CELEX: 32001R0213
Language: it
Date: 2001-01-09 00:00:00
Title: Regolamento (CE) n. 213/2001 della Commissione, del 9 gennaio 2001, che stabilisce modalità d'applicazione del regolamento (CE) n. 1255/1999 per quanto riguarda i metodi per le analisi e la valutazione qualitativa del latte e dei prodotti lattiero-caseari e modifica i regolamenti (CE) n. 2771/1999 e (CE) n. 2799/1999

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32001R0213

Regolamento (CE) n. 213/2001 della Commissione, del 9 gennaio 2001, che stabilisce modalità d'applicazione del regolamento (CE) n. 1255/1999 per quanto riguarda i metodi per le analisi e la valutazione qualitativa del latte e dei prodotti lattiero-caseari e modifica i regolamenti (CE) n. 2771/1999 e (CE) n. 2799/1999  

Gazzetta ufficiale n. L 037 del 07/02/2001 pag. 0001 - 0099

Regolamento (CE) n. 213/2001 della Commissionedel 9 gennaio 2001che stabilisce modalità d'applicazione del regolamento (CE) n. 1255/1999 per quanto riguarda i metodi per le analisi e la valutazione qualitativa del latte e dei prodotti lattiero-caseari e modifica i regolamenti (CE) n. 2771/1999 e (CE) n. 2799/1999LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,visto il trattato che istituisce la Comunità europea,visto il regolamento (CE) n. 1255/1999 del Consiglio, del 17 maggio 1999, relativo all'organizzazione comune dei mercati nel settore del latte e dei prodotti lattiero-caseari(1), in particolare gli articoli 10 e 15, l'articolo 26, paragrafo 3, l'articolo 29, paragrafo 1, e l'articolo 31, paragrafo 14,considerando quanto segue:(1) I regolamenti della Commissione (CEE) n. 1216/68, (CEE) n. 3942/92, (CE) n. 86/94, (CE) n. 2721/95, (CE) n. 1080/96, (CE) n. 1081/96, (CE) n. 1082/96, (CE) n. 1854/96, (CE) n. 880/98 e (CE) n. 1459/98, i cui riferimenti completi figurano nell'allegato XXVI del presente regolamento, stabiliscono i metodi di riferimento e di routine per l'analisi e la valutazione qualitativa del latte e dei prodotti lattiero-caseari e definiscono il campo e le modalità d'applicazione di tali metodi. Per motivi di chiarezza è opportuno procedere alla rifusione dei suddetti regolamenti in un unico testo, in modo da mettere a disposizione degli operatori del settore un unico corpus dei metodi summenzionati e delle relative modalità d'applicazione. Allo stesso scopo è necessario modificare i regolamenti della Commissione (CE) n. 2771/1999, del 16 dicembre 1999, recante modalità di applicazione del regolamento (CE) n. 1255/1999 del Consiglio per quanto riguarda le misure di intervento sul mercato del burro e della crema di latte(2) e (CE) n. 2799/1999, del 17 dicembre 1999, recante modalità d'applicazione del regolamento (CE) n. 1255/1999 in ordine alla concessione di un aiuto per il latte scremato e il latte scremato in polvere destinati all'alimentazione degli animali e in ordine alla vendita di tale latte scremato in polvere(3), al fine di incorporare nel presente regolamento i relativi allegati sui metodi d'analisi.(2) La composizione e le caratteristiche qualitative del latte e dei prodotti lattiero-caseari stabilite nel quadro dei regimi previsti dal regolamento (CE) n. 1255/1999 devono essere verificate allo scopo di garantirne la completa conformità con i requisiti fissati.(3) Spesso i metodi di riferimento previsti per tali verifiche sono metodi pubblicati da organismi internazionali quali CEN, IDF, ISO e AOAC International e regolarmente aggiornati da tali organismi. In alcuni casi esiste un metodo di riferimento comunitario, mentre in altri casi la normativa comunitaria non prevede alcun metodo di riferimento. Allo scopo di garantire un'applicazione uniforme dei metodi di riferimento, è opportuno compilare annualmente un elenco dei metodi di riferimento e precisare che il metodo da applicare deve figurare nel suddetto elenco.(4) Non si deve tuttavia escludere la possibilità di applicare metodi di routine, dei quali occorre quindi specificare le condizioni di applicazione.(5) Allo scopo di stabilire una prassi uniforme per la valutazione dei risultati delle analisi, è inoltre opportuno fissare metodi comuni. Lo stesso vale per la valutazione organolettica dei prodotti considerati e per il riesame dei risultati in caso di contestazione.(6) Per talune analisi non esistono attualmente metodi di riferimento convalidati internazionalmente riconosciuti. Non sono quindi disponibili informazioni sulle variazioni dei risultati analitici da laboratorio a laboratorio. È pertanto opportuno stabilire metodi a livello comunitario, convalidati secondo le norme stabilite a livello internazionale, da applicare come metodi di riferimento.(7) Il regolamento (CE) n. 2571/97 della Commissione, del 15 dicembre 1997, relativo alla vendita a prezzo ridotto di burro e alla concessione di un aiuto per la crema, il burro e il burro concentrato destinati alla fabbricazione di prodotti della pasticceria, di gelati e di altri prodotti alimentari(4), modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 635/2000(5), dispone, in certi casi, l'aggiunta di determinati rivelatori alla crema, al burro e al burro concentrato che permettono di verificarne la corretta utilizzazione finale. Data l'importanza di verificare il corretto funzionamento del sistema di marcatura e per assicurare la parità di trattamento di tutti gli operatori partecipanti, è opportuno stabilire, per quanto possibile, metodi comuni per la determinazione di alcuni di tali rivelatori.(8) Il burro concentrato deve essere sottoposto a marcatura in condizioni controllate, in conformità del regolamento (CEE) n. 3143/1985 della Commissione, dell'11 novembre 1985, relativo allo smaltimento a prezzo ridotto di burro d'intervento destinato al consumo diretto sotto forma di burro concentrato(6), modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 101/1999(7), del regolamento (CEE) n. 429/90 della Commissione, del 20 febbraio 1990, relativo alla concessione tramite gara di un aiuto per il burro concentrato destinato al consumo diretto nella Comunità(8), modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 124/1999(9), e del regolamento (CE) n. 2571/97. Il rigoroso rispetto dei requisiti di marcatura del burro concentrato è essenziale per prevenire il rischio di impieghi non autorizzati. È pertanto opportuno definire un metodo comune di individuazione dei rivelatori.(9) A norma dell'articolo 9 del regolamento (CE) n. 1255/1999 è possibile concedere un aiuto all'ammasso privato di formaggi a base di latte di pecora. Per questi stessi prodotti può essere concessa una speciale restituzione a norma dell'articolo 31 del suddetto regolamento. È prevista l'importazione nella Comunità a condizioni preferenziali, in provenienza da taluni paesi terzi, di formaggi prodotti con latte di pecora, di capra o di bufala oppure con miscele di latte di questi animali. A motivo delle succitate disposizioni è necessario verificare mediante controlli adeguati che nei formaggi di cui trattasi non sia stato incorporato latte vaccino. È quindi opportuno definire un metodo di riferimento comunitario atto a rivelare la presenza di latte vaccino, fatto salvo il ricorso a metodi di routine conformi a determinati criteri.(10) A norma del regolamento (CEE) n. 2921/90 della Commissione, del 10 ottobre 1990, relativo alla concessione di aiuti per il latte scremato destinato alla fabbricazione di caseina e di caseinati(10), modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 2654/1999(11), deve essere accertata l'assenza di coliformi. Il metodo di riferimento riconosciuto a livello internazionale per la ricerca di coliformi nel latte e nei prodotti lattiero-caseari è la norma internazionale IDF 73A: 1985. Tuttavia per la ricerca di coliformi in una certa quantità di prodotto il suddetto metodo può essere utilizzato soltanto in forma modificata. Occorre quindi stabilire un metodo di riferimento comunitario per la ricerca di coliformi basato sulla succitata norma.(11) Il regolamento (CEE) n. 2658/87 del Consiglio, del 23 luglio 1987, relativo alla nomenclatura tariffaria e statistica e alla tariffa doganale comune(12), modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 254/2000(13), differenzia le aliquote dei dazi doganali degli alimenti composti per animali appartenenti alla voce tariffaria 2309 in funzione del loro tenore in prodotti lattiero-caseari. Ai fini di un'applicazione uniforme delle disposizioni in oggetto, occorre determinare un metodo d'analisi del tenore in lattosio obbligatorio per tutti gli Stati membri, adottando a tal fine un metodo generalmente riconosciuto.(12) A norma del regolamento (CE) n. 1255/1999 il burro e il latte scremato in polvere destinati all'intervento, nonché il latte scremato in polvere destinato all'alimentazione degli animali devono soddisfare determinati requisiti di qualità. È quindi opportuno stabilire metodi di riferimento per accertare il rispetto dei suddetti requisiti.(13) L'applicazione di taluni metodi introdotti per la prima volta dal presente regolamento presuppone un periodo di adattamento. È pertanto opportuno differirne l'applicazione.(14) Il comitato di gestione per il latte e i prodotti lattiero-caseari non si è pronunciato nel termine fissato dal suo presidente,HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:CAPO IDISPOSIZIONI GENERALIArticolo 1Finalità e campo di applicazioneIl presente regolamento stabilisce disposizioni d'applicazione dei metodi per le analisi chimiche, fisiche e microbiologiche e per la valutazione organolettica del latte e dei prodotti lattiero-caseari nell'ambito dei regimi previsti dall'organizzazione comune dei mercati nel settore del latte e dei prodotti lattiero-caseari, istituita dal regolamento (CE) n. 1255/1999, e fissa alcuni dei metodi suddetti.Articolo 2Elenco dei metodi1. L'elenco dei metodi di riferimento applicabili alle analisi di cui all'articolo 1 è fissato nell'allegato I.2. La Commissione aggiorna detto elenco almeno una volta all'anno secondo la procedura di cui all'articolo 42 del regolamento (CE) n. 1255/1999.Articolo 3Metodi di routinePer l'esecuzione delle analisi previste dalla normativa comunitaria possono essere applicati metodi di routine, purché questi vengano adeguatamente tarati e periodicamente verificati rispetto al metodo di riferimento.Per il controllo dei risultati ottenuti mediante metodi di routine e prossimi ai valori limite specificati nei pertinenti regolamenti, si può applicare la procedura indicata nell'allegato II.In caso di controversia, prevalgono i risultati ottenuti con il metodo di riferimento.Articolo 4Convalida dei metodi di riferimento1. Un metodo di riferimento è convalidato se è conforme a criteri di precisione prestabiliti per quanto riguarda il limite di ripetibilità e di riproducibilità.2. Se un metodo di riferimento indicato nei pertinenti regolamenti non è stato convalidato, gli Stati membri stabiliscono un limite di riproducibilità provvisorio.Tale limite è ottenuto conformemente alla procedura prevista all'allegato III, lettera b). Tuttavia, nel corso degli otto mesi successivi all'entrata in vigore del presente regolamento, gli Stati membri possono utilizzare una procedura equivalente.Il rispetto del limite è verificato almeno una volta all'anno.3. Se i risultati ottenuti applicando metodi di riferimento convalidati o metodi con valori di precisione provvisori indicano che è stato superato un determinato limite, per determinare la differenza critica rispetto a tale limite si può applicare il metodo di valutazione dei risultati analitici descritto nell'allegato IV.Articolo 5Ammissibilità dei risultati analitici1. Le analisi sono praticate in laboratori che applicano una procedura interna di controllo della qualità conforme a quella descritta all'allegato V, lettera a), o una procedura di livello equivalente.Nel laboratorio deve essere disponibile una descrizione particolareggiata della procedura applicata.2. I laboratori fissano i propri parametri interni di precisione nell'ambito di una serie per tutti i metodi conformementea) alla procedura definita nell'allegato V, lettera b); ob) a una procedura convalidata, pubblicata, avente una determinata ripetibilità.Il rispetto del limite di riproducibilità deve essere verificato almeno una volta all'anno conformemente alla procedura definita nell'allegato III, lettera a).Il secondo comma non si applica qualora il laboratorio abbia partecipato ad un programma di verifica dell'idoneità nel corso dell'anno.3. Nella relazione di laboratorio sui risultati dell'analisi figurano gli elementi atti a consentire una valutazione dei risultati conformemente all'allegato IV e all'allegato VIII.4. I risultati di un'analisi sono considerati ammissibili se sono stati ottenuti in conformità dei criteri di accettabilità descritti nella procedura interna di controllo della qualità di cui al paragrafo 1 e dei parametri interni di precisione di cui al paragrafo 2.Articolo 6Valutazione organolettica1. Nel caso del burro, per verificare il livello delle prestazioni degli assaggiatori e l'attendibilità dei risultati si applicano le procedure indicate nell'allegato VI. La procedura descritta nell'allegato VII si applica come metodo di riferimento per la valutazione organolettica.2. Per quanto riguarda il latte e i prodotti lattiero-caseari diversi dal burro, gli Stati membri utilizzano, quale metodo di riferimento per la valutazione organolettica, la Norma IDF 99C/1997 o altri metodi equivalenti debitamente comunicati alla Commissione.Per verificare il livello delle prestazioni degli assaggiatori e l'attendibilità dei risultati, possono essere applicate le procedure indicate nell'allegato VI.Articolo 7Campionamento e contestazione dei risultati analitici1. Per l'esecuzione delle analisi previste dalla normativa comunitaria si procede al prelievo di campioni in doppio.2. Qualora i risultati di un'analisi siano contestati dall'operatore, si applica la procedura indicata nell'allegato VIII.CAPO IIMETODI DI ANALISIArticolo 8Tenore di acqua, sostanze secche, materie grasse nel burro1. Il metodo di analisi descritto nell'allegato IX si applica come metodo di riferimento per la determinazione del tenore di acqua nel burro.2. Il metodo di analisi descritto nell'allegato X si applica come metodo di riferimento per la determinazione del tenore di sostanze secche non grasse nel burro.3. Il metodo di analisi descritto nell'allegato XI si applica come metodo di riferimento per la determinazione del tenore di materie grasse nel burro.Articolo 9Determinazione dei rivelatori1. Il metodo d'analisi descritto all'allegato XII si applica come metodo di riferimento per la determinazione della vanillina nel burro concentrato, nel burro o nella crema.2. Il metodo d'analisi descritto nell'allegato XIII si applica come metodo di riferimento per la determinazione del tenore di estere etilico dell'acido beta-apo-8'-carotenico nel burro concentrato o nel burro.3. Il metodo d'analisi descritto nell'allegato XIV si applica come metodo di riferimento per la determinazione del tenore di stigmasterolo o di β-sitosterolo nel burro e nel burro concentrato.4. L'aggiunta di rivelatori al burro concentrato, al burro o alla crema è effettuata nel rispetto della pertinente normativa comunitaria se i risultati ottenuti sono conformi alle specifiche del punto 8 degli allegati di cui ai paragrafi 1, 2 e 3.Articolo 10Ricerca di caseina di latte vaccino1. Per verificare che il formaggio che deve essere prodotto esclusivamente con latte di pecora, con latte di capra o con latte di bufala oppure con miscele di latte di pecora, capra o bufala non contenga caseina di latte vaccino si applica il metodo d'analisi di riferimento specificato nell'allegato XV.Si considera che la caseina di latte vaccino è presente se il tenore apparente di caseina di latte vaccino nel campione da analizzare è pari o superiore a quello del campione di riferimento descritto nell'allegato XV contenente l'1 % di latte vaccino.2. I metodi di routine per individuare la presenza di caseina di latte vaccino nei formaggi di cui al paragrafo 1 possono essere applicati alle seguenti condizioni:a) il limite di individuazione non deve essere superiore allo 0,5 %;b) non si devono ottenere risultati falsamente positivi;c) la caseina di latte vaccino deve essere individuabile con l'opportuna sensibilità anche dopo i lunghi periodi di maturazione consueti in commercio.Se la condizione di cui alla lettera b) non è soddisfatta, i campioni risultati positivi devono essere analizzati con il metodo di riferimento.Se la condizione di cui alla lettera c) non è soddisfatta per uno dei tipi di formaggi di cui al paragrafo 1, tale formaggio deve essere analizzato con il metodo di riferimento.Articolo 11Ricerca di coliformi1. Per la ricerca di coliformi nel burro, nel latte scremato in polvere, nella caseina e nei caseinati si applica il metodo d'analisi di riferimento descritto nell'allegato XVI.2. Per la ricerca di coliformi si possono applicare metodi di routine che garantiscano, riguardo ai risultati, una precisione equivalente a quella del metodo di riferimento descritto nel suddetto allegato. In particolare, i metodi di routine devono garantire un sufficiente limite di individuazione. Inoltre, essi non devono produrre risultati falsamente positivi. Se ciò avviene, i risultati positivi dovranno essere confermati applicando il metodo di riferimento.Articolo 12Tenore di lattosioIl metodo per la determinazione del tenore di lattosio nei prodotti appartenenti alla voce 2309 della nomenclatura combinata è descritto nell'allegato XVII.Articolo 13Ricerca di siero di latte presamico1. Il metodo per individuare la presenza di siero di latte presamico nel latte scremato in polvere destinato all'ammasso pubblico è descritto nell'allegato XVIII.2. Il metodo per individuare la presenza di siero di latte presamico nel latte scremato in polvere e nelle miscele destinate all'alimentazione animale è descritto nell'allegato XIX.Articolo 14Ricerca di latticelloIl metodo per individuare la presenza di latticello nel latte scremato in polvere è descritto nell'allegato XX.Articolo 15Residui di antibioticiIl metodo per determinare la presenza di residui di antibiotici e di solfonammide/dapson nel latte scremato in polvere è descritto nell'allegato XXI.Articolo 16Tenore di latte scremato in polvereIl metodo per determinare il tenore di latte scremato in polvere negli alimenti composti per animali è descritto nell'allegato XXII.Articolo 17Ricerca di amidoIl metodo per individuare la presenza di amido nel latte scremato in polvere, nel latte in polvere denaturato e negli alimenti composti per animali è descritto nell'allegato XXIII.Articolo 18Tenore di umidità del latticello acido in polvereIl metodo per determinare il tenore di umidità del latticello acido in polvere destinato all'impiego in alimenti per animali è descritto nell'allegato XXIV.Articolo 19Ricerca di grassi estraneiIl metodo per determinare la presenza di grassi estranei nel grasso del latte è descritto nell'allegato XXV.CAPO IIIDISPOSIZIONI FINALIArticolo 20Modifiche del regolamento (CE) n. 2771/1999Il regolamento (CE) n. 2771/1999 è modificato come segue:1) All'articolo 4, paragrafo 1, il testo della prima frase è sostituito dal seguente: "Le autorità competenti controllano la qualità del burro secondo i metodi di analisi di cui all'allegato I e su campioni prelevati secondo le modalità di cui all'allegato IV".2) All'allegato I, il testo della nota n. 2 a piè di pagina è sostituito dal presente: "Si veda l'allegato I del regolamento (CE) n. 213/2001 (il presente regolamento)".3) Gli allegati II e III sono soppressi.4) All'allegato IV, punto 2, penultima riga, i termini "nell'allegato III" sono sostituiti dai termini: "nell'allegato VIII del regolamento (CE) n. 213/2001 [il presente regolamento]."Articolo 21Modifica del regolamento (CE) n. 2799/1999Il regolamento (CE) n. 2799/1999 è modificato come segue:1) All'articolo 20, il testo dei paragrafi 1, 2, 3 e 4 è sostituito dal seguente: "1. Il tenore in latte scremato in polvere delle miscele e degli alimenti composti viene verificato con una doppia analisi almeno, eseguita secondo il metodo indicato nell'allegato XXII del regolamento (CE) n. 213/2001 [il presente regolamento] e completata dai controlli di cui all'articolo 17, paragrafo 3. In caso di risultati discordanti tra tali verifiche, prevalgono i risultati dei controlli in loco.2. L'assenza di siero di latte presamico è accertata secondo il metodo descritto nell'allegato XIX del regolamento (CE) n. 213/2001 [il presente regolamento].3. Il tenore in amido negli alimenti composti è accertato nell'ambito dei controlli di cui all'articolo 17, paragrafo 3, completati dal metodo di analisi descritto nell'allegato XXIII del regolamento (CE) n. 213/2001 [il presente regolamento].4. Il tenore in umidità del latticello acido in polvere è accertato secondo il metodo d'analisi illustrato nell'allegato XXIV del regolamento (CE) n. 213/2001 [il presente regolamento]."2) Gli allegati III, IV, V e VI sono soppressi.Articolo 22AbrogazioniI regolamenti (CEE) n. 1216/68, (CEE) n. 3942/92, (CE) n. 86/94, (CE) n. 2721/95, (CE) n. 1854/96, (CE) n. 1080/96, (CE) n. 1081/96, (CE) n. 1082/96, (CE) n. 880/98 e (CE) n. 1459/98 sono abrogati.I riferimenti ai regolamenti abrogati s'intendono fatti al presente regolamento.Articolo 23Entrata in vigoreIl presente regolamento entra in vigore il settimo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee.Tuttavia i metodi descritti negli allegati III, IV punto 4, V, VI e VIII si applicano a decorrere dal diciottesimo mese successivo all'entrata in vigore del presente regolamento.Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri.Fatto a Bruxelles, il 9 gennaio 2001.Per la CommissioneFranz FischlerMembro della Commissione(1) GU L 160 del 26.6.1999, pag. 48.(2) GU L 333 del 24.12.1999, pag. 11.(3) GU L 340 del 31.12.1999, pag. 3.(4) GU L 350 del 20.12.1997, pag. 3.(5) GU L 76 del 25.3.2000, pag. 9.(6) GU L 298 del 12.11.1985, pag. 9.(7) GU L 11 del 16.1.1999, pag. 14.(8) GU L 45 del 21.2.1990, pag. 8.(9) GU L 16 del 21.1.1999, pag. 19.(10) GU L 279 dell'11.10.1990, pag. 22.(11) GU L 325 del 17.12.1999, pag. 10.(12) GU L 256 del 7.9.1987, pag. 1.(13) GU L 28 del 3.2.2000, pag. 16.ALLEGATO I(Articolo 2)ELENCO DEI METODI DI RIFERIMENTONote all'elenco dei metodi di riferimento dell'Unione europea:Nota 1: Isolamento delle materie grasse del latte secondo la norma IDF 6B: 1989 (protezione dalla luce).Nota 2: Non è stato stabilito nessun metodo di riferimento.Nota 3: La preparazione del campione dev'essere eseguita secondo la norma IDF 122 C: 1996 o la norma IDF 73A: 1985.Nota 4: Incubazione per 48 ore alla temperatura 55 °C, precauzioni da adottare per evitare il prosciugamento del terreno di coltura.Nota 5: % s.s.n.g. = % sostanza secca - % materia grassa.Nota 6: Il burro deve corrispondere alla categoria nazionale di qualità dello Stato membro di produzione di cui all'allegato V del regolamento (CE) n. 2771/1999 della Commissione.Nota 7: Direttiva n. 4/84/CEE della Commissione.Nota 8: Regolamento (CE) n. 1758/94 della Commissione (GU L 183 del 19.7.1994, pag. 14).Nota 9: Direttiva 78/633/CEE della Commissione.>SPAZIO PER TABELLA>>SPAZIO PER TABELLA>ALLEGATO II(Articolo 3)CONTROLLO DEI RISULTATI OTTENUTI MEDIANTE METODI DI ROUTINE E PROSSIMI AI VALORI LIMITE PER LE CARATTERISTICHE DI COMPOSIZIONE E DI QUALITÀ NEI REGOLAMENTISe mo è valore limite per le caratteristiche di composizione e di qualità specificate in un regolamento, il limite (L) di decisione è>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>se RRout/RRef &lt;= 1RRout: limite di riproducibilità del metodo di routineRRif: limite di riproducibilità del metodo di riferimentoSe mo è un limite superiore RRout/Rrif  &gt; 1, il limite di decisione è dato dalla formula>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>Se, nelle stesse condizioni, mo è un limite inferiore, il limite di decisione è dato da>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>CrD95 è la differenza critica del metodo di riferimento (cfr. allegato IV).Se mo è un limite superiore, il risultato finale, ottenuto mediante un metodo di routine e superiore al limite di decisione, deve venire sostituito con il risultato finale ottenuto con il metodo di riferimento. Questo risultato finale deve essere basato almeno sullo stesso numero di analisi/campioni con cui si è ottenuto il risultato finale del metodo di routine.Se mo è un limite inferiore, occorre applicare la stessa procedura relativa ad un risultato finale ottenuto mediante un metodo di routine e più basso del limite di decisione.Nota:La procedura descritta sopra può venire applicata se non vi sono effetti di matrice rivelabili.Gli effetti di matrice possono venire rivelati nella maniera seguente: per ciascun campione utilizzato per la taratura, si determina la differenza (wi) tra i risultati ottenuti mediante il metodo di riferimento e il metodo di routine.La deviazione standard calcolata utilizzando la formula:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>m: numero di campioni utilizzati per la taraturaviene confrontata con la media aritmetica della deviazione standard di ripetibilità dei metodi di riferimento e di routine>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>Non si può escludere un effetto di matrice se si ha>PIC FILE= "L_2001037IT.001502.EPS">dove:f= m (f: numero di gradi di libertà)α= probabilità di errore; α = 0,05.In questo caso, sono necessari studi ulteriori prima di poter fissare un limite di decisione.ALLEGATO III(Articoli 4 e 5)a) Procedura per la determinazione della conformità con un limite di riproducibilità stabilito (analisi chimica)La conformità con il limite di riproducibilità viene controllata mediante confronto dei risultati del laboratorio con quelli ottenuti da un laboratorio sperimentato(1) su un campione identico. In ambedue i laboratori viene eseguita una determinazione in doppio e i risultati vengono valutati utilizzando la formula:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dove:CrD95: differenza critica (P = 0,95)>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>: media aritmetica di due risultati ottenuti nel laboratorio 1>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>: media aritmetica di due risultati ottenuti nel laboratorio 2R: limite di riproducibilità: da determinarsi mediante interpolazioner: limite di ripetibilità: se la precisione varia in funzione del livelloSe viene superata la differenza critica occorre effettuare un altro esperimento entro i due mesi successivi. In caso di non conformità con il limite di riproducibilità in questo secondo esperimento, le autorità competenti devono prendere le opportune misure.b) Procedura per l'ottenimento di un limite provvisorio di riproducibilità (analisi chimica)Si ottiene un limite provvisorio di riproducibilità (Rprov) utilizzando la seguente formula:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dove:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>: media di due risultati ottenuti nel laboratorio 1>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>: media di due risultati ottenuti nel laboratorio 2 (vedi allegato IIIa)r: limite di ripetibilità o limite provvisorio di ripetibilità.N.B.:1. Rprov può venire utilizzato per calcolare differenze critiche (vedi allegato VI).2. Se il valore calcolato per Rprov è minore di 2r, Rprov viene fissato pari a 2r.3. Se il valore calcolato è maggiore di 3r o maggiore del doppio del valore di R ottenuto dalla formula di Horwitz(2), allora Rprov è troppo alto e non può venire utilizzato per calcolare la differenza critica.4. Rprov deve venire determinato almeno una volta all'anno sulla base di risultati ottenuti in due laboratori (vedi allegato IV).5. Per il calcolo delle differenze critiche usare il valore medio di Rprov. Per ottenere il valore medio di Rprov si applicano le regole di cui ai punti 2 e 3.Il limite di riproducibilità (R) viene ottenuto dal valore calcolato di RSDR- come segue:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>(>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>= media aritmetica dei risultati ottenuti)Valori calcolati di RSDR (esempi)>SPAZIO PER TABELLA>Per una concentrazione dell'analita di 1 g/100 g si ottiene:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>.