CELEX: 32014R0260
Language: sk
Date: 2014-01-24 00:00:00
Title: Nariadenie Komisie (EÚ) č. 260/2014 z  24. januára 2014 , ktorým sa na účely prispôsobenia technickému pokroku mení nariadenie (ES) č. 440/2008, ktorým sa ustanovujú testovacie metódy podľa nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemických látok (REACH)  Text s významom pre EHP

19.3.2014   
            
            
               SK
            
            
               Úradný vestník Európskej únie
            
            
               L 81/1
            
         
      NARIADENIE KOMISIE (EÚ) č. 260/2014
   z 24. januára 2014,
   ktorým sa na účely prispôsobenia technickému pokroku mení nariadenie (ES) č. 440/2008, ktorým sa ustanovujú testovacie metódy podľa nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemických látok (REACH)
   (Text s významom pre EHP)
   EURÓPSKA KOMISIA,
   so zreteľom na Zmluvu o fungovaní Európskej únie,
   so zreteľom na nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 z 18. decembra 2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemikálií (REACH) a o zriadení Európskej chemickej agentúry, o zmene a doplnení smernice 1999/45/ES a o zrušení nariadenia Rady (EHS) č. 793/93 a nariadenia Komisie (ES) č. 1488/94, smernice Rady 76/769/EHS a smerníc Komisie 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES (1), a najmä na jeho článok 13 ods. 3,
   keďže:
   
               (1)
            
            
               Nariadenie Komisie (ES) č. 440/2008 (2) obsahuje testovacie metódy na určovanie fyzikálno-chemických vlastností, toxicity a ekotoxicity látok, ktoré sa majú používať na účely nariadenia (ES) č. 1907/2006.
            
         
               (2)
            
            
               Je potrebné aktualizovať nariadenie (ES) č. 440/2008 tak, aby prioritne zahŕňalo nové a aktualizované alternatívne testovacie metódy, ktoré prijala OECD s cieľom obmedziť počet zvierat používaných na pokusné účely, v súlade so smernicou Európskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 2010 o ochrane zvierat používaných na vedecké účely (3) a so smernicou Rady 86/609/EHS z 24. novembra 1986 o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení členských štátov týkajúcich sa ochrany zvierat používaných na pokusné a iné vedecké účely (4).
            
         
               (3)
            
            
               Prispôsobenie zahŕňa dve metódy určovania fyzikálno-chemických vlastností vrátane aktualizácie metódy testovania rozpustnosti vo vode a novej testovacej metódy na určenie rozdeľovacieho koeficientu, ktoré sú dôležité pre hodnotenie perzistencie, bioakumulácie a toxicity (PBT); štyri nové a jednu aktualizovanú metódu určovania ekotoxicity a environmentálneho osudu a správania; deväť metód určovania toxicity a iných zdravotných účinkov vrátane štyroch testovacích metód určovania inhalačnej toxicity, ktoré zahŕňajú aktualizáciu troch metód a jednu novú metódu znižovania počtu použitých zvierat a zlepšenia hodnotenia účinkov, aktualizáciu opakovanej 28-dňovej metódy testovania orálnej toxicity s cieľom zahrnúť parametre hodnotenia endokrinného pôsobenia, aktualizáciu testovacej metódy určovania toxikokinetiky dôležitú pre prípravu a pochopenie toxikologických štúdií a aktualizáciu testovacích metód určovania chronickej toxicity, karcinogenity a kombinovaných testovacích metód určovania chronickej toxicity a karcinogenity.
            
         
               (4)
            
            
               Nariadenie (ES) č. 440/2008 by sa preto malo zodpovedajúcim spôsobom zmeniť.
            
         
               (5)
            
            
               Opatrenia stanovené v tomto nariadení sú v súlade so stanoviskom výboru založeného podľa článku 133 nariadenia (ES) č. 1907/2006,
            
         PRIJALA TOTO NARIADENIE:
   Článok 1
   Príloha k nariadeniu (ES) č. 440/2008 sa týmto mení v súlade s prílohou k tomuto nariadeniu.
   Článok 2
   Toto nariadenie nadobúda účinnosť tretím dňom po jeho uverejnení v Úradnom vestníku Európskej únie.
   
      Toto nariadenie je záväzné v celom rozsahu a priamo uplatniteľné vo všetkých členských štátoch.
      V Bruseli 24. januára 2014
      
         
            Za Komisiu
         
         
            predseda
         
         José Manuel BARROSO
         
      
   
   
      (1)  Ú. v. EÚ L 396, 30.12.2006, s. 1.
   
      (2)  Ú. v. EÚ L 142, 31.5.2008, s. 1.
   
      (3)  Ú. v. EÚ L 276, 20.10.2010, s. 33.
   
      (4)  Ú. v. ES L 358, 18.12.1986, s. 1.
   
      PRÍLOHA
      Príloha k nariadeniu (ES) č. 440/2008 sa mení takto:
      
                  1.
               
               
                  Kapitola A.6 sa nahrádza takto:
                  „A.6.   ROZPUSTNOSŤ VO VODE
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov (TG) 105 (1995). Táto testovacia metóda je revidovanou verziou pôvodných usmernení TG 105, ktoré boli prijaté v roku 1981. Medzi súčasnou verziou a verziou z roku 1981 nie je žiadny podstatný rozdiel. Zmenil sa najmä formát. Revízia je založená na testovacej metóde EÚ ‚Rozpustnosť vo vode‘ (1).
                           
                        ÚVODNÉ ÚVAHY
                  
                              2.
                           
                           
                              Rozpustnosť látok vo vode môže byť do značnej miery ovplyvnená prítomnosťou prímesí. Táto testovacia metóda je zameraná na určenie rozpustnosti absolútne čistých látok vo vode, ktoré sú vo vode stabilné a nie sú prchavé. Pred stanovením rozpustnosti vo vode je užitočné získať predbežné informácie o testovanej látke, ako je štruktúrny vzorec, tlak pary, disociačná konštanta a hydrolýza ako funkcia pH.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              V rámci tejto testovacej metódy sú opísané dve metódy, metóda vypierania z kolóny, ktorá sa týka rozpustnosti nižšej ako 10–2 g/l, a banková metóda, ktorá sa týka rozpustnosti vyššej ako 10–2 g/l. Takisto je tu opísaný jednoduchý predbežný test. Umožňuje stanovenie približného vhodného množstva vzorky, ktorá sa má použiť v konečnom teste, ako aj čas potrebný na dosiahnutie nasýtenia.
                           
                        POJMY A JEDNOTKY
                  
                              4.
                           
                           
                              Rozpustnosť látky vo vode je saturačná hmotnostná koncentrácia látky vo vode pri danej teplote.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Rozpustnosť vo vode je vyjadrená ako hmotnosť rozpustenej látky na objem roztoku. Jednotka SI je kg/m3, ale môže sa použiť aj g/l.
                           
                        REFERENČNÉ CHEMIKÁLIE
                  
                              6.
                           
                           
                              Referenčné chemikálie sa pri skúmaní testovanej látky nemusia použiť.
                           
                        OPIS METÓD
                  
                     Podmienky testovania
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Test podľa možnosti prebieha pri teplote 20 ± 0,5 °C. Zvolená teplota by sa mala udržiavať na konštantnej úrovni vo všetkých relevantných súčastiach skúšobného zariadenia.
                           
                        
                     Predbežný test
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              V rámci postupu, ktorý pozostáva z niekoľkých krokov, sa pri izbovej teplote pridáva čoraz väčší objem vody približne do 0,1 g vzorky (tuhé testované látky musia byť rozomleté na prach) v 10 ml odmernom valci so sklenou zátkou. Po každom pridaní množstva vody sa zmes trepe počas desiatich minút a vizuálne sa skontroluje, či v nej neostali nerozpustené časti vzorky. Ak sa po pridaní 10 ml vody vzorka alebo jej časti nerozpustia, pokus pokračuje v odmernom valci s objemom 100 ml. Približná rozpustnosť je uvedená v tabuľke 1 pod tým objemom vody, v ktorom dôjde k úplnému rozpusteniu testovanej vzorky. Ak je rozpustnosť nízka, na rozpustenie testovanej látky môže byť potrebný dlhší čas a pokus by mal prebiehať aspoň 24 hodín. Ak ani po 24 hodinách látka nie je rozpustená, malo by sa poskytnúť viac času (až 96 hodín) alebo by sa malo vyskúšať ďalšie riedenie, aby sa získala istota, či by sa nemala použiť metóda vypierania z kolóny alebo banková metóda.
                              
                                 Tabuľka 1
                              
                              
                                          ml vody na 0,1 g rozpustnej látky
                                       
                                       
                                          0,1
                                       
                                       
                                          0,5
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          2
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                       
                                          100
                                       
                                       
                                          > 100
                                       
                                    
                                          približná rozpustnosť v g/l
                                       
                                       
                                          > 1 000
                                       
                                       
                                          1 000 – 200
                                       
                                       
                                          200 – 100
                                       
                                       
                                          100 – 50
                                       
                                       
                                          50 – 10
                                       
                                       
                                          10 – 1
                                       
                                       
                                          < 1
                                       
                                    
                        
                     Metóda vypierania z kolóny
                  
                  
                     Princíp
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Táto metóda je založená na vypieraní testovanej látky vodou z mikrokolóny, ktorá je naplnená inertným nosným materiálom, ktorý sa predtým pokryl nadbytkom testovanej látky (2). Rozpustnosť vo vode je daná hmotnostnou koncentráciou eluátu, keď dosiahne rovnovážny stav, v závislosti od času.
                           
                        
                     Vybavenie
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Vybavenie pozostáva z mikrokolóny (obrázok 1), ktorá sa udržiava pri konštantnej teplote. Je spojené buď s recirkulačným čerpadlom (obrázok 2), alebo s egalizačnou nádobou (obrázok 3). Mikrokolóna obsahuje inertný nosný materiál, ktorý na mieste drží malá zátka zo sklenej vaty, ktorá slúži aj na filtrovanie častíc. Medzi materiál, ktorý je možné použiť ako nosný, patria sklené guľôčky, diatomit alebo iný inertný materiál.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Mikrokolóna znázornená na obrázku 1 je vhodná na zostrojenie vybavenia s recirkulačných čerpadlom. Má uzavretý priestor nad kvapalinou (‚head space‘) poskytujúci päť úložných objemov (vypustených na začiatku pokusu) a objem piatich vzoriek (odobratých na analýzu v priebehu pokusu). Veľkosť je možné prípadne znížiť, ak možno do systému v priebehu pokusu pridať vodu ako náhradu za pôvodných päť úložných objemov vypustených zo systému spolu s prímesami. Kolóna je napojená na rúrku vyrobenú z inertného materiálu, ktorá predstavuje recirkulačné čerpadlo schopné napumpovať približne 25 ml/h. Recirkulačné čerpadlo môže byť napríklad peristaltické alebo membránové čerpadlo. Musí sa dbať na to, aby nedošlo ku kontaminácii a/alebo adsorpcii materiálom, z ktorého sú zhotovené rúrky.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Schematická zostava s využitím egalizačnej nádoby je znázornená na obrázku 3. V tejto zostave je mikrokolóna vybavená jednocestným uzatváracím ventilom. Spojenie s egalizačnou nádobou tvorí zabrúsená sklenená spojka a rúrka vyrobená z inertného materiálu. Prietok z egalizačnej nádoby by mal byť približne 25 ml/h.
                              
                                 Obrázok 1
                              
                              
                                 
                              Rozmery v mm
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          Prípojka pre zabrúsenú sklenenú spojku
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          Uzavretý priestor nad kvapalinou
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          Vnútorná časť 5
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          Vonkajšia časť 19
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          Zátka zo sklenej vaty
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          Uzatvárací ventil
                                       
                                    
                                 Obrázok 2
                              
                              
                                 
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          Vyrovnávanie tlaku vzduchom
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          Prietokomer
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          Mikrokolóna
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          Termostaticky kontrolované cirkulačné čerpadlo
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          Recirkulačné čerpadlo
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          Dvojcestný ventil pre vzorkovanie
                                       
                                    
                                 Obrázok 3
                              
                              
                                 
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          Egalizačná nádoba (napr. 2,5-litrová chemická banka)
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          Kolóna
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          Frakčný akumulátor
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          Termostat
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          Teflónová rúrka
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          Zabrúsená sklenená spojka
                                       
                                    
                                          G.
                                       
                                       
                                          Vodné potrubie (medzi termostatom a kolónou, s vnútorným priemerom približne 8 mm)
                                       
                                    
                        
                              13.
                           
                           
                              Približne 600 mg nosného materiálu sa premiestni do 50 ml banky s guľatým dnom. Vhodné množstvo testovanej látky sa rozpustí v prchavom rozpúšťadle s analytickou kvalitou reagentov a primerané množstvo tohto roztoku sa pridá do nosného materiálu. Rozpúšťadlo sa úplne odparí, napr. pomocou rotačnej odparky, lebo inak sa v priebehu vypierania nedosiahne nasýtenie nosiča vodou z dôvodu rozkladu na povrchu. Nosný materiál s aplikovanou látkou sa nechá máčať približne v 5 ml vody dve hodiny a suspenzia sa vleje do mikrokolóny. Suchý nosný materiál sa prípadne môže vliať do mikrokolóny naplnenej vodou a nechať vyvažovať dve hodiny.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Aplikácia testovanej látky na nosný materiál môže spôsobovať problémy, ktoré budú viesť k chybným výsledkom, napr. ak sa testovaná látka nanáša ako olej. Tieto problémy treba preskúmať a v správe o teste uviesť podrobnosti.
                           
                        
                     Postup s využitím recirkulačného čerpadla
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Spustí sa prúdenie cez kolónu. Odporúča sa použiť prietok približne 25 ml/h, ktorý v prípade opísanej kolóny zodpovedá desiatim úložným objemom/h. Najmenej prvých päť úložných objemov sa vypustí s cieľom odstrániť prímesi rozpustné vo vode. Potom sa čerpadlo nechá bežať až dovtedy, kým sa nedosiahne rovnováha vymedzená piatimi za sebou nasledujúcimi vzorkami, ktorých koncentrácie sa nelíšia viac ako ± 30 % v náhodnom slede. Vzorky by mali byť od seba oddelené časovými intervalmi zodpovedajúcimi prietoku najmenej desať úložných objemov. V závislosti od použitej analytickej metódy môže byť vhodnejšie zostrojiť krivku koncentrácia/čas, aby sa ukázalo, že bola dosiahnutá rovnováha.
                           
                        
                     Postup s využitím egalizačnej nádoby
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Za sebou nasledujúce eluátové frakcie by sa potom mali zachytávať a analyzovať podľa zvolenej metódy. Frakcie zo stredného eluátového rozsahu, v ktorých sú koncentrácie konštantné v rozsahu ± 30 % minimálne v piatich následných frakciách, sa použijú na stanovenie rozpustnosti.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Ako eluent sa uprednostňuje dvakrát destilovaná voda. Takisto možno použiť aj deionizovanú vodu s odporom vyšším ako 10 megaohmov/cm a celkovým obsahom organického uhlíka nižším ako 0,01 %.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              V prípade oboch postupov sa druhé kolo merania vykonáva pri polovičnej miere prvého prietoku. Ak sú výsledky oboch kôl meraní súhlasné, test bol uskutočnený na uspokojivej úrovni. Ak je nameraná rozpustnosť pri nižšom prietoku vyššia, znižovanie miery prietoku na polovicu musí pokračovať dovtedy, kým dve za sebou nasledujúce kolá meraní nevykážu rovnakú rozpustnosť.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              V obidvoch prípadoch by sa frakcie mali kontrolovať z hľadiska prítomnosti koloidného materiálu skúmaním Tyndallovho efektu. Prítomnosť čiastočiek znehodnocuje výsledky a test sa musí zopakovať po zdokonalení postupu filtrácie v kolóne.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Hodnota pH každej vzorky sa musí zmerať podľa možnosti pomocou špeciálnych indikačných pásikov.
                           
                        
                     Banková metóda
                  
                  
                     Princíp
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Testovaná látka (tuhé látky musia byť rozomleté na prach) sa rozpustí vo vode pri teplote o niečo vyššej, ako je testovacia teplota. Keď sa dosiahne nasýtenie, zmes sa ochladí a udržiava sa pri testovacej teplote. Meranie sa môže alternatívne uskutočniť priamo pri testovacej teplote, ak sa vhodným vzorkovaním zabezpečí, že sa dosiahne nasýtený rovnovážny stav. Následne sa hmotnostná koncentrácia testovanej látky vo vodnom roztoku, ktorý nesmie obsahovať žiadne nerozpustené častice, stanoví vhodnou analytickou metódou (3).
                           
                        
                     Vybavenie
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Je potrebný tento materiál:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          normálne laboratórne sklené nádoby a vybavenie laboratórnymi prístrojmi,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          zariadenie na premiešavanie, resp. pretrepávanie, roztokov pri kontrolovanej a regulovanej konštantnej teplote,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          odstredivka (podľa možnosti termostatovaná), ak sa požaduje pri emulziách, a
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analytické vybavenie.
                                       
                                    
                        
                     Postup
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Množstvo testovanej látky potrebnej na nasýtenie želaného objemu vody sa odhaduje z predbežného testu. Približne päťnásobok stanoveného množstva sa odváži do každej z troch sklených nádob vybavených sklenými zátkami (napr. do odstredivkových skúmaviek, sklených baniek). Do každej nádoby sa pridá objem vody zvolený podľa analytickej metódy a rozsahu rozpustnosti. Potom sa nádoby tesne uzavrú a nechajú sa premiešavať pri teplote 30 °C. Odporúča sa použiť trepačku alebo miešačku schopnú fungovať pri konštantnej teplote, napr. magnetické miešadlo v termostatickom vodnom kúpeli. Po uplynutí jedného dňa sa jedna z nádob ďalších 24 hodín opätovne vyváži pri skúšobnej teplote s občasným pretrepaním. Obsah nádoby sa odstredí pri skúšobnej teplote a pomocou vhodnej analytickej metódy sa stanoví koncentrácia testovanej látky v čírej vodnej fáze. So zvyšnými dvoma bankami sa naloží podobne po počiatočnom vyvážení pri teplote 30 °C počas dvoch dní v prípade jednej a počas troch dní v prípade druhej. Ak sa namerané koncentrácie aspoň v dvoch posledných nádobách nelíšia o viac ako 15 %, test bol uskutočnený na uspokojivej úrovni. Ak výsledky z nádob 1, 2 a 3 prejavia tendenciu narastajúcich hodnôt, celý test sa musí zopakovať pri použití dlhších vyvažovacích časov.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Test sa môže uskutočniť aj bez predchádzajúcej inkubácie pri teplote 30 °C. Na účely odhadu rýchlosti vzniku saturačnej rovnováhy sa vzorky odoberú, až keď už čas miešania neovplyvňuje merané koncentrácie.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Hodnota pH každej vzorky sa musí zmerať podľa možnosti pomocou špeciálnych indikačných pásikov.
                           
                        
                     Analytické stanovenie
                  
                  
                              26.
                           
                           
                              Odporúča sa použiť špecifickú metódu pre príslušnú testovanú látku, lebo malé množstvá rozpustných prímesí môžu spôsobiť veľké chyby v nameranej rozpustnosti. Príkladmi takýchto metód sú plynová alebo kvapalinová chromatografia, titrácia, fotometria alebo voltametria.
                           
                        ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV
                  
                     Údaje
                  
                  
                     Metóda vypierania z kolóny
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Pre každé kolo sa musí vypočítať stredná hodnota a smerodajná odchýlka namerané najmenej pri piatich po sebe nasledujúcich vzorkách zo saturačnej úrovne. Stredné hodnoty získané z dvoch testov s rôznym prietokom by sa nemali líšiť o viac ako 30 %.
                           
                        
                     Banková metóda
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Jednotlivé výsledky z každej z troch baniek, ktoré sa nesmú líšiť o viac ako 15 %, sa spriemerujú.
                           
                        
                     Správa o teste
                  
                  
                     Metóda vypierania z kolóny
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Správa o teste musí obsahovať tieto informácie:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          výsledky predbežného testu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          chemická identita a prímesi (opatrenia v rámci predbežnej purifikácie, ak boli uskutočnené),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          koncentrácie, prietoky a pH pre každú vzorku,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          stredné hodnoty a smerodajné odchýlky namerané najmenej pri piatich vzorkách zo saturačnej úrovne každého kola meraní,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          priemer dvoch za sebou nasledujúcich kôl meraní,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          teplota vody počas saturačného procesu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          metóda analýzy,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          charakteristické vlastnosti nosného materiálu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          spôsob aplikácie testovanej látky na nosný materiál,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          druh použitého riedidla,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          dôkazy akejkoľvek chemickej nestálosti látky počas testu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všetky informácie dôležité pre interpretáciu výsledkov, najmä týkajúce sa prímesí a fyzikálneho skupenstva (stavu) testovanej látky.
                                       
                                    
                        
                     Banková metóda
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Správa o teste musí obsahovať tieto informácie:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          výsledky predbežného testu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          chemická identita a prímesi (opatrenia v rámci predbežnej purifikácie, ak boli uskutočnené),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          samostatné analytické stanovenia hodnôt a ich priemer v prípadoch, kde boli pre každú banku stanovené viaceré hodnoty,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pH každej vzorky,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          priemer hodnôt pre rozdielne banky, pri ktorých sa dosiahla súhlasnosť výsledkov,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          testovacia teplota,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analytická metóda,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          dôkazy akejkoľvek chemickej nestálosti látky počas testu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všetky informácie dôležité na interpretáciu výsledkov, najmä týkajúce sa prímesí a fyzikálneho skupenstva (stavu) testovanej látky.
                                       
                                    
                        
                     LITERATÚRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              Smernica Komisie 92/69/EHS z 31. júla 1992, ktorou sa po sedemnástykrát prispôsobuje technickému pokroku smernica Rady 67/548/EHS o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebezpečných látok (Ú. v. ES L 383, 29.12.1992, s. 113).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              NF T 20-045 (AFNOR) (september 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              NF T 20-046 (AFNOR) (september 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.“
                           
                        
            
                  2.
               
               
                  Dopĺňa sa kapitola A.23:
                  „A.23.   ROZDEĽOVACÍ KOEFICIENT (1-OKTANOL/VODA): METÓDA POMALÉHO MIEŠANIA
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov (TG) 123 (2006). Hodnoty rozdeľovacieho koeficientu 1-oktanol/voda (Pow) až po log Pow 8,2 boli presne stanovené metódou pomalého miešania (1). Ide preto o vhodný experimentálny prístup pre priame stanovenie Pow vysoko hydrofóbnych látok.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Inými metódami na stanovenie rozdeľovacieho koeficientu 1-oktanol/voda (Pow) sú metóda trepačkovej banky (2) a stanovenie Pow z retenčného správania HPLC s reverznou fázou (3). Pri metóde trepačkovej banky sa zvyknú tvoriť vedľajšie produkty z dôvodu prenosu oktanolových mikrokvapôčok do vodnej fázy. S narastajúcimi hodnotami Pow vedie prítomnosť týchto kvapôčok vo vodnej fáze k čoraz vyššiemu nadhodnoteniu koncentrácie testovanej látky vo vode. Preto sa jej použitie obmedzuje na látky s log Pow < 4. Druhá metóda sa opiera o spoľahlivé údaje priamo stanovených hodnôt Pow na kalibráciu vzťahu medzi retenčným správaním HPLC a meranými hodnotami Pow. Na stanovenie rozdeľovacích koeficientov 1-oktanol/voda ionizovateľných látok (4) bolo možné použiť predbežné usmernenia OECD, ktoré sa však už nebudú používať.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Túto testovaciu metódu vyvinuli v Holandsku. Presnosť metód, ktoré sú tu opísané, bola potvrdená a optimalizovaná v rámci hodnotiacej štúdie kruhového testu, na ktorej sa zúčastnilo 15 laboratórií (5).
                           
                        ÚVODNÉ ÚVAHY
                  
                     Význam a použitie
                  
                  
                              4.
                           
                           
                              V prípade inertných organických látok boli zistené veľmi dôležité vzťahy medzi rozdeľovacími koeficientmi 1-oktanol/voda (Pow) a ich bioakumuláciou v rybách. Okrem toho sa preukázala korelácia Pow s toxicitou rýb, ako aj sorpcia chemikálií do tuhých látok, ako je zemina a sedimenty. Rozsiahly prehľad vzťahov sa uvádza v odkaze (6).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Medzi rozdeľovacím koeficientom 1-oktanol/voda a vlastnosťami iných látok bola zistená široká škála vzťahov, ktoré majú význam pre environmentálnu toxikológiu a chémiu. V dôsledku toho sa rozdeľovací koeficient 1-oktanol/voda stal kľúčovým parametrom pri hodnotení environmentálneho rizika chemikálií, ako aj pri predpovedaní osudu chemikálií v životnom prostredí.
                           
                        
                     Rozsah
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Pri pokuse pomalého miešania sa predpokladá nižšia tvorba mikrokvapôčok z kvapiek 1-oktanolu vo vodnej fáze. Následne nedochádza k nadhodnoteniu vodnej koncentrácie v dôsledku molekúl testovanej látky, ktoré súvisí s takýmito kvapôčkami. Metóda pomalého miešania je preto veľmi vhodná na stanovenie Pow látok s predpokladanými hodnotami log Pow rovnajúcimi sa 5 alebo vyššími, v prípade ktorých zvykne metóda trepačkovej banky (2) viesť k chybným výsledkom.
                           
                        VYMEDZENIE POJMU A JEDNOTKY
                  
                              7.
                           
                           
                              Rozdeľovací koeficient látky medzi vodou a lipofilickým rozpúšťadlom (1-oktanol) charakterizuje rozloženie rovnováhy chemikálie medzi dvoma fázami. Rozdeľovací koeficient medzi vodou a 1-oktanolom (POW) je vymedzený ako pomer rovnovážnych koncentrácií testovanej látky v 1-oktanole nasýtenom vodou (CO) a vo vode nasýtenej 1-oktanolom (CW).
                              
                                 
                              Keďže ide o pomer, je to bezrozmerné číslo. Najčastejšie sa udáva ako logaritmus pri základe 10 (log Pow). Pow závisí od teploty a údaje v správe by mali zahŕňať teplotu merania.
                           
                        PRINCÍP METÓDY
                  
                              8.
                           
                           
                              Na účely stanovenia rozdeľovacieho koeficientu sa voda, 1-oktanol a testovaná látka navzájom vyvážia pri konštantnej teplote. Následne sa určia koncentrácie testovanej látky v dvoch fázach.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Problémy pokusu súvisiace s tvorbou mikrokvapôčok počas pokusu s trepaním banky je možné znížiť pri pokuse s pomalým miešaním, ktorý sa v tomto texte navrhuje. V prípade pokusu s pomalým miešaním sa voda, 1-oktanol a testovaná látka vyvážia v termostatickom miešanom reaktore. Výmena medzi fázami sa urýchli miešaním. Miešaním dochádza k malej turbulencii, ktorá napomáha výmene medzi 1-oktanolom a vodou bez vytvárania mikrokvapôčok (1).
                           
                        POUŽITEĽNOSŤ TESTU
                  
                              10.
                           
                           
                              Keďže prítomnosť látok iných ako testovaná látka môže ovplyvniť koeficient aktivity testovanej látky, testovaná látka sa musí testovať ako čistá látka. Pri pokuse stanovenia rozdeľovacieho koeficientu 1-oktanol/voda sa použije komerčne dostupná látka najvyššej čistoty.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Uvedená metóda sa vzťahuje na čisté látky, ktoré nedisociujú ani sa nespájajú a ktoré nevykazujú významnú medzipovrchovú aktivitu. Možno ju použiť na stanovenie rozdeľovacieho koeficientu 1-oktanol/voda takýchto látok a zmesí. Ak sa metóda použije v prípade zmesí, stanovené rozdeľovacie koeficienty 1-oktanol/voda sú závislé od chemického zloženia testovanej zmesi a elektrolytického zloženia vo vodnej fáze. Za predpokladu, že sa prijmú dodatočné opatrenia, možno metódu použiť aj na disociujúce alebo spájajúce sa zlúčeniny (odsek 12).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Vzhľadom na viacnásobné rovnovážne stavy vo vode a 1-oktanole, ktoré prispievajú k deleniu disociujúcich látok v systéme 1-oktanol/voda, ako sú organické kyseliny a fenoly, organické bázy a organokovové látky, je rozdeľovací koeficient 1-oktanol/voda závislou konštantou, ktorá vo veľkej miere závisí od elektrolytického zloženia (7) (8). Stanovenie rozdeľovacieho koeficientu 1-oktanol/voda preto vyžaduje, aby sa pH a elektrolytické zloženie počas pokusu kontrolovali a zaznamenali v správe. Pri hodnotení týchto rozdeľovacích koeficientov je potrebné opierať sa o odborný posudok. Pomocou hodnoty disociačnej konštanty (disociačných konštánt) je potrebné vybrať vhodné hodnoty pH, aby sa pre každý ionizačný stav stanovil rozdeľovací koeficient. Pri testovaní organokovových zlúčenín (8) sa musia použiť nekomplexujúce tlmivé roztoky. Pri zohľadnení existujúcich znalostí o roztokovej chémii (konštanty stability komplexu, disociačné konštanty) by sa podmienky pokusu mali zvoliť takým spôsobom, aby bolo možné odhadnúť zloženie testovanej látky vo vodnej fáze. Iónová sila by mala byť totožná pri všetkých pokusoch vzhľadom na použitie základného elektrolytu.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Pri teste sa môžu vyskytnúť problémy v prípade testovania látok s nízkou rozpustnosťou vo vode alebo s vysokým Pow, lebo koncentrácie vo vode sú také nízke, že je náročné ich stanoviť s presnosťou. V rámci tejto testovacej metódy sa uvádzajú usmernenia, ako tento problém riešiť.
                           
                        INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE
                  
                              14.
                           
                           
                              Chemické reagenty musia mať stupeň čistoty – analyticky čistá alebo musia byť čistejšie. Odporúča sa použitie neoznačkovaných testovacích látok so známym chemickým zložením a podľa možnosti aspoň 99 % čistoty alebo rádiooznačených testovaných látok so známym chemickým zložením a rádiochemickej čistoty. V prípade krátkeho polčasu rozpadu by sa mali aplikovať korekcie na rozpad. V prípade rádiooznačených testovaných látok by sa mala použiť analytická metóda pre konkrétnu chemikáliu, aby sa zabezpečilo, že meraná rádioaktivita priamo súvisí s testovanou látkou.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Odhad log Pow je možné urobiť pomocou komerčne dostupného softvéru na odhadovanie log Pow alebo pomocou pomeru rozpustností v oboch roztokoch.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Pred začatím pokusu s pomalým miešaním na stanovenie Pow musia byť k dispozícii tieto informácie o testovanej látke:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          štruktúrny vzorec;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          vhodné analytické metódy na stanovenie koncentrácie látky vo vode a 1-oktanole;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          disociačná konštanta/disociačné konštanty ionizovateľných látok [usmernenie OECD 112 (9)];
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          rozpustnosť vo vode (10);
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          abiotická hydrolýza (11);
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          ľahká biodegradovateľnosť (12);
                                       
                                    
                                          g)
                                       
                                       
                                          tlak pary (13).
                                       
                                    
                        OPIS METÓDY
                  
                     Zariadenie a prístroje
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Vyžaduje sa štandardné laboratórne zariadenie, najmä:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          magnetické miešadlá a magnetické miešacie tyčinky pokryté teflónom sa používajú na miešanie vo vodnej fáze,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analytické prístroje vhodné na stanovenie koncentrácie testovanej látky pri predpokladaných koncentráciách,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          miešacia nádoba s kohútikom na dne. V závislosti od odhadu log Pow a detekčného limitu (LOD) testovanej zlúčeniny je potrebné zvážiť použitie reakčnej nádoby rovnakých geometrických tvarov s objemom vyšším ako jeden liter, aby bolo možné získať dostatočný objem vody na chemickú extrakciu a analýzu. To bude mať za následok vyššie koncentrácie vo vodnom extrakte, a teda spoľahlivejšie analytické stanovenie. Tabuľka s odhadmi minimálneho potrebného objemu, detekčným limitom zlúčeniny, odhadovaným log Pow a rozpustnosťou zlúčeniny vo vode je uvedená v dodatku 1. Tabuľka vychádza zo vzťahu medzi log Pow a pomerom medzi rozpustnosťou v oktanole a vo vode, ako uvádza Pinsuwan a kolektív (14):
                                          
                                             
                                          kde
                                          
                                              (v molarite),
                                          a vzťah podľa Lymana (15) na predpovedanie rozpustnosti vo vode. Rozpustnosť vo vode vypočítaná pomocou rovnice uvedenej v dodatku 1 sa považuje za prvý odhad. Treba poznamenať, že používateľ môže odhadnúť rozpustnosť vo vode na základe akéhokoľvek vzťahu, ktorý sa považuje za lepšie znázornenie vzťahu medzi hydrofobicitou a rozpustnosťou. V prípade tuhých zlúčenín sa napríklad odporúča zahrnutie bodu topenia do predpovede rozpustnosti. V prípade použitia upravenej rovnice sa treba uistiť, že rovnica na výpočet rozpustnosti v oktanole je stále platná. Schematické znázornenie miešacej nádoby so skleným plášťom s objemom približne jeden liter je uvedené v dodatku 2. Rozmery nádoby znázornenej v dodatku 2 sa ukázali byť vhodné a v prípade, že sa použije zariadenie inej veľkosti, by mali ostať zachované,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          prostriedky na udržanie konštantnej teploty počas pokusu s pomalým miešaním sú nevyhnutné.
                                       
                                    
                        
                              18.
                           
                           
                              Nádoby by mali byť vyrobené z inertného materiálu, aby bola adsorpcia na povrchu nádoby zanedbateľná.
                           
                        
                     Príprava testovacích roztokov
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Pow by sa mal stanoviť s využitím 1-oktanolu najvyššej čistoty, ktorý je komerčne dostupný (aspoň + 99 %). Odporúča sa purifikácia 1-oktanolu extrakciou pomocou kyseliny, bázy a vody a následné vysušenie. Okrem toho možno na purifikáciu 1-oktanolu použiť destiláciu. Purifikovaný 1-oktanol sa použije na prípravu štandardných roztokov testovaných látok. Voda, ktorá sa použije na stanovenie Pow, by mala byť destilovaná zo skla alebo kremeňa, alebo získaná zo zariadenia na purifikáciu vody. Takisto je možné použiť vodu HPLC kvality. V prípade destilovanej vody sa vyžaduje filtrácia cez 0,22 μm filter. Mali by sa vykonať aj slepé pokusy na kontrolu, či sa v koncentrovaných extraktoch nenachádzajú žiadne prímesi, ktoré by mohli prísť do styku s testovanou látkou. Ak sa použije filter zo skleného vlákna, musí sa vyčistiť vypálením aspoň počas troch hodín pri teplote 400 °C.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Obe rozpúšťadlá sa pred pokusom navzájom nasýtia vyvažovaním v dostatočnej veľkej nádobe. Rovnováha sa dosiahne pomalým miešaním dvojfázového systému počas dvoch dní.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Zvolí sa vhodná koncentrácia testovanej látky, ktorá sa rozpustí v 1-oktanole (nasýtenom vodou). Rozdeľovací koeficient 1-oktanol/voda sa musí stanoviť v zriedených roztokoch v 1-oktanole a vode. Koncentrácia testovanej látky by preto v žiadnej fáze nemala presiahnuť 70 % svojej rozpustnosti s maximálnou koncentráciou 0,1 M (1). Roztoky 1-oktanolu použité pri pokuse nesmú obsahovať suspendovanú tuhú testovanú látku.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Vhodné množstvo testovanej látky sa rozpustí v 1-oktanole (nasýtenom vodou). Ak je odhad log Pow vyšší ako päť, treba dbať na to, aby roztoky 1-oktanolu použité pri pokuse neobsahovali suspendovanú tuhú testovanú látku. Na tento účel sa v prípade chemikálií s odhadovanou hodnotou log Pow > 5 postupuje takto:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          testovaná látka sa rozpustí v 1-oktanole (nasýtenom vodou),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          roztoku sa poskytne dostatočný čas, aby sa suspendovaná tuhá látka usadila. Počas usádzania sa sleduje koncentrácia testovanej látky,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          potom, ako merané koncentrácie v roztoku 1-oktanolu dosiahnu stabilné hodnoty, sa zásobný roztok zriedi vhodným objemom 1-oktanolu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          odmeria sa koncentrácia zriedeného zásobného roztoku. Ak nameraná koncentrácia zodpovedá zriedeniu, zriedený zásobný roztok možno použiť pri pokuse s pomalým miešaním.
                                       
                                    
                        
                     Extrakcia a analýza vzoriek
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Na skúšku testovanej látky sa použije platná analytická metóda. Výskumníci musia predložiť dôkazy o tom, že koncentrácie v 1-oktanole nasýtenom vodou, ako aj vo fáze vody nasýtenej 1-oktanolom počas pokusu sú vyššie ako kvantifikačný limit metódy použitých analytických postupov. Analytická výťažnosť testovanej látky z vodnej fázy a z 1-oktanolovej fázy sa musí stanoviť pred pokusom v tých prípadoch, v ktorých sú potrebné metódy extrakcie. Analytický signál musí byť korigovaný vzhľadom na slepé pokusy a treba dbať na to, aby nedošlo k prenosu analytu z jednej vzorky do druhej.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Pred analýzou bude pravdepodobne potrebná extrakcia vodnej fázy pomocou organického rozpúšťadla a prekoncentrácia extraktu z dôvodu pomerne nízkych koncentrácií hydrofóbnych testovaných látok vo vodnej fáze. Z toho istého dôvodu je nevyhnutné znížiť koncentrácie pri prípadných slepých pokusoch. Na tento účel treba použiť rozpúšťadlá vysokej čistoty, podľa možnosti rozpúšťadlá na analýzu rezíduí. Takisto práca s vopred dôkladne vyčisteným sklom (napr. umývanie rozpúšťadlom alebo vypaľovanie pri zvýšenej teplote) môže pomôcť zabrániť krížovej kontaminácii.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Odhad log Pow možno získať z programu na odhadovanie alebo z odborného posudku. Ak je hodnota vyššia ako šesť, potom je potrebné dôkladne sledovať korekcie vzhľadom na slepé pokusy a prenos analytu. Podobne ak je odhad log Pow vyšší ako šesť, je potrebné použiť náhradný štandard na korekciu výťažnosti, aby bolo možné dosiahnuť vysoké prekoncentračné faktory. Na odhadovanie log Pow je k dispozícii množstvo komerčne dostupných softvérových programov (1), napr. Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) a ACD log P (19). Opisy postupov odhadovania sú uvedené v odkazoch (20 – 22).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Kvantifikačné limity (LOQ) na určenie testovanej látky v 1-oktanole a vo vode sa stanovia pomocou akceptovaných metód. Podľa štandardného pravidla možno kvantifikačný limit metódy stanoviť ako koncentráciu vo vode alebo v 1-oktanole, ktorej pomer signálu k šumu má hodnotu desať. Treba zvoliť vhodné metódy extrakcie a prekoncentrácie a takisto treba špecifikovať analytickú výťažnosť. Po analytickom stanovení sa vyberie vhodný prekoncentračný faktor s cieľom získať signál požadovanej veľkosti.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Na základe parametrov analytickej metódy a predpokladaných koncentrácií sa určí približná veľkosť vzorky potrebná na presné stanovenie koncentrácie zlúčeniny. Treba sa vyhnúť používaniu vzoriek vody, ktoré sú príliš malé na získanie dostatočného analytického signálu. Takisto sa treba vyhnúť používaniu nadmerne veľkých vzoriek vody, lebo inak sa môže stať, že na minimálny požadovaný počet analýz (n = 5) ostane príliš málo vody. V dodatku 1 je minimálny objem vzorky uvedený ako funkcia objemu nádoby, LOD testovanej látky a rozpustnosti testovanej látky.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Kvantifikácia testovanej látky sa vykonáva porovnaním s kalibračnými krivkami príslušnej zlúčeniny. Koncentrácie v analyzovaných vzorkách musia byť ohraničené koncentráciami štandardov.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              V prípade testovaných látok s odhadovaným log Pow vyšším ako šesť treba náhradný štandard pridať do vzorky vody pred extrakciou s cieľom zaregistrovať straty, ku ktorým došlo v priebehu extrakcie a prekoncentrácie vzoriek vody. S cieľom zabezpečiť presnú korekciu výťažnosti musia mať náhradné látky vlastnosti, ktoré sú veľmi podobné alebo totožné s vlastnosťami testovanej látky. Na tento účel sa uprednostňuje použitie (stabilných) izotopicky označených analógov k skúmaným látkam (napríklad perdeuterovaných alebo označených uhlíkom 13C). Ak nie je možné použiť označené stabilné izotopy, t. j. 13C alebo 2H, treba na základe spoľahlivých údajov z literatúry preukázať, že fyzikálno-chemické vlastnosti náhradnej látky sú veľmi podobné fyzikálno-chemickým vlastnostiam testovanej látky. V priebehu extrakcie kvapaliny kvapalinou vo vodnej fáze môže dôjsť k tvorbe emulzií. Možno ich redukovať pridaním soli a umožnením, aby sa emulzia počas noci usadila. Metódy používané na extrahovanie a prekoncentráciu vzoriek treba uviesť do správy.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Vzorky získané z 1-oktanolovej fázy možno pred analýzou v prípade potreby zriediť vhodným rozpúšťadlom. Okrem toho sa použitie náhradných štandardov na korekciu výťažnosti odporúča v prípade látok, pri ktorých pokusy s výťažnosťou preukázali vysoký stupeň variácie (relatívna smerodajná odchýlka > 10 %).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Podrobné informácie o analytickej metóde sa musia uviesť v správe. Tieto informácie zahŕňajú metódu extrakcie, prekoncentračné a zrieďovacie faktory, parametre prístrojov, postup kalibrácie, rozsah kalibrácie, analytickú výťažnosť testovanej látky z vody, pridanie náhradných štandardov na korekciu výťažnosti, hodnoty slepých pokusov, detekčné limity a kvantifikačné limity.
                           
                        
                     Realizácia testu
                  
                  
                     Optimálne pomery objemov 1-oktanol/voda
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Pri voľbe objemov vody a 1-oktanolu by sa mali zohľadniť LOQ v 1-oktanole a vo vode, prekoncentračné faktory použité pri vzorkách vody, objemy vzoriek 1-oktanolu a vody a predpokladané koncentrácie. Z experimentálnych dôvodov by sa mal objem 1-oktanolu v systéme pomalého miešania zvoliť tak, aby vrstva 1-oktanolu bola dostatočne hrubá (> 0,5 cm) a umožňovala odber vzoriek počas 1-oktanolovej fázy bez jej narušenia.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Bežné fázové pomery používané na stanovenie zlúčenín s log Pow rovnajúcim sa 4,5 alebo vyšším sú 20 – 50 ml 1-oktanolu a 950 – 980 ml vody v litrovej nádobe.
                           
                        
                     Podmienky testovania
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              V priebehu testu sa reakčná nádoba tepelne stabilizuje, aby teplota nekolísala o viac ako 1 °C. Skúška sa vykonáva pri teplote 25 °C.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Pokusný systém by mal byť chránený pred denným svetlom buď tak, že sa pokus vykoná v tmavej miestnosti, alebo tak, že sa reakčná nádoba prikryje hliníkovou fóliou.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Pokus by sa mal vykonať v bezprašnom prostredí (pokiaľ je to možné).
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Systém 1-oktanol-voda sa mieša, až kým sa nedosiahne rovnováha. Pri pilotnom pokuse sa posúdi dĺžka obdobia vyvažovania vykonaním pokusu s pomalým miešaním a pravidelným odberom vzorky vody a 1-oktanolu. Medzi jednotlivými odbermi vzoriek by malo uplynúť minimálne päť hodín.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Pri každom stanovení Pow treba vykonať najmenej tri nezávislé pokusy s pomalým miešaním.
                           
                        
                     Stanovenie času dosiahnutia rovnováhy
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Predpokladá sa, že rovnováha sa dosiahne, keď regresná funkcia pomeru koncentrácie 1-oktanol/voda v závislosti od času v priebehu štyroch časových bodov dosiahne sklon, ktorý sa pri hladine významnosti alfa 0,05 výrazne nelíši od nulového sklonu. Minimálny čas dosiahnutia rovnováhy je jeden deň pred začatím odberov vzoriek. Podľa štandardného pravidla sa môžu vzorky látok s odhadovaným log Pow nižším ako päť odoberať počas druhého a tretieho dňa. Môže sa stať, že vyvažovanie sa bude musieť v prípade hydrofóbnych zlúčenín predĺžiť. V prípade zlúčeniny s log Pow 8,23 (dekachlórbifenyl) stačilo na dosiahnutie rovnováhy 144 hodín. Rovnováha sa posudzuje prostredníctvom opakovaného odberu z jednej nádoby.
                           
                        
                     Začiatok pokusu
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Na začiatku pokusu sa reakčná nádoba naplní vodou nasýtenou 1-oktanolom. Na dosiahnutie stálej teploty by mal byť k dispozícii dostatok času.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Do reakčnej nádoby sa opatrne pridá želané množstvo testovanej látky (rozpustené v požadovanom objeme 1-oktanolu nasýtenom vodou). Tento krok je v rámci pokusu veľmi dôležitý, lebo je potrebné vyhnúť sa prudkému miešaniu dvoch fáz. Na tento účel možno 1-oktanolovú fázu pomaly pipetou preniesť na stenu testovacej nádoby blízko hladiny vody. Tá následne stečie po sklenej stene a vytvorí nad vodnou fázou film. Vždy treba zabrániť tomu, aby 1-oktanol stekal priamo do banky. Kvapky 1-oktanolu by nemali padať priamo do vody.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Po začatí miešania sa rýchlosť miešania pomaly zvyšuje. Ak miešacie motory nemožno vhodne nastaviť, treba uvažovať nad použitím transformátora. Rýchlosť miešania sa nastaví tak, aby sa na rozhraní medzi vodou a 1-oktanolom vytvoril vír s hĺbkou od 0,5 cm do maximálne 2,5 cm. Rýchlosť miešania by sa mala znížiť, ak hĺbka víru presiahne 2,5 cm. V opačnom prípade sa z kvapôčok 1-oktanolu vo vodnej fáze môžu vytvoriť mikrokvapôčky, čo bude mať za následok nadhodnotenie koncentrácie testovanej látky vo vode. Maximálna rýchlosť miešania pri hĺbke 2,5 cm je odporúčaná na základe zistení potvrdzujúcej štúdie kruhového testu (5). Ide o kompromis medzi rýchlym dosiahnutím rovnováhy a zamedzením tvorbe 1-oktanolových mikrokvapôčok.
                           
                        
                     Odber a spracovanie vzoriek
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Miešadlo sa pred odobratím vzoriek vypne a počká sa, kým pohyb kvapalín neustane. Po dokončení odberu vzorky sa miešadlo opäť pomaly spustí, ako je opísané vyššie, a následne sa rýchlosť miešania bude postupne zvyšovať.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Pri vodnej fáze sa vzorka odoberie z uzatváracieho kohútika na dne reakčnej nádoby. Vždy je potrebné odstrániť mŕtvy objem vody v kohútikoch (približne 5 ml v prípade nádoby znázornenej v dodatku 2). Voda v kohútikoch sa nemieša, a preto nie je v rovnováhe s hlavným objemom. Zaznamenajte objem vzoriek vody a uistite sa, že množstvo testovanej látky prítomnej v odstránenej vode sa zohľadní pri nastavovaní hmotnostnej bilancie. Straty vznikajúce pri odparovaní by sa mali minimalizovať, a to tak, že sa umožní, aby voda pokojne stiekla do oddeľovacieho lievika, čím sa zabráni narušeniu vrstvy voda/1-oktanol.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Vzorky 1-oktanolu sa získajú odobratím malej alikvotnej časti (cca. 100 μl) z vrstvy 1-oktanolu 100-mikrolitrovou skleneno-kovovou striekačkou. Treba dbať na to, aby sa nenarušila hranica. Objem odobratej vzorky kvapaliny sa zaznamená. Malá alikvotná časť je postačujúca, lebo vzorka 1-oktanolu sa zriedi.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Treba sa vyhnúť zbytočným prenosom vzorky. Na tento účel by sa objem vzorky mal stanoviť gravimetricky. V prípade vzoriek vody to možno dosiahnuť sústredením vzorky vody v oddeľovacom lieviku, ktorý už obsahuje požadovaný objem rozpúšťadla.
                           
                        ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV
                  
                              47.
                           
                           
                              Podľa tejto testovacej metódy sa Pow stanoví vykonaním troch pokusov s pomalým miešaním (tri pokusné jednotky) so skúmanou zlúčeninou pri totožných podmienkach. Regresia použitá na preukázanie dosiahnutia rovnováhy by mala vychádzať z výsledkov aspoň štyroch stanovení CO/CW v po sebe nasledujúcich časových bodoch. Tým sa umožní výpočet rozptylu ako ukazovateľa neistoty priemernej hodnoty získanej v prípade každej pokusnej jednotky.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Pow je možné charakterizovať rozptylom údajov získaných pre každú pokusnú jednotku. Tieto informácie sa použijú na výpočet Pow ako váženého priemeru výsledkov jednotlivých pokusných jednotiek. Na tento účel sa ako váha použije inverzná funkcia rozptylu výsledkov získaných z pokusných jednotiek. V dôsledku toho majú údaje s vysokou variáciou (vyjadrenou ako rozptyl), a teda nižšou spoľahlivosťou menší vplyv na výsledok ako údaje s nízkym rozptylom.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Analogicky sa vypočíta vážená smerodajná odchýlka. Tá vyjadruje opakovateľnosť merania Pow. Nízka hodnota váženej smerodajnej odchýlky znamená, že stanovenie Pow malo v rámci jedného laboratória vysokú opakovateľnosť. Formálne štatistické spracovanie údajov je vysvetlené ďalej.
                           
                        
                     Spracovanie výsledkov
                  
                  
                     Preukázanie dosiahnutia rovnováhy
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Logaritmus pomeru koncentrácie testovanej látky v 1-oktanole a vo vode [log (CO/Cw)] sa vypočíta pri každom odbere vzorky. Dosiahnutie chemickej rovnováhy sa preukáže jej grafickým znázornením ako funkcie času. Horná hranica (plató) na tomto znázornení, ktoré je založené aspoň na štyroch po sebe nasledujúcich časových bodoch, ukazuje, že rovnováha bola dosiahnutá a že zlúčenina sa v 1-oktanole naozaj rozpustila. Ak to tak nie je, test musí pokračovať, až kým funkcia v priebehu štyroch po sebe nasledujúcich časových bodov nedosiahne sklon, ktorý sa pri hladine významnosti alfa 0,05 výrazne nelíši od nulového sklonu, čo znamená, že log Co/Cw nie je závislý od času.
                           
                        
                     Log Pow – výpočet
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Hodnota log Pow pokusnej jednotky sa vypočíta ako vážená priemerná hodnota log Co/Cw tej časti krivky log Co/Cw ako funkcie času, v ktorej sa preukázala rovnováha. Vážený priemer sa vypočíta vážením údajov inverznou funkciou rozptylu, aby bol vplyv údajov na konečný výsledok nepriamo úmerný neistote údajov.
                           
                        
                     Priemerný log Pow
                     
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Priemerná hodnota log Pow rôznych pokusných jednotiek sa vypočíta ako priemer výsledkov jednotlivých pokusných jednotiek vážený ich zodpovedajúcim rozptylom.
                              Výpočet je takýto:
                              
                                 
                              kde
                              
                                          log Pow,i
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          hodnota log Pow individuálnej pokusnej jednotky i,
                                       
                                    
                                          log Pow,Av
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          vážená priemerná hodnota individuálnych stanovení log Pow,
                                       
                                    
                                          wi
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          štatistická váha pripísaná hodnote log Pow pokusnej jednotky i.
                                       
                                    Recipročná hodnota rozptylu log Pow,i sa použije ako wi
                                 .
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Chyba priemeru log Pow sa odhadne ako opakovateľnosť log Co/Cw stanovená počas fázy rovnováhy pri jednotlivých pokusných jednotkách. Je vyjadrená ako vážená smerodajná odchýlka log Pow,Av (σlog Pow,Av), ktorá je zasa ukazovateľom chyby súvisiacej s log Pow,Av. Váženú smerodajnú odchýlku možno vypočítať z váženého rozptylu (varlog Pow,Av) takto:
                              
                                 
                              
                                 
                              Premenná n predstavuje počet pokusných jednotiek.
                           
                        
                     Správa o teste
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              Správa o teste by mala obsahovať tieto informácie:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovaná látka:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bežný názov, chemický názov, číslo CAS, štruktúrny vzorec, (s vyznačením polôh značkovania, ak sa používa značkovanie rádioaktívnym izotopom) a príslušné fyzikálno-chemické vlastnosti (pozri odsek 17),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      čistota (nečistoty) testovanej látky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      čistota značky chemických látok značených rádioaktívnym izotopom a molárna aktivita (ak je to vhodné),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      predbežný odhad log Pow, ako aj metóda použitá na odvodenie hodnoty.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Podmienky testovania:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dátumy vykonávania štúdií,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      teplota počas pokusu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      objem 1-oktanolu a vody na začiatku testu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      objem odobratých vzoriek 1-oktanolu a vody,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      objem 1-oktanolu a vody, ktorý ostal v testovacích nádobách,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis použitých testovacích nádob a podmienok miešania (geometria miešacej tyčinky a testovacej nádoby, výška pri vortexovaní v mm a v prípade dostupnosti: rýchlosť miešania),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použité analytické metódy na určenie testovanej látky a kvantifikačný limit metódy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      časy odberu vzoriek,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použité pH vodnej fázy a pufrovania, pričom pH je upravené pre ionizovateľné molekuly,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet paraleliek.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opakovateľnosť a citlivosť použitých analytických metód,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      určené koncentrácie testovanej látky v 1-oktanole a vode ako funkcia času,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      demonštrácia hmotnostnej bilancie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      teplota a smerodajná odchýlka alebo rozsah teploty počas pokusu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      regresia koncentračného pomeru v čase,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      priemerná hodnota log Pow,Av a jej štandardná chyba,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozbor a výklad výsledkov,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      príklady nespracovaných údajov reprezentatívnej vzorky (všetky nespracované údaje musia byť uložené v súlade so štandardmi dobrej laboratórnej praxe) vrátane výťažnosti náhradných látok a počtu úrovní použitých pri kalibrácií (spolu s kritériami korelačného koeficientu kalibračnej krivky) a výsledkov zabezpečenia kvality a kontroly kvality (QA/QC),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      v prípade dostupnosti: potvrdzujúca správa o postupe skúšky (ktorá sa uvedie v odkazoch).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATÚRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              De Bruijn, J. H. M., Busser, F., Seinen, W., Hermens, J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the ’slow-stirring‘ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499 – 512.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Kapitola A.8 tejto prílohy, Rozdeľovací koeficient.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Kapitola A.8 tejto prílohy, Rozdeľovací koeficient.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paríž.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Tolls, J. (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Boethling, R. S., Mackay, D. (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Arnold, C. G., Widenhaupt, A., David, M. M., Müller, S. R., Haderlein, S. B., Schwarzenbach, R. P. (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2 596 – 2 602.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paríž.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Kapitola A.6 tejto prílohy, Rozpustnosť vo vode.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Kapitola C.7 tejto prílohy, Degradácia – Abiotická degradácia: hydrolýza ako funkcia pH.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Kapitola C.4 – časť II – VII (metóda A až F) tejto prílohy, Stanovenie ‚ľahkej‘ biodegradovateľnosti.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Kapitola A.4 tejto prílohy, Tlak pary.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Pinsuwan, S., Li A., a Yalkowsky, S. H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623 – 626.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Lyman, W. J. (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman, W. J., Reehl, W. F., Rosenblatt, D. H., Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 až 2-52.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Leo, A., Weininger, D. (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Meylan, W. (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Compudrug, L. (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapešť.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Lyman, W. J. (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman, W. J., Reehl, W. F., Rosenblatt, D. H., eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Rekker, R. F., de Kort, H. M. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479 – 488.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Jübermann, O. (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386 – 390.
                           
                        
                     Dodatok 1
                     
                        Tabuľka na výpočet minimálnych objemov vody požadovaných na zistenie testovaných látok s rôznymi hodnotami log Pow vo vodnej fáze
                     
                     Predpoklady:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Maximálny objem jednotlivých alikvotných častí = 10 % celkového objemu, 5 alikvotných častí = 50 % celkového objemu.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 
                                    . V prípade nižších koncentrácií sa vyžadujú väčšie objemy.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Objem použitý na stanovenie detekčného limitu (LOD) = 100 ml.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 log Pow oproti log Sw a log Pow oproti SR (Soct/Sw) primerane reprezentujú vzťahy testovaných látok.
                              
                           
                        Odhad Sw
                        
                     
                     
                                 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Rovnica
                              
                              
                                 log Sw
                                 
                              
                              
                                 Sw (mg/l)
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 0,496
                              
                              
                                 3,133E+00
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 0,035
                              
                              
                                 1,084E+00
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –0,426
                              
                              
                                 3,750E–01
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –0,887
                              
                              
                                 1,297E–01
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –1,348
                              
                              
                                 4,487E–02
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –1,809
                              
                              
                                 1,552E–02
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –2,270
                              
                              
                                 5,370E–03
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –2,731
                              
                              
                                 1,858E–03
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –3,192
                              
                              
                                 6,427E–04
                              
                           
                        Odhad Soct
                        
                     
                     
                                 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Rovnica
                              
                              
                                 Soct (mg/l)
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 3,763E+04
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 4,816E+04
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 6,165E+04
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 7,890E+04
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,010E+05
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,293E+05
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,654E+05
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 2,117E+05
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 2,710E+05
                              
                           
                        
                     
                                 Celková hmotnosť testovanej látky
                                 (mg)
                              
                              
                                 Hmotnosťokt/hmotnosťvoda
                                 
                              
                              
                                 HmotnosťH2O
                                 
                                 (mg)
                              
                              
                                 KoncentráciaH2O
                                 
                                 (mg/l)
                              
                              
                                 Hmotnosťokt
                                 
                                 (mg)
                              
                              
                                 Koncentráciaokt
                                 
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 1 319
                              
                              
                                 526
                              
                              
                                 2,5017
                              
                              
                                 2,6333
                              
                              
                                 1 317
                              
                              
                                 26 333
                              
                           
                                 1 686
                              
                              
                                 1 664
                              
                              
                                 1,0127
                              
                              
                                 1,0660
                              
                              
                                 1 685
                              
                              
                                 33 709
                              
                           
                                 2 158
                              
                              
                                 5 263
                              
                              
                                 0,4099
                              
                              
                                 0,4315
                              
                              
                                 2 157
                              
                              
                                 43 149
                              
                           
                                 2 762
                              
                              
                                 16 644
                              
                              
                                 0,1659
                              
                              
                                 0,1747
                              
                              
                                 2 762
                              
                              
                                 55 230
                              
                           
                                 3 535
                              
                              
                                 52 632
                              
                              
                                 0,0672
                              
                              
                                 0,0707
                              
                              
                                 3 535
                              
                              
                                 70 691
                              
                           
                                 4 524
                              
                              
                                 1664 36
                              
                              
                                 0,0272
                              
                              
                                 0,0286
                              
                              
                                 4 524
                              
                              
                                 90 480
                              
                           
                                 5 790
                              
                              
                                 5263 16
                              
                              
                                 0,0110
                              
                              
                                 0,0116
                              
                              
                                 5 790
                              
                              
                                 115 807
                              
                           
                                 7 411
                              
                              
                                 1 664 357
                              
                              
                                 0,0045
                              
                              
                                 0,0047
                              
                              
                                 7 411
                              
                              
                                 148 223
                              
                           
                                 9 486
                              
                              
                                 5 263 158
                              
                              
                                 0,0018
                              
                              
                                 0,0019
                              
                              
                                 9 486
                              
                              
                                 189 713
                              
                           
                        Výpočet objemov
                     
                     
                        Minimálny objem požadovaný pre fázu H2O pri každej koncentrácii
                     
                     
                                 log Kow
                                 
                              
                              
                                 LOD (mikrogramy/l)→
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,00
                              
                              
                                 10
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,04
                              
                              
                                 0,38
                              
                              
                                 3,80
                              
                              
                                 38
                              
                              
                                 380
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,09
                              
                              
                                 0,94
                              
                              
                                 9,38
                              
                              
                                 94
                              
                              
                                 938
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,23
                              
                              
                                 2,32
                              
                              
                                 23,18
                              
                              
                                 232
                              
                              
                                 2 318
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,57
                              
                              
                                 5,73
                              
                              
                                 57,26
                              
                              
                                 573
                              
                              
                                 5 726
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,41
                              
                              
                                 14,15
                              
                              
                                 141
                              
                              
                                 1 415
                              
                              
                                 14 146
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 3,50
                              
                              
                                 34,95
                              
                              
                                 350
                              
                              
                                 3 495
                              
                              
                                 34 950
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 8,64
                              
                              
                                 86,35
                              
                              
                                 864
                              
                              
                                 8 635
                              
                              
                                 86 351
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 21,33
                              
                              
                                 213
                              
                              
                                 2 133
                              
                              
                                 21 335
                              
                              
                                 213 346
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 52,71
                              
                              
                                 527
                              
                              
                                 5 271
                              
                              
                                 52 711
                              
                              
                                 527 111
                              
                           
                                 Objem použitý pri LOD l)
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                        Kľúč pre výpočty
                     
                     Predstavuje < 10 % celkového objemu vodnej fázy, jednolitrová nádoba na ustálenie rovnováhy.
                     Predstavuje < 10 % celkového objemu vodnej fázy, dvojlitrová nádoba na ustálenie rovnováhy.
                     Predstavuje < 10 % celkového objemu vodnej fázy, päťlitrová nádoba na ustálenie rovnováhy.
                     Predstavuje < 10 % celkového objemu vodnej fázy, desaťlitrová nádoba na ustálenie rovnováhy.
                     Presahuje 10 % aj v prípade desaťlitrovej nádoby na ustálenie rovnováhy.
                     
                        Prehľad požadovaných objemov ako funkcia rozpustnosti vo vode a log Pow
                        
                     
                     Minimálny objem požadovaný pre fázu H2O pri každej koncentrácii LOD (ml)
                     
                                 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Sw (mg/l)
                              
                              
                                 LOD (mikrogramy/l)→
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,00
                              
                              
                                 10
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,12
                              
                              
                                 1,19
                              
                              
                                 11,90
                              
                              
                                 118,99
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,02
                              
                              
                                 0,24
                              
                              
                                 2,38
                              
                              
                                 23,80
                              
                              
                                 237,97
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 3
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,04
                              
                              
                                 0,40
                              
                              
                                 3,97
                              
                              
                                 39,66
                              
                              
                                 396,62
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,12
                              
                              
                                 1,19
                              
                              
                                 11,90
                              
                              
                                 118,99
                              
                              
                                 1 189,86
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,02
                              
                              
                                 0,20
                              
                              
                                 2,03
                              
                              
                                 20,34
                              
                              
                                 203,37
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                 0,51
                              
                              
                                 5,08
                              
                              
                                 50,84
                              
                              
                                 508,42
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,02
                              
                              
                                 10,17
                              
                              
                                 101,68
                              
                              
                                 1 016,83
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,20
                              
                              
                                 2,03
                              
                              
                                 20,34
                              
                              
                                 203,37
                              
                              
                                 2 033,67
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,09
                              
                              
                                 0,87
                              
                              
                                 8,69
                              
                              
                                 86,90
                              
                              
                                 869,01
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,17
                              
                              
                                 1,74
                              
                              
                                 17,38
                              
                              
                                 173,80
                              
                              
                                 1 738,02
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,375
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,23
                              
                              
                                 2,32
                              
                              
                                 23,18
                              
                              
                                 231,75
                              
                              
                                 2 317,53
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,43
                              
                              
                                 4,35
                              
                              
                                 43,45
                              
                              
                                 434,51
                              
                              
                                 4 345,05
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 0,4
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,19
                              
                              
                                 1,86
                              
                              
                                 18,57
                              
                              
                                 185,68
                              
                              
                                 1 856,79
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,37
                              
                              
                                 3,71
                              
                              
                                 37,14
                              
                              
                                 371,36
                              
                              
                                 3 713,59
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,74
                              
                              
                                 7,43
                              
                              
                                 74,27
                              
                              
                                 742,72
                              
                              
                                 7 427,17
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,49
                              
                              
                                 14,85
                              
                              
                                 148,54
                              
                              
                                 1 485,43
                              
                              
                                 14 854,35
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,63
                              
                              
                                 6,35
                              
                              
                                 63,48
                              
                              
                                 634,80
                              
                              
                                 6 347,95
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,27
                              
                              
                                 12,70
                              
                              
                                 126,96
                              
                              
                                 1 269,59
                              
                              
                                 12 695,91
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 2,54
                              
                              
                                 25,39
                              
                              
                                 253,92
                              
                              
                                 2 539,18
                              
                              
                                 25 391,82
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 5,08
                              
                              
                                 50,78
                              
                              
                                 507,84
                              
                              
                                 5 078,36
                              
                              
                                 50 783,64
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 0,025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 2,17
                              
                              
                                 21,70
                              
                              
                                 217,02
                              
                              
                                 2 170,25
                              
                              
                                 21 702,46
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 4,34
                              
                              
                                 43,40
                              
                              
                                 434,05
                              
                              
                                 4 340,49
                              
                              
                                 43 404,93
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,006
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 9,04
                              
                              
                                 90,43
                              
                              
                                 904,27
                              
                              
                                 9 042,69
                              
                              
                                 90 426,93
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,003
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 18,09
                              
                              
                                 180,85
                              
                              
                                 1 808,54
                              
                              
                                 18 085,39
                              
                              
                                 180 853,86
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 0,006
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 7,73
                              
                              
                                 77,29
                              
                              
                                 772,89
                              
                              
                                 7 728,85
                              
                              
                                 77 288,50
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,003
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 15,46
                              
                              
                                 154,58
                              
                              
                                 1 545,77
                              
                              
                                 15 457,70
                              
                              
                                 154 577,01
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0015
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 23,19
                              
                              
                                 231,87
                              
                              
                                 2 318,66
                              
                              
                                 23 186,55
                              
                              
                                 231 865,51
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 46,37
                              
                              
                                 463,73
                              
                              
                                 4 637,31
                              
                              
                                 46 373,10
                              
                              
                                 463 731,03
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 0,002
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 19,82
                              
                              
                                 198,18
                              
                              
                                 1 981,77
                              
                              
                                 19 817,73
                              
                              
                                 198 177,33
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 39,64
                              
                              
                                 396,35
                              
                              
                                 3 963,55
                              
                              
                                 39 635,47
                              
                              
                                 396 354,66
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0005
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 79,27
                              
                              
                                 792,71
                              
                              
                                 7 927,09
                              
                              
                                 79 270,93
                              
                              
                                 792 709,32
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,00025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 158,54
                              
                              
                                 1 585,42
                              
                              
                                 15 854,19
                              
                              
                                 158 541,86
                              
                              
                                 1 585 418,63
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 33,88
                              
                              
                                 338,77
                              
                              
                                 3 387,68
                              
                              
                                 33 876,77
                              
                              
                                 338 767,72
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0005
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 67,75
                              
                              
                                 677,54
                              
                              
                                 6 775,35
                              
                              
                                 67 753,54
                              
                              
                                 677 535,44
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,00025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 135,51
                              
                              
                                 1 355,07
                              
                              
                                 13 550,71
                              
                              
                                 135 507,09
                              
                              
                                 1 355 070,89
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,000125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 271,01
                              
                              
                                 2 710,14
                              
                              
                                 27 101,42
                              
                              
                                 271 014,18
                              
                              
                                 2 710 141,77
                              
                           
                                 Objem použitý pre LOD l)
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                  
                     Dodatok 2
                     
                        Príklad testovacej nádoby so skleným plášťom pre pokus s pomalým miešaním na stanovenie Pow
                        
                     
                     
                        
                  “
            
                  3.
               
               
                  Kapitola B.2 sa nahrádza takto:
                  „B.2.   AKÚTNA INHALAČNÁ TOXICITA
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov TG 403 (2009) (1). Pôvodné Usmernenia na vykonávanie testov akútnej inhalácie 403 (TG 403) boli prijaté v roku 1981. Táto revidovaná testovacia metóda B.2 (ako rovnocenná verzia revidovaných usmernení TG 403) bola vytvorená s cieľom zabezpečiť väčšiu flexibilitu, znížiť využívanie zvierat a vyhovieť regulačným potrebám. Revidovaná testovacia metóda zahŕňa dva druhy štúdií: tradičný protokol LC50 a protokol koncentrácia × čas (C × t). Základnými črtami tejto testovacej metódy sú schopnosť určiť závislosť koncentrácie a reakcie v rozsahu od neletálnych dôsledkov až po smrteľné dôsledky na účely odvodenia strednej smrteľnej koncentrácie (LC50), neletálnej prahovej koncentrácie (napr. LC01) a sklonu a zistenia potenciálnej vnímavosti pohlaví. Protokol C × t by sa mal použiť v prípade, že existuje konkrétna regulačná alebo vedecká potreba, ktorá vyžaduje testovanie na zvieratách v priebehu viacerých časových intervalov, ako napríklad na účely plánovania núdzovej reakcie [napr. odvodenie hodnôt smerodajných úrovní akútnej expozície (AEGL), usmernení pre plánovanie núdzovej reakcie (ERPG) alebo prahových úrovní akútnej expozície (AETL)] alebo na plánovanie využitia krajiny.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Usmernenia k vykonaniu a interpretácii štúdií tejto testovacej metódy sú k dispozícii v usmerňovacom dokumente o testovaní akútnej inhalačnej toxicity (GD 39) (2).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Vymedzenie pojmov použitých v súvislosti s touto testovacou metódou je uvedené na konci tejto kapitoly a v dokumente GD 39 (2).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda umožňuje charakterizáciu testovanej chemikálie a kvantitatívne posúdenie rizík a umožňuje, aby boli testované chemikálie zoradené a klasifikované podľa nariadenia (ES) č. 1272/2008 (3). V dokumente GD 39 (2) sa uvádzajú usmernenia k výberu vhodnej metódy testovania akútnej toxicity. Ak sa požadujú iba informácie o klasifikácii a označovaní, vo všeobecnosti sa odporúča riadiť sa kapitolou B.52 tejto prílohy (4) [pozri dokument GD 39 (2)]. Táto testovacia metóda B.2 nie je špecificky určená na testovanie špecializovaných materiálov, ako sú slabo rozpustné izometrické alebo vláknité materiály alebo priemyselne vyrábané nanomateriály.
                           
                        ÚVODNÉ ÚVAHY
                  
                              5.
                           
                           
                              Pred zvažovaním testovania podľa tejto testovacej metódy by testovacie laboratórium malo zohľadniť všetky dostupné informácie o testovanej chemikálii vrátane existujúcich štúdií [napr. kapitola B.52 tejto prílohy (4)] obsahujúcich údaje, na základe ktorých sa ďalšie testovanie neodporúča s cieľom minimalizovať využívanie zvierat. Informácie, ktoré môžu pomôcť pri výbere najvhodnejšieho druhu, kmeňa, pohlavia, spôsobu expozície a primeraných testovacích koncentrácií, zahŕňajú identitu, chemickú štruktúru a fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej chemikálie, výsledky všetkých testov toxicity in vitro alebo in vivo, predpokladané použitia a potenciál expozície človeka, dostupné údaje (Q)SAR a toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných látkach [pozri dokument GD 39 (2)].
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Testovaniu žieravých a/alebo dráždivých testovacích chemikálií v koncentráciách, ktoré podľa očakávania spôsobia silnú bolesť a/alebo utrpenie by sa malo v čo najväčšej možnej miere vyhnúť. Žieravý/dráždivý potenciál by sa mal posúdiť prostredníctvom odborného posudku s využitím takých dôkazov, ako sú skúseností u ľudí a pri zvieratách (napr. zo štúdií opakovaných dávok uskutočnených pri nežieravých/dráždivých koncentráciách), existujúce údaje in vitro [napr. z kapitol B.40, (5), B.40a (6) tejto prílohy alebo dokumentu OECD TG 435 (7)], hodnoty pH, informácie o podobných látkach alebo akékoľvek iné súvisiace údaje, s cieľom preskúmať, či je možné vyhnúť sa ďalšiemu testovaniu. Na špecifické regulačné účely (napr. na účely núdzového plánovania) možno túto testovaciu metódu použiť na expozíciu zvierat týmto materiálom, lebo to poskytne vedúcemu štúdie alebo vedúcemu výskumnému pracovníkovi kontrolu nad výberom cieľových koncentrácií. Cieľové koncentrácie by však nemali spôsobovať silné dráždivé/žieravé účinky, mali by však byť dostatočné na predĺženie krivky závislosti reakcie od koncentrácie na úroveň, na ktorej sa zabezpečí regulačný a vedecký cieľ testu. Tieto koncentrácie by sa mali vyberať v závislosti od jednotlivých prípadov a výber koncentrácie by sa mal odôvodniť [pozri dokument GD 39 (2)].
                           
                        PRINCÍP TESTU
                  
                              7.
                           
                           
                              Táto revidovaná testovacia metóda B.2 bola vypracovaná s cieľom získať dostatočné informácie o akútnej toxicite testovanej chemikálie, aby bolo možné ju klasifikovať a aby sa získali údaje o letalite (napr. LC50, LC01 a sklon) v prípade jedného alebo oboch pohlaví potrebné na kvantitatívne posúdenie rizík. V rámci tejto testovacej metódy sú k dispozícii dve metódy. Prvou metódou je tradičný protokol, pri ktorom sú skupiny zvierat vystavené limitnej koncentrácii (limitný test) alebo sérii koncentrácií v rámci postupu niekoľkých krokov väčšinou v intervaloch trvajúcich štyri hodiny, ktoré sa určia vopred. Na špecifické regulačné účely možno použiť iné intervaly expozície. Druhou metódou je protokol (C × t), pri ktorom sú skupiny zvierat vystavené jednej koncentrácii (limitná koncentrácia) alebo sérii viacerých koncentrácií v priebehu viacerých intervalov.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Moribundné zvieratá alebo zvieratá so zjavnými bolesťami alebo zvieratá, ktoré vykazujú príznaky silného a trvalého utrpenia, by sa mali humánnym spôsobom usmrtiť, pričom pri interpretácii výsledku testu sa vyhodnocujú rovnako ako zvieratá, ktoré uhynuli pri teste. Kritériá na rozhodnutie usmrtiť moribundné alebo silne trpiace zvieratá a usmernenie o uznaní predvídateľnej alebo nastávajúcej smrti sú predmetom usmerňovacieho dokumentu OECD č. 19 o humánnych parametroch (Humane Endpoints Guidance Document) (8).
                           
                        OPIS METÓDY
                  
                     Výber druhov zvierat
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Používajú sa zdravé mladé dospelé zvieratá bežne používaných laboratórnych kmeňov. Najvhodnejším zvieraťom je potkan. Použitie iných druhov zvierat je nutné odôvodniť.
                           
                        
                     Príprava zvierat
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Používajú sa samice, ktoré nikdy nevrhli mláďatá a sú negravidné. V deň expozície by zvieratá mali byť mladé dospelé jedince vo veku od 8 do 12 týždňov a ich telesná hmotnosť by mala byť v rozmedzí ± 20 % strednej hmotnosti jednotlivých pohlaví všetkých zvierat toho istého veku, ktoré boli exponované skôr. Zvieratá sa vyberajú náhodne a označia sa na účely individuálnej identifikácie. Zvieratá sa umiestnia do klietok najmenej na päť dní pred začatím testu, aby sa aklimatizovali na laboratórne podmienky. Zvieratá by sa na krátky čas pred testovaním mali aklimatizovať aj na testovacie zariadenie, lebo sa tak zníži stres spôsobený uvedením do nového prostredia.
                           
                        
                     Chov zvierat
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Teplota miestnosti, kde sa pokusné zviera chová, by mala byť 22 ± 3 °C. Relatívna vlhkosť by sa v ideálnom prípade mala udržiavať v rozsahu od 30 do 70 %, hoci to nemusí byť možné, ak sa ako nosič používa voda. Pred a po expozícii sú zvieratá zvyčajne umiestnené v klietkach v skupinách podľa pohlavia a koncentrácie, ale počet zvierat v jednej klietke by nemal prekážať bezproblémovému pozorovaniu každého zvieraťa, pričom by sa mali minimalizovať straty súvisiace so vzájomným požieraním alebo bojom jedincov. V prípade, že sa použije iba expozícia oblasti nosa, môže byť potrebné, aby sa zvieratá aklimatizovali na skúmavky obmedzujúce pohyb. Skúmavky by nemali zvieratám spôsobovať neprimeraný stres súvisiaci s fyzikálnymi vlastnosťami, teplotou alebo obmedzením pohybu. Obmedzenie môže mať vplyv na fyziologické sledované parametre, ako sú telesná teplota (hypertermia) a/alebo respiračný minútový objem. Ak sú k dispozícii všeobecné údaje, podľa ktorých k takýmto zmenám nedochádza vo veľkej miere, potom nie je potrebné predchádzajúce prispôsobenie obmedzujúcim skúmavkám. Zvieratá vystavené účinkom aerosólu celým telom by sa mali v priebehu expozície umiestniť samostatne, aby sa zabránilo filtrovaniu testovaného aerosólu cez srsť ostatných zvierat v klietke. S výnimkou času trvania expozície sa na kŕmenie môže používať bežné a osvedčené laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou miestnej pitnej vody. Osvetlenie by malo byť umelé a malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy.
                           
                        
                     Inhalačné komory
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Pri výbere inhalačnej komory by sa mal vziať do úvahy charakter testovanej chemikálie a cieľ testu. Uprednostňuje sa expozícia oblasti nosa (pričom tento pojem zahŕňa expozíciu hlavy, nosa alebo pysku). Vo všeobecnosti sa pri štúdiách kvapalných alebo tuhých aerosólov a pár, ktoré môžu kondenzovať a vytvárať aerosóly, uprednostňuje expozícia oblasti nosa. Špeciálne ciele štúdie možno lepšie dosiahnuť použitím expozície celého tela, ale tento krok je potrebné v správe o štúdii odôvodniť. Na zabezpečenie stability prostredia pri používaní komory na expozíciu celého tela by celkový objem testovaných zvierat nemal presiahnuť 5 % objemu komory. Princípy metód expozície celého tela a oblasti nosa a ich konkrétne výhody a nevýhody sú opísané v dokumente GD 39 (2).
                           
                        PODMIENKY EXPOZÍCIE
                  
                     Podávanie koncentrácií
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Expozícia oblasti nosa môže mať pri potkanoch akékoľvek trvanie až do šiestich hodín. Ak sa použije expozícia oblasti nosa pri myšiach, vo všeobecnosti by nemala trvať dlhšie ako štyri hodiny. Ak je potrebné, aby expozícia trvala dlhšie, je nutné uviesť odôvodnenie [pozri dokument GD 39 (2)]. Zvieratá vystavené pôsobeniu aerosólov v komorách na expozíciu celého tela by mali byť umiestnené samostatne, aby sa zabránilo požitiu testovanej chemikálie v dôsledku očisťovania tela ostatnými zvieratami v klietke. Počas trvania expozície by sa zviera nemalo kŕmiť. V priebehu expozície celého tela sa zvieraťu môže podať voda.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Zvieratá sú vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie vo forme plynu, pary, aerosólu alebo ich kombinácie. Fyzikálne skupenstvo, ktoré sa testuje, závisí od fyzikálno-chemických vlastností testovanej chemikálie, zvolenej koncentrácie a/alebo najpravdepodobnejšej fyzikálnej formy pri manipulácii a používaní testovanej chemikálie. Hygroskopické a chemicky reaktívne testované chemikálie by sa mali testovať v podmienkach suchého vzduchu. Treba dbať na to, aby sa nevytvorili výbušné koncentrácie.
                           
                        
                     Rozdelenie veľkosti častíc
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Častice by sa mali rozdeliť podľa veľkosti v prípade všetkých aerosólov a pár, ktoré môžu kondenzovať a vytvárať aerosóly. Na umožnenie expozície všetkých relevantných oblastí dýchacej sústavy sa odporúčajú aerosóly so stredným aerodynamickým hmotnostným priemerom (MMAD) v rozsahu od 1 do 4 μm so štandardnou odchýlkou geometrického priemeru (σg) v rozsahu od 1,5 do 3,0 (2) (9) (10). Hoci by sa malo vynaložiť značné úsilie na dodržanie tejto normy, pokiaľ túto podmienku nie je možné splniť, treba predložiť odborný posudok. Napríklad v prípade kovových dymov môžu byť častice menšie, ako stanovuje táto norma, a takisto nabité častice, vlákna a hygroskopické materiály (ktoré sa vo vlhkom prostredí dýchacej sústavy zväčšujú) môžu túto normu prekračovať.
                           
                        
                     Príprava testovanej chemikálie v nosiči
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Na prípravu vhodnej koncentrácie a veľkosti častíc testovanej chemikálie v ovzduší možno použiť nosič. Spravidla sa uprednostňuje voda. Tuhý materiál môže byť podrobený mechanickým procesom s cieľom dosiahnuť požadovanú distribúciu veľkosti častíc, treba však dbať na to, aby sa testovaná chemikália nerozložila ani nezmenila. V prípadoch, v ktorých sa usudzuje, že sa pôsobením mechanických procesov zmenilo zloženie testovanej chemikálie (napr. extrémne teploty spôsobené nadmerným mletím v dôsledku trenia), by sa zloženie testovanej chemikálie malo analyticky overiť. Treba dať dostatočný pozor, aby sa testovaná chemikália neznečistila. Nie je potrebné testovať nedrobivé granulované materiály, ktoré sa účelovo pripravujú tak, aby nebolo možné ich inhalovať. Na preukázanie, že pri manipulácii s granulovaným materiálom nevznikajú dýchateľné častice, by sa mal vykonať test opotrebovania. Ak pri teste opotrebovania nevzniknú dýchateľné látky, treba uskutočniť test inhalačnej toxicity.
                           
                        
                     Kontrolné zvieratá
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Súbežná negatívna kontrolná skupina (ovzdušia) nie je potrebná. V prípade, že sa na vytvorenie testovacieho ovzdušia použije iný nosič ako voda, sa kontrolná skupina nosiča použije iba vtedy, ak nie sú k dispozícii staršie údaje o inhalačnej toxicite. Ak sa pri štúdii toxicity testovanej chemikálie pripravenej v nosiči nezistí žiadna toxicita, znamená to, že nosič pri testovanej koncentrácii nie je toxický, a teda kontrola nosiča nie je potrebná.
                           
                        MONITOROVANIE PODMIENOK EXPOZÍCIE
                  
                     Prúdenie vzduchu v komore
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Prúdenie vzduchu cez komoru by sa počas každej expozície malo dôkladne kontrolovať, nepretržite monitorovať a zaznamenávať aspoň raz za hodinu. Monitorovanie koncentrácie testovacieho ovzdušia (alebo stability) je integrálne meranie všetkých dynamických parametrov a poskytuje nepriamy prostriedok kontroly všetkých relevantných dynamických parametrov tvorby ovzdušia. Osobitne treba dbať na to, aby sa zabránilo opätovnému vdýchnutiu v komorách na expozíciu oblasti nosa v prípadoch, v ktorých prúdenie vzduchu cez systém expozície nestačí na zabezpečenie dynamického prúdenia vzduchu s testovanou chemikáliou. Existujú predpísané metodiky, prostredníctvom ktorých možno dokázať, že v zvolených prevádzkových podmienkach nedochádza k opätovnému vdýchnutiu (2) (11). Koncentrácia kyslíka by mala byť minimálne 19 % a koncentrácia oxidu uhličitého by nemala presiahnuť 1 %. Ak existuje dôvod domnievať sa, že tieto normy nie je možné splniť, koncentrácie kyslíka a oxidu uhličitého by sa mali zmerať.
                           
                        
                     Teplota komory a relatívna vlhkosť
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Komora by sa mala udržiavať pri teplote 22 ± 3 °C. Relatívna vlhkosť v dýchacej zóne zvierat, tak v prípade expozície oblasti nosa, ako aj v prípade expozície celého tela, by sa mala monitorovať a zaznamenávať minimálne trikrát počas expozície v trvaní až štyroch hodín a v prípade kratšej expozície každú hodinu. Relatívna vlhkosť by sa ideálne mala udržiavať v rozsahu od 30 do 70 %, ale môže sa stať, že táto hodnota bude nedosiahnuteľná (napr. v prípade testovania zmesí na báze vody) alebo nemerateľná z dôvodu interferencie testovanej chemikálie a testovacej metódy.
                           
                        
                     Testovaná chemikália: nominálna koncentrácia
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Vždy, keď je to možné, by sa mala vypočítať a zaznamenať nominálna koncentrácia expozície v komore. Nominálna koncentrácia je hmotnosť vytvorenej testovanej chemikálie vydelená celkovým objemom vzduchu, ktorý prešiel systémom komory. Nominálna koncentrácia sa nepoužíva na charakterizáciu expozície zvierat, ale porovnanie nominálnej a skutočnej koncentrácie vypovedá o účinnosti vytvárania testovacieho systému, a teda sa môže použiť na zistenie problémov s tvorbou.
                           
                        
                     Testovaná chemikália: skutočná koncentrácia
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Skutočná koncentrácia je koncentrácia testovanej chemikálie v dýchacej zóne zvierat v inhalačnej komore. Skutočné koncentrácie možno získať špecifickými metódami (napr. priamym odberom vzorky, adsorpčnými alebo chemicky reaktívnymi metódami a následnou analytickou charakterizáciou) alebo nešpecifickými metódami, ako je gravimetrická filtrová analýza. Použitie gravimetrickej analýzy je prípustné iba v prípade jednozložkových práškových aerosólov alebo aerosólov kvapalín s nízkou prchavosťou, pričom je potrebné túto analýzu podložiť primeranými testovými charakterizáciami predbežných štúdií týkajúcich sa konkrétnej chemikálie. Koncentráciu viaczložkových práškových aerosólov možno takisto stanoviť prostredníctvom gravimetrickej analýzy. V tom prípade sú však potrebné analytické údaje, ktoré dokazujú, že zloženie materiálu vo vzduchu je podobné ako zloženie východiskového materiálu. Ak tieto informácie nie sú dostupné, môže byť potrebná opätovná analýza testovanej chemikálie (ideálne v jej skupenstve v ovzduší) v pravidelných intervaloch v priebehu štúdie. V prípade aerosólových látok, ktoré sa môžu vypariť alebo môžu sublimovať, by sa malo preukázať, že všetky fázy sa zhromaždili pomocou zvolenej metódy. V správe o štúdii by sa mali uviesť cieľové, nominálne a skutočné koncentrácie. Na výpočet hodnôt smrteľných koncentrácií sa však v štatistických analýzach použijú iba skutočné koncentrácie.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Ak je to možné, mala by sa použiť jedna dávka testovanej chemikálie, pričom testovaná vzorka by sa mala uskladniť za podmienok, za ktorých sa zachová jej čistota, homogenita a stabilita. Pred začatím štúdie by mala byť k dispozícii charakterizácia testovanej chemikálie vrátane jej čistoty a, ak je to technicky možné, identity a množstiev identifikovaných kontaminantov a prímesí. Charakterizáciu možno preukázať napríklad týmito údajmi: retenčný čas a relatívna plocha píku, molekulová hmotnosť získaná pomocou analýzy hmotnostnej spektrometrie alebo plynovej chromatografie alebo iné odhady. Hoci za identitu testovanej vzorky testovacie laboratórium nenesie zodpovednosť, je vhodné, aby testovacie laboratórium aspoň čiastočne potvrdilo charakterizáciu poskytnutú dodávateľom (napr. farbu, fyzikálne skupenstvo atď.).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Prostredie expozície by malo byť čo najstálejšie a malo by sa nepretržite a/alebo občasne monitorovať v závislosti od metódy analýzy. Ak sa použije občasný odber vzoriek, vzorky ovzdušia komory by sa mali v priebehu štvorhodinovej štúdie odobrať najmenej dvakrát. Ak to pre nízky prietok vzduchu alebo nízke koncentrácie nie je možné, môže sa v priebehu celého intervalu expozície odobrať jedna vzorka. Ak sa medzi jednotlivými vzorkami vyskytnú výrazné výkyvy, pri ďalších testovaných koncentráciách by sa mali použiť štyri vzorky z každej expozície. Jednotlivé vzorky koncentrácie komory by sa nemali odchýliť od strednej koncentrácie o viac ako ± 10 % v prípade plynov a pár alebo o ± 20 % v prípade kvapalných alebo tuhých aerosólov. Čas na dosiahnutie rovnováhy v komore (t95) by sa mal vypočítať a zaznamenať. Interval expozície zahŕňa čas, keď sa testovaná chemikália tvorí, pričom sa zohľadňujú aj časy potrebné na dosiahnutie t95. Usmernenia k odhadovaniu t95 sú uvedené v dokumente GD 39 (2).
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              V prípade veľmi komplexných zmesí tvorených plynmi/parami a aerosólov (napr. spaľovacieho ovzdušia a testovaných chemikálií poháňaných účelovými výrobkami/zariadeniami koncového použitia) sa v inhalačnej komore môže každá fáza správať inak, takže by sa mala vybrať aspoň jedna látka slúžiaca ako ukazovateľ (analyt), najčastejšie hlavná aktívna látka v zmesi, každej fázy (plyn/para a aerosól). Ak je testovaná chemikália zmes, v správe by sa mala uviesť analytická koncentrácia zmesi, nielen aktívnej látky alebo zložky (analytu). Ďalšie informácie týkajúce sa skutočných koncentrácií sú uvedené v dokumente GD 39 (2).
                           
                        
                     Testovaná chemikália: rozdelenie veľkosti častíc
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Rozdelenie veľkosti častíc aerosólov by sa malo stanoviť aspoň dvakrát v priebehu každej expozície v trvaní štyroch hodín, a to pomocou kaskádového impaktora alebo alternatívneho prístroja, ako je napríklad aerodynamický spektrometer častíc. Ak možno preukázať rovnocennosť výsledkov získaných pomocou kaskádového impaktora a alternatívneho prístroja, potom sa alternatívny prístroj môže používať počas celej štúdie. Druhé zariadenie, ako je gravimetrický filter alebo impinger/premývačka, by sa malo použiť súbežne s hlavným prístrojom na potvrdenie zachytávacej účinnosti hlavného prístroja. Hmotnostná koncentrácia získaná analýzou veľkosti častíc by mala byť v rozsahu primeraných limitov hmotnostnej koncentrácie získanej filtrovou analýzou [pozri dokument GD 39 (2)]. Ak možno preukázať rovnocennosť v počiatočnej fáze štúdie, nie je potrebné vykonávať ďalšie potvrdzujúce merania. V záujme zabezpečenia dobrých životných podmienok pre zvieratá by sa mali prijať opatrenia na minimalizáciu nejednoznačných údajov, ktoré môžu viesť k potrebe opakovať expozíciu. Rozdelenie veľkosti častíc by sa malo vykonať v prípade pár, ak existuje možnosť, že kondenzácia pary môže mať za následok tvorbu aerosólu, alebo ak sa v ovzduší pár zistia častice s potenciálom zmiešaných fáz (pozri odsek 15).
                           
                        POSTUP
                  
                              26.
                           
                           
                              Ďalej v texte sú opísané dva druhy štúdií: tradičný protokol a protokol C × t. Obidva protokoly môžu zahŕňať predbežnú štúdiu, základnú štúdiu a/alebo limitný test (tradičný protokol) alebo testovanie pri limitnej koncentrácii (C × t). Ak je známe, že jedno pohlavie je vnímavejšie, vedúci štúdie môže rozhodnúť, že sa na tieto štúdie použije iba vnímavejšie pohlavie. Ak sa v prípade iných hlodavcov ako potkanov použije expozícia oblasti nosa, maximálne trvanie expozície je možné prispôsobiť s cieľom minimalizovať druhovo špecifické utrpenie. Pred začatím by sa mali zvážiť všetky dostupné údaje, aby sa minimalizovalo využívanie zvierat. Napríklad údaje získané s využitím kapitoly B.52 tejto prílohy (4) môžu eliminovať potrebu predbežnej štúdie a môžu takisto preukázať, či je jedno pohlavie vnímavejšie [pozri dokument GD 39 (2)].
                           
                        TRADIČNÝ PROTOKOL
                  
                     Všeobecné úvahy: Tradičný protokol
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Pri tradičnej štúdii sú skupiny zvierat vystavené účinkom testovanej chemikálie počas pevne stanoveného obdobia (vo všeobecnosti štyri hodiny) buď v komore na expozíciu oblasti nosa, alebo v komore na expozíciu celého tela. Zvieratá sú exponované limitnej koncentrácii (limitný test) alebo v prípade postupu zahŕňajúceho viac krokov najmenej trom koncentráciám (základná štúdia). Základnej štúdii môže predchádzať predbežná štúdia, pokiaľ neexistujú informácie o testovanej látke, ako je napríklad štúdia B.52 uskutočnená skôr [pozri GD 39 (2)].
                           
                        
                     Predbežná štúdia: Tradičný protokol
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Predbežná štúdia sa používa na odhad potencie testovanej chemikálie, identifikáciu rozdielov medzi pohlaviami, pokiaľ ide o vnímavosť, a pomoc pri výbere úrovní koncentrácie pri expozícii pre základnú štúdiu alebo pre limitný test. Pri výbere úrovní koncentrácie na účely predbežnej štúdie by sa mali použiť všetky dostupné informácie vrátane údajov (Q)SAR a údajov o podobných chemikáliách. Pri každej koncentrácii by sa nemali exponovať viac ako tri samce a tri samice (na stanovenie rozdielov medzi pohlaviami môžu byť potrebné tri zvieratá z každého pohlavia). Predbežná štúdia sa môže vykonávať s využitím jednej koncentrácie, ale v prípade potreby je možné testovať aj viac koncentrácií. V rámci predbežnej štúdie by sa nemal testovať taký počet zvierat a koncentrácií, ktorý by pripomínal základnú štúdiu. Namiesto predbežnej štúdie sa môže použiť štúdia B.52 (4) uskutočnená skôr [pozri dokument GD 39 (2)].
                           
                        
                     Limitný test: Tradičný protokol
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Limitný test sa používa, ak je známe alebo sa predpokladá, že testovaná chemikália je v podstate netoxická, t. j. vyvoláva toxickú reakciu iba pri koncentrácii vyššej, ako je regulačná limitná koncentrácia. Pri limitnom teste sa jedna skupina troch samcov a troch samíc exponuje testovanej chemikálii pri limitnej koncentrácii. Informácie o toxicite testovanej chemikálie možno získať z poznatkov o podobných testovaných chemikáliách pri zohľadnení identity a percenta zložiek, o ktorých je známe, že sú toxikologicky významné. V situáciách, keď existuje málo informácií alebo neexistujú žiadne informácie o jej toxicite, alebo ak sa očakáva, že testovaná chemikália bude toxická, je potrebné vykonať základný test.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Výber limitných koncentrácií zvyčajne závisí od regulačných požiadaviek. Ak sa použije nariadenie (ES) č. 1272/2008, limitná koncentrácia v prípade plynov je 20 000 ppm, v prípade pár 20 mg/l a v prípade aerosólov 5 mg/l (alebo maximálna dosiahnuteľná koncentrácia) (3). V prípade niektorých testovaných chemikálií, najmä vo forme pár a aerosólov, môže byť technicky náročné pripraviť limitné koncentrácie. Pri testovaní aerosólov by hlavným cieľom malo byť dosiahnutie dýchateľnej veľkosti častíc (MMAD 1 – 4 μm). V prípade väčšiny testovaných chemikálií je túto veľkosť možné dosiahnuť pri koncentrácii 2 mg/l. O testovanie aerosólov pri koncentrácii vyššej ako 2 mg/l sa možno pokúšať, iba ak je možné získať dýchateľnú veľkosť častíc [pozri dokument GD 39 (2)]. V nariadení (ES) č. 1272/2008 sa z dôvodu starostlivosti o zvieratá neodporúča testovanie pri koncentrácii vyššej, ako je limitná koncentrácia (3). Limitná koncentrácia by sa mala zvažovať iba vtedy, ak existuje vysoká pravdepodobnosť, že výsledky takéhoto testu by mali priamy význam pre ochranu ľudského zdravia (3), pričom do správy o štúdii treba uviesť odôvodnenie. V prípade potenciálne výbušných testovaných chemikálií treba dbať na to, aby nenastali podmienky, ktoré by mohli viesť k výbuchu. S cieľom zabrániť zbytočnému využívaniu zvierat by sa malo pred limitným testom vykonať testovacie kolo bez zvierat, aby sa zabezpečilo, že v komore je možné dosiahnuť podmienky na účely limitného testu.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Ak sa pri limitnej koncentrácii pozoruje mortalita alebo moribundita, výsledky limitného testu môžu slúžiť ako predbežná štúdia pre ďalšie testovanie pri iných koncentráciách (pozri základnú štúdiu). Ak fyzikálne alebo chemické vlastnosti testovanej chemikálie znemožňujú dosiahnutie limitnej koncentrácie, mala by sa testovať maximálna dosiahnuteľná koncentrácia. Ak sa pri maximálnej dosiahnuteľnej koncentrácii vyskytne letalita nižšia ako 50 %, ďalšie testovanie nie je potrebné. Ak nebolo možné dosiahnuť limitnú koncentráciu, v správe o štúdii treba uviesť vysvetlenie a podložiť ho údajmi. Ak maximálna dosiahnuteľná koncentrácia pary nevyvoláva toxicitu, môže byť potrebné pripraviť testovanú chemikáliu ako kvapalný aerosól.
                           
                        
                     Základná štúdia: Tradičný protokol
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Základná štúdia sa zvyčajne vykonáva s využitím piatich samcov a piatich samíc (alebo päť zvierat vnímavejšieho pohlavia, ak je známe) pri jednej úrovni koncentrácie, pričom sa testujú najmenej tri úrovne koncentrácie. Na zabezpečenie dôkladnej štatistickej analýzy by sa mali použiť dostatočné úrovne koncentrácie. Časový interval medzi skupinami expozícií je určený nástupom, trvaním a závažnosťou príznakov toxicity. Expozícia zvierat pri ďalšej úrovni koncentrácie by sa mala odložiť, kým sa nenadobudne dostatočná dôvera, že zvieratá, ktoré boli testované, prežijú. To umožní vedúcemu štúdie, aby prispôsobil cieľovú koncentráciu pre ďalšiu expozičnú skupinu. Z dôvodu závislosti od sofistikovaných technológií to v prípade inhalačných štúdií nemusí byť vždy možné, takže expozícia zvierat pri ďalšej úrovni koncentrácie by mala vychádzať z predchádzajúcich skúseností a vedeckého posudku. Pri testovaní zmesí si treba preštudovať dokument GD 39 (2).
                           
                        PROTOKOL KONCENTRÁCIA × ČAS (C × t)
                  
                     Všeobecné úvahy: Protokol C × t
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              O štúdii C × t pozostávajúcej z viacerých krokov možno pri hodnotení inhalačnej toxicity uvažovať ako o alternatíve k tradičnému protokolu (12) (13) (14). Tento prístup umožňuje, aby boli zvieratá exponované testovanej chemikálii pri viacerých úrovniach koncentrácie a počas niekoľkých časových intervalov. Celé testovanie prebieha v komore na expozíciu oblasti nosa (v prípade tohto protokolu nie je možné použiť komory na expozíciu celého tela). Tento protokol je znázornený v tokovom diagrame v dodatku 1. Zo simulačnej analýzy vyplynulo, že v prípade tradičného protokolu, ako aj v prípade protokolu C × t možno získať spoľahlivé hodnoty LC50, ale protokol C × t je všeobecne lepší na získanie spoľahlivých hodnôt LC01 a LC10 (15).
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Simulačná analýza preukázala, že využívanie dvoch zvierat pre jeden interval C × t (jedno zviera z každého pohlavia pri použití oboch pohlaví alebo dve zvieratá vnímavejšieho pohlavia) môže byť vo všeobecnosti v prípade základnej štúdie vhodné pri testovaní štyroch koncentrácií a piatich intervalov expozície. Za určitých okolností sa vedúci štúdie môže rozhodnúť pre použitie dvoch potkanov z každého pohlavia pre jeden interval C × t (15). Použitie dvoch zvierat z každého pohlavia na jednu koncentráciu a časový bod môže znížiť chybu a variabilitu odhadov, zvýšiť úspešnosť odhadu a zvýšiť istotu, pokiaľ ide o rozsah intervalov. V prípade nedostatočne presnej zhody s údajmi pre odhad (pri použití jedného zvieraťa z každého pohlavia alebo dvoch zvierat vnímavejšieho pohlavia) môže postačovať aj piata expozičná koncentrácia. Ďalšie usmernenia týkajúce sa počtu zvierat a koncentrácií, ktoré sa majú použiť v prípade štúdie C × t, sú uvedené v dokumente GD 39 (2).
                           
                        
                     Predbežná štúdia: Protokol C × t
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Predbežná štúdia sa používa na odhad potencie testovanej chemikálie a na pomoc pri výbere úrovní expozičných koncentrácií pre základnú štúdiu. Pri predbežnej štúdii, pri ktorej sa využívajú až tri zvieratá z každého pohlavia na koncentráciu [podrobnejšie informácie sú uvedené v dodatku III dokumentu GD 39 (2)], môže byť potrebné vybrať vhodnú počiatočnú koncentráciu pre základnú štúdiu a minimalizovať počet použitých zvierat. Na zistenie rozdielov medzi pohlaviami môže byť nevyhnutné použiť tri zvieratá z každého pohlavia. Tieto zvieratá by sa mali jednorazovo exponovať zvyčajne počas 240 minút. Otázka, či je možné vytvoriť vhodné testovacie ovzdušie, by sa mala posúdiť v priebehu predbežných technických testov bez zvierat. Vo všeobecnosti nie je potrebné vykonávať predbežnú štúdiu, ak sú k dispozícii údaje o mortalite zo štúdie B.52 (4). Pri výbere počiatočnej cieľovej koncentrácie v štúdii B.2 by mal vedúci štúdie zohľadniť štruktúru mortality pozorovanú pri všetkých dostupných štúdiách B.52 (4) pri oboch pohlaviach a pri všetkých testovaných koncentráciách [pozri dokument GD 39 (2)].
                           
                        
                     Počiatočná koncentrácia: Protokol C × t
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Počiatočná koncentrácia (expozičné kolo I) (dodatok 1) bude buď limitná koncentrácia, alebo koncentrácia, ktorú vyberie vedúci štúdie na základe predbežnej štúdie. Skupiny po jednom zvierati z každého pohlavia sú exponované tejto koncentrácii počas niekoľkých intervalov (napr. 15, 30, 60, 120 alebo 240 minút), čo vedie k celkovému počtu desiatich zvierat (tzv. expozičné kolo I) (dodatok 1).
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Výber limitných koncentrácií zvyčajne závisí od regulačných požiadaviek. Ak sa použije nariadenie (ES) č. 1272/2008, limitná koncentrácia v prípade plynov je 20 000 ppm, v prípade pár 20 mg/l a v prípade aerosólov 5 mg/l (alebo maximálna dosiahnuteľná koncentrácia) (3). V prípade niektorých testovaných chemikálií, najmä vo forme pár a aerosólov, môže byť technicky náročné pripraviť limitné koncentrácie. Pri testovaní aerosólov by malo byť cieľom dosiahnutie dýchateľnej veľkosti častíc (t. j. MMAD 1 – 4 μm) pri limitnej koncentrácii 2 mg/l. Túto veľkosť je možné dosiahnuť v prípade väčšiny testovaných chemikálií. O testovanie aerosólov pri koncentrácii vyššej ako 2 mg/l sa možno pokúšať, iba ak je možné získať dýchateľnú veľkosť častíc [pozri dokument GD 39 (2)]. V nariadení (ES) č. 1272/2008 sa z dôvodu starostlivosti o zvieratá neodporúča testovanie pri koncentrácii vyššej, ako je limitná koncentrácia (3). Testovanie pri limitnej koncentrácii by sa malo zvažovať iba vtedy, ak existuje vysoká pravdepodobnosť, že výsledky takéhoto testu by mali priamy význam pre ochranu ľudského zdravia (3), pričom do správy o štúdii treba uviesť odôvodnenie. V prípade potenciálne výbušných testovaných chemikálií treba dbať na to, aby nenastali podmienky, ktoré by mohli viesť k výbuchu. S cieľom zabrániť zbytočnému využívaniu zvierat by sa malo pred testovaním pri počiatočnej koncentrácii vykonať testovacie kolo bez zvierat, aby sa zaistilo, že v komore je možné zabezpečiť podmienky na dosiahnutie tejto koncentrácie.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Ak sa pri počiatočnej koncentrácii pozoruje mortalita alebo moribundita, výsledky pri tejto koncentrácii môžu slúžiť ako východisko na ďalšie testovanie pri iných koncentráciách (pozri základnú štúdiu). Ak fyzikálne alebo chemické vlastnosti testovanej chemikálie znemožňujú dosiahnutie limitnej koncentrácie, mala by sa testovať maximálna dosiahnuteľná koncentrácia. Ak sa pri maximálnej dosiahnuteľnej koncentrácii vyskytne letalita nižšia ako 50 %, ďalšie testovanie nie je potrebné. Ak nebolo možné dosiahnuť limitnú koncentráciu, v správe o štúdii treba uviesť vysvetlenie a podložiť ho údajmi. Ak maximálna dosiahnuteľná koncentrácia pary nevyvoláva toxicitu, môže byť potrebné pripraviť testovanú chemikáliu ako kvapalný aerosól.
                           
                        
                     Základná štúdia: Protokol C × t
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Počiatočná koncentrácia (expozičné kolo I) (dodatok 1) testovaná v rámci základnej štúdie bude buď limitná koncentrácia, alebo koncentrácia, ktorú vyberie vedúci štúdie na základe predbežnej štúdie. Ak sa v priebehu alebo po kole expozície I pozoruje mortalita, minimálna expozícia (C × t), ktorá má za následok mortalitu, sa použije ako smerodajný údaj na stanovenie koncentrácie a intervalov expozície pre kolo expozície II. Každé následné kolo expozície bude závisieť od predchádzajúceho kola (pozri dodatok 1).
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              V prípade mnohých testovaných chemikálií budú výsledky získané pri počiatočnej koncentrácii spolu s tromi ďalšími kolami expozície s využitím hustejšej súradnicovej siete (t. j. geometrického rozloženia intervalov expozície určeného faktorom medzi intervalmi, ktoré nasledujú po sebe, zvyčajne s hodnotou √2) na stanovenie závislosti mortality v rámci štúdie C × t postačujúce (15). Použitie piatej expozičnej koncentrácie však môže mať isté výhody [pozri dodatok 1 a dokument GD 39 (2)]. Matematická úprava výsledkov protokolu C × t je uvedená v dodatku 1.
                           
                        POZOROVANIA
                  
                              41.
                           
                           
                              Zvieratá by sa mali v priebehu trvania expozície pravidelne klinicky pozorovať. Po expozícii by sa mali klinické pozorovania vykonať najmenej dvakrát v deň expozície alebo častejšie, ak to indikuje reakcia zvierat na testovanie, a následne najmenej raz denne počas 14 dní. Dĺžka pozorovania nie je presne určená, ale mala by sa stanoviť podľa charakteru a času nástupu klinických príznakov a dĺžky obdobia zotavenia. Časy, keď sa objavia a zmiznú príznaky toxicity, sú dôležité, predovšetkým v prípade tendencie oneskorenia príznakov toxicity. Všetky pozorovania sa systematicky zaznamenávajú, pričom každé zviera má individuálny záznam. Moribundné zvieratá a zvieratá, ktoré majú očividne silné bolesti a/alebo vykazujú pretrvávajúce príznaky silného utrpenia, by sa mali z dôvodu starostlivosti o zvieratá humánnym spôsobom utratiť. Pri vyšetrovaní klinických príznakov toxicity treba dávať pozor, aby sa počiatočný nepatrný nález a krátkodobé zmeny dýchania, ktoré sú dôsledkom expozície, nezamieňali za toxicitu súvisiacu s testovanou chemikáliou, ktorá by vyžadovala predčasné utratenie zvierat. Zohľadnia sa zásady a kritériá zosumarizované v usmerňujúcom dokumente o humánnych parametroch (Humane Endpoints Guidance Document) (GD 19) (7). Keď sa zvieratá usmrtia z humánnych dôvodov alebo sa nájdu uhynuté, je potrebné čo možno najpresnejšie zaznamenať čas uhynutia.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Pozorovania v klietkach sa zameriavajú na zmeny kože, srsti, očí, slizníc, dýchania, krvného obehu, autonómneho a centrálneho nervového systému, ako aj somatomotoriky a správania. Ak je to možné, zaznamená sa každý rozdiel medzi lokálnymi a systémovými účinkami. Pozornosť sa zameriava na pozorovanie triašky, kŕčov, slinenia, hnačky, letargie, spánku a kómy. Meraním rektálnej teploty možno získať dôkazy svedčiace o reflexnej bradypney alebo hypo/hypertermii, ktoré súvisia s testovaním alebo s obmedzením pohybu.
                           
                        
                     Telesné hmotnosti
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Individuálne hmotnosti zvierat by sa mali zaznamenať raz počas obdobia aklimatizácie, v deň expozície pred expozíciou (deň 0), minimálne v dňoch 1, 3 a 7 (a následne raz za týždeň) a v čase uhynutia alebo utratenia, pokiaľ k nemu dôjde po dni 1. Telesná hmotnosť sa považuje za kritický ukazovateľ toxicity, takže zvieratá, pri ktorých nastane trvalý úbytok hmotnosti ≥ 20 % v porovnaní s hodnotami pred štúdiou, by sa mali pozorne sledovať. Zvieratá, ktoré prežijú, sa na konci obdobia po expozícii odvážia a humánne usmrtia.
                           
                        
                     Patológia
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Všetky testované zvieratá vrátane tých, ktoré uhynú počas testu alebo sa utratia a vylúčia zo štúdie z dôvodu starostlivosti o zvieratá, sa podrobujú autopsii. Ak nie je možné vykonať autopsiu ihneď po objavení uhynutého zvieraťa, zviera sa schladí (nie zmrazí) na dostatočne nízku teplotu, aby sa minimalizovala autolýza. Autopsie by sa mali vykonať čo najskôr, zvyčajne v priebehu jedného alebo dvoch dní. Pri každom zvierati sa zaznamenajú všetky makroskopické patologické zmeny, pričom osobitná pozornosť sa venuje akýmkoľvek zmenám v dýchacej sústave.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Na účely zvýšenia výpovednej hodnoty štúdie možno zvážiť ďalšie vyšetrenia a priori zahrnuté od začiatku, ako je meranie hmotnosti pľúc potkanov, ktoré prežili, a/alebo poskytnutie dôkazov o podráždení prostredníctvom mikroskopického vyšetrenia dýchacej sústavy. Medzi skúmané orgány môžu patriť aj orgány, ktoré svedčia o makroskopickej patológii pri zvieratách, ktoré prežili 24 alebo viac hodín, a orgány, o ktorých je známe alebo pri ktorých sa predpokladá, že boli zasiahnuté. Mikroskopické vyšetrenie celej dýchacej sústavy môže poskytnúť užitočné informácie o testovaných chemikáliách, ktoré reagujú s vodou, ako sú kyseliny a hygroskopické testované chemikálie.
                           
                        ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV
                  
                     Údaje
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Treba uviesť údaje o telesnej hmotnosti a pitevných nálezoch jednotlivých zvierat. Údaje z klinických pozorovaní sa zhrnú v podobe tabuliek, kde sa uvedie pre každú pokusnú skupinu počet použitých zvierat, počet zvierat vykazujúcich špecifické príznaky toxicity, počet zvierat, ktoré sa našli uhynuté počas testu alebo ich usmrtili z humánnych dôvodov, čas uhynutia jednotlivých zvierat, opis a časový priebeh toxických účinkov a reverzibility a pitevné nálezy.
                           
                        
                     Správa o teste
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Správa o teste by mala obsahovať tieto informácie:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testované zvieratá a chov:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis podmienok v klietkach vrátane: počtu (alebo zmeny počtu) zvierat na klietku, výstelky, teploty prostredia a relatívnej vlhkosti, dĺžky svetlej fázy a identifikácie krmiva,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použité druhy/kmene a odôvodnenie použitia druhov iných ako potkany,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet, vek a pohlavie zvierat,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metóda randomizácie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu/zdroja krmiva, zdroja vody),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis akýchkoľvek podmienok pred testovaním vrátane krmiva, karantény a liečby chorôb.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovaná chemikália:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikálny charakter, čistota a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti (vrátane izomerizácie),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikačné údaje a registračné číslo CAS (Chemical Abstract Services), ak je známe.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosič:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie použitia nosiča a odôvodnenie výberu nosiča (ak je iný ako voda),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      historické alebo súčasné údaje preukazujúce, že nosič nemá vplyv na výsledky štúdie.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhalačná komora:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis inhalačnej komory vrátane rozmerov a objemu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj a opis zariadenia použitého na expozíciu zvierat, ako aj na vytvorenie ovzdušia,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zariadenie na meranie teploty, vlhkosti, veľkosti častíc a skutočnej koncentrácie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj vzduchu a manipulácia s dodaným/extrahovaným vzduchom a použitý klimatizačný systém,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metódy použité na kalibráciu zariadenia s cieľom zabezpečiť homogénne testovacie ovzdušie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozdiel tlakov (pozitívny alebo negatívny),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      expozičné otvory na jednu komoru (v prípade expozície oblasti nosa), umiestnenie zvierat v systéme (v prípade expozície celého tela),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dočasná homogenita/stabilita testovacieho ovzdušia,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      umiestnenie senzorov teploty a vlhkosti a odber vzorky testovacieho ovzdušia v komore,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hodnoty prietoku vzduchu, prietok vzduchu na jeden expozičný otvor (v prípade expozície oblasti nosa) alebo množstvo zvierat na komoru (v prípade expozície celého tela),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informácie o zariadení použitom na meranie kyslíka a oxidu uhličitého, ak sa použilo,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      čas potrebný na dosiahnutie rovnováhy v inhalačnej komore (t95),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet zmien objemu za hodinu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      meracie prístroje (ak sa použili).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Údaje o expozícii:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie výberu cieľovej koncentrácie pre základnú štúdiu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominálne koncentrácie (celková hmotnosť testovanej chemikálie aplikovanej do inhalačnej komory vydelená objemom vzduchu, ktorý prešiel komorou),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skutočné koncentrácie testovanej chemikálie zachytenej z dýchacej zóny zvierat, v prípade zmesí, ktoré vytvárajú heterogénne fyzikálne skupenstvá (plyny, pary, aerosóly) možno každé skupenstvo analyzovať samostatne,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      všetky koncentrácie ovzdušia sa zaznamenajú v hmotnostných jednotkách (napr. mg/l, mg/m3 atď.), v zátvorke možno uviesť aj objemové jednotky (napr. ppm, ppb atď.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozdelenie veľkosti častíc, stredný aerodynamický hmotnostný priemer (MMAD) a štandardná odchýlka geometrického priemeru (σg) vrátane metód ich výpočtu. Jednotlivé analýzy veľkosti častíc sa uvedú v správe.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Podmienky testovania:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné informácie o príprave testovanej chemikálie vrátane podrobných údajov o všetkých postupoch použitých na zmenšenie veľkosti častíc tuhých materiálov alebo na prípravu roztokov testovanej chemikálie. V prípadoch, v ktorých v dôsledku mechanických procesov mohlo dôjsť k zmene zloženia testovanej chemikálie, sa uvedú výsledky analýzy na overenie zloženia testovanej chemikálie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis (podľa možnosti spolu s nákresom) zariadenia použitého na vytvorenie testovacieho ovzdušia a na expozíciu zvierat testovaciemu ovzdušiu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné informácie o použitej chemickej analytickej metóde a o overení metódy (vrátane účinnosti výťažnosti testovanej chemikálie z prostriedku na odber vzorky),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie výberu testovacích koncentrácií.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie teploty, vlhkosti a prúdenia vzduchu v komore,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie údajov o nominálnych a skutočných koncentráciách,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie údajov o veľkosti častíc vrátane údajov o odbere vzoriek na analýzu, o rozdelení veľkosti častíc a o výpočtoch MMAD a σg,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie získaných údajov o reakcii a úrovni koncentrácie pre každé zviera (t. j. zvieratá vykazujúce príznaky toxicity vrátane mortality, charakteru, závažnosti, času nástupu a trvania účinkov),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      telesné hmotnosti jednotlivých zvierat zistené počas štúdie, dátum a čas uhynutia, ak k nemu došlo pred plánovaným utratením, časový priebeh nástupu príznakov toxicity a skutočnosť, či tieto príznaky boli reverzibilné pre každé zviera,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pitevné nálezy a histopatologické nálezy pre každé zviera, ak sú k dispozícii,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odhady letality (napr. LC50, LD01) vrátane 95 % hranice spoľahlivosti a sklon (ak je v rámci metódy hodnotenia k dispozícii),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      štatistický vzťah vrátane odhadu exponenta n (protokol C × t). Uvedie sa názov použitého štatistického softvéru.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rozbor a interpretácia výsledkov:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      osobitný dôraz sa kladie na opis metód použitých na splnenie kritérií tejto testovacej metódy, napr. limitnej koncentrácie alebo veľkosti častíc,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dýchateľnosť častíc vzhľadom na celkové zistenia sa uvedie, najmä ak nebolo možné splniť kritériá na veľkosť častíc,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uvedie sa vysvetlenie, ak bolo potrebné humánnym spôsobom utratiť zvieratá, ktoré mali bolesti alebo vykazovali príznaky silného alebo pretrvávajúceho utrpenia, v súlade s kritériami v usmerňovacom dokumente OECD o humánnych parametroch (Guidance Document on Humane Endpoints) (8),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ak bolo testovanie podľa kapitoly B.52 tejto prílohy (4) prerušené v prospech tejto testovacej metódy B.2, uvedie sa odôvodnenie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      konzistencia metód použitých na stanovenie nominálnej a skutočnej koncentrácie a vzťah skutočnej koncentrácie k nominálnej koncentrácii sa uvedú v celkovom hodnotení štúdie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uvedie sa pravdepodobná príčina uhynutia a prevládajúci druh pôsobenia (systémové verzus lokálne).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATÚRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 16. decembra 2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí, o zmene, doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zmene a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006 (Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Kapitola B.52 tejto prílohy, Akútna inhalačná toxicita – metóda akútnej toxickej triedy (ATC).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Kapitola B.40 tejto prílohy, Poleptanie kože in vitro: test pomocou transkutánneho elektrického odporu (TER).
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Kapitola B.40a tejto prílohy, Poleptanie kože in vitro: test pomocou modelu ľudskej kože.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321 – 327.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Phalen, R. F. (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (druhé vydanie) Informa Healthcare, New York.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Pauluhn, J., a Thiel, A. (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160 – 167.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Zwart, J. H. E., Arts, J. M., ten Berge, W. F., Appelman, L. M. (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278 – 290.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Zwart, J. H. E., Arts, J. M., Klokman-Houweling, E. D., Schoen, E. D. (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105 – 117.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Ten Berge, W. F., a Zwart, A. (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65 – 71.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Finney, D. J. (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, Londýn/New York.
                           
