CELEX: 32008R0440
Language: et
Date: 2008-05-30 00:00:00
Title: Komisjoni määrus (EÜ) nr 440/2008, 30. mai 2008 , millega kehtestatakse katsemeetodid vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrusele (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) (EMPs kohaldatav tekst)

31.5.2008   
            
            
               ET
            
            
               Euroopa Liidu Teataja
            
            
               L 142/1
            
         
      KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 440/2008,
   30. mai 2008,
   millega kehtestatakse katsemeetodid vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrusele (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH)
   (EMPs kohaldatav tekst)
   EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,
   võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut,
   võttes arvesse Euroopa Parlamendi ja nõukogu 18. detsembri 2006. aasta määrust (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) ning millega asutatakse Euroopa Kemikaaliamet, muudetakse direktiivi 1999/45/EÜ ja tunnistatakse kehtetuks nõukogu määrus (EMÜ) nr 793/93 ja komisjoni määrus (EÜ) nr 1488/94 ning samuti nõukogu direktiiv 76/769/EMÜ ja komisjoni direktiivid 91/155/EMÜ, 93/67/EMÜ, 93/105/EÜ ja 2000/21/EÜ, (1) eriti selle artikli 13 lõiget 3,
   ning arvestades järgmist:
   
               (1)
            
            
               Määruse (EÜ) nr 1907/2006 kohaselt tuleb katsemeetodid, mida kasutatakse teabe saamiseks aine omaduste kohta, võtta vastu ühenduse tasandil.
            
         
               (2)
            
            
               Nõukogu 27. juuni 1967. aasta direktiivi nr 67/548/EMÜ (ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta) (2) V lisas on esitatud meetodid ainete ja valmististe füüsikalis-keemiliste omaduste, toksilisuse ja ökotoksilisuse määramiseks. Direktiivi 67/584/EMÜ V lisa on Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiiviga 2006/121/EÜ jäetud välja alates 1. juunist 2008.
            
         
               (3)
            
            
               Direktiivi 67/548/EMÜ V lisas esitatud katsemeetodid tuleks võtta üle käesolevasse määrusesse.
            
         
               (4)
            
            
               Käesoleva määrusega ei välistata muude katsemeetodite kasutamist, kui see on kooskõlas määruse (EÜ) nr 1907/2006 artikli 13 lõikega 3.
            
         
               (5)
            
            
               Katsemeetodite kavandamisel tuleks võtta täielikult arvesse loomkatsete asendamise, vähendamise ja täiustamise põhimõtteid, eriti kui sobivad valideeritud meetodid loomkatsete asendamiseks, vähendamiseks ja täiustamiseks on muutunud kättesaadavaks.
            
         
               (6)
            
            
               Käesoleva määruse sätted on kooskõlas määruse (EÜ) nr 1907/2006 artikli 133 kohaselt asutatud komitee arvamusega,
            
         ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA MÄÄRUSE:
   Artikkel 1
   Määruse (EÜ) nr 1907/2006 rakendamisel kasutatavad katsemeetodid on esitatud käesoleva määruse lisas.
   Artikkel 2
   Komisjon vaatab käesolevas määruses esitatud katsemeetodeid vajaduse korral läbi, et asendada, vähendada ja täiustada selgroogsetega tehtavaid katseid.
   Artikkel 3
   Viiteid direktiivi 67/548/EMÜ V lisale tõlgendatakse viidetena käesolevale määrusele.
   Artikkel 4
   Käesolev määrus jõustub järgmisel päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.
   
      Käesolevat määrust kohaldatakse alates 1. juunist 2008.
      Brüssel, 30. mai 2008
      
         
            Komisjoni nimel
         
         
            komisjoni liige
         
         Stavros DIMAS
         
      
   
   
      (1)  ELT L 396, 30.12.2006, lk 1. Parandatud väljaandes ELT L 136, 29.5.2007, lk 3.
   
      (2)  EÜT  196, 16.8.1967, lk 1. Direktiivi on viimati muudetud Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiiviga 2006/121/EÜ (ELT L 396, 30.12.2006, lk 850), parandatud väljaandes ELT L 136, 29.5.2007, lk 281.
   
      LISA
      A OSA: FÜÜSIKALIS-KEEMILISTE OMADUSTE MÄÄRAMISE MEETODID
      SISUKORD
      
                  A.1.
               
               SULAMIS-/KÜLMUMISTEMPERATUUR
            
                  A.2.
               
               KEEMISTEMPERATUUR
            
                  A.3.
               
               SUHTELINE TIHEDUS
            
                  A.4.
               
               AURURÕHK
            
                  A.5.
               
               PINDPINEVUS
            
                  A.6.
               
               LAHUSTUVUS VEES
            
                  A.8.
               
               JAOTUSTEGUR
            
                  A.9.
               
               LEEKPUNKT
            
                  A.10.
               
               SÜTTIVUS (TAHKED AINED)
            
                  A.11.
               
               SÜTTIVUS (GAASID)
            
                  A.12.
               
               SÜTTIVUS (KOKKUPUUTEL VEEGA)
            
                  A.13.
               
               TAHKETE AINETE JA VEDELIKE ISESÜTTIVUS
            
                  A.14.
               
               PLAHVATUSOHTLIKKUS
            
                  A.15.
               
               ISESÜTTIMISTEMPERATUUR (VEDELIKUD JA GAASID)
            
                  A.16.
               
               TAHKETE AINETE SUHTELINE ISESÜTTIMISTEMPERATUUR
            
                  A.17.
               
               OKSÜDEERIVAD OMADUSED (TAHKED AINED)
            
                  A.18.
               
               POLÜMEERIDE ARVKESKMINE MOLEKULMASS JA MOLEKULMASSIDE JAOTUS
            
                  A.19.
               
               MADALAMOLEKULAARSETE AINETE SISALDUS POLÜMEERIS
            
                  A.20.
               
               POLÜMEERIDE LAHUSTUMIS-/EKSTRAHEERUMISKÄITUMINE VEES
            
                  A.21.
               
               OKSÜDEERIMISVÕIME (VEDELIKUD)
            A.1.   SULAMIS-/KÜLMUMISTEMPERATUUR
      1.   MEETOD
      Enamik kirjeldatud meetoditest põhineb OECD katsesuunisel (1). Meetodite tööpõhimõtted on ära toodud viidetes 2 ja 3.
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Kirjeldatud meetodid ja seadmed on ette nähtud ainete sulamistemperatuuri määramiseks olenemata nende puhtusastmest.
      Meetodi valik sõltub analüüsitava aine iseloomust. Määravaks teguriks on see, kas aine on kergesti või raskesti või üldse mitte peenestatav.
      Mõnede ainete puhul on kohasem määrata külmumis- või tahkumistemperatuur ning meetod sisaldab ka nende määramise standardeid.
      Kui aine teatavate omaduste tõttu ei ole otstarbekohane määrata ühtki eespool toodud parameetrit, võib otstarbekas olla määrata hangumistemperatuur.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Sulamistemperatuuri defineeritakse temperatuurina, mille juures aine läheb tahkest olekust vedelasse, ja ideaalis vastab see temperatuur külmumistemperatuurile.
      Kuna paljude ainete puhul toimub faasisiire mingis temperatuurivahemikus, nimetatakse seda sageli sulamisvahemikuks.
      Ühikute teisendamine (K oC-ks)
      t = T – 273,15
      
                  t:
               
               
                  :
               
               
                  temperatuur Celsiuse skaalal, Celsiuse kraadides ( oC)
               
            
                  T:
               
               
                  :
               
               
                  termodünaamiline temperatuur, kelvinites (K)
               
            1.3.   VÕRDLUSAINED
      Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.
      Mõned kaliibrimisained on loetletud viites 4.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Määratakse temperatuur (temperatuurivahemik), mille juures toimub faasisiire tahkest olekust vedelasse või vedelast olekust tahkesse. Praktikas määratakse testaine proovi atmosfäärirõhul kuumutamisel/jahutamisel sulamise/külmumise alg- ja lõppfaasi temperatuurid. Kirjeldatud viit tüüpi meetodeid, nimelt kapillaartorumeetodit, kuumlaua meetodeid, külmumistemperatuuri määramisi, termoanalüüsimeetodeid ja (naftaõlide jaoks välja töötatud) hangumistemperatuuri määramist.
      Teatud juhtudel võib olla otstarbekas määrata külmumistemperatuuri asemel sulamistemperatuur.
      1.4.1.   Kapillaartorumeetod
      1.4.1.1.   Vedelikuvanniga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks
      Väike kogus peenestatud ainet viiakse kapillaartorusse ja surutakse tihedalt kokku. Kapillaartoru kuumutatakse koos termomeetriga, reguleerides temperatuuri tõusu nii, et tegeliku sulamisprotsessi ajal tõuseb temperatuur kiirusega umbes alla 1 K/min. Määratakse sulamise alg- ja lõpptemperatuur.
      1.4.1.2.   Metallplokiga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks
      Põhimõttelt analoogsed punktis 1.4.1.1 kirjeldatuga, kuid kapillaartoru ja termomeeter asuvad kuumutatavas metallplokis ning on vaadeldavad plokis olevate vaatlusavade kaudu.
      1.4.1.3.   Määramine fotoraku abil
      Kapillaartorus asuvat proovi kuumutatakse automaatrežiimil metallsilindris. Silindris oleva ava kaudu juhitakse läbi aine täppiskaliibritud fotorakule suunatud valguskiir. Enamiku ainete optilised omadused muutuvad sulades läbipaistmatust läbipaistvaks. Fotorakuni jõudva valguse intensiivsus suureneb ja saadab kuumkambris asuva plaatina-takistustermomeetri temperatuuri digitaalnäidikule stoppsignaali. Mõnede tugeva värvusega ainete jaoks see meetod ei sobi.
      1.4.2.   Kuumlauad
      1.4.2.1   Kofleri sulavuslaud
      Kofleri sulavuslaud koosneb kahest erineva soojusjuhtivusega elektriliselt kuumutatavast metallosast, kusjuures laud on valmistatud selliselt, et temperatuurigradient on kogu selle pikkuses peaaegu lineaarne. Sulavuslaua temperatuur võib varieeruda piirides 283–573 K ning sellel on spetsiaalne temperatuurinäidik antud lauale kohandatud skaala, osuti ja jooksikuga. Sulamistemperatuuri määramiseks kantakse aine õhukese kihina otse sulavuslaua pinnale. Mõne sekundi jooksul kujuneb välja terav eraldusjoon vedela ja tahke faasi vahel. Temperatuuri eraldusjoonel loetakse osuti viimisega eraldusjoonele.
      1.4.2.2.   Sulavusmikroskoop
      Väga väikeste materjalikoguste sulamistemperatuuri määramisel kasutatakse mitmesuguste kuumlaudadega mikroskoope. Enamiku kuumlaudade puhul mõõdetakse temperatuuri tundliku termopaari abil, vahel kasutatakse aga elavhõbetermomeetrit. Tüüpilises sulavusmikroskoobi kuumlauas on kuumkamber, milles olevale metallalusele asetatakse objektiklaasil olev proov. Metallaluse keskel on ava, mille kaudu siseneb mikroskoobi valguspeeglist lähtuv valgus. Kasutamise ajal suletakse kamber klaasplaadiga, mis takistab õhu juurdepääsu proovile.
      Proovi kuumutamist reguleeritakse reostaadiga. Väga täpseteks mõõtmisteks optiliselt anisotroopsete ainetega võib kasutada polariseeritud valgust.
      1.4.2.3.   Meniskimeetod
      Seda meetodit kasutatakse eelkõige polüamiidide puhul.
      Temperatuur, mille juures kuumlaua ja polüamiid-katseobjektile toetuva katteklaasi vahele paigutatud silikoonõli menisk nihkub, määratakse visuaalselt.
      1.4.3.   Külmumistemperatuuri määramise meetod
      Proov asetatakse spetsiaalsesse katseklaasi ja paigutatakse külmumistemperatuuri määramiseks seadmesse. Jahutamise ajal segatakse proovi pidevalt kergelt ja mõõdetakse sobivate vaheaegade tagant temperatuuri. Niipea, kui temperatuur paari mõõtmise kestel püsima jääb, registreeritakse see temperatuur külmumistemperatuurina (arvestades ka termomeetri viga).
      Vältida tuleb allajahutamist, säilitades tahke ja vedela faasi vahel tasakaalu.
      1.4.4.   Termoanalüüs
      1.4.4.1   Diferentsiaaltermoanalüüs (DTA)
      Registreeritakse ühele ja samale juhitavale temperatuuriprogrammile allutatud uuritava aine ja võrdlusmaterjali temperatuuride erinevuse sõltuvus temperatuurist. Kui proovis toimub entalpia muutusega seotud üleminek, väljendub see endotermilise (sulamine) või eksotermilise (külmumine) kõrvalekaldena temperatuurikõvera nulljoonest.
      1.4.4.2   Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria (SDK)
      Registreeritakse neelduva energia koguse sõltuvus temperatuurist ühele ja samale juhitavale temperatuuriprogrammile allutatud uuritavas aines ja võrdlusmaterjalis. Neelduv energia kulutatakse uuritava aine ja võrdlusmaterjali temperatuuride ühtlustamisele. Kui proovis toimub entalpia muutusega seotud üleminek, väljendub see endotermilise (sulamine) või eksotermilise (külmumine) kõrvalekaldena soojusbilansi kõvera nulljoonest.
      1.4.5.   Hangumistemperatuur
      Meetod on välja töötatud naftaõlide jaoks ja sobib kasutamiseks madala sulamistemperatuuriga õlitaoliste ainete puhul.
      Pärast algset kuumutamist jahutatakse proovi kindla kiirusega ja jälgitakse iga 3 K tagant selle voolavust. Madalaim temperatuur, mille juures aine liikumist täheldatakse, registreeritakse hangumistemperatuurina.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Erinevate sulamistemperatuuri/sulamisvahemiku määramise meetodite kohaldatavust ja täpsust kirjeldatakse järgmises tabelis.
      TABEL: MEETODITE KOHALDATAVUS
      A.   Kapillaartorumeetodid
      
      
                  Mõõtmismeetod
               
               
                  Peenestatavad ained
               
               
                  Raskesti peenestatavad ained
               
               
                  Temperatuurivahemik
               
               
                  Hinnanguline täpsus (1)
                  
               
               
                  Olemasolev standard
               
            
                  Vedelikuvanniga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks
               
               
                  jah
               
               
                  Ainult mõnede puhul
               
               
                  273–573 K
               
               
                  ±0,3 K
               
               
                  JIS K 0064
               
            
                  Metallplokiga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks
               
               
                  jah
               
               
                  Ainult mõnede puhul
               
               
                  293 kuni > 573 K
               
               
                  ±0,5 K
               
               
                  ISO 1218 (E)
               
            
                  Määramine fotoraku abil
               
               
                  jah
               
               
                  Lisaseadmete abil paljude puhul
               
               
                  253–573 K
               
               
                  ±0,5 K
               
               
                   
               
            
         
      B.   Kuumlauad ja külmutamismeetodid
      
      
                  Mõõtmismeetod
               
               
                  Peenestatavad ained
               
               
                  Raskesti peenestatavad ained
               
               
                  Temperatuurivahemik
               
               
                  Hinnanguline täpsus (2)
                  
               
               
                  Olemasolev standard
               
            
                  Kofleri sulavuslaud
               
               
                  jah
               
               
                  ei
               
               
                  283 kuni > 573 K
               
               
                  ±1,0 K
               
               
                  ANSI/ASTM D 3451-76
               
            
                  Sulavusmikroskoop
               
               
                  jah
               
               
                  Ainult mõnede puhul
               
               
                  273 kuni > 573 K
               
               
                  ±0,5 K
               
               
                  DIN 53736
               
            
                  Meniskimeetod
               
               
                  ei
               
               
                  Eelkõige polüamiidide puhul
               
               
                  293 kuni > 573 K
               
               
                  ±0,5 K
               
               
                  ISO 1218 (E)
               
            
                  Külmumistemperatuuri meetodid
               
               
                  jah
               
               
                  jah
               
               
                  223–573 K
               
               
                  ±0,5 K
               
               
                  nt BS 4695
               
            
         
      C.   Termoanalüüs
      
      
                  Mõõtmismeetod
               
               
                  Peenestatavad ained
               
               
                  Raskesti peenestatavad ained
               
               
                  Temperatuurivahemik
               
               
                  Hinnanguline täpsus (3)
                  
               
               
                  Olemasolev standard
               
            
                  Diferentsiaaltermoanalüüs
               
               
                  jah
               
               
                  jah
               
               
                  173 – 1 273 K
               
               
                  kuni 600 K ±0,5 K kuni 1 273 K ±2,0 K
               
               
                  ASTM E 537-76
               
            
                  Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria
               
               
                  jah
               
               
                  jah
               
               
                  173 – 1 273 K
               
               
                  kuni 600 K ±0,5 K kuni 1 273 K ±2,0 K
               
               
                  ASTM E 537-76
               
            
         
      D.   Hangumistemperatuur
      
      
                  Mõõtmismeetod
               
               
                  Peenestatavad ained
               
               
                  Raskesti peenestatavad ained
               
               
                  Temperatuurivahemik
               
               
                  Hinnanguline täpsus (4)
                  
               
               
                  Olemasolev standard
               
            
                  Hangumistemperatuur
               
               
                  Naftaõlide ja õlitaoliste ainete jaoks
               
               
                  Naftaõlide ja õlitaoliste ainete jaoks
               
               
                  223–323 K
               
               
                  ±3,0 K
               
               
                  ASTM D 97-66
               
            1.6.   MEETODITE KIRJELDUS
      Peaaegu kõigi katsemeetodite kirjeldus on ära toodud rahvusvahelistes ja siseriiklikes standardites (vt liidet 1).
      1.6.1.   Kapillaartorumeetodid
      Temperatuuri aeglasel tõstmisel ilmnevad peenestatud ainete puhul tavaliselt joonisel 1 näidatud sulamisetapid.
      Joonis 1
      
         
      Sulamistemperatuuri määramisel registreeritakse temperatuur nii sulamise alg- kui ka lõppfaasis.
      1.6.1.1.   Vedelikuvanniga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks
      Joonisel 2 on näidatud standarditud klaasist sulamistemperatuuri määramise seadet (JIS K 0064); kõik mõõdud on millimeetrites.
      Joonis 2
      
         
      Vedelikuvannis kuumutamisel kasutatav vedelik
      Valida tuleks sobiv vedelik. Vedeliku valik sõltub määratavast sulamistemperatuurist, nt sobib parafiinõli sulamistemperatuuridele kuni 473 K, silikoonõli sulamistemperatuuridele kuni 573 K.
      523 K ületavate sulamistemperatuuride puhul võib kasutada segu kolmest osast väävelhappest ja kahest osast (massisuhtes) kaaliumsulfaadist. Seesuguste segude kasutamisel tuleb rakendada kohaseid ettevaatusabinõusid.
      Termomeeter
      Kasutada tuleks ainult järgmiste või nendega võrdväärsete standardite nõuetele vastavaid termomeetreid:
      ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.
      Katse käik
      Kuiv aine peenestatakse uhmris ja viiakse ühest otsast kinnisesse kapillaartorusse nii, et pärast kokkusurumist täidab aine kapillaartoru 3 mm ulatuses. Ühtlaselt tihendatud proovi saamiseks tuleks kapillaartorul lasta klaastorus umbes 700 mm kõrguselt vertikaalselt vastu kellaklaasi kukkuda.
      Täidetud kapillaartoru paigutatakse vanni nii, et termomeetri elavhõbedareservuaari keskosa puutub kapillaartoruga kokku kohas, kus asub proov. Tavaliselt asetatakse kapillaartoru seadmesse temperatuuril umbes 10 K alla sulamistemperatuuri.
      Vannivedelikku soojendatakse nii, et temperatuur tõuseb umbes 3 K/min. Soovitatav on vedelikku segada. Umbes 10 K enne eeldatava sulamistemperatuurini jõudmist vähendatakse temperatuuri tõusu kiiruseni mitte üle 1 K/min.
      Arvutamine
      Sulamistemperatuur arvutatakse järgmiselt:
      T = TD+0,00016(TD – TE) n
      kus:
      
                  T
               
               
                  =
               
               
                  parandatud sulamistemperatuur (K)
               
            
                  TD
                  
               
               
                  =
               
               
                  termomeetri D temperatuurinäit (K)
               
            
                  TE
                  
               
               
                  =
               
               
                  termomeetri E temperatuurinäit (K)
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  skaalajaotuste arv termomeetri D elavhõbedasamba väljaulatuval osal
               
            1.6.1.2.   Metallplokiga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks
      Seade
      
         Koosneb:
      
      
                  —
               
               
                  silindrilisest metallplokist, mille ülaosa on õõnes ja moodustab kambri (vt joonist 3);
               
            
                  —
               
               
                  metallkorgist ühe või kahe avaga, mis võimaldavad metallplokki torusid paigaldada;
               
            
                  —
               
               
                  metallploki kütteseadmest, mis võib olla lahendatud näiteks elektritakistusena plokis;
               
            
                  —
               
               
                  reostaadist võimsuse reguleerimiseks juhul, kui kasutatakse elektrilist kütteseadet;
               
            
                  —
               
               
                  neljast üksteise suhtes täisnurga all paiknevast kuumuskindla klaasiga aknast kambri külgseintel. Ühe sellise akna ette on paigaldatud okulaar kapillaartoru jälgimiseks. Kolme ülejäänud akent kasutatakse sisemuse valgustamiseks lampide abil;
               
            
                  —
               
               
                  ühest otsast kinnisest kuumuskindlast klaasist kapillaartorust (vt 1.6.1.1).
               
            Vt punktis 1.6.1.1 nimetatud standardeid. Sobivad ka võrreldava täpsusega termoelektrilised mõõteseadmed.
      Joonis 3
      
         
      1.6.1.3.   Määramine fotoraku abil
      
         Seade ja katse käik
      
      Seade koosneb automaatse küttesüsteemiga metallkambrist. Kolm kapillaartoru täidetakse vastavalt punktile 1.6.1.1 ja paigutatakse ahju.
      Seadme kaliibrimiseks on võimalik kasutada mitmesuguseid lineaarseid temperatuuritõuse; sobivat temperatuuritõusu reguleeritakse elektriliselt vastavalt seadistatud konstantsele lineaarsele tõusukiirusele. Meerikud näitavad ahju tegelikku temperatuuri ja kapillaartorus oleva aine temperatuuri.
      1.6.2.   Kuumlauad
      1.6.2.1.   Kofleri sulavuslaud
      Vt liidet.
      1.6.2.2.   Sulavusmikroskoop
      Vt liidet.
      1.6.2.3.   Meniskimeetod (polüamiididele)
      Vt liidet.
      Sulamistemperatuuri vahemikus ei tohiks temperatuur tõusta kiiremini kui 1 K/min.
      1.6.3.   Külmumistemperatuuri määramise meetodid
      Vt liidet.
      1.6.4.   Termoanalüüs
      1.6.4.1.   Diferentsiaaltermoanalüüs
      Vt liidet.
      1.6.4.2.   Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria
      Vt liidet.
      1.6.5.   Hangumistemperatuuri määramine
      Vt liidet.
      2.   ANDMED
      Mõningatel juhtudel on termomeetri näitusid vaja korrigeerida.
      3.   ARUANDLUS
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  kasutatud meetodit;
               
            
                  —
               
               
                  aine täpset kirjeldust (tunnusandmed ja lisandid) ja eelneva puhastusetapi kirjeldust (kui seda on rakendatud);
               
            
                  —
               
               
                  hinnangulist täpsust.
               
            Sulamistemperatuurina registreeritakse vähemalt kahe hinnangulise täpsuse piiridesse (vt tabeleid) jääva mõõtetulemuse keskmine.
      Kui sulamise alg- ja lõppfaasi temperatuuride vahe jääb meetodi hinnangulise täpsuse piiridesse, registreeritakse sulamistemperatuurina sulamise lõppfaasi temperatuur; vastasel juhul registreeritakse mõlemad väärtused.
      Kui aine enne sulamistemperatuurini jõudmist laguneb või sublimeerub, registreeritakse temperatuur, mille juures see aset leiab.
      Registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmed ja märkused.
      4.   VIITED
      
                  1.
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2.
               
               
                  IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803-834.
               
            
                  3.
               
               
                  R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.
               
            
                  4.
               
               
                  IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505-515.
               
            
         Liide
         Täiendavate tehniliste üksikasjadega tutvumiseks võib näidetena tutvuda järgmiste standarditega.
         1.   Kapillaartoru meetodid
         1.1.   Vedelikuvanniga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks
         
                     ASTM E 324-69
                  
                  
                     Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals
                  
               
                     BS 4634
                  
                  
                     Method for the determination of melting point and/or melting range
                  
               
                     DIN 53181
                  
                  
                     Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren
                  
               
                     JIS K 00-64
                  
                  
                     Testing methods for melting point of chemical products
                  
               1.2.   Metallplokiga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks
         
                     DIN 53736
                  
                  
                     Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen
                  
               
                     ISO 1218 (E)
                  
                  
                     Plastics – polyamides – determination of ’melting point’
                  
               2.   Kuumlauad
         2.1.   Kofleri sulavuslaud
         
                     ANSI/ASTM D 3451
                  
                  
                     76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings
                  
               2.2.   Sulavusmikroskoop
         
                     DIN 53736
                  
                  
                     Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen
                  
               2.3.   Meniskimeetod (polüamiididele)
         
                     ISO 1218 (E)
                  
                  
                     Plastics – polyamides – determination of „melting point”
                  
               
                     ANSI/ASTM D 2133-66
                  
                  
                     Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials
                  
               
                     NF T 51-050
                  
                  
                     Résines de polyamides. Determination du „point de fusion” Methode du ménisque
                  
               3.   Külmumistemperatuuri määramise meetodid
         
                     BS 4633
                  
                  
                     Method for the determination of crystallizing point
                  
               
                     BS 4695
                  
                  
                     Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve)
                  
               
                     DIN 51421
                  
                  
                     Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen
                  
               
                     ISO 2207
                  
                  
                     Cires de pétrole: détermination de la température de figeage
                  
               
                     DIN 53175
                  
                  
                     Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren
                  
               
                     NF T 60-114
                  
                  
                     Point de fusion des paraffines
                  
               
                     NF T 20-051
                  
                  
                     Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation)
                  
               
                     ISO 1392
                  
                  
                     Method for the determination of the freezing point
                  
               4.   Termoanalüüs
         4.1.   Diferentsiaaltermoanalüüs
         
                     ASTM E 537-76
                  
                  
                     Standard method for asseying the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis
                  
               
                     ASTM E 473-85
                  
                  
                     Standard definitions of terms relating to thermal analysis
                  
               
                     ASTM E 472-86
                  
                  
                     Standard practice for reporting thermoanalytical data
                  
               
                     DIN 51005
                  
                  
                     Thermisches Analyse, Begriffe
                  
               4.2.   Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria
         
                     ASTM E 537-76
                  
                  
                     Standard method for asseying the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis
                  
               
                     ASTM E 473-85
                  
                  
                     Standard definitions of terms relating to thermal analysis
                  
               
                     ASTM E 472-86
                  
                  
                     Standard practice for reporting thermoanalytical data
                  
               
                     DIN 51005
                  
                  
                     Thermisches Analyse, Begriffe
                  
               5.   Hangumistemperatuuri määramine
         
                     NBN 52014
                  
                  
                     Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite – Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt
                  
               
                     ASTM D 97-66
                  
                  
                     Standard test method for pour point of petroleum oils
                  
               
                     ISO 3016
                  
                  
                     Petroleum oils – Determination of pour point.
                  
               
      A.2.   KEEMISTEMPERATUUR
      1.   MEETOD
      Enamik kirjeldatud meetoditest põhineb OECD katsesuunisel (1). Meetodite tööpõhimõtted on ära toodud viidetes 2 ja 3.
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Siin kirjeldatud meetodeid ja seadmeid saab kasutada vedelate ja madala sulamistemperatuuriga ainete korral eeldusel, et nendega ei toimu allpool keemistemperatuuri mingeid keemilisi reaktsioone (näiteks autooksüdatsiooni, ümberasetust, lagunemist jne). Meetodid sobivad kohaldamiseks nii puhastele kui ka lisanditega vedelikele.
      Põhirõhk on pandud fotorakk-detektorit või termoanalüüsi kasutavatele meetoditele, kuna need sobivad nii sulamis- kui ka keemistemperatuuri määramiseks. Lisaks on mõõtmised automatiseeritavad.
      „Dünaamilise meetodi” eelis on sobivus ka aururõhu määramiseks ning puudub vajadus parandada keemistemperatuuri normaalrõhule (101,325 kPa), kuna rõhku on mõõtmise käigus võimalik manostaadi abil normaalrõhule reguleerida.
      
         Märkused
      
      Lisandite mõju keemistemperatuuri määramisele sõltub olulisel määral lisandi iseloomust. Kui proov sisaldab tulemust mõjutada võivaid lenduvaid lisandeid, võib seda puhastada.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Keemistemperatuur normaalrõhul defineeritakse temperatuurina, mille juures vedeliku aururõhk on 101,325 kPa.
      Kui keemistemperatuuri ei määrata normaalrõhul, kirjeldab aururõhu sõltuvust temperatuurist Clausiuse-Clapeyroni võrrand:
      
         
      kus:
      
                  P
               
               
                  =
               
               
                  aine aururõhk paskalites
               
            
                  ΔHV
                  
               
               
                  =
               
               
                  aine aurustumissoojus (J mol-1)
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  universaalne gaasikonstant = 8,314 (J mol-1 K-1)
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  termodünaamiline temperatuur (K)
               
            Keemistemperatuur registreeritakse mõõtmisaegse õhurõhu suhtes.
      
         Teisendused
      
      Rõhk (ühikud: kPa)
      
                  100 kPa
               
               
                  =
               
               
                  1bar = 0,1 MPa
                  (ühik „bar” on lubatud, kuid ei ole soovitatav)
               
            
                  133 Pa
               
               
                  =
               
               
                  1mm Hg=1 Torr
                  (ühikud „mm Hg” ja „Torr” ei ole lubatud)
               
            
                  1 atm
               
               
                  =
               
               
                  normaalatmosfäär = 101 325 Pa
                  (ühik „atm” ei ole lubatud)
               
            Temperatuur (ühikud: K)
      t = T - 273,15
      
                  t:
               
               
                  :
               
               
                  temperatuur Celsiuse skaalal, Celsiuse kraadides ( oC)
               
            
                  T:
               
               
                  :
               
               
                  termodünaamiline temperatuur, kelvinites (K)
               
            1.3.   VÕRDLUSAINED
      Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.
      Mõned kaliibrimisained on ära toodud liites loetletud meetodites.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Viis meetodit keemistemperatuuri (keemistemperatuuri vahemiku) määramiseks põhinevad keemistemperatuuri mõõtmisel, ülejäänud kaks termoanalüüsil.
      1.4.1.   Määramine ebulliomeetri abil
      Ebulliomeetrid töötati algselt välja molaarmassi määramiseks keemistemperatuuri tõusu järgi, kuid nad sobivad ka keemistemperatuuri täpseks mõõtmiseks. Väga lihtsat seadet kirjeldatakse ASTM D 1120-72 (vt liidet). Selles seadmes kuumutatakse vedelikku atmosfäärirõhul tasakaalutingimustes kuni keemiseni.
      1.4.2.   Dünaamiline meetod
      Selle meetodi kohaselt mõõdetakse keemise ajal tagasijooksus sobiva termomeetri abil auru kondensatsioonitemperatuur. Meetod võimaldab rõhku varieerida.
      1.4.3.   Destillatsioonimeetod keemistemperatuuri määramiseks
      Selle meetodi kohaselt mõõdetakse vedeliku destillatsioonil auru kondensatsioonitemperatuur ja destillaadi kogus.
      1.4.4.   Siwoloboffi meetod
      Proovi kuumutatakse katseklaasis vedelikuvannil. Katseklaasi paigutatakse alt kinni joodetud kapillaartoru, mille alumises osas on õhumull.
      1.4.5.   Määramine fotoraku abil
      Mõõtmine tehakse eralduvate mullide põhjal automaatselt ja fotoelektriliselt, järgides Siwoloboffi meetodit.
      1.4.6.   Diferentsiaaltermoanalüüs
      Registreeritakse ühele ja samale juhitavale temperatuuriprogrammile allutatud uuritava aine ja võrdlusmaterjali temperatuuride erinevuse sõltuvus temperatuurist. Kui proovis toimub entalpia muutusega seotud üleminek, väljendub see endotermilise (keemine) kõrvalekaldena temperatuurikõvera nulljoonest.
      1.4.7.   Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria
      Registreeritakse neelduva energia koguse sõltuvus temperatuurist ühele ja samale juhitavale temperatuuriprogrammile allutatud uuritavas aines ja võrdlusmaterjalis. Neelduv energia kulutatakse uuritava aine ja võrdlusmaterjali temperatuuride ühtlustamisele. Kui proovis toimub entalpia muutusega seotud üleminek, väljendub see endotermilise (keemine) kõrvalekaldena soojusbilansi kõvera nulljoonest.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Erinevate keemistemperatuuri/keemistemperatuuri vahemiku määramise meetodite kohaldatavust ja täpsust kirjeldatakse tabelis 1.
      Tabel 1.
      Meetodite võrdlus
      
                  Mõõtmismeetod
               
               
                  Hinnanguline täpsus
               
               
                  Olemasolev standard
               
            
                  Ebulliomeeter
               
               
                  ±1,4 K (kuni 373 K) (5), (6)
                  
                  ±2,5 K (kuni 600 K) (5), (6)
                  
               
               
                  ASTM D 1120-72 (5)
                  
               
            
                  Dünaamiline meetod
               
               
                  ±0,5 K (kuni 600 K) (6)
                  
               
               
                   
               
            
                  Destillatsioonimeetod (keemistemperatuuri vahemik)
               
               
                  ±0,5 K (kuni 600 K)
               
               
                  ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71
               
            
                  Siwoloboffi meetod
               
               
                  ± 2 K (kuni 600 K) (6)
                  
               
               
                   
               
            
                  Määramine fotoraku abil
               
               
                  ±0,3 K (373 K juures) (6)
                  
               
               
                   
               
            
                  Diferentsiaaltermoanalüüs
               
               
                  ±0,5 K (kuni 600 K)
                  ±2,0 K (kuni 1 273 K)
               
               
                  ASTM E 537-76
               
            
                  Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria
               
               
                  ±0,5 K (kuni 600 K)
                  ±2,0 K (kuni 1 273 K)
               
               
                  ASTM E 537-76
               
            1.6.   MEETODITE KIRJELDUS
      Osade katsemeetodite kirjeldus on ära toodud rahvusvahelistes ja siseriiklikes standardites (vt liidet).
      1.6.1.   Ebulliomeeter
      Vt liidet.
      1.6.2.   Dünaamiline meetod
      Vt katsemeetodit A.4 aururõhu määramiseks.
      Registreeritakse 101 325 kPA avaldatavale rõhule vastav keemistemperatuur.
      1.6.3.   Destillatsioonimeetod (keemistemperatuuri vahemik)
      Vt liidet.
      1.6.4.   Siwoloboffi meetod
      Ligikaudu 5 mm läbimõõduga katseklaasis olevat proovi kuumutatakse sulamistemperatuuri määramise seadmes (joonis 1).
      Joonisel 1 on näidatud standarditud klaasist sulamis- ja keemistemperatuuri määramise seade (JIS K 0064) (kõik mõõdud on millimeetrites).
      Joonis 1
      
         
      Katseklaasi paigutatakse alumisest otsast ligikaudu 1 cm kauguselt kinni joodetud kapillaartoru (keedukapillaar). Lisatava testaine kogus valitakse selline, et kapillaartoru kinnijoodetud osa jääb allapoole vedeliku pinda. Keedukapillaariga katseklaas seotakse kas kummipaelaga termomeetri külge või kinnitatakse külgtoega (vt joonist 2).
      
                  
                     Joonis 2
                  
                  
                     Siwoloboffi meetod
                  
               
               
                  
                     Joonis 3
                  
                  
                     Muudetud meetod
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  
                     
               
            Vedelikuvannis kuumutamisel kasutatav vedelik valitakse keemistemperatuuri järgi. Temperatuuridel kuni 573 K võib kasutada silikoonõli. Parafiinõli võib kasutada maksimaalselt temperatuurini 473 K. Vannivedelikku soojendatakse nii, et temperatuur tõuseb umbes 3 K/min. Vannivedelikku tuleb segada. Umbes 10 K enne eeldatava keemistemperatuurini jõudmist vähendatakse soojendamist nii, et temperatuur tõuseb kiirusega alla 1 K/min. Keemistemperatuuri lähenedes hakkab keedukapillaarist kiiresti mulle eralduma.
      Keemistemperatuur on selline temperatuur, mille juures mullide voog kiirel jahutamisel katkeb ning vedelikunivoo kapillaartorus hakkab järsult tõusma. Termomeetri vastav näit ongi aine keemistemperatuur.
      Muudetud meetodi (joonis 3) kohaselt määratakse keemistemperatuur sulamistemperatuuri määramisel kasutatavas kapillaartorus. Selle ots tõmmatakse umbes 2 cm pikkuses peeneks (a) ja kapillaartorusse imetakse väike kogus proovi. Kapillaartoru avatud ots joodetakse kinni, nii et tippu jääb väike õhumull. Kuumutamisel sulamistemperatuuri määramise seadmes (b) õhumull paisub. Keemistemperatuur vastab temperatuurile, mille juures ainekork tõuseb vannivedeliku pinna tasemeni (c).
      1.6.5.   Määramine fotoraku abil
      Kapillaartorus olevat proovi kuumutatakse soojendatavas metallplokis.
      Plokis olevate vastavate avade kaudu juhitakse läbi aine täppiskaliibritud fotorakule suunatud valguskiir.
      Proovi temperatuuri tõusmisel hakkab keedukapillaarist üksikuid mulle eralduma. Keemistemperatuurile lähenedes kasvab eralduvate mullide arv märgatavalt. Selle tulemusel fotorakus registreeritava valguse intensiivsus suureneb ja saadab plokis asuva plaatinatakistustermomeetri temperatuuri näidikule stoppsignaali.
      Meetod on väga mugav, kuna võimaldab ilma seadet muutmata mõõta keemistemperatuuri ka allpool toatemperatuuri kuni 253,15 K (–20 oC). Selleks tuleb seade lihtsalt jahutusvanni paigutada.
      1.6.6.   Termoanalüüs
      1.6.6.1.   Diferentsiaaltermoanalüüs
      Vt liidet.
      1.6.6.2.   Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria
      Vt liidet.
      2.   ANDMED
      Väikestel lahknevustel normaalrõhust (kuni ± 5 kPa) normaliseeritakse keemistemperatuuri väärtused keemistemperatuurile normaalrõhul (Tn) järgmise Sidney Youngi arvväärtus-võrrandi abil:
      Tn = T + (fT × Δp)
      kus:
      
                  Δp
               
               
                  =
               
               
                  (101,325 – p) (vt märki)
               
            
                  p
               
               
                  =
               
               
                  mõõdetud rõhk (kPa)
               
            
                  fT
                  
               
               
                  =
               
               
                  keemistemperatuuri muutuse sõltuvus rõhust (K/kPa)
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  mõõdetud keemistemperatuur (K)
               
            
                  Tn
                  
               
               
                  =
               
               
                  normaalrõhule parandatud keemistemperatuur (K)
               
            Paljude ainete temperatuuriparandustegurid (fT) ning valemid nende ligikaudseks arvutamiseks on ära toodud eespool nimetatud rahvusvahelistes ja siseriiklikes standardites.
      Näiteks toob DIN 53171 ära järgmised ligikaudsed parandustegurid värvides kasutatavatele lahustitele:
      Tabel 2.
      Temperatuuriparandustegurid fT
      
      
                  Temperatuur T (K)
               
               
                  Parandustegur fT (K/kPa)
               
            
                  323,15
               
               
                  0,26
               
            
                  348,15
               
               
                  0,28
               
            
                  373,15
               
               
                  0,31
               
            
                  398,15
               
               
                  0,33
               
            
                  423,15
               
               
                  0,35
               
            
                  448,15
               
               
                  0,37
               
            
                  473,15
               
               
                  0,39
               
            
                  498,15
               
               
                  0,41
               
            
                  523,15
               
               
                  0,4
               
            
                  548,15
               
               
                  0,45
               
            
                  573,15
               
               
                  0,47
               
            3.   ARUANDLUS
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  kasutatud meetodit;
               
            
                  —
               
               
                  aine täpset kirjeldust (tunnusandmed ja lisandid) ja eelneva puhastusetapi kirjeldust (kui seda on rakendatud);
               
            
                  —
               
               
                  hinnangulist täpsust.
               
            Keemistemperatuurina registreeritakse vähemalt kahe hinnangulise täpsuse piiridesse (vt tabel 1) jääva mõõtetulemuse keskmine.
      Ära tuuakse nii mõõdetud keemistemperatuurid kui ka nende keskmine; rõhud, mille juures mõõtmised tehti, registreeritakse kilopaskalites (kPa). Eelistatavalt peaks rõhk olema lähedane normaalrõhule.
      Registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmed ja märkused.
      4.   VIITED
      
                  1.
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 final.
               
            
                  2.
               
               
                  IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, volume II.
               
            
                  3.
               
               
                  R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.
               
            
         Liide
         Täiendavate tehniliste üksikasjadega tutvumiseks võib näidetena tutvuda järgmiste standarditega.
         1.   Ebulliomeeter
         
                     1.1.
                  
                  
                     Vedelikuvanniga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks
                  
               
                     ASTM D 1120-72
                  
                  
                     Standard test method for boiling point of engine anti-freezes
                  
               2.   Destillatsioonimeetod (keemistemperatuuri vahemik)
         
                     ISO/R 918
                  
                  
                     Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range)
                  
               
                     BS 4349/68
                  
                  
                     Method for determination of distillation of petroleum products
                  
               
                     BS 4591/71
                  
                  
                     Method for the determination of distillation characteristics
                  
               
                     DIN 53171
                  
                  
                     Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes
                  
               
                     NF T 20-608
                  
                  
                     Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation
                  
               3.   Diferentsiaaltermoanalüüs ja skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria
         
                     ASTM E 537-76
                  
                  
                     Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis
                  
               
                     ASTM E 473-85
                  
                  
                     Standard definitions of terms relating to thermal analysis
                  
               
                     ASTM E 472-86
                  
                  
                     Standard practice for reporting thermoanalytical data
                  
               
                     DIN 51005
                  
                  
                     Thermische Analyse, Begriffe
                  
               
      A.3.   SUHTELINE TIHEDUS
      1.   MEETOD
      Kirjeldatud meetodid põhinevad OECD katsesuunisel (1). Meetodite tööpõhimõte on ära toodud viites (2).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Kirjeldatud suhtelise tiheduse määramise meetodid sobivad kohaldamiseks nii tahketele kui vedelatele ainetele, olenemata nende puhtusastmest. Tabelis 1 on ära toodud mitmesugused meetodid.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Tahkete ainete ja vedelike suhteline tihedus D20
         4 on 20 oC juures määratud kindla mahuga aine massi ja 4 oC juures määratud sama mahuga veekoguse massi suhe. Suhtelisel tihedusel puudub ühik.
      Aine tihedus (p) on tema massi (m) ja mahu (v) suhe.
      Tihedus (p) esitatakse SI-ühikutes (kg/m3).
      1.3.   VÕRDLUSAINED (1, 3)
      Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Kasutatakse nelja tüüpi meetodeid.
      1.4.1.   Ujuvusmeetodid
      1.4.1.1.   Hüdromeeter (vedelike jaoks)
      
      Küllalt täpselt ja kiiresti saab tihedust määrata ujukhüdromeetrite abil, mille skaalajaotised võimaldavad vedeliku tiheduse määrata sukeldunud osa pikkuse põhjal.
      1.4.1.2.   Hüdrostaatilised kaalud (vedelike ja tahkete ainete jaoks)
      
      Proovi tihedust on võimalik määrata selle õhus ja sobivas vedelikus (nt vees) mõõdetud masside vahe põhjal.
      Tahkete ainete puhul iseloomustab leitud tihedus ainult konkreetset proovi. Vedelike tiheduse määramiseks kaalutakse teadaoleva ruumalaga (v) keha kõigepealt õhus ja siis vedelikus.
      1.4.1.3.   Sukeldatud keha meetod (vedelike jaoks) (4)
      
      Selle meetodi kohaselt määratakse vedeliku tihedus vedeliku kaalumisel enne ja pärast teadaoleva ruumalaga keha sukeldamist uuritavasse vedelikku saadud masside vahe põhjal.
      1.4.2.   Püknomeetrit rakendavad meetodid
      Meetodid sobivad nii tahketele ainetele kui ka vedelikele, võimalik on kasutada erineva kujuga ja kindla ruumalaga püknomeetreid. Tihedus arvutatakse täis ja tühja püknomeetri masside vahe ja püknomeetri teadaoleva ruumala põhjal.
      1.4.3.   Õhkvõrdluspüknomeeter (tahkete ainete jaoks)
      
      Gaasvõrdluspüknomeetri abil on toatemperatuuril võimalik määrata mis tahes kujul oleva tahke aine tihedust. Aine ruumala mõõdetakse õhu või inertgaasiga täidetud muutuva kaliibritud mahuga silindris. Tiheduse arvutamiseks määratakse pärast ruumala mõõtmist aine mass.
      1.4.4.   Resonantstihedusmõõtur (5, 6, 7)
      
      Vedeliku tihedust on võimalik määrata resonantstihedusmõõturi abil. U-toruna konstrueeritud mehaaniline ostsillaator pannakse vibreerima ostsillaatori massist sõltuval resonantssagedusel. Proovi viimine U-torru muudab ostsillaatori resonantssagedust. Seade tuleb kaliibrida kahe vedelikuga, mille tihedus on teada. Vedelike valimisel tuleks eelistada selliseid, mille tihedused hõlmavad mõõdetavat vahemikku.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Erinevate suhtelise tiheduse määramise meetodite kohaldatavust kirjeldatakse allpool olevas tabelis.
      1.6.   MEETODITE KIRJELDUS
      Liites on täiendavate tehniliste üksikasjadega tutvumiseks esitatud näidetena standardeid.
      Katsed tuleb läbi viia 20 oC juures ja teha tuleb vähemalt kaks mõõtmist.
      2.   ANDMED
      Vt standardeid.
      3.   ARUANDLUS
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  kasutatud meetodit;
               
            
                  —
               
               
                  aine täpset kirjeldust (tunnusandmed ja lisandid) ja eelneva puhastusetapi kirjeldust (kui seda on rakendatud).
               
            Suhteline tihedus  registreeritakse vastavalt punkti 1.2 definitsioonile koos analüüsitava aine füüsikalise olekuga.
      Registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmed ja märkused.
      Tabel.
      Meetodite rakendatavus
      
                  Mõõtmismeetod
               
               
                  Tihedus
               
               
                  Maksimaalne võimalik dünaamiline viskoossus
               
               
                  Olemasolevad standardid
               
            
                  tahke aine
               
               
                  vedelik
               
            
                  
                              1.4.1.1.
                           
                           
                              Hüdromeeter
                           
                        
               
                   
               
               
                  jah
               
               
                  5 Pa· s
               
               
                  ISO 387
                  ISO 649-2
                  NF T 20-050
               
            
                  
                              1.4.1.2.
                           
                           
                              Hüdrostaatilised kaalud
                           
                        
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              a)
                           
                           
                              tahked ained
                           
                        
               
                  jah
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  ISO 1183 (A)
               
            
                  
                              b)
                           
                           
                              vedelikud
                           
                        
               
                   
               
               
                  jah
               
               
                  5 Pa· s
               
               
                  ISO 901 ja 758
               
            
                  
                              1.4.1.3.
                           
                           
                              Sukeldatud keha meetod
                           
                        
               
                   
               
               
                  jah
               
               
                  20 Pa· s
               
               
                  DIN 53217
               
            
                  
                              1.4.2.
                           
                           
                              Püknomeeter
                           
                        
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  ISO 3507
               
            
                  
                              a)
                           
                           
                              tahked ained
                           
                        
               
                  jah
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  ISO1183(B)
                  NF T 20-053
               
            
                  
                              b)
                           
                           
                              vedelikud
                           
                        
               
                   
               
               
                  jah
               
               
                  500 Pa· s
               
               
                  ISO 758
               
            
                  
                              1.4.3.
                           
                           
                              Õhkvõrdluspüknomeeter
                           
                        
               
                  jah
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  DIN 55990 Teil 3,
                  DIN 53243
               
            
                  
                              1.4.4.
                           
                           
                              Resonantstihedusmõõtur
                           
                        
               
                   
               
               
                  jah
               
               
                  5 Pa· s
               
               
                   
               
            4.   VIITED
      
                  1.
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2.
               
               
                  R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1.
               
            
                  3.
               
               
                  IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508.
               
            
                  4.
               
               
                  Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11,427–430.
               
            
                  5.
               
               
                  Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297-302.
               
            
                  6.
               
               
                  Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen – Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717-726.
               
            
                  7.
               
               
                  Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253-255.
               
            
         Liide
         Täiendavate tehniliste üksikasjadega tutvumiseks võib näidetena tutvuda järgmiste standarditega.
         1.   Ujuvusmeetodid
         1.1.   Hüdromeeter
         
                     DIN 12790, ISO 387
                  
                  
                     Hydrometer; general instructions
                  
               
                     DIN 12791
                  
                  
                     Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use
                     Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation
                     Part III: Use and test
                  
               
                     ISO 649-2
                  
                  
                     Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose
                  
               
                     NF T 20-050
                  
                  
                     Chemical products for industrial use – Determination of density of liquids – Areometric method
                  
               
                     DIN 12793
                  
                  
                     Laboratory glassware: range find hydrometers
                  
               1.2.   Hüdrostaatilised kaalud
         Tahkete ainete jaoks
         
                     ISO 1183
                  
                  
                     Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics
                  
               
                     NF T 20-049
                  
                  
                     Chemical products for industrial use – Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method
                  
               
                     ASTM-D-792
                  
                  
                     Specific gravity and density of plastics by displacement
                  
               
                     DIN 53479
                  
                  
                     Testing of plastics and elastomers; determination of density
                  
               Vedelike jaoks
         
                     ISO 901
                  
                  
                     ISO 758
                  
               
                     DIN 51757
                  
                  
                     Testing of mineral oils and related materials; determination of density
                  
               
                     ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 ja ASTM D 1481-62
                  
               
                     ASTM D 1298
                  
                  
                     Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method
                  
               
                     BS 4714
                  
                  
                     Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method
                  
               1.3.   Sukeldatud keha meetod
         
                     DIN 53217
                  
                  
                     Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method
                  
               2.   Püknomeetrit rakendavad meetodid
         2.1.   Vedelike jaoks
         
                     ISO 3507
                  
                  
                     Pycnometers
                  
               
                     ISO 758
                  
                  
                     Liquid chemical products; determination of density at 20 oC
                  
               
                     DIN 12797
                  
                  
                     Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous)
                  
               
                     DIN 12798
                  
                  
                     Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than l00.10-6 m2 s-1 at 15 oC)
                  
               
                     DIN 12800
                  
                  
                     Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798)
                  
               
                     DIN 12801
                  
                  
                     Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than l00 . 10-6 m2 s-1 at 20 oC, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 oC)
                  
               
                     DIN 12806
                  
                  
                     Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen)
                  
               
                     DIN 12807
                  
                  
                     Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801)
                  
               
                     DIN 12808
                  
                  
                     Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol – water mixture)
                  
               
                     DIN 12809
                  
                  
                     Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous)
                  
               
                     DIN 53217
                  
                  
                     Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer
                  
               
                     DIN 51757
                  
                  
                     Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density
                  
               
                     ASTM D 297
                  
                  
                     Section 15: Rubber products – chemical analysis
                  
               
                     ASTM D 2111
                  
                  
                     Method C: Halogenated organic compounds
                  
               
                     BS 4699
                  
                  
                     Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method)
                  
               
                     BS 5903
                  
                  
                     Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary- stoppered pycnometer method
                  
               
                     NF T 20-053
                  
                  
                     Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method
                  
               2.2.   Tahkete ainete jaoks
         
                     ISO 1183
                  
                  
                     Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics
                  
               
                     NF T 20-053
                  
                  
                     Chemical products for industrial use -Determination of density of solids in powder and liquids -Pyknometric method
                  
               
                     DIN 19683
                  
                  
                     Determination of the density of soils
                  
               3.   Õhkvõrdluspüknomeeter
         
                     DIN 55990
                  
                  
                     Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichrungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte
                  
               
                     DIN 53243
                  
                  
                     Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prüfung
                  
               
      A.4.   AURURÕHK
      1.   MEETOD
      Enamik kirjeldatud meetoditest põhineb OECD katsesuunisel (1). Meetodite tööpõhimõtted on ära toodud viidetes 2 ja 3.
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Katse läbiviimiseks on kasulik teada aine struktuuri, sulamistemperatuuri ja keemistemperatuuri.
      Ühtki mõõtmismeetodit ei saa kohaldada kõigile võimalikele aururõhkudele. Seetõttu soovitatakse aururõhkude mõõtmiseks vahemikus < 10-4-105 Pa mitmeid meetodeid.
      Lisandid avaldavad üldjuhul aururõhule mõju, mis sõltub oluliselt lisandi iseloomust.
      Kui proov sisaldab tulemust mõjutada võivaid lenduvaid lisandeid, võib seda puhastada. Kohane võib olla ka tehniliselt puhta materjali aururõhu registreerimine.
      Mõnedes siin kirjeldatud meetoditest kasutatakse metallosi sisaldavaid seadmeid, söövitavaid aineid analüüsides tuleks seda arvestada.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Aine aururõhk on defineeritud küllastusrõhuna tahke aine või vedeliku kohal. Termodünaamilise tasakaalu tingimustes sõltub puhta aine aururõhk ainult temperatuurist.
      Rõhu mõõtühikuna tuleks kasutada SI ühikut paskal (Pa).
      Allpool on toodud varem kasutatud rõhuühikud koos vastavate teisendusteguritega:
      
                  1 Torr (= 1 mm Hg)
               
               
                  = 1,333 × 102 Pa
               
            
                  1 atmosfäär
               
               
                  = 1,013 × 105 Pa
               
            
                  1 bar
               
               
                  =105 Pa
               
            Temperatuuri mõõtühikuks SI süsteemis on kelvin (K).
      Universaalne gaasikonstant R on 8,314 J mol-1 K-1.
      Temperatuuri sõltuvust aururõhust kirjeldatakse Clausiuse-Clapeyroni võrrandiga:
      
         
      kus:
      
                  p
               
               
                  =
               
               
                  aine aururõhk paskalites
               
            
                  ΔHV
                  
               
               
                  =
               
               
                  aine aurustumissoojus (J mol-1)
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  universaalne gaasikonstant (J mol-1 K-1)
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  termodünaamiline temperatuur (K)
               
            1.3.   VÕRDLUSAINED
      Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.
      1.4.   KATSEMEETODITE PÕHIMÕTE
      Aururõhu määramiseks on välja pakutud seitse meetodit, mis sobivad erinevate aururõhu vahemike jaoks. Iga meetodi puhul määratakse aururõhk erinevatel temperatuuridel. Piiratud temperatuurivahemikus on puhta aine aururõhu logaritm lineaarses sõltuvuses temperatuuri pöördväärtusest.
      1.4.1.   Dünaamiline meetod
      Dünaamilise meetodi puhul mõõdetakse konkreetsele rõhule vastav keemistemperatuur.
      Soovitatav rõhuvahemik:
      103-105 Pa.
      Seda meetodit on soovitatud ka keemistemperatuuri määramiseks normaalrõhul, sel juhul ulatub tema tööpiirkond temperatuurini 600 K.
      1.4.2.   Staatiline meetod
      Staatilise meetodi puhul määratakse suletud süsteemis kindlal temperatuuril termodünaamilise tasakaalu tingimustes välja kujunenud aururõhk. Meetod sobib nii ühe- kui ka mitmekomponendiliste tahkete ainete ja vedelike jaoks.
      Soovitatav rõhuvahemik:
      10–105 Pa.
      Hoolikal käsitlemisel on meetodit võimalik rakendada ka vahemikus 1–10 Pa.
      1.4.3.   Isoteniskoop
      See standarditud meetod on küll staatiline, kuid ei ole üldjuhul kohaldatav mitmekomponendilistele süsteemidele. Lisateavet võib leida ASTM meetodist D-2879-86.
      Soovitatav rõhuvahemik:
      100–105 Pa.
      1.4.4.   Efusioonmeetod: aururõhukaalud
      Vaakumi tingimustes, kus tagasipöörduva aine voo võib arvestamata jätta, mõõdetakse rakust teadaoleva suurusega ava kaudu ajaühikus väljuva aine hulk (nt aurujoa poolt tundlikele kaaludele antud impulsi või massikao mõõtmise kaudu).
      Soovitatav rõhuvahemik:
      10-3–1 Pa.
      1.4.5.   Efusioonmeetod: massikao või aurustunud aine kogumise põhjal
      Meetodi aluseks on ultravaakumi tingimustes Knudseni rakust (4) ajaühikus läbi mikrodüüsi auruna väljuva testaine massi määramine. Välja voolanud auru massi võib leida kas raku massikao määramise kaudu või auru madalal temperatuuril kondenseerimisel ja lendunud aine koguse kromatograafilisel määramisel.
      Aururõhk arvutatakse Hertzi-Knudseni võrrandi abil. Soovitatav rõhuvahemik:
      10-3–1 Pa.
      1.4.6.   Gaasi küllastamise meetod
      Üle aine suunatakse inertse kandegaasi voog, nii et gaas aine aurudega küllastub. Teadaoleva koguse kandegaasiga kaasa kandunud aine koguse saab määrata sobivasse püüdurisse kogumise või pideva analüüsitehnika abil. Selle põhjal arvutatakse seejärel aururõhk antud temperatuuril.
      Soovitatav rõhuvahemik:
      10-4–1 Pa.
      Hoolikal käsitlemisel on meetodit võimalik rakendada ka vahemikus 1–10 Pa.
      1.4.7.   Pöörlev rootor
      Pöördrootormõõturi mõõtelemendiks on väike teraskuul, mis hõljub magnetväljas ja pöörleb suurel kiirusel. Gaasirõhk leitakse teraskuuli gaasirõhust tingitud aeglustumise põhjal.
      Soovitatav rõhuvahemik:
      10-4–0,5 Pa.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Järgmises tabelis võrreldakse omavahel erinevate aururõhu määramise meetodite kohaldatavust, korratavust, reprodutseeritavust, mõõtepiirkonda ja olemasolevat standardit.
      
                  Määramismeetod
               
               
                  Ained
               
               
                  Hinnanguline korratavus (7)
                  
               
               
                  Hinnanguline reprodutseeritavus (7)
                  
               
               
                  Soovitatav rõhuvahemik
               
               
                  Olemasolev standard
               
            
                  tahke aine
               
               
                  vedelik
               
            
                  
                              1.4.1.
                           
                           
                              Dünaamiline meetod
                           
                        
               
                  madala Sulamistemperatuuriga
               
               
                  jah
               
               
                  kuni 25 %
               
               
                  kuni 25 %
               
               
                  103 Pa – 2 × 103 Pa
               
               
                  _
               
            
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  1–5 %
               
               
                  1–5 %
               
               
                  2 × 103 Pa- 105 Pa
               
               
                  —
               
            
                  
                              1.4.2.
                           
                           
                              Staatiline meetod
                           
                        
               
                  jah
               
               
                  jah
               
               
                  5–10 %
               
               
                  5–10 %
               
               
                  10 Pa – 105 Pa (8)
                  
               
               
                  NFT 20-048 (5)
               
            
                  
                              1.4.3.
                           
                           
                              Isoteniskoop
                           
                        
               
                  jah
               
               
                  jah
               
               
                  5–10 %
               
               
                  5–10 %
               
               
                  102 Pa – 105 Pa
               
               
                  ASTM-D
                  2879-86
               
            
                  
                              1.4.4.
                           
                           
                              Efusioonmeetod – aururõhukaalud
                           
                        
               
                  jah
               
               
                  jah
               
               
                  5–20 %
               
               
                  kuni 50 %
               
               
                  10-3 Pa – 1 Pa
               
               
                  NFT
                  20-047 (6)
               
            
                  
                              1.4.5.
                           
                           
                              Efusioonmeetod – massikadu
                           
                        
               
                  jah
               
               
                  jah
               
               
                  10–30 %
               
               
                  —
               
               
                  10-3 Pa – 1 Pa
               
               
                  —
               
            
                  
                              1.4.6.
                           
                           
                              Gaasi küllastamise meetod
                           
                        
               
                  jah
               
               
                  jah
               
               
                  10–30 %
               
               
                  kuni 50 %
               
               
                  10-4 Pa – 1 Pa (8)
                  
               
               
                  —
               
            
                  
                              1.4.7.
                           
                           
                              Pöörleva rootori meetod
                           
                        
               
                  jah
               
               
                  jah
               
               
                  10–20 %
               
               
                   
               
               
                  10-4 Pa – 0,5 Pa
               
               
                  —
               
            1.6.   MEETODITE KIRJELDUS
      1.6.1.   Dünaamiline meetod
      1.6.1.1.   Seade
      Mõõteseade koosneb tavaliselt klaasist või metallist püstjahutiga varustatud keetmiseks mõeldud anumast (joonis 1), temperatuuri mõõtmise ning rõhu reguleerimise ja mõõtmise seadmetest. Joonisel näidatud tüüpiline mõõteseade on valmistatud kuumuskindlast klaasist ja koosneb viiest osast.
      Suur, osaliselt topeltseintega toru, millel on tasalihviga äärikühendus, jahuti, jahutusnõu ja sisseviik.
      Cottrelli pumbaga klaassilinder paikneb toru keetmisosas ning tõukelise keemise vältimiseks on silindril kare paagutatud klaasist sisepind. Temperatuur määratakse sobiva temperatuurianduriga (nt takistustermomeeter, kattega termopaar), mis on mõõteseadmesse viidud vastava sisseviigu (nt lihvkerni) kaudu ja ulatub mõõtepunktini (nr 5 joonisel 1).
      Rõhu reguleerimis- ja mõõteseadmed ühendatakse nii, nagu vaja.
      Puhvermahutina toimiv kolb ühendatakse seadmega kapillaartoru abil.
      Keetmisanumat kuumutatakse klaasseadmesse altpoolt sisestatud kütteelemendiga (nt padrunkuumutiga).
      Kuumutamiseks vajalikku voolutugevust seadistatakse ja reguleeritakse termopaari abil.
      Vajalik vaakum vahemikus 102 Pa kuni ligikaudu 102 Pa tekitatakse vaakumpumba abil.
      Õhu või lämmastiku sissepääsu rõhu reguleerimiseks (mõõtepiirkond ligikaudu 102–105 Pa) või ventileerimiseks reguleeritakse sobiva klapi abil.
      Rõhku mõõdetakse manomeetri abil.
      1.6.1.2   . Mõõtmisprotseduur
      Aururõhk määratakse proovi keemistemperatuuri määramisega kindlatel rõhkudel vahemikus ligikaudu 103–105 Pa. Keemistemperatuurini jõudmist näitab püsiv temperatuur konstantsel rõhul. Meetodit ei saa kasutada vahutavate ainete uurimiseks.
      Aine pannakse puhtasse, kuiva proovinõusse. Probleeme võib tekkida peenestamata tahkete ainetega, kuid vahel on need jahutussärgi soojendamisega lahendatavad. Pärast täitmist suletakse mõõteseadme äärikühendus ja aine degaseeritakse. Seejärel seadistatakse kõige madalam soovitud temperatuur ja lülitatakse küte tööle. Samal ajal ühendatakse temperatuuriandur meerikuga.
      Tasakaaluolekuni jõudmist näitab konstantsel rõhul registreeritav konstantne keemistemperatuur. Vältida tuleb tõukelist keemist. Lisaks peab jahutis toimuma täielik kondensatsioon. Madala sulamistemperatuuriga tahkete ainete sulamistemperatuuri määramisel tuleb jälgida, et jahuti ei ummistuks.
      Pärast tasakaalupunkti registreerimist seadistatakse kõrgem rõhk. Protsessi jätkatakse, kuni jõutakse rõhuni 105 Pa (kokku ligikaudu 5–10 mõõtepunkti). Kontrollimiseks tuleb tasakaalupunkte alanevatel rõhkudel uuesti mõõta.
      1.6.2.   Staatiline meetod
      1.6.2.1.   Seade
      Seade koosneb proovinõust, kütte- ja jahutussüsteemist proovi temperatuuri reguleerimiseks ja temperatuuri mõõtmise vahenditest. Seade sisaldab ka vahendeid rõhu seadistamiseks ja reguleerimiseks. Meetodi tööpõhimõtteid illustreerivad joonised 2a ja 2b.
      Proovikambri (joonis 2a) üks avaus on suletud sobiva kõrgvaakumklapiga. Teine avaus on ühendatud sobivat rõhumõõtmisvedelikku sisaldava U-toruga. U-toru üks haru on ühendatud vaakumpumba, lämmastikusilindri või ventilatsiooniklapi ja manomeetriga.
      U-toru asemel võib kasutada näidikuga rõhumõõturit (joonis 2b).
      Proovi temperatuuri reguleerimiseks paigutatakse proovinõu koos klapi ja U-toru või rõhumõõturiga konstantsel temperatuuril (täpsusega ±0,2 K) hoitavasse vanni. Temperatuuri mõõdetakse kas proovinõu välisseinal või proovinõu sees.
      Vaakumi tekitamiseks kasutatakse seadmes ülesvoolu asuva külmpüüduriga vaakumpumpa.
      Meetodi 2a puhul mõõdetakse aine aururõhk kaudselt, kasutades nullindikaatorit. Siin võetakse arvesse asjaolu, et temperatuuri märgataval muutumisel muutub ka U-torus oleva vedeliku tihedus.
      Sõltuvalt rõhuvahemikust ja testaine keemilisest iseloomust sobivad U-torus nullindikaatorina kasutamiseks sellised vedelikud nagu silikoonõlid ja ftalaadid. Testaine ei tohi U-toru vedelikus ei arvestataval määral lahustuda ega sellega reageerida.
      Rõhuvahemikus normaalõhurõhust rõhuni 102 Pa sobib manomeetris kasutamiseks elavhõbe, rõhkudel alla 102 Pa kuni rõhuni 10 Pa aga silikoonõlid ja ftalaadid. Kuumutatavad mahtuvuslikud membraanrõhumõõturid on kasutatavad ka rõhul alla 10-1 Pa. On ka muid rõhumõõtureid, mida saab kasutada rõhkudel alla 10-2 Pa.
      1.6.2.2.   Mõõtmisprotseduur
      Enne mõõtmist tuleb kõik joonisel 2 näidatud seadme osad hoolikalt puhastada ja kuivatada.
      Meetodi 2a kasutamisel täidetakse U-toru valitud vedelikuga, mis tuleb enne mõõtmisi kõrgemal temperatuuril degaseerida.
      Testaine viiakse seadmesse, mis seejärel suletakse ja temperatuuri alandatakse degaseerimiseks vajaliku tasemeni. Temperatuur peab olema piisavalt madal kindlustamaks, et õhk välja imetaks, kuid mitmekomponendiliste süsteemide koostis ei muutuks. Vajaduse korral võib tasakaalu saavutamist segamisega kiirendada.
      Proovi võib alla jahutada, nt vedela lämmastikuga (vältides hoolikalt õhu ja pumbavedeliku kondenseerumist) või etanooli ja kuiva jää seguga. Mõõtmistel madalatel temperatuuridel kasutatakse krüostaadiga ühendatud vedelikuvanni.
      Õhu kõrvaldamiseks avatakse proovi kohal asuv klapp ja hoitakse proovi õhu eemaldamiseks mitu minutit alandatud rõhul. Seejärel klapp suletakse ja proovi temperatuuri langetatakse madalaima soovitud tasemeni. Vajaduse korral tuleb degaseerimist korrata.
      Proovi soojendamisel selle aururõhk tõuseb. See mõjutab U-torus oleva vedeliku tasakaaluasendit. Selle kompenseerimiseks lastakse klapi kaudu seadmesse lämmastikku või õhku, kuni rõhunäituri vedelik on jälle nullasendis. Selleks vajaliku rõhu näitu saab lugeda toatemperatuuril olevalt täppismanomeetrilt. Leitud rõhk vastab aine aururõhule antud mõõtmistemperatuuril.
      Meetod 2b on eelmisega analoogne, kuid aururõhku loetakse otse.
      Aururõhu temperatuurisõltuvus määratakse sobivalt väikeste vahemike tagant (kokku ligikaudu 5–10 mõõtepunkti) kuni kõrgeima soovitud temperatuurini. Madalaid temperatuurinäite tuleb kontrollimiseks korrata.
      Kui kordamisel saadud väärtused ei lange kokku tõusva temperatuuri kõveraga, võib see olla tingitud ühest järgnevatest asjaoludest.
      
                  1.
               
               
                  Proov sisaldab veel õhku (nt kõrge viskoossusega materjalid) või madala keemistemperatuuriga aineid, mis kuumutamisel eralduvad ja mida on võimalik edasise allajahutamise käigus vaakumiga eemaldada.
               
            
                  2.
               
               
                  Jahutustemperatuur ei ole piisavalt madal. Sellisel juhul tuleb jahutajana kasutada vedelat lämmastikku.
                  Nii juhtumi 1 kui ka 2 puhul tuleb mõõtmisi korrata.
               
            
                  3.
               
               
                  Ainega toimub uuritavas temperatuurivahemikus keemiline reaktsioon (nt lagunemine või polümerisatsioon).
               
            1.6.3.   Isoteniskoop
      Meetodi täielik kirjeldus on toodud viites 7. Mõõteseadme tööpõhimõte on näidatud joonisel 3. Analoogselt punktis 1.6.2 kirjeldatud staatilise meetodiga sobib isoteniskoop nii tahkete ainete kui ka vedelike uurimiseks.
      Vedelike puhul täidab aine ise abimanomeetri rolli. Isoteniskoopi viiakse vedelikukogus, mis on küllaldane nii reservuaari kui ka manomeetri lühikese haru täitmiseks. Isoteniskoop ühendatakse vaakumsüsteemiga ja vakumeeritakse ning täidetakse seejärel lämmastikuga. Süsteemi vakumeerimist ja puhastamist korratakse jääkhapniku eemaldamiseks kahel korral. Täidetud isoteniskoop paigutatakse horisontaalasendisse, nii et proov valgub õhukese kihina üle proovireservuaari ja manomeetri (U-osa). Süsteemi rõhku alandatakse 133 paskalini ja soojendatakse proovi kergelt selle keemahakkamiseni (lahustunud gaaside kõrvaldamiseks). Isoteniskoop paigutatakse seejärel sellisesse asendisse, et proov voolab tagasi reservuaari ja manomeetri lühikesse harru, nii et mõlemad on täielikult vedelikuga täidetud. Hoitakse degaseerimisele vastavat rõhku ja proovireservuaari väljavenitatud tippu kuumutatakse väikesel leegil, kuni proovi aurud küllaldaselt paisuvad ning suruvad osa proovist reservuaari ülaosast ja manomeetri harust isoteniskoobi manomeetri-ossa, nii et tekib auruga täidetud lämmastikuvaba ruum.
      Isoteniskoop paigutatakse seejärel konstantse temperatuuriga vanni ja lämmastiku rõhk võrdsustatakse proovi rõhuga. Rõhkude tasakaalustumist saab jälgida isoteniskoobi manomeetri-osa põhjal. Tasakaaluolekus on lämmastiku rõhk võrdne aine aururõhuga.
      Tahkete ainete puhul kasutatakse olenevalt rõhust ja temperatuurivahemikust punktis 1.6.2.1 loetletud rõhunäiturivedelikke. Degaseeritud rõhunäiturivedelik viiakse isoteniskoobi pikema haru kumerasse ossa. Uuritav tahkis viiakse reservuaari ja degaseeritakse kõrgemal temperatuuril. Seejärel kallutatakse isoteniskoopi nii, et rõhunäiturivedelik voolab U-torusse. Aururõhu temperatuurisõltuvus määratakse vastavalt punktile 1.6.2.
      1.6.4.   Efusioonmeetod: aururõhukaalud
      1.6.4.1.   Seade
      Kirjanduses (1) on kirjeldatud mitmesuguseid seadmeid. Siin kirjeldatud seade illustreerib meetodi üldist tööprintsiipi (joonis 4). Joonisel 4 on näha seadmete peamised osad, sh roostevabast terasest või klaasist kõrgvaakumanum, seadmed vaakumi tekitamiseks ja mõõtmiseks ning katseseadme sees olevad seadmed aururõhu määramiseks kaalude abil. Katseseadmel on järgmised sisemised osad:
      
                  —
               
               
                  aurustusahi ääriku ja pöörleva sisselaskeavaga. Aurustusahi on silindriline anum, mis on valmistatud nt vasest või keemiliselt inertsest, hea soojusjuhtivusega sulamist. Kasutada võib ka vaskseintega klaasanumat. Ahju läbimõõt on ligikaudu 3–5 cm ja kõrgus 2–5 cm. Ahjul on aurujoa tarvis 1–3 erineva suurusega ava. Ahju kütab kas allolev kütteplaat või ümbritsev küttespiraal. Et takistada soojuse kadumist alusplaati, kinnitatakse ahi alusplaadi külge madala soojusjuhtivusega metalli (nikli-hõbedasulami või kroomnikkelterase) abil, mitme avaga ahju kasutamisel nt pöörleva sisselaskeava külge kinnitatud nikli-hõbedasulamist toru abil. Sellise ehituse eeliseks on vaskvarda kasutamise võimalus. Viimane võimaldab kasutada väljastpoolt seadet jahutusvanni abil rakendatavat jahutust;
               
            
                  —
               
               
                  kui vasest ahjukaanel on kolm erineva läbimõõduga ava, mis paiknevad üksteise suhtes 90o nurga all, võimaldab see hõlmata tööpiirkonna erinevaid aururõhuvahemikke (avad läbimõõtudega ligikaudu 0,30–4,50 mm). Suuri avasid kasutatakse madala aururõhu puhul ja vastupidi. Ahju pöörates on auruvoolu (ahjuava – kaitseekraan – kaalukauss) ette võimalik seada mis tahes soovitud ava või vahepealne asend, nii et molekulide voog lastakse või suunatakse ahjuavast kaalukausi poole. Aine temperatuuri mõõtmiseks paigaldatakse sobivasse punkti termopaar või takistustermomeeter;
               
            
                  —
               
               
                  kaitseekraani kohal on ülitundlike mikrokaalude kaalukauss (vt allpool). Kaalukausi läbimõõt on ligikaudu 30 mm. Sobivaks materjaliks on näiteks kullatud alumiinium;
               
            
                  —
               
               
                  kaalukaussi ümbritseb silindriline messingist või vasest külmkamber. Sõltuvalt kaalu tüübist on sel avad kaalukangi jaoks ja kaitseekraanis ava molekulide voo jaoks ning see peaks tagama auru täieliku kondenseerumise kaalukausil. Soojuse hajutamise seadmest väljapoole tagab nt külmkambri külge ühendatud vaskvarras. Varras on viidud läbi alusplaadi ja nende vahel on soojusisolatsioon, nt kroomnikkelterasest toru. Varras on kastetud alusplaadi all olevasse vedelat lämmastikku sisaldavasse Dewari anumasse või juhitakse vedelat lämmastikku läbi varda. Külmkambrit hoitakse nii ligikaudu –120 oC juures. Kaalukauss jahtub ainult kiirguse abil, mis on uuritava rõhuvahemiku jaoks küllaldane (jahutamist alustatakse ligikaudu 1 tund enne mõõtmise algust);
               
            
                  —
               
               
                  kaalud asuvad külmkambri kohal. Sobivateks kaaludeks on näiteks ülitundlikud 2 õlaga mikrokaalud (8) või ülitundlik liikuvpooliga mõõteriist (vt OECD katsesuunist 104, välja antud 12.5.1981);
               
            
                  —
               
               
                  alusplaadis on ka elektrilised kontaktid termopaaride (või takistustermomeetrite) ja küttespiraalide jaoks;
               
            
                  —
               
               
                  vaakum tekitatakse anumas osalise vaakum- või kõrgvaakumpumba abil (vajalik on ligikaudu 1–2 × 10-3 Pa vaakum, mis saavutatakse pärast umbes 2 h pumpamist). Rõhku reguleeritakse sobiva ionisatsioonvaakummeetri abil.
               
            1.6.4.2.   Mõõtmisprotseduur
      Nõu täidetakse testainega ja suletakse kaanega. Kaitseekraan ja külmkamber paigutatakse ahju kohale. Seade suletakse ja käivitatakse vaakumpumbad. Lõplik rõhk peaks enne mõõtmiste alustamist olema ligikaudu 10-4 Pa. Külmkambri jahutamist alustatakse 10-2 Pa juures.
      Vajaliku vaakumi saavutamisel alustatakse kaliibrimisseeriaga, alustades kõige madalamast vajalikust temperatuurist. Sobiv ava ahjukaanes seatakse paika, auruvoog läbib otse ava kohal oleva kaitseekraani ja põrkub jahutatud kaalukausiga. Kaalukauss peab olema piisavalt suur tagamaks, et sellega põrkub kogu kaitseekraanist läbi juhitud auruvoog. Auruvoo impulss toimib jõuna vastu kaalukaussi ning molekulid kondenseeruvad selle külmal pinnal.
      Ühel ajal toimivad impulss ja kondenseerumine tekitavad registreeritava signaali. Signaalid annavad kahesugust teavet.
      
                  1.
               
               
                  Siin kirjeldatud seadme abil määratakse aururõhk otse kaaludele antud impulsi põhjal (molaarmassi ei ole selleks vaja teada (2)). Näitude hindamisel tuleb arvesse võtta geomeetrilisi tegureid, nagu ahju avaja molekulivoo kaldenurka.
               
            
                  2.
               
               
                  Ühel ajal on võimalik mõõta kondensaadi mass ja arvutada selle põhjal aurustumiskiirus. Aururõhu võib Hertzi võrrandi (2) abil arvutada ka aurustumiskiiruse ja molaarmassi põhjal.
               
            
         
      kus:
      
                  G
               
               
                  =
               
               
                  aurustumiskiirus (kg s-1 m-2)
               
            
                  M
               
               
                  =
               
               
                  molaarmass (g mol-1)
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  molaarmass (g mol-1)
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  universaalne gaasikonstant (J mol-1 K-1)
               
            
                  p
               
               
                  =
               
               
                  aururõhk (Pa)
               
            Vajaliku vaakumi saavutamisel alustatakse mõõtmisseeriaga, alustades kõige madalamast soovitud mõõtmistemperatuurist.
      Mõõtmisi jätkatakse, tõstes temperatuuri väikeste vahemike võrra, kuni jõutakse kõige kõrgema soovitud temperatuurini. Seejärel jahutatakse proov uuesti maha ja registreeritakse teine aururõhukõver. Kui teine seeria esimese seeria tulemusi ei kinnita, on võimalik, et aine mõõdetavas temperatuurivahemikus laguneb.
      1.6.5.   Efusioonmeetod: massikao järgi
      1.6.5.1.   Seade
      Efusiooniseade koosneb järgmistest põhiosadest:
      
                  —
               
               
                  mahutist, mis on termostateeritav ja vakumeeritav ning milles asuvad efusioonirakud;
               
            
                  —
               
               
                  vaakummeetriga kõrgvaakumpumbast (nt difusioonpump või turbomolekulaarpump);
               
            
                  —
               
               
                  vedelat lämmastikku või kuiva jääd kasutavast püüdurist.
               
            Joonisel 5 on näitena esitatud elektrikütte ja 4 roostevabast terasest efusioonirakuga alumiiniumist vaakummahuti. Umbes 0,3 mm paksuses roostevabas terasfooliumis on 0,2–1,0 mm läbimõõduga efusioonidüüs ja see on keermestatud katte abil efusiooniraku külge kinnitatud.
      1.6.5.2.   Mõõtmisprotseduur
      Uuritav ja võrdlusaine viiakse kumbki oma efusioonirakku, düüsiga metallmembraan kinnitatakse keermestatud katte abil ja kõik rakud kaalutakse 0,1 mg täpsusega. Rakud paigutatakse termostateeritud seadmesse, mille rõhk viiakse seejärel vähem kui kümnendikuni eeldatavast rõhust. Kindlaksmääratud, 5–30tunniste ajavahemike järel lastakse õhk seadmesse ning määratakse kaalumise teel efusiooniraku massikadu.
      Tagamaks, et lenduvad lisandid tulemusi ei mõjuta, kaalutakse rakk kindlate ajavahemike järel üle, kontrollides, kas aurustumiskiirus jääb vähemalt kahe sellise ajavahemiku kestel konstantseks.
      Aururõhk p efusioonirakus arvutatakse järgmise võrrandi abil:
      
         
      kus:
      
                  p
               
               
                  =
               
               
                  aururõhk (Pa)
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  mass of the substance leaving the cell during time t (kg)
               
            
                  t
               
               
                  =
               
               
                  aeg (s)
               
            
                  A
               
               
                  =
               
               
                  area of the hole (m2)
               
            
                  K
               
               
                  =
               
               
                  parandustegur
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  universal gas constant (Jmol-l K-1)
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  temperatuur (K)
               
            
                  M
               
               
                  =
               
               
                  molaarmass (kg mol-1)
               
            Parandustegur K sõltub silindrilise düüsi pikkuse ja raadiuse suhtest:
      
                  Suhe
               
               
                  0,1
               
               
                  0,2
               
               
                  0,6
               
               
                  1,0
               
               
                  2,0
               
            
                  K
               
               
                  0,952
               
               
                  0,909
               
               
                  0,771
               
               
                  0,672
               
               
                  0,514
               
            Eespool esitatud võrrandi võib kirjutada järgmisel kujul:
      
         
      
         and is the effusion cell constant.
      Efusiooniraku konstandi E võib määrata võrdlusainete (2,9) abil, kasutades järgmist võrrandit:
      
         
      kus:
      
                  p(r)
               
               
                  =
               
               
                  võrdlusaine aururõhk (Pa)
               
            
                  M(r)
               
               
                  =
               
               
                  võrdlusaine molaarmass (kg × mol-1)
               
            1.6.6.   Gaasi küllastamise meetod
      1.6.6.1.   Seade
      Tüüpiline katseseade koosneb mitmest joonisel 6a näidatud komponendist ja seda kirjeldatakse allpool (1).
      Inertgaas
      Kandegaas ei tohi testainega keemiliselt reageerida. Üldjuhul sobib kandegaasiks lämmastik, kuid mõningatel juhtudel on vaja kasutada muid gaase (10). Kasutatav gaas peab olema kuiv (vt joonisel 6a tähist 4: suhtelise niiskuse andur).
      Gaasivoolu reguleerimine
      Konstantse, seadistatud gaasivoolu tagamiseks küllastuskolonnis on vaja sobivat gaasivoolu reguleerimise süsteemi.
      Aurupüüdurid
      Valitakse olenevalt konkreetse proovi omadustest ja valitud analüüsimeetodist. Püüdurid peavad auru kinni püüdma kvantitatiivselt ja järgnevat analüüsi võimaldaval kujul. Mõnedele katseainetele sobivad vedelikke, nagu heksaani või etüleenglükooli, sisaldavad püüdurid. Teistele katseainetele võivad sobida tahked absorbendid.
      Aurude kinnipüüdmise ja järgneva analüüsi asemel võib teadaoleva koguse kandegaasiga transporditava materjalikoguse kvantitatiivseks määramiseks kasutada pidevaid analüüsitehnikaid, nt kromatograafiat. Samuti võib mõõta proovi massikadu.
      Soojusvaheti
      Erinevatel temperatuuridel mõõtmisi tehes võib olla vaja lisada katseseadmele soojusvaheti.
      Küllastuskolonn
      Testaine kantakse lahusest sobivale inertsele tugiainele. Kaetud tugiainega täidetakse küllastuskolonn, mille mõõtmed ja voolukiirus valitakse sellised, et oleks tagatud kandegaasi täielik küllastatus. Küllastuskolonn peab olema termostateeritud. Toatemperatuurist kõrgemal temperatuuril mõõtmisi tehes tuleks küllastuskolonni ja püüdurite vahelist piirkonda soojendada, et vältida testaine kondenseerumist.
      Difusioonist tingitud massiülekande vähendamiseks võib küllastuskolonni järgi ühendada kapillaartoru (joonis 6b).
      1.6.6.2.   Mõõtmisprotseduur
      Küllastuskolonni ttevalmistamine
      Sobivale tugiainekogusele lisatakse hästilenduvas lahustis lahustatud testaine. Lisatava testaine kogus peaks olema piisav, et tagada küllastumine kogu katse ajaks. Lahusti aurustatakse õhus või rootoraurutis ning hoolikalt segatud materjal viiakse küllastuskolonni. Pärast proovi termostateerimist juhitakse läbi katseseadme kuiva lämmastikku.
      Mõõtmine
      Püüdurid või pideva toimega detektor ühendatakse kolonni väljavooluga ja registreeritakse vastav aeg. Voolukiirus määratakse kindlaks nii katse alguses kui ka kindlate ajavahemike tagant katse käigus mullkulumõõturi abil (või pidevalt massivoolumõõturi abil).
      Määrata tuleb ka rõhk küllastuskolonni väljavoolus. Selleks on järgmised võimalused:
      
                  a)
               
               
                  küllastuskolonni ja püüdurite vahele lisatakse rõhumõõtur (meetod ei pruugi sobilik olla, kuna suurendab surnud ruumala ja adsorbeerivat pinda) või
               
            
                  b)
               
               
                  eraldi katses määratakse rõhulangus konkreetses püüdursüsteemis sõltuvalt voolukiirusest (ei pruugi sobida vedelikpüüdurite puhul).
               
            Erinevate analüüsimeetodite jaoks vajaliku ainekoguse kogumiseks vajalik aeg määratakse eelnevalt eelkatsete põhjal või hinnanguliselt. Järgneva analüüsi jaoks testaine kogumise asemel võib kasutada kvantitatiivset pidevat analüüsitehnikat (näiteks kromatograafiat). Enne antud temperatuurile vastava aururõhu arvutamist tuleb teha eelkatsed, et teha kindlaks kõrgeim voolukiirus, mille juures kandegaas aine aurudega täilikult küllastub. Küllastatuses võib kindel olla, kui kandegaas läbib küllastuskolonni nii aeglaselt, et madalama voolukiirusega ei kaasne kõrgemat väljaarvutatud aururõhku.
      Kasutatav analüütiline meetod (nt gaaskromatograafia või gravimeetria) sõltub uuritava aine iseloomust.
      Määratakse teadaoleva koguse kandegaasiga kaasa kandunud ainekogus.
      1.6.6.3.   Aururõhu arvutamine
      Aururõhk arvutatakse auru tihedusest W/V järgmise võrrandi abil:
      
         
      kus:
      
                  P
               
               
                  =
               
               
                  aururõhk (Pa)
               
            
                  W
               
               
                  =
               
               
                  aurustunud testaine mass (g)
               
            
                  V
               
               
                  =
               
               
                  küllastatud gaasi ruumala (m3)
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  universaalne gaasikonstant (J mol-1 K-1)
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  temperatuur (K)
               
            
                  M
               
               
                  =
               
               
                  testaine molaarmass (g mol-1)
               
            Mõõdetud mahtusid tuleb voolumõõturi ja termostateeritud küllastuskolonni rõhu- ja temperatuurierinevusi arvestades korrigeerida. Kui voolumõõtur asub aurupüüdurist allavoolu, võib osutuda vajalikuks teha ka püüdurite aurustunud koostisaineid arvestavad parandusi (1).
      1.6.7.   Pöörlev rootor (8, 11, 13)
      1.6.7.1.   Seade
      Pöörleva rootori meetodi rakendamiseks sobib joonisel 8 näidatud pöörleva rootoriga viskoossusmõõtur. Katseseadmete skeem on esitatud joonisel 7.
      Mõõteseade koosneb tavaliselt pöörlevast rootormõõtepeast, mis on paigutatud 0,1 oC täpsusega termostateeritud kambrisse. Proovinõu paigutatakse 0,01 oC täpsusega termostateeritud kambrisse ning seadmete kõiki ülejäänud osi hoitakse kondensatsiooni vältimiseks kõrgemal temperatuuril. Kõrgvaakumklappide abil on süsteemiga ühendatud kõrgvaakumpump.
      Pöördrootormõõtepea koosneb väikesest torus paiknevast teraskuulist (läbimõõduga 4–5 mm). Kuuli hõljutab ja stabiliseerib magnetväli, mida tavaliselt tekitavad püsimagnetid koos juhtmähistega.
      Kuul pannakse mähiste tekitatud väljade vaheldumisega pöörlema. Kuuli pöörlemiskiirust saab mõõta selle alalist nõrka polaarset magneetumust mõõtvate andurmähistega.
      1.6.7.2.   Mõõtmisprotseduur
      Kui kuul on jõudnud ettenähtud pöörlemiskiiruseni v(o) (tavaliselt umbes 400 pööret sekundis), lõpetatakse edasine kiirendamine ja kuul hakkab gaasikeskkonnast tingitud hõõrdumise tõttu aeglustuma.
      Mõõdetakse pöörlemiskiiruse languse sõltuvust ajast. Kuna magnetilisest hõljutamisest tingitud hõõrdumise võib gaasidest tingitud hõõrdumisega võrreldes arvestamata jätta, leitakse gaasirõhk p järgmisest valemist:
      
         
      kus:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  gaasimolekulide keskmine kiirus
               
            
                  r
               
               
                  =
               
               
                  kuuli raadius
               
            
                  ρ
               
               
                  =
               
               
                  kuuli tihedus
               
            
                  σ
               
               
                  =
               
               
                  tangentsiaalse impulsiülekande tegur (ε = 1 kuuli ideaalse kerakujulise pinna korral)
               
            
                  t
               
               
                  =
               
               
                  aeg
               
            
                  v(t)
               
               
                  =
               
               
                  pöörlemiskiirus pärast aja t möödumist
               
            
                  v(o)
               
               
                  =
               
               
                  algne pöörlemiskiirus
               
            Võrrandi võib kirjutada ka järgmisel kujul:
      
         
      kus tn ja tn-1 on N arvu pöörete tegemiseks kulunud ajavahemikud. Need ajavahemikud järgnevad üksteisele ja tn > tn-1.
      Gaasimolekuli keskmist kiirust väljendab järgmine valem:
      
         
      kus:
      
                  T
               
               
                  =
               
               
                  temperatuur
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  universaalne gaasikonstant
               
            
                  M
               
               
                  =
               
               
                  molaarmass
               
            2.   ANDMED
      Mis tahes eelmise meetodi abil leitud aururõhk tuleks määrata vähemalt kahel temperatuuril. Vahemikus 0–50 oC tuleks aururõhukõvera lineaarsuse kontrollimiseks määrata rõhku kolm või enam korda.
      3.   ARUANDLUS
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  kasutatud meetodit;
               
            
                  —
               
               
                  aine täpset kirjeldust (tunnusandmed ja lisandid) ja eelneva puhastusetapi kirjeldust (kui seda on rakendatud);
               
            
                  —
               
               
                  vähemalt kaht aururõhu ja temperatuuri väärtust, eelistatavalt vahemikus 0–50 oC;
               
            
                  —
               
               
                  kõiki katseandmeid;
               
            
                  —
               
               
                  log p vs. 1/T kõverat;
               
            
                  —
               
               
                  hinnangulist aururõhu väärtust 20 või 25 oC juures.
               
            Üleminekute (oleku muutus, lagunemine) täheldamisel tuleks üles märkida järgmine teave:
      
                  —
               
               
                  ülemineku iseloom;
               
            
                  —
               
               
                  temperatuur, mille juures üleminek atmosfäärirõhul toimub;
               
            
                  —
               
               
                  aururõhk 10 ja 20 oC allpool üleminekutemperatuuri ning 10 ja 20 oC ülevalpool seda temperatuuri (välja arvatud juhul, kui üleminek toimus tahkest olekust gaasilisse).
               
            Registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmed ja märkused.
      4.   VIITED
      
                  1.
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2.
               
               
                  Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol. II.
               
            
                  3.
               
               
                  R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I.
               
            
                  4.
               
               
                  Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, 593.
               
            
                  5.
               
               
                  NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–1 to 10–5 Pa – Static method.
               
            
                  6.
               
               
                  NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method.
               
            
                  7.
               
               
                  ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure-temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.
               
            
                  8.
               
               
                  G. Messer, P. Röhl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987, Vol. 5 (4), 2440.
               
            
                  9.
               
               
                  Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, 1173.
               
            
                  10.
               
               
                  B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, 435.
               
            
                  11.
               
               
                  G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, Vol. 17 (2), 642.
               
            
                  12.
               
               
                  G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), 1148.
               
            
                  13.
               
               
                  J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1985, Vol. 3 (3), 1715.
               
            
         1. liide
         Hindamismeetod
         SISSEJUHATUS
         Aururõhu arvutuslikke väärtusi saab kasutada
         
                     —
                  
                  
                     sobiva katsemeetodi valikul;
                  
               
                     —
                  
                  
                     hinnangu või piirväärtuse saamiseks juhtudel, kus katsemeetodit tehnilistel põhjustel (sh väga madal aururõhk) rakendada ei saa;
                  
               
                     —
                  
                  
                     identifitseerimaks juhtumeid, kus on õigustatud eksperimentaalse määramise kõrvalejätmine, kuna aururõhk toatemperatuuril on eeldatavalt alla 10-5 Pa.
                  
               HINDAMISMEETOD
         Vedelike ja tahkete ainete aururõhku on võimalik hinnata muudetud Watsoni korrelatsiooni (a) abil. Ainus selleks vajalik eksperimentaalselt määratav väärtus on keemistemperatuur normaalrõhul. Meetod on kohaldatav rõhuvahemikus 105 Pa – 10-5 Pa.
         Meetodi üksikasjalik kirjeldus on toodud väljaandes „Handbook of Chemical Property Estimation Methods” (b).
         ARVUTUSKÄIK
         Viite b kohaselt arvutatakse aururõhk järgmiselt:
         
            
         kus:
         
                     T
                  
                  
                     huvi pakkuv temperatuur
                  
               
                     Tb
                     
                  
                  
                     keemistemperatuur normaalrõhul
                  
               
                     Pvp
                     
                  
                  
                     aururõhk temperatuuril T
                  
               
                     ΔHvb
                     
                  
                  
                     aurustumissoojus
                  
               
                     ΔZb
                     
                  
                  
                     kokkusurutavusaste (hinnanguliselt 0,97)
                  
               
                     m
                  
                  
                     empiiriline tegur, mis sõltub füüsikalisest olekust huvi pakkuval temperatuuril
                  
               Edasi,
         
            
         kus KF on aine polaarsust arvestav empiiriline tegur. Paljude ühendiklasside KF tegurid on loetletud viites b.
         Sageli on saadaval andmed keemistemperatuuri kohta alandatud rõhul. Sellisel juhul arvutatakse aururõhk viite b kohaselt järgmiselt:
         
            
         kus T1 on keemistemperatuur alandatud rõhul P1.
         ARUANNE
         Hindamismeetodi kasutamisel peab aruandes sisalduma põhjalik dokumentatsioon arvutuste kohta.
         KIRJANDUS
         
                     a)
                  
                  
                     K.M. Watson, Ind. Eng. Chem; 1943, vol. 35, 398.
                  
               
                     b)
                  
                  
                     W. J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.
                  
               
      
         2. liide
         Joonis 1
         Seade aururõhukõvera määramiseks dünaamilise meetodi kohaselt
         
            
         Joonis 2a
         Seade aururõhukõvera määramiseks staatilise meetodi kohaselt (U-toru-manomeetri abil)
         
            
         Joonis 2b
         Seade aururõhukõvera määramiseks staatilise meetodi kohaselt (rõhunäituri abil)
         
            
         Joonis 3
         Isoteniskoop (vt viidet 7)
         
            
         Joonis 4
         Seade aururõhukõvera määramiseks aururõhukaalude meetodi kohaselt
         
            
         Joonis 5
         Näiteseade aurustumise uurimiseks madalal rõhul efusioonmeetodi abil efusiooniraku mahuga 8 cm
         
            
         Joonis 6a
         Näitlik läbivoolusüsteem aururõhu määramiseks gaasi küllastamise meetodi kohaselt
         
            
         Joonis 6b
         Näitlik küllastuskolonni järgi ühendatud kapillaartoruga süsteem aururõhu määramiseks gaasi küllastamise meetodi kohaselt
         
            
         Joonis 7
         Näitlik katseseade aururõhu uurimiseks pöörleva rootori meetodi kohaselt
         
            
         Joonis 8
         Pöördrootormõõtepea näide
         
            
      
      A.5.   PINDPINEVUS
      1.   MEETOD
      Kirjeldatud meetodid põhinevad OECD katsesuunisel (1). Meetodite tööpõhimõtted on ära toodud viites 2.
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Kirjeldatud meetodid on ette nähtud vesilahuste pindpinevuse mõõtmiseks.
      Katse tegemiseks on kasulik teada aine lahustuvust vees, selle struktuuri, hüdrolüüsuvust ja mitsellitekke lävikontsentratsiooni.
      Järgmised meetodid sobivad kohaldamiseks enamikule keemilistele ainetele, olenemata nende puhtusastmest.
      Pindpinevust saab mõõta rõnga lahtirebimise meetodi abil ainult vesilahuste puhul, mille dünaamiline viskoossus on alla ca. 200 mPa s.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Pindpinevusena käsitatakse pinna vabaentalpiat pinnaühiku kohta.
      Pindpinevust väljendatakse järgmistes ühikutes:
      N/m (SI ühik) või
      mN/m (SI alamühik)
      1N/m = 103 dyn/cm
      1 mN/m = 1 dyn/cm (aegunud CGS-süsteemis)
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.
      Viidetes 1 ja 3 on ära toodud laia pindpinevuste vahemikku hõlmavad võrdlusained.
      1.4.   KATSEMEETODITE PÕHIMÕTE
      Meetodite kohaselt mõõdetakse maksimaalne jõud, mida on vaja püstsuunas rakendada mõõtenõus oleva uuritava vedeliku pinnaga kokkupuutes olevale loogale või rõngale selle lahtirebimiseks pinnalt või pinnaga kokkupuutes oleva plaadi servale tekkinud kile ülestõmbamiseks.
      Aineid, mille lahustuvus vees on vähemalt 1 mg/l, analüüsitakse vesilahuses ainult ühel kontsentratsioonil.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Nende meetodite täpsus ületab tõenäolised vajadused keskkonnaohtlikkuse hindamisel.
      1.6.   MEETODITE KIRJELDUS
      Valmistatakse aine lahus destilleeritud vees. Lahuse kontsentratsioon peaks olema 90 % aine küllastuskontsentratsioonist vees; kui kontsentratsioon ületab 1 g/l, kasutatakse katses kontsentratsiooni 1 g/l. Aineid, mille lahustuvus vees on alla 1 mg/l, pole vaja testida.
      1.6.1.   Plaadimeetod
      Vt ISO 304 ja NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).
      1.6.2.   Loogameetod
      Vt ISO 304 ja NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).
      1.6.3.   Rõngameetod
      Vt ISO 304 ja NF T 73-060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).
      1.6.4.   OECD ühtlustatud rõngameetod
      1.6.4.1.   Seade
      Mõõtmiseks sobivad müügil olevad tensiomeetrid. Need koosnevad järgmistest osadest:
      
                  —
               
               
                  liikuvast proovialusest;
               
            
                  —
               
               
                  dünamomeetrist;
               
            
                  —
               
               
                  mõõtekehast (rõngast);
               
            
                  —
               
               
                  mõõtmisnõust.
               
            1.6.4.1.1.   Liikuv proovialus
      
      Liikuvale proovialusele asetatakse uuritavat vedelikku sisaldav termostateeritud mõõtmisnõu. Alus kinnitatakse koos dünamomeetriga statiivile.
      1.6.4.1.2.   Dünamomeeter
      
      Dünamomeeter (vt joonist) paikneb proovialuse kohal. Viga jõu mõõtmisel ei tohi ületada ± 10-6 N, mis vastab veapiirile ±0,1 mg massi mõõtmisel. Enamikul juhtudel on müügil olevate tensiomeetrite mõõteskaala kaliibritud mN/m skaalas, nii et pindpinevuse saab skaalalt lugeda otse millinjuutonites meetri kohta täpsusega 0,1 mN/m.
      1.6.4.1.3.   Mõõtekeha (rõngas)
      
      Rõngas on tavaliselt valmistatud 0,4 mm jämedusest plaatina-iriidiumtraadist ja selle keskmine ümbermõõt on 60 mm. Rõngas ripub horisontaalselt metallvarda ja looga otsas, mille kaudu ta on ühendatud dünamomeetriga (vt joonist).
      Joonis
      Mõõtekeha
      (Kõik mõõdud on millimeetrites)
      
         
      1.6.4.1.4.   Mõõtmisnõu
      
      Katselahust sisaldava mõõtmisnõuna kasutatakse termostateeritud klaasnõud. Nõu ehitus peab olema selline, et katselahuse ja selle kohal oleva gaasifaasi temperatuurid jäävad katse kestel konstantseks ning proov ei aurustu. Mõõtmisnõuks sobivad silindrilised klaasnõud sisediameetriga vähemalt 45 mm.
      1.6.4.2.   Seadme ettevalmistamine
      1.6.4.2.1.   Puhastamine
      
      Klaasnõud puhastatakse hoolikalt. Vajaduse korral pestakse neid kuuma kroomseguga ja seejärel kontsentreeritud fosforhappega (83–98 % H3PO4 (massi järgi)), loputatakse põhjalikult kraaniveega, pestakse lõpuks bidestilleeritud veega neutraalse reaktsiooni saavutamiseni ja seejärel kuivatatakse või loputatakse osaga mõõdetavast vedelikuproovist.
      Rõngast loputatakse kõigepealt põhjalikult veega, et eemaldada vees lahustuvad ained, kastetakse seejärel lühikeseks ajaks kroomsegusse, pestakse siis bidestilleeritud veega neutraalse reaktsiooni saavutamiseni ja kuumutatakse lõpuks lühikest aega metanoolileegi kohal.
      
         Märkus
      
      Kroomsegus ja fosforhappes mittelahustuvad saasteained, nt silikoonid, eemaldatakse sobiva orgaanilise lahustiga.
      1.6.4.2.2.   Seadme kaliibrimine
      
      Seadme kontrollimiseks kontrollitakse nullpunkti ja reguleeritakse seda nii, et seade võimaldab täpset mõõtmist mN/m skaalas.
      Kinnitus
      Seade looditakse tensiomeetri aluse reguleerimiskruvide abil (näiteks alusel oleva loodinäidiku järgi).
      Nullpunkti reguleerimine
      Pärast rõnga kinnitamist aparaadile ja enne selle vedelikku kastmist reguleeritakse tensiomeetri näit nulli ja kontrollitakse, kas rõngas on vedeliku pinnaga paralleelne. Selleks võib vedelikupinda kasutada peeglina.
      Kaliibrimised
      Seadme kaliibrimiseks võib kasutada üht kahest järgmisest meetodist.
      
                  a)
               
               
                  Raskuste abil: kasutatakse rõngale asetatavaid kindla massiga (0,1–1,0 g) raskusi. Kaliibrimistegur Φa, millega kõiki seadme näitusid tuleb korrutada, leitakse võrrandi 1 abil:
                  
                              
                                 
                           
                           
                              (1)
                           
                        kus:
                  
                     (mN/m)
                  
                              m
                           
                           
                              =
                           
                           
                              raskuse mass (g)
                           
                        
                              g
                           
                           
                              =
                           
                           
                              raskuskiirendus (merepinnal 981 cm s–2)
                           
                        
                              b
                           
                           
                              =
                           
                           
                              rõnga keskmine ümbermõõt (cm)
                           
                        
                              σa
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              tensiomeetri näit pärast raskuse asetamist rõngale (mN/m).
                           
                        
            
                  b)
               
               
                  Vee abil: kasutatakse puhast vett, mille pindpinevus on näiteks 23 oC juures 72,3 mN/m.
                  Selle meetodi kohaselt toimub kaliibrimine kiiremini kui massi abil, kuid alati eksisteerib oht, et vee pindpinevust mõjutavad pindaktiivsed lisandid. Kaliibrimistegur Φb, millega kõiki seadme näitusid tuleb korrutada, leitakse võrrandi 2 abil:
                  
                              
                                 
                           
                           
                              (2)
                           
                        kus:
                  
                              σo
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              vee pindpinevus (mN/m) kirjanduse andmetel
                           
                        
                              σg
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              mõõtmisel leitud vee pindpinevus (mN/m) mõlemad samal temperatuuril.
                           
                        
            1.6.4.3.   Proovide ettevalmistamine
      Uuritavatest ainetest valmistatakse vajaliku kontsentratsiooniga vesilahused, kuhu ei tohi jääda lahustumatut jääki.
      Lahust hoitakse püsival temperatuuril (±0,5 oC). Kuna mõõtmisnõus oleva lahuse pindpinevus muutub aja jooksul, tehakse erinevatel aegadel mitu mõõtmist ja koostatakse kõver pindpinevuse muutumise kohta ajas. Kui pindpinevus enam ei muutu, on saavutatud tasakaal.
      Mõõtmistulemusi mõjutavad tolm ja gaasilised lisandid. Seetõttu tuleb katsed teha suletud kambris.
      1.6.5.   Katsetingimused
      Mõõtmised tehakse ligikaudu 20 oC juures ja temperatuuri reguleeritakse ±0,5 oC täpsusega.
      1.6.6.   Katse tegemine
      Mõõdetavad lahused viiakse põhjalikult puhastatud mõõtmisnõusse, vältides hoolikalt vahutamist, ja mõõtmisnõu paigutatakse katseseadmesse proovialusele. Proovialust mõõtmisnõuga tõstetakse, kuni rõngas on allpool mõõdetava lahuse pinda. Seejärel lastakse proovialust järk-järgult ühtlaselt allapoole (kiirusega ligikaudu 0,5 cm/min), eemaldades rõngast pinnast kuni maksimaalse tõmbejõu saavutamiseni. Rõnga külge kinnitunud vedelikukiht ei tohi sellest eralduda. Pärast mõõtmiste lõppu viiakse rõngas jälle allapoole vedeliku pinda ja korratakse mõõtmisi, kuni jõutakse konstantsete pindpinevuse väärtusteni. Iga mõõtmise juures registreeritakse lahuse mõõtmisnõusse viimisest möödunud aeg. Näidud võetakse rõnga vedelikupinnast lahtirebimiseks vajaliku maksimaalse jõu juures.
      2.   ANDMED
      Pindpinevuse arvutamiseks tuleb seadme näit (mN/m) korrutada kaliibrimisteguriga Φa või Φb (sõltuvalt kasutatud kaliibrimismeetodist). Nii saadakse väärtus, mis on ainult ligikaudne ja vajab seega korrigeerimist.
      Harkins ja Jordan (4) on empiiriliselt kindlaks määranud rõngameetodi abil määratud pindpinevuse väärtuste parandustegurid, mis sõltuvad rõnga mõõtmetest, vedeliku tihedusest ja pindpinevusest.
      Kuna Harkinsi ja Jordani tabelitest iga mõõtmise jaoks eraldi parandustegurite leidmine vesilahuste pindpinevuse arvutamiseks on väga töömahukas, võib kasutada lihtsustatud meetodit, kus parandatud pindpinevuse väärtused loetakse otse tabelist. (Tabeliväärtuste vahele jäävate näitude puhul kasutatakse interpolatsiooni).
      Tabel:
      mõõdetud pindpinevuste parandused
      
         Ainult vesilahuste jaoks, ρ = 1 g/cm3
         
      
      
                  R
               
               
                  = 9,55 mm (rõnga keskmine raadius)
               
            
                  r
               
               
                  = 0,185 mm (rõngatraadi raadius)
               
            
         
      
                  Katseliselt mõõdetud väärtus (mN/m)
               
               
                  Parandatud väärtus (mN/m)
               
            
                  Kaliibrimine raskustega (vt 1.6.4.2.2a)
               
               
                  Kaliibrimine veega (vt 1.6.4.2.2b)
               
            
                  20
               
               
                  16,9
               
               
                  18,1
               
            
                  22
               
               
                  18,7
               
               
                  20,1
               
            
                  24
               
               
                  20,6
               
               
                  22,1
               
            
                  26
               
               
                  22,4
               
               
                  24,1
               
            
                  28
               
               
                  24,3
               
               
                  26,1
               
            
                  30
               
               
                  26,2
               
               
                  28,1
               
            
                  32
               
               
                  28,1
               
               
                  30,1
               
            
                  34
               
               
                  29,9
               
               
                  32,1
               
            
                  36
               
               
                  31,8
               
               
                  34,1
               
            
                  38
               
               
                  33,7
               
               
                  36,1
               
            
                  40
               
               
                  35,6
               
               
                  38,2
               
            
                  42
               
               
                  37,6
               
               
                  40,3
               
            
                  44
               
               
                  39,5
               
               
                  42,3
               
            
                  46
               
               
                  41,4
               
               
                  44,4
               
            
                  48
               
               
                  43,4
               
               
                  46,5
               
            
                  50
               
               
                  45,3
               
               
                  48,6
               
            
                  52
               
               
                  47,3
               
               
                  50,7
               
            
                  54
               
               
                  49,3
               
               
                  52,8
               
            
                  56
               
               
                  51,2
               
               
                  54,9
               
            
                  58
               
               
                  53,2
               
               
                  57,0
               
            
                  60
               
               
                  55,2
               
               
                  59,1
               
            
                  62
               
               
                  57,2
               
               
                  61,3
               
            
                  64
               
               
                  59,2
               
               
                  63,4
               
            
                  66
               
               
                  61,2
               
               
                  65,5
               
            
                  68
               
               
                  63,2
               
               
                  67,7
               
            
                  70
               
               
                  65,2
               
               
                  69,9
               
            
                  72
               
               
                  67,2
               
               
                  72,0
               
            
                  74
               
               
                  69,2
               
               
                  —
               
            
                  76
               
               
                  71,2
               
               
                  —
               
            
                  78
               
               
                  73,2
               
               
                  —
               
            Tabel on koostatud Harkinsi-Jordani paranduste põhjal. Tabel on sarnane DIN standardi (DIN 53914) tabeliga vee ja vesilahuste jaoks (tihedus ρ = 1 g/cm3 ja kehtib müügil olevate rõngaste kohta mõõtmetega R = 9,55 mm (rõnga keskmine raadius) ja r = 0,185 mm (rõngatraadi raadius). Tabelis on esitatud pärast raskuste või veega kaliibrimist mõõdetud pindpinevuse väärtuste ka parandatud väärtused.
      Pindpinevuse võib arvutada ka ilma eelneva kaliibrimiseta, kasutades järgmist valemit:
      
         
      kus:
      
                  F
               
               
                  =
               
               
                  dünamomeetriga kile katkemisel mõõdetud jõud
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  rõnga raadius
               
            
                  f
               
               
                  =
               
               
                  parandustegur (1)
               
            3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  kasutatud meetodit;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud vee või lahuse iseloomu;
               
            
                  —
               
               
                  aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);
               
            
                  —
               
               
                  mõõtmistulemusi: pindpinevuse väärtused, sh kõik üksiktulemused ja nende aritmeetiline keskmine ning parandatud keskmine (mis arvestab nii seadmetest tulenevat parandustegurit kui ka parandustabelit);
               
            
                  —
               
               
                  lahuse kontsentratsiooni;
               
            
                  —
               
               
                  katsetemperatuuri;
               
            
                  —
               
               
                  lahuse vanust, st aega lahuse valmistamise ja mõõtmise vahel;
               
            
                  —
               
               
                  pindpinevuse sõltuvust lahuse mõõtmisnõusse viimisest möödunud ajast;
               
            
                  —
               
               
                  registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmed ja märkused.
               
            3.2.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE
      Arvestades, et destilleeritud vee pindpinevus on 20 oC juures 72,75 mN/m, tuleks ained, mille pindpinevus käesoleva meetodi abil mõõtes on alla 60 mN/m, lugeda pindaktiivseteks aineteks.
      4.   VIITED
      
                  1.
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2.
               
               
                  R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV.
               
            
                  3.
               
               
                  Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511.
               
            
                  4.
               
               
                  Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, 1751.
               
            A.6.   LAHUSTUVUS VEES
      1.   MEETOD
      Kirjeldatud meetodid põhinevad OECD katsesuunisel (1).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Katse tegemiseks on kasulik teada aine struktuuri, aururõhku, dissotsiatsioonikonstanti ja hüdrolüüsuvuse pH-sõltuvust.
      Ükski meetod ei hõlma kogu vees lahustuvuste vahemikku.
      Kaks allpool kirjeldatud meetodit hõlmavad kogu lahustuvuste vahemiku, kuid ei ole kohaldatavad lenduvatele ainetele:
      
                  —
               
               
                  üht neist, mis on kohaldatav madala lahustuvusega (< 10–2 g/l) puhastele, vees stabiilsetele ainetele, nimetatakse kolonn-elueerimismeetodiks;
               
            
                  —
               
               
                  teist, mis on kohaldatav kõrgema lahustuvusega (> 10–2 g/l) puhastele, vees stabiilsetele ainetele, nimetatakse kolvimeetodiks.
               
            Testaine lahustuvus vees võib lisandite mõjul oluliselt muutuda.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Aine lahustuvus vees on selle küllastuskontsentratsioon vees antud temperatuuril. Lahustuvust vees väljendatakse massiühikutes lahuse ruumala kohta. Lahustuvuse SI-ühik on kg/m3 (kasutada võib ka gramme liitris).
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Küllastuskontsentratsiooni saavutamiseks vajalik ligikaudne proovi kogus ja aeg tuleks varem kindlaks teha lihtsas eelkatses.
      1.4.1.   Kolonn-elueerimismeetod
      Meetodi aluseks on testaine veega elueerimine mikrokolonnist, mis on täidetud testaine liiaga kaetud inertse tugiaine, nagu klaashelmeste või liivaga. Lahustuvus vees määratakse siis, kui eluaadi massikontsentratsioon on konstantne. Kontsentratsioon vs. aeg kõveral on see nähtav platoona.
      1.4.2.   Kolvimeetod
      Selle meetodi kohaselt lahustatakse aine (tahked ained peavad olema peenestatud) vees katsetemperatuurist mõnevõrra kõrgemal temperatuuril. Küllastumise saabumisel segu jahutatakse ja hoitakse katsetemperatuuril, segades seda tasakaalu saavutamiseks piisava aja jooksul. Mõõtmist võib alustada ka kohe katsetemperatuuril, kui sobivate proovide põhjal on teada, et küllastustasakaal on saavutatud. Järgnevalt määratakse sobiva analüüsimeetodi abil aine massikontsentratsioon vesilahuses, mis ei tohi sisaldada lahustumata osakesi.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      1.5.1.   Korratavus
      Kolonn-elueerimismeetodil võib saavutada korratavuse < 30 %, kolvimeetodil peaks see olema < 15 %.
      1.5.2.   Tundlikkus
      Sõltub analüüsimeetodist, kuid määrata saab massikontsentratsioone kuni 10–6 g/l.
      1.6.   MEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Katsetingimused
      Eelistatav katsetemperatuur on 20 ±0,5 oC. Kui eeldatakse võimalikku lahustuvuse sõltuvust temperatuurist (> 3 oC kohta), tuleks mõõtmised teha lisaks veel kahel temperatuuril, vähemalt 10 oC algselt valitud temperatuurist kõrgemal ja madalamal. Temperatuuri tuleks sellisel juhul reguleerida täpsusega ±0,1 oC. Valitud temperatuuri tuleks seadme kõigis olulistes osades konstantsena hoida.
      1.6.2.   Eelkatse
      Umbes 0,1 g proovile (tahked ained peavad olema peenestatud) 10 ml klaaskorgiga silindris lisatakse toatemperatuuril järjest suuremad kogused destilleeritud vett vastavalt alltoodud tabelile:
      
                  0,1 g lahustuv „x” ml vees
               
               
                  0,1
               
               
                  0,5
               
               
                  1
               
               
                  2
               
               
                  10
               
               
                  100
               
               
                  > 100
               
            
                  Ligikaudne lahustuvus (g/l)
               
               
                  > 1 000
               
               
                  1 000 – 200
               
               
                  200 – 1 000
               
               
                  100–50
               
               
                  50–10
               
               
                  10–1
               
               
                  < 1
               
            Pärast iga näidatud veekoguse lisamist loksutatakse segu tugevasti kümme minutit ja kontrollitakse visuaalselt lahustumata proovijääkide olemasolu. Kui proov või osa sellest pärast 10 ml vee lisamist ei lahustu, tuleb katset 100 ml mõõtesilindris suuremate veekogustega korrata. Madalamatel lahustuvustel võib aine lahustumiseks vajalik aeg olla oluliselt pikem (aega tuleks anda vähemalt 24 h). Ligikaudne lahustuvus on tabelis esitatud selle lisatud vee mahu all, mille juures proov täielikult lahustub. Kui aine ikka lahustumatu näib, tuleks lahustumiseks jätta rohkem kui 24 h (maksimaalselt 96 h) või segu edasi lahjendada, et veenduda, kas tuleks kasutada kolonn-elueerimis- või kolvimeetodit.
      1.6.3.   Kolonn-elueerimismeetod
      1.6.3.1.   Tugiaine, lahusti ja eluent
      Kolonn-elueerimismeetodi puhul kasutatav tugiaine peab olema inertne. Materjalidest on võimalik kasutada klaashelmeid ja liiva. Tugiaine katmisel testainega tuleks kasutada sobivat analüüsipuhast lahustit. Eluendina tuleks kasutada vett, mis on bidestilleeritud klaas- või kvartsseadmes.
      Märkus
      Otse orgaanilisest ioonvahetist pärit vett kasutada ei tohi.
      1.6.3.2.   Tugiaine katmine
      Kaalutakse ligikaudu 600 mg tugiainet ja viiakse see 50 ml ümarkolbi.
      Sobiv kaalutis testainet lahustatakse valitud lahustis. Sobiv kogus saadud lahust lisatakse tugiainele. Lahusti tuleb täielikult aurustada, nt rootoraurutis, vastasel juhul tugiaine veega küllastumist ei saavutata jaotumisefektide tõttu tugiaine pinnal.
      Tugiaine katmisest võib tekkida probleeme (vigased tulemused) juhul, kui testaine ladestub tugiaine pinnale õli või eraldi kristalse faasina. Probleemi tuleks katseliselt uurida ja tulemuste üksikasjad registreerida.
      Kaetud tugiainet lastakse umbes kaks tundi ligikaudu 5 ml vees seista ja viiakse suspensioon seejärel mikrokolonni. Teine võimalus on valada kuiv kaetud tugiaine veega täidetud mikrokolonni ja lasta sellel umbes kaks tundi tasakaalustuda.
      Katsemenetlus
      Ainet võib tugiainelt elueerida kahel erineval moel:
      
                  —
               
               
                  tsirkulatsioonpumbaga (vt joonist 1);
               
            
                  —
               
               
                  ühtlustava anumaga (vt joonist 4).
               
            1.6.3.3.   Kolonn-elueerimismeetod tsirkulatsioonpumbaga
      Seade
      Joonisel 1 on skemaatiliselt kujutatud tüüpiline süsteem. Sobiv mikrokolonn on näidatud joonisel 2, ehkki sobiv on ka mis tahes muude mõõtmetega kolonn eeldusel, et täidetud on reprodutseeritavuse ja tundlikkuse kriteeriumid. Kolonni peas olev vaba ruum peab olema nii suur, et mahutab eeljooksu jaoks kolonni täitmiseks vajaliku vee vähemalt viiekordse ruumala ja sinna saab paigutada vähemalt viis proovi. Seda vaba ruumi võib ka vähendada, kui lisandite kõrvaldamiseks kuluv viis kolonnitäit eluaati kompenseeritakse.
      Kolonn tuleks ühendada tsirkulatsioonpumbaga, mis tagab voolukiiruse umbes 25 ml/h. Pump ühendatakse polütetrafluoretüleen- (PTFE) ja/või klaasühenduste abil. Kolonnist ja pumbast koosneva seadme korral peab olema ette nähtud võimalus eluaadiproovide võtmiseks ning kolonni peas oleva vaba ruumi rõhu võrdsustamiseks atmosfäärirõhuga. Kolonni täidis toetub väikesele (5 mm) klaasvillast korgile, mis filtreerib ühtlasi välja osakesed. Tsirkulatsioonpumbana võib kasutada näiteks peristaltilist või membraanpumpa (hoolikalt tuleb vältida torustiku materjaliga seotud saastust ja/või absorptsiooni).
      Mõõtmisprotseduur
      Käivitatakse vool läbi kolonni. Soovitatav on kasutada ligikaudset voolukiirust 25 ml/h (kirjeldatud kolonni puhul vastab see kümnele kolonnitäiele tunnis). Vähemalt esimesed viis kolonnitäit väljavoolu kõrvaldatakse vees lahustuvate lisandite eemaldamiseks. Seejärel lastakse tsirkulatsioonpumbal töötada tasakaalu saavutamiseni, st senikaua, kuni viie järjestikuse proovi kontsentratsioonide juhuslikud erinevused ei ületa ± 30 %. Nende proovide vahelised ajavahemikud peaksid vastama ajale, mis kulub vähemalt kümnel kolonnitäiel eluendil kolonni läbimiseks.
      1.6.3.4.   Kolonn-elueerimismeetod ühtlustava anumaga
      Seade (vt jooniseid 4 ja 3)
      
      Ühtlustav anum: ühtlustav anum ühendatakse PTFE torudega ühendatud lihvühenduse abil. Soovitatav on kasutada ligikaudset voolukiirust 25 ml/h. Koguda tuleks järjestikusi eluaadifraktsioone ja neid valitud meetodi abil analüüsida.
      Mõõtmisprotseduur
      Aine lahustuvus vees määratakse nende fraktsioonide põhjal eluaadi keskjooksust, mille kontsentratsioonid jäävad vähemalt viie järjestikuse proovi kestel konstantseks (± 30 %).
      Mõlemal juhul (nii tsirkulatsioonpumba kui ka ühtlustava anuma kasutamisel) tehakse ka teine katse esimesest poole madalama voolukiirusega. Kui mõlema katse tulemused kokku langevad, on katse rahuldavalt sooritatud, kui aga madalamal voolukiirusel mõõdetakse kõrgem näiline lahustuvus, tuleb voolukiirust järjest poole võrra vähendada senikaua, kuni kahel järjestikusel katsel leitakse ühesugune lahustuvus.
      Mõlemal juhul (nii tsirkulatsioonpumba kui ka ühtlustava anuma kasutamisel) tuleb eluaadifraktsioonides kontrollida Tyndalli efekti (valguse hajumise) abil kolloidmaterjali olemasolu. Kolloidosakeste olemasolul tulemusi ei arvestata ja katset korratakse paremate filtreerivate omadustega kolonniga.
      Kõigi proovide pH registreeritakse. Järjestikused katsed tuleks teha samal temperatuuril.
      1.6.4.   Kolvimeetod
      1.6.4.1.   Seade
      Kolvimeetodi kasutamisel on vaja järgmisi vahendeid:
      
                  —
               
               
                  tavalisi labori klaastarvikuid ja seadmeid;
               
            
                  —
               
               
                  seadet lahuste segamiseks konstantsetel termostateeritud temperatuuridel;
               
            
                  —
               
               
                  tsentrifuugi (eelistatavalt termostateeritud), kui seda on vaja tööks emulsioonidega, ning
               
            
                  —
               
               
                  analüüsiseadmeid.
               
            1.6.4.2.   Mõõtmisprotseduur
      Soovitud ruumala vee küllastamiseks vajalik ainekogus määratakse eelkatse abil. Vajalik veekogus sõltub analüüsimeetodist ja lahustuvuste vahemikust. Kolme klaaskorgiga klaasnõusse (nt tsentrifuugiklaasidesse või kolbidesse) kaalutakse igaühte umbes viiekordne eespool määratud ainekogus. Igasse nõusse lisatakse valitud veekogus ja suletakse nõu tihedalt. Seejärel segatakse suletud nõusid 30 oC juures. (Kasutada tuleks konstantsel temperatuuril töötavat loksutit või segajat, nt magnetsegajat termostateeritud veevanniga.) Ühe päeva pärast võetakse üks nõu ja tasakaalustatakse seda aeg-ajalt loksutades 24 h katsetemperatuuril. Nõu sisu tsentrifuugitakse seejärel katsetemperatuuril ja määratakse siis selges veefaasis sobiva analüüsimeetodi abil testaine kontsentratsioon. Ülejäänud kaks nõud läbivad vastavalt kahe- ja kolmepäevase 30 oC juures tasakaalustamise järel sama töötluse. Kui vähemalt kahe järjestikuse nõu mõõtmisel saadud kontsentratsioonid nõutava reprodutseeritavuse piires kokku langevad, on katse rahuldavalt sooritatud. Kui esimese, teise ja kolmanda nõu mõõtmisel saadud väärtused kalduvad kasvama, tuleb katset pikemate tasakaalustamisperioodidega korrata.
      Katse võib teha ka ilma eelinkubeerimiseta 30 oC juures. Küllastustasakaalu saavutamise kiiruse hindamiseks võetakse proove senikaua, kuni segamisaeg enam katselahuse kontsentratsiooni ei mõjuta.
      Kõigi proovide pH registreeritakse.
      1.6.5.   Analüüs
      Määramisel eelistatakse spetsiifilisi määramismeetodeid, kuna juba väikesed lisandikogused võivad mõõdetud lahustuvuse väärtuses anda suure vea. Sellised meetodid on näiteks gaas- ja vedelikkromatograafia, tiitrimismeetodid, fotomeetrilised meetodid ja voltampermeetrilised meetodid.
      2.   ANDMED
      2.1.   KOLONN-ELUEERIMISMEETOD
      Iga katse puhul tuleks välja arvutada vähemalt viie järjestikuse, küllastusplatool võetud proovi keskmine väärtus ning standardhälve. Tulemused tuleks väljendada massiühikutes lahuse ruumala kohta.
      Võrreldakse kahe erineva voolukiirusega katse tulemusi ja nende korratavus peaks olema alla 30 %.
      2.2.   KOLVIMEETOD
      Esitada tuleks kõigi kolme kolvi puhul saadud tulemused; konstantseks loetud tulemused (korratavusega alla 15 %) tuleks keskmistada ja väljendada massiühikutes lahuse ruumala kohta. Selleks võib olla vaja teisendada massiühikud ruumalaühikuteks, kasutades tihedust, kui lahustuvus on väga kõrge (> 100 g/l).
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KOLONN-ELUEERIMISMEETOD
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  eelkatse tulemusi;
               
            
                  —
               
               
                  aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);
               
            
                  —
               
               
                  kõigi proovide kontsentratsiooni, voolukiirust ja pH-d;
               
            
                  —
               
               
                  iga katse kohta vähemalt viie küllastusplatool võetud proovi keskväärtusi ja standardhälbeid;
               
            
                  —
               
               
                  kahe järjestikuse, kriteeriumidele vastava katse keskmist väärtust;
               
            
                  —
               
               
                  vee temperatuuri küllastamisprotsessis;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud analüüsimeetodit;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud tugiaine iseloomu;
               
            
                  —
               
               
                  tugiaine katmisega seotud andmeid;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud lahustit;
               
            
                  —
               
               
                  andmeid aine mis tahes keemilise ebastabiilsuse kohta katse ja kasutatud meetodi tingimustes;
               
            
                  —
               
               
                  kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevaid andmeid.
               
            3.2.   KOLVIMEETOD
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  eelkatse tulemusi;
               
            
                  —
               
               
                  aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);
               
            
                  —
               
               
                  iga üksiku analüüsi tulemust ja tulemuste keskmist, juhul kui ühe kolvi kohta tehti mitu mõõtmist;
               
            
                  —
               
               
                  kõigi proovide pH-d;
               
            
                  —
               
               
                  erinevate, kokkulangevaid tulemusi andnud kolbide puhul mõõdetud tulemuste keskväärtusi;
               
            
                  —
               
               
                  katsetemperatuuri;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud analüüsimeetodit;
               
            
                  —
               
               
                  andmeid aine mis tahes keemilise ebastabiilsuse kohta katse ja kasutatud meetodi tingimustes;
               
            
                  —
               
               
                  kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevaid andmeid.
               
            4.   VIITED
      
                  1.
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2.
               
               
                  NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method.
               
            
                  3.
               
               
                  NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.
               
            
         Liide
         Joonis 1
         Kolonn-elueerimismeetod tsirkulatsioonpumbaga
         
            
         Joonis 2
         Tüüpiline mikrokolonn
         
            (Kõik mõõdud on millimeetrites)
         
         
            
         Joonis 3
         Tüüpiline mikrokolonn
         
            (Kõik mõõdud on millimeetrites)
         
         
            
         Joonis 4
         Kolonn-elueerimismeetod ühtlustava anumaga
         
            
      
      A.8.   JAOTUSTEGUR
      1.   MEETOD
      Kirjeldatud „loksutamismeetod” põhineb OECD katsesuunisel (1).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Katse tegemiseks on kasulik teada aine struktuuri ja dissotsiatsioonikonstanti, lahustuvust vees, hüdrolüüsuvust, lahustuvust oktanoolis ja pindpinevust.
      Sooli moodustavate ainete puhul tuleks mõõtmisi teha ainult vabas olekus ainega (vabal happel või vabal alusel), mis saadakse sobiva puhverlahuse kasutamisel pH-ga vähemalt ühe ühiku võrra alla (vaba happe saamiseks) või üle (vaba aluse saamiseks) vastava pK.
      Katsemeetod sisaldab kaht eraldi protseduuri: loksutamismeetodit ja kõrge eraldusvõimega vedelikkromatograafiat (HPLC). Esimest meetodit kasutatakse ainetel log Pow (mõisteid vt allpool) väärtusega vahemikus –2 kuni 4, viimast ainetel log Pow väärtusega vahemikus 0 kuni 6. Enne kummagi katseprotseduuri rakendamist tuleks varem kindlaks teha jaotusteguri hinnanguline väärtus.
      Loksutamismeetodit saab kasutada ainult puhaste, vees ja oktanoolis lahustuvate ainete puhul. Seda ei saa kasutada pindaktiivsete ainete korral (viimaste puhul tuleks esitada arvutuslikult leitud väärtus või hinnanguline väärtus, mis on leitud üksikute lahustuvuste põhjal oktanoolis ja vees).
      HPLC meetodit ei saa kasutada tugevate hapete ega aluste, metallikomplekside, pindaktiivsete ainete ega eluendiga reageerivate ainete puhul. Nende ainete korral tuleks esitada arvutuslikult leitud väärtus või hinnanguline väärtus, mis on leitud üksikute lahustuvuste põhjal oktanoolis ja vees).
      HPLC meetod on katseühendis olevate lisandite suhtes vähem tundlik kui loksutamismeetod. Sellele vaatamata võivad lisandid tulemuste tõlgendamise keeruliseks muuta, kuna piike ei saa enam kindlalt identifitseerida. Eristamatute piikidega segude puhul tuleks esitada log P ülemine ja alumine piir.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Jaotustegur (P) on määratletud lahustunud aine tasakaalukontsentratsioonide (ci) suhtena kahest praktiliselt segunematust lahustist koosnevas kahefaasilises süsteemis. Oktanooli ja vee puhul:
      
         
      Jaotustegur (P) on seega kahe kontsentratsiooni suhe ja seda väljendatakse harilikult kümnendlogaritmina (log P).
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Loksutamismeetod
      Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.
      HPLC meetod
      Ühendi HPLC mõõtmistulemuste ja tema P väärtuse vastavuse leidmiseks tuleb koostada vähemalt kuue punktiga kaliibrimiskõver telgedes log P vs. HPLC mõõtmistulemused. Sobivad võrdlusained peab valima analüüsi sooritaja. Võimaluse korral peaks üks võrdlusühend olema testainest kõrgema ja üks madalama POW väärtusega. Log P väärtustel alla 4 piisab kaliibrimiseks loksutamismeetodil saadud andmetest. Log P väärtustel üle 4 võib kaliibrimiseks kasutada kirjanduses esitatud andmeid, kui need on kooskõlas arvutuslikult leitud väärtustega. Suurema täpsuse huvides on eelistatav kasutada testainele struktuuriliselt lähedasi võrdlusühendeid.
      Kirjandusest on paljude ainerühmade kohta võimalik leida ulatuslikke andmekogumeid log POW väärtustega (2, 3). Kui samalaadse struktuuriga ühendite jaotustegurite kohta andmed puuduvad, võib kasutada vähem spetsiifilist kaliibrimist muude võrdlusühenditega.
      Liites 2 esitatakse soovitatavate võrdlusainete ja nende POW väärtuste nimekiri.
      1.4.   KATSEMEETODITE PÕHIMÕTE
      1.4.1.   Loksutamismeetod
      Jaotusteguri määramiseks tuleb saavutada kõigi süsteemi vastastiktoimes olevate komponentide tasakaal ja määrata siis kummaski faasis lahustunud ainete kontsentratsioonid. Selleteemalise kirjanduse põhjal on selleks võimalik kasutada mitmeid erinevaid meetodeid; nt kaks faasi segatakse põhjalikult ja eraldatakse seejärel uuritava aine tasakaalukontsentratsiooni määramiseks.
      1.4.2.   HPLC meetod
      HPLC jaoks kasutatakse müügil olevaid analüütilisi kolonne, mille täidiseks on pikkade (nt C8, C18) silikageeliga seotud süsivesinikahelatega tahke faas. Seesugusesse kolonni süstitud kemikaalid liiguvad selles erinevate kiirustega, kuna jaotuvad liikuva faasi ja statsionaarse süsivesinikfaasi vahel erinevalt. Kemikaalide segud elueeruvad oma hüdrofoobsuse järjekorras – vees lahustuvad kemikaalid elueeruvad esimesena ja rasvlahustuvad viimasena, olenevalt oma süsivesiniku-vee jaotustegurist. Nii on retentsiooniaega sellises (pöördfaasilises) kolonnis võimalik seostada oktanooli/vee jaotusteguriga. Jaotustegur leitakse mahtuvustegurist k, mille valem on järgmine:
      
         
      kus tr = testaine retentsiooniaeg ja t0 = keskmine aeg, mille jooksul lahustimolekul läbib kolonni (surnud aeg).
      Kvantitatiivne analüüs pole vajalik, määrata tuleb ainult retentsiooniajad.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      1.5.1.   Korratavus
      Loksutamismeetod
      Leitava jaotusteguri täpsuse tagamiseks tehakse kordusmõõtmised kolmedel erinevatel katsetingimustel, erineva ainekoguse ja erineva lahustite mahu suhtega. Korduskatsetel määratud jaotusteguri väärtused peaksid logaritmina väljendatuna ±0,3 ühiku täpsusega kokku langema.
      HPLC meetod
      Mõõtmistulemuste usaldusväärsuse parandamiseks tuleks teha kordusmõõtmised. Üksikutel mõõtmistel määratud log P väärtused peaksid ±0,1 ühiku täpsusega kokku langema.
      1.5.2.   Tundlikkus
      Loksutamismeetod
      Meetodi mõõtepiirkonna määrab kasutatava analüüsimeetodi avastamispiir. See peaks võimaldama määrata log POW väärtused vahemikus –2 kuni 4 (mõningatel tingimustel võib ülemist piiri nihutada kuni log POW väärtuseni 5) eeldusel, et lahustunud aine kontsentratsioon kummaski faasis ei ületa 0,01 mooli liitris.
      HPLC meetod
      HPLC meetod võimaldab määrata jaotusteguri log POW vahemikus 0–6.
      Üldjuhul langeb selle meetodi abil määratud jaotusteguri logaritmiline väärtus ± 1 ühiku täpsusega kokku loksutamismeetodi abil leitud väärtusega. Tüüpilisi vastavusi võib leida kirjandusest (4, 5, 6, 7, 8). Suurem täpsus on tavaliselt saavutatav samalaadse struktuuriga võrdlusühendite kasutamisel (9).
      1.5.3.   Spetsiifilisus
      Loksutamismeetod
      Nernsti jaotusseadus kehtib ainult konstantsel temperatuuril, rõhul ja pH-l ning ainult lahjendatud lahustes. See kehtib ainult puhta, kahe puhta lahusti vahel dispergeeritud aine puhul. Kui ühes või mõlemas faasis on samal ajal mitu lahustunud ainet, võib see tulemusi mõjutada.
      Lahustunud molekulide dissotsieerumise või assotsieerumisega kaasnevad samuti kõrvalekalded Nernsti jaotusseadusest. Kõrvalekalded väljenduvad sõltuvuse tekkes jaotusteguri ja lahuse kontsentratsiooni vahel.
      Paljude tulemust mõjutavate tasakaalude tõttu ei tohiks seda katsemeetodit dissotsieeruvatel ühenditel vastava paranduseta kasutada. Selliste ühendite puhul tuleks kaaluda puhverlahuse kasutamist vee asemel; puhvri pH peaks vähemalt ühe ühiku võrra erinema aine pKa väärtusest ja arvesse tuleks võtta selle pH mõju antud keskkonnale.
      1.6.   MEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Jaotusteguri esialgne hindamine
      Jaotustegurit on eelistatav hinnata arvutuslikult (vt liidet 1) või testaine lahustuvuse suhte põhjal puhastes lahustites (10).
      1.6.2.   Loksutamismeetod
      1.6.2.1.   Lahustite ettevalmistamine
      Oktanool: jaotusteguri määramisel tuleks kasutada analüüsipuhast lahustit.
      Vesi: kasutada tuleks vett, mis on bidestilleeritud klaas- või kvartsseadmes. Dissotsieeruvate ühendite puhul tuleks vee asemel kasutada puhverlahuseid, juhul kui see on õigustatud.
      
         Märkus
      
      Otse ioonvahetist pärinevat vett kasutada ei tohi.
      1.6.2.1.1.   Lahustite eelküllastamine
      
      Enne jaotustegur määramist tuleks lahustitesüsteemi faasid katsetemperatuuril loksutades üksteise suhtes küllastada. Praktiline lahendus selleks on panna analüüsipuhas oktanool ja vesi kumbki suures pudelis piisava koguse teise lahustiga 24 tunniks mehaanilisele loksutile ja lasta neil seejärel seista faaside eraldumise ja küllastumiseni.
      1.6.2.1.2.   Katseks valmistumine
      
      Kahefaasilise süsteemi kogumaht peaks katseanuma peaaegu täielikult täitma. See aitab vältida kadusid lendumise kaudu. Kasutatavate mahtude suhe ja ainekogused sõltuvad järgmistest asjaoludest:
      
                  —
               
               
                  esialgsest hinnangulisest jaotusteguri väärtusest (vt eespool);
               
            
                  —
               
               
                  analüüsiks vajalikust minimaalsest testaine kogusest ning
               
            
                  —
               
               
                  kontsentratsioonipiirangust 0,01 mol/l kummaski faasis.
               
            Sooritatakse kolm katset. Esimeses kasutatakse arvutatud oktanooli-vee suhet, teises jagatakse see suhe kahega ja kolmandas korrutatakse see suhe kahega (nt 1:1, 1:2, 2:1).
      1.6.2.1.3.   Testaine
      
      Valmistatakse põhilahus veega eelküllastatud oktanoolis. Põhilahuse kontsentratsioon tuleks enne selle jaotusteguri mõõtmisel kasutamist täpselt kindlaks määrata. Lahust tuleks säilitada tingimustes, mis tagavad selle stabiilsuse.
      1.6.2.2.   Katsetingimused
      Katsetemperatuuri tuleks hoida konstantsena (± 1 oC) ja see peaks jääma vahemikku 20–25 oC.
      1.6.2.3.   Mõõtmisprotseduur
      1.6.2.3.1.   Jaotustasakaalu saavutamine
      
      Kõigi katsetingimuste jaoks tuleks kahes eksemplaris ette valmistada vajalikud mõlema lahusti kaalutised koos vajaliku koguse põhilahusega.
      Oktanoolifaase tuleks mõõta mahu järgi. Katseanumaid tuleks loksutada kas sobival loksutil või käsitsi. Tsentrifuugiklaasi kasutamisel on seda soovitatav kiiresti 180o ümber oma risttelje pöörata, nii et sissejäänud õhk tõuseb läbi mõlema faasi. Kogemused on näidanud, et tavaliselt piisab jaotustasakaalu saavutamiseks 50 sellisest pöördest. Kindluse mõttes on soovitatav rakendada 100 pööret viie minuti jooksul.
      1.6.2.3.2.   Faaside eraldamine
      
      Vajaduse korral tuleks segu faaside eraldamiseks tsentrifuugida. Seda tuleks teha toatemperatuuril hoitavas laboritsentrifuugis; mittetermostateeritava tsentrifuugi kasutamisel tuleks tsentrifuugiküvette enne analüüsi vähemalt tund aega tasakaalustada.
      1.6.2.4.   Analüüs
      Jaotusteguri määramiseks tuleb määrata testaine kontsentratsioonid mõlemas faasis. Selleks võib võtta kindla koguse lahust iga katsenõu mõlemast faasist ja analüüsida neid vastavalt valitud meetodile. Arvutada tuleks mõlemas faasis oleva aine koguhulka ja võrrelda seda alguses süsteemi viidud kogusega.
      Proovide võtmisel veefaasist tuleks kasutada meetodit, mille puhul oktanoolifaasi jälgede proovi sattumise oht on minimaalne, näiteks klaassüstlalt eemaldatava nõelaga. Süstal peaks algul olema osaliselt õhuga täidetud. Nõela viimisel läbi oktanoolikihi tuleks õhk õrnalt välja suruda. Küllaldane kogus veefaasi tõmmatakse süstlasse. Süstal tõmmatakse kiirelt lahusest välja ja nõel eemaldatakse. Süstla sisu võib seejärel veefaasi proovina kasutada. Kontsentratsioonid eraldatud faasides tuleks eelistatavalt määrata spetsiifiliste määramismeetodite abil. Sobida võivad näiteks järgmised analüüsimeetodid:
      
                  —
               
               
                  fotomeetrilised meetodid;
               
            
                  —
               
               
                  gaaskromatograafia;
               
            
                  —
               
               
                  kõrge eraldusvõimega vedelikkromatograafia.
               
            1.6.3.   HPLC meetod
      1.6.3.1.   Ettevalmistused
      Seade
      Vajalik on pulseerimisvaba pumba ja sobiva detektoriga vedelikkromatograaf. Soovitatav on kasutada silmusega sisestamisklappi. Polaarsete rühmade esinemine statsionaarses faasis võib HPLC kolonni efektiivsust oluliselt vähendada. Seetõttu peaks polaarsete rühmade sisaldus statsionaarses faasis olema minimaalne (11). Kasutada võib müügil olevaid mikrogranulaarseid pöördfaasilisi täidiseid või valmiskolonne. Sisestamissüsteemi ja analüüsikolonni vahel võib olla kaitsekolonn.
      Liikuvfaas
      Elueerimislahusti valmistatakse HPLC-puhtast metanoolist ja HPLC-puhtast veest ning see degaseeritakse enne kasutamist. Kasutada tuleks isokraatilist elueerimist. Veesisaldus metanooli-vee liikuvfaasides peaks olema vähemalt 25 %. Tavaliselt piisab ühendite, mille log P = 6, elueerimiseks ühe tunni jooksul 1 ml/min voolukiiruse juures metanooli-vee suhtest 3:1 (mahu järgi). Kõrge log P-ga ühendite (ja võrdlusühendite) puhul võib olla vaja retentsiooniaega lühendada, vähendades selleks liikuva faasi polaarsust või kolonni pikkust.
      Oktanoolis väga madala lahustuvusega ühenditel kaldub HPLC meetodi kohaselt leitud log POW väärtus olema ebaharilikult madal; selliste ühendite piigid elueeruvad vahel koos lahusti frondiga. See on tõenäoliselt tingitud asjaolust, et jaotumisprotsess on liiga aeglane, saavutamaks normaalse kestusega HPLC eraldamise jooksul tasakaalu. Usaldusväärse väärtuse saamiseks võib sellisel juhul abi olla voolukiiruse vähendamisest ja/või metanooli-vee suhte alandamisest.
      Katse- ja võrdlusühendite lahustuvus liikuvas faasis peab olema küllaldane nende tuvastamiseks. Metanooli-vee segus võib lisandeid kasutada ainult erandjuhtudel, kuna lisandid muudavad kolonni omadusi. Lisanditega kromatogrammide tegemisel tuleb kasutada teist sama tüüpi kolonni. Kui metanooli-vee eluent ei sobi, võib kasutada muid orgaanilise lahusti ja vee segusid, nt etanooli-vee või atsetonitriili-vee segu.
      Dissotsieeruvate ühendite puhul on eluendi pH kriitilise tähtsusega. See peaks jääma kolonni töövahemikku, mis on tavaliselt 2–8. Soovitatav on kasutada puhverlahust. Hoolikalt tuleks vältida soolade sadestumist ja kolonni omaduste halvenemist, mida tuleb ette mõningate orgaanilise faasi/puhverlahuse segude puhul. HPLC määramisi ei ole silikageelil põhinevate statsionaarsete faasidega pH väärtustel üle 8 soovitatav teha, kuna aluseline liikuv faas võib kolonni omadusi järsult halvendada.
      Lahustunud ained
      Võrdlusühendid peaksid olema võimalikult kõrge puhtusastmega. Uuritavad ja kaliibrimisel kasutatavad ühendid lahustatakse võimaluse korral liikuvas faasis.
      Katsetingimused
      Temperatuur ei tohiks mõõtmiste käigus kõikuda rohkem kui ± 2 K.
      1.6.3.2.   Mõõtmine
      
      Surnud aja t0 arvutamine
      Surnud aega t0 võib määrata kas homoloogilise rea (nt alküülmetüülketoonid) või kolonnis mittepeetuvate orgaaniliste ühendite (nt tiouurea, formamiid) abil. Surnud aja arvutamiseks homoloogilise rea abil süstitakse kolonni vähemalt seitse homoloogilise rea liiget ja määratakse vastavad retentsiooniajad. Töötlemata retentsiooniaja väärtused tr (n c + 1) esitatakse tr (n c) funktsioonina ja leitakse järgmise regressioonivõrrandi lõikepunkt a ja tõus b:
      tr(nc + 1)
          = a + b tr(nc)
         
      
      (nc = süsinikuaatomite arv). Surnud aeg t0 leitakse seejärel järgmisest valemist:
      t0 = a/(1-b)
      Kaliibrimisgraafik
      Järgmise etapina koostatakse sobivate võrdlusühendite log k versus log P korrelatsioonikõver. Praktikas süstitakse ühel ajal 5–10 võrdlusühendit, mille log P jääb eeldatavasse log P vahemikku, ja määratakse retentsiooniajad, eelistatavalt detektorsüsteemiga ühendatud meerikuga integraatori abil. Arvutatakse vastavad logaritmilised mahtuvustegurite väärtused log k ja esitatakse graafiliselt nende sõltuvus loksutamismeetodil leitud log P väärtustest. Kaliibrimine tehakse regulaarsete ajavahemike tagant, vähemalt kord päevas, et võtta arvesse võimalikke kolonni efektiivsuse muutusi.
      Testaine mahtuvusteguri määramine
      Testaine süstitakse võimalikult väikese liikuvfaasi kogusega. Määratakse retentsiooniaeg (soovitatavalt kahe paralleelmääramisena), võimaldades nii arvutada mahtuvustegurit k. Seejärel saab võrdlusühendite korrelatsioonigraafiku põhjal interpoleerida testaine jaotusteguri. Väga kõrgete ja väga madalate jaotustegurite korral tuleb väärtus ekstrapoleerida. Sellisel juhul tuleb hoolikalt silmas pidada regressioonisirge usalduspiiri.
      2.   ANDMED
      Loksutamismeetod
      Määratud log P väärtuste usaldatavust saab kontrollida topeltmääramiste tulemuste keskmise võrdlemisel üldise keskmisega.
      3.   ARUANDLUS
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);
               
            
                  —
               
               
                  kui kumbki meetod ei ole kohaldatav (nt pindaktiivsete ainete puhul), tuleks esitada arvutuslikult leitud väärtus või hinnanguline väärtus, mis on leitud üksikute lahustuvuste põhjal oktanoolis ja vees);
               
            
                  —
               
               
                  kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid, eriti lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmeid ja märkusi.
               
            Loksutamismeetodi puhul:
      
                  —
               
               
                  esialgse hinnangulise määramise tulemust, kui see leiti;
               
            
                  —
               
               
                  määramistemperatuuri;
               
            
                  —
               
               
                  kontsentratsioonide määramisel kasutatud analüüsiprotseduuride andmeid;
               
            
                  —
               
               
                  tsentrifuugimise kestust ja kiirust, kui seda kasutati;
               
            
                  —
               
               
                  mõlemas faasis igal määramisel leitud kontsentratsioone (st kokku 12 kontsentratsiooni väärtust);
               
            
                  —
               
               
                  testaine massi, mõlema faasi mahtu igas katseanumas ja pärast tasakaalustamist kummaski faasis oleva testaine summaarset arvutuslikku kogust;
               
            
                  —
               
               
                  iga katsetingimuste kogumi kohta tuleks esitada jaotusteguri (P) arvutuslikult leitud väärtused ning nende keskmine, samuti kõigi määramiste keskmine. Kui on märke jaotusteguri kontsentratsioonisõltuvusest, tuleks see aruandes ära märkida;
               
            
                  —
               
               
                  esitada tuleks üksikute P väärtuste standardhälve nende keskväärtusest;
               
            
                  —
               
               
                  kõigi määramiste keskmine P väärtus tuleks esitada ka kümnendlogaritmina;
               
            
                  —
               
               
                  arvutuslikku teoreetilist POW väärtust, kui selline väärtus määrati või kui mõõdetud väärtus on suurem kui 104;
               
            
                  —
               
               
                  katses kasutatud vee ja veefaasi pH-d;
               
            
                  —
               
               
                  puhvrite kasutamisel nende vee asemel kasutamise põhjendust, nende koostist, kontsentratsiooni ja pH väärtust ning veefaasi pH väärtust enne ja pärast katset.
               
            HPLC meetodi puhul:
      
                  —
               
               
                  esialgse hinnangulise määramise tulemust, kui see leiti;
               
            
                  —
               
               
                  test- ja võrdlusaineid ja nende puhtust;
               
            
                  —
               
               
                  määramiste temperatuurivahemikku;
               
            
                  —
               
               
                  pH-d, mille juures määramised tehti;
               
            
                  —
               
               
                  andmeid analüüsi- ja kaitsekolonni, liikuva faasi ja kasutatud detektori kohta;
               
            
                  —
               
               
                  kaliibrimisel kasutatud võrdlusühendite retentsiooniandmeid ja kirjanduses esitatud log P väärtusi;
               
            
                  —
               
               
                  sobitatud regressioonisirge (log k versus log P) andmeid;
               
            
                  —
               
               
                  katseühendi keskmisi retentsiooniandmeid ja interpoleeritud log P väärtust;
               
            
                  —
               
               
                  seadmete ja töötingimuste kirjeldust;
               
            
                  —
               
               
                  elueerimisprofiile;
               
            
                  —
               
               
                  kolonni viidud test- ja võrdlusainete koguseid;
               
            
                  —
               
               
                  surnud aega ja selle määramise meetodit.
               
            4.   VIITED
      
                  1.
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2.
               
               
                  C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979.
               
            
                  3.
               
               
                  Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.
               
            
                  4.
               
               
                  L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683.
               
            
                  5.
               
               
                  H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219 (1981).
               
            
                  6.
               
               
                  B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.
               
            
                  7.
               
               
                  W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1.
               
            
                  8.
               
               
                  J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675.
               
            
                  9.
               
               
                  S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, 787.
               
            
                  10.
               
               
                  O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339.
               
            
                  11.
               
               
                  R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479.
               
            
                  12.
               
               
                  A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.
               
            
                  13.
               
               
                  R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977.
               
            
                  14.
               
               
                  NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method.
               
            
                  15.
               
               
                  C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1 459.
               
            
                  16.
               
               
                  A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.
               
            
                  17.
               
               
                  C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16,1 207.
               
            
                  18.
               
               
                  W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1 113.
               
            
                  19.
               
               
                  D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382.
               
            
                  20.
               
               
                  J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979.
               
            
                  21.
               
               
                  R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam 1984,
               
            
                  22.
               
               
                  Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel 1978.
               
            
                  23.
               
               
                  N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.
               
            
         1. liide
         Arvutus-/hindamismeetodid
         SISSEJUHATUS
         Üldise arvutusmeetodite tutvustuse, vastavaid andmeid ja näiteid võib leida raamatust „Handbook of Chemical Property Estimation Methods” (a).
         Arvutuslikke POW väärtusi saab kasutada
         
                     —
                  
                  
                     sobiva katsemeetodi valikul (loksutamismeetod: log POW vahemikus –2 kuni 4, HPLC meetod: log POW vahemikus 0–6);
                  
               
                     —
                  
                  
                     sobivate katsetingimuste valikul (näiteks võrdlusainete valikul HPLC protseduurideks, oktanooli/vee suhte valikul loksutamismeetodi puhul);
                  
               
                     —
                  
                  
                     labori sisekontrollimeetodina võimalike katsevigade avastamiseks;
                  
               
                     —
                  
                  
                     hinnangulise POW väärtuse saamiseks juhtudel, mille puhul katsemeetodeid tehnilistel põhjustel rakendada ei saa.
                  
               HINDAMISMEETOD
         
            Jaotusteguri esialgne hindamine Jaotusteguri hinnangulise väärtuse võib leida testaine lahustuvuse põhjal puhastes lahustites.
         
         Selleks:
         
            
         ARVUTUSMEETODID
         
            Arvutusmeetodite põhimõte
         
         Kõigi arvutusmeetodite kohaselt jagatakse molekul sobivateks alamstruktuurideks, mille kohta on olemas usaldusväärsed log POW osaväärtused. Seejärel arvutatakse terve molekuli log POW, liites kokku funktsionaalrühmadele vastavad osaväärtused ja sisemolekulaarseid vastasmõjusid arvestavad parandusliikmed.
         Rühmakonstantide ja parandusliikmete väärtusi võib leida toodud allikatest (b, c, d, e). Mõnda allikat ajakohastatakse regulaarselt (b).
         Kvaliteedinõuded
         Üldjuhul arvutusmeetodi usaldusväärsus väheneb uuritava ühendi keerukuse kasvades. Madala molaarmassiga lihtsate, ühe või kahe funktsionaalrühmaga molekulide puhul on eeldatav vahe erinevate, funktsionaalrühmade osaväärtusi arvestavate meetodite abil leitud ning mõõdetavate log POW väärtuste vahel 0,1–0,3 ühikut. Keerukamate molekulide puhul võib veapiir olla suurem. See sõltub nii saadaval olevate rühmakonstantide usaldusväärsusest kui ka oskusest hinnata sisemolekulaarseid vastasmõjusid (nt vesiniksidemeid) ja kasutada vastavaid parandusliikmeid (viimane probleem ei ole arvutitarkvara CLOGP-3 kasutamisel eriti oluline) (b). Dissotsieeruvate ühendite puhul on oluline arvestada õigesti dissotsiatsiooniastet ja vastava iooni laengut.
         Arvutuskäik
         Hanschi π-meetod
         Algne hüdrofoobse asendaja konstant π, mille võtsid kasutusele Fujita jt (f), määratletakse järgmiselt:
         πx = log Pow (PhX) - log Pow (PhH)
         kus POW (PhX) on aromaatse derivaadi jaotustegur ja POW (PhH) lähteaine jaotustegur.
         (e.g. πCl = log Pow (C6H5Cl) - log Pow (C6H6) = 2,84 - 2,13 = 0,71).
         Vastavalt määratlusele on π-meetod kohaldatav peamiselt aromaatsetele asendussaadustele. Paljude asendajate π-väärtused on esitatud koondtabelitena (b, c, d). Neid kasutatakse aromaatsete molekulide või alamstruktuuride log POW arvutamisel.
         Rekkeri meetod
         Rekkeri (g) järgi arvutatakse log POW väärtus järgmiselt:
         
            
         kus fi tähistab erinevaid rühmakonstante ja ai nende esinemissagedust uuritavas molekulis. Parandusliikmed võib väljendada summaarselt konstandi Cm (nn maagilise konstandi) korrutisena. Rühmakonstandid fi ja Cm leiti mitme muutujaga regressioonianalüüsi abil 825 ühendi 1 054 eksperimentaalse POW väärtuse põhjal (c, h). Vastasmõju arvestavad liikmed määratakse vastavalt kirjanduses toodud eeskirjadele (e, h, i).
         Hanschi-Leo meetod
         Hanschi ja Leo (c) järgi arvutatakse log POW väärtus järgmiselt:
         
            
         kus fi tähistab erinevaid rühmakonstante, Fj parandusliikmeid ja ai, bj vastavaid esinemissagedusi. Paljude eksperimentaalsete POW väärtuste põhjal koostati katse-eksituse meetodil aatomite ja funktsionaalrühmade osaväärtuste ning parandusliikmete Fj (nn faktorite) nimekiri. Parandusliikmed on jagatud mitmesse eri klassi (a, c). Kõigi reeglite ja parandusliikmete arvestamine on suhteliselt keerukas ja aeganõudev. Selleks otstarbeks on välja töötatud vastavad tarkvarapaketid (b).
         Kombineeritud meetod
         Keerukate molekulide log POW arvutamise täpsust on oluliselt võimalik suurendada, kui jagada molekul suuremateks alamstruktuurideks, mille kohta on olemas usaldusväärsed log POW väärtused kas tabelites (b), (c) või on need saadud isiklikel mõõtmistel. Selliseid fragmente (nt heterotsükleid, antrakinooni, asobenseeni) võib seejärel kombineerida Hanschi π-väärtuste või Rekkeri või Leo rühmakonstantidega.
         Märkused
         
                     i)
                  
                  
                     Osaliselt või täielikult dissotsieerunud ühenditele saab arvutusmeetodeid kohaldada ainult juhul, kui on võimalik arvestada vajalikke parandustegureid.
                  
               
                     ii)
                  
                  
                     Kui võib eeldada sisemolekulaarsete vesiniksidemete olemasolu, tuleb vastavad parandusliikmed liita (ligikaudu +0,6 kuni +1,0 log POW ühikut) (a). Viiteid selliste sidemete olemasolu kohta võib leida molekuli ruumilistest mudelitest või spektroskoopilistest andmetest.
                  
               
                     iii)
                  
                  
                     Kui võimalik on mitu tautomeerset vormi, kasutatakse arvutustes kõige suurema tõenäosusega vormi.
                  
               
                     iv)
                  
                  
                     Hoolikalt tuleks jälgida muudatusi rühmakonstantide tabelites.
                  
               Aruanne
         Arvutus-/hindamismeetodite kasutamisel peaks katsearuanne võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:
         
                     —
                  
                  
                     aine kirjeldust (segu, lisandid jne);
                  
               
                     —
                  
                  
                     märkeid võimalike sisemolekulaarsete vesiniksidemete, dissotsiatsiooni, laengu ja mis tahes muude ebaharilike nähtuste kohta (nt tautomeeria);
                  
               
                     —
                  
                  
                     arvutusmeetodi kirjeldust;
                  
               
                     —
                  
                  
                     märget kasutatud andmebaasi kohta või andmebaasi ennast;
                  
               
                     —
                  
                  
                     lahknevusi tavapärasest fragmentide valikust;
                  
               
                     —
                  
                  
                     põhjalikku arvutusdokumentatsiooni.
                  
               KIRJANDUS
         
                     a)
                  
                  
                     W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.
                  
               
                     b)
                  
                  
                     Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).
                  
               
                     c)
                  
                  
                     C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.
                  
               
                     d)
                  
                  
                     A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.
                  
               
                     e)
                  
                  
                     R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 1979, vol. 14,479.
                  
               
                     f)
                  
                  
                     T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.
                  
               
                     g)
                  
                  
                     R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.
                  
               
                     h)
                  
                  
                     C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12,1459.
                  
               
                     i)
                  
                  
                     R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.
                  
               
      
         2.liide
         Soovitatavad võrdlusained HPLC meetodi puhul
         
                     Nr
                  
                  
                     Võrdlusaine
                  
                  
                     log POW
                     
                  
                  
                     pKa
                  
               
                     1
                  
                  
                     2-butanoon
                  
                  
                     0,3
                  
                  
                      
                  
               
                     2
                  
                  
                     4-atsetüülpüridiin
                  
                  
                     0,5
                  
                  
                      
                  
               
                     3
                  
                  
                     Aniliin
                  
                  
                     0,9
                  
                  
                      
                  
               
                     4
                  
                  
                     Atseetaniliid
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                      
                  
               
                     5
                  
                  
                     Bensüülalkohol
                  
                  
                     1,1
                  
                  
                      
                  
               
                     6
                  
                  
                     p-metoksüfenool
                  
                  
                     1,3
                  
                  
                     pKa = 10,26
                  
               
                     7
                  
                  
                     Fenoksüäädikhape
                  
                  
                     1,4
                  
                  
                     pKa = 3,12
                  
               
                     8
                  
                  
                     Fenool
                  
                  
                     1,5
                  
                  
                     pKa = 9,92
                  
               
                     9
                  
                  
                     2,4-dinitrofenool
                  
                  
                     1,5
                  
                  
                     pKa = 3,96
                  
               
                     10
                  
                  
                     Bensonitriil
                  
                  
                     1,6
                  
                  
                      
                  
               
                     11
                  
                  
                     Fenüülatsetonitriil
                  
                  
                     1,6
                  
                  
                      
                  
               
                     12
                  
                  
                     4-metüülbensüülalkohol
                  
                  
                     1,6
                  
                  
                      
                  
               
                     13
                  
                  
                     Atsetofenoon
                  
                  
                     1,7
                  
                  
                      
                  
               
                     14
                  
                  
                     2-nitrofenool
                  
                  
                     1,8
                  
                  
                     pKa = 7,17
                  
               
                     15
                  
                  
                     3-nitrobensoehape
                  
                  
                     1,8
                  
                  
                     pKa = 3,47
                  
               
                     16
                  
                  
                     4-kloroaniliin
                  
                  
                     1,8
                  
                  
                     pKa = 4,15
                  
               
                     17
                  
                  
                     Nitrobenseen
                  
                  
                     1,9
                  
                  
                      
                  
               
                     18
                  
                  
                     Kaneelalkohol
                  
                  
                     1,9
                  
                  
                      
                  
               
                     19
                  
                  
                     Bensoehape
                  
                  
                     1,9
                  
                  
                     pKa = 4,19
                  
               
                     20
                  
                  
                     p-kresool
                  
                  
                     1,9
                  
                  
                     pKa = 10,17
                  
               
                     21
                  
                  
                     Kaneelhape
                  
                  
                     2,1
                  
                  
                     pKa = 3,89 cis 4,44 trans
                  
               
                     22
                  
                  
                     Anisool
                  
                  
                     2,1
                  
                  
                      
                  
               
                     23
                  
                  
                     Metüülbensoaat
                  
                  
                     2,1
                  
                  
                      
                  
               
                     24
                  
                  
                     Benseen
                  
                  
                     2,1
                  
                  
                      
                  
               
                     25
                  
                  
                     3-metüülbensoehape
                  
                  
                     2,4
                  
                  
                     pKa = 4,27
                  
               
                     26
                  
                  
                     4-klorofenool
                  
                  
                     2,4
                  
                  
                     pKa = 9,1
                  
               
                     27
                  
                  
                     Trikloroetüleen
                  
                  
                     2,4
                  
                  
                      
                  
               
                     28
                  
                  
                     Atrasiin
                  
                  
                     2,6
                  
                  
                      
                  
               
                     29
                  
                  
                     Etüülbensoaat
                  
                  
                     2,6
                  
                  
                      
                  
               
                     30
                  
                  
                     2,6-diklorobensonitriil
                  
                  
                     2,6
                  
                  
                      
                  
               
                     31
                  
                  
                     3-klorobensoehape
                  
                  
                     2,7
                  
                  
                     pKa = 3,82
                  
               
                     32
                  
                  
                     Tolueen
                  
                  
                     2,7
                  
                  
                      
                  
               
                     33
                  
                  
                     1-naftool
                  
                  
                     2,7
                  
                  
                     pKa = 9,34
                  
               
                     34
                  
                  
                     2,3-dikloroaniliin
                  
                  
                     2,8
                  
                  
                      
                  
               
                     35
                  
                  
                     Klorobenseen
                  
                  
                     2,8
                  
                  
                      
                  
               
                     36
                  
                  
                     Allüülfenüüleeter
                  
                  
                     2,9
                  
                  
                      
                  
               
                     37
                  
                  
                     Bromobenseen
                  
                  
                     3,0
                  
                  
                      
                  
               
                     38
                  
                  
                     Etüülbenseen
                  
                  
                     3,2
                  
                  
                      
                  
               
                     39
                  
                  
                     Bensofenoon
                  
                  
                     3,2
                  
                  
                      
                  
               
                     40
                  
                  
                     4-fenüülfenool
                  
                  
                     3,2
                  
                  
                     pKa = 9,54
                  
               
                     41
                  
                  
                     Tümool
                  
                  
                     3,3
                  
                  
                      
                  
               
                     42
                  
                  
                     1,4-diklorobenseen
                  
                  
                     3,4
                  
                  
                      
                  
               
                     43
                  
                  
                     Difenüülamiin
                  
                  
                     3,4
                  
                  
                     pKa = 0,79
                  
               
                     44
                  
                  
                     Naftaleen
                  
                  
                     3,6
                  
                  
                      
                  
               
                     45
                  
                  
                     Fenüülbensoaat
                  
                  
                     3,6
                  
                  
                      
                  
               
                     46
                  
                  
                     Isopropüülbenseen
                  
                  
                     3,7
                  
                  
                      
                  
               
                     47
                  
                  
                     2,4,6-triklorofenool
                  
                  
                     3,7
                  
                  
                     pKa = 6
                  
               
                     48
                  
                  
                     Bifenüül
                  
                  
                     4,0
                  
                  
                      
                  
               
                     49
                  
                  
                     Bensüülbensoaat
                  
                  
                     4,0
                  
                  
                      
                  
               
                     50
                  
                  
                     2,4-dinitro-6-sec-butüülfenool
                  
                  
                     4,1
                  
                  
                      
                  
               
                     51
                  
                  
                     1,2,4-triklorobenseen
                  
                  
                     4,2
                  
                  
                      
                  
               
                     S2
                  
                  
                     Dodekaanhape
                  
                  
                     4,2
                  
                  
                      
                  
               
                     53
                  
                  
                     Difenüüleeter
                  
                  
                     4,2
                  
                  
                      
                  
               
                     54
                  
                  
                     Butüülbenseen
                  
                  
                     4,5
                  
                  
                      
                  
               
                     55
                  
                  
                     Fenantreen
                  
                  
                     4,5
                  
                  
                      
                  
               
                     56
                  
                  
                     Fluoranteen
                  
                  
                     4,7
                  
                  
                      
                  
               
                     57
                  
                  
                     Dibensüül
                  
                  
                     4,8
                  
                  
                      
                  
               
                     58
                  
                  
                     2,6-difenüülpüridiin
                  
                  
                     4,9
                  
                  
                      
                  
               
                     59
                  
                  
                     Trifenüülamiin
                  
                  
                     5,7
                  
                  
                      
                  
               
                     60
                  
                  
                     DDT
                  
                  
                     6,2
                  
                  
                      
                  
               
                     Muud madala log POW väärtusega võrdlusained
                  
               
                     1
                  
                  
                     Nikotiinhape
                  
                  
                     -0,07
                  
                  
                      
                  
               
      A.9.   LEEKPUNKT
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Katse tegemiseks on kasulik teada aine süttivust. Katsemeetod sobib vedelikele, mille aurud võivad süüteallika abil süttida. Siintoodud katsemeetodid annavad usaldusväärseid tulemusi ainult iga meetodi puhul märgitud leekpunkti vahemikus.
      Kasutatava meetodi valikul tuleks arvestada keemiliste reaktsioonide võimalusega aine ja proovianuma vahel.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Leekpunkt on madalaim, normaalrõhule 101,325 kPa normaliseeritud temperatuur, mille juures eraldub vedelikust katsemeetodis määratletud tingimustel aure sellises koguses, et katseanumas tekib süttiv auru/õhu segu.
      Ühikud: oC
      t = T – 273,15
      (t ( oC) ja T (K))
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Aine viiakse katseanumasse ja soojendatakse või jahutatakse iga meetodi puhul kirjeldatud protseduuri kohaselt katsetemperatuurini. Veendumaks, kas proov katsetemperatuuril süttib või mitte, tehakse süütamiskatsed.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      1.5.1.   Korratavus
      Korratavus varieerub vastavalt leekpunkti vahemikule ja kasutatavale katsemeetodile; maksimum on 2 oC.
      1.5.2.   Tundlikkus
      Tundlikkus sõltub kasutatavast katsemeetodist.
      1.5.3.   Spetsiifilisus
      Osade katsemeetodite spetsiifilisus piirdub kindlate leekpunkti vahemikega ja sõltub ainespetsiifilistest omadustest (nt kõrge viskoossus).
      1.6.   MEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Ettevalmistused
      Testaine proov viiakse punktidele 1.6.3.1 ja/või 1.6.3.2 vastavasse katseseadmesse.
      Ohutuse huvides on kõrge siseenergiaga või mürgiste ainete puhul soovitatav kasutada väikest proovikogust, u 2 cm3, kasutavaid meetodeid.
      1.6.2.   Katsetingimused
      Kui see ei ole vastuolus ohutusnõuetega, tuleks katseseade paigaldada tõmbevabasse asukohta.
      1.6.3.   Katse tegemine
      1.6.3.1.   Tasakaaluline meetod
      Vt ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.
      1.6.3.2.   Mittetasakaaluline meetod
      Abeli seade
      Vt BS 2000, 170. osa, NF M07-011, NF T66-009.
      Abel-Pensky seade
      Vt EN 57, DIN 51755, 1. osa (temperatuuridele 5–65 oC), DIN 51755, 2. osa (temperatuuridele alla 5 oC), NF M07-036.
      Tagi seade
      Vt ASTM D 56.
      Pensky-Martensi seade
      Vt ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.
      Märkused
      Kui mittetasakaalulise meetodiga (1.6.3.2) määratud leekpunkt on 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC või 55 ± 2 oC, tuleb saadud tulemust kinnitada sama seadmega ja tasakaalulise meetodi abil.
      Teavitamiseks võib kasutada ainult meetodeid, mille abil saab määrata leekpunkti temperatuuri.
      Viskoossete, lahusteid sisaldavate vedelike (värvid, kummid jms) leekpunkti määramiseks võib kasutada ainult viskoossete vedelike leekpunkti määramiseks ette nähtud seadmeid ja katsemeetodeid.
      Vt ISO 3679, ISO 368O, ISO 1523, DIN 53213, 1. osa.
      