(1) In linea di principio, un laboratorio sperimentato è un laboratorio che ha partecipato con successo alla convalida del metodo di prova o a una prova di idoneità.(2) Formula di Horwitz:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dove:RSDR: deviazione standard relativa della riproducibilitàC: concentrazione espressa come frazione decimale (esempio: 10 g/100 g = 0,1).Bibliografia:Peeler, J.T., Horwitz, W. and Albert, R.J. Ass. Off. Anal. Chem.72 (5), 784-806 (1989).ALLEGATO IV(Articolo 4)VALUTAZIONE DI RISULTATI ANALITICI OTTENUTI CON L'UTILIZZO DI METODI CONVALIDATISe dal risultato analitico risulta che è stato superato un limite, si calcola la media aritmetica di due o più risultati. Si applica la seguente procedura:1) Nel caso in cui il risultato analitico sia costituito di un singolo risultato, si esegue una seconda analisi in condizioni di ripetibilità. Se le due analisi non possono venire eseguite in condizioni di ripetibilità, si esegue un'ulteriore analisi in doppio in condizioni di ripetibilità e si utilizzano tali risultati per la valutazione della conformità con la differenza critica.2) Si determina il valore assoluto della differenza tra la media aritmetica dei risultati ottenuti in condizioni di ripetibilità e il limite. Se il valore assoluto di questa differenza è maggiore della differenza critica, il campione che è stato analizzato non soddisfa i requisiti.La differenza critica viene determinata utilizzando la formula seguente:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dove:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>: media aritmetica dei risultati ottenutimo: limiten: numero di analisi/campioneSe la precisione varia con il livello, può essere necessario determinare r e R per interpolazione.Normalmente, il risultato finale riportato per un campione deve essere conforme con il limite.Risultati finali- compresi tra>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>e>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>, se il limite è un valore massimo,- compresi tra>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>e>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>, se il limite è un valore minimo;devono pertanto presentarsi solo eccezionalmente.Risultati finali compresi nei margini citati sono accettabili solo se si verificano al massimo una volta ogni 5 campioni analizzati per ogni partita. Se per ogni partita vengono analizzati meno di 5 campioni, è accettabile un risultato compreso tra i suddetti valori. Tuttavia, in caso di partite fornite regolarmente da un produttore, va rispettata la regola in base alla quale su 5 campioni analizzati non deve essere ottenuto più di un risultato compreso nei margini sopra specificati.3) Se il risultato finale x viene calcolato applicando la formula x = y1 +/- y2 (per esempio: acqua + contenuto di sostanza secca non grassa del burro per calcolare il tenore di materie grasse), dove y1 e y2 sono i risultati finali di un solo tipo di analisi, i limiti complessivi di ripetibilità e di riproducibilità rx e Rx dei risultati finali x vengono calcolati nel modo seguente:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dove r1 e r2 sono i limiti di ripetibilità e R1 e R2 sono i limiti di riproducibilità rispettivamente di y1 e y2.Si confronta x con il limite mo seguendo le regole specificate ai punti 1 e 2. La differenza critica viene determinata utilizzando la formula>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dove x è la media aritmetica dei risultati xi ottenuti.4) Se il risultato finale viene calcolato utilizzando la formula>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>(esempio: contenuto di grasso nella sostanza secca di formaggio)dove y1 e y2 sono i risultati finali di un solo tipo di analisi, i limiti complessivi di ripetibilità e riproducibilità rx e Rx vengono calcolati come segue:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>μ1: limite o valore ottimale per y1 (per esempio: sostanza grassa)μ2: limite o valore ottimale per y2 (per esempio: sostanza secca)>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dove:r1: limite di ripetibilità, y1r2: limite di ripetibilità, y2>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dove:R1: limite di riproducibilità, y1R2: limite di riproducibilità, y2Le procedure per il calcolo di rx e Rx possono venire applicate solo se i limiti relativi di ripetibilità e di riproducibilità (r*1; r*2; R*1; R*2) sono minori o uguali a 0,15.Si confronta x con il limite μx seguendo le regole specificate ai punti 1 e 2. La differenza critica viene determinata utilizzando la formula>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dove>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>è la media aritmetica dei risultati x ottenuti in ordine cronologico(1).(1) N.B.:Se per esempio vengono ottenuti i risultati y11, y12, y21 e y22 si deve calcolare la media aritmetica di y11/y21 e y12/y22.ALLEGATO VCONTROLLO INTERNO(Articolo 5)a) Procedura per il controllo interno della qualità (CIQ) (analisi chimica)Definizione di materiale di controlloMateriale utilizzato ai fini del controllo interno della qualità e analizzato secondo la stessa procedura, o parte della stessa procedura, dei materiali sottoposti a test.Un materiale di controllo può essere:- un materiale di riferimento certificato,- un materiale di riferimento interno,- un materiale convalidato mediante una prova interlaboratori,- un materiale addizionato di rivelatore.Procedura per instaurare il CIQIl laboratorio deve istituire un CIQ secondo la procedura descritta nel documento IUPAC "Harmonized Guidelines for Internal Quality Control in analytical laboratories"(1).Il CQI viene realizzato mediante l'inclusione di materiali di controllo nella sequenza analitica o mediante analisi in multiplo del campione in esame. I materiali di controllo devono avere una composizione chimica simile a quella dei campioni ed essere adeguatamente stabili nel periodo di tempo di pertinenza. Deve essere dimostrato che essi possono venire suddivisi idoneamente in porzioni identiche per l'analisi e che presentano una concentrazione dell'analita appropriata per l'intervallo di pertinenza.Un materiale di controllo deve venire inserito almeno una volta in ciascuna serie di analisi e il valore ottenuto deve venire riportato su un diagramma di controllo allo scopo di misurare gli errori a lungo termine. Inoltre, il laboratorio deve dimostrare periodicamente la conformità alle condizioni di ripetibilità all'interno della serie. A tal fine si eseguono analisi in doppio di materiali di controllo e/o di test. I risultati di queste analisi devono venire confrontati con eventuali limiti di ripetibilità pubblicati e con dati esistenti relativi alla precisione interna del laboratorio.Nel caso vengano utilizzati materiali di controllo, i valori ottenuti per l'analisi del materiale di controllo tra una serie e l'altra verranno riportati su un diagramma di Shewhart [ISO 8258 (1991)] con appropriati limiti di controllo. I limiti di azione vengono fissati a>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>,dove st è la deviazione standard totale,e i limiti di vigilanza sono fissati a>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>Deviazione standard totale>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dove:sb: deviazione standard tra seriesw: deviazione standard all'interno di una serien: numero di determinazioniIn casi nei quali non vengono utilizzati materiali di controllo (per esempio a causa della mancanza di stabilità), almeno uno dei materiali in esame deve essere analizzato in doppio in ciascuna serie.Le differenze assolute ottenute dalle analisi in doppio entro una serie (vedi allegato III) sono riportate in grafico. La linea centrale è 1,128 sw, il limite inferiore è pari a zero, il limite superiore (limite d'azione) è 3,686 sw, dove sw è la deviazione standard all'interno della serie.La procedura di controllo deve includere materiali dei livelli alto e basso quando l'intervallo di concentrazione è ampio.Se i materiali di analisi coprono un ampio intervallo di concentrazioni dell'analita, il laboratorio deve stabilire la relazione tra precisione e livello. Se la precisione è proporzionale al livello, il successivo controllo deve venire effettuato sulla base della precisione relativa (cioè differenza assoluta in percentuale del valore medio).Si è in condizioni di fuori controllo nel sistema analitico se si verifica uno dei casi seguenti:A) l'ultimo valore del tracciato cade al di fuori dei limiti d'azione,B) l'ultimo valore e il valore precedente cadono al di fuori dei limiti di vigilanza, ma all'interno dei limiti d'azione,C) se si utilizzano materiali di controllo, nove valori successivi cadono sullo stesso lato della linea mediana.In condizioni di fuori controllo il laboratorio deveA) sospendere l'analisi fino a quando vengano eseguite prove diagnostiche e si effettuino le opportune operazioni correttive eB) scartare la serie di risultati e ripetere l'analisi dei materiali in esame.b) Procedura per la selezione di materiale di controllo interno e per la determinazione dei limiti di precisione "interni" (analisi chimica)Dati relativi alla precisione interna del laboratorio vengono ottenuti mediante analisi in multiplo di materiali di controllo e/o mediante analisi in multiplo di campioni da analizzare.Per la determinazione dei parametri di precisione per le variazioni entro una serie e tra serie differenti, da utilizzare in seguito per costruire schede di controllo, i laboratori applicano la seguente procedura. I laboratori possono adottare procedure alternative a condizione che possano dimostrare adeguatamente che ne sono stati derivati parametri di precisione affidabili.1. Scelta dei materiali di controlloNel caso sia opportuno che il laboratorio utilizzi un materiale di controllo, devono innanzitutto venire raccolti dati per definire i limiti. Se possibile, si devono utilizzare materiali di riferimento certificati (MRC). I potenziali materiali di controllo devono venire analizzati in condizioni di ripetibilità all'interno di una serie, includendo adatti MRC con replicazione e randomizzazione. Ove tale approccio non sia possibile, i laboratori devono cercare di partecipare a prove di idoneità e stabilire valori medi di consenso (valori assegnati) che possano venire considerati come media vera convenzionale associata a un'incertezza significativa. Altre procedure consistono nell'assegnazione di un valore vero mediante formulazione oppure mediante l'uso di materiali di controllo addizionati di rivelatore.Inoltre, qualora il laboratorio esegua regolarmente questo tipo di analisi ed abbia già istituito un controllo statistico, un nuovo materiale di controllo (occorrente per esempio a causa dell'esaurimento delle scorte) deve essere scelto per confronto con analisi sotto controllo di materiali esistenti.2. Assegnazione dei limitiDopo aver scelto un materiale di controllo, il laboratorio deve stabilire valori numerici della precisione nell'ambito di una serie e tra serie differenti utilizzando questo materiale.Come requisito minimo per stabilire la precisione nell'ambito di una serie, il materiale di controllo deve venire analizzato in doppio per 12 volte. L'analisi in doppio deve essere eseguita in condizioni di repetibilità, vale a dire dallo stesso operatore, con i medesimi reagenti, ecc. L'analisi in doppio del materiale di controllo deve essere randomizzata all'interno di una serie analitica. Ciascuna analisi in doppio deve essere effettuata in giorni differenti su un periodo di tempo tale da riflettere ragionevoli variazioni da serie a serie, che tengano conto delle variazioni normali, per esempio di reagenti, ritaratura degli strumenti e, se del caso, differenti analisti.NB.Va notato che l'uso di dati non del tutto rappresentativi delle variazioni da serie a serie può causare un'inutile ripetizione dell'analisi a causa della definizione di limiti troppo stretti. Al contrario, un laboratorio che presenti dati di precisione troppo imprecisi può non essere in grado di rispettare i limiti prescritti nei metodi di riferimento, rischia di ottenere risultati scadenti rispetto a laboratori di pari livello e di non riuscire a produrre dati idonei allo scopo.2.1. Determinazione della precisione nell'ambito di una serie2.1.1. Precisione nell'ambito di una serie quando sia disponibile un materiale di controllo.I dati in doppio (minimo 12 analisi in doppio) devono innanzitutto essere sottoposti ad un test di varianza massima di Cochran. Questo consiste nel confronto del quadrato della differenza massima di una prova in doppio con la somma del quadrato delle differenze.>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dovedi= differenza tra analisi in doppioIl valore del criterio di Cochran, C, viene confrontato con valori tabulati [ISO 5725 (1994)]. Se un valore può essere classificato come sospetto o erratico, il risultato deve essere esaminato e spiegato, per esempio per errore tecnico, errore di calcolo, disattenzione nell'esecuzione della prova, analisi di un campione sbagliato. Se, in base alla spiegazione dell'errore tecnico, è impossibile sostituire il risultato sospetto, questo deve venire scartato come vero valore erratico. Se permangono risultati sospetti o erratici privi di spiegazione, i valori sospetti vengono conservati come corretti e i valori erratici statistici vengono scartati. Il laboratorio deve cercare di ottenere valori sostitutivi.Quando il laboratorio è sicuro che i dati non contengono valori erratici, la deviazione standard nell'ambito di una serie sw viene ottenuta come segue:Per ciascuna coppia xi1, xi2 dei dati in doppio, si calcolano la somma dei due risultati>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>e la differenza dei due risultati>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>e si calcolano le somme>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>Una stima della deviazione standard nell'ambito di una serie è>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>Il limite interno di precisione è 2,8 sw.Se si usa un metodo di riferimento, il limite di precisione interno dovrà essere confrontato con il limite di ripetibilità pubblicato. Il laboratorio deve soddisfare a quanto previsto dal metodo di riferimento; in caso contrario bisogna ricercarne le ragioni.I limiti stabiliti devono essere considerati come provvisori e soggetti a revisione.2.1.2. Precisione nell'ambito di una serie nel caso non sia disponibile un materiale di controlloIl laboratorio può scegliere di stabilire la precisione nell'ambito di una serie mediante analisi in doppio di campioni rappresentativi (almeno 12 analisi in doppio). In casi nei quali non sia possibile utilizzare materiali di controllo, per esempio perché instabili, devono venire raccolti dati in doppio ottenuti mediante questo metodo.NB.Si assume che le analisi coprano un intervallo relativamente stretto di valori e che pertanto sia possibile applicare un valore singolo a tutti i campioni. Quando la gamma dei risultati è più ampia (se, per esempio, si estende su un ordine di grandezza) e la precisione dipende dal livello, i laboratori devono prendere in considerazione l'utilizzo di deviazioni standard relative.I dati devono venire sottoposti al test di Cohran, come al punto 2.1.1. Una volta che il laboratorio ha stabilito che i dati non comprendono valori erratici, si possono ottenere la deviazione standard nell'ambito di una serie e il limite di precisione interno come definito al punto 2.1.1.La deviazione standard sw nell'ambito di una serie può venire utilizzata per costruire diagrammi di controllo (vedi allegato II). I limiti stabiliti devono essere considerati come provvisori e soggetti a revisione.2.2. Determinazione della precisione tra serie differentiCalcolare il valore medio (s1/2) per ciascuna coppia e sottoporre questi valori al test di Grubbs [ISO 5725 (1994)]. I criteri di scarto/accettazione dei valori erratici o dei valori sospetti sono uguali a quelli descritti al punto 2.1.1. Il laboratorio deve cercare di ottenere un valore sostitutivo per ogni risultato scartato. Quando il laboratorio è sicuro che i dati non contengano valori erratici, si calcola la deviazione standard tra serie differenti sb.>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>oppure si assume uguale a zero se l'espressione sotto il segno di radice quadrata è negativa.La deviazione standard totale st viene utilizzata per costruire diagrammi di controllo per la media di n determinazioni (vedi allegato II). I limiti stabiliti devono essere considerati come provvisori e soggetti a revisione.3. Revisione dei limiti inizialiI limiti di controllo stabiliti come descritto sopra devono essere considerati stime iniziali.Allo scopo di aggiornare i limiti stabiliti sulla base di una precisione accettabile nell'ambito di una serie (punto 2.1.2) si devono raccogliere ulteriori dati in doppio sui campioni. La frequenza del riesame dei dati dipenderà in generale dalla frequenza delle analisi. Indicativamente, i dati devono venire revisionati ogni 10 risultati successivi in doppio. Tutti i dati devono poi venire sottoposti al test di Cochran e i limiti devono venire fissati nuovamente sulla base del nuovo valore della deviazione standard. Decisioni successive sulla validità dei limiti di controllo verranno prese alla luce di dati ulteriori.Il riesame dei dati iniziali ottenuti per la precisione tra serie differenti dipende anch'esso dalla frequenza di analisi. Indicativamente, dopo aver ottenuto 10 dati dall'analisi del materiale di controllo, ad una frequenza di un'analisi per partita, si dovrebbero riesaminare i valori assunti inizialmente per la deviazione standard e per la media.Tutti i dati devono venire sottoposti al test di Grubbs per la ricerca di valori erratici. Sulla base dei nuovi dati si calcolano poi nuovamente la media e la deviazione standard.In aggiunta, a questo stadio il laboratorio dovrebbe utilizzare un grafico di campionamento sequenziale (grafico "Cusum") [BS 5700: (1984) e modifica 5480 (1987)] per studiare problemi che possono essere associati per esempio all'invecchiamento dei reagenti. Cercare una spiegazione per qualsiasi singolo risultato che cade al di fuori dei limiti della "V-mask" del suddetto grafico.I nuovi limiti (media e deviazione standard) devono venire esaminati regolarmente con l'utilizzo della tecnica del grafico "Cusum". Qualsiasi indicazione che possa far sorgere dubbi sulla validità del materiale di controllo deve essere accuratamente studiata.4. Comunicazione dei dati sulla precisioneIl laboratorio trasmette le seguenti informazioni alle competenti autorità nazionali:- metodo impiegato,- deviazione standard nell'ambito di una serie, sw, e limite di precisione interno,- deviazione standard tra serie differenti, sb,- deviazione standard totale s1,- numero di analisi eseguite per ottenere i dati sulla precisione.(1) M. Thompson and R. Wood: "Pure and Applied Chemistry" 67 (4), 649-666 (1995).ALLEGATO VI(Articolo 6)VALUTAZIONE DEGLI ASSAGGIATORI E DELL'AFFIDABILITÀ DEI RISULTATI DI ANALISI ORGANOLETTICHELe procedure che seguono sono applicabili se vengono utilizzati metodi di classificazione mediante punteggio (norma IDF 99C/1997).a) Determinazione dell'"indice di ripetibilità"Un assaggiatore deve analizzare alla cieca almeno 10 campioni in doppio entro un periodo di 12 mesi. Tale operazione viene usualmente effettuata in più sessioni. I risultati delle caratteristiche dei singoli prodotti vengono valutati utilizzando la formula seguente:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dove:wI: dice di ripetibilitàxi1: punteggio per la prima valutazione del campione xixi2: punteggio per la seconda valutazione del campione xin: numero di campioniI campioni da valutare devono coprire un'ampia gamma di qualità. wI non deve superare 1,5 (scala a 5 punti).b) Determinazione dell'"indice di deviazione"Tale indice si applica per controllare se un assaggiatore utilizza, per la valutazione qualitativa, la stessa scala di un gruppo sperimentato di assaggiatori. I punteggi attribuiti dall'assaggiatore vengono confrontati con la media dei punteggi del gruppo di assaggiatori.Per la valutazione dei risultati si utilizza la formula seguente:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dove:xi1; xi2: cfr. lettera a)>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>;>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>: punteggio medio del gruppo di assaggiatori per la prima e, rispettivamente, la seconda valutazione del campione xin: numero di campioni (almeno 10 in 12 mesi).I campioni da valutare devono coprire un'ampia gamma di qualità. DI non deve superare 1,5 (scala a 5 punti).Gli Stati membri comunicano eventuali difficoltà incontrate nell'applicazione di questa procedura.c) Confronto dei risultati ottenuti in differenti regioni di uno Stato membro e in differenti Stati membriOve del caso, almeno una volta all'anno deve essere organizzata una prova che permetta il confronto dei risultati ottenuti da assaggiatori di differenti regioni. Se si rilevano differenze significative, occorre fare in modo di individuarne le ragioni e arrivare a risultati simili.Gli Stati membri possono organizzare prove che permettano il confronto dei risultati ottenuti dai loro assaggiatori o da assaggiatori di Stati membri confinanti. Eventuali differenze significative formano oggetto di un esame approfondito allo scopo di giungere a risultati simili.Gli Stati membri comunicano alla Commissione i risultati di tali confronti.ALLEGATO VII(Articolo 6)VALUTAZIONE ORGANOLETTICA DEL BURRO1. ObiettivoLa presente procedura per la valutazione organolettica del burro ha lo scopo di fornire un metodo uniforme applicabile in tutti gli Stati membri.2. DefinizioniPer valutazione organolettica si intende l'esame delle caratteristiche di un prodotto mediante gli organi di senso.Per gruppo di esperti si intende un gruppo di esperti selezionati per la valutazione che, durante le operazioni di valutazione, lavorano senza comunicare fra di loro e senza influenzarsi reciprocamente.Per punteggio si intende il risultato della valutazione organolettica effettivata da parte di un gruppo di esperti ed espressa mediante l'uso di una scala numerica. Si deve usare una nomenclatura dei difetti.Per classificazione si intende una classificazione di qualità eseguita sulla base del punteggio.Documenti di controllo: documenti utilizzati per registrare i punteggi singoli per ciascuna caratteristica e la classificazione finale del prodotto. (Questo documento può venire usato anche per registrare la composizione chimica).3. Locale di prova3.1. Prendere opportune precauzioni perché gli assaggiatori nella camera di prova non siano influenzati da fattori esterni.3.2. La camera di prova deve essere esente da odori estranei e facilmente pulibile. Le pareti devono essere di colore chiaro.3.3. La camera di prova e la sua illuminazione devono essere tali da non influire sulle proprietà del prodotto da valutare. La camera deve essere equipaggiata con un'appropriata strumentazione di controllo della temperatura.4. Selezione degli assaggiatoriL'assaggiatore deve avere familiarità con i prodotti a base di burro e avere la competenza necessaria per eseguire una valutazione organolettica. La sua competenza deve essere riesaminata periodicamente (almeno una volta all'anno) da parte dell'autorità competente.5. Requisiti del gruppo di espertiIl numero di esperti nel gruppo deve essere dispari, al minimo tre. Essi devono essere, per la maggior parte, dipendenti dell'autorità competente o persone autorizzate non occupati presso l'industria lattiero-casearia.Affinché gli assaggiatori possano fornire prestazioni ottimali, prima di procedere alla valutazione occorre tener conto di diversi fattori:- gli assaggiatori non devono essere affetti da malattie che potrebbero compromettere le prestazioni; ove ciò si verifichi è necessario inserire nel gruppo un altro assaggiatore,- gli assaggiatori devono presentarsi puntualmente per partecipare alla valutazione e disporre di tempo sufficiente per compierla,- gli assaggiatori devono evitare l'impiego di prodotti fortemente odorosi quali profumi, lozioni dopobarba, deodoranti e astenersi dal consumo di alimenti molto aromatizzati (speziati), ecc.,- nella mezzora che precede la valutazione gli assaggiatori non devono fumare, né mangiare o bere tranne acqua.6. Valutazione di ciascuna caratteristica6.1. La valutazione organolettica viene eseguita in relazione alle seguenti tre caratteristiche: aspetto, consistenza e gusto.Aspetto comprende le caratteristiche seguenti: colore, purezza visibile, sviluppo di muffe e dispersione dell'acqua. La dispersione dell'acqua è valutata conformemente alla norma FIL 112/A/1989.Consistenza comprende le caratteristiche seguenti: compattezza e spalmabilità.Per la valutazione della consistenza del burro si possono utilizzare metodi fisici. La Commissione prevede di armonizzare in futuro questi metodi.Gusto implica le caratteristiche seguenti: sapore e odore.Uno scostamento significativo dalla temperatura raccomandata impedisce una valutazione corretta della consistenza, del gusto. La temperatura è della massima importanza.6.2. Ciascuna caratteristica deve venire valutata, dal punto di vista organolettico, separatamente. Il punteggio deve essere assegnato secondo la tabella 1.6.3. Può essere opportuno che, prima di iniziare la valutazione, gli assaggiatori assegnino insieme un punteggio ad uno o più campioni di riferimento per quanto riguarda aspetto, consistenza e gusto, al fine di raggiungere una maggiore uniformità.6.4. Il punteggio per l'accettazione è il seguente:>SPAZIO PER TABELLA>Quando non si raggiunge il punteggio richiesto, deve essere fornita una descrizione del difetto. Il punteggio assegnato da ciascun assaggiatore per ciascuna caratteristica deve essere registrato nel documento di controllo. Il prodotto viene accettato o scartato sulla base di una decisione a maggioranza. Casi in cui le differenze tra i punteggi individuali per ciascuna caratteristica siano più ampie di un punto non devono verificarsi frequentemente (non più di una volta su venti campioni). In caso contrario il capogruppo deve riesaminare la competenza del gruppo di assaggiatori.7. SupervisioneIn generale, il capogruppo, che deve essere un funzionario dell'autorità competente e che può essere membro del gruppo di assaggiatori, sarà responsabile dell'intera procedura. Il capogruppo deve registrare i punteggi individuali per ciascuna caratteristica nel documento di controllo e certificare se il prodotto è stato accettato o scartato.8. Campionamento e preparazione del campione8.1. - È opportuno che l'identità dei campioni sia tenuta celata durante la valutazione allo scopo di evitare qualsiasi influenza.