CELEX: 32013R0051
Language: mt
Date: 2013-01-16 00:00:00
Title: Regolament tal-Kummissjoni (UE) Nru 51/2013 tas- 16 ta’ Jannar 2013 li jemenda r-Regolament (KE) Nru 152/2009 dwar il-metodi ta’ analiżi għad-determinazzjoni tal-kostitwenti ta’ oriġini mill-annimali għall-kontroll uffiċjali tal-għalf  Test b’relevanza għaż-ŻEE

23.1.2013   
            
            
               MT
            
            
               Il-Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea
            
            
               L 20/33
            
         REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (UE) Nru 51/2013
   tas-16 ta’ Jannar 2013
   li jemenda r-Regolament (KE) Nru 152/2009 dwar il-metodi ta’ analiżi għad-determinazzjoni tal-kostitwenti ta’ oriġini mill-annimali għall-kontroll uffiċjali tal-għalf
   (Test b’relevanza għaż-ŻEE)
   IL-KUMMISSJONI EWROPEA,
   Wara li kkunsidrat it-Trattat dwar il-Funzjonament tal-Unjoni Ewropea,
   Wara li kkunsidrat ir-Regolament (KE) Nru 882/2004 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tad-29 ta’ April 2004 dwar il-kontrolli uffiċjali mwettqa biex tiġi żgurata l-verifikazzjoni tal-konformità mal-liġi tal-għalf u l-ikel, mas-saħħa tal-annimali u mar-regoli dwar il-welfare tal-annimali (1), u b’mod partikolari l-Artikolu 11(4) tiegħu,
   Billi:
   
               (1)
            
            
               L-Artikolu 7(1) tar-Regolament (KE) Nru 999/2001 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta’ Mejju 2001 li jistabbilixxi regoli għall-prevenzjoni, kontroll u eradikazzjoni ta’ ċertu enċefalopatija sponġiformi li tinxtered (2), jipprovdi li l-għalf lir-ruminanti bi proteina li ġejja mill-annimali huwa pprojbit. Din il-projbizzjoni hija estiża għall-annimali għajr ir-ruminanti u ristretta, fir-rigward tal-għalf ta’ dawk l-annimali bi prodotti ta’ oriġini mill-annimali, skont l-Anness IV għal dak ir-Regolament.
            
         
               (2)
            
            
               L-Artikolu 11(1) tar-Regolament (KE) Nru 1069/2009 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tal-21 ta’ Ottubru 2009 li jistabbilixxi regoli tas-saħħa li jirrigwardaw prodotti sekondarji tal-annimali jew derivati minnhom mhux maħsuba għall-konsum mill-bniedem u li jħassar ir-Regolament (KE) Nru 1774/2002 (3) jipprojbixxi l-għalf tal-annimali terrestri ta’ speċi partikolari għajr l-annimali bil-fer bi proteina pproċessata tal-annimali li ġejja minn iġsma jew partijiet ta’ iġsma tal-annimali tal-istess speċi, kif ukoll l-għalf tal-ħut ikkultivat bi proteina pproċessata tal-annimali li ġejja minn iġsma jew partijiet ta’ iġsma tal-ħut ikkultivat tal-istess speċi.
            
         
               (3)
            
            
               Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 152/2009 tas-27 ta’ Jannar 2009 li jistabbilixxi l-metodi tat-teħid ta’ kampjuni u analiżi għall-kontroll uffiċjali tal-għalf (4) jistabilixxi fl-Anness VI tiegħu l-metodi ta’ analiżi għad-determinazzjoni tal-kostitwenti ta’ oriġini mill-annimali għall-kontroll uffiċjali tal-għalf. Il-metodu mikroskopiku, li bħalissa huwa l-uniku metodu vvalidat biex tiġi individwata l-preżenza ta’ proteini tal-annimali fl-għalf, huwa kapaċi jiddistingwi l-preżenza ta’ kostitwenti li ġejjin mill-annimali terrestri mill-preżenza ta’ kostitwenti li ġejjin mill-ħut, iżda mhuwiex kapaċi jikkwantifika b’livell suffiċjenti ta’ preċiżjoni l-ammont ta’ kostitwenti mill-annimali preżenti fl-għalf, u għalhekk ma għandux jintuża għal dan l-iskop.
            
         
               (4)
            
            
               Metodu ġdid tal-iskoperta tal-individwazzjoni tal-kostitwenti mill-annimali msejjes fuq reazzjoni katina tal-polimerażi (PCR) kien ivvalidat mil-laboratorju ta’ referenza tal-UE għall-proteini tal-annimali fl-għalf. L-istudju ta’ implimentazzjoni, organizzat mal-laboratorji ta’ referenza nazzjonali tal-Istati Membri, wera li l-metodu ġdid huwa robust biżżejjed biex jintuża bħala metodu ta’ kontroll uffiċjali fl-Unjoni. Dan il-metodu ġdid jista’ jindividwa l-preżenza ta’ kostitwenti mill-annimali fl-għalf, u jista’ wkoll jidentifika l-oriġini tal-ispeċi ta’ dawn il-kostitwenti. L-użu ta’ dan il-metodu ġdid flimkien mal-metodu mikroskopiku jew minfloku, skont kif xieraq, ikun siewi ferm għall-kontroll tal-implimentazzjoni korretta tal-projbizzjonijiet relatati mal-għalf stabbiliti fir-Regolamenti (KE) Nru 999/2001 u (KE) Nru 1069/2009.
            
         
               (5)
            
            
               L-Anness VI għar-Regolament (KE) Nru 152/2009 għandu għalhekk jiġi sostitwit skont dan.
            