                  2.
               
               
                  ANDMED
               
            3.   ARUANDLUS
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud meetodit ja võimalikke kõrvalekaldeid sellest;
               
            
                  —
               
               
                  kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid andmeid ja lisamärkusi.
               
            4.   VIITED
      Puuduvad.
      A.10.   SÜTTIVUS (TAHKED AINED)
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Katse tegemiseks on kasulik teada aine võimalikku plahvatusohtlikkust.
      Käesolevat katset tuleks kasutada ainult pulbriliste, teraliste või pastataoliste ainete puhul.
      Et mitte hõlmata kõiki süttivaid aineid, vaid ainult kiiresti põlevaid või eriti ohtlike põlemisomadustega aineid, loetakse väga tuleohtlikuks ainult neid aineid, mille põlemiskiirus ületab teatava piirväärtuse.
      Eriti ohtlik võib olla hõõgumise levik läbi metallipuru, kuna see raskendab tule kustutamist. Metallipulbrid tuleks lugeda väga tuleohtlikuks, kui hõõgumisprotsess levib teatava aja jooksul läbi kogu pulbri massi.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Põlemisaeg sekundites.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Nimetamata.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Ainest moodustatakse umbes 250 mm pikkune katkestusteta pulbririba ja tehakse esialgne sõelkatse kontrollimaks, kas gaasileegiga süütamisel levib põlemisprotsess leegi või hõõgumisena edasi. Kui põlemisprotsess levib kindlaksmääratud aja jooksul läbi 200 mm riba, viiakse põlemiskiiruse määramiseks läbi täiemahuline katseprogramm.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Täpsustamata.
      1.6.   MEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Esialgne sõelkatse
      Ainest moodustatakse mittesüttivale, mittepoorsele ja madala soojusjuhtivusega alusplaadile umbes 250 mm pikkune, 20 mm laiune ja 10 mm kõrgune katkestusteta pulbririba. Pulbririba ühele otsale suunatakse pulbri süttimiseni või kuni kaheks minutiks (metallide või metallisulamite pulbrite puhul viieks minutiks) vähemalt 5 mm läbimõõduga gaasipõleti leek. Tehakse kindlaks, kas põlemisprotsess läbib neljaminutilise (metallipulbrite puhul 40minutilise) katseaja jooksul 200 mm ribaosa. Kui pulber ei sütti või põlemisprotsess (leek või hõõgumine) ei läbi neljaminutilise (või 40minutilise) katseaja jooksul 200 mm pulbririba, ei loeta ainet väga tuleohtlikuks ja rohkem katseid sellega ei tehta. Kui põlemisprotsess läbib 200 mm pulbririba vähem kui nelja minutiga või metallipulbrite puhul vähem kui 40 minutiga, viiakse läbi allpool kirjeldatud protseduur (punkt 1.6.2 ja järgmised punktid).
      1.6.2.   Põlemiskiiruse katse
      1.6.2.1.   Ettevalmistused
      250 mm pikk, kolmnurkse läbilõikega, 10 mm sisemise kõrguse ja 20 mm sisemise laiusega vorm täidetakse tihendamata pulbrilise või teralise ainega. Vormi kummalegi küljele paigaldatakse pikisuunas külgpiiranguteks kaks metallplaati, mis ulatuvad 2 mm üle kolmnurkse vao ülaääre (vt joonist). Vorm kukutatakse seejärel kolm korda 2 cm kõrguselt kõvale aluspinnale. Vajaduse korral täidetakse vorm seejärel uuesti. Külgmised piirangud eemaldatakse ja liigne aine kaabitakse ära. Vormi peale paigaldatakse seejärel mittesüttiv, mittepoorne ja madala soojusjuhtivusega alusplaat, keeratakse vorm koos plaadiga ümber ja eemaldatakse vorm.
      Pastataolistest ainetest moodustatakse mittesüttivale, mittepoorsele ja madala soojusjuhtivusega alusplaadile 250 mm pikkune, umbes 1 cm2 läbilõikepindalaga riba.
      1.6.2.2.   Katsetingimused
      Niiskustundlike ainete puhul tehakse katse võimalikult kiiresti pärast aine hoiunõust eemaldamist.
      1.6.2.3.   Katse tegemine
      Riba paigutatakse tõmbekapi alla õhu liikumise suunaga risti.
      Õhu liikumise kiirus peab olema piisav, takistamaks suitsu levikut laborisse, ning seda tuleb katse jooksul konstantsena hoida. Seadme ümber tuleks paigaldada tõmbevari.
      Riba üks ots süüdatakse vähemalt 5 mm läbimõõduga gaasipõleti leegi abil. Kui riba on 80 mm ulatuses põlenud, mõõdetakse järgneva 100 mm kestel põlemiskiirus.
      Katset korratakse kuus korda, iga kord puhta jaheda alusplaadiga, välja arvatud juhul, kui ühel katsel on juba saadud positiivne tulemus.
      2.   ANDMED
      Hindamisel on vajalikud esialgse sõelkatse (1.6.1) põlemisaeg ja kuni kuuel põhikatsel (1.6.2.3) leitud lühim põlemisaeg.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);
               
            
                  —
               
               
                  katseaine kirjeldust, füüsikalist olekut ja niiskusesisaldust;
               
            
                  —
               
               
                  esialgse sõelkatse ja põlemiskiiruse katse tulemusi (kui see tehti);
               
            
                  —
               
               
                  kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.
               
            3.2.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE
      Pulbrilised, teralised või pastataolised ained loetakse väga tuleohtlikuks, kui nende põlemisaeg punktis 1.6.2 kirjeldatud mis tahes katseprotseduuris on alla 45 sekundi. Metallide või metallisulamite pulbrid loetakse väga tuleohtlikuks juhul, kui need süttivad ja leek või reaktsioonivöönd levib kümne minutiga või kiiremini üle kogu proovi.
      4.   VIITED
      1. NF T 20-042 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.
      
         Liide
         Joonis
         Põlemisriba valmistamise vorm ja abivahendid
         (Kõik mõõdud on millimeetrites)
         
            
      
      A.11.   SÜTTIVUS (GAASID)
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      See meetod võimaldab määrata õhuga segunenud gaaside süttivust toatemperatuuril (u 20 oC) ja atmosfäärirõhul ning süttivate gaaside puhul kontsentratsioonivahemikku, milles nad süttivad. Järjest suurenevate kontsentratsioonidega katsegaasi-õhu segudes tekitatakse elektrisäde ja jälgitakse, kas gaas süttib.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Süttimispiirkond on kontsentratsioonivahemik alumise ja ülemise plahvatuspiiri vahel. Alumine ja ülemine plahvatuspiir on piirkontsentratsioonid, mille puhul leek õhuga segatud gaasis ei levi.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Nimetamata.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Gaasi kontsentratsiooni õhus suurendatakse järk-järgult ja igas etapis tekitatakse segus elektrisäde.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Täpsustamata.
      1.6.   MEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Seade
      Katseanumaks on kummuli klaassilinder sisediameetriga vähemalt 50 mm ja kõrgusega vähemalt 300 mm. 3–5 mm vahekaugusega süüteelektroodid paigutatakse 60 mm kõrgusele silindri põhjast. Silindril on survepääsuklapiga ava. Plahvatuskahjustuste vältimiseks tuleb seade varjestada.
      Süüteallikana kasutatakse püsivat 0,5 s kestusega induktsioonsädet, mis tekitatakse 10–15 kV väljundpingega kõrgepingetrafo (maksimaalne sisendvõimsus 300 W) abil. Sobivat seadet on näiteks kirjeldatud viites 2.
      1.6.2.   Katsetingimused
      Katse viiakse läbi toatemperatuuril (u 20 oC).
      1.6.3.   Katse tegemine
      Doseerpumpade abil viiakse klaassilindrisse kindla kontsentratsiooniga gaasi-õhu segu. Segus tekitatakse säde ja jälgitakse, kas süüteallikast eraldub leek ja levib gaasis iseseisvalt. Gaasikontsentratsiooni muudetakse 1 % kaupa kuni eespool kirjeldatud süttimise toimumiseni.
      Kui gaasi keemiline struktuur viitab mittesüttivusele ja on võimalik välja arvutada stöhhiomeetrilise gaasiõhu segu koostis, siis kontrollitakse selliste 1 % astmetega ainult segusid kontsentratsioonivahemikus 10 % alla ja 10 % üle stöhhiomeetrilise kontsentratsiooni.
      2.   ANDMED
      Ainus selle omaduse määramisel oluline teave on leegi levimine.
      3.   ARUANDLUS
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud seadme kirjeldust koos mõõtmetega;
               
            
                  —
               
               
                  katsetemperatuuri;
               
            
                  —
               
               
                  katsekontsentratsioone ja saadud tulemusi;
               
            
                  —
               
               
                  katse tulemust: mittesüttiv gaas või väga tuleohtlik gaas;
               
            
                  —
               
               
                  kui järeldatakse, et gaas on mittesüttiv, tuleks ära märkida kontsentratsioonivahemik, milles seda 1 % sammude kaupa testiti;
               
            
                  —
               
               
                  registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamisega seonduvad andmed ja märkused.
               
            4.   VIITED
      
                  1.
               
               
                  NF T 20-041 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases.
               
            
                  2.
               
               
                  W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. Redeker und H. Schacke. Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech. 1984, vol 56, 2, 126-127.
               
            A.12.   SÜTTIVUS (KOKKUPUUTEL VEEGA)
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Meetodi abil saab kontrollida, kas aine reaktsioonil vee või niiske õhuga tekib ohtlikus koguses gaasi või gaase, mis võivad olla väga tuleohtlikud.
      Katsemeetod on kohaldatav nii tahketele kui ka vedelatele ainetele. Meetod ei ole kohaldatav ainetele, mis kokkupuutel õhuga iseeneslikult süttivad.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Väga tuleohtlik: ained, mis kokkupuutel vee või niiske õhuga eraldavad ohtlikus koguses väga tuleohtlikke gaase kiirusega vähemalt 1 liiter/kg kohta tunnis.
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Ainet kontrollitakse vastavalt allpool esitatud etapiviisilisele eeskirjale; kui mis tahes etapis leiab aset süttimine, pole edasine kontrollimine vajalik. Kui on teada, et aine veega ägedalt ei reageeri, jätkatakse 4. etapiga (1.3.4).
      1.3.1.   1. etapp
      Testaine viiakse 20 oC destilleeritud vett sisaldavasse süvendisse ja kontrollitakse, kas tekkiv gaas süttib.
      1.3.2.   2. etapp
      Testaine kantakse 20 oC destilleeritud vett sisaldavas tassis ujuvale filterpaberile ja kontrollitakse, kas tekkiv gaas süttib. Filterpaberi ainus ülesanne on ainet koos hoida ja süttimise tõenäosust suurendada.
      1.3.3.   3. etapp
      Testainest moodustatakse ligikaudu 2 cm kõrgune ja 3 cm läbimõõduga kuhi. Kuhjale lisatakse mõned tilgad vett ja kontrollitakse, kas tekkiv gaas süttib.
      1.3.4.   4. etapp
      Testaine segatakse 20 oC destilleeritud veega ja mõõdetakse seitsme tunni jooksul ühetunniste vahedega gaasi eraldumise kiirust. Kui gaas eraldub ebaühtlase kiirusega või kiirus kasvab veel seitsme tunni pärast, pikendatakse mõõtmisaega kuni viie päevani. Kui kiirus ületab mis tahes ajahetkel 1 liitri/kg kohta tunnis, võib katse peatada.
      1.4.   VÕRDLUSAINED
      Nimetamata.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Täpsustamata.
      1.6.   MEETODITE KIRJELDUS
      1.6.1.   1. etapp
      1.6.1.1.   Katsetingimused
      Katse tehakse toatemperatuuril (u 20 oC).
      1.6.1.2.   Katse tegemine
      Väike (ligikaudu 2 mm läbimõõduga) kogus testainet viiakse destilleeritud vett sisaldavasse süvendisse. Kontrollitakse, kas i) eraldub gaasi ja ii) kas gaas süttib. Kui gaas süttib, pole edasine uurimine vajalik, kuna aine loetakse ohtlikuks.
      1.6.2.   2. etapp
      1.6.2.1.   Seade
      Mis tahes sobivas nõus, näiteks 100 mm läbimõõduga aurustuskausis, asetatakse destilleeritud vee pinnale filterpaber.
      1.6.2.2.   Katsetingimused
      Katse tehakse toatemperatuuril (u 20 oC).
      1.6.2.3.   Katse tegemine
      Väike (ligikaudu 2 mm läbimõõduga) kogus testainet kantakse filterpaberi keskkohta. Kontrollitakse, kas i) eraldub gaasi ja ii) kas gaas süttib. Kui gaas süttib, pole edasine uurimine vajalik, kuna aine loetakse ohtlikuks.
      1.6.3.   3. etapp
      1.6.3.1.   Katsetingimused
      Katse tehakse toatemperatuuril (u 20 oC).
      1.6.3.2.   Katse tegemine
      Testainest moodustatakse ligikaudu 2 cm kõrgune ja 3 cm läbimõõduga kuhi süvendiga tipus. Auku lisatakse mõned tilgad vett ja kontrollitakse, kas i) eraldub gaasi ja ii) kas gaas süttib. Kui gaas süttib, pole edasine uurimine vajalik, kuna aine loetakse ohtlikuks.
      1.6.4.   4. etapp
      1.6.4.1.   Seade
      Katseseade valmistatakse vastavalt joonisele.
      1.6.4.2.   Katsetingimused
      Kontrollida, kas testaine hoiuanumas leidub < 500 μm suuruseid osakesi sisaldavat pulbrit. Kui sellise pulbri sisaldus koguhulgas on üle 1 % mahu järgi või kui materjal on pude, tuleks kogu aine enne katsetusi pulbriks jahvatada, et arvestada osakeste suuruse vähenemisega ladustamisel ja käitlemisel; vastasel juhul uuritakse ainet töötlemata kujul. Katse tuleks teha toatemperatuuril (u 20 oC) ja atmosfäärirõhul.
      1.6.4.3.   Katse tegemine
      Seadme tilklehtrisse viiakse 10–20 ml vett ja seadme koonilisse kolbi viiakse 10 g ainet. Eralduva gaasi ruumala mõõdetakse mis tahes sobiva meetodiga. Tilklehtri kraan avatakse, nii et vesi pääseb koonilisse kolbi, ja käivitatakse stopper. Gaasi eraldumise kiirust mõõdetakse seitsme tunni jooksul ühetunniste vahedega. Kui gaasi eraldumise kiirus on selle aja kestel ebaühtlane või kasvab veel selle ajavahemiku lõpus, pikendatakse mõõtmisaega kuni viie päevani. Kui gaasi eraldumise kiirus ületab mis tahes ajahetkel 1 liitri/kg kohta tunnis, võib katse peatada. Tuleks teha kolm paralleelkatset.
      Kui ei ole teada, mis gaasiga on tegemist, tuleks seda analüüsida. Kui gaas sisaldab väga tuleohtlikke komponente ja ei ole teada, kas summaarne segu on väga tuleohtlik, tuleb valmistada sama koostisega segu ja kontrollida seda vastavalt meetodile A.11.
      2.   ANDMED
      Aine loetakse ohtlikuks kui
      
                  —
               
               
                  mis tahes katseetapis leiab aset iseeneslik süttimine
                  või
               
            
                  —
               
               
                  eraldub tuleohtlikke gaase kiirusega vähemalt 1 liiter/kg aine kohta tunnis.
               
            3.   ARUANDLUS
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);
               
            
                  —
               
               
                  testaine ettevalmistamise andmeid;
               
            
                  —
               
               
                  katsete tulemusi (1., 2., 3. ja 4. etapp);
               
            
                  —
               
               
                  eralduva gaasi keemilist koostist;
               
            
                  —
               
               
                  4. etapi (1.6.4) käigus gaasi eraldumise kiirust;
               
            
                  —
               
               
                  kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.
               
            4.   VIITED
      
                  1.
               
               
                  Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York.
               
            
                  2.
               
               
                  NF T 20-040 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.
               
            
         Liide
         Joonis
         Seade
         
            
      
      A.13.   TAHKETE AINETE JA VEDELIKE ISESÜTTIVUS
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Katsemeetod on kohaldatav tahketele ja vedelatele ainetele, mis väikestes kogustes toatemperatuuril (u 20 oC) õhuga kokku puutudes lühikese aja jooksul iseeneslikult süttivad.
      Katsemeetod ei hõlma aineid, mis peavad iseeneslikuks süttimiseks toatemperatuuril või kõrgemal temperatuuril õhuga kokku puutuma mitu tundi või päeva.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Ained loetakse isesüttivateks, kui need süttivad või söestuvad punktis 1.6 kirjeldatud tingimustel.
      Vedelike isesüttivust võib vaja olla kontrollida ka meetodi A.15 „Isesüttimistemperatuur (vedelikud ja gaasid)” kohaselt.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Nimetamata.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Tahke aine või vedelik kantakse inertsele tugiainele ja viiakse toatemperatuuril viieks minutiks kokkupuutesse õhuga. Kui vedelik sellistes tingimustes ei sütti, imetakse see filterpaberisse ja viiakse toatemperatuuril (u 20 oC) viieks minutiks kokkupuutesse õhuga. Kui tahke aine või vedelik süttib või kui vedelik süütab või söestab filterpaberi, loetakse aine isesüttivaks.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Korratavus: kuna ohutus on oluline, loetakse aine isesüttivaks juba siis, kui üks tulemus on positiivne.
      1.6.   MEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Seade
      Umbes 10 cm läbimõõduga portselantass täidetakse toatemperatuuril (u 20 oC) umbes 5 mm kõrguselt diatomiitmullaga.
      Märkus
      Diatomiitmulla või mis tahes muu saadaval oleva võrreldava inertse ainega simuleeritakse mulda, millesse testaine õnnetusjuhtumi korral võib voolata.
      Inertsel kandjal õhuga kokku puutudes mittesüttivate vedelike testimiseks on vaja filterpaberit.
      1.6.2.   Katse tegemine
      a)   Pulbrilised tahked ained
      1–2 cm3 uuritavat pulbrit valatakse u 1 m kõrguselt mittesüttivale pinnale ja jälgitakse, kas aine süttib kukkumisel või mahalangemisest viie minuti jooksul.
      Katset korratakse kuus korda, kui aine enne ei sütti.
      b)   Vedelikud
      U 5 cm3 uuritavat vedelikku valatakse ette valmistatud portselantassi ja jälgitakse, kas aine süttib viie minuti jooksul.
      Kui aine kuue katse jooksul ei sütti, tuleb teha järgmised katsed:
      0,5 ml testaine proov viiakse süstla abil sälgustatud filterpaberile ja jälgitakse, kas filterpaber süttib või söestub viie minuti jooksul vedeliku lisamisest. Katset korratakse kolm korda, kui paber enne ei sütti ega söestu.
      2.   ANDMED
      2.1.   TULEMUSTE KÄSITLEMINE
      Katsed võib peatada kohe pärast positiivse tulemuse saamist mis tahes katses.
      2.2.   HINDAMINE
      Kui aine süttib viie minuti jooksul pärast inertsele tugiainele kandmist ja õhu kätte viimist või kui vedelik süütab või söestab filterpaberi viie minuti jooksul pärast lisamist ja õhu kätte viimist, loetakse aine isesüttivaks.
      3.   ARUANDLUS
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  aine täpset kirjeldust (koostist ja lisandeid);
               
            
                  —
               
               
                  katsete tulemusi;
               
            
                  —
               
               
                  kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.
               
            4.   VIITED
      
                  1.
               
               
                  NF T 20-039 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.
               
            
                  2.
               
               
                  Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.
               
            A.14.   PLAHVATUSOHTLIKKUS
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Meetod näeb ette katseskeemi, mille abil kontrollitakse, kas tahke või pastataoline aine on plahvatusohtlik kokkupuutel leegiga (termiline tundlikkus), löögi või hõõrdumise mõjul (mehaaniline tundlikkus) ja kas vedelik on leegi või löögi mõjul plahvatusohtlik.
      Meetod koosneb kolmest osast:
      
                  a)
               
               
                  termilise tundlikkuse katse (1);
               
            
                  b)
               
               
                  mehaanilise tundlikkuse katse löögi suhtes (1);
               
            
                  c)
               
               
                  mehaanilise tundlikkuse katse hõõrdumise suhtes (1).
               
            Meetodi abil saadakse andmeid teatavate tavapäraste mõjuritega seotud plahvatusohu hindamiseks. Meetod ei ole mõeldud aine plahvatusohtlikkuse kontrollimiseks mis tahes tingimustes.
      Meetod sobib ainega seotud plahvatusohu (termilise ja mehaanilise tundlikkuse) määramiseks konkreetsetel direktiivis täpsustatud tingimustel. Meetodi puhul kasutatakse mitut tüüpi katseseadmeid, mis on laias rahvusvahelises kasutuses (1) ja mis annavad tavaliselt usaldusväärseid tulemusi. On selge, et meetod ei ole ammendav. Kirjeldatud seadmete asemel võib kasutada muid seadmeid eeldusel, et need on rahvusvaheliselt tunnustatud ja tulemused on piisavalt sarnased kirjeldatud seadmetel saadavate tulemustega.
      Katseid ei ole vaja teha juhul, kui saadaval olevad termodünaamilised andmed (nt tekkesoojus, lagunemissoojus) ja/või teatavate funktsionaalrühmade (2) puudumine struktuurivalemis tõestavad põhjendatud kahtluseta, et toimeaine ei lagune kiirelt gaaside või soojuse eraldumisega (st materjal ei ole plahvatusohtlik). Mehaanilise tundlikkuse katse hõõrdumise suhtes ei ole vedelike puhul nõutav.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Lõhkeaine
      Ained, mis võivad leegi mõjul plahvatada või on kirjeldatud seadmes löögi- või hõõrdetundlikud (või on muus seadmes suurema mehaanilise tundlikkusega kui 1,3-dinitrobenseen).
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      1,3-dinitrobenseen, tehniline kristalne saadus, läbib 0,5 mm sõela, hõõrdumis- ja löögimeetoditele.
      Perhüdro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triasiin (RDX, heksogeen, tsükloniit, CAS-i nr 121-82-4), kristallitud tsükloheksanooni vesilahusest, märgsõelutud läbi 250 μm sõela ja kinni peetud 150 μm sõelal, kuivatatud neli tundi 103 ± 2 oC juures, hõõrdumis- ja löögikatsete teise seeria jaoks.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Eelkatsed on vajalikud kolme tundlikkuskatse tarvis ohutute tingimuste määramiseks.
      1.4.1.   Käsitlemisohutuse katsed (3)
      Ohutuse huvides rakendatakse väga väikestele proovidele (u 10 mg) enne põhikatsete tegemist kuumutamist gaasileegis vabas õhus, lööke mis tahes tavapärastes seadmetes ja hõõrdumist vasara ja alasi vahel või mis tahes muus hõõrdumisseadmes. Selle eesmärk on kontrollida, kas aine on nii tundlik ja plahvatusohtlik, et ettenähtud tundlikkuskatsetel, eriti termilise tundlikkuse katsetel, tuleb katse tegija vigastamise vältimiseks kasutada erilisi ettevaatusabinõusid.
      1.4.2.   Termiline tundlikkus
      Meetodi puhul kuumutatakse ainet erinevas läbimõõdus düüsidega plaatidega suletud terashülsis, et kontrollida, kas aine võib tugeva kuumuse ja piiratud ruumala tingimustes plahvatada.
      1.4.3.   Mehaaniline tundlikkus (löögitundlikkus)
      Meetodi puhul antakse ainele kindlalt kõrguselt kukutatud kindla massiga löök.
      1.4.4.   Mehaaniline tundlikkus (hõõrdetundlikkus)
      Meetodi puhul mõjutatakse tahkeid ja pastataolisi aineid standardsel pinnal määratud koormuse ja suhtelise liikumise abil tekitatud hõõrdumisega.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Täpsustamata.
      1.6.   MEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Termiline tundlikkus (leegi mõju)
      1.6.1.1.   Seade
      Seade koosneb ühekordselt kasutatavast terashülsist korduvkasutatava sulguriga (joonis 1), mis on paigutatud kaitsvasse kuumutusseadmesse. Kõik hülsid on valmistatud sügavtõmbamisel lehtterasest (vt liidet) ja on 24 mm sisediameetriga, 75 mm pikad ja 0,5 mm paksuse seinaga. Hülssidel on avatud otsas äärik hülsi sulgemiseks düüsiga plaadiga sulgurseadme abil. Sulgur koosneb keskel asuva düüsiga survekindlast plaadist, mis kaheosalise keermega liitmiku (mutter ja keermega võru) abil kindlalt hülsi külge kinnitatakse. Mutter ja keermega võru on valmistatud kroom-mangaanterasest (vt liidet), mis on sädemevaba kuni temperatuurini 800 oC. Düüsiga plaadid on 6 mm paksud, valmistatud kuumuskindlast terasest (vt liidet) ja neid on mitmesuguse avasuurusega.
      1.6.1.2.   Katsetingimused
      Tavaliselt uuritakse ainet töötlemata kujul, kuid mõningatel juhtudel, nt kui see on kokku pressitud, vormi valatud või muul moel tihendatud, võib olla vaja see enne katsetusi purustada.
      Tahkete ainete puhul määratakse katsetes kasutatav ainekogus kaheetapilisel proovitäitmisel. Kaalutud hülss täidetakse 9 cm3 ainega ja tambitakse kogu hülsi ristlõike ulatuses avaldatava 80 N jõuga kokku. Ohutuse huvides või juhtudel, kus proovi füüsikaline olek võib surve mõjul muutuda, võib kasutada muid täitmismeetodeid; nt väga hõõrdetundliku aine puhul ei saa tampimist kasutada. Kui ainet on võimalik kokku suruda, lisatakse veel ainet ja jätkatakse tampimist, kuni hülss on täidetud 55 mm kauguseni ülaäärest. Määratakse hülsi 55 mm tasemeni täitmiseks vajalik ainekogus ja lisatakse veel kaks lisakogust, mis kumbki 80 N jõuga tampimisel tihendatakse. Seejärel ainet vastavalt vajadusele kas lisatakse ja tambitakse või eemaldatakse, nii et hülss täitub 15 mm kõrguseni ülaäärest. Järgmiseks tehakse teine proovitäitmine, alustades tambitud ainekogusega, mis moodustab kolmandiku esimesel proovitäitmisel leitud kogumassist. Lisatakse veel kaks lisakogust, mis 80 N jõuga tampimisel tihendatakse, ja ainekogus reguleeritakse lisamisel või eemaldamisel 15 mm kõrguseni ülaäärest. Teisel proovitäitmisel leitud ainekogust kasutatakse edasistes katsetes, täites hülsi kolmes võrdses osas, mis surutakse kokku ruumalani 9 cm3 mis tahes selleks vajaliku jõuga. (Selleks võib abivahendina kasutada vaherõngaid).
      Vedelikud ja geelid viiakse hülssi 60 mm kõrguseni, vältides geelide puhul hoolikalt õhuvahede teket. Keermega võru libistatakse altpoolt hülsi peale, paigaldatakse sobiv düüsiga plaat ja keeratakse mutter pärast molübdeendisulfiidmäärde lisamist kinni. Väga oluline on kontrollida, et ainet ei jääks ääriku ja plaadi või keermete vahele.
      Kuumutamisel kasutatakse propaani rõhuregulaatori (60–70 mbar) ja voolumõõturiga tööstuslikust balloonist, millest gaas jagatakse jaotustoru kaudu ühtlaselt (kontrollitakse visuaalselt põletite leekide järgi) nelja põleti vahel. Põletid asetsevad ringikujuliselt ümber katsekambri, nagu on näidatud joonisel 1. Kolme põleti kogukulu on umbes 3,2 liitrit propaani minutis. Kasutada võib muid küttegaase ja põleteid, kuid kuumutamise kiirus peab vastama joonisel 3 täpsustatule. Kõigi seadmete puhul tuleb kuumutamise kiirust regulaarselt kontrollida, kasutades selleks dibutüülftalaadiga täidetud hülsse, nagu on näidatud joonisel 3.
      1.6.1.3.   Katsete tegemine
      Iga katset sooritatakse hülsi purunemiseni või viie minuti möödumiseni kuumutamise algusest. Plahvatusega lõppenuks loetakse katse, mille tulemusel hülss puruneb kolmeks või enamaks tükiks, mis võivad omavahel olla kitsaste metalliribadega ühendatud, nagu on näha jooniselt 2. Väiksema arvu tükkidega või purunemiseta lõppenud katset plahvatusega lõppenuks ei loeta.
      Alguses tehakse kolm katset 6,0 mm düüsiga plaadiga ja kui plahvatust ei toimu, tehakse teine kolmene katseseeria 2,0 mm düüsiga plaadiga. Kui kummaski katseseerias plahvatust ei toimu, pole edasised katsed vajalikud.
      1.6.1.4.   Hindamine
      Katse loetakse positiivseks, kui kummaski eespool nimetatud katseseerias toimub plahvatus.
      1.6.2.   Mehaaniline tundlikkus (löögitundlikkus)
      1.6.2.1.   Seade (joonis 4)
      Tüüpilise kukkuva vasaraga seadme põhiosa on valuterasest plokk aluse, alasi, posti, juhtrööbaste, kukkuvate raskuste, päästiku ja proovianumaga. 100 mm (läbimõõt) × 70 mm (kõrgus) terasalasi on kruvitud 230 mm (pikkus) × 250 mm (laius) × 200 mm (kõrgus) terasplokile valatud 450 mm (pikkus) × 450 mm (laius) × 60 mm (kõrgus) alusele. Tõmmatud terastorust liitekohtadeta post on kinnitatud terasploki tagaküljel olevasse fiksaatorisse. Seade on nelja kruviga ankurdatud monoliitsele 60 × 60 × 60 cm betoonplokile nii, et juhtrööpad on täiesti püstsuunalised ja kukkuv raskus langeb vabalt. Kasutada saab nii 5 kg kui ka 10 kg monoliitsest terasest raskusi. Iga raskuse löökpea on valmistatud karastatud terasest, HRC 60–63, ja selle miinimumläbimõõt on 25 mm.
      Uuritav proov on suletud löögiseadmesse, mis koosneb kahest koaksiaalsest, üksteise kohal paiknevast monoliitsest terassilindrist õõnsas silindrilises terasjuhtvõrus. Monoliitsed terassilindrid peaksid olema läbimõõduga 10 (–0,003, –0,005) mm ja kõrgusega 10 mm ning poleeritud pinna, ümarate nurkadega (kõverusraadius 0,5 mm) ja kõvadusega HRC 58–65. Õõnessilindril peab olema 16 mm välisdiameeter, poleeritud 10 (+0,005, +0,010) mm sisediameeter ja 13 mm kõrgus. Vahealasile (läbimõõt 26 mm ja kõrgus 26 mm) on paigaldatud terasest löögiseade, mille keskosas on tekkivaid gaase läbi laskva perforatsiooniga rõngas.
      1.6.2.2.   Katsetingimused
      Proov peaks olema mahuga 40 mm3 või muule seadmele sobiva mahuga. Tahkeid aineid tuleks uurida kuivana ja need ette valmistada järgmiselt:
      
                  a)
               
               
                  pulbrilised ained sõelutakse (sõela ava 0,5 mm) ja katses kasutatakse kogu sõela läbinud osa;
               
            
                  b)
               
               
                  kokku pressitud, vormi valatud või muul moel tihendatud materjalid purustatakse väiksemateks tükkideks ja sõelutakse; katses kasutatakse sõelumisel saadud fraktsiooni osakeste läbimõõduga 0,5–1 mm ja see fraktsioon peab esindama töötlemata algainet.
               
            Tavaliselt pastadena tarnitavaid materjale tuleks võimaluse korral uurida kuivana või vähemalt eemaldada eelnevalt võimalikult suur osa lahjendist. Vedelikke testitakse 1 mm vahega alumise ja ülemise terassilindri vahel.
      1.6.2.3.   Katsete tegemine
      Tehakse kuuest katsest koosnev katseseeria, kukutades 10 kg raskust 0,40 m kõrguselt (40 J). Kui kuue katse jooksul 40 J juures toimub plahvatus, tuleb teha järgmine kuue katsega katseseeria, kukutades 5 kg raskust 0,15 m kõrguselt (7,5 J). Muudes seadmetes võrreldakse proovi tunnustatud meetodi (nt üles-alla tehnika jne) abil valitud võrdlusainega.
      1.6.2.4.   Hindamine
      Katse tulemus loetakse positiivseks, kui vähemalt ühel korral toimub kirjeldatud katseseadmetega mis tahes katses plahvatus (põlema lahvatamine ja/või paugatused on plahvatusega samaväärsed) või kui proov osutub muus löögikatses tundlikumaks kui 1,3-dinitrobenseen või RDX.
      1.6.3.   Mehaaniline tundlikkus (hõõrdetundlikkus)
      1.6.3.1.   Seade (joonis 5)
      Hõõrdeseade koosneb valatud terasest alusplaadist, millele on paigaldatud hõõrdeseade. Viimane koosneb fikseeritud portselanpulgast ja liikuvast portselanplaadist. Portselanplaat asub kahel juhtrööpal jooksval kelgul. Kelk on ühendusvarda, ekstsentrilise nuki ja sobiva ülekande abil ühendatud elektrimootoriga nii, et portselanplaati liigutatakse portselanpulga all ainult üks kord 10 mm ulatuses edasi-tagasi. Portselanpulgale rakendatav jõud võib olla 120–360 N.
      Tasased portselanplaadid on valmistatud valgest tehnilisest portselanist (jämedusega 9–32 μm) ja nende mõõtmed on 25 mm (pikkus) × 25 mm (laius) × 5 mm (kõrgus). Silindriline portselanpulk on samuti valmistatud valgest tehnilisest portselanist ja on 15 mm pikk, 10 mm läbimõõduga ja karestatud ümarate otsapindadega, mille kõverusraadius on 10 mm.
      1.6.3.2.   Katsetingimused
      Proov peaks olema mahuga 10 mm3 või muule seadmele sobiva mahuga.
      Tahkeid aineid uuritakse kuivana ja nad valmistatakse ette järgmiselt:
      
                  a)
               
               
                  pulbrilised ained sõelutakse (sõela ava 0,5 mm) ja katses kasutatakse kogu sõela läbinud osa;
               
            
                  b)
               
               
                  kokku pressitud, vormi valatud või muul moel tihendatud materjalid purustatakse väiksemateks tükkideks ja sõelutakse; katses kasutatakse sõelumisel saadud fraktsiooni osakeste läbimõõduga < 0,5 mm.
               
            Tavaliselt pastadena tarnitavaid materjale tuleks võimaluse korral uurida kuivana. Kui pastast ei ole kuiva ainet võimalik valmistada, testitakse pastat (eemaldades eelnevalt võimalikult suur osa lahjendist) 0,5 mm paksuse, 2 mm laiuse ja 10 mm pikkuse, šablooni abil tekitatud kihina.
      1.6.3.3.   Katsete tegemine
      Portselanpulk viiakse uuritava proovi kohale ja rakendatakse koormus. Katse ajal peavad karedad jooned portselanplaadil olema liikumissuunaga risti. Tuleb jälgida, et pulk toetuks proovile, et pulga all oleks küllaldane kogus testainet ja et plaat pulga all õigesti liiguks. Pastataolised ained kantakse plaadile 0,5 mm paksuse, 2 × 10 mm avaga šablooni abil. Portselanplaat peab portselanpulga all 0,44 sekundi jooksul 10 mm edasi ja tagasi liikuma. Iga plaadi ja pulga pinna osa võib kasutada ainult ühe korra; pulga mõlemat otsa võib kasutada kaheks katseks ja plaadi kumbagi külge kolmeks katseks.
      360 N koormusega tehakse kuuest katsest koosnev katseseeria. Kui nende kuue katse käigus saadakse positiivne tulemus, tehakse 120 N koormusega veel üks kuuest katsest koosnev katseseeria. Muudes seadmetes võrreldakse proovi tunnustatud meetodi (nt üles-alla tehnika jne) abil valitud võrdlusainega.
      1.6.3.4.   Hindamine
      Katse tulemus loetakse positiivseks, kui vähemalt ühel korral toimub kirjeldatud katseseadmetega mis tahes katses plahvatus (pragin ja/või paugatused või põlema lahvatamine on plahvatusega samaväärsed) või kui proov vastab muus hõõrdekatses võrdväärsetele tingimustele.
      2.   ANDMED
      Aine loetakse direktiivi mõistes plahvatusohtlikuks juhul, kui termilise, löögi- või hõõrdetundlikkuse katses saadakse positiivne tulemus.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  testaine tunnusandmeid, koostist, puhtusastet, niiskusesisaldust jne;
               
            
                  —
               
               
                  proovi füüsikalist olekut ja seda, kas seda on purustatud ja/või sõelutud;
               
            
                  —
               
               
                  termilise tundlikkuse katsetes tehtud tähelepanekuid (nt proovi massi, kildude arvu jne);
               
            
                  —
               
               
                  mehaanilise tundlikkuse katsetes tehtud tähelepanekuid (nt suure suitsukoguse teke või täielik lagunemine ilma paugatuste, leekide, sädemete, pragina jne esinemiseta);
               
            
                  —
               
               
                  igat tüüpi katsete tulemusi;
               
            
                  —
               
               
                  kui kasutatud on muid seadmeid, tuleb esitada teaduslik põhjendus ning tõendid tulemuste vastavuse kohta kirjeldatud seadmetel saadud tulemustega;
               
            
                  —
               
               
                  kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid kommentaare, nagu viiteid katsetele analoogsete ainetega;
               
            
                  —
               
               
                  kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.
               
            3.2.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE JA HINDAMINE
      Katsearuandes tuleb ära märkida kõik tulemused, mis loeti valeks, anomaalseks või mitterepresentatiivseks. Kui mõnda tulemust ei arvestata, tuleb selle kohta lisada selgitus ja muude või täiendavate katsete tulemused. Kui anomaalsele tulemusele ei leidu seletust, tuleb seda arvestada täisväärtusliku tulemusena ja kasutada aine vastaval liigitamisel.
      4.   VIITED
      
                  1.
               
               
                  Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.
               
            
                  2.
               
               
                  Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750- 60103-5,1990.
               
            
                  3.
               
               
                  Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol.3, 6-13 and 30-42.
               
            
                  4.
               
               
                  NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of explosion risk.
               
            
         Liide
         Näitlik materjalide spetsifikatsioon termilise tundlikkuse katseks (vt DIN 1623)
         
                     1)
                  
                  
                     Hülss: materjalispetsifikatsioon nr 1.0336 505 g
                  
               
                     2)
                  
                  
                     Düüsiga plaat: materjalispetsifikatsioon nr 1.4873
                  
               
                     3)
                  
                  
                     Keermega võru ja mutter: materjalispetsifikatsioon nr 1.3817
                  
               Joonis 1
         Termilise tundlikkuse katseseade
         (Kõik mõõdud on millimeetrites)
         
            
         Joonis 2
         Termilise tundlikkuse katse
         (purunemise näited)
         
            
         Joonis 3
         Kuumutamiskiiruse kaliibrimine termilise tundlikkuse katseks
         
            
         Temperatuuri/aja graafik 27 cm3 dibutüülftalaadi kuumutamisel suletud (1,5 mm düüsiga plaadiga) hülsis propaani voolukiirusel 3,2 l/min. Temperatuur määratakse 1 mm läbimõõduga roostevabast terasest kattega kromellist/alumellist termopaariga, mis on paigutatud mõõteseadme keskele 43 mm allapoole hülsi serva. Kuumutamise kiirus temperatuurivahemikus 135-285 oC peats olema 185-215 K/min.
         Joonis 4
         Löögikatse seade
         
            (Kõik mõõdud on millimeetrites)
         
         
            
         Joonis 4
         Jätk
         
            
         Joonis 5
         Hõõrdetundlikkuse katseseade
         
            
      
      A.15.   ISESÜTTIMISTEMPERATUUR (VEDELIKUD JA GAASID)
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Lõhkeaineid ja tavalisel temperatuuril õhuga kokkupuutel süttivaid aineid ei tohiks selles katses uurida. Katsemeetod on kohaldatav gaasidele, vedelikele ja aurudele, mis õhu juuresolekul kuuma pinnaga kokku puutudes süttivad.
      Katalüütilised lisandid, pinnamaterjal või katseanuma suurem maht võivad isesüttimistemperatuuri oluliselt alandada.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Isesüttivuse määra väljendatakse isesüttimistemperatuurina. Isesüttimistemperatuur on madalaim temperatuur, mille juures testaine katsemeetodis määratletud tingimustel õhuga segatuna süttib.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Võrdlusained on loetletud standardites (vt 1.6.3). Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Meetodi kohaselt määratakse kambri siseseina minimaalne temperatuur, mis põhjustab kambrisse süstitud gaasi, auru või vedeliku süttimise.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Korratavus varieerub vastavalt isesüttimistemperatuuri vahemikule ja kasutatavale katsemeetodile.
      Tundlikkus ja spetsiifilisus sõltuvad kasutatavast katsemeetodist.
      1.6.   MEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Seade
      Katseseadet kirjeldatakse punktis 1.6.3 viidatud meetodis.
      1.6.2.   Katsetingimused
      Testaine proovi uuritakse punktis 1.6.3 viidatud meetodi kohaselt.
      1.6.3.   Katse tegemine
      Vt IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.
      2.   ANDMED
      Registreerige katsetemperatuur, atmosfäärirõhk, kasutatud proovikogus ja ajavahemik süttimiseni.
      3.   ARUANDLUS
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud proovikogust ja atmosfäärirõhku;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud katseseadet;
               
            
                  —
               
               
                  mõõtmistulemusi (katsetemperatuure, süttimistulemusi ja süttimiseni kulunud ajavahemikke);
               
            
                  —
               
               
                  kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.
               
            4.   VIITED
      Puuduvad.
      A.16.   TAHKETE AINETE SUHTELINE ISESÜTTIMISTEMPERATUUR
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Lõhkeaineid ja tavalisel temperatuuril õhuga kokkupuutel süttivad aineid ei tohiks selles katses uurida.
      Katse annab eelteavet tahkete ainete isesüttivuse kohta kõrgematel temperatuuridel.
      Kui aine reaktsioonil hapnikuga või eksotermilisel lagunemisel tekkiv soojus ei haju küllalt kiiresti keskkonda, leiab aset isesüttimiseni viiv isekuumenemine. Seega leiab isesüttimine aset siis, kui soojuse tekkekiirus ületab soojuskao kiiruse.
      Katse on kasutatav tahkete ainete esialgse sõelkatsena. Arvestades tahkete ainete süttimis- ja põlemisprotsesside keerukust, tuleks selle katsemeetodi abil leitud isesüttimistemperatuuri kasutada ainult võrdlemiseks.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Selle meetodi abil leitud isesüttimistemperatuur on madalaim temperatuur ( oC), mille juures kindel ainekogus määratletud tingimustel süttib.
      1.3.   VÕRDLUSAINE
      Puudub.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritava aine kindlaksmääratud kogus viiakse toatemperatuuril ahju ja registreeritakse temperatuuri/aja kõver proovi keskosas ahju temperatuuri tõstmisel kiirusega 0,5 oC/min temperatuurini 400 oC või aine sulamistemperatuurini, kui viimane on madalam. Käesoleva katse kohaselt loetakse isesüttimistemperatuuriks ahju temperatuur, mille juures proovi temperatuur isekuumenemise tulemusel 400 oCni jõuab.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Puuduvad.
      1.6.   MEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Seade
      1.6.1.1.   Ahi
      Juhitava temperatuuriga laboriahi (mahuga umbes 2 liitrit), millel on loomulik õhuvahetus ja plahvatuskaitseklapp. Vältimaks võimalikku plahvatusohtu, ei tohi eralduvaid lagunemisgaase lasta elektrikütteseadmetega kokku puutuda.
      1.6.1.2.   Traatvõrgust kuubik
      Tükk roostevabast terasest traatvõrku 0,045 mm võrgusilmaga lõigatakse välja vastavalt joonisel 1 toodud skeemile. Võrk volditakse kokku ja kinnitatakse traadiga nii, et tekib avatud ülaosaga kuubik.
      1.6.1.3.   Termopaarid
      Kasutatakse sobivaid termopaare.
      1.6.1.4.   Meerik
      Sobib mis tahes kahe kanaliga meerik, mis on kaliibritud temperatuurivahemikus 0–600 oC või vastavas pingevahemikus.
      1.6.2.   Katsetingimused
      Aineid uuritakse töötlemata kujul.
      1.6.3.   Katse tegemine
      Kuubik täidetakse uuritava ainega ja koputatakse õrnalt, misjärel lisatakse veel ainet, kuni kuubik on täielikult täidetud. Kuubik riputatakse seejärel toatemperatuuril oleva ahju keskele. Temperatuuri registreerimiseks paigutatakse üks termopaar kuubiku keskele ning teine kuubiku ja ahjuseina vahele.
      Ahju ja proovi temperatuur registreeritakse pidevalt ahju temperatuuri tõstmisel kiirusega 0,5 oC/min temperatuurini 400 oC või aine sulamistemperatuurini, kui viimane on madalam.
      Aine süttimisel näitab proovis olev termopaar temperatuuri järsku tõusu üle ahju temperatuuri.
      2.   ANDMED
      Hindamisel on oluline ahju temperatuur, mille juures jõuab proovi temperatuur isekuumenemise tulemusena 400 oCni (vt joonist 2).
      3.   ARUANDLUS
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  uuritava aine kirjeldust;
               
            
                  —
               
               
                  mõõtmistulemusi, sh temperatuuri/aja kõverat;
               
            
                  —
               
               
                  kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.
               
            4.   VIITED
      NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.
      Joonis 1
      20 mm katsekuubiku skeem
      
         
      Joonis 2
      Tüüpiline temperatuuri/aja kõver
      
         
      A.17.   OKSÜDEERIVAD OMADUSED (TAHKED AINED)
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Katse tegemiseks on kasulik teada aine võimalikku plahvatusohtlikkust.
      Katset ei saa kasutada vedelike, gaaside, plahvatusohtlike või väga tuleohtlike ainete ega orgaaniliste peroksiidide puhul.
      Katset ei ole vaja teha juhul, kui toimeaine struktuurivalemi kontrollimisel ei jää põhjendatud kahtlust, et toimeaine reageerib põleva materjaliga eksotermiliselt.
      Kontrollimaks, kas katse tegemisel tuleks kasutada erilisi ettevaatusabinõusid, tuleks teha eelkatse.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Põlemisaeg: reaktsiooniaeg (sekundites), mis kulub reaktsioonivööndi levikuks piki kuhilat vastavalt punktis 1.6 kirjeldatud protseduurile.
      Põlemiskiirus: väljendatakse millimeetrites sekundi kohta.
      Suurim põlemiskiirus: suurim põlemiskiiruse väärtus, mis on mõõdetud 10–90 % oksüdeerijasisaldusega (massi järgi) segudes.
      1.3.   VÕRDLUSAINE
      Võrdlusainena kasutatakse nii katses kui ka eelkatses analüüsipuhast baariumnitraati.
      Võrdlussegu on selline punkti 1.6 kohaselt valmistatud baariumnitraadi ja pulbertselluloosi segu, millega saavutatakse suurim põlemiskiirus (tavaliselt 60 % baariumnitraadi sisaldusega (massi järgi) segu).
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Ohutuse huvides tehakse eelkatse. Kui eelkatse näitab selgelt, et testainel on oksüdeerivad omadused, pole edasine kontrollimine vajalik. Vastupidisel juhul tehakse aine kohta täiemahuline katseprogramm.
      Täiemahulises katseprogrammis segatakse uuritavast ainest ja kindlaksmääratud põlevast ainest mitmesugustes vahekordades segusid. Igast segust tehakse seejärel kuhi ja süüdatakse see ühest otsast. Leitud suurimat põlemiskiirust võrreldakse võrdlussegu suurima põlemiskiirusega.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Vajaduse korral võib kasutada mis tahes peenestamis- ja segamismeetodeid eeldusel, et kuues eraldi katses määratud suurimad põlemiskiirused ei erine aritmeetilisest keskmisest rohkem kui 10 %.
      1.6.   MEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Ettevalmistused
      1.6.1.1.   Testaine
      Uuritava proovi osakeste suurust vähendatakse järgmisel meetodil alla 0,125 mm: testaine sõelutakse, seejärel peenestatakse sõelale jäänud osa ja korratakse protseduuri senikaua, kuni kogu proov on sõela läbinud.
      Kasutada võib kvaliteedinõuetele vastavaid mis tahes peenestamis- ja sõelumismeetodeid.
      Enne segu valmistamist kuivatatakse ainet 105 oC juures konstantse massi saavutamiseni. Kui uuritava aine lagunemistemperatuur on alla 105 oC, kuivatatakse aine sobival madalamal temperatuuril.
      1.6.1.2.   Põlevaine
      Põlevainena kasutatakse pulbertselluloosi. Tselluloos peaks olema õhukese kihi kromatograafias või kolonnkromatograafias kasutatavat tüüpi. Sobivaks on osutunud tselluloositüüp, mille kiupikkused jäävad 85 % ulatuses vahemikku 0,020–0,075 mm. Tselluloosipulber sõelutakse läbi 0,125 mm avasuurusega sõela. Kogu katse kestel tuleb kasutada samast partiist pärit tselluloosi.
      Enne segu valmistamist kuivatatakse pulbertselluloosi 105 oC juures konstantse massi saavutamiseni.
      Kui eelkatses kasutatakse puidutolmu, valmistatakse okaspuu puidutolm ette järgmiselt: kogutakse fraktsioon, mis läbib 1,6 mm avasuurusega sõela, segatakse tolm põhjalikult ja kuivatatakse seda neli tundi 105 oC juures kõige rohkem 25 mm paksuses kihis. Tolm jahutatakse ja suletakse kuni kasutamiseni õhukindlalt võimalikult täis mahutisse; soovitatav on tolmu kasutada 24 tunni jooksul kuivatamisest.
      1.6.1.3.   Süüteallikas
      Süüteallikana tuleks kasutada vähemalt 5 mm läbimõõduga gaasipõleti kuuma leeki. Muu süüteallika kasutamisel (nt katse tegemisel inertses atmosfääris) tuleks esitada selle kirjeldus ja kasutamise põhjendus.
      1.6.2.   Katse tegemine
      
         Märkus
      
      Oksüdeerijate segusid tselluloosi või puidutolmuga tuleb vaadelda potentsiaalselt plahvatusohtlikuna ja käsitleda nõutava ettevaatusega.
      1.6.2.1.   Eelkatse
      Kuivatatud aine segatakse hoolikalt kuivatatud tselluloosi või puidutolmuga vahekorras kaks osa testainet ühe osa tselluloosi või puidutolmu kohta ja tehakse segust väike koonusekujuline kuhi mõõtudega 3,5 cm (aluse läbimõõt) × 2,5 cm (kõrgus), täites selleks ilma tampimata koonusekujulise vormi (nt suletud põhjaga laborilehtri).
      Kuhi asetatakse mittesüttivale, mittepoorsele ja madala soojusjuhtivusega alusplaadile. Katse tehakse tõmbekapis vastavalt kirjeldusele punktis 1.6.2.2.
      Süüteallikas viiakse vastu kuhilat. Jälgitakse järgneva reaktsiooni tugevust ja kestust ning see registreeritakse.
      Kui reaktsioon on tugev, loetakse aine oksüdeerivaks.
      Kui tulemused on kaheldavad, tehakse allpool kirjeldatud täiemahuline katseprogramm põlemisribaga.
      1.6.2.2.   Põlemisribakatse
      Valmistatakse 10 % kaupa kasvava oksüdeerijasisaldusega oksüdeerija/tselluloosi segud, mis sisaldavad 10–90 % oksüdeerijat (massi järgi). Piiripealsetel juhtudel tuleks suurima põlemiskiiruse täpsemaks mõõtmiseks kasutada vahepealsete kontsentratsioonidega oksüdeerija/tselluloosi segusid.
      Kuhi tekitatakse vormi abil. Vorm on metallist, 250 mm pikk ja kolmnurkse läbilõikega, 10 mm sisemise kõrguse ja 20 mm sisemise laiusega. Vormi kummalegi küljele paigaldatakse pikisuunas külgpiireteks kaks metallplaati, mis ulatuvad 2 mm üle kolmnurkse vao ülemise ääre (vt joonist). Seade täidetakse mõningases liias seguga, ilma seda tihendamata. Vorm kukutatakse seejärel 2 cm kõrguselt tugevale aluspinnale ja allesjäänud üleliigne aine tõmmatakse viltuse paberilehega pealt ära. Külgmised piirded eemaldatakse ja allesjäänud pulbrit silutakse rulliga. Vormi peale paigaldatakse seejärel mittesüttiv, mittepoorne ja madala soojusjuhtivusega alusplaat, keeratakse vorm koos plaadiga ümber ja vorm eemaldatakse.
      Riba paigutatakse tõmbekapi alla õhu liikumise suunaga risti.
      Õhu liikumiskiirus peab olema piisav, et takistada suitsu levikut laborisse, ning seda tuleb katse jooksul konstantsena hoida. Seadme ümber tuleks paigaldada tõmbevari.
      Tselluloosi ja mõnede uuritavate ainete hügroskoopsuse tõttu tuleb katse teha võimalikult kiiresti.
      Riba üks ots süüdatakse leegi abil.
      Pärast seda, kui reaktsioonivöönd on levinud esimesed 30 mm, mõõdetakse järgneva 200 mm ulatuses reaktsiooni leviku aeg.
      Katse tehakse võrdlusainega ja vähemalt korra kõigi testaine/tselluloosi segudega.
      Kui leitav suurim põlemiskiirus ületab oluliselt võrdlussegu põlemiskiirust, võib katse peatada; muul juhul korratakse katset viis korda, kasutades kolme suurima põlemiskiirusega segu.
      Kui arvatakse, et positiivne tulemus on ekslik, korratakse katset sama suurte osakestega inertse ainega, näiteks diatomiidiga tselluloosi asemel. Katset võib korrata ka kõrgeima põlemiskiirusega testaine/tselluloosi seguga inertses atmosfääris (hapnikusisaldus < 2 % mahu järgi).
      2.   ANDMED
      Ohutuse huvides loetakse uuritava aine oksüdeerivaid omadusi iseloomustavaks suuruseks suurim põlemiskiirus, mitte selle keskmine väärtus.
      Hindamise seisukohast on oluline antud seguga kuuest katsest koosnevas seerias saadud suurim põlemiskiiruse väärtus.
      Koostatakse graafik, mis näitab iga segu põlemiskiiruse suurima väärtuse sõltuvust oksüdeerija kontsentratsioonist. Graafikult loetakse suurim põlemiskiirus.
      Kuus ühes katses suurima põlemiskiirusega segu mõõtmisel saadud põlemiskiiruse väärtust ei tohi aritmeetilisest keskmisest erineda rohkem kui 10 %, vastasel korral tuleb peenestamis- ja segamismeetodeid täiustada.
      Leitud suurimat põlemiskiirust võrreldakse võrdlussegu suurima põlemiskiirusega (vt 1.3).
      Kui katse tehakse inertses atmosfääris, võrreldakse suurimat reaktsioonikiirust võrdlussegu vastava näitajaga inertses atmosfääris.
      3.   ARUANNE
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  testaine tunnusandmeid, koostist, puhtusastet, niiskusesisaldust jne;
               
            
                  —
               
               
                  proovi mis tahes käitlemist (nt peenestamist, kuivatamist jne);
               
            
                  —
               
               
                  katsetes kasutatud süüteallikat;
               
            
                  —
               
               
                  mõõtmiste tulemusi;
               
            
                  —
               
               
                  reaktsiooni tüüpi (nt kiire põlemine pinnal, põlemine kogu massis, mis tahes andmeid põlemissaaduste kohta jne);
               
            
                  —
               
               
                  kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid märkusi, sh eelkatses test- ja võrdlusainega tekkinud reaktsiooni tugevuse kohta (leegiga, sädemetega, suitsuga, hõõgumisega reaktsioon jne) ning nii test- kui ka võrdlusaine puhul eelkatses/sõelkatses kulunud aega;
               
            
                  —
               
               
                  inertse ainega tehtud katsete tulemusi, kui neid tehti;
               
            
                  —
               
               
                  inertses atmosfääris tehtud katsete tulemusi, kui neid tehti.
               
            3.2.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE
      Aine loetakse oksüdeerivaks, kui
      
                  a)
               
               
                  eelkatses ilmneb tugev reaktsioon;
               
            
                  b)
               
               
                  uuritavate segude suurim täiemahulises katseprogrammis leitud põlemiskiirus on suurem tselluloosist ja baariumnitraadist valmistatud võrdlussegu suurimast põlemiskiirusest või sellega võrdne.
               
            Ekslike positiivsete tulemuste vältimiseks tuleks tulemuste tõlgendamisel arvesse võtta ka aine inertse materjaliga segamisel ja/või inertses atmosfääris tehtud katsete tulemusi.
      4.   VIITED
      NF T 20-035 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.
      
         Liide
         Joonis
         Vorm ja abivahendid põlemisriba valmistamiseks
         (Kõik mõõdud on millimeetrites)
         
            
      
      A.18.   POLÜMEERIDE ARVKESKMINE MOLEKULMASS JA MOLEKULMASSIDE JAOTUS
      1.   MEETOD
      Käesolev geelkromatograafia (GPC) meetod on OECD katsejuhendi nr 118 (1996) koopia. Meetodi põhimõte ja tehniline lisateave on toodud kirjandusviites 1.
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Kuna polümeeride omadused on väga erinevad, siis on võimatu kirjeldada ühtainust meetodit, mis kirjeldaks täpselt eraldamis- ja analüüsitingimusi, mis kataks kõiki polümeeride eraldamisel esinevaid võimalikke juhtumeid ja olukordi. Eelkõige on keeruliste polümeerisegude lahutamine geelkromatograafia abil sageli võimatu. Kui geelkromatograafia ei ole kasutatav, siis võib molekulmassi määramiseks kasutada teisi meetodeid (vt lisa). Sellistel juhtudel tuleb kasutatava meetodi kohta esitada kõik üksikasjad ja põhjendused.
      Kirjeldatav meetod põhineb standardil DIN 55672 (1). Üksikasjalik teave katsete tegemiseks ja andmete hindamiseks on toodud nimetatud DIN standardis. Kui katse tingimuste muutmine osutub vajalikuks, siis peab vastavaid muudatusi põhjendama. Muude standardite kasutamisel peab nende jaoks andma täielikud viited. Kirjeldatava meetodi kalibreerimiseks kasutatakse teadaoleva polüdisperssusega polüstüreeni proove ja teatud polümeeride (näiteks vesilahustuvad ja pika ahelaga hargnenud polümeerid) analüüsimiseks võib osutuda vajalikuks meetodis muudatuste tegemine.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Arvkeskmise molekulmassi Mn ja masskeskmise molekulmassi Mw arvutamiseks kasutatakse järgmisi valemeid:
      
                  
                     
               
               
                  
                     
               
            kus
      Hi on detektori signaali kõrgus mõõdetuna baasjoonelt retentsiooniruumala Vi jaoks,
      Mi on retentsiooniruumalale Vi vastava polümeerifraktsiooni molekulmass ja
      n on mõõtepunktide arv.
      Molekulmassi jaotuse ulatus, mis iseloomustab segu disperssust, leitakse Mw/Mn suhtest.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Kuna geelkromatograafia on suhteline meetod, siis peab seda kalibreerima. Selleks otstarbeks kasutatakse tavaliselt kitsa fraktsioonilise jaotusega lineaarseid polüstüreenistandardeid, mille keskmised molekulmassid Mn ja Mw ning molekulmasside jaotus on teada. Kalibreerimiskõverat võib kasutada tundmatu proovi molekulmassi määramiseks vaid siis, kui proovi ja standardi lahutamiseks kasutatavad tingimused on valitud ühesuguselt.
      Molekulmassi ja elueerunud ruumala vaheline suhe on õige vaid konkreetsele katsele iseloomulikel tingimustel. Nimetatud tingimused hõlmavad eelkõige temperatuuri, lahustit (või lahustite segu), kromatograafilisi tingimusi ja kasutatavat kolonni või kolonnisüsteemi.
      Sellisel viisil proovist määratud molekulmassid on suhtelised ja neid nimetatakse „polüstüreeniekvivalendi molekulmassideks”. See tähendab, et sõltuvalt proovi ja standardi vahelistest struktuurilistest ja keemilistest erinevustest võivad molekulmassid hälbida absoluutsetest väärtustest rohkemal või vähemal määral. Juhul kui kasutatakse teisi standardeid, näiteks polüetüleenglükool, polüetüleenoksiid, polümetüül metakrülaat, polüakrüülhape, siis peab seda põhjendama.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Geelkromatograafia abil võib määrata nii proovi molekulmassi jaotust kui ka keskmisi molekulmasse (Mn, Mw). Geelkromatograafia on spetsiaalne vedelikkromatograafia liik, milles proov lahutatakse üksikute koostisosade hüdrodünaamiliste ruumalade järgi (2).
      Lahutamiseks juhitakse proov läbi poorse materjaliga, tavaliselt orgaanilise geeliga, täidetud kolonni. Väikesed molekulid suudavad tungida pooridesse, kuhu suurte molekulide juurdepääs on takistatud. Seetõttu on suurte molekulide teepikkus lühem ja nad elueeruvad kiiremini. Keskmise suurusega molekulid tungivad osadesse pooridesse, mistõttu nad elueeruvad mõnevõrra aeglasemalt. Kõige väiksemad molekulid, mille keskmine hüdrodünaamiline raadius on väiksem kui geeli poorid, tungivad kõikidesse pooridesse ja elueeruvad viimastena.
      Ideaaljuhul mõjutab lahutamist ainult molekulide suurus, kuid praktikas on raske vältida vähemalt mõningaid adsorptsioonist tingitud segavaid mõjusid. Kolonni ebaühtlane täitematerjal ja suurem omaruumala võivad olukorda halvendada (2).
      Detekteerimiseks kasutatakse näiteks refraktsiooni indeksit või UV-absorptsiooni ja tulemuseks saadakse lihtne jaotuskõver. Selleks, et omistada saadud kõverale tegelikke molekulmassi väärtusi, tuleb kolonni kalibreerida teadaolevate molekulmassidega ja ideaaljuhul üldjoontes sarnase struktuuriga polümeeridega, näiteks erinevad polüstüreenistandardid. Tüüpiliselt saadakse Gaussi kõver, mis on mõnikord madalate molekulmasside osas väljaveninud sabaga, kusjuures vertikaalsel teljel on elueerunud erinevate molekulmassiga ühendite kogus massi järgi ja horisontaalsel teljel on logaritmilises skaalas molekulmass.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Elutsiooniruumala korratavus (suhteline standardhälve, RSD) peaks olema parem kui 0,3 %. Kui kromatogrammi hinnatakse ajalise sõltuvuse põhjal ja see ei vasta ülaltoodud kriteeriumitele, tagatakse nõutav analüüsikorratavus sisestandardi kasutamisega (1). Polüdisperssused sõltuvad standardite molekulmassidest. Polüstüreenistandardite kasutamisel on tüüpilised väärtused järgmised:
      
                  Mp < 2 000
               
               
                  Mw/Mn < 1,20
               
            
                  2 000 ≤ Mp ≤ 106
                  
               
               
                  Mw/Mn < 1,05
               
            
                  Mp > 106
                  
               
               
                  Mw/Mn < 1,20
               
            (Mp on piigi maksimumile vastav standardi molekulmass)
      1.6.   MEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Polüstüreeni standardlahuste valmistamine
      Polüstüreenistandardid lahustatakse ettevaatlikul segamisel valitud eluendiga. Lahuste valmistamisel peab arvestama tootja soovitusi.
      Valitud standardi kontsentratsioonid sõltuvad mitmetest erinevatest teguritest, näiteks süsteruumala, lahuse viskoossus ja analüütilise detektori tundlikkus. Maksimaalset süsteruumala peab kohandama vastavalt kolonni pikkusele, et vältida kolonni ülelaadimist. Geelkromatograafia analüütiliste meetodite korral jäävad tüüpilised süsteruumalad vahemikku 40 kuni 100 μl, kui kolonni mõõdud on 30 cm × 7,8 mm. Võimalik on kasutada ka suuremaid ruumalasid, kuid need ei tohiks ületada 250 μl. Enne kolonni tegelikku kalibreerimist tuleb kindlaks teha süsteruumala ja kontsentratsiooni vaheline optimaalne suhe.
      1.6.2.   Proovilahuse valmistamine
      Põhimõtteliselt kehtivad ülaltoodud nõudsed ka proovilahuste valmistamisel. Proov lahustatakse sobivas lahustis, näiteks tetrahüdrofuraanis (THF), ettevaatlikul loksutamisel. Mitte mingil juhul ei tohi lahustamiseks kasutada ultrahelivanni. Vajaduse korral puhastatakse proovi lahust membraanfiltriga, mille pooride suurus on 0,2 kuni 2 μm.
      Lahustumatute osakeste olemasolu peab ära märkima ka lõplikus aruandes, kuna see võib olla tingitud kõrge molekulmassiga ühenditest. Lahustunud osakeste massiprotsendi määramiseks peab kasutama sobivat meetodit. Valmistatud lahuseid peab kasutama 24 tunni jooksul.
      1.6.3.   Seadmed
      
                  —
               
               
                  mahuti lahustile;
               
            
                  —
               
               
                  degaseerija (vajaduse korral);
               
            
                  —
               
               
                  pump;
               
            
                  —
               
               
                  pulsatsioonisummuti (vajaduse korral);
               
            
                  —
               
               
                  injektsioonisüsteem;
               
            
                  —
               
               
                  kromatograafilised kolonnid;
               
            
                  —
               
               
                  detektor;
               
            
                  —
               
               
                  kulumõõtja (vajaduse korral);
               
            
                  —
               
               
                  andmesalvesti ja -töötleja;
               
            
                  —
               
               
                  nõu jääkide jaoks.
               
            Enne peab kindlaks tegema, et geelkromatograafia süsteem oleks kasutatavate lahustite suhtes inertne (näiteks tetrahüdrofuraani jaoks kasutada teraskapillaare).
      1.6.4.   Injektsiooni ja lahusti etteandmise süsteem
      Proovilahuse etteantud kogus sisestatakse automaatse injektoriga või käsitsi täpselt kindlaks määratud kolonni piirkonda. Käsitsi injektsiooni korral võib süstla kolvi liiga kiire tagasitõmbamine või vabastamine põhjustada muutusi mõõdetava molekulmassi jaotuses. Lahusti etteandmise süsteem peaks olema võimalikult pulseerimisvaba, sisaldades ideaaljuhul pulsatsioonisummutit. Voolukiirus on suurusjärgus 1 ml/min.
      1.6.5.   Kolonn
      Sõltuvalt proovist kasutatakse polümeeri analüüsiks kas ühte lihtsat kolonni või mitut järjestikku ühendatud kolonni. Kolonni täitematerjalidena on kaubanduslikult kättesaadavad paljud poorsed kindlate omadustega ained (näiteks poori suurus, eksklusioonipiirid). Lahutamiseks kasutatava geeli või kolonni pikkuse valik sõltub nii proovi omadustest (hüdrodünaamiline ruumala, molekulmasside jaotus) kui ka spetsiifilistest lahutamistingimustest, näiteks lahusti, temperatuur ja voolukiirus (1, 2, 3).
      1.6.6.   Teoreetilised taldrikud
      Lahutamiseks kasutatavat kolonni või kolonnide süsteemi iseloomustatakse teoreetiliste taldrikute arvuga. Tetrahüdrofuraani kasutamisel eluendina hinnatakse seda etüülbenseeni või mõne muu sobiva mittepolaarse lahustunud aine (soluudi) laadimisel teadaoleva pikkusega kolonni. Teoreetiliste taldrikute arv saadakse järgmiste valemite põhjal:
      
                  
                     
               
               
                  või
               
               
                  
                     
               
            kus
      
                  N
               
               
                  =
               
               
                  teoreetiliste taldrikute arv
               
            
                  Ve
                  
               
               
                  =
               
               
                  piigi maksimumile vastav elutsiooniruumala
               
            
                  W
               
               
                  =
               
               
                  piigi laius baasjoonel
               
            
                  W1/2
                  
               
               
                  =
               
               
                  piigi laius poolel piigi kõrgusel
               
            1.6.7.   Lahutamise efektiivsus
      Lisaks ribalaiust määravale teoreetiliste taldrikute arvule on tähtis ka lahutamise efektiivsus, mis sõltub sellest, kui järsk on kalibreerimiskõvera tõus. Kolonni lahutamisefektiivsus saadakse järgmisest valemist:
      
         
      kus
      
                  Ve, Mx
                     
                  
               
               
                  =
               
               
                  polüstüreeni molekulmassiga Mx elutsiooniruumala
               
            
                  Ve,(10.Mx)
                  
               
               
                  =
               
               
                  kümme korda suurema molekulmassiga polüstüreeni elutsiooniruumala
               
            Süsteemi lahutusvõime defineeritakse tavaliselt järgmiselt:
      
         
      kus
      
                  Ve1, Ve2
                  
               
               
                  =
               
               
                  kahe polüstüreenistandardi elutsiooniruumalad piigi maksimumil
               
            
                  W1, W2
                  
               
               
                  =
               
               
                  piigi laiused baasjoonel
               
            
                  M1, M2
                  
               
               
                  =
               
               
                  piigi maksimumile vastavad molekulmassid (peaksid erinema kümme korda)
               
            Kolonnisüsteemi R-väärtus peaks olema suurem kui 1,7 (4).
      1.6.8.   Lahustid
      Kõik lahustid peavad olema kõrge puhtusastmega (kasutatava tetrahüdrofuraani puhtus on 99,5 %). Lahusti mahuti (vajaduse korral paigutatud inertgaasi atmosfääri) peab olema piisavalt suur, et võimaldada kolonni kalibreerimist ja proovide analüüsi. Enne pumpamist kolonni peab lahustit degaseerima.
      1.6.9.   Temperatuurikontroll
      Kriitilise tähtsusega komponentide (injektsioonisilmus, kolonnid, detektor ja torustik) temperatuur peab olema konstantne ja sobima kasutatavale lahustile.
      1.6.10.   Detektor
      Detektori eesmärk on kolonnist elueeruva proovi kontsentratsiooni kvantitatiivne mõõtmine. Selleks, et vältida piikide tarbetut laienemist, peab detektori mõõteraku küveti ruumala olema võimalikult väike. See ei tohiks olla suurem kui 10 μl, välja arvatud valguse hajuvust ja viskoossust mõõtvate detektorite korral. Detekteerimiseks kasutatakse tavaliselt diferentsiaalrefraktomeetriat. Tingituna proovi või eluendi spetsiifilistest omadustest võib kasutada ka muid detektsioonimeetodeid, näiteks UV/VIS, IR, viskoossusdetektorid jms.
      2.   ANDMED JA ARUANDLUS
      2.1.   ANDMED
      Hindamiskriteeriumitele ning andmete kogumisele ja töötlemisele esitatavate üksikasjaliste nõuete osas peaks järgima DIN standardit (1).
      Iga proovi jaoks peab tegema kaks teineteisest sõltumatut katset. Neid katseid peab eraldi analüüsima.
      Iga mõõtmise tulemused peavad hõlmama Mn, Mw, Mw/Mn ja Mp väärtusi. Üheselt mõistetavalt peab näitama, et mõõdetud väärtused on suhtelised väärtused, mis on ekvivalentsed kasutatud standardi molekulmassidega.
      Pärast retentsiooniruumalade või -aegade kindlaksmääramist (mida võib parandada sisestandardite kasutamisega) esitatakse log Mp väärtused (kus Mp on kalibreerimiseks kasutatava standardi piigi maksimum) ühe eeltoodud suuruse funktsioonina. Molekulmassi dekaadi (kümnekordse vahemiku) kohta on vaja vähemalt kahte kalibreerimiskõvera punkti ja terve kõvera jaoks on vaja vähemalt viit mõõtepunkti, mis peaks hinnanguliselt katma proovi molekulmassi. Kalibreerimiskõvera madala molekulmassiga osa lõpp-punkt määratakse kindlaks n-heksüülbenseeni või muu sobiva mittepolaarse soluudi abil. Arvkeskmised ja masskeskmised molekulmassid arvutatakse tavaliselt elektroonilise andmetöötlusega, mis põhineb punktis 1.2 toodud valemitel. Käsitsi digitaliseerimise kasutamisel võib eeskujuks võtta standardi ASTM D 3536-91 (3).
      Jaotuskõvera peab esitama tabeli või joonise kujul (diferentsiaalne sagedus või protsentide summa log M funktsioonina). Graafilisel kujutamisel peab üks molekulmassi kümnekordne vahemik olema umbes 4 cm laiune ja piigi maksimum peab olema umbkaudu 8 cm kõrgune. Integraalsete jaotuskõverate korral peab ordinaadi 0 ja 100 % vahemik olema umbes 10 cm laiune.
      2.2.   ARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      2.2.1.   Katsetatav aine
      
                  —
               
               
                  Olemasolev teave analüüsitava aine kohta (identifitseerimiskood, lisandid, ebapuhtused).
               
            
                  —
               
               
                  Proovi eeltöötluse täpne kirjeldus, tähelepanekud, probleemid.
               
            2.2.2.   Seadmed
      
                  —
               
               
                  Eluendi mahuti, inertgaas, eluendi degaseerimine, eluendi koostis, ebapuhtused.
               
            
                  —
               
               
                  Pump, pulsatsioonisummuti, injektsioonisüsteem.
               
            
                  —
               
               
                  Lahutuskolonnid (tootja, kõik kolonni näitajad, nagu poori suurus, täitematerjali liik jms, kasutatavate kolonnide arv, pikkus ja järjekord).
               
            
                  —
               
               
                  Kolonni (või nende kombinatsiooni) teoreetiliste taldrikute arv, lahutamise efektiivsus (süsteemi lahutusvõime).
               
            
                  —
               
               
                  Andmed piikide sümmeetria kohta.
               
            
                  —
               
               
                  Kolonni temperatuur, temperatuurikontrolli liik.
               
            
                  —
               
               
                  Detektor (mõõtmise põhimõte, tüüp, küveti ruumala).
               
            
                  —
               
               
                  Kulumõõtja, kui kasutati (tootja, mõõtmispõhimõte).
               
            
                  —
               
               
                  Andmete salvestamise ja töötlemise süsteem (riist- ja tarkvara).
               
            2.2.3.   Süsteemi kalibreerimine
      
                  —
               
               
                  Kalibreerimiskõvera koostamiseks kasutatud meetodi täpne kirjeldus.
               
            
                  —
               
               
                  Andmed selle meetodi kvaliteedikriteeriumite kohta (näiteks korrelatsioonikoefitsient, ruutsumma viga jms).
               
            
                  —
               
               
                  Andmed kõikide ekstrapoleerimiste, oletuste ja lähenduste kohta, mis tehti eksperimendi ning andmete hindamise ja töötlemise käigus;
               
            
                  —
               
               
                  Kõik kalibreerimiskõvera koostamiseks tehtud mõõtmised peavad olema dokumenteeritud tabelis, mis sisaldab kalibreerimiskõvera iga punkti kohta alljärgnevat teavet:
                  
                              —
                           
                           
                              proovi nimetus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              proovi tootja;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tootjapoolsed või mõõtmistel saadud standardit iseloomustavad Mp, Mn, Mw ja Mw/Mn väärtused koos määramismeetodi üksikasjadega;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              süsteruumala ja -kontsentratsioon;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kalibreerimisel kasutatud Mp väärtus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              piigi maksimumile vastav mõõdetud elutsiooniruumala või parandatud retentsiooniaeg;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              piigi maksimumile arvutatud Mp;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              arvutatud Mp protsentuaalne viga ja kalibreerimistulemus.
                           
                        
            2.2.4.   Hindamine
      
                  1)
               
               
                  Aja põhjal hindamine: nõutava korratavuse tagamiseks kasutatavad meetodid (parandusmeetod, sisestandard jms).
               
            
                  2)
               
               
                  Teave selle kohta, kas hindamine viidi läbi elutsiooniruumala või retentsiooniaja põhjal.
               
            
                  3)
               
               
                  Teave hindamise piiratuse kohta, kui piik ei ole täielikult analüüsitud.
               
            
                  4)
               
               
                  Silumismeetodite kirjeldus, kui neid kasutati.
               
            
                  5)
               
               
                  Proovi ettevalmistamise ja eeltöötluse protseduurid.
               
            
                  6)
               
               
                  Lahustumatute osakeste olemasolu.
               
            
                  7)
               
               
                  Süsteruumala (μl) ja -kontsentratsioon (mg/ml).
               
            
                  8)
               
               
                  Tähelepanekud seikade kohta, mis võivad põhjustada kõrvalekaldumist ideaalsest geelkromatograafia profiilist.
               
            
                  9)
               
               
                  Kõikide katseprotseduurides tehtud muudatuste üksikasjalik kirjeldus.
               
            
                  —
               
               
                  Veapiiride üksikasjalikud andmed.
               
            
                  —
               
               
                  Mis tahes muu teave ja tähelepanekud, mis puudutavad tulemuste tõlgendamist.
               
            3.   VIITED
      
                  1.
               
               
                  DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.
               
            
                  2.
               
               
                  Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.
               
            
                  3.
               
               
                  ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
               
            
                  4.
               
               
                  ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
               
            
         Liide
         Näited muudest meetoditest, mida kasutatakse polümeeride arvkeskmise molekulmassi (Mn) määramisel
         Geelkromatograafia (GPC) on eelistatud meetod Mn määramiseks, eriti juhul, kui kättesaadav on standardite kogum, mille struktuur on võrreldav uuritava polümeeri struktuuriga. Kui geelkromatograafia kasutamisel on praktilist laadi raskused või olemasolevate andmete põhjal võib eeldada, et uuritav aine ei vasta esitatavatele Mn kriteeriumitele (vajab eelnevalt kinnitamist), siis on võimalik kasutada alternatiivseid meetodeid, näiteks järgmisi.
         1.   Kolligatiivsete omaduste kasutamine
         
                     1.1.
                  
                  
                     Ebullioskoopia/krüoskoopia
                     Hõlmab lahusti keemistemperatuuri tõusu (ebullioskoopia) või külmumistemperatuuri alanemise (krüoskoopia) mõõtmist pärast polümeeri lisamist. Meetod põhineb sellel, et lahustunud polümeeri mõju keemis- või külmumistemperatuurile sõltub polümeeri molekulmassist (1, 2).
                     Rakendatavus: Mn < 20 000.
                  
               
                     1.2.
                  
                  
                     Aururõhu alandamine
                     Hõlmab valitud võrdlusvedeliku aururõhu mõõtmist enne ja pärast teadaoleva koguse polümeeri lisamist (1, 2).
                     Rakendatavus: Mn < 20 000 (teoreetiliselt; praktikas siiski piiratud).
                  
               
                     1.3.
                  
                  
                     Membraanosmomeetria
                     Põhineb osmoosi põhimõttel, st tasakaalu saavutamiseks läbivad lahusti molekulid poolläbilaskvat membraani lahjemast lahusest kontsentreeritumasse lahusesse. Katses kasutatav lahja lahus on nullkontsentratsiooniga ja kontsentreeritud lahus sisaldab polümeeri. Läbi membraani tungiv lahusti tekitab rõhkude erinevuse, mis sõltub polümeeri kontsentratsioonist ja molekulmassist (1, 3, 4).
                     Rakendatavus: Mn vahemikus 20 000 – 200 000.
                  
               
                     1.4.
                  
                  
                     Aurufaasi osmomeetria
                     Hõlmab puhta lahusti aerosooli aurustumiskiiruse võrdlemist vähemalt kolme aerosooliga, mis sisaldavad uuritava polümeeri erinevaid kontsentratsioone (1, 2, 4).
                     Rakendatavus: Mn < 20 000.
                  
               2.   Lõpprühma alüüs
         Selle meetodi kasutamiseks on vajalik teada nii polümeeri üldist struktuuri kui ka ahela otsmiste rühmade keemilist koostist (mis peab olema eristatav põhiahelast näiteks NMR või tiitrimise/derivatiseerimise abil). Polümeeris esinevate otsmiste rühmade molekulaarse kontsentratsiooni määramise kaudu saab leida molekulmassi (7, 8, 9).
         Rakendatavus: Mn kuni 50 000 (kahaneva usaldusväärsusega).
         3.   Viited
         
                     1.
                  
                  
                     Billmeyer, F. W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York.
                  
               
                     2.
                  
                  
                     Glover, C. A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P. E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.
                  
               
                     3.
                  
                  
                     ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determinition of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Menbrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
                  
               
                     4.
                  
                  
                     Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25 to 52.
                  
               
                     5.
                  
                  
                     ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
                  
               
                     6.
                  
                  
                     Morris, C. E. M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed., John Wiley and Sons.
                  
               
                     7.
                  
                  
                     Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.
                  
               
                     8.
                  
                  
                     Garmon, R. G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P. E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.
                  
               
                     9.
                  
                  
                     Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.
                  
               
      A.19.   MADALAMOLEKULAARSETE AINETE SISALDUS POLÜMEERIS
      1.   MEETOD
      Käesolev geelkromatograafia (GPC) meetod on OECD katsejuhendi nr 119 (1996) koopia. Meetodi põhimõte ja tehniline lisateave on toodud kirjandusviidetes.
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Kuna polümeeride omadused on väga erinevad, siis on võimatu kirjeldada ühtainust meetodit, mille lahutamis- ja analüüsitingimused katavad kõiki polümeeride eraldamisel esinevaid võimalikke juhtumeid ja iseärasusi. Sageli ei ole keeruliste polümeerisegude koostisosadeks lahutamine geelkromatograafiaga võimalik. Kui geelkromatograafia ei ole kasutatav, siis võib molekulmassi määramiseks kasutada teisi meetodeid (vt lisa). Sellistel juhtudel tuleb kasutatava meetodi kohta esitada kõik üksikasjad ja põhjendused.
      Kirjeldatav meetod põhineb standardil DIN 55672 (1). Üksikasjalik teave katsete tegemiseks ja andmete hindamiseks on toodud nimetatud DIN standardis. Kui katse tingimuste muutmine osutub vajalikuks, siis peab vastavaid muudatusi põhjendama. Kasutada võib ka muid standardeid, kui neile antakse täielikud viited. Kirjeldatava meetodi kalibreerimiseks kasutatakse teadaoleva polüdisperssusega polüstüreenproove ja teatud polümeeride (näiteks vesilahustuvad ja pika ahelaga hargnenud polümeerid) analüüsil võib osutuda vajalikuks meetodi muutmine.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Madal molekulmass on kokkuleppeliselt molekulmass, mis on väiksem kui 1 000 daltonit.
      Arvkeskmise molekulmassi Mn ja masskeskmise molekulmassi Mw arvutamiseks kasutatakse järgmisi valemeid:
      
                  
                     
               
               
                  
                     
               
            kus
      
                  Hi
                  
               
               
                  =
               
               
                  on detektori signaali kõrgus mõõdetuna baasjoonelt retentsioonimahu Vi jaoks
               
            
                  Mi
                  
               
               
                  =
               
               
                  on retentsioonimahule Vi vastava polümeerifraktsiooni molekulmass ja n on mõõtepunktide arv
               
            Molekulmassi jaotuse laius, mis iseloomustab segu disperssust, saadakse Mw/Mn suhtest.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Kuna geelkromatograafia on suhteline meetod, siis peab seda kalibreerima. Selleks otstarbeks kasutatakse tavaliselt kitsa fraktsioonilise jaotusega lineaarseid polüstüreenstandardeid, mille keskmised molekulmassid Mn ja Mw ja molekulmasside jaotus on teada. Kalibreerimiskõverat võib kasutada tundmatu proovi molekulmassi määramiseks vaid siis, kui proovi ja standardi lahutamiseks kasutatavad tingimused on valitud ühtviisi.
      Molekulmassi ja elueerunud ruumala vaheline suhe on õige vaid konkreetsele katsele iseloomulikel tingimustel. Nimetatud tingimused hõlmavad eelkõige temperatuuri, lahustit (või lahustite segu), kromatograafilisi tingimusi ja kasutatavat kolonni või kolonnisüsteemi.
      Sellisel viisil proovist määratud molekulmassid on suhtelised ja neid nimetatakse „polüstüreeniekvivalendi molekulmassideks”. See tähendab, et sõltuvalt proovi ja standardi vahelistest struktuurilistest ja keemilistest erinevustest võivad molekulmassid hälbida absoluutsetest väärtustest rohkemal või vähemal määral. Juhul kui kasutatakse teisi standardeid, näiteks polüetüleenglükool, polüetüleenoksiid, polümetüülmetakrülaat, polüakrüülhape, siis peab seda põhjendama.
      1.4.   KATSE MEETODI PÕHIMÕTE
      Geelkromatograafiaga võib määrata nii proovi molekulmassi jaotust kui ka keskmisi molekulmasse (Mn, Mw). Geelkromatograafia on spetsiaalne vedelikkromatograafia liik, milles proov lahutatakse üksikute koostisosade hüdrodünaamiliste ruumalade järgi (2).
      Lahutamiseks juhitakse proov läbi poorse materjaliga, tavaliselt orgaanilise geeliga, täidetud kolonni. Väikesed molekulid suudavad tungida pooridesse, kuhu suurte molekulide juurdepääs on takistatud. Seetõttu on suurte molekulide teepikkus lühem ja nad elueeruvad kiiremini. Keskmise suurusega molekulid tungivad osadesse pooridesse, mistõttu nad elueeruvad mõnevõrra aeglasemalt. Kõige väiksemad molekulid, mille keskmine hüdrodünaamiline raadius on väiksem kui geeli poorid, tungivad kõikidesse pooridesse ja elueeruvad viimastena.
      Ideaaljuhul mõjutab lahutamist ainult molekulide suurus, kuid praktikas on raske vältida vähemalt mõningaid adsorptsioonist tingitud segavaid mõjusid. Kolonni ebaühtlane täitematerjal ja suurem omaruumala võivad olukorda halvendada (2).
      Detekteerimiseks kasutatakse näiteks refraktsiooni indeksit või UV-absorptsiooni ja tulemuseks saadakse lihtne jaotuskõver. Selleks, et omistada saadud kõverale tegelikke molekulmassi väärtusi, tuleb kolonni kalibreerida teadaolevate molekulmassidega ja ideaaljuhul üldjoontes sarnase struktuuriga polümeeridega, näiteks erinevad polüstüreenstandardid. Tüüpiliselt saadakse Gaussi kõver, mis on mõnikord madalate molekulmasside osas väljaveninud sabaga, kusjuures vertikaalsel teljel on elueerunud erinevate molekulmassiga ühendite kogus massi järgi ja horisontaalsel teljel on logaritmilises skaalas molekulmass.
      Nimetatud kõveralt saadakse madalmolekulaarsete ainete sisaldus. Arvutused saavad olla täpsed vaid siis, kui madala molekulmassiga ühendid annavad massi alusel detektorile samase signaali kui kogu polümeer.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Elutsiooniruumala korratavus (suhteline standardhälve, RSD) peaks olema parem kui 0,3 %. Kui kromatogrammi hinnatakse ajalise sõltuvuse põhjal ja see ei vasta ülaltoodud kriteeriumitele, tagatakse analüüsi nõutav korratavus sisestandardi kasutamisega (1). Polüdisperssused sõltuvad standardite molekulmassidest. Polüstüreenistandardite kasutamisel on tüüpilised väärtused järgmised:
      
                  Mp < 2 000
               
               
                  Mw/Mn < 1,20
               
            
                  2 000 ≤ Mp ≤ 106
                  
               
               
                  Mw/Mn < 1,05
               
            
                  Mp > 106
                  
               
               
                  Mw/Mn < 1,20
               
            (Mp on piigi maksimumile vastav standardi molekulmass)
      1.6.   MEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Polüstüreeni standardlahuste valmistamine
      Polüstüreeni standardid lahustatakse ettevaatlikul segamisel valitud eluendiga. Lahuste valmistamisel peab arvestama tootja soovitusi.
      Valitud standardi kontsentratsioonid sõltuvad mitmetest erinevatest teguritest, näiteks süsteruumala, lahuse viskoossus ja analüütilise detektori tundlikkus. Maksimaalset süsteruumala peab kohandama vastavalt kolonni pikkusele, et vältida kolonni ülelaadimist. Geelkromatograafia analüütiliste meetodite korral jäävad tüüpilised süsteruumalad vahemikku 40 kuni 100 μl, kui kolonni mõõdud on 30 cm × 7,8 mm. Võimalik on kasutada ka suuremaid ruumalasid, kuid need ei tohiks ületada 250 μl. Enne kolonni tegelikku kalibreerimist tuleb kindlaks teha süsteruumala ja kontsentratsiooni vaheline optimaalne suhe.
      1.6.2.   Proovilahuse valmistamine
      Põhimõtteliselt kehtivad ülaltoodud nõuded ka proovilahuste valmistamisel. Proov lahustatakse sobivas lahustis, näiteks tetrahüdrofuraanis (THF), ettevaatlikul loksutamisel. Mitte mingil juhul ei tohi lahustamiseks kasutada ultrahelivanni. Vajaduse korral puhastatakse proovi lahust membraanfiltriga, mille pooride suurus on 0,2 kuni 2 μm.
      Lahustumatute osakeste olemasolu peab ära märkima ka lõplikus aruandes, kuna see võib olla tingitud kõrge molekulmassiga ühenditest. Lahustunud osakeste massiprotsendi määramiseks peab kasutama sobivat meetodit. Valmistatud lahuseid peab kasutama 24 tunni jooksul.
      1.6.3.   Parandused ebapuhtuste ja lisandite sisalduse jaoks
      Tavaliselt on vajalik molekulmassiga M < 1 000 ühendite sisalduse korrigeerimine, mis on tingitud mittepolümeersetest komponentidest (näiteks ebapuhtused ja/või lisandid), välja arvatud juhul, kui nende ühendite mõõdetud sisaldus on niigi < 1 %. Selleks analüüsitakse otse polümeerilahust või geelkromatograafi eluaati.
      Kui eluaat on pärast kolonni läbimist liiga lahja edasiseks analüüsiks, siis peab seda kontsentreerima. Vajalik võib olla eluaadi kuivaks aurutamine ja saadud jäägi uuesti lahustamine. Eluaati peab kontsentreerima tingimustel, mis ei põhjusta eluaadis muutusi. Geelkromatograafi eluaadi töötlemine sõltub kvantitatiivseks määramiseks kasutatavast analüütilisest meetodist.
      1.6.4.   Seadmed
      Geelkromatograafia seadmed sisaldavad järgmisi komponente:
      
                  —
               
               
                  mahuti lahustile;
               
            
                  —
               
               
                  degaseerija (vajaduse korral);
               
            
                  —
               
               
                  pump;
               
            
                  —
               
               
                  pulsatsioonisummuti (vajaduse korral);
               
            
                  —
               
               
                  injektsioonisüsteem;
               
            
                  —
               
               
                  kromatograafilised kolonnid;
               
            
                  —
               
               
                  detektor;
               
            
                  —
               
               
                  kulumõõtja (vajaduse korral);
               
            
                  —
               
               
                  andmesalvesti ja-töötleja;
               
            
                  —
               
               
                  nõu jääkide jaoks.
               
            Enne peab kindlaks tegema, et geelkromatograafia süsteem oleks kasutatavate lahustite suhtes inertne (näiteks tetrahüdrofuraani jaoks kasutada teraskapillaare).
      1.6.5.   Injektsiooni ja lahusti etteandmise süsteem
      Proovilahuse etteantud kogus sisestatakse automaatse injektoriga või käsitsi täpselt kindlaks määratud kolonni piirkonda. Käsitsi injektsiooni korral võib süstla kolvi liiga kiire tagasitõmbamine või vabastamine põhjustada muutusi mõõdetava molekulmassi jaotuses. Lahusti etteandmise süsteem peaks olema võimalikult pulseerimisvaba, sisaldades ideaaljuhul pulsatsioonisummutit. Voolukiirus on suurusjärgus 1 ml/min.
      1.6.6.   Kolonn
      Sõltuvalt proovist kasutatakse polümeeri iseloomustamiseks kas ühte kolonni või mitut järjestikku ühendatud kolonni. Kolonni täitematerjalidena on kaubanduslikult kättesaadavad paljud poorsed kindlate omadustega ained (näiteks poori suurus, eksklusioonipiirid). Lahutamiseks kasutatava geeli või kolonni pikkuse valik sõltub nii proovi omadustest (hüdrodünaamiline ruumala, molekulmasside jaotus) kui ka spetsiifilistest lahutamistingimustest, näiteks lahusti, temperatuur ja voolukiirus (1, 2, 3).
      1.6.7.   Teoreetilised taldrikud
      Lahutamiseks kasutatavat kolonni või kolonnide süsteemi iseloomustatakse teoreetiliste taldrikute arvuga. Tetrahüdrofuraani kasutamisel eluendina hinnatakse seda etüülbenseeni või mõne muu sobiva mittepolaarse lahustunud aine (soluudi) laadimisel teadaoleva pikkusega kolonni. Teoreetiliste taldrikute arv saadakse järgmiste valemite põhjal:
      
                  
                     
               
               
                  või
               
               
                  
                     
               
            kus
      
                  N
               
               
                  =
               
               
                  on teoreetiliste taldrikute arv
               
            
                  Ve
                  
               
               
                  =
               
               
                  on piigi maksimumile vastav elutsiooniruumala
               
            
                  W
               
               
                  =
               
               
                  on piigi laius baasjoonel
               
            
                  W1/2
                  
               
               
                  =
               
               
                  on piigi laius poolel piigi kõrgusel
               
            1.6.8.   Lahutamise efektiivsus
      Lisaks ribalaiust määravale teoreetiliste taldrikute arvule on tähtis ka lahutamise efektiivsus, mis sõltub sellest, kui järsk on kalibreerimiskõvera tõus. Kolonni lahutuse efektiivsus saadakse järgmisest seosest:
      
         
      kus
      
                  Ve, Mx
                     
                  
               
               
                  =
               
               
                  on polüstüreeni molekulmassiga Mx elutsiooniruumala
               
            
                  Ve,(10.Mx
                     
                  
               
               
                  =
               
               
                  on kümme korda suurema molekulmassiga polüstüreeni elutsiooniruumala
               
            Süsteemi lahutusvõimet defineeritakse tavaliselt järgmiselt:
      
         
      kus
      
                  Ve1, Ve2
                  
               
               
                  =
               
               
                  on kahe polüstüreenistandardi elutsiooniruumalad piigi maksimumil
               
            
                  W1, W2
                  
               
               
                  =
               
               
                  on piigi laiused baasjoonel
               
            
                  M1, M2
                  
               
               
                  =
               
               
                  on piigi maksimumile vastavad molekulmassid (peaksid erinema kümme korda)
               
            Kolonnisüsteemi R-väärtus peaks olema suurem kui 1,7 (4).
      1.6.9.   Lahustid
      Kõik lahustid peavad olema kõrge puhtusastmega (kasutatava tetrahüdrofuraani puhtus on 99,5 %). Lahustimahuti (vajaduse korral paigutatud inertgaasi atmosfääri) peab olema piisavalt suur, et võimaldada kolonni kalibreerimist ja proovide analüüsi. Enne pumpamist kolonni peab lahustit degaseerima.
      1.6.10.   Temperatuurikontroll
      Kriitilise tähtsusega komponentide (injektsioonisilmus, kolonnid, detektor ja torustik) temperatuur peab olema konstantne ja sobima kasutatavale lahustile.
      1.6.11.   Detektor
      Detektori eesmärk on kolonnist elueeruva proovi kontsentratsiooni kvantitatiivne mõõtmine. Selleks, et vältida piikide tarbetut laienemist, peab detektori mõõteraku küveti ruumala olema võimalikult väike. See ei tohiks olla suurem kui 10 μl, välja arvatud valguse hajuvust ja viskoossust mõõtvate detektorite korral. Detektorina kasutatakse tavaliselt diferentsiaalrefraktomeetriat. Tingituna proovi või eluendi spetsiifilistest omadustest võib kasutada ka muud tüüpi detektsioonimeetodeid, näiteks UV/VIS, IR, viskoossusdetektorid jms.
      2.   ANDMED JA ARUANDLUS
      2.1.   ANDMED
      Hindamiskriteeriumitele ning andmete kogumisele ja töötlemisele esitatavate üksikasjalike nõuete osas peaks järgima DIN standardit (1).
      Iga proovi jaoks peab tegema kaks teineteisest sõltumatut katset. Neid katseid peab eraldi analüüsima. Kõikidel juhtudel on oluline arvestada ka pimekatse andmeid, mis on tehtud prooviga samadel katsetingimustel.
      Üheselt mõistetavalt peab näitama, et mõõdetud väärtused on suhtelised väärtused, mis on ekvivalentsed kasutatud standardi molekulmassidega.
      Pärast retentsiooniruumalade või -aegade kindlaksmääramist (mida võib parandada sisestandardite kasutamisega) esitatakse log Mp väärtused (kus Mp on kalibratsioonistandardi piigi maksimum) ühe järgnevalt toodud suuruse funktsioonina: Mn, Mw või Mw/Mn. Molekulmassi dekaadi (kümnekordse vahemiku) kohta on vaja vähemalt kahte kalibreerimiskõvera punkti ja terve kõvera jaoks on vaja vähemalt viit mõõtepunkti, mis peaks hinnanguliselt katma proovi molekulmassi. Kalibreerimiskõvera madala molekulmassiga osa lõpppunkt määratakse kindlaks n-heksüülbenseeni või muu sobiva mittepolaarse soluudi abil. Kõvera osa, mis vastab molekulmassidele alla 1 000, analüüsitakse ja parandatakse ebapuhtuste ja lisandite suhtes. Elutsioonikõveraid analüüsitakse tavaliselt elektrooniliste andmetöötluse vahenditega. Käsitsi digitaliseerimise kasutamisel võib eeskujuks võtta standardi ASTM D 3536-91 (3).
      Juhul, kui mis tahes lahustumatu polümeer jääb kolonni, siis on selle molekulmass tõenäoliselt suurem kui mis tahes komponendi oma lahustuvas fraktsioonis ja selle arvesse võtmata jätmisel hinnatakse üle madala molekulmassiga komponentide sisaldust. Madala molekulmassiga komponentide sisalduse määramise parandusjuhised lahustumatu polümeeri jaoks on toodud lisas.
      Jaotuskõvera peab esitama tabeli või joonise kujul (diferentsiaalne sagedus või protsentide summa log M funktsioonina). Graafilisel kujutamisel peab üks molekulmassi kümnekordne vahemik olema umbes 4 cm laiune ja piigi maksimum peab olema umbkaudu 8 cm kõrgune. Integraalsete jaotuskõverate korral peab ordinaadi 0 ja 100 % vahemik olema umbes 10 cm laiune.
      2.2.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      2.2.1.   Katsetatav aine
      
                  —
               
               
                  Olemasolev teave analüüsitava aine kohta (identifitseerimiskood, lisandid, ebapuhtused).
               
            
                  —
               
               
                  Proovi eeltöötluse täpne kirjeldus, tähelepanekud, probleemid.
               
            2.2.2.   Seadmed
      
                  —
               
               
                  Eluendimahuti, inertgaas, eluendi degaseerimine, eluendi koostis, ebapuhtused.
               
            
                  —
               
               
                  Pump, pulsatsioonisummuti, injektsioonisüsteem.
               
            
                  —
               
               
                  Lahutuskolonnid (tootja, kõik kolonni näitajad, nagu poori suurus, täitematerjali liik jms, kasutatavate kolonnide arv, pikkus ja järjekord).
               
            
                  —
               
               
                  Kolonni (või nende kombinatsiooni) teoreetiliste taldrikute arv, lahutamise efektiivsus (süsteemi lahutusvõime).
               
            
                  —
               
               
                  Andmed piikide sümmeetria kohta.
               
            
                  —
               
               
                  Kolonni temperatuur, temperatuurikontrolli liik.
               
            
                  —
               
               
                  Detektor (mõõtmispõhimõte, tüüp, küveti ruumala).
               
            
                  —
               
               
                  Kulumõõtja, kui kasutati (tootja, mõõtmispõhimõte).
               
            
                  —
               
               
                  Andmete salvestamise ja töötlemise süsteem (riist- ja tarkvara).
               
            2.2.3.   Süsteemi kalibreerimine
      
                  —
               
               
                  Kalibreerimiskõvera koostamiseks kasutatud meetodi täpne kirjeldus.
               
            
                  —
               
               
                  Andmed selle meetodi kvaliteedinõuete kohta (näiteks korrelatsioonikoefitsient, ruutsumma viga jms).
               
            
                  —
               
               
                  Andmed kõikide ekstrapoleerimiste, oletuste ja lähenduste kohta, mis tehti eksperimendi ning andmete hindamise ja töötlemise käigus.
               
            
                  —
               
               
                  Kõik kalibreerimiskõvera koostamiseks tehtud mõõtmised peavad olema dokumenteeritud tabelis, mis sisaldab kalibreerimiskõvera iga punkti kohta alljärgnevat teavet:
                  
                              —
                           
                           
                              proovi nimetus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              proovi tootja;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tootjapoolsed või mõõtmistel saadud standardit iseloomustavad Mp, Mn, Mw ja Mw/Mn väärtused, koos määramismeetodi üksikasjadega;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              süsteruumala ja -kontsentratsioon;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kalibreerimisel kasutatud Mp väärtus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              piigi maksimumile vastav mõõdetud elutsiooniruumala või parandatud retentsiooniaeg;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              piigi maksimumile arvutatud Mp;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              arvutatud Mp protsentuaalne viga ja kalibreerimistulemus.
                           
                        
            2.2.4.   Andmed madalamolekulaarse polümeeri sisalduse kohta
      
                  —
               
               
                  Analüüsimeetodite kirjeldus ja katsete tegemise viis.
               
            
                  —
               
               
                  Madalamolekulaarsete komponentide protsentuaalne sisaldus (massi järgi) võrreldes kogu prooviga.
               
            
                  —
               
               
                  Andmed ebapuhtuste, lisandite ja muude mittepolümeersete komponentide kohta massiprotsendina kogu proovist.
               
            2.2.5.   Hindamine
      
                  —
               
               
                  Retentsiooniaja järgi hindamine: nõutava korratavuse tagamiseks kasutatavad meetodid (parandusmeetod, sisestandard jms).
               
            
                  —
               
               
                  Teave selle kohta, kas hinnati elutsiooniruumala või retentsiooniaja põhjal.
               
            
                  —
               
               
                  Teave hindamise piiratuse kohta, kui piik ei ole täielikult analüüsitud.
               
            
                  —
               
               
                  Silumismeetodite kirjeldus, kui neid kasutati.
               
            
                  —
               
               
                  Proovi ettevalmistamise ja eeltöötluse protseduurid.
               
            
                  —
               
               
                  Lahustumatute osakeste olemasolu.
               
            
                  —
               
               
                  Süsteruumala (μl) ja -kontsentratsioon (mg/ml).
               
            
                  —
               
               
                  Tähelepanekud seikade kohta, mis võivad põhjustada kõrvalekaldumist ideaalsest geelkromatograafia profiilist.
               
            
                  —
               
               
                  Kõikide katseprotseduurides tehtud muudatuste üksikasjalik kirjeldus.
               
            
                  —
               
               
                  Veapiiride üksikasjalikud andmed.
               
            
                  —
               
               
                  Mis tahes muu teave ja tähelepanekud, mis puudutavad tulemuste tõlgendamist.
               
            3.   VIITED
      
                  1.
               
               
                  DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.
               
            
                  2.
               
               
                  Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.
               
            
                  3.
               
               
                  ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
               
            
                  4.
               
               
                  ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
               
            
         Liide
         Madala molekulmassiga komponentide sisalduse parandamise juhised lahustumatu polümeeri olemasolul
         Proovis sisalduv lahustumatu polümeer põhjustab massikadu geelkromatograafilises analüüsis. Lahustumatu polümeer jääb pöördumatult kolonni või proovi ettevalmistamisel kasutatud filtrile, kuid proovi lahustuv osa läbib kolonni. Kui polümeeri refraktsiooniindeksi juurdekasvu (dn/dc) saab hinnata või mõõta, siis on võimalik hinnata proovi massikadu kolonnis. Sellisel juhul kasutatakse paranduse tegemiseks välist kalibreerimist teadaoleva kontsentratsiooniga ja dn/dc väärtusega standardainetega, et kalibreerida refraktomeetri signaali. Järgnevas näites kasutatakse polü(metüülmetakrülaat) (pMMA) standardit.
         Akrüülpolümeeride analüüsil välise kalibreerimise saamiseks viiakse geelkromatograafi teadaoleva kontsentratsiooniga pMMA standardi lahus tetrahüdrofuraanis ja saadud andmeid kasutatakse refraktomeetri konstandi leidmiseks järgmise valemi põhjal:
         K = R/(C×V× dn/dc)
         kus
         
                     K
                  
                  
                     =
                  
                  
                     refraktomeetri konstant (mikrovoltsekund/ml)
                  
               
                     R
                  
                  
                     =
                  
                  
                     pMMA standardi signaal (mikrovolt/sekund)
                  
               
                     C
                  
                  
                     =
                  
                  
                     pMMA standardi kontsentratsioon (mg/ml)
                  
               
                     V
                  
                  
                     =
                  
                  
                     süsteruumala (ml) ja dn/dc pMMA lahuse tetrahüdrofuraanis refraktsiooniindeksi juurdekasv (ml/mg)
                  
               Järgmised andmed on tüüpilised pMMA standardi jaoks:
         
                     R
                  
                  
                     =
                  
                  
                     2 937 891
                  
               
                     C
                  
                  
                     =
                  
                  
                     1,07 mg/ml
                  
               
                     V
                  
                  
                     =
                  
                  
                     0,1 ml
                  
               
                     dn/dc
                  
                  
                     =
                  
                  
                     9 × 10-5 ml/mg
                  
               Saadavat K väärtust, 3,05 × 10, kasutatakse teoreetilise detektori signaali arvutamiseks, kui 100 % süstitud polümeerist elueerus läbi detektori.
      
      A.20.   POLÜMEERIDE LAHUSTUMIS-/EKSTRAHEERUMISKÄITUMINE VEES
      1.   MEETOD
      Kirjeldatav meetod on OECD katsejuhendi nr 120 (1997) parandatud versiooni koopia. Täpsem tehniline lisateave on toodud kirjandusviites (1).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Osade polümeeride, nagu emulsioonipolümeerid, korral on vajalik eeltöötlus enne allkirjeldatud meetodi kasutamist. Meetod ei ole kasutatav vedelate polümeeride ja katsetingimustel veega reageerivate polümeeride jaoks.
      Kui meetod ei ole otstarbekohane või võimalik, siis võib polümeeri lahustumis- või ekstraheerumiskäitumist uurida muude meetodite abil. Sellistel juhtudel tuleb kasutatava meetodi kohta esitada kõik üksikasjad ja põhjendused.
      1.2.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Polümeeride lahustumis- või ekstraheerumiskäitumist vesilahuses uuritakse muudatustega kolvimeetodil (vt A.6 „Vees lahustuvus”, „Kolvimeetod”), mida on alljärgnevalt kirjeldatud.
      1.4.   KVALITEEDINÕUDED
      Puuduvad.
      1.5.   MEETODI KIRJELDUS
      1.5.1.   Seadmed
      Meetodi jaoks on vajalikud järgmised seadmed:
      
                  —
               
               
                  purustamisseade, näiteks jahvatusmasin, kindla suurusega osakeste valmistamiseks;
               
            
                  —
               
               
                  seade loksutamiseks, temperatuurikontrolli võimalusega;
               
            
                  —
               
               
                  membraanfiltratsiooni süsteem;
               
            
                  —
               
               
                  asjakohased analüütilised seadmed;
               
            
                  —
               
               
                  standardsed sõelad.
               
            1.5.2.   Proovi ettevalmistus
      Esindusliku proovi peab esmalt vähendama osakeste suuruseni 0,125 kuni 0,25 mm, kasutades vastavaid sõelu. Proovi stabiilsuse tagamiseks või jahvatamiseks võib vajalik olla jahutamine. Kummilaadseid materjale saab purustada vedela lämmastiku temperatuuril (1).
      Kui osakeste soovitud suurusega fraktsioon ei ole saavutatav, peab vähendama osakeste suurust nii palju kui võimalik ja saadud tulemused protokollima. Protokollis peab täpselt ära näitama, mil viisil säilitati purustatud proovi enne katset.
      1.5.3.   Protseduur
      Katsetatava aine kolm proovi (igaüks 10 g) kaalutakse vastavalt kolme klaaskorgiga varustatud nõusse ja igaühte lisatakse 1 000 ml vett. Kui polümeeri koguses 10 g ei ole võimalik käsitleda, siis peab kasutama suurimat kogust, mille käsitlemine on veel võimalik, ja muutma vastavalt sellele ka vee kogust.
      Nõud suletakse tihedalt ja seejärel loksutatakse temperatuuril 20 oC. Kasutada tuleks konstantsel temperatuuril töötavat loksutit või segajat. 24 tunni pärast tsentrifuugitakse või filtritakse iga nõu sisu ja selges veefaasis määratakse polümeeri kontsentratsioon sobiva analüüsimeetodiga. Kui veefaasi jaoks puudub sobiv analüüsimeetod, siis võib summaarset lahustuvust/ekstraktiivsust hinnata filtril oleva jäägi või tsentrifuugimise sademe kuivkaalu põhjal.
      Tavaliselt on vajalik ebapuhtuste ja lisandite ning madala molekulmassiga komponentide kvantitatiivne eristamine. Gravimeetrilise analüüsi korral on tähtis sooritada ka pimekatse ilma testaineta, et hinnata katseprotseduurist tingitud jääkide kogust.
      Polümeeride lahustumis- või ekstraheerumiskäitumist vesilahuses temperatuuril 37 oC ning pH 2 ja pH 9 juures võib määrata samal viisil, nagu kirjeldati katse tegemist temperatuuril 20 oC. Vastava pH väärtuse saavutamiseks võib lisada kas sobivaid puhvreid, happeid või aluseid, nagu vesinikkloriidhape, etaanhape, analüütilise puhtusega naatrium- või kaaliumhüdroksiid või ammoniaak.
      Sõltuvalt analüüsimeetodist peaks tegema ühe või kaks katset. Kui polümeeri vesilahuse otsese analüüsi jaoks on olemas piisavalt spetsiifilised meetodid, siis piisab ühest eelnevalt kirjeldatud katsest. Kui sellised meetodid ei ole kättesaadavad ja polümeeri lahustumis- või ekstraheerumiskäitumise määramine piirdub vaid kaudse analüüsiga, kus määratakse veefaasi kogu orgaanilise süsiniku sisaldus (TOC), peab tegema lisakatse. Lisakatse hõlmab samuti kolme paralleelkatset, milles kasutatakse kümme korda väiksemat polümeerikogust ja sama veekogust, mida kasutati esimeses katses.
      1.5.4.   Analüüs
      1.5.4.1.   Ühe proovi suurusega tehtud katse
      Polümeeri komponentide otseseks analüüsiks veefaasis võib olla sobivaid meetodeid. Alternatiivina saab kasutada lahustunud või ekstraheerunud polümeeri komponentide kaudset analüüsi, millega määratakse lahustuvate komponentide üldine sisaldus ning tehakse parandusi polümeerile mittespetsiifiliste komponentide osas.
      Kõikide polümeeri komponentide analüüs veefaasis on võimalik kas piisavalt tundliku meetodiga, näiteks
      kogu orgaanilise süsiniku määramine (TOC), kasutades persulfaadi või dikromaadiga lagundamist, tekkiva süsinikdioksiidi koguse määramiseks kasutatakse infrapunaspektroskoopiat või keemilisi analüüsimeetodeid;
      
                  —
               
               
                  aatomabsorptsioonspektromeetria (AAS) või induktiivsidestunud plasma (ICP) emissioonspektromeetria, kui polümeer sisaldab räni või metalle;
               
            
                  —
               
               
                  UV-absorptsioon või spektrofluoromeetria arüülpolümeeride jaoks;
               
            
                  —
               
               
                  vedelikkromatograafia – mass-spektromeetria (LC-MS) madala molekulmassiga proovide jaoks,
               
            
                  —
               
               
                  või aurutades vee ekstrakti kuivjäägini ja analüüsides saadud jääki spektroskoopiliselt (IR, UV jms) või AAS/ICP abil.
               
            Kui veefaasi analüüs ei ole teostatav, siis peaks vesiekstrakti ekstraheerima vees segunematu orgaanilise lahustiga, näiteks klorosüsivesinikega. Lahusti aurutatakse ja saadud jäägis analüüsitakse ülalnimetatud polümeeri sisaldust. Selles jäägis sisalduvad ebapuhtusena või lisanditena identifitseeritud komponendid lahutatakse tulemusest, et määrata polümeeri lahustumis- või ekstraheerumisastet.
      Kui proov sisaldab suhteliselt palju sellist materjali, siis võib jääki analüüsida vedelikkromatograafia (HPLC) või gaaskromatograafia (GC) abil, et eraldada ebapuhtused monomeeridest ja monomeeridest pärinevatest komponentidest nii, et saab määrata monomeeride tegeliku koguse.
      Osadel juhtudel on piisav orgaanilise lahusti aurutamine kuivjäägini ja saadud jäägi kaalumine.
      1.5.4.2.   Kahe erineva proovi suurusega tehtud katse
      Kõikides vesiekstraktides analüüsitakse kogu orgaanilist süsinikku (TOC).
      Proovi lahustumatut või ekstraheerumatut osa analüüsitakse gravimeetriliselt. Kui pärast iga nõu sisu tsentrifuugimist või filtrimist on nõu seintel polümeeri jääke, siis peab nõud loputama filtraadiga, kuni selle seintel ei ole jääke näha. Seejärel filtritakse või tsentrifuugitakse filtraati uuesti. Filtril või tsentrifuugiklaasis olevat jääki kuivatatakse temperatuuril 40 oC vaakumis ning kaalutakse. Kuivatamist jätkatakse kuni konstantse kaalu saavutamiseni.
      2.   ANDMED
      2.1.   ÜHE PROOVI SUURUSEGA TEHTUD KATSE
      Kõigi kolme kolvikatse tulemused ja keskmised väärtused peab esitama ja tulemused tuleb väljendada massiühikutes lahuse ruumala kohta (tüüpiliselt mg/l) või massiühikutes polümeeri proovi massi kohta (tüüpiliselt mg/g). Lisaks tuleb esitada proovi massikadu (arvutatakse soluudi massi jagamisel esialgse proovi massiga). Katsete puhul tuleks arvutada ka suhteline standardhälve (RSD). Kogu proovi (polümeer + olulised lisandid jms) ja ainult polümeeri (pärast selliste lisandite mõju lahutamist) kohta peab esitama eraldi tulemused.
      2.2.   KAHE ERINEVA PROOVI SUURUSEGA TEHTUD KATSE
      Kahest kolme paralleelkatsega eksperimendist saadud TOC väärtused ja iga eksperimendi keskmine tuleb esitada massiühikuna lahuse ruumala kohta (tavaliselt mgC/l) ja massiühikuna proovi massi kohta (tavaliselt mgC/g).
      Kõrge ja madala proovi/vee suhtega katsetulemuste vahelise erinevuse puudumine viitab sellele, et kõik ekstraheeruvad komponendid on ekstraheerunud. Sellistel juhtudel ei ole tavaliselt otsene analüüs vajalik.
      Jääkide massid peab esitama ja tulemused tuleb väljendada protsendina proovi esialgsest massist. Iga katse jaoks peab arvutama keskmise. Erinevused 100 % ja leitud protsendi vahel esitavad lahustuva ja ekstraheeruva materjali protsendilist sisaldust esialgses proovis.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   ARUANNE
      Katsetulemused peavad sisaldama järgmist teavet.
      3.1.1.   Katsetatav aine
      
                  —
               
               
                  Olemasolev teave analüüsitava ühendi kohta (identifitseerimiskood, lisandid, ebapuhtused, madala molekulmassiga komponentide sisaldus).
               
            3.1.2.   Katse tingimused
      
                  —
               
               
                  Kasutatud protseduuride kirjeldus ja katse tingimused.
               
            
                  —
               
               
                  Analüütiliste ja määramismeetodite kirjeldus.
               
            3.1.3.   Tulemused
      
                  —
               
               
                  Lahustuvuse/ekstraktiivsuse tulemused (mg/l); erinevates lahustes tehtud ekstraktsioonikatsete üksikud ja keskmised väärtused, lagunenud polümeeri sisaldus, ebapuhtused, lisandid jms.
               
            
                  —
               
               
                  Polümeeri lahustuvuse/ekstraktiivsuse tulemused (mg/g).
               
            
                  —
               
               
                  Kui mõõdeti, siis vee ekstraktide TOC tulemused, soluudi mass ja arvutatud protsendid.
               
            
                  —
               
               
                  Iga proovi pH väärtus.
               
            
                  —
               
               
                  Pimekatsete tulemused.
               
            
                  —
               
               
                  Kus vajalik, peab viitama katsetatava ühendi keemilisele ebastabiilsusele nii katse kui ka analüütilise protsessi käigus.
               
            
                  —
               
               
                  Kogu teave, mis on oluline tulemuste tõlgendamisel.
               
            4.   VIITED
      
                  1.
               
               
                  DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.
               
            A.21.   OKSÜDEERIMISVÕIME (VEDELIKUD)
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesolev katsemeetod on välja töötatud selleks, et mõõta vedeliku võimet suurendada põleva materjali põlemiskiirust või põlemisintensiivsust või moodustada segu tuleohtliku ainega, mis süttib iseeneslikult juhul, kui need kaks ainet segatakse omavahel põhjalikult. See põhineb oksüdeerivate vedelike (1) ÜRO katsel ja on sellega samaväärne. Kuna käesolev meetod A.21 on algselt ette nähtud vastama määruse (EÜ) nr 1907/2006 nõuetele, on vaja teha võrdlus üksnes ühe võrdlusainega. Katsete tegemine ja võrdlemine täiendava võrdlusainega võib olla vajalik juhul, kui eeldatakse, et katse tulemusi kasutatakse muudel eesmärkidel (9).
      Käesolevat katset ei ole vaja teha juhul, kui struktuurivalemi uurimine teeb kahtlusteta kindlaks, et aine ei reageeri tuleohtliku materjaliga eksotermiliselt.
      On kasulik teada enne katsetamist, kas aine võib plahvatada.
      Käesolev katse ei ole kasutatav tahkete ainete, gaaside, plahvatusohtlike või kergestisüttivate ainete ega orgaaniliste peroksiidide puhul.
      Käesolevat katset ei ole vaja teha juhul, kui oksüdeerivaid vedelikke (1) käsitlevas ÜRO katses on tulemused uuritava katseaine kohta juba olemas.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Keskmine rõhutõusuaeg on katse käigus manomeeterrõhu suurenemiseks 690 kPa-lt 2 070 kPa-le kulunud aegade keskmine.
      1.3.   VÕRDLUSAINE
      Võrdlusainena kasutatakse 65 %list (massiprotsent) lämmastikhappe vesilahust (analüütiliselt puhas) (10).
      Kui katse tegija näeb ette, et katse tulemusi võib lõpuks kasutada muudel eesmärkidel, (9) võib soovi korral samuti osutuda vajalikuks katse tegemine täiendavate võrdlusainetega (11).
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritav vedelik segatakse kiudtselluloosiga massisuhtes 1:1 ja pannakse surveanumasse. Kui segamisel või anuma täitmisel ilmneb isesüttimine, ei ole vaja katsete tegemist jätkata.
      Kui isesüttimist ei toimu, tehakse kogu katse. Segu kuumutatakse surveanumas ja määratakse kindlaks keskmine aeg, mis kulub manomeeterrõhu suurenemiseks 690 kPa-lt 2 070 kPa-le. Seda võrreldakse sellise keskmise ajaga, mis kulub võrdlusaine(te) ja tselluloosi 1:1 segu korral rõhu suurenemiseks.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Ühe ainega tehtud viiest katsest koosnevas seerias ei tohi ükski tulemus erineda aritmeetilisest keskmisest rohkem kui 30 %. Tulemused, mis erinevad keskmisest rohkem kui 30 %, jäetakse kõrvale, täiustatakse segamis- ja täitmismenetlust ning korratakse katset.
      1.6.   MEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Ettevalmistus
      1.6.1.1.   Põlev aine
      Põleva ainena kasutatakse kuivatatud kiudtselluloosi, mille kiu pikkus on 50–250 μm ja keskmine läbimõõt on 25 μm (12). Seda kuivatakse konstantse kaaluni kuni 25 mm paksuses kihis 105 oC juures neli tundi ja hoitakse eksikaatoris koos desikandiga kuni jahtumise ja kasutamiseni. Kuivatatud tselluloosi niiskusesisaldus peaks olema alla 0,5 % kuivmassist (13). Vajaduse korral peaks selle tagamiseks kuivatamisaega pikendama (14). Tselluloosi sama partiid kasutatakse kogu uuringu vältel.
      1.6.1.2.   Seadmed
      1.6.1.2.1.   Surveanum
      
      Vaja läheb surveanumat. Anumaks on silindriline terasest anum, mille pikkus on 89 mm ja välisläbimõõt on 60 mm (vt joonist 1). Vastaskülgedel paikneb kaks tasapinnalist süvendit (millega on anuma sisemist vaba ruumi vähendatud 50 mm-ni) süüteküünla ja väljalaskeava korgi paigaldamise hõlbustamiseks. Anumas oleva 20 mm siseläbimõõduga kanali mõlemas otsas on 19 mm astmetaoline laiend, mis on keermestatud vastavalt Briti standardsele 1" torukeermele (British Standard Pipe – BSP) või samaväärsele meeterkeermele. Surveanuma kumerasse külgpinda on ühest otsast 35 mm kaugusele kruvitud külgharu, mis paikneb tasapinnaliste süvenditega 90o nurga all ning mis on ette nähtud ühendamiseks rõhuanduriga. Külgharu pesa moodustab 12 mm sügavune puuritud ava, mis on keermestatud vastavalt külgharu otsas oleva 1/2" BSP keermega (või samaväärse meeterkeermega). Vajaduse korral paigaldatakse inertne tihend, mis tagab hermeetilise ühenduskoha. Külgharu ulatub 55 mm surveanuma korpusest väljapoole ja sellesse on puuritud kanal siseläbimõõduga 6 mm. Külgharu otsas on astmetaoline keermestatud süvend, mis on ette nähtud ühendamiseks membraani tüüpi rõhuanduriga. Kasutada võib mis tahes rõhumõõturit, tingimusel et seda ei mõjuta kuumad gaasid või lagunemissaadused ning et see on võimeline reageerima rõhutõusudele 690 – 2 070 kPa vähem kui 5 ms jooksul.
      Surveanuma külgharust kaugemal asuv ots on suletud süüteküünlaga, milles on kaks elektroodi –üks on isoleeritud küünla korpusest ja teine on sellega ühendatud (maandatud). Surveanuma teine ots on suletud puruneva membraaniga (purunemissurve ligikaudu 2 200 kPa), mida hoiab paigal 20 mm läbimõõduga puuritud avaga kork. Vajaduse korral kasutatakse ühenduskoha hermeetilisuse tagamiseks inertset tihendit. Tugiraam (joonis 2) hoiab komplekti kasutamise ajal õiges asendis. Tugiraam koosneb tavaliselt pehmest rauast alusplaadist, mille mõõtmed on 235 mm × 184 mm × 6 mm, ja 185 mm pikkusest õõnsusega ruudukujulisest sektsioonist (S.H.S.) mõõtmetega 70 mm × 70 mm × 4 mm.
      Õõnsusega ruudukujulise sektsiooni ühe otsa kaks vastaskülge on maha lõigatud selliselt, et moodustub kahest tasapinnalise küljega jalast struktuur, mille otsas paikneb 86 mm pikkune terviklik karbikujuline osa. Nende tasapinnaliste külgedega jalgade otsad on lõigatud horisontaalsuuna suhtes 60o all ning on keevitatud alusplaadi külge. Põhisektsiooni ülaosa ühes küljes paikneb pilu laiusega 22 mm ja sügavusega 46 mm nii, et kui rõhuanuma komplekt lastakse allapoole, süüteküünlaga ots ees, siis satub külgharu pilusse. Karbikujulise osa alumise sisepinna külge keevitatakse terasest 30 mm laiune ja 6 mm paksune detail, mis toimib eraldajana. Kaks vastasküljel olevat 7 mm pitskruvi hoiavad surveanumat kindlalt paigal. Kaks 12 mm laiust ja 6 mm paksust terasriba, mis on keevitatud karbikujulise sektsiooni põhjale toetuvate külgmiste elementide külge, toetavad surveanumat altpoolt.
      1.6.1.2.2.   Süütesüsteem
      
      Süütesüsteem koosneb 25 cm pikkusest Ni/Cr traadist, mille läbimõõt on 0,6 mm ja takistus on 3,85 oom/m. Traat on keritud spiraalina 5 mm läbimõõduga varda abil ja kinnitatud süüteküünla elektroodide külge. Spiraali kuju peaks vastama joonisel 3 toodule. Anuma põhja ja süütespiraali alakülje vaheline kaugus peaks olema 20 mm. Kui elektroode ei saa reguleerida, tuleks süütespiraali ja anuma põhja vahel olevad traadi otsad isoleerida keraamilise kestaga. Traati kuumutatakse püsivoolutoiteallikaga, mis suudab tagada vähemalt 10 A voolutugevuse.
      1.6.2.   Katse tegemine
             (15)
         
      
      Seade, mis on komplekteeritud rõhuanduri ja kuumutussüsteemiga, kuid kuhu ei ole paigaldatud purunevat membraani, toetub altpoolt süüteküünlale. 2,5 g uuritavat vedelikku segatakse keeduklaasis 2,5 g kuivatatud tselluloosiga, kasutades klaasist segamispulka (16). Ohutuse tagamiseks on tegija ja segu vahel segamise ajal kaitseekraan. Kui segu süttib segamise või anuma täitmise ajal, ei ole vaja katsetamist jätkata. Segu lisatakse tilkhaaval väikeste portsjonitena surveanumasse, tagades segu paiknemise ümber süütespiraali ja sellega hea kontakti. On oluline, et spiraal ei deformeeru anuma täitmise ajal, kuna see võib põhjustada väärasid tulemusi (17). Purunev membraan asetatakse kohale ja lukustav kork keeratakse kõvasti kinni. Täidetud anum asetatakse tugiraamile nii, et purunev membraan jääb ülespoole. Tugiraam asetatakse sobivasse armeeritud tõmbekappi või põlemiskambrisse. Toiteallikas ühendatakse süüteküünla välimiste klemmidega ja lülitatakse sisse 10 A vool. Aeg segamise alustamisest kuni voolu sisselülitamiseni ei tohiks ületada kümmet minutit.
      Rõhuanduri signaal registreeritakse sobiva süsteemi abil, mis võimaldab nii signaali hindamist kui ka rõhu ajalise sõltuvuse pidevat registreerimist (nt graafilise isekirjutiga ühendatud siirdeprotsesside registraator). Segu kuumutatakse kuni puruneva membraani rebestumiseni või vähemalt 60 s. Kui purunev membraan ei rebestu, tuleks lasta segul jahtuda enne seadme hoolikat lahtimonteerimist, vältides seejuures võimalikku hermeetilisuse kadumist. Uuritava aine ja võrdlusaine(te)ga tehakse viis katset. Fikseeritakse aeg, mis kulub manomeeterrõhu tõusuks 690 kPa-lt 2 070 kPa-le. Arvutatakse keskmine rõhutõusuaeg.
      Mõnedel juhtudel võivad ained tekitada rõhutõusu (liiga suurt või liiga väikest), mille põhjuseks on keemilised reaktsioonid, mis ei ole seotud aine oksüdeerimisvõimega. Neil juhtudel võib osutuda vajalikuks katse kordamine tselluloosi asemel inertse ainega, nt diatomiidiga (kobediatomiit), et selgitada reaktsiooni olemust.
      2.   ANDMED
      Rõhutõusuajad nii uuritava aine kui ka võrdlusaine(te) puhul. Rõhutõusuajad inertse ainega katsete puhul (kui need on tehtud).
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE
      Arvutatakse keskmised rõhutõusuajad nii uuritava aine kui ka võrdlusaine(te) kohta.
      Arvutatakse keskmine rõhutõusuaeg inertse ainega katsete puhul (kui need on tehtud).
      Mõned näited tulemuste kohta on toodud tabelis 1.
      Tabel 1
      Näiteid tulemustest
             (18)
         
      
      
                  Aine (19)
                  
               
               
                  Keskmine rõhutõusu aeg (ms) 1:1 tselluloosisegu puhul
               
            
                  Ammooniumdikromaat, küllastunud vesilahus
               
               
                  20 800
               
            
                  Kaltsiumnitraat, küllastunud vesilahus
               
               
                  6 700
               
            
                  Raud(III)nitraat, küllastunud vesilahus
               
               
                  4 133
               
            
                  Liitiumperkloraat, küllastunud vesilahus
               
               
                  1 686
               
            
                  Magneesiumperkloraat, küllastunud vesilahus
               
               
                  777
               
            
                  Nikkelnitraat, küllastunud vesilahus
               
               
                  6 250
               
            
                  Lämmastikhape, 65 %
               
               
                  4 767 (20)
                  
               
            
                  Perkloorhape, 50 %
               
               
                  121 (20)
                  
               
            
                  Perkloorhape, 55 %
               
               
                  59
               
            
                  Kaaliumnitraat, 30 % vesilahus
               
               
                  26 690
               
            
                  Hõbenitraat, küllastunud vesilahus
               
               
                  — (21)
                  
               
            
                  Naatriumkloraat, 40 % vesilahus
               
               
                  2 555 (20)
                  
               
            
                  Naatriumkloraat, 45 % vesilahus
               
               
                  4 133
               
            
                  Inertne aine
               
               
                   
               
            
                  Vesi: tselluloos
               
               
                  — (21)
                  
               
            3.   ARUANDLUS
      3.1.   ARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet:
      
                  —
               
               
                  uuritud aine nimetus, koostis, puhtus jne;
               
            
                  —
               
               
                  uuritava aine kontsentratsioon;
               
            
                  —
               
               
                  tselluloosi kuivatusmenetlus;
               
            
                  —
               
               
                  tselluloosi niiskusesisaldus;
               
            
                  —
               
               
                  mõõtetulemused;
               
            
                  —
               
               
                  inertse ainega tehtud katsete tulemused, kui need on olemas;
               
            
                  —
               
               
                  arvutatud keskmised rõhutõusuajad;
               
            
                  —
               
               
                  võimalikud kõrvalekalded nimetatud meetodist ja nende põhjused;
               
            
                  —
               
               
                  kogu täiendav teave või märkused, mis on vajalikud tulemuste tõlgendamiseks.
               
            3.2.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE (22)
      
      Katsetulemusi hinnatakse
      
                  a)
               
               
                  selle põhjal, kas uuritava aine ja tselluloosi segu süttib ise, ja
               
            
                  b)
               
               
                  rõhutõusule (690 kPa-lt 2 070 kPa-le) kulunud keskmise aja võrdlemisel võrdlusaine(te) korral selleks kulunud ajaga.
               
            Vedelikku käsitatakse oksüdeerijana juhul, kui
      
                  a)
               
               
                  uuritava aine ja tselluloosi 1:1 segu (massi järgi) süttib iseeneslikult või
               
            
                  b)
               
               
                  uuritava aine ja tselluloosi 1:1 segu (massi järgi) korral on keskmine rõhutõusuaeg väiksem 65 massiprotsendilise lämmastikhappe (vesilahus) ja tselluloosi 1:1 segu (massi järgi) korral saadud keskmisest rõhutõusuajast või on sellega võrdne.
               
            Valepositiivse tulemuse vältimiseks tuleks tulemuste tõlgendamisel arvesse võtta ka tulemusi, mis on saadud aine katsetamisel koos inertse materjaliga.
      4.   VIITED
      
                  1.
               
               
                  Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3. täiendatud väljaanne. ÜRO väljaanne nr: ST/SG/AC.10/ll/Rev. 3, 1999, lk 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids.
               
            Joonis 1
      Surveanum
      
         
      Joonis 2
      Tugiraam
      
         
      Joonis 3
      Süütesüsteem
      
         
      Märkus: toodud kujutistest võib kasutada emba-kumba.
      
         (1)  Sõltub seadme tüübist ja toimeaine puhtusastmest.
      
         (2)  Sõltub seadme tüübist ja toimeaine puhtusastmest.
      
         (3)  Sõltub seadme tüübist ja toimeaine puhtusastmest.
      
         (4)  Sõltub seadme tüübist ja toimeaine puhtusastmest.
      
         (5)  See täpsus kehtib ainult lihtsa, näiteks ASTM D 1120-72 kirjeldusele vastava seadme puhul; keerukamate ebulliomeetrite abil on täpsust võimalik suurendada.
      
         (6)  Kehtib ainult puhaste ainete puhul. Muudel juhtudel kasutamist tuleb põhjendada.
      
         (7)  Sõltub puhtusastmest
      
         (8)  Hoolikal käsitlemisel on neid
      
         (9)  Näiteks ÜRO transpordieeskirjade raames.
      
         (10)  Hapet tuleks kontsentratsiooni kindlaksmääramiseks enne katse tegemist tiitrida.
      
         (11)  Nt 50 % (massiprotsent) perkloorhapet ja 40 % (massiprotsent) naatriumkloraati kasutatakse viites 1.
      
         (12)  Nt Whatman Column Chromatographic Cellulose Powder CF 11, katalooginumber 4021 050.
      
         (13)  Kinnitatakse nt tiitrimisega Karl-Fisheri järgi.
      
         (14)  Nimetatud niiskusesisaldust on võimalik saavutada ka nt kuumutamisel 105 oC juures vaakumis 24 tunni jooksul.
      
         (15)  Oksüdeerijate ja tselluloosi segusid tuleb käsitada plahvatusohtlikena ja käsitleda ettevaatlikult.
      
         (16)  Praktikas saab seda teha, valmistades 1:1 segu uuritavast vedelikust ja tselluloosist suuremas koguses, kui katseks vaja, ning pannes 5 ±0,1 g surveanumasse. Igaks katseks tuleb segu värskelt valmistada.
      
         (17)  Eelkõige tuleb vältida spiraali naaberkeerdude vahelist kontakti.
      
         (18)  Vt viidet 1 ÜRO transpordieeskirjade kohase klassifitseerimise kohta.
      
         (19)  Küllastunud lahused tuleks valmistada 20 oC juures.
      
         (20)  Laboritevaheliste võrdluskatsete keskmine väärtus.
      
         (21)  Suurimat rõhku 2 070 kPa ei ole saavutatud.
      
         (22)  Vt viide 1, tulemuste tõlgendamine ÜRO transpordieeskirjade kohaselt mitmeid võrdlusaineid kasutades.
   
   
      B OSA: MÜRGISUSE JA MUUDE TERVISEMÕJUDE MÄÄRAMISE MEETODID
      SISUKORD
      ÜLDINE SISSEJUHATUS
      
                  B.1a.
               
               ÄGE SUUKAUDNE MÜRGISUS – KINDLA ANNUSE PROTSEDUUR
            
                  B.1b.
               
               ÄGE SUUKAUDNE MÜRGISUS – ÄGEDA MÜRGISUSASTME MEETOD
            
                  B.2.
               
               ÄGE MÜRGISUS (SISSEHINGAMISEL)
            
                  B.3.
               
               ÄGE MÜRGISUS (NAHAKAUDNE)
            
                  B.4.
               
               ÄGE MÜRGISUS: NAHAÄRRITUS/-SÖÖVITUS
            
                  B.5.
               
               ÄGE MÜRGISUS: SILMADE ÄRRITUS/SÖÖVITUS
            
                  B.6.
               
               NAHA SENSIBILISEERIMINE
            
                  B.7.
               
               TOKSILINE TOIME KORDUSDOOSI TÕTTU (28 PÄEVA) (SUUKAUDNE)
            
                  B.8.
               
               KORDUSDOOSI MÜRGISUS (28 PÄEVA, SISSEHINGAMISEL)
            
                  B.9.
               
               KORDUSDOOSI MÜRGISUS (28 PÄEVA, NAHAKAUDNE)
            
                  B.10.
               
               MUTAGEENSUS – IMETAJATE KROMOSOOMABERRATSIOONKATSE IN VITRO
               
            
                  B.11.
               
               MUTAGEENSUS – KROMOSOOMABERRATSIOONKATSE IMETAJATE LUUÜDIS IN VIVO
               
            
                  B.12.
               
               MUTAGEENSUS – PISITUUMA KATSE IMETAJATE ERÜTROTSÜÜTIDES IN VIVO
               
            
                  B.13/14.
               
               MUTAGEENSUS – BAKTERITE PÖÖRDMUTATSIOONKATSE
            
                  B.15.
               
               MUTAGEENSUSE JA KARTSINOGEENSUSE UURING, GEENMUTATSIOON – SACCHAROMYCES CEREVISIAE
               
            
                  B.16.
               
               MITOOTILINE REKOMBINATSIOON – SACCHAROMYCES CEREVISIAE
               
            
                  B.17.
               
               MUTAGEENSUS – IN VITRO IMETAJATE RAKKUDE GEENMUTATSIOONKATSE
            
                  B.18.
               
               DNA KAHJUSTAMINE JA PARANDAMINE – PLAANIVÄLINE DNA SÜNTEES – IMETAJATE RAKKUDEL IN VITRO
               
            
                  B.19.
               
               ÕDEKROMATIIDI VAHETUSE IN VITRO ANALÜÜS
            
                  B.20.
               
               SUGULIITELISE RETSESSIIVSE LETAALSUSE TEST ÄÄDIKAKÄRBSEL DROSOPHILA MELANOGASTER
               
            
                  B.21.
               
               IMETAJARAKU TRANSFORMATSIOONITESTID IN VITRO
               
            
                  B.22.
               
               NÄRILISTE DOMINANTSE LETAALSUSE TEST
            
                  B.23.
               
               IMETAJATE SPERMATOGOONIDE KROMOSOOMABERRATSIOONKATSE
            
                  B.24.
               
               HIIRE NAHALAIKUDE TEST
            
                  B.25.
               
               HIIRE PÄRILIK TRANSLOKATSIOON
            
                  B.26.
               
               SUBKROONILISE SUUKAUDSE TOKSILISUSE KATSE – SUUKAUDSE KORDUSDOOSI TOKSILISUSE 90PÄEVANE UURING NÄRILISTEL
            
                  B.27.
               
               SUBKROONILISE SUUKAUDSE TOKSILISUSE KATSE – SUUKAUDSE KORDUSDOOSI TOKSILISUSE 90PÄEVANE UURING MITTENÄRILISTEL
            
                  B.28.
               
               SUBKROONILISE TOKSILISUSE TEST NAHAKAUDSEL MANUSTAMISEL 90PÄEVANE KORDUVANNUSTE NAHAKAUDSE MANUSTAMISE UURING NÄRILISTE LIIKIDEL
            
                  B.29.
               
               SUBKROONILISE TOKSILISUSE TEST INHALEERIMISEL – 90PÄEVANE KORDUVANNUSTE INHALATSIOONIUURING NÄRILISTE LIIKIDEL
            
                  B.30.
               
               KROONILISE TOKSILISUSE KATSE
            
                  B.31.
               
               SÜNNIEELSE ARENGU MÜRGISUSE UURIMUS
            
                  B.32.
               
               KARTSINOGEENSUSE UURING
            
                  B.33.
               
               KOMBINEERITUD KROONILISE TOKSILISUSE/KARTSINOGEENSUSE UURING
            
                  B.34.
               
               ÜHE PÕLVKONNA REPRODUKTSIOONITOKSILISUSE UURING
            
                  B.35.
               
               KAHE PÕLVKONNA REPRODUKTSIOONI TOKSILISUSE UURING
            
                  B.36.
               
               TOKSIKOKINEETIKA
            
                  B.37.
               
               FOSFORORGAANILISTEST AINETEST PÕHJUSTATUD VIIVISTOIMEGA NEUROTOKSILISUS PÄRAST ÄGEDAT KOKKUPUUTUMIST
            
                  B.38.
               
               FOSFORORGAANILISTEST AINETEST PÕHJUSTATUD VIIVISTOIMEGA NEUROTOKSILISUSE 28PÄEVANE KORDUSDOOSI UURING
            
                  B.39.
               
               PLAANIVÄLISE DNA SÜNTEESI (UDS) KATSE IMETAJATE MAKSARAKKUDEGA IN VIVO
               
            
                  B.40.
               
               NAHASÖÖVITUSKATSE IN VITR0: TRANSKUTAANSE ELEKTRITAKISTUSE (TER) MÕÕTMINE
            
                  B.40a.
               
               NAHASÖÖVITUS IN VITRO: KATSE INIMNAHA MUDELIGA
            
                  B.41.
               
               
                  IN VITRO 3T3 NRU FOTOTOKSILISUSE KATSE
            
                  B.42.
               
               NAHATUNDLIKKUS: PAIKNE LÜMFISÕLMEDE UURING
            
                  B.43.
               
               NEUROTOKSILISUSE UURING NÄRILISTEL
            
                  B.44.
               
               NAHAKAUDNE IMENDUMINE: IN VIVO MEETOD
            
                  B.45.
               
               NAHAKAUDNE IMENDUMINE: IN VITRO MEETOD
            ÜLDINE SISSEJUHATUS
      A.   UURITAVA AINE ISELOOMUSTUS
      Uuritava aine koostis, sealhulgas peamised lisandid ja selle vastavad füüsikalis-keemilised omadused (sealhulgas stabiilsus), peaksid olema teada enne toksilisuse uuringu alustamist.
      Uuritava aine füüsikalis-keemilised omadused annavad olulist teavet manustamisviisi valimise, iga konkreetse uuringu kavandamise ning uuritava aine käitlemise ja säilitamise jaoks.
      Doseeritavas aines ja bioloogilises materjalis oleva uuritava aine (sealhulgas võimaluse korral peamiste lisandite) kindlakstegemiseks kasutatav kvalitatiivne ja kvantitatiivne analüüsimeetod tuleks välja töötada enne uuringu alustamist.
      Katsearuanne peaks hõlmama kogu teavet uuritava aine identifitseerimise, selle füüsikalis-keemiliste omaduste, selle puhtuse ja käitumise kohta.
      B.   LOOMADE HOOLDAMINE
      Toksilisuse uurimisel on oluline keskkonnatingimuste range kontroll ja õiged loomade hooldamise viisid.
      i)   Pidamistingimused
      Katsealuste loomade ruumide või piirdeaedade keskkonnatingimused peaksid olema katseliikide jaoks sobivad. Rottide, hiirte ja merisigade puhul on sobiv toatemperatuur 22 ± 3 oC ning suhteline õhuniiskus peaks olema 30–70 %; küülikute puhul peaks temperatuur olema 20 ± 3 oC ning suhteline õhuniiskus 30–70 %.
      Mõned uurimismeetodid on temperatuuri suhtes eriti tundlikud ning sellistel puhkudel on sobivate temperatuuritingimuste üksikasjad lisatud uurimismeetodi kirjeldusse. Kõikide toksilise toime uuringute puhul tuleks jälgida temperatuuri ja niiskust, samuti tuleks need andmed registreerida ning uuringu lõpparuandesse lisada.
      Valgustus peaks olema kunstlik, 12 tundi valget ja 12 tundi pimedat aega. Valgustustsükli üksikasjad tuleks registreerida ja märkida uuringu lõpparuandesse.
      Kui meetodis ei ole teisiti sätestatud, võib loomi pidada üksikult või väikeste rühmadena, kus emas- ja isasloomad on eraldi; kui puuris on mitu looma, ei tohiks koos olla rohkem kui viis looma.
      Loomkatsete aruannetes on oluline ära märkida, millist tüüpi puure kasutati ning mitu looma igas puuris nii keemilise ainega kokkupuutumise kui ka järgneva vaatlusperioodi jooksul oli.
      ii)   Söötmistingimused
      Toiduvalik peaks vastama kõikidele katses kasutatava liigi toitainevajadustele. Kui uuritavat ainet manustatakse loomadele toidu kaudu, võib toidu toiteväärtust vähendada vastava uuritava aine ja toidukomponendi võrra. Sellise reaktsiooni võimalikkust tuleks katse tulemuste tõlgendamisel arvesse võtta. Kasutada võib ka tavapärast katseloomadele mõeldud toitu ning joogivee hulk peab olema piiramatu. Toidu valikut võib mõjutada vajadus tagada sobiv segu, mis võimaldab uuritava aine manustamist koos toiduga.
      Toksilisust mõjutavaid toidu saasteaineid ei tohiks olla sellises kontsentratsioonis, et see segaks katse tegemist.
      C.   ALTERNATIIVSED KATSED
      Euroopa Liit püüab edendada alternatiivmeetodite väljatöötamist ja kinnitamist, mis annaksid loomkatsetest saadud teabega tasemelt samaväärset teavet, kuid kus kasutataks vähem loomi ja mis põhjustaksid vähem kannatusi või milles välditakse üldse loomade kasutamist.
      Selliste meetodite olemasolu korral tuleb neid kasutada igal võimalusel ohu kirjeldamisel ja seejärel loomuomase ohtlikkuse liigitamisel ja märgistamisel.
      D.   HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE
      Katsete hindamisel ja tõlgendamisel tuleb arvesse võtta seda, millisel määral on loomkatsete ja in vitro uuringute tulemusi võimalik ekstrapoleerida vahetult inimesele, ning seetõttu võib võimaluse korral kasutada katse tulemuste kinnitamiseks tõendeid kahjulikust toimest inimese tervisele.
      E.   VIITED KIRJANDUSELE
      Enamik nendest meetoditest on töötatud välja OECD programmi „Testing Guidelines” raames ning neid tuleks kasutada kooskõlas heade laboritavadega, et tagada võimalikult laialdane „andmete vastastikune heakskiitmine”.
      Lisateavet võib leida OECD suunistes olevatest viidetest ja muust asjakohasest kirjandusest.
      B.1a.   ÄGE SUUKAUDNE MÜRGISUS – KINDLA ANNUSE PROTSEDUUR
      1.   MEETOD
      Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 420ga (2001).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Traditsioonilised ägeda mürgisuse hindamise meetodid kasutavad loomade surma lõpetamiskriteeriumina. 1984. aastal soovitas British Toxicology Society uut lähenemist ägeda mürgisuse katsetamisele, mis põhineb aine manustamisel kindla annusemääraga seeriana (1). See lähenemine vältis loomade surma kasutamist lõpetamiskriteeriumina ja tugines selle asemel selgete mürgisuse nähtude vaatlemisele ühel seeriast valitud kindlal annusemääral. Protseduur kiideti katsemeetodina heaks 1992. aastal Ühendkuningriigi (2) ja rahvusvaheliste (3) in vivo valideerimiste põhjal. Seejärel hinnati kindla annuse protseduuri statistilisi omadusi matemaatiliste mudelite abil mitmetes uuringutes (4, 5, 6). In vivo ja mudeluuringud on tõestanud, et protseduur on korratav, et selles kasutatakse vähe loomi ja et see põhjustab vähem kannatusi kui traditsioonilised meetodid ning et selle abil saab klassifitseerida ained nii nagu muude ägeda mürgisuse katsemeetoditega.
      Juhised antud eesmärgi saavutamiseks kõige sobivama katsemeetodi valimiseks võib leida ägeda suukaudse mürgisuse katsete juhisdokumendist („Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing” (7)). Nimetatud juhisdokument sisaldab samuti lisateavet katsemeetodi B.1a kasutamise ja tõlgendamise kohta.
      Meetodi põhimõte on, et põhiuuringus kasutatakse üksnes mõõdukalt mürgiseid annuseid ja et tõenäoliselt surmavate annuste manustamist tuleks vältida. Samuti ei tohiks manustada annuseid, mis teatavasti põhjustavad märkimisväärset valu või kannatusi sööbivate või tõsiselt ärritavate mõjude tõttu. Suremas loomad või loomad, kes ilmselt on valus või kellel on tugeva ja kestva kannatuse tunnused, surmatakse humaanselt ning need võetakse arvesse katsetulemuste tõlgendamisel samamoodi nagu loomi, kes surid katse käigus. Eraldi juhisdokumendis (8) on esitatud kriteeriumid, mille põhjal tehakse otsus suremas või raskelt kannatavate loomade surmamiseks, ja juhised prognoositava või ähvardava surma kindlakstegemiseks.
      Meetod annab teavet ohtlike omaduste kohta ning võimaldab reastada ja klassifitseerida ainet ägedat mürgisust põhjustavate kemikaalide klassifitseerimiseks vastavalt globaalselt harmoneeritud süsteemile (Globally Harmonised System – GHS (9)).
      Katselaboratoorium võtab arvesse kogu katseaine kohta kättesaadava teabe enne uuringu tegemist. Selline teave sisaldab aine nimetust ja keemilist struktuuri, selle füüsikalis-keemilisi omadusi, muude ainega in vitro või in vivo tehtud mürgisuskatsete tulemusi, struktuurilt samalaadsete ainete toksikoloogilisi andmeid ja aine eeldatavat otstarvet. Selline teave on vajalik kõikide asjaosaliste veenmiseks, et katse on tähtis inimeste tervise kaitsmiseks, ja aitab valida sobivat lähteannust.
      1.2.   MÕISTED
      
         Äge suukaudne mürgisus – viitab sellistele kahjulikele mõjudele, mis ilmnevad pärast aine suukaudselt manustamist ühekordse annuse või seeriaviisiliste annustena 24 tunni jooksul.
      
         Edasilükkunud surm – loom ei sure ega näi olevat suremas 48 tunni jooksul, kuid sureb hiljem, 14päevase jälgimisperioodi jooksul.
      
         Annus – manustatava katseaine kogus. Annust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (nt mg/kg).
      
         Ilmne mürgisus – üldine mõiste, mis kirjeldab katseaine manustamise järel ilmnenud selgeid mürgisuse tunnuseid (vt näiteid viitest 3). Suuruselt järgmine kindel annus võib põhjustada enamikul loomadest tõenäoliselt kas tugevat valu ja kestva tugeva kannatuse tunnuseid, surmaeelset seisundit (kriteeriumid on toodud humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)) või tõenäoliselt surma.
      
         GHS – Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures (keemiliste ainete ja segude globaalselt harmoneeritud klassifitseerimissüsteem). Ühistegevus, milles osalevad OECD (inimeste tervis ja keskkond), ohtlike ainete vedu käsitlev ÜRO eksperdikomitee (füüsikalis-keemilised omadused) ja ILO (ohtudest teavitamine) ning mida koordineerib kemikaalide mõistlikku haldamist käsitlev organisatsioonidevaheline programm (IOMC).
      
         Ähvardav surm – loom on suremas või sureb tõenäoliselt enne järgmist kavandatud jälgimisperioodi. Närilistel võiksid sellisele seisundile viitavateks märkideks olla krambid, külili magamine, loidus ja värin (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)).
      
         LD
         
            50
         
         (surmava annuse mediaan) – aine statistiliselt määratletud ühekordne annus, mis tõenäoliselt põhjustab suukaudsel manustamisel surma 50 %-l loomadest. LD
            50
          väärtust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (mg/kg).
      
         Piirannus – vastab katses kasutatavale maksimaalsele annusele (2 000 või 5 000 mg/kg).
      
         Surmaeelne seisund – loomad, kes on suremas või kes ei suuda ellu jääda ravist hoolimata (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)).
      
         Ennustatav surm – selliste kliiniliste tunnuste olemasolu, mis viitavad sellele, et surm saabub teatud aja möödumisel enne katse kavandatavat lõppu, näiteks suutmatus tarbida vett või toitu (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)).
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Ühesooliste loomade rühmadele annustatakse katseainet järk-järgult 5, 50, 300 ja 2 000 mg/kg kindlate annustena (erandkorras võidakse kasutada 5 000 mg/kg kindlat lisaannust, vt punkti 1.6.2). Esialgne annusemäär valitakse eelkatse põhjal annusena, mis eeldatavasti põhjustab mõningaid mürgisuse nähte, kuid ei põhjusta tõsiseid toksilisi mõjusid või suremust. Valu, kannatuse ja ähvardava surmaga seotud kliinilisi tunnuseid ja tingimusi kirjeldatakse üksikasjalikult OECD juhisdokumendis (8). Järgnevatele loomarühmadele võib annustada kaitseaine suuremaid või väiksemaid kindlaid annuseid sõltuvalt sellest, kas neil on olemas või puuduvad märgid mürgisuse või suremuse kohta. Käesolevat protseduuri jätkatakse seni, kuni on kindlaks tehtud tõenäoliselt mürgisust põhjustav annus või surmajuhtum, või kui suurim annus ei avalda mõju või kui väikseim annus põhjustab surma.
      1.4.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.4.1.   Loomaliikide valik
      Eelistatud näriliste liik on rotid, kuigi võib kasutada ka näriliste teisi liike. Tavaliselt kasutatakse emasloomi (7). Selle põhjuseks on, et tavapäraseid LD50 katseid käsitlevad kirjandusülevaated näitavad, et sugupoolte tundlikkuses on vähe erinevusi, kuid neil juhtudel, kui erinevusi on täheldatud, on emasloomad üldiselt veidi tundlikumad (10). Kui struktuurselt samalaadsete kemikaalide toksikoloogilisi või toksikokineetilisi omadusi käsitlevatest andmetest nähtub, et isasloomad on tõenäoliselt tundlikumad, siis kasutatakse neid. Kui katse sooritatakse isasloomadega, tuleks esitada piisav põhjendus.
      Kasutatakse noorte tervete täiskasvanud loomade enim kasutatavaid laboritüvesid. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Iga loom peaks annustamise alustamisel olema 8–12 nädalat vana ning tema mass ei tohiks erineda rohkem kui ± 20 % varem annuse saanud loomade keskmisest massist.
      1.4.2.   Loomade pidamise ja toitmise tingimused
      Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 oC (± 3 oC). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal, peaks eesmärk olema hoida seda vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega. Loomad võib grupeerida puuridesse annuse põhjal, kuid puuris olevate loomade arv ei tohiks takistada iga looma selget jälgimist.
      1.4.3.   Loomade ettevalmistamine
      Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identifitseerimise võimaldamiseks ning hoitakse oma puurides vähemalt 5 päeva enne annustamise alustamist, et võimaldada neil kohaneda laboritingimustega.
      1.4.4.   Annuste valmistamine
      Üldiselt manustatakse katseaineid kasutatavate annuste vahemikus konstantses mahus nii, et muutub annustatava valmistise kontsentratsioon. Kui uuritakse vedelat lõppsaadust või segu, võib lahjendamata katseaine kasutamine, s.t konstantse kontsentratsiooni juures, olla siiski olulisem nimetatud aine hilisemal riskianalüüsil. See on mõnede reguleerivate asutuste nõue. Kummalgi juhul ei tohi manustamisel ületada annuse suurimat mahtu. Vedeliku suurim ühekordselt manustatav maht sõltub katselooma suurusest. Näriliste puhul ei tohiks maht tavaliselt ületada 1 ml 100 g kehamassi kohta: vesilahuste puhul võib siiski manustada 2 ml 100 g kehamassi kohta. Annuse valmistise koostamiseks on soovitav võimaluse korral kasutada vesilahust/suspensiooni/emulsiooni, tähtsuse järjekorras oleks järjestus lahus/suspensioon/emulsioon õlis (nt maisiõli) ja seejärel muudel kandeainetel põhinev lahus. Veest erinevate kandeainete puhul peaks kandeaine toksikoloogilised omadused olema teada. Annused tuleb valmistada ette natuke aega enne manustamist, välja arvatud juhul, kui valmistise stabiilsus sellel ajavahemikul, mil seda kasutatakse, on teada ja näib aktsepteeritav.
      1.5.   PROTSEDUUR
      1.5.1.   Annuste manustamine
      Katseainet manustatakse ühekordse annusena söögitoru kaudu või sobiva intubeerimiskanüüli abil. Erandkorras, kui ühekordne annus ei ole võimalik, võib annust manustada väiksemates osades kuni 24 tunni jooksul.
      Loomad peaksid enne doosi manustamist paastuma (nt rotte hoitakse söömata terve öö ja hiiri 3–4 tundi, üksnes vesi on saadaval). Paastumise järel loomi kaalutakse ja manustatakse katseaine. Pärast aine manustamist võib hoida rotte söömata veel 3–4 tundi ja hiiri 1–2 tundi. Kui annust manustatakse osadena teatud ajavahemiku jooksul, võib sõltuvalt ajavahemiku pikkusest osutuda vajalikuks anda loomadele toitu ja vett.
      1.5.2.   Eelkatse
      Eelkatse eesmärk on võimaldada valida põhiuuringu tarbeks sobiv lähteannus. Katseainet manustatakse üksikutele loomadele järk-järgult lisas 1 toodud vooskeemide kohaselt. Eelkatse on lõpetatud siis, kui saab langetada otsuse põhikatse lähteannuse kohta (või kui tuvastatakse surm madalaima kindla annuse puhul).
      Eelkatse lähteannus valitakse kindlate annusmäärade 5, 50, 300 ja 2 000 mg/kg hulgast annusena, mis eeldatavasti põhjustab ilmset mürgisust, mis võimaluse korral põhineb sama kemikaali või struktuurselt sarnaste kemikaalidega sooritatud in vivo ja in vitro katsete andmetel. Sellise teabe puudumise korral on lähteannuseks 300 mg/kg.
      Iga looma korral on manustamiste vahel vähemalt 24tunnine vahemik. Kõiki loomi jälgitakse vähemalt 14 päeva.
      Maksimaalset kindla annuse määra 5 000 mg/kg võidakse kasutada erandkorras või siis, kui see on põhjendatud konkreetsete normatiivsete vajadustega (vt 3. lisa). Loomade heaolu pärast ei ole soositud loomkatsete tegemisel GHS 5. kategooria (2 000–5 000 mg/kg) annus ja seda tuleks kasutada üksnes siis, kui on eriti tõenäoline, et sellise katse tulemustel on otsene tähtsus inimeste ja loomade tervise või keskkonna kaitsmiseks.
      Juhul kui loom, kelle peal katsetati madalaimat kindla annuse määra (5 mg/kg), eelkatse käigus sureb, on tavapäraseks toiminguks uuringu peatamine ja aine klassifitseerimine GHS 1. kategooriasse (nagu on näidatud 1. lisas). Kui on siiski nõutav klassifitseerimise täiendav kinnitamine, võib teha järgmise valikulise lisaprotseduuri. Teisele loomale manustatakse annus 5 mg/kg. Kui teine loom sureb, siis kinnitab see GHS 1. kategooriat ja katse lõpetatakse kohe. Kui teine loom jääb ellu, siis manustatakse maksimaalselt kolmele täiendavale loomale annus 5 mg/kg. Kuna suremuse risk on suur, tuleb ainet manustada kõnealustele loomadele ükshaaval, et tagada nende heaolu. Ajavahemik igale loomale annuse manustamise vahel peab olema piisav selleks, et eelmine loom jääks tõenäoliselt ellu. Kui teine loom sureb, lõpetatakse viivitamata annustamine ja rohkematele loomadele doose ei manustata. Kuna teise surma juhtum (olenemata uuritud loomade arvust katse lõpetamise hetkel) kuulub tulemuse kategooriasse A (kaks või enam surma), järgitakse 5 mg/kg fikseeritud annuse puhul 2. lisas toodud klassifitseerimisreeglit (1. kategooria, kui on kaks või enam surmajuhtumit, või 2. kategooria, kui on vaid üks surmajuhtum). Lisaks sellele antakse 4. lisas juhiseid EL süsteemi kohase klassifitseerimise kohta enne uue GHSi kasutuselevõttu.
      1.5.3.   Põhiuuring
      1.5.3.1.   Loomade arv ja annusemäärad
      Lähteannuse tasemel katsete tegemise järel võetavad meetmed on esitatud 2. lisas toodud vooskeemides. Üks kolmest meetmest on nõutav; kas katse peatamine või sobiva ohuklassi määramine, katse sooritamine suurema kindla annusega või väiksema kindla annusega. Loomade kaitsmiseks ei kasutata põhiuuringus uuesti eelkatses surma põhjustanud annusemäära (vt 2. lisa). Kogemused on näidanud, et kõige tõenäolisem tulemus läheannuse tasemel on see, et ainet on võimalik klassifitseerida ja täiendavaid katseid ei ole vaja teha.
      Igal uuritava annusemäära korral kasutatakse tavaliselt kokku viit ühest soost looma. Nende viie looma hulka kuulub üks loom eelkatsest, kellele manustati valitud annusemäärale vastav annus, ja veel neli looma (v.a harvaesineval juhul, kui põhiuuringus kasutatav annusemäär ei sisaldunud eelkatses).
      Annustamistevaheline ajavahemik iga annusemäära korral määratakse kindlaks mürgisuse tunnuste ilmnemise, kestuse ja ägeduse järgi. Järgmise annuse manustamist tuleb edasi lükata, kuni juba doosi saanud loomade ellujäämine on kindel. Vajaduse korral soovitatakse annustamistevaheliseks ajaks jätta iga annusemäära puhul 3 või 4 päeva, et võimaldada jälgida viivitunud mürgisust. Ajavahemikku võib vajaduse korral korrigeerida, nt ebaselge vastuse puhul.
      Kui kasutatakse kõrgeimat kindlat annust 5 000 mg/kg, tuleks järgida 3. lisas esitatud protseduuri (vt ka punkti 1.6.2).
      1.5.3.2.   Piirsisalduskatse
      Piirkatset kasutatakse peamiselt olukordades, kus katse tegijal on teavet selle kohta, et katsematerjal ei ole tõenäoliselt mürgine, s.t selle mürgisus ületab üksnes normatiivseid piirannuseid. Teavet katsematerjali mürgisuse kohta võib saada samalaadseid uuritud ühendeid või segusid või tooteid käsitlevatest teadmistest, võttes arvesse toksikoloogiliselt oluliste koostisosade olemust ja protsendimäära. Sellistel juhtudel, kui on vähe teavet mürgisuse kohta või see puudub üldse või mil katsematerjal on eeldatavasti mürgine, tuleks sooritada põhikatse.
      Käesoleva juhise kohase piirkatsena võidakse tavalist protseduuri kasutades kasutada eelkatset, mille lähteannus on 2 000 mg/kg (või erandkorras 5 000 mg/kg), mille järel manustatakse veel neljale loomale sama annus.
      1.6.   VAATLUSED
      Loomi jälgitakse individuaalselt pärast annustamist vähemalt esimese 30 minuti jooksul, perioodiliselt esimese 24 tunni jooksul, erilist tähelepanu pööratakse esimese 4 tunni jooksul ja seejärel iga päev, kokku 14 päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui loomad tuleb kõrvaldada uuringust ja surmata humaanselt nende heaolu pärast või kui loomad leitakse surnuna. Vaatluse kestust ei tuleks siiski jäigalt määratleda. See tuleks kindlaks määrata toksiliste reaktsioonide, nende algushetke ja taastusperioodi pikkuse põhjal ja seda võib seega vajaduse korral pikendada. Mürgisuse nähtude ilmumise ja kadumise aeg on tähtis, eriti siis, kui on tendents, et mürgisusnähud võivad ilmneda hilistumisega (11). Kõik vaatlused registreeritakse süstemaatiliselt, säilitades iga looma kohta eraldi andmed.
      Täiendavad vaatlused on vajalikud siis, kui loomadel on jätkuvalt mürgisuse tunnused. Vaatlused peaksid hõlmama muutusi nahal ja karvkattes, silmades ja limaskestades ning samuti muutusi hingamissüsteemis, vereringes, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomotoorses tegevuses ja käitumises. Tähelepanu peaks olema suunatud värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, letargia, une ja kooma jälgimisele. Arvesse tuleks võtta humaansete lõpetamiskriteeriumide juhisdokumendis esitatud põhimõtteid ja kriteeriume (8). Suremas olevad loomad või loomad, kellel on tugev valu või tugeva kannatuse kestvad tunnused, tuleks surmata humaanselt. Kui loomad surmatakse humaansel viisil või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg võimalikult täpselt registreerida.
      1.6.1.   Kehamass
      Iga looma mass tuleks määrata kindlaks veidi enne katseaine manustamist ja seejärel vähemalt kord nädalas. Massi muutused tuleks arvutada ja protokollida. Katse lõpus ellujäänud loomad kaalutakse ja siis surmatakse humaanselt.
      1.6.2.   Patoloogia
      Kõik katseloomad (kaasa arvatud need, kes surid katse käigus või kõrvaldatakse uuringust loomade heaolu tagamiseks) lahatakse. Kõik üldpatoloogilised muutused tuleks iga looma puhul protokollida. Esialgse annustamise järel 24 või enam tundi elus püsinud loomade üldpatoloogiliste muutustega organeid võidakse samuti uurida mikroskoopiliselt, kuna see võib anda kasulikku teavet.
      2.   ANDMED
      Tulemused esitatakse iga üksiku looma kohta. Lisaks sellele tuleb kõik andmed esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates ära iga katserühma puhul osalevate loomade arvu, mürgisusnähtudega loomade arvu, katse käigus surnud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahangul tehtud leiud.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama vastavalt vajadusele järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Katseaine:
                  
                              —
                           
                           
                              füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused (kaasa arvatud isomeerumine);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              identifitseerimiseks vajalikud andmed, kaasa arvatud CASi number.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Kandeaine (vajaduse korral):
                  
                              —
                           
                           
                              kandeaine valiku põhjendus, kui see on veest erinev.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katseloomad:
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatud liigid/tüved;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade mikrobioloogiline seisund, kui see on teada;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade arv, vanus ja sugu (sh vajaduse korral põhjendus isasloomade kasutamise kohta emasloomade asemel);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              päritolu, pidamistingimused, toitumine jne.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              katseaine valmistamise üksikasjalikud andmed, sh üksikasjalikud andmed manustatava aine füüsilise oleku kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katseaine manustamise üksikasjad, sh annuste mahud ja annustamise aeg;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikasjalikud andmed toidu ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              põhjendus lähteannuse valikuks.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              tabelid iga looma (st loomad, kellel on mürgistustunnused, kaasa arvatud suremus, mõjude laad, ägedus ja kestus) reageerimise andmete ja annusemäärade kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tabelid kehamassi ja kehamassi muutuste kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              iga looma mass annustamispäeval, seejärel nädalaste intervallidega ja surma- või surmamishetkel;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              surma kuupäev ja kellaaeg juhul, kui loom sureb enne kavandatud surmamist;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              iga looma korral mürgistusnähtude algusaeg ja nende võimalik taandumine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on olemas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutelu ja tõlgendamine.
               
