CELEX: 32001R0213
Language: bg
Date: 2001-01-09 00:00:00
Title: Регламент (ЕО) № 213/2001 на Комисията от 9 януари 2001 година относно определяне на подробни правила за прилагането на Регламент (ЕО) № 1255/1999 на Съвета по отношение на методи за анализ и оценка на качеството на млякото и млечните продукти и за изменение на Регламенти (ЕО) № 2771/1999 и (ЕО) № 2799/1999

Важна правна забележка

|

32001R0213

Официален вестник n° L 037 , 07/02/2001 стр. 0001 - 0099 специално чешко издание глава 3 том 31 стр. 240  - 338 специално испанско издание глава 3 том 31 стр. 240  - 338 специално унгарско издание глава 3 том 31 стр. 240  - 338 специално литвийско издание глава 3 том 31 стр. 240  - 338 LV.ES глава 3 том 31 стр. 240  - 338 MT.ES глава 3 том 31 стр. 240  - 338 PL.ES глава 3 том 31 стр. 240  - 338 SK.ES глава 3 том 31 стр. 240  - 338 специално словенско издание глава 3 том 31 стр. 240  - 338

		20010109Регламент (ЕО) № 213/2001 на Комисиятаот 9 януари 2001 годинаотносно определяне на подробни правила за прилагането на Регламент (ЕО) № 1255/1999 на Съвета по отношение на методи за анализ и оценка на качеството на млякото и млечните продукти и за изменение на Регламенти (ЕО) № 2771/1999 и (ЕО) № 2799/1999КОМИСИЯТА НА ЕВРОПЕЙСКИТЕ ОБЩНОСТИ,като взе предвид Договора за създаване на Европейската общност,като взе предвид Регламент (ЕО) № 1255/1999 на Съвета от 17 май 1999 г. относно общата организация на пазара на мляко и млечни продукти [1], и по-специално членове 10 и 15 и член 26, параграф 3, член 29, параграф 1 и член 31, параграф 14 от него,като има предвид, че:(1) Регламенти (ЕИО) № 1216/68 и (ЕИО) № 3942/92, както и (ЕО) № 86/94, (ЕО) № 2721/95, (ЕО) № 1080/96, (ЕО) № 1081/96, (ЕО) № 1082/96, (ЕО) № 1854/96, (ЕО) № 880/98 и (ЕО) № 1459/98 на Комисията, пълното позоваване на които е дадено в приложение XXVI към настоящия регламент, определят референтните и рутинните методи за анализ и оценка на качеството на млякото и млечните продукти и определят обхвата и правилата за прилагане на тези методи. В интерес на яснотата и с оглед да се осигури за работещите в този сектор единен набор от методи и правила за тяхното прилагане, посочените по-горе регламенти би следвало да бъдат преработени и обединени в общ текст. Поради същата причина, Регламент (ЕО) № 2771/1999 на Комисията от 16 декември 1999 г. относно определянето на подробни правила за прилагането на Регламент (ЕО) № 1255/1999 на Съвета относно интервенцията на пазара на масло и сметана [2] и Регламент (ЕО) № 2799/1999 на Съвета от 17 декември 1999 г. относно определяне на подробни правила за прилагане на Регламент (ЕО) № 1255/1999 по отношение на отпускането на помощ за обезмаслено мляко и обезмаслено мляко на прах, предназначени за храна за животни, и продажбата на такова обезмаслено мляко на прах [3], би следвало да бъдат изменени, така че приложенията към тези регламенти относно методите за анализ да могат да бъдат включени в настоящия регламент.(2) Изискванията към състава и качеството на млякото и млечните продукти, определени в Регламент (ЕО) № 1255/1999, трябва да бъдат проверени, за да се гарантира тяхното стриктно изпълнение.(3) Референтните методи за тези проверки се явяват често методи, които са публикувани от международни организации, като CEN, IDF, ISO и AOAC International, и регулярно се актуализират от тези организации. В някои случаи е определен референтен метод на Общността, докато в други случаи в правилата на Общността не е определен референтен метод. За да се гарантира, че референтните методи се прилагат уеднаквено, всяка година би следвало да бъде съставян списък от референтните методи и само методите, които са включени в този списък, могат да се прилагат.(4) Не би следвало да бъде изключвано използването на рутинни методи. Поради това, би следвало да бъдат определени условията за тяхното използване.(5) Би следвало да бъдат създадени и общи методи за гарантирането на уеднаквена практика при оценяването на резултатите от анализите, при сензорното оценяване на съответните продукти и при прегледа на резултатите, които се оспорват.(6) Понастоящем, за някои анализи няма международно признати утвърдени референтни методи и поради това няма налична информация за варирането на аналитичните резултати от отделните лаборатории. Поради това, би следвало да бъдат определени методи на Общността, които са утвърдени съобразно международните правила и могат да се прилагат като референтни методи.(7) Регламент (ЕО) № 2571/97 на Комисията от 15 декември 1997 г. относно продажбата на масло по намалени цени и отпускането на помощ за сметана, масло и концентрирано масло за влагане в производството на сладкарски продукти, сладолед и други хранителни продукти [4], последно изменен с Регламент (ЕО) № 635/2000 [5], предвижда проследяването на сметаната, маслото и концентрираното масло при определени обстоятелства, за да се гарантира правилната крайна употреба на тези продукти. Тъй като проследяването е важно за надлежното функциониране на системата, както и за да се гарантира равно третиране на операторите, които участват в нея, би следвало да бъдат определени общи методи за определянето на някои от маркерите за проследяването.(8) Съгласно Регламент (ЕИО) № 3143/85 на Комисията от 11 ноември 1985 г. относно продажбата по намалени цени на масло от интервенция, предназначено за директна консумация под формата на концентрирано масло [6], последно изменен с Регламент (ЕО) № 101/1999 [7], Регламент (ЕИО) № 429/90 на Комисията от 20 февруари 1990 г. относно предоставянето чрез тръжна процедура на помощ за концентрирано масло, предназначено за пряка консумация в Общността [8], последно изменен с Регламент (ЕО) № 124/1999 [9] и Регламент (ЕО) № 2571/97, на концентрираното масло трябва да се добавят под наблюдение маркери за проследяване. Изпълнението на изискванията за проследяване на концентрирано масло трябва да се налага стриктно с цел да се гарантира, че продуктите не се отклоняват. Поради това, би следвало да бъде определен общ метод за откриването на такива маркери за проследяване.(9) Съгласно член 9 от Регламент (ЕО) № 1255/1999 може да бъде предоставена помощ за частно складиране на сирена от овче мляко. Съгласно член 31 от този регламент може да се извърши специално възстановяване за тези продукти. Сирената от овче мляко, козе мляко, биволско мляко и смес от овче, козе и биволско мляко могат да бъдат внасяни в Общността от определени трети страни при преференциални условия. Предвид горните разпоредби, е необходимо извършването на подходящи проверки, за да се гарантира, че в съответните продукти няма краве мляко. Поради това, би следвало да бъде определен референтен метод на Общността за откриване на краве мляко, без да се засяга използването на рутинни методи, при условие че те изпълняват определени критерии.(10) Съгласно Регламент (ЕИО) № 2921/90 на Комисията от 10 октомври 1990 г. относно предоставянето на помощ за производството на казеин и казеинати от обезмаслено мляко [10], последно изменен с Регламент (ЕО) № 2654/1999/ЕО [11], следва да бъде установено отсъствието на форми на коли бактерии. Международно признатият референтен метод за откриване на форми на коли бактерии в мляко и млечни продукти е Международен стандарт IDF 73A: 1985. Този стандарт, обаче, е приложим само в модифицирана форма за откриването на форми на коли бактерии в определено количество продукт. Поради това, бе създаден референтен метод на Общността за откриването на форми на коли бактерии, базиращ се на посочения по-горе стандарт.(11) Регламент (ЕИО) № 2658/87 на Съвета от 23 юли 1987 г. относно тарифната и статистическа номенклатура и относно Общата митническа тарифа [12], последно изменен с Регламент (ЕО) № 254/2000 [13], предвижда различни митнически ставки за комбинираните фуражи, които попадат в тарифна позиция № 2309, в зависимост от съдържанието им на млечни продукти. За да се гарантира, че въпросните правила се прилагат унифицирано, би следвало да бъде определен общопризнат метод за анализ на съдържанието на лактоза, който да се използва задължително във всички държави-членки.(12) Съгласно Регламент (ЕО) № 1255/1999, масло и обезмаслено мляко на прах, предназначени за интервенция или в случай на обезмаслено мляко на прах — за храна за животни, трябва да отговарят на определени изисквания за качество. Би следвало да бъдат определени референтни методи за проверка на спазването на тези изисквания.(13) Изпълнението на някои от методите, които се въвеждат за първи път с настоящия регламент, ще изисква известен период за адаптация. Поради това прилагането на тези методи би следвало да бъде отложено.(14) Управителният комитет по млякото и млечните продукти не е предоставил становище в рамките на срока, определен от неговия председател,ПРИЕ НАСТОЯЩИЯ РЕГЛАМЕНТ:ГЛАВА IОБЩИ РАЗПОРЕДБИЧлен 1Предмет и приложно полеНастоящият регламент определя правилата за прилагане на методите за химичен, физичен и микробиологичен анализ и сензорна оценка на мляко и млечни продукти, които следва да се използват в рамките на режимите, предвидени в общата организация на пазара на мляко и млечни продукти, създадена с Регламент (ЕО) № 1255/1999. Също така, той определя някои от тези методи.Член 2Списък от методи1. В приложение I към настоящия регламент се съдържа списък от референтните методи, които са приложими към анализите, посочени в член 1.2. Комисията актуализира този списък поне веднъж годишно в съответствие с процедурата, установена в член 42 от Регламент (ЕО) № 1255/1999.Член 3Рутинни методиЗа анализите, които се изискват съгласно правилата на Общността, могат да бъдат използвани рутинни методи, при условие че те са надлежно приведени в съответствие с референтните методи и се проверяват регулярно за наличието на това съответствие.Процедурата, описана в приложение II, може да се прилага за проверка на резултатите, получени чрез рутинните методи, които са близо до границите, определени в съответните регламенти.В случай на спор, решаващи са получените чрез референтния метод резултати.Член 4Потвърждаване на референтните методи1. Референтните методи се потвърждават, ако отговарят на предварително определените критерии за прецизност по отношение на границата за повторяемост и възпроизвеждане.2. Ако установеният в съответните регламенти референтен метод не е потвърден, държавите-членки определят граница за временно възпроизвеждане.Тази граница се получава съгласно процедурата, описана в приложение III, буква б). За първите 18 месеца, обаче, след влизането в сила на настоящия регламент, държавите-членки могат да използват еквивалентна процедура.Съобразността с границата се проверява поне веднъж годишно.3. Когато резултатите от прилагането на приети референтни методи или методи с временни данни за прецизност показват, че границата е превишена, аналитичните резултати могат да бъдат оценявани, като се използва методът, описан в приложение IV, за определяне на критичната разлика спрямо съответната граница.Член 5Приемливост на резултатите от анализа1. Анализите се извършват в лаборатории при спазване на вътрешната процедура за контрол на качеството в съответствие с тази, описана в приложение V, буква a), или еквивалентна процедура.Подробно описание на прилаганата процедура трябва да бъде на разположение в лабораторията за извършването на справки.2. Лабораториите създават вътрешни правила за прецизност при използването на всички методи, включително:a) процедурата, описана в приложение V, буква б); илиб) публикувана, приета процедура с фиксирана повторяемост.Съблюдаването на границата на възпроизвеждане трябва да бъде проверявано поне веднъж годишно, като се използва процедурата, описана в приложение III, буква a).Втора алинея не се прилага за лаборатории, които са участвали в система за професионално тестване в рамките на последната година.3. Лабораторните отчети на резултатите от анализа трябва да съдържат достатъчно информация за оценката на резултатите, която следва да се направи в съответствие с приложение IV и приложение VIII.4. Резултатите от анализа се считат за приемливи, ако са получени в съответствие с критериите за приемливост, описани във вътрешната процедура за контрол на качеството, посочена в параграф 1 и правилата за вътрешната прецизност, посочени в параграф 2.Член 6Сензорна оценка1. За масло се прилагат процедурите, описани в приложение VI, за проверка на работата на оценителите и надеждността на резултатите. Процедурата, описана в приложение VII, се прилага като референтен метод за сензорна оценка.2. За мляко и млечни продукти, които са различни от масло, като референтен метод за сензорна оценка от държавите-членки се използва IDF стандарт 99C/1997 или други сравними методи, за което се уведомява Комисията.Процедурите, описани в приложение VI, могат да бъдат използвани за проверка на работата на оценителите и надеждността на резултатите.Член 7Вземане на проби и оспорвания на резултатите от анализите1. За анализи, които се изискват съгласно правилата на Общността, трябва да бъдат вземани двойни проби.2. Процедурата, описана в приложение VIII, се използва в случаите, когато резултатите от анализа не се приемат от оператора.ГЛАВА IIMЕТОДИ ЗА АНАЛИЗЧлен 8Съдържание на вода/сухо вещество без мазнини/мазнини в масло1. Методът за анализ, описан в приложение IX, се използва като референтен метод за определяне на водното съдържание в масло.2. Методът за анализ, описан в приложение X, се използва като референтен метод за определяне на съдържанието на сухо вещество без мазнини в масло.3. Методът за анализ, описан в приложение XI, се използва като референтен метод за определяне на маслеността на маслото.Член 9Маркери за проследяване1. Методът за анализ, описан в приложение XII, се използва като референтен метод за определяне на ванилин в концентрирано масло, масло и сметана.2. Методът за анализ, описан в приложение XIII, се използва като референтен метод за определяне на етилов естер с бета-aпо-8' съдържание на каротинна киселина в концентрирано масло и масло.3. Методът за анализ, описан в приложение XIV, се използва като референтен метод за определяне на съдържание на β-ситостерин или сигмастерол в масло и концентрирано масло.4. Концентрираното масло, маслото и сметаната са проследени съобразно съответните правила на Общността, ако получените резултати са в съответствие със спецификациите в параграф 8 от приложенията, посочени в параграфи 1, 2 и 3.Член 10Откриване на казеин в краве мляко1. Референтният метод за анализ, описан в приложение XV, се използва, за да се гарантира, че сирене, което трябва да е произведено изключително от овче мляко, козе мляко или биволско мляко или смес от овче, козе и биволско мляко, на практика не съдържа казеин от краве мляко.Счита се, че е налице казеин от краве мляко, ако видимото съдържание на казеин от краве мляко в анализираната пробата е равно или е по-голямо от съдържанието в референтната проба, съдържаща 1 % краве мляко, както е описано в приложение XV.2. Рутинните методи за откриване на казеин от краве мляко в сирената, посочени в параграф 1, могат да бъдат използвани, при условие че:(a) границата на откриване е 0,5 % или е по-ниска;(б) няма фалшиви положителни резултати;(в) казеинът от краве мляко се открива посредством необходимата чувствителност, дори и след дълги периоди на узряване, които могат да възникват при обичайни търговския условия.Ако предвиденото в буква б) изискване не е спазено, всяка проба, която дава положителен резултат при използване на референтния метод, трябва да бъде анализирана.Ако предвиденото в буква в) изискване не е спазено за един от видовете сирене, посочени в параграф 1, сиренето трябва да бъде анализирано при използване на референтния метод.Член 11Откриване на форми на коли бактерии1. Референтният метод за анализ, описан в приложение XVI, се използва за откриване на форми на коли бактерии в масло, обезмаслено масло, казеин и казеинати.2. Рутинните методи за откриване на форми на коли бактерии могат да се използват, при условие че получените резултати са сравними с резултатите, получени чрез референтния метод, описан в посоченото приложение. Рутинните методи трябва да имат, по-конкретно, адекватна граница за откриване. Не трябва да се получават фалшиви положителни резултати. Ако не може да бъде изключено получаването на фалшиви положителни резултати, всеки положителен резултат трябва да бъде потвърден чрез използване на референтния метод.Член 12Съдържание на лактозаМетодът за определяне на съдържанието на лактоза в продукти, попадащи в код по КН 2309, е описан в приложение XVII.Член 13Откриване на сирищна суроватка1. Методът за определяне на сирищна суроватка в обезмаслено мляко на прах, предназначено за публично складиране, е описан в приложение XVIII.2. Методът за определяне на сирищна суроватка в обезмаслено мляко на прах и смеси, предназначени за използване като храна за животни, е описан в приложение XIX.Член 14Откриване на мътеницаМетодът за откриване на мътеница в обезмаслено мляко на прах е описан в приложение XX.Член 15Антибиотични утайкиМетодът за откриване на антибиотични и сулфонамидни/дапсонови утайки в обезмаслено мляко на прах е описан в приложение XXI.Член 16Съдържание на обезмаслено мляко на прахМетодът за определяне на съдържанието на обезмаслено мляко на прах в смеси от комбинирани фуражи е описан в приложение XXII.Член 17Откриване на скорбялаМетодът за откриване на скорбяла в обезмаслено мляко на прах, денатурирано мляко на прах и смеси от комбинирани фуражи е описан в приложение XXIII.Член 18Съдържание на влага в кисела мътеница на прахМетодът за определяне на съдържанието на влага в кисела мътеница на прах, предназначена за използване в храни за животни, е описан в приложение XXIV.Член 19Откриване на чужди мазниниМетодът за откриване на чужди мазнини в мазнини на мляко е описан в приложение XXV.ГЛАВА IIIЗАКЛЮЧИТЕЛНИ РАЗПОРЕДБИЧлен 20Изменения на Регламент (ЕО) № 2771/1999Регламент (ЕО) № 2771/1999 се изменя, както следва:1. Първото изречение на член 4, параграф 1 се заменя със следното: "Компетентните органи проверяват качеството на маслото, като използват методите, описани в приложение I, както и на базата на проби, вземани в съответствие с правилата, определени в приложение IV".2. В приложение I, бележка под линия (2) се заменя със следното: "Виж приложение I към Регламент (ЕО) № 213/2001."3. Приложения II и III се заличават.4. В предпоследното изречение на приложение IV, точка 2, думите "с приложение III" се заменят със "с приложение VII към Регламент (ЕО) № 213/2001".Член 21Изменения на Регламент (ЕО) № 2799/1999Регламент (ЕО) № 2799/1999 се изменя, както следва:1. Член 20, параграфи 1, 2, 3 и 4 се заменят със следното:"1. Съдържанието на обезмаслено мляко на прах в смески и комбинирани фуражи се определя чрез поне двойно тестване на всяка проба, като се използва методът за анализ, описан в приложение XXII към Регламент (ЕО) № 213/2001, допълнен с проверките, предвидени в член 17, параграф 3 от настоящия регламент. Ако между резултатите от тези проверки има разлика, решаващ се явява резултатът от проверката на място.2. Отсъствието на сирищна суроватка се проверява чрез използването на метода, описан в приложение XIX към Регламент (ЕО) № 213/2001.3. Съдържанието на скорбяла в комбинирани фуражи се определя посредством проверките, предвидени в член 17, параграф 3 от настоящия регламент, които трябва да бъдат допълнени с метода за анализ, описан в приложение XXIII към Регламент (ЕО) № 213/2001.4. Съдържанието на влага в кисела мътеница на прах се определя чрез използване на метода за анализ, описан в приложение XXIV към Регламент (ЕО) № 213/2001."2. Приложения III, IV, V и VI се заличават.Член 22ОтмянаРегламенти (ЕИО) № 1216/68, 3942/92, (ЕО) № 86/94, (ЕО) № 2721/95, (ЕО) № 1854/96, (ЕО) № 1080/96, (ЕО) № 1081/96, (ЕО) № 1082/96, (ЕО) № 880/98 и (ЕО) № 1459/98 се отменят.Позоваванията на отменените регламенти се тълкуват като позовавания на настоящия регламент.Член 23Влизане в силаНастоящия регламент влиза в сила на седмия ден след публикуването му в Официален вестник на Европейските общности.Въпреки това, методите, които са описани в приложения III, IV. 4, V, VI и VIII, се прилагат от осемнадесетия месец от влизането в сила на настоящия регламент.Настоящият регламент е задължителен в своята цялост и се прилага пряко във всички държави-членки.Съставено в Брюксел на 9 януари 2001 година.За КомисиятаFranz FischlerЧлен на Комисията[1] ОВ L 160, 26.6.1999 г., стр. 48.[2] ОВ L 333, 24.12.1999 г., стр. 11.[3] ОВ L 340, 31.12.1999 г., стр. 3.[4] ОВ L 350, 20.12.1997 г., стр. 3.[5] ОВ L 76, 25.3.2000 г., стр. 9.[6] ОВ L 298, 12.11.1985 г., стр. 9.[7] ОВ L 11, 16.1.1999 г., стр. 14.[8] ОВ L 45, 21.2.1990 г., стр. 8.[9] ОВ L 16, 21.1.1999 г., стр. 19.[10] ОВ L 279, 11.10.1990 г., стр. 22.[11] ОВ L 325, 17.12.1999 г., стр. 10.[12] ОВ L 256, 7.9.1987 г., стр. 1.[13] ОВ L 28, 3.2.2000 г., стр. 16.--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ I(член 2)СПИСЪК НА РЕФЕРЕНТНИТЕ МЕТОДИИндексМин. = минимум, Макс. = максимум, Приложение = Приложение към цитирания регламент, SNF = сухо вещество без мазнини, FFA = свободни мастни киселини, PV = пероксидно число, A = форма, F = вкус, C = консистенция, TBC = общо бактериално число, Therm = термофилно бактериално число, MS = държава-членка, IDF = Международна федерация по млякото, ISO = Международна организация по стандартите, IUPAC = Международен съюз за теоретична и приложна химия, ADPI = Американски институт по млечните продукти, SCM = подсладено кондензирано мляко, EMC = сгъстено мляко или сметана, MSNF = млечно сухо вещество без мазнини.Бележка 1 : Изолиране на млечни мазнини, както е описано в IDF стандарт 6B: 1989 (защита от светлина).Бележка 2 : Не е създаден референтен метод.Бележка 3 : Следва да бъде подготвена проба в съответствие с IDF стандарт 122C: 1996 или IDF стандарт 73A: 1985.Бележка 4 : Инкубация за 48 часа при температура от 55 °C; би следвало да се положат грижи за предотвратяване изсушаването на средата на пробата.Бележка 5 : % SNF = % сухо вещество – % мазнина.Бележка 6 : Маслото трябва да отговаря на националния клас за качество на държавата-членка на производството, посочена в приложение V на Регламент (ЕО) № 2771/1999 на Комисията.Бележка 7 : Директива 84/8/ЕИО на Комисията.Бележка 8 : Регламент (ЕО) № 1758/94 на Комисията (ОВ L 183, 19.7.1994 г., стр. 14).Бележка 9 : Директива 78/633/ЕИО на Комисията.ЧАСТ AРегламент на Комисията | Продукт | Параметър | Граница | Референтен метод | Бележка |Регламент (ЕО) № 2771/1999 публично складиране (ОВ L 333, 24.12.1999 г., стр. 11) | Неосолено масло | Млечни мазнини | Мин. 82 % | Приложение XI | |Вода | До 16 % | Приложение IX | |SNF | До 2 % | Приложение X | |FFA (макс.) | 1,2 mmole/100 g мазнина | IDF стандарт 6B: 1989 | |V (макс.) | 0,3 meq. кислород/1000 g мазнина | IDF стандарт 74A: 1991 (английска версия) | Бележка 1 |Форми на коли бактерии | Неустановимо в 1 g | Приложение XVII | Бележка 3 |Немлечна мазнина | Неустановимо чрез триглицериден анализ | Приложение XXVI | |Стеролни индикатори | Неустановимо | Приложение XIV | |Други индикатори:— ванилин | Неустановимо | Приложение XII | |— етилов естер от каротинна киселина | Неустановимо | Приложение XIII | |— триглицериди от хептанова киселина | Неустановимо | IUPAC 2.301 sub 5 | |Сензорни характеристики | Най-малко 4 от 5 точки за A, Ж и В | Приложение VII | |Водна дисперсия | Най-малко 4 точки | IDF стандарт 112A: 1989 | |Регламент (ЕО) № 2771/1999 Частно складиране | Неосолено масло | Млечни мазнини | Мин. 82 % | Приложение XI | Бележка 6 |Вода | до 16 % | Приложение IX | |Регламент (ЕО) № 2771/1999 Частно складиране | Осолено масло | Млечни мазнини | Мин. 80 % | Приложение XI | Бележка 6 |Вода | До 16 % | Приложение IX | |сол | До 2 % | IDF стандарт 12B: 1988 | |Регламент (ЕО) № 2571/97 (ОВ L 350, 20.12.1997 г., стр. 3) | Неосолено масло | Млечни мазнини | Мин. 82 % | Приложение XI | |Вода | До 16 % | Приложение IX | |Индикатори:— стероли | | Приложение XIV | |— ванилин | | Приложение XII | |— етилов естер от каротинна киселина | | Приложение XIII | |— триглицериди от хептанова киселина | | IUPAC 2.301 sub 5 | |Регламент (ЕО) № 2571/97 | Осолено масло | Млечни мазнини | Мин. 80 % | Приложение XI | |Вода | До 16 % | Приложение IX | |Сол | До 2 % | IDF стандарт 12B: 1988 | |Индикатори:— стероли | | Приложение XIV | |— ванилин | | Приложение XII | |— етилов естер от каротинна киселина | | Приложение XIII | |— триглицериди от хептанова киселина | | IUPAC 2.301 sub 5 | |Регламент (ЕО) № 2571/97 | Концентрирано масло | Млечни мазнини | Мин. 99,8 % | IDF стандарт 24: 1964 | |Влага и MSNF | До 0,2 % | IDF стандарт 23A: 1988 (влага) IDF стандарт 24: 1964 (MSNF) | |FFA | До 0,35 % (олеинов) | IDF стандарт 6B: 1989 | |PV (макс.) | 0,5 meq. кислород/1000 g мазнина | IDF стандарт 74A: 1991 (английска версия) | Бележка 1 |Немлечна мазнина | отсъствие | приложение XXV | |Вкус | чисто | | |Миризма | Отсъствие на чужди мазнини | | |Други | Отсъствие на неутрализиращи агенти, антиоксиданти и консерванти | | |Индикатори:— стероли | | Приложение XIV | |— ванилин | | Приложение XII | |— етилов естер от каротинна киселина | | Приложение XIII | |— триглицериди от хептанова киселина | | IUPAC 2.301 sub 5 | |Регламент (ЕО) № 2571/97 | Сметана | Мазнина | 35 % | IDF стандарт 16C: 1987 | |Индикатори:— стероли | | Методи, одобрени от компетентния орган | Бележка 2 |— ванилин | | Приложение XII | |— етилов естер от каротинна киселина | | Методи, одобрени от компетентния орган | Бележка 2 |— триглицериди от хептанова киселина | | IUPAC 2.301 sub 5 | |Регламент (ЕИО) № 429/90 (ОВ L 45, 21.2.1990 г., стр. 8) | Концентрирано масло | Млечни мазнини | Мин. 96 % | Методи, одобрени от компетентния орган | Бележка 2 |SNF | до 2 % | Методи, одобрени от компетентния орган | Бележка 2 |Индикатори:— стигмастерол (95 %) | 15 g/100 kg концентрирано масло | Приложение XIV | |— стигмастерол (85 %) | 17 g/100 kg концентрирано масло | Приложение XIV | |— триглицериди от хептанова киселина | 1,1 kg/100 kg концентрирано масло | IUPAC 2.301 sub 5 | |— етилов естер от маслена киселина и стигмастерол | Виж приложение, точка 1, буква в) | Приложение XIV | Бележка 2 |—лецитин (E 322) | До 0,5 % | Методи, одобрени от компетентния орган | Бележка 2 |NaCl | До 0,75 % | IDF стандарт 12B: 1988 | |FFA | До 0,35 % (олеинов) | IDF стандарт 6B: 1989 | |PV (макс.) | До 0,5 meq. кислород/1000 g мазнина | IDF стандарт 74A: 1991 (английска версия) | Бележка 1 |Вкус | Чисто | | |Миризма | Отсъствие на чужди мазнини | | |Други | Отсъствие на неутрализиращи агенти, антиоксиданти и консерванти | | |Регламент (ЕИО) № 2191/81 (ОВ L 213, 1.8.1981 г., стр. 20) | Неосолено масло | Млечни мазнини | Мин. 82 % | Приложение XI | |Вода | До 16 % | Приложение IX | |Регламент (ЕИО) № 2191/81 | Осолено масло | Млечни мазнини | Мин. 80 % | Приложение XI | |Вода | До 16 % | Приложение IX | |Сол | До 2 % | IDF стандарт 12B: 1988 | |Член 9 и дял II на Регламент (ЕО) № 1255/1999 | Сирене, произведено от овче и/или козе мляко | Краве мляко | < 1 % | Приложение XV | |Регламент (ЕИО) № 2921/90 | Приложение I — кисел казеин | Вода | До 12,00 % | IDF стандарт 78C: 1991 | |Мазнини | До 1,75 % | IDF стандарт 127A: 1988 | |Свободна киселинност | До 0,30 % (млечен) | IDF стандарт 91: 1979 | |Регламент (ЕИО) № 2921/90 | Приложение I — сирищен казеин | Вода | До 12,00 % | IDF стандарт 78C: 1991 | |Мазнини | До 1,00 % | IDF стандарт 127A: 1998 | |Шлака | Мин. 7,50 % | IDF стандарт 90: 1979 | |Регламент (ЕИО) № 2921/90 | Приложение I — казеинати | Вода | До 6,00 % | IDF стандарт 78C: 1991 | |Млечен протеин | Мин. 88,00 % | IDF стандарт 92: 1979 | |Мазнини и шлака | До 6,00 % | IDF стандарт 127A: 1988 IDF стандарт 89: 1979 или IDF стандарт 90: 1979 | |Регламент (ЕИО) № 2921/90 | Приложение II — кисел казеин | Водна киселинност без мазнини TBC (макс.) | До 10,00 % | IDF стандарт 78C: 1991 | |Вода | До 1,50 % | IDF стандарт 127A: 1988 | |Мазнини | До 0,20 % (млечен) | IDF стандарт 91: 1979 | |Свободна киселинност | 30000 l/g | IDF стандарт 100B: 1991 | Бележка 3 |Форми на коли бактерии | Отсъствие в 0,1 g | Приложение XVI | Бележка 3 |Therm. (макс.) | 5000 l/g | IDF стандарт 100B: 1991 | Бележки 3 и 4 |Регламент (ЕИО) № 2921/90 | Приложение II — сирищен казеин | Вода | До 8,00 % | IDF стандарт 78C: 1991 | |Мазнини | До 1,00 % | IDF стандарт 127A: 1988 | |Шлака | Мин. 7,50 % | IDF стандарт 90: 1979 | |TBC (макс.) | 30000 l/g | IDF стандарт 100B: 1991 | Бележка 3 |Форми на коли бактерии | Отсъствие в 0,1 g | Приложение XVI | Бележка 3 |Therm. (макс.) | 5000 l/g | IDF стандарт 100B: 1991 | Бележки 3 и 4 |Регламент (ЕИО) № 2921/90 | Приложение II — казеинати | Вода | До 6,00 % | IDF стандарт 78C: 1991 | |Млечен протеин | Мин. 88,00 % | IDF стандарт 92: 1979 | |Мазнини и шлака | До 6,00 % | IDF стандарт 127A: 1988 IDF стандарт 89: 1979 или 90: 1979 | |TBC (макс.) | 30000 l/g | IDF стандарт 100B: 1991 | Бележка 3 |Форми на коли бактерии | Отсъствие в 0,1 g | Приложение XVI | Бележка 3 |Therm. (макс.) | 5000 l/g | IDF стандарт 100B: 1991 | Бележки 3 и 4 |Регламент (ЕИО) № 2921/90 | Приложение III — казеинати | Вода | До 6,00 % | IDF стандарт 78C: 1991 | |Млечен протеин | Мин. 85,00 % | IDF стандарт 92: 1979 | |Мазнини | До 1,50 % | IDF стандарт 127A: 1988 | |Лактоза | До 1,00 % | IDF стандарт 106: 1982 | |Шлаки | До 6,50 % | IDF стандарт 89: 1979 или 90: 1979 | |Форми на коли | 30000 l/g | IDF стандарт 100B: 1991 | Бележка 3 |бактерии | Отсъствие в 0,1 g | Приложение XVI | Бележка 3 |Therm. (макс.) | 5000 l/g | IDF стандарт 100B: 1991 | Бележки 3 и 4 |Регламент (ЕО) № 2799/1999 (ОВ L 340, 31.12.1999 г., стр. 3) | Смеси от хранителни продукти и обезмаслено мляко на прах (SMP) (за използване в животинска храна) | Вода (кисела мътеница на прах) | До 5 % | | |протеин | 31,4 % (мин.) от сухото вещество без мазнини ) | IDF стандарт 20B: 1993 | |Вода (SMP) | до 5 % | IDF стандарт 26A: 1993 | |Мазнини (SMP) | До 11 % | IDF стандарт 9C: 1987 | |Сирищна суроватка (SMP) | Отсъствие | Приложение XIX | Бележка 7 |Скорбяла (SMP) | Отсъствие | Приложение XXIII | |Вода (смеси) | До 5 % от сухото вещество без мазнини | IDF стандарт 26A: 1993 | |Мазнини (смеси) | — | Директива на Комисията 84/4/EИО (ОВ L 15, 18.1.1984 г., стр. 28) | |Сирищна суроватка (смеси) | Отсъствие | Приложение XIX | |SMP съдържание (на крайния продукт) | Мин. 50 % | Приложение XXII | Бележка 7 |Мазнини (в крайния продукт) | Мин. 2,5 % или 5 % | Директива на Комисията 84/4/EИО | Бележка 8 |Скорбяла (в крайния продукт) | Мин. 2 % | Приложение XXIII | Бележка 9 |Мед (в крайния продукт) | 25 ppm | Директива на Комисията 78/633/EИО (ОВ L 206, 26.7.1987 г., стр. 43) | |Регламент (ЕО) № 322/96 (OВ L 45, 23.2.96 г., стр. 5) | SMP (спрей) | Мазнини | до 1,0 % | IDF стандарт 9C: 1987 | |Протеин | 31,4 % (min) от сухото вещество без мазнини | IDF стандарт 20B: 1993 | |Вода | До 3,5 % | IDF стандарт 26A: 1993 | |Киселинност (N/10 NaOH) | До 19,5 ml | IDF стандарт 86: 1981 | |Лактати | До 150 mg/100 g | IDF стандарт 69B: 1987 | |Фосфати | Отрицателно | ISO стандарт 3356: 1975 | |Разтворяемост | До 0,5 ml при 24 °C | IDF стандарт 129A: 1988 | |Обгорели частички | Филтър B min (15,0 mg) | ADPI: 1990 | |TBC | 40000/l g | IDF стандарт 100B: 1991 | Бележка 3 |Форми на коли бактерии | отрицателно/0,1 g | Приложение XVI | Бележка 3 |Мътеница | Отрицателно | Приложение XX | |Сирищна суроватка | Отрицателно | Приложение XVIII | |Кисела суроватка | Отрицателно | Метод, одобрен от компетентния орган | Бележка 2 |Антимикробни агенти | | Приложение XXI | |ЧАСТ БРеферентните методи, изброени в част Б, могат да бъдат използвани за продуктите, обхванати от някой от регламентите, изброени в колона 1.