji protokol:
            
                        —
                     
                     
                        posušena usedlina se prenese v stekleno epruveto in dvakrat spere s približno 5 ml etanola (vsakič se uporabi vorteks mešalnik za 30 sekund, topilo se pusti stati približno 1 minuto in 30 sekund ter se nato odtoči),
                     
                  
                        —
                     
                     
                        usedlina se pobeli z dodatkom najmanj 1 ml raztopine natrijevega hipoklorita. Čas reakcije je 10 minut. Epruveta se napolni z vodo, usedlina se pusti stati 2 do 3 minute, voda in suspendirani delci pa se previdno odtočijo,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        usedlina se dvakrat spere z 10 ml vode (vsakič se za 30 sekund uporabi vorteks mešalnik, pusti se stati in odtoči se voda),
                     
                  
                        —
                     
                     
                        doda se 2 do 10 kapljic raztopine rdečega alizarina in mešanica se premeša v vorteks mešalniku. Čas reakcije je 30 sekund, obarvana usedlina se dvakrat spere s približno 5 ml etanola, nato pa enkrat z acetonom (vsakič se uporabi vorteks mešalnik za 30 sekund, topilo se pusti stati približno 1 minuto ter se nato odtoči),
                     
                  
                        —
                     
                     
                        obarvana usedlina se posuši.
                     
                  2.1.4   Mikroskopski pregled
            
            2.1.4.1   Priprava preparata
            Mikroskopski preparat se pripravi iz sedimenta in, odvisno od izbire izvajalca, flotata ali osnovnega materiala. Če je bilo med pripravo vzorca uporabljeno sejanje, se pripravita obe tako pridobljeni frakciji (fina in groba). Testni vzorci frakcij, ki se nanesejo na objektna stekelca, so reprezentativni za celotno frakcijo.
            Pripraviti je treba zadostno število preparatov, da se lahko zagotovi izvedba celotnega protokola pregleda, kot je določen v točki 2.1.4.2.
            Mikroskopski preparati se pripravijo s primernim sredstvom za pripravo preparata v skladu s standardnimi operativnimi postopki, ki jih je določil in na svoji spletni strani objavil EURL-AP. Preparati se pokrijejo s krovnimi stekelci.
            2.1.4.2   Protokol pregleda za določanje živalskih delcev v krmnih mešanicah in posamičnih krmilih
            Pripravljeni mikroskopski preparati se pregledajo v skladu s protokolom pregleda, prikazanim v diagramu 1 za krmne mešanice in posamična krmila, razen za čisto ribjo moko, za katero je prikazan v diagramu 2.
            Mikroskopski preparat sedimenta in, odvisno od izbire izvajalca, flotata ali osnovnega materiala se pregleda s sestavljenim mikroskopom. Za grobe frakcije se lahko poleg sestavljenega mikroskopa uporabi stereomikroskop. Vsak preparat se pregleda v celoti pri različnih povečavah.
            Pri vsakem koraku protokola pregleda je treba pregledati določeno minimalno število preparatov, razen če celotna frakcija materiala ne omogoča, da se pripravi zahtevano število preparatov. Pri vsakem določanju se pregleda največ šest preparatov.
            Za lažjo identifikacijo narave in izvora delcev lahko izvajalec uporabi podporne elemente, na primer sisteme za podporo pri odločanju, slikovne knjižnice in referenčne vzorce.
            
               Diagram 1:
            
            
               protokol pregleda za določanje živalskih delcev v krmnih mešanicah in posamičnih krmilih, razen v ribji moki
            
            
               
            
               Diagram 2:
            
            
               protokol pregleda za določanje živalskih delcev v ribji moki
            
            
               
