CELEX: 31978L0633
Language: bg
Date: 1978-06-15 00:00:00
Title: Осма Директива на Комисията от 15 юни 1978 година относно установяване на общностни методи за анализ за целите на официалния контрол на храните за животни

Важна правна забележка

|

31978L0633

Официален вестник n° L 206 , 29/07/1978 стр. 0043 - 0055 специално финландско издание: глава 3 том 10 стр. 0071  специално гръцко издание: глава 03 том 22 стр. 0067  специално шведско издание: глава 3 том 10 стр. 0071  специално испанско издание: глава 03 том 14 стр. 0230  специално португалско издание глава 03 том 14 стр. 0230  специално чешко издание глава 3 том 03 стр. 250  - 262 специално испанско издание глава 3 том 03 стр. 250  - 262 специално унгарско издание глава 3 том 03 стр. 250  - 262 специално литвийско издание глава 3 том 03 стр. 250  - 262 LV.ES глава 3 том 03 стр. 250  - 262 MT.ES глава 3 том 03 стр. 250  - 262 PL.ES глава 3 том 03 стр. 250  - 262 SK.ES глава 3 том 03 стр. 250  - 262 специално словенско издание глава 3 том 03 стр. 250  - 262

		19780615Осма Директива на Комисиятаот 15 юни 1978 годинаотносно установяване на общностни методи за анализ за целите на официалния контрол на храните за животни(78/633/ЕИО)КОМИСИЯТА НА ЕВРОПЕЙСКИТЕ ОБЩНОСТИ,като взе предвид Договора за създаване на Европейската икономическа общност,като взе предвид Директива 70/373/ЕИО от 20 юли 1970 г. относно въвеждането на общностни методи за вземане на проби и анализ за целите на официалния контрол на храните за животни [1], последно изменена с Акта за присъединяване, и по-специално член 2 от нея,като има предвид, че посочената директива изисква официалният контрол на храните за животни да се извършва като се използват методи на Общността за вземане на проби и анализ за проверка спазването на изискванията, произтичащи от законовите, подзаконовите и административните разпоредби, отнасящи се до качеството и състава на храните за животни;като има предвид, че с Директиви 71/250/ЕИО от 15 юни 1971 г. [2], 71/393/ЕИО от 18 ноември 1971 г. [3], 72/199/ЕИО от 27 април 1972 г. [4], 73/46/ЕИО от 5 декември 1972 г. [5], 74/203/ЕИО от 25 март 1974 г. [6], 75/84/ЕИО от 20 декември 1974 г. [7] и 76/372/ЕИО на Комисията от 1 март 1976 г. [8] вече са установени редица общностни методи за анализ; като има предвид, че напредъкът на работата оттогава подсказва, че е препоръчително да се приеме осма поредица от методи;като има предвид, че предвидените в настоящата директива мерки са в съответствие със становището на Постоянния комитет по храните за животни,ПРИЕ НАСТОЯЩАТА ДИРЕКТИВА:Член 11. Държавите-членки изискват анализите за официалния контрол на храните за животни по отношение на съдържанието им на цинк бацитрацин, флавофосфолипол, желязо, мед, манган и цинк да се извършват в съответствие с методите, описани в приложението към настоящата директива.2. Общите разпоредби, изложени в част 1 "Въведение" на приложението към Първа директива 71/250/ЕИО, с изключение на частта, която разглежда приготвянето на пробата за анализ, се прилагат за методите, описани в приложението към настоящата директива.Член 2Държавите-членки приемат на 1 януари 1979 г. законовите, подзаконовите и административните разпоредби, необходими, за да се съобразят с настоящата директива. Те уведомяват незабавно Комисията за това.Член 3Адресати на настоящата директива са държавите-членки.Съставено в Брюксел на 15 юни 1978 година.За КомисиятаFinn GundelachЗаместник-председател[1] ОВ L 170, 3.8.1970 г., стр. 2.[2] ОВ L 155, 12.7.1971 г., стр. 13.[3] ОВ L 279, 20.12.1971 г., стр. 7.[4] ОВ L 123, 29.5.1972 г., стр. 6.[5] ОВ L 83, 30.3.1973 г., стр. 21.[6] ОВ L 108, 22.4.1974 г., стр. 7.[7] ОВ L 32, 5.2.1975 г., стр. 26.[8] ОВ L 102, 15.4.1976 г., стр. 8.--------------------------------------------------19780615ПРИЛОЖЕНИЕ1. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЦИНК БАЦИТРАЦИН ЧРЕЗ ДИФУЗИЯ В АГАРНА СРЕДА1. ЦЕЛ И ОБХВАТМетодът служи за определяне на цинк бацитрацин в храните за животни, концентрираните фуражи и премиксите. Най-ниското ниво за определяне е 5 мг/кг (5 ррм) [*]. Методът не е валиден в присъствието на интерфериращи вещества, особено на големи количества на мед и аскорбинова киселина.2. ПРИНЦИППробата се извлича при рН 2 със смес от метанол/вода/солна киселина. Екстрактът се довежда до рН 6,5, концентриран (ако е необходимо) и разреден. Антибиотичната му активност се определя чрез измерване на дифузията на цинк бацитрацина в агарна среда, инокулиран с Микрококус лутеус (syn. М. flavus). Дифузията е показана чрез образуване на зони на инхибиране на микроорганизма. Диаметърът на тези зони се приема за правопропорционален на логаритъма на антибиотичната концентрация спрямо обема на използваната антибиотична концентрация.3. МИКРООРГАНИЗЪМ: МИКРОКОКУС ЛУТЕУС АТСС 102403.1. Поддържане на култура за размножениеИнокулира се микрококус лутеус на агарните склонове в средата за култивиране (4.1). Инкубира се 24 часа при 30—37 °С, съхранява се в хладилник при около 4 °С и се реинокулира на всеки две седмици в агарните склонове.3.2. Подготовка на бактериална суспензия [2]Събира се растежът от наскоро приготвения агарен склон (3.1) с от 2 до 3 мл разтвор на натриев хлорид (4.3). Използва се суспензията, за да се инокулира 250 мл от средата за култивиране (4.1), съдържаща се в колба на Ру, и се инкубира 18—20 часа при 30—37 °С. Растежът се събира в 25 мл разтвор на натриев хлорид (4.3) и се смесва. Разтворът се разрежда до една десета с разтвор на натриев хлорид (4.3). Леката трансмисия на суспензията трябва да бъде около 75 %, измерено при 650 нм в 1 см клетка срещу разтвор от натриев хлорид (4.3).4. СРЕДА ЗА КУЛТИВИРАНЕ И РЕАГЕНТИ4.1. Среда за култивиране [3]Месен пептон | 6,0 г |Триптон | 4,0 г |Екстракт от дрожди | 3,0 г |Месен екстракт | 1,5 г |Глюкоза | 1,0 г |Агар | 15,0 г |Вода | 1000 мл |рН от 6,5 до 6,6 (след стерилизация) | |4.2. Основна среда за дозировка [4]Триптон | 10,0 г |Екстракт от дрожди | 3,0 г |Месен екстракт | 1,5 г |Глюкоза | 1,0 г |Агар | 20,0 г |Туин 80 | 1 мл |Вода | 1000 мл |рН 6,5 (след стерилизация) | |4.3. Разтвор на натриев хлорид 0,8 % (т/об): разтваря се натриев хлорид А.Р. във вода и се разрежда до 1000 мл; стерилизира се.4.4. Смес от чист метанол/вода/солна киселина А.Р. (р: 1,18—1,19): 80/17,5/2,5 (об/об/об).4.5. Фосфатен буфер, рН 6,5Калиев водороден фосфат К2НРО4 А.Р. (22,15 г).Калиев дихидроген фосфат КН2РО4 А.Р. (27,85 г)Вода до 1000 мл.4.6. Солна киселина А.Р. (р: 1,18—1,19)4.7. Солна киселина А.Р. (0,1 N)4.8. Натриев хидроксид 1 N разтвор А.Р.4.9. Бромокрезол, пурпурен разтвор 0,04 % (т/об): разтваря се 0,1 г пурпурен бромокрезол в 18,5 мл от 0,01 N разтвор на натриев хидроксид. Допълва се обемът до 250 мл с вода и се смесва.4.10. Стандартно вещество: цинк бацитрацин с известно действие (в м.е.)5. СТАНДАРТНИ РАЗТВОРИПремерва се количество от стандартен цинк бацитрацин (4.10), съответстващ на 1050 м.е. (според указаната активност). Добавя се 5 мл 0,1 N солна киселина (4.7) и се оставя 15 минути. Добавя се 30 мл вода, регулира се до рН 4,5 с фосфатен буфер РН 6,5 (4.5) (около 4 мл), достига се обем от 50 мл с вода и се бърка добре (1 мл = 21 м.е.).От този разтвор се приготвят чрез последващо разреждане с фосфатен буфер рН 6,5 (4.5) следните разтвори:S8 | 0,42 | м.е./мл |S4 | 0,21 | м.е./мл |S2 | 0,105 | м.е./мл |S1 | 0,0525 | м.е./мл |6. ПРИГОТВЯНЕ НА ЕКСТРАКТА6.1. Екстракция6.1.1. Концентрирани фуражи, премикси и минерални храни за животниПремерва се количество от пробата от 2,0 до 5,0 г, добавя се 30 мл от сместа (4.4) и се разклаща за кратко време. Проверява се дали рН е около 2. Разклаща се 10 минути, добавя се 30 мл фосфатен буфер рН 6,5 (4.5) и се разклаща в продължение на 15 минути. Разрежда се с фосфатен буфер (4.5), за да се получи очакваното съдържание цинк бацитрацин от 0,42 м.е./мл (= U8).6.1.2. Протеинови концентратиПремерва се количество от пробата при 10,0 г, добавя се 50 мл от сместа (4.4) и се разклаща за кратко време. Проверява се дали рН е около 2. Разклаща се 10 минути, добавя се фосфатния буфер рН 6,5 (4.5) и се разклаща в продължение на 15 минути. Разрежда се с фосфатен буфер (4.5), за да се получи очакваното съдържание на цинк бацитрацин от 0,42 м.е./мл (= U8).6.1.3. Други хранителни веществаПремерва се количество от пробата с 10,0 г (20,0 г за очаквано съдържание на цинк бацитрацин от 5 мг/кг), добавя се 25 мл от сместа (4.4) и се хомогенизира около 10 минути. Добавя се 25 мл от фосфатния буфер рН 6,5 (4.5), разклаща се 15 минути и се центрофугира. Вземат се 20 мл от супернатантния разтвор и се получава рН 6,5 чрез 1 N разтвор на натриев хидроксид (4.8) с разтвор на пурпурен бромокрезол (4.9) като индикатор. Изпарява се до около 4 мл в ротационен изпарител при температура, непревишаваща 35 °С. Разрежда се утайката с вода, за да се постигне очакваното съдържание на цинк бацитрацин от 0,42 м.е./мл (= U8).6.2. Разтвори за експерименти за дозиранеОт разтвор U8 да се изготвят разтвори U4 (очаквано съдържание: 0,21 м.е./мл), U2 (очаквано съдържание: 0,105 м.е./мл) и U1 (очаквано съдържание: 0,0525 м.е./мл), чрез последващо разреждане (1 + 1) с фосфатен буфер (4.5).7. ПРОЦЕДУРА НА ДОЗИРАНЕ7.1. Инокулация на среда на културатаИнокулира се основна среда на дозиране (4.2) с бактериална суспензия (3.2) при около 50 °С. Чрез предварителни опити на плочки със средата (4.2) се определя количеството необходима бактериална суспензия, за да се получат големи и чисти зони на инхибиране с концентрации от пари цинк бацитрацин.7.2. Подготовка на плочкитеИзвършва се дифузия през плочките в агара с четирите концентрации на стандартния разтвор (S8, S4, S2, S1) и четирите концентрации на екстракта (U8, U4, U2, U1). Тези четири концентрации от екстракта и от стандарта трябва непременно да бъдат поставени на всяка плака. За тази цел се подбират достатъчно големи плочки, за да има поне осем дупки с диаметър от 10 до 13 мм и не по-малко от 30 мм между центровете, които трябва да бъдат направени в агарната среда. Тестът може да се извърши на плочки, които се състоят от стъклена плоча с алуминиева повърхност или пластмасов пръстен, поставен отгоре, с 200 мм диаметър и 20 мм височина.