CELEX: 31978L0633
Language: de
Date: 1978-06-15 00:00:00
Title: Achte Richtlinie 78/633/EWG der Kommission vom 15. Juni 1978 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln

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31978L0633

Achte Richtlinie 78/633/EWG der Kommission vom 15. Juni 1978 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln  

Amtsblatt Nr. L 206 vom 29/07/1978 S. 0043 - 0055 Finnische Sonderausgabe: Kapitel 3 Band 10 S. 0071  Griechische Sonderausgabe: Kapitel 03 Band 22 S. 0067  Schwedische Sonderausgabe: Kapitel 3 Band 10 S. 0071  Spanische Sonderausgabe: Kapitel 03 Band 14 S. 0230  Portugiesische Sonderausgabe: Kapitel 03 Band 14 S. 0230 

ACHTE RICHTLINIE DER KOMMISSION  vom 15. Juni 1978  zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln  (78/633/EWG)  DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN -  gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft,  gestützt auf die Richtlinie 70/373/EWG des Rates vom 20. Juli 1970 über die Einführung gemeinschaftlicher Probenahmeverfahren und Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (1), zuletzt geändert durch die Beitrittsakte, insbesondere auf Artikel 2,  in Erwägung nachstehender Gründe:  Die obengenannte Richtlinie bestimmt, daß die amtlichen Untersuchungen von Futtermitteln zur Feststellung, ob die aufgrund der Rechts- oder Verwaltungsvorschriften festgelegten Anforderungen hinsichtlich Beschaffenheit und Zusammensetzung der Futtermittel erfuellt sind, nach gemeinschaftlichen Probenahmeverfahren und Analysemethoden durchgeführt werden.  Mit den Richtlinien der Kommission 71/250/EWG vom 15. Juni 1971 (2), 71/393/EWG vom 18. November 1971 (3), 72/199/EWG vom 27. April 1972 (4), 73/46/EWG vom 5. Dezember 1972 (5), 74/203/EWG vom 25. März 1974 (6), 75/84/EWG vom 20. Dezember 1974 (7) und 76/372/EWG vom 1. März 1976 (8) wurde bereits eine Reihe von Analysemethoden festgelegt. Der Stand der seitdem durchgeführten Arbeiten ermöglicht es nunmehr, eine achte Reihe von Analysemethoden festzulegen.  Die in dieser Richtlinie vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des Ständigen Futtermittelausschusses -  HAT FOLGENDE RICHTLINIE ERLASSEN:    Artikel 1 (1) Die Mitgliedstaaten schreiben vor, daß die Analysen für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln auf ihren Gehalt an Zink-Bacitracin, Flavophospholipol, Eisen, Kupfer, Mangan und Zink nach den in der Anlage zu dieser Richtlinie beschriebenen Methoden durchgeführt werden.  (2) Die allgemeinen Bestimmungen des Teils 1 "Einführung" der Anlage zur Ersten Richtlinie 71/250/EWG, mit Ausnahme des die Vorbereitung der Analyseprobe betreffenden Teils, finden auf die in der Anlage zu dieser Richtlinie beschriebenen Methoden Anwendung.   Artikel 2 Die Mitgliedstaaten setzen zum 1. Januar 1979 die erforderlichen Rechts- oder Verwaltungsvorschriften in Kraft, um den Bestimmungen dieser Richtlinie nachzukommen. Sie setzen die Kommission unverzueglich hiervon in Kenntnis.   Artikel 3 Diese Richtlinie ist an alle Mitgliedstaaten gerichtet.     Brüssel, den 15. Juni 1978  Für die Kommission  Der Vizepräsident  Finn GUNDELACH  (1)ABl. Nr. L 170 vom 3.8.1970, S. 2. (2)ABl. Nr. L 155 vom 12.7.1971, S. 13. (3)ABl. Nr. L 279 vom 20.12.1971, S. 7. (4)ABl. Nr. L 123 vom 29.5.1972, S. 6. (5)ABl. Nr. L 83 vom 30.3.1973, S. 21. (6)ABl. Nr. L 108 vom 22.4.1974, S. 7. (7)ABl. Nr. L 32 vom 5.2.1975, S. 26. (8)ABl. Nr. L 102 vom 15.4.1976, S. 8.     ANLAGE   1. BESTIMMUNG VON ZINK-BACITRACIN - DURCH DIFFUSION IN AGARNÄHRBODEN  1. ZWECK UND ANWENDUNGSBEREICH  Die Methode erlaubt die Bestimmung von Zink-Bacitracin in Futtermitteln, Konzentraten und Vormischungen. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 5 mg/kg (5 ppm) (*). Die Methode ist bei Anwesenheit von Störsubstanzen - insbesondere grösserer Mengen Kupfer oder Ascorbinsäure - nicht gültig.   2. PRINZIP  Die Probe wird bei pH 2 mit einer Mischung aus Methanol/Wasser/Salzsäure extrahiert. Der Extrakt wird auf pH 6,5 gebracht, eingeengt (falls erforderlich) und verdünnt. Seine antibiotische Aktivität wird durch Messung der Diffusion des Zink-Bacitracins in einem mit Micrococcus luteus (Syn. M. flavus) beimpften Agarnährboden bestimmt. Die Diffusion wird durch die entstehenden Hemmzonen mit dem Testorganismus nachgewiesen. Der Durchmesser dieser Hemmzonen wird für den Bereich der angewandten Konzentrationen als dem Logarithmus der Konzentration an Antibiotikum direkt proportional angesehen.  