CELEX: 32016D1840
Language: ro
Date: 2016-10-14 00:00:00
Title: Decizia de punere în aplicare (UE) 2016/1840 a Comisiei din 14 octombrie 2016 de modificare a anexei IV la Directiva 2009/156/CE a Consiliului în ceea ce privește metodele de diagnosticare a pestei cabaline africane [notificată cu numărul C(2016) 6509] (Text cu relevanță pentru SEE)

18.10.2016   
            
            
               RO
            
            
               Jurnalul Oficial al Uniunii Europene
            
            
               L 280/33
            
         DECIZIA DE PUNERE ÎN APLICARE (UE) 2016/1840 A COMISIEI
   din 14 octombrie 2016
   de modificare a anexei IV la Directiva 2009/156/CE a Consiliului în ceea ce privește metodele de diagnosticare a pestei cabaline africane
   
      
         [notificată cu numărul C(2016) 6509]
      
   
   (Text cu relevanță pentru SEE)
   COMISIA EUROPEANĂ,
   având în vedere Tratatul privind funcționarea Uniunii Europene,
   având în vedere Directiva 2009/156/CE a Consiliului din 30 noiembrie 2009 privind condițiile de sănătate animală care reglementează circulația și importul de ecvidee provenind din țări terțe (1), în special articolul 20,
   întrucât:
   
               (1)
            
            
               Anexa IV la Directiva 2009/156/CE stabilește metodele de diagnosticare a pestei cabaline africane care trebuie utilizate, atunci când este cazul, la testarea ecvideelor înainte de deplasările lor în interiorul Uniunii sau la importul lor din țări terțe.
            
         
               (2)
            
            
               De la adoptarea Directivei 2009/156/CE, capacitățile laboratoarelor de a efectua teste avansate, foarte sensibile și eficiente pentru diagnosticarea pestei cabaline africane au evoluat. În paralel, capitolul referitor la diagnosticarea pestei cabaline africane din Manualul de teste de diagnostic și vaccinuri pentru animale terestre al Organizației Mondiale pentru Sănătatea Animalelor (OIE) (2) a fost modificat pentru a reflecta această evoluție.
            
         
               (3)
            
            
               În cadrul programului său de lucru pentru 2014, laboratorul de referință al Uniunii Europene pentru pesta cabalină africană (3) a elaborat un raport privind evaluarea tehnică a metodelor de diagnosticare descrise în anexa IV la Directiva 2009/156/CE. Evaluarea, care a fost prezentată Comisiei în mai 2015, concluziona că testul competitiv de imunoadsorbție cu anticorpi marcați enzimatic (ELISA) nu mai este disponibil, că testul ELISA indirect nu este utilizat în mod curent, dar ar putea fi furnizat în 4-6 luni de la depunerea cererii, și că testul ELISA de blocare este disponibil comercial și utilizat în mod curent la analiza eșantioanelor în decursul exercițiilor de testare a competenței organizate de laboratorul de referință al Uniunii Europene pentru pesta cabalină africană.
            
         
               (4)
            
            
               În plus, raportul arată că metodele de recunoaștere a acidului nucleic prin transcriere inversă cuplată cu reacție de polimerizare în lanț (RT-PCR) prezintă avantaje față de metodele de diagnosticare serologice, deoarece permit detectarea bolii într-un stadiu incipient al infecției. În plus, majoritatea laboratoarelor naționale de referință din statele membre ale Uniunii Europene utilizează, inclusiv pentru diagnosticarea pestei cabaline africane, metode RT-PCR în timp real care s-au dovedit adecvate scopului în cadrul exercițiilor anuale de testare a competenței desfășurate din 2009 până în 2014. Raportul arată, de asemenea, că în afara Uniunii există o serie de laboratoare de referință ale OIE și alte laboratoare cu expertiză specifică în domeniul pestei cabaline africane care au implementat cel puțin una dintre metodele RT-PCR în timp real pentru detectarea genomului virusului pestei cabaline africane.
            