                        VYMEDZENIE POJMU
                  Testovaná chemikália: akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
                  
                     Dodatok 1
                     
                        Protokol C × t
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 O štúdii ‚koncentrácia × čas‘ (C × t) pozostávajúcej z viacerých krokov možno pri hodnotení inhalačnej toxicity uvažovať ako o alternatíve k tradičnému protokolu (12) (13) (14). Jej vykonanie sa uprednostňuje, ak existuje konkrétna regulačná alebo vedecká potreba, ktorá vyžaduje testovanie na zvieratách počas niekoľkých intervalov, ako napr. v prípade plánovania núdzovej reakcie alebo plánovania využitia krajiny. Tento prístup sa zvyčajne začína testovaním limitnej koncentrácie (kolo expozície I), v rámci ktorého sú zvieratá exponované testovanej chemikálii počas piatich časových intervalov (napr. 15, 30, 60, 120 a 240 minút), takže jedno kolo expozície zahŕňa väčší počet časových intervalov (pozri obrázok 1). Ak sa použije nariadenie (ES) č. 1272/2008, limitná koncentrácia v prípade plynov je 20 000 ppm, v prípade pár 20 mg/l a v prípade aerosólov 5 mg/l. Tieto úrovne možno prekročiť iba vtedy, ak existuje regulačná alebo vedecká potreba testovania pri týchto úrovniach (pozri odsek 37 v hlavnom texte kapitoly B.2).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 V situáciách, keď je k dispozícii málo informácií o toxicite testovanej chemikálie alebo nie sú k dispozícii žiadne informácie, sa vykoná predbežná štúdia, v rámci ktorej sú skupiny maximálne troch zvierat z každého pohlavia exponované cieľovým koncentráciám, ktoré vyberie vedúci štúdie, zvyčajne počas 240 minút.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Ak sa limitná koncentrácia testuje počas kola expozície I a je pozorovaná mortalita nižšia ako 50 %, ďalšie testovanie nie je potrebné. Ak existuje regulačná alebo vedecká potreba, aby sa stanovil vzťah medzi koncentráciou, časom a reakciou pri vyšších úrovniach, ako je indikovaná limitná koncentrácia, ďalšia expozícia sa vykoná pri vyššej úrovni, napríklad pri dvojnásobku limitnej koncentrácie (t. j. 2L na obrázku 1).
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Ak sa pri limitnej koncentrácii zistí toxicita, je potrebné ďalšie testovanie (základná štúdia). Tieto ďalšie expozície sa vykonajú buď pri nižších koncentráciách (na obrázku 1: kolá expozície II, III alebo IV‘), alebo pri vyšších koncentráciách s využitím kratších časových intervalov (na obrázku 1: kolo expozície IV), ktoré sú prispôsobené a medzi ktorými nie je veľký časový odstup.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Test (počiatočná a ďalšia koncentrácia) sa vykoná s využitím jedného zvieraťa z každého pohlavia na koncentráciu/časový bod alebo dvoch zvierat vnímavejšieho pohlavia na koncentráciu/časový bod. Za určitých okolností sa vedúci štúdie môže rozhodnúť pre použitie dvoch potkanov z každého pohlavia na koncentráciu/časový bod (alebo štyroch zvierat vnímavejšieho pohlavia na koncentráciu/časový bod) (15). Použitie dvoch zvierat z každého pohlavia na koncentráciu/časový bod vo všeobecnosti znižuje chybu a variabilitu odhadov, zvyšuje úspešnosť odhadu a zvyšuje istotu, pokiaľ ide o rozsah intervalov v súvislosti s protokolom, ktorý je v tomto texte opísaný. Ďalšie informácie sú uvedené v dokumente GD 39 (2).
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Podľa možnosti sa každé kolo expozície uskutoční v jeden deň. Vďaka tomu možno odložiť ďalšiu expozíciu, kým sa nenadobudne primeraná istota prežitia zvierat, a vedúci štúdie môže prispôsobiť cieľovú koncentráciu a intervaly pre ďalšie kolo expozície. Odporúča sa začať každé kolo expozície skupinou, ktorá bude exponovaná najdlhšie, napr. skupinou na 240-minútovú expozíciu, po ktorej nasleduje skupina na 120-minútovú expozíciu atď. Ak napríklad zvieratá v skupine na 240-minútovú expozíciu hynú po 90 minútach alebo vykazujú závažné príznaky toxicity (napr. extrémne zmeny v dýchaní, ako je napríklad namáhavé dýchanie), nemá význam exponovať skupinu na 120 minút, lebo mortalita by pravdepodobne dosiahla 100 %. Vedúci štúdie preto pre danú koncentráciu zvolí kratšie intervaly expozície (napr. 90, 65, 45, 33 a 25 minút).
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Koncentrácia v komore sa musí často merať, aby sa stanovil časovo vážený priemer koncentrácií pre každý interval expozície. Ak je to možné, v štatistickej analýze sa použije čas uhynutia každého zvieraťa (nie interval expozície).
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 Výsledky prvých štyroch kôl expozície sa preskúmajú s cieľom zistiť chýbajúce údaje na krivke závislosti koncentrácie a času (pozri obrázok 1). V prípade nedostatočnej zhody sa môže vykonať ďalšia expozícia (piata koncentrácia). Koncentrácia a intervaly expozície sa v prípade piatej expozície vyberú tak, aby sa zistili tieto chýbajúce údaje.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Všetky kolá expozície (vrátane prvého kola expozície) sa použijú na výpočet vzťahu medzi koncentráciou, časom a reakciou s využitím štatistickej analýzy (16). Ak je to možné, pre každý interval C × t sa použije časovo vážený priemer koncentrácií a trvanie expozície až do uhynutia (ak k uhynutiu došlo v priebehu expozície).
                                 
                                    Obrázok 1
                                 
                                 
                                    Hypotetické znázornenie vzťahu medzi koncentráciou, časom a mortalitou pri potkanoch
                                 
                                 
                                    
                                 Prázdne symboly = zvieratá, ktoré prežili; plné symboly = uhynuté zvieratá.
                                 Trojuholníky = samice; kruhy = samce.
                                 Plná čiara = hodnoty LC50 (rozsah 7,5 – 240 min.) pre samce, ak n = 1.
                                 Prerušovaná čiara = hodnoty LC50 (rozsah 7,5 – 240 min.) pre samice, ak n = 1.
                                 Bodkované čiary = funkcia hypotetických hodnôt LC50 pre samce a samice, ak n = 2 (12).
                                 Glosár
                                 Koncentrácia:
                                 Čas expozície:
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Ďalej je uvedený príklad postupu pozostávajúceho z viacerých krokov:
                                 
                                    Kolo expozície I –   testovanie pri limitnej koncentrácii (pozri obrázok 1)
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             1 zviera z každého pohlavia na koncentráciu/časový bod, spolu desať zvierat (2)
                                             
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             cieľová koncentrácia (3) = limitná koncentrácia,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             exponujte päť skupín zvierat pri tejto cieľovej koncentrácii počas intervalov 15, 30, 60, 120 a 240 minút.
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    Kolo expozície II
                                     (4)
                                    –   základná štúdia
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             1 zviera z každého pohlavia na koncentráciu/časový bod, spolu desať zvierat,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             exponujte päť skupín zvierat pri nižšej koncentrácii (5) (1/2L) počas o niečo dlhších intervalov expozície (faktor √2 s využitím odstupov, pozri obrázok 1).
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    Kolo expozície III –   základná štúdia
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             1 zviera z každého pohlavia na koncentráciu/časový bod, spolu desať zvierat,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             exponujte päť skupín zvierat pri nižšej koncentrácii (5) (1/4L) počas o niečo dlhších intervalov expozície (faktor √2 s využitím odstupov, pozri obrázok 1).
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    Kolo expozície IV‘ –   základná štúdia
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             1 zviera z každého pohlavia na koncentráciu/časový bod, spolu desať zvierat,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             exponujte päť skupín zvierat pri nižšej koncentrácii (5) (1/8L) počas o niečo dlhších intervalov expozície (faktor √2 s využitím odstupov, pozri obrázok 1).
                                          
                                       
                                    ↓ alebo
                                 
                                 
                                    Kolo expozície IV –   základná štúdia
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             1 zviera z každého pohlavia na koncentráciu/časový bod, spolu desať zvierat,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             exponujte päť skupín zvierat pri vyššej koncentrácii (6) (2L) počas o niečo kratších intervalov expozície (faktor √2 s využitím odstupov, pozri obrázok 1).
                                          
                                       
                           
                        Matematická úprava výsledkov protokolu C × t
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Pri postupe C × t so štyrmi alebo piatimi expozičnými koncentráciami a piatimi intervalmi sa získa 20 alebo 25 dátových bodov. Pomocou týchto dátových bodov možno s využitím štatistickej analýzy vypočítať vzťah C × t (16):
                                 
                                    rovnica 1:
                                 
                                 
                                    
                                 kde C = koncentrácia; t = interval expozície, alebo
                                 
                                    rovnica 2:
                                 
                                 
                                    
                                 kde 
                                 Pomocou rovnice 1 možno vypočítať hodnotu LC50 pre daný časový úsek (napr. 4 hodiny, 1 hodina, 30 minút alebo akýkoľvek časový úsek v rámci testovaných období) pri P = 5 (50 % reakcia). Haberovo pravidlo možno použiť iba v prípade, že n = 1. Hodnotu LC01 možno vypočítať pri P = 2,67.
                              
                           “
            
                  4.
               
               
                  Kapitoly B.7 a B.8 sa nahrádzajú takto:
                  „B.7.   28-DŇOVÁ ŠTÚDIA ORÁLNEJ TOXICITY PRI HLODAVCOCH/TEST V OPAKOVANÝCH DÁVKACH
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov TG 407 (2008). Pôvodné Usmernenia na vykonávanie testov 407 boli prijaté v roku 1981. V roku 1995 bola prijatá revidovaná verzia s cieľom získať ďalšie informácie pomocou zvierat použitých v štúdii, najmä informácie o neurotoxicite and imunotoxicite.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Organizácia OECD v roku 1998 iniciovala aktivitu s vysokou prioritou s cieľom zrevidovať existujúce usmernenia k testovaniu a vypracovať nové usmernenia k testovaniu potenciálnych endokrinných disruptorov (8). Jednou zložkou tejto aktivity bolo aktualizovať existujúce usmernenia OECD pre ‚28-dňovú štúdiu orálnej toxicity pri hlodavcoch/test v opakovaných dávkach‘ (TG 407) podľa parametrov vhodných na zistenie endokrinného pôsobenia testovaných chemikálií. Tento postup bol podrobený rozsiahlemu medzinárodnému programu, ktorého účelom bolo otestovať význam a vykonateľnosť ďalších parametrov, výkonnosť týchto parametrov pri chemikáliách s (anti)estrogénnym, (anti)androgénnym a (anti)tyreoidným pôsobením, intralaboratórnu a interlaboratórnu reprodukovateľnosť a vzájomnú interferenciu nových parametrov s parametrami požadovanými v predchádzajúcom usmerňovacom dokumente TG 407. Týmto spôsobom sa zozbieralo veľké množstvo údajov, ktoré sa podrobne zhodnotili v súhrnnej správe OECD (9). Táto aktualizovaná testovacia metóda B.7 (rovnocenná s TG 407) bola vypracovaná na základe skúseností a výsledkov získaných počas medzinárodného programu testovania. Táto testovacia metóda umožňuje skúmanie súvislostí medzi určitými endokrinnými účinkami a inými toxikologickými účinkami.
                           
                        ÚVODNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA
                  
                              3.
                           
                           
                              Pri posudzovaní a vyhodnocovaní toxických charakteristík chemikálie možno po získaní prvotných informácií o toxicite prostredníctvom testovania akútnej toxicity pomocou opakovaných dávok stanoviť orálnu toxicitu. Táto testovacia metóda je zameraná na preskúmanie účinkov na veľmi širokej škále potenciálnych cieľov toxicity. Poskytuje informácie o možnej nebezpečnosti pre zdravie, ktorá sa pravdepodobne vyskytne pri opakovanej expozícii v priebehu pomerne krátkeho časového obdobia, vrátane účinkov na nervový, imunitný a endokrinný systém. Pokiaľ ide o tieto konkrétne sledované parametre, mali by sa pomocou nej identifikovať chemikálie s neurotoxickým potenciálom, čo môže viesť k ďalšiemu dôkladnému skúmaniu tohto aspektu, a chemikálie, ktoré majú vplyv na tyreoidnú fyziológiu. Takisto pomocou nej možno získať údaje o chemikáliách, ktoré majú vplyv na samčie a/alebo samičie rozmnožovacie orgány pri mladých dospelých zvieratách, a možno pomocou nej zistiť imunologické účinky.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Výsledky tejto testovacej metódy B.7 sa použijú na identifikáciu nebezpečnosti a na hodnotenie rizík. Výsledky získané pomocou parametrov súvisiacich s endokrinným systémom by sa mali posudzovať v kontexte Koncepčného rámca OECD na testovanie a hodnotenie chemikálií poškodzujúcich endokrinný systém (11). Metóda zahŕňa základnú štúdiu toxicity pri opakovaných dávkach, ktorú možno použiť v prípade chemikálií, pri ktorých nemožno zaručiť 90-dňovú štúdiu (napr. keď objem produkcie neprekračuje určité limity), alebo ako predbežnú štúdiu k dlhodobej štúdii. Interval expozície trvá 28 dní.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Medzinárodný program uskutočnený na overenie parametrov vhodných na potenciálne odhalenie endokrinného pôsobenia testovanej chemikálie, ukázal, že kvalita údajov získaných touto testovacou metódou B.7 bude vo veľkej miere závisieť od skúseností testovacieho laboratória. Súvisí to najmä s histopatologickým stanovením cyklických zmien pri samičích rozmnožovacích orgánoch a so stanovením hmotnosti malých hormonálnych orgánov, ktorých pitva je náročná. Boli vypracované usmernenia k histopatológii (19), ktoré sú k dispozícii na verejnej webovej stránke OECD o usmerneniach k testovaniu. Ich cieľom je pomôcť patológom pri ich skúmaní a pomôcť zvýšiť citlivosť skúšky. Pri množstve parametrov sa zistilo, že indikujú endokrinnú toxicitu, na základe čoho boli začlenené do testovacej metódy. Parametre, pre ktoré nie sú k dispozícii dostatočné údaje na preukázanie ich užitočnosti alebo pri ktorých bol v rámci programu overovania preukázaný iba slabý prínos pri zisťovaní endokrinných disruptorov, sú navrhnuté ako nepovinné parametre (pozri dodatok 2).
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Vzhľadom na údaje získané v rámci procesu overovania treba zdôrazniť, že táto štúdia nie je dostatočne citlivá na identifikáciu všetkých látok s (anti)androgénnymi alebo (anti)estrogénnymi účinkami (9). Testovacia metóda sa nevykonáva v životnej fáze, v ktorej je endokrinný systém najcitlivejší na poškodenie. Pomocou testovacej metódy sa však v priebehu procesu overovania identifikovali látky slabo alebo silno ovplyvňujúce funkciu štítnej žľazy a látky so silným a stredne silným účinkom na endokrinný systém, ktoré pôsobia na estrogénové alebo androgénové receptory. Na druhej strane vo väčšine prípadov nebolo možné identifikovať látky s účinkami na endokrinný systém, ktorých pôsobenie na estrogénové alebo androgénové receptory je slabé. Testovaciu metódu preto nemožno charakterizovať ako skríningový test endokrinného pôsobenia.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Neexistenciu účinkov súvisiacich s týmito druhmi pôsobenia následne nemožno brať ako dôkaz neexistencie účinkov na endokrinný systém. Pokiaľ ide o endokrinné účinky, charakterizácia látok by preto nemala byť založená iba na výsledkoch tejto testovacej metódy, ale mala by sa použiť v rámci prístupu váhy dôkazov, ktorý zohľadňuje všetky existujúce údaje o chemikálii na účely charakterizácie potenciálneho endokrinného pôsobenia. Z tohto dôvodu by regulačné rozhodovanie o endokrinnom pôsobení (charakterizácia látky) malo byť postavené na širokom základe a nemalo by sa opierať iba o výsledky aplikácie tejto testovacej metódy.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Uznáva sa, že všetky postupy využívajúce zvieratá musia byť v súlade s miestnymi normami starostlivosti o zvieratá. Opisy starostlivosti a zaobchádzania uvedené ďalej predstavujú minimálne normy pre vykonávanie postupov a v prípade, že miestne predpisy sú prísnejšie, budú mať miestne predpisy prednosť. Ďalšie usmernenia k humánnemu zaobchádzaniu so zvieratami uvádza organizácia OECD (14).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Vymedzenie pojmov je uvedené v dodatku 1.
                           
                        PRINCÍP TESTU
                  
                              10.
                           
                           
                              Niekoľkým skupinám experimentálnych zvierat sa denne orálne podáva testovaná chemikália v odstupňovaných dávkach spôsobom, pri ktorom sa každej skupine podáva jedna dávka počas 28-dňovej periódy. Počas periódy podávania sa zvieratá pozorne pozorujú, pričom sa denne kontroluje prítomnosť znakov toxického účinku. Zvieratá, ktoré počas testu uhynú alebo sa utratia, sú následne pitvané a takisto zvieratá, ktoré prežijú, sú na záver testu utratené a podrobené pitve. 28-dňová štúdia poskytuje informácie o účinkoch orálnej expozície v opakovaných dávkach a môže poukázať na potrebu ďalších dlhodobejších štúdií. Takisto môže poskytnúť informácie o výbere koncentrácií na účely dlhodobejších štúdií. Údaje získané pomocou tejto testovacej metódy by mali umožniť charakterizáciu toxicity testovanej chemikálie na zistenie závislosti medzi dávkou a reakciou a na stanovenie hladiny bez pozorovaného nepriaznivého účinku (NOAEL).
                           
                        OPIS METÓDY
                  
                     Výber druhov zvierat
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Uprednostňovanými hlodavcami sú potkany, aj keď sa môžu použiť aj iné hlodavce. Ak sa parametre uvedené v rámci tejto testovacej metódy B.7 skúmajú pri inom druhu hlodavcov, je potrebné uviesť podrobné odôvodnenie. Hoci z biologického hľadiska je hodnoverné, že iné druhy by reagovali na toxikanty podobným spôsobom ako potkany, použitie menších druhov môže mať za následok väčšiu variabilitu z dôvodu technických problémov pri pitve menších orgánov. V rámci medzinárodného programu overovania na zistenie endokrinných disruptorov sa použili iba potkany. Používajú sa mladé zdravé dospelé zvieratá bežne používaných laboratórnych kmeňov. Používajú sa samice, ktoré nikdy nevrhli mláďatá a sú negravidné. Dávkovanie sa musí začať čo najskôr po odstavení mláďat a skôr než zvieratá dovŕšia deväť týždňov. Na začiatku štúdie sú váhové odchýlky pri zvieratách minimálne a neprevyšujú ± 20 % priemernej váhy oboch pohlaví. Ak je štúdia opakovanej orálnej dávky predbežnou štúdiou dlhodobej štúdie, uprednostňuje sa používanie zvierat toho istého kmeňa a z toho istého zdroja v oboch štúdiách.
                           
                        
                     Umiestnenie a kŕmenie
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Všetky postupy musia byť v súlade s miestnymi normami starostlivosti o laboratórne zvieratá. Teplota pokusnej miestnosti, kde sú zvieratá umiestnené, by mala byť 22 °C (± 3 °C). Aj keď by relatívna vlhkosť mala byť aspoň 30 %, a pokiaľ možno by nemala prevyšovať 70 % okrem obdobia počas čistenia miestnosti, cieľom je, aby relatívna vlhkosť dosahovala 50 – 60 %. Osvetlenie by malo byť umelé a malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Výber krmiva môže byť ovplyvnený potrebou zabezpečiť vhodnú prímes testovanej chemikálie, keď sa podáva týmto spôsobom. Zvieratá by mali byť umiestnené spolu v malých skupinách rovnakého pohlavia. Zvieratá možno umiestniť samostatne, ak je to vedecky opodstatnené. Pokiaľ ide o umiestnenie skupín do klietok, v jednej klietke by nemalo byť viac ako päť zvierat.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Krmivo treba pravidelne analyzovať, aby sa zistilo, či neobsahuje kontaminanty. Vzorka krmiva by sa mala zachovať až do dokončenia správy.
                           
                        
                     Príprava zvierat
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Zdravé, mladé, dospelé zvieratá sa náhodne rozdelia do kontrolných a pokusných skupín. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy vzhľadom na ich umiestnenie. Zvieratá sa jednotlivo označia. Zvieratá sa v klietkach aklimatizujú na laboratórne podmienky najmenej päť dní pred začatím testovacej štúdie.
                           
                        
                     Príprava dávok
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Testovaná chemikália sa podáva cez sondu priamo do žalúdka alebo v potrave alebo v pitnej vode. Metóda orálneho podávania závisí od účelu štúdie a fyzikálnych, chemických a toxikokinetických vlastností testovanej chemikálie.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Ak je to potrebné, testovaná chemikália sa rozpustí alebo suspenduje vo vhodnom nosiči. Odporúča sa, aby sa vždy, keď je to možné, najskôr zvážilo použitie vodného roztoku/suspenzie, potom roztoku/suspenzie v oleji (napr. kukuričnom oleji) a nakoniec prípadného roztoku v iných nosičoch. Charakteristiky toxicity nosičov iných ako voda musia byť známe. Určí sa stabilita testovanej chemikálie v nosiči.
                           
                        POSTUP
                  
                     Počet zvierat a ich pohlavie
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Na každej hladine dávkovania sa použije prinajmenšom desať zvierat (päť samíc a päť samcov). Ak je v pláne utratiť nejaké zvieratá aj počas testu, počet by mal byť zvýšený o plánovaný počet zvierat, ktoré majú byť utratené pred ukončením štúdie. Treba zvážiť použitie ďalšej satelitnej skupiny desiatich zvierat (päť z každého pohlavia) ku kontrolnej skupine a ku skupine vystavenej najvyššej dávke na účely pozorovaní reverzibility, perzistencie alebo oneskorenia toxických účinkov, a to najmenej počas 14 dní po testovaní.
                           
                        
                     Dávkovanie
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Zvyčajne sa používajú najmenej tri testovacie skupiny a jedna kontrolná skupina, ale v prípade, že sa na základe hodnotenia ostatných údajov nepredpokladajú účinky pri dávke 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň, môže sa vykonať limitný test. Ak nie sú k dispozícii vhodné údaje, môže sa vykonať štúdia na zistenie rozsahu (zvieratá toho istého kmeňa a z toho istého zdroja), aby sa ľahšie stanovili dávky, ktoré sa použijú. So zvieratami v kontrolnej skupine sa musí zaobchádzať takisto ako so zvieratami v testovaných skupinách, s výnimkou aplikovania testovanej chemikálie. Ak sa pri podávaní testovanej chemikálie používa nosič, kontrolná skupina dostane nosič v najvyššom používanom objeme.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Pri výbere hladín dávok sa berú do úvahy existujúce údaje o toxicite a (toxiko-)kinetike testovanej chemikálie a príbuzných chemikálií. Najvyššia dávka sa vyberá tak, aby indukovala toxické účinky, ale nespôsobovala uhynutie zvierat alebo vážne utrpenie. Podľa toho sa vyberá aj znižujúca sa postupnosť hladín dávok s cieľom určiť závislosť reakcie od dávky a stanoviť hodnotu NOAEL pri najnižšej hladine dávky. Intervaly dávkovania s faktorom dva až štyri sú často optimálne na stanovenie klesajúceho dávkovania a pridanie štvrtej pokusnej skupiny je často vhodnejšie ako používanie veľmi veľkých intervalov (napr. viac ako faktor 10) medzi dávkami.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Ak sa pozoruje všeobecná toxicita (napr. zníženie telesnej hmotnosti, účinky na pečeň, srdce, pľúca alebo obličky atď.) alebo iné zmeny, ktoré nemusia byť toxickou reakciou (napr. nižší príjem potravy, zväčšenie pečene), pozorované účinky na imunitné, neurologické alebo endokrinné citlivé parametre by sa mali interpretovať opatrne.
                           
                        
                     Limitný test
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Ak sa zistí, že test pri jednej hladine najmenej 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti za deň, alebo rovnocenné množstvo v percentách v strave alebo v pitnej vode (založené na určení telesnej hmotnosti) nespôsobil pri testovaných zvieratách žiadne toxické príznaky, a ak sa toxické účinky neočakávajú ani na základe údajov štruktúrne príbuzných chemikálií, potom sa nepovažuje za nevyhnutné uskutočniť celú štúdiu s použitím troch hladín. Výnimkou je prípad, keď expozícia človeka indikuje potrebu skúmania na vyššej hladine, a vtedy sa používa limitný test.
                           
                        
                     Podávanie dávok
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Zvieratám sa podá dávka testovanej chemikálie každý deň sedem dní v týždni počas 28 dní. Ak je testovaná chemikália podávaná cez sondu, musí sa to realizovať v jednej dávke pre zviera za použitia žalúdočnej trubice alebo vhodnej intubačnej kanyly. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorazovo podať, závisí od veľkosti pokusného zvieraťa. Objem nemá byť vyšší ako 1 ml/100 g telesnej hmotnosti, okrem vodných roztokov, keď sa môže použiť 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. S výnimkou dráždivých alebo žieravých chemikálií, ktoré zvyčajne pri vyšších koncentráciách spôsobia zhoršenie účinkov, variabilita v aplikovanom objeme sa minimalizuje tým, že sa koncentrácie upravia tak, aby sa zabezpečil stály objem vo všetkých dávkach.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              V prípade chemikálií podávaných v potrave alebo pitnej vode je dôležité zabezpečiť, aby množstvá použitej testovanej chemikálie neinterferovali s normálnou výživovou a vodnou bilanciou. Ak je testovaná chemikália podávaná v potrave, môže sa použiť buď konštantná stravná koncentrácia (ppm) alebo konštantná úroveň dávkovania s ohľadom na telesnú hmotnosť zvierat; alternatívne používanie je potrebné špecifikovať. V prípade, keď sa chemikália podáva sondou, dávka sa podáva približne v rovnaký čas každý deň a prispôsobí sa podľa potreby, aby sa zachovala stála hladina dávky vzhľadom na telesnú hmotnosť. Ak sa uskutoční predbežná štúdia pri opakovaných dávkach pred uskutočnením dlhodobej štúdie, je potrebné v oboch štúdiách použiť podobnú potravu.
                           
                        
                     Pozorovania
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Pozorovanie trvá 28 dní. Zvieratá v satelitnej skupine, ktoré sa plánujú použiť pri ďalšom sledovaní, sa držia najmenej 14 dní bez akéhokoľvek podávania, aby bolo možné zistiť oneskorené toxické účinky alebo ich perzistenciu, alebo zotavenie sa po nich.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Najmenej raz denne je nutné uskutočniť všeobecné klinické pozorovania, najlepšie vždy v tom istom čase s ohľadom na časový vrchol očakávaných účinkov po podaní. Zaznamenáva sa zdravotný stav zvierat. Najmenej dvakrát denne si treba všímať chorobnosť a úmrtnosť zvierat.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Raz pred prvou expozíciou (je dovolené porovnanie jednotlivých zvierat medzi sebou) a potom najmenej raz týždenne sa uskutočňujú pri všetkých zvieratách podrobné klinické pozorovania. Uskutočňujú sa mimo domovských klietok v štandardnom priestore, pokiaľ možno, vždy v tom istom dennom čase. Musia byť pozorne zaznamenané, s použitím hodnotiaceho systému explicitne vymedzeného testovacím laboratóriom. Je potrebné zaistiť čo najmenšie zmeny testovacích podmienok a výhodné je, ak pozorovania vedie pozorovateľ, ktorý nepozná postup testovania. Medzi príznaky, ktoré je potrebné si všímať, patria zmeny na koži, srsti, očiach, sliznici, výskyt sekrécie, exkrécie a vegetatívnej aktivity (slzenie, piloerekcia, veľkosť zreničiek, nezvyčajné dýchanie), ale uvedené príznaky nie sú vyčerpávajúce. Zmeny v chôdzi, držaní tela a reakcii na zaobchádzanie, ako aj prítomnosť klonických alebo napätých pohybov, stereotypov (napr. opakované točenie sa), prílišné ošetrovanie sa alebo zvláštne správanie (napr. chôdza dozadu, sebaznetvorenie), sa takisto musia zaznamenať (2).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Vo štvrtom týždni expozície sa uskutočňuje určenie zmyslovej reaktivity podnecovanej odlišnými spôsobmi (2) (napríklad zvukovými, zrakovými a proprioceptívnymi podnetmi) (3) (4) (5), určenie sily zovretia (6) a určenie motorickej aktivity (7). Ďalšie podrobnosti o postupoch, ktoré môžu nasledovať, sú uvedené v príslušných odkazoch. Možno však použiť aj iné alternatívne postupy k postupom, ktoré tu boli opísané.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Funkčné pozorovania v štvrtom týždni expozície sa nemusia uskutočniť, ak je štúdia uskutočňovaná ako predbežná štúdia subchronickej štúdie (90 dní). V tomto prípade sa funkčné pozorovania uskutočnia v nasledujúcej štúdii. Na druhej strane, dostupnosť údajov o funkčných pozorovaniach zo štúdie opakovanej dávky zvyšujú možnosť výberu úrovní dávkovaných v nasledujúcej subchronickej štúdii.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Výnimočne sa nemusia uskutočniť funkčné pozorovania ani pri skupinách, v ktorých sa inak preukážu toxické príznaky v takom rozsahu, že by mohli významne interferovať s uskutočnením funkčných testov.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Pri pitve možno stanoviť estrálny cyklus všetkých samíc (nepovinné) odobratím vaginálnych sterov. Tieto pozorovania poskytnú informácie o fáze estrálneho cyklu v čase utratenia a pomôžu pri histologickom hodnotení tkanív citlivých na estrogény [pozri usmernenia o histopatológii (19)].
                           
                        
                     Telesná hmotnosť a spotreba potravy/vody
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Všetky zvieratá sa musia vážiť najmenej raz za týždeň. Meranie spotreby potravy sa robí najmenej raz za týždeň. Ak sa testovaná chemikália podáva vo vode na pitie, spotrebu vody je takisto potrebné merať aspoň raz za týždeň.
                           
                        
                     Hematológia
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Na konci testovacieho obdobia sa uskutočňujú tieto hematologické testy: hematokrit, koncentrácia hemoglobínu, počet erytrocytov, retikulocyty, celkový a diferenciálny počet leukocytov, počet trombocytov a meranie času/potenciálu zrážanlivosti krvi. Medzi ďalšie stanovenia, ktoré sa uskutočňujú, ak testovaná chemikália alebo jej predpokladané metabolity majú oxidačné vlastnosti alebo ak existuje podozrenie, že majú oxidačné vlastnosti, patrí koncentrácia methemoglobínu a Heinzove telieska.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Vzorky krvi sa odoberajú zo stanoveného miesta tesne pred alebo počas postupu utratenia zvierat a uchovávajú sa za vhodných podmienok. Zvieratá sa noc pred utratením nekŕmia (7).
                           
                        
                     Klinická biochémia
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Klinická biochémia skúma hlavné toxické účinky v tkanivách a najmä účinky na obličky a pečeň. Vyšetrenie sa uskutočňuje zo vzoriek krvi, ktoré sa odoberajú všetkým zvieratám tesne pred alebo počas postupu utratenia zvierat (okrem zvierat uhynutých a/alebo utratených pred dokončením štúdie). Vyšetrenie plazmy alebo séra zahŕňa sodík, draslík, glukózu, celkový cholesterol, močovinu, kreatinín, celkové proteíny a albumín, najmenej dva enzýmy indukujúce hepatocelulárne účinky (ako alanín-aminotransferáza, aspartát-aminotransferáza, alkalická fosfatáza, γ-glutamyl transpeptidáza a glutamát-dehydrogenáza) a žlčové kyseliny. Meranie ďalších enzýmov (hepatálneho alebo iného pôvodu) a bilirubínu môže za určitých okolností poskytnúť užitočné informácie.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Nepovinne sa nasledujúce zistenia v analýzach moču môžu vykonať počas posledného týždňa štúdie a použije sa časový zber objemu moču: vzhľad, objem, osmolalita alebo špecifická váha, pH, bielkoviny, glukóza a krv/krvné bunky.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Okrem toho by sa mali brať do úvahy aj štúdie na vyšetrovanie plazmových alebo sérových markerov v základných poškodených tkanivách. Ostatné zisťovanie je možné uskutočniť, ak poznáme vlastnosti testovanej chemikálie, ktoré môžu vplývať, alebo sa o nich predpokladá, že vplývajú na príbuzné metabolické profily zahrňujúce vápnik, fosfáty, triglyceridy, špecifické hormóny a cholínesterázu. Je ich potrebné identifikovať pre chemické látky v určitých skupinách alebo posúdiť prípad po prípade.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Hoci v medzinárodnom hodnotení sledovaných parametrov súvisiacich s endokrinným systémom nebolo možné jednoznačne preukázať jednoznačnú výhodu určenia hormónov štítnej žľazy (T3, T4) a TSH, je vhodné zachovať vzorky plazmy alebo séra na meranie T3, T4 a TSH (nepovinné), ak je indikovaný účinok na os hypofýza – štítna žľaza. Tieto vzorky možno na účely skladovania zmraziť na teplotu – 20 °C. Variabilitu a absolútne koncentrácie hormonálnych ukazovateľov môžu ovplyvniť tieto faktory:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          čas utratenia z dôvodu každodennej zmeny koncentrácií hormónov,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          metóda utratenia s cieľom zabrániť neprimeranému stresu pre zvieratá, ktorý môže ovplyvniť koncentrácie hormónov,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          súpravy na testovanie hormonálnych ukazovateľov, ktoré sa môžu líšiť štandardnými krivkami.
                                       
                                    Definitívna identifikácia chemikálií s tyreoidnými účinkami je spoľahlivejšia na základe histopatologickej analýzy ako na základe hladín hormónov.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Vzorky plazmy špecificky určené na stanovenie hladiny hormónov sa odoberú počas porovnateľných denných časov. Odporúča sa, aby sa zohľadnilo stanovenie hladín T3, T4 a TSH ovplyvnených na základe zmien tyreoidnej histopatológie. Číselné hodnoty získané analýzou koncentrácií hormónov sa v prípade použitia rozličných komerčných testovacích súprav líšia. Následne nemusí byť možné zabezpečiť výkonnostné kritériá založené na jednotných historických údajoch. Laboratóriá by sa namiesto toho mali usilovať, aby boli kontrolné variačné koeficienty nižšie ako 25 v prípade T3 a T4 a nižšie ako 35 v prípade TSH. Všetky koncentrácie sa zaznamenajú v ng/ml.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Ak sú historické bazálne hodnoty nevhodné, zváži sa stanovenie premenných v oblasti hematológie a klinickej biochémie pred začatím dávkovania alebo podľa možnosti na skupine zvierat, ktoré neboli zaradené do pokusných skupín.
                           
                        PATOLÓGIA
                  
                     Makroskopická pitva
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Všetky zvieratá v štúdii budú predmetom úplnej detailnej všeobecnej pitvy, ktorá zahŕňa pozorné vyšetrenie vonkajšieho povrchu tela, všetkých telesných otvorov a lebečnej, hrudnej, brušnej dutiny a ich obsahu. Pečeň, obličky, nadobličky, semenníky, nadsemenníky, prostata + semenné mechúriky s koagulačnými žľazami ako celok, týmus, slezina, mozog a srdce zo všetkých zvierat (okrem tých, ktoré chradnú, a/alebo zvierat, ktoré boli utratené pred ukončením štúdie) by sa mali pitvať na priľnavej tkanine a je potrebné čo najrýchlejšie zistiť ich mokrú hmotnosť skôr, ako pri pitve vyschnú. Orgány prostaty je nutné pitvať veľmi opatrne, aby sa zabránilo prepichnutiu semenných mechúrikov naplnených tekutinou. Semenné mechúriky a prostata sa prípadne môžu pitvať a vážiť aj po fixácii.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Okrem toho sa nepovinne môžu čo najskôr, aby sa zabránilo vyschnutiu, odvážiť ďalšie dve tkanivá: párové vaječníky (mokrá váha) a maternica vrátane krčka maternice [usmernenie o odstránení a príprave maternicových tkanív na meranie hmotnosti sa uvádza v dokumente OECD TG 440 (18)].
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Hmotnosť štítnej žľazy (nepovinné) sa môže určiť po fixácii. Úpravu je potrebné vykonať veľmi opatrne a až po fixácii, aby sa predišlo poškodeniu tkaniva. Poškodenie tkaniva by mohlo ohroziť histopatologickú analýzu.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Tieto tkanivá by sa mali uchovávať v čo najvhodnejšom fixačnom médiu na obidva typy tkanív a na neskoršie histopatologické vyšetrenie (pozri odsek 47): všetky makroskopické poškodenia, mozog (reprezentatívne oblasti vrátane veľkého mozgu, mozočka a mosta), miecha, oko, žalúdok, tenké a hrubé črevo (vrátane Peyerových plakov), pečeň, obličky, nadobličky, slezina, srdce, týmus, štítna žľaza, priedušnica a pľúca (uskladnené nafúknutím s fixačným prostriedkom a potom ponorením), gonády (semenníky a vaječníky), vedľajšie pohlavné orgány (maternica a krčok maternice, nadsemenníky, prostata + semenné mechúriky s koagulačnými žľazami), vagína, močový mechúr, lymfatické uzliny [okrem najbližšej odvodňovacej uzliny by sa mala odobrať ešte jedna lymfatická uzlina podľa praxe laboratória (15)], periférny nerv (sedací alebo tibiálny) podľa možnosti čo najbližšie k svalu, kostrový sval a kosť, s kostnou dreňou (prierez alebo čerstvo odobratá vzorka kostnej drene). Odporúča sa fixovať semenníky ponorením do Bouinovho alebo modifikovaného Davidsonovho fixačného prostriedku (16) (17). Obal tunica albuginea je potrebné opatrne a plytko prepichnúť ihlou na oboch stranách orgánu, aby sa umožnilo rýchle napustenie fixačným prostriedkom. Z klinických a iných nálezov môže vyplynúť potreba vyšetrenia ďalších následných tkanív. Takisto by sa mali zachovať všetky orgány, ktoré vzhľadom na známe vlastnosti testovanej chemikálie možno považovať za cieľové orgány.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Tieto tkanivá môžu poskytnúť cenné údaje o účinkoch na endokrinný systém: gonády (vaječníky a semenníky), vedľajšie pohlavné orgány (maternica vrátane krčka maternice, nadsemenníky, semenné mechúriky s koagulačnými žľazami, dorzolaterálna a ventrálna prostata), vagína, hypofýza, samčia prsná žľaza, štítna žľaza a nadoblička. Zmeny na samčích prsných žľazách nie sú dostatočne zdokumentované, ale tento parameter môže byť veľmi citlivý na látky s estrogénovým pôsobením. Pozorovanie orgánov/tkanív, ktoré nie sú vymenované v odseku 43, je nepovinné (pozri dodatok 2).
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              V Usmernení o histopatológii (19) sa uvádzajú ďalšie podrobnosti o pitvaní, fixácii, vykonávaní rezov a histopatológii endokrinných tkanív.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              V rámci medzinárodného testovacieho programu boli získané dôkazy o tom, že nepatrné endokrinné účinky chemikálií s nízkou potenciou účinku na homeostázu pohlavných hormónov je možné určiť skôr na základe narušenia synchronizácie estrálneho cyklu v rôznych tkanivách a menej na základe zrejmých histopatologických zmien na samičích pohlavných orgánoch. Aj keď sa nezískal žiadny konečný dôkaz o takýchto účinkoch, pri interpretácii histopatológie vaječníkov (folikulárnych, tekálnych a granulóznych buniek), maternice, krčka maternice a vagíny sa odporúča brať do úvahy znaky možnej asynchrónnosti estrálneho cyklu. Ak sa hodnotí štádium cyklu podľa vaginálnych sterov, takisto ho možno zahrnúť do tohto porovnania.
                           
                        
                     Histopatológia
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Úplná histopatológia sa uskutoční na uskladnených orgánoch a tkanivách všetkých zvierat v kontrolnej skupine a v skupinách s vysokými dávkami. Tieto skúšky sa rozšíria o zvieratá zo všetkých skupín s odlišným dávkovaním, ak boli zistené zmeny v skupine s vysokými dávkami.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Preskúmajú sa všetky závažné poškodenia.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Ak boli použité satelitné skupiny, histopatológia sa vykoná na tkanivách a orgánoch, pri ktorých boli v testovaných skupinách zistené účinky.
                           
                        ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV
                  
                     Údaje
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Je potrebné uviesť jednotlivé údaje. Navyše všetky údaje sa musia zhrnúť v tabuľkovej forme, pričom ukazujú pre každú testovanú skupinu počet zvierat na začiatku testu, počet zvierat uhynutých počas testu alebo utratených z humánnych dôvodov, čas uhynutia alebo utratenia jednotlivých zvierat, počet zvierat, pri ktorých sa prejavili príznaky toxicity, opis pozorovaných príznakov toxicity vrátane nástupu, trvania a závažnosti toxických účinkov, počet zvierat vykazujúcich poškodenie, typy poškodení, ich závažnosť a percentuálne množstvo zvierat, pri ktorých sa prejavil daný typ poškodenia.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Ak je to možné, číselné výsledky sa vyhodnotia vhodnou a všeobecne akceptovateľnou štatistickou metódou. Porovnávanie účinkov podľa rozsahu dávkovania má zamedziť používaniu opakovaných t-testov. Štatistické metódy by sa mali vybrať počas prípravnej fázy štúdie.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Na účely kontroly kvality sa navrhuje, aby sa zozbierali historické kontrolné údaje a aby sa vypočítali variačné koeficienty pre číselné údaje, najmä pre parametre spojené s detekciou endokrinného disruptora. Tieto údaje sa môžu použiť pre porovnanie, keď sa vyhodnocujú jednotlivé štúdie.
                           
                        
                     Správa o teste
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Správa o teste musí obsahovať tieto informácie:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovaná chemikália:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikálny charakter, čistota a fyzikálno-chemické vlastnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikačné údaje.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosič (v prípade potreby):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie výberu nosiča, ak je iný ako voda.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovacie zvieratá:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použitý druh/kmeň,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet, vek a pohlavie zvierat,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo atď.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hmotnosti jednotlivých zvierat na začiatku testu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie výberu druhu, ak je iný ako potkan.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Podmienky testovania:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie voľby úrovne dávok,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o príprave testovanej chemikálie/krmiva, dosiahnutých koncentráciách, stabilite a homogenite prípravku,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o podávaní testovanej chemikálie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prepočet koncentrácie testovanej chemikálie v krmive/pitnej vode (ppm) na skutočnú dávku (mg/kg telesnej hmotnosti/deň), ak je to použiteľné,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o kvalite potravy a vody.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nepovinné skúmané parametre
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zoznam nepovinných skúmaných parametrov.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      telesná hmotnosť/zmeny telesnej hmotnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      spotreba krmiva a spotreba vody, ak je to použiteľné,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o toxikologickej reakcii podľa pohlavia a úrovne dávky vrátane príznakov toxicity,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      povaha, závažnosť a trvanie klinických pozorovaní (s údajmi o reverzibilite),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hodnotenie senzorickej aktivity, sily zovretia a motorickej aktivity,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematologické testy s významnými základnými hodnotami,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      testy klinickej biochémie s významnými základnými hodnotami,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      telesná hmotnosť pri utratení a údaje o hmotnosti orgánov,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pitevné nálezy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobný opis všetkých histopatologických nálezov,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      absorpčné údaje, ak sú dostupné,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      štatistické spracovanie výsledkov v prípade potreby.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rozbor výsledkov
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Závery
                                          
                                       
                                    
                        
                     Dodatok 1
                     VYMEDZENIE POJMOV
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Androgenicita je schopnosť chemikálie pôsobiť v organizme cicavcov ako prirodzený androgénny hormón (napr. testosterón).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Antiandrogenicita je schopnosť chemikálie potlačiť v organizme cicavcov pôsobenie prirodzeného androgénneho hormónu (napr. testosterónu).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Antiestrogenicita je schopnosť chemikálie potlačiť v organizme cicavcov pôsobenie prirodzeného estrogénového hormónu (napr. estradiol 17ß).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Antityreoidné pôsobenie je schopnosť látky potlačiť v organizme cicavcov pôsobenie prirodzeného hormónu štítnej žľazy (napr. T3).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Dávkovanie je všeobecný pojem zahŕňajúci dávku látky, jej frekvenciu a trvanie podávania dávok.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Dávka je množstvo podanej testovanej chemikálie. Dávka je vyjadrená ako hmotnosť testovanej chemikálie na jednotku telesnej hmotnosti testovaného zvieraťa za deň (napr. mg/kg telesnej hmotnosti/deň) alebo ako konštantná koncentrácia v potrave.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Zjavná toxicita je všeobecný termín opisujúci jasné príznaky toxicity po podaní testovanej chemikálie. Tieto príznaky by mali postačovať na posúdenie nebezpečnosti a pri zvýšení podanej dávky by podľa nich malo byť možné predpokladať výskyt závažných príznakov toxicity a pravdepodobnej mortality.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    NOAEL je skratka pre hladinu bez pozorovaného nepriaznivého účinku. Je to najvyššia úroveň dávky, pri ktorej po podaní testovanej chemikálie nie sú pozorované žiadne nepriaznivé nálezy.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Estrogenicita je schopnosť látky pôsobiť v organizme cicavcov ako prirodzený estrogénový hormón (napr. estradiol 17ß).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testovaná chemikália: akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tyreoidné pôsobenie je schopnosť látky pôsobiť v organizme cicavcov ako prirodzený hormón štítnej žľazy (napr. T3).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Validácia (overenie) je vedecký postup navrhnutý s cieľom opísať prevádzkové požiadavky a obmedzenia testovacej metódy a dokázať jej spoľahlivosť a významnosť pre konkrétny účel.
                              
                           
                  
                     Dodatok 2
                     
                        Parametre odporúčané pre detekciu endokrinných disruptorov (ED) v rámci tejto testovacej metódy B.7
                     
                     
                                 Povinné parametre
                              
                              
                                 Nepovinné parametre
                              
                           
                                 Hmotnosť
                              
                           
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             semenníky
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nadsemenníky
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nadobličky
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             prostata + semenné mechúriky s koagulačnými žľazami
                                          
                                       
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             vaječníky
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             maternica vrátane krčka maternice
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             štítna žľaza
                                          
                                       
                           
                                 Histopatológia
                              
                           
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             gonády:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         semenníky a
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vaječníky
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vedľajšie pohlavné orgány:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         nadsemenníky
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         prostata + semenné mechúriky s koagulačnými žľazami
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         maternica vrátane krčka maternice
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nadoblička
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             štítna žľaza
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vagína
                                          
                                       
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             vaginálne stery
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             samčie prsné žľazy
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             hypofýza
                                          
                                       
                           
                                 Meranie hormónov
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             cirkulačné hladiny T3, T4
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             cirkulačné hladiny TSH
                                          
                                       
                           
                  
                     LITERATÚRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (Paríž, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Tupper, D. E., Wallace, R. B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: s. 999 – 1003.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: s. 691 – 704.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Moser, V. C., McDaniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: s. 267 – 283.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Meyer, O. A., Tilson, H. A., Byrd, W. C., Riley, M. T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: s. 233 – 236.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Crofton, K. M., Howard, J. L., Moser, V. C., Gill, M. W., Reiter, L. W., Tilson, H. A., MacPhail, R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: s. 599 – 609.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10. – 11. marca 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No. 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              OECD (2012). Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Haley, P., Perry, R., Ennulat, D., Frame, S., Johnson, C., Lapointe, J.-M., Nyska, A., Snyder, P. W., Walker, D., Walter, G. (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: s. 404 – 407.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Hess, R. A., Moore, B. J. (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, s. 52 – 85.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Latendresse, J. R., Warbrittion, A. R., Jonassen, H., Creasy, D. M. (2002). Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, s. 524 – 533.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.
                           
                        B.8.   SUBAKÚTNA INHALAČNÁ TOXICITA: 28-DŇOVÁ ŠTÚDIA
                  
                  ZHRNUTIE
                  Táto revidovaná testovacia metóda B.8 bola vypracovaná s cieľom dôkladne opísať inhalačnú toxicitu testovanej chemikálie po opakovanej expozícii v obmedzenom časovom období (28 dní) a poskytnúť údaje pre kvantitatívne hodnotenie inhalačného rizika. Skupiny minimálne päť samcov a päť samíc hlodavcov sú na šesť hodín denne počas 28 dní exponované a) testovanej chemikálii pri troch alebo viacerých úrovniach koncentrácie; b) filtrovanému vzduchu (negatívna kontrola) a/alebo c) nosiču (kontrola pomocou nosiča). Zvieratá sú zvyčajne exponované päť dní v týždni, ale je povolená aj expozícia na sedem dní v týždni. Testujú sa vždy samce aj samice, môžu však byť vystavované rôznym úrovniam koncentrácie, ak je známe, že jedno z pohlaví je voči danej testovanej chemikálii vnímavejšie. Táto metóda poskytuje vedúcemu štúdie flexibilitu, aby mohol zahrnúť satelitné skupiny (reverzibilita), bronchoalveolárnu laváž (BAL), neurologické testy a doplnkové hodnotenia klinickej patológie a histopatologické hodnotenia s cieľom dôkladnejšie charakterizovať toxicitu testovanej chemikálie.
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov TG 412 (2009). Pôvodné usmernenia na vykonávanie testov subakútnej inhalačnej toxicity 412 (TG 412) boli prijaté v roku 1981 (1). Táto testovacia metóda B.8 (ako rovnocenná verzia revidovaných usmernení TG 412) bola aktualizovaná, aby odrážala stav vedy a spĺňala súčasné a budúce regulačné potreby.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Táto metóda umožňuje opísať nepriaznivé účinky po opakovanej dennej inhalačnej expozícii testovanej chemikálii počas 28 dní. Údaje odvodené z 28-dňových štúdií subakútnej inhalačnej toxicity sa môžu použiť pri kvantitatívnom hodnotení rizík [ak nenasleduje 90-dňová štúdia subchronickej inhalačnej toxicity (kapitola B.29 tejto prílohy)]. Údaje môžu takisto poskytnúť informácie o výbere koncentrácií pre dlhodobejšie štúdie, ako je napríklad 90-dňová štúdia subchronickej inhalačnej toxicity. Táto testovacia metóda nie je špecificky určená na testovanie nanomateriálov. Vymedzenie pojmov použitých v súvislosti s touto testovacou metódou je uvedené na konci tejto kapitoly a v usmerňovacom dokumente 39 (2).
                           
                        ÚVODNÉ ÚVAHY
                  
                              3.
                           
                           
                              Pred samotným vykonaním štúdie testovacie laboratórium zváži všetky dostupné informácie o testovanej chemikálii s cieľom zlepšiť kvalitu štúdie a minimalizovať využívanie zvierat. Informácie, ktoré môžu pomôcť pri výbere vhodných testovacích koncentrácií, zahŕňajú identitu, chemickú štruktúru a fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej chemikálie; výsledky všetkých testov toxicity in vitro alebo in vivo; predpokladané použitie (použitia) a potenciál pre expozíciu ľudí; dostupné údaje (Q)SAR, toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných látkach a údaje odvodené z testov akútnej inhalačnej toxicity. Ak sa očakávajú alebo ak sa v priebehu štúdie objavia príznaky neurotoxicity, vedúci štúdie môže rozhodnúť o zahrnutí vhodných hodnotení, ako je napríklad funkčná pozorovacia batéria (FOB) a meranie motorickej aktivity. Aj keď je pri určitých testoch rozhodujúce načasovanie expozícií, tieto dodatočné činnosti nesmú narušiť základný plán štúdie.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Riedenie žieravých alebo dráždivých testovaných chemikálií sa môže testovať pri koncentráciách, ktoré budú vykazovať želanú mieru toxicity [pozri dokument GD 39 (2)]. Pri vystavovaní zvierat pôsobeniu týchto materiálov musia byť cieľové koncentrácie dostatočne nízke, aby nespôsobovali výraznú bolesť ani utrpenie, a zároveň dostatočné na predĺženie krivky závislosti reakcie od koncentrácie na úroveň, na ktorej sa zabezpečí regulačný a vedecký cieľ testu. Tieto koncentrácie by sa mali vybrať v závislosti od jednotlivých prípadov, pokiaľ možno podľa vhodne navrhnutej štúdie na zistenie rozsahu, ktorá poskytuje informácie o kritickom parametri, každom prahu dráždivosti a čase nástupu príznakov (pozri odseky 11 – 13). Je potrebné zdôvodniť výber koncentrácie.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Moribundné zvieratá alebo zvieratá, ktoré majú očividne silné bolesti alebo vykazujú pretrvávajúce príznaky silného utrpenia, by sa mali humánnym spôsobom usmrtiť. Moribundné zvieratá sa posudzujú rovnako ako zvieratá, ktoré uhynú počas testovania. Kritériá na rozhodnutie usmrtiť moribundné alebo silne trpiace zvieratá a usmernenie o uznaní predvídateľnej alebo nastávajúcej smrti sú predmetom usmerňovacieho dokumentu OECD o humánnych parametroch (Humane Endpoints Guidance Document) (3).
                           
                        OPIS METÓDY
                  
                     Výber druhov zvierat
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Používajú sa zdravé mladé dospelé hlodavce bežne používaných laboratórnych kmeňov. Preferovaným druhom je potkan. Použitie iných druhov je potrebné zdôvodniť.
                           
                        
                     Príprava zvierat
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Používajú sa samice, ktoré nikdy nevrhli mláďatá a sú negravidné. V deň randomizácie majú byť zvieratá mladé dospelé jedince vo veku sedem až deväť týždňov. Telesná hmotnosť má byť v rozsahu ± 20 % priemernej hmotnosti každého pohlavia. Zvieratá sú náhodne vybraté, označené tak, aby sa umožnila jednotlivá identifikácia, a držia sa v klietkach aspoň päť dní pred začiatkom testu, aby sa im umožnila aklimatizácia na laboratórne podmienky.
                           
                        
                     Chov zvierat
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Zvieratá musia byť jednotlivo identifikované, najlepšie pomocou podkožných transpondérov, aby sa zjednodušilo pozorovanie a zamedzilo zámenám. Teplota miestnosti, kde sa pokusné zviera chová, by mala byť 22 ± 3 °C. Relatívna vlhkosť by sa v ideálnom prípade mala udržiavať v rozsahu od 30 do 70 %, hoci to nemusí byť možné, ak sa ako nosič používa voda. Pred a po expozícii sú zvieratá zvyčajne umiestnené v klietkach v skupinách podľa pohlavia a koncentrácie, ale počet zvierat v jednej klietke by nemal prekážať bezproblémovému pozorovaniu každého zvieraťa, pričom by sa mali minimalizovať straty súvisiace so vzájomným požieraním alebo bojom jedincov. V prípade, že sa použije iba expozícia oblasti nosa, môže byť potrebné, aby sa zvieratá aklimatizovali na skúmavky obmedzujúce pohyb. Obmedzujúce skúmavky by nemali zvieratám spôsobovať neprimeraný stres súvisiaci s fyzikálnymi vlastnosťami, teplotou alebo obmedzením pohybu. Obmedzenie môže mať vplyv na fyziologické sledované parametre, ako sú telesná teplota (hypertermia) a/alebo respiračný minútový objem. Ak sú k dispozícii všeobecné údaje, podľa ktorých k takýmto zmenám nedochádza vo veľkej miere, potom obmedzujúce skúmavky nie je potrebné vopred upraviť. Zvieratá vystavené účinkom aerosólu celým telom by sa mali v priebehu expozície umiestniť samostatne, aby sa zabránilo filtrovaniu testovaného aerosólu cez srsť ostatných zvierat v klietke. S výnimkou času trvania expozície sa na kŕmenie môže používať bežné a osvedčené laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou miestnej pitnej vody. Osvetlenie by malo byť umelé a malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy.
                           
                        
                     Inhalačné komory
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Pri výbere inhalačnej komory by sa mal vziať do úvahy charakter testovanej chemikálie a predmet testu. Uprednostňuje sa expozícia oblasti nosa (pričom tento pojem zahŕňa iba expozíciu hlavy, nosa alebo pysku). Vo všeobecnosti sa pri štúdiách kvapalných alebo tuhých aerosólov a pár, ktoré môžu kondenzovať a vytvárať aerosóly, uprednostňuje expozícia oblasti nosa. Špeciálne ciele štúdie možno lepšie dosiahnuť použitím expozície celého tela, ale tento krok je potrebné v správe o štúdii odôvodniť. Na zabezpečenie stability prostredia pri používaní komory na expozíciu celého tela by celkový objem testovaných zvierat nemal presiahnuť 5 % objemu komory. Princípy metód expozície celého tela a oblasti nosa a ich konkrétne výhody a nevýhody sú opísané v dokumente GD 39 (2).
                           
                        ŠTÚDIE TOXICITY
                  
                     Limitné koncentrácie
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Na rozdiel od štúdií akútnej toxicity nie sú pre 28-dňové štúdie subakútnej inhalačnej toxicity stanovené žiadne limitné koncentrácie. Pri maximálnej testovanej koncentrácii je potrebné zvážiť: 1. maximálnu dosiahnuteľnú koncentráciu; 2. najhorší možný prípad úrovne expozície ľudí; 3. potrebu zachovať primeraný prísun kyslíka a/alebo 4. otázky týkajúce sa dobrých životných podmienok zvierat. V prípade chýbajúcich limitov založených na údajoch sa môžu použiť akútne limity podľa nariadenia (ES) č. 1272/2008 (13) (t. j. až do maximálnej koncentrácie 5 mg/l v prípade aerosólov, 20 mg/l v prípade pár a 20 000 ppm v prípade plynov); pozri dokument GD 39 (2). Ak je nutné prekročiť tieto limity pri testovaní plynov alebo vysokoprchavých testovaných chemikálií (napr. chladiace látky), je potrebné uviesť odôvodnenie. Z limitnej koncentrácie by sa mala vyvodiť jednoznačná toxicita bez toho, aby sa zvieratám spôsoboval neprimeraný stres alebo aby bola ovplyvnená dĺžka ich života (3).
                           
                        
                     Štúdia na zistenie rozsahu
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Pred začiatkom základnej štúdie môže byť potrebné vykonať štúdiu na zistenie rozsahu. Štúdia na zistenie rozsahu je komplexnejšia ako predbežná štúdia, lebo sa neobmedzuje na výber koncentrácie. Poznatky získané zo štúdie na zistenie rozsahu môžu viesť k úspešnej základnej štúdii. Štúdia na zistenie rozsahu môže napríklad poskytnúť technické informácie o analytických metódach, rozdelení veľkosti častíc, odhalení toxických mechanizmov, klinickej patológii a histopatologických údajoch a odhadoch koncentrácií NOAEL a MTC v základnej štúdii. Vedúci štúdie sa môže rozhodnúť pre štúdiu na zistenie rozsahu s cieľom identifikovať prah dráždivosti dýchacích ciest (napr. histopatológiou dýchacích ciest, testovaním fungovania pľúc alebo bronchoalveolárnou lavážou), hornú koncentráciu tolerovanú bez toho, aby spôsobovala zvieratám neprimeraný stres, a parametre, ktoré najlepšie charakterizujú toxicitu testovanej chemikálie.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Štúdia na zistenie rozsahu môže pozostávať z jednej alebo viacerých úrovní koncentrácie. Každej úrovni koncentrácie by mali byť vystavené nie viac ako tri samce a tri samice. Štúdia na zistenie rozsahu by mala trvať minimálne päť dní a zvyčajne nie viac ako 14 dní. V správe o štúdii sa uvedú dôvody výberu koncentrácií pre základnú štúdiu. Cieľom základnej štúdie je preukázať vzťah koncentrácie a reakcie založený na parametri, ktorý je podľa očakávaní najcitlivejší. Nízka koncentrácia by mala ideálne predstavovať koncentráciu bez pozorovaného účinku, zatiaľ čo z vysokej koncentrácie by sa mala vyvodiť jednoznačná toxicita bez toho, aby sa zvieratám spôsoboval neprimeraný stres alebo aby bola ovplyvnená dĺžka ich života (3).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Pri výbere úrovní koncentrácie pre štúdiu na zistenie rozsahu je potrebné zvážiť všetky dostupné informácie vrátane vzťahov štruktúry a aktivity a údajov o podobných látkach (pozri odsek 3). Štúdia na zistenie rozsahu môže potvrdiť/vyvrátiť parametre, ktoré sa považujú za najcitlivejšie mechanisticky založené parametre, napr. cholínesterázna inhibícia prostredníctvom organofosfátov, tvorba methemoglobínu prostredníctvom erytrocytotoxických činiteľov, hormóny štítnej žľazy (T3, T4) v prípade látok toxických pre štítnu žľazu, proteín, LDH alebo neutrofily pri bronchoalveolárnej laváži v prípade neškodných slabo rozpustných častíc alebo aerosólov dráždivých pre pľúca.
                           
                        
                     Základná štúdia
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Základná štúdia subakútnej toxicity vo všeobecnosti pozostáva z troch úrovní koncentrácie a podľa potreby aj zo súbežných negatívnych (vzduchových) kontrol a/alebo kontrol nosiča (pozri odsek 17). Pri výbere vhodných úrovní expozície je potrebné použiť všetky dostupné údaje vrátane výsledkov štúdií systémovej toxicity, metabolizmu a kinetiky (osobitne treba dbať na to, aby sa nepoužívali vysoké úrovne koncentrácie, ktoré nasycujú kinetické procesy). Každá testovacia skupina je zložená aspoň z desiatich hlodavcov (piatich samcov a piatich samíc), ktoré sú exponované testovanej chemikálii šesť hodín denne päť dní v týždni počas štyroch týždňov (celkové trvanie štúdie 28 dní). Zvieratá môžu byť pôsobeniu chemikálie vystavené aj sedem dní v týždni (napr. pri testovaní inhalovaných liekov). Ak je o jednom z pohlaví známe, že je voči danej testovanej chemikálii vnímavejšie, môžu byť pohlavia vystavené rôznym úrovniam koncentrácie, aby sa optimalizovala reakcia na koncentráciu podľa opisu v odseku 15. Ak sa v prípade iných hlodavcov ako potkanov použije expozícia oblasti nosa, maximálne trvanie expozície je možné prispôsobiť s cieľom minimalizovať druhovo špecifické utrpenie. Pri použití intervalu expozície v trvaní menej ako šesť hodín denne, alebo ak je potrebné vykonať štúdiu expozície celého tela s dlhým intervalom (napr. 22 hodín denne), treba uviesť odôvodnenie [pozri dokument GD 39 (2)]. Počas trvania expozície by sa zviera nemalo kŕmiť, ak expozícia nepresiahne šesť hodín. V priebehu celej expozície celého tela sa zvieraťu môže podať voda.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Pomocou vybratých cieľových koncentrácií by sa mal identifikovať cieľový orgán (orgány) a preukázať zrejmá reakcia na koncentráciu:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          vysoká úroveň koncentrácie by mala mať za následok toxické účinky, ale nemala by spôsobiť pretrvávajúce príznaky ani letalitu, ktoré by znemožnili zmysluplné hodnotenie,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          stredná úroveň (úrovne) koncentrácie by sa mala podávať v takých odstupoch, aby viedla k stupňovaniu toxických účinkov medzi dávkami nízkej a vysokej koncentrácie,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          nízka úroveň koncentrácie by mala vyvolať malé alebo žiadne príznaky toxicity.
                                       
                                    
                        
                     Satelitná štúdia (štúdia reverzibility)
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Satelitná štúdia (štúdia reverzibility) sa môže použiť na pozorovanie reverzibility, pretrvávania alebo oneskoreného výskytu toxicity počas primerane dlhého obdobia po skončení testovania, najmenej však počas 14 dní. Satelitné skupiny (reverzibility) pozostávajú z piatich samcov a piatich samíc, ktoré sú exponované súbežne s pokusnými zvieratami v základnej štúdii. Skupiny satelitnej štúdie (reverzibility) sú vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie pri najvyššej úrovni koncentrácie a súbežne sa podľa potreby vykonávajú vzduchové kontroly a/alebo kontroly nosiča (pozri odsek 17).
                           
                        
                     Kontrolné zvieratá
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              S kontrolnými zvieratami súbežných negatívnych (vzduchových) kontrol sa zaobchádza rovnako ako so zvieratami testovacej skupiny s tou výnimkou, že sú vystavené filtrovanému vzduchu a nie testovanej chemikálii. Ak sa pri vytváraní testovacieho ovzdušia používa voda alebo iná látka, do štúdie je potrebné namiesto negatívnej (vzduchovej) kontrolnej skupiny zahrnúť kontrolnú skupinu nosiča. Vždy, keď je to možné, sa ako nosič použije voda. Ak sa ako nosič použije voda, kontrolné zvieratá by mali byť exponované vzduchu s rovnakou relatívnou vlhkosťou ako exponované skupiny exponované testovanej chemikálii. Výber vhodného nosiča by mal byť založený na primerane vykonanej predbežnej štúdii alebo na historických údajoch. Ak nie je toxicita nosiča dostatočne známa, vedúci štúdie sa môže rozhodnúť použiť negatívnu (vzduchovú) kontrolu aj kontrolu nosiča, ale tento postup sa vyslovene neodporúča. Ak z historických údajov vyplýva, že nosič nie je toxický, negatívna (vzduchová) kontrolná skupina nie je potrebná a mala by sa použiť iba kontrola nosiča. Ak sa pri predbežnej štúdii testovanej chemikálie pripravenej v nosiči nezistí žiadna toxicita, znamená to, že nosič pri testovanej koncentrácii nie je toxický a táto kontrola nosiča by sa mala použiť.
                           
                        PODMIENKY EXPOZÍCIE
                  
                     Podávanie koncentrácií
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Zvieratá sú vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie vo forme plynu, pary, aerosólu alebo ich kombinácie. Fyzikálne skupenstvo, ktoré sa testuje, závisí od fyzikálno-chemických vlastností testovanej chemikálie, zvolenej koncentrácie a/alebo najpravdepodobnejšej fyzikálnej formy pri manipulácii a používaní testovanej chemikálie. Hygroskopické a chemicky reaktívne testované chemikálie by sa mali testovať v podmienkach suchého vzduchu. Treba dbať na to, aby sa nevytvorili výbušné koncentrácie. Tuhé materiály môžu byť podrobené mechanickým procesom na zmenšenie veľkosti častíc. Ďalšie usmernenia sa nachádzajú v dokumente GD 39 (2).
                           
                        
                     Rozdelenie veľkosti častíc
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Častice my sa mali rozdeliť podľa veľkosti v prípade všetkých aerosólov a pár, ktoré môžu kondenzovať a vytvárať aerosóly. Na umožnenie expozície všetkých relevantných oblastí dýchacej sústavy sa odporúčajú aerosóly so stredným aerodynamickým hmotnostným priemerom (MMAD) v rozsahu od 1 do 3 μm so štandardnou odchýlkou geometrického priemeru (σg) v rozsahu od 1,5 do 3,0 (4). Hoci by sa malo vynaložiť primerané úsilie na dodržanie tejto normy, pokiaľ túto podmienku nie je možné splniť, treba predložiť odborný posudok. Napríklad v prípade kovových dymov môžu byť častice menšie, ako stanovuje táto norma, a nabité častice a vlákna môžu túto normu prekračovať.
                           
                        
                     Príprava testovanej chemikálie v nosiči
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              V ideálnom prípade sa testovaná chemikália testuje bez nosiča. Ak je nevyhnutné použiť nosič, aby sa dosiahla vhodná koncentrácia a veľkosť častíc testovanej chemikálie, uprednostňuje sa voda. Vždy, keď je testovaná chemikália rozpustená v nosiči, je potrebné preukázať jej stabilitu.
                           
                        MONITOROVANIE PODMIENOK EXPOZÍCIE
                  
                     Prúdenie vzduchu v komore
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Prúdenie vzduchu cez expozičnú komoru by sa počas každej expozície malo dôkladne kontrolovať, nepretržite monitorovať a zaznamenávať aspoň raz za hodinu. Monitorovanie koncentrácie testovacieho ovzdušia v reálnom čase (alebo dočasnej stability) je integrálne meranie všetkých dynamických parametrov a poskytuje nepriamy prostriedok kontroly všetkých relevantných dynamických inhalačných parametrov. Ak sa koncentrácia monitoruje v reálnom čase, frekvencia meraní prúdenia vzduchu sa môže obmedziť na jedno meranie na expozíciu za deň. Je potrebné venovať osobitnú pozornosť tomu, aby v komorách na expozíciu oblasti nosa nedochádzalo k opätovnému vdychovaniu. Koncentrácia kyslíka by mala byť minimálne 19 % a koncentrácia oxidu uhličitého by nemala presiahnuť 1 %. Ak existuje dôvod domnievať sa, že túto normu nie je možné splniť, koncentrácie kyslíka a oxidu uhličitého by sa mali zmerať. Ak merania v prvý deň expozície preukážu, že úrovne týchto plynov sú správne, ďalšie merania nie sú nutné.
                           
                        
                     Teplota komory a relatívna vlhkosť
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Teplotu v komore je potrebné udržiavať na úrovni 22 ± 3 °C. Relatívnu vlhkosť v dýchacej zóne zvierat pri expozícii oblasti nosa aj pri expozícii celého tela je potrebné počas každej expozície nepretržite monitorovať a podľa možnosti raz za hodinu zaznamenávať. Relatívna vlhkosť by sa podľa možnosti mala udržiavať v rozsahu od 30 do 70 %, ale môže sa stať, že táto hodnota bude nedosiahnuteľná (napr. v prípade testovania zmesí na báze vody) alebo nemerateľná z dôvodu interferencie testovanej chemikálie a testovacej metódy.
                           
                        
                     Testovaná chemikália: nominálna koncentrácia
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Vždy, keď je to možné, by sa mala vypočítať a zaznamenať nominálna koncentrácia expozície v komore. Nominálna koncentrácia je hmotnosť vytvorenej testovanej chemikálie vydelená celkovým objemom vzduchu, ktorý prešiel systémom inhalačnej komory. Nominálna koncentrácia sa nepoužíva na charakterizáciu expozície zvierat, ale porovnanie nominálnej a skutočnej koncentrácie vypovedá o účinnosti vytvárania testovacieho systému, a teda sa môže použiť na zistenie problémov s tvorbou.
                           
                        
                     Testovaná chemikália: skutočná koncentrácia
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Skutočná koncentrácia je koncentrácia testovanej chemikálie odobratej z dýchacej zóny zvierat v inhalačnej komore. Skutočné koncentrácie možno získať špecifickými metódami (napr. priamym odberom vzorky, adsorpčnými alebo chemicky reaktívnymi metódami a následnou analytickou charakterizáciou) alebo nešpecifickými metódami, ako je gravimetrická filtrová analýza. Použitie gravimetrickej analýzy je prípustné iba v prípade jednozložkových práškových aerosólov alebo aerosólov kvapalín s nízkou prchavosťou, pričom je potrebné túto analýzu podložiť primeranými testovými charakterizáciami predbežných štúdií týkajúcich sa konkrétnej chemikálie. Koncentráciu viaczložkových práškových aerosólov takisto možno stanoviť prostredníctvom gravimetrickej analýzy. V tom prípade sú však potrebné analytické údaje, ktoré dokazujú, že zloženie materiálu vo vzduchu je podobné ako zloženie východiskového materiálu. Ak tieto informácie nie sú dostupné, môže byť potrebná opätovná analýza testovanej chemikálie (ideálne v jej skupenstve v ovzduší) v pravidelných intervaloch v priebehu štúdie. V prípade aerosólových látok, ktoré sa môžu vypariť alebo môžu sublimovať, by sa malo preukázať, že všetky fázy sa zhromaždili pomocou zvolenej metódy.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Ak je to možné, počas celej štúdie by sa mala použiť jedna dávka testovanej chemikálie, pričom testovaná vzorka by sa mala uskladniť za podmienok, za ktorých sa zachová jej čistota, homogenita a stabilita. Pred začatím štúdie by mala byť k dispozícii charakterizácia testovanej chemikálie vrátane jej čistoty a, ak je to technicky možné, identity a množstiev identifikovaných kontaminantov a prímesí. Charakterizáciu možno preukázať napríklad týmito údajmi: retenčný čas a relatívna plocha píku, molekulová hmotnosť získaná pomocou analýzy hmotnostnej spektrometrie alebo plynovej chromatografie alebo iné odhady. Hoci za identitu testovanej vzorky testovacie laboratórium nenesie zodpovednosť, je vhodné, aby testovacie laboratórium aspoň čiastočne potvrdilo charakterizáciu poskytnutú dodávateľom (napr. farbu, fyzikálne skupenstvo atď.).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Podľa možnosti je potrebné udržiavať ovzdušie pri expozícii konštantné. Na preukázanie stability podmienok expozície sa môže použiť zariadenie na monitorovanie v reálnom čase, ako napríklad aerosólový fotometer pre aerosóly alebo komplexný uhľovodíkový analyzátor pre pary. Skutočná koncentrácia v komore by sa mala merať aspoň tri razy v každý deň expozície a pri každej úrovni expozície. Ak to pre nízky prietok vzduchu alebo nízke koncentrácie nie je možné, je prijateľný jeden odber vzorky počas intervalu expozície. V takom prípade by sa mala táto vzorka podľa možnosti odoberať za celé trvanie expozície. Jednotlivé vzorky koncentrácie v komore by sa nemali od strednej koncentrácie v komore odchýliť o viac ako ± 10 % v prípade plynov a pár a o viac ako ± 20 % v prípade kvapalných alebo tuhých aerosólov. Čas na dosiahnutie rovnováhy v komore (t95) by sa mal vypočítať a mala by o ňom podať správa. Interval expozície zahŕňa čas, keď sa testovaná chemikália tvorí. Zohľadňuje sa pri tom čas potrebný na dosiahnutie rovnováhy v komore (t95) a čas rozpadu. Usmernenia k odhadovaniu t95 sú uvedené v dokumente GD 39 (2).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              V prípade veľmi komplexných zmesí tvorených plynmi/parami a aerosólov (napr. spaľovacieho ovzdušia a testovaných chemikálií poháňaných účelovými výrobkami/zariadeniami koncového použitia) sa v inhalačnej komore môže každá fáza správať inak. Preto by sa pre každú fázu (plyn/para a aerosól) mala vybrať aspoň jedna látka slúžiaca ako ukazovateľ (analyt), obyčajne hlavná aktívna látka v zmesi. Ak je testovaná chemikália zmes, v správe by sa mala uviesť analytická koncentrácia celej zmesi, nielen aktívnej látky alebo látky slúžiacej ako ukazovateľ (analyt). Ďalšie informácie týkajúce sa skutočných koncentrácií sú uvedené v dokumente GD 39 (2).
                           
                        
                     Testovaná chemikália: rozdelenie veľkosti častíc
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Rozdelenie veľkosti častíc aerosólov by sa pri každej úrovni koncentrácie malo stanoviť aspoň raz za týždeň, a to pomocou kaskádového impaktora alebo alternatívneho prístroja, ako je napríklad aerodynamický spektrometer častíc (APS). Ak možno preukázať rovnocennosť výsledkov získaných pomocou kaskádového impaktora a alternatívneho prístroja, potom sa alternatívny prístroj môže používať počas celej štúdie.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Druhé zariadenie, ako je gravimetrický filter alebo impinger/premývačka, by sa malo použiť súbežne s hlavným prístrojom na potvrdenie zachytávacej účinnosti hlavného prístroja. Hmotnostná koncentrácia získaná analýzou veľkosti častíc by mala byť v rozsahu primeraných limitov hmotnostnej koncentrácie získanej filtrovou analýzou [pozri dokument GD 39 (2)]. Ak možno preukázať rovnocennosť pri všetkých koncentráciách testovaných v počiatočnej fáze štúdie, nie je potrebné vykonávať ďalšie potvrdzujúce merania. V záujme zabezpečenia dobrých životných podmienok pre zvieratá by sa mali prijať opatrenia na minimalizáciu nejednoznačných údajov, ktoré môžu viesť k potrebe opakovať štúdiu.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Rozdelenie veľkosti častíc by sa malo vykonať v prípade pár, ak existuje možnosť, že kondenzácia pary môže mať za následok tvorbu aerosólu, alebo ak sa v ovzduší pár zistia častice s potenciálom zmiešaných fáz.
                           
                        POZOROVANIA
                  
                              31.
                           
                           
                              Zvieratá by sa mali pred, počas a po skončení expozície klinicky pozorovať. V závislosti od reakcie zvierat počas expozície môžu byť potrebné častejšie pozorovania. Ak pozorovaniu zvierat bráni používanie skúmaviek obmedzujúcich pohyb zvierat, slabo osvetlených komôr na expozíciu celého tela alebo nepriehľadné ovzdušie, zvieratá by sa mali dôkladne preskúmať po skončení expozície. Na základe pozorovaní pred expozíciou v nasledujúcom dni možno zhodnotiť akúkoľvek reverzibilitu alebo zhoršenie toxických účinkov.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Všetky pozorovania sa zaznamenávajú, pričom každé zviera má individuálny záznam. Keď sa zvieratá usmrtia z humánnych dôvodov alebo sa nájdu uhynuté, je potrebné čo možno najpresnejšie zaznamenať čas uhynutia.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Pozorovania v klietkach sa zameriavajú na zmeny kože a srsti, očí, slizníc, dýchania a krvného obehu, zmeny nervového systému, somatomotoriky a správania. Pozornosť sa zameriava na pozorovanie triašky, kŕčov, slinenia, hnačky, letargie, spánku a kómy. Meraním rektálnej teploty možno získať dôkazy svedčiace o reflexnej bradypney alebo hypo/hypertermii, ktoré súvisia s testovaním alebo s obmedzením pohybu. Protokol o štúdii môže zahŕňať ďalšie hodnotenia, ako je napríklad kinetika, biomonitorovanie, funkcia pľúc, zadržiavanie slabo rozpustných materiálov, ktoré sa hromadia v pľúcnom tkanive, a zmeny správania.
                           
                        TELESNÉ HMOTNOSTI
                  
                              34.
                           
                           
                              Hmotnosť jednotlivých zvierat je potrebné zaznamenať krátko pred prvou expozíciou (deň 0), potom dvakrát týždenne (napríklad: piatky a pondelky, aby sa preukázalo zotavenie po víkende bez expozícií, alebo v časovom intervale, ktorý umožňuje hodnotenie systémovej toxicity) a v čase uhynutia alebo utratenia. Ak sa v prvých dvoch týždňoch neobjavia žiadne účinky, po zvyšok štúdie sa môže telesná hmotnosť merať raz za týždeň. Satelitné zvieratá (na štúdiu reverzibility, ak sa použijú) sa naďalej vážia raz za týždeň počas celého obdobia zotavovania. Na konci štúdie by sa všetky zvieratá mali krátko pred utratením odvážiť, aby sa získali neskreslené vypočítané pomery hmotnosti orgánov k telu.
                           
                        SPOTREBA POTRAVY A VODY
                  
                              35.
                           
                           
                              Spotreba potravy by sa mala merať raz za týždeň. Môže sa merať aj spotreba vody.
                           
                        KLINICKÁ PATOLÓGIA
                  
                              36.
                           
                           
                              Hodnotenia klinickej patológie sa po utratení vykonávajú pri všetkých zvieratách vrátane kontrolných a satelitných zvierat. Je potrebné zaznamenať časový interval medzi skončením expozície a odberom krvi, najmä ak je rekonštitúcia sledovaného parametra rýchla. Odber vzoriek po skončení expozície je indikovaný pri tých parametroch, ktoré majú krátky biologický polčas v plazme (napr. COHb, CHE a MetHb).
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              V tabuľke 1 sa uvádza zoznam parametrov klinickej patológie, ktoré sa vo všeobecnosti požadujú pri všetkých toxikologických štúdiách. Rozbor moču sa bežne nevyžaduje, ale môže sa vykonať, ak sa na základe očakávanej alebo pozorovanej toxicity predpokladá, že bude užitočný. Vedúci štúdie sa môže rozhodnúť hodnotiť ďalšie parametre s cieľom lepšie charakterizovať toxicitu testovanej chemikálie (napr. cholínesteráza, lipidy, hormóny, acidobázická rovnováha, methemoglobín alebo Heinzove telieska, kreatinkináza, pomer myelocytov a erytrocytov, troponíny, plyny v arteriálnej krvi, laktát-dehydrogenáza, sorbitol-dehydrogenáza, glutamát-dehydrogenáza a gama-glutamyl transpeptidáza).
                              
                                 Tabuľka 1
                              
                              
                                 Štandardné parametre klinickej patológie
                              
                              
                                          Hematológia
                                       
                                    
                                          Počet erytrocytov
                                          Hematokrit
                                          Koncentrácia hemoglobínu
                                          Stredný korpuskulárny hemoglobín
                                          Stredný korpuskulárny objem
                                          Koncentrácia stredného korpuskulárneho hemoglobínu
                                          Retikulocyty
                                       
                                       
                                          Celkový počet leukocytov
                                          Diferenciálny počet leukocytov
                                          Počet trombocytov
                                          Potenciál zrážania krvi (vyberte jednu z možností):
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Protrombínový čas
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Čas zrážania krvi
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Čiastočný tromboplastínový čas
                                                   
                                                
                                    
                                          Klinická chémia
                                       
                                    
                                          Glukóza (8)
                                          
                                          Celkový cholesterol
                                          Triglyceridy
                                          Dusík z močoviny v krvi
                                          Celkový bilirubín
                                          Kreatinín
                                          Celkový obsah bielkovín
                                          Albumíny
                                          Globulíny
                                       
                                       
                                          Alanín-amintransferáza
                                          Aspartát-aminotransferáza
                                          Alkalická fosfatáza
                                          Draslík
                                          Sodík
                                          Vápnik
                                          Fosfor
                                          Chloridy
                                       
                                    
                                          Rozbor moču (nepovinné)
                                       
                                    
                                          Vzhľad (farba a zakalenie)
                                          Objem
                                          Špecifická hmotnosť alebo osmolalita
                                          pH
                                       
                                       
                                          Celkový obsah bielkovín
                                          Glukóza
                                          Krv/krvinky
                                       
                                    
                        
                              38.
                           
                           
                              Ak existuje dôkaz, že hlavným miestom usadzovania a zachytávania sú dolné dýchacie cesty (t. j. alveoly), ako metóda kvantitatívnej analýzy hypotetických parametrov účinnosti dávky zameranej na hypersenzitívnu pneumonitídu, zápal pľúc a fosfolipidózu sa môže zvoliť bronchoalveolárna laváž (BAL). Tá umožňuje primerane preskúmať priebežné zmeny alveolárneho poškodenia súvisiace so závislosťou reakcie od dávky. Z tekutiny bronchoalveolárnej laváže sa môže analyzovať celkový a diferenciálny počet leukocytov, celkový obsah bielkovín a laktát-dehydrogenáza. Ďalej sa môžu zvážiť parametre indikujúce lyzozomálne poškodenie, fosfolipidózu, fibrózu a dráždivé alebo alergické zápaly, ktoré môžu zahŕňať stanovenie zápalových cytokínov/chemokínov. Merania BAL vo všeobecnosti dopĺňajú výsledky histopatologických testov, nemôžu ich však nahradiť. Usmernenia o postupe pľúcnej laváže sú uvedené v dokumente GD 39 (2).
                           
                        MAKROSKOPICKÁ PATOLÓGIA A ORGÁNOVÉ HMOTNOSTI
                  
                              39.
                           
                           
                              Všetky testované zvieratá vrátane tých, ktoré uhynú počas testu alebo sa vylúčia zo štúdie z dôvodu starostlivosti o zvieratá, sa podrobujú úplnému vykrveniu (ak je uskutočniteľné) a makroskopickej autopsii. Pri každom zvierati sa zaznamená čas medzi skončením poslednej expozície a utratením. Ak nie je možné vykonať autopsiu ihneď po objavení uhynutého zvieraťa, zviera sa schladí (nie zmrazí) na dostatočne nízku teplotu, aby sa minimalizovala autolýza. Autopsie by sa mali vykonať čo najskôr, zvyčajne v priebehu jedného alebo dvoch dní. Pri každom zvierati sa zaznamenajú všetky makroskopické patologické zmeny, pričom osobitná pozornosť sa venuje akýmkoľvek zmenách v dýchacej sústave.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              V tabuľke 2 sa uvádza zoznam orgánov a tkanív, ktoré je počas makroskopickej pitvy potrebné zachovať vo vhodnom médiu na účely histopatologického vyšetrenia. O uchovaní orgánov a tkanív [v zátvorke] a všetkých ostatných orgánov a tkanív rozhodne vedúci štúdie. Orgány vyznačené tučným písmom by sa mali čo najskôr po disekcii upraviť a odvážiť v mokrom stave, aby sa zabránilo ich vyschnutiu. Štítna žľaza a nadsemenníky by sa mali vážiť iba v prípade potreby, lebo úprava artefaktov môže brániť histopatologickému hodnoteniu. Tkanivá a všetky orgány sa fixujú v 10 % formalínovom tlmivom roztoku alebo v inom vhodnom fixačnom prostriedku ihneď po vykonaní autopsie a nie skôr ako 24 – 48 hodín pred úpravou v závislosti od použitého fixačného prostriedku.
                              
                                 Tabuľka 2
                              
                              
                                 Orgány a tkanivá zachované počas makroskopickej pitvy
                              
                              
                                 Nadobličky
                              
                              Kostná dreň (a/alebo čerstvý aspirát)
                              
                                 Mozog (vrátane častí predného mozgu, mozočka a predĺženej miechy/mosta)
                              [Oči (sietnica, očný nerv) a očné viečka]
                              
                                 Srdce
                              
                              
                                 Obličky
                              
                              Hrtan (tri úrovne, jedna úroveň má zahŕňať základňu epiglotis)
                              
                                 Pečeň
                              
                              
                                 Pľúca (všetky laloky na jednej úrovni vrátane hlavných priedušiek)
                              Lymfatické uzliny z hilovej oblasti pľúc najmä v prípade tuhých testovaných chemikálií so slabou rozpustnosťou. Pri detailnejších testoch a/alebo štúdiách s imunologickým zameraním sa môžu zvážiť ďalšie lymfatické uzliny, napr. z mediastinálnych, cervikálnych/submandibulárnych a/alebo aurikulárnych oblastí.
                              Nosohltanové tkanivá [aspoň štyri úrovne; jedna úroveň zahŕňa nosohltanovú trubicu a nosové lymfoidné tkanivo (NALT)]
                              Pažerák
                              [Čuchový bulbus]
                              Vaječníky
                              Semenné mechúriky
                              Miecha (krčná, hrudná a lumbálna)
                              
                                 Slezina
                              
                              Žalúdok
                              
                                 Semenníky
                              
                              
                                 Týmus
                              
                              Štítna žľaza
                              Priedušnica (aspoň dve úrovne vrátane jedného pozdĺžneho rezu cez karinu a jedného priečneho rezu)
                              [Močový mechúr]
                              Maternica
                              Všetky makroskopické poškodenia
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Pľúca by sa mali odňať neporušené, odvážiť a napustiť vhodným fixačným prostriedkom pri tlaku 20 – 30 cm vody, aby sa zachovala ich štruktúra (5). Je potrebné odobrať rezy všetkých lalokov na jednej úrovni vrátane hlavných priedušiek, ale ak sa robí pľúcna laváž, mali by sa vykonať rezy nelavážovaného laloku na troch úrovniach (nie sériové rezy).
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Preskúmajú sa najmenej štyri úrovne nosohltanových tkanív, z ktorých jedna by mala obsahovať nosohltanovú trubicu (5, 6, 7, 8, 9), aby sa umožnilo vhodné preskúmanie dlaždicového, prechodného (neriasinkového dýchacieho), dýchacieho (riasinkového dýchacieho) a čuchového epitelu a odvodného lymfatického tkaniva (NALT; 10, 11). Preskúmajú sa tri úrovne hrtana, pričom jedna z týchto úrovní by mala obsahovať základňu epiglotis (12). Je potrebné preskúmať aspoň dve úrovne priedušnice vrátane jedného pozdĺžneho rezu cez karinu bifurkácie extrapulmonárnych priedušiek a jedného priečneho rezu.
                           
                        HISTOPATOLÓGIA
                  
                              43.
                           
                           
                              Pri kontrolných skupinách a skupinách s vysokými koncentráciami a pri všetkých zvieratách, ktoré uhynú alebo sú utratené počas štúdie, sa vykoná histopatológia všetkých orgánov a tkanív vymenovaných v tabuľke 2. Osobitná pozornosť by sa mala venovať dýchacím cestám, cieľovým orgánom a makroskopickým poškodeniam. Orgány a tkanivá, ktoré majú poškodenia v skupine s vysokými koncentráciami, sa preskúmajú pri všetkých skupinách. Vedúci štúdie sa môže rozhodnúť pre vykonanie histopatologických hodnotení pri ďalších skupinách s cieľom preukázať jednoznačnú reakciu na koncentráciu. Ak boli použité satelitné skupiny (reverzibilita), histopatologické hodnotenie sa vykoná v prípade všetkých tkanív a orgánov, pri ktorých boli v testovaných skupinách zistené účinky. Ak v skupine s vysokou expozíciou došlo k nadmernému predčasnému úhynu alebo iným problémom, ktoré spochybňujú významnosť údajov, je potrebné histopatologicky preskúmať najbližšiu nižšiu koncentráciu. Sledovanie nálezov pitvy by malo korelovať s mikroskopickými nálezmi.
                           
                        ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV
                  
                     Údaje
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Je potrebné uviesť údaje o telesnej hmotnosti, spotrebe potravy, klinickej patológii, makroskopickej patológii, orgánových hmotnostiach a histopatológii jednotlivých zvierat. Údaje z klinických pozorovaní sa zhrnú v podobe tabuliek, kde sa uvedie pre každú pokusnú skupinu počet použitých zvierat, počet zvierat vykazujúcich špecifické príznaky toxicity, počet zvierat, ktoré sa našli uhynuté počas testu alebo ich usmrtili z humánnych dôvodov, čas uhynutia jednotlivých zvierat, opis a časový priebeh toxických účinkov a reverzibility a pitevné nálezy. Všetky výsledky, kvantitatívne aj náhodné, sa vyhodnotia primeranou štatistickou metódou. Možno použiť akúkoľvek všeobecne akceptovanú štatistickú metódu, pričom štatistické metódy je potrebné vybrať počas plánovania štúdie.
                           
                        
                     Správa o teste
                  
                  
                              45.
                           
                           
                              Správa o teste by mala podľa potreby obsahovať tieto informácie:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testované zvieratá a chov:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis podmienok v klietke vrátane: počtu (alebo zmeny počtu) zvierat na klietku, výstelky, teploty prostredia a relatívnej vlhkosti, dĺžky svetlej fázy a identifikácie krmiva,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použité druhy/kmene a odôvodnenie použitia druhov iných ako potkany, môže sa uviesť zdroj a historické údaje, ak sa týkajú zvierat v podobných podmienkach expozície, umiestnenia a nekŕmenia,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet, vek a pohlavie zvierat,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metóda randomizácie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis akýchkoľvek podmienok pred testovaním vrátane krmiva, karantény a liečby chorôb.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovaná chemikália:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikálny charakter, čistota a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti (vrátane izomerizácie),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikačné údaje a registračné číslo CAS (Chemical Abstract Services), ak je známe.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosič:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie použitia nosiča a odôvodnenie výberu nosiča (ak je iný ako voda),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      historické alebo paralelne získané údaje preukazujúce, že nosič nemá vplyv na výsledky štúdie.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhalačná komora:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobný opis inhalačnej komory vrátane objemu a nákresu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj a opis zariadenia použitého na expozíciu zvierat, ako aj na vytvorenie ovzdušia,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zariadenie na meranie teploty, vlhkosti, veľkosti častíc a skutočnej koncentrácie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj vzduchu a použitý klimatizačný systém,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metódy použité na kalibráciu zariadenia s cieľom zabezpečiť homogénne testovacie ovzdušie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozdiel tlakov (pozitívny alebo negatívny),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      expozičné otvory na jednu komoru (v prípade expozície oblasti nosa), umiestnenie zvierat v komore (v prípade expozície celého tela),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stabilita testovacieho ovzdušia,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      umiestnenie senzorov teploty a vlhkosti a odber vzorky testovacieho ovzdušia v komore,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      manipulácia s privádzaným/extrahovaným vzduchom,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hodnoty prietoku vzduchu, prietok vzduchu na jeden expozičný otvor (v prípade expozície oblasti nosa) alebo množstvo zvierat na komoru (v prípade expozície celého tela),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      čas potrebný na dosiahnutie rovnováhy v inhalačnej komore (t95),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet zmien objemu za hodinu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      meracie prístroje (ak sa použili),
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Údaje o expozícii:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie výberu cieľovej koncentrácie pre základnú štúdiu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominálne koncentrácie (celková hmotnosť testovanej chemikálie aplikovanej do inhalačnej komory vydelená objemom vzduchu, ktorý prešiel komorou),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skutočné koncentrácie testovanej chemikálie zachytenej z dýchacej zóny zvierat, v prípade zmesí, ktoré vytvárajú heterogénne fyzikálne skupenstvá (plyny, pary, aerosóly) možno každé skupenstvo analyzovať samostatne,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      všetky koncentrácie vzduchu sa udávajú v hmotnostných jednotkách (mg/l mg/m3 atď.), nie v objemových jednotkách (ppm, ppb atď.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozdelenie veľkosti častíc, stredný aerodynamický hmotnostný priemer (MMAD) a štandardná odchýlka geometrického priemeru (σg) vrátane metód ich výpočtu. Jednotlivé analýzy veľkosti častíc sa uvedú v správe.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Podmienky testovania:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné informácie o príprave testovanej chemikálie vrátane podrobných údajov o všetkých postupoch použitých na zmenšenie veľkosti častíc tuhých látok alebo na prípravu roztokov testovanej chemikálie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis (podľa možnosti spolu s nákresom) zariadenia použitého na vytvorenie testovacieho ovzdušia a na expozíciu zvierat testovaciemu ovzdušiu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné informácie o zariadeniach použitých na monitorovanie teploty, vlhkosti a prúdenia vzduchu v komore (napr. vývoj kalibračnej krivky),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné informácie o zariadeniach použitých pri odbere vzoriek na stanovenie koncentrácie v komore a rozdelenia veľkosti častíc,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné informácie o použitej chemickej analytickej metóde a o overení metódy (vrátane účinnosti výťažnosti testovanej chemikálie z prostriedku na odber vzorky),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metóda randomizácie pri prideľovaní zvierat do testovacích a kontrolných skupín,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu/zdroja krmiva, zdroja vody),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie výberu testovacích koncentrácií.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie teploty, vlhkosti a prúdenia vzduchu v komore,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie údajov o nominálnych a skutočných koncentráciách,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie údajov o veľkosti častíc vrátane údajov o odbere vzoriek na analýzu, o rozdelení veľkosti častíc a o výpočtoch MMAD a σg,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie získaných údajov o reakcii a úrovni koncentrácie pre každé zviera (t. j. zvieratá vykazujúce príznaky toxicity vrátane mortality, charakteru, závažnosti, času nástupu a trvania účinkov),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie hmotností jednotlivých zvierat,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie spotreby potravy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie údajov klinickej patológie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pitevné nálezy a histopatologické nálezy pre každé zviera, ak sú k dispozícii,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie akýchkoľvek ďalších meraných parametrov.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rozbor a interpretácia výsledkov:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      osobitný dôraz sa kladie na opis metód použitých na splnenie kritérií tejto testovacej metódy, napr. limitnej koncentrácie alebo veľkosti častíc,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dýchateľnosť častíc vzhľadom na celkové zistenia sa uvedie, najmä ak nebolo možné splniť kritériá na veľkosť častíc,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      konzistencia metód použitých na stanovenie nominálnej a skutočnej koncentrácie a vzťah skutočnej koncentrácie k nominálnej koncentrácii sa uvedú v celkovom hodnotení štúdie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uvedie sa pravdepodobná príčina uhynutia a prevládajúci druh pôsobenia (systémové verzus lokálne),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uvedie sa odôvodnenie, ak bolo potrebné humánnym spôsobom utratiť zvieratá, ktoré mali bolesti alebo vykazovali príznaky silného alebo pretrvávajúceho utrpenia, v súlade s kritériami v usmerňovacom dokumente OECD o humánnych parametroch (Guidance Document on Humane Endpoints) (3),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikuje sa cieľový orgán (orgány),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stanoví sa NOAEL a LOAEL.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATÚRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 412, Environment Directorate, OECD, Paríž.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paríž.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paríž.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Whalan, J. E., a Redden, J. C. (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Dungworth, D. L., Tyler, W. S., Plopper, C. E. (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H. P. a Brain, J. D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, s. 229 – 258.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Young, J. T. (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309 – 312.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Harkema, J. R. (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231 – 238.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Woutersen, R. A., Garderen-Hoetmer, A., van Slootweg, P. J., Feron, V. J. (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP a Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, s. 215 – 263.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Mery, S., Gross, E. A., Joyner, D. R., Godo, M., Morgan, K. T. (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353 – 372.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Kuper, C. F., Koornstra, P. J., Hameleers, D. M. H., Biewenga, J., Spit, B. J., Duijvestijn, A. M., Breda Vriesman van, P. J. C., Sminia, T. (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219 – 224.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Kuper, C. F., Arts, J. H. E., Feron, V. J. (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140 – 141: s. 281 – 285.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Lewis, D. J. (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419 – 428.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 16. decembra 2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí, o zmene, doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zmene a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006 (Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1).
                           
                        
                     Dodatok 1
                     VYMEDZENIE POJMU
                     Testovaná chemikália: akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
                  “
            
                  5.
               
               
                  Kapitoly B.29 a B.30 sa nahrádzajú takto:
                  „B.29.   SUBCHRONICKÁ INHALAČNÁ TOXICITA: 90-DŇOVÁ ŠTÚDIA
                  
                  ZHRNUTIE
                  Táto revidovaná testovacia metóda B.29 bola vypracovaná s cieľom dôkladne opísať inhalačnú toxicitu testovanej chemikálie počas subchronického trvania (90 dní) a poskytnúť podrobné údaje pre kvantitatívne hodnotenie inhalačného rizika. Skupiny desiatich samcov a desiatich samíc hlodavcov sú na šesť hodín denne počas 90 dní (13 týždňov) exponované a) testovanej chemikálii pri troch alebo viacerých úrovniach koncentrácie, b) filtrovanému vzduchu (negatívna kontrola) a/alebo c) nosiču (kontrola pomocou nosiča). Zvieratá sú zvyčajne exponované päť dní v týždni, ale je povolená aj expozícia na sedem dní v týždni. Testujú sa vždy samce aj samice, môžu však byť vystavované rôznym úrovniam koncentrácie, ak je známe, že jedno z pohlaví je voči danej testovanej chemikálii vnímavejšie. Táto metóda poskytuje vedúcemu štúdie flexibilitu, aby mohol zahrnúť satelitné skupiny (reverzibilita), priebežné utratenie, bronchoalveolárnu laváž (BAL), neurologické testy a doplnkové hodnotenia klinickej patológie a histopatologické hodnotenia s cieľom dôkladnejšie charakterizovať toxicitu testovanej chemikálie.
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov TG 413 (2009). Pôvodné Usmernenia na vykonávanie testov subchronickej inhalačnej toxicity 413 (TG 413) boli prijaté v roku 1981 (1). Táto testovacia metóda B.29 [ako rovnocenná verzia revidovaných usmernení TG 413 (2009)] bola aktualizovaná, aby odrážala stav vedy a spĺňala súčasné a budúce regulačné potreby.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Štúdie subchronickej inhalačnej toxicity sa primárne využívajú na odvodenie regulačných koncentrácií pre hodnotenie rizík pre pracovníkov v prostredí pracoviska. Používajú sa aj na hodnotenie rizík súvisiacich s bývaním ľudí, ich prepravou a životným prostredím. Táto metóda umožňuje opísať nepriaznivé účinky po opakovanej dennej inhalačnej expozícii testovanej chemikálii počas 90 dní (približne 10 % dĺžky života potkana). Údaje odvodené zo štúdií subchronickej inhalačnej toxicity možno použiť pri kvantitatívnom hodnotení rizík a pri výbere koncentrácií pre chronické štúdie. Táto testovacia metóda nie je špecificky určená na testovanie nanomateriálov. Vymedzenie pojmov použitých v súvislosti s touto testovacou metódou je uvedené na konci tejto kapitoly a v usmerňovacom dokumente (GD) 39 (2).
                           
                        ÚVODNÉ ÚVAHY
                  
                              3.
                           
                           
                              Pred samotným vykonaním štúdie testovacie laboratórium zváži všetky dostupné informácie o testovanej chemikálii s cieľom zlepšiť kvalitu štúdie a minimalizovať využívanie zvierat. Informácie, ktoré pomôžu pri výbere vhodných testovacích koncentrácií, zahŕňajú identitu, chemickú štruktúru a fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej chemikálie; výsledky všetkých testov toxicity in vitro alebo in vivo; predpokladané použitie (použitia) a potenciál pre expozíciu ľudí; dostupné údaje (Q)SAR, toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných látkach a údaje odvodené z iných štúdií opakovanej expozície. Ak sa očakávajú alebo ak sa v priebehu štúdie objavia príznaky neurotoxicity, vedúci štúdie môže rozhodnúť o zahrnutí vhodných hodnotení, ako je napríklad funkčná pozorovacia batéria (FOB) a meranie motorickej aktivity. Aj keď je pri určitých testoch rozhodujúce načasovanie expozícií, tieto dodatočné činnosti nesmú narušiť základný plán štúdie.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Riedenie žieravých alebo dráždivých testovaných chemikálií sa môže testovať pri koncentráciách, ktoré budú vykazovať želanú mieru toxicity. Bližšie informácie sú k dispozícii v dokumente GD 39 (2). Pri vystavovaní zvierat pôsobeniu týchto materiálov musia byť cieľové koncentrácie dostatočne nízke, aby nespôsobovali výraznú bolesť ani utrpenie, a zároveň dostatočné na predĺženie krivky závislosti reakcie od koncentrácie na úroveň, na ktorej sa zabezpečí regulačný a vedecký cieľ testu. Tieto koncentrácie by sa mali vybrať v závislosti od jednotlivých prípadov, pokiaľ možno podľa vhodne navrhnutej štúdie na zistenie rozsahu, ktorá poskytuje informácie o kritickom parametri, každom prahu dráždivosti a čase nástupu príznakov (pozri odseky 11 – 13). Je potrebné zdôvodniť výber koncentrácie.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Moribundné zvieratá alebo zvieratá, ktoré majú očividne silné bolesti alebo vykazujú pretrvávajúce príznaky silného utrpenia, by sa mali humánnym spôsobom usmrtiť. Moribundné zvieratá sa posudzujú rovnako ako zvieratá, ktoré uhynú počas testovania. Kritériá na rozhodnutie usmrtiť moribundné alebo silne trpiace zvieratá a usmernenie o uznaní predvídateľnej alebo nastávajúcej smrti sú predmetom usmerňovacieho dokumentu OECD o humánnych parametroch (Humane Endpoints Guidance Document) (3).
                           
                        OPIS METÓDY
                  
                     Výber druhov zvierat
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Používajú sa zdravé mladé dospelé hlodavce bežne používaných laboratórnych kmeňov. Preferovaným druhom je potkan. Použitie iných druhov je potrebné zdôvodniť.
                           
                        
                     Príprava zvierat
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Používajú sa samice, ktoré nikdy nevrhli mláďatá a sú negravidné. V deň randomizácie majú byť zvieratá mladé dospelé jedince vo veku sedem až deväť týždňov. Telesná hmotnosť má byť v rozsahu ± 20 % priemernej hmotnosti každého pohlavia. Zvieratá sú náhodne vybraté, označené tak, aby sa umožnila jednotlivá identifikácia, a držia sa v klietkach aspoň päť dní pred začiatkom testu, aby sa im umožnila aklimatizácia na laboratórne podmienky.
                           
                        
                     Chov zvierat
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Zvieratá musia byť jednotlivo identifikované, najlepšie pomocou podkožných transpondérov, aby sa zjednodušilo pozorovanie a zamedzilo zámenám. Teplota miestnosti, kde sa pokusné zviera chová, by mala byť 22 ± 3 °C. Relatívna vlhkosť by sa v ideálnom prípade mala udržiavať v rozsahu od 30 do 70 %, hoci to nemusí byť možné, ak sa ako nosič používa voda. Pred a po expozícii sú zvieratá zvyčajne umiestnené v klietkach v skupinách podľa pohlavia a koncentrácie, ale počet zvierat v jednej klietke by nemal prekážať bezproblémovému pozorovaniu každého zvieraťa, pričom by sa mali minimalizovať straty súvisiace so vzájomným požieraním alebo bojom jedincov. V prípade, že sa použije iba expozícia oblasti nosa, môže byť potrebné, aby sa zvieratá aklimatizovali na skúmavky obmedzujúce pohyb. Obmedzujúce skúmavky by nemali zvieratám spôsobovať neprimeraný stres súvisiaci s fyzikálnymi vlastnosťami, teplotou alebo obmedzením pohybu. Obmedzenie môže mať vplyv na fyziologické sledované parametre, ako sú telesná teplota (hypertermia) a/alebo respiračný minútový objem. Ak sú k dispozícii všeobecné údaje, podľa ktorých k takýmto zmenám nedochádza vo veľkej miere, potom skúmavky nie je potrebné vopred prispôsobiť. Zvieratá vystavené účinkom aerosólu celým telom by sa mali v priebehu expozície umiestniť samostatne, aby sa zabránilo filtrovaniu testovaného aerosólu cez srsť ostatných zvierat v klietke. S výnimkou času trvania expozície sa na kŕmenie môže používať bežné a osvedčené laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou miestnej pitnej vody. Osvetlenie by malo byť umelé a malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy.
                           
                        
                     Inhalačné komory
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Pri výbere inhalačnej komory by sa mal vziať do úvahy charakter testovanej chemikálie a predmet testu. Uprednostňuje sa expozícia oblasti nosa (pričom tento pojem zahŕňa expozíciu hlavy, nosa alebo pysku). Vo všeobecnosti sa pri štúdiách kvapalných alebo tuhých aerosólov a pár, ktoré môžu kondenzovať a vytvárať aerosóly, uprednostňuje expozícia oblasti nosa. Špeciálne ciele štúdie možno lepšie dosiahnuť použitím expozície celého tela, ale tento krok je potrebné v správe o štúdii odôvodniť. Na zabezpečenie stability prostredia pri používaní komory na expozíciu celého tela by celkový objem testovaných zvierat nemal presiahnuť 5 % objemu komory. Princípy metód expozície celého tela a oblasti nosa a ich konkrétne výhody a nevýhody sú opísané v dokumente GD 39 (2).
                           
                        ŠTÚDIE TOXICITY
                  
                     Limitné koncentrácie
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Na rozdiel od štúdií akútnej toxicity nie sú pre štúdie subchronickej inhalačnej toxicity stanovené žiadne limitné koncentrácie. Pri maximálnej testovanej koncentrácii je potrebné zvážiť: 1. maximálnu dosiahnuteľnú koncentráciu; 2. najhorší možný prípad úrovne expozície ľudí; 3. potrebu zachovať primeraný prísun kyslíka a/alebo 4. otázky týkajúce sa dobrých životných podmienok zvierat. V prípade chýbajúcich limitov založených na údajoch sa môžu použiť akútne limity podľa nariadenia (ES) č. 1272/2008 (13) (t. j. až do maximálnej koncentrácie 5 mg/l v prípade aerosólov, 20 mg/l v prípade pár a 20 000 ppm v prípade plynov); pozri dokument GD 39 (2). Ak je nutné prekročiť tieto limity pri testovaní plynov alebo vysokoprchavých testovaných chemikálií (napr. chladiace látky), je potrebné uviesť odôvodnenie. Z limitnej koncentrácie by sa mala vyvodiť jednoznačná toxicita bez toho, aby sa zvieratám spôsoboval neprimeraný stres alebo aby bola ovplyvnená dĺžka ich života (3).
                           
                        
                     Štúdia na zistenie rozsahu
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Pred začiatkom základnej štúdie je zvyčajne potrebné vykonať štúdiu na zistenie rozsahu. Štúdia na zistenie rozsahu je komplexnejšia ako predbežná štúdia, lebo sa neobmedzuje na výber koncentrácie. Poznatky získané zo štúdie na zistenie rozsahu môžu viesť k úspešnej základnej štúdii. Štúdia na zistenie rozsahu môže napríklad poskytnúť technické informácie o analytických metódach, rozdelení veľkosti častíc, odhalení toxických mechanizmov, klinickej patológii a histopatologických údajoch a odhadoch koncentrácií NOAEL a MTC v základnej štúdii. Vedúci štúdie sa môže rozhodnúť pre štúdiu na zistenie rozsahu s cieľom identifikovať prah dráždivosti dýchacích ciest (napr. histopatológiou dýchacích ciest, testovaním fungovania pľúc alebo bronchoalveolárnou lavážou), hornú koncentráciu tolerovanú bez toho, aby spôsobovala zvieratám neprimeraný stres, a parametre, ktoré najlepšie charakterizujú toxicitu testovanej chemikálie.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Štúdia na zistenie rozsahu môže pozostávať z jednej alebo viacerých úrovní koncentrácie. V závislosti od zvolených parametrov sa každej úrovni koncentrácie vystaví tri až šesť samcov a tri až šesť samíc. Štúdia na zistenie rozsahu by mala trvať minimálne päť dní a zvyčajne nie viac ako 28 dní. V správe o štúdii sa uvedú dôvody výberu koncentrácií pre základnú štúdiu. Cieľom základnej štúdie je preukázať vzťah koncentrácie a reakcie založený na parametri, ktorý je podľa očakávaní najcitlivejší. Nízka koncentrácia by mala ideálne predstavovať hladinu bez pozorovaného nepriaznivého účinku, zatiaľ čo z vysokej koncentrácie by sa mala vyvodiť jednoznačná toxicita bez toho, aby sa zvieratám spôsoboval neprimeraný stres alebo aby bola ovplyvnená dĺžka ich života (3).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Pri výbere úrovní koncentrácie pre štúdiu na zistenie rozsahu je potrebné zvážiť všetky dostupné informácie vrátane vzťahov štruktúry a aktivity a údajov o podobných látkach (pozri odsek 3). Štúdia na zistenie rozsahu môže potvrdiť/vyvrátiť parametre, ktoré sa považujú za najcitlivejšie mechanisticky založené parametre, napr. cholínesterázna inhibícia prostredníctvom organofosfátov, tvorba methemoglobínu prostredníctvom erytrocytotoxických činiteľov, hormóny štítnej žľazy (T3, T4) v prípade látok toxických pre štítnu žľazu, proteín, LDH alebo neutrofily pri bronchoalveolárnej laváži v prípade neškodných slabo rozpustných častíc alebo aerosólov dráždivých pre pľúca.
                           
                        
                     Základná štúdia
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Základná štúdia subchronickej toxicity vo všeobecnosti pozostáva z troch úrovní koncentrácie a podľa potreby aj zo súbežných negatívnych (vzduchových) kontrol a/alebo kontrol nosiča (pozri odsek 18). Pri výbere vhodných úrovní expozície je potrebné použiť všetky dostupné údaje vrátane výsledkov štúdií systémovej toxicity, metabolizmu a kinetiky (osobitne treba dbať na to, aby sa nepoužívali vysoké úrovne koncentrácie, ktoré nasycujú kinetické procesy). Každá testovacia skupina je zložená z desiatich samcov a desiatich samíc hlodavcov, ktoré sú exponované testovanej chemikálii šesť hodín denne päť dní v týždni počas 13 týždňov (celkové trvanie štúdie 90 dní). Zvieratá môžu byť pôsobeniu chemikálie vystavené aj sedem dní v týždni (napr. pri testovaní inhalovaných liekov). Ak je jedno z pohlaví vnímavejšie na testovanú chemikáliu, môžu byť obe pohlavia vystavené rôznym úrovniam koncentrácie, aby sa optimalizovala reakcia na koncentráciu podľa opisu v odseku 15. Ak sa v prípade iných hlodavcov ako potkanov použije expozícia oblasti nosa, maximálne trvanie expozície je možné prispôsobiť s cieľom minimalizovať druhovo špecifické utrpenie. Pri použití intervalu expozície v trvaní menej ako šesť hodín denne alebo ak je potrebné vykonať štúdiu expozície celého tela s dlhým intervalom (napr. 22 hodín denne), treba uviesť odôvodnenie (pozri dokument GD 39) (2). Počas trvania expozície by sa zviera nemalo kŕmiť, ak expozícia nepresiahne šesť hodín. V priebehu expozície celého tela sa zvieraťu môže podať voda.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Pomocou vybratých cieľových koncentrácií by sa mal identifikovať cieľový orgán (orgány) a preukázať zrejmá reakcia na koncentráciu:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          vysoká úroveň koncentrácie by mala mať za následok toxické účinky, ale nemala by spôsobiť pretrvávajúce príznaky ani letalitu, ktoré by znemožnili zmysluplné hodnotenie,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          stredná úroveň (úrovne) koncentrácie by sa mala podávať v takých odstupoch, aby viedla k stupňovaniu toxických účinkov medzi dávkami nízkej a vysokej koncentrácie,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          nízka úroveň koncentrácie by mala vyvolať malé alebo žiadne príznaky toxicity.
                                       
                                    
                        
                     Priebežné utratenie
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Ak sa plánuje priebežné utrácanie zvierat, počet zvierat pri každej úrovni expozície by sa mal zvýšiť o počet, ktorý sa má utratiť pred dokončením štúdie. Priebežné utrácanie zvierat treba odôvodniť, pričom tento postup by mal byť náležite podložený štatistickými analýzami.
                           
                        
                     Satelitná štúdia (štúdia reverzibility)
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Satelitná štúdia (štúdia reverzibility) sa môže použiť na pozorovanie reverzibility, pretrvávania alebo oneskoreného výskytu toxicity počas primerane dlhého obdobia po skončení testovania, najmenej však počas 14 dní. Satelitné skupiny (reverzibility) pozostávajú z desiatich samcov a desiatich samíc, ktoré sú exponované súbežne s pokusnými zvieratami v základnej štúdii. Skupiny satelitnej štúdie (reverzibility) sú vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie pri najvyššej úrovni koncentrácie a súbežne sa podľa potreby vykonávajú vzduchové kontroly a/alebo kontroly nosiča (pozri odsek 18).
                           
                        
                     Kontrolné zvieratá
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              S kontrolnými zvieratami súbežných negatívnych (vzduchových) kontrol sa zaobchádza rovnako ako so zvieratami testovacej skupiny s tou výnimkou, že sú vystavené filtrovanému vzduchu a nie testovanej chemikálii. Ak sa pri vytváraní testovacieho ovzdušia používa voda alebo iná látka, do štúdie je potrebné namiesto negatívnej (vzduchovej) kontrolnej skupiny zahrnúť kontrolnú skupinu nosiča. Vždy, keď je to možné, sa ako nosič použije voda. Ak sa ako nosič použije voda, kontrolné zvieratá by mali byť exponované vzduchu s rovnakou relatívnou vlhkosťou ako skupiny exponované testovanej chemikálii. Výber vhodného nosiča by mal byť založený na riadne vykonanej predbežnej štúdii alebo na historických údajoch. Ak nie je toxicita nosiča dostatočne známa, vedúci štúdie sa môže rozhodnúť použiť negatívnu (vzduchovú) kontrolu aj kontrolu nosiča, ale tento postup sa vyslovene neodporúča. Ak z predchádzajúcich údajov vyplýva, že nosič nie je toxický, negatívna (vzduchová) kontrolná skupina nie je potrebná a mala by sa použiť iba kontrola nosiča. Ak sa pri predbežnej štúdii testovanej chemikálie pripravenej v nosiči nezistí žiadna toxicita, znamená to, že nosič pri testovanej koncentrácii nie je toxický a táto kontrola nosiča by sa mala použiť.
                           
                        PODMIENKY EXPOZÍCIE
                  
                     Podávanie koncentrácií
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Zvieratá sú vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie vo forme plynu, pary, aerosólu alebo ich kombinácie. Fyzikálne skupenstvo, ktoré sa testuje, závisí od fyzikálno-chemických vlastností testovanej chemikálie, zvolených koncentrácií a/alebo najpravdepodobnejšej fyzikálnej formy pri manipulácii a používaní testovanej chemikálie. Hygroskopické a chemicky reaktívne testované chemikálie by sa mali testovať v podmienkach suchého vzduchu. Treba dbať na to, aby sa nevytvorili výbušné koncentrácie. Tuhé materiály môžu byť podrobené mechanickým procesom na zmenšenie veľkosti častíc. Ďalšie usmernenia sa nachádzajú v dokumente GD 39 (2).
                           
                        
                     Rozdelenie veľkosti častíc
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Častice by sa mali rozdeliť podľa veľkosti v prípade všetkých aerosólov a pár, ktoré môžu kondenzovať a vytvárať aerosóly. Na umožnenie expozície všetkých relevantných oblastí dýchacej sústavy sa odporúčajú aerosóly so stredným aerodynamickým hmotnostným priemerom (MMAD) v rozsahu od 1 do 3 μm so štandardnou odchýlkou geometrického priemeru (σg) v rozsahu od 1,5 do 3,0 (4). Hoci by sa malo vynaložiť primerané úsilie na dodržanie tejto normy, pokiaľ túto podmienku nie je možné splniť, treba predložiť odborný posudok. Napríklad v prípade kovových dymov budú častice menšie, ako stanovuje táto norma, a nabité častice a vlákna môžu túto normu prekračovať.
                           
                        
                     Príprava testovanej chemikálie v nosiči
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              V ideálnom prípade sa testovaná chemikália testuje bez nosiča. Ak je nevyhnutné použiť nosič, aby sa dosiahla vhodná koncentrácia a veľkosť častíc testovanej chemikálie, uprednostňuje sa voda. Vždy, keď je testovaná chemikália rozpustená v nosiči, je potrebné preukázať jej stabilitu.
                           
                        MONITOROVANIE PODMIENOK EXPOZÍCIE
                  
                     Prúdenie vzduchu v komore
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Prúdenie vzduchu cez expozičnú komoru by sa počas každej expozície malo dôkladne kontrolovať, nepretržite monitorovať a zaznamenávať aspoň raz za hodinu. Monitorovanie koncentrácie testovacieho ovzdušia v reálnom čase (alebo dočasnej stability) je integrálne meranie všetkých dynamických parametrov a poskytuje nepriamy prostriedok kontroly všetkých relevantných dynamických inhalačných parametrov. Ak sa koncentrácia monitoruje v reálnom čase, frekvencia meraní prúdenia vzduchu sa môže obmedziť na jedno meranie na expozíciu za deň. Je potrebné venovať osobitnú pozornosť tomu, aby v komorách na expozíciu oblasti nosa nedochádzalo k opätovnému vdychovaniu. Koncentrácia kyslíka by mala byť minimálne 19 % a koncentrácia oxidu uhličitého by nemala presiahnuť 1 %. Ak existuje dôvod domnievať sa, že túto normu nie je možné splniť, koncentrácie kyslíka a oxidu uhličitého by sa mali zmerať. Ak merania v prvý deň expozície preukážu, že úrovne týchto plynov sú správne, ďalšie merania nie sú nutné.
                           
                        
                     Teplota komory a relatívna vlhkosť
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Teplotu v komore je potrebné udržiavať na úrovni 22 ± 3 °C. Relatívnu vlhkosť v dýchacej zóne zvierat pri expozícii oblasti nosa aj pri expozícii celého tela je potrebné počas každej expozície nepretržite monitorovať a podľa možnosti raz za hodinu zaznamenávať. Relatívna vlhkosť by sa podľa možnosti mala udržiavať v rozsahu od 30 do 70 %, ale môže sa stať, že táto hodnota bude nedosiahnuteľná (napr. v prípade testovania zmesí na báze vody) alebo nemerateľná z dôvodu interferencie testovanej chemikálie a testovacej metódy.
                           
                        
                     Testovaná chemikália: nominálna koncentrácia
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Vždy, keď je to možné, by sa mala vypočítať a zaznamenať nominálna koncentrácia expozície v komore. Nominálna koncentrácia je hmotnosť vytvorenej testovanej chemikálie vydelená celkovým objemom vzduchu, ktorý prešiel systémom inhalačnej komory. Nominálna koncentrácia sa nepoužíva na charakterizáciu expozície zvierat, ale porovnanie nominálnej a skutočnej koncentrácie vypovedá o účinnosti vytvárania testovacieho systému, a teda sa môže použiť na zistenie problémov s tvorbou.
                           