            
                   
               
               
                  Järeldused.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85–92.
               
            
                  2)
               
               
                  Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279–291.
               
            
                  3)
               
               
                  Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Felling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469–482.
               
            
                  4)
               
               
                  Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313–324.
               
            
                  5)
               
               
                  Stallard, N. and Whitehead, A. (199 5). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol.
               
            
                  6)
               
               
                  Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183–196.
               
            
                  7)
               
               
                  OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Pariis
               
            
                  8)
               
               
                  OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19.
               
            
                  9)
               
               
                  OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.Org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].
               
            
                  10)
               
               
                  Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P, Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, JA. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223–231.
               
            
                  11)
               
               
                  Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation . In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.
               
            
         1. LISA
         EELKATSE VOOSKEEM
         
            
         
            
      
      
         2. LISA
         PÕHIUURINGU VOOSKEEM
         
            
         
            
      
      
         3. Lisa
         KRITEERIUMID SELLISTE KATSEAINETE KLASSIFITSEERIMISE JAOKS, MILLE KORRAL OODATAVAD LD50 VÄÄRTUSED ÜLETAVAD 2 000 MG/KG JA MIDA EI OLE VAJA UURIDA
         Ohukategooriat 5 käsitlevad kriteeriumid on ette nähtud selliste katseainete identifitseerimiseks, mille korral on ägeda mürgisuse oht suhteliselt madal, kuid mis teatud tingimustel võivad ohustada tundlikke populatsioone. Nimetatud ainete LD50 väärtused on oodatavalt vahemikus 2 000–5 000 mg/kg suu- või nahakaudsel manustamisel või samaväärsete annustena muude manustamisviiside korral. Katseained võidakse klassifitseerida ohukategooriasse, mis on määratletud tingimusega: 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (GHS-kategooria 5), järgmistel juhtudel:
         
                     a)
                  
                  
                     kui on suunatud nimetatud kategooriasse lisas 2 toodud mis tahes katsekava korral, mis põhineb surmajuhtumitel;
                  
               
                     b)
                  
                  
                     kui on juba olemas usaldusväärsed tõendid, mis näitavad, et LD50 väärtus asub kategooriale 5 vastavas vahemikus, või muud loomauuringud või toksilised mõjud inimestel osutavad sellele, et ainel on vahetu mõju inimese tervisele;
                  
               
                     c)
                  
                  
                     andmete ekstrapoleerimise, hindamise või mõõtmise alusel, kui määramine ohtlikumasse kategooriasse ei ole põhjendatud, ja
                     
                                 —
                              
                              
                                 usaldusväärse teabe olemasolul oluliste toksiliste mõjude kohta inimestele või
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kui täheldatakse suremust suukaudse manustamisega katsetes kuni kategooriale 4 vastavate väärtusteni või
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kui eksperdiarvamus kinnitab mürgisuse olulisi kliinilisi tunnuseid katsetamisel kuni kategooriale 4 vastavate väärtusteni, välja arvatud kõhulahtisus, piloerektsioon või hoolitsemata välimus, või
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kui eksperdiarvamus kinnitab usaldusväärset teavet võimalike märkimisväärsete ägedate mõjude kohta muude loomauuringute põhjal.
                              
                           
               KATSETAMINE 2 000 MG/KG ÜLETAVATE ANNUSTEGA
         Maksimaalset kindlat annust 5 000 mg/kg võidakse kasutada erandkorras või siis, kui see on põhjendatud konkreetsete normatiivsete vajadustega. Tunnistades vajadust kaitsta loomade heaolu, ei kiideta katsetamist annustega 5 000 mg/kg heaks ja seda kasutatakse üksnes siis, kui on suur tõenäosus, et sellise katse tulemused oleks otseselt seotud loomade või inimeste tervise kaitsega (9).
         Eeluuring
         1. lisas esitatud järjestamist reguleerivate otsuste eeskirju laiendatakse annusemäära 5 000 mg/kg kohta. Seetõttu, kui kasutatakse eeluuringus lähteannusena 5 000 mg/kg, eeldab tulemus A (surm) teise looma korral katse tegemist annusega 2 000 mg/kg; tulemused B ja C (ilmne mürgisus või ei esine mürgisust) lubavad valida põhiuuringus lähteannuseks 5 000 mg/kg. Analoogiliselt, kui lähteannusena kasutatakse 5 000 mg/kg erinevat annust, jätkatakse katset kuni annuseni 5 000 mg/kg sellisel juhul, kui annusega 2 000 mg/kg on tulemus B või C. Kui annusega 5 000 mg/kg on tulemuseks A, on põhiuuringus lähteannuseks 2 000 mg/kg. Kui tulemuseks saadaks B ja C, on põhiuuringus algdoosiks lähteannuseks 5 000 mg/kg.
         Põhiuuring
         2. lisas esitatud järjestamist reguleerivate otsuste eeskirju laiendatakse annusemäära 5 000 mg/kg kohta. Seetõttu, kui kasutatakse põhiuuringus lähteannusena 5 000 mg/kg, eeldab tulemus A (≥2 surma) teise rühmaga katse tegemist annusega 2 000 mg/kg; tulemuste B (ilmne mürgisus ja/või ≤1 surm) või C (ei esine mürgisust) puhul on tulemuseks see, et ainet ei klassifitseerita vastavalt GHSile. Analoogiliselt, kui lähteannusena kasutatakse 5 000 mg/kg erinevat annust, jätkatakse katset kuni annuseni 5 000 mg/kg sellisel juhul, kui annusega 2 000 mg/kg on tulemus C. Kui annusega 5 000 mg/kg on tulemuseks A, klassifitseeritakse aine GHS 5. kategooriasse. Tulemuste B või C puhul jääb aine klassifitseerimata.
      
      
         Lisa 4
         KATSEMEETOD B.1a
         EÜ süsteemi kohased klassifitseerimisjuhised, mida kasutatakse üleminekuperiodil kuni globaalselt harmoneeritud süsteemi (GHS) täieliku rakendamiseni (viites (8))
         
            
         
            
      
      B.1b.   ÄGE SUUKAUDNE MÜRGISUS – ÄGEDA MÜRGISUSASTME MEETOD
      1.   MEETOD
      See katsemeetod on samaväärne OECD TG 423ga (2001).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesolevas katses sätestatud ägeda mürgisusastme meetod (1) on astmeline meetod, mille igal etapil kasutatakse kolme samast soost looma. Olenevalt loomade suremusest ja/või sellest, kas loomad on suremas, on katseaine ägeda mürgisuse hindamiseks vaja keskmiselt 2–4 etappi. Käesolev protseduur on korratav, selles kasutatakse väga vähe loomi. Selle abil võidakse järjestada ained nii nagu muude ägeda mürgisuse katsemeetodite puhul. Ägeda mürgisusastme meetod põhineb biomeetrilistel hindamistel (2, 3, 4, 5), kus kasutatakse kindlaid annuseid, mis on üksteisest piisavalt eraldatud aine klassifitseerimise eesmärgil ja ohu hindamiseks. 1996. aastal vastuvõetud meetodit valideeriti ulatuslikult in vivo, võrreldes kirjandusest saadud LD50 väärtusi käsitlevaid andmeid nii riiklikul (6) kui ka rahvusvahelisel tasandil (7).
      Juhised antud eesmärgi saavutamiseks kõige sobivama katsemeetodi valimiseks võib leida ägeda suukaudse mürgisuse katseid käsitlevast (8) juhisdokumendist. Nimetatud juhisdokument sisaldab samuti lisateavet B.1b katsemeetodi rakendamise ja tõlgendamise kohta.
      Katseaineid ei ole vaja manustada annustes, mis teadaolevalt põhjustavad märkimisväärset valu ja kannatusi sööbiva või tugeva ärritava toime tõttu. Suremas olevad loomad ja loomad, kes kannatavad ilmselgelt valu või kellel ilmnevad tõsiste või kestvate kannatuste tunnused, tuleks surmata humaanselt; need loomad võetakse arvesse katsetulemuste tõlgendamisel samamoodi nagu katse käigus surnud loomi. Eraldi juhisdokumendis (9) on esitatud kriteeriumid, mille alusel tehakse otsus suremas olevate või tõsiselt kannatavate loomade surmamise kohta, ning juhised prognoositava või ähvardava surma äratundmiseks.
      Meetod kasutab kindlaks määratud annuseid ja tulemused võimaldavad aineid järjestada ja klassifitseerida vastavalt ägedat mürgisust põhjustavate kemikaalide klassifitseerimist käsitlevale globaalselt harmoneeritud süsteemile (10).
      Põhimõtteliselt ei ole meetod ette nähtud võimaldama arvutada täpset LD50 annust, kuid võimaldab kindlaks määrata määratletud kokkupuutevahemikku, kus suremus on eeldatav, kuna käesoleva katse põhipunkt on endiselt see, et osa loomi sureb. Meetod võimaldab kindlaks määrata LD50 väärtuse üksnes siis, kui vähemalt kaks annust põhjustavad suremuse, mis on 0 %st suurem ja 100 %st väiksem. Tänu kindlaksmääratud annuste valikule sõltumata katseainest, ja klassifitseerimise selgelt väljendatud seosele erinevas seisundis täheldatud loomade arvuga on laborite aruanded järjepidevamad ja korratavamad.
      Katselaboratoorium võtab arvesse kogu katseaine kohta kättesaadava teabe enne uuringu tegemist. Selline teave sisaldab aine nimetust ja keemilist struktuuri, selle füüsikalis-keemilisi omadusi, muude ainetega in vitro või in vivo tehtud mürgisuskatsete tulemusi, struktuurilt sarnaste ainete toksikoloogilisi andmeid ja aine eeldatavat otstarvet. Selline teave on vajalik kõikide asjaosaliste veenmiseks, et katse on tähtis inimeste tervise kaitsmiseks ja aitab valida sobivat lähteannust.
      1.2.   MÕISTED
      
         Äge suukaudne mürgisus – viitab sellistele kahjulikele mõjudele, mis ilmnevad pärast aine suukaudselt manustamist ühekordse annuse või seeriaviisiliste annustena 24 tunni jooksul.
      
         Edasilükkunud surm – loom ei sure ega näi olevat suremas 48 tunni jooksul, kuid sureb hiljem, 14päevase jälgimisperioodi jooksul.
      
         Annus – manustatava katseaine kogus. Annust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (nt mg/kg).
      
         GHS – Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures (keemiliste ainete ja segude globaalselt harmoneeritud klassifitseerimissüsteem). Ühistegevus, milles osalevad OECD (inimeste tervis ja keskkond), ohtlike ainete vedu käsitlev ÜRO eksperdikomitee (füüsikalis-keemilised omadused) ja ILO (ohtudest teavitamine) ning mida koordineerib kemikaalide mõistlikku haldamist käsitlev organisatsioonidevaheline programm (IOMC).
      
         Ähvardav surm – loom on suremas või sureb tõenäoliselt enne järgmist kavandatud jälgimisperioodi. Närilistel võiksid sellisele seisundile viitavateks märkideks olla krambid, külili magamine, loidus ja värin (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9)).
      
         LD
         
            50
         
         (surmava suukaudse annuse mediaan) – aine statistiliselt määratletud ühekordne annus, mis tõenäoliselt põhjustab suukaudsel manustamisel surma 50 %l loomadest. LD50 väärtust väljendatakse katseaine massina katselooma massiühiku kohta (mg/kg).
      
         Piirannus – vastab katses kasutatavale maksimaalsele annusele (2 000 või 5 000 mg/kg).
      
         Surmaeelne seisund – loomad, kes on suremas või kes ei suuda ellu jääda ravist hoolimata (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9)).
      
         Ennustatav surm – selliste kliiniliste tunnuste olemasolu, mis viitavad sellele, et surm saabub teatud aja pärast enne katse kavandatavat lõppu; näiteks suutmatus tarbida vett või toitu (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9)).
      1.3.   KATSE PÕHIMÕTE
      Tuginedes protseduurile, mille kohaselt kasutatakse igal etapil minimaalset arvu loomi, on katse põhimõtteks saada aine klassifitseerimiseks piisavalt teavet katseaine ägeda mürgisuse kohta. Ainet manustatakse katseloomade rühmale suukaudselt ühe kindlaksmääratud doosina. Ainet katsetatakse etapiviisiliselt, igal etapil kasutatakse kolme ühest soost looma (tavaliselt emaslooma). Ühendiga seotud suremuse puudumine või esinemine loomadel, kellele ühel etapil annustati ainet, määrab kindlaks järgmise etapi, s.t:
      
                  —
               
               
                  lisakatseid ei ole vaja;
               
            
                  —
               
               
                  aine sama annus manustatakse veel kolmele loomale;
               
            
                  —
               
               
                  ainet manustatakse vastavalt vahetult järgmisele või eelmisele annusemäärale veel kolmele loomale.
               
            Katseprotseduuri üksikasju on kirjeldatud 1. lisas. Meetod võimaldab langetada otsuse seoses katseaine klassifitseerimisega ühte mürgisuse kategooriasse, mis on määratletud kindlaksmääratud LD50 piirväärtuse põhjal.
      1.4.   MEETODI KIRJELDUS
      1.4.1.   Loomaliikide valik
      Eelistatud näriliste liik on rotid, kuigi võib kasutada ka näriliste teisi liike. Tavaliselt kasutatakse emasloomi (9). Selle põhjuseks on, et tavapäraseid LD50 katseid käsitlevad kirjandusülevaated näitavad, et sugupoolte tundlikkuses on vähe erinevusi, kuid neil juhtudel, kui on erinevusi täheldatud, on emasloomad üldiselt veidi tundlikumad (11). Kui struktuurselt sarnaste kemikaalide toksikoloogilisi või toksikokineetilisi omadusi käsitlevatest andmetest nähtub, et isasloomad on tõenäoliselt tundlikumad, siis kasutatakse neid. Kui katse tehakse isasloomadega, tuleks esitada piisav põhjendus.
      Kasutatakse noorte tervete täiskasvanud loomade enim kasutatavaid laboritüvesid. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Iga loom peaks annustamise alustamisel olema 8–12 nädalat vana ning tema mass ei tohiks erineda rohkem kui ± 20 % varem annuse saanud loomade keskmisest massist.
      1.4.2.   Loomade pidamise ja toitmise tingimused
      Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 oC (± 3 oC). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi koristamise aja, peaks seda hoidma vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega. Loomad võib grupeerida puuridesse annuse põhjal, kuid puuris olevate loomade arv ei tohiks takistada iga looma selget jälgimist.
      1.4.3.   Loomade ettevalmistamine
      Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identifitseerimise jaoks ning hoitakse oma puurides vähemalt viis päeva enne annustamise alustamist, et võimaldada neil kohaneda laboritingimustega.
      1.4.4.   Annuste valmistamine
      Üldiselt manustatakse katseaineid kasutatavate annuste vahemikus konstantses mahus nii, et muutub annustatava valmistise kontsentratsioon. Kui uuritakse vedelat lõppsaadust või segu, võib lahjendamata katseaine kasutamine, s.t konstantse kontsentratsiooni juures, olla siiski olulisem nimetatud aine hilisemal riskianalüüsil, ja see on mõnede reguleerivate asutuste nõue. Kummalgi juhul ei tohi ületada manustamisel annuste suurimat mahtu. Vedeliku suurim ühekordselt manustatav maht sõltub katselooma suurusest. Näriliste puhul ei tohiks maht tavaliselt ületada 1 ml 100 g kehamassi kohta: vesilahuste puhul võib siiski manustada 2 ml 100 g kehamassi kohta. Annuse valmistise koostamiseks on soovitav võimaluse korral kasutada vesilahust/suspensiooni/emulsiooni, tähtsuse järjekorras oleks järjestus järgmine: lahus/suspensioon/emulsioon õlis (nt maisiõli) ja seejärel muudel kandeainetel põhinev lahus. Veest erinevate kandeainete puhul peaks kandeaine toksikoloogilised omadused olema teada. Annused tuleb valmistada ette natuke aega enne manustamist, välja arvatud juhul, kui valmistise stabiilsus sellel ajavahemikul, mil seda kasutatakse, on teada ja näib aktsepteeritav.
      1.5.   PROTSEDUUR
      1.5.1.   Annuste manustamine
      Katseainet manustatakse ühekordse annusena söögitoru kaudu või sobiva intubeerimiskanüüli abil. Erandkorras, kui ühekordne annus ei ole võimalik, võib annust manustada väiksemates kogustes kuni 24 tunni jooksul.
      Loomad peaksid enne doosi manustamist paastuma (nt rotte hoitakse söömata terve öö ja hiiri 3–4 tundi, üksnes vesi on saadaval). Paastumise järel loomi kaalutakse ja manustatakse katseainet. Pärast aine manustamist võib hoida rotte söömata veel 3–4 tundi ja hiiri 1–2 tundi. Kui annust manustatakse osadena teatud ajavahemiku jooksul, võib sõltuvalt ajavahemiku pikkusest osutuda vajalikuks anda loomadele toitu ja vett.
      1.5.2.   Loomade arv ja annusemäärad
      Igal etapil kasutatakse kolme looma. Lähteannusena kasutatav annusemäär valitakse üks neljast kindlast suurusest – 5, 50, 300 ja 2 000 mg/kehamassi kg. Lähteannuse määr peaks olema sellise väärtusega, mis kutsub suurima tõenäosusega esile suremust mõnede loomade hulgas, kellele ainet manustati. 1. lisas toodud vooskeemid kirjeldavad protseduure, mida tuleks järgida iga lähteannuse puhul. Lisaks sellele antakse 4. lisas juhiseid EL süsteemi kohase klassifitseerimise kohta enne uue GHSi kasutuselevõttu.
      Kui olemasolev teave kinnitab, et suremus on ebatõenäoline suurima algdoosi taseme juures (2 000 mg/kg kehamassi kohta), tuleks teha piirkatse. Kui puudub teave uuritava aine kohta, soovitatakse loomade heaolu tagamiseks kasutada algdoosina 300 mg/kg kehamassi kohta.
      Katserühmadele annustamiste ajavahemik määratakse kindlaks mürgisustunnuste algushetke, kestuse ja raskuse abil. Järgmise annuse manustamist loomadele tuleb edasi lükata hetkeni, kuni juba annuse saanud loomade ellujäämine on kindel.
      Maksimaalset kindla annuse määra 5 000 mg/kg võidakse kasutada erandkorras ja ainult siis, kui see on põhjendatud konkreetsete normatiivsete vajadustega (vt 2. lisa). Loomade heaolu pärast ei ole soositud loomkatsete tegemisel GHS 5. kategooria (2 000 – 5 000 mg/kg) annus ja seda tuleks kasutada üksnes siis, kui on eriti tõenäoline, et sellise katse tulemustel on otsene tähtsus inimeste ja loomade tervise või keskkonna kaitsmisel.
      1.5.3.   Piirkatse
      Piirkatset kasutatakse peamiselt olukordades, kus eksperimentaatoril on teavet selle kohta, et katsematerjal ei ole tõenäoliselt mürgine, s.t selle mürgisus ületab üksnes normatiivseid piirannuseid. Teavet katsematerjali mürgisuse kohta võib saada samalaadseid uuritud ühendeid, segusid või tooteid käsitlevatest teadmistest, võttes arvesse toksikoloogiliselt oluliste koostisosade olemust ja protsendimäära. Sellistel juhtudel, kui on vähe teavet mürgisuse kohta või see puudub üldse või kui katsematerjal on eeldatavasti mürgine, tuleks sooritada põhikatse.
      Piirkatse võidakse teha ühel annusemääral (2 000 mg/kg kehamassi kohta) kuue loomaga (kolm looma igal etapil). Erandkorras võib piirkatse teha ühel annusemääral (5 000 mg/kg) kolme loomaga (vt 2. lisa). Kui esineb katseainega seotud suremust, võib sooritada lisakatseid astme võrra madalama annusemääraga.
      1.6.   VAATLUSED
      Loomi jälgitakse individuaalselt pärast annustamist vähemalt esimese 30 minuti jooksul, perioodiliselt esimese 24 tunni jooksul, erilist tähelepanu pööratakse esimese nelja tunni jooksul ja seejärel iga päev kokku 14 päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui loomad tuleb kõrvaldada uuringust ja surmata humaanselt loomade heaolu pärast või kui nad leitakse surnuna. Vaatluse kestust ei tuleks siiski jäigalt määratleda. See tuleks kindlaks määrata toksiliste reaktsioonide, nende algushetke ja taastusperioodi pikkuse põhjal ja seda võib seepärast vajaduse korral pikendada. Mürgisuse nähtude ilmumise ja kadumise aeg on tähtis, eriti siis, kui on tendents, et mürgisusnähud võivad ilmneda hilistumisega (12). Kõik vaatlused registreeritakse süstemaatiliselt, säilitades iga looma kohta eraldi andmed.
      Lisavaatlused on vajalikud siis, kui loomadel on jätkuvalt mürgisuse tunnused. Vaatlused peaksid hõlmama muutusi nahal ja karvkattes, silmades ja limaskestades ning samuti muutusi hingamissüsteemis, vereringes, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomotoorses tegevuses ja käitumises. Tähelepanu peaks olema suunatud värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, letargia, une ja kooma jälgimisele. Arvesse tuleks võtta humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9) esitatud põhimõtteid ja kriteeriume. Suremas olevad loomad või loomad, kellel on tugev valu või tugeva kannatuse kestvad tunnused, tuleks surmata humaanselt. Kui loomad surmatakse humaansel viisil või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg võimalikult täpselt registreerida.
      1.6.1.   Kehamass
      Iga looma mass tuleks määrata kindlaks veidi enne katseaine manustamist ja seejärel vähemalt kord nädalas. Massi muutused tuleks arvutada ja protokollida. Katse lõpus ellu jäänud loomad kaalutakse ja siis surmatakse humaanselt.
      1.6.2.   Patoloogia
      Kõik katseloomad (kaasa arvatud need, kes surid katse käigus või kõrvaldatakse uuringust loomade heaolu tagamiseks) lahatakse. Kõik üldpatoloogilised muutused tuleks iga looma puhul protokollida. Esialgse annustamise järel 24 või enam tundi elus püsinud loomade üldpatoloogiliste muutustega organeid võidakse samuti uurida mikroskoopiliselt, kuna see võib anda kasulikku teavet.
      2.   ANDMED
      Andmed esitatakse iga üksiku looma kohta. Lisaks sellele tuleb kõik andmed esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates ära iga katserühma puhul osalevate loomade arvu, mürgisusnähtudega loomade arvu, katse käigus surnud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahangul tehtud leiud.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama võimaluse korral järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Katseaine:
                  
                              —
                           
                           
                              füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused (kaasa arvatud isomeerumine);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              identifitseerimiseks vajalikud andmed, kaasa arvatud CASi number.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Kandeaine (vajaduse korral):
                  
                              —
                           
                           
                              kandeaine valiku põhjendus, kui see on veest erinev.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katseloomad:
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatud liigid/tüved;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade mikrobioloogiline seisund, kui see on teada;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade arv, vanus ja sugu (sh vajaduse korral põhjendus isasloomade kasutamise kohta emasloomade asemel);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              päritolu, pidamistingimused, toitumine jne.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              katseaine valmistamise üksikasjad, sh üksikasjad manustatava aine füüsilise oleku kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katseaine manustamise üksikasjad, sh annuste mahud ja annustamise aeg;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              põhjendus lähteannuse valikuks.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              tabelid iga looma (st loomad, kellel on mürgisustunnused, kaasa arvatud suremus, mõjude laad, ägedus ja kestus) reageerimise andmete ja annusemäärade kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tabelid kehamassi ja kehamassi muutuste kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              iga looma mass annustamispäeval, seejärel nädalaste intervallidega ja surma- või surmamishetkel;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              surma kuupäev ja kellaaeg juhul, kui loom sureb enne kavandatud surmamist;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              iga looma korral mürgisusnähtude algusaeg ja nende võimalik taandumine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on olemas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutlus ja tõlgendamine.
               
            
                   
               
               
                  Järeldused.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86.
               
            
                  2)
               
               
                  Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336–341.
               
            
                  3)
               
               
                  Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559–610.
               
            
                  4)
               
               
                  Diener W., Mischke U, Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729–734.
               
            
                  5)
               
               
                  Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129–134.
               
            
                  6)
               
               
                  Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455–470.
               
            
                  7)
               
               
                  Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659–670.
               
            
                  8)
               
               
                  OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
               
            
                  9)
               
               
                  OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.
               
            
                  10)
               
               
                  OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].
               
            
                  11)
               
               
                  Lipnick R.L., Cotruvo, J.A., Hill R.N., Bruce R.D., Stitzel K.A., Walker A.P., Chu I.; Goddard M., Segal L., Springer J.A. and Myers R.C. (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223–231.
               
            
                  12)
               
               
                  Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
               
            
         1. LISA
         PROTSEDUUR, MIDA JÄRGITAKSE IGA LÄHTEANNUSE PUHUL
         ÜLDISED MÄRKUSED
         Selles lisas toodud vastavad katsekavad selgitavad protseduuri, mida tuleb järgida iga lähteannuse puhul.
         
                     —
                  
                  
                     1a lisa: lähteannus on 5 mg kg kehamassi kohta
                  
               
                     —
                  
                  
                     1b lisa: lähteannus on 50 mg kg kehamassi kohta
                  
               
                     —
                  
                  
                     1c lisa: lähteannus on 300 mg kg kehamassi kohta
                  
               
                     —
                  
                  
                     1d lisa: lähteannus on 2 000 mg kg kehamassi kohta
                  
               Humaanselt surmatud või surnud loomade arvust sõltuvalt toimitakse katseprotseduuris vastavalt nooltega näidatud suunale.
         
            1a LISA
            KATSEPROTSEDUUR LÄHTEANNUSE 5 MG/KEHAMASSI KG KORRAL
            
               
         
         
            1b LISA
            KATSEPROTSEDUUR LÄHTEANNUSE 50 MG/KEHAMASSI KG KORRAL
            
               
         
         
            1C Lisa
            KATSEPROTSEDUUR LÄHTEANNUSE 300 MG/KEHAMASSI KG KORRAL
            
               
         
         
            1d LISA
            KATSEPROTSEDUUR LÄHTEANNUSE 2 000 MG/KEHAMASSI KG KORRAL
            
               
         
      
      
         2. LISA
         KLASSIFITSEERIMISKRITEERIUMID SELLISTE KATSEAINETE KORRAL, MILLE OODATAVAD LD50 VÄÄRTUSED ÜLETAVAD 2 000 MG/KG JA MIDA EI OLE VAJA TESTIDA
         Ohukategooriat 5 käsitlevad kriteeriumid on ette nähtud selliste katseainete identifitseerimiseks, mille korral on ägeda mürgisuse oht suhteliselt väike, kuid mis teatud tingimustel võivad ohustada tundlikke populatsioone. Nimetatud ainete korral on LD50 väärtused oodatavalt vahemikus 2 000–5 000 mg/kg suu- või nahakaudsel manustamisel või samaväärsete annustena muude manustamisviiside puhul. Katseaine võidakse klassifitseerida ohukategooriasse, mis on määratletud tingimusega: 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (GHS 5. kategooria), järgmistel juhtudel:
         
                     a)
                  
                  
                     kui on suunatud nimetatud kategooriasse lisades 1a–1d toodud katsete tegemise mis tahes katsekava poolt, mis põhineb surmajuhtumitel;
                  
               
                     b)
                  
                  
                     kui on juba olemas usaldusväärsed tõendid, mis näitavad, et LD50 väärtus asub 5. kategooriale vastavas vahemikus, või muud loomauuringud või toksilised mõjud inimestel osutavad sellele, et ainel on vahetu mõju inimese tervisele;
                  
               
                     c)
                  
                  
                     andmete ekstrapoleerimise, hindamise või mõõtmise alusel, kui määramine ohtlikumasse kategooriasse ei ole põhjendatud, ja
                     
                                 —
                              
                              
                                 usaldusväärse teabe olemasolul oluliste toksiliste mõjude kohta inimestele või
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kui täheldatakse suremust suukaudse manustamisega katsetes kuni 4. kategooriale vastavate väärtusteni või
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kui eksperdiarvamus kinnitab mürgisuse olulisi kliinilisi tunnuseid katsetamisel kuni 4. kategooriale vastavate väärtusteni, välja arvatud kõhulahtisus, piloerektsioon või hoolitsemata välimus, või
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kui eksperdiarvamus kinnitab usaldusväärset teavet võimalike märkimisväärsete ägedate mõjude kohta muude loomauuringute põhjal.
                              
                           
               KATSETAMINE 2 000 MG/KG ÜLETAVATE ANNUSTEGA
         Tunnistades vajadust kaitsta loomade heaolu, ei kiideta heaks loomkatsete tegemist 5. kategooriale vastavas vahemikus (5 000 mg/kg annustega) ja seda kasutatakse üksnes siis, kui on suur tõenäosus, et sellise katse tulemused oleks otseselt seotud loomade või inimeste tervise kaitsega (10). Lisakatseid kõrgemate annusemääradega ei ole vaja teha.
         Kui katse tegemine annusega 5 000 mg/kg on nõutav, vajatakse vaid ühte etappi (st kolme looma). Kui esimese annuse saanud loom sureb, jätkatakse 2 000 mg/kg doosi manustamist vastavalt 1. lisas toodud vooskeemidele. Kui esimene loom jääb ellu, manustatakse doos ka kahele järgmisele loomale. Kui sureb vaid üks kolmest loomast, siis ületab LD50 väärtus eeldatavalt 5 000 mg/kg. Kui mõlemad loomad surevad, jätkatakse manustamist annusega 2 000 mg/kg.
      
      
         Lisa 3
         KATSEMEETOD B.1 b: EÜ süsteemi kohased klassifitseerimisjuhised, mida kasutatakse üleminekuperioodil kuni globaalselt harmoneeritud süsteemi (GHS) täieliku rakendamiseni (viite (8) alusel)
         
            
         
            
         
            
         
            
      
      B.2.   ÄGE MÜRGISUS (SISSEHINGAMISEL)
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Katse tegemiseks on kasulik teada aine osakeste suurusjaotust, aururõhku, sulamistemperatuuri, keemistemperatuuri, leekpunkti ja (vajadusel) plahvatusohtlikkust.
      Vt ka B osa üldist sissejuhatust (A).
      1.2.   MÕISTED
      Vt B osa üldist sissejuhatust (B).
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Mitu katseloomade rühma viiakse kindlaks ajaks kokkupuutesse testaine astmeliste kontsentratsioonidega nii, et üks rühm puutub kokku ühesuguse kontsentratsiooniga. Seejärel jälgitakse mõju ja surmajuhtumite esinemist. Katse jooksul surnud loomad lahatakse, katse lõpus surmatakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad.
      Tõsistele ja kestvatele kannatustele ja valule viitavate märkidega loomad võib vaja olla humaanselt surmata. Testainet pole vaja annustada moel, mis teadaolevalt tekitab märgatavat söövitavatest või ärritavatest omadustest tingitud valu ja kannatusi.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Puuduvad.
      1.6.   MEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Ettevalmistused
      Loomi hoitakse enne katset vähemalt viis päeva katsele vastavatel pidamis- ja söötmistingimustel. Noored terved katseloomad randomiseeritakse enne katset ja jagatakse vajalikku arvu katserühmadesse. Kokkupuute simulatsiooni pole vaja kasutada, kui katseseadme iseloom seda ei eelda.
      Tahked testained võivad vajaliku osakeste suuruse saavutamiseks vajada mikropeenestamist.
      Sobiva kontsentratsiooni saavutamiseks atmosfääris võib testainele lisada vajaduse korral sobivat kandjat; sellisel juhul tuleb kasutada kandja kontrollrühma. Kui annustamise lihtsustamiseks kasutatakse kandjat või muid lisandeid, peab olema kindel, et need ei põhjusta mürgistusnähte. Vajaduse korral võib kasutada varasemaid andmeid.
      1.6.2.   Katsetingimused
      1.6.2.1.   Katseloomad
      Vastunäidustuste puudumisel on eelistatavaks liigiks rott. Kasutada tuleks tavapäraseid laboritöös kasutatavaid liine. Kasutatavate katseloomade masside erinevus katse alguses kummagi soo puhul eraldi ei tohiks ületada ± 20 % vastavast keskmisest.
      1.6.2.2.   Katseloomade arv ja sugu
      Iga uuritavat kontsentratsiooni katsetakse vähemalt 10 närilisel (viiel emas- ja viiel isasloomal). Emasloomad ei tohiks olla poeginud ega tiined.
      
         Märkus: ägeda mürgisuse katsetes närilistest kõrgemate loomadega tuleks kaaluda väiksema arvu loomade kasutamist. Annused tuleks valida hoolikalt ja vältida tuleks mõõdukalt mürgiste annuste ületamist. Testaine surmavate annuste manustamist tuleks sellistes katsetes vältida.
      1.6.2.3.   Kokkupuutekontsentratsioonid
      Erinevaid annusemäärasid peaks olema küllaldaselt, vähemalt kolm, ja nende vahed peaksid olema sellised, et saadakse erinevate mürgistusnähtude ja suremusega katserühmad. Andmeid peaks olema küllaldaselt kontsentratsiooni/reaktsioonikõvera koostamiseks ja võimalusel LC50 nõuetekohaseks määramiseks.
      1.6.2.4.   Piirsisalduskatse
      Kui viiest isas- ja viiest emasloomast koosneval rühmal ei esine neljatunnise kokkupuute järel gaasi või vedeliku või tahke aine aerosooliga kontsentratsioonil 5 mg/l (või kui see ei ole testaine füüsikaliste või keemiliste omaduste, sealhulgas plahvatusohtlikkuse tõttu võimalik, kõrgeimal võimalikul kontsentratsioonil) 14 päeva jooksul ilmnenud ühendiga seotud suremust, võib edasise kontrollimise lugeda tarbetuks.
      1.6.2.5.   Vaatlusperiood
      Kokkupuude peaks kestma neli tundi.
      1.6.2.6.   Seadmed
      Loomkatsetes tuleks kasutada hingamisseadet, mis suudab tagada dünaamilise õhuvoo vähemalt 12 täieliku õhuvahetusega tunnis ning tagab küllaldase hapnikusisalduse ja homogeense kokkupuutekeskkonna. Kambri kasutamisel peaks selle ehitus piirama katseloomade ühte kohta kogunemist ja tagama võimalikult hea inhalatoorse kokkupuute testainega. Stabiilse kambriatmosfääri tagamiseks ei tohiks katseloomade „maht” üldjuhul ületada 5 % kambri üldmahust. Kasutada võib väliseid hingamiselundeid, ainult pead või kogu keha haaravat individuaalset kambrit; esimesed kaks piiravad testaine sattumist organismi muid teid pidi.
      1.6.2.7.   Vaatlusperiood
      Vaatlusperioodi kestus peaks olema vähemalt 14 päeva. Vaatlemise kestust ei tohiks siiski jäigalt fikseerida. See peaks sõltuma mürgistusnähtudest, nende ilmnemise kiirusest ja paranemisperioodi pikkusest; seega võib seda vajaduse korral pikendada. Mürgistusnähtude ilmnemise ja kadumise ning surma aeg on väga olulised, eriti kui surm saabub sageli hiljem.
      1.6.3.   Katse käik
      Kõik loomad kaalutakse vahetult enne kokkupuudet ja viiakse seejärel vastavas seadmes pärast kambrikontsentratsiooni tasakaalustumist neljaks tunniks kokkupuutesse katsekontsentratsiooniga. Tasakaalustumisaeg peaks olema lühike. Katsetemperatuuri tuleks hoida 22 ± 3 oC juures. Ideaaljuhul tuleks suhteline õhuniiskus hoida 30 % ja 70 % vahel, kuid mõningatel juhtudel (nt katsetes mõnede aerosoolidega) ei saa seda rakendada. Väikese alarõhu (< 5 mm H2O) kasutamine kambris välistab testaine lekke ümbritsevasse keskkonda. Süüa ja juua kokkupuute ajal anda ei tohiks. Kasutada tuleks katseatmosfääri tekitamiseks ja jälgimiseks sobivaid seadmeid. Seade peaks võimalikult kiiresti saavutama stabiilsed kokkupuutetingimused. Kambri ehitus ja kasutamine peaksid tagama katseatmosfääri püsiva homogeense jaotuse kambris.
      Mõõta või kontrollida tuleb:
      
                  a)
               
               
                  õhu voolukiirust (pidevalt);
               
            
                  b)
               
               
                  testaine tegelikku kontsentratsiooni hingamistsoonis, seda vähemalt kolm korda kokkupuuteaja jooksul (mõnede keskkondade, nt kõrge kontsentratsiooniga aerosoolkeskkondade puhul võib vajalik olla sagedasem kontroll). Kokkupuute ajal ei tohiks kontsentratsioon keskmise suhtes kõikuda rohkem kui ± 15 %. Mõnede aerosoolide puhul ei ole nii täpne reguleerimine siiski võimalik, sellisel juhul on lubatav suurem kõikumisvahemik. Aerosoolide puhul tuleks piisavalt tihti kontrollida osakeste suurust (igas katserühmas vähemalt üks kord);
               
            
                  c)
               
               
                  temperatuuri ja õhuniiskust, võimalusel pidevalt.
               
            Kokkupuute ajal ja järel loomi jälgitakse ja vaatlustulemused registreeritakse süstemaatiliselt, iga looma kohta tuleb pidada eraldi arvestust. Esimesel päeval tuleks loomi vaadelda tavapärasest sagedamini. Vähemalt kord tööpäevas tuleks teha põhjalik kliiniline uuring; muid vaatlusi tuleks teha iga päev, rakendades sobivaid abinõusid loomade kao piiramiseks uuringus, nt surnuna leitud loomad lahata või külmutada ja nõrgad või surevad loomad eraldada või surmata.
      Vaadelda tuleks muutusi nii nahas ja karvkattes, silmades ja limaskestades kui ka hingamis- ja vereringeelundkonnas, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomotoorses aktiivsuses ja käitumises. Erilist tähelepanu tuleks pöörata hingamise iseloomule, värinatele, krampidele, süljeeritusele, kõhulahtisusele, letargiale, unele ja koomale. Surmahetk tuleks registreerida võimalikult täpselt. Kõik loomad kaalutakse pärast kokkupuudet igal nädalal ja surmahetkel.
      Katse jooksul surnud loomad lahatakse, katse lõpus surmatakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad, pöörates erilist tähelepanu muutustele ülemistes ja alumistes hingamisteedes. Registreerida tuleks kõik makropatoloogilised muutused. Vastaval näidustusel tuleks võtta koeproove histopatoloogilisteks uuringuteks.
      2.   ANDMED
      Andmed tuleks esitada kokkuvõtlikus tabelis, mis iga katserühma puhul näitab katseloomade arvu selle katse algul, iga looma surma aega, muude mürgistusnähtudega loomade arvu, mürgistusnähtude kirjeldust ja lahkamistulemusi. Kõik loomad kaalutakse ja mass registreeritakse vahetult enne testaine manustamist, seejärel igal nädalal ning surmahetkel. Kui looma elulemus katses ületab ühe päeva, tuleks arvutada ja registreerida tema massimuutused. Ühendiga seotud kannatuste ja valu tõttu humaanselt surmatud loomad registreeritakse ühendiga seotud suremusena. Tunnustatud meetodi kohaselt võib määrata LC50. Andmetele hinnangu andmisel tuleks arvesse võtta kõigi kõrvalekallete, sealhulgas käitumuslike ja kliiniliste kõrvalekallete, makropatoloogiliste kahjustuste, kehamassi muutuste, suremuse ja mis tahes muude mürgistusnähtude mis tahes võimalikku sõltuvust kokkupuutest testainega ning nende esinemissagedust ja tõsidust.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  liiki, liini, päritolu, keskkonnatingimusi, toidusedelit jne;
               
            
                  —
               
               
                  katsetingimusi: kokkupuuteseadme kirjeldust, sealhulgas selle ehitust, tüüpi, mõõtmeid, õhuallikat, aerosoolide tekitamise seadet, kliima reguleerimise meetodit ja katsekambri kasutamisel loomade katsekambris pidamise meetodit. Kirjeldada tuleks temperatuuri, õhuniiskuse, aerosooli kontsentratsiooni ja osakeste suurusjaotuse määramise vahendeid.
               
            Andmed kokkupuute kohta
      Andmed tuleks esitada koondtabelina koos vastavate keskmiste ja hajuvuse näitajatega (nt standardhälve) ning võimaluse korral peaksid andmed sisaldama järgmist:
      
                  a)
               
               
                  õhu voolukiirust hingamisseadmes;
               
            
                  b)
               
               
                  õhu temperatuuri ja niiskust;
               
            
                  c)
               
               
                  nimikontsentratsioone (hingamisseadmesse viidud testaine summaarne kogus jagatuna õhu ruumalaga);
               
            
                  d)
               
               
                  kandja kasutamisel viimase iseloomu;
               
            
                  e)
               
               
                  tegelikke kontsentratsioone katse hingamistsoonis;
               
            
                  f)
               
               
                  masskeskmist aerodünaamilist diameetrit (MMAD) ja geomeetrilist standardhälvet (GSD);
               
            
                  g)
               
               
                  tasakaalustumise aega;
               
            
                  h)
               
               
                  kokkupuute kestust:
                  
                              —
                           
                           
                              tabelit reaktsiooni andmetega soo ja kokkupuute ulatuse järgi (st katse käigus surnud või surmatud loomade arvu, mürgistusnähtudega loomade arvu, kokkupuutes olnud loomade arvu);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              surma aega, kui loom sureb kokkupuute ajal või pärast seda, loomade humaanse surmamise põhjusi ja seejuures rakendatud kriteeriume;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kõiki vaatlusandmeid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vaatlusperioodi lõpul kummagi soo puhul määratud LC50 väärtust (koos märkega kasutatud arvutusmeetodi kohta);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              leitud LD50 väärtuse 95 % usaldusvahemikku (kui seda on võimalik esitada);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              annuse/suremuse kõverat ja selle tõusu (kui määramismeetod seda võimaldab);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lahkamistulemusi;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kõiki histopatoloogilisi leide;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tulemuste arutelu (erilist tähelepanu tuleks pöörata katse ajal tehtud humaanse surmamise võimalikule mõjule arvutatud LC50 väärtusele);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tulemuste tõlgendust.
                           
                        
            3.2.   HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE
      Vt B osa üldist sissejuhatust (D).
      4.   VIITED
      Vt B osa üldist sissejuhatust (E).
      B.3.   ÄGE MÜRGISUS (NAHAKAUDNE)
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Vt B osa üldist sissejuhatust (A).
      1.2.   MÕISTED
      Vt B osa üldist sissejuhatust (B).
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Testaine kantakse astmeliste annustena mitme rühma katseloomade nahale nii, et üks rühm saab ühesuguse annuse. Järgnevalt jälgitakse mõju ja surmajuhtumite esinemist. Katse jooksul surnud loomad lahatakse, katse lõpus surmatakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad.
      Tõsistele ja kestvatele kannatustele ja valule viitavate märkidega loomad võib vaja olla humaanselt surmata. Testaineid pole vaja annustada moel, mis teadaolevalt tekitab märgatavat söövitavatest või ärritavatest omadustest tingitud valu ja kannatusi.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Puuduvad.
      1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Ettevalmistused
      Loomi hoitakse enne katset vähemalt viis päeva katsepuurides katsele vastavatel pidamis- ja söötmistingimustel. Täiskasvanud noored terved katseloomad randomiseeritakse enne katset ja jagatakse katserühmadesse. Ligikaudu 24 tundi enne katset eemaldatakse pügamise või raseerimise teel katseloomade keha seljaosalt karvkate. Karvkatte pügamisel või raseerimisel tuleb vältida naha marrastamist, kuna see võib mõjutada naha läbilaskvust. Testaine nahale kandmiseks tuleb vabastada vähemalt 10 % kehapinnast. Tahkete, vajaduse korral peenestatud ainete puhul tuleks testainet nahaga hea kokkupuute saavutamiseks niisutada piisava koguse vee või sobiva kandjaga. Kandja kasutamisel tuleb arvestada selle mõjuga testaine nahaläbimisvõimele. Vedelaid testaineid kasutatakse üldjuhul lahjendamata kujul.
      1.6.2.   Katsetingimused
      1.6.2.1.   Katseloomad
      Kasutada võib täiskasvanud rotte või küülikuid. Kasutada võib ka muid liike, kuid seda tuleb põhjendada. Kasutada tuleks tavapäraseid laboritöös kasutatavaid liine. Kasutatavate katseloomade masside erinevus katse alguses kummagi soo puhul eraldi ei tohiks ületada ± 20 % vastavast keskmisest.
      1.6.2.2.   Katseloomade arv ja sugu
      Iga annuse taseme kohta tuleb kasutada vähemalt viit katselooma. Nad peaksid olema samast soost. Emasloomade kasutamisel ei tohiks nad olla poeginud ega tiined. Kui on andmeid selle kohta, et ühe soo esindajad on märgatavalt tundlikumad, tuleks kasutada sellest soost loomi.
      
         Märkus: ägeda mürgisuse katsetes närilistest kõrgemate loomadega tuleks kaaluda väiksema arvu loomade kasutamist. Annused tuleks valida hoolikalt ja vältida tuleks mõõdukalt mürgiste annuste ületamist. Testaine surmavate annuste manustamist tuleks sellistes katsetes vältida.
      1.6.2.3.   Annused
      Erinevaid annusemäärasid peaks olema küllaldaselt, vähemalt kolm, ja nende vahed peaksid olema sellised, et saadakse erinevate mürgistusnähtude ja suremusega katserühmad. Annusemäärade valikul tuleks arvesse võtta mis tahes võimalikku ärritavat või söövitavat mõju. Andmeid peaks olema küllaldaselt annuse/reaktsioonikõvera koostamiseks ja võimalusel LD50 nõuetekohaseks määramiseks.
      1.6.2.4.   Piirsisalduskatse
      Eespool kirjeldatud meetodi kohaselt võib teha piirsisalduskatse viiest isas- ja viiest emasloomast koosnevas rühmas annusega vähemalt 2 000 mg/kg kehakaalu kohta. Kui katses esineb ühendiga seotud suremust, võib kaaluda täiemahulise uuringu tegemist.
      1.6.2.5.   Vaatlusperiood
      Vaatlusperioodi kestus peaks olema vähemalt 14 päeva. Vaatlemise kestust ei tohiks siiski jäigalt fikseerida. See peaks sõltuma mürgistusnähtudest, nende ilmnemise kiirusest ja paranemisperioodi pikkusest; seega võib seda vajadusel pikendada. Mürgistusnähtude ilmnemise ja kadumise aeg, nende kestus ja surma aeg on väga olulised, eriti kui surm saabub sageli hiljem.
      1.6.3.   Katse käik
      Loomi tuleks puurides pidada ühekaupa. Testaine tuleks kanda ühtlaselt alale, mis moodustab ligikaudu 10 % kogu kehapinnast. Väga mürgiste ainete puhul võib katta väiksema osa kehapinnast, kuid võimalikult suur osa pinnast tuleks katta võimalikult õhukese ja ühtlase kihiga.
      Testainet tuleks 24tunnise kokkupuuteperioodi jooksul poorse marlisideme ja mitteärritava kleeplindi abil naha vastas hoida. Manustamiskoht tuleks veel lisaks sobival moel kinni katta, et hoida marlisidet ja testainet paigal ja vältida testaine allaneelamist katselooma poolt. Et vältida testaine allaneelamist, võib kasutada looma liikuvust piiravaid vahendeid, kuid looma täielikku fikseerimist ei soovitata.
      Kokkupuuteperioodi lõpus tuleks testaine jääk nahalt võimaluse korral veega või muu sobiva puhastusmeetodi abil eemaldada.
      Vaatlustulemused tuleks vaatluse käigus süstemaatiliselt registreerida. Iga looma kohta tuleb pidada eraldi arvestust. Esimesel päeval tuleks loomi vaadelda tavapärasest sagedamini. Vähemalt kord tööpäevas tuleks läbi viia põhjalik kliiniline uuring; muid vaatlusi tuleks teha iga päev, rakendades sobivaid abinõusid loomade kao piiramiseks uuringus, nt surnuna leitud loomad lahata või külmutada ja nõrgad või surevad loomad eraldada või surmata.
      Vaadelda tuleks muutusi nii karvkattes, testainega töödeldud nahas, silmades ja limaskestades kui ka hingamis- ja vereringeelundkonnas, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomotoorses aktiivsuses ja käitumises. Erilist tähelepanu tuleks pöörata värinatele, krampidele, süljeeritusele, kõhulahtisusele, letargiale, unele ja koomale. Surmahetk tuleb registreerida võimalikult täpselt. Katse jooksul surnud loomad lahatakse, katse lõpus surmatakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad. Registreerida tuleks kõik makropatoloogilised muutused. Vastaval näidustusel tuleks võtta koeproove histopatoloogilisteks uuringuteks.
      Mürgisuse hindamine teisel sool
      Uuringute lõpetamisel ühest soost katseloomadega annustatakse vähemalt viiest vastassoost loomast koosnevale rühmale, et kontrollida, ega selle soo esindajad testaine suhtes märgatavalt tundlikumad pole. Üksikjuhtudel võib olla õigustatud väiksema arvu loomade kasutamine. Kui on küllalt andmeid selle kohta, et uuritavast soost loomad on märgatavalt tundlikumad, võib katsetest vastassoost loomadega loobuda.
      2.   ANDMED
      Andmed tuleks esitada kokkuvõtliku tabelina, mis iga katserühma puhul näitab katseloomade arvu selle katse algul, iga looma surma aega, muude mürgistusnähtudega loomade arvu, mürgistusnähtude kirjeldust ja lahkamistulemusi. Kõik loomad kaalutakse ja mass registreeritakse vahetult enne testaine manustamist, seejärel igal nädalal ning surmahetkel; kui looma elumus katses ületab ühe päeva, tuleks arvutada ja registreerida tema massimuutused. Ühendiga seotud kannatuste ja valu tõttu humaanselt surmatud loomad registreeritakse ühendiga seotud suremusena. Tunnustatud meetodi kohaselt määratakse LD50.
      Andmetele hinnangu andmisel tuleks arvesse võtta kõigi kõrvalekallete, sealhulgas käitumuslike ja kliiniliste kõrvalekallete, makropatoloogiliste kahjustuste, kehamassi muutuste, suremuse ja mis tahes muude mürgistusnähtude mis tahes võimalikku sõltuvust kokkupuutest testainega ning nende esinemissagedust ja tõsidust.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  liiki, liini, päritolu, keskkonnatingimusi, toidusedelit jne;
               
            
                  —
               
               
                  katsetingimusi (sealhulgas naha puhastamise meetodit ja sideme tüüpi: oklusiivside või tavaline side);
               
            
                  —
               
               
                  annuseid (kandja kasutamisel koos kandjaga ja kontsentratsioone);
               
            
                  —
               
               
                  katseloomade sugu;
               
            
                  —
               
               
                  tabelit reaktsiooni andmetega soo ja annuse määra järgi (st katse käigus surnud või surmatud loomade arvu, mürgistusnähtudega loomade arvu, kokkupuutes olnud loomade arvu);
               
            
                  —
               
               
                  surma aega, arvestatuna annuse saamise ajast loomade humaanse surmamise põhjusi ja seejuures rakendatud kriteeriume;
               
            
                  —
               
               
                  kõiki vaatlusandmeid;
               
            
                  —
               
               
                  täiemahulises uuringus kasutatud soo 14 päeva kestel määratud LD50 väärtust (märkega määramismeetodi kohta);
               
            
                  —
               
               
                  leitud LD50 väärtuse 95 % usaldusvahemikku (kui seda on võimalik esitada);
               
            
                  —
               
               
                  annuse/suremuse kõverat ja selle tõusu (kui määramismeetod seda võimaldab);
               
            
                  —
               
               
                  lahkamistulemusi;
               
            
                  —
               
               
                  kõiki histopatoloogilisi leide;
               
            
                  —
               
               
                  kõiki katsetulemusi teisest soost loomade puhul;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste analüüsi (erilist tähelepanu tuleks pöörata katse ajal tehtud viidud humaanse surmamise võimalikule mõjule arvutatud LD50 väärtusele);
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste tõlgendust.
               
            3.2.   HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE
      Vt B osa üldist sissejuhatust (D).
      4.   VIITED
      Vt B osa üldist sissejuhatust (E).
      B.4.   ÄGE MÜRGISUS: NAHAÄRRITUS/-SÖÖVITUS
      1.   MEETOD
      Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 404ga (2002).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesoleva ajakohastatud meetodi ettevalmistamisel pööratakse erilist tähelepanu võimalikele parandustele seoses loomade heaoluga ja kogu olemasoleva katseainet käsitleva teabe hindamisele, et vältida mittevajalikke katseid laboriloomadega. Käesoleva meetodi hulka kuulub soovitus, et enne kirjeldatud, aine söövitavust ja ärritavust uuriva in vivo katse tegemist analüüsitaks olemasolevate asjaomaste andmete osakaalu. Kui saadaolevad andmed on ebapiisavad, saab neid täiendada järjestikuste katsete tegemise abil (1). Katsete tegemise strateegia, mis on esitatud käesoleva meetodi lisas, hõlmab valideeritud ja heakskiidetud in vitro katsete sooritamist. Lisaks sellele soovitatakse vastavalt olukorrale, et in vivo algkatses kohaldatakse looma suhtes kolme katselappi järjestikku, mitte korraga.
      Nii mõistlike teaduslike meetodite kui ka loomade heaolu huvides ei tehta in vivo katseid enne, kui on hinnatud kogu kättesaadava katseaine võimalikku naha söövitamist/ärritamist käsitleva teabe osakaalu. Sellisteks andmeteks on tõendid varasematest inimeste ja/või laboriloomadega tehtud uurimustest, tõendid ühe või mitme struktuuriliselt samalaadse aine või selliste ainete segude põhjustatud söövituse ja ärrituse kohta, aine tugevale happesusele või leelisusele viitavad andmed (2, 3) ning valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete tulemused (4, 5, 5a). Käesolev analüüs peaks vähendama vajadust teha in vivo katseid selliste ainetega, mille nahasöövitavuse ja -ärritavuse kohta on muudest uurimustest juba piisavalt tõendeid saadud.
      Eelistatud järjestikuste katsete tegemise strateegia, mis hõlmab valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete sooritamist söövitavuse ja ärritavuse kohta, on esitatud käesoleva meetodi lisas. Strateegia töötati välja OECD seminaril (6), millest osavõtjad seda ühehäälselt soovitasid, ja see kiideti heaks soovitusliku katsestrateegiana keemiliste ainete klassifitseerimist käsitlevas globaalselt harmoneeritud süsteemis (GHS) (7). Soovitatakse, et nimetatud katsestrateegiat kasutataks enne in vivo katsete tegemist. Uute ainete katsetamisel on soovitav etapiviisiline katsete tegemine teaduslikult usaldatavate andmete tootmiseks aine söövitavuse ja ärritatavuse kohta. Olemasolevate ainete puhul, mille nahasöövitavuse ja -ärritavuse kohta ei ole piisavalt andmeid, tuleks strateegiat kasutada puuduvate andmete hankimiseks. Kui otsustatakse kasutada muud katsetamisstrateegiat või menetlust või mitte kasutada etapiviisilist katsete tegemist, siis tuleks seda otsust põhjendada.
      Kui söövitavust või ärritavust ei saa kindlaks määrata järjestikuste katsete tegemise strateegia kohaselt osakaalu analüüsimise abil, tuleks kaaluda in vivo katset (vt lisa).
      1.2.   MÕISTED
      
         Nahaärritus – pöörduva nahakahjustuse tekkimine kuni neli tunni jooksul pärast katseaine manustamist.
      
         Nahasöövitus – pöördumatu nahakahjustuse, s.t nähtava marrasknahast pärisnahani ulatuva nekroosi tekkimine kuni nelja tunni jooksul pärast katseaine manustamist. Tüüpilised söövitusreaktsioonid on haavandid, verejooks, verised kärnad ning 14päevase jälgimisperioodi lõpus naha heledaks muutumise tõttu värvimuutus, täielik karvakadu ja armid. Küsitavate kahjustuste hindamiseks tuleks kaaluda histopatoloogiat.
      1.3   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritavat ainet manustatakse ühekordse annusena katselooma nahale, katselooma töötlemata kehapinnad toimivad kontrollina. Ärritavuse/söövitavuse astet konstateeritakse ja märgitakse täpsustatud intervallid ning seda astet kirjeldatakse mõjude hindamise täiendamiseks. Uurimus kestab niikaua, et vaadeldud mõjude pöörduvust või pöördumatust saaks hinnata.
      Loomad, kellel on jätkuvalt tugeva stressi ja/või valu tunnused igal katseetapil, tuleks humaanselt tappa ja seda võetakse aine hindamisel arvesse. Suremas olevate ja tugevalt kannatavate loomade humaanse tapmise kriteeriumid on toodud viites 8.
      1.4.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.4.1.   In vivo katse ettevalmistamine
      1.4.1.1.   Loomaliikide valik
      Eelistatud laboriloom on albiinoküülik, kasutatakse terveid noori täiskasvanud küülikuid. Muude liikide kasutamist tuleks põhjendada.
      1.4.1.2.   Loomade ettevalmistamine
      Ligikaudu 24 tunni jooksul enne katset lõigatakse loomade seljaosa karvad lühikeseks. Tuleks vältida naha marrastamist ning kasutama peaks üksnes terveid, terve nahaga loomi.
      Mõnedel küüliku liinidel esineb tihedaid karvalaike, mis on silmatorkavamad teatavatel aastaaegadel. Selliseid tiheda karvastikuga kehapindasid ei tohiks kasutada katsetamise kohana.
      1.4.1.3.   Loomade pidamise ja toitmise tingimused
      Loomi hoitakse eraldi puurides. Loomade katseruumi temperatuur küülikutel peaks olema 20 oC (± 3 oC). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi puhastamise ajal, peaks seda hoidma vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega.
      1.4.2.   Katsemenetlus
      1.4.2.1.   Katseaine manustamine
      Katseainet tuleks panna väikesele nahapinnale (ligikaudu 6 cm2) ja see kaetakse marlilapiga, mis kinnitatakse nahka mitteärritava teibiga. Kui ainet ei ole võimalik otse peale kanda (nt vedelikud või mõned pastad), kantakse katseaine esmalt marlilapile, mis seejärel asetatakse nahale. Lappi hoitakse õrnalt vastu nahka sobiva, pooltihke sideme abil kogu mõjuaja. Kui katseaine kantakse lapile, tuleks see lapp kinnitada nahale selliselt, et aine puutuks nahaga hästi kokku ja leviks nahal ühtlaselt. Tuleks tõkestada looma ligipääsu lapile ja katseaine allaneelamist või sissehingamist.
      Vedalaid katseaineid kasutatakse üldiselt lahjendamata kujul. Tehes katseid tahkete ainetega (mida võib vajaduse korral pulbristada), tuleks katseainet niisutada väikese koguse veega (või vajaduse korral muu sobiva kandeainega), et tagada hea kokkupuude nahaga. Kui kasutatakse muid kandeaineid kui vesi, on kandeaine võimalik mõju katseaine põhjustatud nahaärritusele minimaalne või olematu.
      Mõjuaja lõpus, mis kestab tavaliselt neli tundi, allesjäänud katseaine eemaldatakse võimaluse korral vee või sobiva lahustiga, muutmata marrasknaha olemasolevat reaktsiooni või puutumatust.
      1.4.2.2.   Annusmäär
      Uuritavale pinnale kantakse 0,5 ml vedelat või 0,5 g tahket ainet või pastat.
      1.4.2.3.   Algkatse (ühe loomaga in vivo nahaärrituvus-/-söövitavuskatse)
      On eriti soovitav, et algselt tehtaks in vivo katse ühe loomaga, eriti juhul, kui aine võib tõenäoliselt olla söövitav. See on kooskõlas järjestikuste katsete tegemise strateegiaga (vt 1. lisa).
      Kui osakaalu analüüsi põhjal on tõendatud, et aine on söövitav, ei ole vaja loomadega katseid jätkata. Enamiku võimalike söövitavate ainete puhul ei ole tavaliselt täiendava in vivo katse tegemine vajalik. Juhul, kui lisateavet peetakse vajalikuks puudulike tõendite tõttu, võidakse sooritada piiratud loomkatse, kasutades järgmist lähenemist: Loomale pannakse üksteise järel kuni kolm katselappi. Esimene lapp eemaldatakse kolme minuti pärast. Kui ei täheldata tõsist nahareaktsiooni, asetatakse teine lapp ja eemaldatakse tunni aja pärast. Kui vaatlus antud etapil viitab sellele, et mõjutamist võib humaanselt pikendada nelja tunnini, pannakse peale kolmas lapp ja see eemaldatakse nelja tunni pärast, misjärel reaktsiooni hinnatakse.
      Kui sööbiv mõju on vaadeldav pärast ükskõik millist kolmest järjestikusest mõjutamisest, lõpetatakse katse kohe. Kui sööbiv mõju ei ole vaadeldav pärast viimase lapi eemaldamist, jälgitakse looma 14 päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui söövitus ei teki varem.
      Kui katseaine ei tekita söövitust, kuid võib olla ärritav, asetatakse üks lapp ühele loomale neljaks tunniks.
      1.4.2.4.   Kinnitav katse (in vivo nahaärritust käsitlev katse täiendavate loomadega)
      Kui söövitavat toimet ei ole algkatses jälgitud, tuleks ärritavat või negatiivset reaktsiooni kinnitada kahe muu looma kasutamise abil neljatunnisel mõjuperioodil. Kui algkatses on jälgitud ärritavat mõju, tuleks seejärel sooritada kinnitav katse või mõjutada kahte muud looma korraga. Erandkorras, kui algkatset ei ole tehtud, võib kahele või kolmele loomale asetada ühe lapi, mis eemaldatakse nelja tunni pärast. Kui kasutatakse kahte looma, ei ole vaja lisakatset teha, kui mõlematel esineb sama reaktsioon. Muul juhul tehakse katse ka kolmanda loomaga. Ebaselgeid reaktsioone on vaja hinnata, tehes katseid muude loomadega.
      1.4.2.5.   Jälgimisperiood
      Jälgitakse seni, kuni on võimalik täielikult hinnata vaadeldud mõjude pöörduvust. Katse tuleks lõpetada igal juhul siis, kui loomal on jätkuvalt tugeva valu või stressi tunnused. Mõjude pöörduvuse kindlaksmääramiseks tuleks jälgida loomi kuni 14 päeva pärast lapi eemaldamist. Kui pöörduvus ilmneb enne 14 päeva möödumist, tuleks katse lõpetada sel ajal.
      1.4.2.6.   Kliinilised vaatlused ja naha reaktsioonide hindamine
      Kõikidel loomadel uuritakse nahapunetuse ja turse nähte, reaktsioone hinnatakse 60 minuti pärast, seejärel 24, 48 ja 72 tundi pärast lapi eemaldamist. Ühe loomaga algkatses uuritakse uuritavat pinda samuti vahetult pärast lapi eemaldamist. Nahareaktsioone hinnatakse ja registreeritakse vastavalt allpool tabelis toodud hinnetele. Kui nahal on kahjustus, mida ei suudeta tuvastada ärrituse või söövitusena 72 tunni jooksul, võib olla vajalik jälgida kuni 14. päevani, et kindlaks määrata mõjude pöörduvus. Lisaks ärrituse jälgimisele tuleks täielikult kirjeldada ja registreerida kõik sellised paiksed toksilised mõjud nagu naha rasva lahustumine ja mis tahes organismi kahjulikud mõjud (nt mõjud mürgisuse kliinilistele tunnustele ja kehakaalule). Ebaselgete reaktsioonide selgitamiseks tuleks teha histopatoloogiline uurimine.
      Naha reaktsioonide hindamine on tingimata subjektiivne. Naha reaktsiooni hindamise ühtlustamiseks ning katselaboratooriumide ning jälgivate või tõlgendavate isikute abistamiseks on vaja vaatlusi tegevatel isikutel piisavalt tundma õppida kasutatavat hindamissüsteemi (vt tabelit allpool). Illustreeritud juhis nahaärrituse või muude kahjustuste hindamiseks võib olla abiks (9).
      2.   ANDMED
      2.1.   TULEMUSTE ESITAMINE
      Uurimuse tulemused esitatakse tabeli kujul lõplikus katsearuandes ja peaks hõlmama kõiki punktis 3.1 nimetatud asju.
      2.2.   TULEMUSTE HINDAMINE
      Nahaärrituse määramisi tuleks hinnata vastavalt kahjustuse laadile ja raskusele ning nende pöörduvusele või pöördumatusele. Üksikud määramised ei esinda aine ärritavate omaduste absoluutset taset, kuna samuti hinnatakse katseaine muid mõjusid. Selle asemel tuleks vaadelda kontrollväärtustena üksikuid määramisi, mis vajavad hindamist koos kõikide muude uurimuses tehtud vaatlustega.
      Nahakahjustuste pöörduvust tuleb võtta arvesse ärritusreaktsioonide hindamisel. Kui sellised reaktsioonid nagu alopeetsia (piiratud pinnal), liigsarvestus, hüperplaasia ja kestendus jätkuvad 14päevase jälgimisperioodi lõpus, tuleks käsitada katseainet naha ärritajana.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab hõlmama järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Põhjendus in vivo katse tegemiseks: olemasolevate katseandmete, sh järjestikuste katsete tegemise strateegia põhjal saadud tulemuste osakaalu analüüs:
                  
                              —
                           
                           
                              varasematest katsetest saadud asjaomaste andmete kirjeldus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katsestrateegia igal etapil saadud andmed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              
                                 in vitro katsete kirjeldus, sh menetluste üksikasjad, katse-/võrdlusainetest saadud tulemused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              osakaalu analüüs in vivo uurimuse sooritamiseks.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katseaine:
                  
                              —
                           
                           
                              tunnusandmed (nt CASi number, algupära, puhtus, tuntud lisandid, partii number);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              füüsikaline laad ja füüsikalis-keemilised omadused (nt pH, lenduvus, lahustuvus, stabiilsus);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kui tegu on seguga, selle koostis ja koostisosade suhtelised protsendimäärad.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Kandeaine:
                  
                              —
                           
                           
                              nimetus, kontsentratsioon (vajaduse korral), kasutatud kogus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kandeaine valiku põhjendamine.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katseloomad:
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatud liigid/liin, põhjendus muude loomade kui albiinoküülikute kasutamiseks;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              igast soost loomade arv;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikute loomade kaalud katse alguses ja lõpus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vanus katse alguses;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              päritolu, elamistingimused, toitumine jne.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              lapi asetuskoha ettevalmistamine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikandmed lapi materjali kohta ning asetustehnika;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katseaine ettevalmistust, pealekandmist ja eemaldamist käsitlevad üksikasjad.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              iga looma ärritus-/söövitusreaktsioonide määramised igal mõõtmiskorral tabeli kujul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kõikide täheldatud kahjustuste kirjeldused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              täheldatud ärrituse või söövituse laadi ja astme jutustav kirjeldus ja võimalikud histopatoloogilised leiud;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              muude kahjulike paiksete (nt naha rasva lahustumine) ning nahaärritusele ja -söövitusele lisaks kogu organismile suunatud mõjude kirjeldus.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutelu.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, L, Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429.
               
            
                  2)
               
               
                  Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19–26.
               
            
                  3)
               
               
                  Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709–720.
               
            
                  4)
               
               
                  ECETOC (1990) Monograph No. 15, „Skin Irritation”, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels.
               
            
                  5)
               
               
                  Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K, Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524.
               
            
                  5a)
               
               
                  Testing Method B.40 Skin Corrosion.
               
            
                  6)
               
               
                  OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm).
               
            
                  7)
               
               
                  OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
               
            
                  8)
               
               
                  OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
               
            
                  9)
               
               
                  EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.
                  (Saadaval taotluse korral OECD sekretariaadist).
               
            Tabel 1
      NAHA REAKTSIOONIDE MÄÄRAMINE
      
         Nahapunetuse ja kooriku tekkimine
      
      
                  Nahapunetust ei esine …
               
               
                  0
               
            
                  Väga kerge nahapunetus (vaevumärgatav) …
               
               
                  1
               
            
                  Selgesti nähtav nahapunetus …
               
               
                  2
               
            
                  Mõõdukas kuni tõsine nahapunetus…
               
               
                  3
               
            
                  Tõsine nahapunetus (tugev punetus) – kooriku tekkimine, mis takistab nahapunetusele punktide andmist…
               
               
                  4
               
            Suurim võimalik punktide arv: 4
      
         Turse tekkimine
      
      
                  Turset ei esine …
               
               
                  0
               
            
                  Väga kerge turse (vaevumärgatav) …
               
               
                  1
               
            
                  Kerge turse (nahapinna servad on kindlalt üleval)…
               
               
                  2
               
            
                  Mõõdukas turse (ligikaudu 1 mm üleval)…
               
               
                  3
               
            
                  Tugev turse (enam kui 1 mm üleval ja levinud ainega mõjutatud alast kaugemale) …
               
               
                  4
               
            Suurim võimalik punktide arv: 4
      Ebaselgete reaktsioonide selgitamiseks tuleks teha histopatoloogiline uuring.
      
         Lisa
         Nahaärritavuse ja -söövitavuse kohta järjestikuste katsete tegemise strateegia
         ÜLDKAALUTLUSED
         Mõistlike teaduslike meetodite ja loomade heaolu huvides on oluline vältida loomade tarbetut kasutamist ja vähendada selliste katsete tegemist, mis tõenäoliselt tekitavad loomadel raskeid tagajärgi. Kogu teavet aine võimaliku nahaärritavuse/-söövitavuse kohta tuleks hinnata enne in vivo katse tegemise kaalumist. Kui on juba olemas piisavalt tõendeid katseaine klassifitseerimiseks nahaärritavuse või -söövitavuse järgi, ei ole vaja sooritada katset laboriloomadega. Seetõttu vähendaks osakaalu analüüsi kasutamine ja järjestikuste katsete tegemise strateegia vajadust in vivo katsete tegemise järele, eriti siis, kui aine tõenäoliselt tekitab tõsiseid reaktsioone.
         On soovitav, et kasutataks osakaalu analüüsi olemasoleva, nahaärritavust ja -söövitavust käsitleva teabe hindamiseks, et kindlaks määrata, kas sellise võime iseloomustamiseks tuleks teha lisauuringuid, v.a in vivo nahauuringud. Kui on vaja teha täiendavaid uuringuid, on soovitav, et asjaomaste katseandmete parandamiseks kasutataks järjestikuste katsete tegemise strateegiat. Ainete puhul, millega ei ole katseid tehtud, tuleks kasutada järjestikuste katsete tegemise strateegiat sellise andmekogumi parandamiseks, mida läheb vaja nahaärritavuse ja -söövitavuse hindamiseks. Käesolevas lisas kirjeldatud katsete tegemise strateegia töötati välja OECD seminaril (1) ning see kinnitati ja seda laiendati hiljem keemiliste ainete mõju inimeste tervisele ja keskkonnale käsitleva lihtsustatud integreeritud ohu klassifitseerimise süsteemis, nagu see kiideti heaks kemikaalikomitee ja kemikaalitöörühma 28. ühisistungil 1998. aasta novembris (2).
         Kuigi käesolev järjestikuste katsete tegemise strateegia ei ole B.4 katsemeetodi lahutamatu osa, väljendab see soovitavat lähenemist nahaärritavuse ja -söövitavuse tunnuste kindlaksmääramisele. Nimetatud lähenemine väljendab nii head tava kui ka eetilist võrdluspunkti in vivo katsete tegemiseks nahaärritavuse ja -söövitavuse kohta. Katsemeetod annab juhiseid in vivo katse sooritamiseks ja esitab kokkuvõtte teguritest, mida käsitletakse enne katse alustamist. Strateegia on lähenemine katseaine nahaärritavus- ja -söövitavusomadusi käsitlevate olemasolevate andmete hindamisele ja mitmetasandiline lähenemine selliste asjaomaste andmete tekitamisele, mille suhtes on vaja teha lisauuringuid või mille suhtes ei ole tehtud uuringuid. See soovitab samuti nahaärritavust ja -söövitavust käsitlevaid valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete sooritamist teatavatel asjaoludel.
         HINDAMISTE JA KATSETE TEGEMISE STRATEEGIA KIRJELDUS
         Enne katse sooritamist järjestikuste katsete tegemise strateegia osana (joonis) tuleks hinnata kogu kättesaadavad teavet in vivo nahauuringute tegemise vajaduse kindlaksmääramiseks. Kuigi üksikute parameetrite hindamisel võib saada märkimisväärset teavet (nt äärmine pH-väärtus), tuleks olemasolevat teavet tervikuna arvesse võtta. Kõigi kõnealuse aine või selle analoogide mõjusid käsitlevate andmete hindamiseks tuleks teha otsus osakaalu kohta ja esitada selle otsuse kohta põhjendus. Esmalt rõhutatakse inimestelt ja loomadelt varem saadud ainet käsitlevaid andmeid ja seejärel in vitro või ex vivo katsete tulemusi. Söövitavaid aineid käsitlevaid in vivo katseid tuleks võimaluse korral vältida. Katsete tegemise strateegias võetakse arvesse järgmisi tegureid.
         
            Inimestelt ja loomadelt varem saadud andmete hindamine (1. etapp). Inimestelt varem saadud andmeid, nt kliinilised või töökeskkonna uuringud ning juhtumiaruanded, ja/või loomadega tehtud katseid käsitlevaid andmeid, nt ühekordsete või korduvate naha vastuvõtlikkust käsitlevate mürgisusuuringute tulemused, tuleks võtta arvesse esmalt, kuna need annavad sellist teavet, mis on vahetult seotud nahale mõjumisega. Tuntud ärritavuse või söövitavusega ainetega ja nendega, mis on selgelt mittesöövitavad või -ärritavad, ei ole vaja in vivo katseid teha.
         
            Struktuur-aktiivsusanalüüs (SAR) (2. etapp). Struktuuriliselt seotud ainetega tehtud katsete tulemusi tuleks võimaluse korral arvesse võtta. Kui struktuuriliselt samalaadsete ainete või selliste ainete segude kohta on olemas piisavalt inimestelt ja/või loomadelt saadud andmeid, saame eeldada, et hinnatav katseaine põhjustab samu reaktsioone. Sellistel juhtudel ei ole vaja katseainega katset teha. Negatiivsed tulemused struktuuriliselt samalaadsete ainete või selliste ainete segudega tehtud katsete kohta ei anna piisavalt tõendeid aine mitteärritavuse/mittesöövitavuse kohta järjestikuste katsete tegemise strateegia alusel. Valideeritud ja heakskiidetud struktuur-aktiivsusanalüüsi abil tuleks kindlaks teha nii nahasöövitus kui ka -ärritus.
         
            Füüsikalis-keemilised omadused ja keemiline reaktiivsus (3. etapp). Ained, mille äärmine pH-väärtus on näiteks < 2,0 ja > 11,5, võivad avaldada tõsist paikset mõju. Kui äärmine pH-väärtus on aluseks aine nahaärritavuse kindlakstegemisele, siis võib samuti võtta arvesse happe-/alusreservi (või puhverdusvõimet) (3, 4). Kui puhverdusvõime viitab sellele, et aine ei saa olla nahka ärritav, siis tuleks selle kinnitamiseks teha lisakatse, soovitavalt valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete abil (vt 5. ja 6. etapp).
         
            Nahakaudne mürgisus (4. etapp). Kui kemikaal on tõestatult naha kaudu väga mürgine, ei ole otstarbekas teha in vivo nahaärritust ja -söövitust käsitlevat katset, kuna tavapärane katseaine kogus võib ületada väga mürgist annust ning põhjustada seetõttu loomade surma või tõsiseid kannatusi. Lisaks sellele, kui on juba tehtud nahakaudset mürgisust käsitlevaid katseid albiinoküülikutega kuni piirannusmäärani 2 000 mg kg kehakaalu kohta või rohkem ning ei ole tuvastatud nahaärritust või -söövitust, ei ole vaja teha lisakatset nahaärrituse ja -söövituse kohta. Tarvis on meeles pidada mõned kaalutlused, kui hinnatakse varem sooritatud katsete tulemusi ägeda nahakaudse mürgisuse kohta. Näiteks võib nahakahjustuste kohta antud teave olla puudulik. Katsetes ja vaatlustel võib kasutada muid liike kui küülik ning liigid võivad oma reaktsioonide tundlikkuse poolest suuresti erineda. Samuti ei pruugi loomadel kasutatava katseaine vorm olla sobiv nahaärrituse/-söövituse hindamiseks (nt ainete lahjendamine nahakaudse mürgisuse kohta katsete tegemiseks (5)). Juhtudel, mil hästi kavandatud ja nahakaudset mürgisust käsitlevad katsed on sooritatud küülikutega, võidakse käsitada negatiivseid leide piisavate tõenditena selle kohta, et aine ei ole söövitav või ärritav.
         In vitro või ex vivo katsete tulemused (5. ja 6. etapp). Aineid, mis on näidanud söövitavaid või tugevalt ärritavaid omadusi valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katses (6, 7), mis on kavandatud nimetatud konkreetsete mõjude hindamiseks, ei ole vaja katsetada loomade peal. Võib eeldada, et sellistel ainetel on samalaadsed tõsised mõjud in vivo.
         In vivo katse küülikutega (7. ja 8. etapp). Kui tuleks teha osakaaluanalüüs in vivo katse sooritamise kohta, peaks see algama eelkatsest ühte looma kasutades. Kui nimetatud katse tulemused viitavad aine söövitavusele nahal, ei tohiks lisakatseid teha. Kui söövitavat toimet ei ole algkatses jälgitud, tuleks ärritavat või negatiivset reaktsiooni kinnitada kahe muu looma kasutamise abil neljatunnisel mõjuperioodil. Kui algkatses on jälgitud ärritavat mõju, tuleks seejärel sooritada kinnitav katse või mõjutada kahte muud looma korraga.
         VIITED
         
                     1)
                  
                  
                     OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD Workshop söövitavusega Harmonization of Validation and Acceptance Criteria mittesöövitavad Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm).
                  
               
                     2)
                  
                  
                     OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Qass/HCL6.htm).
                  
               
                     3)
                  
                  
                     Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdail D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709–720.
                  
               
                     4)
                  
                  
                     Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1) pp. 19–26.
                  
               
                     5)
                  
                  
                     Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and In Vitro Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1-56032-356-6, Chapter 31, 411–436.
                  
               
                     6)
                  
                  
                     Testing Method B.40.
                  
               
                     7)
                  
                  
                     Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524.
                  
               Joonis
         NAHAÄRRITUST/-SÖÖVITUST KÄSITLEVATE KATSETE JA HINDAMISE STRATEEGIA
         
            
      
      B.5.   ÄGE MÜRGISUS: SILMADE ÄRRITUS/SÖÖVITUS
      1.   MEETOD
      Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 405ga (2002).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesoleva ajakohastatud meetodi ettevalmistamisel pööratakse erilist tähelepanu võimalikele parandustele seoses loomade heaoluga ja kogu olemasoleva katseainet käsitleva teabe hindamisele, et vältida mittevajalikke katseid laboriloomadega. Käesoleva meetodi hulka kuulub soovitus, et enne kirjeldatud, silmade ägedat söövitust ja ärritust uuriva in vivo katse tegemist analüüsitaks olemasolevate asjaomaste andmete osakaalu (1). Kui saadaolevad andmed on puudulikud, saab neid täiendada järjestikuste katsete tegemise abil (2, 3). Katsete tegemise strateegia, mis on esitatud käesoleva meetodi lisas, hõlmab valideeritud ja heakskiidetud in vitro katsete sooritamist. Lisaks sellele on soovitav enne in vivo silmade katse tegemist teha silmade söövituse ennustamiseks in vivo nahaärrituse ja -söövituse katse.
      Nii mõistlike teaduslike meetodite kui ka loomade heaolu huvides ei tehta in vivo katseid enne, kui on hinnatud kogu kättesaadava, katseaine võimalikku silmade söövitamist/ärritamist käsitleva teabe osakaalu. Sellisteks andmeteks on tõendid varasematest inimeste ja/või laboriloomadega tehtud uuringutest, tõendid ühe või mitme struktuuriliselt samalaadse aine või selliste ainete segude põhjustatud söövituse ja ärrituse kohta, aine tugevale happesusele või leelisusele viitavad andmed (4, 5) ning valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo silmade söövitust ja ärritust uurivate katsete tulemused (6, 6a). Katsed võib teha enne osakaalu analüüsi või selle tulemusena.
      Teatavate ainete puhul võib selline analüüs viidata vajadusele teha in vivo katseid aine võimaliku silmade söövitavuse ja ärrituvuse väljaselgitamiseks. Kõikidel sellistel juhtudel on soovitav esmalt enne in vivo silmade katse tegemist teha katse in vivo aine nahakaudsete mõjude väljaselgitamiseks ja hinnata tulemusi vastavalt katsemeetodile B.4 (7). Osakaalu analüüsi tegemine ja järjestikuste katsete tegemise strateegia vähendaksid vajadust in vivo aine võimalikku silmade söövitavust/ärritavust uuriva katse tegemise järele, mille kohta on muudest katsetest saadud juba piisavalt tõendeid. Kui silmade söövitavust või ärritavust ei suudeta kindlaks määrata järjestikuste katsete tegemise strateegiat kasutades isegi pärast in vivo nahasöövitust ja -ärritust uuriva katse tegemist, võib teha in vivo silmade söövitust/ärritust uuriva katse.
      Eelistatud järjestikuste katsete tegemise strateegia, mis hõlmab valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete sooritamist söövitavuse ja ärritavuse kohta, on esitatud käesoleva meetodi lisas. Strateegia töötati välja OECD seminaril (8), kus osalenud seda ühehäälselt soovitasid, ja see kiideti heaks soovitusliku katsete tegemise strateegiana keemiliste ainete klassifitseerimist käsitlevas globaalselt ühtlustatud süsteemis (GHS) (9). Soovitatakse, et nimetatud katsestrateegiat kasutataks enne in vivo katsete tegemist. Uute ainete katsetamisel on soovitav etapiviisiline katsete tegemine teaduslikult usaldatavate andmete tootmiseks aine söövitavuse ja ärritatavuse kohta. Olemasolevate ainete puhul, mille naha ja silmade söövitavuse ja -ärritavuse kohta ei ole piisavalt andmeid, tuleks strateegiat kasutada puuduvate andmete hankimiseks. Kui otsustatakse kasutada muud katsete tegemise strateegiat või menetlust või mitte kasutada etapiviisilist katsete tegemist, siis tuleks seda otsust põhjendada.
      1.2.   MÕISTED
      
         Silmade ärritus – selliste muutuste tekkimine silmas pärast seda, kui katseainet on manustatud silma eespinnale, mis täielikult pöörduvad 21 päeva jooksul pärast manustamist.
      
         Silmade söövitus – koekahjustuse tekkimine silmas või tugev füüsiline nägemislangus pärast seda, kui katseainet on manustatud silma eespinnale, mis on täielikult pöördumatud 21 päeva jooksul pärast aine manustamist.
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritavat ainet manustatakse ühekordse annusena katselooma ühte silma, katselooma töötlemata silm toimib kontrollina. Silmade ärrituse/söövituse astet hinnatakse sidekesta, sarvkesta ja vikerkesta kahjustustele punkte andes teatavate intervallide tagant. Muid mõjusid silmas ja kahjulikke süsteemseid mõjusid kirjeldatakse samuti selleks, et hinnata täielikult mõjusid. Katse kestab niikaua, et vaadeldud mõjude pöörduvust või pöördumatust saaks hinnata.
      Loomad, kellel on jätkuvalt tugeva stressi ja/või valu tunnused igal katseetapil, tuleks humaanselt tappa ja seda võetakse aine hindamisel arvesse. Suremas olevate ja tugevalt kannatavate loomade humaanse tapmise kriteeriumid on toodud viites (10).
      1.4.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.4.1.   In vivo katse ettevalmistamine
      1.4.1.1   Loomaliikide valik
      Eelistatud laboriloom on albiinoküülik, kasutatakse terveid noori täiskasvanud küülikuid. Muude liikide või liinide kasutamist tuleks põhjendada.
      1.4.1.2.   Loomade ettevalmistamine
      Kummagi katsesse valitud looma mõlemat silma uuritakse 24 tunni jooksul enne katse algust. Ei tohiks kasutada loomi, kellel esineb silmade ärritust, silmadefekte või varasemaid sarvkestakahjustusi.
      1.4.1.3.   Loomade pidamise ja toitmise tingimused
      Loomi hoitakse eraldi puurides. Loomade katseruumi temperatuur küülikutel peaks olema 20 oC (± 3 oC). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi puhastamise ajal, siis eesmärk on hoida see vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust.. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega.
      1.4.2.   Katsemenetlus
      1.4.2.1.   Katseaine manustamine
      Katseainet manustatakse iga looma ühe silma sidekestakotti, tõmmates alumist laugu õrnalt silmamunast eemale. Seejärel pigistatakse laud umbes üheks sekundiks õrnalt kinni, et vältida aine silmast väljavalgumist. Teine silm, mida ei töödelda, toimib kontrollina.
      1.4.2.2.   Loputamine
      Katseloomade silmi ei tohiks pesta vähemalt 24 tundi pärast katseaine manustamist, välja arvatud tahkete ainete puhul (vt punkt 1.4.2.3.2) ja koheste sööbivate või ärritavate mõjude korral. 24 tunni pärast võib loputada, kui seda peetakse vajalikuks.
      Pesemise mõju selgitamiseks ei soovitata kasutada loomade kontrollrühma, välja arvatud juhul, kui see on teaduslikult põhjendatud. Kui on vaja kontrollrühma, kasutatakse kahte küülikut. Pesemise tingimused tuleks hoolikalt dokumenteerida, nt pesemisaeg, pesemislahuse koostis ja temperatuur, pesemise kestus, vedeliku kogus ja voolukiirus.
      1.4.2.3   Annusmäär
      1.4.2.3.1.   Vedelike uurimine
      
      Vedelike uurimiseks kasutatakse 0,1 ml annust. Pumppihustist ei tohi ainet otse silma manustada. Vedelikujuga tuleks väljutada ja koguda mahutisse enne 0,1 ml silma manustamist.
      1.4.2.3.2.   Tahkete ainete uurimine
      
      Tahkete ainete, pastade ja osakeste uurimisel peaks kasutatav kogus olema 0,1 ml või kaaluga kuni 100 mg. Katseaine tuleks jahvatada peeneks tolmuks. Tahke aine kogust tuleks mõõta pärast selle õrnalt tihendamist, nt raputades mõõtemahutit. Kui tahket katseainet ei ole katselooma silmast eemaldatud füsioloogiliste mehhanismide abil esimese vaatluse ajal üks tund pärast käsitlemist, loputatakse silma füsioloogilise soolalahusega või destilleeritud veega.
      1.4.2.3.3.   Aerosoolide uurimine
      
      Soovitatavalt kogutakse kõik pumbatavad joad ja aerosoolid enne silma manustamist. Üheks erandiks on survestatud aerosoolmahutites ained, mida ei saa koguda aurustumise tõttu. Sellistel juhtudel tuleks silm hoida lahti ja katseaine panna silma ligikaudu üks sekund kestva lihtsa purskega 10 cm kauguselt otse silma ees. Nimetatud vahemaa võib muutuda sõltuvalt pihusti survest ja sisaldusest. Tuleks olla ettevaatlik, et pihusti surve ei teeks silmale liiga. Mõnel juhul võib osutuda vajalikuks hinnata pihusti tugevusest silmale põhjustatud võimalikke „mehaanilisi” kahjustusi.
      Aerosooliannuse suurust võib hinnata katset järgmiselt simuleerides: ainet pihustatakse kaalupaberile otse paberi ees oleva küüliku silma suurusest avausest. Paberi kaalu suurenemise abil hinnatakse silma pihustatud kogust. Lenduvate ainete puhul võib hinnata annust kogumismahuti kaalumise teel enne ja pärast katseaine eemaldamist.
      1.4.2.4.   Algkatse (ühe loomaga in vivo nahaärrituvus/-söövitavuskatse)
      Järjestikuste katsete tegemise strateegia kohaselt (vt 1. lisa) on väga soovitav, et in vivo katse sooritataks algselt ühe loomaga.
      Kui nimetatud katse tulemused tõendavad, et aine on kirjeldatud menetlust kasutades silma söövitav või tugevalt ärritav, ei ole silma ärritavuse kindlakstegemiseks vaja teha täiendavaid katseid.
      1.4.2.5.   Lokaalanesteetikumid
      Lokaalanesteetikume võib kasutada igal üksikjuhul. Kui osakaalu analüüs viitab sellele, et aine võib põhjustada valu, või kui algkatsega tõendatakse, et võib toimuda valulik reaktsioon, võib lokaalanesteetikume kasutada enne katseaine manustamist. Lokaalanesteetikumi liik, kontsentratsioon ja annus tuleks valida hoolikalt, et erinevused katseainele reageerides ei tuleneks selle kasutamisest. Kontrollsilma tuleb samamoodi tuimestada.
      1.4.2.6.   Kinnitav katse (in vivo silmade ärritust käsitlev katse täiendavate loomadega)
      Kui söövitavat toimet ei ole algkatses täheldatud, tuleks ärritavat või negatiivset reaktsiooni kinnitada kahe muu looma kasutamise abil. Kui algkatses täheldatakse tugevat ärritavat mõju, mis viitab võimalikule tugevale (pöördumatule) mõjule kinnitava katse tegemisel, on soovitav, et kinnitav katse tehtaks järjestikku ühe loomaga korraga, mitte kahte lisalooma korraga mõjutades. Kui teisel loomal esineb söövitavaid või tugevalt ärritavaid mõjusid, siis katset enam ei jätkata. Lisaloomasid võib vaja minna nõrkade või mõõdukate ärritavate reaktsioonide kinnitamiseks.
      1.4.2.7.   Jälgimisperiood
      Jälgitakse seni, kuni on võimalik täielikult hinnata vaadeldud mõjude ulatust ja pöörduvust. Katse tuleks lõpetada igal juhul siis, kui loomal on jätkuvalt tugeva valu või stressi tunnused (9). Mõjude pöörduvuse kindlaksmääramiseks tuleks jälgida loomi tavaliselt 21 päeva pärast katseaine manustamist. Kui pöörduvus ilmneb enne 21 päeva möödumist, tuleks katse lõpetada sel ajal.
      1.4.2.7.1.   Kliinilised vaatlused ja silma reaktsioonide hindamine
      
      Silmi tuleks jälgida 1, 24, 48 ja 72 tundi pärast katseaine manustamist. Loomi ei uurita pärast seda, kui on saadud lõplikud andmed. Loomad, kellel jätkuvalt esineb tugevat valu või stressi, tuleks viivitamata humaanselt tappa, ning ainet tuleks hinnata vastavalt sellele. Humaanselt tuleks tappa loomad, kellel aine manustamise järel esineb järgmisi silmakahjustusi: sarvkesta perforatsioon või märgatav sarvkesta haavand, kaasa arvatud silmasopislaiend; veri silma eeskambris; hinde 4 sarvkesta läbipaistmatus, mis püsib 48 tunni jooksul; valgusrefleksi puudumine (vikerkesta reaktsioon – hinne 2), mis püsib 72 tunni jooksul; sidekesta haavand; sidekesta või niktatsioonikesta nekroos või armistumine. Seda seetõttu, et sellised kahjustused üldiselt on pöördumatud.
      Loomad, kellel ei esine silmakahjustusi, võib tappa mitte varem kui kolm päeva pärast manustamist. Loomi, kellel esinevad kerged või mõõdukad kahjustused, tuleks jälgida seni, kuni kahjustused on selged, või 21 päeva, mil katse lõpetatakse. Jälgitakse 7, 14 ja 21 päeva, et kindlaks määrata kahjustuste seisund ning nende pöörduvus või pöördumatus.
      Silmade reaktsiooni (sidekest, sarvkest ja vikerkest) hinded tuleks registreerida iga kord, kui looma uuritakse (tabel 1). Kõikidest muudest silmakahjustustest (nt silma sarvkestakiht, värvumine) või kahjulikest süsteemsetest mõjudest tuleks samuti teada anda.
      Reaktsioonide uurimist võib hõlbustada binokulaarluubi, pilulambi, biomikroskoobi või muu sobiva seadme kasutamine. Pärast vaatluste registreerimist 24 tunni jooksul võib silmi edasi uurida fluorestseiini abil.
      Silma reaktsioonide hindamine on tingimata subjektiivne. Silma reaktsiooni hindamise ühtlustamiseks ning katselaboratooriumide ning jälgivate või tõlgendavate isikute abistamiseks on vaja vaatlusi tegevatel isikutel piisavalt tundma õppida kasutatavat hindamissüsteemi (vt tabel allpool).
      2.   ANDMED
      2.2.   TULEMUSTE HINDAMINE
      Silmaärrituse punkte tuleks hinnata vastavalt kahjustuste laadile ja raskusele ning nende pöörduvusele või pöördumatusele. Üksikud määramised ei esinda aine ärritavate omaduste absoluutset taset, kuna samuti hinnatakse katseaine muid mõjusid. Selle asemel tuleks käsitada üksikuid punkte kontrollväärtustena ja need on tähendusrikkad üksnes siis, kui neid on täielikult kirjeldatud ja kõiki vaatlusi on hinnatud.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Põhjendus in vivo katse tegemiseks: varasemate katseandmete, sh järjestikuste katsete tegemise strateegia põhjal saadud tulemuste osakaalu analüüs:
                  
                              —
                           
                           
                              varasematest katsetest saadud asjaomaste andmete kirjeldus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katsestrateegia igal etapil saadud andmed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              
                                 in vitro katsete kirjeldus, sh menetluste üksikasjad, katse-/võrdlusainetest saadud tulemused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              
                                 in vivo nahaärritust/-söövitust uuriva katse, sh saadud tulemuste kirjeldus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              osakaalu analüüs in vivo uurimuse sooritamiseks.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katseaine:
                  
                              —
                           
                           
                              tunnusandmed (nt CASi number, algupära, puhtus, tuntud lisandid, partii number);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              füüsikaline laad ja füüsikalis-keemilised omadused (nt pH, lenduvus, lahustuvus, stabiilsus, reaktiivsus veega);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kui tegu on seguga, selle koostis ja koostisosade suhtelised protsendimäärad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kui kasutatakse lokaalanesteetikumi, selle nimetus, puhtus, liik, annus ja võimalik koostoime katseainega.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Kandeaine:
                  
                              —
                           
                           
                              —– nimetus, kontsentratsioon (vajaduse korral), kasutatud kogus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kandeaine valiku põhjendamine.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katseloomad:
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatud liigid/liin, põhjendus muude loomade kui albiinoküülikute kasutamiseks;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              iga looma vanus katse alguses;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mõlemast soost loomade arv katse- ja kontrollrühmas (vajaduse korral);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikute loomade kaalud katse alguses ja lõpus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              päritolu, elamistingimused, toitumine jne.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              igal vaatlusel ärritusele punktide andmisel kasutatava meetodi kirjeldus (nt pilulamp, biomikroskoop, fluorestseiin);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tabeli kujul andmed iga looma ärritavate/söövitavate reaktsioonide kohta igal vaatlusel kuni katselooma kõrvaldamiseni katsest;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              jälgitud ärrituse või söövituse astme ja laadi kirjeldus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              muude jälgitud silmakahjustuste kirjeldus (nt vaskularisatsioon, silma sarvkestakihi tekkimine, liited, värvumine);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mujal kui silmas tuvastatud paiksete või süsteemsete kahjulike mõjude ja histopatoloogiliste leidude kirjeldus.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutelu.
               
            3.2.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE
      Katseloomadega tehtud silma ärritust uurivate katsete tulemuste ekstrapolatsioon inimestele on kehtiv üksnes piiratud ulatuses. Paljudel juhtudel on albiinoküülikud silma ärritavatele või söövitavatele ainetele tundlikumad kui inimesed.
      Tuleks olla ettevaatlik andmete tõlgendamisel, et välistada sekundaarsest nakkusest tingitud ärritust.
      4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, L, Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429.
               
            
                  2)
               
               
                  de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35., 159–164.
               
            
                  3)
               
               
                  Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161–177.
               
            
                  4)
               
               
                  Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P, Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19–26.
               
            
                  5)
               
               
                  Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231.
               
            
                  6)
               
               
                  Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524.
               
            
                  6a)
               
               
                  Testing Method B.40 Skin Corrosion.
               
            
                  7)
               
               
                  Testing method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion.
               
            
                  8)
               
               
                  OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
               
            
                  9)
               
               
                  OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
               
            
                  10)
               
               
                  OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
               
            Tabel 1
      SILMAKAHJUSTUSTE HINDAMINE
      Sarvkest
      Hägusus: tihedusaste (mõõtmised tuleks teha kõige tihedamas kohas) (1)
      
      
                  Ei esine haavandeid või hägusust…
               
               
                  0
               
            
                  Hajutatud või hajusad hägususalad (välja arvatud tavapärase läike kerge tuhmumine); vikerkesta selgelt nähtavad detailid…
               
               
                  1
               
            
                  Kergesti märgatav poolläbipaistev ala; vikerkesta kergelt varjatud detailid…
               
               
                  2
               
            
                  Pärlmutrine ala; vikerkesta detailid ei ole nähtavad; pupilli suurus on vaevunähtav …
               
               
                  3
               
            
                  Läbipaistmatu sarvkest; vikerkest ei eristu läbi hägususe …
               
               
                  4
               
            Suurim võimalik punktide arv: 4
      MÄRKUSED
      Vikerkest
      
                  Tavaline …
               
               
                  0
               
            
                  Selgesti süvenenud kurrud, verepais, turse, mõõdukas liigveresus sarvkesta ümber; või injektsioon; vikerkest reageerib valgusele (pikaldast reaktsiooni peetakse katseaine mõjuks) …
               
               
                  1
               
            
                  Verejooks, täielikult hävinud vikerkest või ei reageeri valgusele …
               
               
                  2
               
            Suurim võimalik punktide arv: 2
      Sidekest
      Punasus (viitab laugude ja silmamuna sidekestale, v.a sarv- ja vikerkest)
      
                  Tavaline …
               
               
                  0
               
            
                  Mõned hüpereemilised veresooned (injekteeritud)…
               
               
                  1
               
            
                  Hajunud sügavpunane värvus; üksikuid veresooni ei ole kerge eristada…
               
               
                  2
               
            
                  Hajunud tumepunane…
               
               
                  3
               
            Suurim võimalik punktide arv: 3
      Sidekesta turse
      Turse (viitab laugudele ja/või niktatsioonikestale)
      
                  Tavaline …
               
               
                  0
               
            
                  Mõningane tavapärasest suurem turse …
               
               
                  1
               
            
                  Selge turse, laud osaliselt ümber pöördunud …
               
               
                  2
               
            
                  Turse, laud poolsuletud …
               
               
                  3
               
            
                  Turse, laud rohkem kui poolsuletud…
               
               
                  4
               
            Suurim võimalik punktide arv: 4
      
         Lisa
         Silma ärritavust ja söövitavust uurivate järjestikuste katsete tegemise strateegia
         ÜLDKAALUTLUSED
         Mõistlike teaduslike meetodite ja loomade heaolu huvides on oluline vältida loomade tarbetut kasutamist ja vähendada selliste katsete tegemist, mis tõenäoliselt tekitab tõsiseid reaktsioone loomadel. Kogu teavet aine võimaliku silmade ärritavuse/söövitavuse kohta tuleks hinnata enne in vivo katse tegemise kaalumist. Võimalik, et on juba olemas piisavalt tõendeid katseaine klassifitseerimiseks silmade ärritavuse või söövitavuse järgi, ja ei ole vaja sooritada katset laboriloomadega. Seetõttu vähendaks osakaaluanalüüsi kasutamine ja järjestikuste katsete tegemise strateegia vajadust in vivo katsete tegemise järele, eriti siis, kui aine tõenäoliselt tekitab tõsiseid reaktsioone.
         On soovitav, et kasutataks osakaaluanalüüsi olemasoleva, silmade ärritavust ja söövitavust käsitleva teabe hindamiseks, et kindlaks määrata, kas tuleks teha lisakatseid, v.a in vivo silmi uurivad katsed, sellise võime iseloomustamiseks. Kui on vaja teha täiendavaid katseid, on soovitav, et kasutatakse järjestikuste katsete tegemise strateegiat asjaomaste katseandmete parandamiseks. Ainete puhul, millega ei ole katseid tehtud, tuleks kasutada järjestikuste katsete tegemise strateegiat selliste andmete parandamiseks, mida läheb vaja silmade ärritavuse ja söövitavuse hindamisel. Käesolevas lisas kirjeldatud katsete tegemise strateegia töötati välja OECD seminaril (1). Seda kinnitati ja laiendati hiljem keemiliste ainete mõju inimeste tervisele ja keskkonnale käsitleva integreeritud ohtude harmoneeritud klassifitseerimise süsteemis, nagu see on heaks kiidetud kemikaalikomitee ja kemikaalitöörühma 28. ühisistungil 1998. aasta novembris (2).
         Kuigi käesolev järjestikuste katsete tegemise strateegia ei ole B.5 katsemeetodi lahutamatu osa, väljendab see soovitavat lähenemist silmade ärritavuse ja söövitavuse tunnuste kindlaksmääramiseks. Nimetatud lähenemine väljendab nii head tava kui ka eetilist võrdluspunkti in vivo silmade ärritust ja söövitust uurivate katsete tegemise kohta. Katsemeetod annab juhiseid in vivo katse sooritamiseks ja esitab kokkuvõtte teguritest, mida käsitletakse enne katse alustamist. Järjestikuste katsete tegemise strateegia on lähenemine katseaine silmade ärritavus- ja söövitavusomadusi käsitlevate olemasolevate andmete hindamisele ning mitmetasandiline lähenemine selliste asjaomaste andmete tekitamisele, mille suhtes on vaja teha täiendavaid katseid või mille suhtes ei ole tehtud katseid. Strateegia hõlmab esmalt valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete ja seejärel katsemeetodi B.4 sooritamist (nahaärritust/-söövitust uurivad katsed) teatavatel tingimustel (3, 4).
         ETAPIVIISILISE KATSETE TEGEMISE STRATEEGIA KIRJELDUS
         Enne katse sooritamist järjestikuste katsete tegemise strateegia osana (joonis) tuleks hinnata kogu kättesaadavad teavet in vivo silmi uurivate katsete tegemise vajaduse kindlaksmääramiseks. Kuigi üksikute parameetrite hindamisel võib saada märkimisväärset teavet (nt äärmine pH-väärtus), tuleks võtta arvesse olemasolev teave tervenisti. Kõiki kõnealuse aine ja selle analoogide mõjusid käsitlevaid andmeid tuleks hinnata, tehes otsuse osakaalu kohta, ja esitada selle otsuse kohta põhjendus. Esmalt rõhutatakse inimestelt ja loomadelt varem saadud, ainet käsitlevaid andmeid ja seejärel in vitro või ex vivo katsete tegemise tulemusi. Söövitavaid aineid käsitlevaid in vivo katseid tuleks võimaluse korral vältida. Katsete tegemise strateegias võetakse arvesse järgmiseid tegureid.
         
            Inimestelt ja loomadelt varem saadud andmete hindamine (1. etapp). Inimestelt varem saadud andmeid, nt kliinilised või töökeskkonna uuringud ning juhtumiaruanded, ja/või loomadega tehtud silmi uurivaid katseid käsitlevaid andmeid tuleks võtta arvesse esmalt, kuna need annavad sellist teavet, mis on vahetult seotud silmadele mõjumisega. Seejärel tuleks hinnata inimesi ja/või loomi uurivatest katsetest kättesaadavaid andmeid, mis uurivad naha söövitust/ärritust. Loomadele ei saa silma manustada aineid, mis on teatavasti silmi söövitavad või tugevalt ärritavad, ega aineid, millel on nahka söövitav või ärritav toime, sest selliseid aineid tuleks pidada samuti silmi söövitavateks ja/või ärritavateks. Aineid, mille kohta on varem tehtud silmi uurivatest katsetest piisavalt tõendeid, et need ei ole söövitavad ega ärritavad, ei tohiks samuti kasutada in vivo silmi uurivates katsetes.
         
            Struktuur-aktiivsusanalüüs (SAR) (2. etapp). Struktuuriliselt samalaadsete ainetega tehtud katsete tulemusi tuleks võimaluse korral arvesse võtta. Kui struktuuriliselt samalaadsete ainete või selliste ainete segude kohta on olemas piisavalt inimestelt ja/või loomadelt saadud andmeid, mis viitavad nende silmi söövitavale/ärritavale mõjule, saame eeldada, et hinnatav katseaine põhjustab samu reaktsioone. Sellistel juhtudel ei ole vaja katseainet uurida. Negatiivsed tulemused struktuuriliselt samalaadsete ainete või selliste ainete segudega tehtud katsete kohta ei anna piisavalt tõendeid aine mitteärritavuse/mittesöövitavuse kohta järjestikuste katsete tegemise strateegia alusel. Valideeritud ja heakskiidetud struktuur-aktiivsusanalüüsi abil tuleks kindlaks teha nii naha kui ka silmade söövitus ja ärritus.
         
            Füüsikalis-keemilised omadused ja keemiline reaktiivsus (3. etapp). Ained, mille äärmine pH-väärtus on näiteks ≤ 2,0 ja ≥ 11,5, võivad avaldada tõsist paikset mõju. Kui äärmine pH-väärtus on aluseks aine silmade söövitavuse või ärritavuse kindlakstegemiseks, siis võib samuti võtta arvesse happe-/alusreservi (või puhverdusvõimet) (5, 6). Kui puhverdusvõime viitab sellele, et aine ei või olla silmi söövitav, siis tuleks selle kinnitamiseks teha lisakatse, soovitavalt valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete abil (vt 5. ja 6. etapp).
         
            Muu olemasoleva teabe arvessevõtmine (4. etapp). Kogu süsteemset nahakaudset mürgisust käsitlevat kättesaadavat teavet tuleks hinnata igal etapil. Samuti tuleks arvesse võtta katseaine ägedat nahakaudset mürgisust. Kui on tõendatud, et katseaine on väga mürgine naha kaudu, siis seda ei või silmas katsetada. Kuigi ägeda nahakaudse mürgisuse ja silmade ärrituse/söövituse vahel ei ole tingimata seost, võib eeldada, et kui aine on naha kaudu väga mürgine, võib see samuti olla väga mürgine silma pannes. Selliseid andmeid võib samuti arvesse võtta 2. ja 3. etapil.
         In vitro või ex vivo katsete tulemused (5. ja 6. etapp). Aineid, mis on näidanud söövitavaid või tugevalt ärritavaid omadusi valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katses (7, 8), mis on valideeritud ja heakskiidetud spetsiaalselt silmade või naha ärrituse/söövituse hindamiseks, ei ole vaja katsetada loomade peal. Võib eeldada, et sellistel ainetel on sarnased tõsised mõjud in vivo. Kui valideeritud ja heakskiidetud in vitro/ex vivo katsed ei ole kättesaadavad, tuleks vahele jätta 5. ja 6. etapp ning liikuda otse etappi 7.
         
            Aine in vivo nahakaudse ärritavuse või söövitavuse hindamine (7. etapp). Kui ei ole piisavalt tõendeid selle kohta, millega teha lõplik osakaaluanalüüs aine võimaliku silmade ärritavuse/söövitavuse kohta, mis põhineb eespool nimetatud katsetest saadud andmetel, siis esmalt hinnatakse in vivo nahaärritavuse/-söövitavuse võimet, kasutades katsemeetodit B.4 (4) ja selle lisa (9). Kui on tõendatud, et aine võib tekitada söövitust või tugevaid nahaärritusi, tuleks seda pidada söövitavaks silmaärritust tekitavaks aineks, välja arvatud juhul, kui teave toetab alternatiivset järeldust. Seega ei ole vaja sooritada in vivo silmi uurivat katset. Kui aine ei ole nahka söövitav ega tugevalt ärritav, siis tuleks sooritada in vivo silmi uuriv katse.
         In vivo katse küülikutega (8. ja 9. etapp). In vivo silmi uurivad katsed peaksid algama algkatsega, kus kasutatakse ühte looma. Kui nimetatud katse tulemused tõendavad, et aine on silma söövitav või tugevalt ärritav kirjeldatud menetlust kasutades, ei ole vaja teha täiendavaid katseid. Kui nimetatud katsest ei ilmne mis tahes söövitavad või tugevalt ärritavad mõjud, tehakse kinnitav katse kahe lisaloomaga.
         VIITED
         
                     1)
                  
                  
                     OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm).
                  
               
                     2)
                  
                  
                     OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Qass/HCL6.htm).
                  
               
                     3)
                  
                  
                     Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161–177.
                  
               
                     4)
                  
                  
                     Testing method B.4. Acute Toxicity: dermal irritation/corrosion.
                  
               
                     5)
                  
                  
                     Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19–26.
                  
               
                     6)
                  
                  
                     Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-231.
                  
               
                     7)
                  
                  
                     Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, PA., Curren, R.D., Earl, L.K, Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524.
                  
               
                     8)
                  
                  
                     Testing Method B.40 Skin Corrosion.
                  
               
                     9)
                  
                  
                     Annex to Testing method B.4: A Sequential Testing Strategy for Skin Irritation and Corrosion.
                  
               Joonis
         Silmade ärritust/söövitust käsitlevate katsete ja hindamise strateegia
         
            
         
            
      
      B.6.   NAHA SENSIBILISEERIMINE
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      
         Märkused
      
      Katsete tundlikkust ja võimet tuvastada inimeste naha võimalikke sensibiliseerijaid loetakse inimese tervisega seotud toksilisuse liigitamise seisukohalt oluliseks.
      Ei ole olemas uurimismeetodit, mis identifitseeriks adekvaatselt kõik ained, mis võivad inimese nahka sensibiliseerida ja mis sobiks kõikide ainete puhul.
      Katse valimisel tuleb kaaluda aine füüsikalisi omadusi, sealhulgas aine võimet tungida läbi naha.
      Välja on töötatud kahte liiki katsed, milles kasutatakse merisigu: abiainega katsed, milles võimendatakse allergiaseisundit sellega, et uuritavat ainet lahustatakse või suspendeeritakse Freundi täielikus abiaines (Freund's Complete Adjuvant – FCA), ja abiaineta katsed.
      Abiainega katsed on tõenäoliselt konkreetse aine võimaliku nahka sensibiliseeriva toime ennustamisel täpsemad kui need meetodid, mis ei kasuta Freundi täielikku abiainet, ning seega tuleks selliseid meetodeid eelistada.
      Merisigade maksimeerimise katse (GPMT) on laialdaselt kasutatud abiainega katse. Olgugi, et on olemas mitmeid meetodeid, millega on võimalik tuvastada aine potentsiaali kutsuda esile naha sensibiliseeriv reaktsioon, loetakse GPMT katset eelistatud abiainega katseks.
      Paljude keemiliste ainete klasside puhul peetakse abiaineta katseid (millest eelistatakse Buehleri katset) vähem tundlikuks.
      Teatavatel juhtudel võib Buehleri katse valimine olla põhjendatud, kuna selles katses manustatakse aine paikselt, mitte nahasisese süstimise teel nagu GPMT puhul. Buehleri katse kasutamist tuleks teaduslikult põhjendada.
      Käesolevas meetodis kirjeldatakse GPMTd ja Buehleri katset. Kasutada võib ka teisi meetodeid tingimusel, et need on hästi valideeritud ja teaduslikult põhjendatud.
      Kui tunnustatud sõelkatsega saadakse positiivne tulemus, võib uuritava aine määrata võimalikuks sensibiliseerijaks ning täiendava meriseakatse tegemine ei pruugi olla vajalik. Kui sellisel katsel on siiski negatiivne tulemus, tuleb meriseakatse teha käesolevas uurimismeetodis kirjeldatud korras.
      Vt ka üldise sissejuhatuse B osa.
      1.2.   MÕISTED
      
         Naha sensibiliseerimine – (allergiline kontaktne dermatiit) on mingi aine poolt põhjustatud immunoloogiliselt vahendatud nahareaktsioon. Inimestel võib vastureaktsiooniks olla sügelemine, punetus, paistetus, paapulid, vesivillid või nende kombinatsioon. Teiste liikide puhul võivad reaktsioonid erineda ning esineda võib ainult punetust ja paistetust.
      
         Induktsioonkokkupuude – katsealuse kokkupuude uuritava ainega, mille eesmärk on kutsuda esile ülitundlik seisund.
      
         Induktsiooniperiood – pärast induktsioonkokkupuudet vähemalt nädal aega kestev periood, mille ajal võib kujuneda ülitundlik seisund.
      
         Allergilise reaktsiooni esile kutsuv kokkupuude – eelnevalt käsitletud katsealuse kokkupuude uuritava ainega pärast induktsiooniperioodi selleks, et määrata kindlaks, kas katsealune reageerib ülitundlikult.
      1.3.   VÕRDLUSMATERJAL
      Kasutatud uurimismeetodi tundlikkust ja usaldusväärsust tuleks hinnata kord kuue kuu jooksul, kasutades selleks aineid, mille puhul on teada, et neil on nõrga või keskmise toimega nahka sensibiliseerivad omadused.
      Nõuetekohaselt tehtud abiainega katses peaks eeldatavasti reageerima vähemalt 30 % ja abiaineta katses vähemalt 15 % nõrga või keskmise toimega sensibiliseerijat.
      Eelistatakse järgmisi aineid:
      
                  CASi number
               
               
                  EINECSi number
               
               
                  EINECSi nimed
               
               
                  Üldnimetused
               
            
                  101-86-0
               
               
                  202-983-3
               
               
                  α-heksüülkaneelaldehüüd
               
               
                  α-heksüülkaneelaldehüüd
               
            
                  149-30-4
               
               
                  205-736-8
               
               
                  bensotiasool-2-tiool (merkaptobensotiasool)
               
               
                  kaptaks
               
            
                  94-07-7
               
               
                  202-303-5
               
               
                  bensokaiin
               
               
                  nordkaiin
               
            Teatavas olukorras võib piisavate põhjenduste korral kasutada ka teisi eespool nimetatud kriteeriumidele vastavaid võrdlusaineid.
      1.4.   UURIMISMEETODI PÕHIMÕTE
      Katseloomad puutuvad uuritava ainega esimest korda kokku nahasisese süstimise ja/või nahale määrimise kaudu (induktsioonkokkupuude). Pärast 10–14päevast puhkeaega (induktsiooniperioodi), mille jooksul võib välja kujuneda immuunsusreaktsioon, puutuvad loomad kokku nakatumist esile kutsuva doosiga. Katseloomade naha reaktsiooni määra ja ulatust võrreldakse võrdlusloomade omaga, kes saavad induktsiooni ajal platseeboravi ning kellele seejärel manustatakse nakatumist esile kutsuv doos.
      1.5.   UURIMISMEETODI KIRJELDUS
      Kui uuritava aine eemaldamist peetakse vajalikuks, tuleks seda teha vee või sobiva lahustiga, ilma et see muudaks olemasolevat reaktsiooni või kahjustaks naha pinda.
      1.5.1.   Merisigade maksimeerimise katse (GPMT)
      
      1.5.1.1.   Valmistised
      
      Terveid albiinomerisigu harjutatakse laboritingimustega vähemalt viie päeva jooksul enne katse tegemist. Enne katse tegemist jagatakse loomad juhuslikkuse alusel katserühmadesse. Karvad eemaldatakse sõltuvalt kasutatavast uurimismeetodist lõikamise, raseerimise või vajaduse korral keemilise depilatsiooni teel. Tuleb olla ettevaatlik, et vältida naha hõõrdumist. Loomi kaalutakse enne katse algust ning katse lõpus.
      1.5.1.2.   Katsetingimused
      
      1.5.1.2.1.   Katseloomad
      Katseloomadena kasutatakse üldkasutatavate albiinomerisigade laboratoorseid aretusliine.
      1.5.1.2.2.   Arv ja sugu
      Kasutada võib isas- ja/või emasloomi. Kui kasutatakse emasloomi, peaksid nad olema nullpaarid ja nad ei tohiks olla tiined.
      Katserühmas on vähemalt kümme looma ning võrdlusrühmas vähemalt viis looma. Kui katserühmas ja võrdlusrühmas on kasutatud vastavalt vähem kui 20 ja kümmet merisiga ning kui ei ole võimalik järeldada, et uuritav aine on sensibilisaator, soovitatakse tungivalt täiendavate loomad uurimist, et kokku oleks vähemalt 20 katse- ja kümme võrdluslooma.
      1.5.1.2.3.   Doositasemed
      Uuritava aine kontsentratsioon peaks iga induktsioonkokkupuute kohta olema süsteemselt hästi talutav ning kasutada tuleks kõrgeimat kerget kuni keskmist nahaärritust tekitavat kontsentratsiooni. Nakatumist esile kutsuva doosi puhul kasutatav kontsentratsioon peaks olema suurim ärritust mitte esile kutsuv doos. Vajaduse korral võib vajalikud kontsentratsioonid määrata kindlaks kahe või kolme loomaga tehtud prooviuuringute põhjal. Sellisel juhul tuleks kaaluda selliste loomade kasutamist, kellele on ainet manustatud FCA abil.
      1.5.1.3.   Katse käik
      
      1.5.1.3.1.   Induktsioon
      Katserühma 0-päev
      Abaluude piirkonda, kust on eemaldatud karvad, süstitakse naha alla 3 × 2 korda 0,1 ml selliselt, et kolm süsti tehakse keskjoonest vasakule ja kolm keskjoonest paremale.
      Injektsioon 1: 1:1 segu (v/v) FCAst ja veest või füsioloogilisest keedusoolalahusest
      Injektsioon 2: valitud kontsentratsiooniga uuritav aine sobivas vehiikelis
      Injektsioon 3: valitud kontsentratsiooniga uuritav aine 1:1 segus (v/v) FCAst ja veest või füsioloogilisest keedusoolalahusest
      Injektsioonis 3 lahustatakse vees lahustuvad ained vesifaasis enne FCAga segamist. Rasvades lahustuvad või lahustumatud ained suspendeeritakse FCAs enne vesifaasiga segamist. Uuritava aine lõppkontsentratsioon peab olema võrdne sellega, mida on kasutatud injektsioonis 2.
      Injektsioonid 1 ja 2 tehakse lähestikku ning peale kõige lähemale, samal ajal kui injektsioon 3 tehakse piirkonna kõige tagapoolsemasse osasse.
      Võrdlusrühma 0-päev
      3 × 2 korda 0,1 ml süstitakse naha alla samadesse kohtadesse kui katseloomade puhul.
      Injektsioon 1: 1:1 segu (v/v) FCAst ja veest või füsioloogilisest keedusoolalahusest
      Injektsioon 2: lahjendamata vehiikel
      Injektsioon 3: 50 %line w/v segu vehiikelit FCA ja vee või füsioloogilise keedusoolalahuse segus 1:1 (v/v).
      Katse- ja võrdlusrühma 5.–7. päev
      Kui aine ei ärrita nahka, manustatakse katsepinda ligikaudu 24 tundi enne paikset induktsioonkokkupuudet ja pärast karvade lõikamist ja/või raseerimist 0,5 ml 10 %list naatriumlaurüülsulfaati vaseliinis kohaliku ärrituse tekitamiseks.
      Katserühma 6.–8. päev
      Katsepiirkond puhastatakse uuesti karvadest. Sobivas vehiikelis oleva uuritava ainega täielikult küllastatud filterpaber (2 × 4 cm) asetatakse katsepiirkonnale ning kaetakse 48 tunniks oklusioonmähisega. Vehiikeli valikut tuleb põhjendada. Tahked ained pulbristatakse peeneks ja lisatakse sobivasse vehiikelisse. Vedelikke võib kasutada vajaduse korral lahjendamata kujul.
      Võrdlusrühma 6.–8. päev
      Katsepiirkond puhastatakse uuesti karvadest. Vehiikel asetatakse samal viisil uuritava ainega katsepiirkonnale ja kaetakse 48 tunniks oklusioonmähisega.
      1.5.1.3.2.   Nakatumise esilekutsumine
      Katse- ja võrdlusrühma 20.–22. päev
      Katserühma ja võrdlusrühma loomade küljed puhastatakse karvadest. Uuritava ainega immutatud lapp või uuritavat ainet sisaldav nõu pannakse looma ühele küljele ja vajaduse korral võib teisele küljele panna vehiikeliga immutatud lapi või seda sisaldava nõu. Lappe hoitakse oklusioonmähisega 24 tundi naha vastas.
      1.5.1.3.3.   Vaatlus ja hindamine: katse- ja võrdlusrühm
      
                  —
               
               
                  Umbes 21 tundi pärast lapi äravõtmist nakatatud ala puhastatakse, pügatakse ja/või raseeritakse ning vajaduse korral depileeritakse.
               
            
                  —
               
               
                  Umbes 3 tundi hiljem (umbes 48 tundi pärast nakatumise esilekutsumise alustamist) vaadeldakse naha reaktsiooni ning see registreeritakse liites esitatud hindamisskaala põhjal.
               
            
                  —
               
               
                  Umbes 24 tundi pärast vaatlust tehakse teine vaatlus (72 tunni pärast) ning tulemused märgitakse üles.
               
            Soovitav on hinnata katse tulemusi pimemeetodiga.
      Kui esimese nakatumist esile kutsuva katse tulemusi on vaja täpsustada, tuleks kaaluda vajaduse korral uue võrdlusrühmaga teise nakatumist esile kutsuva katse (st taasnakatumise katse) tegemist umbes nädal pärast esimest katset. Taasnakatumise katse võib teha ka esialgse võrdlusrühmaga.
      Vaadelda tuleks kõiki nahareaktsioone ja ebatavalisi leidusid, sealhulgas induktsioonist ja nakatumise esilekutsumisest tulenevaid süsteemseid reaktsioone, ja need tuleks üles märkida Magnussoni/Klingmani (vt liidet) hindamisskaala alusel. Muude toimingute puhul, nt histopatoloogiline uuring, võib küsitavate mõjude täpsustamiseks mõõta nahavoldi paksust.
      1.5.2.   Buehleri katse
      
      1.5.2.1.   Valmistised
      
      Terveid albiinomerisigu harjutatakse laboritingimustega vähemalt viie päeva jooksul enne katse tegemist. Enne katse tegemist jagatakse loomad juhuslikkuse alusel katserühmadesse. Karvad eemaldatakse sõltuvalt kasutatavast uurimismeetodist lõikamise, raseerimise või vajaduse korral keemilise depilatsiooni teel. Tuleb olla ettevaatlik, et vältida naha hõõrdumist. Loomi kaalutakse enne katse algust ning katse lõpus.
      1.5.2.2.   Katsetingimused
      
      1.5.2.2.1.   Katseloomad
      Katseloomadena kasutatakse üldkasutatavate albiinomerisigade laboratoorseid aretusliine.
      1.5.2.2.2.   Arv ja sugu
      Kasutada võib isaseid ja/või emaseid loomi. Kui kasutatakse emasloomi, peaksid nad olema nullpaarid ja nad ei tohiks olla tiined.
      Katserühmas on vähemalt 20 looma ning võrdlusrühmas vähemalt kümme looma.
      1.5.2.2.3.   Doositasemed
      Uuritava aine kontsentratsioon iga induktsioonkokkupuute kohta peaks olema kõrgeim kontsentratsioon, mis kutsub esile kerge, kuid mitte ülemäärase ärrituse. Nakatumist esile kutsuva doosi puhul kasutatav kontsentratsioon peaks olema suurim ärritust mitte esile kutsuv doos. Vajaduse korral võib vajalikud kontsentratsioonid määrata kindlaks kahe või kolme loomaga tehtava prooviuuringute põhjal.
      Vees lahustuvate uuritavate ainete puhul on vehiikelina asjakohane kasutada vett või lahjendatud mitteärritavat pindaktiivse aine lahust. Teiste uuritavate ainete vehiikeliks sobib induktsioonkokkupuute 80 %line etanooli ja vee lahus ning nakatumise esilkutsumise puhul atsetoon.
      1.5.2.3.   Analüüsi käik
      
      1.5.2.3.1.   Induktsioon
      Katserühma 0-päev
      Üks külg puhastatakse korralikult karvadest. Katselapp peab olema sobivas vehiikelis uuritava ainega põhjalikult immutatud (vehiikeli valikut tuleks põhjendada; vedelaid uuritavaid aineid võib vajaduse korral kasutada lahjendamata kujul).
      Katselapid pannakse katsepiirkonda ning hoitakse kuus tundi oklusioonlapi või uuritavat ainet sisaldava nõu ja sobiva mähisega naha peal.
      Katselapid peavad olema oklusiivsed. Kasutamiseks sobib umbes 4–6 cm2 suurune puuvillalapike ning see võib olla ümmargune või kandiline. Oklusiooni tagamiseks soovitatakse sobivat kinnitusmehhanismi. Mähise kasutamisel võib olla vaja täiendavat kokkupuudet.
      Võrdlusrühma 0-päev
      Üks külg puhastatakse korralikult karvadest. Vehiikel asetatakse katsepinnale samal viisil kui katserühma puhul. Katselappe hoitakse kuus tundi oklusioonlapi või uuritavat ainet sisaldava nõuga ja sobiva mähisega naha peal. Kui on võimalik tõestada, et platseeboravi saavat võrdlusrühma ei ole vaja, võib kasutada varem kasutamata võrdlusrühma.
      Katse- ja võrdlusrühma 6.–8. ja 13.–15. päev
      Samas katsepiirkonnas, 6.–8. ja siis 13.–15. päevaga samal küljel viiakse läbi samasugune kokkupuude nagu 0-päeval (vajaduse korral puhastatakse nahk karvadest).
      1.5.2.3.2.   Nakatumise esilekutsumine
      Katse- ja võrdlusrühma 27.–29. päev
      Katserühma ja võrdlusrühma loomade külg, mis ei ole seni uuritava ainega kokkupuutes olnud, puhastatakse karvadest. Oklusioonlapp või nõu, milles on piisaval määral kõrgeima mitteärritava kontsentratsiooniga uuritavat ainet, pannakse katse- ja võrdlusrühma loomade selle külje tagaosale, millel ei ole veel katset tehtud.
      Vajaduse korral pannakse katse- ja võrdlusrühma loomade töötlemata külje tagaosale vehiikelit sisaldav oklusioonlapp või -nõu. Neid lappe või nõusid hoitakse sobiva mähisega kuus tundi naha vastas.
      1.5.2.3.3.   Vaatlus ja hindamine
      
                  —
               
               
                  Umbes 21 tundi pärast lapi äravõtmist puhastatakse karvadest ala, millel nakatumine esile kutsuti.
               
            
                  —
               
               
                  Umbes kolm tundi hiljem (umbes 30 tundi pärast nakatumist esile kutsuva lapi katsepiirkonda asetamist) vaadeldakse nahareaktsioone ning need märgitakse üles vastavalt liites esitatud hindamisskaalale.
               
            
                  —
               
               
                  Umbes 24 tundi pärast 30 tundi kestnud vaatlusperioodi (umbes 54 tundi pärast nakatumist esile kutsuva lapi nahapinnale asetamist) vaadeldakse nahareaktsioone uuesti ning tulemused märgitakse üles.
               
            Katse tulemusi tuleks hinnata soovitatavalt pimemeetodiga.
      Kui esimese nakatumist esile kutsuva katse tulemusi on vaja täpsustada, tuleks kaaluda vajaduse korral uue võrdlusrühmaga teise nakatumist esile kutsuva katse (st taasnakatumise katse) tegemist umbes nädal pärast esimest katset. Taasnakatumise katse võib teha ka esialgse võrdlusrühmaga.
      Kõiki nahareaktsioone ja ebatavalisi leidusid, sealhulgas induktsioonist ja nakatumise esilekutsumisest tulenevaid süsteemseid mõjusid, tuleks vaadelda ja need tuleks üles märkida Magnussoni/Klingmani (vt liidet) hindamisskaala alusel. Muude toimingute puhul, nt histopatoloogiline uuring, võib küsitavate mõjude täpsustamiseks mõõta nahavoldi paksust.
      2.   ANDMED (GPMT ja Buehleri katse)
      Andmed tuleks esitada kokkuvõtvalt tabelis, milles oleks iga looma kohta märgitud kõikidel vaatlustel täheldatud nahareaktsioonid.
      3.   ARUANDLUS (GPMT ja Buehleri katse)
      Kui enne merisigade maksimeerimise katset tehakse sõeluuring, tuleb koos katse- ja võrdlusrühmaga saadud tulemustega esitada ka katse (nt paikne lümfisõlmede uuring (LLNA), hiire kõrva turse määratlemise katse (MEST)) kirjeldus või viide sellele, sealhulgas meetodi üksikasjad.
      Katsearuanne (GMPT ja Buehleri katse)
      Katsearuanne peab võimaluse korral sisaldama järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Katseloomad:
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatud merisea aretusliin;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade arv, vanus ja sugu;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              päritolu, pidamistingimused, toit jne;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              iga looma kaal katse alguses.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              lapi asetuskoha ettevalmistamise meetod;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lapi materjali ja lappide asetamise meetodi üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              prooviuuringu tulemused ning järeldused katses kasutatavate induktsiooni- ja nakatumist esile kutsuvate kontsentratsioonide kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine ettevalmistamise, kasutamise ja eemaldamise üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vehiikeli valiku põhjendus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              induktsioonkokkupuutes ja nakatumise esilekutsumisel kasutatud vehiikeli ja uuritava aine kontsentratsioonid ning induktsiooni ja nakatumise esilekutsumise ajal kasutatud aine kogumäär.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              kokkuvõte kõige värskemate tundlikkuse ja usaldusväärsuse kontrollide tulemuste kohta (vt 1.3), sealhulgas teave kasutatud aine, kontsentratsiooni ja vehiikeli kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              iga looma kohta, sealhulgas hindamissüsteem;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              täheldatud toime iseärasuse ja määra kirjeldus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              histopatoloogilised leiud.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste üle arutlemine.
               
            
                   
               
               
                  Järeldused.
               
            4.   VIITED
      Käesolev meetod on analoogne meetodiga OECD TG 406.
      
         Liide
         TABEL
         Magnussoni/Kligmani hindamisskaala mähiskatsega esilekutsutava reaktsiooni hindamiseks
         0 = nähtavat muutust ei esine
         1 = juhuslik või laiguline punetus
         2 = mõõdukas ja kokkuvalgunud punetus
         3 = intensiivne punetus ja paistetus
      
      B.7.   TOKSILINE TOIME KORDUSDOOSI TÕTTU (28 PÄEVA) (SUUKAUDNE)
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Vt üldise sissejuhatuse B osa.
      1.2.   MÕISTED
      Vt üldise sissejuhatuse B osa.
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritav aine manustatakse erinevatele katseloomade rühmadele suu kaudu kord päevas astmeliselt suureneva koguse kaupa selliselt, et üks rühm saaks 28 päeva jooksul ainult ühte doosi. Manustamisperioodi jooksul vaadeldakse loomi põhjalikult toksilisuse märkide tuvastamiseks. Katse ajal surnud või tapetud loomad lahatakse ning katse lõppemisel tapetakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad.
      Selleks et saada võimalikult palju teavet, asetab see meetod lõpp-punktina suuremat rõhku neuroloogilistele mõjudele ning loomade põhjaliku kliinilise vaatlemise vajadusele. Meetod peaks identifitseerima neurotoksilisi kemikaale, mis võivad nõuda neurotoksilisuse osas täiendavat ja põhjalikumat uurimist. Lisaks sellele võib meetod anda teavet immunoloogiliste mõjude ja paljunemisorganeid kahjustava toksilisuse kohta.
      1.4.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.4.1.   Ettevalmistused
      Terved ja noored täiskasvanud loomad määratakse võrdlus- ja katserühmadesse juhuslikult. Puurid peaksid asetsema selliselt, et nende asukohast tingitud võimalikud mõjud oleksid minimaalsed. Loomad märgistatakse eristamise eesmärgil ning neid hoitakse vähemalt viis päeva enne katse algust puurides, et nad jõuaksid laboritingimustega kohaneda.
      Uuritav aine manustatakse kunstlikult või koos toidu või joogiveega. Suukaudse manustamise meetod sõltub uuringu eesmärgist ja aine füüsikalis-keemilistest omadustest.
      Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav aine sobivas vehiikelis. Soovitatakse, et võimaluse korral tuleks kõigepealt kasutada vesilahust/suspensiooni, seejärel õlilahust/emulsiooni (nt maisiõli) ja siis lahustamist teistes vehiikelites. Mittevesilahuseliste vehiikelite puhul peab teadma vehiikeli toksilisi omadusi. Kindlaks tuleks määrata uuritava aine stabiilsus vehiikelis.
      1.4.2.   Katsetingimused
      1.4.2.1.   Katseloomad
      Närilistest eelistatakse rotte, kuigi kasutada võib ka teisi närilisi. Katseloomadena tuleks kasutada üldkasutatavate tervete täiskasvanud laboratooriumiloomade aretusliine. Emasloomad peaksid olema nullpaarid ja nad ei tohiks olla tiined. Doseerimisega tuleks alustada võimalikult kohe pärast võõrutamist ja igal juhul enne loomade üheksanädalaseks saamist.
      Uuringu alguses peaks loomade kaaluerinevus olema minimaalne ega tohiks ületada ± 20 % kummastki soost loomade keskmisest kaalust.
      Kui korduva suukaudse manustamisega uuringule järgneb pikaajaline uuring, tuleks mõlemas uuringus kasutada samast aretusliinist ja sama päritoluga loomi.
      1.4.2.2.   Arv ja sugu
      Igal doositasemel tuleks kasutada vähemalt kümmet looma (viis emas- ja viis isaslooma). Kui osa loomi on kavas katse käigus tappa, tuleks loomade arvu enne katse lõppu tapetavate loomade arvu võrra suurendada.
      Lisaks sellele võib kümnest loomast (viis emas- ja viis isaslooma) koosnevale satelliitrühmale 28 päeva jooksul manustada suure doositaseme ning jälgida 14 päeva jooksul pärast selle manustamist, kas toksiline toime on pöörduv, püsiv või kas toksilise toime avaldumine hilineb. Kasutatakse ka kümnest võrdlusloomast (viis emas- ja viis isaslooma) koosnevat satelliitrühma.
      1.4.2.3.   Doositasemed
      Üldiselt tuleks kasutada kolme katserühma ja ühte võrdlusrühma. Võrdlusrühma loomi tuleks käsitleda samal viisil kui katserühma loomi, välja arvatud uuritava aine manustamisel. Kui uuritava aine manustamisel kasutatakse vehiikelit, tuleb võrdlusrühmale manustada vehiikelit suurimas kasutatud mahus.
      Kui muude andmete hindamise põhjal võib arvata, et päevadoosil 1 000 mg eluskaalu kg kohta ei ole eeldatavasti mõju, võib teha piirsisalduskatse. Kui vajalikke andmeid ei ole, võib kasutatavate dooside kindlaksmääramise hõlbustamiseks teha doosipiirkonna määramise katse.
      Doosimäärade valimisel tuleks arvesse võtta kõiki uuritava aine või sellega seotud ainete toksilisust käsitlevaid ja (toksikoloogilis)kineetilisi andmeid. Toksilise toime esilekutsumise eesmärgil tuleks valida kõrgeim doositase, kuid vältida tuleks surma või tõsiseid kannatusi esile kutsuvat doositaset. Seejärel tuleks doosist tuleneva reaktsiooni ja madalaimal doositasemel täheldatava kahjuliku toimeta doosi (NOAEL) demonstreerimiseks valida aste-astmelt vähenevad doositasemed. Kahanevate doositasemete puhul on tavaliselt optimaalsed kahe- kuni neljakordsed intervallid ja väga pikkadele intervallidele (nt kui koefitsient on suurem kui 10) eelistatakse tavaliselt neljanda katserühma lisamist.
      Ainete puhul, mida manustatakse toidu või joogiveega, on oluline tagada, et toiduga kasutatavad uuritava aine kogused ei häiriks tavalist toitumise või joogivee tasakaalu. Kui uuritavat ainet manustatakse toiduga, võib kasutada kas püsivat kontsentratsiooni toidus (ppm) või püsiva suurusega doosi vastavalt looma kehakaalule; tuleks täpsustada, millist võimalust kasutatakse. Kui ainet manustatakse kunstlikult, tuleks doos anda igal päeval samal ajal ning seda tuleks vajaduse korral kohandada, et looma kehakaalu suhtes säiliks püsiv doositase.
      Kui pärast kordusdoosi uuringut tehakse pikaajaline uuring, tuleks mõlema uuringu puhul kasutada samasugust toitu.
      1.4.2.4.   Piirsisalduskatse
      Kui katses ei tuvastata käesolevas uuringus kirjeldatud menetlusega päevadoosil vähemalt 1 000 mg kehakaalu kg kohta, või uuritava aine manustamisel (kehakaalu määramistele tuginedes) protsentuaalselt samal määral söögi või toidu kaudu, märkimisväärset toksilist mõju ja kui toksilisus ei ole samalaadse struktuuriga ainete osas saadud andmete põhjal ootuspärane, ei loeta täielikku kolme doositasemega uuringut vajalikuks. Võib teha piirsisalduskatse, välja arvatud juhul, kui inimese kokkupuude viitab vajadusele kasutada suuremat doositaset.
      1.4.2.5.   Vaatlusperiood
      Vaatlusperiood peaks olema 28 päeva. Satelliitrühma kuuluvatele loomadele, kelle puhul tehakse järelvaatlus, ei tohiks uuritavat ainet toksilise toime hilinenud ilmnemise, selle püsimise või sellest toibumise tuvastamise eesmärgil veel vähemalt 14 päeva jooksul manustada.
      1.4.3.   Analüüsi käik
      Loomadele doseeritakse uuritavat ainet seitsmel päeval nädalas ja 28 päeva jooksul; nädalas viiepäevase doseerimismeetodi kasutamist tuleb põhjendada. Kui uuritavat ainet manustatakse kunstlikult, peaks seda tegema loomadele ühe doosi kaupa, kasutades maosondi või sobivat intubatsioonikanüüli. Maksimaalne vedelikumaht, mida võib korraga loomale manustada, sõltub katselooma suurusest. Maht ei tohiks ületada 1 ml kehakaalu 100 g kohta, välja arvatud vesilahuste puhul, mille puhul on lubatud 2 ml kehakaalu 100 g kohta. Välja arvatud ärritavate või söövitavate ainete puhul, millel on suurematel kontsentratsioonidel tavaliselt halvem toime, tuleks katsemahu varieeruvus muuta minimaalseks sellega, et kõikidel doositasemetel kohandatakse ühesuguse mahu tagamiseks kontsentratsiooni.
      1.4.3.1.   Üldised märkused
      Üldisi kliinilisi vaatlusi tuleks teha vähemalt kord päevas, soovitavalt iga kord samal ajal ning võttes arvesse, et oodatud tulemusi esineb kõige rohkem pärast doseerimist. Üles tuleks märkida loomade tervislik seisund. Vähemalt kaks korda päevas tuleks kontrollida, kas loomad on haigestunud või surnud. Haigestunud loomad ja loomad, kellel esineb suurt stressi või valu, eemaldatakse katsest, tapetakse humaanselt ja lahatakse.
      Kõikide loomade puhul tuleks üksikasjalik kliiniline vaatlus teha enne seda, kui loomale esimest korda uuritavat ainet manustatakse (selleks, et oleks võimalik teha võrdlusi ühe looma põhjal), ning seejärel vähemalt kord nädalas. Need vaatlused tuleks teha väljaspool puuri, selleks ettenähtud kohas ja eelistatavalt iga kord samal ajal. Tulemused tuleks hoolikalt üles märkida, kasutades selleks võimaluse korral katselabori poolt fikseeritud hindamissüsteeme. Tuleks püüda tagada, et katsetingimuste varieeruvus oleks võimalikult minimaalne ja et eelistatult poleks vaatlejad uuritava aine manustamisest teadlikud. Tuvastatud märgid peaksid hõlmama lisaks muule muutusi nahal, karvades, silmades, limaskestas, ekstraktide ja eritiste esinemist ning autonoomseid toiminguid (nt pisaravool, piloerektsioon, pupillide suurus, ebaregulaarne hingamine). Samuti tuleks üles märkida muudatused kõnnakus, kehaasendis ja selles, kuidas loomad endaga ümberkäimisele reageerivad, samuti kloonilised või toonilised liigutused, stereotüübid (nt ülemäärane karvastiku hooldus, ringiratast keerlemine) või kummaline käitumine (nt enese vigastamine, tagurpidi kõndimine).
      Neljandal kokkupuutenädalal tuleks hinnata sensoorseid reaktsioone erinevat liiki ärritustele (nt kuulmis-, nägemis- ja propriotseptiivsetele ärritajatele), samuti haardetugevust ja motoorset tegevust. Võimalike meetodite täpsemad üksikasjad on esitatud kirjanduse loetelus (vt üldise sissejuhatuse B osa).
      Neljanda kokkupuutenädala funktsionaalsed vaatlused võib ära jätta juhul, kui uuring tehakse subkroonilise toksilisuse 90päevase uuringu eeluuringuna. Sellisel juhul tuleks funktsionaalsed vaatlused hõlmata käesolevasse järeluuringusse. Teiselt poolt võivad kordusdoosi uuringu käigus saadud funktsionaalsete vaatluste andmed hõlbustada järgneva subkroonilise uuringu jaoks doositasemete valimist.
      Erandkorras võib funktsionaalsed vaatlused ära jätta rühmade puhul, millel esineb toksilisuse märke niisugusel määral, et see takistaks märkimisväärselt funktsionaalsete katsete tegemist.
      1.4.3.2.   Kehakaal ja toidu/vee tarbimine
      Kõiki loomi tuleks kaaluda vähemalt kord nädalas. Toidu ja vee tarbimist tuleks mõõta vähemalt kord nädalas. Kui uuritavat ainet manustatakse joogiveega, tuleks vee tarbimist samuti vähemalt kord nädalas mõõta.
      1.4.3.3.   Hematoloogia
      Katseperioodi lõpus tuleks teha järgmised hematoloogilised uuringud: hematokrit, hemoglobiini kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, leukotsüütide üld- ja diferentseeritud arv, vereliistakute arv ja vere hüübimisaja/hüübimisvõime mõõtmine.
      Vereproovid tuleks võtta kindlaksmääratud kohast ja vahetult enne loomade tapmist või selle ajal ning neid tuleks säilitada sobivates tingimustes.
      1.4.3.4.   Kliiniline biokeemia
      Kliinilised biokeemilised analüüsid peamiste toksiliste mõjude uurimiseks kudedes ja eelkõige nende toime uurimisel neerudele ja maksale tuleks teha vereproovidega, mis on võetud loomadelt vahetult enne tapmist või selle ajal (välja arvatud loomad, kes leiti surevana ja/või tapeti katse ajal). Loomadele soovitatakse vereproovi võtmisele eelneval ööl süüa mitte anda (2). Plasma- või seerumiuuringud peavad hõlmama naatriumi, kaaliumi, glükoosi, üldkolesterooli, karbamiidi, kreatiniini, üldvalku ja albumiini, vähemalt kahte hepatotsellulaarsele toimele osutavat ensüümi (näiteks alaniinaminotransferaas, aspartaataminotransferaas, aluseline fosfataas, gamma-glutamüültranspeptidaas, ja sorbitooldehüdrogenaas). Muude maksaensüümide või muud päritolu ensüümide ja sapphapete mõõtmised võivad teatavatel tingimustel anda kasulikku teavet.
      Alternatiivselt on uuringu viimasel nädalal võimalik loomadelt uriiniproovide kogumise teel teha järgmisi uriinianalüüse: välised tunnused, maht, osmolaalsus või suhteline tihedus, pH, valgud, glükoos ja veri/vererakud.
      Lisaks sellele tuleks uurida, kas seerumis on üldistele koekahjustustele osutavaid markereid. Muud määramised, mis tuleks teha juhul, kui uuritava aine teadaolevad omadused võivad mõjutada või mõjutavad eeldatavasti sellega seotud ainevahetuse profiili, hõlmavad kaltsiumi, fosfaati, triglütseriide, mis on määratud enne sööki, teatavaid hormoone, methemoglobiini ja koliinesteraasi. Need on vaja määrata teatavatesse klassidesse kuuluvate ainete puhul või konkreetsete juhtude põhiselt.
      Üldiselt on vaja paindlikku lähenemisviisi, mis sõltub vastava aine liigist ja selle täheldatud ja/või oodatud toimest.
      Kui varasemad lähteandmed ei ole piisavad, tuleks enne doseerimise alustamist määrata hematoloogilised ja kliinilis-biokeemilised muutujad.
      1.4.3.5.   Täielik lahang
      Kõik uuringusse kaasatud loomad läbivad täieliku, põhjaliku lahkamise, milles uuritakse põhjalikult keha välispinda, kõiki haavu, kolju-, rinna- ja kõhuõõnt ja nende sisu. Kõikide loomade maksalt, neerudelt, neerupealsetelt, munanditelt, munandimanustelt, harknäärmelt, põrnalt, ajult ja südamelt tuleb vajaduse korral kõik koed eemaldada ning nende märgkaal määratakse kuivamise vältimiseks võimalikult kiiresti pärast dissekteerimist.
      Järgmisi kudesid tuleks hoida koetüübi ja kavandatava histopatoloogilise uuringu seisukohast kõige sobivamas fiksaatoris: kõik silmaga täheldatavad vigastused, aju (olulised piirkonnad, sealhulgas suuraju, väikeaju, ajusild), seljaaju, magu, jämesool ja peensool (sealhulgas Peyeri naastud), maks, neerud, neerupealsed, põrn, süda, harknääre, kilpnääre, hingetoru ja kopsud (kopsud pumbatakse fiksaatorit täis ja pannakse fiksaatorisse), sugunäärmed, suguelundid (nt emakas, eesnääre), põis, lümfisõlmed (eelistatult üks lümfisõlm, mis hõlmab manustamiskohta, ja teine lümfisõlm, mis on manustamiskohast eemal, et anda teavet süsteemse toime kohta), perifeerne närv (istmiku- või sääreluu närv), mis on eelistatult lihase lähedal, ning osa luuüdi (või alternatiivselt väike kogus toorest luuüdi). Kliinilised ja muud leiud võivad osutada vajadusele uurida ka teisi kudesid. Säilitada tuleks ka teised organid, mis on uuritava aine teadaolevatest omadustest tulenevalt tõenäoliselt sihtorganid.
      1.4.3.6.   Histopatoloogiline uuring
      Kõikide võrdlusrühma ja kõrge doosiga rühmade loomade säilitatud organeid ja kudesid tuleks histopatoloogiliselt põhjalikult uurida. Histopatoloogilised uuringud tuleks teha ka teiste doosirühmade loomade puhul juhul, kui kõrge doosiga rühma osas tuvastatakse manustamisega seotud muudatusi.
      Uurida tuleks kõiki silmaga täheldatavaid kahjustusi.
      Kui kasutatakse satelliitrühma, tuleks histopatoloogiline uuring teha nende kudede ja organite puhul, millel esineb samasugune toime kui katserühma puhul.
      2.   ANDMED
      Loomade kohta tuleks esitada andmed individuaalselt. Lisaks sellele tuleks kõik andmed koondada tabelisse, milles oleks iga katserühma kohta märgitud loomade arv katse alguses, katse ajal surnud või humaansetel põhjustel tapetud loomade arv, toksiliste märkidega loomade arv, täheldatud toksiliste märkide kirjeldus, sealhulgas toksilise toime ilmnemine, kestus, raskusaste, kahjustustega loomade arv, kahjustuste liik ja iga liiki kahjustuse kohta loomade protsent, kellel neid esines.
      Võimaluse korral tuleks numbrilisi tulemusi hinnata asjakohaste ja üldiselt tunnustatud statistilise meetodiga. Statistilised meetodid tuleks valida uuringu kavandamise etapis.
      3.   ARUANDLUS
      KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab võimaluse korral sisaldama järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Katseloomad:
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatud liik/aretusliin;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade arv, vanus ja sugu;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              päritolu, pidamistingimused, toit jne;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              iga looma kaal katse alguses, pärast iga nädalat ning katse lõpus.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              vehiikeli valiku põhjendamine, kui vehiikeliks ei ole vesi;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              doositaseme valimise põhjendus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikasjad uuritava aine koostise/toiduvalmistise kohta, valmistises saavutatud kontsentratsiooni, stabiilsuse ja homogeensuse kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine manustamise üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vajaduse korral toidus/joogivees oleva uuritava aine määra (ppm) muundamine tegelikuks päevadoosiks (mg kehakaalu kg kohta);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              eluskaal/muutused eluskaalus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toidu ja vajaduse korral vee tarbimine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toksilise reaktsiooni andmed vastavalt looma soole ja doositasemele, sealhulgas toksilisuse märgid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kliiniliste vaatluste iseloom, raskusaste ja kestus (pöördumatu või mitte);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sensoorse aktiivsuse, haardetugevuse ja motoorse tegevuse hindamine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              hematoloogilised katsed ja vastavate põhijoonte väärtused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kliinilise biokeemia katsed ja vastavate põhijoonte väärtused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kehakaal tapmise ajal ja organite kaal;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lahkamise tulemused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              võimaluse korral andmed imendumise kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vajaduse korral tulemuste statistiline töötlemine.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste üle arutlemine.
               
            
                   
               
               
                  Järeldused.
               
            4.   VIITED
      Käesolev meetod on analoogne meetodiga OECD TG 407.
      B.8.   KORDUSDOOSI MÜRGISUS (28 PÄEVA, SISSEHINGAMISEL)
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Katse tegemiseks on kasulik teada aine osakeste suurusjaotust, aururõhku, sulamistemperatuuri, keemistemperatuuri, leekpunkti ja (vajaduse korral) plahvatusohtlikkust.
      Vt ka B osa üldist sissejuhatust (A).
      1.2.   MÕISTE
      Vt B osa üldist sissejuhatust (B).
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Mitu katseloomade rühma viiakse 28 päeva jooksul iga päev kindlaks ajaks kokkupuutesse testaine astmeliste kontsentratsioonidega nii, et üks rühm puutub kokku ühesuguse kontsentratsiooniga. Kui testainele lisatakse atmosfääris sobiva kontsentratsiooni saavutamiseks kandjat, tuleks kasutada kandja kontrollrühma. Manustamisperioodil jälgitakse loomi iga päev, et kontrollida mürgistusnähtude ilmnemist. Katse jooksul surnud loomad lahatakse, katse lõpus surmatakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Puuduvad.
      1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Ettevalmistused
      Loomi hoitakse enne katset vähemalt viis päeva katsele vastavates pidamis- ja söötmistingimustes. Noored terved katseloomad randomiseeritakse enne katset ja jagatakse vajalikku arvu katserühmadesse. Sobiva kontsentratsiooni saavutamiseks atmosfääris võib testainele lisada vajaduse korral sobivat kandjat. Kui annustamise lihtsustamiseks kasutatakse kandjat või muid lisandeid, peab olema kindel, et need ei põhjusta mürgistusnähte. Vajaduse korral võib kasutada varasemaid andmeid.
      1.6.2.   Katsetingimused
      1.6.2.1.   Katseloomad
      Vastunäidustuste puudumisel on eelistatavaks liigiks rott. Kasutada tuleks tavapäraseid laboritöös kasutatavaid liine ja noori terveid loomi.
      Kasutatavate katseloomade masside erinevus katse alguses ei tohiks ületada ± 20 % vastavast keskmisest.
      1.6.2.2.   Katseloomade arv ja sugu
      Igas katserühmas peaks olema vähemalt kümme looma (viis emas- ja viis isaslooma). Emasloomad ei tohiks olla poeginud ega tiined. Kui uuringu jooksul plaanitakse loomi surmata, tuleks loomade arvu enne uuringu lõppu surmamisele määratud loomade arvu võrra suurendada. Lisaks võib testaine kõrgeima kontsentratsiooniga mõjutada 28 päeva jooksul üht kümne loomaga (viis looma kummastki soost) satelliitrühma ja jälgida sellel 14 päeva jooksul pärast kokkupuudet mürgistusnähtude pöörduvust, püsivust või hilist avaldumist. Kasutatakse ka üht kümne kontroll-loomaga (viis looma kummastki soost) satelliitrühma.
      1.6.2.3.   Kokkupuutekontsentratsioon
      Kasutatakse vähemalt kolme kontsentratsiooni ja kontrolli või kandja kasutamisel kandja kontrolli (mis vastab kandja kontsentratsioonile testaine kõrgeimal kontsentratsioonitasemel). Kui testainega töötlemine välja arvata, tuleks kontrollrühma loomi kohelda samamoodi nagu katserühma loomi. Kõrgeim kontsentratsioon peaks põhjustama mürgistusnähte, kuid ei tohiks põhjustada suremust või siis peaks suremus olema väike. Väikseima kontsentratsiooni puhul ei tohiks mürgisust ilmneda. Kasutuskõlbuliku hinnangulise inimkokkupuute kontsentratsiooni olemasolul peaks madalaim kontsentratsioon olema sellest kõrgem. Ideaaljuhul peaks keskmine kontsentratsioon põhjustama minimaalseid täheldatavaid mürgistusnähte. Rohkem kui ühe vahepealse kontsentratsiooni kasutamisel peaksid kontsentratsioonitasemed jaotuma nii, et tekkivad mürgistusnähud jaotuvad astmeliselt. Tulemuste usaldusväärse hindamise võimaldamiseks peaks suremus madala ja vahepealsete annusemääradega ning kontrollrühmades, kui seda esineb, olema madal.
      1.6.2.4.   Kokkupuute kestus
      Igapäevase kokkupuuteaja kestus peaks olema kuus tundi, kuid spetsiifiliste vajaduste puhul võib vajalik olla teistsugune kestus.
      1.6.2.5.   Seadmed
      Loomkatsetes tuleks kasutada hingamisseadet, mis suudab tagada dünaamilise õhuvoo vähemalt 12 täieliku õhuvahetusega tunnis ning tagab küllaldase hapnikusisalduse ja homogeense kokkupuutekeskkonna. Kambri kasutamisel peaks selle ehitus piirama katseloomade ühte kohta kogunemist ja tagama võimalikult hea inhalatoorse kokkupuute testainega. Stabiilse kambriatmosfääri tagamiseks ei tohiks katseloomade „maht” üldjuhul ületada 5 % kambri üldmahust. Kasutada võib väliseid hingamiselundeid, ainult pead või kogu keha haaravat individuaalset kambrit; esimesed kaks piiravad testaine sattumist organismi muid teid pidi.
      1.6.2.6.   Vaatlusperiood
      Kõigil katseloomadel tuleb nii kokkupuute- kui ka taastumisperioodil iga päev jälgida mürgistusnähtude ilmnemist. Mürgistusnähtude ilmnemise ja kadumise ning surma aeg on väga olulised ning tuleks registreerida.
      1.6.3.   Katse käik
      Loomad viiakse testainega kokkupuutesse 28päevase perioodi jooksul kord päevas 5–7 päeval nädalas. Mis tahes satelliitrühma loomadele, kellega planeeritakse hilisemaid vaatlusi, ei tohiks järgneva 14 päeva jooksul ainet manustada, et kontrollida mürgistusnähtudest paranemist või nende püsivust. Katsetemperatuuri tuleks hoida 22 ± 3 oC juures.
      Ideaaljuhul tuleks suhteline õhuniiskus hoida 30 % ja 70 % vahel, kuid mõningatel juhtudel (nt katsetes mõnede aerosoolidega) ei saa seda rakendada. Väikese alarõhu (≤ 5 mm H2O) kasutamine kambris välistab testaine lekke ümbritsevasse keskkonda. Süüa ja juua kokkupuute ajal anda ei tohiks.
      Kasutada tuleks analüütilise kontsentratsioonijuhtimissüsteemiga dünaamilist hingamisseadet. Sobivate kokkupuutekontsentratsioonide leidmiseks on soovitatav teha eelkatse. Õhu voolukiirust tuleks reguleerida nii, et tingimused on kogu kokkupuutekambri ulatuses homogeensed. Seade peaks võimalikult kiiresti saavutama stabiilsed kokkupuutetingimused.
      Mõõta või kontrollida tuleb järgmist:
      
                  a)
               
               
                  õhu voolukiirust (pidevalt);
               
            
                  b)
               
               
                  testaine tegelikku kontsentratsiooni hingamistsoonis. Igapäevase kokkupuute ajal ei tohiks kontsentratsioon keskmise suhtes kõikuda rohkem kui ± 15 %. Mõnede aerosoolide puhul ei ole nii täpne reguleerimine siiski võimalik, sellisel juhul on lubatav suurem kõikumisvahemik. Kogu katse kestel tuleks kontsentratsioone päevast päeva võimalikult konstantsena hoida. Aerosoolide puhul tuleks igas katserühmas vähemalt üks kord nädalas kontrollida osakeste suurusi;
               
            
                  c)
               
               
                  temperatuuri ja õhuniiskust, võimaluse korral pidevalt.
               
            Kokkupuute ajal ja järel loomi jälgitakse ja vaatlustulemused registreeritakse süstemaatiliselt, iga looma kohta tuleb pidada eraldi arvestust. Kõiki loomi tuleb iga päev jälgida ja registreerida kõik mürgistusnähud ja nende ilmnemise aeg, raskusaste ja kestus. Vaadelda tuleks muutusi nii nahas ja karvkattes, silmades ja limaskestades kui ka hingamis- ja vereringeelundkonnas, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somato-motoorses aktiivsuses ja käitumises. Loomi tuleks iga nädal kaaluda. Soovitatav on iga nädal mõõta ka toidu tarbimist. Loomi tuleb regulaarselt vaadelda, et võimaluse piirides vältida loomade kadu sellistel põhjustel nagu kannibalism, kudede autolüüs või loomade kaotsiminek nende ümberpaigutamisel. Uuringuperioodi lõpus surmatakse ja lahatakse kõik ellujäänud loomad, v.a satelliitrühma loomad. Surevad ja tõsistes kannatustes või valudes loomad tuleks avastamisel kõrvaldada, humaanselt surmata ja lahata.
      Kõigile loomadele, sh kontrollrühma loomadele, tehakse katseperioodi lõpus järgmine uuring:
      
                  i)
               
               
                  hematoloogia, sealhulgas vähemalt hematokrit, hemoglobiini kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, leukotsüütide üld- ja suhtarv ja hüübimisvõime;
               
            
                  ii)
               
               
                  kliiniline verebiokeemia, sh vähemalt üks maksa ja neerude funktsiooni parameeter: alaniini aminotransferaas (varem tuntud glutamaat-püruvaadi transaminaasina), seerumi aspartaadi aminotransferaas (varem tuntud glutamaat-oksaloatsetaadi transaminaasina), kusiainelämmastik, albumiin, kreatiniin, üldbilirubiin ja seerumi üldvalk.
               
            Muud analüüsinäidud, mida võib pädeva toksikoloogilise hinnangu andmiseks vaja minna, on järgmised: kaltsium, fosfor, kloriid, naatrium, kaalium, veresuhkur (tühja kõhuga), lipiidianalüüs, hormoonid, happe/aluse tasakaal, methemoglobiin ja koliini esteraasi aktiivsus.
      Vajaduse korral võib vaadeldavate mürgistusnähtude põhjalikumaks uurimiseks kasutada täiendavaid kliinilisi biokeemilisi näitajaid.
      1.6.3.1.   Üldlahang
      Kõik katseloomad tuleks üleni lahata. Vähemalt maks, neerud, neerupealised, kopsud ja munandid tuleks kohe pärast lahti lõikamist kuivamise vältimiseks märjalt kaaluda. Elundid ja koed (hingamisteed, maks, neerud, põrn, munandid, neerupealised, süda ja mis tahes muud makropatoloogiliste kahjustustega või muutunud suurusega elundid) tuleks säilitada sobivas keskkonnas võimaliku hilisema histopatoloogilise uuringu jaoks. Kopsud tuleks eemaldada tervelt, kaaluda ja töödelda koestruktuuri säilitamiseks sobiva fiksaatoriga.
      1.6.3.2.   Histopatoloogiline uuring
      Kõrgeima kontsentratsiooniga rühma ja kontrollrühma(de) loomade säilitatud elundeid ja kudesid tuleks histoloogiliselt uurida. Kõrgeima annusega rühmal testainega seostatavate kahjustustega elundeid ja kudesid tuleks kontrollida ka kõigil madalama annusega rühmadel. Võimaliku satelliitrühma loomi tuleks samuti histoloogiliselt uurida, pöörates eriti tähelepanu nendele elunditele ja kudedele, milles muudes katserühmades esines muutusi.
      2.   ANDMED
      Andmed tuleks esitada kokkuvõtliku tabelina, mis iga katserühma puhul näitab katseloomade arvu selle katse algul ja igat tüüpi kahjustustega loomade arvu.
      Kõiki vaatlustulemusi tuleks hinnata sobiva statistilise meetodi abil. Kasutada võib kõiki tunnustatud statistilisi meetodeid.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  liiki, liini, päritolu, keskkonnatingimusi, toidusedelit jne;
               
            
                  —
               
               
                  katsetingimusi:
                  katseseadme kirjeldust, sealhulgas selle ehitust, tüüpi, mõõtmeid, õhuallikat, aerosoolide tekitamise seadet, kliima reguleerimise meetodit, väljuva õhu töötlemise meetodit ja katsekambri kasutamisel loomade katsekambris pidamise meetodit. Kirjeldada tuleks temperatuuri, õhuniiskuse ja vajaduse korral aerosooli kontsentratsiooni ja osakeste suurusjaotuse määramise seadmeid.
                  Andmed kokkupuute kohta
                  Andmed tuleks esitada koondtabelina koos vastavate keskmiste ja hajuvuse näitajatega (nt standardhälve) ning võimaluse korral peaksid andmed sisaldama järgmist:
                  
                              a)
                           
                           
                              õhu voolukiirusi hingamisseadmes;
                           
                        
                              b)
                           
                           
                              temperatuuri ja õhuniiskust;
                           
                        
                              c)
                           
                           
                              nimikontsentratsioone (hingamisseadmesse viidud testaine summaarne kogus jagatuna õhu ruumalaga);
                           
                        
                              d)
                           
                           
                              kandeaine kasutamisel viimase iseloomu;
                           
                        
                              e)
                           
                           
                              tegelikke kontsentratsioone katse hingamistsoonis;
                           
                        
                              f)
                           
                           
                              masskeskmist aerodünaamilist diameetrit (MMAD) ja geomeetrilist standardhälvet (GSD):
                           
                        
            
                  —
               
               
                  mürgistusnähtude andmeid soo ja kontsentratsiooni järgi;
               
            
                  —
               
               
                  surmahetke uuringu aega või seda, kas loomad jäid kuni surmamiseni ellu;
               
            
                  —
               
               
                  mürgistus- või muid nähte; toimeta annust;
               
            
                  —
               
               
                  iga kõrvalekalde täheldamise aega ja kõrvalekalde hilisemat kulgu;
               
            
                  —
               
               
                  sööda ja kehamassi andmeid;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud hematoloogilisi analüüse ja nende tulemusi;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud kliinilise biokeemia analüüse ja nende tulemusi;
               
            
                  —
               
               
                  lahkamistulemusi;
               
            
                  —
               
               
                  kõigi histopatoloogiliste leidude üksikasjalikku kirjeldust;
               
            
                  —
               
               
                  võimaluse korral tulemuste statistilist analüüsi;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste analüüsi;
               
            
                  —
               
               
                  järeldusi.
               
