CELEX: 31991D0180
Language: hu
Date: 1991-02-14 00:00:00
Title: A Bizottság határozata (1991. február 14.) a nyers- és a hőkezelt tejre vonatkozó egyes analitikai, valamint vizsgálati módszerek megállapításáról

Fontos jogi nyilatkozat

|

31991D0180

Hivatalos Lap L 093 , 13/04/1991 o. 0001 - 0048 finn különkiadás fejezet 3 kötet 37 o. 0012  svéd különkiadás fejezet 3 kötet 37 o. 0012 

		A Bizottság határozata(1991. február 14.)a nyers- és a hőkezelt tejre vonatkozó egyes analitikai, valamint vizsgálati módszerek megállapításáról(91/180/EGK)AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA,tekintettel az Európai Gazdasági Közösséget létrehozó szerződésre,tekintettel a legutóbb a 89/662/EGK irányelvvel [1] módosított, a hőkezelt tej Közösségen belüli kereskedelmét érintő egészségügyi és állategészségügyi problémákról szóló, 1985. augusztus 5-i 85/397/EGK tanácsi irányelvre [2] és különösen annak 10. cikke (2) bekezdésére,mivel a 10. cikk (2) bekezdése rendelkezik arról, hogy a Bizottság megállapítja azokat az analitikai és vizsgálati módszereket, amelyeket a nyers- és hőkezelt tejre vonatkozó előírásoknak való megfelelés ellenőrzésére kell alkalmazni;mivel a nyerstej esetében módszereket szükséges megállapítani különösen az összcsíraszám, a sejtszám, a fagyáspont meghatározása, valamint az antibiotikumok kimutatása érdekében;mivel a pasztőrözött tej esetében módszereket szükséges megállapítani különösen a kórokozó-mentesség, a kólibaktériumok száma, az összcsíraszám, a foszfatáz hiánya, a peroxidáz jelenléte, az antibiotikumok hiánya és a fagyáspont meghatározása érdekében;mivel a steril tej és UHT- (ultra magas hőmérsékleten kezelt) tej esetében módszereket szükséges megállapítani különösen az összcsíraszám és az antibiotikumok hiányának meghatározása érdekében;mivel technikai okok miatt időszerű első lépésként az analízis és a vizsgálat tekintetében referenciamódszereket megállapítani az egyes előírásoknak való megfelelés biztosítása érdekében; mivel különösen szükséges azoknak a körülményeknek a folyamatos vizsgálata, amelyek között a rutin-, az analitikai és a vizsgálati módszereket alkalmazni kell; mivel e vizsgálatnak az eredményeire várva a tagállamok felelőssége a 85/397/EGK irányelvben megállapított előírások betartásának biztosítása céljából a megfelelő rutinmódszerek alkalmazása;mivel az analízisre és vizsgálatra vonatkozó referenciamódszereknek a meghatározása magában foglalja a követendő analitikai eljárások meghatározását és a pontossági ismérvek megállapítását az eredmények egységes értelmezése céljából;mivel az e határozatban előírt intézkedések összhangban vannak az Állat-egészségügyi Állandó Bizottság véleményével,ELFOGADTA EZT A HATÁROZATOT:1. cikkA nyerstej analízisére és vizsgálatára vonatkozó referenciaeljárások a következők:- a fagyáspont meghatározása,- a mikroorganizmusok számának meghatározása – összcsíraszám-vizsgálat 30 oC-on,- a szomatikus sejtszám meghatározása,- az antibiotikumok és szulfonamidok kimutatása.2. cikkA pasztőrözött tej analízisére és vizsgálatára vonatkozó referenciaeljárások a következők:- a fagyáspont meghatározása,- a foszfatázaktivitás meghatározása,- a peroxidázaktivitás meghatározása,- a mikroorganizmusok számának meghatározása – összcsíraszám-vizsgálat 30 oC-on,- a mikroorganizmusok számának meghatározása – összcsíraszám-vizsgálat 21 oC-on,- a kólibaktériumok számának meghatározása – telepszámlálás 30 oC-on,- az antibiotikumok és szulfonamidok kimutatása,- a kórokozó mikroorganizmusok kimutatása.3. cikkAz UHT-tej és a steril tej analízisére és vizsgálatára vonatkozó referenciaeljárások a következők:- mikroorganizmusok számának meghatározása – összcsíraszám-vizsgálat 30 oC-on,- a fagyáspont meghatározása,- az antibiotikumok és szulfonamidok kimutatása.4. cikkAz analízisre és a vizsgálatra vonatkozó referenciaeljárásokat és az alkalmazandó pontossági ismérveket érvényre kell juttatni, a mintavételt pedig az 1. mellékletben meghatározott szabályoknak megfelelően kell elvégezni.5. cikkAz 1., 2. és 3. cikkben említett, az analízisre és a vizsgálatra vonatkozó referenciaeljárásokat a 2. melléklet tartalmazza.6. cikkEzt a határozatot 1992. december 31-e előtt felül kell vizsgálni a tudományos és műszaki ismeretek fejlődésének figyelembevétele érdekében.7. cikkEnnek a határozatnak a tagállamok a címzettjei.Kelt Brüsszelben, 1991. február 14-én.a Bizottság részérőlRay Mac Sharrya Bizottság tagja[1] HL L 395., 1989.12.30., 13. o.[2] HL L 226., 1985.8.24., 13. o.--------------------------------------------------I. MELLÉKLETTARTALOMI. | Általános rendelkezések … | 187 |II. | Nyers- és hőkezelt tej mintavétele … | 189 |I. ÁLTALÁNOS RENDELKEZÉSEK1. BevezetésAz általános rendelkezések a vegyszerekre, az eszközökre, az eredmények kiszámolására, a pontosságra és a vizsgálati jelentésekre vonatkoznak. A tagállamok illetékes hatóságai és a tej mintavételével, illetve vizsgálatával megbízott hatósági laboratóriumai kötelesek betartani az általános rendelkezéseket.2. Vegyszerek2.1. Víz2.1.1. Ahol oldat készítése, hígítás vagy öblítés céljából vizet említenek, ott egyéb meghatározás hiányában desztillált vizet, ioncserélt vizet vagy legalább megegyező tisztaságú demineralizált vizet kell alkalmazni. Mikrobiológiai célra a vizet mentesíteni kell minden olyan anyagtól, amely a vizsgálati körülmények között hatással vagy befolyással lehet a mikroorganizmusok növekedésére.2.1.2. Az "oldat" vagy "hígítás" hivatkozások alatt, további jellemzés nélkül, "vizes oldat" vagy "hígítás vízzel" értendő.2.2. VegyszerekMinden felhasznált vegyszernek – egyéb meghatározás hiányában – elismerten analitikaireagens-minőségűnek kell lennie.3. Eszközök3.1. Az eszközök felsorolásaA különböző referencia eljárásokban megadott berendezések felsorolásai csak azokat az elemeket tartalmazzák, amelyek alkalmazása különleges és azokat az elemeket, amelyek különleges jellemzőkkel rendelkeznek.3.2. Analitikai mérlegAz analitikai mérleg olyan mérleg, amely 0,1 mg pontosságú mérésre alkalmas.4. Az eredmények közlése4.1. EredményekEgyéb meghatározás hiányában a vizsgálati jelentésben megadott eredmény két olyan vizsgálat során kapott érték számtani középértéke, amelyek megfelelnek az arra a módszerre megállapított ismételhetőségi feltételnek (5.1.). Ha az ismételhetőségi feltétel nem teljesül, akkor a vizsgálatot vagy meg kell ismételni, vagy az eredményt érvénytelennek kell nyilvánítani.4.2. A százalék kiszámításaEgyéb meghatározás hiányában az eredményt mindig a minta tömegszázalékában kell kifejezni.5. Pontossági ismérvek: ismételhetőség és reprodukálhatóság5.1. Az egyes eljárásokban a pontossági ismérveket a következők szerint határozzák meg:5.1.1. Ismételhetőség (r) az az érték, amelynél az azonos eljárással, azonos vizsgálati anyagon, azonos körülmények között (azonos vizsgáló személy által, azonos felszereléssel, ugyanabban a laboratóriumban, rövid időtartamon belül) végzett két egyedi vizsgálat eredményének abszolút különbsége kisebb.5.1.2. Reprodukálhatóság (R) az az érték, amelynél az azonos eljárással, azonos vizsgálati anyagon, eltérő körülmények között (más vizsgáló személy által, más felszereléssel, más laboratóriumban és/vagy más időpontban) végzett két egyedi vizsgálat eredményének abszolút különbsége kisebb.5.1.3. Egyéb meghatározás hiányában az egyes eljárások megfelelő pontjában megadott ismételhetőségi és reprodukálhatósági követelmények értékei az ISO 5725: második kiadás, 1986 szerint meghatározott 95 %-os megbízhatósági intervallumot képviselnek. Azokat az eljárás kiértékelése céljából alkalmazott elismert körvizsgálatok eredményeiből számították ki. Egyes eljárásokra azonban nem végeztek körvizsgálatokat. Ezekben az esetekben az ismételhetőség és a reprodukálhatóság értékeit becsléssel határozták meg.5.1.4. Az 5.1.3. pontban említett körvizsgálatokat és tanulmányokat a nemzetközi iránymutatásoknak megfelelően kell megtervezni és vezetni.6. Vizsgálati jelentésA vizsgálati jelentés meghatározza az alkalmazott analízismódszert, valamint a kapott eredményeket. Megadja továbbá az alkalmazott eljárás minden részletét, amely nincs meghatározva az analízismódszerben, vagy amely választható, illetve minden egyéb körülményt, amely befolyásolhatta a kapott eredményeket. A vizsgálati jelentés megad minden szükséges tájékoztatást a minta teljes azonosíthatósága érdekében.II. NYERS- ÉS HŐKEZELT TEJ MINTAVÉTELE1. Hatály és alkalmazási területEz az eljárás a nyers- és hőkezelt tej mintavételére vonatkozó referencia-eljárást határozza meg. A minták vételére, szállítására és tárolására vonatkozó eljárások a termelő által szállított nyerstejre, valamint a tároló és szállító tartályokban lévő nyers- és hőkezelt tejre alkalmazhatók.A 2., 4.4., 5. és 6. pontban megadott eljárások a közvetlen fogyasztásra szánt hőkezelt tej mintavételére alkalmazhatók.2. Általános előírásokA kannákban, tartályokban stb. lévő nyers- és hőkezelt tej mintavételét szakképzett személynek kell végeznie, aki a mintavétel elvállalása előtt megfelelő képzésen vett részt.Ha szükséges, az illetékes hatóság vagy a vizsgáló laboratórium utasítással látja el a mintavevő személyzetet a mintavételi technikák tekintetében annak biztosítása érdekében, hogy a minta reprezentatív legyen, és megfeleljen a teljes tételnek.Ha szükséges, az illetékes hatóság vagy a vizsgáló laboratórium utasítja a mintavevő személyzetet a minta megjelölésére, a minta egyértelmű azonosíthatóságának biztosítása érdekében.3. Mintavevő eszköz3.1. Általános előírásokA mintavevő eszközt rozsdamentes acélból vagy más alkalmas, megfelelő erősségű anyagból kell készíteni, amelynek szerkezete alkalmas a kitűzött feladat elvégzésére (keverés, mintavételezés stb.). A tárolóedényekben lévő folyadékok keverésére szolgáló keverőknek elegendően nagyméretűeknek kell lenniük a termék megfelelő keveréséhez, de ne okozzák a termékben avas szag kialakulását. A merítőkanalaknak elegendően hosszú, szilárd nyéllel kell rendelkezniük ahhoz, hogy a tárolóedényben bármilyen mélységből mintát lehessen venni. A merítőkanál térfogata nem lehet kisebb, mint 50 ml.A mintatároló edények és a fedelük üvegből, megfelelő fémből vagy műanyagból legyen.A mintavevő eszköz (beleértve a tárolóedényt és a fedelet) anyaga nem okozhat semmilyen elváltozást a mintában, amely befolyásolhatná a vizsgálatok eredményét. A mintavevő eszköz és a mintatároló-edény minden felülete tiszta és száraz, sima és repedésmentes legyen, a sarkok legyenek legömbölyítve.3.2. Mintavevő eszköz mikrobiológiai vizsgálat céljáraA 3.1. előírásain felül a mintavevő eszköz, a tárolóedényeket is beleértve, steril legyen.Ha ugyanazt a mintavevő eszközt alkalmazzák egymás utáni mintavételeknél, akkor meg kell tisztítani és sterilizálni kell minden egyes mintavétel után, a vizsgáló laboratórium vagy az illetékes hatóság által meghatározott előírásoknak vagy követelményeknek megfelelően úgy, hogy az egymást követő minták sértetlenségét megőrizzék.4. Mintavételi eljárás4.1. Általános előírásokFüggetlenül az elvégzendő vizsgálattól a tejet mintavétel előtt alaposan össze kell keverni, akár kézi, akár gépi módszerrel.A mintát közvetlenül az összekeverés után kell kivenni, miközben a tej még mindig keveredik.Ha a tartályban lévő tejből egyidejűleg több mintát is vesznek különböző vizsgálatok céljából, akkor elsőnek a mikrobiológiai vizsgálatra szánt mintát kell kivenni.A kivett minta térfogatának meg kell felelnie a vizsgálati követelményeknek. Az alkalmazott mintatároló-edények térfogata olyan legyen, hogy azt a minta majdnem teljesen megtöltse, és így lehetséges legyen a tartalmának alapos összekeverése a vizsgálat előtt, de szállítás közben elkerülhető legyen a habzás.4.2. Kézi mintavétel4.2.1. Mintavétel tejesvödrökből és -kannákbólA keveredés érdekében gyorsan mozgassuk a keverőt fel-le a vödörben vagy kannában annak biztosítására, hogy a tej alaposan összekeveredjen, és a tejszín ne tapadjon a kanna nyakára. A teljes szállítmány tekintetében a reprezentatív mintát a 4.2.4. pontnak megfelelően kapjuk.4.2.2. Mintavétel hűtött termelői tejtankokból és -tartályokbólKeverjük a tejet gépi erővel vagy kézzel, amíg a megfelelő homogenitást el nem érjük.Ha a tej térfogata olyan, hogy a gépi keverő nem tudja összekeverni a tejet, akkor végezzünk kézi keverést.4.2.3. Mintavétel mérlegserpenyőbőlA mérlegserpenyőbe öntés előtt elengedhetetlen a tej megfelelő összekeverése. Szükséges lehet további kézi vagy gépi keverés a zsír egyenletes eloszlatása érdekében. Ha a mintázandó szállítmány térfogata meghaladja a mérlegserpenyő kapacitását, akkor a teljes szállítmány tekintetében a reprezentatív mintát a 4.2.4-nek megfelelően kapjuk.4.2.4. Mintavétel osztott tartálybólHa a mintázandó tej teljes mennyisége egynél több tárolóedényben van, akkor vegyünk reprezentatív mennyiséget az összes tárolóedényből, és jegyezzük fel a tej mennyiségét, amelyre az egyes minták vonatkoznak. Ha az egyes tárolóedényekből származó minták vizsgálatára nem egyenként kerül sor, keverjünk össze részmintákat ezekből a reprezentatív mennyiségekből olyan arányban, amely megfelel az egyes tárolóedényekben lévő mennyiségeknek, ahonnan az egyes mintákat vettük. Ezekből az arányosított mennyiségű mintákból összekeverésük után vegyünk mintát, illetve mintákat.4.2.5. Mintavétel nagyméretű edényekből – tároló-, vasúti és közúti tartályokból4.2.5.1. Mintavétel előtt megfelelő eljárással keverjük meg a tejet.Nagyméretű edények, tároló-, vasúti vagy közúti tartályok tartalmának összekeverésére gépi keverés alkalmazása javasolt (4.2.5.2.)A keverés mértékének alkalmazkodnia kell ahhoz az időhöz, amióta a tej nyugalomban volt. Az alkalmazott keverési eljárás hatékonyságáról mindenféle körülmények között igazolni kell, hogy megfelel az előirányzott vizsgálat céljainak; a keverés hatékonyságának követelménye ugyanis jelentős mértékben befolyásolja a mintákból kapott elemzési eredmények hasonlóságát, mind a szállítmány különböző részeiből vett minták esetében, mind a tartály kifolyócsonkjánál a kiürítés során különböző időpontokban vett minták