         
               (5)
            
            
               La 24-25 noiembrie 2015 a avut loc Atelierul comun al laboratoarelor de referință ale Uniunii Europene pentru pesta cabalină africană/boala limbii albastre, împreună cu laboratoarele naționale de referință, la Ascot, în Regatul Unit; în urma acestui atelier s-a recomandat includerea în anexa IV la Directiva 2009/156/CE a metodelor care implică transcriere inversă în timp real (RRT) cuplată cu reacție de polimerizare în lanț (PCR) pentru detectarea virusului pestei cabaline africane.
            
         
               (6)
            
            
               Deși toate metodele RT-PCR în timp real disponibile pentru detectarea genomului virusului pestei cabaline africane sunt suficient de sensibile, procedura descrisă de Agüero et al. (2008) (4) este cel mai mult utilizată de laboratoare. Metoda descrisă de Guthrie et al. (2013) (5) a fost concepută în mod specific pentru a se asigura că din zonele cu risc de pestă cabalină africană caii pot fi transportați în siguranță după perioada de carantină minimă necesară în conformitate cu Codul sanitar pentru animale terestre (6) al OIE.
            
         
               (7)
            
            
               Prin urmare, este adecvată includerea în anexa IV la Directiva 2009/156/CE a unor metode de identificare și de detectare a anticorpilor ca metode complementare pentru diagnosticarea rapidă a pestei cabaline africane.
            
         
               (8)
            
            
               În consecință, anexa IV la Directiva 2009/156/CE ar trebui să fie modificată prin eliminarea testului ELISA competitiv și prin actualizarea procedurilor pentru testele ELISA indirect și ELISA de blocare în conformitate cu capitolul 2.5.1 din Manualul de teste de diagnostic și vaccinuri pentru animale terestre al OIE, ediția 2016, bazat pe versiunea adoptată de Adunarea mondială a delegaților OIE în mai 2012 (7). În același timp, procedurile RT-PCR în timp real, astfel cum sunt descrise de Agüero et al. (2008), precum și de Guthrie et al. (2013), ar trebui să fie incluse în anexa respectivă pentru ca testele respective de identificare a agentului să fie disponibile pentru testarea înainte de deplasările animalelor.
            
         
               (9)
            
            
               Prin urmare, Directiva 2009/156/CE ar trebui modificată în consecință.
            
         
               (10)
            
            
               Măsurile prevăzute în prezenta decizie sunt conforme cu avizul Comitetului permanent pentru plante, animale, produse alimentare și hrană pentru animale,
            
         ADOPTĂ PREZENTA DECIZIE:
   Articolul 1
   Anexa IV la Directiva 2009/156/CE se înlocuiește cu textul din anexa la prezenta decizie.
   Articolul 2
   Prezenta decizie se adresează statelor membre.
   
      Adoptată la Bruxelles, 14 octombrie 2016.
      
         
            Pentru Comisie
         
         Vytenis ANDRIUKAITIS
         
            Membru al Comisiei
         
      
   
   
      (1)  JO L 192, 23.7.2010, p. 1.
   
      (2)  http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.05.01_AHS.pdf
   
      (3)  Directiva 92/35/CEE a Consiliului din 29 aprilie 1992 de stabilire a normelor de control și a măsurilor pentru combaterea pestei cabaline africane (JO L 157, 10.6.1992, p. 19).
   
      (4)  Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. și Jimenez-Clavero A. (2008). Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325-328.
   
      (5)  Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus. Journal of Virological Methods. 2013;189(1):30-35.
   
      (6)  http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahc/current/chapitre_ahs.pdf
   
      (7)  A se vedea nota de subsol 2.
   
