CELEX: 31973L0046
Language: ro
Date: 1972-12-05 00:00:00
Title: A patra Directivă a Comisiei din 5 decembrie 1972 de stabilire a metodelor comunitare de analiză pentru controlul oficial al furajelor

03/Volumul 02
            
            
               RO
            
            
               Jurnalul Ofícial al Uniunii Europene
            
            
               3
            
         31973L0046
   
               L 083/21
            
            
               JURNALUL OFÍCIAL AL UNIUNII EUROPENE
            
            
               
            
         
      A PATRA DIRECTIVĂ A COMISIEI
   
   din 5 decembrie 1972
   de stabilire a metodelor comunitare de analiză pentru controlul oficial al furajelor
   (73/46/CEE)
   COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE,
   având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Economice Europene,
   având în vedere Directiva Consiliului din 20 iulie 1970 privind introducerea modalităților de prelevare de probe și a metodelor comunitare de analiză pentru controlul furajelor (1), modificată de Directiva nr. 72/275/CEE din 20 iulie 1972 (2), în special articolul 2,
   întrucât directiva menționată prevede efectuarea controalelor oficiale ale furajelor în conformitate cu modurile de prelevare de probe și metodele de analiză comunitare în scopul verificării respectării condițiilor prescrise în temeiul actelor cu putere de lege și al actelor administrative privind calitatea și compoziția furajelor;
   întrucât Directivele nr. 71/250/CEE din 15 iunie 1971 (3), nr. 71/393/CEE din 18 noiembrie 1971 (4) și nr. 72/199/CEE din 27 aprilie 1972 (5) ale Comisiei au stabilit deja un număr de metode comunitare de analiză; întrucât progresul înregistrat până acum recomandă adoptarea unui al patrulea set de metode;
   întrucât măsurile prevăzute în prezenta directivă sunt în conformitate cu avizul Comitetului permanent pentru furaje,
   ADOPTĂ PREZENTA DIRECTIVĂ:
   Articolul 1
   Statele membre impun ca analizele pentru controlul oficial al furajelor cu privire la conținutul de umiditate al grăsimilor și uleiurilor vegetale și animale și conținutul de fibre brute și de magneziu al furajelor să fie efectuate în conformitate cu metodele descrise în anexa I la prezenta directivă.
   Dispozițiile generale stabilite în partea 1 (Introducere) a anexei la prima Directivă a Comisiei nr. 71/250/CEE din 15 iunie 1971 se aplică metodelor descrise în anexa I la prezenta directivă.
   Articolul 2
   Statele membre prevăd ca analizele pentru controlul oficial al furajelor cu privire la conținutul de retinol (vitamina A), tiamină (aneurină, vitamina B1), acid ascorbic și dehidroascorbic (vitamina C) să fie efectuate în conformitate cu metodele descrise în anexa II la prezenta directivă.
   Dispozițiile generale care figurează în partea 1 (Introducere) a anexei la prima Directivă a Comisiei nr. 71/250/CEE din 15 iunie 1971, cu excepția părții referitoare la pregătirea probelor care urmează să fie analizate, se aplică metodelor descrise în anexa II la prezenta directivă.
   Articolul 3
   Statele membre pun în aplicare actele cu putere de lege și actele administrative necesare pentru a se conforma prezentei directive până la 1 ianuarie 1974. Statele membre informează de îndată Comisia cu privire la aceasta.
   Articolul 4
   Prezenta directivă se adresează statelor membre.
   
      Adoptată la Bruxelles, 5 decembrie 1972.
      
         
            Pentru Comisie
         
         
            Președintele
         
         S. L. MANSHOLT
         
      
   
   
      (1)  JO L 170, 3.8.1970, p. 2.
   
      (2)  JO L 171, 29.7.1972, p. 39.
   
      (3)  JO L 155, 12.7.1971, p. 13.
   
      (4)  JO L 279, 20.12.1971, p. 7.
   
      (5)  JO L 123, 29.5.1972, p. 6.
   ANEXA I
   1.   DETERMINAREA UMIDITĂȚII DIN GRĂSIMILE ȘI ULEIURILE ANIMALE ȘI VEGETALE
   1.   Obiectul și domeniul de aplicare
   Această metodă permite determinarea conținutului de umiditate (apă și substanțe volatile) din grăsimile și uleiurile animale și vegetale.
   2.   Principiul
   Proba este uscată la 103 °C până la încetarea diminuării masei. Pierderea de masă se determină prin cântărire.
   3.   Aparatura
   3.1.   Vas cu fundul plat din material rezistent la coroziune, cu diametru de 8-9 cm și aproximativ 3 cm adâncime.
   3.2.   Termometru cu mercur, cu rezervor rezistent și tub de expansiune la capătul superior, gradat de la aproximativ 80 °C până la cel puțin 110 °C și de aproximativ 10 cm lungime.
   3.3.   Baie de nisip sau plită electrică.
   3.4.   Desicator, conținând un agent de uscare eficient.
   3.5.   Cântar analitic.
   4.   Modul de lucru
   Se cântăresc aproximativ 20 g din proba omogenizată cu o precizie de 1 mg, în recipientul (3.1) uscat și cântărit, conținând termometrul (3.2). Se încălzește pe baia de nisip sau pe plită (3.3), amestecându-se continuu cu termometrul, astfel încât temperatura să ajungă la 90 °C în aproximativ 7 minute.
   Se reduce intensitatea căldurii, urmărind frecvența cu care bulele se ridică de pe fundul recipientului. Temperatura nu trebuie să depășească 105 °C. Se continuă amestecarea, răzuind fundul vasului, până când bulele încetează să se mai formeze.
   Pentru a asigura eliminarea completă a umidității, se reîncălzește de câteva ori la 103 °C ± 2 °C, răcind la 93 °C între încălzirile succesive. Apoi se lasă să se răcească la temperatura camerei în desicator (3.4) și se cântărește. Se repetă această operație până când pierderea de masă dintre două încălziri succesive nu depășește 2 mg.
   