esetén. A tej összekeverésének eljárása megfelelőnek tekinthető, ha az ilyen körülmények között vett két minta zsírtartalma között az eltérés kevesebb, mint 0,1 %.Egy nagyméretű edényben, amelynek a leeresztőcsonkja az alján található, a kivezető nyílás környékén lehet egy kis tejmennyiség, amely a keverés után sem reprezentatív a teljes tartalom tekintetében. Ezért lehetőség szerint a mintákat búvónyíláson keresztül kell venni. Ha a mintákat a leeresztő csonknál veszik, akkor le kell engedni elegendő mennyiségű tejet annak biztosítása érdekében, hogy a minta reprezentatív legyen a teljes mennyiségre nézve.4.2.5.2. Nagyméretű edények, tároló-, vasúti- vagy közúti tartályok tartalmának keverése a következő módokon végezhető:- a tartályba épített, elektromos motorral meghajtott gépi keverővel,- a tartály búvónyílásába épített, elektromos motorral meghajtott propellerrel vagy keverővel, amelynek a keverőegységét a tejbe eresztjük,- közúti vagy vasúti tartályok esetében körbeáramoltatással a tartály leeresztő szivattyújához csatlakoztatott és a búvónyílásba helyezett tömlőn keresztül,- tisztára szűrt sűrített levegővel. Ebben az esetben a lehető legkisebb levegőnyomást és levegőtérfogatot kell alkalmazni az avas szag kialakulásának elkerülése érdekében.4.3. Automatikus vagy félautomatikus mintavételA termelői nyerstejszállítmányok mintázására automata vagy félautomata mintavevő eszközök a vizsgáló laboratórium vagy más illetékes hatóság által megadott előírásoknak megfelelően alkalmazhatók.Az ilyen eszközöket alkalmazásuk előtt és alkalmazásuk során rendszeres időközönként a felelős hatóság által előírt megfelelő vizsgálatnak kell alávetni. A mintavételi eljárások megfelelőségét igazolni kell, a következők megállapítása érdekében:- a megfelelő mintavételre alkalmas legkisebb összegyűjthető tejmennyiség,- az áthordás aránya (amely a legkisebb mintatérfogathoz tartozik),- a rakományból történő reprezentatív minta adására való alkalmasság, megfelelő keverés után.Automata vagy félautomata mintavevő eszközök alkalmazása esetén a felelős hazai hatóság előírhatja a következőket:- a legkisebb tejmennyiség, amelyből mintát kell venni,- a minta legkisebb mennyisége,- a legnagyobb áthordás,- milyen elemzéseket lehet végrehajtani, vagy milyen óvintézkedéseket kell tenni.4.4. Mintavétel kiskereskedelmi csomagolású, hőkezelt fogyasztói tejbőlA kiskereskedelmi csomagolású, hőkezelt fogyasztói tej mintái a teljes, bontatlan csomagok. Ha lehetséges, a mintákat a csomagológépről vagy a tejfeldolgozó üzem hűtőkamrájából kell venni, a lehető leghamarabb a feldolgozás után. Pasztőrözött tej esetében a feldolgozás napján.Mintákat kell venni a hőkezelt tej valamennyi típusából (pasztőrözött, UHT-kezelt és steril) olyan számban, amely megfelel a végrehajtandó vizsgálatoknak és a vizsgáló laboratórium vagy más illetékes hatóság által meghatározott előírásoknak.5. A minta azonosításaA mintát a könnyebb azonosíthatóság érdekében azonosító kóddal jelölik meg, a vizsgáló laboratórium vagy az illetékes hatóság által a minták azonosításának biztosítására megadott előírások alkalmazásával (lásd 2.).6. A minták szállítása és tárolásaA minták szállításának, tárolásának körülményeivel, és a tej mintázása, illetve vizsgálata között eltelt idővel kapcsolatos előírásokat a vizsgáló laboratórium készíti el a tej típusának és az alkalmazott vizsgálati eljárásnak megfelelően. Az előírásokat az illetékes hazai hatósággal egyetértésben állapítja meg.Az előírások tartalmazzák a következő pontokat:- a szállítás és tárolás közben óvintézkedéseket kell tenni a szennyező szagok és a közvetlen napsütés hatásának elkerülésére. Ha a mintáknál alkalmazott tárolóedény átlátszó, akkor sötét helyen kell tárolni,- a mikrobiológiai vizsgálat céljából vett nyerstejmintákat 0 oC és 4 oC között kell szállítani és tárolni. A mintavétel és a vizsgálat között eltelt időnek a lehető legrövidebbnek kell lennie, és az semmilyen esetben sem haladhatja meg a 36 órát. Az illetékes hatóság elfogadhatja a 0 oC és 6 oC közötti tárolási hőmérsékletet, ha a mintavétel és a vizsgálat között eltelt idő nem haladja meg a 24 órát,- a mikrobiológiai vizsgálat céljából vett pasztőrözött tej mintákat 0 oC és 4 oC között kell szállítani és tárolni. A mintavétel és a vizsgálat között eltelt időnek a lehető legrövidebbnek kell lennie, és az semmilyen esetben sem haladhatja meg a 24 órát,- a mikrobiológiai vizsgálat céljából vett, a nyers- és pasztőrözött tejtől eltérő tejmintákat a laboratóriumban hűtve kell tárolni, és a mintavétel és a vizsgálat között eltelt időnek a lehető legrövidebbnek kell lennie.Az egyes vizsgálatokhoz tartozó különleges óvintézkedések a különböző eljárások leírásainál szerepelnek.--------------------------------------------------II. MELLÉKLETTARTALOMJEGYZÉK| | oldal |I. | Fagyáspont meghatározása… | 193 |II. | Foszfatázaktivitás meghatározása … | 199 |III. | Peroxidázaktivitás meghatározása … | 202 |IV. | Mikroorganizmusok számának meghatározása – összcsíraszám-vizsgálat 30 oC-on… | 203 |V. | Mikroorganizmusok számának meghatározása – összcsíraszám-vizsgálat 21 oC-on… | 208 |VI. | Kólibaktériumok számának meghatározása – telepszámlálás 30 oC-on … | 212 |VII. | Szomatikus sejtszám meghatározása … | 216 |VIII. | Antibiotikumok és szulfonamidok kimutatása … | 222 |IX. | Kórokozó mikroorganizmusok kimutatása … | 231 |I. FAGYÁSPONT MEGHATÁROZÁSA1. Hatály és alkalmazási területEz az eljárás a nyers-, pasztőrözött, UHT-kezelt és steril teljes tej, részben fölözött tej és fölözött tej fagyáspontjának meghatározására adja meg a referencia-eljárást olyan berendezés (termisztoros fagyáspontmérő) alkalmazásával, amelyben a szabályozott hőmérsékletű fürdőt elektromos hűtés segítségével lehűtjük, és ahol a termisztorszonda helyettesíti a higanyos hőmérőt.A műszernek két típusa van. Az első egy olyan műszer, amely megkeresi a legmagasabb fagyáspontot a fagyási görbe "tetőző" szakaszán, míg a másik – kereskedelmi okokból – a fagyás kezdetétől mért rögzített időpontban történő leolvasásra van beállítva. Mivel az egyes tejek esetében, illetve a tej és a kalibrálásra használt hitelesítő oldat között a fagyási görbe eltérő lehet, ez a referenciaeljárás a tetőző szakaszon a keresést végző műszer alkalmazását teszi szükségessé. Rögzített leolvasási idejű műszerek a rutin ellenőrző mérések során alkalmazhatók.A fagyáspont a tejben lévő idegen víz arányának becslésére használható, feltéve hogy a minta savassága nem haladja meg a 0,18 g tejsav per 100 ml-t (lásd 7.4.).2. FogalommeghatározásA tej fagyáspontja: A megadott eljárás szerinti méréssel kapott érték Celsius-fokban (oC) kifejezve.3. A módszer elveA műszertől függő, megfelelő hőmérsékletre túlhűtött vizsgálandó tejmintában a kristályosodást mechanikus rezgéskeltéssel elindítjuk, ez a hőmérséklet gyors emelkedését eredményezi a minta fagyásának megfelelő tetőző szakasz eléréséig.A műszert két hitelesítő oldat megfelelő leolvasási értékének beállításával kalibráljuk, a tejminták esetében alkalmazottal megegyező eljárás segítségével. Az ilyen körülmények közötti tetőző szakasz a tej fagyáspontját adja meg Celsius-fokban.4. Eszközök és üvegedényekÁltalános laboratóriumi felszerelés, és elsősorban:4.1. KrioszkópA krioszkóp egy termosztatikusan szabályozott hűtőfürdőből, egy termisztor szondából (félvezető ellenállásos hőmérő), az ahhoz tartozó áramkörrel és galvanométerrel vagy "leolvasóval", egy mintakeverőből és egy olyan eszközből áll, amely a mintacsövekben megindítja a fagyást.4.1.1. HűtőfürdőA hűtőfürdő két fajtája alkalmazható.4.1.1.1. Bemerülő típusOlyan, jól szigetelt fürdő, amely megfelelő hűtőfolyadékot tartalmaz oly módon keverve, hogy a folyadék bármely két pontja közötti hőmérsékletkülönbség nem haladja meg a 0,2 oC-ot. A folyadék hőmérséklete nem ingadozhat ± 0, 5 oC-nál nagyobb mértékben a gyártó által beállított névleges értékhez képest.Fontos a hűtőfürdőben lévő folyadék állandó szinten tartása. A mintatartó csőnek a térfogatjel alatti teljes felületét fedje a hűtőfolyadék.4.1.1.2. Keringető típusMegfelelő hűtőfolyadék kering folyamatos áramlással a mintatartócső körül. A folyadék hőmérséklete nem ingadozhat ± 0,5 oC-nál nagyobb mértékben a gyártó által beállított névleges értékhez képest.Megfelelő hűtőfolyadék az 1,2-etándiol (etilén-glikol) 33 %-os (V/V) vizes oldata.4.1.2. Termisztor és a hozzá tartozó áramkörA termisztor üvegszonda típusú, legfeljebb 1,80 ± 0, 2 mm átmérővel és legfeljebb 0,31 mm rés-átmérővel. A termisztor időállandója 2 másodpercnél kevesebb, és a β-értéke (lásd megjegyzés) magas. Az üzemi feszültségnek, az áramerősségnek és a veszteségi állandónak olyannak kell lennie, hogy a termisztor hőmérséklete ne emelkedjen 0,0005 oC-nál nagyobb mértékben a környezeti hőmérséklet fölé – 0,512 oC-on. Az ellenállás legnagyobb tűréshatára ± 5 % lehet.Ha a szonda a krioszkópban munkahelyzetben van, akkor az üvegcsepp csúcsának a mintatartó cső tengelyében kell lennie, a cső teteje alatt 44,6 ± 0,1 mm távolságra (lásd az ábrát a 25. oldalon). Egy sablont kell biztosítani a felhasználó számára a szondának ebbe a helyzetbe való beállításához.MegjegyzésA β-érték adja meg a termisztor ellenállás-hőmérséklet jellemzőjét a következő képlet szerint:–×=βT2AholT  a hőmérséklet kelvinben kifejezve,R  az ellenállás ohmban kifejezve, T hőmérsékleten,–×1R  a hőmérsékleti együtthatóβ  a termisztor anyagától függő állandó. A jelenlegi gyakorlat szerint 3000-nél nagyobb érték javasolt.4.1.3. Mérő és kijelző eszköz4.1.3.1. A mérés elveAz alkalmazott műszer a fagyásponti görbe első "tetőpontja" megkeresésének elve szerint működik. A tetőpont a görbének az a szakasza, ahol a hőmérséklet ± 0, 002 oC pontossággal állandó marad legalább 20 másodperc időtartamra.4.1.3.2. Kézi működtetésA termisztor ellenállását Wheatstone-híddal vagy hasonló eszközzel ki kell egyenlíteni, a lehető legjobb minőségű állandó ellenállások alkalmazásával, amelyeknek a tűréshatára nem nagyobb, mint ± 10 %, hőmérsékleti együtthatójuk pedig nem haladja meg a 2 × 10– 5 oC-ot.A változtatható (kiegyenlítő) ellenállás a teljes tartományán belül nem térhet el az egyenestől maximális értékének 0,3 %-ánál nagyobb mértékben.Lehetőséget kell biztosítani az ellenállások beállítására kalibrálási célból.A mérési számlapnak 0,001 oC-nál nem nagyobb osztással kell rendelkeznie.4.1.3.3. Automata működtetésA leolvasó eszköz legalább 0,001 oC-os felbontású a 0 és – 1 oC tartományban.A leolvasó eszköz és az ahhoz tartozó áramkör stabilitása olyan, hogy az azonos hőmérséklet egymást követő kijelzései nem térhetnek el egymástól 0,001 oC-nál nagyobb mértékben.Az áramkör linearitása olyan, hogy a hiba a – 0,400 oC és a – 0,600 oC tartományon belül sehol sem haladja meg a ± 0, 001 oC-ot a műszer helyes használata közben.4.1.4. KeverődrótA tejjel szemben közömbös fémből készített 1 és 1,5 mm közötti átmérőjű drót alkalmazható a vizsgálati minta keverésére.A keverődrót kilengését be kell állítani és függőlegesen kell felszerelni úgy, hogy az alsó vége a termisztorszonda csúcsával egy szinten legyen. Ettől a helyzettől felfelé vagy lefelé 1,5 mm eltérés megengedhető.A keverődrót oldalirányban a gyártó által megállapított megfelelő mértékű kilengéssel (nem kevesebb, mint ± 1, 5 mm) remeg, annak biztosítása érdekében, hogy a vizsgálati mintában a hőmérséklet állandó maradjon a meghatározás alatt. A rendes keverési művelet közben a keverődrót semmikor sem ütődhet neki a termisztorszondának vagy a cső falának.4.1.5. A fagyás megkezdődését kiváltó eszközEz bármilyen eszköz lehet, amelynek alkalmazása azonnal fagyási folyamatot indít a mintában úgy, hogy a vizsgálati minta hőmérséklete a fagyáspont irányában emelkedni kezd. A keverődrót alkalmazható erre a célra; egyik eljárás a rezgés kilengésének fokozása egy-két másodpercre oly módon, hogy a keverődrót nekiütődjön a mintatartó cső falának.4.1.6. Mintatartó csövekA mintatartó csövek (lásd 1. ábra) üvegből készülnek, 50,8 ± 0,1 mm hosszúak, 16,0 ± 0,1 mm külső átmérőjűek és 13,5 ± 0,1 mm belső átmérőjűek. A falvastagság változása a cső kerületén körben sehol sem haladhatja meg a 0,1 mm-t.A csöveken térfogatjelölésnek kell lenni 29,8 mm-rel a végük alatt (21 mm-rel a cső alja fölött), a 2,5 ± 0,1 ml-es mintatérfogat jelzése céljából.4.1.7. ÁramellátásAz ellátó feszültséget stabilizálni kell vagy a készüléken belül, vagy azon kívül úgy, hogy az ingadozás ne haladja meg a névleges érték ± 1 %-át a hálózati ellátás ± 6 %-os ingadozásakor.4.2. Analitikai mérleg4.3. Egyjelű mérőlombikok, 1000 ml-es térfogat, A. osztályú.4.4. Szárítószekrény, jól szellőző, 130 ± 1 oC-os hőmérséklet tartására alkalmasvagyElektromos kemence, szellőztetett, 300 ± 25 oC-os hőmérséklet tartására alkalmas4.5. Exszikkátor5. Vegyszerek5.1. Bórszilikát-üvegben desztillált víz, forralva és 20 ± 2 oC-ra lehűtve, szén-dioxid abszorpciós csővel ellátott lombikban.5.2. Nátrium-klorid, analitikaireagens-minőségű, finomra porított, kemencében 300 ± 25 oC-on öt órán keresztül szárított vagy szárítószekrényben 130 ± 1 oC-on legalább 24 órán keresztül szárított, és megfelelő exszikkátorban szobahőmérsékletre lehűtött.5.3. A hitelesítő oldatok elkészítéseMérjük be a megfelelő mennyiséget (lásd 1. táblázat) a száraz nátrium-kloridból (5.2.) egy mérőüvegbe. Oldjuk fel desztillált vízben (5.1.), vigyük át veszteség nélkül egy 1000 ml-es egyjelű mérőlombikba, és hígítsuk fel a jelig a vízzel 20 ± 2 oC-os hőmérsékleten.Kb. 5 oC-on tároljuk, két hónapnál nem hosszabb ideig, 250 ml-nél nem nagyobb térfogatú, jól lezárt polietilén palackban.Nátrium-klorid oldatok fagyáspontja 20 oC-ong Na Cl/l | oC |6,859 | –0,408 |7,818 | –0,464 |8,149 | –0,483 |8,314 | –0,492 |8,480 | –0,502 |8,646 | –0,512 |8,811 | –0,521 |8,977 | –0,531 |9,143 | –0,541 |10,155 | –0,600 |A hitelesítő oldat felhasználása előtt óvatosan fordítsuk fel és forgassuk meg a palackot néhányszor tartalmának alapos összekeverése céljából. A hitelesítő oldatot soha nem szabad erősen felrázni, nehogy levegőt nyelhessen el.A hitelesítő oldatok mintáit mindig az oldat tiszta, száraz főzőpohárba öntésével nyerjük ki a palackból, azaz nem alkalmazhatunk pipettát erre a célra.Nem használhatunk oldatot olyan palackból, amely kevesebb, mint negyedéig van tele, és amenynyiben nincsen tartósítva gombaölő szerrel (pl. tiomerzál-oldat, 10 g/l), akkor két hónapnál hosszabb tárolás után nem használható.6. A termisztoros krioszkóp kalibrálásaA krioszkópot úgy kell beállítani, hogy a környező levegő hőmérséklete nem térhet el 1 oC-nál nagyobb mértékben a kalibrálási hőmérséklettől. A krioszkópot nem szabad közvetlen napsütés vagy huzat, illetve 26–27 oC-nál nagyobb szobahőmérséklet hatásának kitenni.Biztosítani kell, hogy a krioszkóp jó, működőképes állapotban legyen, a gyártó előírásainak megfelelően, és hogy a kalibrálás előtt legalább 12 órán keresztül legyen bekapcsolva. Ellenőrizzük a szonda helyzetét, a keverődrót rezgésének kilengését és a hűtőfolyadékok hőmérsékletét.Válasszunk ki két hitelesítő oldatot (lásd fent, 1. táblázat), amelyek szorosan közrefogják a vizsgálandó tejminta fagyáspontjának várható értékét. A két oldat fagyáspontjának különbsége lehetőség szerint ne legyen kevesebb, mint – 0,100 oC.