      ANEXĂ
      
         
            „ANEXA IV
            
               PESTA CABALINĂ AFRICANĂ
            
            
               DIAGNOSTICARE
            
            PARTEA A
            Teste serologice
            Metoda serologică descrisă în continuare reprezintă teste de imunoadsorbție cu anticorpi marcați enzimatic (ELISA) bazate pe capitolul 2.5.1 secțiunea B punctul 2 din Manualul de teste de diagnostic și vaccinuri pentru animale terestre, ediția 2016, astfel cum a fost adoptat de Adunarea mondială a delegaților OIE în mai 2012.
            Proteina virală VP7 este un antigen major imunodominant al virusului pestei cabaline africane (VPCA) și există în toate cele nouă serotipuri ale VPCA. S-a dovedit că proteinele recombinante VP7 ale VPCA sunt stabile, inofensive și potrivite pentru a fi utilizate ca antigeni în procedurile ELISA pentru determinarea anticorpilor anti-VPCA cu un grad mare de sensibilitate și de specificitate [Laviada et al., 1992b (1); Maree și Paweska, 2005]. Testul ELISA indirect și testul ELISA de blocare sunt cele două teste ELISA PCA-VP7 adecvate pentru diagnosticul serologic al pestei cabaline africane (PCA).
            1.   Test ELISA indirect pentru detectarea anticorpilor împotriva virusului pestei cabaline africane (VPCA)
            
            Conjugatul utilizat în această metodă este o gamaglobulină anti-cal conjugată cu peroxidază de hrean care reacționează cu ser de cal, de catâr și de măgar. Metoda descrisă de Maree & Paweska (2005) (2) utilizează drept conjugat proteina G, care reacționează și cu serul de zebră.
            Antigenul poate fi furnizat de Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA) din Spania, în termen de 4-6 luni de la cerere.
            1.1.   Procedura de testare
            
            1.1.1.   Faza solidă
            
                     
                        1.1.1.1.
                     
                     
                        Se toarnă în plăcile ELISA proteina recombinantă VP7 a VPCA de serotip 4 diluată într-un tampon carbonat/bicarbonat cu pH 9,6. Se incubează plăcile peste noapte la 4 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.1.2.
                     
                     
                        Se clătesc plăcile de cinci ori cu apă distilată conținând 0,01 % (V/V) Tween-20 (soluție de spălare). Se scutură ușor plăcile pe un material absorbant pentru a îndepărta orice urmă de apă.
                     
                  
                     
                        1.1.1.3.
                     
                     
                        Se blochează plăcile cu o soluție salină tamponată cu fosfat (SSTF) cu pH 7,2 + 5 % (G/V) lapte praf degresat (Nestlé Dry Skim Milk
                           TM), câte 200 μl în fiecare godeu timp de o oră la 37 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.1.4.
                     
                     
                        Se înlătură soluția de blocare și se scutură ușor plăcile pe un material absorbant.
                     
                  1.1.2.   Eșantioane de testat
            
                     
                        1.1.2.1.
                     
                     
                        Eșantioanele de ser de testat și serurile de control pozitiv și negativ se diluează la 1/25 într-o SSTF + 5 % (G/V) lapte degresat + 0,05 % (V/V) Tween-20, 100 μl în fiecare godeu. Se incubează timp de o oră la 37 °C.
                        Pentru titrare, se efectuează serii de diluție de înjumătățire începând cu 1 la 25 (100 μl/godeu), utilizându-se câte un ser pentru o coloană a plăcii; se procedează la fel cu controalele pozitiv și negativ. Se incubează timp de o oră la 37 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.2.2.
                     
                     
                        Se clătesc plăcile de cinci ori cu apă distilată conținând 0,01 % (V/V) Tween-20 (soluție de spălare). Se scutură ușor plăcile pe un material absorbant pentru a îndepărta orice urmă de apă.
                     
                  1.1.3.   Conjugat
            
                     
                        1.1.3.1.
                     
                     
                        Se toarnă în fiecare godeu câte 100 μl de gamaglobuline anti-cal conjugate cu peroxidază de hrean diluate într-o SSTF + 5 % lapte + 0,05 % Tween-20 cu pH 7,2. Se incubează timp de o oră la 37 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.3.2.
                     
                     
                        Se clătesc plăcile de cinci ori cu apă distilată conținând 0,01 % (V/V) Tween-20 (soluție de spălare). Se scutură ușor plăcile pe un material absorbant pentru a îndepărta orice urmă de apă.
                     
