CELEX: 31974L0203
Language: da
Date: 1974-03-25 00:00:00
Title: Kommissionens femte direktiv 74/203/EØF af 25. marts 1974 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol af foderstoffer

Avis juridique important

|

31974L0203

Kommissionens femte direktiv 74/203/EØF af 25. marts 1974 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol af foderstoffer  

EF-Tidende nr. L 108 af 22/04/1974 s. 0007 - 0024 den finske specialudgave: kapitel 3 bind 5 s. 0210  den græske specialudgave: Kapitel 03 bind 10 s. 0168  den svenske specialudgave: kapitel 3 bind 5 s. 0210  den spanske specialudgave: Kapitel 03 bind 7 s. 0191  den portugisiske specialudgave: Kapitel 03 bind 7 s. 0191 

++++  KOMMISSIONENS FEMTE DIREKTIV  af 25 . marts 1974  om fastsaettelse af faellesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol af foderstoffer   ( 74/203/EOEF )  KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -  under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europaeiske oekonomiske Faellesskab ,  under henvisning til Raadets direktiv af 20 . juli 1970 om indfoerelse af faellesskabsproeveudtagningsmaader og -analysemetoder for saa vidt angaar den officielle kontrol med foderstoffer ( 1 ) , senest aendret ved akten ( 2 ) , der er knyttet til traktaten vedroerende nye medlemsstaters tiltraedelse af Det europaeiske oekonomiske Faellesskab og Det europaeiske Atomenergifaellesskab ( 3 ) , undertegnet i Bruxelles den 22 . januar 1972 , saerlig artikel 2 , og  ud fra foelgende betragtninger :  Ovennaevnte direktiv bestemmer , at den officielle kontrol med foderstoffer til konstatering af , om de betingelser , der er fastsat paa grundlag af administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser om foderstoffernes beskaffenhed og sammensaetning , er opfyldt , skal foretages efter faellesskabsproeveudtagningsmaader og -analysemetoder ;  Kommissionens direktiver nr . 71/250/EOEF af 15 . juni 1971 ( 4 ) , nr . 71/393/EOEF af 18 . november 1971 ( 5 ) , nr . 72/199/EOEF af 27 . april 1972 ( 6 ) og nr . 73/46/EOEF af 5 . december 1972 ( 7 ) har allerede fastlagt en raekke faellesskabsanalysemetoder ; i betragtning af den hastighed , hvormed arbejdet siden da er skredet frem , er det hensigtmaessigt at fastlaegge en femte raekke metoder ;  de i dette direktiv fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den staaende Foderstofkomité -  UDSTEDT FOELGENDE DIREKTIV :  Artikel 1  Medlemsstaterne foreskriver , at analyserne i forbindelse med den officielle kontrol af foderstoffer for saa vidt angaar deres indhold af stivelse og af hoejmolekylaere spaltningsprodukter af stivelse i foderstoffer , som indeholder roesnitter , roeaffald , toerrede roeblade eller roetoppe , kartoffelaffald , toergaer , inulinholdige produkter eller fedtegrever , skal foretages efter den metode , der er beskrevet i dette direktivs bilag I .  De almindelige bestemmelser i foerste del ( indledning ) af bilaget til Kommissionens foerste direktiv nr . 71/250/EOEF af 15 . juni 1971 , finder anvendelse paa den metode , der er beskrevet i dette direktivs bilag I .  Artikel 2  Medlemsstaterne foreskriver , at analyserne i forbindelse med den officielle kontrol af foderstoffer for saa vidt angaar deres indhold af amprolium , ethopabat , dinitolmid ( DOT ) , nicarbazin og menadion ( K3 - vitamin ) skal foretages efter de metoder , der er beskrevet i dette direktivs bilag II .  De almindelige bestemmelser i foerste del ( indledning ) af bilaget til Kommissionens foerste direktiv nr . 71/250/EOEF af 15 . juni 1971 , finder med undtagelse af den del , der vedroerer tilberedelsen af analyseproeven , anvendelse paa de metoder , der er beskrevet i dette direktivs bilag II .  Artikel 3  Medlemsstaterne saetter de noedvendige administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser i kraft for senest den 1 . november 1974 at efterkomme bestemmelserne i dette direktiv . De underretter omgaaende Kommissionen herom .  Artikel 4  Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne .  Udfaerdiget i Bruxelles , den 25 . marts 1974 .  Paa Kommissionens vegne  François-Xavier ORTOLI  Formand  ( 1 ) EFT nr . L 170 af 3 . 8 . 1970 , s . 2 .  ( 2 ) EFT nr . L 73 af 27 . 3 . 1972 , s . 14 .  ( 3 ) EFT nr . L 73 af 27 . 3 . 1972 , s . 5 .  ( 4 ) EFT nr . L 155 af 12 . 7 . 1971 , s . 13 .  ( 5 ) EFT nr . L 279 af 20 . 12 . 1971 , s . 7 .  ( 6 ) EFT nr . L 123 af 29 . 5 . 1972 , s . 6 .  ( 7 ) EFT nr . L 83 af 30 . 3 . 1973 , s . 21 .  BILAG I  BESTEMMELSE AF STIVELSE   ( Efter pankreatin-metoden )  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden goer det muligt at bestemme indholdet af stivelse og af hoejmolekylaere spaltningsprodukter af stivelse i foderstoffer , som indeholder roesnitter , roeaffald , toerrede roeblade eller roetoppe , kartoffelaffald , toergaer , inulinholdige produkter  ( f.eks . snitter og mel af jordskokker ) eller fedtegrever . Bestemmelsen foretages kun , hvor en mikroskopisk undersoegelse viser et ikke ubetydeligt indhold af stivelse i proeven .  2 . Princip  De i proeven forekommende sukkerarter fjernes ved ekstraktion med ethanol , hvorefter stivelsen i remanensen reduceres til sukker ved hjaelp af pankreatin . De opstaaede sukkerarter hydrolyseres med saltsyre , og den dannede glucosemaengde bestemmes efter Luff-Schoorl-metoden . Denne glucosemaengde giver med multiplikation med en konstant faktor proevens indhold af stivelse .  3 . Reagenser  3.1 . 90 % ( rf . ) ethanol , neutral over for fenolfthalein  3.2 . N-amylalkohol p.a .  3.3 . Toluen p.a .  3.4 . Bufferoploesning : 9,078 g kaliumdihydrogenphosphat KH2PO4 og 11,876 g dinatriumhydrogenphosphat Na2HPO4 , 2H2O oploeses i vand . Der fyldes op med vand til 1 liter  3.5 . 0,2 n natriumchloridoploesning  3.6 . Carrez I oploesning : 21,9 g zinkacetat Zn(CH3COO)2 , 2H2O og 3 g iseddikesyre oploeses i vand , og der fyldes op med vand til 100 ml  3.7 . Carrez II oploesning : 10,6 g kaliumferrocyanid K4 ( Fe ( CN6 ) ) , 3H2O oploeses i vand , og der fyldes op med vand til 100 ml  3.8 . 1 n saltsyre  3.9 . Saltsyre p.a . , ca . 8 n , mf . = 1,125  3.10 . Natriumhydroxydoploesning p.a . , ca . 