            2.1.4.3   Število določanj
            Če pri prvem določanju, izvedenem v skladu s protokolom iz diagrama 1 ali diagrama 2, ni ugotovljen noben živalski delec danega izvora (tj. od kopenskih živali ali rib), ni potrebno dodatno določanje, rezultate analize pa je treba sporočiti z uporabo terminologije iz točke 2.1.5.1.
            Če je bilo pri prvem določanju, izvedenem v skladu s protokolom iz diagrama 1 ali diagrama 2, skupno ugotovljenih od 1 do 5 živalskih delcev danega izvora (tj. od kopenskih živali ali rib), se izvede drugo določanje na novem 50-gramskem podvzorcu. Če je bilo pri drugem določanju ugotovljenih od 0 do 5 živalskih delcev danega izvora, je treba rezultat analize sporočiti z uporabo terminologije iz točke 2.1.5.2., sicer se izvede tretje določanje na novem 50-gramskem podvzorcu. Če pa je po prvem in drugem določanju vsota ugotovljenih delcev danega izvora višja od 15, dodatno določanje ni potrebno, rezultate analize pa je treba neposredno sporočiti z uporabo terminologije iz točke 2.1.5.3. Če je po tretjem določanju vsota ugotovljenih živalskih delcev danega izvora višja od 15, je treba rezultate analize sporočiti z uporabo terminologije iz točke 2.1.5.3. Sicer je treba rezultate analize sporočiti z uporabo terminologije iz točke 2.1.5.2.
            Če se pri prvem določanju, izvedenem v skladu s protokolom pregleda iz diagrama 1 ali diagrama 2, ugotovi več kot 5 živalskih delcev danega izvora (tj. od kopenskih živali ali rib), je treba rezultat analize sporočiti z uporabo terminologije iz točke 2.1.5.3.
            2.1.5   Prikaz rezultatov
            
            V poročilu o rezultatih laboratoriji navedejo, na kateri vrsti materiala je bila opravljena analiza (usedlina, flotat ali osnovni material) in koliko določanj je bilo izvedenih.
            Laboratorijsko poročilo vsebuje vsaj informacije o prisotnosti sestavin, ki izvirajo od kopenskih živali in rib.
            O različnih primerih se poroča na naslednje načine:
            2.1.5.1   Noben ugotovljen živalski delec danega izvora:
            
                        —
                     
                     
                        kolikor je bilo razvidno iz pregleda s svetlobnim mikroskopom, v predloženem vzorcu niso bili ugotovljeni nobeni delci, ki izvirajo od kopenskih živali,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        kolikor je bilo razvidno iz pregleda s svetlobnim mikroskopom, v predloženem vzorcu niso bili ugotovljeni nobeni delci, ki izvirajo od rib.
                     
                  2.1.5.2   V povprečju ugotovljenih od 1 do 5 živalskih delcev danega izvora:
            
                        —
                     
                     
                        kolikor je bilo razvidno iz pregleda s svetlobnim mikroskopom, v predloženem vzorcu v povprečju na določanje ni bilo ugotovljenih več kot pet delcev, ki izvirajo od kopenskih živali. Delci so bili opredeljeni kot … [kost, hrustanec, mišičevje, dlaka, roževina…]. Ta nizka stopnja prisotnosti, ki je pod mejo določanja z mikroskopsko metodo, pomeni, da ni mogoče izključiti tveganja za lažno pozitiven rezultat.
                     
                  Ali, če je primerno,
            
                        —
                     
                     
                        kolikor je bilo razvidno iz pregleda s svetlobnim mikroskopom, v predloženem vzorcu v povprečju na določanje ni bilo ugotovljenih več kot pet delcev, ki izvirajo od rib. Delci so bili opredeljeni kot … [ribja kost, ribja luskina, hrustanec, mišičevje, otolit, škrga…]. Ta nizka stopnja prisotnosti, ki je pod mejo določanja z mikroskopsko metodo, pomeni, da ni mogoče izključiti tveganja za lažno pozitiven rezultat.
                     
                  V primeru predhodnega presejanja vzorca mora biti v laboratorijskem poročilu navedeno, v kateri frakciji (presejana frakcija, frakcija iz briketov ali zrna) so bili ugotovljeni živalski delci, če je določitev živalskih delcev samo v presejani frakciji, je to lahko znak okoljskega onesnaženja.
            2.1.5.3   V povprečju ugotovljenih več kot 5 živalskih delcev danega izvora
            
                        —
                     
                     
                        kolikor je bilo razvidno iz pregleda s svetlobnim mikroskopom, je bilo v predloženem vzorcu v povprečju na določanje ugotovljenih več kot pet delcev, ki izvirajo od kopenskih živali. Delci so bili opredeljeni kot … [kost, hrustanec, mišičevje, dlaka, roževina…].
                     