Върху плочите (4.2) се изсипва количество среда, инокулирана, както е посочено в точка 7.1, за да се получи слой с около 2 мм дебелина (50 мл за плоча с 200 мм диаметър). Установява се в хоризонтално положение, пробиват се дупки и в тях се поставят точно премерени обеми от разтвори на екстракта и на стандарта (между 0,10 и 0,15 мл на дупка, според диаметъра).Всяка концентрация да се приложи поне четири пъти, така че всяко определяне да подлежи на оценяване в 32 зони на инхибиране.7.3 ИнкубацияПлочите се инкубират 16—18 часа при 28—30 °С.8. ОЦЕНКАИзмерва се диаметърът на зоните на инхибиране до най-близка стойност 0,1 мм. Отбелязва се средната измерена стойност на всяка концентрация върху полулогаритмична графика върху хартия, която показва логаритъма на концентрациите спрямо диаметрите на зоните на инхибиране. Нанасят се най-добре съответстващите линии на стандартния разтвор и на екстракта, например както е посочено по-долу.Определя се "най-добре съответстващата" точка на най-ниското ниво на стандарта (SL), като се използва формулата:a) SL =7 S+ 4 S+ S– 2 S810Определя се "най-добре съответстващата" точка на най-високото ниво на стандарта (SH), като се използва формулата:b) SH =7 S+ 4 S+ S– 2 S110По същия начин се изчисляват "най-добре съответстващите" точки на най-ниската степен на екстракта (UL) и на най-високата степен на екстракта (UH), като се заменят S1, S2, S4 и S8 в посочените по-горе формули с U1, U2, U4 и U8.Отбелязват се изчислените стойности на SL и на SH върху същата разграфена хартия и се свързват, така че "да дадат най-добре съответстващата линия" за стандартен разтвор. По същия начин се нанасят UL и UH и се свързват, така че "да дадат най-добре съответстващата линия" за екстракта.При отсъствие на интерференция линиите следва да бъдат успоредни. За практически цели линиите могат да се считат за успоредни, ако стойностите (SL – SH) и (UL – UН) не се различават с повече от 10 % от средната им стойност.Ако се установи, че линиите не са успоредни, могат да не се вземат предвид U1 и S1 или U8 и S8, а SL, SH, UL, UН да се изчислят, като се използват алтернативните формули с цел да се получат най-добре съответстващите линии:a′) SL =5 S+ 2 S– S46или5 S+ 2 S– Sb′) SH =5 S+ 2 S– S16или5 S+ 2 S– S26като се действа по същия начин за UL и UН. Алтернативните най-добре съответстващи линии трябва да се проверят за паралелност, както е посочено по-горе. Фактът, че резултатът е бил изчислен от три нива, следва да се отбележи в окончателния отчет.Когато линиите се разглеждат за успоредни, се изчислява логаритъмът на относителната активност (log. A) чрез една от следните формули.За четири ниваc) log. A =× 0·602U+ U+ S+ S– U– U– S– S2За три ниваd) log. A =× 0·401U+ S– U– S1илиd′) log. A =× 0·401U+ S– U– S2Действителната активност = предполагаемата активност х относителната активност.Когато линиите се разглеждат, че не са успоредни, определянето се повтаря. Ако все още не е постигната успоредността, се изчислява логаритъмът на относителната активност (log. A) чрез формула в). Въпреки това полученият резултат трябва да се разглежда като приблизителен и това трябва да се отбележи в окончателния отчет.9. ПОВТОРЯЕМОСТРазликите между резултатите от двете определяния, извършвани върху същата проба от същия анализатор, не трябва да превишават:20 % по отношение на най-високата стойност за съдържанията на цинк бацитрацин от 5 и до 25 мг/кг;5 мг/кг в абсолютна стойност за съдържания, по-големи от 25 и до 50 мг/кг;10 %, отнесени към най-голямата стойност, за съдържания над 50 мг/кг.2. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ФЛАВОФОСФОЛИПОЛ ЧРЕЗ ДИФУЗИЯ В СРЕДА АГАР1. ЦЕЛ И ОБХВАТТози метод е предназначен за определяне на флавофосфолипол в храните за животни, концентрираните фуражи и премиксите. Ниската граница на определяне е 1 мг/кг (1 ррм).2. ПРИНЦИППробата се извлича с разреден метанол чрез нагряване под рефлукс. След центрофугиране екстрактът се пречиства (ако е необходимо) чрез третиране с йонообменни смоли и се разрежда. Антибиотичното действие се определя чрез измерване на дифузията на флавофосфолипола в агарна среда, инокулирана със стафилококус ауреус. Дифузията е показана чрез формирането на зони на инхибиране от микроорганизма. Диаметърът на тези зони се приема за правопропорционален на логаритъма на антибиотичната концентрация над обхвата на прилаганите антибиотични концентрации.3. МИКРООРГАНИЗЪМ: СТАФИЛОКОКУС АУРЕУС АТСС 6538 Р3.1. Поддръжка на посевъчната култураИнокулира се стафилококус ауреус в агарните склонове на средата на културата (4.1). Инкубира се 24 часа при 37 °С, държи се в хладилник при около 4 °С и се инокулира всеки месец в косите агарни посявки.3.2. Приготвяне на бактериална суспензия [5]Вземат се две тръбички, съдържащи посевъчна култура (3.1) и се реинокулират месечно. Инкубират се 24 часа при 37 °С и се държат в хладилник при 4 °С.24 часа преди дозирането, се инокулират с този растеж от две до 4 тръбички, съдържащи посявки на кос агар от култивационна среда (4.1). Инкубира се от 16 до 18 часа при 37 °С. Прави се суспензия от растежа в разтвор от натриев хлорид (4.3). Леката трансмисия на суспензията трябва да бъде около 40 %, измерена при 578 NМ в 1 см клетка спрямо разтвор от натриев хлорид (4.3).4. КУЛТИВАЦИОННА СРЕДА И РЕАГЕНТИ4.1. Култивационна среда [6]:Месен пептон | 6,0 г |Триптон | 4,0 г |Екстракт от дрожди | 3,0 г |Месен екстракт | 1,5 г |Глюкоза | 1,0 г |Агар | 15,0 г |Вода | 1000 мл |рН 6,5 (след стерилизация) | |4.2. Среда за дозиране4.2.1. Основен слой [7]Месен пептон | 6,0 г |Екстракт от дрожди | 3,0 г |Месен екстракт | 1,5 г |Агар | 10,0 г |Вода | 1000 мл |рН 6,5 (след стерилизация) | |4.2.2. Посадъчен слойКакто при точка 4.1, с добавяне на 2,0 г силиконова противоразпенваща емулсия [8].4.3. Разтвор от натриев хлорид 0,4 % (т/об): разтваря се 4 г натриев хлорид А.Р. във вода и се разрежда до 1000 мл; стерилизира се.4.4. Чист метанол4.5. Метанол 50 % (об/об): разрежда се 500 мл метанол (4.4) с 500 мл вода.4.6. Метанол 80 % (об/об): разрежда се 800 мл метанол (4.4) с 200 мл вода.4.7. Трис (хидрометил) аминометан А.Р.4.8. Метанолов разтвор от калиев хлорид 1,5 % (т/об): разтваря се 1,5 г от калиевия хлорид А.Р. в 20 мл вода, допълва се обемът до 100 мл с метанол (4.4).4.9. Катионен обменник: Dowex 50 W x 8, 20 to 50 mesh Na form (cat. Serva № 41600) или еквивалентен.4.10. Анионен обменник: Dowex 1 x 2, 50 to 100 mesh, Cl form (cat. Serva № 41010) или еквивалентен. Преди употреба да се държи от 12—14 часа в 80 % метанол (4.6).4.11. Стъклена вата4.12. рН индикаторна хартия (рН от 6,6 до 8,1)4.13. Аскорбинова киселина4.14. Стандартна субстанция: флавофосфолипол с познато действие.5. АПАРАТУРА5.1. Стъклена тръбичка за хроматография, вътрешен диаметър 9 мм, дължина 150—200 мм, снабдена със запушалка в стеснената част в ниската част и скачващо устройство от матово стъкло (за свързване на капковата фуния (5.2)) на горния край.5.2. Капкова фуния 250 мл, снабдена със запушалка и скачващо устройство от матово стъкло.5.3. 250 мл конична колба със скачващо устройство от матово стъкло.5.4. Рефлуксен кондензатор със скачващо устройство от матово стъкло.6. СТАНДАРТНИ РАЗТВОРИРазтваря се прецизно мерно количество от стандартното вещество (4.14) в 50 % метанол (4.5) и се разрежда, за да се получи разтвор от посявка, съдържаща 100 μg флавофосфолипол на милилитър. Съхранява се в запушени колби при 4 °С. Този разтвор е стабилен до 2 месеца.От този посадъчен разтвор да се приготви чрез разреждане с 50 % метанол (4.5) следният разтвор:S8 | 0,2 | μg/ml |S4 | 0,1 | μg/ml |S2 | 0,05 | μg/ml |S1 | 0,025 | μg/ml |7. ПОДГОТОВКА НА ЕКСТРАКТА7.1. Екстракция7.1.1. Концентрирани фуражи, премикси и минерални храни за животниИзмерва се количество от пробата от 2,0 до 5,0 г и се добавя около 150 мг аскорбинова киселина (4.13). Хомогенизира се с 150 мл 50 % метанол (4.5) в конична колба и се постига рН от 8,1 до 8,2 с около 400 мг трис (хидроксиметил) аминометан (4.7). Проверява се рН с индикаторната хартия (4.12). Престоява 15 минути. След това отново се постига рН от 8,1 до 8,2 с трис (хидроксиметил) аминометан (4.7) и кипи 10 минути под рефлукс (5.4) с постоянно бъркане. Екстрактът се охлажда, центрифугира и декантира.7.1.2. Други храни за животниИзмерва се количество от пробата от 5,0 до 30,0 г, съдържащо поне 30 μg флавофосфолипол. Хомогенизира се със 150 мл 50 % метанол (4.5) в конична колба и се постига рН от 8,1 до 8,2 с около 400 мг трис (хидроксиметил) аминометан (4.7). Проверява се рН с индикаторната хартия (4.12). Престоява 15 минути. След това отново се постига рН от 8,1 до 8,2 с трис (хидроксиметил) аминометан (4.7) и кипи 10 минути под рефлукс (5.4) с постоянно бъркане. Екстрактът се охлажда, центрофугира и декантира.7.2. Пречистване (тази стъпка може да се пропусне за концентрирани фуражи, премикси и минерални храни за животни)Смесва се 110 мл от екстракта с 11 г от катионния обменник (4.9), вари се 1 минута под рефлукс (5.4) с постоянно бъркане. Отделя се катионният обменник чрез центрифугиране или филтрация. Смесва се 100 мл от екстракта с 150 мл метанол (4.4) и разтворът се държи 12—15 часа при 4 °С. Филтрира се флокулентната маса докато е студена.