CELEX: 31975L0084
Language: es
Date: 1974-12-20 00:00:00
Title: Sexta Directiva 75/84/CEE de la Comisión, de 20 de diciembre de 1974, sobre determinación de métodos de análisis comunitarios para el control oficial de la alimentación animal

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31975L0084

Sexta Directiva 75/84/CEE de la Comisión, de 20 de diciembre de 1974, sobre determinación de métodos de análisis comunitarios para el control oficial de la alimentación animal  

Diario Oficial n° L 032 de 05/02/1975 p. 0026 - 0033 Edición especial en finés : Capítulo 3 Tomo 6 p. 0045  Edición especial griega: Capítulo 03 Tomo 11 p. 0198  Edición especial sueca: Capítulo 3 Tomo 6 p. 0045  Edición especial en español: Capítulo 03 Tomo 8 p. 0079  Edición especial en portugués: Capítulo 03 Tomo 8 p. 0079 

 SEXTA DIRECTIVA DE LA COMISIÓN    de 20 de diciembre de 1974    sobre determinación de métodos de   análisis comunitarios para el control oficial de la   alimentación animal     ( 75/84/CEE )    LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,    Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad   Económica Europea ,    Vista la Directiva del Consejo , de 20 de julio de 1970 ,   referente a la introducción de modos de toma de   muestras y de métodos de análisis comunitarios para   el control oficial de la alimentación animal (1) ,   modificada en último lugar , por el Acta (2) adjunta   al Tratado relativo a la adhesión de   nuevos Estados miembros a la Comunidad   Económica Europea y a la Comunidad Europea de   la Energía Atómica (3) firmado en Bruselas el   22 de enero de 1972 y , en particular , su   artículo 2 ,    Considerando que la Directiva arriba mencionada prevé   que los controles oficiales de la alimentación animal   que comprueban el cumplimiento de las condiciones   establecidas en virtud de las disposiciones legales ,   reglamentarias y administrativas referentes a la calidad   y la composición de los alimentos para animales , se   realicen de acuerdo con los modos de toma de muestras   y los métodos de análisis comunitarios ;    Considerando que las Directivas n º 71/250/CEE ,   n º 71/393/CEE , n º 72/199/CEE , n º 73/46/CEE y   n º 74/203/CEE de la Comisión , de los días   15 de junio de 1971 (4) , 18 de noviembre de 1971 (5) ,   27 de abril de 1972 (6) , 5 de diciembre de 1972 (7) y   25 de marzo de 1974 (8) , ya han establecido determinado   número de métodos de análisis comunitarios ; que ,   teniendo en cuenta el estado de avance de los trabajos   realizados desde entonces , conviene adoptar una   sexta serie de métodos ;    Considerando que las medidas previstas en la presente   Directiva concuerdan con el dictamen del Comité   permanente de la alimentación animal ,    HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA :    Artículo 1    Los Estados miembros dispondrán que los análisis   para los controles oficiales de la alimentación animal ,   relativos a sus contenidos en buquinolato   sulfaquinoxalina y furazolidona , sean   realizados de acuerdo con los métodos   descritos en el Anexo de la presente Directiva .    Las disposiciones generales que figuran en la primera   parte ( introducción ) del Anexo de la presente   Directiva n º 71/250/CEE de la Comisión , de   15 de junio de 1971 , excepto la parte referente a la   preparación de la muestra por analizar ,   serán aplicables a los métodos descritos en   el Anexo de la presente Directiva .    Artículo 2    Los Estados miembros aplicarán , a más tardar , el   1 de noviembre de 1975 , las disposiciones legales ,   reglamentarias y administrativas necesarias para cumplir   la presente Directiva e informarán de ello   inmediatamente a la Comisión .    