      N.B. O creștere a masei probei după încălzirea repetată indică oxidarea grăsimilor. În acest caz, se calculează rezultatul obținut după cântărirea efectuată imediat înainte ca masa să înceapă să crească.
   5.   Calculul rezultatelor
   Conținutul de umiditate, ca procentaj din probă, este dat de următoarea formulă:
   
      
   unde:
   M0= masa, în grame, a probei testate;
   M1= masa, în grame, a recipientului și a conținutului său înainte de încălzire;
   M2= masa, în grame, a recipientului și a conținutului său după încălzire.
   Rezultatele mai mici de 0,05 % se înregistrează ca fiind „sub 0,05 %”.
   Repetabilitatea
   Diferența de umiditate dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe aceeași probă nu trebuie să depășească 0,05 %, în valoare absolută.
   2.   DETERMINAREA MAGNEZIULUI
   – prin spectrofotometrie de absorbție atomică –
   1.   Obiectul și domeniul de aplicare
   Această metodă permite determinarea cantității de magneziu din furaje. Este indicată în special pentru determinarea conținutului de magneziu sub 5 %.
   2.   Principiul
   Proba este arsă și dizolvată în acid clorhidric diluat. Dacă nu conține substanțe organice, este dizolvat direct în acid clorhidric diluat. Soluția este diluată și conținutul de magneziu este determinat prin spectrofotometrie de absorbție atomică la 285,2 nm, prin compararea cu soluții etalon.
   3.   Reactivi
   3.1.   Acid clorhidric p.a. d: 1,16.
   3.2.   Acid clorhidric concentrat p.a. d: 1,19.
   3.3.   Bandă sau fir de magneziu sau heptahidrat sulfat de magneziu uscat la temperatura camerei.
   3.4.   Soluție de sare de stronțiu (clorură sau nitrat) la 2,5 % (p/v) stronțiu [= 76,08 g SrCl2 6H2O p.a. sau 60,38 g Sr (NO3)2 p.a.].
   3.5.   Soluție etalon de magneziu: se cântărește 1 g de magneziu (3.3), cu precizie de 1 mg, după îndepărtarea cu grijă a stratului de oxid, sau cantitatea corespunzătoare (10,143 g) de heptahidrat sulfat de magneziu (3.3). Se pune într-un balon gradat de 1 000 ml, se adaugă 80 ml de acid clorhidric (3.1), se lasă să se dizolve și apoi se completează cu apă până la 1 000 ml. 1 ml din această soluție conține 1 000 mg magneziu.
   4.   Aparatura
   4.1.   Creuzet pentru ardere din platină, siliciu sau porțelan.
   4.2.   Cuptor electric închis cu termostat.
   4.3.   Spectrofotometru de absorbție atomică.
   5.   Modul de lucru
   5.1.   Prepararea soluției
   5.1.1.   Furaje compuse exclusiv din substanțe minerale
   Se cântăresc 5 g din probă, cu precizie de 1 mg, într-un balon gradat de 500 ml cu 250-300 ml apă. Se adaugă 40 ml de acid clorhidric (3.1), se aduce la fierbere și se fierbe încet timp de 30 de minute. Se lasă să se răcească, se completează volumul cu apă, se amestecă și se filtrează într-un pahar de laborator uscat printr-un filtru plisat uscat. Se îndepărtează primii 30 ml din filtrat. În prezența siliciului, se tratează 5 g de probă cu o cantitate suficientă (15-30 ml) de acid clorhidric (3.2), se evaporă până la uscare pe o baie de apă și se transferă într-un cuptor la 105 °C timp de o oră. Se continuă respectând etapele descrise la punctul 5.1.2, începând cu a treia frază.
   5.1.2.   Furaje compuse predominant din substanțe minerale
   Se cântăresc într-un creuzet 5 g din probă, cu precizie de 1 mg, și se ard la 550 °C în cuptorul închis până când se obține o cenușă fără particule carbonice, apoi se lasă să se răcească. Pentru a elimina siliciul, se adaugă la cenușă o cantitate suficientă (15-30 ml) de acid clorhidric (3.2), se evaporă până la uscare pe o baie de apă și se transferă într-un cuptor la 105 °C timp de o oră. Se tratează reziduul cu 10 ml de acid clorhidric (3.1) și se transferă într-un balon gradat de 500 ml utilizând apă caldă. Se aduce la fierbere, se lasă să se răcească și se completează volumul cu apă. Se amestecă și se filtrează într-un pahar de laborator uscat printr-un filtru plisat uscat. Se îndepărtează primii 30 ml din filtrat.
   5.1.3.   Furaje compuse predominant din substanțe organice
   Se cântăresc într-un creuzet 5 g din probă, cu precizie de 1 mg, și se ard la 550 °C în cuptor închis până când se obține o cenușă fără particule carbonice. Se tratează cenușa cu 5 ml de acid clorhidric (3.2), se evaporă până la uscare pe baie de apă și apoi se usucă timp de o oră în cuptor la 105 °C pentru a insolubiliza siliciul. Se tratează cenușa cu 5 ml de acid clorhidric (3.1), se transferă într-un balon gradat de 250 ml utilizând apă caldă, se aduce la fierbere, se lasă să se răcească și se completează volumul cu apă. Se amestecă și se filtrează într-un pahar de laborator uscat printr-un filtru plisat uscat. Se îndepărtează primii 30 ml din filtrat.
   5.2.   Măsurarea absorbției atomice
   Prin diluarea soluției etalon (3.5) cu apă, se pregătesc cel puțin 5 soluții de referință, de concentrații crescătoare, alese în funcție de intervalul optim de măsurare a spectrofotometrului. Se adaugă în fiecare soluție 10 ml de soluție de sare de stronțiu (3.4) și apoi se completează până la 100 ml cu apă. Se diluează cu apă o cotă-parte din filtratul obținut la punctul 5.1.1, 5.1.2 sau 5.1.3, astfel încât să se obțină o concentrație a magneziului în limitele concentrațiilor soluțiilor de referință. Concentrația de acid clorhidric a acestei soluții nu trebuie să depășească 0,4 N. Se adaugă 10 ml soluție de sare de stronțiu (3.4) și apoi se completează volumul până la 100 ml cu apă. Se măsoară absorbția soluției de determinat și a soluțiilor de referință la lungimea de undă de 285,2 nm.
   6.   Calculul rezultatelor
   Se calculează cantitatea de magneziu din probă în raport cu soluțiile de referință. Rezultatele se exprimă sub formă de procentaj din probă.
   Repetabilitatea
   Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe aceeași probă nu trebuie să depășească 5 %, în valoare relativă.
   3.   DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE CELULOZĂ BRUTĂ
   1.   Obiectul și domeniul de aplicare
   Această metodă permite determinarea cantității de substanțe organice fără grăsimi, insolubile în mediu acid și alcalin, din furaje, cunoscute convențional sub denumirea de celuloză brută.
   2.   Principiul
   Proba, eventual degresată, este tratată succesiv cu soluții în fierbere, de concentrații specifice, de acid sulfuric și hidroxid de potasiu. Reziduul este separat prin filtrare în prezența azbestului, este spălat, uscat, cântărit și ars la 900 °C. Pierderea în greutate rezultată prin ardere corespunde celulozei brute din proba testată.
   3.   Reactivi
   3.1.   Acid sulfuric 0,26 N.
   3.2.   Azbest tratat: la azbestul în cauză folosit cu un creuzet Gooch se adaugă aproximativ de 5 ori masa acidului clorhidric diluat (1 volum acid clorhidric, d: 1,19 + 3 volume apă). Se fierbe amestecul timp de aproximativ 45 de minute, se lasă să se răcească și se filtrează printr-o pâlnie Büchner. Se spală reziduul, mai întâi cu apă până când acidul clorhidric dispare din apa de spălat și apoi cu acetonă (3.6). Se usucă azbestul în cuptor și apoi se arde pentru 2 ore la 900 °C. Se lasă să se răcească într-un balon cu dop. Azbestul astfel tratat poate fi utilizat de mai multe ori. El trebuie să îndeplinească cerințele specificate la punctul 5 privind testul martor.
   3.3.   Emulsie antispumantă (de exemplu silicon).
   3.4.   Soluție de hidroxid de potasiu 0,23 N.
   3.5.   Acid clorhidric 0,5 N.
   3.6.   Acetonă.
   3.7.   Eter dietilic, pur.
   4.   Aparatura
   4.1.   Pahare de laborator de cel puțin 600 ml capacitate, marcate la nivelul de 200 ml.
   4.2.   Discuri de porțelan cu diametrul de aproximativ 80 mm și grosimea de aproximativ 4 mm, având aproximativ 32 de orificii, fiecare cu diametrul de aproximativ 4 mm.
   4.3.   Baloane vidate cu dop de cauciuc, cu capacitate de aproximativ 2 l, marcate la nivelul de 800 ml și prevăzute cu pâlnii de sticlă de 120 mm în diametru.
   4.4.   Plăci filtrante cu diametrul de aproximativ 40 mm și cu grosimea de aproximativ 4 mm, cu margini înclinate corespunzătoare conului pâlniei (4.3), prevăzute cu aproximativ 16 orificii, fiecare cu aproximativ 4 mm în diametru, și acoperite cu o plasă metalică, dimensiunea acesteia fiind de aproximativ 1 mm. Atât plăcile, cât și plasa trebuie să fie rezistente la substanțe acide și alcaline.
   4.5.   Creuzete pentru ardere din platină sau siliciu.
   4.6.   Cuptor electric închis cu termostat.
   4.7.   Desicator.
   4.8.   Filtru de azbest: se pun în suspensie 2,0 g azbest (3.2) în 100 ml apă.
   Se filtrează în vid pe o placă filtrantă acoperită cu plasă metalică (4.4) și plasată în pâlnia unui balon vidat (4.3). Se colectează filtratul și se mai filtrează o dată prin același filtru. Se îndepărtează filtratul.
   5.   Modul de lucru
   Se cântăresc 3 g din probă, cu precizie de 1 mg, și 2 g de azbest tratat (3.2) într-un pahar de laborator (4.1), se adaugă 200 ml de acid sulfuric (3.1) și câteva picături de soluție antispumantă (3.3). Se aduce la fierbere rapid și se lasă să fiarbă exact 30 de minute. Pentru a păstra volumul constant, se acoperă paharul de laborator cu un dispozitiv de răcire care poate fi un balon de 500 ml cu fundul rotund în care apa rece să circule. Se oprește fierberea prin adăugarea a aproximativ 50 ml de apă rece și se filtrează imediat sub vid prin filtrul de azbest pregătit în prealabil astfel cum se indică la punctul 4.8.
   Se spală reziduul cu câte 5 loturi de aproximativ 100 ml apă foarte fierbinte pentru a obține un volum final al filtratului de 800 ml. Se transferă reziduul în paharul de laborator (4.1) după ce acesta a fost prevăzut cu un disc de porțelan (4.2) pentru a regla fierberea. Se adaugă 200 ml de soluție de hidroxid de potasiu (3.4). Se aduce rapid la fierbere și se lasă să fiarbă timp de exact 30 minute. Se adaugă aproximativ 50 ml de apă rece și se filtrează imediat sub vid printr-un alt filtru de azbest proaspăt, pregătit în prealabil în conformitate cu punctul 4.8. Se spală reziduul cu apă foarte fierbinte până când apa de spălat devine neutră (prin testare cu hârtie de turnesol), apoi se spală de 3 ori cu acetonă (3.6) (aproximativ 100 ml de acetonă în total).
   Se transferă reziduul într-un creuzet de ardere (4.5), se divizează, dacă este necesar, și se usucă în cuptor până la atingerea unei greutăți constante, la temperatura de 130 °C.
   Se lasă să se răcească în desicator (4.7) și se cântărește rapid.
   Se introduce creuzetul în cuptorul închis (4.6) și se lasă să ardă timp de 30 minute la 900 °C. Se lasă să se răcească în desicator (4.7) și se cântărește rapid.
   Se realizează un test martor aplicând același mod de lucru azbestului tratat (3.2), în absența probei. Pierderea de greutate rezultată prin arderea celor 6 g de azbest nu trebuie să depășească 10 mg.
   6.   Calcularea rezultatelor
   Conținutul de celuloză brută, ca procent din probă, este dat de raportul:
   