         
               (6)
            
            
               Il-miżuri stipulati f’dan ir-Regolament huma skont l-opinjoni tal-Kumitat Permanenti dwar il-Katina Alimentari u s-Saħħa tal-Annimali u la l-Parlament Ewropew u lanqas il-Kunsill ma opponewhom,
            
         ADOTTAT DAN IR-REGOLAMENT:
   Artikolu 1
   L-Anness VI għar-Regolament (KE) Nru 152/2009 qed jiġi sostitwit bit-test stabbilit fl-Anness għal dan ir-Regolament.
   Artikolu 2
   Dan ir-Regolament għandu jidħol fis-seħħ fl-għoxrin jum wara dak tal-pubblikazzjoni tiegħu f’Il-Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea.
   
      Dan ir-Regolament għandu jorbot fl-intier tiegħu u japplika direttament fl-Istati Membri kollha.
      Magħmul fi Brussell, is-16 ta’ Jannar 2013.
      
         
            Għall-Kummissjoni
         
         
            Il-President
         
         José Manuel BARROSO
      
   
   
      (1)  ĠU L 165, 30.4.2004, p. 1.
   
      (2)  ĠU L 147, 31.5.2001, p. 1.
   
      (3)  ĠU L 300, 14.11.2009, p. 1.
   
      (4)  ĠU L 54, 26.2.2009, p. 1.
   
      ANNESS
      
         
            “ANNESS VI
            
               METODI TA’ ANALIŻI GĦAD-DETERMINAZZJONI TAl-KOSTITWENTI TA’ ORIĠINI MILL-ANNIMALI GĦALL-KONTROLL UFFIĊJALI TAL-GĦALF
            
            1.   L-GĦAN U L-KAMP TA’ APPLIKAZZJONI
            Id-determinazzjoni tal-kostitwenti tal-oriġini mill-annimali fl-għalf għandha ssir permezz ta’ mikroskopija ottika jew ta’ reazzjoni katina tal-polimerażi (PCR) skont id-dispożizzjonijiet stabbiliti f’dan l-Anness.
            Dawn iż-żewġ metodi jagħmluha possibbli li tiġi individwata l-preżenza tal-kostitwenti tal-oriġini mill-annimali f’materjali tal-għalf u fl-għalf kompost. Madankollu, dawn ma jagħmluhiex possibbli li jiġi kkalkolat l-ammont ta’ dawn il-kostitwenti fil-materjali tal-għalf u fl-għalf kompost. Iż-żewġ metodi għandhom limitu ta’ individwazzjoni ta’ inqas minn 0,1 % (w/w).
            Il-metodu PCR jagħmilha possibbli li jiġi identifikat il-grupp tassonomiku tal-kostitwenti ta’ oriġini mill-annimali preżenti fil-materjali tal-għalf u fl-għalf kompost.
            Dawn il-metodi għandhom japplikaw għall-kontroll tal-applikazzjoni tal-projbizzjonijiet stabbiliti fl-Artikolu 7(1) u fl-Anness IV għar-Regolament (KE) Nru 999/2001 u fl-Artikolu 11(1) tar-Regolament (KE) Nru 1069/2009.
            Skont it-tip ta’ għalf li qed jiġi ttestjat, dawn il-metodi jistgħu jintużaw, fi protokoll operazzjonali uniku wieħed, jew waħedhom jew flimkien skont il-proċeduri operattivi standard (SOP) stabbiliti mil-laboratorju ta’ referenza tal-UE għall-proteini tal-annimali fl-għalf (EURL-AP) u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu (1).
            2.   IL-METODI
            2.1.   Mikroskopija ottika
            
            2.1.1.   Il-prinċipju
            
            Il-kostitwenti ta’ oriġini mill-annimali li jistgħu jkunu preżenti fil-materjali tal-għalf u fl-għalf kompost mibgħuta għall-analiżi huma identifikati fuq il-bażi tal-karatteristiċi tipiċi u identifikabbli mikroskopikament bħall-fibri tal-muskoli u partiċelli oħra tal-laħam, il-qarquċa, l-għadam, il-qrun, ix-xagħar, il-lanżit, id-demm, ir-rix, il-qxur tal-bajd, ix-xewk u l-qxur tal-ħut.
            2.1.2.   Ir-reaġenti u t-tagħmir
            