(A jelenleg rendelkezésre álló krioszkópok egyes változatai esetében a termisztorral összeköttetésben lévő áramkör úgy van tervezve, hogy az a műszer mérési tartományán belül egy adott fagyáspontértékre legyen kiegyensúlyozva. Ezekben az esetekben az egyik kalibráló oldatként olyan hitelesítő oldat alkalmazása, amelynek ez a fagyáspontja, leegyszerűsíti a kalibrálási eljárást, és a gyártó megadja ezt az értéket.)Pipettázzunk 2,5 ± 0,1 ml-t az egyik hitelesítő oldatból egy tiszta, száraz mintatartó csőbe, és működtessük a krioszkópot.MegjegyzésA kalibráció során alkalmazott mintatartó csöveknek ugyanabból az üvegtípusból készített csöveknek kell lenniük, és azokat ugyanakkor kell kimosni és kiöblíteni ásványmentesített vízzel, mint a tejminták vizsgálata során alkalmazott csöveket. A hitelesítő oldatok hőmérsékletének a tejminták hőmérsékletéhez hasonlónak kell lenni.Állítsuk a kalibrációs szabályzókat a gyártó előírásai szerint addig, amíg a krioszkóp leolvasási értéke egyenlő nem lesz a hitelesítő oldat fagyáspontjával. Ismételjük meg az eljárást a másik hitelesítő oldattal, és folytassuk ilyen módon, az oldatokat váltogatva addig, amíg az egyes oldatokon végzett egymást követő leolvasások a kalibráló szabályzók további állítása nélkül az egyes fagyáspontok megfelelő értékét adják. Ekkor a krioszkóp használatra kész állapotba került, és közvetlenül a tejminta fagyáspontját fogja jelezni, további korrekció alkalmazása nélkül.7. A vizsgálati minta előkészítése7.1. Szükség esetén a mintákat 0 és 5 oC közötti hőmérsékleten tároljuk.7.2. Szükség esetén távolítsunk el minden látható idegen testet vagy szilárd tejzsírt a mintából egy tiszta, száraz edénybe szűréssel, és óvatosan keverjük össze a mintát. Ha szűrőt alkalmazunk, annak közömbösnek kell lennie a tejjel szemben, és hatékonynak kell lennie a laboratóriumi hőmérsékleten való alkalmazáskor.7.3. A tej vizsgálható a tárolási hőmérsékletén (0 és 5 oC között) vagy lehet hagyni, hogy közvetlenül a vizsgálatot megelőzően elérje a laboratóriumi hőmérsékletet. Mindazonáltal szükséges, hogy a hitelesítő oldatok és a tejminták felhasználáskor azonos hőmérsékletűek legyenek.7.4. Határozzuk meg a tej titrálható savasságát a fagyáspont vizsgálatához képest a lehető legrövidebb időn belül. Az olyan minták, amelyekben a savasság meghaladja a 0,18 g tejsavat 100 ml-enként, nem vizsgálhatók.7.5. UHT-kezelt és steril tejmintáknak a vizsgálat előtt legalább 20 percig állniuk kell nyitott tárolóedényben.8. Eljárás8.1. Előzetes ellenőrzésEllenőrizzük, hogy a hűtőfolyadék szintje és hőmérséklete megfelel-e a gyártó előírásainak és – ha szükséges – azt, hogy a termisztoros szonda egy üres mintatartó csőben a mintaüregben van-e. Kapcsoljuk be a krioszkópot és gondoskodjunk arról, hogy a hűtőfolyadék keverése és cirkulációja megfelelő legyen. Ha a krioszkóp már legalább 12 órája be van kapcsolva, akkor ellenőrizzük a hűtőfolyadék hőmérsékletét és a keverődrót helyzetét, valamint rezgésének kilengését.8.2. Rutin kalibrációs ellenőrzésMinden vizsgálat előtt mérjük meg egy hitelesítő nátrium-klorid-oldat fagyáspontját (pl. egy –0,512 oC fagyáspontú oldatét), amíg két egymást követő meghatározás nem tér el 0,001 oC-nál nagyobb mértékben. Ha ezeknek az értékeknek a középértéke a hitelesítő oldat fagyáspontjától 0,002 oC-nál nagyobb mértékben tér el, akkor újrakalibráljuk a krioszkópot a 6. pontban meghatározottak szerint.Ha a krioszkóp folyamatos üzemben működik, akkor végezzük el a rendszeres kalibrálást legalább óránként egyszer. A gyártó előírásait figyelembe kell venni.8.3. A tej fagyáspontjának meghatározásaÓvatosan fordítsuk fel és forgassuk meg néhányszor a tejminta üvegét, hogy a tartalma összekeveredjen. A mintát soha nem szabad erősen felrázni, nehogy levegőt nyelhessen el.Pipettázzunk 2,5 ± 0,1 ml-t a tejből egy tiszta, száraz mintatartó csőbe, és pipettával távolítsuk el az esetleges felesleget. Győződjünk meg arról, hogy a szonda és a keverődrót tiszta és száraz, ha szükséges, töröljük le óvatosan egy puha, tiszta, foszlánymentes kendővel, lentről felfelé.Helyezzük be a mintatartó csövet a bekalibrált krioszkópba a gyártó előírásainak megfelelően. A tej ekkor lehűl, és megkezdődik a fagyasztás a gyártó által meghatározott értékhez képest 0,1 oC-on belüli hőmérsékleten.(Egyes automatizált készülékek esetében ez a hőmérséklet megjelenik a digitális kijelzőn; kézi készülékek esetében annak a biztosításával érhető el a szükséges pontosság, hogy a fagyás a galvanométer mutatója vagy szálkeresztje és a megfelelő jel együttállásakor kezdődik el.)Ha bármilyen okból a fagyás a megadott hőmérséklettartomány alatt vagy felett kezdődik meg, hagyjuk abba a vizsgálatot és ismételjük meg azt egy másik vizsgálati tejmintával. Ha az ismétléskor a minta újra a meghatározott hőmérséklet előtt kezd fagyni, akkor a minta egy újabb részét fel kell melegíteni 45 oC-ra, és ilyen hőmérsékleten kell tartani 5 percig, hogy a kristályos zsír megolvadjon.Ezután hűtsük le ismét a vizsgálati hőmérsékletre, és azonnal végezzük el a vizsgálatot. A tej hőmérséklete a fagyás megkezdésekor gyorsan emelkedni fog egy értékig, amely gyakorlatilag állandó marad egy időre, mielőtt újra csökkenni kezd. A fagyáspont az ezalatt az időszak alatt elért legmagasabb hőmérsékletnek felel meg, és ezt az értéket kell feljegyezni.MegjegyzésAz az időtartam, ameddig a hőmérséklet állandó marad, és az az időtartam, amely a fagyás megkezdése és a legmagasabb hőmérséklet elérése között telik el, mintánként változhat és jelentősen rövidebb lesz a víz és a nátrium-klorid oldatok esetében, mint a tejnél. Lényeges, hogy a feljegyzés valóban a legmagasabb hőmérsékletet tartalmazza.Ha a mérést megfelelően elvégeztük, távolítsuk el a csövet, öblítsük ki vízzel, azután a termisztor szondáját szárítsuk meg, majd töröljük le egy puha, tiszta, foszlánymentes kendővel lentről felfelé, és végezzünk egy párhuzamos meghatározást a tejminta másik részéből.Ha a kapott fagyáspontok közötti különbség nagyobb, mint az ismételhetőségi érték (0,004 oC), akkor végezzünk párhuzamos meghatározást a minta másik részéből. Amennyiben a két meghatározás 0,004 oC-on belül egyezik, akkor ezeket az értékeket jegyezzük fel, és használjuk a végső eredmény kiszámításakor.8.4. A szonda lehűtéseA műszer használata után tegyünk egy üres mintatartó csövet a mintaüregbe, és süllyesszük le a mérőfejet a szonda hidegen tartása érdekében. (A krioszkópok egyes típusai esetében ez esetleg nem lehetséges; ezekben az esetekben lényeges annak biztosítása, hogy a szondát megfelelően lehűtsük a mérések megkezdése előtt, például néhány álmeghatározás végrehajtásával, amíg egyező eredményeket nem kapunk).9. Az eredmények kiszámítása9.1. SzámításHa a rutin kalibrációs ellenőrzést követően a kalibrálást jóváhagyjuk, számítsuk ki az elfogadható két fagyáspont értékeinek középértékét, és kerekítsük a harmadik tizedes jegyre.Ha a két elfogadható érték összege páratlan szám, akkor a középértéket a legközelebbi páros érték felé kell kerekíteni, a következő példa szerint:Fagyáspont (oC)Párhuzamos értékek | Középérték || |–0,544 | –0,545 | –0,544 |–0,545 | –0,546 | –0,546 |9.2. Pontosság9.2.1. Ismételhetőség ( r ) : 0,004 oC.9.2.2. Reprodukálhatóság ( R ) : 0,006 oC.+++++ TIFF +++++1. ábra:A 4.1. termisztoros krioszkóp részletei (a mintatartó cső helyzete a termisztor célgömbjéhez és a keverődróthoz képest)II. FOSZFATÁZAKTIVITÁS MEGHATÁROZÁSA1. Hatály és alkalmazási területEz az eljárás a foszfatázaktivitás meghatározására adja meg a referenciaeljárást pasztőrözött tejben.2. Fogalommeghatározás2.1. A foszfatázaktivitás a termékben jelen lévő aktív alkalikus foszfatáz mennyiségének mértéke, 1 ml pasztőrözött tej által az eljárásban említett feltételek között felszabadított fenol mikrogrammban megadott mennyiségével kifejezve.2.2. Minden olyan tej, amelynek foszfatázaktivitása 4 μg/ml alatt van, foszfatáz-negatívnak tekintendő.3. A módszer elveA foszfatázaktivitást a mintához adott dinátrium-fenil-foszfátból felszabadított fenol mennyiségéből számítjuk ki. A felszabadított fenol dibróm-indofenol képződése mellett (kékes szín) reagál dibróm-kinon-klórimiddel, amelyet kolorimetriásan mérünk 610 nm-en. Összehasonlítást végzünk olyan mintával, amelyben a foszfatázenzimet elbontottuk.4. Vegyszerek4.1. Bárium-borát-hidroxid puffer4.1.1. Oldjunk fel 50,0 g bárium-hidroxidot [Ba(OH)2.8H2O] vízben, és töltsük fel 1000 ml-re.4.1.2. Oldjunk fel 22,0 g bórsavat [H3BO3] vízben, és töltsük fel 1000 ml-re.4.1.3. Melegítsünk fel 500 ml-t mindkét oldatból 50 oC-ra, öntsük össze az oldatokat, keverjük meg, hűtsük le gyorsan 20 oC-ra, szükség esetén állítsuk be a pH-t 10,6 ± 0, 1-re a 4.1.1. vagy a 4.1.2. oldat hozzáadásával. Szűrjük le. Az oldatot szorosan lezárt tárolóedényben tároljuk.4.1.4. Használat előtt hígítsuk fel az oldatot azonos mennyiségű vízzel.4.2. Színelőhívó pufferOldjunk fel 6,0 g nátrium-metaborátot (NaBO2) vagy 12,6 g (NaBO2. 4H2O), és 20,0 g nátrium-kloridot (NaCl) vízben, és töltsük fel 1000 ml-re.4.3. Hígított színelőhívó pufferHígítsunk fel 10 ml színelőhívó puffert (4.2.) vízzel 100 ml-re.4.4. Puffer szubsztrátOldjunk fel 0,1 g víz- és fenolmentes dinátrium-fenil-foszfátot 100 ml pufferben (4.1.3.), vagy oldjunk fel 0,5 g dinátrium-fenil-foszfátot 4,5 ml színelőhívó pufferben (4.2.), adjunk hozzá két csepp BQC-oldatot (4.6.), és hagyjuk állni szobahőmérsékleten 30 percig. Vonjuk ki az így keletkezett színt 2,5 ml 1-butanollal, és hagyjuk állni amíg az 1-butanol el nem válik. Távolítsuk el az 1-butanolt, és öntsük el. Szükség esetén ismételjük meg a kivonást.Az oldatot hűtőszekrényben néhány napig lehet tárolni; használat előtt hívjuk elő a színt, és vonjuk ki újra. A puffer szubsztrátot közvetlenül használat előtt készítsük el ennek az oldatnak 1 ml-ét 100 ml-re hígítva bárium-borát-hidroxid pufferrel (4.3.).4.5. Cink–réz kicsapószerOldjunk fel 3,0 g cink-szulfátot (ZnSO4. 7H2O) és 0,6 g réz(II)-szulfátot (CuSO4. 5H2O) vízben, és töltsük fel 100 ml-re.4.6. 2,6-dibróm-kinon-klórimid-oldat (BQC-oldat)Oldjunk fel 40 ± 1 mg 2,6-dibróm-kinon-klórimidet (BQC) (C6H2Br2CINO6) 10 ml 96 %-os (V/V) etanolban.Tároljuk sötét színezett üvegben, hűtőszekrényben. Öntsük el, ha elvesztette a színét, vagy több mint 1 hónapos.4.7. Réz-(II)szulfát-oldatOldjunk fel 0,05 g réz(II)-szulfátot (CuSO4. 5H2O) vízben, és töltsük fel 100 ml-re.4.8. Fenol hitelesítő oldatok4.8.1. Mérjünk be 200 ± 2 mg tiszta vízmentes fenolt, vigyük át egy 100 ml-es mérőlombikba, adjunk hozzá vizet, keverjük össze, és töltsük fel a jelig. Ez a törzsoldat hűtőszekrényben változatlan marad néhány hónapig.4.8.2. Hígítsunk fel 10 ml-t a törzsoldatból 100 ml-re vízzel, és keverjük össze. 1 ml 200 μg fenolt tartalmaz.5. Eszközök és üvegedényekMegjegyzések:a) Minden üvegedényt, dugót és mintavevő eszközt gondosan meg kell tisztítani. Javasolt az elöblítésük frissen forralt desztillált vízzel, vagy a meggőzölésük.b) Egyes műanyagdugó típusok fenolos szennyezést okozhatnak, és az alkalmazásuk nem megengedett.Általános laboratóriumi felszerelés és különösen:5.1. Analitikai mérleg5.2. Vízfürdő, 37 ± 1 oC fenntartására alkalmas.5.3. Spektrofotométer, 610 nm-es hullámhosszon történő leolvasásra alkalmas.5.4. Kémcsövek, 16 vagy 18 mm × 150 mm, lehetőleg osztással 5 és 10 ml-nél.5.5. Pipetták5.6. Üvegtölcsérek megfelelő méretben, például 5 cm-es átmérővel.5.7. Redős szűrőpapír legalább 9 cm átmérőjű, közepes szűrési sebességhez.5.8. Mérőlombikok a hitelesítő oldatok elkészítéséhez.6. EljárásMegjegyzések:a) Kerüljük a közvetlen napfény hatását a meghatározások alatt;b) Nyál vagy veríték nyomaival való szennyeződés hamis pozitív eredményre vezethet, és kerülendő. Ebben a vonatkozásban különös figyelmet kell fordítani a pipettázási eljárásra.6.1. A vizsgálati minta előkészítése6.1.1. Az elemzést közvetlenül a mintavétel után végezzük el. Egyéb esetben tartsuk a mintát hűtőszekrényben, de nem több mint két napig.6.2. Vizsgálati mintaPipettázzunk két kémcsőbe (5.4.) 1 ml vizsgálati mintát, az egyik kémcsövet kontroll vagy vakpróba céljára.6.3. Meghatározás6.3.1. Melegítsük a vakpróbát két percig forrásban lévő vízben; fedjük le a kémcsövet és a forrásban lévő víz főzőpoharát alumíniumfóliával annak biztosítása érdekében, hogy a teljes kémcső felmelegedjen. Gyorsan hűtsük le szobahőmérsékletre.6.3.2. Az eljárás további részében a vakpróbával és a vizsgálati mintával azonos módon járjunk el. Adjunk hozzá 10 ml pufferoldatot (4.4.), és keverjük össze.6.3.3. Azonnal tegyük a mintákat vízfürdőbe (5.2.) 60 percre, tartalmukat időnként keverjük meg (legalább négy alkalommal).6.3.4. Melegítsük forrásban lévő vízben két percig, a 6.3.1. szerint leírtakkal azonos módon. Gyorsan hűtsük le szobahőmérsékletre.6.3.5. Adjunk 1 ml cink–réz kicsapószert (4.5.) mindegyik kémcsőhöz, és alaposan keverjük össze.6.3.6. Szűrjük át egy száraz szűrőpapíron, öntsük el az első 2 ml-t, szükség esetén szűrjük újra, amíg a szűrlet teljesen tiszta nem lesz, és fogjunk fel 5 ml-t egy kémcsőben.6.3.7. Adjunk hozzá 5 ml színelőhívó puffert (4.2.).6.3.8. Adjunk hozzá 0,1 ml BQC-oldatot (4.6.), keverjük össze és hagyjuk állni a szín kialakulásához 30 percig szobahőmérsékleten.6.3.9. Mérjük meg az elnyelést az ellenőrző oldattal vagy a vakpróbával szemben a spektrofotométerben (5.3.) 