      
   unde:
   a= pierderea de greutate după ardere în timpul determinării;
   b= pierderea de greutate după ardere în timpul realizării testului martor.
   Repetabilitatea
   Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele realizate pe aceeași probă nu trebuie să depășească:
   0,3, în valoare absolută, pentru un conținut de celuloză brută sub 10 %;
   3 %, în valoare relativă, pentru un conținut de celuloză brută egal sau mai mare de 10 %.
   7.   Observații
   7.1.   Furajele care conțin peste 10 % grăsimi și uleiuri trebuie să fie degresate înainte de a fi supuse analizei cu eter dietilic (3.7). În acest scop, se plasează proba (3 g cântărite cu precizie de 1 mg) pe un filtru de azbest (4.8). Se acoperă de 3 ori cu aproximativ 50 ml de eter dietilic (3,7) și se filtrează cu grijă sub vid de fiecare dată. Se transferă proba degresată și azbestul într-un pahar de laborator (4.1) și se continuă analiza astfel cum se indică la punctul 5.
   7.2.   Furajele conținând grăsimi și uleiuri care nu pot fi extrase direct trebuie degresate astfel cum se indică la punctul 7.1, iar degresarea trebuie refăcută după ce atacul acid a fost îndepărtat prin spălare din reziduu.
   În acest scop, se spală acidul din reziduu de 3 ori cu acetonă (3.6) (100 ml în total) și apoi de 3 ori cu 50 ml de eter dietilic (3.7). Apoi se transferă reziduul într-un pahar de laborator (4.1.) și se continuă analiza astfel cum se indică la punctul 5 al doilea paragraf (tratarea cu soluție de hidroxid de potasiu).
   7.3.   Dacă furajele sunt bogate în calciu (peste 2 % calciu), se plasează proba (3 g cântărite cu precizie de 1 mg) într-un pahar de laborator (4.1) cu 100 ml acid clorhidric 0,5 N (3.5) și se lasă la temperatură scăzută timp de 5 minute. Se filtrează imediat și se spală cu apă rece. La filtrare se folosesc și cele 2 g de azbest destinate fierberii cu acid sulfuric. Dacă filtrarea întâmpină dificultăți, se diluează suspensia cu acetonă (3.6). Se continuă astfel cum se indică la punctul 5.
   ANEXA II
   1.   DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE RETINOL (VITAMINA A)
   1.   Obiectul și domeniul de aplicare
   Această metodă permite determinarea cantității de retinol (vitamina A) din furaje, concentrate și preamestecuri. Limita inferioară a determinării este de 10 000 UI/kg pentru furajele cu colorație mare și 4 000 UI/kg pentru celelalte (1). În funcție de conținutul estimat de retinol, produsele se împart în două grupe:
   