Регламент на Комисията | Продукт | Код по КН | Параметър | Граница | Референтен метод | Бележка |Регламент (ЕИО) № 2658/87 (ОВ L 256, 7.9.1987 г., стр. 1) Регламент (ЕО) № 2414/98 (ОВ L 299, 10.11.1998 г., стр. 7) Регламент (ЕО) № 1374/98 (ОВ L 185, 30.6.1998 г., стр. 21) Регламент (ЕО) № 2508/97 (ОВ L 345, 16.12.1997 г., стр. 31) Регламент (ЕО) № 174/1999 (ОВ L 20, 27.1.1999 г., стр. 8) | Мляко и сметана, неконцентрирани, нито подсладени със захар или друг подсладител | 0401 | Мазнини (≤ 6 %) | Границите са тези, определени в описанието на кода по КН за специфичния продукт, дефиниран по-нататък, когато е приложим в Регламент 3846/87/ЕИО на Комисията (ОВ L 366, 24.12.1987 г., стр. 1)., част 9 от експортната номенклатура, или Регламент 1374/98/ЕО (ОВ L 185, 30.6.1998 г., стр. 21) | IDF стандарт 1D: 1996 | |Мазнини (> 6 %) | IDF стандарт 16C: 1987 | |Мляко и сметана, неконцентрирани, нито подсладени със захар или друг подсладител | 0402 | Мазнини (течна форма) | | IDF стандарт 13C: 1987 | |Мазнини (твърда форма) | | IDF стандарт 9C: 1987 | |Протеин | | IDF стандарт 20B: 1993 | |Захароза (нормално съдържание) | | IDF стандарт 35A: 1992 | |Захароза (ниско съдържание) | | Методи, одобрени от компетентния орган | Бележка 2 |Сухо вещество (SCM) | | IDF стандарт 15B: 1991 | |Сухо вещество (EMC) | | IDF стандарт 21B: 1987 | |Вода (мляко и сметана на прах) | | IDF стандарт 26A: 1993 | |Мътеница, ферментирала или вкиснала, мляко и сметана, концентрирани или неконцентрирани, подсладени със захар или друг подсладител | 0403 | Мазнини | | IDF стандарти 1D: 1996, 9C: 1987, 16C: 1987, 22B: 1987, 126A: 1988 | |Протеин | | IDF стандарт 20B: 1993 | |Захароза (нормално съдържание) | | IDF стандарт 35A: 1992 | |Захароза (ниско съдържание) | | Методи, одобрени от компетентния орган | Бележка 2 |Вода (кисела мътеница на прах) | | Приложение XXIV | |Вода (сладка мътеница на прах) | | IDF стандарт 26A: 1993 | |Сухо вещество (други продукти) | | Методи, одобрени от компетентния орган | |суроватка, концентрирана или неконцентрирана, подсладена със захар или друг подсладител; продукти, съставени от натурални млечни съставки | 0404 | Мазнини | | IDF стандарти 9C: 1987, 16C: 1987 22B: 1987 | |Протеин | | IDF стандарт 20B: 1993 | |Захароза (нормално съдържание) | | IDF стандарт 35A: 1992 | |Захароза (ниско съдържание) | | Методи, одобрени от компетентния орган | Бележка 2 |040490 | Протеин | | IDF стандарт 20B: 1993 | |Вода | | IDF стандарт 26A: 1993 | |Сухо вещество | | IDF стандарт 15B: 1991 | |(Концентрирани продукти) | | IDF стандарт 21B: 1987 | |Масло и други мазнини, получени от мляко; млечни пасти за намазване | 0405 | Мазнини (ако са ≤ 85 %) | | Приложение XI | |вода | | Приложение IX | |Масло | SNF | | Приложение X | |NaCl | | IDF стандарт 12B: 1998 | |Масло за производ-ство на маргарин | Мазнини (ако са > 99 %) | | IDF стандарт 24: 1964 | |Вода (ако мазнините са < 99 %) | | IDF стандарт 23A: 1988 | |Сирене и извара | 0406 | Мазнини | | IDF стандарт 5B: 1986 | |Сухо вещество от мазнини | | IDF стандарт 4A: 1982 | |Сухо вещество (Ricotta) | | IDF стандарт 58: 1970 | |NaCl | | IDF стандарт 88A: 1988 | |Лактоза | | IDF стандарт 79B: 1991 | |Регламент (ЕИО) № 2658/87 | Смеси от хранителни продукти | 2309 | Лактоза | | Приложение XVII | |--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ II(член 3)ПРОВЕРКА НА ПОЛУЧЕНИТЕ ЧРЕЗ РУТИННИТЕ МЕТОДИ РЕЗУЛТАТИ, КОИТО СА БЛИЗКИ ДО ГРАНИЦИТЕ, ОПРЕДЕЛЕНИ В РЕГЛАМЕНТИТЕ ЗА ИЗИСКВАНИЯТА ЗА СЪСТАВ И КАЧЕСТВОАко mо е граница за изискванията за състав и качество, определена в регламент, то решението за границата (L) е:L = mако RRout/RRef ≤ 1RRout : граница на възпроизвеждане на рутинния методRRef : граница на възпроизвеждане на референтния методАко m0 е горна граница и RRout/RRef > 1, решението за границата се получава като се използва формулата:L = m–R/R· CrDАко при същите условия mo е долна граница, решението за границата се получа като се използва формулата:L = m+R/R· CrDкъдето CrD95 е критичната разлика на референтния метод (виж приложение IV).Когато m0 е горна граница, окончателният резултат за решението на границата, получен чрез използване на рутинен метод, трябва да бъде заменен с окончателен резултат, получен чрез използване на референтен метод. Този окончателен резултат трябва да се базира поне на същия брой анализи/проби, както окончателният резултат, получен чрез използване на рутинния метод.Когато mо е долна граница, същата процедура трябва да бъде следвана за окончателен резултат, който се намира под решението за граница, получен чрез използване на рутинен метод.Забележка:Гореописаната процедура може да бъде следвана, ако няма налице откриваеми матрични ефекти.Матричните ефекти могат да бъдат откривани по следния начин: за всяка проба, използвана за калибриране, се определя разликата (wi) между резултатите, получени с референтния и рутинния метод.Стандартното отклонение се изчислява чрез използване на формулата:s =∑wm : брой проби, използвани за калибриранеТо се сравнява с аритметичното значение на повтарящото се стандартно отклонение на референтния и рутинния метод:s=s+ sМатричен ефект може да бъде изключен, ако:+++++ TIFF +++++където,f = m (f: брой на степените на свобода)α = вероятност за грешка; α = 0,05.В този случай, преди да се определи решението за граница, са необходими по-нататъшни изследвания.--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ III(членове 4 и 5)a) Процедура за определяне съблюдаването на установена граница на възпроизвеждане (химически анализ)Съблюдаването на границата на възпроизвеждане се проверя чрез сравняване на лабораторните резултати с резултатите от лаборатория с опит [1], получени чрез използване на идентична проба. В двете лаборатории се извършва двойно определяне и резултатите се оценяват чрез използване на формулата:CrDy– y=2където:CrD 95 : критична разлика (P = 0,95)__NEWLINE__y‾1 : аритметично значение на двата резултата, получени в лаборатория 1__NEWLINE__y–2 : аритметично значение на двата резултата, получени в лаборатория 2R : граница на възпроизвеждане, която следва да се определи чрез интерполацияr : граница на възпроизвеждане, когато прецизността се променя с нивото.Ако критичната разлика е превишена, то тогава в рамките на следващите два месеца трябва да бъде извършен друг експеримент. Ако резултатите от втория експеримент не отговарят на сравнителната граница, компетентните органи трябва да предприемат необходимите стъпки.(б) Процедура за получаване на временна граница на възпроизвеждане (химически анализ)Временна граница на възпроизвеждане(Rprov) се получава чрез използване на следното уравнение:R=y– y2където:__NEWLINE__y–1 : средна стойност на два резултата, получени в лаборатория 1__NEWLINE__y–2 : средна стойност на два резултата, получени в лаборатория 2 (виж приложение IIIa)r : граница на възпроизвеждане или временна граница на възпроизвеждане.Забележки:1. Rprov може да се използва за изчисляване на критични граници (виж приложение VI).2. Rprov се фиксира на 2r, ако изчислената стойност за Rprov е по-малка от 2r.3. Ако изчислената стойност е по-голяма от 3r или е два пъти по-голяма от R-стойността, изчислена с уравнението на Хорвитц, то тогава Rprov е с неприемливо висока стойност и не може да се използва за изчисляване на критичната граница [**].4. Стойността на Rprov би следвало да бъде определяна поне веднъж годишно на базата на резултатите, получени в две лаборатории (виж приложение IV).5. Средната стойност на Rprov трябва да бъде използвана за изчисляването на критични граници. Дадените в 2 и 3 правила се прилагат за средната стойност на R prov.Границата на възпроизвеждане (R-стойност) е получена от изчислената RSDR-стойност, както следва:R = 0.0283 xRSD__NEWLINE__x‾ : средна аритметична стойност на получените резултати)Някои изчислени RSDR — стойности (примери)Концентрация | RSD R (%) |1 g/100 g | 4 |0,01 g/100 g | 8 |1 mg/1000 g | 16 |При концентрация на аналит от 1 g/100 g, се получава следната стойност:[1] Лаборатория с опит би следвало да бъде по принцип лаборатория, която е участвала успешно или в утвърждаване на тестовия метод или в тест за професионалност.[**] Уравнение на Хорвитц:RSDR% = 21-0,5 log10Cкъдето:RSDRотносителното сравнително стандартно отклонениеcконцентрация, изразена като десетична дроб (пример: 10 g/100 g = 0,1).Позовавания:Peeler, J.T., Horwitz, W. and Albert, R.J.Ass. Off. Anal. Chem.72(5), 784-806 (1989).--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ IV(член 4)ОЦЕНКА НА АНАЛИТИЧНИТЕ РЕЗУЛТАТИ, ПОЛУЧЕНИ ЧРЕЗ ИЗПОЛЗВАНЕТО НА УТВЪРДЕНИ МЕТОДИСредно аритметичната стойност на два или повече резултата се изчислява, ако аналитичният резултат показва, че е превишена граница. Следната процедура следва да бъде спазвана:1. В случаите, в които аналитичният резултат представлява единичен резултат, трябва да бъде извършен втори анализ при сравнителни условия. Ако и двата анализа не могат да бъдат извършени при сравнителни условия, се извършва допълнителен двоен анализ при сравнителни условия и тези резултати се използват за оценката на съблюдаването на критичната граница.2. Абсолютната стойност на разликата между средната стойност на резултатите, получени при сравнителни условия, и границата е определена. Абсолютна стойност на разликата, която е по-голяма от критичната разлика, показва, че анализираната проба не изпълнява изискванията.Критичната разлика се определя чрез използване на следната формула:CrDy- m=2nкъдето:__NEWLINE__y‾ : средна стойност на получените резултатиmo : границаn : брой анализи/пробиАко прецизността се променя от нивото, може да е необходимо да се определи r и R чрез интерполация.Обикновено, окончателният резултат, отчитан за пробата, трябва да показва, че границата се съблюдава.Поради това, окончателните резултати:- mm+ CrDy–m0, ако границата е максимум,- mm+ CrDy–m0, ако границата е минимумби следвало да се получат само като изключение.Окончателните резултати в рамките на упоменатите обхвати са приемливи, само ако се получават не повече от веднъж на всеки пет проби, анализирани за пратка. Ако за пратка се анализират по-малко от пет проби, се приема един резултат в рамките на упоменатия обхват. Правилото, че в рамките на упоменатия обхват за пет анализирани проби се получава само един резултат, трябва да се спазва, ако производителят представя едни и същи пратки.3. Ако окончателният резултат x се изчислява чрез използване на формула като x = y1 ± y2 (пример: вода + съдържание сухо вещество без мазнини в масло за изчисляване на съдържанието на мазнини), където y1 и y2 са окончателните резултати на единичен тип анализ, то тогава общите граници на повторяемост и границите на възпроизвеждане r и R на окончателните резултати се изчисляват, като:r=R=2R12 + R22където r1 и r2 са границите за повторяемост, а R1 and R2 са границите на възпроизвеждане на y1 и y2,, съответно.x се сравнява с границата m0, като се спазват определените в 1 и 2 правила. Критичната разлика се определя чрез използването на формула:CrDx - m=2nкъдето x е средната стойност на получените резултати x1.4. Ако окончателният резултат се изчислява чрез използване на формулата:x =yy2(пример: мазнина в съдържание сухо вещество на сирене)където y1 и y2 са окончателните резултати на единичен тип анализ, то тогава общите граници на повторяемост и границите на възпроизвеждане r и R на окончателните резултати могат да бъдат изчислени, като:r= μR= μμ= μ|μ2µ1 : граница или целева стойност за y1 (пример: мазнина)µ2 : граница или целева стойност за y2 (пример: сухо вещество)r=rμ≤ 0.15r=rμ≤ 0.15където:r1 : граница на повторяемост y1r2 : граница на повторяемост y2R=Rμ≤ 0.15R=Rμ≤ 0.15къдетоR1 : граница на възпроизвеждане y1R 2 : граница на възпроизвеждане y2Процедурите за изчисляване на r× и R са приложими, само ако относителните граници на повторяемост и границите на възпроизвеждане r *1;r *2;R *1;R *2 са по-малки или равни на 0,15.x се сравнява с границата µx, като се спазват определените в 1 и 2 правила. Критичната разлика се определя чрез използване на формулата:CrDx- μ=2nx‾където x– е средно аритметичната стойност на резултатите x, получени по хронологичен ред [*].[*] Бележка: Ако например, резултатите y11, и y22,са получени, трябва да бъде изчислена средно аритметичната стойност на y11/y21 и y12/y22.--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ VВЪТРЕШЕН КОНТРОЛ(член 5)a) Процедура за вътрешен контрол на качеството (ВКК) (химически анализ)Дефиниция на контролния материалМатериалът, който се използва за целта на ВКК, е предмет на същата или част от същата процедура за тестване на материали.Контролен материал може да бъде:- сертифициран референтен материал,- вътрешен референтен материал,- материал, утвърден от вътрешен лабораторен тест,- обогатен материал.Процедура за създаване на ВККЛабораторията би следвало да въведе ВКК като спазва процедурата, описана в документа на IUPAC "Хармонизирани указания за вътрешен контрол на качеството в аналитични лаборатории" [1].ВКК се извършва чрез включването на контролните материали в аналитичната им последователност или чрез възпроизвеждането на анализа върху същата тестова проба. Контролните материали трябва да са еднакви по химически състав с тестовите проби и да бъдат адекватно стабилни през наблюдавания период. Трябва да се демонстрира, че те могат да бъдат разделени по подходящ начин на равни части за анализ и имат концентрация на аналити, подходяща за сферата на наблюдение.Контролният материал трябва да бъде включен поне веднъж при всяка аналитична серия и получената стойност трябва да бъде вписвана в контролна диаграма, за да се измерват дългосрочните грешки. В допълнение, лабораторията би следвало периодично да демонстрира изпълнение на границите за повторяемост в рамките на серията. Това може да бъде постигнато чрез двойни анализи на контролните и/или тестовите материали. Резултатите от тези анализи би следвало да бъдат сравнени с всички публикувани граници за повторяемост и съществуващите данни за вътрешната прецизност.Когато се използват контролни материали, получените стойности между аналитичните серии на контролния материал, трябва да бъдат вписвани в диаграма-Shewhart (ISO 8258 (1991)) с подходящи контролни граници. Границите за действие трябва да бъдат установени:x ± 3st,където st е общото стандартно отклонениее:предупредителните граници са приx ± 2st,Общото стандартно отклонение:s=в което:sb : Стандартно отклонение между аналитичните серииsw : Стандартно отклонение в рамките на аналитичните серииn : Брой определянияВ случаите, в които контролните материали не се използват (напр. поради липса на стабилност), във всяка серия трябва да бъде анализиран двойно поне един от тестовите материали.Абсолютната разлика, получена от двойния анализ в рамките на серия (виж приложение III), трябва да бъде вписана. Централната линия е 1.128 sw, долната граница е 0, горната граница (граница на действие) е 3.686 s, където sw е стандартното отклонение в рамките на серията.Контролната процедура би следвало да включва материали с ниско и високо ниво, когато степента на концентрация е голяма.Ако тестовите материали обхващат голяма област на концентрация на аналити, лабораторията би следвало да установи връзката между прецизността и нивото. Ако прецизността е пропорционална на нивото, последващият контрол би следвало да се базира на относителна прецизност (т.e. абсолютната разлика като процент от средната стойност).Когато е налице условие, което е извън контрол в аналитичната система, то се идентифицира при възникване на следното:A. настоящата стойност на резултата попада извън границите на действие;Б. настоящата стойност и предходната стойност попадат извън предупредителните граници, но в рамките на границите на действие;В. когато се използват контролни материали, девет последователни стойности попадат от същата страна на средната линия.Лабораторията би следвало да отговори на условие, което е извън контрол, чрез:A. преустановяване на анализа и провеждане на диагностични тестове и поправителни мерки; иБ. отказ от резултатите от сериите и повторно анализиране на тестовите материали.б) Процедура за избор на вътрешен контролен материал и определяне на "вътрешни" граници за прецизност (химически анализ)Данните за лабораторна прецизност могат да бъдат получени чрез възпроизвеждане на анализ на контролни материали и/или чрез възпроизвеждане на анализ на тестови проби.Лабораториите би следвало да използват при съставянето на контролни диаграми следната процедура за установяване на параметри на прецизността за варирането в рамките на серията и между сериите. Лабораториите могат да приемат алтернативни процедури, при условие че могат да демонстрират по адекватен начин, че са получени надеждни данни за прецизност.1. Избор на контролни материалиКогато за лабораторията е уместно да използва контролен материал, първо трябва да бъдат получени данните, с оглед определянето на граници. Когато е възможно, би следвало да бъдат използвани сертифицирани референтни материали (СРМ). Бъдещите контролни материали би следвало да бъдат анализирани при условия на повторяемост в рамките на серията, включително подходящи СРМ, с възпроизвеждане и хаотизиране. Когато този подход не е подходящ, лабораториите би следвало да се стремят да участват в професионално тестване и да установяват съгласувани средни стойности (определени стойности), които могат да бъдат считани като приета реална средна стойност, съдържаща фактор на несигурност. Други подобни процедури включват определянето на реална стойност чрез изчисляването на формулата или използването на контролни материали, заместени с аналити.В допълнение, когато лабораторията извършва регулярно този тип анализ и вече е създала статистически контрол, всички нови контролни материали (напр. изисквани поради изчерпване на количествата) трябва да бъдат получавани по отношение на анализите, които се контролират при използване на съществуващите материали.2. Определяне на границиСлед като е избран контролен материал, лабораторията би следвало да го използва, за да определи данните на прецизността в рамките на серията и между сериите.Като минимално изискване за установяването на прецизност в рамките на серията, контролният материал би следвало да се анализира двойно 12 пъти. Двойният анализ би следвало да бъде извършван при условия за повторяемост, т.e. същият оператор, същите реагенти и т.н. Двойният анализ на контролния материал би следвало да бъде хаотизиран в рамките на аналитичната серия. Всеки двоен анализ би следвало да бъде предприеман в отделен ден за период от време, така че да се отчете варирането от серия до серия, като се вземат предвид нормалните вариации, напр. реагенти, инструменти, ново калибриране и, ако е уместно, различни анализатори.Бележка: Използването на данните, които не са напълно представителни за вариацията между сериите, може да резултира в ненужно възпроизвеждане на анализ поради определянето на изключително тесни граници. От друга страна, лаборатория с прекалено неточни данни на прецизността може да не достигне предписаните в референтните методи граници и би следвало да очаква да покаже слаб резултат в сравнение с други лаборатории, както и да представи данни, които не са подходящи за целта.2.1. Определяне на прецизност в рамките на серията2.1.1. Прецизност в рамките на серията, когато е наличен контролен материалДвойните данни (минимум 12 дублирания) би следвало първо да бъдат предмет на Cochran-тест за максималните вариации. Това включва сравняване на максималния обхват на дублиране на квадрат със сумата на обхватите на квадрат.c =d2max∑i =1pdi2където:di = разликата между дублиранията.Стойността на критерия С на Cochran се сравнява с табулираните стойности (ISO 5725 (1994)). Когато стойността може да се класифицира като изоставаща или отдалечаваща се, резултатът би следвало да бъде проучен за обяснение, напр. техническа грешка, изчислителна грешка, грешка при провеждането на теста, анализ на грешна проба. Ако обяснението на техническата грешка е такова, че замяната на съмнителния резултат се оказва невъзможна, то този резултат би следвало да се отстрани като реална отдалечаваща се стойност. Ако останат каквито и да е изоставащи или отдалечаващи се стойности, които не могат да бъдат обяснени, изоставащите стойности се запазват като коректни, а статистически отдалечаващите се стойности се отстраняват. Лабораторията би следвало да се стреми да получава заместващи стойности.Когато лабораторията се увери, че в данните няма изоставащи стойности, стандартното отклонение в рамките на серията sw се получава, както следва:За всяка двойка xi1,xi2 на данните на дублиранията, сумата на дублиранията,s= x+ xи разликата между дублиранията,d= x— xсе сравняват и сумират до:A = ∑sB = ∑dC = ∑sОценката на стандартното отклонение в рамките на серията е:s=Границата на вътрешната прецизност е: 2.8. sw.Ако се използва референтен метод, границата на вътрешната прецизност би следвало да бъде сравнявана с публикуваната граница на повторяемост. Лабораторията би следвало да изпълнява изискването на референтния метод. Неспазването на това изискване би следвало да бъде проучвано.Определените граници би следвало да бъдат считани като временни и предмет на преглед.2.1.2. Прецизност в рамките на серията, когато не е наличен контролен материалЛабораторията може да избере да определи прецизност в рамките на серията чрез двоен анализ на представителни тестови проби (минимум 12 дублиращи анализа). В случаите, в които не е възможно да се използват контролни материали, напр. поради нестабилност, дублиращите данни трябва да бъдат събрани с този метод.Бележка: Предполага се, че анализите покриват относително близък обхват на стойностите и поради това за всички проби може да бъде прилагана единична стойност. В случаите, в които обхватът на резултатите е по-широк, напр. по реда на величините, и прецизността зависи от нивото, лабораториите би следвало да проучват използването на относителните стандартни отклонения.Данните би следвало да се подложат на Cochran-тест, както в 2.1.1. Когато лабораторията е уверена, че в данните няма изоставащи стойности, стандартното отклонение в рамките на серията и границата на вътрешната прецизност могат да бъдат получени, както в раздел 2.1.1.Стандартното отклонение sw в рамките на серията може да бъде използвано за съставянето на контролни диаграми (виж приложение II). Определените граници би следвало да бъдат считани като временни и предмет на преглед.2.2. Определяне на прецизността между сериитеЗа всяка двойка се изчислява средно аритметичната стойност (s1/2) и тези стойности се подлагат на Grubbs-тест (ISO 5725 (1994)). Критериите за отказ/приемане на отдалечаващите се стойности или на изоставащите стойности са както описаните в 2.1.1. Лабораторията би следвало да се стреми да получава заместваща стойност за всеки отстранен резултат. Когато лабораторията е уверена, че в данните няма отдалечаващи се стойности, стандартното отклонение между сериите sb се изчислява:s=1C -B -Aили 0, ако изразът под знака за корен квадратен е отрицателен.Общото стандартно отклонение s се използва за съставянето на контролни диаграми за средната стойност на n определяния (виж прилож ение II). Определените граници би следвало да бъдат считани като временни и предмет на преглед.3. Преглед на първоначалните границиКонтролните граници, определени както е описано по-горе, трябва да бъдат считани като първоначални оценки.С оглед да се актуализират определените граници на базата на приемлива оценка в рамките на сериите (раздел 2.1.2), за тестовите проби би следвало да бъдат събрани допълнителни дублиращи данни. Периодът преди прегледа ще зависи от последователността на анализа. Като указание, данните би следвало да бъдат преглеждани след получаването на 10 допълнителни дублирания. След това, всички данни би следвало да бъдат подложени на Cochran-тест, както и отново да бъдат определени границите на базата на новото стандартно отклонение. В светлината на допълнителните данни, трябва да бъдат взети последващи решения за валидността на контролните граници.Прегледът на първоначалните данни, получени при оценката между сериите, зависи също и от последователността на анализа. Като указание, след като са получени допълнително десет точки данни от анализа на контролния материал при последователност от един анализ за партида, направените първоначални предполагания за стандартното отклонение и средната стойност би следвало да бъдат преразгледани.Всички данни би следвало да бъдат подложени на Grubbs-тест за отдалечаващите се резултати. Средната стойност и стандартното отклонение би следвало да бъдат преизчислени на базата на новите данни.В допълнение, на този етап лабораторията би следвало да прилага Cusum-диаграма (BS S700: (1984) с изменение и допълнение 5480 (1987)), за да проучва всички проблеми, които могат да бъдат свързвани, напр. с остаряването на реагенти. Всеки единичен резултат, който попада извън границата на Cusum-"V-маска", трябва да бъде проучен.Новите граници (средна стойност и стандартно отклонение) трябва да са предмет на регулярна проверка чрез използването на Cusum-техниката. Всяка индикация, че валидността на контролния материал се поставя под въпрос, трябва подробно да бъде проучена.4. Отчитане на данните на прецизносттаЛабораториите трябва да изпращат следната информация на компетентния национален орган:- използвания метод,- стандартното отклонение sw в рамките на серията и границата на вътрешната прецизност,- стандартното отклонение sb между сериите,- общото стандартно отклонение s1,- броят на анализите за получаването на данните на прецизността.[1] M. Thompson и R. Wood: "Теоретична и приложна химия" 67 (4), 649-666 (1995).--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ VI(член 6)ОЦЕНЯВАНЕ НА ОЦЕНИТЕЛИТЕ И НАДЕЖНОСТТА НА РЕЗУЛТАТИТЕ ПРИ ЧУВСТВИТЕЛНИ АНАЛИЗИАко се използват методи със скала (IDF стандарт 99C/1997), се прилагат следните процедури:a) Определяне на "индекса на повторяемост"В рамките на 12 месеца оценителят анализира най-малко десет проби като дублирания на празни проби. Обичайно, това се извършва на няколко етапа. Резултатите за отделните характеристики на продукта се оценяват чрез използване на следната формула:w= 1 +∑където:wI : индекс на повторяемостxi1 : резултат за първата оценка на проба xixi2 : резултат за втората оценка на проба xin : брой пробиПробите, които се оценяват, би следвало да покриват широк обхват от качество. wI не би следвало да превишава 5 (5-точкови скали).б) Определяне на "индекса на отклонение"Този индекс би следвало да служи за проверка дали оценителят използва същата скала за оценка на качеството, както използваната от група оценители с опит. Получените от оценителя резултати са сравними със средната стойност на резултатите, получени от групата оценители.