            3.2.   HINDAMINE JA JÄRELDUSED
      Vt B osa üldist sissejuhatust (D).
      4.   VIITED
      Vt B osa üldist sissejuhatust (E).
      B.9.   KORDUSDOOSI MÜRGISUS (28 PÄEVA, NAHAKAUDNE)
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Vt B osa üldist sissejuhatust (A).
      1.2.   MÕISTED
      Vt B osa üldist sissejuhatust (B).
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Testainet kantakse 28 päeva jooksul iga päev astmeliste annustena mitme rühma katseloomade nahale nii, et üks rühm saab ühesuguse annuse. Manustamisperioodil jälgitakse loomi iga päev, et kontrollida mürgistusnähtude ilmnemist. Katse jooksul surnud loomad lahatakse, katse lõpus surmatakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad.
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Puuduvad.
      1.6.   MEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Ettevalmistused
      Loomi hoitakse enne katset vähemalt viis päeva katsele vastavatel pidamis- ja söötmistingimustel. Noored terved katseloomad randomiseeritakse enne katset ja jagatakse katse- ja kontrollrühmadesse. Vahetult enne katset eemaldatakse pügamise teel katselooma keha seljaosalt karvkate. Kasutada võib ka raseerimist, seda tuleks teha 24 tundi enne katset. Korduspügamist või -raseerimist on tavaliselt vaja ligikaudu nädalaste vahedega. Karvkatte pügamisel või raseerimisel tuleb vältida naha marrastamist. Testaine nahale kandmiseks tuleb vabastada vähemalt 10 % kehapinnast. Vabastatava ala ja katte mõõtmete valikul tuleks arvesse võtta looma massi. Tahkete, vajaduse korral peenestatud ainete puhul tuleks testainet nahaga hea kokkupuute saavutamiseks niisutada piisava koguse vee või sobiva kandjaga. Vedelaid testaineid kasutatakse üldjuhul lahjendamata kujul. Testainet kantakse nahale kord päevas, 5–7 päeval nädalas.
      1.6.2.   Katsetingimused
      1.6.2.1.   Katseloomad
      Kasutada võib täiskasvanud rotti, küülikut või merisiga. Kasutada võib ka muid liike, kuid seda tuleb põhjendada.
      Kasutatavate katseloomade masside erinevus katse alguses ei tohiks ületada ± 20 % vastavast keskmisest.
      1.6.2.2.   Katseloomade arv ja sugu
      Iga uuritavat annusemäära katsetakse vähemalt kümnel terve nahaga loomal (viiel emas- ja viiel isasloomal). Emasloomad ei tohiks olla poeginud ega tiined. Kui uuringu jooksul plaanitakse loomi surmata, tuleks loomade arvu enne uuringu lõppu surmamisele määratud loomade arvu võrra suurendada. Lisaks võib testaine kõrgeima annusega mõjutada 28 päeva jooksul üht kümne loomaga (viis looma kummastki soost) satelliitrühma ja jälgida sellel 14 päeva jooksul pärast kokkupuudet mürgistusnähtude pöörduvust, püsivust või hilist avaldumist. Kasutatakse ka üht kümne kontroll-loomaga (viis looma kummastki soost) satelliitrühma.
      1.6.2.3.   Annused
      Kasutatakse vähemalt kolme annusemäära ja kontrolli või kandja kasutamisel kandja kontrolli. Kokkupuuteperioodi kestus peaks olema vähemalt kuus tundi päevas. Testainet tuleks peale kanda iga päev sarnastel kellaaegadel ja annuseid järk-järgult (üks või kaks korda nädalas) reguleerida, et annus jääks looma kehamassi suhtes konstantseks. Testainega töötlemine välja arvatud, tuleks kontrollrühma loomi kohelda samamoodi nagu katserühma loomi. Kui annustamise lihtsustamiseks kasutatakse kandjat, tuleks kandja kontrollrühmale manustada kandjat analoogselt katserühmaga ja nad peaksid saama sama koguse kandjat nagu kõrgeima annusemääraga rühm. Kõrgeim annus peaks põhjustama mürgistusnähte, kuid ei tohiks põhjustada suremust või siis peaks suremus olema väike. Väikseima doosi puhul ei tohiks mürgisust ilmneda. Kasutuskõlbliku hinnangulise inimkokkupuute annuse olemasolul peaks madalaim annus olema sellest kõrgem. Ideaaljuhul peaks keskmine annusemäär põhjustama minimaalseid täheldatavaid mürgistusnähte. Rohkem kui ühe vahepealse annuse kasutamisel peaks annusemäärad jaotuma nii, et tekkivad mürgistusnähud jaotuvad astmeliselt. Tulemuste usaldusväärse hindamise võimaldamiseks peaks suremus madala ja vahepealsete annusemääradega ning kontrollrühmades olema madal.
      Kui testaine nahale kandmine toob kaasa tugeva nahaärrituse, tuleks kontsentratsioone vähendada; selle tulemuseks võib olla muude mürgistusnähtude vähenemine või puudumine kõrgeima annusemäära kasutamisel. Lisaks võib tõsiste nahakahjustuste ilmnemisel olla vaja uuring lõpetada ja teha madalamatel kontsentratsioonidel uus uuring.
      1.6.2.4.   Piirsisalduskatse
      Kui eelkatse annusemääraga 1 000 mg/kg või kõrgema, võimaliku teadaoleva inimkokkupuute kontsentratsiooniga seotud annusemääraga ei kutsu esile mürgistusnähte, võib edasise kontrollimise lugeda tarbetuks.
      1.6.2.5.   Vaatlusperiood
      Kõigil katseloomadel tuleb iga päev jälgida mürgistusnähtude ilmnemist. Mürgistusnähtude ilmnemise ja kadumise ning surma aeg on väga olulised ning tuleks registreerida.
      1.6.3.   Katse käik
      Loomi tuleks puurides pidada ühekaupa. Testainet kantakse loomade nahale 28 päeva jooksul, ideaaljuhul 7 päeval nädalas. Mis tahes satelliitrühma loomadele, kellega planeeritakse hilisemaid vaatlusi, ei tohiks järgneva 14 päeva jooksul ainet manustada, et kontrollida mürgistusnähtudest paranemist või nende püsivust. Kokkupuute kestus peaks olema vähemalt kuus tundi päevas.
      Testaine tuleks kanda ühtlaselt alale, mis moodustab ligikaudu 10 % kogu kehapinnast. Väga mürgiste ainete puhul võib katta väiksema osa kehapinnast, kuid võimalikult suur osa pinnast tuleks katta võimalikult õhukese ja ühtlase kihiga.
      Testainet tuleks kokkupuuteperioodi jooksul hoida poorse marlisideme ja mitteärritava kleeplindi abil naha vastas. Manustamiskoht tuleks veel lisaks sobival moel kinni katta, et hoida marlisidet ja testainet paigal ja vältida testaine allaneelamist katselooma poolt. Et vältida testaine allaneelamist, võib kasutada looma liikuvust piiravaid vahendeid, kuid looma täielikku fikseerimist ei soovitata. Kasutada võib ka kaitsekraed.
      Kokkupuuteperioodi lõpus tuleks testaine jääk nahalt võimaluse korral veega või muu sobiva puhastusmeetodi abil eemaldada.
      Kõiki loomi tuleb iga päev jälgida ja registreerida kõik mürgistusnähud ja nende ilmnemise aeg, raskusaste ja kestus. Vaadelda tuleks muutusi nii nahas ja karvkattes, silmades ja limaskestades kui ka hingamis- ja vereringeelundkonnas, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomotoorses aktiivsuses ja käitumises. Loomi tuleks iga nädal kaaluda. Soovitatav on iga nädal mõõta ka toidu tarbimist. Loomi tuleb regulaarselt vaadelda, et võimaluse piirides vältida loomade kadu sellistel põhjustel nagu kannibalism, kudede autolüüs või loomade kaotsiminek nende ümberpaigutamisel. Uuringuperioodi lõpus surmatakse ja lahatakse kõik ellujäänud loomad, v.a satelliitrühma loomad. Surevad ja tõsistes kannatustes või valudes loomad tuleks avastamisel kõrvaldada, humaanselt surmata ja lahata.
      Kõigile loomadele, sh kontrollrühma loomadele, tehakse katseperioodi lõpus järgmine uuring:
      
                  1)
               
               
                  hematoloogia, sealhulgas vähemalt hematokrit, hemoglobiini kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, leukotsüütide üld- ja suhtarv ja hüübimisvõime;
               
            
                  2)
               
               
                  kliiniline verebiokeemia, sh vähemalt üks maksa ja neerude funktsiooni parameeter: alaniini aminotransferaas (varem tuntud glutamaatpüruvaadi transaminaasina), seerumi aspartaadi aminotransferaas (varem tuntud glutamaatoksaloatsetaadi transaminaasina, kusiainelämmastik, albumiin, kreatiniin, üldbilirubiin ja seerumi üldvalk.
               
            Muud analüüsinäidud, mida võib pädeva toksikoloogilise hinnangu andmiseks vaja minna, on järgmised: kaltsium, fosfor, kloriid, naatrium, kaalium, veresuhkur (tühja kõhuga), lipiidianalüüs, hormoonid, happe/aluse tasakaal, methemoglobiin ja koluni esteraasi aktiivsus.
      Vajaduse korral võib vaadeldava toime põhjalikumaks uurimiseks kasutada täiendavaid kliinilisi biokeemilisi näitajaid.
      1.6.4.   Üldlahang
      Kõik katseloomad tuleks üleni lahata. Vähemalt maks, neerud, neerupealised ja munandid tuleks kohe pärast lahti lõikamist kuivamise vältimiseks märjalt kaaluda. Elundid ja koed, st normaalne ja töödeldud nahk, maks, neerud, põrn, munandid, neerupealised, süda ja muud sihtelundid (see tähendab makropatoloogiliste kahjustustega või muutunud suurusega elundid) tuleks säilitada sobivas keskkonnas võimaliku hilisema histopatoloogilise uuringu jaoks.
      1.6.5.   Histopatoloogiline uuring
      Kõrgeima annusega rühma ja kontrollrühma loomade säilitatud elundeid ja kudesid tuleks histoloogiliselt uurida. Kõrgeima annusega rühmal testainega seostatavaid kahjustusi sisaldavaid elundeid ja kudesid tuleks kontrollida ka kõigil madalama annusega rühmadel. Võimaliku satelliitrühma loomi tuleks samuti histoloogiliselt uurida, pöörates eriti tähelepanu nendele elunditele ja kudedele, milles muudes katserühmades esines muutusi.
      2.   ANDMED
      Andmed tuleks esitada kokkuvõtlikus tabelis, mis iga katserühma puhul näitab katseloomade arvu selle katse algul ja igat tüüpi kahjustustega loomade arvu.
      Kõiki vaatlustulemusi tuleks hinnata sobiva statistilise meetodi abil. Kasutada võib kõiki tunnustatud statistilisi meetodeid.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  katseloomade kohta käivaid andmeid (liiki, liini, päritolu, keskkonnatingimusi, toidusedelit jne);
               
            
                  —
               
               
                  katsetingimusi (sealhulgas sideme tüüpi: oklusiivside või tavaline side);
               
            
                  —
               
               
                  annuseid (kandja kasutamisel koos kandjaga) ja kontsentratsioone;
               
            
                  —
               
               
                  võimaluse korral toimeta annust;
               
            
                  —
               
               
                  mürgistusnähtude andmeid soo ja annuse järgi;
               
            
                  —
               
               
                  surmahetke katse ajal või seda, kas loomad jäid kuni surmamiseni ellu;
               
            
                  —
               
               
                  mürgistus- või muid nähte;
               
            
                  —
               
               
                  iga kõrvalekalde täheldamise aega ja kõrvalekalde hilisemat kulgu;
               
            
                  —
               
               
                  sööda ja kehakaalu andmeid;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud hematoloogilisi analüüse ja nende tulemusi;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud kliinilise biokeemia analüüse ja nende tulemusi;
               
            
                  —
               
               
                  lahkamistulemusi;
               
            
                  —
               
               
                  kõigi histopatoloogiliste leidude üksikasjalikku kirjeldust;
               
            
                  —
               
               
                  võimaluse korral tulemuste statistilist käsitlust;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste analüüsi;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste tõlgendust.
               
            3.2.   HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE
      Vt B osa üldist sissejuhatust (D).
      4.   VIITED
      Vt B osa üldist sissejuhatust (E).
      B.10.   MUTAGEENSUS – IMETAJATE KROMOSOOMABERRATSIOONKATSE IN VITRO
      
      1.   MEETOD
      Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 473, In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test (1997).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      
         In vitro kromosoomaberratsioonkatse eesmärgiks on kindlaks määrata ained, mis põhjustavad struktuurseid kromosoomaberratsioone kultiveeritud imetajarakkudes (1, 2, 3). Struktuursed aberratsioonid võivad olla kahte tüüpi: kromosoom- või kromatiidaberratsioonid. Keemiliste mutageenide põhjustatud aberratsioonid on enamasti kromatiidaberratsioonid, aga esineb ka kromosoomaberratsioone. Polüploidsuse suurenemine võib viidata sellele, et kemikaal võib esile kutsuda numbrilisi aberratsioone. Käesolev meetod ei võimalda siiski mõõta numbrilisi aberratsioone ja seda ei kasutata sel eesmärgil korrapäraselt. Kromo-soommutatsioonid ja nendega seotud juhud on süüdi paljudes inimeste geneetilistes haigustes ja on olemas olulisi tõendeid, et kromosoommutatsioonid ja nendega seotud juhud, mis põhjustavad muutusi keharakkude onkogeenides ja kasvaja supressorgeenides, osalevad vähktõve tekkes inimestel ja katseloomadel.
      
         In vitro kromosoommutatsiooni katsetes võib kasutada loodud rakuliinide kultuure, rakutüvesid või primaarsete rakkude kultuure. Kasutatavad rakud valitakse rakkude kasvuvõime, karüotüüpide püsivuse, kromosoomiarvu, kromosoomide mitmekesisuse ja kromosoomaberratsioonide spontaanse sageduse põhjal.
      Läbiviidud in vitro katsed üldjuhul nõuavad eksogeenset metaboolset aktiveerimist. Kõnealune metaboolse aktiveerimise süsteem ei saa tervenisti jäljendada in vivo tingimusi imetajatel. Tuleb hoolt kanda selle eest, et välditakse positiivseid tulemusi põhjustavaid tingimusi, mis ei peegelda looduslikku mutageensust ja võivad tuleneda pH muutustest, osmolaalsusest või tsütotoksilisuse kõrgetest tasemetest (4, 5).
      Kõnealust katset kasutatakse imetajate võimalike mutageenide ja kantserogeenide skriinimiseks. Mitmed ühendid, mis annavad kõnealuses katses positiivseid tulemusi, on imetajate kantserogeenid; siiski ei ole kõnealuse katse ja kantserogeensuse vahel täielikku korrelatsiooni. Korrelatsioon sõltub ühendi keemilisest klassist ja üha enam uurimistulemusi viitab sellele, et on olemas kantserogeenid, mida kõnealuse katse abil ei avastata, kuna need näivad mõjuvat muude mehhanismide kui otsese DNA kahjustuse kaudu.
      Vt ka üldist sissejuhatust B osas.
      1.2.   MÕISTED
      
         Kromatiidaberratsioon – struktuurne kromosoomikahjustus, mis ilmneb üksikute kromatiidide katkemises või kromatiididevahelises katkemises ja taasühinemises.
      
         Kromosoomaberratsioon – struktuurne kromosoomikahjustus, mis ilmneb mõlema kromosoomi katkemises või mõlema kromatiidi samas kohas katkemises ja taasühinemises.
      
         Endoreduplikatsioon – protsess, milles pärast DNA replikatsiooni S-faasi tuum ei lähe mitoosi, vaid algab uus S-faas. Selle tulemusena tekivad kromosoomid, milles on 4, 8, 16, ... kromatiidi.
      
         Tühik – akromaatiline kahjustus, mis on väiksem kui kromatiidi laius ja millel on kromatiidide orientatsiooni erinevus minimaalne.
      
         Mitootiline indeks – metafaasis olevate rakkude arv jagatakse rakupopulatsioonis vaadeldud rakkude koguarvuga; näitab rakkude proliferatsiooni astet kõnealuses populatsioonis.
      
         Numbriline aberratsioon – kasutatud rakkude tüüpilisest kromosoomiarvust erinev kromosoomide arv.
      
         Polüploidsus – haploidse kromosoomiarvu (n) kordsus, v.a diploidne kromosoomiarv (nt 3n, 4n jne).
      
         Struktuurne aberratsioon – kromosoomistruktuuri muutus, mis on avastatav raku jagunemise metafaasi etapi mikroskoopilisel uurimisel ja mida täheldatakse deletsiooni ja fragmentidena, kromosoomisiseste või -väliste muutustena.
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Rakukultuurid allutatakse uuritava aine toimele nii metaboolse aktiveerimise tingimustes kui ka ilma selleta. Pärast rakukultuuridele uuritava ainega toimimist töödeldakse neid kindlaksmääratud ajavahemike järel metafaasi peatava ainega (nt Colcemid® või kolhitsiin), rakud kogutakse ja värvitakse ning metafaasis olevaid rakke analüüsitakse mikroskoopiliselt kromosoomaberratsioonide suhtes.
      1.4.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.4.1.   Ettevalmistused
      1.4.1.1.   Rakud
      Katses võib kasutada erinevaid rakuliine, rakutüvesid või primaarsete rakkude kultuure, sh inimrakke (nt hiina hamstri fibroplaste, inimeste või muude imetajate perifeerse vere lümfotsüüte).
      1.4.1.2.   Kasvukeskkonnad ja söötmed
      Rakukultuuride säilitamiseks tuleks kasutada vastavaid kasvukeskkondi ja inkubeerimistingimusi (kasvunõud, CO2 kontsentratsioon, temperatuur ja niiskus). Püsivaid rakuliine ja -tüvesid tuleb kontrollida regulaarselt modaalse kromosoomiarvu stabiilsuse ning mükoplasma saastumise puudumise suhtes; kui see on saastunud, siis ei tohiks seda kasutada. Rakkude normaalse rakutsükli kestus ja kasutatavad kasvutingimused peaksid teada olema.
      1.4.1.3.   Rakukultuuride valmistamine
      Püsivad rakuliinid ja -tüved: rakud paljundatakse tüvikultuuridest, mis on külvatud kasvukeskkonda sellise tihedusega, et rakukultuurid ei saavuta konfluentsust enne kogumisaega, ja inkubeeritakse 37 oC juures.
      Lümfotsüüdid: antikoagulandiga (nt hepariin) töödeldud täisveri või tervetelt isenditelt saadud eraldatud lümfotsüüdid lisatakse mitogeeni (nt fütohemaglutiniini) sisaldavale kasvukeskkonnale ja inkubeeritakse 37 oC juures.
      1.4.1.4.   Metaboolne aktiveerimine
      Rakud allutatakse uuritava aine toimele nii vastava metaboolse aktiveerimissüsteemi olemasolu kui ka puudumise korral. Enim kasutatav süsteem on ensüüme indutseerivate ainete, nt Aroclor 1254ga (6, 7, 8, 9) või fenobarbitooni ja β-naftoflavooni seguga (10, 11, 12) töödeldud näriliste maksast valmistatud postmitokondriaalne osa (S9), millele on lisatud kofaktor.
      Tavaliselt kasutatakse postmitokondriaalset fraktsiooni kontsentratsioonis 1–10 mahuprotsenti lõplikus katsekeskkonnas. Metaboolse aktiveerimissüsteemi tingimused võivad sõltuda uuritava keemilise aine klassist. Mõnel juhul on vaja kasutada postmitokondriaalse fraktsiooni rohkem kui üht kontsentratsiooni.
      Rida meetodeid, sh geneetiliselt muudetud rakuliini loomine, mis ekspresseerivad teatavaid aktiveerimisensüüme, võivad omada endogeense aktiveerimise võimet. Kasutatavate rakuliinide valik peab olema teaduslikult põhjendatud (nt tsütokroom P450 isoensüümi tähtsus uuritava aine metabolismi puhul).
      1.4.1.5.   Uuritav aine/preparaat
      Tahked uuritavad ained tuleb lahustada või suspendeerida sobivates lahustites või kandjaainetes ja vajaduse korral lahjendada enne rakkude töötlemist. Vedelad uuritavad ained võib lisada vahetult katsesüsteemidesse ja/või lahjendada enne töötlemist. Tuleks kasutada uuritava aine värskeid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed püsivuse kohta näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav.
      1.4.2.   Katsetingimused
      1.4.2.1.   Lahusti/kandjaaine
      Lahusti/kandjaaine ei tohiks uuritava ainega keemiliselt reageerida ning see peaks sobima rakkude eluvõimelisuse ja S9 aktiivsusega. Kui kasutatakse tuntud lahustist/kandjaainest erinevat, siis peab nende kasutamine toetuma ühtesobivuse kohta käivatele andmetele. Soovitatav on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahusti/-kandjaaine kasutamist. Vees ebapüsivate ainete uurimisel kasutatavad orgaanilised lahustid peavad olema veevabad. Vett saab eemaldada molekulaarsõelte lisamisega.
      1.4.2.2.   Toimimiseks kasutatavad kontsentratsioonid
      Suurima kontsentratsiooni määramisel on arvestatavad kriteeriumid tsütotoksilisus, lahustuvus katsesüsteemis ning pH või osmolaalsuse muutused.
      Tsütotoksilisus määratakse põhikatses kindlaks nii metaboolse aktiveerimisega kui ka ilma selleta, kasutades sobivaid rakkude puhtuse ja kasvu indikaatoreid, nt konfluentsuse astet, eluvõimeliste rakkude arvu või mitootilist indeksit. Tsütotoksilisust ja lahustuvust võib olla kasulik määrata eelkatses.
      Tuleks kasutada vähemalt kolme analüüsitavat kontsentratsiooni. Kui esineb tsütotoksilisust, peaksid need kontsentratsioonid katma vahemiku suurimast kontsentratsioonist vähimani või sellise kontsentratsioonini, mille korral mürgisus puudub; mis tavaliselt tähendab seda, et kontsentratsioonide erinevus üksteisest võib olla mitte rohkem kui vahemikus 2 kuni √10 asuv koefitsient. Rakkude kogumise ajal peaks suurima kontsentratsiooni korral ilmnema märkimisväärne konfluentsuse astme, rakkude arvu või mitootilise indeksi (kõigi osas rohkem kui 50 %) vähenemine. Mitootiline indeks on üksnes tsütotoksiliste/tsütostaatiliste mõjude kaudne mõõt ja sõltub töötlemisele järgnevast ajast. Mitootilist indeksit tunnustatakse siiski suspensioonkultuuride puhul, milles muude toksilisust mõõtvate vahendite kasutamine võib olla tülikas ja ebapraktiline. Teavet rakutsükli kineetika kohta, nagu näiteks keskmist generatsiooniaega (AGT), tuleks kasutada lisateabena. AGT on siiski üldine keskmine, mis alati ei too esile hilistunud alampopulatsioonide olemasolu, ning isegi keskmise generatsiooniaja kerge pikenemine võib lükata aberratsioonide optimaalse tõestamisaja palju hilisemaks.
      Suhteliselt mittetoksiliste ainete puhul peaks suurim testkontsentratsioon olema 5 μl/ml, 5 mg/ml või 0,01 M, sõltuvalt sellest, milline neist on väikseim.
      Suhteliselt lahustumatute ainete puhul, mis ei ole lahustumispiirile vastavast kontsentratsioonist madalamatel kontsentratsioonidel toksilised, peaks suurim kasutatud annus olema lahustumispiiri ületav kontsentratsioon viimases kasvukeskkonnas manustamisperioodi lõpus. Mõnedel juhtudel (nt siis, kui toksilisus esineb üksnes madalaimast lahustumatuskontsentratsioonist kõrgematel kontsentratsioonidel), on soovitav katseid teha rohkem kui ühe kontsentratsiooniga, millel on nähtav sadestus. On kasulik hinnata lahustuvust töötlemise alguses ja lõpus, kuna lahustuvus katsesüsteemis muutub töötlemise ajal rakkude, S9-seerumi jms mõjul. Lahustumatust saab avastada palja silmaga. Sadestus ei tohiks mõjutada tulemust.
      1.4.2.3.   Negatiivsed ja positiivsed kontrollkatsed
      Igas uuringus kasutatakse paralleelseid positiivseid ja negatiivseid (lahusti või kandjaaine) kontrollkatseid koos metaboolse aktiveerimisega või ilma selleta. Kui kasutatakse metaboolset aktiveerimist, käsitatakse positiivse kontrollainena sellist kemikaali, mis eeldab aktiveerimist mutageense reaktsiooni saamiseks.
      Positiivsed kontrollkatsed peaksid kasutama tuntud elastogeeni toimimistasemetel, mis ootuspäraselt peaks reprodutseeritavust ja avastatavust suurendama fooniga võrreldes, mis näitab katsesüsteemi tundlikkust.
      Kontsentratsioonid positiivsetes kontrollkatsetes valitakse sellised, et mõjud on selged, kuid neist ei ilmne riideris kohe kodeeritud objektiklaaside identsus. Positiivsete kontrollainete näited:
      
                  Metaboolse aktiveerimise tingimus
               
               
                  Aine
               
               
                  CASi nr
               
               
                  EINECSi nr
               
            
                  Eksogeense metaboolse aktiveerimise puudumine
               
               
                  Metüülmetaansulfonaat
               
               
                  66-27-3
               
               
                  200-625-0
               
            
                  Etüülmetaansulfonaat
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  N-etüül-N-nitrosokarbamiid
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  Mitomütsiin-C
               
               
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
            
                  4-nitrokinoliin-N-oksiid
               
               
                  56-57-5
               
               
                  200-281-1
               
            
                  Eksogeense metaboolse aktiveerimise olemasolu
               
               
                  Benso(α)püreen
               
               
                  50-32-8
               
               
                  200-028-5
               
            
                  Tsüklofosfamiid
                  Tsüklofosfamiidmonohüdraat
               
               
                  50-18-0
                  6055-19-2
               
               
                  200-015-4
               
            Võidakse kasutada muid sobivaid positiivseid kontrollaineid. Samasse keemiliste ainete klassi kuuluvate positiivsete kontrollkemikaalide kasutamist tuleks kaaluda, kui sellised ained on kättesaadavad.
      Igal kogumisperioodil võetakse ka negatiivsetest kontrollkatsetest proovid, mis koosnevad üksnes kasvukeskkonnas olevast lahustist või kandjaainest ning mida on töödeldud samal viisil kui kasvukultuure. Lisaks sellele kasutatakse ka töötlemata kontrollproove, välja arvatud juhul, kui varasemad kontrollandmed näitavad, et valitud lahustil ei indutseeri kahjulikke ega mutageenseid mõjusid.
      1.4.3.   Menetlus
      1.4.3.1.   Töötlemine uuritava ainega
      Paljunevaid rakke töödeldakse uuritava ainega nii metaboolse aktiveerimise süsteemis kui ka ilma selleta. Lümfotsüütide töötlemist alustatakse ligikaudu 48 tundi pärast mitogeenset stimulatsiooni.
      
                  1.4.3.2.
               
               
                  Tavaliselt tuleks kasutada iga kontsentratsiooni korral paralleelseid kultuure ja see on rangelt soovitatav negatiivsete/lahusti kontrollkultuuride puhul. Kui varasemad andmed näitavad, et paralleelkultuuride vahel on väike erinevus (13, 14), siis võib olla vastuvõetav iga kontsentratsiooni korral ühe kultuuri kasutamine.
                  Gaasilisi või lenduvaid aineid uuritakse sobiva meetodi abil, näiteks suletud kasvuanumates (15, 16).
               
            1.4.3.3.   Kultuuride kogumise aeg
      Esimeses katses alluvad rakud uuritava aine toimele nii metaboolse aktiveerimise teel kui ka ilma selleta 3–6 tunni jooksul ning proovid võetakse pärast töötlemise algust (12) ajal, mis vastab ligikaudu 1,5 normaalse rakutsükli kestusele. Kui kõnealusel meetodil saadakse negatiivsed tulemused nii aktiveerimisega kui ka ilma selleta, tehakse uus katse ilma aktiveerimiseta ja töötlemist jätkatakse kuni proovivõtmise hetkeni, mis vastab ligikaudu 1,5 normaalse rakutsükli kestusele. Teatud keemilisi aineid saab hõlpsamini avastada, kui töötlemis-/proovivõtuaeg on pikem kui 1,5 rakutsüklit. Metaboolse aktiveerimise korral saadud negatiivseid tulemusi tuleb kooskõlastada igal üksikjuhul eraldi. Neil juhtudel, kui negatiivsete tulemuste kooskõlastamist ei peeta vajalikuks, esitatakse põhjendus.
      1.4.3.4.   Kromosoomipreparaatide valmistamine
      Rakukultuure töödeldakse ainega Colcemid® või kolhitsiiniga tavaliselt 1–3 tundi enne kogumist. Iga rakukultuuri kogutakse ja töödeldakse eraldi kromosoomipreparaatide jaoks. Kromosoomipreparaatide valmistamise alla kuulub rakkude hüpotooniline töötlemine, fikseerimine ja värvimine.
      1.4.3.5.   Analüüs
      Kõik objektiklaasid, sh positiivsete ja negatiivsete kontrollkatsete omad, kodeeritakse sõltumatult enne mikroskoopilist analüüsi. Kui fikseerimismenetlused viivad tihti metafaasis olevate rakkude suhte rikkumiseni ja kromosoomide kaotamiseni, peaksid seega loetud rakud sisaldama tsentromeere koguses, mis vastab modaalarvule ± 2 kõikide rakutüüpide korral. Iga kontsentratsiooni ja kontrollkatse puhul tuleb lugeda vähemalt 200 hästi levinud metafaasi, mis on võrdselt jaotunud paralleelkultuuride vahel, kui neid kasutatakse. Seda arvu saab vähendada, kui täheldatakse palju aberratsioone.
      Kuigi katse eesmärk on avastada struktuursed kromosoomaberratsioonid, on tähtis registreerida ka polüploidsus ja endoreduplikatsioon, kui need esinevad.
      2.   ANDMED
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE
      Katseühikuks on rakk, mistõttu hinnatakse nende rakkude protsendimäära, milles on struktuurne kromosoomaberratsioon või struktuursed kromosoomaberratsioonid. Eri tüüpi struktuursed kromosoomaberratsioonid loetletakse koos nende arvukuse ja esinemissagedustega katse- ja kontrollkultuurides. Tühikud registreeritakse eraldi ja nende kohta antakse teavet, aga üldiselt ei arvestata neid aberratsioonide üldsageduse hulka.
      Samuti registreeritakse kõikides töödeldud ja negatiivsetes kontrollkultuurides tehtud samaaegsed tsütotoksilisuse mõõtmised peamistes aberratsioonikatsetes.
      Tulemused esitatakse iga üksiku kultuuri kohta. Lisaks esitatakse kokkuvõte kõikidest tulemustest tabeli kujul.
      Selget positiivset vastust ei ole vaja verifitseerida. Ebaselgeid tulemusi tuleks selgitada täiendaval uurimisel muudetud katsetingimustes. Vajadust negatiivsete tulemuste kinnitamise järele on arutatud punktis 1.4.3.3. Katse parameetrite muutmist hinnatud tingimuste vahemiku laiendamiseks tuleb arvesse võtta järelkatsetel. Katse parameetrite, mida võidakse muuta, hulka kuuluvad kontsentratsioonivahemik ja metaboolse aktiveerimise tingimused.
      2.2.   TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE
      On mitmeid kriteeriume positiivse tulemuse määramiseks, nagu nt kontsentratsioonist sõltuv kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude arvu suurenemine või selle reprodutseeruv kasv. Tulemuste bioloogilist tähtsust tuleks esmalt arvesse võtta. Statistilisi meetodeid võidakse kasutada abivahendina katsetulemuste hindamisel (3, 13). Statistiline olulisus ei saa olla ainus määrav tegur positiivse vastuse jaoks.
      Polüploidsete rakkude arvu suurenemine võib viidata sellele, et katseainel on võime inhibeerida mitoosiprotsessi ja põhjustada numbrilisi kromosoomaberratsioone. Endoreduplitseeritud kromosoome sisaldavate rakkude arvu suurenemine võib viidata sellele, et uuritav aine võib takistada rakutsükli progressi (17, 18).
      Uuritavat ainet, mille tulemused ei vasta eespool toodud kriteeriumidele, peetakse mittemutageenseks aineks käesolevas süsteemis.
      Kuigi enamikul katsetest on selged positiivsed või negatiivsed tulemused, välistavad saadud tulemused harvadel juhtudel kindlate otsuste tegemise uuritava aine aktiivsuse kohta. Tulemused jäävad ebaselgeks või küsitavaks tehtud korduskatsete arvust hoolimata.
      
         In vitro kromosoomaberratsiooni katse positiivsed tulemused viitavad sellele, et uuritav aine põhjustab struktuurseid kromosoomaberratsioone imetajate kultiveeritud keharakkudes. Negatiivsed tulemused viitavad sellele, et katsetingimuste põhjal ei põhjusta uuritav aine kromsoomaberratsioone imetajate kultiveeritud keharakkudes.
      3.   ARUANDLUS
      KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Lahusti/kandjaaine:
                  
                              —
                           
                           
                              kandjaaine valiku põhjendamine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandjaaines, kui on teada.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rakud:
                  
                              —
                           
                           
                              rakkude tüüp ja allikas;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              karüotüübi omadused ja kasutatava rakutüübi sobivus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mükoplasma puudumine, vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              teave rakutsükli pikkuse kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              veredoonorite sugu, täisveri või eraldatud lümfotsüüdid, kasutatav mitogeen;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              passaažide arv, vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rakukultuuri säilitamise meetodid, vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kromosoomide modaalarv
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              metafaasi peatav aine, selle kontsentratsioon ja rakule toimimise kestus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kontsentratsioonide ja rakukultuuride arvu valimise põhimõtted, sh nt tsütotoksilisuse andmed ja lahustuvuse piirangud, kui need on olemas;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kasvukeskkonna koostis, CO2 kontsentratsioon, vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine kontsentratsioon;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lisatud kandjaaine ja uuritava aine maht;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubatsioonitemperatuur;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubatsiooniaeg;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              töötlemise kestus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rakutihedus külvamisel, vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metaboolse aktiveerimise süsteemi tüüp ja koostis, sh selle vastuvõetavuse kriteeriumid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              positiivsed ja negatiivsed kontrollkatsed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              objektiklaaside valmistamise meetodid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aberratsioonide loendamise kriteeriumid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analüüsitud metafaaside arv;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toksilisuse mõõtmise meetodid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kriteeriumid, mille alusel uuringuid liigitatakse positiivseteks, negatiivseteks või ebaselgeteks.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              toksilisuse tunnused, nt konfluentsuse aste, rakutsüklit käsitlev teave, rakkude loendused, mitootiline indeks;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sadestumise tunnused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              teave kasvukeskkonna pH ja osmolaalsuse kohta, kui see on määratud;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aberratsioonide, sh tühikute määratlemine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude arv ja kromosoomaberratsioonide tüüp, mis on toodud eraldi iga katse- ja kontrollkultuuri kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ploidsuse muutused, kui neid esineb;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              doosi ja toime vaheline sõltuvus, võimaluse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              võimalikud statistilised analüüsid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              paralleelsete negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kontrollide tulemused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              varasemate negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kontrollkatsete andmed, sh vahemik, keskväärtused ja standardhälbed.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutelu.
               
            
                   
               
               
                  Järeldused.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, in: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1–29.
               
            
                  2)
               
               
                  Ishidate, M. Jr. and Sofumi, T. (1985), The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427–432.
               
            
                  3)
               
               
                  Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C, Colman, S., Brown, B., Cannon, C, Bloom, A. D., Naka-mura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G. and Zeiger E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environs, Molec. Mutagen 10 (suppl.10), pp. 1–175.
               
            
                  4)
               
               
                  Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257,pp. 147–204.
               
            
                  5)
               
               
                  Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992), Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Res., 268, pp. 297–305.
               
            
                  6)
               
               
                  Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347–364.
               
            
                  7)
               
               
                  Maron, D. M. and Ames, B. N. (19 8 3), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173–215.
               
            
                  8)
               
               
                  Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Mircrosomal System In Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dime-thylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res., 37, pp. 83–90.
               
            
                  9)
               
               
                  Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro, Mutation Res., 66, pp. 277–290.
               
            
                  10)
               
               
                  Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternative to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175–177.
               
            
                  11)
               
               
                  Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A. Safe Substitute for Polychlori-nated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J. Fouts, J. R. Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85–88.
               
            
                  12)
               
               
                  Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., Kirkland, D. J. Morita, T., Mosesso, P., Sofu-mi, T. (1994), Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Res., 312, pp. 241–261.
               
            
                  13)
               
               
                  Richardson, C, Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., (cd) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141–154.
               
            
                  14)
               
               
                  Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells, Mutation Res., 312, pp. 139–149.
               
            
                  15)
               
               
                  Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91–103.
               
            
                  16)
               
               
                  Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795–801.
               
            
                  17)
               
               
                  Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403–413.
               
            
                  18)
               
               
                  Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362–1364.
               
            B.11.   MUTAGEENSUS – KROMOSOOMABERRATSIOONKATSE IMETAJATE LUUÜDIS IN VIVO
      
      1.   MEETOD
      Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 475, Mammalian Bone Marrow Chromosome Aberration Test (1997).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Imetajate in vivo kromosoomaberratsioonkatset kasutatakse uuritava aine põhjustatud strukturaalsete kromosoomaberratsioonide avastamiseks imetajate, tavaliselt näriliste luuüdirakkudes (1, 2, 3, 4). Strukturaalsed kromosoomaberratsioonid võivad olla kahte tüüpi: kromosoom- või kromatiidaberratsioonid. Polüploidsuse suurenemine võib viidata sellele, et kemikaal võib esile kutsuda numbrilisi aberratsioone. Keemiliste mutageenide põhjustatud aberratsioonid on enamasti kromatiidaberratsioonid, aga esineb ka kromosoomaberratsioone. Kromosoommutatsioonid ja nendega seotud juhud põhjustavad paljusid inimeste geneetilisi haigusi ja on olemas olulisi tõendeid selle kohta, et kromosoommutatsioonid ja nendega seotud juhud, mis põhjustavad muutusi keharakkude onkogeenides ja kasvaja supressorgeenides, osalevad vähktõve tekkes inimestel ja katseloomadel.
      Kõnealuses katses kasutatakse tavaliselt närilisi. Kõnealuses katses on sihtkoeks luuüdi, kuna selle verevarustus on väga rikkalik ja see sisaldab rakupopulatsiooni, mille rakutsükkel on kiire ning mida on kerge isoleerida ja töödelda. Käesoleva meetodi puhul ei kasutata muid liike ega sihtkudesid.
      Käesolev kromosoomaberratsioonkatse on eriti oluline mutageensuse ohu hindamisel, kuna see võimaldab arvesse võtta in vivo metabolismi, farmakokineetika ja DNA parandamisprotsesside tegureid, kuigi need võivad erineda liigiti ja kudede vahel. In vivo katset võidakse samuti kasutada in vitro katses avastatud mutageense mõju täiendaval uurimisel.
      Kui on tõendeid selle kohta, et uuritav aine või reageerimisvõimeline metaboliit ei pääse sihtkoesse, ei ole sobiv kasutada käesolevat katset.
      Vt ka üldist sissejuhatust B osas.
      1.2.   MÕISTED
      
         Kromatiidaberratsioon – strukturaalne kromosoomikahjustus, mis ilmneb üksikute kromatiidide katkemises või kromatiididevahelises katkemises ja taasühinemises.
      
         Kromosoomaberratsioon – strukturaalne kromosoomikahjustus, mis ilmneb mõlema kromosoomi katkemises või mõlema kromatiidi katkemises ja taasühinemises samas kohas.
      
         Endoreduplikatsioon – protsess, milles pärast DNA replikatsiooni S-perioodi tuum ei lähe mitoosi, vaid algab uus S-periood. Selle tulemusena tekivad kromosoomid, milles on 4, 8, 16, ... kromatiidi.
      
         Tühik – akromaatiline kahjustus, mis on väiksem kui kromatiidi laius ja millel on kromatiidide orientatsiooni erinevus minimaalne.
      
         Numbriline aberratsioon – kasutatud rakkude tüüpilisest normaalsest kromosoomiarvust erinev kromosoomide arv.
      
         Polüploidsus – haploidse kromosoomiarvu (n) kordsus, v.a diploidne arv (nt 3n, 4n jne).
      
         Struktuurne aberratsioon – kromosoomistruktuuri muutus, mida saab avastada raku jagunemise metafaasi etapi mikroskoopilisel uurimisel ja mida täheldatakse deletsiooni ja fragmentidena, kromosoomisiseste või -väliste muutustena.
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Loomad allutatakse uuritava aine toimele, kasutades sobivat toimimisviisi, ja tapetakse sobiva aja möödudes töötlemisest. Enne tapmist töödeldakse loomi metafaasi peatava ainega (nt kolhitsiiniga või ainega Colcemid®). Seejärel tehakse luuüdirakkudest kromosoomipreparaadid ja need värvitakse ning metafaasi rakkude kromosoomaberratsioone analüüsitakse.
      1.4.   MEETODI KIRJELDUS
      1.4.1.   Ettevalmistused
      1.4.1.1.   Loomaliikide valik
      Tavaliselt kasutatakse rotte, hiiri ja hiina hamstreid, kuigi võib kasutada mis tahes sobivaid imetajate liike. Rakendatakse noorte tervete loomade tavaliselt kasutatavaid laboritüvesid. Uuringut alustades peaks loomade massi muutus olema minimaalne ja ei tohiks ületada ± 20 % iga soo keskmisest massist.
      1.4.1.2.   Pidamis- ja söötmistingimused
      Üldise sissejuhatuse B osas toodud üldtingimusi kohaldatakse, kuigi otstarbekas niiskusesisaldus peaks olema 50–60 %.
      1.4.1.3.   Loomade ettevalmistamine
      Terved noored täiskasvanud loomad määratakse juhuvaliku alusel kontroll- ja katserühma. Puurid asetatakse nii, et puuri asetamisest tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Loomad identifitseeritakse individuaalselt. Loomi harjutatakse laboritingimustega vähemalt viie päeva jooksul.
      1.4.1.4.   Annuste ettevalmistamine
      Tahked uuritavad ained tuleb lahustada või suspendeerida sobivates lahustites või kandjaainetes ja vajaduse korral lahjendada enne loomadele andmist. Vedelaid uuritavaid aineid võib doseerida vahetult või lahjendada enne doseerimist. Tuleks kasutada uuritava aine värskeid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed püsivuse kohta näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav.
      1.4.2.   Katsetingimused
      1.4.2.1.   Lahusti/kandjaaine
      Lahusti/kandjaaine ei tohi avaldada toksilist mõju kasutatava annuse korral ega reageerida keemiliselt siooni uuritava ainega. Kui kasutatakse tuntud lahustist/kandjaainest erinevat, siis peab selle kasutamine toetuma ühtesobivuse kohta käivatele andmetele. Soovitatav on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahusti/-kandjaaine kasutamist.
      1.4.2.2.   Kontrollkatsed
      Käesolevasse katsesse kaasatakse mõlema sugupoole korral paralleelsed positiivsed ja negatiivsed (lahusti/kandjaaine) kontrollkatsed. Kontrollrühma loomi käsitletakse nii nagu katserühma loomi, kuid neid ei töödelda uuritava ainega.
      Positiivsed kontrollkatsed ei tohiks põhjustada struktuurseid aberratsioone in vivo kokkupuutetasemel, mis peaksid põhjustama avastatavat suurenemist fooniga võrreldes. Positiivsete kontrollainete annused valitakse sellised, et mõjud on selged, kuid neist ei ilmne riideris kohe kodeeritud objektiklaaside identsus. On aktsepteeritav, et positiivses kontrollkatses võib kasutada uuritava aine manustamisviisist erinevat viisi ja proovid võetakse üksnes korra. Samasse keemiliste ainete klassi kuuluvate positiivsete kontrollkemikaalide kasutamist võib kaaluda, kui selline aine on kättesaadav. Positiivsete kontrollainete näited:
      
                  Aine
               
               
                  CASi nr
               
               
                  EINECSi nr
               
            
                  Etüül-metaansulfonaat
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  N-etüül-N-nitroso-karbamiid
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  Mitomütsiin-C
               
               
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
            
                  Tsüklofosfamiid
                  Tsiklofosfamiidmonohüdraat
               
               
                  50-18-0
                  6055-19-2
               
               
                  200-015-4
               
            
                  Trietüleen-melamiin
               
               
                  51-18-3
               
               
                  200-083-5
               
            Üksnes lahusti või kandjaainega töödeldud või muul katserühmaga samalaadsel viisil töödeldud negatiivsetest kontrollkatsetest võetakse proovid igal proovivõtukorral, välja arvatud siis, kui varasemad kontrollitulemused näitavad vastuvõetavat loomadevahelist varieerumist ja kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude esinemissagedust. Kui negatiivsetest kontrollkatsetest võetakse üksnes üks proov, on kõige sobivam võtta see esimesel proovivõtukorral. Lisaks sellele kasutatakse ka töötlemata kontrollproove, välja arvatud juhul, kui varasemad või avaldatud kontrollandmed näitavad, et valitud lahusti/kandjaaine ei indutseeri kahjulikke ega mutageenseid mõjusid.
      1.5.   MENETLUS
      1.5.1.   Loomade arv ja sugu
      Nii katse- kui kontrollrühmas on mõlemast soost vähemalt viis analüüsitavat looma. Kui uuringu ajal on kättesaadavad tulemused sama liigi sama vastuvõtlikkuse liini kasutades tehtud uuringute kohta, mille tulemused näitavad, et toksilisuses ei ole sugupoolte vahel olulisi erinevusi, siis piisab vaid ühe sugupoolega katsete tegemisest. Kui inimese vastuvõtlikkus kemikaalidele on soospetsiifiline, nagu näiteks mõnede ravimite puhul, tehakse katse sobivast soost loomadega.
      1.5.2.   Katse kava
      Uuritavad ained tuleb eelistatavalt manustada ühekordsete annustena. Uuritavaid aineid võib manustada ka jagatud annustena, näiteks kaks annust ühel päeval kuni mõnetunnise vahega, et hõlbustada suurte ainekoguste manustamist. Muud manustamisrežiimid peaksid olema teaduslikult tõestatud.
      Proovid võetakse kahel korral samal päeval pärast manustamist. Näriliste puhul esimene proovivõtuaeg on 1,5 normaalset rakutsüklit (rakutsükkel kestab tavaliselt 12–18 tundi) pärast manustamist. Kuna aeg uuritava aine sissevõtmise ja metabolismi vahel ja selle mõju rakutsükli kineetikale saavad mõjutada kromosoomaberratsiooni avastamise optimaalset aega, on soovitav 24 tundi pärast esimese proovi võtmist koguda hilisem proov. Kui uuritavat ainet antakse kauem kui üks päev, tuleks võtta üks proov pärast viimast manustamist ajal, mis vastab 1,5 normaalse rakutsükli kestusele.
      Enne tapmist süstitakse loomade kõhukelmesse sobiv annus metafaasi peatavat ainet (nt ainet Colcemid® või kolhitsiini). Loomadelt võetakse seejärel proovid sobiva intervalli järel. Hiirte puhul on see intervall ligikaudu 3–5 tundi; hiina hamstrite korral ligikaudu 4–5 tundi. Rakud kogutakse luuüdist ja neid analüüsitakse kromosoomaberratsioonide tuvastamiseks.
      1.5.3.   Annused
      Kui sobivate andmete puudumisel tehakse annuse vahemiku määramiseks uuring, siis tehakse uuring samas laboris, kasutades samu liike, tüvesid, sugu ja manustamiskava kui põhiuuringus (5). Kui esineb mürgisus, kasutatakse esimeses proovivõtus kolme erinevat annust. Need annused peaksid hõlmama vahemikku suurimast kuni väiksema mürgisuseni või mürgisuse puudumiseni. Hilisemal proovivõtuajal on vaja kasutada üksnes suurimat annust. Suurim annus on määratletud annusena, mis põhjustab selliseid mürgistusnähte, et samale manustamisrežiimile põhinevate suuremate annusetasemete kasutamine võib põhjustada surma. Ained, millel on spetsiifilised bioloogilised mõjud väikeste mittetoksiliste annustena (nt hormoonid ja mitogeenid), võivad olla erandiks annuse määramise kriteeriumidele ja neid tuleks hinnata iga üksikjuhtumi puhul eraldi. Suurimat annust võidakse samuti määratleda annusena, mis põhjustab mõningaid mürgisusele viitavaid muutusi luuüdis (nt mitootiline indeks väheneb üle 50 %).
      1.5.4.   Piirkatse
      Kui katse ühe annusega, milleks on vähemalt 2 000 mg/kg kehamassi kohta ja mida manustatakse ühekordse annusena või kahe annusena samal päeval, ei põhjusta täheldatavaid toksilisi mõjusid ja kui genotoksilisus ootuspäraselt põhineb struktuurselt lähedaste ainete andmetel, siis ei peeta kolme annuse taset käsitlevat täielikku uuringut vajalikuks. Kauem kestvate uuringute korral on piirannus 2 000 mg/kg kehamassi kohta päevas kuni 14 päeva kestval manustamisel ja 1 000 mg/kg kehamassi kohta päevas, kui manustamine kestab kauem kui 14 päeva. Inimeste ootuspärane vastuvõtlikkus võib viidata piirkatses kasutatavatest annustest suuremate annuste kasutamise vajadusele.
      1.5.5.   Manustamine
      Uuritavat ainet manustatakse tavaliselt söögitoru kaudu või sobiva intubeerimiskanüüli abil või süstides kõhuõõnde. Samuti võib muid manustamisviise aktsepteerida, kui need on põhjendatud. Vedeliku suurim maht, mida saab söögitoru kaudu või süstides ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Maht ei tohiks ületada 2 ml/100 g kehamassi kohta. Suuremate mahtude kasutamine peab olema põhjendatud. Kui välja arvata ärritavad või söövitavad ained, mille mõjud tavaliselt teravnevad suuremate kontsentratsioonide korral, tuleks vähendada katses kasutatavate mahtude varieeruvust, reguleerides kontsentratsioone nii, et kogumaht kõikide annuste korral jääks samaks.
      1.5.6.   Kromosoomipreparaat
      Vahetult pärast tapmist kogutakse luuüdi, seda töödeldakse hüpotoonilise lahusega ja fikseeritakse. Seejärel kantakse rakud objektiklaasidele ja värvitakse.
      1.5.7.   Analüüs
      Mitootiline indeks tuleks määrata tsütotoksilisuse määrana vähemalt 1 000 rakust looma kohta kõikides katseloomades (sh positiivsed kontrollid) ja töötlemata negatiivsetes kontroll-loomades.
      Vähemalt 100 rakku tuleks iga looma puhul analüüsida. Seda arvu saab vähendada, kui täheldatakse palju aberratsioone. Kõik objektiklaasid, sh positiivsete ja negatiivsete kontrollkatsete omad, kodeeritakse sõltumatult enne mikroskoopilist analüüsi. Kui objektiklaasi valmistamise menetlused viivad tihti metafaasis olevate rakkude suhte rikkumiseni ja kromosoomide kaotamiseni, peaksid seega loendatud rakud sisaldama tsentromeere koguses, mis vastab modaalarvule 2n ± 2.
      2.   ANDMED
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE
      Andmed üksikute loomade kohta esitatakse tabeli kujul. Katseühikuks on loom. Iga looma puhul tuleks hinnata loendatud rakkude arvu, aberratsioonide arvu raku kohta ja struktuurse(te) kromosoomaberratsiooni(de)ga rakkude protsendimäära. Eri tüüpi struktuursed kromosoomaberratsioonid tuleks loetleda koos nende arvukuse ja esinemissagedustega katse- ja kontrollkultuurides. Tühikud (gaps) registreeritakse eraldi ja nende kohta antakse teavet, aga üldiselt ei võeta neid aberratsioonide üldsageduse hulka. Kui pole tõestust toime erinevuse kohta sugude vahel, võidakse kombineerida mõlema sugupoole andmed statistiliseks analüüsiks.
      2.2.   TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE
      Positiivse tulemuse saamiseks on mitmeid kriteeriume, nt kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude suhtelise arvu suurenemine annusest tingituna või kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude arvu selge suurenemine ühes annuse rühmas ühel proovivõtuajal. Tulemuste bioloogilist tähtsust tuleks esmalt arvesse võtta. Statistilisi meetodeid võidakse kasutada abivahendina katsetulemuste hindamisel (6). Statistiline olulisus ei saa olla ainus määrav tegur positiivse vastuse jaoks. Ebaselgeid tulemusi tuleks selgitada täiendaval uurimisel muudetud katsetingimustes.
      Polüploidsuse suurenemine võib viidata sellele, et uuritav aine võib esile kutsuda numbrilisi aberratsioone. Endoreduplikatsiooni suurenemine võib viidata sellele, et uuritaval ainel on võime inhibeerida rakutsükli kulgemist (7, 8).
      Uuritavat ainet, mille korral saadud tulemused ei vasta eespool toodud kriteeriumidele, peetakse käesolevas katses mittemutageenseks aineks.
      Kuigi enamikus katsetes saadakse selged positiivsed või negatiivsed tulemused, välistavad harvadel juhtudel saadud tulemused uuritava aine aktiivsuse kohta kindlate otsuste tegemise. Tulemused jäävad ebaselgeks või küsitavaks tehtud katsete arvust sõltumata.
      
         In vivo kromosoomaberratsioonkatsel saadud positiivsed tulemused viitavad sellele, et aine põhjustab kromosoomaberratsioone testitud liikide luuüdis. Negatiivsed tulemused viitavad sellele, et antud katsetingimustes ei põhjusta aine kromosoomaberratsioone testitud liikide luuüdis.
      Tõenäosust, et uuritav aine või selle metaboliidid jõuavad üldisesse vereringesse või eriti sihtkoesse (nt süsteemne toksilisus), tuleks arutada.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Kandjaaine:
                  
                              —
                           
                           
                              kandjaaine valiku põhjendamine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandjaaines, kui see on teada.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katseloomad:
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatud liigid/tüved;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade arv, vanus ja sugu;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              päritolu, pidamistingimused, toitumine jne;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade individuaalne mass katse alustamisel, sh kehamassi vahemik, keskväärtused ja standardhälve iga rühma kohta.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              positiivsed ja negatiivsed (kandjaaine/lahusti) kontrollkatsed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              annuse vahemiku määramise uuringu andmed, kui see on tehtud;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              manustamise tasemete valimise põhimõtted;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine ettevalmistamise üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine manustamise üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              manustamistee põhjendus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              meetodid, mis verifitseerivad, et uuritav aine jõuab üldisesse vereringesse või sihtkoesse, vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toidu/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni (ppm) teisendamine tegelikuks annuseks (mg/kg kehamassi kohta päevas), vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              manustamis- ja proovivõtukavade üksikasjalik kirjeldus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toksilisuse mõõtmise meetodid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metafaasi peatav aine, selle kontsentratsioon ja töötlemise kestus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              objektiklaaside ettevalmistamise meetodid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aberratsioonide loendamise kriteeriumid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analüüsitud rakkude arv looma kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kriteeriumid, mille alusel uurimusi liigitatakse positiivseteks, negatiivseteks või ebaselgeteks.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              toksilisuse tunnused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mitootiline indeks;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aberratsioonide tüüp ja arv, antud iga looma kohta eraldi;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aberratsioonide üldarv rühma kohta ning keskväärtused ja standardhälbed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aberratsioone sisaldavate rakkude arv rühma kohta ning keskväärtused ja standardhälbed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ploidsuse muutused, kui neid esineb;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              doosi ja toime vaheline sõltuvus, võimaluse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              võimalikud statistilised analüüsid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              paralleelsed negatiivsed kontrollandmed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              varasemad negatiivsed kontrollandmed ning vahemikud, keskväärtused ja standardhälbed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              paralleelsed positiivsed kontrollandmed.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutelu.
               
            
                   
               
               
                  Järeldused.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J. M. Parry (eds), IRL Press, Oxford, Washington D. C, pp. 275–306.
               
            
                  2)
               
               
                  Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. F. and Shelby, M. (19 8 7), Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, pp. 157–165.
               
            
                  3)
               
               
                  Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115–141.
               
            
                  4)
               
               
                  Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregaro, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the in Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305–312.
               
            
                  5)
               
               
                  Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313–319.
               
            
                  6)
               
               
                  Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Pap-worth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184–232.
               
            
                  7)
               
               
                  Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403–413.
               
            
                  8)
               
               
                  Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362–1364.
               
            B.12.   MUTAGEENSUS – PISITUUMA KATSE IMETAJATE ERÜTROTSÜÜTIDES IN VIVO
      
      1.   MEETOD
      Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 474, Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test (1997).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Imetajate pisituuma katset in vivo kasutatakse uuritava aine põhjustatud kromosoomikahjustuse või mitoosiaparaadi kahjustuse avastamiseks erütroblastides, analüüsides loomade, tavaliselt näriliste luuüdist ja/või perifeersetest vererakkudest võetud erütrotsüüte.
      Pisituuma katse eesmärk on identifitseerida ained, mis põhjustavad tsütogeenset kahjustust, mille tulemuseks on kromosoomiloive fragmente või terveid kromosoome sisaldava pisituuma moodustamine.
      Kui luuüdi erütroblast areneb polükromaatseks erütrotsüüdiks, siis põhituum lükatakse välja; mis tahes moodustatud pisituum võib jääda muul viisil tuumata tsütoplasmasse. Põhituuma puudumine hõlbustab pisituumade avastamist neis rakkudes. Pisituumsete polükromaatsete erütrotsüütide sageduse suurenemine katseloomade puhul on indutseeritud kromosoomikahjustuse indikaatoriks.
      Tavaliselt kasutatakse näriliste luuüdi käesolevas katses kuni polükromaatsete erütrotsüütide moodustumiseni kõnealuses koes. Ebaküpsete mikrotuumsete (polükromaatsete) erütrotsüütide mõõtmine perifeerses veres on võrdselt vastuvõetav mis tahes liigi puhul, mille põrn ei suuda hävitada pisituumseid erütrotsüüte või mis on piisavalt tundlikud selleks, et avastada struktuurseid või numbrilisi kromosoomaberratsioone põhjustavaid aineid. Pisituuma saab eristada erinevate kriteeriumide alusel. Nende hulka kuulub kinetohoori või tsentromeerse DNA olemasolu või puudumise tõendamine pisituumas. Ebaküpsete (polükromaatsete) pisituumsete erütrotsüütide esinemissagedus on peamine lõpp-punkt. Küpsete (normokromaatsete) erütrotsüütide arvu perifeerses veres, mis sisaldab pisituuma küpsete erütrotsüütide hulgas, saab samuti kasutada katse lõpp-punktina, kui loomadele manustatakse uuritavat ainet nelja või enama nädala jooksul.
      Käesolev imetajate in vivo pisituuma katse on eriti vajalik mutageensuse ohu hindamiseks, kuna selles võidakse arvesse võtta in vivo metabolismi, farmakokineetika ja DNA parandusprotsesside tegureid, kuigi need võivad liigiti, kudede vahel ja geneetiliste lõpp-punktide osas erineda. In vivo katset võidakse samuti kasutada in vitro katses avastatud mutageense mõju täiendaval uurimisel.
      Kui on tõendeid selle kohta, et uuritav aine või reaktsioonivõimeline metaboliit ei pääse sihtkoesse, ei ole sobiv kasutada käesolevat katset.
      Vt ka üldist sissejuhatust B osas.
      1.2.   MÕISTED
      
         Tsentromeer (kinetohoor) – kromosoomi ala(d), kus kääviniidid kinnituvad raku jagunemise ajal, võimaldades tütarkromosoomide korrapärast liikumist tütarrakkude poolustele.
      
         Pisituum – väike tuum, mis on rakkude põhituumast eraldi ja sellega paralleelselt esinev, see on moodustunud mitoosi telofaasi (meioosi) ajal kromosoomiloive fragmentidest või tervetest kromosoomidest.
      
         Normokromaatne erütrotsüüt – küps erütrotsüüt, millel puuduvad ribosoomid ja mida saab eristada mitteküpsetest, polükromaatsetest erütrotsüütidest ribosoomide jaoks valikuliste värvainete abil.
      
         Polükromaatne erütrotsüüt – ebaküps erütrotsüüt, arengu vahefaasis olev erütrotsüüt, millel on endiselt alles ribosoomid ja seetõttu saab seda eristada küpsetest, normokromaatsetest erütrotsüütidest ribosoomide jaoks valikuliste värvainete abil.
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Loomadele manustatakse uuritavat ainet sobiva manustamistee kaudu. Kui kasutatakse luuüdi, tapetakse loomad pärast manustamist sobival ajal, luuüdi eemaldatakse ning valmistatakse preparaadid ja need värvitakse (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). Kui kasutatakse perifeerset verd, kogutakse veri sobival ajal pärast manustamist ning äigepreparaadid valmistatakse ja värvitakse (4, 8, 9, 10). Perifeerse vere uurimisel peaks jääma võimalikult vähe aega viimase manustamise ja rakkude kogumise vahele. Preparaate analüüsitakse pisituuma avastamiseks.
      1.4.   MEETODI KIRJELDUS
      1.4.1.   Ettevalmistused
      1.4.1.1.   Loomaliikide valik
      Kui kasutatakse luuüdi, siis on soovitatav kasutada hiiri või rotte, kuigi võib kasutada mis tahes imetajate liike. Perifeerse vere kasutamise korral soovitatakse hiiri. Siiski võib kasutada mis tahes imetajate liike, kelle põrn ei eemalda pisituumseid erütrotsüüte, või liike, kes on näidanud piisavat tundlikkust struktuursete või numbriliste kromosoomaberratsioonide tekitajate avastamiseks. Kasutatakse noorte tervete loomade tavaliselt kasutatavaid laboritüvesid. Uuringut alustades peaks loomade massi muutus olema minimaalne ega tohiks ületada ± 20 % iga soo keskmisest kaalust.
      1.4.1.2.   Pidamis- ja söötmistingimused
      Üldise sissejuhatuse B osas toodud üldtingimusi kohaldatakse, kuigi otstarbekas niiskusesisaldus peaks olema 50–60 %.
      1.4.1.3.   Loomade ettevalmistamine
      Terved noored täiskasvanud loomad määratakse juhuvaliku alusel kontroll- ja katserühma. Loomad identifitseeritakse individuaalselt. Loomi harjutatakse laboritingimustega vähemalt viie päeva jooksul. Puurid asetatakse nii, et puuri asetamisest tingitud mõjud on võimalikult väikesed.
      1.4.1.4.   Annuste ettevalmistamine
      Tahked uuritavad ained tuleb lahustada või suspendeerida sobivates lahustites või kandjaainetes ja vajaduse korral lahjendada enne loomadele andmist. Vedelaid uuritavaid aineid võib doseerida vahetult või lahjendada enne doseerimist. Tuleks kasutada uuritava aine värskeid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed püsivuse kohta näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav.
      1.4.2.   Katsetingimused
      1.4.2.1.   Lahusti/kandjaaine
      Lahusti/kandjaaine ei tohi avaldada toksilist mõju kasutatavate annuste korral ega reageerida keemiliselt uuritava ainega. Kui kasutatakse tuntud lahustist/kandjaainest erinevat, peab selle kasutamine toetuma ühtesobivuse kohta käivatele võrdlusandmetele. Soovitatav on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahusti/-kandjaaine kasutamist.
      1.4.2.2.   Kontrollkatsed
      Käesolevasse katsesse kaasatakse mõlema sugupoole korral paralleelsed positiivsed ja negatiivsed (lahusti/kandjaaine) kontrollkatsed. Kontrollrühma loomi käsitletakse nii nagu katserühma loomi, kuid neid ei töödelda uuritava ainega.
      Positiivsed kontrollkatsed peaksid tekitama pisituuma in vivo toime tasemel, millelt oodatakse fooniga võrreldes märgatava suurenemise põhjustamist. Positiivsete kontrollainete annused valitakse sellised, et mõjud on selged, kuid neist ei ilmne riideris kohe kodeeritud objektiklaaside identsus. On aktsepteeritav, et positiivses kontrollkatses võib kasutada uuritava aine manustamisviisist erinevat viisi ja proovid võetakse üksnes korra. Lisaks võib kaalutleda samasse keemiliste ainete klassi kuuluvate positiivsete kontrollkemikaalide kasutamist, kui sellised ained on kättesaadavad. Positiivsete kontrollainete näited:
      
                  Aine
               
               
                  CASi nr
               
               
                  EINECSi nr
               
            
                  Etüül-metaansulfonaat
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  N-etüül-N-nitrosokarbamiid
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  Mitomütsiin-C
               
               
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
            
                  Tsüklofosfamiid
                  Tsüklofosfamiidmonohüdraat
               
               
                  50-18-0
                  6055-19-2
               
               
                  200-015-4
               
            
                  Trietüleen-melamiin
               
               
                  51-18-3
               
               
                  200-083-5
               
            Üksnes lahustit või kandjaainet saanud või muul katserühmaga samalaadsel viisil töödeldud negatiivsetest kontrollkatsetest võetakse proovid igal proovivõtukorral, välja arvatud siis, kui varasemad kontrollitulemused näitavad vastuvõetavat loomadevahelist varieerumist ja kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude esinemissagedust. Kui negatiivsetest kontrollkatsetest võetakse üksnes üks proov, on kõige sobivam võtta see esimesel proovivõtukorral. Lisaks sellele kasutatakse ka töötlemata kontrollproove, välja arvatud juhul, kui varasemad või avaldatud kontrollandmed näitavad, et valitud lahusti/kandjaaine ei indutseeri kahjulikke ega mutageenseid mõjusid.
      Kui kasutatakse perifeerset verd, võib enne töötlemist võetud proov olla samuti aktsepteeritav paralleelse negatiivse kontrollina, kuid üksnes perifeerse verega tehtud lühiajalistel katsetel (nt 1–3 töötlemist), kui saadud tulemused on varasemate kontrollide alusel oodatavas vahemikus.
      1.5.   MENETLUS
      1.5.1.   Loomade arv ja sugu
      Nii katse- kui kontrollrühmas on mõlemast soost vähemalt viis analüüsitavat looma (11). Kui uuringu ajal on kättesaadavad tulemused sama liigi korral sama manustamisteed kasutades tehtud uuringute kohta, mille tulemused näitavad, et toksilisuse osas ei ole olulisi erinevusi sugupoolte vahel, siis piisab katsete tegemisest vaid ühe sugupoolega. Kui inimese vastuvõtlikkus kemikaalidele on soospetsiifiline, nagu näiteks mõnede ravimite puhul, tehakse katse sobivast soost loomadega.
      1.5.2.   Manustamiskava
      Ei ole võimalik soovitada ühtegi standardset manustamiskava (nt üks, kaks või enam manustamist 24tunniste intervallidega). Pikemate manustamisrežiimide ajal kogutud proovid on aktsepteeritavad, kui positiivset mõju on näidatud käesolevas katses või negatiivses katses on näidatud toksilisust või on kasutatud piirannust ja manustamist on jätkatud proovivõtmise ajani. Uuritavaid aineid võib manustada ka jagatud annustena, näiteks kaks annust ühel päeval kuni mõnetunnise vahega, et hõlbustada suurte ainemahtude andmist.
      Katset võib sooritada kahel viisil:
      
                  a)
               
               
                  loomadele manustatakse uuritavat ainet ühel korral. Proove luuüdist võetakse vähemalt kahel korral, alustades mitte varem kui 24 tundi pärast manustamist, kuid mitte hiljem kui 48 tundi pärast manustamist, ning proovide võtmise vahel on sobiv intervall. Proovide võtmine varem kui 24 tundi pärast manustamist peaks olema põhjendatud. Perifeerse vere proovid võetakse vähemalt kahel korral, alustades mitte varem kui 36 tundi pärast manustamist, ning esimesele proovile järgneb sobiv intervall, kuid mitte hiljem kui 72 tundi pärast manustamist. Kui positiivne tulemus on tuvastatav ühel proovivõtukorra järel, siis lisaproovide võtmist ei ole vaja;
               
            
                  b)
               
               
                  kui kasutatakse kahte või enamat päevaannust (nt kaks või rohkem manustamist 24tunniste intervallidega), kogutakse proovid üks kord 18–24 tundi pärast viimast manustamist luuüdisse ja korra 36–48 tundi pärast viimast manustamist perifeersesse verre (12).
               
            Vajaduse korral võib lisaproove võtta muul ajal.
      1.5.3.   Annused
      Kui tehakse annuse vahemiku määramiseks uuring sobivate andmete puudumisel, siis tehakse uuring samas laboris, kasutades samu liike, tüvesid, sugu ja manustamisrežiimi, mida kasutatakse põhiuuringus (13). Kui esineb mürgisus, kasutatakse kolme erinevat annust esimese proovivõtu jaoks. Need annused peaksid hõlmama vahemikku suurimast kuni väiksema mürgisuseni või mürgisuse puudumiseni. Hilisemal proovivõtuajal on vaja kasutada üksnes suurimat annust. Suurim annus on määratletud annusena, mis põhjustab selliseid mürgistusnähte, et samale manustamisrežiimile põhinevate suuremate annuste kasutamine võib põhjustada surma. Ained, millel on spetsiifilised bioloogilised mõjud väikeste mittetoksiliste annustena (nt hormoonid ja mitogeenid), võivad olla erandiks annuse määramise kriteeriumidele ja neid tuleks hinnata iga üksikjuhtumi puhul eraldi. Suurimat annust võidakse samuti määratleda annusena, mis põhjustab mõningaid mürgisusele viitavaid muutusi luuüdis (nt ebaküpsete erütrotsüütide hulga vähenemine erütrotsüütide koguarvus luuüdis või perifeerses veres).
      1.5.4.   Piirkatse
      Kui katse ühe annusega, milleks on vähemalt 2 000 mg/kehamassi kg kohta ja mida manustatakse ühekordse annusena või kahe annusena samal päeval, ei põhjusta täheldatavaid toksilisi mõjusid ja kui genotoksilisus ootuspäraselt põhineb struktuurselt lähedaste ainete andmetel, siis ei peeta kolme annuse taset käsitlevat täielikku uuringut vajalikuks. Kauem kestvate uuringute korral on piirannus 2 000 mg/kehamassi kg kohta päevas kuni 14 päeva kestval manustamisel ja 1 000 mg/kehamassi kg kohta päevas, kui manustamine kestab kauem kui 14 päeva. Inimeste ootuspärane vastuvõtlikkus võib viidata piirkatses kasutatavatest annustest suuremate annuste kasutamise vajadusele.
      1.5.5.   Manustamine
      Uuritavat ainet manustatakse tavaliselt söögitoru kaudu või sobiva intubeerimiskanüüli abil või süstides kõhuõõnde. Samuti võib muid manustamisviise aktsepteerida, kui need on põhjendatud. Vedeliku suurim maht, mida saab söögitoru kaudu või süstides ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Maht ei tohiks ületada 2 ml/100 g kehamassi kohta. Suuremate mahtude kasutamine peab olema põhjendatud. Kui välja arvata ärritavad või söövitavad ained, mille mõjud tavaliselt teravnevad suuremate kontsentratsioonide korral, tuleks vähendada katses kasutatavate mahtude varieeruvust, reguleerides kontsentratsioone nii, et kogumaht kõikide annuste korral jääks samaks.
      1.5.6.   Luuüdi-/verepreparaat
      Luuüdirakud saadakse tavaliselt reieluudest või sääreluudest vahetult pärast tapmist. Rakud eemaldatakse reieluudest või sääreluudest, neist tehakse preparaadid ja värvitakse kindlakskujunenud meetoditel. Perifeerne veri võetakse sabaveenist või muust sobivast veresoonest. Vererakud värvitakse kohe supravitaalvärvide abil (8, 9, 10) või tehakse äigepreparaadid ja seejärel värvitakse. DNA-spetsiifilise värvaine kasutamine (nt akridiinoranž (14) või Hoechst 33258 + püroniin-Y (15)) võib kõrvaldada mõned mitte-DNA-spetsiifiliste värvainete kasutamisega seotud artefaktid. See eelis ei välista tavaliste värvainete (nt Giemsa) kasutamist. Täiendavaid süsteeme (nt tsellulooskolonne tuumsete rakkude eemaldamiseks (16)) saab samuti kasutada, kui kõnealused süsteemid on piisavalt toimivad laboris pisituumapreparaatide valmistamiseks.
      1.5.7.   Analüüs
      Ebaküpsete erütrotsüütide osa kõikide (ebaküpsete + küpsete) erütrotsüütide hulgas määratakse iga looma puhul eraldi, loendades kokku vähemalt 200 erütrotsüüti luuüdist ja 1 000 erütrotsüüti perifeersest verest (17). Kõik objektiklaasid, sh positiivsete ja negatiivsete kontrollkatsete omad, kodeeritakse sõltumatult enne mikroskoopilist analüüsi. Ebaküpsete pisituumsete erütrotsüütide esinemissageduse määramiseks loendatakse looma kohta vähemalt 2 000 ebaküpset erütrotsüüti. Lisateavet võidakse saada, loendades pisituumasid küpsetes erütrotsüütides. Objektiklaase analüüsides ei tohiks ebaküpsete erütrotsüütide osa kõikide erütrotsüütide hulgas olla väiksem kui 20 % kontrollväärtusest. Kui loomadele manustatakse uuritavat ainet pidevalt nelja või enama nädala jooksul, saab loendada vähemalt 2 000 küpset erütrotsüüti looma kohta pisituumade esinemissageduse määramiseks. Automaatsed analüüsisüsteemid (kujutise analüüs ja rakususpensioonide voolutsütomeetria) on vastuvõetavad alternatiivid manuaalsele hindamisele, kui see on asjakohaselt põhjendatud ja valideeritud.
      2.   ANDMED
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE
      Andmed üksikute loomade kohta esitatakse tabeli kujul. Katseühikuks on loom. Ebaküpsete erütrotsüütide arv, pisituumsete ebaküpsete erütrotsüütide arv ja ebaküpsete erütrotsüütide osa kõikidest erütrotsüütidest tuleks iga analüüsitava looma kohta loetleda eraldi. Kui loomadele manustatakse uuritavat ainet pidevalt nelja või enama nädala jooksul, tuleks samuti esitada teave küpsete erütrotsüütide kohta, kui seda on kogutud. Ebaküpsete erütrotsüütide osa kõikidest erütrotsüütidest ja, vajaduse korral, pisituumsete erütrotsüütide protsendimäär esitatakse iga looma kohta. Kui pole tõestust vastuse sugudevahelise erinevuse kohta, võidakse kombineerida mõlema sugupoole andmed statistiliseks analüüsiks.
      2.2.   TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE
      Positiivse tulemuse saamiseks on mitmeid kriteeriume, nt pisituumsete rakkude arvu suurenemine annusest tingituna või pisituumsete rakkude arvu selge suurenemine ühes annuse rühmas ühel proovivõtuajal. Tulemuste bioloogilist tähtsust tuleks esmalt arvesse võtta. Statistilisi meetodeid võidakse kasutada abivahendina katsetulemuste hindamisel (18, 19). Statistiline olulisus ei saa olla ainus määrav tegur positiivse vastuse jaoks. Ebaselgeid tulemusi tuleks selgitada täiendaval uurimisel meelepäraselt muudetud katsetingimustes.
      Uuritavat ainet, mille korral saadud tulemused ei vasta eespool toodud kriteeriumidele, peetakse käesolevas katses mittemutageenseks aineks.
      Kuigi enamikus katsetes saadakse selged positiivsed või negatiivsed tulemused, välistavad harvadel juhtudel saadud tulemused uuritava aine aktiivsuse kohta kindlate otsuste tegemise. Tulemused jäävad ebaselgeks või küsitavaks tehtud katsete kordamisest sõltumata.
      Pisituuma katse positiivsed tulemused viitavad sellele, et aine indutseerib pisituumi, mis põhjustavad kromosoomikahjustuse või mitoosiaparaadi kahjustuse katseliikide erütroblastides. Negatiivsed tulemused viitavad sellele, et antud katsetingimustes ei tekita aine katseliikide ebaküpsetes erütrotsüütides pisituumi.
      Tõenäosust, et uuritav aine või selle metaboliidid jõuavad üldisesse vereringesse või eriti sihtkoesse (nt süsteemne toksilisus), tuleks arutada.
      3.   ARUANDLUS
      KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Lahusti/kandjaaine:
                  
                              —
                           
                           
                              kandjaaine valiku põhjendamine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandjaaines, kui see on teada.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katseloomad:
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatud liigid/tüved;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade arv, vanus ja sugu;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              päritolu, pidamistingimused, toitumine jne;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade individuaalne mass katse alustamisel, sh kehamassi vahemik, keskväärtus ja standardhälve iga rühma kohta.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              positiivseid ja negatiivseid (lahus/kandjaaine) kontrollkatseid käsitlevad andmed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              annuse vahemiku määramise uuringu tulemused, kui see on tehtud;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              annuste valimiku põhimõtted;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine ettevalmistamise üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine manustamise üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              manustamistee põhjendus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              meetodid, mis verifitseerivad, et uuritav aine jõuab üldisesse vereringesse või sihtkoesse, vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toidu/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni (ppm) teisendamine tegelikuks annuseks (mg/kehamassi kg kohta päevas), vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              manustamis- ja proovivõtukavade üksikasjalik kirjeldus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              objektiklaaside ettevalmistamise meetodid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toksilisuse mõõtmise meetodid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ebaküpsete pisituumsete erütrotsüütide loendamise kriteeriumid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analüüsitud rakkude arv looma kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kriteeriumid, mille alusel uurimusi liigitatakse positiivseteks, negatiivseteks või ebaselgeteks.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              toksilisuse tunnused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ebaküpsete erütrotsüütide osa kõikides erütrotsüütides;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ebaküpsete pisituumsete erütrotsüütide arv, esitatakse iga looma kohta eraldi;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ebaküpsete erütrotsüütide keskväärtus ± standardhälve rühma kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              doosi ja toime vaheline sõltuvus, võimaluse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kasutatud statistilised analüüsid ja meetodid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              paralleelsed ja varasemad negatiivsed kontrollandmed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              paralleelsed positiivsed kontrollandmed.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutelu.
               
            
                   
               
               
                  Järeldused.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  Heddle, J. A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, pp. 187–190.
               
            
                  2)
               
               
                  Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, pp. 9–15.
               
            
                  3)
               
               
                  Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123, pp. 61–118.
               
            
                  4)
               
               
                  Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C., Salamone, M. F. and Heddle, J. A. (1990), The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, pp. 29–80.
               
            
                  5)
               
               
                  MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N. and Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya. Elsevier, Amsterdam, pp. 555–558.
               
            
                  6)
               
               
                  MacGregor, J. T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C, Salamone, M. F., Tice, R. R., and Wild, D. (1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, pp. 103–112.
               
            
                  7)
               
               
                  MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R. and Shelby, M. E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513–522.
               
            
                  8)
               
               
                  Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, pp. 245–249.
               
            
                  9)
               
               
                  The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridime Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, pp. 83–98.
               
            
                  10)
               
               
                  The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995), Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 153–159.
               
            
                  11)
               
               
                  Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchicrotti, F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S. and Vannier, B. (1994), in Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, pp. 293–304.
               
            
                  12)
               
               
                  Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313–319.
               
            
                  13)
               
               
                  Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313–319.
               
            
                  14)
               
               
                  Hayashi, M., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241–247.
               
            
                  15)
               
               
                  MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y, Mutation Res., 120, pp. 269–275.
               
            
                  16)
               
               
                  Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91–104.
               
            
                  17)
               
               
                  Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to nor-mochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 347, pp. 97–99.
               
            
                  18)
               
               
                  Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetics Assay, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115–141.
               
            
                  19)
               
               
                  Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson R., Richold, M., Pap-worth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Staticical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184–232.
               
            B.13/14.   MUTAGEENSUS – BAKTERITE PÖÖRDMUTATSIOONKATSE
      1.   MEETOD
      Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 471, Bacterial Reverse Mutation Test (1997).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Bakterite pöördmutatsioonkatses kasutatakse aminohappeid vajavaid Salmonella typhimurium’i ja Escherichia coli tüvesid punktmutatsiooni avastamiseks, millega kaasneb ühe või mitme DNA aluspaari asendus, lisamine või deletsioon (1, 2, 3). Käesoleva bakterite pöördmutatsioonkatse põhimõtteks on avastada mutatsioonid, mis parandavad katsetüvedes olevaid mutatsioone ja taastavad bakterite funktsionaalse võime sünteesida põhilisi aminohappeid. Revertantsed bakterid avastatakse seepärast, et nad on võimelised kasvama, kuigi katsebakteritüves vajalik aminohape puudub.
      Punktmutatsioonid põhjustavad inimestel mitmeid geneetilisi haigusi ja on märkimisväärseid tõendeid selle kohta, et punktmutatsioonid onkogeenides ja keharakkude kasvaja supressorgeenides osalevad inimeste ja katseloomade kasvajate moodustumisel. Bakterite pöördmutatsioonkatse on kiire, odav ja suhteliselt kergesti sooritatav. Paljudel katsetüvedel on mitmeid omadusi, mis muudavad nad tundlikumaks mutatsioonide avastamiseks, sh kergesti reageerivad DNA järjestused pöördmutatsiooni saitides, rakkude suurenenud läbitavus suurte molekulide suhtes ja DNA parandamise süsteemide kõrvaldamine või vigadele vastuvõtlike DNA parandamisprotsesside tõhustamine. Katsetüvede spetsiifilisus võib anda vajalikku teavet genotoksiliste ainete põhjustatud mutatsiooni tüüpide kohta. Väga ulatuslik andmebaas eri struktuuride korral saadud tulemuste kohta on kättesaadav bakterite pöördmutatsioonkatsete põhjal ja kindlakskujunenud meetodid on välja töötatud erinevate füüsikalis-keemiliste omadustega keemiliste ainete, sh lenduvate ühendite testimiseks.
      Vt ka üldist sissejuhatust B osas.
      1.2.   MÕISTED
      
         Pöördmutatsioonkatse kas Salmonella typhimurium’i või Escherichia coli puhul avastab mutatsiooni aminohapet (vastavalt histidiinis või trüptofaanis) nõudvas tüves, mille tulemusena tekib väljastpoolt saadud aminohappest sõltumatu tüvi.
      
         Aluspaari asendusmutageenid on ained, mis põhjustavad aluse vahetust DNAs. Pöördmutatsioonkatses võib kõnealune muutus aset leida algupärase mutatsiooni kohas või muus bakterigenoomi saidis.
      
         Raaminihke mutageenid on ained, mis põhjustavad ühe või mitme DNA aluspaari lisamist või deletsiooni, seega muutes RNA lugemisraami.
      1.3.   ALGSED KAALUTLUSED
      Bakterite pöördmutatsioonkatse kasutab prokarüootseid rakke, mis erinevad imetajate rakkudest sellise tegurite poolest nagu tagasihaare, metabolism, kromosoomi struktuur ja DNA parandamisprotsessid. Tehtud in vitro katsed üldjuhul nõuavad eksogeenset metaboolset aktiveerimist. In vitro metaboolse aktiveerimise süsteem ei saa tervenisti jäljendada in vivo tingimusi imetajatel. Seetõttu ei anna katse otsest teavet aine mutageensuse või kantserogeensuse kohta imetajatel.
      Bakterite pöördmutatsioonkatset kasutatakse tavaliselt genotoksilisust ja eriti punktmutatsiooni põhjustava tegevuse algseks skriinimiseks. Ulatuslik andmebaas on näidanud, et mitmetel keemilistel ainetel, mis annavad käesolevas katses positiivseid tulemusi, on mutageenne aktiivsus ka muudes katsetes. On näiteid mutageensetest ainetest, mida ei avastata käesoleva katse abil; nende ebaõnnestumiste põhjusteks on avastatud lõpp-punkti spetsiifiline olemus, metaboolse aktiveerimise erinevused või biosaadavuse erinevused. Teisalt võivad tegurid, mis tõhustavad bakterite pöördmutatsioonikatse tundlikkust, viia mutageense aktiivsuse ülehindamiseni.
      Bakterite pöördmutatsioonkatse ei sobi teatud klassidesse kuuluvate keemiliste ainete hindamiseks, nt väga bakteritsiidsed ühendid (nt teatud antibiootikumid) ja need, mida peetakse (või tuntakse) imetajate raku replikatsioonisüsteemi (nt mõnede topoisomeraasi inhibiitorite ja mõnede nukleosiidide analoogide) mõjutajatena. Sellistel juhtudel on imetajate mutatsioonikatsed sobivamad.
      Kuigi paljud ühendid, mis annavad positiivseid tulemusi käesolevas katses, on imetajate kantserogeenid, ei ole korrelatsioon täielik. See sõltub keemilisest aineklassist ning esineb kantserogeene, mida käesoleva katse abil ei avastata, kuna nad tegutsevad muude, mittegenotoksiliste mehhanismide või bakterirakkudes puuduvate mehhanismide abil.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Bakterirakkude suspensioonid allutatakse uuritava aine toimele eksogeense metaboolse aktiveerimise olemasolu ja puudumise korral. Vahetu kokkusegamise meetodil segatakse kõnealused suspensioonid külviagariga ja asetatakse vahetult minimaalsesse kasvukeskkonda. Preinkubatsioonimeetodi puhul inkubeeritakse uuritavat ainet sisaldav segu ja segatakse seejärel külviagariga enne minimaalsesse kasvukeskkonda asetamist. Mõlema metoodika puhul pärast kahte või kolme inkubatsioonipäeva loendatakse revertantkolooniad ja võrreldakse nende arvu spontaansete revertantkolooniate arvuga lahusti kontrollplaatidel.
      On kirjeldatud mitmeid bakterite pöördmutatsioonkatse sooritamise menetlusi. Nende seas on enimkasutatavad vahetu kokkusegamise meetod (1, 2, 3, 4), preinkubatsioonimeetod (2, 3, 5, 6, 7, 8), fluktuatsioonimeetod (9, 10) ja suspensioonimeetod (11). Gaaside või aurude uurimist käsitlevaid muudatusi on kirjeldatud (12).
      Kõnealuses meetodis kirjeldatud menetlused puudutavad peamiselt vahetu kokkusegamise ja preinkubatsioonimeetodit. Nende mõlema abil võidakse teha katseid koos metaboolse aktiveerimisega või ilma selleta. Mõned ained võivad olla paremini tuvastatavad preinkubatsioonimeetodi abil. Need ained kuuluvad keemilistesse aineklassidesse, kus on lühiahelalised alifaatsed nitrosoamiinid, metallid oksüdatsiooniastmega + 2, aldehüüdid, asovärvid ja diasoühendid, pürollisidiinalkaloidid, allüülühendid ja nitroühendid (3). Samuti on täheldatud, et teatud mutageenide klasse ei tuvastata alati standardmenetluste abil, nagu nt vahetu kokkusegamise meetodil või preinkubatsioonimeetodil. Neid tuleks vaadelda „erijuhtudena” ja on rangelt soovitatav, et nende tuvastamiseks kasutataks alternatiivseid menetlusi. Järgmised „erijuhud” on võimalik ära tunda (koos menetluste näidetega, mida võib nende tuvastamiseks kasutada): asovärvained ja diasoühendid (3, 5, 6, 13), gaasid ja lenduvad kemikaalid (12, 14, 15, 16) ning glükosiidid (17, 18). Kõrvalekaldeid standardmenetlustest on vaja teaduslikult põhjendada.
      1.5.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.5.1.   Ettevalmistused
      1.5.1.1.   Bakterid
      Värsked bakterikultuurid tuleb kasvatada kuni hilise eksponentsiaalse või varase statsionaarse kasvufaasini (ligikaudu 109 rakku ml kohta). Hilises statsionaarses faasis olevaid kultuure ei tohiks kasutada. On oluline, et katses kasutatavad kultuurid sisaldaksid elujõuliste rakkude suuri tiitreid. Tiitrit võib näidata kas varasematest kontrollkatsetest saadud kasvukõverate abil või määrates igas analüüsis elujõuliste rakkude arv külvikatsel.
      Soovitav inkubatsioonitemperatuur on 37 oC.
      Tuleks kasutada vähemalt viit bakteritüve. Nende hulka peaks kuuluma neli tüve S. typhimurium’ilt (TA 1535; TA 1537 või TA97a või TA97; TA98; ja TA100), mida peetakse usaldusväärseteks ja mis on andnud reprodutseeritava vaste eri laborites. Nendes neljas S. typhimurium’i tüves on GC aluspaarid algses pöördmutatsioonisaidis ja on teada, et need ei avasta teatud oksüdeerivaid mutageene, ristseoseid moodustavaid aineid ja hüdrasiine. Selliseid aineid võib avastada E. coli WP2-tüvede või S. typhimurium TA1 02 (19) abil, millel on AT aluspaar algses pöördmutatsioonisaidis. Seetõttu on soovitavad tüvede kombinatsioonid järgmised:
      
                  —
               
               
                  
                     S. typhimurium TA1535;
               
            
                  —
               
               
                  
                     S. typhimurium TA1537 või TA97 või TA97a;
               
            
                  —
               
               
                  
                     S. typhimurium TA98;
               
            
                  —
               
               
                  
                     S. typhimurium TA100;
               
            
                  —
               
               
                  
                     E. coli WP2 uvrA või E. coli WP2 uvrA (pKM101) või S. typhimurium TA102.
               
            Ristseostuvate mutageenide avastamiseks on eelistatav kasutada TA1 02 või lisada DNA parandusele spetsiifilist E. coli tüve (nt E. coli WP2 või E. coli WP2 (pKMIOl)).
      Tüvikultuuri preparaatide valmistamiseks, markeri verifitseerimiseks ja säilitamiseks tuleks kasutada väljakujunenud menetlusi. Kasvuks mõeldud aminohappe vajadust tuleks näidata iga külmutatud tüvikultuuri varupreparaadi puhul (S. typhimurium’i tüvede puhul histidiin ja E. coli tüvede puhul trüptofaan). Muid fenotüüpseid tunnuseid tuleks vastavalt kontrollida: R-faktori plasmiidide esinemist või puudumist, vajaduse korral (nt ampitsilliini resistentsus TA98, TA100 ja TA97a või TA97, WP2 uvrA ja WP2 uvrA (pKM101) tüvede puhul ning ampitsilliini + tetratsükliini resistentsus TA102 tüve puhul); iseloomulike mutatsioonide esinemine (nt tundlikkusest kristallvioleti suhtes põhjustatud rfa-mutatsioon S. typhimurium’is ja tundlikkusest ultraviolettkiirguse suhtes põhjustatud uvrA-mutatsioon E. coli’is või uvrB-mutatsioon S. typhimurium’is) (2, 3). Tüved peaksid samuti andma plaatidel spontaansete revertantsete bakterite kolooniate loendamise tulemusi, mis vastavad laborite esinemissageduste kontrollandmete vahemikele ja kirjanduses eelistatult esitatud vahemikele.
      1.5.1.2.   Sööde
      Kasutatakse sobivat minimaalset agarit (sisaldab nt Vogel-Bonneri minimaalset söödet E ja glükoosi) ja külviagarit, mis sisaldab histidiini ja biotiini või trüptofaani, mis võimaldavad raku jagunemist (1, 2, 9).
      1.5.1.3.   Metaboolne aktiveerimine
      Bakterid puutuvad kokku uuritava ainega nii vastava metaboolse aktiveerimissüsteemi olemasolu kui ka puudumise korral. Enim kasutatav süsteem on ensüüme indutseerivate ainete, nt Aroclor 1254ga (1, 2) või fenobarbitooni ja β-naftoflavooni seguga (18, 20, 21) töödeldud näriliste maksast valmistatud postmitokondriaalne osa (S9), millele on lisatud kofaktor. Tavaliselt kasutatakse postmitokondriaalset fraktsiooni kontsentratsiooni vahemikus 5–30 mahuprotsenti S9-segus. Metaboolse aktiveerimissüsteemi valik ja tingimused võivad sõltuda uuritava keemilise aine klassist. Mõnel juhul on vaja kasutada postmitokondriaalse fraktsiooni rohkem kui üht kontsentratsiooni. Asovärvainete ja diasoühendite puhul võib olla sobivam kasutada redutseerivat metaboolse aktiveerimise süsteemi (6, 13).
      1.5.1.4.   Uuritav aine/ettevalmistused
      Tahked uuritavad ained tuleb lahustada või suspendeerida sobivates lahustites või kandjaainetes ja vajaduse korral lahjendada enne bakterite töötlemist. Vedelad uuritavad ained võib lisada vahetult katsesüsteemidesse ja/või lahjendada enne manustamist. Tuleks kasutada uuritava aine värskeid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed püsivuse kohta näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav.
      Lahusti/kandjaaine ei tohiks uuritava ainega keemiliselt reageerida ning see peaks sobima rakkude eluvõimelisuse ja S9 aktiivsusega (22). Kui kasutatakse muud kui tuntud lahustit/kandjaainet, siis peab selle kasutamine toetuma ühtesobivuse kohta käivatele andmetele. Soovitatav on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahusti/-kandjaaine kasutamist. Vees ebapüsivate ainete uurimisel kasutatavad orgaanilised lahustid peavad olema veevabad.
      1.5.2.   Katsetingimused
      1.5.2.1.   Katsetüved (vt 1.5.1.1)
      1.5.2.2.   Manustamise kontsentratsioon
      Kasutatavate katseainete suurima koguse määramisel võetakse arvesse tsütotoksilisust ja lahustuvust lõplikus katsesegus.
      Tsütotoksilisust ja lahustuvust võib olla kasulik määrata eelkatses. Tsütotoksilisust võib tuvastada töödeldud kultuurides revertantsete kolooniate arvu vähenemise, lausfooni selginemise või vähenemise või rakkude ellujäämisastme abil. Aine tsütotoksilisust võib muuta metaboolsete aktiveerimissüsteemide esinemise korral. Lahustumatust tuleks hinnata lõplikus segus palja silmaga nähtava sadestuse tekke põhjal tegelikes katsetingimustes.
      Soovitatav suurim katsekontsentratsioon lahustuvate mittetoksiliste ainete kohta on 5 mg plaat või 5 μl plaat. Mittetoksiliste ainete puhul, mis on lahustumatud kontsentratsioonidel 5 mg plaadi kohta või 5 μl plaadi kohta, peaks üks või enam uuritavat kontsentratsiooni vastama lahustumatusele lõplikus katsesegus. Katseaineid, mis on tsütotoksilised juba kontsentratsioonidel alla 5 mg plaadi kohta või 5 μl plaadi kohta, tuleks testida tsütotoksilise kontsentratsiooni suhtes. Sadestus ei tohiks mõjutada tulemust.
      Tuleks kasutada vähemalt viit erinevat analüüsitava katseaine kontsentratsiooni, mille korral on katsepunktidele vastav vahemik ligikaudu poollogaritmiline (nt √10). Kontsentratsioonsõltuvuse uurimisel võivad olla sobivamad väiksemad intervallid. Hinnates aineid, mis sisaldavad märkimisväärsel hulgal võimalikke mutageenseid lisandeid, võib kõne alla tulla katsete tegemine suuremate kontsentratsioonidega kui 5 mg plaadi kohta või 5 μl plaadi kohta.
      1.5.2.3.   Negatiivsed ja positiivsed kontrollkatsed
      Igas katses kasutatakse paralleelseid positiivseid ja negatiivseid (lahusti või kandjaaine) kontrollkatseid nii metaboolse aktiveerimisega kui ka ilma selleta. Positiivsetes kontrollkatsetes kasutatavad kontsentratsioonid tuleb valida selliselt, et need näitaksid iga katse sooritamise tõhusust.
      Metaboolset aktiveerimissüsteemi kasutavate katsete puhul tuleks välja valida positiivsete kontrollkatsete võrdlusaine(d) kasutatavate bakteritüvede tüübi põhjal.
      Järgmised ained on näited sobivatest positiivsetest kontrollainetest metaboolse aktiveerimisega katsete jaoks:
      
                  Aine
               
               
                  CASi nr
               
               
                  EINECSi nr
               
            
                  781-43-1
               
               
                  212-308-4
               
               
                  9,10-dimetüülantratseen
               
            
                  57-97-6
               
               
                  200-359-5
               
               
                  7,12-dimetüülbens(α)antratseen
               
            
                  50-32-8
               
               
                  200-028-5
               
               
                  Benso(a)püreen
               
            
                  613-13-8
               
               
                  210-330-9
               
               
                  2-aminoantratseen
               
            
                  50-18-0
               
               
                   
               
               
                  Tsüklofosfamiid
               
            
                  6055-19-2
               
               
                  200-015-4
               
               
                  Tsüklofosfamiidmonohüdraat
               
            Järgmine aine on sobiv positiivseks kontrolliks redutseeriva metaboolse aktiveerimise meetodi jaoks:
      
                  Aine
               
               
                  CASi nr
               
               
                  EINECSi nr
               
            
                  Kongopunane
               
               
                  573-58-0
               
               
                  209-358-4
               
            2-aminoantratseeni ei tohiks kasutada S9-segu tõhususe ainsa indikaatorina. Kui kasutatakse 2-aminoantratseeni, peaks iga S9-partiid samuti iseloomustama mutageeniga (nt benso[a]püreen, dimetüülbensantratseen), mis eeldab mikrosomaalse ensüümi tekitatud metaboolset aktiveerimist.
      Järgmised ained on näited positiivsetest tüvele spetsiifilistest sobivatest kontrollainetest eksogeense metaboolse aktiveerimissüsteemiga katsete jaoks:
      
                  Aine
               
               
                  CASi nr
               
               
                  EINECSi nr
               
               
                  Tüvi
               
            
                  Naatriumasiid
               
               
                  26628-22-8
               
               
                  247-852-1
               
               
                  TA 1535 ja TA 100
               
            
                  2-nitrofluoreen
               
               
                  607-57-8
               
               
                  210-138-5
               
               
                  TA 98
               
            
                  9-aminoakridiin
               
               
                  90-45-9
               
               
                  201-995-6
               
               
                  TA 1537, TA 97 ja TA 97a
               
            
                  ICR 191
               
               
                  17070-45-0
               
               
                  241-129-4
               
               
                  TA 1537, TA 97 ja TA 97a
               
            
                  Kumeenvesinikperoksiid
               
               
                  80-15-9
               
               
                  201-254-7
               
               
                  TA 102
               
            
                  Mitomütsiin-C
               
               
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
               
                  WP2 uvrA ja TA 102
               
            
                  l-metüül-3-nitro-l-nitrosoguanidiin
               
               
                  70-25-7
               
               
                  200-730-1
               
               
                  WP2, WP2uvrA ja WP2uvrA (pKM101)
               
            
                  4-nitrokinoliin-1-oksiid
               
               
                  56-57-5
               
               
                  200-281-1
               
               
                  WP2, WP2uvrA ja WP2uvrA (pKM101)
               
            
                  Furiilfuramiid (AF2)
               
               
                  3688-53-7
               
               
                   
               
               
                  Plasmiidi sisaldavad tüved
               
            Võidakse kasutada muid sobivaid positiivse kontrolli võrdlusaineid. Lähedasse keemilisse aineteklassi kuuluvate positiivsete keemiliste kontrollainete kasutamist tuleks kaaluda, kui selline aine on kättesaadav.
      Tuleks kasutada negatiivseid kontrollaineid, mis sisaldavad üksnes lahustit või kandjaainet ilma katseaineta ja mida muidu manustatakse sarnasel viisil nagu katserühmade puhul. Lisaks sellele kasutatakse ka töötlemata kontrollkatseid, välja arvatud juhul, kui varasemad andmed kontrollaine kohta näitavad, et valitud lahusti ei indutseeri kahjulikke ega mutageenseid mõjusid.
      1.5.3.   Menetlus
      Vahetu kokkusegamise meetodil (1, 2, 3, 4), ilma metaboolse aktiveerimiseta, segatakse 2,0 ml külviagariga tavaliselt 0,05 ml või 0,1 ml katselahuseid, 0,1 ml värskeid bakterikultuure (mis sisaldavad ligikaudu 108 elujõulist rakku) ja 0,5 ml steriilset puhvrit. Metaboolse aktiveerimisega katse puhul segatakse tavaliselt 0,5 ml metaboolse aktiveerimise segu, mis sisaldab piisaval hulgal postmitokondriaalset fraktsiooni (vahemikus 5–30 mahuprotsenti metaboolse aktiveerimise segus) külviagari (2,0 ml) ja bakterite ja uuritava aine/katselahusega. Iga katseklaasi sisu segatakse ja külvatakse minimaalse agarinõu pinnale. Külviagarit võib lasta tahkestuda enne inkubatsiooni.
      Eelinkubatsioonimeetodi puhul (2, 3, 5, 6) eelinkubeeritakse uuritav aine/katselahus uuritava tüvega (mis sisaldab ligikaudu 108 elujõulist rakku) ja steriilse puhvriga või metaboolse aktiveerimise süsteemiga (0,5 ml) enamasti 20 minutit või kauem 30–37 oC juures enne külviagariga segamist ja külvatakse minimaalse agariplaadi pinnale. Tavaliselt segatakse 0,05 või 0,1 ml uuritavat ainet/katselahust, 0,1 ml baktereid ja 0,5 ml S9-segu või steriilset puhvrit 2,0 ml külviagariga. Katseklaase tuleks täita õhuga eelinkubatsiooni ajal, kasutades selleks loksutit.
      Varieerumise piisavaks hindamiseks tuleks kasutada kolme paralleelset plaati iga annuse korral. Kahe paralleelse plaadi kasutamine on aktsepteeritav siis, kui seda on teaduslikult põhjendatud. Plaadi juhuslikul kaotsiminekul ei tunnistata katset ilmtingimata kehtetuks.
      Gaasilisi või lenduvaid aineid uuritakse sobiva meetodi abil, näiteks suletud kasvuanumates (12, 14, 15, 16).
      1.5.4.   Inkubatsioon
      Kõiki antud katse anumaid tuleks inkubeerida 37 oC juures 48–72 tundi. Pärast inkubatsiooniperioodi loendatakse kokku revertantsete kolooniate arv plaadi kohta.
      2.   ANDMED
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE
      Tulemused tuleks esitada revertantsete kolooniate arvuna plaadi kohta. Revertantsete kolooniate arv nii negatiivsete (lahusti kontrollkatse ja töötlemata kontrollkatse, kui seda kasutatakse) kui ka positiivsete kontrollplaatide korral tuleks esitada. Üksikute plaatide korral loendatud bakterite arvud, revertantsete kolooniate keskmine arv plaadi kohta ja standardhälve tuleks esitada uuritava aine ning positiivsete ja negatiivsete (töötlemata ja/või lahusti) kontrollkatsete kohta.
      Selget positiivset vastust ei ole vaja verifitseerida. Ebaselgeid tulemusi tuleks selgitada täiendaval uurimisel meelepäraselt muudetud katsetingimustes. Negatiivseid tulemusi kinnitatakse igal üksikjuhul eraldi. Neil juhtudel, kui negatiivsete tulemuste kinnitamist ei peeta vajalikuks, esitatakse põhjendus. Katse parameetrite muutmist hinnatud tingimuste vahemiku suurendamiseks tuleks arvesse võtta järelkatsetel. Katse parameetrid, mida võidakse muuta, hõlmavad kontsentratsioonivahemikku, manustamisviisi (vahetu kokkusegamise või vedeliku eelinkubatsiooni meetod) ja metaboolse aktiveerimise tingimusi.
      2.2.   TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE
      Positiivse tulemuse määramise kriteeriumid, nagu näiteks kontsentratsiooniga seotud uuritava vahemiku suurenemine ja/või ühes või mitmes kontsentratsioonis revertantsete kolooniate arvu reprodutseeruv suurenemine plaadil vähemalt ühe tüve korral süsteemis koos metaboolse aktiveerimisega või ilma selleta (23). Tulemuste bioloogilist tähtsust tuleks esmalt arvesse võtta. Statistilisi meetodeid võidakse kasutada abivahendina katsetulemuste hindamisel (24). Statistiline olulisus ei saa olla ainus määrav tegur positiivse vastuse saamiseks.
      Uuritavat ainet, mille tulemused ei vasta eespool toodud kriteeriumidele, peetakse mittemutageenseks aineks käesolevas katses.
      Kuigi enamikul katsetest on selged positiivsed või negatiivsed tulemused, välistavad saadud tulemused harvadel juhtudel kindlate otsuste tegemise uuritava aine aktiivsuse kohta. Tulemused jäävad ebaselgeks või küsitavaks tehtud korduskatsete arvust sõltumata.
      Bakterite pöördmutatsioonkatse positiivsed tulemused näitavad, et aine põhjustab punktmutatsioone aluste asendamise või Salmonella typhimurium’i ja/või Escherichia coli genoomi raaminihke abil. Negatiivsed tulemused viitavad sellele, et uuritav aine ei ole katsetingimustes mutageenne uuritavate liikide puhul.
      3.   ARUANDLUS
      KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Lahusti/kandjaaine:
                  
                              —
                           
                           
                              kandjaaine valiku põhjendus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandjaaines, kui on teada.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tüved:
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatavad tüved;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rakkude arv rakukultuuri kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tüvede omadused.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              uuritava aine hulk plaadi kohta (mg plaadi kohta või μl plaadi kohta) annuse valiku põhjendusega ja plaatide arvuga ühe kontsentratsiooni kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kasutatavad söötmed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metaboolse aktiveerimise süsteemi tüüp ja koostis, sh selle vastuvõetavuse kriteeriumid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              manustamismenetlused
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              toksilisuse tunnused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sadestuse tunnused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              individuaalsed loendusandmed plaadi kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              revertantsete kolooniate keskmine arv plaadi kohta ja standardhälve;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              doosi ja toime vaheline sõltuvus, võimaluse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              võimalikud statistilised analüüsid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              paralleelsete negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kontrollkatsete andmed, sh vahemikud, keskväärtused ja standardhälbed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              varasemate negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kontrollkatsete andmed, sh vahemikud, keskväärtused ja standardhälbed.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutelu.
               
            
                   
               
               
                  Järeldused.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  Arnes, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods of Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347–364.
               
            
                  2)
               
               
                  Maron, D. M. and Ames, B. N. (19 8 3), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173–215.
               
            
                  3)
               
               
                  Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays, Mutation Res., 312, pp. 217–233.
               
            
                  4)
               
               
                  Kier, L. D., Brusick D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 168, pp. 69–240.
               
            
                  5)
               
               
                  Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters 1, pp. 91–96.
               
            
                  6)
               
               
                  Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Nor-poth K. H. and Garner, R. C, Springer, Berlin-Heidelberg-New York, pp. 273–285.
               
            
                  7)
               
               
                  Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. and Foster, R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13–61.
               
            
                  8)
               
               
                  Aeschacher, H. U, Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods,/. Food Safety, 8, pp. 167–177.
               
            
                  9)
               
               
                  Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutation Res., 38, pp. 33–42.
               
            
                  10)
               
               
                  Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. and Bridges, J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141–161.
               
            
                  11)
               
               
                  Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagenesis, 3, pp. 453–465.
               
            
                  12)
               
               
                  Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, pp. 335–344.
               
            
                  13)
               
               
                  Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, pp. 33–47.
               
            
                  14)
               
               
                  Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, pp. 2–141.
               
            
                  15)
               
               
                  Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in GeneticToxicology, D. Scott, B. Bridges and F., Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249–258.
               
            
                  16)
               
               
                  Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, pp. 421–441.
               
            
                  17)
               
               
                  Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T. (19 79), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, pp. 3780–3782.
               
            
                  18)
               
               
                  Tamura, G., Gold, C, Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961–4965.
               
            
                  19)
               
               
                  Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, pp. 285–291.
               
            
                  20)
               
               
                  Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlori-nated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85–88.
               
            
                  21)
               
               
                  Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175–177.
               
            
                  22)
               
               
                  Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, pp. 343–350.
               
            
                  23)
               
               
                  Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, pp. 83–91.
               
            
                  24)
               
               
                  Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D. J., Cambridge University Press, pp. 28–65.
               
            B.15.   MUTAGEENSUSE JA KARTSINOGEENSUSE UURING, GEENMUTATSIOON – SACCHAROMYCES CEREVISIAE
      
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.2.   MÕISTED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE
      Pärmseene Saccharomyces cerevisiae erinevaid haploidseid ja diploidseid tüvesid saab kasutada keemiliste ainete poolt põhjustatud geenmutatsioonide uurimiseks koos metabolismi aktiveerimisega või ilma.
      Haploidsete tüvede puhul on kasutusel otsemutatsiooni süsteemid, näiteks mõõtes mutatsiooni punasest, adeniinsõltuvast mutandist (ade-1, ade-2), topelt adeniinsõltuvaks valgeks mutandiks, ja selektiivsed süsteemid, nagu resistentsuse induktsioon kanavnaiinile ja tsükloheksimiidile.
      Kõige laialdasemalt tunnustatud pöördmutatsioonisüsteem hõlmab haploidse tüve XV 185-14C kasutamist, mis kannab ooker-nonsenss-mutatsioone ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 ja trp 5-48. Need mutatsioonid on pöörduvad baasasendatavate mutageenide poolt, mis indutseerivad kohaspetsiifilisi mutatsioone või ooker-supressor-mutatsioone. XV 185-14C kannab ka his 1-7 markerit, missense-mutatsiooni, mis on pöörduv peamiselt sekundaarsete mutatsioonikohtade poolt, ja hom 3-10 markerit, mis on pöörduv raaminihke mutageenide poolt.
      Diploidsete S. cerevisiae tüvede korral on ainukeseks laialdaselt kasutatavaks tüveks D7 mis on homosügootne ilv 1-92 suhtes.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Puuduvad.
      1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      Ettevalmistused
      Testitava aine ja kontrollaine lahused tuleb valmistada vahetult enne testimise alustamist, kasutades sobilikke vehiikleid. Vees mittelahustuvate orgaaniliste koostisosiste puhul ei tohiks kasutada rohkem kui 2 % orgaaniliste ainete lahustamiseks sobivaid lahusteid, näiteks etanool, atsetoon või dimetüülsulfoksiid (DMSO). Abiaine lõplik kontsentratsioon ei tohiks oluliselt mõjutada raku eluvõimet ja kasvu karakteristikuid.
      
         Metaboolne aktivatsioon
      
      Rakud tuleks eksponeerida testitavale kemikaalile nii sobivate eksogeensete metabolismi aktiveerivate süsteemide juuresolekul kui ka ilma.
      Kõige sagedamini kasutatavaks süsteemiks on kofaktor, mille koostises on eelnevalt ensüümindutseeriva ainega mõjutatud näriliste maksast saadav post-mitokondriaalne fraktsioon. Metaboolseks aktivatsiooniks võib kasutada ka teisi loomaliike, kudesid, post-mitokondriaalseid fraktsioone või protseduure.
      Uuringu tingimused
      
         Test-tüvi
      
      Geenmutatsiooni uuringutes on kõige kasutatavamad haploidne tüvi XV 185-14C ja diploidne tüvi D7. Teiste tüvede kasutamine võib olla kohane.
      
         Rakusööde
      
      Elulemuse ja mutantide arvu kindlakstegemiseks kasutatakse sobivaid rakusöötmeid.
      
         Positiivsete ja negatiivsete kontrollide kasutamine
      
      Positiivsed, töötlemata ja lahuse kontrollid tuleb teha korraga. Iga spetsiifilise mutatsioonilise tulemusnäitaja puhul tuleks kasutada sobivaid positiivse kontrolli kemikaale.
      
         Ekspositsiooni kontsentratsioon
      
      Testimisel peaks kasutama vähemalt viit piisavalt erinevat testitava aine kontsentratsiooni. Toksiliste ainete puhul ei tohiks kõrgeim testitav kontsentratsioon vähendada elulemust alla 5–10 %. Vees mittelahustuvad ained tuleks testida lahustuvuspiirini, kasutades selleks sobivaid meetodeid. Vabalt vees lahustuvate mittetoksiliste ainete puhul tuleks maksimaalne kontsentratsioon määrata üksikjuhtumite kaupa.
      
         Inkubatsiooni tingimused
      
      Alusklaase inkubeeritakse seitse päeva 28–30 oC juures pimedas.
      
         Spontaansete mutatsioonide sagedus
      
      Tuleks kasutada subkultuure, mille spontaansete mutatsioonide sagedus on aktsepteeritud normivahemikus.
      
         Replikatsioonide arv
      
      Raku eluvõime ja geenmutatsiooni poolt produtseeritud prototroofide analüüsimiseks tuleks kasutada vähemalt kolme replikatsiooni-alusklaasi iga testitava aine kontsentratsiooniväärtuse kohta. Kui kasutatakse madala mutatsioonitasemega markereid, nagu horn 3-10, tuleb alusklaaside arvu suurendada, et saada statistiliselt olulisi andmeid.
      Protseduur
      
         S.
         cerevisiae tüvede töötlus sooritatakse tavaliselt vedeltesti meetodil latentsete või paljunevate rakkudega. Algsed katsed tuleks teha paljunevate rakkudega: 1-5 x 107 rakku/ml eksponeeritakse testitavale kemikaalile kuni 18 tunni jooksul temperatuuril 28–37 oC, aeg-ajalt loksutades; piisav kogus metabolismi aktiveerivat süsteemi lisatakse töötluse käigus sobilikul ajahetkel. Töötluse lõpus rakud tsentrifuugitakse, pestakse ja külvatakse sobivale rakusöötmele. Pärast inkubatsiooni hinnatakse alusklaase rakkude elulemuse ja mutatsioonide induktsiooni osas. Kui esimene katse on negatiivne, tuleks teha teine katse, kasutades latentse faasi rakke. Kui esimene katse on positiivne, kinnitatakse see sobiva sõltumatu uuringuga.
      2.   ANDMED
      Andmed tuleks esitada tabelis, näidates loendatud kolooniate arvu, mutantide arvu, elulemuse ja mutantide sageduse. Kõik tulemused tuleks kinnitada sõltumatu uuringuga. Andmeid tuleks töödelda sobivaid statistilisi meetodeid kasutades.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  kasutatav tüvi;
               
            
                  —
               
               
                  katsetingimused: latentses faasis või paljunevad rakud, rakusöötme koostis, inkubatsiooni temperatuur ja kestus, metabolismi aktiveeriv süsteem;
               
            
                  —
               
               
                  töötluse tingimused: ekspositsiooni tase, töötluse meetod ja kestus, töötluse temperatuur, positiivsed ja negatiivsed kontrollid;
               
            
                  —
               
               
                  loendatud kolooniate arv, mutantide arv, elulemuse ja mutantide sagedus, doos/vastus suhe (kui oluline), andmete statistiline hinnang;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste arutelu;
               
            
                  —
               
               
                  järeldused.
               
            3.2.   HINNANG JA JÄRELDUSED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      4.   VIITED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      B.16.   MITOOTILINE REKOMBINATSIOON – SACCHAROMYCES CEREVISIAE
      
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.2.   MÕISTED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE
      
         Saccharomyces cerevisiae mitootilist rekombinatsiooni saab määrata geenide vahel (üldisemalt geeni ja selle tsentromeeri vahel) või geenide sees. Esimest nimetatakse mitootiliseks ristsiirdeks, mille tulemuseks on retsiprooksed produktid, teist geeni konversiooniks, mis on kõige sagedamini mitteretsiprookne. Ristsiiret analüüsitakse tavaliselt retsessiivsete homosügootsete kolooniate produktsiooni järgi või heterosügootsete tüvede poolt produtseeritud sektorite järgi. Geeni konversiooni analüüsitakse prototroofsete revertantide produktsiooni järgi, mida toodavad kahte erinevat sama geeni defektset alleeli kandvad auksotroofsed heteroalleelsed tüved. Kõige sagedamini kasutatavad tüved mitootilise geeni konversiooni kindlakstegemiseks on D4 (heteroalleelne ade 2-s ja trp 5-s), D7 (heteroalleelne trp 5-s), BZ34 (heteroalleelne arg 4-s) ja JD1 (heteroalleelne his 4-s ja trp 5-s). Mitootilist ristsiiret, mis produtseerib punaseid ja roosasid homosügootseid sektoreid, saab analüüsida D5-s või D7-s (mis mõõdavad ka mitootilist geeni konversiooni ja pöördmutatsiooni ilv 1-92-s), mõlemad tüved on heteroalleelsed ade 2 komplementaarsete alleelide osas.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Puuduvad.
      1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      Ettevalmistused
      Testitava kemikaali ja kontroll- või võrdluslahused tuleks valmistada vahetult enne testimist, kasutades sobivaid vehiikleid. Vees mittelahustuvate orgaaniliste koostisosade puhul ei tohiks kasutada rohkem kui 2 % orgaaniliste ainete lahustamiseks sobivaid lahusteid, näiteks etanool, atsetoon või dimetüülsulfoksiid (DMSO). Vehiikli lõplik kontsentratsioon ei tohiks oluliselt mõjutada raku eluvõimet ja kasvu omadusi.
      
         Metaboolne aktivatsioon
      
      Rakud tuleks eksponeerida testitavale kemikaalile nii sobiva eksogeense metabolismi aktiveeriva süsteemi juuresolekul kui ka ilma. Kõige sagedamini kasutatavaks süsteemiks on kofaktor, mille koostises on eelnevalt ensüümindutseeriva ainega mõjutatud näriliste maksast saadav post-mitokondriaalne fraktsioon. Ka teiste liikide, kudede, post-mitokondriaalsete fraktsioonide või meetodite kasutamine metaboolseks aktivatsiooniks on lubatud.
      Katsetingimused
      
         Test-tüved
      
      Kõige sagedamini kasutatavad tüved on diploidsed D4, D5, D7 ja JD1. Teiste tüvede kasutamine võib olla kohane.
      
         Rakusööde
      
      Mitootilise rekombinatsiooni ja elulemuse sageduse hindamiseks kasutatakse sobivaid rakusöötmeid.
      
         Positiivsete ja negatiivsete kontrollide kasutamine
      
      Positiivsed, mittetöödeldud ja lahusti kontrollid peaksid olema tehtud korraga. Iga spetsiifilise rekombinatsiooni tulemusnäitaja puhul tuleks kasutada sobivaid positiivse kontrolli kemikaale.
      
         Ekspositsiooni kontsentratsioonid
      
      Tuleks kasutada vähemalt viit piisavalt erinevat testitava aine kontsentratsiooni. Uuritavate faktorite hulgas peavad muu hulgas olema tsütotoksilisus ja lahustuvus. Kõige madalam kontsentratsioon ei tohi mõju avaldada raku eluvõimele. Toksiliste ainete puhul ei tohiks kõrgeim testitav kontsentratsioon vähendada elulemust alla 5–10 %. Vees mittelahustuvaid kemikaale tuleks testida lahustuvuspiirini, kasutades selleks sobivaid meetodeid. Vabalt vees lahustuvate mittetoksiliste ainete kõrgeim kontsentratsioon tuleb määrata üksikjuhtumite kaupa.
      Rakke võib eksponeerida testitavale kemikaalile kas latentses või paljunemisfaasis kuni 18 tunni jooksul. Pika töötlemisaja puhul tuleks kultuure uurida mikroskoopiliselt spooride moodustumise aspektist, spooride olemasolu tühistab testi tulemuse.
      
         Inkubatsioonitingimused
      
      Alusklaase inkubeeritakse pimedas neli kuni seitse päeva temperatuuril 28–30 oC. Alusklaase, mida kasutatakse mitootilise ristsiirde poolt produtseeritud punaste ja roosade homosügootsete sektorite analüüsimiseks, tuleks enne loendust hoida üks kuni kaks päeva külmikus (umbes 4 oC juures), mis võimaldab sobivate pigmenteeritud kolooniate tekke.
      
         Spontaanse mitootilise rekombinatsiooni sagedus
      
      Tuleks kasutada subkultuuri, mille spontaanse mitootilise rekombinatsiooni mutatsiooni sagedus on aktsepteeritud normivahemikus.
      
         Replikatsioonide arv
      
      Elulemuse ja mitootilise geenikonversiooni poolt produtseeritud prototroofide analüüsimiseks tuleks kasutada vähemalt kolme replikatsiooni-alusklaasi iga testitava aine kontsentratsiooni kohta. Mitootilise ristsiirde poolt produtseeritud retsessiivse homosügoosi analüüsimiseks tuleks alusklaaside arvu suurendada, et saada piisavat kolooniate arvu.
      Protseduur
      
         S. cerevisiae tüvede töötlus sooritatakse tavaliselt vedeltesti meetodil, kasutatakse latentseid või paljunevaid rakke. Algsed katsed tuleks teha paljunevate rakkudega. 1-5 x 107 rakku/ml eksponeeritakse testitavale kemikaalile kuni 18 tunniks temperatuuril 28–37 oC loksutades; piisav kogus metabolismi aktiveerivat süsteemi lisatakse töötluse käigus sobilikul ajahetkel.
      Töötluse lõpus rakud tsentrifugeeritakse, pestakse ja külvatakse sobivale rakusöötmele. Pärast inkubatsiooni hinnatakse alusklaase rakkude elulemuse ja mitootilise rekombinatsiooni induktsiooni osas.
      Kui esimene katse on negatiivne, tuleks teha teine katse, kasutades latentse faasi rakke. Kui esimene katse on positiivne, kinnitatakse see sõltumatu uuringuga.
      2.   ANDMED
      Andmed tuleks esitada tabelis, näidates ära loendatud kolooniate arvu, rekombinantide arvu, elulemuse ja rekombinantide sagedus.
      Tulemused tuleks kinnitada sõltumatu uuringuga.
      Andmeid tuleks töödelda sobivaid statistilisi meetodeid kasutades.
      3.   ARUANNE
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  kasutatud tüvi;
               
            
                  —
               
               
                  katsetingimused: latentse faasi või paljunevad rakud, kultuuri koostis, inkubatsiooni temperatuur ja kestus, metabolismi aktiveeriv süsteem;
               
            
                  —
               
               
                  töötluse tingimused: ekspositsiooni kontsentratsioon, meetod ja töötluse kestus, töötluse temperatuur, positiivsed ja negatiivsed kontrollid;
               
            
                  —
               
               
                  loendatud kolooniate arv, rekombinantide arv, elulemus ja rekombinantide sagedus, doosi/vastuse suhe (kui oluline), andmete statistiline hinnang;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste arutelu;
               
            
                  —
               
               
                  järeldused.
               
            3.2.   HINNANG JA JÄRELDUSED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      4.   VIITED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      B.17.   MUTAGEENSUS — IN VITRO IMETAJATE RAKKUDE GEENMUTATSIOONKATSE
      1.   MEETOD
      Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 476, In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test (1997).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      In vitro imetajate rakkude geenmutatsioonkatset saab kasutada keemiliste ainete põhjustatud geenmutatsioonide avastamiseks. Sobivate rakuliinide hulka kuuluvad hiire lümfoomirakud L5178Y, hiina hamstri rakuliinid CHO, CHO-AS52 ja V79 ning inimeste lümfoblastoidrakud TK6 (1). Kõnealustes rakuliinides enim kasutatavad geneetilised lõpp-punktid mõõdavad mutatsioone tümidiinkinaasi- (TK) ja hüpoksantiin-guaniinfosforibosüültransferaasil (HPRT) ja ksantiin-guaniinfosforibosüültransferaasil (XPRT). TK-, HPRT-ja XPRT-mutatsiooni katsed avastavad erinevaid geneetilisi juhtumeid. TK ja XPRT autosomaalne asukoht võimaldab avastada geneetilisi juhtumeid (nt suuri deletsioone), mida ei avastata X-kromosoomides HPRT-lookuses (2, 3, 4, 5, 6).
      
         In vitro imetajate rakkude geenmutatsioonkatses saab kasutada kindlakskujunenud rakuliinide või rakutüvede kultuure. Kasutatavad rakud valitakse kultuuris kasvamisvõime ja nende spontaanse mutatsioonisageduse stabiilsuse põhjal.
      Tehtud in vitro katsed üldjuhul nõuavad eksogeenset metaboolset aktiveerimist. Kõnealune metaboolse aktiveerimise süsteem ei saa tervenisti jäljendada in vivo tingimusi imetajates. Tuleks hoolikalt vältida tingimusi, mille tulemused ei peegelda neile omaseid mutageensusi. Positiivsed tulemused, mis ei peegelda omast mutageensust, võivad tekkida pH, osmolaalsuse või tsütotoksilisuse kõrgete tasemete muutuste põhjal (7).
      Kõnealust katset kasutatakse imetajate võimalike mutageenide ja kantserogeenide skriinimiseks. Mitmed ühendid, mis annavad positiivseid tulemusi kõnealuses katses, on imetajate kantserogeenid; siiski ei ole kõnealuse katse ja kantserogeensuse vahel täielikku korrelatsiooni. Korrelatsioon sõltub keemilisest aineklassist ning üha suuremal arvul esineb kantserogeene, mida ei avastata käesoleva katse abil, kuna need toimivad muude, mittegenotoksiliste mehhanismide või bakterirakkudes puuduvate mehhanismide abil (6).
      Vt ka üldist sissejuhatust B osas.
      1.2.   MÕISTED
      
         Päripidine mutatsioon: geenimutatsioon parentaalset tüüpi mutantvormist, mille tulemusena kodeeritud valk kaotab ensümaatilise aktiivsuse või seda ensümaatilist aktiivsust muudetakse.
      
         Aluspaari asendust põhjustavad mutageenid: ained, mis põhjustavad ühe või mitme aluspaari asendust DNAs.
      
         Raaminihke mutageenid: ained, mis põhjustavad ühe või mitme aluspaari lisamist või deletsiooni DNA-molekulis.
      
         Fenotüübi ekspressiooniaeg: periood, mille jooksul muutmata geeniproduktid lahkuvad äsja muteerunud rakkudest.
      
         Mutatsioonsagedus: vaadeldud mutantrakkude arv, mis on jagatud elujõuliste rakkude arvuga.
      
         Suhteline kogukasv: rakkude arvu suurenemine ajas võrrelduna rakkude kontrollpopulatsiooniga; arvutatud korrutisena, mille teguriteks on suspensioonikasv negatiivse kontrollkatse suhtes ja kloonimisefektiivsus negatiivse kontrollkatse suhtes.
      
         Suhteline suspensioonikasv: rakkude arvu suurenemine ekspressiooniperioodi jooksul võrreldes negatiivse kontrollkatsega.
      
         Elujõulisus: töödeldud rakkude kloonimisefektiivsus valiktingimustel plaatidele paigutamisel pärast ekspressiooniperioodi.
      
         Ellujäämine: töödeldud rakkude kloonimisefektiivsus plaatidele paigutamisel töötlemisperioodi lõpus; ellujäämist väljendatakse tavaliselt rakkude kontrollpopulatsiooni elujäämise suhtes.
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Rakud, millel TK+/- —> TK-/--mutatsiooni tulemusel puudub tümidiinkinaas (TK), on resistentsed pürimidiini analoogi trifluorotümidiini (TFT) tsütotoksiliste mõjude suhtes. Tümidiinkinaasi suhtes spetsiifilised rakud on tundlikud TFT-le, mis takistab rakuainevahetust ja peatab edasise raku jagunemise. Seega mutantrakud on võimelised TFT esinemise korral vohama, samal ajal kui normaalsed rakud, milles on tümidiinkinaas, ei voha. Analoogiliselt valitakse HPRT- või XPRT-defitsiidiga rakud 6-tioguaniinile (TG) või 8-asaguaniinile (AG) resistentsuse alusel. Uuritava aine omadusi tuleb hoolikalt arvesse võtta, kui testitakse selektiivainega seotud alusanaloogi või ühendit mis tahes imetajate rakkude geenimutatsiooni katsetes. Näiteks tuleb uurida uuritava aine võimalikku kahtlustatavat selektiivset toksilisust mutantsetes või mittemutantsetes rakkudes. Valikusüsteemi/aine efektiivsust tuleb kinnitada, testides selektiivainega lähedase struktuuriga kemikaale (8).
      Suspensioonis või monokihilises kultuuris olevad rakud allutatakse uuritava aine toimele, nii koos metaboolse aktiveerimisega kui ka ilma selleta, sobiva aja jooksul ning tsütotoksilisuse määramiseks külvatakse rakud ümber võimaldamaks fenotüübi avaldumist enne mutandi valikut (9, 10, 11, 12, 13). Tavaliselt määratakse tsütotoksilisus suhtelise kloonimisefektiivsuse (ellujäämise) või suhtelise rakkude kogukasvu mõõtmisega pärast töötlemisperioodi. Töödeldud katsekultuure hoitakse kasvukeskkonnas piisava aja jooksul, mis on igale valitud lookusele ja rakutüübile iseloomulik, võimaldamaks saavutatud mutatsioonide fenotüüpide avaldumist võimalikult lähedal optimaalsele tasemele. Mutatsioonisagedus määratakse teadaoleva arvu rakkude külvamisel söötmesse, mis sisaldab selektiivainet, millega avastatakse mutantrakud, ja söötmesse, milles pole selektiivainet kloonimisefektiivsuse (elujõulisuse) määramiseks. Pärast piisavat inkubatsiooniaega loendatakse kolooniad. Mutatsioonisagedus saadakse selektiivses kasvukeskkonnas olevate mutantkolooniate arvu ja mitteselektiivses keskkonnas olevate kolooniate arvu alusel.
      1.4.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.4.1.   Ettevalmistused
      1.4.1.1.   Rakud
      Käesolevas katses kasutatakse erinevaid rakutüüpe, sh L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 või TK6 rakkude subkloone. Käesolevas katses kasutatavad rakutüübid on näidanud tundlikkust keemiliste mutageenide suhtes, suurt kloonimisefektiivsust ja stabiilset spontaanset mutatsioonsagedust. Rakkudes kontrollitakse mükoplasma saastatust ja saastumise korral ei tohiks neid kasutada.
      Katsed tuleb kavandada etteantud tundlikkusest ja usaldusväärsusest lähtudes. Rakkude, kultuuride ja uuritava aine kontsentratsioonide arv peaks peegeldama neid määratletud parameetreid (14). Töötlemise järel ellu jäänud ja igas katsefaasis kasutatavate elujõuliste rakkude minimaalne arv peaks põhinema spontaansel mutatsioonsagedusel. Üldjuhendiks on see, et rakkude arv on vähemalt kümnekordse spontaanse mutatsioonsageduse pöördväärtus. On soovitatav kasutada vähemalt 106 rakku. Kasutatava rakusüsteemi kohta peab olema piisavalt varasemaid andmeid, mis viitavad katse efektiivsuse vastavusele.
      1.4.1.2.   Kasvukeskkonnad ja söötmed
      Tuleks kasutada sobivaid kasvukeskkondasid ja inkubatsioonitingimusi (kasvuanumad, temperatuur, CO2 kontsentratsioon ja niiskus). Kasvukeskkonnad tuleks valida vastavalt katses kasutatavatele valikusüsteemidele ja rakutüüpidele. On eriti tähtis, et kasvutingimused valitakse nii, et tagatakse rakkude optimaalne kasv ekspressiooniperioodi ajal ning nii mutantsete kui mittemutantsete rakkude võime moodustada kolooniaid.
      1.4.1.3.   Rakukultuuride ettevalmistamine
      Rakud paljundatakse tüvekultuuridest, mis on külvatud kasvukeskkonda ja inkubeeritud 37 oC juures. Enne käesoleva katse tegemist tuleb kultuurid puhastada varasematest mutantrakkudest.
      1.4.1.4.   Metaboolne aktiveerimine
      Rakud allutatakse uuritava aine toimele nii vastava metaboolse aktiveerimissüsteemi olemasolu kui ka puud umise korral. Enim kasutatav süsteem on ensüüme indutseerivate ainetega, nt Aroclor 1254-ga (15, 16, 17, 18) või fenobarbitooni ja β-naftoflavooni seguga (19, 20), töödeldud näriliste maksast valmistatud postmitokondriaalne osa (S9), millele on lisatud kofaktor.
      Tavaliselt kasutatakse postmitokondriaalset fraktsiooni kontsentratsioonis 1–10 mahuprotsenti lõplikus katsekeskkonnas. Metaboolse aktiveerimissüsteemi valik ja tingimused võivad sõltuda uuritava aine keemilisest aineklassist. Mõnel juhul on vaja kasutada rohkem kui üht postmitokondriaalse fraktsiooni kontsentratsiooni.
      Osade meetodite korral, sh geneetiliselt muudetud rakuliini saamine, mis ekspresseerib spetsiifilisi aktiveerimisensüüme, võib avalduda endogeense aktiveerimise võime. Kasutatavate rakuliinide valik peab olema teaduslikult põhjendatud (nt tsütokroom P450 isoensüümi tähtsus uuritava aine metabolismil).
      1.4.1.5.   Uuritav aine/ettevalmistused
      Tahked uuritavad ained tuleb lahustada või suspendeerida sobivates lahustites või kandjaainetes ja vajaduse korral lahjendada enne rakkude töötlemist. Vedelad uuritavad ained võib lisada vahetult katsesüsteemidesse ja/või lahjendada enne töötlemist. Tuleks kasutada uuritava aine värskeid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed püsivuse kohta näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav.
      1.4.2.   Katsetingimused
      1.4.2.1.   Lahusti/kandjaaine
      Lahusti/kandjaaine ei tohiks uuritava ainega keemiliselt reageerida ning see peaks sobima rakkude eluvõimelisuse ja S9 aktiivsusega. Kui kasutatakse tuntud lahustist/kandjaainest erinevat, siis peab selle kasutamine toetuma ühtesobivuse kohta käivatele andmetele. Soovitatav on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahusti/-kandjaaine kasutamist. Vees ebapüsivate ainete uurimisel kasutatavad orgaanilised lahustid peavad olema veevabad. Vett saab eemaldada molekulaarsõelte lisamisega.
      1.4.2.2.   Toimimiseks kasutatavad kontsentratsioonid
      Suurima kontsentratsiooni määramisel on arvestatavad kriteeriumid tsütotoksilisus, lahustuvus katsesüsteemis ning pH või osmolaalsuse muutused.
      Tsütotoksilisus määratakse põhikatses kindlaks nii metaboolse aktiveerimisega kui ka ilma selleta, kasutades sobivaid rakkude puhtuse ja kasvu indikaatoreid, nt suhtelist kloonimisefektiivsust (ellujäämine) või suhtelist kogukasvu. Tsütotoksilisust ja lahustuvust võib olla kasulik määrata eelkatses.
      Tuleks kasutada vähemalt nelja analüüsitavat kontsentratsiooni. Kui esineb tsütotoksilisust, peaksid need kontsentratsioonid katma vahemiku suurimast kontsentratsioonist vähimani või sellise kontsentratsioonini, mille korral mürgisus puudub; mis tavaliselt tähendab seda, et kontsentratsioonide erinevus üksteisest võib olla mitte rohkem kui vahemikus 2 kuni √10 asuv koefitsient. Kui maksimaalne kontsentratsioon põhineb tsütotoksilisusel, siis on selle tulemuseks ligikaudu 10–20 % (aga mitte vähem kui 10 %) suhteline ellujäämine (suhteline kloonimisefektiivsus) või suhteline kogukasv. Suhteliselt mittetsütotoksiliste ainete puhul peaks suurim katsekontsentratsioon olema 5 μl/ml, 5 mg/ml või 1,01 M, selle järgi, olenevalt sellest, milline neist on väikseim.
      Suhteliselt lahustumatute ainetega tehakse katseid kasvukeskkonnatingimustes kuni lahustuvuspiirini või üle selle. Lahustumatus määratakse lõplikus katsekeskkonnas, kuhu on rakud paigutatud. On kasulik hinnata lahustuvust töötlemise alguses ja lõpus, kuna katsesüsteemis võib lahustuvus töötlemise ajal muutuda rakkude, S9-seerumi jms mõjul. Lahustumatust saab avastada palja silmaga. Sadestus ei tohiks mõjutada tulemust.
      1.4.2.3   Kontrollkatsed
      Igas uuringus kasutatakse paralleelseid positiivseid ja negatiivseid (lahusti või kandjaaine) kontrollkatseid nii koos metaboolse aktiveerimisega kui ka ilma selleta. Kui kasutatakse metaboolset aktiveerimist, käsitatakse positiivse kontrollainena sellist kemikaali, mis eeldab aktiveerimist mutageense reaktsiooni saamiseks.
      Positiivsete kontrollainete näited:
      
                  Metaboolse aktiveerimise tingimus
               
               
                  Lookus
               
               
                  Aine
               
               
                  CAS nr
               
               
                  EINECSi nr
               
            
                  Eksogeense metaboolse aktiveerimise puudumine
               
               
                  HPRT
               
               
                  Etüül-metaansulfonaat
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  N-etüül-N-nitrosokarbamiid
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  TK (väikesed ja suured kolooniad)
               
               
                  Metüül-metaansulfonaat
               
               
                  66-27-3
               
               
                  200-625-0
               
            
                  XPRT
               
               
                  Etüül-metaansulfonaat
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  N-etüül-N-nitrosokarbamiid
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  Eksogeense metaboolse aktiveerimise olemasolu
               
               
                  HPRT
               
               
                  3-metüülkolantreen
               
               
                  56-49-5
               
               
                  200-276-4
               
            
                  Dimetüülnitrosoamiin
               
               
                  62-75-9
               
               
                  200-549-8
               
            
                  7,12-dimetüülbensantratseen
               
               
                  57-97-6
               
               
                  200-359-5
               
            
                  TK (väikesed ja suured kolooniad)
               
               
                  Tsüklofosfamiid
               
               
                  50-18-0
               
               
                  200-015-4
               
            
                  Tsüklofosfamiidmonohüdraat
               
               
                  6055-19-2
               
               
                   
               
            
                  Benso(α)püreen
               
               
                  50-32-8
               
               
                  200-028-5
               
            
                  3-metüülkolantreen
               
               
                  56-49-5
               
               
                  200-276-5
               
            
                  XPRT
               
               
                  Dimetüülnitrosoamiin (S9 kõrge taseme jaoks)
               
               
                  62-75-9
               
               
                  200-549-8
               
            
                  Benso(α)püreen
               
               
                  50-32-8
               
               
                  200-028-5
               
            Muid sobivaid positiivse kontrolli võrdlusaineid võib kasutada nt siis, kui laboril on andmebaas 5-bromo-2'-desoksüuridiini kohta (CASi nr 59-14-3, EINECSi nr 200-415-9), siis võib samuti kasutada kõnealust võrdlusainet. Lähedasse keemilisse aineklassi kuuluvate positiivsete kontrollkemikaalide kasutamist tuleks kaaluda, kui selline aine on kättesaadav.
      Negatiivsed kontrollid, mis koosnevad üksnes kasvukeskkonnas olevast lahustist või kandjaainest ning mida on käsitletud samal viisil kui katserühma, peaksid sisalduma. Lisaks sellele käsitletakse ka manustamata kontrollaineid, välja arvatud juhul, kui varasemad andmed kontrollaine kohta näitavad, et valitud lahustil ei ole kahjulikke ega mutageenseid mõjusid.
      1.4.3.   Menetlus
      1.4.3.1.   Vastuvõtlikkus uuritavale ainele
      Rakukultuure manustatakse uuritavale ainele koos metaboolse aktiveerimisega ja ilma selleta. Manustamisaeg peab olema sobiv (efektiivne aeg on tavaliselt 3–6 tundi). Manustamist võidakse jätkata ühe või mitme rakutsükli jooksul.
      Igal uuritaval kontsentratsioonil võib kasutada kas kahte paralleelset või ühte kultuuri. Kui kasutatakse üksikkultuure, peaks kontsentratsioonide arv tõusma, et tagada analüüsitavate kultuuride piisav arv (nt vähemalt 8 analüüsitavat kontsentratsiooni). Tuleks kasutada paralleelseid negatiivseid (lahusti) kontrollkultuure.
      Gaasilisi või lenduvaid aineid uuritakse sobiva meetodi abil, näiteks suletud kasvuanumates (21, 22).
      1.4.3.2.   Ellujäämise, elujõulisuse ja mutatsioonisageduse mõõtmine
      Manustamisperioodi lõpus rakud pestakse ja kultiveeritakse ellujäämise määramiseks ja mutantse fenotüübi avaldumise võimaldamiseks. Tsütotoksilisuse suhtelise kloonimisefektiivsuse (ellujäämise) või suhtelise rakkude kogukasvu mõõtmise määramine algatatakse tavaliselt pärast manustamisperioodi.
      Iga lookus on kindlaksmääratud minimaalse ajaga, et värskelt põhjustatud mutantide fenotüüpide avaldumine oleks lähedal optimaalsele (HPRT ja XPRT eeldab vähemalt 6–8 päeva ja TK vähemalt kahte päeva). Rakud kasvatakse selektiivse(te) aine(te)ga söötmes mutantide arvu ja ilma selektiivse(te) aine(te)ta söötmes kloonimisefektiivsuse määramiseks. Elujõulisuse mõõtmine (kasutatakse mutatsioonisageduse arvutamiseks) algatatakse avaldumisaja lõpus, asetades rakke mitteselektiivsesse söötmesse.
      Kui uuritav aine on positiivne L5178Y TK+/- katses, tuleks kolooniate arv määrata vähemalt ühes uuritavas kultuuris (suurim positiivne kontsentratsioon) ning negatiivsetes ja positiivsetes kontrollides. Kui uuritav aine on negatiivne L5178Y TK+/- katses, tuleks kolooniate arv määrata negatiivsetes ja positiivsetes kontrollides. Uurimustes, kus kasutatakse TK6TK+/-, võidakse samuti kolooniate arvu määrata.
      2.   ANDMED
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE
      Tulemuste hulgas peaksid olema tsütotoksilisuse ja elujõulisuse määramine, kolooniate arv ja mutatsioonisagedused katse- ja kontrollkultuuride kohta. L5178Y TK+/- katse positiivse vastuse korral loendatakse kolooniad, kasutades selles väikeste või suurte kolooniate kriteeriume uuritava aine vähemalt ühel kontsentratsioonil (suurim positiivne kontsentratsioon) ning negatiivses ja positiivses kontrollis. Nii suurte kui ka väikeste kolooniate mutantide molekulaarset ja tsütogeenilist olemust on uuritud täpsemalt (23, 24). TK+/- katses loendatakse kolooniad, kasutades normaalse kasvuga (suurte) ja aeglase kasvuga (väikeste) kolooniate kriteeriumeid (25). Mutantsed rakud, millel on kõige ulatuslikum geneetiline kahjustus, on pikendanud kahekordistumise aega ja seetõttu moodustavad väikeseid kolooniaid. Kõnealune kahjustus ulatub tüüpiliselt kogu geeni kaotamisest kuni karüotüüpiliselt nähtavate kromosoomide aberratsioonideni. Väikese koloonia mutantide moodustamine on seotud keemiliste ainetega, mis põhjustavad suuri kromosoomaberratsioone (26). Vähem tõsiselt mõjutatud mutantrakud kasvavad kiirusel, mis on sarnane parentaalsete rakkudega ja moodustavad suuri kolooniaid.
      Ellujäämine (suhtelised kloonimisefektiivsused) või suhteline kogukasv on ära toodud. Mutatsioonisagedust väljendatakse mutantrakkude arvuga ellujäänud rakkude arvu kohta.
      Tulemused esitatakse iga üksiku kultuuri kohta. Lisaks esitatakse kokkuvõte kõikidest tulemustest tabeli kujul.
      Selget positiivset vastust ei ole vaja kontrollida. Ebaselgeid tulemusi tuleks selgitada täiendaval uurimisel meelepäraselt muudetud katsetingimustes. Negatiivseid tulemusi kinnitatakse igal üksikjuhul eraldi. Neil juhtudel, kui negatiivsete tulemuste kinnitamist ei peeta vajalikuks, esitatakse põhjendus. Katse parameetrite muutmist hinnatud tingimuste vahemiku suurendamiseks tuleks arvesse võtta ebaselgete või negatiivsete tulemuste järelkatsetel. Katse selliste parameetrite, mida võidakse muuta, hulka kuuluvad kontsentratsioonivahemik ja metaboolse aktiveerimise tingimused.
      2.2.   TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE
      On mitmeid kriteeriume positiivse tulemuse määramiseks, nagu nt mutatsioonisageduse kontsentratsiooniga seotud suurenemine või paljundamine. Tulemuste bioloogilist tähtsust tuleks esmalt arvesse võtta. Statistilisi meetodeid võidakse kasutada abivahendina katsetulemuste hindamisel. Statistiline olulisus ei saa olla ainus määrav tegur positiivse vastuse jaoks.
      Uuritavat ainet, mille puhul tulemused ei vasta eespool toodud kriteeriumidele, peetakse mittemutageenseks aineks käesolevas katses.
      Kuigi enamikul katsetest on selged positiivsed või negatiivsed tulemused, välistavad saadud tulemused harvadel juhtudel kindlate otsuste tegemise uuritava aine aktiivsuse kohta. Tulemused jäävad ebaselgeks või küsitavaks tehtud katsete kordamisest sõltumata.
      Positiivsed tulemused in vitro imetajate rakkude geenmutatsiooni katses viitavad sellele, et uuritav aine põhjustab geenmutatsioone kasutatud kultiveeritud imetajate rakkudes. Paljundatav positiivne kontsentratsiooni ja toime suhe on kõige tähelepanuväärsem. Negatiivsed tulemused viitavad sellele, et katsetingimuste põhjal ei põhjusta uuritav aine geenmutatsioone kasutatud kultiveeritud imetajate rakkudes.
      3.   ARUANDLUS
      KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Lahusti/kandjaaine:
                  
                              —
                           
                           
                              kandjaaine/lahusti valiku põhjendamine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandjaaines, kui on teada.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rakud:
                  
                              —
                           
                           
                              rakkude tüüp ja allikas;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rakukultuuride arv;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              raku passaažide arv, vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rakukultuuri säilitamise meetodid, vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mükoplasma puudumine.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              kontsentratsioonide ja rakukultuuride arvu valimise põhimõtted, sh nt tsütotoksilisuse andmed ja lahustuvuse piirangud, kui need on olemas;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kasvukeskkonna koostis, CO2 kontsentratsioon;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine kontsentratsioon;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lisatud kandjaaine ja uuritava aine hulk;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubatsioonitemperatuur;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubatsiooniaeg;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              manustamise kestus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rakutihedus manustamise ajal;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metaboolse aktiveerimise süsteemi tüüp ja koostis, sh selle heakskiitmise kriteeriumid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              positiivsed ja negatiivsed kontrollid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              avaldumisperioodi pikkus (sh külvatud rakkude arv, subkultuurid ja söötmiskavad, vajaduse korral);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              selektiivsed ained;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kriteeriumid, mille alusel uurimusi liigitatakse positiivseteks, negatiivseteks või ebaselgeteks;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              meetodid elujõuliste ja mutantrakkude loendamiseks;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kolooniate kindlakstegemine, kus kolooniate arvu ja tüüpi võetakse arvesse (sh „väikeste” ja „suurte” kolooniate kriteeriumid, vajaduse korral).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              toksilisuse tunnused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sadestuse tunnused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              teave pH ja osmolaalsuse kohta uuritavale ainele vastuvõtlikkuse ajal, kui see on määratud;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              koloonia suurus, kui see on arvutatud vähemalt negatiivsetest ja positiivsetest kontrollidest;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              labori valmisolek väikeste mutantide kolooniate avastamiseks L5178Y TK+/- süsteemi abil, vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              doosi ja toime suhe, võimaluse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              võimalikud statistilised analüüsid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              paralleelsete negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kontrollide tulemused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              varasemate negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kontrollide andmed, sh vahemikud, keskväärtused ja standardhälbed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mutatsioonisagedus.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutelu.
               
            
                   
               
               
                  Järeldused.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  Moore, M. M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J. and Tindal, K. R. (eds.) (1987), Banbury Report 28; Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
               
            
                  2)
               
               
                  Chu, E. H. Y. and Mailing H. V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, pp. 1306–1312.
               
            
                  3)
               
               
                  Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res. 94, pp. 467–485.
               
            
                  4)
               
               
                  Moore, M. M., Harington-Brock, K., Doerr, C. L. and Dearfield, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 4, pp. 394–403.
               
            
                  5)
               
               
                  Aaron, C. S., and Stankowski, Jr. L. F., (1989), Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates, Mutation Res. 223, pp. 121–128.
               
            
                  6)
               
               
                  Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res. 312, pp. 235–239.
               
            
                  7)
               
               
                  Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res. 257, pp. 147–204.
               
            
                  8)
               
               
                  Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavournin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, pp. 225–251.
               
            
                  9)
               
               
                  Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U. S. Environmental Protections Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 196, pp. 17–36.
               
            
                  10)
               
               
                  Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., ÓNeill, J. P., Riddle, J. C, Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, pp. 135–141.
               
            
                  11)
               
               
                  Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res., 216, pp. 9–17.
               
            
                  12)
               
               
                  Stankowski, L. F. Jr., Tindal, K. R., and Hsie, A. W. (1986), Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate – and ICR 191 -Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate – and lCR 191 Induced Mutation in AS52 Cells, Mutation Res., 160, pp. 133–147.
               
            
                  13)
               
               
                  Turner, N. T, Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedure for the L5178Y/TK+/„— TK+/" Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239–268.
               
            
                  14)
               
               
                  Ariett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith S. C. (1989), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., ed., Cambirdge University Press, pp. 66–101.
               
            
                  15)
               
               
                  Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccoro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res. 46, pp. 365–373.
               
            
                  16)
               
               
                  Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res. 31, pp. 347–364.
               
            
                  17)
               
               
                  Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson A. G. and Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of the L5178Y/TK+'” – Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutat. Res. 59, pp. 61–108.
               
            
                  18)
               
               
                  Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res. 113, pp. 173–215.
               
            
                  19)
               
               
                  Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in: In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis 7, pp. 175–177.
               
            
                  20)
               
               
                  Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polycholri-nated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85–88.
               
            
                  21)
               
               
                  Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Ticc, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91–103.
               
            
                  22)
               
               
                  Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795–801.
               
            
                  23)
               
               
                  Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 51–55.
               
            
                  24)
               
               
                  Moore, M. M., Clive, D. Hozier, J. C, Howard, B. E., Batson, A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluoronthymidine, Resistant (TFT+) Mutants of L5178Y/TK+'" – Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res. 151, pp. 161–174.
               
            
                  25)
               
               
                  Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res. 229, pp. 89–102.
               
            
                  26)
               
               
                  Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+'" – 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis, 5, pp. 609–614.
               
            B.18.   DNA KAHJUSTAMINE JA PARANDAMINE – PLAANIVÄLINE DNA SÜNTEES – IMETAJATE RAKKUDEL IN VITRO
      
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.2.   MÕISTED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Plaanivälise DNA sünteesi (PDS) test mõõdab DNA reparatiivset sünteesi pärast keemiliste ja füüsikaliste tegurite poolt kahjustatud DNA segmendi väljalõikamist. Test põhineb triitiumiga märgistatud tümidiini (3H-TdR) sisestamisel sünteesifaasis (S) mitte oleva imetajaraku DNAsse. Radioaktiivse tümidiini (3H-TdR) seondumist töödeldud rakkude DNAga võib määrata autoradiograafiliselt või vedelik-stsintillatsiooniloenduri (VSL) abil. Imetajarakkude kultuuri, juhul kui ei kasutata primaarseid roti hepatotsüüte, töödeldakse uuritava ainega nii ilma kui ka koos eksogeense metaboolse aktivatsioonisüsteemiga. PDSi võib mõõta ka in vivo süsteemides.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Puuduvad.
      1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      Ettevalmistused
      Analüüsis kasutamiseks tuleb uuritavad kemikaalid ja kontroll- või võrdlusained valmistada söötmes või suspendeerida vastavatesse lahustitesse ja seejärel lahustada söötmes. Lahuse lõppkontsentratsioon ei tohiks mõjutada rakkude eluvõimelisust.
      Analüüsiks võib kasutada roti hepatotsüütide primaarkultuuri, inimese lümfotsüüte või püsiliini rakke (nt inimese diploidseid fibroblaste).
      Rakke tuleb eksponeerida uuritavale kemikaalile nii vastava metaboolse aktivatsioonisüsteemi olemasolul kui ka ilma selleta.
      Katsetingimused
      
         Rakukultuuride arv
      
      Igas eksperimendi lõigus on vajalikud vähemalt kaks rakukultuuri autoradiograafia jaoks ja kuus kultuuri (või vähem, kui see on teaduslikult põhjendatud) VSLi abil PDSi määramise jaoks.
      
         Negatiivsete ja positiivsete kontrollide kasutamine
      
      Igasse eksperimenti peaks olema kaasatud sobiv positiivne ja negatiivne (töötlemata ja/või lahusti) kontroll nii aktivatsioonisüsteemi olemasolu korral kui ka ilma selleta.
      Positiivseteks kontrollideks roti hepatotsüütide analüüsil võivad olla näiteks kas 7,12-dimetüülbensatratseen (7,12-DMBA) või 2-atsetüülaminofluoreen (2-AAF). Püsiliini rakkude puhul võib 4-nitrokinoliin-N-oksiid (4-NQO) olla positiivseks kontrolliks nii autoradiograafia kui ka VSLi analüüsi puhul, mis tehakse ilma metaboolse aktivatsioonita; N-dimetüülnitroosamiin on positiivse kontrolli näiteks sel juhul, kui kasutatakse metaboolset aktivatsioonisüsteemi.
      
         Kasutatavad kontsentratsioonid
      
      Kasutada tuleb uuritava aine palju erinevaid kontsentratsioone piirides, mis võimaldaksid välja selgitada selle aine toime. Kõige kõrgem kontsentratsioon peaks esile kutsuma mõningaid tsütotoksilisi toimeid. Vees suhteliselt halvasti lahustuvaid ühendeid tuleks uurida kuni nende veeslahustuvuse piirini. Vabalt vees lahustuvate mittetoksiliste kemikaalide ülemine testitav piirikontsentratsioon tuleb määrata igal üksikjuhul eraldi.
      
         Rakud
      
      Säilituskultuurides tuleb kasutada sobivat söödet, CO2 kontsentratsiooni ja temperatuuri. Püsiliini rakke tuleb perioodiliselt kontrollida mükoplasmaga kontamineerituse suhtes.
      
         Metaboolne aktiveerimine
      
      Metaboolse aktivatsiooni süsteemi ei kasutata hepatotsüütide primaarkultuuris. Püsiliini rakkude ja lümfotsüütide puhul eksponeeritakse neid uuritavale ainele nii vastava metaboolse aktivatsiooni süsteemi olemasolu korral kui ka selle puudumisel.
      Protseduur
      
         Rakukultuuride valmistamine
      
      Püsiliini rakud saadakse tüvikultuurist (nt selle trüpsiniseerimisel või lahtiraputamisel), külvatakse kultiveerimisnõusse vastaval tihedusel ja inkubeeritakse + 37 oC juures.
      Roti hepatotsüütide lühiajalised kultuurid saadakse, kui värskelt üksteisest eraldatud hepatotsüütidel lastakse vastavas söötmes kinnituda kasvupinnasele.
      Inimese lümfotsüütide kultuurid valmistatakse selleks ette nähtud viisil.
      
         Rakukultuuride töötlemine uuritavate ainetega
      
      Primaarsed roti hepatotsüüdid
      Värskelt isoleeritud roti hepatotsüüte töödeldakse uuritava ainega ettenähtud aja jooksul radioaktiivset tümiini 3H-TdR sisaldavas söötmes. Töötluse lõpus eemaldatakse rakkudelt sööde, nad loputatakse, fikseeritakse ja kuivatatakse. Alusklaasid kastetakse kiirgustundlikku vedelasse emulsiooni (alternatiivselt võib kasutada kile-emulsiooni), eksponeeritakse, ilmutatakse, värvitakse ja loendatakse.
      Püsiliini rakud ja lümfotsüüdid
      Autoradiograafilised tehnikad: pärast töötlemist 3H-TdR-ga allutatakse rakukultuurid ettenähtud ajaks uuritava aine toimele. Toimeaja kestus sõltub aine omadustest, metaboolsete süsteemide aktiivsusest ja rakutüübist. Et kindlaks määrata PDSi maksimaaltulemust, tuleks 3H-TdR-i lisada kas samal ajal uuritava ainega või mõne minuti jooksul pärast kokkupuudet uuritava ainega. Protseduuri valikut mõjutab võimalik koosmõju uuritava aine ja 3H-TdR-i vahel. Selleks, et eristada PDSi semikonservatiivsest DNA replikatsioonist, võib viimase inhibeerida näiteks kas arginiin-defitsiitset söödet, madala seerumisisaldusega või hüdroksüuureat sisaldavat rakukultuuri söödet kasutades.
      PDSi mõõtmine VSLi abil: enne uuritava ainega töötlemist tuleb blokeerida rakkude sisenemine S-faasi, nagu ülalpool kirjeldatud; seejärel tuleb rakke eksponeerida testitavale kemikaalile nagu autoradiograafia puhul. Inkubatsiooniaja lõpus tuleb DNA rakkudest eraldada ja määrata kogu DNA hulk ning 3H-TdR-ga liitumise ulatus.
      Tuleb märkida, et kui ülalkirjeldatud meetodi puhul kasutatakse inimese lümfotsüüte, siis ei ole stimuleerimata kultuurides semi-konservatiivse DNA replikatsiooni mahasurumine vajalik.
      Analüüs
      
         
            Autoradiograafilised määramised
         
      
      PDSi määramisel rakukultuuris S-faasis olevaid rakutuumi ei loendata. Iga erineva kontsentratsiooni kohta tuleb loendada vähemalt 50 rakku. Alusklaasid tuleb enne loendamist kodeerida. Igal alusklaasil tuleb loendada mitu eraldi asetsevat juhuslikult valitud välja. Seondunud 3H-TdR-i kogus tsütoplasmas tuleb määrata, loendades igas loendatava raku tsütoplasmas kolm rakutuuma suurust ala.
      
         VSLi määramised
      
      VSLi PDSi määramisel tuleb kasutada iga erineva kontsentratsiooni ja kontrolli puhul adekvaatset kultuuride arvu.
      Kõiki andmeid tuleb kinnitada sõltumatu katsega.
      2.   ANDMED
      Andmed tuleb esitada tabelina.
      2.1.   AUTORADIOGRAAFILISED MÄÄRAMISED
      
         3H-TdR-i tsütoplasmasse seondumise ulatus ja rakutuumalt leitud hõbedaterade arv tuleb eraldi registreerida.
      
         3H-TdR-i tsütoplasmaga seondumuse ulatuse ja tuuma kohta tuleva hõbedaterade arvu kirjeldamiseks võib kasutada keskmist näitajat, mediaani ja moodväärtust.
      2.2.   VSLI MÄÄRAMISED
      VSLi määramisteks tuleb 3H-TdR-i seondumist väljendada kui dpm/μg DNA. Seondumise jaotuse kirjeldamiseks võib kasutada näitajat keskmine dpm/μg DNA koos standardhälbega.
      Andmeid tuleb hinnata vastavaid statistilisi meetodeid kasutades.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  kasutatud rakud, tihedus ja külvi number töötluse ajal, rakukultuuride arv;
               
            
                  —
               
               
                  rakukultuuride säilitamiseks kasutatud meetodid, sealhulgas rakkude sööde, temperatuur ja CO2 kontsentratsioon;
               
            
                  —
               
               
                  uuritav aine, lahusti, kontsentratsioonid ja analüüsiks kasutatud kontsentratsioonide valiku põhjendus;
               
            
                  —
               
               
                  metaboolsete aktivatsioonisüsteemide detailid;
               
            
                  —
               
               
                  töötluste kava;
               
            
                  —
               
               
                  positiivsed ja negatiivsed kontrollid;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud autoradiograafilised meetodid;
               
            
                  —
               
               
                  rakkude S-faasi mineku blokeerimiseks kasutatud meetodid;
               
            
                  —
               
               
                  DNA eraldamiseks ja DNA koguhulga määramiseks VSLiga kasutatud tehnikad;
               
            
                  —
               
               
                  kus võimalik, anda doosi/vastuse suhe;
               
            
                  —
               
               
                  statistiline hinnang;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste arutelu;
               
            
                  —
               
               
                  järeldused.
               
            3.2.   HINNANG JA JÄRELDUSED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      4.   VIITED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      B.19.   ÕDEKROMATIIDI VAHETUSE IN VITRO ANALÜÜS
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.2.   MÕISTED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE
      Õdekromatiidi vahetuse (ÕKV) analüüs on lühiajaline test retsiprooksete DNA vahetuste kindlakstegemiseks kahe õdekromatiidi vahel duplitseeruvas kromosoomis. ÕKV väljendab DNA replikatsiooniproduktide väljavahetamist ilmselt homoloogsetes lookustes. Eeldatavasti sisaldab see vahetusprotsess DNA ahela lõhkumist ja uuesti ühendamist, ehkki tema molekulaarsest olemusest on vähe teada. ÕKV määramine nõuab õdekromatiidide erinevat märgistamist, mida võib teha bromodeoksüuridiini (BrdU) sisestamisega kromosomaalsesse DNAsse kahes rakutsüklis.
      Imetajate rakud eksponeeritakse testitavale kemikaalile nii koos imetajate eksogeense metaboolse aktivatsioonisüsteemiga kui ka ilma selleta ja kultiveeritakse kahe replikatsiooni vältel BrdU-d sisaldavas meediumis. Pärast töötlust spindel-inhibiitoriga (nt kolhitsiin), et akumuleerida rakke mitoosi metafaasi staadiumis (c-metafaasis), rakud külvatakse ja kromosoomid prepareeritakse.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Puuduvad.
      1.6.   UURINGUMEETODI KIRJELDUS
      Ettevalmistused
      
                  —
               
               
                  Selles analüüsis võib kasutada primaarkultuure (inimese lümfotsüüte) või püsiliini rakke (nt hiina hamstri munasarja rakke). Püsiliini rakukultuure tuleb kontrollida mükoplasmaga kontamineerumise suhtes.
               
            
                  —
               
               
                  Kasutada tuleks sobivat söödet ja inkubeerimise tingimusi (nt temperatuur, kultiveerimisnõud, CO2 kontsentratsioon ja niiskus).
               
            
                  —
               
               
                  Uuritavad ained võib ette valmistada söötmes või suspendeerida nad vastavatesse lahustitesse enne rakkude töötlemist. Lahusti lõppkontsentratsioon rakukultuuris ei tohiks oluliselt mõjutada rakkude eluvõimelisust ega kasvukiirust ja selle mõju ÕKV sagedusele tuleb jälgida lahustiga kontrollis.
               
            
                  —
               
               
                  Rakke tuleb eksponeerida uuritavale ainele nii eksogeense imetajate metaboolse aktivatsioonisüsteemi olemasolu kui ka selle puudumise korral. Kui kasutatakse sisemist metaboolset aktiivsust omavaid rakutüüpe, peab selle aktiivsuse kiirus ja olemus olema vastavuses testitava kemikaalide klassi omadustega.
               
            Katsetingimused
      
         Rakukultuuride arv
      
      Igas eksperimendi lõigus tuleb kasutada vähemalt kahte kultuuri.
      
         Negatiivsete ja positiivsete kontrollide kasutamine
      
      Positiivseid kontrolle peab kaasama igasse katsesse, kasutades nii otseselt toimivat ühendit kui metaboolset aktiveerimist vajavat ühendit, ja samuti tuleb kontrollina kasutada lahustit.
      Järgnevalt on näitena ära toodud ained, mida võiks kasutada positiivsete kontrollidena:
      
                  —
               
               
                  otseselt toimiv ühend:
                  
                              —
                           
                           
                              etüülmetaansulfonaat;
                           
                        
            
                  —
               
               
                  kaudselt toimiv ühend:
                  
                              —
                           
                           
                              tsüklofosfamiid.
                           
                        
            Sobivuse korral võib kasutada ka täiendavat positiivset kontrolli samast kemikaalide klassist, kust pärineb uuritav kemikaal.
      
         Testimiseks kasutatavad kontsentratsioonid
      
      Tuleks kasutada vähemalt kolme erinevat uuritava aine kontsentratsiooni. Kõige suurem kontsentratsioon peaks esile kutsuma olulise toksilise efekti, võimaldades samal ajal rakkudel siiski normaalselt jaguneda. Vees suhteliselt halvasti lahustuvaid aineid tuleks testida kuni lahustuvuse piirini, kasutades selleks sobivaid protseduure. Vabalt vees lahustuvate mittetoksiliste kemikaalide ülemine testitav piirikontsentratsioon tuleb määrata igal üksikjuhul eraldi.
      Protseduur
      
         Rakukultuuride valmistamine
      
      Püsiliini rakud saadakse tüvikultuurist (nt selle trüpsiniseerimisel või lahtiraputamisel), külvatakse kultiveerimisnõusse vastaval tihedusel ja inkubeeritakse 37 oC juures. Ühekihiliste rakukultuuride saamiseks peab olema rakkude arv kultiveerimisnõus viidud vastavusse nii, et kultuuride konfluentsus ei oleks külvamise ajal üle 50 %. Teiseks võimaluseks on rakkude kasvatamine suspensioonis. Inimese lümfotsüütide kultuurid valmistatakse hepariniseeritud verest vastavat tehnikat kasutades ja inkubeeritakse 37 oC juures.
      
         Töötlemine
      
      Eksponentsiaalse kasvu faasis olevaid rakke töödeldakse ettenähtud aja jooksul uuritava ainega. Enamikul juhtudest võib 1–2 tundi olla piisav, kuid teatud juhtudel võib töötluse aeg ulatuda kuni kahe täieliku rakutsüklini. Rakud, millel puudub metaboolne aktiivsus, tuleb allutada testitavate kemikaalide toimele, tehes seda nii vastava metaboolse aktivatsioonisüsteemi olemasolu korral kui ka selle puudumisel. Kokkupuuteaja lõpus pestakse rakud uuritavast ainest puhtaks ja kultiveeritakse BrdU juuresolekul kahe replikatsioonitsükli ajaks. Teiseks võimaluseks on rakkude samaaegne kokkupuude uuritava aine ja BrdU-ga kahe rakutsükli vältel.
      Inimese lümfotsüütide kultuure töödeldakse semisünkroonse seisundi ajal.
      Rakke analüüsitakse pärast töötlust aset leidva teise jagunemise ajal, tagades nii kõige tundlikumate rakutsükli staadiumide eksponeerituse kemikaalile. Kõiki kultuure, kuhu on lisatud BrdU, tuleb töödelda pimedas või hämaras hõõglambi valguses kuni rakkude külvamiseni, et viia miinimumini BrdU-d sisaldava DNA fotolüüs.
      
         Rakkude külvamine
      
      Üks kuni neli tundi enne külvamist töödeldakse rakukultuure spindel-inhibiitoriga (nt kolhitsiin). Iga kultuur külvatakse ja töödeldakse kromosoomide prepareerimiseks eraldi.
      
         Kromosoomide prepareerimine ja värvimine
      
      Kromosoomide prepareerimiseks kasutatakse standardseid tsütogeneetilisi meetodeid. Preparaate võib ÕKV näitamiseks värvida mitmel meetodil (nt fluorestsents pluss Giemsa meetod).
      
         Analüüs
      
      Analüüsitavate rakkude arv peab põhinema ÕKV spontaanse kontrolli sagedusel. Tavaliselt analüüsitakse ÕKV kindlakstegemiseks vähemalt 25 hästi väljakujunenud metafaasi kultuuri kohta. Alusklaasid kodeeritakse enne analüüsi. Inimese lümfotsüütide puhul analüüsitakse vaid 46 tsentromeeri sisaldavaid metafaase. Püsiliini rakkude puhul analüüsitakse modaalarvust ainult ± 2 tsentromeeri sisaldavaid metafaase. Tuleb ära näidata, kas tsentromeerse märgistuse lülitumist loetakse ÕKVks või ei. Tulemusi tuleb kinnitada sõltumatu katsega.
      2.   ANDMED
      Andmed tuleb esitada tabelis. ÕKVde arv iga metafaasi kohta ja ÕKVde arv kromosoomi kohta igas metafaasis tuleb märkida eraldi kõigi töödeldud ja kontrollkultuuride kohta.
      Andmeid tuleb hinnata vastavate statistiliste meetoditega.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  kasutatud rakud, rakukultuuride säilitamise meetodid;
               
            
                  —
               
               
                  katsetingimused: söötme koostis, CO2 kontsentratsioon, uuritava aine kontsentratsioon, kasutatud lahusti, inkubeerimise temperatuur, töötluse aeg, kasutatud tuumakäävi inhibiitor, selle kontsentratsioon ja sellega töötlemise kestus, kasutatud imetajate aktivatsioonisüsteemi tüüp, positiivsed ja negatiivsed kontrollid;
               
            
                  —
               
               
                  rakukultuuride arv igas katse lõigus;
               
            
                  —
               
               
                  mikroskopeeritavate preparaatide valmistamise tehnika üksikasjad;
               
            
                  —
               
               
                  analüüsitud metafaaside arv (andmed iga kultuuri kohta eraldi);
               
            
                  —
               
               
                  keskmine ÕKV arv raku ja kromosoomi kohta (andmed iga kultuuri kohta eraldi);
               
            
                  —
               
               
                  kriteeriumid ÕKV hindamiseks;
               
            
                  —
               
               
                  annuste valiku põhjendus;
               
            
                  —
               
               
                  võimaluse korral anda annuse/vastuse reaktsiooni suhe;
               
            
                  —
               
               
                  statistiline analüüs;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste arutelu;
               
            
                  —
               
               
                  järeldused.
               