                        
                     Testovaná chemikália: skutočná koncentrácia
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Skutočná koncentrácia je koncentrácia testovanej chemikálie odobratej z dýchacej zóny zvierat v inhalačnej komore. Skutočné koncentrácie možno získať špecifickými metódami (napr. priamym odberom vzorky, adsorpčnými alebo chemicky reaktívnymi metódami a následnou analytickou charakterizáciou) alebo nešpecifickými metódami, ako je gravimetrická filtrová analýza. Použitie gravimetrickej analýzy je prípustné iba v prípade jednozložkových práškových aerosólov alebo aerosólov kvapalín s nízkou prchavosťou, pričom je potrebné túto analýzu podložiť primeranými testovými charakterizáciami predbežných štúdií týkajúcich sa konkrétnej chemikálie. Koncentráciu viaczložkových práškových aerosólov takisto možno stanoviť prostredníctvom gravimetrickej analýzy. V tom prípade sú však potrebné analytické údaje, ktoré preukazujú, že zloženie materiálu vo vzduchu je podobné ako zloženie východiskového materiálu. Ak tieto informácie nie sú dostupné, môže byť potrebná opätovná analýza testovanej chemikálie (ideálne v jej skupenstve v ovzduší) v pravidelných intervaloch v priebehu štúdie. V prípade aerosólových látok, ktoré sa môžu vypariť alebo môžu sublimovať, by sa malo preukázať, že všetky fázy sa zhromaždili pomocou zvolenej metódy.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Ak je to možné, počas celej štúdie by sa mala použiť jedna dávka testovanej chemikálie, pričom testovaná vzorka by sa mala uskladniť za podmienok, za ktorých sa zachová jej čistota, homogenita a stabilita. Pred začatím štúdie by mala byť k dispozícii charakterizácia testovanej chemikálie vrátane jej čistoty a, ak je to technicky možné, identity a množstiev identifikovaných kontaminantov a prímesí. Charakterizáciu možno preukázať napríklad týmito údajmi: retenčný čas a relatívna plocha píku, molekulová hmotnosť získaná pomocou analýzy hmotnostnej spektrometrie alebo plynovej chromatografie alebo iné odhady. Hoci za identitu testovanej vzorky testovacie laboratórium nenesie zodpovednosť, je vhodné, aby testovacie laboratórium aspoň čiastočne potvrdilo charakterizáciu poskytnutú dodávateľom (napr. farbu, fyzikálne skupenstvo atď.).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Podľa možnosti je potrebné udržiavať ovzdušie pri expozícii konštantné. Na preukázanie stability podmienok expozície sa môže použiť zariadenie na monitorovanie v reálnom čase, ako napríklad aerosólový fotometer pre aerosóly alebo komplexný uhľovodíkový analyzátor pre pary. Skutočná koncentrácia v komore by sa mala merať aspoň tri razy v každý deň expozície a pri každej úrovni expozície. Ak to pre nízky prietok vzduchu alebo nízke koncentrácie nie je možné, je prijateľný jeden odber vzorky počas intervalu expozície. V takom prípade by sa mala táto vzorka podľa možnosti odoberať za celé trvanie expozície. Jednotlivé vzorky koncentrácie v komore by sa nemali od strednej koncentrácie v komore odchýliť o viac ako ± 10 % v prípade plynov a pár a o viac ako ± 20 % v prípade kvapalných alebo tuhých aerosólov. Čas na dosiahnutie rovnováhy v komore (t95) by sa mal vypočítať a zaznamenať. Interval expozície zahŕňa čas, keď sa testovaná chemikália tvorí. Zohľadňuje sa pri tom čas potrebný na dosiahnutie rovnováhy v komore (t95) a čas rozpadu. Usmernenia k odhadovaniu t95 sú uvedené v dokumente GD 39 (2).
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              V prípade veľmi komplexných zmesí tvorených plynmi/parami a aerosólov (napr. spaľovacieho ovzdušia a testovaných chemikálií poháňaných účelovými výrobkami/zariadeniami koncového použitia) sa v inhalačnej komore môže každá fáza správať inak. Preto by sa pre každú fázu (plyn/para a aerosól) mala vybrať aspoň jedna látka slúžiaca ako ukazovateľ (analyt), obyčajne hlavná aktívna zložka v zmesi. Ak je testovaná chemikália zmes, v správe by sa mala uviesť analytická koncentrácia celej zmesi, nielen aktívnej látky alebo látky slúžiacej ako ukazovateľ (analyt). Ďalšie informácie týkajúce sa skutočných koncentrácií sú uvedené v dokumente GD 39 (2).
                           
                        
                     Testovaná chemikália: rozdelenie veľkosti častíc
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Rozdelenie veľkosti častíc aerosólov by sa pri každej úrovni koncentrácie malo stanoviť aspoň raz za týždeň, a to pomocou kaskádového impaktora alebo alternatívneho prístroja, ako je napríklad aerodynamický spektrometer častíc (APS). Ak možno preukázať rovnocennosť výsledkov získaných pomocou kaskádového impaktora a alternatívneho prístroja, potom sa alternatívny prístroj môže používať počas celej štúdie.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Druhé zariadenie, ako je gravimetrický filter alebo impinger/premývačka, by sa malo použiť súbežne s hlavným prístrojom na potvrdenie zachytávacej účinnosti hlavného prístroja. Hmotnostná koncentrácia získaná analýzou veľkosti častíc by mala byť v rozsahu primeraných limitov hmotnostnej koncentrácie získanej filtrovou analýzou [pozri dokument GD 39 (2)]. Ak možno preukázať rovnocennosť pri všetkých koncentráciách testovaných v počiatočnej fáze štúdie, nie je potrebné vykonávať ďalšie potvrdzujúce merania. V záujme zabezpečenia dobrých životných podmienok pre zvieratá by sa mali prijať opatrenia na minimalizáciu nejednoznačných údajov, ktoré môžu viesť k potrebe opakovať štúdiu.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Rozdelenie veľkosti častíc by sa malo vykonať v prípade pár, ak existuje možnosť, že kondenzácia pary môže mať za následok tvorbu aerosólu, alebo ak sa v ovzduší pár zistia častice s potenciálom zmiešaných fáz.
                           
                        POZOROVANIA
                  
                              32.
                           
                           
                              Zvieratá by sa mali pred, počas a po skončení expozície klinicky pozorovať. V závislosti od reakcie zvierat počas expozície môžu byť potrebné častejšie pozorovania. Ak pozorovaniu zvierat bráni používanie skúmaviek obmedzujúcich pohyb zvierat, slabo osvetlených komôr na expozíciu celého tela alebo nepriehľadné ovzdušie, zvieratá by sa mali dôkladne preskúmať po skončení expozície. Na základe pozorovaní pred expozíciou v nasledujúcom dni možno zhodnotiť akúkoľvek reverzibilitu alebo zhoršenie toxických účinkov.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Všetky pozorovania sa zaznamenávajú, pričom každé zviera má individuálny záznam. Keď sa zvieratá usmrtia z humánnych dôvodov alebo sa nájdu uhynuté, je potrebné čo možno najpresnejšie zaznamenať čas uhynutia.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Pozorovania v klietkach sa zameriavajú na zmeny kože a srsti, očí, slizníc, dýchania a krvného obehu, zmeny nervového systému a zmeny somatomotoriky a správania. Pozornosť sa zameriava na pozorovanie triašky, kŕčov, slinenia, hnačky, letargie, spánku a kómy. Meraním rektálnej teploty možno získať dôkazy svedčiace o reflexnej bradypney alebo hypo/hypertermii, ktoré súvisia s testovaním alebo s obmedzením pohybu. Protokol o štúdii môže zahŕňať ďalšie hodnotenia, ako je napríklad kinetika, biomonitorovanie, funkcia pľúc, zadržiavanie slabo rozpustných materiálov, ktoré sa hromadia v pľúcnom tkanive, a zmeny správania.
                           
                        TELESNÉ HMOTNOSTI
                  
                              35.
                           
                           
                              Hmotnosť jednotlivých zvierat je potrebné zaznamenať krátko pred prvou expozíciou (deň 0), potom dvakrát týždenne (napríklad: piatky a pondelky, aby sa preukázalo zotavenie po víkende bez expozícií, alebo v časovom intervale, ktorý umožňuje hodnotenie systémovej toxicity) a v čase uhynutia alebo utratenia. Ak sa v prvých štyroch týždňoch neobjavia žiadne účinky, po zvyšok štúdie sa môže telesná hmotnosť merať raz za týždeň. Satelitné zvieratá (na štúdiu reverzibility, ak sa použijú) sa naďalej vážia raz za týždeň počas celého obdobia zotavovania. Na konci štúdie by sa všetky zvieratá mali krátko pred utratením odvážiť, aby sa získali neskreslené vypočítané pomery hmotnosti orgánov k telu.
                           
                        SPOTREBA POTRAVY A VODY
                  
                              36.
                           
                           
                              Spotreba potravy by sa mala merať raz za týždeň. Môže sa merať aj spotreba vody.
                           
                        KLINICKÁ PATOLÓGIA
                  
                              37.
                           
                           
                              Hodnotenia klinickej patológie sa po utratení vykonávajú pri všetkých zvieratách vrátane kontrolných a satelitných zvierat (na štúdiu reverzibility). Je potrebné zaznamenať časový interval medzi skončením expozície a odberom krvi, najmä ak je rekonštitúcia sledovaného parametra rýchla. Odber vzoriek po skončení expozície je indikovaný pri tých parametroch, ktoré majú krátky biologický polčas v plazme (napr. COHb, CHE a MetHb).
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              V tabuľke 1 sa uvádza zoznam parametrov klinickej patológie, ktoré sa vo všeobecnosti požadujú pri všetkých toxikologických štúdiách. Rozbor moču sa bežne nevyžaduje, ale môže sa vykonať, ak sa na základe očakávanej alebo pozorovanej toxicity predpokladá, že bude užitočný. Vedúci štúdie sa môže rozhodnúť hodnotiť ďalšie parametre s cieľom lepšie charakterizovať toxicitu testovanej chemikálie (napr. cholínesteráza, lipidy, hormóny, acidobázická rovnováha, methemoglobín alebo Heinzove telieska, kreatinkináza, pomer myelocytov a erytrocytov, troponíny, plyny v arteriálnej krvi, laktát-dehydrogenáza, sorbitol-dehydrogenáza, glutamat-dehydrogenáza a gama-glutamyl transpeptidáza).
                              
                                 Tabuľka 1
                              
                              
                                 Štandardné parametre klinickej patológie
                              
                              
                                          Hematológia
                                       
                                    
                                          Počet erytrocytov
                                          Hematokrit
                                          Koncentrácia hemoglobínu
                                          Stredný korpuskulárny hemoglobín
                                          Stredný korpuskulárny objem
                                          Koncentrácia stredného korpuskulárneho hemoglobínu
                                          Retikulocyty
                                       
                                       
                                          Celkový počet leukocytov
                                          Diferenciálny počet leukocytov
                                          Počet trombocytov
                                          Potenciál zrážania krvi (vyberte jednu z možností):
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Protrombínový čas
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Čas zrážania krvi
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Čiastočný tromboplastínový čas
                                                   
                                                
                                    
                                          Klinická chémia
                                       
                                    
                                          Glukóza (9)
                                          
                                          Celkový cholesterol
                                          Triglyceridy
                                          Dusík z močoviny v krvi
                                          Celkový bilirubín
                                          Kreatinín
                                          Celkový obsah bielkovín
                                          Albumíny
                                          Globulíny
                                       
                                       
                                          Alanín-amintransferáza
                                          Aspartát-aminotransferáza
                                          Alkalická fosfatáza
                                          Draslík
                                          Sodík
                                          Vápnik
                                          Fosfor
                                          Chloridy
                                       
                                    
                                          Rozbor moču (nepovinné)
                                       
                                    
                                          Vzhľad (farba a zakalenie)
                                          Objem
                                          Špecifická hmotnosť alebo osmolalita
                                          pH
                                       
                                       
                                          Celkový obsah bielkovín
                                          Glukóza
                                          Krv/krvinky
                                       
                                    
                        
                              39.
                           
                           
                              Ak existuje dôkaz, že hlavným miestom usadzovania a zachytávania sú dolné dýchacie cesty (t. j. alveoly), ako metóda kvantitatívnej analýzy hypotetických parametrov účinnosti dávky zameranej na hypersenzitívnu pneumonitídu, zápal pľúc a fosfolipidózu sa môže zvoliť bronchoalveolárna laváž (BAL). Tá umožňuje primerane preskúmať priebežné zmeny alveolárneho poškodenia súvisiace so závislosťou reakcie od dávky. Z tekutiny bronchoalveolárnej laváže sa môže analyzovať celkový a diferenciálny počet leukocytov, celkový obsah bielkovín a laktát-dehydrogenáza. Ďalej sa môžu zvážiť parametre indikujúce lyzozomálne poškodenie, fosfolipidózu, fibrózu a dráždivé alebo alergické zápaly, ktoré môžu zahŕňať stanovenie zápalových cytokínov/chemokínov. Merania BAL vo všeobecnosti dopĺňajú výsledky histopatologických testov, nemôžu ich však nahradiť. Usmernenia o postupe pľúcnej laváže sú uvedené v dokumente GD 39 (2).
                           
                        OFTALMOLOGICKÉ VYŠETRENIE
                  
                              40.
                           
                           
                              Pomocou oftalmoskopu alebo podobného vhodného zariadenia sa vykoná oftalmologické vyšetrenie očného pozadia, refrakčného systému oka, dúhovky a spojoviek pri všetkých zvieratách pred podaním testovanej chemikálie a po skončení expozície pri všetkých skupinách s vysokými koncentráciami a pri kontrolných skupinách. Ak sa zistia zmeny na oku, vyšetria sa všetky zvieratá v ostatných skupinách vrátane satelitnej skupiny (reverzibilita).
                           
                        MAKROSKOPICKÁ PATOLÓGIA A ORGÁNOVÉ HMOTNOSTI
                  
                              41.
                           
                           
                              Všetky testované zvieratá vrátane tých, ktoré uhynú počas testu alebo sa vylúčia zo štúdie z dôvodu starostlivosti o zvieratá, sa podrobujú úplnému vykrveniu (ak je uskutočniteľné) a makroskopickej autopsii. Pri každom zvierati sa zaznamená čas medzi skončením poslednej expozície a utratením. Ak nie je možné vykonať autopsiu ihneď po objavení uhynutého zvieraťa, zviera sa schladí (nie zmrazí) na dostatočne nízku teplotu, aby sa minimalizovala autolýza. Autopsie by sa mali vykonať čo najskôr, zvyčajne v priebehu jedného alebo dvoch dní. Pri každom zvierati sa zaznamenajú všetky makroskopické patologické zmeny, pričom osobitná pozornosť sa venuje akýmkoľvek zmenám v dýchacej sústave.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              V tabuľke 2 sa uvádza zoznam orgánov a tkanív, ktoré je počas makroskopickej pitvy potrebné zachovať vo vhodnom médiu na účely histopatologického vyšetrenia. O uchovaní orgánov a tkanív [v zátvorke] a všetkých ostatných orgánov a tkanív rozhodne vedúci štúdie. Orgány vyznačené tučným písmom by sa mali čo najskôr po disekcii upraviť a odvážiť v mokrom stave, aby sa zabránilo ich vyschnutiu. Štítna žľaza a nadsemenníky by sa mali vážiť iba v prípade potreby, lebo úprava artefaktov môže brániť histopatologickému hodnoteniu. Tkanivá a všetky orgány sa fixujú v 10 % formalínovom tlmivom roztoku alebo v inom vhodnom fixačnom prostriedku ihneď po vykonaní autopsie a nie skôr ako 24 – 48 hodín pred úpravou v závislosti od použitého fixačného prostriedku.
                              
                                 Tabuľka 2
                              
                              
                                 Orgány a tkanivá zachované počas makroskopickej pitvy
                              
                              
                                 Nadobličky
                              
                              Srdcovnica
                              Kostná dreň (a/alebo čerstvý aspirát)
                              
                                 Mozog (vrátane častí predného mozgu, mozočka a predĺženej miechy/mosta)
                              Slepé črevo
                              Hrubé črevo
                              Dvanástnik
                              [Nadsemenníky]
                              [Oči (sietnica, očný nerv) a očné viečka]
                              Stehnová kosť a kolenný kĺb
                              Žlčník
                              [Harderove žľazy]
                              
                                 Srdce
                              
                              Ileum
                              Lačník
                              
                                 Obličky
                              
                              [Slzné žľazy (extraorbitálne)]
                              Hrtan (tri úrovne vrátane základne epiglotis)
                              
                                 Pečeň
                              
                              
                                 Pľúca (všetky laloky na jednej úrovni vrátane hlavných priedušiek)
                              Lymfatické uzliny z hilovej oblasti pľúc, najmä v prípade tuhých testovaných chemikálií so slabou rozpustnosťou. Pri detailnejších testoch a/alebo štúdiách s imunologickým zameraním sa môžu zvážiť ďalšie lymfatické uzliny, napr. z mediastinálnych, cervikálnych/submandibulárnych a/alebo aurikulárnych oblastí.
                              Lymfatické uzliny (distálne od brány vstupu)
                              Prsná žľaza (samičia)
                              Sval (stehenný)
                              Nosohltanové tkanivá (aspoň štyri úrovne; jedna úroveň zahŕňa nosohltanovú trubicu a nosové lymfoidné tkanivo (NALT))
                              Pažerák
                              [Čuchový bulbus]
                              
                                 Vaječníky
                              
                              Pankreas
                              Prištítne telieska
                              Periférny nerv (sedací alebo tibiálny, podľa možnosti blízko svalu)
                              Hypofýza
                              Prostata
                              Rektum
                              Slinné žľazy
                              Semenné mechúriky
                              Koža
                              Miecha (krčná, hrudná a lumbálna)
                              
                                 Slezina
                              
                              Hrudná kosť
                              Žalúdok
                              Zuby
                              
                                 Semenníky
                              
                              
                                 Týmus
                              
                              
                                 Štítna žľaza
                              
                              [Jazyk]
                              Priedušnica (najmenej dve úrovne vrátane jedného pozdĺžneho rezu cez karinu a jedného priečneho rezu)
                              Močovod
                              Močová rúra
                              Močový mechúr
                              
                                 Maternica
                              
                              Cieľové orgány
                              Všetky makroskopické poškodenia a hmotnosti
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Pľúca by sa mali odňať neporušené, odvážiť a napustiť vhodným fixačným prostriedkom pri tlaku 20 – 30 cm vody, aby sa zachovala ich štruktúra (5). Je potrebné odobrať rezy všetkých lalokov na jednej úrovni vrátane hlavných priedušiek, ale ak sa robí pľúcna laváž, mali by sa vykonať rezy nelavážovaného laloku na troch úrovniach (nie sériové rezy).
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Preskúmajú sa najmenej štyri úrovne nosohltanových tkanív, z ktorých jedna by mala obsahovať nosohltanovú trubicu (5) (6) (7) (8) (9), aby sa umožnilo vhodné preskúmanie dlaždicového, prechodného (neriasinkového dýchacieho), dýchacieho (riasinkového dýchacieho) a čuchového epitelu a odvodného lymfatického tkaniva (NALT) (10) (11). Preskúmajú sa tri úrovne hrtana, pričom jedna z týchto úrovní by mala obsahovať základňu epiglotis (12). Je potrebné preskúmať aspoň dve úrovne priedušnice vrátane jedného pozdĺžneho rezu cez karinu bifurkácie extrapulmonárnych priedušiek a jedného priečneho rezu.
                           
                        HISTOPATOLÓGIA
                  
                              45.
                           
                           
                              Pri kontrolných skupinách a skupinách s vysokými koncentráciami a pri všetkých zvieratách, ktoré uhynú alebo sú utratené počas štúdie, sa vykoná histopatológia všetkých orgánov a tkanív vymenovaných v tabuľke 2. Osobitná pozornosť by sa mala venovať dýchacím cestám, cieľovým orgánom a makroskopickým poškodeniam. Orgány a tkanivá, ktoré majú poškodenia v skupine s vysokými koncentráciami, sa preskúmajú pri všetkých skupinách. Vedúci štúdie sa môže rozhodnúť pre vykonanie histopatologických hodnotení pri ďalších skupinách s cieľom preukázať jednoznačnú reakciu na koncentráciu. Ak boli použité satelitné skupiny (reverzibilita), histopatologické hodnotenie sa vykoná v prípade všetkých tkanív a orgánov, pri ktorých boli v testovaných skupinách zistené účinky. Ak v skupine s vysokou expozíciou došlo k nadmernému predčasnému úhynu alebo iným problémom, ktoré spochybňujú významnosť údajov, je potrebné histopatologicky preskúmať najbližšiu nižšiu koncentráciu. Sledovanie nálezov pitvy by malo korelovať s mikroskopickými nálezmi.
                           
                        ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV
                  
                     Údaje
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Je potrebné uviesť údaje o telesnej hmotnosti, spotrebe potravy, klinickej patológii, makroskopickej patológii, orgánových hmotnostiach a histopatológii jednotlivých zvierat. Údaje z klinických pozorovaní sa zhrnú v podobe tabuliek, kde sa uvedie pre každú pokusnú skupinu počet použitých zvierat, počet zvierat vykazujúcich špecifické príznaky toxicity, počet zvierat, ktoré sa našli uhynuté počas testu alebo ich usmrtili z humánnych dôvodov, čas uhynutia jednotlivých zvierat, opis a časový priebeh toxických účinkov a reverzibility a pitevné nálezy. Všetky výsledky, kvantitatívne aj náhodné, sa vyhodnotia primeranou štatistickou metódou. Možno použiť akúkoľvek všeobecne akceptovanú štatistickú metódu, pričom štatistické metódy je potrebné vybrať počas plánovania štúdie.
                           
                        
                     Správa o teste
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Správa o teste by mala podľa potreby obsahovať tieto informácie:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testované zvieratá a chov:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis podmienok v klietkach vrátane: počtu (alebo zmeny počtu) zvierat na klietku, výstelky, teploty prostredia a relatívnej vlhkosti, dĺžky svetlej fázy a identifikácie krmiva,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použité druhy/kmene a odôvodnenie použitia druhov iných ako potkany, môže sa uviesť zdroj a historické údaje, ak sa týkajú zvierat v podobných podmienkach expozície, umiestnenia a kŕmenia,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet, vek a pohlavie zvierat,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metóda randomizácie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis akýchkoľvek podmienok pred testovaním vrátane krmiva, karantény a liečby chorôb.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovaná chemická látka:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikálny charakter, čistota a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti (vrátane izomerizácie),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikačné údaje a registračné číslo CAS (Chemical Abstract Services), ak je známe.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosič:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie použitia nosiča a odôvodnenie výberu nosiča (ak je iný ako voda),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      historické alebo súčasné údaje preukazujúce, že nosič nemá vplyv na výsledky štúdie.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhalačná komora:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobný opis inhalačnej komory vrátane objemu a nákresu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj a opis zariadenia použitého na expozíciu zvierat, ako aj na vytvorenie ovzdušia,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zariadenie na meranie teploty, vlhkosti, veľkosti častíc a skutočnej koncentrácie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj vzduchu a použitý klimatizačný systém,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metódy použité na kalibráciu zariadenia s cieľom zabezpečiť homogénne testovacie ovzdušie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozdiel tlakov (pozitívny alebo negatívny),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      expozičné otvory na jednu komoru (v prípade expozície oblasti nosa), umiestnenie zvierat v komore (v prípade expozície celého tela),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stabilita testovacieho ovzdušia,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      umiestnenie senzorov teploty a vlhkosti a odber vzorky testovacieho ovzdušia v komore,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      manipulácia s privádzaným/extrahovaným vzduchom,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hodnoty prietoku vzduchu, prietok vzduchu na jeden expozičný otvor (v prípade expozície oblasti nosa) alebo množstvo zvierat na komoru (v prípade expozície celého tela),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      čas potrebný na dosiahnutie rovnováhy v inhalačnej komore (t95),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet zmien objemu za hodinu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      meracie prístroje (ak sa použili).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Údaje o expozícii:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie výberu cieľovej koncentrácie pre základnú štúdiu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominálne koncentrácie (celková hmotnosť testovanej chemikálie aplikovanej do inhalačnej komory vydelená objemom vzduchu, ktorý prešiel komorou),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skutočné koncentrácie testovanej chemikálie zachytenej z dýchacej zóny zvierat, v prípade zmesí, ktoré vytvárajú heterogénne fyzikálne skupenstvá (plyny, pary, aerosóly) možno každé skupenstvo analyzovať samostatne,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      všetky koncentrácie vzduchu sa udávajú v hmotnostných jednotkách (mg/l mg/m3 atď.), nie v objemových jednotkách (ppm, ppb atď.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozdelenie veľkosti častíc, stredný aerodynamický hmotnostný priemer (MMAD) a štandardná odchýlka geometrického priemeru (σg) vrátane metód ich výpočtu. Jednotlivé analýzy veľkosti častíc sa uvedú v správe.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Podmienky testovania:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné informácie o príprave testovanej chemikálie vrátane podrobných údajov o všetkých postupoch použitých na zmenšenie veľkosti častíc tuhých materiálov alebo na prípravu roztokov testovanej chemikálie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis (podľa možnosti spolu s nákresom) zariadenia použitého na vytvorenie testovacieho ovzdušia a na expozíciu zvierat testovaciemu ovzdušiu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné informácie o zariadeniach použitých na monitorovanie teploty, vlhkosti a prúdenia vzduchu v komore (t. j. vývoj kalibračnej krivky),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné informácie o zariadeniach použitých pri odbere vzoriek na stanovenie koncentrácie v komore a rozdelenia veľkosti častíc,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné informácie o použitej chemickej analytickej metóde a o overení metódy (vrátane účinnosti výťažnosti testovanej chemikálie z prostriedku na odber vzorky),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metóda randomizácie pri prideľovaní zvierat do testovacích a kontrolných skupín,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu/zdroja krmiva, zdroja vody),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie výberu testovacích koncentrácií.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie teploty, vlhkosti a prúdenia vzduchu v komore,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie údajov o nominálnych a skutočných koncentráciách,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie údajov o veľkosti častíc vrátane údajov o odbere vzoriek na analýzu, o rozdelení veľkosti častíc a o výpočtoch MMAD a σg,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie získaných údajov o reakcii a úrovni koncentrácie pre každé zviera (t. j. zvieratá vykazujúce príznaky toxicity vrátane mortality, charakteru, závažnosti, času nástupu a trvania účinkov),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie hmotností jednotlivých zvierat,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie spotreby potravy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie údajov klinickej patológie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pitevné nálezy a histopatologické nálezy pre každé zviera, ak sú k dispozícii.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rozbor a interpretácia výsledkov:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      osobitný dôraz sa kladie na opis metód použitých na splnenie kritérií tejto testovacej metódy, napr. limitnej koncentrácie alebo veľkosti častíc,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dýchateľnosť častíc vzhľadom na celkové zistenia sa uvedie, najmä ak nebolo možné splniť kritériá na veľkosť častíc,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      konzistencia metód použitých na stanovenie nominálnej a skutočnej koncentrácie a vzťah skutočnej koncentrácie k nominálnej koncentrácii sa uvedú v celkovom hodnotení štúdie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uvedie sa pravdepodobná príčina uhynutia a prevládajúci druh pôsobenia (systémové či lokálne),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uvedie sa vysvetlenie, ak bolo potrebné humánnym spôsobom utratiť zvieratá, ktoré mali bolesti alebo vykazovali príznaky silného alebo pretrvávajúceho utrpenia, v súlade s kritériami v usmerňovacom dokumente OECD o humánnych parametroch (Guidance Document on Humane Endpoints) (3),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikuje sa cieľový orgán (orgány),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stanoví sa NOAEL a LOAEL.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATÚRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 413, Environment Directorate, OECD, Paríž.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paríž.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paríž.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Whalan, J. E., a Redden, J. C. (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Dungworth, D. L., Tyler, W. S., Plopper, C. E. (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H. P., a Brain, J. D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, s. 229 – 258.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Young, J. T. (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309 – 312.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Harkema, J. R. (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231 – 238.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Woutersen, R. A., Garderen-Hoetmer, A., van Slootweg, P. J., Feron, V. J. (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes, M. P., a Ward, J. M. (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, s. 215 – 263.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Mery, S., Gross, E. A., Joyner, D. R., Godo, M., Morgan, K. T. (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353 – 372.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Kuper, C. F., Koornstra, P. J., Hameleers, D. M. H., Biewenga, J., Spit, B. J., Duijvestijn, A. M., Breda Vriesman van, P. J. C., Sminia, T. (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219 –224.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Kuper, C. F., Arts, J. H. E., Feron, V. J. (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140 – 141: 281 – 285.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Lewis, D. J. (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419 – 428.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 16. decembra 2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí, o zmene, doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zmene a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006 (Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1).
                           
                        
                     Dodatok 1
                     VYMEDZENIE POJMU
                     Testovaná chemikália: akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
                  
                  B.30.   ŠTÚDIE CHRONICKEJ TOXICITY
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov (TG) 452 (2009). Pôvodné usmernenia TG 452 boli prijaté v roku 1981. Vypracovanie tejto revidovanej testovacej metódy B.30 sa považovalo za potrebné na zohľadnenie najnovšieho vývoja v oblasti starostlivosti o zvieratá a regulačných požiadaviek (1) (2) (3) (4). Aktualizácia tejto testovacej metódy B.30 bola vykonaná súbežne s revíziou kapitoly B.32 tejto prílohy, Štúdie karcinogenity, a kapitoly B.33 tejto prílohy, Kombinované štúdie chronickej toxicity/karcinogenity, s cieľom získať ďalšie informácie pomocou zvierat použitých v štúdii a poskytnúť ďalšie podrobné údaje o výbere dávky. Táto testovacia metóda je vypracovaná pre testovanie širokej škály chemikálií vrátane pesticídov a priemyselných chemikálií.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Väčšina štúdií chronickej toxicity sa vykonáva na hlodavcoch a táto testovacia metóda sa preto primárne vzťahuje na štúdie vykonávané na týchto živočíšnych druhoch. Ak sa takéto štúdie budú vyžadovať v prípade nehlodavcov, takisto sa s príslušnými úpravami môžu uplatniť princípy a postupy uvedené v tejto testovacej metóde spolu s princípmi a postupmi uvedenými v kapitole B.27 tejto prílohy, 90-dňová štúdia orálnej toxicity pri nehlodavcoch v opakovaných dávkach (5), ako sa uvádza v Usmerňovacom dokumente OECD č. 116 o príprave a vykonávaní štúdií chronickej toxicity a karcinogenity (6).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Tri hlavné spôsoby podávania používané v štúdiách chronickej toxicity sú orálne, dermálne a inhalačné podávanie. Výber spôsobu podávania závisí od fyzikálnych a chemických vlastností testovanej chemikálie a najčastejšieho spôsobu expozície u človeka. Ďalšie informácie o výbere spôsobu expozície sú uvedené v usmerňovacom dokumente OECD č. 116 (6).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda je zameraná na orálnu expozíciu, ktorá sa v štúdiách chronickej toxicity používa najčastejšie. Hoci dlhodobé štúdie chronickej toxicity využívajúce dermálnu alebo inhalačnú expozíciu môžu byť takisto potrebné na hodnotenie zdravotných rizík pre človeka a/alebo sa môžu vyžadovať v určitých regulačných režimoch, oba spôsoby expozície sú do značnej miery technicky zložité. Takéto štúdie budú musieť byť pripravené v závislosti od jednotlivých prípadov, hoci testovacia metóda, ktorá sa tu uvádza na posúdenie a vyhodnotenie chronickej toxicity pri orálnom podávaní, by mohla slúžiť ako základ protokolu pre inhalačné a/alebo dermálne štúdie vzhľadom na odporúčania týkajúce sa období testovania, klinických a patologických parametrov atď. K dispozícii sú usmernenia OECD o podávaní testovaných chemikálií inhalačným (6) (7) a dermálnym spôsobom (6). Pri príprave dlhodobejších štúdií zahŕňajúcich inhalačnú expozíciu je nutné si preštudovať najmä kapitolu B.8 tejto prílohy (8) a kapitolu B.29 tejto prílohy (9) spolu s Usmerňovacím dokumentom OECD o testovaní akútnej inhalačnej toxicity (7). Kapitolu B.9 tejto prílohy (10) je nutné konzultovať v prípade testovania dermálnej expozície.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Štúdia chronickej toxicity poskytuje informácie o možnej nebezpečnosti pre zdravie, ktorá sa pravdepodobne vyskytne pri opakovanej expozícii v priebehu významnej časti dĺžky života použitého živočíšneho druhu. Štúdia poskytne informácie o toxických účinkoch testovanej chemikálie, indikuje cieľové orgány a možnosť akumulácie. Môže takisto zabezpečiť odhad hladiny bez pozorovaného nepriaznivého účinku, ktorý možno použiť na stanovenie bezpečnostných kritérií týkajúcich sa expozície človeka. Takisto sa v nej zdôrazňuje nutnosť dôkladných klinických pozorovaní zvierat s cieľom získať čo najväčšie množstvo informácií.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Medzi ciele štúdie v rámci tejto testovacej metódy patrí:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikácia chronickej toxicity testovanej chemikálie,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikácia cieľových orgánov,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          charakterizácia vzťahu medzi dávkou a reakciou,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikácia hladiny bez pozorovaného nepriaznivého účinku (NOAEL) alebo východiska na stanovenie porovnávacej dávky (BMD),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          predpovedanie účinkov chronickej toxicity na úrovniach expozície človeka,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          poskytnutie údajov na testovanie hypotéz týkajúcich sa druhu pôsobenia (6).
                                       
                                    
                        ÚVODNÉ ÚVAHY
                  
                              7.
                           
                           
                              Pri posudzovaní a vyhodnocovaní toxikologických vlastností testovanej chemikálie testovacie laboratórium pred vykonaním štúdie zváži všetky dostupné informácie o testovanej chemikálii s cieľom zamerať prípravu štúdie na účinnejšie testovanie potenciálu chronickej toxicity a minimalizovať využívanie zvierat. Informácie, ktoré pomôžu pri príprave štúdie, zahŕňajú identitu, chemickú štruktúru a fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej chemikálie, akékoľvek informácie o druhu pôsobenia, výsledky všetkých testov toxicity in vitro alebo in vivo, predpokladané použitie/použitia a potenciál pre expozíciu ľudí, dostupné údaje (Q)SAR a toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných chemikáliách, dostupné toxikokinetické údaje (kinetika pri jednej dávke a takisto pri opakovaných dávkach, ak je k dispozícii) a údaje získané z iných štúdií opakovanej expozície. Stanovenie chronickej toxicity sa vykoná až po získaní prvotných informácií o toxicite z 28-dňového a/alebo 90-dňového testu toxicity v opakovaných dávkach. Stratégiu fázového testovania pri testovaní chronickej toxicity treba zvážiť ako súčasť celkového hodnotenia potenciálnych nepriaznivých zdravotných účinkov danej testovanej chemikálie (11) (12) (13) (14).
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Štatistické metódy, ktoré sú vzhľadom na prípravu pokusu a ciele na analýzu výsledkov najprimeranejšie, sa stanovia pred začatím štúdie. Je potrebné zvážiť, či by štatistiky nemali zahŕňať úpravu vzhľadom na prežitie zvierat a analýzu v prípade predčasného konca jednej alebo viacerých skupín. Usmernenia o vhodných štatistických analýzach a kľúčové odkazy na medzinárodne uznávané štatistické metódy sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (6), ako aj v Usmerňovacom dokumente č. 35 o analýze a hodnotení štúdií chronickej toxicity a karcinogenity (15).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Pri vykonávaní štúdie chronickej toxicity je vždy nutné sa riadiť hlavnými zásadami a úvahami uvedenými v Usmerňovacom dokumente OECD č. 19 o rozpoznaní, hodnotení a použití klinických príznakov ako humánnych parametrov pre pokusné zvieratá používané pri hodnotení bezpečnosti (16), najmä v odseku 62. V tomto odseku sa uvádza, že ‚ak v štúdiách s opakovanými dávkami zviera vykazuje klinické príznaky, ktoré sú progresívne a vedú k ďalšiemu zhoršeniu stavu, je potrebné na základe informácií rozhodnúť, či sa má zviera humánne usmrtiť alebo nie. Pri rozhodovaní treba zvážiť hodnotu informácií, ktoré by sa získali ďalším udržiavaním zvieraťa pri živote v rámci štúdie, v spojitosti s jeho celkovým stavom. Ak sa prijme rozhodnutie, že testovanie zvieraťa bude pokračovať, frekvencia pozorovaní by sa mala podľa potreby zvýšiť. Takisto je možné, bez toho, aby to malo negatívny vplyv na účel testu, dočasne pozastaviť podávanie dávok, ak sa tým zvieraťu uľaví od bolesti alebo utrpenia, alebo znížiť testovaciu dávku.‘
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Podrobné usmernenia a rozbor zásad výberu dávky v štúdiách chronickej toxicity a karcinogenity sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (6), ako aj v dvoch publikáciách Medzinárodného inštitútu prírodných vied (International Life Sciences Institute) (17) (18). Základná stratégia výberu dávky závisí od primárneho cieľa alebo cieľov štúdie (odsek 6). Pri výbere vhodných úrovní dávky je potrebné dosiahnuť rovnováhu medzi skríningom nebezpečnosti na jednej strane a charakterizáciou reakcie na nízke dávky a jej významu na druhej strane. To má význam najmä v prípade kombinovanej štúdie chronickej toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 tejto prílohy, odsek 11).
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Treba zvážiť vykonanie kombinovanej štúdie chronickej toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 tejto prílohy) namiesto samostatného vykonania štúdie chronickej toxicity (táto testovacia metóda B.30) a štúdie karcinogenity (kapitola B.32 tejto prílohy). Kombinovaným testom sa zabezpečí vyššia účinnosť, pokiaľ ide o čas a náklady, ako v prípade vykonania dvoch samostatných štúdií bez toho, aby sa znížila kvalita údajov, či už vo fáze chronickej toxicity alebo vo fáze karcinogenity. V prípade kombinovanej štúdie chronickej toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 tejto prílohy) však treba náležite zohľadniť zásady výberu dávky (odseky 9 a 20 – 25), pričom sa takisto pripúšťa, že v určitých regulačných rámcoch sa môže vyžadovať vykonanie samostatných štúdií.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Vymedzenie pojmov použitých v súvislosti s touto testovacou metódou je uvedené na konci tejto kapitoly a v usmerňovacom dokumente (GD) č. 116 (6).
                           
                        PRINCÍP TESTU
                  
                              13.
                           
                           
                              Testovaná chemikália sa podáva denne v odstupňovaných dávkach niekoľkým skupinám pokusných zvierat, zvyčajne počas 12 mesiacov, hoci v závislosti od regulačných požiadaviek možno zvoliť aj dlhšie alebo kratšie obdobia (pozri odsek 33). Vybraté obdobie by malo byť dostatočne dlhé, aby sa mohli prejaviť účinky kumulatívnej toxicity, ale bez toho, aby testovanie zmarili zmeny súvisiace so starnutím zvierat. Odchýlky od 12-mesačného trvania expozície je potrebné odôvodniť, najmä v prípade kratších trvaní. Testovaná chemikália sa zvyčajne podáva orálne, aj keď môže byť vhodné aj testovanie inhalačnej alebo dermálnej expozície. Plán štúdie môže zahŕňať aj jedno alebo viaceré priebežné utratenia, napr. po troch a šiestich mesiacoch, pričom na doplnenie počtu je možné použiť ďalšie skupiny zvierat (pozri odsek 19). Počas tohto obdobia sú na zvieratách dôkladne pozorované prípadné znaky toxicity látok. Pitva sa uskutoční na zvieratách uhynutých alebo usmrtených počas testovania a aj po ukončení testu na zvieratách, ktoré test prežijú.
                           
                        OPIS METÓDY
                  
                     Výber druhov zvierat
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda primárne zahŕňa posudzovanie a vyhodnocovanie chronickej toxicity pri hlodavcoch (pozri odsek 2), hoci sa pripúšťa, že v určitých regulačných režimoch sa môžu vyžadovať podobné štúdie pri nehlodavcoch. Výber druhu zvierat je potrebné odôvodniť. Príprava a vykonanie štúdií chronickej toxicity pri nehlodavcoch, ak sa požadujú, by mali byť založené na zásadách uvedených v tejto testovacej metóde, ako aj na zásadách uvedených v kapitole B.27 tejto prílohy, 90-dňová štúdia orálnej toxicity pri nehlodavcoch v opakovaných dávkach (5). Ďalšie informácie o výbere druhov a kmeňa zvierat sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (6).
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              V rámci tejto testovacej metódy je najvhodnejším hlodavcom potkan, hoci sa môžu použiť aj iné hlodavce, napr. myši. Potkany a myši sú uprednostňované pokusné modely vzhľadom na ich pomerne krátku dĺžku života, ich rozsiahle využívanie vo farmakologických a toxikologických štúdiách, ich náchylnosť na indukciu nádoru a dostupnosť dostatočne charakterizovaných kmeňov. Vzhľadom na tieto charakteristiky je k dispozícii veľké množstvo informácií o ich fyziológii a patológii. Používajú sa mladé zdravé dospelé zvieratá bežne používaných laboratórnych kmeňov. Štúdiu chronickej toxicity možno vykonať pri zvieratách z toho istého kmeňa a zdroja, ako sú zvieratá, ktoré sa použili v predbežnej štúdii (štúdiách) toxicity s kratším trvaním. Používajú sa samice, ktoré nikdy nevrhli mláďatá a sú negravidné.
                           
                        
                     Podmienky umiestnenia a kŕmenia
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Zvieratá môžu byť umiestnené jednotlivo alebo v malých skupinách rovnakého pohlavia v klietkach. Samostatné umiestnenie by sa malo zvážiť iba v prípade, že je to vedecky opodstatnené (19) (20) (21). Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy vzhľadom na ich umiestnenie. Teplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by mala byť 22 °C (± 3 °C). Hoci relatívna vlhkosť by mala byť najmenej 30 % a prednostne by nemala presiahnuť 70 %, okrem času čistenia miestnosti, cieľom by mala byť 50 – 60 % vlhkosť. Osvetlenie by malo byť umelé a malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Potrava musí vyhovovať všetkým výživovým požiadavkám pre testované druhy zvierat a obsah kontaminantov potravy vrátane rezíduí pesticídov, perzistentných organických znečisťujúcich látok, fytoestrogénov, ťažkých kovov, mykotoxínov a iných kontaminantov, ktoré môžu mať vplyv na výsledky testu, musí byť čo najnižší. Analytické informácie o úrovni živín a kontaminantov potravy by sa mali získavať priebežne, aspoň na začiatku štúdie a pri zmene používanej šarže, a mali by sa uviesť v záverečnej správe. Podobne treba uviesť analytické informácie o pitnej vode použitej v štúdii. Výber krmiva môže byť ovplyvnený potrebou zabezpečiť vhodnú prímes testovanej chemikálie a potrebou splniť výživové požiadavky pri zvieratách v prípade, že sa testovaná chemikália podáva v potrave.
                           
                        
                     Príprava zvierat
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Použijú sa zdravé zvieratá, ktoré sa aklimatizovali na laboratórne podmienky aspoň sedem dní a ktoré sa predtým nepodrobili iným pokusom. V prípade hlodavcov sa musí dávkovanie začať čo najskôr po odstavení mláďat a aklimatizácii a podľa možnosti skôr, než zvieratá dovŕšia vek ôsmich týždňov. Pokusné zvieratá sa charakterizujú na základe druhu, kmeňa, zdroja, pohlavia, hmotnosti a veku. Na začiatku štúdie má byť rozdiel medzi hmotnosťami použitých zvierat z každého pohlavia minimálny a pre každé pohlavie zvlášť nemá presahovať ± 20 % priemernej hmotnosti všetkých zvierat v štúdii. Zvieratá by mali byť postupne zadelené do kontrolných skupín a skupín, ktorým sa podáva látka. Po randomizácii by medzi jednotlivými skupinami v rámci každého pohlavia nemali byť výrazné rozdiely v priemernej telesnej hmotnosti. Ak existujú štatisticky významné rozdiely, randomizácia by sa podľa možnosti mala zopakovať. Každému zvieraťu sa pridelí jedinečné identifikačné číslo, ktorým sa zviera trvalo označí tetovaním, mikročipovým implantátom alebo inou vhodnou metódou.
                           
                        POSTUP
                  
                     Počet zvierat a ich pohlavie
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Použijú sa obe pohlavia. Mal by sa použiť dostatočný počet zvierat, aby bol na konci štúdie v každej skupine k dispozícii dostatok zvierat na dôkladné biologické a štatistické hodnotenie. V prípade hlodavcov sa zvyčajne použije minimálne 20 zvierat z každého pohlavia na skupinu pri každej úrovni dávky, zatiaľ čo pri nehlodavcoch sa odporúča použitie minimálne štyroch zvierat z každého pohlavia na skupinu. V štúdiách, v ktorých sa využívajú myši, môže byť na uskutočnenie všetkých požadovaných hematologických vyšetrení potrebné použiť v každej skupine s dávkou viac zvierat.
                           
                        
                     Zabezpečenie priebežného utrácania, satelitných skupín a sentinelových zvierat
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Ak je to vedecky opodstatnené, v štúdii sa môže počítať s priebežným utrácaním (najmenej desať zvierat z každého pohlavia na skupinu), napr. po šiestich mesiacoch, s cieľom získať informácie o progresii toxikologických zmien a mechanistické informácie. Ak už takéto informácie o testovanej chemikálii sú k dispozícii z predchádzajúcich štúdií toxicity v opakovaných dávkach, priebežné utrácanie zvierat nie je vedecky opodstatnené. Takisto je možné použiť satelitné skupiny na monitorovanie reverzibility akýchkoľvek toxikologických zmien vyvolaných skúmanou testovanou chemikáliou. Tieto skupiny sa zvyčajne obmedzujú na najvyššiu úroveň dávky použitej v štúdii a na kontrolu. Na monitorovanie stavu choroby možno počas štúdie v prípade potreby použiť aj ďalšiu skupinu sentinelových zvierat (zvyčajne päť zvierat z každého pohlavia) (22). Ak sa plánuje priebežné utrácanie zvierat alebo použitie satelitných alebo sentinelových skupín, počet zvierat zahrnutých v pláne štúdie by mal byť zvýšený o plánovaný počet zvierat, ktoré majú byť utratené pred ukončením štúdie. Tieto zvieratá sa zvyčajne podrobia tým istým pozorovaniam vrátane pozorovaní telesnej hmotnosti, spotreby potravy/vody, hematologickým meraniam a meraniam klinickej biochémie a patologickým vyšetreniam ako zvieratá vo fáze chronickej toxicity v rámci základnej štúdie, hoci sa takisto môže zabezpečiť, aby sa (v skupinách, v ktorých sa plánuje priebežné utrácanie zvierat) merania obmedzili na špecifické kľúčové ukazovatele, ako je neurotoxicita alebo imunotoxicita.
                           
                        
                     Skupiny s dávkami a dávkovanie
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Usmernenia o všetkých aspektoch výberu dávky a odstupoch medzi jednotlivými úrovňami dávok sú uvedené v usmerňovacom dokumente č.116 (6). Použijú sa aspoň tri úrovne dávky a súbežná kontrola s výnimkou prípadov, keď sa vykonáva limitný test (pozri odsek 27). Úroveň dávky zvyčajne vychádza z výsledkov krátkodobých štúdií v opakovaných dávkach alebo štúdií na zistenie rozsahu, pričom je potrebné prihliadať na existujúce toxikologické a toxikokinetické údaje, ktoré sú o testovanej chemikálii alebo príbuzných chemikáliách k dispozícii.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Pokiaľ to dovoľuje fyzikálno-chemický charakter alebo biologické účinky testovanej chemikálie, na identifikáciu hlavných cieľových orgánov a toxických účinkov by sa mala vybrať najvyššia úroveň dávky, ktorá súčasne nebude mať za následok utrpenie, závažnú toxicitu, morbiditu alebo uhynutie. Pri súčasnom zohľadnení faktorov uvedených v odseku 22 by sa mala vybrať najvyššia úroveň dávky preukazujúca toxicitu, o ktorej svedčí napríklad pokles prírastku telesnej hmotnosti (o približne 10 %).
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              V závislosti od cieľov štúdie (pozri odsek 6) však možno vybrať najvyššiu dávku, ktorá je nižšia ako dávka preukazujúca toxicitu, napr. ak dávka vyvoláva daný nepriaznivý účinok, ktorý má však malý vplyv na dĺžku života alebo na telesnú hmotnosť. Najvyššia dávka by nemala presiahnuť 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň (limitná dávka, pozri odsek 27).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Úrovne dávok a odstupy medzi úrovňami dávok možno vybrať s cieľom určiť vzťah medzi dávkou a reakciou a hladinu NOAEL alebo iný plánovaný výsledok štúdie, napr. BMD (pozri odsek 25) pri najnižšej úrovni dávky. Medzi faktory, ktoré by sa mali zvážiť pri podávaní nižších dávok, patrí predpokladaný sklon krivky závislosti reakcie od dávky, dávky, pri ktorých môže dochádzať k významným zmenám v metabolizme, alebo druhu toxického pôsobenia, keď sa očakáva prahová hodnota alebo keď sa očakáva východisko pre extrapoláciu nízkej dávky.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Vybraté odstupy medzi úrovňami dávok budú závisieť od vlastností testovanej chemikálie a nemožno ich v rámci tejto testovacej metódy predpísať, ale dobrá účinnosť testov sa často dosahuje, ak sa na stanovenie zostupného dávkovania použijú intervaly dávkovania s faktorom dva až štyri, pričom pridanie štvrtej pokusnej skupiny je často vhodnejšie ako používanie veľmi veľkých intervalov (napr. s faktorom vyšším ako 6 – 10) medzi dávkami. Vo všeobecnosti by sa nemali používať faktory vyššie ako 10 a v prípade, že sa použijú, je nutné tento postup odôvodniť.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Ako sa ďalej uvádza v usmerňovacom dokumente č.116 (6), pri výbere dávky je potrebné zvážiť tieto body:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          známe alebo predpokladné nelinearity alebo inflexné body krivky závislosti reakcie od dávky,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toxikokinetika a rozsahy dávok, pri ktorých dochádza alebo nedochádza k metabolickej indukcii, nasýteniu alebo nelinearite medzi externými a internými dávkami,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          prekurzorné poškodenia, markery účinkov alebo ukazovatele prebiehajúcich kľúčových základných biologických procesov,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kľúčové (alebo predpokladané) aspekty druhu pôsobenia, ako sú dávky, pri ktorých začína vznikať cytotoxicita, narúšajú sa hormonálne hladiny, preťažujú sa homeostatické mechanizmy atď.,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          oblasti krivky závislosti reakcie od dávky, kde je potrebný veľmi podrobný odhad, napr. v oblasti predpokladanej dávky BMD alebo predpokladanej prahovej úrovne,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          zváženie očakávaných úrovní expozície človeka.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              Kontrolnou skupinou je skupina, ktorá nebola vystavená účinkom chemikálie, alebo skupina, ktorej sa podáva nosič, ak sa pri podávaní testovanej chemikálie používa nosič. So zvieratami v kontrolnej skupine sa musí zaobchádzať takisto ako so zvieratami v testovaných skupinách, s výnimkou aplikovania testovanej chemikálie. Ak sa použije nosič, kontrolná skupina dostane nosič v najvyššom objeme, aký bol použitý pri skupinách s dávkami. Ak sa testovaná chemikália podáva v potrave a vedie k výraznému zníženiu príjmu potravy v dôsledku zvýšeného nechutenstva, môže byť užitočné použiť ďalšiu súčasne kŕmenú kontrolnú skupinu, ktorá poslúži ako vhodnejšia kontrola.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Ak na základe informácií z predbežných štúdií možno predpokladať, že test pri jednej úrovni dávky dosahujúcej najmenej 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň s využitím postupov opísaných pre túto štúdiu pravdepodobne nebude mať nepriaznivé účinky a ak sa na základe údajov o štrukturálne príbuzných chemikáliách neočakáva toxicita, potom sa úplná štúdia s využitím troch úrovní dávok nepovažuje za potrebnú. Uplatňuje sa limit 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň s výnimkou prípadu, keď expozícia človeka indikuje potrebu použitia vyššej úrovne dávky.
                           
                        
                     Príprava dávok a podávanie testovanej chemikálie
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Testovaná chemikália sa zvyčajne podáva orálne, v potrave alebo pitnej vode alebo cez sondu. Ďalšie informácie o spôsoboch a metódach podávania sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (6). Spôsob a metóda podávania závisí od účelu štúdie, fyzikálnych/chemických vlastností testovanej chemikálie, jej biodostupnosti a prevládajúceho spôsobu a metódy expozície u človeka. Vybratý spôsob a metódu podávania je potrebné odôvodniť. V záujme zabezpečenia dobrých životných podmienok pre zvieratá sa orálna sonda zvyčajne zvolí iba v prípade látok, pri ktorých spôsob a metóda podávania primerane reprezentuje potenciálnu expozíciu u človeka (napr. v prípade liekov). Potravinové alebo environmentálne chemikálie obsahujúce pesticídy sa zvyčajne podávajú v potrave alebo v pitnej vode. V určitých prípadoch, napr. v prípade expozície na pracovisku, však môže byť vhodnejšie podanie iným spôsobom.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Ak je to potrebné, testovaná chemikália sa rozpustí alebo suspenduje vo vhodnom nosiči. Náležitá pozornosť by sa mala venovať nasledujúcim vlastnostiam nosiča a ostatným aditívam: vplyv na absorpciu, distribúciu, metabolizmus alebo zadržiavanie testovanej chemikálie, vplyvy na chemické vlastnosti testovanej chemikálie, ktoré môžu zmeniť svoje toxické vlastnosti, vplyv na spotrebu potravy a vody alebo na stav výživy zvierat. Odporúča sa, aby sa vždy, keď je to možné, najskôr zvážilo použitie vodného roztoku/suspenzie, potom roztoku/emulzie v oleji (napr. kukuričný olej) a nakoniec prípadného roztoku v iných nosičoch. Charakteristiky toxicity nosičov iných ako voda musia byť známe. Musia byť k dispozícii informácie o stabilite testovanej chemikálie a homogenite dávkovacích roztokov alebo krmív (podľa potreby) v podmienkach podávania (napr. v potrave).
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              V prípade chemikálií podávaných v potrave alebo pitnej vode je dôležité zabezpečiť, aby množstvá použitej testovanej chemikálie neinterferovali s normálnou výživovou a vodnou bilanciou. V dlhodobých štúdiách toxicity, pri ktorých sa využíva podávanie v potrave, by koncentrácia testovanej chemikálie v krmive zvyčajne nemala presiahnuť horný limit 5 % z celkového množstva krmiva, aby sa zabránilo nutričnej nevyváženosti. Ak je testovaná chemikália podávaná v potrave, môže sa použiť buď konštantná stravná koncentrácia (mg/kg potravy alebo ppm) alebo konštantná úroveň dávky vzhľadom na telesnú hmotnosť zvieraťa (mg/kg telesnej hmotnosti), ktorá sa vypočíta každý týždeň. Použitú alternatívu je potrebné špecifikovať.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              V prípade orálneho podávania sa zvieratám podávajú dávky testovanej chemikálie denne (sedem dní v týždni), zvyčajne počas 12 mesiacov (pozri aj odsek 33), hoci v závislosti od regulačných požiadaviek sa môže požadovať dlhšie obdobie. Použitie každého iného režimu dávkovania, napr. päť dní v týždni, sa musí odôvodniť. V prípade podávania cez kožu sa zvieratám zvyčajne aplikuje testovaná chemikália najmenej šesť hodín denne, sedem dní v týždni, ako je uvedené v kapitole B.9 tejto prílohy (10), počas 12 mesiacov. Inhalačná expozícia sa vykonáva šesť hodín denne, sedem dní v týždni, ale ak je to odôvodnené, môže sa použiť aj expozícia počas piatich dní v týždni. Obdobie expozície zvyčajne trvá 12 mesiacov. Ak sa v prípade iných hlodavcov ako potkanov použije expozícia oblasti nosa, maximálne trvanie expozície je možné prispôsobiť s cieľom minimalizovať druhovo špecifické utrpenie. Ak sa použije expozícia v trvaní menej ako šesť hodín denne, treba uviesť odôvodnenie. Pozri aj kapitolu B.8 tejto prílohy (8).
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Ak sa testovaná chemikália zvieratám podáva pomocou sondy, podáva sa prostredníctvom žalúdočnej sondy alebo vhodnej intubačnej kanyly približne v rovnakom čase každý deň. Zvyčajne sa podáva jedna dávka raz za deň. Ak je napríklad chemikália lokálne dráždivá, je možné zachovať dennú dávku tak, že sa rozdelí a podá v dvoch častiach (dvakrát denne). Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorazovo podať, závisí od veľkosti pokusného zvieraťa. Objem by mal byť podľa možnosti čo najnižší a v prípade hlodavcov by zvyčajne nemal presahovať 1 ml/100 g telesnej hmotnosti (22). Zmeny v aplikovanom objeme sa minimalizujú tým, že sa koncentrácie upravia tak, aby sa zabezpečil stály objem vo všetkých dávkach. Výnimkou sú potenciálne žieravé alebo dráždivé chemikálie, ktoré je nutné zriediť, aby sa predišlo závažným lokálnym účinkom. Nemalo by sa testovať pri koncentráciách, ktoré sú pravdepodobne žieravé alebo dráždivé pre gastrointestinálny trakt.
                           
                        
                     Trvanie štúdie
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              Hoci táto testovacia metóda je primárne navrhnutá ako 12-mesačná štúdia chronickej toxicity, plán štúdie možno použiť aj pri štúdiách s kratším (napr. šesť alebo deväť mesiacov) alebo dlhším trvaním (napr. 18 alebo 24 mesiacov) v závislosti od požiadaviek konkrétnych regulačných režimov alebo špecifických mechanistických účelov. Odchýlky od 12-mesačného trvania expozície je potrebné odôvodniť, najmä v prípade kratších trvaní. Satelitné skupiny zahrnuté s cieľom monitorovať reverzibilitu všetkých toxikologických zmien spôsobených skúmanou testovanou chemikáliou by sa mali zachovať bez dávkovania najmenej počas štyroch týždňov a najviac počas jednej tretiny celkového trvania štúdie po ukončení expozície. Ďalšie usmernenia vrátane úvah o prežití v štúdii sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (6).
                           
                        POZOROVANIA
                  
                              34.
                           
                           
                              Pri všetkých zvieratách si treba všímať morbiditu alebo mortalitu, zvyčajne na začiatku a na konci každého dňa vrátane víkendov a sviatkov. Všeobecné klinické pozorovania sa vykonávajú najmenej raz denne, najlepšie každý deň v rovnakom čase, vzhľadom na časový vrchol očakávaných účinkov po dávkovaní v prípade podávania cez sondu.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Všetky zvieratá sa pred prvou expozíciou najmenej raz podrobia dôkladným klinickým pozorovaniam (aby sa umožnilo porovnávanie jednotlivých zvierat navzájom), potom na konci prvého týždňa štúdie a následne každý mesiac. Protokol o pozorovaniach musí byť pripravený tak, aby sa rozdiely medzi jednotlivými pozorovateľmi minimalizovali a neboli závislé od testovacej skupiny. Tieto pozorovania sa vykonávajú mimo domovskej klietky, radšej v štandardnej aréne a v podobnom čase pri každej príležitosti. Musia byť pozorne zaznamenané, s použitím hodnotiaceho systému explicitne vymedzeného testovacím laboratóriom. Je potrebné minimalizovať odlišnosti v podmienkach pozorovaní. Medzi príznaky, ktoré je potrebné si všímať, patria zmeny na koži, srsti, očiach, sliznici, výskyt sekrécie, exkrécie a vegetatívnej aktivity (slzenie, piloerekcia, veľkosť zreničiek a nezvyčajné dýchanie), ale uvedené príznaky nie sú vyčerpávajúce. Zmeny v chôdzi, držaní tela a reakcii na zaobchádzanie, ako aj prítomnosť kónických alebo napätých pohybov, stereotypov (napr. nadmerné očisťovanie tela, opakované točenie sa) alebo zvláštne správanie (napr. chôdza dozadu, sebaznetvorenie) sa takisto musia zaznamenať (24).
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Pred prvým podaním testovanej chemikálie sa pri všetkých zvieratách vykoná oftalmologické vyšetrenie pomocou oftalmoskopu alebo iného vhodného zariadenia. Na konci štúdie sa toto vyšetrenie podľa možnosti vykoná pri všetkých zvieratách, ale minimálne pri zvieratách v skupine s vysokou dávkou a zvieratách v kontrolnej skupine. Ak sa po vystavení zvierat účinkom látky zistia zmeny na očiach, musia byť vyšetrené všetky zvieratá. Ak štrukturálna analýza alebo iné informácie indikujú toxicitu očí, potom je potrebné zvýšiť frekvenciu očných vyšetrení.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              V prípade chemikálií, pri ktorých predchádzajúce 28-dňové a/alebo 90-dňové testy toxicity v opakovaných dávkach indikovali potenciál vyvolať neurotoxické účinky, sa môže nepovinne vykonať určenie zmyslovej reaktivity podnecovanej rôznymi spôsobmi (24) (napr. zvukovými, zrakovými a proprioceptívnymi podnetmi) (25) (26) (27), hodnotenie sily zovretia (28) a hodnotenie motorickej aktivity (29), a to pred začiatkom štúdie a každé tri mesiace po začatí štúdie počas až 12 mesiacov, ako aj pri ukončení štúdie (ak štúdia trvá dlhšie ako 12 mesiacov). Ďalšie podrobnosti o postupoch, ktoré môžu nasledovať, sú uvedené v príslušných odkazoch. Možno však použiť aj iné alternatívne postupy k postupom, ktoré tu boli opísané.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              V prípade chemikálií, pri ktorých predchádzajúce 28-dňové a/alebo 90-dňové testy toxicity v opakovaných dávkach indikovali potenciál vyvolať imunotoxické účinky, možno nepovinne na konci testu vykonať ďalšie vyšetrenia tohto parametra.
                           
                        
                     Telesná hmotnosť, spotreba potravy/vody a účinnosť krmiva
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Všetky zvieratá sa odvážia na začiatku testu, najmenej raz týždenne počas prvých 13 týždňov a následne najmenej raz za mesiac. Spotreba potravy a účinnosť krmiva sa merajú najmenej raz za týždeň počas prvých 13 týždňov a následne najmenej raz za mesiac. Ak sa chemikália podáva vo vode na pitie, spotreba vody sa meria najmenej raz za týždeň počas prvých 13 týždňov a následne najmenej raz za mesiac. Merania spotreby vody by sa mali zvážiť aj v prípade štúdií, pri ktorých sa mení pitný režim.
                           
                        
                     Hematológia a klinická biochémia
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              V štúdiách využívajúcich hlodavce sa hematologické vyšetrenia vykonajú najmenej pri desiatich samcoch a desiatich samiciach v každej skupine, a to po 3, 6 a 12 mesiacoch, a takisto na konci štúdie (ak štúdia trvá dlhšie ako 12 mesiacov), pričom sa vždy použijú tie isté zvieratá. V prípade myší môžu byť na uskutočnenie všetkých požadovaných hematologických vyšetrení potrebné satelitné zvieratá (pozri odsek 18). V prípade štúdií nehlodavcov sa vzorky odoberú menšiemu počtu zvierat (napr. v prípade štúdií psov štyrom zvieratám z každého pohlavia v každej skupine), a to v priebežných časoch na odber vzoriek a na konci štúdie, podobne ako sa uvádza pri štúdiách hlodavcov. Pri hlodavcoch ani nehlodavcoch nie je nutné vykonať merania po troch mesiacoch, ak v predchádzajúcej 90-dňovej štúdii vykonanej pri porovnateľných úrovniach dávok nebol na hematologických parametroch pozorovaný žiadny účinok. Vzorky krvi sa odoberajú v anestézii zo stanoveného miesta, napríklad vpichom do srdca alebo zo zadnej očnicovej dutiny.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Je potrebné vyšetriť tieto parametre (30): celkový a diferenciálny počet leukocytov, počet erytrocytov, počet trombocytov, koncentrácia hemoglobínu, hematokrit, stredný objem erytrocytu (MCV), stredná koncentrácia hemoglobínu v erytrocyte (MCH), stredná farebná koncentrácia hemoglobínu (MCHC), protrombínový čas a aktivovaný parciálny tromboplastínový čas. Podľa potreby sa v závislosti od toxicity testovanej chemikálie môžu merať ďalšie hematologické parametre, ako sú Heinzove telieska alebo iná atypická morfológia erytrocytov alebo methemoglobín. Vo všeobecnosti treba zaujať flexibilný postoj v závislosti od pozorovaného a/alebo očakávaného účinku danej testovanej chemikálie. Ak má testovaná chemikália vplyv na hematopoetický systém, môže byť indikovaný aj počet retikulocytov a cytológia kostnej drene, hoci tieto vyšetrenia sa bežne nemusia vykonávať.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Klinická biochémia skúma hlavné toxické účinky na tkanivá a najmä účinky na obličky a pečeň. Vyšetrenie sa uskutočňuje zo vzoriek krvi, ktoré sa odoberú aspoň desiatim samcom a desiatim samiciam z každej skupiny v tých istých časových intervaloch, ako je špecifikované pre hematologické vyšetrenia, pričom sa vždy použijú tie isté zvieratá. V prípade myší môžu byť na uskutočnenie všetkých požadovaných vyšetrení klinickej biochémie potrebné satelitné zvieratá. V prípade štúdií nehlodavcov sa vzorky odoberú menšiemu počtu zvierat (napr. v prípade štúdií psov štyrom zvieratám z každého pohlavia v každej skupine), a to v priebežných časoch na odber vzoriek a na konci štúdie, podobne ako sa uvádza pri štúdiách hlodavcov. Pri hlodavcoch ani nehlodavcov nie je nutné vykonať merania po troch mesiacoch, ak v predchádzajúcej 90-dňovej štúdii vykonanej pri porovnateľných úrovniach dávok nebol na parametroch klinickej biochémie pozorovaný žiadny účinok. Odporúča sa, aby sa zvieratá (s výnimkou myší) noc pred odobratím vzoriek krvi nekŕmili. Je potrebné vyšetriť tieto parametre (30): glukóza, močovina (močovinový dusík), kreatinín, celkový obsah bielkovín, albumín, vápnik, sodík, draslík, celkový cholesterol, najmenej dva vhodné testy na hepatocelulárne hodnotenie (alanín-aminotransferáza, aspartát-aminotransferáza, glutamát-dehydrogenáza, celkový obsah žlčových kyselín) (31) a najmenej dva vhodné testy na hepatobiliárne hodnotenie (alkalín-fosfatáza, gama-glutamyl-transferáza, 5-nukleotidáza, celkový bilirubín, celkový obsah žlčových kyselín) (31). Podľa potreby sa v závislosti od toxicity testovanej chemikálie môžu merať ďalšie parametre klinickej chémie, ako je hladina triglyceridov nalačno, špecifické hormóny a cholínsteráza. Vo všeobecnosti treba zaujať flexibilný postoj v závislosti od pozorovaného a/alebo očakávaného účinku danej testovanej chemikálie.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Rozbor moču sa vykonáva najmenej pri desiatich samcoch a desiatich samiciach v každej skupine zo vzoriek odobratých v rovnakých intervaloch ako v prípade hematológie a klinickej chémie. Nie je nutné vykonať merania po troch mesiacoch, ak v predchádzajúcej 90-dňovej štúdii vykonanej pri porovnateľných úrovniach dávok nebol v rozbore moču pozorovaný žiadny účinok. Do odborného odporúčania pre štúdie klinickej patológie bol zahrnutý tento zoznam parametrov (30): vzhľad, objem, osmolalita alebo špecifická váha, pH, celkový obsah bielkovín a glukóza. Medzi ostatné parametre patria ketón, urobilinogén, bilirubín a okultné krvácanie. Ďalšie parametre sa môžu použiť, ak je potrebné rozšíriť vyšetrovanie pozorovaných účinkov.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Vo všeobecnosti je potrebné určiť základné hematologické ukazovatele a ukazovatele klinickej biochémie pred začatím testovania v štúdiách psov, ale nemusia sa určiť v štúdiách hlodavcov (30). Ak však historické základné údaje (pozri odsek 50) nie sú vhodné, treba uvažovať o získaní týchto údajov.
                           
                        
                     Patológia
                  
                  
                     Makroskopická pitva
                  
                  
                              45.
                           
                           
                              Všetky zvieratá v štúdii sa zvyčajne podrobujú kompletnej podrobnej makroskopickej pitve, ktorá zahŕňa dôkladné skúmanie vonkajšieho povrchu tela, všetkých telesných otvorov a lebečnej, hrudnej a brušnej dutiny a ich obsahu. Môžu sa však takisto zabezpečiť (v prípade priebežného utrácania alebo satelitných skupín), aby sa merania obmedzovali na špecifické kľúčové ukazovatele, ako je neurotoxicita alebo imunotoxicita (pozri odsek 19). Tieto zvieratá sa nemusia podrobiť pitve ani ďalším postupom opísaným v nasledujúcich odsekoch. Pri sentinelových zvieratách môže byť v závislosti od konkrétneho prípadu potrebná pitva, o ktorej rozhodne vedúci štúdie.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Orgánové hmotnosti by sa mali zistiť pri všetkých zvieratách, s výnimkou tých, ktoré sú vylúčené podľa ďalšej časti odseku 45. Nadobličky, mozog, nadsemenníky, srdce, obličky, pečeň, vaječníky, slezina, semenníky, štítna žľaza (vážená po fixácii, s prištítnymi telieskami) a maternica zo všetkých zvierat (okrem tých, pri ktorých sa zistilo chradnutie alebo ktoré sa priebežne utratili) by sa mali upraviť na priľnavej tkanine a je potrebné čo najrýchlejšie po disekcii zistiť ich mokrú hmotnosť, aby sa zabránilo vyschnutiu. V štúdii myší nie je povinné vážiť nadobličky.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Tieto tkanivá by sa mali uchovávať v čo najvhodnejšom fixačnom médiu na obidva typy tkanív a na neskoršie histopatologické vyšetrenie (32) (vyšetrenia tkanív v hranatých zátvorkách sú nepovinné):
                              
                                          Všetky makroskopické poškodenia
                                       
                                       
                                          srdce
                                       
                                       
                                          pankreas
                                       
                                       
                                          žalúdok (predný žalúdok, žľaznatý žalúdok)
                                       
                                    
                                          nadoblička
                                       
                                       
                                          ileum
                                       
                                       
                                          prištítne teliesko
                                       
                                       
                                          [zuby]
                                       
                                    
                                          aorta
                                       
                                       
                                          lačník
                                       
                                       
                                          periférny nerv
                                       
                                       
                                          semenníky
                                       
                                    
                                          mozog (vrátane častí predného mozgu, mozočka a predĺženej miechy/mosta)
                                       
                                       
                                          oblička
                                       
                                       
                                          hypofýza
                                       
                                       
                                          týmus
                                       
                                    
                                          slepé črevo
                                       
                                       
                                          slzná žľaza (extraorbitálna)
                                       
                                       
                                          prostata
                                       
                                       
                                          štítna žľaza
                                       
                                    
                                          krčok maternice
                                       
                                       
                                          pečeň
                                       
                                       
                                          rektum
                                       
                                       
                                          [jazyk]
                                       
                                    
                                          koagulačná žľaza
                                       
                                       
                                          pľúca
                                       
                                       
                                          slinná žľaza
                                       
                                       
                                          priedušnica
                                       
                                    
                                          hrubé črevo
                                       
                                       
                                          lymfatické uzliny (povrchové aj hlboké)
                                       
                                       
                                          semenný mechúrik
                                       
                                       
                                          močový mechúr
                                       
                                    
                                          dvanástnik
                                       
                                       
                                          prsná žľaza (povinné pri samiciach, a ak je zrejmé, že možno urobiť disekciu, aj pri samcoch)
                                       
                                       
                                          kostrové svaly
                                       
                                       
                                          maternica (vrátane krčka maternice)
                                       
                                    
                                          nadsemenníky
                                       
                                       
                                          [horný dýchací trakt vrátane nosa, nosových mušlí a prínosových dutín]
                                       
                                       
                                          koža
                                       
                                       
                                          [močovod]
                                       
                                    
                                          oko (vrátane sietnice)
                                       
                                       
                                          pažerák
                                       
                                       
                                          miecha (na troch úrovniach: krčnej, hrudnej a lumbálnej)
                                       
                                       
                                          [močová rúra]
                                       
                                    
                                          [stehnová kosť s kĺbom]
                                       
                                       
                                          [čuchový bulbus]
                                       
                                       
                                          slezina
                                       
                                       
                                          vagína
                                       
                                    
                                          žlčník (v prípade iných druhov zvierat ako potkany)
                                       
                                       
                                          vaječníky
                                       
                                       
                                          [hrudná kosť]
                                       
                                       
                                          prierez kostnej drene a/alebo čerstvý aspirát kostnej drene
                                       
                                    
                                          Harderova žľaza
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    V prípade párových orgánov, ako sú napríklad obličky a nadobličky, sa zachovajú obidva orgány. Z klinických a iných nálezov môže vyplynúť potreba vyšetrenia ďalších tkanív. Takisto by sa mali zachovať všetky orgány, ktoré vzhľadom na známe vlastnosti testovanej chemikálie možno považovať za cieľové orgány. V štúdiách, v ktorých sa chemikália podáva dermálne, je zoznam orgánov rovnaký ako v prípade orálneho podávania, pričom je nevyhnutný špecifický odber vzorky a zachovanie kože z miesta aplikácie chemikálie. V inhalačných štúdiách sa zoznam zachovaných a skúmaných tkanív dýchacieho traktu zostaví na základe odporúčaní kapitoly B.8 tejto prílohy (8) a kapitoly B.29 tejto prílohy (9). Pokiaľ ide o orgány/tkanivá (a popri špecificky uchovávaných tkanivách dýchacieho traktu), je potrebné vyšetriť tie isté orgány ako v prípade orálnej expozície.
                           
                        
                     Histopatológia
                  
                  
                              48.
                           
                           
                              K dispozícii sú usmernenia o najlepších postupoch na vykonávanie štúdií toxikologickej patológie (32). Histopatologickým vyšetreniam sa podrobia minimálne:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          všetky tkanivá zo skupín s vysokou dávkou a kontrolných skupín,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všetky tkanivá zo zvierat, ktoré uhynuli alebo boli utratené v priebehu štúdie,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všetky tkanivá vykazujúce makroskopické abnormality,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          cieľové tkanivá alebo tkanivá, ktoré v skupinách s vysokou dávkou vykazujú zmeny spôsobené aplikáciou chemikálie, zo všetkých zvierat zo všetkých skupín s odlišným dávkovaním,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          v prípade párových orgánov, ako sú napríklad obličky alebo nadobličky, sa vyšetria obidva orgány.
                                       
                                    
                        ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV
                  
                     Údaje
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Pri všetkých hodnotených parametroch sa uvedú údaje o jednotlivých zvieratách. Navyše všetky údaje sa musia zhrnúť v tabuľkovej forme, pričom ukazujú pre každú testovanú skupinu počet zvierat na začiatku testu, počet zvierat uhynutých počas testu alebo usmrtených z humánnych dôvodov, čas uhynutia alebo humánneho usmrtenia jednotlivých zvierat, počet zvierat, pri ktorých sa prejavili známky toxicity, opis pozorovaných známok toxicity vrátane nástupu, času a prudkosti toxických účinkov, počet zvierat vykazujúcich poškodenie, typy poškodení a percentuálne množstvo zvierat, pri ktorých sa prejavil daný typ poškodenia. Zhrnuté údaje v tabuľkách musia okrem stupňa poškodení udávať priemer a smerodajnú odchýlku (v prípade priebežných údajov o teste) pri zvieratách vykazujúcich toxické účinky alebo poškodenia.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Pri interpretácii výsledkov štúdie môžu byť užitočné historické kontrolné údaje, napr. v prípade, ak existujú indikácie, že údaje získané v rámci súbežných kontrol sa výrazne odlišujú v porovnaní s novými údajmi pri kontrolných zvieratách z rovnakého testovacieho zariadenia/kolónie. V prípade hodnotenia historických kontrolných údajov by ich malo predložiť to isté laboratórium a mali by sa vzťahovať na zvieratá rovnakého veku a z toho istého kmeňa vytvoreného v priebehu piatich rokov, ktoré danej štúdii predchádzali.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Ak je to možné, numerické výsledky budú spracované vhodnou a všeobecne uplatniteľnou štatistickou metódou. Štatistické metódy a údaje, ktoré budú analyzované, sa vyberú počas plánovania štúdie (odsek 8). Výber musí v prípade potreby počítať s úpravami vzhľadom na prežitie.
                           
                        
                     Správa o teste
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Správa o teste musí obsahovať tieto informácie:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovaná chemikália:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikálny charakter, čistota a fyzikálno-chemické vlastnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikačné údaje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj chemikálie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      číslo šarže,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      certifikát chemickej analýzy.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosič (v prípade potreby):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie výberu nosiča (ak je iný ako voda).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovacie zvieratá:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použitý druh/kmeň a odôvodnenie výberu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet, vek a pohlavie zvierat na začiatku testu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo atď.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hmotnosti jednotlivých zvierat na začiatku testu.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Podmienky testovania:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie spôsobu podávania a výberu dávky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ak je to použiteľné, štatistické metódy použité na analýzu údajov,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o príprave testovanej chemikálie/krmiva,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analytické údaje o dosiahnutej koncentrácii, stabilite a homogenite prípravku,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      spôsob podávania a údaje o podávaní testovanej chemikálie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      v prípade inhalačných štúdií, či ide o expozíciu oblasti nosa alebo expozíciu celého tela,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skutočné dávky (mg/kg telesnej hmotnosti/deň), faktor konverzie z potravy/pitnej vody, koncentrácia testovanej chemikálie (mg/kg alebo ppm), ak je to použiteľné,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné informácie o kvalite potravy a vody.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky (predloží sa tabuľkové zhrnutie údajov a údaje o jednotlivých zvieratách):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o prežití,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      telesná hmotnosť a zmeny telesnej hmotnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      spotreba potravy, výpočty účinnosti krmiva, pokiaľ sa vykonali, a spotreba vody, ak je to použiteľné,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o toxikologickej reakcii podľa pohlavia a úrovne dávky vrátane príznakov toxicity,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      povaha, rozsah (a ak sa hodnotí, závažnosť) a trvanie klinických pozorovaní (či už prechodných alebo stálych),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oftalmologické vyšetrenia,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematologické testy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      testy klinickej biochémie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      testy rozboru moču,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      výsledky všetkých vyšetrení neurotoxicity alebo imunotoxicity,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      konečná telesná hmotnosť,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      orgánové hmotnosti (a ich pomery, ak je to použiteľné),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pitevné nálezy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobný opis všetkých histopatologických nálezov súvisiacich s aplikáciou chemikálie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      absorpčné údaje, ak sú dostupné.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Štatistické spracovanie výsledkov v prípade potreby
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rozbor výsledkov zahŕňajúci:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vzťah medzi dávkou a reakciou,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zváženie všetkých informácií o druhu pôsobenia,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozbor všetkých prístupov modelovania,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stanovenie BMD, NOAEL alebo LOAEL,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      historické kontrolné údaje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      význam pre človeka.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Závery
                                          
                                       
                                    
                        
                     LITERATÚRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rím, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paríž.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Combes, R. D., Gaunt, I., Balls, M. (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163 – 208.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Barlow, S. M., Greig, J. B., Bridges, J. W. a kol. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145 – 191.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Chhabra, R. S., Bucher, J. R., Wolfe, M., Portier, C. (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437 – 445.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Kapitola B.27 tejto prílohy, Test subchronickej orálnej toxicity: opakovaná 90-dňová štúdia orálnej toxicity u nehlodavcov.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – druhé vydanie. Series on Testing and Assessment No. 116, dostupné na verejnej webovej stránke OECD s usmerneniami na vykonávanie testov na adrese www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paríž.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Kapitola B.8 tejto prílohy, Subakútna inhalačná toxicita: 28-dňová štúdia.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Kapitola B.29 tejto prílohy, Subchronická inhalačná toxicita: 90-dňová štúdia
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Kapitola B.9 tejto prílohy, Toxicita po 28–dňovej opakovanej dávke (dermálna).
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Carmichael, N. G., Barton, H. A., Boobis, A. R. a kol. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1 – 7.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Barton, H. A., Pastoor, T. P., Baetcke, T. a kol. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9 – 35.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Doe, J. E., Boobis, A. R., Blacker, A. a kol. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37 – 68.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Cooper, R. L., Lamb, J. S., Barlow, S. M. a kol. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69 – 98.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paríž.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paríž.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Rhomberg, L. R., Baetcke, K., Blancato, J., Bus, J., Cohen, S., Conolly, R., Dixit, R., Doe, J., Ekelman, K., Fenner-Crisp, P., Harvey, P., Hattis, D., Jacobs, A., Jacobson-Kram, D., Lewandowski, T., Liteplo, R., Pelkonen, O., Rice, J., Somers, D., Turturro, A., West, W., Olin, S. (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran, J. A. (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Smernica Európskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 2012 o ochrane zvierat používaných na vedecké účely (Ú. v. EÚ L 276, 20.10.2010, s. 33).
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Diehl, K.-H., Hull, R., Morton, D., Pfister, R., Rabemampianina, Y., Smith, D., Vidal, J.-M., van de Vorstenbosch, C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21: 15 – 23.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Tupper, D. E., Wallace, R. B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999 – 1003.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691 – 704.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Moser, V. C., McDaniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267 – 283.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Meyer, O. A., Tilson, H. A., Byrd, W. C., Riley, M. T. (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233 – 236.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Crofton, K. M., Howard, J. L., Moser, V. C., Gill, M. W., Reiter, L. W., Tilson, H. A., MacPhail, R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599 – 609.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Weingand, K., Brown, G., Hall R. a kol. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198 – 201.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              EMEA (draft) document ‘Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity‘ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126 – 131.
                           
                        
                     Dodatok 1
                     VYMEDZENIE POJMU
                     Testovaná chemikália: akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
                  “
            
                  6.
               
               
                  Kapitoly B.32 a B.33 sa nahrádzajú takto:
                  „B.32.   ŠTÚDIE KARCINOGENITY
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov (TG) 451 (2009). Pôvodné usmernenia TG 451 o štúdiách karcinogenity boli prijaté v roku 1981. Vypracovanie tejto revidovanej testovacej metódy B.32 sa považovalo za potrebné na zohľadnenie najnovšieho vývoja v oblasti starostlivosti o zvieratá a regulačných požiadaviek (2) (3) (4) (5) (6). Aktualizácia tejto testovacej metódy B.32 bola vykonaná súbežne s revíziou kapitoly B.30 tejto prílohy, Štúdie chronickej toxicity, a kapitoly B.33 tejto prílohy, Kombinované štúdie chronickej toxicity/karcinogenity, s cieľom získať ďalšie informácie pomocou zvierat použitých v štúdii a poskytnúť ďalšie podrobné údaje o výbere dávky. Táto testovacia metóda B.32 je vypracovaná na testovanie širokej škály chemikálií vrátane pesticídov a priemyselných chemikálií. Treba však poznamenať, že v prípade liekov sa niektoré podrobnosti a požiadavky môžu líšiť [pozri usmernenia S1B Medzinárodnej konferencie o zosúladení (ICH) o testovaní karcinogenity liekov].
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Väčšina štúdií karcinogenity sa vykonáva na hlodavcoch a táto testovacia metóda sa preto primárne vzťahuje na štúdie vykonávané na týchto živočíšnych druhoch. Ak sa takéto štúdie budú vyžadovať v prípade nehlodavcov, takisto by sa s príslušnými úpravami mali uplatniť princípy a postupy uvedené v tejto testovacej metóde spolu s princípmi a postupmi uvedenými v kapitole B.27 tejto prílohy, 90-dňová štúdia orálnej toxicity pri nehlodavcoch v opakovaných dávkach (6). Ďalšie usmernenia sú k dispozícii v Usmerňovacom dokumente OECD č. 116 o príprave a vykonávaní štúdií chronickej toxicity a karcinogenity (7).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Tri hlavné spôsoby podávania používané v štúdiách karcinogenity sú orálne, dermálne a inhalačné podávanie. Výber spôsobu podávania závisí od fyzikálnych a chemických vlastností testovanej chemikálie a najčastejšieho spôsobu expozície u človeka. Ďalšie informácie o výbere spôsobu expozície sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (7).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda je zameraná na orálnu expozíciu, ktorá sa v štúdiách karcinogenity používa najčastejšie. Hoci štúdie karcinogenity využívajúce dermálnu alebo inhalačnú expozíciu môžu byť takisto potrebné na hodnotenie zdravotných rizík pre človeka a/alebo sa môžu vyžadovať v určitých regulačných režimoch, oba spôsoby expozície sú do značnej miery technicky zložité. Takéto štúdie budú musieť byť pripravené v závislosti od jednotlivých prípadov, hoci testovacia metóda, ktorá sa tu uvádza na posudzovanie a vyhodnocovanie karcinogenity pri orálnom podávaní, by mohla slúžiť ako základ protokolu pre inhalačné a/alebo dermálne štúdie vzhľadom na odporúčania týkajúce sa období testovania, klinických a patologických parametrov atď. K dispozícii sú usmernenia OECD o podávaní testovaných chemikálií dermálnym (7) a inhalačným spôsobom (7) (8). Pri príprave dlhodobejších štúdií zahŕňajúcich inhalačnú expozíciu je nutné si preštudovať najmä kapitolu B.8 tejto prílohy (9) a kapitolu B.29 tejto prílohy (10) spolu s Usmerňovacím dokumentom OECD o testovaní akútnej inhalačnej toxicity (8). Kapitolu B.9 tejto prílohy (11) je nutné konzultovať v prípade testovania dermálnej expozície.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Štúdia karcinogenity poskytuje informácie o možnej nebezpečnosti pre zdravie, ktorá sa pravdepodobne vyskytne pri opakovanej expozícii v priebehu celej dĺžky života použitého živočíšneho druhu. Štúdia poskytne informácie o toxických účinkoch testovanej chemikálie vrátane potenciálnej karcinogenity a môže indikovať cieľové orgány a možnosť akumulácie. Môže zabezpečiť odhad hladiny bez pozorovaného nepriaznivého účinku pre toxické účinky a v prípade negenotoxických karcinogénov pre reakcie na nádory, ktorý možno použiť na stanovenie bezpečnostných kritérií týkajúcich sa expozície človeka. Takisto sa v nej zdôrazňuje nutnosť dôkladných klinických pozorovaní zvierat s cieľom získať čo najväčšie množstvo informácií.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Medzi ciele štúdie karcinogenity v rámci tejto testovacej metódy patrí:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikácia karcinogénnych vlastností testovanej chemikálie, ktoré vedú k zvýšenému výskytu nádorov, zvýšenému podielu zhubných nádorov alebo k skráteniu času do výskytu nádorov v porovnaní so súbežnými kontrolnými skupinami,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikácia cieľových orgánov karcinogenity,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikácia času do výskytu nádorov,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          charakterizácia vzťahu medzi dávkou a reakciou v prípade nádorov,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikácia hladiny bez pozorovaného nepriaznivého účinku (NOAEL) alebo východiska na stanovenie porovnávacej dávky (BMD),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          extrapolácia karcinogénnych účinkov na úrovne expozície človeka pri nízkych dávkach,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          poskytnutie údajov na testovanie hypotéz týkajúcich sa druhu pôsobenia (2) (7) (12) (13) (14) (15).
                                       
                                    
                        ÚVODNÉ ÚVAHY
                  
                              7.
                           
                           
                              Pri posudzovaní a vyhodnocovaní potenciálnej karcinogenity testovanej chemikálie testovacie laboratórium pred vykonaním štúdie zváži všetky dostupné informácie o testovanej chemikálii s cieľom zamerať prípravu štúdie na účinnejšie testovanie karcinogénneho potenciálu a minimalizovať využívanie zvierat. Informácie a úvahy o druhu pôsobenia podozrivého karcinogénu (2) (7) (12) (13) (14) (15) sú mimoriadne dôležité, lebo optimálne plánovanie sa môže líšiť v závislosti od toho, či je testovaná chemikália známym alebo podozrivým genotoxickým karcinogénom. Ďalšie usmernenia k úvahám o druhu pôsobenia sú uvedené v usmerňovacom dokumente č.116 (7).
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Informácie, ktoré pomôžu pri príprave štúdie, zahŕňajú identitu, chemickú štruktúru a fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej chemikálie, výsledky všetkých testov toxicity in vitro alebo in vivo vrátane testov genotoxicity, predpokladané použitie (použitia) a potenciál pre expozíciu ľudí, dostupné údaje (Q)SAR, údaje o mutagenite/genotoxicite a iné toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných chemikáliách, dostupné toxikokinetické údaje (kinetika pri jednej dávke a takisto pri opakovaných dávkach, ak je k dispozícii) a údaje získané z iných štúdií opakovanej expozície. Hodnotenie karcinogenity sa vykoná po získaní prvotných informácií o toxicite z 28-dňového a/alebo 90-dňového testu toxicity v opakovaných dávkach. Krátkodobé testy nástupu a šírenia rakoviny by takisto mohli priniesť užitočné informácie. Stratégiu fázového testovania pri testovaní karcinogenity treba zvážiť ako súčasť celkového hodnotenia potenciálnych nepriaznivých zdravotných účinkov danej testovanej chemikálie (16) (17) (18) (19).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Štatistické metódy, ktoré sú vzhľadom na prípravu pokusu a ciele na analýzu výsledkov najprimeranejšie, sa stanovia pred začatím štúdie. Je potrebné zvážiť, či by štatistiky nemali zahŕňať úpravu vzhľadom na prežitie zvierat, analýzu kumulatívnych nádorových rizík súvisiacich s dĺžkou prežitia, analýzu času do progresie nádoru a analýzu v prípade predčasného konca jednej alebo viacerých skupín. Usmernenia o vhodných štatistických analýzach a kľúčové odkazy na medzinárodne uznané štatistické metódy sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (7), ako aj v Usmerňovacom dokumente č. 35 o analýze a hodnotení štúdií chronickej toxicity a karcinogenity (20).
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Pri vykonávaní štúdie karcinogenity je vždy nutné sa riadiť hlavnými zásadami a úvahami uvedenými v Usmerňovacom dokumente OECD č. 19 o rozpoznaní, hodnotení a použití klinických príznakov ako humánnych parametrov pre pokusné zvieratá používané pri hodnotení bezpečnosti (21), najmä v odseku 62. V tomto odseku sa uvádza, že „ak v štúdiách s opakovanými dávkami zviera vykazuje klinické príznaky, ktoré sú progresívne a vedú k ďalšiemu zhoršeniu stavu, je potrebné na základe informácií rozhodnúť, či sa má zviera humánne usmrtiť alebo nie. Pri rozhodovaní treba zvážiť hodnotu informácií, ktoré by sa získali ďalším udržiavaním zvieraťa pri živote v rámci štúdie, v spojitosti s jeho celkovým stavom. Ak sa prijme rozhodnutie, že testovanie zvieraťa bude pokračovať, frekvencia pozorovaní by sa mala podľa potreby zvýšiť. Takisto je možné, bez toho, aby to malo negatívny vplyv na účel testu, dočasne pozastaviť podávanie dávok, ak sa tým zvieraťu uľaví od bolesti alebo utrpenia, alebo znížiť testovaciu dávku.“
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Podrobné usmernenia a rozbor zásad výberu dávky v štúdiách chronickej toxicity a karcinogenity sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (7), ako aj v dvoch publikáciách Medzinárodného inštitútu prírodných vied (International Life Sciences Institute) (22) (23). Základná stratégia výberu dávky závisí od primárneho cieľa alebo cieľov štúdie (odsek 6). Pri výbere vhodných úrovní dávky je potrebné dosiahnuť rovnováhu medzi skríningom nebezpečnosti na jednej strane a charakterizáciou reakcie na nízke dávky a jej významu na druhej strane. To má význam najmä v prípade kombinovanej štúdie chronickej toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 tejto prílohy, odsek 12).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Treba zvážiť vykonanie kombinovanej štúdie chronickej toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 tejto prílohy) namiesto samostatného vykonania štúdie chronickej toxicity (kapitola B.30 tejto prílohy) a štúdie karcinogenity (táto testovacia metóda B.32). Kombinovaným testom sa zabezpečí vyššia účinnosť, pokiaľ ide o čas a náklady, ako v prípade vykonania dvoch samostatných štúdií bez toho, aby sa znížila kvalita údajov, či už vo fáze chronickej toxicity alebo vo fáze karcinogenity. V prípade kombinovanej štúdie chronickej toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 tejto prílohy) však treba náležite zohľadniť zásady výberu dávky (odseky 11 a 22 – 25), pričom sa takisto pripúšťa, že v určitých regulačných rámcoch sa môže vyžadovať vykonanie samostatných štúdií.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Vymedzenie pojmov použitých v súvislosti s touto testovacou metódou je uvedené na konci tejto kapitoly a v usmerňovacom dokumente (GD) č. 116 (7).
                           
                        PRINCÍP TESTU
                  
                              14.
                           
                           
                              Niekoľkým skupinám pokusných zvierat sa denne zvyčajne orálne podáva testovaná chemikália v odstupňovaných dávkach po väčšinu dĺžky ich života. Testovanie inhalačným alebo dermálnym spôsobom môže byť takisto vhodné. Na zvieratách sa dôkladne pozorujú príznaky toxicity a tvorba nádorových poškodení. Pitva sa uskutoční aj na zvieratách uhynutých alebo usmrtených počas testovania, tak aj po ukončení testu na zvieratách, ktoré test prežijú.
                           
                        OPIS METÓDY
                  
                     Výber druhov zvierat
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda primárne zahŕňa posudzovanie a vyhodnocovanie karcinogenity pri hlodavcoch (odsek 2). Použitie nehlodavcov sa môže zvážiť, ak z dostupných údajov vyplýva, že to má pre predpovedanie zdravotných účinkov u ľudí väčší význam. Výber druhu zvierat je potrebné odôvodniť. Najvhodnejším hlodavcom je potkan, hoci sa môžu použiť aj iné hlodavce, napr. myši. Hoci používanie myší pri testovaní karcinogenity môže mať obmedzený význam (24) (25) (26), niektoré súčasné regulačné programy stále vyžadujú testovanie karcinogenity na myšiach, pokiaľ sa nestanoví, že takáto štúdia nie je z vedeckého hľadiska potrebná. Potkany a myši sú uprednostňované pokusné modely vzhľadom na ich pomerne krátku dĺžku života, ich rozsiahle využívanie vo farmakologických a toxikologických štúdiách, ich náchylnosť na indukciu nádoru a dostupnosť dostatočne charakterizovaných kmeňov. Vzhľadom na tieto charakteristiky je k dispozícii veľké množstvo informácií o ich fyziológii a patológii. Ďalšie informácie o výbere druhov a kmeňa zvierat sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (7).
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Používajú sa mladé zdravé dospelé zvieratá bežne používaných laboratórnych kmeňov. Štúdia karcinogenity sa podľa možnosti vykonáva na zvieratách z toho istého kmeňa a zdroja, ako sú zvieratá použité v predbežnej štúdii/štúdiách toxicity v kratšom trvaní, hoci ak je známe, že pri zvieratách z tohto istého kmeňa a zdroja sa pri dlhodobých štúdiách problematicky dosahujú bežne akceptované kritériá prežitia [pozri usmerňovací dokument č. 116 (7)], je nutné zvážiť použitie kmeňa zvierat s prijateľnou mierou prežitia v dlhodobej štúdii. Používajú sa samice, ktoré nikdy nevrhli mláďatá a sú negravidné.
                           
                        
                     Umiestnenie a kŕmenie
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Zvieratá môžu byť umiestnené jednotlivo alebo v malých skupinách rovnakého pohlavia v klietkach. Samostatné umiestnenie by sa malo zvážiť iba v prípade, že je to vedecky opodstatnené (27) (28) (29). Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy vzhľadom na ich umiestnenie. Teplota pokusnej miestnosti, kde sú zvieratá umiestnené, by mala byť 22 °C (± 3 °C). Hoci relatívna vlhkosť by mala byť najmenej 30 % a podľa možnosti by nemala presiahnuť 70 %, okrem času čistenia miestnosti, cieľom by mala byť 50 – 60 % vlhkosť. Osvetlenie by malo byť umelé a malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Potrava musí vyhovovať všetkým výživovým požiadavkám pre testované druhy zvierat a obsah kontaminantov potravy vrátane rezíduí pesticídov, perzistentných organických látok, fytoestrogénov, ťažkých kovov, mykotoxínov a iných kontaminantov, ktoré môžu mať vplyv na výsledky testu, musí byť čo najnižší. Analytické informácie o úrovni živín a kontaminantov potravy by sa mali získavať priebežne, aspoň na začiatku štúdie a pri zmene používanej šarže, a mali by sa uviesť v záverečnej správe. Podobne treba uviesť analytické informácie o pitnej vode použitej v štúdii. Výber krmiva môže byť ovplyvnený potrebou zabezpečiť vhodnú prímes testovanej chemikálie a potrebou splniť výživové požiadavky pri zvieratách v prípade, že sa testovaná chemikália podáva v potrave.
                           
                        
                     Príprava zvierat
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Použijú sa zdravé zvieratá, ktoré sa aklimatizovali na laboratórne podmienky aspoň sedem dní a ktoré sa predtým nepodrobili iným pokusom. V prípade hlodavcov sa musí dávkovanie začať čo najskôr po odstavení mláďat a aklimatizácii a podľa možnosti skôr, než zvieratá dovŕšia vek ôsmich týždňov. Pokusné zvieratá sa charakterizujú na základe druhu, kmeňa, zdroja, pohlavia, hmotnosti a veku. Na začiatku štúdie má byť rozdiel medzi hmotnosťami použitých zvierat z každého pohlavia minimálny a pre každé pohlavie zvlášť nemá presahovať ± 20 % priemernej hmotnosti všetkých zvierat v štúdii. Zvieratá sa náhodne zadelia do kontrolných skupín a testovaných skupín. Po randomizácii by medzi jednotlivými skupinami v rámci každého pohlavia nemali byť výrazné rozdiely v priemernej telesnej hmotnosti. Ak existujú štatisticky významné rozdiely, randomizácia by sa podľa možnosti mala zopakovať. Každému zvieraťu sa pridelí jedinečné identifikačné číslo, ktorým sa zviera trvalo označí tetovaním, mikročipovým implantátom alebo inou vhodnou metódou.
                           
                        POSTUP
                  
                     Počet zvierat a ich pohlavie
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Použijú sa obe pohlavia. Použije sa dostatočný počet zvierat, aby bolo možné dôkladné biologické a štatistické hodnotenie. V každej skupine s dávkou a v súbežnej kontrolnej skupine by preto malo byť minimálne 50 zvierat z každého pohlavia. V závislosti od cieľa štúdie je možné zvýšiť štatistickú významnosť kľúčových odhadov tak, že sa zvieratá nerovnomerne rozdelia do jednotlivých skupín s dávkami, pričom v skupinách s nízkou dávkou bude viac ako 50 zvierat, napr. pri odhadovaní karcinogénneho potenciálu pri nízkych dávkach. Treba však uznať, že miernym zvýšením počtu zvierat v skupine sa dosiahne pomerne nízke zvýšenie štatistickej významnosti štúdie. Ďalšie informácie o štatistickom plánovaní štúdie a výbere úrovní dávok s cieľom maximalizovať štatistickú významnosť sú k dispozícii v usmerňovacom dokumente č. 116 (7).
                           
                        
                     Zabezpečenie priebežného utrácania a satelitných (sentinelových) skupín
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Ak je to vedecky opodstatnené, v štúdii sa môže počítať s priebežným utrácaním, napr. po 12 mesiacoch, s cieľom získať informácie o progresii nádorových zmien a mechanistické informácie. Ak už takéto informácie o testovanej chemikálii sú k dispozícii z predchádzajúcich štúdií toxicity v opakovaných dávkach, priebežné utrácanie zvierat nie je vedecky opodstatnené. Ak sa v rámci štúdie plánuje priebežné utrácanie zvierat, v každej skupine s dávkou, v ktorej sa plánuje utratenie, je zvyčajne desať zvierat z každého pohlavia, pričom celkový počet zvierat zahrnutých v pláne štúdie by sa mal zvýšiť o počet zvierat, ktoré majú byť utratené pred dokončením štúdie. Na monitorovanie stavu choroby možno počas štúdie v prípade potreby použiť ďalšiu skupinu sentinelových zvierat (zvyčajne päť zvierat z každého pohlavia) (30). Ďalšie usmernenia sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (7).
                           
                        
                     Skupiny s dávkami a dávkovanie
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Usmernenia o všetkých aspektoch výberu dávky a odstupoch medzi jednotlivými úrovňami dávok sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (7). Použijú sa aspoň tri veľkosti dávok a uskutoční sa paralelná kontrola. Úroveň dávky zvyčajne vychádza z výsledkov krátkodobejších štúdií v opakovaných dávkach alebo štúdií na zistenie rozsahu, pričom je potrebné prihliadať na existujúce toxikologické a toxikokinetické údaje, ktoré sú o testovanej chemikálii alebo príbuzných chemikáliách k dispozícii.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Pokiaľ to dovoľuje fyzikálno-chemický charakter alebo biologické účinky testovanej chemikálie, na identifikáciu hlavných cieľových orgánov a toxických účinkov by sa mala vybrať najvyššia úroveň dávky, ktorá súčasne nebude mať za následok utrpenie, závažnú toxicitu, morbiditu alebo uhynutie. Pri súčasnom zohľadnení faktorov uvedených v odseku 23 by sa mala zvyčajne vybrať najvyššia úroveň dávky preukazujúca toxicitu, o ktorej svedčí napríklad pokles prírastku telesnej hmotnosti (približne o 10 %). V závislosti od cieľov štúdie (pozri odsek 6) však možno vybrať najvyššiu dávku, ktorá je nižšia ako dávka preukazujúca toxicitu, napr. ak dávka vyvoláva daný nepriaznivý účinok, ktorý má však malý vplyv na dĺžku života alebo na telesnú hmotnosť.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Úrovne dávok a odstupy medzi úrovňami dávok možno vybrať s cieľom určiť vzťah medzi dávkou a reakciou a v závislosti od druhu pôsobenia testovanej chemikálie hladinu NOAEL alebo iný plánovaný výsledok štúdie, napr. BMD (pozri odsek 25) pri najnižšej úrovni dávky. Medzi faktory, ktoré by sa mali zvážiť pri podávaní nižších dávok, patrí predpokladaný sklon krivky závislosti reakcie od dávky, dávky, pri ktorých môže dochádzať k významným zmenám v metabolizme alebo druhu toxického pôsobenia, keď sa očakáva prahová hodnota alebo keď sa očakáva východisko na extrapoláciu nízkej dávky.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Vybraté odstupy medzi úrovňami dávok budú závisieť od vlastností testovanej chemikálie a nemožno ich v rámci tejto testovacej metódy predpísať, ale dobrá účinnosť testov sa často dosahuje, ak sa na stanovenie zostupného dávkovania použijú intervaly dávkovania s faktorom dva až štyri, pričom pridanie štvrtej pokusnej skupiny je často vhodnejšie ako používanie veľmi veľkých intervalov (napr. s faktorom vyšším ako 6 – 10) medzi dávkami. Vo všeobecnosti by sa nemali používať faktory vyššie ako 10 a v prípade, že sa použijú, je nutné tento postup odôvodniť.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Ako sa ďalej uvádza v usmerňovacom dokumente č. 116 (7), pri výbere dávky je potrebné zvážiť tieto body:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          známe alebo predpokladné nelinearity alebo inflexné body krivky závislosti reakcie od dávky,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toxikokinetika a rozsahy dávok, pri ktorých dochádza alebo nedochádza k metabolickej indukcii, nasýteniu alebo nelinearite medzi externými a internými dávkami,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          prekurzorné poškodenia, markery účinkov alebo ukazovatele prebiehajúcich kľúčových základných biologických procesov,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kľúčové (alebo predpokladané) aspekty druhu pôsobenia, ako sú dávky, pri ktorých začína vznikať cytotoxicita, narúšajú sa hormonálne hladiny, preťažujú sa homeostatické mechanizmy atď.,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          oblasti krivky závislosti reakcie od dávky, kde je potrebný veľmi podrobný odhad, napr. v oblasti predpokladanej dávky BMD alebo predpokladanej prahovej úrovne,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          zváženie očakávaných úrovní expozície človeka.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              Kontrolnou skupinou je skupina, ktorá nebola vystavená účinkom chemikálie, alebo skupina, ktorej sa podáva nosič, ak sa pri podávaní testovanej chemikálie používa nosič. So zvieratami v kontrolnej skupine sa musí zaobchádzať takisto ako so zvieratami v testovaných skupinách, s výnimkou aplikovania testovanej chemikálie. Ak sa použije nosič, kontrolná skupina dostane nosič v najvyššom objeme, aký bol použitý pri skupinách s dávkami. Ak sa testovaná chemikália podáva v potrave a vedie k výraznému zníženiu príjmu potravy v dôsledku zvýšeného nechutenstva, môže byť užitočné použiť ďalšiu súčasne kŕmenú kontrolnú skupinu, ktorá poslúži ako vhodnejšia kontrola.
                           
                        
                     Príprava dávok a podávanie testovanej chemikálie
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Testovaná chemikália sa zvyčajne podáva orálne, v potrave alebo pitnej vode alebo cez sondu. Ďalšie informácie o spôsoboch a metódach podávania sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (7). Spôsob a metóda podávania závisí od účelu štúdie, fyzikálno-chemických vlastností testovanej chemikálie, jej biodostupnosti a prevládajúceho spôsobu a metódy expozície u človeka. Vybratý spôsob a metódu podávania je potrebné odôvodniť. V záujme zabezpečenia dobrých životných podmienok pre zvieratá sa orálna sonda zvyčajne zvolí iba v prípade látok, pri ktorých spôsob a metóda podávania primerane reprezentuje potenciálnu expozíciu u človeka (napr. v prípade liekov). Potravinové alebo environmentálne chemikálie obsahujúce pesticídy sa zvyčajne podávajú v potrave alebo v pitnej vode. V určitých prípadoch, napr. v prípade expozície na pracovisku, však môže byť vhodnejšie podanie iným spôsobom.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Ak je to potrebné, testovaná chemikália sa rozpustí alebo suspenduje vo vhodnom nosiči. Náležitá pozornosť by sa mala venovať nasledujúcim vlastnostiam nosiča a ostatným aditívam: vplyv na absorpciu, distribúciu, metabolizmus alebo zadržiavanie testovanej chemikálie, vplyvy na chemické vlastnosti testovanej chemikálie, ktoré môžu zmeniť svoje toxické vlastnosti, vplyv na spotrebu potravy a vody alebo na stav výživy zvierat. Odporúča sa, aby sa vždy, keď je to možné, najskôr zvážilo použitie vodného roztoku/suspenzie, potom roztoku/emulzie v oleji (napr. kukuričný olej) a nakoniec prípadného roztoku v iných nosičoch. Charakteristiky toxicity iných nosičov ako voda musia byť známe. Musia byť k dispozícii informácie o stabilite testovanej chemikálie a homogenite dávkovacích roztokov alebo krmív (podľa potreby) v podmienkach podávania (napr. v potrave).
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              V prípade chemikálií podávaných v potrave alebo pitnej vode je dôležité zabezpečiť, aby množstvá použitej testovanej chemikálie neinterferovali s normálnou výživovou a vodnou bilanciou. V dlhodobých štúdiách toxicity, pri ktorých sa využíva podávanie v potrave, by koncentrácia testovanej chemikálie v krmive zvyčajne nemala presiahnuť horný limit 5 % z celkového množstva krmiva, aby sa zabránilo nutričnej nevyváženosti. Ak je testovaná chemikália podávaná v potrave, môže sa použiť buď konštantná stravná koncentrácia (mg/kg potravy alebo ppm), alebo konštantná úroveň dávky vzhľadom na telesnú hmotnosť zvieraťa (mg/kg telesnej hmotnosti), ktorá sa vypočíta každý týždeň. Použitú alternatívu je potrebné špecifikovať.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              V prípade orálneho podávania sa zvieratám podávajú dávky testovanej chemikálie denne (sedem dní v týždni), v prípade hlodavcov zvyčajne počas 24 mesiacov (pozri aj odsek 32). Použitie každého iného režimu dávkovania, napr. päť dní v týždni, sa musí odôvodniť. V prípade podávania cez kožu sa zvieratám zvyčajne aplikuje testovaná chemikália najmenej šesť hodín denne, sedem dní v týždni, ako je uvedené v kapitole B.9 tejto prílohy (11), počas 24 mesiacov. Inhalačná expozícia sa vykonáva šesť hodín denne, sedem dní v týždni, ale ak je to odôvodnené, môže sa použiť aj expozícia počas piatich dní v týždni. Obdobie expozície zvyčajne trvá 24 mesiacov. Ak sa v prípade iných hlodavcov ako potkanov použije expozícia oblasti nosa, maximálne trvanie expozície je možné prispôsobiť s cieľom minimalizovať druhovo špecifické utrpenie. Ak sa použije expozícia v trvaní menej ako šesť hodín denne, treba uviesť odôvodnenie. Pozri aj kapitolu B.8 tejto prílohy (9).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Ak sa testovaná chemikália zvieratám podáva cez sondu, podáva sa prostredníctvom žalúdočnej sondy alebo vhodnej intubačnej kanyly približne v rovnakom čase každý deň. Zvyčajne sa podáva jedna dávka raz za deň. Ak je napríklad chemikália lokálne dráždivá, je možné zachovať dennú dávku tak, že sa rozdelí a podá v dvoch častiach (dvakrát denne). Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorazovo podať, závisí od veľkosti pokusného zvieraťa. Objem by mal byť podľa možnosti čo najnižší a v prípade hlodavcov by zvyčajne nemal presahovať 1 ml/100 g telesnej hmotnosti (31). Zmeny v aplikovanom objeme sa minimalizujú tým, že sa koncentrácie upravia tak, aby sa zabezpečil stály objem vo všetkých dávkach. Výnimkou sú potenciálne žieravé alebo dráždivé chemikálie, ktoré je nutné zriediť, aby sa predišlo závažným lokálnym účinkom. Nemalo by sa testovať pri koncentráciách, ktoré sú pravdepodobne žieravé alebo dráždivé pre gastrointestinálny trakt.
                           
                        
                     Trvanie štúdie
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Štúdia v prípade hlodavcov zvyčajne trvá 24 mesiacov, čo predstavuje väčšiu časť normálnej dĺžky života zvierat, ktoré sa majú použiť. V závislosti od dĺžky života kmeňa živočíšneho druhu v štúdii možno použiť aj kratšie alebo dlhšie trvanie, ale tento postup je nutné odôvodniť. V prípade určitých kmeňov myší, napr. kmeňov AKR/J, C3H/J alebo C57BL/6J, môže byť vhodná štúdia v trvaní 18 mesiacov. Nasledujúce informácie poskytujú usmernenia k trvaniu, ukončeniu štúdie a prežitiu. Ďalšie usmernenia vrátane úvah o prijateľnosti negatívnej štúdie karcinogenity v súvislosti s prežitím počas štúdie sú uvedené v Usmerňovacom dokumente OECD č. 116 o príprave a vykonávaní štúdií chronickej toxicity a karcinogenity (7).
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Ukončenie štúdie treba zvážiť, ak počet zvierat, ktoré prežili v skupinách s nižšou dávkou alebo v kontrolnej skupine, klesne pod 25 %.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Ak v dôsledku toxicity predčasne uhynie iba skupina s vysokou dávkou, štúdia by sa nemala ukončiť.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Prežitie sa pri jednotlivých pohlaviach posudzuje samostatne.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Trvanie štúdie by nemalo presiahnuť hranicu, pri ktorej už údaje získané pomocou štúdie nepostačujú na vykonanie štatisticky platného vyhodnotenia.
                                       
                                    
                        POZOROVANIA
                  
                              33.
                           
                           
                              Pri všetkých zvieratách si treba všímať morbiditu alebo mortalitu, zvyčajne na začiatku a na konci každého dňa vrátane víkendov a sviatkov. Pri zvieratách sa navyše denne kontrolujú špecifické príznaky, ktoré majú toxikologický význam, pričom sa zohľadňuje časový vrchol očakávaných účinkov po dávkovaní v prípade podávania cez sondu. Osobitnú pozornosť treba venovať tvorbe nádorov. Čas nástupu nádoru, lokalizáciu, rozmery, vzhľad a progresiu každého výrazne viditeľného alebo hmatateľného nádoru je nutné zaznamenať.
                           
                        
                     Telesná hmotnosť, spotreba potravy/vody a účinnosť krmiva
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Všetky zvieratá sa odvážia na začiatku testu, najmenej raz týždenne počas prvých 13 týždňov a následne najmenej raz za mesiac. Spotreba potravy a účinnosť krmiva sa merajú najmenej raz za týždeň počas prvých 13 týždňov a následne najmenej raz za mesiac. Ak sa testovaná chemikália podáva vo vode na pitie, spotreba vody sa meria najmenej raz za týždeň počas prvých 13 týždňov a následne najmenej raz za mesiac. Merania spotreby vody by sa mali zvážiť aj v prípade štúdií, pri ktorých sa mení pitný režim.
                           
                        
                     Hematológia, klinická biochémia a iné merania
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              S cieľom maximalizovať informácie získané pomocou štúdie, najmä pokiaľ ide o úvahy týkajúce sa druhu pôsobenia, možno odobrať vzorky krvi na hematológiu a klinickú biochémiu, pričom rozhodnutie o tomto kroku ostáva na vedúcom štúdie. Takisto môže byť vhodné urobiť rozbor moču. Ďalšie usmernenia o význame odberu takýchto vzoriek v rámci štúdie karcinogenity sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (7). Ak je to vhodné, odber vzoriek krvi na hematologické vyšetrenia, vyšetrenia klinickej biochémie a rozbor moču sa môže vykonať ako súčasť priebežného utrácania (odsek 20) a na konci štúdie pri minimálne desiatich zvieratách z každého pohlavia v každej skupine. Vzorky krvi sa odoberajú v anestézii zo stanoveného miesta, napríklad vpichom do srdca alebo zo zadnej očnicovej dutiny, a podľa možnosti sa uchovávajú v primeraných podmienkach. Takisto je možné na vyšetrenie pripraviť krvné stery, najmä ak sa zdá, že kostná dreň je cieľovým orgánom, hoci význam takéhoto vyšetrenia pri hodnotení karcinogénneho/onkogénneho potenciálu sa spochybňuje (32).
                           
                        PATOLÓGIA
                  
                     Makroskopická pitva
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Všetky zvieratá v štúdii s výnimkou sentinelových zvierat (pozri odsek 20) a ostatných satelitných zvierat sa podrobujú kompletnej podrobnej makroskopickej pitve, ktorá zahŕňa dôkladné skúmanie vonkajšieho povrchu tela, všetkých telesných otvorov a lebečnej, hrudnej a brušnej dutiny a ich obsahu. Pri sentinelových a ostatných satelitných zvieratách môže byť v závislosti od konkrétneho prípadu potrebná pitva, o ktorej rozhodne vedúci štúdie. Orgánové hmotnosti väčšinou nie sú súčasťou štúdie karcinogenity, keďže geriatrické zmeny a v neskorších štádiách tvorba nádorov znehodnocujú užitočnosť údajov o orgánových hmotnostiach. Môžu však mať veľký význam pri hodnotení váhy dôkazov, najmä v rámci úvah o druhu pôsobenia. Ak sú súčasťou satelitnej štúdie, zozbierajú sa najneskôr do jedného roka od začatia štúdie.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Tieto tkanivá by sa mali uchovávať v čo najvhodnejšom fixačnom médiu na obidva typy tkanív a na neskoršie histopatologické vyšetrenie (33) (vyšetrenia tkanív v hranatých zátvorkách sú nepovinné):
                              
                                          Všetky makroskopické poškodenia
                                       
                                       
                                          srdce
                                       
                                       
                                          pankreas
                                       
                                       
                                          žalúdok (predný žalúdok, žľaznatý žalúdok)
                                       
                                    
                                          nadoblička
                                       
                                       
                                          ileum
                                       
                                       
                                          prištítne teliesko
                                       
                                       
                                          [zuby]
                                       
                                    
                                          aorta
                                       
                                       
                                          lačník
                                       
                                       
                                          periférny nerv
                                       
                                       
                                          semenníky
                                       
                                    
                                          mozog (vrátane častí predného mozgu, mozočka a predĺženej miechy/mosta)
                                       
                                       
                                          oblička
                                       
                                       
                                          hypofýza
                                       
                                       
                                          týmus
                                       
                                    
                                          slepé črevo
                                       
                                       
                                          slzná žľaza (extraorbitálna)
                                       
                                       
                                          prostata
                                       
                                       
                                          štítna žľaza
                                       
                                    
                                          krčok maternice
                                       
                                       
                                          pečeň
                                       
                                       
                                          rektum
                                       
                                       
                                          [jazyk]
                                       
                                    
                                          koagulačná žľaza
                                       
                                       
                                          pľúca
                                       
                                       
                                          slinná žľaza
                                       
                                       
                                          priedušnica
                                       
                                    
                                          hrubé črevo
                                       
                                       
                                          lymfatické uzliny (povrchové aj hlboké)
                                       
                                       
                                          semenný mechúrik
                                       
                                       
                                          močový mechúr
                                       
                                    
                                          dvanástnik
                                       
                                       
                                          prsná žľaza (povinné pri samiciach, a ak je zrejmé, že možno urobiť disekciu, aj pri samcoch)
                                       
                                       
                                          kostrové svaly
                                       
                                       
                                          maternica (vrátane krčka maternice)
                                       
                                    
                                          nadsemenníky
                                       
                                       
                                          [horný dýchací trakt vrátane nosa, nosových mušlí a prínosových dutín]
                                       
                                       
                                          koža
                                       
                                       
                                          [močovod]
                                       
                                    
                                          oko (vrátane sietnice)
                                       
                                       
                                          pažerák
                                       
                                       
                                          miecha (na troch úrovniach: krčnej, hrudnej a lumbálnej)
                                       
                                       
                                          [močová rúra]
                                       
                                    
                                          [stehnová kosť s kĺbom]
                                       
                                       
                                          [čuchový bulbus]
                                       
                                       
                                          slezina
                                       
                                       
                                          vagína
                                       
                                    
                                          žlčník (v prípade iných druhov zvierat ako potkany)
                                       
                                       
                                          vaječníky
                                       
                                       
                                          [hrudná kosť]
                                       
                                       
                                          prierez kostnej drene a/alebo čerstvý aspirát kostnej drene
                                       
                                    
                                          Harderova žľaza
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    V prípade párových orgánov, ako sú napríklad obličky a nadobličky, sa zachovajú obidva orgány. Z klinických a iných nálezov môže vyplynúť potreba vyšetrenia ďalších následných tkanív. Takisto by sa mali zachovať všetky orgány, ktoré vzhľadom na známe vlastnosti testovanej chemikálie možno považovať za cieľové orgány. V štúdiách, v ktorých sa chemikália podáva dermálne, je zoznam orgánov rovnaký ako v prípade orálneho podávania, pričom je nevyhnutný špecifický odber vzorky a zachovanie kože z miesta aplikácie chemikálie. V inhalačných štúdiách sa zoznam zachovaných a skúmaných tkanív dýchacieho traktu zostaví na základe odporúčaní kapitoly B.8 a kapitoly B.29 tejto prílohy. Pokiaľ ide o orgány/tkanivá (a popri špecificky uchovávaných tkanivách dýchacieho traktu), je potrebné vyšetriť tie isté orgány ako v prípade orálnej expozície.
                           
                        
                     Histopatológia
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              K dispozícii sú usmernenia o dobrej praxi na vykonávanie štúdií toxikologickej patológie (33). Vyšetreniam sa podrobia minimálne tieto tkanivá:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          všetky tkanivá zo skupín s vysokou dávkou a kontrolných skupín,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všetky tkanivá zo zvierat, ktoré uhynuli alebo boli utratené v priebehu štúdie,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všetky tkanivá vykazujúce makroskopické abnormality vrátane nádorov,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          ak sú v skupine s vysokou dávkou pozorované histopatologické zmeny súvisiace s aplikáciou chemikálie, tie isté tkanivá sa vyšetria pri všetkých zvieratách zo všetkých skupín s odlišným dávkovaním,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          v prípade párových orgánov, ako sú napríklad obličky alebo nadobličky, sa vyšetria obidva orgány.
                                       
                                    
                        ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV
                  
                     Údaje
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Pri všetkých hodnotených parametroch sa uvedú údaje o jednotlivých zvieratách. Navyše všetky údaje sa musia zhrnúť v tabuľkovej forme, pričom ukazujú pre každú testovanú skupinu počet zvierat na začiatku testu, počet zvierat uhynutých počas testu alebo usmrtených z humánnych dôvodov, čas uhynutia alebo humánneho usmrtenia jednotlivých zvierat, počet zvierat, pri ktorých sa prejavili známky toxicity, opis pozorovaných známok toxicity vrátane nábehu, času a prudkosti toxických účinkov, počet zvierat vykazujúcich poškodenie, typy poškodení a percentuálne množstvo zvierat, pri ktorých sa prejavil daný typ poškodenia. Zhrnuté údaje v tabuľkách musia okrem stupňa poškodení udávať priemer a smerodajnú odchýlku (v prípade priebežných údajov o teste) pri zvieratách vykazujúcich toxické účinky alebo poškodenia.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Pri interpretácii výsledkov štúdie môžu byť užitočné historické kontrolné údaje, napr. v prípade, ak existujú indikácie, že údaje získané v rámci súbežných kontrol sa výrazne odlišujú v porovnaní s novými údajmi pri kontrolných zvieratách z rovnakého testovacieho zariadenia/kolónie. V prípade hodnotenia historických kontrolných údajov by ich malo predložiť to isté laboratórium a mali by sa vzťahovať na zvieratá rovnakého veku a z toho istého kmeňa vytvoreného v priebehu piatich rokov, ktoré danej štúdii predchádzali.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Ak je to možné, numerické výsledky budú spracované vhodne a všeobecne uplatniteľnou metódou. Štatistické metódy a údaje, ktoré budú analyzované, sa vyberú počas plánovania štúdie (odsek 9). Výber musí v prípade potreby počítať s úpravami vzhľadom na prežitie.
                           