10 n , mf . = 1,33  3.11 . Indikator : 0,1 % ( vaegt ) methylorangeoploesning  3.12 . Pankreatin i pulverform , svarende til forskrifterne under punkt 8 . Opbevares , beskyttet imod lys og fugtighed , i tilproppet flaske  3.13 . Luff-Schoorl-reagens : Under forsigtig omrystning saettes citronsyreoploesningen ( 3.13.2 ) til natriumcarbonatoploesningen ( 3.13.3 ) .  Derefter tilsaettes kobbersulfatoploesningen  ( 3.13.1 ) , og der fyldes op med vand til 1 liter . Blandingen henstaar natten over og filtreres . Normaliteten af det saaledes opnaaede reagens kontrolleres ( 0,1 n Cu ; 2 n Na2 CO3 ) . Oploesningens pH skal vaere ca . 9,4  3.13.1 . Kobbersulfatoploesning : 25 g kobbersulfat p.a . , CuSO4 , 5H2O , oploeses i 100 ml vand  3.13.2 . Citronsyreoploesning : 50 g citronsyre p.a . , C6H8O7 , H2O , oploeses i 50 ml vand  3.13.3 . Natriumcarbonatoploesning : 143,8 g vandfrit natriumcarbonat p.a . oploeses i ca . 300 ml varmt vand , og oploesningen saettes til afkoeling  3.14 . Granuleret pimpsten , udkogt med saltsyre , vasket med vand og toerret  3.15 . 30 % ( vaegt ) kaliumiodidoploesning p.a .  3.16 . Svovlsyre , ca . 6 n , mf . = 1,18  3.17 . 0,1 n natriumthiosulfatoploesning  3.18 . Stivelsesoploesning : en blanding af 5 g oploeselig stivelse i 30 ml vand tilsaettes til 1 liter kogende vand . Blandingen holdes kogende i 3 minutter og hensaettes derefter til afkoeling . Tilberedes umiddelbart foer brugen .  4 . Apparatur  4.1 . Ekstraktionsapparat ( se skitsen s . 12 ) bestaaende af :  4.1.1 . En 500 ml konisk kolbe med vid hals  4.1.2 . En tilbagesvaler tilpasset til den koniske kolbe med en prop  4.1.3 . En glidestang igennem tilbagesvalerens midterroer forsynet med en krog i den nederste ende . En klemme til at fastholde stangen med  4.1.4 . En metalkurv til at haenge op paa glidestangens krog ( 4.1.3 ) , saa den kan baere filtrerdiglen ( 4.1.5 ) ;  4.1.5 . En hurtigfiltrerdigel paa ca . 30 ml . Maks . porestoerrelse : 90 - 150 um ( f.eks . G 1 ) ;  4.1.6 . Filtrerpapir , som passer til filtrerdiglen  ( 4.1.5 ) ;  4.2 . Varmeskab , indstillet paa 38 * C .  4.3 . 200 ml maalekolber med normalslip og tilbagesvaler .  4.4 . 100 ml maalekolber med normalslib og tilbagesvaler .  5 . Fremgangsmaade  5.1 . Tilberedning af proeven  Proeven findeles i en saadan grad , at den i sin helhed kan gaa igennem en sigte med en maskevidde paa 0,5 mm .  5.2 . Ekstraktion  Med en noejagtighed paa 1 mg afvejes 2 g af proeven og anbringes i filtrerdiglen ( 4.1.5 ) , hvis bund forud daekkes med et stykke filtrerpapir ( 4.1.6 ) , fugtet med ethanol ( 3.1 ) , 55 ml ethanol ( 3.1 ) haeldes sammen med nogle stykker pimpsten ( 3.14 ) i den koniske kolbe ( 4.1.1 ) , og filtrerdiglen anbringes i metalkurven ( 4.1.4 ) , som ophaenges paa krogen af glidestangen ( 4.1.3 ) . Svaleren anbringes over den koniske kolbe , og glidestangen saenkes saa meget , at bunden af diglen netop beroerer ethanolens overflade , hvorefter stangen ved hjaelp af klemmen fastgoeres i denne stilling . Ethanolen bringes i kog og holdes kogende i 3 timer . Derefter henstaar kolben til afkoeling , idet glidestanden ( 4.1.3 ) haeves , saaledes at diglen anbringes saa hoejt som muligt i kolben . Proppen tages forsigtigt af kolben , og man lader 45 ml vand loebe ned langs dennes inderside , hvorefter svaleren paa ny anbringes over den koniske kolbe , idet filtrerdiglen holdes 10 cm over vaeskens overflade . Vaesken bringes i kog og holdes kogende i 3 timer . Derefter hensaettes den til afkoeling , proppen tages af , og diglen fjernes fra kurven .  5.3 . Enzymatisk hydrolyse og invertering  Filtrerdiglen anbringes i en Buechnertragt og toerres ved sugning . Ekstraktionsremanensen findeles i en morter , og pulveret overfoeres ved hjaelp af ca . 60 ml vand til en 200 ml maalekolbe med normalslib . Derefter tilsaettes et par draaber amylalkohol ( 3.2 ) , og en tilbagesvaler anbringes over kolben . Vaesken bringes i kog og holdes kogende i 1 time , hvorefter den hensaettes til afkoeling , og svaleren fjernes .  Der tilsaettes 25 ml bufferoploesning ( 3.4 ) . 250 mg pankreatin ( 3.12 ) , 2,5 ml natriumchloridoploestung  ( 3.5 ) og 10 draaber toluen ( 3.3 ) . Kolben rystes i 2 minutter og anbringes i varmeskabet ( 4.2 ) , hvor den under lejlighedsvis omrystning opbevares i 21 timer for derpaa af afkoeles til stuetemperatur .  Der tilsaettes 5 ml Carrez I oploesning ( 3.6 ) og omrystes i 1 minut ; derefter 5 ml Carres II oploesning ( 3.7 ) , fulgt af en ny omrystning paa 1 minut . Der fyldes op med vand , blandes omhyggeligt og filtreres . Med pipette overfoeres 50 ml af filtratet til en 100 ml maalekolbe ( eller 100 ml filtrat til en 200 ml maalekolbe ) . Der tilsaettes et par draaber indikatoroploesning ( 3.11 ) og derpaa 8 n saltsyre  ( 3.9 ) indtil omslag til roedt . Derefter tilsaettes yderligere 6,25 ml 8 n saltsyre ( 3.9 ) ( 12,50 ml hvis der arbejdes med 100 ml filtrat ) , og kolben forbindes med tilbagesvaleren . Oploesningen opvarmes til kogepunktet og holdes kogende i 1 time , hvorefter den afkoeles , og der neutraliseres med 10 n natriumhydroxydoploesning  ( 3.10 ) , indtil indikatoren slaar om til gult . Derpaa goeres oploesningen svagt sur ved tilsaetning af en smule 1 n saltsyre ( 3.8 ) , og der fyldes op med vand og blandes grundigt . Glucoseindholdet bestemmes efter Luff-Schoorl-metoden , som angivet under 5.4 .  5.4 . Titrering efter Luff-Schoorl-metoden  Med en pipette anbringes 25 ml af Luff-Schoorl-reagensen  ( 3.13 ) i en 300 ml konisk kolbe , og der tilsaettes noejagtigt 25 ml af den efter 5.3 fremstillede oploesning , som maksimalt maa indeholde 60 mg glucose . To stykker pimpsten ( 3.14 ) haeldes i kolben , som under manuel omrystning opvarmes over en middelstor flamme , saaledes at vaesken i loebet af ca . 2 minutter opvarmes til kogepunktet . Derpaa anbringes kolben omgaaende paa et traadnet med en asbestskive , hvori er udstanset et hul med en diameter paa ca . 6 cm . Forinden er der under traadnettet anbragt en flamme , indstillet saaledes , at kun bunden af den koniske kolbe opvarmes . Saa forbindes kolben med en tilbagesvaler , og vaesken koges i noejagtig 10 minutter og afkoeles derpaa oejeblikkeligt i koldt vand . Efter ca . 