      Grupa A: conținut sub 200 000 UI/kg;
   
      Grupa B: conținut mai mare sau egal cu 200 000 UI/kg.
   2.   Principiul
   Proba este supusă unei reacții de hidroliză la cald, sub acțiunea unei soluții de hidroxid de potasiu în mediu de etanol și în prezența unui antioxidant sau în atmosferă de azot. Amestecul este extras cu 1,2-dicloretan. Extrasul se evaporă până la uscare și se tratează cu eter de petrol. Soluția este supusă cromatografiei pe o coloană de oxid de aluminiu (pentru produsele din grupa B, cromatografia este necesară numai în anumite cazuri). Pentru produsele din grupa A, retinolul este determinat prin spectrofotometrie la 610 nm după dezvoltarea unui produs complex colorat, corespunzător reacției Carr-Price; pentru produsele din grupa B, spectrofotometria se realizează în UV la 325 nm.
   3.   Reactivi
   (a)   utilizați pentru analiza produselor din grupele A și B
   3.1.   Etanol 96 % (v/v).
   3.2.   Soluție ascorbat de sodiu p.a. 10 % (p/v) sau
   3.3.   Azot purificat.
   3.4.   Soluție hidroxid de potasiu p.a. 50 % (p/v).
   3.5.   Soluție hidroxid de potasiu 1 N p.a.
   3.6.   Soluție hidroxid de potasiu 0,5 N p.a.
   3.7.   1,2-dicloretan p.a.
   3.8.   Eter de petrol, pur, interval de fierbere: 30-50 °C. Dacă este necesar, se purifică după cum urmează: se amestecă 1 000 ml eter de petrol cu loturi de 20 ml de acid sulfuric concentrat până când acidul își pierde culoarea. Se îndepărtează acidul, iar eterul de petrol se spală foarte bine cu 500 ml apă, apoi de două ori cu câte 250 ml soluție hidroxid de sodiu 10 % (p/v) și de trei ori cu câte 500 ml apă. Se îndepărtează stratul apos, se usucă eterul de petrol timp de o oră pe carbon activ și soluție anhidră de sulfat de sodiu, se filtrează și se distilează.
   3.9.   Oxid de aluminiu, standardizat conform Brockmann: se arde timp de 8 ore la 750 °C, se răcește în desicator și se păstrează într-un balon de sticlă de culoare brună, prevăzut cu dop de sticlă mată. Înainte de a fi folosit în cromatografie, se hidratează astfel: se pun într-un balon de sticlă de culoare brună 10 g oxid de aluminiu și 0,7 ml apă, se sigilează cu un dop, se reîncălzește timp de 5 minute în baie fierbinte de apă în timp ce se agită puternic. Se lasă să se răcească, agitând în continuare. Se verifică activitatea aluminiului astfel preparat prin analiza în conformitate cu punctele 5.3 și 5.4 a unei cantități cunoscute de retinol etalon (3.17) (aproximativ 500 UI) și se verifică refacerea.
   3.10.   Oxid de aluminiu bazic, grad de activitate 1 (Woelm, Merck sau un echivalent).
   3.11.   Eter dietilic, pur. Se îndepărtează peroxizii și urmele de apă prin cromatografie în coloană de oxid de aluminiu bazic (3.10). (25 g oxid de aluminiu la 250 ml eter dietilic).
   3.12.   Soluții de eter de petrol (3.8) în eter dietilic (3.11) de 4, 8, 12, 16 și 20 % (v/v).
   3.13.   Soluție sulfură de sodiu 0,5 molară în glicerină 70 % (v/v), preparată din sulfură de sodiu p.a.
   (b)   utilizați exclusiv pentru analiza produselor din grupa A
   3.14.   Benzen cristalizabil p.a.
   3.15.   Cloroform p.a. Se îndepărtează etanolul, fosgenul și urmele de apă prin cromatografie în coloană de oxid de aluminiu bazic (3.10) (50 g oxid de aluminiu la 200 ml cloroform; se recomandă aplicarea cromatografiei primilor 50 ml din eluat a doua oară).
   3.16.   Reactiv Carr-Price: se agită aproximativ 25 g triclorură de antimoniu p.a. (păstrată în desicator) cu 100 ml cloroform (3.15) până la saturarea soluției. O depunere mică de triclorură de antimoniu nu reprezintă o problemă. Se adaugă 2 ml anhidridă acetică p.a. Se păstrează în frigider într-un balon de sticlă de culoare brună, prevăzut cu dop rodat. Soluția se poate păstra timp de câteva săptămâni.
   3.17.   Retinol etalon, controlat prin spectrofotometrie.
   (c)   utilizați exclusiv pentru analiza produselor din grupa B
   3.18.   Izopropanol, pentru cromatografie.
   4.   Aparatura
   4.1.   Baie de apă.
   4.2.   Aparat rotativ de evaporare sub vid prevăzut cu baloane de diferite capacități.
   4.3.   Tuburi cromatografice din sticlă (lungime: 300 mm; diametru interior: aproximativ 13 mm).
   4.4.   Spectrofotometru cu cuve de 10 mm. Măsurările în UV necesită celule din siliciu.
   4.5.   Lămpi UV, 365 nm.
   5.   Modul de lucru
   