Следната формула се използва за оценка на резултатите:D= 1 ++където:xi1; xi2 : виж буква а)__NEWLINE__x‾il__NEWLINE__x‾i2 : среден резултат на групата оценители, съответно за първата и втората оценка на пробата xin : брой проби (най-малко десет за 12 месеца)Пробите, които се оценяват, би следвало да покриват широк обхват от качество. DI не би следвало да превишава 1.5 (5-точкови скали).Държавите-членки трябва да съобщават за всички трудности, които са срещнати при прилагането на тази процедура.в) Сравнение на резултатите, получени в различни региони на държава-членка и в различни държави-членкиКогато е приложимо, поне веднъж годишно трябва да бъде организиран тест за сравняване на резултатите, които са получени от оценители от различни региони. Ако се наблюдават значителни разлики, би следвало да бъдат предприети необходимите стъпки за идентифицирането на причините и получаването на сравними резултати.Държавите-членки могат да организират тестове, за да сравняват резултатите, получени от техните оценители и от оценители от съседни държави-членки. Значителните разлики би следвало да бъдат предмет на задълбочено проучване с цел получаването на сравними резултати.Държавите-членки би следвало да уведомяват Комисията за резултатите от тези сравнения.--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ VII(член 6)СЕНЗОРНА ОЦЕНКА НА МАСЛО1. ОбхватЦелта на тази процедура за сензорна оценка на масло е да осигури унифициран метод, приложим във всички държави-членки.2. ДефиницииСензорна оценка означава проверка на белезите на продукт чрез сетивата.Панел означава група от избрани оценители, които работят по време на оценяването без вътрешни комуникации и без да се влияят един от друг.Оценка на резултатите означава сензорна оценка от панел чрез използване на точкова скала. Трябва да бъде използвана номенклатура на грешките.Степенуване означава класификация на качеството, която се извършва на базата на оценката на резултатите.Контролни документи: документи, използвани за отчитане на индивидуалните резултати за всеки белег и окончателното степенуване на продукта. (Този документ може да бъде използван също и за отчитане на химически състав).3. Стая за тестове3.1. Трябва да бъдат взети предварителни мерки, за да не могат оценителите в стаята за тестове да се влияят от външни фактори.3.2. В стаята за тестове не трябва да има чужди миризми, както и стаята да е лесна за почистване. Стените трябва да са светли.3.3. Стаята за тестове и нейното осветление трябва да бъдат такива, че качествата на оценяваните продукти да не се засягат. В стаята трябва да има подходящ температурен контрол.4. Избор на оценителиОценителят трябва да е запознат с масла и да е компетентен да извършва чувствително степенуване. Неговата компетентност би следвало да бъде оценявана на регулярна основа (поне веднъж годишно) от компетентния орган.5. Изисквания за панелаБроят на оценителите в панела не би следвало да е четен, като минималният брой следва да е три. Мнозинството оценители трябва да бъдат служители на компетентния орган или упълномощени лица, които не работят в млечната промишленост.С оглед извършването на оптимална работа от лицата, преди оценката трябва да бъдат взети предвид определен брой фактори:- лицата не трябва да страдат от болест, която би могла да засегне работата им. В обратния случай, съответният оценител би следвало да бъде заменен от друг оценител в панела,- лицата трябва да пристигат навреме на съответното място, за да участват в оценката и да имат достатъчно време за извършването на индивидуалната оценка,- лицата не трябва да използват субстанции със силен аромат, като парфюм, лосион след бръснене, дезодорант и т. н., както и би следвало да избягват храни със силен аромат (напр. силни подправки) и т.н.,- в рамките на половин час преди оценката, на лицата не се разрешава да пушат, да се хранят или да пият, с изключение на вода.6. Оценка на стойността на всеки белег6.1. Сензорната оценка следва да се извършва по отношение на следните три белега: външност, консистенция и аромат.Външността включва следните характеристики: цвят, видима степен на хомогенност, растеж на плесени и водна дисперсия. Водната дисперсия се тества съгласно IDF-стандарт 112A/1989.Консистенцията включва следните характеристики: твърдост и способност за намазване.За оценката на консистенцията на масло могат да бъдат прилагани физически методи. Комисията планира бъдещото хармонизиране на тези методи.Ароматът включва следните характеристики: вкус и миризма.При значително отклонение на препоръчваната температура не е възможна надеждна оценка на консистенцията и аромата. Температурата е от изключително значение.6.2. Всеки белег се оценява чувствително поотделно. Оценяването на резултата трябва да бъде направено съгласно таблица 1.6.3. С оглед постигането на унифициране, би могло да е уместно оценителите да оценяват резултатите заедно преди началото на оценката на една или две референтни проби за външност, консистенция и аромат.6.4. Приемането на оценката на резултатите е, както следва:| Максимум | Изискване |Външност | 5 | 4 |Консистенция | 5 | 4 |Аромат | 5 | 4 |Когато необходимият резултат не е получен, следва да бъде дадено описание на грешката. Резултатът, даден от всеки оценител за всеки белег, трябва да бъде записан в контролния документ. Продуктът е приет или отхвърлен на базата на решението, прието с мнозинствоо. Случаите, в които разликите между индивидуалните резултати за всеки белег са по-големи от съответстващите точки, не би следвало да възникват регулярно (не повече от веднъж на 20 проби). В противен случай, ръководителят на панела би следвало да провери компетентността на последния.7. НадзорПо принцип, за цялата процедура отговаря ръководителят на панела, който трябва да бъде служител на компетентния орган и може да бъде член на панела. Той трябва да записва индивидуалните резултати за всеки белег в контролния документ и да удостоверява дали продуктът е приет или отхвърлен.8. Вземане на проба и подготовка на пробата8.1. - Желателно е идентичността на пробите да не бъде откривана по време на оценката, за да се избягва всяко възможно предубеждение.- Това би следвало да бъде организирано преди оценката от ръководителя на панела, без присъствието на други членове на панела.8.2. Когато сензорната оценка се извършва в хладилен склад, пробата се взема чрез използване на инструмент за вземане на проби от масло. Когато сензорната оценка се извършва на друго място, различно от хладилен склад, то тогава би следвало да бъде взета поне 500 g проба.8.3. По време на оценката маслото би следвало да е с температура от 10 до 12 °C. При всички случаи би следвало да бъдат избягвани големи отклонения от тази температура.9. НоменклатураВиж приложената таблица 2.Таблица 1: оценяване на резултатите на маслоВъншност | Консистенция | Аромат |Точ-ки | № [1] | Б ележки | точ-ки (клас качество) | № [1] | Бележки | точ-ки (клас качество) | № [1] | Бележки |5 | | Много добра идеален тип най-високо качество (суха) | 5 | | Много добра идеален тип най-високо качество (добре се намазва) | 5 | | Много добър идеален тип най-високо качество (абсолютно чист най-фин аромат) |4 | | Добра [2] няма видими дефекти | 4 | | Добра [2] | 4 | | Добър [2] няма видими дефекти || | 17 | твърда | | || | 18 | мека | | |3 | | Задоволителна (леки дефекти) | 3 | | Задоволителна (леки дефекти) | 3 | | Задоволителна (леки дефекти) |1 | ронлива, влага | 14 | сипкава, трошлива лепкава, | 21 | нечист |2 | нееднаква, двуцветна | 15 | тестява, мазна | 22 | чужд вкус |3 | неравномерно оцветяване, | 16 | влажна | 25 | кисел |4 | изпъстрена като мрамор | 17 | твърда | 27 | готварски вкус, |5 | на петна | 18 | мека | 33 | вкус на изгоряло |6 | отделяне на олио | | | 34 | вкус на ядене |7 | прекалено оцветена | | | 35 | долнокачествен, горчив пресолен |8 | водниста консистенция | | | | | |2 | | Незадоволителна (видими дефекти) | 2 | | Незадоволителна (видими дефекти) | 2 | | Незадоволителна (видими дефекти) |1 | ронлива, влага | 14 | сипкава, трошлива тестява, | 21 | нечист |3 | неравномерно оцветяване | 15 | мазна | 22 | чужд вкус |4 | изпъстрена като мрамор | 16 | лепкава, | 23 | вкиснал |5 | на петна | 17 | твърда | 25 | кисел |6 | отделяне на олио | 18 | мека | 32 | окислен вкус, метален вкус |10 | чужди съставки | | | 33 | вкус на ядене |11 | плесенясала | | | 34 | долнокачествен, горчив |12 | неразтворена сол | | | 35 | пресолен || | | | 36 | мухлясало-застоял, гнил || | | | 38 | химически вкус |1 | | Лоша (големи дефекти) | 1 | | Лоша (големи дефекти) | 1 | | Лоша (големи дефекти) |1 | ронлива, влага | 14 | сипкава, трошлива | 22 | чужд вкус |3 | неравномерно оцветяване | 15 | лепкава, тестява, мазна | 24 | сиреняв, аромат на кисело |4 | изпъстрена като мрамор | 16 | влажна | 25 | сирене |5 | на петна | 17 | твърда | 26 | ферментирал |6 | отделяне на олио прекалено | 18 | мека | 28 | вкус на плесен |7 | оцветена | | | 29 | гранясал |9 | гранулирана | | | 30 | мазен, с вкус на риба |10 | чужди съставки | | | 31 | лоен |11 | плесенясала | | | 32 | окислен вкус, метален вкус |12 | неразтворена сол | | | 34 | долнокачествен, горчив || | | | 36 | мухлясало-застоял, гнил || | | | 37 | малцов || | | | 38 | химически вкус |Таблица 2: таблица на дефектите на маслоI. Външност1. ронлива, влага2. нееднаква, двуцветна3. неравномерно оцветяване4. изпъстрена като мрамор5. на петна6. отделяне на олио7. прекалено оцветена8. водниста консистенция9. гранулирана10. чужди съставки11. плесенясала12. неразтворена солII. Консистенция14. сипкава, трошлива15. лепкава, тестява, мазна16. влажна17. твърда18. мекаIII. Аромат20. без аромат21. нечист [3]22. чужд вкус23. вкиснал24. сиренен, аромат на кисело сирене25. кисел26. ферментирал27. a) готварски вкусб) вкус на изгоряло28. вкус на плесен29. гранясал30. мазен, с вкус на риба31. лоен32. a) окислен вкусб) метален вкус33. вкус на ядене34. долнокачествен, горчив35. пресолен36. мухлясало-застоял, гнил37. малцов38. химически вкус[1] Таблица 2.[2] Дефектите, упоменати под "добре" представляват само малки отклонения от идеалния тип.[3] Това обозначаване би следвало да се използва възможно най-рядко и само когато дефектът не може да бъде описан по-точно.--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ VIII(член 7)ПРИЛОЖИМА ПРОЦЕДУРА ПРИ ОСПОРВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ ОТ АНАЛИЗА (химически анализ)1. По искане на оператора може да бъде извършен допълнителен анализ в рамките на седем работни дни от съобщаването на резултатите от първия анализ, при условие че са налични запечатани дублиращи проби от продукта, които се съхраняват по подходящ начин от компетентните органи.2. По искане и за сметка на оператора, компетентният орган изпраща тези проби на втора лаборатория. Тази лаборатория трябва да е оторизирана да извършва официални анализи и трябва да има доказана компетентност за въпросните анализи. Компетентността би следвало да е документирана от успешно участие в съвместни изследвания, професионални тестове или сравнения между лаборатории. Втората лаборатория трябва да използва реферетния метод. Получените от двете лаборатории резултати трябва да бъдат оценени, както следва:a) Когато двете лаборатории изпълняват изискването за повторяемост и изискването за възпроизвежданеСредно аритметичната стойност на тестовите резултати, получени от двете лаборатории, се използва при окончателния резултат. Този окончателен резултат се оценява, като се взема предвид критичната разлика, при използване на следната формула:CrDy- m=2R- r11където__NEWLINE__y‾ : средно аритметичната стойност на всички резултати, получени от двете лабораторииmо : границаR : възпроизвежданеr : повторяемостn1 : брой резултати, получени от лаборатория 1n2 : брой резултати, получени от лаборатория 2.Бележка: Ако окончателният резултат се изчислява при използване на формулата:x = y± yx = y/y2(виж приложение IV(3) и (4), съответно), R2x и r2x би следвало да бъдат внесени във формулата вместо R2 и r2.б) Когато двете лаборатории изпълняват изискването за повторяемост, но не изпълняват изискването за възпроизвежданеАко вторият анализ потвърждава първия, анализираното количество би следвало да бъде отхвърлено. В противен случай, количеството би следвало да се приеме.в) Когато само една лаборатория изпълнява изискването за повторяемостОкончателният резултат на лабораторията, която изпълнява изискването за повторяемост, следва да се използва, за да се реши дали да се приеме анализираното количество.г) Когато никоя лаборатория не изпълнява изискването за повторяемост, но изискването за възпроизвеждане е изпълненоПрилага се a).д) Когато никоя лаборатория не изпълнява нито изискването за повторяемост, нито изискването за възпроизвежданеАнализираното количество би следвало да бъде прието, ако получените от една лаборатория резултати водят до това заключение.е) Когато резултатите са получени чрез използването на невалидни методиАнализираното количество би следвало да бъде прието, ако получените от една лаборатория резултати водят до това заключение.3. Резултатите от втория анализ трябва да бъдат съобщени на оператора от компетентния орган възможно най-бързо. Разходите за втория анализ следва да бъдат поети от оператора, ако анализираното количество се отхвърли.4. Ако операторът може да докаже в рамките на пет работни дни от вземането на пробата, че процедурата по вземането на пробата не е извършена коректно, вземането на пробата трябва да бъде повторено, когато това е възможно. Ако вземането на пробата не може да бъде повторено, анализираното количество трябва да бъде прието.--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ IX(член 8)ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ВОДНОТО СЪДЪРЖАНИЕ НА МАСЛО1. Обхват и приложно полеТози референтен метод установява методика за определяне на водното съдържание на масло.2. ПозоваванияIDF стандарт 50 °C: 1995 — Мляко и млечни продукти — методи за вземане на проби3. ДефиницияВодно съдържание на масло: загубата на маса след завършване на подгряващия процес, определен в упоменатия стандарт. Изразява се в грамове на 100 грама.4. ПринципИзпаряване на вода от тестова доза в сушилня, в присъствието на пемза и при температура от 102 °C.5. Апаратура и материалиОбичайна лабораторна апаратура, и по-специално:5.1. Аналитична везна с чувствителност 1 mg5.2. Пещ за сушене, снабдена с ефективен сушилен агент (например, прясно изсушен гел на силициев двуокис с индикатор за влага).5.3. Пещ за сушене, вентилирана, термостатично контролирана, оперираща при 102 ± 2 °C в цялото работно пространство.5.4. Стъклени, порцеланови и неръждаеми метални съдове, с височина от около 20 mm., диаметър от 60 до 80 mm.5.5. Пемза, гранулирана, измита, с диаметър от 0,8—10 mm.6. Вземане на пробиВиж IDF 50 C: 19957. Процедура7.1. Подготовка на тестовата пробаЛабораторната проба се затопля в затворен стъклен или подходящ пластмасов съд, който би следвало да е пълен от една втора до две-трети, до температура, при която пробата ще стане достатъчно мека, за да се улесни смесването до постигане на хомогенно състояние (или с механичен шейкър или с ръка). Обичайно, температурата на смесване не би следвало да надвишава 35 °C. Пробата се охлажда до стайна температура. Съдът се отваря възможно най-бързо след охлаждането на пробата и се разклаща бързо (не повече от 10 секунди) с подходящ предмет, например лъжица или шпатула, преди да се претегли.7.2. Определяне на водното съдържание7.2.1. В съда (5.4) се поставят приблизително 10 g пемза.7.2.2. Съдът с пемзата се изсушава в пещта (5.3) при 102 ± 2 °C най-малко за един час.Бележка: Периодите на сушене, упоменати в 7.2.2, 7.2.5 и 7.2.7, започват, когато температурата на пещта достигне 102 ± 2 °C.7.2.3. Съдът се оставя да се охлади в ексикатор (5.2) до температурата на стаята за претегляне и се претегля с точност до 1 mg7.2.4. В съда се измерва с точност до 1 mg тестова доза от приблизително 5 mg от тестовата проба.7.2.5. Съдът се поставя в пещта за сушене при 102 ± 2 °C и се оставя да престои три часа.7.2.6. Съдът се оставя да се охлади в ексикатор до температурата на стаята за претегляне и се претегля с точност до 1 mg7.2.7. Процесът на сушене се повтаря за допълнителни периоди от един час, като охлаждането и претеглянето се извършва всеки път, както е посочено, докато се постигне константна маса (промяната на масата не трябва да надвишава 1 mg).В случай на увеличаване на масата, за изчисление се взема отчетената най-малка маса.8. Изразяване на резултати8.1. Метод на изчисляване и формулаВодното съдържание W се изчислява като процент от масата чрез използване на следната формула:W =m-mm-m×100където:m0 | е масата в грамове на съда с пемзата (7.2.3) |m 1 | е масата в грамове на тестовата доза, съда и пемзата преди сушене (7.2.4) |m 2 | е масата в грамове на тестовата доза, съда и пемзата след сушене (7.2.7) |Резултатите се отчитат до първия десетичен знак.8.2. ПовторяемостАбсолютната разлика между резултатите от две отделни определяния, извършени едновременно или едно след друго от същия оператор и при същите условия върху идентичен тестов материал, не надвишава 0,2 %.8.3. ВъзпроизвежданеАбсолютната разлика между два отделни и независими резултата, получени от двама оператори, които работят в различни лаборатории върху идентичен тестов материал, не надвишава 0,3 %.9. Отчитане на тестаПри отчитането на теста се посочват използваният метод и получените резултати. Също така, се упоменават всички оперативни детайли, които не са определени в този международен стандарт или които се считат като опция, заедно с детайлите за всички случайности, които може да са повлияли на резултатите. При отчитането на теста се дава всяка необходима информация за пълното идентифициране на пробата.--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ X(член 8)МАСЛО: ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА СУХО ВЕЩЕСТВО БЕЗ МАЗНИНИ1. Обхват и приложно полеТози стандарт установява метод за определяне на съдържанието на сухо вещество без мазнини в масло.2. ПозоваванияIDF стандарт 50 C: 1995 — Мляко и млечни продукти — методи за вземане на проби3. ДефиницииСъдържание на сухо вещество без мазнини в масло: процент от масата, установен при определената процедура. Изразява се в грама на 100 грама.4. ПринципИзпаряване на вода от известна маса масло, екстракция на мазнината с петролен етер и измерване на утайката.5. РеагентПетролен етер с амплитуда на кипене от 30 до 60 °C. След изпаряването на 100 ml, реагентът не оставя повече от 1 mg утайка.6. Апаратура и материали.6.1. Аналитична везна с чувствителност 1 mg.6.2. Пещ за сушене, снабдена с ефективен сушилен агент (например, прясно изсушен гел на силициев двуокис с индикатор за влага).6.3. Пещ за сушене, вентилирана, термостатично контролирана, оперираща при 102 ± 2 °C в цялото работно пространство.6.4. Стъклени, порцеланови и неръждаеми метални съдове, с височина от около 20 mm., диаметър от 60 до 80 mm., с предвидена стъклена бъркалка.6.5. Филтърен тегел, синтерово стъкло, с диаметър на пора от 16 до 40 µm, с колба за всмукване.7. Вземане на проби.Виж IDF стандарт 50 C: 19958. Процедура8.1. Подготовка на тестовата пробаЛабораторната проба се затопля в затворен стъклен или подходящ пластмасов съд, който би следвало да е пълен от една втора до две-трети, до температура, при която пробата ще стане достатъчно мека, за да се улесни смесването до постигане на хомогенно състояние (или с механичен шейкър или с ръка). Обичайно, температурата на смесване не би следвало да надвишава 35 °C. Пробата се охлажда до стайна температура. Съдът се отваря възможно най-бързо след охлаждането на пробата и се разклаща бързо (не повече от 10 секунди) с подходящ предмет, например лъжица или шпатула, преди претеглянето.8.2. Определяне8.2.1. Съдът с бъркалката (6.4) и тегела (6.5) се изсушава в пещта (6.3) за 1 час. Тези предмети се оставят да се охладят в ексикатора и се претеглят заедно (напр. съд, бъркалка и тегел) с точност до 1 mg (m0).Бележки:- Като правило, достатъчното време за охлаждане е 45 минути.- Важно е, когато се анализира повече от една тестова доза в партидата, за всяка тестова доза да се използва същата комбинация от съд, бъркалка и тегел.8.2.2. Тегелът се отстранява, отчита се общото тегло на съда и бъркалката с точност до 1 mg (m1).8.2.3. В съда се измерва с точност до 1 mg тестова доза от приблизително 5 mg на тестовата проба (8.1) (m2).8.2.4. Съдът (заедно с бъркалката и маслото) се поставя в пещта при 102 ± 2 °C и се оставя да престои през нощта.8.2.5. Съдът (8.2.3) се оставя да се охлади на стайна температура.8.2.6. 15 ml топъл (приблизително 25 °C) петролен етер се добавя към съда и се отделя колкото е възможно повече от седимента, залепнал за съда, чрез използването на стъклената бъркалка. Разтворителят се прехвърля в тегела и се оставя да се филтрира в колбата за просмукване.8.2.7. Операция 8.2.6 се извършва допълнително четири пъти. Ако върху повърхността на чашата няма следи от мазнина, по време на четвъртото измиване в тегела се прехвърля възможно най-много количество от седимента. В противен случай, операция 8.2.6 се повтаря до цялостното елиминиране на всички следи от мазнина.8.2.8. Седиментът в тегела се измива с 25 ml топъл петролен естер.8.2.9. Съдът и бъркалката се изсушават заедно с тегела в пещта при 102 ± 2 °C за 30 минути.8.2.10. Съдът се оставя да се охлади в ексикатора на стайна температура и се измерва с точност до 1 mg.8.2.11. Операции 8.2.9 и 8.2.10 се повтарят, докато не се получи обща константна маса (промяната на масата не трябва да надвишава 1 mg) за съда, бъркалката и тегела (m3).9. Изразяване на резултати9.1. Изчисляване на съдържанието на сухо вещество без мазниниСъдържанието на сухо вещество без мазнини SNF се изчислява като процент от масата чрез използване на следната формула:SNF =m– mm– m× 100където:m0  е масата в грамове на празния съд със стъклената бъркалка и тегела (8.2.1)m1  е масата в грамове на празния съд със стъклената бъркалка (8.2.2)m2  е масата в грамове на тестовата доза и съда със стъклената бъркалка (8.2.3)m3  крайната маса в грамове на съда с бъркалката и тегела, съдържащ седимента (8.2.11)Резултатите се отчитат до първия десетичен знак.9.2. ПовторяемостАбсолютната разлика между резултатите на две отделни определяния, извършени едновременно или едно след друго от същия оператор и при същите условия върху идентичен тестов материал, не надвишава 0,2 %.9.3. ВъзпроизвежданеАбсолютната разлика между два отделни и независими резултата, получени от двама оператори, които работят в различни лаборатории върху идентичен тестов материал, не надвишава 0,2 %.10. Отчитане на тестаПри отчитането на теста се посочват използваният метод и получените резултати. Също така, се упоменават всички оперативни детайли, които не са определени в този международен стандарт или които се считат като опция, заедно с детайлите за всички случайности, които може да са повлияли на резултатите. При отчитането на теста се дава всяка необходима информация за пълното идентифициране на пробата.Бележка:Ако се анализира осолено масло, прибавената сол се определя като сухо вещество без мазнини. За определянето на съдържанието на сухо вещество без мазнини в мляко, съдържанието на прибавената сол трябва да се извлече от съдържанието на сухото вещество без мазнини. Изчисляването на данните на прецизността за определянето на съдържанието на сухо вещество без мазнини в мляко е:повторяемост: | r = 0,104 % |възпроизвеждане: | R = 0,206 %. |Може да се направи заключение, че данните на прецизността, получени за определянето на съдържанието на сухо вещество без мазнини, са валидни за определянето на съдържанието на сухо вещество без мазнини в мляко.--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ XI(член 8)ОПРЕДЕЛЯНЕ НА МАСЛЕНОСТТА НА МАСЛОТОМаслеността на маслото се получава директно чрез определяне на водното съдържание и съдържанието на сухото вещество без мазнини, съответно съгласно прилож ение IX и прилож ение X. Процентът на маслеността от масата е равен на:100 –където:W: | процент на вода от масата |SNF: | процент на сухото вещество без мазнини от масата |Изчислените данни на прецизността за определянето на маслеността са:повторяемост: | r = 0,22 % |възпроизвеждане: | R = 0,36 %. |--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ XII(член 9)ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА ВАНИЛИН В КОНЦЕНТРИРАНО МАСЛО, МАСЛО ИЛИ СМЕТАНА ЧРЕЗ ВИСОКООПТИМАЛНА TЕЧНА ХРОМАТОГРАФИЯ1. Обхват и приложно полеМетодът описва процедура за количествено определяне на ванилин в концентрирано масло, масло или сметана.2. ПринципИзвличане на известно количество проба със смес на изопропанол/етанол/ацетонитрил (1:1:2). Утаяване на по-голямата част от мазнините чрез охлаждане между –15 °C и –20 °C, последвано от центрофугиране.След разреждане с вода, определяне на съдържанието на ванилин чрез високооптимална течна хроматография (HPLC).3. АпаратураОбичайна лабораторна апаратура, и по-специално следното:3.1. Хладилник, с температура на охлаждане от –15 °C до –20 °C;3.2. Спринцовки, с обем от 2 ml;3.3. Мембранни микрофилтри с размер на пора от 0,45 µm, резистентни на разтвор, който съдържа 5 % екстрактен разтвор (4.4);3.4. Система за течна хроматография, състояща се от помпа (поток от 1,0 ml/min), инжектор (20 µl инжектиране, автоматично или ръчно), UV-детектор (функциониращ при 306 nm, 0,01 AU пълна скала), датчик или интегратор и колонен термостат, функциониращ при 25 °C;3.5. Аналитична колона (250 mm. × 4,6 mm.ID), обвита с LiChrospher RP 18 (Merck, 5 µm) или еквивалентен материал;3.6. Защитна колона (около 20 mm. × 3 mm. ID), обвита в сухо състояние с Perisorb RP 18 (от 30 до 40 µm) или еквивалентен материал.4. РеагентиВсички използвани реагенти трябва да са с признато аналитично качество.4.1. Изопропанол4.2. Етанол 96 % (v/v)4.3. Ацетонитрил4.4. Екстрактен разтворСмесва се изопропанол (4.1), етанол (4.2) и ацетонитрил (4.3) в съотношение 1:1:2 (v/v).4.5. Ванилин (4-хидрокси-3-метоксибензалдехид)4.5.1. Основен разтвор на ванилин (= 500 µg/ml)Около 50 mg (СМ.mg) ванилин (4.5) се претегля с точност до 0,1 mg в 100 ml измерителна колба, добавя се 25 ml екстрактен разтвор (4.4) и се долива вода.4.5.2. Стандартен разтвор на ванилин (= 10 µg/ml).5 ml от основния разтвор на ванилин (4.5.1) се капват в измерителна колба от 250 ml и се долива вода.4.6. Метанол, HPLC-качество4.7. Оцетна киселина, кристализирала4.8. Вода, HPLC-качество4.9. HPLC-мобилна фаза300 ml метанол (4.6) се смесват с около 500 ml вода (4.8) и 20 ml оцетна киселина (4.7) в измерителна колба от 1000 ml и се долива вода (4.8). Филтрира се през 0,45 µm филтър (3.3).5. Процедура5.1. Подготовка на тестовата проба5.1.1. МаслоПробата се загрява докато започне топенето. Избягва се прегряването над 40 °C. Когато пробата стане достатъчно гъвкава, тя се хомогенизира чрез разклащане. Маслото се разбърква за 15 секунди преди вземането на пробата. Около 5 g (SМ g) масло се претеглят се с точност до 1 mg в 100 ml измерителна колба.5.1.2. Концентрирано маслоНепосредствено преди вземането на пробата, съдът с концентрираното масло се поставя в пещ при 40 до 50 °C, докато маслото се разтопи напълно. Пробата се смесва чрез разклащане или бъркане, като се избягва образуването на мехурчета въздух от прекалено силното бъркане. Около 4 g (SМ g) концентрирано масло се претегля с точност до 1 mg в 100 ml измерителна колба.5.1.3. СметанаПробата се загрява във водна баня или инкубатор при температура от 35 до 40 °C. Мазнината се разпределя хомогенно чрез разклащане, и ако е необходимо- чрез бъркане. Пробата се охлажда бързо до 20 ± 2 °C. Пробата трябва да изглежда хомогенна, в противен случай процедурата би следвало да бъде повторена. Около 10 g (SМ g) сметана се претегля с точност до 1 mg в 100 ml измерителна колба.5.2. Подготовка на тестовия разтворДобавя се около 75 ml екстрактен разтвор (4.4) към тестовата доза (5.1.1, 5.1.2 или 5.1.3), разбърква се или се разклаща силно за около 15 минути и се допълва с екстрактен разтвор (4.4). Около 10 ml от този екстракт се поставя в реагентна стъклена чаша със запушалка. Реагентната стъклена чаша се поставя в хладилник (3.1 ) и се оставя да престои около 30 минути. Студеният екстракт се центрофугира за около 5 минути при приблизително 2000 rpm и веднага се прелива. Прелетият разтвор се оставя да се охлади до стайна температура. 5 ml от прелетия разтвор се капва в 100 ml измерителна колба и се долива вода. Една аликвотна част се филтрира чрез мембранен филтър (3.3). Филтратът е готов за определяне от HPLC.5.3. Калибриране5 ml стандартен разтвор ванилин (4.5.2) се капват в 100 ml измерителна колба. Добавят се около 5 ml екстрактен разтвор (4.4) и се долива до маркировката с вода. Този разтвор съдържа 0,5 µg/ml ванилин.5.4. Определяне чрез HPLCХроматографската система се оставя да се стабилизира за 30 минути. Инжектира се стандартният разтвор (5.3). Това се повтаря докато разликата в пиковата повърхност или пиковата височина между две последователни инжектирания е по-малка от 2 %. При описаните условия, времето за запазване на ванилина е около 9 минути. Стандартният разтвор (5.3) се анализира двойно чрез инжектиране на 20 µl. Инжектира се 20 µl от тестовите разтвори (5.2). Определя се пиковата повърхност или височина за ванилина, който е получен. Двойното инжектиране на стандартния разтвор (5.3) се повтаря след 10 инжектирания на тестови проби (5.2).6. Изчисляване на резултатитеИзчислява се средната пикова повърхност (или височина) (AC) на ванилина, свързвана с двойните инжектирания за всяка партида на тестовите разтвори (общо четири повърхности или височини).