610 nm-es hullámhosszon.6.3.10. Ismételjük meg a meghatározást a minta megfelelő hígítása után, ha a 6.3.9. szerint mért elnyelés meghaladja a 6.4.4. szerint megmért és csövenként 20 μg fenolt tartalmazó hitelesítő oldat elnyelését. Ezt a hígítást egy térfogatnyi vizsgálati mintának azonos vizsgálati minta olyan, megfelelő térfogatú részével történő összekeverésével készítsük, amelyet óvatosan felmelegítettünk forrásig a foszfatáz inaktiválása céljából.6.4. A kalibrációs görbe elkészítése6.4.1. Készítsünk megfelelő sorozatot hígított hitelesítő oldatokból, a hitelesítő fenolból kiindulva (4.8.2.), amelyek 0 (kontroll vagy vakpróba), 2, 5, 10 és 20 μg fenolt tartalmaznak milliliterenként, és pipettázzunk rendre 1 ml vizet és 1-1 ml-t a négy fenol hitelesítő oldatból az öt kémcsőbe.6.4.2. Adjunk minden kémcsőhöz 1 ml réz(II)szulfát-oldatot (4.7.), 5 ml hígított színelőhívó puffert (4.3.), 3 ml vizet és 0,1 ml BQC-oldatot (4.6.); keverjük össze.6.4.3. Hagyjuk állni a szín kialakulásához 30 percig szobahőmérsékleten.6.4.4. A spektrofotométerben 610 nm-es hullámhosszon mérjük meg a minta mérőoldathoz vagy vakpróbához viszonyított abszorbanciáját (5.3.).6.4.5. Az egyes hozzáadott fenolmennyiségek (6.4.1.) esetén kapott elnyelések értékeiből (6.4.4.) számítsuk ki a regressziós egyenest a legkisebb négyzetek eljárásának segítségével.7. Az eredmények kiszámítása7.1. Számítás és képletek7.1.1. A leolvasott elnyelésből (6.3.9.) számítsuk ki a fenol mennyiségét a kapott regressziós egyenes segítségével (6.4.5.).7.1.2. Számítsuk ki a foszfatázaktivitást a pasztőrözött tej egy milliliterében lévő fenol mikrogramm egységben kifejezve a következő képlettel:Foszfatázaktivitás = 2,4 × A × Dahol:A  a 7.1.1. szerint kapott fenolmennyiség mikrogrammban;D  a 6.3.10. szerinti hígítás hígítási tényezője (hígítás hiánya esetén D = 1);A 2,4-es tényező a hígítási tényező (1 ml vizsgálati minta 5/12-e) – Lásd 6.2. összefüggésben a 6.3.2., 6.3.5. és 6.3.6. ponttal.7.2. Pontosság7.2.1. Ismételhetőség (r): 2 μg fenol/ml.7.2.2. Reprodukálhatóság (R): 3 (előzetes) μg fenol/ml.7.2.3. Ha a 6.3.10. szerint hígítást alkalmazunk, akkor a 7.2.1. és 7.2.2. alatt említett határ a hígított mintán kapott értékekre vonatkozik.III. PEROXIDÁZAKTIVITÁS MEGHATÁROZÁSA1. Hatály és alkalmazási területEz az eljárás a peroxidázenzim tejben való jelenlétének vagy hiányának meghatározására adja meg a referenciaeljárást a pasztőrözés ellenőrzéseként.2. FogalommeghatározásPeroxidáz pozitív reakció:Ha a tej megfelelően pasztőrözött, akkor kék szín jelenik meg az összekeverés után 30 másodpercen belül.Peroxidáz negatív reakció:Az összekeverés után 30 másodpercen belül nem jelenik meg elszíneződés.3. A módszer elveA peroxidázenzim bontja a hidrogén-peroxidot. A felszabaduló atomos oxigén oxidálja a színtelen 1,4-feniléndiamint lila színű indofenollá (Storch-próba). A szín élénksége arányos az enzim koncentrációjával.4. Vegyszerek4.1. 1,4-feniléndiamin-oldatOldjunk fel 2,0 g 1,4-feniléndiamint (C6H8N2) meleg (50oC) vízben, és töltsük fel 100 ml-re. Tartsuk az oldatot sötétbarna üvegben, üvegdugóval lezárva, és tároljuk sötét, hűvös helyen. Elkészítés után az 1,4-feniléndiamin-oldat egy–két napon belül üledéket képez: ekkor el kell önteni.4.2. Hidrogén-peroxid-oldatHígítsunk fel 9 ml 30 %-os hidrogén-peroxidot vízzel, és töltsük fel 100 ml-re. A stabilizálásához adjunk hozzá az oldathoz literenként 1 ml tömény kénsavat.A hidrogén-peroxid-oldat 1 hónapig stabil, ha hűvös, sötét helyen van tárolva üvegdugóval lezárt üvegben, amely megakadályoz mindenféle érintkezést szerves anyagokkal.5. Eljárás5.1. Tegyünk 5 ml tejmintát egy megfelelően lezárható, tiszta kémcsőbe.5.2. Adjunk hozzá 5 ml 1,4-fenilén-diamin-oldatot (4.1.).5.3. Adjunk hozzá 2 csepp hidrogénperoxid-oldatot (4.2.).5.4. Figyeljük meg a színképződést az elkeverés után 30 másodpercen belül. Ha a kék szín a vegyszerek hozzáadását követő 30 másodperc eltelte után jelenik meg, akkor a reakció nem jellemző.IV. MIKROORGANIZMUSOK SZÁMÁNAK MEGHATÁROZÁSA – ÖSSZCSÍRASZÁM-VIZSGÁLAT 30 oC-ON1. Hatály és alkalmazási területEz az eljárás a mikroorganizmusok számának 30 oC-on történő telepszámlálással való meghatározására adja meg a referencia-eljárást. Az eljárás nyerstej és pasztőrözött tej, illetve 15 napig 30 oC-on előinkubált UHT-kezelt és steril tej esetében alkalmazható.2. FogalommeghatározásA "mikroorganizmus" elnevezés jelentése: levegő jelenlétében, a leírt feltételek melletti inkubálás során megszámlálható telepeket képző szervezetek.3. A módszer elveA tejminta meghatározott mennyiségét Petri-csészében összekeverjük a táptalajjal, és 30 oC-on inkubáljuk 72 órán keresztül. A telepeket megszámláljuk, és kiszámítjuk a mikroorganizmusok számát a nyers- vagy pasztőrözött tej 1 ml-ében, illetve az előinkubált UHT-kezelt vagy steril tej 0,1 ml-ében.4. Eszközök és üvegedényekÁltalános laboratóriumi felszerelés és különösen:4.1. Eszközök4.1.1. Szárítószekrény, 170-175 oC-os üzemelésre alkalmas.4.1.2. Autokláv, 121 ± 1 oC-os üzemelésre alkalmas.4.1.3. Termosztát, 30 ± 1 oC tartására alkalmas a teljes térfogatán belül.4.1.4. pH-mérő, hőmérséklet-kompenzált, ± 0,1 pH egység pontosságú.4.1.5. Vízfürdő, 45 ± 1 oC-os üzemelésre alkalmas.4.1.6. Nagyítók, 2–4×-es nagyításúak.4.1.7. Nagyítók, 8–10×-es nagyításúak.4.1.8. Jelölő számláló.4.1.9. Keverő, amely alkalmas 1 ml tejmintának vagy decimális hígításnak 9 ml hígítóoldattal történő összekeverésére, és amely a kémcső tartalmának excentrikus rotációja elvén alapszik.4.2. Üvegedények4.2.1. Megfelelően lezárható kémcsövek, az elkeveréshez szükséges felső üres térfogat biztosítása mellett 10 ml alaphígításhoz vagy további decimális hígításokhoz elegendő űrtartalommal.4.2.2. Lombikok 150–250 ml-es űrtartalommal, vagy csövek kb. 20 ml űrtartalommal a táptalaj tárolására.4.2.3. Pipetták (vattadugóval) üvegből vagy steril szintetikus anyagból, bontatlan heggyel, 1 ml névleges űrtartalommal, 1,75 és 3 mm közötti kifolyási átmérővel.4.2.4. Petri-csészék, átlátszó, színezetlen üvegből vagy steril szintetikus anyagból, amelyek alsó része kb. 90–100 mm belső átmérőjű. A belső mélysége legalább 10 mm legyen. Az alján nem lehet semmilyen egyenetlenség, amely zavarná a telepek megszámlálását.4.2.5. Az üvegedények sterilizálása:Az üvegedényeket a következő módszerek egyikével kell sterilizálni.a) Szárítószekrényben (4.1.1.), nem kevesebb, mint egy órán keresztül 170–175 oC-os hőmérsékleten tartva;b) Autoklávban (4.1.2.), nem kevesebb, mint 20 percen keresztül 121 ± 1 oC-os hőmérsékleten tartva.Az autoklávban biztosítani kell, hogy a gőz megfelelően átjárja az eszközöket, például ha a sterilizálás tárolóedényekben történik, akkor azokat nem szabad szorosan lezárni, a palackok kupakja laza legyen.Az autoklávban sterilizált üvegedényeket a gőz kiszellőztetésével meg kell szárítani.A pipettákat szárítószekrényben (4.1.1.) kell sterilizálni.5. Táptalaj – agar táptalajon meghatározott tejösszcsíraszám5.1. Összetétel:Élesztőkivonat | 2,5 g |Tripton | 5,0 g |Glükóz D (+) vagy Dextróz | 1,0 g |Sovány tejpor | 1,0 g |Agar | 10-15 g, az alkalmazott agar gélerősségétől függően |Víz | 1000 ml |A sovány tejpornak gátlóanyagoktól mentesnek kell lennie. Ezt egy ismert gátlóanyagmentes sovány tejporral végzett összehasonlító vizsgálattal kell bizonyítani.Elkészítés:Szuszpendáljuk el, és oldjuk fel a vízben az összetevőket a következő sorrendben: élesztőkivonat, tripton, glükóz és végül sovány tejpor. A szuszpenzió felmelegítése segíti a folyamatot. Adjuk hozzá az agart, és forraljuk fel folyamatos keverés mellett, amíg az agar teljesen fel nem oldódik, vagy gőzöljük kb. 30 percig.Szükség esetén szűrjük át szűrőpapíron.Ellenőrizzük a pH-t pH-mérővel (4.1.4.), és szükség esetén (legalább 0,1 mol/l töménységű) nátrium-hidroxid vagy sósavoldattal állítsuk be a pH-t úgy, hogy a sterilizálás után 25 oC-on 6,9 ± 0,1 legyen.5.2. A táptalaj adagolása, sterilizálása és tárolásaAdagoljuk ki a táptalajt (5.1.) 100–150 ml-es mennyiségekben palackokba, vagy 12–15 ml-enként csövekbe (4.2.2.). Dugóval zárjuk le a palackokat és csöveket.Sterilizáljuk autoklávban (4.1.2.), 121 ± 1 oC-on 15 percig.Ellenőrizzük a táptalaj pH-ját.Ha a táptalajt nem használjuk fel azonnal, tároljuk sötétben 1 és 5 oC közötti hőmérsékleten, nem tovább, mint az elkészítésétől számított 1 hónapig.5.3. Kereskedelemben készen kapható, vízmentes táptalajA táptalaj (5.1.) elkészíthető a kereskedelemben készen kapható, vízmentes táptalajból. Kövessük a gyártó előírásait, de adjunk hozzá sovány tejport a feloldás előtt, ha azt nem tartalmaz.Állítsuk be a pH-t 25 oC-on 6,9 ± 0, 1-re az 5.1. pontban leírt eljárás szerint, adagoljuk ki, sterilizáljuk és tároljuk a táptalajt az 5.2. pontban megadottak szerint.6. Hígítófolyadékok6.1. Pepton/sóoldatÖsszetétel:Pepton | 1,0 g |Nátrium-klorid (NaCl) | 8,5 g |Víz | 1000 ml |Előkészítés:Oldjuk fel az összetevőket vízben, szükség esetén melegítéssel.Ellenőrizzük a pH-t pH-mérővel (4.1.4.), és szükség esetén (legalább 0,1 mol/l töménységű) nátrium-hidroxid vagy sósavoldattal állítsuk be a pH-t úgy, hogy a sterilizálás után 25 oC-on 7,0 ± 0,1 legyen.6.2. A hígítófolyadék adagolása, sterilizálása és tárolásaAdagoljuk ki a hígítófolyadékot (6.1.) kémcsövekbe (4.2.1.) olyan mennyiségekben, hogy a sterilizálás után minden cső 9,0 ± 0,2 ml hígítófolyadékot tartalmazzon. Dugóval zárjuk le a csöveket.Sterilizáljuk autoklávban (4.1.2.), 121 ± 1 oC-on 15 percig.Ellenőrizzük a hígítófolyadék pH-ját.Ha a hígítófolyadékot nem használjuk fel azonnal, tároljuk sötétben 1 és 5 oC közötti hőmérsékleten, nem tovább, mint az elkészítésétől számított 1 hónapig.6.3. Kereskedelemben kapható, vízmentes hígítóanyagA hígítófolyadék (6.1.) elkészíthető kereskedelemben kapható tablettából vagy porból. Kövessük a gyártó előírásait. Állítsuk be a pH-t a 6.1. szerint, adagoljuk ki, sterilizáljuk és tároljuk a hígítófolyadékot a 6.2. pontban megadottak szerint.7. Eljárás7.1. A táptalaj felolvasztásaA mikrobiológiai vizsgálat megkezdése előtt olvasszuk fel gyorsan a kívánt mennyiségű táptalajt, és tartsuk 45 ± 1 oC-os vízfürdőben (4.1.5.).7.2. A tejminta előkészítéseKeverjük össze alaposan a tejmintát a minta tárolóedényének 25-szöri gyors felfordításával úgy, hogy a mikroorganizmusok a lehető legegyenletesebben legyenek eloszlatva. A habzást el kell kerülni, vagy hagyni kell a habot eloszlani. Az összekeverés és a vizsgálati minta kivétele között nem telhet el három percnél több.7.3. Az alaphígítás (10– 1) elkészítése (nyers- és pasztőrözött tej)Steril pipettával (4.2.3.) tegyünk 1 ml mintát (7.2.) a nyerstejből vagy a pasztőrözött tejből 9 ml hígítófolyadékba (6.1.) a pipetta és a hígítófolyadék érintkezésének elkerülésével. A hígítófolyadék hőmérséklete megközelítőleg azonos legyen a tejminta hőmérsékletével. Keverjük óvatosan ezt az alaphígítást a keverőben (4.1.9.) 5–10 másodpercig.Ilyen módon 10– 1 alaphígítást kapunk.7.4. További tízszeres (decimális) hígítások elkészítése (nyers- és pasztőrözött tej)Steril pipettával (4.2.3.) tegyünk 1 ml-t az alaphígításból (7.3.) 9 ml hígítófolyadékba (6.1.) a 7.3. szerinti utasítások betartásával.Ilyen módon 10– 2 hígítást kapunk.Ismételjük ezeket a műveleteket, hogy további decimális hígításokat kapjunk, amíg várhatóan a megfelelő számú mikroorganizmust kapjuk (8.1.1.).7.5. A Petri-csészék beoltása7.5.1. Nyerstej: steril pipettával (4.2.3.) tegyünk 1 ml mintát és/vagy 1 ml-t a megfelelő decimális hígításból egy csészébe (4.2.4.). Legalább két hígítást kell vizsgálni. Készítsünk egy csészét minden megfelelően (8.1.1.) választott hígításból.7.5.2. Pasztőrözött tej: steril pipettával (4.2.3.) tegyünk 1 ml mintát és/vagy 1 ml-t a megfelelő decimális hígításból egy csészébe (4.2.4.). Legalább két hígítást kell vizsgálni. Készítsünk két csészét minden megfelelően (8.1.1.) választott hígításból.7.5.3. UHT-kezelt és steril tej (15 napos 30 oC-os inkubálás után vizsgálva – 85/397/EGK irányelv A. melléklet, VII. fejezet, 5. pont):Steril pipettával (4.2.3.) tegyünk 0,1 ml tejmintát (7.2.) egy csészébe (4.2.4.). Készítsünk két csészét.7.6. LemezöntésÖntsünk kb. 15–18 ml táptalajt (7.1.) minden beoltott csészébe.Keverjük össze közvetlenül a kiöntés után a Petri-csésze körkörös mozgatásával, hogy az inkubálás után egyenletesen szétoszlatott telepeket kapjunk.A tejminta előkészítésének befejezése és az összekeverés között eltelt idő a tej típusának, a vizsgálati mintának, illetve a táptalajjal való hígításnak megfelelőennem haladhatja meg a 15 percet.Hagyjuk megszilárdulni egy tiszta, hűvös, vízszintes felületen.7.7. A Petri-csészék inkubálásaTegyük a csészéket a termosztátba (4.1.3.). A csészéket felfordítva inkubáljuk. Ne tegyünk egymás tetejére több mint hat darabot. Az egymásra rakott csészék legyenek elválasztva egymástól, és a termosztát falától és tetejétől.Inkubáljunk 72 ± 2 óráig 30 ± 1 oC-on.7.8. A telepek megszámlálásaSzámoljuk meg a telepeket azokban a Petri-csészékben, amelyek nem több, mint 300 telepet tartalmaznak.Vizsgáljuk meg a csészéket tompa fényben. A számolás megkönnyítésére használhatunk megfelelő nagyítólencséket (4.1.6.) és/vagy jelölő számlálót (4.1.8.). Kerüljük el a Petri-csészében kicsapódott anyag részecskéinek a tűszúrásnyi telepekkel való összetévesztését. Szükség esetén a kétes eseteket vizsgáljuk meg alaposan, nagyobb nagyítású lencse (4.1.7.) alkalmazásával a telepeknek az idegen anyagoktól való megkülönböztetése céljából.Az összefolyó telepek egy telepnek számítanak. Ha a csészének kevesebb, mint egynegyed részét borítják összefolyó telepek, akkor számláljuk meg a telepeket a csésze azoktól mentes részén, és vonatkoztassuk ezt a számot az egész csészére. Ha a Petri-csészének több mint