                        
                     Správa o teste
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Správa o teste by mala obsahovať tieto informácie:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovaná chemikália:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikálny charakter, čistota a fyzikálno-chemické vlastnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikačné údaje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj chemikálie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      číslo šarže,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      certifikát chemickej analýzy.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosič (v prípade potreby):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie výberu nosiča (ak je iný ako voda).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovacie zvieratá:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použitý druh/kmeň a odôvodnenie výberu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet, vek a pohlavie zvierat na začiatku testu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo atď.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hmotnosti jednotlivých zvierat na začiatku testu.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Podmienky testovania:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie spôsobu podávania a výberu dávky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ak je to použiteľné, štatistické metódy použité na analýzu údajov,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o príprave testovanej chemikálie/krmiva,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analytické údaje o dosiahnutej koncentrácii, stabilite a homogenite prípravku,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      spôsob podávania a údaje o podávaní testovanej chemikálie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      v prípade inhalačných štúdií, či ide o expozíciu oblasti nosa alebo expozíciu celého tela,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skutočné dávky (mg/kg telesnej hmotnosti/deň), faktor konverzie z potravy/pitnej vody, koncentrácia testovanej chemikálie (mg/kg alebo ppm), ak je to použiteľné,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o kvalite potravy a vody.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky (predloží sa tabuľkové zhrnutie údajov a údaje o jednotlivých zvieratách)
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Všeobecné informácie:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o prežití,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      telesná hmotnosť a zmeny telesnej hmotnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      spotreba potravy, výpočty účinnosti krmiva, pokiaľ sa vykonali, a spotreba vody, ak je to použiteľné,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toxikokinetické údaje (ak sú dostupné),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oftalmoskopia (ak je dostupná),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematológia (ak je dostupná),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klinická chémia (ak je dostupná).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Klinické nálezy:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      príznaky toxicity,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozsah (a ak sa hodnotí, závažnosť) každej abnormality,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      povaha, závažnosť a trvanie klinických pozorovaní (či už prechodných alebo stálych).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Údaje o pitve:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      konečná telesná hmotnosť,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      orgánové hmotnosti a ich pomery, ak je to použiteľné,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pitevné nálezy, rozsah a závažnosť abnormalít.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Histopatológia:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nenádorové histopatologické nálezy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nádorové histopatologické nálezy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      korelácia medzi makroskopickými a mikroskopickými nálezmi,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobný opis všetkých histopatologických nálezov súvisiacich s aplikáciou chemikálie vrátane stupňa závažnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      správa o všetkých partnerských hodnoteniach preparátov (sklíčok).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Štatistické spracovanie výsledkov v prípade potreby
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rozbor výsledkov zahŕňajúci:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozbor všetkých prístupov modelovania,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vzťahy medzi dávkou a reakciou,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      historické kontrolné údaje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zváženie všetkých informácií o druhu pôsobenia,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stanovenie BMD, NOAEL alebo LOAEL,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      význam pre človeka.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Závery
                                          
                                       
                                    
                        
                     LITERATÚRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rím, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paríž.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Combes, R. D., Gaunt, I., Balls, M. (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163 – 208.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Barlow, S. M., Greig, J. B., Bridges, J. W., a kol. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145 – 191.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Chhabra, R. S., Bucher, J. R., Wolfe, M., Portier, C. (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437 – 445.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Kapitola B.27 tejto prílohy, Test subchronickej orálnej toxicity: opakovaná 90-dňová štúdia orálnej toxicity u nehlodavcov.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 a 453 – druhé vydanie. Series on Testing and Assessment No. 116, dostupné na verejnej webovej stránke OECD s usmerneniami na vykonávanie testov na adrese www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paríž.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Kapitola B.8 tejto prílohy, Subakútna inhalačná toxicita: 28-dňová štúdia.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Kapitola B.29 tejto prílohy, Subchronická inhalačná toxicita: 90-dňová štúdia.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Kapitola B.9 tejto prílohy, Toxicita po 28–dňovej opakovanej dávke (dermálna).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Boobis, A. R., Cohen, S. M., Dellarco, V., McGregor, D., Meek, M. E., Vickers, C., Willcocks, D., Farland, W. (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793 – 801.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Cohen, S. M., Meek, M. E., Klaunig, J. E., Patton, D. E., a Fenner-Crisp, P. A. (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581 – 589.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Holsapple, M. P., Pitot, H. C., Cohen, S. N., Boobis, A. R., Klaunig, J. E., Pastoor, T., Dellarco, V. L., Dragan, Y. P. (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89: 51 – 56.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Meek, E. M., Bucher, J. R., Cohen, S. M., Dellarco, V., Hill, R. N., Lehman-McKemmon, L. D., Longfellow, D. G., Pastoor, T., Seed, J., Patton, D. E. (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 591 – 653.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Carmichael, N. G., Barton, H. A., Boobis, A. R., a kol. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1 – 7.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Barton, H. A., Pastoor, T. P., Baetcke, T. a kol. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9 – 35.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Doe, J. E., Boobis, A. R., Blacker, A., a kol. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37 – 68.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Cooper, R. L., Lamb, J. S., Barlow, S. M., a kol. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69 – 98.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paríž.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paríž.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Rhomberg, L. R., Baetcke, K., Blancato, J., Bus, J., Cohen, S., Conolly, R., Dixit, R., Doe, J., Ekelman, K., Fenner-Crisp, P., Harvey, P., Hattis, D., Jacobs, A., Jacobson-Kram, D., Lewandowski, T., Liteplo, R., Pelkonen, O., Rice, J., Somers, D., Turturro, A., West, W., Olin, S. (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran, J. A. (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Griffiths, S. A., Parkinson, C., McAuslane, J. A. N., a Lumley, C. E. (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1): 214.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Usui, T., Griffiths, S. A., a Lumley, C. E. (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy P. O. F. & Harron D. W. G. (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. s. 279 – 284.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Carmichael, N. G., Enzmann, H., Pate, I., Waechter, F. (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105: 1196 – 1203.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Smernica Európskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 2012 o ochrane zvierat používaných na vedecké účely, Ú. v. EÚ L 276, 20.10.2010, s. 33.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington, D.C., US Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Diehl, K.-H., Hull, R., Morton, D., Pfister, R., Rabemampianina, Y., Smith, D., Vidal, J.-M., van de Vorstenbosch, C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21: 15 – 23.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Weingand, K. a kol. (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198 – 201.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Crissman, J., Goodman, D., Hildebrandt, P. a kol. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126 – 131.
                           
                        
                     Dodatok 1
                     VYMEDZENIE POJMU
                     Testovaná chemikália: akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
                  
                  B. 33.   KOMBINOVANÁ ŠTÚDIA CHRONICKEJ TOXICITY/KARCINOGENITY
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov (TG) 453 (2009). Pôvodné usmernenia TG 453 boli prijaté v roku 1981. Vypracovanie tejto aktualizovanej testovacej metódy B.33 sa považovalo za potrebné na zohľadnenie najnovšieho vývoja v oblasti starostlivosti o zvieratá a regulačných požiadaviek (1) (2) (3) (4) (5). Aktualizácia tejto testovacej metódy B.33 bola vykonaná súbežne s revíziou kapitoly B.32 tejto prílohy, Štúdie karcinogenity, a kapitoly B.30 tejto prílohy, Štúdie chronickej toxicity, s cieľom získať ďalšie informácie pomocou zvierat použitých v štúdii a poskytnúť ďalšie podrobné údaje o výbere dávky. Táto testovacia metóda je vypracovaná na testovanie širokej škály chemikálií vrátane pesticídov a priemyselných chemikálií. Treba však poznamenať, že v prípade liekov sa niektoré podrobnosti a požiadavky môžu líšiť (pozri usmernenia S1B Medzinárodnej konferencie o zosúladení (ICH) o testovaní karcinogenity liekov).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Väčšina štúdií chronickej toxicity a karcinogenity sa vykonáva na hlodavcoch a táto testovacia metóda sa preto primárne vzťahuje na štúdie vykonávané na týchto živočíšnych druhoch. Ak sa takéto štúdie budú vyžadovať v prípade nehlodavcov, takisto sa s príslušnými úpravami môžu uplatniť uvedené princípy a postupy spolu s princípmi a postupmi uvedenými v kapitole B.27 tejto prílohy, 90-dňová štúdia orálnej toxicity pri nehlodavcoch v opakovaných dávkach (6), ako sa uvádza v Usmerňovacom dokumente OECD č. 116 o príprave a vykonávaní štúdií chronickej toxicity a karcinogenity (7).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Tri hlavné spôsoby podávania používané v štúdiách chronickej toxicity/karcinogenity sú orálne, dermálne a inhalačné podávanie. Výber spôsobu podávania závisí od fyzikálnych a chemických vlastností testovanej chemikálie a najčastejšieho spôsobu expozície u človeka. Ďalšie informácie o výbere spôsobu expozície sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (7).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda je zameraná na orálnu expozíciu, ktorá sa v štúdiách chronickej toxicity a karcinogenity používa najčastejšie. Hoci dlhodobé štúdie využívajúce dermálnu alebo inhalačnú expozíciu môžu byť takisto potrebné na hodnotenie zdravotných rizík pre človeka a/alebo sa môžu vyžadovať v určitých regulačných režimoch, oba spôsoby expozície sú do značnej miery technicky zložité. Takéto štúdie budú musieť byť pripravené v závislosti od jednotlivých prípadov, hoci testovacia metóda, ktorá sa tu uvádza na posudzovanie a vyhodnocovanie chronickej toxicity a karcinogenity pri orálnom podávaní, by mohla slúžiť ako základ protokolu pre inhalačné a/alebo dermálne štúdie vzhľadom na odporúčania týkajúce sa období testovania, klinických a patologických parametrov atď. K dispozícii sú usmernenia OECD o podávaní testovaných chemikálií inhalačným (7) (8) a dermálnym spôsobom (7). Pri príprave dlhodobejších štúdií zahŕňajúcich inhalačnú expozíciu je nutné si preštudovať najmä kapitolu B.8 tejto prílohy (9) a kapitolu B.29 tejto prílohy (10) spolu s Usmerňovacím dokumentom OECD o testovaní akútnej inhalačnej toxicity (8). Kapitolu B.9 tejto prílohy (11) je nutné konzultovať v prípade testovania dermálnej expozície.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Kombinovaná štúdia chronickej toxicity/karcinogenity poskytuje informácie o možnej nebezpečnosti pre zdravie, ktorá sa pravdepodobne vyskytne pri opakovanej expozícii v priebehu celej dĺžky života použitého živočíšneho druhu. Štúdia poskytne informácie o toxických účinkoch testovanej chemikálie vrátane potenciálnej karcinogenity, indikuje cieľové orgány a možnosť akumulácie. Môže zabezpečiť odhad hladiny bez pozorovaného nepriaznivého účinku pre toxické účinky a v prípade negenotoxických karcinogénov pre reakcie na nádory, ktorý možno použiť na stanovenie bezpečnostných kritérií týkajúcich sa expozície človeka. Takisto sa v nej zdôrazňuje nutnosť dôkladných klinických pozorovaní zvierat s cieľom získať čo najväčšie množstvo informácií.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Medzi ciele štúdie chronickej toxicity/karcinogenity v rámci tejto testovacej metódy patrí:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikácia karcinogénnych vlastností testovanej chemikálie, ktoré vedú k zvýšenému výskytu nádorov, zvýšenému podielu zhubných nádorov alebo k skráteniu času do výskytu nádorov v porovnaní so súbežnými kontrolnými skupinami,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikácia času do výskytu nádorov,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikácia chronickej toxicity testovanej chemikálie,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikácia cieľových orgánov chronickej toxicity a karcinogenity,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          charakterizácia vzťahu medzi dávkou a reakciou,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikácia hladiny bez pozorovaného nepriaznivého účinku (NOAEL) alebo východiska na stanovenie porovnávacej dávky (BMD),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          extrapolácia karcinogénnych účinkov na úrovne expozície človeka pri nízkych dávkach,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          predpovedanie účinkov chronickej toxicity na úrovniach expozície človeka,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          poskytnutie údajov na testovanie hypotéz týkajúcich sa druhu pôsobenia (2) (7) (12) (13) (14) (15).
                                       
                                    
                        ÚVODNÉ ÚVAHY
                  
                              7.
                           
                           
                              Pri posudzovaní a vyhodnocovaní potenciálnej karcinogenity a chronickej toxicity testovanej chemikálie testovacie laboratórium pred vykonaním štúdie zváži všetky dostupné informácie o testovanej chemikálii s cieľom zamerať prípravu štúdie na účinnejšie testovanie jej toxikologických vlastností a minimalizovať využívanie zvierat. Informácie a úvahy o druhu pôsobenia podozrivého karcinogénu (2)(7) (12) (13) (14) (15) sú mimoriadne dôležité, lebo optimálne plánovanie sa môže líšiť v závislosti od toho, či je testovaná chemikália známym alebo podozrivým genotoxickým karcinogénom. Ďalšie usmernenia k úvahám o druhu pôsobenia sú uvedené v usmerňovacom dokumente č.116 (7).
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Informácie, ktoré pomôžu pri príprave štúdie, zahŕňajú identitu, chemickú štruktúru a fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej chemikálie, akékoľvek informácie o druhu pôsobenia, výsledky všetkých testov toxicity in vitro alebo in vivo vrátane testov genotoxicity, predpokladané použitie (použitia) a potenciál pre expozíciu ľudí, dostupné údaje (Q)SAR, údaje o mutagenite/genotoxicite a iné toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných chemikáliách, dostupné toxikokinetické údaje (kinetika pri jednej dávke a takisto pri opakovaných dávkach, ak je k dispozícii) a údaje získané z iných štúdií opakovanej expozície. Stanovenie chronickej toxicity/karcinogenity sa vykoná až po získaní prvotných informácií o toxicite z 28-dňového a/alebo 90-dňového testu toxicity v opakovaných dávkach. Krátkodobé testy nástupu a šírenia rakoviny by takisto mohli priniesť užitočné informácie. Stratégiu fázového testovania pri testovaní karcinogenity treba zvážiť ako súčasť celkového hodnotenia potenciálnych nepriaznivých zdravotných účinkov danej testovanej chemikálie (16) (17) (18) (19).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Štatistické metódy, ktoré sú vzhľadom na prípravu pokusu a ciele na analýzu výsledkov najprimeranejšie, sa stanovia pred začatím štúdie. Je potrebné zvážiť, či by štatistiky nemali zahŕňať úpravu vzhľadom na prežitie zvierat, analýzu kumulatívnych nádorových rizík súvisiacich s dĺžkou prežitia, analýzu času do progresie nádoru a analýzu v prípade predčasného konca jednej alebo viacerých skupín. Usmernenia o vhodných štatistických analýzach a kľúčové odkazy na medzinárodne uznávané štatistické metódy sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (7), ako aj v Usmerňovacom dokumente č. 35 o analýze a hodnotení štúdií chronickej toxicity a karcinogenity (20).
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Pri vykonávaní štúdie karcinogenity je vždy nutné sa riadiť hlavnými zásadami a úvahami uvedenými v Usmerňovacom dokumente OECD o rozpoznaní, hodnotení a použití klinických príznakov ako humánnych parametrov pre pokusné zvieratá používané pri hodnotení bezpečnosti (21), najmä v odseku 62. V tomto odseku sa uvádza, že ‚ak v štúdiách s opakovanými dávkami zviera vykazuje klinické príznaky, ktoré sú progresívne a vedú k ďalšiemu zhoršeniu stavu, je potrebné na základe informácií rozhodnúť, či sa má zviera humánne usmrtiť alebo nie. Pri rozhodovaní treba zvážiť hodnotu informácií, ktoré by sa získali ďalším udržiavaním zvieraťa pri živote v rámci štúdie, v spojitosti s jeho celkovým stavom. Ak sa prijme rozhodnutie, že testovanie zvieraťa bude pokračovať, frekvencia pozorovaní by sa mala podľa potreby zvýšiť. Takisto je možné, bez toho, aby to malo negatívny vplyv na účel testu, dočasne pozastaviť podávanie dávok, ak sa tým zvieraťu uľaví od bolesti alebo utrpenia, alebo znížiť testovaciu dávku.‘
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Podrobné usmernenia a rozbor zásad výberu dávky v štúdiách chronickej toxicity a karcinogenity sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (7), ako aj v dvoch publikáciách Medzinárodného inštitútu prírodných vied (International Life Sciences Institute) (22) (23). Základná stratégia výberu dávky závisí od primárneho cieľa alebo cieľov štúdie (odsek 6). Pri výbere vhodných úrovní dávky je potrebné dosiahnuť rovnováhu medzi skríningom nebezpečnosti na jednej strane a charakterizáciou reakcie na nízke dávky a jej významu na druhej strane. To je v prípade tejto kombinovanej štúdie chronickej toxicity a karcinogenity veľmi dôležité.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Treba zvážiť vykonanie tejto kombinovanej štúdie chronickej toxicity a karcinogenity namiesto samostatného vykonania štúdie chronickej toxicity (kapitola B.30 tejto prílohy) a štúdie karcinogenity (kapitola B.32 tejto prílohy). Kombinovaným testom sa zabezpečí vyššia účinnosť, pokiaľ ide o čas a náklady, a o niečo menšie využívanie zvierat ako v prípade vykonania dvoch samostatných štúdií bez toho, aby sa znížila kvalita údajov, či už vo fáze chronickej toxicity alebo vo fáze karcinogenity. V prípade kombinovanej štúdie chronickej toxicity a karcinogenity však treba náležite zohľadniť zásady výberu dávky (odseky 11 a 22 – 26), pričom sa takisto pripúšťa, že v určitých regulačných rámcoch sa môže vyžadovať vykonanie samostatných štúdií. Ďalšie usmernenia o príprave kombinovanej štúdie chronickej toxicity a karcinogenity s cieľom dosiahnuť maximálnu účinnosť štúdie v súvislosti s možnosťami zníženia počtu použitých zvierat, ako aj prostredníctvom zefektívnenia jednotlivých experimentálnych postupov sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (7).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Vymedzenie pojmov použitých v súvislosti s touto testovacou metódou je uvedené na konci tejto kapitoly a v usmerňovacom dokumente (GD) č. 116 (7).
                           
                        PRINCÍP TESTU
                  
                              14.
                           
                           
                              Plán štúdie pozostáva z dvoch paralelných fáz, fázy chronickej toxicity a fázy karcinogenity (ich trvania sú uvedené v odsekoch 34 a 35). Testovaná chemikália sa zvyčajne podáva orálne, aj keď môže byť vhodné aj testovanie inhalačnej alebo dermálnej expozície. Počas fázy chronickej toxicity sa testovaná chemikália podáva denne v odstupňovaných dávkach niekoľkým skupinám testovacích zvierat (jedna úroveň dávky na skupinu), zvyčajne počas 12 mesiacov, hoci v závislosti od regulačných požiadaviek možno zvoliť aj dlhšie alebo kratšie obdobia (pozri odsek 34). Vybraté obdobie by malo byť dostatočne dlhé, aby sa mohli prejaviť účinky kumulatívnej toxicity, ale bez toho, aby testovanie zmarili zmeny súvisiace so starnutím zvierat. Plán štúdie môže zahŕňať aj jedno alebo viaceré priebežné utratenia, napr. po troch a šiestich mesiacoch, pričom na doplnenie počtu je možné použiť ďalšie skupiny zvierat (pozri odsek 20). Počas fázy karcinogenity sa testovaná chemikália podáva denne niekoľkým skupinám testovacích zvierat po väčšinu dĺžky ich života. Na zvieratách sa v oboch fázach dôkladne pozorujú príznaky toxicity a tvorba nádorových poškodení. Pitva sa uskutoční na zvieratách uhynutých alebo usmrtených počas testovania, ako aj po ukončení testu na zvieratách, ktoré test prežijú.
                           
                        OPIS METÓDY
                  
                     Výber druhov zvierat
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda primárne zahŕňa posudzovanie a vyhodnocovanie chronickej toxicity karcinogenity pri hlodavcoch (odsek 2). Použitie nehlodavcov sa môže zvážiť, ak z dostupných údajov vyplýva, že to má pre predpovedanie zdravotných účinkov u ľudí väčší význam. Výber druhu zvierat je potrebné odôvodniť. Najvhodnejším hlodavcom je potkan, hoci sa môžu použiť aj iné hlodavce, napr. myši. Hoci používanie myší pri testovaní karcinogenity môže mať obmedzený význam (24) (25) (26), niektoré súčasné regulačné programy stále vyžadujú testovanie karcinogenity na myšiach, pokiaľ sa nestanoví, že takáto štúdia nie je z vedeckého hľadiska potrebná. Potkany a myši sú uprednostňované pokusné modely vzhľadom na ich relatívne krátku dĺžku života, ich rozsiahle využívanie vo farmakologických a toxikologických štúdiách, ich náchylnosť na indukciu nádoru a dostupnosť dostatočne charakterizovaných kmeňov. Vzhľadom na tieto charakteristiky je k dispozícii veľké množstvo informácií o ich fyziológii a patológii. Príprava a vykonanie štúdií chronickej toxicity/karcinogenity pri nehlodavcoch, ak sa požadujú, by mali byť založené na zásadách uvedených v tejto testovacej metóde, ako aj na zásadách uvedených v kapitole B.27 tejto prílohy, 90-dňová štúdia orálnej toxicity pri nehlodavcoch v opakovaných dávkach (6). Ďalšie informácie o výbere druhov a kmeňa zvierat sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (7).
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Používajú sa mladé zdravé dospelé zvieratá bežne používaných laboratórnych kmeňov. Kombinovaná štúdia chronickej toxicity/karcinogenity sa vykonáva na zvieratách z toho istého kmeňa a zdroja, ako sú zvieratá použité v predbežnej štúdii (štúdiách) toxicity v kratšom trvaní, hoci ak je známe, že pri zvieratách z tohto istého kmeňa a zdroja sa pri dlhodobých štúdiách problematicky dosahujú bežne akceptované kritériá prežitia [pozri usmerňovací dokument č. 116 (7)], je nutné zvážiť použitie kmeňa zvierat s prijateľnou mierou prežitia v dlhodobej štúdii. Používajú sa samice, ktoré nikdy nevrhli mláďatá a sú negravidné.
                           
                        
                     Podmienky umiestnenia a kŕmenia
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Zvieratá môžu byť umiestnené jednotlivo alebo v malých skupinách rovnakého pohlavia v klietkach. Samostatné umiestnenie by sa malo zvážiť iba v prípade, že je to vedecky opodstatnené (27) (28) (29). Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy vzhľadom na ich umiestnenie. Teplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by mala byť 22 °C (± 3 °C). Hoci relatívna vlhkosť by mala byť najmenej 30 % a prednostne by nemala presiahnuť 70 %, okrem času čistenia miestnosti, cieľom by mala byť 50 – 60 % vlhkosť. Osvetlenie by malo byť umelé a malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Potrava musí vyhovovať všetkým výživovým požiadavkám pre testované druhy zvierat a obsah kontaminantov potravy vrátane rezíduí pesticídov, perzistentných organických látok, fytoestrogénov, ťažkých kovov, mykotoxínov a iných kontaminantov, ktoré môžu mať vplyv na výsledky testu, musí byť čo najnižší. Analytické informácie o úrovni živín a kontaminantov potravy by sa mali získavať priebežne, aspoň na začiatku štúdie a pri zmene používanej šarže, a mali by sa uviesť v záverečnej správe. Podobne treba uviesť analytické informácie o pitnej vode použitej v štúdii. Výber krmiva môže byť ovplyvnený potrebou zabezpečiť vhodnú prímes testovanej chemikálie a potrebou splniť výživové požiadavky pri zvieratách v prípade, že sa testovaná chemikália podáva v potrave.
                           
                        
                     Príprava zvierat
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Použijú sa zdravé zvieratá, ktoré sa aklimatizovali na laboratórne podmienky aspoň sedem dní a ktoré sa predtým nepodrobili iným pokusom. V prípade hlodavcov sa musí dávkovanie začať čo najskôr po odstavení mláďat a aklimatizácii a podľa možnosti skôr, než zvieratá dovŕšia vek ôsmich týždňov. Pokusné zvieratá sa charakterizujú na základe druhu, kmeňa, zdroja, pohlavia, hmotnosti a veku. Na začiatku štúdie má byť rozdiel medzi hmotnosťami použitých zvierat z každého pohlavia minimálny a pre každé pohlavie zvlášť nemá presahovať ± 20 % priemernej hmotnosti všetkých zvierat v štúdii. Zvieratá by mali byť postupne zadelené do kontrolných a testovaných skupín. Po randomizácii by medzi jednotlivými skupinami v rámci každého pohlavia nemali byť výrazné rozdiely v priemernej telesnej hmotnosti. Ak existujú štatisticky významné rozdiely, randomizácia by sa podľa možnosti mala zopakovať. Každému zvieraťu sa pridelí jedinečné identifikačné číslo, ktorým sa zviera trvalo označí tetovaním, mikročipovým implantátom alebo inou vhodnou metódou.
                           
                        POSTUP
                  
                     Počet zvierat a ich pohlavie
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Použijú sa obe pohlavia. Použije sa dostatočný počet zvierat, aby bolo možné dôkladné biologické a štatistické hodnotenie. V prípade hlodavcov by preto v každej skupine s dávkou (ako sa uvádza v odseku 22) a v súbežnej kontrolnej skupine určenej pre fázu karcinogenity tejto štúdie malo byť minimálne 50 zvierat z každého pohlavia. V závislosti od cieľa štúdie je možné zvýšiť štatistickú významnosť kľúčových odhadov tak, že sa zvieratá nerovnomerne rozdelia do jednotlivých skupín s dávkami, pričom v skupinách s nízkou dávkou bude viac ako 50 zvierat, napr. pri odhadovaní karcinogénneho potenciálu pri nízkych dávkach. Treba však uznať, že miernym zvýšením počtu zvierat v skupine sa dosiahne pomerne nízke zvýšenie štatistickej významnosti štúdie. V každej skupine s dávkou (ako sa uvádza v odseku 22) a v súbežnej kontrolnej skupine určenej pre fázu chronickej toxicity štúdie by v prípade hlodavcov malo byť minimálne desať zvierat z každého pohlavia. Treba poznamenať, že tento počet je nižší ako pri štúdii chronickej toxicity (kapitola B.30 tejto prílohy). Interpretácia údajov zo zníženého počtu zvierat v skupine vo fáze chronickej toxicity tejto kombinovanej štúdie však bude podložená údajmi z väčšieho počtu zvierat vo fáze karcinogenity štúdie. V štúdiách, v ktorých sa využívajú myši, môže byť na uskutočnenie všetkých požadovaných hematologických vyšetrení potrebné vo fáze chronickej toxicity použiť v každej skupine s dávkou viac zvierat. Ďalšie informácie o štatistickom plánovaní štúdie a výbere úrovní dávok s cieľom maximalizovať štatistickú významnosť sú k dispozícii v usmerňovacom dokumente č. 116 (7).
                           
                        
                     Zabezpečenie priebežného utrácania, satelitnej skupiny a sentinelových zvierat
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Ak je to vedecky opodstatnené, v štúdii sa môže počítať s priebežným utrácaním, napr. po šiestich mesiacoch pre fázu chronickej toxicity, s cieľom získať informácie o progresii nenádorových zmien a mechanistické informácie. Ak už takéto informácie o testovanej chemikálii sú k dispozícii z predchádzajúcich štúdií toxicity v opakovaných dávkach, priebežné utrácanie zvierat nie je vedecky opodstatnené. Zvieratá použité vo fáze chronickej toxicity štúdie, zvyčajne v trvaní 12 mesiacov (odsek 34), poskytujú údaje o priebežnom utrácaní pre fázu karcinogenity štúdie, čím sa dosiahne zníženie celkového počtu použitých zvierat. Vo fáze chronickej toxicity štúdie možno použiť aj satelitné skupiny na monitorovanie reverzibility akýchkoľvek toxikologických zmien spôsobených skúmanou testovanou chemikáliou. Tieto skupiny sa môžu obmedzovať na najvyššiu úroveň dávky v štúdii a na kontrolu. Na monitorovanie stavu choroby možno počas štúdie v prípade potreby použiť ďalšiu skupinu sentinelových zvierat (zvyčajne päť zvierat z každého pohlavia) (30). Ďalšie usmernenia o príprave štúdie s cieľom zahrnúť priebežné utrácanie, satelitné a sentinelové zvieratá a súčasne minimalizovať celkový počet použitých zvierat sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (7).
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Ak sa v rámci štúdie plánuje použitie satelitných zvierat a/alebo priebežné utrácanie zvierat, v každej skupine s dávkou zahrnutej na tento účel je zvyčajne desať zvierat z každého pohlavia, pričom celkový počet zvierat zahrnutých v pláne štúdie by sa mal zvýšiť o počet zvierat, ktoré majú byť utratené pred dokončením štúdie. Priebežne utratené zvieratá a satelitné zvieratá sa zvyčajne podrobia tým istým pozorovaniam vrátane pozorovaní telesnej hmotnosti, spotreby potravy/vody, hematologickým meraniam a meraniam klinickej biochémie a patologickým vyšetreniam ako zvieratá vo fáze chronickej toxicity v rámci základnej štúdie, hoci sa takisto môže zabezpečiť, aby sa (v skupinách, v ktorých sa plánuje priebežné utrácanie zvierat) merania obmedzili na špecifické kľúčové ukazovatele, ako je neurotoxicita alebo imunotoxicita.
                           
                        
                     Skupiny s dávkami a dávkovanie
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Usmernenia o všetkých aspektoch výberu dávky a odstupoch medzi jednotlivými úrovňami dávok sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (7). Pre fázu chronickej toxicity aj fázu karcinogenity sa použijú aspoň tri veľkosti dávok a vykoná sa paralelná kontrola. Úroveň dávky zvyčajne vychádza z výsledkov krátkodobých štúdií v opakovaných dávkach alebo štúdií na zistenie rozsahu, pričom je potrebné prihliadať na existujúce toxikologické a toxikokinetické údaje, ktoré sú o testovanej chemikálii alebo príbuzných chemikáliách k dispozícii.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Pre fázu chronickej toxicity štúdie nemusí byť potrebné vykonať kompletnú štúdiu s využitím troch úrovní dávok, ak sa predpokladá, že test pri jednej úrovni dávky zodpovedajúcej najmenej 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň pravdepodobne nespôsobí nepriaznivé účinky. Toto rozhodnutie musí byť založené na informáciách z predbežných štúdií a zvážení skutočnosti, že podľa údajov o štrukturálne príbuzných chemikáliách sa toxicita neočakáva. Uplatňuje sa limit 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň s výnimkou prípadu, keď expozícia človeka indikuje potrebu použitia vyššej úrovne dávky.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Pokiaľ to dovoľuje fyzikálno-chemický charakter alebo biologické účinky testovanej chemikálie, na identifikáciu hlavných cieľových orgánov a toxických účinkov by sa mala vybrať najvyššia úroveň dávky, ktorá súčasne nebude mať za následok utrpenie, závažnú toxicitu, morbiditu alebo uhynutie. Zvyčajne sa vyberie najvyššia úroveň dávky preukazujúca toxicitu, o ktorej svedčí napríklad pokles prírastku telesnej hmotnosti (o približne 10 %). V závislosti od cieľov štúdie (pozri odsek 6) však možno vybrať najvyššiu dávku, ktorá je nižšia ako dávka preukazujúca toxicitu, napr. ak dávka vyvoláva daný nepriaznivý účinok, ktorý má však malý vplyv na dĺžku života alebo na telesnú hmotnosť.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Úrovne dávok a odstupy medzi úrovňami dávok možno vybrať s cieľom určiť vzťah medzi dávkou a reakciou a v závislosti od druhu pôsobenia testovanej chemikálie hladinu NOAEL alebo iný plánovaný výsledok štúdie, napr. BMD (pozri odsek 27). Medzi faktory, ktoré by sa mali zvážiť pri podávaní nižších dávok, patrí predpokladaný sklon krivky závislosti reakcie od dávky, dávky, pri ktorých môže dochádzať k významným zmenám v metabolizme alebo druhu toxického pôsobenia, keď sa očakáva prahová hodnota alebo keď sa očakáva východisko pre extrapoláciu nízkej dávky. Pri kombinovanej štúdii karcinogenity/chronickej toxicity je primárnym cieľom získať informácie na účely hodnotenia rizika karcinogenity, pričom informácie o chronickej toxicite sú zvyčajne vedľajším cieľom. Tento fakt treba mať pri výbere úrovní dávok a odstupov medzi úrovňami dávok v štúdii na pamäti.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Vybraté odstupy medzi úrovňami dávok budú závisieť od cieľov štúdie a vlastností testovanej chemikálie a nemožno ich v rámci tejto testovacej metódy podrobne predpísať, ale dobrá účinnosť testov sa často dosahuje, ak sa na stanovenie zostupného dávkovania použijú intervaly dávkovania s faktorom dva až štyri, pričom pridanie štvrtej pokusnej skupiny je často vhodnejšie ako používanie veľmi veľkých intervalov (napr. s faktorom vyšším ako 6 – 10) medzi dávkami. Vo všeobecnosti by sa nemali používať faktory vyššie ako 10 a v prípade, že sa použijú, je nutné tento postup odôvodniť.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Ako sa ďalej uvádza v usmerňovacom dokumente č. 116 (7), pri výbere dávky je potrebné zvážiť tieto body:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          známe alebo predpokladané nelinearity alebo inflexné body krivky závislosti reakcie od dávky,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toxikokinetika a rozsahy dávok, pri ktorých dochádza alebo nedochádza k metabolickej indukcii, nasýteniu alebo nelinearite medzi externými a internými dávkami,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          prekurzorné poškodenia, markery účinkov alebo ukazovatele prebiehajúcich kľúčových základných biologických procesov,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kľúčové (alebo predpokladané) aspekty druhu pôsobenia, ako sú dávky, pri ktorých začína vznikať cytotoxicita, narúšajú sa hormonálne hladiny, preťažujú sa homeostatické mechanizmy atď.,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          oblasti krivky závislosti reakcie od dávky, kde je potrebný veľmi podrobný odhad, napr. v oblasti predpokladanej dávky BMD alebo predpokladanej prahovej úrovne,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          zváženie očakávaných úrovní expozície človeka, najmä pri výbere stredných a nízkych dávok.
                                       
                                    
                        
                              28.
                           
                           
                              Kontrolnou skupinou je skupina, ktorá nebola vystavená účinkom chemikálie, alebo skupina, ktorej sa podáva nosič, ak sa pri podávaní testovanej chemikálie používa nosič. So zvieratami v kontrolnej skupine sa musí zaobchádzať takisto ako so zvieratami v testovaných skupinách, s výnimkou aplikovania testovanej chemikálie. Ak sa použije nosič, kontrolná skupina dostane nosič v najvyššom objeme, aký bol použitý pri skupinách s dávkami. Ak sa testovaná chemikália podáva v potrave a vedie k výraznému zníženiu príjmu potravy v dôsledku zvýšeného nechutenstva, môže byť užitočné použiť ďalšiu súčasne kŕmenú kontrolnú skupinu, ktorá poslúži ako vhodnejšia kontrola.
                           
                        
                     Príprava dávok a podávanie testovanej chemikálie
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Testovaná chemikália sa zvyčajne podáva orálne, v potrave alebo pitnej vode alebo cez sondu. Ďalšie informácie o spôsoboch a metódach podávania sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (7). Spôsob a metóda podávania závisí od účelu štúdie, fyzikálnych/chemických vlastností testovanej chemikálie, jej biodostupnosti a prevládajúceho spôsobu a metódy expozície u človeka. Vybratý spôsob a metódu podávania je potrebné odôvodniť. V záujme zabezpečenia dobrých životných podmienok pre zvieratá sa orálna sonda zvyčajne zvolí iba v prípade látok, pri ktorých spôsob a metóda podávania primerane reprezentuje potenciálnu expozíciu u človeka (napr. v prípade liekov). Potravinové alebo environmentálne chemikálie obsahujúce pesticídy sa zvyčajne podávajú v potrave alebo v pitnej vode. V určitých prípadoch, napr. v prípade expozície na pracovisku, však môže byť vhodnejšie podanie iným spôsobom.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Ak je to potrebné, testovaná chemikália sa rozpustí alebo suspenduje vo vhodnom nosiči. Náležitá pozornosť by sa mala venovať nasledujúcim vlastnostiam nosiča a ostatným aditívam: vplyv na absorpciu, distribúciu, metabolizmus alebo zadržiavanie testovanej chemikálie, vplyvy na chemické vlastnosti testovanej chemikálie, ktoré môžu zmeniť svoje toxické vlastnosti, vplyv na spotrebu potravy a vody alebo na stav výživy zvierat. Odporúča sa, aby sa vždy, keď je to možné, najskôr zvážilo použitie vodného roztoku/suspenzie, potom roztoku/emulzie v oleji (napr. kukuričný olej) a nakoniec prípadného roztoku v iných nosičoch. Charakteristiky toxicity nosičov iných ako voda musia byť známe. Musia byť k dispozícii informácie o stabilite testovanej chemikálie a homogenite dávkovacích roztokov alebo krmív (podľa potreby) v podmienkach podávania (napr. v potrave).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              V prípade chemikálií podávaných v potrave alebo pitnej vode je dôležité zabezpečiť, aby množstvá použitej testovanej chemikálie neinterferovali s normálnou výživovou a vodnou bilanciou. V dlhodobých štúdiách toxicity, pri ktorých sa využíva podávanie v potrave, by koncentrácia testovanej chemikálie v krmive zvyčajne nemala presiahnuť horný limit 5 % z celkového množstva krmiva, aby sa zabránilo nutričnej nevyváženosti. Ak je testovaná chemikália podávaná v potrave, môže sa použiť buď konštantná stravná koncentrácia (mg/kg potravy alebo ppm) alebo konštantná úroveň dávky vzhľadom na telesnú hmotnosť zvieraťa (mg/kg telesnej hmotnosti), ktorá sa vypočíta každý týždeň. Použitú alternatívu je potrebné špecifikovať.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              V prípade orálneho podávania sa zvieratám podávajú dávky testovanej chemikálie denne (sedem dní v týždni) počas 12 mesiacov (fáza chronickej toxicity) alebo 24 mesiacov (fáza karcinogenity), pozri aj odseky 33 a 34. Použitie každého iného režimu dávkovania, napr. päť dní v týždni, sa musí odôvodniť. V prípade podávania cez kožu sa zvieratám zvyčajne aplikuje testovaná chemikália najmenej šesť hodín denne, sedem dní v týždni, ako je uvedené v kapitole B.9 tejto prílohy (11), počas 12 mesiacov (fáza chronickej toxicity) alebo 24 mesiacov (fáza karcinogenity). Inhalačná expozícia sa vykonáva šesť hodín denne, sedem dní v týždni, ale ak je to odôvodnené, môže sa použiť aj expozícia počas piatich dní v týždni. Obdobie expozície zvyčajne trvá 12 mesiacov (fáza chronickej toxicity) alebo 24 mesiacov (fáza karcinogenity). Ak sa v prípade iných hlodavcov ako potkanov použije expozícia oblasti nosa, maximálne trvanie expozície je možné prispôsobiť s cieľom minimalizovať druhovo špecifické utrpenie. Ak sa použije expozícia v trvaní menej ako šesť hodín denne, treba uviesť odôvodnenie. Pozri aj kapitolu B.8 tejto prílohy (9).
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Ak sa testovaná chemikália zvieratám podáva cez sondu, podáva sa prostredníctvom žalúdočnej sondy alebo vhodnej intubačnej kanyly približne v rovnakom čase každý deň. Zvyčajne sa podáva jedna dávka raz za deň. Ak je napríklad chemikália lokálne dráždivá, je možné zachovať dennú dávku tak, že sa rozdelí a podá v dvoch častiach (dvakrát denne). Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorazovo podať, závisí od veľkosti pokusného zvieraťa. Objem by mal byť podľa možnosti čo najnižší a v prípade hlodavcov by zvyčajne nemal presahovať 1 ml/100 g telesnej hmotnosti (31). Zmeny v aplikovanom objeme sa minimalizujú tým, že sa koncentrácie upravia tak, aby sa zabezpečil stály objem vo všetkých dávkach. Výnimkou sú potenciálne žieravé alebo dráždivé chemikálie, ktoré je nutné zriediť, aby sa predišlo závažným lokálnym účinkom. Nemalo by sa testovať pri koncentráciách, ktoré sú pravdepodobne žieravé alebo dráždivé pre gastrointestinálny trakt.
                           
                        
                     Trvanie štúdie
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Obdobie dávkovania a trvanie fázy chronickej toxicity je zvyčajne 12 mesiacov, hoci plán štúdie možno použiť aj pri štúdiách s kratším (napr. šesť alebo deväť mesiacov) alebo dlhším trvaním (napr. 18 alebo 24 mesiacov) v závislosti od požiadaviek konkrétnych regulačných režimov alebo špecifických mechanistických účelov. Odchýlky od 12-mesačného trvania expozície je potrebné odôvodniť, najmä v prípade kratších trvaní. Všetky skupiny s dávkami umiestnené v tejto fáze budú ukončené v plánovanom čase na účely hodnotenia chronickej toxicity a nenádorovej patológie. Satelitné skupiny zahrnuté s cieľom monitorovať reverzibilitu všetkých toxikologických zmien spôsobených skúmanou testovanou chemikáliou by sa mali zachovať bez dávkovania počas najmenej štyroch týždňov a najviac počas jednej tretiny celkového trvania štúdie po ukončení expozície.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Fáza karcinogenity tejto štúdie v prípade hlodavcov zvyčajne trvá 24 mesiacov, čo predstavuje väčšiu časť normálnej dĺžky života zvierat, ktoré sa majú použiť. V závislosti od dĺžky života kmeňa živočíšneho druhu v štúdii možno použiť aj kratšie alebo dlhšie trvanie, ale tento postup je nutné odôvodniť. V prípade určitých kmeňov myší, napr. kmeňov AKR/J, C3H/J alebo C57BL/6J, môže byť vhodná štúdia v trvaní 18 mesiacov. Nasledujúce informácie poskytujú usmernenia k trvaniu, ukončeniu štúdie a prežitiu. Ďalšie usmernenia vrátane úvah o prijateľnosti negatívnej štúdie karcinogenity v súvislosti s prežitím počas štúdie sú uvedené v Usmerňovacom dokumente č. 116 o príprave a vykonávaní štúdií chronickej toxicity a karcinogenity (7):
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Ukončenie štúdie treba zvážiť, ak počet zvierat, ktoré prežili v skupinách s nižšou dávkou alebo v kontrolnej skupine, klesne pod 25 %.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Ak v dôsledku toxicity predčasne uhynie iba skupina s vysokou dávkou, štúdia by sa nemala ukončiť.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Prežitie sa pri jednotlivých pohlaviach posudzuje samostatne.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Trvanie štúdie by nemalo presiahnuť hranicu, pri ktorej už údaje získané pomocou štúdie nepostačujú na vykonanie štatisticky platného hodnotenia.
                                       
                                    
                        POZOROVANIA (FÁZA CHRONICKEJ TOXICITY)
                  
                              36.
                           
                           
                              Pri všetkých zvieratách si treba všímať morbiditu alebo mortalitu, zvyčajne na začiatku a na konci každého dňa vrátane víkendov a sviatkov. Všeobecné klinické pozorovania sa vykonávajú najmenej raz denne, najlepšie každý deň v rovnakom čase, vzhľadom na časový vrchol očakávaných účinkov po dávkovaní v prípade podávania cez sondu.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Všetky zvieratá sa pred prvou expozíciou najmenej raz podrobia dôkladným klinickým pozorovaniam (aby sa umožnilo porovnávanie jednotlivých zvierat navzájom), potom na konci prvého týždňa štúdie a následne každý mesiac. Protokol o pozorovaniach musí byť pripravený tak, aby sa rozdiely medzi jednotlivými pozorovateľmi minimalizovali a neboli závislé od testovacej skupiny. Tieto pozorovania sa vykonávajú mimo domovskej klietky, radšej v štandardnej aréne a v podobnom čase pri každej príležitosti. Musia byť pozorne zaznamenané, pokiaľ možno s použitím hodnotiaceho systému explicitne vymedzeného testovacím laboratóriom. Je potrebné minimalizovať odlišnosti v podmienkach pozorovaní. Medzi príznaky, ktoré je potrebné si všímať, patria zmeny na koži, srsti, očiach, sliznici, výskyt sekrécie, exkrécie a vegetatívnej aktivity (napr. slzenie, piloerekcia, veľkosť zreničiek, nezvyčajné dýchanie), ale uvedené príznaky nie sú vyčerpávajúce. Zmeny v chôdzi, držaní tela a reakcii na zaobchádzanie, ako aj prítomnosť klonických alebo napätých pohybov, stereotypov (napr. opakované točenie sa), prílišné ošetrovanie sa alebo zvláštne správanie (napr. chôdza dozadu, sebaznetvorenie) sa takisto musia zaznamenať (32).
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Pred prvým podaním testovanej chemikálie sa pri všetkých zvieratách vykoná oftalmologické vyšetrenie pomocou oftalmoskopu alebo iného vhodného zariadenia. Na konci štúdie sa toto vyšetrenie podľa možnosti vykoná pri všetkých zvieratách, ale minimálne pri zvieratách v skupine s vysokou dávkou a zvieratách v kontrolnej skupine. Ak sa po vystavení zvierat účinkom látky zistia zmeny na očiach, musia byť vyšetrené všetky zvieratá. Ak štrukturálna analýza alebo iné informácie indikujú toxicitu očí, potom je potrebné zvýšiť frekvenciu očných vyšetrení.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              V prípade chemikálií, pri ktorých predchádzajúce 28-dňové a/alebo 90-dňové testy toxicity v opakovaných dávkach indikovali potenciál vyvolať neurotoxické účinky, sa môže nepovinne vykonať určenie zmyslovej reaktivity podnecovanej rôznymi spôsobmi (32) (napr. zvukovými, zrakovými a proprioceptívnymi podnetmi) (33) (34) (35), hodnotenie sily zovretia (36) a hodnotenie motorickej aktivity (37), a to pred začiatkom štúdie a každé tri mesiace po začatí štúdii počas až 12 mesiacov, ako aj pri ukončení štúdie (ak štúdia trvá dlhšie ako 12 mesiacov). Ďalšie podrobnosti o postupoch, ktoré môžu nasledovať, sú uvedené v príslušných odkazoch. Možno však použiť aj iné alternatívne postupy k postupom, ktoré tu boli opísané.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              V prípade chemikálií, pri ktorých predchádzajúce 28-dňové a/alebo 90-dňové testy toxicity v opakovaných dávkach indikovali potenciál vyvolať imunotoxické účinky, možno nepovinne na konci testu vykonať ďalšie vyšetrenia tohto parametra.
                           
                        
                     Telesná hmotnosť, spotreba potravy/vody a účinnosť krmiva
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Všetky zvieratá sa odvážia na začiatku testu, najmenej raz týždenne počas prvých 13 týždňov a následne najmenej raz za mesiac. Spotreba potravy a účinnosť krmiva sa merajú najmenej raz za týždeň počas prvých 13 týždňov a následne najmenej raz za mesiac. Ak sa testovaná chemikália podáva vo vode na pitie, spotreba vody sa meria najmenej raz za týždeň počas prvých 13 týždňov a následne najmenej raz za mesiac. Merania spotreby vody by sa mali zvážiť aj v prípade štúdií, pri ktorých sa mení pitný režim.
                           
                        
                     Hematológia a klinická biochémia
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              V štúdiách využívajúcich hlodavce sa hematologické vyšetrenia vykonajú pri všetkých zvieratách v štúdii (desiatich samcoch a desiatich samiciach v každej skupine), a to po 3, 6 a 12 mesiacoch, a takisto na konci štúdie (ak štúdia trvá dlhšie ako 12 mesiacov). V prípade myší môžu byť na uskutočnenie všetkých požadovaných hematologických vyšetrení potrebné satelitné zvieratá (pozri odsek 19). V prípade štúdií nehlodavcov sa vzorky odoberú menšiemu počtu zvierat (napr. v prípade štúdií psov štyrom zvieratám z každého pohlavia v každej skupine), a to v priebežných časoch na odber vzoriek a na konci štúdie, podobne ako sa uvádza pri štúdiách hlodavcov. Pri hlodavcoch ani nehlodavcoch nie je nutné vykonať merania po troch mesiacoch, ak v predchádzajúcej 90-dňovej štúdii vykonanej pri porovnateľných úrovniach dávok nebol na hematologických parametroch pozorovaný žiadny účinok. Vzorky krvi sa odoberajú v anestézii zo stanoveného miesta, napríklad vpichom do srdca alebo zo zadnej očnicovej dutiny.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Je potrebné vyšetriť tieto parametre (38): celkový a diferenciálny počet leukocytov, počet erytrocytov, počet trombocytov, koncentrácia hemoglobínu, hematokrit, stredný objem erytrocytu (MCV), stredná koncentrácia hemoglobínu v erytrocyte (MCH), stredná farebná koncentrácia hemoglobínu (MCHC), protrombínový čas a aktivovaný parciálny tromboplastínový čas. Podľa potreby sa v závislosti od toxicity testovanej chemikálie môžu merať ďalšie hematologické parametre, ako sú Heinzove telieska alebo iná atypická morfológia erytrocytov alebo methemoglobín. Vo všeobecnosti treba zaujať flexibilný postoj v závislosti od pozorovaného a/alebo očakávaného účinku danej testovanej chemikálie. Ak má testovaná chemikália vplyv na hematopoetický systém, môže byť indikovaný aj počet retikulocytov a cytológia kostnej drene, hoci tieto vyšetrenia sa bežne nemusia vykonávať.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Klinická biochémia skúma hlavné toxické účinky na tkanivá a najmä účinky na obličky a pečeň. Vyšetrenie sa uskutočňuje zo vzoriek krvi, ktoré sa odoberú všetkým zvieratám v štúdii (desiatim samcom a desiatim samiciam z každej skupiny) v tých istých časových intervaloch, ako je špecifikované pre hematologické vyšetrenia. V prípade myší môžu byť na uskutočnenie všetkých požadovaných vyšetrení klinickej biochémie potrebné satelitné zvieratá. V prípade štúdií nehlodavcov sa vzorky odoberú menšiemu počtu zvierat (napr. v prípade štúdií psov štyrom zvieratám z každého pohlavia v každej skupine), a to v priebežných časoch na odber vzoriek a na konci štúdie, ako sa uvádza pri štúdiách hlodavcov. Pri hlodavcoch ani nehlodavcoch nie je nutné vykonať merania po troch mesiacoch, ak v predchádzajúcej 90-dňovej štúdii vykonanej pri porovnateľných úrovniach dávok nebol na parametroch klinickej biochémie pozorovaný žiadny účinok. Odporúča sa, aby sa zvieratá (s výnimkou myší) noc pred odobratím vzoriek krvi nekŕmili (10). Je potrebné vyšetriť tieto parametre (38): glukóza, močovina (močovinový dusík), kreatinín, celkový obsah bielkovín, albumín, vápnik, sodík, draslík, celkový cholesterol, najmenej dva vhodné testy na hepatocelulárne hodnotenie (alanín-aminotransferáza, aspartát-aminotransferáza, glutamát-dehydrogenáza, celkový obsah žlčových kyselín) (39) a najmenej dva vhodné testy na hepatobiliárne hodnotenie (alkalín-fosfatáza, gama-glutamyl-transferáza, 5-nukleotidáza, celkový bilirubín, celkový obsah žlčových kyselín) (39). Podľa potreby sa v závislosti od toxicity testovanej chemikálie môžu merať ďalšie parametre klinickej chémie, ako je hladina triglyceridov nalačno, špecifické hormóny a cholínsteráza. Vo všeobecnosti treba zaujať flexibilný postoj v závislosti od pozorovaného a/alebo očakávaného účinku danej testovanej chemikálie.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Rozbor moču sa vykonáva pri všetkých zvieratách v štúdii (desiatich samcoch a desiatich samiciach v každej skupine) zo vzoriek odobratých v rovnakých intervaloch ako v prípade hematológie a klinickej chémie. Nie je nutné vykonať merania po troch mesiacoch, ak v predchádzajúcej 90-dňovej štúdii vykonanej pri porovnateľných úrovniach dávok nebol v rozbore moču pozorovaný žiadny účinok. Do odborného odporúčania pre štúdie klinickej patológie bol zahrnutý tento zoznam parametrov (38): vzhľad, objem, osmolalita alebo špecifická váha, pH, celkový obsah bielkovín a glukóza. Medzi ostatné parametre patria ketón, urobilinogén, bilirubín a okultné krvácanie. Ďalšie parametre sa môžu použiť, ak je potrebné rozšíriť vyšetrovanie pozorovaných účinkov.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Vo všeobecnosti je potrebné určiť základné hematologické ukazovatele a ukazovatele klinickej biochémie pred začatím testovania v štúdiách psov, ale nemusia sa určiť v štúdiách hlodavcov (38). Ak však historické základné údaje (pozri odsek 58) nie sú adekvátne, treba uvažovať o získaní týchto údajov.
                           
                        PATOLÓGIA
                  
                     Makroskopická pitva
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Všetky zvieratá v štúdii sa zvyčajne podrobujú kompletnej podrobnej makroskopickej pitve, ktorá zahŕňa dôkladné skúmanie vonkajšieho povrchu tela, všetkých telesných otvorov a lebečnej, hrudnej a brušnej dutiny a ich obsahu. Môžu sa však takisto zabezpečiť (v prípade priebežného utrácania alebo satelitných skupín), aby sa merania obmedzovali na špecifické kľúčové ukazovatele, ako je neurotoxicita alebo imunotoxicita (pozri odsek 21). Tieto zvieratá sa nemusia podrobiť pitve ani ďalším postupom opísaným v nasledujúcich odsekoch. Pri sentinelových zvieratách môže byť v závislosti od konkrétneho prípadu potrebná pitva, o ktorej rozhodne vedúci štúdie.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Orgánové hmotnosti by sa mali zistiť pri všetkých zvieratách, s výnimkou tých, ktoré sú vylúčené podľa ďalšej časti odseku 47. Nadobličky, mozog, nadsemenníky, srdce, obličky, pečeň, vaječníky, slezina, semenníky, štítna žľaza (vážená po fixácii, s prištítnymi telieskami) a maternica zo všetkých zvierat (okrem tých, pri ktorých sa zistilo chradnutie alebo ktoré sa priebežne utratili) by sa mali upraviť na priľnavej tkanine a je potrebné čo najrýchlejšie po disekcii zistiť ich mokrú hmotnosť, aby sa predišlo vyschnutiu.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Tieto tkanivá by sa mali uchovávať v čo najvhodnejšom fixačnom médiu na obidva typy tkanív a na neskoršie histopatologické vyšetrenie (40) (vyšetrenia tkanív v hranatých zátvorkách sú nepovinné):
                              
                                          Všetky makroskopické poškodenia
                                       
                                       
                                          srdce
                                       
                                       
                                          pankreas
                                       
                                       
                                          žalúdok (predný žalúdok, žľaznatý žalúdok)
                                       
                                    
                                          nadoblička
                                       
                                       
                                          ileum
                                       
                                       
                                          prištítne teliesko
                                       
                                       
                                          [zuby]
                                       
                                    
                                          aorta
                                       
                                       
                                          lačník
                                       
                                       
                                          periférny nerv
                                       
                                       
                                          semenníky
                                       
                                    
                                          mozog (vrátane častí predného mozgu, mozočka a predĺženej miechy/mosta)
                                       
                                       
                                          oblička
                                       
                                       
                                          hypofýza
                                       
                                       
                                          týmus
                                       
                                    
                                          slepé črevo
                                       
                                       
                                          slzná žľaza (extraorbitálna)
                                       
                                       
                                          prostata
                                       
                                       
                                          štítna žľaza
                                       
                                    
                                          krčok maternice
                                       
                                       
                                          pečeň
                                       
                                       
                                          rektum
                                       
                                       
                                          [jazyk]
                                       
                                    
                                          koagulačná žľaza
                                       
                                       
                                          pľúca
                                       
                                       
                                          slinná žľaza
                                       
                                       
                                          priedušnica
                                       
                                    
                                          hrubé črevo
                                       
                                       
                                          lymfatické uzliny (povrchové aj hlboké)
                                       
                                       
                                          semenný mechúrik
                                       
                                       
                                          močový mechúr
                                       
                                    
                                          dvanástnik
                                       
                                       
                                          prsná žľaza (povinné pri samiciach, a ak je zrejmé, že možno urobiť disekciu, aj pri samcoch)
                                       
                                       
                                          kostrové svaly
                                       
                                       
                                          maternica (vrátane krčka maternice)
                                       
                                    
                                          nadsemenníky
                                       
                                       
                                          [horný dýchací trakt vrátane nosa, nosových mušlí a prínosových dutín]
                                       
                                       
                                          koža
                                       
                                       
                                          [močovod]
                                       
                                    
                                          oko (vrátane sietnice)
                                       
                                       
                                          pažerák
                                       
                                       
                                          miecha (na troch úrovniach: krčnej, hrudnej a lumbálnej)
                                       
                                       
                                          [močová rúra]
                                       
                                    
                                          [stehnová kosť s kĺbom]
                                       
                                       
                                          [čuchový bulbus]
                                       
                                       
                                          slezina
                                       
                                       
                                          vagína
                                       
                                    
                                          žlčník (v prípade iných druhov zvierat ako potkany)
                                       
                                       
                                          vaječníky
                                       
                                       
                                          [hrudná kosť]
                                       
                                       
                                          prierez kostnej drene a/alebo čerstvý aspirát kostnej drene
                                       
                                    
                                          Harderova žľaza
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    V prípade párových orgánov, ako sú napríklad obličky a nadobličky, sa zachovajú obidva orgány. Z klinických a iných nálezov môže vyplynúť potreba vyšetrenia ďalších tkanív. Takisto by sa mali zachovať všetky orgány, ktoré vzhľadom na známe vlastnosti testovanej chemikálie možno považovať za cieľové orgány. V štúdiách, v ktorých sa chemikália podáva dermálne, sa vyšetria tie isté orgány ako v prípade orálneho podávania, pričom je nevyhnutný špecifický odber vzorky a zachovanie kože z miesta aplikácie chemikálie. V inhalačných štúdiách sa zoznam zachovaných a skúmaných tkanív dýchacieho traktu zostaví na základe odporúčaní kapitoly B.8 tejto prílohy (9) a kapitoly B.29 tejto prílohy (10). Pokiaľ ide o orgány/tkanivá (a popri špecificky uchovávaných tkanivách dýchacieho traktu), je potrebné vyšetriť tie isté orgány ako v prípade orálnej expozície.
                           
                        
                     Histopatológia
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              K dispozícii sú usmernenia o dobrej praxi na vykonávanie štúdií toxikologickej patológie (40). Histopatologickým vyšetreniam sa podrobia minimálne:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          všetky tkanivá zo skupín s vysokou dávkou a kontrolných skupín,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všetky tkanivá zo zvierat, ktoré uhynuli alebo boli utratené v priebehu štúdie,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všetky tkanivá vykazujúce makroskopické abnormality,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          cieľové tkanivá alebo tkanivá, ktoré v skupinách s vysokou dávkou vykazujú zmeny spôsobené aplikáciou chemikálie, zo všetkých zvierat zo všetkých skupín s odlišným dávkovaním,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          v prípade párových orgánov, ako sú napríklad obličky alebo nadobličky, sa vyšetria obidva orgány.
                                       
                                    
                        POZOROVANIA (FÁZA KARCINOGENITY)
                  
                              51.
                           
                           
                              Pri všetkých zvieratách si treba všímať morbiditu alebo mortalitu, zvyčajne na začiatku a na konci každého dňa vrátane víkendov a sviatkov. Pri zvieratách sa navyše raz denne kontrolujú špecifické príznaky, ktoré majú toxikologický význam. V prípade štúdií, v ktorých sa chemikália podáva cez sondu, sa zvieratá kontrolujú okamžite po podaní dávky. Osobitnú pozornosť treba venovať tvorbe nádorov. Čas nástupu nádoru, lokalizáciu, rozmery, vzhľad a progresiu každého výrazne viditeľného alebo hmatateľného nádoru je nutné zaznamenať.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Všetky zvieratá sa odvážia na začiatku testu, najmenej raz týždenne počas prvých 13 týždňov a následne najmenej raz za mesiac. Spotreba potravy a účinnosť krmiva sa merajú najmenej raz za týždeň počas prvých 13 týždňov a následne najmenej raz za mesiac. Ak sa testovaná chemikália podáva vo vode na pitie, spotreba vody sa meria najmenej raz za týždeň počas prvých 13 týždňov a následne najmenej raz za mesiac. Merania spotreby vody by sa mali zvážiť aj v prípade štúdií, pri ktorých sa mení pitný režim.
                           
                        
                     Hematológia, klinická biochémia a iné merania
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              S cieľom maximalizovať informácie získané pomocou štúdie, najmä pokiaľ ide o úvahy týkajúce sa druhu pôsobenia, možno odobrať vzorky krvi na hematológiu a klinickú biochémiu, pričom rozhodnutie o tomto kroku ostáva na vedúcom štúdie. Takisto môže byť vhodné urobiť rozbor moču. Údaje o zvieratách použitých vo fáze chronickej toxicity štúdie, zvyčajne v trvaní 12 mesiacov (odsek 34), o týchto parametroch poskytnú informácie. Ďalšie usmernenia o význame odberu takýchto vzoriek v rámci štúdie karcinogenity sú uvedené v usmerňovacom dokumente č. 116 (7). Ak sa odoberú vzorky krvi, mali by sa odoberať na konci testovacieho obdobia hneď pred utratením alebo počas utrácania zvierat. Odoberajú sa v anestézii zo stanoveného miesta, napríklad vpichom do srdca alebo zo zadnej očnicovej dutiny. Takisto je možné na vyšetrenie pripraviť krvné stery, najmä ak sa zdá, že kostná dreň je cieľovým orgánom, hoci význam takéhoto vyšetrenia krvných sterov vo fáze karcinogenity pri hodnotení karcinogénneho/onkogénneho potenciálu sa spochybnil (38).
                           
                        PATOLÓGIA
                  
                     Makroskopická pitva
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              Všetky zvieratá v štúdii s výnimkou sentinelových zvierat a ostatných satelitných zvierat (pozri odsek 20) sa podrobujú kompletnej podrobnej makroskopickej pitve, ktorá zahŕňa dôkladné skúmanie vonkajšieho povrchu tela, všetkých telesných otvorov a lebečnej, hrudnej a brušnej dutiny a ich obsahu. Pri sentinelových a ostatných satelitných zvieratách môže byť v závislosti od konkrétneho prípadu potrebná pitva, o ktorej rozhodne vedúci štúdie. Orgánové hmotnosti zvyčajne nie sú súčasťou štúdie karcinogenity, keďže geriatrické zmeny a v neskorších štádiách tvorba nádorov znehodnocujú užitočnosť údajov o orgánových hmotnostiach. Môžu však mať veľký význam pri hodnotení váhy dôkazov, najmä v rámci úvah o druhu pôsobenia. Ak sú súčasťou satelitnej štúdie, zozbierajú sa najneskôr do jedného roka od začatia štúdie.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Tieto tkanivá by sa mali uchovávať v čo najvhodnejšom fixačnom médiu na obidva typy tkanív a na neskoršie histopatologické vyšetrenie (40) (vyšetrenia tkanív v hranatých zátvorkách sú nepovinné):
                              
                                          Všetky makroskopické poškodenia
                                       
                                       
                                          srdce
                                       
                                       
                                          pankreas
                                       
                                       
                                          žalúdok (predný žalúdok, žľaznatý žalúdok)
                                       
                                    
                                          nadoblička
                                       
                                       
                                          ileum
                                       
                                       
                                          prištítne teliesko
                                       
                                       
                                          [zuby]
                                       
                                    
                                          aorta
                                       
                                       
                                          lačník
                                       
                                       
                                          periférny nerv
                                       
                                       
                                          semenníky
                                       
                                    
                                          mozog (vrátane častí predného mozgu, mozočka a predĺženej miechy/mosta)
                                       
                                       
                                          oblička
                                       
                                       
                                          hypofýza
                                       
                                       
                                          týmus
                                       
                                    
                                          slepé črevo
                                       
                                       
                                          slzná žľaza (extraorbitálna)
                                       
                                       
                                          prostata
                                       
                                       
                                          štítna žľaza
                                       
                                    
                                          krčok maternice
                                       
                                       
                                          pečeň
                                       
                                       
                                          rektum
                                       
                                       
                                          [jazyk]
                                       
                                    
                                          koagulačná žľaza
                                       
                                       
                                          pľúca
                                       
                                       
                                          slinná žľaza
                                       
                                       
                                          priedušnica
                                       
                                    
                                          hrubé črevo
                                       
                                       
                                          lymfatické uzliny (povrchové aj hlboké)
                                       
                                       
                                          semenný mechúrik
                                       
                                       
                                          močový mechúr
                                       
                                    
                                          dvanástnik
                                       
                                       
                                          prsná žľaza (povinné pri samiciach, a ak je zrejmé, že možno urobiť disekciu, aj pri samcoch)
                                       
                                       
                                          kostrové svaly
                                       
                                       
                                          maternica (vrátane krčka maternice)
                                       
                                    
                                          nadsemenníky
                                       
                                       
                                          [horný dýchací trakt vrátane nosa, nosových mušlí a prínosových dutín]
                                       
                                       
                                          koža
                                       
                                       
                                          [močovod]
                                       
                                    
                                          oko (vrátane sietnice)
                                       
                                       
                                          pažerák
                                       
                                       
                                          miecha (na troch úrovniach: krčnej, hrudnej a lumbálnej)
                                       
                                       
                                          [močová rúra]
                                       
                                    
                                          [stehnová kosť s kĺbom]
                                       
                                       
                                          [čuchový bulbus]
                                       
                                       
                                          slezina
                                       
                                       
                                          vagína
                                       
                                    
                                          žlčník (v prípade iných druhov zvierat ako potkany)
                                       
                                       
                                          vaječníky
                                       
                                       
                                          [hrudná kosť]
                                       
                                       
                                          prierez kostnej drene a/alebo čerstvý aspirát kostnej drene
                                       
                                    
                                          Harderova žľaza
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    V prípade párových orgánov, ako sú napríklad obličky a nadobličky, sa zachovajú obidva orgány. Z klinických a iných nálezov môže vyplynúť potreba vyšetrenia ďalších tkanív. Takisto by sa mali zachovať všetky orgány, ktoré vzhľadom na známe vlastnosti testovanej chemikálie možno považovať za cieľové orgány. V štúdiách, v ktorých sa chemikália podáva dermálne, sa vyšetria tie isté orgány ako v prípade orálneho podávania, pričom je nevyhnutný špecifický odber vzorky a zachovanie kože z miesta aplikácie chemikálie. V inhalačných štúdiách sa zoznam zachovaných a skúmaných tkanív dýchacieho traktu zostaví na základe odporúčaní kapitoly B.8 tejto prílohy (8) a kapitoly B.29 tejto prílohy (9). Pokiaľ ide o orgány/tkanivá (a popri špecificky uchovávaných tkanivách dýchacieho traktu), je potrebné vyšetriť tie isté orgány ako v prípade orálnej expozície.
                           
                        
                     Histopatológia
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              K dispozícii sú usmernenia o dobrej praxi na vykonávanie štúdií toxikologickej patológie (40). Vyšetreniam sa podrobia minimálne tieto tkanivá:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          všetky tkanivá zo skupín s vysokou dávkou a kontrolných skupín,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všetky tkanivá zo zvierat, ktoré uhynuli alebo boli utratené v priebehu štúdie,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          všetky tkanivá vykazujúce makroskopické abnormality vrátane nádorov,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          ak sú v skupine s vysokou dávkou pozorované histopatologické zmeny súvisiace s aplikáciou chemikálie, tie isté tkanivá sa vyšetria pri všetkých zvieratách zo všetkých skupín s odlišným dávkovaním,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          v prípade párových orgánov, ako sú napríklad obličky alebo nadobličky, sa vyšetria obidva orgány.
                                       
                                    
                        ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV (KARCINOGENITA A CHRONICKÁ TOXICITA)
                  
                     Údaje
                  
                  
                              57.
                           
                           
                              Pri všetkých hodnotených parametroch sa uvedú údaje o jednotlivých zvieratách. Navyše všetky údaje sa musia zhrnúť v tabuľkovej forme, pričom ukazujú pre každú testovanú skupinu počet zvierat na začiatku testu, počet zvierat uhynutých počas testu alebo usmrtených z humánnych dôvodov, čas uhynutia alebo humánneho usmrtenia jednotlivých zvierat, počet zvierat, pri ktorých sa prejavili známky toxicity, opis pozorovaných známok toxicity vrátane nábehu, času a prudkosti toxických účinkov, počet zvierat vykazujúcich poškodenie, typy poškodení a percentuálne množstvo zvierat, pri ktorých sa prejavil daný typ poškodenia. Zhrnuté údaje v tabuľkách musia okrem stupňa poškodení udávať priemer a smerodajnú odchýlku (v prípade priebežných údajov o teste) pri zvieratách vykazujúcich toxické účinky alebo poškodenia.
                           
                        
                              58.
                           
                           
                              Pri interpretácii výsledkov štúdie môžu byť užitočné historické kontrolné údaje, napr. v prípade, ak existujú indikácie, že údaje získané v rámci súbežných kontrol sa výrazne odlišujú v porovnaní s novými údajmi pri kontrolných zvieratách z rovnakého testovacieho zariadenia/kolónie. V prípade hodnotenia historických kontrolných údajov by ich malo predložiť to isté laboratórium a mali by sa vzťahovať na zvieratá rovnakého veku a z toho istého kmeňa vytvoreného v priebehu piatich rokov, ktoré danej štúdii predchádzali.
                           
                        
                              59.
                           
                           
                              Ak je to možné, numerické výsledky budú spracované vhodne a všeobecne uplatniteľnou štatistickou metódou. Štatistické metódy a údaje, ktoré budú analyzované, sa vyberú počas plánovania štúdie (odsek 9). Výber musí v prípade potreby počítať s úpravami vzhľadom na prežitie.
                           
                        
                              60.
                           
                           
                              Správa o teste by mala obsahovať tieto informácie:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovaná chemikália:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikálny charakter, čistota a fyzikálno-chemické vlastnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikačné údaje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj chemikálie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      číslo šarže,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      certifikát chemickej analýzy.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosič (v prípade potreby):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie výberu nosiča (ak je iný ako voda).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovacie zvieratá:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použitý druh/kmeň a odôvodnenie výberu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet, vek a pohlavie zvierat na začiatku testu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo atď.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hmotnosti jednotlivých zvierat na začiatku testu.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Podmienky testovania:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie spôsobu podávania a výberu dávky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ak je to použiteľné, štatistické metódy použité na analýzu údajov,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o príprave testovanej chemikálie/krmiva,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analytické údaje o dosiahnutej koncentrácii, stabilite a homogenite prípravku,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      spôsob podávania a údaje o podávaní testovanej chemikálie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      v prípade inhalačných štúdií, či ide o expozíciu oblasti nosa alebo expozíciu celého tela,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skutočné dávky (mg/kg telesnej hmotnosti/deň), faktor konverzie z potravy/pitnej vody, koncentrácia testovanej chemikálie (mg/kg alebo ppm), ak je to použiteľné,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o kvalite potravy a vody.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky (predloží sa tabuľkové zhrnutie údajov a údaje o jednotlivých zvieratách)
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Všeobecné informácie:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o prežití,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      telesná hmotnosť a zmeny telesnej hmotnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      spotreba potravy, výpočty účinnosti krmiva, pokiaľ sa vykonali, a spotreba vody, ak je to použiteľné,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toxikokinetické údaje, ak sú dostupné,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oftalmoskopia (ak je dostupná),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematológia (ak je dostupná),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klinická chémia (ak je dostupná).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Klinické nálezy:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      príznaky toxicity,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozsah (a ak sa hodnotí, závažnosť) každej abnormality,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      povaha, závažnosť a trvanie klinických pozorovaní (či už prechodných alebo stálych).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Údaje o pitve:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      konečná telesná hmotnosť,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      orgánové hmotnosti a ich pomery, ak je to použiteľné,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pitevné nálezy, rozsah a závažnosť abnormalít.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Histopatológia:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nenádorové histopatologické nálezy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nádorové histopatologické nálezy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      korelácia medzi makroskopickými a mikroskopickými nálezmi,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobný opis všetkých histopatologických nálezov súvisiacich s aplikáciou chemikálie vrátane stupňa závažnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      správa o všetkých partnerských hodnoteniach preparátov (sklíčok).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Štatistické spracovanie výsledkov v prípade potreby
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rozbor výsledkov zahŕňajúci:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozbor všetkých prístupov modelovania,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vzťah medzi dávkou a reakciou,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      historické kontrolné údaje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zváženie všetkých informácií o druhu pôsobenia,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stanovenie BMD, NOAEL alebo LOAEL,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      význam pre človeka.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Závery
                                          
                                       
                                    
                        
                     LITERATÚRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rím, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paríž.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Combes, R. D., Gaunt, I., Balls, M. (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163 – 208
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Barlow, S. M., Greig, J. B., Bridges, J. W., a kol. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145 – 191
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Chhabra, R. S., Bucher, J. R., Wolfe, M., Portier, C. (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437 – 445.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Kapitola B.27 tejto prílohy, Test subchronickej orálnej toxicity: opakovaná 90-dňová štúdia orálnej toxicity u nehlodavcov.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – druhé vydanie. Series on Testing and Assessment No. 116, dostupné na verejnej webovej stránke OECD s usmerneniami na vykonávanie testov na adrese www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paríž.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Kapitola B.8 tejto prílohy. Subakútna inhalačná toxicita: 28-dňová štúdia.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Kapitola B.29 tejto prílohy, Subchronická inhalačná toxicita: 90-dňová štúdia.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Kapitola B.9 tejto prílohy, Toxicita po 28–dňovej opakovanej dávke (dermálna).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Boobis, A. R., Cohen, S. M., Dellarco, V., McGregor, D., Meek, M. E., Vickers, C., Willcocks, D., Farland, W. (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793 – 801.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Cohen, S. M., Meek, M. E., Klaunig, J. E., Patton, D. E., Fenner-Crisp, PA (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581 – 589.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Holsapple, M. P., Pitot, H. C., Cohen, S. N., Boobis, A. R., Klaunig, J. E., Pastoor, T., Dellarco, V. L., Dragan, Y. P. (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89: 51 – 56.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Meek, E. M., Bucher, J. R., Cohen, S. M., Dellarco, V., Hill, R. N., Lehman-McKemmon, L. D., Longfellow, D. G., Pastoor, T., Seed, J., Patton D. E. (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 591 – 653.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Carmichael, N. G., Barton, H. A., Boobis, A. R. a kol. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1 – 7.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Barton, H. A., Pastoor, T. P., Baetcke, T. a kol. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Crit. Rev. Toxicol. 36: 9 – 35.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Doe, J. E., Boobis, A. R., Blacker, A. a kol. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 37 – 68.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Cooper, R. L., Lamb, J. S., Barlow, S. M. a kol. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69 – 98.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paríž.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paríž.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Rhomberg, L. R., Baetcke, K., Blancato, J., Bus, J., Cohen, S., Conolly, R., Dixit, R., Doe, J., Ekelman, K., Fenner-Crisp P., Harvey, P., Hattis, D., Jacobs, A., Jacobson-Kram, D., Lewandowski, T., Liteplo, R., Pelkonen, O., Rice, J., Somers, D., Turturro, A., West, W., Olin, S. (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Griffiths, S. A., Parkinson, C., McAuslane, J. A. N., a Lumley, C. E. (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1): 214.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Usui, T., Griffiths, S. A., a Lumley, C. E. (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy, P. O. F., & Harron, D. W. G. (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. s. 279 – 284.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Carmichael, N. G., Enzmann, H., Pate, I., Waechter, F. (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect 105: 1196 – 1203.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Smernica Európskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 2012 o ochrane zvierat používaných na vedecké účely (Ú. v. EÚ L 276, 20.10.2010, s. 33).
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, december 1989). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-06-9.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Diehl, K.-H., Hull, R., Morton, D., Pfister, R., Rabemampianina, Y., Smith, D., Vidal, J.-M., van de Vorstenbosch, C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology, 21: 15 – 23.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Tupper, D. E., Wallace, R. B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999 – 1003.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health 9: 691 – 704.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Moser, V. C., McDaniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267 – 283.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Meyer, O. A., Tilson, H. A., Byrd, W. C., Riley, M. T. (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233 – 236.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Crofton, K. M., Howard, J. L., Moser, V. C., Gill, M. W., Reiter, L. W., Tilson, H. A., MacPhail, R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599 – 609.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Weingand, K., Brown, G., Hall, R. a kol. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198 – 201.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              EMEA (návrh) dokument „Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity“ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Crissman, J. W., Goodman, D. G., Hildebrandt, P. K. a kol. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126 – 131.
                           
                        
                     Dodatok 1
                     VYMEDZENIE POJMU
                     Testovaná chemikália: akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
                  “
            
                  7.
               
               
                  Kapitola B.36 sa nahrádza takto:
                  „B.36.   TOXIKOKINETIKA
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda je rovnocenná s OECD TG 417 (2010). Štúdie skúmajúce toxikokinetiku (TK) testovanej chemikálie sa vykonávajú s cieľom získať primerané informácie o jej absorpcii, distribúcii, biotransformácii (t. j. metabolizme) a exkrécii, aby bolo možné ľahšie priradiť koncentráciu alebo dávku k pozorovanej toxicite a lepšie pochopiť jej mechanizmus toxicity. TK môže pomôcť porozumieť toxikologickým štúdiám tak, že preukáže, že pokusné zvieratá sú systémovo vystavené účinkom testovanej chemikálie, a zistí cirkulujúce podiely (materská chemikália/metabolity). Základné TK parametre určené na základe týchto štúdií poskytnú aj informácie o potenciáli akumulácie testovanej chemikálie v tkanivách a/alebo v orgánoch a o potenciáli indukcie biotransformácie ako dôsledku expozície testovanej chemikálii.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              TK údaje môžu pomôcť pri hodnotení vhodnosti a významnosti údajov o toxicite pri zvieratách na účely extrapolácie hodnotenia nebezpečnosti a/alebo rizík pre človeka. Okrem toho toxikokinetické štúdie môžu priniesť užitočné informácie na stanovenie úrovní dávok pre štúdie toxicity (lineárna alebo nelineárna kinetika), zistenie účinkov spôsobu podávania, biodostupnosti a otázok spojených s prípravou štúdie. Niektoré druhy TK údajov možno použiť pri vývoji fyziologicky založených toxikokinetických (PBTK) modelov.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Dôležité využitie údajov o metabolitoch/TK údajov predstavuje napríklad predpovedanie možnej toxicity a druhu pôsobenia a ich vzťahu k úrovni dávky a spôsobu expozície. Okrem toho môžu údaje o metabolizme poskytnúť informácie, ktoré sú užitočné pri hodnotení toxikologického významu expozície pre exogénne vytvárané metabolity testovanej chemikálie.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Vhodné toxikokinetické údaje sú užitočné pri zabezpečovaní ďalšej prijateľnosti a použiteľnosti kvantitatívnych vzťahov štruktúry a aktivity, krížových alebo skupinových prístupov pri hodnotení bezpečnosti chemikálií. Kinetické údaje sa môžu využiť aj pri hodnotení toxikologickej významnosti iných štúdií (napr. in vivo/in vitro).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Pokiaľ sa neuvádza iný spôsob podávania (pozri najmä odseky 74 – 78), táto testovacia metóda sa používa v prípade orálneho podávania testovanej chemikálie.
                           
                        ÚVODNÉ ÚVAHY
                  
                              6.
                           
                           
                              Regulačné systémy majú na rôzne triedy chemikálií (napr. pesticídy, biocídy, priemyselné chemikálie) rôzne požiadavky a potreby týkajúce sa merania ukazovateľov a parametrov súvisiacich s toxikokinetikou. Na rozdiel od väčšiny testovacích metód je v tejto testovacej metóde opísané testovanie toxikokinetiky, ktoré zahŕňa viacero meraní a parametrov. V budúcnosti môžu byť vypracované nové testovacie metódy a/alebo usmerňovacie dokumenty, ktoré budú opisovať každý parameter samostatne a podrobnejšie. V prípade tejto testovacej metódy závisí otázka, ktoré testy alebo hodnotenia sa vykonávajú, od požiadaviek a/alebo potrieb jednotlivých regulačných systémov.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Existuje mnoho štúdií, ktoré sa môžu vykonať na regulačné účely s cieľom posúdiť TK správanie testovanej chemikálie. V závislosti od konkrétnych regulačných potrieb alebo situácií však nemusia byť všetky tieto štúdie na posúdenie testovanej chemikálie nutné. Pri príprave toxikokinetických štúdií je potrebná flexibilita, pričom sa zohľadnia charakteristiky skúmanej testovanej chemikálie. V niektorých prípadoch môže byť na zistenie nebezpečnosti a rizík spojených s testovanou chemikáliou potrebné preskúmať iba určitý súbor otázok. V určitých situáciách možno údaje TK zozbierať v rámci hodnotenia v iných toxikologických štúdiách. V iných situáciách môžu byť potrebné ďalšie a/alebo rozsiahlejšie TK štúdie v závislosti od regulačných potrieb a/alebo v prípade, že sa v rámci hodnotenia testovanej chemikálie objavia nové otázky.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Pred samotným vykonaním štúdie testovacie laboratórium zváži všetky dostupné informácie o testovanej chemikálii, relevantných metabolitoch a analógoch s cieľom zlepšiť kvalitu štúdie a predísť zbytočnému využívaniu zvierat. Toto zváženie sa môže týkať údajov získaných pomocou iných relevantných testovacích metód (štúdie in vivo, štúdie in vitro a/alebo hodnotenia in silico). Fyzikálno-chemické vlastnosti, ako je napríklad rozdeľovací koeficient oktanol – voda (vyjadrený ako log Pow), pKa, rozpustnosť vo vode, tlak pary a molekulová hmotnosť chemikálie, môžu byť užitočné pri plánovaní štúdie a interpretácii výsledkov. Možno ich stanoviť pomocou vhodných metód, ktoré sú opísané v príslušných testovacích metódach.
                           
                        OBMEDZENIA
                  
                              9.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda nie je určená pre prípad osobitných okolností, ako sú gravidné zvieratá alebo zvieratá v laktácii a mláďatá, ani na hodnotenie potenciálnych rezíduí pri exponovaných zvieratách určených na produkciu potravín. Údaje získané pomocou štúdie B.36 však môžu poskytnúť základné informácie na plánovanie konkrétnych štúdií na účely takéhoto vyšetrovania. Táto testovacia metóda nie je určená na testovanie nanomateriálov. Zo správy o predbežnej revízii usmernení OECD na vykonávanie testov, pokiaľ ide o ich použiteľnosť v prípade nanomateriálov, vyplýva, že usmernenia TG 417 (rovnocenné s touto testovacou metódou B.36) nie je možné použiť v prípade nanomateriálov (1).
                           
                        VYMEDZENIE POJMOV
                  
                              10.
                           
                           
                              Vymedzenie pojmov použitých na účely tejto testovacej metódy je uvedené v dodatku.
                           
                        OTÁZKA DOBRÝCH ŽIVOTNÝCH PODMIENOK ZVIERAT
                  
                              11.
                           
                           
                              Usmernenia o humánnom zaobchádzaní so zvieratami sú k dispozícii v usmerňovacom dokumente OECD (GD) č. 19 (2). Odporúča sa preštudovať si dokument OECD GD 19 v prípade všetkých štúdií in vivo a in vitro opísaných v rámci tejto testovacej metódy.
                           
                        OPIS METÓD
                  
                     Pilotné štúdie
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Pri výbere experimentálnych parametrov pre štúdie toxikokinetiky (napr. metabolizmus, hmotnostná bilancia, analytické postupy, stanovenie dávok, exhalácia CO2 atď.) sa dôrazne odporúča použitie pilotných štúdií. Na charakterizáciu niektorých týchto parametrov nemusí byť potrebné použitie rádiooznačených chemikálií.
                           
                        
                     Výber zvierat
                  
                  
                     Druh
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Druh (a kmeň) zvierat použitých na TK testovanie by podľa možnosti mal byť rovnaký ako druh (a kmeň) použitý v ostatných toxikologických štúdiách vykonaných s použitím skúmanej testovanej chemikálie. Zvyčajne sa používa potkan, lebo tento druh sa pri toxikologických štúdiách využíva vo veľkej miere. Iné alebo ďalšie druhy sa môžu použiť, ak kritické toxikologické štúdie pri týchto druhoch preukazujú významnú toxicitu alebo ak sa preukáže, že ich toxicita/toxikokinetika má väčší význam pre ľudí. Výber druhu a kmeňa zvierat je potrebné odôvodniť.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Pokiaľ nie je uvedené inak, v tejto testovacej metóde je testovaným živočíšnym druhom potkan. Určité aspekty metódy sa možno v prípade použitia iného testovacieho druhu budú musieť pozmeniť.
                           
                        
                     Vek a kmeň
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Použijú sa mladé zdravé dospelé zvieratá (zvyčajne vo veku 6 – 12 týždňov v čase dávkovania) (pozri aj odseky 13 a 14). Použitie zvierat, ktoré nie sú mladé a dospelé jedince, je potrebné odôvodniť. Všetky zvieratá by mali mať na začiatku štúdie približne rovnaký vek. Variácia hmotnosti jednotlivých zvierat by nemala presiahnuť ± 20 % strednej hmotnosti v testovacej skupine. Podľa možnosti by použitý kmeň mal byť rovnaký ako kmeň použitý pri tvorbe toxikologickej databázy pre testovanú chemikáliu.
                           
                        
                     Počet a pohlavie zvierat
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Pri každej testovanej dávke sa použijú najmenej štyri zvieratá z jedného pohlavia. Výber pohlavia použitých zvierat je potrebné odôvodniť. Použitie oboch pohlaví (štyri samce a štyri samice) sa zváži, ak existujú dôkazy svedčiace o významných rozdieloch v toxicite, ktoré súvisia s pohlavím.
                           
                        
                     Podmienky umiestnenia a kŕmenia
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Zvieratá sú počas obdobia testovania zvyčajne umiestnené samostatne. Za osobitných okolností môže byť opodstatnené umiestnenie v skupinách. Osvetlenie by malo byť umelé a malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Teplota miestnosti pre pokusné zvieratá by mala byť 22 °C (± 3 °C) a relatívna vlhkosť by mala byť 30 – 70 %. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody.
                           
                        
                     Testovaná chemikália
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              V prípade aspektov štúdie súvisiacich s hmotnostnou bilanciou a identifikáciou metabolitov sa použije testovaná chemikália rádiooznačená pomocou 14C. Ak však možno preukázať, že:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          hmotnostnú bilanciu a identifikáciu metabolitov možno primerane posúdiť pomocou neoznačenej testovanej chemikálie,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analytická špecifickosť a citlivosť použitej metódy s využitím nerádioaktívnej testovanej chemikálie je rovnaká alebo väčšia ako analytická špecifickosť a citlivosť, ktorú možno získať pomocou rádiooznačenej testovanej chemikálie,
                                       
                                    potom sa nemusí použiť rádiooznačená testovaná chemikália. Okrem toho možno použiť iné rádioaktívne a stabilné izotopy, najmä ak daný prvok vyvoláva alebo prispieva k toxickej zložke testovanej chemikálie. Ak je to možné, rádiooznačenie by sa malo nachádzať v ústrednej časti molekuly, ktorá je metabolicky stabilná (nie je zameniteľná, neodstráni sa metabolicky ako CO2 a nestane sa súčasťou jednouhlíkového lôžka organizmu). Označenie viacerých miest alebo špecifických oblastí molekuly môže byť potrebné pri sledovaní metabolickej premeny testovanej chemikálie.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Rádiooznačené testované chemikálie a testované chemikálie, ktoré nie sú rádiooznačené, sa analyzujú pomocou vhodných metód na určenie ich čistoty a identity. Rádiočistota rádioaktívnej testovanej chemikálie by mala byť najvyššia, ktorú možno pri danej testovanej chemikálii dosiahnuť (v ideálnom prípade by mala byť vyššia ako 95 %), pričom by sa malo vynaložiť primerané úsilie na identifikáciu prímesí tvoriacich 2 % alebo viac. Čistota spolu s identitou a podielom všetkých prímesí, ktoré boli identifikované, sa uvedú v správe. V rámci jednotlivých regulačných programov môžu byť k dispozícii ďalšie usmernenia na uľahčenie vymedzenia a špecifikácií testovaných chemikálií zložených zo zmesí a metódy na určenie čistoty.
                           
                        
                     Výber dávky
                  
                  
                     Pilotná štúdia
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Zvyčajne na účely pilotnej štúdie postačuje jednorazová orálna dávka. Dávka by mala byť netoxická, ale dostatočne vysoká, aby umožnila identifikáciu metabolitov v exkrétoch (a v plazme, ak je to vhodné), ako aj splnenie stanoveného účelu pilotnej štúdie, ako sa uvádza v odseku 12 tejto testovacej metódy.
                           
                        
                     Základné štúdie
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              V prípade základných štúdií sa uprednostňujú minimálne dve dávky, lebo informácie získané pomocou najmenej dvoch skupín s dávkou môžu byť užitočné pri stanovení dávky v ďalších štúdiách toxicity a pri hodnotení vzťahu dávky a reakcie v rámci testov toxicity, ktoré sú už k dispozícii.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Ak sa podajú dve dávky, obidve dávky by mali byť dostatočne vysoké, aby bolo možné identifikovať metabolity v exkrétoch (a v plazme, ak je to vhodné). Pri výbere dávok treba zvážiť informácie získané z dostupných údajov o toxicite. Ak takéto informácie nie sú k dispozícii (napr. zo štúdií akútnej orálnej toxicity s údajmi o klinických príznakoch toxicity alebo zo štúdií toxicity v opakovaných dávkach), možno zvážiť použitie takej hodnoty vyššej dávky, ktorá je nižšia ako odhadovaná dávka LD50 (orálny a dermálny spôsob podávania) alebo odhadovaná koncentrácia LC50 (inhalačný spôsob podávania) alebo ktorá je pod úrovňou nižšej hodnoty odhadu rozsahu akútnej toxicity. Nižšia dávka by mala byť zlomkom vyššej dávky.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Ak sa skúma iba jedna úroveň dávky, podľa možnosti by dávka mala byť dostatočne vysoká, aby bolo možné identifikovať metabolity v exkrétoch (a v plazme, ak je to vhodné), ale súčasne by nemala viesť k zjavnej toxicite. Nepoužitie druhej úrovne dávky je potrebné odôvodniť.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Ak je potrebné zistiť účinok dávky na kinetické procesy, dve dávky nemusia postačovať a aspoň jedna dávka by mala byť dostatočne vysoká na nasýtenie týchto procesov. Ak plocha pod krivkou závislosti koncentrácie a času (AUC) medzi dvoma úrovňami dávky použitými v základnej štúdii nie je lineárna, je zrejmé, že k nasýteniu jedného alebo dvoch kinetických procesov dochádza niekde medzi týmito dvomi úrovňami dávky.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              V prípade testovaných chemikálií s nízkou toxicitou sa použije maximálna dávka na úrovni 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti (orálny a dermálny spôsob podávania) (usmernenia pre inhalačný spôsob podávania sú k dispozícii v kapitole B.2 tejto prílohy; táto dávka zvyčajne nepresahuje 2 mg/l). V rámci úvah týkajúcich sa chemikálie môže byť v závislosti od regulačných potrieb potrebná vyššia dávka. Výber dávky treba vždy odôvodniť.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Na stanovenie potenciálu akumulácie a/alebo perzistencie môžu byť vhodné toxikokinetické údaje a údaje o rozdelení tkanív týkajúce sa jednorazovej dávky. Za určitých okolností však môže byť nutné podanie v opakovaných dávkach i) na účely komplexnejšieho stanovenia potenciálu akumulácie a/alebo perzistencie alebo zmien v TK (t. j. napríklad enzýmovej indukcie a inhibície) alebo ii) na základe požiadaviek príslušného regulačného systému. Hoci v štúdiách v opakovaných dávkach väčšinou postačuje opakované podanie nízkej dávky, za určitých okolností môže byť nutné aj opakované podanie vysokej dávky (pozri odsek 57).
                           
                        
                     Podávanie testovanej chemikálie
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Testovaná chemikália sa rozpustí alebo homogénne suspenduje v rovnakom nosiči, aký bol použitý v štúdiách orálnej toxicity pri podávaní danej testovanej chemikálie cez sondu, ak sú tieto informácie o nosiči k dispozícii. Výber nosiča je potrebné odôvodniť. Výber nosiča a objemu dávkovania by sa mal zvážiť v pláne štúdie. Chemikália sa zvyčajne podáva cez sondu. Podávanie formou želatínových kapsúl alebo ako zmes krmiva však môže mať v určitých situáciách výhody (v oboch prípadoch je potrebné uviesť odôvodnenie). Treba overiť, či bola každému zvieraťu podaná skutočná dávka.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Maximálny objem tekutiny, ktorá sa jednorazovo podá cez orálnu sondu, závisí od veľkosti testovacích zvierat, druhu nosiča dávky a od skutočnosti, či sa pred podaním testovanej chemikálie zviera kŕmilo alebo nie. Podávanie alebo obmedzenie krmiva pred dávkovaním je potrebné odôvodniť. Objem by za bežných okolností mal byť podľa možnosti čo najnižší v prípade vodných, ako aj v prípade bezvodých nosičov. Objemy dávok by v prípade hlodavcov normálne nemal presahovať 10 ml/kg telesnej hmotnosti. Objemy nosičov použitých v prípade lipofilnejších testovaných chemikálií sa môžu začínať na úrovni 4 ml/kg telesnej hmotnosti. V prípade opakovaných dávok, keď je kontraindikovaný denný pôst, je potrebné zvážiť nižšie objemy dávok (napr. 2 – 4 ml/kg telesnej hmotnosti). Podľa možnosti by sa malo zvážiť použitie takého objemu dávky, ktorý je konzistentný s objemom použitým v iných štúdiách orálnej toxicity testovanej chemikálie pri podávaní cez sondu.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Intravenózne (IV) podávanie testovanej chemikálie a meranie testovanej chemikálie v krvi a/alebo v exkrétoch možno použiť na stanovenie biodostupnosti alebo relatívnej orálnej absorpcie. V prípade IV štúdie sa pomocou vhodného nosiča podá jedna dávka (zvyčajne rovnaká, ale nie vyššia ako nižšia orálna dávka – pozri výber dávky) testovanej chemikálie. Tento materiál sa vo vhodnom objeme (napr. 1 ml/kg telesnej hmotnosti) aplikuje na vybraté miesto najmenej štyrom zvieratám príslušného pohlavia (ak je to opodstatnené, možno použiť obidve pohlavia, pozri odsek 16). Pri IV podávaní testovanej chemikálie je potrebná príprava úplne rozpustenej alebo suspendovanej dávky. Nosič by pri IV podávaní nemal interferovať s integritou krvi alebo s prietokom krvi. Ak sa testovaná chemikália podáva infúzne, dávka podaná infúziou by sa mala uviesť v správe a medzi jednotlivými zvieratami by mala byť štandardizovaná, za predpokladu, že sa použije infúzna pumpa. Kanylovanie hrdelnej žily (na podanie testovanej chemikálie a/alebo na odber krvi) alebo podanie cez femorálnu artériu sa vykonáva v anestézii. Druh anestézie treba dôkladne zvážiť, lebo môže ovplyvniť toxikokinetiku. Zvieratám by sa pred podaním testovanej chemikálie s nosičom malo umožniť, aby sa dostatočne zotavili.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Iné spôsoby podávania, ako je dermálne alebo inhalačné podávanie (pozri odseky 74 – 78), možno použiť v prípade určitých testovaných chemikálií po zvážení ich fyzikálno-chemických vlastností a predpokladaného použitia a expozície u ľudí.
                           
                        
                     Merania
                  
                  
                     Hmotnostná bilancia
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Hmotnostná bilancia sa stanoví sčítaním percenta podanej (rádioaktívnej) dávky vylúčenej v moči, výkaloch a vydychovanom vzduchu a percenta prítomného v tkanivách, zostávajúcich častiach mŕtveho tela a zvyškoch v klietke (pozri odsek 46). Vo všeobecnosti sa celková výťažnosť podanej testovanej chemikálie (rádioaktivita) v rozsahu > 90 % považuje za primeranú.
                           
                        
                     Absorpcia
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Počiatočný odhad absorpcie možno získať odčítaním percenta dávky v gastrointestinálnom trakte a/alebo výkaloch od ukazovateľa hmotnostnej bilancie. Pre výpočet percenta absorpcie pozri odsek 33 Pre vyšetrovanie exkrétov pozri odseky 44 – 49. Ak presný rozsah absorpcie nasledujúcej po orálnom dávkovaní nie je možné určiť pomocou štúdií hmotnostnej bilancie (napr. ak je vo výkaloch prítomných viac ako 20 % podanej dávky), mohli by byť potrebné ďalšie vyšetrenia. Tieto štúdie môžu zahŕňať buď 1. orálne podávanie testovanej chemikálie a meranie testovanej chemikálie v žlči, alebo 2. orálne a IV podávanie testovanej chemikálie a meranie čistej testovanej chemikálie prítomnej v moči, vo vydychovanom vzduchu a v mŕtvom tele v prípade oboch spôsobov podávania. Pri oboch plánoch štúdie sa vykoná meranie rádioaktivity ako zástupná metóda chemicky špecifickej analýzy testovanej chemikálie a metabolitov.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Ak sa vykonáva štúdia exkrécie žlčou, zvyčajne sa použije orálne podávanie. V tejto štúdii sa kanylujú žlčovody najmenej štyroch zvierat príslušného pohlavia (alebo oboch pohlaví, ak je to opodstatnené) a podá sa jednorazová dávka testovanej chemikálie. Po podaní testovanej chemikálie sa sleduje exkrécia rádioaktivity/testovanej chemikálie v žlči tak dlho, ako je potrebné na odhad percenta podanej dávky, ktorá sa vylúči touto cestou. Odhad možno použiť na priamy výpočet rozsahu orálnej absorpcie takto:
                              
                                 
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              V prípade niektorých tried testovanej chemikálie môže dôjsť k priamej sekrécii absorbovanej dávky cez črevné membrány. V takých prípadoch sa meranie percentuálnej dávky vo výkaloch po orálnom podaní dávky pri potkanovi s kanylovaným žlčovodom nepovažuje za reprezentatívne percento neabsorbovanej dávky. V prípade, že sa očakáva črevná sekrécia, sa odporúča, aby bolo percento absorbovanej dávky založené na absorpcii vypočítanej na základe porovnania exkrécie pri orálnom a IV podaní (potkan s neporušeným alebo s kanylovaným žlčovodom) (pozri odsek 35). Takisto sa odporúča, aby sa v prípade, keď sa kvantifikácia črevnej sekrécie považuje za nevyhnutnú, odmerala exkrécia v kanylovanom žlčovode potkana po IV podaní dávky.
                           
                        
                     Biodostupnosť
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Biodostupnosť možno stanoviť z kinetiky plazmy/krvi pri skupinách s orálnym a IV podávaním, ako sa uvádza v odsekoch 50 – 52, pomocou špecifickej chemickej analýzy testovanej chemikálie a/alebo príslušného metabolitu/metabolitov. Nevyžaduje sa teda rádiooznačená testovaná chemikália. Biodostupnosť (F) testovanej chemikálie alebo príslušného metabolitu/metabolitov možno vypočítať takto:
                              
                                 
                           
                        kde AUC je oblasť pod krivkou závislosti koncentrácie plazmy a času a exp je experimentálny spôsob podávania (orálny, dermálny alebo inhalačný).
                  
                              36.
                           
                           
                              Na účely hodnotenia rizík systémových účinkov sa vo všeobecnosti pri porovnávaní systémových koncentrácií zo štúdií zvierat s analogickými biomonitorovacími údajmi zo štúdií expozície pracovníkov uprednostňuje biodostupnosť toxickej zložky pred percentom absorpcie. Situácia môže byť ešte zložitejšia, ak sú dávky v nelineárnom rozsahu, preto je dôležité, aby sa v rámci toxikokinetického skríningu stanovili dávky v lineárnom rozsahu.
                           
                        
                     Distribúcia v tkanivách
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Poznatky o distribúcii testovanej chemikálie a/alebo jej metabolitov v tkanivách sú dôležité na identifikáciu cieľových tkanív a na pochopenie hlavných mechanizmov toxicity, ako aj na získanie informácií o potenciáli akumulácie a perzistencie testovanej chemikálie a metabolitov. Percento celkovej (rádioaktívnej) dávky v tkanivách, ako aj vo zvyšných častiach mŕtveho tela by sa malo odmerať aspoň na konci pokusu s exkréciou (napr. zvyčajne do siedmich dní po dávke alebo skôr, v závislosti od špecifického správania testovanej chemikálie). Ak sa na konci štúdie v tkanivách nezistí testovaná chemikália (napr. z dôvodu, že testovaná chemikália mohla byť eliminovaná pred ukončením štúdie pre krátky polčas), treba dať pozor, aby sa predišlo nesprávnej interpretácii údajov. V takejto situácii treba vyšetriť distribúciu v tkanivách v čase, keď má testovaná chemikália (a/alebo metabolit) najvyššiu koncentráciu v plazme/krvi (Tmax) alebo v čase najvyššej močovej exkrécie (pozri odsek 38). Okrem toho môže byť potrebný odber tkanív v iných časoch s cieľom určiť distribúciu testovanej chemikálie a/alebo jej metabolitov v tkanivách na účely posúdenia závislosti od času (ak je to vhodné), pomôcť pri stanovení hmotnostnej bilancie a/alebo vyhovieť požiadavkám príslušného orgánu. Medzi tkanivá, ktoré treba odobrať, patrí pečeň, tuk, gastrointestinálny trakt, obličky, slezina, celá krv, zvyšné časti mŕtveho tela, tkanivá cieľových orgánov a všetky ostatné tkanivá (napr. štítna žľaza, erytrocyty, rozmnožovacie orgány, koža, oči – najmä pri zvieratách s pigmentáciou), ktoré majú potenciálny význam pre toxikologické hodnotenie testovanej chemikálie. Pre maximalizáciu využiteľnosti zvierat a v prípade, že je v štúdiách subchronickej alebo chronickej toxicity pozorovaná toxicita cieľového orgánu, by sa mala zvážiť analýza ďalších tkanív v tých istých časoch. Do správy sa uvedie aj koncentrácia (rádioaktívnych) rezíduí a pomer tkaniva a plazmy (krvi).
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Hodnotenie distribúcie v tkanivách v ďalších časoch, ako je čas najvyššej koncentrácie v plazme/krvi (napr. Tmax) alebo čas najvyššej močovej exkrécie, získané pomocou príslušných pokusov týkajúcich sa kinetiky plazmy/krvi alebo exkrécie môže byť takisto potrebné alebo ho môže požadovať príslušný orgán. Tieto informácie môžu byť užitočné na pochopenie toxicity a potenciálu akumulácie a perzistencie testovanej chemikálie a jej metabolitov. Je potrebné uviesť odôvodnenie výberu vzoriek. Vzorky na analýzu by vo všeobecnosti mali byť rovnaké ako vzorky uvedené vyššie (pozri odsek 37).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Rádioaktivitu možno v štúdiách distribúcie v tkanivách kvantifikovať pomocou disekcie orgánov, homogenizácie, horenia a/alebo rozpustenia a následnej kvapalinovej scintilačnej spektroskopie (LSC) zachytených rezíduí. Určité metódy, ktoré sú v súčasnosti v rôznych štádiách vývoja, napr. kvantitatívna autorádiografia celého tela a receptorová mikroskopická autorádiografia, môžu preukázať užitočnosť pri zisťovaní distribúcie testovanej chemikálie v orgánoch a/alebo v tkanivách (3) (4).
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              V prípade iného ako orálneho spôsobu expozície sa odoberú a analyzujú konkrétne tkanivá, ako sú pľúca v prípade inhalačných štúdií alebo koža v prípade dermálnych štúdií. Pozri odseky 74 – 78.
                           
                        
                     Metabolizmus
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Exkréty (a plazma, ak je to vhodné) sa odoberú na účely identifikácie a kvantifikácie nezmenenej testovanej chemikálie a metabolitov, ako sa uvádza v odsekoch 44 – 49. Zhromažďovanie exkrétov s cieľom uľahčiť identifikáciu metabolitov v rámci danej skupiny s dávkou je prípustné. Pri každom čase odberu sa odporúča profilovanie metabolitov. Ak tomu však bráni nedostatok vzoriek a/alebo rádioaktivity, je prípustný odber moču a výkalov v rôznych časoch. Odber od rôznych pohlaví alebo zvierat s rôznymi dávkami však prípustný nie je. Na vyšetrenie moču, výkalov, vydychovanej rádioaktivity zo zvierat, ktorým bola podaná dávka, a, ak je to vhodné, žlče by sa mali použiť vhodné kvalitatívne a kvantitatívne metódy.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Je potrebné vynaložiť primerané úsilie na identifikáciu všetkých metabolitov, ktoré predstavujú 5 % alebo viac podanej dávky, a zistiť metabolickú schému testovanej chemikálie. Je nutné identifikovať testované chemikálie, ktoré v exkrétoch predstavujú 5 % alebo viac podanej dávky. Identifikácia znamená presné štrukturálne určenie zložiek. Identifikácia sa najčastejšie vykonáva buď súbežnou chromatografiou metabolitu s využitím známych štandardov pomocou dvoch rôznych systémov, alebo metódami, pri ktorých možno zabezpečiť pozitívnu identifikáciu štruktúry, ako je hmotnostná spektrometria, jadrová magnetická rezonancia (NMR) atď. V prípade súbežnej chromatografie sa chromatografické metódy využívajúce rovnakú stacionárnu fázu pri dvoch rôznych systémoch rozpúšťania nepovažujú za vhodnú dvojmetódovú verifikáciu identity metabolitu, lebo tieto metódy nie sú nezávislé. Identifikácia pomocou súbežnej chromatografie by sa mala vykonať pomocou dvoch odlišných, analyticky nezávislých systémov, ako je chromatografia na tenkej vrstve (TLC) s reverznou a normálnou fázou a vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC). Za predpokladu, že chromatografická separácia má dostatočnú kvalitu, nie je potrebné ďalšie overenie spektroskopickými prostriedkami. Jednoznačnú identifikáciu možno prípadne zabezpečiť aj pomocou metód, ktoré poskytujú informácie o štruktúre, ako sú: kvapalinová chromatografia – hmotnostná spektrometria (LC-MS) alebo kvapalinová chromatografia – tandemová hmotnostná spektrometria (LC-MS/MS), plynová chromatografia s hmotnostnou spektrometriou (GC-MS) a spektrometria NMR.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Ak identifikácia metabolitov predstavujúcich 5 % alebo viac podanej dávky nie je možná, v záverečnej správe treba uviesť odôvodnenie/vysvetlenie. Môže byť vhodné identifikovať metabolity predstavujúce menej ako 5 % podanej dávky s cieľom lepšie pochopiť metabolickú premenu na účely hodnotenia nebezpečnosti a/alebo rizík testovanej chemikálie. Ak je to možné, vždy treba uviesť potvrdenie štruktúry. To môže zahŕňať profilovanie v plazme, krvi alebo v iných tkanivách.
                           
                        
                     Exkrécia
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Miera a rozsah exkrécie podanej dávky by sa mala stanoviť na základe merania percenta (rádioaktívnej) dávky získanej z moču, výkalov a vydychovaného vzduchu. Tieto údaje budú užitočné aj pri stanovovaní hmotnostnej bilancie. Množstvá testovanej chemikálie (rádioaktivity) odstránenej prostredníctvom moču, výkalov a vydychovaného vzduchu sa stanovia v príslušných časových intervaloch (pozri odseky 47 – 49). Pokusy v opakovaných dávkach by mali byť vhodne naplánované, aby bolo možné zozbierať údaje o exkrécii a splniť ciele opísané v odseku 26. To umožní porovnanie s pokusmi v jednorazových dávkach.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Ak pilotná štúdia preukáže, že nedošlo k exkrécii významného množstva testovanej chemikálie (rádioaktivity) (podľa odseku 49) vo vydychovanom vzduchu, potom v konečnej štúdii nie je potrebný odber vydychovaného vzduchu.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Každé zviera sa umiestni do samostatnej metabolickej jednotky na odber exkrétov (moču, výkalov a vydychovaného vzduchu). Na konci každého obdobia odberu (pozri odseky 47 – 49) sa metabolické jednotky vyčistia vhodným rozpúšťadlom (tento krok sa nazýva ‚čistenie klietky‘), aby sa zabezpečila maximálna výťažnosť testovanej chemikálie (rádioaktivity). Odber exkrétov sa ukončí po siedmich dňoch alebo po tom, ako sa zozbiera aspoň 90 % podanej dávky, podľa toho, čo nastane skôr.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Celkové množstvá testovanej chemikálie (rádioaktivity) v moči sa stanovia najmenej v dvoch časoch v prvý deň odberu, pričom jedno stanovenie by sa malo vykonať 24 hodín po dávkovaní, a následne každý deň až do konca štúdie. V prvý deň sa odporúča zvoliť si viac ako dva časy odberu (napr. po 6, 12 a 24 hodinách). V rámci výsledkov pilotných štúdií sa analyzujú informácie o alternatívnych alebo ďalších časoch odberu. Plán odberov je potrebné odôvodniť.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Celkové množstvá testovanej chemikálie (rádioaktivity) vo výkaloch sa stanovia na dennej báze, pričom prvý odber sa vykoná 24 hodín po dávkovaní a odbery budú pokračovať až do konca štúdie, pokiaľ z pilotných štúdií nevyplýva, že by bolo vhodnejšie použiť alternatívne alebo ďalšie časy odberov. Plánovanie alternatívnych plánov odberu je potrebné odôvodniť.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Odber vydychovaného CO2 a iných prchavých materiálov možno v rámci pokusu danej štúdie prerušiť v prípade, že sa počas 24-hodinového obdobia odberu vo vydychovanom vzduchu zistí menej ako 1 % podanej dávky.
                           
                        
                     Štúdie časového priebehu
                  
                  
                     Kinetika plazmy/krvi
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Účelom týchto štúdií je získať odhady základných TK parametrov [napr. Cmax, Tmax, polčas (t1/2), AUC] testovanej chemikálie. Tieto štúdie sa môžu vykonávať s využitím jednej dávky alebo častejšie s využitím dvoch alebo viacerých dávok. Dávky sa stanovia na základe charakteru pokusu a/alebo otázky, ktorá sa skúma. Kinetické údaje môžu byť potrebné na riešenie otázok, ako je biodostupnosť testovanej chemikálie, a/alebo na objasnenie účinku dávky na klírens (napr. na objasnenie, či dôjde k nasýteniu klírensu v závislosti od dávky).
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Pre tieto štúdie sa v každej skupine s dávkou použijú najmenej štyri zvieratá z jedného pohlavia. Výber pohlavia použitých zvierat je potrebné odôvodniť. Použitie oboch pohlaví (štyri samce a štyri samice) sa zváži, ak existujú dôkazy svedčiace o významných rozdieloch v toxicite, ktoré súvisia s pohlavím.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Po podaní (rádiooznačenej) testovanej chemikálie sa pomocou vhodnej metodiky odberu v primeraných časoch z každého zvieraťa odoberú vzorky krvi. Objem a počet vzoriek krvi, ktoré možno odobrať z každého zvieraťa, môže byť obmedzený potenciálnymi účinkami opakovaných odberov na zdravie/fyziológiu zvierat a/alebo citlivosťou analytickej metódy. Vzorky sa analyzujú v prípade každého zvieraťa. Za určitých okolností (napr. pri charakterizácii metabolitov) môže byť nutné odobrať vzorky z viac ako jedného zvieraťa. Odobraté vzorky sa jasne identifikujú, pričom sa uvedie odôvodnenie odberu. Ak sa použije rádiooznačená testovaná chemikália, môže byť vhodné uviesť analýzu celkovej prítomnej rádioaktivity. V takom prípade sa celková rádioaktivita analyzuje v celej krvi a v plazme alebo v plazme a v červených krvinkách, čo umožní výpočet pomeru krvi a plazmy. Za iných okolností môžu byť potrebné konkrétnejšie vyšetrenia, ktoré si vyžadujú identifikáciu materskej zlúčeniny a/alebo metabolitov, alebo vyšetrenia na účely hodnotenia bielkovinových väzieb.
                           
                        
                     Kinetika ostatných tkanív
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Účelom týchto štúdií je získať informácie o časovom priebehu na objasnenie otázok súvisiacich s problémami, ako sú druh toxického pôsobenia, bioakumulácia a bioperzistencia, a to prostredníctvom stanovenia úrovne testovanej chemikálie v jednotlivých tkanivách. Výber tkanív a počet hodnotených časových bodov bude závisieť od skúmaného problému a toxikologickej databázy testovanej chemikálie. Pri plánovaní týchto dodatočných štúdií kinetiky tkanív treba zohľadniť zozbierané informácie, ako sa uvádza v odsekoch 37 – 40. Tieto štúdie sa môžu vykonávať s využitím jednorazovej dávky alebo opakovaných dávok. Použitý prístup je potrebné podrobne odôvodniť.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Dôvody na vykonanie ďalších kinetických štúdií tkanív môžu zahŕňať:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          dôkazy o predĺženom polčase krvi, ktoré svedčia o možnej akumulácii testovanej chemikálie v jednotlivých tkanivách, alebo
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          záujem zistiť, či sa dosiahla stabilná úroveň v konkrétnych tkanivách (napr. v štúdiách v opakovaných dávkach aj v prípade, že sa zdanlivo dosiahla stabilná úroveň testovanej chemikálie v krvi, môže byť záujem uistiť sa, či sa stabilná úroveň dosiahla aj v cieľových orgánoch).
                                       
                                    
                        
                              55.
                           
                           
                              Pri týchto druhoch štúdií časového priebehu sa orálne podá vhodná dávka testovanej chemikálie najmenej štyrom zvieratám v každej skupine s dávkou v každom časovom bode, pričom sa monitoruje časový priebeh distribúcie vo vybratých tkanivách. Ak nie je pozorovaná toxicita príznačná pre niektoré pohlavie, možno použiť iba jedno pohlavie. To, či sa bude analyzovať celková rádioaktivita alebo materská chemikália a/alebo metabolity, bude takisto závisieť od skúmaného problému. Hodnotenie distribúcie v tkanivách by sa malo vykonať s využitím primeraných metód.
                           
                        
                     Enzýmová indukcia/inhibícia
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Štúdie skúmajúce možné účinky enzýmovej indukcie/inhibície alebo biotransformáciu skúmanej testovanej chemikálie môžu byť potrebné v jednom alebo vo viacerých z uvedených prípadov:
                              
                                          1.
                                       
                                       
                                          dostupné dôkazy indikujú vzťah medzi biotransformáciou testovanej chemikálie a zvýšenou toxicitou;
                                       
                                    
                                          2.
                                       
                                       
                                          dostupné údaje o toxicite indikujú nelineárny vzťah medzi dávkou a metabolizmom;
                                       
                                    
                                          3.
                                       
                                       
                                          výsledky štúdií identifikácie metabolitov ukazujú identifikáciu potenciálne toxických metabolitov, ktoré mohli vzniknúť enzýmovým pôsobením indukovaným testovanou chemikáliou;
                                       
                                    
                                          4.
                                       
                                       
                                          pri vysvetľovaní účinkov, pri ktorých sa predpokladá súvislosť s enzýmovou indukciou;
                                       
                                    
                                          5.
                                       
                                       
                                          ak sa pozorujú toxikologicky významné zmeny v metabolickom profile testovanej chemikálie na základe pokusov in vitro alebo in vivo s využitím rôznych druhov zvierat alebo podmienok, môže byť potrebná charakterizácia pôsobiaceho enzýmu (enzýmov) (napr. enzýmov fázy I, ako sú izoenzýmy cytochróm P450 monooxygenázového systému, enzýmy fázy II, ako sú izoenzýmy sulfotransferázy alebo uridín-difosfát-glukuronosyltransferázy, alebo akýchkoľvek iných relevantných enzýmov). Tieto informácie možno použiť pri hodnotení vhodnosti živočíšnych druhov pre extrapoláciu druhov.
                                       
                                    
                        
                              57.
                           
                           
                              Na hodnotenie testovanej chemikálie v súvislosti so zmenami v TK sa použijú vhodné protokoly k štúdii, ktoré sú náležite overené a odôvodnené. Príklady plánov štúdií pozostávajú z opakovaného dávkovania neoznačenej testovanej chemikálie, po ktorom nasleduje jednorazová rádiooznačená dávka v deň 14 alebo opakované dávkovanie rádiooznačenej testovanej chemikálie a odber vzoriek v dňoch 1, 7 a 14 na stanovenie profilov metabolitov. Pomocou opakovaného dávkovania rádiooznačenej testovanej chemikálie možno získať aj informácie o bioakumulácii (pozri odsek 26).
                           
                        DOPLŇUJÚCE PRÍSTUPY
                  
                              58.
                           
                           
                              Doplňujúce prístupy presahujúce rámec pokusov in vivo opísaných v tejto testovacej metóde môžu priniesť užitočné informácie o absorpcii, distribúcii, metabolizme alebo eliminácii testovanej chemikálie pri určitých živočíšnych druhoch.
                           
                        
                     Použitie informácií in vitro
                     
                  
                  
                              59.
                           
                           
                              Pomocou vhodných testovacích systémov možno v štúdiách in vitro objasniť viaceré otázky týkajúce sa metabolizmu testovanej chemikálie. Čerstvo izolované alebo kultivované hepatocyty a subcelulárne frakcie (napr. mikrozómy a cytosól alebo frakcia S9) z pečene možno použiť na štúdium možných metabolitov. Pre hodnotenie rizík môže byť zaujímavý lokálny metabolizmus v cieľovom orgáne, napr. v pľúcach. Na tieto účely môžu byť užitočné mikrozómové frakcie cieľových tkanív. Štúdie s mikrozómami môžu byť prínosné pri riešení potenciálnych rozdielov medzi pohlaviami a životnými fázami a pri charakterizácii enzýmových parametrov (Km a Vmax), ktoré môžu pomôcť pri hodnotení závislosti metabolizmu od dávky v súvislosti s úrovňami expozície. Okrem toho môžu byť mikrozómy užitočné pri identifikácii špecifických mikrozómových enzýmov podieľajúcich sa na metabolizme testovanej chemikálie, ktoré môžu mať význam pri extrapolácii živočíšnych druhov (pozri aj odsek 56). Takisto potenciál indukcie biotransformácie možno preskúmať pomocou pečeňových subcelulárnych frakcií (napr. mikrozómov a cytosólu) zvierat, ktoré boli skúmanej testovanej chemikálii vystavené skôr, in vitro prostredníctvom štúdií hepatocytovej indukcie alebo zo špecifických bunkových línií vyjadrujúcich relevantné enzýmy. Za určitých okolností a v primeraných podmienkach možno pri určovaní potenciálnych rozdielov v biotransformácii medzi živočíšnymi druhmi zvážiť použitie subcelulárnych frakcií pochádzajúcich z ľudských tkanív. Výsledky z vyšetrení in vitro môžu byť užitočné aj pri vývoji modelov PBTK (5).
                           
                        
                              60.
                           
                           
                              Štúdie dermálnej absorpcie in vitro môžu priniesť doplňujúce informácie na účely charakterizácie absorpcie (6).
                           
                        
                              61.
                           
                           
                              Primárne bunkové kultúry z pečeňových buniek a čerstvé plátky tkanív možno použiť na zodpovedanie podobných otázok ako v prípade pečeňových mikrozómov. V určitých prípadoch je možné zodpovedať konkrétne otázky pomocou bunkových línií s vymedzeným vyjadrením relevantného enzýmu alebo pomocou kultivovaných bunkových línií. V určitých prípadoch môže byť užitočné študovať inhibíciu a indukciu špecifických cytochróm P450 izozýmov (napr. CYP1A1, 2E1, 1A2 a iných) a/alebo enzýmov fázy II materskej zlúčeniny s využitím štúdií in vitro. Získané informácie môžu mať význam v prípade zlúčenín s podobnou štruktúrou.
                           
                        
                     Použitie toxikokinetických údajov zo štúdií toxicity ako doplňujúcich informácií
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Analýza vzoriek krvi, tkanív a/alebo exkrétov odobratých v priebehu akýchkoľvek iných štúdií toxicity môže priniesť údaje o biodostupnosti, zmenách koncentrácií v plazme v závislosti od času (AUC, Cmax), potenciáli bioakumulácie, klírense a zmenách súvisiacich s pohlavím alebo polčasom v metabolizme a kinetike.
                           