5 minutters forloeb titreres paa foelgende maade :  Foerst tilsaettes 10 ml kaliumiodidoploesning ( 3.15 ) og umiddelbart derefter meget forsigtigt ( paa grund af faren for kraftig skumdannelse ) 25 ml 6 n svovlsyre ( 3.16 ) . Saa titreres med 0,1 n natriumthiosulfatoploesning ( 3.17 ) , indtil oploesningen antager en matgul farve . Endelig tilsaettes et par draaber stivelsesoploesning ( 3.18 ) som indikator , og titreringen tilendebringes .  Samme titrering gennemfoeres med en blanding af noejagtigt 25 ml Luff-Schoorl-reagens ( 3.13 ) og 25 ml vand efter tilsaetning af 10 ml kaliumiodidoploesning  ( 3.15 ) og 25 ml 6 n svovlsyre ( 3.16 ) , men uden forudgaaende opvarmning .  5.5 . Blindproeve  Et blindforsoeg , det vil sige et forsoeg uden proeve , gennemfoeres efter den under 5.3 og 5.4 beskrevne fremgangsmaade .  6 . Beregning  Ved hjaelp af tabellen i bilaget bestemmes den glucosemaengde i mg , der svarer til forskellen imellem resultaterne af de to titreringer  ( udtrykt i ml 0,1 n natriumthiosulfat ) saavel for proevens som for blindproevens vedkommende .  Proevens stivelsesindhold i procent beregnes efter formlen :  0,72 ( a - b )  hvor  a = mg glucose i proeven  b = mg glucose i blindproeven ( se bemaerkning 7.2 ) .  7 . Bemaerkninger  7.1 . En samtidig tilstedevaerelse i proeven af lactose og af stivelse , som helt eller delvis er omdannet til dekstrin , kan foere til , at det beregnede stivelsesindhold ligger 0,5 - 3 % for hoejt . I saadanne tilfaelde bestemmes det virkelige stivelsesindhold paa foelgende maade :  a ) Foerst bestemmes indholdet af reducerende sukkerarter i den efter 5.2 udvundne ethanolekstrakt , og resultatet udtrykkes i procent glucose .  b ) Dernaest bestemmes proevens indhold af vandoploeselige reducerende sukkerarter , ligeledes udtrykt i procent glucose .  c ) Det under a ) opnaaede resultat traekkes fra det under b ) opnaaede , og forskellen multipliceres med 0,9 .  d ) Den under c ) fremkomne vaerdi traekkes fra det resultat , som opnaaedes ved beregningen af stivelsesindholdet efter den under 6 . angivne metode .  7.2 . Glucosemaengden ligger for blindproevens vedkommende normalt paa 0,25 mg og maa ikke overstige 0,50 mg .  8 . Forskrifter vedroerende pankreatin  Tilstandsform : Gullig-hvidt amorft pulver .  Glucoseindhold : Glucosemaengden for blindproeven  ( se 5.5 ) ligger normalt paa 0,25 mg . Resultater paa over 0,50 mg betyder , at pankreatinen ikke laengere er anvendelig .  Kontrolproeve med hensyn til iodforbrug : 62,5 mg pankreatin opslemmes i ca . 50 ml vand ved en temperatur paa 25 - 30 * C . Der tilsaettes 1 ml 0,1 n iodoploesning og omroeres i 2 minutter . Derpaa titreres med 0,1 n natriumthiosulfatoploesning efter tilsaetning af stivelsesindikator . Pankreatinens forbrug af 0,1 n iodoploesning maa ikke overstige 0,5 ml .  Kontrolproeve med hensyn til amylolytisk reaktion : 100 ml stivelsesoploesning ( 3.18 ) , 5 ml bufferoploesning ( 3.4 ) og 0,5 ml natriumchloridoploesning ( 3.5 ) blandes med 62,5 mg pankreatin , og blandingen opvarmes til 25 - 30 * C under samtidig omroering i 2 minutter . Saa tilsaettes 1 ml 0,1 n iodoploesning . Den blaa farve skal vaere forsvundet senest 15 minutter efter tilsaetningen af iodoploesningen .  Tabel for 25 ml Luff-Schoorl-reagens  ml 0,1 n Na2S2O3 ved 2 minutters opvarmning og 10 minutters kogning  0,1 n Na2S2O3 * Glucose , fructose , invertsukker C6H12O6 * Lactose C12H22O11 * Maltose C12H22O11 * 0,1 n Na2S2O3 *  ml * mg * differens * mg * differens * mg * differens * ml *  1 * 2,4 * * 3,6 * * 3,9 * * 1 *   * * 2,4 * * 3,7 * * 3,9 * *  2 * 4,8 * * 7,3 * * 7,8 * * 2 *   * * 2,4 * * 3,7 * * 3,9 * *  3 * 7,2 * * 11,0 * * 11,7 * * 3 *   * * 2,5 * * 3,7 * * 3,9 * *  4 * 9,7 * * 14,7 * * 15,6 * * 4 *   * * 2,5 * * 3,7 * * 4,0 * *  5 * 12,2 * * 18,4 * * 19,6 * * 5 *   * * 2,5 * * 3,7 * * 3,9 * *  6 * 14,7 * * 22,1 * * 23,5 * * 6 *   * * 2,5 * * 3,7 * * 4,0 * *  7 * 17,2 * * 25,8 * * 27,5 * * 7 *   * * 2,6 * * 3,7 * * 4,0 * *  8 * 19,8 * * 29,5 * * 31,5 * * 8 *   * * 2,6 * * 3,7 * * 4,0 * *  9 * 22,4 * * 33,2 * * 35,5 * * 9 *   * * 2,6 * * 3,8 * * 4,0 * *  10 * 25,0 * * 37,0 * * 39,5 * * 10 *   * * 2,6 * * 3,8 * * 4,0 * *  11 * 27,6 * * 40,8 * * 43,5 * * 11 *   * * 2,7 * * 3,8 * * 4,0 * *  12 * 30,3 * * 44,6 * * 47,5 * * 12 *   * * 2,7 * * 3,8 * * 4,1 * *  13 * 33,0 * * 48,4 * * 51,6 * * 13 *   * * 2,7 * * 3,8 * * 4,1 * *  14 * 35,7 * * 52,2 * * 55,7 * * 14 *   * * 2,8 * * 3,8 * * 4,1 * *  15 * 38,5 * * 56,0 * * 59,8 * * 15 *   * * 2,8 * * 3,9 * * 4,1 * *  16 * 41,3 * * 59,9 * * 63,9 * * 16 *   * * 2,9 * * 3,9 * * 4,1 * *  17 * 44,2 * * 63,8 * * 68,0 * * 17 *   * * 2,9 * * 3,9 * * 4,2 * *  18 * 47,1 * * 67,7 * * 72,2 * * 18 *   * * 2,9 * * 4,0 * * 4,3 * *  19 * 50,0 * * 71,7 * * 76,5 * * 19 *   * * 3,0 * * 4,0 * * 4,4 * *  20 * 53,0 * * 75,7 * * 80,9 * * 20 *   * * 3,0 * * 4,1 * * 4,5 * *  21 * 56,0 * * 79,8 * * 85,4 * * 21 *   * * 3,1 * * 4,1 * * 4,6 * *  22 * 59,1 * * 83,9 * * 90,0 * * 22 *   * * 3,1 * * 4,1 * * 4,6 * *  23 * 62,2 * * 88,0 * * 94,6 * * 23 *  FIGUR : JFR . EFT  BILAG II  1 . BESTEMMELSE AF AMPROLIUM   ( 1-(4-amino-2-propyl-5-pyrimidylmethyl)-2 -picoliniumchlorid-hydrochlorid )  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden goer det muligt at bestemme amproliumindholdet i foderstoffer , koncentrater og forblandinger . Den mindste maengde , der kan bestemmes , er 40 ppm .  2 . Princip  Proeven ekstraheres med fortyndet methanol . Ekstrakten renses paa en soejle af aluminiumoxyd og behandles med en methanoloploesning af 2,7-dihydroxynaphthalen , kaliumferricyanid , kaliumcyanid og natriumhydroxyd . Der fremkommer en purpurfarvning , og amproliumindholdet bestemmes spektrofotometrisk ved 530 nm .  3 . Reagenser  3.1 . Methanol p.a .  3.2 . Fortyndet methanol : 2 dele methanol  ( 3.1 ) blandes med 1 del vand .  3.3 . 0,2 % ( vaegt ) oploesning af kaliumferricyanid p.a . , K3Fe(CN)6 . Denne oploesning kan holde sig i to uger .  3.4 . 1 % ( vaegt ) oploesning af kaliumcyanid p.a . Oploesningen kan holde sig i to uger .  3.5 . 1,125 % ( vaegt ) oploesning af natriumhydroxyd p.a .  3.6 . Methanolisk natriumhydroxydoploesning : 15 ml af ( 3.5)-oploesningen fyldes op med methanol til 200 ml .  3.7 . 