egynegyed részét borítják összefolyó telepek, ne vegyük figyelembe a csészét.8. Számítás és az eredmények közlése8.1. Nyers- és pasztőrözött tej8.1.1. Vegyük figyelembe az összes 10 és 300 közötti telepet tartalmazó csészéből kapott számértéket (lásd 8.1.3. és 8.1.4.).8.1.2. Az 1 ml nyers- vagy pasztőrözött tejben lévő mikroorganizmusokszámát a következő képlet adja meg:dahol:∑C  a 8.1.1. szerint megszámolt telepek összes száma,(n1+0,1n2)d  egyenlő a lemezekre tett minta térfogatával, amelyben:n1  az első hígításból megszámolt Petri-csészék száma,n2  a második hígításból megszámolt csészék száma,d  az első értékelt hígítás hígítási faktora.A számot kétértékes számjegyre adjuk meg. Ha a kerekíteni kívánt számjegy öt, akkor úgy kerekítsünk, hogy a közvetlenül balra mellette lévő számjegy páros legyen.Példa (pasztőrözött tej):Hígítás 10– 2: 278 és 290 telepHígítás 10– 3: 33 és 28 telepSzám/ml | =278 + 290 + 33 + 282 + 0,1 × 210-2 || = 6290,022 || = 28590 || = 29000 || = 2,9 × 104. |8.1.3. Ha csak 10-nél kisebb számok vannak, akkor a mikroorganizmusok milliliterenkénti számát "kevesebb mint 10 × d/ml" formában közöljük, ahol "d" a legkisebb hígítási faktor reciproka.8.1.4. Ha csak 300-nál több telep van, de a megszámlálás lehetséges, akkor számítsunk ki egy becsült értéket, és szorozzuk meg a hígítási faktor reciprokával. Az eredményt a "mikroorganizmusok becsült száma milliliterenként" formában közöljük.8.2. UHT- és steril tejHa a számlálás során 10-nél több telepet találunk a 0,1 ml esetében, akkor azt nem tekinthetjük úgy, hogy a 85/397/EGK irányelv követelményeinek megfelel.9. PontosságNemzetközileg elfogadott körvizsgálatok eredményei egyelőre nem állnak rendelkezésre.V. MIKROORGANIZMUSOK SZÁMÁNAK MEGHATÁROZÁSA – ÖSSZCSÍRASZÁM-VIZSGÁLAT 21 oC-ON1. Hatály és alkalmazási területEz az eljárás a mikroorganizmusok számának 21 oC-on történő telepszámlálással való meghatározására adja meg a referencia-eljárást pasztőrözött tejre, a tej 5 napos, 6 oC-on történő inkubálása után, a tejben 6 oC-on szaporodni képes pszichotróp mikroorganizmusokkal való szennyeződése mértékének meghatározására.2. FogalommeghatározásA "mikroorganizmus" megnevezés jelentése: levegő jelenlétében, a leírt feltételek melletti inkubálás során megszámlálható telepeket képző szervezetek.3. A módszer elveA pasztőrözött tejet 5 napig 6 oC-on inkubáljuk. Meghatározott mennyiségű tejmintát Petri-csészékben táptalajjal keverünk össze, és 21 oC-on inkubáljuk 25 órán keresztül. A telepeket megszámláljuk, és kiszámítjuk a mikroorganizmusok számát 1 ml pasztőrözött tejben.4. Eszközök és üvegedényekÁltalános laboratóriumi felszerelés és elsősorban:4.1. Felszerelés4.1.1. Szárítószekrény, 170–175 oC-os üzemelésre alkalmas.4.1.2. Autokláv, 121 ± 1 oC-os üzemelésre alkalmas.4.1.3. Termosztát, alkalmasa) 6 ± 0,2 oCb) 21 ± 1 oC tartására a teljes térfogatán belül.4.1.4. pH-mérő, hőmérséklet-kompenzált, ± 0,1 pH egység pontosságú.4.1.5. Vízfürdő, 45 ± 1 oC-os üzemelésre alkalmas.4.1.6. Nagyítók, 2–4 × nagyításúak.4.1.7. Nagyítók, 8–10 × nagyításúak.4.1.8. Jelölő számláló.4.1.9. Keverő, amely alkalmas 1 ml tejmintának vagy decimális hígításnak 9 ml hígítóoldattal történő összekeverésére, és amely a kémcső tartalmának excentrikus rotációja elvén alapszik.4.2. Üvegedények4.2.1. Megfelelően lezárható kémcsövek az elkeveréshez szükséges felső üres térfogat biztosítása mellett 10 ml alaphígításhoz vagy további decimális hígításhoz elegendő űrtartalommal.4.2.2. Lombikok 150–250 ml-es űrtartalommal vagy csövek kb. 20 ml űrtartalommal, a táptalaj tárolására.4.2.3. Pipetták (vattadugóval) üvegből vagy steril szintetikus anyagból, bontatlan heggyel, 1 ml névleges űrtartalommal, 1,75 és 3 mm közötti kifolyási átmérővel.4.2.4. Petri-csészék, átlátszó, színezetlen üvegből vagy steril szintetikus anyagból, amelyek alsó része kb. 90–100 mm belső átmérőjű. A belső mélység legalább 10 mm legyen. Az alján nem lehet semmilyen egyenetlenség, amely zavarná a telepek megszámlálását.4.2.5. Az üvegedények sterilizálásaAz üvegedényeket a következő módszerek egyikével kell sterilizálni.a) Szárítószekrényben (4.1.1.) legalább egy órán keresztül, 170–175 oC-os hőmérsékleten tartva;b) Autoklávban (4.1.2.) legalább 20 percen keresztül, 121 ± 1 oC-os hőmérsékleten tartva.Az autoklávban biztosítani kell, hogy a gőz megfelelően átjárja az eszközöket, például ha a sterilizálás tárolóedényekben történik, akkor azokat nem szabad szorosan lezárni, a palackok kupakja laza legyen.Az autoklávban sterilizált üvegedényeket a gőz kiszellőztetésével meg kell szárítani.A pipettákat szárítószekrényben (4.1.1.) kell sterilizálni.5. Táptalaj – agar táptalajon meghatározott tejösszcsíraszám5.1. Összetétel:Élesztőkivonat | 2,5 g |Tripton | 5,0 g |Glükóz D (+) vagy Dextróz | 1,0 g |Sovány tejpor | 1,0 g |Agar | 10-15 g, az alkalmazott agar gélerősségétől függően |Víz | 1000 ml |A sovány tejpornak gátlóanyagoktól mentesnek kell lennie. Ezt egy ismert gátlóanyagmentes sovány tejporral végzett összehasonlító vizsgálattal kell bizonyítani.Elkészítés:Szuszpendáljuk el, és oldjuk fel a vízben az összetevőket a következő sorrendben: élesztőkivonat, tripton, glükóz és végül sovány tejpor. A szuszpenzió felmelegítése segíti a folyamatot. Adjuk hozzá az agart, és forraljuk fel folyamatos keverés mellett, amíg az agar teljesen fel nem oldódik, vagy gőzöljük kb. 30 percig.Szükség esetén szűrjük át szűrőpapíron.Ellenőrizzük a pH-t pH-mérővel (4.1.4.), és szükség esetén (legalább 0,1 mol/l töménységű) nátrium-hidroxid vagy sósavoldattal állítsuk be a pH-t úgy, hogy a sterilizálás után 25 oC-on 6,9 ± 0,1 legyen.5.2. A táptalaj adagolása, sterilizálása és tárolásaAdagoljuk ki a táptalajt (5.1.) 100-150 ml-es mennyiségekben palackokba vagy 12-15 ml-enként csövekbe (4.2.2.). Dugóval zárjuk le a palackokat és csöveket.Sterilizáljuk autoklávban (4.1.2.), 121 ± 1 oC-on 15 percig.Ellenőrizzük a táptalaj pH-ját.Ha a táptalajt nem használjuk fel azonnal, tároljuk sötétben 1 és 5 oC közötti hőmérsékleten, nem tovább, mint az elkészítésétől számított 1 hónapig.5.3. Kereskedelemben kapható, vízmentes táptalajA táptalaj (5.1.) elkészíthető kereskedelemben kapható, vízmentes táptalajból. Kövessük a gyártó előírásait, de adjunk hozzá sovány tejport a feloldás előtt, ha azt nem tartalmaz.Állítsuk be a pH-t 25 oC-on 6,9 ± 0,1-re az 5.1. pontban leírt eljárás szerint, és adagoljuk ki, sterilizáljuk, és tároljuk a táptalajt az 5.2. pontban megadottak szerint.6. Hígítófolyadékok6.1. Pepton/sóoldatÖsszetétel:Pepton | 1,0 g |Nátrium-klorid (NaCl) | 8,5 g |Víz | 1000 ml |Elkészítés:Oldjuk fel az összetevőket vízben, szükség esetén melegítéssel.Ellenőrizzük a pH-t pH-mérővel (4.1.4.), és szükség esetén (legalább 0,1 mol/l töménységű) nátrium-hidroxid vagy sósavoldattal állítsuk be a pH-t úgy, hogy a sterilizálás után 25 oC-on 7,0 ± 0, 1 legyen.6.2. A hígítófolyadék adagolása, sterilizálása és tárolásaAdagoljuk ki a hígítófolyadékot (6.1.) kémcsövekbe (4.2.1.) olyan mennyiségekben, hogy a sterilizálás után minden cső 9,0 ± 0, 2 ml hígítófolyadékot tartalmazzon. Dugóval zárjuk le a csöveket.Sterilizáljuk az autoklávban (4.1.2.) 121 ± 1 oC 15 percig. Ellenőrizzük az oldószer pH-ját.Ha a hígítófolyadékot nem használjuk fel azonnal, tároljuk sötétben 1 és 5 oC közötti hőmérsékleten, nem tovább, mint az elkészítésétől számított 1 hónapig.6.3. Kereskedelemben kapható, vízmentes hígítóanyagA hígítófolyadék (6.1.) elkészíthető kereskedelemben kapható tablettákból vagy porból. Kövessük a gyártó előírásait. Állítsuk be a pH-t a 6.1. szerint és adagoljuk ki, sterilizáljuk és tároljuk a hígítófolyadékot a 6.2. pontban megadottak szerint.7. Eljárás7.1. A táptalaj felolvasztásaA mikrobiológiai vizsgálat megkezdése előtt olvasszuk fel gyorsan a kívánt mennyiségű táptalajt, és tartsuk 45 ± 1 oC-os vízfürdőben (4.1.5.).7.2. A tejminta előkészítése7.2.1. Inkubáljunk egy bontatlan csomag pasztőrözött tejet, vagy ha ez nem lehetséges, akkor egy legalább 100 ml mennyiségű reprezentatív mintát 120 ± 2 órán keresztül 6 ± 0,5 oC-on termosztátban (4.1.3.a)).7.2.2. Inkubálás után keverjük össze alaposan a tejmintát a minta tárolóedényének 25-szöri gyors felfordításával úgy, hogy a mikroorganizmusok a lehető legegyenletesebben legyenek eloszlatva. A habzást el kell kerülni, vagy hagyni kell a habot eloszlani. Az összekeverés és a vizsgálati minta kivétele között nem telhet el három percnél több.7.3. Az alaphígítás (10– 1) elkészítéseSteril pipettával (4.2.3.) tegyünk 1 ml mintát (7.2.2.) 9 ml hígítófolyadékba (6.1.) a pipetta és a hígítófolyadék érintkezésének elkerülésével. A hígítófolyadék hőmérséklete megközelítőleg azonos legyen a tejminta hőmérsékletével. Keverjük óvatosan ezt az alaphígítást a keverőben (4.1.9.) 5–10 másodpercig.Ilyen módon 10– 1 alaphígítást kapunk.7.4. További decimális hígítások elkészítéseSteril pipettával (4.2.3.) tegyünk 1 ml-t az alaphígításból (7.3.) 9 ml hígítófolyadékba (6.1.) a 7.3. szerinti utasítások betartásával.Ilyen módon 10– 2 hígítást kapunk.Ismételjük ezeket a műveleteket, hogy további decimális hígításokat kapjunk, amíg várhatóan a megfelelő számú mikroorganizmust kapjuk (8.1.).7.5. A Petri-csészék beoltásaSteril pipettával (4.2.3.) tegyünk 1 ml mintát és/vagy 1 ml-t a megfelelő decimális hígításból egy csészébe (4.2.4.). Legalább két hígítást kell vizsgálni. Készítsünk két csészét minden megfelelően (8.1.) választott hígításból.7.6. LemezöntésÖntsünk kb. 15–18 ml táptalajt (7.1.) minden beoltott csészébe.Keverjük össze közvetlenül a kiöntés után, a Petri csésze körkörös mozgatásával úgy, hogy az inkubálás után egyenletesen szétoszlatott telepeket kapjunk.A tejminta előkészítésének befejezése és az összekeverés között eltelt idő nem haladhatja meg a 15 percet.Hagyjuk megszilárdulni egy tiszta, hűvös, vízszintes felületen.7.7. A Petri-csészék inkubálásaTegyük a csészéket a termosztátba (4.1.3.b)). A csészéket felfordítva inkubáljuk. Ne tegyünk egymás tetejére hatnál több darabot. Az egymásra rakott csészék legyenek elválasztva egymástól és a termosztát falától és tetejétől.Inkubáljunk 25 óráig 21 ± 1 oC-on.7.8. A telepek megszámlálásaSzámláljuk meg a telepeket azokban a Petri-csészékben, amelyek nem több, mint 300 telepet tartalmaznak.Vizsgáljuk meg a csészéket tompa fényben. A számolás megkönnyítésére használhatunk megfelelő nagyítókat (4.1.6.) és/vagy jelölő számlálót (4.1.8.). Kerüljük el a Petri-csészében kicsapódott anyag részecskéinek a tűszúrásnyi telepekkel való összetévesztését. Szükség esetén a kétséges eseteket vizsgáljuk meg alaposan nagyobb nagyítású lencse (4.1.7.) alkalmazásával, a telepeknek az idegen anyagoktól való megkülönböztetése céljából.Az összefolyó telepek egy telepnek számítanak. Ha a csészének kevesebb, mint egynegyed részét borítják összefolyó telepek, akkor számláljuk meg a telepeket a csésze azoktól mentes részén, és vonatkoztassuk ezt a számot az egész csészére. Ha a Petri-csészének több mint egynegyed részét borítják összefolyó telepek, ne vegyük figyelembe a csészét.8. Számítás és az eredmények közlése8.1. Vegyük figyelembe az összes, 10 és 300 közötti telepet tartalmazó csészéből kapott számértéket (lásd 8.3. és 8.4.).8.2. Az 1 ml nyers- vagy pasztőrözött tejben lévő mikroorganizmusokszámát a következő képlet adja meg:dahol:∑C  a 8.1. szerint megszámolt telepek összes száma,(n1+ 0,1n2)d  egyenlő a lemezekre tett minta térfogatával, amelyben:n1  az első hígításból megszámolt Petri-csészék száma,n2  a második hígításból megszámolt Petri-csészék száma,d  az első értékelt hígítás hígítási faktora.A számot kétértékű számjegyre adjuk meg. Ha a kerekíteni kívánt számjegy 5, akkor úgy kerekítsünk, hogy a közvetlenül balra mellette lévő számjegy páros legyen.Példa:Hígítás 10– 2: 278 és 290 telepHígítás 10– 3: 33 és 28 telepSzám/ml | =278 + 290 + 33 + 282 0,1 × 210- 2 || = 6290,022 || = 28590 || = 29000 || = 2,9 × 104. |8.3. Ha csak 10-nél kisebb számok vannak, akkor a mikroorganizmusok milliliterenkénti számát "kevesebb mint 10 × d/ml" formában közöljük, ahol "d" a legkisebb hígítási tényező reciproka.8.4. Ha csak 300-nál több telep van, de a megszámlálás lehetséges, akkor számítsunk ki egy becsült értéket, és szorozzuk meg a hígítási tényező reciprokával. Az eredményt a "mikroorganizmusok becsült száma milliliterenként" formában közöljük.9. PontosságNemzetközileg elfogadott körvizsgálatok eredményei egyelőre nem állnak rendelkezésre.VI. KÓLIBAKTÉRIUMOK SZÁMÁNAK MEGHATÁROZÁSA – TELEPSZÁMLÁLÁS 30 oC-ON1. Hatály és alkalmazási területEz az eljárás a pasztőrözött tejben lévő kólibaktériumok számának 30 oC-on történő telepszámlálással való meghatározásához adja meg a referencia-eljárást.2. FogalommeghatározásA "kólibaktérium" megnevezés olyan baktériumokat jelent, amelyek a leírt feltételek mellett gáz fejlesztésével laktózt fermentáló, jellegzetes vagy nem jellegzetes telepeket képeznek.3. A módszer elveMeghatározott mennyiségű tejmintát Petri-csészékben táptalajjal összekeverünk, és 30 oC-on inkubáljuk 24 órán keresztül. A jellegzetes telepeket megszámláljuk, és szükség esetén a nem jellegzetes telepek azonosítását megerősítjük a laktózfermentálási képesség vizsgálatával. Kiszámítjuk a kólibaktériumok számát 1 ml pasztőrözött tejben.4. Eszközök és üvegedényekÁltalános laboratóriumi felszerelés és különösen:4.1. Felszerelés4.1.1. Szárítószekrény, 170–175 oC-os üzemelésre alkalmas.4.1.2. Autokláv, 121 ± 1 oC-os üzemelésre alkalmas.4.1.3. Termosztát, 30 ± 1 oC tartására alkalmas a teljes térfogatán belül.4.1.4. pH-mérő, hőmérséklet-kompenzált, ± 0,1 pH-egység pontosságú.4.1.5. Vízfürdő, 45 ± 1 oC-os üzemelésre alkalmas.4.1.6. Dróttű, platina-irídiumból vagy króm-nikkelből.4.2. Üvegedények4.2.1. Megfelelően lezárható, 20 ml űrtartalmú kémcsövek a megerősítő közeg (5.2.) számára, és megfelelő méretű Durham-csövek a kémcsövekkel való használatra.4.2.2. Lombikok 150–250 ml-es űrtartalommal a szilárd, szelektív táptalaj tárolására. (5.1.)4.2.3. Pipetták (vattadugóval) üvegből vagy steril szintetikus anyagból, bontatlan heggyel, 1–10 ml névleges űrtartalommal, 1,75 és 3 mm közötti kifolyási átmérővel.4.2.4. Petri-csészék átlátszó, színezetlen üvegből vagy steril szintetikus anyagból, amelyek alsó része kb. 90-100 mm belső átmérőjű. A belső mélység legalább 10 mm legyen. Az alján nem lehet semmilyen egyenetlenség, amely zavarná a telepek megszámlálását.4.2.5. Az üvegedények sterilizálása:Az üvegedényeket a következő módszerek egyikével kell sterilizálni.a) Szárítószekrényben (4.1.1.) legalább egy órán keresztül, 170–175 oC-os hőmérsékleten tartva;b) Autoklávban (4.1.2.) legalább 20 percen keresztül, 121 ± 1 oC-os hőmérsékleten tartva.Az autoklávban biztosítani kell, hogy a gőz megfelelően átjárja az eszközöket, például ha a sterilizálás tárolóedényekben történik, akkor azokat nem szabad szorosan lezárni, a lombikok és palackok kupakja laza legyen.Az autoklávban sterilizált üvegedényeket a gőz kiszellőztetésével meg kell szárítani.A pipettákat szárítószekrényben (4.1.1.) kell sterilizálni.5. Táptalaj5.1. Kristályibolya-neutrálvörös-epe-laktóz-agar (VRBL-agar). Szilárd szelektív táptalaj.