                        
                              63.
                           
                           
                              Úvahy o pláne štúdie možno použiť na zodpovedanie otázok týkajúcich sa: nasýtenia absorpcie, ciest biotransformácie alebo exkrécie pri vyšších úrovniach dávky, pôsobenia nových metabolických ciest pri vyšších dávkach a obmedzenia toxických metabolitov na vyššie dávky.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Ostatné úvahy v rámci hodnotenia nebezpečnosti môžu zahŕňať otázky, ako napríklad:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          citlivosť súvisiaca s vekom v dôsledku rozdielov stavu hematoencefalickej bariéry, obličiek a/alebo detoxifikačných schopností,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          citlivosť subpopulácie v dôsledku rozdielov medzi schopnosťami biotransformácie alebo iných TK rozdielov,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          rozsah expozície plodu v dôsledku transplacentárneho prenosu chemikálií alebo expozície novorodenca prostredníctvom laktácie.
                                       
                                    
                        
                     Použitie toxikokinetického modelovania
                  
                  
                              65.
                           
                           
                              Toxikokinetické modely môžu byť užitočné pri rôznych aspektoch hodnotenia nebezpečnosti a rizík, ako napríklad pri predpovedaní systémovej expozície a dávky vo vnútorných tkanivách. Okrem toho sa môžu vyšetrovať konkrétne otázky týkajúce sa druhu pôsobenia, pričom tieto modely môžu predstavovať základ pre extrapoláciu živočíšnych druhov, spôsoby expozície, štruktúry dávkovania a hodnotenie rizík pre človeka. Údaje užitočné pre vývoj PBTK modelov pre testovanú chemikáliu pri akomkoľvek živočíšnom druhu zahŕňajú 1. rozdeľovacie koeficienty; 2. biochemické konštanty a fyziologické parametre; 3. absorpčné parametre pre konkrétne cesty a 4. kinetické údaje in vivo pre hodnotenie modelov [napr. parametre klírensu pre relevantné (> 10 %) vylučovacie cesty, Km a Vmax pre metabolizmus]. Experimentálne údaje použité pri vývoji modelov by sa mali získať metódami, ktoré sú z vedeckého hľadiska primerané, pričom výsledky modelov treba overiť. Na uľahčenie vývoja nekompartmentových fyziologicky založených modelov sa často stanovujú parametre špecifické pre testovanú chemikáliu a živočíšny druh, ako je miera absorpcie, rozdeľovacia konštanta krv – tkanivo a konštanta miery metabolizmu (7).
                           
                        ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV
                  
                              66.
                           
                           
                              Odporúča sa, aby správa o štúdii zahŕňala obsah.
                           
                        
                     Hlavná časť správy
                  
                  
                              67.
                           
                           
                              Hlavná časť správy zahŕňa informácie získané pomocou tejto testovacej metódy, ktoré sú rozdelené do oddielov a odsekov takto:
                           
                        
                     Zhrnutie
                  
                  
                              68.
                           
                           
                              Tento oddiel správy o štúdii obsahuje zhrnutie plánu štúdie a opis použitých metód. Takisto by mal poukazovať na hlavné zistenia týkajúce sa hmotnostnej bilancie, charakteru a veľkosti metabolitov, zvyškov tkanív, klírensu, potenciálu bioakumulácie, rozdielov medzi pohlaviami atď. Zhrnutie by malo byť dostatočne podrobné, aby umožnilo hodnotenie zistení.
                           
                        
                     Úvod
                  
                  
                              69.
                           
                           
                              Tento oddiel správy obsahuje ciele, odôvodnenie a plán štúdie, ako aj príslušné odkazy a akékoľvek informácie o skutočnostiach, ktoré štúdii predchádzali.
                           
                        
                     Materiály a metódy
                  
                  
                              70.
                           
                           
                              Tento oddiel správy obsahuje podrobné opisy všetkých súvisiacich informácií vrátane týchto údajov:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          Testovaná chemikália
                                          Tento pododdiel zahŕňa identifikáciu testovanej chemikálie: chemický názov, molekulárnu štruktúru, kvalitatívne a kvantitatívne stanovenie jej chemického zloženia, chemickú čistotu a, ak je to možné, druh a množstvá všetkých prímesí. Takisto zahŕňa informácie o fyzikálno-chemických vlastnostiach vrátane fyzikálneho skupenstva, farby, makroskopickej rozpustnosti a/alebo rozdeľovacieho koeficientu, stability a, ak je to vhodné, žieravosti. Podľa potreby sa uvedú informácie o izoméroch. Ak je testovaná chemikália rádiooznačená, tento pododdiel bude obsahovať tieto informácie: druh rádionuklidu, umiestnenie značky, špecifická aktivita a rádiochemická čistota.
                                          Uvedie sa druh alebo opis všetkých nosičov, riedidiel, suspenzných látok a emulzifikátorov alebo iných materiálov použitých pri podávaní testovanej chemikálie.
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          Pokusné zvieratá
                                          Tento pododdiel obsahuje informácie o pokusných zvieratách vrátane výberu živočíšneho druhu a odôvodnenia, kmeňa a veku na začiatku štúdie, pohlavia, ako aj telesnej hmotnosti, zdravotného stavu a chovu zvierat.
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          Metódy
                                          Tento pododdiel obsahuje informácie o pláne štúdie a použitej metodike. Zahŕňa tieto údaje:
                                          
                                                      1.
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie akýchkoľvek zmien spôsobu expozície a podmienok expozície, ak je to vhodné;
                                                   
                                                
                                                      2.
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie výberu úrovní dávok;
                                                   
                                                
                                                      3.
                                                   
                                                   
                                                      opis pilotných štúdií použitých v experimentálnom pláne následných štúdií, ak je to vhodné, pričom sa predložia doplňujúce údaje o pilotných štúdiách;
                                                   
                                                
                                                      4.
                                                   
                                                   
                                                      postup prípravy dávkovacieho roztoku a druh rozpúšťadla alebo nosiča, ak sa použil;
                                                   
                                                
                                                      5.
                                                   
                                                   
                                                      počet skupín, ktorým sa aplikovala chemikália, a počet zvierat v skupine;
                                                   
                                                
                                                      6.
                                                   
                                                   
                                                      úrovne a objem dávkovania (a špecifická aktivita dávky, ak sa použila rádioaktivita);
                                                   
                                                
                                                      7.
                                                   
                                                   
                                                      spôsob (spôsoby) a metódy podávania;
                                                   
                                                
                                                      8.
                                                   
                                                   
                                                      frekvencia dávkovania;
                                                   
                                                
                                                      9.
                                                   
                                                   
                                                      obdobie pôstu (ak sa použilo);
                                                   
                                                
                                                      10.
                                                   
                                                   
                                                      celková rádioaktivita na jedno zviera;
                                                   
                                                
                                                      11.
                                                   
                                                   
                                                      zaobchádzanie so zvieratami;
                                                   
                                                
                                                      12.
                                                   
                                                   
                                                      odber vzoriek a manipulácia s nimi;
                                                   
                                                
                                                      13.
                                                   
                                                   
                                                      analytické metódy použité na separáciu, kvantifikáciu a identifikáciu metabolitov;
                                                   
                                                
                                                      14.
                                                   
                                                   
                                                      detekčný limit pre použité metódy;
                                                   
                                                
                                                      15.
                                                   
                                                   
                                                      iné pokusné merania a postupy, ktoré sa použili (vrátane overenia metód analýzy metabolitov).
                                                   
                                                
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          Štatistická analýza
                                          Ak sa na analyzovanie zistení štúdie použije štatistická analýza, je potrebné uviesť dostatočné informácie o použitej metóde analýzy a o počítačovom programe, aby mohol analýzu opätovne vyhodnotiť a zrekonštruovať nezávislý kontrolór/štatistik.
                                          V prípade štúdií modelovania systémov, ako je PBTK, by prezentácia modelov mala zahŕňať kompletný opis modelu, ktorý umožní nezávislú rekonštrukciu a overenie modelu (pozri odsek 65 a dodatok: Vymedzenie pojmov).
                                       
                                    
                        
                     Výsledky
                  
                  
                              71.
                           
                           
                              Všetky údaje sa zhrnú do tabuliek s príslušným štatistickým hodnotením a opíšu sa v texte v rámci tohto oddielu. Výpočtové údaje o rádioaktivite sa zhrnú a uvedú v závislosti od štúdie, zvyčajne ako mikrogramové alebo miligramové ekvivalenty na hmotnosť vzorky, hoci je možné použiť aj iné jednotky. Tento oddiel zahŕňa grafické znázornenia zistení, reprodukciu reprezentatívnych chromatografických a spektrometrických údajov, identifikáciu/kvantifikáciu metabolitov a navrhované metabolické cesty vrátane molekulárnej štruktúry metabolitov. Okrem toho sa v tomto oddiele podľa možnosti uvedú tieto informácie:
                              
                                          1.
                                       
                                       
                                          Množstvo a percentuálna výťažnosť rádioaktivity v moči, výkaloch, vydychovanom vzduchu a v moči a výkaloch zo zvyškov v klietke:
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      v prípade dermálnych štúdií sa uvedú aj údaje o výťažnosti testovanej chemikálie z kože po aplikácii chemikálie, z omytia kože a údaje o reziduálnej rádioaktivite v krycom obväze kože a metabolickej jednotke, ako aj výsledky štúdie dermálneho omytia. Ďalšie informácie sú uvedené v odsekoch 74 – 77,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      v prípade inhalačných štúdií sa uvedú aj údaje o výťažnosti testovanej chemikálie z pľúc a nosových tkanív (8). Ďalšie informácie sú uvedené v odseku 78;
                                                   
                                                
                                    
                                          2.
                                       
                                       
                                          distribúcia v tkanivách uvádzaná ako percento podanej dávky a koncentrácia (mikrogramové ekvivalenty na gram tkaniva) a pomery tkanivo – krv alebo tkanivo – plazma;
                                       
                                    
                                          3.
                                       
                                       
                                          materiálová bilancia získaná z každej štúdie vrátane vyšetrenia telesných tkanív a exkrétov;
                                       
                                    
                                          4.
                                       
                                       
                                          koncentrácie plazmy a toxikokinetické parametre (biodostupnosť, AUC, Cmax, Tmax, klírens, polčas) po podaní príslušným spôsobom (spôsobmi) expozície;
                                       
                                    
                                          5.
                                       
                                       
                                          rýchlosť a rozsah absorpcie testovanej chemikálie po podaní príslušným spôsobom (spôsobmi) expozície;
                                       
                                    
                                          6.
                                       
                                       
                                          množstvá testovanej chemikálie a metabolitov (uvádzané ako percento podanej dávky) získané z exkrétov;
                                       
                                    
                                          7.
                                       
                                       
                                          odkaz na dodatky, ktoré obsahujú údaje o všetkých meraných parametroch pri jednotlivých zvieratách (napr. podávanie dávok, percentuálna výťažnosť, koncentrácie, TK parametre atď.);
                                       
                                    
                                          8.
                                       
                                       
                                          obrázok s navrhovanými metabolickými cestami a molekulárnou štruktúrou metabolitov.
                                       
                                    
                        
                     Rozbor a závery
                  
                  
                              72.
                           
                           
                              V tomto oddiele autor/autori:
                              
                                          1.
                                       
                                       
                                          uvedie/uvedú navrhovanú metabolickú cestu na základe výsledkov metabolizmu a charakteru testovanej chemikálie;
                                       
                                    
                                          2.
                                       
                                       
                                          analyzuje/analyzujú všetky potenciálne živočíšne druhy a rozdiely medzi pohlaviami týkajúce sa charakteru a/alebo biotransformácie testovanej chemikálie;
                                       
                                    
                                          3.
                                       
                                       
                                          uvedie/uvedú v tabuľkách a zanalyzuje/zanalyzujú identifikáciu a veľkosť metabolitov, klírens, potenciál bioakumulácie a úroveň tkanivových rezíduí materskej chemikálie a/alebo metabolitu (metabolitov), ako aj možné zmeny v TK parametroch súvisiace s dávkou;
                                       
                                    
                                          4.
                                       
                                       
                                          začlení/začlenia do tohto oddielu všetky relevantné TK údaje získané v priebehu štúdií toxicity;
                                       
                                    
                                          5.
                                       
                                       
                                          uvedie/uvedú stručný záver, ktorý možno podložiť zisteniami štúdie;
                                       
                                    
                                          6.
                                       
                                       
                                          vloží/vložia oddiely (podľa potreby).
                                       
                                    
                        
                              73.
                           
                           
                              Na uvedenie podkladových bibliografických informácií, tabuliek, obrázkov, dodatkov atď. možno použiť ďalšie oddiely.
                           
                        ALTERNATÍVNE SPÔSOBY EXPOZÍCIE
                  
                     Dermálna
                  
                  
                     Dermálna aplikácia
                  
                  
                              74.
                           
                           
                              V tomto oddiele sa uvádzajú špecifické informácie o vyšetrení toxikokinetiky testovanej chemikálie pri dermálnom spôsobe podávania. V prípade dermálnej absorpcie je potrebné si preštudovať kapitolu B.44 tejto prílohy [Absorpcia kožou: metóda in vivo (9)]. Na ostatné parametre, ako je distribúcia a metabolizmus, možno použiť túto testovaciu metódu B.36. V prípade dermálnej aplikácie sa použije jedna alebo viac úrovní dávok testovanej chemikálie. Testovaná chemikália (napríklad čistý, zriedený alebo vytvorený materiál obsahujúci testovanú chemikáliu, ktorá sa aplikuje na kožu) by mala byť rovnaká (prípadne realisticky zástupná) ako chemikália, ktorej môže byť vystavený človek alebo iný potenciálny cieľový živočíšny druh. Úroveň/úrovne dávky sa vyberie/vyberú podľa odsekov 20 – 26 tejto testovacej metódy. Medzi faktory, ktoré možno vziať pri výbere dermálnej dávky do úvahy, patrí predpokladaná expozícia človeka a/alebo dávky, pri ktorých bola v iných štúdiách toxicity pozorovaná toxicita. Dermálna/dermálne dávka/dávky sa podľa potreby rozpustí/rozpustia vo vhodnom nosiči a aplikujú v objeme primeranom na podávanie dávok. Krátko pred začatím testu sa pokusným zvieratám ostrihá srsť na chrbte. Vyholenie srsti je takisto prípustné, malo by sa však uskutočniť asi 24 hodín pred testom. Pri strihaní alebo holení treba brať ohľad na to, aby sa nepoškodila koža zvierat, lebo by to viedlo k zmene priepustnosti. Na účely aplikácie testovanej chemikálie sa približne 10 % povrchu tela zbaví srsti. V prípade vysokotoxických chemikálií môže povrchová plocha predstavovať menej ako približne 10 %, ale čo najväčšia časť tejto plochy sa pokryje tenkým a rovnomerným filmom. Vo všetkých skupinách dermálneho testovania sa na aplikáciu použije tá istá povrchová plocha. Plochy, na ktoré bola chemikália aplikovaná, sa prikryjú vhodným krycím obväzom, ktorý sa upevní na dané miesto. Zvieratá sa umiestnia samostatne.
                           
                        
                              75.
                           
                           
                              Na posúdenie množstva aplikovanej dávky testovanej chemikálie, ktorú možno z kože odstrániť omytím ošetrenej plochy kože šetrným mydlom a vodou, by sa mala vykonať štúdia dermálneho omytia. Táto štúdia môže byť užitočná aj pri stanovovaní hmotnostnej bilancie v prípade, že sa testovaná chemikálie podáva cez kožu. V tejto štúdii dermálneho omytia sa dvom zvieratám jednorazovo aplikuje dávka testovanej chemikálie. Úroveň dávky sa vyberie podľa odseku 23 tejto testovacej metódy (pre rozbor času kontaktu s kožou pozri aj odsek 76). Množstvá testovanej chemikálie získané z omytia sa stanovia s cieľom posúdiť efektívnosť eliminácie testovanej chemikálie prostredníctvom omytia.
                           
                        
                              76.
                           
                           
                              Pokiaľ tomu nebráni žieravosť, testovaná chemikália sa aplikuje a nechá pôsobiť na koži minimálne šesť hodín. V čase odstránenia krycieho obväzu sa ošetrená plocha umyje podľa postupu uvedeného v štúdii dermálneho omytia (pozri odsek 75). Krycí obväz aj zmytý materiál sa analyzujú s cieľom zistiť, či neobsahujú zvyšky testovanej chemikálie. Na konci štúdií sa každé zviera humánne utratí podľa bodu (2) a ošetrená koža sa odstráni. Na určenie rezíduí testovanej chemikálie (rádioaktivity) sa analyzuje vhodný rez ošetrenej kože.
                           
                        
                              77.
                           
                           
                              Na účely toxikokinetického hodnotenia liekov môžu byť potrebné odlišné postupy, ktoré sú v súlade s príslušným regulačným systémom.
                           
                        
                     Inhalačná
                  
                  
                              78.
                           
                           
                              Použije sa jedna koncentrácia (alebo podľa potreby viac koncentrácií) testovanej chemikálie. Koncentrácia/koncentrácie sa vyberie/vyberú podľa odsekov 20 – 26 tejto testovacej metódy. Inhalačná aplikácia sa vykoná pomocou nosového kónu alebo zariadenia na oblasť hlavy, aby sa predišlo absorpcii inými expozičnými cestami (8). Ak sa pri inhalačnej expozícii použijú iné podmienky, je potrebné v dokumentácii uviesť odôvodnenie tejto zmeny. Je potrebné vymedziť trvanie expozície inhaláciou. Expozícia zvyčajne trvá štyri až šesť hodín.
                           
                        
                     LITERATÚRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paríž.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paríž.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Solon, E. G., Kraus, L. (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73 – 81.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Stumpf, W. E. (2005). Drug localization and targeting with receptor microscopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25 – 40.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Loizou, G., Spendiff, M., Barton, H. A., Bessems, J., Bois, F. Y., d’Yvoire, M. B., Buist, H., Clewell, H. J. 3rd, Meek, B., Gundert-Remy, U., Goerlitz, G., Schmitt, W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400 – 411.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Kapitola B.45 tejto prílohy, Absorpcia kožou: metóda in vitro.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              IPCS (2010). Characterization and application of Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS Harmonization Project Document No 9. Ženeva, Svetová zdravotnícka organizácia, Medzinárodný program chemickej bezpečnosti.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paríž.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Kapitola B.44 tejto prílohy, Absorpcia kožou: metóda in vivo.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Barton, H. A. a kol. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9 – 35.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Gibaldi, M., a Perrier, D., (1982), Pharmacokinetics, druhé vydanie, Marcel Dekker, Inc., New York.
                           
                        
                     Dodatok
                     VYMEDZENIE POJMOV
                     
                        Absorpcia: proces (procesy) vstrebávania chemikálií do tkanív alebo cez tkanivá. Absorpcia sa vzťahuje na materskú zlúčeninu a všetky jej metabolity. Nesmie sa zamieňať s ‚biodostupnosťou‘.
                     
                        Akumulácia (bioakumulácia): priebežné zvyšovanie množstva testovanej chemikálie v tkanivách (zvyčajne v tukových tkanivách po opakovanej expozícii). Ak je príjem testovanej chemikálie do tela vyšší ako rýchlosť, ktorou sa chemikália odstraňuje, organizmus testovanú chemikáliu hromadí a môže dôjsť k vzniku toxických koncentrácií testovanej chemikálie.
                     
                        ADME: skratka pre ‚absorpciu, distribúciu, metabolizmus a exkréciu‘.
                     
                        AUC: (plocha pod krivkou závislosti koncentrácie v plazme a času): plocha pod krivkou v znázornení koncentrácie testovanej chemikálie v plazme za čas. Predstavuje celkové množstvo testovanej chemikálie, ktorú telo absorbovalo počas vopred stanoveného obdobia. V lineárnych podmienkach je krivka AUC (od nulového času po nekonečno) priamo úmerná celkovému množstvu testovanej chemikálie absorbovanej telom bez ohľadu na mieru absorpcie.
                     
                        Autorádiografia: (autorádiografia celého tela): používa sa na kvalitatívnu a/alebo kvantitatívnu lokalizáciu rádioaktívnej testovanej chemikálie v tkanivách. Táto metóda využíva röntgenový film alebo najnovšie digitálny phosphorimaging (fosforové zobrazovanie) na vizualizáciu rádioaktívne značených molekúl alebo fragmentov molekúl prostredníctvom zaznamenávania žiarenia emitovaného v rámci objektu, ktorý je predmetom štúdie. Kvantitatívna autorádiografia celého tela v porovnaní s disekciou orgánov môže mať výhody pri hodnotení distribúcie testovanej chemikálie a pri hodnotení celkovej výťažnosti a rozkladu rádioaktívneho materiálu v tkanivách. Významnou výhodou je napríklad možnosť využitia na modeli zvieraťa s pigmentáciou na účely hodnotenia možnej súvislosti testovanej chemikálie s melanínom, ktorý môže viazať určité molekuly. Hoci táto metóda môže zabezpečiť vhodné zobrazenia celého tela s miestami viazania s vysokou kapacitou a nízkou afinitou, môže mať obmedzenia pri detegovaní špecifických cieľových miest, ako sú miesta viazania receptorov, kde je na detekciu potrebné pomerne vysoké rozlíšenie a vysoká citlivosť. Ak sa použije autorádiografia, pokusy určené na stanovenie hmotnostnej bilancie podanej zlúčeniny sa vykonajú ako samostatná skupina alebo v rámci samostatnej štúdie oddelenej od pokusu na zistenie distribúcie v tkanivách, kde sa všetky exkréty (ktoré môžu zahŕňať aj vydychovaný vzduch) a celé mŕtve telá homogenizujú a vyšetria pomocou kvapalinovej scintilačnej spektroskopie.
                     
                        Exkrécia žlčou: exkrécia prostredníctvom žlčovodu.
                     
                        Bioakumulácia: pozri ‚akumulácia‘.
                     
                        Biodostupnosť: časť podanej dávky, ktorou sa dosahuje systémový obeh alebo ktorá je dostupná na mieste fyziologickej aktivity. Zvyčajne sa biodostupnosť testovanej chemikálie vzťahuje na materskú zlúčeninu, ale môže sa vzťahovať aj na jej metabolit. Zohľadňuje iba jednu chemickú formu. Poznámka biodostupnosť a absorpcia nie je to isté. Rozdiel medzi napríklad orálnou absorpciou (t. j. prítomnosťou v črevnej stene a v portálnom obehu) a biodostupnosťou (t. j. prítomnosťou v systémovej krvi a v tkanivách) môže vzniknúť v súvislosti s chemickým rozkladom v dôsledku metabolizmu črevnej steny alebo v dôsledku spätného odtoku do črevného lumenu alebo predsystémového metabolizmu v pečeni okrem iných faktorov (10). Biodostupnosť toxickej zložky (materskej zlúčeniny alebo metabolitu) je kritický parameter pri hodnotení rizika pre človeka (extrapolácia vysokých a nízkych dávok, extrapolácia jednotlivých spôsobov expozície) na odvodenie internej hodnoty z externej úrovne NOAEL alebo BMD (aplikovanej dávky). Na vznik účinkov na pečeň po orálnom podaní je postačujúca orálna absorpcia. V prípade každého účinku, ktorý sa prejaví inde ako pri vstupnej bráne, je však vo všeobecnosti spoľahlivejším parametrom, ktorý možno ďalej použiť pri hodnotení rizík, biodostupnosť, nie absorpcia.
                     
                        Bioperzistencia: pozri ‚perzistencia‘.
                     
                        Biotransformácia: (zvyčajne enzýmová) chemická premena skúmanej testovanej chemikálie na inú chemikáliu v tele. Synonymom je ‚metabolizmus‘.
                     
                        Cmax
                        : buď maximálna (vrcholová) koncentrácia v krvi (v plazme/sére) po podaní alebo maximálna (vrcholová) exkrécia (v moči alebo vo výkaloch) po podaní.
                     
                        Klírens: kvantitatívny ukazovateľ rýchlosti, ktorou sa testovaná chemikália odstraňuje z krvi, plazmy alebo určitého tkaniva za jednotku času.
                     
                        Kompartment: štrukturálna alebo biochemická zložka (alebo jednotka) tela, tkaniva alebo bunky, ktorá ja oddelená od zvyšku.
                     
                        Detoxifikačné cesty: súbor krokov, ktoré vedú k odstráneniu toxických chemikálií z tela buď metabolickou premenou, alebo exkréciou.
                     
                        Distribúcia: disperzia testovanej chemikálie a jej derivátov v organizme.
                     
                        Enzýmy/izozýmy: bielkoviny, ktoré katalyzujú chemické reakcie. Izozýmy sú enzýmy, ktoré katalyzujú podobné chemické reakcie, ale líšia sa svojou sekvenciou aminokyselín.
                     
                        Enzýmové parametre: Km: Michaelisova konštanta a Vmax: maximálna rýchlosť.
                     
                        Exkrécia: proces/procesy, ktorým/ktorými sa podaná testovaná chemikália a/alebo jej metabolity odstraňujú z tela.
                     
                        Exogénne: zavedené z prostredia mimo organizmu alebo systému alebo vytvorené v prostredí mimo organizmu alebo systému.
                     
                        Extrapolácia: odvodenie jednej alebo viacerých neznámych hodnôt na základe toho, čo je známe alebo bolo pozorované.
                     
                        Polčas (t1/2): čas potrebný na pokles koncentrácie testovanej chemikálie v kompartmente na polovicu. Zvyčajne sa vzťahuje na koncentráciu v plazme alebo na množstvo testovanej chemikálie v celom tele.
                     
                        Indukcia/enzýmová indukcia: enzýmová syntéza ako reakcia na environmentálny podnet alebo induktorovú molekulu.
                     
                        Linearita/lineálna kinetika: proces je lineárny z hľadiska kinetiky, ak sú všetky rýchlosti prechodu medzi kompartmentmi priamo úmerné prítomným množstvám alebo koncentráciám, t. j. sú prvého rádu. Následne sú klírens a objemy distribúcie konštantné, rovnako ako polčasy. Dosiahnuté koncentrácie sú priamo úmerné miere dávkovania (expozícii) a akumulácia sa dá ľahšie predpovedať. Linearitu/nelinearitu možno hodnotiť porovnaním príslušných parametrov, napr. AUC, po rôznych dávkach alebo po jednorazovej a opakovanej expozícii. Chýbajúca závislosť od dávky môže indikovať nasýtenie enzýmov podieľajúcich sa na metabolizme zlúčeniny, rast krivky AUC po opakovanej expozícii v porovnaní s jednorazovou expozíciou môže indikovať inhibíciu metabolizmu a klesanie krivky AUC môže indikovať indukciu metabolizmu [pozri aj bod (11)].
                     
                        Hmotnostná bilancia: započítanie vstupov a výstupov testovanej chemikálie do/zo systému.
                     
                        Materiálová bilancia: pozri ‚hmotnostná bilancia‘.
                     
                        Mechanizmus (druh) toxicity/mechanizmus (druh) pôsobenia: mechanizmus pôsobenia sa vzťahuje na špecifické biochemické interakcie, prostredníctvom ktorých testovaná chemikália vytvára svoj účinok. Druhom pôsobenia sa myslia bežné cesty vedúce k toxicite testovanej chemikálie.
                     
                        Metabolizmus: synonymom je ‚biotransformácia‘.
                     
                        Metabolity: produkty metabolizmu alebo metabolických procesov.
                     
                        Orálna absorpcia: percento dávky testovanej chemikálie absorbované z miesta podania (t. j. z gastrointestinálneho traktu). Tento kritický parameter možno použiť na zistenie frakcie podanej testovanej chemikálie, ktorá sa dostane do vrátnice a následne do pečene.
                     
                        Rozdeľovací koeficient: takisto známy ako distribučný koeficient, je ukazovateľ diferenčnej rozpustnosti chemikálie v dvoch rozpúšťadlách.
                     
                        Vrcholové úrovne v krvi (plazme/sére): maximálna (vrcholová) koncentrácia v krvi (plazme/sére) po podaní (pozri aj ‚Cmax‘).
                     
                        Perzistencia (bioperzistencia): dlhodobá prítomnosť chemikálie (v biologickom systéme) v dôsledku rezistencie voči rozkladu/eliminácii.
                     
                        Krížový prístup: informácie o parametri jednej alebo viacerých chemikálií sa použijú na predpovedanie parametra cieľovej chemikálie.
                     
                        Receptorová mikroskopická autorádiografia (alebo receptorová mikroautorádiografia): túto metódu možno použiť na zistenie xenobiotickej interakcie so špecifickými miestami tkanív alebo s bunkovými populáciami, ako napríklad pri štúdiách viazania receptorov alebo špecifického druhu pôsobenia, ktoré môžu vyžadovať vysoké rozlíšenie a vysokú citlivosť, ktoré nemožno dosiahnuť inými metódami, ako je napríklad autorádiografia celého tela.
                     
                        Spôsob podania (orálny, IV, dermálny, inhalačný atď.): vzťahuje sa na spôsob, akým sa chemikálie podajú do tela (napr. orálne cez sondu, orálne v krmive, dermálne, inhaláciou, intravenózne atď.).
                     
                        Nasýtenie: stav, v ktorom jeden alebo viacero kinetických (napr. absorpcia, metabolizmus alebo klírens) procesov dosiahli maximum (teda ‚sú nasýtené‘).
                     
                        Citlivosť: schopnosť metódy alebo nástroja rozlišovať medzi reakciami merania predstavujúcimi rôzne úrovne skúmanej premennej.
                     
                        Stabilné úrovne v krvi (plazme): nerovnovážny stav otvoreného systému, v ktorom sú všetky sily pôsobiace na systém presne vyvážené protichodnými silami takým spôsobom, že jeho zložky majú stabilnú koncentráciu, hoci dochádza k toku čiastočiek cez systém.
                     
                        Modelovanie systémov (fyziologicky založené toxikokinetické, farmakokineticky založené, fyziologicky založené farmakokinetické, biologicky založené atď.): abstraktný model, ktorý využíva matematický jazyk na opis správania systému.
                     
                        Cieľové tkanivo: tkanivo, v ktorom sa preukazuje hlavný nepriaznivý účinok toxikantu.
                     
                        Testovaná chemikália: akákoľvek chemikália alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
                     
                        Distribúcia v tkanivách: reverzibilný pohyb testovanej chemikálie z jedného miesta v tele na iné miesto. Distribúciu v tkanivách možno študovať pomocou disekcie orgánov, homogenizácie, horenia a kvapalinovej scintilačnej spektroskopie alebo kvalitatívnej a/alebo kvantitatívnej autorádiografie celého tela. Prvý spôsob je užitočný na získanie koncentrácie a percenta výťažnosti z tkanív a zvyškov mŕtveho tela tých istých zvierat, ale nemusí zabezpečovať dostatočné rozlíšenie pre všetky tkanivá a môže mať nižšiu ako ideálnu celkovú výťažnosť (< 90 %). Vymedzenie druhej metódy pozri vyššie.
                     
                        Tmax
                        : čas na dosiahnutie Cmax.
                     
                        Toxikokinetika (farmakokinetika): štúdia absorpcie, distribúcie, metabolizmu a exkrécie chemikálií za určitý čas.
                     
                        Validácia (overenie) modelov: proces hodnotenia vhodnosti modelu s cieľom konzistentne opísať dostupné toxikokinetické údaje. Modely možno hodnotiť prostredníctvom štatistického a vizuálneho porovnania predpovedí modelov s experimentálnymi hodnotami a spoločnej nezávislej premennej (napr. času). Rozsah hodnotenia je potrebné odôvodniť v súvislosti s plánovaným využitím modelu.
                  “
            
                  8.
               
               
                  Dopĺňa sa kapitola B.52:
                  „B.52.   AKÚTNA INHALAČNÁ TOXICITA – METÓDA AKÚTNEJ TOXICKEJ TRIEDY
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov (TG) 436 (2009). Prvé usmernenia TG 403 na vykonávanie testov akútnej inhalácie boli prijaté v roku 1981 a medzičasom boli revidované [pozri kapitolu B.2 tejto prílohy (1)]. Po prijatí revidovanej metódy orálnej akútnej toxickej triedy (ATC) (kapitola B.1b tejto prílohy) (5) sa považovalo za vhodné vypracovať metódu inhalačnej ATC (2) (3) (4). Z retrospektívneho hodnotenia výkonnosti metódy ATC pre akútnu inhalačnú toxicitu vyplynulo, že metóda je vhodná na účely klasifikácie a označovania (6). Testovacia metóda inhalačnej ATC umožní použitie po sebe nasledujúcich stupňov pevne stanovených cieľových koncentrácií na účely klasifikácie toxicity testovanej chemikálie. Kľúčovým parametrom je letalita, ale zvieratá, ktoré majú bolesti, trpia alebo sú moribundné, by sa mali humánne utratiť, aby sa minimalizovalo ich utrpenie. Usmernenia k humánnym parametrom sú k dispozícii v usmerňovacom dokumente OECD č. 19 (7).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Usmernenia k vykonaniu a interpretácii tejto testovacej metódy sú k dispozícii v Usmerňovacom dokumente č. 39 o testovaní akútnej inhalačnej toxicity (GD 39) (8).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Vymedzenie pojmov použitých v súvislosti s touto testovacou metódou je uvedené v dodatku 1 a v dokumente GD 39 (8).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Testovacia metóda poskytuje informácie o nebezpečných vlastnostiach a umožňuje, aby bolo možné testovanú chemikáliu zatriediť a klasifikovať podľa nariadenia (ES) č. 1272/2008 o klasifikácii chemikálií, ktoré spôsobujú akútnu toxicitu (9). V prípade, že sa vyžadujú bodové odhady hodnôt LC50 alebo analýzy vzťahu koncentrácie a reakcie, je kapitola B.2 tejto prílohy (1) vhodnou testovacou metódou, ktorú možno použiť. Ďalšie usmernenia o výbere testovacej metódy sú uvedené v dokumente GD 39 (8). Táto testovacia metóda nie je osobitne určená na testovanie špecializovaných materiálov, ako sú slabo rozpustné izometrické alebo vláknité materiály alebo priemyselne vyrábané nanomateriály.
                           
                        ÚVODNÉ ÚVAHY
                  
                              5.
                           
                           
                              Pred zvažovaním testovania podľa tejto testovacej metódy by testovacie laboratórium malo zohľadniť všetky dostupné informácie o testovanej chemikálii vrátane existujúcich štúdií obsahujúcich údaje, na základe ktorých sa ďalšie testovanie neodporúča s cieľom minimalizovať využívanie zvierat. Informácie, ktoré môžu pomôcť pri výbere najvhodnejšieho druhu, kmeňa, pohlavia, spôsobu expozície a primeraných testovacích koncentrácií, zahŕňajú identitu, chemickú štruktúru a fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej chemikálie, výsledky všetkých testov toxicity in vitro alebo in vivo, predpokladané použitia a potenciál expozície človeka, dostupné údaje (Q)SAR a toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných chemikáliách. Koncentrácie, pri ktorých sa predpokladá, že spôsobia silnú bolesť a utrpenie v dôsledku žieravého (11) alebo silno dráždivého pôsobenia, by sa nemali testovať podľa tejto testovacej metódy [pozri dokument GD 39 (8)].
                           
                        PRINCÍP TESTU
                  
                              6.
                           
                           
                              Princíp testu spočíva v tom, že v rámci postupu niekoľkých krokov sa v priebehu expozície v trvaní štyroch hodín o akútnej inhalačnej toxicite testovanej chemikálie získajú dostatočné informácie, ktoré umožnia jej klasifikáciu. Na špecifické regulačné účely možno použiť iné intervaly expozície. V každom kroku, pre ktorý je vymedzená koncentrácia, sa testujú tri zvieratá z každého pohlavia. V závislosti od mortality a/alebo moribundného stavu zvierat môžu na posúdenie akútnej toxicity testovanej chemikálie postačovať dva kroky. Ak sú k dispozícii dôkazy o tom, že jedno pohlavie je vnímavejšie ako druhé, potom môže test pokračovať s využitím iba vnímavejšieho pohlavia. V závislosti od výsledku predchádzajúceho kroku bude nasledovať tento krok:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          nie je potrebné ďalšie testovanie;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          testovanie troch zvierat z každého pohlavia alebo
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          testovanie šiestich zvierat vnímavejšieho pohlavia, t. j. nižšie hraničné odhady toxickej triedy budú založené na šiestich zvieratách v každej skupine s koncentráciou bez ohľadu na pohlavie.
                                       
                                    
                        
                              7.
                           
                           
                              Moribundné zvieratá alebo zvieratá so zjavnými bolesťami, alebo zvieratá, ktoré vykazujú príznaky silného a trvalého utrpenia, by sa mali humánnym spôsobom usmrtiť, pričom pri interpretácii výsledkov testu sa vyhodnocujú rovnako ako zvieratá, ktoré uhynuli pri teste. Kritériá na rozhodnutie usmrtiť moribundné alebo silne trpiace zvieratá a usmernenie o uznaní predvídateľnej alebo nastávajúcej smrti sú predmetom Usmerňovacieho dokumentu č. 19 o humánnych parametroch (Humane Endpoints Guidance Document) (7).
                           
                        OPIS METÓDY
                  
                     Výber druhov zvierat
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Používajú sa zdravé mladé dospelé zvieratá bežne používaných laboratórnych kmeňov. Najvhodnejším zvieraťom je potkan. Použitie iných druhov zvierat je nutné odôvodniť.
                           
                        
                     Príprava zvierat
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Používajú sa samice, ktoré nikdy nevrhli mláďatá a sú negravidné. V deň expozície by zvieratá mali byť mladé dospelé jedince vo veku od 8 do 12 týždňov a ich telesná hmotnosť by mala byť v rozmedzí ± 20 % strednej hmotnosti jednotlivých pohlaví všetkých zvierat toho istého veku, ktoré boli exponované skôr. Zvieratá sa vyberajú náhodne a označia sa na účely individuálnej identifikácie. Zvieratá sa umiestnia do klietok najmenej na päť dní pred začatím testu, aby sa aklimatizovali na laboratórne podmienky. Zvieratá by sa na krátky čas pred testovaním mali aklimatizovať aj na testovacie zariadenie, lebo sa tak zníži stres spôsobený uvedením do nového prostredia.
                           
                        
                     Chov zvierat
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Teplota miestnosti, kde sa pokusné zviera chová, by mala byť 22 ± 3 °C. Relatívna vlhkosť by sa v ideálnom prípade mala udržiavať v rozsahu od 30 do 70 %, hoci to nemusí byť možné, ak sa ako nosič používa voda. Pred a po expozícii sú zvieratá zvyčajne umiestnené v klietkach podľa pohlavia a koncentrácie, ale počet zvierat v jednej klietke by nemal prekážať bezproblémovému pozorovaniu každého zvieraťa, pričom by sa mali minimalizovať straty súvisiace so vzájomným požieraním alebo bojom jedincov. V prípade, že sa použije iba expozícia oblasti nosa, môže byť potrebné, aby sa zvieratá aklimatizovali na skúmavky obmedzujúce pohyb. Skúmavky by nemali zvieratám spôsobovať neprimeraný stres súvisiaci s fyzikálnymi vlastnosťami, teplotou alebo obmedzením pohybu. Obmedzenie môže mať vplyv na fyziologické sledované parametre, ako sú telesná teplota (hypertermia) a/alebo respiračný minútový objem. Ak sú k dispozícii všeobecné údaje, podľa ktorých k takýmto zmenám nedochádza vo veľkej miere, potom skúmavky nie je potrebné vopred upraviť. Zvieratá vystavené účinkom aerosólu celým telom by sa mali v priebehu expozície umiestniť samostatne, aby sa zabránilo filtrovaniu testovaného aerosólu cez srsť ostatných zvierat v klietke. S výnimkou času trvania expozície sa na kŕmenie môže používať bežné a osvedčené laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou miestnej pitnej vody. Osvetlenie by malo byť umelé a malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy.
                           
                        
                     Inhalačné komory
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Pri výbere inhalačnej komory by sa mal vziať do úvahy charakter testovanej chemikálie a cieľ testu. Uprednostňuje sa expozícia oblasti nosa (pričom tento pojem zahŕňa expozíciu hlavy, nosa alebo pysku). Vo všeobecnosti sa pri štúdiách kvapalných alebo tuhých aerosólov a pár, ktoré môžu kondenzovať a vytvárať aerosóly, uprednostňuje expozícia oblasti nosa. Špeciálne ciele štúdie možno lepšie dosiahnuť použitím expozície celého tela, ale tento krok je potrebné v správe o štúdii odôvodniť. Na zabezpečenie stability prostredia pri používaní komory na expozíciu celého tela by celkový objem testovaných zvierat nemal presiahnuť 5 % objemu komory. Princípy metód expozície celého tela a oblasti nosa a ich konkrétne výhody a nevýhody sú opísané v dokumente GD 39 (8).
                           
                        PODMIENKY EXPOZÍCIE
                  
                     Podávanie koncentrácií
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Odporúča sa použitie stabilného intervalu expozície v trvaní štyroch hodín, do ktorých nie je započítaný čas na dosiahnutie rovnováhy. Na splnenie špecifických požiadaviek môžu byť nutné iné intervaly, v správe o štúdii však treba uviesť odôvodnenie [pozri dokument GD 39 (8)]. Zvieratá exponované v komorách na expozíciu celého tela by mali byť umiestnené samostatne, aby sa zabránilo požitiu testovanej chemikálie v dôsledku očisťovania tela ostatnými zvieratami v klietke. Počas trvania expozície by sa zviera nemalo kŕmiť. V priebehu expozície celého tela sa zvieraťu môže podať voda.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Zvieratá sú vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie vo forme plynu, pary, aerosólu alebo ich kombinácie. Fyzikálne skupenstvo, ktoré sa testuje, závisí od fyzikálno-chemických vlastností testovanej chemikálie, zvolenej koncentrácie a/alebo najpravdepodobnejšej fyzikálnej formy pri manipulácii a používaní testovanej chemikálie. Hygroskopické a chemicky reaktívne testované chemikálie by sa mali testovať v podmienkach suchého vzduchu. Treba dbať na to, aby sa nevytvorili výbušné koncentrácie.
                           
                        
                     Rozdelenie veľkosti častíc
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Častice by sa mali rozdeliť podľa veľkosti v prípade všetkých aerosólov a pár, ktoré môžu kondenzovať a vytvárať aerosóly. Na umožnenie expozície všetkých relevantných oblastí dýchacej sústavy sa odporúčajú aerosóly so stredným aerodynamickým hmotnostným priemerom (MMAD) v rozsahu od 1 do 4 μm so štandardnou odchýlkou geometrického priemeru (σg) v rozsahu od 1,5 do 3,0 (8) (13) (14). Hoci by sa malo vynaložiť značné úsilie na dodržanie tejto normy, pokiaľ túto podmienku nie je možné splniť, treba predložiť odborný posudok. Napríklad v prípade kovových dymov môžu byť častice menšie, ako stanovuje táto norma, a takisto nabité častice, vlákna a hygroskopické materiály (ktoré sa vo vlhkom prostredí dýchacej sústavy zväčšujú) môžu túto normu prekračovať.
                           
                        
                     Príprava testovanej chemikálie v nosiči
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Na prípravu vhodnej koncentrácie a veľkosti častíc testovanej chemikálie v ovzduší možno použiť nosič. Spravidla sa uprednostňuje voda. Tuhý materiál môže byť podrobený mechanickým procesom s cieľom dosiahnuť požadovanú distribúciu veľkosti častíc, treba však dbať na to, aby sa testovaná chemikália nerozložila ani nezmenila. V prípadoch, v ktorých sa usudzuje, že sa pôsobením mechanických procesov zmenilo zloženie testovanej chemikálie (napr. extrémna teplota spôsobená nadmerným mletím v dôsledku trenia), by sa zloženie testovanej chemikálie malo analyticky overiť. Treba dať pozor, aby sa testovaná chemikália neznečistila. Nie je potrebné testovať nedrobivé granulované materiály, ktoré sa účelovo pripravujú tak, aby nebolo možné ich inhalovať. Na preukázanie, že pri manipulácii s granulovaným materiálom nevznikajú dýchateľné častice, by sa mal vykonať test opotrebovania. Ak pri teste opotrebovania vzniknú dýchateľné častice, treba uskutočniť test inhalačnej toxicity.
                           
                        
                     Kontrolné zvieratá
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Súbežná negatívna kontrolná skupina (ovzdušia) nie je potrebná. V prípade, že sa na vytvorenie testovacieho ovzdušia použije iný nosič ako voda, sa kontrolná skupina nosiča použije iba vtedy, ak nie sú k dispozícii staršie údaje o inhalačnej toxicite. Ak sa pri štúdii toxicity testovanej chemikálie pripravenej v nosiči nezistí žiadna toxicita, znamená to, že nosič pri testovanej koncentrácii nie je toxický, a teda kontrola nosiča nie je potrebná.
                           
                        MONITOROVANIE PODMIENOK EXPOZÍCIE
                  
                     Prúdenie vzduchu v komore
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Prúdenie vzduchu cez komoru by sa počas každej expozície malo dôkladne kontrolovať, nepretržite monitorovať a zaznamenávať aspoň raz za hodinu. Monitorovanie koncentrácie testovacieho ovzdušia (alebo stability) je integrálne meranie všetkých dynamických parametrov a poskytuje nepriamy prostriedok kontroly všetkých relevantných dynamických parametrov tvorby ovzdušia. Osobitne treba dbať na to, aby sa zabránilo opätovnému vdýchnutiu v komorách na expozíciu oblasti nosa v prípadoch, v ktorých prúdenie vzduchu cez systém expozície nestačí na zabezpečenie dynamického prúdenia vzduchu s testovanou chemikáliou. Existujú predpísané metodiky, prostredníctvom ktorých možno dokázať, že v zvolených prevádzkových podmienkach nedochádza k opätovnému vdýchnutiu (8) (15). Koncentrácia kyslíka by mala byť minimálne 19 % a koncentrácia oxidu uhličitého by nemala presiahnuť 1 %. Ak existuje dôvod domnievať sa, že tieto normy nie je možné splniť, koncentrácie kyslíka a oxidu uhličitého by sa mali zmerať.
                           
                        
                     Teplota komory a relatívna vlhkosť
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Komora by sa mala udržiavať pri teplote 22 ± 3 °C. Relatívna vlhkosť v dýchacej zóne zvierat, a to v prípade expozície oblasti nosa, ako aj v prípade expozície celého tela, by sa mala monitorovať a zaznamenávať minimálne trikrát počas expozície v trvaní až štyroch hodín a v prípade kratšej expozície každú hodinu. Relatívna vlhkosť by sa ideálne mala udržiavať v rozsahu od 30 do 70 %, ale môže sa stať, že táto hodnota bude nedosiahnuteľná (napr. v prípade testovania zmesí na báze vody) alebo nemerateľná z dôvodu interferencie testovanej chemikálie a testovacej metódy.
                           
                        
                     Testovaná chemikália: nominálna koncentrácia
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Vždy, keď je to možné, by sa mala vypočítať a zaznamenať nominálna koncentrácia expozície v komore. Nominálna koncentrácia je hmotnosť vytvorenej testovanej chemikálie vydelená celkovým objemom vzduchu, ktorý prešiel systémom komory. Nominálna koncentrácia sa nepoužíva na charakterizáciu expozície zvierat, ale porovnanie nominálnej a skutočnej koncentrácie vypovedá o účinnosti vytvárania testovacieho systému, a teda sa môže použiť na zistenie problémov s tvorbou.
                           
                        
                     Testovaná chemikália: skutočná koncentrácia
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Skutočná koncentrácia je koncentrácia testovanej chemikálie v dýchacej zóne zvierat v inhalačnej komore. Skutočné koncentrácie možno získať špecifickými metódami (napr. priamym odberom vzorky, adsorpčnými alebo chemicky reaktívnymi metódami a následnou analytickou charakterizáciou) alebo nešpecifickými metódami, ako je gravimetrická filtrová analýza. Použitie gravimetrickej analýzy je prípustné iba v prípade jednozložkových práškových aerosólov alebo aerosólov kvapalín s nízkou prchavosťou, pričom je potrebné túto analýzu podložiť primeranými testovými charakterizáciami predbežných štúdií týkajúcich sa konkrétnej testovanej chemikálie. Koncentráciu viaczložkových práškových aerosólov takisto možno stanoviť prostredníctvom gravimetrickej analýzy. V tom prípade sú však potrebné analytické údaje, ktoré dokazujú, že zloženie materiálu vo vzduchu je podobné ako zloženie východiskového materiálu. Ak tieto informácie nie sú dostupné, môže byť potrebná opätovná analýza testovanej chemikálie (ideálne v jej skupenstve v ovzduší) v pravidelných intervaloch v priebehu štúdie. V prípade aerosólových látok, ktoré sa môžu vypariť alebo môžu sublimovať, by sa malo preukázať, že všetky fázy sa zhromaždili pomocou zvolenej metódy. V správe o štúdii by sa mali uviesť cieľové, nominálne a skutočné koncentrácie. Na výpočet hodnôt smrteľných koncentrácií sa však v štatistických analýzach použijú iba skutočné koncentrácie.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Ak je to možné, mala by sa použiť jedna dávka testovanej chemikálie, pričom testovaná vzorka by sa mala uskladniť za podmienok, za ktorých sa zachová jej čistota, homogenita a stabilita. Pred začatím štúdie by mala byť k dispozícii charakterizácia testovanej chemikálie vrátane jej čistoty a, ak je to technicky možné, identity a množstiev identifikovaných kontaminantov a prímesí. Charakterizáciu možno preukázať napríklad týmito údajmi: retenčný čas a relatívna plocha píku, molekulová hmotnosť získaná pomocou analýzy hmotnostnej spektrometrie alebo plynovej chromatografie alebo iné odhady. Hoci za identitu testovanej vzorky testovacie laboratórium nenesie zodpovednosť, je vhodné, aby testovacie laboratórium aspoň čiastočne potvrdilo charakterizáciu poskytnutú dodávateľom (napr. farbu, fyzikálne skupenstvo atď.).
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Prostredie expozície by malo byť čo najstálejšie a malo by sa nepretržite a/alebo občasne monitorovať v závislosti od metódy analýzy. Ak sa použije občasný odber vzoriek, vzorky ovzdušia komory by sa mali v priebehu štvorhodinovej štúdie odobrať najmenej dvakrát. Ak to pre nízky prietok vzduchu alebo nízke koncentrácie nie je možné, môže sa v priebehu celého intervalu expozície odobrať jedna vzorka. Ak sa medzi jednotlivými vzorkami vyskytnú výrazné výkyvy, pri ďalších testovaných koncentráciách by sa mali použiť štyri vzorky z každej expozície. Jednotlivé vzorky koncentrácie v komore by sa nemali od strednej koncentrácie v komore odchýliť o viac ako ± 10 % v prípade plynov a pár a o viac ako ± 20 % v prípade kvapalných alebo tuhých aerosólov. Čas na dosiahnutie rovnováhy v komore (t95) by sa mal vypočítať a zaznamenať. Interval expozície zahŕňa čas, keď sa testovaná chemikália tvorí, pričom sa zohľadňujú aj časy potrebné na dosiahnutie t95. Usmernenia k odhadovaniu t95 sú uvedené v dokumente GD 39 (8).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              V prípade veľmi komplexných zmesí tvorených parami/plynmi a aerosólov (napr. spaľovacieho ovzdušia a testovaných chemikálií poháňaných účelovými výrobkami/zariadeniami koncového použitia) sa v inhalačnej komore môže každá fáza správať inak, takže by sa mala vybrať aspoň jedna látka slúžiaca ako ukazovateľ (analyt), najčastejšie hlavná aktívna látka v zmesi, každej fázy (para/plyn a aerosól). Ak je testovaná chemikália zmes, v správe by sa mala uviesť analytická koncentrácia celej zmesi, nielen aktívnej látky alebo zložky (analyt). Ďalšie informácie týkajúce sa skutočných koncentrácií sú uvedené v dokumente GD 39 (8).
                           
                        
                     Testovaná chemikália: rozdelenie veľkosti častíc
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Rozdelenie veľkosti častíc aerosólov by sa malo stanoviť aspoň dvakrát v priebehu každej expozície v trvaní štyroch hodín, a to pomocou kaskádového impaktora alebo alternatívneho prístroja, ako je napríklad aerodynamický spektrometer častíc. Ak možno preukázať rovnocennosť výsledkov získaných pomocou kaskádového impaktora a alternatívneho prístroja, potom sa alternatívny prístroj môže používať počas celej štúdie. Druhé zariadenie, ako je gravimetrický filter alebo impinger/premývačka, by sa malo použiť súbežne s hlavným prístrojom na potvrdenie zachytávacej účinnosti hlavného prístroja. Hmotnostná koncentrácia získaná analýzou veľkosti častíc by mala byť v rozsahu primeraných limitov hmotnostnej koncentrácie získanej filtrovou analýzou [pozri dokument GD 39 (8)]. Ak možno preukázať rovnocennosť v počiatočnej fáze štúdie, nie je potrebné vykonávať ďalšie potvrdzujúce merania. V záujme zabezpečenia dobrých životných podmienok pre zvieratá by sa mali prijať opatrenia na minimalizáciu nejednoznačných údajov, ktoré môžu viesť k potrebe opakovať expozíciu. Rozdelenie veľkosti častíc by sa malo vykonať v prípade pár, ak existuje možnosť, že kondenzácia pary môže mať za následok tvorbu aerosólu, alebo ak sa v ovzduší pár zistia častice s potenciálom zmiešaných fáz (pozri odsek 14).
                           
                        POSTUP
                  
                     Základný test
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              V každom kroku sa použijú tri zvieratá z každého pohlavia alebo šesť zvierat vnímavejšieho pohlavia. Ak sa v prípade iných hlodavcov ako potkanov použije expozícia oblasti nosa, maximálne trvanie expozície je možné prispôsobiť s cieľom minimalizovať druhovo špecifické utrpenie. Úroveň koncentrácie, ktorá sa použije ako počiatočná dávka, sa vyberie zo štyroch stabilných úrovní, pričom počiatočná úroveň koncentrácie by mala byť tá, pri ktorej sa pri exponovaných zvieratách s najväčšou pravdepodobnosťou vyskytne toxicita. Schémy testovania pre plyny, pary a aerosóly (vrátane schém uvedených v dodatkoch 2 – 4) predstavujú testovanie s hraničnými hodnotami kategórií CLP 1 – 4 (9) v prípade plynov (100; 500; 2 500; 20 000 ppm/4 h) (dodatok2), v prípade pár (0,5; 2; 10; 20 mg/l/4 h) (dodatok 3) a v prípade aerosólov (0,05; 0,5; 1; 5 mg/l/4 h) (dodatok 4). Kategória 5, ktorá nie je začlenená do nariadenia (ES) č. 1272/2008, (9) sa týka vyšších koncentrácií, ako sú príslušné limitné koncentrácie. Pre každú počiatočnú koncentráciu platí tá istá schéma testovania. V závislosti od počtu zvierat usmrtených humánnym spôsobom alebo uhynutých sa postup testovania uskutočňuje podľa naznačených šípok, až kým nie je možné chemikáliu kategorizovať.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Časový interval medzi skupinami expozícií je určený nástupom, trvaním a závažnosťou príznakov toxicity. Expozícia zvierat pri ďalšej úrovni koncentrácie by sa mala odložiť, kým sa nenadobudne dostatočná dôvera, že zvieratá, ktoré boli testované, prežijú. Medzi expozíciami pri jednotlivých úrovniach koncentrácie sa odporúča interval tri alebo štyri dni, aby sa umožnilo pozorovanie oneskorenej toxicity. Časový interval sa môže nastaviť podľa potreby, napr. v prípade nepresvedčivej reakcie.
                           
                        
                     Limitný test
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Limitný test sa používa, ak je známe alebo sa predpokladá, že testovaná chemikália je v podstate netoxická, t. j. vyvoláva toxickú reakciu iba pri vyššej koncentrácii, ako je regulačná limitná koncentrácia. Informácie o toxicite testovanej chemikálie možno získať z poznatkov o podobných testovaných látkach alebo podobných zmesiach pri zohľadnení identity a percenta zložiek, o ktorých je známe, že sú toxikologicky významné. V týchto situáciách, keď existuje málo informácií alebo neexistujú žiadne informácie o jej toxicite, alebo ak sa očakáva, že testovaná chemikália bude toxická, je potrebné vykonať základný test [ďalšie usmernenia sú uvedené v dokumente GD 39 (8)].
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Podľa bežného postupu sa tri zvieratá z každého pohlavia alebo šesť zvierat vnímavejšieho pohlavia vystaví koncentrácii 20 000 ppm v prípade plynov, 20 mg/l v prípade pár a 5 mg/l v prípade prachu/hmly (ak je to možné), ktorá v rámci tejto testovacej metódy slúži ako limitný test. Pri testovaní aerosólov by hlavným cieľom malo byť dosiahnutie dýchateľnej veľkosti častíc (t. j. MMAD 1 – 4 μm). V prípade väčšiny testovaných chemikálií je túto veľkosť možné dosiahnuť pri koncentrácii 2 mg/l. O testovanie aerosólov pri vyššej koncentrácii ako 2 mg/l sa možno pokúšať, iba ak je možné získať dýchateľnú veľkosť častíc [pozri dokument GD 39 (8)]. Podľa Globálneho harmonizovaného systému (GHS) (16) sa z dôvodu starostlivosti o zvieratá neodporúča testovanie pri vyššej koncentrácii, ako je limitná koncentrácia. Testovanie v kategórii 5 systému GHS (16), ktorá nie je plne začlenená do nariadenia (ES) č. 1272/2008 (9), by sa malo zvažovať iba vtedy, ak existuje vysoká pravdepodobnosť, že výsledky takéhoto testu by mali priamy význam pre ochranu ľudského zdravia, pričom do správy o štúdii sa uvedie odôvodnenie. V prípade potenciálne výbušných testovaných chemikálií treba dbať na to, aby nenastali podmienky, ktoré by mohli viesť k výbuchu. S cieľom zabrániť zbytočnému využívaniu zvierat by sa malo pred limitným testom vykonať testovacie kolo bez zvierat, aby sa zabezpečilo, že v komore je možné dosiahnuť podmienky na účely limitného testu.
                           
                        POZOROVANIA
                  
                              29.
                           
                           
                              Zvieratá by sa mali v priebehu trvania expozície pravidelne klinicky pozorovať. Po expozícii by sa mali klinické pozorovania vykonať najmenej dvakrát v deň expozície alebo častejšie, ak to indikuje reakcia zvierat na testovanie, a následne najmenej raz denne počas 14 dní. Dĺžka pozorovania nie je presne určená, ale mala by sa stanoviť podľa charakteru a času nástupu klinických príznakov a dĺžky obdobia zotavenia. Časy, keď sa objavia a zmiznú príznaky toxicity, sú dôležité, predovšetkým v prípade tendencie oneskorenia príznakov toxicity. Všetky pozorovania sa systematicky zaznamenávajú, pričom každé zviera má individuálny záznam. Moribundné zvieratá a zvieratá, ktoré majú silné bolesti a/alebo vykazujú pretrvávajúce príznaky silného utrpenia, by sa mali z dôvodu starostlivosti o zvieratá humánnym spôsobom utratiť. Pri vyšetrovaní klinických príznakov toxicity treba dávať pozor, aby sa počiatočný nepatrný nález a krátkodobé zmeny dýchania, ktoré sú dôsledkom expozície, nezamieňali za účinky súvisiace s aplikáciou chemikálie. Zohľadnia sa zásady a kritériá zhrnuté v Usmerňujúcom dokumente o humánnych parametroch (Humane Endpoints Guidance Document) (7). Keď sa zvieratá usmrtia z humánnych dôvodov alebo sa nájdu uhynuté, je potrebné čo možno najpresnejšie zaznamenať čas uhynutia.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Pozorovania v klietkach sa zameriavajú na zmeny kože, srsti, očí, slizníc, dýchania, krvného obehu, autonómneho a centrálneho nervového systému, ako aj somatomotoriky a správania. Ak je to možné, zaznamená sa každý rozdiel medzi lokálnymi a systémovými účinkami. Pozornosť sa zameriava na pozorovanie triašky, kŕčov, slinenia, hnačky, letargie, spánku a kómy. Meraním rektálnej teploty možno získať dôkazy svedčiace o reflexnej bradypney alebo hypo/hypertermii, ktoré súvisia s testovaním alebo s obmedzením pohybu.
                           
                        
                     Telesné hmotnosti
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Individuálne hmotnosti zvierat by sa mali zaznamenať raz počas obdobia aklimatizácie, v deň expozície pred expozíciou (deň 0), minimálne v dňoch 1, 3 a 7 (a následne raz za týždeň) a v čase uhynutia alebo utratenia, pokiaľ k nemu dôjde po dni 1. Telesná hmotnosť sa považuje za kritický ukazovateľ toxicity a zvieratá, pri ktorých nastane trvalý úbytok hmotnosti ≥ 20 % v porovnaní s hodnotami pred štúdiou, by sa mali pozorne sledovať. Zvieratá, ktoré prežijú, sa na konci obdobia po expozícii odvážia a humánne usmrtia.
                           
                        
                     Patológia
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Všetky testované zvieratá vrátane tých, ktoré uhynú počas testu alebo sa utratia a vylúčia zo štúdie z dôvodu starostlivosti o zvieratá, sa podrobujú makroskopickej pitve. Ak nie je možné vykonať pitvu ihneď po objavení uhynutého zvieraťa, zviera sa schladí (nie zmrazí) na dostatočne nízku teplotu, aby sa minimalizovala autolýza. Pitvy by sa mali vykonať čo najskôr, zvyčajne v priebehu jedného alebo dvoch dní. Pri každom zvierati sa zaznamenajú všetky makroskopické patologické zmeny, pričom osobitná pozornosť sa venuje akýmkoľvek zmenám v dýchacej sústave.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Na účely zvýšenia výpovednej hodnoty štúdie možno zvážiť ďalšie vyšetrenia a priori zahrnuté od začiatku, ako je meranie hmotnosti pľúc potkanov, ktoré prežili, a/alebo poskytnutie dôkazov o podráždení prostredníctvom mikroskopického vyšetrenia dýchacej sústavy. Medzi skúmané orgány môžu patriť aj orgány, ktoré svedčia o makroskopickej patológii pri zvieratách, ktoré prežili 24 alebo viac hodín, a orgány, o ktorých je známe alebo pri ktorých sa predpokladá, že boli zasiahnuté. Mikroskopické vyšetrenie celej dýchacej sústavy môže poskytnúť užitočné informácie o testovaných chemikáliách, ktoré reagujú s vodou, ako sú kyseliny a hygroskopické testované chemikálie.
                           
                        ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV
                  
                     Údaje
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Treba uviesť údaje o telesnej hmotnosti a pitevných nálezoch jednotlivých zvierat. Údaje z klinických pozorovaní sa zhrnú v podobe tabuliek, kde sa uvedie pre každú pokusnú skupinu počet použitých zvierat, počet zvierat vykazujúcich špecifické príznaky toxicity, počet zvierat, ktoré sa našli uhynuté počas testu alebo ich usmrtili z humánnych dôvodov, čas uhynutia jednotlivých zvierat, opis a časový priebeh toxických účinkov a reverzibility a pitevné nálezy.
                           
                        
                     Správa o teste
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Správa o teste by mala obsahovať tieto informácie:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testované zvieratá a chov:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis podmienok v klietkach vrátane: počtu (alebo zmeny počtu) zvierat na klietku, výstelky, teploty prostredia a relatívnej vlhkosti, dĺžky svetlej fázy a identifikácie krmiva,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použité druhy/kmene a odôvodnenie použitia druhov iných ako potkany,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet, vek a pohlavie zvierat,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metóda randomizácie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu/zdroja krmiva, zdroja vody),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis akýchkoľvek podmienok pred testovaním vrátane krmiva, karantény a liečby chorôb.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovaná chemikália:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikálny charakter, čistota a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti (vrátane izomerizácie),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikačné údaje a registračné číslo CAS (Chemical Abstract Services), ak je známe.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosič:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie použitia nosiča a odôvodnenie výberu nosiča (ak je iný ako voda),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      historické alebo súčasné údaje preukazujúce, že nosič nemá vplyv na výsledky štúdie.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhalačná komora:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis inhalačnej komory vrátane rozmerov a objemu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj a opis zariadenia použitého na expozíciu zvierat, ako aj na vytvorenie ovzdušia,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zariadenie na meranie teploty, vlhkosti, veľkosti častíc a skutočnej koncentrácie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj vzduchu, manipulácia s dodaným/extrahovaným vzduchom a použitý klimatizačný systém,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metódy použité na kalibráciu zariadenia s cieľom zabezpečiť homogénne testovacie ovzdušie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozdiel tlakov (pozitívny alebo negatívny),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      expozičné otvory na jednu komoru (v prípade expozície oblasti nosa), umiestnenie zvierat v systéme (v prípade expozície celého tela),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dočasná homogenita/stabilita testovacieho ovzdušia,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      umiestnenie senzorov teploty a vlhkosti a odber vzorky testovacieho ovzdušia v komore,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hodnoty prietoku vzduchu, prietok vzduchu na jeden expozičný otvor (v prípade expozície oblasti nosa) alebo množstvo zvierat na komoru (v prípade expozície celého tela),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informácie o zariadení použitom na meranie kyslíka a oxidu uhličitého, ak sa použilo,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      čas potrebný na dosiahnutie rovnováhy v inhalačnej komore (t95),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet zmien objemu za hodinu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      meracie prístroje (ak sa použili).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Údaje o expozícii:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie výberu cieľovej koncentrácie pre základnú štúdiu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominálne koncentrácie (celková hmotnosť testovanej chemikálie aplikovanej do inhalačnej komory vydelená objemom vzduchu, ktorý prešiel komorou),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skutočné koncentrácie testovanej chemikálie zachytenej z dýchacej zóny zvierat, v prípade testovaných zmesí, ktoré vytvárajú heterogénne fyzikálne skupenstvá (plyny, pary, aerosóly), možno každé skupenstvo analyzovať samostatne,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      všetky koncentrácie ovzdušia sa zaznamenajú v hmotnostných jednotkách (napr. mg/l, mg/m3 atď.), v zátvorke možno uviesť aj objemové jednotky (napr. ppm, ppb),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozdelenie veľkosti častíc, stredný aerodynamický hmotnostný priemer (MMAD) a štandardná odchýlka geometrického priemeru (σg) vrátane metód ich výpočtu. Jednotlivé analýzy veľkosti častíc sa uvedú v správe.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Podmienky testovania:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné informácie o príprave testovanej chemikálie vrátane podrobných údajov o všetkých postupoch použitých na zmenšenie veľkosti častíc tuhých látok alebo na prípravu roztokov testovanej chemikálie. V prípadoch, v ktorých v dôsledku mechanických procesov mohlo dôjsť k zmene zloženia testovanej chemikálie, sa uvedú výsledky analýzy na overenie zloženia testovanej chemikálie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis (podľa možnosti spolu s nákresom) zariadenia použitého na vytvorenie testovacieho ovzdušia a na expozíciu zvierat testovaciemu ovzdušiu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné informácie o použitej chemickej analytickej metóde a o overení metódy (vrátane účinnosti výťažnosti testovanej chemikálie z prostriedku na odber vzorky),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie výberu testovacích koncentrácií.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie teploty, vlhkosti a prúdenia vzduchu v komore,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie údajov o nominálnych a skutočných koncentráciách,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie údajov o veľkosti častíc vrátane údajov o odbere vzoriek na analýzu, o rozdelení veľkosti častíc a o výpočtoch MMAD a σg,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tabuľkové spracovanie získaných údajov o reakcii a úrovni koncentrácie pre každé zviera (t. j. zvieratá vykazujúce príznaky toxicity vrátane mortality, charakteru, závažnosti a trvania účinkov),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      telesné hmotnosti jednotlivých zvierat zistené počas dní štúdie, dátum a čas uhynutia, ak k nemu došlo pred plánovaným utratením, časový priebeh nástupu príznakov toxicity a skutočnosť, či tieto príznaky boli reverzibilné pre každé zviera,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pitevné nálezy a histopatologické nálezy pre každé zviera, ak sú k dispozícii,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klasifikácia kategórie CLP a hraničná hodnota LC50.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rozbor a interpretácia výsledkov:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      osobitný dôraz sa kladie na opis metód použitých na splnenie kritérií tejto testovacej metódy, napr. limitnej koncentrácie alebo veľkosti častíc,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dýchateľnosť častíc vzhľadom na celkové zistenia sa uvedie, najmä ak nebolo možné splniť kritériá na veľkosť častíc,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      konzistencia metód použitých na stanovenie nominálnej a skutočnej koncentrácie a vzťah skutočnej koncentrácie k nominálnej koncentrácii sa uvedú v celkovom hodnotení štúdie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uvedie sa pravdepodobná príčina uhynutia a prevládajúci druh pôsobenia (systémové či lokálne),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uvedie sa vysvetlenie, ak bolo potrebné humánnym spôsobom utratiť zvieratá, ktoré mali bolesti alebo vykazovali príznaky silného alebo pretrvávajúceho utrpenia, v súlade s kritériami v usmerňovacom dokumente OECD o humánnych parametroch (Guidance Document on Humane Endpoints) (7).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATÚRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              Kapitola B.2 tejto prílohy, Akútna toxicita (inhalačná).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Holzhütter, H.-G., Genschow, E., Diener, W., a Schlede, E. (2003). Dermal and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System. Arch. Toxicol. 77: 243 – 254.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Diener, W., Kayser, D., a Schlede, E. (1997). The Inhalation Acute-Toxic-Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations. Arch. Toxicol. 71: 537 – 549.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Diener, W., a Schlede, E. (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives to LD/LC50 Tests. ALTEX 1: 129 – 134.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Kapitola B.1b tejto prílohy, Akútna orálna toxicita — metóda triedy akútnej toxickej.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 105, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 16. decembra 2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí, o zmene, doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zmene a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006 (Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1).
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Kapitola B.40 tejto prílohy, Poleptanie kože in vitro: test pomocou transkutánneho elektrického odporu (TER).
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Kapitola B.40a tejto prílohy, Poleptanie kože in vitro: test pomocou modelu ľudskej kože.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Phalen, R. F. (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (druhé vydanie) Informa Healthcare, New York.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321 – 327.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Pauluhn, J., a Thiel, A. (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160 – 167
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              OSN (2007), Globálny harmonizovaný systém klasifikácie a označovania chemických látok (GHS), ST/SG/AC.10/30, OSN New York a Ženeva. K dispozícii na: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_welcome_e.html].
                           
                        
                     Dodatok 1
                     VYMEDZENIE POJMU
                     Testovaná chemikália: akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
                  
                  
                     Dodatok 2
                     
                        Postup, ktorý treba dodržať pri každej počiatočnej koncentrácii v prípade plynov (ppm/4 h)
                     
                     Všeobecné poznámky (12)
                     
                     Pri každej počiatočnej koncentrácii príslušné testovacie schémy, ako je uvedené v tejto prílohe, uvádzajú postup, ktorý je potrebné dodržiavať.
                     Dodatok 2a: Počiatočná koncentrácia je 100 ppm.
                     Dodatok 2b: Počiatočná koncentrácia je 500 ppm.
                     Dodatok 2c: Počiatočná koncentrácia je 2 500 ppm.
                     Dodatok 2d: Počiatočná koncentrácia je 20 000 ppm.
                     V závislosti od počtu zvierat usmrtených humánnym spôsobom alebo uhynutých sa postup testovania uskutočňuje podľa naznačených šípok.
                  
                  
                     Dodatok 2a
                     
                        Acute Inhalation Toxicity:
                     
                     
                        Test Procedure with a starting concentration of 100 ppm/4 h for gases
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatok 2b
                     
                        Acute Inhalation Toxicity:
                     
                     
                        Test Procedure with a starting concentration of 500 ppm/4h for gases
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatok 2c
                     
                        Acute Inhalation Toxicity:
                     
                     
                        Test Procedure with a starting concentration of 2 500 ppm/4h for gases
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatok 2d
                     
                        Acute Inhalation Toxicity:
                     
                     
                        Test Procedure with a starting concentration of 20 000 ppm/4h for gases
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatok 3
                     
                        Postup, ktorý treba dodržať pri každej počiatočnej koncentrácii v prípade pár (mg/L/4 h)
                     
                     Všeobecné poznámky (13)
                     
                     Pri každej počiatočnej koncentrácii príslušné testovacie schémy, ako je uvedené v tejto prílohe, uvádzajú postup, ktorý je potrebné dodržiavať.
                     Dodatok 3a: Počiatočná koncentrácia je 0,5 mg/l.
                     Dodatok 3b: Počiatočná koncentrácia je 2,0 mg/l.
                     Dodatok 3c: Počiatočná koncentrácia je 10 mg/l.
                     Dodatok 3d: Počiatočná koncentrácia je 20 mg/l.
                     V závislosti od počtu zvierat usmrtených humánnym spôsobom alebo uhynutých sa postup testovania uskutočňuje podľa naznačených šípok.
                  
                  
                     Dodatok 3a
                     
                        Acute Inhalation Toxicity:
                     
                     
                        Test procedure with a starting concentration of 0.5 mg/L/4h for vapours
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatok 3b
                     
                        Acute Inhalation Toxicity:
                     
                     
                        Test procedure with a starting concentration of 2 mg/L/4h for vapours
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatok 3c
                     
                        Acute Inhalation Toxicity:
                     
                     
                        Test procedure with a starting concentration of 10 mg/L/4h for vapours
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatok 3d
                     
                        Acute Inhalation Toxicity:
                     
                     
                        Test procedure with a starting concentration of 20 mg/L/4h for vapours
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatok 4
                     
                        Postup, ktorý treba dodržať pri každej počiatočnej koncentrácii v prípade aerosólov (mg/L/4 h)
                     
                     Všeobecné poznámky (14)
                     
                     Pri každej počiatočnej koncentrácii príslušné testovacie schémy, ako je uvedené v tejto prílohe, uvádzajú postup, ktorý je potrebné dodržiavať.
                     Dodatok 4a: Počiatočná koncentrácia je 0,05 mg/l.
                     Dodatok 4b: Počiatočná koncentrácia je 0,5 mg/l.
                     Dodatok 4c: Počiatočná koncentrácia je 1 mg/l.
                     Dodatok 4d: Počiatočná koncentrácia je 5 mg/l.
                     V závislosti od počtu zvierat usmrtených humánnym spôsobom alebo uhynutých sa postup testovania uskutočňuje podľa naznačených šípok.
                  
                  
                     Dodatok 4a
                     
                        Acute Inhalation Toxicity:
                     
                     
                        Test procedure with a starting concentration of 0,05 mg/L/4h for vapours
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatok 4b
                     
                        Acute Inhalation Toxicity:
                     
                     
                        Test procedure with a starting concentration of 0,5 mg/L/4h for aerosols
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatok 4c
                     
                        Acute inhalation toxicity:
                     
                     
                        Test procedure with a starting concentration of 1 mg/L/4h for aerosols
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatok 4d
                     
                        Acute Inhalation Toxicity:
                     
                     
                        Test procedure with a starting concentration of 5 mg/L/4h for aerosols
                     
                     
                        
                  “
            
                  9.
               
               
                  Kapitola C.10 sa nahrádza takto:
                  „C.10.   SIMULAČNÝ TEST AERÓBNEHO ČISTENIA ODPADOVÝCH VÔD C.10-A: JEDNOTKY S TECHNOLÓGIOU AKTIVOVANÉHO KALU – C.10-B: BIOFILMY
                  
                  
                     C.10-A:   Jednotky s technológiou aktivovaného kalu
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov (TG) 303 (2001). V 50. rokoch 20. storočia sa zistilo, že novozavedené povrchovo aktívne činidlá spôsobujú v čistiarňach odpadových vôd a v riekach nadmerné penenie. Aeróbnym čistením sa neodstránili úplne a v niektorých prípadoch bránili odstráneniu iných organických materiálov. Tento problém podnietil mnohé výskumy zaoberajúce sa otázkou, ako možno z odpadových vôd odstrániť povrchovo aktívne činidlá a či možno nové chemikálie, ktoré priemysel produkuje, prispôsobiť čisteniu odpadových vôd. Na tento účel sa použili modelové jednotky dvoch hlavných druhov aeróbneho biologického čistenia odpadových vôd (aktivovaný kal a filtrácia perkoláciou alebo prekvapkávaním). Bolo by nepraktické a finančne veľmi náročné distribuovať každú novú chemikáliu a monitorovať veľké čistiarne odpadových vôd, aj keby to bolo len na lokálnej úrovni.
                           
                        ÚVODNÉ ÚVAHY
                  
                     Jednotky s technológiou aktivovaného kalu
                  
                  
                              2.
                           
                           
                              Modelové jednotky s technológiou aktivovaného kalu sú opísané v rozmedzí veľkosti od 300 ml približne do 2 000 ml. Niektoré jednotky v mnohom pripomínali skutočné čistiarne tým, že mali nádrže na usadzovanie kalu, z ktorých sa usadený kal prečerpával späť do prevzdušňovacej nádrže, zatiaľ čo iné jednotky nemali vybavenie na usadzovanie, napr. Swisher (1). Veľkosť zariadenia je výsledkom kompromisu. Na jednej strane musí byť dostatočne veľké na zabezpečenie funkčnej mechanickej prevádzky a dostatočného množstva vzoriek bez toho, aby to ovplyvnilo prevádzku, a na druhej strane by nemalo byť také veľké, aby vyžadovalo nadmerný priestor a materiál.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Dvomi druhmi zariadenia s rozsiahlym a vyhovujúcim použitím sú jednotky Husmann (2) a jednotky s pórovitou nádobou (3) (4), ktoré sa prvýkrát použili vo výskume povrchovo aktívnych činidiel. Tieto zariadenia sú opísané v tejto testovacej metóde. Uspokojivé využitie mali aj iné zariadenia, napr. Eckenfelder (5). Vzhľadom na pomerne vysokú finančnú náročnosť a úsilie pri aplikovaní tohto simulačného testu boli súbežne skúmané jednoduchšie a lacnejšie skríningové testy, ktoré sú teraz začlenené do kapitoly C.4 A – F tejto prílohy (6). Zo skúseností s mnohými povrchovo aktívnymi činidlami a inými chemikáliami vyplynulo, že tie, ktoré prešli skríningovými testmi (ľahko biodegradovateľné), sa rozložili aj v simulačnom teste. Niektoré chemikálie, ktoré neprešli skríningovými testmi, prešli testmi inherentnej biodegradovateľnosti [kapitoly C.12 (7) a C.19 (8) tejto prílohy], ale iba niektoré z nich sa rozložili v simulačnom teste, zatiaľ čo chemikálie, ktoré neprešli testmi inherentnej biodegradovateľnosti, sa v simulačných testoch nerozložili (9) (10) (11).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Na niektoré účely postačujú simulačné testy uskutočnené s využitím jedného súboru prevádzkových podmienok. Výsledky sú vyjadrené ako percentuálna eliminácia testovanej chemikálie alebo rozpusteného organického uhlíka (DOC). Opis takéhoto testu je uvedený v tejto testovacej metóde. Na rozdiel od predchádzajúcej verzie tejto kapitoly, v ktorej bol opísaný iba jeden druh zariadenia na čistenie syntetických médií cez spojenie s využitím pomerne hrubej metódy odstraňovania kalu, tento text ponúka viacero možností. Sú tu opísané alternatívne druhy zariadení, prevádzkové režimy a spôsoby odstraňovania odpadovej vody a kalu. Tento text je v súlade s normou ISO 11733 (12), ktorá bola počas prípravy predmetom dôkladnej kontroly, aj keď nebola podrobená kruhovému testu.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Na iné účely je nevyhnutné poznať koncentráciu testovanej chemikálie vo výtoku s väčšou presnosťou, a je teda potrebná rozsiahlejšia metóda. Napríklad rýchlosť odstraňovania kalu sa musí presnejšie kontrolovať počas každého dňa a počas trvania testu a čistiarne musia fungovať pri niekoľkých rýchlostiach odstraňovania. V rámci plne komplexnej metódy by testy takisto mali prebiehať pri dvoch alebo troch rôznych teplotách: takúto metódu opisuje Birch (13) (14) a je zhrnutá v dodatku 6. Súčasné znalosti však nepostačujú na rozhodnutie o tom, ktoré kinetické modely sú použiteľné na biodegradáciu chemikálií pri čistení odpadových vôd a vo vodnom prostredí všeobecne. Použitie Monodovej kinetiky, uvedené v dodatku 6 ako príklad, je obmedzené na chemikálie prítomné v koncentrácii 1 mg/l a viac, ale podľa niektorých názorov aj to ešte treba podložiť dôkazmi. Testy pri koncentráciách, ktoré reálnejšie odrážajú hodnoty namerané v odpadových vodách, sa uvádzajú v dodatku 7, ale tieto testy spolu s testami v dodatku 6 sú zahrnuté do dodatkov a nie sú publikované ako samostatné testovacie metódy.
                           
                        
                     Filtre
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Modelom perkolačných filtrov bola venovaná oveľa menšia pozornosť možno preto, lebo sú ťažšie ovládateľné a menej kompaktné ako modely jednotiek s technológiou aktivovaného kalu. Gerike a kol. vyvinul jednotky s technológiou prekvapkávacích filtrov a prevádzkoval ich s využitím spojenia (15). Tieto filtre boli pomerne veľké (výška 2 m, objem 60 l) a každý vyžadoval 2 l/h odpadovej vody. Baumann a kol. (16) simuloval prekvapkávacie filtre tak, že vložil polyesterové vlnené pásy do trubíc dlhých 1 m (vnútorný priemer 14 mm) po tom, ako boli pásy na 30 minút ponorené do koncentrovaného aktivovaného kalu. Testovaná chemikália ako jediný zdroj C v roztoku minerálnych solí bola napustená vertikálnou trubicou a biodegradácia sa vyhodnotila na základe meraní DOC vo výtoku a CO2 vo vychádzajúcom plyne.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Biofiltre boli simulované inak (15). Vnútorné povrchy rotujúcich trubíc, ktoré boli pod malým uhlom naklonené k horizontálnym, boli napustené odpadovou vodou (približne 250 ml/h) s testovanou chemikáliou a bez nej, pričom v odobraných výtokoch sa analyzovala prítomnosť DOC a/alebo konkrétnej testovanej chemikálie.
                           
                        PRINCÍP TESTU
                  
                              8.
                           
                           
                              Táto metóda bola vypracovaná s cieľom stanoviť elimináciu a primárnu a/alebo úplnú biodegradáciu organických chemikálií rozpustných vo vode pomocou aeróbnych mikroorganizmov v testovacom systéme s nepretržitou prevádzkou, ktorý simuluje proces aktivovaného kalu. Ľahko biodegradovateľné organické médium a organická testovaná chemikália sú pre mikroorganizmy zdrojom uhlíka a energie.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Dve testovacie jednotky s nepretržitou prevádzkou (čistiarne s technológiou aktivovaného kalu alebo pórovité nádoby) sú v prevádzke súbežne za rovnakých podmienok, ktoré sa vyberú tak, aby vyhovovali účelu testu. Priemerný hydraulický retenčný čas je zvyčajne 6 h a priemerný vek kalu (retenčný čas kalu) je šesť až desať dní. Kal sa odstraňuje jednou alebo dvoma metódami, testovaná chemikália sa zvyčajne pridá v koncentrácii medzi 10 mg/l rozpusteného organického uhlíka (DOC) a 20 mg/l DOC do prítoku (organické médium) iba jednej z jednotiek. Druhá jednotka sa použije ako kontrolná jednotka s cieľom stanoviť biodegradáciu organického média.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              V často odoberaných vzorkách výtokov sa špecifickou analýzou podľa možnosti určí DOC alebo chemická spotreba kyslíka (COD) spolu s koncentráciou testovanej chemikálie (ak sa požaduje) vo výtoku z jednotky, do ktorej sa pridáva testovaná chemikália. Predpokladá sa, že rozdiel medzi koncentráciami DOC alebo COD vo výtoku medzi testovacími a kontrolnými jednotkami vzniká v dôsledku testovanej chemikálie alebo jej organických metabolitov. Tento rozdiel sa porovná s koncentráciou DOC alebo COD v prítoku v dôsledku pridanej testovanej chemikálie s cieľom určiť elimináciu testovanej chemikálie.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Biodegradáciu je možné zvyčajne odlíšiť od bioadsorpcie tak, že sa dôkladne preskúma krivka závislosti eliminácie chemikálie od času, a zvyčajne ju možno potvrdiť pomocou testu ľahkej biodegradovateľnosti s použitím aklimatizovaného inokula z jednotky, do ktorej sa pridáva testovaná chemikália.
                           
                        INFORMÁCIE O TESTOVANEJ CHEMIKÁLII
                  
                              12.
                           
                           
                              Je potrebné poznať čistotu, rozpustnosť vo vode, prchavosť a adsorpčné vlastnosti testovanej chemikálie, aby bolo možné správne interpretovať výsledky. Prchavé a nerozpustné chemikálie sa zvyčajne nemôžu testovať, pokiaľ sa neprijmú zvláštne opatrenia (pozri dodatok 5). Je nutné poznať aj chemickú štruktúru alebo aspoň empirický vzorec, aby bolo možné vypočítať teoretické hodnoty a/alebo skontrolovať namerané hodnoty parametrov, napr. teoretická spotreba kyslíka (ThOD), rozpustený organický uhlík (DOC) a chemická spotreba kyslíka (COD).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Informácie týkajúce sa toxicity testovanej chemikálie pre mikroorganizmy (pozri dodatok 4) môžu byť užitočné pri výbere vhodných testovaných koncentrácií a môžu byť nevyhnutné pre správnu interpretáciu nízkych hodnôt biodegradácie.
                           
                        ÚROVNE ÚSPEŠNOSTI
                  
                              14.
                           
                           
                              Pri pôvodnom použití tohto simulačného (potvrdzujúceho) testu primárnej biodegradácie povrchovo aktívnych činidiel sa požaduje odstránenie viac ako 80 % špecifickej chemikálie pred tým, ako sa povrchovo aktívne činidlo môže uviesť na trh. Ak sa nedosiahne hodnota 80 %, môže sa použiť tento simulačný (potvrdzujúci) test a povrchovo aktívne činidlo možno uviesť na trh, iba ak sa odstráni viac ako 90 % špecifickej chemikálie. Pri chemikáliách vo všeobecnosti nevzniká otázka úspešného/neúspešného hodnotenia v teste a získaná hodnota percentuálnej eliminácie sa môže použiť v približných výpočtoch pravdepodobnej koncentrácie v životnom prostredí, ktoré sa použijú v hodnotení rizika predstavovaného chemikáliami. Výsledky sa zvyčajne riadia schémou „všetko alebo nič“. V mnohých štúdiách čistých chemikálií sa zistilo, že percentuálna eliminácia DOC je > 90 % v prípade viac ako troch štvrtín chemikálií a > 80 % pri vyše 90 % chemikálií, ktoré vykazovali významný stupeň biodegradovateľnosti.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              V odpadových vodách je prítomných pomerne málo chemikálií (napr. povrchovo aktívnych činidiel) v koncentráciách (približne 10 mg C/l) použitých v tomto teste. Niektoré chemikálie môžu mať pri týchto koncentráciách inhibičný účinok, zatiaľ čo kinetika eliminácie iných chemikálií sa pri nízkych koncentráciách môže líšiť. Presnejšie hodnotenie degradácie možno uskutočniť prostredníctvom upravených metód s využitím realisticky nízkych koncentrácií testovanej chemikálie a zozbierané údaje možno použiť na výpočet kinetických konštánt. Potrebné experimentálne postupy však ešte nie sú celkom overené a nie sú stanovené ani kinetické modely, ktoré opisujú biodegradačné reakcie (pozri dodatok 7).
                           
                        REFERENČNÉ CHEMIKÁLIE
                  
                              16.
                           
                           
                              S cieľom zabezpečiť správne vykonanie experimentálneho postupu je užitočné súbežne so skúmaním testovaných chemikálií príležitostne testovať aj chemikálie, ktorých správanie je známe. Medzi také chemikálie patrí kyselina adipová, 2-fenylfenol, 1-naftol, kyselina 2,2-bifenyldikarboxylová, kyselina 1-naftoová atď. (9) (10) (11).
                           
                        REPRODUKOVATEĽNOSŤ VÝSLEDKOV TESTU
                  
                              17.
                           
                           
                              Existuje podstatne menej správ o štúdiách simulačných testov ako správ o štúdiách testov ľahkej biodegradovateľnosti. Reprodukovateľnosť medzi (súbežnými) opakovaniami testu je dobrá (v rozsahu 10 – 15 %) v prípade testovaných chemikálií rozložených na 80 % alebo viac, ale v prípade horšie rozložiteľných chemikálií je variabilita väčšia. Pri niektorých hraničných chemikáliách boli takisto pri rôznych príležitostiach počas deviatich týždňov povolených v teste zaznamenané veľmi rôznorodé výsledky (napr. 10 %, 90 %).
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Medzi výsledkami získanými pomocou dvoch druhov zariadení boli zistené malé rozdiely, ale niektoré chemikálie sa rozložili vo väčšej miere a konzistentnejšie v prítomnosti domácich splaškových vôd ako v syntetických médiách OECD.
                           
                        OPIS TESTOVACEJ METÓDY
                  
                     Zariadenie
                  
                  
                     Testovací systém
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Testovací systém pre jednu testovanú chemikáliu pozostáva z testovacej jednotky a z kontrolnej jednotky. Ak sa však vykonávajú iba špecifické analýzy (primárna biodegradácia), vyžaduje sa len testovacia jednotka. Jedna kontrolná jednotka sa môže použiť pre viaceré testovacie jednotky, do ktorých sa pridávajú rovnaké alebo rôzne testované chemikálie. V prípade spájania (dodatok 3) musí mať každá testovacia jednotka svoju vlastnú kontrolnú jednotku. Testovacím systémom môže byť buď model čistiarne s technológiou aktivovaného kalu, jednotka Husmann (dodatok 1, obrázok 1), alebo pórovitá nádoba (dodatok 1, obrázok 2). V oboch prípadoch sú potrebné dostatočne veľké zásobné nádoby pre prítoky a výtoky, ako aj pumpy na dávkovanie prítoku buď zmiešaného s roztokom testovanej chemikálie, alebo dodaného samostatne.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Každá jednotka čistiarne s technológiou aktivovaného kalu sa skladá z prevzdušňovacej nádoby so známou kapacitou približne tri litre aktivovaného kalu a separátora (sekundárny čerič), ktorý pojme približne 1,5 litra. Objemy možno do určitej miery meniť nastavením výšky separátora. Nádoby rôznych veľkostí sú prípustné, ak sa prevádzkujú pri porovnateľných hydraulických záťažiach. Ak nie je možné udržať teplotu v testovacej miestnosti v želanom rozsahu, odporúča sa použiť nádoby s vodným plášťom s kontrolou teploty vody. Na nepretržitú alebo v pravidelných intervaloch prerušovanú recykláciu aktivovaného kalu zo separátora do prevzdušňovacej nádoby sa používa vzduchové alebo dávkovacie čerpadlo.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Systém pórovitej nádoby sa skladá z vnútorného pórovitého valca s kónickým dnom umiestneného v o niečo väčšej nádobe rovnakého tvaru, ktorá je však vyrobená z nepriepustného plastového materiálu. Vhodným materiálom pre pórovitú nádobu je pórovitý polyetylén s maximálnou veľkosťou pórov 90 μm a s hrúbkou 2 mm. Separácia kalu z ošetreného organického média sa uskutočňuje diferenciálnym prechodom cez pórovitú stenu. Výtok sa zhromažďuje v prstencovom priestore, odkiaľ preteká do zbernej nádoby. Nedochádza k usadzovaniu, a teda ani k obnove kalu. Celý systém môže byť upevnený vo vodnou kúpeli s termostatickou kontrolou. Pórovité nádoby sa môžu upchať a pretekať do počiatočných fáz. V takom prípade je potrebné vymeniť pórovitú vložku za čistú tak, že sa odčerpá kal z nádoby do čistého vedra a odstráni sa upchatá vložka. Po očistení nepriepustného vonkajšieho valca sa vloží čistá vložka a kal sa vráti späť do nádoby. Všetok kal, ktorý sa zachytil po stranách upchatej vložky, sa takisto dôkladne zotrie a prenesie. Upchaté nádoby sa najskôr vyčistia jemným prúdom vody, ktorým sa odstráni zostávajúci kal, a namočia do zriedeného roztoku chlórnanu sodného, potom do vody a následne sa dôkladne opláchnu vodou.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Na prevzdušňovanie kalu v prevzdušňovacích nádobách obidvoch systémov sú nevyhnutné vhodné metódy, napríklad sintrované frity (difúzne kamene) a stlačený vzduch. V prípade potreby sa musí vzduch čistiť cez vhodný filter a premývať. Do systému sa musí vháňať dostatok vzduchu s cieľom zachovať aeróbne podmienky a udržať vločky kalu v suspenznom stave počas celého trvania testu.
                           
                        
                     Filtračné zariadenie alebo odstredivka
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Prístroj na filtráciu vzoriek s membránovými filtrami vhodnej pórovitosti (nominálny priemer otvoru 0,45 μm), ktoré adsorbujú rozpustné organické chemikálie a uvoľňujú organický uhlík v minimálnej miere. Ak sa použijú filtre, ktoré uvoľňujú organický uhlík, je potrebné dôkladne umyť filtre horúcou vodou, aby sa odstránil vylúhovateľný organický uhlík. Prípadne sa môže použiť odstredivka schopná dosiahnuť 40 000 m/s2.
                           
                        
                     Analytické zariadenie
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Prístroj schopný určiť:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          DOC (rozpustený organický uhlík) a TOC (celkový organický uhlík) alebo COD (chemická spotreba kyslíka),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          špecifickú chemikáliu v prípade potreby,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          suspendované tuhé látky, pH, koncentráciu kyslíka vo vode,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          teplotu, kyslosť a zásaditosť,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          amónium, dusitan a dusičnan, ak sa test vykonáva v nitrifikačných podmienkach.
                                       
                                    
                        
                     Voda
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Voda z vodovodu s obsahom DOC nižším ako 3 mg/l. Určí sa zásaditosť, ak ešte nie je známa.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Deionizovaná voda s obsahom DOC nižším ako 2 mg/l.
                           
                        
                     Organické médium
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Ako organické médium sú prípustné syntetické médiá, domáce splaškové vody alebo zmes obidvoch. Ukázalo sa (11) (14), že pri použití samotných domácich splaškových vôd často dochádza k zvýšenej percentuálnej eliminácii DOC a dokonca je možná eliminácia a biodegradácia niektorých chemikálií, ktoré nepodliehajú biodegradácii pri použití syntetických médií OECD. Nepretržitým alebo prerušovaným pridávaním domácich splaškových vôd sa takisto často stabilizuje aktivovaný kal vrátane rozhodujúcej schopnosti dobrého usadzovania sa. Preto sa odporúča používať domáce splaškové vody. Meria sa koncentrácia DOC alebo COD v každej novej dávke organického média. Je potrebné poznať kyslosť alebo zásaditosť organického média. Organické médium môže vyžadovať pridanie vhodného tlmivého roztoku (hydrogénuhličitan sodný alebo dihydrogénfosforečnan draselný), ak má nízku kyslosť alebo zásaditosť, aby počas testu v prevzdušňovacej nádobe ostalo zachované pH s hodnotou približne 7,5 ± 0,5. O množstve a čase pridania tlmivého roztoku sa rozhoduje individuálne pre každý prípad. Ak sa používajú zmesi, či už nepretržite alebo prerušovane, DOC (alebo COD) v zmesi sa musí udržiavať na približne stálych hodnotách, napríklad riedením vodou.
                           
                        
                     Syntetické médiá
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              V každom litri vody z vodovodu sa rozpustí: 160 mg peptónu, 110 mg mäsového extraktu, 30 mg močoviny, 28 mg bezvodého hydrogénfosforečnanu draselného (K2HPO4), 7 mg chloridu sodného (NaCl), 4 mg dihydrátu chloridu vápenatého (CaCl2.2H2O), 2 mg heptahydrátu síranu horečnatého (Mg2SO4.7H20). Toto syntetické médium OECD je uvedené ako príklad a zabezpečuje strednú koncentráciu DOC v prítoku v hodnote približne 100 mg/l. Môžu sa prípadne použiť iné zloženia s približne rovnakou koncentráciou DOC, ktoré sa viac približujú skutočným splaškovým vodám. Ak je potrebný prítok s nižšou koncentráciou, zriedia sa syntetické médiá napríklad v pomere 1: 1 s vodou z vodovodu, aby sa získala koncentrácia približne 50 mg/l. Takýto slabší prítok umožní lepší rast nitrifikačných organizmov, pričom táto modifikácia by sa mala použiť v prípade skúmania simulácie nitrifikačných čistiarní odpadových vôd. Tieto syntetické médiá sa môžu pripraviť v destilovanej vode v koncentrovanej forme a do jedného týždňa skladovať pri teplote približne 1 °C. V prípade potreby sa zriedia vodou z vodovodu. (Toto médium nie je vyhovujúce, napr. koncentrácia dusíka je veľmi vysoká, pomerne nízky obsah uhlíka, ale nebolo navrhnuté nič lepšie okrem pridania ďalšieho fosfátu ako tlmivého roztoku a ďalšieho peptónu).
                           
                        
                     Domáce splaškové vody
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Použijú sa čerstvo usadené splaškové vody zbierané denne z čistiarní odpadových vôd, do ktorých sa dodávajú prevažne domáce splaškové vody. Mali by sa odobrať pred primárnou sedimentáciou z prietokového kanála nádrže primárnej sedimentácie alebo z prívodu do čistiarne s technológiou aktivovaného kalu a mali by byť zbavené hrubých častíc. Splaškové vody sa môžu použiť po niekoľkodňovom uskladnení (ktoré by však vo všeobecnosti nemalo presiahnuť sedem dní) pri teplote približne 4 °C, ak sa preukáže, že DOC (alebo COD) sa výrazne neznížil (t. j. o menej ako 20 %). Na obmedzenie porúch systému je potrebné pred použitím upraviť DOC (alebo COD) každej novej dávky na vhodnú stálu hodnotu, napr. zriedením vodou z vodovodu.
                           
                        
                     Aktivovaný kal
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Odoberie sa aktivovaný kal na inokuláciu z prevzdušňovacej nádrže správne prevádzkovanej čistiarne odpadových vôd alebo z laboratórnej jednotky s technológiou aktivovaného kalu spracúvajúcej prevažne domáce splaškové vody.
                           
                        
                     Zásobné roztoky testovanej chemikálie
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              V prípade chemikálií s dostatočnou rozpustnosťou sa pripravia zásobné roztoky s vhodnými koncentráciami (napr. 1 – 5 g/l) v deionizovanej vode alebo v minerálnej časti syntetických médií (pre nerozpustné a prchavé chemikálie pozri dodatok 5). Určí sa DOC a celkový organický uhlík (TOC) zásobného roztoku a merania sa opakujú pri každej novej dávke. Ak je rozdiel medzi DOC a TOC väčší ako 20 %, je potrebné skontrolovať rozpustnosť testovanej chemikálie vo vode. Porovná sa DOC alebo koncentrácia testovanej chemikálie nameraná špecifickou analýzou zásobného roztoku a nominálna hodnota, aby sa zistilo, či je výťažnosť dostatočná (zvyčajne možno očakávať > 90 %). Je potrebné sa uistiť, najmä pri disperziách, či sa DOC môže alebo nemôže použiť ako analytický parameter alebo či sa môže použiť iba analytická metóda špecifická pre testovanú chemikáliu. Pri disperziách sa vyžaduje odstredenie vzoriek. Pri každej novej dávke sa odmeria DOC, COD alebo testovaná chemikália pomocou špecifickej analýzy.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Určí sa pH zásobného roztoku. Z krajných hodnôt vyplýva, že pridanie chemikálie môže vplývať na pH aktivovaného kalu v testovacom systéme. V takom prípade je potrebné neutralizovať zásobný roztok na získanie pH 7 ± 0,5 pomocou malých množstiev anorganickej kyseliny alebo zásady, ale treba zabrániť zrážaniu testovanej chemikálie.
                           
                        POSTUP
                  
                              33.
                           
                           
                              Opísaný postup je určený pre čistiarne s technológiou aktivovaného kalu. Pre systém pórovitej nádoby je potrebné ho mierne prispôsobiť.
                           
                        
                     Príprava inokula
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Na začiatku testu sa testovací systém inokuluje buď s aktivovaným kalom, alebo inokulom obsahujúcim nízku koncentráciu mikroorganizmov. Inokulum je potrebné udržiavať prevzdušnené pri izbovej teplote až do jeho použitia a použiť ho do 24 hodín. V prvom prípade sa zoberie vzorka aktivovaného kalu z prevzdušňovacej nádrže účinne prevádzkovanej biologickej čistiarne odpadových vôd alebo z laboratórnej čistiarne, do ktorej sa dodávajú prevažne domáce splaškové vody. Ak sa simulujú nitrifikačné podmienky, kal sa odoberie z nitrifikačnej čistiarne odpadových vôd. Určí sa koncentrácia suspendovaných tuhých látok a v prípade potreby sa kal koncentruje usadením tak, aby bol objem pridaný do testovacieho systému čo najmenší. Je nutné zabezpečiť, aby bola počiatočná koncentrácia suchej hmoty približne 2,5 g/l.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              V druhom prípade sa ako inokulum použije 2 – 10 ml/l výtoku z biologickej čistiarne domácich odpadových vôd. Na získanie čo najväčšieho počtu rôznych druhov baktérií môže byť užitočné pridať inokulá z viacerých iných zdrojov, napríklad z povrchovej vody. V takom prípade v testovacom systéme vznikne a pribudne aktivovaný kal.
                           
                        
                     Dávkovanie organického média
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Zabezpečí sa, aby boli prítokové a výtokové nádoby a potrubia z prítokových nádob a do výtokových nádob dôkladne očistené, aby sa eliminovalo množenie mikróbov na začiatku a počas trvania testu. Testovacie systémy sa sústredia v miestnosti s kontrolovanou teplotou (zvyčajne v rozsahu 20 – 25 °C) alebo sa použijú testovacie jednotky s vodným plášťom. Pripraví sa dostatočný objem požadovaného organického média (odseky 27– 29). Najskôr sa prevzdušňovacia nádoba a separátor naplnia organickým médiom a pridá sa inokulum (odseky 34, 35). Začne sa s prevzdušňovaním tak, aby sa kal udržiaval v suspenzii a v aeróbnom stave, a následne sa začne s dávkovaním prítoku a recykláciou usadeného kalu. Organické médium sa dávkuje zo skladovacích nádob do prevzdušňovacích nádob (odseky 20, 21) testovacích a kontrolných jednotiek, pričom príslušné výtoky sa odoberú do podobných skladovacích nádob. S cieľom dosiahnuť bežný hydraulický retenčný čas 6 h sa organické médium prečerpáva rýchlosťou 0,5 l/h. Na účely potvrdenia tejto rýchlosti sa denné množstvo dávkovaného organického média odmeria tak, že sa zaznamená zníženie objemov média v skladovacích nádobách. Na zistenie účinkov prerušovaného vypúšťania a „šokového“ pridávania chemikálií by boli potrebné iné spôsoby dávkovania.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Ak sa organické médium pripravuje na použitie na obdobie dlhšie ako jeden deň, je potrebné chladenie pri teplote približne 4 °C alebo iné vhodné metódy konzervácie, aby sa predišlo množeniu mikróbov a biodegradácii mimo testovacích jednotiek (odsek 29). Ak sa použijú syntetické médiá, môže sa pripraviť a pri teplote približne 4 °C uskladniť koncentrovaný zásobný roztok (napr. desaťnásobok bežnej koncentrácie, odsek 28). Tento zásobný roztok možno pred použitím dôkladne zmiešať s primeraným množstvom vody z vodovodu, prípadne ho možno prečerpávať priamo, kým sa zvlášť prečerpáva primerané množstvo vody z vodovodu.
                           
                        
                     Dávkovanie testovanej chemikálie
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Primerané množstvo zásobného roztoku testovanej chemikálie (odsek 31) sa pridá do skladovacej nádoby prítoku alebo sa samostatnou pumpou dávkuje priamo do prevzdušňovacej nádoby. Bežná priemerná testovacia koncentrácia v prítoku by mala byť medzi 10 mg/l a 20 mg/l DOC s hornou koncentráciou nie vyššou ako 50 mg/l. Ak je testovaná chemikália slabo rozpustná vo vode alebo ak sú pravdepodobné toxické účinky, je potrebné znížiť koncentráciu na 5 mg/l DOC alebo aj menej, ale len v prípade, že je k dispozícii a vykoná sa vhodná špecifická analytická metóda (rozptýlené testované chemikálie, ktoré sú slabo rozpustné vo vode, sa môžu pridať s využitím špeciálnych dávkovacích metód, pozri dodatok 5).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Testovaná chemikália sa začne pridávať po uplynutí intervalu, v ktorom sa systém stabilizoval a účinne odstraňuje DOC organického média (približne 80 %). Pred pridaním testovanej chemikálie je dôležité skontrolovať, či všetky jednotky pracujú rovnako účinne. Ak to tak nie je, zvyčajne pomáha zmiešať jednotlivé kaly a do jednotlivých jednotiek znovu rozdeliť rovnaké objemy. Ak sa použije inokulum (približne) 2,5 g/l (suchá hmotnosť) aktivovaného kalu, testovaná chemikália sa môže pridávať od začiatku testu, lebo priame pridávanie zvyšujúcich sa množstiev od začiatku má tú výhodu, že aktivovaný kal môže byť schopný lepšie sa prispôsobiť testovanej chemikálii. Pri ktoromkoľvek spôsobe pridávania testovanej chemikálie sa odporúča v pravidelných intervaloch merať príslušnú rýchlosť prietoku a/alebo objemy v skladovacej nádobe (nádobách).
                           
                        
                     Manipulácia s aktivovaným kalom
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Koncentrácia tuhých látok v aktivovanom kale sa zvyčajne v priebehu testu nezávisle od použitého inokula stabilizuje medzi limitmi v rozsahu 1 – 3 g/l (suchá hmotnosť) v závislosti od kvality a koncentrácie organického média, prevádzkových podmienok, charakteru prítomných mikroorganizmov a vplyvu testovanej chemikálie.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Buď sa určia suspendované tuhé látky v prevzdušňovacej nádobe aspoň raz týždenne a odoberie sa prebytočný kal s cieľom udržať koncentráciu na úrovni 1 – 3 g/l (suchá hmotnosť), alebo sa pri stálej hodnote kontroluje stredný vek kalu, zvyčajne v rozmedzí šesť až desať dní. Ak sa napríklad zvolí retenčný čas kalu v trvaní ôsmich dní, denne je potrebné odstrániť 1/8 objemu aktivovaného kalu v prevzdušňovacej nádobe a zlikvidovať ho. Tento postup sa vykonáva každý deň alebo podľa možnosti prostredníctvom automatickej prerušovane prevádzkovanej pumpy. Udržiavaním konštantnej koncentrácie suspendovaných tuhých látok alebo jej udržiavaním v rámci úzkych limitov sa nezachováva stály retenčný čas kalu (SRT), ktorý je prevádzkovou premennou podmieňujúcou hodnotu koncentrácie testovanej chemikálie vo výtoku.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Počas trvania testu sa aspoň raz denne odstráni všetok kal, ktorý sa zachytáva na stenách prevzdušňovacej nádoby a separátora, aby sa resuspendoval. Je potrebné pravidelne kontrolovať a čistiť všetky trubice a potrubia, aby sa predišlo rastu biofilmu. Usadený kal zo separátora sa recykluje do prevzdušňovacej nádoby podľa možnosti prerušovaným prečerpávaním. V systéme pórovitej nádoby nedochádza k recyklovaniu, ale je nutné zabezpečiť vloženie čistých vnútorných nádob, skôr než objem v nádobe výrazne stúpne (odsek 21).
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              V čistiarňach Husmann môže dochádzať k slabému usadzovaniu a strate kalu. To možno napraviť súbežným použitím jedného alebo viacerých krokov uvedených ďalej v testovacích aj kontrolných jednotkách:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          v pravidelných intervaloch, napr. raz týždenne, sa môže pridávať čerstvý kal alebo flokulačné činidlo (napríklad 2 ml/na nádobu 50 g/l FeCl3), ale je potrebné sa uistiť, či nedochádza k žiadnej reakcii s FeCl3 ani ku zrážaniu testovanej chemikálie,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          vzduchové čerpadlo sa môže nahradiť peristaltickým čerpadlom, čím sa umožní približne rovnaký recirkulačný prietok kalu ako prítokový prietok, ktorý je potrebné použiť, a umožní sa vytvorenie anaeróbnej zóny v usadenom kale (geometria vzduchového čerpadla obmedzuje minimálny prietok navráteného kalu na približne 12-násobok prítokového prietoku),
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kal sa môže prečerpávať zo separátora do prevzdušňovacej nádoby prerušovane (napr. 5 min. každú 2,5 h s cieľom recyklovať 1 – 1,5 l/h,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      môže sa použiť netoxické protipeniace činidlo v minimálnej koncentrácii, aby sa predišlo strate v dôsledku penenia (napr. silikónový olej),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      do kalu v separátore sa môže v krátkych šokových dávkach púšťať vzduch (napr. 10 sekúnd každú hodinu),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      do prevzdušňovacej nádoby sa môže v intervaloch dávkovať organické médium (napr. 3 – 10 min. každú hodinu).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     Odber vzoriek a analýza
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              V pravidelných intervaloch je potrebné merať koncentráciu rozpusteného kyslíka, teplotu a hodnotu pH aktivovaného kalu v prevzdušňovacích nádobách. Treba zabezpečiť, aby bol nepretržite k dispozícii dostatok kyslíka (> 2 mg/l) a aby bola teplota udržiavaná v požadovanom rozmedzí (zvyčajne 20 – 25 °C). Hodnota pH sa udržiava na úrovni 7,5 ± 0,5 pomocou dávkovania malých množstiev anorganickej zásady alebo kyseliny do prevzdušňovacej nádoby alebo do prítoku alebo pomocou zvyšovania tlmivej kapacity organického média (pozri odsek 27). Pri nitrifikácii dochádza k tvorbe kyseliny, pričom oxidácia 1 mg N vytvára približne 7 mg CO3
                                 –. Frekvencia meraní závisí od meraného parametra a od stability systému a môže byť rôzna medzi dennými a týždennými meraniami.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Odmeria sa DOC alebo COD v prítokoch do kontrolných a testovacích nádob. Koncentráciu testovanej chemikálie je potrebné odmerať v testovacom prítoku špecifickou analýzou alebo ju odhadnúť z koncentrácie v zásobnom roztoku (odsek 31), použitého objemu a množstva splaškových vôd dávkovaných do testovacej jednotky. Odporúča sa vypočítať koncentráciu testovanej chemikálie, aby sa znížila variabilita údajov týkajúcich sa koncentrácie.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Z odobratého výtoku sa zoberú vhodné vzorky (napr. 24-hodinové kompozity) a filtrujú sa cez membránu s veľkosťou pórov 0,45 μm alebo sa odstreďujú rýchlosťou približne 40 000 m/s2 asi 15 min. Odstreďovanie by sa malo použiť, ak je filtrovanie zložité. Určí sa DOC alebo COD aspoň v dvoch vyhodnoteniach s cieľom zmerať konečnú biodegradáciu a v prípade potreby primárnu biodegradáciu analýzou špecifickou pre testovanú chemikáliu.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Použitie COD môže pri nízkych koncentráciách viesť k vzniku analytických problémov, preto sa odporúča iba pri použití dostatočne vysokej testovacej koncentrácie (približne 30 mg/l). Pri silne adsorbujúcich chemikáliách sa takisto odporúča merať množstvo adsorbovanej chemikálie v kale pomocou analytickej metódy špecifickej pre testovanú chemikáliu.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Frekvencia odoberania vzoriek závisí od očakávanej dĺžky testu. Odporúčaná frekvencia je trikrát týždenne. Keď sú jednotky v účinnej prevádzke, po zavedení testovanej chemikálie sa umožní ich adaptácia počas jedného až maximálne šiestich týždňov, aby dosiahli stabilný stav. Na vyhodnotenie výsledku testu je potrebné získať aspoň 15 platných hodnôt v rovnovážnej fáze (odsek 59), ktorá zvyčajne trvá tri týždne. Test sa môže ukončiť, ak sa dosiahne dostatočný stupeň eliminácie (napr. > 90 %) a ak je k dispozícii týchto 15 hodnôt, ktoré predstavujú analýzy vykonávané každý pracovný deň počas troch týždňov. Po pridaní testovanej chemikálie by test zvyčajne nemal trvať dlhšie ako 12 týždňov.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Ak kal nitrifikuje a ak sa skúmajú účinky testovanej chemikálie na nitrifikáciu, aspoň raz týždenne sa analyzuje vzorka výtoku z testovacích a kontrolných jednotiek s cieľom zistiť, či neobsahuje amónium a/alebo dusitan a dusičnan.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Všetky analýzy by sa mali vykonať čo najskôr, najmä stanovenie dusíka. Ak sa analýzy musia odložiť, vzorky sa uskladnia v tme pri teplote približne 4 °C v plných, pevne uzavretých fľašiach. Ak musia byť vzorky uskladnené viac ako 48 hodín, zakonzervujú sa hlbokým zmrazením, acidifikáciou (napr. 10 ml/l z 400 g/l roztoku kyseliny sírovej) alebo pridaním vhodnej toxickej látky (napr. 20 ml/l z 10 g/l roztoku chloridu ortutnatého). Je potrebné zabezpečiť, aby metóda konzervácie neovplyvnila výsledky analýzy.
                           
                        
                     Spájanie testovacích jednotiek
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Ak sa použije spájanie (dodatok 3), denne sa vymení rovnaké množstvo aktivovaného kalu (150 ml za 1 500 ml v prípade prevzdušňovacích nádob s obsahom troch litrov tekutiny) medzi prevzdušňovacími nádobami testovacej jednotky a jej kontrolnej jednotky. Ak testovaná látka silno adsorbuje na kale, vymení sa iba supernatant zo separátorov. V obidvoch prípadoch sa na výpočet výsledkov testu použije faktor korekcie (odsek 55).
                           
                        ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV
                  
                     Spracovanie výsledkov
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Vypočíta sa percentuálna eliminácia DOC alebo COD testovanej chemikálie pre každé časované hodnotenie pomocou rovnice:
                              
                                 
                              kde
                              
                                          Dt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          % eliminácie DOC alebo COD v čase t,
                                       
                                    
                                          Cs
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          DOC alebo COD v prítoku v dôsledku testovanej chemikálie, podľa možnosti odhadnuté zo zásobného roztoku (mg/l),
                                       
                                    
                                          E
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          nameraná hodnota DOC alebo COD v testovacom výtoku v čase t (mg/l),
                                       
                                    
                                          Eo
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          nameraná hodnota DOC alebo COD v kontrolnom výtoku v čase t (mg/l).
                                       
                                    
                        
                              53.
                           
                           
                              Stupeň eliminácie DOC alebo COD organického média v kontrolnej jednotke je informácia užitočná pri hodnotení biodegradačnej činnosti aktivovaného kalu počas testu. Vypočíta sa percentuálna eliminácia z rovnice:
                              
                                 
                              kde
                              
                                          DB
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          % eliminácia DOC alebo COD organického média v kontrolnej jednotke v čase t,
                                       
                                    
                                          CM
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          DOC alebo COD organického média v kontrolnom prítoku (mg/l).
                                       
                                    Môže sa zvoliť aj vypočítanie percentuálnej eliminácie DOC alebo COD v dôsledku organického média a testovanej chemikálie v testovacej jednotke z rovnice:
                              
                                 
                              kde
                              
                                          DT
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          % eliminácie celkového testovacieho prítoku DOC alebo COD,
                                       
                                    
                                          CT
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          DOC alebo COD celkového testovacieho prítoku alebo vypočítané zo zásobných roztokov (mg/l).
                                       
                                    
                        
                              54.
                           
                           
                              Vypočíta sa eliminácia testovanej chemikálie, ak je meraná špecifickou analytickou metódou, pri každom časovom hodnotení z rovnice:
                              
                                 
                              kde
                              
                                          DST
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          % primárnej eliminácie testovanej chemikálie v čase t,
                                       
                                    
                                          Si
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          nameraná alebo odhadnutá koncentrácia testovanej chemikálie v testovacom prítoku (mg/l),
                                       
                                    
                                          Se
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          nameraná koncentrácia testovanej chemikálie v testovacom výtoku v čase t (mg/l).
                                       
                                    
                        
                              55.
                           
                           
                              Ak sa použilo spájanie, zriedenie testovanej chemikálie v prevzdušňovacej nádobe výmenou kalu sa kompenzuje pomocou faktoru korekcie (pozri dodatok 3). Ak sa použil stredný hydraulický retenčný čas 6 h a výmena polovice objemu aktivovaného kalu v prevzdušňovacej nádobe, stanovené denné hodnoty eliminácie (Dt, odsek 52) sa musia opraviť, aby sa získal skutočný stupeň eliminácie, Dtc, testovanej chemikálie z rovnice:
                              
                                 
                           
                        
                     Vyjadrenie výsledkov testu
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Zakreslí sa percentuálna eliminácia Dt (alebo Dtc) a Dst, ak je k dispozícii, v závislosti od času (pozri dodatok 2). Z tvaru krivky eliminácie testovanej chemikálie (per se alebo ako DOC) možno vyvodiť niekoľko záverov o procese odstraňovania.
                           
                        
                     Adsorpcia
                  
                  
                              57.
                           
                           
                              Ak sa od začiatku testu pozoruje vysoká eliminácia DOC testovanej chemikálie, testovaná chemikália je pravdepodobne eliminovaná adsorpciou na tuhých látkach aktivovaného kalu. Je možné to dokázať určením adsorbovanej testovanej chemikálie pomocou špecifickej analýzy. Eliminácia DOC adsorbovateľných chemikálií zvyčajne neostáva vysoká počas celého testu. Bežne sa na začiatku vyskytne vysoký stupeň eliminácie, ktorý postupne klesá na rovnovážnu hodnotu. Ak by však adsorbovateľná testovaná chemikália nejakým spôsobom bola schopná spôsobiť aklimatizáciu populácie mikróbov, eliminácia DOC testovanej chemikálie by následne stúpla a dosiahla by hornú rovnovážnu hodnotu.
                           
                        
                     Lag fáza
                  
                  
                              58.
                           
                           
                              Podobne ako pri statických skríningových testoch si mnohé testované chemikálie vyžadujú pred úplnou biodegradáciou lag fázu. Počas lag fázy prebieha aklimatizácia alebo adaptácia degradačných baktérií pri takmer nulovej eliminácii testovanej chemikálie. Potom nastane počiatočné množenie týchto baktérií. Táto fáza sa končí a degradačná fáza sa začína, keď sa odstráni približne 10 % počiatočného množstva testovanej chemikálie (po umožnení adsorpcie, ak k nej dochádza). Lag fáza je často veľmi variabilná a slabo reprodukovateľná.
                           
                        
                     Rovnovážna fáza
                  
                  
                              59.
                           
                           
                              Rovnovážna fáza krivky eliminácie v nepretržitom teste je vymedzená ako fáza, v ktorej nastáva maximálna degradácia. Rovnovážna fáza by mala trvať najmenej tri týždne a mala by mať približne 15 nameraných platných hodnôt.
                           
                        
                     Stredný stupeň eliminácie testovanej chemikálie
                  
                  
                              60.
                           
                           
                              Vypočíta sa stredná hodnota z hodnôt eliminácie (Dt) testovanej chemikálie počas rovnovážnej fázy. Hodnota zaokrúhlená na celé číslo (1 %) predstavuje stupeň eliminácie testovanej chemikálie. Odporúča sa aj vypočítať 95 % interval spoľahlivosti strednej hodnoty.
                           
                        
                     Eliminácia organického média
                  
                  
                              61.
                           
                           
                              Zakreslí sa percentuálna eliminácia DOC alebo COD organického média v kontrolnej jednotke (DB) v závislosti od času. Stredný stupeň eliminácie sa označí rovnakým spôsobom ako v prípade testovanej chemikálie (odsek 60).
                           