Изчислява се коефициентът на влияние (R):където: СМ. е масата ванилин в mg (4.5.1).Съдържанието (mg/kg) ванилин (C) в тестовата проба е дадено от:C =където:AS = пикова повърхност на ванилина в тестовата пробаSM = масата на тестовата проба в g (5.1.1, 5.1.2 или 5.1.3).Когато се анализира сметана за съдържание на ванилин, концентрацията на индикаторите трябва да бъде изразена като mg индикатор/kg млечни мазнини. Това се извършва чрез умножаване на C с 100/f. f е съдържанието на мазнини в сметана, изразено в проценти (m/m).20 = фактор, който взема предвид разрежданията в стандартната и тестовата проба0,96 = фактор на коригиране за съдържанието на мазнини в първото разреждане на тестовата пробаБележка: Вместо пикова повърхност могат да бъдат използвали пикови височини (виж 8.3).7. Точност на метода7.1. Повторяемост (r)Разликата между резултатите от две определяния, извършени в най-краткия възможен срок от един и същ оператор и при използване на същата апаратура върху идентичен тестов материал, не могат да надвишават 16 mg/kg.7.2. Възпроизвеждане (R)Разликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и при използване на същата апаратура върху идентичен тестов материал, не могат да надвишават 27 mg/kg.8. Граници на толерантност8.1. От обозначения продукт трябва да бъдат взети три проби за проверка на хомогенността.8.2. Индикаторите се получават или от ванилин или от синтетичен ванилин.8.2.1. Размерът за смесване за 4-хидрокси-3-метоксибензалдехид е 250 g за тон концентрирано масло или масло. Когато се индикира сметана, размерът за смесване е 250 g за тон млечни мазнини.8.2.2. Получените от анализа на продукта резултати за трите проби се използват за проверка на размера и хомогенността на смесването на индикатора, като най-ниският от резултатите се сравнява със следните граници (критична граница за вероятност от 95 % (DCr95) е взета предвид):- 221,0 mg/kg (95 % от минималния размер за смесване),- 159,0 mg/kg (70 % от минималния размер за смесване).Използва се концентрацията на индикатора на пробата с най-ниския резултат, който се получава чрез изпаряване между 221,0 mg/kg и 159,0 mg/kg8.3. Индикатор, получен изключително от ванилови зърна или интегрални екстракти от тях8.3.1. Размерът за смесване за 4-хидрокси-3-метоксибензалдехид е 100 g за тон концентрирано масло или масло. Когато се индикира сметана, размерът за смесване е 100 g за тон млечни мазнини.8.3.2. Получените от анализа на продукта резултати за трите проби се използват за проверка на размера и хомогенността на смесването на индикатора, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните граници (критична граница за вероятност от 95 % (DCr95) е взета предвид):- 79,0 mg/kg (95 % от минималния размер за смесване),- 54,0 mg/kg (70 % от минималния размер за смесване).Използва се концентрацията на индикатора на пробата с най-ниския резултат, който се получава чрез изпаряване между 79,0 mg/kg и 54,0 mg/kg9. Бележки9.1. Повторяемостта r е стойността, под която абсолютната разлика между два отдели тестови резултата, получени чрез един и същ метод върху идентичен тестови материал и при същите условия (същата апаратура, същата лаборатория и за кратък период от време), може да бъде очаквана с определена вероятност; при отсъствието на други индикации, вероятността е 95 %.9.2. Възпроизвеждането R е стойността, под която абсолютната разлика между два отделни тестови резултата, получени чрез един и същ метод върху идентичен тестови материал и при различни условия (различна апаратура, различни лаборатории, и/или в различен период от време), може да бъде очаквана с определена вероятност; при отсъствието на други индикации, вероятността е 95 %.9.3. Откриването на прибавен ванилин при количество от 250 mg/kg масло варира от 97,0 до 103,8. Откритото средно съдържание бе 99,9 % със стандартно отклонение от 2,7 %.9.4. Стандартният разтвор съдържа 5 % екстрактен разтвор, за да се компенсира пиковото разширяване, причинено от присъствието на 5 % екстрактен разтвор на тестовите проби. Това позволява определянето на количеството чрез пиковите височини.9.5. Анализът се базира на нормална линия на калибриране с нулева отсечка.Чрез използването на подходящи разреждания на стандартния разтвор (4.5.2), линеарността би следвало да бъде проверявана първия път, когато се извършва анализът, а след това- на регулярни интервали от време и при промени или ремонтиране на оборудването за HPLC.--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ XIII(член 9)ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЕТИЛОВ ЕСТЕР НА БЕТА-АПО-8'-КАРОТИННА КИСЕЛИНА В КОНЦЕНТРИРАНО МАСЛО И МАСЛО ЧРЕЗ СПЕКТРОМЕТРИЯ1. Обхват и приложно полеМетодът описва процедура за количествено определяне на етилов естер на бета-апо-8'-каротинна киселина (апо-каротинен естер) в концентрирано масло и масло. Апо-каротинният естер е сумата от всички субстанции, намиращи с е в екстракт от проби, получени при описаните в метода условия, които абсорбират светлината при 440 nm.2. ПринципМазнините на маслото се разтварят в петролен естер, като абсорбцията се измерва при 440 nm. Съдържанието на апо-каротинен естер се определя чрез външен стандарт.3. Апаратура3.1. Капкомери — градуирани, с обем от 0,25, 0,50, 0,75 и 1,0 ml3.2. Спектрофотометър — подходящ за използване при 440 nm (и 447—449 nm) и оборудван с кювети с оптична дължина на траекторията от 1 cm.3.3. Измерителни колби, 20 ml и 100 ml3.4. Аналитична колона с чувствителност от 0,1 mg.4. РеагентиВсички реагенти трябва да са с признато аналитично качество.4.1. Суспензия на апо-каротинен естер (приблизително 20 %)4.1.1. Съдържанието на суспензията се установява, както следва:Претегля се около 400 mg в измерителна колба (100 ml), разтваря се в 20 ml хлороформ (4.4) и обемът се запълва с циклохексан (4.5). 5 ml от този разтвор се разрежда в 100 ml циклохексан (разтвор A). 5 ml на разтвор A се разтваря в 100 ml циклохексан. Абсорбцията се измерва при 447—449 nm (измерва се максимумът спрямо циклохексана като празна проба при използването на кювети с 1 см. оптична дължина на траекторията):Съдържание на апо - каротинен естер=A max = абсорбция на измервания разтвор при максимумA = тегло на проба (g)2550 = референтна стойност A (1 %, 1 см.)Степента на хомогенност на суспензията е P (%).Бележка: Суспензията на апо-каротинен естер е сензорна на въздух, топлина и светлина. В затворен, оригинален съд (запечатан с азот) и на хладно място тя може да бъде съхранявана 12 месеца. След отварянето, съдържанието би следвало да бъде използвано за кратък период от време.4.1.2. Стандартен разтвор на апо-каротинен естер, прибл. 0.2 mg/mlОколо 0.100 g суспензия на апо-каротинен естер (4.1.1) (Wg) се измерват с точност до 0.1 mg и се разтварят в лаков бензин (4.2); количеството се прехвърля в измерителна колба с вместимост от 100 ml, като до маркировката се долива лаков бензин.Този разтвор съдържа (W.P)/10 mg/ml апо-каротинен естер.Бележка: Разтворът трябва да се съхранява на хладно и тъмно място. Неизползваният разтвор се изхвърля след един месец.4.2. Лаков бензин (40—60 °C).4.3. Натриев сулфат, дехидратиран, гранулат, предварително изсушен при 102 °C за два часа.4.4. Хлороформ.4.5. Циклохексан.5. Процедура5.1. Подготовка на тестовата проба5.1.1. Концентрирано маслоПробата се стопява в пещта при приблизително 45 °C.5.1.2. МаслоПробата се стопява в пещта при приблизително 45 °C и представителна доза от нея се филтрира през филтър, който съдържа около 10 g дехидратиран натриев сулфат (4.3), в среда, защитена от естествена и изкуствена светлина и поддържаща температура от 45 °C. От маслото се отнема подходящо количество мазнини.5.2. Определяне1 g концентрирано масло (или екстракт на мазнини от масло (5.1.2)), (Mg) се измерва с приблизителна точност от 1 mg Количеството се прехвърля в 20 ml (Vml) измерителна колба при използване на лаков бензин (4.2), допълва се до маркировката и внимателно се смесва.Аликвотна част се прехвърля в кювета от 1 cm и се измерва абсорбцията при 440 nm, като се сравнява с празната проба на лаков бензин. Концентрацията на апо-каротинен естер се получава в разтвора чрез графиката на калибриране (C µ/ml).5.3. Графика на калибриране0, 0,25, 0,5, 0,75 и 0 1,0 ml стандартен разтвор на апо-каротинен естер (4.1.2) се капват в пет 100 ml измерителни колби. Обемът се разрежда с лаков бензин (4.2) и се смесва.Подходящите концентрации на разтворите са в обхвата от 0 до 2 µg/ml и се изчисляват точно чрез концентрацията на стандартния разтвор (4.1.2) (W.P)/10 mg/ml. Абсорбциите се измерват при 440 nm, като се сравняват с празната проба на лаков бензин (4.2).Стойностите на абсорбцията се записват в y-координата срещу концентрацията на апо-каротинен естер в х-координатата.6. Изчисляване на резултатите6.1. Съдържанието на апо-каротинен естер, изразено като mg/kg продукт, се дава чрез:концентрирано масло: (C.V)/Mмасло: 0.82 (C.V)Mкъдето:C = съдържанието на апо-каротинен естер, µg/ml, чете се от графиката на калибриране (5.3)V = обем (ml) на тестовия разтвор (5.2)M = маса (g) на тестовата доза (5.2)0.82 = фактор на коригиране на съдържанието на мазнини в масло.7. Точност на метода7.1. Повторяемост7.1.1. Анализ на маслоРазликата между резултатите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор и чрез използване на същата апаратура върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишават 1.4 mg/kg7.1.2. Анализ на концентрирано маслоРазликата между резултатите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор и чрез използване на същата апаратура върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишават 1.6 mg/kg7.2. Възпроизвеждане7.2.1. Анализ на маслоРазликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и чрез използване на различни апаратури върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишават 4.7 mg/kg7.2.2. Анализ на концентрирано маслоРазликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и чрез използване на различни апаратури върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишават 5.3 mg/kg7.3. Източник на данните на прецизносттаДанните на прецизността бяха определени от експеримент, проведен през 1995 г. и включващ 11 лаборатории и 12 индикаторни проби (шест празни дублирания) за масло и 12 индикаторни проби (шест празни дублирания) за концентрирано масло.8. Граници на толерантност8.1. От индикаторния продукт трябва да бъдат взети проби за проверка на коректността на индикирането на продукта.8.2. Масло8.2.1. Размерът за смесване за масло, като се вземе предвид основната абсорбция, е 22 mg/kg8.2.2. Получените от анализа на продукта резултати за трите проби се използват за проверка на размера и хомогенността на смесването на индикатора, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните граници (критична граница за вероятност от 95 % (DCr95) е взета предвид):- 18.0 mg/kg (95 % от минималния размер за смесване),- 13.0 mg/kg (70 % от минималния размер за смесване).Използва се концентрацията на индикатора на пробата с най-ниския резултат, който се получава чрез изпаряване между 18.0 mg/kg и 13.0 mg/kg8.3. Концентрирано масло8.3.1. Размерът за смесване за концентрирано масло, като се вземе предвид основната абсорбция, е 24 mg/kg.8.3.2. Получените от анализа на продукта резултати за трите проби се използват за проверка на размера и хомогенността на смесването на индикатора, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните граници (критична граница на вероятност от 95 % (DCr95) е взета предвид):- 20,0 mg/kg (95 % от минималния размер за смесване),- 14,0 mg/kg (70 % от минималния размер за смесване).Използва се концентрацията на индикатора на пробата с най-ниския резултат, който се получава чрез изпаряване между 20,0 mg/kg и 14,0 mg/kg--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ XIV(член 9)ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СИТОСТЕРИН ИЛИ СТИГМАСТЕРОЛ В МАСЛО ИЛИ КОНЦЕНТРИРАНО МАСЛО ЧРЕЗ ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ С КАПИЛЯРНА КОЛОНА1. ОБХВАТ И ПРИЛОЖНО ПОЛЕМетодът описва процедура за количествено определяне на ситостерин или стигмастерол в масло и концентрирано масло. Ситостеринът се взема като сума от β-ситостерин и 22 дихидро-β-ситостерин; други ситостерини се вземат като незначителни.2. ПРИНЦИПМаслото или концентрираното масло се хидролизира с разтвор на калиев хидроксид и нехидрализираните съставки се извличат с диетилов етер.Стеролите се прехвърлят върху триметил-силил етери и се анализират чрез газова хроматография с капилярна колона, с бетулин като външен стандарт.3. АПАРАТУРА3.1. 150 ml колба за хидролиза с охладител за отливната течност и връзки от шлифовано стъкло.3.2. 500 ml отделителни фунии.3.3. 250 ml колби.3.4. Фунии за изравняване на налягането, 250 ml или подобни, за събирането на остатъка от диетиловия естер.3.5. Стъклена колона, 350 mm × 20 mm, със запушалка от синтерово стъкло.3.6. Водна баня или кожух.3.7. Реактивни флакони от 2 ml.3.8. Газова хроматография, подходяща за използване с капилярна колона, снабдена с отделителна система и състояща се от:3.8.1. Термостатична камера за колони, които могат да поддържат желаната температура с точност от ± 1 °C;3.8.2. Отделение за изпаряване с настройване на температурата;3.8.3. Детектор за йонизиране на пламъка и конверторен увеличител;3.8.4. Интегратор-датчик, подходящ за използване с конверторния увеличител (3.8.3).3.9. Капилярна колона от кварцово стъкло, изцяло обвита с BP1 или еквивалентен материал с унифицирана плътност от 0,25 µm; колоната трябва да може да разтваря триметил-силил производни на ланостерин и ситостерин. Подходящ е BP1 с дължина от 12 m, с вътрешен диаметър от 0,2 mm.3.10. 1- µl- микро-спринцовка за газова хроматография със заострена игла.4. РЕАГЕНТИВсички реагенти трябва да са с доказано аналитично качество. Използваната вода трябва да е дестилирана или да се използва вода с най-малко еквивалентна степен на чистота.4.1. Етанол, поне 95 % чисто съдържание.4.2. Калиев хидроксид, 60 % разтвор (600 g калиев хидроксид (минимум 85 %) се разтваря във вода и се долива до един литър с вода.4.3. Бетулин, поне 99 % чисто съдържание.4.3.1. Разтвори на бетулин в диетилов етер (4.4).4.3.1.1. Концентрацията на бетулиновия разтвор, използван за определянето на ситостерин би следвало да бъде 1,0 mg/ml;4.3.1.2. Концентрацията на бетулиновия разтвор, използван за определянето на стигмастерол, би следвало да бъде 0,4 mg/ml.4.4. Диетилов етер с аналитична степен на чистота (без прекиси и утайки).4.5. Натриев сулфат, дехидратиран, гранулиран и предварително изсушен при 102 °C за два часа.4.6. Силилов реагент, например TRI-SIL (наличен от Pierce Chemical Co, кат. № 49001) или подобен (важно: TRI-SIL е възпламеним, токсичен, корозивен и е възможно да бъде канцерогенен. Лабораторният персонал трябва да е запознат с данните за безопасност на TRI-SIL и да вземе необходимите предварителни мерки.)4.7. Ланостерин.4.8. Ситостерин известна степен на чистота, с не по-малко от 90 % чисто съдържание (P).Бележка 1: Степента на чистота на използваните стандартни материали за калибриране трябва да бъде определена чрез използването на метода на нормализиране. Прима се, че всички стероли, присъстващи в пробата, са представени върху хроматограмата, като общата пикова повърхност представлява 100 % от стеролните съставки, и че стеролите дават същия детекторен отговор. Линеарността на системата трябва да бъде валидирана за областите на концентрация, които са от интерес.4.8.1. Ситостеринен стандартен разтвор — приготвя се разтвор, съдържащ с точност до 0,001 mg/ml приблизително 0,5 mg/ml (W1) ситостерин (4.8) в диетилов етер (4.4).4.9. Стигмастерол с известна степен на хомогенност, не по-малко от 90 % чисто съдържание (P).4.9.1. Стигмастеролен стандартен разтвор — приготвя се разтвор, съдържащ с точност до 0,001 mg/ml приблизително 0,2 mg/ml (W1) стигмастерол (4.9) в диетилов етер 4.4).4.10. Тестов разтвор за проверка на разтварянето. Приготвя се разтвор, съдържащ 0,05 mg/ml ланостерин (4.7) и 0,5 mg/ml ситостерин (4.8) в диетилов етер (4.4).5. МЕТОД5.1. Приготвяне на стандартни разтвори за хроматография. Вътрешният стандартен разтвор (4.3.1) трябва да се добави към подходящ стеролов разтвор в същото време, когато се добавя към хидролизираната проба (виж 5.2.2).5.1.1. Ситостеринов стандартен хроматографски разтвор: 1 ml ситостеринов стандартен разтвор (4.8.1) се поставя във всеки от двата реактивни флакона (3.7) и диетиловият етер се отстранява чрез струя азот. Добавя се 1 ml вътрешен разтвор (4.3.1.1) и диетиловият етер се отстранява чрез струя азот.5.1.2. Сигмастеролен стандартен хроматографски разтвор: 1 ml сигмастеролен стандартен разтвор (4.9.1) се поставя във всеки от двата реактивни флакона (3.7) и диетиловият етер се отстранява чрез струя азот. Добавя се 1 ml вътрешен разтвор (4.3.1.2) и диетиловият етер се отстранява чрез струя азот.5.2. Подготовка на нехидрализираните съставки5.2.1. Пробата масло се стопява при температура, която не надвишава 35 °C; пробата се смесва внимателно чрез бъркане.В 150 ml колба (3.1) се измерва с точност до 1 mg приблизително 1 g масло (W2) или концентрирано масло (W2). Добавя се 50 ml етанол (4.1) и 10 ml разтвор на калиев хидроксид (4.2). Поставя се конверторният увеличител и се загрява приблизително при 75 °C за 30 минути. Конверторният увеличител се отваря и колбата се охлажда на близка до стайната температура.5.2.2. В колбата се добавя 1,0 ml вътрешен стандартен разтвор (4.3.1.1), ако ситостеринът трябва да се определи, или (4.3.1.2), ако стигмастеролът трябва да се определи. Смесва се внимателно. Съдържанието на колбата се поставя в 500 ml отделителна фуния (3.2), като колбата последователно се измива с 50 ml вода и 250 ml диетилов етер (4.4). Отделителната фуния се разклаща силно за две минути и се оставя за отделяне на фазите. Долният воден слой се отстранява и етеровият слой се измива чрез разклащане с четири последователни части вода от 100 ml.Бележка 2: За да се избегне образуването на емулсия, е съществено първите две измивания с вода да се извършват леко (10 превъртания). При третото измиване може да се разклаща силно за 30 секунди. Ако е образувана емулсия, тя може да бъде унищожена с добавянето на 5—10 ml етанол. Око се добавя етанол, е важно да се извършат две допълнителни енергични измивания с вода.5.2.3. Чистият нехидрализиран етеров слой се оставя да изтече през стъклена колона (3.5), съдържаща 30 g дихидратиран натриев сулфат (4.5). Етерът се събира в 250 ml колба (3.3). Добавя се гранула против кипене с енергично отделяне на пара и се изпарява близо до изсушаване във водна баня или кожух, като се събират остатъците от разтвора.Бележка 3: Ако екстрактите от пробата са отнети, за да се завърши сушенето при прекалено висока температура, може да възникне загуба на стерол.5.3. Приготвяне на триметил силил етери5.3.1. Етеровият разтвор, оставащ в колбата се поставя в 2 ml реактивен флакон (3.7) заедно с 2 ml диетилов етер и етерът се отстранява чрез използване на струя азот. Колбата се измива с две допълнителни части от 2 ml диетилов етер, който се поставя във флакона, и етерът се отстранява всеки път с азот.5.3.2. Пробата се силилира чрез добавянето на 1 ml TRI-SIL (4.6). Флаконът се затваря и се разклаща силно, за да се разтвори. Ако разтварянето не е завършило, се подгрява при 65—70 °C. Оставя се да престои най-малко пет минути преди инжектирането в газовата хроматография. Стандартите се силилират по същия начин като пробите. Тестовият разтвор за проверка на разтварянето (4.10) се силилира по същия начин като пробите.Бележка 4: Силилирането трябва да се извършва в безводна среда. Непълното силилиране на бетулин се индикира с втори пик, близък до този на бетулина.Присъствието на етанол на етапа на силилиране влияе на силилирането. Това може да е резултат от неадекватното измиване на етапа на извличането. Ако този проблем продължава, на етапа на екстракцията може да бъде въведено пето измиване, като се разклаща силно за 30 секунди.5.4. Газов хроматографски анализ5.4.1. Избор на оперативни условияГазовият хромотограф се настройва съобразно инструкциите на производителя.Указанията за условията на работа са, както следва:- температура на колоната: 265 °C- температура на инжектора: 265 °C- температура на детектора: 300 °C- скорост на струята на носещия газ: 0,6 ml/min- водородно налягане: 84 kPa- налягане на въздуха: 155 kPa- съотношение на разделянето на пробата: от 10:1 до 50:1; съотношението на разделяне трябва да бъде оптимизирано съобразно инструкциите на производителя и линеарността на отговора на детектора и след това да бъде валидирано за обхвата на концентрацията, който е от интерес.Бележка 5: Изключително важно е тръбичката за инжектиране да се почиства регулярно.- количество на инжектираната субстанция: 1 µl на разтвор TMSE.Преди започването на какъвто и да е анализ, системата се оставя да се уравновеси и да даде удовлетворителен постоянен сигнал-отговор.Тези условия трябва да варират в светлината на характеристиките на колоната и газовия хроматограф, така че да се получат хроматограми, които изпълняват следните условия:- пикът ситостерин трябва да бъде адекватно разтворен от ланостерина. Фигура 1 показва типична хроматограма, която би следвало да бъде получена от силилирания тестови разтвор за проверка (4.10),- относителните времена на запазване на следните стероли би следвало да бъдат приблизително:холестерол: 1.0стигмастерол: 1.3ситостерин: 1.5бетулин: 2.5- времето за запазване за бетулин би следвало да бъде приблизително 24 минути.5.4.2. Аналитична процедураИнжектира се 1 µl силилиран стандартен разтвор (стигмастерол или ситостерин) и се настройват параметрите за калибриране на интегратора.Инжектира се допълнително 1 µl силилиран стандартен разтвор, за да се определят коефициентите на влияние по отношение на бетулина.Инжектира се 1 µl силилиран разтвор на пробата и се измерват пиковите повърхности. Всяка хроматографска серия трябва да бъде придружавана с инжектиране на стандарти.Като указание, във всяка серия би следвало да бъдат включени шест инжектирания на проба.Бележка 6: Интегрирането на стигмастероловия пик би следвало да включва всички образования на неясни пикове, както са определени в точки 1, 2 и 3 във фигура 2б.Интегрирането на ситостериновия пик би следвало да включва повърхността на пика на 22-дихидро-β-ситостерин (стигмастанол), който се отмива веднага след ситостерина (виж фигура 3б), когато се оценява общият ситостерин.6. ИЗЧИСЛЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ6.1. Пиковата повърхност на стерол и бетулин се определя в двата стандарта за партида и се изчислява R1:R=Определя се пиковата повърхност на стерол (стигмастерол и ситостерин) и на бетулин в пробата и се изчислява R2:R=W1 = стеролно съдържание на стандарта (mg), което се съдържа в 1 ml стандартен разтвор (4.8.1 или 4.9.1)W2 = тегло на пробата (g) (5.2.1)P = степен на чистота на стандартния стерол (4.8 или 4.9)Стеролово съдържание на пробата=RR×WW× P × 107. ТОЧНОСТ НА МЕТОДА7.1. Масло7.1.1. Повторяемост7.1.1.1. СтигмастеролРазликата между резултатите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор и чрез използване на същата апаратура върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишава 19,3 mg/kg.7.1.1.2. СитостеринРазликата между резултатите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор и чрез използване на същата апаратура върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишава 23,0 mg/kg.7.1.2. Възпроизвеждане7.1.2.1. СтигмастеролРазликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и чрез използване на различни апаратури върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишава 31,9 mg/kg.7.1.2.2. СитостеринРазликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и чрез използване на различни апаратури върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишава 8,7 % от средната стойност на определянето.7.1.3. Източник на данните на прецизносттаДанните на прецизността бяха определени от експеримент, проведен през 1992 г. и включващ осем лаборатории и шест проби (три празни дублирания) за стигмастерол в масло и шест проби (три празни дублирания) за ситостерин.7.2. Концентрирано масло7.2.1. Повторяемост7.2.1.1. СтигмастеролРазликата между резултатите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор и чрез използване на същата апаратура върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишава 10,2 mg/kg7.2.1.2. СитостеринРазликата между резултатите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор и чрез използване на същата апаратура върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишава 3,6 % от средната стойност на определянето.7.2.2. Възпроизвеждане7.2.2.1. СтигмастеролРазликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и чрез използване на различни апаратури върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишават 25,3 mg/kg7.2.2.2. СитостеринРазликата между резултатите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и чрез използване на различни апаратури върху идентичен тестови материал, не трябва да надвишава 8,9 % от средната стойност на определянето.7.2.3. Източник на данните на прецизносттаДанните на прецизността бяха определени от експеримент, проведен през 1991 г. и включващ девет лаборатории и шест проби (три празни дублирания) за стигмастерол в масло и шест проби (три празни дублирания) за ситостерин.8. ГРАНИЦИ НА ТОЛЕРАНТНОСТ8.1. От индикаторния продукт трябва да бъдат взети проби за проверка на коректността на индикирането на продукта.8.2. Масло8.2.1. Стигмастерол8.2.1.1. Количеството за смесване за стигмастерол е 150 g от най-малко 95 % чист стигмастерол за тон масло, т.е. 142,5 mg/kg или 170 g от най-малко 85 % чист стигмастерол за тон масло, т.e. 144,5 mg/kg.8.2.1.2. Получените от анализа на продукта резултати за трите проби се използват за проверка на размера и хомогенността на смесването на индикатора, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните граници (критична граница на вероятност от 95 % (DCr95) е взета предвид):- 116,0 mg/kg (95 % от минималното количество за смесване за 95 % чист стигмастерол),- 118,0 mg/kg (95 % от минималното количество за смесване за 85 % чист стигмастерол),- 81,0 mg/kg (70 % от минималното количество за смесване за 95 % чист стигмастерол),- 82,0 mg/kg (70 % oт минималното количество за смесване за 85 % чист стигмастерол).Използва се концентрацията на индикатора на пробата с най-ниския резултат, който се получава чрез изпаряване между 116,0 mg/kg и 81,0 mg/kg или 118,0 mg/kg и 82,0 mg/kg.8.2.2. Ситостерин8.2.2.1. Количеството за смесване за ситостерин е 600 g от най-малко 90 % хомогенен ситостерин за тон масло, т.e. 540 mg/kg.8.2.2.2. Получените от анализа на продукта резултати за трите проби се използват за проверка на размера и хомогенността на смесването на индикатора, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните граници (критична граница на вероятност от 95 % (DCr95) е взета предвид):- 486,0 mg/kg (95 % от минималното количество за смесване за 90 % чист ситостерин),- 358,0 mg/kg (70 % от минималното количество за смесване за 90 % чист ситостерин).Използва се концентрацията на индикатора на пробата с най-ниския резултат, който се получава чрез изпаряване между 486,0 mg/kg и 358,0 mg/kg.8.3. Концентрирано масло8.3.1. Стигмастерол8.3.1.1. Количеството за смесване за стигмастерол е 150 g от най-малко 95 % чист стигмастерол за тон концентрирано масло, т.e. 142,5 mg/kg или 170 g от най-малко 85 % чист стигмастерол за тон концентрирано масло, т.e. 144,5 mg/kg.8.3.1.2. Получените от анализа на продукта резултати за трите проби се използват за проверка на размера и хомогенността на смесването на индикатора, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните граници (критична граница на вероятност от 95 % (DCr95) е взета предвид):- 120,0 mg/kg (95 % от минималното количество за смесване за 95 % чист стигмастерол),- 122,0 mg/kg (95 % от минималното количество за смесване за 85 % чист стигмастерол),- 84,0 mg/kg (70 % от минималното количество за смесване за 95 % чист стигмастерол),- 86,0 mg/kg 70 % от минималното количество за смесване за 85 % чист стигмастерол).Използва се концентрацията на индикатора на пробата с най-ниския резултат, който се получава чрез изпаряване между 120,0 mg/kg и 84,0 mg/kg или 122,0 mg/kg и 86,0 mg/kg.8.3.2. Ситостерин8.3.2.1. Количеството за смесване за ситостерин е 600 g от най-малко 90 % чист ситостерин за тон концентрирано масло, т.e. 540 mg/kg.8.3.2.2. Получените от анализа на продукта резултати за трите проби се използват за проверка на размера и хомогенността на смесването на индикатора, като най-ниският от тези резултати се сравнява със следните граници (критична граница на вероятност от 95 % (DCr95) е взета предвид):- 486,0 mg/kg (95 % от минималното количество за смесване за 90 % чист ситостерин),- 358,0 mg/kg (70 % от минималното количество за смесване за 90 % чист ситостерин).