3. TESTORGANISMUS : MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240    3.1. Haltung der Stammkultur  Agarschrägröhrchen mit dem Kulturnährboden (4.1) werden mit Micrococcus luteus beimpft und 24 Stunden bei 30 bis 37º C bebrütet. Die Kultur wird im Kühlschrank bei etwa 4º C aufbewahrt und alle zwei Wochen neu überimpft.     3.2. Herstellung der keimsuspension (a) >PIC FILE= "T0013268">       4. NÄHRBÖDEN UND REAGENZIEN  4.1. Kulturnährböden (b)  >PIC FILE= "T9001025">   4.2. Testnährboden  >PIC FILE= "T9001026">   4.3. Natriumchlorid-Lösung 0,8 v.H.(G/V): 8 g Natriumchlorid p.a. werden in Wasser aufgelöst und auf 1000 ml verdünnt ; die Lösung wird sterilisiert.   4.4. Mischung aus Methanol, rein/Wasser/Salzsäure p.a. (D : 1,18 bis 1,19) : 80/17, 5/2,5 (V/V/V).    (*)1 mg Zink-Bacitracin (Futtermittel-Qualität) entspricht 42 Internationalen Einheiten (IE) (a)Andere Methoden, die entsprechende Bakteriensuspensionen ergeben, können verwendet werden. (b)Jeder handelsübliche Nährboden entsprechender Zusammensetzung, der dieselben Ergebnisse erbringt, kann verwendet werden.  4.5. Phosphatpuffer, pH 6,5: >PIC FILE= "T0013269">  4.6 Salzsäure p.a., D : 1,18 bis 1,19   4.7 Salzsäure p.a., 0,1 N   4.8 Natriumhydroxidlösung p.a., 1 N   4.9 Bromkresol-Purpurlösung 0,04 v.H. (G/V):  0,1 g Bromkresol-Purpur werden in 18,5 ml 0,01 N Natriumhydroxidlösung aufgelöst, bis 250 ml mit Wasser aufgefuellt und gemischt.   4.10 Standardsubstanz : Zink-Bacitracin von bekannter Aktivität (in IE).      5.  STANDARDLÖSUNGEN  Eine Menge der Standardsubstanz (4.10), die 1050 IE (gemäß der angegebenen Aktivität) entspricht, wird eingewogen und 15 Minuten mit 5 ml 0,1 N Salzsäure (4.7) stehengelassen. Nach Zusatz von 30 ml Wasser wird der pH-Wert auf 4,5 mit Phosphatpuffer pH 6,5 (4.5) (ca. 4 ml) eingestellt und die Lösung bis 50 ml mit Wasser aufgefuellt und gemischt (1 ml = 21 IE).  Aus dieser Lösung werden durch aufeinanderfolgende Verdünnungen mit Phosphatpuffer pH 6,5 (4.5) folgende Lösungen hergestellt: >PIC FILE= "T0013270">    6. HERSTELLUNG DES EXTRAKTS      6.1. Extraktion        6.1.1. Konzentrate, Vormischungen und Mineralfutter  Einer abgewogenen Menge von 2,0 bis 5,0 g der Probe werden 30 ml der Mischung (4.4) zugesetzt und kurz geschüttelt. Nach einer Kontrolle des pH-Wertes, der etwa 2 betragen soll, wird 10 Minuten geschüttelt, 30 ml Phosphatpuffer pH 6,5 (4.5) zugesetzt und erneut 15 Minuten geschüttelt. Dann wird mit Phosphatpuffer (4.5) verdünnt, um einen erwarteten Zink-Bacitracin-Gehalt von 0,42 IE/ml (= U8) zu erhalten.               6.1.2. Protein-Konzentrate  Einer abgewogenen Menge von 10,0 g der Probe werden 50 ml der Mischung (4.4) zugesetzt und kurz geschüttelt. Nach einer Kontrolle des pH-Wertes, der etwa 2 betragen soll, wird 10 Minuten geschüttelt, 50 ml Phosphatpuffer pH 6,5 (4.5) zugesetzt und erneut 15 Minuten geschüttelt. Dann wird mit Phosphatpuffer (4.5) verdünnt, um einen erwarteten Zink-Bacitracin-Gehalt von 0,42 IE/ml (= U8) zu erhalten.               6.1.3. Sonstige Futtermittel  Einer abgewogenen Menge von 10,0 g der Probe (20,0 g für einen erwarteten Zink-Bacitracin-Gehalt von 5 mg/kg) werden 25 ml der Mischung (4.4) zugesetzt und 10 Minuten gemischt. Dann werden 25 ml Phosphatpuffer pH 6,5 (4.5) zugesetzt, 15 Minuten geschüttelt und zentrifugiert. 20 ml der überstchenden Lösung werden abgenommen und der pH-Wert auf 6,5 mit 1 Natriumhydroxidlösung (4.8) eingestellt, wobei die Bromkresol-Purpurlösung (4.9) als Indikator gebraucht wird. Dann wird die Lösung in einem Rotationsverdampfer bei einer 35º C nicht überschreitenden Temperatur bis auf etwa 4 ml eingedampft. Der Rückstand wird mit Wasser verdünnt, um einen erwarteten Zink-Bacitracin-Gehalt von 0,42 IE/ml (= U8) zu erhalten.                          6.2. Testlösungen  Von der Lösung U8 wurden die Lösungen U4 (erwarteter Gehalt : 0,21 IE/ml), U2 (erwarteter Gehalt : 0,105 IE/ml) und U1 (erwarteter Gehalt : 0,0525 IE/ml) durch aufeinanderfolgende Verdünnung (1+1) mit Phosphatpuffer (4.5) hergestellt.       7. TESTVERFAHREN        7.1. Beimpfung des Nährbodens  Der Testnährboden (4.2) wird mit der Keimsuspension (3.2) bei ca. 50 ºC beimpft. Bei Vorversuchen auf Platten mit dem Testnährboden (4.2) wird die Menge der Keimsuspension ermittelt, die möglichst grosse, aber noch scharfe Hemmzonen mit den verschiedenen verwendeten Konzentrationen an Zink-Bacitracin ergibt.                7.2. Herstellung der Platten  Der Test ist als Diffusionstest auf Platten mit je vier Konzentrationsstufen der Standardlösung (S8, S4, S2, S1) und der Testlösung (U8, U4, U2, U1) angelegt.  