- Di questo si deve occupare il capogruppo prima della valutazione, in assenza degli altri membri del gruppo.8.2. Quando la valutazione organolettica viene eseguita presso il magazzino frigorifero, il campione di burro viene prelevato mediante un campionatore per burro. Se la valutazione organolettica viene eseguita in un luogo diverso dal magazzino frigorifero, prelevare un campione di almeno 500 g.8.3. Durante la valutazione, il burro deve avere una temperatura di 10-12 °C. Evitare assolutamente grandi scostamenti da questo intervallo.9. NomenclaturaFare riferimento all'allegata tabella 2.Tabella 1: Punteggio del burro>SPAZIO PER TABELLA>>SPAZIO PER TABELLA>>SPAZIO PER TABELLA>Tabella 2: Nomenclatura dei difetti del burroI. Aspetto1. acquoso, goccioline d'acqua evidenti2. colore non uniforme, due colori3. striata4. screziato, marezzato5. chiazzato6. separazione d'olio7. colore eccessivo8. poroso9. granuloso10. materiale estraneo11. muffa12. sale non discioltoII. Consistenza14. corta, fragile, friabile15. pastosa, untuosa, molle16. appiccicosa17. dura18. molleIII. Gusto e aroma20. mancanza d'aroma, insipido21. impuro(1)22. gusto estraneo23. stantio24. sapore di formaggio, di formaggio acido25. acido26. sapore di lievito27. a) sapore di cottob) sapore di bruciato28. sapore di muffa29. rancido30. oleoso, di pesce31. sapore di sego32. a) sapore di ossidatob) sapore metallico33. sapore di foraggio34. acre, amaro35. eccessivamente salato36. ammuffito, marcio37. sapore di malto38. sapore di prodotti chimici(1) Questa definizione deve venire usata il più raramente possibile e solo quando il difetto non può venire descritto in modo più accurato.ALLEGATO VIII(Articolo 7)PROCEDURA DA SEGUIRE IN CASO DI CONTROVERSIA SUI RISULTATI DI UN'ANALISI (ANALISI CHIMICA)1. Un'ulteriore analisi viene praticata su richiesta del produttore entro 7 giorni lavorativi dalla comunicazione dei risultati della prima analisi, a condizione che siano disponibili campioni prelevati in doppio, sigillati e che siano stati conservati in modo appropriato presso organismi competenti.2. Su richiesta del produttore e a spese del medesimo, l'organismo competente invia tali campioni ad un secondo laboratorio. Questo laboratorio deve essere autorizzato ad eseguire analisi ufficiali e deve possedere una dimostrata competenza per le analisi in questione. Tale competenza deve risultare della sua partecipazione (con risultati soddisfacenti) a studi in collaborazione, a prove di idoneità o a confronti interlaboratori. Il secondo laboratorio deve utilizzare il metodo di riferimento. I risultati ottenuti dai due laboratori vengono valutati come segue.a) Se i due laboratori soddisfano i requisiti di ripetibilità e di riproducibilitàCome risultato finale viene riportata la media aritmetica dei risultati d'analisi ottenuti dai due laboratori. Questo risultato finale viene valutato, tenendo conto della differenza critica, con la formula seguente:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dove:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>: media aritmetica di tutti i risultati ottenuti dai due laboratorimo: limiteR: riproducibilitàr: ripetibilitàn1: numero dei risultati ottenuti dal laboratorio 1n2: numero dei risultati ottenuti dal laboratorio 2Nota:Se il risultato finale viene calcolato utilizzando le formule>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>o>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>(si veda l'allegato IV, rispettivamente ai punti 3 e 4) nelle formule occorre inserire R2x e r2x al posto di R2 e r2.b) Se i due laboratori soddisfano il requisito di ripetibilità ma non quello di riproducibilitàSe la prima analisi è confermata dalla seconda, la quantità analizzata è respinta come non conforme. In caso contrario tale quantità viene accettata.c) Se solo un laboratorio soddisfa il requisito di ripetibilitàPer la decisione sull'accettabilità della quantità sottoposta ad analisi, ci si basa sul risultato finale del laboratorio che soddisfa il requisito di ripetibilità.d) Se nessuno dei due laboratori soddisfa il requisito di ripetibilità, ma solo quello di riproducibilitàSi applica il disposto della lettera a).e) Se nessuno dei due laboratori soddisfa il requisito di ripetibilità né quello di riproducibilitàLa quantità sottoposta ad analisi viene accettata se i risultati ottenuti da un laboratorio portano a questa conclusione.f) Se i risultati sono stati ottenuti con metodi non convalidatiLa quantità sottoposta ad analisi viene accettata se i risultati ottenuti da un laboratorio portano a questa conclusione.3. L'autorità competente comunica quanto prima al produttore i risultati della seconda analisi. Nel caso in cui la quantità sottoposta ad analisi sia respinta i costi della seconda analisi sono a carico del produttore.4. Se il produttore dimostra che la procedura di campionamento non è stata correttamente eseguita, occorre, se possibile, ripetere il campionamento. Ove non sia possibile procedere a un nuovo campionamento, la quantità sottoposta ad analisi viene accettata.ALLEGATO IX(Articolo 8)DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO IN ACQUA DEL BURRO1. Finalità e campo di applicazioneIl presente metodo specifica le modalità per la determinazione del contenuto in acqua del burro.2. RiferimentoNorma IDF 50 C: 1995 - Latte e prodotti lattiero-caseari - metodo di campionamento.3. DefinizioneContenuto in acqua del burro: la perdita di massa dopo completamento del processo di riscaldamento descritto nella presente norma. Esso è espresso in grammi/100 grammi.4. PrincipioEvaporazione dell'acqua da un'aliquota di prova, in presenza di pomice, alla temperatura di 102 °C in stufa di essiccazione.5. Apparecchiatura e materialiUsuale apparecchiatura di laboratorio; in particolare:5.1. Bilancia analitica, con sensibilità 1 mg.5.2. Essiccatore, fornito di un efficace agente essiccante (esempio: gel di silice recentemente essiccato, con indicatore igroscopico).5.3. Stufa di essiccazione, ventilata, sotto controllo termostatico, funzionante a 102 ± 2 °C su tutto lo spazio di lavoro.5.4. Capsule di vetro, porcellana o materiale anticorrosione, di altezza 20 mm circa e diametro 60-80 mm.5.5. Pietra pomice lavata, in granuli, di diametro 0,8-10 mm.6. CampionamentoCfr. norma IDF 50 C: 19957. Modo di operare7.1. Preparazione della porzione da esaminare:Nel recipiente chiuso, in vetro o materiale plastico idoneo, che deve essere pieno da metà a due terzi, riscaldare il campione di laboratorio fino a una temperatura alla quale il campione sia abbastanza molle da consentire una facile miscelazione (con agitatore meccanico o a mano) fino al raggiungimento di uno stato omogeneo. La temperatura di miscelazione non deve normalmente superare i 35 °C. Lasciar raffreddare il campione a temperatura ambiente. Appena possibile dopo il raffreddamento, aprire il contenitore del campione ed agitare brevemente (non più di 10 secondi) con un appropriato strumento come un cucchiaio o una spatola, prima della pesata.7.2. Determinazione del contenuto in acqua7.2.1. Introdurre almeno 10 grammi di pomice nella capsula.7.2.2. Essiccare la capsula contenente la pomice nella stufa, alla temperatura di 102 ± 2 °C per almeno un'ora.Nota:i periodi di essiccazione menzionati ai punti 7.2.2, 7.2.5 e 7.2.7 iniziano quando la temperatura della stufa raggiunge i 102 ± 2 °C.7.2.3. Lasciar raffreddare la capsula nell'essiccatore fino alla temperatura della sala bilance e pesare con l'approssimazione di 1 mg.7.2.4. Pesare nella capsula, con l'approssimazione di 1 mg, una porzione da 5 gr circa del campione in esame.7.2.5. Porre la capsula nel forno a 102 ± 2 °C e lasciarvela per 3 ore.7.2.6. Lasciar raffreddare la capsula nell'essiccatore alla temperatura della sala bilance e pesare con l'approssimazione di 1 mg.7.2.7. Ripetere il processo di essiccazione per ulteriori periodi di 1 ora, lasciando raffreddare e pesando ogni volta come specificato al punto 7.2.6 fino a massa costante (le variazioni di massa non debbono superare 1 mg).Nel caso di un incremento della massa, assumere come base di calcolo il più basso valore di massa registrato.8. Espressione dei risultati8.1. Metodo di calcolo e formulaCalcolare il contenuto d'acqua W come percentuale rispetto alla massa, impiegando la seguente formula:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dovem0: massa in grammi della capsula contenente la pomice (7.2.3)m1: massa in grammi della porzione esaminata, della capsula e della pomice prima dell'essiccazione (7.2.4)m2: massa in grammi della porzione esaminata, della capsula e della pomice dopo essiccazione (7.2.7)Indicare il risultato con una cifra decimale.8.2. RipetibilitàLa differenza assoluta tra i risultati di due singole determinazioni effettuate simultaneamente o a breve distanza di tempo dallo stesso operatore, nelle stesse condizioni e su materiale di prova identico, non deve superare lo 0,2 %.8.3. RiproducibilitàLa differenza assoluta fra due singoli risultati indipendenti ottenuti da due operatori che lavorano in laboratori diversi su materiale di esame identico non deve superare lo 0,3 %.9. RelazioneLa relazione deve precisare il metodo impiegato e i risultati ottenuti. Essa deve altresì menzionare tutti i particolari operativi non specificati nella citata norma internazionale o considerati come facoltativi, nonché gli eventuali incidenti che possano avere influenzato il risultato. La relazione deve comprendere tutti i dati necessari per la completa identificazione del campione.ALLEGATO X(Articolo 8)DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO IN SOLIDI MAGRI DEL BURRO1. Finalità a campo di applicazioneLa presente norma specifica un metodo per la determinazione del contenuto di solidi magri del latte.2. RiferimentoNorma IDF Standard 50 C: 1995 - Latte e prodotti lattiero-caseari - metodo di campionamento.3. DefinizioniContenuto in solidi magri del burro: percentuale in massa delle sostanze, come determinata col procedimento specificato. Essa è espressa in grammi/100 grammi.4. PrincipioEvaporazione dell'acqua da una massa nota di burro, estrazione del grasso con etere di petrolio o pesatura del residuo.5. ReattiviEtere di petrolio con intervallo di ebollizione compreso tra 30 e 60 °C. Dopo evaporazione, 100 ml del reattivo non debbono lasciare più di 1 mg di residuo.6. Attrezzatura e materiali6.1. Bilancia analitica, con sensibilità di 1 mg.6.2. Essiccatore, fornito di un efficace agente essiccante (esempio: gel di silice recentemente essiccato, con indicatore igroscopico).6.3. Stufa di essiccazione, ventilata, sotto controllo termostatico, funzionante a 102 +- 2 °C su tutto lo spazio di lavoro6.4. Capsule di vetro, porcellana o materiale anticorrosione, di altezza 20 mm circa e diametro 60-80 mm, fornita di bacchetta in vetro per l'agitazione.6.5. Crogiuolo filtrante in vetro sinterizzato, diametro dei pori da 16 a 40 μm con matraccio di aspirazione.7. CampionamentoCfr. norma IDF Standard 50 C: 19958. Modo di operare8.1. Preparazione del campione per la provaNel recipiente chiuso, in vetro o materiale plastico idoneo, che deve essere pieno da metà a due terzi, riscaldare il campione di laboratorio fino a una temperatura alla quale il campione sia abbastanza molle da consentire una facile miscelazione (con agitatore meccanico o a mano) fino al raggiungimento di uno stato omogeneo. La temeperatura di miscelazione non deve normalmente superare i 35 °C. Lasciar raffreddare il campione a temperatura ambiente. Appena possibile dopo il raffreddamento, aprire il contenitore del campione ed agitare brevemente (non più di 10 secondi) con un appropriato strumento, come un cucchiaio o una spatola, prima della pesata.8.2. Determinazioni8.2.1. Essiccare per 1 ora la capsula contenente la bacchetta (6.4) e il crogiuolo (6.5) nel forno (6.3). Lasciare raffreddare questi oggetti nell'essiccatore a pesare insieme capsula, bacchetta e crogiuolo con l'approssimazione di 1 mg (m0)Note:- Di norma, un tempo di raffreddamento di 45 minuti è sufficiente.- È importante impiegare la stessa combinazione di capsula, bacchetta e crogiuolo per ciascuna aliquota di prova, qualora nella partita venga analizzata più di una porzione di prova.8.2.2. Allontanare il crogiuolo, registrare il peso globale della bacchetta e della capsula con l'approssimazione di 1 mg (m1).8.2.3. Pesare nella capsula, con l'approssimazione di 1 mg, una aliquota da circa 5 gr del campione in esame (8.1) (m2).8.2.4. Collocare la capsula (contenente la bacchetta e il burro) nel forno a 102 +- 2 °C e lasciarveli per tutta la notte.8.2.5. Lasciar raffreddare il piatto (8.2.3) fino a temperatura ambiente.8.2.6. Aggiungere nella capsula 15 ml di etere di petrolio tiepido (a 25 °C circa) e con la bacchetta di vetro staccare la maggior parte possibile del sedimento che aderisce alla capsula. Trasferire il solvente nel crogiuolo e filtrarlo nel matraccio ad aspirazione.8.2.7. Eseguire altre 4 volte l'operazione 8.2.6. Qualora non si rilevino tracce di grasso sulla superficie della capsula, trasferire quantitativamente, durante il quarto lavaggio, la maggior parte possibile del sedimento nel crogiuolo. Altrimenti, ripetere l'operazione 8.2.6 fino ad eliminazione completa di tutte le tracce di grasso.8.2.8. Lavare il sedimento nel crogiuolo con 25 ml di etere di petrolio con 25 ml di etere di petrolio tiepido.8.2.9. Essiccare insieme nel forno la capsula, la bacchetta di vetro e il crogiuolo, alla temperatura di 102 +- 2 °C per 30 minuti.8.2.10. Lasciar raffreddare nell'essiccatore fino a temperatura ambiente e pesare con l'approssimazione di 1 mg.8.2.11. Ripetere le operazioni 8.2.9 e 8.2.10 fino a massa costante (variazioni della massa non superiori a 1 mg) per l'insieme capsula, bacchetta e crogiolo (m3).9. Espressione dei risultati9.1. Calcolo del contenuto in solidi magriCalcolare il contenuto in solidi magri SNF come percentuale rispetto alla massa, impiegando la seguente formula:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dovem0: massa in grammi della capsula vuota con la bacchetta di vetro e il crogiolo (8.2.1)m1: massa in grammi della capsula vuota con la bacchetta di vetro (8.2.2)m2: massa in grammi dell'aliquota in esame e della capsula contenente la bacchetta di vetro (8.2.3)m3: massa finale in grammi della capsula con la bacchetta e del crogiolo contenente i sedimenti (8.2.11)Indicare il risultato con una cifra decimale.9.2. RipetibilitàLa differenza assoluta fra i risultati di due singole determinazioni effettuate simultaneamente o a breve distanza di tempo dallo stesso operatore, nelle stesse condizioni e su materiale identico, non deve superare lo 0,1 %.9.3. RiproducibilitàLa differenza assoluta fra due singoli risultati indipendenti ottenuti da due operatori che lavorano in laboratori diversi su materiali di esame identici non deve superare lo 0,2 %.10. RelazioneLa relazione deve precisare il metodo impiegato e i risultati ottenuti. Essa deve inoltre menzionare tutti i particolari operativi non specificati nella citata norma internazionale o considerati come facoltativi, nonché gli eventuali incidenti che possano avere influenzato i risultati. La relazione deve comprendere tutti i dati necessari per la completa identificazione del campione.Nota:>SPAZIO PER TABELLA>Si può concludere che i valori relativi alla precisione ottenuti per la determinazione dei solidi magri valgono per la determinazione dei solidi magri del latte.ALLEGATO XI(Articolo 8)DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO IN MATERIE GRASSE DEL BURROIl contenuto in materie grasse è contenuto indirettamente tramite determinazione del contenuto in acqua e del contenuto in solidi magri, secondo gli allegati IX e X. La percentuale in massa di materie grasse è pari a:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>doveW percentuale in massa di acquaSNF percentuale in massa di solidi magri>SPAZIO PER TABELLA>ALLEGATO XII(Articolo 9)DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO IN VANILLINA NEL BURRO CONCENTRATO, NEL BURRO O NELLA CREMA, PER CROMATOGRAFIA IN FASE LIQUIDA AD ALTO RENDIMENTO1. Finalità e campo di applicazioneIl metodo descrive un procedimento per la determinazione quantitativa del contenuto di vanillina nel burro concetrato, nel burro o nella crema.2. PrincipioEstrazione di una quantità nota di campione con una miscela di isopropanolo/acetonitrile (1:1:2). Precipitazione della maggior parte del grasso per raffreddamento fra -15 e -20 °C e successiva centrifugazione.Dopo diluizione con acqua, determinazione del contenuto in vanillina per cromatografia in fase liquida ad alto rendimento (HPLC).3. ApparecchiaturaNormale apparecchiatura di laboratorio, e in particolare:3.1. congelatore, campo di temperatura da -15 a -20 °C;3.2. siringhe a perdere, della capacità di 2 ml;3.3. microfiltri a membrana con pori da 0,45 μm e resistenti a una soluzione contenente il 5 % della soluzione di estrazione (4.4);3.4. sistema di cromatografia in fase liquida, consistente in una pompa (della portata di 1,0 ml/min), un iniettore (iniezione da 20 μl, automatica o manuale), un rivelatore UV (funzionante, a 306 nm, fondo scala a 0,01 AU), un registratore o integratore e un termostato a colonna funzionante a 25 °C;3.5. colonna analitica (250 mm x 4,6 mm d.i.), riempita con LiChrospher RP 18 (Merck, 5μm) o equivalente;3.6. colonna di guardia (ca. 20 mm x 3 mm d.i.), riempita a secco con Perisorb RP 18 (30-40 μm) od equivalente;4. ReagentiTutti i reagenti impiegati debbono essere di purezza analitica riconosciuta.4.1. Isopropanolo4.2. Etanolo 96 % (v/v)4.3. Acetonitrile4.4. Soluzione di estrazioneMescolare isopropanolo (4.1), etanolo (4.2) ed acetonitrile (4.3) nel rapporto 1:1:2 (v/v).4.5. Vanillina (4-idrossi-3-metossibenzaldeide)4.5.1. Soluzione madre di vanillina (=50 μg/ml)In un matraccio tarato da 100 ml, persare 50 mg circa (CM mg) di vanillina (4.5) con la precisione di 0,1 mg; aggiungere 25 ml di soluzione di estrazione (4.4) e portare a volume con acqua.4.5.2. Soluzione standard di vanillina (= 10 μg/ml)Pipettare 5,00 ml di soluzione di riserva di vanillina (4.5.1) in un matraccio tarato da 250 ml e portare a volume con acqua.4.6. Metanolo per HPLC4.7. Acido acetico glaciale4.8. Acqua per HPLC4.9. Fase mobile HPLCIn un matraccio tarato da 1000 ml, miscelare 300 ml di metanolo (4.6) con 500 ml circa d'acqua (4.8) e 20,0 ml di acido acetico (4.7); portare a volume con acqua (4.8). Filtrare per filtro da 0,45 μm (3.3).5. Procedimento5.1. Preparazione delle aliquote da analizzare5.1.1. BurroRiscaldare il campione fino a fusione incipiente. Evitare il surriscaldamento locale oltre i 40 °C. Quando il campione diventa sufficientemente plastico, renderlo omogeneo agitando. Rimescolare il burro per 15 secondi prima di prelevarne un'aliquota. In un matraccio tarato da 100 ml, pesare 5 g (s.s.n.g.) di burro, con l'approssimazione di 1 mg.5.1.2. Burro concentratoImmediatamente prima di prelevare l'aliquota da analizzare, collocare il contenitore col burro concentrato in una stufa a 40-50 °C fino a fusione completa a rendere omogeneo il campione, agitando in senso rotatorio o rimescolando, senza eccedere in energia per evitare la formazione di bolle d'aria. In un matraccio tarato da 100 ml, pesare 4 g (SM g) di burro concentrato, con l'approssimazione di 1 mg.5.1.3. CremaRiscaldare il campione in bagnomaria o termostato a 35-40 °C. Distribuire il grasso in modo omogeneo agitando in senso rotatorio e, se necessario, rimescolando. Portare rapidamente il campione alla temperatura di 20 +- + 2 °C. Il campione deve presentarsi omogeneo; in caso contrario, ripetere l'operazione. In un matraccio tarato da 100 ml, pesare 10 g (SM g) di crema, con l'approssimazione di 1 mg.5.2. Preparazione della soluzione da analizzareAggiungere 75 ml circa di soluzione di estrazione (4.4) all'aliquota da analizzare (5.1.1, 5.1.2 o 5.1.3), agitare o scuotere energicamente per 15 minuti circa e portare a volume con la soluzione di estrazione (4.4). Trasferire 10 ml circa di questo estratto in una provetta fornita di tappo. Collocare la provetta nel congelatore (3.1) e lasciar riposare per 30 minuti circa. Centrifugare l'estratto freddo per 5 minuti a 2000 rpm circa e decantare immediatamente. Lasciare che la soluzione decantata raggiunga la temperatura ambiente. Pipettare 5,00 ml della soluzione decantata in un matraccio tarato da 100 ml e portare a volume con acqua. Filtrare una porzione del liquido per microfiltro a membrana (3.3). Il filtrato è pronto per la determinazione HPLC.5.3. CalibraturaIn un matraccio tarato da 100 ml, pipettare 5,00 ml della soluzione standard di vanillina (4.5.2). Aggiungere 5,0 ml di soluzione di estrazione (4.4) e portare a segno con acqua. Questa soluzione contiene 0,5 μg/ml vanillina.5.4. Determinazione HPLCLasciar stabilizzare il sistema cromatografico per 30 minuti circa. Iniettare la soluzione standard (5.3). Ripetere l'operazione finché la differenza di superficie o di altezza delle cuspidi fra due iniezioni successive è inferiore al 2 %. Nelle condizioni descritte, il tempo di ritenzione della vanillina è di circa 9 minuti. Analizzare in doppio la soluzione standard (5.3), iniettando 20 μl. Iniettare 20 μl delle soluzioni (5.2). Determinare la superficie o l'altezza della cuspide ottenuta per la vanillina. Ripetere il duplicato della soluzione standard (5.3) dopo dieci iniezioni delle soluzioni (5.2).6. Calcolo dei risultatiCalcolare il valore medio delle superfici (o delle altezze), (AC), delle cuspidi per la vanillina associate all'iniezione in doppio effettuata per inquadrare ciascun gruppo di soluzioni (quattro superfici o altezze in totale).Calcolare il fattore di risposta (R) con la formula>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dove CM rappresenta la massa della vanillina in mg (4.5.1).Il contenuto (C) di vanillina nel campione esaminato, espresso in mg/kg, è dato dalla formula>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dove:AS= area della cuspide della vanillina del campione esaminatoSM= massa in g del campione esaminato (5.1.1, 5.1.2, 5.1.3).Quando la crema viene analizzata per individuare la vanillina, la concentrazione del rivelatore va espressa in mg rivelatore/kg grasso di latte. A tal fine si moltiplica C per 100/f, essendo il tenore di grasso in percentuale della crema (m/m).20= fattore che tiene conto delle diluizioni dello standard e del campione esaminato0,96= fattore di correzione per il contenuto in grasso nella prima diluizione del campione di prova.Nota:in luogo delle superfici delle cuspidi, si possono impiegare le rispettive altezze (cfr. 8.3).7. Precisione del metodo7.1. Ripetibilità (r)La differenza fra i risultati di due determinazioni eseguite nel più breve tempo possibile da un solo operatore, impiegando la stessa apparecchiatura su materiali identici, non deve superare 16 mg/kg.7.2. Riproducibilità (R)La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate da operatori in laboratori diversi, impiegando apparecchiature diverse su materiali identici, non deve superare 27 mg/kg.8. Limiti di tolleranza8.1. Per verificare l'omogeneità del prodotto contrassegnato, bisogna prelevare tre campioni.8.2. Rivelatore ottenuto partendo dalla vainiglia o dalla vanillina sintetica.8.2.1. La quantità di 4-idrossi-3-metossibenzaldeide da incorporare è di 250 g grammi per tonnellate di burro concentrato o di burro. Nel caso della crema, il tasso di incorporazione è di 250 g/t di materia grassa del latte.8.2.2. I risultati dell'analisi dei tre campioni del prodotto vengono utilizzati per verificare il tasso e l'omogeneità di incorporazione del rivelatore: il risultato più basso ottenuto dall'analisi del prodotto viene confrontato con i seguenti limiti [si prende in considerazione la differenza critica per una probabilità del 95 % (DCr95)]:- 221,0 mg/kg (il 95 % del tasso minimo di incorporazione),- 159,0 mg/g (il 70 % del tasso minimo di incorporazione).La concentrazione di rivelatore nel campione che dà il risultato più basso viene utilizzata per interpolazione tra 221,0 mg/kg e 159,0 mg/kg.8.3. Tracciante ottenuto esclusivamente a partire da baccelli di vaniglia o loro estratti integrali.8.3.1. La quantità di 4-idrossi-3-metossibenzaldeide da incorporare è di 100 grammi per tonnellata di burro concentrato o di burro. Nel caso della crema, il tasso di incorporazione è di 100 g/t di grasso di latte.8.3.2. I risultati dell'analisi dei tre campioni del prodotto vengono utilizzati per verificare il tasso e l'omogeneità di incorporazione del rivelatore: il risultato più basso ottenuto dall'analisi del prodotto viene confrontato con i seguenti limiti [si prende in considerazione la differenza critica per una probabilità del 95 % (DCr95)]:- 79,0 mg/kg (il 95 % del tasso minimo di incorporazione),- 54,0 mg/kg (il 70 % del tasso minimo di incorporazione).La concentrazione di rivelatore nel campione che dà il risultato più basso viene utilizzata per interpolazione tra 79,0 mg/kg e 54,0 mg/kg.9. Note9.1. Il valore r della ripetibilità è il valore al di sotto del quale la differenza assoluta fra i risultati di due prove singole ottenuti applicando lo stesso metodo a materiali identici e nelle stesse condizioni (stessa apparecchiatura, stesso laboratorio e a breve distanza di tempo), può prevedibilmente rientrare in una probabilità specifica; in mancanza di altre indicazioni, la probabilità è del 95 %.9.2. Il valore R della riproducibilità è il valore al di sotto del quale la differenza assoluta tra i risultati di due prove singole, ottenuti applicando lo stesso metodo a materiali identici ma in condizioni diverse (operatori diversi, apparecchiature differenti, laboratori differenti e/o tempi differenti), può prevedibilmente rientrare in una probabilità specifica; in mancanza di altre indicazioni, la probabilità è del 95 %.9.3. Il recupero della vanillina aggiunta al livello di 250 mg/kg di butteroil varia da 97,0 a 103,8. Il contenuto medio ritrovato è risultato essere del 99,9 % con una deviazione standard del 2,7 %.9.4. La soluzione standard contiene il 5 % di soluzione di estrazione per compensare l'allargamento della cuspide provocato dalla presenza del 5 % della soluzione di estrazione nelle aliquote analizzate. Ciò consente una quantificazione attraverso l'altezza della cuspide.9.5. L'analisi è fondata su una curva di taratura lineare, con intercetta zero.La linearità deve essere controllata impiegando appropriate diluizioni della soluzione standard (4.5.2), la prima volta che l'analisi viene effettuata e successivamente ad intervalli regolari, nonché dopo ogni modifica o riparazione dell'apparecchiatura HPLC.ALLEGATO XIII(Articolo 9)DETERMINAZIONE PER SPETTROMETRIA DELL'ESTERE ETILICO DELL'ACIDO BETA-APO-8'-CAROTENICO NEL BURRO E NEL BURRO CONCENTRATO1. Finalità a campo d'applicazioneIl metodo descrive un procedimento per la determinazione quantitativa dell'estere etilico dell'acido beta-apo-8'-carotenico (estere apocarotenico) nel burro e nel burro concentrato. L'estere apocarotenico è la somma di tutte le sostanze presenti in un estratto di campioni ottenuto nelle condizioni descritte nel metodo e che assorbe luce di lunghezza d'onda 440 nm.2. PrincipioIl grasso di burro viene sciolto in etere di petrolio e l'assorbanza è misurata a 440 nm. Il tenore di estere apocarotenico viene determinato ad uno standard esterno.3. Apparecchiatura3.1. Pipette graduate da 0,25, 0,50, 0,75 e 1,0 ml.3.2. Spettrofotometro utilizzabile a 440 nm (e da 447 a 449 nm) e munito di celle con cammino ottico di 1 cm.3.3. Palloni volumetrici, ad esempio da 20 ml e da 100 ml.3.4. Bilancia analitica, con sensibilità 0,1 mg4. ReagentiTutti i reagenti devono essere di purezza analitica riconosciuta.4.1. Sospensione di estere apocarotenico (circa 20 %).4.1.1. Determinare il tenore della sospensione come segue.In un taraccio (100 ml) pesare con precisione 400 mg, disciogliere in 20 ml di cloroformio (4.4) e portare a volue con cicloesano (4.5). Diluire 5 ml di questa soluzione portandola a 100 ml con cicloesano. Misurare l'assorbanza a 447-449 (misurare il massimo in rapporto al cicloesano come bianco, utilizzando celle con cammino ottico di un 1 cm)>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>AmaxX= assorbanza della soluzione in esame al massimoA= peso del campione (g)2550= valore di riferimento A (1 %, 2 cm)La purezza della sospensione è P (%).Nota:la sospensione di estere apocarotenico è sensibile all'aria, al calore e alla luce; può essere conservata per circa 12 mesi nel suo contenitore originale chiuso (sigillato sotto azoto), in luogo fresco; dopo l'apertura, la sospensione deve essere utilizzata entro breve tempo.4.1.2. Soluzione standard di estere apocarotenico, circa 0,2 mg/ml.Pesare, a meno di 0,1 mg, circa 0,100 g di sospensione di estere apocarotenico (4.1.1) (Wg), disciogliere in essenza di petrolio (4.2), trasferire quantitativamente in un pallone volumetrico della capacità di 100 ml e portare alla tacca con essenza di petrolio.Questa soluzione contiene (W.P.)