CELEX: 31981L0715
Language: bg
Date: 1981-07-31 00:00:00
Title: Девета директива на Комисията от 31 юли 1981 година относно установяване на общностни методи за анализ за целите на официалния контрол на храните за животни

Важна правна забележка

|

31981L0715

Официален вестник n° L 257 , 10/09/1981 стр. 0038 - 0046 специално финландско издание: глава 3 том 13 стр. 0233  специално испанско издание: глава 03 том 23 стр. 0070  специално шведско издание: глава 3 том 13 стр. 0233  специално португалско издание глава 03 том 23 стр. 0070  специално чешко издание глава 03 том 05 стр. 76  - 84 специално испанско издание глава 03 том 05 стр. 76  - 84 специално унгарско издание глава 03 том 05 стр. 76  - 84 специално литвийско издание глава 03 том 05 стр. 76  - 84 LV.ES глава 03 том 05 стр. 76  - 84 MT.ES глава 03 том 05 стр. 76  - 84 PL.ES глава 03 том 05 стр. 76  - 84 SK.ES глава 03 том 05 стр. 76  - 84 специално словенско издание глава 03 том 05 стр. 76  - 84

		19810731Девета Директива на Комисиятаот 31 юли 1981 годинаотносно установяване на общностни методи за анализ за целите на официалния контрол на храните за животни(81/715/ЕИО)КОМИСИЯТА НА ЕВРОПЕЙСКИТЕ ОБЩНОСТИ,като взе предвид Договора за създаване на Европейската икономическа общност,като взе предвид Директива 70/373/ЕИО на Съвета от 20 юли 1970 г. относно въвеждането на общностни методи за вземане на проби и анализ за целите на официалния контрол на храните за животни [1], последно изменена с Акта за присъединяване на Гърция, и по-специално член 2 от нея,като има предвид, че горепосочената директива изисква официалният контрол върху храните за животни, целта на който е да се провери, че законовите, подзаконовите и административни разпоредби относно качеството и състава на храните за животни, се извършва в съответствие с методите на Общността за вземане на проби и анализ;като има предвид, че Директиви 71/250/ЕИО [2], 71/393/ЕИО [3], 72/199/ЕИО [4], 73/46/ЕИО [5], 74/203/ЕИО [6], 75/84/ЕИО [7], 76/372/ЕИО [8] и 78/633/ЕИО на Комисията [9], последно изменени с Директива от 30 юли 1981 г., вече са установили известен брой методи на Общността за вземане на проби и анализ; като отчита напредъка на работата оттогава, препоръчително е да се приеме девети набор от методи;като има предвид, че мерките, предвидени в настоящата директива, са в съответствие със становището на Постоянния комитет по храните за животни,ПРИЕ НАСТОЯЩАТА ДИРЕКТИВА:Член 1Държавите-членки изискват анализите от официалния контрол върху храните за животни относно съдържанието им на авопарцин и натриев монензин, да се извършват в съответствие с методите, описани в приложението.Член 2Държавите-членки въвеждат в сила законовите, подзаконовите и административните разпоредби, необходими, за да се съобразят с настоящата директива до 1 декември 1981 г. и незабавно информират Комисията за това.Член 3Адресати на настоящата директива са държавите-членки.Съставено в Брюксел на 31 юли 1981 година.За КомисиятаПредседателGaston Thorn[1] ОВ L 170, 3.8.1970 г., стр. 2.[2] ОВ L 155, 12.7.1971 г., стр. 13.[3] ОВ L 279, 20.12 1971 г., стр. 7.[4] ОВ L 123, 29.5.1972 г., стр. 6.[5] ОВ L 83, 30.3.1973 г., стр. 21.[6] ОВ L 108, 22.4.1974 г., стр. 7.[7] ОВ L 32, 5.2.1975 г., стр. 26.[8] ОВ L 102, 15.4.1976 г., стр. 8.[9] ОВ L 206, 29.7.1978 г., стр. 43.--------------------------------------------------19810731ПРИЛОЖЕНИЕ1. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА АВОПАРЦИН ЧРЕЗ ДИФУЗИЯ В СРЕДА НА АГАР1. ЦЕЛ И ОБХВАТМетодът се използва за определянето на авопарцин в храните за животните и в предварителните смеси. Долната граница за определянето е 2 mg/kg (2 части на хиляда). Присъствието на полиетерни антибиотици може да окаже влияние при определянето.2. ПРИНЦИППробата се извлича със смес от ацетон/вода/солна киселина. Антибиотичната активност на екстракта се определя посредством измерване на дифузията на авопарцина в среда от агар със бацилус субтилис. Дифузията се показва чрез формирането на зони за инхибиране на микроорганизмите. За диаметъра на тези зони се приема, че е в директно съотношение спрямо логаритъма на антибиотичната концентрация, в рамките на спектъра от използваните антибиотични концентрации.3. МИКРООРГАНИЗЪМ: БАЦИЛУС СУБТИЛИС АТСС 6633 (NCIB 8054)3.1. Поддържане на щамова култураПрави се посявка в тръбички, съдържащи полегати плоскости от културна среда (4.1), с бацилус субтилис и се оставя да пренощува при температура 30 °С. Културата се съхранява в хладилник при температура около 4 °С. Ежемесечно се правят нови посевки.3.2. Подготовка на суспензията от спори [1]Обира се добивът от неотдавна подготвената полегата плоскост от агар (3.1) посредством 2 до 3 ml стерилна вода. Тази суспензия се използва, за да се направи посявка върху 300 ml от културната среда (4.1), съдържаща се в колба на Рукс и се оставя да престои три до пет дни при температура 30 °С. Добивът в 15 ml етанол (4.2), след като се провери под микроскоп формирането на малки спори и се смесва добре. Тази суспензия може да се запази в продължение на най-малко пет месеца при температура около 4 °С.4. КУЛТУРНИ СРЕДИ И РЕАГЕНТИ4.1. Културна среда [2]Пептон | 6,0 g |Триптофан | 4,0 g |Екстракт от дрожди | 3,0 g |Месо-костен екстракт | 1.5 g |Глюкоза | 1,0 g |Агар | 15,0 g |Вода | 1000 ml |pH 6,5 (след стерилизация). | |4.2. Етанол 20 % (v/v): 200 ml етанол се разреждат с 800 ml вода.4.3. Солна киселина, разреждане 1,18 до 1,19.4.4. Натриева основа, разтвор 2 М.4.5. Фосфатен буфер, 0,1 М:калиев дихидроген фосфат KH2PO4: 13,6 g.Вода до 1000 ml.Стойността на рН се регулира на 4,5.4.6. Смес на ацетон/вода/солна киселина (4.3): 65/32,5/ 2,5 (v/v/v).4.7. Стандартна субстанция: авопарциновов сулфат с позната активност.5. СТАНДАРТНИ РАЗТВОРИТочно претеглено количество от приблизително 10 mg от стандартната субстанция (4.7) се разтваря във фосфатен буфер (4.5) и се разрежда с този буфер, така че да се получи основен разтвор, съдържащ 100 µg авопарцин на 1 ml. Съхранен в затапена колба при температура 4 °С, този разтвор остава стабилен в продължение на седем дни.5.1. За предварителни смесиОт този основен разтвор посредством последователно разреждане с буфера (4.5) се подготвят следните разтвори:S8 | 4,0 µg/ml |S4 | 2,0 µg/ml |S2 | 1,0 µg/ml |S1 | 0,5 µg/ml |5.2. За храни за животниОт този основен разтвор посредством последователно разреждане с буфера (4.5) се подготвят следните разтвори:S8 | 2,0 µg/ml |S4 | 1,0 µg/ml |S2 | 0,5 µg/ml |S1 | 0,25 µg/ml |6. ПОДГОТВЯНЕ НА ЕКСТРАКТА И РАЗТВОРИТЕ ЗА АНАЛИЗИ6.1. Предварителни смесиПретегля се възможно най-близко до 10 mg, достатъчно количество проба, която да съдържа 10 до 100 mg авопарцин. Прехвърля се в градуирана от 100 ml колба с 60 ml от сместа (4.6) и се разклаща в продължение на 15 минути на механичен шейкър. Проверява се киселинността и рН се довежда до стойност 2, ако е необходимо, се използва солна киселина (4.3). Приготвя се обем със сместа (4.6) и се смесва добре. Една част се филтрира през подходяща филтърна хартия (напр. Уотман № 1), като се изхвърлят първите 5 ml от филтрата. Взима се една аликвотна част и рН се регулира на 4,5 с разтвор на солна киселина (4.4). Този разтвор се разрежда с буфер (4.5), така че да се получи очакваната концентрация на авопарцин от 4 μg/ml (= U8).