            2.1.2.1.   Ir-reaġenti
            2.1.2.1.1.   Aġent ta’ konċentrazzjoni
            2.1.2.1.1.1.   Tetrakloroetilen (gravità speċifika 1,62)
            2.1.2.1.2.   Ir-reaġent għat-tilwin
            2.1.2.1.2.1.   Soluzzjoni tal-Aħmar tal-Aliżarina (dewweb 2,5 ml 1M aċidu idrokloriku f’100 ml ilma u żid 200 mg Aħmar Alżarin ma’ din is-soluzzjoni)
            2.1.2.1.3.   Il-mezzi tal-immuntar
            2.1.2.1.3.1.   Lissija (NaOH 2,5 % w/v jew KOH 2,5 % w/v)
            2.1.2.1.3.2.   Gliċerol (mhux dilwit, viskożità: 1 490 cP)
            2.1.2.1.3.3.   Norland ® Optical Adhesive 65 (viskożità: 1 200 cP) jew raża bi proprjetajiet ekwivalenti għall-preparazzjoni tas-slajd permanenti
            2.1.2.1.4.   Il-mezzi tal-immuntar bi proprjetajiet tat-tilwin
            2.1.2.1.4.1.   Is-soluzzjoni lugol (dewweb 2 g jodur tal-potassju f’100 ml ilma u żid 1 g jodur filwaqt li tħawwad ta’ spiss)
            2.1.2.1.4.2.   Ir-reaġent ċistina (2 g aċetat taċ-ċomb, 10 g NaOH/100 ml ilma)
            2.1.2.1.4.3.   Ir-reaġent Fehling (ippreparat qabel l-użu minn partijiet indaqs (1/1) ta’ żewġ soluzzjonijiet ewlenin A u B. Soluzzjoni A: Dewweb 6,9 g sulfat tar-ram (II) pentaidrat f’100 ml ilma. Soluzzjoni B: dewweb 34,6 g tartrat tal-potassju u tas-sodju, tetraidrat u 12 g NaOH f’100 ml ilma)
            2.1.2.1.4.4.   Tetrametilbenżidina/Perossidu tal-idroġenu. (dewweb 1 g 3,3’,5,5’ tetrametilbenżidina (TMB) f’100 ml aċidu aċetiku glaċjali u 150 ml ilma. Qabel l-użu, ħallat 4 partijiet ta’ din is-soluzzjoni TMB ma’ parti waħda 3 % perossidu tal-idroġenu)
            2.1.2.1.5.   L-aġenti tat-tlaħliħ
            2.1.2.1.5.1.   Etanol ≥ 96 % (grad tekniku)
            2.1.2.1.5.2.   Aċeton (grad tekniku)
            2.1.2.1.6.   Ir-reaġent għall-ibbliċjar
            2.1.2.1.6.1.   Is-soluzzjoni kummerċjali ipoklorit tas-sodju (9 – 14 % kloru attiv)
            2.1.2.2.   It-tagħmir
            2.1.2.2.1.   Miżien analitiku bi preċiżjoni ta’ 0,001 g
            2.1.2.2.2.   Tagħmir tat-tħin: mitħna - jew mehrież
            2.1.2.2.3.   Għeriebel bi xbieki kwadri ta’ 0,25 mm u 1 mm wisa’
            2.1.2.2.4.   Il-lenbut għas-separazzjoni koniku tal-ħġieġ b’kontenut ta’ 250 ml b’tapp tal-ħġieġ matt jew tat-Teflon fil-qiegħ tal-lenbut. Id-dijametru tal-fetħa tat-tapp għandu jkun ≥ 4 mm. Alternattivament, jista’ jintuża bekk bil-qiegħ koniku għall-ġbir tas-sediment b’kundizzjoni li l-laboratorju jkun wera li l-livelli ta’ individwazzjoni huma ekwivalenti għal dawk miksuba bl-użu tal-lenbut għas-separazzjoni koniku tal-ħġieġ.
            
               Il-lenbut għas-separazzjoni
            
            
               
            2.1.2.2.5.   L-isterjomikroskopju li jkopri mill-inqas firxa ta’ manjetizzazzjoni finali bejn 6,5 × u 40 ×
            2.1.2.2.6.   Mikroskopju kompost li jkopri mill-inqas firxa ta’ manjetizzazzjoni finali bejn 100 × u 400 × bi sfond ċar permezz tat-trażmissjoni tad-dawl. Jistgħu jintużaw ukoll id-dawl polarizzat u l-kuntrast interferenzjali differenzjali
            2.1.2.2.7.   L-oġġetti tal-ħġieġ standard tal-laboratorju
            2.1.2.2.8.   It-tagħmir għall-preparazzjoni tas-slajd: is-slajds tal-mikroskopju klassiċi, is-slajds vojta, il-coverslips (20 × 20 mm), il-pinzetti, l-ispatula fina
            2.1.3.   It-teħid ta’ kampjuni u l-preparazzjoni tal-kampjuni
            