/10 mg/ml di estere apocarotenico.Nota:la soluzione deve essere conservata in luogo fresco e al buio; la soluzione non utilizzata deve essere scartata dopo un mese.4.2. Essenza di petrolio (40-60 °C).4.3. Solfato di sodio anidro, granulare e preventivamente essiccato a 102 °C per due ore.4.4. Cloroformio4.5. Cicloesano5. Procedura5.1. Preparazione del campione di prova5.1.1. Burro concentratoFondere il campione in un forno a circa 45 °C.5.1.2. BurroFondere il campione in un forno a circa 45 °C e filtrarne una parte rappresentativa attraverso un filtro contenente circa 10 g di solfato di sodio anidro (4.3), in ambiente protetto da luce naturale e artificiale forte, alla temperatura di 45 °C. Raccogliere una quantità opportuna di materia grassa del latte.5.2. DeterminazionePesare, a meno di 1 mg, circa 1 g di burro concentrato o di materia grassa del latte (5.1.2), (Mg). Trasferire quantitativamente in un pallone volumetrico da 20 ml (Vml) usando essenza di petrolio (4.2); portare alla tacca e miscelare accuratamente.Trasferirne una parte in una cella da 1 cm e misurare l'assorbanza a 440 nm, in rapporto ad un bianco di essenza di petrolio. Ottenere la concentrazione di estere apocarotenico nella soluzione, per riferimento al diagramma di taratura (C μg/ml).5.3. Diagramma di tataturaPipettare 0, 0,25, 0,5 0,75 e 1,0 ml di soluzione standard di estere apocarotenico (4.1.2) in cinque palloni volumetrici da 100 ml. Diluire a volume con essenza petrolio (4.2) ed agitare.Le concentrazioni approssimative delle soluzioni vanno da 0 a 2 μg/ml e sono calcolate accuratamente per riferimento alla concentrazione della soluzione standard (4.1.2) (W.P)/10 mg/ml. Misurare le assorbanze a 440 nm in rapporto ad un bianco di essenza di petrolio (4.2).Riportare su un diagramma i valori dell'assorbanza (asse delle y) in funzione della concentrazione di estere apocarotenico (asse delle x).6. Calcolo dei risultati6.1. Il tenore di estere apocarotenico, espresso in mg/kg di prodotto, è dato daBurro concentrato (C.V.)/MBurro: 0,82 (C.V)Mdove:C= tenore di estere apocarotenico (μg/ml) letto sul diagramma di taratura (5.3).V= volume (ml) della soluzione da analizzare (5.2)M= massa (g) della porzione di prova (5.2).0,82= fattore di correzione per il tenore di materia grassa del latte del burro.7. Precisione del metodo7.1. Ripetibilità7.1.1. Analisi del burroLa differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate nell'intervallo di tempo minimo possibile dallo stesso opertore con la stessa apparecchiatura su un materiale di prova identico non deve superare 1,4 mg/kg.7.1.2. Analisi del burro concentratoLa differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate nell'intervallo di tempo minimo possibile dallo stesso operatore con la stessa apparecchiatura su un materiale di prova identico non deve superare 1,6 mg/kg.7.2. Riproducibilità7.2.1. Analisi del burroLa differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate da opeatori in laboratori differenti con apparecchiature differenti con apparecchiature differenti su un identico materiale di prova non deve superare 4,7 mg/kg.7.2.2. Analisi del burro concentratoLa differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate da operatori in laboratori differenti con apparecchiature differenti su un identico materiale di prova non deve superare 5,3 mg/kg.7.3. Fonte dei dati di precisioneI dati di precisione sono stati determinati mediante un esperimento eseguito nel 1995, cui hanno partecipato 11 laboratori, su 12 campioni marcati (6 prove in doppio cieco) per il burro e altrettanti 12 campioni marcati (6 prove in doppio cieco) per il burro concentrato.8. Limiti di tolleranza8.1. Per verificare che l'aggiunta di rivelatori ha avuto luogo correttamente, dal prodotto marcato devono essere prelevati tre campioni.8.2. Burro8.2.1. Il tasso di incorporazione per il burro, tenendo conto dell'assorbanza di fondo, è 22 mg/kg.8.2.2. I risultati dell'analisi dei tre campioni del prodotto vengono utilizzati per verificare il tasso e l'omogeneità di incorporazione del rivelatore: il risultato più basso ottenuto dall'analisi del prodotto viene confrontato con i seguenti limiti [si prende in considerazione la differenza critica per una probabilità del 95 % (DCr95)]:- 18,0 mg/kg (il 95 % del tasso minimo di incorporazione),- 13,0 mg/kg (il 70 % del tasso minimo di incorporazione).La concentrazione di rivelatore nel campione che dà il risultato più basso viene utilizzata per interpolazione tra 18,0 mg/kg e 13,0 mg/kg.8.3. Burro concentrato8.3.1. Il tasso di incorporazione per il burro concentrato, tenendo conto dell'assorbanza di fondo, è 24 mg/kg.8.3.2. i risultati dell'analisi dei tre campioni del prodotto vengono utilizzati per verificare il tasso e l'omogeneità di incorporazione del rivelatore: il risultato più basso ottenuto dall'analisi del prodotto viene confrontato con i seguenti limiti [si prende in considerazione la differenza critica per una probabilità del 95 % (DCr95)]:- 20,0 mg/kg (il 95 % del tasso minimo di incorporazione),- 14,0 mg/kg (il 70 % del tasso minimo di incorporazione).La concentrazione di rivelatore nel campione che dà il risultato più basso viene utilizzata per interpolazione tra 20,0 mg/kg e 14,0 mg/kg.ALLEGATO XIV(Articolo 9)DETERMINAZIONE DEL SITOSTEROLO OPPURE DELLO STIGMASTEROLO NEL BURRO CONCENTRATO O NEL BURRO MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA CON COLONNA CAPILLARE1. Finalità e campo d'applicazioneIl metodo descrive un procedimento per la determinazione quantitativa del sitosterolo o dello stigmasterolo nel burro concentrato e nel burro. Il sitosterolo viene considerato come la somma del β-sitosterolo e del 22-diidro-β-sitosterolo, in quanto gli altri sitosteroli vengono considerati irrilevanti.2. PrincipioIl burro concentrato o il burro viene saponificato con idrossido di potassio in soluzione etanolica e l'insaponificabile viene estratto con etere etilico.Gli steroli vengono trasformati in eteri trimetil-sililici ed analizzati mediante gascromatografia su colonna capillare facendo riferimento ad uno standard interno a base di betulino.3. Apparecchiatura3.1. Pallone di saponificazione da 150 ml provvisto di condensatore a ricadere con giunti in vetro smerigliato.3.2. Imbuti separatori da 500 ml.3.3. Palloni da 250 ml.3.4. Imbuti livellatori di pressione, da 250 ml o simili, per la raccolta dell'etere etilico di scarto.3.5. Colonna di vetro, da 350 mm x 20 mm, provvista di setto in vetro sinterizzato.3.6. Bagnomaria o cuffia riscaldante.3.7. Fiale da 2 ml.3.8. Gascromatografo idoneo ad essere usato con una colonna capillare e provvisto di un sistema di splitting costituito da:3.8.1. camera termostatica per colonne, capace di mantenere la temperatura desiderata con una precisione di +- 1 °C;3.8.2. una unità di vaporizzazione termoregolabile;3.8.3. un rivelatore a ionizzazione di fiamma ed un convertitore-amplificatore;3.8.4. un integratore-registratore idoneo ad essere usato con il convertitore-amplificatore (3.8.3).3.9. Una colonna capillare in silice fusa coperta interamente di BP1 o equivalente con uno spessore uniforme di 0,25 μm; la colonna deve essere in grado di separare i derivati trimetilsililici di lanosterolo e sitosterolo ed è consigliabile un BP1 avente una lunghezza di 12 m ed un diametro interno di 0,2 mm.3.10. Microsiringa per gascromatografia, da 1 μl, provvista di ago in acciaio temperato.4. ReagentiTutti i reagenti devono essere di purezza analitica riconosciuta. L'acqua che viene usata deve essere acqua distillata o acqua di purezza perlomeno equivalente.4.1. Etanolo, avente una purezza di almeno il 95 %.4.2. Idrossido di potassio, soluzione al 60 %: sciogliere 600 g di idrossido di potassio (minimo 85 %) in acqua e portare al volume di 1 l con acqua.4.3. Betulino avente una purezza di almeno il 99 %.4.3.1. Soluzioni di standard interno di betulino in etere etilico (4.4).4.3.1.1. La concentrazione della soluzione di betulino usata per la determinazione del sitosterolo deve essere pari a 1,0 mg/ml.4.3.1.2. La concentrazione della soluzione di betulino usata per la determinazione dello stigmasterolo deve essere pari a 0,4 mg/ml.4.4. Etere etilico, di purezza analitica (esente da perossidi o da residui).4.5. Solfato di sodio anidro, granulare, preventivamente essiccato a 102 o C per 2 ore.4.6. Reagente sililante, ad esempio TRI-SIL (disponibile presso la Pierce Chemical Co., Cat No. 49001) o equivalente (Attenzione: il TRI-SIL è infiammabile, tossico, corrosivo e forse cancerogeno. Il personale di laboratorio deve conoscere i dati di sicurezza relativi al prodotto e prendere le relative precauzioni.)4.7. Lanosterolo.4.8. Sitosterolo, di purezza nota non inferiore al 90 % (P).Nota 1:La purezza dei materiali standard usati per la calibratura deve essere determinata con il metodo di normalizzazione. Si suppone che tutti gli steroli presenti nel campione siano rappresentati sul cromatogramma, che l'area totale dei picchi rappresenti il 100 % dei costituenti sterolici e che gli steroli diano la stessa risposta al rivelatore. La linearità del sistema deve essere convalidata alle gamme di concentrazione che interessano.4.8.1. Soluzione standard di sitosterolo: preparare una soluzione contenente, con l'approssimazione di 0,001 mg/ml, circa 0,5 mg/ml (W1) di sitosterolo (4.8) in etere etilico (4.4).4.9. Stigmasterolo, di purezza nota non inferiore al 90 % (P).4.9.1. Soluzione standard di stigmasterolo: preparare una soluzione contenente, con l'approssimazione di 0,001 mg/ml, circa 0,2 mg/ml (W1) di stigmasterolo (4.9) in etere etilico (4.4).4.10. Miscela per la prova di risoluzione: preparare una soluzione contenente 0,05 mg/ml di lanosterolo (4.7) e 0,05 mg/ml di sitosterolo (4.8) in etere etilico (4.4).5. Procedimento5.1. Preparazione di soluzioni standard per cromatografia: la soluzione di standard interno (4.3.1) dev'essere aggiunta alla appropriata soluzione standard di sterolo, nello stesso momento in cui viene aggiunta al campione saponificato (cfr. 5.2.2).5.1.1. Soluzione cromatografica standard di sitosterolo: trasferire 1 ml di soluzione standard di sitosterolo (4.8.1) in ciascuna delle due fiale (3.7) ed eliminare l'etere etilico in corrente di azoto. Aggiungere 1 ml di soluzione di standard interno (4.3.1.1) ed eliminare l'etere etilico in corrente di azoto.5.1.2. Soluzione cromatografica standard di stigmasterolo: trasferire 1 ml di soluzione standard di stigmasterolo (4.9.1) in ciascuna delle due fiale (3.7) ed eliminare l'etere etilico in corrente di azoto. Aggiungere 1 ml di soluzione di standard interno (4.3.1.2) ed eliminare l'etere etilico in corrente di azoto.5.2. Preparazione degli insaponificabili5.2.1. Fondere il campione di burro ad una temperatura non superiore a 35 °C, agitare vigorosamente.Pesare con l'approssimazione di 1 mg, circa 1 g di burro (W2) o di burro concentrato (W2) in un pallone da 150 ml (3.1). Aggiungere 50 ml di etanolo (4.1) e 10 ml di soluzione di idrossido di potassio (4.2). Applicare il condensatore a ricadere e scaldare a circa 75 °C per 30 minuti. Staccare il condensatore e raffreddare il pallone a una temperatura prossima a quella ambiente.5.2.2. Aggiungere 1,0 ml di soluzione di standard interno (4.3.1.1) al pallone se si deve determinare il sitosterolo, oppure di soluzione (4.3.1.2) se si deve determinare lo stigmasterolo. Agitare accuratamente. Trasferire quantitativamente il contenuto dei palloni in un imbuto separatore da 500 ml (3.2), sciacquando il pallone alternativamente con 50 ml d'acqua e 250 ml di etere etilico (4.4). Agitare vigorosamente l'imbuto separatore per due minuti e lasciar separare le fasi. Eliminare lo stato acquoso inferiore e lavare lo strato etereo agitando con 4 successive aliquote d'acqua da 100 ml ciascuna.Nota 2:Per evitare che si formi un'emulsione, è essenziale che i primi due risciacqui con acqua vengano effettuati delicatamente (10 inversioni). Il terzo risciacquo dev'essere effettuato agitando vigorosamente per 30 secondi. Se si forma un'emulsione, essa può essere dissolta aggiungendo 5-10 ml di etanolo. Se si aggiunge l'etanolo, è essenziale effettuare due ulteriori lavaggi vigorosi con acqua.5.2.3. Far passare lo strato etereo limpido, esente da sapone, attraverso una colonna di vetro (3.5) contenente 30 g di solfato di sodio anidro (4.5). Raccogliere l'etere in un pallone di 250 ml (3.3). Aggiungere granuli regolatori d'ebollizione ed evaporare quasi completamente su bagnomaria o cuffia riscaldante avendo cura di raccogliere i solventi di scarto.Nota 3:Se gli estratti di campione sono portati a completo essiccamento a una temperatura troppo elevata, si possono verificare perdite di sterolo.5.3. Preparazione di eteri trimetilsililici5.3.1. Trasferire la soluzione eterea che resta nel pallone in una fiala da 2 ml (3.7) con 2 ml di etere etilico ed eliminare l'etere in corrente di azoto. Sciacquare il pallone con altri 2 ml di etere etilico, trasferendo nella fiala ed eliminando ogni volta l'etere in corrente di azoto.5.3.2. Sililare il campione aggiungendo 1 ml di TRI-SIL (4.6). Chiudere la fiala ed agitare vigorosamente in modo da sciogliere. Se lo scioglimento è incompleto, scaldare a 65-70 °C. Far riposare per almeno 5 minuti prima di iniettare nel gascromatografo. Sililare gli standard nello stesso modo dei campioni. Sililare la miscela per la prova di risoluzione (4.10) nello stesso modo dei campioni.Nota 4:La sililazione deve essere effettuata in ambiente anidro. La sililazione incompleta del betulino è indicata da un secondo picco vicino a quello del betulino.La presenza di etanolo nella fase di sililazione interferisce con la sililazione stessa. Ciò può derivare da un risciacquo insufficiente nella fase di estrazione. Se questo problema persiste, nella fase di estrazione si può risciacquare per la quinta volta, agitando vigorosamente per 30 secondi.5.4. Analisi gascromatografica5.4.1. Scelta delle condizioni operative.Regolare il gascromatografo conformemente alle istruzioni del fabbricante.Le condizioni operative sono le seguenti:- temperatura della colonna: 265 °C- temperatura dell'iniettore: 280 °C- temperatura del rivelatore: 300 °C- flusso del gas vettore: 0,6 ml/min.- pressione dell'idrogeno: 84 kPa- pressione dell'aria: 155 kPa- rapporto di splittagio da 10: 1 fino a 50: 1; il rapporto di splittagio deve essere ottimizzato conformemente alle istruzioni del fabbricante e la linearità della risposta del rivelatore deve essere convalidata sulla gamma di concentrazione che interessa.Nota 5:È importante soprattutto che l'iniettore venga regolarmente pulito.- Quantitativo di sostanza iniettata, 1 μl di soluzione di TMSE.Prima di dare inizio a qualsiasi analisi, far sì che il sistema si riequilibri e che si ottenga una risposta sufficientemente stabile.Queste condizioni possono essere modificate alla luce delle caratteristiche della colonna e del gascromatografo in modo da ottenere cromatogrammi che rispettino i seguenti requisiti:- il picco del sitosterolo deve essere opportunamente separato da quello del lanosterolo. La figura 1 mostra un tipico cromatogramma che dovrebbe essere ottenuto da una miscela sililata per la prova di risoluzione (4.10),- i tempi di ritenzione relativi degli steroli sottoindicati devono essere all'incirca i seguenti:colesterolo: 1,0stigmasterolo: 1,3sitosterolo: 1,5betulino: 2,5,- il tempo di ritenzione relativo al betulino deve essere di circa 24 minuti.5.4.2. Procedimento analitico.Iniettare 1 μl di soluzione standard sililata (stigmasterolo o sitosterolo) e regolare i parametri della taratura integrati).Iniettare un altro μl di soluzione standard sililata per determinare i fattori di risposta relativi al betulino.Iniettare 1 μl di soluzione di campione sililata e misurare le aree dei picchi. Ogni cromatografia effettuata deve essere preceduta da una iniezione di standard.A titolo indicativo, ogni cromatologia deve comprendere sei iniezioni di campione.Nota 6:L'integrazione del picco dello stigmasterolo deve comprendere le eventuali "code", come definito ai punti 1, 2 e 3 della figura 2 b).L'integrazione del picco del sitosterolo deve comprendere l'area del picco del 22-diidro-β-sitosterolo (stigmastanolo) che eluisce immediatamente dopo il sitosterolo (vedi figura 3 b) al momento della valutazione del sitosterolo totale.6. Calcolo dei risultati6.1. Determinare l'area dei picchi degli steroli e del betulino in entrambi gli standard che precedono l'area media del picco dello sterolo nello standard seguono un campione e calcolare R1:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>Determinare l'area del picco dello sterolo (stigmasterolo o sitosterolo) e quello del betulino nel campione e calcolare R2:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>W1= quantità di sterolo dello standard (mg) contenuto in 1 ml di soluzione standard (4.8.1 oppure 4.9.1)W2= peso del campione (g) (5.2.1)P= purezza dello dello sterolo standard (4.8 oppure 4.9)>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>7. Precisione del metodo7.1. Burro7.1.1. Ripetibilità7.1.1.1. StigmasteroloLa differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate entro l'intervallo di tempo minimo possibile, da un solo operatore che usa la stessa apparecchiatura su un materiale di prova identico non deve superare 19,3 mg/kg.7.1.1.2. SitosteroloLa differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate entro l'intervallo di tempo minimo possibile, da un solo operatore che usa la stessa apparecchiatura su un materiale di prova identico non deve superare 23,0 mg/kg.7.1.2. Riproducibilità7.1.2.1. StigmasteroloLa differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate da operatori in diversi laboratori, usando diverse apparecchiature su un identico materiale di prova non deve superare 31,9 mg/kg.7.1.2.2. SitosteroloLa differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate da operatori di diversi laboratori, facendo uso di diverse apparecchiature su un identico materiale di prova non deve superare l'8,7 % relativo della media delle determinazioni.7.1.3. Fonte dei dati di precisioneI dati di precisione sono stati determinati con un esperimento eseguito nel 1992 e comprendente 8 laboratori e 6 campioni (3 prove in doppio cieco) per lo stigmasterolo e 6 campioni (3 prove in doppio cieco) per il sitosterolo.7.2. Burro concentrato7.2.1. Ripetibilità7.2.1.1. StigmasteroloLa differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate entro l'intervallo di tempo minimo possibile da un solo operatore che usa la stessa apparecchiatura su un identico materiale di prova non deve superare 10,2 mg/kg.7.2.1.2. SitosteroloLa differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate nell'intervallo di tempo minimo possibile, da un solo operatore che usa la stessa apparecchiatura su un materiale di prova identico non deve superare il 3,6 % riferito alla media delle determinazioni.7.2.2. Riproducibilità7.2.2.1. StigmasteroloLa differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate da operatori in diversi laboratori, usando diverse apparecchiature su un identico materiale non deve superare i 25,3 mg/kg.7.2.2.2. SitosteroloLa differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate da operatori di diversi laboratori, facendo uso di diverse apparecchiature su un identico materiale di prova non deve superare l'8,9 % relativo della media delle determinazioni.7.2.3. Fonte dei dati di precisioneI dati di precisione sono stati determinati con un esperimento eseguito nel 1991 e comprendente 9 laboratori e 6 campioni (3 prove in doppio cieco) per lo stigmasterolo e 6 campioni (3 prove in doppio cieco) per il sitosterolo.8. Limiti di tolleranza8.1. Per verificare che l'aggiunta di rivelatori è stata effettuata correttamente, dal prodotto marcato devono essere prelevati tre campioni.8.2. Burro8.2.1. Stigmasterolo8.2.1.1. Il tasso di incorporazione relativo allo stigmasterolo è di 150 g di stigmasterolo puro ad almeno il 95 % per tonnellata di burro, cioè 142,5 mg/kg oppure 170 g di stigmasterolo puro ad almeno l'85 % per tonnellata di burro cioè 144,5 mg/kg.8.2.1.2. I risultati dell'analisi dei tre campioni del prodotto vengono utilizzati per verificare il tasso e l'omogeneità di incorporazione del rivelatore: il risultato più basso ottenuto dall'analisi del prodotto viene confrontato con i seguenti limiti [si prende in considerazione la differenza critica per una probabilità del 95 % (DCr95)]:- 116,0 mg/kg (il 95 % del tasso minimo di incorporazione per stigmasterolo puro al 95 %),- 118,0 mg/kg (il 95 % del tasso minimo di incorporazione per stigmasterolo puro all'85 %),- 81,0 mg/kg (il 70 % del tasso minimo di incorporazione per stigmasterolo puro al 95 %),- 82,0 mg/kg (il 70 % del tasso minimo di incorporazione per stigmasterolo puro all'85 %).La concentrazione di rivelatore del campione che dà il risultato più basso viene utilizzata per interpolazione tra 116,0 mg/kg e 81,0 mg/kg o rispettivamente tra 118,0 mg/kg e 82,0 mg/kg.8.2.2. Sitosterolo8.2.2.1. Il tasso di incorporazione per il sitosterolo è di 600 g di sitosterolo puro ad almeno il 90 % per tonnellata di burro, ovvero di 540 mg/kg.8.2.2.2. I risultati dell'analisi dei tre campioni del prodotto vengono utilizzati per verificare il tasso e l'omogeneità di incorporazione del rivelatore: il risultato più basso ottenuto dall'analisi del prodotto viene confrontato con i seguenti limiti [si prende in considerazione la differenza critica per una probabilità del 95 % (DCr95)]:- 486,0 mg/kg (il 95 % del tasso minimo di incorporazione per sitosterolo puro al 90 %),- 358,0 mg/kg (il 70 % del tasso minimo di incorporazione per sitosterolo puro al 90 %).La concentrazione di rivelatore nel campione che dà il risultato più basso viene utilizzata per interpolazione tra 486,0 mg/kg e 358,0 mg/kg.8.3. Burro concentrato8.3.1. Stigmasterolo8.3.1.1. Il tasso di incorporazione relativo allo stigmasterolo è di 150 g di stigmasterolo puro ad almeno il 95 % per tonnellata di burro concentrato, cioè 142,5 mg/kg oppure 170 g di stigmasterolo puro ad almeno l'85 % per tonnellata di burro concentrato, cioè 144,5 mg/kg.8.3.1.2. I risultati dell'analisi dei tre campioni del prodotto vengono utilizzati per verificare il tasso e l'omogeneità di incorporazione del rivelatore: il risultato più basso ottenuto dall'analisi del prodotto viene confrontato con i seguenti limiti [si prende in considerazione la differenza critica per una probabilità del 95 % (DCr95)]:- 120,0 mg/kg (il 95 % del tasso minimo di incorporazione per stigmasterolo puro al 95 %),- 122,0 mg/kg (il 95 % del tasso minimo di incorporazione per stigmasterolo puro all'85 %),- 84,0 mg/kg (il 70 % del tasso minimo di incorporazione per stigmasterolo puro al 95 %),- 86,0 mg/kg (il 70 % del tasso minimo di incorporazione per stigmasterolo puro all'85 %).La concentrazione di rivelatore del campione che dà il risultato più basso viene utilizzata per interpolazione tra 120,0 mg/kg e 84,0 mg/kg o rispettivamente tra 122,0 mg/kg e 86,0 mg/kg.8.3.2. Sitosterolo8.3.2.1. Il tasso di incorporazione per il sitosterolo è di 600 g di sitosterolo puro ad almeno il 90 % per tonnellata di burro concentrato, ovvero di 540 mg/kg.8.3.2.2. I risultati dell'analisi dei tre campioni del prodotto vengono utilizzati per verificare il tasso e l'omogeneità di incorporazione del rivelatore: il risultato più basso ottenuto dall'analisi del prodotto viene confrontato con i seguenti limiti [si prende in considerazione la differenza critica per una probabilità del 95 % (DCr95)]:- 486,0 mg/kg (il 95 % del tasso minimo di incorporazione per sitosterolo puro al 90 %),- 358,0 mg/kg (il 70 % del tasso minimo di incorporazione per sitosterolo puro al 90 %).La concentrazione di rivelatore nel campione che dà il risultato più basso viene utilizzata per interpolazione tra 486,0 mg/kg e 358,0 mg/kg.>PIC FILE= "L_2001037IT.004801.EPS">>PIC FILE= "L_2001037IT.004901.EPS">>PIC FILE= "L_2001037IT.005001.EPS">ALLEGATO XV(Articolo 10)METODO DI RIFERIMENTO PER LA RIVELAZIONE DI CASEINATO E DI LATTE VACCINI IN FORMAGGI PRODOTTI CON LATTE DI PECORA, DI CAPRA O DI BUFALA O CON MISCELE DI LATTI DI PECORA, DI CAPRA E DI BUFALA1. OggettoRivelazione di latte vaccino e caseinato in formaggi di latte di pecora, di capra o di bufala o di miscele di latti di pecora, capra e bufala mediante focalizzazione isoelettrica delle γ-caseine dopo plasminolisi.2. Campo di applicazioneIl metodo è idoneo per una rivelazione sensibile e specifica di latte vaccino crudo o trattato termicamente e di caseinto in formaggi freschi e stagionati di latte di pecora, di capra o di bufala o di miscele di latti di pecora, capra e bufala. Il metodo non è adatto per la rivelazione dell'adulterazione di latte e formaggi mediante concentrati di proteine del siero di latte vaccino trattate termicamente.3. Principio del metodo3.1. Isolamento delle caseine dal formaggio e dagli standard di riferimento.3.2. Solubilizzazione delle caseine isolate ed azione plasminica sulle stesse (EC.3.4.21.7).3.3. Focalizzazione isoelettrica delle caseine trattate con plasmina in presenza di urea e colorazione delle proteine.3.4. Valutazione dei profili di γ3- e γ2-caseina (prova della presenza di latte vaccino) per confronto del profilo del campione con quelli ottenuti sullo stesso gel da standard di riferimento contenenti lo 0 % e l'1 % di latte vaccino.4. ReagentiSalvo dove diversamente indicato, utilizzare solo reagenti chimici per analisi. L'acqua deve essere bidistillata o di purezza equivalente.Nota:Le indicazioni che seguono valgono per gel di poliacrilammide preparati in laboratorio, contenenti urea, delle dimensioni di 265 x 125 x 0,25 mm. Nel caso vengano utilizzati gel di differenti dimensioni o differente tipo, può rendersi necessario modificare le condizioni di separazione.Focalizzazione isoelettrica4.1. Reagenti per la produzione di gel di poliacrilammide contenenti urea4.1.1. Soluzione madre di gelSciogliere in acqua:4,85 g di acrilammide0,15 g N, N,N'-metilen-bis-acrilammide (BIS)48,05 g di urea15,00 g di glicerolo (87 % p/p)e portare a 100 ml. Conservare in frigorifero in un flacone di vetro scuro.Nota:È preferibile utilizzare una soluzione premiscelata di acrilammide/BIS, disponibile in commercio, invece dei pesi prestabiliti delle acrilammidi neurotossiche. Se una tale soluzione contiene il 30 % p/v di acrilammide e lo 0,8 % p/v di BIS, utilizzare per la formulazione un volume di 16,2 ml invece del peso prestabilito. La soluzione madre può venire conservata per un massimo di 10 giorni; se la sua conducibilità è superiore a 5 μS, deionizzarla agitandola per 30 minuti con 2 g di Amberlite MB-3, poi filtrare attraverso una membrana da 0,45 μm.4.1.2. Soluzione di gelPreparare una soluzione di gel miscelando additivi e anfoliti con la soluzione madre di gel (4.1.1):9,0 ml di soluzione madre24 mg de β-alanina500 μl di anfolita pH 3,5-9,5(1)250 μl di anfolita pH 5-7(2)250 μl di anfolita pH 6-8(3).Miscelare la soluzione di gel e degassarla per due o tre minuti in un bagno a ultrasuoni o sotto vuoto.Nota:La soluzione di gel va preparata appena prima dell'uso (vedi 6.2).4.1.3. Soluzioni dei catalizzatori4.1.3.1. N,N,N'N'-tetrametiletilendiammina (TEMED)4.1.3.2. Persolfato d'ammonio (PER) al 40 % p/v:Sciogliere 800 mg di PER in acqua e portare a 2 ml.Nota:Usare sempre soluzioni di PER appena preparate.4.2. Fluido di contattoCherosene o paraffina liquida.4.3. Soluzione anodicaSciogliere 5,77 g di acido fosforico (85 % p/p) in acqua e portare a 100 ml.4.4. Soluzione catodicaSciogliere 2,00 g di idrossido di sodio in acqua e portare a 100 ml con acqua.Preparazione del campione4.5. Reagenti per l'isolamento delle proteine4.5.1. Acido acetico diluito (25,0 ml di acido acetico glaciale portati a 100 ml con acqua).4.5.2. Diclorometano4.5.3. Acetone4.6. Tampone per la solubilizzazione delle proteineSciogliere in acqua:5,75 g di glicerolo (87 % p/p)24,03 g di urea250 mg di ditiotreitoloe portare a 50 ml.Nota:Conservare in frigorifero, per 1 settimana al massimo.4.7. Reagenti per la scissione plasmidica delle caseine4.7.1. Tampone di carbonato d'ammonioTitolare una soluzione di idrogenocarbonato d'ammonio a 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml di acqua) contenente 0,05 mol/l di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, 