0,0025 % ( vaegt ) oploesning af 2,7-dihydroxynaphthalen : 25 mg 2,7-dihydroxynaphtalen p.a . oploeses i methanol ( 3.1 ) , og der fyldes op med methanol ( 3.1 ) til 1000 ml .  3.8 . Farvereagens : 90 ml 2,7-dihydroxynaphthalenoploesning ( 3.7 ) blandes i en 250 ml konisk kolbe ( 4.1 ) med 5 ml kaliumferricyanidoploesning ( 3.3 ) .  Derpaa tilsaettes 5 ml kaliumcyanidoploesning  ( 3.4 ) , hvorefter kolben tilproppes og rystes grundigt . Herefter lader man kolben henstaa i 30 - 35 minutter for til slut at tilsaette 100 ml methanoloploesning af natriumhydroxyd ( 3.6 ) , blande godt og filtrere paa en filtrerdigel ( 4.3 ) . Dette reagens maa anvendes i maksimalt 75 minutter efter filtreringen .  3.9 . Aluminiumoxyd til soejlechromatografi . Umiddelbart forud for anvendelsen rystes 100 g aluminiumoxyd med 500 ml vand i 30 minutter , filtreres og vaskes tre gange med 50 ml methanol  ( 3.1 ) pr . gang , toerres ved sugning , henstaar natten over og vakuumtoerres i 2 timer ved 100 * C for til slut af afkoeles i en ekssikkator . Aluminiumoxydet efterproeves ved at analysere kendt maengde standardoploesning ( 3.11 ) efter den beskrevne fremgangsmaade , begyndende ved punkt 5.2 Genfindelsesprocenten for amprolium skal vaere 100 % mere eller mindre 4 % .  3.10 . Standardsubstans : rent amprolium , som udviser foelgende karakteristiske egenskaber : Smeltepunkt ( soenderdeling ) : 248 * C .  Molekylaer lysabsorptionskoefficient ved baade 265 og 235 nm i destilleret vand : 11.0 gange 10 3 .  3.11 . Standardoploesning : 50 mg standardsubstans  ( 3.10 ) afvejes med en noejagtighed paa 0,1 mg og oploeses i fortyndet methanol ( 3.2 ) i en 500 ml maalekolbe . Der fyldes op til maerket med oploesningsmiddel og blandes omhyggeligt . 10 ml af blandingen overfoeres til en maalekolbe , fyldes op til 50 ml med fortyndet methanol ( 3.2 ) og blandes grundigt . 1 ml af denne oploesning indeholder 20 mg amprolium .  4 . Apparatur  4.1 . 50 ml , 250 ml og 500 ml koniske kolber med sleben glasprop .  4.2 . Rysteapparat .  4.3 . Filtrerdigel , poroesitet G 3 , diameter : 60 mm .  4.4 . Chromatografiroer af glas ( indvendig diameter : 9 mm , laengde : 400 - 500 mm ) .  4.5 . Centrifuge og 25 ml centrifugeglas med sleben prop .  4.6 . Spektrofotometer med 10 mm kuvetter .  5 . Fremgangsmaade  5.1 . Ekstraktion og rensning  5.1.1 . Foderstoffer og forblandinger  Med en noejagtighed paa 1 mg afvejes 10 g omhyggeligt findelt og homogeniseret proevemateriale .  ( Forblandinger afvejes med en noejagtighed paa 1 mg i maengder paa 3 - 6 g ) . Proevematerialet haeldes i en 250 ml konisk kolbe ( 4.1 ) , og der tilsaettes noejagtig 100 ml fortyndet methanol ( 3.2 ) . Derpaa omrystes i 60 minutter og filtreres . Om noedvendigt fortyndes med fortyndet methanol ( 3.2 ) for at faa en oploesning , som indeholder 5 - 15 mg amprolium pr . ml .  I et chromatografiroer ( 4.4 ) , som i bunden er forsynet med en vatprop , haeldes 5 g aluminiumoxyd ( 3.9 ) 25,0 ml ekstrakt saettes paa soejlen . De foerste 5 ml , som loeber igennem , kassetes , og de naeste 12 ml opsamles i et maaleglas .  5.1.2 . Koncentrater  Med en noejagtighed paa 1 mg afvejes 0,5 g omhyggeligt findelt og homogeniseret proevemateriale og haeldes i en 500 ml konisk kolbe ( 4.1 ) . Der tilsaettes noejagtig 250 ml fortyndet methanol ( 3.2 ) , omrystes i 60 minutter og filtreres 5,0 ml af filtratet overfoeres til en maalekolbe og fyldes op til 200 ml med fortyndet methanol ( 3.2 ) .  5.2 . Farvendvikling og maaling af lysabsorption  5,0 ml af den under 5.1.1 eller 5.1.2 fremstillede oploesning overfoeres til et centrifugeglas A  ( 4.5 ) og 5,0 ml fortyndet methanol ( 3.2 ) til et andet centrifugeglas B ( 4.5 ) . Til hvert af glassene A og B saettes 10,0 ml farvereagens ( 3.8 ) , hvorefter glassene tilproppes , omrystes og henstaar i 18 minutter . Derpaa centrifugeres i 3 minutter for at opnaa en klar oploesning , hvorefter oploesningerne A og B dekanteres over i to 50 ml koniske kolber ( 4.1 ) .  Lysabsorptionen af oploesning A maales umiddelbart herefter i et spektrofotometer ved 530 nm og med oploesning B som blindproeve . Amproliumindholdet bestemmes paa grundlag af kalibreringskurven ( 5.3 ) .  5.3 . Kalibreringskurve  I 5 centrifugeglas ( 4.5 ) afpipetteres henholdsvis , 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 og 5,0 ml standardoploesning  ( 3.11 ) . De fire foerste glas fyldes derpaa op til 5,0 ml med fortyndet methanol ( 3.2 ) . Alle 5 glas tilsaettes nu 10,0 ml farvereagens ( 3.8 ) , tilproppres , omrystes og henstaar i 18 minutter . Derefter centrifugeres oploesningerne i 3 minutter og dekanteres over i 50 ml koniske kolber ( 4.1 ) .  Oploesningernes lysabsorption maales derpaa straks i spektrofotometret ved 530 nm , idet der som blindproeve benyttes en blanding af 5 ml fortyndet methanol ( 3.2 ) og 10 ml farvereagens ( 3.8 ) . Kalibreringskurven optegnes nu ved at afsaette lysabsorptionsvaerdierne som ordinat og de tilsvarende amproliummaengder i mg som abscisse .  6 . Beregning  6.1 . Foderstoffer og forblandinger  Amproliumindholdet i mg pr . kg proevemateriale beregnes efter formlen :  A/P * F . 20 000  hvor :  A = amproliummaengden i mg , bestemt ved den fotometriske maaling  P = proevens vaegt i gram  F = fortyndingsgraden ( saaledes som evt . anvendt under 5.1.1 ) .  6.2 . Koncentrater  Det procentisk amproliumindhold i proevematerialet beregnes efter formlen :  A/P * 200  hvor :  A = amproliummaengden i mg , bestemt ved den fotometriske maaling  P = proevens vaegt i gram .  7 . Reproducerbarhed  Forskellen mellem resultaterne af dobbeltbestemmelser maa ikke overstige :  10 ppm i absolut vaerdi for et amproliumindhold paa under 100 ppm ;  10 % i relativ vaerdi for et indhold i mellem 100 og 5 000 ppm ;  500 ppm i absolut vaerdi for et indhold i mellem 5 000 og 10 000 ppm ;  5 % i relativ vaerdi for et indhold paa over 10 000 ppm .  2 . BESTEMMELSE AF ETHOPABAT   ( methyl-4-acetamido-2-ethoxybenzoat )  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden goer det muligt at bestemme ethopabatindholdet i foderstoffer , koncentrater og forblandinger . Den mindste maengde , der kan bestmmes , er 2 ppm .  