От този разтвор се приготвят разтвори U4 (очаквано съдържание: 2 μg/ml), U2 (очаквано съдържание: 1 μg/ml) и U1 (очаквано съдържание: 0,5 μg/ml), посредством последователно разреждане (1 + 1) с буфер (4.5).6.2. Храни за животниПретеглят се 50 g от пробата и 100 ml от сместа (4.6) и се разклащат в продължение на 30 мин. на механичен шейкър. Екстрактът се избистря посредством центрофугиране (като се използва затапени центрофужни тръби), взима се аликвотна част от избистрения екстракт (виж таблицата по-долу) и се регулира киселинността на рН до 4,5 с разтвор на натриев хидроксид (4.4). Тази аликвотна част се разрежда с буфер (4.5), така че да се получи U8 (виж таблицата по-долу).От този разтвор се приготвят разтвори U4 (очаквано съдържание: 1 μg/ml), U2 (очаквано съдържание: 0,5 μg/ml) и U1 (очаквано съдържание: 0,25 μg/ml), посредством последователно разреждане (1 + 1) с буфер (4.5).Ниво на авопарцина в (mg/kg) | 5 | 7,5 | 10 | 15 | 20 | 40 |Тегло на пробата (g(± 0,1г)) | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |Количество на разтвора (4.6)(ml) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |Обем на чистия екстракт | 20 | 15 | 20 | 15 | 20 | 10 |Краен обем (ml): U8 | 25 | 25 | 50 | 50 | 100 | 100 |Очаквана концентрация на U8 (μg/ml) | 2 | Прибл. 2 | 2 | Прибл.2 | 2 | 2 |7. ПРОЦЕДУРА НА АНАЛИЗИРАНЕ НА ПРОБАТА7.1. Посявка върху средата на пробатаПриготвя се посявка на пробната среда (4.1) със съдържащата спори суспензия (3.2) при температура 50 до 60 °С. Посредством предварителни опити върху панички със пробна среда (4.1), се определя количеството суспензия със спори, което е необходимо за получаването на максимално големи и чисти зони на инхибиране, при различните концентрации на авопарцин.7.2. Подготвяне на паничкитеДифузията през агара се осъществява в панички с четирите концентрации на стандартния разтвор (S8, S4, S2, S1) и четирите концентрации на пробния разтвор (U8, U4, U2, U1). Тези четири концентрации на екстракта и стандарта е необходимо да се поставят във всяка паничка. За тази цел, се избират достатъчно големи панички, които да позволят да бъдат направени поне осем отвора с диаметър 10 до 13 mm при разстояние не по-малко от 30 mm между центровете в средата от агар. Опитът трябва да се извършва върху панички, състоящи се от лист стъкло с покрит алуминий или пластмасов пръстен, поставен отгоре, с диаметър 200 mm и височина 20 mm.В паничките се налива количество от средата (4.1), върху което е било направена посявка в съответствие с точка 7.1, така че да се получи слой с дебелина около 2 mm (60 mm за паничка с дебелина 200 mm). Оставя се така че да застане в равна позиция, пробиват се отворите и в тях се поставят точно измерени обеми от пробата и стандартните разтвори (между 0,10 и 0,15 ml на отвор, в зависимост от диаметъра). Всяка концентрация се прилага поне четири пъти, така че всяко определяне да бъде обект на оценяването на 32 зони на инхибиране.7.3. Инкубация (престояване)Паничките се оставят да престоят в продължение на 16 до 18 ч, при температура 30 °С.8. ОЦЕНКАИзмерва се диаметърът на зоните на инхибиране до най-близките 0,1 mm. Записват се средните измервания за всяка концентрация върху хартия за полулогаритмична графика (милиметрова), която показва логаритъма на концентрациите в съотношение с диаметрите на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на "най-добро напасване" както на стандартния разтвор, така и на екстракта, така както е показано например тук по-долу.Пунктът на "най-добро напасване" за стандартното най-ниско ниво (SL), се определя по формулата:a) SL =10Пунктът на "най-добро напасване" за стандартното най-високо ниво (SН), се определя по формулата:б) SH =10Аналогично се изчисляват точките на "най-добро напасване" за най-ниското ниво на екстракта (UL) и за най-високото ниво на екстракта (UH), като се заместят U1, U2, U4 и U8 с S1, S2, S4 и S8 в посочените формули.