                        
                     Indikácia biodegradácie
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Ak testovaná chemikália výrazne neadsorbuje na aktivovanom kale a krivka eliminácie má typický tvar biodegradačnej krivky s lag, degradačnou a rovnovážnou fázou (odseky 58, 59), nameraná eliminácia sa môže s istotou pripísať biodegradácii. Ak bola počiatočná eliminácia vysoká, simulačný test nemôže rozlišovať medzi biologickými a abiotickými eliminačnými procesmi. V takých prípadoch a v prípade akýchkoľvek pochybností o biodegradácii (napr. ak dochádza k stripovaniu) sa vykoná analýza adsorbovanej testovanej chemikálie alebo ďalšie statické biodegradačné testy založené na parametroch, ktoré jednoznačne indikujú biologické procesy. Takými testmi sú metódy absorpcie kyslíka [kapitola C.4 D, E a F tejto prílohy (6)] alebo test s meraním tvorby oxidu uhličitého [kapitola C.4 C tejto prílohy (6)] alebo ISO metóda uzavretého priestoru nad kvapalinou (18) s použitím predexponovaného inokula zo simulačného testu. Ak sa odmerala eliminácia DOC aj eliminácia špecifickej chemikálie, výrazné rozdiely (v prípade prvej hodnoty nižšej ako druhej) medzi percentuálnou elimináciou indikujú prítomnosť organických medziproduktov vo výtokoch, ktoré sa môžu rozkladať ťažšie ako materská chemikália.
                           
                        
                     Platnosť výsledkov testu
                  
                  
                              63.
                           
                           
                              Informácie o bežnom biodegradačnom správaní inokula sa získajú, ak sa určí stupeň eliminácie organického média (odsek 53) v kontrolnej jednotke. Test možno považovať za platný, ak po dvoch týždňoch stupeň eliminácie DOC alebo COD v kontrolnej jednotke (jednotkách) je > 80 % a nie sú pozorované žiadne nezvyčajné javy.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Ak sa použila ľahko biodegradovateľná (referenčná) chemikália, stupeň biodegradácie (Dt, odsek 52) by mal byť > 90 %.
                           
                        
                              65.
                           
                           
                              Ak sa test vykonáva v nitrifikačných podmienkach, stredná koncentrácia vo výtokoch by mala byť < 1 mg/l amoniaku-N a < 2 mg/l dusitanu-N.
                           
                        
                              66.
                           
                           
                              Ak neboli splnené tieto kritériá (odseky 63 – 65), je potrebné opakovať test s použitím inokula z iného zdroja, testovať referenčnú chemikáliu a skontrolovať testovacie postupy.
                           
                        
                     Správa o teste
                  
                  
                              67.
                           
                           
                              Správa o teste musí obsahovať:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovaná chemikália:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikačné údaje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikálny charakter a pokiaľ je to relevantné významné fyzikálno-chemické vlastnosti.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Podmienky testovania:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      druh testovacieho systému, všetky modifikácie pri testovaní nerozpustných a prchavých chemikálií,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      druh organického média,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podiel a charakter priemyselných odpadových vôd prítomných v splaškových vodách, ak je známy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inokulum: charakter a miesto odberu, koncentrácia a jeho predpríprava,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zásobný roztok testovanej chemikálie: obsah DOC a TOC, spôsob prípravy v prípade suspendovania, použitá testovacia koncentrácia, odôvodnenie v prípade hodnôt mimo rozsahu 10 – 20 mg/l DOC, metóda pridávania, dátum prvého pridania, všetky zmeny,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stredný vek kalu a stredný hydraulický retenčný čas, metóda odstraňovania kalu, metódy na zamedzenie zväčšovaniu objemu, úbytok kalu atď.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použité analytické metódy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      teplota počas testu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kvalita zväčšovania objemu kalu, objemový index kalu (SVI), suspendované tuhé látky v zmiešanej tekutine (MLSS),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      všetky odchýlky od štandardných postupov a všetky okolnosti, ktoré mohli ovplyvniť výsledky.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky testu:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      všetky namerané údaje (DOC, COD, špecifické analýzy, pH, teplota, koncentrácia kyslíka, suspendované tuhé látky, N chemikálie v prípade potreby,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      všetky vypočítané hodnoty Dt (alebo Dtc), DB, DSt v tabuľkovej podobe a krivky eliminácie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informácie o lag a rovnovážnej fáze, trvanie testu, stupeň eliminácie testovanej chemikálie a organického média v kontrolnej jednotke spolu so štatistickými informáciami a vyjadreniami biodegradovateľnosti a platnosti testu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozbor výsledkov.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATÚRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              Swisher, R. D. (1987). Surfactant Biodegradation, druhé vydanie. Marcel Dekker Inc. New York, 1085 s
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Nemecká vláda (1962). Ordinance of the degradability of detergents in washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt. 1 No. 49: 698 – 706.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Painter, H. A., a King, E. F. (1978a). WRc porous-pot method for assessing biodegradability. Technical Report No. 70, Water Research Centre, Medmenham, UK.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Painter, H. A. a King, E. F. (1978b). The effect of phosphate and temperature on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. Res. 12: 909 – 915.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Eckenfelder, W. W. (19) US EPA.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Kapitola C.4 tejto prílohy, Stanovenie ‚ľahkej‘ biodegradovateľnosti.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Kapitola C.12 tejto prílohy, Biodegradácia – upravený test SCAS.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Kapitola C.19 tejto prílohy, Odhad adsorpčného koeficientu (K
                                    OC
                                 ) na pôde a kale z odpadových vôd pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Gerike, P., a Fischer, W. K. (1979). A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3:157 – 173.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Gerike, P., a Fischer, W. K. (1981), ako (9), II Additional results and conclusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45 – 55.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Painter, H. A., a Bealing, D. (1989). Experience and data from the OECD activated sludge simulation test. pp 113 – 138, In: Laboratory tests for simulation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen B. N., Muntau H., Angeletti G.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              ISO 11733 (1995; revidované 2004). Stanovenie eliminácie a biodegradability organických zlúčenín vo vodnom prostredí. Simulačná skúška s aktivovaným kalom.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Birch, R. R. (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol. Deterg.: 33 – 48.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Birch, R. R. (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 (2): 340 – 343.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Gerike, P., Fischer, W. K., a Holtmann, W. (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753 – 758.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Baumann, U., Kuhn, G., a Benz, M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214 – 220.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. Methods for the examination of waters and associated materials. s. 91 – 98 ISBN 011 751661 9.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              ISO 14593 (1998) Kvalita vody. Hodnotenie úplnej aeróbnej biodegradability organických látok vo vodnom prostredí. Metóda analýzy uvoľneného anorganického uhlíka v uzavretých nádobách (skúška CO2 headspace).
                           
                        
                     Dodatok 1
                     
                        Obrázok 1
                     
                     
                        Zariadenie používané na hodnotenie biodegradovateľnosti
                     
                     Jednotka Husmann
                     
                        
                     
                                 A.
                              
                              
                                 Zásobná nádoba
                              
                           
                                 B.
                              
                              
                                 Dávkovacie čerpadlo
                              
                           
                                 C.
                              
                              
                                 Prevzdušňovacia komora (kapacita 31)
                              
                           
                                 D.
                              
                              
                                 Usadzovacia nádrž
                              
                           
                                 E.
                              
                              
                                 Vzduchové čerpadlo
                              
                           
                                 F.
                              
                              
                                 Zberná nádoba
                              
                           
                                 G.
                              
                              
                                 Prevzdušňovač
                              
                           
                                 H.
                              
                              
                                 Vzduchový prietokomer
                              
                           
                        Obrázok 2
                     
                     
                        Zariadenie používané na hodnotenie biodegradovateľnosti
                     
                     Pórovitá nádoba
                     
                        
                     
                                 A.
                              
                              
                                 Zásobná nádoba
                              
                           
                                 B.
                              
                              
                                 Dávkovacie čerpadlo
                              
                           
                                 C.
                              
                              
                                 Pórovitá prevzdušňovacia nádoba
                              
                           
                                 D.
                              
                              
                                 Vonkajšia nepriepustná nádoba
                              
                           
                                 E.
                              
                              
                                 Zberná nádoba
                              
                           
                                 F.
                              
                              
                                 Difúzor
                              
                           
                                 G.
                              
                              
                                 Vzduchový prietokomer
                              
                           
                        Obrázok 3
                     
                     
                        Detaily trojlitrovej pórovitej prevzdušňovacej nádoby
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatok 2
                     
                        Príklad krivky eliminácie
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatok 3
                     [INFORMATÍVNY]
                     SPÁJANIE TESTOVACÍCH JEDNOTIEK
                     V úsilí o vyrovnanie populácie mikróbov v kaloch v testovacej jednotke, do ktorej sa pridávajú odpadové vody a testované chemikália, a v kontrolnej jednotke, do ktorej sa pridávajú iba odpadové vody, bola zavedená každodenná vzájomná výmena kalu (1). Postup sa nazýva spájanie a metóda je známa ako metóda spojených jednotiek. Spájanie sa prvýkrát vykonalo s použitím jednotiek Husmann s technológiou aktivovaného kalu, ale vykonáva sa aj s pórovitými nádobami (2) (3). Nezistili sa žiadne významné rozdiely vo výsledkoch medzi nespojenými a spojenými jednotkami, či už ide o jednotky Husmann alebo pórovité nádoby, preto z vynaloženého času a energie potrebnej na spájanie jednotiek nevyplýva žiadna výhoda.
                     Výmeny kalu môžu vytvárať dojem pomerne významnej eliminácie, lebo časť testovanej chemikálie sa prenesie a koncentrácie testovanej chemikálie v testovacích a kontrolných výtokoch sa do väčšej miery takmer vyrovnajú. Preto sa musia použiť faktory korekcie, ktoré závisia od vymenenej časti a stredného hydraulického retenčného času. Ďalšie informácie o výpočte boli uverejnené (1).
                     Vypočíta sa korigovaný stupeň eliminácie DOC alebo COD pomocou všeobecného vzorca:
                     
                        
                     kde
                     
                                 Dtc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 korigované % eliminácie DOC alebo COD,
                              
                           
                                 Dt
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 stanovené % eliminácie DOC alebo COD,
                              
                           
                                 a
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 vymenená časť objemu jednotiek s technológiou aktivovaného kalu,
                              
                           
                                 r
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 stredný hydraulický retenčný čas (h).
                              
                           Ak sa napríklad vymení polovica objemu prevzdušňovacej nádrže (a = 0,5) a stredný hydraulický retenčný čas je 6 h, korekčný vzorec je:
                     
                        
                     
                        LITERATÚRA
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Fischer, W., Gerike, P., Holtmann, W. (1975). Biodegradability Determinations via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131 – 1135.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Painter, H. A., Bealing, D. J. (1989). Experience and Data from the OECD Activated Sludge Simulation Test. s. 113 – 138. In: Laboratory Tests for Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen, B. N., Muntau, H., Angeletti, G.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Painter, H. A., King, E. F. (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK.
                              
                           
                  
                     Dodatok 4
                     HODNOTENIE INHIBÍCIE AKTIVOVANÉHO KALU
                     
                        Postup s testovanými chemikáliami
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Chemikália (alebo odpadová voda) sa v simulačnom teste nemusí degradovať alebo odstrániť a môže mať na mikroorganizmy v kale dokonca inhibičný účinok. Iné chemikálie sa biodegradujú pri nízkych koncentráciách ale pri vyšších koncentráciách sú inhibičné (horméza). Inhibičné účinky sa môžu zistiť v skoršej fáze alebo sa môžu určiť v teste toxicity s použitím inokula podobného alebo rovnakého ako inokulum použité v simulačnom teste (1). Takýmito metódami sú inhibícia absorpcie kyslíka [kapitola C.11 tejto prílohy (2) a ISO 8192(3)] alebo inhibícia množenia organizmov v kale [ISO 15522 (4)].
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 V simulačnom teste sa inhibícia prejaví tak, že rozdiel v rozpustenom organickom uhlíku (DOC) alebo v chemickej spotrebe kyslíka (COD) medzi výtokom z testovacej nádoby a výtokom z kontrolnej nádoby bude väčší ako DOC pridaný ako testovaná chemikália. Inak povedané percentuálna eliminácia DOC (a biochemickej spotreby kyslíka BOD, chemickej spotreby kyslíka COD a/alebo NH+
                                    4) organického média pri čistení sa zníži prítomnosťou testovanej chemikálie. Ak taká situácia nastane, je potrebné test opakovať a znižovať koncentráciu testovanej chemikálie, až kým sa nedosiahne úroveň, pri ktorej nedochádza k inhibícii, prípadne koncentráciu ďalej znižovať, kým nedôjde k biodegradácii testovanej chemikálie. Ak má však testovaná chemikália (alebo odpadová voda) na proces nepriaznivé účinky pri všetkých koncentráciách, znamená to, že chemikáliu je možné ťažko, ak vôbec, biologicky spracovať, ale môže byť vhodné zopakovať test s aktivovaným kalom z iného zdroja a/alebo umožniť postupnejšiu aklimatizáciu kalu.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Naopak, ak sa testovaná chemikália v simulačnom teste bioeliminuje pri prvom pokuse, jej koncentrácia by sa mala zvýšiť, ak je nutné zistiť, či by chemikália mohla mať inhibičný účinok.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Pri určovaní stupňov inhibície je potrebné mať na pamäti, že populácia v aktivovanom kale sa môže meniť, takže mikroorganizmy si časom môžu vybudovať voči inhibičnej chemikálii toleranciu.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Výpočet stupňa inhibície:
                                 Celkové percentuálne eliminácie Ro pre BOD, DOC, COD atď. pre testovacie a kontrolné jednotky možno vypočítať podľa tohto vzorca:
                                 
                                    
                                 kde:
                                 
                                             I
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentrácia BOD, DOC, COD atď. v prítoku pre testovacie alebo kontrolné nádoby (mg/l),
                                          
                                       
                                             E
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             príslušné koncentrácie vo výtoku (mg/l).
                                          
                                       I a E sa musia korigovať vzhľadom na DOC v dôsledku testovanej chemikálie v testovacích jednotkách, inak budú výpočty percentuálnej inhibície nesprávne.
                                 Stupeň inhibície spôsobený prítomnosťou testovanej chemikálie sa môže vypočítať podľa vzorca:
                                 
                                    
                                 kde:
                                 
                                             Rc
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             percentuálna eliminácia v kontrolných nádobách,
                                          
                                       
                                             Rt
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             percentuálna eliminácia v testovacích nádobách.
                                          
                                       
                           
                        LITERATÚRA
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Reynolds, L. a kol. (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2 259.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Kapitola C.11 tejto prílohy, Biodegradácia – respiračno-inhibičný test aktivovaného kalu.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 ISO 8192 (2007) Kvalita vody. Skúška inhibície spotreby kyslíka aktivovaným kalom na oxidáciu uhlíka a amónnych iónov.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 ISO 15522 (1999) Water Quality – Determination of the inhibitory effect of water constituents on activated sludge microorganisms.
                              
                           
                  
                     Dodatok 5
                     
                        Testované chemikálie so slabou rozpustnosťou vo vode – prchavé chemikálie
                     
                     
                        Chemikálie so slabou rozpustnosťou vo vode
                     
                     Podľa všetkého bolo publikovaných len málo správ o testoch chemikálií so slabou rozpustnosťou vo vode alebo nerozpustných chemikálií simulujúcich čistenie odpadových vôd (1) (2) (3).
                     Neexistuje ani jedna metóda disperzie testovanej chemikálie, ktorá by sa mohla aplikovať na všetky nerozpustné chemikálie. Dva zo štyroch druhov metód opísaných v norme ISO 10634 (4) sa zdajú byť vhodné na pokus o disperziu testovaných chemikálií pri simulačnom testovaní: je to použitie emulgátorov a/alebo ultrazvukovej energie. Je potrebné stanoviť stabilitu počas najmenej 24-hodinových intervalov výslednej disperzie. Vhodne stabilizované disperzie obsiahnuté v nádrži s nepretržitým miešaním (odsek 38) sa potom dávkujú do prevzdušňovacej nádrže oddelene od domácich splaškových vôd (alebo syntetických médií).
                     Ak sú disperzie stabilné, je potrebné preskúmať, ako možno testovanú chemikáliu určiť v disperznej forme. Je nepravdepodobné, že by bola vhodná hodnota DOC, preto je potrebné pre testovanú chemikáliu stanoviť špecifickú analytickú metódu, ktorá by sa mohla použiť na výtoky, tuhé látky vo výtokoch a aktivovaný kal. Osud testovanej chemikálie pri simulácii procesu aktivovaného kalu sa následne určí v tekutej a v tuhej fáze. Stanoví sa teda „hmotnostná bilancia“ s cieľom určiť, či sa testovaná chemikália biodegradovala. Tento postup by však indikoval iba primárnu biodegradáciu. Je potrebné pokúsiť sa o preukázanie úplnej biodegradácie prostredníctvom respirometrického testu na ľahkú biodegradovateľnosť [kapitola C.4 tejto prílohy (5) C, F alebo D] pomocou kalu exponovaného testovanej chemikálii v simulačnom teste ako inokula.
                     
                        Prchavé chemikálie
                     
                     Použitie simulácií čistenia odpadových vôd v prípade prchavých chemikálií je diskutabilné a problematické. Podobne ako v prípade testovaných chemikálií so slabou rozpustnosťou vo vode bolo zdá sa uverejnených len málo správ opisujúcich simulačné testy s použitím prchavých látok. Bežne používaný druh zariadenia na úplné miešanie sa upraví tak, že sa hermeticky uzavrú prevzdušňovacie a usadzovacie nádrže, pomocou prietokometrov sa meria a kontroluje prúd vzduchu a vychádzajúci plyn sa vháňa do zachytávačov s cieľom zachytiť prchavú organickú látku. V niektorých prípadoch sa používa vákuová pumpa na prečerpávanie vychádzajúceho plynu cez ‚studený‘ zachytávač alebo čistiaci zachytávač obsahujúci Tenax a silikagél pre plynovochromatografickú analýzu. Testovaná chemikália prítomná v zachytávači sa môže určiť analyticky.
                     Test sa vykoná v dvoch častiach. Jednotky sa najskôr prevádzkujú bez kalu, ale so syntetickou odpadovou vodou a testovanou chemikáliou, ktorá sa prečerpáva do prevzdušňovacej nádrže. Niekoľko dní sa odoberajú vzorky prítoku, výtoku a vychádzajúceho plynu a analyzujú sa s cieľom zistiť, či neobsahujú testovanú chemikáliu. Zo zozbieraných údajov možno vypočítať percento (Rvs) testovanej chemikálie odobratej zo systému stripovaním.
                     Následne sa vykoná bežný biologický test (s kalom) za rovnakých prevádzkových podmienok ako v štúdii stripovania. Vykonajú sa aj merania DOC alebo COD s cieľom preveriť, či jednotky fungujú účinne. V prvej časti testu sa vykonajú príležitostné analýzy na stanovenie testovanej chemikálie v prítoku, výtoku a vychádzajúcom plyne. Po aklimatizácii sa analýzy robia častejšie. Z údajov v stabilnom stave možno opäť vypočítať percentuálnu elimináciu testovanej chemikálie z tekutej fázy všetkými postupmi (RT) (fyzické a biologické), ako aj podiel (RV), ktorý bol zo systému odobratý stripovaním.
                     Výpočet:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 V nebiologickom teste možno percento (RVP) testovaného materiálu odobratého zo systému stripovaním vypočítať podľa tohto vzorca:
                                 kde
                                 
                                             RVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             eliminácia testovanej chemikálie vyprchaním (%),
                                          
                                       
                                             SVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             testovaná chemikália zachytená v zachytávači vyjadrená ako ekvivalentná koncentrácia v tekutej fáze (mg/l),
                                          
                                       
                                             SIP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentrácia testovanej chemikálie v prítoku (mg/l).
                                          
                                       
                           
                                 b)
                              
                              
                                 V biologickom teste možno percento (RV) testovaného materiálu odobratého zo systému stripovaním vypočítať podľa tohto vzorca:
                                 kde
                                 
                                             RV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             eliminácia testovanej chemikálie vyprchaním v biologickom teste (%),
                                          
                                       
                                             SV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             testovaná chemikália zachytená v zachytávači v biologickom teste vyjadrená ako ekvivalentná koncentrácia v tekutom prítoku (mg/l),
                                          
                                       
                                             SI
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentrácia testovanej chemikálie v prítoku (mg/l).
                                          
                                       
                           
                                 c)
                              
                              
                                 V biologickom teste sa percento (RV) testovanej chemikálie odstránenej všetkými postupmi vypočíta takto:
                                 kde
                                 SE= koncentrácia testovanej chemikálie v (tekutom) výtoku (mg/l).
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 Percento (RBA) odstránené biodegradáciou a adsorpciou teda možno vypočítať podľa tohto vzorca:
                                 Je potrebné vykonať samostatné testy s cieľom určiť, či testovaná chemikália adsorbuje, a ak áno, možno urobiť ďalšiu korekciu.
                              
                           
                                 e)
                              
                              
                                 Porovnanie podielu testovanej chemikálie odobratej stripovaním z biologického (Rv) a nebiologického testovacieho (Rvp) systému indikuje celkový účinok, ktorý má biologické spracovanie na emisiu testovanej chemikálie do ovzdušia.
                                 
                                             
                                                Príklad:
                                             
                                          
                                          
                                             Benzén
                                          
                                       Retenčný čas kalu = 4 dni
                                 Syntetické médiá, retenčný čas = 8 h
                                 
                                             SIP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             SI = 150 mg/l
                                          
                                       
                                             SVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             150 mg/l (SEP = 0)
                                          
                                       
                                             SV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             22,5 mg/l
                                          
                                       
                                             SE
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             50 μg/l
                                          
                                       Teda
                                 
                                             RVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             100 %, RV = 15 %
                                          
                                       
                                             RT
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             100 % a RBA = 85 %.
                                          
                                       Usúdilo sa, že benzén neadsorboval na kale.
                              
                           
                        LITERATÚRA
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Horn, J. A., Moyer, J. E., Hale, J. H. (1970). Biological degradation of tertiary butyl alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939 – 854.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Pitter, P., Chudoba, J. (1990). Biodegradability of organic substances in the aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Stover, E. L., Kincannon, D. F. (1983). Biological treatability of specific organic compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control Fed. 55: 97.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 ISO 10634 (1995) Kvalita vody. Pokyny na prípravu a spracovanie organických látok málo rozpustných vo vode na následné hodnotenie ich biodegradability vo vodnom prostredí.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Kapitola C.4 tejto prílohy, Stanovenie ‚ľahkej‘ biodegradovateľnosti.
                              
                           
                  
                     Dodatok 6
                     
                        Účinky retenčného času kalu (SRT) na odbúrateľnosť chemikálií
                     
                     ÚVOD
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Metóda opísaná v základnom texte bola vypracovaná s cieľom uistiť sa, či sa testované chemikálie (zvyčajne tie, ktoré sú známe ako inherentné, nie však ľahko biodegradovateľné) môžu biodegradovať v rámci limitov súvisiacich s čistiarňami odpadových vôd. Výsledky sú vyjadrené ako percento eliminácie a percento biodegradácie. Prevádzkové podmienky jednotiek s technológiou aktivovaného kalu a výber prítoku umožňujú pomerne rozsiahle variácie koncentrácií testovanej chemikálie vo výtoku. Testy sa vykonávajú iba pri jednej nominálnej koncentrácii tuhých látok v kale alebo pri jednom nominálnom retenčnom čase kalu (SRT), pričom opísané režimy odstraňovania kalu môžu spôsobiť, že sa hodnota SRT počas testu bude výrazne meniť, a to zo dňa na deň, ako aj počas dňa.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 V tomto variante (1) (2) sa SRT kontroluje v rámci oveľa užších limitov počas každého 24-hodinového intervalu (ako v prípade veľkých čistiarní), čo má za následok stálejšiu koncentráciu vo výtokoch. Odporúča sa použiť domáce splaškové vody, lebo umožňujú dôslednejšiu a vyššiu percentuálnu elimináciu. Skúmajú sa aj účinky viacerých hodnôt SRT a v podrobnejšej štúdii možno určiť účinky škály teplôt na koncentráciu vo výtoku.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Zatiaľ neexistuje všeobecná zhoda o tom, ktoré kinetické modely prebiehajú, keď sa chemikálie biodegradujú v podmienkach čistenia odpadových vôd. Pre zozbierané údaje bol vybratý Monodov model bakteriálneho rastu a využitia substrátu (1) (2), lebo táto metóda je určená iba pre chemikálie produkované vo veľkých hmotnostiach, ktorých koncentrácia v splaškových vodách je vyššia ako 1 mg/l. Platnosť zjednodušeného modelu a vyvodených predpokladov sa stanovila pomocou súboru etoxylátov alkoholov s rôznymi stupňami primárnej biodegradovateľnosti (2) (3).
                                 
                                             
                                                Poznámka:
                                             
                                          
                                          
                                             Tento variant metódy sa úzko pridŕža väčšiny znenia tejto testovacej metódy C.10-A a ďalej sú uvedené iba tie údaje, ktoré sa líšia.
                                          
                                       
                           PRINCÍP TESTU
                     
                                 4.
                              
                              
                                 Jednotky pórovitých nádob s aktivovaným kalom navrhnuté s cieľom zabezpečiť (takmer) nepretržité odstraňovanie miešanej tekutiny umožňujúce veľmi presnú kontrolu retenčného času kalu (SRT alebo θs) sú prevádzkované bez spojenia pri niekoľkých retenčných časoch kalu (SRT) a nepovinne pri niekoľkých teplotách. Retenčný čas je zvyčajne dva až desať dní a teplota je v rozmedzí 5 a 20 °C. Splaškové vody, najlepšie domáce, a roztok testovanej chemikálie sa do jednotiek dávkujú zvlášť rýchlosťou, ktorou sa zabezpečí požadovaný retenčný čas splaškových vôd (tri až šesť hodín) a požadovaná koncentrácia testovanej chemikálie v prítoku. Na účely porovnávania súbežne fungujú kontrolné jednotky, do ktorých sa nepridáva testovaná chemikália.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Možno použiť aj iný druh zariadenia, ale je potrebné venovať pozornosť tomu, aby sa zabezpečila dobrá kontrola SRT. Napríklad pri použití čistiarní, ktoré zahŕňajú sedimentačnú nádrž, môže byť nevyhnutné stanoviť toleranciu straty tuhých látok cez výtok čistiarne. Takisto je potrebné prijať opatrenia, aby sa predišlo chybám v dôsledku kolísania množstva kalu v sedimentačnej nádrži.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Jednotky sú prevádzkované v každom zvolenom súbore podmienok a po dosiahnutí rovnováhy sa získajú priemerné stabilné koncentrácie testovanej chemikálie vo výtokoch, prípadne aj DOC za obdobie približne troch týždňov. Okrem hodnotenia percentuálnej eliminácie testovanej chemikálie, prípadne DOC, sa v grafickej podobe vyjadrí aj vzťah medzi prevádzkovými podmienkami čistiarne a koncentráciou vo výtoku. Z tohto vyjadrenia možno vypočítať predbežné kinetické konštanty a predpovedať podmienky, za ktorých sa testovaná chemikália môže odbúrať.
                              
                           INFORMÁCIE O TESTOVANEJ CHEMIKÁLII
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Kapitola C.10 A, uplatňujú sa odseky 12 a 13.
                              
                           ÚROVNE ÚSPEŠNOSTI
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Kapitola C.10 A, uplatňujú sa odseky 14 a 15.
                              
                           REFERENČNÁ TESTOVANÁ CHEMIKÁLIA
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Kapitola C.10 A, uplatňuje sa odsek 16
                              
                           REPRODUKOVATEĽNOSŤ VÝSLEDKOV TESTU
                     
                                 10.
                              
                              
                                 Kapitola C.10 A, uplatňujú sa odseky 17 a 18.
                              
                           OPIS METÓDY
                     
                        Zariadenie
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Vhodnou jednotkou je modifikovaný systém pórovitej nádoby (dodatok 6.1). Pozostáva z vnútornej nádoby (alebo vložky) vyrobenej z pórovitého polypropylénu s hrúbkou 3,2 mm a s veľkosťou pórov približne 90 μm, pričom spoj je bezšvový. (Ide o mohutnejšiu jednotku v porovnaní s jednotkou, ktorá je opísaná v odseku 21 tejto kapitoly C.10 A). Vložka je osadená do nepriepustnej polyetylénovej vonkajšej nádoby, ktorá sa skladá z dvoch častí: kruhová základňa s prevŕtanými dierami na umiestnenie dvoch vzduchovodov a trubice na odstránenie kalu, a vrchný valec, ktorý sa závitom pripevní na základňu a ktorý má vývod umiestnený tak, aby do pórovitej nádoby privádzal známy objem (3 l). Jeden zo vzduchovodov je osadený difúznym kameňom, druhý má otvorený koniec a je umiestnený v pravom uhle ku kameňu v nádobe. Tento systém vytvára potrebné vírenie zabezpečujúce, že obsah v nádobe sa dôkladne premiešava, a takisto zabezpečuje koncentrácie rozpusteného kyslíka vyššie ako 2 mg/l.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Zachováva sa primeraný počet jednotiek pri kontrolovaných teplotách v rozsahu od 5 do 20 °C (± 1 °C) buď vo vodných kúpeľoch, alebo v miestnostiach s konštantnou teplotou. Čerpadlá musia do prevzdušňovacích nádob dávkovať roztok testovanej chemikálie a usadené splaškové vody požadovanými rýchlosťami (0 – 1,0 ml/min a 0 – 25 ml/min) a tretie čerpadlo odstraňuje odpadový kal z prevzdušňovacích nádob. Potrebná veľmi nízka prietoková rýchlosť odpadového kalu sa dosiahne nastavením čerpadla na vyššiu rýchlosť, pričom jeho činnosť sa prerušuje pomocou časového spínača, napr. je činný desať sekúnd každú minútu pri rýchlosti prečerpávania 3 ml/min, čím sa dosiahne rýchlosť odstraňovania 0,5 ml/min.
                              
                           
                        Filtračné zariadenie alebo odstredivka
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Kapitola C10 A, uplatňuje sa odsek 23.
                              
                           
                        Analytické zariadenie
                     
                     
                                 14.
                              
                              
                                 Kapitola C.10 A, uplatňuje sa odsek 24.
                              
                           
                        Voda
                     
                     
                                 15.
                              
                              
                                 Kapitola C.10 A, uplatňujú sa odseky 25 a 26.
                              
                           
                        Organické médium
                     
                     
                                 16.
                              
                              
                                 Kapitola C.10 A, uplatňuje sa odsek 27.
                              
                           
                        Syntetické médiá
                     
                     
                                 17.
                              
                              
                                 Kapitola C.10 A, uplatňuje sa odsek 28.
                              
                           
                        Domáce splaškové vody
                     
                     
                                 18.
                              
                              
                                 Kapitola C.10 A, uplatňuje sa odsek 29.
                              
                           
                        Aktivovaný kal
                     
                     
                                 19.
                              
                              
                                 Kapitola C10 A, uplatňuje sa odsek 30.
                              
                           
                        Zásobné roztoky testovanej chemikálie
                     
                     
                                 20.
                              
                              
                                 Kapitola C.10 A, uplatňujú sa odseky 31 a 32.
                              
                           POSTUP
                     
                        Príprava inokula
                     
                     
                                 21.
                              
                              
                                 Kapitola C.10 A, uplatňuje sa iba odsek 34 – použije sa aktivovaný kal (približne 2,5 g/l).
                              
                           
                        Počet testovacích jednotiek
                     
                     
                                 22.
                              
                              
                                 Pri jednoduchom teste, t. j. na meranie percentuálnej eliminácie, sa vyžaduje iba jeden SRT, ale na získanie údajov potrebných na výpočet predbežných kinetických konštánt je potrebných štyri alebo päť hodnôt SRT. Zvyčajne sa vyberú hodnoty medzi dvoma a desiatimi dňami. Z praktického hľadiska je vhodné vykonať test pri štyroch alebo piatich retenčných časoch kalu (SRT) súčasne pri jednej teplote. V rozšírených štúdiách sa použijú rovnaké hodnoty SRT alebo prípadne iný rozsah hodnôt pri iných teplotách v rozsahu 5 – 20 °C. Na primárnu biodegradáciu (základné použitie) je zvyčajne potrebná iba jedna jednotka pre daný súbor podmienok. Na úplnú biodegradáciu je však potrebná kontrolná jednotka pre každý súbor podmienok, do ktorej sa pridávajú splaškové vody, ale nie testovaná chemikália. Ak sa predpokladá prítomnosť testovanej chemikálie v použitých splaškových vodách, je potrebné pri hodnotení primárnej biodegradácie a aplikovaní potrebných korekcií vo výpočtoch použiť kontrolné jednotky.
                              
                           
                        Dávkovanie organického média a testovanej chemikálie
                     
                     
                                 23.
                              
                              
                                 Kapitola C.10 A, platia odseky 36 – 39, ale treba zohľadniť skutočnosť, že roztok testovanej chemikálie sa dávkuje zvlášť a že sa použijú rôzne rýchlosti odstraňovania kalu. Takisto treba monitorovať a v prípade potreby upraviť, v rozsahu ± 10 %, prietokové rýchlosti prítokov, výtokov a odstraňovania kalu, napr. dvakrát denne. Ak sa v analytických metódach objavia problémy pri používaní domácich splaškových vôd, test je potrebné vykonať s použitím syntetických médií, treba sa však uistiť, že iné médiá prinesú porovnateľné kinetické údaje.
                              
                           
                        Manipulácia s jednotkami s technológiou aktivovaného kalu
                     
                     
                                 24.
                              
                              
                                 Kapitola C.10 A, uplatňujú sa odseky 40 – 43, SRT však treba iba ‚konštantným‘ odstraňovaním kalu.
                              
                           
                        Odber vzoriek a analýza
                     
                     
                                 25.
                              
                              
                                 Kapitola C.10 A, platia odseky 44 – 50, s výnimkou, že je potrebné určiť koncentráciu testovanej chemikálie a nepovinne DOC, COD by sa nemala použiť.
                              
                           ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV
                     
                        Spracovanie výsledkov
                     
                     
                                 26.
                              
                              
                                 Kapitola C.10 A, uplatňujú sa odseky 52 – 54.
                              
                           
                        Vyjadrenie výsledkov testu
                     
                     
                                 27.
                              
                              
                                 Kapitola C.10 A, uplatňujú sa odseky 56 – 62.
                              
                           
                        Výpočet kinetických konštánt
                     
                     
                                 28.
                              
                              
                                 Je reálnejšie uviesť strednú stabilnú koncentráciu testovanej chemikálie vo výtoku a opísať, ako sa mení s prevádzkovými podmienkami čistiarne, ako uviesť percentuálnu primárnu biodegradáciu. To je možné zvážením rovnice (6) v dodatku 6.2, ktorá môže priniesť hodnoty pre KS, μm a θSC, kritický retenčný čas kalu.
                                 [Približné hodnoty KS a μm možno prípadne získať pomocou jednoduchého počítačového programu s cieľom prispôsobiť teoretickú krivku vypočítanú z rovnice 2 (dodatok 6.2) získaným experimentálnym hodnotám. Hoci žiadny konkrétny roztok nebude jedinečný, možno získať primeranú približnú hodnotu KS a μm.]
                              
                           
                        Variabilita výsledkov
                     
                     
                                 29.
                              
                              
                                 Je bežnou praxou, že pre jednotlivé chemikálie sa získavajú premenlivé hodnoty kinetických parametrov. Predpokladá sa, že podmienky, v ktorých kal rástol, ako aj podmienky, ktoré prevažujú v použitom teste (podobne ako v odseku 5 a v iných testoch), majú veľký vplyv na výsledné hodnoty. Jednému aspektu tejto variability sa venoval Grady a kol. (4), ktorý navrhol používanie výrazov ‚existujúci‘ a ‚vnútorný‘ pre dve extrémne podmienky predstavujúce ohraničenie fyziologického stavu, ktorý môže kultúra dosiahnuť počas kinetického pokusu. Ak sa stav nesmie počas testu zmeniť, hodnoty kinetických parametrov odrážajú podmienky v prostredí, z ktorého boli mikroorganizmy odobraté. Tieto hodnoty sa nazývajú ‚existujúce‘ alebo momentálne existujúce. Pri opačnom extréme, ak podmienky v teste dovoľujú úplné vytvorenie systému syntetizujúceho proteíny, ktorý umožňuje maximálnu možnú rýchlosť rastu, sa získané kinetické parametre nazývajú ‚vnútorné‘ a závisia iba od charakteru substrátu a od druhov baktérií v kultúre. Pomôckou je, že existujúce hodnoty sa získajú udržiavaním nízkeho pomeru koncentrácie substrátu k príslušným mikroorganizmom (So/Xo), napr. 0,025, a vnútorné hodnoty sa získajú, keď je pomer vysoký, napr. najmenej 20. V obidvoch prípadoch by hodnota So mala byť rovná alebo vyššia ako príslušná hodnota Ks, konštanta polovičného nasýtenia.
                              
                           
                                 30.
                              
                              
                                 Variabilita a iné aspekty biodegradačnej kinetiky sa preberali na nedávnom seminári SETAC (5). Takéto štúdie, o ktorých sa podali správy a ktoré sú plánované, by mali poskytnúť jasnejší pohľad na kinetiku prebiehajúcu v čistiarňach odpadových vôd, aby sa umožnila lepšia interpretácia existujúcich údajov a takisto aby sa v budúcnosti navrhovali vhodnejšie testovacie metódy.
                              
                           
                        LITERATÚRA:
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Birch, R. R. (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol Deterg.: 33 – 48.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Birch, R. R. (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 340 – 343.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Birch, R. R. (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage treatment. J. Chem. Technická Biotechnol., 50: 411 – 422.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Grady, C. P. L., Smets, B. F., a Barbeau, D. S. (1996). Variability in kinetic parameter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. Wat. Res., 30 (3): 742 – 748.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales S. G., Feitjel T., King H., Fox K., Verstraete W. 4. – 6. sept. 1996. SETAC- Európa, Brusel.
                              
                           
                  
                     Dodatok 6.1
                     
                        Pórovitá nádoba s kontrolou SRT
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatok 6.2
                     
                        Výpočet kinetických konštánt
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Za predpokladu, že sa použije Monodova kinetika, a s prihliadnutím na hmotnostnú rovnováhu aktívnych tuhých látok a substrátu v celom systéme aktivovaného kalu (1), možno získať tieto vyjadrenia stabilného stavu:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [1]
                                          
                                       alebo
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [2]
                                          
                                       kde
                                 
                                             S1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentrácia substrátu vo výtoku, (mg/l),
                                          
                                       
                                             KS
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             konštanta polovičného nasýtenia, koncentrácia, pri ktorej μ = μm/2 (mg/l),
                                          
                                       
                                             μ
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             špecifická miera rastu (d–1),
                                          
                                       
                                             μm
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             maximálna hodnota μm(d–1),
                                          
                                       
                                             Kd
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             špecifická rýchlosť rozpadu aktívnych tuhých látok (d–1),
                                          
                                       
                                             θS
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             stredný retenčný čas kalu, SRT d).
                                          
                                       Preskúmanie tejto rovnice vedie k týmto záverom:
                                 
                                             i)
                                          
                                          
                                             Koncentrácia vo výtoku je nezávislá od koncentrácie v prítoku (S0), a preto sa percentuálna biodegradácia mení spolu s koncentráciou v prítoku, S0.
                                          
                                       
                                             ii)
                                          
                                          
                                             Jediný parameter kontrolovaný v čistiarni, ktorý má vplyv na S1, je retenčný čas kalu, θS.
                                          
                                       
                                             iii)
                                          
                                          
                                             Pre danú koncentráciu v prítoku, S0, bude kritický retenčný čas kalu, takže:
                                             
                                                         
                                                            
                                                      
                                                      
                                                         [3]
                                                      
                                                   kde
                                             θSC= kritický retenčný čas kalu, pod hranicou ktorého budú príslušné mikroorganizmy vymyté z čistiarne.
                                          
                                       
                                             iv)
                                          
                                          
                                             Keďže ostatné parametre v rovnici (2) sú spojené s kinetikou rastu, teplota pravdepodobne ovplyvní úroveň substrátu vo výtoku a kritický vek kalu, t. j. retenčný čas kalu potrebný na dosiahnutie určitého stupňa čistenia sa s klesajúcou teplotou zvýši.
                                          
                                       
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Podľa hmotnostnej bilancie tuhých látok v systéme pórovitej nádoby a za predpokladu, že koncentrácia tuhých látok vo výtoku čistiarne X2 je v porovnaní s koncentráciou v prevzdušňovacej nádobe X1 nízka, retenčný čas kalu
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [4]
                                          
                                       a
                                 
                                    
                                 kde
                                 
                                             V
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             objem prevzdušňovacej nádoby (l),
                                          
                                       
                                             X1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentrácia tuhých látok v prevzdušňovacej nádobe (mg/l),
                                          
                                       
                                             X2
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentrácia tuhých látok vo výtoku (mg/l),
                                          
                                       
                                             Q0
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             prietoková rýchlosť prítoku (l/d),
                                          
                                       
                                             Q1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             prietoková rýchlosť odpadového kalu (l/d).
                                          
                                       Retenčný čas kalu teda možno kontrolovať pri akejkoľvek vopred zvolenej hodnote prostredníctvom kontroly prietokovej rýchlosti odpadového kalu, Q1.
                                 Závery
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Hlavným účelom testu je teda umožniť predvídanie koncentrácie vo výtoku, a teda aj úrovne testovanej chemikálie vo vode, do ktorej sa chemikália pridáva.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Zakreslením S1 oproti θS možno niekedy okamžite vyhodnotiť kritický retenčný čas kalu, θSC, napr. krivka 3 na obrázku 1. Ak to nie je možné, θSC spolu s približnými hodnotami μm a KS možno vypočítať zakreslením S1 oproti S1•θS.
                                 Podľa úpravy rovnice (1):
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [5]
                                          
                                       Ak je Kd nízke, potom 1 + θs • Kd ~ 1 a z rovnice [5] dostaneme:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [6]
                                          
                                       Nákres by teda mala byť rovná priamka (pozri obrázok 2) so sklonom 1/μm a priesečníkom KS/μm; takisto θS ~1/μm.
                                 
                                    Obrázok 1
                                 
                                 
                                    Tri teploty, päť retenčných časov kalu SRT
                                 
                                 
                                    
                                 
                                    Obrázok 2
                                 
                                 
                                    Regresná krivka SRT · S1 oproti S1, keď T = 5 °C
                                 
                                 
                                    
                                 
                                    Glosár:
                                 
                                 Koncentrácia vo výtoku:
                                 Krivka:
                              
                           
                  
                     Dodatok 7
                     TEST PRI NÍZKOM (μg/l) ROZSAHU KONCENTRÁCIE
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Mnohé chemikálie sú vo vodnom prostredí, dokonca v odpadových vodách, bežne prítomné pri veľmi nízkych koncentráciách (μg/l). Pri takýchto koncentráciách pravdepodobne neslúžia ako primárny substrát pre rast, ale oveľa pravdepodobnejšie degradujú ako nerastové, sekundárne substráty prítomné súčasne s množstvom prirodzene sa vyskytujúcich uhlíkových chemikálií. Degradácie týchto chemikálií preto nezodpovedajú modelu opísanému v dodatku 6. Existuje veľa modelov, ktoré by sa mohli použiť, a v podmienkach prevažujúcich v čistiarňach odpadových vôd by mohli prebiehať viaceré súčasne. Na objasnenie tohto problému bude potrebný ďalší rozsiahlejší výskum.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Dovtedy sa možno riadiť postupom uvedeným v základnom texte (kapitola C.10 A), ale len pre primárnu biodegradovateľnosť s použitím primerane nízkych koncentrácií (< 100 μg/l) a validovaného analytického postupu. Percentuálnu biodegradáciu možno vypočítať (pozri odsek 54 testovacej metódy), ak sa zohľadnia abiotické procesy (adsorpcia, prchavosť atď.). Príkladom je štúdia, ktorú vypracoval Nyholm a jeho spolupracovníci (1) (2), využívajúca štvorhodinový cyklus v systéme plnenia a odčerpávania. Do správy uviedli pseudokonštanty prvého rádu pre päť chemikálií pridaných do syntetických médií v koncentrácii 5 – 100 μg/l. (Pre úplnú biodegradovateľnosť sa môžu použiť testované chemikálie označené 14C. Tento opis presahuje rámec tejto testovacej metódy, lebo zatiaľ neexistuje zhoda o postupoch, hoci navrhovaná metóda pre ISO 14592 (3) obsahuje usmernenie k použitiu chemikálií označených 14C.).
                              
                           
                        SCAS test
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Neskôr bol navrhnutý jednoduchší dvojfázový test (4) (5) (6), po metóde polosúvislého aktivovaného kalu (SCAS) nasledujú krátkodobé kinetické testy na vzorkách odobratých z jednotiek SCAS. SCAS systém funguje so známymi rýchlosťami odstraňovania kalu (na rozdiel od pôvodnej testovacej metódy C.12) a napúšťa sa modifikovanými syntetickými médiami OECD alebo domácimi splaškovými vodami. Syntetické médiá boli modifikované (z dôvodu meniacej sa hodnoty pH a slabej usadzovacej schopnosti kalu) pridaním fosfátu ako tlmivého roztoku, kvasnicového extraktu, chloridu železitého a stopových prvkov solí a ich COD sa zvýšila približne na 750 mg/l zvýšením koncentrácie peptónu a mäsového extraktu. Jednotky boli prevádzkované v 24-hodinovom cykle: prevzdušňovanie počas 23 h, odstraňovanie kalu, usadzovanie, odoberanie supernatantu (výtok), po ktorom nasledovalo pridanie syntetických médií a testovanej chemikálie až na úroveň 100 μg/l, (t. j. pri približne rovnakej koncentrácii ako v krátkodobom teste). Raz týždenne sa vymenilo 10 % celkového kalu za čerstvý kal, aby sa zachovala vyvážená populácia mikróbov.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Koncentrácie testovanej chemikálie sa merajú na začiatku a na konci prevdzušňovania a test pokračuje, až kým sa nedosiahne konštantná eliminácia testovanej chemikálie, čo trvá od jedného týždňa až niekoľko mesiacov.
                              
                           
                        Krátkodobý test
                     
                     
                                 5.
                              
                              
                                 Krátkodobý test (napr. osem hodín) sa používa na určenie (pseudo)konštanty kinetickej rýchlosti prvého rádu pre rozklad testovanej chemikálie v aktivovanom kale známeho ale rozdielneho pôvodu a histórie. Konkrétne, vzorky kalu sa odoberajú zo SCAS reaktorov – na konci prevzdušňovacieho obdobia, keď je koncentrácia organického substrátu nízka – v priebehu testu aklimatizácie (odseky 3, 4). Kal sa môže na porovnanie odobrať aj zo súbežnej SCAS jednotky, ktorá nebola exponovaná testovanej chemikálii. Zmesi kalu a testovanej chemikálie pridané v dvoch alebo viacerých koncentráciách v rozsahu 1 – 50 μg/l sa prevzdušňujú bez pridávania syntetických médií alebo iného organického substrátu. Testovaná chemikália, ktorá ostala v roztoku, sa určuje v pravidelných intervaloch, napr. každú hodinu, v závislosti od degradovateľnosti chemikálie v období nepresahujúcom 24 h Vzorky sa pred príslušnou analýzou odstredia.
                              
                           
                        Výpočty
                     
                     
                                 6.
                              
                              
                                 Údaje zo SCAS jednotiek sa použijú na výpočet percentuálnej eliminácie testovanej chemikálie (odsek 54). Takisto konštantu priemernej rýchlosti K1, (štandardizovanú pre koncentráciu suspendovaných tuhých látok) možno vypočítať podľa vzorca:
                                 
                                    
                                 kde
                                 
                                             t
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             čas prevzdušňovania (23 h),
                                          
                                       
                                             Ce
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentrácia na konci prevzdušňovacieho obdobia (μg/l),
                                          
                                       
                                             Ci
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentrácia na začiatku prevzdušňovania (μg/l),
                                          
                                       
                                             SS
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentrácia tuhých látok v aktivovanom kale (g/l).
                                          
                                       
                           
                                 7.
                              
                              
                                 V krátkodobom teste sa zakreslí log % zostávajúcej koncentrácie v závislosti od času, pričom sklon počiatočnej časti (10 – 50 % degradácia) grafu je ekvivalentný s K1, (pseudo)konštantou prvého rádu. Konštanta sa štandardizuje vzhľadom na koncentráciu tuhých látok v kale prostredníctvom rozdelenia sklonu koncentráciou tuhých látok v kale. Výsledok uvedený v správe musí zahŕňať aj údaje o počiatočných koncentráciách testovanej chemikálie a suspendovaných tuhých látok, retenčnom čase kalu, aplikácii a zdroji kalu, ako aj údaje o predchádzajúcej expozícii (ak k nej došlo) testovanej chemikálii.
                              
                           
                        Variabilita výsledkov
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Variabilita a iné aspekty biodegradačnej kinetiky sa preberali na nedávnom seminári SETAC (7). Takéto štúdie, o ktorých sa podali správy a ktoré sú plánované, by mali poskytnúť jasnejší pohľad na kinetiku prebiehajúcu v čistiarňach odpadových vôd, aby sa umožnila lepšia interpretácia existujúcich údajov a takisto aby sa v budúcnosti navrhovali vhodnejšie testovacie metódy.
                              
                           
                        LITERATÚRA
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Nyholm, N., Jacobsen, B. N., Pedersen, B. M., Poulsen, O., Dambourg, A., a Schultz, B. (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339 – 353.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Jacobsen, B. N., Nyholm, N., Pedersen, B. M., Poulsen, O., a Ostfeldt, P. (1993). Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505 – 1510.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Kvalita vody – hodnotenie aeróbnej biodegradovateľnosti organických zlúčenín pri nízkych koncentráciách vo vode.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Nyholm, N., Ingerslev, F., Berg, U. T., Pedersen, J. P., a Frimer-Larsen, H. (1996). Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851 – 864.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Berg, U. T., a Nyholm, N. (1996). Biodegradability simulation Studies in semi-continuous activated sludge reactors with low (μg/l range) and standard (ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711 – 735.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegradability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Ministerstvo životného prostredia a energetiky, Kodaň.
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, S. G. Feitjel, T. King, H. Fox, K. a Verstraete, W. 4. – 6. sept. 1996. SETAC- Európa, Brusel.
                              
                           
                  
                     C.10-B:   Biofilmy
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Simulačné testy sa zvyčajne používajú pri chemikáliách, ktoré nevyhoveli skríningovému testu ľahkej biodegradovateľnosti [kapitola C.5 A – F tejto prílohy (9)], ale úspešne prešli testom inherentnej biodegradovateľnosti. Výnimočne sa simulačné testy používajú aj v prípade akejkoľvek chemikálie, o ktorej je potrebné získať viac informácií, najmä v prípade veľkotonážnych chemikálií, pričom zvyčajne sa použije test s aktivovaným kalom (C.10 A). Za určitých okolností sú však potrebné špecifické informácie, ktoré vypovedajú o vzťahu medzí správaním chemikálie a metódami čistenia odpadových vôd zahŕňajúcimi biofilmy, konkrétne perkolačné alebo prekvapkávajúce filtre, rotačné biologické reaktory, fluidné lôžka. S cieľom vyhovieť tejto potrebe boli vytvorené rôzne zariadenia.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Gerike a kolektív (1) použili veľké pilotné prekvapkávajúce filtre, ktoré použili v spojení. Tieto filtre zaberali veľa priestoru a vyžadovali si pomerne veľké množstvá splaškových vôd alebo syntetických médií. Truesdale a kolektív (2) opísali menšie filtre (priemer 183 cm × 152 mm), do ktorých sa napúšťali prírodné splaškové vody bez povrchovo aktívnych činidiel, ale stále boli potrebné pomerne veľké množstvá. Na vytvorenie ‚zrelého‘ biofilmu bolo potrebných až 14 týždňov, a kým došlo k aklimatizácii po prvom zavedení testovaného povrchovo aktívneho činidla, bolo potrebných ďalších štyri až osem týždňov.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Baumann a kolektív (3) vytvorili oveľa menší filter, ktorý ako inertné médium na podporu biofilmu využíval polyesterovú ‚vlnu‘, ktorá sa predtým namočila do aktivovaného kalu. Testovaná chemikália sa použila ako jediný zdroj uhlíka a biodegradovateľnosť sa hodnotila z meraní rozpusteného organického uhlíka (DOC) v prítoku a výtoku a z množstva CO2 vo vychádzajúcom plyne.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Celkom odlišný prístup zaujali Gloyna a kolektív (4), ktorí vynašli rotačný tubulárny reaktor. Na vnútornom povrchu rotačnej trubice sa na známej povrchovej ploche vytvoril biofilm privádzaním prítoku na horný koniec trubice naklonenej k horizontálnej úrovni pod malým uhlom. Reaktor sa použil na pozorovanie biodegradovateľnosti povrchovo aktívnych činidiel (5), ako aj na skúmanie optimálnej hrúbky biofilmu a difúzie cez film (6). Títo autori reaktor ďalej vyvíjali a upravovali, aby bol schopný určiť CO2 vo vychádzajúcom plyne.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Rotačný tubulárny reaktor prijal Stály výbor analytikov (Spojené kráľovstvo) ako štandardnú metódu na hodnotenie biodegradovateľnosti chemikálií (7) a odbúrateľnosti a toxicity odpadových vôd (8). Výhodami opísanej metódy sú jednoduchosť, kompaktnosť, reprodukovateľnosť a potreba pomerne malých množstiev organického média.
                           
                        PRINCÍP TESTU
                  
                              6.
                           
                           
                              Na vnútorný povrch pomaly rotujúcej naklonenej trubice sa aplikujú syntetické médiá alebo domáce splaškové vody a testovaná chemikália v prímesi alebo samostatne. Na vnútornom povrchu sa vytvorí vrstva mikroorganizmov podobných tým, ktoré sú prítomné na médiách s biofiltrami. Podmienky činnosti reaktora sa zvolia tak, aby sa zabezpečila primeraná eliminácia organickej hmoty a, ak sa to požaduje, oxidácia amónia.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Výtok z trubice sa odoberie a pred analýzou na zistenie rozpusteného organického uhlíka (DOC) a/alebo testovanej chemikálie pomocou špecifickej metódy sa buď usadí a/alebo prefiltruje. Na účely porovnávania súbežne a za tých istých podmienok fungujú kontrolné jednotky, do ktorých sa nepridáva testovaná chemikália. Predpokladá sa, že rozdiel medzi koncentráciami DOC vo výtoku z testovacích a kontrolných jednotiek vzniká v dôsledku testovanej chemikálie a jej organických metabolitov. Tento rozdiel sa porovná s koncentráciou pridanej testovanej chemikálie (ako DOC) s cieľom vypočítať elimináciu testovanej chemikálie.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Biodegradáciu možno od bioadsorpcie bežne odlíšiť na základe dôkladného preskúmania krivky eliminácie v závislosti od času. Potvrdiť ju zvyčajne možno pomocou testu ľahkej biodegradovateľnosti (absorpcia kyslíka alebo tvorba oxidu uhličitého) s použitím aklimatizovaného inokula odobratého na konci testu z reaktorov, do ktorých sa pridáva testovaná chemikália.
                           
                        INFORMÁCIE O TESTOVANEJ CHEMIKÁLII
                  
                              9.
                           
                           
                              Je potrebné poznať čistotu, rozpustnosť vo vode, prchavosť a adsorpčné vlastnosti testovanej chemikálie, aby bolo možné správne interpretovať výsledky.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Prchavé a slabo rozpustné chemikálie sa zvyčajne nemôžu testovať, pokiaľ sa neprijmú zvláštne opatrenia (pozri dodatok 5 ku kapitole C.10 A). Je nutné poznať aj chemickú štruktúru alebo aspoň empirický vzorec, aby bolo možné vypočítať teoretické hodnoty a/alebo skontrolovať namerané hodnoty parametrov, napr. teoretickú spotrebu kyslíka (ThOD).
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Informácie týkajúce sa toxicity testovanej chemikálie pre mikroorganizmy (pozri dodatok 4 ku kapitole C.10 A) môžu byť užitočné pri výbere vhodných testovaných koncentrácií a môžu byť nevyhnutné na správnu interpretáciu nízkych hodnôt biodegradácie.
                           
                        ÚROVNE ÚSPEŠNOSTI
                  
                              12.
                           
                           
                              Pôvodne sa požadovalo, aby primárna biodegradácia povrchovo aktívnych činidiel dosahovala úroveň 80 % alebo viac, skôr než bolo možné uviesť chemikáliu na trh. Ak sa nedosiahne hodnota 80 %, môže sa použiť tento simulačný (potvrdzujúci) test a povrchovo aktívne činidlo možno uviesť na trh, iba ak sa odstráni viac ako 90 % špecifickej chemikálie. Pri chemikáliách vo všeobecnosti nevzniká otázka úspešnej/neúspešnej úrovne a hodnota percentuálnej eliminácie sa môže použiť v približných výpočtoch pravdepodobnej koncentrácie v životnom prostredí, ktoré sa použijú v hodnotení rizika predstavovaného chemikáliami. V mnohých štúdiách čistých chemikálií sa zistilo, že percentuálna eliminácia DOC je > 90 % v prípade viac ako troch štvrtín chemikálií a > 80 % pri vyše 90 % chemikálií, ktoré vykazovali významný stupeň biodegradovateľnosti.
                           
                        REFERENČNÉ CHEMIKÁLIE
                  
                              13.
                           
                           
                              S cieľom zabezpečiť správne vykonanie experimentálneho postupu je užitočné príležitostne testovať aj referenčné chemikálie, ktorých správanie je známe. Medzi také chemikálie patrí kyselina adipová, 2-fenylfenol, 1-naftol, kyselina 2,2-bifenyldikarboxylová a kyselina 1-naftoová.
                           
                        REPRODUKOVATEĽNOSŤ VÝSLEDKOV TESTU
                  
                              14.
                           
                           
                              Laboratórium v Spojenom kráľovstve zistilo, že relatívna smerodajná odchýlka v rámci testov je 3,5 % a medzi testmi 5 % (7).
                           
                        OPIS METÓDY
                  
                     Zariadenie
                  
                  
                     Rotujúce tubulárne reaktory
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Zariadenie (pozri obrázky 1 a 2 v dodatku 8) pozostáva z banky z akrylových trubíc, z ktorých každá má dĺžku 30,5 cm a jej vnútorný priemer je 5 cm, podopretej kolesami s gumovým lemovaním upevnenými v kovovom podpernom ráme. Každá trubica má vonkajší okraj, s hĺbkou približne 0,5 cm, ktorým je zaistená na kolesách, vnútorný povrch je zdrsnený hrubou drôtenkou a na hornom (prívodnom) konci sa nachádza vnútorný okraj na zadržiavanie tekutiny s hĺbkou 0,5 cm. Trubice sú naklonené v uhle približne jeden stupeň k horizontálnej úrovni, aby sa zabezpečil požadovaný kontaktný čas, keď sa testovacie médium aplikuje do čistej trubice. Kolesá s gumovými pneumatikami sa otáčajú pôsobením pomalého motora s variabilnou rýchlosťou. Teplota trubíc sa kontroluje tak, že trubice sa uložia do miestnosti s konštantnou teplotou.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Vďaka tomu, že každý tubulárny reaktor sa vloží do mierne väčšej trubice s uzáverom a že sa zabezpečia plynotesné prepojenia, možno na účely ďalšieho merania odobrať vychádzajúci plyn CO2 v alkalickom roztoku (6).
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              24-hodinový prívod organického média podľa možnosti s pridanou testovanou chemikáliou do každej trubice sa nachádza v 20-litrovej zásobnej nádobe (A) (pozri obrázok 2). Ak sa to požaduje, roztok testovanej chemikálie sa môže dávkovať samostatne. V blízkosti dna každej zásobnej nádoby sa nachádza vývod, ktorý je vhodnou trubicou, napr. zo silikónového kaučuku, prostredníctvom peristaltického čerpadla (B) pripojený ku sklenej alebo akrylovej prívodnej trubici, ktorá vstupuje v rozsahu 2 – 4 cm do vyššieho (prívodného) konca naklonenej trubice (C). Výtok sa nechá odkvapkávať z nižšieho konca naklonenej trubice, aby sa zozbieral v inej zásobnej nádobe (D). Pred analýzou sa výtok usadí alebo prefiltruje.
                           
                        
                     Filtračné zariadenie – odstredivka
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Prístroj na filtráciu vzoriek s membránovými filtrami vhodnej pórovitosti (nominálny priemer otvoru 0,45 μm), ktoré adsorbujú organické chemikálie a uvoľňujú organický uhlík v minimálnej miere. Ak sa použijú filtre, ktoré uvoľňujú organický uhlík, je potrebné dôkladne ich umyť horúcou vodou, aby sa odstránil vylúhovateľný organický uhlík. Prípadne sa môže použiť odstredivka schopná dosiahnuť 40 000 m/s2.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Analytické vybavenie na stanovenie týchto parametrov:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          DOC/celkový organický uhlík (TOC) alebo chemická spotreba kyslíka (COD),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          špecifická chemikália (HPLC, GC atď.), ak sa požaduje,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pH, teplota, kyslosť, zásaditosť,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          amónium, dusitan, dusičnan, ak sa testy vykonávajú v nitrifikačných podmienkach.
                                       
                                    
                        
                     Voda
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Voda z vodovodu s obsahom DOC nižším ako 3 mg/l.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Destilovaná alebo deionizovaná voda s obsahom DOC nižším ako 2 mg/l.
                           
                        
                     Organické médium
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Ako organické médium možno použiť syntetické médiá, domáce splaškové vody alebo zmes obidvoch. Ukázalo sa, že pri použití samotných domácich splaškových vôd často dochádza k zvýšenej percentuálnej eliminácii DOC (v jednotkách s technológiou aktivovaného kalu) a dokonca je možná biodegradácia niektorých chemikálií, ktoré nepodliehajú biodegradácii pri použití syntetických médií OECD. Preto sa odporúča používať domáce splaškové vody. Meria sa koncentrácia DOC alebo COD v každej novej dávke organického média. Je potrebné poznať kyslosť alebo zásaditosť organického média. Médium môže vyžadovať pridanie vhodného tlmivého roztoku (hydrogénuhličitan sodný alebo hydrogénfosforečnan draselný), ak má nízku kyslosť alebo zásaditosť, aby počas testu v reaktore ostalo zachované pH s hodnotou približne 7,5 ± 0,5. O množstve a čase pridania tlmivého roztoku sa rozhoduje individuálne pre každý prípad.
                           
                        
                     Syntetické médiá
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              V každom jednom litri vody z vodovodu sa rozpustí: 160 mg peptónu, 110 mg mäsového extraktu, 30 mg močoviny, 28 mg bezvodého hydrogénfosforečnanu draselného (K2HPO4), 7 mg chloridu sodného (NaCl), 4 mg dihydrátu chloridu vápenatého (CaCl2.2H2O), 2 mg heptahydrátu síranu horečnatého (MgSO4.7H2O). Toto syntetické médium OECD je uvedené ako príklad a zabezpečuje strednú koncentráciu DOC v prítoku v hodnote približne 100 mg/l. Môžu sa prípadne použiť iné zloženia s približne rovnakou koncentráciou DOC, ktoré sa viac približujú skutočným splaškovým vodám. Tieto syntetické médiá sa môžu pripraviť v destilovanej vode v koncentrovanej forme a až do jedného týždňa skladovať pri teplote približne 1 °C. V prípade potreby sa zriedia vodou z vodovodu. (Toto médium nie je vyhovujúce, napr. koncentrácia dusíka je veľmi vysoká, pomerne nízky obsah uhlíka, ale nebolo navrhnuté nič lepšie okrem pridania ďalšieho fosfátu ako tlmivého roztoku a ďalšieho peptónu).
                           
                        
                     Domáce splaškové vody
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Použijú sa čerstvo usadené splaškové vody zbierané denne z čistiarní odpadových vôd, do ktorých sa dodávajú prevažne domáce splaškové vody. Mali by sa odobrať z prietokového kanála nádrže primárnej sedimentácie alebo z prívodu do čistiarne s technológiou aktivovaného kalu a mali by byť vo veľkej miere zbavené hrubých častíc. Splaškové vody sa môžu použiť po niekoľkodňovom uskladnení pri teplote približne 4 °C, ak sa preukáže, že DOC (alebo COD) sa počas uskladnenia výrazne nezníži (t. j. o menej ako 20 %). Na obmedzenie porúch systému je potrebné pred použitím upraviť DOC (alebo COD) každej novej dávky na vhodnú stálu hodnotu, napr. zriedením vodou z vodovodu.
                           
                        
                     Mazivo
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Na mazanie valcov peristaltického čerpadla možno použiť glycerol alebo olivový olej: na trubice zo silikónového kaučuku sú vhodné obe mazivá.
                           
                        
                     Zásobné roztoky testovanej chemikálie
                  
                  
                              26.
                           
                           
                              V prípade chemikálií s dostatočnou rozpustnosťou sa pripravia zásobné roztoky s vhodnými koncentráciami (napr. 1 – 5 g/l) v deionizovanej vode alebo v minerálnej časti syntetických médií. Pre nerozpustné chemikálie pozri dodatok 5 v kapitole C.10-A. Táto metóda nie je vhodná pre prchavé chemikálie bez úprav tubulárnych reaktorov (odsek 16). Určí sa DOC a TOC zásobného roztoku a merania sa opakujú pri každej novej dávke. Ak je rozdiel medzi DOC a TOC väčší ako 20 %, je potrebné skontrolovať rozpustnosť testovanej chemikálie vo vode. Porovná sa DOC alebo koncentrácia testovanej chemikálie nameraná špecifickou analýzou zásobného roztoku a nominálna hodnota, aby sa zistilo, či je výťažnosť dostatočná (zvyčajne možno očakávať > 90 %). Je potrebné sa uistiť, najmä pri disperziách, či sa DOC môže alebo nemôže použiť ako analytický parameter alebo či sa môže použiť iba analytická metóda špecifická pre testovanú chemikáliu. Pri disperziách sa vyžaduje odstredenie vzoriek. Pri každej novej dávke sa odmeria DOC, COD alebo testovaná chemikália pomocou špecifickej analýzy.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Určí sa pH zásobného roztoku. Z krajných hodnôt vyplýva, že pridanie chemikálie môže vplývať na pH aktivovaného kalu v testovacom systéme. V takom prípade je potrebné neutralizovať zásobný roztok na získanie pH 7 ± 0,5 pomocou malých množstiev anorganickej kyseliny alebo zásady, ale treba zabrániť zrážaniu testovanej chemikálie.
                           
                        POSTUP
                  
                     Príprava organického média na dávkovanie
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Zabezpečí sa, aby boli všetky prítokové a výtokové nádoby a potrubia z prítokových nádob a do výtokových nádob dôkladne očistené, aby sa eliminovalo množenie mikróbov na začiatku a počas trvania testu.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Každý deň sa vhodným zriedením vodou z vodovodu čerstvo pripraví syntetické médium (odsek 23) buď z tuhých látok, alebo z koncentrovaného zásobného roztoku. Vo valci sa odmeria požadované množstvo, ktoré sa pridá do čistej prítokovej nádoby. V prípade potreby sa pred zriedením takisto pridá požadované množstvo zásobného roztoku testovanej chemikálie alebo referenčnej chemikálie do syntetického média. Ak je to vhodnejšie alebo potrebné na zabránenie straty testovanej chemikálie, pripraví sa zvlášť zriedený roztok testovanej chemikálie v samostatnej nádrži a pridá sa do naklonených trubíc prostredníctvom iného dávkovacieho čerpadla.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Prípadne (a podľa možnosti) sa použijú usadené domáce splaškové vody (odsek 24) čerstvo odobraté každý deň.
                           
                        
                     Činnosť rotujúcich tubulárnych reaktorov
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Na hodnotenie jednej testovanej chemikálie sú potrebné dva identické tubulárne reaktory, ktoré sa umiestnia do miestnosti s konštantnou teplotou, zvyčajne 22 ± 2 °C.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Peristaltické čerpadlá sa nastavia tak, aby privádzali 250 ± 25 ml/h organického média (bez testovanej chemikálie) do naklonených trubíc, ktoré rotujú rýchlosťou 18 ± 2 rpm. Na trubice čerpadla sa na začiatku a pravidelne v priebehu testu aplikuje mazivo (odsek 25), aby sa zabezpečilo správne fungovanie a predĺžila sa životnosť trubíc.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Uhol sklonu trubíc sa prispôsobí horizontálnej úrovni, aby sa dosiahol čas zotrvania prívodu v čistej trubici 125 ± 12,5 sekúnd. Pridaním nebiologického markera (napr. NaCl, inertné farbivo) do prívodu sa odhadne retenčný čas: čas potrebný na dosiahnutie najvyššej koncentrácie vo výtoku sa použije ako stredný retenčný čas (keď je prítomný maximálny film, retenčný čas možno zvýšiť až na približne 30 min.).
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Tieto miery, rýchlosti a časy sa určili s cieľom zabezpečiť primeranú elimináciu (> 80 %) DOC (alebo COD) a vytvoriť nitrifikované výtoky. Prietoková rýchlosť by sa mala zmeniť, ak je eliminácia nedostatočná alebo ak sa simuluje výkon konkrétnej čistiarne. V druhom prípade je potrebné prispôsobiť mieru dávkovania organického média, kým výkon reaktora nedosiahne výkon čistiarne.
                           
                        
                     Inokulácia
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Vzduchová inokulácia môže byť na začatie množenia mikroorganizmov dostatočná, ak sa použijú syntetické médiá, v iných prípadoch je však potrebné do prívodu pridávať 1 ml/l usadeného média počas troch dní.
                           
                        
                     Merania
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              V pravidelných intervaloch sa skontroluje, či sú miery dávok a rýchlosti rotácie v rozsahu požadovaných limitov. Takisto sa odmeria pH výtoku, najmä v prípade, že sa očakáva nitrifikácia.
                           
                        
                     Odber vzoriek a analýza
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Metóda, spôsob a frekvencia odberu vzoriek sa zvolia tak, aby vyhovovali účelu testu. Napríklad sa zachytia vzorky prítoku a výtoku alebo sa zozbierajú vzorky v priebehu dlhšieho obdobia, napr. 3 – 6 h. V prvej fáze, bez testovanej chemikálie, sa vzorky odoberajú dvakrát týždenne. Vzorky sa filtrujú cez membrány alebo odstredivkou pri približne 40 000 m/s2 počas približne 15 minút (odsek 18). Môže byť potrebné, aby sa vzorky pred membránovou filtráciou usadili a/alebo hrubo prefiltrovali. Určí sa DOC (alebo COD) aspoň v dvoch vyhodnoteniach a v prípade potreby BOD, amónium a dusitan/dusičnan.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Všetky analýzy by sa mali vykonať čo najskôr po odbere a príprave vzoriek. Ak sa analýzy musia odložiť, vzorky sa uskladnia v tme pri teplote približne 4 °C v plných, pevne uzavretých fľašiach. Ak musia byť vzorky uskladnené viac ako 48 hodín, zakonzervujú sa hlbokým zmrazením, acidifikáciou alebo pridaním vhodnej toxickej chemikálie (napr. 20 ml/l z 10 g/l roztoku chloridu ortutnatého). Je potrebné zabezpečiť, aby metóda konzervácie neovplyvnila výsledky analýzy.
                           
                        
                     Obdobie zábehu
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              V tomto období povrchový biofilm rastie, až kým nedosiahne optimálnu hrúbku, čo zvyčajne trvá približne dva týždne, ale nemalo by to trvať dlhšie ako šesť týždňov. Eliminácia (odsek 44) DOC (alebo COD) sa zvyšuje a dosiahne rovnovážnu úroveň. Keď sa dosiahne rovnováha pri podobnej hodnote v oboch trubiciach, vyberie sa jedna, ktorá bude slúžiť ako kontrolná počas zvyšku testu, v priebehu ktorého by ich výkon mal zostať konzistentný.
                           
                        
                     Zavedenie testovanej chemikálie
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              V tejto fáze sa do druhého reaktora pridá testovaná chemikália v požadovanej koncentrácii, zvyčajne 10 – 20 mg C/l. Kontrola pokračuje s cieľom získať samostatné organické médium.
                           
                        
                     Obdobie aklimatizácie
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Dvakrát týždenne sa pokračuje v analýzach na zistenie DOC (alebo COD) a, ak sa hodnotí primárna biodegradovateľnosť, odmeria sa aj koncentrácia testovanej chemikálie prostredníctvom špecifickej analýzy. Po prvom zavedení testovanej chemikálie sa počká jeden až šesť týždňov (alebo v špeciálnych podmienkach dlhšie), aby sa umožnila aklimatizácia. Ak percentuálna eliminácia (odseky 43 – 45) dosiahne maximálnu hodnotu, získa sa 12 – 15 platných hodnôt v rovnovážnej fáze za obdobie približne troch týždňov na účely hodnotenia strednej percentuálnej eliminácie. Test sa považuje za ukončený, ak sa dosiahne dostatočne vysoký stupeň eliminácie. Po prvom pridaní testovanej chemikálie by test zvyčajne nemal trvať dlhšie ako 12 týždňov.
                           
                        
                     Odlupovanie filmu
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              K náhlemu odstráneniu veľkých množstiev nadbytočného filmu z trubíc alebo k odlupovaniu dochádza v pomerne pravidelných intervaloch. S cieľom zabezpečiť, že to nebude mať vplyv na porovnateľnosť výsledkov, musia testy zahŕňať aspoň dva úplné cykly rastu a odlupovania.
                           
                        ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV
                  
                     Spracovanie výsledkov
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Vypočíta sa percentuálna eliminácia DOC alebo COD testovanej chemikálie pre každé časované hodnotenie pomocou rovnice:
                              
                                 
                              kde
                              
                                          Dt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          percentuálna eliminácia DOC (alebo COD) v čase t,
                                       
                                    
                                          Cs
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          koncentrácia DOC (alebo COD) v prítoku v dôsledku testovanej chemikálie, podľa možnosti odhadnutá z koncentrácie v zásobnom roztoku a pridaného objemu zásobného roztoku (mg/l),
                                       
                                    
                                          E
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          nameraná hodnota DOC (alebo COD) v testovacom výtoku v čase t (mg/l),
                                       
                                    
                                          Eo
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          nameraná hodnota DOC (alebo COD) v kontrolnom výtoku v čase t (mg/l).
                                       
                                    Výpočet sa zopakuje pri referenčnej chemikálii, pokiaľ sa testuje.
                           
                        
                     Činnosť kontrolného reaktora
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Stupeň eliminácie DOC (alebo COD) (DB) organického média v kontrolných reaktoroch je informácia užitočná pri hodnotení biodegradačnej činnosti biofilmu počas testu. Vypočíta sa percentuálna eliminácia z rovnice:
                              
                                 
                              kde
                              Cm= DOC (alebo COD) organického média v kontrolnom prítoku (mg/l).
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Vypočíta sa eliminácia (DST) testovanej chemikálie, ak je meraná špecifickou analytickou metódou, pri každom časovom hodnotení z rovnice:
                              
                                 
                              kde
                              
                                          Si
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          nameraná alebo podľa možnosti odhadnutá koncentrácia testovanej chemikálie v testovacom prítoku (mg/l),
                                       
                                    
                                          Se
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          nameraná koncentrácia testovanej chemikálie v testovacom výtoku v čase t (mg/l).
                                       
                                    Ak sa analytickou metódou získaná pozitívna hodnota v neupravených splaškových vodách rovná Sc mg/l, percentuálna eliminácia (DSC) sa vypočíta podľa vzorca:
                              
                                 
                           
                        
                     Vyjadrenie výsledkov testu
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Zakreslí sa percentuálna eliminácia Dt a DST (alebo DSC), ak je k dispozícii, v závislosti od času (pozri dodatok 2 v kapitole C.10-A). Zoberie sa stredná (vyjadrená ako najbližšie celé číslo) a smerodajná odchýlka 12 – 15 hodnôt pre DT (a pre DST, ak je k dispozícii) získaná v rovnovážnej fáze ako percentuálna eliminácia testovanej chemikálie. Z tvaru krivky eliminácie možno vyvodiť niekoľko záverov o procesoch odstraňovania.
                           
                        
                     Adsorpcia
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Ak sa na začiatku testu pozoruje vysoká eliminácia DOC testovanej chemikálie, testovaná chemikália je pravdepodobne eliminovaná adsorpciou na biofilme. To možno dokázať určením adsorbovanej testovanej chemikálie na tuhých látkach odlúpnutých z filmu. Eliminácia DOC adsorbovateľných chemikálií zvyčajne neostáva vysoká počas celého testu. Bežne sa na začiatku vyskytne vysoký stupeň eliminácie, ktorý postupne klesá na rovnovážnu hodnotu. Ak by však adsorbovaná testovaná chemikália bola schopná spôsobiť aklimatizáciu populácie mikróbov, eliminácia DOC testovanej chemikálie by následne stúpla a dosiahla by hornú rovnovážnu úroveň.
                           
                        
                     Lag fáza
                  
                  
                              48.
                           
                           
                              Podobne ako pri statických skríningových testoch si mnohé testované chemikálie vyžadujú pred úplnou biodegradáciou lag fázu. Počas lag fázy prebieha aklimatizácia alebo adaptácia príslušných baktérií pri takmer nulovej eliminácii testovanej chemikálie. Potom nastane počiatočné množenie týchto baktérií. Táto fáza sa končí a degradačná fáza sa svojvoľne začína, keď sa odstráni približne 10 % počiatočného množstva testovanej chemikálie (po umožnení adsorpcie, ak k nej dochádza). Lag fáza je často veľmi variabilná a slabo reprodukovateľná.
                           
                        
                     Rovnovážna fáza
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Rovnovážna fáza krivky eliminácie v nepretržitom teste je vymedzená ako fáza, v ktorej nastáva maximálna degradácia. Táto fáza by mala trvať najmenej tri týždne a mala by mať približne 12 – 15 nameraných platných hodnôt.
                           
                        
                     Stredný stupeň eliminácie testovanej chemikálie
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Vypočíta sa stredná hodnota z hodnôt eliminácie Dt (a Dst, ak je dostupná) testovanej chemikálie počas rovnovážnej fázy. Hodnota zaokrúhlená na celé číslo (1 %) predstavuje stupeň eliminácie testovanej chemikálie. Odporúča sa aj vypočítať 95 % interval spoľahlivosti strednej hodnoty. Podobným spôsobom sa vypočíta stredný stupeň (DB) eliminácie organického média v kontrolnej nádobe.
                           
                        
                     Indikácia biodegradácie
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Ak testovaná chemikália výrazne neadsorbuje na biofilme a krivka eliminácie má typický tvar biodegradačnej krivky s lag, degradačnou a rovnovážnou fázou (odseky 48, 49), nameraná eliminácia sa môže s istotou pripísať biodegradácii. Ak bola počiatočná eliminácia vysoká, simulačný test nemôže rozlišovať medzi biologickými a abiotickými eliminačnými procesmi. V takých prípadoch a v prípade akýchkoľvek pochybností o biodegradácii (napr. ak dochádza k stripovaniu) sa vykoná analýza adsorbovanej testovanej chemikálie na vzorkách filmu alebo ďalšie statické (skríningové) testy biodegradovateľnosti založené na parametroch, ktoré jednoznačne indikujú biologické procesy. Takými testmi sú metódy absorpcie kyslíka (kapitola C.4 tejto prílohy D, E a F) (9) alebo test, v ktorom sa meria tvorba CO2 (kapitola C.4-C tejto prílohy alebo metóda uzavretého priestoru nad kvapalinou) (10). Ako inokulum sa použije predexponovaný biofilm z príslušného reaktora.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Ak sa odmerala eliminácia DOC aj eliminácia špecifickej chemikálie, výrazné rozdiely (v prípade prvej hodnoty nižšej ako druhej) medzi percentuálnou elimináciou indikujú prítomnosť organických medziproduktov, ktoré sa môžu rozkladať ťažšie. Tieto medziprodukty treba preskúmať.
                           
                        
                     Platnosť výsledkov testu
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Test možno považovať za platný, ak po dvoch týždňoch prevádzky stupeň eliminácie DOC (alebo COD) (DB) v kontrolných jednotkách je > 80 % a nie sú pozorované žiadne nezvyčajné javy.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Ak sa testovala ľahko biodegradovateľná (referenčná) chemikália, stupeň biodegradácie by mal byť > 90 % a rozdiel medzi hodnotami duplikátov by nemal byť väčší ako 5 %. Ak nie sú splnené tieto dve kritériá, je potrebné skontrolovať experimentálne postupy a/alebo získať domáce splaškové vody z iného zdroja.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Podobne rozdiely medzi hodnotami biodegradácie z duplicitných jednotiek (ak sa použili), v ktorých sa spracúva testovaná chemikália, by sa nemali líšiť o viac ako 5 %. Ak toto kritérium nie je splnené, ale eliminácia je vysoká, v analýze sa pokračuje ďalšie tri týždne. Ak je eliminácia nízka, preskúmajú sa inhibičné účinky testovanej chemikálie, pokiaľ nie sú známe, a test sa podľa možnosti zopakuje pri nižšej koncentrácii testovanej chemikálie.
                           
                        
                     Správa o teste
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Správa o teste musí obsahovať tieto informácie:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovaná chemikália:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikačné údaje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikálny charakter a významné fyzikálno-chemické vlastnosti.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Podmienky testovania:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      všetky modifikácie testovacieho systému, najmä ak sa testujú nerozpustné alebo prchavé látky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      druh organického média,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podiel a charakter priemyselného odpadu prítomného v splaškových vodách, ak sa použije a je známy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metóda inokulácie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zásobný roztok testovanej chemikálie – obsah DOC (rozpustený organický uhlík) a TOC (celkový organický uhlík), spôsob prípravy v prípade suspendovania, použitá testovacia koncentrácia, odôvodnenie v prípade hodnôt mimo rozsahu 10 – 20 mg/l DOC, metóda pridávania, dátum prvého pridania, všetky zmeny koncentrácie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stredný hydraulický retenčný čas (bez rastu), rotačná rýchlosť trubice, približný uhol sklonu, ak je to možné,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o odlupovaní, čas a intenzita,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      testovacia teplota a rozsah,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použité analytické metódy.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky testu:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      všetky namerané údaje DOC, COD, špecifické analýzy, pH, teplota, N chemikálie v prípade potreby,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      všetky vypočítané hodnoty Dt (alebo Dtc), DB, Ds v tabuľkovej podobe a krivky eliminácie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informácie o lag a rovnovážnej fáze, trvanie testu, stupeň eliminácie testovanej chemikálie, referenčnej chemikálie (ak sa testovala) a organického média (v kontrolnej jednotke) spolu so štatistickými údajmi a vyjadreniami biodegradovateľnosti a platnosťou testu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozbor výsledkov.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATÚRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              Gerike, P., Fischer, W., Holtmann, W. (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. Res. 14: 753 – 758.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Truesdale, G. A., Jones, K., Vandyke, K. G. (1959). Removal of synthetic detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441 – 444.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Baumann, U., Kuhn, G., a Benz, M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214 – 220.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Gloyna, E. F., Comstock, R. F., Renn, C. E. (1952). Rotary tubes as experimental trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355 – 1357.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Kumke, G. W., Renn, C. E. (1966). LAS removal across an institutional trickling filter. JAOCS 43: 92 – 94.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Tomlinson, T. G., Snaddon, D. H. M. (1966). Biological oxidation of sewage by films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865 – 881.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, Londýn.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, Londýn.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Kapitola C.4 tejto prílohy, Stanovenie ‚ľahkej‘ biodegradovateľnosti A – F.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              ISO 14593 (1998) Kvalita vody. Hodnotenie úplnej aeróbnej biodegradability organických látok vo vodnom prostredí. Metóda analýzy uvoľneného anorganického uhlíka v uzavretých nádobách.
                           
                        
                     Dodatok 8
                     
                        Obrázok 1
                     
                     
                        Rotujúce trubice
                     
                     
                        
                     Glosár:
                     Pôdorys:
                     Pohľad A/B:
                     Poháňané kolesá:
                     Voľnobežné kolesá:
                     Hnací motor:
                     Redukčný ozubený prevod:
                     Vnútorný okolesník:
                     Výklopný mechanizmus:
                     Pohon šikmého ozubeného prevodu:
                     
                        Obrázok 2
                     
                     
                        Postupový diagram
                     
                     
                        
                     A: Prívodná nádrž
                     B: Peristaltické čerpadlo
                     C: Rotujúca trubica
                     D: Nádoba na zber výtoku
                     
                        VYMEDZENIE POJMOV:
                     
                     Testovaná chemikália: akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
                     Chemikálie: ‚Treba poznamenať, že pojem chemikálie má rozsiahle použitie v dohodách UNCED a neskorších dokumentoch na označenie látok, produktov, zmesí, prípravkov alebo akýchkoľvek iných pojmov, ktoré sa môžu používať v existujúcich systémoch, na vymedzenie rozsahu‘.
                  “
            
                  10.
               
               
                  Dopĺňajú sa kapitoly C.27, C.28, C.29 a C.30:
                  „C.27   TEST TOXICITY CHIRONOMIDAE V SYSTÉME SEDIMENT – VODA ZA POUŽITIA OBOHATENÉHO SEDIMENTU
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov (TG) 218 (2004). Táto testovacia metóda bola vypracovaná s cieľom hodnotiť účinky predĺženého pôsobenia chemikálií na vodné larvy dvojkrídlovcov rodu Chironomus žijúce v sedimente. Vychádza z existujúcich protokolov o testoch toxicity pri druhoch Chironomus riparius a Chironomus tentans, ktoré boli vypracované v Európe (1) (2) (3) a Severnej Amerike (4) (5) (6) (7) (8) a boli podrobené kruhovým testom (1) (6) (9). Môžu sa použiť aj iné dobre zdokumentované druhy pakomárov, napr. Chironomus yoshimatsui (10) (11).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Expozičný scenár použitý v tejto testovacej metóde je obohacovanie sedimentu testovanou látkou. Výber vhodného expozičného scenára závisí od plánovaného použitia testu. Scenár obohacovania sedimentu je určený na simuláciu akumulovaných úrovní chemikálií pretrvávajúcich v sedimente. Tento expozičný systém zahŕňa obohacovanie sedimentu v testovacom systéme sediment – voda.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Látky, ktoré je potrebné testovať na organizmoch žijúcich v sedimente, zvyčajne pretrvajú v tomto kompartmente dlhý čas. Organizmy žijúce v sedimente môžu byť exponované viacerými spôsobmi. Relatívny význam každého spôsobu expozície a časové obdobie, v ktorom sa každý z nich podieľa na celkových toxických účinkoch, závisí od fyzikálno-chemických vlastností danej chemikálie. V prípade silno adsorbujúcich látok (napr. s log Kow > 5) alebo látok, ktoré sa kovalentne viažu na sediment, môže byť významným spôsobom expozície prijímanie kontaminovanej potravy. S cieľom zabrániť podhodnoteniu toxicity vysokolipofilných látok možno zvážiť použitie potravy pridanej do sedimentu pred aplikáciou testovanej látky. S cieľom zohľadniť všetky potenciálne spôsoby expozície sa táto testovacia metóda zameriava na dlhodobú expozíciu. Trvanie testu je v rozsahu 20 – 28 dní v prípade druhov C. riparius a C. yoshimatsui a 28 – 65 dní pri C. tentans. Ak sú na špecifické účely potrebné krátkodobé údaje, napríklad s cieľom skúmať účinky nestabilnej chemikálie, môžu sa po desiatich dňoch odstrániť ďalšie replikáty.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Meranými parametrami sú celkový počet vykuklených dospelých jedincov a čas do vykuklenia. Ak sú potrebné ďalšie krátkodobé údaje, odporúča sa vykonať merania prežitia a rastu lariev až po desiatich dňoch s použitím ďalších replikátov podľa potreby.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Odporúča sa použiť umelo pripravený sediment. Umelo pripravený sediment má oproti prírodným sedimentom niekoľko výhod:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          zníži sa variabilita testu, lebo umelo pripravený sediment vytvára reprodukovateľnú ‚štandardizovanú matricu‘, a odstráni sa potreba nájsť nekontaminované a čisté zdroje sedimentu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          testy je možné začať kedykoľvek bez problému sezónnej variability v testovanom sedimente a nie je potrebné sediment predpripraviť, aby sa odstránila pôvodná fauna. Použitie umelo pripraveného sedimentu takisto znižuje náklady spojené s odberom dostatočných množstiev sedimentu v teréne na rutinné testovanie,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          použitie umelo pripraveného sedimentu umožňuje porovnanie toxicity a následné zatriedenie látok.
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              Vymedzenie pojmov je uvedené v dodatku 1.
                           
                        PRINCÍP TESTU
                  
                              7.
                           
                           
                              Larvy pakomárov v prvom instare sú exponované rozsahu koncentrácií testovanej chemikálie v systémoch sediment – voda. Sediment sa obohatí testovanou látkou a následne sa larvy prvého instaru zavedú do testovacích kadičiek, v ktorých sa stabilizovali koncentrácie sedimentu a vody. Na konci testu sa meria vykuklenie pakomárov a vývojový pomer. Podľa potreby sa môže po desiatich dňoch merať aj prežitie a hmotnosť lariev (pomocou ďalších replikátov podľa potreby). Tieto údaje sa analyzujú buď prostredníctvom regresného modelu na odhadnutie koncentrácie, ktorá by spôsobila × % pokles vo vykuklení, prežívaní lariev alebo raste (napr. EC15, EC50 atď.), alebo prostredníctvom testovania štatistickej hypotézy na stanovenie koncentrácie NOEC/LOEC. Pri druhom spôsobe je potrebné pomocou štatistických testov porovnať hodnoty účinkov s kontrolnými hodnotami.
                           
                        INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE
                  
                              8.
                           
                           
                              Je potrebné poznať rozpustnosť testovanej látky vo vode, jej tlak pary, namerané alebo vypočítané delenie na sediment a stabilitu vo vode a v sedimente. Mala by byť k dispozícii spoľahlivá analytická metóda so známou a zdokumentovanou presnosťou a detekčným limitom na kvantifikáciu testovanej látky v nadložnej vode, pórovej vode a sedimente. Medzi užitočné informácie patrí štrukturálny vzorec a čistota testovanej látky. Užitočnou informáciou je aj chemický osud testovanej chemikálie (napr. rozptýlenie, abiotická a biotická degradácia atď.). Ďalšie informácie pre testované látky s fyzikálno-chemickými vlastnosťami, ktoré sťažujú ich testovanie, sú uvedené v odkaze (12).
                           
                        REFERENČNÉ CHEMIKÁLIE
                  
                              9.
                           
                           
                              Referenčné chemikálie sa môžu testovať pravidelne ako prostriedok na zabezpečenie spoľahlivosti testovacieho protokolu a testovacích podmienok. Príkladmi referenčných toxických látok, ktoré sa úspešne používajú v kruhových testoch a overovacích štúdiách, sú: lindán, trifluralín, pentachlórfenol, chlorid kademnatý a chlorid draselný (1) (2) (5) (6) (13).
                           
                        PLATNOSŤ TESTU
                  
                              10.
                           
                           
                              Pre platnosť testu je potrebné uplatňovať tieto podmienky:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          vykuklenie v kontrolných skupinách musí byť na konci testu na úrovni minimálne 70 % (1) (6),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          vykuklenie druhov C. riparius a C. yoshimatsui na dospelé jedince z kontrolných nádob by malo nastať 12 – 23 dní po ich vložení do nádob. V prípade druhu C. tentans je potrebné obdobie 20 – 65 dní,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          na konci testu je potrebné zmerať v každej nádobe pH a koncentráciu rozpusteného kyslíka. Koncentrácia kyslíka by pri použitej teplote mala predstavovať najmenej 60 % saturačnej hodnoty vzduchom (ASV) a hodnota pH nadložnej vody by vo všetkých testovacích nádobách mala byť v rozmedzí 6 – 9,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          teplota vody by sa nemala líšiť o viac ako ± 1,0 °C. Teplotu vody je možné kontrolovať pomocou izotermickej komory a v tom prípade je potrebné v primeranom časovom intervale potvrdiť teplotu v komore.
                                       
                                    
                        OPIS METÓDY
                  
                     Testovacie nádoby
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Štúdia sa vykonáva v sklenených kadičkách s objemom 600 ml a s priemerom 8 cm. Sú vhodné aj iné nádoby, ale musia zaručiť vhodnú hĺbku nadložnej vody a sedimentu. Povrch sedimentu by mal byť dostatočne veľký, aby poskytoval 2 – 3 cm2 priestoru na larvu. Pomer hĺbky vrstvy sedimentu k hĺbke nadložnej vody by mal byť 1: 4. Testovacie nádoby a iné prístroje, ktoré prichádzajú do styku s testovacím systémom, by mali byť vyrobené výlučne zo skla alebo iného chemicky inertného materiálu (napr. teflónu).
                           
                        
                     Výber druhov
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Uprednostňovaným druhom na použitie v teste je Chironomus riparius. Chironomus tentans je takisto vhodný, ale je náročnejší na starostlivosť a vyžaduje si dlhšie trvanie testu. Možno použiť aj Chironomus yoshimatsui. Podrobné informácie o kultivačných metódach v prípade druhu Chironomus riparius sú uvedené v dodatku 2. Informácie o kultivačných podmienkach sú k dispozícii aj pre iné druhy, t. j. Chironomus tentans (4) a Chironomus yoshimatsui (11). Identifikácia druhov musí byť pred testovaním potvrdená, ale nevyžaduje sa pred každým testom, ak organizmy pochádzajú z internej kultúry.
                           
                        
                     Sediment
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Uprednostňuje sa použitie umelo pripraveného sedimentu (známeho aj pod názvom rekonštituovaný, umelý alebo syntetický sediment). Ak sa však použije prírodný sediment, je potrebné ho charakterizovať (aspoň pH, obsah organického uhlíka, odporúča sa takisto stanovenie ostatných parametrov ako pomer C/N a granulometria) a nemal by obsahovať žiadne kontaminanty ani iné organizmy, ktoré by mohli s pakomármi súperiť alebo ich požierať. Takisto sa odporúča, aby bol prírodný sediment pred použitím v teste toxicity pri pakomároch na sedem dní uvedený do podmienok, ktoré budú prevládať v nasledujúcom teste. V tomto teste (1) (15) (16) sa odporúča použiť nasledujúci umelo pripravený sediment založený na umelej pôde použitej v testovacej metóde C.8 (14):
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          4 – 5 % (suchá hmotnosť) rašeliny: čo najbližšie k pH 5,5 – 6,0. Je dôležité použiť rašelinu v práškovej forme, jemne rozomletú (veľkosť častíc ≤ 1 mm) a sušenú iba vzduchom;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          20 % (suchá hmotnosť) kaolínu (obsah kaolinitu podľa možnosti nad 30 %);
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          75 – 76 % (suchá hmotnosť) kremenného piesku (mal by prevládať jemný piesok s viac ako 50 % častíc s veľkosťou od 50 do 200 μm);
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          deionizovaná voda sa pridá, aby sa dosiahla vlhkosť konečnej zmesi v rozsahu 30 - 50 %;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          uhličitan vápenatý chemicky čistej kvality (CaCO3) sa pridá, aby sa pH konečnej zmesi sedimentu upravila na 7,0 ± 0,5; obsah organického uhlíka v konečnej zmesi by mal byť 2 % (± 0,5 %) a je potrebné ho upraviť pomocou primeraného množstva rašeliny a piesku podľa písmen a) a c).
                                       
                                    
                        
                              14.
                           
                           
                              Zdroj rašeliny, kaolínu a piesku by mal byť známy. Je potrebné skontrolovať, či zložky sedimentu neobsahujú chemické kontaminanty (napr. ťažké kovy, organochlórové zlúčeniny, organofosforové zlúčeniny atď.). Príklad prípravy umelo pripraveného sedimentu je uvedený v dodatku 3. Miešanie suchých zložiek je takisto prípustné, ak sa preukáže, že po pridaní nadložnej vody nedochádza k separácii zložiek sedimentu (napr. k vyplaveniu častíc rašeliny) a že rašelina alebo sediment sú v dostatočnej miere uvedené do podmienok.
                           
                        
                     Voda
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Každá voda, ktorá vyhovuje chemickým charakteristikám prijateľnej riediacej vody podľa zoznamu uvedeného v dodatkoch 2 a 4, je vhodná ako testovacia voda. Každá vhodná voda, prírodná voda (povrchová alebo podzemná voda), rekonštituovaná voda (pozri dodatok 2) alebo odchlórovaná voda z vodovodu sú prijateľné ako voda na kultiváciu a testovacia voda, ak v nej pakomáre prežijú počas celej kultivácie a testovania bez príznakov stresu. Na začiatku testu by pH testovacej vody mala mať hodnotu medzi 6 a 9 a celková tvrdosť by nemala byť vyššia ako 400 mg/l pre CaCO3. Ak však existuje podozrenie na interakciu medzi iónmi tvrdosti a testovanou látkou, mala by sa použiť voda s nižšou tvrdosťou (a v takom prípade sa teda nesmie použiť Elendtovo médium M4). Počas celej štúdie by sa mal používať rovnaký druh vody. Charakteristiky kvality vody uvedené v dodatku 4 by sa mali merať najmenej dvakrát za rok alebo ak existuje podozrenie, že sa tieto charakteristiky mohli významne zmeniť.
                           
                        
                     Zásobné roztoky – obohatené sedimenty
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Obohatené sedimenty vybratej koncentrácie sa zvyčajne pripravujú pridaním roztoku testovanej látky priamo do sedimentu. Zásobný roztok testovanej látky rozpustenej v deionizovanej vode sa zmieša s umelo pripraveným sedimentom pomocou valcovne, stroja na miešanie krmív alebo ručným miešaním. Ak je testovaná látka slabo rozpustná vo vode, možno ju rozpustiť v čo najmenšom objeme vhodného organického rozpúšťadla (napr. hexán, acetón alebo chloroform). Tento roztok sa následne zmieša s 10 g jemného kremenného piesku na jednu testovaciu nádobu. Počká sa, kým sa rozpúšťadlo odparí, pričom sa musí z piesku celkom odstrániť. Piesok sa potom zmieša s vhodným množstvom sedimentu na testovaciu kadičku. Na zvýšenie rozpustnosti, na disperziu alebo na emulziu testovanej látky možno použiť iba látky, ktoré sú ľahko prchavé. Treba mať na pamäti, že pri príprave sedimentu je nutné zohľadniť piesok, ktorý pochádza z testovanej látky a pieskovej zmesi (t. j. sediment by sa teda mal pripraviť s menším množstvom piesku). Je nutné zabezpečiť, aby sa testovaná látka pridávaná do sedimentu v sedimente dôkladne a rovnomerne distribuovala. V prípade potreby možno na účely stanovenia stupňa homogenity analyzovať podvzorky.
                           
                        KONCEPCIA TESTU
                  
                              17.
                           
                           
                              Koncepcia testu sa vzťahuje na výber počtu a odstup testovaných koncentrácií, počet nádob pri každej koncentrácii a počet lariev v každej nádobe. Sú tu opísané koncepcie na odhadnutie bodu EC, na odhadnutie koncentrácie NOEC a na vykonanie limitného testu.
                           
                        
                     Koncepcia regresnej analýzy
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Účinná koncentrácia (napr. EC15, EC50) a koncentračný rozsah, v ktorom sa skúmajú účinky testovanej látky, sa merajú koncentráciami zahrnutými do testu. Vo všeobecnosti sú presnosť a najmä platnosť, s ktorou možno odhadovať účinné koncentrácie (ECx), lepšie, ak je účinná koncentrácia v rozsahu testovaných koncentrácií. Je potrebné vyhýbať sa extrapolácii hlboko pod najnižšou pozitívnou koncentráciou alebo nad najvyššou koncentráciou. Pri výbere rozsahu koncentrácií, ktoré sa použijú, je užitočný predbežný test na zistenie rozsahu (pozri odsek 27).
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Ak je potrebné odhadnúť ECx, malo by sa testovať najmenej päť koncentrácií a tri replikáty pre každú koncentráciu. V každom prípade sa odporúča použiť dostatočné testovacie koncentrácie, ktoré umožnia dobrý modelový odhad. Faktor medzi koncentráciami by nemal byť väčší ako dva (v prípadoch, keď má krivka závislosti reakcie od dávky plytký sklon, možno urobiť výnimku). Počet replikátov pri každej aplikácii sa môže znížiť, ak sa zvýši počet testovacích koncentrácií s rozdielnymi reakciami. Zvýšenie počtu replikátov alebo skrátenie dĺžky intervalov testovacích koncentrácií zvyčajne vedie k nižším intervalom spoľahlivosti testu. Ak sa odhaduje desaťdňové prežívanie a rast lariev, sú potrebné ďalšie replikáty.
                           
                        
                     Koncepcia odhadu NOEC/LOEC
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Ak sa odhadujú koncentrácie LOEC alebo NOEC, použije sa päť testovacích koncentrácií s najmenej štyrmi replikátmi a faktor medzi koncentráciami by nemal byť vyšší ako 2. Počet replikátov by mal byť dostatočný, aby sa zabezpečila primeraná štatistická výpovedná hodnota na zistenie rozdielu 20 % pri kontrole pri úrovni významnosti 5 % (p = 0,05). V prípade vývojového pomeru je zvyčajne vhodná analýza rozptylu (ANOVA), ako napríklad Dunnettov test a Williamsov test (17) (18) (19) (20). Pri pomere vykuklenia možno použiť Cochranov-Armitageho test, Fisherov exaktný test (s Bonferroniho korekciou) alebo Mantelov-Haenszelov test.
                           
                        
                     Limitný test
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Môže sa vykonať limitný test (jedna testovaná koncentrácia a kontrola), ak v predbežnom teste na zistenie rozsahu neboli pozorované žiadne účinky. Účelom limitného testu je vykonať test pri dostatočne vysokej koncentrácii, ktorá umožní subjektom zodpovedným za rozhodovanie vylúčiť možné toxické účinky testovanej látky a stanoviť limit pri koncentrácii, ktorá sa neočakáva v žiadnej situácii. Odporúča sa úroveň 1 000 mg/kg (suchá hmotnosť). Zvyčajne je na aplikáciu aj kontrolu potrebných najmenej šesť replikátov. Je nutné preukázať primeranú štatistickú výpovednú hodnotu na zistenie rozdielu 20 % pri kontrole pri úrovni významnosti 5 % (p = 0,05). V prípade metrickej reakcie (vývojový pomer a hmotnosť) je vhodnou štatistickou metódou t-test, pokiaľ údaje spĺňajú požiadavky tohto testu (normalita, homogénne rozptyly). Ak tieto požiadavky nie sú splnené, môže sa použiť t-test nerovnomerných rozptylov alebo neparametrický test ako napríklad Wilcoxonov-Mannov-Whitheyho test. Pri pomere vykuklenia je vhodný Fisherov exaktný test.
                           
                        POSTUP
                  
                     Podmienky expozície
                  
                  
                     Príprava systému obohatený sediment – voda
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Postup obohacovania opísaný v testovacej metóde C.8: Toxicita pre dážďovky je odporúčaným postupom na aplikáciu testovanej látky (14). Obohatené sedimenty sa umiestnia do nádob, do ktorých sa pridá nadložná voda, aby sa vytvoril objemový pomer sediment – voda 1: 4 (pozri odseky 11 a 15). Výška vrstvy sedimentu by mala byť v rozsahu 1,5 - 3 cm. S cieľom zabrániť separácii zložiek sedimentu a resuspendovaniu jemného materiálu počas pridávania testovacej vody do vodného stĺpca môže byť sediment v čase, keď sa naň nalieva voda, prikrytý umelohmotným kotúčom, ktorý sa hneď potom odstráni. Môže byť vhodné aj použitie iných prístrojov.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Testovacie nádoby sa zakryjú (napr. sklenenými platňami). V prípade potreby sa počas štúdie dopĺňajú hladiny vody na pôvodný objem s cieľom kompenzovať vyparovanie vody. Na tento účel sa použije destilovaná alebo deionizovaná voda, aby sa predišlo hromadeniu solí.
                           
                        
                     Stabilizácia
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Keď je obohatený sediment s nadložnou vodou pripravený, je vhodné umožniť delenie testovanej látky z vodnej fázy do sedimentu (3) (4) (6) (13). To by sa podľa možnosti malo vykonať za rovnakých teplotných a prevzdušňovacích podmienok, aké sa použijú v teste. Primeraný čas vyvažovania závisí od konkrétneho sedimentu a chemikálie a môže trvať niekoľko hodín až dní a v zriedkavých prípadoch až niekoľko týždňov (štyri až päť týždňov). Keďže tým by sa poskytol čas na degradáciu mnohých chemikálií, na rovnovážny stav sa nečaká, ale odporúča sa vyvažovacie obdobie v trvaní 48 hodín. Na konci tohto ďalšieho vyvažovacieho obdobia sa odmeria koncentrácia testovanej látky v nadložnej vode, pórovej vode a sedimente aspoň pri najvyššej koncentrácii a pri jednej nižšej koncentrácii (pozri odsek 38). Tieto analytické skúmania testovanej látky umožňujú výpočet hmotnostnej bilancie a vyjadrenie výsledkov na základe meraných koncentrácií.
                           
                        
                     Pridanie testovacích organizmov
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Štyri až päť dní pred pridaním testovacích organizmov do testovacích nádob sa z kultúr odoberú vajíčkové masy a umiestnia sa do malých nádob s kultivačných médiom. Môže sa použiť staršie médium zo zásobnej kultúry alebo čerstvo pripravené médium. Ak sa použije čerstvo pripravené kultivačné médium, je potrebné doň pridať malé množstvo potravy, napr. zelené riasy a/alebo niekoľko kvapiek filtrátu z jemne rozomletej suspenzie vločkového krmiva pre ryby (pozri dodatok 2). Použijú sa iba čerstvo nakladené vajíčkové masy. Larvy sa zvyčajne začnú liahnuť niekoľko dní po nakladení vajíčok (dva až tri dni v prípade druhu Chironomus riparius pri teplote 20 °C a jeden až štyri dni v prípade Chironomus tentans pri teplote 23 °C a Chironomus yoshimatsui pri teplote 25 °C) a rast lariev prebieha v štyroch instaroch, z ktorých každý trvá štyri až osem dní. V teste sa použijú larvy prvého instaru (dva až tri alebo jeden až štyri dni po vyliahnutí). Instar pakomárov je možné skontrolovať podľa šírky hlavového segmentu (6).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Larvy 21. instaru sa pomocou tupej pipety náhodne rozdelia do jednotlivých testovacích nádob obsahujúcich obohatený sediment a vodu. Prevzdušňovanie vody je nutné počas pridávania lariev do testovacích nádob prerušiť a musí byť pozastavené počas ďalších 24 hodín po pridaní lariev (pozri odseky 25 a 32). Podľa použitej koncepcie testu (pozri odseky 19 a 20) je počet lariev použitých pri každej koncentrácii najmenej 60 na odhad bodu EC a 80 na stanovenie koncentrácie NOEC.
                           
                        
                     Testovacie koncentrácie
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Pri určovaní rozsahu koncentrácií pre konečný test môže byť užitočný test na zistenie rozsahu. Na tento účel sa použije súbor koncentrácií testovanej látky s veľkými odstupmi. S cieľom zabezpečiť rovnakú hustotu povrchu na pakomára, ktorá sa použije pri konečnom teste, sú pakomáre vystavené každej koncentrácii testovanej látky na obdobie, ktoré umožňuje odhad vhodných testovacích koncentrácií, pričom nie sú potrebné žiadne replikáty.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Testovacie koncentrácie pre konečný test sa vyberú na základe výsledkov testu na zistenie rozsahu. Je potrebné použiť a vybrať najmenej päť koncentrácií, ako sa uvádza v odsekoch 18 – 20.
                           
                        
                     Kontroly
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Súčasťou testu sú kontrolné nádoby bez prítomnosti testovanej látky, ktoré však obsahujú sediment, a primeraný počet replikátov (pozri odseky 19 – 20). Ak sa pri aplikácii testovanej látky použije rozpúšťadlo (pozri odsek 16), je potrebné pridať kontrolu rozpúšťadla v sedimente.
                           
                        
                     Testovací systém
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Použijú sa statické systémy. Vo výnimočných prípadoch sa môžu použiť semistatické alebo prietokové systémy s prerušovaným alebo nepretržitým obmieňaním nadložnej vody, napríklad ak sú špecifikácie kvality vody nevhodné pre testovacie organizmy alebo ak ovplyvňujú chemickú rovnováhu (napr. úrovne rozpusteného kyslíka príliš klesnú, koncentrácia vylučovaných produktov príliš stúpne alebo sa zo sedimentu lúhujú minerály, čo má vplyv na pH a/alebo tvrdosť vody). Zvyčajne však postačujú a uprednostňujú sa iné metódy zlepšenia kvality nadložnej vody, ako napríklad prevzdušňovanie.
                           
                        
                     Potrava
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Je nevyhnutné larvy kŕmiť podľa možnosti každý deň alebo najmenej trikrát do týždňa. V prvých desiatich dňoch je pre mladé larvy podľa všetkého vhodné krmivo pre ryby (suspenzia vo vode alebo jemne rozomletá potrava, napr. Tetra-Min alebo Tetra-Phyll, bližšie informácie pozri v dodatku 2) v dennom množstve 0,25 – 0,5 mg (0,35 – 0,5 mg pre druh C. yoshimatsui) na jednu larvu. Pre staršie larvy môže byť potrebné o niečo väčšie množstvo potravy: denné množstvo 0,5 – 1 mg na jednu larvu by malo po zvyšok testu postačovať. Ak sa pozoruje rast hubovitých organizmov alebo ak sa v kontrolných nádobách pozoruje mortalita, prídel potravy by sa mal vo všetkých testovacích nádobách znížiť a mal by sa kontrolovať. Ak nie je možné vznik hubovitých organizmov zastaviť, test je nutné opakovať. Pri testovaní silno adsorbujúcich látok (napr. s log Kow > 5) alebo látok, ktoré sa kovalentne viažu na sediment, sa môže do umelo pripraveného sedimentu pred stabilizačným obdobím pridať množstvo potravy potrebné na zabezpečenie prežitia a prirodzeného rastu organizmov. Na tento účel sa namiesto krmiva pre ryby musí použiť rastlinný materiál, napr. sa môže pridať 0,5 % (suchá hmotnosť) jemne rozomletých listov napr. pŕhľavy dvojdomej (Urtica dioica), moruše (Morus alba), ďateliny plazivej (Trifolium repens), špenátu (Spinacia oleracea) alebo iného rastlinného materiálu (Cerophyl alebo alfa celulóza).
                           
                        
                     Podmienky inkubácie
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Najlepšie po 24 hodinách od pridania lariev sa zabezpečí jemné prevzdušňovanie nadložnej vody v testovacích nádobách a pokračuje v ňom počas celého testu (treba dbať na to, aby koncentrácia rozpusteného kyslíka neklesla pod 60 % ASV). Prevzdušňovanie sa zabezpečí pomocou sklenenej Pasteurovej pipety upevnenej 2 – 3 cm nad vrstvou sedimentu (t. j. jedna alebo niekoľko bublín za sekundu). Ak sa testujú prchavé chemikálie, možno zvážiť, že systém sediment – voda sa nebude prevzdušňovať.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Test sa vykonáva pri konštantnej teplote 20 °C (± 2 °C). V prípade druhu C. tentans sa odporúča teplota 23 °C a v prípade C. yoshimatsui 25 °C (± 2 °C). Použije sa 16-hodinová svetlá fáza, pričom intenzita svetla by mala byť 500 – 1 000 luxov.
                           
                        
                     Trvanie expozície
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Expozícia sa začne pridaním lariev do obohatených a kontrolných nádob. Maximálna dĺžka expozície je 28 dní v prípade druhov C. riparius a C. yoshimatsui a 65 dní v prípade C. tentans. Ak sa pakomáre vykuklia skôr, test sa môže ukončiť najskôr po piatich dňoch po vykuklení posledného dospelého jedinca v kontrolnej skupine.
                           
                        
                     Pozorovania
                  
                  
                     Vykuklenie
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Určí sa čas vývoja a celkový počet úplne vykuklených samčích a samičích pakomárov. Samčeky sa ľahko identifikujú podľa obrvených tykadiel.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Testovacie nádoby je potrebné pozorovať najmenej trikrát do týždňa s cieľom vizuálne zhodnotiť každé abnormálne správanie (napr. opúšťanie sedimentu, nezvyčajné plávanie) v porovnaní s kontrolnou skupinou. Počas obdobia očakávaného vykuklenia je nevyhnutné každý deň spočítať vykuklené pakomáre. Pohlavie a počet úplne vykuklených pakomárov sa zaznamenáva denne. Po identifikácii sa pakomáre vyberú z nádob. Všetky vajíčkové masy nakladené pred ukončením testu sa zaznamenajú a následne odstránia, aby sa predišlo opätovnému zavedeniu lariev do sedimentu. Takisto sa zaznamená počet viditeľných kukiel, ktoré sa nevykuklili. Usmernenie k meraniu vykuklenia je uvedené v dodatku 5.
                           
                        
                     Rast a prežívanie
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Ak je potrebné získať údaje o desaťdňovom prežívaní a raste lariev, na začiatku sa pripravia ďalšie testovacie nádoby tak, aby sa mohli následne použiť. Sediment z týchto ďalších nádob sa precedí pomocou cedidla s hrúbkou 250 μm, aby sa zachytili larvy. Kritérium na stanovenie smrti je nehybnosť alebo absencia reakcie na mechanický podnet. Stratené larvy sa takisto počítajú medzi mŕtve (larvy, ktoré uhynuli na začiatku testu, sa mohli rozložiť pôsobením mikróbov). Určí sa suchá hmotnosť (bez popola) lariev, ktoré prežili v každej testovacej nádobe, a vypočíta sa stredná suchá hmotnosť jedincov na jednu nádobu. Je užitočné určiť, do ktorého instaru patria larvy, ktoré prežili. Na toto meranie sa môže použiť šírka hlavového segmentu každého jedinca.
                           
                        
                     Analytické merania
                  
                  
                     Koncentrácia testovanej látky
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Pred začiatkom testu (t. j. pred pridaním lariev) sa pri každom ošetrení z najmenej jednej nádoby odstránia súhrnné vzorky sedimentu na účely analytického stanovenia koncentrácie testovanej látky v sedimente. Odporúča sa, aby sa vzorky nadložnej vody, pórovej vody a sedimentu analyzovali minimálne na začiatku (pozri odsek 24) a na konci testu pri najvyššej koncentrácii a pri jednej nižšej koncentrácii. Tieto skúmania testovanej látky poskytujú informácie o správaní/delení testovanej látky v systéme voda – sediment.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Ak sa vykonajú prostredné merania (napr. v deň 7) a ak sú na analýzu potrebné veľké vzorky, ktoré nemožno odobrať z testovacích nádob bez ovplyvnenia testovacieho systému, analytické vyšetrenia je potrebné vykonať na vzorkách z ďalších testovacích nádob, s ktorými sa zaobchádzalo rovnakým spôsobom (vrátane prítomnosti testovacích organizmov), ale ktoré sa nepoužijú na biologické pozorovania.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Na izolovanie intersticiálnej vody je odporúčaným postupom odstredenie napr. pri 10 000 g a 4 °C počas 30 minút. Ak sa však preukáže, že testovaná látka sa na filtroch neadsorbuje, môže byť prijateľná aj filtrácia. V niektorých prípadoch nemusí byť možné analyzovať koncentrácie v pórovej vode, lebo vzorka je príliš malá.
                           
                        
                     Fyzikálno-chemické parametre
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Je potrebné vhodným spôsobom odmerať pH a teplotu v testovacích nádobách (pozri odsek 10). Tvrdosť a amoniak sa merajú v kontrolných nádobách a v jednej testovacej nádobe pri najvyššej koncentrácii na začiatku a na konci testu.
                           
                        ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV
                  
                     Spracovanie výsledkov
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Účelom tohto testu je určiť vplyv testovanej látky na vývojový pomer a celkový počet úplne vykuklených samčích a samičích pakomárov, alebo v prípade desaťdňového testu účinky na prežívanie a hmotnosť lariev. Ak nič nepoukazuje na štatisticky rozdielnu vnímavosť medzi pohlaviami, výsledky pre samčeky a samičky možno na účely štatistických analýz zhrnúť spoločne. Rozdiely vnímavosti medzi pohlaviami sa môžu štatisticky posúdiť napr. tabuľkovým testom χ2 – r × 2. Prežívanie lariev a stredná suchá hmotnosť jedincov na jednu nádobu sa podľa potreby musí určiť po desiatich dňoch.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Účinné koncentrácie vyjadrené a vychádzajúce zo suchej hmotnosti sa podľa možnosti vypočítajú na základe koncentrácií nameraných v sedimente na začiatku testu (pozri odsek 38).
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Na vyčíslenie odhadu bodu EC50 alebo akejkoľvek inej hodnoty ECx sa ako pravé replikáty môže použiť štatistika na jednu nádobu. Pri výpočte intervalu spoľahlivosti pre každú hodnotu ECx je potrebné zohľadniť variabilitu medzi nádobami alebo je nutné preukázať, že táto variabilita je taká malá, že je možné ju ignorovať. Ak sa model upraví metódou najmenších štvorcov, v štatistike na jednu nádobu je potrebné aplikovať transformáciu, aby sa zlepšila homogénnosť rozptylu. Hodnoty ECx by sa však mali vypočítať po tom, ako sa reakcia transformuje naspäť na pôvodnú hodnotu.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Ak je cieľom štatistickej analýzy určenie koncentrácie NOEC/LOEC prostredníctvom testovania hypotézy, je potrebné zohľadniť variabilitu medzi nádobami, napr. pomocou hierarchickej analýzy ANOVA. Alternatívne môžu byť vhodné podrobnejšie testy (21) v prípadoch, keď dochádza k nedodržaniu zvyčajných predpokladov analýzy ANOVA.
                           
                        
                     Pomer vykuklenia
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Pomery vykuklenia sú kvantové údaje a môžu sa analyzovať pomocou Cochranovho-Armitageho testu aplikovaného zostupne v prípadoch, keď sa očakáva monotónna reakcia na dávku a tieto údaje zodpovedajú tomuto očakávaniu. Ak to tak nie je, možno použiť Fisherov exaktný test alebo Mantzelov-Haentzalov test s Bonferroniho-Holmovou úpravou hodnôt p. Ak sa medzi replikátmi pri rovnakej koncentrácii preukáže väčšia variabilita, než akú by indikovala binomická distribúcia (často sa uvádza ako ‚extra-binomická‘ variácia), potom by sa mal použiť podrobný Cochranov-Armitageho test alebo Fisherov exaktný test, ako sa navrhuje v bode (21).
                              Určí sa súčet pakomárov vykuklených na jednu nádobu, ne, a vydelí sa počtom zavedených lariev, na:
                              
                                 
                              kde:
                              
                                          ER
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          pomer vykuklenia,
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          počet pakomárov vykuklených na nádobu,
                                       
                                    
                                          na
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          počet zavedených lariev na nádobu.
                                       
                                    
                        
                              47.
                           
                           
                              Najvhodnejšou alternatívou pri veľkých vzorkách v prípadoch extra binomickej variácie je brať pomer vykuklenia (ER) ako nepretržitú reakciu a použiť postupy, ako je napríklad Williamsov test, ak sa očakáva monotónna reakcia na dávku, ktorá je konzistentná s týmito údajmi o ER. Ak reakcia nie je monotónna, je vhodný Dunnettov test. Za veľkú vzorku sa pokladá vzorka, v ktorej je počet vykuklených aj počet nevykuklených jedincov v každom replikáte (nádobe) vyšší ako päť.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Pri aplikovaní metód ANOVA je potrebné najskôr transformovať hodnoty ER pomocou arkussínusovej transformácie druhej odmocniny alebo Freemanovej-Tukeyho transformácie s cieľom získať približnú normálnu distribúciu a vyrovnať rozptyly. Cochranov-Armitageho test, Fisherov exaktný (Bonferroniho) test alebo Mantelov-Haenszelov test možno aplikovať, ak sa použijú absolútne frekvencie. Arkussínusová transformácia druhej odmocniny sa aplikuje pomocou prevrátenej hodnoty sínusu (sin–1) druhej odmocniny ER.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Pri pomeroch vykuklenia sa hodnoty ECx vypočítajú pomocou regresnej analýzy (alebo napr. pomocou modelov probit (22), logit, Weibull, vhodného komerčného softvéru atď.). Ak je regresná analýza neúspešná (napr. ak sú k dispozícii menej ako dve čiastkové reakcie), použijú sa iné neparametrické metódy, ako je metóda pohyblivého priemeru alebo jednoduchá interpolácia.
                           