            2.1.3.1.   It-teħid tal-kampjuni
            Għandu jintuża kampjun rappreżentattiv, meħud b’konformità mad-dispożizzjonijiet stabbiliti fl-Anness I.
            2.1.3.2.   Il-prekawzjonijiet li jridu jittieħdu
            Sabiex tiġi evitata t-transkontaminazzjoni tal-laboratorju, it-tagħmir kollu li jista’ jerġa’ jintuża għandu jitnaddaf bir-reqqa qabel ma jintuża. Il-biċċiet tal-lenbut għas-separazzjoni għandu jiġi żarmat qabel it-tindif. Il-biċċiet tal-lenbut għas-separazzjoni u l-oġġetti tal-ħġieġ għandhom jinħaslu minn qabel bl-idejn u mbagħad jinħaslu fil-magna tal-ħasil. L-għeriebel għandhom jitnaddfu permezz ta’ xkupilja bix-xagħar sintetiku u iebes. Huwa rrakomandat li l-għeriebel jitnaddfu bl-aċeton u bl-arja kkompressata wara t-tgħarbil tal-materjal xaħmi bħall-ħut mitħun.
            2.1.3.3.   Il-preparazzjoni tal-kampjuni għajr ix-xaħam jew iż-żejt
            2.1.3.3.1.   It-tnixxif tal-kampjun: il-kampjuni b’kontenut ta’ umdità > 14 % għandhom jitnixxfu qabel ma jiġu trattati.
            2.1.3.3.2.   Tgħarbil minn qabel tal-kampjun: Huwa rakkomandat it-tgħarbil minn qabel f’1 mm ta’ għalf granulat u qlub u biex sussegwentement jiġu ppreparati u analizzati ż-żewġ frazzjonijiet li rriżultaw bħala kampjuni distinti.
            2.1.3.3.3.   It-teħid ta’ sottokampjuni u t-tħin: għandu jittieħed is-sottokampjun ta’ mill-inqas 50 g tal-kampjun għall-analiżi u sussegwentement mitħun.
            2.1.3.3.4.   L-estrazzjoni u l-preparazzjoni tas-sediment: porzjon ta’ 10 g (bi preċiżjoni sa 0,01 g) tas-sottokampjun mitħun għandu jiġi trasferit fil-lenbut għas-separazzjoni jew fil-bekk bil-qiegħ koniku għall-ġbir tas-sediment u għandu jiġi miżjud 50 ml ta’ tetrakloroetilen. Il-porzjon trasferit fil-lenbut għandu jkun limitat għal 3 g fil-każ tal-ħut mitħun jew prodotti tal-annimali puri oħrajn, ingredjenti minerali jew taħlitiet lesti minn qabel li jiġġeneraw aktar minn 10 % tas-sediment. It-taħlita għandha tiġi mħawda vigorożament għal mill-inqas 30 sekonda u għandu jiġi miżjud bir-reqqa mill-inqas 50 ml aktar ta’ tetrakloroetilen waqt il-ħasil tal-wiċċ ta’ ġewwa tal-lenbut biex titneħħa kull partiċella li tkun imwaħħla. It-taħlita li tirriżulta għandha titħalla toqgħod għal mill-anqas 5 minuti qabel ma s-sediment jiġi sseparat billi jinfetaħ it-tapp.
            Jekk jintuża bekk bil-qiegħ koniku għall-ġbir tas-sediment, it-taħlita għandha mbagħad titħawwad vigorożament għal mill-anqas 15-il sekonda u kull partiċella mwaħħla mal-ġenb tal-bekk għandha tinħasel bir-reqqa biex titneħħa mill-wiċċ ta’ ġewwa b’mill-inqas 10 ml ta’ tetrakloroetilen nadif. It-taħlita għandha titħalla toqgħod għal 3 minuti u mbagħad terġa’ titħawwad għal 15-il sekonda u kull partiċella mal-ġenb tal-bekk għandha tinħasel bir-reqqa biex titneħħa minn mal-wiċċ ta’ ġewwa b’mill-inqas 10 ml ta’ tetrakloroetilen nadif. It-taħlita li tirriżulta għandha titħalla toqgħod għal mill-anqas 5 minuti u mbagħad il-frazzjoni likwida titneħħa u tintrama b’dikantazzjoni bir-reqqa, filwaqt li tingħata attenzjoni biex ma jintilef l-ebda sediment.
            Is-sediment għandu jitnixxef u sussegwentement jintiżen (bi preċiżjoni sa 0,001 g). Jekk aktar minn 5 % tas-sediment jikkonsisti f’partiċelli > 0,50 mm, dan għandu jintgħarbel f’0,25 mm u ż-żewġ frazzjonijiet li jirriżultaw għandhom jiġu eżaminati.
            2.1.3.3.5.   L-estrazzjoni u l-preparazzjoni tal-flotate: wara l-irkupru tas-sediment permezz tal-metodu deskritt hawn fuq, għandu jifdal żewġ fażijiet fil-lenbut għas-separazzjoni: waħda likwida magħmula minn tetrakloroetilen u waħda solida magħmula minn materjal li jżomm fil-wiċċ. Din il-fażi solida hija l-flotate u għandha tiġi rkuprata billi t-tetrakloroetilen jitferra ‘l barra kompletament mil-lenbut billi jinfetaħ it-tapp. Billi jinqaleb il-lenbut għas-separazzjoni, il-flotate għandu jiġi trasferit f’dixx Petri kbir u mnixxef bl-arja f’kabinett għad-dħaħen. Jekk aktar minn 5 % tal-flotate jikkonsisti f’partiċelli > 0,50 mm, dan għandu jintgħarbel f’0,25 mm u ż-żewġ frazzjonijiet li jirriżultaw għandhom jiġu eżaminati.
            2.1.3.3.6.   Preparazzjoni tal-materja prima: għandu jitħejja porzjon ta’ mill-anqas 5 g tas-sottokampjun mitħun. Jekk aktar minn 5 % tal-materjal jikkonsisti f’partiċelli > 0,50 mm, dan għandu jintgħarbel f’0,25 mm u ż-żewġ frazzjonijiet li jirriżultaw għandhom jiġu eżaminati.
            2.1.3.4.   Il-preparazzjoni ta’ kampjuni li jikkonsistu f’xaħam jew żejt
            Il-protokoll li ġej għandu jiġi segwit għall-preparazzjoni ta’ kampjuni li jikkonsistu f’xaħam jew żejt:
            
                        —
                     
                     
                        jekk ix-xaħam huwa solidu, dan għandu jiġi msaħħan fil-forn sakemm isir likwidu;
                     
                  
                        —
                     
                     
                        bl-użu ta’ pipetta, għandu jiġi trasferit 40 ml ta’ xaħam jew żejt mill-qiegħ tal-kampjun lejn tubu taċ-ċentrifugazzjoni;
                     
                  
                        —
                     
                     
                        iċċentrifuga għal 10 minuti f’4 000 r.p.m.;
                     
                  
                        —
                     
                     
                        jekk ix-xaħam ikun solidu wara ċ-ċentrifugazzjoni, dan għandu jiġi msaħħan fil-forn sakemm isir likwidu;
                     
                  
                        —
                     
                     
                        irrepeti ċ-ċentrifugazzjoni għal 5 minuti f’4 000 r.p.m.;
                     
                  
                        —
                     
                     
                        bl-użu ta’ mgħarfa żgħira jew spatula, għandhom jiġu trasferiti nofs l-impuritajiet dekantati għas-slajds mikroskopiċi għal eżami, u l-Gliċerol huwa rakkomandat bħala l-mezz tal-immuntar;
                     
                  
                        —
                     
                     
                        l-impuritajiet li jkun fadal għandhom jintużaw għall-preparazzjoni tas-sediment kif deskritt fil-punt 2.1.3.3..
                     