Artículo 3    Los destinatarios de la presente Directiva serán   los Estados miembros .    Hecho en Bruselas , el 20 de diciembre de 1974 .    Por la Comisión    El Presidente    François-Xavier ORTOLI    (1) DO n º L 170 de 3 . 8 . 1970 , p. 2 .    (2) DO n º L 73 de 27 . 3 . 1972 , p. 14 .    (3) DO n º L 73 de 27 . 3 . 1972 , p. 5 .    (4) DO n º L 155 de 12 . 7 . 1971 , p. 13 .    (5) DO n º L 279 de 20 . 12 . 1971 , p. 7 .    (6) DO n º L 123 de 29 . 5 . 1972 , p. 6 .    (7) DO n º L 83 de 30 . 3 . 1973 , p. 21 .    (8) DO n º L 108 de 22 . 4 . 1974 , p. 7 .    ANEXO    1 . DOSIFICACÓN DEL BUQUINOLATO     ( etil-4-hidroxi-6,7-diisobutoxi-3-quinoleina   carboxilato )    1 . Objeto y ámbito de aplicación    El método permite dosificar el buquinolato en los   alimentos , los concentrados y las premezclas . El   límite inferior de la dosificación es de 10 ppm . El   decoquinato interfiere en la dosificación .    2 . Principio    La muestra se somete a la extracción mediante   cloroformo . El extracto se evapora en seco , el   residuo se recoge mediante cloroformo y luego se   somete la solución a una cromatografía en capa   fina . El buquinalato es eluído con etanol y se   determina mediante espectrofotofluorimetría por   comparación con soluciones patrón .    3 . Reactivos    3.1 . Cloroformo p.a.    3.2 . Etanol de 96 grados ( v/v ) p.a.    3.3 . Mezcla de cloroformo y de etanol : mezclar   10 volúmenes de cloroformo ( 3.1 ) y 1 volumen de   etanol ( 3.2 ) .    3.4 . Etanol de 80 grados ( v/v ) p.a.    3.5 . Gel de sílice G para cromatografía en   capa fina .    3.6 . Sustancia patrón : buquinolato puro .    3.7 . Soluciones patrón :    3.7.1 . Solución patrón de 0,2 mg de buquinolato   por ml : Pesar , con un margen de error máximo   de 0,1 mg , 50 mg de sustancia patrón ( 3.6 ) . Disolver   con cloroformo ( 3.1 ) en un matraz graduado de   250 ml calentando en baño de agua a 50 ° C . Dejar   enfriar hasta temperatura ambiente , completar el   volumen con cloroformo ( 3.1 ) y homogeneizar .    3.7.2 . Soluciones patrón de trabajo : tomar ,   respectivamente , unos volúmenes de   5,0-10,0-15,0-20,0 y 25,0 ml de la solución ( 3.7.1 ) e   introducirlos en matraces graduados de 25 ml .   Completar el volumen con cloroformo ( 3.1 ) y   homogeneizar . Preparar en el momento de su   utilización . Dichas soluciones contienen ,   respectivamente 0,04-0,08-0,12-0,16 y 0,20 mg de   buquinolato por ml .    4 . Equipo    4.1 . Frascos cónicos de 50 y 250 ml , con   tapón esmerilado .    4.2 . Agitador    4.3 . Centrifugadora , con tubos de 15 ml , con tapón   esmerilado .    4.4 . Baño de agua a 50 ° C .    4.5 . Equipo para cromatografía en capa fina .    4.6 . Placas de vidrio para cromatografía en   capa fina , 200 por 200 mm , preparadas de la siguiente   manera : extender uniformemente sobre las placas una   capa de 0,5 mm de espesor de gel de sílice G   ( 3.5 ) y dejar secar al aire durante 15 minutos .   Luego , mantener las placas durante 2 horas en la   estufa ( 4.11 ) , después trasladarlas a un   desecador provisto del gel de sílice deshidratante .   Las placas preparadas para su utilización son   convenientes en la medida en que dan resultados   similares a los de las placas tratadas como arriba   se indica .    4.7 . Micropipetas de 0,50 ml .    4.8 . Colector de zonas para cromatografía en   capa fina .    4.9 . Lámpara UV de onda corta .    4.10 . Espectrofotofluorímetro dotado de una   lámpara Xenon y de dos monocromadores .    4.11 . Estufa dotada de un ventilador y regulada   a 100 ° C .    4.12 . Aparato rotativo de evaporación en vacío   con matraz de 250 ml .    5 . Modo de operar    5.1 . Preparación de la muestra    Triturar la muestra de manera que pase en su totalidad   a través de un tamiz de malla de 1 mm   ( conforme a la recomendación ISO R 565 ) .    