1,46 g/100 ml), con una soluzione di carbonato d'ammonio a 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml di acqua) contenente 0,05 mol/l EDTA a pH 8.4.7.2. Plasmina bovina (E.C. 3.4.21.7), attività non minore di 5 U/ml.4.7.3. Soluzione di acido ε-amminocapronico per l'inibizione dell'enzimaSciogliere 2,624 g di acido ε-amminocapronico (acido 6-ammino-n-esanoico) in 100 ml di etanolo al 40 % (v/v).4.8. Standard4.8.1. Standard di riferimento certificati di una miscela di coagulo presamico a partire da latte scremato di pecora e capra contenenti lo 0 % e l'1 % di latte vaccino possono essere richiesti allo Institute for Reference Materials and Measurements, della Commissione, B-2440 Geel, Belgio.4.8.2. Preparazione di standard di laboratorio provvisori di coagulo presamico di latte di bufala contenenti lo 0 % e l'1 % di latte vaccino.Il latte scremato viene preparato mediante centrifugazione di latte crudo di bufala o di vacca, a 37 °C, a 2500 g per 20 minuti. Dopo aver raffreddato rapidamente a 6-8 °C la provetta e il contenuto, lo strato superiore di grasso viene completamente rimosso. Per la preparazione dello standard all'1 %, aggiungere 5,00 ml di latte vaccino scremato a 495 ml di latte scremato di bufala in un becher da 1 litro, regolare il pH a 6,4 aggiungendo acido lattico diluito (10 % p/v). Regolare la temperatura su 35 °C e aggiungere 100 μl di caglio di vitello (attività 1: 10000, c. 3000 U/ml), agitare per 1 minuto e poi lasciare a riposo il becher coperto con un foglio di alluminio a 35 °C per 1 ora per permettere la formazione della cagliata. Dopo la formazione della cagliata, liofilizzare l'intero latte coagulato, senza preventiva omogeneizzazione né drenaggio del siero. Dopo la liofilizzazione, macinare finemente fino ad ottenere una polvere omogenea. Per la preparazione dello standard allo 0 %, eseguire la stessa procedura usando latte scremato di bufala puro. Conservare gli standard a - 20 °C.Nota:È consigliabile controllare la purezza del latte di bufala mediante focalizzazione isoelettrica delle caseine trattate con plasmina prima della preparazione degli standard.Reagenti per la colorazione delle proteine4.9. FissativoSciogliere 150 g di acido tricloroacetico in acqua e portare a 1000 ml.4.10. Soluzione decolorantePortare 500 ml di metanolo e 200 ml di acido acetico glaciale a 2000 ml con acqua distillata.Nota:Preparare la soluzione decolorante ogni giorno; per la preparazione si possono utilizzare soluzioni madre di metanolo al 50 % (v/v) e acido acetico glaciale al 20 % (v/v), da miscelare in volumi uguali.4.11. Soluzioni coloranti4.11.1. Soluzioni di colorante (soluzione madre 1)Sciogliere 3,0 g di blu brillante Coomassie G 250 (C.I. 42655) in 1000 ml di metanolo al 90 % (v/v) con un agitatore magnetico (circa 45 minuti), filtrare attraverso due filtri a pieghe, a velocità media.4.11.2. Soluzione colorante (soluzione madre 2)Sciogliere 5,0 g di solfato di rame pentaidrato in 1000 ml di acido al 20 % (v/v).4.11.3. Soluzione colorante (soluzione di lavoro)Miscelare 125 ml di ciascuna delle soluzioni madre (4.11.1, 4.11.2) appena prima della colorazione.Nota:la soluzione colorante deve venire preparata il giorno stesso in cui viene usata.5. Apparecchiatura5.1. Lastre di vetro (265 x 125 x 4 mm); rullo di gomma (larghezza 15 cm); tavolo con piano regolabile5.2. Foglio di supporto del gel (265 x 125 mm)5.3. Foglio di copertura (280 x 125 mm). Applicare una striscia di nastro adesivo (280 x 6 x 0,25 mm) a ciascun bordo lungo (vedi figura 1).5.4. Camera di elettrofocalizzazione con piastra di raffreddamento (per esempio 265 x 125 mm) e alimentazione elettrica adatta (&gt;= 2,5 kV) o dispositivo per elettroforesi automatica.5.5. Criostato a circolazione, con regolazione termostatica su 12 +- 0,5 °C5.6. Centrifuga regolabile su 3000 g5.7. Strisce elettrodiche (lunghezza &gt;= 265 mm)5.8. Flaconi contagocce per le soluzioni anodica e catodica5.9. Applicatori per campioni (10 x 5 mm, viscosa o carta da filtro a scarso assorbimento di proteine)5.10. Forbici, bisturi e pinzette in acciaio inossidabile5.11. Vaschette di colorazione e decolorazione in acciaio inossidabile o vetro (per esempio vassoi portastrumenti da 280 x 150 mm)5.12. Omogeneizzatore ad asta regolabile (diametro 10 mm), velocità 8000-20000 giri al minuto5.13. Agitatore magnetico5.14. Bagno a ultrasuoni5.15. Saldatore per pellicola5.16. Micropipette da 5-25 μl5.17. Concentratore sotto vuoto o liofilizzatore5.18. Bagnomaria a controllo termostatico regolabile su 35 e 40 +- 1 °C con agitatore5.19. Densitometro con lettura a λ = 634 nm6. Procedimento6.1. Preparazione del campione6.1.1. Isolamento delle caseinePesare una quantità equivalente a 5 g di sostanza secca di formaggio o degli standard di riferimento in una provetta da centrifuga da 100 ml, aggiungere 60 ml di acqua distillata e omogeneizzare con un omogeneizzatore ad asta (8000-10000 giri/min). Regolare di pH 4,6 con acido acetico diluito (4.5.1) e centrifugare (5 min, 3000 g). Decantare il grasso e il siero, omogeneizzare il residuo a 20000 giri/min in 40 ml di acqua distillata portata a pH 4-5 con acido acetico diluito (4.5.1), aggiungere 20 ml di diclorometano (4.5.2), omogeneizzare di nuovo e centrifugare (5 min, 3000 g). Recuperare con una spatola lo strato di caseina disposto tra la fase acquosa e la fase organica (vedi figura 2) e separare le due fasi per decantazione. Riomogeneizzare la caseina in 40 ml di acqua distillata (vedi sopra) e 20 ml di diclorometano (4.5.2) e centrifugare. Ripetere questo procedimento fino quando le due fasi di estrazione diventano incolori (2 o 3 volte). Omogeneizzare il residuo proteico con 50 ml di acetone (4.5.3) e filtrare attraverso carta da filtro e pieghe di media velocità. Lavare il residuo sul filtro con due aliquote separate di acetone di 24 ml ciascuna e far essicare all'aria o in corrente d'azoto, quindi polverizzare finemente nel mortaio.Nota:Gli isolati di caseina secchi devono essere conservati a - 20 °C.6.1.2. Scissione plasminica delle γ-caseine per intensificare le bande di γ-caseineDisperdere 25 mg di caseine isolate (6.1.1) in 0,5 ml di tampone carbonato d'ammonio (4.7.1) e omogeneizzare per 20 minuti, per esempio utilizzando un trattamento ad ultrasuoni. Riscaldare a 40 °C e aggiungere 10 μl di plasmina (4.7.2), miscelare e incubare per 1 ora a 40 °C agitando in continuazione. Per inibire l'enzima, aggiungere 20 μl di soluzione di acido ε-amminocapronico (4.7.3), poi aggiungere 200 mg di urea solida e 2 mg di ditiotreitolo.Nota:Per ottenere una maggiore simmetria nelle bande di caseina focalizzate, è consigliabile liofilizzare la soluzione dopo aver aggiunto l'acido ε-amminocapronico e disciolto poi i residui in 0,5 ml di tampone di solubilizzazione delle proteine (4.6).6.2. Preparazione di gel di poliacrilammide contenenti ureaCon qualche goccia d'acqua e col rullo stendere il foglio di supporto del gel (5.2) su una lastra di vetro (5.1) rimuovendo l'acqua in eccesso con carta assorbente o con un panno. Con il rullo, stendere il foglio di copertura (5.3) con distanziatori (0,25 mm) su un'altra lastra di vetro nello stesso modo. Posare la lastra orizzontalmente su un piano a livello regolabile.Aggiungere 10 μl TEMED (4.1.3.1) alla soluzione di gel preparata e disaereata (4.1.2) agitare e aggiungere 10 μl di soluzione di PER (4.1.3.2), miscelare accuratamente e versare immediatamente in modo regolare sul centro del foglio di copertura. Posizionare un bordo della lastra di supporto del gel (con il lato del foglio in basso) sulla lastra del foglio di copertura e abassarla lentamente in modo che tra i fogli si formi una pellicola di gel uniforme e senza bolle (figura 3). Abbassare completamente la lastra di supporto del gel con attenzione usando una spatola sottile e porre altre tre lastre di vetro su di essa come pesi. Dopo il completamento della polimerizzazione (circa in 60 minuti), rimuovere il gel polimerizzato sul foglio di supporto insieme con il foglio di copertura scostando le lastre di vetro. Pulire accuratamente il rovescio della lastra di supporto per rimuovere residui di gel e urea. Saldare il "sandwich di gel" in una pellicola tubolare e conservare in frigorifero (massimo 6 settimane).Nota:Il foglio di copertura con i distanziatori può venire riutilizzato. Il gel di poliacrilammide può venire tagliato in porzioni più piccole, cosa raccomandata quando i campioni sono pochi o si utilizza un dispositivo automatico per elettroforesi (2 gel, dimensioni 4,5 x 5 cm).6.3. Focalizzazione isoelettricaRegolare il termostato di raffreddamento su 12 °C. Detergere il rovescio del foglio di supporto del gel con cherosene, poi far cadere qualche goccia di cherosene (4.2) sul centro del blocco di raffreddamento. Far ruotare su di esso il sandwich di gel con il lato del supporto verso il basso, facendo attenzione che non rimangono bolle. Detergere l'eccesso di cherosene e rimuovere il foglio di copertura. Bagnare le strisce elettrodiche con le soluzioni elettrodiche (4.3, 4.4), tagliarle nel senso della lunghezza del gel e posizionarle nei punti previsti (distanza tra gli elettroidi 9,5 cm).Condizioni della focalizzazione isoelettrica6.3.1. Dimensioni del gel: 265 x 125 x 0,25 mm>SPAZIO PER TABELLA>Nota:Se lo spessore o la larghezza del gel vengono modificati, i valori di corrente e potenza devono venire regolati di conseguenza (per esempio raddoppiare i valori della corrente elettrica e della potenza se si utilizza un gel a 265 x 125 x 0,5 mm).6.3.2. Esempio di un programma di tensione per un dispositivo per elettroforesi automatica (2 gel da 5,0 x 4,5 cm), elettrodi senza strisce applicate direttamente al gel>SPAZIO PER TABELLA>Posizionare l'applicatore del campione nella fase 2 a 0 VhRimuovere l'applicatore del campione nella fase 2 a 30 Vh6.4. Colorazione delle proteine6.4.1. Fissaggio delle proteineRimuovere le strisce elettrodiche immediatamente dopo aver interrotto l'alimentazione elettrica e porre il gel immediatamente in una bacinella di colorazione/decolorazione con 200 ml di fissativo (4.9). Lasciare per 15 minuti agitando continuamente.6.4.2. Lavaggio e colorazione della lastra di gelEliminare accuratamente il fissativo e lavare la lastra di gel due volte per 30 secondi, ogni volta con 100 ml di soluzione decolorante (4.10). Eliminare la soluzione decolorante e riempire la bacinella con 250 ml di soluzione colorante (4.11.3); lasciar colorare per 45 minuti agitando delicatamente.6.4.3. Decolorazione della lastra di gelEliminare la soluzione colorante, lavare due volte la lastra di gel con 100 ml di soluzione decolorante (4.10) ogni volta; agitare con 200 ml di soluzione di decolorazione per 15 minuti e ripetere l'operazione almeno due o tre volte fino a quando il fondo è chiaro e incolore. Risciaquare poi la lastra di gel con acqua distillata (2 x 2 min.) e asciugare all'aria per 2 o 3 ore o con un asciugacapelli per 10-15 minuti.Nota 1:Eseguire il fissaggio, il lavaggio, la colorazione e la decolorazione a 20 °C. Non usare temperature elevate.Nota 2:Se si preferisce una colorazione più sensibile con argento (per esempio Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, codice n. 17-1150-01) i campioni di caseina trattata con plasmina devono essere diluiti a 5 mg/ml.7. ValutazioneLa valutazione viene eseguita confrontando i profili proteici del campione sconosciuto con quello dello standard di riferimento sullo stesso gel. La presenza di latte vaccino nei formaggi di latte di pecora, di capra o di bufala e di miscele di latti di pecora, capra e bufala, viene rivelata attraverso le γ3 e γ2-caseine, i cui punti isoelettrici sono compresi tra pH 6,5 e pH 7,5 (figure 4a, 4b e figura 5). Il limite di rivelazione è inferiore allo 0,5 %.7.1. Stima visivaPer una valutazione visiva della quantità di latte vaccino, è consigliabile regolare le concentrazioni dei campioni e degli standard in modo da ottenere lo stesso livello di intensità delle γ2- e γ3-caseine ovine, caprine e/o di bufala (vedi "γ2 E, G, B" e "γ3 E, G, B" nelle figure 4a, 4b e in figura 5). Dopo di ciò, la quantità di latte vaccino (minore, uguale o maggiore dell'1 %) nel campione in esame può venire valutata direttamente confrontando l'intensità delle γ3- e γ2-caseine vaccine (vedi "γ3 C" e "γ2 C" nelle figure 4a, 4b e in figura 5) con quella degli standard di riferimento allo 0 % e all'1 % (pecora, capra) o con gli standard provvisori di laboratorio (bufala).7.2. Stima densitometricaSe disponibile, ricorrere alla densitometria (5.19) per la determinazione del rapporto tra le aree dei picchi delle γ2- e γ3-caseine vaccine sulle γ2- e γ3-caseine ovine, caprine e/o di bufala (vedi figura 5). Confrontare questo valore con il rapporto dei picchi delle aree delle γ2- e γ3-caseine dello standard di riferimento all'1 % (pecora, capra) o dello standard provvisorio di laboratorio (bufala) analizzati sullo stesso gel.Nota:Il metodo è soddisfacente nel caso di un chiaro segnale positivo per le γ2- e γ3-caseine vaccine nello standard di riferimento all'1 %, ma non nello standard di riferimento allo 0 %. In caso contrario, ottimizzare la procedura seguendo con estrema precisione i dettagli del metodo.Un campione viene considerato positivo se entrambe le γ2- e γ3-caseine vaccine, o i corrispondenti rapporti di area dei picchi, sono uguali o maggiori del livello dello standard di riferimento all'1 %.8. Bibliografia1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).3. Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goal milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholyte/immobilised pH gradient - isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pag. 389-393, Bode-Verlag, München (1989).4. Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).5. Radola B. J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).Figura 1: Disegno schematico del foglio di copertura.>PIC FILE= "L_2001037IT.005701.EPS">Figura 2: Strato di caseina sospeso tra la fase acquosa e la fase organica dopo centrifugazione.>PIC FILE= "L_2001037IT.005702.EPS">Figura 3: Tecnica per la colata di gel poliacrilammide ultrasottile>PIC FILE= "L_2001037IT.005703.EPS">a = nastro distanziatore (0,25 mm); b = foglio di copertura (5.3); c, e = lastre di vetro (5.1); d = soluzione di gel (4.1.2); f = foglio di supporto del gel (5.2).Figura 4a: Focalizzazione isoelettrica di caseine di formaggio di latte di pecora e capra contenente varie quantità di latte vaccino trattate con plasmina>PIC FILE= "L_2001037IT.005801.EPS">% CM = percentuali di latte vaccino, C = vacca, E = pecora, G = capraÈ mostrata la metà superiore del gel IEF.Figura 4b: Focalizzazione isoelettrica di caseine, trattate con plasmina, di formaggio di miscele di latte di pecora, capra e bufala contenenti varie quantità di latte vaccino>PIC FILE= "L_2001037IT.005802.EPS">% CM = percentuali di latte vaccino, 1 + = campione contenente l'1 % di latte vaccino con aggiunta di caseina vaccina pura al centro della traccia; C = vacca, E = pecora, G = capra, B = bufalaÈ mostrata la distanza totale di separazione del gel IEF.Figura 5: Sovrapposizione dei densitogrammi di standard (STD) e di campioni di formaggio prodotto con miscele di latte di pecora e capra dopo focalizzazione isoelettrica>PIC FILE= "L_2001037IT.005901.EPS">a,b = standard contenenti lo 0 e l'1 % di latte vaccino; c-g = campioni di formaggio contenenti lo 0, 1, 2, 3 e 7 % di latte vaccino. C = vacca, E = pecora, G = capra.È stata analizzata la metà superiore del gel IEF a λ = 634 nm.(1) Per ottenere la separazione riechiesta delle γ-caseine, si sono dimostrati particolarmente validi i prodotti Ampholine ® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) e Resolyte ® pH 5-7 e pH 6-8 (BDH, Merck).(2) Per ottenere la separazione riechiesta delle γ-caseine, si sono dimostrati particolarmente validi i prodotti Ampholine ® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) e Resolyte ® pH 5-7 e pH 6-8 (BDH, Merck).(3) Per ottenere la separazione riechiesta delle γ-caseine, si sono dimostrati particolarmente validi i prodotti Ampholine ® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) e Resolyte ® pH 5-7 e pH 6-8 (BDH, Merck).ALLEGATO XVI(Articolo 11)METODO DI RIFERIMENTO PER LA RICERCA DI COLIFORMI NEL BURRO, NEL LATTE SCREMATO IN POLVERE, NELLA CASEINA E NEI CASEINATINel caso del burro, inoculare dei campioni corrispondenti a 1 g di burro nel terreno di coltura.Nel caso di latte scremato in polvere o di caseina/caseinato, inoculare dei campioni di 0,1 g nel terreno di coltura.Applicare la norma IDF 73A/1985, metodo B, con le seguenti modifiche:1) Preparare i campioni secondo la norma IDF-122B/1992; per la caseina acida, per la preparazione dei campioni può essere applicato, in via alternativa, il metodo descritto nella norma IDF 73A/1985;2) Incubare e valutare soltanto tubi inoculati con campioni di 1 g (burro) o di 0,1 g (latte scremato in polvere, caseina/caseinato); non effettuare diluizioni decimali.Valutazione dei risultati>SPAZIO PER TABELLA>Nota:Numero di coliformi: 1/10 g di burro; 1/g di latte scremato in polvere o di caseina/caseinato, in media.I risultati che indicano che il requisito è soddisfatto sono ottenuti con una probabilità del 93 %.Numero di coliformi: 1/g di burro; 1/0,1 g di latte scremato in polvere di caseina/caseinato, in media.I risultati che indicano che il requisito non è soddisfatto sono ottenuti con una probabilità del 91 %.(Ipotesi: distribuzione di Poisson)ALLEGATO XVII(Articolo 12)METODO D'ANALISI PER LA DETERMINAZIONE DEL TENORE DI LATTOSIO NEI PRODOTTI APPARTENENTI ALLA VOCE 2309 DELLA NOMENCLATURA COMBINATA(1)PARTE I1. Campo d'applicazioneIl metodo è applicabile per un tenore di lattosio superiore allo 0,5 %.2. PrincipioSciogliere gli zuccheri in acqua. Far agire il lievito (Saccharomyces cerevisiae) che lascia intatto il lattosio. Determinare il tenore di lattosio della soluzione secondo il metodo Luff-Schoorl, dopo defecazione e filtrazione.3. ReagentiTiosolfato di sodio 0,1 NIndicatore: soluzione d'amido. Aggiungere ad 1 litro d'acqua bollente una miscela di 5 g d'amido solubile (aggiungere eventualmente 10 mg di ioduro di mercurio come agente di conservazione) e di 30 ml d'acqua; mantenere la miscela in ebollizione per 3 minuti; lasciar raffreddare.Soluzione di ioduro di potasso p.a. al 30 % (p/v)Soluzione di acido solforico 6 NReattivo secondo Luff-Schoorl:a) Sciogliere 25 g di solfato di rame p.a. esente da ferro (CuSO45H2O) in 100 ml d'acqua;b) Sciogliere 50 g di acido citrico p.a. (C6H8O7H2O) in 50 ml di acqua;c) Sciogliere 143,8 g di carbonato di sodio p.a. anidro (Na2CO2) in circa 300 ml di acqua calda.Versare b) in c) (previo raffreddamento) agitando con cautela ed aggiungere successivamente a). Portare ad 1 litro, lasciar riposare per una notte e filtrare. È necessario verificare le normalità del reattivo così ottenuto (0,1 N in Cu, 2 N in Na2CO3). Il pH deve avvicinarsi a 9,4.Soluzione Carrez I: sciogliere 23,8 g di Zn (C2H302)2.2H2O e 3 g di acido acetico glaciale in acqua e portare a 100 ml.Soluzione Carrez II: sciogliere 10,6 g di K4F2 (CN)6.3H2O in acqua e portare a 100 ml.Grani di pietra pomice fatti bollire con acido cloridrico, lavati in acqua e asciugati. Sospensione di Saccharomyces cerevisiae: 25 g di lievito fresco in 100 ml d'acqua (non conservare più di una settimana in frigorifero).4. Modo di operarePesare, con l'approssimazione di 1 mg, 1 g del campione da analizzare e introdurre il saggio in un pallone tarato da ml 100. Aggiungere da 25 a 30 ml d'acqua. Porre il pallone per 30 minuti in un bagnomaria bollente e raffreddare poi a circa 35 °C.Aggiungere 5 ml della sospensione di lievito(2) e agitare. Mantenere il pallone tarato e il suo contenuto per 2 ore a bagnomaria a una temperatura compresa fra 38 e 40 °C.Dopo la fermentazione raffreddare a una temperatura di circa 20 °C. Aggiungere 2,5 ml della soluzione Carrez I e agitare per 30 secondi; aggiungere quindi 2,5 ml della soluzione Carrez II e agitare nuovamente per 30 secondi. Portare a 100 ml con acqua, mescolare e filtrare. Prelevare con la pipetta una quantità di filtrato non superiore a 25 ml e contenente di preferenza da 40 a 80 mg di lattosio; all'occorrenza, portare a 25 ml con acqua e determinare il tenore di lattosio anidro secondo Luff-Schoorl.Procedere a una prova in bianco completa con il solo lievito.PARTE II1. Determinazione del tenore di lattosio secondo il metodo Luff-SchoorlPrelevare con la pipetta 25 ml di reattivo secondo Luff-Schoorl e introdurli in un Erlenmeyer da 300 ml; aggiungere 25 ml, esattamente misurati, della soluzione defecata.Dopo aggiunta di due grani di pietra pomice, riscaldare, agitando a mano, sopra una fiamma libera di media altezza portando il liquido al ebollizione in circa 2 minuti. Porre immediatamente l'Erlenmeyer su una reticella provvista di schermo d'amianto, sotto la quale è stata preventivamente accesa una fiamma. Quest'ultima è regolata in modo che l'Erlenmeyer riceva il calore unicamente alla base; adattare quindi un refrigerante a ricadere. A partire da questo momento, far bollire per 10 minuti esatti. Raffreddare immediatamente in acqua fredda e, dopo 5 minuti circa, titolare come segue:Aggiungere al liquido 10 ml di ioduro di potassio e, immediatamente dopo, ma con cautela (a causa della formazione di abbondante schiuma), 25 ml di acido solforico 6 N.Titolare quindi con il tiosolfato di sodio fino ad apparizione di una colorazione gialla pallida e, verso la fine della titolazione, aggiungere l'indicatore all'amido.Effettuare la stessa titolazione su una miscela rigorosamente misurata di 25 ml di reattivo secondo Luff-Schoorl d'acqua, dopo aver aggiunto 10 ml di ioduro di potassio e 25 ml di acido solforico 6 N, questa volta senza portare ad ebollizione.Stabilire a mezzo della tabella allegata il quantitativo in mg di lattosio corrispondente alla differenza dei risultati delle due titolazioni (espressi in ml di tiosolfato di sodio 0,1 N).TABELLATabella per 25 ml di reattivo secondo Luff-Schoorl(vedi condizioni indicate nel testo)1. Tissolfato di sodio 0,1 N2. Lattosio C12H22O11>SPAZIO PER TABELLA>(1) Regolamento (CEE) n. 222/88.(2) Nel caso dei prodotti con un tenore di zuccheri fermentescibili superiore al 40 % aumentare la quantità di sospensione.ALLEGATO XVIII(Articolo 13)RICERCA DEL LATTOSIERO PRESAMICO NEL LATTE SCREMATO IN POLVERE DESTINATO ALL'AMMASSO PUBBLICO ATTRAVERSO IL DOSAGGIO DEI GLICOMACROPEPTIDI MEDIANTE IL METODO PER CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA PRESTAZIONE (HPLC)1. Finalità e campo di applicazioneQuesto metodo permette di evidenziare la presenza di lattosiero presamico nel latte scremato in polvere destinato all'ammasso pubblico attraverso il dosaggio dei glicomacropeptidi.2. RiferimentoNorma internazionale ISO 707 - Latte e prodotti lattieri - Metodo di campionamento, in conformità alle indicazioni di cui all'ultimo capoverso del punto 2 c) dell'allegato I.3. DefinizioneContenuto in glicomacropeptidi del latte scremato in polvere: contenuto di tali sostanze determinato secondo il metodo appresso specificato ed espresso come percentuale di massa.4. Principio- Ricostituzione del latte scremato in polvere in acqua calda, eliminazione dei grassi e delle proteine con acido tricloroacetico e centrifugazione.- Determinazione della quantità di glicomacropeptidi (GMP) presente nel surnatante mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC).- Valutazione del risultato ottenuto in confronto con campioni di riferimento costituiti da latte scremato in polvere esente o addizionato di una percentuale nota di lattosiero in polvere.5. ReattiviTutti i reattivi devono essere di purezza analitica riconosciuta. L'acqua da impiegare deve essere acqua distillata o acqua di purezza almeno equivalente.5.1. Soluzione di acido tricloroaceticoSciogliere in acqua 240 g di acido tricloroacetico (C13CCOOH) e portare a 1000 ml.5.2. Soluzione eluente a pH 6,0Sciogliere 1,74 g di fosfato dipotassico (K2HPO4), 12,37 g di fosfato monopotassico (KH2PO4) e 21,41 g di solfato di sodio (Na2SO4) in 700 ml d'acqua circa. Se necessario, regolare a pH 6,0 mediante una soluzione di acido fosforico o di idrossido di potassio.Portare a 1000 ml con acqua e miscelare.Prima dell'impiego, filtrare la soluzione eluente su membrana filtrante con pori del diametro di 0,45 μm.5.3. Soluzione di lavaggio e conservazione delle colonneMescolare 1 volume di acetonitrile (CH3CN) con 9 volumi d'acqua. Prima dell'utilizzazione, filtrare la miscela su membrana filtrante con pori del diametro di 0,45 μm.Nota:Può essere impiegata qualsiasi altra soluzione di lavaggio dotata di effetto battericida e tale da non alterare l'efficacia di risoluzione delle colonne.5.4. Campioni di riferimento5.4.1. Latte scremato in polvere rispondente alle esigenze del presente regolamento, indicato in seguito con [0].5.4.2. Lo stesso latte, sofisticato al 5 % (m/m) con lattosiero in polvere di tipo presamico di composizione media, indicato in seguito con [5].6. Apparecchiatura6.1. Bilancia analitica6.2. Centrifuga capace di raggiungere 2200 g e fornita di provette a tappo della capacità di 25 ml circa6.3. Agitatore meccanico6.4. Agitatore magnetico6.5. Imbuti in vetro del diametro di 7 cm circa6.6. Dischi di carta da filtro (porosità media) del diametro di 12,5 cm circa6.7. Dispositivo di filtrazione sotto vuoto in vetro provvisto di membrana filtrante con pori del diametro di 0,45 μm6.8. Pipetta graduata da 10 ml, conforme alla norma ISO 648, classe A, od alla norma ISO/R 8356.9. Bagno ad acqua, termostatato a 25 +- 0,.5 °C6.10. Apparecchiatura HPLC comprendente:6.10.1. pompa;6.10.2. iniettore, manuale od automatico, da 125 a 30 μl di capacità;6.10.3. due colonne in serie TSK 2000 SW (lunghezza 30 cm, diametro interno 0,75 cm) o colonne di pari efficacia ed una precolonna a monte (3 cm x 0,3 cm), caricata con I 125 o con un materiale di pari efficacia;6.10.4. forno a colonna, termostatato a 35 +- 1 °C;6.10.5. rivelatore UV a lunghezza d'onda variabile, capace di effettuare misure a 205 nm con la sensibilità di 0,008 A;6.10.6. integratore capace di integrare da valle a valle.Nota:Si può lavorare mantenendo le colonne a temperatura ambiente, ma il potere di risoluzione risulta leggermente più basso. In questo caso, le variazioni di temperatura nel corso di una stessa serie di analisi devono essere inferiori a +- 5 °C.7. Campionamento7.1. Norma internazionale ISO 707 - Latte e prodotti lattieri - Metodo di campionamento, in conformità alle indicazioni di cui all'ultimo capoverso del punto 2 c) dell'allegato I7.2. Conservare il campione in condizioni tali da non consentire alcuna deteriorazione o modifica di composizione8. Modo di operare8.1. Preparazione del campione per la provaTravasare il latte in polvere in un recipiente di capacità all'incirca doppia del volume della polvere, provvisto di un coperchio impermeabile all'aria. Chiudere immediatamente il recipiente. Mescolare bene il latte capovolgendo più volte il recipiente.8.2. Aliquota da analizzareIn una provetta da centrifuga (6.2) pesare 2,000 g del campione con l'approssimazione di 0,001 g.8.3. Eliminazione dei grassi e delle proteine8.3.1. Aggiungere all'aliquota da analizzare 20,0 g di acqua tiepida (50 °C). Sciogliere la polvere agitando per 5 minuti con l'agitatore (6.3). Portare la temperatura della provetta a 25 °C.8.3.2. Lavorando sotto agitazione magnetica (6.4), aggiungere 10,0 ml della soluzione di acido tricloroacetico (5.1) in 2 minuti. Collocare la provetta nel bagno ad acqua (6.9) e mantenervela per 60 minuti.8.3.3. Centrifugare (6.2) a 2200 g per 10 minuti, oppure: filtrare su carta (6.6), eliminando i primi 5 ml di filtrato.8.4. Determinazione cromatografica8.4.1. Iniettare nell'apparecchio HPL (6.10) da 15 a 30 μl del surnatante o del filtrato (8.3.3), misurati esattamente, mantenendo la velocità di flusso della soluzione eluente (5.2) sul valore di 1,0 ml/minuto.Nota:1. Mantenere la soluzione eluente (5.2) alla temperatura di 85 °C durante tutta l'analisi cromatografica, per mantenere l'eluente esente da gas e prevenire ogni proliferazione batterica. Qualunque precauzione