                        
                     Vývojový pomer
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Stredný vývojový čas predstavuje stredné časové rozpätie medzi zavedením lariev (deň 0 testu) a vykuklením pokusnej kohorty pakomárov. (Pri výpočte reálneho vývojového času sa zohľadní vek lariev v čase zavedenia). Vývojový pomer je prevrátená hodnota vývojového času (jednotka: 1/deň) a predstavuje časť vývinu lariev, ktorá prebieha za deň. Pri hodnotení týchto štúdií toxicity v sedimente sa uprednostňuje vývojový pomer, lebo jeho rozptyl je nižší a v porovnaní s vývojovým časom je homogénnejší a bližší normálnej distribúcii. Výkonné parametrické testovacie postupy teda možno lepšie použiť s vývojovým pomerom ako s vývojovým časom. Pre vývojový pomer ako nepretržitú reakciu možno hodnoty ECx odhadnúť pomocou regresnej analýzy [napr. (23), (24)].
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Pri nasledujúcich štatistických testoch sa predpokladá, že počet pakomárov pozorovaných v kontrolnom dni × sa vykuklil v strednom časovom intervale medzi dňom × a dňom x - l (l = dĺžka kontrolného intervalu, zvyčajne jeden deň). Stredný vývojový pomer na nádobu sa vypočíta podľa tejto rovnice:
                              
                                 
                              kde:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          stredný vývojový pomer na nádobu,
                                       
                                    
                                          i
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          index kontrolného intervalu,
                                       
                                    
                                          m
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          maximálny počet kontrolných intervalov,
                                       
                                    
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          počet pakomárov vykuklených v kontrolnom intervale i,
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          celkový počet pakomárov vykuklených na konci pokusu, (= ),
                                       
                                    
                                          xi
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          vývojový pomer pakomárov vykuklených v intervale i;
                                       
                                    
                                 
                              kde:
                              
                                          deňi
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          kontrolný deň (dni od aplikácie),
                                       
                                    
                                          li
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          dĺžka kontrolného intervalu i (dni, zvyčajne jeden deň).
                                       
                                    
                        
                     Správa o teste
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Správa o teste musí obsahovať aspoň tieto informácie:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovaná látka:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikálny charakter a významné fyzikálno-chemické vlastnosti (rozpustnosť vo vode, tlak pary, rozdeľovací koeficient v pôde (alebo v sedimente, ak je k dispozícii), stabilita vo vode atď.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      chemické identifikačné údaje (bežný názov, chemický názov, štrukturálny vzorec, číslo CAS atď.) vrátane čistoty a analytickej metódy kvantifikácie testovanej látky.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovacie druhy:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použité testovacie zvieratá: druh, vedecký názov, zdroj organizmov a podmienky chovu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informácie o manipulácii s vajíčkovými masami a larvami,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vek testovacích zvierat pri umiestnení do testovacích nádob.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Podmienky testovania:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použitý sediment, t. j. prírodný alebo umelo pripravený sediment,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      v prípade prírodného sedimentu poloha a opis miesta odobratia vzoriek vrátane histórie kontaminácie, ak je to možné, charakteristiky: pH, obsah organického uhlíka, pomer C/N a granulometria (podľa potreby),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      príprava umelo pripraveného sedimentu: zložky a charakteristiky (obsah organického uhlíka, pH, vlhkosť atď. na začiatku testu),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      príprava testovacej vody (ak sa použije rekonštituovaná voda) a charakteristiky (koncentrácia kyslíka, pH, vodivosť, tvrdosť atď. na začiatku testu),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      výška sedimentu a nadložnej vody,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      objem nadložnej a pórovej vody, hmotnosť mokrého sedimentu s pórovou vodou a bez nej,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      testovacie nádoby (materiál a veľkosť),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metóda obohatenia sedimentu: použité testovacie koncentrácie, počet replikátov a prípadné použitie rozpúšťadiel,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rovnovážna fáza stabilizácie systému obohatený sediment – voda: trvanie a podmienky,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inkubačné podmienky: teplota, svetelný cyklus a intenzita, prevdzušňovanie (frekvencia a intenzita),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné informácie o kŕmení vrátane druhu potravy, prípravy, množstva a kŕmneho režimu.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominálne testovacie koncentrácie, namerané testovacie koncentrácie a výsledky všetkých analýz na stanovenie koncentrácie testovanej látky v testovacej nádobe,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kvalita vody v testovacích nádobách, t. j. pH, teplota, rozpustený kyslík, tvrdosť a amoniak,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kompenzácia prípadnej vyparenej testovacej vody,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet vykuklených samčích a samičích pakomárov na nádobu na deň,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet lariev na nádobu, ktoré sa nevykuklili,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stredná suchá hmotnosť jednotlivých lariev na nádobu a na instar podľa potreby,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      percentuálne vykuklenie na replikát a testovaciu koncentráciu (samčie a samičie pakomáre spolu),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stredný vývojový pomer úplne vykuklených pakomárov na replikát a miera ošetrenia (samčie a samičie pakomáre spolu),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odhady toxických parametrov, napr. ECx (a súvisiace intervaly spoľahlivosti), NOEC a/alebo LOEC a štatistické metódy použité na ich stanovenie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozbor výsledkov vrátane každého vplyvu na výsledok testu vyplývajúceho z odchýlok od tejto testovacej metódy.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATÚRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Upravili M. Streloke a H.Köpp. Berlín 1995.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Fleming, R. a kol. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Záverečná správa pre Európsku komisiu. Správa č.: EK, 3738. August 1994. WRc, UK.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. Zo seminára WOSTA, ktorý sa uskutočnil v Holandsku.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. s. 1125 – 1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Druhé vydanie. EPA 600/R-99/064. Marec 2000. Revízia prvého vydania z júna 1994.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Milani, D., Day, K. E., McLeay, D. J., a Kirby, R. S. (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Sugaya, Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345 – 350.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Kawai, K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47 – 57.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Testovacia metóda C.8 tejto prílohy, Toxicita pre dážďovky.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Suedel, B. C., a Rodgers, J. H. (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163 – 1175.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Naylor, C., a Rodrigues, C. (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291 – 3303.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Dunnett, C. W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096 – 1121.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482 – 491.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103 – 117.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510 – 531.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Rao, J. N. K., a Scott, A. J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577 – 585.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Christensen, E. R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213 – 221.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Bruce a Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485 – 1494.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Slob, W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312.
                           
                        
                     Dodatok 1
                     VYMEDZENIE POJMOV
                     Na účely tejto testovacej metódy sa používajú tieto vymedzenia pojmov:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Umelo pripravený sediment alebo rekonštituovaný, umelý alebo syntetický sediment, je zmes materiálov použitých na napodobnenie fyzických zložiek prírodného sedimentu.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Nadložná voda je voda umiestnená v testovacej nádobe nad sedimentom.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Intersticiálna voda alebo pórová voda je voda nachádzajúca sa v priestore medzi časticami sedimentu a pôdy.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Obohatený sediment je sediment, do ktorého bola pridaná testovaná látka.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testovaná chemikália: akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
                              
                           
                  
                     Dodatok 2
                     
                        Odporúčania ku kultúre Chironomus riparius
                        
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Larvy rodu Chironomus sa môžu chovať v kryštalizačných miskách alebo vo väčších nádobách. Na dno nádoby sa nanesie tenká vrstva jemného kremenného piesku vo výške 5 – 10 mm. Je preukázané, že vhodným substrátom je aj diatomit (napr. Merck, článok 8117) (postačuje tenšia vrstva do výšky len niekoľkých milimetrov). Potom sa pridá vhodná voda do výšky niekoľkých centimetrov. Hladiny vody by sa mali podľa potreby dopĺňať, aby sa kompenzovala strata vyparením a aby sa predišlo vysychaniu. Vodu je možné v prípade potreby vymeniť. Je potrebné zabezpečiť jemné prevzdušňovanie. Misky na chov lariev by mali byť umiestnené vo vhodnej klietke, ktorá zabráni úniku vykuklených dospelých jedincov. Klietka by mala byť dostatočne veľká, aby umožňovala rojenie vykuklených dospelých jedincov, v opačnom prípade by nemuselo dôjsť ku kopulácii (minimálna veľkosť je asi 30 × 30 × 30 cm).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Klietky je potrebné udržiavať pri izbovej teplote alebo v miestnosti so stálym prostredím pri teplote 20 ± 2 °C so svetlou fázou v trvaní 16 hodín (intenzita asi 1 000 luxov) a fázou tmy v trvaní 8 hodín. Je preukázané, že vlhkosť vzduchu nižšia ako 60 % RH môže brániť reprodukcii.
                              
                           
                        Riediaca voda
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Možno použiť akúkoľvek vhodnú prírodnú alebo syntetickú vodu. Bežne sa používa studňová voda, odchlórovaná voda z vodovodu a umelé médiá (napr. Elendtovo médium ‚M4‘ alebo ‚M7‘, pozri ďalej). Pred použitím je potrebné vodu prevzdušniť. V prípade potreby možno kultivačnú vodu obnoviť opatrným odliatím alebo odčerpaním použitej vody z kultivačných nádob bez toho, aby sa poškodili trubice lariev.
                              
                           
                        Kŕmenie lariev
                     
                     
                                 4.
                              
                              
                                 Larvy rodu Chironomus sa kŕmia vločkovým krmivom pre ryby [Tetra Min®, Tetra Phyll® alebo iná podobná značka patentovaného krmiva pre ryby] približným množstvom 250 mg na nádobu na deň. Krmivo sa môže podávať ako suchý rozomletý prášok alebo ako suspenzia vo vode: 1,0 g vločkového krmiva sa pridá do 20 ml riediacej vody a premieša sa, aby sa získala homogénna zmes. Tento prípravok sa môže podávať v množstve približne 5 ml na nádobu na deň (pred použitím pretrepať). Staršie larvy môžu dostávať viac.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Kŕmenie sa upraví podľa kvality vody. Ak sa kultivačné médium zakalí, kŕmenie je potrebné obmedziť. Prídavky do krmiva sa musia starostlivo monitorovať. Nedostatok potravy spôsobí, že larvy sa budú presúvať k vodnému stĺpcu, a prebytok potravy spôsobí zvýšenie činnosti mikróbov a zníženie koncentrácií kyslíka. V obidvoch prípadoch môže dôjsť k zníženiu rastových pomerov.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Pri založení nových kultivačných nádob sa môžu pridať aj bunky niektorých zelených rias (napr. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris).
                              
                           
                        Kŕmenie vykuklených dospelých jedincov
                     
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Z niektorých pokusov vyplýva, že ako potrava pre vykuklené dospelé jedince môže slúžiť vatový tampón napustený nasýteným sacharózovým roztokom.
                              
                           
                        Vykuklenie
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Pri teplote 20 ± 2 °C sa dospelé jedince začnú kukliť z nádoby na chov lariev po približne 13 – 15 dňoch. Samčeky sa ľahko rozlíšia podľa obrvených tykadiel.
                              
                           
                        Vajíčkové masy
                     
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Keď sú v chovnej klietke prítomné dospelé jedince, vo všetkých nádobách na chov lariev je potrebné trikrát do týždňa kontrolovať kladenie želatínových vajíčkových más. Ak sú vajíčkové masy prítomné, opatrne sa odoberú. Mali by sa preniesť na malú misku so vzorkou kultivačnej vody. Vajíčkové masy sa použijú na založenie nových kultivačných nádob (napr. dve až štyri vajíčkové masy na nádobu) alebo sa použijú v testoch toxicity.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Larvy prvého instaru by sa mali vyliahnuť po dvoch až troch dňoch.
                              
                           
                        Založenie nových kultivačných nádob
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Po vytvorení kultúr by malo byť možné založiť novú nádobu na kultiváciu lariev každý týždeň alebo menej často v závislosti od testovacích požiadaviek, pričom staršie nádoby sa po vykuklení dospelých pakomárov odstránia. Týmto spôsobom sa pri minimálnom riadení zabezpečí pravidelné dopĺňanie dospelých jedincov.
                              
                           
                        Príprava testovacích roztokov ‚M4‘ a ‚M7‘
                     
                     
                                 12.
                              
                              
                                 Elendt (1990) opísal médium ‚M4‘. Médium ‚M7‘ sa pripravuje ako médium ‚M4‘ s výnimkou látok označených v tabuľke 1, pre ktoré sú koncentrácie v médiu ‚M7‘ štyrikrát nižšie ako v médiu ‚M4‘. Publikácia o médiu ‚M7‘ je v štádiu prípravy (Elendt, osobná komunikácia). Testovací roztok by sa nemal pripraviť podľa Elendta a Biasa (1990), lebo koncentrácie NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 a K2HPO4 uvedené pre prípravu zásobných roztokov nie sú vhodné.
                              
                           
                        Príprava média ‚M7‘
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Každý zásobný roztok (I) sa pripraví jednotlivo a kombinovaný zásobný roztok (II) sa pripraví z týchto zásobných roztokov (I) (pozri tabuľku 1). Na prípravu média ‚M7‘ sa 50 ml z kombinovaného zásobného roztoku (II) a množstvá každého makronutričného zásobného roztoku uvedené v tabuľke 2 doplnia do jedného litra deionizovanej vody. Vitamínový zásobný roztok sa pripraví pridaním troch vitamínov do deionizovanej vody, ako je uvedené v tabuľke 3, a krátko pred použitím sa do konečného média ‚M7‘ pridá 0,1 ml kombinovaného vitamínového zásobného roztoku. (Vitamínový zásobný roztok sa skladuje zmrazený v malých alikvotných častiach.) Médium sa prevzdušňuje a stabilizuje.
                              
                           
                        LITERATÚRA
                     
                     BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Upravili M. Streloke a H.Köpp. Berlín 1995.
                     
                        Tabuľka 1
                     
                     
                        Zásobné roztoky stopových prvkov pre médiá M4 a M7
                     
                     
                                 Zásobné roztoky (I)
                              
                              
                                 Množstvo (mg) doplnené do jedného litra deionizovanej vody
                              
                              
                                 Na prípravu kombinovaného zásobného roztoku (II) sa zmiešajú tieto množstvá (ml) zásobných roztokov (I) a doplnia sa do jedného litra deionizovanej vody
                              
                              
                                 Konečné koncentrácie v testovacích roztokoch (mg/l)
                              
                           
                                 M4
                              
                              
                                 M7
                              
                              
                                 M4
                              
                              
                                 M7
                              
                           
                                 H3BO3
                                     (15)
                                 
                              
                              
                                 57 190
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 2,86
                              
                              
                                 0,715
                              
                           
                                 MnCl2 · 4 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 7 210
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,361
                              
                              
                                 0,090
                              
                           
                                 LiCl (15)
                                 
                              
                              
                                 6 120
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,306
                              
                              
                                 0,077
                              
                           
                                 RbCl (15)
                                 
                              
                              
                                 1 420
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,071
                              
                              
                                 0,018
                              
                           
                                 SrCl2 · 6 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 3 040
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,152
                              
                              
                                 0,038
                              
                           
                                 NaBr (15)
                                 
                              
                              
                                 320
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,016
                              
                              
                                 0,004
                              
                           
                                 Na2MoO4 · 2 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 1 260
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,063
                              
                              
                                 0,016
                              
                           
                                 CuCl2 · 2 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 335
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,017
                              
                              
                                 0,004
                              
                           
                                 ZnCl2
                                 
                              
                              
                                 260
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,013
                              
                              
                                 0,013
                              
                           
                                 CaCl2 · 6 H2O
                              
                              
                                 200
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,010
                              
                              
                                 0,010
                              
                           
                                 KI
                              
                              
                                 65
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,0033
                              
                              
                                 0,0033
                              
                           
                                 Na2SeO3
                                 
                              
                              
                                 43,8
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,0022
                              
                              
                                 0,0022
                              
                           
                                 NH4VO3
                                 
                              
                              
                                 11,5
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,00058
                              
                              
                                 0,00058
                              
                           
                                 Na2EDTA · 2 H2O (15)
                                     (16)
                                 
                              
                              
                                 5 000
                              
                              
                                 20,0
                              
                              
                                 5,0
                              
                              
                                 2,5
                              
                              
                                 0,625
                              
                           
                                 FeSO4 · 7 H2O (15)
                                     (16)
                                 
                              
                              
                                 1 991
                              
                              
                                 20,0
                              
                              
                                 5,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,249
                              
                           
                        
                     
                        Tabuľka 2
                     
                     
                        Makronutričné zásobné roztoky pre médiá M4 a M7
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 Množstvo doplnené do jedného litra deionizovanej vody
                                 (mg)
                              
                              
                                 Množstvo pridaných makronutričných zásobných roztokov pri príprave médií M4 a M7
                                 (ml/l)
                              
                              
                                 Konečné koncentrácie v testovacích roztokoch M4 a M7
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 CaCl2 · 2 H2O
                              
                              
                                 293 800
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 293,8
                              
                           
                                 MgSO4 · 7 H2O
                              
                              
                                 246 600
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                 123,3
                              
                           
                                 KCl
                              
                              
                                 58 000
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 5,8
                              
                           
                                 NaHCO3
                                 
                              
                              
                                 64 800
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 64,8
                              
                           
                                 NaSiO3 · 9 H2O
                              
                              
                                 50 000
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                 10,0
                              
                           
                                 NaNO3
                                 
                              
                              
                                 2 740
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,274
                              
                           
                                 KH2PO4
                                 
                              
                              
                                 1 430
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,143
                              
                           
                                 K2HPO4
                                 
                              
                              
                                 1 840
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,184
                              
                           
                        
                     
                        Tabuľka 3
                     
                     
                        Vitamínový zásobný roztok pre médiá M4 a M7. Všetky tri vitamínové roztoky sa skombinujú, aby sa vytvoril jeden vitamínový zásobný roztok.
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 Množstvo doplnené do jedného litra deionizovanej vody
                                 (mg)
                              
                              
                                 Množstvo pridaného vitamínového zásobného roztoku pri príprave médií M4 a M7
                                 (ml/l)
                              
                              
                                 Konečné koncentrácie v testovacích roztokoch M4 a M7
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 Tiamín hydrochlorid
                              
                              
                                 750
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,075
                              
                           
                                 Kyanokobalamín (B12)
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,0010
                              
                           
                                 Biotín
                              
                              
                                 7,5
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,00075
                              
                           
                        LITERATÚRA
                     
                     Elendt, B. P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25 – 33.
                     Elendt, B. P., a Bias, W.-R. (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157 – 1167.
                  
                  
                     Dodatok 3
                     PRÍPRAVA UMELO PRIPRAVENÉHO SEDIMENTU
                     
                        Zloženie sedimentu
                     
                     Zloženie umelo pripraveného sedimentu by malo byť takéto:
                     
                                 Zložka
                              
                              
                                 Charakteristika
                              
                              
                                 % suchej hmotnosti
                                 sedimentu
                              
                           
                                 Rašelina
                              
                              
                                 Rašelinníková rašelina, pH čo najbližšie k 5,5 – 6,0, bez viditeľných zvyškov rastlín, jemne rozomletá (veľkosť častíc ≤ 1 mm) a usušená vzduchom
                              
                              
                                 4 – 5
                              
                           
                                 Kremenný piesok
                              
                              
                                 Veľkosť zrniek: > 50 % častíc by malo mať veľkosť v rozsahu 50 – 200 μm
                              
                              
                                 75 – 76
                              
                           
                                 Kaolín
                              
                              
                                 Obsah kaolinitu ≥ 30 %
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                 Organický uhlík
                              
                              
                                 Upravený pridaním rašeliny a piesku
                              
                              
                                 2 (± 0,5)
                              
                           
                                 Uhličitan vápenatý
                              
                              
                                 CaCO3, rozomletý na prach, chemicky čistý
                              
                              
                                 0,05 - 0,1
                              
                           
                                 Voda
                              
                              
                                 Vodivosť ≤ 10 μS/cm
                              
                              
                                 30 - 50
                              
                           
                        Príprava
                     
                     Rašelina sa usuší vzduchom a rozomelie na jemný prášok. V deionizovanej vode sa pomocou vysokovýkonného homogenizačného prístroja pripraví suspenzia požadovaného množstva rašelinového prášku. Hodnota pH tejto suspenzie sa upraví na 5,5 ± 0,5 pomocou CaCO3. Suspenzia sa aspoň na dva dni uvedie do podmienok jemným premiešavaním pri teplote 20 ± 2 °C, aby sa stabilizovala hodnota pH a vytvorila stabilná mikrobiálna zložka. Opäť sa zmeria pH, ktoré by malo byť na úrovni 6,0 ± 0,5. Rašelinová suspenzia sa následne zmieša s ostatnými zložkami (piesok a kaolín) a s deionizovanou vodou, aby sa získal homogénny sediment s obsahom vody v rozsahu 30 - 50 percent suchej hmotnosti sedimentu. Znova sa zmeria hodnota pH konečnej zmesi a podľa potreby sa pomocou CaCO3 upraví na 6,5 – 7,5. Odoberú sa vzorky sedimentu, aby sa určila suchá hmotnosť a obsah organického uhlíka. Následne sa odporúča, aby sa pred použitím v teste toxicity pri pakomároch umelo pripravený sediment uviedol na sedem dní do rovnakých podmienok, aké budú prevládať v nasledujúcom teste.
                     
                        Skladovanie
                     
                     Suché zložky na prípravu umelého sedimentu sa môžu skladovať na suchom a chladnom mieste pri izbovej teplote. Umelo pripravený (mokrý) sediment by sa pred použitím v teste nemal skladovať. Mal by sa použiť hneď po sedemdňovom období uvádzania do podmienok, ktorým sa končí jeho príprava.
                     
                        LITERATÚRA
                     
                     Kapitola C.8 tejto prílohy. Toxicita pre dážďovky.
                     Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10 – 20.
                  
                  
                     Dodatok 4
                     
                        Chemické charakteristiky prijateľnej riediacej vody
                     
                     
                                 Látka
                              
                              
                                 Koncentrácie
                              
                           
                                 Pevné častice
                              
                              
                                 < 20 mg/l
                              
                           
                                 Celkový organický uhlík
                              
                              
                                 < 2 mg/l
                              
                           
                                 Neionizovaný amoniak
                              
                              
                                 < 1 μg/l
                              
                           
                                 Tvrdosť ako CaCO3
                                 
                              
                              
                                 < 400 mg/l (17)
                                 
                              
                           
                                 Zostatkový chlór
                              
                              
                                 < 10 μg/l
                              
                           
                                 Celkové organofosfátové pesticídy
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Celkové organochlórované pesticídy plus polychlórované bifenyly
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Celkový organický chlór
                              
                              
                                 < 25 ng/l
                              
                           
                  
                     Dodatok 5
                     
                        Usmernenie k monitorovaniu vykuklenia lariev pakomárov
                     
                     Na testovacie kadičky sa umiestnia pasce na vykuklené jedince. Tieto pasce sú potrebné odo dňa 20 do skončenia testu. Ďalej je znázornený príklad použitej pasce.
                     
                        
                     A: nylonová sieťka
                     B: prevrátené umelohmotné misky
                     C: expozičná kadička bez okraja
                     D: sieťované otvory na výmenu vody
                     E: voda
                     F: sediment
                  
                  C. 28.   TEST TOXICITY CHIRONOMIDAE V SYSTÉME SEDIMENT – VODA ZA POUŽITIA OBOHATENEJ VODY
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda je rovnocenná s OECD TG 219 (2004). Táto testovacia metóda bola vypracovaná s cieľom hodnotiť účinky predĺženého pôsobenia chemikálií na vodné larvy dvojkrídlovcov rodu Chironomus žijúce v sedimente. Vychádza najmä z usmernenia BBA, ktoré používa testovací systém sediment – voda s umelou pôdou a expozičným scenárom vo vodnom stĺpci (1). Zohľadňuje aj existujúce protokoly o testoch toxicity na Chironomus riparius a Chironomus tentans, ktoré boli vypracované v Európe a Severnej Amerike (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) a boli podrobené kruhovým testom (1) (6) (9). Môžu sa použiť aj iné dobre zdokumentované druhy pakomárov, napr. Chironomus yoshimatsui (10) (11).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Expozičný scenár použitý v tejto testovacej metóde je obohacovanie vody. Výber vhodného expozičného scenára závisí od plánovaného použitia testu. Vodný expozičný scenár zahŕňajúci obohatenie vodného stĺpca je určený na simuláciu prípadu pesticídneho postreku a zahŕňa počiatočné maximálne koncentrácie v pórovej vode. Je užitočný aj pri iných druhoch expozície (vrátane chemických únikov) s výnimkou akumulačných procesov, ktoré trvajú dlhšie ako testovacie obdobie.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Látky, ktoré je potrebné testovať na organizmoch žijúcich v sedimente, zvyčajne pretrvajú v tomto kompartmente dlhý čas. Organizmy žijúce v sedimente môžu byť exponované viacerými spôsobmi. Relatívny význam každého spôsobu expozície a časové obdobie, v ktorom sa každý z nich podieľa na celkových toxických účinkoch, závisí od fyzikálno-chemických vlastností danej chemikálie. V prípade silno adsorbujúcich látok (napr. s log Kow > 5) alebo látok, ktoré sa kovalentne viažu na sediment, môže byť významným spôsobom expozície prijímanie kontaminovanej potravy. S cieľom vyhnúť sa podhodnoteniu toxicity vysokolipofilných látok možno zvážiť použitie potravy pridanej do sedimentu pred aplikáciou testovanej látky. S cieľom zohľadniť všetky potenciálne spôsoby expozície sa táto testovacia metóda zameriava na dlhodobú expozíciu. Trvanie testu je v rozsahu 20 – 28 dní v prípade druhov C. riparius a C. yoshimatsui a 28 – 65 dní pri C. tentans. Ak sú na špecifické účely potrebné krátkodobé údaje, napríklad s cieľom skúmať účinky nestabilných chemikálií, môžu sa po desiatich dňoch odstrániť ďalšie replikáty.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Meranými parametrami sú celkový počet vykuklených dospelých jedincov a čas do vykuklenia. Ak sú potrebné ďalšie krátkodobé údaje, odporúča sa vykonať merania prežitia a rastu lariev až po desiatich dňoch s použitím ďalších replikátov podľa potreby.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Odporúča sa použiť umelo pripravený sediment. Umelo pripravený sediment má oproti prírodným sedimentom niekoľko výhod:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          zníži sa variabilita testu, lebo umelo pripravený sediment vytvára reprodukovateľnú ‚štandardizovanú matricu‘, a odstráni sa potreba nájsť nekontaminované a čisté zdroje sedimentu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          testy je možné začať kedykoľvek bez problému sezónnej variability v testovanom sedimente a nie je potrebné sediment predpripraviť, aby sa odstránila pôvodná fauna. Použitie umelo pripraveného sedimentu takisto znižuje náklady spojené s odberom dostatočných množstiev sedimentu v teréne na rutinné testovanie,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          použitie umelo pripraveného sedimentu umožňuje porovnanie toxicity a následné zatriedenie látok: údaje o toxicite z testov s prírodnými a umelými sedimentmi boli v prípade viacerých chemikálií porovnateľné (2).
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              Vymedzenie pojmov je uvedené v dodatku 1.
                           
                        PRINCÍP TESTU
                  
                              7.
                           
                           
                              Larvy pakomárov v prvom instare sú exponované rozsahu koncentrácií testovanej látky v systémoch sediment – voda. Test sa začne umiestnením lariev v prvom instare do testovacích kadičiek obsahujúcich systém sediment – voda a následne obohatením vody testovanou látkou. Na konci testu sa meria vykuklenie pakomárov a vývojový pomer. Podľa potreby sa môže po desiatich dňoch merať aj prežitie a hmotnosť lariev (pomocou ďalších replikátov podľa potreby). Tieto údaje sa analyzujú buď prostredníctvom regresného modelu na odhadnutie koncentrácie, ktorá by spôsobila x % pokles vo vykuklení, prežívaní lariev alebo raste (napr. EC15, EC50 atď.), alebo prostredníctvom testovania štatistickej hypotézy na stanovenie koncentrácie NOEC/LOEC. Pri druhom spôsobe je potrebné pomocou štatistických testov porovnať hodnoty účinkov s kontrolnými hodnotami.
                           
                        INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE
                  
                              8.
                           
                           
                              Je potrebné poznať rozpustnosť testovanej látky vo vode, jej tlak pary, namerané alebo vypočítané delenie na sediment a stabilitu vo vode a v sedimente. Mala by byť k dispozícii spoľahlivá analytická metóda so známou a zdokumentovanou presnosťou a detekčným limitom na kvantifikáciu testovanej látky v nadložnej vode, pórovej vode a sedimente. Medzi užitočné informácie patrí štrukturálny vzorec a čistota testovanej látky. Užitočnou informáciou je aj chemický osud testovanej chemikálie (napr. rozptýlenie, abiotická a biotická degradácia atď.). Ďalšie informácie pre testované látky s fyzikálno-chemickými vlastnosťami, ktoré sťažujú ich testovanie, sú uvedené v odkaze (12).
                           
                        REFERENČNÉ CHEMIKÁLIE
                  
                              9.
                           
                           
                              Referenčné chemikálie sa môžu testovať pravidelne ako prostriedok na zabezpečenie spoľahlivosti testovacieho protokolu a testovacích podmienok. Príkladmi referenčných toxických látok, ktoré sa úspešne používajú v kruhových testoch a overovacích štúdiách, sú: lindán, trifluralín, pentachlórfenol, chlorid kademnatý a chlorid draselný (1) (2) (5) (6) (13).
                           
                        PLATNOSŤ TESTU
                  
                              10.
                           
                           
                              Aby bol test platný, musí spĺňať tieto podmienky:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          vykuklenie v kontrolných skupinách musí byť na konci testu na úrovni minimálne 70 % (1) (6),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          vykuklenie druhov C. riparius a C. yoshimatsui na dospelé jedince z kontrolných nádob by malo nastať 12 – 23 dní po ich vložení do nádob. V prípade druhu C. tentans je potrebné obdobie 20 – 65 dní,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          na konci testu je potrebné zmerať v každej nádobe pH a koncentráciu rozpusteného kyslíka. Koncentrácia kyslíka by pri použitej teplote mala predstavovať najmenej 60 % saturačnej hodnoty vzduchom (ASV) a hodnota pH nadložnej vody by vo všetkých testovacích nádobách mala byť v rozmedzí 6 – 9,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          teplota vody by sa nemala líšiť o viac ako ± 1,0 °C. Teplotu vody je možné kontrolovať pomocou izotermickej komory a v tom prípade je potrebné v primeraných časových intervaloch potvrdiť teplotu v komore.
                                       
                                    
                        OPIS METÓDY
                  
                     Testovacie nádoby
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Štúdia sa vykonáva v sklenených kadičkách s objemom 600 ml a s priemerom 8 cm. Sú vhodné aj iné nádoby, ale musia zaručiť vhodnú hĺbku nadložnej vody a sedimentu. Povrch sedimentu by mal byť dostatočne veľký, aby poskytoval 2 – 3 cm2 priestoru na larvu. Pomer hĺbky vrstvy sedimentu k hĺbke nadložnej vody by mal byť 1: 4. Testovacie nádoby a iné prístroje, ktoré prichádzajú do styku s testovacím systémom, by mali byť vyrobené výlučne zo skla alebo iného chemicky inertného materiálu (napr. teflónu).
                           
                        
                     Výber druhov
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Uprednostňovaným druhom na použitie v teste je Chironomus riparius. Chironomus tentans je takisto vhodný, ale je náročnejší na starostlivosť a vyžaduje si dlhšie trvanie testu. Možno použiť aj Chironomus yoshimatsui. Podrobné informácie o kultivačných metódach v prípade druhu Chironomus riparius sú uvedené v dodatku 2. Informácie o kultivačných podmienkach sú k dispozícii aj pre iné druhy, t. j. Chironomus tentans (4) a Chironomus yoshimatsui (11). Identifikácia druhov musí byť pred testovaním potvrdená, ale nevyžaduje sa pred každým testom, ak organizmy pochádzajú z internej kultúry.
                           
                        
                     Sediment
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Uprednostňuje sa použitie umelo pripraveného sedimentu (známeho aj pod názvom rekonštituovaný, umelý alebo syntetický sediment). Ak sa však použije prírodný sediment, je potrebné ho charakterizovať (aspoň pH, obsah organického uhlíka, odporúča sa aj stanovenie ostatných parametrov ako pomer C/N a granulometria) a nemal by obsahovať žiadne kontaminanty ani iné organizmy, ktoré by mohli s pakomármi súperiť alebo ich požierať. Takisto sa odporúča, aby bol prírodný sediment pred použitím v teste toxicity pri pakomároch na sedem dní uvedený do podmienok, ktoré budú prevládať v nasledujúcom teste. V tomto teste (1) (15) (16) sa odporúča použiť nasledujúci umelo pripravený sediment založený na umelej pôde použitej v testovacej metóde C.8 (14):
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          4 – 5 % (suchá hmotnosť) rašeliny: čo najbližšie k pH 5,5 – 6,0. Je dôležité použiť rašelinu v práškovej forme, jemne rozomletú (veľkosť častíc ≤ 1 mm) a sušenú iba vzduchom;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          20 % (suchá hmotnosť) kaolínu (obsah kaolinitu podľa možnosti nad 30 %);
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          75 – 76 % (suchá hmotnosť) kremenného piesku (mal by prevládať jemný piesok s viac ako 50 % častíc s veľkosťou od 50 do 200 μm);
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          deionizovaná voda sa pridá, aby sa dosiahla vlhkosť konečnej zmesi v rozsahu 30 – 50 %;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          uhličitan vápenatý chemicky čistej kvality (CaCO3) sa pridá, aby sa pH konečnej zmesi sedimentu upravila na 7,0 ± 0,5;
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          obsah organického uhlíka v konečnej zmesi by mal byť 2 % (± 0,5 %) a je potrebné ho upraviť pomocou primeraného množstva rašeliny a piesku podľa písmen a) a c).
                                       
                                    
                        
                              14.
                           
                           
                              Zdroj rašeliny, kaolínu a piesku by mal byť známy. Je potrebné skontrolovať, či zložky sedimentu neobsahujú chemické kontaminanty (napr. ťažké kovy, organochlórové zlúčeniny, organofosforové zlúčeniny atď.). Príklad prípravy umelo pripraveného sedimentu je uvedený v dodatku 3. Miešanie suchých zložiek je takisto prípustné, ak sa preukáže, že po pridaní nadložnej vody nedochádza k separácii zložiek sedimentu (napr. k vyplaveniu častíc rašeliny) a že rašelina alebo sediment sú v dostatočnej miere uvedené do podmienok.
                           
                        
                     Voda
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Každá voda, ktorá vyhovuje chemickým charakteristikám prijateľnej riediacej vody podľa zoznamu uvedeného v dodatkoch 2 a 4, je vhodná ako testovacia voda. Každá vhodná voda, prírodná voda (povrchová alebo podzemná voda), rekonštituovaná voda (pozri dodatok 2) alebo odchlórovaná voda z vodovodu sú prijateľné ako voda na kultiváciu a testovacia voda, ak v nej pakomáre prežijú počas celej kultivácie a testovania bez príznakov stresu. Na začiatku testu by pH testovacej vody mala mať hodnotu medzi 6 a 9 a celková tvrdosť by nemala byť vyššia ako 400 mg/l pre CaCO3. Ak však existuje podozrenie na interakciu medzi iónmi tvrdosti a testovanou látkou, mala by sa použiť voda s nižšou tvrdosťou (a v takom prípade sa teda nesmie použiť Elendtovo médium M4). Počas celej štúdie by sa mal používať rovnaký druh vody. Charakteristiky kvality vody uvedené v dodatku 4 by sa mali merať najmenej dvakrát za rok, alebo ak existuje podozrenie, že sa tieto charakteristiky mohli významne zmeniť.
                           
                        
                     Zásobné roztoky – obohatená voda
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Testovacie koncentrácie sa vypočítajú na základe koncentrácií vo vodnom stĺpci, t. j. vody nad sedimentom. Testovacie roztoky vybratých koncentrácií sa zvyčajne pripravujú zriedením zásobného roztoku. Zásobné roztoky sa podľa možnosti pripravujú rozpustením testovanej látky v testovacom médiu. V niektorých prípadoch môže byť na vytvorenie vhodne koncentrovaného zásobného roztoku potrebné použiť rozpúšťadlá alebo disperzné činidlá. Príkladmi vhodných rozpúšťadiel sú acetón, etanol, metanol, etylénglykolmonoetyléter, etylénglykoldimetyléter, dimetylformamid a trietylénglykol. Ako disperzné činidlá možno použiť Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % metylcelulózu a HCO-40. Koncentrácia látky zvyšujúcej rozpustnosť v konečnom testovacom médiu by mala byť minimálna (t. j. ≤ 0,1 ml/l) a mala by byť vo všetkých pokusoch rovnaká. Ak sa použije látka zvyšujúca rozpustnosť, nesmie mať žiadne signifikantné účinky na prežívanie ani žiaden viditeľný škodlivý účinok na larvy pakomárov, aké sa preukázali pri kontrole s rozpúšťadlom. Je však potrebné vynaložiť maximálne úsilie, aby sa predišlo použitiu týchto materiálov.
                           
                        KONCEPCIA TESTU
                  
                              17.
                           
                           
                              Koncepcia testu sa vzťahuje na výber počtu a odstup testovaných koncentrácií, počet nádob pri každej koncentrácii a počet lariev v každej nádobe. Sú tu opísané koncepcie na odhadnutie bodu EC, na odhadnutie koncentrácie NOEC a na vykonanie limitného testu. Uprednostňuje sa regresná analýza pred testovaním hypotéz.
                           
                        
                     Koncepcia regresnej analýzy
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Účinná koncentrácia (napr. EC15, EC50) a koncentračný rozsah, v ktorom sa skúmajú účinky testovanej látky, sa merajú koncentráciami zahrnutými do testu. Vo všeobecnosti sú presnosť a najmä platnosť, s ktorou možno odhadovať účinné koncentrácie (ECx), lepšie, ak je účinná koncentrácia v rozsahu testovaných koncentrácií. Je potrebné vyhýbať sa extrapolácii hlboko pod najnižšou pozitívnou koncentráciou alebo nad najvyššou koncentráciou. Pri výbere rozsahu koncentrácií, ktoré sa použijú, je užitočný predbežný test na zistenie rozsahu (pozri odsek 27).
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Ak je potrebné odhadnúť ECx, malo by sa testovať najmenej päť koncentrácií a tri replikáty pre každú koncentráciu. V každom prípade je vhodné použiť dostatočné testovacie koncentrácie, ktoré umožnia dobrý modelový odhad. Faktor medzi koncentráciami by nemal byť väčší ako 2 (v prípadoch, keď má krivka závislosti reakcie od dávky plytký sklon, možno urobiť výnimku). Počet replikátov pri každej aplikácii sa môže znížiť, ak sa zvýši počet testovacích koncentrácií s rozdielnymi reakciami. Zvýšenie počtu replikátov alebo skrátenie dĺžky intervalov testovacích koncentrácií zvyčajne vedie k nižším intervalom spoľahlivosti testu. Ak sa odhaduje desaťdňové prežívanie a rast lariev, sú potrebné ďalšie replikáty.
                           
                        
                     Koncepcia odhadu NOEC/LOEC
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Ak sa odhadujú koncentrácie NOEC/LOEC, použije sa päť testovacích koncentrácií s najmenej štyrmi replikátmi a faktor medzi koncentráciami by nemal byť vyšší ako dva. Počet replikátov by mal byť dostatočný, aby sa zabezpečila primeraná štatistická výpovedná hodnota na zistenie rozdielu 20 % pri kontrole pri úrovni významnosti 5 % (p = 0,05). V prípade vývojového pomeru je zvyčajne vhodná analýza rozptylu (ANOVA), ako napríklad Dunnettov test a Williamsov test (17) (18) (19) (20). Pri pomere vykuklenia možno použiť Cochranov-Armitageho, Fisherov exaktný (s Bonferroniho korekciou) alebo Mantelov-Haenszelov test.
                           
                        
                     Limitný test
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Môže sa vykonať limitný test (jedna testovaná koncentrácia a kontrola), ak v predbežnom teste na zistenie rozsahu neboli pozorované žiadne účinky. Účelom limitného testu je ukázať, že toxická hodnota testovanej látky je väčšia ako testovaná limitná koncentrácia. V tejto testovacej metóde nemožno navrhnúť odporúčanú koncentráciu. Toto rozhodnutie je na posúdení regulačného orgánu. Zvyčajne je na aplikáciu aj kontrolu potrebných najmenej šesť replikátov. Je nutné preukázať primeranú štatistickú výpovednú hodnotu na zistenie rozdielu 20 % pri kontrole pri úrovni významnosti 5 % (p = 0,05). V prípade metrickej reakcie (vývojový pomer a hmotnosť) je vhodnou štatistickou metódou t-test, pokiaľ údaje spĺňajú požiadavky tohto testu (normalita, homogénne rozptyly). Ak tieto požiadavky nie sú splnené, môže sa použiť t-test nerovnomerných rozptylov alebo neparametrický test, ako napríklad Wilcoxonov-Mannov-Whitheyho test. Pri pomere vykuklenia je vhodný Fisherov exaktný test.
                           
                        POSTUP
                  
                     Podmienky expozície
                  
                  
                     Príprava systému obohatená voda – sediment
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Do testovacích nádob sa pridajú primerané množstvá umelo pripraveného sedimentu (pozri odseky 13 – 14 a dodatok 3), aby sa vytvorila vrstva hrubá najmenej 1,5 cm. Voda sa pridá do výšky 6 cm (pozri odsek 15). Pomer výšky vrstvy sedimentu a výšky vody by nemal presiahnuť 1: 4, pričom vrstva sedimentu by nemala byť hrubšia ako 3 cm. Systém sediment – voda by sa mal pred pridaním testovacích organizmov nechať jemne prevzdušňovať počas siedmich dní (pozri odsek 14 a dodatok 3). S cieľom zabrániť separácii zložiek sedimentu a resuspendovaniu jemného materiálu počas pridávania testovacej vody do vodného stĺpca môže byť sediment v čase, keď sa naň nalieva voda, prikrytý umelohmotným kotúčom, ktorý sa hneď potom odstráni. Môže byť vhodné aj použitie iných prístrojov.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Testovacie nádoby sa zakryjú (napr. sklenenými platňami). V prípade potreby sa počas štúdie dopĺňajú hladiny vody na pôvodný objem s cieľom kompenzovať vyparovanie vody. Na tento účel sa použije destilovaná alebo deionizovaná voda, aby sa predišlo hromadeniu solí.
                           
                        
                     Pridanie testovacích organizmov
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Štyri až päť dní pred pridaním testovacích organizmov do testovacích nádob sa z kultúr odoberú vajíčkové masy a umiestnia sa do malých nádob s kultivačných médiom. Môže sa použiť staršie médium zo zásobnej kultúry alebo čerstvo pripravené médium. Ak sa použije čerstvo pripravené kultivačné médium, je potrebné doň pridať malé množstvo potravy, napr. zelené riasy a/alebo pár kvapiek filtrátu z jemne rozomletej suspenzie vločkového krmiva pre ryby (pozri dodatok 2). Použijú sa iba čerstvo nakladené vajíčkové masy. Larvy sa zvyčajne začnú liahnuť niekoľko dní po nakladení vajíčok (dva až tri dni v prípade druhu Chironomus riparius pri teplote 20 °C a jeden až štyri dni v prípade Chironomus tentans pri teplote 23 °C a Chironomus yoshimatsui pri teplote 25 °C) a rast lariev prebieha v štyroch instaroch, z ktorých každý trvá štyri až osem dní. V teste sa použijú larvy prvého instaru (dva až tri alebo jeden až štyri dni po vyliahnutí). Instar pakomárov je možné skontrolovať podľa šírky hlavového segmentu (6).
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Larvy 21. instaru sa pomocou tupej pipety náhodne rozdelia do jednotlivých testovacích nádob obsahujúcich obohatený sediment a vodu. Prevzdušňovanie vody je nutné počas pridávania lariev do testovacích nádob prerušiť a musí byť pozastavené počas ďalších 24 hodín po pridaní lariev (pozri odseky 24 a 32). Podľa použitej koncepcie testu (pozri odseky 19 a 20) je počet lariev použitých pri každej koncentrácii najmenej 60 na odhad bodu EC a 80 na stanovenie koncentrácie NOEC.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Dvadsaťštyri hodín po pridaní lariev sa do nadložného vodného stĺpca pridá testovaná látka a opäť sa začne s jemným prevzdušňovaním. Pod povrch vody sa pomocou pipety aplikujú malé množstvá roztokov testovanej látky. Nadložná voda sa potom opatrne premieša, aby sa nenarušil sediment.
                           
                        
                     Testovacie koncentrácie
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Pri určovaní rozsahu koncentrácií pre konečný test môže byť užitočný test na zistenie rozsahu. Na tento účel sa použije súbor koncentrácií testovanej látky s veľkými odstupmi. S cieľom zabezpečiť rovnakú hustotu povrchu na pakomára, ktorá sa použije pri konečnom teste, sú pakomáre vystavené každej koncentrácii testovanej látky na obdobie, ktoré umožňuje odhad vhodných testovacích koncentrácií, pričom nie sú potrebné žiadne replikáty.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Testovacie koncentrácie pre konečný test sa vyberú na základe výsledkov testu na zistenie rozsahu. Je potrebné použiť a vybrať najmenej päť koncentrácií, ako sa uvádza v odsekoch 18 – 20.
                           
                        
                     Kontroly
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Súčasťou testu sú kontrolné nádoby bez prítomnosti testovanej látky, ktoré však obsahujú sediment, a primeraný počet replikátov (pozri odseky 19 – 20). Ak sa pri aplikácii testovanej látky použije rozpúšťadlo (pozri odsek 16), je potrebné pridať kontrolu rozpúšťadla v sedimente.
                           
                        
                     Testovací systém
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Použijú sa statické systémy. Vo výnimočných prípadoch sa môžu použiť semistatické alebo prietokové systémy s prerušovaným alebo nepretržitým obmieňaním nadložnej vody, napríklad ak sú špecifikácie kvality vody nevhodné pre testovacie organizmy alebo ak ovplyvňujú chemickú rovnováhu (napr. úrovne rozpusteného kyslíka príliš klesnú, koncentrácia vylučovaných produktov príliš stúpne alebo sa zo sedimentu lúhujú minerály, čo má vplyv na pH a/alebo tvrdosť vody). Zvyčajne však postačujú a uprednostňujú sa iné metódy zlepšenia kvality nadložnej vody, ako napríklad prevzdušňovanie.
                           
                        
                     Potrava
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Je nevyhnutné larvy kŕmiť podľa možnosti každý deň alebo najmenej trikrát do týždňa. V prvých desiatich dňoch je pre mladé larvy podľa všetkého vhodné krmivo pre ryby (suspenzia vo vode alebo jemne rozomletá potrava, napr. Tetra-Min alebo Tetra-Phyll, bližšie informácie pozri v dodatku 2) v dennom množstve 0,25 – 0,5 mg (0,35 – 0,5 mg pre druh C. yoshimatsui) na jednu larvu. Pre staršie larvy môže byť potrebné o niečo väčšie množstvo potravy: denné množstvo 0,5 – 1 mg na jednu larvu by malo po zvyšok testu postačovať. Ak sa pozoruje rast hubovitých organizmov alebo ak sa v kontrolných nádobách pozoruje mortalita, prídel potravy by sa mal vo všetkých testovacích a kontrolných nádobách znížiť. Ak nie je možné vznik hubovitých organizmov zastaviť, test je nutné opakovať. Pri testovaní silno adsorbujúcich látok (napr. s log Kow > 5) alebo látok, ktoré sa kovalentne viažu na sediment, sa môže do umelo pripraveného sedimentu pred stabilizačným obdobím pridať množstvo potravy potrebné na zabezpečenie prežitia a prirodzeného rastu organizmov. Na tento účel sa namiesto krmiva pre ryby musí použiť rastlinný materiál, napr. sa môže pridať 0,5 % (suchá hmotnosť) jemne rozomletých listov napr. pŕhľavy dvojdomej (Urtica dioica), moruše (Morus alba), ďateliny plazivej (Trifolium repens), špenátu (Spinacia oleracea) alebo iného rastlinného materiálu (Cerophyl alebo alfa celulóza).
                           
                        
                     Podmienky inkubácie
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Najlepšie po 24 hodinách od pridania lariev sa zabezpečí jemné prevzdušňovanie nadložnej vody v testovacích nádobách a pokračuje v ňom počas celého testu (treba dbať na to, aby koncentrácia rozpusteného kyslíka neklesla pod 60 % ASV). Prevzdušňovanie sa zabezpečí pomocou sklenenej Pasteurovej pipety upevnenej 2 – 3 cm nad vrstvou sedimentu (t. j. jedna alebo niekoľko bublín za sekundu). Ak sa testujú prchavé chemikálie, možno zvážiť, že systém sediment – voda sa nebude prevzdušňovať.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Test sa vykonáva pri konštantnej teplote 20 °C (± 2 °C). V prípade druhu C. tentans sa odporúča teplota 23 °C a v prípade C. yoshimatsui 25 °C (± 2 °C). Použije sa 16-hodinová svetlá fáza, pričom intenzita svetla by mala byť 500 – 1 000 luxov.
                           
                        
                     Trvanie expozície
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Expozícia sa začne pridaním lariev do obohatených a kontrolných nádob. Maximálna dĺžka expozície je 28 dní v prípade druhov C. riparius a C. yoshimatsui a 65 dní v prípade C. tentans. Ak sa pakomáre vykuklia skôr, test sa môže ukončiť najskôr päť dní po vykuklení posledného dospelého jedinca v kontrolnej skupine.
                           
                        POZOROVANIA
                  
                     Vykuklenie
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Určí sa čas vývoja a celkový počet úplne vykuklených samčích a samičích pakomárov. Samčeky sa ľahko identifikujú podľa obrvených tykadiel.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Testovacie nádoby je potrebné pozorovať najmenej trikrát do týždňa s cieľom vizuálne zhodnotiť každé abnormálne správanie (napr. opúšťanie sedimentu, nezvyčajné plávanie) v porovnaní s kontrolnou skupinou. Počas obdobia očakávaného vykuklenia je nevyhnutné každý deň spočítať vykuklené pakomáre. Pohlavie a počet úplne vykuklených pakomárov sa zaznamenáva denne. Po identifikácii sa pakomáre vyberú z nádob. Všetky vajíčkové masy nakladené pred ukončením testu sa zaznamenajú a následne odstránia, aby sa predišlo opätovnému zavedeniu lariev do sedimentu. Takisto sa zaznamená počet viditeľných kukiel, ktoré sa nevykuklili. Usmernenie k meraniu vykuklenia je uvedené v dodatku 5.
                           
                        
                     Rast a prežívanie
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Ak je potrebné získať údaje o desaťdňovom prežívaní a raste lariev, na začiatku sa pripravia ďalšie testovacie nádoby tak, aby sa mohli následne použiť. Sediment z týchto ďalších nádob sa precedí pomocou cedidla s hrúbkou 250 μm, aby sa zachytili larvy. Kritériami na stanovenie smrti sú nehybnosť alebo chýbajúca reakcia na mechanický podnet. Stratené larvy sa takisto počítajú medzi mŕtve (larvy, ktoré uhynuli na začiatku testu, sa mohli rozložiť pôsobením mikróbov). Určí sa suchá hmotnosť (bez popola) lariev, ktoré prežili v každej testovacej nádobe, a vypočíta sa stredná suchá hmotnosť jedincov na jednu nádobu. Je užitočné určiť, do ktorého instaru patria larvy, ktoré prežili. Na toto meranie sa môže použiť šírka hlavového segmentu každého jedinca.
                           
                        
                     Analytické merania
                  
                  
                     Koncentrácia testovanej látky
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Vzorky nadložnej vody, pórovej vody a sedimentu sa musia analyzovať minimálne na začiatku (najlepšie jednu hodinu po aplikácii testovanej látky) a na konci testu pri najvyššej koncentrácii a pri jednej nižšej koncentrácii. Tieto skúmania koncentrácie testovanej látky poskytujú informácie o správaní/delení testovanej látky v systéme voda – sediment. Odoberanie vzoriek na začiatku testu môže ovplyvniť testovací systém (napr. odstránenie testovaných lariev), preto je potrebné použiť ďalšie testovacie nádoby, aby bolo podľa potreby možné vykonať analytické vyšetrenia na začiatku a počas testu (pozri odsek 39). Merania v sedimente nemusia byť potrebné, ak sa delenie testovanej látky medzi vodu a sediment jednoznačne určilo v štúdii voda/sediment pri porovnateľných podmienkach (napr. pomer sedimentu k vode, druh aplikácie, obsah organického uhlíka v sedimente).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Ak sa vykonajú prostredné merania (napr. v deň 7) a ak sú na analýzu potrebné veľké vzorky, ktoré nemožno odobrať z testovacích nádob bez ovplyvnenia testovacieho systému, analytické vyšetrenia je potrebné vykonať na vzorkách z ďalších testovacích nádob, s ktorými sa zaobchádzalo rovnakým spôsobom (vrátane prítomnosti testovacích organizmov), ale ktoré sa nepoužijú na biologické pozorovania.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Na izolovanie intersticiálnej vody je odporúčaným postupom odstredenie napr. pri 10 000 g a 4 °C počas 30 minút. Ak sa však preukáže, že testovaná látka sa na filtroch neadsorbuje, môže byť prijateľná aj filtrácia. V niektorých prípadoch nemusí byť možné analyzovať koncentrácie v pórovej vode, lebo vzorka je príliš malá.
                           
                        
                     Fyzikálno-chemické parametre
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Je potrebné vhodným spôsobom odmerať pH, rozpustený kyslík v testovacej vode a teplotu v testovacích nádobách (pozri odsek 10). Tvrdosť a amoniak sa merajú v kontrolných nádobách a v jednej testovacej nádobe pri najvyššej koncentrácii na začiatku a na konci testu.
                           
                        ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV
                  
                     Spracovanie výsledkov
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Účelom tohto testu je určiť účinok testovanej látky na vývojový pomer a celkový počet úplne vykuklených samčích a samičích pakomárov, alebo v prípade desaťdňového testu účinky na prežívanie a hmotnosť lariev. Ak nič nepoukazuje na štatisticky rozdielnu vnímavosť medzi pohlaviami, výsledky pre samčeky a samičky možno na účely štatistických analýz zhrnúť spoločne. Rozdiely vnímavosti medzi pohlaviami sa môžu štatisticky posúdiť, napr. tabuľkovým testom χ2 – r × 2. Prežívanie lariev a stredná suchá hmotnosť jedincov na jednu nádobu sa podľa potreby musí určiť po desiatich dňoch.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Účinné koncentrácie vyjadrené ako koncentrácie v nadložnej vode sa podľa možnosti vypočítajú na základe nameraných koncentrácií na začiatku testu (pozri odsek 38).
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Na vyčíslenie odhadu bodu EC50 alebo akejkoľvek inej hodnoty ECx sa ako pravé replikáty môže použiť štatistika na jednu nádobu. Pri výpočte intervalu spoľahlivosti pre každú hodnotu ECx je potrebné zohľadniť variabilitu medzi nádobami alebo je nutné preukázať, že táto variabilita je taká malá, že je možné ju ignorovať. Ak sa model upraví metódou najmenších štvorcov, v štatistike na jednu nádobu je potrebné aplikovať transformáciu, aby sa zlepšila homogénnosť rozptylu. Hodnoty ECx by sa však mali vypočítať po tom, ako sa reakcia transformuje naspäť na pôvodnú hodnotu.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Ak je cieľom štatistickej analýzy určenie koncentrácie NOEC/LOEC prostredníctvom testovania hypotézy, je potrebné zohľadniť variabilitu medzi nádobami, napr. pomocou hierarchickej analýzy ANOVA. Alternatívne môžu byť vhodné podrobnejšie testy (21) v prípadoch, keď dochádza k nedodržaniu zvyčajných predpokladov analýzy ANOVA.
                           
                        
                     Pomer vykuklenia
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Pomery vykuklenia sú kvantové údaje a môžu sa analyzovať pomocou Cochranovho-Armitageho testu aplikovaného zostupne v prípadoch, keď sa očakáva monotónna reakcia na dávku a tieto údaje zodpovedajú tomuto očakávaniu. Ak tomu tak nie je, možno použiť Fisherov exaktný test alebo Mantzelov-Haentzalov test s Bonferroniho-Holmovou úpravou hodnôt p. Ak sa medzi replikátmi pri rovnakej koncentrácii preukáže väčšia variabilita, než akú by indikovala binomická distribúcia (často sa uvádza ako ‚extra-binomická‘ variácia), potom by sa mal použiť podrobný Cochranov-Armitageho test alebo Fisherov exaktný test, ako sa navrhuje v bode (21).
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Určí sa súčet pakomárov vykuklených na jednu nádobu, ne, a vydelí sa počtom zavedených lariev, na:
                              
                                 
                              kde:
                              
                                          ER
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          pomer vykuklenia,
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          počet pakomárov vykuklených na nádobu,
                                       
                                    
                                          na
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          počet zavedených lariev na nádobu.
                                       
                                    
                        
                              48.
                           
                           
                              Najvhodnejšou alternatívou pri veľkých vzorkách v prípadoch extra binomickej variácie je brať pomer vykuklenia (ER) ako nepretržitú reakciu a použiť postupy, ako je napríklad Williamsov test, ak sa očakáva monotónna reakcia na dávku, ktorá je konzistentná s týmito údajmi o ER. Ak reakcia nie je monotónna, je vhodný Dunnettov test. Za veľkú vzorku sa pokladá vzorka, v ktorej je počet vykuklených aj počet nevykuklených jedincov v každom replikáte (nádobe) vyšší ako päť.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Pri aplikovaní metód ANOVA je potrebné najskôr transformovať hodnoty ER pomocou arkussínusovej transformácie druhej odmocniny alebo Freemanovej-Tukeyho transformácie s cieľom získať približnú normálnu distribúciu a vyrovnať rozptyly. Cochranov-Armitageho test, Fisherov exaktný (Bonferroniho) test alebo Mantelov-Haenszelov test možno aplikovať, ak sa použijú absolútne frekvencie. Arkussínusová transformácia druhej odmocniny sa aplikuje pomocou prevrátenej hodnoty sínusu (sin–1) druhej odmocniny ER.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Pri pomeroch vykuklenia sa hodnoty ECx vypočítajú pomocou regresnej analýzy (alebo napr. pomocou modelov probit (22), logit, Weibull, vhodného komerčného softvéru atď.). Ak je regresná analýza neúspešná (napr. ak sú k dispozícii menej ako dve čiastkové reakcie), použijú sa iné neparametrické metódy, ako je metóda pohyblivého priemeru alebo jednoduchá interpolácia.
                           
                        
                     Vývojový pomer
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Stredný vývojový čas predstavuje stredné časové rozpätie medzi zavedením lariev (deň 0 testu) a vykuklením pokusnej kohorty pakomárov. (Pri výpočte reálneho vývojového času sa zohľadní vek lariev v čase zavedenia). Vývojový pomer je prevrátená hodnota vývojového času (jednotka: 1/deň) a predstavuje časť vývinu lariev, ktorá prebieha za deň. Pri hodnotení týchto štúdií toxicity v sedimente sa uprednostňuje vývojový pomer, lebo jeho rozptyl je nižší a v porovnaní s vývojovým časom je homogénnejší a bližší normálnej distribúcii. Výkonné parametrické testovacie postupy teda možno lepšie použiť s vývojovým pomerom ako s vývojovým časom. Pre vývojový pomer ako nepretržitú reakciu možno hodnoty ECx odhadnúť pomocou regresnej analýzy [napr. (23) (24)].
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Pri nasledujúcich štatistických testoch sa predpokladá, že počet pakomárov pozorovaných v kontrolnom dni × sa vykuklil v strednom časovom intervale medzi dňom × a dňom x - l (l = dĺžka kontrolného intervalu, zvyčajne jeden deň). Stredný vývojový pomer na nádobu x) sa vypočíta podľa tejto rovnice:
                              
                                 
                              kde:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          stredný vývojový pomer na nádobu,
                                       
                                    
                                          i
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          index kontrolného intervalu,
                                       
                                    
                                          m
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          maximálny počet kontrolných intervalov,
                                       
                                    
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          počet pakomárov vykuklených v kontrolnom intervale i,
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          celkový počet pakomárov vykuklených na konci pokusu (= ),
                                       
                                    
                                          xi
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          vývojový pomer pakomárov vykuklených v intervale i;
                                       
                                    
                                 
                              kde:
                              
                                          deňi
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          kontrolný deň (dni od aplikácie),
                                       
                                    
                                          li
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          dĺžka kontrolného intervalu i (dni, zvyčajne jeden deň).
                                       
                                    
                        
                     Správa o teste
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Správa o teste musí obsahovať aspoň tieto informácie:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovaná látka:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fyzikálny charakter a, ak je to relevantné, fyzikálno-chemické vlastnosti (rozpustnosť vo vode, tlak pary, rozdeľovací koeficient v pôde (alebo v sedimente, ak je k dispozícii), stabilita vo vode atď.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      chemické identifikačné údaje (bežný názov, chemický názov, štrukturálny vzorec, číslo CAS atď.) vrátane čistoty a analytickej metódy kvantifikácie testovanej látky.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovacie druhy:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použité testovacie zvieratá: druh, vedecký názov, zdroj organizmov a podmienky chovu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informácie o manipulácii s vajíčkovými masami a larvami,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vek testovacích zvierat pri umiestnení do testovacích nádob.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Podmienky testovania:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použitý sediment, t. j. prírodný alebo umelo pripravený sediment,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      v prípade prírodného sedimentu poloha a opis miesta odobratia vzoriek sedimentu vrátane histórie kontaminácie, ak je to možné, charakteristiky: pH, obsah organického uhlíka, pomer C/N a granulometria (podľa potreby),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      príprava umelo pripraveného sedimentu: zložky a charakteristiky (obsah organického uhlíka, pH, vlhkosť atď. na začiatku testu),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      príprava testovacej vody (ak sa použije rekonštituovaná voda) a charakteristiky (koncentrácia kyslíka, pH, vodivosť, tvrdosť atď. na začiatku testu),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      výška sedimentu a nadložnej vody,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      objem nadložnej a pórovej vody, hmotnosť mokrého sedimentu s pórovou vodou a bez nej,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      testovacie nádoby (materiál a veľkosť),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metóda prípravy zásobných roztokov a testovacích koncentrácií,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aplikácia testovanej látky: použité testovacie koncentrácie, počet replikátov a prípadné použitie rozpúšťadiel,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inkubačné podmienky: teplota, svetelný cyklus a intenzita, prevdzušňovanie (frekvencia a intenzita),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné informácie o kŕmení vrátane druhu potravy, prípravy, množstva a kŕmneho režimu.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominálne testovacie koncentrácie, namerané testovacie koncentrácie a výsledky všetkých analýz na stanovenie koncentrácie testovanej látky v testovacej nádobe,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kvalita vody v testovacích nádobách, t. j. pH, teplota, rozpustený kyslík, tvrdosť a amoniak,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kompenzácia prípadnej vyparenej testovacej vody,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet vykuklených samčích a samičích pakomárov na nádobu na deň,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet lariev na nádobu, ktoré sa nevykuklili,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stredná suchá hmotnosť jednotlivých lariev na nádobu a na instar podľa potreby,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      percentuálne vykuklenie na replikát a testovaciu koncentráciu (samčie a samičie pakomáre spolu),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stredný vývojový pomer úplne vykuklených pakomárov na replikát a miera ošetrenia (samčie a samičie pakomáre spolu),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odhady toxických parametrov, napr. ECx (a súvisiace intervaly spoľahlivosti), NOEC a/alebo LOEC a štatistické metódy použité na ich stanovenie,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozbor výsledkov vrátane každého vplyvu na výsledok testu vyplývajúceho z odchýlok od tejto testovacej metódy.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATÚRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Upravili M. Streloke a H. Köpp. Berlín 1995.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Fleming, R. a kol. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Záverečná správa pre Európsku komisiu. Správa č.: EK, 3738. August 1994. WRc, UK.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. Zo seminára WOSTA, ktorý sa uskutočnil v Holandsku.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates, s. 1125 – 1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Druhé vydanie. EPA 600/R-99/064. Marec 2000. Revízia prvého vydania z júna 1994.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Milani, D., Day, K. E., McLeay, D. J., Kirby, R. S. (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Sugaya, Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345 – 350.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Kawai, K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47 – 57.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Kapitola C.8 tejto prílohy, Toxicita pre dážďovky.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Suedel, B. C., a Rodgers, J. H. (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163 – 1175.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Naylor, C., a Rodrigues, C. (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291 – 3303.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Dunnett, C. W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096 – 1121.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482 – 491.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103 – 117.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510 – 531.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Rao, J. N. K., a Scott, A. J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577 – 585.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Christensen, E. R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213 – 221.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Bruce a Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485 – 1494.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Slob, W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298 – 312.
                           
                        
                     Dodatok 1
                     VYMEDZENIE POJMOV
                     Na účely tejto metódy sa používajú tieto vymedzenia pojmov:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Umelo pripravený sediment alebo rekonštituovaný, umelý alebo syntetický sediment je zmes materiálov použitých na napodobnenie fyzických zložiek prírodného sedimentu.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Nadložná voda je voda umiestnená v testovacej nádobe nad sedimentom.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Intersticiálna voda alebo pórová voda je voda nachádzajúca sa v priestore medzi časticami sedimentu a pôdy.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Obohatená voda je voda, do ktorej bola pridaná testovaná látka.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testovaná chemikália: akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
                              
                           
                  
                     Dodatok 2
                     
                        Odporúčania ku kultúre Chironomus riparius
                        
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Larvy rodu Chironomus sa môžu chovať v kryštalizačných miskách alebo vo väčších nádobách. Na dno nádoby sa nanesie tenká vrstva jemného kremenného piesku vo výške 5 – 10 mm. Je preukázané, že vhodným substrátom je aj diatomit (napr. Merck, článok 8117) (postačuje tenšia vrstva do výšky len niekoľkých milimetrov). Potom sa pridá vhodná voda do výšky niekoľkých centimetrov. Hladiny vody by sa mali podľa potreby dopĺňať, aby sa kompenzovala strata vyparením a aby sa predišlo vysychaniu. Vodu je možné v prípade potreby vymeniť. Je potrebné zabezpečiť jemné prevzdušňovanie. Misky na chov lariev by mali byť umiestnené vo vhodnej klietke, ktorá zabráni úniku vykuklených dospelých jedincov. Klietka by mala byť dostatočne veľká, aby umožňovala rojenie vykuklených dospelých jedincov, v opačnom prípade by nemuselo dôjsť ku kopulácii (minimálna veľkosť je asi 30 × 30 × 30 cm).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Klietky je potrebné udržiavať pri izbovej teplote alebo v miestnosti so stálym prostredím pri teplote 20 ± 2 °C so svetlou fázou v trvaní 16 hodín (intenzita asi 1 000 luxov) a fázou tmy v trvaní osem hodín. Je preukázané, že vlhkosť vzduchu nižšia ako 60 % RH môže brániť reprodukcii.
                              
                           
                        Riediaca voda
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Možno použiť akúkoľvek vhodnú prírodnú alebo syntetickú vodu. Bežne sa používa studňová voda, odchlórovaná voda z vodovodu a umelé médiá (napr. Elendtovo médium ‚M4‘ alebo ‚M7‘, pozri ďalej). Pred použitím je potrebné vodu prevzdušniť. V prípade potreby možno kultivačnú vodu obnoviť opatrným odliatím alebo odčerpaním použitej vody z kultivačných nádob bez toho, aby sa poškodili trubice lariev.
                              
                           
                        Kŕmenie lariev
                     
                     
                                 4.
                              
                              
                                 Larvy rodu Chironomus sa kŕmia vločkovým krmivom pre ryby [Tetra Min®, Tetra Phyll® alebo inou podobnou značkou patentovaného krmiva pre ryby] približným množstvom 250 mg na nádobu na deň. Krmivo sa môže podávať ako suchý rozomletý prášok alebo ako suspenzia vo vode: 1,0 g vločkového krmiva sa pridá do 20 ml riediacej vody a premieša sa, aby sa získala homogénna zmes. Tento prípravok sa môže podávať v množstve približne 5ml na nádobu na deň (pred použitím pretrepať). Staršie larvy môžu dostávať viac.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Kŕmenie sa upraví podľa kvality vody. Ak sa kultivačné médium zakalí, kŕmenie je potrebné obmedziť. Prídavky do krmiva sa musia starostlivo monitorovať. Nedostatok potravy spôsobí, že larvy sa budú presúvať k vodnému stĺpcu, a prebytok potravy spôsobí zvýšenie činnosti mikróbov a zníženie koncentrácií kyslíka. V obidvoch prípadoch môže dôjsť k zníženiu rastových pomerov.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Pri založení nových kultivačných nádob sa môžu pridať aj bunky niektorých zelených rias (napr. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris).
                              
                           
                        Kŕmenie vykuklených dospelých jedincov
                     
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Z niektorých pokusov vyplýva, že ako potrava pre vykuklené dospelé jedince môže slúžiť vatový tampón napustený nasýteným sacharózovým roztokom.
                              
                           
                        Vykuklenie
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Pri teplote 20 ± 2 °C sa dospelé jedince začnú kukliť z nádoby na chov lariev po približne 13 – 15 dňoch. Samčeky sa ľahko rozlíšia podľa obrvených tykadiel.
                              
                           
                        Vajíčkové masy
                     
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Keď sú v chovnej klietke prítomné dospelé jedince, vo všetkých nádobách na chov lariev je potrebné trikrát do týždňa kontrolovať kladenie želatínových vajíčkových más. Ak sú vajíčkové masy prítomné, opatrne sa odoberú. Mali by sa preniesť na malú misku so vzorkou kultivačnej vody. Vajíčkové masy sa použijú na založenie nových kultivačných nádob (napr. dve až štyri vajíčkové masy na nádobu) alebo sa použijú v testoch toxicity.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Larvy prvého instaru by sa mali vyliahnuť po dvoch až troch dňoch.
                              
                           
                        Založenie nových kultivačných nádob
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Po vytvorení kultúr by malo byť možné založiť novú nádobu na kultiváciu lariev každý týždeň alebo menej často v závislosti od testovacích požiadaviek, pričom staršie nádoby sa po vykuklení dospelých pakomárov odstránia. Týmto spôsobom sa pri minimálnom riadení zabezpečí pravidelné dopĺňanie dospelých jedincov.
                              
                           
                        Príprava testovacích roztokov ‚M4‘ a ‚M7‘
                     
                     
                                 12.
                              
                              
                                 Elendt (1990) opísal médium ‚M4‘. Médium ‚M7‘ sa pripravuje ako médium ‚M4‘ s výnimkou látok označených v tabuľke 1, pre ktoré sú koncentrácie v médiu ‚M7‘ štyrikrát nižšie ako v médiu ‚M4‘. Publikácia o médiu ‚M7‘ je v štádiu prípravy (Elendt, osobná komunikácia). Testovací roztok by sa nemal pripraviť podľa Elendta a Biasa (1990), lebo koncentrácie NaSiO3.5H2O, NaNO3, KH2PO4 a K2HPO4 uvedené pre prípravu zásobných roztokov nie sú vhodné.
                              
                           
                        Príprava média ‚M7‘
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Každý zásobný roztok (I) sa pripraví jednotlivo a kombinovaný zásobný roztok (II) sa pripraví z týchto zásobných roztokov (I) (pozri tabuľku 1). Na prípravu média ‚M7‘ sa 50 ml z kombinovaného zásobného roztoku (II) a množstvá každého makronutričného zásobného roztoku uvedené v tabuľke 2 doplnia do 1 l deionizovanej vody. Vitamínový zásobný roztok sa pripraví pridaním troch vitamínov do deionizovanej vody, ako je uvedené v tabuľke 3, a krátko pred použitím sa do konečného média ‚M7‘ pridá 0,1 ml kombinovaného vitamínového zásobného roztoku. (Vitamínový zásobný roztok sa skladuje zmrazený v malých alikvotných častiach). Médium sa prevzdušňuje a stabilizuje.
                                 
                                    Tabuľka 1
                                 
                                 
                                    Zásobné roztoky stopových prvkov pre médiá M4 a M7
                                 
                                 
                                             Zásobné roztoky (I)
                                          
                                          
                                             Množstvo (mg) doplnené do jedného litra deionizovanej vody
                                          
                                          
                                             Na prípravu kombinovaného zásobného roztoku (II) sa zmiešajú tieto množstvá (ml) zásobných roztokov (I) a doplnia sa do jedného litra deionizovanej vody
                                          
                                          
                                             Konečné koncentrácie v testovacích roztokoch (mg/l)
                                          
                                       
                                             M4
                                          
                                          
                                             M7
                                          
                                          
                                             M4
                                          
                                          
                                             M7
                                          
                                       
                                             H3BO3
                                                 (18)
                                             
                                          
                                          
                                             57 190
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             2,86
                                          
                                          
                                             0,715
                                          
                                       
                                             MnCl2 • 4 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             7 210
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,361
                                          
                                          
                                             0,090
                                          
                                       
                                             LiCl (18)
                                             
                                          
                                          
                                             6 120
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,306
                                          
                                          
                                             0,077
                                          
                                       
                                             RbCl (18)
                                             
                                          
                                          
                                             1 420
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,071
                                          
                                          
                                             0,018
                                          
                                       
                                             SrCl2 • 6 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             3 040
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,152
                                          
                                          
                                             0,038
                                          
                                       
                                             NaBr (18)
                                             
                                          
                                          
                                             320
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,016
                                          
                                          
                                             0,004
                                          
                                       
                                             Na2MoO4 • 2 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             1 260
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,063
                                          
                                          
                                             0,016
                                          
                                       
                                             CuCl2 • 2 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             335
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,017
                                          
                                          
                                             0,004
                                          
                                       
                                             ZnCl2
                                             
                                          
                                          
                                             260
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,013
                                          
                                          
                                             0,013
                                          
                                       
                                             CaCl2 • 6 H2O
                                          
                                          
                                             200
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,010
                                          
                                          
                                             0,010
                                          
                                       
                                             KI
                                          
                                          
                                             65
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,0033
                                          
                                          
                                             0,0033
                                          
                                       
                                             Na2SeO3
                                             
                                          
                                          
                                             43,8
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,0022
                                          
                                          
                                             0,0022
                                          
                                       
                                             NH4VO3
                                             
                                          
                                          
                                             11,5
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,00058
                                          
                                          
                                             0,00058
                                          
                                       
                                             Na2EDTA • 2 H2O (18)
                                                 (19)
                                             
                                          
                                          
                                             5 000
                                          
                                          
                                             20,0
                                          
                                          
                                             5,0
                                          
                                          
                                             2,5
                                          
                                          
                                             0,625
                                          
                                       
                                             FeSO4 • 7 H2O (18)
                                                 (19)
                                             
                                          
                                          
                                             1 991
                                          
                                          
                                             20,0
                                          
                                          
                                             5,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,249
                                          
                                       
                                    Tabuľka 2
                                 
                                 
                                    Makronutričné zásobné roztoky pre médiá M4 a M7
                                 
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Množstvo doplnené do jedného litra deionizovanej vody
                                             (mg)
                                          
                                          
                                             Množstvo pridaných makronutričných zásobných roztokov pri príprave médií M4 a M7
                                             (ml/l)
                                          
                                          
                                             Konečné koncentrácie v testovacích roztokoch M4 a M7
                                             (mg/l)
                                          
                                       
                                             CaCl2 • 2 H2O
                                          
                                          
                                             293 800
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             293,8
                                          
                                       
                                             MgSO4 • 7 H2O
                                          
                                          
                                             246 600
                                          
                                          
                                             0,5
                                          
                                          
                                             123,3
                                          
                                       
                                             KCl
                                          
                                          
                                             58 000
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             5,8
                                          
                                       
                                             NaHCO3
                                             
                                          
                                          
                                             64 800
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             64,8
                                          
                                       
                                             NaSiO3 • 9 H2O
                                          
                                          
                                             50 000
                                          
                                          
                                             0,2
                                          
                                          
                                             10,0
                                          
                                       
                                             NaNO3
                                             
                                          
                                          
                                             2 740
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,274
                                          
                                       
                                             KH2PO4
                                             
                                          
                                          
                                             1 430
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,143
                                          
                                       
                                             K2HPO4
                                             
                                          
                                          
                                             1 840
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,184
                                          
                                       
                                    Tabuľka 3
                                 
                                 
                                    Vitamínový zásobný roztok pre médiá M4 a M7
                                 
                                 Všetky tri vitamínové roztoky sa skombinujú, aby sa vytvoril jeden vitamínový zásobný roztok.
                                 
                                    
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Množstvo doplnené do jedného litra deionizovanej vody
                                             (mg)
                                          
                                          
                                             Množstvo pridaného vitamínového zásobného roztoku pri príprave médií M4 a M7
                                             (ml/l)
                                          
                                          
                                             Konečné koncentrácie v testovacích roztokoch M4 a M7
                                             (mg/l)
                                          
                                       
                                             Tiamín hydrochlorid
                                          
                                          
                                             750
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,075
                                          
                                       
                                             Kyanokobalamín (B12)
                                          
                                          
                                             10
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,0010
                                          
                                       
                                             Biotín
                                          
                                          
                                             7,5
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,00075
                                          
                                       
                           
                        LITERATÚRA
                     
                     BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Upravili M. Streloke a H.Köpp. Berlín 1995.
                     Elendt, B. P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25 – 33.
                     Elendt, B. P., a Bias, W.-R. (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157 – 1167.
                  
                  
                     Dodatok 3
                     PRÍPRAVA UMELO PRIPRAVENÉHO SEDIMENTU
                     
                        Zloženie sedimentu
                     
                     Zloženie umelo pripraveného sedimentu by malo byť takéto:
                     
                                 Zložka
                              
                              
                                 Charakteristika
                              
                              
                                 % suchej hmotnosti
                                 sedimentu
                              
                           
                                 Rašelina
                              
                              
                                 Rašelinníková rašelina, pH čo najbližšie k 5,5 – 6,0, bez viditeľných zvyškov rastlín, jemne rozomletá (veľkosť častíc ≤ 1 mm) a usušená vzduchom
                              
                              
                                 4 – 5
                              
                           
                                 Kremenný piesok
                              
                              
                                 Veľkosť zrniek: > 50 % častíc by malo mať veľkosť v rozsahu 50 – 200 μm
                              
                              
                                 75 – 76
                              
                           
                                 Kaolín
                              
                              
                                 Obsah kaolinitu ≥ 30 %
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                 Organický uhlík
                              
                              
                                 Upravený pridaním rašeliny a piesku
                              
                              
                                 2 (± 0,5)
                              
                           
                                 Uhličitan vápenatý
                              
                              
                                 CaCO3, rozomletý na prach, chemicky čistý
                              
                              
                                 0,05 – 0,1
                              
                           
                                 Voda
                              
                              
                                 Vodivosť ≤ 10 μS/cm
                              
                              
                                 30 – 50
                              
                           
                        Príprava
                     
                     Rašelina sa usuší vzduchom a rozomelie na jemný prášok. V deionizovanej vode sa pomocou vysokovýkonného homogenizačného prístroja pripraví suspenzia požadovaného množstva rašelinového prášku. Hodnota pH tejto suspenzie sa upraví na 5,5 ± 0,5 pomocou CaCO3. Suspenzia sa aspoň na dva dni uvedie do podmienok jemným premiešavaním pri teplote 20 ± 2 °C, aby sa stabilizovala hodnota pH a vytvorila stabilná mikrobiálna zložka. Opäť sa zmeria pH, ktoré by malo byť na úrovni 6,0 ± 0,5. Rašelinová suspenzia sa následne zmieša s ostatnými zložkami (piesok a kaolín) a s deionizovanou vodou, aby sa získal homogénny sediment s obsahom vody v rozsahu 30 – 50 percent suchej hmotnosti sedimentu. Znova sa zmeria hodnota pH konečnej zmesi a podľa potreby sa pomocou CaCO3 upraví na 6,5 – 7,5. Odoberú sa vzorky sedimentu, aby sa určila suchá hmotnosť a obsah organického uhlíka. Následne sa odporúča, aby sa pred použitím v teste toxicity pri pakomároch umelo pripravený sediment uviedol na sedem dní do rovnakých podmienok, aké budú prevládať v nasledujúcom teste.
                     
                        Skladovanie
                     
                     Suché zložky na prípravu umelého sedimentu sa môžu skladovať na suchom a chladnom mieste pri izbovej teplote. Umelo pripravený (mokrý) sediment by sa pred použitím v teste nemal skladovať. Mal by sa použiť hneď po sedemdňovom období uvádzania do podmienok, ktorým sa končí jeho príprava.
                     
                        LITERATÚRA:
                     
                     Kapitola C.8 tejto prílohy. Toxicita pre dážďovky.
                     Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10 – 20.
                  
                  
                     Dodatok 4
                     
                        Chemické charakteristiky prijateľnej riediacej vody
                     
                     
                                 Látka
                              
                              
                                 Koncentrácie
                              
                           
                                 Pevné častice
                              
                              
                                 < 20 mg/l
                              
                           
                                 Celkový organický uhlík
                              
                              
                                 < 2 mg/l
                              
                           
                                 Neionizovaný amoniak
                              
                              
                                 < 1 μg/l
                              
                           
                                 Tvrdosť ako CaCO3
                                 
                              
                              
                                 < 400 mg/l (20)
                                 
                              
                           
                                 Zostatkový chlór
                              
                              
                                 < 10 μg/l
                              
                           
                                 Celkové organofosfátové pesticídy
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Celkové organochlórované pesticídy plus polychlórované bifenyly
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Celkový organický chlór
                              
                              
                                 < 25 ng/l
                              
                           
                  
                     Dodatok 5
                     
                        Usmernenie k monitorovaniu vykuklenia lariev pakomárov
                     
                     Na testovacie kadičky sa umiestnia pasce na vykuklené jedince. Tieto pasce sú potrebné odo dňa 20 do skončenia testu. Ďalej je znázornený príklad použitej pasce.
                     
                        
                     
                                 A
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 nylonová sieťka
                              
                           
                                 B
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 prevrátené umelohmotné misky
                              
                           
                                 C
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 expozičná kadička bez okraja
                              
                           
                                 D
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 sieťované otvory na výmenu vody
                              
                           
                                 E
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 voda
                              
                           
                                 F
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 sediment
                              
                           
                  C.29.   ĽAHKÁ BIODEGRADOVATEĽNOSŤ – CO2 V HERMETICKY UZAVRETÝCH NÁDOBÁCH (TEST V UZAVRETOM PRIESTORE NAD KVAPALINOU)
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov (TG) 310 (2003). Táto testovacia metóda je skríningovou metódou na hodnotenie ľahkej biodegradovateľnosti chemikálií a poskytuje podobné informácie ako šesť testovacích metód opísaných v kapitole C.4 tejto prílohy A až F. Chemikáliu, pri ktorej sa v tejto testovacej metóde preukážu pozitívne výsledky, možno preto považovať za ľahko biodegradovateľnú, a teda za rýchlo degradovateľnú v životnom prostredí.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Zvyčajne bola prvou voľbou na testovanie slabo rozpustných chemikálií a chemikálií, ktoré silne adsorbujú, osvedčená metóda (1) oxidu uhličitého (CO2) založená na Sturmovom pôvodnom teste (2) na hodnotenie biodegradovateľnosti organických chemikálií meraním oxidu uhličitého vytváraného mikrobiálnym pôsobením. Vyberá sa aj v prípade rozpustných (ale nie prchavých) chemikálií, lebo uvoľňovanie oxidu uhličitého mnohí považujú za jediný jednoznačný dôkaz mikrobiálnej činnosti. Rozpustený organický uhlík možno odstrániť fyzikálno-chemickými procesmi (adsorpciou, vyparením, zrážaním, hydrolýzou), ako aj mikrobiálnym pôsobením, pričom mnohé nebiologické reakcie spotrebúvajú kyslík. V zriedkavých prípadoch sa CO2 z organických chemikálií tvorí abioticky. V pôvodnom a modifikovanom Sturmovom teste (1) (2) sa CO2 odstráni z tekutej fázy do absorbujúcich nádob čerením (t. j. bublajúcim vzduchom aplikovaným s cieľom odstrániť CO2 cez tekuté médium), zatiaľ čo v Larsonovej verzii (3) (4) sa CO2 prevedie z reakčnej nádoby do absorbérov púšťaním vzduchu bez obsahu CO2 cez uzavretý priestor nad kvapalinou a ďalej nepretržitým pretrepávaním testovacej nádoby. Reakčná nádoba sa pretrepáva iba v Larsonovej modifikácii. Premiešavanie je v ISO 9439 (5) a v pôvodnej americkej verzii (6) špecifikované iba pre nerozpustné látky, pričom obe normy špecifikujú skôr čerenie namiesto výmeny uzavretého priestoru nad kvapalinou. V ďalšej oficiálnej metóde USA EPA (7) založenej na Gledhillovej metóde (8) sa pretrepávaná reakčná nádoba uzavrie pred ovzduším a vyprodukované CO2 sa hromadí vo vnútornom alkalickom zachytávači priamo z plynnej fázy podobne ako v prípade klasických Warburgových/Barcroftových respirometrických baniek.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Ukázalo sa však, že počas aplikácie štandardného modifikovaného Sturmovho testu na viaceré chemikálie sa v médiu hromadí anorganický uhlík (IC) (9). Počas degradácie 20 mg C/l anilínu bola zistená koncentrácia IC až 8 mg/l. Hromadenie CO2 v alkalických zachytávačoch preto nezodpovedalo reálnemu množstvu mikrobiologicky vyprodukovaného CO2 v medzičasoch počas degradácie. Špecifikácia, podľa ktorej na to, aby sa testovaná chemikália klasifikovala ako ľahko biodegradovaná, sa musí počas ‚desaťdňového okna‘ (desať dní nasledujúcich ihneď po dosiahnutí 10 % biodegradácie) nahromadiť > 60 % teoretickej maximálnej produkcie CO2 (ThCO2), nebude splnená v prípade niektorých chemikálií, ktoré by takto boli klasifikované po použití eliminácie rozpusteného organického uhlíka (DOC).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Ak je percentuálna degradácia nižšia, ako sa očakáva, je možné, že IC sa akumuloval v testovacom roztoku. Degradovateľnosť sa potom môže hodnotiť pomocou iných testov ľahkej biodegradovateľnosti.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Ďalšie nedostatky Sturmovej metodiky (náročnosť vykonania, náročnosť na čas, náchylnosť k chybám pri pokusoch a nemožnosť použitia v prípade prchavých chemikálií) dali podnet k skúmaniu metódy uzavretej nádoby, ktorá by bola iná ako Gledhillova a ktorá by nahradila prúdenie plynu (10) (11). Boatman a kolektív (12) vyhodnotili predchádzajúce metódy a zaviedli systém uzavretého priestoru nad kvapalinou, v ktorom sa CO2 na konci inkubácie uvoľňoval do priestoru nad kvapalinou prostredníctvom okysľovania média. CO2 sa meral plynovou chromatografiou (GC)/analýzou IC vo vzorkách automaticky odoberaných z priestoru nad kvapalinou, ale nezohľadňoval sa rozpustený anorganický uhlík (DIC) v tekutej fáze. Takisto použité nádoby boli veľmi malé (20 ml) a obsahovali iba 10 ml média, čo spôsobovalo problémy napr. pri pridávaní nevyhnutne veľmi malých množstiev nerozpustných testovaných chemikálií a/alebo problém s mikroorganizmami schopnými degradovať testovanú chemikáliu, ktoré mohli byť v inokulovanom médiu prítomné v nedostatočnom množstve alebo vôbec.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Tieto problémy prekonali nezávislé štúdie Struijsa a Stoltenkampa (13) a Bircha a Fletchera (14), pričom druhých menovaných inšpirovali ich skúsenosti so zariadením používaným v teste anaeróbnej biodegradácie (15). V prvej metóde (13) sa CO2 meria v priestore nad kvapalinou po acidifikácii a vyrovnaní, zatiaľ čo v druhej metóde (14) sa meria DIC v plynnej aj tekutej fáze bez ošetrenia. Vyše 90 % vytvoreného IC sa vyskytovalo v tekutej fáze. Obidve metódy majú oproti Sturmovmu testu výhody v tom, že testovací systém je kompaktnejší a ovládateľnejší, môžu sa testovať prchavé chemikálie a predišlo sa možnosti oneskorenia v meraní vyprodukovaného CO2.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Tieto dva prístupy boli skombinované do normy ISO o CO2 v uzavretom priestore nad kvapalinou (16), ktorá bola podrobená kruhovým testom (17), a práve táto norma predstavuje základ uvedenej testovacej metódy. Tieto dva prístupy sa podobne využili v metóde USA EPA (18). Odporúčajú sa dve metódy merania CO2, konkrétne CO2 v uzavretom priestore nad kvapalinou po acidifikácii (13) a IC v tekutej fáze po pridaní prebytočných alkálií. Druhú uvedenú metódu predstavil Peterson počas kruhového testu CONCAWE (19) tejto metódy uzavretého priestoru nad kvapalinou, ktorá bola modifikovaná na meranie inherentnej biodegradovateľnosti. Zmeny vykonané pri revízii metód z roku 1992 (20) v kapitole C.4 tejto prílohy týkajúce sa ľahkej biodegradovateľnosti boli začlenené do tejto testovacej metódy tak, aby podmienky (médium, trvanie atď.) boli inak rovnaké ako podmienky v revidovanom Sturmovom teste (20). Birch a Fletcher (14) preukázali, že pri tomto teste uzavretého priestoru nad kvapalinou sa dosiahli veľmi podobné výsledky, aké sa s rovnakými chemikáliami dosiahli v kruhovom teste OECD (21) revidovaných testovacích metód.
                           
                        PRINCÍP TESTU
                  
                              8.
                           
                           
                              Testovaná chemikália, zvyčajne v koncentrácii 20 mg C/l, sa ako jediný zdroj uhlíka a energie inkubuje v tlmivom médiu s obsahom minerálnych solí, ktoré bolo inokulované zmiešanou populáciou mikroorganizmov. Test prebieha v hermeticky uzavretých fľašiach s priestorom nad kvapalinou obsahujúcim vzduch, ktorý predstavuje rezervoár kyslíka pre aeróbnu biodegradáciu. Uvoľňovanie CO2, ktoré je dôsledkom úplnej aeróbnej biodegradácie testovanej chemikálie, sa stanoví meraním množstva IC vyprodukovaného v testovacích fľašiach, ktoré presahuje množstvo IC vyprodukované v slepých kontrolných nádobách obsahujúcich iba inokulované médium. Rozsah biodegradácie je vyjadrený ako percento teoretickej maximálnej produkcie IC (ThIC) založené na množstve testovanej chemikálie (ako organického uhlíka) pridanej na začiatku testu.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Takisto možno odmerať aj elimináciu DOC a/alebo rozsah primárnej biodegradácie testovanej chemikálie (20).
                           
                        INFORMÁCIE O TESTOVANEJ CHEMIKÁLII
                  
                              10.
                           
                           
                              Je potrebné poznať obsah organického uhlíka (hmotnostné percento) v testovanej chemikálii buď z jej chemickej štruktúry, alebo na základe merania, aby bolo možné vypočítať percentuálnu degradáciu. V prípade prchavých testovaných chemikálií je na stanovenie vhodného pomeru priestoru nad kvapalinou k objemu kvapaliny užitočná nameraná alebo vypočítaná Henryho konštanta. Pri výbere vhodnej testovacej koncentrácie a pri interpretácii výsledkov poukazujúcich na slabú biodegradovateľnosť sú užitočné informácie o toxicite testovanej chemikálie na mikroorganizmy: pokiaľ nie je známe, že testovaná chemikália nemá na mikrobiálnu činnosť inhibičné účinky, odporúča sa zahrnúť kontrolu inhibície (pozri odsek 24).
                           
                        POUŽITEĽNOSŤ METÓDY
                  
                              11.
                           
                           
                              Test možno použiť na testované chemikálie rozpustné vo vode a na nerozpustné testované chemikálie, je však potrebné zabezpečiť dobrú disperziu testovanej chemikálie. Pri použití odporúčaného pomeru priestoru nad kvapalinou k objemu kvapaliny 1: 2 možno testovať prchavé chemikálie s Henryho konštantou do 50 Pa.m3.mol–1, lebo podiel testovanej chemikálie v uzavretom priestore nad kvapalinou nepresiahne 1 % (13). Pri testovaní prchavejších chemikálií možno použiť menší objem priestoru nad kvapalinou, ale ich biodostupnosť môže byť obmedzujúca, najmä ak sú slabo rozpustné vo vode. Používatelia však musia zabezpečiť, aby pomer priestoru nad kvapalinou k objemu kvapaliny a koncentrácia testovanej chemikálie boli také, aby bol k dispozícii dostatok kyslíka, ktorý umožňuje úplnú aeróbnu biodegradáciu (napr. sa treba vyhnúť používaniu vysokej koncentrácie substrátu a malého objemu priestoru nad kvapalinou). Usmernenia k tejto téme sú uvedené v bodoch (13) (23).
                           
                        REFERENČNÉ CHEMIKÁLIE
                  
                              12.
                           
                           
                              Na kontrolu postupu testovania sa súbežne testuje referenčná chemikália so známou biodegradovateľnosťou. Na tento účel možno pri testovaní chemikálií rozpustných vo vode použiť anilín, benzoan sodný alebo etylénglykol a pri testovaní slabo rozpustných chemikálií 1-oktanol (13). Biodegradácia týchto chemikálií musí v priebehu 14 dní dosiahnuť úroveň > 60 % ThIC.
                           
                        REPRODUKOVATEĽNOSŤ
                  
                              13.
                           
                           
                              V ISO kruhovom teste metódy (17) sa pri použití odporúčaných podmienok vrátane 20 mg C testovanej chemikálie/l získali tieto výsledky.
                              
                                          Testovaná chemikália
                                       
                                       
                                          Stredná percentuálna biodegradácia
                                          (28 d)
                                       
                                       
                                          Variačný koeficient
                                          (%)
                                       
                                       
                                          Počet laboratórií
                                       
                                    
                                          Anilín
                                       
                                       
                                          90
                                       
                                       
                                          16
                                       
                                       
                                          17
                                       
                                    
                                          1-oktanol
                                       
                                       
                                          85
                                       
                                       
                                          12
                                       
                                       
                                          14
                                       
                                    Variabilita v rámci testu (replikovateľnosť) pri použití anilínu bola takmer vo všetkých uskutočnených testoch v prípade variačných koeficientov nepresahujúcich 5 % nízka. V dvoch prípadoch, v ktorých bola replikovateľnosť horšia, bola väčšia variabilita pravdepodobne spôsobená vysokou produkciou IC v slepých kontrolných nádobách. Replikovateľnosť bola horšia v prípade 1-oktanolu, ale stále bola v 79 % uskutočnených testov pod úrovňou 10 %. Táto väčšia variabilita v rámci testu mohla byť spôsobená chybami v dávkovaní, lebo do hermeticky uzavretých testovacích fliaš sa musel vstreknúť malý objem (3 – 4 μl) 1-oktanolu. Pri použití nižších koncentrácií testovanej chemikálie by výsledné variačné koeficienty boli vyššie, a to najmä pri koncentráciách nižších ako 10 mg C/l. Čiastočne možno tento problém vyriešiť znížením koncentrácie celkového anorganického uhlíka (TIC) v inokule.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Kruhový test EÚ (24) piatich povrchovo aktívnych činidiel pridávaných v koncentrácii 10 mg C/l priniesol tieto výsledky:
                              
                                          Testovaná chemikália
                                       
                                       
                                          Stredná percentuálna biodegradácia
                                          (28 d)
                                       
                                       
                                          Variačný koeficient
                                          (%)
                                       
                                       
                                          Počet laboratórií
                                       
                                    
                                          Tetrapropylén
                                          Benzénsulfonát
                                       
                                       
                                          17
                                       
                                       
                                          45
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Di-izo-oktylsulfo-sukcinát
                                          (aniónový)
                                       
                                       
                                          72
                                       
                                       
                                          22
                                       
                                       
                                          9
                                       
                                    
                                          Hexadecyltrimetyl- (21)
                                          
                                          amónium chlorid
                                          (katiónový)
                                       
                                       
                                          75
                                       
                                       
                                          13
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Izo-nonylfenol-(etoxylát)9
                                          
                                          (neiónový)
                                       
                                       
                                          41
                                       
                                       
                                          32
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Koko-amid-propyl
                                          dimetylhydroxy
                                          sulfobetaín
                                          (amfotérny)
                                       
                                       
                                          60
                                       
                                       
                                          23
                                       
                                       
                                          11
                                       
                                    Z výsledkov vyplýva, že vo všeobecnosti bola variabilita vyššia v prípade horšie degradovaných povrchovo aktívnych činidiel. Variabilita v rámci testu bola nižšia ako 15 % vo vyše 90 % prípadov, pričom najvyššia úroveň dosiahla 30 – 40 %.
                              
                                          
                                             Poznámka:
                                          
                                       
                                       
                                          Väčšina povrchovo aktívnych činidiel nie sú jednomolekulové substancie, ale zmesi izomérov, homológov atď., ktoré degradujú po rôznych charakteristických lag obdobiach a pri rôznych kinetických rýchlostiach, čo vedie k ‚nejasným‘ podhodnoteným krivkám, takže hodnota úspešnosti 60 % sa v rámci ‚desaťdňového okna‘ nemusí dosiahnuť, ani v prípade, že by každá individuálna molekulárna substancia pri samostatnom testovaní za desať dní dosiahla úroveň > 60 %. Tento jav možno pozorovať aj pri iných komplexných zmesiach.
                                       
                                    
                        OPIS METÓDY
                  
                     Zariadenie
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Bežné laboratórne zariadenie a:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          sklenené sérové fľaše hermeticky uzavreté butylovými gumenými zátkami a tesniacimi hliníkovými uzávermi. Odporúčaná veľkosť je 125 ml, pričom celkový objem je približne 160 ml (v tomto prípade by mal známy objem každej fľaše byť 160 ± 1 ml). Menšie nádoby možno použiť, ak výsledky spĺňajú podmienky uvedené v odsekoch 66 a 67;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          uhlíkový analyzátor alebo iný prístroj (napr. plynový chromatograf) na meranie anorganického uhlíka;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          striekačky s vysokou presnosťou na plynné a kvapalné vzorky;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          orbitálna trepačka v prostredí s kontrolovanou teplotou;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          prívod vzduchu bez obsahu CO2 – môže sa pripraviť púšťaním vzduchu cez granule nátronového vápna alebo použitím plynnej zmesi 80 % N2/20 % 02 (nepovinné) (pozri odsek 28);
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          membránové filtračné zariadenie s pórovitosťou 0,20 – 0,45 μm (nepovinné);
                                       
                                    
                                          g)
                                       
                                       
                                          analyzátor organického uhlíka (nepovinné).
                                       
                                    
                        
                     Činidlá
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Vždy sa používajú analyticky čisté činidlá.
                           
                        
                     Voda
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Používa sa destilovaná alebo deionizovaná voda s obsahom celkového organického uhlíka ≤ 1 mg/l. Táto hodnota predstavuje ≤ 5 % počiatočného obsahu organického uhlíka pridaného v odporúčanej dávke testovanej chemikálie.
                           
                        
                     Zásobné roztoky pre médium s obsahom minerálnych solí
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Zásobné roztoky a médium s obsahom minerálnych solí sú podobné tým, ktoré sú špecifikované v norme ISO 14593 (16) a v testoch ‚ľahkej biodegradovateľnosti‘ v kapitole C.4 (20). Použitie vyššej koncentrácie chloridu amónneho (2,0 g/l namiesto 0,5 g/l) je nutné iba vo výnimočných prípadoch, napr. ak je koncentrácia testovanej chemikálie > 40 mg C/l. Zásobné roztoky sú uskladnené v chlade a mali by sa zlikvidovať po šiestich mesiacoch alebo skôr, ak vykazujú známky zrážania alebo mikrobiálneho rastu. Pripravia sa tieto zásobné roztoky:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          dihydrogénfosforečnan draselný (KH2PO4) 8,50 g,
                                          hydrogénfosforečnan draselný (K2HPO4) 21,75 g,
                                          dihydrát hydrogénfosforečnanu disodného (Na2HPO4.2H2O) 33,40 g,
                                          chlorid amónny (NH4Cl) 0,50 g.
                                          Rozpustí sa vo vode a doplní na jeden liter. Hodnota pH tohto roztoku by mala byť 7,4 (± 0,2). Ak tomu tak nie je, pripraví sa nový roztok;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          dihydrát chloridu vápenátého (CaCl2.2H2O) 36,40 g.
                                          Rozpustí sa vo vode a doplní na jeden liter;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          heptahydrát síranu horečnatého (MgSO4.7H2O) 22,50 g.
                                          Rozpustí sa vo vode a doplní na jeden liter;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          chlorid železitý hexahydrát (FeCl3.6H20) 0,25 g.
                                          Rozpustí sa vo vode a doplní na jeden liter, pričom sa pridá jedna kvapka koncentrovaného roztoku.
                                       
                                    
                        
                     Príprava minerálneho média
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Zmieša sa 10 ml roztoku v písmene a) s približne 800 ml vody (odsek 17), potom sa pridá 1 ml roztokov v písmenách b), c) a d) a doplní vodou (odsek 17) na jeden liter.
                           
                        
                     Iné činidlá
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Koncentrovaná kyselina trihydrogénfosforečná (H3PO4) (> 85 % hmotnosti na objem).
                           
                        
                     Roztok hydroxidu sodného 7 M
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              V jednom litri vody sa rozpustí 280 g hydroxidu sodného (NaOH) (odsek 17). Určí sa koncentrácia DIC tohto roztoku a táto hodnota sa zohľadní pri výpočte výsledkov testu (pozri odseky 55 a 61), najmä v súvislosti s kritériom platnosti podľa odseku 66 písm. b). Ak je koncentrácia DIC príliš vysoká, pripraví sa nový roztok.
                           
                        
                     Testovaná chemikália
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Vo vode (odsek 17) alebo v testovacom médiu (odsek 19) sa pripraví zásobný roztok testovanej chemikálie, ktorá je dostatočne rozpustná vo vode, s koncentráciou pokiaľ možno stokrát vyššou, ako je konečná koncentrácia, ktorá sa použije v teste. Môže byť potrebné upraviť pH zásobného roztoku. Zásobný roztok sa pridá do minerálneho média, aby sa dosiahla konečná koncentrácia organického uhlíka medzi 2 a 40 mg C/l, ideálne 20 mg C/l. Použitie nižších ako uvedených koncentrácií môže mať za následok nižšiu presnosť. Rozpustné a nerozpustné kvapalné chemikálie možno do nádob pridávať priamo pomocou striekačiek s vysokou presnosťou. Slabo rozpustné a nerozpustné testované chemikálie môžu vyžadovať osobitné postupy (25). Možnosti sú tieto:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          priame pridanie známych odvážených množstiev;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          ultrazvuková disperzia pred pridaním;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          disperzia pomocou emulgujúcich činidiel potrebná na zistenie inhibičných alebo stimulačných účinkov na mikrobiálnu činnosť pred pridaním;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          adsorpcia kvapalnej testovanej chemikálie alebo roztoku vo vhodnom prchavom rozpúšťadle, na inertnom médiu alebo nosnom materiáli (napr. filter zo sklenených vlákien), po ktorej nasleduje odparenie rozpúšťadla, ak sa použilo, a priame pridanie známych množstiev;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          pridanie známeho objemu roztoku testovanej chemikálie vo vysokoprchavom rozpúšťadle do prázdnej testovacej nádoby a následné odparenie rozpúšťadla.
                                       
                                    Činidlá alebo rozpúšťadlá použité v písmenách c), d) a e) je potrebné testovať na zistenie akýchkoľvek stimulačných alebo inhibičných účinkov na mikrobiálnu činnosť [pozri odsek 42 písm. b)].
                           
                        
                     Referenčná chemikália
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Vo vode sa pripraví zásobný roztok (rozpustnej) referenčnej chemikálie (odsek 17), s koncentráciou, pokiaľ možno stokrát vyššou, ako je konečná koncentrácia, ktorá sa použije (20 mg C/l) v teste.
                           
                        
                     Kontrola inhibície
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Testované chemikálie v podmienkach použitých pri hodnotení ľahkej biodegradácie často nevykazujú významnú degradáciu. Jednou z možných príčin je skutočnosť, že testovaná chemikália v koncentrácii, v ktorej sa aplikuje v teste, má na inokulum inhibičné účinky. Do koncepcie testu sa môže zahrnúť kontrola inhibície s cieľom umožniť identifikáciu (pri spätnom pohľade) inhibície ako možnej príčiny alebo prispievajúceho faktora. Kontrolou inhibície možno prípadne takéto interferencie vylúčiť a preukázať, že nulovú alebo nepatrnú degradáciu možno pripísať výhradne rezistencii voči mikrobiálnemu napadnutiu v podmienkach testu. Na účely získania informácií o toxických účinkoch testovanej chemikálie na (aeróbne) mikroorganizmy sa pripraví roztok v testovacom médiu obsahujúci testovanú chemikáliu a referenčnú chemikáliu (odsek 19), každý v rovnakej koncentrácii, v akej sa pridáva (pozri odsek 22 a 23).
                           
                        
                     Inokulum
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Inokulum možno získať z rôznych zdrojov: aktivovaný kal, výtok splaškových vôd (nechlórovaný), povrchové vody a pôdy alebo zmes uvedeného (20). Biodegradačnú činnosť zdroja treba skontrolovať pomocou referenčnej chemikálie. Ak sa daný postup použije ako test ľahkej biodegradovateľnosti, bez ohľadu na zdroj by sa nemali použiť mikroorganizmy, ktoré boli predtým exponované testovanej chemikálii.
                              
                                          
                                             Upozornenie:
                                          
                                       
                                       
                                          Aktivovaný kal, splaškové vody a výtok splaškových vôd obsahujú choroboplodné organizmy a je nutné s nimi zaobchádzať opatrne.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              Na základe skúseností je optimálny objem inokula taký, ktorý:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          je dostatočný na zabezpečenie primeranej biodegradačnej činnosti,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          degraduje referenčnú chemikáliu o stanovené percento (pozri odsek 66),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          poskytuje 102 – 105 jednotiek tvoriacich kolónie na mililiter v konečnej zmesi,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          zvyčajne poskytuje koncentráciu 4 mg/l suspendovaných tuhých látok v konečnej zmesi pri použití aktivovaného kalu; môžu sa použiť koncentrácie do 30 mg/l, ale tie môžu významne zvýšiť produkciu CO2 v slepých kontrolných nádobách (26),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          predstavuje menej ako 10 % počiatočnej koncentrácie organického uhlíka zavedeného testovanou chemikáliou,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          predstavuje vo všeobecnosti 1 – 10 ml inokula na jeden liter testovacieho roztoku.
                                       
                                    
                        
                     Aktivovaný kal
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Odoberie sa čerstvá vzorka aktivovaného kalu z prevzdušňovacej nádrže čističky odpadových vôd alebo z laboratórnej jednotky, ktoré spracúvajú prevažne domáce splaškové vody. V prípade potreby sa cedením odstránia hrubé častice (napr. pomocou cedidla, ktorého oká majú veľkosť 1 mm2) a kal sa až do použitia uskladňuje v aeróbnych podmienkach.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Po odstránení hrubých častíc sa prípadne nechá sedimentovať alebo sa odstredí (napr. 1 100 × g na 10 minút). Supernatantová kvapalina sa zleje. Kal sa môže premyť v minerálnom roztoku. Koncentrovaný kal sa suspenduje v minerálnom médiu s cieľom získať koncentráciu 3 – 5 g suspendovaných tuhých látok/l. Následne sa prevzdušňuje podľa potreby.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Kal sa odoberie zo správne pracujúcej čističky. Ak sa musí kal odobrať z vysokostupňovej čističky alebo je možné, že obsahuje inhibítory, mal by sa premyť. Po dôkladnom premiešaní sa sedimentuje alebo odstredí resuspendovaný kal, odstráni sa supernatantová kvapalina a premytý kal znovu suspenduje v ďalšom objeme minerálneho média. Tento postup sa opakuje, kým sa z kalu neodstráni nadbytočný substrát alebo inhibítor.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Z úplne resuspendovaného alebo neošetreného kalu sa odoberie vzorka tesne pred použitím na stanovenie suchej hmotnosti suspendovaných tuhých látok.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Ďalšou alternatívou je homogenizácia aktivovaného kalu (3 – 5 g suspendovaných tuhých látok/l). Kal sa prevzdušňuje v mixéri Waring dve minúty pri strednej rýchlosti. Zmiešaný kal sa nechá sedimentovať 30 minút, alebo ak je to potrebné, aj dlhšie, a dekantuje sa kvapalinou na nižšie použitie ako inokulum v množstve 10 mg/l minerálneho média.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Ďalšie zníženie uvoľňovania čistého CO2 možno dosiahnuť prevzdušňovaním kalu počas noci vzduchom bez obsahu CO2. Ako inokulum sa v tomto teste použije koncentrácia 4 mg/l tuhých látok aktivovaného kalu (13).
                           
                        
                     Sekundárny výtok splaškových vôd
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              Inokulum možno prípadne získať zo sekundárneho výtoku čističky alebo z laboratórnej jednotky, ktoré prevažne spracúvajú domáce splaškové vody. Vzorka sa udržiava v aeróbnych podmienkach a použije sa v deň odberu alebo sa podľa potreby aklimatizujte. Výtok sa prefiltruje cez hrubý filter, aby sa odstránili hrubé pevné častice, a odmeria sa hodnota pH.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Filtrát sa s cieľom zníženia obsahu IC počas jednej hodiny čerí vzduchom bez obsahu CO2 [odsek 15 písm. e)], pričom hodnota pH sa udržiava na úrovni 6,5 pomocou kyseliny trihydrogénfosforečnej (odsek 20). Hodnota pH sa zmení na pôvodnú úroveň pomocou hydroxidu sodného (odsek 21) a po približne hodinovej sedimentácii sa odoberie vhodné množstvo supernatantu na inokuláciu. Týmto postupom čerenia sa znižuje obsah IC v inokule. Napríklad ak sa ako inokulum použil maximálny odporúčaný objem filtrovaného čereného výtoku (100 ml) na liter, množstvo IC prítomné v slepých kontrolných nádobách bolo v rozsahu 0,4 – 1,3 mg/l (14), čo predstavuje 2 – 6,5 % C testovanej chemikálie pri 20 mg C/l a 4 – 13 % pri 10 mg C/l.
                           
                        
                     Povrchové vody
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Z vhodnej povrchovej vody sa odoberie vzorka. Mala by sa udržiavať v aeróbnych podmienkach a použiť v deň odberu. Vzorka sa podľa potreby koncentruje filtráciou alebo odstredením. Objem inokula, ktoré sa použije v každej testovacej nádobe, by mal spĺňať kritériá uvedené v odseku 26.
                           
                        
                     Pôda
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Z maximálnej hĺbky 20 cm pod pôdnym povrchom sa odoberie vzorka vhodnej pôdy. Skôr než sa vzorka pôdy preoseje cez sito s veľkosťou ôk 2 mm, odstránia sa z nej kamene, zvyšky rastlín a bezstavovcov (ak je vzorka príliš mokrá a nie je možné ju ihneď preosiať, čiastočne sa usuší vzduchom, aby sa uľahčilo preosievanie). Vzorka sa udržiava v aeróbnych podmienkach a použije sa v deň odberu. (Ak sa vzorka prenáša vo voľne uviazanom čiernom polyetylénovom vreci, možno ju v tomto vreci skladovať pri teplote 2 – 4 °C až jeden mesiac).
                           
                        
                     Aklimatizácia inokula
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Inokulum sa môže aklimatizovať na experimentálne podmienky, ale nie predadaptovať na testovanú chemikáliu. Aklimatizáciou možno znížiť uvoľňovanie čistého CO2. Aklimatizácia pozostáva z prevzdušňovania aktivovaného kalu po zriedení v testovacom médiu na úroveň 30 mg/l pomocou vlhkého vzduchu bez obsahu CO2 v trvaní päť až sedem dní pri testovacej teplote.
                           
                        POSTUP TESTOVANIA
                  
                     Počet fliaš
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Počet fliaš [odsek 15 písm. a)] potrebný na test bude závisieť od frekvencie analýz a trvania testu.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Odporúča sa analyzovať trojice fliaš po dostatočnom počte časových intervalov, aby sa mohlo určiť desaťdňové okno. Na konci testu sa takisto analyzuje najmenej päť testovacích fliaš [odsek 15 písm. a)] zo súborov fliaš v písmenách a), b) a c) (pozri odsek 42) s cieľom umožniť výpočet 95 % intervalov spoľahlivosti pre strednú hodnotu percentuálnej biodegradácie.
                           
                        
                     Inokulované médium
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Inokulum sa použije pri koncentrácii 4 mg/l suchých tuhých látok v aktivovanom kale. Tesne pred použitím sa pripraví dostatočne inokulované médium pridaním napríklad 2 ml vhodne upraveného aktivovaného kalu (odseky 27 – 32) s koncentráciou 2 000 mg/l do jedného litra média s obsahom minerálnych solí (odsek 19). Ak sa použije sekundárny výtok splaškových vôd, maximálne 100 ml výtoku (odsek 33) sa pridá do 900 ml média s obsahom minerálnych solí (odsek 19) a zriedi sa médiom na jeden liter.
                           
                        
                     Príprava fliaš
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Alikvotné časti inokulovaného média sa rozdelia do paralelných fliaš tak, aby bol pomer priestoru nad kvapalinou ku kvapaline 1: 2 (napr. sa pridá 107 ml do fliaš s kapacitou 160 ml). Možno použiť aj iné pomery, ale treba venovať pozornosť varovaniu uvedenému v odseku 11. Bez ohľadu na použité inokulum je nutné sa uistiť, že inokulované médium je dostatočne premiešané, aby sa zabezpečila jeho rovnomerná distribúcia do fliaš.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Pripravia sa súbory fliaš [odsek 15 písm. a)], ktoré obsahujú:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          testovacie nádoby (označené FT) obsahujúce testovanú chemikáliu;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          slepé kontrolné nádoby (označené FB) obsahujúce iba testovacie médium a inokulum; takisto sa musia pridať všetky chemikálie, rozpúšťadlá, činidlá alebo filtre zo sklenených vlákien, ktoré sa použili na zavedenie testovanej chemikálie do testovacích nádob;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          nádoby (označené FC) na kontrolu postupu obsahujúce referenčnú chemikáliu;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          v prípade potreby nádoby (označené FI) na kontrolu možných inhibičných účinkov testovanej chemikálie obsahujúce testovanú chemikáliu aj referenčnú chemikáliu v rovnakých koncentráciách (odsek 24) ako vo fľašiach FT a FC;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          nádoby (označené FS) na kontrolu možnej abiotickej degradácie ako v písmene a) plus 50 mg/l HgCl2 alebo sterilizované inými prostriedkami (napr. v autokláve).
                                       
                                    
                        
                              43.
                           
                           
                              Vo vode rozpustné testované chemikálie a referenčné chemikálie sa pridajú ako vodné zásobné roztoky (odseky 22, 23 a 24), aby sa dosiahla koncentrácia 10 – 20 mg C/l.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Nerozpustné testované chemikálie a nerozpustné referenčné chemikálie sa pridajú do fliaš rôznymi spôsobmi [pozri odsek 22 písm. a) – e)] podľa charakteru testovanej chemikálie pred alebo po pridaní inokulovaného média v závislosti od metódy aplikácie testovanej chemikálie. Ak sa použije jeden z postupov uvedených v odseku 22 písm. a) – e), potom by sa so slepými fľašami FB [odsek 42 písm. b)] malo naložiť podobným spôsobom, ale s vylúčením testovanej chemikálie alebo referenčnej chemikálie.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Prchavé testované chemikálie sa pomocou mikrostriekačky vstreknú do hermeticky uzavretých fliaš (odsek 47). Dávka sa vypočíta zo vstreknutého objemu a hustoty testovanej chemikálie.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Podľa potreby sa do nádob pridá voda, aby bol v každej nádobe rovnaký objem kvapaliny. Treba zabezpečiť, aby pomer priestoru nad kvapalinou ku kvapaline (zvyčajne 1: 2) a koncentrácia testovanej chemikálie boli nastavené tak, aby bol k dispozícii dostatok kyslíka, ktorý umožní úplnú biodegradáciu.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Všetky fľaše sa potom hermeticky uzatvoria napríklad butylovými gumenými priehradkami a hliníkovými uzávermi. Prchavé testované chemikálie je potrebné pridať v tejto fáze (odsek 45). Na účely monitorovania poklesu koncentrácie DOC testovanej chemikálie a analýz, ktoré sa vykonávajú v nulovom čase pri počiatočnej koncentrácii IC [sterilné kontroly, odsek 42 písm. e)], alebo iných determinantov sa z testovacej nádoby odoberie primeraná vzorka. Testovacia nádoba a jej obsah sa následne zlikviduje.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Hermeticky uzavreté fľaše sa umiestnia na rotačnú trepačku [odsek 15 písm. d)] s rýchlosťou pretrepávania, ktorá je dostatočná na to, aby obsahy fliaš ostali dobre premiešané a v suspenzii (napr. 150 – 200 rpm), a následne sa inkubujú v tme pri teplote 20 °C a skladujú pri tejto teplote v rozmedzí ± 1 °C.
                           
                        
                     Odber vzoriek
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Systém odberu vzoriek bude závisieť od lag fázy a kinetickej rýchlosti biodegradácie testovanej chemikálie. V deň odberu vzoriek sa fľaše zlikvidujú na účely analýzy, čo by sa malo vykonávať najmenej raz do týždňa alebo častejšie (napr. dvakrát do týždňa), ak sa požaduje úplná krivka degradácie. Z trepačky sa odoberie požadovaný počet paralelných fliaš predstavujúcich FT, FB a FC a, ak sa použili, FI a FS (pozri odsek 42). Test zvyčajne trvá 28 dní. Ak z biodegradačnej krivky vyplýva, že sa dosiahol rovnovážny stav pred uplynutím 28 dní, test môže byť ukončený skôr. Z piatich fliaš vyhradených na 28. deň testu sa odoberú vzorky na analýzu a výsledky sa použijú na výpočet limitov spoľahlivosti alebo variačného koeficientu percentuálnej biodegradácie. Z fliaš, ktoré slúžia ako kontroly inhibície a abiotickej degradácie, nie je potrebné odoberať vzorky tak často ako z ostatných fliaš; postačuje deň 1 a deň 28.
                           
                        
                     Analýza anorganického uhlíka (IC)
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Produkcia CO2 vo fľašiach sa zistí tak, že sa odmeria zvýšenie koncentrácie anorganického uhlíka (IC) počas inkubácie. Na meranie množstva IC vyprodukovaného v teste sú k dispozícii dve odporúčané metódy, ktoré sú opísané ďalej. Keďže výsledky týchto metód sa môžu mierne líšiť, v priebehu testu by sa mala použiť iba jedna.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Metóda a) sa odporúča, ak médium pravdepodobne obsahuje napríklad zvyšky papiera zo skleneného filtra a/alebo nerozpustnej testovanej chemikálie. Ak nie je k dispozícii uhlíkový analyzátor, možno túto analýzu možno vykonať pomocou plynového chromatografu. Je dôležité, aby mali fľaše počas analýzy plynu v uzavretom priestore nad kvapalinou teplotu, ktorá je rovnaká alebo sa blíži k testovacej teplote. Metóda b) môže byť jednoduchšia pre laboratóriá, ktoré na meranie IC používajú uhlíkový analyzátor. Je dôležité, aby bol roztok hydroxidu sodného (odsek 21), ktorý sa použije na premenu CO2 na uhličitan, čerstvo pripravený alebo aby bol známy jeho obsah IC, takže bude možné ho zohľadniť pri výpočte výsledkov testu [pozri odsek 66 písm. b)].
                           
                        
                     Metóda a):   acidifikácia na pH < 3
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Pred každou várkou analýz sa IC analyzátor nakalibruje pomocou vhodného štandardu IC (napr. 1 % hmotnostného CO2 v N2). Koncentrovaná kyselina trihydrogénfosforečná (odsek 20) sa vstrekne cez priehradku každej fľaše, z ktorej sa odoberá vzorka, s cieľom znížiť pH média na úroveň < 3 (napr. sa pridá 1 ml do 107 ml testovacieho média). Fľaše sa umiestnia späť do trepačky. Po jednohodinovom pretrepávaní pri testovacej teplote sa fľaše vyberú z trepačky, odoberú sa alikvotné časti (napr. 1 ml) plynu z uzavretého priestoru nad kvapalinou každej fľaše a vstreknú sa do IC analyzátora. Namerané koncentrácie IC sa zaznamenajú v jednotkách mg C/l.
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Princípom tejto metódy je, že po acidifikácii na pH < 3 a vyvážení pri teplote 20 °C je rovnovážna konštanta pre distribúciu CO2 medzi kvapalnou a plynnou fázou v testovacích fľašiach 1,0 v prípade, že sa meria ako koncentrácia (13). Tento fakt je potrebné pre testovací systém aspoň raz preukázať týmto spôsobom:
                              Založia sa fľaše obsahujúce 5 a 10 mg/l IC s využitím roztoku bezvodého uhličitanu sodného (Na2CO3) vo vode bez obsahu CO2, ktorý sa pripraví tak, že voda sa pomocou koncentrovanej kyseliny trihydrogénfosforečnej okyslí na pH 6,5 (odsek 20), počas noci sa čerí pomocou vzduchu bez obsahu CO2 a pomocou alkálie sa jeho pH zvýši na neutrálnu úroveň. Je potrebné zabezpečiť, aby bol pomer objemu uzavretého priestoru nad kvapalinou k objemu kvapaliny rovnaký ako v testoch (napr. 1 : 2). Obsah fliaš sa okyslí a vyváži podľa opisu v odseku 52 a odmeria sa koncentrácia IC v uzavretom priestore nad kvapalinou, ako aj v kvapalnej fáze. Skontroluje sa, či sú tieto dve koncentrácie v rozsahu pokusnej chyby rovnaké. Ak nie sú, pracovník by mal skontrolovať postupy. Túto kontrolu distribúcie IC medzi kvapalnou a plynnou fázou nie je potrebné vykonať počas každého testu. Pravdepodobne ju bude možné vykonať počas kalibrácie.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Ak sa meria eliminácia DOC (iba testované chemikálie rozpustné vo vode), vzorky z kvapalnej fázy sa odoberú zo samostatných (neokyslených) fliaš, prefiltrujú sa cez membránu a vstreknú sa do analyzátora DOC. Tieto fľaše možno v prípade potreby použiť pri iných analýzach na meranie primárnej biodegradácie.
                           