Поставя се запушалка от стъклена вата (4.11) на дъното на стъклената тръбичка, изсипва се в нея 5 мл от анионния обменник (4.10) и стълбът се измива със 100 мл 80 % метанол (4.6). Използвайки фуния (5.2), към стълба се прехвърля обем от филтрата от поне 100 мл, за който се очаква да съдържа 16 μg флавофосфолипол (200 мл за 30 г проба от хранителното вещество при 1 ррм). Ако е необходимо преди прилагането в стълба филтратът се разрежда с 80 % метанол (4.6), за да се получи очакваното съдържание на флавофосфолипол от 16 μg/100 мл. Напасва се потокът до около 2 мл/минута. Изхвърля се ефлуентът. След това стълбът се измива с 50 мл 80 % метанол (4.6) и ефлуентът се отстранява.Елуира се флавофосфолипола с метанолов разтвор от калиев хлорид (4.8), като се поддържа поток от около 2 мл/минута. Събира се 50 мл от елуата в градуирана колба, добавя се 30 мл вода и се бърка. Този разтвор трябва да има флавофосфолиполно съдържание от 0,2 μg/мл = (U8).7.3. Разтвори за дозиранеАко е необходимо (където се пропуска пречистване), полученият в точка 7.1.1. екстракт се разрежда с 50 % метанол, за да се получи очаквано съдържание на флавофосфолипол от 0,2 μg/мл.От разтвор U8 се приготвят разтвори U4 (очаквано съдържание: 0,1 μg/мл), U2 (очаквано съдържание: 0,05 μg/мл) и U1 очаквано съдържание: 0,025 μg/мл) чрез последващо разреждане (1 + 1) с 50 % метанол (4.5).8. ПРОЦЕДУРА НА ДОЗИРАНЕ8.1. Инокулация на средата на култивиранеИнокулира се средата за дозиране (4.2.2.) с бактериална суспензия (3.2) при 50 °С. С предварителни опити върху плочки със среда (4.2.2.) се определя количеството бактериална суспензия, необходимо, за да се получат най-големи и най-ясни зони на инхибиране с различните концентрации от флавофосфолипол (около 30 мл на литър).8.2. Приготвяне на плочкитеИзвършва се дифузия през среда за дозиране върху плочки с четири концентрации на стандартните разтвори (S8, S4, S2, S1) и четирите концентрации на екстракта (U8, U4, U2, U1). Тези четири концентрации на екстракта и стандарта трябва да бъдат поставени на всяка плочка. За целта се избират достатъчно големи плочки, за да има поне 8 дупки с диаметър 10—13 мм и не по-малко от 30 мм между центровете, които трябва да бъдат направени в среда за дозиране. Тестовете трябва да се извършват върху плочките, състоящи се от стъклени листове с облицовка от алуминий или с пластмасов пръстен отгоре, 200 мм в диаметър и 20 мм височина.Изсипва се върху плочките количество от средата (4.2.1.), за да се получи слой от 1,5 мм дебелина (45 мл за плочка от 200 мм диаметър). Установява се в хоризонтално положение и се покрива отгоре с количество (4.2.2.), инокулирано както в точка 8.1., за да се получи слой с дебелина 1 мм (30 мл за плоча с 200 мм диаметър). Поставя се в хоризонтално положение. Пробиват се дупки и в тях се поставя точно премереното количество екстракти и стандартни разтвори (между 0,10 и 0,15 мл на дупка, според диаметъра).Всяка концентрация се прилага поне четири пъти, така че всяко определяне да може да се оценява в три зони на инхибиране.8.3. ИнкубиранеПлочките се инкубират 16—18 часа при 28—30 °С.9. ОЦЕНКАИзмерва се диаметърът на зоните на инхибиране до най-близката стойност 0,1 мм. Отбелязва се средната измерена стойност на всяка концентрация върху полулогаритмична графика върху хартия, която показва логаритъма на концентрациите спрямо диаметрите на зоните на инхибиране. Нанасят се най-добре съответстващите линии на стандартния разтвор и на екстракта, например както е посочено по-долу.Определя се "най-добре съответстващата" точка на най-ниското ниво на стандарта (SL), като се използва формулата:a) SL =7 S+ 4 S+ S– 2 S810б) SH =7 S+ 4 S+ S– 2 S110По същия начин се изчисляват "най-добре съответстващите" точки на най-ниската степен на екстракта (UL) и на най-високата степен на екстракта (UH), като се заменят S1, S2, S4 и S8 в посочените по-горе формули с U1, U2, U4 и U8.Отбелязват се изчислените стойности на SL и на SH върху същата разграфена хартия и се свързват така, че "да дадат най-добре съответстващата линия" за стандартен разтвор. По същия начин се нанасят UL и UH и се свързват така, че "да дадат най-добре съответстващата линия" за екстракта.При отсъствие на интерференция линиите следва да бъдат успоредни. За практически цели линиите могат да се считат за успоредни, ако стойностите (SL – SH) и (UL – UН) не се различават с повече от 10 % от средната им стойност.Ако се установи, че линиите не са успоредни, могат да не се вземат предвид U1 и S1 или U8 и S8, а SL, SH, UL, UН да се изчислят, като се използват алтернативните формули, с цел да се получат най-добре съответстващите линии:a′) SL =5 S+ 2 S– S46или5 S+ 2 S– Sб′) SH =5 S+ 2 S– S16или5 S+ 2 S– S26като се действа по същия начин за UL и UН. Алтернативните най-добре съответстващи линии трябва да се проверят за паралелност както по-горе. Фактът, че резултатът е бил изчислен от три нива, следва да се отбележи в окончателния отчет.Когато линиите се разглеждат за успоредни, се изчислява логаритъмът на относителната активност (log. A) чрез една от следните формули.За четири нивав) log. A =× 0.602U+ U+ S+ S– U– U– S– S2За три ниваг) log. A =× 0·401U+ S– U– S1илид) log. A =× 0·401U+ S– U– S2Действителната активност = предполагаемата активност х относителната активност.