      N.B. Toate operațiile trebuie efectuate fără expunere la lumina zilei, dacă este necesar utilizând echipament din sticlă brună.
   5.1.   Prelevarea de probe
   Din proba fin divizată se ia o probă test, direct proporțională cu conținutul estimat de retinol, astfel:
   0,1-1,0 g pentru concentrate (conținut peste 20 000 UI/g);
   3,0-5,0 g pentru preamestecuri (conținut între 400 și 20 000 UI/g);
   10-20 g pentru amestecuri minerale;
   30 g pentru produse din grupa A.
   Proba test se introduce imediat într-un balon de 500 ml cu dop rodat.
   5.2.   Hidroliza și extracția (2)
   
   Se adaugă succesiv la proba test 40 ml etanol (3.1), 2 ml soluție de ascorbat de sodiu (3.2) (3), 10 ml soluție de hidroxid de potasiu (3.4) și 2 ml soluție de sulfură de sodiu (3.13).
   Se încălzește timp de 30 minute la 70-80 °C sub un condensator de reflux și apoi se lasă să se răcească sub un curent de apă. Se adaugă 50 ml etanol (3.1) și 100 ml 1,2-dicloretan (3.7) (cu ajutorul unei pipete). Se agită puternic și apoi se decantează lichidul supernatant într-un container de decantare. În acesta se adaugă 150 ml soluție de hidroxid de potasiu (3.5), se agită timp de 30 secunde apoi se lasă să se stabilizeze până când straturile s-au separat. Se colectează stratul de dicloretan (stratul inferior) într-un container de decantare, se adaugă 40 ml soluție de hidroxid de potasiu (3.6), se agită timp de 10 secunde și se lasă apoi să se stabilizeze până când se separă straturile. Se colectează stratul de dicloretan într-un container de decantare și se spală de 6-8 ori cu loturi de 40 ml apă până când dispare alcalinitatea (testul cu fenolftaleină). Se colectează stratul de dicloretan și se îndepărtează ultimele urme de apă folosind benzi de hârtie de filtru.
   Se evaporă până la uscare o cotă-parte din soluție, sub vid și pe baia de apă la 40 °C. Reziduul este tratat imediat cu 5 ml eter de petrol (3.8).
   
      Pentru produsele din grupa A, se aplică cromatografia astfel cum se indică la punctul 5.3.1.
   
      Pentru produsele din grupa B, se transferă soluția într-un balon gradat de 50 ml, se completează volumul cu eter de petrol (3.8), se amestecă și se măsoară densitatea optică astfel cum se indică la punctul 5.4.2.
   5.3.   Cromatografia
   5.3.1.   Produse din grupa A
   Se umple un tub cromatografic (4.3) până la înălțimea de 200 mm cu 10 g oxid de aluminiu (3.9) care a fost ținut în prealabil în suspensie cu eter de petrol (3.8). Se pune în tub soluția obținută la punctul 5.2 și se adaugă imediat 20 ml eter de petrol (3.8). Se eluează succesiv cu loturi de 10 ml soluție eter de petrol în eter etilic de 4, 8, 12, 16 și 20 % (3.12) sub presiune sau vid parțial, rata debitului fiind de 2-3 picături pe secundă.
   Primul eluat este carotenul (4). Retinolul este eluat în general cu soluție de eter de petrol în eter etilic 20 % (3.12). Eluția se realizează sub lumină UV (scurtă iradiere a coloanei cu lampa de mercur). Zona fluorescentă a retinolului se separă evident de zonele galbene xantofile ce o urmează. Se colectează fracția din eluat care conține retinol într-un vas Erlenmeyer.
   5.3.2.   Produse din grupa B
   Cromatografia se folosește numai dacă măsurările de densitate optică obținute la punctul 5.4.2 nu sunt în conformitate cu cerințele indicate la punctul respectiv.
   Dacă cromatografia se dovedește necesară, se introduce în coloana cromatografică o cotă-parte din soluția cu eter de petrol obținută la punctul 5.2, care conține aproximativ 500 UI de retinol, și se aplică metoda cromatografică conform punctului 5.3.1.
   5.4.   Măsurarea densității optice
   5.4.1.   Produse din grupa A
   Se evaporă până la uscare sub vid eluatul conținând retinolul obținut la punctul 5.3.1. Se tratează reziduul cu 2 ml benzen (3.14). Se iau 0,3 ml din această soluție și se adaugă 3 ml de reactiv Carr-Price (3.16). Se dezvoltă o colorație albastră. Se măsoară densitatea optică cu ajutorul spectrofotometrului la 610 nm timp de exact 30 de secunde de la declanșarea reacției. Se determină conținutul de retinol prin raportare la o curbă standard obținută din soluțiile de benzen de concentrații crescătoare de retinol etalon, tratate cu reactiv Carr-Price [de la 2 la 16 UI de vitamina A etalon (3.17) per 0,3 ml benzen (3.14) + 3 ml reactiv Carr-Price (3.16)]. Curba de etalonare trebuie verificată periodic și frecvent cu ajutorul unui etalon și al unei soluții proaspăt preparate de reactiv Carr-Price.
   5.4.2.   Produse din grupa B
   Se ia o cotă-parte din soluția de eter de petrol obținută la punctul 5.2 conținând aproximativ 200 UI de retinol. Se evaporă până la uscare sub vid și se tratează reziduul obținut cu 25 ml izopropanol (3.18). Se măsoară densitatea optică cu ajutorul spectrofotometrului la 325, 310 și 334 nm. Maximul de absorbție este localizat la 325 nm. Conținutul de retinol A al soluției se calculează după cum urmează:
   E325 18,30 = UI de retinol/ml
   Totuși, raportul densităților optice
   E310 : E325 și E334 : E325
   