                  2.1.3.5.   L-użu ta’ reaġenti għat-tilwin
            Sabiex tiġi ffaċilitata l-identifikazzjoni korretta tal-kostitwenti tal-oriġini mill-annimali, l-operatur jista’ juża r-reaġenti għat-tilwin matul il-preparazzjoni tal-kampjun skont il-linji gwida maħruġa mill-EURL-AP u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu.
            Fil-każ li tintuża s-soluzzjoni tal-Aħmar tal-Aliżarina għat-tilwin tas-sediment, għandu japplika l-protokoll li ġej:
            
                        —
                     
                     
                        is-sediment imnixxef għandu jiġi trasferit f’test tube tal-ħġieġ u mlaħlaħ darbtejn b’madwar 5 ml ta’ etanol (kull darba għandu jintuża vortiċi ta’ 30 sekonda, is-solvent għandu jitħalla joqgħod għal madwar minuta u 30 sekonda u mbagħad imferra’ ‘l barra);
                     
                  
                        —
                     
                     
                        is-sediment għandu jiġi bbliċjat billi jiżdied mill-anqas 1 ml tas-soluzzjoni ipoklorit tas-sodju. Ir-reazzjoni għandha titħalla tissokta għal 10 min. It-tubu għandu jimtela bl-ilma, is-sediment għandu jitħalla joqgħod minn 2 sa 3 minuti, u l-ilma u l-partiċelli sospiżi għandhom jitferrgħu ‘l barra bil-mod;
                     
                  
                        —
                     
                     
                        is-sediment għandu jitlaħlaħ darbtejn aktar b’madwar 10 ml ta’ ilma (għandu jintuża vortiċi għal 30 sekonda, jitħalla joqgħod, u l-ilma jitferra’ ‘l barra kull darba);
                     
                  
                        —
                     
                     
                        Għandhom jiżdiedu bejn 2 u 10 taqtiriet tas-soluzzjoni tal-Aħmar tal-Aliżarina u t-taħlita għandha titħawwad bil-qawwi. Ir-reazzjoni għandha titħalla sseħħ għal 30 sekonda u s-sediment ikkulurit għandu jitlaħlaħ darbtejn b’madwar 5 ml etanol segwit bi tlaħliħa waħda bl-aċeton (kull darba għandu jintuża vortiċi ta’ 30 sekonda, is-solvent għandu jitħalla joqgħod għal madwar minuta u mferra’ ‘l barra);
                     
                  
                        —
                     
                     
                        is-sediment ikkulurit għandu jitnixxef.
                     
                  2.1.4.   L-eżami mikroskopiku
            
            2.1.4.1.   Il-preparazzjoni tas-slajd
            Għandhom jiġu ppreparati slajds mikroskopiċi mis-sediment u, skont l-għażla tal-operatur, jew mill-flotate jew mill-materja prima. Fil-każ li jintuża t-tgħarbil matul il-preparazzjoni tal-kampjun, għandhom jiġu ppreparati ż-żewġ frazzjonijiet li jirriżultaw (dik fina u dik mhux raffinata). Il-porzjonijiet tat-test ta’ frazzjonijiet mifruxa fuq is-slajds għandhom ikunu rappreżentattivi tal-frazzjoni sħiħa.
            Għandu jiġi ppreparat numru suffiċjenti ta’ slajds sabiex jiġi żgurat li jista’ jitwettaq il-protokoll ta’ eżami komplut kif stabbilit fil-punt 2.1.4.2.
            Is-slajds mikroskopiċi għandhom jiġu mmuntati bil-mezz tal-immuntar adegwat skont l-SOP stabbiliti mill-EURL-AP u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu. Is-slajds għandhom ikunu mgħottija b’coverslips.
            2.1.4.2.   Il-protokolli ta’ osservazzjoni għall-individwazzjoni ta’ partiċelli tal-annimali fl-għalf kompost u fil-materjal tal-għalf
            Is-slajds mikroskopiċi ppreparati għandhom jiġu osservati skont il-protokolli ta’ oservazzjoni stabbiliti fil-dijagramma 1 għall-għalf kompost u għall-materjali tal-għalf għajr il-ħut mitħun pur, jew fid-dijagramma 2 għall-ħut mitħun pur.
            L-osservazzjonijiet mikroskopiċi għandhom jitwettqu billi jintuża mikroskopju kompost fuq is-sediment u, skont l-għażla tal-operatur, jew fuq il-flotate jew fuq il-materja prima. L-isterjomikroskopju jista’ jintuża flimkien mal-mikroskopju kompost għall-frazzjonijiet mhux raffinati. Kull slajd għandha tiġi skrinjata kompletament f’diversi manjetizzazzjonijiet.
            In-numri minimi ta’ slajds li għandhom jiġu osservati f’kull stadju tal-protokoll ta’ osservazzjoni għandhom jiġu rrispettati rigorożament ħlief meta l-materjal kollu tal-frazzjoni ma jkunx jippermetti li jintlaħaq in-numru ta’ slajds stipulat. Għandhom jiġu osservati mhux aktar minn 6 slajds għal kull determinazzjoni.
            Sabiex tiġi ffaċilitata l-identifikazzjoni tan-natura u l-oriġini tal-partiċelli, l-operatur jista’ juża għodod ta’ appoġġ bħal sistemi ta’ appoġġ għad-deċiżjonijiet, il-libreriji tal-immaġnijiet u l-kampjuni ta’ referenza.
            