Когато линиите се разглеждат, че не са успоредни, определянето се повтаря. Ако все още не е постигната успоредността, се изчислява логаритъмът на относителната активност (log. A) чрез формула в). Въпреки това полученият резултат трябва да се разглежда като приблизителен и това трябва да се отбележи в окончателния отчет.10. ПОВТОРЯЕМОСТРазликата между резултатите от двете определяния, извършени върху една и съща проба от един анализатор, не трябва да превишават:0,5 мг/кг в абсолютна стойност за съдържанията на флавофосфолипол от 1 до 2 мг/кг;25 %, съотнесени към най-високата стойност за съдържания, по-големи от 2 и до 10 мг/кг;20 %, съотнесени към най-високата стойност за съдържания, по-големи от 10 и до 25 мг/кг;5 мг/кг, в абсолютна стойност за съдържания, по-големи от 25 и до 50 мг/кг;10 %, съотнесени към най-високата стойност за съдържания над 50 мг/кг.3. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЛЕДИ ОТ ЕЛЕМЕНТИ — ЖЕЛЯЗО, МЕД, МАНГАН И ЦИНК1. ЦЕЛ И ОБХВАТМетодът позволява да се определят и малки количества от желязо, мед, манган и цинк в храните. Ниските граници на определяне са следните:желязо (Fе): 20 mg/kgмед (Cu): 10 mg/kgманган (Mn): 20 mg/kgцинк (Zn): 20 mg/kg2. ПРИНЦИППробата се поставя в разтвор от солна киселина след деструкция на органичното вещество, ако има такова. Елементите желязо, мед, манган и цинк се определят с атомноабсорбционна спектрометрия.3. РЕАГЕНТИУводен коментарЗа изготвянето на реагентите и аналитичните разтвори се използва вода, в която не присъстват катионите за определяне. Тя се получава чрез двойно дестилиране в боросиликатно стъкло или кварц с двойно третиране чрез йонообменна смола.Реагентите трябва да бъдат поне с аналитично качество (А.Р.) Отсъствието на елемента за определяне трябва да се проверява чрез експеримент на празна проба. Ако е необходимо реагентите трябва допълнително да се пречистват.Вместо по-долу описаните стандартни разтвори могат да се използват стандартни комерсиални радтвори, ако те са гарантирани и проверени преди употреба.3.1. Солна киселина А.Р. (р:1,19)3.2. Солна киселина А.Р. (6 N)3.3. Солна киселина А.Р. (0,5 N)3.4. Солна киселина 38 до 40 % (об/об) със съдържание на желязо по-малко от 1 мг на литър и утайка след изпаряване по-малко от 10 мг (като сулфат) на литър.3.5. Сярна киселина А.Р. (p 1,84).3.6. Водороден прекис А.Р. (приблизително 100 обема кислород (30 % на тегло)).3.7. Стандартен железен разтвор (1000 μg Fe/ml), приготвен, както следва: разтваря се 1 г желязна тел А.Р. в 200 мл от 6 N солна киселина (3.2), добавят се 16 мл водороден прекис (3.6) и се допълва до един литър с вода.3.7.1. Работен стандартен железен разтвор (100 μg Fe/ml), приготвен чрез разреждане на стандартния разтвор (3.7) с вода 1 + 9.3.8. Стандартен меден разтвор (1000 μg Сu/ml), приготвен, както следва: разтваря се 1 г мед на прах (А.Р.) в 25 мл от 6 N солна киселина (3.2), добавя се водороден прекис и се допълва до един литър с вода.3.8.1. Работен стандартен меден разтвор (10 μg Сu/ml), приготвен чрез разреждане на стандартния разтвор (3.8) с вода и след това разреждане на получения разтвор с вода 1 + 9.3.9. Стандартен манганов разтвор (1000 μg Mn/ml), приготвен, както следва: разтваря се 1 г манган на прах (А.Р.) в 25 мл от 6 N солна киселина (3.2) и се допълва до един литър с вода.3.9.1. Работен стандартен манганов разтвор (10 μg Mn/ml), приготвен чрез разреждане на стандартния разтвор (3.9) с вода 1 + 9 и след това разреждане на получения разтвор с вода 1 + 9.3.10. Стандартен цинков разтвор (1000 μg Zn/ml), приготвен, както следва: разтваря се 1 г цинк на парчета или листове (А.Р.) в 25 мл 6 N солна киселина (3.2) и се допълва до 1 литър с вода.3.10.1. Работен стандартен цинков разтвор (10 μg Zn/ml), приготвен чрез разреждане на стандартния разтвор (3.10) с вода 1 + 9 и след това разреждане на получения разтвор с вода 1 + 9.3.11. Разтвор на лантаниев хлорид, приготвен, както следва: разтварят се 12 г лантаниев окис в 150 мл вода, добавят се 100 мл 6 N солна киселина (3.2) и се допълва до 1 литър с вода.4. АПАРАТУРА4.1. Муфелна пещ с регулиране на температурата и записващо устройство.4.2. Стъклените съдове трябва да бъдат от устойчив боросиликатен тип и се препоръчва да се използва апарат, който е изключително предназначен за определяне на редки елементи.4.3. Платинен и (опция) кварцов тигел.4.4. Атомен абсорбционен спектрометър, съответстващ на изискванията на метода, с оглед на чувствителността и прецизността в необходимия обхват.5. ПРОЦЕДУРА5.1. Проби, съдържащи органично вещество5.1.1. Опепеляване и изготвяне на разтвор за анализ []i) Поставя се от 5 до 10 г проба, премерена с приблизителна точност до 0,2 мг, в платинен или кварцов тигел (4.3) (виж забележка б), изсушава се в пещ при 105 °С и тигелът се поставя в студена муфелна пещ (4.1). Пещта се затваря (виж забележка в) и температурата постепенно се повишава до 450—475 °С за около 90 минути. Тази температура се поддържа 4—16 часа (например през нощта) за отделяне на саждите, след това пещта се отваря, за да се охлади (виж забележка г).