                  1.1.4.   Cromogen/substrat
            
                     
                        1.1.4.1.
                     
                     
                        Se adaugă 200 μl/godeu de soluție de cromogen/substrat [10 ml de DMAB (dimetilaminobenzaldehidă) 80,6 mM + 10 ml de MBTH (hidroclorură de 3-metil-2-benzotiazolină hidrazonă) 1,56 mM + 5 μl de H2O2].
                        Se blochează reacția colorimetrică după aproximativ 5-10 minute (înainte să înceapă să se coloreze controlul negativ) prin adăugarea a 50 μl de H2SO4 3N.
                        Se pot utiliza și alți cromogeni, cum ar fi ABTS [acid 2,2′-azino-bis-(3-etilbenzotiazolină-6-sulfonic)], TMB (tetrametil de benzidină) sau OFD (ortofenildiamină).
                     
                  
                     
                        1.1.4.2.
                     
                     
                        Se citesc plăcile la 600 nm (sau 620 nm).
                     
                  1.2.   Interpretarea rezultatelor
            
            
                     
                        1.2.1.
                     
                     
                        Se calculează valoarea-prag adăugând 0,06 la valoarea controlului negativ (0,06 este abaterea standard calculată pe baza unui grup de 30 de seruri negative).
                     
                  
                     
                        1.2.2.
                     
                     
                        Eșantioanele testate care prezintă valori ale absorbanței inferioare valorii-prag sunt considerate negative.
                     
                  
                     
                        1.2.3.
                     
                     
                        Eșantioanele testate care prezintă valori ale absorbanței superioare valorii-prag + 0,15 sunt considerate pozitive.
                     
                  
                     
                        1.2.4.
                     
                     
                        Eșantioanele testate care prezintă valori ale absorbanței intermediare sunt neconcludente și trebuie utilizată o a doua tehnică pentru confirmarea rezultatului.
                     
                  2.   Test ELISA de blocare pentru detectarea anticorpilor împotriva virusului pestei cabaline africane (VPCA)
            
            Testul ELISA de blocare competitiv este conceput pentru detectarea anticorpilor specifici VPCA în serurile provenite de la animale din orice specie de ecvidee, și anume cai, măgari, zebre și hibrizii acestora, prevenind problema specificității care este întâlnită ocazional atunci când se utilizează testele ELISA indirecte.
            Principiul testului este blocarea reacției dintre proteina recombinantă VP7 absorbită în placa ELISA și un anticorp monoclonal conjugat specific proteinei VP7 a PCA (Mab). Anticorpii din serurile de testat vor bloca reacția dintre antigen și Mab, ceea ce va duce la atenuarea culorii. Deoarece Mab este îndreptat împotriva proteinei VP7, testul va fi foarte sensibil și foarte specific.
            Testul ELISA de blocare competitiv este disponibil comercial.
            2.1.   Procedura de testare
            
            2.1.1.   Faza solidă
            
                     
                        2.1.1.1.
                     
                     
                        Se toarnă în plăcile ELISA 50-100 ng de proteină recombinantă VP7 a VPCA de serotip 4, diluată într-un tampon carbonat/bicarbonat cu pH 9,6. Se incubează peste noapte la 4 °C.
                     
                  
                     
                        2.1.1.2.
                     
                     
                        Se spală plăcile de trei ori cu o soluție salină tamponată cu fosfat (SSTF) 0,1x conținând 0,135 M NaCl și 0,05 % (V/V) Tween-20 (SSTFT). Se scutură ușor plăcile pe un material absorbant pentru a îndepărta orice urmă de apă.
                     
                  2.1.2.   Eșantioane de testat și controale
            
                     
                        2.1.2.1.
                     