Jede Platte erhält unbedingt alle vier Konzentrationen des Standards und des Extrakts. Daher muß die Plattengrösse so bemessen sein, daß mindestens acht Löcher mit einem Durchmesser von 10 bis 13 mm und mindestens 30 mm zwischen den Lochzentren in die Nährbodenschicht gestanzt werden können.  Der Test sollte vorzugsweise auf Platten durchgeführt werden, die aus einer Glasscheibe mit einem darauf gelegten plangedrehten Alumunium- oder Kunststoffring von 20 mm Höhe und 200 mm Durchmesser hergestellt werden. Auf die Platten wird eine Menge des nach 7.1 beimpften Testnährbodens (4.2) gegossen, daß sich eine ca. 2 mm dicke Schicht ergibt (50 ml für eine Platte von 200 mm Durchmesser). Nachdem die Schicht fest geworden ist, werden die Löcher gestanzt und genau abgemessene Mengen der Standard- und Testlösungen einpipettiert (zwischen 0,10 und 0,15 ml pro Loch, je nach Lochdurchmesser).  Jede Konzentration muß mindestens in 4facher Wiederholung angewendet werden, so daß für jeden Test 32 Hemmzonen ausgewertet werden.               7.3. Inkubation  Die Inkubation erfolgt während 16 bis 18 Stunden bei 28 bis 30º C.    8. AUSWERTUNG  Der Durchmesser der Hemmzonen wird auf 0,1 mm genau gemessen. Für jede Konzentration werden die Mittelwerte auf Semilogarithmenpapier aufgetragen, wobei der Logarithmus der Konzentrationen gegen den Durchmesser der Hemmzonen eingetragen wird. Für die Standardlösung sowie für den Extrakt werden die geeignetsten Geraden - wie beispielsweise nachstehend berechnet - gezogen.  Der geeignetste Punkt für das niedrigste Niveau der Standardlösung (SL) wird nach folgender Formel ermittelt: >PIC FILE= "T0013271">  Der geeignetste Punkt für das höchste Niveau der Standardlösung (SH) wird nach folgender Formel ermittelt: >PIC FILE= "T0013272">  Genauso werden auch die geeignetsten Punkte für das niedrigste (UL) und höchste Niveau (UH) des Extrakts ermittelt, indem in der obigen Formel - anstelle von s1, s2, s4 und s8 - u1, u2, u 4 und u8 eingesetzt werden. Die ermittelten SL- und SH-Werte werden auf dasselbe Diagramm aufgetragen. Indem man die beiden Punkte miteinander verbindet, erhält man die geeignetste Gerade für die Standardlösung. Ebenso wird mit den UL- und UH-Werten verfahren, um die geeignetste Gerade für den Extrakt zu erhalten.  In Abwesenheit von Störfaktoren sollten die Geraden parallel sein. Die Geraden können als parallel angesehen werden, wenn die Werte (SH-SL) und (UH-UL) nicht mehr als 10 v.H. vom Mittelwert abweichen.  Falls die Geraden nicht parallel sind, kann man entweder u1 und s1 oder u8 und s8 ausschalten. Dann sind die Werte SL, SH, UL und UH mit folgenden Formeln zu ermitteln, um die geeignetste Gerade zu erhalten: >PIC FILE= "T0013273">  Ebenso wird für UL und UH verfahren. Mit diesen Alternativen soll auch die Parallelität der Geraden überprüft werden. Ergebnisse, die aus drei Niveaus ermittelt wurden, sollen in dem Analyseprotokoll vermerkt sein.  Wenn die Geraden als parallel anzusehen sind, wird der Logarithmus der relativen Aktivität (log. A) durch eine der folgenden Formeln ermittelt:  Für 4 Niveaus >PIC FILE= "T0013274">   Für 3 Niveaus >PIC FILE= "T0013275">  Tatsächliche Aktivität = angenommene Aktivität × relative Aktivität.  Wenn die Geraden nicht als parallel anzusehen sind, wird die Bestimmung wiederholt, Wenn auch dann keine Parallelität erreicht wurde, ist der Logarithmus der relativen Aktivität (log. A) mit der Formel (c) zu ermitteln. Das erhaltene Ergebnis ist als angenähert anzusehen ; dies sollte im Analysenprotokoll vermerkt werden.   9. WIEDERHOLBARKEIT  Der Unterschied zwischen den Ergebnissen zweier Bestimmungen eines Analytikers sollte bei ein- und derselben Probe bei Gehalten von:  5 bis 25 mg/kg Zink-Bacitracin 20 v.H. des höheren Resultats,  mehr als 25 bis 50 mg/kg 5 mg/kg absolut,  mehr als 50 mg/kg 10 v.H. des höheren Resultats  nicht überschreiten.     2. BESTIMMUNG VON FLAVOPHOSPHOLIPOL - DURCH DIFFUSION IN AGARNÄHRBODEN          1. ZWECK UND ANWENDUNGSBEREICH Die Methode erlaubt die Bestimmung von Flavophospholipol in Futtermitteln, Konzentraten und Vormischungen. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 1 mg/kg (1 ppm).                   2. PRINZIP  Die Probe wird mit verdünntem Methanol durch Erhitzen am Rückfluß extrahiert. Nach Zentrifugieren wird der Extrakt (falls erforderlich) durch Behandlung mit Ionenaustauschern gereinigt und verdünnt. Seine antibiotische Aktivität wird durch Messung der Diffusion des Flavophospholipols in einem mit Staphylococcus aureus beimpften Agarnährboden bestimmt. Die Diffusion wird durch die entstehenden Hemmzonen mit dem Testorganismus nachgewiesen. Der Durchmesser dieser Hemmzonen wird für den Bereich der angewandten Konzentrationen als dem Logarithmus der Konzentration an Antibiotikum direkt proportional angesehen.                   