5.2 . Extracción    Pesar , con un margen de error máximo de 1 mg ,   una cantidad de muestra dividida y homogeneizada   que contenga alrededor de 1,25 mg de buquinolato .   Introducir la zona de muestra en un frasco cónico   de 250 ml ( 4.1 ) y agregar 100,0 ml de cloroformo   ( 3.1 ) . Mezclar , tapar el frasco y agitar con   el agitador ( 4.2 ) durante una hora . Dejar decantar ,   filtrar y eliminar los primeros ml de líquido   filtrado .    Introducir 80,0 ml de líquido filtrado limpio en   una copa de vidrio de 150 ml o en el matraz del   aparato rotativo ( 4.12 ) . Evaporar casi hasta secar   en baño de agua ( 4.4 ) , volver a poner el residuo   aceitoso , repetidas veces , en unos ml de cloroformo   ( 3.1 ) y trasvasar cuantitativamente los líquidos   a un matraz graduado de 10 ml , por medio de un embudo   de conducto fino . Completar el volumen con   cloroformo ( 3.1 ) y homogeneizar . Si la solución   no está limpia , centrifugar durante 3 minutos   a 3 000 t/m tubo tapado .    5.3 . Cromatografía en capa fina    Depositar puntualmente sobre una placa para   cromatografía en capa fina ( 4.6 ) , mediante una   micropipetea ( 4.7 ) y a unas distancias respectivas   de 2 cm , unos volúmenes de 0,25 ml del extracto   obtenido en 5.2 y cinco soluciones patrón de   trabajo ( 3.7.2 ) .    Revelar el cromatograma con cloroformo ( 3.1 )   hasta que el frente del disolvente alcance   prácticamente el borde superior de la placa ,   luego secar mediante una corriente de aire . Luego ,   revelar con la mezcla cloroformo/etanol ( 3.3 ) hasta   que el frente del disolvente se haya desplazado   alrededor de 12 cm . Dejar evaporar los disolventes .   Irradiar el comatograma con la luz UV ( 4.9 ) y delimitar   las manchas de buquinolato ( valor Rf : 0,4 a 0,6 ) por   medio de una aguja .    5.4 . Elución    Recoger la sílice de cada zona delimitada , por   medio de un colector de zonas ( 4.8 ) , en un tubo de   centrifugación ( 4.3 ) . Agregar en cada tubo   10,0 ml de etanol ( 3.4 ) , agitar durante 20 minutos ,   luego , centrifugar durante 5 minutos a 3 000 t/m .   Decantar las soluciones limpias en unos frascos   cónicos de 50 ml ( 4.1 ) .    5.5 . Medida de la fluorescencia    Regular en 100 la escala del espectrofotofluorímetro   ( 4.10 ) por medio del eluido ( 5.4 ) procedente   de la solución patrón más concentrada , utilizando   para la estimulación la extensión de onda   comprendida entre 200 y 280 mm que dan la fluorescencia   más intensa y , para la emisión , la   extensión de onda de 375 mm .    Medir , en estas condiciones , la intensidad de   la fluorescencia de los otros eluidos ( 5.4 ) .   Determinar , a partir de los valores encontrados ,   la cantidad ( A ) de buquinolato en mg contenido en   los 10 ml del eluido procedente de la muestra .    6 . Cálculo de resultados    El contenido en mg de buquinolato por kg de muestra   se expresa con la fórmula    A/P · 50 000    en la cual :    A - cantidad en mg de buqinolato determinada por   la medida espectrofluorimétrica .    P - peso en g de la toma de muestra .    7 . Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos   determinaciones paralelas realizadas sobre la misma   muestra no debe sobrepasar :    el 50 % del resultado más elevado para los   contenidos en buquinolato comprendidos entre 10 y 20 ppm ;    10 ppm , en valor absoluto , para los contenidos entre   20 y 100 ppm ;    el 10 % del resultado más elevado para los   contenidos comprendidos entre 100 y 5 000 ppm ;    500 ppm , en valor absoluto , para los contenidos   comprendidos entre 5 000 y 10 000 ppm ;    el 5 % del resultado más elevado para los   contenidos superiores a 10 000 ppm .    