                  Ali, če je primerno,
            
                        —
                     
                     
                        kolikor je bilo razvidno iz pregleda s svetlobnim mikroskopom, je bilo v predloženem vzorcu v povprečju na določanje ugotovljenih več kot pet delcev, ki izvirajo od rib. Delci so bili opredeljeni kot … [ribja kost, ribja luskina, hrustanec, mišičevje, otolit, škrga…].
                     
                  V primeru predhodnega presejanja vzorca mora biti v laboratorijskem poročilu navedeno, v kateri frakciji (presejana frakcija, frakcija iz briketov ali zrna) so bili ugotovljeni živalski delci, če je določitev živalskih delcev samo v presejani frakciji, je to lahko znak okoljskega onesnaženja.
            2.2   PCR
            
            2.2.1   Načelo
            
            Fragmenti dezoksiribonukleinske kisline (DNK) živalskega izvora, ki so lahko prisotni v posamičnih krmilih in krmnih mešanicah, se ugotavljajo z metodo PCR (tehnika za pomnoževanje genskega materiala), s katero se ugotavljajo posebne sekvence DNK, značilne za vrsto.
            Pri metodi PCR se najprej opravi ekstrakcija DNK. Pomnoževalni del metode se nato izvede na tako dobljenem ekstraktu DNK, da se ugotovi živalska vrsta, na katero se pregleduje.
            2.2.2   Reagenti in oprema
            
            2.2.2.1   Reagenti
            2.2.2.1.1   Reagenti za ekstrakcijo DNK
            Uporabljajo se le reagenti, ki jih je odobril in na svoji spletni strani objavil EURL-AP.
            2.2.2.1.2   Reagenti za pomnožitev genskega materiala
            2.2.2.1.2.1   Začetni oligonukleotidi in sonde
            Uporabljajo se samo začetni oligonukleotidi in sonde z zaporedji oligonukleotidov, ki jih je validiral EURL-AP (2).
            2.2.2.1.2.2   Osnovna zmes
            Uporabljajo se samo raztopine osnovne zmesi, ki ne vsebujejo reagentov, ki lahko povzročijo lažne rezultate zaradi prisotnosti živalske DNK (3).
            2.2.2.1.2.3   Reagenti za dekontaminacijo
            2.2.2.1.2.3.1   Raztopina klorovodikove kisline (0,1M)
            2.2.2.1.2.3.2   Belila (raztopina natrijevega hipoklorita z 0,15 % aktivnega klora)
            2.2.2.1.2.3.3   Nejedki reagenti za dekontaminacijo dragih naprav, kot so analitske tehtnice (npr. DNA EraseTM od MP Biomedicals).
            2.2.2.2   Oprema
            2.2.2.2.1   Analitska tehtnica, natančna na 0,001 g
            2.2.2.2.2   Oprema za mletje
            2.2.2.2.3   Naprava za ciklično termostatiranje, ki omogoča PCR v realnem času
            2.2.2.2.4   Mikrocentrifuga za mikrocentrifugirke
            2.2.2.2.5   Sklop mikropipet, ki omogočajo pipetiranje od 1 μl do 1 000 μl
            2.2.2.2.6   Standardna plastična oprema za molekularno biologijo: mikrocentrifugirke, plastični nastavki s filtri za mikropipete, plošče, primerne za napravo za ciklično termostatiranje.
            2.2.2.2.7   Zamrzovalniki za shranjevanje vzorcev in reagentov
            2.2.3   Vzorčenje in priprava vzorcev
            