                     
                        Eșantioanele de ser de testat și serurile pozitiv și negativ de control se diluează 1 la 5 într-un diluant care conține 0,35 M NaCl, 0,05 % (V/V) Tween-20 și 0,1 % Kathon, 100 μl în fiecare godeu. Se incubează timp de o oră la 37 °C.
                        Pentru titrare, se efectuează serii de diluție de înjumătățire a serurilor de testat, începând cu 1 la 10 până la 1 la 280 în 8 godeuri (100 μl/godeu), utilizându-se câte un ser pentru o coloană a plăcii; se procedează la fel cu controalele pozitiv și negativ. Se incubează timp de o oră la 37 °C.
                     
                  
                     
                        2.1.2.2.
                     
                     
                        Se spală plăcile de cinci ori cu o soluție salină tamponată cu fosfat (SSTF) 0,1× conținând 0,135 M NaCl și 0,05 % (V/V) Tween-20 (SSTFT). Se scutură ușor plăcile pe un material absorbant pentru a îndepărta orice urmă de apă.
                     
                  2.1.3.   Conjugat
            
                     
                        2.1.3.1.
                     
                     
                        Se depun în fiecare godeu câte 100 μl de Mab anti-VP7 conjugat cu peroxidază de hrean. Înainte de această operațiune, Mab respectiv a fost diluat la 1/5 000-1/15 000 într-o soluție 1/1 de stabilizator StabiliZyme Select® (referința SurModics.: SZ03) în apă distilată. Se incubează timp de 30 de minute la 37 °C.
                     
                  
                     
                        2.1.3.2.
                     
                     
                        Se spală plăcile de cinci ori cu o soluție salină tamponată cu fosfat (SSTF) 0,1× conținând 0,135 M NaCl și 0,05 % (V/V) Tween-20 (SSTFT). Se scutură ușor plăcile pe un material absorbant pentru a îndepărta orice urmă de apă.
                     
                  2.1.4.   Cromogen/substrat
            Se adaugă în fiecare godeu câte 100 μl din soluția de cromogen/substrat, și anume 1 ml de ABTS [acid 2,2′-azino-bis-(3-etilbenzotiazolină-6-sulfonic)] 5 mg/ml + 9 ml de tampon de substrat (0,1 M de tampon de fosfat-citrat cu pH 4 conținând 0,03 % H2O2), apoi se incubează timp de 10 minute la temperatura ambiantă. Se blochează reacția colorimetrică prin adăugarea în fiecare godeu a 100 μl de SDS (dodecilsulfat de sodiu) 2 % (G/V).
            2.1.5.   Citire
            Se citește la 405 nm într-un cititor de plăci ELISA.
            2.2.   Interpretarea rezultatelor
            
            
                     
                        2.2.1.
                     
                     
                        Determinarea procentului de blocare (PB) din fiecare eșantion prin aplicarea următoarei formule, unde «Abs» înseamnă anticorpi:
                        
                           
                     
                  
                     
                        2.2.2.
                     
                     
                        Eșantioanele care prezintă o valoare a PB mai mare de 50 % ar trebui considerate pozitive pentru anticorpi VPCA.
                     
                  
                     
                        2.2.3.
                     
                     
                        Eșantioanele care prezintă o valoare a PB mai mică de 45 % ar trebui considerate negative pentru anticorpi VPCA.
                     
                  
                     
                        2.2.4.
                     
                     
                        Eșantioanele care prezintă o valoare a PB cuprinsă între 45 % și 50 % ar trebui considerate neconcludente și trebuie supuse din nou testelor. Dacă rezultatul este tot neconcludent, animalele ar trebui retestate pe baza unor eșantioane prelevate nu mai devreme de două săptămâni de la prelevarea eșantionului considerat neconcludent.
                     