2 . Princip  Proeven ekstraheres med fortyndet methanol . Oploesningen goeres sur og ekstraheres med chloroform . Chloroformekstrakten vaskes foerst med en alkalisk oploesning og derefter med vand . Den rensede ekstrakt koncentreres , og ethopabatet hydrolyseres med fortyndet saltsyre . Det saaledes fremkomne aminoderivat diazoteres og sammenkobles med 2-aminoethyl-1-naphthylamin . Det farvede kompleks ekstraheres med butanol , og oploesningens lysabsorption maales ved 555 nm .  3 . Reagenser  3.1 . Methanol p.a .  3.2 . 50 % ( rf . ) methanol : blanding af lige dele methanol ( 3.1 ) og vand .  3.3 . Saltsyre p.a . mf . = 1,19 .  3.4 . 1/10 fortyndet saltsyre : 10,0 ml saltsyre  ( 3.3 ) fyldes op med vand til 100 ml .  3.5 . Ca . 0,3 n saltsyre : 25,0 ml saltsyre ( 3.3 ) fyldes op med vand til 1000 ml .  3.6 . Chloroform p.a .  3.7 . 4 % ( vaegt ) natriumcarbonatoploesning : 40,0 g vandfrit natriumcarbonat p.a . oploeses i vand , og der fyldes op med vand til 1000 ml .  3.8 . 0,2 % ( vaegt ) natriumnitritoploesning : 100 mg analyserent natriumnitrit p.a . oploeses i vand , og der fyldes op med vand til 50 ml . Tilberedes umiddelbart foer anvendelsen .  3.9 . 1,0 % ( vaegt ) ammoniumamidsulfonatoploesning : 500 mg amidsulfonat p.a . oploeses i vand i en maalekolbe , og der fyldes op med vand til 50 ml . Tilberedes umiddelbart foer anvendelsen .  3.10 . 0,2 % ( vaegt ) 2-aminoethyl-1-naphtylaminoploesning : 100 mg 2-aminoethyl-1-naphthylamin p.a . oploeses i vand i en maalekolbe , og der fyldes op med vand til 50 ml . Tilberedes umiddelbart foer anvendelsen .  3.11 . Vandfrit natriumchlorid p.a .  3.12 . n-butanol p.a .  3.13 . Standardsubstans : rent ethopabat .  3.14 . Standardoploesninger :  3.14.1 . Ethopabatoploesning paa 0,040 mg/ml : 40 mg standardsubstans ( 3.13 ) afvejes med en noejagtighed paa 0,1 mg og oploeses i fortyndet methanol ( 3.2 ) i en 100 ml maalekolbe . Der fyldes op til maerket med samme oploesningsmiddel og blandes omhyggeligt . 10,0 ml af denne oploesning overfoeres til en anden maalekolbe , fortyndes med methanol ( 3.2 ) til 100 ml og blandes godt . Denne oploesning kan kun holde sig i en maaned .  3.14.2 . Ethopabatoploesning paa 0,016 mg/20 ml : 5,0 ml af ( 3.14.1 ) -oploesningen fortyndes i en maalekolbe med fortyndet methanol ( 3.2 ) til 250 ml og blandes grundigt . Tilberedes frisk foer anvendelsen .  4 . Apparatur  4.1 . 250 ml koniske kolber med sleben prop .  4.2 . 100 ml skilletragte med sleben prop .  4.3 . Rysteapparat .  4.4 . Vakuum-rotations-fordamper med 250 ml kolber .  4.5 . Vandbad .  4.6 . Centrifuge og 15 ml og 50 ml centrifugeglad med normalslib og glasprop .  4.7 . Luftkoeler med normalslib .  4.8 . Spektrofotometer med 10 mm kuvetter .5 . Fremgangsmaade  5.1 . Ekstraktion  Med en noejagtighed paa 1 mg afvejes en omhyggeligt findelt og homogeniseret proevemaengde , som indeholder ca . 80 mg ethopabat . Proeven fyldes i en 250 ml konisk kolbe ( 4.1 ) og blandes med 100,0 ml fortyndet methanol  ( 3.2 ) , hvorefter kolben tilproppes og omrystes i 1 time paa rysteapparatet ( 4.3 ) . Efter bundfaeldelse filtreres , idet de foerste ml af filtratet kasseres .  5.2 . Rensning  NB . De arbejdsoperationer , som er beskrevet under dette punkt , skal udfoeres hurtigt . 20,0 ml af den klare ekstrakt haeldes i en 100 ml skilletragt ( 4.2 ) , og der tilsaettes 5,0 ml 1/10 fortyndet saltsyre ( 3.4 ) og 20,0 ml chloroform ( 3.6 ) . Derpaa omrystes foerst forsigtigt og dernaest kraftigt i 3 minutter . Blandingen henstaar , indtil faserne er adskilt , og chloroformfasen opsamles derpaa i en anden 100 ml skilletragt ( 4.2 ) .  Den sure fase ekstraheres to gange med 20,0 ml chloroform  ( 3.6 ) pr . gang , og chloroformekstrakterne opsamles begge i den anden skilletragt , medens den sure fase bortkastes . Chloroformoploesningen tilsaettes 10 ml natriumcarbonatoploesning ( 3.7 ) , omrystes i 3 minutter og henstaar , indtil faserne er adskilt . Chloroformfasen opsamles i en tredje 100 ml skilletragt ( 4.2 ) , og vandfasen kastes bort . Chloroformoploesningen tilsaettes 10 ml natriumcarbonatoploesning ( 3.7 ) , omrystes i 3 minutter og henstaar , indtil faserne er adskilt .  Chloroformfasen opsamles i en fjerde 100 ml skilletragt  ( 4.2 ) , og vaskes to gange med 25 ml vand pr . gang . Vandfaserne haeldes sammen og chloroformekstrakten overfoeres kvantitativt til en 250 ml kolbe ( 4.4 ) . De toemte skilletragte renses med nogle ml chloroform  ( 3.6 ) , hvorefter vandfasen vaskes med denne chloroform . Chloroformfasen skilles fra og overfoeres ligeledes til 250 ml kolben .  5.3 . Hydrolyse  Chloroformekstrakten inddampes ved hjaelp af vakuum-rotations-fordamperen ( 4.4 ) . Vandbadets temperatur skal vaere 50 * C . Remanensen oploeses i 2-3 ml methanol  ( 3.1 ) og overfoeres ved hjaelp af to 10 ml portioner og en 5 ml portion paa ca . 0,3 n saltsyre ( 3.5 ) til et 50 ml centrifugerglas ( 4.6 ) . Der blandes godt og tilsaettes nogle stykker pimpsten , hvorefter luftkoeleren ( 4.7 ) saettes paa , og glasset nedsaenkes i kogende vand i 45 minutter . Til slut afkoeles det under rindende vand .  5.4 . Farveudvikling og maaling af lysabsorption  Man tilsaetter 1,0 ml natriumnitritoploesning ( 3.8 ) , omryster og lader henstaa i 2 minutter . Saa tilsaetter man 1.0 ml ammoniumsulfamat-oploesning ( 3.9 ) , omryster og lader henstaa i 10 minutter . Endelig tilsaetter man 1,0 ml 2-aminoethyl-1-naphthylaminoploesning ( 3.10 ) , omryster og lader henstaar i 10 minutter . Endelig tilsaetter man 5,0 g natriumchlorid ( 3.11 ) og 10,0 ml n-butanol ( 3.12 ) og omryster kraftigt , indtil natriumchloridet er fuldsaetndigt oploest .  Med en pipette overfoeres butanolfasen , som ligger oeverst ( oeverste fase ) , til et 15 ml centrifugeglas ( 4.6 ) og centrifugeres . Derpaa maales lysabsorptionen E A med et spektrofotometer ved 555 nm , idet n-butanol ( 3.12 ) bruges som blindproeve .  5.5 . Blindforsoeg  Efter samme fremgangsmaade , begyndende ved punkt 5.2 , gennemfoeres et blindforsoeg med 20,0 ml fortyndet methanol ( 3.2 ) , idet lysabsorptionen E B maales ved 555 nm med n-butanol ( 3.12 ) som blindproeve .  5.6 . Standardforsoeg  Efter samme fremgangsmaade , begyndende ved punkt 5.2 , gennemfoeres et standardforsoeg med 20,0 ml standardoploesning ( 3.14.2 ) , idet lysabsorptionen E C maales ved 555 nm med n-butanol ( 3.12 ) som blindproeve .  