Összetétel:Pepton | 7 g |Élesztőkivonat | 3 g |Laktóz (C12H22O11. H2O) | 10 g |Nátrium-klorid (NaCl) | 5 g |Epesók | 1,5 g |Neutrálvörös | 0,03 g |Kristályibolya | 0,0002 g |Agar | 10 – 15 g, az alkalmazott agar gélerősségétől függően |Víz | 1000 ml |ElkészítésSzuszpendáljuk el, és oldjuk fel a vízben az összetevőket, és hagyjuk állni néhány percig, végül alaposan keverjük össze.Ellenőrizzük a pH-t pH-mérővel (4.1.4.), és szükség esetén (legalább 0,1 mol/l töménységű) nátrium-hidroxid vagy sósavoldattal állítsuk be a pH-t úgy, hogy a forralás után 25 oC-on 7,4 ± 0, 1 legyen.Forraljuk fel gyorsan, időnként megkeverve, és azonnal adagoljuk ki 100-150 ml-es mennyiségekben steril lombikokba (4.2.2.). Tartsuk a táptalajt vízfürdőben (4.1.5.) 45 ± 1 oC-on.A táptalaj sterilitását a felhasználáskor ellenőrizni kell (lásd 6.4.).Az elkészítésétől számított három órán belül használjuk fel a táptalajt.5.2. Brillantzöld-epe-laktóz tartalmú folyékony táptalaj. Megerősítő táptalaj.Összetétel:Pepton | 10 g |Laktóz (C12H22O11. H2O) | 10 g |Szárított marhaepe | 20 g |Brillantzöld | 0,0133 g |Víz | 1000 ml |Elkészítés:Oldjuk fel forralással az összetevőket a vízben.Ellenőrizzük a pH-t pH-mérővel (4.1.4.), és szükség esetén (legalább 0,1 mol/l töménységű) nátrium-hidroxid vagy sósavoldattal állítsuk be a pH-t úgy, hogy a sterilizálás után 25 oC-on 7,2 ± 0,1 legyen.Adagoljuk ki a táptalajt 10 ml-es mennyiségekben kémcsövekbe (4.2.1.), amelyek Durham-csövet tartalmaznak. A csöveket zárjuk le dugóval.Autoklávban (4.1.2.) sterilizáljuk 121 ± 1 oC-on, 15 percig.Sterilizálás után a Durham-csövek nem tartalmazhatnak levegőbuborékokat.Ellenőrizzük a táptalaj pH-ját.Ha a táptalajt nem használjuk fel azonnal, akkor tartsuk sötétben 0 és 5 oC közötti hőmérsékleten, nem tovább, mint az elkészítésétől számított egy hónapig.5.3. Kereskedelemben kapható, vízmentes táptalajA táptalajok (5.1., 5.2.) elkészíthetők kereskedelemben kapható, vízmentes táptalajból. Kövessük a gyártó előírásait. Állítsuk be a pH-t és adagoljuk ki, forraljuk fel vagy sterilizáljuk, és tároljuk a táptalajokat az 5.1. és az 5.2. pontban megadottak szerint.6. Eljárás6.1. A táptalajHasználjuk az 5.1.-ben leírt táptalajt (VRBL-agar).6.2. A tejminta előkészítéseKeverjük össze alaposan a tejmintát a minta tárolóedényének 25-szöri gyors felfordításával úgy, hogy a mikroorganizmusok a lehető legegyenletesebben legyenek eloszlatva. A habzást el kell kerülni, vagy hagyni kell a habot eloszlani. Az összekeverés és a vizsgálati minta kivétele között nem telhet el három percnél több.6.3. A Petri-csészék beoltásaSteril pipettával (4.2.3.) felszívott 3 ml mintából (6.2.) három Petri-csészét (4.2.4.) oltunk le, mindegyikbe 1 ml tejmintát téve.6.4. LemezöntésÖntsünk kb. 12 ml VRBL-agart (6.1.) minden beoltott csészébe.Keverjük össze közvetlenül a kiöntés után a Petri-csésze körkörös mozgatásával, hogy az inkubálás után egyenletesen szétoszlatott telepeket kapjunk.A tejminta előkészítésének befejezése és a vizsgálati minta táptalajjal való összekeverése között eltelt idő nem haladhatja meg a 15 percet.A sterilitás ellenőrzésére készítsünk beoltatlan Petri-csészét 12 ml, a beoltott csészéknél alkalmazott VRBL-agarral.Hagyjuk megszilárdulni egy tiszta, hűvös, vízszintes felületen, amíg a táptalaj megköt.A teljes megszilárdulás után öntsünk legalább 4 ml VRBL-agart (6.1.) a beoltott táptalajok felületére.Hagyjuk megszilárdulni.6.5. A Petri-csészék inkubálásaTegyük a csészéket a termosztátba (4.1.3.). A csészéket felfordítva inkubáljuk. Ne tegyünk egymás tetejére hatnál több darabot. Az egymásra rakott csészék legyenek elválasztva egymástól és a termosztát falától és tetejétől.Inkubáljunk 24 ± 2 óráig 30 ± 1oC-on.6.6. A telepek megszámlálása6.6.1. Számoljuk meg a telepeket azokban a Petri-csészékben, amelyek nem több, mint 150 telepet tartalmaznak. Számoljuk meg a sötétvörös színű telepeket, amelyek átmérője legalább 0,5 mm, akár van körülöttük a kólibaktériumokra jellemző kiválás, akár nincs.6.6.2. Ha az összes, vagy néhány telep nem jellemző megjelenésű (pl. eltérő a színe, mérete, vagy a kiválás formája a tipikus telepekhez képest), akkor végezzünk megerősítő vizsgálatot (6.7.).6.7. Megerősítő vizsgálatA 6.6.2. pontban megadottaknak megfelelően végezzünk megerősítő vizsgálatot megfelelő számú (pl. 3–5) nem jellemző telepen brillant-zöld-epe-laktóz tartalmú folyékony táptalaj táptalajba való beoltással (5.2.), dróttű (4.1.6.) alkalmazásával. Inkubáljuk a csöveket 24 ± 2 óráig 30 ± 1 oC-on.Azokat a telepeket tekintjük megerősített kólibaktériumoknak, amelyek a Durham-csőben gázt termelnek.7. Számítás és az eredmények közlése7.1. Vegyük figyelembe az összes, 150-nél nem több telepet tartalmazó Petri-csészéből kapott számértéket (lásd 7.4.).7.2. Ha megerősítő vizsgálatot is alkalmaztunk, akkor a kólibaktérium-telepek számát a megerősített kólibaktérium-telepek százalékos arányából számítsuk ki.7.3. Az 1 ml pasztőrözött tejben lévő kólibaktériumok számát a következő képlet adja meg:nahol:∑C  a tejminta (3 ml) vizsgálatával kapott összes kólibaktérium-telep száma (7.1. összefüggésben a 7.2.-vel),n  a vizsgált minta (6.3.) millilitereinek száma (3 ml).A számot kétértékű számjegyre adjuk meg, ha több mint 100 telep van. Ha a kerekíteni kívánt számjegy 5, akkor úgy kerekítsünk, hogy a közvetlenül balra mellette lévő számjegy páros legyen.Ha csak 150-nél több telep van, akkor az eredményt úgy adjuk meg, mint a "kólibaktériumok becsült száma milliliterenként".8. PontosságNemzetközileg elfogadott körvizsgálatok eredményei egyelőre nem állnak rendelkezésre.VII. SZOMATIKUS SEJTSZÁM MEGHATÁROZÁSAEz az eljárás két referenciaeljárást határoz meg a szomatikus sejtszám meghatározására:A. Mikroszkópos módszerB. Fluoro-opto-elektronikus módszer.A. Mikroszkópos módszer1. Hatály és alkalmazási területEz az eljárás a szomatikus sejtszám meghatározására adja meg a referenciaeljárást nyerstej esetében.Ez az eljárás adja meg a referenciaeljárást a sejtszám meghatározására tejmintában a flouro-opto-elektronikus eljárás kalibrálása és pontosságának ellenőrzése céljából (lásd B.1.).2. FogalommeghatározásEbben az eljárásban a szomatikus sejtek azok a sejtek, pl. fehérvérsejtek, hámsejtek, amelyek sejtmagja tisztán megfesthető metilénkék alkalmazásával.3. A módszerelve0,01 ml tejet szélesztünk a tárgylemez 1 cm2 területű részén. A kenetet megszárítjuk és megfestjük. A számlálást mikroszkóp alatt végezzük. Egy meghatározott területen megszámolt szomatikus sejtek számát megszorozzuk a mikroszkóp szorzótényezőjével, hogy megkapjuk a milliliterenkénti sejtszámot.4. VegyszerekAnalitikai tisztaságú vegyszereket kell alkalmazni.Festékoldat:Összetétel:Metilénkék | 0,6 g |Etanol – 99 % | 54 ml |1,1,1-triklór-etán vagy tetraklór-etán | 40 ml |Jégecet | 6 ml |FigyelmeztetésA tetraklór-etán mérgező. Ha azt alkalmazzuk, akkor az elkészítése és felhasználása közben vegyszerfülkében kell dolgozni.ElkészítésKeverjük össze az etanolt 1,1,1-triklór-etánnal vagy tetraklór-etánnal egy üvegben, és melegítsük vízfürdőben 60–70 oC-ra. Adjuk hozzá a metilénkéket, óvatosan keverjük össze, hűtsük le hűtőszekrényben 4 oC-ra 12–14 óra alatt, és adjuk hozzá a jégecetet. Szűrjük le 10–12 mikron vagy annál kisebb pórusméretű szűrőn, és tartsuk a festékoldatot légmentesen lezárt üvegben. Ha részecskék vagy üledék képződik, használat előtt szűrjük le.5. Felszerelés és üvegedények5.1. Mikroszkóp, 500–1000 × nagyítással.5.2. Mikrofecskendő, 0,01 ml-es ± 2 %-os vagy annál jobb pontossággal.5.3. Tárgylemez, a kenet számára kijelölt 20 × 5 mm-es területtel, vagy egy szabványos tárgylemez és egy 20 × 5 mm-es sablon a kenet számára.5.4. Szabályozott fűtőlap, (30–50 oC) a tárgylemezek megszárítására.5.5. Ventillátor (hajszárító), a kenet megszárítására.5.6. Vízfürdő, 30 és 40 oC közötti üzemelésre alkalmas, a tejminta melegítése céljából.5.7. Mikrométeres beosztású tárgylemez, 0,01 mm osztással ellátva.6. Eljárás6.1. A tejmintaA tejmintát a mintavétel után 6 órán belül vizsgálni kell. A tárolás alatt a minta hőmérséklete nem haladhatja meg a 6 oC-ot. A megfagyást el kell kerülni.6.2. A minta előkészítése a laboratóriumbanMelegítsük fel a mintát vízfürdőben (5.6.) 30–40 oC-ra. Ezután óvatosan keverjük össze. Hűtsük le arra a hőmérsékletre, amelyen a mikrofecskendőt (5.2.) kalibrálták, pl. 20 oC-ra.6.3. A tárgylemezek előkezeléseTisztítsuk meg a tárgylemezeket (5.3.), például etanollal, szárítsuk meg pormentes papírral, lángoljuk le és hűtsük le. Tároljuk dobozban, hogy ne porosodjon.6.4. A kenet elkészítéseVegyünk ki 0,01 ml tejet a fentiek szerint előkészített mintából a mikrofecskendővel (5.2.). Óvatosan tisztítsuk le a fecskendő tejjel érintkező külső felületét. Tegyük a fecskendőt a tárgylemezre (5.3.), először az alakzat külső határvonalát megrajzolva (20 mm × 5 mm). Ezután a lehető legegyenletesebben töltsük ki a területet. Szárítsuk meg a filmet szabályozott fűtőlapon (5.4.), amíg teljesen meg nem szárad.Valamennyi tejmintából legalább két kenetet kell készíteni és megvizsgálni.6.5. A kenet festéseMerítsük a festék oldatba (4.) 10 percre. Szárítsuk meg, szükség esetén ventillátorral (5.5.) befejezve. Merítsük a keneteket csapvízbe, amíg minden felesleges festék kimosódik. Ezután szárítsuk meg ismét, és portól védve tároljuk.6.6. A mikroszkóp látóterének kalibrálásaA mikrométeres beosztású tárgylemez (5.7.) segítségével és a választott nagyítástól függően (500–1000 ×) határozzuk meg a mikroszkóp alatti terület méretét.7. Számlálás és számítás7.1. A sejtek megszámlálásaHasználjunk mikroszkópot (5.1.). A sejtek megszámlálása helyett csak a sejtmagokat számláljuk meg. Ezek tisztán felismerhetőek és a számláláshoz a sejtmagoknak legalább a fele kell, hogy látszódjon a mikroszkóp látóterében. A kenet középső harmadán átmenő sávokat vagy területeket számláljuk meg, kerüljük olyan sávok vagy területek megszámlálását, amelyet kizárólag a kenet szélső területeiről választottunk. A kenetek gondos előkészítését és így az eredmények megbízhatóságát legalább havonta egyszer ellenőrizni kell a kenet különböző részeinek megszámlálásával. A számlálást úgy is el lehet végezni, hogy látómezőket számlálunk meg olyan rendszerben, hogy azok a kenet minden részét egyformán reprezentálják.7.2. A megszámlálandó sejtek minimális számaMivel a szomatikus sejtek mikroszkópos megszámlálása automatikus és mechanikus számlálási eljárások szabványosítására is használható, a számok variációs együtthatója azonos mintákon nem lehet nagyobb, mint az elektronikus műszereké. A variációs együttható a milliliterenként 400000–600000 sejtet tartalmazó tejmintákon nem lehet több, mint 5 %.A megszámlálandó szomatikus sejtek számának az egyes mintákban – a Poisson-eloszlásnakmegfelelően – legalább 400-nak kell lennie, hogy ennek az ismételhetőségnek megfeleljen.A Poisson-eloszlás feltételezi, hogyM = V = s2,AholM  a középértékV  a varianciaéss  a normál eltérés.A variációs együttható:CV =MvagyCV =vagyCV =M (középérték) jelzi a részecskék (sejtek) számát, amelyet megszámoltunk (azaz 400 a CV = 5 % esetén).7.3. A szorzótényező kiszámítása0,01 ml tej felhasználásával a szorzótényező a 7.3.1. vagy a 7.3.2. pont szerint számítható ki.7.3.1. A keneten átmenő sávok megszámlálásaA megszámlálandó sávok hossza minden esetben 5 mm. A sávok szélessége megfelel a mikroszkóp látótér átmérőjének, amint azt a mikrométeres beosztású tárgylemezzel meghatároztuk (5.7.).Szorzótényező =20 × 100d × bahol:d  a mikroszkóp látóterének átmérője mm-ben, amint azt a mikrométeres beosztású tárgylemezzel meghatároztuk (5.7.).b  a teljesen megszámlált sávok száma.7.3.2. A kenet középső harmadában lévő vagy a rácsozattal megadott mikroszkóp látóterek megszámlálásaSzorzótényező =Π × d× s=12732d2× sahol:d  a mikroszkóp látóterének átmérője mm-ben, amint azt a mikrométeres beosztású tárgylemezzel meghatároztuk (5.7.)s  a megszámlált területek száma.7.4. A sejtszám kiszámításaA megszámlált szomatikus sejtek számát (7.1. és 7.2.) megszorozzuk a szorzótényezővel (7.3.), hogy megkapjuk a tejben a milliliterenkénti sejtszámot.7.5. PontosságA variációs koefficiens (lásd 7.2.) nem haladhatja meg az 5 %-ot.Nemzetközileg elfogadott körvizsgálatok eredményei egyelőre nem állnak rendelkezésre.B. Fluoro-opto-elektronikus módszer1. Hatály és alkalmazási területEz az eljárás a szomatikus sejtszám meghatározására megfelelő kalibrálás után (lásd A.1.) használható referenciaeljárást adja meg – kémiailag tartósított vagy tartósítás nélküli – nyerstej esetében.2. FogalommeghatározásEbben az eljárásban a szomatikus sejtek azok a részecskék, amelyek minimális fluoreszcens intenzitással rendelkeznek a szomatikus sejtek sejtmagjában lévő DNS megfestése miatt.3. A módszer elveA minta egy részét, (pl. 0,2 ml-t) alaposan elkeverjük a pufferoldattal és a fluoreszcens oldattal. Ennek a keveréknek egy részét egy vékony film formájában felvisszük egy forgó korongra, amely tárgysíkként szolgál a mikroszkóp számára.Minden sejt elektromos impulzust kelt, amit felerősítünk és megmérünk. A szomatikus sejtek számát 1000/ml-ben íratjuk ki.4. VegyszerekEltérő rendelkezés hiányában analitikai minőségű vegyszereket kell alkalmazni. A víznek vagy desztilláltnak vagy ioncseréltnek kell lennie, vagy azzal azonos tisztaságúnak.4.1. PufferoldatÖsszetétel:Kálium-hidrogén-ftalát | 51,0 g |Kálium-hidroxid | 13,75 g |Polietilén-glikol-mono-p(1,1,3,3-tetrametil-butil)-fenil-éter (pl. Triton X-100), 1 térfogat % | 10 ml |pH 5,7-5,9. Töltsük fel vízzel 10000 ml-re. | |Elkészítés:Az egyes összetevőket összekeverjük. A légmentes tárolás nem haladhatja meg a 7 napot.4.2. Fluoreszcens oldat (törzsoldat)Összetétel:Etidium-bromid | 1,0 g |Töltsük fel vízzel 1000 ml-re.Elkészítés:Az etidium-bromidot feloldjuk vízben. A fényvédett és légmentes üvegben történő tárolás nem haladhatja meg a két hónapot.4.3. Fluoreszcens oldat (munkaoldat)20 ml törzsoldatot (4.2.) keverjünk össze a pufferoldattal (4.1.) 