3. TESTORGANISMUS : STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P            3.1. Haltung der Stammkultur  Agarschrägröhrchen mit Kulturnährboden (4.1) werden mit Staphylococcus aureus beimpft und 24 Stunden bei 37º C bebrütet. Die Kultur wird im Kühlschrank bei etwa 4º C aufbewahrt und jeden Monat neu überimpft.                       3.2. Herstellung der Keimsuspension (a)  Von der Stammkultur (3.1) werden 2 Schrägröhrchen wöchentlich überimpft, 24 Stunden bei 37º C bebrütet und im Kühlschrank bei etwa 4º C aufbewahrt.  24 Stunden vor dem Test werden mit dieser Kultur 2 bis 4 Schrägröhrchen mit Kulturnährboden (4.1) beimpft und 16 bis 18 Stunden bei 37º C bebrütet. Dann werden die Keime mit Natriumchloridlösung (4.3) aufgenommen und die Suspension verdünnt, um eine Lichtdurchlässigkeit bei 578 nm und 1 cm Schichtdicke gegen Natriumchloridlösung (4.3) von etwa 40 v.H. zu erhalten.  (a)Andere Methoden, die entsprechende Bakteriensuspensionen ergeben, können verwendet werden.      >PIC FILE= "T0013276">     >PIC FILE= "T0013277">  7. HERSTELLUNG DES EXTRAKTS              7.1. Extraktion                7.1.1. Konzentrate, Vormischungen und Mineralfutter  Einer abgewogenen Menge von 2,0 bis 5,0 g der Probe werden 150 mg Ascorbinsäure (4.13) zugesetzt und in einem Erlenmeyerkolben (5.3) mit 150 ml 50 v.H. Methanol (4.5) gemischt. Der pH-Wert wird auf 8,1 bis 8,2 mit ca. 400 mg Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (4.7) eingestellt und mit Indikatorpapier (4.12) kontrolliert. Nach 15 Minuten wird der pH-Wert mit Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (4.7) erneut auf 8,1 bis 8,2 eingestellt und die Mischung 10 Minuten am Rückfluß (5.4) unter ständigem Rühren gekocht. Nach Abkühlen wird abzentrifugiert und der Exakt dekantiert.                               7.1.2. Sonstige Futtermittel  Eine Menge von 5,0 bis 30,0 g der Probe, die mindestens 30 ¶g Flavophospholipol enthält, wird eingewogen und in einem Erlenmeyerkolben (5.3) mit 150 ml 50 v.H. Methanol (4.5) gemischt. Der pH-Wert wird auf 8,1 bis 8,2 mit ca. 400 mg Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (4.7) eingestellt und mit Indikatorpapier (4.12) kontrolliert. Nach 15 Minuten wird der pH-Wert mit Tris(thydroxymethyl)-aminomethan (4.7) erneut auf 8,1 bis 8,2 eingestellt und die Mischung 10 Minuten am Rückfluß (5.4) unter ständigem Rühren gekocht. Nach Abkühlen wird abzentrifugiert und der Extrakt dekantiert.                                                          7.2. Reinigung (bei Konzentraten, Vormischungen und Mineralfutter nicht erforderlich)  110 ml des Extraktes werden mit 11 g Kationenaustauscher (4.9) versetzt und eine Minute am Rückfluß (5.4) unter ständigem Rühren gekocht.  Nach Abtrennung des Kationenaustauschers durch Zentrifugieren oder Filtrieren werden 100 ml des Extraktes mit 150 ml Methanol (4.4) versetzt und die Lösung 12 bis 15 Stunden bei 4 ºC aufbewahrt. Die Abtrennung der Ausflockung erfolgt durch Filtration der gekühlten Lösung.  Am unteren Ende eines Glasrohrs (5.1) wird ein Glaswollstopfen (4.11) eingeführt, anschließend werden 5 ml des Anionenaustauschers (4.10) in das Rohr gegossen und die Säule mit 100 ml 80 v.H. Methanol (4.6) gewaschen. Mit Hilfe des Trichters (5.2) werden mindestens 100 ml des Filtrats, das 16 ¶g Flavophospholipol enthalten sollte (200 ml für 30 g Futtermittelprobe mit 1 ppm) auf die Säule gegeben. Falls erforderlich, wird das Filtrat vor Aufbringen auf die Säule mit 80 v.H. Methanol (4.6) verdünnt, um einen erwarteten Flavophospholipolgehalt von 16 ¶g/100 ml zu erhalten. Die Durchflußgeschwindigkeit wird auf ca. 2 ml/Minute eingestellt, der Durchlauf verworfen. Die Säule wird dann mit 50 ml 80 v.H. Methanol (4.6) gewaschen und der Durchlauf verworfen.  Das Flavophospholipol wird mit der Kaliumchlorid-Methanollösung (4.8) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von ca. 2 ml/Minute eluiert. 50 ml des Eluats werden in einem Meßzylinder aufgefangen und mit 30 ml Wasser gemischt. Diese Lösung sollte 0,2 ¶g/ml (= U8) Flavophospholipol enthalten.                           7.3. Testlösungen  Falls erforderlich (d.h. wenn keine Reinigung vorgenommen wurde), wird der in 7.1.1 erhaltene Extrakt mit 50 v.H. Methanol (4.5) verdünnt, um einen erwarteten Flavophospholipolgehalt von 0,2 ¶g/ml (= U8) zu erhalten.  