   trebuie să fie 6 : 7 = 0,857.
   Dacă unul din aceste rapoarte diferă mult față de această valoare (< 0,830 sau > 0,880), măsurarea densităților optice trebuie să fie precedată de cromatografie, în conformitate cu procedeul indicat la punctul 5.3.2. Dacă măsurarea densităților optice efectuate după cromatografie arată că rapoartele menționate mai sus diferă în continuare apreciabil față de valoarea de 0,857 (< 0,830 sau > 0,880), determinarea trebuie realizată în conformitate cu procedeul indicat pentru produsele din grupa A.
   6.   Calculul rezultatelor
   Se calculează conținutul de retinol al probei, ținând cont de greutatea probei test și de diluțiile realizate în cursul analizei. Rezultatele se exprimă în UI de retinol per kg de furaje sau per kg de concentrat sau preamestec.
   Repetabilitatea
   Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele realizate pe aceeași probă nu trebuie să depășească:
   
               —
            
            
               20 %, în valoare relativă, pentru un conținut de retinol sub 75 000 UI/kg;
            
         
               —
            
            
               15 000 UI pentru un conținut cuprins între 75 000 și 150 000 UI/kg;
            
         
               —
            
            
               10 %, în valoare relativă pentru un conținut cuprins între 150 000 și 250 000 UI/Kg;
            
         
               —
            
            
               25 000 UI pentru un conținut cuprins între 25 000 și 500 000 UI/kg;
            
         
               —
            
            
               5 %, în valoare relativă, pentru un conținut mai mare de 500 000 UI/kg.
            
         2.   DETERMINAREA TIAMINEI (ANEURINĂ, VITAMINA B1)
   1.   Obiectul și domeniul de aplicare
   Această metodă permite determinarea cantității de tiamină (aneurină, vitamina B1) din furaje, concentrate sau preamestecuri. Limita inferioară a determinării este 5 ppm.
   2.   Principiul
   Proba este tratată la cald cu acid sulfuric diluat și apoi hidrolizată enzimatic. Soluția obținută este supusă oxidării alcaline. Tiocromul format este extras cu ajutorul izobutanolului și se determină prin fluorimetrie.
   3.   Reactivi
   3.1.   Soluția etalon de tiamină la 100 μg/ml: se dizolvă 112,3 mg de clorhidrat de tiamină, foarte pur, uscat în prealabil sub vid până la atingerea unei greutăți constante, în 1 000 ml de acid sulfuric 0,2 N (3.2). Dacă se păstrează într-un loc rece și întunecos, această soluție se menține timp de o lună.
   3.2.   Acid sulfuric 0,2 N.
   3.3.   Bisulfit de sodiu, Na2S2O5, pur.
   3.4.   Soluție de fericianură de potasiu 20 % (p/v) p.a.
   3.5.   Soluție de hidroxid de potasiu 25 % (p/v) p.a.
   3.6.   Amestec oxidant: se amestecă 2 ml soluție de fericianură de potasiu (3.4) cu 48 ml soluție de hidroxid de potasiu (3.5). Acest amestec nu poate fi păstrat mai mult de 4 ore.
   3.7.   Izobutanol p.a.
   3.8.   Soluție de acetat de sodiu 2,5 N.
   3.9.   Preparat multienzimatic conținând protează, fosfatază și amilază (de exemplu, Clarase).
   3.10.   Etanol 96 % (v/v).
   4.   Aparatura
   4.1.   Baie de apă.
   4.2.   Centrifugă (3 500 rpm) cu tuburi de 30-50 ml cu dopuri rodate.
   4.3.   Fluorimetru.
   5.   Modul de lucru
   5.1.   Hidroliza enzimatică
   Se introduc în fiecare dintre cele două baloane gradate de 250 ml, A și B, cantități identice de probă fin divizată conținând aproximativ 100 μg de tiamină și 125 ml de acid sulfuric (3.2). De asemenea, se adaugă, numai în balonul A, 1,0 ml soluție etalon (3.1) (etalon intern).
   Se agită puternic balonul, se pune pe baia de apă adusă la fierbere și se lasă timp de 15 minute, agitând din când în când. Se lasă să se răcească la aproximativ 45 °C. Se adaugă în fiecare balon 20 ml soluție de acetat de sodiu (3.8) și 0,5 g de preparat multienzimatic (3.9), apoi se lasă deoparte timp de 20 minute la temperatura camerei. Se adaugă 20 ml soluție de acetat de sodiu (3.8), se completează volumul cu apă, se omogenizează și se filtrează. Se colectează filtratele A și B după îndepărtarea primilor 15 ml. Se prepară următoarele soluții:
   5.1.1.   Soluția martor T
   Se pun într-un tub de centrifugare (4.2) 5 ml din filtratul A și aproximativ 10 mg bisulfit de sodiu (3.3). Se scufundă tubul în baia de apă în fierbere timp de 15 minute și apoi se lasă să se răcească la temperatura camerei.
   5.1.2.   Soluțiile A (etalon intern) și B (probă)
   Se introduc 5 ml din filtratul A într-un tub de centrifugare (4.2) și 5 ml din filtratul B într-un alt tub (4.2).
   5.2.   Oxidarea
   Se adaugă soluțiilor T, A și B 5 ml de amestec oxidant (3.6) și, după un minut, 10 ml izobutanol (3.7). Se închid tuburile și se agită puternic timp de 5 secunde. Se lasă deoparte un minut și se centrifughează pentru a separa straturile. Din fiecare tub se transferă 5 ml din stratul de izobutanol supernatant în fiecare dintre baloanele gradate de 25 ml, se completează volumul cu etanol (3.10) și se omogenizează (= extractele T, A și B).
   5.3.   Măsurarea fluorescenței
   Măsurările se realizează la lungimea de undă pentru care fluorimetrul oferă un răspuns optim la fluorescența tiocromului. Se iradiază la aproximativ 365 nm.
   Se face ajustarea instrumentului la 0 folosind extractul T. Se măsoară intensitatea fluorescenței extractelor A și B.
   6.   Calculul rezultatelor
   Conținutul de tiamină în µg/kg de probă este dat de raportul:
   
      
   unde:
   a= intensitatea fluorescenței extractului A (etalon intern);
   b= intensitatea fluorescenței extractului B (probă);
   c= greutatea probei test în g;
   d= cantitatea de tiamină în μg adăugată probei test (etalon intern).
   Repetabilitatea
   Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele realizate pe aceeași probă nu trebuie să depășească:
   
                
            
            
               10 %, în valoare relativă, pentru un conținut sub 500 ppm și
            
         
                
            
            
               5 %, în valoare relativă, pentru un conținut egal sau mai mare de 500 ppm.
            