2 . DOSIFICACIÓN DE LA SULFAQUINOXALINA     ( 2-sulfanilamidoquinoxalina )    1 . Objeto y ámbito de aplicación    El método permite dosificar la sulfaquinoxalina   en los alimentos , los concentrados y las premezclas .   El límite inferior de la dosificación es de   20 ppm . Otras sulfonamidas , así como el ácido   arsanílico interfieren en la dosificación .    2 . Principio    La muestra se somete a la extracción mediante la   dimetilformamida y el cloroformo . La sulfaquinoxalina   se hidroliza en medio alcalino . Después de la   neutralización , el derivado aminado que se ha formado ,   se diazota y acopla a la N-1 naftil ) etilenodiamina .   La densidad óptica de la solución se mide en 545 mm .    3 . Reactivos    3.1 . N,N-dimetilformamida p.a.    3.2 . Cloroformo p.a.    3.3 . Etanol absoluto .    3.4 . Lejía alcalina : disolver en agua 10 mg de   hidróxido de sodio p.a. y 25 de cloruro de sodio   p.a.    Completar los 500 ml con agua y homogeneizar .    3.5 . Acido clorídrico concentrado p.a.   ( d = 1,18 ) .    3.6 . Solución de 0,1 % ( p/v ) de nitrito de   sodio : disolver en agua 100 mg de nitrito de   sodio p.a. , completar los 100 ml con agua y   homogeneizar . Preparar inmediatamente antes de su   utilización .    3.7 . Solución de 0,5 % ( p/v ) de sulfamato de   amonio : disolver en el agua 500 mg de sulfamato de   amonio p.a. , completar los 100 ml con agua y   homogeneizar . Preparar inmediatamente antes de su   utilización .    3.8 . Solución de 0,1 por ciento ( p/v ) de   diclorhidrato de N-(1-naftil) etilenodiamina :   disolver en ácido clorídrico p.a. de 0,1 %   ( v/v ) 100 mg de diclorhidrato de N-(1-naftil)   etilenodiamina p.a. , completar los 100 ml con el   mismo ácido y homogeneizar . Preparar inmediatamente   antes de su utilización .    3.9 . Sustancia patrón : sulfaquinoxalina pura .    3.10 . Solución patrón : pesar , con un margen   de error máximo de 0,1 mg , 250 mg de sustancia   patrón ( 3.9 ) . Disolver en 50 ml de una solución   de hidróxido de sodio ( 25 ml de solución de   hidróxido de sodio p.a. 0,1 N + 25 ml de agua ) ,   completar los 500 ml con agua y homogeneizar . Tomar   5,0 ml de dicha solución y diluir con agua hasta   los 100 ml . Un ml de dicha solución contiene   25 microgramos de sulfaquinoxalina .    4 . Equipo    4.1 . Frascos cónicos de 250 ml , de esmerilado   normal .    4.2 . Agitador    4.3 . Crisol filtrante , porosidad 3 , diámetro :   80 mm , con frasco en vacío .    4.4 . Ampollas de decantación de 250 ml .    4.5 . Matraces graduados de 50 , 100 , 250 y 500 ml .    4.6 . Tubos de ensayo , 150 mm por 25 mm .    4.7 . Baño de agua hirviendo .    4.8 . Espectrofotómetro , con cubeta de 20 mm   de espesor .    5 . Modo de operar    5.1 . Preparación de la muestra    Triturar la muestra de forma que pase en su totalidad   por un tamiz de malla de 1 mm ( conforme a la   recomendación ISO R 565 ) .    5.2 . Extracción    Pesar , con un margen de error máximo de 1 mg , una   cantidad de muestra dividida y homogeneizada que contenga   de 0,25 a 1,25 mg de sulfaquinoxalina . Introducir la   toma de muestra en un frasco cónico de 250 ml ( 4.1 ) y   agregar 20 ml de N,N-dimetilfromamida ( 3.1 ) . Mezclar   y calentar durante 20 minutos en baño de agua ( 4.7 ) .   Dejar enfriar bajo una corriente de agua fría . Agregar   60 ml de cloroformo ( 3.2 ) , tapar el frasco y agitar   durante 30 minutos con el agitador ( 4.2 ) .    Filtrar el líquido en un crisol filtrante ( 4.3 )   aspirando levemente . Enjugar el frasco con cuatro   porciones de 5 ml de cloroformo ( 3.2 ) y trasvasar los   líquidos al crisol filtrante . Luego , trasvasar el   líquido a una ampolla de decantación ( 4.4 ) , enjuagar   el frasco con 15 ml de cloroformo ( 3.2 ) aproximadamente ,   y trasvasar el líquido a la ampolla .    