Von der Lösung U8 werden die Lösungen U 4 (erwarteter Gehalt : 0,1 ¶g/ml), U2 (erwarteter Gehalt : 0,05 ¶g/ml) und U1 (erwarteter Gehalt : 0,025 ¶g/ml) durch aufeinanderfolgende Verdünnung (1+1) mit 50 v.H. Methanol (4.5) hergestellt.   8. TESTVERFAHREN                8.1. Beimpfung des Nährbodens  Der Testnährboden (4.2.2) wird mit der Keimsuspension (3.2) bei ca. 50º C beimpft. Bei Vorversuchen auf Platten mit dem Testnährboden (4.2.2) wird die Menge der Keimsuspension ermittelt, die möglichst grosse, aber noch scharfe Hemmzonen mit den verschiedenen verwendeten Konzentrationen an Flavophospholipol ergibt (etwa 30 ml pro Liter).                               8.2. Herstellung der Platten  Der Test ist als Diffusionstest auf Platten mit je vier Konzentrationsstufen der Standardlösung (S8, S 4, S2, S1) und der Testlösung (U8, U4, U2, U1) angelegt. Jede Platte erhält unbedingt alle vier Konzentrationen des Standards und des Extrakts. Daher muß die Plattengrösse so bemessen sein, daß mindestens acht Löcher mit einem Durchmesser von 10 bis 13 mm und mindestens 30 mm  zwischen den Lochzentren in die Nährbodenschicht gestanzt werden können. Der Test sollte vorzugsweise auf Platten durchgeführt werden, die aus einer Glasscheibe mit einem darauf gelegten plangedrehten Aluminium- oder Kunststoffring von 20 mm Höhe und 200 mm Durchmesser hergestellt werden.  Auf die Platten wird eine Menge der Basalschicht (4.2.1) gegossen, daß sich eine 1,5 mm dicke Schicht ergibt (45 ml für eine Platte von 200 mm Durchmesser). Nachdem die Schicht fest geworden ist, wird mit einer Menge der Keimschicht (4.2.2) - beimpft wie unter 8.1 - überschichtet, um eine Schicht von 1 mm zu erhalten (30 ml für eine Platte von 200 mm Durchmesser). Nachdem auch diese Schicht fest geworden ist, werden die Löcher gestanzt und genau abgemessene Mengen der Standard- und Testlösungen einpipettiert (zwischen 0,10 und 0,15 ml pro Loch, je nach Lochdurchmesser).  Jede Konzentration muß mindestens in 4facher Wiederholung angewendet werden, so daß für jeden Test 32 Hemmzonen ausgewertet werden.                               8.3. Inkubation  Die Inkubation erfolgt während 16 bis 18 Stunden bei 28 bis 30º C.    9. AUSWERTUNG  Der Durchmesser der Hemmzonen wird auf 0,1 mm genau gemessen. Für jede Konzentration werden die Mittelwerte auf Semilogarithmenpapier aufgetragen, wobei der Logarithmus der Konzentrationen gegen den Durchmesser der Hemmzonen eingetragen wird. Für die Standardlösung sowie für den Extrakt werden die geeignetsten Geraden - wie beispielsweise nachstehend berechnet - gezogen.  Der geeignetste Punkt für das niedrigste Niveau der Standardlösung (SL) wird nach folgender Formel ermittelt: >PIC FILE= "T0013278">  Der geeignetste Punkt für das höchste Niveau der Standardlösung (SH) wird nach folgender Formel ermittelt: >PIC FILE= "T0013279">  Genauso werden auch die geeignetsten Punkte für das niedrigste (UL) und höchste Niveau (UH) des Extraktes ermittelt, indem in der obigen Formel - anstelle von s1, s2, s4 und s8 - u1, u 2, u 4 und u8 eingesetzt werden.  Die ermittelten SL- und SH-Werte werden auf dasselbe Diagramm aufgetragen. Indem man die beiden Punkte miteinander verbindet, erhält man die geeignetste Gerade für die Standardlösung. Ebenso wird mit den UL- und UH-Werten verfahren, um die geeignetste Gerade für den Extrakt zu erhalten.  In Abwesenheit von Störfaktoren sollten die Geraden parallel sein. Die Geraden können als parallel angesehen werden, wenn die Werte (SH-SL) und (UH-UL) nicht mehr als 10 v.H. vom Mittelwert abweichen.  Falls die Geraden nicht parallel sind, kann man entweder u1 und s1 oder u8 und s8 ausschalten. Dann sind die Werte SL, SH, UL und UH mit folgenden Formeln zu ermitteln, um die geeignetste Gerade zu erhalten: >PIC FILE= "T0013280">  Ebenso wird für UL und UH verfahren. Mit diesen Alternativen soll auch die Parallelität der Geraden überprüft werden. Ergebnisse, die aus drei Niveaus ermittelt wurden, sollen in dem Analyseprotokoll vermerkt sein.  Wenn die Geraden als parallel anzusehen sind, wird der Logarithmus der relativen Aktivität (log. A) durch eine der folgenden Formeln ermittelt:  Für 4 Niveaus >PIC FILE= "T0013281">   Für 3 Niveaus >PIC FILE= "T0013282">  Tatsächliche Aktivität = angenommene Aktivität × relative Aktivität.  Wenn die Geraden nicht als parallel anzusehen sind, wird die Bestimmung wiederholt. Wenn auch dann keine Parallelität erreicht wurde, ist der Logarithmus der relativen Aktivität (log. A) mit der Formel (c) zu ermitteln. Das erhaltene Ergebnis ist als angenähert anzusehen ; dies sollte im Analysenprotokoll vermerkt werden.   