dotata di effetto analogo è accettabile.2. Al momento di ogni interruzione, risciacquare le colonne con acqua. Non lasciarle mai sotto la soluzione eluente (5.2).Prima di ogni interruzione superiore a 24 ore, risciacquare le colonne con acqua, poi lavarle con la soluzione (5.3) per almeno 3 ore, alla velocità di 0,2 ml/minuto.8.4.2. I risultati dell'analisi cromatografica del campione in esame [E] sono ottenuti sotto forma di cromatogramma in cui ogni picco è identificato dal suo tempo di ritenzione RT, vale a dire:>SPAZIO PER TABELLA>La qualità delle colonne può influire sui tempi di ritenzione dei vari picchi.L'integratore (6.10.6) calcola automaticamente la superficie A di ogni picco:>SPAZIO PER TABELLA>Per rilevare le eventuali anomalie dovute a un cattivo funzionamento dell'apparecchiatura o delle colonne, oppure all'origine e alla natura del campione analizzato, è necessario osservare l'aspetto di ogni cromatogramma prima di qualsiasi interpretazione quantitativa.In caso di dubbio, ripetere l'analisi.8.5. Taratura8.5.1. Applicare esattamente ai campioni di riferimento (5.4) il modo di operare descritto dal punto 8.2 al punto 8.4.2.Utilizzare soluzioni preparate di recente, in quanto, in presenza di tricloroacetico all'8 %, i GMP si degradano (alla temperatura di 30 °C, difatti, la loro concentrazione diminuisce dello 0,2 % circa ogni ora).8.5.2. Prima di procedere a qualsiasi determinazione cromatografica sui campioni, condizionare le colonne iniettando ripetutamente la soluzione (8.5.1) del campione di riferimento (5.4.2), finché la superficie e il tempo di ritenzione del picco corrispondente ai GMP risultino costanti.8.5.3. Determinare i coefficienti di risposta R iniettando volumi di filtrati (8.5.1) uguali a quelli utilizzati per i campioni.9. Espressione dei risultati9.1. Metodo di calcolo e formule9.1.1. Calcolo dei coefficienti di risposta R:>SPAZIO PER TABELLA>in cui:RII ed RIV= coefficienti di risposta rispettivamente dei picchi II e IV,AII [0] e AIV [0]= superfici rispettivamente dei picchi II e IV del campione di riferimento [0] ottenute al punto 8.5.3>SPAZIO PER TABELLA>in cui:RIII= coefficiente di risposta del picco III;AIII [0] e AIII [5]= superfici del picco III nei campioni di riferimento [0] e [5] rispettivamente ottenute al punto 8.5.3;W= quantità di lattosiero presente nel campione di riferimento [5], cioè 5.9.1.2. Calcolo della superficie relativa dei picchi del campione [E]:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>di cui:SII [E], SIII [E], SIV [E]= superfici relative, rispettivamente dei picchi II, III e IV del campione [E];AII [E], AIII [E], AIV [E]= superfici rispettivamente dei picchi II, III e IV del campione [E] ottenute al punto 8.4.2;RII, RIII, RIV= coefficienti di risposta calcolati al punto 9.1.1.9.1.3. Calcolo del tempo di ritenzione relativo del picco III del campione [E]:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>in cui:RRTIII [E]= tempo di ritenzione relativo del picco III del campione [E];RTIII[E]= tempo di ritenzione del picco III del campione [E] ottenuto al punto 8.4.2;RTIII [5]= tempo di ritenzione del picco III del campione di riferimento [5] ottenuto al punto 8.5.3.9.1.4. È stata sperimentalmente dimostrata l'esistenza di una relazione lineare fra il tempo di ritenzione relativo del picco III, cioè RRTIII [E], e la percentuale di lattosiero in polvere aggiunto fino al 10 %:- per un contenuto  &gt; 5 %, è RRTIII [E] &lt;  1,000;- per un contenuto &lt;= 5 %, è RRTIII [E] &gt;= 1,000.L'incertezza ammessa per i valori di RRTIII, è di +- 0,002.Normalmente, il valore di RRTIII [0] è poco diverso da 1,034. Secondo lo stato delle colonne, esso può accostarsi a 1,000, restando tuttavia sempre superiore.9.2. Calcolo della percentuale di lattosiero presamico in polvere contenuto nel campione:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dove:W= percentuale m/m di lattosiero presamico contenuto nel campione [E];SIII [E]= superficie relativa del picco III del campione da analizzare [E] ottenuto al punto 9.1.2;1,3= superficie relativa media del picco III, espressa in g di lattosiero per 100 kg di prodotto determinata in campioni di latte scremato in polvere non adulterato di origine diversa. Questa cifra è stata ottenuta sperimentalmente;SIII [0]= superficie relativa del picco III, che è uguale a RIII x AIII [0]. Tali valori sono ottenuti rispettivamente ai punti 9.1.1 e 8.5.3;SIII [0] - 0,9)= correzione da apportare alla superficie relativa media 1,3 quando il valore SIII [0] è diverso da 0,9. Sperimentalmente, la superficie relativa media del picco III del campione di riferimento [0] è di 0,9.9.3. Precisione del metodo9.3.1. RipetibilitàLa differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate simultaneamente o a breve distanza di tempo dallo stesso analista, impiegando la stessa apparecchiatura e sulla stessa aliquota di campione, non deve superare lo 0,2 % m/m.9.3.2. RiproducibilitàLa differenza tra due risultati individuali ed indipendenti ottenuti in due laboratori diversi sulla stessa aliquota di campione, non deve superare lo 0,4 % m/m.9.4. Interpretazione9.4.1. È possibile concludere per l'assenza di lattosiero se la superficie relativa del picco III, SIII [E], espressa in g di lattosiero presamico per 100 g di prodotto, è &lt;= a>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>,in cui:>SPAZIO PER TABELLA>9.4.2. Se la superficie relativa del picco III, SIII [E] è &gt;>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>e la superficie relativa del picco II, SII [E] è &lt;= 160, determinare il tenore di lattosiero presamico presente nel modo indicato al punto 9.2.9.4.3. Se la superficie relativa del picco III, SIII [E] è  &gt; di>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>e la superficie relativa del picco II, SII [E], è  &gt; 160, determinare il tenore di proteine totale (P %); in seguito esaminare i grafici 1 e 2.9.4.3.1. I dati ottenuti dall'analisi di campioni di latte scremato in polvere non alterato che presentano un tenore elevato di proteine totale sono riportati nei grafici 1 e 2.La retta continua rappresenta la retta di regressione lineare i cui coefficienti sono calcolati con il metodo dei minimi quadrati.La retta tratteggiata indica il limite superiore della superficie relativa del picco III, con una probabilità del 90 % di non essere superata.Le equazioni delle rette tratteggiate dei grafici 1 e 2 sono, rispettivamente, uguali a:>SPAZIO PER TABELLA>in cui:>SPAZIO PER TABELLA>Queste equazioni son equivalenti a 1,3, valore menzionato al punto 9.2.Lo scarto (T1 e T2) tra la superficie relativa SIII [E] osservata e la superficie relativa SIII si ricava dalle seguenti relazioni:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>9.4.3.2.>SPAZIO PER TABELLA>Il tenore di lattosiero presente è calcolato utilizzando la formula seguente:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>in cui:0,91 rappresenta lo scarto sull'asse verticale tra la retta continua e la retta tratteggiata.>PIC FILE= "L_2001037IT.006801.EPS">ALLEGATO XIX(Articolo 13)DETERMINAZIONE DEL LATTOSIERO PRESAMICO IN POLVERE NEL LATTE SCREMATO IN POLVERE E NELLE MISCELE DI CUI AL REGOLAMENTO (CE) N. 2799/19991. Obiettivo: ricerca dell'aggiunta di siero di latte presamico in polvere:a) Latte scremato in polvere come definito all'articolo 2 del regolamento (CE) n. 2799/1999 eb) Le miscele di cui all'articolo 4 del regolamento (CE) n. 2799/19992. Riferimenti: norma internazionale ISO 7073. DefinizioneIl contenuto di siero di latte presamico in polvere è espresso come percentuale di massa determinato secondo il metodo in appresso descritto.4. PrincipioDeterminazione della quantità di glicomacropeptide A conformemente all'allegato XVIII. I campioni che danno risultati positivi sono analizzati ai fini della ricerca del glicomacropeptide A (GMPA) mediante il metodo per cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) in fase inversa. Valutazione del risultato ottenuto in confronto con campioni di riferimento costituiti da latte scremato in polvere esente o addizionato di una percentuale nota di siero di latte in polvere. I risultati superiori all'1 % (p/p) mostrano la presenza di polvere di siero di latte presamico.5. ReagentiTutti i reagenti devono essere di purezza analitica riconosciuta. L'acqua da impiegare deve essere acqua distillata o acqua di purezza almeno equivalente. L'acetonitrile dovrebbe essere di qualità spettroscopica o HPLC.I reagenti necessari per il metodo sono descritti nell'allegato XVIII del presente regolamento.Reagenti per HPLC in fase inversa.5.1. Soluzione di acido tricoloraceticoSciogliere in acqua 240 g di acido tricloroacetico (CCI3CCOOH) e portare a 1000 ml.5.2. Eluente A e BEluente A: 150 ml di acetonitrile (CH3CN), 20 ml di isopropanolo (CH3CHOHCH3) e 1,00 ml di acido trifluoroacetico (TFA, CF3COOH) sono portati a 1000 ml con acqua. Eluente B: 550 ml di acetonitrile, 20 ml di isopropanolo e 1,00 ml di TFA sono portati a 1000 ml con acqua. Filtrare la soluzione eluente prima dell'impiego, su membrana filtrante con pori del diametro di 0,45 micron (μ,m).5.3. Conservazione della colonnaDopo le analisi la colonna viene lavata con l'eluente B (con gradiente) e successivamente con acetonitrile (con gradiente in 30 minuti). La colonna è conservata in acetonitrile.5.4. Campioni di riferimento5.4.1. Latte scremato in polvere rispondente ai requisiti previsti per l'ammasso pubblico, indicato in appresso con (0).5.4.2. Lo stesso latte, sofisticato al 5 % (p/p) con siero di latte in polvere di tipo presamico di composizione media, indicato in appresso con (5).5.4.3. Lo stesso latte sofisticato al 50 % (p/p) con siero di latte in polvere di tipo presamico di composizione media, indicato in appresso con [50](1).6. ApparecchiaturaL'apparecchiatura necessaria per il metodo descritto è specificata nell'allegato XVIII del presente regolamento.6.1.1. Bilancia analitica6.2. Centrifuga capace di raggiungere 2200 g giri e fornita di provette a tappo della capacità di 50 ml circa6.3. Agitatore meccanico in grado di funzionare a 50 °C6.4. Agitatore magnetico6.5. Imbuti in vetro del diametro di 7 cm circa6.6. Dischi di carta da filtro (porosità media) del diametro di 12,5 cm circa6.7. Dispositivo di filtrazione in vetro provvisto di membrana filtrante con pori del diametro di 0,45 micron6.8. Pipette graduate capaci di erogare 10 ml (norma ISO 648, classe A o ISO/R 835) oppure un sistema capace di erogare 10,0 ml in due minuti6.9. Bagnomaria, termostatato a 25 +- 0,5 °C6.10. Apparecchiatura HPLC comprendente:6.10.1. Sistema di pompaggio a gradiente binario6.10.2. Iniettore manuale o automatico da 100 μl di capacità6.10.3. Colonna Dupont Protein Plus (25 x 0,46 cm I. D.) o una colonna equivalente per fase inversa a base di silice a pori larghi.6.10.4. Forno a colonna, termostatato a 35 +- 1 °C6.10.5. Rilevatore UV a lunghezza d'onda variabile, capace di effettuare misure fino a 210 nm (se necessario si può utilizzare una lunghezza d'onda superiore, fino a 220 nm), con la sensibilità di 0,02 Å6.10.6. Integratore capace di misurare l'altezza dei picchiNota:È possibile far funzionare la colonna a temperatura ambiente purché tale temperatura non abbia fluttuazioni superiori ad 1 °C, altrimenti il tempo di ritenzione del GMPÅ sarebbe soggetto a variazioni troppo grandi.7. Campionamento7.1. Il prelievo dei campioni si effettua in base alla procedura prevista dalla norma internazionale ISO 707. Gli Stati membri possono tuttavia impiegare un altro metodo di campionamento purché esso sia conforme a principi della succitata norma.7.2. Conservare il campione in condizioni tali da non consentire alcuna deteriorazione o modifica di composizione.8. Modo di operare8.1. Preparazione delle aliquote da analizzareTravasare la polvere in un recipiente di capacità all'incirca doppia del volume della polvere, provvisto di un coperchio impermeabile all'aria. Chiudere immediatamente il recipiente. Mescolare bene il latte in polvere capovolgendo più volte il recipiente.8.2. Aliquota da analizzareIn una provetta da centrifuga o in una bottiglia chiusa idonea (50 ml) pesare 2,00 g del campione con l'approssimazione di 0,001 g.8.3. Eliminazione dei grassi e delle proteine8.3.1. Aggiungere all'aliquota da analizzare 20,0 g di acqua calda (50 °C). Sciogliere la polvere agitando per 5 minuti, o per 30 minuti nel caso di latticello acido, con l'agitatore meccanico (punto 6.3). Mettere la provetta a bagnomaria (punto 6.9) fino a raggiungere i 25 °C.8.3.2. Aggiungere 10,0 ml di soluzione di acido tricloroacetico a 25 °C senza interruzione per 2 minuti (punto 5.1 ), agitando vigorosamente con l'agitatore magnetico (pnto 6.4). Collocare la provetta nel bagno ad acqua (punto 6.9) e mantenervela per 60 minuti.8.3.3. Centrifugare a 2200 g giri per 10 minuti (punto 6.2) oppure filtrare su carta (punto 6.6), eliminando i primi 5 ml di filtrato.8.4. Determinazione cromatografica8.4.1. Eseguire l'analisi HPLC come descritto nell'allegato XVIII. Se si ottiene un risultato negativo il campione analizzato non contiene polvere di siero di latte presamico in quantità rilevabili. In caso di risultato positivo si deve applicare il metodo HPLC in fase inversa descritto in appresso. La presenza di polvere di latticello acido può dare origine a risultati falsamente positivi. Il metodo HPLC in fase inversa esclude questa possibilità.8.4.2. Prima di eseguire l'analisi HPLC in fase inversa andranno ottimizzate le condizioni del gradiente. Un tempo di ritenzione di 26 minuti t 2 minuti per il GMP è ottimale per i sistemi a gradiente con un volume morto di circa 6 ml (volume dal punto in cui i solventi confluiscono sino al volume del circuito dell'iniettore, compreso). Per i sistemi a gradiente con un volume morto inferiore (ad esempio 2 ml) si deve utilizzare come tempo ottimale di ritenzione un tempo di 22 minuti.Prendere soluzioni dei campioni di riferimento (5.4) con e senza lattosiero presamico al 50 %.Iniettare 100 μl del surnatante o del filtrato (8.3.3) nell'apparecchiatura HPLC operante alle condizioni di gradiente di esplorazione date nella tabella 1.Tabella 1Condizioni del gradiente di esplorazione per l'ottimizzazione della cromatografia>SPAZIO PER TABELLA>Confrontando i due cromatogrammi si dovrebbe individuare il picco del GMPA.Utilizzando la formula che segue si può calcolare la composizione del solvente iniziale da utilizzare per il gradiente normale (secondo 8.4.3):>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>In cui:RTgmpA: tempo di ritenzione del GMPA nel gradiente di esplorazione.10: la % B iniziale del gradiente di esplorazione.2,5: la % B al punto intermedio meno la % B al punto iniziale nel gradiente normale.13,5: tempo del punto intermedio del gradiente di esplorazione.26: tempo di ritenzione necessario del GMPA.6: rapporto dei coefficienti di direzione del gradiente di esplorazione e del gradiente normale.30: la % B al punto iniziale meno la % B a 27 minuti nel gradiente di esplorazione.27: tempo di operazione del gradiente di esplorazione.8.4.3. Prendere soluzioni dei campioni per la provaIniettare nell'apparecchio HPLC 100 μl del surnatante o del filtrato (8.3.3) misurati esattamente, mantenendo la velocità di flusso della soluzione eluente (5.2) sul valore di 1,0 ml/minuto.La composizione dell'eluente all'inizio dell'analisi si ottiene da 8.4.2. Normalmente essa è prossima ad A: B = 76: 24 (5.2). Subito dopo l'iniezione viene avviato un gradiente lineare che dopo 27 minuti porta ad una percentuale di B maggiore del 5 %. Successivamente viene avviato un gradiente lineare che in 5 minuti, porta la composizione dell'eluente a 90 % B. Questa composizione viene mantenuta per 5 minuti, dopo di che con un gradiente lineare la composizione cambia e torna in 5 minuti a quella iniziale. Sulla base del volume interno del sistema di pompaggio l'iniezione successiva può essere effettuata 15 minuti dopo aver raggiunto le condizioni iniziali.Osservazioni1. Il tempo di ritenzione del glicomacropeptide deve essere di 26 minuti +- 2 minuti. Esso può essere ottenuto variando le condizioni iniziali e finali del primo gradiente. Tuttavia la differenza nella % B per quanto riguarda le condizioni iniziali e finali del primo gradiente deve rimanere del 5 % B.2. Gli eluenti devono essere adeguatamente degassati e restalio. Ciò è essenziale per il corretto funzionamento del sistema di pompaggio del gradiente. La deviazione standard per il tempo di ritenzione del picco GMP deve essere inferiore a 0,1 minuto (n = 10).3. Ogni 5 campioni è necessario iniettare il campione di riferimento [5] da utilizzare per calcolare un nuovo fattore di risposta R (9.1.1).8.4.4. I risultati dell'analisi cromatografica del campione per la prova [E] sono ottenuti sotto forma di un cromatogramma in cui il picco GMP è identificato dal suo tempo di ritenzione che è di circa 26 minuti.L'integratore (6.10.6) calcola automaticamente l'altezza di picco H del picco GMP. In ogni cromatogramma si deve controllare la posizione della linea di base. Se la linea di base non è stata correttamente localizzata occorre ripetere l'analisi o l'integrazione.Prima di procedere all'interpretazione quantitativa è necessario esaminare l'aspetto di ciascun cromatogramma al fine di individuare anomalie dovute al cattivo funzionamento dell'apparecchio o della colonna, oppure all'origine e alla natura del campione analizzato. In caso di dubbio, ripetere l'analisi.8.5. Taratura8.5.1. Applicare esattamente ai campioni di riferimento (5.4.1-5.4.2) il modo di operare descritto dal punto 8.2 al punto 8.4.4. Utilizzare soluzioni preparate di recente, in quanto a temperatura ambiente in ambiente tricloroacetico all'8 % il GMP si degrada. A 4 °C la soluzione rimane stabile per 24 ore. Nel caso si debba procedere a lunghe serie di analisi è opportuno l'impiego nell'iniettore automatico di una vaschetta raffreddata per il campione.Nota8.4.2 può essere omesso se la % B alle condizioni iniziali è nota da analisi precedenti.Il cromatogramma del campione di riferimento [5] dovrebbe essere analogo alla figura 1. In questa figura il picco GMPA è preceduto da due piccoli picchi. È essenziale ottenere una separazione analoga.8.5.2. Prima di procedere alla determinazione cromatografica dei campioni iniettare 100 μl del campione di riferimento senza lattosiero presamico [0] (5.4.1).Nel cromatogramma non si deve vedere un picco al tempo di ritenzione del picco GMPA.8.5.3. Determinare i coefficienti di risposta R iniettando un volume di filtrato (8.5.1) pari a quello utilizzato per i campioni.9. Espressione dei risultati9.1. Metodo di calcolo e formule9.1.1. Calcolo del coefficiente di risposta R:Picco GMP: R = W/HIn cuiR= coefficiente di risposta del picco GMPH= altezza del picco GMPW= quantità di lattosiero presente nel campione di riferimento [5].9.2. Calcolo della percentuale di lattosiero presamico in polvere contenuto nel campione:W[E] = R x H[E]In cuiW[E]= percentuale (mm) di lattosiero presamico contenuto nel campione [E]R= coefficiente di risposta del picco GMP (9.1.1).H[E]= altezza del picco GMP del campione [E].Se W[E] è maggiore dell'1 % e la differenza fra il tempo di ritenzione del campione di riferimento [5] è inferiore a 0,2 minuti, è presente lattosiero presamico in polvere.9.3. Precisione del metodo9.3.1. RipetibilitàLa differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate simultaneamente o a breve distanza di tempo dallo stesso analista, impiegando la stessa apparecchiatura e sulla stessa aliquota di campione non deve superare lo 0,2 % p/p.9.3.2. RiproducibilitàNon ancora determinata.9.3.3. LinearitàDallo 0 al 16 % di lattosiero presamico si deve ottenere una relazione lineare con un coefficiente di correlazione  &gt; 0,99.9.4. Interpretazione9.4.1. Si considera che ci sia presenza di siero se il risultato ottenuto al punto 9.2 è superiore ad 1 % p/p e il tempo di ritenzione del picco GMP differisce di meno di 0,2 minuti da quello del campione di riferimento [5]. Il limite dell'1 % è fissato conformemente alle disposizioni del regolamento (CEE) n. 625/78, allegato V, punti 9.2 e 9.4.1.>PIC FILE= "L_2001037IT.007301.EPS">(1) Il lattosiero presamico in polvere di composizione standard e il latte scremato in polvere adulterato possono essere ottenuti presso NIZO, Kernhemseweg 2, PO Box 20, NL-6710 BA. Possono tuttavia essere ugualmente utilizzate polveri che diano risultati equivalenti a quelli delle polveri NIZO.ALLEGATO XX(Articolo 14)LATTE SCREMATO IN POLVERE: DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI FOSFATIDILSERINA E FOSFATIDILETANOLAMINAMetodo HPLC a fase inversa1. Oggetto e campo d'applicazioneIl metodo descrive una procedura per la determinazione quantitativa della fosfatidilserina (PS) e della fosfatidiletanolamina (PE) nel latte scremato in polvere (LSP) ed è adatto per rivelare particelle solide di latticello nel LSP.2. DefinizioneContenuto di PS + PE: la frazione in massa di sostanza determinata utilizzando la procedura qui specificata. Il risultato è espresso in milligrammi di dipalmitoilfosfatidiletanolamina (PEDP) per 100 g di polvere.3. PrincipioEstrazione degli amminofosfolipidi mediante metanolo da latte in polvere ricostituito. Determinazione di PS e PE come derivati della dialdeide o-ftalica (OPA) mediante HPLC a fase inversa (RP) e rivelazione per fluorescenza. Quantificazione del contenuto di PS e PE nel campione d'analisi per riferimento ad un campione standard contenente una quantità nota di PEDP.4. ReagentiTutti i reagenti devono essere di purezza analitica riconosciuta. L'acqua deve essere distillata o di purezza almeno equivalente, salvo diversamente specificato.4.1. Materiale standard: PEDP, purezza 99 % minimoNota:il materiale standard deve essere conservato a -18 °C.4.2. Reagenti per le preparazioni del campione standard e del campione d'analisi4.2.1. Metanolo per HPLC.4.2.2. Cloroformio per HPLC.4.2.3. Triptamina monocloridrato.4.3. Reagenti per la derivatizzazione con dialdeide o-ftalica4.3.1. Idrossido di sodio, soluzione acquosa 12M.4.3.2. Acido borico, soluzione acquosa 0,4M regolata a pH 10,0 con idrossido di sodio (4.3.1).4.3.3. 2-mercaptoetanolo.4.3.4. Dialdeide o-ftalica (OPA).4.4. Solventi per l'eluizione HPLCI solventi di eluizione devono essere preparati utilizzando reagenti per HPLC.4.4.1. Acqua per HPLC.4.4.2. Metanolo di purezza fluorimetrica controllata.4.4.3. Tetraidrofurano.4.4.4. Diidrogenofosfato di sodio.4.4.5. Acetato di sodio.4.4.6. Acido acetico.5. Apparecchiatura5.1. Bilancia analitica5.2. Becher da 25 e 100 ml5.3. Pipette da 1 e 10 ml5.4. Agitatore magnetico5.5. Pipette graduate da 0,2, 0,5 e 5 ml5.6. Matracci tarati da 10, 50 e 100 ml5.7. Siringhe da 20 e 100 μl5.8. Bagno ad ultrasuoni5.9. Centrifuga a 27000 x g5.10. Flaconi di vetro della capacità di circa 5 ml5.11. Cilindro graduato da 25 ml5.12. pH-metro5.13. Apparecchiatura HPLC5.13.1. Sistema di pompaggio a gradiente in grado di funzionare a 1,0 ml/min a 200 bar5.13.2. Autocampionatore con possibilità di derivatizzazione5.13.3. Riscaldatore colonna regolato su 30 °C5.13.4. Rivelatore a fluorescenza regolato alla lunghezza d'onda di eccitazione di 300 nm e alla lunghezza d'onda di emissione di 440 nm5.13.5. Integratore o software di elaborazione dati in grado di misurare l'area dei picchi5.13.6. Una colonna lichrosphere -100 (250 x 4,6 mm) o una colonna equivalente riempita con ottadecilsilano (C 18), granulometria 5 μm.6. CampionamentoIl campionamento deve essere eseguito secondo la norma IDF 50B-1985.7. Modo di operare7.1. Preparazione della soluzione dello standard internoPesare 30,0 +- 0,1 mg di triptamina monocloridrato (4.2.3) in un matraccio tarato da 100 ml (5.6) e portare alla tacca con metanolo (4.2.1). Pipettare 1 ml (5.3) di questa soluzione in un matraccio tarato da 10 ml (5.6) e integrare alla tacca con metanolo (4.2.1) in modo da ottenere una concentrazione di triptamina pari a 0,15 mM.7.2. Preparazione della soluzione campione d'analisiPesare 1000 +- 0,001 g del campione di LSP in un becher da 25 ml (5.2). Aggiungere 10 ml di acqua distillata a 40 °C mediante una pipetta (5.3) e agitare con l'agitatore magnetico (5.4) per 30 minuti per sciogliere eventuali grumi. Pipettare 0,2 ml (5.5) del latte ricostituito in un matraccio tarato da 10 ml (5.6), aggiungere 100 μl della soluzione di triptamina 0,15 mM (7.1) con una siringa (5.7) e portare a volume con metanolo (4.2.1). Miscelare accuratamente capovolgendo il matraccio e sottoponendolo a bagno ultrasonico (5.8) per 15 minuti. Centrifugare (5.9) a 27000 x g per 10 minuti e raccogliere il surnatante in un flacone di vetro (5.10).Nota:La soluzione del campione d'analisi deve essere conservata a 4 °C fino al momento dell'esecuzione dell'analisi HPLC.7.3. Preparazione della soluzione dello standard esternoPesare 55,4 mg di PEDP (4.1) in un matraccio tarato da 50 ml (5.6) e aggiungere circa 25 ml di cloroformio (4.2.2) mediante un cilindro graduato (5.11). Riscaldare il matraccio tappato a 50 ° e miscelare accuratamente fino a quando il PEDP si scioglie. Raffreddare il matraccio a 20 °C, portare a volume con metanolo (4.2.1) e miscelare capovolgendolo. Pipettare 1 ml (5.3) di questa soluzione in un matraccio tarato da 100 ml (5.6) e portare a volume con metanolo (4.2.1). Pipettare 1 ml (5.3) di questa soluzione in un matraccio tarato da 10 ml (5.6), aggiungere 100 μl (5.7) di soluzione di triptamina 0,15 mM (7.1) e portare a volume con metanolo (4.2.1). Miscelare mediante capovolgimento.Nota:La soluzione del campione di riferimento deve essere conservata a 4 °C fino al momento dell'esecuzione dell'analisi HPLC.7.4. Preparazione del reagente di derivatizzazionePesare 25,0 +- 0,1 mg di OPA (4.3.4) in un matraccio tarato da 10 ml (5.6), aggiungere 0,5 ml (5.5) di metanolo (4.2.1) e miscelare accuratamente per sciogliere l'OPA. Portare alla tacca con soluzione di acido borico (4.3.2) e aggiungere 20 μl di 2-mercaptoetanolo (4.3.3) mediante una siringa (5.7).Nota:Il reagente di derivatizzazione deve essere conservato a 4 °C in un flacone scuro; in tal modo rimane stabile per una settimana.7.5. Determinazione HPLC7.5.1. Solventi di eluizione (4.4)Solvente A:soluzione di diidrogenofosfato di sodio 0,3 mM e di acetato di sodio 3 mM (regolata a pH 6,5 con acido acetico): metanolo: tetraidrofurano = 558: 440: 2 (v/v/v).Solvente B:metanolo7.5.2. Gradiente di eluizione consigliato:>SPAZIO PER TABELLA>Nota:Il gradiente di eluizione può richiedere leggere modifiche per ottenere la risoluzione mostrata in figura 1.Temperatura della colonna: 30 °C7.5.3. Volume di iniezione: 50 μl di reagente di derivatizzazione e 50 μl di soluzione campione.7.5.4. Equilibratura della colonnaTutti i giorni, all'avviamento del sistema flussare la colonna con solvente B al 100 % per 15 minuti, regolarla poi su A: B = 40: 60 ed equilibrarla a 1 ml/min per 15 minuti. Eseguire una prova in bianco iniettando metanolo (4.2.1).Nota:Se si prevede di non usare la colonna per un tempo prolungato, flussarla con metanolo: cloroformio = 80: 20 (v/v) per 30 minuti.7.5.5. Determinazione del contenuto di PS + PE nel campione d'analisi7.5.6. Eseguire la sequenza delle analisi cromatografiche mantenendo costante il tempo da una prova all'altra allo scopo di ottenere tempi di ritenzione costanti. Iniettare la soluzione dello standard esterno (7.3) ogni 5-10 soluzioni del campione d'analisi per valutare il fattore di risposta.Nota:La colonna deve essere pulita mediante flussaggio con solvente B al 100 % (7.5.1) per almeno 30 minuti ogni 20-25 prove.7.6. Modalità di integrazione7.6.1. Picco PEDPIl PEDP viene eluito come picco singolo. Determinare l'area del picco mediante integrazione da valle a valle.7.6.2. Picco della triptaminaLa triptamina viene eluita come picco singolo (figura 1). Determinare l'area del picco mediante integrazione da valle a valle.7.6.3. Gruppo dei picchi PS e PENelle condizioni descritte (figura 1), la PS eluisce nella forma di due picchi principali parzialmente non risolti preceduti da un picco minore, la PE eluisce nella forma di tre picchi principali parzialmente non risolti. Determinare l'area totale di ciascun gruppo di picchi fissando la linea di base come indicato nella figura 1.8. Calcolo ed espressione dei risultatiCalcolare il contenuto di PS e PE nel campione d'analisi con la formula seguente:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dove:C= contenuto di PS o PE (mg/100 g di polvere) nel campione d'analisi;A1= area del picco della PEDP della soluzione campione standard (7.3);A2= area del picco PS o PE della soluzione campione d'analisi (7.2);T1= area del picco della triptamina della soluzione campione standard (7.3);T2= area del picco della triptamina della soluzione campione d'analisi (7.2).9. PrecisioneNota:I valori della ripetibilità sono stati calcolati secondo la norma internazionale IDF(1). Il limite provvisorio di riproducibilità è stato calcolato in base all'allegato III, punto b.9.1. RipetibilitàLa deviazione standard relativa della ripetibilità (che esprime la variabilità di risultati analitici indipendenti ottenuti dallo stesso operatore utilizzando la stessa apparecchiatura nelle stesse condizioni sullo stesso campione d'analisi e a breve distanza di tempo) non deve superare il 2 %. La differenza relativa tra i risultati di due determinazioni ottenute in queste condizioni non deve essere superiore al 6 % della media aritmetica dei risultati.9.2. RiproducibilitàLa differenza relativa tra i risultati di due determinazioni ottenute da operatori di differenti laboratori utilizzando apparecchiature differenti in differenti condizioni per l'analisi dello stesso campione non deve essere maggiore dell'11 % della media aritmetica dei risultati.10. Note bibliografiche10.1. Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids. Sci. ecn. Latt.-Cas., 39, 395 (1988).Figura 1: Diagramma HPLC di derivati OPA della fosfatidilserina (PS) e della fosfatidiletanolammina (PE) in estratto metanolico di latte scremato in polvere ricostituito. È riportato il modo di integrazione dei picchi di PS, PE e triptamina (standard interno).>PIC FILE= "L_2001037IT.007801.EPS">(1) International IDF Standard 135B/1991. Milk and milk products. Precision characteristics of analytical methods. Outline of collaborative study procedure.ALLEGATO XXI(Articolo 15)RIVELAZIONE DI RESIDUI DI ANTIBIOTICO E SOLFONAMMIDE/DAPSON NEL LATTE SCREMATO IN POLVEREEffettuare un test di ricerca degli inibitori microbici impiegante, come microorganismo di prova, il Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953 e sufficientemente sensibile per rivelare 4 μg di benzilpenicillina per litro di latte e 100 μg di sulfadimidina per litro di latte. In commercio esistono apparecchiature complete d'analisi utilizzabili, purché abbiano la sensibilità richiesta per benzilpenicillina e sulfadimidina(1).Per l'analisi usare latte in polvere scremato ricostituito (1 g di polvere + 9 ml di acqua distillata). Procedere come descritto nel bollettino IDF N. 258/1991, sezione 1, capitolo 2, o secondo le istruzioni del fabbricante dell'apparecchiatura d'analisi.I risultati positivi devono essere interpretati come segue:1) Ripetere la prova aggiungendo penicillinasi al sistema d'analisi:Risultato positivo: La sostanza inibitrice non può venire identificata mediante questa procedura.Risultato negativo: La sostanza inibitrice è un antibiotico β-lattamico.2) Ripetere la prova aggiungendo acido p-amminobenzoico al sistema d'analisi:Risultato positivo: La sostanza inibitrice non può venire identificata mediante questa procedura.Risultato negativo: La sostanza inibitrice è una solfonammide/dapson.3) Ripetere la prova aggiungendo penicillinasi + acido p-amminobenzoico al sistema d'analisi:Risultato positivo: La sostanza inibitrice non può venire identificata mediante questa procedura.Risultato negativo: Le sostanze inibitrici sono un antibiotico β-lattamico e una solfonammide/dapson.(1) Nota importante:Nell'analisi di latte in polvere scremato si possono ottenere risultati falsi-positivi. È pertanto importante verificare che il sistema di analisi non dia risultati falsi-positivi.ALLEGATO XXII(Articolo 16)DETERMINAZIONE DELLA QUANTITÀ DI LATTE SCREMATO IN POLVERE PRESENTE NEGLI ALIMENTI COMPOSTI PER ANIMALI PER COAGULAZIONE ENZIMATICA DELLA PARACASEINA1. OggettoDeterminazione della quantità di latte scremato in polvere presente in un alimento composto per animali, per coagulazione enzimatica della paracaseina.2. Campo di applicazioneIl presente metodo si applica agli alimenti composti per animali contenenti almeno il 50 % di latte scremato in polvere; la presenza di quantità notevoli di latticello e/o di talune proteine non lattee può provocare interferenze.3. Principio del metodo3.1. Solubilizzazione della caseina contenuta nell'alimento composto per animali, per estrazione con una soluzione di citrato di sodio.3.2. Ripristino della concentrazione di ioni calcio necessaria per la precipitazione della paracaseina; trasformazione della caseina in paracaseina attraverso l'azione del caglio.3.3. Determinazione dell'azoto della paracaseina dopo mineralizzazione secondo il metodo Kjeldahl, come descritto nell'IDF 20 A 1986; calcolo delle quantità di latte scremato in polvere presente, sulla base di un contenuto minimo di caseina del 27,5 % (vedi 9.1).4. ReattiviI reattivi impiegati sono di purezza analitica. L'acqua deve essere distillata o avere purezza equivalente. Ad eccezione del caglio (4.5) tutti i reattivi e le soluzioni impiegate devono essere esenti da sostanze azotate.4.1. Citrato trisodico con 2 molecole d'acqua di idratazione (soluzione all'1 % p/v).4.2. Cloruro di calcio [soluzione 2)M]. Pesare 20,018 g di CaCO2 (grado analitico) in una capsula di porcellana di dimensioni adeguate (150-200 ml) o in un becher. Coprire con acqua distillata e trasferire su bagnomaria bollente. Aggiungere lentamente 50-60 ml di una soluzione di HCl (HCl conc.: acqua = 1: 1) per solubilizzare completamente il carbonato. Mantenere su bagnomaria bollente fino all'essiccazione del CaCl2 al fine di eliminare l'HCl che non ha reagito. Trasferire con acqua distillata in un matraccio graduato da 100 ml e portare a volume. Controllare il pH, che non deve essere inferiore a 4,0. Conservare la soluzione di frigorifero.4.3. Idrossido di sodio 0,1 N.4.4. Acido cloridrico 0,1 N.4.5. Soluzione di caglio standardizzata all'1:10000 (estratto da pellette di vitello); conservare in frigorifero a 4-6 °C.4.6. Reattivi per il dosaggio dell'azoto secondo il metodo Kjeldahl, come descritto nell'IDF 20 A 1986.5. ApparecchiatureMateriale corrente di laboratorio, ed in particolare:5.1. Mortaio o mulino omogeneizzatore5.2. Bilancia analitica5.3. Centrifuga da tavolo (2000-3000 rpm) e relative provette da 50 ml5.4. Agitatore magnetico con sbarrette da 10-15 mm.5.5. Becherks da 150-200 ml5.6. Matracci da 250 ml e 500 ml5.7. Imbuti in vetro, del diametro di 60-80 mm5.8. Filtri circolari senza ceneri, per filtrazione rapida, del diametro di 150 mm (SS. 5892, S.S. 595 1/2)5.9. Pipette di varie misure5.10. Bagnomaria termostato a 37 °C5.11. pH-metro5.12. Apparecchio di mineralizzazione e distillazione secondo il metodo Kjeldhal con relativi accessori5.13. Buretta graduata da 25 ml per la titolazione5.14. Spruzzetta in plastica per acqua distillata5.15. Spatole in acciaio inossidabile5.16. Termometro5.17. Stufa a temperatura regolabile6. Procedimento analitico6.1. Preparazione del campione.10-20 g del campione vengono triturati in mortaio o miscelati nell'omogeneizzatore-miscelatore in modo da ottenere una miscela omogenea.6.2. Solubilizzazione della polvere di latte e separazione del residuo insolubile.6.2.1. Pesare 1,000 +- 0,002 di alimento composto per gli animali ben omogeneizzato (6.1) direttamente in una provetta da centrifuga da 50 ml. Aggiungere 30 ml di soluzione di citrato trisodico (4.1) riscaldata in precedenza a 45 °C. Disperdere la polvere sottoponendo ad agitazione magnetica per almeno 5 minuti.6.2.2. Centrifugare a 500 g (2000-3000 rpm) per 10 minuti e raccogliere il surnatante acquoso in un becher da 150-200 ml. Evitare la perdita di patticelle insolubili durante il trasferimento del surnatante.6.2.3. Procedere a due altre estrazioni sul residuo, operando allo stesso modo e mescolando i tre estratti acquosi.6.2.4. Qualora dovesse verificarsi una separazione della sostanza grassa, raffreddare fino a solidificazione della fase grassa, che verrà poi esportata mediante una spatola.6.3. Coagulazione della caseina con gli enzimi del caglio.6.3.1. All'estratto acquoso totale (circa 100 ml) aggiungere, goccia a goccia e sotto agitazione, 3,4 ml di una soluzione satura di cloruro di calcio (4.2). Regolare il pH su 6,4-6,5 con soluzioni diluite di NaOH (4.3) o HCl (4.4). Porre la soluzione in bagno termostatato a 37 °C per 15-20 minuti, per consentire la creazione dell'equilibrio salino. Questo si manifesta con la comparsa di un aspetto lattescente.6.3.2. Trasferire il liquido in una o due provette da centrifuga e centrifugare a 2000 g per 10 minuti per eliminare il precipitato. Trasferire il surnatante, senza lavare il sedimento, in una o due provette da centrifuga.6.3.3. Riportate la temperatura del surnatante a 37 °C. Aggiungere goccia a goccia all'estratto agitando 0,5 ml di caglio liquido (4.5). La coagulazione si verifica in 1-2 minuti.6.3.4. Riportare il campione nel bagnomaria e lasciarlo alla temperatura di 37 °C per 15 minuti. Togliere il campione dal bagnomaria e rompere il coagulo agitando. Centrifugare a 2000 g per 10 minuti. Filtrare il surnatante con una carta da filtro adatta(1), Whatman n. 541 o equivalente, e conservare la carta da filtro. Lavare il precipitato nella provetta da centrifuga con 50 ml di acqua a circa 35 °C mescolando il precipitato.Centrifugare nuovamente a 2000 g per 10 minuti. Filtrare il surnatante attraverso la carta da filtro conservata in precedenza.6.4. Determinazione dell'azoto caseinico.6.4.1. Dopo il lavaggio, trasferire quantitativamente il precipitato sulla carta da filtro utilizzata per il procedimento di cui al punto 6.3.4 usando acqua distillata. Trasferire la carta da filtro nel pallone Kjeldahl e procedere al dosaggio dell'azoto secondo il metodo Kjeldahl come descritto nell'IDF 20 A 1986.7. Prova in bianco7.1. Effettuare sistematicamente una prova in bianco utilizzando un filtro senza ceneri (5.8), umettato con una miscela contenente 90 ml di soluzione di citrato di sodio (4.1), 1 ml di una soluzione satura di cloruro di calcio (4.2), 0,5 ml di caglio liquido (4.5) e lavato con 3 x 15 ml d'acqua prima di essere mineralizzato secondo il Kjeldahl, descritto nell'IDF 20 A 1986.7.2. Detrarre dal volume di acido (4.4) impiegato per la titolazione del campione esaminato il volume necessario per la prova in bianco.8. Prova di controllo8.1. Per controllare il procedimento analitico ed i reattivi sopra menzionati eseguire una determinazine su un alimento composto per animali, di composizione standard, il cui contenuto in latte scremato in polvere già noto sia stato stabilito attraverso un'analisi circolare. Il risultato medio di una determinazione in doppio non deve discostarsi più dell'1 % dai risultati dell'analisi circolare.9. Espressione dei risultati9.1. Il testo è sostituito dal testo seguente: "La percentuale di latte scremato in polvere nell'alimento composto per animali è calcolato con la formula seguente:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dove-N rappresenta la percentuale di azoto della para-caseina: 27,5 è il fattore per convertire la caseina determinata nella percentuale di latte scremato in polvere; 2,81 e 0,908 sono i fattori di correzione ottenuti dall'analisi di regressione."10. Precisione del metodo10.1. RipetibilitàNel 95 % almeno dei casi studiati la differenza fra due risultati singoli, ottenuti sullo stesso campione, nel medesimo laboratorio dallo stesso operatore, non deve superare 2,3 g di latte scremato in polvere su 100 g dell'alimento composto per gli animali esaminato.10.2. RiproducibilitàNel 95 % almeno dei casi studiati, la differenza fra i risultati ottenuti da due laboratori sullo stesso campione, non deve superare 6,5 g di latte scremato in polvere su 100 g dell'alimento composto per gli animali esaminato.11. Limite di tolleranzaIl valore CrD95 (differenza critica: limite di fiducia 95 %) è calcolato tramite la seguente formula (ISO 5725):>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>(R: riproducibilità, r: ripetibilità)Doppia determinazione: CrDys = 4,5 gSe dall'analisi chimica risulta una differenza, rispetto al contenuto dichiarato di latte scremato in polvere, non superiore a 4,5 g (doppia determinazione), la fornitura di alimenti composti si considera conforme alle prescrizioni del regolamento.12. Osservazioni12.1. L'aggiunta di una percentuale rilevante di talune proteine non lattee, e in particolare di quelle di soia che siano state riscaldate insieme al latte scremato in polvere, comporta risultati troppo elevati, dovuti alla coprecipitazione delle proteine stesse insieme alla paracaseina del latte.12.2. L'aggiunta di latticello può comportare valori troppo bassi, poiché la determinazione si riferisce soltanto all'estratto sgrassato. L'aggiunta di taluni tipi di latticello di crema acida può dare valori nettamente più bassi, poiché la dissoluzione di tali prodotti nel citrato è incompleta.12.3. L'aggiunta di lecitina in quantità non inferiore allo 0,5 % può parimenti comportare risultati troppo bassi.12.4. L'incorporazione di latte in polvere riscaldato ad alta temperatura (high-heat) può condurre a valori troppo elevati, dovuti alla coprecipitazione di talune proteine del lattosiero insieme alla paracaseina del latte.(1) Usare carta da filtro esente da ceneri, per filtrazione rapida.ALLEGATO XXIII(Articolo 17)DETERMINAZIONE QUALITATIVA DELL'AMIDO NELLA POLVERE DI LATTE DENATURATO O NEGLI ALIMENTI COMPOSTI1. ObiettivoIl presente metodo serve ad individuare l'amido utilizzato come tracciante nel latte in polvere denaturato.Il suo valore minimo di rivelazione è di circa 0,05 g di amido per 100 g di campione.2. PrincipioLa reazione è basata su quella utilizzata nella iodometria:- fissazione da parte dei colloidi dello iodio libero in soluzione acquosa,- assorbimento da parte delle micelle di amido e conseguente colorazione.3. Reattivi3.1. Soluzione di iodio:- iodio: 1 g,- ioduro di potassio: 2 g,- acqua distillata: 100 ml.4. Apparecchiature4.1. Bilancia analitica4.2. Bagnomaria4.3. Provette, 25 mm x 200 mm5. Modo di operarePesare 1 g del campione e collocarlo nella provetta (punto 4.3).Aggiungere 20 ml di acqua distillata e agitare per disperdere il campione.Mettere la provetta nel bagnomaria bollente (punto 4.2) e mantenervela per 5 minuti.Togliere la provetta dal bagnomaria e lasciare raffreddare a temperatura ambiente.Aggiungere 0,5 ml della soluzione di iodio (punto 3.1), agitare e osservare il colore risultante.6. Espressione dei risultatiLa colorazione blu indica la presenza di amido nativo nel campione.Se il campione contiene amido modificato il colore non può essere blu.7. OsservazioniIl colore, la sua intensità e l'aspetto dell'amido al microscopio variano a seconda dell'origine dell'amido nativo (ad esempio: mais o patate) e del tipo di amido modificato presente nel campione.Nel caso di amidi modificati, il colore risultante vira al violetto, al rosso o al marrone, secondo il grado di modificazione della struttura cristallina dell'amido nativo.ALLEGATO XXIV(Articolo 18)DETERMINAZIONE DELL'UMIDITÀ DEL LATTICELLO ACIDO IN POLVERE1. OggettoDeterminazione del tenore d'umidità nel latticello acido in polvere per alimenti per animali.2. Principio del metodoIl campione è essiccato sotto vuoto. La massa persa è determinata mediante pesatura.3. Apparecchiature3.1. Bilancia analitica3.2. Recipienti di vetro o di metallo non intaccabile da sostanze corrosive con coperchi a chiusura ermetica; superficie utile su cui possa essere distribuito il campione in esame a circa 0,3 g/cm2.3.3. Stufa a vuoto a riscaldamento elettrico regolabile munita di poma ad olio e di un dispositivo per introdurre aria secca calda o un agente essiccante (ad esempio ossido di calcio).3.4. Essiccatore con un efficace agente essiccante.3.5. Forno di essiccazione ventilato, a termoregolazione (termostato), a 102 +- 2 °C.4. ProcedimentoRiscaldare un ricipiente (3.2) e il suo coperchio nel forno (3.5) per almeno un'ora. Porre il coperchio sul recipiente e trasferire immediatamente nell'essiccatore (3.4); lasciare raffreddare a temperatura ambiente e pesare a meno di 0,5 mg.Pesare un recipiente (3.2) e il suo coperchio a meno di 0,5 mg. Pesare nel recipiente pesato, a meno di 1 mg, circa 5 g del campione e ripartirli uniformemente. Porre il recipiente senza coperchio nella stufa (3.3) preriscaldata ad 83 °C. Per evitare che la temperatura della stufa si abbassi eccessivamente, introdurvi il recipiente il più rapidamente possibile.Portare la pressione a 100 Torr (13,3 kPa) e lasciare essiccare per quattro ore a questa pressione in una corrente di aria secca calda o utilizzando un agente essiccante (circa 300 g per 20 campioni). In quest'ultimo caso, disinserire la pompa da vuoto quando si è raggiunta la pressione prescritta. Iniziare il conteggio del tempo di essiccazione dal momento in cui la temperatura della stufa ritorna ad 83 °C. Portare con cautela la stufa alla pressione atmosferica. Aprire la stufa, porre immediatamente il coperchio sul recipiente, togliere quest'ultimo dalla stufa, lasciare raffreddare per 30-45 min. nell'essiccatore (3.4) e pesare a meno di 1 mg. Fare essiccare per altri 30 min. nella stufa a vuoto (3.3) ad 83 °C e pesare nuovamente. La differenza tra le due pesate non deve superare lo 0,1 % di umidità.5. Calcolo>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>dove:E= massa iniziale del campione in esame, espressa in grammim= massa del campione essiccato, espressa in grammi.6. Precisione6.1. RipetibilitàLa differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate nel più breve tempo possibile da un operatore con la stessa apparecchiatura su materiale identico non deve essere superiore a 0,4 g di acqua/100 g di latticello acido in polvere.6.2. RiproducibilitàLa differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate da operatori in differenti laboratori, utilizzando apparecchiature differenti, su materiale identico non deve essere superiore a 0,6 g di acqua/100 g di latticello acido in polvere.6.3. Fonte dei dati relativi alla precisioneI dati relativi alla precisione sono stati stabiliti in base ad un esperimento svolto nel 1995 in otto laboratori e su dodici campioni (sei in doppio cieco).ALLEGATO XXV(Articolo 19)METODO DI RIFERIMENTO PER LA RILEVAZIONE DI GRASSI ESTRANEI NEL GRASSO DEL LATTE MEDIANTE ANALISI CROMATOGRAFICA DEI TRIGLICERIDI - REVISIONE 11. Scopo e campo di applicazioneLa presente norma stabilisce un metodo per la rilevazione di grassi estranei, sia vegetali che animali come sego e lardo, nel grasso di latte e di prodotti lattiero-caseari con l'utilizzo dell'analisi gascromatografica dei trigliceridi.Mediante l'uso di formule trigliceridiche definite, i grassi vegetali e animali vengono rivelati qualitativamente e quantitativamente nel grasso di latte puro, indipendentemente dalle condizioni di alimentazione o lattazione.Nota 1:Benché l'acido butirrico (C 4), che è presente esclusivamente nel grasso di latte, permetta stime quantitative di quantità da piccole a medie di grasso di latte in grassi vegetali, difficilmente è possibile ottenere informazioni qualitative e quantitative per aggiunte fino ad almeno il 20 % (in peso) di grassi estranei al grasso di latte puro a causa delle ampie variazioni del C 4, che oscilla approssimativamente tra il 3,5 e il 4,5 % (in peso).Nota 2:Risultati quantitativi possono venire ottenuti praticamente solo mediante l'analisi dei trigliceridi perché il contenuto di steroli nei grassi vegetali varia in funzione delle condizioni di produzione e di trattamento.2. DefinizionePer grassi estranei nel grasso di latte si intendono, ai fini della presente norma, tutti i grassi vegetali e animali, escluso il grasso di latte.3. Principio del metodoDopo estrazione del grasso di latte, viene preparata una soluzione madre. Su questa soluzione, vengono determinati i trigliceridi (secondo il numero di atomi di carbonio) per via gascromatografica su colonne impaccate. Inserendo la percentuale in peso delle molecole di grasso di differenti dimensioni (C 24-C 54 - solo numeri pari) nella formula dei trigliceridi, i grassi estranei vengono rilevati qualitativamente o determinati quantitativamente.Nota:Osservando la valutazione qui descritta, è possibile utilizzare la gascromatografia capillare purché venga garantito l'ottenimento di risultati equivalenti(1).4. ReagentiUsare prodotti chimici per analisi.4.1. Gas di trasporto: azoto, purezza [gE      ] 99,996 %.4.2. Trigliceridi standard(2), saturi, nonché colesterolo per la standardizzazione di un grasso di latte standard secondo la sezione 6.5.4.4.3. Metanolo anidro.4.4. n-Esano.4.5. n-Eptano.4.6. Toluene.4.7. Soluzione di dimetilclorosilano: 50 ml di dimetilclorosilano vengono sciolti in 283 ml di toluene.4.8. Gas combustibile: idrogeno e aria sintetica.4.9. Fase stazionaria, OV-I al 3 % su Gas ChromQ(3) da 125/150 μm (100/120 mesh).4.10. Soluzione di burro di cacao al 10 %.5. StrumentiNormali apparecchiature da laboratorio, in particolare le seguenti:5.1. Gascromatografo ad alta temperatura adatto per temperature almeno da 400 a 450 °C, equipaggiato con un rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) e controllare di flusso a massa costante per il gas di trasporto. Gas di combustione: 30 ml/min di H2, 270 ml/min di aria sintetica.Data la notevole portata del gas di trasporto, l'ugello della fiamma dovrebbe essere particolarmente ampio.Nota:A motivo delle elevate temperature che si presentano durante l'analisi dei trigliceridi, gli inserti di vetro del FID o del sistema iniettore devono venire puliti frequentemente.Il gascromatografo deve essere equipaggiato di setti resistenti alle alte temperature che possano venire utilizzati frequentemente e presentino in generale un livello di cessione bassissimo.Nota:Sono adatti setti Chromblue (r) (Chrompack).I setti devono venire sostituiti a intervalli regolari, per esempio dopo circa 100 iniezioni oppure appena la risoluzione comincia a deteriorarsi (vedi figura 4).5.2. Colonna cromatograficaColonna di vetro a U (diametro interno 2 mm, lunghezza 500 mm), preventivamente silanizzata (vedi sezione 6.1) con dimetilclorosilano allo scopo di disattivare la superficie di vetro.Nota:Sono adatte anche colonne impaccate leggermente più lunghe (lunghezza 800-2000 mm). Con queste colonne è possibile ottenere una riproducibilità dei risultati leggermente migliore. D'altra parte, la fase stazionaria presenta talvolta fratture dopo l'uso che a loro volta possono portare a peggiori risultati quantitativi. Inoltre, facilmente la fiamma del FID si spegne in conseguenza della portata del gas di trasporto estremamente elevata necessaria, da 75 a 85 ml/min.5.3. Apparecchiatura per il riempimento della colonna (vedi figura 1)Figura 1Riempimento della colonna>PIC FILE= "L_2001037IT.008701.EPS">5.3.1. Colonna di plastica con tappi terminali a vite provvista di una tacca indicante il livello di riempimento per la quantità richiesta di fase stazionaria.5.3.2. Setaccio (maglia da circa 100 μm) con tappo a vite adatto per la chiusura della colonna di vetro secondo la figura 1.5.3.3. Lana di vetro silanizzata disattivata.5.3.4. Vibratore per distribuire in modo uniforme la fase stazionaria durante il riempimento.5.4. Colonna Extrelut(4) da 1 a 3 ml con gel di silice. Questa colonna può venire utilizzata in via alternativa per l'estrazione, allo scopo di ottenere il grasso di latte.5.5. Guarnizione di grafite da 6,4 mm (l/4") con foro da 6 mm.5.6. Dispositivi per la silanizzazione della superficie di vetro della colonna secondo la sezione 6.1.5.6.1. Bottiglia di Woulff.5.6.2. Pompa di aspirazione ad acqua.5.7. Bagnomaria regolabile su (50 +- 2) °C.5.8. Stufa regolabile su (50 +- 2) °C e (100 +- 2) °C.5.9. Pipetta con graduazione in microlitri.5.10. Pipetta graduata da 5 ml per il dosaggio di 1,5 ml di metanolo.5.11. Pallone a fondo rotondo da 50 ml.5.12. Beuta, volume nominale 50 ml.5.13. Imbuto.5.14. Filtro a pori fini.5.15. Evaporatore rotante.5.16. Fiale, volume nominale 1 ml, sigillabili con un tappo d'alluminio, con setto all'interno.5.17. Siringa di iniezione, lo stantuffo della siringa usata non deve raggiungere la punta dell'ago.Nota:Tali siringhe permettono di ottenere una migliore riproducibilità dei risultati.Allo scopo di evitare il deterioramento del setto, la punta dell'ago deve essere controllata a intervalli regolari (per esempio con uno stereomicroscopio).6. Procedura6.1. Preparazione della colonna (silanizzazione):Dopo avere collegato la bottiglia di Woulff, come mostrato nella figura 2, con la pompa di aspirazione ad acqua, il tubo 2 viene immerso nella soluzione secondo la sezione 4.7. Chiudendo il rubinetto, la colonna viene riempita; successivamente i 2 tubi vengono rimossi.Figura 2Apparecchiatura per la silanizzazione>PIC FILE= "L_2001037IT.008801.EPS">La colonna viene fissata su uno stativo e riempita completamente con la soluzione di dimetilclorosilano mediante una pipetta.Dopo 20-30 minuti, la bottiglia Woulff viene sostituita con una beuta per filtrazione e la colonna viene svuotata collegandola alla pompa di aspirazione ad acqua (vedi figura 3).6.2. Riempimento della colonna:Questa operazione è seguita da risciacqui successivi con 75 ml di toluene e 50 ml di metanolo; la colonna vuotata viene poi essiccata nell'essiccatore a 100 °C per circa 30 minuti.Figura 3Apparecchiatura per il risciacquo>PIC FILE= "L_2001037IT.008901.EPS">Per il riempimento della colonna, si utilizza il dispositivo rappresentato nella figura 1. La fase stazionaria di cui al punto 4.9 viene introdotta nella colonna di plastica fino alla tacca.L'estremità inferiore della colonna di vetro da riempire viene chiusa con un tappo della lunghezza di circa 1 cm di lana di vetro preventivamente silanizzata, che viene pressata dentro con un'asta di acciaio. Poi l'estremità della colonna viene chiusa con il setaccio descritto in 5.3.2.La colonna viene riempita sotto pressione (3 bar di N2) con la fase stazionaria. Per ottenere un riempimento uniforme, continuo e compatto, durante il riempimento muovere un vibratore su e giù lungo la colonna di vetro. Dopo il riempimento, un tappo compatto di lana di vetro silanizzata viene premuto nell'altra estremità della colonna riempita, le estremità sporgenti vengono tagliate via e il tappo viene pressato nella colonna per qualche millimetro con una spatola.6.3. Preparazione dei campioni:Per la preparazione dei campioni si usa uno dei seguenti tre metodi:6.3.1. Isolamento del grasso di latte dal burro.Fondere 5-10 g di burro in un recipiente adatto in un bagnomaria secondo la sezione 5.7 a 50 °C.Riscaldare a 50 °C una beuta da 50 ml e un imbuto con inserito un filtro secondo la sezione 5.14, nel vano di riscaldamento. Filtrare lo strato di grasso del campione di burro fuso utilizzando il dispositivo preriscaldato.Questo grasso di latte è pressoché esente da fosfolipidi.6.3.2. Estrazione della frazione grassa con il metodo di Röse-Gottlieb.L'estrazione viene effettuata secondo la norma IDF 1C: 1987, 16C: 1987, 116A: 1987 o 22 B: 1987.Con un tale grasso di latte, i fosfolipidi permettono di ottenere un picco del colesterolo aumentato approssimativamente dello 0,1 %.Lo spettro dei trigliceridi standardizzato a 100 sul colesterolo ne risulta influenzato solo in misura trascurabile.6.3.3. Estrazione dal latte con l'utilizzo di colonne a gel di silice.Un campione di latte da 0,7 ml termostato a 20 °C viene applicato ad una colonna Extrelut da 1 a 3 ml con una micropipetta secondo la sezione 5.9 e lasciato distribuire in maniera uniforme sul gel di silice per circa 5 minuti.Per denaturare i complessi proteo-lipidici, aggiungere 1,5 ml di metanolo con una pipetta. Successivamente il campione viene estratto con 20 ml di n-esano. L'n-esano viene aggiunto lentamente in piccole