Използва се концентрацията на индикатора на пробата с най-ниския резултат, който се получава чрез изпаряване между между 486,0 mg/kg и 358,0 mg/kg.+++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF +++++--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ XV(член 10)РЕФЕРЕНТЕН МЕТОД ЗА ОТКРИВАНЕ НА КРАВЕ МЛЯКО И КАЗЕИНАТИ В СИРЕНА ОТ ОВЧЕ МЛЯКО, КОЗЕ МЛЯКО ИЛИ БИВОЛСКО МЛЯКО ИЛИ СМЕСИ ОТ ОВЧЕ, КОЗЕ И БИВОЛСКО МЛЯКО1. ОбхватОткриване на краве мляко и казеинати в сирена, произведени от овче мляко, козе мляко, биволско мляко или смеси от овче, козе и биволско мляко чрез изоелектрическо фокусиране на γ-казеини след плазминолиза.2. Приложно полеМетодът е подходящ за чувствително и специфично откриване на натурално и топлинно обработвано краве мляко и казеинати в пресни и узрели сирена, произведени от овче мляко, козе мляко, биволско мляко или смеси от овче, козе и биволско мляко. Той не е подходящ за откриването на подправяне на мляко и сирене чрез топлинно обработени концентрати на протеин в краве суроватка.3. Принцип на метода3.1. Изолиране на казеини от сирене и референтни проби.3.2. Разтваряне на изолираните казеини и плазмено отделяне (EC.3.4.21.7).3.3. Изоелектрическо фокусиране на обработени с плазма казеини в присъствието на урея и оцветяване на протеини.3.4. Оценка на оцветените γ3 и γ2-ивици на казеин (доказателство за краве мляко) чрез сравняване на получените от пробата ивици с тези, които са получени в същия гел от референтните проби, съдържащи 0 % и 1 % краве мляко.4. РеагентиАко не е посочено друго, трябва да бъдат използвани химикали с аналитично качество. Водата трябва да е двойно дестилирана или да е с еквивалента степен на чистота.Бележка: Следните данни се прилагат за лаборатория, която е подготвила полиакриламидни гелове, съдържащи урея, с размери 265 × 125 × 0,25 mm. Когато се използват други размери и типове гел, би могло да е необходимо адаптирането на условията за отделяне.Изоелектрическо фокусиране4.1. Реагенти за добиването на уреята, съдържащи полиакриламидни гелове4.1.1. Разтваряне на основен гелРазтваряне на:4,85 g акриламид0,15 g N, N'-метилетилен-би-акриламид (BIS)48,05 g урея15,00 g глицерин (87 % w/w),във вода, като се допълва до 100 ml и се съхранява в бутилка от кафяво стъкло в хладилник.Бележка: Вместо цитираните определени дози невротоксични акриламиди може да се използва обичайният готов разтвор акриламид/BIS. Когато такъв разтвор съдържа 30 % w/v акриламид и 0,8 % w/v BIS, вместо определените дози за сместа трябва да бъде използван обем от 16,2 ml. Годността на основния разтвор е максимум 10 дни; ако неговата проводимост е повече от 5 µS, той се дейонизира чрез разклащане с 2 g Амберлит MB-3 за 30 минути, след това се филтрира през мембрана от 0,45 µm.4.1.2. Разтвор на гел.Приготвя се разтвор на гел чрез смесването на добавки и амфолити с основния разтвор на гел (виж 4.1.l).9,0 ml основен разтвор24 mg β-аланин500 µl амфолит pH 3,5—9,5 [1]250 µl амфолит pH 5—7 [1]250 µl амфолит pH 6—8 [1]Разтворът на гел се смесва и се подлага на суха дестилация за две до три минути в ултразвукова баня или във вакуум.Бележка: Разтворът на гел се приготвя непосредствено преди изливането му (виж 6.2).4.1.3. Катализаторни разтвори4.1.3.1. N, N, N′ N′ — тетраметилетиленедиамин (Temed).4.1.3.2. 40 % w/v амониев персулфат (PER):800 mg PER се разтварят във вода и се долива до 2 mlБележка: Винаги се използва прясно приготвен разтвор PER.4.2. Контактна течностКеросин или течен парафин4.3. Aноден разтвор5,77 g фосфорна киселина (85 % w/w) се разтваря във вода и се разрежда до 100 ml.4.4. Катоден разтвор2,00 g натриев хидроксид се разтваря във вода и се разрежда до 100 ml с вода.Подготовка на проби4.5. Реагенти за изолиране на протеин4.5.1. Разредена оцетна киселина (25,0 ml кристализирала оцетна киселина с добавена вода до 100 ml)4.5.2. Дихлорметан4.5.3. Ацетон4.6. Неутрализатор за разтваряне на протеинРазтварят се:5,75 g глицерин (87 % w/w),24,03 g урея,250 mg дитиотрейтол,във вода и се добавя до 50 mlБележка: Съхранява се в хладилник; максимална годност- една седмица.4.7. Реагенти за плазмено отделяне на казеини4.7.1. Неутрализатор- амониев карбонат0,2 mol/l разтвор на амониев бикарбонат (1,58 g/100 ml вода), съдържащ 0,05 mol/l етилен-диамин-тетраацетна киселина (EDTA, 1,46 g/100 ml), се титрува с 0,2 mol/l разтвор на амониев кaрбонат (1,92 g/100 ml вода), съдържащ 0,05 mol/l EDTA, до ph 8.4.7.2. Плазма на краве мляко (EC. 3.4.21.7), с дейност най-малко 5 U/ml.4.7.3. ε-разтвор на амино-капронна киселина за активиране на ензими2,624 g ε-амино-капронна киселина (6 амино-n-циклохексанонова киселина) се разтварят в 100 ml 40 % (v/v) етанол.4.8. Стандартни проби4.8.1. Сертифицирани референтни стандартни проби на смес от засирени овче и козе обезмаслено мляко, съдържащи 0 % и 1 % краве мляко, са налични в Института на Комисията за референтни материали и метрология, B-2440 Geel, Белгия.4.8.2. Подготовка на вътрешнолабораторни стандартни проби на биволско засирено мляко, съдържащо 0 % и 1 % краве мляко:Обезмасленото мляко се приготвя чрез центрофугиране на биволско или краве сурово непакетирано мляко при 37 °C за 2500 g за 20 минути. След бързо охлаждане на съда със съдържанието от 6 до 8 °C, горният слой се отстранява напълно. За подготовката на 1 % -на стандартна проба, към 495 ml биволско обезмаслено мляко се добавя 5,00 ml краве обезмаслено мляко в 1 л. бехерова чаша, адаптира се pH до 6,4 чрез прибавяне на разредена млечна киселина (10 % w/v). Температурата се регулира на 35 °C и се прибавя 100 µl телно сирище (сирищна дейност 1: 10000, c. 3000 U/ml), разклаща се за 1 минута и бехеровата чаша се оставя покрита с алуминиево фолио при 35 °C за един час, за да може да се образува съсирване. След образуването на съсирването, цялото сирищно мляко се суши чрез сублимиране без предварително хомогенизиране или отцеждане на суроватката. След сушенето чрез сублимиране, то е основа за добиването на хомогенен прах. За подготовката на 0 %-на стандартна проба се извършва същата процедура чрез използване на натурално биволско обезмаслено мляко. Стандартните проби трябва да бъдат съхранявани при –20 °C.Бележка: Препоръчително е да се проверява чистотата на биволското мляко чрез изоелектрическо фокусиране на третираните с плазма казеини, преди подготовката на стандартните проби.Реагенти за оцветяване на протеин4.8. Фиксатори150 g трихлор оцетна киселина се разтварят във вода и се добавя до 1000 ml.4.9. Обезцветяващ разтвор500 ml метанол и 200 ml кристализирала оцетна киселина се разреждат до 2000 ml с дестилирана вода.Бележка: Всеки ден се приготвя пресен обезцветяващ разтвор; той може да бъде приготвен чрез смесване на равни обеми основни разтвори на 50 % (v/v) метанол и 20 % (v/v) кристализирала оцетна киселина.4.11. Оцветяващи разтвори4.11.1. Оцветяващ разтвор (основен разтвор 1)3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) се разтваря в 1000 ml 90 % (v/v) метанол чрез използване на магнитна бъркалка (приблизително 45 минути), филтрира се чрез два прегънати филтъра със средна скорост.4.11.2. Оцветяващ разтвор (основен разтвор 2)5,0 g меден сулфатен пентахидрат се разтваря в 1000 ml 20 % (v/v) оцетна киселина.4.11.3. Оцветяващ разтвор (работен разтвор)Смесват се заедно 125 ml от всеки от основните разтвори (4.11.1, 4.11.2) непосредствено преди оцветяването.Бележка: Оцветяващият разтвор би следвало да бъде приготвен в деня, в който се използва.5. Оборудване5.1. Огледални стъкла (265 ×125 × 4 mm); гумена ролка (ширина 15 cm); нивелирана маса.5.2. Носещо фолио на гел (265 × 125 mm).5.3. Покривно фолио (280 × 125 mm). Двете дължини се залепват с импрегнирана ивица (280 × 6 × 0,25 mm) (виж фигура 1).5.4. Камера за електрофокусиране с охлаждаща плоча (напр. 265 × 125 mm.) и подходящо електрическо захранване (≥ 2,5 kV) или автоматично устройство за електрофореза.5.5. Криостат за циркулация, термостатно контролиран при 12 ± 0,5 °C.5.6. Центрофуга, приспособена за 3000 g.5.7. Електродни ленти (≥ 265 mm. дълги).5.8. Пластмасови флакони за капене на анодните и катодните разтвори.5.9. Апликатори за проби (10 × 5 mm., вискозна филтърна хартия или филтърна хартия с ниска абсорбция на протеин).5.10. Ножове от неръждаема стомана, скалпели и пинсети.5.11. Чаши от неръждаема стомана или от стъкло за оцветяване и обезцветяване (напр. 280 ×150 mm. корита за инструменти).5.12. Приспособим хомогенизатор с мотовилка (с диаметър на ос от 10 mm.), при обхват от 8000 до 20000.5.13. Магнитна бъркалка.5.14. Ултразвукова баня.5.15. Фолиен оксижен.5.16. 25 µl микро-капкомери.5.17. Вакуумен концентратор или сушилня чрез сублимиране.5.18. Термостатично контролирана водна баня, регулируема за 35 и 40 ± 1 °C с шейкър.5.19. Денсиметър, четящ при λ = 634 nm.6. Процедура6.1. Подготовка на проби6.1.1. Изолиране на казеиниМасата, еквивалентна на 5 g сухо вещество сирене, или референтните стандартни проби се претеглят в 100 ml цетрофужен съд, прибавя се 60 g дестилирана вода и се хомогенизира с хомогенизатор с мотовилка (от 8000 до 10000 rpm). Регулира се до pH 4,6 с разредена оцетна киселина (4.5.1) и се центрофугира (5 минути, 3000 г.). Мазнината и суроватката се отделят, утайката се хомогенизира при 20000 rpm в 40 ml дестилирана вода, регулирана до pH 4,5 с разредена оцетна киселина (4.5.1), добавя се 20 ml дихлорметан (4.5.2), отново се хомогенизира и се центрофугира (5 минути, 3000 g). Казеиновият слой, който се намира между водната и органичната фаза (виж фигура 2) се отстранява със шпатула и двете фази се отделят. Казеинът се хомогенизира отново в 40 ml дестилирана вода (виж по-горе) и 20 ml дихлорметан (4.5.2) и се центрофугира. Тази процедура се повтаря, докато двете фази на екстракцията останат безцветни (от два до три пъти). Утайката от протеин се хомогенизира с 50 ml ацетон (4.5.3) и се филтрира чрез прегъната филтърна хартия със средна скорост. Утайката върху филтъра се измива с две отделни части от 25 ml ацетон и се оставя да се изсуши на въздух или чрез струя азот, след което фино се стрива на прах в хаван.Бележка: Сухият изолиран казеин би следвало да бъде съхраняван при –20 °C.6.1.2. Плазмено отделяне на β-казеини за интензифициране на γ-казеини25 mg изолирани казеини (6.1.1) се разпръскват в 0,5 ml неутрализатор на амониев карбонат (4.7.1) и се хомогенизират за 20 минути чрез напр. използване на ултразвуково третиране. Подгрява се до 40 °C и се добавя 10 µl плазма (4.7.2), смесва се и се инкубира за един час при 40 °C, с непрекъснато разклащане. За да се активизира ензимът, се добавя 20 µl разтвор от ε-амино-капронна киселина (4.7.3), след това се добавя 200 mg твърда урея и 2 mg дитиотрейтол.Бележка: За да се получи по-голяма симетрия на фокусираните казеинови ивици, е препоръчително разтворът да се изсуши чрез сублимиране след добавянето на ε-аминокапронна киселина, като след това утайките се разредят в 0,5 ml неутрализатор за обезцветяване на протеин (4.6).6.2. Приготвяне на урея, съдържаща полиакриламидни геловеС помощта на няколко капки вода, носещото фолио на гела (5.2) се навива на огледално стъкло (5.1), като излизащата навън вода се отстранява с хартиена кърпа или памук. По същия начин, покривното фолио (5.3) се навива с ограничителите (0,25 mm) върху друго огледално стъкло. Стъклото се поставя хоризонтално върху нивелирана маса.Към приготвения и с отстранен въздух разтвор от гел (4.1.2) се добавя 10 µl Temed (4.1.3.1 ), разклаща се и се добавя 10 µl PER-разтвор (4.1.3.2), внимателно се смесва и веднага се излива равномерно върху центъра на покривното фолио. Единият край на носещото фолио на гела (с фолиото надолу) се поставя върху стъклото с покривното фолио и се смъква бавно, така че филмът от гел да се разпредели между фолията, без да се образуват мехурчета (фигура 3). Носещото стъкло на гела се смъква внимателно чрез използването на тънка шпатула и върху върха му се поставят още три огледални стъкла за тежест. След завършването на полимеризацията (около 60 минути), полимеризираният гел върху носещото фолио на гела се отстранява заедно с покривното фолио чрез наклоняване на огледалните стъкла. Обратната страна на носещото фолио се почиства внимателно, за да се отстрани утайката и уреята. "Гел-сандвичът" се затваря във фолиев съд и се съхранява в хладилник (максимум шест седмици).Бележка: Покривното фолио с ограничителите не може да бъде използвано повторно. Полиакриламидният гел може да бъде разпределен на по-малки части, което е препоръчително, когато има няколко проби или ако се използва автоматично устройство за електрофореза (два гела, с размер 4,5 × 5 см).6.3. Изоелектрическо фокусиранеОхлаждащият термостат се настройва на 12 °C. Обратната страна на фолиото на съда с гел се избърсва с керосин, след това в центъра на охлаждащия блок се капват няколко капки керосин (4.2). След това "гел-сандвичът" се притиска надолу към страната на съда, като се внимава да не се образуват мехурчета. Излишният керосин се избърсва и покривното фолио се отстранява. Електродните ивици се напояват с електродните разтвори (4.3, 4.4), изрязват се по дължината на гела и се поставят на предвидените места (разстояние на електродите от 9,5 cm).Условия за изоелектрическо фокусиране:6.3.1. Размер на гел — 265 × 125 × 0,25 mm.Стъпка | Време (min) | Волтаж (V) | Ток (mA) | Мощност (W) | Волтчаса (Vh) |1.Предфокусиране | 30 | Максимум 2500 | Максимум 15 | Константа 4 | Ок. 300 |2.Фокусиране на проби [2] | 60 | Максимум 2500 | Максимум 15 | Константа 4 | Ок. 1000 |3.Окончателно фокусиране | 60 | Максимум 2500 | Максимум 5 | Максимум 20 | Ок. 3000 |40 | Максимум 2500 | Максимум 6 | Максимум 20 | Ок. 3000 |30 | Максимум 2500 | Максимум 7 | Максимум 25 | Ок. 3000 |Бележка: Ако се промени плътността и ширината на геловете, стойностите за електрически ток и мощност следва да се адаптират по подходящ начин (напр. удвояване на стойностите за електрически ток и за мощност, ако се използва гел с размери 265 × 125 × 0,5 mm).6.3.2. Примери за програма за волтаж за автоматично устройство за електрофореза (2 гела с размери 5,0 × 4,5 cm); електродите без ивици се прилагат директно върху гела.Стъпка | волтаж | ток | мощност | темп. | волт-часа |1.Пред-фокусиране | 1000 V | 10,0 mA | 3,5 W | 8 °C | 85 Vh |2.Фокусиране на проби | 250 V | 5,0 mA | 2,5 W | 8 °C | 30 Vh |3.Фокусиране | 1200 V | 10,0 mA | 3,5 W | 8 °C | 80 Vh |4.Фокусиране | 1500 V | 5,0 mA | 7,0 W | 8 °C | 570 Vh |При стъпка 2, апликаторът на пробата се поставя на 0 Vh.При стъпка 2, апликаторът на пробата се отстранява на 30 Vh.6.4. Оцветяване на протеин6.4.1. Фиксиране на протеинЕлектродните ивици се отстраняват непосредствено след изключване на захранването и гелът веднага се поставя в съд за оцветяване/премахване на цвета, пълен с 200 ml фиксатор (4.9); оставя се за 15 минути, като непрекъснато се разклаща.6.4.2. Измиване и оцветяване на съда с гелФиксаторът се отцежда внимателно и съдът с гел се измива два пъти за 30 секунди, всеки път със 100 ml обезцветяващ разтвор (4.10). Обезцветяващият разтвор се излива и съдът се пълни с 250 ml оцветяващ разтвор (4.11.3); оставя се да се оцвети за 45 минути с леко разклащане.6.4.3. Обезцветяване на съда с гелОцветяващият разтвор се излива, съдът с гел се измива два пъти, като всеки път се използва 100 ml обезцветяващ разтвор (4.10), след това се разклаща с 200 ml обезцветяващ разтвор за 15 минути и стъпката за обезцветяване се повтаря най-малко два или три пъти, докато основата стане чиста и безцветна. След това съдът с гел се изплаква с дестилирана вода (2 × 2 минути) и се изсушава на въздуха (от 2 до 3 часа) или със сешоар (от 10 до 15 минути).Бележка 1: Фиксирането, измиването, оцветяването и обезцветяването се извършва при 20 °C. Не се използват високи температури.Бележка 2: Ако се предпочита по-изразено сребърно оцветяване (напр. кит за сребърно оцветяване, протеин, Pharmacia Biotech, код № 17-1150-01), пробите от казеин, третирани с плазма, следва да бъдат разредени до 5 mg/ml.7. ОценкаОценката се извършва чрез сравняване на ивиците протеин на непозната проба с референтни проби върху същия гел. Откриването на краве мляко в сирена от овче мляко, козе мляко и биволско мляко и смеси от овче, козе и биволско мляко се извършва чрез γ3-and γ2-казеини, чийто обхват на изоелектрически точки е между pH 6,5 и pH 7,5 (фигури 4 a, б, фигура 5). Границата на откриване е по-ниска от 0,5 %.7.1. Визуална оценкаЗа визуална оценка на количеството краве мляко се препоръчва да се адаптират концентрациите на пробите и стандартите за получаване на същото ниво на интензивност на овчи, кози и/или биволски γ2-и γ3-казеини (виж "γ2 E,G,B" и "γ3 E,G,B" във фигури 4 a, б и фигура 5). След това, количеството на кравето мляко (по-малко от, равно или по-голямо от 1 %) в непознатата проба може да бъде оценявано директно чрез сравняване интензитета на краве γ3-и γ2-казеини (виж "γ3 C" и "γ2 C" във фигури 4 a, б и фигура 5) с тези на 0 % и 1 % референтни стандарти (овца, коза) или вътрешнолабораторни стандарти (бивол).7.2. Денсиметрична оценкаАко е налице, за определянето на съотношението на най-високите повърхности на краве спрямо овчи, кози и/или биволски γ2-и γ3-казеини (виж фигура 5) се използва денсиметър (5.19). Тази стойност се сравнява със съотношението на най-високите повърхности на γ2-и γ3-казеини от 1 % референтен стандарт (овца, коза) или вътрешнолабораторен стандарт (бивол), анализирани върху същия гел.Бележка: Методът функционира задоволително, ако има ясен положителен сигнал за двата краве γ2-и γ3-казеина в 1 % референтен стандарт, но не и в 0 % референтен стандарт. Ако няма, процедурата се оптимизира, като прецизно се съблюдават детайлите на метода.Пробата се оценява като положителна, ако двата краве γ2-и γ3-казеина или съотношенията на най-високите повърхности са равни или по-големи от нивото на 1 % референтен стандарт.8. Позовавания1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Използване на плазмата за увеличаване на чувствителността на откриване на краве мляко в овче и/или козе сирене с изоелектрическо фокусиране с гел на γ2-казеини. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: Контролен метод за откриване на краве мляко в овче и биволско сирене чрез използване на имуноблотинг. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).3. Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Чувствително откриване на краве мляко в овче и козе мляко и сирене чрез амфолит-носител и амфолит-носител/неутрализиран pH градиент — изоелектрическо фокусиране на γ-казеини чрез използване на плазма като индикаторен фермент. В: форум по електрофорезата 89 (B. J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, München (1989).4. Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schafand Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).5. Radola B.J.: Изо-електрическо фокусиране със свръх тънък слой в 50-100 µm полиакриламидни гелове върху силилизирани стъклени съдове или полиестерни филми. Електрофореза 1, 43-56 (1980).+++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF +++++[1] Продуктите Ampholine® pH 3,5—9,5 (Pharmacia), както и Resolyte® pH 5—7, съответно pH 6—8 (BDH, Merck), се оказват особено подходящи за получаване на исканото отделяне на γ-казеини.[2] Прилагане на проби: След пред-фокусирането (стъпка 1), 18 µl от всеки от разтворите от пробата се дозират с капкомер върху апликаторите на пробата (10 × 5 mm.), поставят се върху гела на разстояние 1 mm. един от друг и на разстояние 5 mm. от анода и се притискат леко. Фокусирането се извършва, като се използват горните условия и след 60 минути фокусиране на пробата апликаторите внимателно се отстранят.--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ XVI(член 11)РЕФЕРЕНТЕН МЕТОД ЗА ОТКРИВАНЕ НА ФОРМИ НА КОЛИ БАКТЕРИИ В МАСЛО, ОБЕЗМАСЛЕНО МЛЯКО НА ПРАХ, КАЗЕИН И КАЗЕИНАТИЗа тестване наличието на форми на коли бактерии в масло, в средата на пробата се инокулират проби от 1 g масло.Когато за наличието на форми на коли бактерии се тества обезмаслено мляко на прах или казеин/казеинати, в средата на пробата се инокулират 0,1 g проби.IDF стандарт 73A: 1985. Метод B се прилага със следните модификации:1) приготвянето на пробите е съобразно IDF стандарт 122B:1992. За кисел казеин може да бъде използвана алтернативно процедурата за подготовка на проби, описана в IDF стандарт 73A:1985.2) Инкубират се и се оценяват само реагентни стъкла, които са инокулирани с 1 g проби (масло), или съответно 0,1 g проби (обезмаслено мляко на прах, казеин/казеинати). Не се извършва разреждане до десетичния знак.Оценка на резултатитеТри отрицателни резултата: | Изпълнено изискване |Три или три положителни резултата: | Неизпълнено изискване |Два отрицателни резултата: | Би следвало да бъдат анализирани допълнително две проби, като се претегля 1 g (масло) и 0,1 g (обезмаслено мляко на прах, казеин/казеинати). Ако последните два резултата са отрицателни, изискването е изпълнено; в противен случай, изискването не е изпълнено. |Бележка:Съдържание на форми на коли бактерии: 1/10 g за масло; 1/g за обезмаслено мляко на прах, казеин/казеинати.Резултатите, които показват, че изискването е изпълнено, са получени с вероятност от 93 %.Съдържание на форми на коли бактерии: 1/g за масло; 1/0,1 g за обезмаслено мляко на прах или казеин/казеинати средно.Резултатите, които показват, че изискването не е изпълнено, са получени с вероятност от 91 %.(Предположение: разпространение на инфекция)--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ XVII(член 12)МЕТОД ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА ЛАКТОЗА В ПРОДУКТИ, КОИТО ПОПАДАТ В КОД ПО КН 2309 [1]ЧАСТ I1. Приложно полеМетодът би следвало да се прилага в случаите, в които съдържанието на лактоза надвишава 0,5 %.2. ПринципЗахарта се разтваря във вода. Дрождите (Saccharomyces cerevisiae) се оставят да подействат; това ще запази лактозата. Чрез Luff-Schoorl-метода се определя съдържанието на лактоза в този разтвор, след избистрянето и филтрирането.3. РеагентиНатриев тиосулфат 0,1 NИндикатор: разтвор на скорбяла. Добавя се смес от 5 g разтворима скорбяла (10 mg живачен йодид може да бъде добавен като консервиращ агент) и 30 ml вода към 1 литър кипяща вода; сместа се оставя да кипи три минути; оставя се да се охлади.Разтвор на калиев йодид AR при 30 % (w/v)Разтвор на сярна киселина 6 NLuff-Schoorl-реагент:a) 25 g меден II сулфат пентахидрат (CuSO45H2O), без съдържание на желязо, се разваря в 100 ml вода;б) 50 g монохидрат на лимонена киселина (C6H8O7H2O) се разтваря в 50 ml вода;в) 143,8 g безводен натриев карбонат (Na2CO2) се разтваря в около 300 ml гореща вода и се оставя да се охлади.б) се добавя към в), като се разклаща леко, след това се добавя (a). Допълва се до 1 литър, оставя се да престои през нощта и след това се филтрира. Проверява се нормалността на така получения реагент (Cu 0.1 N, Na2CO32 N). pH трябва да бъде приблизително 9,4.Carrez I-разтвор: 23,8 g Zn (C2H3O2).2H2O и 3 g кристализирала оцетна киселина се разтварят във вода е се долива до 100 ml.Carrez II-разтвор: 10,6 g de K4F2(CN)6.3H2O се разтваря във вода и се долива до 100 ml.Зрънца от пемза, третирани при кипенето със солна киселина, измити с вода и изсушени. Суспензия на Saccharomyces cerevisae: 25 g пресни дрожди в 100 ml вода (не се съхранява повече от една седмица в хладилник).4. Процедура1 g от пробата за анализ се претегля с точност до 1 mg; поставя се в измерителна колба от 100 ml. Добавя се от 25 до 30 ml вода. Колбата се поставя в кипяща водна баня за три минути, след което се охлажда приблизително при 35 °C.Добавят се 5 ml от суспензията на дрождите [2] и се разклаща. Измерителната колба със съдържанието се оставя във водна баня при температура от 38 до 40 °C за два часа.След ферментирането, колбата се охлажда до температура от приблизително 20 °C. Добавят се 2,5 ml Carrez I-разтвор и се разклаща за тридесет секунди; след това се добавят 2,5 ml Carrez II-разтвор и отново се разклаща за тридесет секунди. Допълва се до 100 ml с вода, смесва се и се филтрира. Капва се количество от филтрата, което е не повече от 25 ml и при възможност съдържа от 40 до 80 mg лактоза; ако е необходимо, се допълва до 25 ml с вода и Luff-Schoorl-метода се определя съдържанието на безводната лактоза.Само с дрожди се извършва пълен празен тест.ЧАСТ II1. Определяне на съдържанието на лактоза с Luff-Schoorl-методаКапват се 25 ml Luff-Schoorl-реагент и се поставят в Erlenmeyer-колба от 300 ml; добавя се 25 ml избистрен разтвор, претеглен с точност.Добавят се две зрънца пемза и се подгрява, като се разклаща с ръка над непокрит пламък от средна височина; течността се оставя да заври за приблизително две минути. Erlenmeyer-колбата се поставя веднага на метална цедка с азбестово сито, под която предварително е запален пламък. Регулира се така, че Erlenmeyer-колбата да се нагрява единствено в долната част; след това се свързва с кондензатор за отлив. От този момент се оставя да кипи точно за десет минути. Веднага се охлажда в студена вода и се тества приблизително за пет минути, както следва:Към течността се добавят 10 ml калиев йодид и веднага след това, но внимателно (тъй като може да възникне значително пенене), 25 ml сярна киселина 6 N.Тестът с натриев тиосулфат се извършва до появяването на матов жълт цвят, като в края на теста се добавя индикатор за скорбяла.Същият тест се извършва със смес от точно 25 ml реагент Luff-Schoorl и 25 ml вода, след добавянето на 10 ml калиев йодид и 25 ml сярна киселина 6 N, този път без кипене.Със следната таблица се определя количеството лактоза в mg, отговарящо на разликата между резултатите от двата теста (изразено в ml натриев тиосулфат 0,1 N):ТАБЛИЦАТаблица за 25 ml Luff-Schoorl-реагент(виж описанието в текста)1. 0,1 N натриев тиосулфат2. Лактоза C12H22O111 | 2 |ml | mg | разлика |1 | 3,6 | |3,7 |2 | 7,3 | |3,7 |3 | 11,0 | |3,7 |4 | 14,7 | |3,7 |5 | 18,4 | |3,7 |6 | 22,1 | |3,7 |7 | 25,8 | |3,7 |8 | 29,5 | |3,7 |9 | 33,2 | |3,8 |10 | 37,0 | |3,8 |11 | 40,8 | |3,8 |12 | 44,6 | |3,8 |13 | 48,4 | |3,8 |14 | 52,2 | |3,8 |15 | 56,0 | |3,9 |16 | 59,9 | |3,9 |17 | 63,8 | |3,9 |18 | 67,7 | |4,0 |19 | 71,7 | |4,0 |20 | 75,7 | |4,1 |21 | 79,8 | |4,1 |22 | 83,9 | |4,1 |23 | 88,0 | |[1] Регламент (ЕИО) № 222/88.[2] За продуктите, които съдържат повече от 40 % ферментационна захар, количеството на суспензията се увеличава.--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ XVIII(член 13)ОТКРИВАНЕ НА СИРИЩНА СУРОВАТКА В ОБЕЗМАСЛЕНО МЛЯКО НА ПРАХ ЗА ОБЩЕСТВЕНО СКЛАДИРАНЕ ЧРЕЗ ОПРЕДЕЛЯНЕТО НА ГЛИКОМАКРОПЕПТИДИ ЧРЕЗ ВИСОКООПТИМАЛНА ТЕЧНА ХРОМАТОГРАФИЯ (HPLC)1. Обхват и приложно полеТози метод позволява откриването на сирищна суроватка в обезмаслено мляко на прах, предназначено за обществено складиране, чрез определянето на гликомакропептиди.2. ПозоваванеМеждународен стандарт ISO 707 — Мляко и млечни продукти — методи за вземане на проби в съответствие с указанията, съдържащи се в приложение I(2)(в), последен параграф.3. ДефиницияСъдържание на гликомакропептиди в обезмаслено мляко напрах: съдържание на субстанции, определено от метода, изложен по-долу, и изразено като процент от масата.4. Принцип- Промяна на състава на обезмасленото мляко на прах, отстраняване на мазнините и протеините с трихлор-оцетна киселина, последвано от центрофугиране;- Определяне количеството гликомакропептиди (GMP) в супернатанта чрез високооптимална течна хроматография (HPLC);- Оценка на получения резултат за пробите чрез позоваване на стандартните проби, съдържащи обезмаслено мляко на прах с или без прибавяне на известен процент суроватка на прах.5. РеагентиВсички реагенти трябва да са с доказано аналитично качество. Използваната вода трябва да е дестилирана или с най-малко същата чистота.5.1. Разтвор на трихлор-оцетна киселина240 g трихлор-оцетна киселина (Cl3CCOOH) се разтварят във вода и се долива до 1000 ml5.2. Елюентен разтвор, pH 6,01,74 g Di-калиев фосфат (K2HPO4), 12,37 g Mono-калиев фосфат (KH2PO4) и 21,41 g натриев сулфат (Na2SO4) се разтварят в около 700 ml вода. Регулира се, ако е необходимо, до pH 6,0, като се използва разтвор на фосфорна киселина или калиев хидроксид.Долива се до 1000 ml с вода и се хомогенизира.Елюентният разтвор се филтрира, преди да се използва, чрез мембранен филтър с 0,45 µm диаметър на пората.5.3. Промиващ разтворителЕдин обем ацетонитрил (CH3CN) се смесва с девет обема вода. Преди да се използва, сместа се филтрира чрез мембранен филтър с 0,45 µm диаметър на пората.