                        
                     Metóda b):   premena CO2 na uhličitan
                  
                  
                              55.
                           
                           
                              Pred každou várkou analýz sa IC analyzátor nakalibruje pomocou vhodného štandardu, ako je napríklad roztok hydrogénuhličitanu sodného (NaHCO3) vo vode bez obsahu CO2 (pozri odsek 53) v rozsahu 0 – 20 mg/l ako IC. Roztok hydroxidu sodného (7M, odsek 21) (napr. 1 ml do 107 ml média) sa vstrekne cez priehradku každej fľaše, z ktorej sa odoberajú vzorky, a fľaše sa nechajú pretrepávať pri testovacej teplote jednu hodinu. V prípade všetkých fliaš zlikvidovaných v daný deň sa použije rovnaký roztok NaOH, ale nemusí sa nevyhnutne použiť pri každom odbere vzoriek počas testu. Ak sa v čase každého odberu vzoriek požadujú absolútne hodnoty IC v slepých pokusoch, bude potrebné stanoviť IC roztoku NaOH pri každom použití. Fľaše sa vyberú z trepačky a nechajú sa sedimentovať. Striekačkou sa z každej nádoby odoberú vhodné objemy (napr. 50 – 1 000 μl) kvapalnej fázy. Vzorky sa vstreknú do IC analyzátora a zaznamenajú sa koncentrácie IC. Je potrebné zabezpečiť, aby bol použitý analyzátor správne vybavený na spracovanie zásaditých vzoriek produkovaných pri tejto metóde.
                           
                        
                              56.
                           
                           
                              Princípom tejto metódy je, že po pridaní alkálie a pretrepaní je koncentrácia IC v uzavretom priestore nad kvapalinou zanedbateľná. Tento fakt je pre testovací systém nutné aspoň raz skontrolovať pomocou štandardov IC, pridaním alkálie, vyvážením a odmeraním koncentrácie IC v uzavretom priestore nad kvapalinou, ako aj v kvapalnej fáze (pozri odsek 53). Koncentrácia v uzavretom priestore nad kvapalinou by sa mala blížiť nule. Túto kontrolu prakticky úplnej absorpcie CO2 nie je potrebné vykonávať pri každom teste.
                           
                        
                              57.
                           
                           
                              Ak sa meria eliminácia DOC (iba testované chemikálie rozpustné vo vode), vzorky z kvapalnej fázy sa odoberú zo samostatných fliaš (neobsahujúcich žiadne pridané alkálie), prefiltrujú sa cez membránu a vstreknú sa do analyzátora DOC. Tieto fľaše možno v prípade potreby použiť pri iných analýzach na meranie primárnej biodegradovateľnosti.
                           
                        ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV
                  
                     Výpočet výsledkov
                  
                  
                              58.
                           
                           
                              Pri predpoklade stopercentnej mineralizácie testovanej chemikálie na CO2 sa nadbytočný ThIC vyprodukovaný v slepých kontrolných testoch rovná TOC pridanému do každej testovacej fľaše na začiatku testu, teda:
                              
                                 
                              Celková hmotnosť (mg) anorganického uhlíka (TIC) v každej fľaši je:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          rovnica [1]
                                       
                                    kde:
                              
                                          VL
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          objem kvapaliny vo fľaši (litre),
                                       
                                    
                                          CL
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          koncentrácia IC v kvapaline (mg/l ako uhlík),
                                       
                                    
                                          VH
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          objem uzavretého priestoru nad kvapalinou (litre),
                                       
                                    
                                          CH
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          koncentrácia IC v uzavretom priestore nad kvapalinou (mg/l ako uhlík).
                                       
                                    Výpočty TIC pre dve analytické metódy použité na meranie IC v tomto teste sú opísané ďalej v odsekoch 60 a 61. Percentuálna biodegradácia (% D) sa v jednotlivých prípadoch vypočíta podľa vzorca:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          rovnica [2]
                                       
                                    kde:
                              
                                          TICt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          mg TIC v testovacej fľaši v čase t,
                                       
                                    
                                          TICb
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          stredná mg TIC v slepých kontrolných fľašiach v čase t,
                                       
                                    
                                          TOC
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          mg TOC pridaná do testovacej nádoby na začiatku.
                                       
                                    Z príslušných množstiev TIC vyprodukovaných do časov odberu sa vypočíta percentuálna biodegradácia, % D, pre testovacie (FT), referenčné (FC) a, ak sú zahrnuté, kontrolné (FI) fľaše na monitorovanie inhibície.
                           
                        
                              59.
                           
                           
                              Ak v priebehu testovacieho obdobia došlo k výraznému zvýšeniu obsahu TIC sterilných kontrolných fliaš (FS), potom možno vyvodiť záver, že došlo k abiotickej degradácii testovanej chemikálie, ktorú treba zohľadniť pri výpočte D v rovnici [2].
                           
                        
                     Acidifikácia na pH < 3
                  
                  
                              60.
                           
                           Keďže acidifikácia na pH < 3 a vyvažovanie vedie k vyrovnaniu koncentrácie TIC v kvapalnej a plynnej fáze, stačí odmerať iba koncentráciu IC v plynnej fáze. Teda z rovnice [1] 
                                 , kde VB = objem sérovej fľaše.
                        
                     Premena CO2 na uhličitan
                  
                  
                              61.
                           
                           Pri tejto metóde sú výpočty rovnaké ako v rovnici [1], ale zanedbateľné množstvo IC v plynnej fáze sa ignoruje, čiže 
                                  a 
                                 .
                        
                     Vyjadrenie výsledkov
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Krivka biodegradácie sa získa tak, že sa zakreslí percentuálna biodegradácia, D, v závislosti od času inkubácie a podľa možnosti sa naznačí lag fáza, biodegradačná fáza, desaťdňové okno a rovnovážna fáza, teda fáza, v ktorej sa dosiahla maximálna degradácia a krivka biodegradácie sa vyrovnala. Ak sa pre súbežné testovacie nádoby získajú porovnateľné výsledky FT (< 20 % rozdiel), zakreslí sa stredná krivka (pozri dodatok 2, obrázok 1), ak nie, krivky sa zakreslia pre každú nádobu. Stanoví sa stredná hodnota percentuálnej biodegradácie v rovnovážnej fáze alebo sa posúdi najvyššia hodnota (napr. keď krivka v rovnovážnej fáze klesá), ale je dôležité zvážiť, či v druhom prípade nejde o odľahlú hodnotu. Táto maximálna úroveň biodegradácie sa v správe o teste uvedie ako ‚stupeň biodegradácie testovanej chemikálie‘. Ak počet testovacích nádob nebol na naznačenie rovnovážnej fázy dostatočný, na výpočet strednej hodnoty sa použijú údaje namerané v posledný deň testu. Táto posledná hodnota, priemer piatich replikátov, slúži na určenie presnosti, s ktorou bola stanovená percentuálna biodegradácia. Do správy sa uvedie aj hodnota získaná na konci desaťdňového okna.
                           
                        
                              63.
                           
                           
                              Rovnakým spôsobom sa zakreslí krivka pre referenčnú chemikáliu, FC, a, ak je zahrnutá, pre abiotickú kontrolu eliminácie, FS, a kontrolu inhibície, FI.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Zaznamenajú sa množstvá TIC prítomné v slepých kontrolných nádobách (FB), rovnako ako množstvá v bankách FS (abiotická kontrola), ak takéto nádoby boli zahrnuté do testu.
                           
                        
                              65.
                           
                           
                              Vypočíta sa D pre nádoby FI podľa teoretického nárastu IC očakávaného iba v dôsledku referenčnej zložky zmesi. Ak v deň 28 [(DFC
                                  (22) – DFI
                                  (23))/DFC] × 100 > 25 %, možno predpokladať, že testovaná chemikália potlačila činnosť inokula, čo mohlo viesť k nízkym hodnotám DFT získaným v podmienkach testu. V takom prípade možno test opakovať s využitím nižšej testovacej koncentrácie a podľa možnosti znížením DIC v inokule a TIC vytvorenej v slepých kontrolných nádobách, lebo nižšia koncentrácia bude mať inak za následok menšiu presnosť metódy. Prípadne možno použiť iné inokulum. Ak je vo fľaši FS (abiotická) pozorované výrazné zvýšenie (> 10 %) množstva TIC, mohlo dôjsť k abiotickým degradačným procesom.
                           
                        
                     Platnosť výsledkov
                  
                  
                              66.
                           
                           
                              Test sa považuje za platný, ak:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          stredná percentuálna degradácia v nádobách FC obsahujúcich referenčnú chemikáliu je > 60 % do 14. dňa inkubácie a
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          stredné množstvo TIC prítomnej v slepých kontrolných nádobách FB na konci testu je > 3 mg C/l.
                                       
                                    Ak tieto limity nie sú splnené, test by sa mal zopakovať s využitím inokula z iného zdroja a/alebo je potrebné preveriť použité postupy. Napríklad ak je problémom vysoká produkcia IC v slepých kontrolných nádobách, treba sa riadiť postupom uvedeným v odsekoch 27 – 32.
                           
                        
                              67.
                           
                           
                              Ak testovaná chemikália nedosiahne 60 % ThIC a preukáže sa, že nemá inhibičné účinky (odsek 65), test možno zopakovať pri vyššej koncentrácii inokula (až do 30 mg/l aktivovaného kalu a 100 ml výtoku/l) alebo s využitím inokúl z iných zdrojov, najmä ak bola degradácia v rozsahu 20 – 60 %.
                           
                        
                     Interpretácia výsledkov
                  
                  
                              68.
                           
                           
                              Biodegradácia > 60 % ThIC počas desaťdňového okna v tomto teste preukazuje, že testovaná chemikália ja ľahko biodegradovateľná v aeróbnych podmienkach.
                           
                        
                              69.
                           
                           
                              Ak sa nedosiahne hraničná hodnota 60 % ThIC, stanoví sa hodnota pH v médiách vo fľašiach, ktoré sa neacidifikovali ani nealkalizovali. Hodnota pod 6,5 môže znamenať, že došlo nitrifikácii. V takom prípade je potrebné test zopakovať s tlmivým roztokom vyššej koncentrácie.
                           
                        
                     Správa o teste
                  
                  
                              70.
                           
                           
                              Pre každý deň, v ktorom sa odoberali vzorky, sa zostaví tabuľka % D pre každú testovaciu (FT), referenčnú (FC) a, ak bola zahrnutá, inhibičnú kontrolnú fľašu (FI). Ak sa v prípade paralelných fliaš získajú porovnateľné výsledky, zakreslí sa krivka strednej hodnoty % D v závislosti od času. Zaznamená sa množstvo TIC v slepých kontrolných (FB) a v sterilných kontrolných nádobách (FS), DOC a/alebo ostatných determinantov a ich percentuálna eliminácia.
                           
                        
                              71.
                           
                           
                              Stanoví sa stredná hodnota % D v rovnovážnej fáze alebo v prípade, že biodegradačná krivka v rovnovážnej fáze klesá, sa použije najvyššia hodnota a táto hodnota sa v správe uvedie ako ‚stupeň biodegradácie testovanej chemikálie‘. Je dôležité zabezpečiť, aby v druhom prípade najvyššia hodnota nebola odľahlá.
                           
                        
                              72.
                           
                           
                              Správa o teste musí obsahovať tieto informácie:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovaná chemikália:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bežný názov, chemický názov, číslo CAS, štrukturálny vzorec a významné fyzikálno-chemické vlastnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      čistota (nečistoty) testovanej chemikálie.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Podmienky testovania:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odkaz na túto testovaciu metódu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis použitého testovacieho systému (napr. objem nádoby, pomer uzavretého priestoru nad kvapalinou a kvapaliny, metóda miešania atď.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aplikácia testovanej chemikálie a referenčnej chemikálie v testovacom systéme: použitá testovacia koncentrácia a množstvo uhlíka dávkované do každej testovacej fľaše, použitie akýchkoľvek rozpúšťadiel,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      údaje o použitom inokule, akomkoľvek predchádzajúcom ošetrení a aklimatizácii,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inkubačná teplota,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      overenie princípu analýzy IC,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hlavné charakteristiky použitého IC analyzátora (a všetkých ostatných použitých analytických metód),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      počet replikátov.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nespracované údaje a vypočítané hodnoty biodegradovateľnosti v tabuľkovej forme,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      graf percentuálnej degradácie v závislosti od času pre testovanú a referenčnú chemikáliu, lag fáza, fáza degradácie, desaťdňové okno a sklon,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      percentuálna eliminácia v rovnováhe, na konci testu a po desaťdňovom okne,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dôvody pre akékoľvek odmietnutie testovacích výsledkov,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      akékoľvek ďalšie skutočnosti, ktoré majú význam pre použitý postup,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rozbor výsledkov.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATÚRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              Kapitola C.4 tejto prílohy, Stanovenie ‚ľahkej‘ biodegradovateľnosti – test uvoľňovania CO2 (metóda C.4-C).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Sturm, R. N. (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 159 – 167.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Larson, R. J. (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153 – 1161.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Larson, R. J., Hansmann, M. A., a Bookland, E. A. (1996). Carbon dioxide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195 – 1210.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              ISO 9439 (1990; revidované 1999). Kvalita vody. Hodnotenie úplnej aeróbnej biodegradability organických látok vo vodnom prostredí. Skúška tvorby oxidu uhličitého (Sturm)
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Gledhill, W. E. (1975). Screening test for assessment of biodegradability: Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922 – 929.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Weytjens, D., Van Ginneken, I., a Painter, H. A. (1994). The recovery of carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801 – 812.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Ennis, D. M., a Kramer, A. (1975). A rapid microtechnique for testing biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181 – 185.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Ennis, D. M., Kramer, A., Jameson, C. W., Mazzoccki, P. H., a Bailey, P. H. (1978). Appl. Env. Microbiol. 35: 51 – 53.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Boatman, R. J., Cunningham, S. L., a Ziegler, D. A. (1986). A method for measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233 – 243.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Struijs, J., a Stoltenkamp, J. (1990). Head space determination of evolved carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204 – 211.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Birch, R. R., a Fletcher, R. J. (1991). The application of dissolved inorganic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 23: 507 – 524.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Birch, R. R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W. E., Pagga, U., Steber, J., Reust, H., a Bontinck, W. J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19: 1527 – 1550.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              ISO 14593, (1999) Kvalita vody. Hodnotenie úplnej aeróbnej biodegradability organických látok vo vodnom prostredí. Metóda analýzy uvoľneného anorganického uhlíka v uzavretých nádobách (skúška CO2 headspace)
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Battersby, N. S. (1997). The ISO headspace C02 biodegradation test, Chemosphere 34: 1813 – 1822.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance, Washington, DC.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Battersby, N. S., Ciccognani, D., Evans, M. R., King, D., Painter, H. A., Peterson, D. R., a Starkey, M. (1999). An ‚inherent‘ biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219 – 3235.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Kapitola C.4 tejto prílohy, Stanovenie ‚ľahkej‘ biodegradovateľnosti.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegradability: Správa predsedu (M. Hashimoto; MITI) a záverečná správa (M. Kitano a M. Takatsuki; CITI). Paríž.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Kapitola C.11 tejto prílohy, Respiračno-inhibičný test aktivovaného kalu.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Struijs, J., Stoltenkamp-Wouterse, M. J., a Dekkers, A. L. M. (1995). A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319 – 327.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              EÚ (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO2 method: application to surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, máj 1999, Medmenham, SL7 2HD, Spojené kráľovstvo.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              ISO 10634 (1996) Kvalita vody. Pokyny na prípravu a spracovanie organických látok málo rozpustných vo vode na následné hodnotenie ich biodegradability vo vodnom prostredí.
                           
                        
                     Dodatok 1
                     SKRATKY A VYMEDZENIE POJMOV
                     IC: anorganický uhlík.
                     ThCO2: teoretický oxid uhličitý (mg) je vypočítané množstvo oxidu uhličitého, ktoré sa vytvorí zo známeho alebo odmeraného obsahu uhlíka v testovanej chemikálii, keď je kompletne mineralizovaná. Je vyjadrený aj ako mg oxidu uhličitého uvoľneného z mg testovanej chemikálie.
                     DOC: rozpustený organický uhlík je organický uhlík prítomný v roztoku alebo ten, ktorý prechádza cez 0,45-mikrometrový filter alebo ostáva v supernatante po odstredení pri cca. 4 000 g (približne 40 000 m s-2) počas 15 minút.
                     DIC: rozpustený anorganický uhlík.
                     ThIC: teoretický anorganický uhlík.
                     TIC: celkový anorganický uhlík.
                     Ľahko biodegradovateľné: dohodnutá klasifikácia chemikálií, ktoré prešli cez určité špecifické skríningové testy na úplnú biodegradovateľnosť. Tieto testy sú také prísne, že sa predpokladá, že takéto chemikálie sa budú rýchlo a úplne biodegradovať vo vodnom prostredí v aeróbnych podmienkach.
                     Desaťdňové okno: desať dní nasledujúcich ihneď po dosiahnutí 10 % degradácie.
                     Inherentná biodegradovateľnosť: klasifikácia chemikálií, pre ktoré existuje jednoznačný dôkaz ich biodegradácie (primárnej alebo úplnej) v každom teste na biodegradovateľnosť.
                     Úplná aeróbna biodegradácia: úroveň degradácie, ktorá sa dosiahne, keď testovanú chemikáliu úplne spotrebujú mikroorganizmy, čoho výsledkom je tvorba oxidu uhličitého, vody, minerálnych solí a nových mikrobiálnych bunkových zložiek (biomasy).
                     Mineralizácia: mineralizácia je úplná degradácia organickej chemikálie na CO2 a H2O v aeróbnych podmienkach a na CH4, CO2 a H2O v anaeróbnych podmienkach.
                     Lag fáza: dosiahnutý čas od začiatku testu do aklimatizácie a/alebo prispôsobenia degradujúcich mikroorganizmov a do zvýšenia stupňa biodegradácie testovanej chemikálie alebo organického materiálu na úroveň stanoviteľnosti (napr. 10 % maximálnej teoretickej biodegradácie alebo menej v závislosti od presnosti meracej techniky).
                     Fáza degradácie: čas od konca lag fázy až po čas, keď sa dosiahne 90 % maximálnej úrovne degradácie.
                     Rovnovážna fáza: rovnovážna fáza je fáza, v ktorej sa dosiahla maximálna degradácia a v ktorej je krivka biodegradácie vyrovnaná.
                     Testovaná chemikália: akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
                  
                  
                     Dodatok 2
                     
                        Príklad krivky biodegradácie
                     
                     
                        Obrázok 1
                     
                     
                        Biodegradácia 1-oktanolu v teste CO2 v uzavretom priestore nad kvapalinou
                     
                     
                        
                     Glosár
                     Biodegradácia:
                     Fáza degradácie:
                     Maximálna úroveň biodegradácie:
                     Rovnovážna fáza:
                     Desaťdňové okno:
                     Čas testovania (dni):
                  
                  C. 30.   BIOAKUMULÁCIA PRI SUCHOZEMSKÝCH MÁLOŠTETINAVCOCH
                  
                  ÚVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov (TG) 317 (2010). Pokiaľ ide o testovacie metódy týkajúce sa environmentálneho osudu, Biokoncentrácia: prietokový rybí test [kapitola C.13 tejto prílohy (49)] bola uverejnená v roku 1996 a Bioakumulácia pri bentických máloštetinavcoch žijúcich v sedimente [kapitola C.51 tejto prílohy (53)] bola uverejnená v roku 2008. Extrapolácia údajov o vodnej bioakumulácii na suchozemské organizmy, ako sú dážďovky, je zložitá, resp. nemožná. Modelové výpočty založené na lipofilite testovanej chemikálie, napr. (14) (37), sa v súčasnosti využívajú na hodnotenie bioakumulácie chemikálií v pôde, ako napríklad v technickom usmerňovacom dokumente EÚ (19). Potrebe testovacej metódy špecifickej pre kompartmenty už bola venovaná pozornosť, napr. (55). Takáto metóda je dôležitá najmä pre hodnotenie sekundárnej otravy v suchozemských potravinových reťazcoch (4). Problému bioakumulácie v organizmoch iných ako ryby sa venuje niekoľko testovacích metód na vnútroštátnej úrovni, napr. (2) a (72). Metódu merania bioakumulácie pri dážďovkách a červoch čeľade Enchytraeidae (Eisenia fetida, Savigny) z kontaminovanej pôdy vypracovala Americká spoločnosť pre testovanie a materiály (American Society for Testing and Materials) (3). Medzinárodne uznávaná metóda na stanovenie bioakumulácie v obohatenej pôde prispeje k lepšiemu hodnoteniu rizík chemikálií v suchozemských ekosystémoch, napr. (25) (29).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Bezstavovce požívajúce pôdu sú vystavené účinkom chemikálií naviazaných na pôdu. Medzi týmito zvieratami zohrávajú suchozemské máloštetinavce významnú úlohu v štruktúre a funkcii pôdy (15) (20). Suchozemské máloštetinavce žijú v pôde a čiastočne na pôdnom povrchu (najmä v nadložnom horizonte). Často predstavujú najhojnejšie zastúpený živočíšny druh v biomase (54). Tieto zvieratá vzhľadom na bioturbáciu pôdy a skutočnosť, že bývajú častou korisťou, významne ovplyvňujú biodostupnosť chemikálií pre iné organizmy, ako sú dravce patriace do skupiny bezstavovcov [napr. dravé roztoče a chrobáky, napr. (64)] alebo stavovcov (napr. líšky a čajky) (18) (62). Niektoré druhy suchozemských máloštetinavcov, ktoré sa v súčasnosti využívajú v ekotoxikologickom testovaní, sú opísané v dodatku 5.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              V štandardnej príručke ASTM na vykonávanie laboratórnych testov pôdnej toxicity alebo bioakumulácie pri dážďovkách druhu Eisenia fetida a červov čeľade Enchytraeidae druhu Enchytraeus albidus (3) sa uvádza mnoho základných a užitočných informácií týkajúcich sa postupu tejto testovacej metódy bioakumulácie v pôde. Medzi ďalšie dokumenty, ktoré sú uvedené v tejto testovacej metóde, patrí kapitola C.13 tejto prílohy, Biokoncentrácia: prietokový rybí test (49) a kapitola C.51 tejto prílohy: Bioakumulácia pri bentických máloštetinavcoch žijúcich v sedimente (53). Ďalší významný zdroj informácií o tejto testovacej metóde predstavujú aj praktické skúsenosti so štúdiami bioakumulácie v pôde a publikácie uvedené v literatúre, napr. (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Túto testovaciu metódu možno použiť najmä v prípade stabilných, neutrálnych organických chemikálií, ktoré sa zvyčajne adsorbujú na pôde. Pomocou tejto testovacej metódy možno testovať bioakumuláciu stabilných organokovových zlúčenín, ktoré sa viažu na pôdu. Možno ju použiť aj na kovy a iné stopové prvky.
                           
                        PREDPOKLADANÉ PODMIENKY
                  
                              5.
                           
                           
                              Testy na meranie bioakumulácie chemikálie pri suchozemských máloštetinavcoch boli vykonané s ťažkými kovmi [pozri napr. (63)] a perzistentnými, organickými chemikáliami s hodnotami log Kow od 3,0 do 6,0, napr. (40). Takéto testy sa vzťahujú aj na:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          chemikálie, ktoré vykazujú nízky log Kow vyšší ako 6,0 (superhydrofóbne chemikálie),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          chemikálie patriace do triedy organických chemikálií, o ktorých je známe, že majú potenciál sa bioakumulovať v živých organizmoch, napr. povrchovo aktívne alebo vysokoadsorpčné chemikálie,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          chemikálie, ktoré vykazujú potenciál bioakumulácie vzhľadom na štruktúrne charakteristiky, napr. analógy chemikálií, pri ktorých je známy potenciál bioakumulácie, a
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kovy.
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              Informácie o testovanej chemikálii, ako je bežný názov, chemický názov (podľa možnosti názov IUPAC), štrukturálny vzorec, registračné číslo CAS, čistota, bezpečnostné opatrenia, vhodné podmienky skladovania a analytické metódy, je potrebné získať pred začiatkom štúdie. Okrem toho je nutné poznať tieto informácie:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          rozpustnosť vo vode;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          rozdeľovací koeficient oktanol – voda, Kow;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          rozdeľovací koeficient pôda – voda, vyjadrený ako Koc;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          tlak pary;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          degradovateľnosť (napr. v pôde, vo vode);
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          známe metabolity.
                                       
                                    
                        
                              7.
                           
                           
                              Možno použiť rádiooznačené testované chemikálie alebo chemikálie bez rádiooznačenia. Na uľahčenie analýzy sa však odporúča použiť rádiooznačenú testovanú chemikáliu. Rozhodnutie bude závisieť od detekčných limitov alebo od požiadavky na meranie materskej testovanej chemikálie a metabolitov. Ak sa použije rádiooznačená testovaná chemikália a merajú sa celkové rádioaktívne rezíduá, je dôležité, aby sa rádiooznačené rezíduá v pôde aj v testovacích organizmoch charakterizovali prostredníctvom určenia percenta materskej testovanej chemikálie a percenta označenej nematerskej chemikálie, napr. vo vzorkách odobratých v rovnovážnom stave alebo na konci fázy absorpcie, aby bolo možné vypočítať bioakumulačný faktor (BAF) pre danú materskú testovanú chemikáliu a pre metabolity v pôde (pozri odsek 50). Metódu, ktorá je tu opísaná, možno modifikovať, napr. na účely zabezpečenia dostatočnej biomasy, na meranie organickej testovanej chemikálie bez rádiooznačenia alebo v prípade kovov. Ak sa merajú celkové rádioaktívne rezíduá (prostredníctvom kvapalinovej scintilačnej spektroskopie nasledujúcej po extrakcii, horení alebo stabilizácii tkaniva), bioakumulačný faktor je založený na materskej testovanej chemikálii a metabolitoch. Výpočet BAF by podľa možnosti mal vychádzať z koncentrácie materskej testovanej chemikálie v organizmoch a celkových rádioaktívnych rezíduí. Následne sa na účely porovnateľnosti medzi výsledkami rôznych testov bioakumulácie na základe BAF vypočíta akumulačný faktor bioty k pôde (BSAF) normalizovaný na obsah lipidov v červoch a obsah organického uhlíka (OC) v pôde.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Toxicita testovanej chemikálie pre živočíšny druh použitý v teste by mala byť známa, napr. účinná koncentrácia (ECx) alebo letálna koncentrácia (LCx) počas fázy absorpcie [napr. (19)]. Vybratá koncentrácia testovanej chemikálie by podľa možnosti mala predstavovať približne 1 % jej akútnej asymptotickej LC50 a mala by byť najmenej desaťkrát vyššia ako jej detekčný limit v pôde pri použitej analytickej metóde. Prednostne by sa mali použiť hodnoty toxicity získané z dlhodobých štúdií o subletálnych parametroch, pokiaľ sú k dispozícii (51) (52). Ak takéto údaje nie sú dostupné, užitočné informácie prinesie test akútnej toxicity [pozri napr. (23)].
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Mala by byť k dispozícii vhodná analytická metóda známej správnosti, presnosti a citlivosti na kvantifikáciu chemikálie v testovacích roztokoch, v pôde a v biologickom materiáli, ako aj údaje o príprave a skladovaní vzoriek a karty bezpečnostných údajov o materiáli. Treba poznať aj analytické detekčné limity testovanej látky v pôde a v tkanivách červov. Ak sa použije testovaná chemikália označená 14C, je nutné poznať špecifickú rádioaktivitu (t. j. Bq mol–1) a percento rádioaktivity spojenej s nečistotami. Špecifická rádioaktivita testovanej chemikálie by mala byť dostatočne vysoká, aby umožnila analýzu, a použité testovacie koncentrácie by nemali vyvolávať toxické účinky.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Test možno vykonať s využitím umelej alebo prírodnej pôdy. Informácie o charakteristikách použitej prírodnej pôdy, napr. pôvod pôdy alebo jej zložiek, pH, obsah organického uhlíka, rozdelenie veľkosti častíc (percento piesku, siltu a hliny), a retenčná kapacita vody (WHC) by mali byť známe pred začiatkom testu (3) (48).
                           
                        PRINCÍP TESTU
                  
                              11.
                           
                           
                              Medzi parametre, ktoré charakterizujú bioakumuláciu testovanej chemikálie, patrí bioakumulačný faktor (BAF), konštanta rýchlosti absorpcie (ks) a konštanta rýchlosti eliminácie (ke). Vymedzenie pojmov je uvedené v dodatku 1.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Test pozostáva z dvoch fáz: fázy absorpcie (expozícia) a fázy eliminácie (po expozícii). Počas fázy absorpcie sa paralelné skupiny červov vystavia pôsobeniu pôdy, ktorá bola obohatená testovanou chemikáliou. Okrem testovacích zvierat sa za tých istých podmienok bez testovanej chemikálie chovajú skupiny kontrolných červov. Odmeria sa suchá hmotnosť a obsah lipidov v testovacích organizmoch. Na toto meranie možno použiť červy z kontrolnej skupiny. Analytické hodnoty pozadia (slepý test) možno získať analýzou vzoriek kontrolných červov a pôdy. Vo fáze eliminácie sa červy prenesú do pôdy, ktorá neobsahuje testovanú chemikáliu. Fáza eliminácie je nutná vždy okrem prípadu, keď je absorpcia testovanej chemikálie počas fázy expozície bezvýznamná. Fáza eliminácie poskytuje informácie o rýchlosti, ktorou testovacie organizmy vylučujú testovanú chemikáliu [napr. (27)]. Ak sa v priebehu fázy absorpcie nedosiahol rovnovážny stav, stanovenie kinetických parametrov – kinetického bioakumulačného faktora BAFk, konštánt rýchlosti absorpcie a eliminácie – by podľa možnosti malo byť založené na súbežnej úprave výsledkov z fáz absorpcie a eliminácie. Koncentrácia testovanej chemikálie v/na červoch sa monitoruje v priebehu oboch fáz testu.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Počas fázy absorpcie sa vykonávajú merania v časoch odberov vzoriek počas až 14 dní (čeľaď Enchytraeidae) alebo 21 dní (dážďovky), až kým sa nedosiahne rovnovážny stav (11) (12) (67). Rovnovážny stav nastáva vtedy, keď je krivka závislosti koncentrácie pri červoch od času paralelná s časovou osou a ak sa tri po sebe nasledujúce analýzy vzoriek odobratých v intervaloch najmenej dvoch dní navzájom nelíšia o viac ako ± 20 % na základe štatistických porovnaní (napr. analýza rozptylu, regresná analýza).
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Fáza eliminácie pozostáva z prenosu testovacích organizmov do nádob obsahujúcich rovnaký substrát bez testovanej chemikálie. Počas fázy eliminácie sa merania vykonávajú v časoch odberov vzoriek počas 14 dní (čeľaď Enchytraeidae) alebo 21 dní (dážďovky), pokiaľ skoršie analytické skúmanie nepreukázalo 90-percentné zníženie rezíduí testovanej chemikálie pri červoch. Koncentrácia testovanej chemikálie pri červoch na konci fázy eliminácie sa do správy uvedie ako neeliminované rezíduá. Rovnovážny bioakumulačný faktor (BAFss) sa podľa možnosti vypočíta ako pomer koncentrácie pri červoch (Ca) a v pôde (Cs) pri zrejmom rovnovážnom stave, a ako kinetický bioakumulačný faktor, BAFK, ako pomer konštanty rýchlosti absorpcie z pôdy (ks) a konštanty rýchlosti eliminácie (ke) (pre vymedzenie pojmov pozri dodatok 1) pri predpoklade kinetiky prvého rádu (pre výpočty pozri dodatok 2). Ak je zrejmé, že nie je možné použiť kinetiku prvého rádu, mali by sa použiť iné modely.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Konštanta rýchlosti absorpcie, konštanta rýchlosti eliminácie (alebo konštanty, ak boli použité ďalšie modely), kinetický bioakumulačný faktor (BAFK) a podľa možnosti limity spoľahlivosti každého z týchto parametrov sa vypočítajú pomocou počítačových modelových rovníc (pre ďalšie usmernenia pozri dodatok 2). Správnosť odhadu každého modelu možno stanoviť napr. na základe korelačného koeficientu alebo koeficientu určenia (koeficienty blízke hodnote jeden indikujú vysokú mieru zhody) alebo na základe chí-kvadrátu. Takisto veľkosť štandardnej chyby alebo limit spoľahlivosti blízko odhadovaných parametrov môžu indikovať správnosť odhadu modelu.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Na zníženie variability výsledkov testu v prípade testovaných chemikálií s vysokou lipofilitou by bioakumulačné faktory mali byť vyjadrené vo vzťahu k obsahu lipidov a k obsahu organického uhlíka (kg organického uhlíka (OC) kg–1 obsahu lipidov pri červoch). Tento prístup je založený na skutočnosti, že v prípade iektorých chemických tried existuje zrejmá závislosť medzi potenciálom bioakumulácie a lipofilitou, ktorá bola zistená pri rybách (47). Medzi obsahom lipidov pri rybách a bioakumuláciou takýchto chemikálií existuje vzťah. V prípade bentických organizmov boli zistené podobné korelácie, napr. (30) (44). Podobne sa táto korelácia preukázala v prípade suchozemských máloštetinavcov, napr. (5) (6) (7) (14). Ak je k dispozícii dostatok ntkaniva z červov, obsah lipidov v testovacích zvieratách možno určiť na rovnakom biologickom materiáli, aký bol použitý na určenie koncentrácie testovanej chemikálie. Na meranie obsahu lipidov možno prípadne použiť kontrolné zvieratá.
                           
                        PLATNOSŤ TESTU
                  
                              17.
                           
                           
                              Ak má byť test platný, musia byť splnené tieto kritériá v prípade kontrolných zvierat, ako aj v prípade ošetrených zvierat:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          na konci testu by celková mortalita počas fázy absorpcie a eliminácie nemala presahovať 10 % (dážďovky) alebo 20 % (červy čeľade Enchytraeidae) celkového počtu zavedených červov,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pri druhoch Eisenia fetida a Eisenia andrei by strata strednej hmotnosti nameraná na konci fázy absorpcie a na konci fázy eliminácie nemala presahovať 20 % v porovnaní s počiatočnou čerstvou hmotnosťou (f.w.) na začiatku jednotlivých fáz.
                                       
                                    
                        OPIS METÓDY
                  
                     Testovacie druhy
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Na testovanie bioakumulácie sa odporúča niekoľko druhov suchozemských máloštetinavcov. Najbežnejšie používané druhy Eisenia fetida alebo Eisenia andrei (čeľaď Lumbricidae), alebo Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus alebo Enchytraeus luxuriosus (čeľaď Enchytraeidae) sú opísané v dodatku 5.
                           
                        
                     Zariadenie
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              V prípade všetkých častí zariadenia treba dbať na to, aby sa predišlo používaniu materiálov, ktoré môžu rozpustiť, adsorbovať testovanú chemikáliu alebo vylúhovať iné chemikálie a mať škodlivé účinky na testovacie zvieratá. Možno použiť štandardné nádoby pravouhlého alebo valcovitého tvaru vyrobené z chemicky inertného materiálu a s primeranou kapacitou, ktorá zodpovedá veľkosti násady, t. j. počtu testovacích červov. Na každé zariadenie, ktoré prichádza do kontaktu s testovacími médiami, možno použiť nerezovú oceľ, umelú hmotu alebo sklo. Testovacie nádoby by mali byť vhodne prikryté, aby sa zabránilo úniku červov, ale zároveň bol zabezpečený dostatočný prívod vzduchu. V prípade chemikálií s vysokým adsorpčným koeficientom, ako sú syntetické pyretroidy, môže byť potrebné posilanizované sklo. V takýchto prípadoch je potrebné zariadenia po skončení pokusu zlikvidovať (49). Je nutné zabrániť úniku rádiooznačených testovaných látok a prchavých chemikálií. Na zachytenie všetkých rezíduí odparených z testovacích nádob by sa mali použiť zachytávače (napr. sklenené fľaše na premývanie plynu) obsahujúce vhodné absorbenty.
                           
                        
                     Pôda
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Testovacia pôda by mala mať takú kvalitu, aby umožnila prežívanie a podľa možnosti reprodukciu testovacích organizmov počas celého obdobia aklimatizácie a testovania bez toho, aby sa pri týchto organizmoch prejavil nezvyčajný vzhľad alebo správanie. Červy by sa mali zahrabať do pôdy.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Ako substrát v týchto testoch sa odporúča použiť umelú pôdu opísanú v kapitole C.8 tejto prílohy (48). Príprava umelej pôdy pre testy bioakumulácie a odporúčania týkajúce sa skladovania umelej pôdy sú uvedené v dodatku 4. Umelú pôdu vysušenú vzduchom možno až do použitia skladovať pri izbovej teplote.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Ako testovacia a/alebo kultivačná pôda však môže slúžiť prírodná pôda z neznečistených miest. V prípade prírodnej pôdy je nutné uviesť aspoň pôvod (miesto odberu), pH, obsah organického uhlíka, rozdelenie veľkosti častíc (percento piesku, siltu a hliny), maximálnu retenčnú kapacitu vody (WHCmax) a percentuálny obsah vody (3). Analýzou pôdy alebo jej zložiek pred použitím možno získať užitočné informácie o znečisťujúcich mikrolátkach. Ak sa použije pôda z poľnohospodárskeho poľa, nemala by byť ošetrovaná výrobkami na ochranu plodín ani hnojivom z ošetrovaných zvierat, ako sú umelé hnojivá, najmenej jeden rok a v prípade organických hnojív najmenej šesť mesiacov pred odberom vzoriek (50). Postupy manipulácie s prírodnou pôdou pred jej použitím v ekotoxikologických testoch s máloštetinavcami v laboratóriu sú opísané v odseku (3). Čas skladovania prírodnej pôdy v laboratóriu by mal byť čo najkratší.
                           
                        
                     Aplikácia testovanej chemikálie
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Testovaná chemikália sa pridá do pôdy. Je potrebné zohľadniť fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej chemikálie. Testovaná chemikália rozpustná vo vode by sa mala pred tým, ako sa zmieša s pôdou, vo vode úplne rozpustiť. Odporúčaný postup obohacovania v prípade testovanej chemikálie, ktorá je slabo rozpustná vo vode, zahŕňa nanesenie testovanej chemikálie na jednu alebo viacero (umelých zložiek) pôdy. Napríklad kremenný piesok alebo jeho časť možno napustiť roztokom testovanej chemikálie vo vhodnom organickom rozpúšťadle, ktorý sa následne odparí do sucha. a Časť s nánosom možno potom zamiešať do mokrej pôdy. Hlavnou výhodou tohto postupu je fakt, že do pôdy sa nedostane žiadne rozpúšťadlo. Ak sa použije prírodná pôda, testovanú chemikáliu možno pridať obohatením časti pôdy vysušenej vzduchom, ako je opísané v prípade umelej pôdy, alebo zamiešaním testovanej chemikálie do mokrej pôdy, pričom ďalším krokom bude odparenie v prípade, že sa použilo činidlo zvyšujúce rozpustnosť. Vo všeobecnosti treba v čo najväčšej možnej miere zabrániť kontaktu mokrej pôdy s rozpúšťadlami. Je možné uvažovať o nasledujúcich možnostiach (3):
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          ak sa použije iné rozpúšťadlo ako voda, malo by byť miešateľné s vodou a/alebo by malo byť možné ho odstrániť (napríklad odparením), v dôsledku čoho by v pôde zostala iba testovaná chemikália,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          ak sa použije kontrola rozpúšťadla, negatívna kontrola nie je nutná. Kontrola rozpúšťadla by mala obsahovať najvyššiu koncentráciu rozpúšťadla pridaného do pôdy a malo by sa pri nej použiť rozpúšťadlo z tej istej dávky, aká bola použitá na prípravu zásobného roztoku. Toxicita a prchavosť rozpúšťadla a rozpustnosť testovanej chemikálie vo vybratom rozpúšťadle by mali byť hlavnými kritériami pri výbere vhodného činidla zvyšujúceho rozpustnosť.
                                       
                                    
                        
                              24.
                           
                           
                              V prípade chemikálií, ktoré sú slabo rozpustné vo vode a v organických rozpúšťadlách, možno na dosiahnutie želanej testovacej koncentrácie zmiešať 2,0 – 2,5 g jemného kremenného piesku na testovaciu nádobu s určitým množstvom testovanej chemikálie, napr. pomocou trecej misky a paličky. Táto zmes kremenného piesku a testovanej chemikálie sa pridá do predvlhčenej pôdy a dôkladne sa zmieša s primeraným množstvom deionizovanej vody, aby sa získal požadovaný obsah vlhkosti. Konečná zmes sa rozdelí do testovacích nádob. Postup sa opakuje pri každej testovacej koncentrácii a pripraví sa aj vhodná kontrola s 2,0 – 2,5 g jemne zomletého kremenného piesku na testovaciu nádobu.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Koncentrácia testovanej chemikálie v pôde sa stanoví po obohatení. Pred zavedením testovacích organizmov je potrebné overiť homogénnu distribúciu testovanej chemikálie do pôdy. Metóda použitá na obohatenie a dôvody pre výber konkrétneho postupu obohacovania sa uvedú do správy (24).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Rovnováha medzi pôdnou fázou a fázou pórovej vody by sa podľa možnosti mala stanoviť ešte pred pridaním organizmov. Odporúča sa použiť obdobie štyroch dní pri teplote 20 °C. V prípade mnohých organických chemikálií slabo rozpustných vo vode sa čas potrebný na dosiahnutie skutočnej rovnováhy medzi adsorbovanými a rozpustenými časťami môže počítať na dni alebo mesiace. V závislosti od účelu štúdie, napríklad ak sa napodobňujú podmienky životného prostredia, sa obohatená pôda môže nechať ‚zrieť‘ dlhšie, napr. v prípade kovov počas troch týždňov pri teplote 20 °C (22).
                           
                        
                     Kultivácia testovacích organizmov
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Červy sa podľa možnosti chovajú v stálej laboratórnej kultúre. Usmernenia o metódach laboratórnej kultivácie v prípade druhov Eisenia fetida a Eisenia andrei a druhov čeľade Enchytraeidae sú uvedené v dodatku 5 [pozri aj (48) (51) (52)].
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Červy použité v testoch by nemali mať žiadne badateľné choroby, abnormality a parazity.
                           
                        VYKONANIE TESTU
                  
                              29.
                           
                           
                              Testovacie organizmy sú počas fázy absorpcie vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie. Fáza absorpcie by mala trvať 14 dní (Enchytraeidae) alebo 21 dní (dážďovky), pokiaľ sa nepreukáže, že bol dosiahnutý rovnovážny stav.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Vo fáze eliminácie sa červy prenesú do pôdy, ktorá neobsahuje testovanú chemikáliu. Prvá vzorka sa odoberie po 4 – 24 hodinách od začiatku fázy eliminácie. Príklady harmonogramu odberov vzoriek v prípade 21-dňovej fázy absorpcie a 21-dňovej fázy eliminácie sú uvedené v dodatku 3.
                           
                        
                     Testovacie organizmy
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              V prípade mnohých druhov suchozemských červov čeľade Enchytraeidae je individuálna hmotnosť veľmi nízka (napr. 5 – 10 mg čerstvej hmotnosti na jedinca v prípade druhu Enchytraeus albidus a ešte menej v prípade druhu Enchytraeus crypticus alebo Enchytraeus luxuriosus). Na vykonanie meraní hmotnosti a chemickú analýzu môže byť potrebné zozbierať červy z paralelných testovacích nádob (t. j. na získanie jedného analytického výsledku z tkaniva sa použijú všetky červy z paralelnej nádoby). Do každého replikátu sa pridá 20 jedincov Enchytraeidae, pričom sa použijú najmenej tri replikáty. Ak je analytický detekčný limit testovanej chemikálie vysoký, môže byť potrebných viac červov. V prípade testovacích druhov s vyššou individuálnou hmotnosťou (Eisenia fetida a Eisenia andrei) možno použiť paralelné nádoby obsahujúce jedného jedinca.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Dážďovky použité v teste by mali mať podobnú hmotnosť (napr. individuálna hmotnosť Eisenia fetida a Eisenia andrei by mala byť v rozmedzí 250 – 600 mg). Červy čeľade Enchytraeidae (napr. Enchytraeus albidus) by mali mať dĺžku približne 1 cm. Všetky červy použité v konkrétnom teste by mali pochádzať z rovnakého zdroja a malo by ísť o dospelé zvieratá s klitelom (pozri dodatok 5). Keďže hmotnosť a vek zvieraťa môže mať vplyv na hodnoty BAF (napr. v dôsledku meniaceho sa obsahu lipidov a/alebo prítomnosti vajíčok), tieto parametre je nutné presne zaznamenať a zohľadniť pri interpretácii výsledkov. Okrem toho počas obdobia expozície môže dôjsť k nakladeniu kokónov, čo bude mať takisto vplyv na hodnoty BAF. Pred testom sa odporúča odvážiť podvzorku testovacích červov na odhadnutie strednej čerstvej a suchej hmotnosti.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Používa sa vysoký pomer pôdy k červom, aby sa minimalizovalo znižovanie koncentrácie testovanej chemikálie v pôde počas fázy absorpcie. V prípade druhov Eisenia fetida a Eisenia andrei je minimálne odporúčané množstvo 50 g suchej hmotnosti (d.w.) pôdy na červa a v prípade červov čeľade Enchytraeidae minimálne 10 – 20 g d.w. pôdy na testovaciu nádobu. Nádoby by mali obsahovať vrstvu pôdy hrubú 2 – 3 cm (Enchytraeidae) alebo 4 – 5 cm (dážďovky).
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Červy použité v teste sa odoberú z kultúry (napr. červy Enchytraeidae pomocou pinzety). Dospelé zvieratá sa prenesú do neošetrenej testovacej pôdy, aby sa aklimatizovali, a kŕmia sa (pozri odsek 36). Ak sa podmienky testovania líšia od podmienok kultivácie, fáza aklimatizácie v trvaní 24 – 72 hodín by mala postačovať, aby sa červy adaptovali na podmienky testovania. Po aklimatizácii sa dážďovky prepláchnu tak, že sa prenesú do sklenených misiek (napr. Petriho misiek) obsahujúcich čistú vodu a následne sa odvážia pred tým, ako sa vložia do testovacej pôdy. Pred vážením treba z červov odstrániť nadbytočnú vodu jemným dotykom o hranu misky alebo opatrným osušením mierne navlhčenou papierovou vreckovkou.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Zahrabávanie testovacích organizmov sa pozoruje a zaznamená. V testoch s dážďovkami sa zvieratá (kontrolné a ošetrené) zvyčajne zahrabú do pôdy za niekoľko hodín, čo treba najneskôr do 24 hodín po pridaní červov do testovacích nádob skontrolovať. Ak sa dážďovky nezahrabú do pôdy (napr. viac ako 10 % v priebehu vyše polovice fázy absorpcie), znamená to buď, že podmienky testovania nie sú vhodné, alebo že testovacie organizmy nie sú zdravé. V takom prípade je potrebné test pozastaviť a zopakovať. Červy Enchytraeidae žijú najmä v intersticiálnych póroch pôdy a ich integument môže byť často v kontakte s okolitým substrátom iba čiastočne. Predpokladá sa, že expozícia zahrabávajúcich sa a nezahrabávajúcich sa červov Enchytraeidae je rovnaká a v prípade, že sa červy nezahrabú, nie je nevyhnutne potrebné test opakovať.
                           
                        
                     Kŕmenie
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Ak sa použije pôda s nízkym celkovým obsahom organického uhlíka, je potrebné naplánovať kŕmenie. Ak sa použije umelá pôda, odporúčaná týždenná dávka krmiva (t. j. červy sa kŕmia raz týždenne) je 7 mg sušeného hnoja na g suchej hmotnosti pôdy v prípade dážďoviek a 2 – 2,5 mg zomletých ovsených vločiek na g suchej hmotnosti pôdy v prípade červov Enchytraeidae (11). Prvá dávka potravy sa zmieša s pôdou tesne pred pridaním testovacích organizmov. Podľa možnosti sa použije rovnaký druh potravy, aký sa použil v kultúrach (pozri dodatok 5).
                           
                        
                     Svetlo a teplota
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Testy sa vykonávajú v kontrolovaných 16/8-hodinových cykloch svetla/tmy, podľa možnosti s intenzitou 400 – 800 lx v priestore testovacích nádob (3). Testovacia teplota by počas celého testu mala byť 20 ± 2 °C.
                           
                        
                     Testovacie koncentrácie
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Použije sa jedna koncentrácia. Prípady, keď je potrebná ďalšia koncentrácia (koncentrácie), treba odôvodniť. Ak sa toxicita (ECx) testovanej chemikálie blíži k analytickému detekčnému limitu, na testovanie sa odporúča sa použiť rádiooznačenú chemikáliu s vysokou špecifickou rádioaktivitou. V prípade kovov by koncentrácia mala byť vyššia ako úroveň pozadia v tkanive a pôde.
                           
                        
                     Replikáty
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Na kinetické merania (fáza absorpcie a eliminácie) sa pri každom odbere vzorky použijú minimálne tri ošetrené paralelné nádoby. Celkový počet pripravených replikátov by mal byť dostatočný na pokrytie všetkých časov odberu vzoriek vo fáze absorpcie a eliminácie.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Na účely biologických pozorovaní a meraní (napr. pomer suchej a čerstvej hmotnosti, obsahu lipidov) a na analýzu koncentrácií v pozadí pri červoch a v pôde musí byť v prípade, že sa nepoužilo iné rozpúšťadlo ako voda, k dispozícii najmenej 12 paralelných nádob negatívnej kontroly (zo štyroch sa vzorka odoberie na začiatku, zo štyroch na konci fázy absorpcie a zo štyroch na konci fázy eliminácie). Ak sa pri aplikácii testovanej chemikálie použije činidlo zvyšujúce rozpustnosť, okrem ošetrených replikátov treba vykonať kontrolu rozpúšťadla (zo štyroch paralelných nádob sa vzorka odoberie na začiatku, zo štyroch na konci fázy absorpcie a zo štyroch na konci fázy eliminácie) obsahujúcu všetky zložky okrem testovanej látky. V tomto prípade možno na nepovinný odber vzorky na konci fázy absorpcie použiť ďalšie štyri paralelné nádoby na negatívnu kontrolu (bez rozpúšťadla). Tieto replikáty možno biologicky porovnať s kontrolou rozpúšťadla s cieľom získať informácie o možnom vplyve rozpúšťadla na testovacie organizmy. Odporúča sa založenie dostatočného počtu ďalších rezervných paralelných nádob (napr. osem) na aplikáciu látky a kontrolu.
                           
                        
                     Frekvencia merania kvality pôdy
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Hodnota pH pôdy, obsah vlhkosti pôdy a teplota (nepretržitá) v testovacej miestnosti sa odmerajú na začiatku a na konci fázy absorpcie a eliminácie. Raz týždenne sa obsah vlhkosti pôdy skontroluje odvážením testovacích nádob a porovnaním skutočných hmotností s počiatočnými hmotnosťami na začiatku testu. Straty vody treba kompenzovať pridávaním deionizovanej vody.
                           
                        
                     Odber vzoriek a analýza červov a pôdy
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Príklad harmonogramu fázy absorpcie a fázy eliminácie v testoch bioakumulácie pri dážďovkách a Enchytraeidae je uvedený v dodatku 3.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Vzorky pôdy sa z testovacích nádob na účely stanovenia koncentrácie testovanej chemikálie odoberú pred pridaním červov a počas fázy absorpcie a fázy eliminácie. V priebehu testu sa stanovia koncentrácie testovanej chemikálie v červoch a v pôde. Vo všeobecnosti sa merajú celkové koncentrácie pôdy. Nepovinne možno odmerať koncentrácie v pórovej vode. V takom prípade je nutné pred začiatkom štúdie uviesť odôvodnenie a príslušné metódy a zahrnúť ich do správy.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Vzorky červov a pôdy sa počas fázy absorpcie a fázy eliminácie odoberú najmenej šesťkrát. Ak sa preukáže stabilita testovanej chemikálie, počet analýz pôdy možno znížiť. Odporúča sa analyzovať najmenej tri replikáty na začiatku a na konci fázy absorpcie. Ak sa koncentrácia v pôde nameraná na konci fázy absorpcie líši od počiatočnej koncentrácie o viac ako 30 %, treba analyzovať aj vzorky pôdy odobraté v iné dni.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Červy z daného replikátu sa z pôdy pri každom čase odberu vzorky vyberú (napr. sa na plytkú misku rozotrie pôda z replikátu a červy sa povyberajú pomocou jemnej pinzety) a rýchlo sa prepláchnu vodou v plytkom pohári alebo oceľovej miske. Nadbytočná voda sa odstráni (pozri odsek 34). Červy sa opatrne prenesú do predváženej nádoby a okamžite sa odvážia vrátane obsahu tráviaceho traktu.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              V prípade dážďoviek (druh Eisenia) sa počká jednu noc na vyprázdnenie tráviaceho traktu červov, napr. sa umiestnia na vlhký filtračný papier do prikrytej Petriho misky (pozri odsek 34). Po vyprázdnení sa stanoví hmotnosť červov, aby sa posúdilo možné zníženie biomasy počas testu (pozri kritériá platnosti v odseku 17). Váženie a analýza tkaniva sa v prípade Enchytraeidae vykonáva bez vyprázdňovania, lebo je to vzhľadom na malú veľkosť týchto červov technicky náročné. Po stanovení konečnej hmotnosti sa červy okamžite najvhodnejšou metódou usmrtia (napr. pomocou tekutého dusíka alebo zmrazením pri teplotách pod – 18 °C).
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Vo fáze eliminácie červy nahradia kontaminovaný obsah tráviaceho traktu čistou pôdou. To znamená, že merania pri nevyprázdnených červoch (v tomto kontexte Enchytraeidae), z ktorých sa vzorky odoberali tesne pred fázou eliminácie, obsahujú kontaminovanú pôdu v tráviacom trakte. Pri vodných máloštetinavcoch sa predpokladá, že po prvých 4 – 24 hodinách fázy eliminácie sa väčšina kontaminovaného obsahu tráviaceho traktu nahradí čistým sedimentom, napr. (46). Podobné zistenia boli zaznamenané aj pri dážďovkách v štúdiách akumulácie rádiooznačeného kadmia a zinku (78). Pri nevyprázdnených Enchytraeidae možno koncentráciu tejto prvej vzorky fázy eliminácie považovať za koncentráciu v tkanive po vyprázdnení tráviaceho traktu. Na zohľadnenie zriedenia koncentrácie testovanej látky nekontaminovanou pôdou počas fázy eliminácie možno hmotnosť obsahu tráviaceho traktu odhadnúť na základe pomeru čerstvej hmotnosti a hmotnosti popola alebo pomeru suchej hmotnosti a hmotnosti popola pri červoch.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Vzorky pôdy a červov by sa podľa možnosti mali analyzovať ihneď po odobratí (t. j. do jedného až dvoch dní), aby sa predišlo degradácii alebo iným stratám, pričom sa odporúča vypočítať približnú rýchlosť absorpcie a rýchlosť eliminácie v priebehu testu. Ak sa analýza odloží, vzorky by sa mali vhodnou metódou uskladniť, napr. hlbokým zmrazením (≤ – 18 °C).
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Treba skontrolovať, či presnosť a reprodukovateľnosť chemickej analýzy, ako aj výťažnosť testovanej chemikálie zo vzoriek pôdy a červov vyhovujú danej metóde. V správe sa uvedie extrakčná účinnosť, detekčný limit (LOD) a kvantifikačný limit (LOQ). Podobne treba skontrolovať, či testovaná chemikália nie je prítomná v kontrolných nádobách vo vyšších koncentráciách, ako je koncentrácia v pozadí. Ak je koncentrácia testovanej chemikálie v testovacom organizme Ca pri kontrolných červoch > 0, treba túto skutočnosť pri výpočte kinetických parametrov zohľadniť (pozri dodatok 2). So všetkými vzorkami by sa počas celého testu malo zaobchádzať tak, aby sa minimalizovala kontaminácia a strata (napr. v dôsledku adsorpcie testovanej chemikálie na zariadenie na odber vzoriek).
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Pri práci s rádiooznačenými testovanými chemikáliami sa môže analyzovať materská chemikália a metabolity. Kvantifikáciou materskej testovanej chemikálie a metabolitov v rovnovážnom stave alebo na konci fázy absorpcie sa získajú dôležité informácie. Vzorky by sa následne mali vyčistiť, aby bolo možné kvantifikovať materskú testovanú chemikáliu samostatne. Ak v analyzovanej vzorke (vzorkách) samotné metabolity presahujú 10 % celkovej rádioaktivity, odporúča sa identifikovať tieto metabolity.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Celková výťažnosť a výťažnosť testovanej chemikálie v červoch, v pôde a, ak sa použijú, v zachytávačoch obsahujúcich absorbenty na zadržanie odparenej testovanej chemikálie sa zaznamená a uvedie do správy.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Spájanie vzoriek jedincov odobratých z danej testovacej nádoby je prípustné v prípade červov Enchytraeidae, ktoré sú menšie ako dážďovky. Ak spájanie vzoriek vedie k zníženiu počtu replikátov, štatistické postupy, ktoré možno použiť pri spracúvaní údajov, budú obmedzenejšie. Ak sa vyžaduje špecifický štatistický postup a významnosť, potom je potrebné do testu zahrnúť primeraný počet paralelných testovacích nádob, aby sa zabezpečilo želané spájanie vzoriek, postup a významnosť.
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Odporúča sa vyjadriť BAF ako funkciu celkovej suchej hmotnosti a v prípade potreby (t. j. v prípade vysokohydrofóbnych chemikálií) aj ako funkciu obsahu lipidov. Na stanovenie obsahu lipidov sa použijú vhodné metódy (niektoré existujúce metódy – napr. (31) (58) – je potrebné na tento účel upraviť). Tieto metódy využívajú extrakciu zmesou chloroformu a metanolu. S cieľom predísť použitiu chlórovaných rozpúšťadiel by sa mala použiť upravená metóda podľa Bligha a Dyera (9) uvedená v odkaze (17). Keďže rôznymi metódami sa nemusí dospieť k identickým hodnotám, je dôležité uviesť podrobné informácie o použitej metóde. Ak je to možné, t. j. ak je k dispozícii dostatočné množstvo tkaniva z červov, analýza lipidov by sa podľa možnosti mala vykonať na rovnakej vzorke alebo extrakte, aké boli použité na analýzu testovanej chemikálie, lebo lipidy je často nutné z extraktu odstrániť, skôr než ich možno chromatograficky analyzovať (49). Prípadne možno použiť kontrolné zvieratá na meranie obsahu lipidov, ktorý sa následne môže použiť na normalizáciu hodnôt BAF. Pri druhom prístupe je kontaminácia zariadenia testovanou chemikáliou nižšia.
                           
                        ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV
                  
                     Spracovanie výsledkov
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              Krivka absorpcie testovanej chemikálie sa získa tak, že sa na aritmetické osi zakreslí jej koncentrácia v/na červoch počas fázy absorpcie v závislosti od času. Ak krivka dosiahne rovnováhu alebo rovnovážny stav (pozri vymedzenie pojmov v dodatku 1), rovnovážny bioakumulačný faktor BAFss sa vypočíta podľa tohto vzorca:
                              
                                 
                              Ca je koncentrácia testovanej chemikálie v testovacom organizme,
                              Cs je koncentrácia testovanej chemikálie v pôde.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Ak sa nedosiahne rovnovážny stav, namiesto BAFss sa na základe konštánt rýchlosti určí BAFK týmto spôsobom:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          určí sa akumulačný faktor (BAFK) ako pomer ks/ke,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          rýchlosti absorpcie a eliminácie sa podľa možnosti vypočítajú súbežne (pozri rovnicu 11 v dodatku 2),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          konštanta rýchlosti eliminácie (ke) sa zvyčajne stanoví podľa krivky eliminácie (t. j. znázornenia koncentrácie testovanej látky v červoch počas fázy eliminácie). Konštanta rýchlosti absorpcie ks sa potom vypočíta podľa ke a hodnoty Ca, ktorá je odvodená z krivky absorpcie (opis týchto metód je uvedený v dodatku 2). Prednostným spôsobom stanovovania BAFK a oboch rýchlostných konštánt ks a ke sú nelineárne metódy odhadovania parametrov pomocou počítača. Ak je zrejmé, že eliminácia nie je prvého rádu, potom je potrebné použiť komplexnejšie modely.
                                       
                                    
                        
                     Správa o teste
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Správa o teste musí obsahovať tieto informácie:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovaná chemikália:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      všetky dostupné informácie o akútnej alebo dlhodobej toxicite (napr. ECx, LCx, NOEC) testovanej chemikálie pre máloštetinavce žijúce v pôde,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      čistota, fyzický charakter a fyzikálno-chemické vlastnosti, napr. log Kow, rozpustnosť vo vode,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      chemické identifikačné údaje; zdroj testovanej látky, identita a koncentrácia akéhokoľvek použitého rozpúšťadla,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ak sa použije rádiooznačená testovaná chemikália, presná poloha označených atómov, špecifická rádioaktivita a rádiochemická čistota.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Testovacie druhy:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vedecký názov, kmeň, pôvod, všetky zásahy uskutočnené pred pokusom, aklimatizácia, vek, rozsah hmotností atď.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Podmienky testovania:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      použitý postup testovania,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      typ a charakteristiky osvetlenia a dĺžka svetlej fázy (svetlých fáz),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      koncepcia testu (napr. počet a veľkosť testovacích nádob, hmotnosť pôdy a výška vrstvy pôdy, počet replikátov, počet červov v jednom replikáte, počet testovacích koncentrácií, trvanie fázy absorpcie a fázy eliminácie, frekvencia odberov vzoriek),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      odôvodnenie výberu materiálu testovacej nádoby,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metóda prípravy a aplikácie testovanej látky, ako aj dôvody pre výber špecifickej metódy,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominálne testovacie koncentrácie, priemery hodnôt nameraných v testovacích nádobách a ich smerodajné odchýlky a spôsob, akým sa vypočítali,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      zdroj zložiek umelej pôdy alebo – ak boli použité prírodné médiá – pôvod pôdy, opis všetkých zásahov uskutočnených pred pokusom, výsledky kontrol (prežívanie, tvorba biomasy, reprodukcia), charakteristiky pôdy (pH, celkový obsah organického uhlíka, rozdelenie veľkosti častíc (percento piesku, siltu a hliny), WHCmax, percentuálny obsah vody na začiatku a na konci testu a akékoľvek iné uskutočnené merania),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrobné informácie o manipulácii so vzorkami pôdy a červov vrátane údajov o príprave, skladovaní, postupoch obohacovania, extrakcii a analytických postupoch (a presnosti) testovanej látky v červoch a v pôde, obsahu lipidov (ak sa meral) a výťažnosti testovanej látky.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Výsledky:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      mortalita kontrolných červov a červov v jednotlivých testovacích nádobách a akékoľvek pozorované nezvyčajné správanie (napr. vyhýbanie sa pôde, chýbajúca reprodukcia v teste bioakumulácie pri Enchytraeidae),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pomer suchej hmotnosti k čerstvej hmotnosti pôdy a testovacích organizmov (užitočné na účely normalizácie),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      čerstvé hmotnosti červov v každom čase odberu vzorky; v prípade dážďoviek, čerstvé hmotnosti na začiatku testu a v každom čase odberu vzorky pred a po vyprázdnení tráviaceho traktu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      obsah lipidov v testovacích organizmoch (ak bol stanovený),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      krivky znázorňujúce absorpčnú a eliminačnú kinetiku testovanej chemikálie pri červoch a v čase rovnovážneho stavu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Ca a Cs (so smerodajnou odchýlkou a rozsahom, ak je to vhodné) pre všetky časy odberov vzoriek (Ca vyjadrené v g kg–1 čerstvej a suchej hmotnosti celého tela, Cs vyjadrená v g kg–1 čerstvej a suchej hmotnosti pôdy). Ak sa požaduje akumulačný faktor bioty k pôde (BSAF) (napr. na porovnanie výsledkov z dvoch alebo viacerých testov vykonaných so zvieratami s odlišným obsahom lipidov), Ca možno dodatočne vyjadriť ako g kg–1 obsahu lipidov v organizme a Cs možno vyjadriť ako g kg–1 organického uhlíka (OC) v pôde,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      BAF (vyjadrený v kg pôdy·kg–1 červov), konštanta rýchlosti absorpcie pôdy ks (vyjadrená v g pôdy kg–1 červov deň–1) a konštanta rýchlosti eliminácie ke (vyjadrená v deň–1), BSAF (vyjadrený v kg pôdy OC kg–1 obsahu lipidov pri červoch) možno do správy uviesť dodatočne,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ak sa merajú: percentá materskej chemikálie, metabolitov a viazaných rezíduí (t. j. percento testovanej chemikálie, ktoré nemožno extrahovať pomocou bežných metód extrakcie) zistené v pôde a testovacích zvieratách,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metódy použité na štatistické analýzy údajov.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Hodnotenie výsledkov:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      súlad výsledkov s kritériami platnosti uvedenými v odseku 17,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      neočakávané alebo nezvyčajné výsledky, napr. neúplná eliminácia testovanej chemikálie z testovacích zvierat.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATÚRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              Amorim, M. (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane (γ-HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Diplomová práca, Univerzita Coimbra.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1688-00a.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid potworm Enchytraeus albidus. ASTM International, E1676-04: 26 s.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Beek, B., Boehling, S., Bruckmann, U., Franke, C., Joehncke, U., Studinger, G. (2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): Bioaccumulation – New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235 – 276.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Belfroid, A., Sikkenk, M., Seinen, W., Van Gestel, C., Hermens, J. (1994). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93 – 99.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Belfroid, A., Van Wezel, A., Sikkenk, M., Van Gestel, C., Seinen, W., a Hermens, J. (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 154 – 165.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Belfroid, A., Meiling, J., Drenth, H., Hermens, J., Seinen, W., Van Gestel, C. (1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei). Ecotox. Environ. Safety 31: 185 – 191.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Bell, A. W. (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902: 1 – 13.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Bligh, E. G., a Dyer, W. J. (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911 – 917.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Bouche, M. (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paríž, 671 s
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Bruns, E., Egeler, Ph., Moser, T., Römbke, J., Scheffczyk, A., Spörlein, P. (2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Bruns, E., Egeler, Ph., Römbke, J., Scheffczyk, A., Spörlein, P. (2001b). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes Enchytraeus luxuriosus and Enchytraeus albidus (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). Hydrobiologia 463: 185 – 196.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Conder, J. M., a Lanno, R. P. (2003). Lethal critical body residues as measures of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm Eisenia fetida. J. Soils Sediments 3: 13 – 20.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Connell, D. W., a Markwell, R. D. (1990). Bioaccumulation in the Soil to Earthworm System. Chemosphere 20: 91 – 100.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Didden, W. A. M. (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37: 2 – 29.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Didden, W. (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd., Holandsko, s. 555 – 576.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              De Boer, J., Smedes, F., Wells, D., Allan, A. (1999). Report on the QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing Programme.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Dietrich, D. R., Schmid, P., Zweifel, U., Schlatter, C., Jenni-Eiermann, S., Bachmann, H., Bühler, U., Zbinden, N. (1995). Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 140 – 145.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 z 18. decembra 2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemických látok (REACH) a o zriadení Európskej chemickej agentúry, o zmene a doplnení smernice 1999/45/ES a o zrušení nariadenia Rady (EHS) č. 793/93 a nariadenia Komisie (ES) č. 1488/94, smernice Rady 76/769/EHS a smerníc Komisie 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES (Ú. v. EÚ L 396, 30.12.2006, s. 1).
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Edwards, C. A., a Bohlen, P. J. (1996). Biology and ecology of earthworms. Tretie vydanie, Chapman & Hall, Londýn, 426 s
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Kapitola C.51 tejto prílohy, Bioakumulácia pri bentických máloštetinavcoch žijúcich v sedimente.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Egeler, Ph., Gilberg, D., Scheffczyk, A., Moser, Th., a Römbke, J. (2009). Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: 149 s Dostupné na prevzatie na: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Elmegaard, N., a Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: 57 s.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195 – 208.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Franke, C. (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk assessment? Chemosphere 32: 1897-1905.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Franke, C., Studinger, G., Berger, G., Böhling, S., Bruckmann, U., Cohors-Fresenborg, D., Jöhncke, U. (1994). The assessment of bioaccumulation. Chemosphere 29: 1501 – 1514.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Füll, C. (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Dichlorprop) beim Regenwurm Lumbricus rubellus (Oligochaeta, Lumbricidae). Dizertačná práca, Univerzita Mainz, 156 s.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Füll, C., Schulte, C., Kula, C. (2003). Bewertung der Auswirkungen von Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF – Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 78 – 84.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Gabric, A. J., Connell, D. W., Bell, P. R. F. (1990). A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225 – 1231.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Gardner, W. S., Frez, W. A., Cichocki, E. A., Parrish, C. C. (1985). Micromethods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099 – 1105.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Hawker, D. W., a Connell, D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701 – 707.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Hund-Rinke, K., a Wiechering, H. (2000). Earthworm avoidance test for soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sediments 1: 15 – 20.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Hund-Rinke, K., Römbke, J., Riepert, F., Achazi, R. (2000). Beurteilung der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. V: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59 – 81.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              ISO 11268-2 (1998) Kvalita pôdy – účinky znečisťujúcich látok na dážďovky (Eisenia fetida). Časť 2: Stanovenie účinkov na reprodukciu.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Jaenike, J. (1982). ‚Eisenia foetida‘ is two biological species. Megadrilogica 4: 6 – 8.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Jager, T. (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080 – 2090.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Jager, T., Sanchez, P. A., Muijs, B., van der Welde, E., Posthuma, L. (2000). Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in Eisenia andrei (Oligochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953 – 961.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Jager, T., Baerselman, R., Dijkman, E., De Groot, A. C., Hogendoorn, E. A., DeJong, A., Kruitbosch, J. A. W., Peijnenburg, W. J. G. M. (2003a). Availability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms (Eisenia andrei, Oligochaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 767 – 775.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Jager, T., Fleuren, R. L. J., Hoogendoorn, E., de Korte, G. (2003b). Elucidating the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm, Eisenia andrei (Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399 – 3404.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Janssen, M. P. M., Bruins, A., De Vries, T. H., Van Straalen, N. M. (1991). Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305 – 312.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Kasprzak, K. (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217 – 232.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Khalil, A. M. (1990). Aufnahme und Metabolismus von 14C-Hexachlorbenzol und 14C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dizertačná práca, Univerzita Mníchov, 137 s.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Landrum, P. F. (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23: 588 – 595.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Marinussen, M. P. J. C., Van der Zee, S. E. A. T. M., De Haan, F. A. M. (1997). Cu accumulation in Lumbricus rubellus under laboratory conditions compared with accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17 – 26.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Mount, D. R., Dawson, T. D., Burkhard, L. P. (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegates. Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244 – 1249.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Nendza, M. (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumulation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlín 1990, VCH, Weinheim.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Kapitola C.8 tejto prílohy, Toxicita pre dážďovky.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Kapitola C.13 tejto prílohy, Biokoncentrácia: prietokový rybí test.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Kapitola C.21 tejto prílohy, Pôdne mikroorganizmy: test dusíkovej premeny.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Kapitola C.35 tejto prílohy, Test reprodukcie pri Enchytraeidae.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Kapitola C.36 tejto prílohy, Test reprodukcie pri dážďovkách
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Kapitola C.51 tejto prílohy: Bioakumulácia pri bentických máloštetinavcoch žijúcich v sedimente.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Petersen, H., a Luxton, M. (1982). A comparative analysis of soil fauna populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287 – 388.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Phillips, D. J. H. (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology Vol. 1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378 – 396.
                           
                        
                              56.
                           
                           
                              Pflugmacher, J. (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser-Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77 – 81.
                           
                        
                              57.
                           
                           
                              Posthuma, L., Weltje, L., Anton-Sanchez, F. A. (1996). Joint toxic effects of cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm Eisenia fetida. RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.
                           
                        
                              58.
                           
                           
                              Randall, R. C., Lee, II H., Ozretich, R. J., Lake, J. L., Pruell, R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ.Toxicol. Chem. 10: 1431 – 1436.
                           
                        
                              59.
                           
                           
                              Römbke, J., Egele, P., Füll, C. (1998). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 s
                           
                        
                              60.
                           
                           
                              Römbke, J., a Moser, Th. (1999). Organisation and performance of an international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 s
                           
                        
                              61.
                           
                           
                              Römbke, J., Riepert, F., Achazi, R. (2000). Enchytraeen als Testorganismen, In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105 – 129.
                           
                        
                              62.
                           
                           
                              Romijn, C. A. F. M., Luttik, R., Van De Meent, D., Slooff, W.,Canton, J. H. (1993). Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107 – 127.
                           
                        
                              63.
                           
                           
                              Sample, B. E., Suter, D. W., Beauchamp, J. J., Efroymson, R. A. (1999). Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110 – 2120.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Schlosser, H.-J., a Riepert, F. (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 413 – 433.
                           
                        
                              65.
                           
                           
                              Schmelz, R., a Collado, R. (1999). Enchytraeus luxuriosus sp. nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 57: 93 – 100.
                           
                        
                              66.
                           
                           
                              Sims, R. W., a Gerard, B. M. (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 31. 171 S. Londýn: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.
                           
                        
                              67.
                           
                           
                              Sousa, J. P., Loureiro, S., Pieper, S., Frost, M., Kratz, W., Nogueira, A. J. A., Soares, A. M. V. M. (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557 – 2563.
                           
                        
                              68.
                           
                           
                              Spacie, A., a Hamelink, J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309 – 320.
                           
                        
                              69.
                           
                           
                              Stephenson, G. L., Kaushik, A., Kaushik, N. K., Solomon, K. R., Steele, T., Scroggins, R. P. (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxicology. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac Press, Pensacola, 67 – 81.
                           
                        
                              70.
                           
                           
                              Sterenborg, I., Vork, N. A., Verkade, S. K., Van Gestel, C. A. M., Van Straalen, N. M. (2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta. Environ. Toxicol. Chemistry 22: 1167 – 1171.
                           
                        
                              71.
                           
                           
                              UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation – Bewertungskonzept und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlín.
                           
                        
                              72.
                           
                           
                              US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Druhé vydanie, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, MN, marec 2000.
                           
                        
                              73.
                           
                           
                              Van Brummelen, T. C., a Van Straalen, N. M. (1996). Uptake and elimination of benzoa)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: 277 – 285.
                           
                        
                              74.
                           
                           
                              Van Gestel, C. A. M. (1992). The influence of soil characteristics on the toxicity of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earthworms (Ed. Becker, H., Edwards, P. J., Greig-Smith, P. W., a Heimbach, F.). Intercept Press, Andover (GB).
                           
                        
                              75.
                           
                           
                              Van Gestel, C. A., a Ma, W.-C. (1990). An approach to quantitative structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. Chemosphere 21: 1023 – 1033.
                           
                        
                              76.
                           
                           
                              Van Straalen, N. M., Donker, M. H., Vijver, M. G., van Gestel, C. A. M. (2005). Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil invertebrates. Environmental Pollution 136: 409 – 417.
                           
                        
                              77.
                           
                           
                              Venter, J. M., a Reinecke, A. J. (1988). The life-cycle of the compost-worm Eisenia fetida (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161 – 165.
                           
                        
                              78.
                           
                           
                              Vijver, M. G., Vink, J. P. M., Jager, T., Wolterbeek, H. T., van Straalen, N. M., van Gestel, C. A. M. (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm Lumbricus rubellus exposed to contaminated floodplain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843 – 1851.
                           
                        
                              79.
                           
                           
                              Widianarko, B., a Van Straalen, N. M. (1996). Toxicokinetics-based survival analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402 – 406.
                           
                        
                     Dodatok 1
                     VYMEDZENIE POJMOV
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bioakumulácia je zvyšovanie koncentrácie testovanej chemikálie v alebo na organizme vzhľadom na koncentráciu testovanej chemikálie v okolitom médiu. Bioakumulácia je dôsledkom procesov biokoncentrácie a biomagnifikácie (pozri ďalej).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Biokoncentrácia je zvyšovanie koncentrácie testovanej chemikálie v alebo na organizme, ktoré je dôsledkom absorpcie chemikálie výlučne z okolitého média (t. j. prostredníctvom povrchu tela a požitej pôdy), vzhľadom na koncentráciu testovanej chemikálie v okolitom médiu.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Biomagnifikácia je zvyšovanie koncentrácie testovanej chemikálie v alebo na organizme, ktoré je dôsledkom hlavne absorpcie z kontaminovanej potravy alebo koristi, vzhľadom na koncentráciu testovanej chemikálie v potrave alebo koristi. Biomagnifikácia môže viesť k prenosu alebo akumulácii testovanej látky v rámci potravinového reťazca.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Eliminácia testovanej chemikálie je strata tejto chemikálie z tkaniva testovacieho organizmu aktívnymi alebo pasívnymi procesmi, ku ktorým dochádza bez ohľadu na prítomnosť alebo neprítomnosť testovanej látky v okolitom médiu.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bioakumulačný faktor (BAF) v akomkoľvek čase počas fázy absorpcie tohto testu bioakumulácie je koncentrácia testovanej chemikálie v/na testovacom organizme (Ca v g·kg–1 suchej hmotnosti červov) vydelená koncentráciou chemikálie v okolitom médiu (Cs ako g·kg–1 suchej hmotnosti pôdy); jednotkou BAF je kg pôdy·kg–1 červov.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rovnovážny bioakumulačný faktor (BAFss) je BAF v rovnovážnom stave a v priebehu dlhšieho obdobia sa výrazne nemení, pričom koncentrácia testovanej chemikálie v okolitom médiu (Cs ako g kg–1 suchej hmotnosti pôdy) je počas tohto obdobia konštantná.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bioakumulačné faktory vypočítané priamo na základe pomeru konštanty rýchlosti absorpcie pôdy a konštanty rýchlosti eliminácie (ks a ke, pozri ďalej) sa označujú ako kinetický bioakumulačný faktor (BAFK).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Akumulačný faktor bioty k pôde (BSAF) je koncentrácia testovanej chemikálie v/na testovacom organizme normalizovaná na lipidy vydelená koncentráciou testovanej chemikálie v pôde v rovnovážnom stave normalizovanou na organický uhlík. Ca je potom vyjadrená ako g·kg–1 obsahu lipidov v organizme a Cs ako g·kg–1 organického obsahu pôdy; jednotkou BSAF je kg OC·kg–1 lipidov.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rovnováha alebo rovnovážny stav sa vymedzuje ako rovnováha medzi procesmi absorpcie a eliminácie, ku ktorým dochádza súčasne počas fázy expozície. Rovnovážny stav nastáva pri grafickom znázornení závislosti BAF od času vtedy, keď sa priebeh krivky stáva paralelný s časovou osou a tri po sebe idúce analýzy BAF uskutočnené na vzorkách odobratých minimálne v dvojdňových intervaloch sa od seba neodlišujú o viac ako 20 % a ak medzi týmito tromi obdobiami odberu vzoriek neexistujú štatisticky významné rozdiely. V prípade testovaných chemikálie, ktoré sa vstrebávajú pomalšie, sú vhodnejšie intervaly v trvaní sedem dní (49).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rozdeľovací koeficient organický uhlík – voda (Koc) je pomer koncentrácie chemikálie v/na zlomku pôdy tvorenom organickým uhlíkom a koncentrácie chemikálie vo vode v rovnováhe.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rozdeľovací koeficient oktanol – voda (Kow) je pomer rozpustnosti chemikálie v n-oktanole a vo vode v rovnováhe, niekedy vyjadrený aj ako Pow. Dekadický logaritmus Kow (log Kow) sa používa na vyjadrenie potenciálu chemikálie na bioakumuláciu vo vodných živočíchoch.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Fáza absorpcie alebo expozície je čas, počas ktorého sú testovacie organizmy vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Konštanta rýchlosti absorpcie pôdy (ks) je číselná hodnota vyjadrujúca rýchlosť zvyšovania koncentrácie testovanej látky v/na testovacom organizme v dôsledku absorpcie z pôdnej fázy; ks je vyjadrená v g pôdy kg–1 červov d–1.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Fáza eliminácie je čas nasledujúci po prenose testovacích organizmov z kontaminovaného média do média bez obsahu testovanej látky, počas ktorého sa skúma eliminácia (alebo čistá strata) chemikálie z testovacích organizmov.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Konštanta rýchlosti eliminácie (ke) je číselná hodnota vyjadrujúca rýchlosť znižovania koncentrácie testovanej látky v/na testovacom organizme po prenose testovacích organizmov z média obsahujúceho testovanú látku do média bez obsahu testovanej látky; ke je vyjadrená v d–1.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testovaná chemikália: akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
                              
                           
                  
                     Dodatok 2
                     
                        Výpočet parametrov absorpcie a eliminácie
                     
                     Hlavným parametrom testu bioakumulácie je bioakumulačný faktor, BAF. Meraný BAF možno vypočítať tak, že koncentrácia v testovacom organizme, Ca, sa vydelí koncentráciou v pôde, Cs, v rovnovážnom stave. Ak sa počas fázy absorpcie nedosiahne rovnovážny stav, BAFK sa vypočíta z konštánt rýchlosti, nie z BAFss. Treba však uviesť, či je BAF založený na koncentráciách v rovnovážnom stave alebo nie.
                     Zvyčajným prostriedkom stanovovania kinetického bioakumulačného faktora (BAFK), konštanty rýchlosti absorpcie pôdy (ks) a konštanty rýchlosti eliminácie (ke) je použitie nelineárnych metód odhadovania parametrov na počítači, napr. na základe modelov opísaných v odkaze (68). Vzhľadom na súbor sekvenčných údajov o koncentrácii v závislosti od času a modelové rovnice:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [rovnica 1]
                              
                           alebo
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 [rovnica 2]
                              
                           kde
                     
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 koncentrácia chemikálie v červoch [g kg–1 čerstvej alebo suchej hmotnosti],
                              
                           
                                 ks
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 konštanta rýchlosti absorpcie v tkanivách [g pôdy kg–1 červov d–1],
                              
                           
                                 Cs
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 koncentrácia chemikálie v pôde [g kg–1 čerstvej alebo suchej hmotnosti],
                              
                           
                                 ke
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 konštanta rýchlosti eliminácie [d–1],
                              
                           
                                 tc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 čas na konci fázy absorpcie,
                              
                           tieto počítačové programy počítajú hodnoty BAFK, ks a ke.
                     Ak sa koncentrácia v pozadí pri neexponovaných červoch, napr. v deň 0, výrazne líši od nuly (to môže nastať napr. v prípade kovov), daná koncentrácia v pozadí (Ca,0) by sa mala zahrnúť do týchto rovníc, ktoré budú mať takúto podobu:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [rovnica 3]
                              
                           a
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 [rovnica 4]
                              
                           V prípadoch, keď je pozorovaný výrazný priebežný pokles koncentrácie testovacej chemikálie v pôde počas fázy absorpcie, možno použiť tieto modely, napr. (67) (79):
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [rovnica 5]
                              
                           kde
                     
                                 Cs
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 koncentrácia chemikálie v pôde [g kg–1 čerstvej alebo suchej hmotnosti],
                              
                           
                                 k0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 konštanta rýchlosti degradácie v pôde [d–1],
                              
                           
                                 C0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 počiatočná koncentrácia chemikálie v pôde [g kg–1 čerstvej alebo suchej hmotnosti],
                              
                           
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [rovnica 6]
                              
                           
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 [rovnica 7]
                              
                           kde
                     
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 koncentrácia chemikálie v červoch [g kg–1 čerstvej alebo suchej hmotnosti],
                              
                           
                                 ks
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 konštanta rýchlosti absorpcie v tkanivách [g pôdy kg–1 červov d–1],
                              
                           
                                 k0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 konštanta rýchlosti degradácie v pôde [d–1],
                              
                           
                                 ke
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 konštanta rýchlosti eliminácie [d–1],
                              
                           
                                 tc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 čas na konci fázy absorpcie.
                              
                           Ak sa počas fázy absorpcie dosiahne rovnovážny stav (t. j. t = ∞), rovnicu 1
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [rovnica 1]
                              
                           možno zredukovať na:
                     
                        
                     alebo
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [rovnica 8]
                              
                           Potom ks/ke x Cs je prístup ku koncentrácii testovanej látky v tkanivách červov v rovnovážnom stave (Ca,ss).
                     Akumulačný faktor bioty k pôde (BSAF) možno vypočítať takto:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [rovnica 9]
                              
                           kde foc je frakcia pôdneho organického uhlíka a flip je frakcia lipidov z červov, podľa možnosti obe stanovené zo vzoriek odobratých počas testu a na základe suchej hmotnosti alebo čerstvej hmotnosti.
                     Kinetiku eliminácie možno modelovať na základe údajov z fázy eliminácie a s využitím tejto modelovej rovnice a počítačovej metódy odhadovania nelineárnych parametrov. Ak dátové body zakreslené v závislosti od času poukazujú na konštantný exponenciálny pokles koncentrácie testovanej látky pri zvieratách, na opísanie časového priebehu eliminácie možno použiť jednokompartmentový model (rovnica 9).
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [rovnica 10]
                              
                           Procesy eliminácie sa niekedy javia ako dvojfázové, pričom počas počiatočných fáz vykazujú rýchly pokles Ca, ktorý prechádza v pomalšiu stratu testovaných látok v neskorších fázach eliminácie, napr. (27) (68). Dve fázy možno interpretovať s využitím predpokladu, že v organizme, z ktorého sa testovaná látka stráca rôznymi rýchlosťami, existujú dva rôzne kompartmenty. V týchto prípadoch je potrebné si preštudovať konkrétnu literatúru, napr. (38) (39) (40) (78).
                     Pomocou uvedených modelových rovníc možno kinetické parametre (ks a ke) vypočítať aj v jednom kole použitím modelu kinetiky prvého rádu na všetky údaje z fázy absorpcie aj eliminácie súčasne. Opis metódy, ktorá umožňuje takýto kombinovaný výpočet konštánt rýchlostí absorpcie a eliminácie, možno nájsť v odkazoch 41, 73 a 70.
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [rovnica 11]
                              
                           
                                 
                                    Poznámka:
                                 
                              
                              
                                 Ak sa parametre absorpcie a eliminácie odhadujú súčasne z kombinovaných údajov o absorpcii a eliminácii, premenná ‚m‘ uvedená v rovnici 11 je deskriptor, ktorý umožňuje počítačovému programu priradiť podpojmy rovnice k súborom údajov z príslušnej fázy a vykonať správne hodnotenie (m = 1 pre fázu absorpcie; m = 2 pre fázu eliminácie).
                              
                           Tieto modelové rovnice by sa však mali používať opatrne, najmä ak počas testu dôjde k zmenám v biodostupnosti alebo (bio)degradácie testovanej chemikálie [pozri napr. (79)].
                  
                  
                     Dodatok 3
                     PRÍKLADY HARMONOGRAMOV TESTOV BIOAKUMULÁCIE V PÔDE
                     
                        Test s dážďovkami
                     
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Fáza absorpcie s použitím ôsmich dní odberu vzoriek na výpočet kinetiky
                                 
                                             Deň
                                          
                                          
                                             Činnosť
                                          
                                       
                                             – 6
                                          
                                          
                                             aklimatizácia pripravenej pôdy počas 48 h;
                                          
                                       
                                             – 4
                                          
                                          
                                             obohatenie pôdnej frakcie s roztokom testovanej chemikálie; odparenie akéhokoľvek rozpúšťadla; miešanie pôdnych zložiek; rozdelenie pôdy do testovacích nádob; vyvažovanie v testovacích podmienkach počas štyroch dní (troch týždňov v prípade pôdy obohatenej kovmi);
                                          
                                       
                                             – 3 až – 1
                                          
                                          
                                             separácia testovacích organizmov z kultúry na aklimatizáciu; príprava a zvlhčovanie pôdnych zložiek;
                                          
                                       
                                             0
                                          
                                          
                                             meranie teploty a pH pôdy; odstránenie pôdnych vzoriek z ošetrených nádob a kontrol rozpúšťadla na stanovenie koncentrácie testovanej chemikálie; pridanie prídelu potravy; váženie a náhodné rozdelenie červov do testovacích nádob; zachovanie dostatočných podvzoriek červov na stanovenie analytických hodnôt pozadia, čerstvej a suchej hmotnosti a obsahu lipidov; váženie všetkých testovacích nádob na kontrolu vlhkosti pôdy; kontrola prívodu vzduchu, ak sa používa uzavretý testovací systém;
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             kontrola prívodu vzduchu, zaznamenanie správania červov a teploty; odber vzoriek pôdy a červov na stanovenie koncentrácie testovanej látky;
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1;
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             kontrola prívodu vzduchu, správania červov a teploty;
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1;
                                          
                                       
                                             5 – 6
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 3;
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1; pridanie prídelu potravy; kontrola vlhkosti pôdy opätovným odvážením testovacích nádob a kompenzáciou odparenej vody;
                                          
                                       
                                             8 – 9
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 3;
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1;
                                          
                                       
                                             11 – 13
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 3;
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1; pridanie prídelu potravy; kontrola vlhkosti pôdy opätovným odvážením testovacích nádob a kompenzáciou odparenej vody;
                                          
                                       
                                             15 – 16
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 3;
                                          
                                       
                                             17
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1;
                                          
                                       
                                             18 – 20
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 3;
                                          
                                       
                                             21
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1; meranie teploty a pH pôdy; kontrola vlhkosti pôdy opätovným odvážením testovacích nádob; koniec fázy absorpcie; prenos červov zo zvyšných exponovaných replikátov do nádob obsahujúcich čistú pôdu pre fázu eliminácie (bez vyprázdnenia tráviaceho traktu); odber vzoriek pôdy a červov z kontrol rozpúšťadla.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Činnosti pred expozíciou (fáza vyvažovania) by sa mali naplánovať tak, aby boli zohľadnené vlastnosti testovanej chemikálie.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Činnosti opísané pre deň 3 by sa mali vykonávať denne (aspoň cez pracovné dni).
                                          
                                       
                           
                                 b)
                              
                              
                                 Fáza eliminácie
                                 
                                             Deň
                                          
                                          
                                             Činnosť
                                          
                                       
                                             – 6
                                          
                                          
                                             príprava a zvlhčovanie pôdnych zložiek; aklimatizácia pripravenej pôdy počas 48 h;
                                          
                                       
                                             – 4
                                          
                                          
                                             miešanie pôdnych zložiek; rozdelenie pôdy do testovacích nádob; inkubácia v testovacích podmienkach počas štyroch dní;
                                          
                                       
                                             0 (koniec fázy absorpcie)
                                          
                                          
                                             meranie teploty a pH pôdy; váženie a náhodné rozdelenie červov do testovacích nádob; pridanie prídelu potravy; prenos červov zo zvyšných exponovaných replikátov do nádob obsahujúcich čistú pôdu; odber vzoriek pôdy a červov po 4 – 6 h na stanovenie koncentrácie testovanej chemikálie;
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             kontrola prívodu vzduchu, zaznamenanie správania červov a teploty; odber vzoriek pôdy a červov na stanovenie koncentrácie testovanej chemikálie;
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1;
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             kontrola prívodu vzduchu, správania červov a teploty;
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1;
                                          
                                       
                                             5 – 6
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 3;
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1; pridanie prídelu potravy; kontrola vlhkosti pôdy opätovným odvážením testovacích nádob a kompenzáciou odparenej vody;
                                          
                                       
                                             8 – 9
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 3;
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1;
                                          
                                       
                                             11 – 13
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 3;
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1; pridanie prídelu potravy; kontrola vlhkosti pôdy opätovným odvážením testovacích nádob a kompenzáciou odparenej vody;
                                          
                                       
                                             15 – 16
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 3;
                                          
                                       
                                             17
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1;
                                          
                                       
                                             18 – 20
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 3;
                                          
                                       
                                             21
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1; meranie teploty a pH pôdy; kontrola vlhkosti pôdy opätovným odvážením testovacích nádob; odber vzoriek pôdy a červov z kontrol rozpúšťadla.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Príprava pôdy pred začiatkom fázy eliminácie by mala byť rovnaká ako pred fázou absorpcie.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Činnosti opísané pre deň 3 by sa mali vykonávať denne (aspoň cez pracovné dni).
                                          
                                       
                           
                        Test s Enchytraeidae
                        
                     
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Fáza absorpcie s použitím ôsmich dní odberu vzoriek na výpočet kinetiky
                                 
                                             Deň
                                          
                                          
                                             Činnosť
                                          
                                       
                                             – 6
                                          
                                          
                                             aklimatizácia pripravenej pôdy počas 48 h;
                                          
                                       
                                             – 4
                                          
                                          
                                             obohatenie pôdnej frakcie s roztokom testovanej chemikálie; odparenie akéhokoľvek rozpúšťadla; miešanie pôdnych zložiek; rozdelenie pôdy do testovacích nádob; vyvažovanie v testovacích podmienkach počas štyroch dní (troch týždňov v prípade pôdy obohatenej kovmi);
                                          
                                       
                                             – 3 až – 1
                                          
                                          
                                             separácia testovacích organizmov z kultúry na aklimatizáciu; príprava a zvlhčovanie pôdnych zložiek;
                                          
                                       
                                             0
                                          
                                          
                                             meranie teploty a pH pôdy; odstránenie pôdnych vzoriek z ošetrených nádob a kontrol rozpúšťadla na stanovenie koncentrácie testovanej chemikálie; pridanie prídelu potravy do pôdy; váženie a náhodné rozdelenie červov do testovacích nádob; zachovanie dostatočných podvzoriek červov na stanovenie analytických hodnôt pozadia, čerstvej a suchej hmotnosti a obsahu lipidov; váženie všetkých testovacích nádob na kontrolu vlhkosti pôdy; kontrola prívodu vzduchu, ak sa používa uzavretý testovací systém;
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             kontrola prívodu vzduchu, zaznamenanie správania červov a teploty; odber vzoriek pôdy a červov na stanovenie koncentrácie testovanej látky;
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1;
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             kontrola prívodu vzduchu, správania červov a teploty;
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1;
                                          
                                       
                                             5 – 6
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 3;
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1; pridanie prídelu potravy do pôdy; kontrola vlhkosti pôdy opätovným odvážením testovacích nádob a kompenzáciou odparenej vody;
                                          
                                       
                                             9
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1;
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 3;
                                          
                                       
                                             11
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1;
                                          
                                       
                                             12 – 13
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 3;
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             rovnako ako deň 1; pridanie prídelu potravy do pôdy; meranie teploty a pH pôdy; kontrola vlhkosti pôdy opätovným odvážením testovacích nádob; koniec fázy absorpcie; prenos červov zo zvyšných exponovaných replikátov do nádob obsahujúcich čistú pôdu pre fázu eliminácie (bez vyprázdnenia tráviaceho traktu); odber vzoriek pôdy a červov z kontrol rozpúšťadla.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Činnosti pred expozíciou (fáza vyvažovania) by sa mali naplánovať tak, aby boli zohľadnené vlastnosti testovanej chemikálie.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Činnosti opísané pre deň 3 by sa mali vykonávať denne (aspoň cez pracovné dni).
                                          
                                       
                           
                  
                     Dodatok 4
                     
                        Umelá pôda – odporúčania týkajúce sa prípravy a skladovania
                     
                     Keďže prírodné pôdy z konkrétneho zdroja nemusia byť k dispozícii po celý rok a autochtónne organizmy, ako aj prítomnosť znečisťujúcich mikrolátok môže ovplyvniť test, v tomto teste sa odporúča použiť umelý substrát, umelú pôdu podľa kapitoly C.8 tejto prílohy, Toxicita pre dážďovky (48). V takejto pôde môžu prežiť, rásť a rozmnožovať sa viaceré testovacie druhy a je zabezpečená maximálna štandardizácia, ako aj intra- a interlaboratórna porovnateľnosť testovacích a kultivačných podmienok.
                     Pôdne zložky
                     
                                 Rašelina:
                              
                              
                                 10 %
                              
                              
                                 Rašelinníková rašelina, podľa usmernenia OECD 207 (48)
                              
                           
                                 Kremenný piesok:
                              
                              
                                 70 %
                              
                              
                                 Priemyselný kremenný piesok (vysušený vzduchom); veľkosť častíc: viac ako 50 % častíc by malo mať veľkosť v rozsahu 50 – 200 μm, ale všetky častice by mali byť ≤ 2 mm
                              
                           
                                 Kaolín:
                              
                              
                                 20 %
                              
                              
                                 Obsah kaolinitu ≥ 30 %
                              
                           
                                 Uhličitan vápenatý:
                              
                              
                                 ≤ 1 %
                              
                              
                                 CaCO3, rozomletý na prach, chemicky čistý
                              
                           Obsah organického uhlíka v umelej pôde možno prípadne znížiť, napr. znížením obsahu rašeliny na 4 – 5 % suchej pôdy a zodpovedajúcim zvýšením obsahu piesku. V dôsledku takéhoto zníženia obsahu organického uhlíka sa môžu znížiť možnosti adsorpcie testovanej chemikálie na pôde (organický uhlík) a dostupnosť testovanej chemikálie pre červy sa môže zvýšiť (74). Preukázalo sa, že druhy Enchytraeus albidus a Eisenia fetida môžu splniť kritéria platnosti týkajúce sa reprodukcie, ak sa testujú v poľných pôdach s nižším obsahom organického uhlíka, napr. 2,7 % (33), 61, a na základe skúseností možno tento výsledok dosiahnuť aj v umelej pôde, ktorá obsahuje 5 % rašeliny.
                     
                        Príprava
                     
                     Suché zložky pôdy sa dôkladne zmiešajú (napr. vo veľkokapacitnom laboratórnom miešači). Zložky sa zmiešajú približne týždeň pred začiatkom testu. Zmiešané suché pôdne zložky sa zvlhčia deionizovanou vodou najmenej 48 hodín pred aplikáciou testovanej látky, aby sa vyvážila/stabilizovala kyslosť. Na stanovenie pH zmesi pôdy sa používa roztok 1 M KCl v pomere 1: 5. Ak hodnota pH nie je v požadovanom rozmedzí (6,0 ± 0,5), do pôdy sa pridá dostatočné množstvo CaCO3 alebo sa pripraví nová várka pôdy.
                     Maximálna retenčná kapacita vody (WHC) umelej pôdy sa určí podľa ISO 11268-2 (35). Najmenej dva dni pred začiatkom testu sa suchá umelá pôda zvlhčí pridaním dostatočného množstva deionizovanej alebo rekonštituovanej vody, aby sa získala približne polovica konečného obsahu vody. Konečný obsah vody by mal predstavovať 40 – 60 % maximálnej WHC. Na začiatku testu sa predvlhčená pôda rozdelí na toľko várok, koľko je testovacích koncentrácií a kontrol použitých v teste, a obsah vlhkosti sa pomocou roztoku testovanej látky a/alebo pridaním deionizovanej alebo rekonštituovanej vody upraví na 40 – 60 % WHCmax. Obsah vlhkosti sa stanoví na začiatku a na konci testu (pri teplote 105 °C). Mal by optimálne zodpovedať požiadavkám jednotlivých druhov (obsah vlhkosti možno skontrolovať aj takto: keď sa pôda jemne stlačí v ruke, medzi prstami by sa mali objaviť malé kvapky vody).
                     
                        Skladovanie
                     
                     Suché zložky umelej pôdy možno až do použitia skladovať pri izbovej teplote. Pripravená predvlhčená pôda sa pred obohatením môže skladovať na chladnom mieste počas až troch dní. Je potrebné dbať na to, aby sa minimalizovalo odparovanie vody. Pôda obohatená o testovanú látku by sa mala ihneď použiť, pokiaľ nie sú k dispozícii informácie, podľa ktorých možno konkrétnu pôdu skladovať bez toho, aby to malo vplyv na toxicitu a biodostupnosť testovanej látky. Vzorky obohatenej pôdy sa môžu do analýzy uskladniť v podmienkach odporúčaných pre konkrétnu testovanú látku.
                  
                  
                     Dodatok 5
                     
                        Odporúčané druhy suchozemských máloštetinavcov na testovanie bioakumulácie z pôdy
                     
                     
                        Dážďovky
                     
                     Odporúčaný testovací druh je Eisenia fetida (Savigny 1826) patriaci do čeľade Lumbricidae. Od roku 1972 sa delí na dva poddruhy [Eisenia fetida a Eisenia andrei (10)]. Podľa Jaenikeho (36) ide v skutočnosti o dva samostatné druhy. Eisenia fetida sa ľahko rozpozná podľa svetlých intersegmentálnych žltých pásikov, zatiaľ čo Eisenia andrei má jednotné tmavočervené zafarbenie. Tieto druhy pravdepodobne pochádzajú z oblasti Čierneho mora a v súčasnosti sú rozšírené na celom svete, najmä v antropogénne modifikovaných biotopoch, ako sú haldy kompostu. Oba druhy možno použiť na ekotoxikologické aj bioakumulačné testy.
                     
                        Eisenia fetida a Eisenia andrei sú komerčne dostupné, napr. ako návnady na ryby. V porovnaní s inými dážďovkovitými červami majú krátky životný cyklus, pričom dospelosť dosahujú približne v dvoch až troch mesiacoch (pri izbovej teplote). Ich optimálna teplota je približne 20 – 24 °C. Majú radšej pomerne vlhké substráty s takmer neutrálnym pH a vysokým obsahom organického materiálu. Keďže tieto druhy sa vo veľkej miere využívajú v štandardizovaných ekotoxikologických testoch približne 25 rokov, ich kultivácia je zaužívaná (48) (77).
                     Oba druhy možno chovať v širokej škále živočíšnych odpadov. Chovné médium, ktoré sa odporúča podľa ISO (35), je zmes konského alebo dobytčieho hnoja a rašeliny v pomere 50: 50. Médium by malo mať hodnotu pH 6 – 7 (regulovaná pomocou uhličitanu vápenatého), nízku iónovú vodivosť (menej ako 6 mS/cm alebo menej ako 0,5 % koncentrácie soli) a nemalo by byť nadmerne kontaminované amoniakom alebo zvieracím močom. Možno použiť aj komerčnú záhradnú pôdu bez prísad alebo umelú pôdu podľa OECD (48) alebo zmes oboch pôd v pomere 50: 50. Substrát by mal byť vlhký, ale nie príliš mokrý. Vhodné sú chovné boxy s objemom 10 – 50 litrov.
                     Na získanie červov štandardného veku a hmotnosti je najlepšie začať kultiváciou kokónov. Dospelé červy sa preto pridajú do chovného boxu obsahujúceho čerstvý substrát na tvorbu kokónov. Praktické skúsenosti preukázali, že hustota populácie približne 100 dospelých červov na kg substrátu (čerstvá hmotnosť) zabezpečuje dobrú mieru reprodukcie. Po 28 dňoch sa dospelé červy odoberú. Dážďovky vyliahnuté z kokónov sa použijú na testovanie, keď dosiahnu dospelosť, aspoň po dvoch mesiacoch, ale pred uplynutím 12 mesiacov.
                     Červy opísaných druhov možno považovať za zdravé, keď sa pohybujú v substráte, nesnažia sa opustiť substrát a priebežne sa rozmnožujú. Veľmi pomalý pohyb alebo žltá zadná časť (v prípade Eisenia fetida) znamená vyčerpanie substrátu. V takom prípade sa odporúča čerstvý substrát a/alebo nižší počet zvierat v boxe.
                     
                        Ďalšie vybraté odkazy
                     
                     Gerard, B. M. (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean Soc. Londýn, 6: 1 – 58.
                     Graff, O. (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1 – 81.
                     Römbke, J., Egeler, P., Füll, C. (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 s
                     Rundgren, S. (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. Oikos 28: 49 – 55.
                     Satchell, J. E. (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 180 – 201.
                     Sims, R. W., a Gerard, B. M. (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. Londýn 31: 1 – 171.
                     Tomlin, A. D. (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm Ecology – from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, Londýn. 331 – 338 s.
                     
                        Enchytraeidae
                     
                     Odporúčaný testovací druh je Enchytraeus albidus Henle 1837 (mrlica biela). Enchytraeus albidus je jeden z najväčších (až 15mm) druhov obrúčkavých máloštetinavcov čeľade Enchytraeidae a vyskytuje sa na celom svete, napr. (8). Enchytraeus albidus sa vyskytuje v morských, sladkovodných a suchozemských biotopoch, najmä v rozkladajúcej sa organickej hmote (morské riasy, kompost) a vzácne na lúkach (42). Táto široká ekologická tolerancia a niektoré morfologické variácie poukazujú na skutočnosť, že môže existovať niekoľko rás tohto druhu.
                     
                        Enchytraeus albidus je komerčne dostupný, predáva sa ako potrava pre ryby. Treba skontrolovať, či kultúra nie je kontaminovaná inými, zvyčajne menšími druhmi (60). Ak dôjde ku kontaminácii, všetky červy by sa mali premyť vodou v Petriho miske. Veľké dospelé jedince druhu Enchytraeus albidus sa následne vyberú (pomocou stereomikroskopu) na založenie novej kultúry. Všetky ostatné červy sa zlikvidujú. Životný cyklus tohto druhu je krátky, keďže dospieva od 33 dní (pri teplote 18 °C) do 74 dní (pri teplote 12 °C). V teste možno použiť iba kultúry, ktoré sa udržiavali v laboratóriu bez problémov počas najmenej piatich týždňov (jedna generácia).
                     Iné druhy rodu Enchytraeus sú takisto vhodné, najmä Enchytraeus luxuriosus. Tento druh sa fyziologicky vyskytuje v pôde a najnovšie bol opísaný v odkaze (65). Ak sa použijú iné druhy rodu Enchytraeus, musia byť jednoznačne identifikované a do správy sa musí uviesť odôvodnenie výberu daného druhu.
                     
                        Enchytraeus crypticus (Westheide a Graefe 1992) je druh, ktorý patrí do tej istej skupiny ako Enchytraeus luxuriosus. Nebolo s istotou zistené, či sa tento druh vyskytuje v poli, a opísaný bol iba z kultúr dážďoviek a háld kompostu (Römbke 2003). Jeho pôvodné ekologické potreby preto nie sú známe. Najnovšie laboratórne štúdie v rôznych poľných pôdach však potvrdili, že tento druh má vysokú toleranciu voči vlastnostiam pôdy, ako je pH a štruktúra (Jänsch a kol. 2005). V posledných rokoch sa tento druh často používa v ekotoxikologických štúdiách pre jednoduchosť chovu a testovania, napr. Kuperman a kol. 2003). Je však malý (3 – 12 mm; 7 mm v priemere (Westheide a Müller 1996), v dôsledku čoho je manipulácia problematickejšia ako v prípade druhu Enchytraeus albidus. Ak sa tento druh použije namiesto Enchytraeus albidus, veľkosť testovacej nádoby môže, ale nemusí byť menšia. Okrem toho je potrebné zohľadniť, že tento druh sa veľmi rýchlo rozmnožuje, a generačný čas pri teplote 20 ± 2 °C je menej ako 20 dní (Achazi a kol. 1999) alebo pri vyšších teplotách ešte menej.
                     
                        Enchytraeidae druhu Enchytraeus albidus (ako aj iné druhy rodu Enchytraeus) možno chovať vo veľkých umelohmotných boxoch (napr. 30 × 60 × 10 cm alebo 20 × 12 × 8 cm, ktorý je vhodný pre kultúry malých červov) naplnených zmesou umelej pôdy a komerčne dostupnej nekontaminovanej záhradnej pôdy bez prísad. Kompostový materiál by sa nemal používať, lebo môže obsahovať toxické chemikálie, ako sú ťažké kovy. Faunu je potrebné z chovnej pôdy pred použitím odstrániť prostredníctvom hlbokého zmrazenia, ktoré sa vykoná trikrát. Možno použiť aj čistú umelú pôdu, ale miera reprodukcie môže byť pomalšia v porovnaní s mierou, ktorá sa dosiahne pomocou zmiešaných substrátov. Hodnota pH substrátu by mala byť 6,0 ± 0,5. Kultúra je uložená v inkubátore pri teplote 15 ± 2 °C bez svetla. V každom prípade treba zabrániť tomu, aby bola teplota vyššia ako 23 °C. Umelá/prírodná pôda by mala byť vlhká, ale nie mokrá. Keď sa pôda jemne stlačí v ruke, mali by sa objaviť iba malé kvapky vody. V každom prípade treba predchádzať anoxickým podmienkam (napr. ak sa použije veko, počet dier vo veku by mal byť dostatočne vysoký, aby zabezpečoval dostatočnú výmenu vzduchu). Chovná pôda by sa mala raz týždenne prevzdušniť dôkladným miešaním.
                     Červy by sa mali kŕmiť najmenej raz týždenne ad libitum ovsenými otrubami, ktoré sa vložia do dutiny na povrchu pôdy a prikryjú pôdou. Ak v nádobe ostala potrava z posledného dňa kŕmenia, množstvo podávanej potravy by sa malo zodpovedajúco upraviť. Ak na zvyšnej potrave rastú huby, mala by sa nahradiť novým množstvom ovsených vločiek. Na stimuláciu reprodukcie možno ovsené vločky každé dva týždne doplniť komerčne dostupným bielkovinovým práškom s vitamínmi. Po troch mesiacoch sa zvieratá prenesú do čerstvo pripravenej kultúry alebo chovného substrátu. Ovsené otruby, ktoré musia byť uskladnené v hermeticky uzavretých nádobách, sa pred použitím autoklávujú alebo zohrejú, aby sa zabránilo infekciám v dôsledku múčnych roztočov (napr. druh Glyzyphagus, Astigmata, Acarina) alebo dravých roztočov (napr. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina). Po dezinfekcii sa potrava zomelie, aby ju bolo možné ľahko rozsypať po povrchu pôdy. Ďalším možným zdrojom potravy sú pekárske kvasnice alebo potrava pre ryby TetraMin®.
                     Vo všeobecnosti sú kultivačné podmienky dostatočné, ak sa červy nesnažia opustiť substrát, v pôde sa pohybujú rýchlo, majú lesklý vonkajší povrch bez prilepených častíc pôdy a sú viac-menej do biela zafarbené a ak možno pozorovať červy rôzneho veku. Červy možno v skutočnosti považovať za zdravé, ak sa priebežne rozmnožujú.
                     
                        Ďalšie vybraté odkazy
                     
                     Achazi, R. K., Fröhlich, E., Henneken, M., Pilz, C. (1999). The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117 – 126.
                     Jänsch, S., Amorim, M. J. B., Römbke, J. (2005). Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51 – 83.
                     Kuperman, R. G., Checkai, R. T., Simini, M., Phillips, C. T., Kolakowski, J. E., Kurnas, C. W., Sunahara, G. I. (2003). Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651 – 656.
                     Römbke, J. (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. Pedobiologia 47: 607 – 616.
                     Westheide, W., a Graefe, U. (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479 – 488.
                     Westheide, W., a Müller, M. C. (1996). Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263 – 267.“
                  “
            
         (1)  Táto informácia sa uvádza iba s cieľom pomôcť používateľom. Možno použiť iné rovnocenné počítačové programy, ak je možné preukázať, že sa nimi dosahujú rovnaké výsledky.
      
         (2)  Ak nie sú k dispozícii informácie o vnímavosti pohlaví, použijú sa potkany oboch pohlaví, t. j. jedno zviera z každého pohlavia na koncentráciu. Na základe existujúcich informácií alebo ak v priebehu tohto kola expozície vyjde najavo, že jedno pohlavie je vnímavejšie, v priebehu ďalšieho testovania sa použije desať zvierat vnímavejšieho pohlavia (dve zvieratá na koncentráciu/časový bod) pri každej úrovni koncentrácie.,
      
         (3)  Ak sa použije nariadenie (ES) č. 1272/2008, limitná koncentrácia v prípade plynov je 20 000 ppm, v prípade pár 20 mg/l a v prípade aerosólov 5 mg/l. V prípade predpokladanej toxicity alebo na základe výsledkov predbežnej štúdie sa zvolia nižšie počiatočné koncentrácie. V prípade regulačnej alebo vedeckej potreby možno použiť vyššie koncentrácie.
      
         (4)  Expozícia zvierat pri ďalšej úrovni koncentrácie by sa podľa možnosti mala odložiť, kým sa nenadobudne dostatočná istota, že zvieratá, ktoré boli exponované skôr, prežijú. To umožní vedúcemu štúdie, aby prispôsobil cieľovú koncentráciu a intervaly pre ďalšie kolo expozície.
      
         (5)  Minimálna dávka (koncentrácia × čas), ktorá mala za následok mortalitu počas testovania pri počiatočnej koncentrácii (prvé kolo expozície), bude smerodajná pri stanovení ďalšej kombinácie koncentrácie a časových intervalov. Koncentrácia sa zvyčajne zníži na polovicu (1/2L) a zvieratá budú exponované v priebehu nového časového obdobia pri hustejšej súradnicovej sieti s využitím geometrického delenia intervalov expozície faktorom 1,4 (√2; pozri odkaz 11) v čase podľa minimálnej letálnej dávky (čas × koncentrácia) pozorovanej počas prvej expozície. Na tomto obrázku (obrázok 1) bola v kole expozície I pozorovaná mortalita po 15 minútach; intervaly počas kola II sa teda sústredia okolo 30 minút a majú trvanie 15, 21, 30, 42 a 60 minút. Po prvých dvoch expozíciách sa dôrazne odporúča zakresliť údaje do podobného obrázka, ako je znázornený vyššie, a overiť, či funkcia závislosti medzi koncentráciou a časom zviera uhol 45 stupňov (n = 1) alebo či je funkcia závislosti medzi koncentráciou, časom a reakciou menej strmá (napr. n = 2) alebo strmšia (napr. n = 0,8). V druhom prípade sa dôrazne odporúča náležite prispôsobiť ďalšie koncentrácie a intervaly.
      
         (6)  V určitých prípadoch môže byť potrebné zvýšiť koncentráciu (2L) v priebehu nového časového obdobia pri hustejšej súradnicovej sieti s využitím geometrického delenia intervalov expozície faktorom 1,4 (√2) v čase podľa minimálnej letálnej úrovne koncentrácie pozorovanej počas prvej expozície. Minimálne trvanie expozície by podľa možnosti malo presiahnuť päť minút; maximálne trvanie expozície by nemalo presiahnuť osem hodín.
      
         (7)  Pri mnohých meraniach v sére a plazme, najmä glukózy, sa uprednostňuje nepodávanie potravy cez noc pred odberom. Hlavným dôvodom je zvýšenie pravdepodobnosti kolísania hodnôt ako nevyhnutný dôsledok prijímania potravy. Môže to viesť k zakrytiu jemnejších účinkov a sťaží to interpretáciu. Na druhej strane nočné postenie môže rušivo vplývať na celkový metabolizmus zvierat a čiastočne aj na štúdie výživy, a môže to rušiť aj dennú expozíciu testovanou chemikáliou. Ak sa použije nočné postenie, klinicko-biochemické vyšetrenie sa uskutočňuje po funkčných pozorovaniach v štvrtom týždni štúdie.
      
         (8)  Keďže dlhé obdobie bez kŕmenia môže pri pokusných zvieratách v porovnaní s kontrolnými zvieratami viesť k skresleniu meraní glukózy, vedúci štúdie by mal určiť, či je primerané, aby sa zvieratá nekŕmili. Ak sa použije obdobie bez kŕmenia, malo by byť primerané použitému živočíšnemu druhu; pri potkanoch to môže byť 16 hodín (nočný pôst). Stanovenie glukózy nalačno sa môže vykonať po nočnom pôste počas posledného týždňa expozície alebo po nočnom pôste pred pitvou (v druhom prípade spolu so všetkými ostatnými parametrami klinickej patológie).
      
         (9)  Keďže dlhé obdobie bez kŕmenia môže pri pokusných zvieratách v porovnaní s kontrolnými zvieratami viesť k skresleniu meraní glukózy, vedúci štúdie by mal určiť, či je primerané, aby sa zvieratá nekŕmili. Ak sa použije obdobie bez kŕmenia, malo by byť primerané použitému živočíšnemu druhu; pri potkanoch to môže byť 16 hodín (nočný pôst). Stanovenie glukózy nalačno sa môže vykonať po nočnom pôste počas posledného týždňa expozície alebo po nočnom pôste pred pitvou (v druhom prípade spolu so všetkými ostatnými parametrami klinickej patológie).
      
         (10)  Pri mnohých meraniach v sére a plazme, najmä glukózy, sa uprednostňuje nepodávanie potravy cez noc pred odberom. Hlavným dôvodom je zvýšenie pravdepodobnosti kolísania hodnôt ako nevyhnutný dôsledok prijímania potravy. Môže to viesť k zakrytiu jemnejších účinkov a sťaží to interpretáciu. Treba však poznamenať, že nočný pôst môže rušivo vplývať na celkový metabolizmus zvierat a čiastočne aj na štúdie výživy, a môže to rušiť aj dennú expozíciu testovanej chemikálii. Všetky zvieratá by sa mali posudzovať v rovnakých fyziologických podmienkach, a preto by sa podrobné alebo neurologické hodnotenia podľa možnosti mali naplánovať na iný deň ako odber vzoriek na klinickú biochémiu.
      
         (11)  Hodnotenie žieravosti môže byť založené na odbornom posudku s využitím takých dôkazov, ako sú: skúsenosti u ľudí a pri zvieratách, existujúce údaje (in vitro), napr. kapitola B.40 (10), B.40a (11) tejto prílohy alebo dokument OECD TG 435 (12), hodnoty pH, informácie o podobných chemikáliách alebo akékoľvek iné súvisiace údaje.
      
         (12)  V týchto tabuľkách je uvedený odkaz na GHS (Globálny harmonizovaný systém klasifikácie a označovania chemických látok). Ekvivalentom na úrovni EÚ je nariadenie (ES) č. 1272/2008. V prípade akútnej inhalačnej toxicity nie je v nariadení (ES) č. 1272/2008 (9) zahrnutá kategória 5.
      
         (13)  V týchto tabuľkách je uvedený odkaz na GHS (Globálny harmonizovaný systém klasifikácie a označovania chemických látok). Ekvivalentom na úrovni EÚ je nariadenie (ES) č. 1272/2008. V prípade akútnej inhalačnej toxicity nie je v nariadení (ES) č. 1272/2008 (9) zahrnutá kategória 5.
      
         (14)  V týchto tabuľkách je uvedený odkaz na GHS (Globálny harmonizovaný systém klasifikácie a označovania chemických látok). Ekvivalentom na úrovni EÚ je nariadenie (ES) č. 1272/2008. V prípade akútnej inhalačnej toxicity nie je v nariadení (ES) č. 1272/2008 (9) zahrnutá kategória 5.
      
         (15)  Tieto látky sa líšia v M4 a M7, ako je uvedené vyššie.
      
         (16)  Tieto roztoky sa pripravia jednotlivo, potom sa zlejú dokopy a okamžite sa autoklávujú.
      
         (17)  Treba však poznamenať, že ak existuje podozrenie na interakciu medzi iónmi tvrdosti a testovanou látkou, mala by sa použiť voda s nižšou tvrdosťou (a v takom prípade sa teda nesmie použiť Elendtovo médium M4).
      
         (18)  Tieto látky sa líšia v M4 a M7, ako je uvedené vyššie.
      
         (19)  Tieto roztoky sa pripravia jednotlivo, potom sa zlejú dokopy a okamžite sa autoklávujú.
      
         (20)  Treba však poznamenať, že ak existuje podozrenie na interakciu medzi iónmi tvrdosti a testovanou látkou, mala by sa použiť voda s nižšou tvrdosťou (a v takom prípade sa teda nesmie použiť Elendtovo médium M4).
      
         (21)  SiO2 bol pridaný s cieľom neutralizovať toxicitu.
      
         (22)  Percentuálna degradácia v nádobách FC obsahujúcich referenčnú látku.
      
         (23)  Percentuálna degradácia v nádobách FI.