                  PARTEA B
            Identificarea agentului
            Transcriere inversă cuplată cu reacție de polimerizare în lanț în timp real (rRT-PCR)
            Testele de identificare a agentului bazate pe metode în care se utilizează acizi nucleici trebuie să detecteze tulpini de referință de la cele nouă serotipuri ale virusului VPCA.
            Metoda descrisă la punctul 2.1 se bazează pe capitolul 2.5.1 secțiunea B punctul 1.2 din Manualul de teste de diagnostic și vaccinuri pentru animale terestre, ediția 2016, astfel cum a fost adoptat de Adunarea mondială a delegaților OIE în mai 2012.
            Orice metodă de detectare bazată pe RT-PCR care este utilizată pentru testarea eșantioanelor, fie sânge, fie splină, în contextul Directivei 2009/156/CE, trebuie să fie cel puțin la fel de sensibilă cu metodologiile descrise la punctul 2.
            Tulpinile de referință de virus inactivat din serotipurile 1-9 pot fi obținute de la laboratorul de referință al Uniunii Europene sau de la laboratorul de referință al OIE pentru pesta cabalină africană din Algete, Spania.
            1.   Extracția ARN-ului viral
            
            Pentru a asigura o reacție bună este necesar să se extragă din eșantion un ARN al VPCA de înaltă calitate. Extracția acizilor nucleici din eșantioanele clinice se poate realiza printr-o varietate de metode interne și de metode disponibile comercial.
            Seturile comerciale utilizează metode diferite pentru izolarea ARN-ului. Majoritatea se bazează pe una dintre următoarele proceduri:
            
                        —
                     
                     
                        extracția cu fenol-cloroform a acizilor nucleici;
                     
                  
                        —
                     
                     
                        adsorbția acizilor nucleici într-un sistem de filtrare;
                     
                  
                        —
                     
                     
                        adsorbția acizilor nucleici într-un sistem cu bile magnetice.
                     
                  Un exemplu de extracție internă a ARN-ului este indicat mai jos:
            
                        1.1.
                     
                     
                        Un eșantion de 1 g de țesut este omogenizat în 1 ml de soluție de denaturare (tiocianat de guanidină 4 M, citrat de sodiu 25 mM, 2-mercaptoetanol 0,1 M, sarcozil 0,5 %).
                     
                  
                        1.2.
                     
                     
                        După centrifugare, la supernatant se adaugă 1 μg de ARN de drojdie, 0,1 ml de acetat de sodiu 2 M cu pH 4, 1 ml de fenol și 0,2 ml de amestec de cloroform/alcool izoamilic (49/1).
                     
                  
                        1.3.
                     
                     
                        Suspensia se scutură energic și se răcește pe gheață timp de 15 minute.
                     
                  
                        1.4.
                     
                     
                        După centrifugare, ARN-ul prezent în faza apoasă este extras cu fenol, precipitat cu etanol și resuspendat în apă sterilă.
                     
                  2.   Procedura RT-PCR în timp real
            
            2.1.   RT-PCR în timp real specifică de grup, de Agüero et al., 2008
                (3)
            
            Această RT-PCR în timp real specifică de grup vizează proteina VP7 a VPCA și poate detecta toate serotipurile și tulpinile cunoscute de VPCA care circulă în prezent. Ea a fost folosită cu rezultate foarte bune de către laboratoarele naționale de referință din statele membre ale Uniunii Europene care au participat la testele de competență anuale organizate de laboratorul de referință al Uniunii Europene pentru perioada 2009-2015. În plus, în cursul unei testări interlaboratoare organizate în 2015 în cadrul rețelei laboratoarelor de referință ale OIE, acest protocol a fost clasificat la un nivel foarte înalt față de altele.
            Primer și secvențe de probe pentru detectarea virusurilor din specia VPCA:
            
                        —
                     
                     
                        Primer sens
                     
                     
                        5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        Primer antisens
                     
                     
                        5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        Probă MGB-TaqMan
                     
                     
                        5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
                     
                  
                        2.1.1.
                     
                     
                        Concentrația soluției de primer este diluată la o concentrație de lucru de 8 μM («soluție de primer de lucru 8 μM»), în timp ce proba este diluată la o concentrație de lucru de 50 μM («soluție de probă de lucru 50 μM»). Trebuie concepută o dispoziție a plăcii de testat, care trebuie încărcată în softul mașinii de PCR în timp real. Utilizând dispoziția ca ghid, se adaugă 2,5 μl din fiecare soluție de primer de lucru 8 μM în fiecare godeu care va conține eșantioane de ARN, controale pozitiv și/sau negativ (concentrația finală a primerului va fi de 1 μM în cei 20 μl de amestec RT-PCR). Placa se ține pe gheață.
                     