            2.2.3.1   Vzorčenje
            Uporabi se reprezentativni vzorec, ki je bil odvzet v skladu z določbami iz Priloge I.
            2.2.3.2   Priprava vzorca
            Pri pripravi laboratorijskih vzorcev do ekstrakcije DNK je treba upoštevati zahteve iz Priloge II. Iz najmanj 50 g vzorca se pripravi podvzorec za analizo, ki se nato zmelje.
            V skladu s standardom ISO 24276 se priprava vzorca izvede v drugem prostoru kot ekstrakcija DNK in pomnožitev genskega materiala.
            Pripravita se dva testna vzorca z najmanj 100 mg.
            2.2.4   Ekstrakcija DNK
            
            Ekstrakcija DNK se opravi na vsakem pripravljenem testnem vzorcu v skladu s standardnimi operativnim postopki, ki jih je določil in na svoji spletni strani objavil EURL-AP.
            Za vsako serijo ekstrakcije DNK se pripravita dva kontrolna vzorca, kot je opisano v standardu ISO 24276:
            
                        —
                     
                     
                        slepi kontrolni vzorec na stopnji ekstrakcije DNK,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        pozitivni kontrolni vzorec na stopnji ekstrakcije DNK.
                     
                  2.2.5   Pomnožitev genskega materiala
            
            Genski material se pomnoži z metodami, ki so bile validirane za vsako vrsto, na katero se pregleduje. Te metode so določene v standardnih operativnih postopkih, ki jih je določil in na svoji spletni strani objavil EURL-AP. Vsak ekstrakt DNK se analizira pri najmanj dveh različnih razredčitvah, da se oceni učinek zaviranja.
            Za vsako ciljno vrsto se pripravita dva kontrolna vzorca, ki se pomnožita, kot je opisano v standardu ISO 24276:
            
                        —
                     
                     
                        pozitivni kontrolni vzorec s ciljno DNK se uporabi za vsako ploščo ali serijo analiz PCR,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        kontrolni vzorec reagenta za pomnoževanje (imenovan tudi kontrolni vzorec brez matrice) se uporabi za vsako ploščo ali serijo analiz PCR.
                     
                  2.2.6   Razlaga in prikaz rezultatov
            
            V poročilu o rezultatih mora laboratorij navesti vsaj maso uporabljenega testnega vzorca, uporabljeno tehniko za ekstrakcijo, število izvedenih določanj in mejo zaznavnosti metode.
            Rezultati se ne smejo razlagati in poročati, če pozitivni kontrolni vzorec na stopnji ekstrakcije DNK in pozitivni kontrolni vzorec s ciljno DNK ne omogočata določitve ciljne vrste pri analizi, medtem ko je rezultat pri kontrolnem vzorcu reagenta za pomnoževanje negativen.
            Če se rezultata dveh testnih vzorcev ne ujemata, je treba ponoviti vsaj korak pomnožitve genskega materiala. Če laboratorij domneva, da so razlog za neujemanje lahko ekstrakti DNK, je treba pred razlago rezultatov opraviti novo ekstrakcijo DNK in pomnožitev genskega materiala.
            Pri končnem prikazu rezultatov je treba upoštevati smernice o vključevanju in razlagi rezultatov dveh testnih vzorcev v skladu s standardnimi operativnimi postopki, kot jih je določil in na svoji spletni strani objavil EURL-AP.
            2.2.6.1   Negativen rezultat
            O negativnem rezultatu se poroča na naslednji način:
            V predloženem vzorcu ni bila ugotovljena DNK iz X (X pomeni živalsko vrsto ali skupino živalskih vrst, na katere se pregleduje).
            2.2.6.2   Pozitiven rezultat
            O pozitivnem rezultatu se poroča na naslednji način:
            V predloženem vzorcu je bila ugotovljena DNK iz X (X pomeni živalsko vrsto ali skupino živalskih vrst, na katere se pregleduje).“
         
      
      
         (1)  http://eurl.craw.eu/
      
         (2)  Seznam teh začetnih oligonukleotidov in sond za vsako živalsko vrsto, na katero se pregleduje, je na voljo na spletni strani EURL-AP.
      
         (3)  Primeri osnovnih zmesi, ki so funkcionalne. so na voljo na spletni strani EURL-AP.