Изчислените стойности на SL и SH се заместват върху милиметрова хартия и се свързват така че да се получи линията на "най-добро напасване" за стандартния разтвор. Аналогично, се записват стойностите на UL и UH и се свързват така че да се получи линията на "най-добро напасване" за екстракта.В случай, че липсва каквото и да е смущение, линиите трябва да са успоредни. За целите на практиката линиите могат да се приемат за успоредни, при положение че стойностите (SH-SL) и (UH-UL) не се различават с повече от 10 % от техните средни стойности.Ако се установи, че линиите не са успоредни, то или U1 и S1, или U8 и S8 могат да се отхвърлят и да се изчислят SL, SH, UL и UH, като се използват алтернативните формули, така че да се получат линии на "най-добро напасване":a′)SL = 5 S1 + 2 S2 – S46 | или | 5 S2 + 2 S4 – S86 |б′)SH = 5 S4 + 2 S2 – S16 | или | 5 S8 + 2 S4 – S26 |и аналогично за UL и UH. Алтернативните линии на "най-добро напасване" се проверяват за успоредност, така както е показано тук по-горе. В крайния отчет се отбелязва фактът, че резултатът е бил изчислен на база трите нива.Ако се приеме, че линиите са успоредни, тогава се изчислява логаритъмът на относителната активност (логаритъм А) посредством една от следните формули:За четири нива:в) log A =U+ U+ U+ U– S– S– S– S8 × 0,602U4 + U8 + S4 + S8 – U1 – U2 – S1 – S2За три нива:г) log A =U+ U+ U– S– S– S4 × 0,401U4 + S4 – U1 – S1илиг′) log A =U+ U+ U– S– S– S8 × 0,401U8 + S8 – U2 – S2Действителна активност = допусканата активност Х относителна активност.Ако бъде установено, че относителната активност е извън обхвата от 0,5 до 2, опитът се повтаря, като се извършват целесъобразни напасвания към концентрациите на екстракта или ако това не е възможно, към стандартните разтвори. Когато относителната активност не може да бъде ограничена в рамките на необходимия обхват, то всеки получен резултат трябва да се счита за приблизителен и това трябва да се отбележи в крайния отчет.Ако се приеме, че линиите не са успоредни, определянето се повтаря. Ако все още не може да се постигне успоредност на линиите, определянето се счита за незадоволително.9. ПОВТОРЯЕМОСТРазликата между резултатите на двете определяния, които се извършват на базата на една и съща проба и от един и същ аналитик, не трябва да надвишава:- 2 mg/kg в абсолютна стойност — за съдържания на авопарцин от 2 и нагоре до 10 mg/kg,- 20 % спрямо най-високата стойност — за съдържания от 10 до 25 mg/kg,- 5 mg/kg, в абсолютна стойност — за съдържания от 25 до 50 mg/kg,- 10 % спрямо най-високата стойност — за съдържания над 50 mg/kg,2. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА НАТРИЕВ МОНЕНЗИН ПОСРЕДСТВОМ ДИФУЗИЯ В СРЕДА НА АГАР1. ЦЕЛ И ОБХВАТМетодът се използва за определянето на натриев монензин в храните за животни и в предварителните смеси. Долната граница за определянето е 10 mg/kg (10 части на хиляда) [3].2. ПРИНЦИППробата се извлича посредством 90 % метанол. Екстрактът се подлага на съответни процедури, в съответствие със съдържанието на натриев монензин в пробата. Антибиотичната активност се определя, като се измери дифузията на натриев монензин в среда от агар, върху която има посявка на бацилус субтилис. Дифузията се показва чрез формирането на зони за инхибиране на микроорганизмите. За диаметъра на тези зони се приема, че е в директно съотношение спрямо логаритъма на антибиотичната концентрация, в целия спектър на използваните антибиотични концентрации. Чувствителността на тази система на пробата за анализи се намалява в присъствието на натриеви йони.3. МИКРООРГАНИЗЪМ: БАЦИЛУС СУБТИЛИС АТСС 6633 (NCIB 