            3.2.   HINNANG JA JÄRELDUSED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      4.   VIITED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      B.20.   SUGULIITELISE RETSESSIIVSE LETAALSUSE TEST ÄÄDIKAKÄRBSEL DROSOPHILA MELANOGASTER
      
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.2.   MÕISTED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE
      Suguliitelise retsessiivse letaalsuse (SLRL) test äädikakärbsel Drosophila melanogaster teeb kindlaks nii punktmutatsioonide kui ka väikeste deletsioonide esinemise putuka idurakkudes. See test kujutab endast otsemutatsioonide analüüsi, skriinides mutatsioone ligi kaheksasajas X-kromosoomi lookuses, esindades kuni 80 % kõikidest X-kromosoomi lookustest. X-kromosoom esindab ligikaudu ühte viiendikku tervest haploidsest genoomist.
      X-kromosoomi mutatsioonid väljenduvad fenotüüpselt Drosophila melanogaster’i isasel, kes kannab mutantset geeni. Kui mutatsioon on hemisügootses olekus letaalne, siis tema esinemine järeldub ühe klassi isaste järglaskonna puudumisest kahe asemel, mida tavaliselt produtseerib heterosügootne emane. SLRL test võimaldab neid fakte tuvastada spetsiaalselt markeeritud ja korraldatud kromosoomide abil.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Puuduvad.
      1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      Ettevalmistused
      
         Kärbseliinid
      
      Võib kasutada isaseid hästi eristatavast metsiktüübist ja Muller-5 liini emaseid. Samuti võib kasutada teiste liinide vastavalt markeeritud emaseid, kellel esinevad mitmekordselt inverteerunud X-kromosoomid.
      
         Uuritav aine
      
      Uuritavad ained tuleb vees lahustada. Vees mittelahustuvaid aineid võib lahustada või suspendeerida vastavates lahustites (nt etanooli ja Tween-60 või 80 segus) ning vahetult enne kasutamist lahustatakse nad vees või soolalahuses. Lahustina ei tohi kasutada dimetüülsulfoksiidi (DMSO).
      
         Loomade arv
      
      Test tuleb planeerida ettemääratud tundlikkuse ja võimsusega. Spontaansete mutatsioonide sagedus vastaval kontrollil mõjutab tugevalt töödeldavate ja analüüsimisele kuuluvate kromosoomide arvu.
      
         Manustamisviis
      
      Aineid võib loomadele manustada kas suukaudselt, süstevedelikuga või eksponeerides neid selle aine gaasidele või aurudele. Testitavat ainel võib kärbestele sisse sööta koos suhkrulahusega. Vajaduse korral võib uuritavad ained lahustada 0,7 % NaCl lahuses ja süstida rindmikku või tagakehasse.
      
         Negatiivsete ja positiivsete kontrollide kasutamine
      
      Kasutada negatiivseid (lahusti) ja positiivseid kontrolle. Kui on aga olemas vastavad eelnevad laboratoorsed andmed kontrollide kohta, ei ole samaaegseid kontrolle vaja.
      
         Ekspositsiooni tasemed
      
      Kasutada kolme ekspositsiooni taset. Uuritava aine esialgseks hindamiseks võib kasutada ühte ekspositsiooni taset, mis oleks kas maksimaalne talutav kontsentratsioon või mis tekitaks juba mõningast toksilisust. Mitte-toksiliste ainete puhul tuleks kasutada praktikas kasutatavat maksimaalset kontsentratsiooni.
      
         Protseduur
      
      Metsiktüüpi isaseid (kolm kuni viis päeva vanad) töödeldakse uuritava ainega ja paaritatakse individuaalselt liias olevate eelnevalt paaritamata Muller-5 liini või mõne muu vastavalt markeeritud (mitmekordselt inverteeritud X-kromosoomidega) liini emastega. Paaritatud emased asendatakse noorte veel paaritamata emastega iga kahe kuni kolme päeva järel, et kogu idurakkude tsükkel saaks kaetud. Nende emaste järglaskonna põhjal hinnatakse letaalseid efekte, mis vastavad küpsete spermatosoidide mõjutamisele, keskmise või lõpustaadiumi spermatiidide mõjutamisele, noorte spermatiidide, spermatotsüütide ja spermatogoonia mõjutamisele uuritava ainega.
      Ülalkirjeldatud ristamistest saadud heterosügootseid F1 emaseid lastakse individuaalselt paarituda (s.o üks emane viaali kohta) oma vendadega. F2 generatsioonis hinnatakse igat kultuuri metsiktüübi isaste puudumise alusel. Kui kultuur on tekkinud F1 emasest, kellel oli vanematelt saadud letaalsust kandev X-kromosoom (s.o töödeldud kromosoomiga isased isendid puuduvad), tuleb selle emase sama genotüübiga tütreid testida, et teha kindlaks, kas letaalsus kordub järgmises generatsioonis.
      2.   ANDMED
      Andmed esitatakse tabelis, et näidata testitud X-kromosoomide arv, mittefertiilsete isaste arv ja letaalsete kromosoomide arv iga testitud aine kontsentratsiooni kohta ja iga töödeldud isase iga paaritusperioodi kohta. Raportis tuleb ära tuua ühe isase kohta esinevate erineva suurusega klastrite arv. Neid andmeid tuleb kinnitada sõltumatu eksperimendiga.
      Suguliitelise retsessiivse letaalsuse testide hindamiseks tuleb kasutada vastavaid statistilisi meetodeid. Arvesse tuleb võtta ühelt isaselt pärinevate retsessiivsete letaalide klastrite moodustumist ja hinnata seda vastava statistilise meetodiga.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  liin: Drosophila kasutatud tüved või liinid, putukate vanus, töödeldud isaste arv, steriilsete isaste arv, saadud F2 kultuuride arv, ilma järglaskonnata F2 kultuuride arv, letaalset geeni kandvate kromosoomide arv, mis määratakse igas idurakkude staadiumis;
               
            
                  —
               
               
                  töödeldud gruppide suuruse kindlaksmääramise kriteeriumid;
               
            
                  —
               
               
                  katsetingimused: üksikasjalik töötluste ja katseplaani kirjeldus, ekspositsiooni tasemed, toksilisuse andmed, vajaduse korral negatiivne (lahusti) ja positiivne kontroll;
               
            
                  —
               
               
                  letaalsete mutatsioonide hindamiskriteeriumid;
               
            
                  —
               
               
                  kus võimalik, esitada ekspositsiooni/toime suhe;
               
            
                  —
               
               
                  andmete hindamine;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste arutelu;
               
            
                  —
               
               
                  järeldused.
               
            3.2.   HINNANG JA JÄRELDUSED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      4.   VIITED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      B.21.   IMETAJARAKU TRANSFORMATSIOONITESTID IN VITRO
      
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.2.   MÕISTED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Imetajarakukultuure on võimalik in vitro kasutada keemiliste mutageenide poolt indutseeritud fenotüübiliste muutuste avastamiseks. Neid mutageene seostatakse maliigse transformatsiooni tekkega in vivo. Laialt kasutatavateks rakkudeks on C3H10T1/2, 3T3, SHE ja Fischeri roti rakuliinid. Testid põhinevad rakumorfoloogia muutuste, fookuse moodustumise või agaroosgeelidel rakkude pesastumise muutuste avastamisel. Harvem tehakse uuringuid, mis avastavad kartsinogeensetele kemikaalidele eksponeeritud rakkudel teisi morfoloogilisi või füsioloogilisi muutuseid. Ükski in vitro testi tulemusnäitaja ei ole kinnitanud ühegi mehhanismi konkreetset süstemaatilist seost kasvajatega. Osad testsüsteemid on võimelised kindlaks tegema kasvajate promootoreid. Uuritavate ainete tsütotoksilisuse astet saab määrata, kui mõõta aine toimet pesasid moodustavatele ühikutele (kloonide produktsiooni efektiivsusele) ja rakukultuuride kasvukiirusele. Tsütotoksilisuse määramine on oluline tõestamaks, et testitav kemikaal avaldab toksilist toimet rakkudele, vaatamata sellele, et rakkude maliigse transformatsiooni sagedust ei ole alati võimalik mõõta. Põhjuseks on osades katsetes kasutatav pikem inkubatsiooniaeg ja/või ümber külvamine teisele alusele.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Puuduvad.
      1.6.   UURINGUMEETODI KIRJELDUS
      Ettevalmistused
      
         Rakud
      
      Läbiviidavast transformatsioonitestist sõltuvalt on võimalik kasutada erinevaid rakuliine või tüvirakke. Katse tegija peab olema kindel, et testis kasutatavad rakud teevad läbi vajaliku fenotüüpse muutuse pärast kokkupuudet tuntud kartsinogeenidega. Samuti peab katse tegija tagama optimaalsed laboritingimused ning dokumenteeritud tõestuse, et uuring on kehtiv ja usaldusväärne.
      
         Keskkond
      
      Transformatsiooni analüüsi tegemise keskkond ja katsetingimused peavad vastama vajadustele.
      
         Uuritav aine
      
      Uuritavad ained võib valmistada kultiveerimiskeskkonnas või lahustada või suspendeerida vastavates lahustis enne rakkude töötlemist. Lahusti lõppkontsentratsioon kultiveerimiskeskkonnas ei tohi mõjutada rakkude elulemust ega kasvukiirust.
      
         Metaboolne aktivatsioon
      
      Rakud peaksid olema eksponeeritud uuritavale ainele nii imetaja metaboolse aktivatsioonisüsteemi olemasolul kui ka selle puudumisel. Kui kasutatakse sisemist metaboolset aktiivsust omavaid rakutüüpe, peab tegema kindlaks, et rakkude metabolismi kiirus ja aktiivsuse iseloom vastavad tingimustele.
      Katsetingimused
      
         Positiivsete ja negatiivsete kontrollide kasutamine
      
      Igas eksperimendis peab rakendama positiivset kontrolli rakkudele otsest mõju avaldava ühendiga ja ka ühendiga, mille toime avaldumiseks on vajalik metaboolse aktiivsuse olemasolu. Samuti on vajalik negatiivne kontroll (lahusti).
      Positiivsete kontrollidena võib kasutada
      
                  —
               
               
                  otsest toimet avaldavaid ühendeid:
                  
                              —
                           
                           
                              etüülmetaansulfonaat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              β-propiolaktoon;
                           
                        
            
                  —
               
               
                  kaudse toimega ühendeid:
                  
                              —
                           
                           
                              2-atsetüülaminofluoreen;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              4-dimetüülaminoasobenseen;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              7,12-dimetüülbensantratseen.
                           
                        
            Kui võimalik, võib kasutada positiivse kontrollina uuritava ühendiga samasse keemilisse klassi kuuluvat ainet.
      
         Kasutatavad kontsentratsioonid
      
      Testis tuleb kasutada erineva uuritava aine kontsentratsiooniga lahuseid. Eesmärk on teha kindlaks kontsentratsioonist sõltuv toksiline efekt. Efekti olemasolul peaks kõrge uuritava aine kontsentratsiooniga lahuse toime järel rakkude elulemus langema ning väikese kontsentratsiooniga lahuse toime järel peaks rakkude elulemus olema ligikaudu sama, mis negatiivses kontroll-lahuses. Vees suhteliselt halvasti lahustuvaid aineid tuleks vastavate meetodite abil uurida lahustuvuse piirini. Täielikult veeslahustuvatele mittetoksilistele ainetele tuleb maksimaalne kontsentratsioonimäär valida vastavalt iga katse vajadusele.
      Protseduur
      Rakud peavad toksilisele substantsile olema eksponeeritud sobiva aja vältel, mis oleneb kasutatud testisüsteemist. Kui kokkupuuteaega pikendatakse, võib olla vajalik aine uuesti lisamine koos keskkonna vahetamisega (ja vajaduse korral värske, metaboolselt aktiivse lahuse lisamine). Piisava sisemise metaboolse aktiivsuseta rakud peavad uuritava ainega kokku puutuma nii sobiva metaboolset aktivatsiooni esilekutsuva süsteemi olemasolul kui ka puudumisel. Kokkupuuteaja lõppemisel pestakse rakud uuritavast ainest puhtaks ning külvatakse tingimustel, mis sobivad uuritava fenotüübi muutuse ilmnemiseks ja transformatsioonide arvu määramiseks. Kõik tulemused tõestatakse sõltumatu uuringuga.
      2.   ANDMED
      Andmed tuleks esitada tabelis, mis võib olla erinev sõltuvalt kasutatud testist (kasutatud alusklaaside arv, positiivse tulemusega alusklaaside arv, mutatsioonidega rakkude arv). Võimaluse korral tuleks esitada mutatsioonisagedus muteerunud rakkude arvu ja eluvõimeliste rakkude arvu suhtena. Eluvõimelisuse määr ja kloonide produtseerimismäär esitatakse protsendina kontrollmäärast. Andmeid peab analüüsima sobivate statistiliste meetodite abil.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  kasutatud rakuliin, rakukultuuride arv, rakukultuuride säilitusmeetodid;
               
            
                  —
               
               
                  katsetingimused: uuritava aine kontsentratsioon, kasutatud lahusti, inkubatsiooni aeg, rakutihedus töötlemise ajal, imetaja metaboolset aktiivsust omava süsteemi tüüp, positiivsed ja negatiivsed kontrollid, jälgitud fenotüüpide kirjeldus, kasutatud selektiivsed ained (kui on asjakohane), annuste valiku põhimõte;
               
            
                  —
               
               
                  eluvõimeliste ja mutantsete rakkude loendamise meetod;
               
            
                  —
               
               
                  statistiline hindamine;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste arutelu;
               
            
                  —
               
               
                  järeldused.
               
            3.2.   HINNANG JA JÄRELDUSED
      Vt üldtutvustus, B osa.
      4.   VIITED
      Vt üldtutvustus, B osa.
      B.22.   NÄRILISTE DOMINANTSE LETAALSUSE TEST
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Vt üldtutvustus, B osa.
      1.2.   MÕISTED
      Vt üldtutvustus, B osa.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Dominantsed letaalsed toimed põhjustavad loote surma. Dominantsete letaalide indutseerimine keemiliste ainetega töötlemisel näitab, et see aine on mõjutanud uuritava liigi lootekudet. Üldiselt aktsepteeritakse, et dominantne letaalsus tekib kromosoomide kahjustumise tõttu (struktuurilised ja arvulised anomaaliad). Loodete suremine ravitud emasloomal võib olla ka toksilise mõju tulemuseks.
      Üldiselt eksponeeritakse uuritavale ainele isasloomi ning neid paaritatakse ravimata ja seni paaritamata emastega. Erinevaid iduraku staadiume võib testida eraldi, kasutades järjestikuseid paarituste intervalle. Ühe emase kohta tulevate surnud implanteerunud loodete arvu suurenemine töödeldud grupis võrrelduna surnud implantaatide arvuga kontrollgrupi emastel peegeldab implantatsioonijärgset loodete surma. Enne implantatsiooni toimunud loodete hävimist saab hinnata kollaskehade (corpora lutea) arvu järgi või võrreldes ühe emase kohta tulevat implantaatide koguarvu ravi saanute ja kontrollgrupis. Dominantne letaalne üldtoime on implantatsioonieelsete ja -järgsete kadude summa. Dominantse letaalse üldtoime arvutamine põhineb ravi saanute grupis ühe emase kohta tulevate elusate implantaatide arvu võrdlemisel kontrollgrupi sama näitajaga. Implantaatide arvu vähenemine teatud ajavahemikes võib olla rakkude hävimise tulemuseks (s.o kas spermatotsüütide ja/või spermatogoonide).
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Puuduvad.
      1.6.   UURINGUMEETODI KIRJELDUS
      Ettevalmistused
      Kui võimalik, tuleb uuritavad ained lahustada või suspendeerida isotoonilises soolalahuses. Vees mittelahustuvad ained võib lahustada või suspendeerida vastavates lahustites. Kasutatav lahusti ei tohi omada koostoimeid uuritava kemikaaliga ega avaldada tokilist mõju. Uuritav kemikaal tuleb ette valmistada vahetult enne kasutamist.
      Katsetingimused
      
         Manustamisviis
      
      Testitavat ühendit tuleb üldjuhul manustada ainult üks kord. Vajaduse korral võib rakendada korduvaid manustamisi, olenevalt toksikoloogilisest informatsioonist. Tavalisteks manustamisviisideks on suukaudselt sondi teel või intraperitoneaalne süstimine. Võivad sobida ka teistsugused manustamisviisid.
      
         Katseloomad
      
      Soovitatavateks loomaliikideks on rotid ja hiired. Terved täielikult suguküpsed loomad jagatakse juhuslikkuse alusel töötlemisele kuuluva ja kontrollgrupi vahel ära.
      
         Arv ja sugu
      
      Uuritava aine manustamiseks tuleb kasutada piisavat arvu isaseid loomi, võttes arvesse hinnatava bioloogilise tunnuse iseeneslikku varieerumist. Loomade arvu valik peaks põhinema eelnevalt kindlaks tehtud määramise tundlikkusel ja olulisuse määral. Näiteks ühes tüüpilises testis peaks olema isaste arv igas erineva annusega ravitavas grupis piisav, et saada 30–50 tiinet emaslooma ühe paaritusintervalli kohta.
      
         Negatiivsete ja positiivsete kontrollide kasutamine
      
      Tavaliselt peavad igas eksperimendis olema korraga nii positiivsed kui ka negatiivsed (lahusti) kontrollid. Kui samas laboratooriumis on olemas hiljuti tehtud katse positiivse kontrolli aktsepteeritavad tulemused, siis võib kasutada neid tulemusi positiivse kontrolli katsesse lülitamise asemel. Positiivseid kontrollaineid tuleb kasutada vastavas madalas annuses (nt MMS, intraperitoneaalselt annuses 10 mg/kg), et näidata testi sensitiivsust.
      
         Annused
      
      Tavaliselt tuleb kasutada kolme annust. Kõrge annus peaks avaldama toksilist toimet või vähendama uuritavat ainet saanud loomade viljakust. Teatud juhtudel võib olla piisav ühe suure annuse kasutamine.
      
         Piirtest
      
      Mittetoksilisi aineid tuleb testida annuses 5 g/kg ühekordsel manustamisel või 1 g/kg päevas korduval manustamisel.
      Protseduur
      Kasutusel on mitmesugused uuritava aine manustamise skeemid. Kõige enam kasutatakse uuritava aine ühekordset manustamist. Võib kasutada ka teisi skeeme.
      Ühte isaslooma paaritatakse manustamisjärgselt ettenähtud aja möödudes järgemööda ühe või kahe ainet mittesaanud ja paaritamata emasega. Emased tuleb jätta isastega kokku vähemalt ühe östraaltsükli ajaks või seniks, kuni paaritumine on toimunud. Seda hinnatakse sperma leidumise alusel tupes või vaginaalkorgi olemasolu järgi.
      Aine manustamise järgsete paarituste arvu määrab manustamise ajaline skeem, mis peab võimaldama kõigi idurakustaadiumide mõjutamise uurimist.
      Emased lahatakse tiinuse teisel poolel ja emaka sisaldist uuritakse surnud ja elusate implanteerunud loodete arvu kindlakstegemiseks. Munasarju võib uurida kollaskehade arvu kindlakstegemiseks.
      2.   ANDMED
      Andmed tuleb esitada tabelis, näidates isaste arvu, tiinete ja mittetiinete emaste arvu. Iga paarituse tulemused tuleb esitada individuaalselt iga isase ja emase kohta eraldi. Iga emase kohta tuleb näidata paarituse nädal, isasele manustatud annus, elusate ja surnud loodete esinemine.
      Dominantse letaalsuse kogutoime arvutatakse välja, võrreldes omavahel elusate implantaatide arvu ühe emase kohta testgrupis elusate implantaatide arvuga ühe emase kohta kontrollgrupis. Saadud andmeid – surnud loodete suhe elusatesse ainet saanute grupis võrrelduna sama suhtega kontrollgrupis – analüüsitakse implantatsioonijärgset loodete hävimise näitamiseks.
      Kui andmed pannakse kirja varaste ja hiliste surmadena, peab ka see tabelites kajastuma. Kui hinnatakse implantatsioonieelset kadu, peab see olema registreeritud. Implantatsioonieelset kadu võib arvutada kui erinevust kollaskehade arvu ja implantaatide arvu vahel või kui implantaatide keskmise arvu vähenemist emaka kohta võrrelduna kontrollpaaritustega.
      Andmeid hinnatakse vastavaid statistilisi meetodeid kasutades.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  kasutatud loomade liik, aretusliin, vanus, kehakaal, isaste ja emaste arv testitavas ja kontrollgrupis;
               
            
                  —
               
               
                  testitav aine, lahusti, testitavad annused ja annuste valiku põhjendus, negatiivsed ja positiivsed kontrollid, andmed toksilisuse kohta;
               
            
                  —
               
               
                  töötlemisviis ja töötluste ajakava;
               
            
                  —
               
               
                  paarituste ajakava;
               
            
                  —
               
               
                  paarituse toimumise määramiseks kasutatud meetod;
               
            
                  —
               
               
                  lahangu aeg;
               
            
                  —
               
               
                  dominantse letaalsuse hindamise kriteeriumid;
               
            
                  —
               
               
                  võimaluse korral anda annuse/vastuse reaktsiooni suhe;
               
            
                  —
               
               
                  statistiline analüüs;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste arutelu;
               
            
                  —
               
               
                  järeldused.
               
            3.2.   HINNANG JA JÄRELDUSED
      Vt üldtutvustus, B osa.
      4.   VIITED
      Vt üldtutvustus, B osa.
      B.23.   IMETAJATE SPERMATOGOONIDE KROMOSOOMABERRATSIOONKATSE
      1.   MEETOD
      Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 483, Mammalian Spermatogonial Chromosome Aberration Test (1997).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      In vivo imetajate spermatogoonide kromosoomaberratsioonide katse eesmärk on ära tunda need ained, mis põhjustavad struktuurseid kromosoomaberratsioone imetajate spermatogoonide rakkudes (1, 2, 3, 4, 5). Struktuursed aberratsioonid võivad olla kahte tüüpi: kromosoom- või kromatiidaberratsioonid. Keemiliste mutageenide põhjustatud aberratsioonid on enamuses kromatiidaberratsioonid, aga esineb ka kromosoomaberratsioone. Käesolev meetod ei ole siiski mõeldud numbriliste aberratsioonide mõõtmiseks ja seda ei kasutata korrapäraselt sel eesmärgil. Kromosoommutatsioonid ja sellega seotud juhud on paljude inimeste geneetiliste haiguste põhjuseks.
      Käesolev katse mõõdab kromosoomaberratsioone spermatogoonide idurakkudes ja seetõttu oodatakse, et need ennustaksid idurakkudes pärinevaid mutatsioone.
      Käesolevas katses kasutatakse tavaliselt närilisi. Käesolev in vivo tsütogeneetiline katse avastab kromosoomaberratsioonid spermatogoonide mitoosides. Käesolevat meetodit ei kasutata muudes sihtkudedes.
      Et avastada kromatiidaberratsioone spermatogoonide rakkudes, tuleks uurida esimest mitoosiraku jagunemist manustamise järel enne, kui need kahjustused kaovad järgmistes raku jagunemistes. Lisateavet manustatud spermatogoonide tüverakkudest saadakse meiootilise kromosoomi analüüsil kromosoomaberratsioonide suhtes diakineesi-metafaasis I, kui manustatud rakud muutuvad spermatotsüütideks.
      Käesolev in vivo katse on määratud uurima, kas keharakkude mutageenid on ka aktiivsed idurakkudes. Lisaks sobib spermatogoonidega tehtav katse ka mutageensuse ohu hindamiseks, kuna see võimaldab in vivo metabolismi, farmakokineetika ja DNA parandusprotsesside tegurite arvessevõtmist.
      Munandites on mitu spermatogoonide põlvkonda, mille tundlikkus keemiliste ainete mõjule vaheldub. Seetõttu esindavad avastatud aberratsioonid töödeldud spermatogoonide rakupopulatsioonide koguvastust, milles domineerib suurem hulk eristunud spermatogoonide rakke. Eri põlvkondadesse kuuluvate spermatogoonide kuulumine üldvereringesse sõltub nende asukohast munandites.
      Kui on tõendeid selle kohta, et uuritav aine või reaktiivne metaboliit ei pääse sihtkoesse, ei ole asjakohane kasutada käesolevat katset.
      Vt ka üldist sissejuhatust B osas.
      1.2.   MÕISTED
      
         Kromatiidaberratsioon – struktuurne kromosoomikahjustus, mis ilmneb üksikute kromatiidide katkemises või kromatiididevahelises katkemises või taasühinemises.
      
         Kromosoomaberratsioon – struktuurne kromosoomikahjustus, mis ilmneb mõlema kromosoomi katkemises või katkemises ja taasühinemises samas kohas.
      
         Tühik – akromaatiline kahjustus, mis on väiksem kui kromatiidi laius ja millel on minimaalne kromatiidide üleminek.
      
         Numbriline aberratsioon – kasutatud rakkude tüüpilisest normaalsest kromosoomiarvust erinev kromosoomide arv.
      
         Polüploidsus – haploidse kromosoomiarvu (n) paljukordsus, v.a diploidne arv (nt 3n, 4n jne).
      
         Struktuurne aberratsioon – kromosoomistruktuuri muutus, mis on avastatud rakujaotuse metafaasi faasi mikroskoopilisel uurimisel ja mida täheldatakse deletsiooni ja fragmentidena, kromosoomisiseste või -väliste muutustena.
      1.3.   KATSE PÕHIMÕTE
      Loomadele manustatakse uuritavat ainet, kasutades sobivat manustamisteed, ja tapetakse sobiva aja möödumisel manustamisest. Enne tapmist antakse loomadele metafaasi peatavat ainet (nt kolhitsiini või ainet Colcemid®). Seejärel tehakse idurakkudest kromosoomipreparaadid ja need värvitakse ning metafaasi rakkude kromosoomaberratsioone analüüsitakse.
      1.4.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.4.1.   Ettevalmistused
      1.4.1.1.   Loomaliikide valik
      Enamasti kasutatakse isaseid hiina hamstreid ja hiiri. Võib kasutada ka muude sobivate imetajate liikide isaseid loomi. Rakendatakse noorte tervete loomade enim kasutatavaid laboritüvesid. Uuringut alustades peaks loomade kaalumuutus olema minimaalne ja ei tohiks ületada ± 20 % keskmisest kaalust.
      1.4.1.2.   Elamis- ja söötmistingimused
      Kohaldatakse üldise sissejuhatuse B osas toodud üldtingimusi, kuigi niiskuse eesmärk peaks olema 50–60 %.
      1.4.1.3.   Loomade ettevalmistamine
      Terved noored täiskasvanud isasloomad määratakse juhuvaliku alusel kontroll- ja katserühmadesse. Puurid asetatakse nii, et puuri asetamisest tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Loomad identifitseeritakse individuaalselt. Loomi harjutatakse laboritingimustega vähemalt viis päeva enne uuringu alustamist.
      1.4.1.4.   Annuste ettevalmistamine
      Tahked uuritavad ained tuleb lahustada või suspendeerida sobivates lahustites või kandjaainetes ja vajaduse korral lahjendada enne loomadele andmist. Vedelaid uuritavaid aineid võib doseerida vahetult või lahjendatakse neid enne doseerimist. Tuleks kasutada uuritava aine värskeid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed püsivuse kohta näitavad, et säilitamine on lubatav.
      1.4.2.   Katsetingimused
      1.4.2.1.   Lahusti/kandjaaine
      Lahusti/kandjaaine ei tohi avaldada toksilist mõju kasutatavate annuste korral ja ei tohi astuda keemilisse reaktsiooni uuritava ainega. Kui kasutatakse muid kui tuntud lahusteid/kandjaaineid, peab nende kasutamine toetuma ühtesobivuse kohta käivatele andmetele. Soovitatav on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahustite/-kandjaainete kasutamist.
      1.4.2.2.   Kontrollid
      Käesolevasse katsesse kaasatakse paralleelsed positiivsed ja negatiivsed (lahusti/kandjaaine) kontrollid. Kontrollrühma loomi käsitletakse sarnaselt katserühma loomadega, kuid neile ei anta uuritavat ainet.
      Positiivsed kontrollid ei tohiks põhjustada struktuurseid aberratsioone in vivo spermatogoonide rakkudes manustamistasemetel, mis peaksid põhjustama avastatavat suurenemist taustaga võrreldes.
      Positiivsete kontrollainete annused valitakse nii, et mõjud on selged, kuid need ei paljasta lugejale kohe kodeeritud objektiklaaside identiteeti. On aktsepteeritav, et positiivsed kontrollid võivad kasutada erinevaid manustamisteid kui uuritav aine ja proovid võetakse üksnes korra. Keemiliste ainete rühmaga seotud positiivsete keemiliste kontrollainete kasutamist tuleks kaaluda, kui sellised ained on kättesaadavad. Positiivsete kontrollainete näited:
      
                  Aine
               
               
                  CASi nr
               
               
                  EINECSi nr
               
            
                  Tsüklofosfamiid
                  Tsüklofosfamiidmonohüdraat
               
               
                  50-18-0
                  6055-19-2
               
               
                  200-015-4
               
            
                  Tsükloheksüülamiin
               
               
                  108-91-8
               
               
                  203-629-0
               
            
                  Mitomütsiin-C
               
               
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
            
                  Akrüülamiidmonomeer
               
               
                  79-06-1
               
               
                  201-173-7
               
            
                  Trietüleenmelamiin
               
               
                  51-18-3
               
               
                  200-083-5
               
            Üksnes lahustit või kandjaainet saanud või muul katserühmaga samalaadsel viisil töödeldud negatiivsetest kontrollidest võetakse proovid igal proovivõtukorral, välja arvatud siis, kui varasemad kontrollitulemused näitavad loomade väliste varieerumiste ja kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude esinemissageduste tunnustamist. Lisaks sellele käsitletakse ka töötlemata kontrolle, välja arvatud juhul, kui varasemad või avaldatud andmed kontrolli kohta näitavad, et valitud lahustil/kandjaainel ei ole kahjulikke ega mutageenseid mõjusid.
      1.5.   MENETLUS
      1.5.1.   Loomade arv
      Nii katse- kui ka kontrollrühmas on vähemalt viis analüüsitavat looma.
      1.5.2.   Manustamiskava
      Uuritavaid aineid manustatakse eelistatult ühel või kahel korral (nt ühekordse annusena või kahekordsete annustena). Uuritavaid aineid võib anda ka jagatud annustena, näiteks kaks annust ühel päeval kuni mõnetunnise vahega, et hõlbustada suurte ainekoguste andmist. Muud manustamiskavad peaksid olema teaduslikult tõestatud.
      Suurimat annust saavas rühmas võetakse manustamise järel proove kahel korral. Kuna uuritav aine saab mõjutada rakutsükli kineetikat, siis võetakse proove üks kord varajasel ja teine kord hilisemal ajal ligikaudu 24–48 tunni jooksul pärast manustamist. Muude annuste, v.a suurim annus, puhul on proovide võtmise ajaks 24 tundi või 1,5 rakutsüklit pärast manustamist, välja arvatud siis, kui muu proovivõtuaeg on sobivam mõjude avastamiseks (6).
      Lisaks võib kasutada muid proovivõtuaegasid. Näiteks keemiliste ainete puhul, mis võivad põhjustada kromosoomi aeglustumist või võivad esile tuua S-faasist sõltumatuid mõjusid, on sobivam varajasem proovide võtmise aeg (1).
      Kordusmanustamiste sobivus tuleb määrata iga üksikjuhtumi puhul eraldi. Kordusmanustamise järel tuleb loomad tappa 24 tunni (1,5 rakutsükli) jooksul pärast viimast manustamist. Täiendavaid proovivõtuaegasid võib kasutada vajaduse korral.
      Enne tapmist süstitakse loomade kõhukelmesse metafaasi peatavat ainet (nt ainet Colcemid® või kolhitsiini). Loomadelt võetakse seejärel proovid sobiva intervalli järel. Hiirte puhul on see intervall ligikaudu 3–5 tundi, hiina hamstritel ligikaudu 4–5 tundi.
      1.5.3.   Annused
      Kui tehakse annuste vahemiku määramiseks uuring sobivate andmete puudumisel, siis tehakse uurimus samas laboris, kasutades samu liike, tüvesid, sugu ja manustamiskava, mida kasutatakse põhiuurimuses (7). Kui esineb mürgisus, kasutatakse kolme erinevat annust esimesest proovivõtust alates. Need annused peaksid hõlmama vahemikku suurimast kuni väiksema mürgisuseni või mürgisuse puudumiseni. Hilisemal proovivõtuajal on vaja kasutada üksnes suurimat annust. Suurim annus määratakse annusena, mis põhjustab sarnaseid mürgisusenähte, et samale manustamisrežiimile põhinevate suuremate annuste kasutamine võib põhjustada surma.
      Ained, millel on spetsiifilised bioloogilised mõjud väikeste mittetoksiliste annustena (nt hormoonid ja mitogeenid), võivad olla erandiks annuse määramise kriteeriumidele ja neid tuleks hinnata iga üksikjuhtumi puhul eraldi. Suurim annus võib samuti põhjustada toksilisuse nähte spermatogoonide rakkudes (nt spermatogoonide mitooside suhe esimese ja teise meiootilisse metafaasi on vähenenud; kõnealune vähenemine ei tohi ületada 50 %).
      1.5.4.   Piirkatse
      Kui katse ühe annusega, milleks on vähemalt 2 000 mg/kg kehakaalu kohta päevas ja mida manustatakse ühekordse annusena või kahe annusena samal päeval, ei põhjusta täheldatavaid toksilisi mõjusid ja kui genotoksilisus ootuspäraselt põhineb struktuurselt seotud ainete andmetel, siis ei peeta kolme annuse taset käsitlevat täielikku uurimust vajalikuks. Inimeste ootuspärane vastuvõtlikkus võib viidata piirkatses kasutavatest annustest suuremate annuste kasutamise vajadusele.
      1.5.5.   Manustamine
      Uuritavat ainet manustatakse tavaliselt söögitoru kaudu või sobiva intubeerimise kanüüli abil või süstides kõhuõõnde. Samuti võib muid manustamisteid aktsepteerida, kui need on põhjendatud. Vedeliku suurim kogus, mida saab söögitoru kaudu või süstides ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Kogus ei tohiks ületada 2 ml/100 g kehakaalu kohta. Suurimate koguste kasutamine peab olema põhjendatud. Välja arvatud ärritavad või söövitavad ained, mille mõjud tavaliselt teravnevad suuremate kontsentratsioonide korral, tuleks vähendada katsekoguse varieeruvust, reguleerides kontsentratsioone nii, et kogumaht kõikide annuste korral jääks samaks.
      1.5.6.   Kromosoomipreparaat
      Kohe pärast tapmist võetakse rakususpensioonid ühest või mõlemast munandist, mis pannakse hüpotoonilisse lahusesse ja fikseeritakse. Seejärel rakud asetatakse objektiklaasidele ja värvitakse.
      1.5.7.   Analüüs
      Iga looma puhul analüüsitakse vähemalt 100 väga levinud metafaasi (vähem kui 500 metafaasi rühma kohta). Seda arvu saab vähendada, kui esineb palju aberratsioone. Kõik objektiklaasid, sh positiivsete ja negatiivsete kontrollide omad, kodeeritakse sõltumatult enne mikroskoopilist analüüsi. Kui fikseerimise menetlused viivad tihti metafaasis olevate rakkude katkemise ja kromosoomide kaotamiseni, peaksid arvutatud rakud sisaldama tsentromeeride hulka, mis vastab arvule 2n ± 2.
      2.   ANDMED
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE
      Üksikute loomade andmed esitatakse tabelis. Katseühikuks on loom. Iga üksiku looma puhul hinnatakse struktuurseid kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude arvu ja kromosoomaberratsioonide arvu raku kohta. Eri tüüpi struktuursed kromosoomaberratsioonid tuleks loetleda ning mainitakse nende arvud ja esinemissagedused katse- ja kontrollkultuurides. Tühikud registreeritakse eraldi ja nende kohta antakse teavet, aga üldiselt ei kuulu need aberratsioonide üldsageduse hulka.
      Kui vaadeldakse nii meioosi kui ka mitoosi, tuleks määrata kindlaks spermatogoonide mitooside suhe esimesse ja teise meiootilisse metafaasi tsütotoksilisuse mõõduna kõikidest uuritavale ainele vastuvõtlikest loomadest ja negatiivsetest kontrollidest kokku 100 jaguneva rakuga proovis looma kohta võimalikule tsütotoksilisele mõjule osutamiseks. Kui üksnes mitoosi vaadeldakse, tuleks määrata mitootiline indeks vähemalt 1 000 rakust iga looma kohta.
      2.2.   TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE
      Positiivse tulemuse saamiseks on mitmeid kriteeriume, nt kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude suhtelise arvu annusest tingitud suurenemine või kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude arvu selge suurenemine ühes annuses ühel proovivõtuajal. Tulemuste bioloogilist tähtsust tuleks esmalt arvesse võtta. Statistilisi meetodeid võidakse kasutada abivahendina katsetulemuste hindamisel (8). Statistiline olulisus ei saa olla ainus määrav tegur positiivse vastuse jaoks. Ebaselgeid tulemusi tuleks selgitada täiendaval uurimisel ootuspäraselt muudetud katsetingimustes.
      Uuritavat ainet, mille tulemused ei vasta eespool toodud kriteeriumidele, peetakse mittemutageenseks aineks käesolevas katses.
      Kuigi enamikul katsetest on selged positiivsed või negatiivsed tulemused, välistavad saadud tulemused harvadel juhtudel kindlate otsuste tegemise uuritava aine aktiivsuse kohta. Tulemused jäävad ebaselgeks või küsitavaks tehtud katsete kordamisest sõltumata.
      
         In vivo kromosoomaberratsiooni katsel saadud positiivsed tulemused viitavad sellele, et aine põhjustab struktuurseid kromosoomaberratsioone uuritud liikide idurakkudes. Negatiivsed tulemused viitavad sellele, et katsetingimuste põhjal ei põhjusta aine kromosoomaberratsioone uuritud liikide idurakkudes.
      Tõenäosust, et uuritav aine või selle metaboliidid jõuavad sihtkoesse, tuleks arutada.
      3.   ARUANDLUS
      KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Lahusti/kandjaaine:
                  
                              —
                           
                           
                              kandjaaine valiku põhjendamine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandjaaines, kui on teada.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katseloomad:
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatud liigid/tüved;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade arv ja vanus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              päritolu, elamistingimused, toitumine jne;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade individuaalne kaal katse alustamisel, sh kehakaalu vahemik, keskväärtus ja standardhälve iga rühma kohta.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              annuse määramise katse tulemused, kui need on läbi viidud;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              annuste valiku põhimõtted;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              manustamisviis;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine ettevalmistamise üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine manustamise üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tapmisaja põhjendused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toidu/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni (ppm) muutmine tegelikuks annuseks (mg/kehakaalu kg kohta päevas), vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              manustamis- ja proovivõtukavade detailne kirjeldus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toksilisuse mõõtmise meetodid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metafaasi peatav aine, selle kontsentratsioon ja manustamise kestus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              objektiklaaside valmistamise meetodid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aberratsioonide loendamise kriteeriumid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analüüsitud rakkude arv looma kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kriteeriumid, mille alusel uurimusi liigitatakse positiivseteks, negatiivseteks või ebaselgeteks.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              toksilisuse tunnused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mitootiline indeks;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              spermatogoonide mitoosirakkude suhe esimesse ja teise meiootilisse metafaasi;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aberratsioonide tüüp ja arv, antud iga looma kohta eraldi;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aberratsioonide koguarv rühma kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aberratsioone sisaldavate rakkude arv rühma kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              doosi ja toime suhe, võimaluse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              võimalikud statistilised analüüsid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              paralleelsed negatiivse kontrolli tulemused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              varasemad negatiivsest kontrollist saadud tulemused ning vahemikud, keskväärtused ja standardhälbed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              paralleelse positiivse kontrolli tulemused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ploidsuse muutused, kui neid esineb.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutelu.
               
            
                   
               
               
                  Järeldused.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  Adler, I. D., (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications, in: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C, Lambert, B. and Magnusson, J. (eds) Liss, New York, pp. 477–484.
               
            
                  2)
               
               
                  Adler, I. D., (1984), Cytogenetic tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, (ed.) S. Venitt and J. M. Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275–306.
               
            
                  3)
               
               
                  Evans, E. P., Breckon, G. and Ford, C. E. (1964), An Air-drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes, Cytogenetics and Cell Genetics, 3, pp. 289–294.
               
            
                  4)
               
               
                  Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115–141.
               
            
                  5)
               
               
                  Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (19 78), A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes, Mutation Res., 52, pp. 207–209.
               
            
                  6)
               
               
                  Adler, I. D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (19 94), International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests, Mutation Res., 312, pp. 313–318.
               
            
                  7)
               
               
                  Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313–319.
               
            
                  8)
               
               
                  Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clarc, G., Ferguson, R., Richold, M., Pap-worth, D. G. and Savage J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184–232.
               
            B.24.   HIIRE NAHALAIKUDE TEST
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.2.   MÕISTED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE
      See on in vivo test hiirtega, kelles arenevaid embrüoid mõjutatakse kemikaalidega. Märklaudadeks arenevas embrüos on melanoblastid ja märklaudgeenideks on need, mis kontrollivad karvastiku pigmentatsiooni. Arenevad embrüod on heterosügootsed terve rea karvavärvuse geenide suhtes. Sellise geeni dominantse alleeli muteerumine või kadumine (erinevate geneetiliste sündmuste tulemusena) melanoblastis annab tulemuseks retsessiivse fenotüübi ekspressiooni tema järglasrakkudes, moodustades muutunud värvusega laigu hiire karvastikus. Tehakse kindlaks selliste laikudega – mutatsioonidega – järglaste arv ja nende sagedust võrreldakse sama näitajaga järglaskonnas, keda embrüostaadiumis töödeldi ainult lahustiga. Hiire nahalaikude test teeb kindlaks eeldatavaid somaatilisi mutatsioone loote rakkudes.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Puuduvad.
      1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      Ettevalmistused
      Võimaluse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritavad ained isotoonilises soolalahuses. Vees mitte-lahustuvad kemikaalid lahustatakse või suspendeeritakse vastavates lahustites. Kasutatav lahusti ei tohi omada koostoimet uuritava kemikaaliga ega avaldada toksilist toimet. Katses tuleb kasutada värskelt valmistatud kemikaali.
      
         Katseloomad
      
      T-liini hiiri (mitteaguuti, a/a; tšintšilja, roosa silm, cchp/cchp; pruun, b/b; dilute, lühike kõrv, d se/d se; laiguline, s/s) paaritatakse kas HT liiniga (kahkjas, mitteaguuti, brahhüpoodne, pa a bp/pa a bp; tinajas kräsukarvaline, ln fz/ln fz; pärl pe/pe) või C57 BL liiniga (mitteaguuti, a/a). Teisi sobivaid ristamisi nagu NMRI (mitteaguuti, a/a; albiino, c/c) ja DBA (mitteaguuti, a/a; pruun, b/b; dilute d/d) vahel võib samuti kasutada, juhul kui nad annavad mitteaguutit järglaskonda.
      
         Arv ja sugu
      
      Uuritavat ainet manustatakse piisavale arvule tiinetele emastele, et saada vastav arv ellujäävat järglaskonda iga annuse jaoks. Vastav proovide suurus määratakse uuritavat ainet saanud hiirtel kindlaks tehtud karvalaikude arvu ja kontrollandmete põhjal. Negatiivne tulemus on ainult siis aktsepteeritav, kui hinnatud on vähemalt 300 kõige suurema annusega töödeldud emaste järglast.
      
         Negatiivsete ja positiivsete kontrollide kasutamine
      
      Kättesaadavad peavad olema samaaegsed kontrollandmed hiirtelt, kes said ainult vehiiklit (negatiivsed kontrollid). Samast laboratooriumist saadud varasemaid kontrollandmed võib testi tundlikkuse suurendamiseks ühendada eeldusel, et nad on homogeensed. Kasutatavad peavad olema samast laboratooriumist selle testiga hiljuti saadud positiivse kontrolli andmed teadaolevalt mutageense kemikaali kohta, kui testitava kemikaali puhul ei avastata mutageenset toimet.
      
         Manustamisviis
      
      Tavalisteks manustamisviisideks on suukaudne sondi teel manustamine või tiinete emaste intraperitoneaalne süstimine. Vajaduse korral kasutatakse inhalatsiooni või teisi manustamisviise.
      
         Annused
      
      Kasutatakse vähemalt kahte annust, millest ühel ilmneb toksilisuse tunnuseid või mis põhjustab väiksemaarvulisi pesakondi. Mittetoksiliste kemikaalide puhul tuleb kasutada maksimaalset praktikas kasutatavat annust.
      Protseduur
      Ühekordne töötlus tehakse tavaliselt 8., 9. või 10. tiinuse päeval, lugedes esimeseks päeva, mil esmakordselt täheldati vaginaalkorki. Need päevad vastavad 7,25., 8,25. ja 9,25. päevale pärast viljastamist. Nendel päevadel võib rakendada järjestikusi töötlemisi.
      
         Analüüs
      
      Järglaskond kodeeritakse ning neid hinnatakse laikude esinemise alusel kolmanda ja neljanda nädala jooksul pärast sündimist. Eristatakse kolme laikude klassi:
      
                  a)
               
               
                  kuni 5 mm suurused valged laigud ventraalsel keskjoonel, mida peetakse rakkude surmamise tulemuseks (WMVS);
               
            
                  b)
               
               
                  kollased aguutivärvi laigud, mis on seotud piimanäärmete, genitaalide, kõri, õlavarre ja kubemepiirkonnaga ning lauba keskosaga, arvatakse olevat diferentseerumishäirete (MDS) tulemuseks ja
               
            
                  c)
               
               
                  hajusalt üle keha esinevad pigmenteerunud ja valged laigud, mida peetakse somaatiliste mutatsioonide (RS) tulemuseks.
               
            Kõik need kolm erinevat laikude klassi kuuluvad hindamisele, kuid ainult viimane neist (RS) omab geneetilist tähtsust. MDS ja RS eristamisel tekkivaid probleeme saab lahendada proovikarvade uurimisel fluorestsentsmikroskoobi abil.
      Tuleb tähele panna kõiki ilmseid morfoloogilisi ebanormaalsusi järglaskonnas.
      2.   ANDMED
      Andmed esitatakse hinnatud järglaskonna koguarvuna ja ühte või enamat eeldatavat somaatilise mutatsioonilaiku omavate järglaste arvuna. Uuritavat ainet saanud loomade ja negatiivse kontrolli andmeid võrreldakse vastavate meetodite abil. Andmed esitatakse samuti eraldi iga pesakonna kohta.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  ristamiseks kasutatud liinid;
               
            
                  —
               
               
                  tiinete emaste arv katse- ja kontrollgrupis;
               
            
                  —
               
               
                  keskmine pesakonna suurus uuritavat ainet saanute ja kontrollgrupis sündimise ja võõrutamise ajal;
               
            
                  —
               
               
                  testitava kemikaali annus(ed);
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud lahusti;
               
            
                  —
               
               
                  tiinuse päev, millal töötlus tehti;
               
            
                  —
               
               
                  manustamisviis;
               
            
                  —
               
               
                  hinnatud järglaskonna koguarv, WMVS, MDS ja RS muutusi kandvate järglaste arv eksperimentaal- ja kontrollgrupis;
               
            
                  —
               
               
                  kõik morfoloogilised anomaaliad;
               
            
                  —
               
               
                  võimaluse korral anda annuse/toime suhe RS muutuste kohta;
               
            
                  —
               
               
                  statistiline analüüs;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste arutelu;
               
            
                  —
               
               
                  järeldused.
               
            3.2.   HINNANG JA JÄRELDUSED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      4.   VIITED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      B.25.   HIIRE PÄRILIK TRANSLOKATSIOON
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.2.   MÕISTED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE
      Hiire päriliku translokatsiooni test teeb kindlaks esimese põlvkonna järglastel kindlaks tehtud struktuursed ja arvulised muutused imetajate idurakkude kromosoomides. Kindlaks tehtud kromosomaalsed muutused on retsiprooksed translokatsioonid ja juhul kui kaasa on haaratud ka järglaskonna emasloomad, kantakse edasi X-kromosoomide kadu. Translokatsioonide kandjatel ja XO-emastel on vähenenud viljakus, mida kasutatakse F1 järglaskonna selekteerimiseks tsütogeneetilise analüüsi jaoks. Täielikku steriilsust põhjustavad teatud kindlat tüüpi translokatsioonid (X-autosoomi ja c-t tüüp). Translokatsioone jälgitakse tsütogeneetiliselt meiootilistes rakkudes diakineesi I metafaasis isastel indiviididel, kas F1 isastel või F1 emaste isastel järglastel. XO-emased identifitseeritakse tsütogeneetiliselt ainult 39 kromosoomi olemasolu põhjal luuüdi mitoosides.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Puuduvad.
      1.6.   UURINGUMEETODI KIRJELDUS
      Ettevalmistused
      Testitavad kemikaalid lahustatakse isotoonilises soolalahuses. Kui ained on vees lahustumatud, siis lahustatakse või suspendeeritakse nad vastavates lahustites. Kasutatakse värskelt valmistatud testitavate ühendite lahuseid. Kui lahustit kasutatakse annustamise lihtsustamiseks, ei tohi sellel olla koostoimet testitava kemikaaliga, samuti ei tohi see mõjuda toksiliselt.
      
         Manustamisviis
      
      Manustamisviisideks on tavaliselt suukaudselt sondi teel või intraperitoneaalne süstimine. Sobida võivad ka teised manustamisviisid.
      
         Katseloomad
      
      Paarituste läbiviimise ja tsütoloogilise tõestamise lihtsustamiseks tehakse need katsed hiirtega. Spetsiifiliste hiireliinide kasutamine ei ole vajalik, kuid keskmine pesakonna suurus antud liini hiirtel peaks olema suurem kui kaheksa ja see peaks olema suhteliselt konstantne.
      Katsesse valitakse terved suguküpsed loomad.
      
         Loomade arv
      
      Vajalik loomade arv sõltub spontaansete translokatsioonide sagedusest ja positiivse tulemuse saamiseks vajaliku induktsiooni minimaalsest tasemest.
      Test põhineb tavaliselt F1 järglaskonna isasloomade analüüsil. Ühes uuritavat ainet saavate hiirte grupis tuleb testida vähemalt 500 F1 järglaskonna isast. Kui on kaasatud ka F1 järglaskonna emased, siis tuleb testida 300 isas- ja 300 emaslooma.
      
         Negatiivsete ja positiivsete kontrollide kasutamine
      
      Kasutatavad peavad olema vastavad kontrollandmed, mis on saadud konkureerivate ja varem tehtud testide kontrollrühmade kohta. Kui on olemas aktsepteeritavad hiljuti samas laboris tehtud eksperimentide positiivsete kontrollide tulemused, siis võib kasutada neid andmeid ja jätta positiivsed kontrollid käesolevast testist välja.
      
         Annused
      
      Testitakse ühte, tavaliselt kõige suuremat annust, mis on seotud loomal minimaalsete toksiliste mõjutuste esilekutsumisega, kuid mis ei mõjuta reproduktiivset käitumist ega ellujäämist. Annuse/vastusreaktsiooni suhte kindlakstegemiseks on vaja katsesse lisada kaks madalamat annust. Mittetoksilise kemikaali puhul tuleb uurida maksimaalset praktiliselt kasutatavat annust.
      Protseduur
      
         Uuritava aine manustamine ja paaritamine
      
      Kasutusel on kaks skeemi. Kõige laialdasemalt kasutatakse uuritava aine ühekordset manustamist. Võib kasutada ka uuritava aine manustamist seitsmel päeval nädalas 35 päeva järjest. Manustamisele järgnev paarituste arv sõltub manustamisskeemist ja peaks tagama, et proove võetaks kõigist iduraku staadiumidest. Pärast paaritusperioodi lõppu pannakse emasloomad eraldi puuridesse. Kui emasloom poegib, märgitakse üles poegimise kuupäev ja järglaste arv ning sugu. Kõik isased järeltulijad võõrutatakse ja kõik emased järeltulijad hukatakse, välja arvatud juhul, kui nad on kaasatud eksperimenti.
      
         Translokatsiooni heterosügootsuse testimine
      
      Kasutatakse ühte kahest võimalikust meetodist:
      
                  —
               
               
                  F1 järglaskonna viljakuse testimine ja järgnev võimalike translokatsiooni kandjate kindlakstegemine tsütogeneetilise analüüsi abil;
               
            
                  —
               
               
                  kogu isase F1 järglaskonna tsütogeneetiline analüüs ilma eelneva fertiilsuse testimisel põhineva selektsioonita.
               
            
                  a)
               
               
                  Viljakuse testimine
                  Vähenenud viljakust F1 indiviididel saab kindlaks teha pesakonna suuruse põhjal ja/või paaritatud emaste emaka sisu analüüsimisel.
                  Normaalse ja vähenenud viljakuse määratlemise kriteerium peab olema kasutava hiireliini jaoks kindlaks määratud.
                  
                     Pesakonna suuruse jälgimine: uuritavad F1 isased paigutatakse individuaalselt puuridesse kas koos sama eksperimendi või kolooniast saadud emastega. Puure kontrollitakse iga päev 18. paaritusjärgsest päevast alates. Pesakonna suurus ja sooline vahekord registreeritakse F2 põlvkonna sünnimomendil ja seejärel pesakond likvideeritakse. Kui testitakse emast F1 järglaskonda, siis jäetakse väikeste pesakondade F2 järglased ellu edaspidisteks testimisteks. Emaseid translokatsiooni kandjaid kontrollitakse tsütogeneetilise translokatsiooni analüüsiga kõigi nende isaste järeltulijate põhjal. XO-emaseid tuntakse ära sugude suhte muutumise põhjal nende järglaskonnas suhtelt 1:1 suhtele 1:2 isased vs. emased. Järgnevas protseduuris elimineeritakse normaalsed F1 loomad edasisest testimisest, kui esimene F2 pesakond saavutab või ületab predetermineeritud normaalväärtuse, vastasel korral võetakse vaatluse alla teine või kolmas F2 pesakond.
                  F1 loomi, keda ei saa kuni kolme F2 pesakonna jälgimise põhjal normaalseks tunnistada, kas testitakse edasi paaritatud emaste emaka sisu analüüsimisega või tehakse kohe tsütogeneetiline analüüs.
                  
                     Emaka sisu analüüsimine: pesakonna suuruse vähenemine translokatsiooni kandjatel on põhjustatud loodete embrüonaalsest hukkumisest, nii et surnud implantaatide suur arv peegeldab translokatsiooni esinemist testitaval loomal. Igat testitavat F1 isaslooma paaritatakse 2–3 emasega. Viljastumine tehakse kindlaks igahommikuse vaginaalkorkide olemasolu kontrollimisega. Emased surmatakse 14–16 päeva pärast ning nende emakates loendatakse elusad ja surnud implantaadid.
               
            
                  b)
               
               
                  Tsütogeneetiline analüüs
                  Testised valmistatakse ette õhu käes kuivatamise tehnika abil. Translokatsiooni kandjad identifitseeritakse multivalentsete konfiguratsioonide leiu alusel diakineesi I metafaasis olevatel primaarsetel spermatotsüütidel. Vähemalt kahe multivalentse assotsiatsiooniga raku leidmine on piisavaks tõestuseks, et testitav loom on translokatsiooni kandja.
                  Juhul kui aretusselektsiooni pole rakendatud, kontrollitakse kõiki F1 isasloomi tsütogeneetiliselt. Mikroskoopiliselt tuleb uurida vähemalt 25 diakineesi I metafaasis olevat rakku ühe isase looma kohta. Mitootiliste metafaaside uurimine kas spermatogoonia ajal või luuüdis on nõutav F1 isaste puhul, kellel on väikesed testised ja meioosi katkemine enne diakineesi või F1 emastel XO kahtlusalusklaasidel. Ebatavaliselt pika ja/või lühikese kromosoomi olemasolu igas kümnes rakus kümnest on erilise steriilsust põhjustava translokatsiooni (c-t tüüpi) tõenduseks isasloomal. Mõnesid X-autosoomi translokatsioone, mis põhjustavad isaste steriilsust, saab identifitseerida ainult mitootiliste kromosoomide bandinganalüüsi abil. 39 kromosoomi esinemine igas kümnes mitoosis kümnest on tõestuseks emase XO seisundile.
               
            2.   ANDMED
      Andmed esitatakse tabelis.
      Keskmine pesakonna suurus ja sugude suhe sünnimomendil ja võõrutamise ajal registreeritakse iga paaritusintervalli kohta.
      F1 loomade viljakuse hindamiseks esitatakse keskmine pesakondade suurus kõikide normaalsete paarituste kohta ja individuaalne pesakonna suurus F1 translokatsiooni kandjatel. Emaka sisaldise analüüsimiseks registreeritakse elus ja surnud implantaatide keskmine arv normaalpaarituste korral ja individuaalsed elus ja surnud implantaatide arvud iga F1 translokatsiooni kandja paarituse kohta.
      Diakineesi I metafaasi tsütokineetilisel analüüsil leitakse multivalentsete konfiguratsioonide arv ja tüübid ja antakse rakkude üldarv iga translokatsiooni kandja kohta.
      Steriilsete F1 indiviidide puhul registreeritakse paarituste üldarv ja paaritusperioodi kestus. Antakse testiste kaalud ja tsütogeneetilise analüüsi detailid.
      XO emaste puhul registreeritakse keskmine pesakonna suurus, sugude suhe F1 järglaskonnas ja tsütogeneetilise analüüsi tulemused.
      Kus on võimalik, eelselekteeritakse F1 translokatsiooni kandjad fertiilsustesti põhjal, tabelid peavad sisaldama informatsiooni selle kohta, kui paljude korral neist oli tõestatud translokatsiooniline heterosügootsus.
      Esitatakse negatiivsete ja positiivsete kontrollide testimisandmed.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  hiirte liin, loomade vanus, töödeldud loomade kaalud;
               
            
                  —
               
               
                  mõlemast soost vanemloomade arv katse- ja kontrollgrupis;
               
            
                  —
               
               
                  katsetingimused, detailne aine manustamise kirjeldus, annused, lahustid, paarituste skeem;
               
            
                  —
               
               
                  järglaste arv ja sugu ühe emase kohta, saadud järglaste arv ja sugu translokatsiooni analüüsil;
               
            
                  —
               
               
                  translokatsiooni analüüsi aeg ja kriteeriumid;
               
            
                  —
               
               
                  translokatsiooni kandjate arv ja detailne kirjeldus, kus võimaluse korral oleks antud ka paarituste andmed ja emaka sisaldise uurimise andmed;
               
            
                  —
               
               
                  tsütogeneetilised protseduurid ja mikroskoopilise uuringu detailid, eelistatavalt koos piltidega;
               
            
                  —
               
               
                  statistiline hinnang;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste arutelu;
               
            
                  —
               
               
                  järeldused.
               
            3.2.   HINNANG JA JÄRELDUSED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      4.   VIITED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      B.26.   SUBKROONILISE SUUKAUDSE TOKSILISUSE KATSE – SUUKAUDSE KORDUSDOOSI TOKSILISUSE 90PÄEVANE UURING NÄRILISTEL
      1.   MEETOD
      Käesolev subkroonilise suukaudse toksilisuse uurimismeetod lähtub juhendist OECD TG 408 (1998).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Kemikaali toksiliste omaduste määramisel ja hindamisel võib teha subkroonilise suukaudse toksilisuse katseid, kasutades kordusdoose pärast seda, kui toksilisuse kohta on akuutsetest või 28päevastest kordusdoosidega toksilisuse katsetest saadud esialgne teave. 90päevane uuring annab teavet võimalike terviseriskide kohta, mis võivad tõenäoliselt tekkida korduva kokkupuute korral pikaajalise perioodi jooksul alates võõrutusjärgsest küpsemisest kuni täisealiseks arenemiseni. Uuring annab teavet toksilisuse peamiste mõjude kohta, tuvastab sihtorganid ja akumuleerumisvõimaluse ja võib anda katsealustele organismidele täheldatavat toimet mitteavaldava kontsentratsiooni väärtuse, mida saab kasutada doositasemete valimisel krooniliste mõjude uurimisel ja kokkupuutel inimestega ohutuskriteeriumide väljatöötamisel.
      Meetod asetab lisarõhu neuroloogilistele küsimustele ja selle abil saadakse teavet immunoloogilist ja paljunemisvõimet puudutavate mõjude kohta. Samuti rõhutatakse vajadust teha loomade hoolikas kliiniline läbivaatus, et hankida võimalikult palju teavet. Kõnealune uuring peaks võimaldama määrata neid kemikaale, mis on võimelised põhjustama neurotoksilist ja immunoloogilist mõju või mõju paljunemisorganitele, mis võib tagada edasise sügavuti uuringu.
      Vt ka üldise sissejuhatuse B osa.
      1.2.   MÕISTED
      
         Doos – uuritava aine manustatav kogus. Doosi väljendatakse massina (g, mg) või uuritava aine massina katsealuse looma kaaluühiku kohta (nt mg/kg) või toidus oleva püsikontsentratsioonina (ppm).
      
         Doseerimine – üldmõiste, mis hõlmab doosi, manustamise sagedust ja doseerimise kestust.
      
         NOAEL – lühend sõnadest „no observed adverse effect level” ehk doosi kõige kõrgem tase, mis vastab katseorganismidele täheldatavat toimet mitteavaldavale kontsentratsioonile.
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritavat ainet manustatakse katseloomade erinevatele rühmadele suu kaudu iga päev astmeliselt suurenevates doosides, üks doosi suurus rühma kohta 90 päeva jooksul. Manustamisperioodi jooksul jälgitakse loomi hoolikalt mürgitusnähtude suhtes. Loomad, kes surevad või katse jooksul tapetakse, lahatakse ja uuringu lõppedes tapetakse ja lahatakse ka need loomad, kes jäid ellu.
      1.4.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.4.1.   Loomade ettevalmistamine
      Kasutada tuleks terveid loomi, kes on labororitingimustega vähemalt viie päeva jooksul kohanenud ning keda ei ole varem uuringutes kasutatud. Katseloomi tuleks kirjeldada vastavalt nende liigile, liinile, päritolule, soole, kaalule ja/või vanusele. Loomad tuleks kontroll- ja menetlusrühmadesse paigutada juhuslikult. Puurid tuleks asetada nii, et puuri ümberasetamisega seotud võimalikud mõjud oleks minimaalsed. Igale loomale peab määrama unikaalse identifitseerimisnumbri.
      1.4.2.   Dooside ettevalmistamine
      Uuritavat ainet manustatakse kunstlikult või koos toidu või joogiveega. Suukaudse manustamise meetod sõltub uuringu eesmärgist ja uuritava aine fuüsikalis-keemilistest omadustest.
      Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav aine sobivas vehiikelis. Soovitatakse, et võimaluse korral tuleks kõigepealt kasutada vesilahust/suspensiooni, seejärel õlilahust/emulsiooni (nt maisiõli) ja siis lahustamist teistes vehiikelites. Mittevesilahuseliste vehiikelite puhul peab teadma kandeaine toksilisi omadusi. Kindlaks tuleks määrata uuritava aine püsivus manustamise tingimustes.
      1.4.3.   Katsetingimused
      1.4.3.1.   Katseloomad
      Närilistest eelistatakse rotte, kuigi kasutada võib ka teisi närilisi, nt hiiri. Katseloomadena tuleks kasutada üldkasutatavate tervete täiskasvanud laboratooriumiloomade aretusliine. Emasloomad peaksid olema nullpaarid ja nad ei tohiks olla tiined. Doseerimisega tuleks alustada võimalikult kohe pärast võõrutamist ja igal juhul enne loomade üheksanädalaseks saamist. Uuringu alguses peaks loomade kaaluerinevus olema minimaalne ega tohiks ületada ± 20 % kummastki soost loomade keskmisest kaalust. Kui uuring tehakse eeluuringuna pikaajalise kroonilise toksilisuse uuringu raames, tuleks mõlemas uuringus kasutada samast aretusliinist ja sama päritoluga loomi.
      1.4.3.2.   Arv ja sugu
      Igal doositasemel tuleks kasutada vähemalt 20 looma (10 emast ja 10 isast). Kui osa loomi on kavas katse käigus tappa, tuleks loomade arvu enne katse lõppu tapetavate loomade arvu võrra suurendada. Tuginedes eelnevatele teadmistele kemikaali või selle lähedase analoogi kohta, tuleks kaaluda kümneloomalise (viis kummastki soost) satelliitrühma lisamist kontrollrühma ja suurima doosi rühma, et jälgida pärast manustamisperioodi lõppu mis tahes toksilise toime pöörduvust või püsivust. Selle menetlusjärgse perioodi kestus tuleks dokumenteerida vastavalt täheldatud mõjudele.
      1.4.3.3.   Annused
      Uuringus tuleb kasutada vähemalt kolme doositaset ja uuringuga samal ajal peab tegema ka kontrolli, välja arvatud siis, kui tehakse piirsisalduskatse (vt 1.4.3.4). Doositasemed võivad põhineda kordusdoosi või vahemiku leidmise uuringu tulemustel ja peaksid arvesse võtma uuritava aine või sellega seotud materjalide kohta olemasolevat toksikoloogilist ja toksikokineetilist teavet. Kui uuritava aine füüsikalis-keemilised omadused või bioloogiline mõju ei piira suurima doosi valimist, tuleb doositase valida nii, et sellega kaasneks mürgitus, kuid et see ei põhjustaks surma ega tõsiseid kannatusi. Dooside suurused tuleks valida kahanevas järjekorras eesmärgiga näidata iga doosiga seotud reaktsioonid ja katseorganismidele täheldatavat toimet mitteavaldav sisaldus (NOAEL) kõige madalama annuse korral. Kahanevate annuste puhul on tavaliselt optimaalsemad kahe- kuni neljakordsed intervallid ja väga pikkadele intervallidele (nt kui koefitsient on 6–10) eelistatakse tavaliselt neljanda katserühma lisamist.
      Kontrollrühm peab olema rühm, millele ei manustata, või rühm, mis saab vehiikelit siis, kui uuritava aine manustamisel kasutatakse vehiikelit. Kontrollrühma loomi tuleb käidelda samal viisil kui katserühmade loomi, välja arvatud see, et neile ei anta uuritavat ainet. Kui kasutatakse vehiikelit, manustatakse kontrollrühmale vehiikelit suurimas kasutatavas ruumalas. Kui uuritavat ainet antakse koos toiduga ja see põhjustab toidu tarbimise vähenemist, võib paaristoidetav kontrollrühm olla kasulik selleks, et teha vahet maitsest või katsemudelis aset leidnud toksikoloogilistest muutustest põhjustatud vähenemistel.
      Vastavalt vajadusele tuleks arvesse võtta järgmisi vehiikeli ja teiste lisandite omadusi: mõju uuritava aine imendumisele, jaotuvusele, ainevahetusele või retentsioonile; mõju uuritava aine keemilistele omadustele, mis võivad muuta selle toksilisi omadusi; ja mõju loomade toidu või vee tarbimisele või nende toitumisseisundile.
      1.4.3.4.   Piirsisalduskatse
      Kui katses ei tuvastata käesolevas uuringus kirjeldatud menetlusega päevadoosil 1 000 mg kehakaalu kg kohta täheldatavat toksilist toimet ja kui toksilisus ei ole samalaadse struktuuriga ainete osas saadud andmete põhjal ootuspärane, ei loeta suurema doosiga uuringut vajalikuks. Teha võib piirsisalduskatse, välja arvatud juhul, kui inimese kokkupuude viitab vajadusele kasutada suuremat doositaset.
      1.5.   ANALÜÜSI KAIK
      1.5.1.   Doseerimine
      Loomadele doseeritakse uuritavat ainet seitsmel päeval nädalas ja 90 päeva jooksul. Mis tahes muu doseerimismeetodi, nt viis päeva nädalas, kasutamist tuleb põhjendada. Kui uuritavat ainet manustatakse kunstlikult, peaks seda tegema loomadele ühe doosi kaupa, kasutades maosondi või sobivat intubatsioonikanüüli. Maksimaalne vedelikumaht, mida võib korraga loomale manustada, sõltub katselooma suurusest. Maht ei tohiks ületada 1 ml kehakaalu 100 g kohta, välja arvatud vesilahuste puhul, mille puhul võib kasutada ka suhet 2 ml kehakaalu 100 g kohta. Välja arvatud ärritavate ja söövitavate ainete puhul, millel on suurematel kontsentratsioonidel tavaliselt halvem toime, tuleks katsemahu varieeruvus muuta minimaalseks sellega, et kõikide annuste puhul kohandatakse ühesuguse mahu tagamiseks kontsentratsiooni.
      Ainete puhul, mida manustatakse toidu või joogiveega, on oluline tagada, et toiduga kasutatavad uuritava aine kogused ei häiriks tavalist toitmise või joogivee tasakaalu. Kui uuritavat ainet manustatakse toiduga, võib kasutada kas püsivat kontsentratsiooni toidus (ppm) või püsiva suurusega doosi vastavalt looma kehakaalule; tuleks täpsustada, millist võimalust kasutatakse. Kui ainet manustatakse kunstlikult, tuleks doos anda igal päeval samal ajal ning seda tuleks vajaduse korral kohandada, et looma kehakaalu suhtes säiliks püsiv doositase. Kui 90päevane uuring tehakse eeluuringuna pikaajalise kroonilise toksilisuse uuringu raames, tuleks mõlema uuringu puhul kasutada samasugust toitu.
      1.5.2.   Vaatlused
      Vaatlusperiood peaks kestma vähemalt 90 päeva. Järelvaatluse jaoks planeeritud satelliitrühma loomad tuleks hoida sobiva perioodi jooksul menetlemata, et oleks võimalik avastada toksilise toime pööratavust või püsivust.
      Vähemalt üks kord päevas tuleks teha üldine kliiniline läbivaatus, eelistatavalt igal päeval samal ajal (samadel aegadel), arvestades eeldatavat mõju kõrgperioodil pärast doseerimist. Loomade kliiniline seisund tuleks dokumenteerida. Vähemalt kaks korda päevas, tavaliselt iga päeva alguses ja lõpus, tuleks kontrollida, kas loomad on haigestunud või surnud.
      Vähemalt üks kord enne esimest kokkupuudet (et võimaldada subjektide omavahelist kõrvutamist) ja pärast seda kord nädalas tuleks teha kõikide loomade üksikasjalik kliiniline läbivaatus. Need vaatlused tuleks teha väljaspool puuri, eelistatavalt selleks ette nähtud kohas ja iga kord samal ajal. Tulemused tuleks hoolikalt üles märkida, kasutades selleks võimaluse korral katselabori poolt fikseeritud hindamissüsteeme. Tuleks püüda tagada, et vaatlustingimuste varieeruvus oleks võimalikult minimaalne. Tuvastatud märgid peaksid hõlmama lisaks muule muutusi nahal, karvades, silmades, limaskestas, ekstraktide ja eritiste esinemist ning autonoomseid toiminguid (nt pisarate vool, piloerektsioon, pupillide suunis, ebaregulaarne hingamine). Samuti tuleks üles märkida muudatused kõnnakus, kehaasendis ja selles, kuidas loomad endaga ümberkäimisele reageerivad, samuti kloonilised või toonilised liigutused, stereotüübid (nt ülemäärane karvastiku hooldus, ringiratast keerlemine) või kummaline käitumine (nt enese vigastamine, vastupidine käitumine) (1).
      Oftalmoloogiline läbivaatus, kasutades silmapeeglit või samalaadset sobivat vahendit, tuleks teha enne uuritava aine manustamist ja uuringu lõppedes eelistatavalt kõikidel loomadel, kuid vähemalt suure doosiga rühmas ja kontrollrühmas. Kui silmades avastatakse muutusi, tuleb läbi vaadata kõik loomad.
      Kokkupuuteperioodi lõpupoole, kuid mitte varem kui 11. nädalal, tuleks läbi viia sensoorse reageerimise kontroll erinevat liiki ärritajatele (1) (nt kuulmis-, nägemis- ja propriotseptori ärritustele) (2, 3, 4), kinnihaaramise tugevuse (5) ja motoorse aktiivsuse (6) hindamine. Võimalike meetodite täpsemad üksikasjad on esitatud vastavates viidetes. Siiski võib kasutada ka muid meetodeid kui need, millele viidatakse.
      Funktsionaalsed vaatlused, mis viiakse läbi uuringu lõpupoole, võib ka ära jätta, kui on olemas teiste uuringute funktsionaalsete vaatluste andmed ja kui igapäevased kliinilised vaatlused ei toonud esile mingeid funktsionaalseid vaegusi.
      Erandkorras võib funktsionaalsed vaatlused ära jätta rühmade puhul, millel esineb toksilisuse märke niisugusel määral, et see takistaks märkimisväärselt funktsionaalsete katsete läbiviimist.
      1.5.2.1.   Kehakaal ja toidu/vee tarbimine
      Kõiki loomi tuleks kaaluda vähemalt kord nädalas. Toidu tarbimist tuleks mõõta vähemalt kord nädalas. Kui uuritavat ainet manustatakse joogiveega, tuleks vee tarbimist samuti vähemalt kord nädalas mõõta. Vee tarbimise mõõtmist võib kaaluda ka selliste toitumis- või sundsöötmise uuringute korral, mille jooksul võib joomisaktiivsuses esineda muutusi.
      1.5.2.2.   Hematoloogia ja kliiniline biokeemia
      Vereproovid tuleks võtta kindlaksmääratud kohast ja neid tuleks vajaduse korral säilitada sobivates tingimustes. Katseperioodi lõpus võetakse proovid vahetult enne loomade tapmist või selle käigus.
      Katseperioodi lõpul või kui võetakse vahepealseid vereproove, tuleks teha järgmised hematoloogilised uuringud: hematokrit, hemoglobiini kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, leukotsüütide üld- ja diferentseeritud arv, vereliistakute arv ja vere hüübimisaja/hüübimisvõime mõõtmine.
      Kliinilised biokeemilised analüüsid peamiste toksiliste mõjude uurimiseks kudedes ja eelkõige nende toime uurimisel neerudele ja maksale tuleks teha vereproovidega, mis on võetud loomadelt vahetult enne tapmist või selle ajal (välja arvatud loomad, kes leiti surevana ja/või tapeti katse ajal). Nii nagu hematoloogilisel uuringul, võib võtta ka kliiniliste biokeemiliste katsete jaoks vahepealseid proove. Üks öö enne vereproovi võtmist soovitatakse loomadel paastuda (3). Plasma või seerumiuuringud peavad hõlmama naatriumi, kaaliumi, glükoosi, üldkolesterooli, karbamiidi, kreatiniini, üldvalku ja albumiini, vähemalt kahte hepatotsellulaarsele toimele osutavat ensüümi (näiteks alaniinaminotransferaas, aspartaataminotransferaas, aluseline fosfataas, gammaglutamüültranspeptidaas, ja sorbitooldehüdrogenaas). Teha võib ka muude ensüümide (maksa või teiste organite) ja sapphapete mõõtmisi, mis võivad teatavatel tingimustel anda kasulikku teavet.
      Alternatiivselt on uuringu viimasel nädalal võimalik loomadelt uriiniproovide kogumise teel teha järgmisi uriinianalüüse: välimus, ruumala, osmolaalsus või suhteline tihedus, pH, valk, glükoos ja veri/vererakud.
      Lisaks sellele tuleks uurida, kas seerumis on üldistele koekahjustustele osutavaid markereid. Muud määramised, mis tuleks teha juhul, kui uuritava aine teadaolevad omadused võivad mõjutada või mõjutavad eeldatavasti sellega seotud ainevahetuse profiili, hõlmavad kaltsiumi, fosforit, triglütseriide, mis on määratud enne sööki, teatavaid hormoone, methemoglobiini ja koliinesteraasi. Need on vaja määrata teatavatesse klassidesse kuuluvate ainete puhul või konkreetsete juhtude põhiselt.
      Üldiselt on vaja paindlikku lähenemisviisi, mis sõltub vastava aine liigist ja selle täheldatud ja/või oodatud toimest.
      Kui varasemad lähteandmed ei ole piisavad, tuleks enne doseerimise alustamist määrata hematoloogilised ja kliinilis-biokeemilised muutujad; tavaliselt ei soovitata neid andmeid hankida enne menetlust (7).
      1.5.2.3.   Täielik lahang
      Kõik uuringusse kaasatud loomad läbivad täieliku, põhjaliku lahkamise, milles uuritakse põhjalikult keha välispinda, kõiki haavu, kolju-, rinna- ja kõhuõõnt ja nende sisu. Kõikide loomade (välja arvatud need, kes leitakse surevatena ja/või tapetakse uuringu ajal) maks, neerud, neerupealsed, munandid, munandimanused, emakas, munasarjad, harknääre, põrn, aju ja süda tuleb vajaduse korral puhastada muudest kudedest ja nende märgmass määratakse kuivamise vältimiseks võimalikult kiiresti pärast dissekteerimist.
      Järgmisi kudesid tuleks hoida koetüübi ja kavandatava histopatoloogilise uuringu seisukohast kõige sobivamas fiksaatoris: kõik silmaga täheldatavad vigastused, aju (olulised piirkonnad, sealhulgas suuraju, väikeaju ja medulla/ajusild), seljaaju (kolmel tasandil: tservikaalne, poolrindmik, lumbaarne), ajuripats, kilpnääre, kõrvalkilpnääre, harknääre, söögitoru, süljenäärmed, magu, peen- ja jämesool (sealhulgas Peyeri naastud), maks, kõhunääre, neerud, neerupealsed, põrn, süda, trahhea ja kopsud (mis puhutakse kõigepealt säilitusainet täis ja seejärel sukeldatakse sinna), aort, sugunäärmed, emakas, lisasuguorganid, emaste rinnanäärmed, eesnääre, kusepõis, sapipõis (hiir), lümfisõlmed (eelistatult üks lümfisõlm, mis hõlmab manustamiskohta, ja teine lümfisõlm, mis on manustamiskohast eemal, et anda teavet süsteemse toime kohta), perifeerne närv (istmiku- või sääreluu närv), mis on eelistatult lihase lähedal, ning osa luuüdi (või alternatiivselt väike kogus toorest luuüdi), nahk ja silmad (kui oftalmoloogilise läbivaatuse käigus avastati muutusi). Kliinilised ja muud leiud võivad osutada vajadusele uurida ka teisi kudesid. Säilitada tuleks ka teised organid, mis on uuritava aine teadaolevatest omadustest tulenevalt tõenäoliselt sihtorganid.
      1.5.2.4.   Histopatoloogia
      Kõikide võrdlusrühma ja kõrge doosiga rühmade loomade säilitatud organeid ja kudesid tuleks histopatoloogiliselt põhjalikult uurida. Histopatoloogilised uuringud tuleks läbi viia ka teiste doosirühmade loomade puhul juhul, kui kõrge doosiga rühma osas tuvastatakse manustamisega seotud muudatusi.
      Uurida tuleks kõiki silmaga täheldatavaid kahjustusi.
      Kui kasutatakse satelliitrühma, tuleks histopatoloogiline uuringteha nende kudede ja organite puhul, millel esineb samasugune toime kui katserühma puhul.
      2.   ANDMED JA ARUANDLUS
      2.1.   ANDMED
      Loomade kohta tuleks esitada andmed individuaalselt. Lisaks sellele tuleks kõik andmed koondada tabelisse, milles oleks iga katserühma kohta märgitud loomade arv katse alguses, katse ajal surnud või humaansetel põhjustel tapetud loomade arv, toksiliste märkidega loomade arv, täheldatud toksiliste märkide kirjeldus, sealhulgas toksilise toime ilmnemine, kestus, raskusaste, kahjustustega loomade arv, kahjustuste liik ja iga liiki kahjustuse kohta loomade protsent, kellel neid esines.
      Kui võimalik, tuleks numbrilisi tulemusi hinnata asjakohaste ja üldiselt tunnustatud statistilise meetodiga. Statistiliste meetodite ja analüüsitavate andmete valik tuleks teha uuringu kavandamisel.
      2.2.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab võimaluse korral sisaldama järgmist teavet.
      2.2.1.   Uuritav aine:
      
                  —
               
               
                  füüsikaline loomus, puhtus ning füüsikalis-keemilised omadused;
               
            
                  —
               
               
                  identifitseerimisandmed;
               
            
                  —
               
               
                  vehiikel (vajaduse korral): vehiikeli valiku põhjendamine, kui vehiikeliks ei ole vesi.
               
            2.2.2.   Katseloomade liigid:
      
                  —
               
               
                  liik ja kasutatav liin;
               
            
                  —
               
               
                  loomade arv, vanus ja sugu;
               
            
                  —
               
               
                  päritolu, pidamistingimused, toit jne;
               
            
                  —
               
               
                  iga looma kaal katse alguses.
               
            2.2.3.   Katsetingimused:
      
                  —
               
               
                  doositaseme valimise põhjendus;
               
            
                  —
               
               
                  üksikasjad uuritava aine koostise/toiduvalmistise kohta, valmistises saavutatud kontsentratsiooni, stabiilsuse ja homogeensuse kohta;
               
            
                  —
               
               
                  uuritava aine manustamise üksikasjad;
               
            
                  —
               
               
                  tegelikud doosid (mg kehakaalu kg kohta päevas) ja vajaduse korral ümberarvestustegur toidu/joogivee uuritava aine kontsentratsiooni (ppm) ja tegeliku doosi vahel;
               
            
                  —
               
               
                  toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad.
               
            2.2.4.   Tulemused:
      
                  —
               
               
                  eluskaal ja muutused eluskaalus;
               
            
                  —
               
               
                  toidu ja vajaduse korral vee tarbimine;
               
            
                  —
               
               
                  toksilise reaktsiooni andmed vastavalt looma soole ja doositasemele, sealhulgas toksilisuse märgid;
               
            
                  —
               
               
                  kliiniliste vaatluste iseloom, raskusaste ja kestus (pöördumatu või mitte);
               
            
                  —
               
               
                  oftalmoloogilise läbivaatuse tulemused;
               
            
                  —
               
               
                  sensoorse aktiivsuse, haardetugevuse ja motoorse tegevuse hindamine (kui võimalik);
               
            
                  —
               
               
                  hematoloogilised katsed ja vastavate põhijoonte väärtused;
               
            
                  —
               
               
                  kliinilise biokeemia katsed ja vastavate põhijoonte väärtused;
               
            
                  —
               
               
                  lõplik kehakaal, organite kaal ja organite/kehakaalu suhted;
               
            
                  —
               
               
                  lahkamise tulemused;
               
            
                  —
               
               
                  histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  võimaluse korral andmed imendumise kohta;
               
            
                  —
               
               
                  vajaduse korral tulemuste statistiline töötlemine.
               
            Tulemuste arutelu.
      Järeldused.
      3.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No 60.
               
            
                  2)
               
               
                  Tupper, D. E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, pp. 999–1003.
               
            
                  3)
               
               
                  Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, pp. 691–704.
               
            
                  4)
               
               
                  Moser, V. C, Mc Daniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, pp. 267–283.
               
            
                  5)
               
               
                  Meyer O. A., Tilson H. A., Byrd W. C, Riley M. T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore-and Hind- limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, pp. 233–236.
               
            
                  6)
               
               
                  Crofton K. M., Howard J. L., Moser V. C, Gill M. W, Reiter L. W, Tilson H. A, MacPhail R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, pp. 599–609.
               
            
                  7)
               
               
                  Weingand K., Brown G., Hall R. et al. (1996). „Harmonisation of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies”, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, pp. 198–201.
               
            B.27.   SUBKROONILISE SUUKAUDSE TOKSILISUSE KATSE – SUUKAUDSE KORDUSDOOSI TOKSILISUSE 90PÄEVANE UURING MITTENÄRILISTEL
      1.   MEETOD
      See subkroonilise suukaudse toksilisuse uurimismeetod lähtub juhendist OECD TG 409 (1998).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Kemikaali toksiliste omaduste kindlaksmääramisel ja hindamisel võib teha subkroonilise suukaudse toksilisuse katseid, kasutades kordusdoose pärast seda, kui on saadud esialgne teave toksilisuse kohta akuutsetest või 28päevastest kordusdoosidega toksilisuse katsetest. 90päevane uuring annab teavet võimalike terviseriskide kohta, mis võivad tõenäoliselt tekkida korduva kokkupuute korral kiire kasvuperioodi jooksul kuni nooremasse täisikka arenemiseni. Uuring annab teavet toksilisuse peamiste mõjude kohta, tuvastab sihtorganid ja akumuleerumisvõimaluse ja võib anda katsealustele organismidele täheldatavat toimet mitteavaldava kontsentratsiooni väärtuse, mida saab kasutada doositasemete valimisel krooniliste mõjude uurimisel ja ohutuskriteeriumide väljatöötamisel kokkupuutel inimestega.
      Käesolev uurimismeetod võimaldab kindlaks määrata keemilise ainega kokkupuute ebasoodsaid mõjusid mittenäriliste liikidel ja seda tuleks kasutada ainult siis,
      
                  —
               
               
                  kui teistes uuringutes täheldatud mõjud viitavad vajadusele saada selgust või iseloomustust teise, mittenäriliste liigi kohta või
               
            
                  —
               
               
                  kui toksikokineetilised uuringud viitavad sellele, et konkreetse mittenäriliste liigist laboratooriumiloomade kasutamine on parim valik, või
               
            
                  —
               
               
                  kui mõni muu konkreetne põhjus õigustab mittenäriliste liigi kasutamist.
               
            Vt ka üldise sissejuhatuse B osa.
      1.2.   MÕISTED
      
         Doos – uuritava aine manustatav kogus. Doosi väljendatakse massina (g, mg) või uuritava aine massina katsealuse looma kaaluühiku kohta (nt mg/kg) või toidus oleva püsikontsentratsioonina (ppm).
      
         Doseerimine – üldmõiste, mis hõlmab doosi, selle sagedust ja doseerimise kestust.
      
         NOAEL – lühend sõnadest „no observed adverse effect level” ehk dooside kõige kõrgem tase, mis vastab katseorganismidele täheldatavat toimet mitteavaldavale sisaldusele.
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritav aine manustatakse erinevatele katseloomade rühmadele suu kaudu kord päevas astmeliselt suureneva koguse kaupa selliselt, et üks rühm saaks 90 päeva jooksul ainult ühte doosi. Manustamisperioodi jooksul vaadeldakse loomi põhjalikult toksilisuse märkide tuvastamiseks. Katse ajal surnud või tapetud loomad lahatakse ning katse lõppemisel tapetakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad.
      1.4.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.4.1.   Loomaliigi valik
      Tavaliselt kasutatav mittenäriliste liik on koerad, kelle tõug peaks olema täpselt määratletud; sageli kasutatakse jänesekoeri. Kasutada võib ka teisi liike, nt sigu ja minisigu. Esikloomaliste kasutamine ei ole soovitatud ja nende kasutamist tuleb põhjendada. Kasutada tuleks noori, terveid loomi ja koerte puhul võiks doseerimine eelistatavalt alata 4-6 kuu aga mitte hiljem kui üheksa kuu vanuselt. Kui uuring tehakse eeluuringuna pikaajalise kroonilise toksilisuse uuringu raames, tuleks mõlemas uuringus kasutada sama liiki/tõugu loomi.
      1.4.2.   Loomade ettevalmistamine
      Kasutada tuleks terveid noori loomi, kes on aklimatiseerunud laboratooriumi tingimustega ning keda ei ole varem uuringus kasutatud. Aklimatiseerumise kestus sõltub valitud katselooma liigist ja päritolust. Selle kestuseks soovitatakse vähemalt viis päeva koertele või vastaval eesmärgil kohapeal kasvatatavatele sigadele ja vähemalt kaks nädalat kõnealustele loomadele, kui need on pärit väljastpoolt laboratooriumi. Katseloomad tuleks kirjeldada vastavalt nende liigile, liinile, päritolule, soole, kaalule ja/või vanusele. Loomad tuleks juhuslikult paigutada kontroll- ja katserühmadesse. Puurid tuleks asetada nii, et puuri ümberasetamisega seotud võimalikud mõjud oleks minimaalsed. Igale loomale peab määrama unikaalse identifitseerimisnumbri.
      1.4.3.   Dooside ettevalmistamine
      Uuritavat ainet võib manustada söögi või joogiveega, sundsöötmisega või kapslitena. Suukaudse manustamise meetod sõltub uuringu eesmärgist ja uuritava aine füüsikalis-keemilistest omadustest.
      Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav aine sobivas vehiikelis. Soovitatakse, et võimaluse korral tuleks kõigepealt kasutada vesilahust/suspensiooni, seejärel õlilahust/emulsiooni (nt maisiõli) ja siis lahustamist teistes vehiikelites. Mittevesilahuseliste vehiikelite puhul peab teadma vehiikeli toksilisi omadusi. Kindlaks tuleks määrata uuritava aine püsivus manustamise tingimustes.
      1.5.   KATSE KÄIK
      1.5.1.   Loomade arv ja sugu
      Iga doositaseme juures tuleks kasutada vähemalt kaheksat looma (nelja emast ja nelja isast). Kui osa loomi on kavas katse käigus tappa, tuleks loomade arvu enne katse lõppu tapetavate loomade arvu võrra suurendada. Loomade arv uuringu lõpul peab olema piisav toksilise mõju adekvaatseks hindamiseks. Tuginedes eelnevatele teadmistele aine või selle lähedase analoogi kohta, tuleks kaaluda kaheksaloomalise (neli kummastki soost) satelliitrühma lisamist kontrollrühma ja suurima doosi rühma, et jälgida pärast manustamisperioodi lõppu mis tahes toksilise toime pööratavust või püsivust. Selle menetlusjärgse perioodi kestus tuleks dokumenteerida vastavalt täheldatud mõjudele.
      1.5.2.   Doseerimine
      Uurimuses tuleb kasutada vähemalt kolme doositaset ja ühel ajal uuringuga peab tegema ka kontrolli, välja arvatud piirsisalduskatse tegemisel (vt 1.5.3). Doositasemed võivad põhineda kordusdoosi või vahemiku leidmise uuringu tulemustel ja peaksid arvesse võtma uuritava ühendi või sellega seotud materjalide kohta olemasolevat toksikoloogilist ja toksikokineetilist teavet. Kui uuritava aine füüsikalis-keemilised omadused või bioloogiline mõju ei piira suurima doosi valimist, tuleb doositase valida nii, et sellega kaasneks mürgitus, kuid et see ei põhjustaks surma ega tõsiseid kannatusi. Doositasemed tuleks valida kahanevas järjekorras, eesmärgiga näidata iga doosiga seotud reaktsioonid ja katseorganismidele täheldatavat toimet mitteavaldav sisaldus (NOAEL) kõige madalamal doositasemel. Sageli on kõige optimaalsemad kahe- kuni neljakordsed erinevused alanevate doositasemete korral ja sageli on kasulikum lisada neljas katserühm, kui kasutatakse väga suuri vahesid dooside vahel (nt suuremaid kui 6–10kordseid).
      Kontrollrühm peab olema rühm, millele ei manustata, või rühm, mis saab vehiikelit, kui uuritava aine manustamisel kasutatakse vehiikelit. Kontrollrühma loomi tuleb käidelda samal viisil kui katserühmade loomi, välja arvatud see, et neile ei anta uuritavat ainet. Kui kasutatakse vehiikelit, manustatakse kontrollrühmale vehiikelit suurimas kasutatavas ruumalas. Kui uuritavat ainet antakse koos toiduga ja see põhjustab toidu tarbimise vähenemist, võib paaristoidetav kontrollrühm olla kasulik selleks, et teha vahet maitsest või katsemudelis aset leidnud toksikoloogilistest muutustest põhjustatud vähenemisel.
      Vastavalt vajadusele tuleks arvesse võtta järgmiseid vehiikeli ja teiste lisandite omadusi: mõju uuritava aine imendumisele, jaotumisele, ainevahetusele või retentsioonile; mõju uuritava aine keemilistele omadustele, mis võivad muuta selle toksilisi omadusi; ja mõju loomade toidu või vee tarbimisele või nende toitumisseisundile.
      1.5.3.   Piirsisalduskatse
      Kui katse ühe doosi suurusega, mis on vähemalt 1 000 mg looma kehakaalu kg kohta ööpäevas, kasutades käesoleva uuringu jaoks kirjeldatud töökorda, ei põhjusta märgatavat ebasoodsat mõju ja kui toksilisust ei eeldata samalaadse struktuuriga ainete kohta käivate andmete põhjal, ei ole kolme doosi suurustega täisuuring vajalik. Teha võib piirsisalduskatse, välja arvatud juhul, kui inimese kokkupuude viitab vajadusele kasutada suuremat doositaset.
      1.5.4.   Doseerimine
      Loomadele doseeritakse uuritavat ainet seitsmel päeval nädalas ja 90 päeva jooksul. Mis tahes muu doseerimisrežiim, nt viis päeva nädalas, vajab põhjendamist. Kui uuritavat ainet manustatakse kunstlikult, peaks seda tegema loomadele ühe doosi kaupa, kasutades maosondi või sobivat intubatsioonikanüüli. Maksimaalne vedelikumaht, mida võib korraga loomale manustada, sõltub katselooma suurusest. Tavaliselt tuleks hoida need mahud võimalikult madalal. Välja arvatud ärritavate või söövitavate ainete puhul, millel on suurematel kontsentratsioonidel tavaliselt halvem toime, tuleks katsemahu varieeruvus muuta minimaalseks sellega, et kõikidel doositasemetel kohandatakse ühesuguse mahu tagamiseks kontsentratsiooni.
      Ainete puhul, mida manustatakse toidu või joogiveega, on oluline tagada, et toiduga kasutatavad uuritava aine kogused ei häiriks tavalist toitmise või joogivee tasakaalu. Kui uuritavat ainet manustatakse toiduga, võib kasutada kas püsivat kontsentratsiooni toidus (ppm) või püsiva suurusega doosi vastavalt looma kehakaalule; valitud alternatiiv tuleb täpsustada. Kui ainet manustatakse kunstlikult, tuleks doos anda igal päeval samal ajal ning seda tuleks vajaduse korral kohandada, et looma kehakaalu suhtes säiliks püsiv doositase. Kui 90päevane uuring tehakse eeluuringuna pikaajalise kroonilise toksilisuse uuringu raames, tuleks mõlemas uuringus kasutada samalaadset toitu.
      1.5.5.   Vaatlused
      Vaatlusperiood peaks kestma vähemalt 90 päeva. Järelvaatluse jaoks planeeritud satelliitrühma loomad tuleks hoida sobiva perioodi jooksul menetlemata, et oleks võimalik avastada toksilise toime pööratavust või püsivust.
      Vähemalt üks kord päevas tuleks teha üldine kliiniline läbivaatus, eelistatavalt igal päeval samal ajal/samadel aegadel, arvestades eeldatavat mõju kõrgperioodil pärast doseerimist. Loomade kliiniline seisund tuleks dokumenteerida. Vähemalt kaks korda päevas, tavaliselt iga päeva alguses ja lõpus, tuleks kontrollida, kas loomad on haigestunud või surnud.
      Vähemalt üks kord enne esimest kokkupuudet (et võimaldada subjektide omavahelist kõrvutamist) ja pärast seda kord nädalas tuleks teha kõikide loomade üksikasjalik kliiniline läbivaatus. Kui see on praktiliselt võimalik, tuleks sellised vaatlused tuleks teha väljaspool puuri, selleks ettenähtud kohas ja eelistatavalt iga kord samal ajal. Tuleks üritada tagada, et vaatlustingimuste varieerumine oleks minimaalne. Toksilisuse nähud tuleks koos nende algusaja, raskusastme ja kestusega hoolikalt üles märkida. Vaatlus peaks sealhulgas sisaldama muutusi nahal, karvkattes, silmades, limaskestadel, sekretsiooni ja ekskretsiooni esinemises ja autonoomses tegevuses (nt pisaratevool, karvade jäigastumine, pupilli suurus, ebatavaline hingamisrütm). Samuti tuleks üles märkida muutused käimises, seisangus ja samuti reageerimine käitlemisele ning klooniliste või tooniliste liigutuste esinemine, stereotüübid (nt liigne karvade puhastamine, korduv tiirlemine) või igasugune kummaline käitumine.
      Oftalmoloogiline läbivaatus, kasutades silmapeeglit või samalaadset sobivat vahendit, tuleks teha enne uuritava aine manustamist ja uuringu lõppedes eelistatavalt kõikidel loomadel, kuid vähemalt suure doosiga rühmas ja kontrollrühmas. Kui silmades avastatakse muutusi, tuleb läbi vaadata kõik loomad.
      1.5.5.1.   Kehakaal ja toidu/vee tarbimine
      Kõiki loomi tuleks kaaluda vähemalt kord nädalas. Toidu tarbimist tuleks mõõta vähemalt kord nädalas. Kui uuritavat ainet manustatakse joogiveega, tuleb vee tarbimist samuti vähemalt kord nädalas mõõta. Vee tarbimise mõõtmist võib kaaluda ka selliste toitumis- või kunstlikult toitmise uuringute korral, mille jooksul võib joomisaktiivsuses esineda muutusi.
      1.5.5.2.   Hematoloogia ja kliiniline biokeemia
      Vereproovid tuleks võtta kindlaksmääratud kohast ja neid tuleks vajaduse korral säilitada sobivates tingimustes. Katseperioodi lõpus võetakse proovid vahetult enne loomade tapmist või selle käigus.
      Katse alguses tuleks uurida hematoloogiat, sealhulgas hematokritti, hemoglobiini kontsentratsiooni, erütrotsüütide arvu, leukotsüütide üld- ja diferentseeritud arvu, vereliistakute arvu ja mõõta vere hüübimisvõimet, nagu näiteks hüübimise kiirust, protrombiiniaega või tromboplastiiniaega, seejärel kas kord iga kuu või katseperioodi keskel ja lõpuks katseperioodi lõpus.
      Kliinilise biokeemia analüüsid, millega uuritakse kõige tähtsamaid mürgi mõjusid kudedes ja eriti selle mõju neerule ja maksale, tuleks teha vereproovide kohta, mis on võetud kõikidelt loomadelt katse alguses, seejärel kas kord iga kuu või katseperioodi keskel ja lõpuks katseperioodi lõpus. Vaatluse alla tuleks võtta sellised uuringuvaldkonnad nagu elektrolüütide tasakaal, sahhariidide ainevahetus ja maksa ning neeru funktsioon. Konkreetsete katsete valikut mõjutavad tähelepanekud uuritava aine mõju kohta. Sõltuvalt liigist ei tohiks loomadele enne vereproovide võtmist teatud aja vältel süüa anda. Soovitatavad analüüsid on kaltsium, fosfor, kloriid, naatrium, kaalium, paastumise glükoos, alaniinaminotransferaas, aspartaadaminotransferaas, ornitiindekarboksülaas, gamma-glutamüültranspeptidaas, karbamiidlämmastik, albumiin, vere kreatiniin, kogu bilirubiin ja kogu seeriumi valgu mõõtmised.
      Uriinianalüüsi peaks tegema vähemalt uuringu alguses, keskel ja lõpus, kasutades uriini kogumist kindlatel aegadel. Uriinianalüüsi puhul määratakse välimus, ruumala, osmolaalsus või erikaal, pH, valk, glükoos ja veri ja/või vererakud. Vajadusel võib kasutada lisaparameetreid, kui on tarvis laiendada täheldatud mõju uurimist.
      Lisaks tuleks kaaluda üldisele kudede kahjustusele osutavate markerite uurimist. Muud analüüsid, mis võivad osutuda vajalikuks adekvaatse toksikoloogilise hindamise saamiseks, hõlmavad lipiidide, hormoonide, happe-aluse tasakaalu, methemoglobiini ja kolinesteraasi pärssimise analüüse. Vajadusel võib kasutada täiendavaid kliinilise biokeemia valdkonda kuuluvaid uuringuid, kui on tarvis laiendata täheldatud mõju uurimist. Need tuleb kindlaks määrata teatud klassi kuuluvate kemikaalide puhul või iga juhtumi puhul eraldi.
      Üldiselt on vaja paindlikku lähenemist, mis sõltub liigist ja antud aine täheldatud ja/või eeldatavast mõjust.
      1.5.5.3.   Täielik lahang
      Kõik uuringusse kaasatud loomad läbivad täieliku, põhjaliku lahkamise, milles uuritakse põhjalikult keha välispinda, kõiki haavu, kolju-, rinna- ja kõhuõõnt ja nende sisu. Kõikide loomade (välja arvatud need, kes leitakse surevatena ja/või tapetakse uuringu ajal) maks koos sapipõiega, neerud, neerupealsed, munandid, munandimanused, munasarjad, emakas, kilpnääre (koos kõrvalkilpnäärmetega), harknääre, põrn, aju ja süda tuleb vajaduse korral puhastada muudest kudedest ja nende märgmass tuleks fikseerida võimalikult kohe pärast nende eemaldamist, et vältida kuivamist.
      Järgmisi kudesid tuleks hoida koetüübi ja kavandatava histopatoloogilise uuringu seisukohast kõige sobivamas fiksaatoris: kõik silmaga täheldatavad vigastused, aju (olulised piirkonnad, sealhulgas suuraju, väikeaju ja medulla/ajusild), seljaaju (kolmel tasandil: tservikaalne, poolrindmik, lumbaarne), ajuripats, silmad, kilpnääre, kõrvalkilpnääre, harknääre, söögitoru, süljenäärmed, magu, peen- ja jämesool (sealhulgas Peyeri naastud), maks, sapipõis kõhunääre, neerud, neerupealsed, põrn, süda, trahhea ja kopsud, aort, sugunäärmed, emakas, lisasuguorganid, emaste rinnanäärmed, eesnääre, kusepõis, lümfisõlmed (eelistatavalt üks lümfisõlm, mis paikneb manustamise teel, ja teine, mis asub manustamise teest kaugel ja näitab süsteemset mõju), perifeerne närv (istmik või sääreluu), eelistatavalt vastava lihase läheduses olev, luuüdi proov (ja/või värske luuüdi aspiraat) ja nahk. Kliinilised ja muud leiud võivad osutada vajadusele uurida ka teisi kudesid. Säilitada tuleks ka teised organid, mis on uuritava aine teadaolevatest omadustest tulenevalt tõenäoliselt sihtorganid.
      1.5.5.4.   Histopatoloogia
      Kõikide võrdlusrühma ja kõrge doosiga rühmade loomade säilitatud organeid ja kudesid tuleks histopatoloogiliselt põhjalikult uurida. See uuring tuleks läbi viia ka teiste doosirühmade loomade puhul juhul, kui kõrge doosiga rühma osas tuvastatakse manustamisega seotud muudatusi.
      Uurida tuleks kõiki silmaga täheldatavaid kahjustusi.
      Kui kasutatakse satelliitrühma, tuleks histopatoloogiline uuring teha nende kudede ja organite puhul, millel esineb samasugune toime kui katserühma puhul.
      2.   ANDMED JA ARUANDLUS
      2.1.   ANDMED
      Loomade kohta tuleks esitada andmed individuaalselt. Lisaks sellele tuleks kõik andmed koondada tabelisse, milles oleks iga katserühma kohta märgitud loomade arv katse alguses, katse ajal surnud või humaansetel põhjustel tapetud loomade arv, toksiliste märkidega loomade arv, täheldatud toksiliste märkide kirjeldus, sealhulgas toksilise toime ilmnemine, kestus, raskusaste, kahjustustega loomade arv, kahjustuste liik ja iga liiki kahjustuse kohta loomade protsent, kellel neid esines.
      Võimaluse korral tuleks numbrilisi tulemusi hinnata asjakohase ja üldiselt tunnustatud statistilise meetodiga. Statistilised meetodid ja analüüsitavad andmed tuleks valida uuringu kavandamise etapis.
      2.2.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      2.2.1.   Uuritav aine:
      
                  —
               
               
                  füüsikaline loomus, puhtus ning füüsikalis-keemilised omadused;
               
            
                  —
               
               
                  identifitseerimisandmed;
               
            
                  —
               
               
                  vehiikel (vajaduse korral): vehiikeli valiku põhjendus, kui vehiikeliks ei ole vesi.
               
            2.2.2.   Katseloomade liigid:
      
                  —
               
               
                  liik ja kasutatav liin;
               
            
                  —
               
               
                  loomade arv, vanus ja sugu;
               
            
                  —
               
               
                  päritolu, pidamistingimused, toit jne;
               
            
                  —
               
               
                  iga looma kaal katse alguses.
               
            2.2.3.   Katsetingimused:
      
                  —
               
               
                  doositaseme valimise põhjendus;
               
            
                  —
               
               
                  üksikasjad uuritava aine koostise/toiduvalmistise kohta, valmistises saavutatud kontsentratsiooni, stabiilsuse ja homogeensuse kohta;
               
            
                  —
               
               
                  uuritava aine manustamise üksikasjad;
               
            
                  —
               
               
                  tegelikud doosid (mg kehakaalu kg kohta päevas) ja vajaduse korral ümberarvestustegur toidu/joogivee uuritava aine kontsentratsiooni (ppm) ja tegeliku doosi vahel;
               
            
                  —
               
               
                  toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad.
               
            2.2.4.   Tulemused
      
                  —
               
               
                  eluskaal/muutused eluskaalus;
               
            
                  —
               
               
                  toidu ja vajaduse korral vee tarbimine;
               
            
                  —
               
               
                  toksilise reaktsiooni andmed vastavalt looma soole ja doositasemele, sealhulgas toksilisuse märgid;
               
            
                  —
               
               
                  kliiniliste vaatluste iseloom, raskusaste ja kestus (pöördumatu või mitte);
               
            
                  —
               
               
                  oftalmoloogiline läbivaatus;
               
            
                  —
               
               
                  hematoloogilised katsed ja vastavate põhijoonte väärtused;
               
            
                  —
               
               
                  kliinilise biokeemia katsed ja vastavate põhijoonte väärtused;
               
            
                  —
               
               
                  lõplik kehakaal, organite kaal ja organite kaalu/kehakaalu suhted;
               
            
                  —
               
               
                  lahkamise tulemused;
               
            
                  —
               
               
                  histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  vajaduse korral tulemuste
               
            
                  —
               
               
                  statistiline töötlemine.
               
            Tulemuste arutelu.
      Järeldused.
      B.28.   SUBKROONILISE TOKSILISUSE TEST NAHAKAUDSEL MANUSTAMISEL – 90PÄEVANE KORDUVANNUSTE NAHAKAUDSE MANUSTAMISE UURING NÄRILISTE LIIKIDEL
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.2.   MÕISTED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritavat ainet manustatakse 90 päeva jooksul iga päev suu kaudu gradueeritud annustes mitmele katseloomade rühmale, iga uuringurühm saab eri suurusega annuse. Ravimi manustamise perioodil jälgitakse loomi iga päev, et tuvastada toksilisuse nähtude ilmnemist. Katse ajal surnud loomad lahatakse, katse lõppedes surmatakse ja lahatakse kõik ellujäänud loomad.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Puuduvad.
      1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Ettevalmistused
      Loomi hoitakse eksperimentaalsetes elu- ja toitumistingimustes vähemalt viis päeva enne uuringu algust. Enne katse algust terved noored loomad randomiseeritakse ning määratakse ravi- ja kontrollrühmadesse. Vahetult enne uuringut pügatakse katseloomade karv kehatüvelt selja piirkonnast. Kasutada võib raseerimist, kuid seda tuleb teha umbes 24 tundi enne uuringu algust. Korduvat pügamist või raseerimist on tavaliselt vaja rakendada nädalaste intervallidega. Karva lõigates või raseerides tuleb olla ettevaatlik, et mitte nahka kriimustada. Uuritava aine manustamiseks peaks olema paljastatud vähemalt 10 % nahapinnast. Paljastamist vajava nahapinna suuruse ja katmise dimensioonide otsustamisel tuleb arvesse võtta looma kaalu. Tahkete ainete manustamisel pulverisaatoriga, kui see on sobilik, tuleb uuritavat ainet piisavalt niisutada veega või vajadusel sobiva kandeainega, et kindlustada head kontakti nahaga. Vedelaid aineid kasutatakse tavaliselt ilma lahjendamata. Kasutatakse igapäevast manustamist viiest kuni seitsme päevani nädalas.
      1.6.2.   Katsetingimused
      
      1.6.2.1.   Katseloomad
      
      Kasutada tuleks täiskasvanud rotte, küülikuid või merisigu. Teisi liike võib kasutada, kuid selline otsus peab olema põhjendatud. Uuringu alguses ei tohiks loomade kaal erineda keskmisest rohkem kui ±20 %. Kui subkroonilise nahakaudse manustamise uuring tehakse pikaajalise uuringu eelfaasina, tuleks mõlemas kasutada samu loomaliike ja liine.
      1.6.2.2.   Arv ja sugu
      
      Igasse annuserühma peaks kuuluma vähemalt 20 terve nahaga looma (10 isast ja 10 emast). Emasloomad tohi olla poeginud ega tiined. Kui osa loomi kavandatakse surmata uuringu vältel, tuleb katsealuste algarvu suurendada enne uuringu lõppu surmata plaanitud loomade arvu võrra. Peale selle võib moodustada satelliitrühma 20 loomast (10 looma kummastki soost), keda ravida suurte annustega 90 päeva ja jälgida toksiliste toimete pöörduvust, püsivust ja hilinenud avaldumist 28 päeva pärast ravi lõppu.
      1.6.2.3.   Annused
      
      Kasutada tuleb vähemalt kolme erinevat annust saavat rühma ja ühte kontrollrühma või vehiikli kontrollrühma, kui kasutatakse vehiiklit. Uuritavat ainet tuleks manustada iga päev samal ajal ja annuseid tuleb kohandada kindlate ajavahemike järel (üks või kaks korda nädalas), et säilitada püsiv tase looma kehamassi kohta. Kontrollrühma loomi tuleks kohelda nii nagu katserühma loomi (v.a uuritava ravimi manustamine). Kui annustamiseks kasutatakse vehiiklit, tuleks kontrollrühmale manustada vehiiklit samal viisil nagu ravirühmale ja nad peaksid seda saama võrdses koguses suurimat annust saava rühmaga. Suurima annuse korral peaks ilmnema toksiline toime, kuid surmajuhte ei tohiks olla või tekib neid vähe. Väikseim annus ei peaks põhjustama mingeid toksilisuse nähte. Kui saadaval on andmeid inimese ekspositsioonist, peaks madalaim annus ületama inimesel kasutatud taset. Ideaalselt peaks keskmine annus põhjustama minimaalset tuvastatavat toksilisust. Kui kasutatakse enam kui ühte vahepealset annusetaset, peaks nende vahed olema sellised, et tekiks toksiliste toimete astmeline suurenemine. Väikesi ja keskmisi annuseid saavates rühmades ja kontrollrühmas peaks surmajuhte olema vähe, et tulemustest saaks teha tähenduslikke järeldusi.
      Kui uuritava aine manustamine põhjustab tõsist nahaärritust, tuleb kontsentratsiooni vähendada. See võib kaasa tuua toksiliste toimete vähenemise või puudumise suure annuse rühmas. Kui nahk on raskelt kahjustunud, võib osutuda vajalikuks uuring lõpetada ja alustada uut uuringut madalamate kontsentratsioonidega.
      1.6.3.   Piirsisalduskatse
      
      Kui eelnev uuring annusega 1 000 mg/kg kehakaalu kohta päevas või teadaolev inimese ekspositsioon sellest suuremale annusele ei ole põhjustanud toksilisi toimeid, pole edasine uuring vajalik.
      1.6.4.   Jälgimisaeg
      
      Katseloomi tuleb iga päev jälgida toksilisuse ilmingute suhtes. Registreerida tuleb surma aeg ja aeg, millal toksilisuse nähud ilmuvad või kaovad.
      1.6.5.   Protseduur
      
      Loomad peavad olema kambrites ühekaupa. Loomadele manustatakse uuritavat ainet ideaalsel juhul seitse päeva nädalas 90 päeva jooksul.
      Satelliitrühmadesse kuuluvaid loomi hoitakse jälgimiseks ilma ravita järgmised 28 päeva, et tuvastada toksilise toime möödumist või püsimist. Ekspositsiooni aeg peab olema kuus tundi päevas.
      Uuritavat ainet tuleb manustada ühtlaselt nahapiirkonnale suurusega umbes 10 % kehapinnast. Väga toksiliste ainete puhul võib kasutada väiksemat nahapinda, kuid üldiselt tuleks katta nii suur ala kui võimalik võimalikult õhukese ja ühtlase kihiga.
      Ekspositsiooniaja jooksul hoitakse uuritavat ainet nahaga kontaktis poorse marlisideme ja mitteärritava teibiga. Manustamiskohta tuleb katta sobival viisil, et hoida side ja uuritav aine paigal ja kindlustada, et loomad ei saaks uuritavat ainet alla neelata. Uuritava aine allaneelamise vältimiseks võib kasutada piiravaid vahendeid, kui täielik immobilisatsioon ei ole soovitatav meetod.
      Ekspositsiooniaja lõpus tuleb uuritava aine jäägid nahalt kõrvaldada, kui see on rakendatav. Puhastamiseks kasutatakse vett või mõnda muud sobivat nahapuhastamise meetodit.
      Kõiki loomi tuleb jälgida iga päev ja registreerida toksilisuse ilmingud, sealhulgas algusaeg, ulatus ja kestus. Puuri juures tehtavad vaatlused peaksid hõlmama naha ja karvkatte, silmade ja limaskestade, aga ka hingamis-, vereringe- ning autonoomse ja tsentraalse närvisüsteemi muutusi, somatomotoorset aktiivsust ja käitumismustrit. Iga nädal tuleks mõõta toidu tarbimist ja loomi kaaluda. Loomade regulaarne jälgimine on vajalik tagamaks niipalju kui võimalik, et loomad ei langeks katsest välja sellistel põhjustel nagu kannibalism, kudede autolüüs või loomade vale paigutus. Katseperioodi lõpus lahatakse kõik mitte-satelliitravirühma kuulunud loomad. Surevad loomad tuleb eemaldada, surmata ja lahata, kui nad leitakse.
      Tavalisel juhul tehakse kõigil loomadel (kaasa arvatud kontrollgruppi kuuluvatel) järgmised uuringud:
      
                  a)
               
               
                  oftalmoloogiline uuring tuleks teha oftalmoskoobi või sobiva samaväärse vahendi abil enne kokkupuudet uuritava ainega ja uuringu lõppedes kõigile loomadele, kuid kindlasti suuri annuseid saanud ja kontrollrühma kuulunud loomadele. Kui leitakse muutusi silmades, tuleks uurida kõiki loomi;
               
            
                  b)
               
               
                  katse lõpus tuleks uurida hematoloogilisi näitajaid, sealhulgas hematokrit, hemoglobiini kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, leukotsüütide absoluutarv ja valem ning vere hüübimisnäitajaid, nagu näiteks hüübimisaeg, protrombiini aeg, tromboplastiini aeg või trombotsüütide arv;
               
            
                  c)
               
               
                  kliinilise biokeemia näitajaid tuleb määrata uuringuperioodi lõpus. Kõikide uuringute puhul sobivate analüüside hulka kuuluvad elektrolüütide tasakaalu, süsivesikute metabolismi, maksa- ja neerufunktsiooni kajastavad näitajad. Spetsiifiliste testide valik sõltub vaatlusandmetest uuritava aine toimeviisi kohta. Soovitatavad analüüsid on: kaltsium, fosfor, kloriid, naatrium, kaalium, tühja kõhu glükoos (liigile kohase näljaperioodiga), seerumi glutamaatpüruvaadi transaminaas, (4) seerumi glutamaatoksaloatsetaadi transami-naas, (5) ornitiini dekarboksülaas, gammaglutamüültranspeptidaas, uurea lämmastik, albumiin, seerumi kreatiniin, üldbilirubiin ja üldvalk. Toksilisuse adekvaatseks hindamiseks võib olla vajalik määrata järgmisi näitajaid: lipiidid, hormoonid, hape-alus tasakaal, methemoglobiin ja koliinesteraasi aktiivsus. Kui ilmnenud toimeid on vaja põhjalikumalt uurida, võib kasutada veel teisigi kliinilise biokeemia analüüse;
               
            
                  d)
               
               
                  uriinianalüüsi ei ole vaja teha rutiinselt, vaid ainult juhul, kui see on näidustatud oodatava või ilmnenud toksilisuse tõttu.
               
            Kui teadaolevad lähteandmed ei ole piisavad, tuleks kaaluda hematoloogiliste ja kliinilise biokeemia näitajate määramist enne annustamise algust.
      
         Lahang
      
      Kõikidele loomadele tuleb teha täielik lahang, mis hõlmab keha välispinna ja kõigi kehaavauste uurimist, samuti kolju, rindkere ja kõhuõõne ja nende sisu uurimist. Maks, neerud, neerupealised ja testised tuleb kaaluda nii kiiresti kui võimalik, et vältida kuivamist. Kõik järgmised organid või koed tuleb säilitada vastavates keskkonnatingimustes võimalikeks hilisemateks histopatoloogilisteks uuringuteks: ajukude, sealhulgas piklikaju/ajusild, väikeaju ja suuraju korteksi lõigud, ajuripats, kilpnääre/kõrvalkilpnääre, kõik harknäärme koed, hingetoru ja kopsud, süda, aort, süljenäärmed, maks, põrn, neerud, neerupealised, pankreas, gonaadid, emakas lisasugunäärmed, sapipõis (kui see on olemas), söögitoru, magu, kaksteistsõrmiksool, tühi- ja niudesool, umbsool, jämesool, pärak, põis, näidislümfisõlmed, (emasloomal piimanäärmed), (reiepiirkonna lihaskond), perifeerne närv, (silmad), rinnak koos luuüdiga, (reieluu, sealhulgas liigespind), (seljaaju kolmel tasemel – kaelaosa, keskmine rinnaosa, lumbaarosa) ja (ekstraorbitaalsed pisaranäärmed). Kudesid, mida on mainitud sulgudes, on vaja uurida ainult juhul, kui see on näidustatud toksilisuse ilmingute tõttu või sihtorgani haaratuse tõttu.
      
         Histopatoloogiline uuring
      
      
                  a)
               
               
                  Täielik histopatoloogiline uuring tuleb teha kontrollrühma või suuri annuseid saanud rühma kuulunud loomade normaalsest ja ravitud nahast ja organitest ja kudedest.
               
            
                  b)
               
               
                  Uurida tuleb kõiki silmaga nähtavaid lesioone.
               
            
                  c)
               
               
                  Teiste annustega rühmades tuleb uurida sihtorganeid.
               
            
                  d)
               
               
                  Kui kasutatakse rotte, tuleks väikese ja keskmise annuse rühmadesse kuuluvatel loomadel teostada kopsude histopatoloogilised uuringud infektsioonitunnuste suhtes, sest sel viisil on mugav hinnata loomade tervislikku seisundit. Edasisi histopatoloogilisi uuringuid ei pruugi nendesse rühmadesse kuuluvatel loomadel rutiinselt vaja olla, kuid need tuleb igal juhul teostada organitel, kus suurte annuste kasutamisel täheldati lesioonide teket.
               
            
                  e)
               
               
                  Kui kasutatakse satelliitrühma, tuleks histopatoloogilised uuringud teha nendel organitel, mis ravi saanutel kahjustusid.
               
            2.   ANDMED
      Andmed tuleks võtta kokku tabelis, näidates iga katsegrupi puhul ära loomade arvu uuringu alguses, nende loomade arvu, kellel ilmnes lesioone ja lesioonide tüübid ja iga tüübi protsentuaalse osakaalu. Tulemusi tuleb hinnata sobiva statistilise meetodi abil. Kasutada võib ükskõik millist tunnustatud statistilist meetodit.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  loomaliik, liin, päritolu, keskkonnatingimused, dieet;
               
            
                  —
               
               
                  katsetingimused;
               
            
                  —
               
               
                  annused (sealhulgas vehiikel, kui seda kasutatakse) ja kontsentratsioonid;
               
            
                  —
               
               
                  toksilise mõju andmed soo ja annuste kaupa;
               
            
                  —
               
               
                  toime puudumise tase, kui see on võimalik;
               
            
                  —
               
               
                  surmaaeg uuringu ajal või kas loomad elasid kuni uuringu lõpetamiseni;
               
            
                  —
               
               
                  toksiliste või muude toimete kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  iga normist kõrvalekalduva sümptomi ilmnemise aeg ja edasine kulg;
               
            
                  —
               
               
                  andmed toidu ja kehakaalu kohta;
               
            
                  —
               
               
                  oftalmoloogilised leiud;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud hematoloogilised analüüsid ja kõik tulemused;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud kliinilise biokeemia analüüsid ja kõik tulemused (sealhulgas kõik uriinianalüüside tulemused);
               
            
                  —
               
               
                  lahanguleiud;
               
            
                  —
               
               
                  histopatoloogiliste leidude detailne kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste statistiline analüüs, kui see on võimalik;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste arutelu;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste tõlgendamine.
               
            3.2.   HINNANG JA TÕLGENDAMINE
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      4.   VIITED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      B.29.   SUBKROONILISE TOKSILISUSE TEST INHALEERIMISEL – 90PÄEVANE KORDUVANNUSTE INHALATSIOONIUURING NÄRILISTE LIIKIDEL
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.2.   MÕISTED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritavale ainele gradueeritud kontsentratsioonides eksponeeritakse iga päev kindlal ajavahemikul mitut katseloomade rühma. Iga kontsentratsiooni kasutatakse ühel uuringurühmal. Uuringu kestus on 90 päeva. Kui kasutatakse vehiiklit, et aidata kaasa vajaliku kontsentratsiooni saavutamisele atmosfääris, tuleks kasutada veel vehiikli kontrollrühma. Ravimi manustamise perioodil jälgitakse loomi iga päev, et tuvastada mürgistusnähtude ilmnemist. Katse ajal surnud loomad lahatakse; katse lõppedes surmatakse ja lahatakse kõik ellujäänud loomad.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Puuduvad.
      1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Ettevalmistused
      
      Loomi hoitakse eksperimentaalsetes elu- ja toitumistingimustes vähemalt viis päeva enne uuringu algust. Enne katse algust terved noored loomad randomiseeritakse ning määratakse ravi- ja kontrollrühmadesse. Vajaduse korral võib uuritavale ainele lisada vehiikli, mis aitab tekitada uuritava aine sobilikku kontsentratsiooni õhus. Kui annustamiseks kasutatakse vehiiklit või teisi lisaaineid, peab olema teada, et neil ainetel ei ole toksilist toimet. Kui see on sobilik, võib kasutada varasemaid andmeid.
      1.6.2.   Katsetingimused
      
      1.6.2.1.   Katseloomad
      
      Vastunäidustuste puudumisel eelistatakse katseloomana rotti. Kasutada tuleks tavapärastest laboris kasvatatavatest loomaliinidest pärit noori terveid loomi. Uuringu alguses ei tohiks loomade kaal erineda keskmisest rohkem kui ± 20 %. Kui subkrooniline inhalatsiooniuuring tehakse pikaajalise uuringu eelfaasina, tuleks mõlemas kasutada samu loomaliike ja liine.
      1.6.2.2.   Arv ja sugu
      
      Igasse annuserühma peaks kuuluma vähemalt 20 looma (10 isast ja 10 emast). Emasloomad tohi olla poeginud ega tiined. Kui osa loomi kavandatakse surmata uuringu vältel, tuleb katsealuste algarvu suurendada enne uuringu lõppu surmata plaanitud loomade arvu võrra. Peale selle võib moodustada satelliitrühma 20 loomast (10 looma kummastki soost), keda ravitakse suurte annustega 90 päeva ja jälgitakse toksiliste toimete pöörduvust, püsivust ja hilinenud avaldumist 28 päeva pärast ravi lõppu.
      1.6.2.3.   Annused
      
      Kasutada tuleb vähemalt kolme erinevat annust saavat rühma ja ühte kontrollrühma või vehiikli kontrollrühma, kui kasutatakse vehiiklit (kontsentratsioon peab vastama vehiikli kontsentratsioonile suurima annuse grupis). Kontrollrühma loomi tuleks kohelda nii nagu katserühma loomi (v.a uuritava ravimi manustamine). Suurima annuse korral peaks ilmnema toksiline toime, kuid surmajuhte ei tohiks olla või tekib neid vähe. Kui saadaval on andmed inimese ekspositsioonist, peaks madalaim annus ületama inimesel kasutatud taset. Kui kasutatakse enam kui ühte vahepealset annusetaset, peaks nende vahed olema sellised, et tekiks toksiliste toimete astmeline suurenemine. Väikesi ja keskmisi annuseid saavates rühmades ja kontrollrühmas peaks surmajuhte olema vähe, et tulemustest saaks teha tähenduslikke järeldusi.
      1.6.2.4.   Ekspositsiooni aeg
      
      Igapäevane ekspositsioon peaks kestma kuus tundi pärast tasakaalukontsentratsiooni saabumist kambris. Teisi ekspositsiooni kestusi võib kasutada, kui seda nõuavad erivajadused.
      1.6.2.5.   Varustus
      
      Katseloomad peavad olema inhalatsiooniruumides, mis on kavandatud nii, et võimaldavad dünaamiliselt vähemalt 12 õhuvahetust tunnis, et kindlustada piisav hapnikusisaldus ja uuritava aine ühtlane jaotus. Kui kasutatakse kambreid, tuleks need kavandada nii, et võimalikult välditaks loomade tunglemist ja maksimeeritaks nende ekspositsiooni uuritavale ainele. Üldise reegli kohaselt, selleks et tagada kambri atmosfääri stabiilsus, ei tohi katseloomade kogumaht ületada 5 % kambrimahust. Kasutada või oronasaalset, ainult pead haaravat või individuaalset kogukehakambrit kasutavat ekspositsiooni; esimesed kaks viisi minimiseerivad aine teisi teid pidi organismi sattumise.
      1.6.2.6.   Jälgimisaeg
      
      Kõiki loomi tuleb iga päev jälgida ja kõik toksilisuse ilmingud registreerida, märkides üles nende algusaja, ulatuse ja kestuse. Registreerida tuleb samuti surmaaeg ja aeg, millal toksilisuse nähud ilmuvad või kaovad.
      1.6.3.   Protseduur
      
      Loomi eksponeeritakse uuritavale ainele viis kuni seitse päeva nädalas 90 päeva jooksul. Satelliitrühmadesse kuuluvaid loomi hoitakse jälgimise eesmärgil ilma ravita järgmised 28 päeva, et tuvastada toksilise toime möödumist või püsimist. Uuringu ajal tuleks säilitada temperatuuri 22 ± 3 oC. Ideaaljuhul peaks õhuniiskus olema vahemikus 30 % kuni 70 %, kuid teatud juhtudel (näiteks aerosoolide uuringud), ei pruugi see olla rakendatav. Ekspositsiooni ajal ei anta loomadele süüa ega juua.
      Kasutatakse dünaamilist inhalatsioonisüsteemi, et saavutada sobivad analüütilised kontsentratsioonid. Sobilike ekspositsioonikontsentratsioonide leidmiseks on soovitatav teha prooviuuring. Õhuvoolu tuleb kohandada nii, et tingimused kogu ekspositsioonikambris oleksid homogeensed. Süsteem peaks kindlustama, et stabiilsed ekspositsiooni tingimused saavutatakse nii ruttu kui võimalik.
      Jälgida ja mõõta on vaja järgmisi parameetreid:
      
                  a)
               
               
                  õhuvoolu kiirus (pidevalt);
               
            
                  b)
               
               
                  uuritava aine tegelik kontsentratsioon hingatavas piirkonnas. Katseaine sisaldus igapäevase ekspositsiooni ajal ei tohi erineda keskmisest väärtusest rohkem kui ± 15 %. Siiski võib tolmude ja aerosoolide puhul osutuda võimatuks sellise kontrollitaseme saavutamine, sellisel juhul on aktsepteeritav laiem kõikumine. Uuringu kestel tuleb hoida päevast päeva aine kontsentratsioon võimalikult ühtlasena. Generaatorsüsteemi arendamisel tuleb teha osakeste suuruse analüüsid, et selgitada aerosooli stabiilsust. Ekspositsiooniperioodil tuleb analüüse teha nii tihti kui vaja, et määrata partiklisuuruste jaotuvuse ühtlust;
               
            
                  c)
               
               
                  temperatuur ja niiskus;
               
            
                  d)
               
               
                  ekspositsiooni ajal ja järel teha süstemaatilisi vaatlusi ja registreerida tulemused; iga looma kohta peetakse eraldi dokumentatsiooni. Kõiki loomi tuleb jälgida iga päev ja märkida ära toksilisuse sümptomid (sh nende algusaeg, ulatus ja kestus). Puuri juures tehtavad vaatlused peaksid hõlmama naha ja karvkatte, silmade ja limaskestade, aga ka hingamis-, vereringe- ning autonoomse ja tsentraalse närvisüsteemi muutusi, somatomotoorset aktiivsust ja käitumismustrit. Iga nädal tuleks mõõta toidu tarbimist ja loomi kaaluda. Loomade regulaarne jälgimine on vajalik tagamaks niipalju kui võimalik, et loomad ei langeks katsest välja sellistel põhjustel nagu kannibalism, kudede autolüüs või loomade vale paigutus. Katseperioodi lõpus lahatakse kõik mitte-satelliit ravirühma kuulunud loomad. Surnud loomad tuleb eemaldada ja lahata, kui nad leitakse.
               
            Tavalisel juhul tehakse kõigil loomadel (kaasa arvatud kontrollgruppi kuuluvatel) järgmised uuringud:
      
                  a)
               
               
                  oftalmoloogiline uuring tuleks teha oftalmoskoobi või sobiva samaväärse vahendi abil enne uuritava aine manustamist ja uuringu lõppedes kõigile loomadele, kuid kindlasti suuri annuseid saanud ja kontrollrühma kuulunud loomadele. Kui leitakse muutusi silmades, tuleks uurida kõiki loomi;
               
            
                  b)
               
               
                  katse lõpus tuleks uurida hematoloogilisi näitajaid, sealhulgas hematokrit, hemoglobiini kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, leukotsüütide absoluutarv ja valem ning vere hüübimisnäitajaid, nagu näiteks hüübimisaeg, protrombiini aeg, tromboplastiini aeg või trombotsüütide arv;
               
            
                  c)
               
               
                  kliinilise biokeemia näitajaid tuleb määrata uuringu lõpus. Kõikide uuringute puhul sobivate analüüside hulka kuuluvad elektrolüütide tasakaalu, süsivesikute metabolismi, maksa- ja neerufunktsiooni kajastavad näitajad. Spetsiifiliste testide valik sõltub vaatlusandmetest uuritava aine toimeviisi kohta. Soovitatavad analüüsid on: kaltsium, fosfor, kloriid, naatrium, kaalium, tühja kõhu glükoos (liigile kohase näljaperioodi-ga), seerumi glutamaatpüruvaadi transaminaas, (4) seerumi glutamaatoksaloatsetaadi transaminaas, (5) ornitiini dekarboksülaas, gammaglutamüül-transpeptidaas, uurea lämmastik, albumiin, seerumi kreatiniin, üldbilirubiin ja seerumi üldvalk. Toksilisuse adekvaatseks hindamiseks võib olla vajalik määrata järgmisi näitajaid: lipiidid, hormoonid, happe-aluse tasakaal, methemoglobiin ja koliinesteraasi aktiivsus. Kui ilmnenud toimeid on vaja põhjalikumalt uurida, võib kasutada veel teisigi kliinilise biokeemia analüüse;
               
            
                  d)
               
               
                  uriinianalüüsi ei ole vaja teha rutiinselt, vaid ainult juhul, kui see on näidustatud oodatava või ilmnenud toksilisuse tõttu.
               
            Kui teadaolevad lähteandmed ei ole piisavad, tuleks kaaluda hematoloogiliste ja kliinilise biokeemia näitajate määramist enne annustamise algust.
      
         Lahang
      
      Kõikidele loomadele tuleb teha lahang. See hõlmab keha välispinna ja kõigi kehaavauste uurimist, samuti kolju, rindkere ja kõhuõõne ja nende sisu uurimist. Maks, neerud, neerupealised ja testised tuleb kaaluda nii kiiresti kui võimalik, et vältida kuivamist. Kõik järgmised organid või koed tuleb säilitada vastavates keskkonnatingimustes võimalikeks hilisemateks histopatoloogilisteks uuringuteks: kõik suured lesioonid, kopsud – tuleb eemaldada tervelt, kaaluda ja töödelda sobiva fiksaatoriga, et kindlustada kopsustruktuuri säilimine (perfusiooni fiksaatoriga peetakse efektiivseks protseduuriks), ninaneelu kude, ajukude – sealhulgas piklikaju/ajusild, väikeaju ja suuraju korteksi lõigud, ajuripats, kilpnääre/kõrvalkilpnääre, kõik harknäärme koed, hingetoru ja kopsud, süda, aort, (süljenäärmed), maks, põrn, neerud, neerupealised, pankreas, gonaadid, emakas (lisasugunäärmed), (nahk), sapipõis (kui see on olemas), söögitoru, magu, kaksteistsõrmiksool, tühi- ja niudesool, umbsool, jämesool, pärak, põis, näidislümfisõlmed, (emasloomal piimanäärmed), (reiepiirkonna lihased), perifeerne närv, rinnak koos luuüdiga, (silmad), (reieluu, sealhulgas liigespind), (seljaaju kolmel tasemel – kaelaosa, keskmine rinnaosa, lumbaarosa) ja (ekstraorbitaalsed pisaranäärmed). Kudesid, mida on mainitud sulgudes, on vaja uurida ainult juhul, kui see on näidustatud toksilisuse ilmingute tõttu või sihtorgani haaratuse tõttu.
      
         Histopatoloogiline uuring
      
      
                  a)
               
               
                  Täielik histopatoloogiline uuring tuleb teha kontrollrühma või suuri annuseid saanud rühma kuulunud loomade hingamiselundkonna ja teiste organite puhul.
               
            
                  b)
               
               
                  Uurida tuleb kõiki suuri lesioone.
               
            
                  c)
               
               
                  Teiste annustega rühmades tuleb uurida sihtorganeid.
               
            
                  d)
               
               
                  Väikese ja keskmise annuse rühmadesse kuuluvatel loomadel tuleks teha kopsude histopatoloogilised uuringud infektsioonitunnuste suhtes, sest sel viisil on mugav hinnata loomade tervislikku seisundit. Edasisi histopatoloogilisi uuringuid ei pruugi nendesse rühmadesse kuuluvatel loomadel rutiinselt vaja olla, kuid need tuleb igal juhul teha organitel, kus suurte annuste kasutamisel täheldati lesioonide teket.
               
            
                  e)
               
               
                  Kui kasutatakse satelliitrühma, tuleks histopatoloogilised uuringud teha nendel organitel, mis ravi saanutel kahjustusid.
               
            2.   ANDMED
      Andmed tuleks võtta kokku tabelis, näidates iga katsegrupi puhul ära loomade arvu uuringu alguses, nende loomade arvu, kellel ilmnes lesioone ja lesioonide tüübid ja iga tüübi protsentuaalse osakaalu. Tulemusi tuleb hinnata sobiva statistilise meetodi abil. Kasutada võib ükskõik millist tunnustatud statistilist meetodit.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  loomaliik, liin, päritolu, keskkonnatingimused, dieet;
               
            
                  —
               
               
                  katsetingimused:
                  
                     Uuringuaparatuuri kirjeldus: sealhulgas kavand, tüüp, mõõtmed, õhuallikas, partiklite ja aerosooli tekitamise süsteem, õhu konditsioneerimise meetod, väljuva õhu töötlemine ja loomade kambritesse paigutamise metoodika, kui seda kasutatakse. Kirjeldada tuleb metoodikat, mida kasutatakse temperatuuri, niiskuse ja aerosooli partiklite suuruse või kontsentratsiooni stabiilsuse määramiseks, kui seda kasutatakse.
                  Ekspositsiooni andmed: need tuleks tuua tabelites ja esitada keskmiste väärtustena ja variaabluse näitajatega (nt standarddeviatsioon). Andmete hulgas tuleb registreerida:
                  
                              a)
                           
                           
                              õhuvoolu kiirused inhalatsiooniseadeldises;
                           
                        
                              b)
                           
                           
                              õhu temperatuuri ja niiskuse;
                           
                        
                              c)
                           
                           
                              kontsentratsioonid nominaalväärtustes (katseaine kogumaht, mis sisestatakse inhalatsiooniseadeldisse, jagatud õhu mahuga);
                           
                        
                              d)
                           
                           
                              vehiikli olemus, kui seda kasutatakse;
                           
                        
                              e)
                           
                           
                              tegelikud kontsentratsioonid katseajal loomade hingamise tsoonides;
                           
                        
                              f)
                           
                           
                              keskmine osakeste suurus (vajaduse korral);
                           
                        
            
                  —
               
               
                  toksilise mõju andmed soo ja annuste kaupa;
               
            
                  —
               
               
                  toime puudumise tase, kui see on võimalik;
               
            
                  —
               
               
                  surmaaeg uuringu ajal või kas loomad elasid kuni uuringu lõpetamiseni;
               
            
                  —
               
               
                  toksiliste või muude toimete kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  iga normist kõrvalekalduva sümptomi ilmnemise aeg ja edasine kulg;
               
            
                  —
               
               
                  andmed toidu ja kehakaalu kohta;
               
            
                  —
               
               
                  oftalmoloogilised leiud;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud hematoloogilised analüüsid ja kõik tulemused;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud kliinilise biokeemia analüüsid ja kõik tulemused (sealhulgas kõik uriinianalüüside tulemused);
               
            
                  —
               
               
                  lahanguleiud;
               
            
                  —
               
               
                  histopatoloogiliste leidude detailne kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste statistiline analüüs, kui see on võimalik;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste arutelu,
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste tõlgendamine.
               
            3.2.   HINNANG JA TÕLGENDAMINE
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      4.   VIITED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      B.30.   KROONILISE TOKSILISUSE KATSE
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.2.   MÕISTED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritavat ainet antakse tavaliselt seitse päeva nädalas sobival manustamisviisil mitmele katseloomade rühmale. Igale rühmale ordineeritakse kindel uuritava aine annus ja seda manustatakse suurem osa nende loomade elueast. Aine manustamise ajal ja järgselt jälgitakse katseloomi iga päev, et sedastada toksiliste mõjude tunnuseid.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Puuduvad.
      1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Ettevalmistused
      
      Loomi hoitakse eksperimentaalsetes elamis- ja toitumistingimustes vähemalt viis päeva enne uuringut. Enne uuringu algust terved noored loomad randomiseeritakse ja määratakse uuritavat ainet saavatesse ning kontrollrühmadesse.
      1.6.2.   Katsetingimused
      
      1.6.2.1.   Katseloomad
      
      Eelistatud liigiks on rott.
      Võttes arvesse eelnevalt tehtud uuringute tulemusi, võib kasutada eelmistest katsetest erinevaid loomaliike (närilisi või mittenärilisi). Kasutada tuleb tavapäraste laboriloomade liinide noori terveid isendeid ja uuritava aine manustamine peaks algama võimalikult vara pärast võõrutamist.
      Uuringu alguses ei tohi katseloomade kaal erineda keskmisest kaalust enam kui ± 20 %. Kui pikaajalisele uuringule eelneb subkroonilise suukaudse manustamise test, tuleb mõlemal juhul kasutada sama loomaliiki/-tõugu ja -liini.
      1.6.2.2.   Arv ja sugu
      
      Näriliste korral peab igas eri annust saavas rühmas ja samuti kontrollrühmas olema vähemalt 40 isendit (20 emast ja 20 isast). Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Kui plaanitakse vahepealset loomade surmamist, tuleb isendite arvu suurendada vastavalt selle arvu võrra, kui palju loomi kavatsetakse surmata enne uuringu täielikku lõpetamist.
      Mittenäriliste puhul on aktsepteeritavad väiksemad rühmas, kuid mitte alla nelja isendi kummastki soost ühes grupis.
      1.6.2.3.   Annused ja ekspositsiooni sagedus
      
      Lisaks kontrollgrupile peab kasutama vähemalt kolme erinevat annust saavat rühma. Kõige suurem annus peab esile kutsuma selgeid toksilisuse ilminguid, põhjustamata sealjuures liigselt surmajuhte.
      Madalaim annus ei tohi tekitada vähimalgi määral toksilisi mõjusid.
      Vahepealne annus või annused tuleb valida suure ja väikse annuse väärtuste vahemiku keskelt.
      Annuste valimisel tuleb arvesse võtta eelmiste toksilisuse katsete ja uuringute andmeid.
      Ekspositsioon uuritavale ainele peaks normaalselt toimuma iga päev. Kui kemikaali manustatakse joogiveega või toidu hulka segatult, peavad need olema pidevalt kättesaadavad.
      1.6.2.4.   Kontrollrühm
      
      Kasutada tuleb kontrollrühma, mis on igas suhtes identne katserühmaga, erinevus on vaid kokkupuutes katseainega.
      Teatud tingimustel, näiteks inhalatsiooniuuringute korral, mille puhul kasutatakse aerosoole, või suukaudse manustamise uuringute puhul, kui kasutatakse iseloomustamata bioloogilise aktiivsusega emulgaatorit, peab kasutama lisaks negatiivset kontrollrühma. Negatiivsesse kontrollrühma kuuluvaid loomi koheldakse nii nagu katserühma loomi, välja arvatud asjaolu, et loomad ei puutu kokku uuritava ainega ega vehiikliga.
      1.6.2.5.   Manustamisviis
      
      Kaks peamist manustamisviisi on suukaudne ja inhalatsioon. Valik sõltub katseaine füüsikalistest ja keemilistest omadustest ning aine võimalikust manustamisviisist inimestel.
      Nahakaudse manustamistee rakendamine hõlmab olulisi praktilisi probleeme. Nahakaudse imendumise tagajärjel tekkinud kroonilise süsteemse toksilisuse saab normaalsel juhul tuletada/üle kanda teiste suukaudsete uuringute tulemustest ja varasematest nahakaudse toksilisuse testide põhjal saadud nahakaudse imendumise ulatuse andmetest.
      1.6.2.6.   Suukaudse manustamise uuringud
      
      Kui uuritav aine imendub mao-sooletraktist ja kui allaneelamine on üks võimalikest inimese ekspositsiooni viisidest, eelistatakse vastunäidustuste puudumisel suukaudset manustamist. Loomad võivad saada uuritavat ainet toiduga, lahustatuna joogivees või kapsliga. Ideaaltingimustes manustatakse uuritavat ainet iga päev seitse korda nädalas, sest viiepäevane manustamine võib lubada looma paranemist või toksiliste nähtude taandumist perioodil, kui uuritavat ainet ei manustata. See võib mõjutada tulemusi koos järgneva hinnanguga. Siiski, peamiselt praktilistel kaalutlustel peetakse ka viis päeva nädalas manustamist vastuvõetavaks.
      1.6.2.7.   Inhalatsiooniuuringud
      
      Et inhalatsiooniuuringud kätkevad endas teiste manustamisviisidega võrreldes mitmeid keerukaid tehnilisi probleeme, on siin toodud detailsemad juhtnöörid selle meetodi kohta. Peab ka märkima, et intratrahheaalne tilgutamine võib olla üks arvestatavaid alternatiivseid meetodeid, et teatud olukordades ainet manustada.
      Pikemaajaline ekspositsioon on tavaliselt kavandatud, et jäljendada ekspositsiooni inimesel. Loomade ekspositsioon uuritava ainega korraldatakse kas kuus tundi päevas viiel päeval nädalas pärast kambri kontsentratsioonide tasakaalustamist (seda nimetatakse vahelduvaks kokkupuuteks) või kasutatakse sarnaselt pideva keskkonnamõjuriga kokkupuuteaega 22 kuni 24 tundi seitsmel päeval nädalas (katkematu kokkupuude). Viimasel juhul jääb üks tund päevas loomade söötmiseks, mis peaks toimuma samadel kellaaegadel, ja kambrite korrashoiuks. Mõlema skeemi korral eksponeeritakse loomi ettenähtud ainele kindlatel kontsentratsioonidel.
      Suurim erinevus vahelduva ja katkematu inhalatsiooniuuringu vahel on see, et esimesel jääb 17- või 18tunnine periood, mil loomad võivad taastuda kokkupuute mõjust, ja nädalavahetuseti on taastumisperiood veelgi pikem.
      Vahelduva või katkematu ekspositsiooni valik sõltub uuringu eesmärkidest ning inimesel kasutatavast manustamisviisist, mida tahetakse jäljendada. Siiski tuleb arvestada teatud tehnilisi raskusi. Näiteks katkematu kokkupuute eelised keskkonna tingimuste jäljendamiseks võivad saada vastulöögi tehniliste raskuste tõttu, sealhulgas söötmise ja jootmise vajadus ekspositsiooni ajal ning keerukamate (ja usaldusväärsemate) aerosool- ja aurugeneraatorite ning jälgimistehnika vajadus.
      1.6.2.8.   Ekspositsioonikambrid
      
      Katseloomad peavad olema inhalatsioonikambrites, mis on kavandatud nii, et võimaldavad dünaamilist õhuvoolu vähemalt 12 õhuvahetust tunnis, selleks et kindlustada piisava hapniku ja ühtlaselt jaotunud katseaine sisalduse. Kontrollrühmale ja katserühmale mõeldud kambrid peavad olema ehituslikult ja disainilt samasugused, et tagada kõikides aspektides võrreldavad mõjustustingimused, välja arvatud katseainega kokkupuutumise faktoris. Kambris hoitakse vähene negatiivne rõhk, mis takistab katseaine väljaimbumist ümbritsevasse õhku. Katseloomade tunglemine kambrites peaks olema viidud miinimumini. Üldise reegli kohaselt, selleks et tagada kambri õhkkonna stabiilsus, ei tohi katseloomade kogumaht ületada 5 % kambrimahust.
      Kambrites tuleb teha järgmisi mõõtmisi või kontrolle:
      
                  i)
               
               
                  õhuvool: eelistatult tuleb õhuvoolu kiirust kambrites jälgida pidevalt;
               
            
                  ii)
               
               
                  kontsentratsioon: igapäevase ekspositsiooni ajal ei tohi uuritava aine kontsentratsioon erineda keskmisest väärtusest rohkem kui ± 15 %;
               
            
                  iii)
               
               
                  temperatuur ja niiskus: näriliste jaoks tuleb temperatuur hoida 22 ± 2 oC ja niiskus kambrites peab olema 30 % kuni 70 %, välja arvatud juhul, kui eksponeeritava aine viimiseks kambri atmosfääri kasutatakse vett. Soovitatavalt peaks mõlemat faktorit jälgima pidevalt;
               
            
                  iv)
               
               
                  osakeste suuruse mõõtmised: osakeste suuruse jaotumust tuleb kambrite atmosfääris määrata nii vedelates kui ka tahketes aerosoolides. Aerosoolpartiklid peavad olema katseloomadele sissehingamiseks sobiva suurusega. Kambri õhu analüüsid peavad olema võetud aladelt, kus loomad hingavad. Õhu analüüsid peavad iseloomustama nende osakeste jaotumust, millele katseloomi eksponeeritakse, ja neid tuleb aerosoolheljumites gravimeetriliselt analüüsida, isegi kui suur osa aerosoolist ei ole võimalik sisse hingata. Generaatorsüsteemi väljatöötamisel tuleb sagedasti teha osakeste suuruse analüüse, et selgitada aerosooli stabiilsust. Edaspidi tuleb analüüse teha nii tihti kui vaja, et määrata adekvaatselt loomadele kokkupuuteks vajaliku aine partiklite jaotuvuse ühtlust.
               
            1.6.2.9.   Uuringu kestus
      
      Manustamisperioodi kestus peaks olema vähemalt 12 kuud.
      1.6.3.   Protseduur
      
      
         Vaatlused
      
      Hoolikas kliiniline uurimine tuleb teha vähemalt üks kord päevas. Igapäevased lisavaatlused koos asjakohase sekkumisega on vajalikud, et minimeerida loomade uuringust väljalangemist, näiteks tuleb surnud loomad lahata või külmutada, nõrgad või suremas loomad surmata või isoleerida. Hoolikaid vaatlusi tuleb teha toksiliste nähtude ilmnemise ja progresseerumise kindlakstegemiseks, aga ka haiguse, autolüüsi või kannibalismi tõttu tekkivate kadude vältimiseks.
      Kõikide loomade kliinilised andmed tuleb registreerida, sealhulgas neuroloogilised ja silmas toimuvad muutused, aga ka suremus. Toksilise seisundi tekke ja progresseerumise aeg, samuti kasvajakahtlus tuleb registreerida.
      Iga looma kehakaal tuleb registreerida eraldi korra nädalas katseperioodi esimesel kolmeteistkümnel nädalal ja seejärel vähemalt korra nelja nädala jooksul. Toidu tarbimist hinnatakse igal nädalal uuringu esimesel kolmeteistkümnel nädalal ja seejärel ligikaudu 3kuuliste intervallidega, kui loomade tervislik seisund või kehakaalu muutused ei nõua teisiti.
      
         Hematoloogiline uuring
      
      Hematoloogiline uuring (näiteks hemoglobiini sisaldus, leukotsüütide absoluutarv, trombotsüütide arv või teised vere hüübimisvõimet peegeldavad näitajad) tuleks teha kolme kuu järel, kuue kuu järel ja seejärel umbes kuuekuuliste intervallidega ning uuringu lõpetamisel kõikidel loomadel mittenäriliste liikide puhul ja rottide puhul kümnel loomal kummaski soost igas rühmas. Kui võimalik, tuleks kõikidel ajamomentidel võtta analüüsid samadelt rottidelt. Lisaks tuleks mittenärilistel võtta ka uuringueelne vereanalüüs.
      Kui kliiniliste vaatluste käigus ilmneb loomade tervisliku seisundi halvenemine, tuleks nendel loomadel teha vereanalüüs rakkude valemi loendamisega.
      Verevalem loendatakse suure annuse rühma ja kontrollrühma kuuluvate loomade vereanalüüsist. Järgmises madalama annusega grupis tuleb valem loendada ainult juhtudel, kui suure annuse rühma ja kontrollrühma vahel ilmnes oluline lahknemine või kui see on näidustatud patoloogiliste leidude tõttu.
      
         Uriinianalüüs
      
      Uriinianalüüsid võetakse mittenäriliste puhul kõikidelt loomadelt ja rottide puhul iga rühma kohta kümnelt loomalt kummaski soost. Võimaluse korral tuleks analüüsid koguda samadelt rottidelt samade intervallidega nagu hematoloogiliseks uuringuks. Järgmised näitajad määratakse kas kõikidel loomadel eraldi või kokkusegatud proovist/soo/uuringurühma kohta:
      
                  —
               
               
                  välimus: maht ja tihedus igal loomal eraldi;
               
            
                  —
               
               
                  valk, glükoos, ketoonid, peiteveri (poolkvantitatiivselt);
               
            
                  —
               
               
                  sademe mikroskoopia (poolkvantitatiivselt).
               
            
         Kliiniline keemia
      
      Vereanalüüse kliinilise keemia uuringuteks võetakse umbes kuuekuulise intervalliga ja uuringu lõpetamisel kõikidelt loomadelt mittenäriliste liikide puhul ja kümnelt rotilt kummastki soost kõikides rühmades; võimaluse korral tuleks igal ajahetkel võtta analüüs samadelt loomadelt. Lisaks kogutakse mittenäriliste liikidel uuringu eelsed analüüsid. Proovidest eraldatakse plasma ja tehakse järgmised määramised:
      
                  —
               
               
                  valgu kontsentratsioon;
               
            
                  —
               
               
                  albumiini kontsentratsioon;
               
            
                  —
               
               
                  maksafunktsiooni näitajad (nagu alkaalse fosfataasi aktiivsus, glutamaadi püruvaattransaminaasi (4) aktiivsus, glutamaadi oksaloatsetaattransaminaasi (5) aktiivsus), gammaglutamüüli transpeptidaas, ornitiini dekarboksülaas;
               
            
                  —
               
               
                  süsivesikute metabolism, nagu näiteks tühja kõhu glükoos;
               
            
                  —
               
               
                  neerufunktsiooni näitajad, nagu vere uurea lämmastik.
               
            
         Lahang
      
      Lahang tehakse kõikidele loomadele, kaasa arvatud nendele, kes surid katseajal või surmati, kuna leiti suremas. Enne surmamist tuleb vererakkude valemi loendamiseks koguda vereproovid kõikidelt loomadelt. Säilitada tuleb kõik makroskoopiliselt nähtavad lesioonid, kasvajad või kasvaja kahtlased lesioonid. Tuleks püüda leida korrelatsiooni makroskoopiliste mikroskoopiliste leidude vahel.
      Kõik järgmised organid või koed tuleb säilitada vastavates keskkonnatingimustes võimalikeks hilisemateks histopatoloogilisteks uuringuteks: ajukude (6) (piklikaju/ajusild, väikeaju ja suuraju korteks), ajuripats, kilpnääre (sealhulgas kõrvalkilpnääre), harknääre, kopsud (koos trahheaga), süda, aort, süljenäärmed, maks, (6) põrn, neerud, (6) neerupealised, (6) söögitoru, magu, kaksteistsõrmiksool, tühi- ja niudesool, umbsool, jämesool, pärasool, emakas, kusepõis, lümfisõlmed, kõhunääre, suguorganid, (6) lisasugunäärmed, nahk, emasloomadel piimanäärmed, lihaskond, perifeerne närv, seljaaju kolmel tasandil (kaelaosa, keskmine rinnaosa ja nimmeosa), rinnak koos luuüdiga, reieluu koos liigesega ja silmad. Kopsude ja kusepõie parimaks säilitamiseks tuleb nad puhuda fikseerivat ainet täis; täispuhutud kopsud on inhalatsioonikatsete korral olulise tähtsusega õigeks histopatoloogiliseks analüüsiks. Inhalatsiooniuuringute korral peab säilitama kogu hingamiselundkonna, sealhulgas ninaõõne, neelu ja kõri.
      Kui tehakse teisi kliinilisi uuringud, peaks neist saadav informatsioon olema kättesaadav enne mikroskoopilisi uuringuid, sest need võivad anda patoloogile väärtuslikke juhtnööre.
      
         Histopatoloogiline uuring
      
      Kõiki silmaga nähtavaid muutusi, eriti kasvajaid ja muid lesioone, mis leitakse ükskõik millisest organist, tuleks uurida mikroskoopiliselt. Lisaks on soovitatav teha järgmised uuringud:
      
                  a)
               
               
                  kõigi säilitatud organite ja kudede mikroskoopiline uuring koos leitud lesioonide täieliku kirjeldusega:
                  
                              1.
                           
                           
                              kõigil loomadel, kes surid või surmati uuringu kestel;
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              kõigil suure annuse rühma ja kontrollrühma loomadel;
                           
                        
            
                  b)
               
               
                  organeid ja kudesid, milles ilmneb muutusi, mis on põhjustatud või mis võivad olla põhjustatud uuritava aine mõjust, tuleb uurida ka väikesi annuseid saanud rühmades;
               
            
                  c)
               
               
                  kui uuringu tulemustes ilmneb loomade normaalse elukestuse oluline vähenemine või tekivad mõjustused, mis võivad muuta toksilist vastust, tuleks eelkirjeldatud viisil uurida järgmise väiksema annuse rühma kuuluvaid loomi;
               
            
                  d)
               
               
                  informatsioon vastaval loomaliinil normaalselt tekkivate lesioonide sageduse kohta samalaadsetel laboritingimustel, st ajaloolised kontrollandmed, on asendamatud ravitud loomadel leitud muutuste olulisuse korrektseks hindamiseks.
               
            2.   ANDMED
      Andmed tuleb esitada kokkuvõtlikus tabelis, näidates iga katsegrupi puhul loomade arvu katse alguses; isendite arvu, kellel ilmneb katseaja jooksul lesioone, ja iga lesiooni protsentuaalne esinemissagedus loomadel. Tulemusi tuleb hinnata sobiva statistilise meetodiga. Kasutada võib iga tunnustatud statistilist meetodit.
      3.   ARUANDLUS
      KATSEARUANNE
      Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  loomaliik, liin, päritolu, keskkonnatingimused, dieet;
               
            
                  —
               
               
                  katsetingimused:
                  ekspositsiooniseadeldise kirjeldus:
                  tuleb märkida seadeldise disain, tüüp, mõõtmed, õhu lähteallikas, osakesi ja aerosoole tootev süsteem, õhu konditsioneerimise meetod, heitõhu töötlemine, loomade majutamise korraldus testkambrites, kui neid kasutatakse. Kirjeldada tuleb temperatuuri ja niiskuse mõõtmise vahendeid ning vajadusel aerosooli kontsentratsiooni stabiilsust ja osakeste suurust;
                  andmed ekspositsiooni kohta:
                  Andmed tuleb esitada tabelina ja esitada keskmiste väärtustena ja variaabluse näitajatega (nt standarddeviatsioon). Andmete hulgas tuleb registreerida:
                  
                              a)
                           
                           
                              õhuvoolu kiirused inhalatsiooniseadeldises;
                           
                        
                              b)
                           
                           
                              õhu temperatuur ja niiskus;
                           
                        
                              c)
                           
                           
                              kontsentratsioonid nominaalväärtustes (katseaine kogumaht, mis sisestatakse inhalatsiooniseadeldisse jagatud õhu mahuga);
                           
                        
                              d)
                           
                           
                              vehiikli olemus, kui seda kasutatakse;
                           
                        
                              e)
                           
                           
                              tegelikud kontsentratsioonid katseajal loomade hingamise tsoonides;
                           
                        
                              f)
                           
                           
                              keskmine osakeste suurus (vajaduse korral);
                           
                        
            
                  —
               
               
                  annused (sealhulgas vehiikli annused, kui seda kasutatakse) ja kontsentratsioonid;
               
            
                  —
               
               
                  toime puudumise tase,
               
            
                  —
               
               
                  kui see on võimalik;
               
            
                  —
               
               
                  surmaaeg uuringu ajal või kas loomad elasid kuni uuringu lõpetamiseni;
               
            
                  —
               
               
                  toksiliste või muude toimete kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  iga normist kõrvalekalduva sümptomi ilmnemise aeg ja edasine kulg;
               
            
                  —
               
               
                  andmed toidu ja kehakaalu kohta;
               
            
                  —
               
               
                  oftalmoloogilised leiud;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud hematoloogilised analüüsid ja kõik tulemused;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud kliinilise biokeemia analüüsid ja kõik tulemused (sealhulgas kõik uriinianalüüside tulemused);
               
            
                  —
               
               
                  lahanguleiud;
               
            
                  —
               
               
                  histopatoloogiliste leidude detailne kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste statistiline analüüs, kui see on võimalik;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste arutelu;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste tõlgendamine.
               
            3.2.   HINNANG JA TÕLGENDAMINE
      Vt B osa üldiste sissejuhatust.
      4.   VIITED
      Vt B osa üldiste sissejuhatust.
      B.31.   SÜNNIEELSE ARENGU MÜRGISUSE UURIMUS
      1.   MEETOD
      Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 414 (2001).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesolev arenguaegse mürgisuse uurimise meetod on välja töötatud selleks, et pakkuda üldist teavet sünnieelse kokkupuute mõjude kohta tiinetel katseloomadel ja emakas areneval organismil; see võib hõlmata nii emalt pärinevat mõjude kui ka surma, strukturaalsete kõrvalekallete või loote muundunud arengu hindamist. Funktsionaalsed puudujäägid, mis on arengu tähtis osa, ei ole käesoleva testi lahutamatu osa. Neid võib uurida eraldi uurimuses või käesoleva uurimuse täiendusena, kasutades neurotoksilisuse uuringutele suunatud katsemeetodit. Funktsionaalsete puudujääkide ja muude sünnijärgsete mõjude uurimist käsitleva teabe puhul tuleks vajadusel pidada nõu kahe põlvkonna reproduktiivse mürgisuse uuringut ja arengulise neurotoksilisuse uuringut käsitleva katsemeetodi üle.
      Käesolev katsemeetod võib eeldada konkreetset kohandamist üksikjuhtudel spetsiaalsete, nt katseaine füüsikalis-keemilisi või toksikoloogilisi omadusi puudutavate teadmiste põhjal. Selline kohandamine on aktsepteeritav, kui on olemas veenvad teaduslikud tõendid, et kohandamise tõttu on katse informatiivsem. Sellisel juhul tuleks hoolikalt dokumenteerida uurimisprotokollis nimetatud teaduslikud tõendid.
      1.2.   MÕISTED
      
         Arengutoksikoloogia – selliste areneva organismi kahjulike mõjude uuring, mis võivad tuleneda kokkupuutest enne viljastumist, sünnieelse arengu ajal või sünnijärgselt kuni seksuaalse küpsuse eani. Arengutoksikoloogia peamised ilmingud on järgmised: 1) organismi surm, 2) strukturaalsed kõrvalekalded, 3) muundunud kasv ja 4) funktsionaalsed puudujäägid. Arengutoksikoloogiale viidati varem sageli kui teratoloogiale.
      
         Kahjulik mõju – selline töötlemisega seotud muutus algtasemest, mis vähendab organismi võimet ellu jääda, sigida või kohaneda keskkonnaga. Võttes arvesse arengutoksikoloogiat, oma kõige laiemas tähenduses sisaldab see mis tahes mõju, mis segab viljastamise tulemuse normaalset arengut nii enne kui ka pärast sündi.
      
         Muundunud areng – järglase organi või keha kaalu või suuruse muutumine.
      
         Muundumised (anomaaliad) – strukturaalsed muundumised, mis hõlmavad nii väärarenguid kui ka muutusi (28).
      
         Väärareng/suur kõrvalekalle – strukturaalne muutus, mida peetakse loomale kahjulikuks (võib olla samuti surmav) ja mida juhtub tavaliselt harva.
      
         Muutus/väike kõrvalekalle – strukturaalne muutus, millel on vähe või ei ole üldse kahjulikku mõju loomadele; võib olla ajutine ja võib esineda suhteliselt sagedasti kontrollpopulatsioonis.
      
         Viljastumise tulemus (conceptus
         ) – viljastunud munaraku derivaatide summa arengu igal etapil viljastumisest kuni sünnini, kaasa arvatud lootevälised kestad ning embrüo või loode.
      
         Implantatsioon (nidatsioon) – lootepõiekese kinnitumine emaka epiteelkoele, kaasa arvatud selle tungimine läbi emakaepiteeli, ning selle kinnitumine emakalimaskestale.
      
         Embrüo – organismi varane või arengustaadium, eelkõige munaraku viljastumise tulemus pärast pikitelje ilmumist ja seni, kuni kõik suuremad struktuurid on olemas.
      
         Embrüotoksilisus – embrüo tavalist struktuuri, arengut, kasvu ja/või elujõulisust kahjustav.
      
         Loode – sündimata järglane embrüojärgsel perioodil.
      
         Lootetoksilisus – loote tavalist struktuuri, arengut, kasvu ja/või elujõulisust kahjustav.
      
         Abort – viljastumise tulemuse (embrüo või mitteelujõulise loote) enneaegne väljumine emakast.
      
         Resorptsioon – viljastumise tulemus (conceptus), kes pärast emakasse istutamist sureb või resorbeerub või on resorbeerunud.
      
         Varajane resorptsioon – tõendid implantatsiooni kohta ilma äratuntava embrüo/looteta.
      
         Hiline resorptsioon – surnud embrüo või väliste degeneratiivsete muutustega loode.
      