Бележка: Може да бъде използван всеки друг промиващ разтворител с бактерициден ефект, който не уврежда ефективността на разтварянето в колоната.5.4. Стандартни проби5.4.1. Обезмаслено мляко на прах, което изпълнява изискванията на това разтваряне (т.e. [0]).5.4.2. Същото обезмаслено мляко на прах, подправено с 5 % (m/m) сирищна суроватка на прах със стандартен състав (т.e. [5]).6. Апаратура6.1. Аналитична везна.6.2. Центрофуга, с капацитет за центрофугиране на 2200 g, снабдена със стопорни центрофужни туби с капацитет от около 25 ml.6.3. Механичен шейкър.6.4. Магнитна бъркалка.6.5. Стъклени фунии, с диаметър от около 7 сm.6.6. Филтърна хартия, средно филтриране, с диаметър около 12,5 сm.6.7. Оборудване за филтриране през стъкло с 0,45 µm диаметър на пората на мембранния филтър.6.8. Градуирани капкомери, с обем от 10 ml (ISO 648, клас A, или ISO/R 835).6.9. Термостатична водна баня, при 25 ± 0,5 °C.6.10. Оборудване за HPLC, състоящо се от:6.10.1. Помпа.6.10.2. Инжектор, ръчен или автоматичен, с капацитет от 15 до 30 µl.6.10.3. Две колони TSK 2000-SW в серии (дължина 30 cm, вътрешен диаметър 0,75 cm) или еквивалентни колони и пред-колона (3 см. × 0,3 см.), обвита с I 125 или материал с еквивалентна ефективност.6.10.4. Термостатична колонна пещ, при 35 ± 1 °C.6.10.5. UV детектор с променлива дължина на вълните, позволяващ измервания при 205 nm, с чувствителност от 0,008 A.6.10.6. Интегратор, с възможност за "valley-to-valley" интеграция.Бележка: Възможно е да се работи с колони, които се държат на стайна температура, но тяхната ефективност на разтваряне е малко по-ниска. В този случай, при една и съща аналитична серия температурата би следвало да варира с по-малко от ± 5 °C.7. Вземане на проби7.1. Международен стандарт ISO 707 — "Мляко и млечни продукти — методи на вземане на проби" в съответствие с указанията, съдържащи се в приложение I, част 2 буква в), последен параграф.7.2. Пробата се съхранява при условия, които изключват всякакво увреждане или промяна на състава.8. Процедура8.1. Подготовка на тестовата пробаМлякото на прах се прехвърля в съд, снабден с уплътнен капак.и имащ вместимост, която е около два пъти обема на праха. Съдът се затваря веднага. Млякото на прах се смесва добре чрез многократна инверсия на съда.8.2. Тестова доза2000 + 0,001 g от тестовата проба се измерват в центрофужна туба (6.2).8.3. Отстраняване на протеини8.3.1. Към тестовата доза се прибавят 20 g топла вода (50 °C). Прахът се разтваря чрез разклащане за пет минути при използването на механичен шейкър (6.3). Тубата се охлажда до 25 °C.8.3.2. 10,0 ml разтвор на трихлор-оцетна киселина (5.1) се добавят за две минути, като в същото време се бърка с помощта на магнитната бъркалка (6.4). Тубата се поставя във водна баня (6.9) и се оставя за 60 минути.8.3.3. Пробата се центрофугира при 2200 g (6.2) за 10 минути или се филтрира през хартия (6.6), като се отстраняват първите 5 ml oт филтрата.8.4. Хроматографско определяне8.4.1. От 15 до 30 µl точно измерен супернатант или филтрат (8.3.3) се инжектира в апарата HPLC (6.10), опериращ със струя от 1,0 ml елюентен разтвор (5.2) на минута.Бележки:1. По време на хроматографския анализ, елюентният разтвор (5.2) се съхранява при 85 °C, с оглед елюентът да се държи дегазиран и да се предотврати развитието на бактерии. Могат да бъдат използвани всякакви предварителни мерки, които имат подобен ефект.2. Колоните се изплакват с вода при всяко прекъсване. Елюентният разтвор (5.2) никога не се оставя в тях.Преди всяко прекъсване за повече от 24 часа колоните се изплакват свода, след това се измиват с разтвор (5.3) за поне три часа при струя от 0,2 ml за минута.8.4.2. Резултатите от хроматографския анализ на тестовата проба [E] се получават под формата на хроматограма, в която всеки пик е показан чрез времето му на запазване RT, както следва:Пик II: | вторият пик на хроматограмата с RT от около 12,5 минути. |Пик III: | третият пик на хроматограмата, съответстващ на GMP, с RT от 15,5 ± 1,0 минути. |Пик IV: | четвъртия пик на хроматограмата с RT от около 17,5 минути. |Качеството на колоните може да повлияе на времената на запазване на отделните пикове.Интеграторът (6.10.6) автоматично изчислява повърхността A на всеки пик:AII: | повърхност на пик II, |AIII: | повърхност на пик III, |AIV: | повърхност на пик IV. |Съществено е да се изследва появяването на всяка хроматограма преди количественото тълкуване, с оглед да се открият всякакви отклонения, които се дължат или на неправилното функциониране на апаратурата или на колоните, или на произхода и естеството на анализираната проба.Ако има съмнение, анализът се повтаря.8.5. Калибриране8.5.1. Процедурата, описана в точки 8.2—8.4.2, се прилага с точност за стандартните проби (5.4).Използват се прясно приготвени разтвори, тъй като GMP се унищожава в 8 %-на трихлор-оцетна- среда. Загубата се оценява на 0,2 % за час при 30 °C.8.5.2. Преди хроматографското определяне на пробите, колоните се подготвят чрез многократно инжектиране на стандартната проба (5.4.2) в разтвора (8.5.1), докато повърхността и времето на запазване на пика, съответстващ на GMP, станат постоянни.8.5.3. Определят се коефициентите на влияние R чрез инжектирането на същия обем филтрати (8.5.1), използвани за пробите.9. Изразяване на резултатите9.1. Метод на изчисляване и формула9.1.1. Изчисляване на коефициентите на влияние R:пик II: | RII = 100AII0 |пик IV: | RIV = 100AIV0 |където:RII и R0IV = коефициентите на влияние, съответно на пикове II и IV,A II [0] и AIV = повърхностите, съответно на пикове II и IV на стандартната проба [0], получена в 8.5.3.пик III: | RIII = WAIII5 - AIII0 |където:R III = коефициентът на влияние на пик III,АIII [0] и AIII [5] = повърхностите на пик III на стандартните проби [0] и [5], съответно получени в 8.5.3,W = количеството суроватка в стандартната проба [5], т.e. 5.9.1.2. Изчисляване на относителната повърхност на пиковете на пробата [E]:S= R× AS= R× AS= R× Aкъдето:SII [E], SIII [E], SIV [E] = относителните повърхности, съответно на пикове II, III и IV на пробата [E],A II [E], AIII [E], AIV [E] = повърхностите, съответно на пикове II, III и IV на пробата [E], получена в 4.2,R II, R III, R IV = коефициентите на влияние, изчислени в 9.1.1.9.1.3. Изчисляване на относителното време на запазване на пик III на проба [E]:RRT=където:RRTIII [E] = относителното време на запазване на пик III на проба [E],RT III [E] = относителното време на запазване на пик III на проба [E], получена в 8.4.2,RT III [5] = относителното време на запазване на пик III на контролната проба [5], получена в 8.5.3.9.1.4. Експериментите показаха, че има линейна връзка между относителното време на запазване на пик III, т.e. RRTIII [E] и процента на суроватка на прах, прибавена до 10 %:- RRTIII [E] е < 1,000, когато съдържанието на суроватка е> 5 %;- RRTIII [E] е ≥ 1,000, когато съдържанието на суроватка е ≤ 5 %.Допустимата несигурност за стойностите на RRTIII е ± 0,002.Обичайно, стойността на RRTIII [0] се отклонява малко от 1034. В зависимост от състоянието на колоните, стойността може да достигне 1000, но трябва винаги да бъде по-голяма.9.2. Изчисляване на процента на сирищна суроватка на прах в пробатаW = S-S– 0,9където:W = | процентът m/m на сирищна суроватка в пробата [E]; |S III [E ]= | относителната повърхност на пик III на тестовата проба [E], получена както в 9.1.2; |1,3 | представлява относителната средна повърхност на пик III, изразена в грамове сирищна суроватка за 100 g, определена в неподправено обезмаслено мляко на прах от различен произход. Тази цифра бе получена експериментално; |S III [0 ] | представлява относителната повърхност на пик III, която е равна на RIII × AIII [0]. Тези стойности са получени в 9.1.1 и съответно 8.5.3; |(S III [0 ] – 0,9) | представлява корекцията, която следва да бъде направена спрямо относителната средна повърхност 1,3, когато SIII [0] не е равно на 0,9. По пътя на експеримента, относителната средна повърхност на пик III на контролната проба [0] е 0,9. |9.3. Точност на процедурата9.3.1. ПовторяемостРазликата между резултатите от две отделни определяния, извършени едновременно или едно след друго от същия анализатор и при използване на същата апаратура върху идентичен тестов материал, не надвишава 0,2 % m/m.9.3.2. ВъзпроизвежданеРазликата между два отделни и независими резултата, получени в две различни лаборатории върху идентичен тестов материал, не надвишава 0,4 % m/m.9.4. Тълкуване9.4.1. 2,0 +SIII0 - 0,9където:2,0 | е максимално допустимата стойност за относителната повърхност на пик III, т.e. 1,3, като се вземе предвид несигурността, която се дължи на вариациите в състава на обезмасленото мляко на прах, както и сравнението на метода (9.3.2), |(SIII [0] – 0,9) | е корекцията, която следва да бъде направена, когато повърхността SIII [0] е различна от 0,9 (виж 9.2). |9.4.2. 2,0 +SIII0 - 0,9и относителната повърхност на пик II, SII [E], ≤ 160, съдържанието на сирищна суроватка се определя, както е посочено в точка 9.2.9.4.3. 2,0 +SIII0 – 0,9и ако относителната повърхност на пик II, SII [E], ≤ 160, се определя общото съдържание на протеин (P %); след това се изследват графики 1 и 2.9.4.3.1. Данните, получени след анализа на пробите на неподправено обезмаслено мляко на прах с високо общо съдържание на протеин, са събрани в графики 1 и 2.Непрекъснатата линия представлява линейна регресия, коефициентите на която са изчислени чрез метода на най-малките квадрати.Пунктираната права линия определя горната граница на сравнителната повърхност на пик III с вероятност, която не се надвишава в 90 % от случаите.Уравненията на пунктираните прави линии на графики 1 и 2 са:SIII = 0,376 P% – 10,7 | (графика 1), |SIII = 0,0123 SII [E] + 0,93 | (графика 2), |където:SIII | е относителната повърхност на пик III, изчислена съобразно общото съдържание на протеин или съобразно относителната повърхност на пик SIII [E], |P% | е общото тегловно съдържание протеин, изразено като процент, |SII [E] | е относителната повърхност на пробата, изчислена в точка 9.1.2. |Тези уравнения са еквивалентни по стойност на 1,3, упомената в точка 9.2.Разликата (T1 and T2) между относителната повърхност SIII [E] и относителната повърхност SIII се дава посредством следното:T= S–S– 0,9T= S–0,0123 S+ 0,93S– 0,9Ако T1 и/или T2 | са нула или по-малко, не може да бъде определено присъствието на сирищна суроватка. |Ако T1 и T2 | са по-големи от нула, то налице е сирищна суроватка. |9.4.3.2. Съдържанието на сирищна суроватка се изчислява съобразно следната формула:W = T+ 0,91където:0,91 е разстоянието между непрекъснатата и пунктираната права линия на вертикалната ос.+++++ TIFF +++++--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ XIX(член 13)ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СУХО ВЕЩЕСТВО НА СИРИЩНА СУРОВАТКА В ОБЕЗМАСЛЕНО МЛЯКО НА ПРАХ И В СМЕСИТЕ, НАЗОВАНИ В РЕГЛАМЕНТ (ЕО) № 2799/19991. Цел: откриване прибавянето на сухо вещество от сирищна суроватка към:a) обезмаслено мляко на прах, дефинирано в член 2 на Регламент (ЕО) № 2799/1999; иб) смеси, дефинирани в член 4 на Регламент (ЕО) № 2799/1999.2. Позовавания: Международен стандарт ISO 7073. ДефиницияСъдържанието на сухо вещество на сирищна суроватка се дефинира като процент от масата, както е определено в описаната процедура.4. ПринципСъдържанието на гликомакропептиди се определя в съответствие с приложение XVIII. Пробите, които дават положителни резултати, се анализират за гликомакропептид A с високооптимална течна хроматограма с обратни фази (HPLC процедура). Оценката на резултата се получава чрез позоваване на стандартни проби, съдържащи обезмаслено мляко не прах с или без известен процент суроватка на прах. Резултатите, които са по-високи от 1 % (m/m), показват наличието на сухо вещество на сирищна суроватка.5. РеагентиВсички реагенти трябва да са с доказано аналитично качество. Използваната вода трябва да е дестилирана или да е с най-малко същата чистота. Ацетонитрилът би следвало да бъде със спектроскопично качество или с HPLC-качество.Необходимите за процедурата реагенти са описани в приложение XVIII към настоящия регламент.Реагенти за HPLC с обратни фази.5.1. Разтвор на трихлор-оцетна киселина240 g трихлор-оцетна киселина (Cl3CCOOH) се разтварят във вода и се долива до 1000 ml.5.2. Елюенти A и BEлюент A: 150 ml ацетонитрил (CH3CN), 20 ml изопропанол (CH3CHOHCH3), и 1,00 ml трифлуор-ацетна киселина (TFA, CF3COOH) се поставят в 1000 ml измерителна колба. Долива се до 1000 ml с вода. Елюент B: 550 ml ацетонитрил, 20 ml изопропанол и 1,00 ml TFA се поставят в 1000 ml измерителна колба. Долива се до 1000 ml с вода. Елюентният разтвор се филтрира, преди да се използва, чрез мембранен филтър с 0,45 µm диаметър на пората.5.3. Консервиране на колонатаСлед анализа, колоната се облива с елюент B (чрез градиент) и впоследствие се облива с ацетонитрил (чрез градиент за 30 минути). Колоната се оставя в ацетонитрила.5.4. Стандартни проби5.4.1. Обезмаслено мляко на прах, което изпълнява изискванията за обществено складиране (т. e. (0)).5.4.2. Същото обезмаслено мляко на прах, подправено с 5 % (m/m) сирищна суроватка на прах със стандартен състав (т.e. (5)).5.4.3. Същото обезмаслено мляко на прах, подправено с 50 % (m/m) сирищна суроватка на прах със стандартен състав (т.e. (50)) [1].6. АпаратураНеобходимата апаратура за описаната процедура е дадена в прилож ение XVIII към настоящия регламент.6.1. Аналитична везна.6.2. Центрофуга, с капацитет за центрофугиране при 2200 g, снабдена със стопорни центрофужни туби с капацитет от около 50 ml6.3. Механичен шейкър с възможност за бъркане при 50 °C.6.4. Магнитна бъркалка.6.5. Стъклени фунии, с диаметър от около 7 см.6.6. Филтърна хартия, средно филтриране, с диаметър около 12,5 см.6.7. Оборудване за филтриране през стъкло с 0,45 µm диаметър на пората на мембранния филтър.6.8. Градуирани капкомери, с обем от 10 ml (ISO 648, клас A, или ISO/R 835) или система с вместимост от 10,0 ml за две минути.6.9. Термостатична водна баня при 25 ± 0,5 °C.6.10. Оборудване за HPLC, състоящо се от:6.10.1. Двойно градуирана помпена система.6.10.2. Инжектор, ръчен или автоматичен, с капацитет от 100 µl.6.10.3. Dupont Protein Plus-колона (дължина 25 см., с вътрешен диаметър от 0,46 см.) или еквивалентна широко-пореста кварцова колона с обратни фази.6.10.4. Термостатична колонна пещ при 35 ± 1 °C.6.10.5. UV детектор с променлива дължина на вълните, позволяващ измервания при 210 nm (ако е необходимо, може да бъде използвана по-голяма дължина на вълните до 220 nm), с чувствителност от 0,02 A.6.10.6. Интегратор, с възможност за "valley-to-valley" интеграция.Бележка:Функционирането на колоната на стайна температура е възможно, при условие че стайната температура не се отклонява повече от 1 °C, в противен случай се получава прекалено голямо вариране във времето на запазване на GMPÅ.7. Вземане на проби7.1. Пробите трябва да се вземат в съответствие с процедурата, установена в международен стандарт ISO 707. Държавите-членки, обаче, могат да използват друг метод за вземане на проби, при условие че той е в съответствие с принципите на гореупоменатия стандарт.7.2. Пробата се съхранява при условия, които изключват всякакво увреждане или промяна на състава.8. Процедура8.1. Подготовка на тестовата пробаМлякото на прах се прехвърля в съд, снабден с уплътнен капак и с вместимост, която е около два пъти обема на праха. Съдът се затваря веднага. Млякото на прах се смесва добре чрез многократна инверсия на съда.8.2. Тестова доза2,00 ± 0,001 g от тестовата проба се измерват в центрофужна туба (6.2) или подходяща уплътнена колба (50 ml).8.3. Отстраняване на мазнини и протеини8.3.1. 20,0 g топла вода (50 °C) се добавят към тестовата доза. Прахът се разтваря чрез разклащане за пет минути или 30 минути — в случай на кисела мътеница, при използване на механичен шейкър (6.3). Съдът се поставя във водна баня (6.9) и се оставя да се регулира до 25 °C.8.3.2. 10,0 ml разтвор на трихлор-оцетна киселина се добавят при 25 °C (5.1) за две непрекъснати минути, като в същото време се бърка с помощта на магнитната бъркалка (6.4). Съдът се поставя във водна баня (6.9) и се оставя за 60 минути.8.3.3. Пробата се центрофугира при 2200 g (6.2) за 10 минути или се филтрира през хартия (6.6), като се отстраняват първите 5 ml oт филтрата.8.4. Хроматографско определяне8.4.1. Извършва се HPLC-анализ, както е описан в приложение XVIII. Ако е получен отрицателен резултат, анализираната проба не съдържа сухо вещество на сирищна суроватка, което може да се открие. Ако резултатът е положителен, се прилага HPLC-процедура с обратни фази, както е описана по-долу. Наличието на кисела мътеница на прах може да не причини фалшиви положителни резултати. HPLC-методът с обратни фази изключва тази възможност.8.4.2. Преди извършването на HPLC-анализа с обратни фази, условията на градиента би следвало да бъдат оптимизирани. Времето на запазване от 26 ± 2 минути за GMPΑ е оптимално за системите на градиента с обем на работа от около 6 ml (обем от точката, в която разредителите се събират с обема на пръстена на инжектора, включително). Системите на градиент с по-малък обем на работа (например 2 ml) би следвало да използват 22 минути като оптимално време за запазване.Вземат се разтвори на стандартни проби (5.4) и на стандартни проби с 50 % сирищна суроватка.100 µl супернатант или филтрат (8.3.3) се инжектират в HPLC-апаратурата, която функционира при условията на градиента, дадени в таблица 1.Таблица 1Условия на градиента за оптимизиране на хроматографиятаВреме (минути) | Струя (ml/минути) | % A | % B | крива |Начало | 1,0 | 90 | 10 | * |27 | 1,0 | 60 | 40 | lin |32 | 1,0 | 10 | 90 | lin |37 | 1,0 | 10 | 90 | lin |42 | 1,0 | 90 | 10 | lin |При сравняването на двете хроматограми би следвало да се открие местонахождението на пика на GMPΑ.Чрез използване на формулата, дадена по-долу, може да бъде изчислен първоначалният състав на разредителя, който ще се използва за нормалния градиент (виж 8.4.3):% B = 10 – 2,5 +*30/27% B = 7,5 +*1,11където:RTgmpA : времето за запазване на GMPΑв тестовия градиент,10 : първоначалният% B на тестовия градиент2,5 : % B на половината време минус % B първоначално в нормалния градиент13,5 : половината време на тестовия градиент26 : изисквано време за запазване на GMPΑ6 : съотношение на наклоните на тестовия и нормалния градиент30 : % B първоначално минус% B при 27 минути в тестовия градиент27 : време на тестовия градиент.8.4.3. Анализ на разтвори на тестови проби100 µl точно измерен супернатант или филтрат (8.3.3) се инжектира в апаратура HPLC, функционираща при струя от 1,0 ml елюентен разтвор (5.2) за минута.Съставът на елюента в началото на анализа се получава съгласно 8.4.2. Той обичайно е близко до A:B = 76:24 (5.2). Непосредствено се стартира инжектирането на линеарен градиент, което резултира в 5 % по-висок процент на B след 27 минути. Впоследствие се стартира линеарен градиент, с който съставът на елюента става 90 % B за пет минути. Този състав се поддържа за пет минути, след което съставът се променя чрез линеарен градиент за пет минути към първоначалния състав. В зависимост от вътрешния обем на помпената система, следващото инжектиране може да бъде направено 15 минути след постигането на първоначалните условия.Бележки:1. Времето за запазване на гликомакропептида би следвало да бъде 26 ± две минути. Това може да бъде постигнато чрез вариране на първоначалните и крайните условия на първия градиент. Разликата, обаче, в % B за първоначалните и крайните условия на първия градиент, трябва да остане 5 % B.2. Елюентите би следвало да бъдат дегазирани в достатъчна степен и да се запазят такива. Това е съществено за надлежното функциониране на помпената система на градиента. Стандартното отклонение на времето за запазване на пика GMP би следвало да бъде по-малко от 0,1 минути (n = 10).3. Всеки пет проби на референтната проба (5) би следвало да бъдат инжектирани и използвани за изчисляването на нов коефициент на влияние R. (9.1.1).8.4.4. Резултатите от хроматографския анализ на тестовата проба (E) се получават под формата на хроматограма, в която пикът GMP се идентифицира чрез времето запазване от около 26 минути.Интеграторът (6.40.6) автоматично изчислява височината H на пика GMP. Във всяка хроматограма би следвало да бъде проверявано основното местоположение. Анализът или интеграцията би следвало да бъдат повторени, ако основното местоположение е било определено неправилно.Съществено е да се изследва появяването на всяка хроматограма преди количественото тълкуване, с оглед да се открият всякакви отклонения, които се дължат или на неправилното функциониране на апаратурата или на колоната, или на произхода и естеството на анализираната проба. Ако има съмнение, анализът се повтаря.8.5. Калибриране8.5.1. Процедурата, описана в точки 8.2 - 8.4.4, се прилага с точност за стандартните проби (от 5.4.1 до 5.4.2).Използват се прясно приготвени разтвори, тъй като GMP се унищожава в 8 %-на трихлор-оцетна среда на стайна температура. При 4 °C разтворът остава стабилен за 24 часа. В случай на дълги аналитични серии, е желателно в автоматичния инжектор да се използва корито с охладена проба.Бележка: Точка 8.4.2. може да бъде пропусната, ако% B при първоначалните условия е известен от предходни анализи.Хроматограмата на референтната проба (5) би следвало да бъде аналогична на фигура 1. В тази фигура, пикът GMPA се предшества от два малки пика. Важно е да се получи подобно отделяне.8.5.2. Преди хроматографското определяне на пробите, се инжектира 100 µl стандартна проба без сирищна суроватка (0) (5.4.1).Хроматограмата не би следвало да показва пик във времето за запазване на пика GMPA.8.5.3. Коефициентите на влияние R се определят чрез инжектиране на същия обем филтрати (8.5.1), използвани за пробите.9. Изразяване на резултатите9.1. Метод за изчисляване и формула9.1.1. Изчисляване на кефициента на влияние R:пик GMP: R = W/Hкъдето:R = коефициент на влияниe на пика GMPH = височина на пика GMPW = количеството суроватка в стандартната проба (5).9.2. Изчисляване на процента на сирищна суроватка на прах в пробата:W(E) = R × H(E)където:W(E) = процент (m/m) сирищна суроватка в пробата (E)R = коефициент на влияниe на пика GMP (9.1.1)H(E) = височината на пика GMP на пробата (E).Ако W(E) е по-голямо от 1 % и разликата между времето за запазване и това на стандартната проба (5) е по-малка от 0,2 минути, то тогава е налице сухо вещество на сирищна суроватка.9.3. Точност на процедурата9.3.1. ПовторяемостРазликата от резултатите на две определяния, извършени едновременно или последователно едно след друго от един и същ анализатор и при използване на същата апаратура върху идентичен тестови материал, не надвишава 0,2 % m/m.9.3.2. ВъзпроизвежданеВсе още не е определено.9.3.3. ЛинеарностПри 0 до 16 % сирищна суроватка би следвало да се получи линейна връзка с коефицент на корелация > 0,99.9.4. Тълкуване9.4.1. Счита се, че суроватка е налице, ако резултатът, получен в точка 9.2, е по-висок от 1 % m/m и времето за запазване на пика GMP се различава с по-малко от 0,2 минути от това на стандартната проба (5). Границата от 1 % се определя в съответствие с разпоредбите на точки 9.2 и 9.4.1 на приложение V към Регламент (ЕИО) № 625/78.+++++ TIFF +++++[1] Сирищната суроватка на прах със стандартен състав и подправеното обезмаслено мляко на прах са налични от NIZO, Kernhemseweг 2, п.к. 20 — NL-6710 BA Ede. Също така, могат да бъдат използвани прахове, които дават еквивалентни резултати на праховете на NIZO.--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ XX(член 14)ОБЕЗМАСЛЕНО МЛЯКО НА ПРАХ: КОЛИЧЕСТВЕНО ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ФОСФАТИДИЛСЕРИН И ФОСФАДИЛЕТАНОЛАМИНHPLC-метод с обърнати фази1. Цел и приложно полеМетодът описва процедура за количествено определяне на фосфатидилсерин (PS) и фосфатидилетаноламин (PE) в обезмаслено мляко на прах (SMP) и е подходящ за откриване на сухо вещество на мътеница в SMP.2. ДефиницияPS + PE съдържание: фракция маса на определената субстанция чрез използване на определената процедура. Резултатът е изразен като милиграма фосфатидилетаноламин дипалмитол (PEDP) за 100 g прах.3. ПринципЕкстракт на аминофосфолипиди с метанол от мляко на прах с променен състав. Определяне на PS и PE като o-фталдиалдехид (OPA) производни чрез HPLC с обратни фази и флуоресцентно откриване. Определяне на количеството на съдържанието на PS и PE в тестовата проба чрез позоваване на стандартна проба, съдържаща познато количество PEDP.4. РеагентиВсички реагенти трябва да бъдат с признато аналитично качество. Водата трябва да е дестилирана или с най-малко еквивалентна чистота, ако не е определено друго.4.1. Стандартен материал: PEDP, най-малко 99 % чисто съдържаниеБележка: Стандартният материал трябва да бъде съхраняван при –18 °C.4.2. Реагенти за стандартна проба и подготовка на тестовата проба4.2.1. Метанол за HPLC4.2.2. Хлороформ за HPLC4.2.3. Триптамин-монохидрохлорид4.3. Реагенти за o-фталдиалдехид дериватизация4.3.1. Натриев хидроксид, 12 M-воден разтвор4.3.2. Борна киселина, 0,4 M-воден разтвор, регулиран до pH 10,0 с натриев хидроксид (4.3.1)4.3.3. 2-меркаптоетанол4.3.4. o-фталдиалдехид (OPA)4.4. HPLC-отмиващи разредителиОтмиващите разредители трябва да бъдат приготвени чрез използване на реагенти за HPLC.4.4.1. Вода за HPLC4.4.2. Метанол с флуоритметична тествана хомогенност4.4.3. Тетрахидрофуран4.4.4. Натриев дихидроген фосфат4.4.5. Натриев ацетат4.4.6. Оцетна киселина5. Апаратура5.1. Аналитична везна5.2. Бехерови чаши с обем от 25 и 100 ml5.3. Капкомери с обем от 1 и 10 ml5.4. Магнитна бъркалка5.5. Градуирани капкомери с обем от 0,2, 0,5 и 5 ml5.6. Измерителни колби с обем от 10, 50 и 100 ml5.7. Спринцовки с обем от 20 и 100 µl5.8. Ултразвукова баня5.9. Центрофуга, функционираща при 27000 × g5.10. Огледални стъкла с обем от около 5 ml5.11. Градуиран цилиндър с обем от 25 ml5.12. pH-метър5.13. Оборудване за HPLC5.13.1. Градиентна помпена система, с възможност да функционира при 1,0 ml/min при 200 bar5.13.2. Автоматичен уред за вземане на проби с възможност за дериватизация5.13.3. Подгревател за колони, поставен при 30 °C5.13.4. Флуоресцентен детектор, поставен при 330 nm електризация на дължината на вълната и 440 nm емисия на дължината на вълната5.13.5. Интегратор или софтуер за обработка на данни, с възможност за измерване на пиковите повърхности5.13.6. Lichrosphere-колона —100 (250 × 4,6 mm.) или еквивалентна колона, обвита с октадецилсилан (C 18), с размер на частиците от 5 µm6. Вземане на пробиВземането на проби трябва да се извършва в съответствие с IDF стандарт 50B:1985.7. Процедура7.1. Приготвяне на вътрешния стандартен разтвор30,0 ± 0,1 mg триптамин-монохлорхидрат (4.2.3) се претегля в 100 ml измерителна колба (5.6) и се долива до маркировката с метанол (4.2.1). Капва се 1 ml (5.3) от този разтвор в 10 ml измерителна колба (5.6) и се долива до маркировката с метанол (4.2.1), с оглед да се получи 0,15 mM триптаминов концентрат.7.2. Подготовка на тестовия разтвор1,000 ± 0,001 g на SMP-пробата се измерва в 25 ml бехерова чаша (5.2). Добавя се 10 ml дестилирана вода при 40 °C с капкомер (5.3) и се разбърква с магнитна бъркалка (5.4) за 30 минути, за да се разтворят всички бучки. От млякото с променен състав се капват 0,2 ml (5.5) в 10 ml измерителна колба (5.6), добавя се 100 µl от 0,15 mM триптаминов разтвор (7.1) чрез използването на инжекция (5.7) и се долива до обема с метанол (4.2.1). Смесва се внимателно с инверсия и се извършва дисперсия с помощта на ултразвук (5.8) за 15 min Центрофугира се (5.9) при 27000 × g за 10 минути и супернатантът се събира в стъклен флакон (5.10).Бележка: Разтворът на тестовата проба би следвало да бъде съхраняван при 4 °C, докато се извърши HPLC-анализ.7.3. Подготовка на външния стандартен разтвор55,4 mg PEDP (4.1 ) се измерват в 50 ml измерителна (5.6) и се добавя около 25 ml хлороформ (4.2.2) като се използва градуиран цилиндър (5.11). Затворената колба се загрява до 50 °C и се смесва внимателно докато се разтвори PEDP. Колбата се охлажда до 20 °C, обемът се долива с метанол (4.2.1) и се смесва с инверсия. Капва се 1 ml (5.3) от този разтвор в 100 ml измерителна колба (5.6) и се долива до обема с метанол (4.2.1). Капва се 1 ml (5.3) от този разтвор в 10 ml измерителна колба (5.6), добавя се 100 µl (5.7) от 0,15 mM триптаминов разтвор (7.1) и обемът се долива с метанол (4.2.1). Смесва се чрез инверсия.Бележка: Разтворът на стандартната проба би следвало да се съхранява при 4 °C, докато се извърши HPLC-анализ.7.4. Подготовка на дериватизиращия реагент25,0 ± 0,1 mg от OPA (4.3.4) се измерва в 10 ml измерителна колба (5.6), добавя се 0,5 ml (5.5) метанол (4.2.1) и се смесва внимателно, за да се разтвори OPA. Долива се до маркировката с разтвор на борна киселина (4.3.2) и се добавя 20 µl от 2-монотиогликол (4.3.3) чрез спринцовка (5.7).Бележка: Дериватизиращият реагент би следвало да бъде съхраняван при 4 °C в тъмен флакон; той е годен една седмица.7.5. Определяне чрез HPLC7.5.1. Отмиващи разтворители (4.4)Разтворител A:Разтвор на 0,3 mM мононатриев фосфат и разтвор на 3 mM натриев ацетат (регулиран до pH 6,5 с оцетна киселина): метанол: тетрахидрофуран = 558:440:2 (v/v/v)Разтворител B:метанол7.5.2. Предложен отмиващ градиент:време (min) | разтворител A (%) | разтворител B (%) | струя (ml/min) |Първоначално | 40 | 60 | 0 |0,1 | 40 | 60 | 0,1 |5,0 | 40 | 60 | 0,1 |6,0 | 40 | 60 | 1,0 |6,5 | 40 | 60 | 1,0 |9,0 | 36 | 64 | 1,0 |10,0 | 20 | 80 | 1,0 |11,5 | 16 | 84 | 1,0 |12,0 | 16 | 84 | 1,0 |16,0 | 10 | 90 | 1,0 |19,0 | 0 | 100 | 1,0 |20,0 | 0 | 100 | 1,0 |21,0 | 40 | 60 | 1,0 |29,0 | 40 | 60 | 1,0 |30,0 | 40 | 60 | 0 |Бележка: Отмиващият градиент може да изисква лека модификация, с оглед да се постигне разтварянето, показано във фигура 1.