5.3 . Hidrólisis    Agregar en la ampolla 50 ml de lejía alcalina ( 3.4 ) y   5 ml de etanol ( 3.3 ) . Mezclar completamente evitando   la formación de emulsión , bien invirtiendo la ampolla   unas veinte veces , bien haciéndola girar alrededor del   eje horizontal que pasa del cuello al tapón .    Luego dejar reposar hasta la separación de las fases   ( generalmente la separación culmina después de   15 minutos aproximadamente ) .    Trasvasar la fase superior ( fase acuosa ) a un matraz   graduado de 250 ml ( 4.5 ) . Extraer nuevamente la fase   clorofórmica mediante tres porciones de 50 ml de lejía   alcalina ( 3.4 ) y trasvasar después de cada extracción   el extracto acuoso al matraz graduado . Completar el   volumen con agua y homogeneizar .    Introducir 25,0 ml de la solución en un matraz graduado   de 50 ml ( 4.5 ) , agregar 5,0 ml de ácido clorídrico   ( 3.5 ) , completar el volumen con agua y homogeneizar .   Filtrar , si es necesario , y eliminar los 15 primeros   ml del líquido filtrado . Introducir 10,0 ml de la   solución en dos tubos de ensayo ( 4.6 ) A y B ,   respectivamente .    5.4 . Revelado de la coloración y medida de la densidad   óptica    Agregar en cada tubo , 2,0 ml de solución de nitrito   de sodio ( 3.6 ) , agitar y dejar reposar 3 minutos .   Agregar 2,0 ml de solución de sulfamato de amonio   ( 3.7 ) , agitar y dejar reposar 2 minutos . Luego ,   agregar 1,0 ml de solución de diclorhidrato de   N-(1-naftil) etilenodiamina ( 3.8 ) en el tubo B . Mezclar   intensamente el contenido de cada tubo . Unir los tubos   a una trompa de agua mediante junturas de caucho y aplicar   un pequeño vacío para eliminar el nitrógeno   disuelto .    Pasados 10 minutos , medir las densidades ópticas   E A y E B de las soluciones en el espectrofotómetro   ( 4.8 ) a 545 nm por comparación con el agua . Determinar   a partir del valor E A - E B la cantidad ( A ) de   sulfaquinoxalina presente en la solución de la muestra   con referencia a la curva de contraste ( 5.5 ) establecida   previamente .    5.5 . Curva de contraste    Introducir en los matraces graduados de 100 ml ( 4.5 ) ,   respectivamente , los volúmenes 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0   y 10,0 ml de la solución patrón ( 3.10 )   correspondientes a 50 , 100 , 150 , 200 y 250   microgramos de sulfaquinoxalina . Agregar 8 ml de ácido   clorídrico ( 3.5 ) en cada matraz , completar el volumen   con agua y homogeneizar .    Tomar 10,0 ml de cada solución ( 10 que corresponde   respectivamente a 5 , 10 , 15 , 20 y 25 microgramos de   sulfaquinoxalina ) e introducirlos en tubos de ensayo   ( 4.6 ) . Revelar la coloración como se indica en el   apartado primero 5.4 . Luego , medir las densidades   ópticas a 545 nm por comparación con el agua . Trazar   la curva de contraste situando en ordenada los valores de   la densidad óptica y en abscisa las correspondientes   cantidades de sulfaquinoxalina , en microgramos .    6 . Cálculo de resultados    El contenido en mg de sulfaquinoxalina por kg de   muestra se expresa con la fórmula    A/P · 50    en la cual    A = cantidad en microgramos de sulfaquinoxalina ,   determinada por la medida fotométrica ;    P = peso en gramos de la toma de muestra .    7 . Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos determinaciones   paralelas realizadas sobre la misma muestra no debe   sobrepasar :    10 ppm , en valor absoluto , para los contenidos en   sulfaquinoxalina comprendidos entre 20 y 100 ppm ;    el 10 % del resultado más elevado para los contenidos   comprendidos entre 100 y 5 000 ppm ;    500 ppm , en valor absoluto , para los contenidos   comprendidos entre 5 000 y 10 000 ppm ;    el 5 por ciento del resultado más elevado para los   contenidos superiores a 10 000 ppm .    