         NOAEL – lühend sõnadest „no observed adverse effect” – täheldamata kahjuliku mõju tase. See on kõrgeim annus- või kokkupuutetase, kus ei ole täheldatud kahjulikke, töötlemisega seotud leide.
      1.3.   VÕRDLUSAINE
      Puudub.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Tavaliselt manustatakse katseainet tiinetele loomadele vähemalt alates implantatsioonist kuni ühe päevani enne ettemääratud tapmist, mis peaks olema niipalju kui võimalik tavalise sünnitustähtaja lähedal, et ei läheks andmed kaduma varase sünnituse tõttu. Katsemeetod ei ole mõeldud ainult uurima organogeneesi perioodi (nt närilistel 5.–15. päev ja küülikutel 6.–18. päev), vaid samuti kogu tiinusperioodi aegseid mõjusid alates enne implantatsiooni ja lõppedes päev enne keisrilõiget. Natuke enne keisrilõiget emasloomad tapetakse, emakasisu uuritakse ning loodetele antakse hinnang väliselt nähtavate anomaaliate kohta ning pehme koe ja skeletimuutuste kohta.
      1.5.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.5.1.   Loomaliikide valik
      On soovitav, et katse tehtaks kõige sobivamate liikidega ja et kasutataks laboriliike ja -liine, mida tavaliselt kasutatakse sünnieelse arengutoksilisuse uurimiseks. Eelistatud näriliste liik on rott ja eelistatud muude kui näriliste liik on küülik. Tuleks põhjendada seda, kui kasutatakse muid liike.
      1.5.2.   Loomade pidamise ja toitmise tingimused
      Loomade katseruumi temperatuur peaks närilistel olema 22 oC (± 3o) ja küülikutel 18 oC (± 3o). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal, siis eesmärk on hoida see vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega.
      Paaritumine peab toimuma selleks ettenähtud puurides. Kuna paaritunud loomade puhul eelistatakse eraldi hoidmist, on samuti lubatud väikesearvulistes rühmades hoidmine.
      1.5.3.   Loomade ettevalmistamine
      Tuleks kasutada terveid loomi, kes on harjutatud laboritingimustega vähemalt viis päeva ja keda ei ole varem katsetes kasutatud. Katseloomade liik, liin, päritolu, sugu, kaal ja/või vanus on äratuntavad. Kõikide katserühmade loomad peaksid niipalju kui võimalik olema ühesuguse kaalu ja vanusega. Noori täiskasvanud ja sünnitamata emasloomi tuleks kasutada iga annusmäära juures. Emasloomad tuleks paaritada sama liigi ja liini isasloomadega ning õdede-vendade paaritamist tuleks vältida. Näriliste puhul on tiinuse 0- päevaks päev, mil tupekorki ja/või spermat jälgiti; küülikute puhul on 0-päev tavaliselt suguühte või kunstliku viljastamise päev, kui kasutatakse sellist tehnikat. Paaritunud loomad määratakse erapooletult kontroll- või töödeldavatesse rühmadesse. Puurid asetatakse nii, et puuri asetamisest tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Igale loomale tuleks anda ainulaadne tunnusnumber. Paaritunud emasloomad tuleks erapooletult jagada kontroll- või töödeldavatesse rühmadesse ning kui emasloomi paaritatakse partiides, tuleks iga partii loomad jaotada ühtlaselt rühmade vahel. Samamoodi tuleks sama isaslooma poolt viljastatud emasloomad jagada ühtlaselt rühmadesse.
      1.6.   KATSE KÄIK
      1.6.1.   Loomade arv ja sugu
      Igas katse- ja kontrollrühmas peaks olema piisaval hulgal emasloomi, et lahanguks saadakse ligikaudu 20 emaslooma, kellel täheldatakse implantatsiooni. Rühmad, kus on alla 16 sellise looma, ei ole sobivad. Emade suremus ei pruugi tunnistada kehtetuks uurimist, tingimusel et see ei ületa 10 %.
      1.6.2.   Annuste valmistamine
      Kui kandeainet või lisandit kasutatakse manustamise lihtsustamiseks, arvesse tuleks võtta järgmisi omadusi: katseaine absorbtsiooni, jaotamist, metabolismi ja peetumist või eritumist käsitlevad mõjud; katseaine keemilisi omadusi käsitlevad mõjud, mis võivad muuta toksilisi omadusi; ning toidu- või veetarbimist või toitumust käsitlevad mõjud. Kandeaine ei tohiks olla arengust lähtuvalt mürgine ega mõjutada reproduktsiooni.
      1.6.3.   Annustamine
      Tavaliselt katseainet manustatakse iga päev alates implantatsioonist (nt 5. päev pärast paaritumist) kuni päevani enne kavandatud keisrilõiget. Kui esialgsed uurimused vajaduse korral ei viita preimplanatatsiooni kaotuse kõrgele riskile, võib ravi pikendada kuni kogu tiinusperioodini paaritumiste ja ettekavandatud tapmiseni. On hästi teada, et ebasobiv käsitlemine või tiinusaegne stress võivad viia loote kaotuseni. Et vältida lootekaotust muude kui katsega seotud tegurite poolt, tiinete loomade tarbetu käsitamine ning stress välistest teguritest, nagu näiteks müra, tuleks vältida.
      Tuleks kasutada vähemalt kolme annusmäära ja teha samaaegselt kontrolli. Paaritunud loomad jagatakse erapooletult kontroll- või töödeldavatesse rühmadesse. Annusmäärade vahemikud määratakse nii, et saaks hinnata toksilisi mõjusid. Kui katseaine füüsikalis-keemiline laad või bioloogilised omadused ei sea piiranguid, valitakse kõrgeim annus eesmärgiga põhjustada mõningat arengu- ja/või emale suunatud mürgisust (kliinilised nähud või kehakaalu vähenemine), kuid mitte surma või tõsiseid kannatusi. Vähemalt üks vahepealne annusmäär tekitab minimaalseid täheldatavaid toksilisi mõjusid. Väikseima annusmäära puhul ei tohiks emale suunatud või arengutoksilisust ilmneda. Tuleks valida annusmäärade alanev järjestus, et näidata annusega seotud reaktsiooni ja mittetäheldatud kahjuliku mõju taset (NOAEL). Kahe- või neljakordsed vahemikud on sageli optimaalsed alanevate annusmäärade kehtestamisel ja sageli on eelistatav neljanda katserühma lisamine väga suurte vahemike (nt üle kümnekordne tegur) annuste vahel. Kuigi eesmärgiks on määrata ema täheldamata kahjulikud mõjud, kiideti samuti heaks uuringud, kus sellist vahemikku ei kasuta (1).
      Annusmäärad tuleks valida, võttes arvesse olemasolevaid andmeid mürgisuse kohta ning ka lisateavet katseaine või samalaadse aine metabolismi ja toksikokineetika kohta. Käesolev teave aitab samuti viidata sellele, et annustamisrežiim on adekvaatne.
      Tuleks kasutada samaaegset kontrollrühma. Nimetatud rühmaks on võltskontrollrühm (platseebot saav kontrollrühm) või kandeainet saav kontrollrühm, kui kandeainet kasutatakse katseaine manustamisel. Kõikidele rühmadele tuleks manustada sama kogus kas katseainet või kandeainet. Kontrollrühma(de) loomi tuleks kohelda nii nagu katserühma loomi. Kandeainet saavatele kontrollrühmadele tuleks anda suurim kogus kasutatud kandeaineid (madalaim katserühm):
      1.6.4.   Piirsisalduskatse
      Kui suukaudne annusmäär on vähemalt 1 000 mg kg kehakaalu kohta päevas, kasutades käesolevas uurimuses kirjeldatud menetlusi, täheldatavat mürgisust põhjustamata, kas tiinetel loomadel ja/või nende järglastel ning kui mõju eeldatavasti ei põhine olemasolevatel andmetel (nt struktuuriliselt ja/või metaboolselt samalaadsed ühendid), siis ei peeta vajalikuks kolme annusmäära kasutavat täielikku uurimust. Inimeste ootuspärane vastuvõtlikkus võib viidata piirkatses kasutavatest annustest suuremate suukaudsete annuste kasutamise vajadusele. Muude manustamisviiside puhul, nagu näiteks sissehingamine või nahakaudne kasutamine, võivad katseaine füüsikalis-keemilised omadused tihti viidata ja piirata suurimat saavutatava kokkupuutumise ulatusega (nt nahakaudne kasutamine ei põhjusta rasket paikset mürgisust).
      1.6.5.   Annuste manustamine
      Katseainet või kandeained manustatakse tavaliselt suu kaudu intubeerimise teel. Kui kasutatakse muud manustamisviisi, peaks katse tegija põhjendama selle valikut ja asjakohased muutused võivad olla vajalikud (2, 3, 4). Katseainet tuleks manustada ligikaudu samal ajal iga päev.
      Üksikute loomade annus peab tavaliselt põhinema kõige viimasel ühe looma kehakaalu kindlaksmääramisel. Annuse määramisel tuleks siiski olla ettevaatlik tiinuse viimasel trimestril. Varasemaid andmeid tuleks kasutada annuse valimisel, et vältida liigset emale suunatud mürgisust. Kui liigset mürgisust on täheldatud käsitletud emasloomadel, tuleks need loomad humaanselt tappa. Kui mitmetel tiinetel loomadel on liigse mürgisuse nähud, tuleks kaaluda nimetatud annusrühma lõpetamist. Kui aineid manustatakse sundsöötmise teel, peaks see olema eelistatult ühekordne annus loomadele söögitoru kaudu või sobiva intubeerimise kanüüli abil. Vedeliku suurim kogus, mida saab ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Maht ei tohiks ületada 1 ml 100 g kehakaalu kohta, välja arvatud vesilahuste puhul, kui võib kasutada mahtu 2 ml 100 g kehakaalu kohta. Kui kandeainena kasutatakse maisiõli, ei tohiks selle maht ületada 0,4 ml 100 g kehakaalu kohta. Katsekoguse muutlikkust tuleks vähendada, kohandades kontsentratsioone konstantse koguse tagamiseks kõikidel annusmääradel.
      1.6.6.   Emasloomade jälgimine
      Kliinilised vaatlused tuleks teha ja registreerida vähemalt üks kord päevas, soovitavalt sama ajal iga päev, võttes arvesse pärast annustamist oodatavate mõjude kõrgperioodi. Loomade seisund tuleks registreerida, kaasa arvatud suremus, haigestumus, asjassepuutuvad käitumismuutused ning kõik selge mürgisuse nähud.
      1.6.7.   Kehakaal ja toidu tarbimine
      Loomi tuleks kaaluda tiinuse 0-päeval ja mitte hiljem kui tiinuse 3. päeval, kui kasutatakse välise aretaja tarnitud aegpaaritunud loomi, annustamise esimesel päeval, vähemalt iga kolme päeva tagant annustamisperioodil ja ettemääratud tapmise päeval.
      Toidu tarbimist tuleks registreerida kolmepäevaste ajavahemike tagant ja see peaks kokku langema kehakaalu kindlaksmääramisega.
      1.6.8.   Tapajärgne uurimine
      Emasloomad tuleks tappa päev enne oodatavat sünnitustähtpäeva. Emasloomad, kellel ilmnevad abordi või enneaegse sünnituse nähud enne ettemääratud tapmiskuupäeva, tuleks tappa ja neile tehakse põhjalik makroskoopiline uuring.
      Lõpetamise ajal või uurimuse käigus aset leidnud surma korral tuleks uurida emaslooma makroskoopiliselt igasuguste strukturaalsete kõrvalekallete või patoloogiliste muutuste osas. Emasloomade hindamine keisrilõike ajal ja sellele järgnevad looteanalüüsid tuleks teha soovitavalt teadmata, millisesse rühma emasloom kuulub, et vähendada süstemaatilist viga.
      1.6.9.   Emakasisu uurimine
      Vahetult pärast lõpetamist või nii kiiresti kui võimalik pärast surma tuleks emakas eemaldada ja kinnitada loomade tiinust. Emakat, mis ei ole tiine, tuleks edasi uurida (nt näriliste puhul ammooniumsulfiidiga värvimisega ja Salewski värvimisega või muu sobiva meetodiga küülikute puhul), et kinnitada tiinuse puudumist (5).
      Tiine emakas, kaasa arvatud emakakael, tuleks ära kaaluda. Tiine emaka kaalu ei tohiks saada loomadelt, kes surid katse käigus.
      Kollakehade arv tuleks kindlaks määrata tiinete loomade puhul.
      Emakasisu tuleks uurida mitmete embrüo- või lootesurmade suhtes ja elujõuliste loodete suhtes. Resorptsiooni ulatust tuleks kirjeldada, et hinnata conceptus’e surma suhtelist aega (vt punkti 1.2).
      1.6.10.   Loodete uurimine
      Iga loote sugu ja kehakaal tuleks kindlaks määrata.
      Iga loodet uuritakse väliste muundumiste suhtes (6).
      Looteid uuritakse skeleti- ja pehmekoe muundamiste osas (nt muutused ja väärarengud või anomaaliad) (7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24). Loote muunduste liigitamine on soovitav, kuid mitte nõutav. Kui liigitamine on tehtud, tuleks selgesti sõnastada iga kategooria kindlaks määramise kriteeriumid. Erilist tähelepanu tuleks pöörata reproduktiivorganile, mida tuleks uurida muundunud arengu tunnuste suhtes.
      Närilistel ligikaudu pool pesakonnast valmistataks ette skeletimuundumiste uurimiseks. Ülejäänud pesakond valmistatakse ette pehmekoe muundumiste uurimiseks, kasutades heakskiidetud või sobivat mikrotoommenetlust või hoolsat dissekteerimistehnikat.
      Muude kui näriliste puhul, nt küülikud, tuleks uurida kõiki looteid nii pehmekoe- kui ka skeletimuutuste suhtes. Nende loodete kehasid hinnatakse hoolsa dissekteerimise abil pehmekoemuutuste osas, mis võivad hõlmata jätkumenetlusi südame sisestruktuuri (25) hindamiseks. Pooltel, selliselt uuritud loodetel eemaldatakse pead, mille pehmekoemuutusi (sh silmad, aju, ninaõõned ja keel) uuritakse tavalise mikrotoommenetluse abil (26) või võrdselt tundliku meetodi abil. Nende loodete kehad ja ülejäänud looted, keda ei ole uuritud, prepareeritakse skeletimuutuste uurimise tarbeks, kasutades samu meetodeid nagu näriliste puhul.
      2.   ANDMED
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE
      Andmed edastatakse iga emaslooma ja nende järglase kohta tabeli kujul, näidates iga katserühma ja põlvkonna kohta loomade arvu katse alguses, katse käigus surnud või humaansetel kaalutlustel tapetud loomade arvu, surma ja humaanse tapmise ajad, tiinete emasloomade arvu, mürgisuse nähtudega loomade aru, mürgisuse nähtude kirjelduse, sh toksiliste mõjude algusaja, kestuse ja raskuse, embrüot/loodet käsitlevate vaatluste liigid ja kogu asjaomane teave pesakonna kohta.
      Numbrilisi tulemusi hinnatakse asjaomase statistilise meetodi abil, kasutades andmeanalüüsi üksusena pesakonda. Kasutatakse üldiselt heakskiidetud statistilist meetodit; statistilised meetodid tuleks valida uurimuse kavandamisel ja neid tuleks põhjendada. Andmed loomadest, kes ei ela ettemääratud tapmiseni, tuleks samuti edastada. Nimetatud andmed võivad sisalduda rühmakeskmiste hulgas vajaduse korral. Sellistelt loomadelt saadud andmete olulisus ja seetõttu nende sisaldumist rühmakeskmis(t)e hulgas või sealt väljajätmist tuleks põhjendada ja hinnata ükshaaval.
      2.2.   TULEMUSTE HINDAMINE
      Sünnieelse arengutoksilisust käsitleva uurimuse avastusi hinnatakse vaadeldud mõjude tähenduses. Hindamine peab hõlmama järgmist teavet:
      
                  —
               
               
                  ema ja embrüot/loodet uuriva katse tulemused, sh loomade katseainega kokkupuute ning kõikide avastuste esinemise ja raskuse vahelise seose või selle puudumise hindamine;
               
            
                  —
               
               
                  loote väliste muutuste, pehmekoe- ja skeletimuutuste liigitamisel kasutatavad kriteeriumid, kui liigitamist on kasutatud;
               
            
                  —
               
               
                  vajaduse korral ajaloolised kontrollandmed katsetulemuste tõlgendamise tõhustamiseks;
               
            
                  —
               
               
                  kõikide protsendimäärade või indeksite arvutamisel kasutatud arvud;
               
            
                  —
               
               
                  vajaduse korral katseavastuste piisav statistiline analüüs, mis peaks sisaldama piisavalt teavet analüüsimeetodi kohta, nii et sõltumatu arvustaja/statistik saaks uuesti hinnata ja rekonstrueerida analüüsi.
               
            Igas katses, mis tõendab toksiliste mõjude puudumist, tuleks kaaluda jätkuuurimisi katseaine absorbtsiooni ja biosaadavuse kindlaksmääramiseks.
      2.3.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE
      Sünnieelset arengutoksilisust käsitlev katse annab teavet emasloomade korduva ainega kokkupuute kohta tiinuse ajal ja nende järglase üsasisese arengu kohta. Katse tulemusi tõlgendatakse koostoimes subkroonilisel, reproduktsiooni, toksikokineetilisel ja muudel katsetel saadud avastustega. Kuna rõhutatakse nii üldist mürgisust emale mõjuva mürgisuse tähenduses kui ka arengutoksilisuse lõpp-punkte, võimaldavad katsetulemused mingis teatud ulatuses vahetegemist üldise toksilisuse puudumisel asetleidvate arengumõjude ja nende arengumõjude vahel, mis on tekkinud tasemetel, mis on samuti emasloomale (27) mürgised.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Katseaine:
                  
                              —
                           
                           
                              füüsiline laad ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tunnusandmed, kaasa arvatud CASi number, kui see on teada/kasutusel;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              puhtus.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Kandeaine (vajadusel):
                  
                              —
                           
                           
                              kandeaine valiku põhjendus, kui see on muu kui vesi. Katseloomad:
                           
                        
            
                   
               
               
                  kasutatud liigid ja liinid;
                  
                              —
                           
                           
                              loomade arv ja vanus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              päritolu, elamistingimused, toitumine jne;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              iga looma kaal katse alguses.
                           
                        
                              —
                           
                           
                              Katsetingimused:
                           
                        
            
                   
               
               
                  annuste valiku põhjendus;
                  
                              —
                           
                           
                              katseaine valmistamise/toiduvalmistise üksikandmed, saavutatud kontsentratsioon, valmistise stabiilsus ja homogeensus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katseaine manustamise üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toidu/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni (ppm) muutmine tegelikuks annuseks (mg/kg kehakaalu kohta päevas) vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              keskkonnatingimused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta.
                           
                        
                              —
                           
                           
                              Tulemused
                           
                        
            
                   
               
               
                  Andmed emaslooma mürgisele annusele reageerimise kohta,
               
            
                   
               
               
                  sealhulgas:
                  
                              —
                           
                           
                              loomade arv katse alguses, ellujäänud loomade arv, tiinete loomade arv ja katkenud tiinusega loomade arv, enneaegselt sünnitanud loomade arv;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              surmapäev katse ajal või andmed loomade ellujäämise kohta kuni lõpetamiseni;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              andmed loomade kohta, kes ei elanud kuni ettemääratud tapmiseni, edastatakse, kuid ei sisaldu rühmadevahelistes statistilistes võrdlustes;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              iga ebatavalise kliinilise tunnuse jälgimise päev ja selle edasiarenemine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kehakaal, kehakaalu muutus ja tiine emaka kaal, sh valikuliselt kehakaalu muutus, mida on korrigeeritud tiine emaka kaalu võrra;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toidu tarbimine ja, kui seda on mõõdetud, vee tarbimine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lahangu leiud, sh emaka kaal;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              edastatakse NOAEL-väärtused ema ja areneva loote kohta.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Arenguga seotud lõpp-punktid annuse järgi pesakonna kohta, kellel on implantaadid, kaasa arvatud:
                  
                              —
                           
                           
                              kollakehade arv;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              implantatsioonide arv, elus ja surnud loodete ning resorptsioonide arv ja protsent;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              implantatasioonieelsete või -järgsete tiinuste katkemise arv ja protsent.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Arenguga seotud lõpp-punktid annuse järgi pesakonna kohta, kus on elus looted, kaasa arvatud:
                  
                              —
                           
                           
                              elus järglaste arv ja protsent;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sooline jagunemine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loote kehakaal, soovitavalt soo järgi ja kombineeritud mõlema sooga;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              väliste, pehmekoe- ja skeletiväärarengud ning muud asjaomased muutused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              liigitamise kriteeriumid vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loodete ja selliste pesakondade koguarv ja protsent, kellel on välised, pehmekoe- või skeletimuutused. ning individuaalsete anomaaliate ja muude asjaomaste muutuste liigid ja esinemine.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutelu.
               
            
                   
               
               
                  Järeldused.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for Developmental Toxicity. Risk Analysis 16; 399-410.
               
            
                  2)
               
               
                  Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies. Fundamental and Applied Toxicology 14; 386-398.
               
            
                  3)
               
               
                  Wong, B.A., et al. (19 9 7) Developing Specialized Inhalation Exposure Systems to Address Toxicological Problems. CUT Activities 17; 1-8.
               
            
                  4)
               
               
                  US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E-Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation Developmental Toxicity Study.
               
            
                  5)
               
               
                  Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte. Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experimentelle Pathologic 247:367.
               
            
                  6)
               
               
                  Edwards, J.A. (19 6 8) The external Development of the Rabbit and Rat Embryo. In Advances in Teratology. D.H.M. Woolam (ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.
               
            
                  7)
               
               
                  Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S. Congenital Anomalies 16; 171-173.
               
            
                  8)
               
               
                  Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial Skeletal Variations Detected by the Double Staining Techniquefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses. Congenital Anomalies 32;:381-391.
               
            
                  9)
               
               
                  Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following Heat Exposure in the Rat. Teratology 47:229-242.
               
            
                  10)
               
               
                  Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats. Teratology 37; 476.
               
            
                  11)
               
               
                  Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Foetuses. Journal of Morphology 127:291-306.
               
            
                  12)
               
               
                  Fritz, H. (19 74) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative of Foetal Maturity. Teratology 11; 313-320.
               
            
                  13)
               
               
                  Gibson, J.P. et al. (19 6 6) Use of the Rabbit in Teratogenicity Studies. Toxicology and Applied Pharmacology 9; :398-408.
               
            
                  14)
               
               
                  Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in Rats: Malformations or Variations? Teratology 8; 309-316.
               
            
                  15)
               
               
                  Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD (Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to Ethylene Glycol. Teratology 46; 169-181.
               
            
                  16)
               
               
                  Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and Histological Study of Viscera. Supplement to Teratology Workshop Manual, pp. 163-173.
               
            
                  17)
               
               
                  Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Possible Influence of the Sex Factor. American Journal of Anatomy 41; 411-445.
               
            
                  18)
               
               
                  Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for Fetal Bone. Stain Technology 39; 61-63.
               
            
                  19)
               
               
                  Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton. American Journal of Anatomy 36; 313-355.
               
            
                  20)
               
               
                  Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Examination of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Testing. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis 4; 181-188.
               
            
                  21)
               
               
                  Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957) The Genesis of the Rat Skeleton. Thomas, Springfield, IL.
               
            
                  22)
               
               
                  Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Teratology. In Teratology: Principles and Techniques, Wilson J.G. and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, pp 251-277.
               
            
                  23)
               
               
                  Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977) Handbook of Teratology, Vol. 4. Plenum, NY.
               
            
                  24)
               
               
                  Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Techniques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity. Acta Vet. Acad. Sci. Hung. 28; 233-239.
               
            
                  25)
               
               
                  Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in Mammalian Foetuses. Teratology 9; 37-38.
               
            
                  26)
               
               
                  Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In: Methods in Prenatal Toxicology Neubert, D., Merker, H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of Chicago, Chicago, IL, pp. 126-144.
               
            
                  27)
               
               
                  US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for Developmental Toxicity Risk Assessment. Federal Register 56; 63798-63826.
               
            
                  28)
               
               
                  Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental Abnormalities in Common Laboratory Mamma ls (Version 1) Teratology 55; 249-292.
               
            B.32.   KARTSINOGEENSUSE UURING
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.2.   MÕISTED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritavat ainet antakse tavaliselt seitse päeva nädalas sobival manustamisviisil mitmele katseloomade rühmale. Igale rühmale ordineeritakse kindel uuritava aine annus ja seda manustatakse suurem osa nende loomade elueast. Aine manustamise ajal ja pärast seda jälgitakse katseloomi iga päev, et sedastada toksiliste mõjude tunnuseid, eriti tuumorite arenemist.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Puuduvad.
      1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      Loomi hoitakse eksperimentaalsetes elamis- ja toitumistingimustes vähemalt viis päeva enne uuringut. Enne testi terved noored loomad randomiseeritakse ja määratakse uuritavat ainet saavatesse ning kontrollrühmadesse.
      1.6.1.   Katseloomad
      
      Võttes arvesse eelnevalt tehtud uuringute tulemusi, võib kasutada eelmistest katsetest erinevaid loomaliike (närilisi või mittenärilisi). Kasutada tuleb tavapäraseid laboriloomade liinide noori terveid isendeid ja uuritava aine manustamine peab algama võimalikult vara pärast imetamisperioodi.
      Uuringu alguses ei tohi katseloomade kaal erineda keskmisest kaalust enam kui ± 20 %. Kui pikaajalisele uuringule eelneb subkroonilise suukaudse manustamise test, tuleb mõlemal juhul kasutada sama loomaliiki/-tõugu ja -liini.
      1.6.2.   Arv ja sugu
      
      Näriliste korral peab igas eri annust saavas rühmas ja samuti kontrollrühmas olema vähemalt 100 isendit (50 emast ja 50 isast). Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Kui plaanitakse vahepealset loomade surmamist, tuleb isendite arvu suurendada vastavalt selle arvu võrra, kui palju loomi kavatsetakse surmata enne uuringu täielikku lõpetamist.
      1.6.3.   Annused ja kokkupuute sagedus
      
      Kaasnevale kontrollgrupile lisaks peab kasutama vähemalt kolme erinevat annust saavat rühma. Kõige kõrgem annus peab esile kutsuma minimaalseid toksilisi mõjusid, näiteks kehakaalu juurdekasvu vähene pidurdumine (vähem kui 10 %), ilma et normaalset elukestust mõjutaks teised toimed peale kasvajate.
      Madalaim annus ei tohi häirida looma normaalset kasvu, arengut ja pikaealisust või tekitada vähimalgi määral toksilisi mõjusid. Tavaliselt ei tohi madalaim annus olla vähem kui 10 % suurest doosist.
      Vahepealne annus või vahepealsed annused tuleb valida suure ja väikse annuse väärtuste vahemiku keskelt.
      Annuste valimisel tuleb arvesse võtta eelmiste toksilisuse katsete ja uuringute andmeid.
      Ekspositsioon uuritavale ainele peaks reeglipäraselt toimuma iga päev.
      Kui kemikaali manustatakse joogiveega või toidu hulka segatult, peavad need olema pidevalt kättesaadavad.
      1.6.4.   Kontrollrühm
      
      Kasutada tuleb kontrollrühma, mis on igas suhtes identne katserühmaga, erinevus on vaid kokkupuutes katseainega.
      Teatud tingimustel, näiteks inhalatsiooniuuringute korral, mille puhul kasutatakse aerosoole, või suukaudse manustamise uuringute puhul, kui kasutatakse iseloomustamata bioloogilise aktiivsusega emulgaatorit, peab kasutama lisaks kontrollrühma, kus loomad ei puutu kokku ülekandeainega.
      1.6.5.   Manustamisviis
      
      Kolm peamist manustamisviisi on suukaudne, nahakaudne ja inhalatsioon. Valik sõltub katseaine füüsikalistest ja keemilistest omadustest ning aine võimalikust manustamisviisist inimestel.
      1.6.5.1   Suukaudse manustamise uuringud
      Kui uuritav aine imendub mao-sooletraktist ja kui allaneelamine on üks võimalikest inimese ekspositsiooni viisidest, eelistatakse vastunäidustuste puudumisel suukaudset manustamist. Loomad võivad saada uuritavat ainet toiduga, lahustatuna joogivees või kapsliga.
      Ideaaltingimustes annustatakse uuritavat ainet iga päev seitse korda nädalas, sest viie korra puhul võib loom paraneda või toksilised nähud taanduda perioodil, kui uuritavat ainet ei manustata. See võib mõjutada tulemusi koos järgneva hinnanguga. Siiski, peamiselt praktilistel kaalutlustel peetakse ka viis päeva nädalas manustamist vastuvõetavaks.
      1.6.5.2   Nahakaudse manustamise uuringud
      Nahakaudne manustamine, aine määrimine nahapinnale sobib juhul, kui soovitakse jäljendada selle aine peamist manustamisviisi inimesele ja koostatakse mudel järelduste tegemiseks nahakahjustuste kohta.
      1.6.5.3   Inhalatsiooniuuringud
      Et inhalatsiooniuuringud kätkevad endas teiste manustamisviisidega võrreldes mitmeid keerukamaid tehnilisi probleeme, antakse siin selle meetodi kohta detailsemaid juhtnööre. Peab märkima, et intratrahheaalne tilgutamine võib olla üks arvestatavaid alternatiivseid meetodeid, et teatud olukordades ainet manustada.
      Pikemaajaline ekspositsioon on tavaliselt kavandatud nii, et see jäljendaks inimese ekspositsiooni. Loomade kokkupuude uuritava ainega korraldatakse kas kuus tundi päevas viiel päeval nädalas pärast kambri kontsentratsioonide tasakaalustamist (seda nimetatakse vahelduvaks kokkupuuteks) või kasutatakse sarnaselt pidevale keskkonnamõjurile kokkupuute aega 22 kuni 24 tundi seitsmel päeval nädalas (katkematu kokkupuude). Viimasel juhul jääb üks tund päevas loomade söötmiseks, mis peaks toimuma samadel kellaaegadel, ja kambrite korrashoiuks. Mõlema skeemi korral eksponeeritakse loomi ettenähtud ainele kindlatel kontsentratsioonidel. Suurim erinevus vahelduva ja katkematu inhalatsiooniuuringu vahel on see, et esimesel jääb 17- või 18tunnine periood, mil loomad võivad taastuda kokkupuute mõjust, ja nädalavahetuseti on taastumisperiood veelgi pikem.
      Vahelduva või katkematu kokkupuute valik sõltub uuringu eesmärkidest ning inimesel rakendatavast manustamisviisist, mida tahetakse jäljendada. Siiski tuleb arvestada teatud tehnilisi raskusi. Näiteks katkematu kokkupuute eelised keskkonna tingimuste jäljendamiseks võivad saada vastulöögi tehniliste raskuste tõttu, sealhulgas söötmise ja jootmise vajadus ekspositsiooni ajal ning keerukamate (ja usaldusväärsemate) aerosool- ja aurugeneraatorite ning jälgimistehnika vajadus.
      1.6.6.   Ekspositsioonikambrid
      
      Katseloomad peavad olema inhalatsioonikambrites, mis on kavandatud nii, et võimaldavad dünaamiliselt vähemalt 12 õhuvahetust tunnis, selleks et kindlustada piisava hapniku ja ühtlaselt jaotunud katseaine sisalduse. Kontrollgrupile ja katsegrupile mõeldud kambrid peavad olema ehituslikult ja disainilt samasugused, et tagada võrreldavad mõjustustingimused kõikides aspektides, välja arvatud katseainega kokkupuutumise faktoris. Kambris hoitakse vähene negatiivne rõhk, mis takistab katseaine väljaimbumist ümbritsevasse õhku. Katseloomade tunglemine kambrites peaks olema viidud miinimumini. Üldise reegli kohaselt, selleks et tagada kambri õhkkonna stabiilsus, ei tohi katseloomade kogumaht ületada 5 % kambrimahust.
      Kambrites tuleb teha järgmisi mõõtmisi või kontrolle:
      
                  i)
               
               
                  õhuvool: eelistatult tuleb õhuvoolu kiirust kambrites jälgida pidevalt;
               
            
                  ii)
               
               
                  kontsentratsioon: igapäevase ekspositsiooni ajal ei tohi katseaine sisaldus erineda keskmisest väärtusest rohkem kui ± 15 %. Uuringu kestel tuleb aine kontsentratsioon hoida päevade lõikes võimalikult ühtlasena;
               
            
                  iii)
               
               
                  temperatuur ja niiskus: näriliste jaoks tuleb temperatuur hoida 22 ± 2 oC ja niiskus peab olema kambrites 30 % kuni 70 %, välja arvatud juhul, kui eksponeeritava aine viimiseks kambri atmosfääri kasutatakse vett. Soovitatavalt peaks mõlemat faktorit jälgima pidevalt;
               
            
                  iv)
               
               
                  osakeste suuruse mõõtmised: osakeste suuruse jaotumus peab olema kambrite atmosfääris määratud nii vedelates kui ka tahketes aerosoolides. Aerosoolpartiklid peavad olema katseloomadele sissehingamiseks sobiva suurusega. Kambri õhu analüüsid peavad olema võetud aladelt, kus loomad hingavad. Õhu analüüsid peavad iseloomustama nende osakeste jaotumust, millele katseloomi eksponeeritakse, ja neid tuleb aerosoolheljumites gravimeetriliselt analüüsida, isegi kui suur osa aerosoolist ei ole võimalik sisse hingata. Generaatorsüsteemi väljatöötamisel tuleb sagedasti teha osakeste suuruse analüüse, et selgitada aerosooli stabiilsust. Edaspidi tuleb analüüse teha nii tihti kui vaja, et määrata adekvaatselt loomadele kokkupuuteks vajaliku aine partiklite jaotuvuse ühtlust.
               
            1.6.7.   Uuringu kestus
      
      Kartsinogeensuse uuringu kestus hõlmab tavaliselt suurema osa katseloomade elueast. Uuring peaks lõppema hiirtel ja hamstritel 18 kuu järel ja rottidel 24 kuu järel. Siiski, teatud pikemaealistel ja/või kasvaja madala spontaanse tekkimise kiirusega liinidel peaks uuring lõppema hiirtel ja hamstritel 24. kuul ja rottidel 30. kuul. Teine võimalus on lõpetada selline laiaulatuslik uuring juhul, kui ellujäänute arv madalaimat annust saanud loomarühmas või kontrollrühmas ulatub 25 %. Kui katset lõpetades ilmneb elusolevatel isendite hulgas väljendunud sooline erinevus, peab iga sugu analüüsima eraldi. Kui loomad surevad enneaegselt selgelt sedastatavate toksiliste nähtude tõttu ainult kõrge annusega uuringugrupis ja need toksilised mõjud ei põhjusta probleeme teistes gruppides, ei pruugi seetõttu uuringut lõpetada. Negatiivne uurimustulemus on vastuvõetav, kui mitte üheski grupis ei kaotatud katseajal üle 10 % isenditest autolüüsi, kannibalismi või hooldamise probleemide tõttu ja ühegi grupi elulemus ei ole vähem kui 50 % 18. kuul hiirte ja hamstrite kasutamisel ning 24. kuul rottide korral.
      1.6.8.   Protseduur
      
      1.6.8.1.   Vaatlused
      
      Igapäevased vaatlused kambrites peavad hõlmama naha- ja karvkatte, silmade ja limaskesta muutusi, lisaks tuleb hinnata hingamis-, vereringeelundkonda, autonoomset ja kesknärvisüsteemi, somatosensoorset aktiivsust ja käitumismudelit.
      Loomade regulaarsed vaatlused on vajalikud selleks, et mitte kaotada isendeid uuringu ajal selliste põhjuste tõttu nagu kannibalism, kudede autolüüs või looma vale paigutuse. Surnud loomad tuleb koheselt eemaldada, surmata ja lahata.
      Kõikide loomade kliinilised andmed ja suremus peavad olema registreeritud. Erilist tähelepanu tuleb pöörata kasvajate tekkimisele: iga nähtava või palpeeritava tuumori puhul tuleb märkida märkamisaeg, lokalisatsioon, mõõtmed, väline kuju ja levik.
      Toidu tarbimist (ja joogi tarbimist, kui katseaine manustatakse joogivee kaudu) hinnatakse igal nädalal uuringu esimesel kolmeteistkümnel nädalal ja seejärel ligikaudu kolmekuuliste intervallidega, kui loomade tervislik seisund või kehakaalu muutused ei nõua teisiti.
      Iga looma kehakaal tuleb registreerida eraldi korra nädalas katseperioodi esimesel kolmeteistkümnel nädalal ja seejärel vähemalt korra nelja nädala jooksul.
      1.6.8.2.   Kliinilised analüüsid
      
      
         Hematoloogia
      
      Kui katseloomade kliinilised vaatlused kinnitavad loomade tervisliku seisundi muutust katseperioodil, tuleb nendel loomade määrata vereanalüüs koos verevalemiga.
      Vere äigepreparaadid võetakse 12. ja 18. kuul ja enne lahangut. Vererakud loendatakse kõrge annuse saanud loomadel ja kontrollrühmal. Kui need andmed, eelkõige enne lahkamist võetud analüüsid, või patoloogilised andmed kinnitavad vajadust, loendatakse valem järgmisel madalama annusega rühmal või rühmadel.
      
         Lahang
      
      Lahang tehakse kõikidele loomadele, kaasa arvatud nendele, kes surid katseajal või surmati, kuna leiti suremas. Säilitada tuleb kõik makroskoopiliselt nähtavad tuumorid või kahjustused või tuumori kahtlased lesioonid.
      Kõik järgmised organid või koed tuleb säilitada vastavates keskkonnatingimustes võimalikeks hilisemateks histopatoloogilisteks uuringuteks: ajukude (sealhulgas piklikaju/ajusild, väikeaju ja suuraju korteksi lõigud), ajuripats, kilpnääre/kõrvalkilpnääre, kõik harknäärme koed, hingetoru ja kopsud, süda, aort, süljenäärmed, maks, põrn, neerud, neerupealised, kõhunääre, suguorganid, emakas, lisasugunäärmed, nahk, söögitoru, magu, kaksteistsõrmiksool, tühi- ja niudesool, umbsool, jämesool, pärasool, kusepõis, iseloomulik lümfisõlm, emasloomadel piimanäärmed, reie lihaskond, perifeerne närv, rinnak koos luuüdiga, reieluu koos liigesega, seljaaju kolmel tasandil (kaelaosa, keskmine rinnaosa ja nimmeosa) ja silmad.
      Kopsude ja kusepõie parimaks säilitamiseks tuleb nad täis puhuda fikseerivat ainet; täispuhutud kopsud on inhalatsioonikatsete korral olulise tähtsusega õigeks histopatoloogiliseks analüüsiks. Inhalatsiooniuuringute korral peab säilitama kogu hingamiselundkonna, sealhulgas ninaõõne, neelu ja kõri.
      
         Histopatoloogiline uuring
      
      
                  a)
               
               
                  Täielik histopatoloogiline uuring tuleb teha kõikide uuringuperioodil surnud või surmatud loomade organitel ja kudedel ja kõikidel kontrollrühma ja suurt annust saanud rühma kuulunud loomadel.
               
            
                  b)
               
               
                  Kõik selgelt nähtavad kasvajad või kasvajakahtlased kahjustused tuleb kõikides rühmades kontrollida mikroskoopiliselt.
               
            
                  c)
               
               
                  Neoplastiliste kahjustuste olulise erinevuse korral kõrge annusega rühmas ja kontrollrühmas tuleb teistes rühmades teha vastava organi või koe histopatoloogiline uuring.
               
            
                  d)
               
               
                  Kui suure annuse rühmas on elulemus märkimisväärselt madalam kui kontrollgrupil, tuleb täielik uuring teha madalama annuse rühmast järgmise grupi isenditele.
               
            
                  e)
               
               
                  Kui esineb tõendeid, et kõrge annusega rühma loomadel on toksilisi või teisi nähtusid, mis võivad mõjutada neoplastilist reaktsiooni, tuleb täielik uuring teha madalama annusega rühmast järgmise rühma isenditele.
               
            2.   ANDMED
      Andmed tuleb esitada kokkuvõtlikus tabelis, näidates iga katsegrupi puhul loomade arvu katse alguses; isendite arvu, kellel ilmneb katseaja jooksul kasvajaid; kasvaja sedastamise aeg ja loomade arv, kellel pärast surmamist leiti kasvajaid. Tulemused tuleb hinnata sobiva statistilise meetodiga. Kasutada võib iga tunnustatud statistilist meetodit.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  loomaliik, liin, päritolu, keskkonnatingimused, dieet;
               
            
                  —
               
               katsetingimused:
                              3.1 .1.
                           
                           
                              ekspositsiooniseadeldise kirjeldus:
                           
                        
                              3.1.2.
                           
                           
                              tuleb märkida seadeldise disain, mõõtmed, õhu lähteallikas, osakesi ja aerosoole tootev süsteem, õhu-puhastamise meetod, heitõhu menetlemine, testkambrite kasutamisel tuleb märkida elamistingimuste loomise meetod. Kirjeldada tuleb temperatuuri ja niiskuse mõõtmise meetodit ning vajadusel aerosooli kontsentratsiooni stabiilsust ja osakeste suurust;
                              andmed katseainega kokkupuutumise kohta:
                              andmed tuleb esitada tabelis ja märkida aritmeetilised keskmised koos statistilise rea andmete erinevusega (nt standarddeviatsioon). Andmete hulgas tuleb registreerida järgmised:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          õhuvoolu kiirused inhalatsiooniseadeldises;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          õhu temperatuuri ja niiskuse;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          kontsentratsioonid nominaalväärtustes (katseaine kogumaht, mis sisestatakse inhalatsiooniseadeldisse, jagatud õhu mahuga);
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          osakesi edasi kandva aine liik, kui seda kasutati;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          tegelikud kontsentratsioonid katseajal loomade hingamise tsoonides;
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          keskmine osakeste suurus (vajaduse korral),
                                       
                                    
                        
            
                  —
               
               
                  annused (sealhulgas ülekandva aine annused, kui seda kasutatakse) ja kontsentratsioonid;
               
            
                  —
               
               
                  kasvaja esinemissageduse andmed vastavalt soole, annusele ja kasvaja tüübile;
               
            
                  —
               
               
                  surmaaeg uuringu ajal või kas loomad elasid kuni uuringu lõppemiseni;
               
            
                  —
               
               
                  toksilise mõju andmed soo ja annuste kaupa;
               
            
                  —
               
               
                  toksiliste või muude toimete kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  iga normist kõrvalekalduva sümptomi ilmnemise aeg ja edasine kulg;
               
            
                  —
               
               
                  andmed toidu ja kehakaalu kohta;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud hematoloogilised analüüsid ja kõik tulemused;
               
            
                  —
               
               
                  lahanguleiud;
               
            
                  —
               
               
                  histopatoloogiliste leidude detailne kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste statistiline analüüs koos statistiliste meetodite kirjeldusega;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste arutelu;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste tõlgendamine.
               
            3.2.   HINNANG JA TÕLGENDAMINE
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      4.   VIITED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      B.33.   KOMBINEERITUD KROONILISE TOKSILISUSE/KARTSINOGEENSUSE UURING
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.2.   MÕISTED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Kombineeritud kroonilise toksilisuse/kartsinogeensuse uuringu eesmärk on määrata mingi aine kroonilist toksilisust ja kartsinogeensust imetajatel pikaajalise ekspositsiooni korral.
      Sel juhul lisandub kartsinogeensuse uuringule veel vähemalt üks ravitav satelliitrühm ja kontrollsatelliitrühm. Annused, mida kasutatakse suuri annuseid saaval satelliitrühmal, võivad olla suuremad kui kartsinogeensuse uuringu suure annuse rühmas. Kartsinogeensuse uuringus olevaid loomi jälgitakse nii üldise toksilisuse kui ka kartsinogeense toime suhtes. Satelliitrühma loomi jälgitakse üldise toksilisuse suhtes.
      Uuritavat ainet antakse tavaliselt seitse päeva nädalas sobival manustamisviisil mitmele katseloomade rühmale. Igale rühmale ordineeritakse kindel uuritava aine annus ja seda manustatakse suurem osa nende loomade elueast. Aine manustamise ajal ja pärast seda jälgitakse katseloomi iga päev, et sedastada toksiliste mõjude tunnuseid ja kasvajate arengut.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Puuduvad.
      1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      Loomi hoitakse eksperimentaalsetes elamis- ja toitumistingimustes vähemalt viis päeva enne uuringut. Enne uuringu algust terved noored loomad randomiseeritakse ja määratakse uuritavat ainet saavatesse ning kontrollrühmadesse.
      1.6.1.   Katseloomad
      
      Eelistatud liigiks on rott. Võttes arvesse eelnevalt tehtud uuringute tulemusi, võib kasutada eelmistest katsetest erinevaid loomaliike (närilisi või mittenärilisi). Kasutada tuleb tavapäraste laboris kasvatatavate liinide noori terveid isendeid ja uuritava aine manustamine peaks algama võimalikult vara pärast võõrutamist.
      Uuringu alguses ei tohi katseloomade kaal erineda keskmisest kaalust enam kui ± 20 %. Kui pikaajalisele uuringule eelneb subkroonilise suukaudse manustamise uuring, tuleb mõlemal juhul kasutada sama loomaliiki/tõugu ja -liini.
      1.6.2.   Arv ja sugu
      
      Näriliste korral peab igas eri annust saavas rühmas ja samuti kontrollrühmas olema vähemalt 100 isendit (50 emast ja 50 isast). Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Kui plaanitakse vahepealset loomade surmamist, tuleb isendite arvu suurendada vastavalt selle arvu võrra, kui palju loomi kavatsetakse surmata enne uuringu täielikku lõpetamist.
      Ravitav satelliitrühm või -rühmad, keda kasutatakse uurimaks muid patoloogiaid peale kasvajate, peaksid sisaldama 20 looma kummastki soost ja satelliit kontrollgrupp peaks sisaldama 10 looma kummastki soost.
      1.6.3.   Annused ja ekspositsiooni sagedus
      
      Kartsinogeensuse uurimiseks peab lisaks kontrollgrupile kasutama vähemalt kolme erinevat annust saavat rühma. Kõige kõrgem annus peab esile kutsuma minimaalseid toksilisi mõjusid, näiteks kehakaalu juurdekasvu vähene pidurdumine (vähem kui 10 %), ilma et normaalset elukestust mõjutaks teised toimed peale kasvajate.
      Madalaim annus ei tohi häirida looma normaalset kasvu, arengut ja pikaealisust või tekitada vähimalgi määral toksilisi mõjusid. Tavaliselt ei tohi madalaim annus olla vähem kui 10 % suurest doosist.
      Vahepealne annus või vahepealsed annused tuleb valida suure ja väikse annuse väärtuste vahemiku keskelt.
      Annuste valimisel tuleb arvesse võtta eelmiste toksilisuse katsete ja uuringute andmeid.
      Kroonilise toksilisuse määramiseks haaratakse uuringusse lisa ravirühmad ja kaasuv satelliitkontrollgrupp. Suur annus ravitaval satelliitrühmal peaks kutsuma esile kindlaid toksilisuse ilminguid.
      Kokkupuude uuritava ainega peaks reeglipäraselt toimuma iga päev.
      Kui kemikaali manustatakse joogiveega või toidu hulka segatult, peavad need olema pidevalt kättesaadavad.
      1.6.4.   Kontrollrühm
      
      Kasutada tuleb kontrollrühma, mis on igas suhtes identne katserühmaga, erinedes vaid katseainega kokkupuute poolest.
      Teatud tingimustel, näiteks inhalatsiooniuuringute korral, mille puhul kasutatakse aerosoole, või suukaudse manustamise uuringute puhul, kui kasutatakse iseloomustamata bioloogilise aktiivsusega emulgaatorit, peab kasutama lisaks ühte kontrollrühma, milles loomad ei puutu kokku vehiikliga.
      1.6.5.   Manustamisviis
      
      Kolm peamist manustamisviisi on suukaudne, nahakaudne ja inhalatsioon. Valik sõltub katseaine füüsikalistest ja keemilistest omadustest ning aine võimalikust manustamisviisist inimestel.
      1.6.5.1.   Suukaudse manustamise uuringud
      Kui uuritav aine imendub mao-sooletraktist ja kui allaneelamine on üks võimalikest inimese ekspositsiooni viisidest, eelistatakse vastunäidustuste puudumisel suukaudset manustamist. Loomad võivad saada uuritavat ainet toiduga, lahustatuna joogivees või kapsliga.
      Ideaaltingimustes manustatakse uuritavat ainet iga päev seitse korda nädalas, sest viiepäevane manustamine võib lubada looma paranemist või toksiliste nähtude taandumist perioodil, kui uuritavat ainet ei manustata. See võib mõjutada tulemusi koos järgneva hinnanguga. Siiski, peamiselt praktilistel kaalutlustel peetakse ka viis päeva nädalas manustamist vastuvõetavaks.
      1.6.5.2.   Nahakaudse manustamise uuringud
      Nahakaudne manustamine, aine määrimine nahapinnale sobib juhul, kui soovitakse jäljendada selle aine peamist manustamisviisi inimesele ja koostatakse mudel järelduste tegemiseks nahakahjustuste kohta.
      1.6.5.2.   Inhalatsiooniuuringud
      Et inhalatsiooniuuringud kätkevad endas teiste manustamisviisidega võrreldes mitmeid keerukaid tehnilisi probleeme, on siin toodud detailsemad juhtnöörid selle meetodi kohta. Peab ka märkima, et intratrahheaalne tilgutamine võib olla üks arvestatavaid alternatiivseid meetodeid, et teatud olukordades ainet manustada.
      Pikemaajaline ekspositsioon on tavaliselt kavandatud, et jäljendada ekspositsiooni inimesel. Loomade ekspositsioon uuritavale ainega korraldatakse kas kuus tundi päevas viiel päeval nädalas pärast kambri kontsentratsioonide tasakaalustamist (seda nimetatakse vahelduvaks kokkupuuteks) või kasutatakse sarnaselt pidevale keskkonnamõjurile kokkupuute aega 22 kuni 24 tundi seitsmel päeval nädalas (katkematu kokkupuude). Viimasel juhul jääb üks tund päevas loomade söötmiseks, mis peaks toimuma samadel kellaaegadel, ja kambrite korrashoiuks. Mõlema skeemi korral eksponeeritakse loomi ettenähtud ainele kindlatel kontsentratsioonidel. Suurim erinevus vahelduva ja katkematu inhalatsiooniuuringu vahel on see, et esimesel jääb 17- või 18tunnine periood, mil loomad võivad taastuda ekspositsiooni mõjust ja nädalavahetustel on taastumisperiood veelgi pikem.
      Vahelduva või katkematu ekspositsiooni valik sõltub uuringu eesmärkidest ning inimesel kasutatavast manustamisviisist, mida tahetakse jäljendada. Siiski tuleb arvestada teatud tehnilisi raskusi. Näiteks katkematu ekspositsiooni eelised keskkonna tingimuste jäljendamiseks võivad saada vastulöögi tehniliste raskuste tõttu, sealhulgas söötmise ja jootmise vajadus ekspositsiooni ajal ning keerukamate (ja usaldusväärsemate) aerosool- ja aurugeneraatorite ning jälgimistehnika vajadus.
      1.6.6.   Ekspositsioonikambrid
      
      Katseloomad peavad olema inhalatsioonikambrites, mis on kavandatud nii, et võimaldavad dünaamilist õhuvoolu vähemalt 12 õhuvahetusega tunnis, selleks et kindlustada piisava hapniku ja ühtlaselt jaotunud katseaine sisaldus. Kontrollrühmale ja katserühmale mõeldud kambrid peavad olema ehituslikult ja disainilt samasugused, et tagada kõikides aspektides võrreldavad mõjustustingimused, välja arvatud katseainega kokkupuutumise faktoris. Kambris hoitakse vähene negatiivne rõhk, mis takistab katseaine väljaimbumist ümbritsevasse õhku. Katseloomade tunglemine kambrites peaks olema viidud miinimumini. Üldise reegli kohaselt, selleks et tagada kambri õhkkonna stabiilsus, ei tohi katseloomade kogumaht ületada 5 % kambrimahust.
      Kambrites tuleb teha järgmisi mõõtmisi või kontrolle:
      
                  i)
               
               
                  õhuvool: eelistatult tuleb õhuvoolu kiirust kambrites jälgida pidevalt;
               
            
                  ii)
               
               
                  kontsentratsioon: igapäevase ekspositsiooni ajal ei tohi uuritava aine kontsentratsioon erineda keskmisest väärtusest rohkem kui ± 15 %. Uuringu kestel tuleb aine kontsentratsioon hoida päevade lõikes võimalikult ühtlasena;
               
            
                  iii)
               
               
                  temperatuur ja niiskus: näriliste jaoks tuleb temperatuur hoida 22 ± 2 oC ja niiskus kambrites peab olema 30 % kuni 70 %, välja arvatud juhul, kui eksponeeritava aine viimiseks kambri atmosfääri kasutatakse vett. Soovitatavalt peaks mõlemat faktorit jälgima pidevalt;
               
            
                  iv)
               
               
                  osakeste suuruse mõõtmised: osakeste suuruse jaotumust tuleb kambrite atmosfääris määrata nii vedelates kui ka tahketes aerosoolides. Aerosoolpartiklid peavad olema katseloomadele sissehingamiseks sobiva suurusega. Kambri õhu analüüsid peavad olema võetud aladelt, kus loomad hingavad. Õhu analüüsid peavad iseloomustama nende osakeste jaotumust, millele katseloomi eksponeeritakse, ja neid tuleb aerosoolheljumites gravimeetriliselt analüüsida, isegi kui suur osa aerosoolist ei ole võimalik sisse hingata. Generaator-süsteemi väljatöötamisel tuleb sagedasti teha osakeste suuruse analüüse, et selgitada aerosooli stabiilsust. Edaspidi tuleb analüüse teha nii tihti kui vaja, et määrata adekvaatselt loomadele kokkupuuteks vajaliku aine partiklite jaotuvuse ühtlust.
               
            1.6.7.   Uuringu kestus
      
      Kartsinogeensuse uuringu kestus hõlmab tavaliselt suurema osa katseloomade elueast. Uuring peaks lõppema hiirtel ja hamstritel 18 kuu järel ja rottidel 24 kuu järel. Siiski, teatud pikemaealistel ja/või kasvaja madala spontaanse tekkimise kiirusega liinidel peaks uuring lõppema hiirtel ja hamstritel 24. kuul ja rottidel 30. kuul. Teine võimalus on lõpetada selline laiaulatuslik uuring juhul, kui ellujäänute arv madalaimat annust saanud loomarühmas või kontrollrühmas ulatub 25 %. Kui katset lõpetades ilmneb elusolevatel isendite hulgas väljendunud sooline erinevus, peab iga sugu analüüsima eraldi. Kui loomad surevad enneaegselt selgelt sedastatavate toksiliste nähtude tõttu ainult kõrge annusega uuringugrupis ja need toksilised mõjud ei põhjusta probleeme teistes gruppides, ei pruugi seetõttu uuringut lõpetada. Negatiivne uurimustulemus on vastuvõetav, kui mitte üheski grupis ei kaotatud katseajal üle 10 % isenditest autolüüsi, kannibalismi või hooldamise probleemide tõttu ja ühegi grupi elulemus ei ole vähem kui 50 % 18. kuul hiirte ja hamstrite kasutamisel ning 24. kuul rottide korral.
      Satelliitrühmad, milles on 20 looma kummastki soost koos vastavate kontrollidega (10 looma kummastki soost), peaksid jääma uuringusse vähemalt 12 kuuks. Need loomad tuleks plaanipäraselt surmata määramaks uuritava ainega seotud patoloogiat, ilma et seda komplitseeriks gerontoloogilised muutused.
      1.6.8.   Protseduur
      
      1.6.8.1.   Vaatlused
      
      Iga päev puuri juures tehtavad vaatlused peaksid hõlmama naha ja karvkatte, silmade ja limaskestade, aga ka hingamis-, vereringe- ning autonoomse ja tsentraalse närvisüsteemi muutusi, somatomotoorset aktiivsust ja käitumismustrit.
      Ravitava(te)sse satelliitrühma(desse) kuuluvaid loomi tuleks sobivate ajavahemike järel kliiniliselt uurida.
      Loomade regulaarne jälgimine on vajalik tagamaks niipalju kui võimalik, et loomad ei langeks katsest välja sellistel põhjustel nagu kannibalism, kudede autolüüs või loomade vale paigutus. Surnud loomad tuleb kohe eemaldada, surmata ja lahata.
      Kõikide loomade kliinilised andmed tuleb registreerida, sealhulgas neuroloogilised ja silmas toimuvad muutused, aga ka suremus. Erilist tähelepanu tuleb pöörata kasvajate tekkimisele: iga nähtava või palpeeritava tuumori puhul tuleb märkida märkamisaeg, lokalisatsioon, mõõtmed, väline kuju ja levik; samuti tuleb registreerida toksilise seisundi tekke ja progresseerumise aeg, samuti kasvajakahtlus.
      Toidu tarbimist (ja joogi tarbimist, kui katseaine manustatakse joogivee kaudu) hinnatakse igal nädalal uuringu esimesel kolmeteistkümnel nädalal ja seejärel ligikaudu kolmekuuliste intervallidega, kui loomade tervislik seisund või kehakaalu muutused ei nõua teisiti.
      Iga looma kehakaal tuleb registreerida eraldi korra nädalas katseperioodi esimesel kolmeteistkümnel nädalal ja seejärel vähemalt korra nelja nädala jooksul.
      1.6.8.2.   Kliinilised uuringud
      
      
         Hematoloogiline uuring
      
      Hematoloogiline uuring (näiteks hemoglobiini sisaldus, leukotsüütide absoluutarv, trombotsüütide arv või teised vere hüübimisvõimet peegeldavad näitajad) tuleks teha kolme kuu järel, kuue kuu järel ja seejärel umbes kuuekuuliste intervallidega ning uuringu lõpetamisel kõikidel loomadel mittenäriliste liikide puhul ja rottide puhul kümnel loomal kummaski soost igas rühmas. Kui võimalik, tuleks kõikidel ajamomentidel võtta analüüsid samadelt rottidelt.
      Kui kliiniliste vaatluste käigus ilmneb loomade tervisliku seisundi halvenemine, tuleks nendel loomadel teha vereanalüüs rakkude valemi loendamisega. Verevalem loendatakse suure annuse rühma ja kontrollrühma kuuluvate loomade vereanalüüsist. Järgmises madalama annusega grupis tuleb valem loendada ainult juhtudel, kui suure annuse rühma ja kontrollrühma vahel ilmnes oluline lahknemine või kui see on näidustatud patoloogiliste leidude tõttu.
      
         Uriinianalüüs
      
      Uriinianalüüsid võetakse kümnelt loomalt kummaski soost iga rühma kohta. Võimaluse korral tuleks analüüsid koguda samadelt rottidelt samade intervallidega nagu hematoloogiliseks uuringuks. Järgmised näitajad määratakse kas kõikidel loomadel eraldi või kokkusegatud proovist/soo/uuringurühma kohta:
      
                  —
               
               
                  välimus: maht ja tihedus igal loomal eraldi;
               
            
                  —
               
               
                  valk, glükoos, ketoonid, peiteveri (poolkvantitatiivselt);
               
            
                  —
               
               
                  sademe mikroskoopia (poolkvantitatiivselt).
               
            
         Kliiniline keemia
      
      Vereanalüüse kliinilise keemia uuringuteks võetakse umbes kuuekuulise intervalliga ja uuringu lõpetamisel kõikidelt loomadelt mittenäriliste liikide puhul ja kümnelt rotilt kummastki soost kõikides rühmades; võimaluse korral tuleks igal ajahetkel võtta analüüs samadelt loomadelt. Lisaks kogutakse mittenäriliste liikidel uuringu eelsed analüüsid. Proovidest eraldatakse plasma ja tehakse järgmised määramised:
      
                  —
               
               
                  valgu kontsentratsioon;
               
            
                  —
               
               
                  albumiini kontsentratsioon;
               
            
                  —
               
               
                  maksafunktsiooni näitajad (nagu alkaalse fosfataasi aktiivsus, glutamaadi püruvaattransaminaasi (4) aktiivsus, glutamaadi oksaloatsetaattransaminaasi (5) aktiivsus), gammaglutamüüli transpeptidaas, ornitiini dekarboksülaas,
               
            
                  —
               
               
                  süsivesikute metabolism, nagu näiteks tühja kõhu glükoos;
               
            
                  —
               
               
                  neerufunktsiooni näitajad, nagu vere uurea lämmastik.
               
            
         Lahang
      
      Lahang tehakse kõikidele loomadele, kaasa arvatud nendele, kes surid katseajal või surmati, kuna leiti suremas. Enne surmamist tuleb vererakkude valemi loendamiseks koguda vereproovid kõikidelt loomadelt. Säilitada tuleb kõik makroskoopiliselt nähtavad kasvajad või kasvaja kahtlased lesioonid. Tuleks püüda leida korrelatsiooni makroskoopiliste ja mikroskoopiliste leidude vahel.
      Kõik järgmised organid või koed tuleb säilitada vastavates keskkonnatingimustes võimalikeks hilisemateks histopatoloogilisteks uuringuteks: ajukude (7) (piklikaju/ajusild, väikeaju ja suuraju korteks), ajuripats, kilpnääre (sealhulgas kõrvalkilpnääre), harknääre, kopsud (koos trahheaga), süda, aort, süljenäärmed, maks, (7) põrn, neerud, (7) neerupealised, (7) söögitoru, magu, kaksteistsõrmiksool, tühi- ja niudesool, umbsool, jämesool, pärasool, emakas, kusepõis, lümfisõlmed, kõhunääre, suguorganid, (7) lisasugunäärmed, nahk, emasloomadel piimanäärmed, lihaskond, perifeerne närv, selja-aju kolmel tasandil (kaelaosa, keskmine rinnaosa ja nimmeosa), rinnak koos luuüdiga, reieluu koos liigesega ja silmad.
      Kopsude ja kusepõie parimaks säilitamiseks tuleb nad puhuda fikseerivat ainet täis; täispuhutud kopsud on inhalatsioonikatsete korral olulise tähtsusega korralikuks histopatoloogiliseks analüüsiks. Inhalatsiooniuuringute korral peab säilitama kogu hingamiselundkonna, sealhulgas ninaõõne, neelu ja kõri.
      Kui teostatakse teisi kliinilisi uuringud, peaks neist saadav informatsioon olema kättesaadav enne mikroskoopilisi uuringuid, sest need võivad anda patoloogile väärtuslikke juhtnööre.
      
         Histopatoloogiline uuring
      
      Kroonilise toksilisuse osa jaoks:
      kõigi säilitatud organite ja kudede detailne uuring tuleb teha suurt annust saavasse satelliitrühma ja kontrollrühma kuuluvatel loomadel. Kui suure annuse rühmas leitakse uuritava ainega seostatav patoloogia, tuleks kõikidesse teistesse ravi saavatesse satelliitrühmadesse kuuluvatel loomadel, samuti kartsinogeensuse uuringus olevatel loomadel, uuringu lõpetamisel teha selle organi detailne histoloogiline uuring.
      Kartsinogeensuse osa jaoks:
      
                  a)
               
               
                  täielik histopatoloogiline uuring tuleb teha kõikide uuringuperioodil surnud või surmatud loomade organitel ja kudedel ja kõikidel kontrollrühma ja suurt annust saanud rühma kuulunud loomadel;
               
            
                  b)
               
               
                  kõik selgelt nähtavad kasvajad või kasvajakahtlased kahjustused tuleb kõikides rühmades mikroskoopiliselt kontrollida;
               
            
                  c)
               
               
                  neoplastiliste kahjustuste olulise erinevuse korral kõrge annusega rühmas ja kontrollrühmas tuleb teistes rühmades teha vastava organi või koe histopatoloogiline uuring;
               
            
                  d)
               
               
                  kui suure annuse rühmas on elulemus märkimisväärselt madalam kui kontrollgrupil, tuleb täielik uuring teha madalama annuse rühmast järgmise grupi isenditele;
               
            
                  e)
               
               
                  kui esineb tõendeid, et kõrge annusega rühma loomadel on toksilisi või teisi nähtusid, mis võivad mõjutada neoplastilist reaktsiooni, tuleb täielik uuring teha madalama annusega rühmast järgmise rühma isenditele.
               
            2.   ANDMED
      Andmed tuleb esitada kokkuvõtlikus tabelis, näidates iga katsegrupi puhul loomade arvu katse alguses; isendite arvu, kellel ilmnevad katse ajal kasvajad või toksilisuse nähud; nende sedastamise aeg ja loomade arv, kellel pärast surmamist leiti kasvajaid. Tulemused tuleb hinnata sobiva statistilise meetodiga. Kasutada võib iga tunnustatud statistilist meetodit.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  loomaliik, liin, päritolu, keskkonnatingimused, dieet;
               
            
                  —
               
               katsetingimused:
                              3.1.1.
                           
                           
                              ekspositsiooniseadeldise kirjeldus:
                              tuleb märkida seadeldise disain, tüüp, mõõtmed, õhu lähteallikas, osakesi ja aerosoole tootev süsteem, õhu konditsioneerimise meetod, heitõhu töötlemine, loomade majutamise korraldus testkambrites, kui neid kasutatakse. Kirjeldada tuleb temperatuuri ja niiskuse mõõtmise vahendeid ning vajadusel aerosooli kontsentratsiooni stabiilsust ja osakeste suurust;
                           
                        
                              3.1.2.
                           
                           
                              andmed ekspositsiooni kohta:
                              Andmed tuleb esitada tabelina ja esitada keskmiste väärtustena ja variaabluse näitajatega (nt standarddeviatsioon). Andmete hulgas tuleb registreerida:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          õhuvoolu kiirused inhalatsiooniseadeldises;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          õhu temperatuur ja niiskus;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          kontsentratsioonid nominaalväärtustes (katseaine kogumaht, mis sisestatakse inhalatsiooniseadeldisse jagatud õhu mahuga);
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          vehiikli olemus, kui seda kasutatakse;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          tegelikud kontsentratsioonid katseajal loomade hingamise tsoonides;
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          keskmine osakeste suurus (vajaduse korral),
                                       
                                    
                        
            
                  —
               
               
                  annused (sealhulgas ülekandva aine annused, kui seda kasutatakse) ja kontsentratsioonid;
               
            
                  —
               
               
                  kasvaja esinemissageduse andmed vastavalt soole, annusele ja kasvaja tüüp;
               
            
                  —
               
               
                  surmaaeg uuringu ajal või kas loomad elasid kuni uuringu lõppemiseni;
               
            
                  —
               
               
                  toksilise mõju andmed soo ja annuste kaupa;
               
            
                  —
               
               
                  toksiliste või muude toimete kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  iga normist kõrvalekalduva sümptomi ilmnemise aeg ja edasine kulg;
               
            
                  —
               
               
                  oftalmoloogilised leiud;
               
            
                  —
               
               
                  andmed toidu ja kehakaalu kohta;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud hematoloogilised analüüsid ja kõik tulemused;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud kliinilise biokeemia analüüsid ja kõik tulemused (sealhulgas uriinianalüüs);
               
            
                  —
               
               
                  lahanguleiud;
               
            
                  —
               
               
                  histopatoloogiliste leidude detailne kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste statistiline analüüs koos statistiliste meetodite kirjeldusega;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste arutelu;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste tõlgendamine.
               
            3.2.   HINNANG JA TÕLGENDAMINE
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      4.   VIITED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      B.34.   ÜHE PÕLVKONNA REPRODUKTSIOONITOKSILISUSE UURING
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.2.   MÕISTED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritavat ainet manustatakse gradueeritud annustes mitmele isas- ja emasloomade rühmale. Isasloomadele tuleks ainet manustada kasvuperioodil ja vähemalt ühe täieliku spermatogeneesi tsükli (ligikaudu 56 päeva hiirel ja 70 päeva rotil) vältel, et võimaldada ükskõik milliste uuritava aine poolt tekitatavate ebasoovitavate kõrvalmõjude toimimist spermatogeneesile.
      Emasloomadele tuleks uuritavat ainet manustada vähemalt kahe täieliku innatsükli vältel, et võimaldada ükskõik milliste uuritava aine poolt tekitatavate ebasoovitavate kõrvalmõjude toimimist östrusele. Seejärel loomad paaritatakse. Uuritavat ainet manustatakse mõlemast soost loomadele paaritumisperioodi jooksul, seejärel ainult emasloomadele tiinuse ja imetamisperioodi vältel. Uuritava aine manustamiseks inhalatsioonina tuleb meetodit modifitseerida.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Puuduvad.
      1.6.   UURINGUMEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Ettevalmistused
      
      Enne uuringu algust jagatakse terved katseloomad juhuslikkuse alusel kontroll- ja katserühmadesse. Loomi peetakse eksperimentaalsetes söötmis- ja pidamistingimustes vähemalt viie päeva vältel enne uuringu algust. On soovitatav, et uuritavat ainet manustatakse söödas või joogivees. Teised manustamisviisid on samuti aktsepteeritavad. Kõigile loomadele tuleks manustada uuritavat ainet kogu katseperioodi vältel samal meetodil. Kui manustamise lihtsustamiseks kasutatakse vehiiklit või mõnda muud lisandit, peaks olema teada, et need ei oma toksilisi toimeid. Aine manustamine peaks toimuma kõigil seitsmel nädalapäeval.
      1.6.2.   Katseloomad
      
      Liikide valik
      Eelistatud liikideks on rott ja hiir. Kasutada tuleks terveid loomi, keda pole varem rakendatud mingites katseprotseduurides. Madala viljakusega liine ei tohiks kasutada. Katseloomi iseloomustatakse liigi, liini, soo, kaalu ja/või vanuse järgi.
      Viljakuse adekvaatseks hindamiseks tuleks uurida nii isas- kui emasloomi. Kõik katse- ja kontroll-loomad peaksid olema enne uuringu algust võõrutatud.
      Arv ja sugu
      Igas katse- ja kontrollrühmas peaks olema piisavalt loomi, et tulemuseks oleks umbes 20 lõpptiinet emaslooma.
      Eesmärgiks on piisava hulga tiinuste ja järglaste saamine, et kindlustada aine potentsiaalsete mõjude tähendusrikas hindamine viljakusele, tiinusele, emaslooma käitumisele P generatsioonis, imetamisele, ning F1 järglaste kasvule ja arengule viljastumisest suguküpsuseni.
      1.6.3.   Katsetingimused
      
      Sööta ja vett peaks katseloomadele võimaldama ad libitum. Poegimise lähenedes tuleks tiined emased paigutada eraldi poegimis- või pesapuuridesse, kuhu neile võib paigutada ka pesategemiseks sobivaid materjale.
      1.6.3.1.   Annused
      
      Uuringus tuleks kasutada vähemalt kolme katserühma ja kontrollrühma. Kui uuritava aine annustamiseks kasutatakse vehiiklit, tuleks seda kontrollrühmale manustada selle kõige suuremas kasutatavas koguses. Kui uuritav aine põhjustab söödatarbimise või söödakasutuse langust, võib osutuda vajalikuks paralleelselt söödetava kontrollrühma kasutamine. Ideaalselt, kui seda ei piira uuritava aine keemilised, füüsikalised või bioloogilised omadused, peaks kõrgeim doos põhjustama toksilisuse nähte, kuid mitte suremust vanemate (P) põlvkonna loomadel. Keskmine annus või annused peaksid põhjustama minimaalseid uuritavale ainele omistatavaid toksilisuse nähte ja madalaim annus ei tohiks põhjustada mingeid märgatavaid ebasoovitavaid uuritavale ainele omistatavaid toimeid ei vanematel ega järglastel. Kui manustamine toimub soni abil või kapslitena, peaks iga looma individuaalne annus põhinema tema kehamassil ja seda tuleks igal nädalal kohandada vastavalt kehakaalu muutustele. Emasloomade annus võib tiinuse ajal soovi korral põhineda nende kehamassil tiinuse 0- või 6. päeval.
      1.6.3.2.   Piirsisalduskatse
      
      Madala toksilisusega ainete puhul ei pruugi katsed teiste annustega vajalikuks osutuda, kui vähemalt 1 000 mg/kg annuse juures ei ilmne mingeid tunnuseid reproduktiivfunktsioonide häirumisest. Kui eelnevast uuringust suurte annuste tasemel, kindlate toksilisuse tunnustega emasloomal, ei nähtu mingeid ebasoovitavaid toimeid viljakusele, ei pruugi katsed teiste annustega vajalikuks osutuda.
      1.6.3.3.   Katse tegemine
      
      
         Katsegraafikud
      
      Uuritava aine igapäevast manustamist vanemate (P) põlvkonna isasloomadele tuleks alustada, kui nad on umbes viie kuni üheksa nädala vanused, pärast võõrutamist ja aklimatiseerimist vähemalt viie päeva vältel. Rottide puhul jätkatakse manustamist 10 nädala jooksul enne paaritamisperioodi (hiirte puhul 8 nädalat). Isasloomad tuleks hukata ja uurida pärast paaritusperioodi lõppu, või, teise võimalusena, võib isasloomi pidada katseratsioonil võimaliku teise pesakonna produtseerimiseni ning hukata ja uurida mingil ajaperioodil enne uuringu lõppu. Uuritava aine manustamine vanemate (P) põlvkonna emasloomadele peaks algama pärast vähemalt viie päeva pikkust aklimatisatsiooniperioodi ja vältama paaritamise eelselt vähemalt kaks nädalat. Uuritava aine igapäevane manustamine P emasloomadele peaks jätkuma kolmenädalase paaritumisperioodi, tiinuse ja imetamise vältel kuni F1 järglaste võõrutamiseni. Annustamisskeemi modifitseerimist tuleks kaaluda juhtudel, kui uuritava aine kohta on lisaandmeid, näiteks aine metabolismi või bioakumulatsiooni puudutavat teavet.
      
         Paaritusprotseduur
      
      Viljakust mõjutava toksilisuse uurimustes võib kasutada kas 1:1 (üks isane ühe emase kohta) või 1:2 (üks isane kahe emase kohta) paaritusi.
      1:1 paaritusel korral tuleks üks emane panna kokku sama isasega kuni tiinuse ilmnemise või kolme nädala möödumiseni. Igal hommikul tuleks emasloomi uurida sperma või tupekorkide avastamiseks. Tiinuse 0-päevaks loetakse päeva, mil leitakse sperma või tupekork.
      Katseloomi, kes ei paaritu, tuleks uurida eeldatava viljatuse põhjuste kindlaks tegemiseks.
      See võib hõlmata selliseid protseduure, nagu lisavõimalused paaritumiseks teiste tõestatud viljakusega emas- või isasloomadega, suguorganite mikroskoopiline uurimine ja innatsüklite või spermatogeneesi uurimine.
      
         Pesakondade suurused
      
      Viljakuse uurimuses kasutatavatel loomadel võimaldatakse poegida normaalsel viisil ja kasvatada järglasi kuni võõrutamiseni ilma pesakondade standardiseerimiseta.
      Kui kasutatakse standardiseerimist, on soovitav rakendada allpool toodud protseduuri. 1. ja 4. poegimisjärgse päeva vahel võib iga pesakonna suurust korrigeerida, eemaldades valikuliselt liigsed pojad nii, et tulemuseks oleks võimalikult täpselt neli emast ja neli isast pesakonna kohta.
      Kui emaste või isaste poegade arv ei võimalda koostada pesakonda neljast kummastki soost pojast, on sobiv ka osaline korrigeerimine (nt viis isast ja kolm emast). Korrigeerimine ei ole kohaldatav pesakondadele, kus on vähem kui kaheksa poega.
      1.6.4.   Jälgimine
      
      Kogu uurimisperioodi vältel tuleks katseloomi jälgida vähemalt kord päevas. Registreerida tuleks asjakohased käitumise muutused, raske või pika poegimise tunnused ja kõik toksilisusele viitavad tunnused, sealhulgas suremus. Paaritamiseelse ja paaritamisperioodi vältel tuleks söödatarbimist mõõta kord nädalas. Soovi korral võib tiinuse jooksul iga päev mõõta söödatarbimist. Pärast poegimist ja imetamise jooksul tuleks söödatarbimist mõõta samal päeval, kui toimub pesakondade kaalumine. P emaseid ja isaseid loomi tuleks kaaluda annustamise esimesel päeval ja seejärel kord nädalas. Need tähelepanekud tuleks registreerida iga looma kohta individuaalselt.
      Tiinusperioodi kestus tuleks arvutada tiinuse 0-päeva aluseks võttes. Iga pesakonda tuleks pärast sündi võimalikult ruttu uurida, et teha kindlaks poegade arv ja sugu, surnultsünnid, elussünnid ja tugevate kõrvalekallete olemasolu.
      Surnud ja 4. päeval hukatud pojad tuleks säilitada ja uurida võimalike defektide avastamiseks. Elusad pojad tuleks loendada ja pesakonnad kaaluda sünnijärgsel hommikul, 4. ja 7. päeval ja seejärel kord nädalas kuni uuringu lõpuni, mil loomi kaalutakse individuaalselt.
      Emasloomal ja poegadel täheldatud käitumuslikud või füüsilised kõrvalekalded tuleb registreerida.
      1.6.5.   Patoloogia
      
      1.6.5.1.   Lahang
      
      Pärast surma või hukkamist tuleks kõiki P generatsiooni loomi mikroskoopiliselt uurida tuvastamaks mistahes ehituslikke kõrvalekaldeid või patoloogilisi muutusi, pöörates erilist tähelepanu sigimisorganitele. Surnud või surevaid poegi tuleks uurida defektide tuvastamiseks.
      1.6.5.2.   Histopatoloogia
      
      Kõigi P generatsiooni katseloomade munasarjad, emakas, emakakael, tupp, munandid, munandimanused, seemnepõied, teised lisasugunäärmed, eesnääre, hüpofüüs ja sihtorgan(id) tuleb säilitada mikroskoopiliseks uurimiseks. Juhul, kui neid organeid pole uuritud teistes hulgiannustega uuringutes, tuleks neid mikroskoopiliselt uurida kõigil suurimat annust saanud ja kontrollrühma loomadel, paaritamiseks valitud loomadel, ja kui see on teostatav, siis ka loomadel, kes surid uuringu vältel.
      Kõrvalekallete avastamisel organites, tuleks samu organeid uurida ka teistesse annuserühmadesse kuulunud loomadel. Nendel juhtudel tuleks mikroskoopiline uurimine läbi viia kõigi kudede puhul, milles ilmnevad makroskoopilised patoloogilised muutused. Nagu on soovitatud alajaotuses „Paaritusprotseduur”, võib mikroskoopilisele uurimisele allutada ka sigimatuses kahtlustatavate katseloomade sigimisorganid.
      2.   ANDMED
      Andmed tuleks võtta kokku tabeli vormis, näidates iga katserühma kohta loomade arvu uuringu alguses, tiinete loomade arvu, muutuste tüübi ja iga tüüpi muutuse puhul nende loomade suhtarv, kellel see esines.
      Võimaluse korral tuleks arvuliste tulemuste hindamiseks kasutada sobivat statistilist meetodit. Kasutada võib ükskõik millist üldiselt aktsepteeritud statistilist meetodit.
      3.   ARUANDLUS
      KATSEARUANNE
      Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  kasutatud liik/liin;
               
            
                  —
               
               
                  toksilise mõju andmed soo ja annuste kaupa, kaasa arvatud viljakuse, tiinuse ja elulemuse indeksid;
               
            
                  —
               
               
                  surmaaeg uuringu ajal või kas loomad elasid kuni uuringu lõpetamiseni;
               
            
                  —
               
               
                  tabelina esitatud iga pesakonna kaal, poja keskmine kehamass ja poegade individuaalsed kehamassid hukkamisel;
               
            
                  —
               
               
                  toksilised või muud mõjud sigivusele, järglastele ja sünnijärgsele kasvule;
               
            
                  —
               
               
                  iga kõrvalekalde täheldamise päev ja selle edasine areng;
               
            
                  —
               
               
                  paaritamiseks valitud P loomade kehamassi andmed;
               
            
                  —
               
               
                  lahanguleiud;
               
            
                  —
               
               
                  kõigi mikroskoopiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste statistiline töötlus, vajaduse korral;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste arutelu;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste tõlgendamine.
               
            3.2.   HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      4.   VIITED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      B.35.   KAHE PÕLVKONNA REPRODUKTSIOONI TOKSILISUSE UURING
      1.   MEETOD
      Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 416 (2001).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesolev kahe põlvkonna reproduktsiooni uurimise meetod on välja töötatud selleks, et pakkuda üldist teavet katseaine mõjude kohta isas- ja emasloomade reproduktiivsüsteemide rikkumatusele ja toimimisele, kaasa arvatud sugunäärmete funktsioonile, innatsüklile, paaritumiskäitumisele, viljastumisele, tiinusele, poegimisele, imetamisele ja võõrutamisele, ning teavet järglase kasvu ja arengu kohta. Uurimus võib pakkuda teavet ka katseaine mõjude kohta vastsündinu haigestumisele, suremusele ning anda esialgseid andmeid sünnieelse ja sünnijärgse arengutoksilisuse kohta ja võib juhendada järgmiste katsete tegemist. Lisaks F1-põlvkonna kasvu ja arengu uurimisele on käesolev katsemeetod samuti mõeldud nii F2-põlvkonna isas- ja emasloomade reproduktiivsüsteemide rikkumatuse ja toimimise kui ka kasvu ja arengu hindamiseks. Arengutoksilisust ja funktsionaalseid puudujääke käsitleva täiendava teabe puhul saab käesolevasse protokolli lisada kas täiendavaid osauurimusi, vajadusel pidada nõu arengutoksilisust ja/või arenguga seotud neurotoksilisust käsitlevate meetodite üle või saab neid lõpp-punkte uurida eraldi uurimustes, kasutades sobivaid katsemeetodeid.
      1.2.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Katseainet manustatakse gradueeritud annustena mitmetele isas- ja emasloomade rühmadele. P-põlvkonna isasloomadele tuleks annustada kasvu ajal ja vähemalt ühe täieliku spermatogeneesi tsükli jooksul (hiirtel ligikaudu 56 päeva ja rottidel 70 päeva), et tekitada spermatogeneesile kahjulikke mõjusid. Mõju spermale määratakse kindlaks mitmete spermaparameetrite (nt sperma morfoloogia ja liikuvus) ning koepreparaatide ja üksikasjalike histopatoloogiliste uurimuste abil. Kui spermatogeneesi käsitlevad andmed on olemas varasemast, korduvaid annuseid kasutavast uurimusest, mille kestus on piisav, nt 90päevane uurimus, ei ole vaja lisada hindamisse P-põlvkonna isasloomi. On siiski soovitav, et P-põlvkonna spermaproove või digitaalseid salvestusi säilitatakse hilisema hindamise tarbeks. P-põlvkonna emasloomadele tuleks annustada katseainet kasvu ajal ja mitme täieliku innatsükli käigus, et tuvastada katseaine võimalikud kahjulikud mõjud tavapärasele innatsüklile. Katseainet manustatakse järglaste vanematele (P) nende paaritumise ajal, tiinuste ajal ja kuni F1-järglase võõrutamiseni. Võõrutamise ajal jätkatakse aine manustamist F1-järglastele ajal, mil nad arenevad täiskasvanuteks, paaritumise ajal ja F2-põlvkonna poegimise järel kuni võõrutamiseni.
      Kliinilisi vaatlusi ja patoloogilisi uuringuid viiakse läbi kõikidel loomadel mürgisuse sümptomite tuvastamiseks, eriline tähelepanu on mõjudel isas- ja emasloomade reproduktiivsüsteemide rikkumatusele ja toimimisele ning järglase kasvule ja arengule.
      1.3.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.3.1.   Loomaliikide valik
      Eelistatud loomaliik on rott. Kui kasutatakse muid liike, tuleks seda põhjendada ja asjaomased mugandused on vajalikud. Liine, kellel on madal sigivus või kellel teatakse olevat arenguhäireid, ei tohiks kasutada. Uuringut alustades peaks loomade massi muutus olema minimaalne ja ei tohiks ületada 20 % kummagi soo keskmisest massist.
      1.3.2.   Loomade pidamise ja toitmise tingimused
      Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 oC (± 3o). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt ei tohiks ületada 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal, siis eesmärgiks on hoida see vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust.. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega. Toiduvalikut võib mõjutada vajadus tagada katseaine sobiv lisamine, kui katseainet manustatakse käesoleva meetodi abil.
      Loomi võib hoida eraldi või väikestes, samast soost loomade rühmades. Paaritumine peab toimuma selleks ettenähtud puurides. Kui võib tõdeda, et suguühe on toimunud, pannakse paaritunud emasloomad oma poegimis- või poegimispuuridesse. Paaritunud rotte võib samuti pidada väikestes rühmades ja eraldatakse üksteisest üheks või kaheks päevaks enne sünnitamist. Paaritunud loomadele antakse sünnituse lähenedes sobivad ja kindlaksmääratud pesapunumismaterjalid.
      1.3.3.   Loomade ettevalmistamine
      Tuleks kasutada terveid täiskasvanud loomi, keda on harjutatud laboritingimustega vähemalt 5 päeva ja keda ei ole varem katsetes kasutatud. Katseloomade liik, liin, päritolu, sugu, kaal ja/või vanus on äratuntavad. Teadma peaks õe-venna suhteid loomade vahel, et vältida õdede-vendade paaritamist. Loomad määratakse juhuvaliku teel kontroll- ja katserühmadesse (kihistamine kehamassi järgi on soovitav). Puurid asetatakse nii, et puuri asetamisest tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Igale loomale tuleks anda ainulaadne tunnusnumber. P-põlvkonna puhul tuleks seda teha enne annustamise algust. F1-põlvkonna puhul tuleks seda teha paaritumiseks valitud loomade võõrutamisel. F1-sugupõlve kõikide valitud loomade puhul säilitatakse andmed pesakonna kohta, millest nad pärit on. Lisaks sellele soovitatakse identifitseerida pojad individuaalselt nii ruttu pärast sündi kui võimalik, kui poegi kaalutakse või tehakse muid funktsionaalseid katseid.
      P-põlvkonna vanemad on ligikaudu 5–9 nädalat vanad annustamise alguses. Kõikide katserühmade loomad peaksid niipalju kui võimalik olema ühesuguse kaalu ja vanusega.
      1.4.   KATSE KÄIK
      1.4.1.   Loomade arv ja sugu
      Igas katse- ja kontrollrühmas on piisav arv loomi, et katsesse saadakse eelistatult mitte vähem kui 20 tiinet emaslooma, kes on poegimas või hakkavad varsti poegima. Ainete puhul, mis põhjustavad käsitlemisega seotud soovimatuid mõjusid (nt steriilsus, liigne mürgisus suure annuse juures), ei ole see võimalik. Eesmärgiks on luua piisavalt tiinuse juhtumeid, et kindlustada sellise aine tähendusrikas hindamine, millel on võime mõjutada viljakust, tiinust ja ema käitumist ning imetamist, F1-järglase kasvu ja arengut viljastumisest kuni suguküpseks saamiseni ning nende järglaste (F2) arengut kuni võõrutamiseni. Seetõttu, kui ei saada soovitud arvu tiineid loomi (s.t 20 looma), ei tähenda see, et katse on ilmtingimata invaliidne. Katse valiidsust hinnatakse iga üksikjuhtumi puhul eraldi.
      1.4.2.   Dooside valmistamine
      On soovitav, et katseainet manustatakse suu kaudu (toidu ja joogivee kaudu või sondi abil), välja arvatud juhul, kui muud manustamisviisi (nt naha kaudu või sissehingamine) peetakse sobivamaks.
      Vajadusel lahustatakse või suspendeeritakse katseaine sobivas kandeaines. On soovitav, et võimaluse korral kaalutakse esmalt vesilahuse/-suspensiooni kasutamist, seejärel õlilahuse/-emulsiooni (nt maisiõli) kasutamist ja siis võimalikku muude kandealuste lahust. Veest erinevate kandeainete puhul peaks kandeaine toksikoloogilised omadused teada olema. Katseaine stabiilsus kandeaines määratakse kindlaks.
      1.4.3.   Annustamine
      Tuleks kasutada vähemalt kolme annusemäära ja samaaegset kontrolli. Kui katseaine füüsikalis-keemiline laad või bioloogilised mõjud ei sea piiranguid, valitakse suurim annusemäär selliselt, et põhjustab mürgisust, kuid ei põhjusta surma ega raskeid kannatusi. Ootamatu suremuse korral on tavaliselt siiski aktsepteeritavad sellised uuringud, milles P-sugupõlve vanemate suremus on ligikaudu alla 10 %. Tuleks valida annusemäärade alanev järjestus, et näidata annusega seotud reaktsiooni ja täheldamata kahjuliku mõju taset (NOAEL). Kahe- või neljakordsed vahemikud on sageli optimaalsed alanevate annusemäärade kehtestamisel ja sageli on eelistatud neljanda katserühma lisamine väga suurte vahemike (nt üle kümnekordne tegur) annuste vahel. Toitumisuuringute puhul ei tohiks annuste vahemik olla mitte suurem kui kolmekordne. Annusemäärad tuleks valida varasemaid mürgisust käsitlevaid andmeid, eriti annuseid käsitlevate kordusuuringute tulemusi arvesse võttes. Mis tahes kättesaadavat teavet metabolismi ja katseühendi või sellega seotud ainete kineetika kohta tuleks samuti arvesse võtta. Selline teave aitab samuti viidata sellele, et annustamisrežiim on adekvaatne.
      Kontrollrühmaks on rühm, kellega katseid ei tehta, või kandeainet saav kontrollrühm, kui kandeainet kasutatakse katseaine manustamisel. Kontrollrühma loomi käsitletakse sarnaselt katserühma loomadega, kuid neile ei anta uuritavat ainet. Kui kasutatakse kandeainet, saab kontrollrühm kandeainet suuremas mahus. Kui katseainet manustatakse toidu kaudu ja seetõttu väheneb toidu võtmine või ärakasutamine, siis võib pidada vajalikuks paariskontrollrühma kasutamist. Teise võimalusena võib kasutada samaaegsete paariskontrollrühmade asemel andmeid, mis on saadud sellistest kontrollitud uuringutest, mis on välja töötatud selliste mõjude hindamiseks, mille on vähenenud toidutarbimine põhjustanud reproduktiivsetele parameetritele.
      Arvesse võetakse kandeaine ja muude lisandite järgmiseid omadusi: katseaine absorbtsiooni, jaotamist, metabolismi või peetumist käsitlevad mõjud; katseaine keemilisi omadusi käsitlevad mõjud, mis võivad muuta toksilisi omadusi; ning toidu- või veetarbimist või toitumust käsitlevad mõjud.
      1.4.4.   Piirsisalduskatse
      Kui suukaudne uuring ühe annusemääraga, mis on vähemalt 1 000 mg kg kehamassi kohta päevas või vastav protsendimäär toidus või joogivees, kui manustatakse toidu või joogivee kaudu, kasutades käesolevas uuringus kirjeldatud protseduure, ei tekita täheldatavaid toksilisi mõjusid vanematele või nende järglastele ja kui mürgisus eeldatavasti ei põhine struktuurselt ja/või metaboolselt sarnaste ühendite kohta käivatel andmetel, siis ei peeta vajalikuks täieliku uuringu tegemist, kus kasutatakse mitmeid annusemäärasid. Piirsisalduskatset kohaldatakse, välja arvatud siis, kui inimese kokkupuude viitab vajadusele kasutada suuremat suukaudset annusemäära. Muude manustamisviiside korral, nagu näiteks sissehingamine või naha kaudu manustamine, võivad katseaine füüsikalis-keemilised omadused nagu lahustuvus tihti viidata suurimale kokkupuutetasemele ja seada sellele piiranguid.
      1.4.5.   Annuste manustamine
      Loomadele annustatakse katseainet 7 päeva nädalas. Eelistatakse suukaudset manustamist (toit, joogivesi või sond). Kui kasutatakse muud manustamisviisi, tuleks seda põhjendada ning asjaomased muudatused võivad osutuda vajalikuks. Kõikidele loomadele annustatakse ainet sama meetodi järgi asjaomase katseperioodi jooksul. Kui katseainet manustatakse sondi abil, tehakse seda läbi söögitoru. Korraga manustatava vedeliku maht ei ületa 1 ml 100 g kehamassi kohta (0,4 ml 100 g kehamassi koha on maksimum maisiõli puhul), välja arvatud vesilahuste puhul, kui võib kasutada 2 ml 100 g kehamassi kohta. Välja arvatud ärritavad või söövitavad ained, mille mõjud tavaliselt teravnevad suuremate kontsentratsioonide korral, tuleks vähendada katses kasutatavate mahtude varieeruvust, reguleerides kontsentratsioone nii, et kogumaht kõikide annuste korral jääks samaks. Sundsöötmisega seotud uuringutes saavad pojad tavaliselt katseainet üksnes kaudselt piimast, vahetu annustamine algab nende jaoks võõrutuse ajal. Toidu või joogiveega seotud uuringutes saavad pojad täiendavalt katseainet vahetult, kui nad hakkavad ise sööma imetamisperioodi viimasel nädalal.
      Toidu või joogivee kaudu manustatud ainete puhul on oluline tagada, et hõlmatud katseaine kogused ei häiriks tavapärast toitumist või veetasakaalu. Kui katseainet manustatakse toidus kas püsiva toidukontsentratsioonina (ppm) või võidakse kasutada püsivat annusemäära looma kehamassi suhtes, siis tuleb täpsustada kasutatud alternatiivi. Sondi kaudu manustatud aine puhul tuleks annus anda samal kellaajal iga päev ja kohandada vähemalt igal nädalal, et säilitada konstantset annusemäära looma kehamassi suhtes. Sondiannuse kohandamisel kaalu järgi tuleks arvesse võtta teavet katseaine platsenta kaudu levimise kohta.
      1.4.6.   Katsete ajakava
      P-põlvkonna isas- ja emasloomade puhul algab igapäevane annustamine siis, kui nad on 5–9 nädalat vanad. F1-isas- ja emasloomade puhul algab igapäevane annustamine võõrutamise ajal, tuleb meeles pidada, et katseaine toidu või joogivee kaudu manustamise korral võib toimuda F1-põlvkonna poegade vahetu kokkupuude katseainega juba imetamise ajal. Mõlema soo puhul (P ja F1) jätkatakse annustamist vähemalt 10 nädalat enne paaritamist. Annustamist jätkatakse mõlemast soost loomade puhul kahenädalase paaritumisperioodi jooksul. Isasloomad surmatakse humaanselt ja uuritakse neid siis, kui neid ei ole enam vaja reproduktiivsuse mõjude hindamiseks. P-põlvkonna emasloomade puhul jätkatakse annustamist kogu tiinuse aja ja kuni F1-järglaste võõrutamiseni. Arvesse tuleks võtta muudatusi annustamise ajakavas, mis põhinevad katseaine, sh varasematel mürgisuse, metabolismi või bioakumulatsiooni tekke kohta käivatel kättesaadavatel andmetel. Iga looma annus peab tavaliselt põhinema looma kõige viimase individuaalse kehamassi kindlaksmääramisel. Annuse määramisel tuleks siiski olla ettevaatlik tiinuse viimasel trimestril.
      P- ja F1-põlvkonna isas- ja emasloomade käsitlemist jätkatakse kuni surmamiseni. Kõik P- ja F1-põlvkonna täiskasvanud isas- ja emasloomad surmatakse humaanselt, kui neid enam ei vajada reproduktiivsuse mõjude hindamiseks. F1-järglased, keda ei ole valitud paaritumiseks, ning kõik F2-järglased surmatakse humaanselt pärast võõrutamist.
      1.4.7.   Paaritumisprotseduur
      1.4.7.1.   P-põlvkonna paaritumine
      Iga paaritumise korral pannakse emasloom ühte puuri ühe sama annusemääraga isasloomaga (1:1 paaritumine) kuni suguühte toimumiseni või kaheks nädalaks. Iga päev uuritakse emasloomadel sperma või tupekorgi olemasolu. Tiinuse 0. päevaks peetakse päeva, mil leitakse tupekork või sperma. Kui paaritumine ei õnnestunud, saab kaaluda emaslooma uuesti paaritamist sama rühma viljakaks peetava isasloomaga. Paarituvad paarid tuleks selgesti andmetes ära näidata. Õdede-vendade paaritumist tuleks vältida.
      1.4.7.2.   F1-põlvkonna paaritumine
      F1-järglaste paaritumise korral valitakse vähemalt üks isasloom ja üks emasloom võõrutamise ajal igast pesakonnast paaritumiseks muude sama annusemääraga, kuid erinevast pesakonnast poegadega, et sünniks F2-põlvkond. Poegade valimine igast pesakonnast peaks olema juhuslik, kui poegade kehamassis või välimuses olulisi erinevusi ei ole täheldatud. Juhul kui on täheldatud nimetatud erinevusi, valitakse iga pesakonna parimad esindajad. Pragmaatiliselt on seda kõige parem teha kehamassi põhjal, kuid seda võib teha ka välimuse põhjal. F1-järglasi ei paaritata enne, kuni nad on saanud täiesti suguküpseks.
      Poegimata paare tuleks hinnata, et kindlaks määrata viljatuse näiv põhjus. See võib hõlmata selliseid protseduure nagu lisavõimalused paaritumiseks muude viljakaks peetavate isade või emadega, suguelundite mikroskoopiline uurimine ning innatsüklite või spermatogeneesi uurimine.
      1.4.7.3.   Teine paaritumine
      Teatavatel juhtudel, nagu käsitlemisega seotud muutused pesakonna suuruses või ebaselge mõju täheldamine esimesel paaritumisel, on soovitav, et P- või F1-sugupõlve täiskasvanud loomad paarituksid uuesti teise pesakonna saamiseks. On soovitav uuesti paaritada emas- ja isasloomi, kellel ei ole varem pesakonda olnud, viljakaks peetavate erinevast soost loomadega. Kui teise pesakonna saamist peetakse mõlemas põlvkonnas vajalikuks, tuleks loomad uuesti paaritada ligikaudu nädal pärast eelmise pesakonna võõrutamist.
      1.4.7.4.   Pesakonna suurus
      Loomadel lubatakse poegida tavaliselt ja kasvatada järglased üles kuni võõrutamiseni. Pesakonna suuruse ühtlustamine ei ole kohustuslik. Kui seda on ühtlustatud, tuleks üksikasjalikult kirjeldada kasutatud meetodit.
      1.5.   VAATLUSED
      1.5.1.   Kliinilised vaatlused
      Iga päev tuleks teha üldine kliiniline vaatlus ja sondi kaudu annustamise korral peaks selle ajastamisel arvesse võtma mõjude oodatavat kõrghetke pärast annustamist. Käitumise muutused, raske või pikaleveninud poegimise märgid ja kõik mürgisuse tunnused tuleks registreerida. Üksikasjalikum lisauuring iga looma kohta tuleks teostada vähemalt iga nädal ja kõige parem oleks seda teha siis, kui looma kaalutakse. Kõiki loomi tuleks jälgida haigestumise ja suremuse osas kaks korda päevas ja vajadusel nädalavahetusel kord päevas.
      1.5.2.   Poeginud loomade kehamass ja toidu/vee tarbimine
      P- ja F1-põlvkonna poeginud loomi kaalutakse annustamise esimesel päeval ja seejärel vähemalt kord nädalas. Poeginud emasloomi (P-ja F1-põlvkond) kaalutakse vähemalt tiinuse 0-, 7., 14. ja 20. või 21. päeval ning imetamise ajal samadel päevadel poegade kaalumisel ja loomade surmamispäeval. Nimetatud vaatlustest tuleks teatada ükshaaval iga täiskasvanud looma kohta. Paaritumisele eelneval ajal ja tiinusperioodil mõõdetakse toidu tarbimist vähemalt iga nädal. Vee tarbimist mõõdetakse vähemalt iga nädal, kui katseainet manustatakse vees.
      1.5.3.   Innatsükkel
      Innatsükli pikkuse ja normaalsust hinnatakse P- ja F1-põlvkonna emasloomadel tupeäiete abil enne paaritumist ja valikuliselt paaritumise ajal, kuni leitakse tõendeid paaritumise toimumise kohta. Tupe-/emakakaelarakke võttes tuleks olla ettevaatlik, et vältida limaskesta kahjustamist ja seejärel pseudotiinuse teket (1).
      1.5.4.   Spermaparameetrid
      Kõikide P- ja F1-põlvkonna isasloomade surmamisel registreeritakse munandite ja munandimanuse mass ning üks kummastki elundist säilitatakse histopatoloogiliseks uurimiseks (vt punkte 1.5.7, 1.5.8.1). P- ja F1-põlvkonna igast rühmast eraldatakse vähemalt kümne isaslooma suurune osarühm, allesjäänud munanditest ja munandimanustest loendatakse homogeenimisele resistentsed spermatiidid ja munandimanuse sabas säilinud sperma hulk. Sama osarühma isasloomade puhul tuleks koguda munandimanuse sabas või seemnejuhas olev sperma liikuvuse ja sperma morfoloogia hindamiseks. Kui täheldatakse käsitlemisega seotud mõjusid või kui on tõendeid muude uuringute võimalike mõjude kohta spermatogeneesile, tuleks hinnata iga annusrühma kõikide isasloomade spermat; vastasel juhul võib loendamine piirduda kontrollrühma ning suure annusega rühma P- ja F1-põlvkonna isasloomadega.
      Homogeenimisele resistentsete munandites olevate spermatiidide ja munandimanuse sabas oleva sperma koguhulk tuleks arvutada (2, 3). Munandimanuse sabas säilinud seemnerakkude arv võib lähtuda kvalitatiivseteks hindamisteks kasutatud suspensioonis olevate seemnerakkude kontsentratsioonist ja mahust ning järelejäänud munandimanuse sabakoe jahvatamisel ja/või homogeenimisel saadud seemnerakkude arvust. Arvutamised tuleks teha kõikide valitud isasloomade osarühmade kõikides annuserühmades pärast loomade surmamist, välja arvatud juhul, kui tehakse video- või digitaalsalvestusi või kui proovid külmutatakse ja analüüsitakse hiljem. Sellistel juhtudel võib esmalt analüüsida kontrollrühma ja suure annusega rühma. Kui käsitlemisega ei kaasne mõjusid (nt mõjud seemnerakkude arvule, sperma liikuvusele ja morfoloogiale), ei ole vaja analüüsida muid annuserühmasid. Kui on täheldatud käsitlemisega kaasnevaid mõjusid, siis tuleks samuti hinnata väiksema annusega rühmasid.
      Munandimanuse (või seemnejuha) sperma liikuvust tuleks hinnata või videosalvestada kohe pärast surmamist. Sperma tuleks koguda, minimiseerides kahju, ning lahjendada liikuvusanalüüsi jaoks vastuvõetavaid meetodeid kasutades (4). Progressiivselt liikuva sperma protsendimäär tuleks kindlaks määrata kas subjektiivselt või objektiivselt. Kui arvutipõhine liikuvusanalüüs sooritatakse (5, 6, 7, 8, 9, 10), sõltub progressiivne liikumine kasutaja määratud keskmise liikumiskiiruse ja otsesuse künnisest või lineaarsest indeksist. Kui proove filmitakse (11) või kujundid salvestatakse muul moel lahangu ajal, võib jätkuanalüüsi teha üksnes kontrollrühma ja suure annusega rühma P- ja F1-põlvkonna isasloomadega, välja arvatud juhul, kui täheldatakse käsitlemisega kaasnevaid mõjusid; sellisel juhul tuleks samuti hinnata väikese annusega rühmasid. Video- või digitaalpildi puudumisel tuleks analüüsida kõikide katserühmade kõiki proove lahangu ajal.
      Munandimanuse (või seemnejuhade) spermaproovi tuleks morfoloogiliselt hinnata. Spermat (vähemalt 200 seemnerakku proovi kohta) tuleks uurida fiksatiiviga käsitletud märgpreparaatidena (12) ja liigitada kas tavaliseks või ebatavaliseks. Morfoloogiliste sperma kõrvalekallete näidete hulka kuuluvad kokkusulamine, isoleeritud pead ning peade ja/või sabade ebamoodustised. Hinnata tuleks kõikidest annuserühmadest valitud isasloomade osarühma kas vahetult pärast loomade surmamist või video- ja digitaalsete salvestuste põhjal hiljem. Äigeid, mis on juba fikseeritud, võib uurida hiljem. Sellistel juhtudel võib esmalt analüüsida kontrollrühma ja suure annusega rühma. Kui käsitlemisega ei kaasne mõjusid (nt mõjud sperma morfoloogiale), ei ole vaja analüüsida muid annuserühmasid. Kui on täheldatud käsitlemisega kaasnevaid mõjusid, siis tuleks samuti hinnata väiksema annusega rühmasid.
      Kui mõnda eespool nimetatud sperma hindamisparameetritest on juba uuritud süsteemse toksilisuse uuringu osana vähemalt 90 päeva, ei ole neid vaja tingimata korrata kahe põlvkonna uuringus. On siiski soovitav, et P-põlvkonna spermaproovid või digitaalsed salvestused säilitatakse hilisema hindamise tarbeks.
      1.5.5.   Järglane
      Iga pesakonda uuritakse nii ruttu kui võimalik pärast poegimist (imetamise 0-päev), et kindlaks määrata poegade arv ja sugu, surnult sünnid, elussünnid ja kõikide anomaaliate olemasolu. 0-päeval surnult leitud poegi (kui nende laibad on leotamata) tuleks soovitavalt uurida võimalike defektide ja surmapõhjuse osas ning laibad tuleks säilitada. Elusad pojad tuleks kokku lugeda ja ükshaaval kaaluda sünni hetkel (imetamise 0-päev) või 1. päeval, ning seejärel regulaarsetel kaalumispäevadel, nt imetamise 4., 7., 14. ja 21. päeval. Füüsilised või käitumuslikud kõrvalekalded, mida on täheldatud emadel või järglastel, tuleks registreerida.
      Järglase füüsiline areng tuleks registreerida peamiselt kehamassi lisandumise teel. Muud füüsilised parameetrid (nt kõrva ja silma avanemine, hammaste teke, karvakasv) võivad anda täiendavat teavet, kuid nimetatud andmeid peaks soovitavalt hindama seksuaalset küpsust käsitlevate andmete kontekstis (nt vanus ja kehamass tupe avanemisel või suguti ja eesnaha eraldumisel) (13). Soovitatakse F1-põlvkonna järglaste funktsionaalseid uuringuid (nt motoorne tegevus, sensoorne funktsioon, reflekside ontogenees) enne ja/või pärast võõrutamist, eelkõige neid uuringuid, mis on seotud seksuaalse küpsusega, juhul kui selliseid uuringuid ei käsitleta eraldi katsetes. Tupe avanemise ja eesnaha eraldumise iga määratakse kindlaks paaritumiseks valitud F1-põlvkonna võõrutatud poegade puhul. Anogenitaalset vahemaad mõõdetakse sünnijärgsel 0. päeval F2-põlvkonna poegade puhul, kui F1-põlvkonna sooline jagunemine või seksuaalse küpsuse saavutamise ajastus selleks põhjust annavad.
      Funktsionaalsed vaatlused võib ära jätta rühmades, millel vastasel juhul ilmneksid negatiivsete mõjude selged tunnused (nt oluline massi vähenemine jne). Kui funktsionaalseid uuringuid tehakse, ei peaks neid tegema paaritumiseks valitud poegadega.
      1.5.6.   Üldlahang
      Surmamise või uuringu käigus suremise korral uuritakse makroskoopiliselt kõiki poeginud loomi (P- ja F1-põlvkond), kõiki väliste kõrvalekalletega või kliiniliste tunnustega poegi ja juhuslikult valitud F1- ja F2-põlvkonna mõlemast soost ja igast pesakonnast poegi mis tahes strukturaalsete kõrvalekallete või patoloogiliste muutuste suhtes. Erilist tähelepanu tuleks pöörata reproduktiivsüsteemi elunditele. Tuleks uurida humaanselt surmatud suremisseisundis poegade või surnud poegade (kui nende laibad on leotamata) võimalikke defekte ja/või surmapõhjust ning nende laibad tuleks säilitada.
      Kõikide esimest korda poegivate emasloomade emakat tuleks uurida implantatsioonikohtade olemasolu ja arvu suhtes viisil, mis ei sisalda histopatoloogilist hindamist.
      1.5.7.   Elundite massid
      Surmamise ajal määratakse kindlaks kõikide P- ja F1-põlvkonna poeginud loomade kehamass ja järgmiste elundite mass (paariselundid peaks kaaluma ükshaaval):
      
                  —
               
               
                  emakas, munasarjad;
               
            
                  —
               
               
                  munandid, munandimanused (kogumass ja sabaosa mass);
               
            
                  —
               
               
                  eesnääre;
               
            
                  —
               
               
                  seemnepõiekesed koos näärmete ja nendes olevate vedelikega ning eesnäärmega (tervikuna);
               
            
                  —
               
               
                  aju, maks, neerud, põrn, ajuripats, kilpnäärmed ja neerupealised ning määratud sihtelundid.
               
            Lahanguks valitud F1 – ja F2-põlvkonna poegade kehamassid tuleks määrata kindlaks surmamisel. Kaalutakse järgmiseid elundeid, mis on juhuslikult valitud ühest pojast/soost/pesakonnast (vt punkt 1.5.6): aju, põrn ja harknääre.
      Üldlahangu ja elundite kaalumise tulemusi tuleks hinnata muudes, korduvate annustega uuringutes tehtud vaatluste kontekstis, kui see on teostatav.
      1.5.8.   Histopatoloogia
      1.5.8.1.   Poeginud loomad
      P- ja F1-põlvkonna poeginud loomadelt eemaldatakse järgmised elundid ja koed või nende representatiivsed proovid ja neid säilitatakse sobivas kasvukeskkonnas histopatoloogilise uuringu tarbeks:
      
                  —
               
               
                  tupp, emakas koos emakakaelaga ning munasarjad (säilitatakse sobivas kinnitis);
               
            
                  —
               
               
                  üks munand (säilitatakse Bouini või võrreldavas kinnitis), üks munandimanus, seemnepõiekesed, eesnääre ja selle eesosa;
               
            
                  —
               
               
                  eelnevalt identifitseeritud sihtelund(id) kõikidelt paaritumiseks valitud P- ja F1-põlvkonna loomadelt.
               
            Eespool loetletud säilitatud elundite ja kudede täielik histopatoloogiline uuring tehakse kõikide paaritumiseks valitud ning suure annusega ja kontrollrühma kuuluvate P-ja F1-põlvkonna loomade kohta. P-põlvkonna loomade munasarjade uurimine ei ole kohustuslik. Käsitlemisega seotud muutustega elundeid tuleks samuti uurida väikese ja keskmise annusega rühmades, et aidata NOAELi välja selgitada. Lisaks sellele tuleks selliste väikese ja keskmise annusega loomade, kellel kahtlustatakse vähenenud viljakust, nt need, kellel ei õnnestunud paarituda, viljastuda, sigitada või sünnitada terveid järglasi, või need, kelle innatsüklit või sperma hulka, liikuvust või morfoloogiat mõjutati, suguelundeid hinnata histopatoloogiliselt. Kõiki üldkahjustusi, nagu atroofia või kasvajad, tuleks uurida.
      Munandeid tuleks üksikasjalikult histopatoloogiliselt uurida (nt kasutades Bouini kinnitit, parafiinilõike või 4–5 μm paksuseid läbilõikeid), et kindlaks teha käsitlemisega seotud mõjud nagu paigale jäänud spermatiidid, puuduvad sugurakukihid või -liigid, hulktuumsed hiidrakud või spermatogeensete rakkude irdumine luumenisse (14). Puutumatu munandimanuse puhul tuleb uurida pead, keha ja saba, mida saab teha pikilõigete hindamise teel. Munandimanuse puhul tuleks hinnata leukotsüüdi infiltratsiooni, rakutüüpide esinemissageduse muutusi, hälbivaid rakutüüpe ja sperma fagotsütoosi. PAS- ja hematoksüliiniga värvimist võib kasutada isasloomade suguelundite uurimisel.
      Imetamisjärgne munasari peaks sisaldama alg- ja kasvavaid munarakke ning imetamisaegseid suuri kollakehasid. Histopatoloogiline uurimine peaks tuvastama algmunarakkude populatsiooni kvalitatiivse vähenemise. Algmunarakkude kvantitatiivne hindamine tuleks teha F1-põlvkonna emasloomadele; loomade arv, munasarjalõigete valik ja lõikeproovi suurus peaksid statistiliselt sobima kasutatava hindamisprotseduuriga. Uurimisel peaks arvutama algmunarakkude arvu, mida saab kombineerida väikeste kasvavate munarakkudega, katse- ja kontrollrühma kuuluvate munasarjade võrdlemiseks (15, 16, 17, 18, 19).
      1.5.8.2.   Võõrutatud pojad
      Kõikide väliste kõrvalekalletega või kliiniliste tunnustega poegade, samuti paaritumiseks mittevalitud F1- ja F2-põlvkonnast juhuslikult valitud ühe poja/soo/pesakonna selgete kõrvalekalletega kude ja sihtelundid fikseeritakse ja säilitatakse sobivas kasvukeskkonnas histopatoloogilise uurimise tarbeks. Säilitatud kudedele tehakse täielik histopatoloogiline määramine, milles pearõhk on reproduktiivsüsteemi elunditel.
      2.   ANDMED
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE
      Andmed edastatakse kokkuvõtlikult iga emaslooma ja nende järglase kohta tabeli kujul, näidates iga katserühma ja põlvkonna kohta loomade arvu katse alguses, katse käigus surnud või humaansetel kaalutlustel surmatud loomade arvu, surma ja humaanse surmamise ajad, viljakate emasloomade arvu, tiinete emasloomade arvu, mürgistusnähtudega loomade aru, mürgistusnähtude kirjelduse, sh toksiliste mõjude algusaja, kestuse ja raskuse, embrüot/loodet käsitlevate vaatluste liigid ja kogu asjaomane teave pesakonna kohta.
      Numbrilisi tulemusi tuleks hinnata sobiva, üldiselt heakskiidetud statistilise meetodi abil; statistilised meetodid tuleks valida uurimuse kavandamisel ja neid tuleks põhjendada. Annuse ja sellele reageerimise statistilised mudelid võivad olla andmete analüüsimisel vajalikud. Protokoll peaks hõlmama piisavalt teavet analüüsimeetodi kohta ja kasutatava arvutiprogrammi kohta, nii et sõltumatu arvestaja/statistik võib uuesti hinnata ja rekonstrueerida analüüsi.
      2.2.   TULEMUSTE HINDAMINE
      Kahe põlvkonna reproduktsiooni toksilisuse uuringu avastusi tuleks hinnata täheldatud mõjude, kaasa arvatud lahangu- ja mikroskoopilised leiud, suhtes. Hindamine hõlmab katseaine annuse ja kõrvalekallete – sh üldkahjustused, identifitseeritud sihtelundid, mõjutatud viljakus, kliinilised kõrvalekalded, mõjutatud paljunemisvõime ja pesakonna suurus/laad, kehamassi muutused, mõjud suremusele ja mis tahes muud toksilised mõjud – olemasolu või puudumise, esinemissageduse ja raskusastme vahelist seost või selle puudumist. Katseaine füüsikalis-keemilisi omadusi ja vajaduse korral toksikokineetilisi andmeid tuleks võtta arvesse katsetulemuste hindamisel.
      Nõuetekohaselt tehtud reproduktsiooni toksilisuse uuring hindab rahuldavalt mõjuta määrasid ja mõistab reproduktsioonile, poegimisele, imetamisele, sünnijärgsele arengule, kaasa arvatud kasv ja seksuaalne areng, kahjulikke mõjusid.
      2.3.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE
      Kahe põlvkonna reproduktsiooni toksilisuse uuring annab teavet korduvate ainega kokkupuudete mõjude kohta reproduktiivtsükli kõikidel etappidel. Eelkõige annab uuring teavet reproduktiivparameetrite kohta ning järglaste arengu, kasvu, suguküpseks saamise ja ellujäämise kohta. Uuringu tulemusi tõlgendatakse koostoimes subkroonilisel, sünnieelse arengu ja toksikokineetilisel ning muudel uuringutel tehtud avastustega. Käesoleva uuringu tulemusi võib kasutada kemikaali täiendava uurimise vajaduse hindamisel. Uuringu tulemuste ekstrapoleerimine on kehtiv piiratud ulatuses. Neid saab kõige paremini kasutada teabe andmiseks mõjuta määrade ja inimeste lubatud kokkupuudete kohta (20, 21, 22, 23).
      3.   PROTOKOLL
      3.1.   KATSEPROTOKOLL
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Katseaine:
                  
                              —
                           
                           
                              füüsiline laad ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tunnusandmed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              puhtus.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Kandeaine (vajaduse korral):
                  
                              —
                           
                           
                              kandeaine valiku põhjendus, kui see on veest erinev.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katseloomad:
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatud liigid/tüved;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade arv, vanus ja sugu;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              päritolu, pidamistingimused, toitumine, pesamaterjalid jne;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              iga looma kaal katse alguses.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              annuste valiku põhjendus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katseaine valmistise/toidupreparaadi üksikasjad, saadud kontsentratsioonid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              preparaadi stabiilsus ja homogeensus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katseaine manustamise üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toidu/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni (ppm) muutmine tegelikuks annuseks (mg kg kehamassi kohta päevas), vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              toidu tarbimine ja vajaduse korral vee tarbimine, toidu tõhusus (kehamassi lisandumine tarbitud toidu grammi kohta) ning katseaine tarbimine P- ja F1-põlvkonna loomadel, välja arvatud perioodil, mil loomi hoitakse koos, ja vähemalt imetamise viimasel kolmandikul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              andmed absorbtsiooni kohta (kui seda on mõõdetud);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              paaritumiseks valitud P- ja F1-põlvkonna loomade kehamassi andmed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pesakonna ja poegade massi andmed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              andmed poeginud loomade kehamassi kohta surmamisel ning elundite täieliku ja suhtelise massi kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kliiniliste vaatluste laad, raskus ja kestus (sõltuvalt sellest, kas kahjud on pöörduvad või mitte);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              surmaaeg katse ajal või andmed loomade ellujäämise kohta kuni surmamiseni;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              andmed toksilise reaktsiooni kohta sooti ja annuste kaupa, kaasa arvatud paaritumis-, viljakus-, tiinus-, sünni-, elujõulisus- ja imetamisindeksid; protokoll peaks viitama nende indeksite arvutamisel kasutatud arvudele;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toksilised või muud mõjud reproduktsioonile, järglastele, sünnijärgsele kasvule jne;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lahangu leiud;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kõikide histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tavalise innatsükliga P- ja F1-põlvkonna emasloomade arv ning tsükli pikkus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              munandimanuse sabaosas oleva sperma koguarv, progressiivselt liikuva sperma protsendimäär, morfoloogiliselt normaalse sperma protsendimäär ning tuvastatud kõrvalekaldega sperma protsendimäär;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aega paaritumiseni, sh päevade arv paaritumiseni;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tiinuse pikkus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              implantatsioonide arv, kollakehad, pesakonna suurus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              elussündide arv ja implantatsioonide järel toimunud abordid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              selgelt nähtavate arenguhälvetega poegade arv, kui see on kindlaks määratud, tuleks teatada kängujäänud loomade arv;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              andmed poegade füüsilise arengu järkude kohta ja andmed muude sünnijärgsete arengute kohta; hinnatud füüsilise arengu järke tuleks põhjendada;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              andmed poegade ja täiskasvanud loomade funktsionaalsete vaatluste kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vajaduse korral tulemuste statistiline töötlemine.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutelu.
               
            
                   
               
               
                  Järeldused, sh NOAEL-väärtused mõjude kohta emadele ja järglastele.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In: Reprodudion in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.
               
            
                  2)
               
               
                  Gray, L.E. et al., (1989). A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat. Fundamental and Applied Toxicology 12:92-108.
               
            
                  3)
               
               
                  Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats. Journal of Reproduction and Fertility 54:103-107.
               
            
                  4)
               
               
                  Klinefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat. Reprodudive Toxicology 5:39-44.
               
            
                  5)
               
               
                  Seed, J. et al. (19 9 6). Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report. Reproductive Toxicology 10(3):237-244.
               
            
                  6)
               
               
                  Chapin, R.E. et al., (1992).Methods for Assessing Rat Sperm Motility. Reprodudive Toxicology 6:267-273.
               
            
                  7)
               
               
                  Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration. journal of Andrology 13:409-421.
               
            
                  8)
               
               
                  Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations. Reproductive Toxicology 5:449-458.
               
            
                  9)
               
               
                  Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In: Methods in Toxicology, Part A., Academic, Orlando, Florida, pp. 319-333.
               
            
                  10)
               
               
                  Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology 10: 401-415.
               
            
                  11)
               
               
                  Working, P.K. and M. Hurtt (1987). Computerized Videomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andrology 8:330-337.
               
            
                  12)
               
               
                  Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6:491-505.
               
            
                  13)
               
               
                  Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biological Reproduction 17:298303.
               
            
                  14)
               
               
                  Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.
               
            
                  15)
               
               
                  Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Orlando, Florida.
               
            
                  16)
               
               
                  Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York, pp. 421-426.
               
            
                  17)
               
               
                  Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989). Test Methods for Assessing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven, New York.
               
            
                  18)
               
               
                  Smith, B.J. et al,. (1991). Comparison of Random and Serial Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive Toxicology 5:379-383.
               
            
                  19)
               
               
                  Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histology. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston,. and CA. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.
               
            
                  20)
               
               
                  Thomas, J. A. (19 91). Toxic Responses of the Reproductive System. In: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, J. Doull, and CD. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.
               
            
                  21)
               
               
                  Zenick, H. and E.D. Clegg, (1989). Assessment of Male Reproductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, New York.
               
            
                  22)
               
               
                  Palmer, A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York.
               
            
                  23)
               
               
                  (23) Palmer, A.K. (19 78). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. Wilson and F.C Fraser (eds.), Plenum Press, New York.
               
            B.36.   TOKSIKOKINEETIKA
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.2.   MÕISTED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritavat ainet manustatakse sobival viisil. Sõltuvalt uuringu eesmärgist võib ainet manustada ühekordsete või korduvate annustena kindla ajaperioodi jooksul ühele või mitmele katseloomade grupile. Olenevalt uuringu tüübist määratakse aine ja/või selle metaboliitide sisaldus kehavedelikes, kudedes ja/või ekskreetides.
      Uuringuid võib teha uuritava aine „märgistatud” või „mittemärgistatud” vormiga. Kui kasutatakse märgistust, peab see olema liidetud uuritava ainega nii, et see võimaldab saada enim informatsiooni aine käitumise kohta.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Puuduvad.
      1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Ettevalmistused
      Terved noored täiskasvanud loomad aklimatiseeritakse laboritingimustes vähemalt viie päeva jooksul enne testi algust. Enne testi loomad randomiseeritakse ja määratakse uuritavatesse gruppidesse. Erijuhtudel võib kasutada väga noori, tiineid või eelnevalt mõjutatud loomi.
      1.6.2.   Katsetingimused
      1.6.2.1.   Katseloomad
      Toksikokineetilisi uuringuid võib korraldada ühe või enama sobiliku loomaliigiga, mida on kasutatud või kavatsetakse kasutada teistes sama uuritava ainega teostatud toksikokineetilistes uuringutes. Kui testimiseks kasutatakse närilisi, ei tohi nende kehakaal erineda keskmisest enam kui ± 20 %.
      1.6.2.2.   Arv ja sugu
      Absorptsiooni ja ekskretsiooni uuringutes peaks igas annuserühmas algselt olema neli looma. Sooline eelistus ei ole kohustuslik, kuid mõningatel juhtudel võib vajalikuks osutuda mõlema sugupoole uurimine. Kui reaktsioonides on soolised erinevused, tuleb kummastki soost uurida nelja looma. Kui uuringus ei kasutata närilisi, võib kasutada vähem loomi. Kui uuritakse aine jaotuvust kudedes, peaks grupi suuruse määramisel arvesse võtma nii igal planeeritud ajahetkedel surmatavate loomade hulka, kui ka valitud ajahetkede koguarvu.
      Kui uuritakse ainevahetust, on grupi suurus sõltuv uuringu vajadustest. Mitme annusetaseme ning mitme vahepealse ajapunktiga uuringutes tuleks rühma suurusel arvesse võtta vaheetappide ja surmamiste arvu, kuid rühm ei tohi olla väiksem kui kaks looma. Rühma suurus peaks olema piisav iseloomustamaks uuritava aine ja/või metaboliitide omastamist, platood ja lagunemist (kui vajalik).
      1.6.3.   Annused
      Ühekordse annuse manustamise puhul tuleks kasutada vähemalt kahte erinevat annust. Kasutama peaks väikest annust, mille juures ei ilmne toksilisi efekte ning suurt annust, mille puhul võivad tekkida muutused toksikokineetilistes parameetrites või ilmnevad toksilisuse efektid.
      Korduval manustamisel piisab tavaliselt väikestest annustest, kuid teatud tingimustes võib vaja minna ka suuri annuseid.
      1.6.4.   Manustamisviis
      Toksikokineetilistes uuringutes tuleks kasutada samu manustamisviise ning, kui võimalik, samu vehiikleid, mida on kasutatud või kavatsetakse kasutada teistes toksilisuse uuringutes. Uuritavat ainet manustatakse katseloomadele tavaliselt suu kaudu maosondiga või söögiga, kutaanselt või inhaleeritava õhuga kindla ajavahemiku jooksul. Uuritava aine intravenoosne manustamine võib osutuda kasulikuks, kui uuritakse suhtelist imendumist teiste manustamisviiside puhul. Lisaks võib pärast uuritava aine intravenoosset manustamist saada kasulikku informatsiooni selle kudedes jaotumise seaduspärasuste kohta.
      Arvesse tuleks võtta aine manustamiseks kasutatavate vehiiklite ja uuritava aine vahelist mõju. Tähelepanu tuleks pöörata absorptsiooni erinevustele, kui kasutatakse uuritava aine manustamist sondiga või söögiga, ning vajadusele annuse täpseks määramiseks, eriti kui uuritav aine manustatakse koos söögiga.
      1.6.5.   Jälgimisaeg
      Kõiki loomi tuleks iga päev jälgida ning märkida üles toksilisuse nähud ja teised kliiniliselt olulised ilmingud, muu hulgas nende tekke aeg, aste ja kestus.
      1.6.6.   Protseduur
      Pärast katseloomade kaalumist manustatakse uuritav aine sobivat teed pidi. Loomi võib hoida näljas enne uuritava aine manustamist, kui seda peetakse oluliseks.
      Imendumine
      Uuritava aine imendumise kiirust ja ulatust võib hinnata erinevate meetodite abil, kas koos või ilma referentsgrupita, (8) näiteks:
      
                  —
               
               
                  määrata uuritava aine ja/või metaboliitide hulka ekskreetides, nagu uriin, sapp, väljaheide, väljahingatav õhk või looma karkass;
               
            
                  —
               
               
                  võrrelda bioloogilisi vastuseid (nt ägeda toksilisuse uuringud) uuritava ja kontroll- ja/või referentsgrupi vahel;
               
            
                  —
               
               
                  võrrelda neerude kaudu erituvat uuritava aine ja/või metaboliitide hulka test- ja referentsgrupi loomadel;
               
            
                  —
               
               
                  uuritava aine ja/või metaboliitide plasmakontsentratsiooni ja aja kõvera aluse pindala kindlakstegemine ning test- ja referentsgrupi andmete võrdlemine.
               
            Jaotumine
      Käesoleval hetkel kasutatakse kahte meetodit, millest ühte või mõlemat võib kasutada jaotuvuse kindlakstegemiseks:
      
                  —
               
               
                  kasulikku kvalitatiivset informatsiooni saab kasutades kogu keha autoradiograafilisi tehnikaid;
               
            
                  —
               
               
                  kvantitatiivset informatsiooni saab loomade surmamisest erinevatel vaheetappidel pärast loomade uuritavale ainele eksponeerimist ning uuritava aine ja/või metaboliitide kontsentratsiooni ja hulga määramisest kudedes ja organites.
               
            Eritumine
      Ekskretsiooni uuringutes kogutakse uriin, väljaheide, väljahingatav õhk ja mõningatel juhtudel sapp. Uuritava aine ja/või metaboliitide hulka ekskreetides tuleks pärast ekspositsiooni mõõta mitmeid kordi, kuni umbes 95 % manustatud annusest on eritunud, või seitsme päeva jooksul (olenevalt sellest, kumb jõuab kätte esimesena).
      Erijuhtudel tuleb arvestada uuritava aine eritumist lakteeriva katselooma piimaga.
      Metabolism
      Metabolismi ulatuse ja seaduspärasuste kindlakstegemiseks peaks analüüsima bioloogilisi näidiseid, kasutades selleks sobilikke tehnikaid. Metaboliitide struktuur tuleks välja selgitada ning esitada sobivad metabolismi teed, kui on vaja vastata varasemates toksikoloogilistes uuringutes tekkinud küsimustele. Informatsiooni saamisel metabolismi teede kohta võivad kasulikuks osutuda in vitro uuringud.
      Metabolismi ja toksilisuse vahekorra kohta võib lisainfot saada biokeemilistest uuringutest, näiteks metaboliseerivate ensüümide süsteemide toime kindlakstegemisest, endogeensete mitte-proteiinsulfüdrüülkomponentide lagunemisest ja aine seondumisest makromolekulidega.
      2.   ANDMED
      Olenevalt uuringu tüübist peavad andmed olema summeeritud tabelikujul, koos graafilise esitlusega, kui vajalik. Iga testrühma kohta tuleb näidata mõõtmiste keskmine ja statistiline variatsioon suhtes aja ja annusega, vajadusel näidata ära koed ja organid. Sobivate meetoditega tuleks kindlaks määrata absorptsiooni ulatus ning ekskretsiooni kogus ja tase. Kui tehakse metabolismi uuringuid, tuleks esitada kindlakstehtud metaboliitide struktuur ja arvatavad metabolismi teed.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Vastavalt uuringu tüübile peab uuringu raport võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  loomaliik, liin, päritolu, keskkonnatingimused, dieet;
               
            
                  —
               
               
                  märgistatud ainete iseloomustus, kui on kasutatud;
               
            
                  —
               
               
                  annuste tase ja manustamise intervall;
               
            
                  —
               
               
                  manustamisviis(id), kõik kasutatud vehiiklid;
               
            
                  —
               
               
                  täheldatud toksilised ja teised efektid;
               
            
                  —
               
               
                  uuritava aine ja/või metaboliitide kindlakstegemise meetodid bioloogilistes näidistes, kaasa arvatud väljahingatav õhk;
               
            
                  —
               
               
                  andmed soo, annuse, režiimi, aja, kudede ja organite kohta tabelina;
               
            
                  —
               
               
                  absorptsiooni ja ekskretsiooni esitamine ajas;
               
            
                  —
               
               
                  meetodid metaboliitide iseloomustamiseks ja identifikatsiooniks bioloogilistes näidistes;
               
            
                  —
               
               
                  meetodid metabolismiga seotud biokeemiliste mõõtmiste kohta;
               
            
                  —
               
               
                  metabolismi arvatav tee;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste arutelu;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste tõlgendamine.
               
            3.2.   HINNANG JA TÕLGENDAMINE
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      4.   VIITED
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      B.37.   FOSFORORGAANILISTEST AINETEST PÕHJUSTATUD VIIVISTOIMEGA NEUROTOKSILISUS PÄRAST ÄGEDAT KOKKUPUUTUMIST
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Ainete toksilise toime iseloomustamisel ja hindamisel on oluline vaadelda teatavate aineklasside potentsiaali põhjustada spetsiifilist neurotoksilisust, mida ei pruugi olla võimalik teiste toksilisuse uuringutega tuvastada. Teatavad fosfororgaanilised ained põhjustavad viivistoimega neurotoksilisust ja neid tuleks pidada võimalikeks uurimisobjektideks.
      Viivistoimega polüneuropaatiat põhjustada võivate ainete tuvastamiseks tuleks kasutada in vitro sõelumiskatseid; in vitro uuringute negatiivsed leiud ei tõenda, et uuritav aine ei ole neurotoksiline.
      Vt B osa üldist sissejuhatust.
      1.2.   MÕISTED
      Fosfororgaanilised ained sisaldavad laenguta fosfororgaanilisi estreid või fosfororgaaniliste või fosfoonorgaaniliste või orgaaniliste fosforamidohapete või analoogsete fosfortio, fosfoontio või fosfortioamidohapete tioestrid või anhüdriide, mis võivad põhjustada selle aineklassi puhul täheldatavat viivistoimega neurotoksilisust.
      Viivistoimega neurotoksilisus on sündroom, mis on seotud pika viivitusega ataksia, seljaaju ja perifeerse närvi distaalse aksonopaatia ilmnemisel ja närvikoes neuropaatia sihtesteraasi (NTE) takistamise ja vananemisega.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Võrdlusaineid võib uurida positiivse võrdlusrühmaga tõestamaks, et uuritava liigi vastus ei ole laboratoorsetel katsetingimustel märkimisväärselt muutunud.
      Üks näide laialdaselt kasutatud neurotoksilisest ainest on tri-o-tolüül-3-fosfaat (CASi nr 78-30-8, EINECSi nr 201-103-5, CASi nomenklatuur: fosforhape, tris(2-metüülfenüül)ester), samuti tuntud kui tris-o-kresüülfosfaat.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritav aine manustatakse suu kaudu ühekordse doosina kanadele, keda on vajaduse korral kaitstud ägedate kolinergiliste mõjude eest. Loomi vaadeldakse käitumuslike kõrvalekallete, ataksia ja paralüüsi tuvastamiseks 21 päeva. Biokeemilised mõõtmised, eelkõige neuropaatia sihtesteraasi pidurdamine (NTE), tehakse tavaliselt 24 ja 48 tundi pärast doosi andmist igast rühmast juhuslikkuse printsiibil valitud kanadel. 21 päeva pärast kokkupuudet tapetakse ülejäänud kanad ning seejärel viiakse läbi valitud närvikudede histopatoloogiline uuring.
      1.5.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.5.1.   Ettevalmistused
      Noored terved täiskasvanud kanad, kellel ei esine takistavaid viirushaigusi, kellele ei manustata ravimeid ja kelle kõnnakus ei esine kõrvalekaldeid, jagatakse juhuslikkuse printsiibil katse- ja võrdlusrühmadesse ning seejärel lastakse neil vähemalt viis päeva enne uuringu algust laboritingimustega kohaneda.
      Kasutada tuleks puure või piirdeaedu, mis on piisavalt suured, et kanad saaksid vabalt liikuda ja et neid saaks kergesti vaadelda.
      Uuritav aine tuleks tavaliselt manustada sondi, želatiinikapslite või mõne samaväärse meetodi abil suu kaudu. Vedelikke võib anda lahjendamata kujul või sobivas vehiikelis (nt maisiõli) lahustatuna; tahked ained tuleks võimaluse korral lahustada, kuna suured kogused ei pruugi želatiinikapslites täielikult absorbeeruda. Mitte-vesilahuseliste vehiikelite puhul peaksid olema teada vehiikeli toksilised omadused ning kui need ei ole teada, tuleks need enne katse läbiviimist kindlaks teha.
      1.5.2.   Katsetingimused
      1.5.2.1.   Katseloomad
      Soovitatakse kasutada noori, 8–12 kuu vanuseid täiskasvanud munakanu (Gallus gallus domesticus). Kasutada tuleks normaalsuuruses ja -aretusliini kanu ning kanad peaksid üldjuhul olema kasvatatud tingimuses, kus neil oli võimalik vabalt liikuda.
      1.5.2.2.   Arv ja sugu
      Lisaks katserühmale tuleks kasutada nii võrdlusrühma, millele antakse vehiikelit, kui ka positiivset võrdlusrüh-ma. Võrdlusrühma, millele antakse vehiikelit, tuleks käsitada samal viisil kui katserühma, välja arvatud uuritava aine manustamise osas.
      Igas lindude rühmas peab olema piisav arv kanu, et biokeemiliste määramiste tegemiseks oleks võimalik tappa vähemalt kuus lindu (kolm lindu kahel eri ajahetkel) ja et kuus lindu jääksid ellu 21 päevase vaatlusperioodi ajaks patoloogiauuringu läbiviimiseks.
      Positiivset võrdlusrühma võib uurida samaaegselt või hilisema võrdlusrühmana. Positiivses võrdlusrühmas peaks olema vähemalt kuus kana, kellele on manustatud tuntud viivistoimega neurotoksilist ainet, kolme kana puhul tehakse biokeemiline uuring ja kolmel kanal patoloogiline uuring. Varasemaid andmeid tuleks korrapäraselt ajakohastada. Uued positiivse võrdlusrühma andmed on vajalikud siis, kui katset tegev laboratoorium on mõnda katse tegemiseks olulist elementi (aretusliin, toit, pidamistingimused) muutnud.
      1.5.2.3.   Annused
      Põhiuuringus kasutatav doositase tuleb määrata kindlaks eeluuringus, milles kasutatakse asjakohasel arvul kanu ja doositasemerühmasid. Selleks et määrata kindlaks piisav doos põhiuuringu jaoks, peab eeluuringus tavaliselt mõni lind surema. Vältimaks surma ägedate kolinergiliste mõjude tagajärjel, võib siiski kasutada atropiini või mõnda teist uuritavat ainet, mis teadaolevalt ei mõjuta viivistoimega neurotoksilisi reaktsioone. Uuritava aine mittesurmava maksimaalse doosi (vt meetod B.1a) määramiseks võib kasutada erinevaid uurimismeetodeid. Doosi valikul võib abi olla varasematest andmetest või muust toksikoloogilisest teabest.
      Uuritava aine doositase peaks põhiuuringus olema võimalikult kõrge, võttes võimaluse korral arvesse doosivaliku eeluuringu tulemusi ja ülemist piirdoosi 2 000 mg kehakaalu kg kohta. Suremus ei tohiks olla nii suur, et see takistaks 21. päeval allesjäävate loomadega läbi viia biokeemilist uuringut (kuus katselooma) ja histoloogilist uuringut (kuus katselooma). Vältimaks surma ägedate kolinergiliste mõjude tagajärjel, võib kasutada atropiini või mõnda teist kaitseainet, mis teadaolevalt ei mõjuta viivistoimega neurotoksilisi reaktsioone.
      1.5.2.4.   Piirsisalduskatse
      Kui katses ei tuvastata käesolevas uuringus kirjeldatud menetlusega päevadoosil 2 000 mg kehakaalu kg kohta täheldatavat toksilist toimet ja kui toksilisus ei ole samalaadse struktuuriga ainete osas saadud andmete põhjal ootuspärane, ei loeta suurema doosiga uuringut vajalikuks. Läbi võib viia piirsisalduskatse, välja arvatud juhul, kui inimese kokkupuude viitab vajadusele kasutada suuremat doositaset.
      1.5.3.   Vaatlusperiood
      Vaatlusperiood peaks olema 21 päeva.
      1.5.4.   Katse käik
      Pärast kaitseaine manustamist ägedast kolinergilisest toimest tuleneva surma vältimiseks manustatakse uuritav aine ühekordse doosina.
      
         Üldine vaatlus
      
      Vaatlused peaksid algama kohe pärast kokkupuudet. Kõiki kanu tuleks esimese kahe päeva jooksul mitu korda hoolikalt vaadelda ning seejärel 21 päeva jooksul või kuni kavandatud tapmiseni vähemalt kord päevas. Kõik toksilisuse märgid tuleks üles märkida, sealhulgas ilmnemise aeg, liik, raskusaste ja käitumuslike kõrvalekallete kestus. Ataksiat tuleks mõõta ordinaalse hindamisskaalaga, milles on vähemalt neli taset, ja paralüüsi esinemine tuleks registreerida. Patoloogilise uuringu jaoks välja valitud kanu tuleks vähemalt kaks korda nädalas puurist välja lasta ning neid tuleks väiksemate toksiliste mõjude hindamise hõlbustamiseks liikuma sundida (näiteks redelil ronimine). Haigestunud loomad ja loomad, kellel esineb suurt stressi või valu, eemaldatakse katsest, tapetakse humaanselt ja lahatakse.
      
         Kehakaal
      
      Kõiki kanu tuleks kaaluda vahetult enne uuritava aine manustamist ning seejärel vähemalt kord nädalas.
      
         Biokeemia
      
      Kuus juhuslikult valitud kana igast katserühmast ja võrdlusrühmast, millele antakse vehiikelit, ja kolm kana positiivsest võrdlusrühmast (kui katse viiakse läbi samaaegselt) tuleks tappa mõne päeva jooksul pärast viimase doosi manustamist ning ajust ja nimmelülidest valmistatud valmistist hinnatakse neuropaatia sihtesteraasi (NTE) pidurdamisaktiivsuse osas. Lisaks sellele tuleks neuropaatia sihtesteraasi pidurdamisaktiivsuseks ette valmistada ja analüüsida istmikunärvi kude. Tavaliselt tapetakse 24 ja 48 tunni pärast kolm võrdlusrühma ja iga katserühma lindu ning 24 tunni pärast tuleks tappa ka kolm positiivsesse võrdlusrühma kuuluvat lindu. Kui toksilisuse kliiniliste märkide vaatlus (mida on võimalik hinnata kolinergiliste märkide ilmnemise aja vaatlemisel) viitab toksilise aine eriti aeglasele kõrvaldamisele, on soovitav võtta kahel erineval ajahetkel 24–72 tunni jooksul pärast manustamist kolmelt linnult koeproov.
      Vajaduse korral võib nende proovidega teha ka atsetüülkoliinesteraasi analüüsi (AChE). AChE võib siiski spontaanselt in vivo reaktiveeruda ja tuua kaasa selle, et aine potentsiaali AChE inhibiitorina alahinnatakse.
      
         Täielik lahang
      
      Kõikide loomade (kelle tapmine oli kavatsetud ja kes olid suremas) täielik lahang peaks hõlmama aju ja seljaaju väliste tunnuste vaatlemist.
      
         Histopatoloogiline uuring
      
      Vaatlusperioodil ellujäänud ja biokeemilistes uuringutes kasutamata loomade närvikude tuleks mikroskoopiliselt uurida. Koed tuleks kinnitada perfusiooni abil kohapeal. Lõiked tuleks võtta väikeajust (keskmiselt pikitasandilt), piklikajust, seljaajust ja perifeersetest närvidest. Seljaaju puhul tuleb lõiked võtta ülemistest kaelalülidest, kesktorakaalosast ja lumbosakraalosast. Tuleks võtta lõiked ka tibiaalnärvi distaalsest osast ja selle kaksiksääre-marjalihase harudest ja istmikunärvist. Lõiked tuleks katta sobivate müeliini- ja aksonispetsiifiliste ainetega.
      2.   ANDMED
      Käesolevas meetodis valitud lõpp-punktide (biokeemia, histopatoloogia ja käitumuslik vaatlus) negatiivsed tulemused ei nõua tavapäraselt täiendavat uurimist viivistoimega neurotoksilisuse osas. Nendes lõpp-punktides saadud ebaselged või poolikud tulemused võivad nõuda täiendavat hindamist.
      Loomade kohta tuleks esitada andmed individuaalselt. Kõik andmed tuleks esitada kokkuvõtvalt tabelis, milles oleks iga katserühma kohta märgitud loomade arv katse alguses, vigastustega loomade arv, toime käitumisele või biokeemiline toime, kahjustuste või toime liik ja raskusaste, loomade protsent iga tüüpi vigastuste ja raskusastmete kohta.
      Käesoleva uuringu tulemusi tuleks hinnata käitumuslike, biokeemiliste ja histopatoloogiliste mõjude esinemise, raskusastme ja korrelatsiooni põhjal ja katse- või võrdlusrühmas täheldatud muude mõjude suhtes.
      Numbrilisi tulemusi tuleks hinnata asjakohaste ja üldiselt tunnustatud statistiliste meetoditega. Kasutatavad statistilised meetodid tuleks valida uuringu kavandamise etapis.
      3.   ARUANDLUS
      KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab võimaluse korral sisaldama järgmist teavet
      
                  3.1.
               
               
                  Katseloomad:
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatud aretusliin;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade arv ja vanus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              päritolu, pidamistingimused, toit jne;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              iga looma kaal katse alguses.
                           
                        
            
                  3.2.
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              uuritava aine ettevalmistamise, stabiilsuse ja homogeensuse üksikasjad; vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vehiikeli valiku põhjendus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine manustamise üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              doosi valimise põhjendused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              manustatud dooside üksikasjad, sealhulgas andmed vehiikeli, mahu ja manustatud aine füüsilise vormi kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              võimalike kaitseainete identifitseerimine ja nende manustamise üksikasjad.
                           
                        
            
                  3.3.
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              kehakaalu andmed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toksilise reaktsiooni andmed vastavalt rühmale, sealhulgas suremus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kliiniliste vaatluste iseloom, raskusaste ja kestus (pöördumatu või mitte);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              biokeemiliste meetodite ja leidude üksikasjalik kirjeldus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lahkamise tulemused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vajaduse korral tulemuste statistiline töötlemine.
                           
                        Tulemuste arutelu.
                  Järeldused.
               
            4.   VIITED
      Käesolev meetod on analoogne meetodiga OECD TG 418.
      B.38.   FOSFORORGAANILISTEST AINETEST PÕHJUSTATUD VIIVISTOIMEGA NEUROTOKSILISUSE 28PÄEVANE KORDUSDOOSI UURING
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Ainete toksilise toime iseloomustamisel ja hindamisel on oluline vaadelda teatavate aineklasside potentsiaali põhjustada spetsiifilist neurotoksilisust, mida ei pruugi olla võimalik teiste toksilisuse uuringutega tuvastada. Teatavad fosfororgaanilised ained põhjustavad viivistoimega neurotoksilisust ja neid tuleks pidada võimalikeks uurimisobjektideks.
      Nende ainete tuvastamiseks, mis võivad põhjustada viivistoimega polüneuropaatiat, tuleks kasutada in vitro sõelumiskatseid; in vitro uuringute negatiivsed leiud ei tõenda, et uuritav aine ei ole neurotoksiline.
      Käesolev 28päevane viivistoimega neurotoksilisuse katse annab teavet võimalike ohtude kohta tervisele, mis võivad tõenäoliselt tuleneda korduvatest kokkupuudetest piiratud ajavahemiku jooksul. Nimetatud uuringuga saab teavet doosireaktsiooni kohta ning selle abil on võimalik hinnata täheldatava kahjuliku toimeta doosi taset, mis aitaks määrata kokkupuute ohutuskriteeriumeid.
      Vt samuti B osa üldist sissejuhatust.
      1.2.   MÕISTED
      Fosfororgaanilised ained sisaldavad laenguta fosfororgaanilisi estreid või fosfororgaaniliste või fosfoonorgaaniliste või orgaaniliste fosforamidohapete või analoogsete fosfortio, fosfoontio või fosfortioamidohapete tioestreid või anhüdriide, mis võivad põhjustada selle aineklassi puhul täheldatavat viivistoimega neurotoksilisust.
      Viivistoimega neurotoksilisus on sündroom, mis on seotud pika viivitusega ataksia, seljaaju ja perifeerse närvi distaalse aksonopaatia ilmnemisel ja närvikoes neuropaatia sihtesteraasi (NTE) takistamise ja vananemisega.
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritava aine päevaseid doose manustatakse kanadele suu kaudu 28 päeva jooksul. Loomi vaadeldakse vähemalt kord päevas käitumuslike kõrvalekallete, ataksia ja paralüüsi tuvastamiseks 14 päeva jooksul pärast viimase doosi manustamist. Biokeemilised mõõtmised, eelkõige neuropaatia sihtesteraasi pidurdamine (NTE), tehakse igast rühmast juhuslikkuse printsiibil valitud kanadel tavaliselt 24 ja 48 tundi pärast viimase doosi andmist. Kaks nädalat pärast kokkupuudet tapetakse ülejäänud kanad ning viiakse läbi valitud närvikudede histopatoloogiline uuring.
      1.4.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.4.1.   Ettevalmistused
      Noortel tervetel täiskasvanud kanadel, kellel ei esine takistavaid viirushaigusi, kellele ei manustata ravimeid ja kelle kõnnakus ei esine kõrvalekaldeid, jagatakse juhuslikkuse põhimõtte alusel katse- ja võrdlusrühmadesse ning seejärel lastakse neil vähemalt viis päeva enne uuringu algust laboritingimustega kohaneda.
      Kasutada tuleks puure või piirdeaedu, mis on piisavalt suured, võimaldades kanadel vabalt liikuda ja neid kergesti vaadelda.
      Doosid tuleks manustada suu kaudu seitsmel päeval nädalas ning eelistatult sondi või želatiinikapslite abil. Vedelikke võib anda lahjendamata kujul või sobivas vehiikelis (nt maisiõli) lahustatuna; tahked ained tuleks võimaluse korral lahustada, kuna suured kogused ei pruugi želatiinikapslites täielikult absorbeeruda. Mitte-vesilahuseliste vehiikelite puhul peaksid olema teada vehiikeli toksilised omadused ning kui need ei ole teada, tuleks need enne katse läbiviimist kindlaks teha.
      1.4.2.   Katsetingimused
      1.4.2.1.   Katseloomad
      Soovitatakse kasutada noori, 8–12 kuu vanuseid täiskasvanud munakanu (Gallus gallus domesticus). Kasutada tuleks normaalsuuruses ja -aretusliini kanu ning kanad peaksid üldjuhul olema kasvatatud tingimuses, kus neil oli võimalik vabalt liikuda.
      1.4.2.2.   Arv ja sugu
      Üldiselt tuleks kasutada kolme katserühma ja ühte vehiikeli võrdlusrühma. Võrdlusrühma, millele antakse vehiikelit, tuleks käsitada samal viisil kui katserühma, välja arvatud uuritava aine manustamise osas.
      Igas lindude rühmas peab olema piisav arv kanu selleks, et biokeemiliste määramiste tegemiseks oleks võimalik tappa vähemalt kuus lindu (kolm lindu kahel eri ajahetkel) ja et kuus lindu jääksid ellu 14päevase vaatlusperioodi ajaks patoloogiauuringu tegemiseks.
      1.4.2.3.   Annused
      Annuste valimisel tuleks arvesse võtta kolme viivistoimega neurotoksilisuse ägeda toksilisuse katse tulemusi ja teisi uuritava ühendi toksilisi või kineetilisi andmeid. Tuleks valida kõrgeim doositase, mille eesmärgiks oleks toksilise toime esilekutsumine, eelistatult viivistoimega neurotoksilisus, kuid vältida tuleks doositaset, mis kutsub esile surma või tõsised kannatused. Seejärel tuleks valida aste-astmelt vähenevad doositasemed doosist tuleneva reaktsiooni ja madalaimal doositasemel täheldatava kahjuliku toimeta doosi (NOAEL) demonstreerimiseks.
      1.4.2.4.   Piirsisalduskatse
      Kui katses ei tuvastata käesolevas uuringus kirjeldatud menetlusega päevadoosil 1 000 mg kehakaalu kg kohta täheldatavat toksilist toimet ja kui toksilisus ei ole samalaadse struktuuriga ainete osas saadud andmete põhjal ootuspärane, ei loeta suurema doosiga uuringut vajalikuks. Teha võib piirsisalduskatse, välja arvatud juhul, kui inimese eeldatav kokkupuude viitab vajadusele kasutada suuremat doositaset.
      1.4.2.5.   Vaatlusperiood
      Kõiki loomi tuleks kokkupuuteperioodi ajal vaadelda vähemalt kord päevas ja pärast seda 14 päeva jooksul kuni kavandatava lahkamiseni.
      1.4.3.   Katse käik
      Loomadele doseeritakse uuritavat ainet seitsmel päeval nädalas ja 28 päeva jooksul.
      Üldised märkused
      Vaatlused peaksid algama kohe pärast katse algust. Kõiki kanu tuleks põhjalikult vaadelda 28päevase katseaja jooksul vähemalt kord päevas ja seejärel 14 päeva jooksul pärast manustamist või kuni kavandatava tapmiseni. Kõik toksilisuse märgid tuleks üles märkida, sealhulgas ilmnemise aeg, liik, raskusaste ja kestus. Vaatluste käigus tuleks vaadelda lisaks muule kõrvalekaldeid käitumises. Ataksiat tuleks mõõta ordinaalse hindamisskaalaga, milles on vähemalt neli taset ja paralüüsi esinemine tuleks registreerida. Kanad tuleks vähemalt kaks korda nädalas puurist välja lasta ning neid tuleks väiksemate toksiliste mõjude hindamise hõlbustamiseks liikuma sundida (näiteks redelil ronimine). Haigestunud loomad, kellel esineb suurt stressi või valu, eemaldatakse katsest, tapetakse humaanselt ja lahatakse.
      Kehakaal
      Kõiki kanu tuleks kaaluda vahetult enne uuritava aine esmakordset manustamist ning seejärel iga nädala järel.
      Biokeemia
      Kuus juhuslikult valitud kana igast katserühmast ja võrdlusrühmast, millele antakse vehiikelit, tuleks tappa mõne päeva jooksul pärast viimase doosi manustamist ning ajust ja nimmelülidest valmistatud valmistist hinnatakse neuropaatia sihtesteraasi (NTE) pidurdamisaktiivsuse osas. Lisaks sellele tuleks ette valmistada ja analüüsida istmikunärvi kude neuropaatia sihtesteraasi (NTE) pidurdamisaktiivsuse osas. Tavaliselt tapetakse kolm võrdlusrühma ja katserühma kuuluvat lindu 24 tunni pärast ja kolm lindu pärast viimase doosi manustamist. Kui ägeda toksilisuse uuringute või muude uuringute (nt toksikokineetika) andmed osutavad sellele, et loomade tapmine peaks toimuma muul ajal kui pärast viimase doosi andmist, tuleks neid aegu järgida ning põhjendused dokumenteerida.
      Vajaduse korral võib nende proovidega läbi viia ka atsetüülkoliinesteraasi analüüsi (AChE). AChE võib siiski spontaanselt in vivo reaktiveeruda ja tuua kaasa selle, et aine potentsiaali AChE inhibiitorina alahinnatakse.
      Täielik lahang
      Kõikide loomade (kelle tapmine oli kavatsetud ja kes olid suremas) täielik lahang peaks hõlmama aju ja seljaaju väliste tunnuste vaatlemist.
      Histopatoloogiline uuring
      Vaatlusperioodil ellujäänud ja biokeemilistes uuringutes kasutamata loomade närvikude tuleks mikroskoopiliselt uurida. Koed tuleks kinnitada kohapeal perfusiooni abil. Lõiked tuleks võtta väikeajust (keskmiselt pikitasandilt), piklikajust, seljaajust ja perifeersetest närvidest. Seljaaju puhul tuleb lõiked võtta ülemistest kaelalülidest, kesktorakaalosast ja lumbosakraalosast. Tuleks võtta lõiked ka tibiaalnärvi distaalsest osast ja selle kaksiksääre-marjalihase harudest ja istmikunärvist. Lõiked tuleks katta sobivate müeliini- ja aksonispetsiifiliste ainetega. Alguses tuleks kõikide võrdlusrühma ja kõrge doosiga rühmade loomade säilitatud kudesid mikroskoopiliselt uurida. Kui kõrge doosiga rühmade puhul on toime kohta tõendid olemas, tuleks mikroskoopiline uuring viia läbi ka keskmise ja madala doosiga rühmade puhul.
      2.   ANDMED
      Käesolevas meetodis valitud lõpp-punktide (biokeemia, histopatoloogia ja käitumuslik vaatlus) negatiivsed tulemused ei nõua tavapäraselt täiendavat uurimist viivistoimega neurotoksilisuse osas. Nendes lõpp-punktides saadud ebaselged või poolikud tulemused võivad nõuda täiendavat hindamist.
      Loomade kohta tuleks esitada andmed individuaalselt. Kõik andmed tuleks esitada kokkuvõtvalt tabelis, milles oleks iga katserühma kohta märgitud loomade arv katse alguses, vigastustega loomade arv, toime käitumisele või biokeemiline toime, kahjustuste või toime liik ja raskusaste, loomade protsent iga tüüpi vigastuste ja raskusastmete kohta.
      Käesoleva uuringu tulemusi tuleks hinnata käitumuslike, biokeemiliste ja histopatoloogiliste mõjude esinemise, raskusastme ja korrelatsiooni põhjal ja katse või võrdlusrühmas täheldatud muude mõjude suhtes.
      Numbrilisi tulemusi tuleks hinnata asjakohaste ja üldiselt tunnustatud statistiliste meetoditega. Statistilised meetodid tuleks valida uuringu kavandamise etapis.
      3.   ARUANDLUS
      KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab võimaluse korral sisaldama järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Katseloomad:
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatud aretusliin;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade arv ja vanus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              päritolu, pidamistingimused, toit jne;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              iga looma kaal katse alguses.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              uuritava aine ettevalmistamise, stabiilsuse ja homogeensuse üksikasjad, kui see on asjakohane;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vehiikeli valiku põhjendus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine manustamise üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              doosi valimise põhjendused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              manustatud dooside üksikasjad, sealhulgas andmed vehiikeli, mahu ja manustatud aine füüsilise vormi kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              teiste biokeemiliste määramiste aegade valimise põhjendus, kui selleks ei ole 24 või 48 tundi.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              kehakaalu andmed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toksilise reaktsiooni andmed vastavalt doositasemele, sealhulgas suremus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              täheldatava kahjuliku toimeta doos;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kliiniliste vaatluste iseloom, raskusaste ja kestus (pöördumatu või mitte);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              biokeemiliste meetodite ja leidude üksikasjalik kirjeldus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lahkamise tulemused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vajaduse korral tulemuste statistiline töötlemine.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste üle arutlemine.
               
            
                   
               
               
                  Järeldused.
               
            4.   VIITED
      Käesolev meetod on analoogne meetodiga OECD TG 419.
      B.39.   PLAANIVÄLISE DNA SÜNTEESI (UDS) KATSE IMETAJATE MAKSARAKKUDEGA IN VIVO
      
      1.   MEETOD
      Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 486, Unscheduled DNA Synthesis (UDS) Test with Mammalian Liver Cells In Vivo (1997).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Plaanivälise DNA sünteesi (UDS) katse imetajate maksarakkudega in vivo eesmärk on identifitseerida katseained, mis põhjustavad DNA parandust katseloomade maksarakkudes (1, 2, 3, 4).
      Käesolev in vivo katse on meetod keemiliste ainete genotoksiliste mõjude uurimiseks maksas. Mõõdetud lõpp-punkt ilmneb DNA kahjustuses ja selle hilisemas parandamises maksarakkudes. Maks on tavaliselt imendunud ühendite ainevahetuse peamine koht. See on seega sobiv koht DNA kahjustuse mõõtmiseks in vivo.
      
      Kui on tõendeid selle kohta, et uuritav aine ei pääse sihtkoesse, siis ei ole vaja kasutada käesolevat katset.
      Plaanivälise DNA sünteesi (UDS) lõpp-punkt mõõdetakse määrates märgistatud nukleosiidide ühinemist S-faasi DNA sünteesi väliste rakkudega. Enimkasutatav meetod on triitiumiga märgistatud tümidiini (3H-TdR) ühinemise määramine autoradiograafiliselt. In vivo UDS-katsetes kasutatakse eelistatult rotimaksasid. Võib kasutada ka muid kudesid peale maksa, kuid neid ei kirjeldata käesolevas meetodis.
      UDS-vastuse avastamine sõltub väljalõigatud ja asendatud DNA aluste arvust kahjustuse kohas. Seega on UDS-katse eriti väärtuslik ainetest põhjustatud „pikkade DNA osade paranduse” (longpatch repair) avastamiseks (20–30 alust). „Lühikeste osade parandus” (shortpatch repair) (1–3 alust) avastatakse palju väiksema tundlikkusega. Lisaks võivad mutageensed muutused aset leida DNA kahjustuste parandamata jätmisel, parandamisvigade või replikatsioonivigade tegemisel. UDS-vastuse ulatus ei viita parandusprotsessi usaldusväärsusele. Lisaks on võimalik, et mutageen reageerib DNAga, aga DNA kahjustust ei parandata lõikamis-parandamisprotsessi kaudu. Kuna lõpp-punkt mõõdetakse kogu genoomist, siis potentsiaalne tundlikkus korvab selle, et UDS-katse ei anna spetsiifilist teavet mutageense aktiivsuse kohta.
      Vt ka B osa üldist sissejuhatust.
      1.2.   MÕISTED
      
         Parandatavad rakud – osakeste netoarv tuumas ehk NNG-väärtus on suurem kui arvestuslik väärtus, mida on põhjendatud katset tegevas laboris.
      
         NNG-väärtus (net nuclear grains
         ) – rakkude UDS-aktiivsuse kvantitatiivne mõõtmine autoradiograafilistes UDS-katsetes, arvutatuna tuumale vastavatel tsütoplasma aladel (CG) tsütoplasma osakeste keskmise arvu mahaarvamisel tuumaosakeste arvust (NG): NNG = NG – CG. NNG-arvud arvutatakse üksikute rakkude kohta ja seejärel pannakse rakud kultuuris, paralleelsetes kultuurides jm kokku.
      
         Plaaniväline DNA süntees (UDS) – DNA parandussüntees pärast seda, kui keemiliste ainete või füüsikaliste mõjurite põhjustatud kahjustuse alal sisalduva DNA osa on lahti lõigatud ja eemaldatud kromosoomist.
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      UDS-katse imetajate maksarakkudega in vivo viitab DNA parandussünteesile pärast seda, kui keemiliste ainete või füüsikaliste mõjurite põhjustatud kahjustuse alal sisalduva DNA osa on lahti lõigatud ja eemaldatud kromosoomist. Katse põhineb enamasti 3H-TdR lisamisel maksarakkude DNA-sse, millel on üksnes väike rakutsükli S-faasis olevate rakkude esinemissagedus. 3H-TdR lisamine määratakse tavaliselt autoradiograafiliselt, kuna kõnealune tehnika ei ole vastuvõtlik S-faasis olevatele rakkudele, nagu nt vedeliktsintsillatsiooniloendus.
      1.4.   MEETODI KIRJELDUS
      1.4.1.   Preparaadid
      1.4.1.1.   Loomaliikide valik
      Tavaliselt kasutatakse rotte, kuigi võib kasutada mis tahes sobivaid imetajate liike. Rakendatakse noorte tervete loomade enimkasutatavaid laboritüvesid. Uuringut alustades peaks loomade kaalumuutus olema minimaalne ja ei tohiks ületada ± 20 % iga soo keskmisest kaalust.
      1.4.1.2.   Elamis- ja söötmistingimused
      Üldise sissejuhatuse B osas toodud üldtingimusi kohaldatakse, kuigi niiskuse eesmärk peaks olema 50–60 %.
      1.4.1.3.   Loomade ettevalmistamine
      Terved noored täiskasvanud loomad määratakse juhuvaliku alusel kontroll- ja katserühma. Puurid asetatakse nii, et puuri asetamisest tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Loomad identifitseeritakse individuaalselt ja hoitakse oma puurides vähemalt viis päeva enne uurimuse alustamist, et võimaldada labori tingimustega kohanemist.
      1.4.1.4.   Uuritav aine/preparaat
      Tahked uuritavad ained tuleb lahustada või suspendeerida sobivates lahustites või kandjaainetes ja vajadusel lahjendada enne loomadele andmist. Vedelaid uuritavaid aineid võib doseerida vahetult või lahjendatakse enne doseerimist. Tuleks kasutada uuritava aine värskeid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed püsivuse kohta näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav.
      1.4.2.   Katsetingimused
      1.4.2.1.   Lahusti/kandjaaine
      Lahusti/kandjaaine ei tohi avaldada toksilist mõju kasutatavate annuste korral ja ei tohi astuda keemilise reaktsiooni uuritava ainega. Kui kasutatakse muud kui tuntud lahustit/kandjaainet, peab nende kasutamine toetuma ühtesobivuse kohta käivatele andmetele. Soovitatav on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahustite/-kandjaainete kasutamist.
      1.4.2.2.   Kontrollid
      Igasse sõltumatult läbiviidud katseossa kaasatakse paralleelsed positiivsed ja negatiivsed (lahusti/kandjaaine) kontrollid. Kontrollrühma loomi käsitletakse sarnaselt katserühma loomadega, kuid neid ei töödelda uuritava ainega.
      Positiivsed kontrollid peaksid olema ained, mis teatavasti põhjustavad UDS-i, kui neid antakse annustena, mis ootuspäraselt põhjustavad avastatavat suurenemist taustaga võrreldes. Metaboolset aktiveerimist vajavaid positiivseid kontrolle tuleks kasutada annustena, mis annavad mõõduka vastuse (4). Annused valitakse nii, et mõjud on selged, kuid need ei paljasta lugejale koheselt kodeeritud objektiklaaside identiteeti. Positiivsete kontrollainete näited:
      
                  Proovivõtuaeg
               
               
                  Aine
               
               
                  CASi nr
               
               
                  EINECSi nr
               
            
                  Varane proovivõtuaeg (2–4 tundi)
               
               
                  Dimetüülnitrosoamiin
               
               
                  62-75-9
               
               
                  200-249-8
               
            
                  Hiline proovivõtuaeg (12–16 tundi)
               
               
                  N-2-atsetamiidfluor (2-AAF)
               
               
                  53-96-3
               
               
                  200-188-6
               
            Võidakse kasutada muid sobivaid positiivseid kontrollaineid. Positiivseid kontrollaineid võib manustada uuritavast ainest erineva manustamistee kaudu.
      1.5.   MENETLUS
      1.5.1.   Loomade arv ja sugu
      Katseloomade arv peaks olema piisav katsevastuses loodusliku bioloogilise varieerumise arvessevõtmiseks. Analüüsitavaid loomi peaks olema vähemalt kolm rühma kohta. Kui märkimisväärne andmebaas on kogutud juba varem, paralleelsete negatiivsete või positiivsete kontrollrühmade jaoks on vaja üksnes üks või kaks looma.
      Üksnes üht sugupoolt, eelistatult isasloomasid, võidakse kasutada, kui uurimuse ajal on kättesaadavad tulemused samas liigis ja sama vastuvõtlikkuse liini kasutades tehtud uurimuste kohta, mille tulemused näitavad, et toksilisuse osas ei ole märkimisväärseid erinevusi sugupoolte vahel. Kui inimese vastuvõtlikkus kemikaalidele on soospetsiifiline, nagu näiteks mõnede ravimite puhul, tehakse katse sobivast soost loomadega.
      1.5.2.   Manustamiskava
      Uuritavaid ained tuleb üldiselt anda ühekordse annusena.
      1.5.3.   Annused
      Normaalselt kasutatakse vähemalt kaht erinevat annust. Suurim annus määratletakse annusena, mis põhjustab sarnaseid mürgisusenähte, et samale manustamiskavale põhinevate suuremate annuste puhul võib tulemuseks olla surm. Üldiselt peaksid väiksemad annused olema 50–25 % suurest annusest.
      Ained, millel on spetsiifilised bioloogilised mõjud väikeste mittetoksiliste annustena (nt hormoonid ja mitogeenid), võivad olla erandiks annuse määramise kriteeriumidele ja neid tuleks hinnata iga üksikjuhtumi puhul eraldi. Kui tehakse annuse määramiseks uurimus sobivate andmete puudumisel, siis tehakse uurimus samas laboris, kasutades samu liike, tüvesid, sugu ja manustamiskava, mida kasutatakse põhiuurimuses.
      Suurim annus võidakse samuti määratleda annusena, mis viitab toksilisusele maksas (nt püknootiline tuum).
      1.5.4.   Piirsisalduskatse
      Kui katse ühe annusega, milleks on vähemalt 2 000 mg/kg kehakaalu kohta päevas ja mida manustatakse ühekordse annusena või kahe annusena samal päeval, ei põhjusta täheldatavaid toksilisi mõjusid ja kui genotoksilisus ootuspäraselt põhineb struktuurselt seotud ainete andmetel, siis ei peeta kolme annuse taset käsitlevat täielikku uurimust vajalikuks. Inimeste ootuspärane vastuvõtlikkus võib viidata piirkatses kasutavatest annustest suuremate annuste kasutamise vajadusele.
      1.5.5.   Manustamine
      Uuritavat ainet manustatakse tavaliselt söögitoru kaudu või sobiva intubeerimise kanüüli abil. Samuti võib muid manustamisteid kasutada, kui need on põhjendatud. Kõhukelmesisest teed siiski ei soovitata, kuna maks on sel juhul uuritavale ainele vahetult vastuvõtlikum kui vereringe kaudu. Vedeliku suurim kogus, mida saab söögitoru kaudu või süstides ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Kogus ei tohiks ületada 2 ml/100 g kehakaalu kohta. Suurimate koguste kasutamine peab olema põhjendatud. Arvesse võtmata ärritavaid või söövitavaid aineid, mille mõjud tavaliselt halvenevad suuremate kontsentratsioonide korral, tuleks vähendada katsekoguse varieeruvust, reguleerides kontsentratsioone nii, et kogumaht kõikide annuste korral jääks samaks.
      1.5.6.   Maksarakkude preparaadid
      Maksarakud prepareeritakse uuritavat ainet saanud loomadelt tavaliselt 12–16 tundi pärast annustamist. Täiendav varasem proovivõtuaeg (tavaliselt kaks kuni neli tundi manustamisjärgselt) on üldiselt vajalik, välja arvatud juhul, kui on saadud selge positiivne vastus 12–16 tunni jooksul. Muid proovivõtuaegasid võib kasutada, kui need on põhjendatud toksokineetiliste andmete põhjal.
      Imetajate maksarakkude lühiajalised kultuurid tehakse tavaliselt selleks, et perforeerida maksa kollagenaa-siga in situ ja võimaldada värskelt eraldunud maksarakkudel end kinnitada sobivale pinnasele. Negatiivsetelt kontroll-loomadelt pärit maksarakkudel peaks olema elujõulisus (5) vähemalt 50 %.
      1.5.7.   UDS-määramine
      Värskelt isoleeritud imetajate maksarakud inkubeeritakse tavaliselt keskkonnas, mis sisaldab 3H-TdR-i, sobiva pikkusega aja jooksul, nt kolm kuni kaheksa tundi. Inkubatsiooniperioodi lõpus tuleks sööde eraldada rakkudest, mida võidakse seejärel inkubeerida söötmes, mis sisaldab liiga palju märgistamata tümidiini inkorporeerimata radioaktiivsuse vähendamiseks (cold chase). Seejärel rakud loputatakse, fikseeritakse ja kuivatatakse. Pikema inkubatsiooniaja jooksul ei pruugi märgistamata tümidiiniga töötlemine olla vajalik. Objektiklaasid kastetakse autoradiograafilise emulsiooni sisse, valgustatakse pimedas (säilitatakse külmkapis 7–14 päeva), ilmutatakse, värvitakse ning arvutatakse valgustatud hõbeosakesed. Kaks kuni kolm objektiklaasi valmistatakse iga looma kohta.
      1.5.8.   Analüüs
      Objektiklaasi preparaadid peaksid sisaldama piisavalt rakke, mille morfoloogia on normaalne, milles võimaldatakse teha UDSi tähendusrikast hindamist. Preparaate uuritakse mikroskoopiliselt ilmsete tsütotoksiliste tunnuste suhtes (nt püknoos, radiomärgistuse vähenemine).
      Objektiklaasid kodeeritakse enne osakeste kokkulugemist. Tavaliselt igast loomast loetletakse 100 rakku vähemalt kahelt objektiklaasilt. Vähem kui 100 rakku/loom loendamine peab olema põhjendatud. Osakeste arvu ei arvutata S-faasis olevast tuumast, kuid S-faasi rakkude osa registreeritakse.
      Morfoloogiliselt normaalsete rakkude tuuma ja tsütoplasmasse inkorporeeritud 3H-TdR hulk, mida nähakse hõbeosakeste sadestumisel, määratakse sobivate meetodite abil.
      2.   ANDMED
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE
      Tuleb esitada individuaalsed objektiklaasi ja loomade andmed. Lisaks esitatakse kokkuvõte kõikidest tulemustest tabeli kujul. NNG-arvud arvutatakse iga raku, iga looma, iga annuse ja aja kohta CG-arvude mahaarvamisel NG-arvudest. Kui arvutatakse „parandatavate rakkude” arvu, peaks „parandatavate rakkude” määratlemine olema põhjendatud ja põhinema varasemate ja paralleelsete negatiivsete kontrollide andmetel. Numbrilisi tulemusi hinnatakse statistiliste meetodite abil. Kui statistilisi katseid kasutatakse, valitakse ja põhjendatakse neid enne uurimuse läbiviimist.
      2.2.   TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE
      Positiivsete/negatiivsete vastuste kriteeriumide näited hõlmavad:
      
                  positiivne
               
               
                  i)
               
               
                  NNG-väärtused on suuremad kui arvestuslik lävi, mis on õigustatud varasemate laboriandmete põhjal;
               
            
                  või
               
               
                  ii)
               
               
                  NNG väärtused on oluliselt suuremad kui paralleelsetes kontrollkatsetes;
               
            
                  negatiivne
               
               
                  i)
               
               
                  NNG väärtused on varasema kontroll-läve piires või sellest väiksemad;
               
            
                  või
               
               
                  ii)
               
               
                  NNG väärtused ei ole oluliselt suuremad kui paralleelsetes kontrollkatsetes.
               