Температура на колоната: 30 °C.7.5.3. Обем на инжектиране: 50 µl дериватизиращ реагент и 50 µl разтвор на пробата.7.5.4. Равновесие на колонатаСистемата се стартира ежедневно, колоната се облива със 100 % разтворител B за 15 минути, след това се настройва на A:B = 40:60 и се балансира при 1 ml/min за 15 минути. Чрез инжектирането на метанол (4.2.1) се извършва празна серия.Бележка: Преди дългосрочно съхранение, колоната се облива с метанол:хлороформ = 80: 20 (v/v) за 30 минути.7.5.5. Определяне на съдържанието на PS + PE в тестовата проба7.5.6. Извършва се последователността от хроматографски анализи, като времето от серия до серия се поддържа константно, с оглед да се получат константни времена на запазване. Външният стандартен разтвор (7.3) се инжектира на всеки 5—10 разтвори на тестовите проби, с оглед да се оцени коефициентът на влияние.Бележка: Колоната трябва да бъде почистена чрез обливане със 100 % разтворител B (7.5.1) за най-малко 30 минути на всеки 20—25 серии.7.6. Метод на интегриране7.6.1. PEDP-пикPEDP се отмива като единствен пик. Повърхността на пика се определя чрез "valley-to-valley" интеграция.7.6.2. Триптаминов пикТриптаминът се отмива като единствен пик (фигура 1). Повърхността на пика се определя чрез "valley-to-valley" интеграция.7.6.3. Групи на пикове PS и PEСъгласно описаните условия (фигура 1), PS се отмива като два основни частично неразтворени пика, предшествани от по-малък пик. PE се отмива като три основни частично неразтворени пика. Определя се цялата повърхност на всяка група пикове, като се фиксира основната линия, както е отчетено във фигура 1.8. Изчисляване и изразяване на резултатитеСъдържанието на PS и PE в тестовата проба се изчислява, както следва:C = 55,36 ×AA×TTкъдето:C = съдържанието на PS или PE (mg/100 g прах) в тестовата пробаA 1 = PEDP пикова повърхност на разтвора на стандартната проба (7.3)A 2 = PS или PE пикова повърхност на разтвора на стандартната проба (7.2)T 1 = триптаминова пикова повърхност на разтвора на стандартната проба (7.3)T 2 = триптаминова пикова повърхност на разтвора на тестовата проба (7.2).9. ПрецизностБележка: Стойностите за повторяемост бяха изчислени в съответствие с IDF международен стандарт [1]. Временната граница за сравнение бе изчислена в съответствие с процедурата, определена в прилож ение III, буква б) към настоящото.9.1. ПовторяемостОтносителното стандартно отклонение на повторяемостта изразява варирането на резултатите на независим аналитичен анализ, получени от същия оператор чрез използване на същата апаратура и при същите условия върху същия тестови материал в и в кратък период от време; не би следвало да се надвишава относителната стойност от 2 %. Ако при тези условия са получени две определяния, относителната разлика между двата резултата не би следвало да бъде по-голяма от 6 % от средно аритметичната стойност на резултатите.9.2. ВъзпроизвежданеАко две определяния са получени от оператори в различни лаборатории чрез използване на различна апаратура, при различни условия за анализа на същия тестови материал, относителната разлика между двата резултата не би следвало да бъде по-голяма от 11 % от средно аритметичната стойност на резултатите.10. Позовавания10.1. Resmini P., Pelleг.rino L., Hoг.enboom J.A., Sadini V., Rampilli M., "Откриване на сухо вещество на мътеница в обезмаслено мляко на прах чрез HPLC-определяне на количеството на аминофосфолипиди." Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988).Фигура 1 : НPLC-модели на OPA-производни на фосфатидилсерин (PS) и фосфатидилетаноламин (РЕ) в метанолов екстракт на обезмаслено мляко на прах с променен състав. Отчита се методът на интеграция за пиковете на PS, РЕ и триптамин (вътрешен стандарт).+++++ TIFF +++++[1] Международен IDF стандарт 135B/1991- Мляко и млечни продукти. Характеристики на прецизността на аналитични методи. Описание на процедурата за съвместно изследване.--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ XXI(член 15)ОТКРИВАНЕ НА АНТИБИОТИЧНИ И СУЛФОНАМИДНИ /ДАПСОНОВИ УТАЙКИ В ОБЕЗМАСЛЕНО МЛЯКО НА ПРАХИзползва се скрининг тест за микробен антиокислител, използващ Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953 като тестов микроорганизъм, който е достатъчно чувствителен да открива 4 µg бензилпеницилин за мляко и 100 µg сулфаметазин за мляко. Могат да бъдат използвани обичайните тестове, ако имат необходимата чувствителност за бензилпеницилин и сулфаметазин [1].За теста се използва обезмаслено мляко на прах с променен състав (1 g прах + 9 ml дестилирана вода). Тестът се извършва, както е описано в IDF — бюлетин № 258/1991, раздел 1, глава 2, или съобразно инструкциите на производителя на теста.Положителните резултати следва да се тълкуват, както следва:1. Тестът се повтаря с добавянето на пеницилиназа към тестовата система:Положителен резултат: антиокислителната субстанция не може да бъде открита чрез тази процедура.Отрицателен резултат: антиокислителната субстанция е β-лактам антибиотик.2. Тестът се повтаря с добавянето на p-аминобензоатна киселина към тестовата система:Положителен резултат: антиокислителната субстанция не може да бъде открита чрез тази процедура.Отрицателен резултат: антиокислителната субстанция е сулфонамид/дапсон.3. Тестът се повтаря с добавянето на пеницилиназа + p-аминобензоатна киселина към тестовата система:Положителен резултат: антиокислителната субстанция не може да бъде открита чрез тази процедура.Отрицателен резултат: антиокислителните субстанции са β-лактам антибиотик и сулфонамид/дапсон.[1] Важно: Когато се анализира обезмаслено мляко на прах, могат да бъдат получени фалшиви положителни резултати. Поради това е важно да се провери дали използваната тестова система не произвежда фалшиви положителни резултати.--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ XXII(член 16)КОЛИЧЕСТВЕНО ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ОБЕЗМАСЛЕНО МЛЯКО НА ПРАХ В СМЕСИ ОТ ХРАНИТЕЛНИ ПРОДУКТИ ЧРЕЗ ЕНЗИМНА КОАГУЛАЦИЯ НА ПАРА-КАЗЕИН1. ЦелКоличествено определяне на обезмаслено мляко на прах в смеси от хранителни продукти чрез ензимна коагулация на пара-казеин.2. ОбхватТози метод се прилага за смеси от хранителни продукти, съдържащи най-малко 10 % обезмаслено мляко на прах; наличието на големи количества мътеница и/или определени немлечни протеини може да доведе до определени въздействия.3. Принцип на метода3.1. Разтваряне на казеин, съдържащ се в смесите от хранителни продукти, чрез екстракция с разтвор на натриев цитрат.3.2. Регулиране на калциево-йонната концентрация до изискваното ниво, за да се утаи пара-казеинът; пара-казеинът се добива от казеин чрез добавянето на сирище.3.3. Азотното съдържание на утайката от пара-казеина се определя чрез Kjeldahl-метода, както е описан от IDF стандарт 20A 1986; количеството на обезмасленото мляко на прах се изчислява на базата на минималното съдържание казеин от 27,5 % (виж 9.1).4. РеагентиИзползваните реагенти трябва да са с аналитично качество. Използваната вода трябва да е дестилирана или с еквивалентна чистота. С изключение на сирището (4.5), всички реагенти и разтвори трябва да бъдат без азотни субстанции.4.1. Тринатриев цитрат като дихидрат (1 % w/v разтвор).4.2. Калциев хлорид (2M разтвор). 20,018 g CaCO3 (с аналитично качество) се измерват в порцеланов съд с подходящ размер (от 150 до 200 ml) или в бехерова чаша. Покрива се с дестилирана вода и се прехвърля в кипяща водна баня. Бавно се добавят от 50 до 60 ml HCl разтвор (концентр. HCl:вода = 1:1), за да може карбонатът да се разтвори напълно. Оставя се във врящата водна баня, докато CaCl2 се изсуши, за да се елимира HCl, който не предизвиква реакция. Заедно с дестилираната вода се прехвърля в 100 ml измерителна колба и се разрежда до маркировката. Измерва се pH-стойността, която не трябва да бъде по-ниска от 4,0. Разтворът се съхранява в хладилник.4.3. 0,1 N натриев хидроксид.4.4. 0,1 N хлорводородна киселина.4.5. Течно телно сирище (стандартен състав 1:10000). Съхранява се в хладилник от 4 до 6 °C.4.6. Реагенти за количествено определяне на азот в съответствие с Kjeldahl-метода, както е описан в IDF стандарт 20A 1986.5. АпаратураОбща лабораторна апаратура, включваща:5.1. Хаван или хомогенизатор5.2. Аналитична везна5.3. Настолна центрофуга (от 2000 до 3000 rpm) с 50 ml туби5.4. Магнитна бъркалка с (от 10 до 15 mm) с отводни палци5.5. Бехерови чаши от 150 до 200 ml5.6. Колби от 250 и 500 ml5.7. Стъклени фунии с диаметър от 60 до 80 mm.5.8. Бързо филтриращи филтри с диаметър от 150 mm. (S.S. 5892, S.S. 595 1/2)5.9. Капкомери с различна номинална вместимост5.10. Термостатично контролирана водна баня при 37 °C5.11. pH метър5.12. Kjeldahl-устройство за разтваряне и дестилация, с принадлежности5.13. 25 ml градуирана бюретка5.14. Пластмасов флакон за дестилирана вода5.15. Шпатули от неръждаема стомана5.16. Термометри5.17. Пещ за изсушаване с контролиране на температурата.6. Процедура6.1. Подготовка на пробата.От 10 до 20 g от пробата се смила в хавана или се хомогенизира в пресата, за да се получи хомогенна смес.6.2. Разтваряне на млякото на прах и отделяне на неразтворимата утайка.6.2.1. 1,000 ± 0,002 g от добре хомогенизираната смес от хранителни продукти (6.1) се претегля директно в 50 ml центрофужна туба. Добавят се 30 ml разтвор на тринатриев цитрат (4.1), който е предварително загрят при 45 °C. Смесва се с помощта на магнитната бъркалка за най-малко пет минути.6.2.2. 500 g (от 2000 до 3000 rpm) се центрофугират за 10 минути и ясният воден супернатант се прелива в бехерова чаша от 150 до 200 ml, като се внимава по време на преливането да не се загуби никакъв ронлив материал на дъното.6.2.3. Извършват се допълнителни екстракции на утайката, в съответствие със същата процедура, като екстрактите се добавят към първите.6.2.4. Ако на повърхността се образува слой мазнина, се охлажда в хладилник, докато мазнината се втвърди и твърдият слой се отстранява със шпатула.6.3. Коагулиране на казеин с ензимите на сирище.6.3.1. При непрекъснато разбъркване, се прибавят на капки 3,4 ml наситен разтвор на калциев хлорид (4.2) към общия воден екстракт (около 100 ml). Регулира се до pH 6,4—6,5 с разтвори на NaOH (4.3) или HCl (4.4). Поставя се в термостатично контролирана водна баня при 37 °C за 15 до 20 минути, за да се получи солен баланс. Това се изразява чрез образуването на лека гъстота.6.3.2. Течността се поставя в една (или две) центрофужни туби и при 2000 g се центрофугира за 10 минути, с оглед да се отстрани утаеният материал. Супернатантът се прехвърля, без да се измива седимента, в една (или две) центрофужни туби.6.3.3. Температурата на супернатанта се регулира отново до 37 °C. При разбъркване на екстракта, се прибавят на капки 0,5 ml течно сирище (4.5). Коагулирането се получава за една или две минути.6.3.4. Пробата се връща във водната баня и се оставя при температура от 37 °C за 15 минути. Пробата се отстранява от банята и коагулацията се прекъсва чрез разбъркване. Центрофугира се при 2000 g за 10 минути. Супернатантът се филтрира чрез подходяща филтърна хартия [1] (Whatman № 541 или подобна), като филтърната хартия се запазва. Утайката се измива в центрофужната туба с 50 ml вода при приблизително 35 °C чрез разбъркване.Центрофугира се отново при 2000 g за 10 минути. Супернатантът се филтрира през филтърната хартия, която преди това е запазена.6.4. Определяне на азот в казеин.6.4.1. След измиването, количеството утайка се прехвърля върху филтърната хартия, запазена при 6.3.4, като се използва дестилирана вода. Филтърната хартия се прехвърля в Kjeldahl-колбата. Азотът се определя чрез Kjeldahl-метода, както е описан в IDF стандарт 20A 1986.7. Празен тест7.1. Регулярно се прави празен тест, като се използва филтърна хартия (5.8), навлажнена със смес от 90 ml (4.1) разтвор на натриев цитрат, 1 ml наситен разтвор на калциев хлорид (4.2), 0,5 ml течно сирище (4.5); измива се с 3 ×15 ml дестилирана вода преди минерализацията чрез Kjeldahl-метода, описан от IDF стандарт 20A 1986.7.2. Обемът киселина, който се използва за празния тест, трябва да бъде изваден от обема киселина (4.4), който се използва за титруването на пробата.8. Контролен тест8.1. За да се тестват гореупоменатите процедура и реагенти, се прави определяне върху стандартна смес от хранителни продукти с известно съдържание на обезмаслено мляко на прах, установено от съвместно изследване. Средният резултат на двойното определяне не би следвало да се отличава с повече от 1 % от това на съвместното изследване.9. Изразяване на резултати9.1. Процентът обезмаслено мляко на прах в сместа от хранителни продукти се изчислява със следната формула:% MMP =27,5– 2,81където N е процентът азот в пара-казеин; 27,5 е факторът за конвертиране на определен казеин в процента обезмаслено мляко на прах; 2,81 и 0,908 са факторите за корекция, получени от анализа на регресията.10. Точност на метода10.1. ПовторяемостВ поне 95 % от проучваните случаи, двойният анализ на една и съща проба от същия оператор и в същата лаборатория трябва да даде разлики в резултатите, които са равни на не повече от 2,3 g обезмаслено мляко на прах в 100 g смес от хранителни продукти.10.2. ВъзпроизвежданеВ поне 95 % от проучваните случаи, анализираната от две лаборатории една и съща проба трябва да даде разлики в резултатите, които са равни на не повече от 6,5 g обезмаслено мляко на прах в 100 g смес от хранителни продукти.11. Граница на толерантностСтойността CrD95 (критична разлика; 95 % граница на сигурност) се изчислява чрез използване на формулата (ISO 5725):CrD=2n(R: възпроизвеждане; r: повторяемост)двойно определяне: CrD95 = 4,5 gКогато резултатът от химическия анализ се различава от декларираното съдържание на обезмасленото мляко на прах с не повече от 4,5 g (двойно определяне), пратката от сместа от хранителни продукти се счита като изпълняваща тази разпоредба на регламента.12. Наблюдение12.1. Прибавянето на големи проценти определени немлечни протеини, и по-специално соеви протеини, когато се подгряват заедно с обезмаслено мляко на прах, може да доведе до прекалено високи резултати, които се дължат на съвместното утаяване с пара-казеин на мляко.12.2. Прибавянето на мътеница може да доведе до сравнително ниски данни, които се дължат на факта, че се определя само дозата, която е без мазнини. Прибавянето на определена кисела мътеница може да даде значително ниски данни, които се дължат на непълното разтваряне в цитратния разтвор.12.3. Добавките от лецитин от 0,5 % или повече могат също да доведат до ниски резултати.12.4. Включването на обезмаслено мляко на прах с висока температура може да доведе до прекалено високи данни, които се дължат на съвместното утаяване на определени протеини от суроватка с пара-казеина на мляко.[1] Би следвало да бъде използвана бързо филтрираща филтърна хартия.--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ XXIII(член 17)КОЛИЧЕСТВЕНО ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СКОРБЯЛА В ОБЕЗМАСЛЕНО МЛЯКО НА ПРАХ, ДЕНАТУРИРАНО МЛЯКО НА ПРАХ И СМЕСИ ОТ ХРАНИТЕЛНИ ПРОДУКТИ1. ОбхватТози метод е за откриването на скорбяла като индикатор в денатурирано мляко на прах.Границата на откриване на метода е приблизително 0,05 g скорбяла за 100 g проба.2. ПринципРеакцията се базира върху тази, използвана в иодометрията:- фиксиране чрез колоидите на свободния йод във воден разтвор,- абсорбция чрез мицелите на скорбялата и чрез образуването на цвят.3. Реагенти3.1. Йоден разтвор:- йод: 1 г.,- калиев йод: 2 г.,- дестилирана вода: 100 ml.4. Апаратура4.1. Аналитична везна4.2. Водна баня4.3. Тестови съдове, 25 mm × 200 mm.5. Процедура1 g от пробата се претегля и се прехвърля в тестовия съд (4.3).Добавя се 20 ml дестилирана вода и се разбърква, с оглед да се получи дисперсия на пробата.Поставя се в кипящата водна баня (4.2) и се оставя за 5 минути.Отстранява се от банята и се охлажда на стайна температура.Добавя се 0,5 ml йоден разтвор (3.1), разбърква се и се наблюдава полученият цвят.6. Изразяване на резултатитеСиньото оцветяване показва наличие в пробата на натурална скорбяла.Ако пробата съдържа модифицирана скорбяла, цветът може да не е син.7. БележкиЦветът, интензивността на цвета и микроскопската форма на скорбялата варират в зависимост от произхода на натуралната скорбяла (напр. царевица или картоф) и вида на модифицираната скорбяла, който присъства в пробата.При наличието на модифицирана скорбяла, полученият цвят преминава във виолетов, червен или кафяв, в съответствие със степента на модификация на кристалната структура на натурална скорбяла.--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ XXIV(член 18)ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ВЛАГА В КИСЕЛА МЪТЕНИЦА НА ПРАХ1. ОбхватДа определи съдържанието на влага в кисела мътеница на прах, предназначена за животинска храна.2. ПринципПробата се изсушава под вакуум. Загубата на маса се определя чрез претегляне.3. Апаратура3.1. Аналитична везна3.2. Сухи съдове от некорозивен метал или от стъкло с уплътнени капаци, с работна повърхност, която позволява тестовата проба да се разпространи на около 0,3 г./см.2.3.3. Регулируема електрическа вакуумна пещ, снабдена с маслена помпа и с механизъм за въвеждане на горещ изсушен въздух или с изсушаващ агент (напр. калциев оксид).3.4. Ексикатор с ефективен изсушаващ агент.3.5. Изсушаваща пещ, вентилирана и термостатично контролирана при 102 ± 2 °C.4. ПроцедураСъдът (3.2) се загрява с капака в пещта (3.5) за най-малко един час. Капакът се поставя върху съда, веднага се поставя върху ексикатора (3.4), оставя се да се охлади на стайна температура и се претегля с точност до 0,5 mgСъдът (3.2) с капака се претегля с точност до 0,5 mg В претегления съд се измерва с точност до 1 mg около 5 g от пробата и се разпространява равномерно. Съдът без капака се поставя във вакуумната пещ (3.3), предварително загрята до 83 °C. За да се предотврати прекомерното спадане на температурата на пещта, съдът се внася възможно най-бързо.Налягането се регулира до 100 Torr (13,3 kPa) и пробата се оставя да се изсуши за четири часа при това налягане, с потока от горещ, сух въздух или чрез използването на изсушаващ агент (около 300 g за 20 проби). В последния случай, вакуумната помпа се откача при постигне на предписаното налягане. Времето за изсушаване се изчислява от момента, в който температурата на пещта се върне до 83 °C. Пещта се връща внимателно към атмосферно налягане. Пещта се отваря, капакът се поставя веднага върху съда, съдът се отстранява от пещта, оставя се да се охлади за 30 до 45 минути в ексикатор (3.4) и се претегля с точност до 1 mg Изсушава се за допълнително 30 минути във вакуумната пещ (3.3) при 83 °C и отново се претегля. Разликата между двете претегляния не трябва да надвишава 0,1 % влага.5. Изчисляване·където:E = първоначалната маса на тестовата проба, в грамове,m = маса на сухата тестова проба, в грамове.6. Прецизност6.1. Граница на повторяемостРазликата от резултатите на две определяния, извършени във възможно най-кратък срок от един и същ оператор и при използване на същата апаратура върху идентичен тестови материал, не надвишава 0,4 g вода/100 g кисела мътеница на прах.6.2. Граница на възпроизвежданеРазликата от резултатите на две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории и при използване на същата апаратура върху идентичен тестови материал, не надвишава 0,6 g вода/100 g кисела мътеница на прах.6.3. Източник на данните за прецизносттаДанните за прецизността бяха определени от експеримент, проведен през 1995 г. и включващ осем лаборатории и 12 проби (6 празни дублирания).--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ XXV(член 19)РЕФЕРЕНТЕН МЕТОД ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЧУЖДИ МАЗНИНИ В МЛЕЧНА МАЗНИНА ЧРЕЗ ГАЗОВ ХРОМАТОГРАФСКИ АНАЛИЗ НА ТРИГЛИЦЕРИДИ — РЕВИЗИЯ 11. Обхват и приложно полеТози стандарт определя метод за откриване на чужди мазнини, растителни и животински, такива като говежда лой и свинска мае в млечна мазнина на млечни продукти, като се използва газов хроматографски анализ на триглицериди.Чрез използването на определена формула за триглицерид се откриват качествата и количествата на растителни и животински мазнини в чиста млечна мазнина, независимо от условията на хранене или лактация.Бележка 1: Въпреки, че маслената киселина (C4), която се появява изключително в млечни мазнини, прави възможно извършването на количествени оценки на ниски до средни стойности млечна мазнина в растителни мазнини, качествена и количествена информация едва ли може да бъде получена при прибавена най-малко 20 % (% тегло) чужда мазнина към чисто мляко поради голямата вариация на C4, приблизително в обхват между 3,5 до 4,5 % (% тегло).Бележка 2: На практика, количествените резултати могат да бъдат получени само от триглицериден анализ, тъй като стеролното съдържание на растителните мазнини е различно в зависимост от условията на производство и обработка.2. ДефиницияЧужди мазнини в млечна мазнина: чужди мазнини, дефинирани в този стандарт, са всички растителни и животински мазнини, с изключение на млечната мазнина.3. Принцип на методаСлед екстракцията на млечната мазнина се приготвя основен разтвор. От този разтвор се определят триглицеридите (общо въглеродно число) чрез газова хроматография с обвити колони. Чрез внасянето на %-та тегло на молекулите мазнина от различен размер (C24 — C54 — само четни числа) в триглицеридната формула, чуждите мазнини се откриват качествено или се определят количествено.Бележка: При съблюдаването на описаната оценка може да бъде използвана капилярна газова хроматография, ако се гарантира постигането на сравними резултати [1].4. РеагентиТрябва да бъдат използвани химикали с аналитично качество.4.1. Носещ газ: азот, степен на чистота >=99,996 %.4.2. Стандартни триглицериди [2], наситени, както и холестерол за стандартизиране на стандартна млечна мазнина съобразно раздел 6.5.4.4.3. Метанол, безводен.4.4. n-хексан4.5. n-хептан4.6. Толуол4.7. Разтвор на диметилхлоросилан: 50 ml диметилхлоросилан се разтварят в 283 ml толуол.4.8. Възпламеним газ: въглерод и синтетичен въздух4.9. Стационарна фаза, 3–% OV-1 върху 125/150 µm (100/120 mesh) газ ChromQ [3].4.10. 10 % разтвор на какаово масло в n-хептан.5. АпаратураОбичайна лабораторна апаратура, и по-специално следното:5.1. Газов хроматограф с висока температура, подходящ за температури от най-малко 400—450°C, съоръжен с детектор за йонизация на пламък (FID) и контролиращо устройство за константния поток маса за носещия газ. Газ за възпламеняване: 30 ml/min H2, 270 ml/min синтетичен въздух.Като се има предвид силният поток носещ газ, горелката на детектора би следвало да бъде по-широка.Бележка: Поради високите температури, които се получават по време на триглицеридните анализи, стъклените вложки в FID или инжекторната система трябва да бъдат регулярно почиствани.Газовият хроматограф трябва да е снабден с прегради, устойчиви на високи температури, които могат да бъдат използвани често и имат по принцип много ниска степен на "избледняване".Бележка: Подходящи са Chromblue (tm)—прегради (Chrompack).Преградата трябва да бъде сменяна често, напр. след приблизително 100 инжекции или след като разтварянето започне да се влошава (виж фигура 4).5.2. Хроматографска колонаU-образна стъклена колона (диаметър във вътрешността от 2 mm., 500 mm. дължина), която първо е силилирана съобразно раздел 6.1 с диметилхлорсилан, с оглед да се деактивира стъклената повърхност.Бележка: Подходящи са също малко по-дълги (с дължина 80—200 mm.) обвити колони. С тях може да бъде постигнато малко по-добро възпроизвеждане на резултатите. От друга страна, стационарната фаза показва понякога счупвания след работа, които могат да доведат, от своя страна, до лоши количествени резултати. В допълнение, пламъкът FID се загася лесно в резултат на необходимия изключително силен поток носещ газ от 75 до 85 ml/min.5.3. Начин на пълнене на колоната (виж фигура 1)+++++ TIFF +++++Фигура 1Пълнене на колонатаN2 inНапълва се до маркировката с OV-1Капакът се завинтва с филтъра, към който са притиснати стъклената нишка и стационарната фаза.Стъклена колона, която следва да се напълни5.3.1. Пластмасова колона с горни капаци с винт, снабдена с маркировка, до която може да бъде пълнено необходимото количество на стационарната фаза5.3.2. Фин филтър (размер на клетката от приблизително 100 µm) с капак с винт, подходящ за затваряне на стъклената колона съобразно фигура 1.5.3.3. Деактивирана, силилирана стъклена вата5.3.4. Вибратор за еднакво разпространение на стационарната фаза по време на пълненето5.4. От 1 до 3 ml Extrelut-колона [4] с кварцов гел. Тази колона може да бъде алтернативно използвана за екстракцията с цел получаване на млечна мазнина.5.5. Графитно уплътнение от 6,4 mm. (1/4), с отвор от 6 mm.5.6. Устройства за силилиране на стъклената повърхност на колоната съобразно раздел 6.1.5.6.1. Woulff-бутилка5.6.2. Водно-смукателна помпа5.7. Водна баня, регулируема до (50 ± 2) °C5.8. Сушилня, регулируема до (50 ± 2) °C и (100 ± 2) °C5.9. Милилитров капкомер5.10. Градуиран капкомер с обем от 5 ml за дозиране на 1,5 ml метанол5.11. Колба с кръгло дъно с обем от 50 ml5.12. Erlenmeyer-колба с номинален обем от 50 ml5.13. Фуния5.14. Филтър с фини пори5.15. Ротативен изпарител5.16. Ампули с номинален обем от 1 ml, затворени с алуминиева запушалка, с преграда във вътрешността5.17. Спринцовка за инжектиране, използваната запушалка на спринцовката не трябва да достига до края на иглата.Бележка: Такива спринцовки позволяват по-добро сравнение на получаваните резултати.С оглед да се избегне развалянето на преградата, краят на иглата би следвало да бъде проверяван регулярно (напр. със стерео микроскоп).6. Процедура6.1. Подготовка на колоната (силилиране)След свързването на Woulff-бутилката, както е показано във фигура 2, с водно-смукателната помпа, съд 2 се потопява в разтвора съобразно раздел 4.7. Колоната се пълни чрез затваряне на стопиращия кран; впоследствие двата съда се отстраняват.+++++ TIFF +++++Фигура 2Условия за силилиранеВодно-смукателна помпаСтопиращ кранСъд 1Съд 2Диметилдихл-орсилан + туленСтъклена колонаКолоната се поставя в изправено положение и се пълни изцяло с разтвора на диметилдихлорсилан с помощта на капкомер.След 20—30 min Woulff-бутилката се заменя от колба с филтър и колоната се изпразва чрез свързването й с водно-смукателната помпа (виж фигура 3).6.2. Пълнене на колонатаТова се изпълнява чрез последователно изплакване с използване на 75 ml толуол и 50 ml метанол; след това, изпразнената колона се изсушава в сушилнята при 100 °C за приблизително 30 минути.+++++ TIFF +++++Фигура 3Условия за изплакванеСъд 1Водно-смукателна помпаСъд 2Измиващ агентФилтърна колбаСтъклена колонаЗа пълнене на колоната се използва начинът, представен във фигура 1. Съобразно 4.9, стационарната фаза се пълни в пластмасовата колона до маркировката. Долният край на стъклената колона, който следва да се напълни, се затваря със запушалка от стъклена вата, дълга приблизително 1 см., която преди това е била силилирана и пресована чрез използването на стоманена пръчка. След това, краят на колоната се затваря с филтъра съобразно раздел 5.3.2.Колоната се пълни под налягане (3 bar, with N2) със стационарната фаза. За да се получи еднакво, непрекъснато и стабилно обвиване, нагоре и надолу по стъклената колона, докато се пълни, се движи вибратор.След напълването, към другия край на обвитата колона се притиска плътна запушалка от силилирана стъклена вата, издадените краища се изрязват и запушалката се притиска няколко милиметра в колоната със шпатула.6.3. Подготовка на пробитеЗа подготовка на пробите се използва един от следните три метода:6.3.1. Изолиране на млечната мазнина от маслоОт 5 до 10 g масло се стопяват в подходящ съд във водна баня съобразно раздел 5.7 при 50 °C.50 ml Erlenmeyer-колба и фуния с поставен филтър съобразно раздел 5.14 се загряват в сушилнята до 50 °C. Слоят мазнина на пробата от стопено масло се филтрира чрез използването на предварително загрято устройство.Такава млечна мазнина е почти без фосфолипиди.6.3.2. Екстракция на фракцията мазнина съобразно Röse-Gottlieb-методаЕкстракцията се извършва или в съответствие с IDF стандарт 1 C: 1987, 16C: 1987, 116A: 1987 или 22B: 1987.С такава млечна мазнина, фосфолипидите позволяват получаването на пик на холестерола, който е увеличен с приблизително 0,1 %.Триглицеридният спектър, стандартизиран до 100 с холестерола, е повлиян от това само до незначителна степен.6.3.3. Екстракция от мляко чрез използване на колони с кварцов гел0,7 ml от проба мляко, темперирана до 20 °C, се поставят в 1 до 3 ml Extrelut-колона с милилитров капкомер съобразно раздел 5.4 и се оставя да се разпространят еднакво върху кварцовия гел за приблизително пет минути.За денатурирането на съвкупността от протеин и липид, с капкомер се добавя 1,5 ml метанол. Впоследствие се извършва екстракция от пробата с 20 ml n-хаксан. n-хексанът се добавя бавно на малки количества и отцеждащият се разтворител се събира в 50 ml колба с кръгло дъно, която е била изсушена до константно, известно тегло.След екстракцията колоната се оставя празна.Разтворителите се дестилират от елюента в ротативен изпарител на температура на водна баня от 40 до 50 °C.