6 . Beregning  Ethopabatindholdet i proevematerialet i mg/kg beregnes efter formlen :   ( E A - E B ) / ( E C - E B ) * 80/P  hvor :  E A = lysabsorptionen for oploesningen af proevematerialet  E B = lysabsorptionen for blindproeveoploesningen  E C = lysabsorptionen for standardoploesningen  P = proevens vaegt i gram .  7 . Reproducerbarhed  Forskellen mellem resultaterne af dobbeltbestemmelser maa ikke overstige :  20 % i relativ vaerdi for et ethopabatindhold paa under 7,5 ppm ;  1,5 ppm i absolut vaerdi for et indhold paa mellem 7,5 og 10 ppm ;  15 % i relativ vaerdi for et indhold paa over 10 ppm .  3 . BESTEMMELSE AF DINITOLMID ( DOT )   ( 3,5-dinitro-o-toluamid )  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden goer det muligt at bestemme indholdet af dinitolmid ( DOT ) i foderstoffer , koncentrater og forblandinger . Nitrofuranderivater paavirker analyseresultaterne . Den mindste maengde , der kan bestemmes , er 40 ppm .  2 . Princip  Proeven ekstraheres med acetonitril . Ekstrakten renses ved hjaelp af aluminiumoxyd og filtreres . En alikvot del af filtratet inddampes til toerhed , og remanensen oploeses i dimenthylformamid og behandles med ethylendiamin , hvorved der fremkommer en purpurfarvning . Dinitolmidindholdet bestemmes spektrofotometrisk ved 560 nm .  3 . Reagenser  3.1 . 85 % ( rf ) acetonitril : 850 ml ren acetonitril blandes med 150 ml vand . Blandingen destilleres forud for anvendelsen , og den fraktion , der har kogepunkt imellem 75 og 77 * C , opsamles .  3.2 . Aluminiumoxyd til soejlechromatografi . Det opvarmes i mindst 2 timer ved 750 * C , afkoeles i ekssikkator og opbevares i brun glasflaske med sleben prop . Fugtes foer brugen paa foelgende maade : i en brun glasflaske haeldes 10 g aluminiumoxyd og 0,7 ml vand . Flasken lukkes hermetisk og opvarmes i 5 minutter i kogende vand under kraftig omrystning , hvorefter den afkoeles under fortsat omrystning . Aluminiumoxydet efterproeves ved at en bestemt maengde standardoploesning ( 3.6 ) analyseres efter den beskrevne fremgangsmaade , begyndende med punkt 5.1 . Genfindelsesprocenten for dinitolmid skal vaere 100 % mere eller mindre 2 % .  3.3 . 95 % ( rf ) N,N-dimethylformamid : 95,0 ml N,N-dimethylformamid p.a . blandes med 5,0 ml vand .  3.4 . Ethylendiamin p.a . , maksimalt vandindhold : 2,0 % .  3.5 . Standardsubstans : 3,5-dinitro-o-toluamid , ren , med foelgende egenskaber :  Smeltepunkt : 177 * C ;  Molekylaer lysabsorptionskoefficient ved 248 nm i acentonitril : 13,1 gange 10 3 ;  Molekylaer lysabsorptionskoefficient ved 266 nm i N,N-dimethylformamid : 10,1 gange 10 3 .  3.6 . Standardoploesning : 40 mg standardsubstans ( 3.5 ) afvejet med en noejagtighed paa 0,1 mg oploeses i acetonitril ( 3.1 ) i en 200 ml maalekolbe , som fyldes op til maerket med samme oploesningsmiddel og omrystes . 20,0 ml af denne oploesning fyldes i en maalekolbe med acetonitril ( 3.1 ) til 100 ml og blandes godt . 1 ml af denne oploesning indeholder 40 mg dinitolmid .  4 . Apparatur  4.1 . 250 ml konisk kolbe med normalslib .  4.2 . Tilbagesvaler med normalslib .  4.3 . Filtrerdigel , poroesitet G 3 , diameter : 60 mm .  4.4 . Vakuumfilter ( f.eks . Witts apparat ) .  4.5 . Vandbad , indstillet paa 50 * C .  4.6 . Spektrofotometer med 10 mm kuvetter .  5 . Fremgangsmaade  5.1 . Ekstraktion og rensning  10 g omhyggeligt findelt og homogeniseret proevemateriale afvejes med en noejagtighed paa 1 mg . For koncentraters og forblandingers vedkommende afvejes 1 g med en noejagtighed paa 1 mg . Proeven blandes i en 250 ml konisk kolbe ( 4.1 ) med 65 ml acetonitril ( 3.1 ) , hvorefter kolben forbindes med en tilbagesvaler ( 4.2 ) og opvarmes paa vandbad ( 4.5 ) i 30 minutter under stadig omrystning . Derefter afkoeles under rindende vand , hvorpaa der tilsaettes 20 g aluminiumoxyd ( 3.2 ) , omrystes i 3 minutter og dekanteres .  En 100 ml maalekolbe anbringes i vakuumfilteret ( 4.4 ) , hvorefter filtrerdiglen anbringes ovenover , og oploesningen filtreres under sugning . Bundfaldet overfoeres ved hjaelp af nogle faa ml acetonitril ( 3.1 ) til diglen under fortsat sugning . Vakuumsugningen afbrydes , og remanensen opslemmes i nogle faa ml acetonitril  ( 3.1 ) , og der suges paa ny . Disse sidste operationer gentages , indtil filtratet naar et rumfang paa ca . 95 ml . Derpaa fyldes op til 100 ml med acetonitril ( 3.1 ) og blandes omhyggeligt . Om noedvendigt fortyndes en alikvot maengde af oploesningen med acetonitril for at opnaa en oploesning , som indeholder 5-15 mg dinitolmid pr . ml .  5.2 . Farveudvikling og maaling af lysabsorption  Til tre 50 ml baegerglas A , B og C afpippetteres 4,0 ml af den under 5.1 opnaaede oploesning . Desuden tilsaettes , kun i bagerglas C , 1,0 ml standardoploesning  ( 3.6 ) . De tre baegerglas anbringes i vandbad i et stinkskab med god ventilation , og der inddampes til toerhed i en luftstroem . Derefter afkoeles de til stuetemperatur . Til baeger A saettes nu 10,0 ml N,N-dimethylformamid , medens der til B og C saettes 2,0 ml af dette oploesningsmiddel . Man lader oploesningsmidlet virke i nogle minutter under svag omrystning , indtil bundfaldet er fuldstaendig oploest . Derefter tilsaettes 8,0 ml ethylendiamin ( 3.4 ) til baegrene B og C , og der blandes grundigt . Noejagtigt 5 minutter efter tilsaetningen af ethylendiamin maales lysabsorptionen af de tre oploesninger i spektrotometret ( 4.6 ) ved 560 nm , idet N,N-dimethylformamid ( 3.3 ) benyttes som blindproeve .  6 . Bergening  Dinitolmidindholdet i proevematerialet i mg/kg beregnes efter formlen   ( E B - E A ) / ( E C - E B ) * F/P 1 000  hvor  E A = lysabsorption af oploesning A ( blindproeve )  E B = lysabsorption af oploesning B ( proeve )  E C = lysabsorption af oploesning C ( intern standard )  P = proevens vaegt i gram  F = fortyndingsgraden ( saaledes som evt . anvendt under 5.1 ) .  7 . Reproducerbarhed  Forskellen imellem resultaterne af dobbeltbestemmelser maa ikke overstige :  10 ppm i absolut vaerdi for et dinitolmidindhold paa under 100 ppm ;  10 % i relativ vaerdi for et indhold paa mellem 100 og 5 000 ppm ;  500 ppm i absolut vaerdi for et indhold paa mellem 5 000 og 10 000 ppm ;  5 % i relativ vaerdi for et indhold paa over 10 000 ppm .  