3 . DOSIFICACIÓN DE LA FURAZOLIDONA     [ N-(5-nitro-2-furfurilideno)-3-amino-2-oxazolidona ]    1 . Objeto y ámbito de aplicación    El método permite dosificar la furazolidona en los   alimentos , los concentrados y las premezclas . El   límite inferior de la dosificación es de 10 ppm .    2 . Principio    La furazolidona se extrae por medio de la acetona , una   vez realizado el previo desengrasado de la muestra   mediante éter de petróleo . El extracto se purifica por   cromatografía sobre columna de óxido de aluminio   y la furazolidona se eluye con acetona . El eluido se   evapora en seco y el residuo se recoge mediante alcohol   amílico . La furazolidona se extrae mediante una   solución de urea y la densidad óptica del extracto   se mide en 375 nm .    3 . Reactivos    3.1 . Acetona p.a.    3.2 . Óxido de aluminio para cromatografía , neutro ,    granulometría : 100 a 240 mallas que se preparan de la   siguiente manera : mezclar 500 g de óxido de aluminio   con un l de agua destilada caliente y luego decantar el   líquido que queda en la superficie . Repetir dos   veces dicha operación y luego filtrar por un embudo   Buchner . Secar el óxido de aluminio a 105 % ° C   hasta el peso constante .    3.3 . Acetato de amilo p.a.    3.4 . Alcohol amílico p.a. ( son convenientes las   mezclas de isómeros ) .    3.5 . Eter de petróleo , eb. 40 - 60 ° C .    3.6 . Solución de urea : mezclar 90 g de urea p.a.   con 100 ml de agua , calentar suavemente para que se   disuelva por completo .    3.7 . Sustancia patrón : furazolidona pura .    3.8 . Solución patrón : pesar , con un margen de error   máximo de 0,1 mg , 25 mg de sustancia patrón ( 3.7 ) .   Disolver con la acetona ( 3.1 ) en un matraz graduado de   250 ml ( 4.1 ) , completar el volumen con acetona   ( 3.1 ) y homogeneizar . Un ml de dicha solución contiene   100 microgramos de furazolidona .    4 . Equipo    4.1 . Matraces graduados de vidrio pardo , 100 y 250 ml .    4.2 . Ampollas de decantación de vidrio pardo , 100 ml .    4.3 . Aparatos de extracción , por ej. : Soxhlet o   Twisselmann .    4.4 . Cartuchos de extracción , 25 por 80 mm   ó 28 por 100 mm .    4.5 . Tubos de vidrio para cromatografía , diámetro   interior : 10 mm ; longitud : 300 mm .    4.6 . Baño de agua hirviendo .    4.7 . Espectrofotómetro con cubetas de 10 mm de   espesor .    5 . Modo de operar    NB Todas las operaciones se deben realizar fuera del   alcance de la luz directa .    5.1 . Preparación de la muestra    Triturar la muestra de forma que pase en su totalidad   por un tamiz de malla de 1 mm ( conforme a la   recomendación ISO R 565 ) .    5.2 . Extracción    Pesar , con un margen de error máximo de 1 mg , 5   a 20 g de la muestra dividida y homogeneizada ( que   contenga un máximo de 1 mg de furazolidona ) en un   cartucho de extracción ( 4.4 ) , colocarla en un   aparato de extracción ( 4.3 ) y extraer mediante éter   de petróleo ( 3.5 ) . Para el aparato de Soxhlet , se   necesitan de 13 a 17 ciclos de disolvente ; para otros   aparatos , la duración de la extracción no debe ser   inferior a 30 minutos . Luego , retirar el cartucho del   aparato , eliminar el residuo de disolvente y secar el   cartucho y su contenido mediante una corriente de aire   caliente .    Luego , colocar el cartucho y su contenido en un aparato   de extracción limpio y extraer con acetona ( 3.1 ) .   Para el aparato de Soxhlet , se necesitan , por lo menos ,   25 ciclos de disolvente ; para otros aparatos , las   condiciones necesarias para la obtención de una   extracción completa se deben determinar previamente .   Evaporar el extracto acetónico en el baño de agua   ( 4.6 ) hasta un volumen de 5 a 10 ml y luego dejar enfriar   hasta temperatura ambiente .    