Колбата се изсушава и утайката от мазнини се претегля.Бележка: Методът за екстракция на мазнина според Gerber, Weibull-Berntrop, Schmid-Bondzynski-Ratzlaff или изолирането на млечна мазнина чрез използване на детергенти (метод BDI) не са подходящи за триглицериден анализ, тъй като с тези методи във фазата на мазнината могат да преминат повече или по-малко големи количества частични глицериди или фосфолипиди.6.4. Подготовка на разтвора на пробатаЗа газова хроматография се използва 5 %-ен разтвор на мазнината в n-хептан, получен съобразно раздел 6.3. За подготовката на този разтвор на пробата се измерват съответстващи количества от материала на пробата, получен съобразно раздели 6.3.1 и 6.3.2, и се разтварят в съответни количества n-хептан.С подготовката на пробата съобразно раздел 6.3.3, количеството n-heptane, което следва да се добави към материала на пробата в колбата, се изчислява чрез претегляне, а остатъкът се разтваря.Приблизително 1 ml от разтвора на пробата се пълни в ампула съобразно раздел 5.16.6.5. Хроматографско определяне на триглицеридС високите температури до 350 °C за отмиване на дългата верига триглицериди C52—C56, лесно се появява увеличение на основната стойност, по-специално ако в началото колоните не са били адекватно поставени. Това увеличение на основната стойност при високи температури може да бъде изцяло предотвратено чрез комбинирането на две колони или изваждането на основната стойност.За компенсиращия начин или работата с единични колони, както и за стъклените вложки в инжектора и в детектора, следва да бъдат използвани графитните уплътнения съобразно раздел 5.5.6.5.1. Коригиране на основната стойностЗа да се избегне увеличаване на основната стойност, се използва един от следните четири метода:6.5.1.1. Комбиниране на колониДве обвити колони се използват по компенсиращ се начин.6.5.1.2. Коригиране на основната стойност чрез газовия хроматографУвеличаването на основната стойност може да се избегне чрез прилагане на серия от газовия хроматограф без инжектиране на разтвор мазнина и последващо извличане на натрупаната основна стойност.6.5.1.3. Коригиране на основната стойност чрез софтуер за интераграцияУвеличаването на основната стойност може да се избегне чрез прилагане на серия от интеграционната система без инжектиране на разтвор мазнина и последващо извличане на натрупаната основна стойност.6.5.1.4. Коригиране на основната стойност с подходящо предварително третиранеС адекватното първоначално поставяне на колоната и приблизително 20 инжекции с разтвори на млечна мазнина, увеличаването на основната стойност при високи температури е често толкова малко, че коригиранията на основната стойност не са необходими.6.5.2. Техника за инжектиранеЗа да се избегнат дискриминиращи ефекти, техниката на "гореща инжекция" се прилага за постигането на по-добри количествени резултати с триглицеридните компоненти, кипящи при високи температури. Тук, разтворът на мазнината е изтеглен в спринцовката и студената игла на спринцовката е затоплена преди инжектирането за прилблизитено три секунди в в инжекторния блок. След това, съдържанието на спринцовката се инжектира бързо.Бележка: С тази техника за инжектиране се намалява рискът от фракциониране вътре в спринцовката или инжекционния блок. Не се прилага директно инжектиране "върху колоната" в горната, разширена нагрята част на колоната, тъй като парчетата на преградата, които се събират тук, както и замърсяванията могат лесно да бъдат елиминирани с използваната техника чрез регулярно сменяне на инжекторната вложка, без да се демонтира колоната.Извиването на края на иглата, причинено от докосване дъното на бехеровата чаша с пробата (дори и ако едва се вижда с просто око) трябва да бъде абсолютно избягвано, с оглед да не се уврежда преградата.+++++ TIFF +++++Фигура 4Триглицеридна хроматограма на проба от млечна мазнина383652(a)50404842344644543230Chol.2826(б)(a)лошо разтваряне в резултат на повреждане на преградата(б)добро разтваряне6.5.3. Предварително третиране на обвита колонаПо време на стъпките от a) до в), върхът на колоната не е свързан с детектора, за да се избегне замърсяване.Напълните колони съобразно раздел 6.2 се третират, както следва:a) 15 min с 40 ml/min N2-струя при 50 °C;б) загряване с 1 K/min до 355 °Cat 10ml N2/min;в) фаза на задържане от 12 до 15 часа при 355 °C;г) две инжекции от 1 µl от разтвора на какаово масло съобразно раздел 4.10 и съответната температурна програма;д) 20 инжекции от 0,5 µm от разтвор на млечна мазнина за два до три дни съобразно раздел 6.4.Бележка: Какаовото масло се състои почти изключително от кипящи при висока температура C5O до C56 триглицериди. Инжекцията с какаово масло служи за специално предварително третиране в този обхват на дългата верига. С кипящите при висока температура C5O до C54 триглицериди, могат да възникнат частично коефициенти на влияние до приблизително 1,20. Обичайно, с повторна инжекция на разтвор на млечна мазнина може да се очаква намаляване на първоначално високите коефициенти на влияние за C50 до C54. С триглицериди с ниско ацил-c число, коефициентите се доближават до 1. Подготвят се три двойки, съответно на напълнените колони съобразно раздел 6.2. Предварително третираните колони се проверяват, съответно с анализ на млечната мазнина за рутинно тестване.Използва се двойката с най-добрите количествени резултати (коефициенти на влияние почти 1). Колоната не се използва с коефициенти на влияние > 1,20.6.5.4. КалибриранеЗа калибрирането би следвало да бъдат определени коефициенти на влияние на съответстващите триглицериди, както и на холестерола на млечна мазнина (стандартизирана мазнина) чрез използването на стандартизираните триглицериди (поне наситените триглицериди C24, C30, C36, C42, C48 и C54, както и холестерол; още по-добре, допълнително C50 и C52). Междинните коефициенти на влияние могат да бъдат открити чрез математическа интерполация.Всеки ден трябва да бъдат извършвани от две до три калибрирания при използване на стандартизираната мазнина. Ако се получават почти идентични резултати, количествени резултати с добро възпроизвеждане се постигат с триглицериден анализ на пробите.Стандартизираната млечна мазнина има годност от няколко месеца при максимална температура на съхранение от –18 °C и така може да бъде използвана като стандарт.Бележка: Коефициентът на влияние на всяка съставка може също да бъде определен чрез използвана на стандартизирана мазнина със сертифициран триглицириден състав, такъв като CRM519 (безводна млечна мазнина), от Института за референтни материали и метрология, Geel, Белгия.6.5.5. Температурна програма, носещ газ и други условия за триглицериден анализтемпературна програма: първоначална температура на колоната от 210 °C, поддържана за една минута, след това се програмира при 6 °C/min до 350 °C и се поддържа при крайната температура за пет минути.Температура на детектора и инжектора: 370 °C, съответно.Бележка: Температурите (първоначална температура) на детектора, инжектора и пещта би следвало да бъдат поддържани на константно ниво (също и през нощта, почивните и празничните дни).Носещ газ: азот, поток от 40 ml/minБележка: Ако се използват 80 см. колони, потокът трябва да бъде най-малко 75 ml/min N2. Потокът на носещия газ трябва да се поддържа константен (също и през нощта, почивните и празничните дни). Потокът от носещ газ трябва да се регулира толкова точно, че C54 да се разтваря при 341 °C, независимо от дължината на колоната.Времетраене на анализа: 29,3 минути.Обем на инжектиране: 0,5 µl.Бележка: След всяко инжектиране, спринцовката трябва се измива няколко пъти с чист хептан.FID- условия: в съответствие с раздел 5.1Бележка: Детекторът за йонизация на пламък се загрява в началото на веки работен ден.7. Интеграция, оценка и контрол на условията за измерванеТриглицериди с нечетно ацил-c число (2n + 1) се комбинират с предходното по-малко четно число триглицерид (2n). Ниските съдържания на C56, с по-малка граница на възпроизвеждане, не се вземат под внимание. Оставащите триглицериди (пикова повърхност) в хроматограмата, включително холестерол (с пик близо до C24) се умножават със съответните коефициенти на влияние на стандартната мазнина (последно калибриране) и заедно се нормализират до 100. Освен свободният холестерол, по този начин се оценяват и триглицеридите C24, C26, C28, C30, C32, C34, C36, C38, C40, C42, C44, C46, C48, C50, C52 и C54. Резултатите се изразяват в тегловни проценти (г./100 г.).Оценката на хроматограмните пикове би следвало да бъде извършвана с интегратор, с който може да бъде показвана основаната линия. Възможна е ре-интеграция с оптимизирани параметри на интеграцията.Фигури 5 и 6 показват два примера на триглицеридни хроматограми. Фигура 5 показва хроматограма, която може да бъде оценена добре, докато фигура 6 представлява спорадична грешка в областта от C50 до C54, като основната линия се движи неправилно, в сравнение с фигура 5. Такива типични грешки могат да бъдат откривани с по-голяма сигурност, както и да бъдат избягвани, само с използването на интегратор, с който се показва основната линия.+++++ TIFF +++++Фигура 5Лесна за оценка триглицеридна хроматограма на млечна мазнина, с начертана основна линияC38C52C50C40C36C48C46C42C44C34C54C32C30Chol.C28C26C24+++++ TIFF +++++Фигура 6Грешно интегрирана хроматограма на млечна мазнинаC38C52C50C40C36C48C46C42C44C54C34C32Chol.C30C28C26C24неправилна интеграцияЗа контролирането на условията на измерване, за различните триглицериди могат да бъдат използвани относителните стандартни отклонения (RSD: коефициент на отклонение ×100), дадени в таблица 1. Те бяха изчислени от 19 последователни анализа на една и съща млечна мазнина.Таблица 1Относителни стандартни отклонения (RSD) на триглицеридни съдържания (n = 19)Триглицерид | RSD (%) |C24 | 10,00 |C26 | 2,69 |C28 | 3,03 |C30 | 1,76 |C32 | 1,03 |C34 | 0,79 |C36 | 0,25 |C38 | 0,42 |C40 | 0,20 |C42 | 0,26 |C44 | 0,34 |C46 | 0,37 |C48 | 0,53 |C50 | 0,38 |C52 | 0,54 |C54 | 0,60 |Ако RSD-стойностите са значително по-високи от стойностите в таблица 1, то хроматографските условия не са подходящи и преградите или потокът носещ газ трябва да бъдат проверени. В допълнение, малки частици на преградата може да са образували отлагания върху стъклената вата на входа на колоната може да е станала негодна за използване в резултат на износване, температурни влияния и пр. (виж фигура 3).Бележка: Дадените в таблица 1 стойности не са задължителни, но са индикативни за целите на качествения контрол. Ако, обаче, се приемат по-високи RSD-стойности, границите на повторяемост и на възпроизвеждане, дадени в точка 11, трябва да бъдат съблюдавани.8. Качествено откриване на чужди мазниниЗа откриването на чужди мазнини бяха разработени формулите на триглицерид (таблица 2) с S-граници (таблица 3), в които S-стойностите на чистите млечни мазнини могат да варират. Ако тези граници се надвишават, то се предполага наличието на чужда мазнина.Най-чувствителната формула за откриване прибавянето на свинска мас е, например:Бележка: Чрез използването на 755 различни проби на млечна мазнина бе определен 99 %-ен обхват на сигурност на S = 97,96 – 102,04 за проби на чиста млечна мазнина със стандартно отклонение за всички S-стойности SD = 0,39897.Изхождайки от триглицеридния състав на проба на неизвестна мазнина, такава формула позволява, без използването на компютър, да се провери по прост начин дали сумата на триглицеридните съдържания, предвидени тук със съответните коефициенти, попада извън обхвата от 97,96—102,04 и дали, по всяка вероятност, става въпрос за прибавяне на чужда мазнина.Таблица 2 показва различни триглицеридни формули за откриването на различни чужди мазнини. За откриването на соево олио, слънчогледово олио, зехтин, рапично олио, ленено олио, житно олио, царевично олио, олио от памук и хидрирано рибно олио, за кокосова и палмова мазнина, както и за палмово олио и говежда лой, може да бъде използвана обща формула.Тъй като триглицеридният състав на чуждите мазнини е също предмет на вариации, бяха използвани до четири различни, експериментално измерени триглицеридни данни на чужда мазнина от един и същ тип. (Към едни и същи типове чужда мазнина е взета е предвид най-малко благоприятната граница (виж таблица 4)).Със следната "обща формула", за всички чужди мазнини могат да бъдат получени по подобен начин добри резултати:Изчисленията за откриването на всякакви комбинации на чужда мазнина в млечна мазнина показват, че напр. въпреки ниската граница с дадената в таблица 2 формула на свинска мас, а именно от 2,7 %, други мазнини като кокосова мазнина, палмово олио или палмова мазнина с граници на откриване, съответно от 26,8, 12,5 и 19,3 %, могат да бъдат открити с тази формула, само ако към млечната мазнина са добавени изключително големи количества. Това се прилага и за други формули в таблица 2.Таблица 2Триглицеридни формули за откриване на различни чужди мазнини в млечна мазнина, с индикиране на стандартните отклонения SD за SФормула за соево олио, слънчогледово олио, зехтин, рапично олио, ленено олио, житно олио, царевично олио, олио от памук и рибно олиоФормула за кокосова и палмова мазнинаФормула за палмово олио и говежда лойФормула за свинска масПоради това, за проверката на проба на непозната мазнина трябва да бъдат използвани всички формули, дадени в таблица 2, и общата формула (2), ако пробата по всяка вероятност е смес от млечна мазнина и една от 14 различни чужди мазнини или комбинация от тези чужди мазнини. Ако при анализирането на триглицерида на проба мазнина се получава S-стойност, която при само една от петте формули попада извън обхватите на таблица 3, то тогава пробата най-вероятно е модифицирана млечна мазнина. Откриването на чужда мазнина в млечна мазнина посредством една от четирите формули в таблица 2 не позволява да бъдат направени заключения за типа комбинация от чужди мазнини.Таблица 3S-граници за млечни мазниниФормула за откриване на | Обхват на S-стойностите |соево олио, слънчогледово олио, зехтин, рапично олио, ленено олио, житно олио, царевично олио, олио от памук и рибно олио | 98,05–101,95 |кокосова и палмова мазнина | 99,42–100,58 |палмово олио и говежда лой | 95,90–104,10 |свинска мас | 97,96–102,04 |обща формула | 95,68–104,32 |В таблица 4, границите на откриване за различните чужди мазнини са дадени с 99 % сигурност. Първата колона показва минималните граници на откриване за най-добрата формула за млечна мазнина в таблица 2. Във втората колона са дадени границите на откриване за общата формула. Въпреки, че границите са в известна степен по-високи, само тази формула е необходима за откриване на малко по-големи количества чужди мазнини. С всички формули могат да бъдат откривани и комбинации на различни чужди мазнини. Обхватите на вариране на триглицеридите на различни чужди мазнини от един тип нямат значително влияние върху границите на откриване.Таблица 499 % граници на откриване чрез прибавяне на чужда мазнина към млечна мазнина в %| Идивидуална формула | Обща формула |Соево олио | 2,1 | 4,4 |Слънчогледово олио | 2,3 | 4,8 |зехтин | 2,4 | 4,7 |Кокосова мазнина | 3,5 | 4,3 |Палмово олио | 4,4 | 4,7 |Палмова мазнина | 4,6 | 5,9 |Рапично олио | 2,0 | 4,4 |Ленено олио | 2,0 | 4,0 |Житно олио | 2,7 | 6,4 |Царевично олио | 2,2 | 4,5 |Олио от памук | 3,3 | 4,4 |Свинска мас | 2,7 | 4,7 |Говежда лой | 5,2 | 5,4 |Хидрирано рибно олио | 5,4 | 6,1 |Бележка: S-обхватите се изчисляват по такъв начин, че наличието на чужда мазнина се предполага, ако границите на индивидуалната формула са надвишени (виж таблица 4).9. Количествено определяне на чужда мазнинаС оглед да се получи количествена информация за съдържанието на чужда мазнина в проба млечна мазнина, се използва следната формула:X= 100·100 – Sкъдето: X е количеството на неизвестна чужда мазнина или смес от чужди мазнини в непозната млечна мазнина. S резултира от прибавянето на непозната чужда мазнина чрез внасянето на триглицериди на сместа от чужди мазнини/млечна мазнина в горната триглицеридна формула. Ако към млечната мазнина се прибави непозната чужда мазнина, средната S-стойност на различните чужди мазнини за общата формула е избрана за SF; тази средна S-стойност е получена чрез внасянето на триглицеридните данни на чистите чужди мазнини в тази формула и чрез изчисляването на средна стойност (SF = 7,46). Добри количествени резултати за всички прибавяния на чужда мазнина се получават и чрез използване на формулата за палмово олио/говежда лой (таблица 2) и средната SF-стойност от 10,57.При познати типове чужда мазнина, в горната формула трябва да бъдат внесени следните SF-стойности, като трябва да бъде избрана съответната формула за чужда мазнина от таблица 2:Таблица 5SF-стойности на различни чужди мазниниЧужда мазнина | SF |Соево олио | 8,18 |Слънчогледово олио | 9,43 |Зехтин | 12,75 |Кокосова мазнина | 118,13 |Палмово масло | 7,55 |Палмова мазнина | 112,32 |Рапично олио | 3,30 |Ленено олио | 4,44 |Житно олио | 27,45 |Царевично олио | 9,29 |Олио от памук | 41,18 |Свинска мас | 177,55 |Говежда лой | 17,56 |Рибно олио | 64,12 |10. Обхват на приложение на метода за откриванеОписаният метод се прилага към непакетирани млека и се базира на представителността на пробите млечна мазнина.Би било възможно много специфично откриване, ако за представителен брой млечни мазнини се извеждат формули, както са описани по-горе, за различните страни.По-конкретно, би могло да има подходящи възможности за откриването, ако формулите, както са описани тук, за различните страни са съставени от представителен брой млечни мазнини. В този случай не се изисква използването на сложни компютърни програми, ако се прилагат триглицеридните комбинации, използвани в таблица 2, и коефициентите се определят отново чрез използването на метода на най-малкия квадрат.При прилагането на S-обхватите, както е показано в таблица 3, формулите се прилагат по принцип при конкретни условия на хранене, като например недохранване или хранене на кравите с хранителна мая или Ca-сапуни. Само в случай на извънредни условия на хранене (напр. поемане на големи количества чисти мазнини в храна, използване на големи количества Ca-сапуни, комбинирани с мазнина в храна и пр.), формулите показват частично наличието на модифицирана млечна мазнина.Бележка: По принцип, фракционираните млечни мазнини се признават като немодифицирана млечна мазнина, ако модификацията се предполага само на базата на превишение на границите. Формулите показват модификация само с фракционирани млечни мазнини с необичаен състав на млечна мазнина, какъвто е напр. случаят с твърда фракция, получена с фракциониране чрез физични методи при високи температури от приблизително 30 °C и с ниски резултати от няколко процента, или с фракциониране със свръхкритичен CO2.Фракционирането на млечната мазнина може, обаче, да бъде открито чрез използване на други процедури, напр. диференциално-сканираща-калориметрия.11. Точност на методаИзползваната млечна мазнина се определя на базата на формулите от таблица 2 и S-обхватите в таблица 3.11.1. ПовторяемостРазлика на S-стойностите от две определяния, извършени в рамките на възможно най-краткия срок от един оператор при използване на същата процедура, върху идентичен материал на пробата и при същите условия (същото лице, същите инструменти/същите уреди, същата лаборатория):Таблица 6Граници на повторяемост (r) за различните формулиФормула за откриване на | r |соево олио, слънчогледово олио, зехтин, рапично олио, ленено олио, житно олио, царевично олио, олио от памук и рибно олио | 0,67 |кокосова и палмова мазнина | 0,12 |палмово олио и говежда лой | 1,20 |свинска мас | 0,58 |обща формула | 1,49 |11.2. ВъзпроизвежданеРазлика на S-стойностите от две определяния, извършени от оператори в различни лаборатории, при използване на същата процедура върху идентичен материал на пробата и при различни условия (различно лице, различни инструменти) по различно време.Таблица 7Граници за възпроизвеждане (R) за различните формулиФормула за откриване на | R |соево олио, слънчогледово олио, зехтин, рапично олио, ленено олио, житно олио, царевично олио, олио от памук и рибно олио | 1,08 |кокосова и палмова мазнина | 0,40 |палмово олио и говежда лой | 1,81 |свинска мас | 0,60 |обща формула | 2,07 |11.3. Критична разликаКритичните разлики за всички S-обхвати на таблица 3 могат да бъдат изчислени (двойни анализи) с границите на повторяемост (r) и на възпроизвеждането (R). Съответните стойности са дадени в таблица 8.Таблица 8Критични разлики за всички триглицеридни формулиФормула за откриване на | обхват |соево олио, слънчогледово олио, зехтин, рапично олио, ленено олио, житно олио, царевично олио, олио от памук и рибно олио | 97,43 – 102,57 |кокосова и палмова мазнина | 99,14 – 100,86 |палмово олио и говежда лой | 94,91 – 105,09 |свинска мас | 97,65 – 102,35 |обща формула | 94,58 – 105,42 |11.4. Приемливост на резултатитеВсички калибрирани със закръгление до втория десетичен знак триглицеридни съдържания на C24, C26, C28 до C54, както и холестерол, трябва да бъдат нормализирани точно до 100.Резултатите на двойния анализ се използват като проверка за повторяемостта. Ако абсолютната разлика между двата S-резултата за всичките пет триглицеридни формули не преминава границите на повторяемост r в таблица 6, то тогава изискването за повторяемост е изпълнено.За контрол върху оптималните условия за газова хроматография, и по-специално качеството на колоната, би следвало да се гарантира, че с 10 повтарящи се серии разликата между максималната и минималната S-стойности на всичките пет триглицеридни формули няма да надвишава обхватът x ·r, като x = 1,58 (за 10 серии, виж позоваване (16)), и границите на повторяемост r за различните формули в таблица 6.12. Цитирани стандартиDIN 10 336: 1994 | Nachweis und Bestimmung von Fremdfetten in Milchfett anhand einer gaschromatogгaphischen Triglyceridanalyse |IDF стандарт 1 C: 1987 | Мляко. Определяне на съдържанието на мазнини — Röse-Gottlieb- Gravimetric-метод |IDF стандарт 16C: 1987 | Сметана. Определяне на съдържанието на мазнини — Röse-Gottlieb- Gravimetric-метод |IDF стандарт 116A: 1987 | Ядивен лед и смеси от лед на млечна основа. Определяне на съдържанието на мазнини— Röse-Gottlieb Gravimetric-метод |IDF стандарт 22B: 1987 | Обезмаслено мляко, суроватка & мътеница. Определяне на съдържанието на мазнини— Röse-Gottlieb- Gavimetric-метод. |13. Позовавания1. Комисия на Европейските общности: Откриване на чужди мазнини в млечна мазнина чрез газов хроматографски триглицериден анализ, Doc. No VI/5202/90-EN, VI/2645/91.2. Комисия на Европейските общности: Контрол на чистота на мазнини в масло на 100 различни проби от различни периоди на хранене от 11 EО-страни; Doc. No VI/4577/93.3. Комисия на Европейските общности: Разглеждане на резултатите от първото, второто, третото, четвъртото, петото и шестото съвместно изпитание на: Определяне на триглицериди в млечна мазнина; Doc. No VI/2644/91, VI/8.11.91, VI/1919/92, VI/3842/92, VI/5317/92, VI/4604/93.4. Timms, R. E.: Откриване и определяне на количеството на немлечна мазнина в смеси от млечни и немлечни мазнини. Изследване в областта на млякото 47 295—303 (1980).5. Precht, D., Heine, K.: Nachweis von modifiziertem Milchfett mit der Triglyceridanalyse. 2. Fremdfettnachweis im Milchfett mit Hilfe von Triglyceridkombinationen, 41 406—410 (1986).6. Luf, W., Stock, A., Brandl, E.: Zum Nachweis von Fremdfett in Milchfett über die Triglylceridanalyse. Österr. Milchwirtsch. Wissensch. Beilag.e 5, 42 29—35 (1987).7. Precht, D.: Bestimmung. von pflanzlichen Fetten oder tierischen Depotfetten in Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 143—157 (1989).8. Precht, D.: Schnelle Extraktion von Milchfett, Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 119—128 (1990).9. Precht, D.: Schnelle gaschromatographische Triglyceridanalyse von Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 139—154 (1900).10. Precht, D.: Контрол на чистотата на млечна мазнина с газов хроматографски триглицериден анализ. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 43 (3) 219—242 (1991).11. Precht, D.: Откриване на подправена млечна мазнина чрез мастно киселинен и триглицериден анализ. Fat Sci. Technol. 93 538—544 (1991).12. Precht, D.: Откриване на чужда мазнина в млечна мазнина. I. Количествено откриване с триглицеридови формули. II. Количествена оценка на смеси от чужди мазнини. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 194 1—8, 107—114 (1992).13. Precht, D.: Газова хроматография на триглицерини и други липиди върху обвити колони в CRC Наръчник по хроматография: Анализ на липиди, стр. 123—138, Ed. K.D. Mukherjee, N. Weber, J. Sherma, CRC Press, Boca Raton (1993).14. Precht, D., Molkentin, J.: Количествен триглицериден анализ чрез използване на къси капилярни колони, Chrompack News 4 16—17 (1993).15. Molkentin, J., Precht, D.: Сравнение на обвити и капилярни колони за количествена газова хроматография на триглицериди в млечна мазнина. Хроматография 39 (5/6) 265—270 (1994).16. Stange, K.: Angewandte Statistik, Erster Teil, Eindimensionale Probleme, Springer-Verlag., Berlin, P. 378 (1970).[1] Подходящи методи вече са описани, виж D. Precht и J. Molkentin: Количествен анализ на триглицериди чрез използване на къси капилярни колони, Chrompack News 4, 16-17 (1993).[2] Подходящи продукти се намират в търговската мрежа.[3] Търговски имена, такива като напр. Extrelut, газ ChromQ, Chrompack, са примери за подходящи продукти, които се намират в специализираната търговска мрежа. Тази информация служи за по-лесното боравене със стандарта от потребителя и не представлява изискване за продукт. Индикацията на зърно бе включена като SI-единица µm съгласно BS 410:1988 "Британска спецификация на стандарта за тестови филтри".[4] ОВ L 37, 7.2.2001, стр. 86, бележка под .линия (3).--------------------------------------------------20010109ПРИЛОЖЕНИЕ XXVIСПИСЪК НА РЕГЛАМЕНТИТЕ, ПОСОЧЕНИ В ПЪРВОТО СЪОБРАЖЕНИЕ ОТ ПРЕАМБЮЛА- Регламент (ЕИО) № 1216/68 на Комисията от 9 август 1968 г. за установяването на метода за определяне на съдържанието на лактоза в комбинираните фуражи, внасяни от трети страни [1], изменен с Регламент (ЕИО) № 222/88 на Комисията от 22 декември 1987 г. за изменение на определени мерки за прилагането на общата организация на пазара в сектора на млякото и млечните продукти след въвеждането на Комбинираната номенклатура [2];- Регламент (ЕИО) № 3942/92 на Комисията от 22 декември 1992 г. за установяване на референтен метод за определянето на ситостерин и стигмастерол в масло за производство на маргарин [3], последно изменен с Регламент (ЕО) № 175/1999 на Комисията за изменение на Регламенти (ЕИО) № 3942/92, (ЕО) № 86/94, (ЕО) № 1082/96 и (ЕО) № 1459/98 за установяване на референтни методи за определянето на някои маркери за проследяване за масло, масло за производство на маргарин и сметана [4];- Регламент (ЕО) № 86/94 на Комисията от 19 януари 1994 г. за установяване на референтен метод за определянето на ситостерин и стигмастерол в масло [5], последно изменени с Регламент (ЕО) № 175/1999;- Регламент (ЕО) № 2721/95 на Комисията от 24 ноември 1995 г. относно установяване на правила за прилагането на референтни и рутинни методи за анализ и оценка на качеството на мляко и млечни продукти съгласно общата организация на пазара [6];- Регламент (ЕО) № 1080/96 на Комисията от 14 юни 1996 г. за установяване на референтен метод за откриването на форми на коли бактерии в масло, обезмаслено мляко на прах и казеин /казеинати [7];- Регламент (ЕО) № 1081/96 на Комисията от 14 юни 1996 г. за установяване на референтен метод за откриването на краве мляко и казеинати в сирена, произведени от овче мляко, козе мляко или биволско мляко или смеси от овче, козе и биволско мляко и за отмяна на Регламент (ЕИО) № 690/92 [8];- Регламент (ЕО) № 1082/96 на Комисията от 14 юни 1996 г. за установяване на референтен метод за откриването на етилов естер от бета-апо-8' каротинна киселина в концентрирано масло и масло [9], изменен с Регламент (ЕО) № 175/1999;- Регламент (ЕО) № 1854/96 на Комисията от 26 септември 1996 г. за установяване на списък от референтни методи, които следва да се прилагат за анализ и оценка на качеството на млякото и млечните продукти съгласно общата организация на пазара [10], изменен с Регламент (ЕО) № 881/1999 [11];- Регламент (ЕО) № 880/98 на Комисията от 24 април 1998 г. за установяване на референтен метод за определяне на съдържанието на вода, сухо вещество без мазнини и масленост в масло [12];- Регламент (ЕО) № 1459/98 на Комисията от 8 юли 1998 г. за установяване на референтен метод за определянето на ванилин в концентрирано масло, масло или сметана [13], последно изменен с Регламент (ЕО) № 175/1999.[1] ОВ L 198, 10.8.1968 г., стр. 13.[2] ОВ L 28, 1.2.1988 г., стр. 1.[3] ОВ L 399, 31.12.1992 г., стр. 29.[4] ОВ L 20, 27.1.1999 г., стр. 22.[5] ОВ L 17, 20.1.1994 г., стр. 7.[6] ОВ L 283, 25.11.1995 г., стр. 7.[7] ОВ L 142, 15.6.1996 г., стр. 13.[8] ОВ L 142, 15.6.1996 г., стр. 15.[9] ОВ L 142, 15.6.1996 г., стр. 26.[10] ОВ L 246, 27.9.1996 г., стр. 5.[11] ОВ L 111, 29.4.1999 г., стр. 24.[12] ОВ L 124, 25.4.1998 г., стр. 16.[13] ОВ L 193, 9.7.1998 г., стр. 16.--------------------------------------------------