               Dijagramma 1
            
            
               Il-protokoll ta’ osservazzjoni għall-individwazzjoni ta’ partiċelli tal-annimali fl-għalf kompost u fil-materjal tal-għalf, għajr il-ħut mitħun
            
            
               Dijagramma 2
            
            
               Il-Protokoll ta’ osservazzjoni għall-individwazzjoni ta’ partiċelli tal-annimali fil-ħut mitħun
            
            2.1.4.3.   In-numru ta’ determinazzjonijiet
            Jekk wara li ssir l-ewwel determinazzjoni skont il-protokoll ta’ osservazzjoni stabbilit fid-dijagramma 1 jew fid-dijagramma 2 kif relevanti, ma tiġi individwata l-ebda partiċella tal-annimali ta’ natura partikolari (jiġifieri annimali terrestri jew ħut), ma tkun meħtieġa l-ebda determinazzjoni addizzjonali u r-riżultat tal-analiżi għandu jiġi rrappurtat billi tintuża t-terminoloġija stabbilita fil-punt 2.1.5.1.
            Jekk, wara li ssir l-ewwel determinazzjoni skont il-protokolli ta’ osservazzjoni stabbiliti fid-dijagramma 1 jew fid-dijagramma 2 kif relevanti, in-numru totali tal-partiċelli tal-annimali ta’ natura partikolari (jiġifieri annimali terrestri jew ħut) individwat ikun ivarja minn 1 sa 5, għandha ssir it-tieni determinazzjoni minn sottokampjun ġdid ta’ 50 g. Jekk, wara din it-tieni determinazzjoni, in-numru ta’ partiċelli tal-annimali ta’ din in-natura partikolari jkun ivarja minn 0 sa 5, ir-riżultat tal-analiżi għandu jiġi rrappurtat billi tinuża t-terminoloġija stabbilita fil-punt 2.1.5.2., jew inkella għandha ssir it-tielet determinazzjoni minn sottokampjun ġdid ta’ 50 g. Madankollu, jekk wara l-ewwel u t-tieni determinazzjoni, it-total ta’ partiċelli ta’ natura partikolari individwat matul iż-żewġ determinazzjonijiet ikun ogħla minn 15, ma tkun meħtieġa l-ebda determinazzjoni addizzjonali u r-riżultat tal-analiżi għandu jiġi rrappurtat direttament billi tintuża t-terminoloġija stabbilita fil-punt 2.1.5.3. Jekk, wara t-tielet determinazzjoni, it-total ta’ partiċelli tal-annimali ta’ natura partikolari individwat matul it-tliet determinazzjonijiet ikun ogħla minn 15, ir-riżultat tal-analiżi għandu jiġi rrappurtat billi tinuża t-terminoloġija stabbilita fil-punt 2.1.5.3. Inkella, ir-riżultat tal-analiżi għandu jiġi rrappurtat billi tintuża t-terminoloġija stabbilita fil-punt 2.1.5.2.
            Jekk wara li ssir l-ewwel determinazzjoni skont il-protokolli ta’ osservazzjoni stabbiliti fid-dijagramma 1 jew fid-dijagramma 2 kif relevanti, jiġu individwati aktar minn 5 partiċelli tal-annimali ta’ natura partikolari (jiġifieri annimali terrestri jew ħut), ir-riżultat tal-analiżi għandu jiġi rrappurtat billi tintuża t-terminoloġija stabbilita fil-punt 2.1.5.3.
            2.1.5.   L-espressjoni tar-riżultati
            
            Meta jirrapporta r-riżultati, il-laboratorju għandu jindika fuq liema tip ta’ materjal tkun twettqet l-analiżi (is-sediment, il-flotate jew il-materja prima) u kemm ikunu saru determinazzjonijiet.
            Ir-rapport tal-laboratorju għandu jinkludi mill-anqas l-informazzjoni dwar il-preżenza ta’ kostitwenti miksuba mill-annimali terrestri u mill-ħut.
            Is-sitwazzjonijiet differenti għandhom jiġu rrapportati b’dawn il-modi:
            2.1.5.1.   Ma tiġi individwata l-ebda partiċella tal-annimali ta’ natura partikolari:
            
                        —
                     
                     
                        sa fejn seta’ jidher bl-użu ta’ mikroskopju tad-dawl, ma ġiet individwata l-ebda partiċella miksuba minn annimali terrestri fil-kampjun ippreżentat,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        sa fejn seta’ jidher bl-użu ta’ mikroskopju tad-dawl, ma ġiet individwata l-ebda partiċella miksuba mill-ħut fil-kampjun ippreżentat,
                     
                  2.1.5.2.   Jiġu individwati bħala medja bejn 1 u 5 partiċelli tal-annimali ta’ natura partikolari:
            
                        —
                     
                     
                        sa fejn seta’ jidher bl-użu ta’ mikroskopju tad-dawl, ġew individwati, bħala medja, mhux aktar minn 5 partiċelli miksuba mill-annimali terrestri għal kull determinazzjoni fil-kampjun ippreżentat. Il-partiċelli ġew identifikati bħala … [għadam, qarquċa, muskolu, xagħar, qrun …]. Din il-preżenza ta’ livell baxx, li tkun taħt il-limitu ta’ indivdwazzjoni tal-metodu mikroskopiku, tfisser li ma jistax jiġi eskluż ir-riskju ta’ riżultat pożittiv falz.
                     