         3.   DETERMINAREA ACIDULUI ASCORBIC ȘI A ACIDULUI DEHIDROASCORBIC
   1.   Obiectul și domeniul de aplicare
   Această metodă permite determinarea cantității totale de acid ascorbic și dehidroascorbic (vitamina C) din furaje, concentrate sau preamestecuri. Limita inferioară a determinării este de 5 ppm. Produsele sunt clasificate în două grupe, în funcție de conținutul lor estimat în vitamina C:
   
      Grupa A: conținut mai mic de 10 g/kg;
   
      Grupa B: conținut egal sau mai mare de 10 g/kg.
   2.   Principiul
   Proba, introdusă în suspensie într-o soluție diluată de acid metafosforic, este extrasă cu cloroform. Faza lichidă se tratează cu o soluție de 2,6-diclorofenol-indofenol pentru a transforma acidul ascorbic în acid dehidroascorbic și apoi cu o soluție de 2,4-dinitrofenilhidrazină. Hidrazona formată este extrasă cu un amestec de acetat de etil, acid acetic glacial și acetonă. Soluția este cromatografiată pe o coloană de gel de siliciu, eluatul este evaporat până la uscare, iar reziduul este dizolvat în acid sulfuric diluat. Densitatea optică a soluției se măsoară cu ajutorul spectrofotometrului la 509 nm.
   