8054)3.1. Поддържане на щамова култураПрави се посявка в тръбички, съдържащи полегати плоскости от културна среда (4.1), с бацилус субтилис и се оставя да пренощува при температура 30 °С. Културата се съхранява в хладилник при температура около 4 °С. Нови посевки се правят ежемесечно.3.2. Подготовка на суспензията от спори [4]Събира се добивът от наскоро приготвената полегата плоскост от агар (3.1) посредством 2 до 3 ml стерилна вода. Тази суспензия се използва, за да се направи посявка върху 300 ml от културната среда (4.1), съдържаща се в колба на Рукс и се оставя да престои три до пет дни при температура 30 °С. Добивът се събира в 15 ml 20 % етанол (4.3), след като се проверява под микроскоп формирането на малки спори, и се смесва добре. Тази суспензия може да се запази в продължение на най-малко пет месеца при температура около 4 °С.4. КУЛТУРНИ СРЕДИ И РЕАГЕНТИ4.1. Културна среда [2]Триптофан | 10 g |Екстракт от дрожди | 3 g |Месо-костен екстракт | 1,5 g |Глюкоза | 1 g |Агар (по качество) | 10—20 g |Вода | 1000 ml |pH 6,5 (след стерилизация). | |4.2. Среда на пробата за анализиГлюкоза | 10 g |Екстракт от дрожди | 2,5 g |Дикалиев хидроген фосфат K2HPO4 | 0,69 g |Калиев дихидроген фосфат KH2PO4 | 0,45 g |Агар (според качеството) | 10 до 20 g |Вода | 1000 ml |pH 6 (след стерилизация). | |4.3. Етанол 20 % (v/v): разреждат се 200 ml етанол с 800 ml вода.4.4. Метанол дехидратен.4.5. Метанол 90 % (v/v): разрежда се 900 ml метанол (4.4) със 100 ml вода.4.6. Метанол 50 % (v/v): разрежда се 500 ml метанол (4.4) с 500 ml вода.4.7. Алуминиев окис, гранулиран (алкоа F, мрежа с 20 дупки; активиран алуминий UG1: фирма "Ланкастър и Ко." или еквивалент).4.8. Стандартни субстанции: натриев монензин с позната активност (напр. от Международната лаборатория за биологични стандарти. Централна ветеринарна лаборатория, Уейбридж, Обединено кралство — графство Сърей КТ 15 3NB).5. АПАРАТУРА5.1. Ротационен вакуумен изпарител, с 250 ml колба с кръгло дъно.5.2. Стъклена тръбичка за хроматографски анализ с вътрешен диаметър: 25 mm с дължина 400 mm, с един отворен край с диаметър 2 mm.5.3. Стъклена тръбичка за хроматографски анализ с вътрешен диаметър: 11 mm с дължина приблизително 300 mm, с един отворен край с диаметър 2 mm.6. СТАНДАРТНИ РЕШЕНИЯРазтваря се точно претеглено количество от стандартната субстанция (4.8) в метанол (4.4), така че да се получи основен разтвор, съдържащ 800 µg натриев монензин на 1 ml. Съхранен в затапена колба при температура 4 °С, този разтвор остава стабилен в продължение на две седмици.От този основен разтвор се подготвят посредством последователно разреждане с 50 % метанол (4.6) следните разтвори:S8 | 8,0 µg/ml |S4 | 4,0 µg/ml |S2 | 2,0 µg/ml |S1 | 1,0 µg/ml |7. ПОДГОТВЯНЕ НА ЕКСТРАКТА7.1. Екстрахиране7.1.1. Предварителни смесиПретегля се количество от пробата с тегло 2 g, добавя се 100 ml 90 % метанол (4.5), хомогенизира се и се центрофугира в продължение на няколко минути. Изплувалият отгоре разтвор се разрежда с 50 % метанол (4.6), така че да се получи очакваното съдържание на натриев монензин от 8 μg/ml (= U8).7.1.2. Храни за животни с ниво на натриевия монензин не по-малко от 50 частици на хиляда.Претегля се количество от пробата с тегло от 10 до 20 грама, добавят се 100 ml 90 % метанол (4.5), хомогенизира се в продължение на 15 минути и разтворът се оставя да се утаи.Вкарва се запушалка от стъклен памук в тесния край на една стъклена тръбичка (5.2) и се добавя алуминиев окис (4.7), като леко се почува, докато колоната достигне височина 75 до 80 mm.