                  
                        2.1.2.
                     
                     
                        2 μl de ARN izolat (eșantioanele de testat și controlul pozitiv) sau 2 μl de apă fără ARNază în controale de reacție negativă se amestecă cu primeri sens și antisens. Acest amestec este denaturat prin încălzire la 95 °C timp de 5 minute, urmată de o răcire rapidă pe gheață timp de cel puțin 5 minute.
                     
                  
                        2.1.3.
                     
                     
                        Se pregătește, conform instrucțiunilor producătorului, un volum adecvat de amestec principal pentru RT-PCR în timp real într-o singură etapă, pentru numărul de eșantioane care trebuie să fie testate. În fiecare godeu care conține eșantioane de ARN se adaugă 0,1 μl de soluție de probă de lucru 50 μM (concentrația finală a probei va fi de 0,25 μM în fiecare godeu care conține eșantioane de ARN). Se distribuie, în fiecare godeu al plăcii PCR care conține ARN-ul și primerii denaturați, 13 μl de amestec principal pentru RT-PCR în timp real într-o singură etapă.
                     
                  
                        2.1.4.
                     
                     
                        Se pune placa într-un thermocycler în timp real programat pentru transcriere inversă și pentru detectarea ADNc prin fluorescență/amplificare. Condițiile de amplificare constau într-o primă etapă de transcriere inversă la 48 °C timp de 25 de minute, urmată de 10 minute la 95 °C («hot start») și de 40 de cicluri de 15 secunde la 95 °C, de 35 de secunde la 55 °C și de 30 de secunde la 72 °C (sau 40 de cicluri la 97 °C timp de 2 secunde și la 55 °C timp de 30 de secunde dacă se utilizează reactivi și un thermocycler care permit reacții rapide). Datele privind fluorescența sunt obținute la sfârșitul etapei de 55 °C.
                     
                  
                        2.1.5.
                     
                     
                        Dacă se obțin curbe de amplificare atipice, testul nu este considerat valabil și trebuie repetat.
                        Eșantioanele sunt considerate pozitive dacă valoarea Ct (numărul ciclului la care fluorescența generată în cadrul unei reacții depășește pragul de fluorescență) este mai mică sau egală cu pragul Ct definit (35) în decurs de maximum 40 de cicluri PCR (Ct ≤ 35).
                        Eșantioanele sunt considerate neconcludente dacă valoarea Ct este mai mare decât pragul Ct definit (35) în decurs de maximum 40 de cicluri PCR (Ct > 35).
                        Eșantioanele sunt considerate negative dacă se obține o curbă de amplificare orizontală care nu traversează linia pragului în decurs de maximum 40 de cicluri PCR.
                     
                  2.2.   RT-PCR în timp real specifică de grup, de Guthrie et al., 2013
                (4)
            
            RT-PCR în timp real care utilizează probe de transfer de energie prin rezonanță în fluorescență (FRET) pentru detectarea acidului nucleic al VPCA.
            Testul RT-PCR pentru VPCA descris a fost conceput pe baza secvențelor dintr-o gamă largă de tulpini sălbatice de VPCA care circulă în prezent (Quan et al., 2010 (5)). De asemenea, el include un test de control extern sintetic brevetat pentru a verifica buna funcționare a componentelor de testare.
            Seturile pentru PCR în timp real într-o sigură etapă sunt disponibile comercial. Mai jos sunt câteva etape de bază descrise de Guthrie et al. (2013), care pot fi modificate în funcție de cerințele locale/specifice de caz, de seturile utilizate și de echipamentele disponibile.
            Primer și secvențe de probe pentru detectarea virusurilor din specia VPCA:
            
                        —
                     
                     
                        Primer sens
                     
                     
                        5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        Primer antisens
                     
                     
                        5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        Probă MGB-TaqMan
                     
                     
                        5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′
                     
                  
                        2.2.1.
                     