Тигелът се измива с около 5 мл солна киселина (3.1), като последната бавно и внимателно се добавя към чаша от химически устойчиво стъкло (може да има бурна реакция поради образуването на СО2). Добавя се солна киселина (3.1) на капки с разклащане докато спре отделянето на мехурчета. Да се изпарява до изсъхване, като от време на време се разбърква със стъклена пръчка.След това се добавя 15 мл 6 N солна киселина (3.2) към утайката, след това 120 мл вода, разбърка се със стъклена пръчка, която трябва да остане в мензурата, а тя да се покрие със стъкло за наблюдение. Достига се до кипене бавно, поддържа се точката на кипене докато повече не се наблюдава разтварянето на пепел. Филтрира се през чиста от пепел филтърна хартия и филтратът се събира в 250 мл мерителна колба. Мензурната чаша и филтърът се измиват с 5 мл гореща 6 N солна киселина (3.2) и два пъти с вряща вода. Напълва се мерителната колба до мярката с вода (концентрацията на солната киселина около 0,5 N).ii) Ако седиментът във филтъра изглежда черен (въглерод), той се връща в пещта и се опепелява отново при 450—475 °С. Това опепеляване, което само изисква няколко часа (около 3—5 часа), е завършено, когато пепелта изглежда бяла или почти бяла. Седиментът се разтваря с около 2 мл солна киселина (3.1), изпарява се до изсъхване и се добавят 5 мл 6 N солна киселина (3.2). Нагрява се, филтрира се разтворът в мерителната колба и се достига маркировката чрез прибавяне на вода (концентрация на солната киселина около 0,5 N).Забележки:а) При определянето на остатъчните елементи е важно да се обърне внимание на рисковете от замърсяване, особено с цинк, мед и желязо. По тази причина използваните прибори не трябва да съдържат тези метали.За намаляване на общия риск от замърсяване трябва да се работи в обезпрашена атмосфера с безупречно чисти прибори и внимателно измити стъклени съдове. Определянето на цинка е особено чувствително към много видове замърсяване, например от стъклените съдове, реагентите, прахта и др.б) Теглото на пробата, която трябва да се опепелява, се изчислява от приблизителното съдържание на проследявания елемент в храната за животни по отношение на чувствителността на използвания спектрофотометър. За определени храни за животни, които съдържат малко следи на елементи, може да е необходимо да се започне с проба от 10—20 г и да се ограничи крайният разтвор само до 100 мл.в) Опепеляването трябва да се извършва в затворени пещи без подаване на въздух или кислород.г) Температурата, която показва пирометърът, не трябва да превишава 475 °С.5.1.2. Определяне чрез спектрофотометрия5.1.2.1. Приготвяне на разтворите за калибриранеЗа всеки от елементите, които ще се определят, се приготвя от работните стандартни разтвори, посочени в точки 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1, и 3.1.1, гама от калибрационни разтвори, като всеки има концентрация на солна киселина около 0,5 N и (в случаите за желязото, мангана и цинка) концентрация на лантаниев хлорид еквивалентна на 0,1 % Lа (т/об). Подбраните концентрации на следите на елементи трябва да бъдат в рамките на чувствителността на използвания спектрометър. Таблицата по-долу показва чрез пример съставите на типични калибрационни разтвори; в зависимост обаче от вида и чувствителността на използвания спектрофотометър, може да се наложи да се изберат други концентрации.Желязоμg Fe/ml | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |работен стандартен разтвор в мл (3.7.1) | | | | | | | |(1 мл = 100 μg Fe) | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |+ мл6 N HCl (3.2) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |+ 10 мл разтвор на лантаниев хлорид (3.11) и допълване до 100 мл с вода. |Медμg Cu/ml | 0 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 08 | 1,0 |работен стандартен разтвор в мл (3.8.1) | | | | | | | |(1 мл = 10 μg Cu) | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |+ мл 6 N HCl (3.2) | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 |Допълва се до 100 мл с вода. |Манганμg Mn/ml | 0 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0 |работен стандартен разтвор в мл (3.9.1) | | | | | | | |(1 мл = 10 μg Mn) | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |+ мл 6 N HCl (3.2) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |+ 10 мл разтвор на лантаниев хлорид (3.11) и допълване до 100 мл с вода. |Цинкμg Zn/ml | 0 | 0,05 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 |работен стандартен разтвор в мл (3.10.1) | | | | | | | |(1 мл = 10 μg Zn) | 0 | 0·5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 |+ мл 6 N HCl (3.2) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |+ 10 мл разтвор на лантаниев хлорид (3.11) и допълване до 100 мл с вода. |5.1.2.2. Подготовка на разтвора за анализЗа определяне на медта разтворът, приготвен, както е указано в точка 5.1.1, може да се използва директно. Ако е необходимо концентрацията му да се сведе до рамките на разтворите за калибриране, може да се прибави аликвотна част с пипета в 100 мл измервателна колба и да се достигне до маркировката с 0,5 N солна киселина (3.3).