Екстрактът се прелива върху колона от алуминиевия окис и филтратът се събира. Разреждат се 30 mm от филтрата до 50 ml с вода. След това се разрежда с 50 % метанол (4.6), така че да се получи очакваното съдържание на натриев монензин от 8 μg/ml (= U8).7.1.3. Храни за животни с ниво на натриевия монензин по-малко от 50 частици на хиляда (до границата от 10 части на хиляда).Претегля се проба с тегло от 10 до 20 грама, добавят се 100 ml 90 % метанол (4.5) и се хомогенизира в продължение на 15 минути. Центрофугира се докато разтворът стане прозрачен.За една проба, съдържаща 20 частици на хиляда натриев монензин, се взимат 40 ml от изплувалата на повърхността течност. За проба, съдържаща 10 частици на хиляда, се вземат 80 ml и се изпаряват под вакуум, върху ротационен изпарител (5.1) при температура не повече от 40 °С. Остатъкът се разтваря в 10 ml 90 % етанол (4.5).Вкарва се запушалка от стъклен памук в тесния край на една стъклена тръбичка (5.3) и се добавя алуминиев окис (4.7), като леко се почуква, докато колоната достигне височина 75 до 80 mm.Прелива се метаноловият разтвор на остатъка върху колоната от алуминиевия окис и филтратът се събира. Колоната се измива с 10 ml 90 % метанол (4.5) и измитите разтвори се комбинират с филтрата.Разтворът се изпарява до изсъхване под вакуум, върху ротационен изпарител (5.1) при температура не повече от 40 °С. Разтваря се остатъкът в 10 ml дехидриран метанол (4.4) и се добавя вода, докато се получи 20 ml. Разтворът се центрофугира при честота на въртене не по-малко от 4000 оборота/мин в продължение на поне пет минути. След това се прави разреждане с 50 % метанол (4.6), така че да се получи очакваното съдържание на натриев монензин от 8 μg/ml (= U8).7.2. Разтвори на пробите за анализиОт разтвор U8, се подготвят разтвори U4 (очаквано съдържание: 4 μg/ml), U2 (очаквано съдържание: 2 μg/ml) и U1 (очаквано съдържание: 1 μg/ml), посредством последователно разреждане (1 + 1) с 50 % разтвор на метанол (4.6).8. ПРОЦЕДУРА НА АНАЛИЗИРАНЕ НА ПРОБАТА8.1. Посявка върху средата на пробатаПрави се посявка върху пробната среда (4.2) със съдържащата спори суспензия (3.2) при температура 50 до 60 °С. Посредством предварителни опити върху панички със пробна среда (4.2), определя се количеството суспензия със спори, което ще е необходимо за получаването на максимално големи и чисти зони на инхибиране, при различните концентрации на натриев монензин.8.2. Подготвяне на паничкитеОсъществява се дифузия през агара върху панички с четирите концентрации на стандартния разтвор (S8, S4, S2, S1) и четирите концентрации на пробния разтвор (U8, U4, U2, U1). Четирите концентрации на екстракта и стандарта е необходимо да се поставят във всяка паничка. За тази цел се избират достатъчно големи панички, които да позволят да бъдат направени поне осем отвора с диаметър 10 до 13 mm с разстояние не по-малко от 30 mm между центровете, в средата от агар. Опитът трябва да се проведе върху панички, състоящи се от лист стъкло с покрит алуминий или пластмасов пръстен, поставен отгоре, с диаметър 200 mm и височина 20 mm.В паничките се налива количество от средата (4.2), върху което е било направена посявка в съответствие с точка 8.1, така че да се получи слой с дебелина около 2 mm (60 ml за паничка с дебелина 200 mm). Оставя се така че да застане в равна позиция, правят се отворите и в тях се поставят точно измерени обеми от пробата за анализи и стандартните разтвори (между 0,10 и 0,15 ml за всеки отвор, в зависимост от диаметъра). Всяка концентрация се прилага поне четири пъти, така че всяко определяне да бъде обект на оценката на 32 зони на инхибиране.8.3. Инкубация (престой)Паничките се оставят да престоят в продължение на приблизително 18 часа при температура 35 до 37 °С.9. ОЦЕНКАИзмерва се диаметърът на зоните на инхибиране до най-близките 0,1 mm. Записват се средните измервания за всяка концентрация върху милиметрова хартия, която показва логаритъма на концентрациите в съотношение с диаметрите на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на "най-добро напасване" както на стандартния разтвор, така и на екстракта, така както е показано например тук по-долу.