quantità e il solvente drenato viene raccolto in un pallone a fondo rotondo da 50 ml preventivamente essiccato a peso costante noto.Dopo l'estrazione drenare la colonna fino a quando è vuota.Allontanare dall'eluato i solventi per distillazione su un evaporatore rotante ad una temperatura del bagnomaria da 40 a 50 °C.Essiccare il pallone e determinare la resa di grasso mediante pesata.Nota:I metodi di estrazione dei grassi secondo Gerber, Weibull-Berntrop, Schmid-Bondzynski-Ratzlaff o l'isolamento del grasso di latte con l'utilizzo di detergenti (metodo BDI) non sono adatti per l'analisi dei trigliceridi perché con questi metodi quantità più o meno grandi di gliceridi parziali o fosfolipidi possono passare nella fase grassa.6.4. Preparazione della soluzione campione.Per la gascromatografia, si usa una soluzione al 5 % del grasso in n-eptano ottenuta secondo la sezione 6.3. Per la preparazione di questa soluzione campione, pesare le quantità corrispondenti del materiale campione ottenuto secondo le sezioni 6.3.1 e 6.3.2 e scioglierle in quantità corrispondenti di n-eptano.Con la preparazione del campione secondo la sezione 6.3.3, calcolare la quantità di n-eptano da aggiungere al campione nel pallone sulla base della pesata e sciogliere in esso il residuo.Introdurre circa 1 ml della soluzione campione in una fiala secondo la sezione 5.16.6.5. Determinazione cromatografica dei trigliceridi.Con le temperature elevate (fino a 350 °C) usate per l'eluizione dei trigliceridi a catena lunga C52 - C56, si verifica sovente un innalzamento della linea di base, in particolare se le colonne non sono state adeguatamente condizionate all'inizio. Questo innalzamento della linea di base ad alte temperature può venire completamente evitato combinando due colonne o mediante sottrazione della linea di base.Operando con il sistema di compensazione oppure con colonne singole, come pure per gli inserti di vetro nell'iniettore e nel rivelatore, si devono usare le guarnizioni di grafite secondo la sezione 5.5.6.5.1. Correzione della linea di base.Per evitare che la linea di base si alzi si usa uno dei seguenti quattro metodi:6.5.1.1. Combinazione di colonne.Si usano 2 colonne impaccate nella modalità di compensazione.6.5.1.2. Correzione della linea di base mediante il gascromatografo.Mediante una prova di funzionamento del gascromatografo senza iniezione della soluzione di grassi e successiva sottrazione della linea di base registrata, è possibile eliminare l'innalzamento della linea di base.6.5.1.3. Correzione della linea di base tramite software di integrazione.Mediante una prova di funzionamento del sistema di integrazione senza iniezione della soluzione di grasso e successiva sottrazione della linea di base registrata, è possibile eliminare l'innalzamento della linea di base.6.5.1.4. Correzione della linea di base mediante adeguato condizionamento.Con un adeguato condizionamento iniziale della colonna e approssimativamente 20 iniezioni di soluzioni di grasso di latte, l'aumento della linea di base ad alte temperature è generalmente così basso che non sono necessarie correzioni della linea di base.6.5.2. Tecnica di iniezione.Allo scopo di evitare effetti di discriminazione, si applica la tecnica di iniezione a caldo per ottenere risultati quantitativi migliori con i componenti trigliceridici alto-bollenti. In questa tecnica, la soluzione di grasso viene aspirata in una siringa e l'ago freddo della siringa viene riscaldato per circa 3 secondi nella testa dell'iniettore prima dell'iniezione. Poi il contenuto della siringa viene iniettato rapidamente.Nota:Con questa tecnica di iniezione, si riduce il rischio di fenomeni di frazionamento all'interno della siringa o di arresto dell'iniezione. Non si applica l'iniezione diretta "in colonna" nella parte superiore estesa riscaldata della colonna perché i frammenti del setto che vi si accumulano nonché i contaminanti possono venire facilmente eliminati con la tecnica utilizzata cambiando con regolarità l'inserto dell'iniettore senza smontare la colonna.Evitare assolutamente che la punta dell'ago si pieghi a contatto con il fondo del beaker del campione (tale piegatura è difficilmente visibile a occhio nudo) per non danneggiare il setto.Figura 4Cromatogramma dei trigliceridi di un campione di grasso di latte>PIC FILE= "L_2001037IT.009101.EPS">6.5.3. Condizionamento di una colonna impaccata.Durante gli stadi da a) a c), l'estremità della colonna non è collegata al rivelatore allo scopo di evitare contaminazioni.Le colonne riempite secondo la sezione 6.2 vengono condizionate come segue:a) 15 minuti a 40 ml/min N2 a 50 °C;b) riscaldamento a 1 K/min fino a 355 °C a 10 ml N2/min;c) mantenimento per 12-15 ore a 355 °C;d) 2 iniezioni di 1μl della soluzione di burro di cacao di cui alla sezione 4.10 e rispettivo programma di temperatura;e) 20 iniezioni di 0,5 μl di soluzione di grasso di latte per 2-3 giorni, secondo la sezione 6.4.Nota:Il burro di cacao è costituito pressoché esclusivamente da trigliceridi alto-bollenti C50-C56. L'iniezione di burro di cacao serve ad un condizionamento speciale in questo intervallo di catene lunghe. Con i trigliceridi altobollenti da C50 a C54, possono in parte aversi fattori di risposta fino a circa 1,20. Normalmente, con iniezioni ripetute di una soluzione di grasso di latte ci si deve attendere una riduzione dei fattori di risposta, inizialmente elevati, per C50-C54. Con trigliceridi con un basso numero di carboni acilici, i fattori si avvicinano ad 1.Preparare tre coppie, rispettivamente, delle colonne riempite secondo la sezione 6.2. Le coppie condizionate vengono controllate, rispettivamente, con un'analisi del grasso di latte per la prova di routine. Verrà utilizzata la coppia che fornisce i migliori risultati quantitativi (fattori di risposta pressoché uguali a 1). Con fattori di risposta maggiori di 1,20, la colonna non deve essere utilizzata.6.5.4. Taratura.Per la taratura, determinare i fattori di riposta dei trigliceridi corrispondenti, nonché del colesterolo di un grasso di latte (grasso standardizzato) utilizzando i trigliceridi standardizzati (almeno i trigliceridi saturi C24, C30, C36, C42, C48 e C54 e il colesterolo; preferibilmente anche con C50 e C52). Fattori di risposta intermedi possono venire trovati mediante interpolazione matematica.Utilizzando il grasso standardizzato, eseguire da 2 a 3 tarature ogni giorno. Se si ottengono risultati pressoché identici, i risultati quantitativi dell'analisi dei trigliceridi dei campioni avranno una buona riproducibilità.Il grasso di latte standardizzato ha una conservabilità di parecchi mesi ad una temperatura di conservazione non superiore a -18 °C e può pertanto venire utilizzato come standard.Nota:il fattore di risposta di ogni costituente può anche essere determinato utilizzando un grasso standardizzato avente una composizione trigliceridica certificata, quale il CRM 519 (grasso di latte anidro) commercializzato dall'"Institut de Matériaux de Référence et de Mesures" di Geel (Belgio).6.5.5. Programma di temperatura, gas di trasporto e altre condizioni per l'analisi dei trigliceridi.Programma di temperatura: temperatura iniziale della colonna 210 °C, mantenuta per 1 minuto, poi programma a 6 °C/min fino a 350 °C e mantenimento della temperatura finale per 5 minuti.Temperatura del rivelatore e dell'iniettore: 370 °C.Nota:Le temperature del rivelatore, dell'iniettore e del forno (temperatura iniziale) devono venire mantenute a livello costante (anche durante la notte, i fine settimana e le vacanze).Gas di trasporto: azoto, portata 40 ml/min.Nota:Se si utilizzano colonne da 80 cm, la portata deve essere di almeno 75 ml/min N2. Il flusso di gas di trasporto deve venire mantenuto costante (anche durante la notte, durante i fine settimana e le vacanze). La portata esatta del gas di trasporto dovrebbe essere regolata in modo che, indipendentemente dalla lunghezza della colonna, C54 venga eluito a 341 °C.Durata dell'analisi: 29,3 minuti.Volume di iniezione: 0,5 μl.Nota:La siringa deve venire risciacquata diverse volte con eptano puro dopo ogni iniezione.Condizioni del FID: secondo la sezione 5.1.Nota:Accendere il rivelatore a ionizzazione di fiamma all'inizio di ogni giorno di lavoro.7. Integrazione, valutazione e controllo delle condizioni di misuraI trigliceridi con numero dispari C acilici (2n + 1) sono combinati con il trigliceride a numero pari precedente (2n). Non si tiene conto del basso contenuto di C56, meno riproducibile. I trigliceridi rimanenti (area dei picchi) nel cromatogramma, incluso il colesterolo (picco in prossimità di C24) vengono moltiplicati per i rispettivi fattori di risposta del grasso standard (ultima taratura) e normalizzati tutti insieme a 100. Oltre al colesterolo libero, vengono così valutati i trigliceridi C24, C26, C28, C30, C32, C34, C36, C38, C40, C42, C44, C46, C48, C50, C52 e C54. I risultati vengono forniti in % in peso (g/100 g).La valutazione dei picchi del cromatogramma deve essere effettuata con un integratore con il quale sia possibile tracciare la linea di base. Deve essere possibile operare la reintegrazione con parametri di integrazione ottimizzati.Le figure 5 e 6 presentano due esempi di cromatogrammi dei trigliceridi. La figura 5 mostra un cromatogramma che può venire valutato correttamente, mentre la figura 6 rappresenta un errore sporadico nell'intervallo da C50 a C54 in cui la linea di base ha un andamento scorretto in confronto con la figura 5. Tali errori tipici possono venire individuati con un elevato grado di certezza ed evitati solo mediante l'uso di un integratore con il quale venga tracciata la linea di base.Figura 5Cromatogramma di trigliceridi facilmente valutabile di un grasso di latte con il tracciato della linea di base>PIC FILE= "L_2001037IT.009201.EPS">Figura 6Cromatogramma scorrettamente integrato del grasso di latte>PIC FILE= "L_2001037IT.009301.EPS">Per controllare le condizioni di misura si possono utilizzare le deviazioni standard relative (RSD: coefficiente di variazione x100) riportate nella tabella 1 per i vari trigliceridi, calcolate sulla base di 19 analisi consecutive del medesimo grasso di latte.Tabella 1Deviazioni standard relative (RSD) del tenore di trigliceridi (n=19)>SPAZIO PER TABELLA>Se le RSD sono nettamente superiori ai valori della tabella 1, le condizioni cromatografiche non sono corrette e occorre verificare i setti o il flusso del gas vettore. Inoltre piccole particelle di setto possono aver formato depositi sulla lana di vetro sulla testa della colonna o la colonna può non essere più utilizzabile a causa del suo invecchiamento, dell'azione della temperatura, ecc.Nota:I valori riportati nella tabella 1 non sono vincolanti e si limitano a fornire un'indicazione per il controllo di qualità. Se si accettano RSD più elevate, occorre comunque rispettare i limiti di ripetibilità e di riproducibilità di cui al punto 11.8. Rilevazione qualitativa di grassi estraneiPer la rilevazione dei grassi estranei, sono state sviluppate delle formule dei trigliceridi (tabella 2) con limiti S (tabella 3) in cui i valori di S dei grassi di latte puri possono fluttuare. Se si superano questi limiti, si può supporre la presenza di un grasso estraneo.La formula più sensibile per la rilevazione dell'aggiunta di lardo è per esempio:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>Nota:Utilizzando 755 differenti campioni di grasso di latte, è stato calcolato un intervallo di confidenza al 99 % di S = 97,96 - 102,04 per campioni di grasso di latte puro con una deviazione standard SD = 0,39897 per tutti i valori di S.Partendo dalla composizione trigliceridica di un campione di grasso sconosciuto, tale formula permette di verificare, senza l'utilizzo di un computer e in maniera semplice, se la somma dei contenuti di trigliceridi qui definita con i fattori corrispondenti ricada al di fuori dell'intervallo 97,96 - 102,04 e che pertanto molto probabilmente siano stati aggiunti grassi estranei.Per la rilevazione di differenti grassi estranei, la tabella 2 mostra differenti formule trigliceridiche. Per la rilevazione dei grassi estranei olio di soia, olio di girasole, olio di oliva, olio di ravizzone, olio di semi di lino, olio di germi di frumento, olio di germi di mais, olio di semi di cotone e olio di pesce idrogenato, dei grassi vegetali di cocco e di palmisto e anche dell'olio di palma e il sego è possibile utilizzare rispettivamente una formula comune.Poiché la composizione trigliceridica dei grassi estranei è anch'essa soggetta a fluttuazioni, sono stati utilizzati fino a quattro differenti dati sperimentali di trigliceridi di grassi estranei dello stesso tipo [con gli stessi tipi di grasso estraneo, è stato rispettivamente considerato il limite meno favorevole (vedi tabella 4)].Con la seguente "formula totale" è possibile ottenere risultati anch'essi buoni per tutti i grassi estranei:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>Calcoli per la rilevazione di qualsiasi combinazione di grassi estranei nel grasso di latte hanno mostrato che, anche se con la formula per il lardo fornita in tabella 2 il limite per questo grasso estraneo è basso (2,7 %), altri grassi, come il grasso di cocco, l'olio di palpa o il grasso di palmisto, che hanno limiti di rilevazione del 26,8, 12,5 e 19,3 %, rispettivamente, con questa formula possono venire rilevati solo se al grasso di latte ne sono state aggiunte quantità estremamente elevate. Questo vale anche per le altre formule della tabella 2.Tabella 2Formule trigliceridiche per la rilevazione di vari grassi estranei nel grasso di latte, con l'indicazione delle deviazioni standard SD per SFormula per gli oli di soia, girasole, oliva, ravizzone, semi di lino, germe di grano, germe di granturco, semi di cotone e olio di pesce>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>Formula per il grasso di cocco e di palmisto>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>Formula per l'olio di palma e il sego>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>Formula per il lardo>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>Pertanto, allo scopo di controllare un campione di grasso sconosciuto occorre usare tutte le formule presentate nella tabella 2 e la formula totale (2), se è probabile che il campione sia una miscela di grasso di latte e di uno dei 14 differenti grassi estranei oppure una combinazione di questi grassi estranei. Se, inserendo i trigliceridi di un campione di grasso da analizzare, si ottiene un valore di S che cade al di fuori degli intervalli della tabella 3 di solo una delle cinque formule, allora è estremamente probabile che il campione sia un grasso di latte modificato. La rilevazione di un grasso estraneo nel grasso di latte mediante una delle quattro formule presentate nella tabella 2 non permette di trarre conclusioni sul tipo di grasso estraneo aggiunto.Tabella 3Limiti di S per i grassi di latte>SPAZIO PER TABELLA>Nella tabella 4 sono presentati i limiti di rilevazione per i differenti grassi estranei con una confidenza del 99 %. La prima colonna mostra i limiti massimi di rilevazione per le migliori formule del grasso di latte della tabella 2. Nella seconda colonna sono forniti i limiti di rilevazione per la formula totale. Anche se i limiti sono alquanto più elevati, basta questa formula per rilevare quantità leggermente più elevate di grassi estranei. Con tutte le formule è possibile rilevare anche combinazioni dei differenti grassi estranei. Gli intervalli di variazione dei trigliceridi di differenti grassi estranei di un tipo non hanno un'influenza considerevole sui limiti di rilevazione.Tabella 4Limite di rilevazione al 99 % per l'aggiunta di grasso estraneo al grasso di latte>SPAZIO PER TABELLA>Nota:Gli intervalli S sono calcolati in modo tale da presumere la presenza di un grasso estraneo solo se si superano i limiti delle formule per un grasso singolo (vedi tabella 4).9. Determinazione quantitativa dei grassi estraneiAllo scopo di ottenere informazioni quantitative riguardo la concentrazione dei grassi estranei in un campione di grasso di latte, si utilizza la formula seguente:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>, dove X è la quantità di grasso estraneo sconosciuto o di miscela di grassi estranei sconosciuta in un grasso di latte. S risulta dall'aggiunta di un grasso estraneo sconosciuto mediante inserimento dei trigliceridi della miscela grasso estraeno/grasso di latte nella formula trigliceridica totale vista sopra. Se viene aggiunto un grasso estraneo sconosciuto al grasso di latte, per SF si sceglie il valore medio di S dei differenti grassi estranei per la formula totale; questo valore medio di S viene ottenuto inserendo i dati dei trigliceridi dei grassi estranei puri in questa formula e calcolando un valore medio (SF = 7,46). Risultati quantitativi di buona qualità per qualsiasi aggiunta di grassi estranei vengono ottenuti anche utilizzando la formula dell'olio di palma/sego (tabella 2) e un valore medio SF = 10,57.Conoscendo i tipi di grasso estraneo, inserire i seguenti valori di SF nella formula vista sopra e scegliere la rispettiva formula del grasso estraneo dalla tabella 2:Tabella 5Valore di SF di vari grassi estranei>SPAZIO PER TABELLA>10. Campo di validità del metodo di rilevazioneIl metodo descritto vale per latti di massa ed è basato sulla rappresentatività dei campioni di grasso di latte.Sarebbe possibile una rilevazione altamente specifica se, per un numero rappresentativo di grassi di latte, venissero derivate formule come quelle viste sopra, per differenti paesi.Possibilità di rilevazione particolarmente idonee sarebbero ottenibili se nei differenti paesi venissero definite formule come quelle descritte sopra basate su un numero rappresentativo di grassi di latte. In questo caso, senza usare complessi programmi per computer, basta applicare le combinazioni di trigliceridi usate nella tabella 2 e rideterminare i fattori utilizzando il metodo dei minimi quadrati.Applicando gli intervalli di S mostrati nella tabella 3, le formule sono in generale applicabili in condizioni particolari di alimentazione come, per esempio, sottoalimentazione o alimentazione delle mucche con lieviti o con saponi di Ca. Solo in caso di condizioni di alimentazione estreme (per esempio elevata assunzione di oli alimentari puri, elevata somministrazione di saponi di Ca combinati con grasso alimentare ecc.), le formule indicano in parte un grasso di latte modificato.Nota:I grassi di latte frazionati vengono in generale riconosciuti come grasso di latte non modificato se si assume che vi è modificazione solo quando vengono superati i limiti. Solo con grassi di latte frazionati aventi una composizione insolita, come per esempio nel caso di una frazione dura ottenuta per frazionamento con metodi fisici a temperature elevate di approssimativamente 30 °C con basse rese di pochi punti percentuali o per frazionamento con CO2 supercritica, le formule indicano una modificazione.Il frazionamento del grasso di latte può tuttavia venire rivelato utilizzando altri metodi, per esempio la calorimetria differenziale a scansione.11. Precisione del metodoViene determinata utilizzando grasso di latte sulla base delle formule della tabella 2 e degli intervalli di S della tabella 3.11.1. RipetibilitàCome differenza dei valori di S di due determinazioni eseguite nell'intervallo di tempo più breve possibile da parte di un operatore che utilizza la stessa procedura e materiale campione identico nelle stesse condizioni (stessa persona, stessi strumenti/stesso dispositivo, stesso laboratorio).Tabella 6Limiti di ripetibilità (r) per le differenti formule>SPAZIO PER TABELLA>11.2. RiproducibilitàCome differenza dei valori di S di due determinazioni eseguite da operatori in differenti laboratori, secondo la stessa procedura utilizzando materiale campione identico in differenti condizioni (differente persona, differenti strumenti) in momenti differenti.Tabella 7Limiti di riproducibilità (R) per le differenti formule>SPAZIO PER TABELLA>11.3. Differenza criticaCon i limiti di ripetibilità (r) e riproducibilità (R), è possibile calcolare le differenze critiche per tutti gli intervalli di S della tabella 3 (analisi in doppio). I rispettivi valori sono presentati nella tabella 8.Tabella 8Differenze critiche per tutte le formule dei trigliceridi>SPAZIO PER TABELLA>11.4. Accettabilità dei risultatiTutti i contenuti di trigliceridi C24, C26, C28-C54 nonché colesterolo, tarati e calcolati con l'arrotondamento al secondo decimale, devono essere esattamente normalizzati a 100.I risultati dell'analisi in doppio vengono utilizzati come controllo della ripetibilità. Se le differenze assolute tra due risultati di S per tutte le cinque formule dei trigliceridi non superano i limiti di ripetibilità r della tabella 6, allora è soddisfatto il requisito di ripetibilità.Per il controllo delle condizioni gascromatografiche ottimali e in particolare della qualità della colonna, si dovrebbe garantire che su dieci prove ripetitive le differenze tra i valori massimi e minimi di S in tutte le cinque formule dei trigliceridi non superino l'intervallo x· r con x = 1,58 (per 10 prove, vedi riferimento 16) e i limiti di ripetibilità r per le differenti formule di tabella 6.12. Norme citate>SPAZIO PER TABELLA>13. Riferimenti bibliografici1. Commissione delle Comunità europee: Detection of foreign fats in milk fat by means of gas chromatographic triglyceride analysis; doc. n. VI/5202/90-EN, VI/2645/91.2. Commissione delle Comunità europee: Control of butter fat purity of 100 different samples of different feeding periods from 11 EEC countries; doc. VI/4577/93.3. Commissione delle Comunità europee: Consideration of results from the first, second, third, fourth, fifth and sixth EEC collaborative trial: Determination of triglycerides in milk fat, doc. n. VI/2644/91, VI/8.11.91, VI/1919/92, VI/3842/92, VI/5317/92, VI/4604/93.4. Timms, R. E.: Detection and quantification of non-milk fat in mixtures of milk and non-milk fats. Dairy Research 47 295-303 (1980).5. Precht, D., Heine, K.: Nachweis von modifiziertem Milchfett mit der Triglyceridanalyse. 2. Fremdfettnachweis im Milchfett mit Hilfe von Triglyceridkombinationen 41 406-410 (1986).6. Luf, W., Stock, A., Brandl, E.: Zum Nachweis von Fremdfett in Milchfett über die Trigylceridanalyse. Österr. Milchwirtsch. Wissensch. Beilage 5, 42 20-35 (1987).7. Precht, D.: Bestimmung von pflanzlichen Fetten oder tierischen Depotfetten in Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 143/157 (1989).8. Precht D.: Schnelle Extraktion von Milchfett, Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 119-128 (1990).9. Precht, D.: Schnelle gaschromatographische Triglyceridanalyse von Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 139-154 (1900).10. Precht, D.: Control of milk fat purity by gas chromatographic triglyceride analysis. Kieler Milchtwirtsch. Forschungsber. 43 (3) 219-242 (1991).11. Precht, D.: Detection of adulterated milk fat by fatty acid and triglyceride analysis. Fat Sci. Technol. 93 538-544 (1991).12. Precht, D.: Detection for foreign fat in milk fat. I, Qualitative detection by triacylglycerol formulae. II, Quantitative evaluation of foreign fat mixtures. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 194 1-8, 107-114 (1992).13. Precht, D.: Gas chromatography of triacylglycerols and other lipids on packed columns in CRC Handbook of Chromatography: Analysis of Lipids, p. 123-138, ed. K.D. Mukherjee, N. Weber, J. Scherma, CRC Press, Boca Raton (1993).14. Precht, D., Molkentin, J.: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns, Chrompack News 4 16-17 (1993).15. Molkentin, J., Precht, D.: Comparison of packed and capillary columns for quantitative gas chromatography of triglycerides in milk fat. Chromatographia 39 (5/6) 265-270 (1994).16. Stange, K.: Angewandte Statistik, Erster Teil, Eindimensionale Probleme, Springer-Verlag, Berlin, P. 378 (1970).(1) Metodi adatti sono già stati descritti, vedi D. Precht and J. Molkentin: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns, Chrompack News 4, 16-17 (1993).(2) Prodotti adatti sono disponibili in commercio.(3) I marchi, per esempio Extrelut, GasChromQ, Chrompack, sono esempi di prodotti adatti ottenibili da fornitori specializzati. Queste informazioni hanno lo scopo di facilitare l'applicazione della norma da parte dell'utilizzatore e non rappresentano un requisito vincolante per il prodotto. L'indicazione in grani è stata convertita in μm nel sistema SI secondo BS 410: 1988 "British Standard Specification for test sieves".(4) Vedi nota 3 di pagina 86.ALLEGATO XXVIELENCO DEI REGOLAMENTI DI CUI AL 1o CONSIDERANDO- Regolamento (CEE) n. 1216/68 della Commissione, del 9 agosto 1968, che determina il metodo per la constatazione del tenore in lattosio degli alimenti composti per animali importati in provenienza dai paesi terzi(1), modificato dal regolamento (CEE) n. 222/88 della Commissione, del 22 dicembre 1987, che modifica alcuni atti nel settore del latte e dei prodotti lattiero-caseari in seguito all'instaurazione della nomenclatura combinata(2).- Regolamento (CEE) n. 3942/92 della Commissione, del 22 dicembre 1992, che fissa un metodo di riferimento per la determinazione del sitosterolo e dello stigmasterolo nel butteroil(3), modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 175/1999 della Commissione, che modifica i regolamenti (CEE) n. 3942/92, (CE) n. 86/94, (CE) n. 1082/96 e (CE) n. 1459/98 che stabiliscono metodi di riferimento per la determinazione di taluni traccianti nel burro, nel butteroil e nella crema(4).- Regolamento (CE) n. 86/94 della Commissione, del 19 gennaio 1994, che fissa un metodo di riferimento per la determinazione del sitosterolo e dello stigmasterolo nel burro(5), modificato dal regolamento (CE) n. 175/1999.- Regolamento (CE) n. 2721/95 della Commissione, del 24 novembre 1995, recante disposizioni di applicazione sui metodi di riferimento e di routine per le analisi e la valutazione quantitativa del latte e dei prodotti lattiero-caseari soggetti all'organizzazione comune dei mercati(6).- Regolamento (CE) n. 1080/96 della Commissione, del 14 giugno 1996, che definisce un metodo di riferimento per la rivelazione della presenza di coliformi nel burro, nel latte scremato in polvere, nella caseina e nei caseinati(7).- Regolamento (CE) n. 1081/96 della Commissione, del 14 giugno 1996, che definisce un metodo di riferimento per rivelare la presenza di caseinato e di latte vaccini nei formaggi prodotti con latte di pecora, con latte di capra o con latte di bufala o con miscele di tali latti e che abroga il regolamento (CEE) n. 690/92(8).- Regolamento (CE) n. 1082/96 della Commissione, del 14 giugno 1996, che fissa un metodo di riferimento per la determinazione dell'estere di etile dell'acido beta-apo-8'-carotenico nel burro e nel burro concentrato(9), modificato dal regolamento (CE) n. 175/1999.- Regolamento (CE) n. 1854/96 della Commissione, del 26 settembre 1996, che stabilisce (elenco dei metodi di riferimento da applicare per l'analisi e la valutazione qualitativa del latte e dei prodotti lattiero-caseari soggetti all'organizzazione comune dei mercati(10), modificato dal regolamento (CE) n. 881/1999(11).- Regolamento (CE) n. 880/98 della Commissione, del 24 aprile 1998, che istituisce metodi di riferimento per la determinazione del contenuto in acqua, solidi magri e materie grasse del burro(12).- Regolamento (CE) n. 1459/98 della Commissione, dell'8 luglio 1998, che stabilisce un metodo di riferimento per la determinazione della vanillina nel burro concentrato, nel burro o nella crema(13), modificato dal regolamento (CE) n. 175/1999.(1) GU L 198 del 10.8.1968, pag. 13.(2) GU L 28 dell'1.2.1988, pag. 1.(3) GU L 399 del 31.12.1992, pag. 29.(4) GU L 20 del 27.1.1999, pag. 22.(5) GU L 17 del 20.1.1994, pag. 7.(6) GU L 283 del 25.11.1995, pag. 7.(7) GU L 142 del 15.6.1996, pag. 13.(8) GU L 142 del 15.6.1996, pag. 15.(9) GU L 142 del 15.6.1996, pag. 26.(10) GU L 246 del 27.9.1996, pag. 5.(11) GU L 111 del 29.4.1999, pag. 24.(12) GU L 124 del 25.4.1998, pag. 16.(13) GU L 193 del 9.7.1998, pag. 16.