За определяне на желязото, мангана и цинка се прибавя с пипета аликвотна част от разтвора, приготвен, както е указано в точка 5.1.1, в 100 мл измервателна колба, добавя се 10 мл разтвор от лантаниев хлорид (3.11) и се достига до маркировката с 0,5 N солна киселина (3.3). (Виж също точка 8 "Наблюдение").5.1.2.3. Контролен експериментКонтролният експеримент трябва да включва всички указани стъпки на процедурата, с изключение на това, че се изпуска пробният материал.Калибрационен разтвор "0" не трябва да се използва като контролен.5.1.2.4. Измерване на атомната абсорбцияДа се измери атомната абсорбция на калибрационните разтвори, които ще се анализират, чрез използване на оксидиращ и въздушноацетиленов пламък при следните дължини на вълната:Fe: 248,3 nmCu: 324,8 nmMn: 279,5 nmZn: 213,8 nmВсички измервания да се извършат няколко пъти.5.2. Минерални храни за животниАко пробата не съдържа органично вещество, не е необходимо да се извършва предварително опепеляване. Трябва да се процедира, както е указано в точка 5.1.1, i), като се започне от втори параграф. Може да се пропусне изпаряването с хидрофлуорна киселина.6. ИЗЧИСЛЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕЧрез калибрационна крива се изчисляват концентрациите на редките елементи в разтвора за анализ и резултатът се изразява в милиграми рядък елемент на килограм проба (ррм).7. ПОВТОРЯЕМОСТРазликата между резултатите от две паралелни определяния, извършени чрез една проба от един анализатор, не трябва да превишават:- 5 мг/кг в абсолютна стойност за съдържания на въпросните редки елементи до 50 мг/кг;- 10 % от по-високия резултат за съдържание на въпросния рядък елемент от 50 и до 100 мг/кг;- 10 мг/кг в абсолютна стойност за съдържания на въпросните редки елементи от 100 и до 200 мг/кг;- 5 % от по-високия резултат за съдържание на въпросния рядък елемент над 200 мг/кг.8. НАБЛЮДЕНИЕНаличието на големи количества фосфати може да попречи на определянето на желязото, мангана и цинка. Това влияние може да се коригира с прибавяне на разтвор от лантаниев хлорид (3.11). Ако обаче тегловното съотношение в пробата еCa + MgP, добавянето на разтвор от лантаниев хлорид (3.11) към разтвора за анализ и към калибрационните разтвори може да се пропусне.[*] 1 мг храна за животни с цинк бацитрацин е еквивалентен на 42 международни единици (м.е.).[2] Могат да бъдат използвани и други методи, ако е установено, че те дават сродни бактериални суспензии.[3] Може да бъде използвана всяка комерсиална среда за култивиране със сроден състав и даваща същите резултати.[4] Може да бъде използвана всяка комерсиална среда за култивиране със сроден състав и даваща същите резултати.[5] Други методи могат да се използват, ако е установено, че такива дават сродни бактериални суспензии.[6] Всяка комерсиална култивационна среда или сроден състав, даващ същите резултати, могат да се използват, напр. оксоидна антибиотична среда 1 (см 327) с добавяне на оксоиден агар № 3 (L 13).[7] Всяка комерсиална култивационна среда или сроден състав, даващ същите резултати, могат да се използват, напр. оксоидна антибиотична среда 2 (см 335) с добавяне на оксоиден агар № 3 (L 13).[8] Например SE 2 от Wacker Chemie GmbH, Munich.[] Зеленият фураж (пресен или изсушен) често съдържа големи количества растителни силикати, които могат да задържат следи от елементи и трябва да се отстраняват. Следователно за проби от тези храни за животни следната изменена процедура трябва да се следва.Операция 5.1.1. i) трябва да се извърши по отношение на филтрацията. Филтърната хартия, която съдържа неразтворимата утайка, трябва да се измие два пъти с вряща вода и да се постави в платинения тигел (4.3). Да се запали муфлената пещ (4.1) да гори при температура под 550 °С докато изчезнат напълно всички въглеродни материали и сажди. Да се остави да се охлади. Да се прибавят няколко капки вода, след това 10—15 мл хидрофлуорна киселина (3.4) и да се изпарява до изсъхване при около 150 °С. Ако остават някакви силициеви частици в седимента, да се разтвори отново в няколко милилитра хидрофлуорна киселина и да се изпари до сухо състояние. Да се добавят пет капки сярна киселина (3.5) и да се нагрее докато не се появяват повече бели пушеци. След добавянето на 5 мл 6 N солна киселина (3.2) и около 30 мл вода да се нагрее, разтворът да се филтрира в 250 мл мерителна колба и да се достигне до маркировката чрез добавяне на вода (концентрация на HCl около 0,5 N). Продължава се с определянето от точка 5.1.3.--------------------------------------------------