                  Jew, kif rilevanti,
            
                        —
                     
                     
                        sa fejn seta’ jidher bl-użu ta’ mikroskopju tad-dawl, ġew individwati, bħala medja, mhux aktar minn 5 partiċelli miksuba mill-ħut għal kull determinazzjoni fil-kampjun ippreżentat. Il-partiċelli ġew identifikati bħala … [xewk tal-ħut, qxur tal-ħut, qarquċa, muskolu, otolit, garġi …]. Din il-preżenza ta’ livell baxx, li tkun taħt il-limitu ta’ individwazzjoni tal-metodu mikroskopiku, tfisser li ma jistax jiġi eskluż ir-riskju ta’ riżultat pożittiv falz.
                     
                  Fil-każ ta’ tgħarbil minn qabel tal-kampjun, ir-rapport tal-laboratorju għandu jsemmi f’liema frazzjoni (frazzjoni mgħarbla, frazzjoni granulata jew qlub) ġew individwati l-partiċelli tal-annimali kemm-il darba l-individwazzjoni tal-partiċelli tal-annimali fil-frazzjoni mgħarbla biss tista’ tkun sinjal ta’ kontaminazzjoni ambjentali.
            2.1.5.3.   Jiġu individwati bħala medja aktar minn 5 partiċelli tal-annimali ta’ natura partikolari
            
                        —
                     
                     
                        sa fejn seta’ jidher bl-użu ta’ mikroskopju tad-dawl, ġew individwati, bħala medja, aktar minn 5 partiċelli miksuba mill-annimali terrestri għal kull determinazzjoni fil-kampjun ippreżentat. Il-partiċelli ġew identifikati bħala … [għadam, qarquċa, muskolu, xagħar, qrun …].
                     
                  Jew, kif rilevanti,
            
                        —
                     
                     
                        sa fejn seta’ jidher bl-użu ta’ mikroskopju tad-dawl, ġew individwati, bħala medja, aktar minn 5 partiċelli miksuba mill-ħut għal kull determinazzjoni fil-kampjun ippreżentat. Il-partiċelli ġew identifikati bħala … [xewk tal-ħut, qxur tal-ħut, qarquċa, muskolu, otolit, garġi …].
                     
                  Fil-każ ta’ tgħarbil minn qabel tal-kampjun, ir-rapport tal-laboratorju għandu jsemmi f’liema frazzjoni (frazzjoni mgħarbla, frazzjoni granulata jew qlub) ġew individwati l-partiċelli tal-annimali kemm-il darba l-individwazzjoni tal-partiċelli tal-annimali fil-frazzjoni mgħarbla biss tista’ tkun sinjal ta’ kontaminazzjoni ambjentali.
            2.2.   Il-PCR
            
            2.2.1.   Il-prinċipju
            
            Il-frammenti tal-aċidu deossiribonukleiku (DNA) ta’ oriġini mill-annimali li jistgħu jkunu preżenti fil-materjali tal-għalf u fl-għalf kompost, jiġu individwati b’teknika ta’ amplifikazzjoni ġenetika permezz tal-PCR, li timmira lejn is-sekwenzi tad-DNA speċifiku għall-ispeċi.
            Il-metodu tal-PCR l-ewwel jirrikjedi stadju tal-estrazzjoni tad-DNA. Wara għandu jiġi applikat l-istadju tal-amplifikazzjoni għall-estrazzjoni tad-DNA miksuba b’dan il-mod, sabiex jiġu individwati l-ispeċi tal-annimali li jinsabu fil-mira tat-test.
            2.2.2.   Ir-reaġenti u t-tagħmir
            
            2.2.2.1.   Ir-reaġenti
            2.2.2.1.1.   Ir-reaġenti għall-istadju tal-estrazzjoni tad-DNA
            Għandhom jintużaw biss ir-reaġenti approvati mill-EURL-AP u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu.
            2.2.2.1.2.   Ir-reaġenti għall-istadju ta’ amplifikazzjoni ġenetika
            2.2.2.1.2.1.   Il-primers u s-sondi
            Għandhom jintużaw biss primers u sondi b’sekwenzi ta’ oligonukleotidi vvalidati mill-EURL-AP (2).
            2.2.2.1.2.2.   Il-Master Mix
            Għandhom jintużaw biss soluzzjonijiet tal-Master Mix li ma jkunx fihom reaġenti suxxettibbli li jwasslu għal riżultati foloz minħabba l-preżenza ta’ DNA tal-annimali (3).
            2.2.2.1.2.3.   Ir-reaġenti ta’ dekontaminazzjoni
            2.2.2.1.2.3.1.   Is-soluzzjoni tal-aċidu idrokloriku (0,1N)
            2.2.2.1.2.3.2.   Il-bliċ (is-soluzzjoni tal-ipoklorit tas-sodju f’0,15 % ta’ kloru attiv)
            2.2.2.1.2.3.3.   Ir-reaġenti mhux korrużivi għad-dekontaminazzjoni tal-apparat li jiswa l-flus bħal imwieżen analitiċi (eż. id-DNA EraseTM tal-MP Biomedicals)
            2.2.2.2.   It-tagħmir
            2.2.2.2.1.   Miżien analitiku bi preċiżjoni ta’ 0,001 g
            2.2.2.2.2.   It-tagħmir tat-tħin
            2.2.2.2.3.   Ċiklatur termali li jippermetti li ssir PCR f’ħin reali
            2.2.2.2.4.   Mikroċentrifugu għal tubi mikrofugi
            2.2.2.2.5.   Sett ta’ mikropipetti li tippermetti li jitferra’ minn 1 μl sa 1 000 μl
            2.2.2.2.6.   Oġġetti tal-plastik standard għall-bijoloġija molekulari: tubi mikrofugi, kontenituri tal-plastik bil-filtru għall-mikropipetti, platti adattati għaċ-ċiklatur termali.
            2.2.2.2.7.   Friżers għall-ħżin tal-kampjuni u tar-reaġenti
            2.2.3.   It-teħid ta’ kampjuni u l-preparazzjoni tal-kampjuni
            