            Tulemuste bioloogilist olulisust arutatakse: nt loomade väliste varieerumiste, doosi ja toime suhte ja tsütotoksilisuse parameetreid tuleks arvesse võtta. Statistilisi meetodeid võidakse kasutada abivahendina katsetulemuste hindamisel. Statistiline olulisus ei saa olla ainus määrav tegur positiivse vastuse saamiseks.
      Kuigi enamikul katsetest on selged positiivsed või negatiivsed tulemused, välistavad saadud tulemused harvadel juhtudel kindlate otsuste tegemise uuritava aine aktiivsuse kohta. Tulemused jäävad ebaselgeks või küsitavaks tehtud katsete kordamisest sõltumata.
      UDS-katse imetajate maksarakkudega in vivo positiivne tulemus viitab sellele, et uuritav aine põhjustab DNA kahjustuse imetajate maksarakkudes in vivo, mida saab parandada plaanivälise DNA sünteesi in vitro abil. Negatiivne tulemus viitab sellele, et uuritav aine ei põhjusta katsetingimustes DNA kahjustust, mis oleks käesolevas katses avastatav.
      Tõenäosust, et uuritav aine jõuab üldisesse vereringesse või eriti sihtkoesse (nt süsteemne toksilisus), tuleks arutada.
      3.   ARUANDLUS
      KATSEARUANNE
      Katsearuanne sisaldab järgmisi andmeid.
      
                   
               
               
                  Kandjaaine:
                  
                              —
                           
                           
                              kandjaaine valiku põhjendamine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandjaaines, kui on teada.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katseloomad:
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatud liigid/tüved;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade arv, vanus ja sugu;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              päritolu, elamistingimused, toitumine jne;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade individuaalne kaal katse alustamisel, sh kehakaalu vahemik, keskväärtus ja standardhälve iga rühma kohta;
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              positiivsed ja negatiivsed (kandjaaine/lahus) kontrollid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              annuse määramise katse tulemused, kui need on läbi viidud;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              annuste valiku põhimõtted;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine ettevalmistamise üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine manustamise üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              manustamistee;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              meetodid, mis kinnitavad, et uuritav aine jõuab üldvereringesse või sihtkoesse, vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toidu/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni (ppm) muutmine tegelikuks annuseks (mg/kg kehakaalu kohta päevas), vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              manustamis- ja proovivõtukavade detailne kirjeldus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toksilisuse mõõtmise meetodid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              maksarakkude preparaatide ja kultuuride valmistamise meetod;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kasutatud autoradiograafiline tehnika;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              prepareeritud objektiklaaside arv ja loendatud rakkude arv;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              hindamiskriteeriumid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kriteeriumid, mille alusel uurimusi liigitatakse positiivseteks, negatiivseteks või ebaselgeteks.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              tuumas olevate osakeste, tsütoplasmas olevate osakeste ja osakeste koguarvu tuumas keskväärtused üksikute objektiklaaside, loomade ja rühma kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              doosi ja toime suhe, võimaluse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              võimalikud statistilised analüüsid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toksilisuse tunnused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              paralleelsete negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kontrollide tulemused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              varasemate negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kontrollide andmed, sh vahemikud, keskväärtused ja standardhälbed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              „parandatavate rakkude” arv, kui see on määratud;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              S-faasi rakkude arv, kui see on määratud;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rakkude elujõulisus.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutelu.
               
            
                   
               
               
                  Järeldused
               
            4.   VIITED
      
                  (1)
               
               
                  Ashby, J. Lefevre, P. A., Burlinson, B. and Penman, M. G. (1985), An Assessment of the In Vivo Rat. Hepatocyte DNA Repair Assay, Mutation Res., 156, pp. 1-18.
               
            
                  (2)
               
               
                  Butterworth, B. E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G. (1987), A Protocol and Guide for the In Vivo Rat Hepatocyte DNA Repair Assay, Mutation Res., 189, pp. 123-133.
               
            
                  (3)
               
               
                  Kennelly, J. C, Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson, B., Benford, D. J., Dean, S. W. and Mitchell, I. de G. (1993), In Vivo Rat Liver UDS Assay, in: Kirkland D. J. and Fox M., (eds), Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part II revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 52-77.
               
            
                  (4)
               
               
                  Madle, S., Dean, S. W., Andrac, U., Brambilla. G., Burlinson, B., Doolittle, D. J., Furihata, C, Hertner, T., McQueen, C. A. and Mori, H. (1993), Recommendations for the Performance of UDS Tests In Vitro and In Vivo, Mutation Res., 312, pp. 263-285.
               
            
                  (5)
               
               
                  Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl. C. (1993), Assessment of the Relation Between the Initial Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes Used for the In Vivo/In Vitro DNA Repair Assay (UDS), Mutation Res., 291, pp. 21-27.
               
            
                  (6)
               
               
                  Mirsalis, J. C, Tyson, C. K. and Butterworth, B. E. (1982), Detection of Genotoxic Carcinogens in the In Vivo/In Vitro Hepalocyte DNA Repair Assay, Environ. Mutagen, 4, pp. 553-562.
               
            B.40.   NAHASÖÖVITUSKATSE IN VITRO: TRANSKUTAANSE ELEKTRITAKISTUSE (TER) MÕÕTMINE
      1.   MEETOD
      
      Käesolev katsemeetod vastab suunisele OECD TG 430 (2004).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Nahasöövitus tähendab pöördumatu koekahjustuse tekitamist nahas uuritava ainega (vastavalt keemiliste ainete ja segude liigitamise ja märgistamise ülemaailmselt harmoneeritud süsteemi (GHS) määratlusele) (1). Käesoleva meetodi puhul ei kasutata söövitava toime hindamiseks elusloomi.
      Nahka söövitava toime hindamisel on tavaliselt kasutatud laboriloomi (2). Kuna selline määramine põhjustas loomadele valu ja kannatusi, töötati välja katsemeetodi B.4 uus versioon, mille kohaselt on nahka söövitavat toimet võimalik hinnata alternatiivsete in vitro meetoditega, vältides valu ja kannatusi.
      Esimene samm muude katsete määratlemisel, mida saaks kasutada nahka söövitava toime uurimiseks õigusliku reguleerimise eesmärgil, oli eelvalideerimisuuring (3). Seejärel viidi läbi nahasöövituse hindamise in vitro meetodite (4 ja 5) vormikohane valideerimine (6, 7 ja 8). Kõnealuste uuringute ja muude kirjandusandmete alusel soovitatakse in vivo nahka söövitava toime määramiseks kasutada järgmisi katseid (9, 10 ja 11): katse inimnaha mudeliga (vt katsemeetod B.40a) ja transkutaanse elektritakistuse mõõtmine (käesolev meetod).
      Valideerimisuuring ja muud avaldatud uuringud on näidanud, et rotinaha transkutaanse elektritakistuse (TER) mõõtmisega (12 ja 13) saab usaldusväärselt eristada teadaolevaid nahka söövitavaid ja mittesöövitavaid aineid (5 ja 9).
      Käesolevas metoodikas kirjeldatud katse võimaldab kindlaks teha söövitavad keemilised ained ja segud. Samuti võimaldab see kindlaks määrata mittesöövitavad ained ja segud, kui seejuures arvestatakse ka muid kaalukaid tõendeid (nt pH, struktuuri-aktiivsuse seos, inim- ja/või loomkatsete andmed) (1, 2, 11 ja 14). Katse ei anna teavet nahaärrituse kohta, samuti ei võimalda see söövitavate ainete liigitamist ülemaailmselt harmoneeritud liigitus süsteemi (GHS) (1) lubatavuskriteeriumide alusel alamkategooriatesse.
      Lokaalse nahatoime põhjalikuks hindamiseks pärast naha ühekordset kokkupuudet ainega on soovitatav järgida järjestikuste katsete strateegiat, mis on esitatud katsemeetodi B.4 (2) lisas ja ülemaailmselt harmoneeritud süsteemis (1). Nimetatud katsestrateegia näeb ette in vitro katsete läbiviimise nahasöövituse (nagu kirjeldatud käesolevas meetodis) ja nahaärrituse uurimiseks, enne kui hakatakse kaaluma katsete läbiviimist elusloomadega.
      1.2.   MÕISTED
      
         Nahasöövitus
         
            in vivo
          – pöördumatu kahjustuse tekitamine nahas: läbi epidermise pärisnahka (dermasse) ulatuv nähtav nekroos, mis tekib kuni neljatunnisel kokkupuutel katseainega. Söövitusreaktsioonide tüüpilised avaldumisvormid on haavandid, verejooks, verised kärnad ning 14päevase vaatlusperioodi lõpuks värvimuutus naha valastumise tõttu, täielikult karvavabad alad ja armid. Küsitavate kahjustuste hindamiseks tuleks kaaluda histopatoloogilisi uuringuid.
      
         Transkutaanne elektritakistus (TER) – naha elektrilise impedantsi mõõt, takistuse väärtus väljendatuna kilo-oomides. Lihtne ja töökindel meetod kaitsefunktsiooni hindamiseks, salvestades Wheatstone’i silla abil nahka läbivad ioonivood.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Tabel 1
      Etalonkemikaalid
      
                  Nimetus
               
               
                  EINECSi number
               
               
                  CASi nr
               
               
                   
               
            
                  1,2-diaminopropaan
               
               
                  201-155-9
               
               
                  78-90-0
               
               
                  tugevalt söövitav
               
            
                  akrüülhape
               
               
                  201-177-9
               
               
                  79-10-7
               
               
                  tugevalt söövitav
               
            
                  2-tert-butüülfenool
               
               
                  201-807-2
               
               
                  88-18-6
               
               
                  söövitav
               
            
                  kaaliumhüdroksiid (10 %)
               
               
                  215-181-3
               
               
                  1310-58-3
               
               
                  söövitav
               
            
                  väävelhape (10 %)
               
               
                  231-639-5
               
               
                  7664-93-9
               
               
                  söövitav
               
            
                  oktaanhape (kaprüülhape)
               
               
                  204-677-5
               
               
                  124-07-02
               
               
                  söövitav
               
            
                  4-amino-1,2,4-triasool
               
               
                  209-533-5
               
               
                  584-13-4
               
               
                  mittesöövitav
               
            
                  eugenool
               
               
                  202-589-1
               
               
                  97-53-0
               
               
                  mittesöövitav
               
            
                  fenetüülbromiid
               
               
                  203-130-8
               
               
                  103-63-9
               
               
                  mittesöövitav
               
            
                  tetrakloroetüleen
               
               
                  204-825-9
               
               
                  27-18-4
               
               
                  mittesöövitav
               
            
                  isosteariinhape
               
               
                  250-178-0
               
               
                  30399-84-9
               
               
                  mittesöövitav
               
            
                  4-(metüültio)-bensaldehüüd
               
               
                  222-365-7
               
               
                  3446-89-7
               
               
                  mittesöövitav
               
            Enamik loetletud kemikaale on võetud ECVAMi rahvusvahelise valideerimisuuringu (4) jaoks valitud kemikaalide loetelust. Nende valimine põhineb järgmistel kriteeriumidel:
      
                  i)
               
               
                  söövitavate ja mittesöövitavate ainete võrdne arv;
               
            
                  ii)
               
               
                  kaubanduslikult kättesaadavad ained, millega on hõlmatud olulisemad keemiliste ainete klassid;
               
            
                  iii)
               
               
                  tugevalt söövitavate ja vähem söövitavate ainete lisamine loetellu, et võimaldada vahetegemist söövitusvõime alusel;
               
            
                  iv)
               
               
                  kemikaalid, mis ei kujuta laboris kasutamisel muud tõsist ohtu peale söövitava toime.
               
            1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritav aine kantakse kuni 24 tunniks nahaliistakute epidermisele kahekambrilises katsesüsteemis, milles nahaliistakud toimivad vaheseinana kambrite vahel. Nahaliistakud võetakse humaansel viisil surmatud 28–30 päeva vanustelt rottidelt. Söövitavad ained tehakse kindlaks nende võime järgi põhjustada normaalse sarvkihi (stratum corneum) terviklikkuse ja kaitsefunktsiooni kadumist, mida näitab TERi vähenemine allapoole läviväärtust (12). Roti TERi kriitiliseks väärtuseks on valitud 5 kΩ, selle valiku aluseks on suur hulk andmeid mitmesuguste kemikaalide kohta, kus enamik väärtusi olid kas tuntavalt üle (sageli rohkem kui 10 kΩ) või alla (sageli vähem kui 3 kΩ) selle väärtuse (12). Ained, mis ei ole loomadele mittesöövitavad, kuid on ärritavad või mitteärritavad, üldiselt ei vähenda TERi sedavõrd, et see langeb alla kõnealuse kriitilise väärtuse. Muude nahapreparaatide või muu aparatuuri kasutamine võib seejuures muuta seda kriitilist väärtust ning sel juhul on vajalik täiendav valideerimine.
      Meetodile on lisatud värvaine sidumise etapp, et kinnitada katsetamisel saadavaid TERi positiivseid tulemusi, sealhulgas 5 kΩ lähedal olevaid väärtusi. Värvaine sidumisega määratakse kindlaks, kas ioonilise läbitavuse suurenemine on tingitud sarvkihi füüsilisest hävimisest. TERi meetodiga suudeti rotinahka kasutades prognoosida in vivo söövitavat toimet jänesel, mida hinnati katsemeetodiga B.4 (2). Tuleb märkida, et in vivo katse jänesega on äärmiselt konservatiivne, nii naha söövitamise kui ka nahaärrituse seisukohast, võrreldes inimnaha tükikese katsega (15).
      1.5.   MEETODI KIRJELDUS
      1.5.1.   Katseloomad
      Valitud liigiks on rott, kuna eelnevalt on tõendatud roti naha tundlikkus kemikaalide suhtes selles katses (viide 10). Roti vanus (naha võtmise hetkel) ja aretusliin on eriti tähtsad, kuna peab olema tagatud, et karvanääpsud on uinuvas faasis enne täiskasvanu karvakasvu algust.
      Väikeste kääridega eemaldatakse hoolikalt noorte, umbes 22päevaste (Wistar-päritolu või võrreldava aretusliiniga) emas- või isasrottide selja- ja küljekarv. Seejärel pestakse loomad hoolikalt pühkides ning pügatud piirkond kastetakse üleni antibiootikumilahusesse (mis sisaldab näiteks streptomütsiini, penitsilliini, klooramfenikooli ja amfoteritsiini kontsentratsioonis, mis pidurdab bakterite kasvu). Loomi pestakse antibiootikumidega uuesti kolmandal või neljandal päeval pärast esimest puhastust ning kasutatakse kolme päeva jooksul pärast teist puhastust, kui sarvkiht on karvade eemaldamisest paranenud.
      1.5.2.   Nahaliistakute ettevalmistamine
      Loomad surmatakse humaansel viisil 28–30 päeva vanuses; see vanus on väga oluline. Seejärel eemaldatakse iga looma selja- ja küljenahk ning tõmmatakse sellelt ettevaatlikult maha liigne nahaalune rasvakiht. Nahast võetakse ümmargused liistakud läbimõõduga umbes 20 mm. Nahka võib enne liistakute kasutamist säilitada, kui on tõendatud, et positiivsed ja negatiivsed kontrollandmed on samaväärsed värsket nahka kasutades saadud andmetega.
      Iga nahaliistak asetatakse polütetrafluoroetüleentoru (edaspidi: PTFE-toru) ühele otsale, nii et toruga on kontaktis epidermisepoolne pind. Toru otsa surutakse naha paigal hoidmiseks kummist rõngastihend ja liigne kude lõigatakse ära. Toru ja rõngastihendi mõõtmed on esitatud joonisel 2. Seejärel ühendatakse kummist rõngastihendi ja PTFE-toru ühenduskoht hoolikalt vaseliiniga. Toru kinnitatakse vedruklambriga vastuvõtunõus, mis sisaldab magneesiumsulfaadi (MgSO4) lahust (154 mM) (joonis 1). Kogu nahaliistak peab asuma MgSO4 lahuses. Ühe roti nahast võib saada 10–15 nahaliistakut.
      Enne katse algust mõõdetakse iga looma naha kvaliteedi kontrollimiseks kahe nahaliistaku elektritakistus. Mõlema liistaku elektritakistus peaks olema suurem kui 10 kΩ, ainult siis tohib ülejäänud liistakuid kasutada. Kui takistus on väiksem kui 10 kΩ, tuleb kõik sellest nahast saadud liistakud ära visata.
      1.5.3.   Uuritavate ja kontrollainete pealekandmine
      Uurimismudeli adekvaatse toimimise tagamiseks tuleks igas uuringus kasutada paralleelselt nii positiivseid kui ka negatiivseid kontrollaineid. Tuleks kasutada ühelt ja samalt loomalt saadud nahaliistakuid. Soovitatavad positiivsed ja negatiivsed kontrollained on vastavalt 10 M soolhape ja destilleeritud vesi.
      Vedelad katseained (150 μl) kantakse ühtlaselt toru sees olevale epidermisele. Tahke aine uurimisel kantakse piisav kogus tahket ainet ühtlaselt nahaliistakule, nii et kogu epidermise pind on kaetud. Tahkele ainele valatakse deioniseeritud vett (150 μl) ja toru raputatakse ettevaatlikult. Nahaga maksimaalse kontakti saavutamiseks võib tahke aine olla sulamiseks või pehmenemiseks soojendatud kuni 30 oC-ni või peenestatud teralise materjali või pulbri saamiseks.
      Iga uuritava ja kontrollaine puhul kasutatakse kolme nahaliistakut. Uuritav aine kantakse liistakule 20–23 oC juures 24 tunniks. Uuritav aine kõrvaldatakse pesemisega kuni 30kraadise kraanivee joa all, kuni täiendavat materjali maha pesta enam ei õnnestu.
      1.5.4.   TER i mõõtm ine
      Naha impedantsi – TERi – mõõdetakse madalpingel töötava Wheatstone'i vahelduvvoolusilla abil (13). Mõõtesilla üldised tehnilised näitajad on järgmised: tööpinge 1–3 V, siinus- või ristkülikvahelduvvool sagedusega 50–1 000 Hz ja mõõtediapasoon vähemalt 0,1–30 kΩ. Valideerimisel kasutatud mõõtesillaga mõõdetakse induktiivsust, mahtuvust ja takistust kuni väärtusteni vastavalt 2 000 H, 2 000 μF ja 2 MD sagedustel 100 Hz või 1 kHz, kasutades jada- või rööpühenduse puhul saadud näitusid. TERi määramiseks söövitavuskatses registreeritakse takistuse väärtused sagedusel 100 Hz, kasutades jadaühenduse puhul saadud näitusid. Enne elektritakistuse mõõtmist vähendatakse naha pindpinevust, lisades epidermise katmiseks piisavas koguses 70 %list etanooli. Mõne sekundi pärast eemaldatakse etanool torust ja kude niisutatakse 3 ml MgSO4 lahuse (154 mM) lisamisega. Nahaliistaku mõlemale küljele paigutatakse mõõtesilla elektroodid, et mõõta takistust ühikutes kΩ/nahaliistak (joonis 1). Elektroodi mõõtmed ja hammasklambrist allapoole ulatuva elektroodiosa pikkus on esitatud joonisel 2. Sisemisele elektroodile kinnitatav klamber toetub takistuse mõõtmise ajal PTFE-toru otsale, nii et elektrood on ettenähtud pikkuses sukeldatud MgSO4 lahusesse. Välimine elektrood paigutatakse vastuvõtunõusse nii, et see toetub nõu põhjale. Vedruklambri ja PTFE-toru põhja vaheline kaugus hoitakse konstantne (joonis 2), sest see kaugus mõjutab saadud takistuse väärtust. Seega peaks vahemaa sisemise elektroodi ja nahaliistaku vahel olema konstantne ja minimaalne (1–2 mm).
      Kui mõõdetud takistuse väärtus on üle 20 kΩ, võib see olla tingitud nahaliistaku epidermist katva katseaine jääkidest. Võib proovida seda kihti veel kord eemaldada, näiteks sulgedes PTFE-toru kinnastatud pöidlaga ja loksutades seda umbes kümne sekundi jooksul; MgSO4 lahus valatakse ära ja takistuse mõõtmist korratakse värske MgSO4 lahusega.
      Katseseadme omadused ja mõõtmed ning katse läbiviimise kord võivad mõjutada saadud TERi väärtusi. Söövituse läviväärtus 5 kΩ töötati välja käesolevas metoodikas kirjeldatud konkreetse seadme ja mõõtmismeetodiga saadud andmete põhjal. Katsetingimuste muutmisel või teistsuguse seadme kasutamisel võivad lävi- ja kontrollväärtused olla teised. Seepärast on vaja metoodika ja takistuse läviväärtused kalibreerida, tehes mõõtmisi valideerimisel kasutatud kemikaalide (4 ja 5) või uuritavate kemikaalidega sarnaste keemiliste klasside hulgast valitud etalonkemikaalidega. Sobivate etalonkemikaalide loetelu on esitatud tabelis 1.
      1.5.5.   Värvaine sidumisel põhinevad meetodid
      Teatavate mittesöövitavate ainetega kokkupuutumise tulemusel võib takistus väheneda alla kriitilise väärtuse 5 kΩ, võimaldades ioonivoogudel liikuda läbi sarvkihi ja vähendades niimoodi elektritakistust (5). Näiteks võivad pinnakihti mõjutavate omadustega neutraalsed orgaanilised ühendid ja kemikaalid (sealhulgas detergendid, emulgaatorid ja muud pindaktiivsed ained) eemaldada nahast lipiidid, muutes kaitsekihi ioonidele paremini läbitavaks. Kui uuritavate ainete TERi väärtused nähtavate kahjustuste puudumise korral on väiksemad kui 5 kΩ või sellega võrdsed, tuleks seepärast nii kontroll- kui ka katsekoega viia läbi värvaine sissetungimise määramine, mis võimaldab otsustada, kas saadud TERi väärtused olid põhjustatud naha suurenenud läbilaskevõimest või söövitusest (3 ja 5). Viimasel juhul tungib värvaine sulforodamiin B nahapinnale kantuna vigastatud sarvkihi kohalt kiiresti läbi naha ja värvib nahaalused koed. See konkreetne värvaine on püsiv paljude kemikaalide suhtes ning seda ei mõjuta allpool kirjeldatud ekstraheerimine.
      1.5.5.1.   Värvaine sulforodamiin B pealekandmine ja kõrvaldamine
      Pärast TERi määramist valatakse magneesiumsulfaat torust välja ja nahka uuritakse hoolikalt märgatavate kahjustuste suhtes. Kui märgatavaid kahjustusi ei ole, kantakse iga nahaliistaku epidermiseküljele kaheks tunniks 150 μl värvaine sulforodamiin B (happeline punane 52; C.I. 45100; EINECSi number 222-529-8; CASi number 3520-42-1) 10 %list (mass/maht) lahust destilleeritud vees. Seejärel pestakse nahaliistakuid mitte soojema kui toatemperatuuril kraaniveega ligikaudu kümme sekundit liigse/mitteseotud värvaine eemaldamiseks. Iga nahaliistak eemaldatakse ettevaatlikult PTFE-torult ja asetatakse väiksesse pudelisse (nt 20 ml klaasist stsintillatsioonianum), mis sisaldab deioniseeritud vett (8 ml). Pudelikesi loksutatakse ettevaatlikult viis minutit, et eemaldada kogu mitteseotud värvaine. Seejärel loputusprotseduuri korratakse ning pärast seda eemaldatakse nahaliistakud ja pannakse väikestesse pudelitesse, mis sisaldavad 5 ml 30 %list (mass/maht) naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) lahust destilleeritud vees ning inkubeeritakse temperatuuril 60 oC hommikuni.
      Pärast inkubeerimist eemaldatakse nahaliistakud ja visatakse ära ning järelejäänud lahust tsentrifuugitakse kaheksa minutit temperatuuril 21 oC (suhteline tsentrifugaaljõud ~175 g). Seejärel lahjendatakse supernatandist võetud 1 ml proovi viis korda (maht/maht) (st 1 ml + 4 ml) 30 %lise (massi/mahuprotsent) SDSiga destilleeritud vees. Mõõdetakse lahuse optiline tihedus lainepikkusel 565 nm.
      1.5.5.2.   Värvaine sisalduse arvutamine
      Värvaine sulforodamiin B sisaldus liistakus arvutatakse optilise tiheduse väärtustest (5) (värvaine sulforodamiin B molaarne ekstinktsioonikoefitsient lainepikkusel 565 nm on 8,7 x 104; molekulmass on 580). Sobiva kalibreerimiskõvera abil määratakse värvainesisaldus igas nahaliistakus ning seejärel arvutatakse värvaine keskmine sisaldus paralleelkatsetes.
      2.   ANDMED
      Takistuse väärtused (kΩ) ja värvainesisalduse keskmised väärtused (μg/liistak) tuleks võimaluse korral esitada tabelina nii uuritava aine kui ka positiivse ja negatiivse kontrollproovi kohta (üksikkatsete tulemused ja keskmised ± standardhälve); esitatakse kõigi paralleel- või korduskatsete tulemused, keskmised ja individuaalsed väärtused.
      2.1.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE
      TERi keskmised tulemused on aktsepteeritavad, kui samaaegsete positiivsete ja negatiivsete kontrollkatsete väärtused langevad väärtuste lubatud vahemikku, mis on mõõtmist läbiviivas laboris saadud käesoleva meetodi puhul. Lubatud takistuse piirväärtused eespool kirjeldatud metoodika ja seadme puhul on esitatud järgmises tabelis:
      
                  
                     Kontrollkatse
                  
               
               
                  
                     Aine
                  
               
               
                  
                     Takistuse vahemik (kΩ)
                  
               
            
                  positiivne
               
               
                  10 M soolhape
               
               
                  0,5–1,0
               
            
                  negatiivne
               
               
                  destilleeritud vesi
               
               
                  10–25
               
            Värvaine sidumise keskmised tulemused on aktsepteeritavad tingimusel, et samaaegsed kontrollväärtused jäävad meetodi jaoks lubatud piiridesse. Soovitatavad aktsepteeritavad värvainesisalduse vahemikud kontrollainete jaoks eespool kirjeldatud metoodika ja seadme puhul on järgmised:
      
                  
                     Kontrollkatse
                  
               
               
                  
                     Aine
                  
               
               
                  Värvainesisalduse vahemik (μg/liistak)
               
            
                  positiivne
               
               
                  10 M soolhape
               
               
                  40–100
               
            
                  negatiivne
               
               
                  destilleeritud vesi
               
               
                  15–35
               
            Katseainet peetakse nahka mitte söövitavaks, kui
      
                  i)
               
               
                  uuritava aine jaoks saadud TERi keskmine väärtus on üle 5 kΩ või
               
            
                  ii)
               
               
                  TERi keskmine väärtus on väiksem kui 5kΩ või sellega võrdne ja
                  
                              —
                           
                           
                              nahaliistakul ei näi olevat silmanähtavat kahjustust;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              nahaliistaku keskmine värvainesisaldus on palju väiksem liistaku keskmisest värvainesisaldusest samaaegselt tehtud positiivses kontrollkatses 10 M HCl-ga.
                           
                        
            Katseaine loetakse nahka söövitavaks, kui:
      
                  i)
               
               
                  TERi keskmine väärtus on väiksem kui 5 kΩ või sellega võrdne ja nahaliistak on märgatavalt kahjustatud või
               
            
                  ii)
               
               
                  TERi keskmine väärtus on väiksem kui 5 kΩ või sellega võrdne ja
                  
                              —
                           
                           
                              nahaliistakul ei paista märgatavat kahjustust, aga
                           
                        
                              —
                           
                           
                              nahaliistaku keskmine värvainesisaldus on suurem kui liistaku keskmine värvainesisaldus samaaegselt läbiviidud positiivses kontrollkatses 10 M HCl-ga või sellega võrdne.
                           
                        
            3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuandes esitatakse järgmine teave.
      
                   
               
               
                  Uuritav aine ja kontrollaine:
                  
                              —
                           
                           
                              keemiline nimetus või nimetused, nagu IUPACi või CASi nimetus ja CASi number, kui on teada;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aine puhtus või valmisuse koostis (massiprotsendina), füüsikalised omadused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              füüsikalis-keemilised omadused nagu füüsiline olek, pH, püsivus, lahustuvus vees, mis on olulised katse
                           
                        
                              —
                           
                           
                              läbiviimise seisukohast;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava/kontrollaine töötlemine enne katset, kui see on asjakohane (nt soojendamine, peenestamine);
                           
                        
            
                   
               
               
                  püsivus, kui on teada.
                  
                              —
                           
                           
                              Katseloomad:
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kasutatud aretusliinid ja sugu;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              looma vanus doonorloomana kasutamise hetkel;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              päritolu, pidamistingimused, toit jms;
                           
                        
            
                   
               
               
                  naha ettevalmistamise üksikasjad.
                  
                              —
                           
                           
                              Katsetingimused:
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katseseadme kalibreerimiskõverad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kalibreerimiskõverad värvaine sidumise katse läbiviimiseks;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              TERi mõõtmise meetodi üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              värvaine sidumise määramismeetodi üksikasjad (vajaduse korral);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kõigi metoodikas tehtud muudatuste kirjeldus;
                           
                        
            
                   
               
               
                  kasutatud hindamiskriteeriumide kirjeldus.
                  
                              —
                           
                           
                              Tulemused:
                           
                        
                              —
                           
                           
                              andmetabelid TERi ja värvaine sidumise katsete kohta (kui sellised katseid tehti) üksikute loomade ja üksikute nahaproovide kaupa; mis tahes täheldatud muutuste kirjeldus.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutelu.
               
            
                   
               
               
                  Järeldused.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
               
            
                  2)
               
               
                  Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/Corrosion.
               
            
                  3)
               
               
                  Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995). A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219-255.
               
            
                  4)
               
               
                  Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic. in Vitro 12, 471-482.
               
            
                  5)
               
               
                  Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhütter, H.-G., and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxic. in Vitro 12, 483-524.
               
            
                  6)
               
               
                  OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods, 62pp.
               
            
                  7)
               
               
                  Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. The report and recommendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147.
               
            
                  8)
               
               
                  ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf
               
            
                  9)
               
               
                  ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.
               
            
                  10)
               
               
                  ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
               
            
                  11)
               
               
                  OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st - 2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from the Secretariat
               
            
                  12)
               
               
                  Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C. (1986). An in vitro skin corrosivity test -modificationsand validation. Fd. Chem. Toxicol. 24, 507-512.
               
            
                  13)
               
               
                  Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, J. (1992). The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial. Toxic. in Vitro 6, 191-194.
               
            
                  14)
               
               
                  Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 709-720.
               
            
                  15)
               
               
                  Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, M., Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, 845-852.
               
            
                  16)
               
               
                  Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C. (1988). An In Vitro model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial Validation. Toxic. in Vitro. 2, 7-17.
               
            Joonis 1
      Rotinaha TERi mõõtmisel kasutatav seade
      
         
      Joonis 2
      Polütetrafluoroetüleentoru (PTFE-toru) j a vastuvõtunõu ning kasutatud elektroodide mõõtmed
      
         
      
         Olulised tegurid eespool kujutatud seadme puhul:
      
      
                  —
               
               
                  PTFE-toru siseläbimõõt;
               
            
                  —
               
               
                  elektroodide pikkus PTFE-toru ja vastuvõtunõuga võrreldes on selline, et nahaliistak ei puutuks elektroodide vastu ning et elektroodi teatav standardpikkus oleks kokkupuutes MgS04 lahusega;
               
            
                  —
               
               
                  MgSO4 lahuse hulk vastuvõtunõus peaks vedeliku tasemega PTFE torus võrreldes olema selline, et vedeliku sügavus vastaks joonisel 1 näidatule;
               
            
                  —
               
               
                  nahaliistak peaks olema kinnitatud PTFE-toru külge nii hästi, et elektritakistus iseloomustaks tõepoolest naha omadusi.
               
            B.40b.   NAHASÖÖVITUS IN VITRO: KATSE INIMNAHA MUDELIGA
      1.   MEETOD
      Käesolev katsemeetod vastab suunisele OECD TG 431 (2004).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Nahasöövitus tähendab pöördumatu koekahjustuse tekitamist nahas uuritava ainega (vastavalt keemiliste ainete ja segude liigitamise ja märgistamise ülemaailmselt harmoneeritud süsteemi (GHS) määratlusele) (1). Käesoleva meetodi puhul ei kasutata nahka söövitava toime hindamiseks elusloomi ega loomset kudet.
      Nahka söövitava toime hindamisel on tavaliselt kasutatud laboriloomi (2). Kuna selline määramine põhjustab loomadele valu ja kannatusi, töötati välja katsemeetodi B.4 uus versioon, millega saab nahka söövitavat toimet hinnata alternatiivsete in vitro meetoditega, vältides loomadele valu ja kannatuste tekitamist.
      Esimene samm muude katsete määratlemisel, mida saaks kasutada nahka söövitava toime uurimiseks õigusliku reguleerimise eesmärgil, oli eelvalideerimisuuring (3). Seejärel viidi läbi nahasöövituse hindamise in vitro meetodite (4 ja 5) vormikohane valideerimine (6, 7 ja 8). Kõnealuste uuringute ja muude kirjandusandmete (9) alusel soovitatakse in vivo nahka söövitava toime määramiseks kasutada järgmisi katseid (10–13): katse inimnaha mudeliga (käesolev meetod) ja transkutaanse elektritakistuse mõõtmine (vt katsemeetod B.40).
      Valideerimisuuringutega on näidatud, et katsetega inimnaha mudelil (3, 4, 5 ja 9) saab usaldusväärselt eristada teadaolevaid nahka söövitavaid ja mittesöövitavaid aineid. Katseprotokolli alusel võib samuti teha järeldusi, kas aine kuulub nahka tugevalt või nõrgalt söövitavate ainete hulka.
      Käesolevas metoodikas kirjeldatud katse võimaldab kindlaks teha söövitavad keemilised ained ja segud. Samuti võimaldab see kindlaks määrata mittesöövitavad ained ja segud, kui seejuures arvestatakse ka muid kaalukaid tõendeid (nt pH, struktuuri-aktiivsuse seos, inim- või loomkatsete andmed) (1, 2, 13 ja 14). Katse ei anna üldiselt piisavat teavet nahaärrituse kohta, samuti ei võimalda see söövitavate ainete liigitamist ülemaailmselt harmoneeritud liigitus süsteemi (GHS) (viide 1) lubatavuskriteeriumide alusel alamkategooriatesse.
      Lokaalse nahatoime täielikul hindamisel pärast naha ühekordset kokkupuudet ainega on soovitatav järgida järjestikuste katsete strateegiat, mis on esitatud katsemeetodi B.4 (2) lisas ja ülemaailmselt harmoneeritud süsteemis (1). Nimetatud strateegia hõlmab in vitro katsete läbiviimist nahasöövituse (nagu kirjeldatud käesolevas meetodis) ja nahaärrituse uurimiseks, enne kui hakatakse kaaluma katsete läbiviimist elusloomadega.
      1.2.   MÕISTED
      
         Nahasöövitus
         
            in vivo – pöördumatu kahjustuse tekitamine nahas: läbi epidermise pärisnahka (dermasse) ulatuv nähtav nekroos, mis tekib kuni neljatunnisel kokkupuutel katseainega. Söövitusreaktsioonide tüüpilised avaldumisvormid on haavandid, verejooks, verised kärnad ning 14päevase vaatlusperioodi lõpuks värvimuutus naha valastumise tõttu, täielikult karvavabad alad ja armid. Küsitavate kahjustuste hindamiseks tuleks kaaluda histopatoloogilisi uuringuid.
      
         Rakkude eluvõimelisus – rakupopulatsiooni üldist aktiivust (nt raku mitokondrite dehüdrogenaaside võime taandada vitaalvärvainet MTT) väljendav parameeter, mis olenevalt mõõdetavast muutujast ja katseplaanist korreleerub rakkude koguarvu ja/või vitaalsusega.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Tabel 1
      Etalonkemikaalid
      
                  Nimetus
               
               
                  EINECSi number
               
               
                  CASi nr
               
               
                   
               
            
                  1,2-diaminopropaan
               
               
                  201-155-9
               
               
                  78-90-0
               
               
                  tugevalt söövitav
               
            
                  akrüülhape
               
               
                  201-177-9
               
               
                  79-10-7
               
               
                  tugevalt söövitav
               
            
                  2-tert-butüülfenool
               
               
                  201-807-2
               
               
                  88-18-6
               
               
                  söövitav
               
            
                  kaaliumhüdroksiid (10 %)
               
               
                  215-181-3
               
               
                  1310-58-3
               
               
                  söövitav
               
            
                  väävelhape (10 %)
               
               
                  231-639-5
               
               
                  7664-93-9
               
               
                  söövitav
               
            
                  oktaanhape (kaprüülhape)
               
               
                  204-677-5
               
               
                  124-07-02
               
               
                  söövitav
               
            
                  4-amino-1,2,4-triasool
               
               
                  209-533-5
               
               
                  584-13-4
               
               
                  mittesöövitav
               
            
                  eugenool
               
               
                  202-589-1
               
               
                  97-53-0
               
               
                  mittesöövitav
               
            
                  fenetüülbromiid
               
               
                  203-130-8
               
               
                  103-63-9
               
               
                  mittesöövitav
               
            
                  tetrakloroetüleen
               
               
                  204-825-9
               
               
                  27-18-4
               
               
                  mittesöövitav
               
            
                  isosteariinhape
               
               
                  250-178-0
               
               
                  30399-84-9
               
               
                  mittesöövitav
               
            
                  4-(metüültio)-bensaldehüüd
               
               
                  222-365-7
               
               
                  3446-89-7
               
               
                  mittesöövitav
               
            Enamik loetletud kemikaale on võetud ECVAMi rahvusvahelise valideerimisuuringu (4) jaoks valitud kemikaalide loetelust. Nende valimine põhineb järgmistel kriteeriumidel:
      
                  i)
               
               
                  söövitavate ja mittesöövitavate ainete võrdne arv;
               
            
                  ii)
               
               
                  kaubanduslikult kättesaadavad ained, millega on hõlmatud olulisemad keemiliste ainete klassid;
               
            
                  iii)
               
               
                  tugevalt söövitavate ja vähem söövitavate ainete lisamine loetellu, et võimaldada vahetegemist söövitusvõime alusel;
               
            
                  iv)
               
               
                  kemikaalid, mis ei kujuta laboris kasutamisel muud tõsist ohtu peale söövitava toime.
               
            1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritav aine kantakse paikselt kolmemõõtmelisele inimnaha mudelile, mis sisaldab vähemalt talitleva sarvkihiga (stratum corneum) rekonstrueeritud epidermist. Söövitavad ained tehakse kindlaks nende võime järgi vähendada rakkude eluvõimelisust (mis määratakse näiteks MTT taandamise katse abil (15)) alla kindlaksmääratud läviväärtuse kindla toimeaja jooksul. Inimnaha mudeli katse põhineb hüpoteesil, et söövitavad kemikaalid suudavad difusiooni või erosiooni teel tungida läbi sarvkihi ja on tsütotoksilised allpool asuvatele rakukihtidele.
      1.4.1.   Katse käik
      1.4.1.1.   Inimnaha mudelid
      Võib kasutada tööstuslikult konstrueeritud või saadud inimnaha mudelit (nt mudelid EpiDerm™ ja EPISKIN™) (16–19) või mudelit, mis on välja töötatud või konstrueeritud oma laboris (20 ja 21). Inimese naha kasutamine toimub muidugi vastavalt iga riigi ja rahvusvahelistele eetilistele tõekspidamistele ja tingimustele. Iga uus mudel tuleks valideerida (vähemalt sel määral, nagu kirjeldatud punktis 1.4.1.1.2). Käesolevas katses kasutatavad inimnaha mudelid peavad vastama järgmistele tingimustele:
      1.4.1.1.1.   Mudeli üldised tingimused
      
      Epiteelkoe ehitamiseks tuleb kasutada inimese epiteelrakke (keratinotsüüte). Talitleva sarvkihi all peab olema mitu kihti eluvõimelisi epiteelrakke. Nahamudelis võib olla ka stroomakiht. Sarvkiht peab olema mitmekihiline ja vajaliku lipiidse koostisega, et tekiks sellise tugevusega funktsionaalne kaitsekiht, mis suudab takistada tsütotoksiliste markerite kiiret läbitungimist. Mudel peab olema selline, et aine ei saaks tungida eluskudedesse sarvkihist mööda minnes. Kui uuritav aine pääseb sarvkihist mööda, siis ei modelleeri see süsteem enam uuritava aine kokkupuutumist nahaga. Nahamudel ei tohi olla saastunud bakterite (sealhulgas mükoplasma) ega seentega.
      1.4.1.1.2.   Mudeli funktsionaalsed tingimused
      
      Eluvõimelisust mõõdetakse tavaliselt MTT või muude metaboolselt muundatavate vitaalvärvainete abil. Sellisel juhul peab negatiivse kontrolli koest ekstraheeritud (lahustatud) värvaine optiline tihedus (OD) olema vähemalt 20 korda suurem kui ekstraheerimislahuse OD (vt ülevaade, 22). Negatiivse kontrolli kude peaks olema kasvatamisel stabiilne (eluvõimelisuse näitajad ei tohiks muutuda) kogu katseaja jooksul. Sarvkiht peaks olema piisavalt tugev, et teatavad tsütotoksilised markerkemikaalid (nt 1 % Triton X-100) ei saaks sellest kiiresti läbi tungida. Seda omadust saab hinnata kokkupuuteaja järgi, mis on vajalik rakkude eluvõimelisuse vähendamiseks 50 % võrra (ET50) (nt EpiDerm™ ja EPISKIN™ mudelite puhul on see üle kahe tunni). Kudet peaks saama reprodutseerida ajas ja eelistatavalt ka eri laborites. Lisaks peaks koega saama valitud katsemeetodit kasutades prognoosida võrdluskemikaalide (vt tabel 1) söövitusvõimet.
      1.4.1.2.   Uuritavate ja kontrollainete pealekandmine
      Iga töötlemise (kokkupuuteaja), sealhulgas kontrollproovide puhul kasutatakse kahte ühesugust koeproovi. Vedela aine korral tuleb nahale kanda piisav kogus uuritavat ainet, et see kataks naha ühtlaselt: tuleks kasutada vähemalt 25 μl/cm2. Tahket uuritavat ainet tuleb nahale kanda piisav kogus, et see kataks kogu naha ühtlaselt, ja niisutada deioniseeritud või destilleeritud veega, et tagada hea kontakt nahaga. Tahked ained tuleks enne pealekandmist peenestada vajaduse korral pulbriks. Tuleb valida uuritava aine kohane pealekandmise meetod (vt nt viidet 5). Kokkupuuteperioodi lõpus tuleb katseaine nahapinnalt hoolikalt maha pesta sobiva puhverlahusega või 0,9 %lise NaCl lahusega.
      Uurimismudeli adekvaatsuse tõendamiseks tuleks igas uuringus kasutada paralleelselt nii positiivseid kui ka negatiivseid kontrollaineid. Soovitatavad positiivsed kontrollained on jää-äädikhape või 8N KOH. Soovitatavad negatiivsed kontrollained on 0,9 %line NaCl või vesi.
      1.4.1.3.   Rakkude eluvõimelisuse mõõtmine
      Rakkude eluvõimelisuse mõõtmiseks võib kasutada ainult kvantitatiivseid valideeritud meetodeid. Lisaks peab eluvõimelisuse mõõt sobima kasutamiseks kolmemõõtmelises koekonstruktsioonis. Värvaine mittespetsiifiline sidumine ei tohi segada eluvõimelisuse mõõtmist. Seepärast ei sobi valku siduvad värvained ja ained, mida metaboolselt ei muundata (nt neutraalpunane). Kõige sagedamini kasutatav katse on MTT [3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid, tiasolüülsinine: EINECSi number 206-069-5, CASi number 298-93-1)] taandamine, mille kohta on näidatud, et tulemused on täpsed ja reprodutseeritavad (5), kuid kasutada võib ka muid. Nahaproov asetatakse sobiva kontsentratsiooniga (nt 0,3–1 mg/ml) MTT lahusesse sobival inkubatsioonitemperatuuril kolmeks tunniks. Sadestunud sinine formasaan ekstraheeritakse seejärel lahustiga (isopropanool) ja formasaani kontsentratsioon määratakse OD mõõtmisega lainepikkusel 540–595 nm.
      Uuritava aine keemiline toime vitaalvärvile võib jäljendada raku ainevahetust, mille tagajärjel hinnatakse eluvõimelisust valesti. See juhtub siis, kui uuritavat ainet ei ole loputamisega nahalt täielikult eemaldatud (9). Kui uuritav aine reageerib otse vitaalvärviga, tuleks kasutada täiendavaid kontrollproove, et avastada ja parandada uuritava aine segavat mõju eluvõimelisuse määramisele (9 ja 23).
      2.   ANDMED
      Iga koe puhul esitatakse OD väärtused ja rakkude eluvõimelisuse andmed (protsentides) uuritava aine ning positiivsete ja negatiivsete kontrollproovide kohta tabelina; tabelis esitatakse ka andmed dubleeritud korduskatsetest, kui neid tehti, ning keskmised ja individuaalväärtused.
      2.1.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE
      Iga uuritava proovi kohta saadud OD väärtusi saab kasutada selleks, et arvutada rakkude eluvõimelisuse protsent, võrreldes negatiivse kontrollprooviga, mille eluvõimelisus on võetud võrdseks 100 %ga. Rakkude eluvõimelisuse protsendi kriitiline väärtus, mille alusel jagatakse ained söövitavateks ja mittesöövitavateks (või erineva söövitusvõimega ainete klassidesse), ning statistikameetodid, mida kasutatakse tulemuste hindamiseks ja söövitavate ainete kindlaksmääramiseks, tuleb selgesti määratleda ja dokumenteerida ning nende valik peab olema põhjendatud. Üldiselt määratakse need kriitilised väärtused katse optimeerimise käigus, neid katsetatakse eelvalideerimise etapis ja kinnitatakse valideerimisuuringuga. Näiteks söövitava toime ennustamine EpiDerm™ mudeliga tehtud katse alusel toimub järgmiselt (9).
      Uuritav aine loetakse nahka söövitavaks, kui
      
                  i)
               
               
                  eluvõime pärast kolmeminutilist kokkupuudet on alla 50 % või
               
            
                  ii)
               
               
                  eluvõime pärast kolmeminutilist kokkupuudet on suurem kui 50 % või sellega võrdne ja eluvõime pärast ühetunnist kokkupuudet on alla 15 %.
               
            Uuritav aine loetakse nahka mittesöövitavaks, kui
      
                  i)
               
               
                  eluvõime pärast kolmeminutilist kokkupuudet on suurem kui 50 % või sellega võrdne ja eluvõime pärast ühetunnist kokkupuudet on 15 % või üle selle.
               
            3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuandes tuleb esitada järgmine teave.
      
                   
               
               
                  Uuritav ja kontrollaine:
                  
                              —
                           
                           
                              keemiline nimetus või keemilised nimetused, nagu IUPACi või CASi nimetus ja CASi number, kui on teada;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aine puhtus või valmisuse koostis (massiprotsendina);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              füüsikalis-keemilised omadused, nagu füüsiline olek, pH, püsivus, lahustuvus vees, mis on olulised katse läbiviimise seisukohast;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava/kontrollaine töötlemine enne katset, kui see on asjakohane (nt soojendamine, peenestamine);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              püsivus, kui on teada.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Kasutatud nahamudeli ja katse tegemise käigu põhjendus.
               
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatud rakusüsteem;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rakkude eluvõimelisuse mõõtmiseks kasutatud mõõteriista (nt spektrofotomeetri) kaliibrimist käsitlev teave;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kogu täiendav teave kasutatud konkreetse nahamudeli ja selle valideerimise kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katsemetoodika üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kasutatud uuritavad annused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kõigi metoodikas tehtud muudatuste kirjeldus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              viide varasematele andmetele mudeli kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kasutatud hindamiskriteeriumide kirjeldus.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              andmetabelid individuaalsete uuritavate proovide kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mis tahes täheldatud toimete kirjeldus.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutelu.
               
            
                   
               
               
                  Järeldused.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
               
            
                  2)
               
               
                  Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/Corrosion.
               
            
                  3)
               
               
                  Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995). A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report recommendations of ECVAM Workshop 6 ATLA 23, 219-255.
               
            
                  4)
               
               
                  Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, A.P., and Worth, A.P. (1998). TheECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic. In Vitro 12, 471-482.
               
            
                  5)
               
               
                  Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team Toxic. In Vitro 12, 483-524.
                  
               
            
                  6)
               
               
                  OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods, 62pp.
               
            
                  7)
               
               
                  Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. Test report and recommendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147.
               
            
                  8)
               
               
                  ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. MH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf
               
            
                  9)
               
               
                  Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C, Spielmann, H., Uphill, P., Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C, Kaufmann, T., Remmele, M. and Holzhutter, H.G. (2000). The ECVAM prevalidation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, pp.371-401.
               
            
                  10)
               
               
                  ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.
               
            
                  11)
               
               
                  ECVAM (2000). ECVAM News & Views. ATLA 28, 365-67.
               
            
                  12)
               
               
                  ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDerm™, EPISKIN™ (EPI-200), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf
               
            
                  13)
               
               
                  OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st - 2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from the Secretariat
               
            
                  14)
               
               
                  Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 709-720.
               
            
                  15)
               
               
                  Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity asssays. J.Immunol. Meth. 65, 55-63.
               
            
                  16)
               
               
                  Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and Klausner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxic. In Vitro 8, 889-891.
               
            
                  17)
               
               
                  Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural characterization of reconstructed skin models. International Journal of Pharmaceutics. 203, 211-225.
               
            
                  18)
               
               
                  Tinois E, Gaetani Q, Gayraud B, Dupont D, Rougier A, Pouradier DX (1994). The Episkin model: Successful reconstruction of human epidermis in vitro. In In vitro Skin Toxicology. Edited by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach: 133-140.
               
            
                  19)
               
               
                  Tinois E, Tiollier J, Gaucherand M, Dumas H, Tardy M, Thivolet J (1991). In vitro and post -transplantation differentiation of human keratinocytes grown on the human type IV collagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental Cell Research 193: 310-319.
               
            
                  20)
               
               
                  Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., and Rosenberg, H. (1992). The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology 9, 163-171.
               
            
                  21)
               
               
                  Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier, S.F., Parentau, N.L. (1994). Development of a bilayered living skin construct for clinical applications. Biotechnology and Bioengineering 43/8, 747-756.
               
            
                  22)
               
               
                  Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, S.J. (1995). A critical assessment of the use of microculture tetrazolium assays to measure cell growth and function. Growth Regulation 5, 69-84.
               
            
                  23)
               
               
                  Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne', C, Elliot, G.R, Harbell, J.W., Heylings, J.R, Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, J.J.M., and Botham, P.A. (2001). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation: results and evaluation by the Management Team. Toxic. In Vitro J15, 57-93.
               
            B.41.   IN VITRO 3T3 NRU FOTOTOKSILISUSE KATSE
      1.   MEETOD
      Käesolev meetod vastab suunisele OECD TG 432 (2004).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Fototoksilisust määratletakse kui kehale kantud aine toksilist reaktsiooni, mis tekib või (madalama doosi puhul) ägeneb pärast järgnevat kokkupuudet valguskiirgusega või mille kutsub esile naha kiiritamine pärast aine süsteemset manustamist.
      
         In vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katset kasutatakse selleks, et teha kindlaks kokkupuutel valgusega ergastanud uuritava aine fototoksilisus. Katsega hinnatakse fototsütotoksilisust: kuivõrd sõltub rakkude eluvõime vähenemine kemikaaliga kokkupuutumisel sellest, kas see toimub valguse käes või pimedas. Selles katses positiivseks osutunud ained on tõenäoliselt fototoksilised in vivo pärast süsteemset manustamist ja naha sisse jõudmist või pärast paikset kasutamist.
      Fototoksiline mõju on leitud paljudel kemikaaliliikidel (viited 1–4). Nende ühine omadus on võime neelata valgusenergiat päikesevalguse lainepikkustel. Fotokeemia esimese seaduse (Grotthausi-Draperi seadus) kohaselt on fotoreaktsiooni toimumiseks vajalik piisava hulga valguskvantide neeldumine. Seepärast tuleb enne bioloogilise katse sooritamist määrata uuritava kemikaali UV ja nähtava valguse neeldumisspekter vastavalt OECD katsejuhendile 101. Väidetakse, et kui molaarse ekstinktsiooni/neeldumise koefitsient on väiksem kui 10 l × mol-1 × cm-1, ei ole kemikaal tõenäoliselt valgustundlik. Sellisele kemikaalile ei ole vaja teha in vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katset või muud bioloogilist katset kahjuliku fotokeemilise toime kindlakstegemiseks (1 ja 5). Vt ka lisa 1.
      Hiljuti hinnati in vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katse usaldusväärsust ja asjakohasust (6–9). Näidati, et in vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katsega saab prognoosida ägedat fototoksilist reaktsiooni loomadel ja inimestel in vivo. Katse eesmärk ei ole prognoosida muid kahjulikke toimeid, mis võivad ilmneda kemikaali ja valguse koostoimel, nagu fotogenotoksilisus, fotoallergia või fotokantserogeensus, samuti ei võimalda see hinnata fototoksilist potentsiaali. Lisaks ei ole katse ette nähtud fototoksilisuse kaudsete mehhanismide, uuritava aine metaboliitide mõju või segude mõju kontrollimiseks.
      Kuigi kõigi genotoksilise ja kantserogeense potentsiaali ennustamiseks tehtavate in vitro katsete korral on üldiselt nõutav metaboliseeriva süsteemi kasutamine, on seni vähe näiteid, kus kemikaali in vivo või in vitro fototoksilise toime avaldumiseks on vaja metaboolset transformatsiooni. Seega ei peeta vajalikuks ega teaduslikult põhjendatuks, et käesolevat katset tuleks läbi viia metaboolse aktiveerimissüsteemi abil.
      1.2.   MÕISTED
      
         Kiiritustihedus – pinnale langeva ultraviolett- (UV) või nähtava valguse intensiivsus, mida mõõdetakse ühikutes W/m2 või W/cm2.
      
         Kiiritusannus – pinnale langeva ultraviolett- või nähtava kiirguse hulk (s.o intensiivsus × aeg), mida väljendatakse džaulides (Ws) pinnaühiku kohta, näiteks J/m
         
            2
          või J/cm2.
      
         UV-valguse lainealad – CIE (Rahvusvaheline Valgustuskomisjon) soovitatud tähistused on järgmised: UVA (315–400 nm), UVB (280–315 nm) ja UVC (100–280 nm). Kasutatakse ka teisi nimetusi; piiriks UVB ja UVA vahel võetakse sageli 320 nm ja UVA võib jagada aladeks UV-A1 ja UV-A2 piiriga umbes 340 nm juures.
      
         Rakkude eluvõimelisus – rakupopulatsiooni üldist aktiivsust (näiteks vitaalvärvi neutraalpunase neeldumist raku lüsosoomidesse) väljendav parameeter, mis olenevalt mõõdetavast muutujast ja katseplaanist korreleerub rakkude koguarvu ja/või vitaalsusega.
      
         Rakkude suhteline eluvõimelisus – rakkude eluvõimelisus, mida väljendatakse lahusti (negatiivsete) kontrollproovide suhtes, millega tehakse läbi kogu katse (kas +Irr või –Irr), välja arvatud uuritava kemikaaliga töötlemine.
      
         PIF (
         
            Photo-Irritation-Factor –
         fotoärrituvustegur) – tegur, mis põhineb sellel, et võrreldakse uuritava kemikaali kahte võrdselt tsütotoksilist kontsentratsiooni (IC50): valguse puudumisel (–Irr) ja kiiritamisel mittetsütotoksilise UVA või nähtava valgusega (+Irr).
      
         IC
         
            50
          – uuritava kemikaali kontsentratsioon, mis vähendab rakkude elujõulisust 50 %.
      
         MPE
         
            (Mean-Photo-Effect –
         keskmine fotoefekt) – mõõdetav suurus, mis saadakse kontsentratsiooni-mõju sõltuvuste matemaatilise analüüsiga, võrreldes mõju valguse puudumisel (–Irr) ja kiiritamisel mittetsütotoksilise UVA või nähtava valgusega (+Irr).
      
         Fototoksilisus – äge toksiline reaktsioon, mis tekib pärast naha kokkupuudet teatava kemikaaliga ja sellele järgnevat kiiritamist või mida sarnasel viisil tekitab naha kiiritamine pärast kemikaali süsteemset manustamist.
      1.3.   MEETODI PÕHIMÕTE
      
         In vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katses võrreldakse kemikaali tsütotoksilisust pimeduses ja päikesevalgusele samase valguse mittetsütotoksilise annusega kiiritamisel. Tsütotoksilisus avaldub käesolevas katses vitaalvärvi neutraalpunase rakkudes neeldumise vähenemisena, sõltuvalt uuritava aine kontsentratsioonist; seda mõõdetakse 24 tundi pärast uuritava kemikaaliga töötlemist ja kiiritamist (10). Neutraalpunane on nõrk katioonne värvaine, mis tungib mittedifusioonilisel teel kergesti läbi rakumembraani ja koguneb rakus lüsosoomidesse. Tundliku lüsosoomimembraani muutused muudavad lüsosoomid hapraks ja põhjustavad muid muutusi, mis lõpuks osutuvad pöördumatuks. Sellised võõrainete toimel tekkivad muutused vähendavad neutraalpunase neelamist ja sidumist. Nii saab eristada elujõulisi, kahjustatud ja surnud rakke, mis ongi käesoleva katse aluseks.
      Monokihtide saamiseks hoitakse Balb/c 3T3 rakke 24 tundi kasvukeskkonnas. Kaht 96 süvendiga plaati uuritava kemikaali kohta inkubeeritakse uuritava aine kaheksa kontsentratsiooniga 1 tunni vältel. Seejärel kiiritatakse üht kahest plaadist kõrgeima mittetsütotoksilise kiirituse kogusega, samas kui teist plaati hoitakse pimedas. Seejärel asendatakse mõlemal plaadil töötlemiskeskkond kasvukeskkonnaga ja pärast edasist 24tunnist inkubeerimist määratakse raku elujõulisus kindlaks neutraalpunase neeldumise kaudu. Rakkude elujõulisus väljendatakse protsendina uuritava ainega töötlemata, kuid lahustit sisaldavate kontrollproovide suhtes ning see arvutatakse uuritava aine iga kontsentratsiooni puhul. Fototoksilise potentsiaali prognoosimiseks võrreldakse kontsentratsiooni-mõju sõltuvusi, mis on saadud pimedas hoitud ja valgusega kiiritatud katsetes, tavaliselt IC50 tasemel, st kontsentratsiooni kaudu, mis vähendab raku eluvõimelisust 50 %, võrreldes uuritava ainega töötlemata kontrollproovidega.
      1.4.   MEETODI KIRJELDUS
      1.4.1.   Ettevalmistused
      1.4.1.1.   Rakud
      Valideerimisel kasutati hiire fibroblasti püsivat rakuliini Balb/c 3T3, kloon 31, mis pärines kas USA kollektsioonist (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA) või Euroopa kollektsioonist (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, UK), ning rakuliin soovitatakse hankida hea tasemega rakuhoidlast. Uurimiseks võib kasutada teisi rakke või rakuliine, kui kasvatamistingimused kohandatakse rakkude erivajadustele, kuid siis on vaja tõendada tulemuste samaväärsust.
      Rakke tuleks regulaarselt kontrollida mükoplasma nakkuse suhtes ja kasutada vaid siis, kui seda ei esine (11).
      On oluline, et rakkude UV-tundlikkust kontrollitakse regulaarselt vastavalt käesolevas metoodikas kirjeldatud kvaliteedikontrolli eeskirjale. Kuna rakud võivad passaažide arvu suurenemisega muutuda UVA-tundlikumaks, tuleks kasutada Balb/c 3T3 rakke, mille passaažide arv on võimalikult väike, eelistatavalt alla 100 (vt punkti 1.4.2.2.2 ja 2. lisa).
      1.4.1.2.   Kasvukeskkonnad ja kultiveerimistingimused
      Rutiinseks rakupassaažiks ja mõõtmiste ajal tuleb kasutada sobivat kasvukeskkonda ja inkubeerimistingimusi, näiteks Balb/c 3T3 rakkude puhul on need DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), millele on lisatud 10 % vastsündinud vasika seerumit, 4 mM glutamiini, penitsilliini (100 IU) ja streptomütsiini (100 μg/ml), ning niisutatud inkubatsioon 37 oC ja 5–7,5 % CO2 juures, olenevalt puhvrist (vt punkti 1.4.1.4 teist lõiku). On väga oluline, et rakukultuuri tingimustega oleks tagatud rakkude olek rakutsükli perioodis, mis on kasutatavate rakkude või kasutatava rakuliini jaoks normaalses ajaloolises vahemikus.
      1.4.1.3.   Kultuuride ettevalmistamine
      Külmutatud varukultuuridest pärit rakud külvatakse kasvukeskkonda sobiva tihedusega ja külvatakse ümber vähemalt korra, enne kui neid kasutatakse in vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katses.
      Fototoksilisuse katses kasutatavad rakud külvatakse kasvukeskkonda sobiva tihedusega, nii et kultuurid ei laatu katse lõpuks, st selleks ajaks, kui 48 tundi pärast rakkude külvamist määratakse rakkude elujõulisust. Rakkude Balb/c 3T3 kasvatamisel 96 süvendiga plaatidel on soovitatav külvamistihedus 1 × 104 rakku süvendi kohta.
      Igas kemikaali uurimise katses külvatakse rakud ühtemoodi kahele eraldi 96 süvendiga plaadile, mida hoitakse seejärel kogu katse ajal ühesugustes kasvutingimustes, välja arvatud ajavahemik, mil üht plaati kiiritatakse (+Irr) ja teist hoitakse pimedas (–Irr).
      1.4.1.4   Uuritava aine ettevalmistamine
      Uuritav aine peab olema valmistatud vahetult enne kasutamist, välja arvatud juhul, kui andmed näitavad, et aine on hoidmisel püsiv. Soovitav on kemikaale käsitseda ja rakke esialgselt töödelda sellistes valgustustingimustes, et uuritava aine fotoaktivatsioon või lagunemine enne kiiritamist oleks välistatud.
      Uuritavad kemikaalid lahustatakse puhvriga soolalahuses, näiteks Earle'i tasakaalustatud soolalahuses (EBSS: Earle's Balanced Salt Solution) või muus füsioloogiliselt tasakaalustatud puhvri lisandiga soolalahuses, mis ei tohi sisaldada valke, valgust neelavaid komponente (näit pH-indikaatorvärvid ja vitamiinid), mis võiksid segada kiiritamist. Kuna kiiritamise ajal hoitakse rakke umbes 50 minutit CO2-inkubaatorist väljas, tuleb olla ettevaatlik, et ei toimuks leelistumist. Nõrga puhvri nagu EBSSi kasutamisel saab leelistumist vältida rakkude inkubeerimisega 7,5 % CO2 juures. Kui rakke inkubeeritakse kõigest 5 % CO2 juures, tuleks valida tugevam puhver.
      Halvasti vees lahustuvad uuritavad kemikaalid tuleks lahustada sobivas lahustis. Lahusti kasutamisel peab seda olema ühesugune kogus kõikides kultuurides, st nii negatiivsetes (lahusti) kontrollkatsetes kui ka uuritava kemikaali iga kontsentratsiooni juures, ja lahusti kasutatav kontsentratsioon ei tohi olla tsütotoksiline. Uuritava kemikaali kontsentratsioon tuleb valida nii, et aine ei sadeneks ja et lahuses ei tekiks hägu.
      Lahustina soovitatakse kasutada dimetüülsulfoksiidi (DMSO) või etanooli (ETOH). Võib kasutada ka muid madala tsütotoksilisusega lahusteid. Enne kasutamist tuleb hinnata iga lahusti sobivust, arvestades lahusti konkreetseid omadusi, näiteks reageerimine uuritava kemikaaliga, fototoksilise toime nõrgendamine, radikaalide sidumine ja/või kemikaali stabiilsus lahustis.
      Lahustamise hõlbustamiseks võib kasutada keerissegamist, ultraheliga töötlemist ja/või soojendamist sobiva temperatuurini, kui see ei mõjuta uuritava kemikaali stabiilsust.
      1.4.1.5   Kiiritamise tingimused
      1.4.1.5.1.   Valgusallikas
      
      Sobiva valgusallika ja filtrite valimine on fototoksilisuse katse puhul ülioluline tegur. UVA ja nähtav valgus on tavaliselt seotud fototoksiliste reaktsioonidega in vivo (3 ja 12), samas kui UVB on üldiselt vähem oluline; UVB on aga väga tsütotoksiline – lainepikkuse vahemikus 313–280 nm suureneb tsütotoksilisus 1 000 korda (viide 13). Sobiva valgusallika valimise kriteeriumid peavad hõlmama nõuet, et valgusallikas kiirgaks lainepikkusi, mis neelduvad uuritavas kemikaalis (neeldumisspekter), ja et (mõistliku aja jooksul saavutatav) kiiritusannus oleks piisav tuntud fototsütotoksiliste kemikaalide avastamiseks. Lisaks ei tohi kasutatav lainepikkus ja kiiritusannus liigselt kahjustada katsesüsteemi, näit soojuse eraldumise tõttu (infrapunapiirkond).
      Sobivaimaks tehisvalguse allikaks peetakse päikesevalgust järgiaimavat „kunstlikku päikest”. „Kunstliku päikese” kiirguse intensiivsuse jaotumine pärast filtrimist peaks olema lähedane päikesevalguse omale vabas looduses (14). „Kunstliku päikesena” kasutatakse nii ksenoonkaarlampe kui (dopeeritud) elavhõbe-metallhalogeniid-kaarlampe (15). Viimaste eelis on nõrgem soojuskiirgus ja odavus, kuid nende valgus ei ole päikesevalgusega nii sarnane kui ksenoonkaarlambi oma. Kuna kõik „kunstlikud päikesed” kiirgavad palju UVBd, tuleks nende valgust filtrida, et vähendada ülimalt tsütotoksilist UVB-lainepikkusega kiirgust. Kuna rakukultuuri plastmaterjalid sisaldavad UV-stabilisaatoreid, tuleks spektrit mõõta läbi 96 süvendiga plaadi kaane, mis on sama tüüpi kui analüüsis kasutatav. Sõltumata sellest, kas mõnd spektri osa nõrgendatakse filtrimise abil või seadmete vältimatu filtrimistoimega, ei tohiks pärast nende filtrite läbimist registreeritud spekter erineda standardsest päevavalgusest vabas looduses (14). Viidetes 8 ja 16 on näidatud „kunstliku päikese” filtritud kiirgusvoo spektraalne jaotus; sellist valgust kasutati 3T3 NRU fototoksilisuse in vitro katse valideerimisel. Vt ka lisa 2 joonist 1.
      1.4.1.5.2.   Kiiritusannuse mõõtmine
      
      Valguse intensiivsust (kiiritustihedust) tuleb regulaarselt kontrollida enne iga fototoksilisuse katset, kasutades sobivat lairiba-UV-mõõturit. Intensiivsust tuleb mõõta läbi sama tüüpi 96 süvendiga plaadi kaane, nagu kasutatakse analüüsis. UV-mõõtur peab olema kaliibritud konkreetse allika järgi. UV-mõõturi mõõtmiskvaliteeti tuleb kontrollida ja selleks on soovitatav kasutada teist, võrdlus-UV-mõõturit, mis on sama tüüpi ja identselt kaliibritud. Pikemate ajavahemike järel oleks väga hea kasutada spektroradiomeetrit valgusallika filtritud kiirguse spektri mõõtmiseks ja lairiba-UV-mõõturi kalibreeringu kontrollimiseks.
      On näidatud (6 ja 17), et annus 5 J/cm2 (mõõdetud UVA piires) ei ole tsütotoksiline Balb/c 3T3 rakkude suhtes, kuid on piisav, et ergastada kemikaale ja kutsuda esile fototoksilisi reaktsioone; annuse 5 J/cm2 saavutamiseks 50 minutiga kasutati kiiritustihedust 1,7 mW/cm2. Vt lisa 2 joonist 2. Kui kasutatakse muud rakuliini või valgusallikat, tuleb kiiritusannus kaliibrida nii, et saaks valida kiiritusrežiimi, mis ei ole rakkude jaoks kahjulik, kuid on piisav standardfototoksiinide ergastamiseks. Valgusega kokkupuute aeg arvutatakse järgmiselt:
      
                  
                     
               
               
                  (1 J = 1 Wsec)
               
            1.4.2.   Katsetingimused
      1.4.2.1.   Uuritava aine kontsentratsioon
      Annuse vahemiku määramise eelkatsetes määratakse uuritava aine kontsentratsiooni vahemik, mida kasutatakse kõnealuse aine toime uurimiseks valgustatud (+Irr) ja pimedas hoitud (–Irr) katsetes. Kuna lahustuvus võib aja jooksul või valgustamise ajal muutuda, võib olla kasulik hinnata lahustuvust katse alguses ja siis uuesti 60 minuti (või muu kasutatava töötlemisaja) pärast. Ebasobivate kasvutingimuste või liiga happeliste või aluseliste kemikaalide põhjustatud toksilisuse vältimiseks peab rakukultuuri pH pärast uuritava kemikaali lisamist jääma vahemikku 6,5–7,8.
      Uuritava aine suurim kontsentratsioon peaks jääma füsioloogiliste katsetingimuste piiridesse, tuleks vältida rakkude osmootset või pH-stressi. Konkreetse uuritava kemikaali puhul võib osutuda vajalikuks võtta arvesse muid füüsikalisi ja keemilisi omadusi, mis võivat piirata uuritava aine kontsentratsiooni suurendamist katses. Raskesti lahustuvate ainete puhul, mis ei ole kuni lahustuvuse piirini toksilised, tuleks uurida kõige kõrgemat kontsentratsiooni, mida on võimalik saavutada. Üldiselt ei tohiks uuritav kemikaal sadeneda ühelgi uuritaval kontsentratsioonil. Uuritava aine maksimaalne kontsentratsioon ei tohiks ületada 1 000 μg/ml; osmolaarsus ei tohiks olla suurem kui 10 mmol/l. Tuleks kasutada kaheksat lahust uuritava aine kontsentratsioonidega, mis moodustavad konstantse lahjendusteguriga geomeetrilise jada (vt punkti 2.1 teist lõiku).
      Kui annuse vahemiku kindlakstegemise katse näitas, et uuritav kemikaal ei ole kuni kõrgeima kontsentratsioonini tsütotoksiline pimedas (–Irr), kuid on väga tsütotoksiline kiiritatuna (+Irr), võivad (+Irr) katseteks valitavad kontsentratsioonid erineda nendest, mis valitakse (–Irr) katseteks, et saadavad andmed oleksid nõutava kvaliteediga.
      1.4.2.2.   Kontrollkatsed
      1.4.2.2.1.   Rakkude kiirgustundlikkus: varasema arengu andmete kindlakstegemine:
      
      Rakkudel tuleb regulaarselt (umbes iga viienda passaaži järel) kontrollida tundlikkust valgusallika suhtes, hinnates nende elujõulisust pärast nende kokkupuudet suurenevate kiirgusdoosidega. Kõnealuse hindamise puhul tuleks kasutada mitut kiiritusannust, sealhulgas annuseid, mis on palju suuremad 3T3 NRU fototoksilisuse katses kasutatavatest. Nende dooside suurust on kõige kergem määrata valgusallika spektri UV-osade mõõtmistega. Rakud külvatakse tihedusel, mida kasutatakse in vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katses, ja neid kiiritatakse järgmisel päeval. Rakkude elujõulisus määratakse veel üks päev hiljem neutraalpunase sidumise järgi. Tuleb tõendada, et tulemuseks saadud suurim mittetsütotoksiline annus (näiteks valideerimisel: 5 J/cm2 [UVA]) oli piisav võrdluskemikaalide (tabel 1) õigeks klassifitseerimiseks.
      1.4.2.2.2.   Kiirgustundlikkus: jooksva katse kontroll
      
      Katse vastab kvaliteedikriteeriumidele, kui kiiritatud negatiivsetes või lahusti kontrollproovides on rakkudel alles üle 80 % elujõulisusest, võrrelduna mittekiiritatud negatiivsete või lahusti kontrollproovidega.
      1.4.2.2.3.   Lahusti kontrollproovide elujõulisus
      
      Lahusti kontrollproovidest eraldatud neutraalpunase absoluutne optiline tihedus (OD540 NRU
         ) näitab, kas igasse süvendisse külvatud 1 × 104 rakku on kasvanud normaalse kahekordistumisajaga analüüsi kahe päeva jooksul. Katse vastab nõuetekohasuse tingimustele, kui töötlemata kontrollide keskmine OD540 NRU
          on > 0,4 (st umbes 20 korda suurem lahusti taustneeldumisest).
      1.4.2.2.4.   Positiivne kontrollproov
      
      Teadaolevat fototoksilist kemikaali katsetatakse samaaegselt iga in vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katsega. Selleks soovitatakse kloorpromasiini (CPZ). Standardeeskirja järgi in vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katses uuritud CPZ puhul määrati järgmised katse nõuetekohasuse tingimused: kiiritatud (+Irr) CPZ: IC50 = 0,1–2,0 μg/ml, mittekiiritatud (–Irr) CPZ: IC50 = 7,0–90,0 μg/ml. Fotoärrituvustegur (PIF) peaks olema > 6. Jälgida tuleks positiivse kontrolli varasemat tegemist.
      Kloorpromasiini asemel võib samaaegsete positiivsete kontrollproovidena kasutada muid fototoksilisi kemikaale, mis kuuluvad uuritava kemikaaliga ühte kemikaalide klassi või on sarnase lahustuvusega.
      1.4.3.   Katse käik (6–8, 16 ja 17):
      1.4.3.1.   Esimene päev
      96 süvendiga koekultuuri mikrotiiterplaadi välimistesse süvenditesse kantakse 100 μl kasvukeskkonda (pimekatse). Ülejäänud süvenditesse kantakse 100 μl rakususpensiooni kontsentratsiooniga 1 × 105 rakku kasvukeskkonna milliliitris (see tähendab 1 × 104 rakku süvendi kohta). Uuritava aine iga kontsentratsiooniseeria jaoks ning lahusti- ja positiivse kontrolli jaoks tuleks ette valmistada kaks plaati.
      Rakke inkubeeritakse 24 tunni jooksul (vt punkti 1.4.1.2), kuni need moodustavad pooleldi laatunud monokihi. Kõnealune inkubeerimisperiood võimaldab rakkudel taastuda, kinnituda põhjale ja eksponentsiaalselt kasvada.
      1.4.3.2.   Teine päev
      Pärast inkubeerimist dekanteeritakse kasvukeskkond rakkudelt ja rakke pestakse hoolikalt 150 μl inkubeerimiseks kasutatud puhverlahusega. Lisatakse 100 μl puhverlahust, mis sisaldab vajalikus kontsentratsioonis uuritavat kemikaali või lahustit (lahustiga kontrollproov). Kasutatakse uuritava kemikaali 8 kontsentratsiooni. Rakke inkubeeritakse uuritava ainega pimedas 60 minutit (vt punkti 1.4.1.2 ja punkti 1.4.1.4 teist lõiku).
      Kahest plaadist, mis on ette valmistatud uuritava aine iga kontsentratsiooni ja kontrollproovide seeria jaoks, valitakse üks, tavaliselt juhuslikkuse alusel, tsütotoksilisuse (–Irr) määramiseks (see on kontrollplaat) ja teine fototsütotoksilisuse (+Irr) määramiseks (uuritav plaat).
      Katse +Irr-osa läbiviimiseks kiiritatakse rakke toatemperatuuril 50 minutit läbi 96 süvendiga plaadi kaane suurima kiiritusdoosiga, millel ei ole veel tsütotoksilist mõju (vt ka lisa 2). Kiiritamata plaate (–Irr) hoitakse toatemperatuuril 50 minutit (s.o kogu kiiritamise aja) pimedas kastis.
      Katselahus dekanteeritakse ja rakke pestakse hoolikalt kaks korda 150 μ1 inkubeerimiseks kasutatud, kuid uuritavat ainet mitte sisaldava puhverlahusega. Puhverlahus asendatakse kasvukeskkonnaga ja inkubeeritakse (vt punkti 1.4.1.2) hommikuni (18–22 tundi).
      1.4.3.3.   Kolmas päev
      1.4.3.3.1.   Uurimine mikroskoobiga
      
      Rakke vaadeldakse kasvu, morfoloogia ja monokihi terviklikkuse hindamiseks faasikontrastmikroskoobiga. Märgitakse üles kõik muutused rakkude morfoloogias ja mõjud rakkude kasvule.
      1.4.3.3.2.   Neutraalpunase sidumise katse
      
      Rakke pestakse 150 μl eelsoojendatud puhvriga. Pesemislahus eemaldatakse ettevaatliku koputamisega. Lisatakse 100 μl neutraalpunase (3-amino-7-dimetüülamino-2-metüülfenasiinhüdrokloriid, EINECSi number 209-035-8; CASi number 553-24-2; C.I. 50040) lahust kontsentratsiooniga 50 μg/ml seerumit mittesisaldavas keskkonnas (16) ja inkubeeritakse 3 tundi, nagu on kirjeldatud punktis 1.4.1.2. Pärast inkubeerimist eemaldatakse neutraalpunase keskkond ja rakke pestakse 150 μl puhverlahusega. Liigne puhver dekanteeritakse ja eemaldatakse kuivatamise või tsentrifuugimisega.
      Lisatakse täpselt 150 μl neutraalpunase desorbeerimislahust (mis on värskelt valmistatud 49 osast veest, 50 osast etanoolist ja 1 osast äädikhappest).
      Mikrotiiterplaati loksutatakse ettevaatlikult mikrotiiterplaadi loksutil 10 minutit, kuni neutraalpunane on väljunud rakkudest ja moodustanud homogeense lahuse.
      Spektrofotomeetriga mõõdetakse neutraalpunase ekstrakti optiline tihedus 540 nm jumes, kasutades võrdlusena pimekatse süvendeid. Andmed salvestatakse sobivas elektroonilise faili formaadis edaspidiseks analüüsiks.
      2.   ANDMED
      2.1.   ANDMETE KVALITEET JA HULK
      Katseandmete alusel peaks saama analüüsida kiiritatud ja kiiritamata proovides avaldunud mõju sõltuvust kontsentratsioonist ja võimaluse korral määrata uuritava kemikaali kontsentratsioon, millel rakkude elujõulisus väheneb 50 % (IC50). Tsütotoksilisuse esinemisel valitakse nii kontsentratsioonide vahemik kui ka üksikud kontsentratsioonid selliselt, et sõltuvust saaks sobitada katseandmetega.
      Nii selgelt positiivsete kui ka selgelt negatiivsete tulemuste (vt punkti 2.3 esimest lõiku) puhul võib piisata esmasest katsest, millele on toeks üks või mitu annuste vahemiku määramiseks tehtud eelkatset.
      Raskesti tõlgendatavat, piiripealset või ebaselget tulemust tuleks selgitada edasiste katsete abil (vt ka punkt 2.4 teine lõik). Sel juhul tuleks kaaluda katsetingimuste muutmist. Katsetingimustes võib muuta kontsentratsioone või nende intervalle, inkubeerimiseelset aega ja kiiritamisaega. Vees ebapüsivate kemikaalide puhul võib sobida lühem kokkupuuteaeg.
      2.2.   TULEMUSTE HINDAMINE
      Andmete hindamise võimaldamiseks võib arvutada fotoärrituvusteguri (Photo-Irritation-Factor, PIF) või keskmise fotoefekti (Mean Photo Effect, MPE).
      Fototsütotoksilisuse näitajate arvutamiseks (vt allpool) on vaja lähendamisega panna läbi kontsentratsiooni ja mõju määratud väärtuste mingi sobiv pidev kontsentratsiooni-mõju kõver (mudel). Kõvera sobitamine andmetega toimub tavaliselt mittelineaarse regressiooni meetodil (18). Selleks et hinnata, kuidas andmete varieerumus mõjutab sobitatud kõvera parameetreid, soovitatakse kasutada bootstrap-meetodit.
      Fotoärrituvustegur (PIF) arvutatakse järgmise valemi abil:
      
         
      Kui kiiritatud või kiiritamata proovides ei saa IC50 arvutada, siis ei saa katsematerjali PIFi määrata.Keskmine fotoefekt (MPE) põhineb täielike kontsentratsiooni-mõju sõltuvuste võrdlemisel (19). See on fotoefekti väärtuste esindusliku hulga kaalutud keskmine:
      
         
      Fotoefekt PEC igal kontsentratsioonil C on võrdne mõjuefekti REC ja annuseefekti DEC korrutisega s.t PEc = REc × DEC. Mõjuefekt REC on kiiritatud ja kiiritamata proovides avaldunud mõju vahe, s.t REc = Rc (—Irr) – Rc (+Irr). Annuseefekt leitakse järgmiselt:
      
         
      kus C* on ekvivalentsuskontsentratsioon, s.o kontsentratsioon, mille puhul +Irr-mõju võrdub –Irr-mõjuga kontsentratsioonil C. Kui C* ei ole võimalik määrata, kuna mõju väärtused +Irr-kõveral on süstemaatiliselt kõrgemad või madalamad kui Rc(–Irr), loetakse annuseefekt võrdseks ühega. Kaalutegurid Wi on määratud kõrgeima mõju väärtusega, st Wi = MAX {Ri (+Irr), Ri (–Irr) }. Kontsentratsioonide võrk Ci valitakse nii, et ühepalju punkte langeks igasse kontsentratsiooniintervalli, mis on määratud katses kasutatud kontsentratsiooni väärtustega. MPE arvutamine on piiratud maksimaalse kontsentratsiooni väärtusega, mille puhul vähemalt ühel kahest kõverast on veel näha vähemalt 10 %list mõju. Kui see maksimaalne kontsentratsioon on kõrgem kui +Irr-katses kasutatud kõrgeim kontsentratsioon, loetakse +Irr-kõvera ülejäänud osas mõju väärtus võrdseks nulliga. Sõltuvalt sellest, kas MPE väärtus on suurem kui nõuetekohaselt valitud piirväärtus (MPEc = 0,15) või mitte, liigitatakse kemikaal fototoksiliseks.
      Tarkvarapaketi PIF ja MPE arvutamiseks võib leida viite 20 veebilehel.
      2.3.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE
      Valideerimisuuringu (8) põhjal võib öelda, et uuritava aine PIF < 2 või MPE < 0,1 puhul võib ennustada, et aine ei ole fototoksiline. Kui PIF > 2 ja < 5 või MPE > 0,1 ja < 0,15, siis on võimalik, et aine on fototoksiline; kui PIF > 5 või MPE > 0,15, siis võib ennustada, et aine on fototoksiline.
      Igas laboris, kus seda analüüsi esmakordselt läbi viiakse, tuleks enne uuritavate ainete fototoksilisuse hindamisele asumist mõõta tabelis 1 osutatud etalonaineid. Leitavad PM või MPE väärtused peaksid olema lähedased tabelis 1 esitatud väärtustele.
      
         Tabel 1
      
      
                  Keemiline nimetus
               
               
                  EINECSi nr
               
               
                  CASi nr
               
               
                  PIF
               
               
                  MPE
               
               
                  Neeldumismaksimum
               
               
                  Lahusti (9)
                  
               
            
                  amiodaroon HCL
               
               
                  243-293-2
               
               
                  [19774-82-4]
               
               
                  > 3,25
               
               
                  0,27–0,54
               
               
                  242 nm
                  300 nm
                  (õlg)
               
               
                  etanool
               
            
                  kloorpromasiin HCL
               
               
                  200-701-3
               
               
                  [69-09-0]
               
               
                  > 14,4
               
               
                  0,33–0,63
               
               
                  309 nm
               
               
                  etanool
               
            
                  norfloksatsiin
               
               
                  274-614-4
               
               
                  [70458-96-7]
               
               
                  > 71,6
               
               
                  0,34–0,90
               
               
                  316 nm
               
               
                  atsetonitriil
               
            
                  antratseen
               
               
                  204-371-1
               
               
                  [120-12-7]
               
               
                  > 18,5
               
               
                  0,19–0,81
               
               
                  356 nm
               
               
                  atsetonitriil
               
            
                  Dinaatriumprotoporfüriin IX
               
               
                  256-815-9
               
               
                  [50865-01-5]
               
               
                  > 45,3
               
               
                  0,54–0,74
               
               
                  402 nm
               
               
                  etanool
               
            
                  L-histidiin
               
               
                   
               
               
                  [7006-35-1]
               
               
                  PIFi ei esine
               
               
                  0,05–0,10
               
               
                  211 nm
               
               
                  vesi
               
            
                  heksaklorofeen
               
               
                  200-733-8
               
               
                  [70-30-4]
               
               
                  1,1–1,7
               
               
                  0,00–0,05
               
               
                  299 nm
                  317 nm
                  (õlg)
               
               
                  etanool
               
            
                  naatriumlaurüülsulfaat
               
               
                  205-788-1
               
               
                  [151-21-3]
               
               
                  1,0–1,9
               
               
                  0,00–0,05
               
               
                  neeldumist ei esine
               
               
                  vesi
               
            2.4.   ANDMETE TÕLGENDAMINE
      Kui fototoksiline mõju avaldub ainult kõige kõrgemal uuritud kontsentratsioonil (eriti vees lahustuvate uuritavate ainete puhul), tuleb ohu hindamisel lisaks arvestada veel muid asjaolusid. Nende hulka võivad kuuluda neeldumine nahas ja kemikaali kogunemine nahas ning muude katsete andmed, näiteks uuringud, kuidas kemikaal mõjub looma või inimese nahale in vitro või naha mudelitele.
      Kui toksilisust ei ilmne (+Irr ja –Irr) ja kui halb lahustuvus ei luba uurida kõrgemaid kontsentratsioone, võib küsida, kas käesolev meetod sobib aine uurimiseks; sel juhul tuleb kaaluda kinnitavate uuringute läbiviimist, näiteks teise mudeliga.
      3.   ARUANDLUS
      KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama vähemalt järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Uuritav aine:
                  
                              —
                           
                           
                              andmed aine määratlemiseks, tavanimetused ning IUPACi ja CASi numbrid, kui need on teada;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              füüsikaline olek ja puhtus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuringu tegemisel olulised füüsikalis-keemilised omadused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              UV/nähtava valguse neeldumisspekter;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              stabiilsus ja fotostabiilsus, kui need on teada.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Lahusti:
                  
                              —
                           
                           
                              lahusti valiku põhjendus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava kemikaali lahustuvus lahustis;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lahusti protsendiline sisaldus töötlemiskeskkonnas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rakud:
                  
                              —
                           
                           
                              rakkude tüüp ja päritolu;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mükoplasma puudumine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              raku passaaži number, kui see on teada;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rakkude kiirgustundlikkus, mis on määratud kiiritusseadmete abil, mida kasutatakse in vitro 3T3 NRU fototoksilisuse katses.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katse tingimused (1): inkubeerimine enne ja pärast töötlust:
                  
                  
                              —
                           
                           
                              kasvukeskkonna tüüp ja koostis;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubeerimistingimused (CO2 kontsentratsioon, temperatuur, niiskus);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubeerimise kestus (enne töötlust, pärast töötlust).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katse tingimused (2): töötlemine kemikaaliga:
                  
                  
                              —
                           
                           
                              kiiritatud ja kiiritamata proovides kasutatud uuritava kemikaali kontsentratsioonide valiku põhjendus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava kemikaali piiratud lahustuvuse ja tsütotoksilisuse puudumise puhul: kõrgeima uuritud kontsentratsiooni valiku põhjendus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              töötlemiskeskkonna tüüp ja koostis (soolasisaldusega puhverlahus);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kemikaaliga töötlemise kestus.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katse tingimused (3): kiiritamine:
                  
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatud valgusallika – valiku põhjendus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              valgusallika ja kiirgusmõõtja valmistaja ja tüüp;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              valgusallika kiirguse spektri näitajad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kasutatud filtri(te) läbilaskvuse ja neeldumise näitajad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiirgusmõõtja iseloomustus ja kaliibrimise üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              valgusallika kaugus katsesüsteemist;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              UVA-kiirgus kõnealuse kauguse puhul, väljendatuna mW/cm2;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              UV/nähtava valgusega kiiritamise kestus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              UVA-annus (kiiritustihedus × aeg), väljendatuna J/cm2;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rakukultuuride temperatuur kiiritamise ajal ja samaaegselt pimedas hoitud rakukultuuride temperatuur.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katse tingimused (4): elujõulisuse määramine neutraalpunase abil:
                  
                  
                              —
                           
                           
                              neutraalpunasega töötlemise keskkonna koostis;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              neutraalpunasega inkubeerimise kestus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubeerimistingimused (CO2 kontsentratsioon, temperatuur, niiskus);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              neutraalpunase ekstraheerimise tingimused (ekstrahent; kestus);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              neutraalpunase optilise tiheduse spektrofotomeetriliseks määramiseks kasutatud lainepikkus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              teine (võrdlus)lainepikkus, kui seda kasutati;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mida kasutati spektrofotomeetrilise pimekatsena (kui kasutati).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              rakkude mõõdetud elujõulisus uuritava kemikaali igal kontsentratsioonil, võrreldes samaaegsete lahustikontrollproovide keskmise elujõulisusega, protsentides;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kontsentratsiooni-mõju sõltuvused (rakkude suhtelise elujõulisuse sõltuvus uuritava kemikaali kontsentratsioonist), mis on saadud samaaegsete +Irr- ja –Irr-katsetega;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kontsentratsiooni-mõju sõltuvuste analüüs: võimaluse korral IC50 (+Irr) ja IC50 (–Irr) arvutamine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiiritatud ja kiiritamata proovidest mõõdetud kahe kontsentratsiooni-mõju sõltuvuse võrdlus kas fotoärrituvusteguri (PIF) või keskmise fotoefekti (MPE) arvutamisega;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katse nõuetekohasuse tingimused; samaaegsed lahustikontrollproovid:
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiiritatud ja kiiritamata rakkude absoluutne elujõulisus (neutraalpunase ekstrakti optiline tihedus);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              varasemad negatiivsete ja lahustikontrollproovide andmed; keskväärtused ja standardhälbed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katse nõuetekohasuse tingimused; samaaegne positiivne kontrollproov;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              positiivse kontrollina kasutatud kemikaali IC50 (+Irr) ja IC50 (–Irr) ning PIF/MPE;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              varasemad andmed positiivse kontrolli kemikaali kohta: IC50 (+Irr) ja IC50 (–Irr) ja PIF/MPE; keskväärtused ja standardhälbed.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutelu.
               
            
                   
               
               
                  Järeldused.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  Lovell W.W. (1993). A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential. Toxic. In Vitro 7: 95–102.
               
            
                  2)
               
               
                  Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic substances. In „Research Progress in Organic, Biological and Medicinal Chemistry” Vol. 3 part 1. North Holland Publishing Co. Amsterdam. p XI–XXXV.
               
            
                  3)
               
               
                  Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., Maurer, T., Miranda, M.A, Pape, W.J.W., Sapora, O., and Sladowski, D. (1994). In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, 314–348.
               
            
                  4)
               
               
                  Spikes, J.D. (1989). Photosensitization. In „The science of Photobiology” Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New York. 2nd edition, p 79–110.
               
            
                  5)
               
               
                  OECD (1997) Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.7 „Guidance Document On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water” Environment Directorate, OECD, Paris.
               
            
                  6)
               
               
                  Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H.G., Kalweit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and Willshaw, A. (1994). EEC/COLJPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay. Toxic. In Vitro 8. 793–796.
               
            
                  7)
               
               
                  Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA, 26, 7–8.
               
            
                  8)
               
               
                  Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pechovitch, G. De Silva, O., Holzhütter, H.G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W., and Brantom, P. (1998). The international EÜ/COLIPA IN
                     vitro phototoxicity validation study: results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxic. In Vitro 12, 305–327.
               
            
                  9)
               
               
                  OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin, 30th-31th October 2001, Secretariat's Final Summary Report, 15th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from the Secretariat.
               
            
                  10)
               
               
                  Borenfreund, E., and Puerner, J.A. (1985). Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Lett., 24, 119–124.
               
            
                  11)
               
               
                  Hay, R.J. (1988) The seed stock concept and quality control for cell lines. Analytical Biochemistry 171, a. 225-237.
               
            
                  12)
               
               
                  Lambert L.A, Warner W.G., and Kornhauser A. (1996) Animal models for phototoxicity testing. In „Dermatotoxicology”, edited by F.N. Marzulli and H.I. Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. 5th Edition, p 515–530.
               
            
                  13)
               
               
                  Tyrrell R.M., Pidoux M (1987) Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes. Cancer Res., 47, 1825–1829.
               
            
                  14)
               
               
                  ISO 10977. (1993). Photography – Processed photographic colour films and paper prints – Methods for measuring image stability.
               
            
                  15)
               
               
                  Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, International Commission on Illumnation, Publication No. 90, Vienna, 1993, ISBN 3 900 734 275
               
            
                  16)
               
               
                  ZEBET/ECVAM/COLIPA – Standard Operating Procedure: In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 September, 1998. 18 pgs.
               
            
                  17)
               
               
                  Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, O., Holzhütter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter chemicals from Annex VII of the European Union Directive 76/768/EEC, in the in vitro 3T3 NRU phototoxicity test. ATLA 26, 679–708.
               
            
                  18)
               
               
                  Holzhütter, H.G., and Quedenau, J. (1995) Mathematical modeling of cellular responses to external signals. J. Biol. Systems 3, 127–138.
               
            
                  19)
               
               
                  Holzhütter, H.G. (1997). A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals. ATLA, 25, 445–462.
               
            
                  20)
               
               
                  http://ww.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34377_2349687_l_l_l_l,00.html
               
            
         1. Lisa
         3T3 NRU PT osa kemikaalide fototoksilisuse uuringu jadakäsitlusel
         
            
      
      
         2. Lisa
         Joonis 1
         „Kunstliku päikese” filtritud kiirgusvoo spektraaljaotus
         
            
         (vt punkti 1.4.1.5 teist lõiku)
         Joonisel 1 on esitatud näide, milline peaks olema „kunstliku päikese” flltritud kiirgusvoo spektraaljaotus. Valgusallikas on dopeeritud metallhalogeniidkaarlamp, mida kasutati 3T3 NRU fototoksilisuse määramise valideerimisel (6, 8, 17). Joonisel on näidatud kahe erineva filtri toime ja 96 süvendiga rakukultuuri plaadi kaane täiendav filtriv toime. Filtrit H2 kasutati ainult katsesüsteemide puhul, mis taluvad suuremat hulka UVB kiirgust (nahamudeli test ja vere punaliblede foto-hemolüüsi test). 3T3 NRU fototoksilisuse katses kasutati filtrit H1. Jooniselt on näha, et plaadi kaane täiendav filtriv toime ilmneb peamiselt UVB kiirguse alas; siiski jääb kiirgusspektrisse piisavalt UVB kiirgust, et ergastada selliseid kemikaale nagu amiodaroon, mille neeldumisspekter asub tavaliselt UVB kiirguse piirkonnas (vt tabelit 1).
         Joonis 2
         Balb/c 3T3 rakkude kiirgustundlikkus (mõõdetud UVA kiirguse alas)
         Rakkude elujõulisus (neutraalpunase sidumise protsent kiiritamata kontrollproovides)
         
            
         (vt punkti 1.4.1.5.2 teist lõiku ja punkte 1.4.2.2.1, 1.4.2.2.2)
         Balb/c 3T3 rakkude tundlikkus 3T3 NRU fototoksilisuse katse valideerimisel kasutatud „kunstliku päikesega” kiiritamise suhtes, mõõdetuna UVA piirkonnas. Joonisel on näidatud seitsmes laboris saadud valideerimiseelsed tulemused (1). Kaks valgete sümbolitega sõltuvust saadi vananenud rakkudega (palju passaaže), need rakud tuli asendada uute varurakkudega; mustade sümbolitega sõltuvused iseloomustavad rakke, kelle kiirgustaluvus on lubatud piirides.
         Nendest andmetest määrati kõrgeim mittetsütotoksiline kiirgusdoos 5 J/cm2. Vertikaalne katkendjoon näitab lisaks maksimaalset kiirgustaluvust, mida käsitletakse punktis 1.4.2.2.
      
      B.42.   NAHATUNDLIKKUS: PAIKNE LÜMFISÕLMEDE UURING
      1.   MEETOD
      Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 429ga (2002).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Paikne lümfisõlmede uuring (Local Lymph Node Assay, LLNA) on piisavalt valideeritud ja heaks kiidetud, et selle võiks põhjendatult võtta vastu uue meetodina (1, 2, 3). See on teine meetod kemikaalide nahatundlikkusvõime hindamiseks loomadel. Teises meetodis (B.6) kasutatakse katseid merisigadega, nimelt merisigadega tehtav maksimiseerimiskatse ja Buehleri katse (4).
      LLNA on alternatiivne meetod, mille abil võidakse kindlaks teha nahka sensibiliseerivad kemikaalid ja kinnitada, et kemikaalidel puudub oluline naha sensibiliseerimisvõime. See ei tähenda tingimata seda, et kõikidel juhtudel tuleks kasutada LLNA merisigadega tehtavate katsete asemel, kuid pigem seda, et uuring on ühtmoodi hea ja seda võib kasutada alternatiivina, milles positiivsed ja negatiivsed tulemused üldiselt ei vaja enam kinnitamist.
      LLNA näeb ette teatavad soodustused seoses nii teadusliku arengu kui ka loomade heaoluga. See uurib nahatundlikkuse esilekutsumise etappi ja esitab kvantitatiivsed andmed, mis sobivad annusele reageerimise hindamiseks. LLNA valideerimise üksikasjad ja sellega seotud töö ülevaade avaldatakse (5, 6, 7, 8). Lisaks sellele tuleks märkida, et kerged/mõõdukad sensibilisaatorid, mida soovitatakse sobivaks positiivseks kontrollaineks merisigadega tehtavate katsemeetodite puhul, on samuti sobivad kasutamiseks LLNAga (6, 8, 9).
      LLNA on in vivo meetod ja seetõttu ei lõpetata loomade kasutamist puutetundlikkuse hindamisel. Selles võidakse siiski vähendada selleks ettenähtud loomade arvu vähendamist. Lisaks sellele LLNA-s kasutatud viis loomade puutetundlikkuse uurimiseks on tunduvalt täiustatum. LLNA põhineb kemikaalide põhjustatud immunoloogiliste juhtumite kontrollil tundlikkuse esilekutsumisel. Erinevalt merisigadega tehtavatest katsetest ei eelda LLNA, et tekiksid esilekutsutud naha ülitundlikkusreaktsioonid. Samuti ei eelda LLNA adjuvandi kasutamist, nagu seda tehakse merisigadega tehtava maksimeerimiskatse puhul. Seetõttu vähendab LLNA loomade kannatusi. Hoolimata LLNA hüvedest traditsiooniliste meriseakatsetega võrreldes, tuleks tunnistada, et on teatud piirangud, mis võivad tingida traditsiooniliste meriseakatsete kasutamise (nt valenegatiivsed LLNA leiud teatavate metallide puhul, valepositiivsed leiud teatavate nahka ärritavate ainete puhul) (10).
      Vt ka B osa sissejuhatust.
      1.2.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      LLNA põhimõte on selline, et sensibilisaatorid kutsuvad esile primaarse lümfotsüütide vohamise lümfisõlmes, mis tühjendab keemilise aine ala. Nimetatud vohamine on võrdeline manustatud annusega (ja allergeeni tõhususega) ning pakub lihtsaid vahendeid tundlikkuse objektiivseks ja kvantitatiivseks mõõtmiseks. LLNA hindab nimetatud vohamist annuse ja sellele reageerimise suhtena, milles vohamist katserühmades võrreldakse vohamisega kandeainet manustatud kontrollrühmades. Katserühmade ja kandeainet saanud kontrollrühmade vohamise suhe (stimulatsiooniindeks) määratakse kindlaks ja see peab olema vähemalt 3 enne, kui katseainet saab edasi hinnata võimaliku nahasensibilisaatorina. Siin kirjeldatud meetodid põhinevad radioaktiivse märgistuse kasutamisel, et mõõta raku vohamist. Vohamise hindamise muid lõpp-punkte võib siiski kasutada, tingimusel et on olemas põhjendus ja piisav teaduslik toetus, kaasa arvatud täielikud viited ja meetodite kirjeldus.
      1.3.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.3.1.   Ettevalmistused
      1.3.1.1.   Loomade pidamise ja toitmise tingimused
      Loomi hoitakse eraldi puurides. Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 oC (± 3 oC). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt ei ületa 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal, siis eesmärgiks peaks olema selle hoidmine vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega.
      1.3.1.2.   Loomade ettevalmistamine
      Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identifitseerimise võimaldamiseks (kuid mitte kõrvamärkide kujul) ning hoitakse oma puurides vähemalt viis päeva enne annustamise alustamist, et võimaldada neil kohaneda laboritingimustega. Enne katse alustamist uuritakse kõiki loomi, tagamaks, et neid ei ole nähtavaid nahakahjustusi.
      1.3.2.   Katsetingimused
      1.3.2.1.   Katseloomad
      Käesoleva katse jaoks valitud liik on hiir. Kasutatakse CBA/Ca või CBA/J liini noori täiskasvanud emashiiri, kes ei ole poeginud ega ei ole tiined. Katse alguses peaksid loomad olema 8–12 nädalat vanad ning loomade massimuutus peaks olema minimaalne ja mitte ületama 20 % keskmisest massist. Muid liine ja isasloomi võib kasutada, kui on loodud piisavalt andmeid, tõendamaks, et LLNA reaktsioonis ei ole olulisi liini ja/või soospetsiifilisi erinevusi.
      1.3.2.2.   Usaldusväärsuse kontroll
      Positiivseid kontrolle kasutatakse selleks, et tõendada katse sobivat sooritamist ja labori pädevust katse edukaks sooritamiseks. Positiivne kontroll peaks andma positiivse LLNA reaktsiooni kokkupuutetasemel, mis eeldatavasti suurendab stimulatsiooniindeksit (SI) > 3 negatiivse kontrollrühma suhtes. Positiivne kontrollannus tuleks valida selline, et esilekutsumine on selge, kuid mitte liigne. Eelistatud ained on heksüülkanüülaldehüüd (CASi nr 101-86-0, EINECSi nr 202-983-3) ja merkaptobensotiasool (CASi nr 149-30-4, EINECSi nr 205-736-8). Võib olla olukordi, kus piisavalt põhjendatult võib kasutada muid kontrollaineid, mis vastavad eespool toodud kriteeriumidele. Kuigi tavaliselt võidakse eeldada positiivset kontrollrühma igas katses, võib olla olukordi, kus katselaboritel on olemas varasemad positiivse kontrolli andmed, mis näitavad rahuldava reaktsiooni järjepidevust kuue kuu või pikema perioodi jooksul. Sellistel juhtudel võib osutuda vajalikuks katsete tegemine harvem positiivsete kontrollrühmadega mitte pikemate kui kuuekuuliste intervallidega. Kuigi tuleks uurida positiivset kontrollainet kandeaines, mis teatavasti annab samasuguse reaktsiooni (nt atsetoon: oliiviõli), võib esineda teatavaid normatiivseid olukordi, kus mittestandardse kandeainega (kliiniliselt/keemiliselt asjaomane preparaat) katsete tegemine võib samuti olla vajalik. Sellises olukorras tuleks uurida võimalikku positiivse kontrollaine ja nimetatud ebatavalise kandeaine vahelist koostoimet.
      1.3.2.3   Loomade arv, annusemäärad ja kandeaine valik
      Ühes annuserühmas kasutatakse minimaalselt nelja looma, minimaalselt kolme katseaine kontsentratsiooni ja negatiivset kontrollrühma, kelle puhul kasutatakse kandeainet katseaine puhul, ning vajadusel positiivset kontrollrühma. Sellistel juhtudel, kus kogutakse kokku andmed iga looma kohta, kasutatakse minimaalselt viit looma ühes annuserühmas. Kontrollrühma loomi käsitletakse sarnaselt katserühma loomadega, kuid neile ei anta uuritavat ainet.
      Annuse ja kandeaine valik peaks põhinema viites 1 antud soovitusel. Annused valitakse kontsentratsioonide seeriatest 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % jne. Varasemaid andmeid ägeda mürgisuse ja nahaärrituse kohta tuleks arvesse võtta vajadusel kolme järjestikuse kontsentratsiooni valimisel selliselt, et kõrgeim kontsentratsioon suurendab kokkupuudet, kuid väldib süsteemset mürgisust ja liigselt paikset nahaärritust (2, 11).
      Kandeaine tuleks valida katsekontsentratsioonide ja lahustuvuse suurendamisel, samal ajal valmistades katseaine kohaldamiseks sobiva lahuse/suspensiooni. Eelistuse järjekorras on soovitud kandeained atsetoon/oliiviõli (4:1 v/v), dimetüülformamiid, metüületüülketoon, propüleenglükool ja dimetüülsulfoksiid (2, 10), kuid võib kasutada ka muid kandeaineid, kui esitada selleks piisav teaduslik põhjendus. Teatud olukordades võib osutuda vajalikuks kasutada täiendavaks kontrolliks kliiniliselt põhjendatud lahustit või kaubanduslikku valmistist, milles katseainet turustatakse. Tuleks olla eriliselt ettevaatlik, tagamaks, et hüdrofiilsed ained lisatakse kandeaine süsteemi, mis niisutab nahka ja ei voola kohe maha. Seetõttu tuleks täielikke vesilahuseid vältida.
      1.3.3.   Katse käik
      1.3.3.1.   Katsete ajakava
      Katse ajakava on järgmine:
      
                   
               
               
                  
                     1. päev
                  
                  Tehakse ükshaaval kindlaks iga looma mass ja see registreeritakse. Katselooma kummagi kõrva tagaossa annustatakse lähteannusena 25 μl katseaine, kandeaine või positiivse kontrollaine (vajadusel) sobivat lahjendust.
               
            
                   
               
               
                  
                     2. ja 3. päev
                  
                  Korratakse 1. päeval tehtud annustamisprotseduuri.
               
            
                   
               
               
                  
                     4.
                     ja 5. päev
                  
                  Katseid ei tehta.
               
            
                   
               
               
                  6. päev
                  
                  Registreeritakse iga looma mass. Süstitakse 250 μl fosfaatpuhvri lisandiga soolalahust (PBS), mis sisaldab 20 μCi (7,4e + 8 Bq) 3H-metüültümidiini, igale katse- ja kontrollrühma hiirele sabaveeni kaudu. Alternatiivselt süstitakse 250 μL fosfaatpuhvrilisandiga soolalahust, mis sisaldab 2 μCi (7,4e + 7 Bq) 125l-jododeoksüuridiini ja 10-5 M-fluorodeoksüuridiini, kõikidele hiirtele sabaveeni kaudu.
                  Viis tundi hiljem loomad surmatakse. Iga katserühma puhul lõigatakse kummastki kõrvast lahti vedelikku ärajuhtivad kõrvalesta lümfisõlmed ning uputatakse fosfaatpuhvrilisandiga soolalahusesse (katserühma proovid pannakse kokku); alternatiivselt iga üksiku looma lümfisõlmepaarid võidakse lahti lõigata ja uputada fosfaatpuhvrilisandiga soolalahusesse (ühe looma proov). Sõlme identifitseerimise ja dissekteerimise üksikasjad ja diagrammid võib leida viite 10 I lisast.
               
            1.3.3.2.   Rakususpensioonide ettevalmistamine
      Katserühmade kokkupandud lümfisõlmerakkudest või üksikute loomade lümfisõlmepaari rakkudest valmistatakse suspensioon, kus kõik rakud õrnalt mehaaniliselt hajutatakse läbi 200 μm avaga roostevabast terasest võrgu. Lümfisõlmerakud pestakse kaks korda ohtralt fosfaatpuhvrilisandiga soolalahusega ja sadestatakse 5 % triklooräädikhappega (TCA) 4 oC juures 18 tundi (2). Graanulid kas suspendeeritakse uuesti 1 ml TCA-s ja pannakse stsintsillatsioonipudelisse, mis sisaldab 10 ml stsintsillatsioonivedelikku 3H-loendamiseks, või pannakse otse gammaloenduri torru 125I-loendamiseks.
      1.3.3.3.   Raku vohamise (inkorporeeritud radioaktiivsuse) määramine
      
         3H-metüültümidiini inkorporeerumist mõõdetakse β-stsintsillatsiooni loendamise teel eraldumistena minutis (DPM). 125I-jododeoksüuridiini inkorporeerumist mõõdetakse 125I-loendamise teel ning samuti väljendatakse DPM-na. Sõltuvalt kasutatud lähenemisest väljendatakse inkorporeerumist DPM-na katserühma kohta (kokkupandud proovid) või DPM-na looma kohta (üksikproovid).
      1.3.3.4.   Vaatlused
      1.3.3.4.1.   Kliinilised vaatlused
      
      Loomadel tuleks hoolikalt jälgida kord päevas kliinilisi tunnuseid – kas annustamiskoha paikne ärritus või süsteemne mürgisus. Kõik vaatlused registreeritakse süstemaatiliselt, säilitades iga looma kohta eraldi andmed.
      1.3.3.4.2.   Kehamassid
      
      Vastavalt punktile 1.3.3.1 tuleks mõõta iga looma kehamass katse alguses ja loomade ettemääratud surmamise hetkel.
      1.3.4.   Tulemuste arvutamine
      Tulemusi väljendatakse stimulatsiooniindeksina (SI). Kokkupandud proove kasutades saadakse SI, jagades iga katserühma kokkupandud radioaktiivne inkorporeerumine kandeaine-kontrollrühma kokkupandud inkorporeerumisega; selle tulemuseks on keskmine SI: Individuaalset lähenemist kasutades tuletatakse SI, jagades iga katseainerühma ja positiivse kontrollrühma keskmise DPM-i looma kohta lahusti-/kandeaine-kontrollrühma keskmise DPM-iga looma kohta. Keskmine SI kandeaine-kontrollrühmade puhul on seega 1.
      Individuaalse lähenemise kasutamine SI arvutamiseks võimaldab sooritada andmete statistilise analüüsi. Sobiva statistilise analüüsi meetodi valimisel peaks uurija säilitama teadlikkuse dispersioonide võimalike ebavõrdsuste kohta ja muude seotud probleemide kohta, mis võivad tingida andmete muutmise või mitteparameetrilise statistilise analüüsi. Andmete tõlgendamise piisav lähenemine on hinnata kõiki katse-ja kandeaine-kontrollrühma üksikandmeid ja saada neist kõige paremini sobiv annuse ja sellele reageerimise kõver, võttes arvesse usalduspiire (8, 12, 13). Uurija peaks jälgima rühmas esinevaid üksikute loomade võimalikke „lubatud veaga” reaktsioone, mis võivad tingida reaktsiooni alternatiivse mõõtmise (nt keskmise asemel mediaan) või lubatud vea kõrvaldamise.
      Otsustusprotsess seoses positiivse reaktsiooniga hõlmab stimulatsiooniindeksit ≥ 3, kui annust ja sellele reageerimist ning vajadusel statistilist olulisust arvesse võetakse (3, 6, 8, 12, 14).
      Kui on vaja selgitada saadud tulemusi, tuleks arvesse võtta katseaine erinevaid omadusi, kaasa arvatud võimalik struktuuriline sarnasus tuntud naha sensibilisaatoritega, võimalik liigne nahaärritus ning annuse ja sellele reageerimise olemus. Neid ja muid kaalutlusi on arutatud üksikasjalikult viites (7).
      2.   ANDMED
      Andmed esitatakse kokkuvõtlikult tabeli kujul, kus on näidatud keskmised ja individuaalsed DPM-väärtused ning stimulatsiooniindeksid iga annuserühma, kaasa arvatud kandeainet saanud rühma puhul.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Katseaine:
                  
                              —
                           
                           
                              tunnusandmed (nt CASi number, kui see on olemas; algupära; puhtus; tuntud lisandid; partii number);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              füüsikaline laad ja füüsikalis-keemilised omadused (nt lenduvus, stabiilsus, lahustuvus);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kui tegu on seguga, selle koostis ja koostisosade suhtelised protsendimäärad.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Kandeaine:
                  
                              —
                           
                           
                              tunnusandmed [puhtus; kontsentratsioon (vajaduse korral), kasutatud kogus];
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kandeaine valiku põhjendamine.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katseloomad:
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatav hiirte liin;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade mikrobioloogiline seisund, kui see on teada;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              päritolu, elamistingimused, toitumine jne;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade arv, vanus ja sugu.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              katseaine ettevalmistamise ja kasutamise üksikasjad,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              annuse valiku põhjendus, kaasa arvatud annusepiirkonna määramise katse tulemused, kui see on sooritatud; kandeaine ja katseaine kontsentratsioonid ning manustatud aine koguhulk;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikandmed toidu ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Usaldusväärsuse kontroll:
                  
                              —
                           
                           
                              kokkuvõte viimase usaldusväärsuse kontrolli tulemustest, mis sisaldavad teavet kasutatud aine, kontsentratsiooni ja kandeaine kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katselaborite praegused ja/või varasemad positiivsed ja negatiivsed kontrollandmed.
                           
                        
            
                   
               
               
                  tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              iga looma mass annustamise alguses ja ettemääratud surmamise hetkel;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tabel keskmiste DPM-väärtuste kohta (kokkupandud proovid) ja üksikute DPM-väärtuste kohta (üksikproovid) ning iga annuserühma (kaasa arvatud kandeaine-kontrollrühm) stimulatsiooniindeksid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vajadusel statistilised analüüsid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mürgisuse ilmnemise algus ja nähud, kaasa arvatud võimalik nahaärritus annustamiskohas igal loomal.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutelu:
                  
                              —
                           
                           
                              lühikommentaar tulemuste, annuse ja sellele reageerimise analüüsi ning vajadusel statistiliste analüüside kohta ja järeldused selle kohta, kas katseainet tuleks pidada naha sensibilisaatoriks.
                           
                        
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  Kimber, I. and Basketter, DA. (1992). The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary. Food and Chemical Toxicology 30, 165–169.
               
            
                  2)
               
               
                  Kimber, I, Derman, R.J., Scholes E.W, and Basketter, DA. (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicology, 93, 13–31.
               
            
                  3)
               
               
                  Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, DA., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E., Hastings, K.L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. Journal of Toxicology and Environmental Health, 53, 563–79.
               
            
                  4)
               
               
                  Testing Method B.6.
               
            
                  5)
               
               
                  Chamberlain, M. and Basketter, DA. (1996). The local lymph node assay: status of validation. Food and Chemical Toxicology, 34, 999–1002.
               
            
                  6)
               
               
                  Basketter, DA., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E (1996). The local lymph node assay- A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology, 34, 985–997.
               
            
                  7)
               
               
                  Basketter, DA., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998). Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology. 36, 327–33.
               
            
                  8)
               
               
                  Van Och, F.M.M, Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J., Van Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employement of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicology, 146, 49–59.
               
            
                  9)
               
               
                  Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, DA. and Kimber, I. (1998). Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde. Journal of Applied Toxicology, 18, 281–4.
               
            
                  10)
               
               
                  National Institute of Environmental Health Sciences (1999). The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds: The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494, Research Triangle Park, N.C. (http://iccvam.niehs.nih.gov).
               
            
                  11)
               
               
                  Testing method B.4.
               
            
                  12)
               
               
                  Basketter, DA., Selbie, E., Scholes, E.W. Lees, D. Kimber, I. and Botham, PA. (1993) Results with OECD recommended positive control sensitisers in the maximisation, Buehler and local lymph node assays. Food and Chemical Toxicology, 31, 63–67.
               
            
                  13)
               
               
                  Basketter DA., Lea L.J., Dickens A., Briggs D., Pate I., Dearman R.J., Kimber I. (1999). A comparison of statistical approaches to the derivation of EC3 values from local lymph node assay dose responses. J. Appl. Toxicology, 19, 261–266.
               
            
                  14)
               
               
                  Basketter DA, Blaikie L, Derman RJ, Kimber I, Ryan CA, Gerberick GF, Harvey P, Evans P, White IR and Rycroft RTG (2000). Use of local lymph node assay for the estimation of relative contact allergenic potency. Contact Dermatitis 42, 344–48.
               
            B.43.   NEUROTOKSILISUSE UURING NÄRILISTEL
      1.   MEETOD
      Käesolev meetod on samaväärne OECD TG 424ga (1997).
      Käesolev katsemeetod on välja töötatud sellise teabe saamiseks, mis on vajalik kemikaalide võimaliku neurotoksilisuse kinnitamiseks või täiendavaks iseloomustamiseks täiskasvanud loomadel. Seda saab kombineerida olemasolevate, korduva annusega toksilisuse uuringute katsemeetoditega või sooritatakse eraldi uuringuna. On soovitav, et OECD neurotoksilisuse uurimise strateegiaid ja meetodeid käsitleva juhisdokumendi (1) osas peetaks nõu, et aidata välja töötada käesoleval katsemeetodil põhinevaid uuringuid. See on eriti tähtis siis, kui võetakse arvesse käesoleva meetodi rutiinseks kasutamiseks soovitatud vaatluste ja katsemenetluste muudatusi. Juhisdokument on koostatud, et hõlbustada muude, teatavates olukordades kasutatavate katsemenetluste valikut.
      Käesoleva meetodi abil ei hinnata arenguga seotud neurotoksilisust.
      1.1   SISSEJUHATUS
      Kemikaalide toksiliste omaduste hindamisel on oluline arvesse võtta võimalikke neurotoksilisi mõjusid. Juba korduvate annustega süsteemset toksilisust uuriv katsemeetod hõlmab vaatlusi, mis skriinivad võimalikku neurotoksilisust. Käesolevat katsemeetodit võib kasutada sellise uuringu väljatöötamiseks, mille abil saadakse lisateavet või kinnitust täheldatud neurotoksiliste mõjude kohta korduva annusega süsteemse toksilisuse uuringutes. Kemikaalide teatavate klasside võimaliku neurotoksilisuse arvessevõtmine võib viidata sellele, et neid võib sobivamalt hinnata, kasutades meetodid ilma eelnevalt korduva annusega neurotoksilisuse uuringutest saadud võimalike neurotoksilisuse märkideta. Selliste kaalutluste hulka kuuluvad nt:
      
                  —
               
               
                  neuroloogiliste märkide või neuropatoloogiliste kahjustuste jälgimine muudes toksilisuse uuringutes kui korduva annusega süsteemse toksilisuse uuringud või
               
            
                  —
               
               
                  struktuuriline samalaadsus või muu teave, mis seob kemikaalid tuntud neurotoksiliste ainetega.
               
            Lisaks sellele võib olla muid näiteid, kui käesoleva katsemeetodi kasutamine on vajalik, vt täiendavad üksikasjad viites (1).
      Käesolev meetod on välja töötatud selliselt, et seda saab kohandada vastavalt erilistele vajadustele, mis kinnitavad kemikaalide teatavat histopatoloogilist ja käitumusega seotud neurotoksilisust ning iseloomustavad ja kvantifitseerivad neurotoksilisi reaktsioone.
      Varem võrdsustati neurotoksilisust neuropaatiaga, millega kaasnevad neuropatoloogilised kahjustused või neuroloogilised väärtalitlused nagu atakk, halvatus või värin. Kuigi neuropaatia on neurotoksilisuse tähtis ilming, on nüüd selge, et on palju muid närvisüsteemi mürgistusnähte (nt motoorse koordinatsiooni kadumine, sensoorsed puudujäägid, õppimis- ja mäluhäired), mida ei pruugita kajastada neuropaatias või muud liiki uuringutes.
      Käesolev neurotoksilisust uuriv katsemeetod on välja töötatud närvikäitumis- ja neuropatoloogiliste häirete tuvastamiseks täiskasvanud närilistel. Kuigi käitumishäired, isegi juhul, kui morfoloogilised muutused puuduvad, võivad peegeldada negatiivset mõju organismile, ei ole mitte kõik käitumismuutused närvisüsteemile omased. Seetõttu tuleks täheldatud muutusi hinnata koostoimes nii korrelatiivsete histopatoloogiliste, hematoloogiliste või biokeemiliste andmetega kui ka muud süsteemse toksilisuse liiki käsitlevate andmetega. Käesoleva meetodiga ettenähtud neurotoksiliste reaktsioonide iseloomustamiseks ja kvantifitseerimiseks tehtav uurimine hõlmab histopatoloogilisi ja käitumisega seotud menetlusi, mida võivad toetada elektrofüsioloogilised ja/või biokeemilised uuringud (1, 2, 3, 4).
      Neurotoksilised ained võivad toimida närvisüsteemi mitmetele osadele ja paljude mehhanismide kaudu. Kuna ükski katsesari ei ole võimeline põhjalikult hindama kõikide ainete neurotoksilist võimet, võib osutuda vajalikuks kasutada muid in vivo või in vitro katseid, mis on omased täheldatud või ootuspärase neurotoksilisuse liigile.
      Käesolevat katsemeetodit võib samuti kasutada koostoimes OECD neurotoksilisuse uurimise strateegiat ja meetodeid käsitlevas juhisdokumendis (1) sätestatud juhistega, et töötada välja uuringud, mis on ette nähtud täiendavaks kirjeldamiseks või annus-reaktsiooni kvantifikatsiooni tundlikkuse suurendamiseks, et paremini hinnata täheldamata negatiivse mõju määra või kinnitaksid kemikaali teadaolevaid või kahtlustatavaid ohte. Näiteks võib välja töötada uuringud, millega neurotoksilisi mehhanisme identifitseeritakse ja hinnatakse või täiendatakse andmeid, mis on saadud juba põhiliste närvi-käitumis- ja neuropatoloogiliste vaatlusprotseduuride kasutamisel. Sellistes uuringutes ei ole vaja hankida andmeid, mis on saadud juba käesoleva meetodi poolt soovitatud standardmenetluste kasutamisel, kui sellised andmed on juba olemas ja neid ei peeta vajalikuks uuringu tulemuste tõlgendamisel.
      Käesolev neurotoksilisuse uuring, kas eraldi või millegagi koos kasutades, annab sellist teavet, mida saab:
      
                  —
               
               
                  kindlaks teha, kas närvisüsteem on alaliselt või pöörduvalt uuritud kemikaali tõttu kahjustatud;
               
            
                  —
               
               
                  aidata kaasa selliste närvisüsteemi muutuste iseloomustamisele, mis on seotud kemikaalidega kokkupuutega ja aluseks oleva mehhanismi mõistmisele;
               
            
                  —
               
               
                  kindlaks määrata annuse ja selle reaktsiooni ning aja ja reaktsiooni suhted, et hinnata täheldamata negatiivse mõju määra (mida saab kasutada kemikaalide ohutuskriteeriumide loomisel).
               
            Käesolevas katsemeetodis manustatakse katseainet suu kaudu. Võib kasutada ka muid manustamisteid (nt naha kaudu või sisse hingates), kuid see võib eeldada soovitatud protseduuride muutmist. Manustamistee valiku kaalutlused sõltuvad inimeste kokkupuute profiilist ja olemasolevast toksikoloogilisest või kineetilisest teabest.
      1.2.   MÕISTED
      
         Kahjulik mõju – selline töötlemisega seotud muutus algtasemest, mis vähendab organismi võimet ellu jääda, sigida või kohaneda keskkonnaga.
      
         Annus – manustatava katseaine kogus. Annust väljendatakse massina (g, mg) või katseaine massina katselooma massiühiku kohta (nt mg kg kohta) või konstantsete toidukontsentratsioonidega (ppm).
      
         Annustamine – üldmõiste, mis hõlmab annust, annustamise sagedust ja kestust.
      
         Neurotoksilisus – negatiivne muutus närvisüsteemi struktuuris ja funktsioonis, mis tuleneb kemikaali, bioloogilise või füüsilise mõjuritega kokkupuutest.
      
         Neurotoksiline aine – kemikaal, bioloogiline või füüsiline mõjur, mis võib põhjustada neurotoksilisust.
      
         NOAEL – lühend täheldamata-kahjuliku-mõju määra kohta ja see on kõrgeim annusmäär, kus ei ole täheldatud kahjulikke, katse tegemisega seotud leide.
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Katsekemikaali manustatakse suu kaudu erinevat annustena laborinäriliste mitmele rühmale. Korduvad annused on tavaliselt eeldatud, ning annustamisrežiim võib olla 28 päeva, subkrooniline 90 päeva või krooniline üks aasta või kauemgi. Käesolevas katsemeetodis sätestatud menetlusi võib samuti kasutada ägeda neurotoksilisuse uuringuks. Loomi uuritakse, et tuvastata või iseloomustada käitumise ja/või neuroloogilisi kõrvalekaldeid. Igal vaatlusperioodil hinnatakse neurotoksiliste ainete mõjutatud hulka kattumisi. Katse lõpus osale loomadest (igas katserühmast, mõlemast soost) tehakse in situ perfusioon ning ajust, seljaajust ja perifeersetest närvidest prepareeritakse lõiked ja neid uuritakse.
      Kui uuring tehakse eraldi uuringuga neurotoksilisuse skriinimiseks või neurotoksiliste mõjude iseloomustamiseks, võib kasutada igast rühmast loomi, keda ei kasutatud perfusioonil ja hiljem histopatoloogilisel uuringul (vt tabel 1), teatavate närvi-käitumis-, neuropatoloogilistel, neurokeemilistel või elektrofüsioloogilistel protseduuridel käesoleva meetodi (1) poolt nõutavatest standarduuringutest saadud andmete täiendamiseks. Need täiendavad protseduurid võivad olla eriti kasulikud, kui empiirilised vaatlused või oodatavad mõjud viitavad kemikaali neurotoksilisuse teatavale liigile või sihtmärgile. Alternatiivselt võib kasutada allesjäänud loomi sellistel hindamistel, mis on ette nähtud närilistega tehtavate korduva annusega toksilisuse uuringute katsemeetodites.
      Kui käesoleva katsemeetodi protseduure kombineeritakse muude katsemeetodite protseduuridega, on vaja piisavalt loomi mõlemate uuringute vaatluste nõuete rahuldamiseks.
      1.4.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.4.1.   Loomaliikide valik
      Eelistatud näriliste liik on rotid, kuigi võib põhjenduse korral kasutada ka näriliste teisi liike. Rakendatakse noorte täiskasvanute ja tervete loomade enimkasutatavaid laboritüvesid. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Annustamist tuleks alustada tavaliselt nii kiiresti kui võimalik pärast võõrutamist, soovitavalt mitte enne, kui loomad on kuuenädalased, ja igal juhul enne, kui loomad on üheksanädalased. Kui käesolevat uuringut siiski kombineeritakse muude uuringutega, on vaja kohandada vanusenõuet. Uuringut alustades peaks loomade massi muutus olema minimaalne ja ei tohiks ületada ± 20 % iga soo keskmisest massist. Kui tehakse korduva annusega lühiajaline uuring pikaajalise uuringu alguuringuna, tuleks kasutada mõlemas uuringus samast liinist ja sama päritolu loomi.
      1.4.2.   Loomade pidamise ja toitmise tingimused
      Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 oC (± 3 oC). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt ei ületa 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal, siis eesmärgiks on seda hoida vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Valju katkendlikku heli tuleks vältida. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega. Toiduvalikut võib mõjutada vajadus tagada katseaine sobiv lisamine, kui katseainet manustatakse käesoleva meetodi abil. Loomi võib hoida eraldi või väikestes samast soost loomade rühmades.
      1.4.3.   Loomade ettevalmistamine
      Terved noored loomad määratakse juhuvaliku alusel kontroll- ja katserühma. Puurid asetatakse nii, et puuri asetamisest tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Loomad identifitseeritakse individuaalselt ja hoitakse oma puurides vähemalt viis päeva enne uurimuse alustamist, et võimaldada laboritingimustega kohanemist.
      1.4.4.   Manustamisviis ja annuste ettevalmistamine
      Käesolevas katsemeetodis manustatakse katseainet suu kaudu. Suu kaudu saab manustada sondi abil, toiduga, joogiveega või kapslitena. Võib kasutada ka muid manustamisviise (nt naha kaudu või sisse hingates), kuid see võib eeldada soovitatud protseduuride muutmist. Manustamisviisi valiku kaalutlused sõltuvad inimeste kokkupuute omadustest ja olemasolevast toksikoloogilisest või kineetilisest teabest. Tuleks ära märkida põhjendus manustamisviisi valimiseks ning käesoleva meetodi protseduuride muudatuste tegemiseks.
      Vajadusel lahustatakse või suspendeeritakse katseaine sobivas kandeaines. On soovitav, et võimaluse korral kaalutakse esmalt vesilahuse/-suspensiooni kasutamist, seejärel õlilahuse/-emulsiooni (nt maisiõli) kasutamist ja siis võimalikku muude kandealuste lahust/suspensiooni. Kandeaine toksilised omadused peaksid olema teada. Lisaks sellele tuleks arvesse võtta järgmisi kandeaine omadusi: katseaine absorbtsiooni, jaotamist, metabolismi või peetumist käsitlevad mõjud; katseaine keemilisi omadusi käsitlevad mõjud, mis võivad muuta toksilisi omadusi; ning loomade toidu- või veetarbimist või toitumust käsitlevad mõjud.
      1.5.   PROTSEDUURID
      1.5.1.   Loomade arv ja sugu
      Kui uuring tehakse eraldi uuringuga, tuleks kasutada vähemalt 20 looma (10 emaslooma ja 10 isaslooma) igas annus- ja kontrollrühmas üksikasjalike kliiiniliste ja funktsionaalsete vaatluste hindamiseks. Vähemalt viiele isasloomale ja viiele emasloomale, kes on valitud nimetatud 10 isaslooma ja 10 emaslooma hulgast, teha perfusioon in situ ja kasutada neid üksikasjalikus neurohistopatoloogilises uuringus katse lõpus. Juhul, kui vaadeldakse üksnes piiratud arvu antud annusrühmas olevaid loomi neurotoksiliste mõjude tunnuste osas, tuleks arvesse võtta nimetatud loomade lisamist nende hulka, kes valitakse perfusiooniks. Kui uuring tehakse koos korduva annusega toksilisuse uuringuga, tuleks kasutada piisavalt loomi mõlema uuringu eesmärkide täitmiseks. Loomade minimaalne arv iga rühma kohta erinevate uuringute kombinatsioonides on toodud tabelis 1. Kui osa loomades surmatakse uuringu kestel või suunatakse toibuvatest loomadest koosnevasse rühma toksiliste mõjude pöörduvuse, püsivuse või hilisema esinemise vaatlemiseks katse järel või kui kaalutakse täiendavaid vaatlusi, siis tuleks suurendada loomade arvu, tagamaks, et vaatluseks ja histopatoloogilisteks uuringuteks oleks kättesaadav nõutav arv loomi.
      1.5.2.   Katse- ja kontrollrühm
      Tuleks kasutada vähemalt kolme katse- ja kontrollrühma, kuid kui muude andmete hindamisel ei eeldata ühtegi mõju korduva annusega 1 000 mg kg kehamassi kohta päevas, võib teha piirkatse. Kui puuduvad sobivad andmed, tuleks teha annuse piirkonna määramise katse, et aidata kindlaks määrata kasutatavaid annuseid. Kontrollrühma loomi käsitletakse sarnaselt katserühma loomadega, kuid neile ei anta uuritavat ainet. Kui kandeainet kasutatakse katseaine manustamisel, peaks kontrollrühm saama kandeainet suurima kasutatud kogusena.
      1.5.3.   Usaldusväärsuse kontroll
      Uuringut teostav labor peaks esitama andmed oma võime kohta teostada uuringut ja kasutatud protseduuride tundlikkuse kohta. Sellised andmed peaksid tõendama võimet tuvastada ja kvantifitseerida muutusi lõpp-punktides, mille vaatlemist soovitatakse. Nendeks on autonoomsed sümptomid, sensoorne reaktiivsus, jäseme haardejõud ja motoorne aktiivsus. Teave kemikaalide kohta, mis põhjustavad erinevat liiki neurotoksilisi reaktsioone ja mida võib kasutada positiivsete kontrollainetena, võib leida viidetes 2–9. Varasemaid andmeid võib kasutada, kui katsemenetluste olulised aspektid jäävad samaks. Varasemate andmete perioodiline ajakohastamine on soovitav. Protseduuride jätkuvat tundlikkust tõendavad uued andmed tuleks luua, kui katset sooritav labor on muutnud katse tegemise mõningaid olulisi osasid või menetlusi.
      1.5.4.   Annuse valik
      Annusemäärade valimisel tuleks võtta arvesse kõiki katseühendi või sellega seotud ainete saadaolevaid varem saadud toksilisuse ja kineetilisi andmeid. Kõrgeim annusemäär tuleks valida eesmärgiga põhjustada neurotoksilisi mõjusid või selgeid süsteemseid toksilisi mõjusid. Tuleks valida annusmäärade alanev järjestus, eesmärgiga näidata annusega seotud reaktsiooni ja mittetäheldatud kahjulikku mõju (NOAEL) väikseima annusemäära puhul. Põhimõtteliselt tuleks annusemäärad kehtestada nii, et saaks eristada algseid toksilisi mõjusid närvisüsteemile süsteemse toksilisusega seotud mõjudest. Kahe- või kolmekordsed vahemikud on sageli optimaalsed ning sageli on eelistatud neljanda katserühma lisamine väga suurte vahemike (nt üle kümnekordne tegur) annuste vahel. Kui inimese vastuvõtlikkuse kohta on olemas mõistlik hinnang, tuleks seda arvesse võtta.
      1.5.5.   Piirkatse
      Kui katse ühe annusega, milleks on vähemalt 1 000 mg kg kehamassi kohta, kasutades kirjeldatud protseduure, ei põhjusta täheldatavaid neurotoksilisi mõjusid ja kui toksilisus ootuspäraselt põhineb struktuurselt lähedaste ainete andmetel, siis ei peeta kolme annuse taset käsitlevat täielikku uuringut vajalikuks. Inimeste ootuspärane kokkupuude võib viidata piirkatses kasutavatest suukaudsetest annustest suuremate annuste kasutamise vajadusele. Muude manustamisviiside korral, nagu näiteks sissehingamine või naha kaudu manustamine, võivad katseaine füüsikalis-keemilised omadused tihti viidata suurimale kokkupuutetasemele. Ägeda suukaudse uuringu tegemiseks peaks piirkatse annus olema vähemalt 2 000 mg/kg.
      1.5.6.   Annuste manustamine
      Loomadele annustatakse katseainet kord päevas, seitse päeva nädalas, vähemalt 28 päeva; viiepäevase annustamisrežiimi või lühema kokkupuute perioodi kasutamist on vaja põhjendada. Katseainet manustatakse ühekordse annusena sondi abil söögitoru kaudu või sobiva intubeerimise kanüüli abil. Vedeliku suurim kogus, mida saab ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Kogus ei tohiks ületada 1 ml/100 g kehamassi kohta. Vesilahuste puhul võib siiski manustada 2 ml/100 g kehamassi kohta. Arvesse võtmata ärritavaid või söövitavaid aineid, mille mõjud tavaliselt halvenevad suuremate kontsentratsioonide korral, tuleks vähendada katsekoguse varieeruvust, reguleerides kontsentratsioone nii, et kogumaht kõikide annuste korral jääks samaks.
      Toidu või joogivee kaudu manustatud ainete puhul on oluline tagada, et hõlmatud katseaine kogused ei häiriks tavapärast toitumist või veetasakaalu. Kui katseainet manustatakse toiduga kas püsiva toidukontsentratsioonina (ppm) või võidakse kasutada püsivat annusemäära looma kehamassi suhtes, siis tuleb täpsustada kasutatud alternatiivi. Sondi kaudu manustatud aine puhul tuleks annus anda samal kellaajal iga päev ja kohandada vähemalt igal nädalal, et säilitada konstantne annusemäär looma kehamassi suhtes. Kui korduva annusega uuringut tehakse pikaajalise uuringu alguuringuga, tuleks kasutada mõlemas uuringus sama toitu. Erandkorras, kui ühekordne annus ei ole võimalik, manustatakse annust väiksemates osades kuni 24 tunni jooksul.
      1.6.   VAATLUSED
      1.6.1.   Vaatluste ja katsete sagedus
      Korduva annusega uuringutes peaks vaatlusperiood hõlmama annustamisperioodi. Akuutsetes uuringutes tehakse vaatlusi katse järel 14 päeva. Satelliitrühma kuuluvate loomade puhul, keda hoitakse kokkupuutumise eest katsejärgsel perioodil, peaks vaatlused hõlmama sama perioodi.
      Vaatlusi tuleks teha piisavalt sageli, et suurendada mis tahes käitumisega seotud ja/või neuroloogiliste kõrvalekallete tuvastamise tõenäosust. Vaatlusi peaks tegema soovitavalt sama ajal iga päev, võttes arvesse oodatavate mõjude kõrghetke pärast annustamist. Kliiniliste vaatluste ja funktsionaalsete katsete sagedus on esitatud kokkuvõtlikult tabelis 2. Kui varasematest uuringutest saadud kineetilised või muud andmed viitavad vajadusele kasutada erinevaid vaatlus-, katse- või vaatlusjärgseid aja hetki, tuleks vastu võtta alternatiivne ajakava maksimaalse teabe saamiseks. Ajakava muudatuste kohta tuleks esitada põhjendus.
      1.6.1.1.   Üldise tervisliku seisundi ja suremuse/haigestumuse vaatlused
      Kõiki loomi tuleks hoolikalt vaadelda vähemal kord päevas nende tervisliku seisundit arvesse võttes ning vähemalt kaks korda päevas haigestumuse ja suremuse osas.
      1.6.1.2.   Üksikasjalikud kliinilised vaatlused
      Üksikasjalikud kliinilised vaatlused tuleks teha kõikide loomade kohta, kes on valitud sel eesmärgil (vt tabel 1), üks kord enne esimest kokkupuudet (et võimaldada sama katselooma käsitlevaid võrdlusi) ja seejärel erinevate ajavahemike tagant, sõltuvalt uuringu kestusest (vt tabel 2). Üksikasjalikud kliinilised vaatlused toibuvate loomade satelliitrühmade kohta tuleks teha toibumisperioodi lõpus. Üksikasjalikud kliinilised vaatlused tuleks teha looma oma puurist väljaspool standardalal. Neid peaks hoolikalt registreerima, kasutades punktisüsteeme, mis hõlmavad kriteeriume või punktiskaalasid iga vaatluse käigus tehtava mõõtmise kohta. Kasutatavad kriteeriumid või skaalad tuleks selgesõnaliselt määratleda katselabori poolt. Tuleb püüda tagada, et muutused katsetingimustes oleksid minimaalsed (mitte süsteemselt seotud katsega) ning et vaatlusi teeks koolitatud vaatlejad, kes ei ole teadlikud tegelikust käsitlemisest.
      On soovitav, et vaatlusi tehtaks struktuurselt, et täpselt määratletud kriteeriume (kaasa arvatud määratlus „normaalne vahemik”) kohaldatakse süsteemselt iga looma suhtes igal vaatlusel. Normaalne vahemik tuleks adekvaatselt dokumenteerida. Kõik täheldatud sümptomid tuleks registreerida. Kui see on teostatav, tuleks registreerida ka täheldatud sümptomite suurus. Kliinilised vaatlused peaksid hõlmama, kuid mitte ainult, naha, karvkatte, silmade, limaskestade, eritiste esinemise ja autonoomse aktiivsuse (nt pisaravool, piloerektsioon, pupilli suurus, ebatavaline hingamismudel ja/või suu kaudu hingamine (lõõtsutamine), kõik urineerimise või roojamisega seotud ebatavalised sümptomid ning uriini värvumine) muutusi.
      Kõik ebatavalised reaktsioonid seoses kehaasendi, aktiivsuse astme (nt standardala vähenenud või suurenenud uurimine) ning liigutuste koordinatsiooniga tuleks samuti üles märkida. Muutused kõnnakus (nt taarumine, ataksia), kehaasendis (nt küürus selg) ning käsitlemise, asetamise või muude keskkonnaga stiimulitega seotud reaktiivsuses ning klooniliste või tooniliste liigutuste, krampide või värinate esinemine, stereotüübid (nt ülemäärane sugemine, ebatavalised pea liigutused, korduv tiirutamine) või veider käitumine (nt hammustamine või ülemäärane lakkumine, enesesandistamine, tagurpidi kõndimine, häälitsemine) või agressiivsus tuleks registreerida.
      1.6.1.3.   Funktsionaalsed katsed
      Sarnaselt üksikasjalikele kliinilistele vaatlustele, tuleks funktsionaalsed katsed samuti teostada üks kord enne kokkupuudet ja seejärel sageli kõiki loomadega, kes on sel eesmärgil välja valitud (vt tabel 1). Funktsionaalsete katsete tegemise sagedus on samuti sõltuv uuringu kestuses (vt tabel 2). Lisaks tabelis 2 sätestatud vaatlusperioodidele tuleks funktsionaalsed vaatlused toibuvate loomade satelliitrühmade suhtes samuti teha võimalikult lähedal lõplikule surmamisele. Funktsionaalsetes katsetes peaks käsitlema sensoorset reaktiivsust erinevatele stiimulitele (nt kuulmis-, nägemis- ja propriotseptoorsed stiimulid (5, 6, 7)), jäseme haardejõu hindamine (8) ja motoorse tegevuse hindamine (9). Motoorset tegevust tuleks mõõta automaatseadme abil, mis on võimeline avastama nii tegevuse vähenemise kui suurenemise. Kui kasutatakse muud kindlaksmääratud süsteemi, peaks see olema kvantitatiivne ning selle tundlikkus ja usaldusväärsus peaksid olema tõendatud. Iga seadet tuleb testida selle usaldusväärsuse tagamiseks aja jooksul ja seadmete vastavuse tagamiseks. Järgitavate protseduuride täiendavad üksikasjad on toodud vastavates viidetes. Kui puuduvad andmed (nt struktuuraktiivsus, epidemioloogilised andmed, muud toksikoloogilised uuringud), mis viitaksid võimalikele neurotoksiliste mõjudele, tuleks kaaluda sensoorseid ja motoorseid funktsioone või õppimist ja mälu uurivate täpsemate katsete lisamist nimetatud võimalike mõjude uurimiseks üksikasjalikumalt. Viites 1 on esitatud rohkem teavet täpsemate katsete ja nende kasutamise kohta.
      Erandkorras, loomad, kel ilmnevad mürgistusnähud sellises ulatuses, et see oluliselt häiriks funktsionaalse katse sooritamist, võib katsest välja jätta. Tuleks esitada loomade funktsionaalsest katsest väljajätmise põhjendus.
      1.6.2.   Kehamass ja toidu/vee tarbimine
      Kuni 90päevaste uuringute puhul tuleks loomi kaaluda vähemalt kord nädalas ja mõõtmisi tuleks teha toidu tarbimise kohta (vee tarbimine, kui katseainet manustatakse nimetatud keskkonnas) vähemalt kord nädalas. Pikaajaliste uuringute puhul tuleks kaaluda kõiki loomi vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala jooksul ja seejärel vähemalt kord iga 4 nädala tagant. Mõõtmisi toidu tarbimise kohta (vee tarbimine, kui katseainet manustatakse nimetatud keskkonnas) tuleks teha vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala jooksul ja seejärel ligikaudu kolmekuuliste intervallide tagant, välja arvatud juhul, kui tervislik seisundi või kehamassi muutumine näeb ette teisiti.
      1.6.3.   Oftalmoloogia
      Pikemate kui 28päevaste uuringute puhul tuleks teha oftalmoloogiline uuring, kasutades oftalmoskoopi või samalaadset sobivat instrumenti, enne katseaine manustamist ja katse lõpetamisel, eelistatavalt kõikide loomadega, kuid vähemalt loomadega, kes on suure annusemääraga või kontrollrühmades. Kui avastatakse muutused silmades või kui kliinilised tunnused viitavad selle vajadusele, tuleks uurida kõiki loomi. Pikaajaliste uuringute puhul tuleks teha oftalmoloogiline uuring 13 nädala jooksul. Oftalmoloogilisi uuringuid ei ole vaja teha, kui selle kohta on juba olemas andmed, mis on saadud muudest, sarnase kestusega ja samalaadse annusemääraga uuringutest.
      1.6.4.   Hematoloogia ja kliiniline biokeemia
      Kui neurotoksilisuse uuring tehakse koos korduva annusega süsteemse toksilisuse uuringuga, tuleks teha hematoloogilised uuringud ja kliinilise biokeemia määramised vastavalt süsteemse toksilisuse uuringu asjaomasele meetodile. Proove tuleks koguda selliselt, et vähendatakse kõiki võimalikke mõjusid neuroloogilisele käitumisele.
      1.6.5.   Histopatoloogia
      Neuropatoloogiline uuring tuleks välja töötada uuringu in vivo etapis tehtud vaatluste täiendamiseks ja laiendamiseks. Proovid vähemalt viie looma kudedest soo ja rühma kohta (vt tabel 1 ja järgmine lõige) fikseeritakse in situ, kasutades üldtunnustatud perfusiooni- ja fiksatsioonitehnikat (vt 3. viite 5. peatükk ja 4. viite 50. peatükk). Kõik täheldatavad suured muutused tuleks registreerida. Kui uuringut teostatakse eraldi uuringuga neurotoksilisuse skriinimiseks või neurotoksiliste mõjude iseloomustamiseks, võib kasutada ülejäänud loomi kas teatavate neuroloogilise käitumisega seotud (10, 11), neuropatoloogilistes (10, 11, 12, 13), neurokeemilistes (10, 11, 14, 15) või elektrofüsioloogilistes (10, 11 ,16 17) protseduurides, mis võivad täiendada siin kirjeldatud protseduure ja uuringuid, või kasutada histopatoloogias uuritavate subjektide arvu suurendamiseks. Need täiendavad protseduurid võivad olla eriti kasulikud, kui empiirilised vaatlused või oodatavad mõjud viitavad kemikaali neurotoksilisuse (2, 3) teatavale liigile või sihtmärgile. Alternatiivselt võib ülejäänud loomi samuti kasutada rutiinsetes patoloogilistes hindamistes, nagu on kirjeldatud korduvate annustega uuringute meetodis.
      Kõik parafiini valatud koeproovid värvitakse üldise värvimisprotseduuri abil, nt hematoksüliin ja eosiin (H&E), ning neid uuritakse mikroskoopiliselt. Kui täheldatakse või kahtlustatakse perifeerse neuropaatia sümptomeid, tuleks uurida plastikusse valatud perifeerse närvikoe proove. Kliinilised tunnused võivad anda põhjust uute kohtade uurimisele või eriliste värvimismenetluste kasutamisele. Viidetes (3) ja (4) on antud juhised täiendavate uuringukohtade kohta. Samuti võivad sobivad erivärvid olla abiks teatud liiki patoloogilistele muutustele viitamisel (18).
      Kesk- ja perifeerse närvisüsteemi representatiivsed lõike tuleks uurida histoloogiliselt (vt 3. viite 5. peatükk ja 4. viite 50. peatükk). Uuritavad alad peaksid tavaliselt sisaldama järgmist: eesaju, suuraju keskosa, sh hipokampi läbiv lõige, keskaju, väikeaju, ajusild, piklikaju, silm koos nägemisnärviga ja võrkkestaga, seljaaju kaela- ja nimmetüve kohal, spinaalganglion, spinaal- ja ventraalnärvikiud, proksimaalne istmikunärv, proksimaalne säärenärv (põlves) ja säärenärvipoolsed sääremarjalihase harud. Seljaajust ja perifeersest närvist tehtavate lõigete hulka kuuluvad nii rist- kui pikilõiked. Tähelepanu tuleks pöörata närvisüsteemi veresoonestikule. Samuti tuleks uurida skeletilihasest, eelkõige sääremarjalihasest võetud proovi. Erilist tähelepanu tuleks pöörata kesk- ja perifeerse närvisüsteemi kohtadele, mille raku- ja kiustruktuur ja -tüüp on teatavasti eriti mõjutatud neurotoksiliste ainete poolt.
      Viidetes 3 ja 4 on toodud selliseid neuropatoloogilisi muutusi käsitlev juhend, mida põhjustab kokkupuude toksiliste ainetega. Etapiviisiline koeproovide uuring on soovitav, milles võrreldakse esmalt suure annusega rühma lõikeid kontrollrühma lõigetega. Kui ei ole täheldatud neuropatoloogilisi muutusi nimetatud rühmade proovides, ei ole vaja teha hilisemaid analüüse. Kui neuropatoloogilisi muutusi on täheldatud suure annusega rühmas, tuleks seejärel keskmiste ja väikese annusega rühma igast võimalikust mõjutatud koest võetud proovid kodeerida ja hiljem neid uurida.
      Kui leitakse tõendeid neuropatoloogiliste muutuste kohta kvalitatiivses uuringus, siis tuleks teha teine uuring kõikides närvisüsteemi piirkondades, kus nimetatud muutused esinevad. Kõikide annuserühmade igast võimalikust mõjutatud piirkonnast võetud lõiked tuleks kodeerida ja neid tuleks uurida juhuslikult ilma koodi teadmata. Iga kahjustuse sagedus ja raskusaste tuleks registreerida. Pärast seda, kui kõikide annuserühmade kõiki piirkondi on hinnatud, saab koodi murda ja teha statistilise analüüsi annuse ja sellele reageerimise suhte hindamiseks. Erineva raskusastmega kahjustuse näiteid tuleks kirjeldada.
      Neuropatoloogilisi leide tuleks hinnata käitumisega seotud vaatluste ja mõõtmiste kontekstis ning katseaine varasematest ja praegustest süsteemse toksilisuse uuringutest saadud muude andmete põhjal.
      2.   TULEMUSED
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE
      Tulemused esitatakse iga üksiku looma kohta. Lisaks sellele tuleks esitada kõik andmed kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates iga katse- või kontrollrühma puhul ära loomade arvu katse alguses, katse käigus surnud või humaanselt surmatud loomade arvu ning kõikide surmade või humaansete tapmiste aja, mürgistusnähtude arvu, täheldatud mürgistusnähtude kirjelduse, sh toksiliste mõjude algusaja, kestuse, liigi ja raskuse, kahjustustega loomade arvu, sh kahjustus(t)e liik ja raskus.
      2.2.   TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE
      Uuringu avastusi peaks hindama neuroloogiliste käitumisega seotud ja neuropatoloogiliste mõjude (neurokeemilised või eletkrofüsioloogilised mõjud ning kui lisatakse täiendavad uuringud) esinemissageduse, raskuse ja korrelatsiooni osas ning kõikide muude negatiivsete mõjude osas. Võimaluse korral tuleks hinnata numbrilisi tulemuse sobiva ja üldiselt heakskiidetud statistilise meetodi abil Statistilised meetodid tuleks valida uuringu väljatöötamise ajal.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Katseaine:
                  
                              —
                           
                           
                              füüsiline laad (sh isomeersus, puhtus ja füüsikalis-keemilised omadused);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tunnusandmed.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Kandeaine (vajaduse korral):
                  
                              —
                           
                           
                              kandeaine valiku põhjendamine.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katseloomad:
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatud liigid/liinid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade arv, vanus ja sugu;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              päritolu, pidamistingimused, kohanemine, toitumine jne;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              iga looma kaal katse alguses.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              katseaine valmistise/toiduvalmistise üksikandmed, saavutatud kontsentratsioon, valmistise stabiilsus ja homogeensus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              manustatavate annuste täpsustamine, sh kandeaine, mahu ja manustatava aine füüsilise vormi üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katseaine manustamise üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              annusemäärade valiku põhjendus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              põhjendus kokkupuute viise ja kestuse kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toidu/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni (ppm) muutmine tegelikuks annuseks (mg/kg kehamassi kohta päevas), vajaduse korral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Vaatlus ja katsemenetlused:
                  
                              —
                           
                           
                              üksikasjad igast rühmast loomade määramise kohta perfusiooni alamrühmadesse;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              punktisüsteeme käsitlevad üksikasjad, sh üksikasjalike kliiniliste vaatluste iga mõõtmise kriteeriumid ja punktiskaalad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikasjad funktsionaalsete katsete kohta, milles uuritakse sensoorset reaktiivsust erinevatele stiimulitele (nt kuulmis-, nägemis- ja propriotseptoorsed stiimulid); hinnatakse jäseme haardejõudu; hinnatakse motoorset tegevust (sh üksikasjad automaatseadmete kohta, mis avastavad tegevust); ja, muude käsutatavate menetluste kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikasjad oftalmoloogiliste uuringute kohta ja vajadusel hematoloogiliste uuringute ning kliinilise biokeemia katsete kohta ning asjaomase lähtetaseme väärtuste kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikasjad teatavate neuroloogiliste käitumisega seotud, neuropatoloogiliste, neurokeemiliste või elektrofüsioloogiliste menetluste kohta.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              kehamass/kehamassi muutused, sh kehamass surmamise hetkel;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toidu ja vee tarbimine vajadusel;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toksilist reaktsiooni käsitlevad andmed ja annusemäär, sh toksilisuse või suremuse sümptomid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikasjalike kliiniliste vaatluste (pöörduvad või pöördumatud) olemuse, raskuse ja kestuse kohta (algusaeg ja edasine käik);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              funktsionaalsete katsete tulemuste üksikasjalik kirjeldus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lahangu leiud;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vajadusel kõikide neuroloogiliste käitumisega seotud, neuropatoloogiliste ja neurokeemiliste või elektrofüsioloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              andmed absorbtsiooni ja metabolismi kohta (kui seda on mõõdetud)
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vajadusel tulemuste statistiline töötlemine.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutelu:
                  
                              —
                           
                           
                              teave annuse ja sellele reageerimise kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              muude toksiliste mõjude seos uuritud kemikaali võimaliku neurotoksilisuse kohta tehtud järeldusega;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              täheldamata negatiivse mõju tase.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Järeldused:
                  
                              —
                           
                           
                              uuritava kemikaali üldist neurotoksilisust käsitlevat erimärget soositakse.
                           
                        
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.
               
            
                  2)
               
               
                  Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.
               
            
                  3)
               
               
                  World Health Organization (WHO) (1986). Environmental Health Criteria document 60: Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemicals.
               
            
                  4)
               
               
                  Spencer, PS. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, PS. and Schaumburg, H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.
               
            
                  5)
               
               
                  Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurological Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999–1003.
               
            
                  6)
               
               
                  Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691–704.
               
            
                  7)
               
               
                  Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. Pharmacol., 108, 267–283.
               
            
                  8)
               
               
                  Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. (19 79). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233–236.
               
            
                  9)
               
               
                  Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599–609.
               
            
                  10)
               
               
                  Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (19 9 2). Neurotoxicology Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.
               
            
                  11)
               
               
                  Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. Marcel Dekker, New York.
               
            
                  12)
               
               
                  Broxup, B. (19 91). Neuopathology as a screen for Neurotoxicity Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689–695.
               
            
                  13)
               
               
                  Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. (1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydroxyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18, 343–352.
               
            
                  14)
               
               
                  O'Callaghan, J.P. (19 8 8). Neurotypic and Gliotypic Proteins as Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445–452.
               
            
                  15)
               
               
                  O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368–378.
               
            
                  16)
               
               
                  Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Electrophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, pp. 299–335.
               
            
                  17)
               
               
                  Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neurotoxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicology. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wilkins Co., Baltimore/London, pp. 726–742.
               
            
                  18)
               
               
                  Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Techniques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livingstone.
               
            Tabel 1
      Minimaalne loomade arv rühmas, kui neurotoksilisuse uuringut tehakse eraldi või koos muude uuringutega
      
                   
               
               
                  NEUROTOKSILISUSE UURING, MIS ON TEHTUD:
               
            
                  eraldi uuringuna
               
               
                  kombineeritud 28päevase uuringuga
               
               
                  kombineeritud 90päevase uuringuga
               
               
                  kombineeritud kroonilise toksilisuse uuringuga
               
            
                  
                     Loomade koguarv rühma kohta
                  
               
               
                  10 isaslooma ja 10 emaslooma
               
               
                  10 isaslooma ja 10 emaslooma
               
               
                  15 isaslooma ja 15 emaslooma
               
               
                  25 isaslooma ja 25 emaslooma
               
            
                  Funktsionaalsete katsete, sh üksikasjalike kliiniliste vaatluste jaoks välja valitud loomade arv
               
               
                  10 isaslooma ja 10 emaslooma
               
               
                  10 isaslooma ja 10 emaslooma
               
               
                  10 isaslooma ja 10 emaslooma
               
               
                  10 isaslooma ja 10 emaslooma
               
            
                  Perfusiooniks in situ ja neurohistopatoloogiaks valitud loomade arv
               
               
                  5 isaslooma ja 5 emaslooma
               
               
                  5 isaslooma ja 5 emaslooma
               
               
                  5 isaslooma ja 5 emaslooma
               
               
                  5 isaslooma ja 5 emaslooma
               
            
                  Loomade arv, kes on välja valitud korduva annusega/subkroonilise/kroonilise mürgisuse vaatlustes, hematoloogias, kliinilises biokeemias, histopatoloogias jne, nagu on märgitud vastavates juhendites
               
               
                   
               
               
                  5 isaslooma ja 5 emaslooma
               
               
                  10 isaslooma (10) ja 10 emaslooma (10)
                  
               
               
                  20 isaslooma (10) ja 20 emaslooma (10)
                  
               
            
                  Vajadusel täiendavad vaatlused
               
               
                  5 isaslooma ja 5 emaslooma
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
         
      Tabel 2
      Kliiniliste vaatluste ja funktsionaalsete katsete sagedus
      
                  Vaatluste liik
               
               
                  Uuringu kestus
               
            
                  Äge
               
               
                  28päevane
               
               
                  90päevane
               
               
                  Krooniline
               
            
                  Kõikidel loomadel
               
               
                  üldine tervislik seisund
               
               
                  kord päevas
               
               
                  kord päevas
               
               
                  kord päevas
               
               
                  kord päevas
               
            
                  suremus/haigestumus
               
               
                  kaks korda päevas
               
               
                  kaks korda päevas
               
               
                  kaks korda päevas
               
               
                  kaks korda päevas
               
            
                  
                     Funktsionaalseteks vaatlusteks valitud loomadel
                  
               
               
                  
                     üksikasjalikud kliinilised vaatlused
                  
               
               
                  
                              —
                           
                           
                              enne esimest kokkupuudet
                           
                        
                              —
                           
                           
                              8 tunni jooksul pärast annustamist ajal, mil mõju on hinnanguliselt suurim
                           
                        
                              —
                           
                           
                              7. ja 14. päeval pärast annustamist
                           
                        
               
                  
                              —
                           
                           
                              enne esimest kokkupuudet
                           
                        
                              —
                           
                           
                              seejärel kord nädalas
                           
                        
               
                  
                              —
                           
                           
                              enne esimest kokkupuudet
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kord esimese ja teise kokkupuutenädala jooksul
                           
                        
                              —
                           
                           
                              seejärel kord kuus
                           
                        
               
                  
                              —
                           
                           
                              enne esimest kokkupuudet
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kord esimese kokkupuutekuu lõpus
                           
                        
                              —
                           
                           
                              seejärel iga kolme kuu tagant
                           
                        
            
                  Funktsionaalsed katsed
               
               
                  
                              —
                           
                           
                              enne esimest kokkupuudet
                           
                        
                              —
                           
                           
                              8 tunni jooksul pärast annustamist ajal, mil mõju on hinnanguliselt suurim
                           
                        
                              —
                           
                           
                              7. ja 14. päeval pärast annustamist
                           
                        
               
                  
                              —
                           
                           
                              enne esimest kokkupuudet
                           
                        
                              —
                           
                           
                              neljandal annustamisnädalal võimalikult lähedal kokkupuuteperioodi lõpule
                           
                        
               
                  
                              —
                           
                           
                              enne esimest kokkupuudet
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kord esimese ja teise kokkupuutenädala jooksul
                           
                        
                              —
                           
                           
                              seejärel kord kuus
                           
                        
               
                  
                              —
                           
                           
                              enne esimest kokkupuudet
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kord esimese kokkupuutekuu lõpus
                           
                        
                              —
                           
                           
                              seejärel iga kolme kuu tagant
                           
                        
            B.44.   NAHAKAUDNE IMENDUMINE: IN VIVO MEETOD
      1.   MEETOD
      Käesolev katsemeetod vastab suunisele OECD TG 427 (2004).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Paljude kemikaalidega puututakse kokku peamiselt naha kaudu, samas kui suurema osa toksikoloogiliste uuringute puhul manustatakse uuritavaid aineid katseloomadele suu kaudu. Käesolevas juhendis kirjeldatud in vivo nahakaudse imendumise uuring annab vajaliku seose, millega suukaudse manustamise uuringutest saab teha oletusi aine ohutuse kohta naha kaudu kokkupuutumisel.
      Aine peab enne vereringesse jõudmist läbima suure hulga naharakkude kihte. Enamiku ainete puhul määrab sissetungimise kiiruse sarvkiht (stratum corneum), mis koosneb surnud rakkudest. Naha läbilaskvus sõltub kemikaali lipofiilsusest ja epidermise välimise kihi paksusest ning ka sellistest teguritest nagu aine molekulmass ja kontsentratsioon. Üldiselt on rottide ja küülikute nahk kergemini läbitav kui inimnahk, samas kui merisigade ja ahvide naha läbitavus sarnaneb inimnaha omale.
      Nahakaudse imendumise mõõtmise meetodeid saab jagada kahte kategooriasse: in vivo ja in vitro. In vivo meetod võib anda usaldusväärset teavet nahakaudse imendumise kohta eri liikide katseloomadel. Viimasel ajal on välja töötatud in vitro meetodeid. Nende puhul uuritakse aine tungimist läbi looma või inimese osalise või täispaksusega naha vedelikureservuaari. In vitro meetodit on kirjeldatud eraldi teise katsemeetodi all (1). Soovitav on tutvuda OECD juhenddokumendiga nahakaudse imendumise uuringute läbiviimiseks (2); dokument aitab valida kõige sobivama meetodi igas konkreetses olukorras, kuna selles on esitatud rohkem üksikasju nii in vivo kui ka in vitro meetodi sobivuse kohta.
      Käesolevas metoodikas kirjeldatud in vivo meetod võimaldab määrata uuritava aine tungimist läbi naha süsteemsesse vereringesse. Kõnealust meetodit on laialdaselt kasutatud palju aastaid (3, 4, 5, 6 ja 7). Kuigi paljudel juhtudel võivad sobida nahakaudse imendumise in vitro uuringud, võib esineda ka olukordi, kus ainult in vivo uuringuga on võimalik saada vajalikke andmeid.
      
         In vivo meetodi eelis on füsioloogia ja metabolismi seisukohast täieliku süsteemi kasutamine, ühe loomaliigi kasutamine paljude toksilisusuuringute läbiviimiseks ja võimalus meetodit modifitseerida teiste loomaliikidega kasutamiseks. Puudusteks on elusloomade kasutamine, vajadus kasutada usaldusväärsete tulemuste saamiseks radioaktiivselt märgistatud materjali, raskused varase imendumise faasi kindlaksmääramisel ning eelistatava loomaliigi (rott) ja inimese naha läbilaskvuse erinevused. Loomade nahk laseb üldiselt aineid paremini läbi ja seetõttu võidakse imendumist läbi inimnaha üle hinnata (6, 8 ja 9). Leeliselisi/söövitavaid aineid ei tohiks elusloomadel katsetada.
      1.2.   MÄÄRATLUSED
      
         Imendumata kogus – kogus, mis pestakse maha naha pinnalt pärast kokkupuudet ja mis leidub difusiooniraku peal asuval kattel, sealhulgas kogus, mille kohta näidatakse, et see lendub nahalt kokkupuute ajal.
      
         Imendunud kogus
         
            (in vivo) – kogus, mis leitakse uriinis, puuri pesemise vedelikus, roojas, väljahingatud õhus (kui seda mõõdetakse), veres, kudedes (kui neid kogutakse) ja ülejäänud korjuses pärast pealekandmiskoha naha eemaldamist.
      