10. WIEDERHOLBARKEIT  Der Unterschied zwischen den Ergebnissen zweier Bestimmungen eines Analytikers sollte bei ein- und derselben Probe bei Gehalten von:  1 bis 2 mg/kg Flavophospholipol 0,5 mg/kg absolut,  mehr als 2 bis 10 mg/kg 25 v.H. des höheren Resultats,  mehr als 10 bis 25 mg/kg 20 v.H. des höheren Resultats,  mehr als 25 bis 50 mg/kg 5 mg/kg absolut,  mehr als 50 mg/kg 10 v.H. des höheren Resultats  nicht überschreiten.     3. BESTIMMUNG DER SPURENELEMENTE EISEN, KUPFER, MANGAN UND ZINK                   1. ZWECK UND ANWENDUNGSBEREICH  Die Methode erlaubt die Bestimmung der Spurenelemente Eisen, Kupfer, Mangan und Zink in Futtermitteln. Die unteren Grenzen der Bestimmbarkeit betragen: >PIC FILE= "T0013283">                                   2. PRINZIP  Die Probe wird nach Zerstörung eventuell vorhandener organischer Substanz in Salzsäure gelöst. Die Elemente Eisen, Kupfer, Mangan und Zink werden nach entsprechender Verdünnung der Analysenlösung mittels Atomabsorptionsspektrometrie bestimmt.                                   3. REAGENZIEN  Vorbemerkungen  Das zur Herstellung der Reagenzien und Analysenlösungen verwendete Wasser muß "frei" von den zu bestimmenden Kationen sein. Hierfür kann Wasser verwendet werden, das, entweder in einer Borsilikatglas- oder Quarzapparatur zweifach destilliert oder durch doppelten Ionenaustausch gereinigt wurde.  Die zur Analyse verwendeten Reagenzien müssen mindestens von p.a. -Qualität sein. Die Abwesenheit des zu bestimmenden Elements wird mittels eines Blindversuchs kontrolliert. Falls erforderlich, sind die Reagenzien einer zusätzlichen Reinigung zu unterziehen.  Anstelle der nachfolgend beschriebenen Standardlösungen können auch handelsübliche Standardlösungen verwendet werden, deren Reinheit garantiert und vor Verwendung kontrolliert wurde.                    3.1. Salzsäure p.a., d : 1,19                                       3.2. Salzsäure p.a., 6 N                                       3.3. Salzsäure p.a., 0,5 N                                        3.4. Fluorwasserstoffsäure, 38 bis 40 % ig (v/v) ; Eisengehalt : weniger als 1 mg/l Glührückstand (als Sulfat) : weniger als 10 mg/l                                       3.5. Schwefelsäure p.a., d : 1,84                                       3.6. Wasserstoffperoxid p.a., ca. 100 Vol. Sauerstoff (30 % Gew. %)                                       3.7. Eisen-Standardlösung (1000 ¶g Fe/ml) : 1 g Eisendraht p.a. wird in 200 ml 6 N Salzsäure (3.2) gelöst, es werden 16 ml Wasserstoffperoxid (3.6) zugegeben, dann wird mit Wasser auf 1 l aufgefuellt.                      3.7.1. Eisen-Gebrauchsstandardlösung (100 ¶g Fe/ml) : Die Standardlösung (3.7) wird im Verhältnis 1 + 9 mit Wasser verdünnt.                                                                                  3.8. Kupfer-Standardlösung (1 000 ¶g Cu/ml) : 1 g Kupfer p.a. in Pulverform wird in 25 ml 6 N Salzsäure (3.2) gelöst, es werden 5 ml Wasserstoffperoxid (3.6) zugegeben, dann wird mit Wasser auf 1 l aufgefuellt.                      3.8.1. Kupfer-Gebrauchsstandardlösung (10 ¶g Cu/ml) : Die Standardlösung (3.8) wird im Verhältnis 1 + 9 mit Wasser verdünnt und anschließend die entstehende Lösung wiederum im Verhältnis 1 + 9 mit Wasser verdünnt.                                                                                  3.9. Mangan-Standardlösung (1000 ¶g Mn/ml) : 1 g Mangan p.a. in Pulverform wird in 23 ml 6 N Salzsäure (3.2) gelöst, dann wird mit Wasser auf 1 l aufgefuellt.                      3.9.1. Mangan-Gebrauchsstandardlösung (10 ¶g Mn/ml) : Die Standardlösung (3.9) wird im Verhältnis 1 + 9 mit Wasser verdünnt und anschließend die entstehende Lösung wiederum im Verhältnis 1 + 9 mit Wasser verdünnt.                                                                                  3.10. Zink-Standardlösung (1000 g Zn/ml) : 1 g Zink p.a. in Streifen- oder Plattenform wird in 25 ml 6 N Salzsäure (3.2) gelöst ; dann wird mit Wasser auf 1 l aufgefuellt.                      3.10.1. Zink-Gebrauchsstandardlösung (10 ¶g Zn/ml) : die Standardlösung (3.10) wird im Verhältnis 1 + 9 mit Wasser verdünnt und die entstehende Lösung wiederum im Verhältnis 1 + 9 mit Wasser verdünnt.                                                                                  3.11. Lanthanchloridlösung : Es werden 12 g Lanthanoxid in 150 ml Wasser aufgelöst, 100 ml 6 N Salzsäure (3.2) zugegeben und mit Wasser auf 1 l aufgefuellt.                                                                          