1000 ml végső térfogat elérésével. A munkaoldat 7 napnál hosszabb ideig nem használható.4.4. Tisztító oldatÖsszetétel:Pufferoldat (4.1.) | 10 ml |Polietilén-glikol-mono-p(1,1,3,3-tetrametil-butil)-fenil-éter (pl. Triton X-100), 1 térfogat % | 10 ml |Ammónia, 25 térfogat %-os | 25 ml |Töltsük fel vízzel 10000 ml-re.Elkészítés:Az egyes összetevőket összekeverjük. A tárolás nem haladhatja meg a 30 napot.5. Felszerelés és üvegedények5.1. Számláló eszköz, a fluoreszcens optikai elvnek megfelelő működéssel.MegjegyzésHasználat előtt az eszközt kalibrálni kell. Így határozzuk meg az összefüggést a megszámlálandó részecskék térfogata és aközött a küszöbérték között, amely fölött a számolás történik. A felszerelés kalibrálását az előállító előírásainak megfelelően végezzük, olyan minták alkalmazásával, amelyek sejtszámát a mikroszkópos eljárással (A) meghatároztuk.5.2. Vízfürdő keringetéssel, 40 ± 1 oC-os üzemelésre alkalmas.5.3. Kémcső megfelelő kupakkal, kb. 15 ml-es.6. A tejminta6.1. A mintát kémcsőben (5.3.), alacsony hőmérsékleten kell tárolni. Ha a minta nincs kémiailag tartósítva, akkor nem szabad a fejés után 24 órán belül megszámlálni, mert a kapott érték túlságosan alacsony lesz. A tárolási hőmérséklet nem haladhatja meg a 6 oC-ot.6.2. TartósításA kémiai tartósítást 24 órán belül kell elvégezni. A tartósítást a mintavétel után a lehető leghamarabb el kell végezni.6.2.1. A minta kémiai tartósítása elvégezhető a következő tartósítószerek egyikének hozzáadásával:- ortobórsav:az ortobórsav végső koncentrációja a mintában nem haladhatja meg a 0,6 g/100 ml-t. Az ilyen tartósított minta további 24 óráig tárolható 6–12 oC-os hőmérsékleten,- kálium-dikromát:a kálium-dikromát végső koncentrációja nem haladhatja meg a 0,2 g/100 ml-t. Egy ilyen tartósított minta további 72 óráig tárolható 6–12 oC-os hőmérsékleten,- nátrium-azid:a minták tartósíthatók nátrium-aziddal 0,024 g/100 ml végső koncentrációig, feltéve hogy a mintát a mintavétel után azonnal lehűtjük 6-12 oC-os hőmérsékletre, és a mintavételtől számított 48 órán belül megszámláljuk,- bronopol:a minták tartósíthatók bronopollal 0,05 g/100 ml végső koncentrációig, feltéve hogy a mintát a mintavétel után azonnal lehűtjük 6–12 oC-os hőmérsékletre, és a mintavételtől számított 72 órán belül megszámláljuk.6.2.2. Az ortobórsavval már tartósított mintát tovább tartósíthatjuk 48 órára kálium-dikromát alkalmazásával.MegjegyzésA minták kálium-dikromátos tartósítása esetén a szennyvízkezelésre vonatkozó helyi feltételeket be kell tartani.7. Eljárás7.1. A minta előkezeléseA vizsgálandó tejet a fejés után legalább 24 órán keresztül kell tárolni hozzávetőleg 2–6 oC-on. A minták előkezelés nélküli megszámlálása a fejés napján nem ajánlatos, mert az eredmények túl alacsonyak lehetnek. Ha ilyen minta megszámlálása válik szükségessé, akkor előkezelést kell alkalmazni legalább három órán keresztül kálium-dikromáttal (lásd 6.2.1.).7.2. ElkészítésAz előkezelt mintát (lásd 7.1.), vagy a legalább 1 napos kezeletlen mintát vízfürdőben (5.2.) felmelegítjük kb. 40 oC-ra. Ezután a mintát szobahőmérsékleten tároljuk a számlálás elvégzéséig.7.3. SejtszámlálásA számlálást a számláló műszer (5.1.) segítségével végezzük a melegítés (lásd 7.2.) befejezése után 15 percen belül. Közvetlenül a számlálás előtt a mintát alaposan összekeverjük a szomatikus sejtek lehető legegyenletesebb eloszlásának elérése érdekében.A további hígítás és mintaelőkészítés a műszerben automatikusan történik.8. PontosságIsmételhetőségi (r) és reprodukálhatósági (R) értékek nemzetközileg elfogadott körvizsgálatokból egyelőre nem állnak rendelkezésre. A jövőben a pontossági adatok megállapításra kerülnek.A nemzeti szinten rendelkezésre álló adatok a következő becsléseket teszik lehetővé:(1) 400000és500000/ml közötti sejtszám szinten- az ismételhetőség normál eltérése:sr = 20000 sejt/ml(megfelel 5–4 %-os variációs együtthatónak)- a reprodukálhatóság normál eltérése:sR = 40000 sejt/ml(megfelel 10–8 %-os variációs együtthatónak)9. A találati pontosság ellenőrzéseA találati pontosság ellenőrzése mikroszkópos sejtszámlálással a nemzeti referencia laboratóriumban meghatározott, ismert sejtszámú minták alkalmazásával történik.VIII. ANTIBIOTIKUMOK ÉS SZULFONAMIDOK KIMUTATÁSAHATÁLY ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLETEz az eljárás az antibiotikumok és szulfonamidok kimutatására adja meg a referencia-eljárást nyerstej és hőkezelt tej esetében.A referenciaeljárás a következőket tartalmazza:A. Kvalitatív módszerEz az eljárás olyan elsődleges eljárás, amellyel az antibiotikumokat – beleértve a szulfonamidokat – tartalmazó tejmintákat ki lehet választani. A megadott eljárás egy a számos hasonló eljárásból, amelyek alapvetően mind a Bacillus stearothermophilus var. calidolactis, ATCC 10149-et alkalmazzák tesztorganizmusként. Az eljárás reprezentatív az ilyen vizsgálatokra vonatkozóan.B. Eljárás a penicillin megerősítésére és meghatározásáraEzt az eljárást kell alkalmazni a kvalitatív eljárás eredményeinek megerősítésére, a penicillin azonosítására és a penicillin koncentrációjának meghatározására.A. Kvalitatív eljárás1. Hatály és alkalmazási területEz az eljárás a következő táblázatban megadott határértékeket meghaladó antibiotikumok és szulfonamidok kvalitatív kimutatására adja meg a referencia-eljárást nyerstej és hőkezelt tej esetében:Különböző antibiotikumok és szulfonamidok kimutatható koncentrációja [1]| A vizsgálat érzékenysége |Mind negatív | Mind pozitív |Benzil-penicillin | 0,002 | 0,006 |Ampicillin | 0,002 | 0,005 |Kloxacillin | 0,015 | 0,035 |Nafcillin | 0,006 | 0,011 |Tetraciklin | 0,10 | 0,40 |Oxy-tetraciklin | 0,20 | 0,45 |Klór-tetraciklin | 0,15 | 0,50 |Kloramfenikol | 7 | 15 |Dihidro-streptomicin | 4 | 13 |Neomicin | 1 | 22 |Kanamicin | 9 | 28 |Bacitracin | 0,06 | 0,14 |Eritromicin | 1 | 2,25 |Rifamicin | 0,01 | 0,14 |Diafenil-szulfon | 0,01 | 0,1 |Szulfametazin (Szulfadimidin) | 0,5 | 1 |Élesztőkivonat | 2 g |Pepton | 5 g |Húskivonat | 1 g |Nátrium-klorid | 5 g |Agar | 10-15 g |Víz | 1000 ml |ElkészítésOldjuk fel az összetevőket a vízben. Forraljuk fel időnként megkeverve. Állítsuk be a pH-t úgy, hogy a sterilizálás után 25 oC-on 7,4 ± 0, 1 legyen.Adagoljuk ki 10 ml-es mennyiségekben kémcsövekbe agargélek készítéséhez vagy 100 ml-es mennyiségekben üvegekbe.Sterilizáljuk 121 ± 1 oC-on 15 percig.5.1.2. Agar táptalajÖsszetételNátrium-klorid | 2 g |Agar | 15 g |Víz | 1000 ml |Trimethoprim- vagy Tetroxoprim-oldat (lásd 5.1.3.) | 10 ml |ElkészítésOldjuk fel az összetevőket a trimethoprim vagy tetroxoprim kivételével vízben. Forraljuk fel időnként megkeverve. Adjuk hozzá a trimethoprimot vagy tetroxoprimot, és sterilizáljuk 121 ± 1 oC-on 15 percig; állítsuk be a pH-t úgy, hogy a sterilizálás után 25 oC-on 7,0 ± 0, 1 legyen.5.1.3. Trimethoprim- vagy Tetroxoprim-oldatÖsszetételTrimethoprim | 5 mg |vagy Tetroxoprim | 30 mg |Etanol 96 % | 5 ml/30 ml |Víz | 1000 ml-re |ElkészítésOldjuk fel a trimethoprimot vagy tetroxoprimot etanolban (5 vagy 30 ml), és hígítsuk fel vízzel.5.1.4. TáptalajÖsszetételÉlesztőkivonat | 0,75 mg |Glükóz | 5,0 mg |Oldható keményítő | 8,0 mg |Brómkrezolbíbor | 0,025 mg |Víz | 50 ml-re |ElkészítésOldjuk fel a tápanyagokat és az indikátort vízben, szükség esetén melegítéssel, szűréssel sterilizáljuk. A táptalaj a kereskedelmi forgalomban tabletta formájában kapható.5.2. Hitelesítő penicillinoldatok5.2.1. Készítsünk 60 μg/ml-es (= 100 IU/ml) penicillinoldatot kristályos nátrium- vagy kálium-benzil-penicillin feloldásával steril desztillált vízben egy megfelelő steril ledugózott üvegben.5.2.2. Készítsünk penicillin munkaoldatot 1,25 ml penicillinoldat (5.2.1.) felhígításával 1000 ml-re, steril desztillált vízben. Ez a munkaoldat 0,075 μg-ot (= 0,125 IU/ml) tartalmaz.5.2.3. Készítsünk 75 ml hitelesítő penicillinoldatot, amely 0,004 μg/ml-t (= 0,0067 IU/ml) tartalmaz úgy, hogy 71 ml gátlóanyag-mentes tejet (5.3.) adunk 4 ml penicillin munkaoldathoz (5.2.2.) és összekeverjük.5.2.4. Az 5.2.1–5.2.3. pontokban említett penicillinoldatokat a vizsgálat elvégzésének napján kell elkészíteni.5.3. Gátlóanyag-mentes tejKontrollként steril, desztillált vízzel készítsünk gátlóanyag-mentes tejet sovány tejpor (10 % m/V) rekonstituálásával, amelyet előzőleg megvizsgáltunk és gátlóanyagoktól mentesnek találtunk. Más megoldásként, megfelelő mennyiségű friss elegytejet, amelyet mentesnek találtunk a gátlóanyagoktól, elosztunk üvegekben, 1 órán keresztül 100 oC-on forraljuk, és ezután 0 és 6 oC között hűtőszekrényben tároljuk legfeljebb egy hétig.5.4. Tesztorganizmus5.4.1. A Bacillus stearothermophilus var. calidolactis, ATCC 10149 törzset alkalmazzuk tesztorganizmusként. A törzs azonos a C 953-mal.5.4.2. Készítsünk törzstenyészetet a tesztorganizmus fenntartására. A tesztorganizmust törzsfenntartó agargélben (5.1.1.) tartjuk. Az agargélt a felületén szélesztve beoltjuk egy kacsnyi tesztorganizmussal, és levegőn inkubáljuk 48 órán keresztül 63 ± 1 oC-on. Inkubálás után a csövet steril gumidugóval lezárjuk. Az így kapott törzstenyészet néhány hónapig tárolható hűtőszekrényben 0 és 5 oC között.5.5. Teszttenyészet (spóraszuszpenzió)5.5.1. 20 ml törzsfenntartó agart (5.1.1.) sterilen átviszünk egy steril Petri-csészébe (4.2.2.), és lehűtjük szobahőmérsékletre.5.5.2. Tegyünk steril pipettával (4.2.4.) 5 ml steril desztillált vizet a törzstenyészetet tartalmazó csőbe (5.4.2.), és mossuk le a spórákat az agargélről steril kacs segítségével. Ezt a spóraszuszpenziót 0 és 5 oC között kell tárolni, és használjuk fel 36 órán belül.5.5.3. Tegyünk steril pipettával (4.2.4.) 0,5 ml spóraszuszpenziót (5.5.2.) a tesztlemezre (5.5.1.), és oszlassuk el teljesen az oltóanyagot az egész felületen egy hajlított üvegbot segítségével. Inkubáljuk 16–18 órán keresztül 63 ± 1 oC-on (4.1.1.).A törzstenyészet (5.4.2.), vagy egy olyan tenyészet használatakor, amely több mint 36 órás, az átoltást legalább kétszer el kell végezni úgy, hogy az átoltások között ne teljen el 36 óránál több.5.5.4. Tegyünk steril pipettával (4.2.4.) 10 ml desztillált vizet a tesztlemezre (5.5.3.), és vigyük a szuszpenzióba a felületről a spórákat egy üvegbot segítségével.Tegyük át a spóraszuszpenziót egy üvegbe (4.2.3.), amely 250 ml steril desztillált vizet tartalmaz. Zárjuk le az üveget, és alaposan rázzuk össze. Azokat a tenyészeteket, amelyeket nem oltunk át azonnal, hűtőszekrényben kell tartani 0 és 6 oC között.5.5.5. A spóraszuszpenziónak ml-enként 5 és 10 millió közötti életképes telepszámot kell adnia egy 16-18 órán keresztül 63 ± 1 oC-on inkubált csíraszám-meghatározó táptalajon. A spóraszuszpenziónak egyenletesen zavarosnak kell lennie, és ha pelyhes csapadékot vagy üledéket tartalmaz, akkor el kell dobni, és új szuszpenziót kell készíteni a törzstenyészetből (5.4.2.).5.6. A kémcsövek/ampullák előkészítése5.6.1. Olvasszuk fel az agar táptalajt (5.1.2.), és hűtsük le 55 oC-ra.5.6.2. Adjunk egy rész friss spóraszuszpenziót (5.5.4.) öt rész agar táptalajhoz (5.6.1.) kémcsőben vagy üvegben, majd keverjük alaposan össze.5.6.3. Vigyünk át 0,3 ml-t a beoltott táptalajból (5.6.2.), amely a számítás szerint 5 mm vastag réteget ad egy steril csőben vagy ampullában (4.2.6.), és zárjuk le dugóval vagy kupakkal, vagy a tetejének megolvasztásával. Hagyjuk a kémcsövet/ampullát függőleges helyzetben lehűlni, a táptalajt megszilárdulni, és végül hagyjuk állni 12 órát.5.6.4. A kémcsövek/ampullák felhasználhatók ugyanazon a napon, de el is tarthatók néhány hónapig, feltéve hogy a készítés után azonnal lehűtjük és 0 és 6 oC között tároljuk.6. Eljárás6.1. A mintákat a lehető leghamarabb, lehetőség szerint a mintavétel után 24 órán belül meg kell vizsgálni, amely időszak alatt a mintákat 0 és 5 oC között tároljuk. Ha nem lehetséges a minták 24 órán belüli vizsgálata, akkor azokat mélyhűtőben kell tartani (–30 és – 15 oC között) a penicillin inaktiválódásának minimalizálása érdekében.6.2. Minden csövet/ampullát (5.6.) olvashatóan és letörölhetetlenül azonosítsunk. Távolítsuk el a kupakot vagy dugót. Tegyünk kellő számú vizsgálandó mintát és kontrollt (5.2. és 5.3.) egy megfelelő tartóba (4.1.3.).6.3. Adjunk 50 mikroliter 5.1.4. pontban említett táptalajt minden csőhöz/ampullához.6.4. Keverjük alaposan össze a tejmintát és fecskendővel (4.1.4.) tegyünk 0,1 ml-t a megfelelő, felcímkézett csőbe/ampullába. Használjunk tiszta, eldobható hegyetminden mintaátvitelhez.6.5. Ismételjük a 6.4. szerint megadott műveletet még egyszer, hitelesítő penicillinoldat felhasználásával, amely 0,004 μg/ml (= 0,0067 IU/ml) penicillint tartalmaz a tejminta helyett (5.2.3.).6.6. Ismételjük a 6.4. szerint megadott műveletet a tejminta helyett a kontroll, gátlóanyagtól mentes tej (5.3.) felhasználásával.6.7. Zárjuk le a csöveket/ampullákat, és tegyük a csöveket/ampullákat tartalmazó tartót 63 ± 1oC-os vízfürdőbe (4.1.2.) legalább 2½–2¾ órára.6.8. Vegyük ki a csöveket/ampullákat tartalmazó tartót a vízfürdőből.6.9. Figyeljük meg a teszttáptalaj színét (lásd 7.)7. Az eredmények értelmezése7.1. A teszttáptalaj lila színe bármely tejminta vagy az ellenőrző cső/ampulla esetében antibiotikumok vagy szulfonamidok jelenlétére utal a mintában a 39. oldalon található táblázatban a "mind