      Pentru produsele din grupa A, eluatul rezultat în urma cromatografiei în coloană este supus, în plus, unei cromatografii în strat subțire pentru a izola hidrazona.
   3.   Reactivi
   3.1.   Soluție etalon cu 0,05 % acid L-ascorbic: se dizolvă 50 mg acid L-ascorbic p.a. în aproximativ 20 ml soluție acid metafosforic (3.2) și se completează cu apă până la 100 ml. Se prepară imediat înaintea utilizării.
   3.2.   Soluție cu 10 % acid metafosforic (p/v): după mărunțirea într-un mojar, se dizolvă în apă 200 g acid metafosforic p.a. și se completează cu apă până la 2 000 ml. Se păstrează la 4 °C. Această soluție se reînnoiește după o săptămână.
   3.3.   Cloroform p.a.
   3.4.   Soluție de 0,5 % (p/v) 2,6-diclorfenol-indofenol p.a. Se prepară imediat înaintea utilizării.
   3.5.   Auxiliar de filtrare (S. și S. nr. 121 sau echivalent).
   3.6.   Soluție acidă cu 2 % (p/v) 2,4-dinitrofenilhidrazină: se dizolvă 2 g de 2,4-dinitrofenilhidrazină în 100 ml acid sulfuric (25 ml acid sulfuric p.a., d:1,84, diluat prin completare cu apă până la 100 ml). Păstrată la rece, această soluție este activă timp de o săptămână.
   3.7.   Azot sau
   3.8.   Anhidridă carbonică.
   3.9.   Amestec de acetat de etil p.a./acid acetic glacial/acetonă: 96/2/2 în volum.
   3.10.   Amestec de diclormetan p.a./acid acetic glacial: 97/3 în volum.
   3.11.   Gel de siliciu, granulometrie: 0,05-0,2 mm.
   3.12.   Gel de siliciu H cu diviziuni Stahl pentru cromatografia în strat subțire.
   3.13.   Acid sulfuric diluat: se introduc 105 ml apă într-un balon gradat de 200 ml, se completează volumul cu acid sulfuric p.a., d: 1,84.
   3.14.   Solvent de eluare pentru cromatografia în strat subțire: se amestecă 75 ml de eter etilic p.a., 25 ml acetat de etil p.a. și 4,0 ml 96 % (p/v) acid acetic p.a. Se reînnoiește după 2 sau 3 cromatografii.
   4.   Aparatura
   4.1.   Baie de apă reglată la 20 °C prin ultratermostat.
   4.2.   Centrifugă (3 500 rpm) cu 40-50 tuburi prevăzute cu dopuri de sticlă mată.
   4.3.   Aparat rotativ de evaporare sub vid cu baloane de 250 ml.
   4.4.   Tuburi pentru cromatografie din sticlă (lungime:100 mm, diametru interior: 20 mm), cu un disc sinterizat (de exemplu tuburi Allihn).
   4.5.   Spectrofotometru sau colorimetru cu filtre, cu cuve de 10 mm grosime.
   4.6.   Aparatură pentru cromatografia în strat subțire, cu plăci de gel de siliciu (3.12), grosime a stratului de la 0,5 la 0,6 mm. (Se recomandă plăcile gata fabricate.) Se usucă plăcile timp de 2½ până la 3 ore în cuptor la temperatura de 120-130 °C. Se lasă să se răcească, apoi se păstrează în desicator timp de cel puțin 24 ore înainte de utilizare.
   4.7.   Cuptor pentru uscare reglat la 120-130 °C.
   5.   Modul de lucru
   5.1.   Extracția
   Se introduc în două baloane gradate de 250 ml cu dop rodat, A și B, cantități identice de probă fin divizată, conținând aproximativ 200 μg de vitamina C. Se adaugă numai în balonul A 0,4 ml soluție etalon (3.1) și se amestecă, agitându-se ușor (etalon intern).
   Se adaugă în fiecare balon 30 ml cloroform (3.3) și 25 ml soluție acid metafosforic (3.2) la 4 °C. Se agită ușor și apoi se lasă în repaus timp de 10-15 minute. Se adaugă 25 ml apă, se închid baloanele, se agită puternic timp de 10 secunde, apoi se lasă în repaus timp de 10-15 minute pe baia de apă (4.1). Se centrifughează până când faza apoasă se separă de faza de cloroform. Operațiile se efectuează simultan, așa cum sunt descrise în continuare, pe extractele apoase A (etalon intern) și B.
   5.2.   Oxidarea
   Cu ajutorul unei pipete, se transferă 40 ml din soluția apoasă supernatantă (ușor tulbure) obținută la 5.1 într-un tub de reacție prevăzut cu dop rodat, se adaugă 0,5-1 ml soluție de 2,6-diclorfenol-indofenol (3.4) și se amestecă. Se dezvoltă o culoare roșie care trebuie să persiste timp de cel puțin 15 minute. Apoi se adaugă aproximativ 300 mg auxiliar de filtrare (3.5), se agită și se filtrează printr-un filtru plisat uscat. Filtratul nu trebuie neapărat să fie clar.
   5.3.   Reacția cu 2,4-dinitrofenilhidrazină și extragerea hidrazonei
   Cu ajutorul unei pipete, se transferă 10 ml din filtratul obținut la 5.2 în tubul de centrifugă (4.2), se adaugă 2 ml soluție 2,4-dinitrofenilhidrazină (3.6) și se amestecă. Se trece rapid prin tub un curent de azot (3.7) sau dioxid de carbon (3.8), se închide tubul și se scufundă în baia de apă (4.1) timp de 15 ore (peste noapte).
   Apoi se adaugă 3 ml apă, 20 ml din amestecul de acetat de etil/acid acetic glacial/acetonă (3.9) și aproximativ 800 mg auxiliar de filtrare (3.5). Se închide tubul, se agită puternic timp de 30 de secunde și se centrifughează. Se pun 15 ml din faza supernatantă într-un balon de evaporare și se lasă în evaporatorul rotativ (4.3), sub presiune scăzută, până când se obține un reziduu uleios. Acesta se dizolvă în 2 ml din amestecul de acetat de etil/acid acetic glacial/acetonă (3.9) prin reîncălzire la 50 °C, se lasă să se răcească și apoi se adaugă 10 ml din amestecul diclormetan/acid acetic glacial (3.10) și se amestecă.
   5.4.   Cromatografia în coloană cromatografică
   Se umple un tub de cromatografie (4.4) până la un nivel de 30 mm cu amestec diclormetan/acid acetic glacial (3.10). Se face o suspensie (prin agitare puternică) de 5 g gel de siliciu (3.11) în 30 ml din amestecul diclormetan/acid acetic glacial (3.10); se toarnă suspensia în tub. Se lasă în repaus, apoi se comprimă la presiune scăzută sub azot (3.7). Se decantează în tub soluția obținută la 5.3, se spală balonul cu o cantitate mică din amestecul diclormetan/acid acetic glacial (3.10) și se decantează în tub, iar acesta se umple cu amestecul (3.10), apoi se trece la spălarea coloanei cu același amestec (3 până la 4 loturi de câte 5 ml), până când se obține un eluat lipsit de culoare. Se îndepărtează acea parte a eluatului colorată în galben.
   Se eluează zona roșiatică din capătul superior al coloanei cu amestec acetat de etil/acid acetic glacial/acetonă (3.9), se colectează eluatul și se evaporă până la uscare.
   5.4.1.   Pentru produsele din grupa A (conținut de vitamina C sub 10 g/kg), se dizolvă reziduul în 2,0 ml din amestecul de acetat de etil/acid acetic glacial/acetonă (3.9) și se supune imediat cromatografiei în strat subțire astfel cum se indică la punctul 5.5.
   5.4.2.   Pentru produsele din grupa B (conținut de vitamina C mai mare sau egal cu 10 g/kg), se tratează reziduul uleios cu 4,0 ml acid sulfuric diluat (3.13), se agită puternic pentru a dizolva complet reziduul, apoi se măsoară densitatea optică, astfel cum se indică la punctul 5.6.
   5.5.   Cromatografia în strat subțire
   Operațiile descrise în cele ce urmează se efectuează în duplicat. Se pun pe placă (4.6), într-o linie subțire, 0,5 ml din soluția obținută la 5.4.1. Folosind solventul de eluare (3.14), se developează timp de cel puțin 20 minute într-o cuvă saturată cu vapori de solvent, până când zona colorată în roz a hidrazonei se separă clar. Se lasă la uscat în cuptor. Se marchează limita zonei roz, se răzuiește zona cu o spatulă și se transferă pulberea într-un tub de cromatografie (4.4).
   Se eluează succesiv, o dată cu 2 ml și de două ori cu 1,5 ml de amestec acetat de etil/acid acetic glacial/acetonă (3.9). Se colectează eluatul într-un balon mic (ultima fracție trebuie să fie incoloră). Se evaporă până la uscare, se tratează reziduul uleios cu 4,0 ml de acid sulfuric diluat (3.13), se agită puternic pentru a dizolva reziduul complet și se măsoară densitatea optică.
   5.6.   Măsurarea densității optice
   Se măsoară densitatea optică cu ajutorul unui spectrofotometru la 509 nm timp de 20-30 minute după dizolvarea reziduului în acid sulfuric. Se efectuează măsurările prin comparație cu acidul sulfuric diluat (3.13).
   5.7.   Test martor
   Se realizează un test martor prin aplicarea aceluiași mod de lucru, în absența probei.
   6.   Calculul rezultatelor
   Conținutul de vitamina C din probă în g pe kg de probă este dat de raportul:
   
      
   unde:
   a= densitatea optică a martorului;
   b= densitatea optică a soluției de etalon intern;
   c= densitatea optică a soluției de probă;
   d= greutatea în grame a probei test.
   Repetabilitatea
   Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe aceeași probă nu trebuie să depășească:
   
                
            
            
               10 % în valoare relativă, pentru conținut în vitamina C sub 10 g/kg și
            
         
                
            
            
               5 % în valoare relativă, pentru conținut mai mare sau egal decât 10 g/kg.
            
         
      (1)  1 UI = 0,3 μg retinol.
   
      (2)  Pentru produse lactate și produse cu tendința de aglomerare sau de mărire a volumului, se dublează cantitatea de reactivi descriși în primele două paragrafe de la punctul 5.2.
   
      (3)  Ascorbatul de sodiu nu se adaugă dacă reacția de hidroliză se desfășoară în atmosferă de azot.
   
      (4)  Conținutul de caroten poate fi determinat prin măsurarea densității optice la 450 nm;.