4. GERÄTE             4.1. Muffelofen mit Regelvorrichtung und Temperaturanzeige.                                       4.2. Glasgeräte müssen aus resistentem Borsilikatglas sein. Empfohlen wird, Glasgeräte zu benutzen, die ausschließlich der Bestimmung von Spurenelementen vorbehalten bleiben.                                       4.3. Platin- und eventuell Quarzschalen.                                       4.4. Atomabsorptions-Spektrophotometer ; das Gerät muß hinsichtlich seiner Empfindlichkeit und Genauigkeit innerhalb des vorgesehenen Meßbereichs den Methodenanforderungen genügen.                                                                          5. AUSFÜHRUNG                    5.1. Proben mit organischen Bestandteilen                      5.1.1. Veraschung und Herstellung der Analysenlösung (*)                        (i) 5 bis 10 g der Probe (auf ± 0,2 mg genau abgewogen) werden in eine Quarz- oder Platinschale (4.3) gegeben (siehe Hinweis (b)) und im Trockenschrank bei 105 ºC getrocknet ; dann wird die Schale in den kalten Muffelofen (4.1) verbracht. Der Ofen wird geschlossen (siehe Hinweis (c)) und die Temperatur innerhalb ca. 90 Min. langsam auf 450 bis 475 ºC erhöht. Diese Temperatur wird 4 bis 16 Stunden (z. B. über Nacht) aufrechterhalten, um Kohleteilchen zu entfernen ; dann wird der Ofen geöffnet und man lässt abkühlen (siehe Hinweis (d)).  Die Asche wird mit Wasser angefeuchtet und in ein 250-ml-Becherglas überführt. Die Schale wird mit insgesamt etwa 5 ml Salzsäure (3.1) ausgespült und letztere langsam und vorsichtig in das Becherglas gegeben (durch CO2-Bildung eventuell stürmische Reaktion). Unter (*)Grünfutter (frisch oder getrocknet) kann grössere Mengen pflanzlicher Kieselsäure enthalten, welche Spurenelemente binden kann und daher entfernt werden muß. Für Proben dieser Futtermittel muß also nach folgendem geändertem Verfahren vorgegangen werden: Das Verfahren 5.1.1 (i) wird bis zur Filtration durchgeführt. Das den unlöslichen Rückstand enthaltende Filterpapier wird zweimal mit kochendem Wasser ausgewaschen, in eine Platinschale (4.3) gegeben und im Muffelofen bei weniger als 550 ºC bis zum Vollständigen Verschwinden aller Kohleteilchen verascht. Nach dem Abkühlen werden einige Tropfen Wasser, danach 10 bis 15 ml Fluorwasserstoffsäure (3.4) zugegeben und bei circa 150 ºC zur Trockne eingedampft. Verbleibt im Rückstand noch Kieselsäure, so wird diese erneut in einigen ml Fluorwasserstoffsäure (3.4) gelöst und anschließend zur Trockne eingedampft. Dann werden 5 Tropfen Schwefelsäufe (3.5) zugesetzt und so lange erhitzt, bis keine weissen Dämpfe mehr auftreten Nach Zugabe von 5 ml 6 N Salzsäure (3.2) und etwa 30 ml Wasser wird erhitzt, die Lösung in den 250-ml-Meßkolben filtriert und dieser mit Wasser bis zur Marke aufgefuellt (HCl-Konzentration etwa 0,5 N). Man verfährt dann ab 5.1.3.   Schütteln wird Salzsäure (3.1) tropfenweise zugegeben bis die Schaumbildung aufhört. Die Salzsäure wird unter gelegentlichem Umrühren mit einem Glasstab bis zur Trockne abgedampft.  Man gibt dann zum Rückstand 15 ml 6 N Salzsäure (3.2) und anschließend etwa 120 ml Wasser. Umgerührt wird mit dem Glasstab, der in dem Becherglas belassen wird ; dieses wird mit einem Uhrglas abgedeckt. Die Flüssigkeit wird zu schwachem Sieden gebracht und dieses so lange aufrechterhalten, bis die Asche vollständig gelöst ist. Dann wird durch ein aschefreies Filterpapier filtriert und das Filtrat in einem 250-ml-Meßkolben aufgefangen. Man wäscht das Becherglas und den Filter mit 5 ml heisser 6 N Salzsäure (3.2) und zweimal mit kochendem Wasser aus und fuellt den Meßkolben mit Wasser bis zur Marke auf (HCI-Konzentration etwa 0,5 N).                                               (ii) Sollte der Filterrückstand schwarz aussehen (Kohlenstoff), so gibt man ihn in die Veraschungsschale zurück und verascht abermals bei 450º C bis 475º C. Diese Veraschung, die nur wenige Stunden erfordert (etwa 3 bis 5 Std.) ist beendet, wenn die Asche weiß oder nahezu weiß aussieht. Der Rückstand wird mit etwa 2 ml Salzsäure (3.1) aufgenommen, zur Trockne eingedampft, und mit 5 ml 6 N Salzsäure (3.2) versetzt. Nach dem Erwärmen wird die Lösung in den Meßkolben filtriert und dieser mit Wasser bis zur Marke aufgefuellt (HCl-Konzentration etwa 0,5 N).  Hinweise:                          (a) Bei der Bestimmung von Spurenelementen ist unbedingt auf die Gefahr von Verunreinigungen, insbesondere durch Zink, Kupfer und Eisen zu achten. Deshalb müssen die bei der Probenvorbereitung benutzten Geräte frei von diesen Metallen sein.  