4 . BESTEMMELSE AF NICARBAZIN   ( aekvimolekylaer blanding af 4,4-dinitrocarbanilid og 2-hydroxy-4,6-dimethylpyrimidin )  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden goer det muligt at bestemme nicarbazinindholdet i foderstoffer , koncentrater og forblandinger , som ikke indeholder mere end 5 % groenmel . Nitrofuranderivater , acetylenheptin og carbadox paavirker analyseresultaterne . Den mindste maengde , der kan bestemmes , er 20 ppm .  2 . Princip  Proeven ekstraheres med N,N-dimethylformanid . Ekstrakten renses ved soejlechromatografi paa aluminiumoxyd , og nicarbazinen elueres med ethanol . Eluatet behandles med en ethanoloploesning af natriumhydroxyd , hvorved der fremkommer en gulvfarvning . Nicarbazinen bestemmes spektrofotometrisk ved 430 nm .  3 . Reagenser  3.1 . N,N-dimethlformamid p.a .  3.2 . Aluminiumoxyd til soejlechromatografi . Det opvarmes i mindst 2 timer ved 750 * C , afkoeles i ekssikkator og opbevares i en brun glasflaske med sleben prop . Foer brugen kontrolleres aluminiumoxydet ved analyse af en bestemt maengde standardoploesning ( 3.8.3 ) , begyndende ved punkt 5.2 . Genfindelsesprocenten for nicarbazin skal vaere 100 % mere eller mindre 2 % .  3.3 . 95 % ( rf ) ethanol .  3.4 . 80 % ( rf ) ethanol .  3.5 . 50 % ( vaegt ) oploesning af natriumhydroxyd p.a .  3.6 . 1 % ( vaegt ) oploesning af natriumhydroxyd i ethanol :  1 ml natriumhydroxydoploesning ( 3.5 ) haeldes i en 50 ml maalekolbe , og der fyldes op med 80 % ethanol  ( 3.4 ) . Tilberedes umiddelbart foer anvendelsen .  3.7 . Standardsubstans : ren nicarbazin , molekylaer lysabsorptionskoefficient ved 362 nm i N,N-dimethylformamid : 37,8 gange 10 3 .  3.8 . Standardoploesninger :  3.8.1 . Nicarbazinoploesning paa 1,25 mg/ml : 125 mg standardsubstans ( 3.7 ) afvejes med en noejagtighed paa 0,1 mg og oploeses i N,N-dimethylformamid ( 3.1 ) i en 100 ml maalekolbe under svag opvarmning . Efter afkoeling fyldes op til maerket med samme oploesningsmiddel og blandes omhyggeligt . Skal opbevares lysbeskyttet .  3.8.2 . Nicarbazinoploesning paa 0,125 mg/ml : 10,0 ml af ( 3.8.1 ) -oploesningen haeldes i en 100 ml maalekolbe , hverefter der fyldes op til maerket med N,N-dimethylformamid ( 3.1 ) og blandes grundigt .  3.8.3 . Nicarbazinoploesning paa 0,025 mg/ml : 20,0 ml af ( 3.8.2 ) -oploesningen haeldes i en 100 ml maalekolbe , hvorefter der fyldes op til maerket med N,N-dimethylformamid ( 3.1 ) og blandes grundigt .  4 . Apparatur  4.1 . 250 ml koniks kolbe med normalslib .  4.2 . Tilbagesvaler med normalslib .  4.3 . Kogende vandbad .  4.4 . Centrifuge og 120 ml centrifugeglas .  4.5 . Chromatografiroer af glas ( indvendig diameter : 25 mm , laengde : 300 mm ) .  4.6 . Spektrofotometret med 10 mm kuvetter .  4.7 . Burette med inddelinger paa 1/10 ml .  5 . Fremgangsmaade  5.1 . Ekstraktion  10 g omhyggelig findelt og homogeniseret proevemateriale afvejes med en noejagtighed paa 1 mg . For koncentraters og forblandingers vedkommende afvejes 1 g med en noejagtighed paa 1 mg . Proeven anbringes i en 250 ml konisk kolbe ( 4.1 ) , og der tilsaettes noejagtigt 100 ml N,N-dimethylformamid ( 3.1 ) og blandes omhyggeligt . Tilbagesvaleren ( 4.2 ) saettes paa , og der opvarmes i kogende vandbad ( 4.3 ) i 15 minutter under lejlighedsvis omrystning . Derefter afkoeling under rindende koldt vand . Den oeverste fase overfoeres til et centrifugeglas ( 4.4 ) og centrifugeres i ca . 3 minutter . Om noedvendigt fortyndes 25 ml af den oeverste fase med N,N-dimethylformamid ( 3.1 ) for at opnaa en oploesning , som indeholder 2,0-10,0 mg nicarbazin pr . ml .  5.2 . Chromatografi  30 g aluminiumoxyd ( 3.2 ) opslemmet i N,N-dimethylformamid  ( 3.1 ) haeldes i et chromatografiroer ( 4.5 ) , og naar vaeskeniveauet er sunket til 1 cm over aluminiumoxydsoejlen saettes 25,0 ml af ekstrakten , der er opnaaet under punkt 5.1 , paa soejlen . Man lader vaesken loebe igennem , uden at soejlen maa blive toer , og vasker derpaa soejlen tre gange med 10 ml N,N-dimethylformamid ( 3.1 ) pr . gang . Derefter elueres med 70 ml 95 % ethanol ( 3.3 ) , idet de foerste 10 ml af eluatet kasseres , medens resten opsamles i foelgende fraktioner :  en fraktion ( a ) paa 5 ml ;  en fraktion ( b ) paa 50 ml i en maalekolbe ;  en fraction ( c ) paa 5 ml .  Det kontrolleres , at fraktionerne ( a ) og ( c ) ikke viser nogen gulfarvning ved tilsaetning af natriumhydroxyd oploest i ethanol ( 3.6 ) . Fraktion  ( b ) viderebehandles som angivet under punkt 5.3 .  5.3 . Farveudvikling og maaling af lysabsorption  I hver af to 25 ml maalekolber A og B haeldes 20,0 ml af eluatfraktion ( b ) . Derpaa tilsaettes til kolbe A 5,0 ml natriumhydroxyd oploest i ethanol ( 3.6 ) og til kolbe B 5,0 ml 95 % ethanol ( 3.3 ) , og begge kolber rystes grundigt .  Inden for de naeste fem minutter maales de to oploesningers lysabsorption ved 430 nm , idet der som blindproeve anvendes en blanding af 20,0 ml 95 % ethanol ( 3.3 ) og 5,0 ml natriumhydroxyd oploest i ethanol ( 3.6 ) .  Lysabsorptionsvaerdien for oploesning B traekkes fra vaerdien for oploesning A , og paa grundlag heraf bestemmes nicarbazinmaengden ud fra kalibreringskurven  ( 5.4 ) .  5.4 . Kalibreringskurve  25,0 ml af standardoploesningen ( 3.8.3 ) chromatograferes som beskrevet under punkt 5.2 . Eluatfraktionen  ( b ) overfoeres til en burette ( 4.7 ) , og i 5 maalekolber a 25 ml aftappes henhodsvis 2.0 , 4.0 , 6.0 , 8,0 og 10,0 ml ( svarende til et nicarbazinindhold paa henholdsvis 0,025 , 0,050 , 0,075 , 0,100 og 0,125 mg ) . Til hver kolbe tilsaettes 5,0 ml ethanoloploesning af natriumhydroxyd ( 3.6 ) , og der fyldes op med 95 % ethanol og omrystes .  Inden for de naeste fem minutter maales oploesningernes lysabsorption ved 430 nm , idet der som blindproeve anvendes en blanding af 20,0 ml 95 % ethanol ( 3.3 ) og 5,0 ml ethanoloploesning af natriumhydroxyd ( 3.6 ) .  Kalibreringskurven optegnes ved at afsaettes lysabsorptionsvaerdierne som ordinat og de tilsvarende nicarbazinmaengder i mg som abscisse .  6 . Beregning  Nicarbazinindholdet i proevematerialet i mg/kg beregnes efter formlen :  A/P * F * 10 000  hvor  A = nicarbazinmaengden i mg , bestemt ved fotometri ;  P = proevens vaegt i gram ;  F = fortyndingsgraden ( saaledes som evt . anvendt under punkt 5.1 ) .  