            2.2.3.1.   It-teħid ta’ kampjuni
            Għandu jintuża kampjun rappreżentattiv, meħud b’konformità mad-dispożizzjonijiet stabbiliti fl-Anness I.
            2.2.3.2.   Il-preparazzjoni tal-kampjun
            Il-preparazzjoni tal-kampjuni tal-laboratorju sal-estrazzjoni tad-DNA għandhom jikkonformaw mar-rekwiżiti fl-Anness II. Għandu jittieħed sottokampjun ta’ mill-inqas 50 g tal-kampjun għall-analiżi u sussegwentement jiġi mitħun.
            Il-preparazzjoni tal-kampjun għandha titwettaq f’kamra differenti minn dawk maħsuba għall-estrazzjoni tad-DNA u għar-reazzjonijiet ta’ amplifikazzjoni ġenetika kif deskritt minn ISO 24276.
            Għandhom jiġu preparati żewġ porzjonijiet tat-test ta’ mill-inqas 100 mg kull waħda.
            2.2.4.   L-estrazzjoni tad-DNA
            
            L-estrazzjoni tad-DNA għandha titwettaq fuq kull porzjon tat-test ippreparata bl-użu tal-SOP stabbiliti mill-EURL-AP u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu.
            Għandhom jiġu preparati żewġ kontrolli tal-estrazzjoni għal kull serje ta’ estrazzjonijiet kif deskritt minn ISO 24276.
            
                        —
                     
                     
                        kontroll tal-estrazzjoni in bjank,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        kontroll tal-estrazzjoni tad-DNA pożittiv.
                     
                  2.2.5.   Amplifikazzjoni ġenetika
            
            L-amplifikazzjoni ġenetika għandha titwettaq billi jintużaw il-metodi vvalidati għal kull speċi li tirrikjedi l-identifikazzjoni. Dawn il-metodi huma stipulati fl-SOP stabbiliti mill-EURL-AP u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu. Kull estratt tad-DNA għandu jiġi analizzat mill-inqas f’żewġ dilwizzjonijiet differenti sabiex tiġi evalwata l-inibizzjoni.
            Għandhom jiġu preparati żewġ kontrolli ta’ amplifikazzjoni għal kull speċi fil-mira kif deskritt minn ISO 24276.
            
                        —
                     
                     
                        għandu jintuża kontroll pożittiv tad-DNA fil-mira għal kull platt jew serje ta’ testijiet tal-PCR,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        għandu jintuża kontroll tar-reaġent ta’ amplifikazzjoni (imsejjaħ ukoll kontroll negattiv) għal kull platt jew serje ta’ testijiet tal-PCR.
                     
                  2.2.6.   L-interpretazzjoni u l-espressjoni tar-riżultati
            
            Meta jirrapporta r-riżultati, il-laboratorju għandu jindika mill-inqas il-piż tal-porzjonijiet tat-test użati, it-teknika tal-estrazzjoni użata, in-numru ta’ determinazzjonijiet imwettqa u l-limitu ta’ individwazzjoni tal-metodu.
            Ir-riżultati ma għandhomx jiġu interpretati u rrappurtati jekk il-kontroll pożittiv tal-estrazzjoni tad-DNA u l-kontrolli pożittivi tad-DNA fil-mira ma jipprovdux riżultati pożittivi għall-ispeċi li qed tiġi ttestjata filwaqt li l-kontroll tar-reaġent ta’ amplifikazzjoni jkun negattiv.
            Fil-każ li r-riżultati miż-żewġ porzjonijiet tat-test ma jkunux konsistenti, għandu jiġi ripetut mill-inqas l-istadju tal-amplifikazzjoni ġenetika. Jekk il-laboratorju jissuspetta li l-estratti tad-DNA jistgħu jkunu l-kważa tal-inkonsistenza, għandha titwettaq estrazzjoni ġdida tad-DNA segwita minn amplifikazzjoni ġenetika qabel ma jiġu interpretati r-riżultati.
            L-espressjoni finali tar-riżultati għandha tissejjes fuq l-integrazzjoni u l-interpretazzjoni tar-riżultati taż-żewġ porzjonijiet tat-test skont l-SOP stabbiliti mill-EURL-AP u ppubblikati fuq il-websajt tiegħu.
            2.2.6.1.   Ir-riżultat negattiv
            Ir-riżultat negattiv għandu jiġi rrappurtat kif ġej:
            Ma ġie indivdwat l-ebda DNA minn X fil-kampjun ippreżentat (fejn X huwa l-ispeċi tal-annimal jew il-grupp tal-ispeċi tal-annimal li jinsab fil-mira tat-test).
            2.2.6.2.   Ir-riżultat pożittiv
            Ir-riżultat pożittiv għandu jiġi rrappurtat kif ġej:
            Ġie individwat id-DNA minn X fil-kampjun ippreżentat (fejn X huwa l-ispeċi tal-annimal jew il-grupp tal-ispeċi tal-annimal li jinsab fil-mira tat-test).”
         
      
      
         (1)  http://eurl.craw.eu/
      
         (2)  Il-lista ta’ dawn il-primers u s-sondi għal kull speċi tal-annimali fil-mira tat-test hija disponibbli fuq il-websajt tal-EURL-AP.
      
         (3)  Eżempji ta’ Master Mixes li huma funzjonali huma disponibbli fuq il-websajt tal-EURL-AP.