Пунктът на "най-добро напасване" за стандартното най-ниско ниво (SL) се определя по формулата:a) SL =10Определя се пунктът на "най-добро напасване" за стандартното най-високо ниво (SН), като се използва формулата:б) SH =10Аналогично, се изчисляват точките на "най-добро напасване" за най-ниското ниво на екстракта (UL) и за най-високото ниво на екстракта (UH), като се заместват U1, U2, U4 и U8 със S1, S2, S4 и S8 в посочените формули.Изчислените стойности на SL и SH върху същата хартия за чертане на диаграми (милиметрова) и се обединяват така че да се получи линията на "най-добро напасване" за стандартния разтвор. Аналогично се записват стойностите на UL и UH и се обединяват така че да се получи линията на "най-добро напасване" за екстракта.В случай, че липсва каквото и да е смущение, линиите трябва да са успоредни. За целите на практиката линиите могат да се приемат за успоредни, при положение че стойностите (SH-SL) и (UH-UL) не се различават с повече от 10 % от техните средни стойности.Ако се установи, че линиите не са успоредни, то или U1 и S1, или U8 и S8 могат да се отхвърлят и да се изчислят SL, SH, UL и UH, като се използват алтернативните формули, така че да се получат линии на "най-добро напасване":а')SL = 5 S1 + 2 S2 – S46 | или | 5 S2 + 2 S4 – S86 |б')SH = 5 S4 + 2 S2 – S16 | или | 5 S8 + 2 S4 – S26 |и аналогично за UL и UH. Алтернативните линии на "най-добро напасване" се проверяват за успоредност, както е показано по-горе. В крайния отчет се отбелязва фактът, че резултатът е бил изчислен на база трите нива.Ако се приеме, че линиите са успоредни, се изчислява логаритъмът на относителната активност (логаритъм А) посредством една от следните формули:За четирите нива:в) log A =U+ U+ U+ U– S– S– S– S8 × 0,602U4 + U8 + S4 + S8 – U1 – U2 – S1 – S2За трите нива:г) log A =U+ U+ U– S– S– S4 × 0,401U4 + S4 – U1 – S1илиг') log A =U+ U+ U– S– S– S8 × 0,401U8 + S8 – U2– S2Действителна активност = допусканата активност Х относителната активност.Ако бъде установено, че относителната активност е извън обхвата от 0,5 до 2, опитът се повтаря, като се извършват целесъобразни напасвания към концентрациите на екстракта или, ако това не е възможно, към стандартните разтвори. Когато относителната активност не може да бъде ограничена в рамките на необходимия обхват, всеки получен резултат се счита за приблизителен и това се отбелязва в крайния отчет.Ако се приеме, че линиите не са успоредни, определянето се повтаря. Ако все още не може да се постигне успоредност на линиите, определянето се счита за незадоволително.10. ПОВТОРЯЕМОСТРазликата между резултатите от двете определяния, които се извършват на базата на една и съща проба и от един и същ аналитик, не трябва да надвишава:- 20 % спрямо най-високата стойност - за съдържания на натриев монензин от 10 до 25 mg/kg,- 5 mg/kg в абсолютна стойност - за съдържания от 25 до 50 mg/kg,- 10 % спрямо най-високата стойност - за съдържания над 50 mg/kg.[1] Могат да се използват и други методи, при условие че се установи, че дават аналогични суспензии от спори.[2] Може да се използва всяка продавана на пазара среда с аналогичен състав, която дава същите резултати.[3] 1 mg натриев монензин е еквивалентен на 1000 единици UK.[4] Могат да се използват и други методи, при условие че се установи получаването на аналогични суспензии от спори.--------------------------------------------------