5.3 . Cromatografía    Introducir un tapón de lana de vidrio en la extremidad   inferior de un tubo para cromatografía ( 4.5 ) y   comprimir el tapón mediante una varilla adecuada para   obtener un espesor de 2 a 3 mm . Luego preparar una   suspensión de óxido de aluminio ( 3.2 ) en la   acetona ( 3.1 ) , introducir la suspensión en el tubo   y dejar que se deposite . La columna así obtenida debe   tener una altura de 200 mm aproximadamente . Dejar que   descienda la acetona hasta la superficie superior de la   columna .    Trasvasar el extracto acetónico obtenido en 5.2 sobre   la columna , enjuagar el frasco varias veces con   acetona ( 3.1 ) y trasvasar los líquidos sobre la   columna , colocar un frasco adecuado debajo de la   columna y eluir la furazolidona con acetona ( 3.1 ) . El   volumen total de acetona que se debe utilizar , incluido   el volumen que se haya empleado para el enjuague , debe   ser de 150 ml aproximadamente .    5.4 . Extracción y medida de la densidad óptica    Evaporar en baño de agua ( 4.6 ) el eluido obtenido   en 5.3 hasta que quede seco . ( Ocasionalmente se   obtiene una pequeña cantidad de diacetona-alcohol ,   producida por condensación de la acetona en el   óxido de aluminio , que no obstaculiza las extracciones   posteriores ) . Disolver el residuo en 10 ml de alcohol   amílico ( 3.4 ) y trasvasar la solución a una ampolla de   decantación ( 4.2 ) . Enjuagar el frasco sucesivamente ,   con 10 ml de acetato de amilo ( 3.3 ) y 10 ml de solución   de urea ( 3.6 ) , trasvasar dichas soluciones a la ampolla   de decantación y agitar enérgicamente durante 2   minutos .    Dejar reposar durante 3 ó 4 minutos y luego recoger la   fase acuosa en un matraz graduado de 100 ml ( 4.1 ) .   Repetir el enjuague y la extracción mediante cuatro   porciones de 10 ml de solución de urea ( 3.6 ) y ,   cada vez , recoger la fase acuosa en el matraz graduado .   Completar 100 ml del contenido del matraz con la solución   de urea ( 3.6 ) y homogeneizar . Medir la densidad   óptica de la solución en el espectrofotómetro   ( 4.7 ) en 375 nm por comparación con la solución de   urea ( 3.6 ) . Determinar la cantidad de furazolidona con   referencia a la curva de contraste ( 5.5 ) .    5.5 . Curva de contraste    Preparar cuatro columnas cromatográficas de acuerdo   con el modo de operar indicado en el primer apartado de   5.3 . Introducir con la pipeta , en las columnas ,   respectivamente , unos volúmenes de 2,5 - 5,0 - 7,5 - y   10,00 ml de la solución patrón ( 3.8 ) . Eluír cada   columna con 150 ml de acetona ( 3.1 ) y proseguir el modo   de operar como se indica en 5.4 . Trazar la curva de   contraste situando en ordenada los valores de la   densidad óptica y en abscisa las correspondientes   cantidades de furazolidona en microgramos .    6 . Cálculo de resultados    El contenido en mg de furazolidona por kg de muestra   se expresa con la fórmula    A/P    en la cual :    A = cantidad en microgramos de furazolidano determinada   por la medida fotométrica ,    P = peso en gramos de la toma de muestra .    7 . Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos determinaciones   paralelas realizadas sobre la misma muestra no debe   sobrepasar :    el 50 % del resultado más elevado para los contenidos   en furazolidona comprendidos entre 10 y 20 ppm ;    10 ppm , en valor absoluto , para los contenidos   comprendidos entre 20 y 100 ppm ;    el 10 % del resultado más elevado para los contenidos   comprendidos entre 100 y 5 000 ppm ;    500 ppm , en valor absoluto , para los contenidos   comprendidos entre 5 000 y 10 000 ppm ;    el 5 % del resultado más elevado para los contenidos   superiores a 10 000 ppm .