7 . Reproducerbarhed  Forskellen mellem resultaterne af dobbeltbestemmelser maa ikke overstige :  10 ppm i absolut vaerdi for et nicarbazinindhold paa under 100 ppm ;  10 % i relativ vaerdi for et indhold paa mellem 100 og 5 000 ppm ;  500 ppm , i absolut vaerdi for et indhold paa mellem 5 000 og 10 000 ppm ;  5 % i relativ vaerdi for et indhold paa over 10 000 ppm .  5 . BESTEMMELSE AF MENADION ( K3-VITAMIN )  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden goer det muligt at bestemme indholdet af menadion ( K3-vitamin ) i foderstoffer , koncentrater og forblandinger . Den mindste maengde , der kan bestemmes , er 1 ppm .  2 . Princip  Proeven ekstraheres med fortyndet ethanol , og blandingen goeres klar med en tanninoploesning og centrifugeres . Ekstrakten behandles med en natriumcarbonatoploesning , og den frigjorte menadion ekstraheres med 1,2-dichlorethan . Dichlorethanekstrakten behandles , afhaengigt af menadionindholdet , enten direkte eller efter inddampning , med 2,4-dinitrophenylhydrazin oploest i ethanol og gjort sur med saltsyre . Af det dannede hydrazon opstaar efter tilsaetning af ammoniak i overskud et blaagroent farvekompleks , hvis lysabsorption maales ved 635 nm .  3 . Reagenser  3.1 . 96 % ( rf . ) ethanol .  3.2 . ethanol ( 3.1 ) fortyndet med vand til 40 % .  3.3 . 10 % ( vaegt ) tanninoploesning , fremstillet af ren tannin i pulverform .  3.4 . 1,2-dichlorethan p.a .  3.5 . 10 % ( vaegt ) oploesning af vandfrit natriumcarbonat p.a .  3.6 . 37 % ( vaegt ) salstsyre , mf . = 1,19 .  3.7 . absolut ethanol p.a .  3.8 . 2,4-dinitrophenylhydrazin-reagens : 40 mg 2,4-dinitrophenylhydrazin p.a . oploeses i ca . 40 ml kogende absolut ethanol ( 3.7 ) , afkoeles og overfoeres til en 50 ml maalekolbe . Der tilsaettes 1 ml saltsyre  ( 3.6 ) og fyldes op med absolut ethanol ( 3.7 ) . Tilberedes umiddelbart foer anvendelsen .  3.9 . 25 % ( vaegt ) ammoniakvand , mf . = 0,91 .  3.10 . Ethanol-ammoniakoploesning : blanding af lige volumendele ethanol ( 3.7 ) og ammoniakvand ( 3.9 ) .  3.11 . Standardoploesninger af menadion : 20 mg menadion  ( K3-vitamin ) oploeses i 1,2-dichlorethan ( 3.4 ) , og der fyldes op til 200 ml . Alikvote maengder af denne oploesning fortyndes med 1,2-dichlorethan ( 3.4 ) for at faa en raekke oploesninger , hvis indhold af menadion er paa mellem 2 og 10 mg/ml . Oploesningerne skal fremstilles umiddelbart foer brugen .  4 . Apparatur  4.1 . Mekanisk rysteapparat .  4.2 . Centrifuge ( 3 000-5 000 0/min . ) .  4.3 . 100 ml og 250 ml skilletragte med sleben prop .  4.4 . Vakuum-rotations-fordamper med 250 ml kolber .  4.5 . Vandbad .  4.6 . Spektrofotometer med 10 mm kuvetter .  5 . Fremgangsmaade  NB : Alle arbejdsoperationer maa foregaa i daempet belysning , evt . ved benyttelse af apparatur af brunt glas  5.1 . Proeveudtagning  Af det omhyggeligt findelte proevemateriale afvejes en proeve , svarende til det formodede indhold af menadion , f.eks . :  0,1-5,0 g af koncentrater og forblandinger ;  20-30 g af foderstoffer .  Proeven overfoeres straks til en 250 ml kolbe med sleben glasrop .  5.2 . Ekstraktion  Der tilsaettes noejagtigt 96 ml fortyndet ethanol ( 3.2 ) og omrystes mekanisk i 15 minutter ved stuetemperatur . Derpaa tilsaettes 4,0 ml tanninoploesning ( 3.3 ) og der blandes godt , hvorefter ekstrakten overfoeres til et centrifugeglas , der centrifugeres ( 3 000-5 000 0/min ) , og dekanteres .  En noeje afmaalt ekstraktmaengde paa 20-40 ml haeldes i en 250 ml skilletragt , og der tilsaettes med pipette 50 ml 1,2-dichlorethan ( 3.4 ) , der omrystes og tilfoeres med pipette 20 ml natriumcarbonatoploesning ( 3.5 ) . Derpaa rystes kraftigt i 30 sekunder , hvorefter dichlorethanfasen opsamles i en 100 ml skilletragt . Der tilsaettes 20 ml vand , rystes i endnu 15 sekunder , hvorefter dichlorethanfasen opsamles , og vandrester fjernes med strimler af filtrerpapir .  For koncentraters og forblandingers vedkommende fortyndes en alikvot ekstraktmaengde med 1,2-dichlorethan ( 3.4 ) , saa der opnaas en menadionkoncentration paa 2-10 mg/ml . For foderstoffers vedkommende inddampes en alikvot ekstraktmaengde til toerhed ved formindsket tryk og i en kvaelstofatmosfaere over et vandbad ved 40 * C . Remanensen behandles hurtigt med saa meget 1,2-dichlorethan ( 3.4 ) , at der opnaas en oploesning , som indeholder 2-10 mg menadion pr . ml .  5.3 . Hydrazondannelse  2,0 ml af dichlorethanekstrakten under punkt 5.2 anbringes i en 10 ml maalekolbe og tilsaettes 3,0 ml 2,4-dinitrophenylhydrazin-reagens ( 3.8 ) , hvorefter kolben lukkes med en kork-eller teflonprop paa en saadan maade , at enhver fordampning undgaas . Blandingen opvarmes i vandbad ved 70 * C i 2 timer , afkoeles og tilsaettes 3,0 ml ethanol-ammoniakoploesning ( 3.10 ) blandes godt , fyldes op med absolut ethanol og blandes igen .  5.4 . Maaling af lysabsorption  Lysabsorptionen af det blaagroenne farvekompleks maales paa spektrofotometret ved 635 nm over for en blindproeve fremstillet ved at behandle 2,0 ml 1,2-dichlorethan  ( 3.4 ) som angivet under punkt 5.3 . Menadionmaengden bestemmes paa grundlag af en kalibreringskurve , som optegnes for hver enkelt analyseraekke .  5.5 . Kalibreringskurve  2,0 ml af menadion-standardoploesningerne ( 3.11 ) behandles som angivet under punkt 5.3 og lysabsorptionen maales som beskrevet under punkt 5.4 . Derpaa optegnes kalibreringskurven ved at afsaette lysabsorptionsvaerdierne som ordinat og de tilsvarende menadionmaengder i mg som abscisse .  6 . Beregning  Proevens menadionindhold beregnes under hensyntagen til proevens vaegt og til de fortyndingsgrader , der er arbejdet med i analysen . Resultatet udtrykkes i mg menadion pr . kg .  7 . Reproducerbarhed  Forskellen mellem resultaterne af dobbeltbestemmelser maa ikke overstige :  20 % i relativ vaerdi for et menadionindhold paa under 10 ppm ;  2 ppm i absolut vaerdi for et indhold paa mellem 10 og 14 ppm ;  15 % i relativ vaerdi for et indhold paa mellem 14 og 100 ppm ;  15 ppm i absolut vaerdi for et indhold paa mellem 100 og 150 ppm ;  10 % i relativ vaerdi for et indhold paa over 150 ppm .