                     
                        Soluțiile de amestec de primer și de probă sunt preparate într-o concentrație de 25× la 5 μΜ pentru primerii sens și antisens și la 3 μΜ pentru probă. Trebuie concepută o dispoziție a plăcii de testat, care trebuie încărcată în softul mașinii de PCR în timp real. Utilizând dispoziția ca ghid, în godeurile corespunzătoare de pe placă, conform dispoziției, se adaugă 5 μl de eșantioane de ARN, inclusiv eșantioanele de testat și controalele pozitiv și negativ.
                     
                  
                        2.2.2.
                     
                     
                        ARN-ul este denaturat prin încălzire la 95 °C timp de 5 minute, urmată de o răcire rapidă pe gheață timp de cel puțin 3 minute.
                     
                  
                        2.2.3.
                     
                     
                        Se pregătește, conform instrucțiunilor producătorului, un volum adecvat de amestec principal pentru RT-PCR în timp real într-o singură etapă, pentru numărul de eșantioane care trebuie să fie testate. În amestecul principal se include 1 μl de 25× soluție de amestec primer probă (de la punctul 2.2.1 de mai sus), pentru a obține în fiecare godeu o concentrație finală de 200 nM pentru fiecare primer și de 120 nM pentru probă. Se distribuie 20 μl de amestec principal în fiecare godeu al plăcii PCR care conține ARN-ul denaturat.
                     
                  
                        2.2.4.
                     
                     
                        Se pune placa într-un thermocycler în timp real programat pentru transcriere inversă și pentru detectarea ADNc prin fluorescență/amplificare, conform sugestiilor producătorilor. Condițiile de amplificare constau, de exemplu, într-o primă etapă de transcriere inversă la 48 °C timp de 10 minute, urmată de 10 minute la 95 °C și de 40 de cicluri de 15 secunde la 95 °C și de 45 de secunde la 60 °C.
                     
                  
                        2.2.5.
                     
                     
                        Probele sunt considerate pozitive dacă fluorescența normalizată pentru testul RT-PCR privind VPCA depășește un prag de 0,1 în decurs de 36 de cicluri PCR în toate duplicatele unui eșantion.
                        Probele sunt considerate neconcludente dacă fluorescența normalizată pentru testul RT-PCR privind VPCA depășește un prag de 0,1 în decursul a 36-40 de cicluri PCR în orice duplicat al unui eșantion.
                        Eșantioanele sunt considerate negative dacă fluorescența normalizată pentru testul RT-PCR privind VPCA nu a depășit un prag de 0,1 în decurs de 40 de cicluri PCR în toate duplicatele unui eșantion și dacă fluorescența normalizată pentru testul de control extern sintetic brevetat a depășit un prag de 0,1 în decurs de 33 de cicluri PCR.”
                     
                  
      
      
         (1)  Laviada M.D., Roy P. și Sanchez-Vizcaino J.M (1992b). Adaptation and evaluation of an indirect ELISA and immunoblotting test for African horse sickness antibody detection. In: Bluetongue, African Horse Sickness and Related Orbiviruses: Proceedings of the Second International Symposium. Walton T.E. & Osburn B.l., Eds. CRC Press, Boca Raton, Florida, SUA, 646-650.
      
         (2)  Maree S. și Paweska J.T. (2005). Preparation of recombinant African horse sickness virus VP7 antigen via a simple method and validation of a VP7-based indirect ELISA for the detection of group-specific IgG antibodies in horse sera. J. Virol. Methods, 125 (1), 55-65.
      
         (3)  Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. și Jimenez-Clavero A. (2008). Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325-328.
      
         (4)  Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus. Journal of Virological Methods. 2013;189(1):30-5.
      
         (5)  Quan, M., Lourens, C.W., MacLachlan, N.J., Gardner, I.A., Guthrie, A.J., 2010. Development and optimisation of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay targeting the VP7 and NS2 genes of African horse sickness virus. J. Virol. Methods 167, 45-52.