Um die Verunreinigungsrisiken einzuschränken, ist in staubfreier Luft, mit absolut reinen Geräten und sorgfältig gewaschenen Glasgeräten zu arbeiten. Die Zinkbestimmung ist für Verunreinigungen durch Glasgeräte, Reagenzien, Staub usw. besonders empfindlich.                                                   (b) Die Einwaage wird nach dem etwa zu erwartenden Gehalt des Futtermittels an Spurenelementen unter Berücksichtigung der Empfindlichkeit des verwendeten Spektrophotometers berechnet. Bei Futtermitteln, die einen sehr niedrigen Gehalt an Spurenelementen aufweisen, kann es erforderlich sein, eine Probe von 10 bis 20 g einzuwägen und das Volumen der Analysenlösung auf 100 ml zu begrenzen.                                                   (c) Die Veraschung erfolgt im geschlossenen Muffelofen ohne Einblasen von Luft oder Sauerstoff.                                                   (d) Die vom Pyrometer angezeigte Temperatur darf 475º C nicht überschreiten.                                                                                                                                             5.1.2. Spektrophotometrische Bestimmung                        5.1.2.1. Herstellen der Eichlösungen  Aus den Gebrauchsstandardlösungen 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 und 3.10.1 werden für jedes der zu bestimmenden Spurenelemente eine Reihe von Eichlösungen hergestellt. Jede dieser Eichlösungen hat eine etwa 0,5 N HCl-Konzentration und (im Falle von Eisen, Mangan und Zink) eine Lanthanchlorid-Konzentration, die 0,1 % La (g/v) entspricht. Die gewählten Spurenelementkonzentrationen müssen im Empfindlichkeitsbereich des verwendeten Spektrophotometers liegen. Die nachfolgenden Tabellen zeigen als Beispiel die Zusammensetzung typischer Reihen von Eichlösungen. Je nach Typ und Empfindlichkeit des verwendeten Spektrophotometers kann es jedoch erforderlich sein, für die Eichlösungen eine andere Konzentration zu wählen. >PIC FILE= "T0013284">    >PIC FILE= "T0013285">                                                5.1.2.2. Herstellen der Meßlösungen  Für die Kupferbestimmung kann die nach 5.1.1 hergestellte Analysenlösung in der Regel direkt verwendet werden. Gegebenenfalls wird ein aliquoter Teil dieser Analysenlösung in einen 100-ml-Meßkolben pipettiert und mit 0,5 N Salzsäure (3.3) zur Marke aufgefuellt, um ihre Konzentration in den Bereich der Eichlösungen zu bringen.  Für die Bestimmung der Elemente Eisen, Mangan und Zink wird ein aliquoter Teil nach 5.1.1 hergestellten Analysenlösung in einen 100-ml-Meßkolben pipettiert. Man gibt 10 ml Lanthanchloridlösung (3.11) hinzu und fuellt mit 0,5 N Salzsäure (3.3) zur Marke auf (siehe 8 "Bemerkung").                                               5.1.2.3. Blindversuch  Es wird ein Blindversuch ausgeführt, der alle Verfahrensschritte umfassen muß, nur daß das Probematerial selbst weggelassen wird. Die Eichlösung "0" ersetzt nicht den Blindversuch.                                               5.1.2.4. Messung der Atomabsorption  Die Absorption der Eichlösungen und der zu analysierenden Lösungen ist mit oxydierender Luft-Azetylenflamme bei folgenden Wellenlängen zu messen: >PIC FILE= "T0013286">   Jede Messung ist viermal auszuführen.                                                                                                                                 5.2. Mineralische Futtermittel  Enthält die Probe keine organischen Substanzen, so erübrigt sich eine vorherige Veraschung. Man verfährt dann wie unter 5.1.1 (i) ab 2. Absatz beschrieben. Ein Abrauchen mit Fluorwasserstoffsäure kann entfallen.                                                                          6. BERECHNUNG DER ERGEBNISSE  Die Spurenelement-Konzentration in der Analysenlösung wird mit Hilfe einer Eichkurve berechnet und das Ergebnis in mg Spurenelement/kg Probe (ppm) ausgedrückt.                                   7. WIEDERHOLBARKEIT  Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen eines Analytikers sollte an derselben Probe bei Gehalten an dem betreffenden Spurenelement von:                    - bis 50 mg/kg 5 mg/kg absolut,                                        - mehr als 50 bis 100 mg/kg 10 % des höheren Resultats,                                       - mehr als 100 bis 200 mg/kg 10 mg/kg absolut,                                       - mehr als 200 mg/kg 5 % des höheren Resultats                                         nicht überschreiten.                                   8. BEMERKUNG >PIC FILE= "T0013287">