pozitív" oszlopban megadott szinten, vagy annak közelében. A hitelesítő penicillinoldatot (6.5.) tartalmazó csövek/ampullák színének lilának kell maradnia annak bizonyítása érdekében, hogy a teszttáptalaj megfelelően érzékeny.7.2. A teszttáptalaj csak egy részének lila színe vagy a szabálytalan elszíneződés bármelyik tejmintát tartalmazó cső/ampulla esetében gátlóanyagokat jelent a mintában a 39. oldalon található táblázatban megadott értékek közötti mennyiségben.7.3. A teszttáptalaj sárga elszíneződése bármely tejminta vagy az ellenőrző cső/ampulla esetében a tesztorganizmus számára gátlóanyagok hiányát jelenti.7.4. Ha minden vizsgált cső/ampulla esetében lila szín tapasztalható, beleértve a negatív kontrollt is, akkora csövek/ampullák nem tartalmaznak életképes spórákat, és a mintákat újra meg kell vizsgálni frissen készített vizsgálati anyaggal.8. Az eredmények megerősítése8.1. Erősítsük meg az eredményt minden minta esetében a 7.1. és 7.2. szerinti reakciókkal a "B. módszer" szerint.Ha a megerősítés előtt a tejminták tárolására van szükség, akkor azokat mélyhűteni kell az antibiotikumok lebomlásának elkerülése érdekében.B. Eljárás a penicillinek megerősítésére és a koncentráció meghatározására1. Hatály és alkalmazási területEz az eljárás határozza meg a penicillinek vagy a penicillintől eltérő antibiotikumok megerősítő vizsgálatát, valamint a tejmintákban található penicillin koncentrációjának meghatározási eljárását pozitív (A.7.1.) és kétséges (A.7.2.) esetekben.A különböző antibiotikumok érzékenysége az eljárás szerintlásd A.1.2. Fogalommeghatározás2.1. A tejminta akkor tartalmaz antibiotikumokat, beleértve a szulfonamidokat, ha a megadott eljárás szerint a minta legalább 2 mm-es világos gátlási zónát ad a korong körül.2.2. Ha egy minta, amely tartalmaz antibiotikumokat, beleértve a szulfonamidokat (2.1.) és amelyhez penicillinázt (béta-laktamázt) adtunk, nem ad világos zónát, vagy a penicillináz nélküli esethez képest kisebb világos zónát ad, akkor a gátlóanyag vagy penicillin, vagy penicillin is és egy másik antibiotikum is, beleértve a szulfonamidokat.2.3. Ha a világos zóna képződését nem semlegesíti a penicillináz (2.2.), akkor a tejmintában lévő gátlóanyag nem penicillin, hanem más szermaradvány (lásd 85/397/EGK irányelv, A. melléklet, VI. fejezet, A.1.f) és 2.b)).Egyes félszintetikus penicillineket, pl. a nátrium-kloxacillint, nem vagy csak részben semlegesíti a penicillináz, vagy teljesen ellenállók, és ezért nem azonosíthatók penicillinként (lásd 7.3.).3. A módszer elveA vizsgálandó tejmintával átitatott itatóspapír-korongot rátesszük egy agar táptalaj felületére, amely be van oltva a Bacillus stearothermophilus, var. Calidolactis-szal. A szervezet normális növekedését eredményező inkubálás az agar megzavarosodását okozza. Olyan anyagok jelenlétét a tejben, amelyek gátolják a szervezetek növekedését, egy a korong körüli világos zóna jelzi. A világos zóna mérete – többek között – a gátlóanyag koncentrációjától és típusától függ.4. Felszerelés, üvegedények és berendezés4.1. Felszerelés4.1.1. lásd A.4.1.4.1.2. Vízfürdő, 80 ± 1 oC-os üzemelésre alkalmas4.2. Üvegedényeklásd A.4.2.4.3. Papírkorongok, gátlóanyag-mentes, 9–13 mm átmérőjű, alkalmas kb. 130 mg tej felvételére (lehetőség szerint exszikkátorban tartva).5. Táptalajok, hitelesítő oldatok, penicillináz-oldat, vegyszerek, tesztorganizmus stb.A táptalajok összetevőinek alkalmasaknak kell lenniük bakteriológiai célokra. Az alkalmazott víznek üveg-desztilláltnak vagy demineralizáltnak, illetve legalább azzal azonos tisztaságúnak kell lenni. Nem tartalmazhat a tesztorganizmus számára gátló hatású anyagokat.5.1. Táptalajok5.1.1. Törzsfenntartó agar (A.5.1.1.)5.1.2. Teszttáptalaj a gátlóanyagok kimutatásáraÖsszetételÉlesztőkivonat | 2,5 g |Tryptone | 5 g |Glükóz | 1 g |Trimethoprim- vagy Tetroxoprim-oldat (lásd A.5.1.3.) | 10 ml |Agar | 10–15 g (a gélerősségtől függően) |Víz | 1000 ml |ElkészítésOldjuk fel teljesen a szilárd összetevőket vízben forralással és keveréssel, mielőtt a trimethoprim- vagy tetroxoprim-oldatot hozzáadnánk. A trimethoprim- vagy tetroxoprim-oldat hozzáadása után állítsuk be a pH-t úgy, hogy a sterilizálás után 25 oC-on 8,0 ± 0,1 legyen. A táptalajt 121 ± 1 oC-on 15 percig sterilizáljuk.5.2. Hitelesítő penicillinoldatok tejbenlásd A.5.2.A gátlóanyagok mennyiségének meghatározása érdekében (8.) készítsünk hitelesítő penicillin-oldatokat gátlóanyagmentes tejben (A.5.3.) a következő koncentrációkban:a) 0,004 μg/ml (0,0067 IU/ml)b) 0,006 μg/ml (0,01 IU/ml)c) 0,03 μg/ml (0,05 IU/ml)d) 0,06 μg/ml (0,1 IU/ml)5.3 Penicillináz-oldat5.3.1. Oldjunk fel megfelelő mennyiségű penicillinázt (béta-laktamázt) steril desztillált vízben 1000 U/ml koncentráció elérésére. Ezt az oldatot, lehetőleg kis részletekre szétosztva, 0–5oC-on legfeljebb négy hétig lehet tárolni.MegjegyzésNincs egységes nemzetközi szabvány a penicillináz tekintetében. Ennek az eljárásnak az értelmezésében azt feltételezzük, hogy 10 egység penicillináz elegendő 0,6 μg (= 1 IU) penicillin inaktiválására. Ismeretlen erősségű penicillináz-készlet esetén ellenőrizni kell ennek a feltételezésnek az érvényességét. Ellenkező esetben a penicillináz koncentrációját ennek megfelelően meg kell változtatni.5.3.2. A penicillináz-oldat helyett a kereskedelmi forgalomban beszerezhető, penicillinázzal előkezelt korongokat is lehet használni, ha egy ellenőrző eljárás során bebizonyosodott, hogy megfelelő mennyiségű penicillinázt tartalmaznak.5.4. Tesztorganizmuslásd A.5.4.5.5. Teszttenyészet (spóraszuszpenzió)lásd A.5.5.5.6. A tesztlemezek előkészítése5.6.1. Olvasszuk fel a gátlóanyagok kimutatására szolgáló teszttáptalajt (5.1.2.), és hűtsük le 55 oC-ra.5.6.2. Adjunk egy üvegben egy rész friss spóraszuszpenziót (5.5.) a gátlóanyagok kimutatására szolgáló teszttáptalaj (5.1.2.) akkora részéhez, amely megfelelő telepsűrűséget ad a beoltott teszttáptalajban, majd keverjük alaposan össze.5.6.3. Vigyük át a beoltott táptalajt (5.6.2.) egy steril Petri-csészébe (A.4.2.2.), amelyet előzőleg 55 oC-ra felmelegítettünk úgy, hogy az 0,6–0,8 mm vastag réteget adjon. Egy 140 mm belső átmérőjű Petri-csésze esetében kb. 15 ml teszttáptalaj szükséges 0,8 mm vastag réteg eléréséhez.5.6.4. Tegyük át a Petri-csészéket egy hideg, vízszintes felületre, amelyet előzőleg vízszintezővel ellenőriztünk, távolítsuk el a fedeleket és hagyjuk az agar táptalajt megszilárdulni. Ha a táptalaj megszilárdult, a fedeleket visszahelyezzük a csészékre, amelyeket ezután felfordítunk, hogy a lecsapódást a lehető legkisebbre csökkentsük az agar táptalaj felületén.5.6.5. Az így készített tesztlemezeket lehetőleg ugyanazon a napon kell felhasználni, de el is tarthatók két hétig, feltéve hogy a készítés után azonnal zárt, polietilén tasakba tesszük, és 5 oC-on tároljuk.5.6.6. A minták azonosítása érdekében jelöljük meg a tesztlemezek alját.6. Eljárás6.1. A minta előkészítése6.1.1. Az "A. módszer" (A.7.1. és A.7.2.) esetében pozitív vagy kétséges eredményt adó mintákat ismételten meg kell vizsgálni, azonosítani kell, és a penicillin mennyiségét meg kell azokban határozni.6.1.2. Először ezeket a mintákat 10 percre felmelegítjük 80 ± 1 oC-ra a hőmérséklet emelkedésére bomlékony, nem specifikus gátlóanyagok hatásának elkerülése céljából.6.1.3. Alapos összekeverés után, nagyjából 10 ml felmelegített tejmintát átteszünk egy alkalmas steril, széles szájú üvegbe. Kb. 0,4 ml penicillináz-oldatot (5.3.) adunk a tejhez, és alaposan összekeverjük.6.2. Gátlóanyagok kimutatása6.2.1. Merítsünk egy papírkorongot (4.3.) a tejmintába (6.1.2.) tiszta, száraz csipesz használatával. Távolítsunk el minden felesleges tejet a korongnak a mintatartó üveg falához való érintésével. Tegyük a korongot lapjával a tesztlemez felületére (5.6.), és óvatosan nyomjuk le a csipesz segítségével.6.2.2. A különböző tejmintákkal készített korongokat legalább 20 mm távolságra tegyük egymástól, és legalább 10 mm-re a lemez szélétől.6.2.3. Az érzékenység ellenőrzése céljából hitelesítő penicillinoldatba (5.2.) merített korongokat (4.3.) véletlenszerűen kell elhelyezni a tejmintakorongok között, legalább a tejmintakorongok 2 %-át kitevő arányban, és minden egyes vizsgálat során legalább öt hitelesítő korong alkalmazásával.6.2.4. Ha minden korongot véletlenszerűen elhelyeztünk az agar táptalajon és azonosítottunk, fordítsuk fel a lemezeket, és 2 és ½ – 5 órán keresztül 63 ± 1oC-on inkubáljuk.6.2.5. Inkubálás után a lemezeket alkalmas fényforrás előtt megvizsgáljuk a gátlás által a papírkorongok körül okozott világos zónák megfigyelésére. A világos zónákat megmérjük.6.2.6. A hitelesítő penicillinoldatot tartalmazó korongok (6.2.3.) körüli zónának legalább 2 mm-nek kell lennie.6.2.7. A tejmintát tartalmazó korongok körülötti világos zóna, amely legalább azonos méretű, mint a 6.2.6. szerinti zóna, vagy annál nagyobb, a tesztorganizmust gátló anyagok jelenétére utal.6.3. A gátlóanyagok azonosítása és mennyiségi meghatározása6.3.1. A 6.2.1. eljárást még egyszer megismételjük a melegített tejmintán (6.1.2.) és a penicillinázzal kezelt tejmintán (6.1.3.). A tejminta 10 ml-éhez penicillináz adása helyett egy előkészített penicillináz korongot (5.3.2.) is lehet ebbe a mintába meríteni és a lemezre helyezni.6.3.2. A 6.2.1. eljárást ismétlésben végezzük el az 5.2.a)–d) szerinti hitelesítő penicillinoldatok mindegyikére.6.3.3. A tejminta és a penicillináz ellenőrző oldat, valamint a hitelesítő penicillinoldatok gátló hatása révén keletkezett világos zónák átlagos átmérőjét kell meghatározni.7. Az eredmények értelmezése (lásd 2.)7.1. Ha nincs világos zóna a penicillináz ellenőrző oldatot tartalmazó korong körül, de a tejmintát tartalmazó korong körül van világos zóna, amely egyenlő vagy nagyobb, mint a hitelesítő penicillinoldatot tartalmazó korong körül (5.2.a)), akkor a tejmintában lévő gátlóanyag megfelel legalább 0,004 μg/ml nátrium-(kálium)-benzil-penicillin koncentrációnak.7.2. Ha a penicillinázt tartalmazó korong körüli világos zóna átlagos átmérője egyenlő a tejmintát tartalmazó korong körüli tiszta terület átlagos átmérőjével, akkor a tej tartalmaz olyan gátlóanyagokat, amelyeket az ebben az eljárásban alkalmazott penicillináz-koncentrációk mellett nem lehet inaktiválni.7.3. Ha a penicillinázt tartalmazó korong körüli világos zóna átlagos átmérője kisebb a 6.1.2. szerint felmelegített tejmintát tartalmazó korong körüli világos zóna átlagos átmérőjénél, akkor a tej a penicillinnel együtt tartalmaz más antibiotikumokat is, beleértve a penicillin és a félszintetikus penicillin mellett a szulfonamidokat, amelyeket az ebben az eljárásban alkalmazott penicillináz-koncentrációval nem lehet azonosítani. A szintetikus penicillinek, mint a nátrium-kloxacillin, a vizsgálat körülményei között nem semlegesíthetők penicillinázzal, és ezért azokat a penicillintől eltérő gátlóanyagként lehet azonosítani.MegjegyzésA penicillintől eltérő gátlóanyagokat szükség esetén alkalmas eljárásokkal azonosítani lehet.8. A penicillintartalom meghatározása8.1. A penicillintartalom meghatározását vagy egy hitelesítő görbe felrajzolásával, vagy számítással lehet elvégezni, a tejes hitelesítő penicillinoldatok esetén kapott zónák méretéből (5.2.a)–d)).8.2. Hitelesítő görbe felrajzolásaMivel a penicillin-koncentráció 10-es alapú logaritmusa és a gátló zónák átmérője között egyenes arányosság áll fenn, a hitelesítő görbe féllogaritmikus papíron felrajzolható a logaritmikus ordinátán feltüntetve a penicillin-koncentrációt, az abszcisszán pedig a gátló zónát. A gátló zónákat két vizsgálat átlagából számítjuk ki. A gátló zónák átmérőjét felrajzoljuk a hitelesítő penicillin-koncentrációkkal szemben, és ezzel elkészült a hitelesítő görbe.8.3. SzámításA tejmintában lévő penicillin-koncentráció kiszámítható a zónájuk átmérőjéből az egyenlet vagy a hitelesítő görbe felhasználásával. Pontossági elemzéseknél a gátló zónák sugara legalább kétszer nagyobb legyen, és nem lehet ötször nagyobb, mint a korongok sugara.9. Az eredmények kifejezése9.1. Az eredményeket így fejezzük ki: a penicillintartalom egyenlő vagy nagyobb, mint 0,004 μg/ml (vagy a meghatározott koncentráció megjelölésével), vagy penicillintől eltérő gátlóanyag-tartalom.9.2. Ismételhetőség (r) és reprodukálhatóság (R)Számadatok nem állnak rendelkezésre és nem is értelmezhetők, mert az eljárás összehasonlító standardot tartalmaz.IX. KÓROKOZÓ MIKROORGANIZMUSOK KIMUTATÁSA1. Hatály és alkalmazási területA 85/397/EGK irányelv A. melléklete VII. fejezetének (2) bekezdésében megadott követelménnyel összhangban ez az eljárás megadja azokat az utasításokat, amelyeket követni kell a pasztőrözött tejben kórokozó mikroorganizmusok jelenlétének ellenőrzése során.2. FogalommeghatározásA vizsgálatot azokra a baktériumfajokra kell elvégezni, amelyek a leggyakrabban játszanak szerepet a táplálék által közvetített betegségekben.A pasztőrözés olyan eljárás, amely megóv a tejben jelenlévő, hőre nem ellenálló kórokozók ellen. Ha az irányelv A. melléklete VII. fejezetének (2) bekezdésében megadott követelmények teljesülnek a 30 oC-os és 21 oC-os telepszámlálás, a kólibaktériumok és a foszfatáz tekintetében, akkor a kórokozókra vonatkozó különleges vizsgálat csak akkor szükséges, ha fennáll a gyanú, hogy a tej kapcsolatban van egy ételmérgezés kialakulásával.3. EljárásAz eljárásokat és a vizsgálatok gyakoriságát a nemzeti hatóságoknak kell megállapítaniuk olyan módon, amely lehetővé teszi az egészségügyi bizonyítvány kiadását a Közösségen belüli kereskedelemre szánt hőkezelt tej esetében. A kórokozó mikroorganizmusok kimutatására a nemzetközileg elfogadott követelmények és eljárások érvényesek, amennyiben azok rendelkezésre állnak.4. Az eredmények közléseMinden egyes vizsgált kórokozó mikroorganizmusról a következő formában kell közölni az eredményeket:A tej egy milliliterében talált mikroorganizmus-szám, illetve a kórokozó mikroorganizmus "jelenléte" vagy "hiánya" a pasztőrözött tej alkalmazott eljárás által előírt térfogatában. A jelentésnek világosan le kell írnia az alkalmazott eljárást.--------------------------------------------------