         Imenduv kogus – kogus, mis jääb nahale või naha sisse pärast pesemist.
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritav aine, eelistatavalt radioaktiivselt märgistatud, kantakse looma paljakspügatud nahale ühes või enamas sobivas annuses tavaliselt kasutatava preparaadi kujul. Uuritav valmistis jäetakse ettenähtud ajaks nahaga kokkupuutesse sobiva katte all (mis võib kokkupuutekohta lihtsalt katta, pooltihedalt või tihedalt katta), et vältida uuritava valmistise allaneelamist. Kokkupuute lõppedes eemaldatakse kate ja nahk puhastatakse sobiva puhastusainega; kate ja puhastusmaterjal jäetakse analüüsimise jaoks alles ja pannakse uus kate. Loomi hoitakse enne kokkupuudet, selle ajal ja pärast seda metabolismi uurimise üksikpuurides ning nende perioodide väljaheited ja väljahingatud õhk kogutakse analüüsimiseks. Väljahingatud õhu kogumise võib ära jätta, kui on piisavalt teavet selle kohta, et lenduvat radioaktiivset metaboliiti tekib vähe või üldse mitte. Iga uuringu jaoks võetakse tavaliselt mitu rühma loomi, kes viiakse kokkupuutesse uuritava valmistisega. Üks rühm surmatakse kokkupuuteperioodi lõpus. Teised rühmad surmatakse kindlaksmääratud ajavahemike järel pärast seda (2). Proovivõtuaja lõppedes surmatakse allesjäänud loomad, veri kogutakse analüüsimiseks, uuritava aine pealekandmise koht eemaldatakse analüüsimiseks ja korjust analüüsitakse eritumata materjali määramiseks. Proove analüüsitakse sobivate meetoditega ning hinnatakse nahakaudse imendumise taset (6, 8 ja 9).
      1.4.   MEETODI KIRJELDUS
      1.4.1.   Loomaliigi valimine
      Kõige sagedamini kasutatav loomaliik on rott, kuid kasutada võib ka karvavabasid liine ja liike, kellel nahakaudse imendumise kiirus sarnaneb enam inimese omale (viited 3, 6, 7, 8 ja 9). Kasutada tuleb noori terveid täiskasvanud loomi, kes on ühest soost (tavaliselt isased) ja kuuluvad tavaliselt kasutatavatesse laboriliinidesse. Uuringu alguses ei tohiks katselooma kehakaalu erinevus keskmisest kehakaalust ületada ± 20 %. Näiteks on sobivad 200–250 g kaaluvad isasrotid, eriti selle vahemiku ülemisse poolde kuuluvad loomad.
      1.4.2.   Loomade arv ja sugu
      Iga uuritava valmistise ja iga planeeritud lõpetamisaja kohta tuleb kasutada vähemalt nelja ühest soost looma. Iga loomade grupp surmatakse erinevate ajavahemike möödudes, näiteks kokkupuuteperioodi (tavaliselt 6 või 24 tundi) lõppedes ja sellele järgnevate ajavahemike järel (nt 48 ja 72 tunni möödudes). Kui on andmeid, et nahakaudne toksilisus isas- ja emasloomade suhtes on oluliselt erinev, tuleb valida tundlikum sugu. Kui selliseid andmeid ei ole, võib kasutada ükskõik kumba sugu.
      1.4.3.   Pidamis- ja söötmistingimused
      Temperatuur katseloomade ruumis peab olema 22 oC (± 3 oC). Kuigi suhteline niiskus peab olema vähemalt 30 % ja eelistatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal, peaks eesmärgiks olema 50–60 %. Valgustus peab olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmiseks võib kasutada tavalist laborisööta ja see peab olema vabalt kättesaadav koos piiramatu joogivee varuga. Uuringu ajal ja eelistatavalt ka aklimatiseerumise ajal on loomad metabolismi uurimise üksikpuurides. Kuna sööda ja vee sattumine puuri põrandale võib tulemusi rikkuda, tuleb püüda seda võimalust minimeerida.
      1.4.4.   Loomade ettevalmistamine
      Loomad märgistatakse, et iga looma saaks identifitseerida, ja neid hoitakse enne uuringu algust puurides vähemalt viis päeva, et nad harjuksid laboritingimustega.
      Pärast aklimatiseerumisperioodi ja umbes 24 tundi enne uuritava aine pealekandmist pügatakse igal loomal nahk õlgade ja selja piirkonnas paljaks. Kahjustatud naha läbilaskvus erineb terve naha omast, seepärast tuleb olla ettevaatlik ja vältida naha marrastamist. Pärast pügamist ja umbes 24 tundi enne uuritava aine kandmist nahale (vt punkti 1.4.7) puhastatakse naha pinda atsetooniga rasu eemaldamiseks. Lisapesu seebi ja veega ei soovitata, kuna seebijäägid võivad soodustada katseaine imendumist. Ala peab olema piisavalt suur, et võimaldada imendunud uuritava kemikaali koguse arvutamist naha cm2 kohta, eelistatavalt vähemalt 10 cm2. Selline ala on saavutatav 200–250 g kaaluvatel rottidel. Pärast loomade ettevalmistamist pannakse nad tagasi metabolismi uurimise puuridesse.
      1.4.5.   Uuritav aine
      Uuritav aine on aine, mille läbitungimisvõimet uuritakse. Väga hea oleks, kui uuritav aine oleks radioaktiivselt märgistatud.
      1.4.6.   Uuritav valmistis
      Uuritava aine valmistis (st puhas aine, lahjendatud aine või segu, mis sisaldab nahale kantavat uuritavat kemikaali) peab olema sama, millega inimesed või võimalikud sihtloomaliigid võivad kokku puutuda (või aimama seda tõetruult järele). Kõiki kõrvalekaldeid tegelikult kasutatavast valmistisest tuleb põhjendada. Vajadusel lahustatakse või suspendeeritakse uuritav aine sobivas kandjas. Muude kandeainete kui vee puhul peavad olema teada imendumisomadused ja võimalik koostoime katseainega.
      1.4.7.   Nahale kandmine
      Nahapinnal määratakse pealekandmise kohana kindlaks konkreetse suurusega ala. Teadaolev uuritava valmistise kogus kantakse seejärel ühtlaselt sellele alale. See kogus peaks reeglina järele aimama võimalikku kokkupuudet inimesel, tavaliselt 1–5 mg/cm2 tahkete ainete või kuni 10 μl/cm2 vedelike puhul. Muid koguseid tuleb põhjendada eeldatavate kasutamistingimuste, uuringu eesmärkide või uuritava valmistise füüsikaliste omadustega. Pealekandmise järel tuleb seda kohta kaitsta, et loom ei saaks seda puhastada. Tüüpilise vahendi näide on esitatud joonisel 1. Tavaliselt kaitstakse pealekandmiskohta mittetiheda kattega (nt õhku läbilaskev nailonmarlist kate). Ent piiramatu annuse puhul tuleb pealekandmiskoht katta tiheda kattega. Kui pooleldi lenduva uuritava aine aurumine vähendab katseaine määramissaagist liiga palju (vt ka punkti 1.4.10 esimest lõiku), on aurunud aine vaja kinni püüda pealekandmisvahendi aktiivsöest filtrisse (vt joonis 1). On oluline, et vahend ei kahjustaks nahka, seoks katseainet ega reageeriks sellega. Loomad pannakse tagasi metabolismi uurimise üksikpuuridesse väljaheidete kogumiseks.
      1.4.8.   Kokkupuute kestus ja proovide võtmine
      Kokkupuute kestus on ajavahemik uuritava aine pealekandmise ja nahalt pesemise teel eemaldamise vahel. Tuleb kasutada sobivat kokkupuuteaega (tavaliselt 6 või 24 tundi), arvestades inimese kokkupuute eeldatavat kestust. Kokkupuuteaja järel hoitakse loomi metabolismi uurimise puurides kuni planeeritud lõpetamisajani. Loomi tuleb jälgida toksilisuse/ebanormaalsete reaktsioonide suhtes korrapäraste ajavahemike järel kogu uuringu jooksul. Kokkupuuteaja lõpus tuleb nahka vaadelda nähtavate ärritusnähtude suhtes.
      Metabolismi uurimise puurid peavad võimaldama uriini ja rooja eraldi kogumist uuringu jooksul. Need peavad võimaldama ka 14C-süsinikdioksiidi ja lenduvate 14C-süsinikühendite kogumist, mida tuleb analüüsida, kui neid tekib suures koguses (> 5 %). Uriin, roe ja kogumisseadmesse jäänud gaasid (nt 14C-süsinikdioksiid ja lenduvad 14C-süsinikühendid) tuleb koguda eraldi igalt rühmalt igal proovide võtmise ajal. Kui on piisavalt teavet selle kohta, et lenduvat radioaktiivset metaboliiti tekib vähe või üldse mitte, võib kasutada avatud puure.
      Väljaheiteid kogutakse kokkupuuteperioodi ajal, kuni 24 tundi pärast esmast nahakontakti ja seejärel iga päev kuni katse lõpuni. Kolmest väljaheidete kogumise ajavahemikust tavaliselt piisab, ent valmistise uurimise eesmärke või olemasolevaid kineetikaandmeid arvestades võib valida uuringu jaoks sobivamaid või täiendavaid aegu.
      Kokkupuuteperioodi lõpus eemaldatakse igalt loomalt kaitsevahend ja säilitatakse eraldi analüüsimise jaoks. Uuritava valmistisega kokkupuutes olnud nahka pestakse kõikidel loomadel vähemalt 3 korda puhastusvahendiga, kasutades sobivaid tampoone. Tuleb olla ettevaatlik, et mitte saastada teisi kehaosasid. Puhastusaine peab olema tavaline hügieenis kasutatav aine, nt seebi vesilahus. Lõpuks tuleb nahk kuivatada. Kõik tampoonid ja pesuvesi tuleb säilitada analüüsimise jaoks. Seejärel tuleb paigaldada värske kate, et kaitsta kokkupuutes olnud pinda neil loomadel, kes kuuluvad hilisemale ajale vastavatesse rühmadesse, enne kui loomad pannakse tagasi üksikpuuridesse.
      1.4.9.   Katse lõpetamine
      Igas rühmas surmatakse loomad planeeritud ajal ja veri kogutakse analüüsimiseks. Kaitsevahend või kate tuleb analüüsimise jaoks eemaldada. Igalt loomalt eemaldatakse analüüsimiseks kokkupuutekoha nahkja sama suur pügatud nahapind, mis uuritava valmistisega kokku ei puutunud. Kokkupuutekoha naha võib jagada osadeks, eraldades sarvkihi selle all olevast epidermisest, et saada rohkem teavet uuritava kemikaali paiknemise kohta. Uuringud, kuidas kemikaali kogused naha osades muutuvad pärast kokkupuuteperioodi mööduva aja jooksul, peaksid andma ettekujutuse sellest, mis juhtub uuritava kemikaaliga sarvkihis. Naha osadeks jagamise hõlbustamiseks (pärast naha lõplikku pesemist ja looma surmamist) eemaldatakse kaitsekate. Kokkupuutekoha nahk koos rõngakujulise tüki ümbritseva nahaga lõigatakse roti seljast maha ja kinnitatakse alusele. Kleeplindiriba vajutatakse ettevaatlikult naha pinnale ja tõmmatakse siis ära koos osaga sarvkihist. Naha pinnale vajutatakse järjest üha uusi kleeplindiribasid ja tõmmatakse ära; kui kogu sarvkiht on eemaldatud, ei jää riba enam nahapinnale kinni. Iga looma kõik ribad võib panna ühte anumasse, kuhu sarvkihi lahustamiseks lisatakse kudesid lahustavat ainet. Võimalikud sihtkoed võib eemaldada eraldi mõõtmisteks, enne kui ülejäänud korjust analüüsitakse imendunud koguse määramiseks. Üksikloomade korjused säilitatakse analüüsimiseks. Tavaliselt piisab üldsisalduse määramisest. Sihtorganid võib eemaldada eraldi analüüsimiseks (kui see on näidustatud teiste uuringute alusel). Planeeritud surmamise ajal põies leiduv uriin tuleb lisada varem kogutud uriinile. Pärast väljaheidete kogumist metabolismi uurimise puuridest planeeritud surmamise ajal pestakse puurid ja kogumisseadmed sobiva lahustiga. Tuleb uurida ka muud varustust, mis võib olla saastunud uuritava ainega.
      1.4.10.   Määramine
      Kõigis uuringutes tuleb püüda täieliku määramissaagise poole (st saagis peaks olema keskmiselt 100 ± 10 % radioaktiivsusest). Kui saagis jääb väljapoole seda vahemikku, siis tuleb seda põhjendada. Igas proovis kasutatud kogust tuleb analüüsida sobivalt valideeritud meetoditega.
      Statistiliste arvutustega tuleb määrata iga pealekandmiskatse paralleelkatsete dispersioon.
      2.   ANDMED
      Iga looma puhul tuleb igal proovide võtmise ajal teha järgmised uuritava kemikaali ja/või metaboliitide mõõtmised. Lisaks individuaalsetele andmetele tuleb esitada ka proovide võtmise aja alusel rühmitatud andmete keskväärtused.
      
                  —
               
               
                  kaitsevahenditega seotud kogused;
               
            
                  —
               
               
                  nahalt eraldatavad kogused;
               
            
                  —
               
               
                  kogused nahas/nahal, mida ei saa nahalt ära pesta;
               
            
                  —
               
               
                  kogus uurimiseks võetud veres;
               
            
                  —
               
               
                  kogus väljaheidetes ja väljahingatud õhus (vajadusel);
               
            
                  —
               
               
                  kogus, mis jääb korjusesse ja eraldi analüüsimise jaoks eemaldatud organitesse.
               
            Uuritava aine ja/või metaboliitide kogus väljaheidetes, väljahingatud õhus, veres ja korjuses võimaldab määrata igal ajahetkel imendunud aine üldkoguse. Samuti saab arvutada uuritava kemikaali koguse, mis absorbeerus uuritava ainega kokkupuutunud naha 1 cm2 kohta kokkupuuteperioodi vältel.
      3.   TULEMUSTE VORMISTAMINE
      3.1.   KATSEPROTOKOLL
      Katseprotokollis tuleb esitada katse läbiviimisele seatud nõuded, sealhulgas kasutatud katsesüsteemi põhjendus, ning järgmine teave.
      
                   
               
               
                  Uuritav aine:
                  
                              —
                           
                           
                              andmed aine määratlemiseks [nt CASi number, kui see on teada; aine tootja; puhtus (radiokeemiline puhtus); teadaolevad lisandid; partii number];
                           
                        
                              —
                           
                           
                              füüsikaline iseloomustus, füüsikalis-keemilised omadused (nt pH, lenduvus, lahustuvus, stabiilsus, molekulmass ja log Pow).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Uuritav valmistis:
                  
                              —
                           
                           
                              koostis ja kasutamise põhjendus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikasjad uuritava valmistise kohta, pealekantud kogus, saavutatud kontsentratsioon, kandeaine, stabiilsus ja homogeensus.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katseloom:
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatud liik/aretusliin;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade arv, vanus ja sugu,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              loomade päritolu, pidamistingimused, söötmine jne;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikloomade kaal katse alguses.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              uuritava valmistise manustamise üksikasjad (pealekandmiskoht, määramismeetod, katmine tihedalt või mittetihedalt, maht, ekstraheerimine, määramine);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              kõik toksilisuse nähud;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tabel imendumisandmete kohta (väljendatud kiiruse, koguse või protsendina);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katse üldised määramissaagised;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tulemuste tõlgendamine, võrdlus katseaine nahakaudse imendumise seniste andmetega.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutelu.
               
            
                   
               
               
                  Järeldused.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  Testing Method B.45. Skin Absorption: In vitro Method.
               
            
                  2)
               
               
                  OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. OECD, Paris.
               
            
                  3)
               
               
                  ECETOC (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph No. 20.
               
            
                  4)
               
               
                  Zendzian RP (1989) Skin Penetration Method suggested for Environmental Protection Agency Requirements. J. Am. Coll. Toxicol. 8(5), 829–835.
               
            
                  5)
               
               
                  Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990) Methods for skin absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA
               
            
                  6)
               
               
                  EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and Applications. Exposure Assessment Group, Office of Health and Environmental Assessment.
               
            
                  7)
               
               
                  EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic Substances.
               
            
                  8)
               
               
                  Bronaugh RL, Wester RC, Bucks D, Maibach HI and Sarason R (1990) In vivo percutaneous absorption of fragrance ingredients in reshus monkeys and humans. Fd. Chem. Toxic. 28, 369–373.
               
            
                  9.
               
               
                  Feldman RJ and Maibach HI (1970) Absorption of some organic compounds through the skin in man. J. Invest Dermatol. 54, 399–404.
               
            Joonis 1
      Tüüpiline vahend nahakaudse kokkupuute koha määratlemiseks ja kaitsmiseks in vivo nahakaudse imendumise uuringute ajal
      
         
      B.45.   NAHAKAUDNE IMENDUMINE: IN VITRO MEETOD
      1.   MEETOD
      Käesolev katsemeetod vastab suunisele OECD TG 428 (2004).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesoleva meetodiga määratakse väljalõigatud nahatükile kantud uuritava aine imendumist läbi naha. Seda võib kasutada kas koos naha kaudu imendumise in vivo meetodiga (1) või iseseisvalt. Sel meetodil põhinevate uuringute kavandamise hõlbustamiseks soovitatakse kasutada OECD juhenddokumenti nahakaudse imendumise uuringute läbiviimiseks (2). Juhenddokument on ette valmistatud, et lihtsustada sobivate in vitro protseduuride valimist konkreetsete tingimuste puhul, et tagada selle meetodiga saadud tulemuste usaldusväärsus.
      Nahakaudse imendumise ja dermaalse jaotumise mõõtmise meetodid võib jagada kahte kategooriasse: in vivo ja in vitro. Nahakaudse imendumise in vivo meetodeid kasutatakse laialdaselt ja nende abil saadakse farmakoloogilist teavet mitme loomaliigi kohta. In vivo meetodit kirjeldatakse eraldi teise katsemeetodi juures (1). Ka in vitro meetodeid on juba palju aastaid kasutatud nahakaudse imendumise mõõtmiseks. Kuigi käesoleva katsemeetodiga hõlmatud in vitro meetodeid pole ametlikult uuringutega valideeritud, leppisid OECD eksperdid 1999. aastal kokku, et hinnatud andmeid on in vitro meetodi toetamiseks piisavalt (3). Täiendavad üksikasjad, mis seda kinnitavad, sealhulgas ka palju in vitro ja in vivo meetodite otseseid võrdlusi, on esitatud juhenddokumendis (viide 2). Käesolevat teemat on käsitletud mitmes monograafia, milles on üksikasjalikult kirjeldatud in vitro meetodi kasutamise tausta (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ja 12). In vitro meetoditega mõõdetakse kemikaalide difusiooni nahasse ja läbi naha vedelikureservuaari ning seejuures võib kasutada kas mitteelujõulist nahka ainult difusiooni mõõtmiseks või värsket, metaboolselt aktiivset nahka, et mõõta samaaegselt nii difusiooni kui ka metabolismi nahas. Selliseid meetodeid on kasutatud sõeluuringutes mitmesugustest segudest kemikaalide nahka ja läbi naha imendumise võrdlemisel ning need võivad olla ka kasulikeks mudeliteks läbi naha toimuva imendumise hindamiseks inimesel.
      
         In vitro meetod ei pruugi olla kohaldatav igas olukorras ja kõigi kemikaaliklasside puhul. In vitro meetod võib sobida naha läbitavuse esialgseks kvalitatiivseks hindamiseks. Mõnikord on neid andmeid vaja täiendada in vivo andmetega. Juhenddokumendis (2) on täpsustatud, millal võib kasutada in vitro meetodit. Viites 3 on esitatud täiendav üksikasjalik teave sellekohase otsuse põhjendamiseks.
      Käesolevas meetodis esitatakse nahakaudse imendumise ja jaotumise mõõtmise üldpõhimõtted väljalõigatud nahatüki kasutamisel. Võib kasutada paljude imetajaliikide, kaasa arvatud inimese nahka. Naha läbitavusega seotud omadused säilivad pärast kehalt eemaldamist, kuna peamiseks difusioonibarjääriks on eluvõimetu sarvkiht (stratum corneum); aktiivset kemikaalide transporti läbi naha ei ole täheldatud. On tõendatud, et nahal on võime metaboli seerida teatud kemikaale nahakaudse imendumise ajal (6); see protsess ei ole küll kiirust limiteeriv tegelikult imendunud kemikaalikoguse seisukohast, kuid võib mõjutada vereringesse sattuva materjali koostist.
      1.2.   MÕISTED
      
         Imendumata kogus – kogus, mis pestakse maha naha pinnalt pärast kokkupuudet ja mis leidub difusiooniraku peal asuval kattel, sealhulgas kogus, mille kohta näidatakse, et see lendub nahalt kokkupuute ajal.
      
         Imendunud kogus
         
            (in vitro) –
          katseaine mass, mis jõuab vastuvõtvasse vedelikku või süsteemsesse ringesse konkreetse ajavahemiku jooksul.
      
         Imendatav kogus
         
            (in vitro) –
          kogus, mis jääb nahale või naha sisse pärast pesemist.
      1.3.   KATSEEETODI PÕHIMÕTE
      Katseaine, mis võib olla radioaktiivselt märgistatud, kantakse kahte difusiooniraku kambrit eraldava nahatüki pinnale. Kemikaal jääb nahale katseprotokollis näidatud ajaks seal kirjeldatud tingimustes, misjärel see eemaldatakse sobiva puhastamisprotseduuriga. Vastuvõtvast vedelikust võetakse katse käigus proovid teatud ajahetkedel ja analüüsitakse neid uuritava kemikaali ja/või metaboliitide suhtes.
      Kui kasutatakse metaboolselt aktiivseid süsteeme, võib sobivate meetoditega analüüsida uuritava kemikaali metaboliite. Katse lõpus mõõdetakse vajadusel uuritava kemikaali ja selle metaboliitide jaotumine.
      Sobivates tingimustes, mis on kirjeldatud käesoleva meetodi juhendis ja juhenddokumendis (2), mõõdetakse uuritava aine imendumine teatava ajavahemiku vältel, analüüsides vastuvõtvat vedelikku ja nahka, millele oli kantud kemikaal. Naha sisse jäävat uuritavat ainet tuleb käsitada imendununa, välja arvatud juhtudel, kui saab näidata, et imendumist saab määrata ainult vastuvõtva vedeliku väärtuste abil. Teiste komponentide (nahalt maha pestud ja nahakihtidesse jäänud materjal) analüüsimine võimaldab andmeid täiendavalt hinnata, sealhulgas määrata kogu uuritava aine jaotumise ja saagise protsendi.
      Katse läbiviimise korrektsuse ja usaldusväärsuse tõendamiseks viiakse laboris läbi katsed asjaomaste võrdluskemikaalidega; saadud tulemused peavad vastama kasutatud meetodi kohta avaldatud kirjandusandmetele. Selleks võib mõõta sobivat võrdlusainet (mille lipofiilsus võiks olla lähedane uuritava aine omale) samaaegselt uuritava ainega või esitada piisav hulk varasemaid andmeid erineva lipofiilsusega võrdlusainete (nt kofeiin, bensoehape ja testosteroon) imendumise mõõtmise kohta.
      1.4.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.4.1.   Difusioonirakk
      Difusioonirakk koosneb doonorkambrist ja vastuvõtukambrist, mille vahele paigutatakse nahk (tüüpilise kujundusega rakk on kujutatud joonisel 1). Rakuseina ja nahatüki ühenduskoht peab olema tihe, naha alumise pinnaga kontaktis olevast vastuvõtvast lahusest peab saama kergesti proove võtta ja seda lahust peab saama korralikult segada ning raku ja selle sisu temperatuur peab olema hästi kontrollitav. Kasutada võib nii staatilist kui ka läbivooluga difusioonirakku. Tavaliselt jäetakse doonorkamber uuritava aine lõpliku kogusega kokkupuute ajal tihedalt sulgemata. Doonorkambri võib aga pideva pealekandmisega katse ja teatavate lõplike kogustega korraldatavate katsete ajal ka tihedalt sulgeda.
      1.4.2.   Vastuvõttev vedelik
      Eelistatakse füsioloogilisele keskkonnale lähedase vastuvõtva vedeliku kasutamist, kuid kasutada võib ka muid vedelikke, kui see on põhjendatud. Tuleb esitada vastuvõtva vedeliku täpne koostis. Tuleb näidata, et uuritav kemikaal on vastuvõtvas vedelikus piisavalt lahustuv, nii et see vedelik ise ei takistaks imendumist. Lisaks ei tohi vastuvõttev vedelik nahatükki kahjustada. Läbivooluga süsteemi puhul ei tohi voolukiirus takistada uuritava aine difusiooni vastuvõtvasse vedelikku. Staatilise rakuga süsteemis tuleb vedelikku pidevalt segada ja sealt regulaarselt proove võtta. Kui uuritakse metabolismi, peab vastuvõttev vedelik toetama naha elutegevust katse ajal.
      1.4.3.   Nahapreparaadid
      Võib kasutada inimeselt või loomalt võetud nahka. Inimese naha kasutamine toimub muidugi vastavalt iga riigi ja rahvusvahelistele eetilistele tõekspidamistele ja tingimustele. Kuigi eelistatakse elusat nahka, võib kasutada ka mitteelusat nahka, kui saab näidata, et see ei ole kahjustatud. Lubatav on kasutada kas epidermaalmembraane (ensümaatiliselt, kuumusega või keemiliselt eraldatud) või dermatoomi abil saadud õhukest nahakihti (paksusega harilikult 200–400 μm). Võib kasutada täispaksusega nahka, kuid liigset paksust (ca > 1 mm) tuleb vältida, kui eesmärk ei ole määrata uuritavat kemikaali nahakihtides. Loomaliigi, anatoomilise lokalisatsiooni ja preparatsioonitehnika valik peab olema põhjendatud. Nõutavad on usaldusväärsed andmed vähemalt neljast paralleelproovist uuritava preparaadi kohta.
      1.4.4.   Nahapreparaadi kahjustamatus
      On oluline, et nahk oleks õigesti prepareeritud. Vale prepareerimine võib kahjustada stratum corneum’i, seepärast tuleb kontrollida, et prepareeritud nahk ei oleks kahjustatud. Kui uuritakse naha metabolismi, tuleb kasutada värskelt lõigatud nahka võimalikult kiiresti pärast lõikamist ja tingimustes, mis teadaolevalt toetavad metaboolset aktiivsust. Üldreeglina tuleb värskelt lõigatud nahka kasutada 24 tunni jooksul, kuid vastuvõetav säilitusperiood võib oleneda metaboliseerivast ensüümsüsteemist ja säilitustemperatuuridest (13). Kui nahapreparaate on enne kasutamist säilitatud, tuleb tõendada, et barjäärfunktsioon on alles.
      1.4.5.   Uuritav aine
      Uuritav aine on aine, mille läbitungimisvõimet uuritakse. Väga hea oleks, kui uuritav aine oleks radioaktiivselt märgistatud.
      1.4.6.   Uuritav preparaat
      Uuritava aine preparaat (st puhas, lahjendatud või segu koostisse viidud materjal, mis sisaldab nahale kantavat uuritavat ainet) peab olema sama, millega inimene või muu loomaliigi esindaja võib kokku puutuda (või selle lähedane aseaine). Iga kõrvalekaldumine „kasutusel olevast” preparaadist peab olema põhjendatud.
      1.4.7.   Uuritavate ainete kontsentratsioon ja segud
      Tavaliselt kasutatakse mitut uuritava aine kontsentratsiooni, mis on võrreldavad suurima kontsentratsiooniga, millega inimene võib kokku puutuda. Samuti tuleb kaaluda tüüpiliste segude imendumise uurimist.
      1.4.8.   Kandmine nahale
      Inimese harilike kokkupuutetingimuste puhul on tavaliselt tegu lõplike kogustega. Seepärast tuleb nahale kanda kogus, mis modelleerib inimese kokkupuudet ainega, ja see on tavaliselt 1–5 mg/cm2 naha kohta tahkete ainete ja kuni 10 μl/cm2 vedelike puhul. Kogus peaks olema põhjendatud eeldatavate kasutamistingimuste, uuringu eesmärkide või uuritava preparaadi füüsikaliste omadustega. Näiteks võib naha pinnale kantud koguse lugeda lõpmata suureks, kui uuritavat ainet kantakse pindalaühikule suures mahus.
      1.4.9.   Temperatuur
      Temperatuur mõjutab kemikaalide passiivset difusiooni (ja seetõttu nende nahakaudset imendumist). Difusioonikambrit ja nahka tuleb hoida konstantsel temperatuuril, mis on sarnane naha normaalse temperatuuriga 32 ± 1 oC. Erineva kujundusega mõõtmisrakkude puhul on vaja kasutada erinevaid veevanni või soojendatava ploki temperatuure, et tagada vastuvõtva lahuse/naha olek füsioloogilise normi juures. Niiskus peab eelistatavalt olema 30 % ja 70 % vahel.
      1.4.10.   Kokkupuute kestus ja proovide võtmine
      Nahk võib uuritava preparaadiga kokku puutuda kogu katse ajal või lühemate ajavahemike jooksul (et modelleerida inimese kokkupuute mõnd konkreetset tüüpi). Liigne uuritava preparaadi kogus pestakse nahalt sobiva puhastusainega ja loputusvesi kogutakse analüüsimiseks. Uuritava preparaadi eemaldamise viis sõltub oodatavatest kasutustingimustest ning peab olema põhjendatud. Tavaliselt on imendumisprofiili piisavaks kirjeldamiseks vaja võtta proove 24 tunni jooksul. Kuna naha kvaliteet võib 24 tunni pärast hakata langema, ei tohi proove tavaliselt võtta kauem kui 24 tunni jooksul. Kiiresti naha sisse tungivate uuritavate ainete puhul ei pruugi pikem mõõtmine olla vajalikki, aeglasemalt naha sisse tungivate ainete puhul võib olla vaja kasutada pikemat aega. Vastuvõtvast vedelikust proovide võtmise sagedus peab olema piisav, et uuritava aine imendumise profiili saaks esitada graafiliselt.
      1.4.11.   Katse lõpus tehtavad mõõtmised
      Kõik katsesüsteemi komponendid tuleb analüüsida ja määrata uuritava aine kogused. See hõlmab doonorkambrit, naha pinna loputusvedelikku, nahapreparaati ja vastuvõtva vedeliku kambrit. Mõnel juhul võib eraldi analüüsimise jaoks jagada naha eksponeeritud nahapinnaks ja nahaks, mis paiknes raku ääre all, ning stratum corneum’iks, epidermiseks ja dermiseks.
      1.4.12.   Analüüsimine
      Kõigis uuringutes tuleb saavutada piisav saagis (eesmärk peaks olema, et keskmine saagis on 100 ± 10 % radioaktiivsusest ja kõrvalekalded sellest peavad olema põhjendatud). Uuritava aine kogused vastuvõtvas vedelikus, naha pesemise vedelikus ja aparaadi loputamise vedelikus tuleb määrata sobiva meetodi abil.
      2.   ANDMED
      Esitatakse vastuvõtva vedeliku analüüs, uuritava kemikaali jaotus katsesüsteemis ja imendumisprofiil sõltuvana ajast. Kui kasutatakse lõplikule kogusele vastavaid kokkupuutetingimusi, tuleb arvutada kogus, mis pesti nahalt ära, nahaga (sh eri nahakihtidega, kui neid analüüsitakse) seotud kogus ja vastuvõtvas vedelikus olev kogus (kiirus ja kogus või protsent pealekantud kogusest). Mõnikord saab nahakaudset imendumist väljendada ainult vastuvõtva vedeliku andmete kasutamisega. Kui katseaine jääb uuringu lõpus naha sisse, võib siiski olla vajalik arvestada ka see kogus imendunud koguse hulka (vt viide 3, punkt 66). Kui kasutatakse lõpmatule kogusele vastavaid kokkupuutetingimusi, võivad andmed võimaldada läbilaskvuskonstandi (Kp) arvutamist. Nende tingimuste puhul pole imendumise protsent oluline.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuandes tuleb esitada katse läbiviimisele seatud nõuded, sealhulgas kasutatud katsesüsteemi põhjendus, ning lisaks järgmine teave.
      
                   
               
               
                  Uuritav aine:
                  
                              —
                           
                           
                              füüsikaline iseloomustus, füüsikalis-keemilised omadused (vähemalt molekulmass ja log Pow), puhtus (radiokeemiline puhtus);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              identifitseerimiseks vajalikud andmed (nt partii number);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lahustuvus vastuvõtvas vedelikus.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Uuritav preparaat:
                  
                              —
                           
                           
                              koostis ja kasutamise põhjendus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              homogeensus.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katse tingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              naha päritolu ja lokalisatsioon, prepareerimise meetod, säilitustingimused enne kasutamist, mis tahes eeltöötlus (puhastamine, antibiootiline töötlus jne), naha kahjustamatuse mõõtmised, metaboolne staatus, kasutamise põhjendus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              difusiooniraku ehitus, vastuvõtva vedeliku koostis, vastuvõtva vedeliku voolukiirus või proovide võtmise ajad ja meetod;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava preparaadi pealekandmise üksikasjad ja pealekantud kogus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kokkupuute kestus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava preparaadi nahalt eemaldamise, nt naha loputamise üksikasjad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              naha analüüsi üksikasjad ja millist fraktsioneerimistehnikat kasutati, et määrata jaotumine nahas;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              raku ja varustuse pesemise kord;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analüüsimeetodid, ekstraheerimistehnika, avastamispiirid ja analüüsimeetodi valideerimine.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              uuritava aine üldised määratud kogused katses (pealekantud kogus = naha pesuvedelik + nahk + vastuvõttev vedelik + raku pesuvedelik);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tabel mõõdetud koguste kohta raku igas kambris;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              imendumisprofiil;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              imendumist iseloomustavate andmete tabel (väljendatud kiiruse, koguse või protsendina).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemuste arutelu.
               
            
                   
               
               
                  Järeldused.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  Testing Method B.44. Skin Absorption: In vivo Method.
               
            
                  2)
               
               
                  OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. OECD, Paris.
               
            
                  3)
               
               
                  OECD (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, Annex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris.
               
            
                  4)
               
               
                  Kemppainen BW and Reifenrath WG. (1990). Methods for skin absorption. CRC Press, Boca Raton.
               
            
                  5)
               
               
                  Bronaugh RL and Collier, SW. (1991). Protocol for In vitro Percutaneous Absorption Studies, in In vitro Percutaneous Absorption: Principles, Fundamentals and Applications, RL Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, pp. 237–241.
               
            
                  6)
               
               
                  Bronaugh RL and Maibach HI. (1991). In vitro Percutaneous Absorption: Principles,
                     Fundamentals and Applications. CRC Press, Boca Raton.
               
            
                  7)
               
               
                  European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals (1993). Monograph No. 20, Percutaneous Absorption, ECETOC, Brussels.
               
            
                  8)
               
               
                  Diembeck W, Beck H, Benech-Kieffer F, Courtellemont P, Dupuis J, Lovell W, Paye M, Spengler J, Steiling W (1999). Test Guidelines for In Vitro Assessment of Dermal Absorption and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd Chem Tox, 37, 191–205.
               
            
                  9)
               
               
                  Recommended Protocol for In vitro Percutaneous Absorption Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No. 65.
               
            
                  10)
               
               
                  Howes D, Guy R, Hadgraft J, Heylings JR et al. (1996). Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM Workshop Report ATLA 24, 81 R10.
               
            
                  11)
               
               
                  Schaefer H and Redelmeier TE. (1996). Skin barrier: principles of percutaneous absorption. Karger, Basel.
               
            
                  12)
               
               
                  Roberts MS and Walters KA. (1998). Dermal absorption and toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.
               
            
                  13)
               
               
                  Jewell, C., Heylings, JR., Clowes, HM. And Williams, FM. (2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitrochlorobenzene in vitro. Arch Toxicol 74: 356–365.
               
            Joonis 1
      Tüüpilise staatilise difusiooniraku ehitus nahakaudse imendumise in vitro uuringute puhul
      
         
      
         (1)  Sarvkesta hägususala tuleks mainida.
      
         (2)  Mitmete seerumi ja plasma, peamiselt glükoosi mõõtmiste korral ei tohiks loomadele eelneva öö jooksul toitu anda. Selle peamiseks põhjuseks on see, et toidu andmise korral oleks tulemuste varieeruvus suurem ning see varjaks raskemini tuvastatava toime ning muudaks tõlgendamise raskeks. Teisest küljest võib see aga häirida loomade tavapärast üldist ainevahetust ja eelkõige toitumise uuringute puhul võib see häirida igapäevaseid kokkupuuteid uuritava ainega. Kui loomadele ei anta öö jooksul toitu, tuleks uuringu neljandal nädalal tehtud funktsionaalsete vaatluste järel läbi viia kliinilis-biokeemilised määramised.
      
         (3)  Mitmete seerumi ja plasma, peamiselt glükoosi mõõtmiste korral ei tohiks loomadele eelneva öö jooksul toitu anda. Selle peamiseks põhjuseks on see, et toidu andmise korral oleks tulemuste varieeruvus suurem ning see varjaks raskemini tuvastatava toime ning muudaks tõlgendamise raskeks. Teisest küljest võib see aga häirida loomade tavapärast üldist ainevahetust ja eelkõige toitumisuuringute puhul võib see häirida igapäevaseid kokkupuuteid uuritava ainega. Kui loomadele ei anta öö jooksul toitu, tuleks uuringu neljandal nädalal tehtud funktsionaalsete vaatluste järel teha kliinilis-biokeemilised määramised
      
         (4)  Praegu tuntud kui aspartaadi aminotransferaas.
      
         (5)  Praegu tuntud kui alaniini aminotransferaas.
      
         (6)  Need organid (pluss kilpnääre koos kõrvalkilpnäärmetega) tuleb kaaluda kümnel loomal kummastki soost iga rühma kohta näriliste puhul ja kõigil loomadel mittenäriliste puhul.
      
         (7)  Need organid tuleb näriliste puhul kaaluda kümnel loomal kummastki soost iga rühma kohta.
      
         (8)  Selles meetodis on referentsgrupiks grupp, kellele uuritav aine manustatakse viisil, mis tagab annuse täieliku biosaadavuse.
      
         (9)  Neeldumise mõõtmiseks kasutatav lahusti.
      
         (10)  
      
                  †
               
               
                  Siia rühma kuulub viis looma, kes on valitud funktsionaalseks katseks ja üksikasjalilkeks kliinilisteks vaatlusteks neurotoksilisuse uuringu osana.
               
            
   
      C OSA: KESKKONNAMÜRGISUSE MÄÄRAMISE MEETODID
      SISUKORD
      
                  C.1.
               
               ÄGE MÜRGISUS KALADELE
            
                  C.2.
               
               
                  DAPHNIA SP. LIIKUMISVÕIME AKUUTSE PÄRSSIMISE KATSE
            
                  C.3.
               
               VETIKATE KASVU PIDURDAMISE KATSE
            
                  C.4.
               
               KOHESE BIOLAGUNDUVUSE MÄÄRAMINE
            
                  I OSA.
               
               ÜLDPÕHIMÕTTED
            
                  II OSA.
               
               DOC KÕRVALDAMISE KATSE (meetod C.4-A)
            
                  III OSA.
               
               MUUDETUD OECD SÕELKATSE (meetod C.4-B)
            
                  IV OSA.
               
               CO2 ERALDUMISE KATSE (meetod C.4-C)
            
                  V OSA.
               
               MANOMEETRILISE RESPIROMEETRIA KATSE (meetod C.4-D)
            
                  VI OSA.
               
               KINNISE PUDELI KATSE (meetod C.4-E)
            
                  VII OSA.
               
               MITI KATSE (meetod C.4-F)
            
                  C.5.
               
               LAGUNEMINE – BIOKEEMILINE HAPNIKUTARVE
            
                  C.6.
               
               LAGUNEMINE – KEEMILINE HAPNIKUTARVE
            
                  C.7.
               
               LAGUNEMINE – ABIOOTILINE LAGUNEMINE: HÜDROLÜÜSI SÕLTUVUS pHst
            
                  C.8.
               
               TOKSILISUS VIHMAUSSIDELE – TEHISMULLA TEST
            
                  C.9.
               
               BIODEGRADATSIOON – ZAHNI-WELLENSI TEST
            
                  C.10.
               
               BIODEGRADATSIOON – AKTIIVMUDA SIMULATSIOONITESTID
            
                  C.11.
               
               BIODEGRADATSIOON – AKTIIVMUDA RESPIRATSIOONI PÄRSSIMISE TEST
            
                  C.12.
               
               BIODEGRADATSIOON – MODIFITSEERITUD SCAS TEST
            
                  C.13.
               
               BIOKONTSENTRATSIOON: KALADEGA LÄBIVOOLUKATSE
            
                  C.14.
               
               NOORKALADE KASVUKATSE
            
                  C.15.
               
               KALA EMBRÜO JA REBUKOTIGA VASTSETEGA TEHTAV LÜHIAJALINE TOKSILISUSE KATSE
            
                  C.16.
               
               MESILASED – AKUUTSE SUUKAUDSE TOKSILISUSE KATSE
            
                  C.17
               
               MESILASED – AKUUTSE KONTAKTTOKSILISUSE KATSE
            
                  C.18.
               
               ADSORPTSIOON/DESORPTSIOON, KASUTADES PARTII TASAKAALUSTAMISE MEETODIT
            
                  C.19.
               
               ADSORPTSIOONITEGURI (KOC) KINDLAKSMÄARAMINEMULLAS JA REOVEESETTES KÕRGSURVEVEDELIKKROMATOGRAAFIA (HPLC) ABIL
            
                  C.20.
               
               HIIDKIIVRIKU (DAPHNIA MAGNA) SIGIVUSE KATSE
            
                  C.21.
               
               MULLAMIKROOBID: LÄMMASTIKU TRAMSFORMATSIOONI KATSE
            
                  C.22.
               
               MULLAMIKROOBID: SÜSINIKU TRANSFORMATSIOONI KATSE
            
                  C.23.
               
               AEROOBNE JA ANAEROOBNE TRANSFORMATSIOON MULLAS
            
                  C.24.
               
               AEROOBNE JA ANAEROOBNE TRANSFORMATSIOON PÕHJASETTES
            C.1.   ÄGE MÜRGISUS KALADELE
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Katses määratakse aine äge surmav mürgisus mageveekaladele. Katse kestel testaine piisavalt püsiva kontsentratsiooni tagamiseks parima katsemeetodi (seisva, poolseisva veega või läbivooluga katsesüsteem) valimisel on kasulik teada võimaluse korral aine lahustuvust vees, aururõhku, keemilist stabiilsust, dissotsiatsioonikonstante ja biolagunduvust.
      Katse kavandamisel ja tulemuste tõlgendamisel tuleks arvestada ka muid andmeid (näiteks struktuurivalemit, puhtusastet, peamiste lisandite iseloomu ja protsentuaalset sisaldust, lisaainete olemasolu ja koguseid ning oktanooli/vee jaotustegurit).
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Äge mürgisus on märgatav kahjulik mõju, mis avaldub organismis lühikese aja (päevade) jooksul pärast ainega kokkupuudet. Käesolevas katses väljendatakse ägedat mürgisust keskmise surmava kontsentratsioonina (LC50), see tähendab kontsentratsioonina vees, mis surmab kindla katkematu kokkupuuteaja (mis peab olema märgitud) jooksul 50 % katses kasutatud kaladest.
      Kõiki testaine kontsentratsioone väljendatakse massiühikutes mahuühiku kohta (milligrammides liitri kohta). Neid võib väljendada ka massiühikutes massiühiku kohta (mg/kg–1).
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Katses võib kasutada võrdlusainet näitamaks, et katseliigi reaktsioon ei ole laboratoorsetes katsetingimustes oluliselt muutunud.
      Käesoleva katse jaoks ei ole võrdlusaineid nimetatud.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Kontsentratsioonil 100 mg/l võib teha piirsisalduskatse näitamaks, et LC50 on sellest kontsentratsioonist kõrgem.
      Kalad viiakse 96 tunniks kokkupuutesse veele kindlaksmääratud kontsentratsioonides lisatud testainega. Suremus registreeritakse vähemalt iga 24 tunni tagant ja igas vaatluspunktis arvutatakse võimaluse korral kontsentratsioon, mis surmab 50 % kaladest (LC50).
      1.5.   KVALITEEDINÕUDED
      Kvaliteedinõuded kehtivad nii piirsisalduskatse kui ka täiskatseprogrammi suhtes.
      Kontrollkatsete suremus ei tohi katse lõpuks ületada 10 % (alla kümne kala kasutamisel võib surra vaid üks kala).
      Lahustunud hapniku kontsentratsioon peab kogu katse kestel olema kõrgem kui 60 % küllastusväärtusest.
      Testaine kontsentratsioon peab kogu katse kestel olema vähemalt 80 % algkontsentratsioonist.
      Katsekeskkonnas hästi lahustuvaid ja püsivaid lahuseid, st arvestataval määral mitte lenduvaid, lagunevaid, hüdrolüüsuvaid ega adsorbeeruvaid lahuseid andvate ainete puhul võib algkontsentratsiooni lugeda võrdseks nimikontsentratsiooniga. Kontsentratsiooni püsimist kogu katse kestel ja kvaliteedinõuete täitmist tuleb tõendada.
      Ainete puhul, mis:
      
                  i)
               
               
                  on katsekeskkonnas vähelahustuvad või
               
            
                  ii)
               
               
                  moodustavad stabiilseid emulsioone või dispersioone või
               
            
                  iii)
               
               
                  ei ole vesilahuses stabiilsed,
               
            loetakse algkontsentratsiooniks lahuses mõõdetud kontsentratsioon (või veesambas mõõdetud kontsentratsioon, kui lahuses mõõtmine ei ole tehniliselt võimalik). Kontsentratsioon mõõdetakse pärast mõningast tasakaalustumist, kuid enne kalade lahusesse viimist.
      Kõigil neil juhtudel tuleb katse kestel teha täiendavaid mõõtmisi, mis kinnitaksid tegelikku kokkupuutekontsentratsiooni ja kvaliteedinõuete täitmist.
      pH ei tohiks kõikuda rohkem kui ühe ühiku võrra.
      1.6.   MEETODI KIRJELDUS
      Kasutada võib kolme tüüpi katseskeemi.
      
         Seisva veega katsesüsteem:
      
      mürgisuse katse ilma katselahuse läbivooluta (lahus ei vahetu katse kestel).
      
         Poolseisva veega katse:
      
      katse ilma katselahuse läbivooluta, kuid regulaarse katselahuse osakaupa vahetamisega pikemate perioodide (nt 24 tunni) järel.
      
         Läbivooluga katse:
      
      mürgisuse katse, mille puhul vesi katsekambrites pidevalt vahetub, kusjuures koos vahetusveega viiakse katsekambritesse ka uuritav kemikaal.
      1.6.1.   Reaktiivid
      1.6.1.1.   Testainete lahused
      Vajaliku kontsentratsiooniga põhilahused valmistatakse aine lahustamisel deioniseeritud vees või punktile 1.6.1.2 vastavas vees.
      Vajaliku kontsentratsiooniga katselahused valmistatakse põhilahuse lahjendamisel. Kõrgete kontsentratsioonide uurimisel võib aine lahustada otse lahjendusvees.
      Aineid kontrollitakse üldjuhul lahustuvuse piirini. Mõnede ainete puhul (nt vees vähelahustuvate, kõrge POW-ga või vees pigem stabiilse dispersiooni kui tõelise lahuse moodustavate ainete puhul) võib katse teha aine lahustuvuspiirist kõrgemal kontsentratsioonil, et tagada kõrgeima lahustuva/stabiilse kontsentratsiooni saavutamine. Samas on oluline, et see kontsentratsioon ei häiriks katsesüsteemi muul moel (nt nii, et aine kile vee pinnal takistab hapniku lahustumist vees jne).
      Vees vähelahustuvate ainete põhilahuste valmistamisel või nende dispergeerimisel katsekeskkonnas võib abivahendina kasutada ultrahelidispergeerimist, orgaanilisi lahusteid, emulgaatoreid või dispergaatoreid. Selliste abiainete kasutamisel peavad kõik katsekontsentratsioonid sisaldama sama koguse abiainet ja täiendavad kontrollkalad tuleks viia kokkupuutesse katseseeriaga võrdväärse abiaine kontsentratsiooniga. Seesuguste abiainete kontsentratsioon katsekeskkonnas peaks olema minimaalne ega tohiks mingil juhul ületada 100 mg/l.
      Katse tuleks teha ilma pH-d reguleerimata. Märgatavate pH muutuste ilmnemisel on soovitatav katset reguleeritava pH-ga korrata ja esitada korduskatse tulemused. Eriliste vastunäidustuste puudumisel tuleks sellisel juhul põhilahuse pH reguleerida võrdseks lahjendusvee omaga. Eelistatav on selleks kasutada HCl ja NaOH. pH-d tuleb reguleerida nii, et testaine kontsentratsioon põhilahuses märgatavalt ei muutu. Ära tuleks märkida pH reguleerimisest tingitud võimalikud keemilised reaktsioonid või sademe teke.
      1.6.1.2.   Pidamis- ja lahjendusvesi
      Kasutada võib kraanivett (milles ei leidu ohtlikus kontsentratsioonis kloori, raskmetalle ega muid aineid), kvaliteetset looduslikku vett või taastatud vett. Eelistada tuleks vett üldkaredusega 10–250 mg/l (arvestatud CaCO3-na) ja pH-ga 6,0–8,5.
      1.6.2.   Seade
      Kõik seadme osad peavad olema valmistatud keemiliselt inertsest materjalist:
      
                  —
               
               
                  automaatne lahjendussüsteem (läbivooluga katses);
               
            
                  —
               
               
                  hapnikumõõtur;
               
            
                  —
               
               
                  vee kareduse määramise seade;
               
            
                  —
               
               
                  asjakohane termoregulaator;
               
            
                  —
               
               
                  pH-meeter.
               
            1.6.3.   Katses kasutatavad kalad
      Kalad peaksid olema terved ja nähtavate väärarenguteta.
      Kasutatav liik tuleks valida praktiliste kaalutluste põhjal, näiteks aastaringse kättesaadavuse, vähese hooldusvajaduse ja hõlpsa katses kasutatavuse põhjal, tundlikkuse põhjal kemikaalide suhtes ja mis tahes asjaomaste majanduslike, bioloogiliste või ökoloogiliste tegurite põhjal. Kalaliigi valikul tuleks silmas pidada andmete võrreldavust ja olemasolevaid rahvusvahelisi kooskõlastusi (viide 1).
      Soovitatavate katses kasutatavate liikide nimekiri on esitatud 2. liites; eelistatavad liigid on sebrakala ja vikerforell.
      1.6.3.1.   Pidamine
      Katses kasutatavad kalad peaksid olema pärit ühest allikast ja olema sarnase pikkuse ja vanusega. Kalu tuleb vähemalt 12 päeva pidada järgmistel tingimustel:
      
         katseaine sisaldus:
      
      vastavalt süsteemile (tsirkulatsiooni või läbivooluga) ja kalaliigile,
      
         vesi:
      
      vt 1.6.1.2,
      
         valgus:
      
      12–16 tundi päevas,
      
         lahustunud hapniku kontsentratsioon:
      
      vähemalt 80 % küllastusväärtusest,
      
         söötmine:
      
      kolm korda nädalas või iga päev, söötmine lõpetatakse 24 tundi enne katset.
      1.6.3.2.   Suremus
      Pärast 48tunnist stabiliseerumisperioodi registreeritakse suremus ja rakendatakse järgmiseid kriteeriume:
      
                  —
               
               
                  üle 10 % populatsioonist seitsme päeva jooksul:
                  kalad loetakse sobimatuks;
               
            
                  —
               
               
                  5–10 % populatsioonist:
                  kalu jälgitakse veel seitse päeva.
                  Kui suremust rohkem ei esine, on kalad sobivad, vastasel juhul loetakse need sobimatuks;
               
            
                  —
               
               
                  alla 5 % populatsioonist:
                  kalad loetakse sobivaks.
               
            1.6.4.   Kohandumisperiood
      Kõiki kalu tuleb enne katset pidada vähemalt seitse päeva katsetingimustele vastavas vees katsetingimustele vastaval temperatuuril.
      1.6.5.   Katse käik
      Lõplikule katsele võib eelneda annusevahemiku leidmise katse, kus kogutakse andmeid katses kasutatava kontsentratsioonivahemiku kohta.
      Lisaks katseseeriale tehakse üks kontrollkatse ilma testaineta ja vajaduse korral ka üks kontrollkatse abiainet sisaldava lahusega.
      Vastavalt katseühendi füüsikalis-keemilistele omadustele valitakse kvaliteedinõuete täitmiseks seisva veega, poolseisva veega või läbivooluga katsesüsteem.
      Kalad viiakse testainega kokkupuutesse allpool kirjeldatud moel:
      
                  —
               
               
                  kestus: 96 tundi;
               
            
                  —
               
               
                  isendite arv: iga kontsentratsiooni kohta vähemalt seitse;
               
            
                  —
               
               
                  mahutid: küllaldase mahuga soovitatava koguse jaoks;
               
            
                  —
               
               
                  katseaine sisaldus: seisva veega ja poolseisva veega katsesüsteemis on suurim soovitatav sisaldus 1 g/l, läbivooluga süsteemides võib see olla suurem;
               
            
                  —
               
               
                  katsekontsentratsioon: kasutatakse vähemalt viit kontsentratsiooni, mis erinevad üksteisest konstantse teguri (kuni 2,2) võrra ja mis võimaluse korral hõlmavad kogu suremusvahemikku 0–100 %;
               
            
                  —
               
               
                  vesi: vt 1.6.1.2;
               
            
                  —
               
               
                  valgus: 12–16 tundi päevas;
               
            
                  —
               
               
                  temperatuur: vastavalt liigile (2. liide), kuid ei tohi ühegi katse kestel kõikuda rohkem kui ± 1 oC;
               
            
                  —
               
               
                  lahustunud hapniku kontsentratsioon: vähemalt 60 % küllastusväärtusest antud temperatuuril;
               
            
                  —
               
               
                  söötmine: ei söödeta.
               
            Kalu vaadeldakse esimese 2–4 tunni pärast ja seejärel vähemalt iga 24 tunni järel. Kalad loetakse surnuks, kui sabavarre puudutamine ei kutsu esile reaktsiooni ja puuduvad nähtavad hingamisliigutused. Surnud kalade avastamisel need kõrvaldatakse ja suremus registreeritakse. Registreeritakse ka nähtavad kõrvalekalded (nt tasakaalu puudumine, muutused ujumiskäitumises, hingamisfunktsioonis või pigmentatsioonis jne).
      Iga päev tuleb mõõta pH-d, lahustunud hapniku kontsentratsiooni ja temperatuuri.
      Piirsisalduskatse
      Käesoleva katsemeetodi protseduuri järgides võib kontsentratsioonil 100 mg/l teha piirsisalduskatse näitamaks, et LC50 on sellest kontsentratsioonist kõrgem.
      Kui aine iseloom välistab kontsentratsiooni 100 mg/l saavutamise katses kasutatavas vees, tuleks piirsisalduskatse teha kontsentratsioonil, mis on võrdne aine lahustuvusega kasutatavas keskkonnas (või kõrgeimal kontsentratsioonil, kus moodustub stabiilne dispersioon) (vt ka punkti 1.6.1.1).
      Piirsisalduskatses tuleks kasutada 7–10 kala ja samapalju kontrollkalu. (Binomiaalteooria kohaselt võib 99,9 % tõenäosusega väita, et kui 10 kalaga katses on suremus null, siis on LC50 piirsisalduskatses kasutatud kontsentratsioonist kõrgem. 7, 8 või 9 kala puhul näitab suremuse puudumine vähemalt 99 % tõenäosusega seda, et LC50 on kasutatud kontsentratsioonist kõrgem.)
      Suremuse esinemisel tuleb teha täiemahuline uuring. Subletaalse toime avaldumisel tuleks see registreerida.
      2.   ANDMED JA HINDAMINE
      Iga vaatlustulemuste registreerimise ajavahemiku puhul (24, 48, 72 ja 96 tundi) tuleb näidata iga soovitatava kokkupuuteperioodi kohta logaritmilisel diagrammil graafiliselt suremusprotsendi sõltuvus kontsentratsioonist.
      Võimaluse korral tuleks iga vaatlushetke kohta leida standardmeetodeid kasutades hinnanguline LC50 väärtus ja usalduspiirid (p = 0,05); need väärtused tuleks ümardada ühe või maksimaalselt kahe tüvenumbrini (kahe tüvenumbrini ümardamise näited: 173,5 → 170; 0,127 → 0,13; 1,21 → 1,2).
      Juhtudel, kus kontsentratsiooni/protsentuaalse reaktsiooni kõvera tõus on LC50 arvutamiseks liiga suur, piisab selle väärtuse graafilisest hindamisest.
      Kui kahe järjestikuse, 2,2kordse vahega kontsentratsiooni suremus on vastavalt 0 ja 100 %, piisab LC50 vahemiku näitamiseks neist kahest väärtusest.
      Kui täheldatakse, et testaine stabiilsust või homogeensust ei ole võimalik säilitada, tuleks see ära märkida ja olla tulemuste tõlgendamisel ettevaatlik.
      3.   ARUANDLUS
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  andmeid katses kasutatavate kalade kohta (teaduslikku nimetust, liini, päritolu, mis tahes eelnevat mõjutamist ning igal katsekontsentratsioonil kasutatud kalade suurust ja arvu);
               
            
                  —
               
               
                  lahjendusvee päritolu ja peamisi keemilisi näitajaid (pH, karedus, temperatuur);
               
            
                  —
               
               
                  vees vähelahustuva aine puhul põhi- ja katselahuste valmistamise meetodit;
               
            
                  —
               
               
                  kõigi abiainete kontsentratsiooni;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud kontsentratsioone ja kõiki olemasolevaid andmeid uuritava kemikaali kontsentratsioonide stabiilsuse kohta katselahuses;
               
            
                  —
               
               
                  keemiliste analüüside tegemisel kasutatud meetodeid ja saadud tulemusi;
               
            
                  —
               
               
                  piirsisalduskatse tulemusi, kui see tehti;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud katsemeetodi valiku põhjusi ja meetodi üksikasju (nt seisva veega, poolseisva veega katsesüsteem, annustamiskiirus, läbivoolu kiirus, aeratsioon, kalade hulk jne);
               
            
                  —
               
               
                  katseseadmete kirjeldust;
               
            
                  —
               
               
                  valgusrežiimi;
               
            
                  —
               
               
                  katselahuste hapnikusisaldust, pH väärtusi ja temperatuuri iga 24 tunni järel;
               
            
                  —
               
               
                  tõendeid kvaliteedinõuete täitmise kohta;
               
            
                  —
               
               
                  tabelit kumulatiivse suremuse kohta igal kontsentratsioonil ja kontrollkatses (ja vajaduse korral abiainega kontrollkatses) kõigil soovitatud vaatlushetkedel;
               
            
                  —
               
               
                  kontsentratsiooni/protsentuaalse reaktsioonikõvera graafikut katse lõpus;
               
            
                  —
               
               
                  võimaluse korral LC50 väärtusi kõigil soovitatud vaatlushetkedel (95 % usalduspiiridega);
               
            
                  —
               
               
                  LC50 määramisel kasutatud statistilisi meetodeid;
               
            
                  —
               
               
                  võrdlusainete kasutamisel nendega saadud tulemusi;
               
            
                  —
               
               
                  kõrgeimat katsekontsentratsiooni, mille puhul katse kestel suremust ei esinenud;
               
            
                  —
               
               
                  madalaimat katsekontsentratsiooni, mille puhul suremus katse kestel oli 100 %.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.
               
            
                  2)
               
               
                  AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio - Static and Flow Through methods – NFT 90-303 June 1985.
               
            
                  3)
               
               
                  AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri - Static and Flow Through methods – NFT 90-305 June 1985.
               
            
                  4)
               
               
                  ISO 7346/l,/2 and/3 – Water Quality – Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan – Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.
               
            
                  5)
               
               
                  Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden – Part II 1974.
               
            
                  6)
               
               
                  DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L (15).
               
            
                  7)
               
               
                  JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.
               
            
                  8)
               
               
                  NEN 6506 – Water – Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980.
               
            
                  9)
               
               
                  Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.
               
            
                  10)
               
               
                  Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978.
               
            
                  11)
               
               
                  Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979.
               
            
                  12)
               
               
                  Standard methods for the examination of water and wastewater, fourteen edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.
               
            
                  13)
               
               
                  Commission of the European Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979.
               
            
                  14)
               
               
                  Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Okotoxikologie, Grundlagen fur die okotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.986.
               
            
                  15)
               
               
                  Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., A simplified method for evaluating dose effects experiments, J. Pharm, Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99.
               
            
                  16)
               
               
                  Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.
               
            
                  17)
               
               
                  Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.
               
            
                  18)
               
               
                  Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, 3-32.
               
            
                  19)
               
               
                  Stephan, C.E. Methods for calculating an LC50.C50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I..I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84.
               
            
                  20)
               
               
                  Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R.W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.
               
            
         1. liide
         Taastatud vesi
         Sobiva lahjendusvee näited
         Kõik kemikaalid peavad olema analüüsipuhtad.
         Vesi peaks olema kvaliteetne destilleeritud vesi või deioniseeritud vesi juhtivusega alla 5 μS/cm–1.
         
         Vee destilleerimise seade ei tohi sisaldada vaskosi.
         Põhilahused
         
                     CaCl2. 2H2O (kaltsiumkloriiddihüdraat):
                     Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini.
                  
                  
                     11,76 g
                  
               
                     MgSO4. 7H2O (magneesiumsulfaatheptahüdraat):
                     Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini.
                  
                  
                     4,93 g
                  
               
                     NaHCO3 (naatriumvesinikkarbonaat):
                     Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini.
                  
                  
                     2,59 g
                  
               
                     KCl (kaaliumkloriid):
                     Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini.
                  
                  
                     0,23 g
                  
               Taastatud lahjendusvesi
         25 ml kõigist neljast põhilahusest segatakse kokku ja täiendatakse veega 1 liitrini.
         Aereeritakse, kuni hapnikusisaldus jõuab küllastuskontsentratsioonini.
         pH peaks olema 7,8 ± 0,2.
         Vajaduse korral reguleeritakse pH-d NaOH (naatriumhüdroksiidi) või HCl-ga (vesinikkloriidhappega).
         Sel viisil valmistatud lahjendusvett lastakse 12 tundi seista ja seda ei tohi enam aereerida.
         Ca ja Mg ioonide summaarne kogus selles lahuses on 2,5 mmol/l. Ca:Mg ioonide suhe on 4:1 ja Na:K ioonide suhe 10:1. Lahuse üldleelisus on 0,8 mmol/1.
         Ükski kõrvalekalle lahjendusvee valmistamisprotseduurist ei tohi muuta vee koostist või omadusi.
      
      
         2. liide
         Katseks soovitatavad kalaliigid
         
                     Soovitatav liik
                  
                  
                     Soovitatav katsetemperatuuride vahemik ( oC)
                  
                  
                     Soovitatav katseisendi täispikkus (cm)
                  
               
                     
                        Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) Sebrakala
                  
                  
                     20–24
                  
                  
                     3,0 ± 0,5
                  
               
                     
                        Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) Pakspea lepamaim
                  
                  
                     20–24
                  
                  
                     5,0 ± 2,5
                  
               
                     
                        Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus 1758) Sasaan
                  
                  
                     20–24
                  
                  
                     6,0 ± 2,0
                  
               
                     
                        Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) Cyprinodontidae (Tomminck ja Schlegel 1850) Riisikala
                  
                  
                     20–24
                  
                  
                     3,0 ± 1,0
                  
               
                     
                        Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters 1859) Gupi
                  
                  
                     20–24
                  
                  
                     3,0 ± 1,0
                  
               
                     
                        Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque Linneaus 1758) Suur päikeseahven
                  
                  
                     20–24
                  
                  
                     5,0 ± 2,0
                  
               
                     
                        Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum 1988) Vikerforell
                  
                  
                     12–17
                  
                  
                     6,0 ± 2,0
                  
               
                     
                        Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus 1758) Harilik säinas
                  
                  
                     20–24
                  
                  
                     6,0 ± 2,0
                  
               Kogumine
         Eespool loetletud kalu on lihtne kasvatada ja/või neid on võimalik aasta läbi hankida. Neid on võimalik aretada ja kasvatada kalakasvandustes või laboris, tingimustes, kus haigused ja parasiidid on kontrolli all, nii et katses kasutatav isend on terve ja tema põlvnemine teada. Need kalad on saadaval mitmel pool maailmas.
      
      
         3. liide
         Kontsentratsiooni näide: suremusprotsendi sõltuvus
         Näide LC50 määramise kohta logaritmilise probit-diagrammi abil
         
            
      
      C.2.   DAPHNIA SP. LIIKUMISVÕIME AKUUTSE PÄRSSIMISE KATSE
      1.   MEETOD
      Käesolev liikumisvõime akuutse pärssimise katsemeetod vastab suunisele OECD TG 202 (2004).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesolevas metoodikas kirjeldatakse akuutse toksilisuse katset kemikaalide toime hindamiseks vesikirpudele. Olemasolevaid katsemeetodeid kasutati võimalikus ulatuses (viited 1, 2, 3).
      1.2.   MÕISTED
      Käesoleva metoodika puhul kasutatakse järgmisi mõisteid.
      
                   
               
               
                  
                     EC
                     
                        50
                      – kontsentratsioon, mis hinnanguliselt muudab liikumisvõimetuks 50 % vesikirpudest konkreetse kokkupuuteaja vältel. Muu määratluse kasutamisest tuleb teatada ja anda viide.
               
            
                   
               
               
                  
                     Liikumisvõime kaotus – neid loomi, kes ei ole võimelised ujuma 15 sekundi jooksul pärast katseanuma ettevaatlikku raputamist, loetakse liikumisvõime kaotanuks (isegi kui nad suudavad liigutada oma tundlaid).
               
            1.3.   MEETODI PÕHIMÕTE
      Noored vesikirbud vanuses kuni 24 tundi (katse alguseks) viiakse kokkupuutesse uuritava aine eri kontsentratsioonidega 48 tunniks. Liikumisvõime kaotus registreeritakse 24 ja 48 tunni pärast ja seda võrreldakse kontrollkatse väärtustega. Tulemustest arvutatakse EC50 48 tunni pärast (vt punkt 1.2, määratlus). EC50 kindlaksmääramine pärast 24tunnist kokkupuudet ei ole kohustuslik.
      1.4.   ANDMED UURITAVA AINE KOHTA
      Teada peaksid olema uuritava aine lahustuvus vees ja aururõhk ning peaks olema usaldusväärne analüütiline meetod, mille abil määrata kindlaks aine kogus uuritavas lahuses ja mille kohta on teada määramise saagis ja määramispiir. Kasulik on teada järgmist: struktuurvalem, aine puhtus, püsivus vees või valguse käes, POW ja kiire biolagundatavuse katse tulemused (vt meetod C.4).
      Märkus: suunised uuritava aine kohta, mille mõju uurimist raskendavad selle füüsikalis-keemilised omadused, on esitatud viites 4.
      1.5.   VÕRDLUSAINED
      EC50 määramist võrdlusaine jaoks võib pidada vahendiks, millega tõendatakse katsetingimuste usaldusväärsust. Selleks soovitatakse kasutada rahvusvahelistes laboritevahelistes võrdluskatsetes kasutatavaid mürkaineid (viited 1, 5) (1). Katse(d) võrdlusainega tuleb teha eelistatavalt iga kuu, kuid kindlasti vähemalt kaks korda aastas.
      1.6.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Määramise õigsuse tõendamisel kohaldatakse järgmisi kriteeriume:
      
                  —
               
               
                  kontrollkatsetes, sealhulgas lahuse valmistamisel kasutatud abiainega kontrollkatsetes, ei tohiks liikumisvõimet kaotada üle 10 % vesikirpudest;
               
            
                  —
               
               
                  lahustunud hapniku kontsentratsioon katse lõpus peab kontrollkatse- ja katseanumates olema ≥ 3 mg/l.
               
            Märkus: esimese kriteeriumi puhul ei tohi rohkem kui 10 %-1 vesikirpudest esineda liikumisvõime kaotust või muid haiguse või stressi nähte, näiteks värvuse muutust, ebaharilikku käitumist nagu veepinnale lõksu jäämine.
      1.7.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.7.1.   Seadmed
      Katseanumad ja muud seadmed, mis puutuvad kokku katselahustega, peavad täielikult olema valmistatud klaasist või keemiliselt inertsest materjalist. Katseanumateks on tavaliselt klaasist katseklaasid või keeduklaasid, neid tuleb tavaliste laborimeetoditega puhastada enne iga kasutamist. Katseanumad peavad olema vabalt kaetud, et vähendada veekaotust auramise tõttu ja vältida tolmu sattumist lahustesse. Lenduvaid aineid tuleb uurida tihedalt suletud nõudes, mis on piisavalt suured, et hapnikusisaldus ei hakkaks limiteerima ega langeks liiga madalale (vt osa 1.6 ja osa 1.8.3 esimene lõik).
      Lisaks kasutatakse veel järgmisi vahendeid: hapnikumõõtja (mikroelektroodi või muu sobiva anduriga, mis võimaldaks mõõta lahustunud hapnikku väikese ruumalaga proovis), pH-meeter, temperatuuri reguleerimiseks vajalik seade, seade orgaanilise süsiniku kogusisalduse (TOC) määramiseks, seade keemilise hapnikutarbe (COD) määramiseks, seade vee kareduse määramiseks jne.
      1.7.2.   Katsealune organism
      
         Daphnia magna Straus on eelistatud katseliik, kuigi kõnealuses katses võib kasutada ka muid sobivaid Daphnia liike (nt Daphnia pulex). Katse alguses peavad loomad olema alla 24 tunni vanad ja varieeruvuse vähendamiseks soovitatakse tungivalt, et nad ei oleks esimese haudme järglased. Nad peavad olema terved (st neil ei tohi esineda selliseid stressi tunnuseid nagu suur suremus, isaste ja puhkeolekus munade esinemine, esimese haudme saamise viibimine, loomade värvuse muutus jne). Kõik konkreetses katses kasutatavad organismid peavad pärinema vesikirpude sama populatsiooni kultuuridest. Populatsiooni loomi tuleb säilitada katsetingimustega sarnanevates kasvutingimustes (valgus, temperatuur, keskkond). Kui katses kasutatav vesikirpude kasvukeskkond erineb sellest, mida kasutatakse tavalise vesikirpude kultuuri jaoks, on heaks tavaks näha ette katse-eelne aklimatiseerumisperiood. Selleks tuleb haudmevesikirpe hoida lahjendamiseks kasutatavas vees katsetemperatuuril vähemalt 48 tundi enne katse alustamist.
      1.7.3.   Hoidmisvesi ja lahjendamiseks kasutatav vesi
      Hoidmisveena ja lahjendamiseks kasutatava veena lubatakse kasutada looduslikku vett (pinna- või põhjavesi), taastatud vett või deklooritud kraanivett, kui vesikirbud jäävad selles ellu kasvatamise, aklimatiseerimise ja katsetamise ajal ega ilmuta stressi tunnuseid. Katseveeks sobib vesi, mis vastab 1. liites esitatud nõuetekohase lahjendamiseks kasutatava vee keemilistele omadustele. See vesi peab katse vältel olema ühesuguse kvaliteediga. Taastatud vee valmistamiseks lisatakse deioniseeritud või destilleeritud veele täpsed kogused tunnustatud analüütilise puhtusega reaktiive. Viidetes 1 ja 6 ning 2. liites on esitatud taastatud vee näited. Metalle sisaldavate uuritavate ainete puhul tuleks vältida kelaadimoodustajaid sisaldavaid toitesegusid, nagu M4 ja M7 2. liites. pH peaks olema vahemikus 6–9. Karedus peaks Daphnia Magna puhul olema vahemikus 140–250 mg/l (CaCO3-na); teiste Daphnia liikide puhul võib sobida väiksem karedus. Lahjendamiseks kasutatavat vett võib enne katses kasutamist aereerida, et lahustunud hapniku kontsentratsioon jõuaks küllastuseni.
      Kui kasutatakse looduslikku vett, tuleb selle kvaliteedi parameetreid mõõta vähemalt kaks korda aastas või kui kahtlustatakse, et need omadused võivad olla oluliselt muutunud (vt eelmist lõiku ja 1. liidet). Samuti tuleb mõõta raskmetallide (st Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni) sisaldus. Kui kasutatakse deklooritud kraanivett, on soovitatav iga päev mõõta kloori sisaldust. Kui lahjendamiseks kasutatakse pinna- või põhjavett, tuleb mõõta juhtivus ja orgaanilise süsiniku kogusisaldus (TOC) või keemiline hapnikutarve (COD).
      1.7.4.   Katselahused
      Valitud kontsentratsioonidega katselahused saadakse tavaliselt põhilahuse lahjendamisel. Põhilahuse valmistamiseks on soovitatav lahustada aine lahjendamiseks kasutatavas vees. Võimaluse korral tuleb vältida lahustite, emulgaatorite ja dispersantide kasutamist. Siiski võivad nimetatud ühendid olla teatud juhtudel vajalikud piisava kontsentratsiooniga põhilahuse valmistamiseks. Suunised sobivate lahustite, emulgaatorite ja dispersantide kohta on esitatud viites 4. Igal juhul ei tohi uuritava aine sisaldus katselahustes olla kõrgem kui lahustuvuse piir lahjendamiseks kasutatavas vees.
      Katse tuleb teha ilma pH-d muutmata. Kui pH ei püsi vahemikus 6–9, siis võib teha teise katse, milles põhilahuse pH väärtuseks seatakse lahjendamiseks kasutatava vee pH väärtus enne uuritava aine lisamist. pH tuleb korrigeerida nii, et see ei muudaks oluliselt põhilahuse kontsentratsiooni ega põhjustaks uuritava aine keemilist reaktsiooni ega sadenemist. Eelistatakse HCl ja NaOH lahuseid.
      1.8.   KATSE KÄIK
      1.8.1.   Kokkupuutetingimused
      1.8.1.1.   Katserühmad ja kontrollkatsed
      Katseanumasse viiakse vajalik kogus lahjendamiseks kasutatavat vett ja uuritava aine lahust. Õhu ja vee mahu suhe anumates peab olema katse- ja kontrollrühma puhul ühesugune. Seejärel lisatakse anumatesse vesikirbud. Iga uuritava kontsentratsiooni juures ja ka kontrollkatses tuleb kasutada vähemalt 20 looma, eelistatavalt jaotatuna neljaks viieloomaliseks rühmaks. Iga looma kohta peab olema vähemalt 2 ml uuritavat lahust (st viie vesikirbu kohta peab katseanumas olema 10 ml lahust). Katse tegemisel võib kasutada poolstaatilist uuendamist või läbivoolusüsteemi, kui uuritava aine kontsentratsioon ei ole püsiv.
      Lisaks uuritavate lahuste seeriatele tuleb kasutada ühte lahjendamiseks kasutatava vee kontrollseeriat ja vajaduse korral ühte kontrollseeriat, mis sisaldab lahuse valmistamisel kasutatud abiainet.
      1.8.1.2.   Uuritavad kontsentratsioonid
      Kui uuritava aine toksilisuse kohta ei ole andmeid, võib lõpliku katse kontsentratsioonivahemiku kindlaksmääramiseks teha eelkatse. Selleks viiakse vesikirbud kokkupuutesse lahustega, mis sisaldavad uuritavat ainet suuresti erinevas kontsentratsioonis. Viit vesikirpu hoitakse uuritava aine teatava kontsentratsiooniga lahuses kuni 48 tundi; korduskatseid ei ole vaja. Kokkupuuteaeg võib olla lühem (nt 24 tundi või vähem), kui vahemiku kindlaksmääramiseks vajalikud andmed saadakse kiiremini.
      Tuleb kasutada vähemalt viit uuritavat kontsentratsiooni. Need peavad olema geomeetrilises jadas, mille kordaja on eelistatavalt mitte üle 2.2. Kui kasutatakse vähem kui viit kontsentratsiooni, tuleb seda põhjendada. Kõige kõrgema uuritava kontsentratsiooni tulemuseks peaks eelistatavalt olema 100 %line liikumisvõime kaotus ja kõige madalamal uuritaval kontsentratsioonil ei peaks eelistatavalt olema jälgitavat toimet.
      1.8.1.3.   Inkubatsioonitingimused
      Temperatuur peab olema vahemikus 18–22 oC ja iga üksiku katse puhul peaks see olema konstantne piirides ± 1 oC. Soovitatav on 16tunnise valguse ja kaheksatunnise pimeduse tsükkel. Lubatud on ka täielik pimedus, eriti testitavate ainete puhul, mis on valguse käes ebastabiilsed.
      Katseanumaid ei tohi katse ajal aereerida. Katse tehakse ilma pH-d muutmata. Vesikirpe ei tohi katse ajal toita.
      1.8.1.4.   Kestus
      Katse kestus on 48 tundi.
      1.8.2.   Vaatlused
      Igas katseanumas tuleb 24 ja 48 tundi pärast katse algust määrata liikumisvõime kaotanud vesikirpude arv (vt punkt 1.2 „Mõisted”). Lisaks liikumisvõime kaotusele tuleb registreerida kõik normist kõrvalekaldumised käitumises või välimuses.
      1.8.3.   Analüütilised mõõtmised
      Katse alguses ja lõpus mõõdetakse kontrollkatse(te)s ja kõige kõrgema uuritava aine kontsentratsiooniga lahuses lahustunud hapniku sisaldus ja pH. Lahustunud hapniku sisaldus kontrollkatsetes peab vastama määramise õigsuse kriteeriumile (vt punkt 1.6). pH ei tohiks tavaliselt muutuda üle 1,5 ühiku üheski katses. Temperatuuri mõõdetakse tavaliselt kontrollkatse anumates või ümbritsevas õhus ja see tuleb kirja panna eelistatavalt pidevalt katse käigus või äärmisel juhul vähemalt katse alguses ja lõpus.
      Uuritava aine kontsentratsioon tuleb mõõta vähemalt kõige kõrgemal ja madalamal kontsentratsioonil katse alguses ja lõpus (viide 4). Tulemused peaksid soovitatavalt põhinema mõõdetud kontsentratsioonidel. Ent kui saab tõendada, et uuritava aine kontsentratsioon on katse jooksul rahuldavalt säilinud ± 20 % juures nominaalsest või mõõdetud algkontsentratsioonist, võivad katse tulemused põhineda nominaalsetel või mõõdetud algväärtustel.
      1.9.   PIIRSISALDUSKATSE
      Käesolevat meetodit kasutades võib teha piirsisalduskatse uuritava aine kontsentratsioonil 100 mg/l või katsekeskkonnas lahustuvuse piiril (olenevalt sellest, kumb neist on madalam) ja tõendada nii, et EC50 on kõrgem kui see kontsentratsioon. Piirsisalduskatse tegemisel tuleb kasutada 20 vesikirpu (eelistatavalt jaotatuna neljaks viieloomaliseks rühmaks) ja panna sama arv loomi ka kontrollkatse(te)sse. Kui kas või osagi vesikirpudest kaotab liikumisvõime, tuleb sooritada täielik uuring. Iga kõrvalekalle normaalsest käitumisest tuleb registreerida.
      2.   ANDMED
      Andmed tuleb esitada kokkuvõtvas tabelis, näidates iga katse- ja kontrollrühma jaoks kasutatud vesikirpude arvu ja liikumisvõime kaotuse igal vaatlemisel. Koostatakse graafik 24 ja 48 tundi pärast liikumisvõime kaotanud vesikirpude protsendi sõltuvuse kohta uuritava aine kontsentratsiooni. Andmeid analüüsitakse sobivate statistiliste meetoditega (nt probit-analüüs jne), et arvutada kõverate tõusud ja EC50 95 %lised usalduspiirid (p = 0,05) (7, 8).
      Kui saadud andmete puhul ei saa EC50 arvutamise standardmeetodeid rakendada, tuleb EC50 umbkaudseks määramiseks kasutada kõige kõrgemat kontsentratsiooni, mis ei põhjusta liikumisvõime kaotust, ja kõige madalamat kontsentratsiooni, mis põhjustab liikumisvõime kaotuse 100 % (selleks peetakse nende kahe kontsentratsiooni geomeetrilist keskmist).
      3.   TULEMUSTE VORMISTAMINE
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuandes esitatakse järgmine teave.
      Uuritav aine:
      
                  —
               
               
                  füüsikaline laad ja olulised füüsikalis-keemilised omadused;
               
            
                  —
               
               
                  andmed keemiliseks identifitseerimiseks, sealhulgas puhtus.
               
            Katseorganismi liik:
      
                  —
               
               
                  
                     Daphnia päritolu ja liik, algne tarnija (kui on teada) ja kasutatud kultuuri tingimused (kaasa arvatud toidu päritolu, tüüp ja kogus, toitmise sagedus).
               
            Katsetingimused:
      
                  —
               
               
                  katseanumate kirjeldus: anumate tüüp, lahuse kogus, vesikirpude arv katseanuma kohta, katseanumate (korduskatsete) arv kontsentratsiooni kohta;
               
            
                  —
               
               
                  põhi- ja katselahuste valmistamise meetodid, kaasa arvatud mis tahes lahustite või dispersantide kasutamine, kasutatud kontsentratsioonid;
               
            
                  —
               
               
                  üksikasjad lahjendamiseks kasutatava vee kohta: vee päritolu ja kvaliteediomadused (pH, karedus, Ca/Mg suhe, Na/K suhe, aluselisus, juhtivus jne); taastatud vee koostis, kui seda kasutati;
               
            
                  —
               
               
                  inkubatsioonitingimused: temperatuur, valguse intensiivsus ja valgustamise perioodid, lahustunud hapnik, pH jne.
               
            Tulemused:
      
                  —
               
               
                  kontrollkatsetes ja igas katserühmas mis tahes vaatlusajal liikumisvõime kaotanud või kõrvalekaldeid (kaasa arvatud ebanormaalne käitumine) ilmutanud vesikirpude arv ja protsent ning ilmnenud nähtuste kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  võimaluse korral võrdlusainega tehtud katse tulemused ja kuupäev;
               
            
                  —
               
               
                  nominaalsed uuritavad kontsentratsioonid ja kõik tulemused, mis saadi uuritava aine kontsentratsiooni määramisel katseanumas; samuti tuleb teatada määramismeetodi saagis ja määramispiir;
               
            
                  —
               
               
                  kõigi katse ajal tehtud füüsikalis-keemiliste mõõtmiste tulemused: temperatuuri, pH ja lahustunud hapniku väärtused;
               
            
                  —
               
               
                  EC50 48 tunni pärast koos usaldusintervallidega ja graafik sobitatud mudeli kohta, millest need arvutati, annuse ja toime kõverate tõusud ja nende standardviga; EC50 kindlaksmääramiseks kasutatud statistiline meetod (kui määrati ka liikumisvõime kadu 24 tunni pärast, tuleb esitada ka need andmed);
               
            
                  —
               
               
                  selgitused iga kõrvalekalde kohta katse tegemise eeskirjast ja arutelu, kuivõrd see võis mõjutada katse tulemusi.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  ISO 6341. (1996). Water quality – Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) – Acute toxicity test. Third edition, 1996.
               
            
                  2)
               
               
                  EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guidelines – Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater Daphnids.
               
            
                  3)
               
               
                  Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute Lethality Test Using Daphnia spp. EPS 1/RM/11. Environment Canada, Ottawa, Ontario, Canada.
               
            
                  4)
               
               
                  Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. No. 23. Paris 2000.
               
            
                  5)
               
               
                  Commission of the European Communities. Study D8369. (1979). Inter-laboratory Test Programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to Daphnia.
                  
               
            
                  6)
               
               
                  OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211: Daphnia magna Reproduction Test, adopted September 1998.
               
            
                  7)
               
               
                  Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 – American Society for Testing and Materials. Pp 65-84
               
            
                  8)
               
               
                  Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3rd ed. London. Griffin, Weycombe, UK.
               
            
         1. liide
         LAHJENDAMISEKS KASUTATAVA VEE NÕUTAVAD KEEMILISED OMADUSED
         
                     Aine
                  
                  
                     Kontsentratsioon
                  
               
                     tahked osakesed
                  
                  
                     < 20 mg/l
                  
               
                     orgaanilise süsiniku kogusisaldus
                  
                  
                     < 2 mg/l
                  
               
                     ioniseerimata ammoniaak
                  
                  
                     < 1 μg/l
                  
               
                     jääkkloor
                  
                  
                     < 10 μg/l
                  
               
                     fosfororgaaniliste pestitsiidide kogusisaldus
                  
                  
                     < 50 ng/l
                  
               
                     kloororgaaniliste pestitsiidide ja polüklooritud bifenüülide kogusisaldus
                  
                  
                     < 50 ng/l
                  
               
                     orgaanilise kloori kogusisaldus
                  
                  
                     < 25 ng/1
                  
               
      
         2. liide
         SOBIVA TAASTATUD KATSEVEE NÄITED
         SO katsevesi (1)
         
                     Põhilahused (üks aine)
                  
                  
                     Taastatud vee valmistamiseks lisada järgmised põhilahuste kogused 1 liitrile veele (2)
                     
                  
               
                     Aine
                  
                  
                     1 liitrile veele lisatav kogus (2)
                     
                  
               
                     kaltsiumkloriid
                     CaCl2 , 2H2O
                  
                  
                     11,76 g
                  
                  
                     25 ml
                  
               
                     magneesiumsulfaat
                     MgSO4 , 7H2O
                  
                  
                     4,93 g
                  
                  
                     25 ml
                  
               
                     naatriumvesinikkarbonaat
                     NaHCO3
                     
                  
                  
                     2,59 g
                  
                  
                     25 ml
                  
               
                     kaaliumkloriid
                     KCl
                  
                  
                     0,23 g
                  
                  
                     25 ml
                  
               Elendti keskkonnad M7 ja M4
         Aklimatiseerimine Elendti keskkondadega M4 ja M7
         Mõnes laboris on olnud raskusi vesikirbu otsesel üleviimisel keskkondadesse M4 ja M7. Teatavat edu on siiski saavutatud järkjärgulise aklimatiseerimisega, st viimisega oma keskkonnast 30 %lisse, siis 60 %lisse ja seejärel 100 %lisse Elendti keskkonda. Aklimatiseerumisperioodid võivad olla kuu aja pikkused.
         Valmistamine
         Mikroelemendid
         Individuaalsete mikroelementide põhilahused (I) valmistatakse esmalt sobiva puhtusega vees, st deioniseeritud, destilleeritud või pöördosmoosiga puhastatud vees. Nendest põhilahustest (I) valmistatakse järgmine üks põhilahus (II), mis sisaldab kõiki mikroelemente (kombineeritud lahus), st:
         
                     I põhilahus(ed) (üks aine)
                  
                  
                     Veele lisatav kogus (mg/l)
                  
                  
                     Kontsentratsioon (keskkond M4-ga võrreldes)
                  
                  
                     Kombineeritud II põhilahuse valmistamiseks lisada veele järgmine kogus I põhilahust (ml/l)
                  
               
                     M4
                  
                  
                     M7
                  
               
                     H3BO3
                     
                  
                  
                     57 190
                  
                  
                     20 000kordne
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     MnCl2-4H2O
                  
                  
                     7 210
                  
                  
                     20 000kordne
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     LiCl
                  
                  
                     6 120
                  
                  
                     20 000kordne
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     RbCl
                  
                  
                     1 420
                  
                  
                     20 000kordne
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     SrCl2-6H2O
                  
                  
                     3 040
                  
                  
                     20 000kordne
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     NaBr
                  
                  
                     320
                  
                  
                     20 000kordne
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     Na2MoO4-2H2O
                  
                  
                     1 230
                  
                  
                     20 000kordne
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     CuCl2-2H2O
                  
                  
                     335
                  
                  
                     20 000kordne
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     ZnCl2
                     
                  
                  
                     260
                  
                  
                     20 000kordne
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     CoCl2-6H2O
                  
                  
                     200
                  
                  
                     20 000kordne
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     KI
                  
                  
                     65
                  
                  
                     20 000kordne
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     Na2SeO3
                     
                  
                  
                     43,8
                  
                  
                     20 000kordne
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     NH4VO3
                     
                  
                  
                     11,5
                  
                  
                     20 000kordne
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     Na2EDTA-2H2O
                  
                  
                     5 000
                  
                  
                     2 000kordne
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     FeSO4-7H2O
                  
                  
                     1 991
                  
                  
                     2 000kordne
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Na2EDTA ja FeSO4 lahused valmistatakse eraldi, valatakse kokku autoklaavitakse kohe
                  
               
                     Nii saadakse:
                  
               
                     2 l Fe-EDTA lahust
                  
                  
                      
                  
                  
                     1 000kordne
                  
                  
                     20,0
                  
                  
                     5,0
                  
               Keskkonnad M4 ja M7
         Keskkondade M4 ja M7 valmistamiseks kasutatakse II põhilahust, makrotoitaineid ja vitamiine järgmiselt:
         
                      
                  
                  
                     Veele lisatav kogus (mg/l)
                  
                  
                     Kontsentratsioon (keskkond M4-ga võrreldes)
                  
                  
                     Keskkonnale lisatav II põhilahuse kogus (ml/1)
                  
               
                     M4
                  
                  
                     M7
                  
               
                     II põhilahus (kombineeritud mikroelemendid)
                  
                  
                      
                  
                  
                     20kordne
                  
                  
                     50
                  
                  
                     50
                  
               
                     Makrotoitainete põhilahused (üks aine)
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     CaCl2 – 2H2O
                  
                  
                     293 800
                  
                  
                     1 000kordne
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     MgSO4 – 7H2O
                  
                  
                     246 600
                  
                  
                     2 000kordne
                  
                  
                     0,5
                  
                  
                     0,5
                  
               
                     KCI
                  
                  
                     58 000
                  
                  
                     10 000kordne
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     NaHCO3
                     
                  
                  
                     64 800
                  
                  
                     1 000kordne
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     Na2SiO3 – 9H2O
                  
                  
                     50 000
                  
                  
                     5 000kordne
                  
                  
                     0,2
                  
                  
                     0,2
                  
               
                     NaNO3
                     
                  
                  
                     2 740
                  
                  
                     10 000kordne
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     KH2PO4
                     
                  
                  
                     1 430
                  
                  
                     10 000kordne
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     K2HPO4
                     
                  
                  
                     1 840
                  
                  
                     10 000kordne
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     Kombineeritud vitamiinide põhilahus
                  
                  
                     —
                  
                  
                     10 000kordne
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     Kombineeritud vitamiinide põhilahuse valmistamiseks lisatakse 3 vitamiini 1 liitrile veele järgmistes kogustes:
                  
               
                     tiamiinvesinikkloriid
                  
                  
                     750
                  
                  
                     10 000kordne
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     tsüanokobalamiin (B12)
                  
                  
                     10
                  
                  
                     10 000kordne
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     biotiin
                  
                  
                     7,5
                  
                  
                     10 000kordne
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Kombineeritud vitamiinide põhilahust säilitatakse külmutatult väikeste alikvootidena. Vitamiinid lisatakse keskkonnale vahetult enne kasutamist.
         
                     NB
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Soolade sadenemise vältimiseks lisatakse täieliku keskkonna valmistamisel põhilahuste alikvoodid umbes 500–800 ml deioniseeritud veele ja seejärel täiendatakse veega kuni 1 liitrini.
                  
               
                     NB
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Keskkonna M4 koostis avaldati esimest korda järgmises artiklis: Elendt, B. P. (1990). Selenium deficiency in Crustacea; an ultrastructual approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
                  
               
      C.3.   VETIKATE KASVU PIDURDAMISE KATSE
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Katses määratakse aine mõju ainuraksete rohevetikaliikide kasvukiirusele. Suhteliselt lühikestes (72tunnistes) katsetes on võimalik hinnata aine mõju mitme põlvkonna kestel. Meetodit võib kohandada mitmele ainuraksele vetikaliigile, sellisel juhul tuleb katsearuandele lisada kasutatud meetodi kirjeldus.
      Meetod sobib kõige paremini vees lahustuvatele ainetele, mis jäävad katse tingimustes tõenäoliselt veefaasi.
      Meetodit saab kasutada ainete puhul, mis ei takista otseselt vetikate kasvu mõõtmist.
      Katse tegemiseks on kasulik teada aine lahustuvust vees, aururõhku, keemilist stabiilsust, dissotsiatsioonikonstante ja biolagunduvust.
      Katse kavandamisel ja tulemuste tõlgendamisel tuleks arvestada ka muid andmeid (näiteks struktuurivalemit, puhtusastet, peamiste lisandite iseloomu ja protsentuaalset sisaldust, lisaainete olemasolu ja koguseid ning oktanooli/vee jaotustegurit).
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Rakkude kontsentratsioon – rakkude arv milliliitris:
      Kasv – rakkude kontsentratsiooni kasv katse kestel:
      Kasvukiirus – rakkude kontsentratsiooni kasv ajaühikus:
      EC50 – käesolevas meetodis on see testaine kontsentratsioon, mis vähendab kasvu (EbC50) või kasvukiirust (ErC50) kontrollkatsega võrreldes 50 % võrra.
      NOEC (täheldatava toimeta kontsentratsioon) – käesolevas meetodis on see kõrgeim uuritud kontsentratsioon, mille puhul ei täheldata kontrollkatsega võrreldes kasvu pidurdumist.
      Kõiki testaine kontsentratsioone väljendatakse massiühikutes mahuühiku kohta (milligrammides liitri kohta). Neid võib väljendada ka massiühikutes massiühiku kohta (mg/kg–1).
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Katses võib kasutada võrdlusainet näitamaks, et katseliigi tundlikkus ei ole laboratoorsetes katsetingimustes oluliselt muutunud.
      Võrdlusaine kasutamisel tuleks sellega saadud tulemused esitada katsearuandes. Võrdlusainena võib kasutada kaaliumdikromaati, kuid selle värv võib mõjutada nii rakkudeni jõudva valguse omadusi ja tugevust kui ka spektrofotomeetrilisi mõõtmisi, kui neid kasutatakse. Kaaliumdikromaati on kasutatud rahvusvahelises laboritevahelises katses (vt viidet 3 ja 2. liidet).
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Kontsentratsioonil 100 mg/l võib teha piirsisalduskatse näitamaks, et EC50 on sellest kontsentratsioonist kõrgem.
      Valitud rohevetika eksponentsiaalselt kasvavad kultuurid viiakse kindlatel tingimustel mitme põlvkonna kestel kokkupuutesse testaine erinevate kontsentratsioonidega.
      Katselahuseid inkubeeritakse 72 tundi, mõõtes rakkude kontsentratsiooni lahuses vähemalt iga 24 tunni tagant. Määratakse kasvu pidurdumine võrreldes kontrollkultuuriga.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Kvaliteedinõuded kehtivad nii piirsisalduskatse kui ka täiskatseprogrammi suhtes.
      Rakkude kontsentratsioon kontrollkultuurides peaks olema kolme päeva jooksul kasvanud vähemalt 16 korda.
      Testaine kontsentratsioon peab katse kestusele vastava aja jooksul säilitama vähemalt 80 % algkontsentratsioonist.
      Katsekeskkonnas hästi lahustuvaid ja püsivaid lahuseid, st arvestataval määral mitte lenduvaid, lagunevaid, hüdrolüüsuvaid ega adsorbeeruvaid lahuseid andvate ainete puhul võib algkontsentratsiooni lugeda võrdseks nimikontsentratsiooniga. Kontsentratsiooni püsimist kogu katse kestel ja kvaliteedinõuete täitmist tuleb tõendada.
      Ainete puhul, mis
      
                  i)
               
               
                  on katsekeskkonnas vähelahustuvad või
               
            
                  ii)
               
               
                  moodustavad stabiilseid emulsioone või dispersioone või
               
            
                  iii)
               
               
                  ei ole vesilahuses stabiilsed,
               
            loetakse algkontsentratsiooniks katse algul mõõdetud kontsentratsioon. Kontsentratsioon mõõdetakse pärast mõningast tasakaalustumist.
      Kõigil neil juhtudel tuleb katse kestel teha täiendavaid mõõtmisi, mis kinnitaksid tegelikku kokkupuutekontsentratsiooni ja kvaliteedinõuete täitmist.
      On teada, et oluline osa testainest võidakse katse kestel vetikate biomassi haarata. Seetõttu tuleb eespool esitatud kvaliteedinõuete täitmise kinnitamiseks arvesse võtta nii vetikate biomassi haaratav kui ka lahuses mõõdetud ainekogus (või veesambas mõõdetud ainekogus, kui lahuses mõõtmine ei ole tehniliselt võimalik). Kuna aine kontsentratsiooni mõõtmine vetikate biomassis võib aga tehniliselt üsnagi keerukas olla, võib kvaliteedinõuete täitmist kinnitada katse tegemisel aine kõrgeima kontsentratsiooniga, kuid ilma vetikateta ja mõõtes kontsentratsioonid lahuses (või veesambas, kui lahuses mõõtmine ei ole tehniliselt võimalik) nii katse alguses kui ka lõpus.
      1.6.   KATSE KIRJELDUS
      1.6.1.   Reaktiivid
      1.6.1.1.   Testainete lahused
      Vajaliku kontsentratsiooniga põhilahused valmistatakse aine lahustamisel deioniseeritud vees või punktile 1.6.1.2 vastavas vees.
      Vajaliku kontsentratsiooniga katselahused valmistatakse sobivate koguste lisamisel vetikate eelkultuuridele (vt 1. liidet).
      Aineid kontrollitakse üldjuhul lahustuvuse piirini. Mõnede ainete puhul (nt vees madala lahustuvusega, kõrge POW-ga või vees pigem stabiilse dispersiooni kui tõelise lahuse moodustavate ainete puhul) võib katse teha aine lahustuvuspiirist kõrgemal kontsentratsioonil, et tagada kõrgeima lahustuva/stabiilse kontsentratsiooni saavutamine. Samas on oluline, et see kontsentratsioon ei häiriks katsesüsteemi muul moel (nt nii, et aine kile vee pinnal takistab hapniku lahustumist vees jne).
      Vees vähelahustuvate ainete põhilahuste valmistamisel või nende dispergeerimisel katsekeskkonnas võib abivahendina kasutada ultrahelidispergeerimist, orgaanilisi lahusteid, emulgaatoreid või dispergaatoreid. Selliste abiainete kasutamisel peavad kõik katsekontsentratsioonid sisaldama sama koguse abiainet ja täiendavad kontrollkultuurid tuleks viia kokkupuutesse katseseeriaga võrdväärse abiaine kontsentratsiooniga. Seesuguste abiainete kontsentratsioon katsekeskkonnas peaks olema minimaalne ega tohiks mingil juhul ületada 100 mg/l.
      Katse tuleks teha ilma pH-d reguleerimata. Märgatavate pH muutuste ilmnemisel on soovitatav katset reguleeritava pH-ga korrata ja esitada korduskatse tulemused. Eriliste vastunäidustuste puudumisel tuleks sellisel juhul põhilahuse pH reguleerida võrdseks lahjendusvee omaga. Eelistatav on selleks kasutada HCl ja NaOH. pH-d tuleb reguleerida nii, et testaine kontsentratsioon põhilahuses märgatavalt ei muutu. Ära tuleks märkida pH reguleerimisest tingitud võimalikud keemilised reaktsioonid või sademe teke.
      1.6.1.2.   Katses kasutatav toitelahus
      Vesi peaks olema kvaliteetne destilleeritud vesi või deioniseeritud vesi juhtivusega alla 5 μS/cm–1. Vee destilleerimise seade ei tohi sisaldada vaskosi.
      Soovitatav on kasutada järgmist toitelahust.
      Järgmise tabeli põhjal valmistatakse neli põhilahust. Põhilahused steriliseeritakse membraanfiltratsioonil või autoklaavimisel ja säilitatakse seejärel pimedas 4 oC juures. Põhilahust nr 4 tuleks steriliseerida ainult membraanfiltratsioonil. Need põhilahused lahjendatakse nii, et saadakse lõplikud toitainete kontsentratsioonid katselahuses.
      
                  Toitaine
               
               
                  Kontsentratsioon põhilahuses
               
               
                  Lõplik kontsentratsioon katselahuses
               
            
                  
                     Põhilahus nr 1: makrotoitained
                  
               
            
                  NH4Cl
               
               
                  1,5 g/l
               
               
                  15 mg/l
               
            
                  MgCl2.6H2O
               
               
                  1,2 g/l
               
               
                  12 mg/l
               
            
                  CaCl2.2H2O
               
               
                  1,8 g/l
               
               
                  18 mg/l
               
            
                  MgSO4.7H2O
               
               
                  1,5 g/l
               
               
                  15 mg/l
               
            
                  KH2PO4
                  
               
               
                  0,16 g/l
               
               
                  1,6 mg/l
               
            
                  
                     Põhilahus nr 2: Fe-EDTA
               
            
                  FeCl3.6H2O
               
               
                  80 mg/l
               
               
                  0,08 mg/l
               
            
                  Na2EDTA.2H2O
               
               
                  100 mg/l
               
               
                  0,1 mg/l
               
            
                  
                     Põhilahus nr 3: mikroelemendid
                  
               
            
                  H3BO3
                  
               
               
                  185 mg/l
               
               
                  0,185 mg/l
               
            
                  MnCl2.4H2O
               
               
                  415 mg/l
               
               
                  0,415 mg/l
               
            
                  ZnCl2
                  
               
               
                  3 mg/l
               
               
                  3 × 103 mg/l
               
            
                  CoCl2.6H2O
               
               
                  1,5 mg/l
               
               
                  1,5 × 10–3 mg/l
               
            
                  CuCl2.2H2O
               
               
                  0,01 mg/l
               
               
                  10–5 mg/l
               
            
                  Na2MoO4.2H2O
               
               
                  7 mg/l
               
               
                  7 × 10–3 mg/l
               
            
                  
                     Põhilahus nr 4: NaHCO
                     
                        3
                     
                  
               
            
                  NaHCO3
                  
               
               
                  50 g/l
               
               
                  50 mg/l
               
            Toitelahuse pH on pärast õhuga tasakaalustamist ligikaudu 8.
      1.6.2.   Seade
      
                  —
               
               
                  Harilikud laboriseadmed.
               
            
                  —
               
               
                  Sobiva mahuga kolvid (näiteks 100 ml katselahuse mahu puhul sobivad 250 ml koonilised kolvid). Kõik katses kasutatavad kolvid peaksid olema ühesugusest materjalist ja ühesuguste mõõtmetega.
               
            
                  —
               
               
                  Kultiveerimisseade: kapp või kamber, mida saab hoida temperatuuril 21–25 oC täpsusega ± 2 oC ja ühtlaselt valgustada spektrivahemikus 400–700 nm. Kui kontrollkultuuride vetikad on saavutanud soovitatava kasvukiiruse, võib selle põhjal järeldada, et kasvutingimused, sh valgustugevus, on olnud sobivad.
                  Keskmiste katselahusekontsentratsioonide puhul on soovitatavaks valgustugevuseks 60–120 μE m–2.s–1 (35–70 × 1018 footonit.m–2.s–1) mõõdetuna sobiva detektori abil vahemikus 400–700 nm. Luksides kaliibritud fotomeetrite puhul on sobivaks vahemikuks 6 000-10 000 l×.
                  Vajalik valgustugevus on saavutatav nelja kuni seitsme 30 W universaalvalge luminofoorlambi abil (värvustemperatuuriga ligikaudu 4 300 K), mis on paigutatud 0,35 m kaugusele vetikakultuurist.
               
            
                  —
               
               
                  Rakkude kontsentratsiooni tuleks mõõta elusrakkude otsese loendamise teel, nt loenduskambritega mikroskoobi abil. Kasutada võib aga ka muid meetodeid (fotomeetria, turbidimeetria, ...), kui need on küllalt tundlikud ja näidatakse, et tulemused vastavad piisavalt hästi rakkude kontsentratsioonile.
               
            1.6.3.   Katseorganismid
      Soovitatav on kasutada kiire kasvuga rohevetika liiki, mis sobib hästi kultiveerimiseks ja katseteks. Eelistatavad on järgmised liigid:
      
                  —
               
               
                  
                     Selenastrum capricornutum, nt ATCC 22662 või CCAP 278/4;
               
            
                  —
               
               
                  
                     Scenedesmus subspicatus, nt 86.81 SAG.
               
            
         Märkus:
      
      
                  ATCC
               
               
                  =
               
               
                  American Type Culture Collection (USA)
               
            
                  CCAP
               
               
                  =
               
               
                  Culture Centre of Algae and Protozoa (Ühendkuningriik)
               
            
                  SAG
               
               
                  =
               
               
                  Sammlung Algenkulturen (Göttingen, Saksamaa)
               
            Muu liigi kasutamisel tuleks vastav tüvi ära märkida.
      1.6.4.   Katse käik
      Eeldatav mõjupiirkond leitakse annusevahemiku leidmise katsete põhjal.
      Kahe eri kasvukriteeriumi (biomassi ja kasvukiiruse) põhjal võib saada väga erinevaid kasvu pidurdumise tulemusi; annusevahemiku leidmise katses tuleks kasutada mõlemat, tagamaks, et kontsentratsioonide geomeetriline kasv võimaldab määrata nii EbC50 kui ka ErC50.
      Rakkude algkontsentratsioon
      
         Selenastrum capricornutu
         m’i ja Scenedesmus subspicatus’e puhul on rakkude soovitatavaks algkontsentratsiooniks kultuuris 104 rakku/ml. Muude liikide kasutamisel peaks kasutatav biomass olema võrreldavas suurusjärgus.
      Testainete kontsentratsioonid
      Katseks valmistatakse geomeetrilise jadana ette vähemalt viis kontsentratsiooni kontsentratsioonide suhtega mitte üle 2,2. Madalaimal uuritaval kontsentratsioonil ei tohiks ilmneda täheldatavat mõju vetikate kasvule. Kõrgeim uuritav kontsentratsioon peaks pidurdama vetikate kasvu kontrollkultuuriga võrreldes vähemalt 50 % ja eelistatavalt peatama kasvu täielikult.
      Kordus- ja kontrollkatsed
      Igal uuritaval kontsentratsioonil tuleb teha vähemalt kolm korduskatset. Ilma testaineta tehakse kolm kontrollkatset, vajaduse korral tehakse ka kolm kontrollkatset abiainet sisaldava lahusega. Kui see on õigustatud, võib katseskeemi muuta, suurendades kontsentratsioonide arvu ja vähendades korduskatsete arvu kontsentratsiooni kohta.
      Katse tegemine
      Vajaliku testaine ja vetikainokulaadi sisaldusega katsekultuurid valmistatakse nõutavate põhilahusekoguste lisamisel sobivatele vetikate eelkultuuride kogustele (vt 1. liidet).
      Kultiveerimiskolbe loksutatakse ja need asetatakse kultiveerimisseadmesse. Vetikarakke hoitakse loksutamise, segamise või õhuga läbipuhumise teel suspendeerituna, parandades nii gaasivahetust ja vähendades pH kõikumisi katselahustes. Kultuure tuleks hoida temperatuurivahemikus 21–25 oC täpsusega ± 2 oC.
      Igas kolvis määratakse rakkude kontsentratsioon vähemalt 24, 48 ja 72 tunni möödumisel katse algusest. Kui rakkude kontsentratsiooni mõõdetakse muude meetodite abil, mitte otsese loendamise teel, kasutatakse võrdlusproovina filtritud vetikate toitelahust, mis sisaldab vastavas kontsentratsioonis uuritavat kemikaali.
      pH-d mõõdetakse katse algul ja 72 tunni pärast.
      Kontrollkultuuride pH ei tohiks katse kestel üldjuhul erineda rohkem kui 1,5 ühiku võrra.
      Lenduvate ainete uurimine
      Kuni praeguseni puudub üldtunnustatud meetod lenduvate ainete uurimiseks. Kui on teada, et aine kaldub aurustuma, võib kasutada suurema tühja ülaosaga suletud kolbi. Kolvi vajaliku tühja ülaosa mahu arvutamisel tuleb arvestada CO2 puudujäägi võimalust. Välja on pakutud meetodi mõningaid eri variante (vt viidet 4).
      Tuleks püüda määrata lahusesse jäävat ainekogust ning lenduvate kemikaalidega suletud süsteemides saadud tulemusi tuleks tõlgendada väga ettevaatlikult.
      Piirsisalduskatse
      Käesoleva katsemeetodi protseduuri järgides võib kontsentratsioonil 100 mg/l teha piirsisalduskatse näitamaks, et EC50 on sellest kontsentratsioonist kõrgem.
      Kui aine iseloom välistab kontsentratsiooni 100 mg/l saavutamise katses kasutatavas vees, tuleks piirsisalduskatse teha kontsentratsioonil, mis on võrdne aine lahustuvusega kasutatavas keskkonnas (või kõrgeimal kontsentratsioonil, kus moodustub stabiilne dispersioon) (vt ka punkti 1.6.1.1).
      Piirsisalduskatse tuleks teha vähemalt kolme paralleelkatsena, sama arvu kontrollkatsetega. Piirsisalduskatses tuleks rakendada kaht eri kasvukriteeriumi (biomassi ja kasvukiirust).
      Kui biomassi või kasvukiiruse järgi tehtud katses on keskmine pidurdumine 25 % või suurem, tuleb teha täiemahuline uuring.
      2.   ANDMED JA HINDAMINE
      Mõõdetud rakukontsentratsioonid katse- ja kontrollkultuurides esitatakse tabelis koos testaine kontsentratsioonide ja mõõtmisaegadega. Kasvukõverate saamiseks esitatakse graafiliselt rakkude keskmise kontsentratsiooni muutus ajas (0–72 h) iga testaine kontsentratsiooni puhul.
      Kontsentratsiooni/mõju sõltuvuse määramisel võib kasutada järgmisi meetodeid. Madalatel kontsentratsioonidel mõned ained stimuleerivad kasvu. Arvestada tuleks ainult kasvu 0–100 % pidurdumisele viitavaid andmepunkte.
      2.1.   KASVUKÕVERATE ALUSE PINDALA VÕRDLEMINE
      Pindala kasvukõvera ja horisontaaljoone N = N0 vahel võib arvutada järgmise valemi järgi:
      
         
      kus
      
                  A
               
               
                  =
               
               
                  pindala,
               
            
                  N0
                  
               
               
                  =
               
               
                  rakkude arv/ml ajahetkel t0 (katse algul),
               
            
                  N1
                  
               
               
                  =
               
               
                  mõõdetud rakkude arv/ml ajahetkel t1
                  
               
            
                  Nn
                  
               
               
                  =
               
               
                  mõõdetud rakkude arv/ml ajahetkel tn,
               
            
                  t1
                  
               
               
                  =
               
               
                  esimese mõõtmise aeg katse algusest,
               
            
                  tn
                  
               
               
                  =
               
               
                  n-nda mõõtmise aeg katse algusest,
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  mõõtmiste arv katse algusest alates.
               
            Rakkude kasvu protsentuaalne pidurdumine testaine igal kontsentratsioonil (IA) arvutatakse järgmise valemi järgi:
      
         
      kus
      
                  Ac
                  
               
               
                  =
               
               
                  pindala kasvukõvera ja horisontaaljoone N = N0 vahel kontrollkultuuris,
               
            
                  At
                  
               
               
                  =
               
               
                  pindala kasvukõvera ja horisontaaljoone N = N0 vahel kontsentratsioonil t,
               
            
                  IA
                  
               
               
                  =
               
               
                  väärtuste sõltuvus vastavatest kontsentratsioonidest esitatakse graafiliselt poollogaritmilisel diagrammil või poollogaritmilisel probitdiagrammil. Probitdiagrammi kasutamisel tõmmatakse läbi punktide sirge kas silma järgi või arvutatud regressiooni põhjal.
               
            EC50 leitakse hinnanguliselt regressioonisirgelt, määrates 50 % pidurdumisele (I = 50 %) vastava kontsentratsiooni. Väärtuse üheseks esitamiseks seostatuna kasutatud arvutusmeetodiga on soovitatav kasutada sümbolit EbC50. On oluline, et EbC50 esitatakse koos vastava kokkupuuteperioodi kestusega, nt EbC50 (0–72 h).
      2.2.   KASVUKIIRUSTE VÕRDLEMINE
      Kasvu keskmise erikiiruse (μ) võib eksponentsiaalselt kasvava kultuuri puhul arvutada järgmiselt
      
         
      kus t0 on aeg katse alguses.
      Kasvu keskmise erikiiruse (μ) võib leida ka graafiku ln N versus aeg regressioonisirge tõusust.
      Kasvu erikiiruse protsentuaalne pidurdumine testaine igal kontsentratsioonil (Iμt) arvutatakse järgmise valemi järgi:
      
         
      kus
      
                  μc
                  
               
               
                  =
               
               
                  kontrollkultuuri kasvu keskmine erikiirus
               
            
                  μt
                  
               
               
                  =
               
               
                  kasvu keskmine erikiirus katsekontsentratsioonil t
               
            Kasvu keskmise erikiiruse protsentuaalne vähenemine testaine igal kontsentratsioonil võrreldes kontrollkultuuri vastava väärtusega esitatakse graafiliselt kontsentratsiooni logaritmi funktsioonina. EC50 saab määrata saadud graafikult. Selle meetodi abil leitud EC50 väärtuse üheseks esitamiseks on soovitatav kasutada sümbolit ErC50. Näidata tuleb mõõtmise aeg, nt kui väärtus kehtib ajavahemiku 0–72 tundi kohta, on vastav sümbol ErC50 (0–72 h).
      
         Märkus. Kasvu erikiirus on logaritmiline suurus ja selle väikesed muutused võivad tähendada suuri muutusi biomassis. EbC ja ErC arvväärtused ei ole seega võrreldavad.
      2.3.   TÄHELDATAVA TOIMETA KONTSENTRATSIOONI (NOEC) ARVUTAMINE
      Täheldatava toimeta kontsentratsioon määratakse statistiliselt sobiva mitmese võrdlemise meetodi (nt dispersioonanalüüsi ja Dunnetti testi) abil, kasutades individuaalsete korduskatsete kasvukõvera aluse pindala A (vt punkti 2.1) väärtusi või kasvu erikiiruse (vt punkti 2.2) väärtusi.
      3.   ARUANDLUS
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  testainet: keemilisi tunnusandmeid;
               
            
                  —
               
               
                  katseorganisme: päritolu, laborikultuuri, tüve numbrit, kultiveerimismeetodit;
               
            
                  —
               
               
                  katsetingimusi:
                  
                              —
                           
                           
                              katse algus- ja lõppkuupäeva ning kestust;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              temperatuuri;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toitelahuse koostist;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kultiveerimisseadet;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lahuste pH väärtusi katse alguses ja lõpus (pH kõikumisel rohkem kui 1,5 ühiku võrra tuleks sellele anda seletus);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              testaine lahustamisel kasutatud kandjat ja meetodit ning kandja kontsentratsiooni katselahustes;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              valguse tugevust ja omadusi;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritud kontsentratsioone (mõõdetud või nimiväärtusi);
                           
                        
            
                  —
               
               
                  tulemusi:
                  
                              —
                           
                           
                              rakkude kontsentratsiooni igas kolvis igas mõõtepunktis ja rakkude kontsentratsiooni määramise meetodit;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rakkude kontsentratsiooni keskmisi väärtusi;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kasvukõveraid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kontsentratsiooni/mõju graafilist väljendust;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              EC väärtusi ja vastavaid arvutusmeetodeid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              täheldatava toimeta kontsentratsiooni (NOEC);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              muid täheldatud toimeid.
                           
                        
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2)
               
               
                  Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subspicatus”, in: Rudolph/Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.
               
            
                  3)
               
               
                  ISO 8692 – Water quality – Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.
                  
               
            
                  4)
               
               
                  S. Galassi and M. Vighi – Chemosphere, 1981, vol.10, 1123-1126.
               
            
         1. liide
         Vetikate kultiveerimise meetodi näide
         Üldised märkused
         Järgmises meetodis kultiveeritakse vetikaid mürgisuskatsete jaoks.
         Vetikakultuuride bakteritega nakatumise vältimiseks tuleb kasutada kohaseid meetodeid (ISO 4833). Eelistatav võib olla puhaskultuuride kasutamine, üheliigiliste kultuuride kasutamine on aga nõutav.
         Bakterite või teiste vetikaliikidega saastumise vältimiseks tuleb kõik toimingud teha steriilsetes tingimustes. Saastunud kultuurid tuleks välja praakida.
         Vetikakultuuride saamise meetodid
         Toitelahuste (söötmete) valmistamine
         Toitelahused võib valmistada toitainete kontsentreeritud põhilahuste lahjendamisel. Tahke söötme saamiseks lisatakse 0,8 % agarit. Kasutatavad toitelahused peavad olema steriilsed. Steriliseerimine autoklaavimisel võib põhjustada NH3 kadu.
         Tüvikultuur
         Tüvikultuurid on väikesed vetikakultuurid, mida viiakse regulaarselt värskesse söötmesse uue katsematerjali saamiseks. Kui kultuure regulaarselt ei kasutata, kantakse need viirgudena längagarile. Vähemalt kord kahe kuu jooksul kantakse need üle uuele söötmele.
         Tüvikultuure kasvatatakse sobiva söötmega koonilistes kolbides (mahuga umbes 100 ml). Vetikate inkubeerimisel 20 oC ja pideva valgustuse tingimustes tuleb neid iga nädal üle kanda.
         Ülekandmise käigus viiakse teatav kogus „vana” kultuuri steriilsete pipettidega värske söötmega kolbi nii, et kiirelt kasvava liigi puhul on algkontsentratsioon umbes 100 korda väiksem kui vanas kultuuris.
         Liigi kasvukiiruse võib määrata kasvukõveralt. Kui see on teada, on võimalik hinnanguliselt määrata kultuuri uude söötmesse viimisel vajalik kontsentratsioon. Seda on vaja teha enne, kui kultuur jõuab suremisfaasi.
         Eelkultuur
         Eelkultuurid on mõeldud katsekultuuride inokuleerimiseks sobiva vetikakoguse saamiseks. Eelkultuuri inkubeeritakse katse tingimustes ja kasutatakse siis, kui see veel eksponentsiaalselt kasvab, üldjuhul umbes pärast kolmepäevast inkubatsiooniperioodi. Kui vetikakultuur sisaldab moondunud või kõrvalekalletega rakke, tuleb kultuur kõrvaldada.
      
      
         2. liide
         Dokumendis ISO 8692 – Water quality – Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum esitatakse 16 labori vahel kaaliumdikromaadiga tehtud uuringu kohta järgmised tulemused:
         
                      
                  
                  
                     Keskmised (mg/l)
                  
                  
                     Vahemik (mg/1)
                  
               
                     ErC50 (0–72 h)
                  
                  
                     0,84
                  
                  
                     0,60—1,03
                  
               
                     EbC50 (0–72 h)
                  
                  
                     0,53
                  
                  
                     0,20—0,75
                  
               
      C.4.   KOHESE BIOLAGUNDUVUSE MÄÄRAMINE
      I OSA   ÜLDPÕHIMÕTTED
      I.1.   SISSEJUHATUS
      Kirjeldatakse kuut katsemeetodit, mis sobivad kemikaalide kohese biolagunduvuse sõelkatseteks aeroobses veekeskkonnas:
      
                  a)
               
               
                  lahustunud orgaanilise süsiniku (DOC) kõrvaldamine (meetod C.4-A);
               
            
                  b)
               
               
                  muudetud OECD sõelkatse – DOC kõrvaldamine (meetod C.4-B);
               
            
                  c)
               
               
                  süsinikdioksiidi (CO2) eraldumine (muudetud Sturmi katse) (meetod C.4-C);
               
            
                  d)
               
               
                  manomeetriline respiromeetria (meetod C.4-D);
               
            
                  e)
               
               
                  kinnise pudeli katse (meetod C.4-E);
               
            
                  f)
               
               
                  MITI (Jaapani Väliskaubandus- ja Tööstusministeeriumi) katse (meetod C.4-F).
               
            Kõigi kuue katse üldpõhimõtted on esitatud meetodi I osas. Üksikute meetodite spetsiifilised osad on esitatud II–VII osas. Lisades on toodud määratlused, valemid ja suunismaterjalid.
      1988. a tehtud OECD laboritevaheline võrdluskatse näitas, et nende meetoditega saadakse ühtseid tulemusi. Siiski võib mõni meetod olenevalt aine füüsikalistest omadustest olla eelistatav.
      I.2.   SOBIVA MEETODI VALIMINE
      Sobivaima meetodi valikul on olulised andmed kemikaali lahustuvuse, aururõhu ja adsorptsiooniomaduste kohta. Teoreetiliste väärtuste arvutamisel ja/või mõõdetud väärtuste, nt ThOD, ThCO2, DOC, TOC, COD (vt 1. ja 2. liide) kontrollimisel on vaja teada aine keemilist struktuuri või valemit.
      Aineid, mille lahustuvus vees on vähemalt 100 mg/ml, võib analüüsida kõigi meetoditega eeldusel, et ained ei ole lenduvad ega adsorbeeruvad. Tabelis 1 on märgitud meetodid, mis sobivad vees vähelahustuvate, lenduvate või adsorbeeruvate kemikaalide puhul. Vees vähelahustuvate ja lenduvate kemikaalide käsitlemisviise on kirjeldatud 3. liites. Mõõdukalt lenduvaid kemikaale võib uurida DOC kõrvaldamise katses eeldusel, et katseanumates (mis peaksid olema sobival moel suletud) on küllaldaselt vaba ruumi gaasifaasile. Sellisel juhul tuleb füüsikaliste kadude arvessevõtmiseks teha ka abiootiline kontrollkatse.
      Tabel 1
      Katsemeetodite kohaldatavus
      
                  Katse
               
               
                  Analüüsimeetod
               
               
                  Sobivus ainetele, mis on:
               
            
                  vähelahustuvad
               
               
                  lenduvad
               
               
                  adsorbeeruvad
               
            
                  DOC kõrvaldamine
               
               
                  Lahustunud orgaaniline süsinik
               
               
                  —
               
               
                  —
               
               
                  +/-
               
            
                  Muudetud OECD sõelkatse
               
               
                  Lahustunud orgaaniline süsinik
               
               
                  —
               
               
                  —
               
               
                  +/-
               
            
                  CO2 eraldumine
               
               
                  Respiromeetria: CO2 eraldumine
               
               
                  +
               
               
                  —
               
               
                  +
               
            
                  Manomeetriline respiromeetria
               
               
                  Manomeetriline respiromeetria: hapniku tarbimine
               
               
                  +
               
               
                  +/-
               
               
                  +
               
            
                  Kinnise pudeli katse
               
               
                  Respiromeetria: lahustunud hapnik
               
               
                  +/-
               
               
                  +
               
               
                  +
               
            
                  MITI katse
               
               
                  Respiromeetria: hapniku tarbimine
               
               
                  +
               
               
                  +/-
               
               
                  +
               
            Saadud tulemuste tõlgendamisel on vaja andmeid katsematerjali puhtusastme või põhikomponentide osakaalu kohta, eriti kui tulemused on väikesed või piiripealsed.
      Andmed uuritava kemikaali mürgisuse kohta bakteritele (IV liide) võivad olla sobivate katsekontsentratsioonide valikul väga kasulikud ja madalate biolagunduvuse väärtuste õigel tõlgendamisel hädavajalikud.
      I.3.   VÕRDLUSAINED
      Töövõtete kontrollimiseks tehakse koos tavaliste katsetega sobivas kolvis paralleelkatse kohese biolagunduvuse kriteeriumidele vastavate võrdlusainetega.
      Sobivad võrdlusained on aniliin (värskelt destilleeritud), naatriumatsetaat ja naatriumbensoaat. Võrdlusained lagunevad nende meetodite puhul isegi ilma otseselt inokulaati lisamata.
      On tehtud ettepanekuid bioloogiliselt kergesti laguneva, kuid inokulaadi lisamist nõudva võrdlusaine otsimiseks. Välja on pakutud kaaliumvesinikftalaati, kuid enne selle aine võrdlusainena tunnustamist tuleb selle kohta rohkem andmeid koguda.
      Respiromeetrilistes katsetes võivad lämmastikku sisaldavad ühendid nitrifikatsiooni kaudu mõjutada hapniku tarbimist (vt II ja V liidet).
      I.4.   KATSEMEETODITE PÕHIMÕTE
      Testaine lahus või suspensioon mineraalses toitelahuses inokuleeritakse ja seda inkubeeritakse aeroobsetes tingimustes pimedas või hajutatud valguse käes. Inokulaadist pärit DOC kogus katselahuses tuleks testainest pärit DOC kogusega võrreldes hoida võimalikult madal. Et arvestada endogeenset aktiivsust inokulaadis, tehakse paralleelne pimekatse inokulaadiga ja ilma testaineta, ehkki endogeenne aktiivsus rakkudes testaine juuresolekul ei ole täpselt identne endogeense kontrollproovi omaga. Töövõtete toimimise kontrolliks tehakse paralleelkatse võrdlusainega.
      Üldjuhul jälgitakse lagundamisprotsessi mitmesuguste parameetrite, nagu DOC, CO2 eraldumise ja hapniku tarbimise põhjal ja mõõtmisi tehakse nii sageli, et see võimaldab määrata biolagundamise algust ja lõppu. Automaatsete respiromeetrite kasutamisel toimub mõõtmine pidevalt. Lisaks mingile muule parameetrile mõõdetakse vahel DOC-d, kuid tavaliselt tehakse seda ainult katse alguses ja lõpus. Kasutada võib ka spetsiifilist keemilist analüüsi testaine esmase lagunemise ja mis tahes tekkinud vaheühendite kontsentratsiooni määramiseks (nõutav MITI katses).
      Üldjuhul on katse pikkus 28 päeva. Katsed võib siiski lõpetada enne 28 päeva möödumist, st kohe, kui biolagundamise graafik on jõudnud platooni ja jäänud sinna vähemalt kolmeks mõõtmiseks. Katseid võib pikendada ka pikemaks kui 28 päeva, kui graafik näitab, et biolagundumine on alanud, kuid platooni ei ole 28 päeva jooksul jõutud.
      I.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      I.5.1.   Reprodutseeritavus
      Biodegradatsiooni ja inokulaadina kasutatud bakteripopulatsioonide iseloomu tõttu tuleks kõiki määramisi teha vähemalt kahe paralleelina.
      Kogemus näitab, et mida suurem on katsekeskkonda lisatud mikroorganismide kontsentratsioon, seda väiksemad on korduskatsete vahelised erinevused. Laboritevahelised võrdlused on näidanud ka seda, et eri laborites saadud tulemused võivad erineda üsna palju, kuid tavaliselt saadakse hea biolagunduvusega ühendite puhul üsna sarnased tulemused.
      I.5.2.   Katse kehtivus
      Katse loetakse kehtivaks, kui uuritava kemikaali kõrvaldamisparameetri kordusväärtuste suurim erinevus platool ja katse lõpus või kümnepäevase akna lõpus on väiksem kui 20 % ja kui võrdlusaine protsentuaalne lagunemine on 14 päeva jooksul jõudnud kohese biolagunduvuse määrani. Kui kas või üks neist tingimustest ei ole täidetud, tuleb katset korrata. Meetodite piiratuse tõttu ei tähenda madalad väärtused tingimata seda, et testaine keskkonnas bioloogiliselt ei lagune, küll aga seda, et biolagunduvuse määramine nõuab rohkem tööd.
      Kui lagunemise määr on testaine ja võrdlusainega mürgisuse katses 14 päeva jooksul alla 35 % (DOC järgi) või alla 25 % (ThOD või ThCO2 järgi), võib testaine lugeda bioloogilisi protsesse pidurdavaks (vt ka IV liidet). Katseseeriat tuleks korrata, võimaluse korral uuritava kemikaali madalama kontsentratsiooni ja/või inokulaadi kõrgema kontsentratsiooniga, kuid mitte rohkem kui 30 mg tahkeid aineid/liitris.
      I.6.   ÜLDISED TÖÖMEETODID JA ETTEVALMISTUSED
      Katsete puhul kehtivad üldnõuded on kokku võetud tabelis 2. Konkreetselt üksikute katsetega seotud seadmeid ja katsetingimusi kirjeldatakse hiljem, vastava katse alapunktis.
      Tabel 2
      Katsetingimused
      
                  Katse
               
               
                  DOC kõrvaldamine
               
               
                  CO2 eraldumine
               
               
                  Manomeetriline respiromeetria
               
               
                  Muudetud OECD sõelkatse
               
               
                  Kinnise pudeli katse
               
               
                  MITI (I)
               
            
                  Testaine kontsentratsioon
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  mg/l
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  100
               
               
                   
               
               
                  2–10
               
               
                  100
               
            
                  mg DOC/l
               
               
                  10–40
               
               
                  10–20
               
               
                  10–40
               
               
                  10–40
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  mg ThOD/l
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  50–100
               
               
                   
               
               
                  5–10
               
               
                   
               
            
                  Inokulaadi kontsentratsioon (rakkudes/l, ligikaudne)
               
               
                  ≤ 30 mg/l hõljumit
                  või ≤ 100 ml reovett/l
                  (107–108)
               
               
                  0,5 ml töödeldud reovett/l
                  (105)
               
               
                  ≤ 5 ml reovett/l
                  (104–106)
               
               
                  30 mg/l hõljumit
                  (107–108)
               
            
                  Elementide kontsentratsioonid mineraalses toitelahuses (mg/l)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  P
               
               
                  116
               
               
                  11,6
               
               
                  29
               
            
                  N
               
               
                  1,3
               
               
                  0,13
               
               
                  1,3
               
            
                  Na
               
               
                  86
               
               
                  8,6
               
               
                  17,2
               
            
                  K
               
               
                  122
               
               
                  12,2
               
               
                  36,5
               
            
                  Mg
               
               
                  2,2
               
               
                  2,2
               
               
                  6,6
               
            
                  Ca
               
               
                  9,9
               
               
                  9,9
               
               
                  29,7
               
            
                  Fe
               
               
                  0,05—0,1
               
               
                  0,05—0,1
               
               
                  0,15
               
            
                  pH
               
               
                  7,4±0,2
               
               
                  eelistatavalt 7,0
               
            
                  Temperatuur
               
               
                  22 ± 2 oC
               
               
                  25 ± 1 oC
               
            
                  
                              DOC
                           
                           
                              =
                           
                           
                              lahustunud orgaaniline süsinik
                           
                        
               
                  
                              ThOD
                           
                           
                              =
                           
                           
                              lahustunud orgaaniline süsinik
                           
                        
               
                  
                              SS
                           
                           
                              =
                           
                           
                              hõljuvaine
                           
                        
            I.6.1.   Lahjendusvesi
      Kasutatakse deioniseeritud või destilleeritud vett, mis ei sisalda inhibeerivates kontsentratsioonides mürgiseid aineid (nt Cu++ ioone). Orgaanilise süsiniku sisaldus ei tohi olla suurem kui 10 % testainest tulenevast orgaanilise süsiniku sisaldusest. Vee kõrge puhtusaste aitab välistada kõrgete tulemuste saamise nullproovidega. Saastus võib tuleneda nii testaines olevatest lisanditest kui ka ioonvahetusvaikudest ja lüüsunud bakteri- või vetikamaterjalist. Igas katseseerias tuleb kasutada ainult samast partiist pärit vett, millele on eelnevalt tehtud DOC analüüs. Kinnise pudeli katses selline analüüs vajalik ei ole, kuid vee hapnikutarve peab olema madal.
      I.6.2.   Mineraalainete põhilahused
      Katselahuste jaoks valmistatakse sobivate mineraalainete kontsentratsioonidega põhilahused. Järgmised põhilahused sobivad (erinevaid lahjendusastmeid kasutades) DOC kõrvaldamise katse, muudetud OECD sõelkatse, CO2 eraldumise katse, manomeetrilise respiromeetria katse ja kinnise pudeli katse jaoks.
      Lahjendusastmed ja MITI katse mineraalse toitelahuse valmistamisjuhend on esitatud vastavate katsete alapunktides.
      Põhilahused
      Analüüsipuhastest reaktiividest valmistatakse järgmised põhilahused.
      
                  a)
               
               
                  Kaaliumdivesinikfosfaat, KH2PO4
                  
               
               
                  8,50 g
               
            
                  Dikaaliumvesinikfosfaat, K2HPO4
                  
               
               
                  21,75 g
               
            
                  Dinaatriumvesinikfosfaatdihüdraat, Na2HPO4, 2H2O
               
               
                  33,40 g
               
            
                  Ammooniumkloriid, NH4Cl
               
               
                  0,50 g
               
            
                  Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini. Lahuse pH peaks olema 7,4.
               
               
                   
               
            
                  b)
               
               
                  Kaltsiumkloriid, veevaba, CaCl2
                  
               
               
                  27,50 g
               
            
                  või kaltsiumkloriiddihüdraat, CaCl2 × 2 H2O
               
               
                  36,40 g
               
            
                  Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini
               
               
                   
               
            
                  c)
               
               
                  Magneesiumsulfaatheptahüdraat, MgSO4 × 7 H2O
               
               
                  22,50 g
               
            
                  Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini
               
               
                   
               
            
                  d)
               
               
                  Raud(III)kloriidheksahüdraat, FeCl3 × 6 H2O
               
               
                  0,25 g
               
            
                  Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini.
               
               
                   
               
            
         Märkus. Vältimaks vajadust valmistada lahus vahetult enne kasutamist, tuleb neile 1 liitri kohta lisada üks tilk konts. vesinikkloriidhapet või 0,4 g etüleendiamiintetraäädikhappe dinaatriumsoola.
      I.6.3.   Kemikaalide põhilahused
      Juhul kui aine lahustuvus ületab 1 g/l, lahustada vastavalt vajadusele 1–10 g test- või võrdlusainet deioniseeritud vees ja täiendada veega 1 liitrini. Teise võimalusena võib valmistada põhilahuse mineraalses toitelahuses või lisada kemikaali otse mineraalsele toitelahusele. Halvemini lahustuvate kemikaalide käsitlemist vt 3. liitest, kuid MITI katses (meetod C.4-F) ei tohi kasutada ei lahusteid ega emulgaatoreid.
      1.6.4.   Inokulaadid
      Inokulaadi saamisel võib kasutada mitmeid lähtematerjale: aktiivmuda, (klooritamata) reovett, pinnavett või mulda või nende segu. DOC kõrvaldamise, CO2 eraldumise või manomeetrilise respiromeetria katses aktiivmuda kasutamisel peaks see olema pärit valdavalt olmereovett töötlevast puhastusjaamast või laborimõõdus seadmest. Teistest allikatest pärit inokulaatide puhul on ilmnenud tulemuste suurem hajuvus. Muudetud OECD sõelkatse ja kinnise pudeli katse jaoks on vaja lahjemat, mudahelvesteta inokulaati, eelistatav allikas on valdavalt olmereovett töötlevast puhastusjaamast või laborimõõdus seadmest väljuv töödeldud reovesi. MITI katse inokulaat valmistatakse mitmete lähtematerjalide segust ja vastav kirjeldus on esitatud konkreetse katse alapunktis.
      I.6.4.1.   Aktiivmudast saadud inokulaat
      Proov võetakse valdavalt olmereovett töötleva puhastusjaama või laborimõõdus seadme aeratsioonibasseini värskest aktiivmudast. Vajaduse korral eemaldatakse peene sõelaga filtrimisel jämedad osakesed ja hoitakse muda seejärel aeroobsena.
      Teine võimalus on muda pärast jämedate osakeste eemaldamist setitada või tsentrifuugida (näiteks 1 100 g 10 min). Kõrvaldatakse supernatant. Muda võib pesta mineraalse toitelahusega. Kontsentreeritud muda suspendeeritakse mineraalses toitelahuses kontsentratsioonil 3–5 g hõljumit/l ja aereeritakse tarvitamiseni.
      Muda tuleks võtta tavapärasest, töökorras puhastusjaamast. Suure koormusega puhastusjaamast pärinevat või inhibiitoreid sisaldada võivat muda tuleks pesta. Pärast põhjalikku segamist resuspendeeritud muda setitatakse või tsentrifuugitakse, kõrvaldatakse supernatant ja resuspendeeritakse muda järgmises koguses mineraalses toitelahuses. Protseduuri korratakse, kuni muda loetakse substraadi liiast või inhibiitorist vabaks.
      Täielikult resuspendeeritud või töötlemata mudast võetakse vahetult enne kasutamist proov hõljumi kuivmassi määramiseks.
      Veel üks võimalus on aktiivmuda homogeniseerida (3–5 g hõljumit/l). Muda töödeldakse keskmisel kiirusel 2 min mehaanilises segistis. Homogeniseeritud muda setitatakse 30 min või vajaduse korral kauem ja dekanteeritakse vedelik, mida kasutatakse inokulaadina kontsentratsioonil 10 ml/l mineraalse toitelahuse kohta.
      I.6.4.2.   Muud inokulaadiallikad
      Inokulaadi võib valmistada valdavalt olmereovett töötlevast puhastusjaamast või laborimõõdus seadmest väljuvast töödeldud reoveest. Selleks võetakse värske proov, mida hoitakse transportimisel aeroobsena. Mudal lastakse 1 h seista või filtritakse see läbi jämeda filterpaberi ja hoitakse dekanteeritud vedelik või filtraat kuni tarvitamiseni aeroobsena. Sellist inokulaati võib kasutada kuni 100 ml toitelahuse liitri kohta.
      Veel üks võimalik inokulaadiallikas on pinnavesi. Sobivast pinnaveekogust, nt jõest või järvest võetakse proov ja hoitakse seda tarvitamiseni aeroobsena. Vajaduse korral kontsentreeritakse inokulaati filtrimise või tsentrifuugimise teel.
      I.6.5.   Inokulaatide kohandamine
      Inokulaate võib lasta kohanduda katsetingimustega, kuid mitte adapteeruda uuritava kemikaaliga. Kohandamine seisneb aktiivmuda aeratsioonis mineraalses toitelahuses või töödeldud reovees katsetemperatuuril 5–7 päeva jooksul. Mõnikord parandab kohandamine katsemeetodite täpsust, vähendades nullproovidega saadavaid tulemusi. MITI inokulaadi kohandamist ei peeta vajalikuks.
      I.6.6.   Abiootilised kontrollproovid
      Vajaduse korral kontrollitakse testaine võimalikku abiootilist lagunemist, uurides DOC kõrvaldamist, hapniku tarbimist või süsinikdioksiidi eraldumist steriilsetes inokulaadita kontrollproovides. Proov steriliseeritakse filtrimisel läbi membraani (0,2–0,45 μm) või sobiva mürkaine lisamisel vajalikus kontsentratsioonis. Membraanfiltratsiooni kasutamisel võetakse proovid steriilsuse tagamiseks aseptiliselt. Kui uuritava kemikaali adsorbeerumine ei ole eelnevalt välistatud, tuleb katsetes, kus biolagundumist mõõdetakse DOC kõrvaldamise järgi, eriti aktiivmuda-inokulaatide kasutamisel, kasutada inokuleeritavat ja mürgitatavat abiootilist kontrollproovi.
      I.6.7.   Kolbide arv
      Kolbide arv tüüpilises katses on ära toodud iga katse alapunktis.
      Kasutada võib järgmisi kombinatsioone:
      
                  —
               
               
                  katsesuspensioon: sisaldab testainet ja inokulaati;
               
            
                  —
               
               
                  inokulaadi nullproov: sisaldab ainult inokulaati;
               
            
                  —
               
               
                  protseduuri kontrollproov: sisaldab võrdlusainet ja inokulaati;
               
            
                  —
               
               
                  abiootiline steriilne kontrollproov: steriilne, sisaldab testainet (vt I.6.6);
               
            
                  —
               
               
                  adsorptsiooni kontrollproov: sisaldab testainet, inokulaati ja steriliseerivat ainet;
               
            
                  —
               
               
                  mürgisuse kontrollproov: sisaldab testainet, võrdlusainet ja inokulaati.
               
            Paralleelmõõtmised katsesuspensiooni ja inokulaadi nullprooviga on kohustuslikud. Soovitatav on teha mõõtmised ka ülejäänud paralleelidega.
      See ei pruugi aga alati võimalik olla. Tagada tuleb küllaldane proovide või mõõtmiste arv protsentuaalse kõrvaldamise leidmiseks 10-päevase akna kestel.
      I.7.   ANDMED JA HINDAMINE
      Protsentuaalse lagunemise (Dt) arvutamisel kasutatakse nii katseanuma kui ka inokulaadi nullproovi kordusmõõtmiste keskmisi. Vastavad valemid on sätestatud allpool, konkreetsetele katsetele vastavates alapunktides. Lagunemise käik esitatakse graafiliselt ja näidatakse ära kümnepäevane aken. Tuleks arvutada ja esitada kõrvaldamisprotsent kümnepäevase akna lõpus ja väärtus platool või katse lõpus, vastavalt vajadusele.
      Respiromeetrilistes katsetes võivad lämmastikku sisaldavad ühendid nitrifikatsiooni kaudu mõjutada hapniku tarbimist (vt II ja V liidet).
      I.7.1.   DOC määramise põhjal mõõdetud lagunemine
      Katse kehtivuse hindamiseks tuleks testainet sisaldavate kolbide kohta eraldi arvutada protsentuaalne lagunemine (Dt) igal proovi võtmise hetkel, kasutades DOC topeltmõõtmiste keskmisi väärtusi (vt I.5.2). See arvutatakse järgmise võrrandi abil:
      
         
      kus:
      
                  Dt
                  
               
               
                  =
               
               
                  lagunemisprotsent ajahetkel t,
               
            
                  Co
                  
               
               
                  =
               
               
                  DOC keskmine algkontsentratsioon testainet sisaldavas inokuleeritud toitelahuses (mg DOC/l),
               
            
                  Ct
                  
               
               
                  =
               
               
                  DOC keskmine kontsentratsioon testainet sisaldavas inokuleeritud toitelahuses ajahetkel t (mg DOC/l),
               
            
                  Cbo
                  
               
               
                  =
               
               
                  DOC keskmine algkontsentratsioon substraadivabas inokuleeritud mineraalses toitelahuses (mg DOC/l),
               
            
                  Cbt
                  
               
               
                  =
               
               
                  DOC keskmine kontsentratsioon substraadivabas inokuleeritud mineraalses toitelahuses ajahetkel t (mg DOC/l).
               
            Kõik kontsentratsioonid määratakse katseliselt.
      I.7.2.   Spetsiifilise analüüsi põhjal mõõdetud lagunemine
      Kui on olemas spetsiifilise analüüsi andmed, arvutatakse esmane biolagunemine valemist:
      
         
      kus:
      
                  Dt
                  
               
               
                  =
               
               
                  lagunemisprotsent ajahetkel t, üldjuhul 28 päeva möödumisel,
               
            
                  Sa
                  
               
               
                  =
               
               
                  testaine jääk inokuleeritud toitelahuses katse lõpul (mg),
               
            
                  Sb
                  
               
               
                  =
               
               
                  testaine jääk pimekatses vee/toitelahusega, kuhu on lisatud ainult testaine (mg).
               
            1.7.3.   Abiootiline lagunemine
      Abiootilise steriilse kontrollproovi kasutamisel arvutatakse protsentuaalne abiootiline lagunemine valemist:
      
         
      kus
      
                  Cs(o)
                  
               
               
                  =
               
               
                  DOC kontsentratsioon steriilses kontrollproovis 0-päeval,
               
            
                  Cs(t)
                  
               
               
                  =
               
               
                  DOC kontsentratsioon steriilses kontrollproovis päeval t.
               
            I.8.   ARUANDLUS
      Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  test- ja võrdlusaineid ning nende puhtusastet;
               
            
                  —
               
               
                  katsetingimusi;
               
            
                  —
               
               
                  inokulaadi kohta: tüüpi ja päritolu, kontsentratsiooni ja kohandamist, kui seda kasutati;
               
            
                  —
               
               
                  tööstuslike heitmete osakaalu ja iseloomu reovees, kui see on teada;
               
            
                  —
               
               
                  katse kestust ja temperatuuri;
               
            
                  —
               
               
                  vähelahustuvate testainete puhul nende käsitlemismeetodeid;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud katsemeetodit; meetodi mis tahes muudatusi tuleb teaduslikult põhjendada ja seletada;
               
            
                  —
               
               
                  andmeid;
               
            
                  —
               
               
                  kõiki täheldatud inhibitsiooninähte;
               
            
                  —
               
               
                  abiootilist lagunemist, kui seda täheldati;
               
            
                  —
               
               
                  spetsiifilise keemilise analüüsi andmeid, kui neid on;
               
            
                  —
               
               
                  vaheühendite analüüsiandmeid, kui neid analüüsiti;
               
            
                  —
               
               
                  test- ja võrdlusainete protsentuaalse lagunemise graafikut ajas; selgelt tuleks näidata ootefaas, lagunemisfaas, kümnepäevane aken ja tõus (1. liide). Kui katse vastab kvaliteedinõuetele, võib graafikul kasutada testainet sisaldavate kolbide lagunemisprotsentide keskmist väärtust;
               
            
                  —
               
               
                  lagunemisprotsenti kümnepäevase akna lõpus ja platool või katse lõpus.
               
            II OSA   DOC KÕRVALDAMISE KATSE (meetod C.4-A)
      
      II.1.   PÕHIMÕTE
      Kindlat kogust inokuleeritud mineraalset toitelahust kindla testaine kontsentratsiooniga (10–40 mg DOC/l), mis on ainus nominaalne orgaanilise süsiniku allikas, aereeritakse pimedas või hajutatud valguse käes 22 ± 2 oC juures.
      Lagunemisprotsessi jälgitakse 28 päeva jooksul sagedaste DOC analüüsidega. Arvutatakse biolagundumise määr, väljendades kõrvaldatud DOC kontsentratsiooni (mida on parandatud inokulaadiga nullproovi vastava väärtuse võrra) protsendina algkontsentratsioonist. Esmase biolagundumise määra võib arvutada ka inkubeerimise algul tehtud täiendava keemilise analüüsi põhjal.
      II.2.   MEETODI KIRJELDUS
      II.2.1.   Seade
      
                  a)
               
               
                  koonilised kolvid, mahuga nt 250 ml kuni 2 l, olenevalt DOC analüüsiks vajalikust mahust;
               
            
                  b)
               
               
                  kooniliste kolbide loksutusseade, mis on termostateeritud või asub püsiva temperatuuriga ruumis ja on piisava võimsusega aeroobsete tingimuste tagamiseks kõigis kolbides;
               
            
                  c)
               
               
                  sobivate membraanidega filtrimisseade;
               
            
                  d)
               
               
                  DOC analüsaator;
               
            
                  e)
               
               
                  lahustunud hapniku määramise seade;
               
            
                  f)
               
               
                  tsentrifuug.
               
            II.2.2.   Mineraalse toitelahuse valmistamine
      Põhilahuste valmistamist vt I.6.2.
      10 ml lahust a segatakse 800 ml lahjendusveega, liidetakse 1 ml lahuseid b kuni d ja täiendatakse veega 1 liitrini.
      II.2.3.   Inokulaadi valmistamine ja kohandamine
      Inokulaadi saamisel võib kasutada mitmeid lähtematerjale: aktiivmuda; reovett; pinnavett või mulda või nende segu.
      Vt punkte I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ja I.6.5.
      II.2.4.   Kolbide ettevalmistamine
      Näiteks viiakse 800 ml kogused mineraalset toitelahust 2 l koonilistesse kolbidesse ning lisatakse eri kolbidesse küllaldased kogused test- ja võrdlusainete põhilahuseid, nii et saadakse kemikaalikontsentratsioon, mis vastab 10–40 mg DOC-ile liitris. Kontrollitakse pH väärtusi ja viiakse need vajaduse korral 7,4ni. Kolvid inokuleeritakse aktiivmuda või muud päritolu inokulaadiga (vt I.6.4), lõpliku hõljumi kontsentratsiooniga kuni 30 mg/l. Valmistatakse ka inokulaadi kontrollproovid mineraalse toitelahusega, kuid ilma test- või võrdlusaineta.
      Vajaduse korral kontrollitakse ühes kolvis testaine võimalikku inhibeerivat mõju, inokuleerides võrreldavate kontsentratsioonidega test- ja võrdlusaine lahuse mineraalses toitelahuses.
      Vajaduse korral kontrollitakse veel ühes steriilses kolvis testaine abiootilist lagunemist, kasutades aine inokuleerimata lahust (vt I.6.6).
      Kui arvatakse, et testaine võib olulisel määral adsorbeeruda klaasil, mudal jne, tehakse eelkatse, kus hinnatakse adsorptsiooni tõenäolist ulatust ja seega ka katse sobivust antud ainele (vt tabelit 1). Selleks valmistatakse ette kolb testaine, inokulaadi ja steriliseeriva ainega.
      Lahused kõigis kolbides täiendatakse mineraalse toitelahusega 1 liitrini ja võetakse pärast segamist igast kolvist DOC algkontsentratsiooni määramiseks proov (vt II.4 liide). Kolbide avad kaetakse nt alumiiniumfooliumiga nii, et see ei takista õhu vaba liikumist kolvi ja ümbritseva atmosfääri vahel. Seejärel asetatakse kolvid katse alustamiseks loksutisse.
      II.2.5.   Kolbide arv tüüpilises katses
      Kolvid 1 ja 2: katsesuspensioon.
      Kolvid 3 ja 4: inokulaadi nullproov.
      Kolb 5: protseduuri kontrollproov.
      Eelistatavalt ja vajaduse korral:
      kolb 6: abiootiline steriilne kontrollproov,
      kolb 7: adsorptsiooni kontrollproov,
      kolb 8: mürgisuse kontrollproov.
      Vt ka punkti I.6.7.
      II.2.6.   Katse tegemine
      Kogu katse kestel määratakse igas kolvis kindlate ajavahemike järel DOC kontsentratsioon, piisava sagedusega kümnepäevase akna alguse määramiseks ja protsentuaalse kõrvaldamise määramiseks kümnepäevase akna lõpus. Igaks määramiseks võetakse ainult minimaalne vajalik kogus katsesuspensiooni.
      Enne proovide võtmist korvatakse vajaduse korral aurustumiskaod kolbides vajaliku koguse lahjendusvee lisamisega (I.6.1). Segu segatakse enne proovi võtmist hoolikalt ja veendutakse, et nõu seintele sadestunud materjal enne proovi võtmist lahustub või suspendeerub. Kohe pärast võtmist proovid membraan-filtreeritakse või tsentrifuugitakse (vt II.4 liidet). Filtritud või tsentrifuugitud proovid analüüsitakse samal päeval või säilitatakse 2–4 oC juures kuni 48 tundi või pikaajalisemal säilitamisel alla –18 oC juures.
      II.3.   ANDMED JA ARUANDLUS
      II.3.1.   Tulemuste käsitlemine
      Protsentuaalne lagunemine ajahetkel t arvutatakse punktis I.7.1 (DOC määramine) ja vajaduse korral ka punktis 1.7.2 (spetsiifiline analüüs) kirjeldatud moel.
      Kõik tulemused esitatakse etteantud andmetabelis.
      II.3.2.   Tulemuste kehtivus
      Vt punkti I.5.2.
      II.3.3.   Aruandlus
      Vt punkti I.8.
      II.4.   ANDMETABEL
      Järgneb andmetabeli näide.
      DOC KÕRVALDAMISE KATSE
      
                  1.
               
               
                  LABOR
               
            
                  2.
               
               
                  KATSE ALGUSKUUPÄEV
               
            3.   TESTAINE
      Nimi:
      Põhilahuse kontsentratsioon: … (kemikaali sisaldus, mg/l)
      Algkontsentratsioon toitelahuses, t0: … (kemikaali sisaldus, mg/l)
      4.   INOKULAAT
      Allikas:
      Töötlus:
      Kohandamine, kui seda tehti:
      Hõljumi kontsentratsioon segus: … mg/l
      5.   SÜSINIKU MÄÄRAMINE
      Süsinikuanalüsaator:
      
                   
               
               
                  Kolvi nr
               
               
                   
               
               
                  DOC n päeva pärast (mg/l)
               
            
                  0
               
               
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                  n3
                  
               
               
                  nx
                  
               
            
                  Testaine koos inokulaadiga
               
               
                  1
               
               
                  a1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a, keskmine
                  Ca(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                  b1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  b2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  b, keskmine
                  Cb(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Inokulaadi nullproovid testaineta
               
               
                  3
               
               
                  C1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  C2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  c, keskmine Cc(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  4
               
               
                  d1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  d2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  d, keskmine
                  Cd(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            6.   TÖÖTLEMATA ANDMETE HINDAMINE
      
                  Kolvi nr
               
               
                   
               
               
                  Lagunemisprotsent in päeva möödumisel
               
            
                  0
               
               
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                  n3
                  
               
               
                  nx
                  
               
            
                  1
               
               
                  
                     
               
               
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                  
                     
               
               
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Keskmine (3)
                  
               
               
                  
                     
               
               
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
         Märkus. Võrdlusaine ja mürgisuse kontrollproovide jaoks võib kasutada analoogseid tabeleid.
      7.   ABIOOTILINE KONTROLLPROOV (pole kohustuslik)
      
      
                   
               
               
                  Aeg (päevades)
               
            
                  0
               
               
                  t
               
            
                  DOC konts. steriilses kontrollproovis (mg/l)
               
               
                  Cs(o)
                  
               
               
                  Cs(t)
                  
               
            
         
      8.   SPETSIIFILINE KEEMILINE ANALÜÜS (pole kohustuslik)
      
      
                   
               
               
                  Testaine jääk katse lõpus (mg/l)
               
               
                  Esmase lagunemise %
               
            
                  Steriilne kontrollproov
               
               
                  Sb
                  
               
               
                   
               
            
                  Inokuleeritud toitelahus
               
               
                  Sa
                  
               
               
                  
                     
               
            III OSA   MUUDETUD OECD SÕELKATSE (meetod C.4-B)
      
      III.1.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Kindlat kogust inokuleeritud mineraalset toitelahust kindla testaine kontsentratsiooniga (10–40 mg DOC/l), mis on ainus nominaalne orgaanilise süsiniku allikas, inokuleeritakse 0,5 ml reoveega liitri lahuse kohta. Seejärel aereeritakse segu pimedas või hajutatud valguse käes 22 ± 2 oC juures.
      Lagunemisprotsessi jälgitakse 28 päeva jooksul sagedaste DOC analüüsidega. Arvutatakse biolagundumise määr, väljendades kõrvaldatud DOC kontsentratsiooni (mida on parandatud inokulaadiga nullproovi vastava väärtuse võrra) protsendina algkontsentratsioonist. Esmase biolagundumise määra võib arvutada ka inkubeerimise algul ja lõpul tehtud täiendava keemilise analüüsi põhjal.
      III.2.   MEETODI KIRJELDUS
      III.2.1.   Seadmed:
      
      
                  a)
               
               
                  koonilised kolvid, mahuga nt 250 ml kuni 2 l, olenevalt DOC analüüsiks vajalikust mahust;
               
            
                  b)
               
               
                  kooniliste kolbide loksutusseade, mis on termostateeritud või asub püsiva temperatuuriga ruumis ja on piisava võimsusega aeroobsete tingimuste tagamiseks kõigis kolbides;
               
            
                  c)
               
               
                  sobivate membraanidega filtrimisseade;
               
            
                  d)
               
               
                  DOC analüsaator;
               
            
                  e)
               
               
                  lahustunud hapniku määramise seade;
               
            
                  f)
               
               
                  tsentrifuug.
               
            III.2.2.   Mineraalse toitelahuse valmistamine
      Põhilahuste valmistamist vt I.6.2.
      10 ml lahust a segatakse 80 ml lahjendusveega, lisatakse 1 ml lahuseid b–d ja täiendatakse veega 1 liitrini.
      Selles meetodis kasutatakse ainult 0,5 ml inokulaati liitri kohta, mistõttu võib olla vaja lisada toitelahusele mikroelemente ja kasvutegureid. Selleks lisatakse liitri lõpliku toitelahuse kohta 1 ml igast järgmisest lahusest:
      Mikroelementide lahus:
      
                  Mangaansulfaattetrahüdraat, MnSO4. 4H2O
               
               
                  39,9 mg
               
            
                  Boorhape, H3BO3
                  
               
               
                  57,2 mg
               
            
                  Tsinksulfaatheptahüdraat, ZnSO4. 7H2O
               
               
                  42,8 mg
               
            
                  Ammooniumheptamolübdaat, (NH4)6Mo7O24
                  
               
               
                  34,7 mg
               
            
                  Fe-kelaat (FeCl3-etüleendiamiintetraäädikhape)
               
               
                  100,0 mg
               
            
                  Lahustatakse vees ja täiendatakse lahjendusveega 1 000 ml-ni.
               
               
                   
               
            
                  Vitamiinilahus:
               
               
                   
               
            
                  pärmiekstrakt
               
               
                  15,0 mg
               
            Pärmiekstrakt lahustatakse 100 ml vees. Lahus steriliseeritakse filtrimisel läbi 0,2 μm membraani või valmistatakse vahetult enne kasutamist.
      III.2.3.   Inokulaadi valmistamine ja kohandamine
      Inokulaadi võib valmistada valdavalt olmereovett töötlevast puhastusjaamast või laborimõõdus seadmest väljuvast töödeldud reoveest. Vt punkte I.6.4.2 ja I.6.5.
      Kasutatav kogus on 0,5 ml ühe liitri mineraalse toitelahuse kohta.
      III.2.4.   Kolbide ettevalmistamine
      Näiteks viiakse 800 ml kogused mineraalset toitelahust 2 l koonilistesse kolbidesse ning lisatakse eri kolbidesse küllaldased kogused test- ja võrdlusainete põhilahuseid, nii et saadakse kemikaalikontsentratsioon, mis vastab 10–40 mg DOC-ile liitris. Kontrollitakse pH väärtust ja viiakse see vajaduse korral 7,4ni. Kolvid inokuleeritakse 0,5 ml reovee lisamisega liitri kohta (vt I.6.4.2). Valmistatakse ka inokulaadi kontrollproovid mineraalse toitelahusega, kuid ilma test- või võrdlusaineta.
      Vajaduse korral kontrollitakse ühes kolvis testaine võimalikku inhibeerivat mõju, inokuleerides võrreldavate kontsentratsioonidega test- ja võrdlusaine lahuse mineraalses toitelahuses.
      Vajaduse korral kontrollitakse veel ühes steriilses kolvis testaine abiootilist lagunemist, kasutades aine inokuleerimata lahust (vt I.6.6).
      Kui arvatakse, et testaine võib olulisel määral adsorbeeruda klaasil, mudal jne, tehakse eelkatse, kus hinnatakse adsorptsiooni tõenäolist ulatust ja seega ka katse sobivust antud ainele (vt tabelit 1). Selleks valmistatakse ette kolb testaine, inokulaadi ja steriliseeriva ainega.
      Lahused kõigis kolbides täiendatakse mineraalse toitelahusega 1 liitrini ja võetakse pärast segamist igast kolvist DOC algkontsentratsiooni määramiseks proov (vt II.4 liidet). Kolbide avad kaetakse näiteks alumiiniumfooliumiga nii, et see ei takista õhu vaba liikumist kolvi ja ümbritseva atmosfääri vahel. Seejärel asetatakse kolvid katse alustamiseks loksutisse.
      III.2.5.   Kolbide arv tüüpilises katses
      Kolvid 1 ja 2: katsesuspensioon.
      Kolvid 3 ja 4: inokulaadi nullproov.
      Kolb 5: protseduuri kontrollproov.
      Eelistatavalt ja vajaduse korral
      kolb 6: abiootiline steriilne kontrollproov,
      kolb 7: adsorptsiooni kontrollproov,
      kolb 8: mürgisuse kontrollproov.
      Vt ka punkti I.6.7.
      III.2.6.   Katse tegemine
      Kogu katse kestel määratakse igas kolvis kindlate ajavahemike järel DOC kontsentratsioon piisava sagedusega kümnepäevase akna alguse määramiseks ja protsentuaalse kõrvaldamise määramiseks kümnepäevase akna lõpus. Igaks määramiseks võetakse ainult minimaalne vajalik kogus katsesuspensiooni.
      Enne proovide võtmist korvatakse vajaduse korral aurustumiskaod kolbides vajaliku koguse lahjendusvee lisamisega (I.6.1). Segu segatakse enne proovi võtmist hoolikalt ja veendutakse, et nõu seintele sadestunud materjal enne proovi võtmist lahustub või suspendeerub. Kohe pärast võtmist proovid membraan-filtreeritakse või tsentrifuugitakse (vt II.4 liidet). Filtritud või tsentrifuugitud proovid analüüsitakse samal päeval või säilitatakse 2–4 oC juures kuni 48 tundi või pikaajalisemal säilitamisel alla –18 oC juures.
      III.3.   ANDMED JA ARUANDLUS
      III.3.1.   Tulemuste käsitlemine
      Protsentuaalne lagunemine ajahetkel t arvutatakse punktis I.7.1 (DOC määramine) ja vajaduse korral ka punktis I.7.2 (spetsiifiline analüüs) kirjeldatud moel.
      Kõik tulemused esitatakse etteantud andmetabelis.
      III.3.2.   Tulemuste kehtivus
      
      Vt punkti I.5.2.
      III.3.3.   Aruandlus
      
      Vt punkti I.8.
      III.4.   ANDMETABEL
      Järgneb andmetabeli näide.
      MUUDETUD OECD SÕELKATSE
      
                  1.
               
               
                  LABOR
               
            
                  2.
               
               
                  KATSE ALGUSKUUPÄEV
               
            3.   TESTAINE
      Nimi:
      Põhilahuse kontsentratsioon: … (kemikaali sisaldus, mg/l)
      Algkontsentratsioon toitelahuses, t0: … (kemikaali sisaldus, mg/l)
      4.   INOKULAAT
      Allikas:
      Töötlus:
      Kohandamine, kui seda tehti:
      Hõljumi kontsentratsioon segus: … mg/l
      5.   SÜSINIKU MÄÄRAMINE
      
      Süsinikuanalüsaator:
      
                   
               
               
                  Kolvi nr
               
               
                   
               
               
                  DOC n päeva möödumisel (mg/l)
               
            
                  0
               
               
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                  n3
                  
               
               
                  nx
                  
               
            
                  Testaine koos inokulaadiga
               
               
                  1
               
               
                  a1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a, keskmine
                  Ca(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                  b1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  b2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  b, keskmine
                  Cb(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Inokulaadi nullproovid testaineta
               
               
                  3
               
               
                  C1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  C2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  c, keskmine Cc(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  4
               
               
                  d1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  d2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  d, keskmine
                  Cd(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            6.   TÖÖTLEMATA ANDMETE HINDAMINE
      
                  Kolvi nr
               
               
                   
               
               
                  Laguremisprotsent n päeva pärast
               
            
                  0
               
               
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                  n3
                  
               
               
                  nx
                  
               
            
                  1
               
               
                  
                     
               
               
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                  
                     
               
               
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Keskmine (4)
                  
               
               
                  
                     
               
               
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
         Märkus. Võrdlusaine ja mürgisuse kontrollproovide jaoks võib kasutada analoogseid tabeleid.
      7.   ABIOOTILINE KONTROLLPROOV (pole kohustuslik)
      
      
                   
               
               
                  Aeg (päevades)
               
            
                  0
               
               
                  t
               
            
                  DOC konts. steriilses kontrollproovis (mg/l)
               
               
                  CS(o)
                  
               
               
                  Cs(t)
                  
               
            
         
      8.   SPETSIIFILINE KEEMILINE ANALÜÜS (pole kohustuslik)
      
      
                   
               
               
                  Testaine jääk katse lõpus
               
               
                  Esmase lagunemise %
               
            
                  Steriilne kontrollproov
               
               
                  Sb
                  
               
               
                   
               
            
                  Inokuleeritud toitelahus
               
               
                  Sa
                  
               
               
                  
                     
               
            IV OSA   CO2 ERALDUMISE KATSE (meetod C.4-C)
      
      IV.1.   PÕHIMÕTE
      Kindlat kogust inokuleeritud mineraalset toitelahust kindla testaine kontsentratsiooniga (10–20 mg DOC/l), mis on ainus nominaalne orgaanilise süsiniku allikas, aereeritakse süsinikdioksiidivaba õhu läbipuhumisega kindlal kiirusel pimedas või hajutatud valguse käes. Lagunemisprotsessi jälgitakse 28 päeva jooksul eralduva CO2 määramise abil, viimane püütakse baarium- või naatriumhüdroksiidi ja mõõdetakse hüdroksiidi jäägi tiitrimise või anorgaanilise süsiniku määramise teel. Testainest tekkiv süsinikdioksiidi kogus (mida on parandatud inokulaadiga nullproovi vastava väärtuse võrra) väljendatakse protsendina ThCO2-st. Biolagundumise määra võib arvutada ka inkubeerimise algul tehtud täiendava DOC analüüsi põhjal.
      IV.2.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      IV.2.1.   Seadmed
      
                  a)
               
               
                  2–5liitrised kolvid peaaegu põhjani ulatuva aeratsioonitoru ja väljaviiguga;
               
            
                  b)
               
               
                  vähelahustuvate ainete uurimisel magnetsegajad;
               
            
                  c)
               
               
                  gaasipüüdurpudelid;
               
            
                  d)
               
               
                  õhuvoolu reguleerimise ja mõõtmise seade;
               
            
                  e)
               
               
                  seade süsinikdioksiidi väljapesemiseks süsinikdioksiidivaba õhu valmistamiseks; teise võimalusena võib kasutada õiges vahekorras segu (20 % O2: 80 % N2) CO2-vabast balloonihapnikust ja CO2-vabast balloonilämmastikust;
               
            
                  f)
               
               
                  seade süsinikdioksiidi määramiseks kas tiitrimeetriliselt või mis tahes põhimõttel töötava anorgaanilise süsiniku analüsaatori abil;
               
            
                  g)
               
               
                  membraanfiltratsiooniseade (ei ole kohustuslik);
               
            
                  h)
               
               
                  DOC analüsaator (ei ole kohustuslik).
               
            IV.2.2.   Mineraalse toitelahuse valmistamine
      Põhilahuste valmistamist vt I.6.2.
      10 ml lahust a segatakse 800 ml lahjendusveega, lisatakse 1 ml lahuseid b kuni d ja täiendatakse veega 1 liitrini.
      IV.2.3.   Inokulaadi valmistamine ja kohandamine
      Inokulaadi saamisel võib kasutada mitmeid lähtematerjale: aktiivmuda, reovett, pinnavett või mulda või nende segu.
      Vt punkte I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ja I.6.5.
      IV.2.4.   Kolbide ettevalmistamine
      Järgmises näites on esitatud mahulised kogused ja kaalutised viieliitriste kolbide jaoks 3 1 suspensiooniga. Väiksemate koguste kasutamisel võib koguseid vastavalt muuta, kuid tagada tuleb täpseks mõõtmiseks piisav süsinikdioksiidi eraldumine.
      Igasse viieliitrisesse kolbi lisatakse 2 400 ml mineraalset toitelahust. Seejärel lisatakse sobiv kogus ettevalmistatud aktiivmuda (vt I.6.4.1 ja I.6.5) nii, et hõljumi kontsentratsioon lõplikus 3 liitris inokuleeritud segus ei ületa 30 mg/l. Teise võimalusena võib ettevalmistatud muda kõigepealt lahjendada mineraalse toitelahusega nii, et saadakse suspensioon kontsentratsiooniga 500 – 1 000 mg/l, misjärel lisatakse sellest kindel kogus viieliitrisesse kolbi nii, et saadakse lõppkontsentratsioon 30 mg/l; nõnda tagatakse suurem täpsus. Kasutada võib muid inokulaadiallikaid (vt I.6.4.2).
      Inokuleeritud segusid aereeritakse üleöö CO2-vaba õhuga, et puhastada süsteem süsinikdioksiidist.
      Eraldi paralleelkolbidele lisatakse kindla koguse põhilahuse näol test- ja võrdlusaine nii, et neist tulenev DOC või TOC kontsentratsioon on 10–20 mg/l; mõned kolvid jäetakse kemikaalita inokulaadi kontrollproovideks. Vähelahustuvad testained lisatakse massi või mahu järgi otse kolbi või neid käsitletakse 3. liites kirjeldatud moel.
      Vajaduse korral kontrollitakse ühes kolvis testaine võimalikku inhibeerivat mõju, lisades kolbi ülejäänud kolbidega võrdses kontsentratsioonis nii test- kui ka võrdlusainet.
      Vajaduse korral kontrollitakse veel ühes steriilses kolvis testaine abiootilist lagunemist, kasutades aine inokuleerimata lahust (vt I.6.6). Proov steriliseeritakse sobivas kontsentratsioonis mürkaine lisamisega.
      Enne seda täiendatakse suspensioonid kõigis kolmes kolvis CO2-vaba õhuga aereeritud mineraalse toitelahusega 3 liitrini. Lisaks võib võtta proove DOC analüüsiks (vt II.4 liidet) ja/või spetsiifiliseks analüüsiks. Pesupudelid ühendatakse kolbide väljaviiguga.
      Baariumhüdroksiidi kasutamisel ühendatakse iga viieliitrise kolviga järjestikku kolm pesupudelit, millest igaühes on 100 ml 0,0125 M baariumhüdroksiidlahust. Lahus ei tohi sisaldada sulfaadi ja karbonaadi sadet ja selle kontsentratsioon tuleb määrata vahetult enne kasutamist. Naatriumhüdroksiidi kasutamisel ühendatakse järjestikku kaks püüdurit, kusjuures teine on kontrollpüüdur, mis peab näitama, kas esimene absorbeeris kogu süsinikdioksiidi. Sobivad ka seerumipudeli sulguriga pesupudelid. Igasse pudelisse lisatakse 200 ml 0,05 M naatriumhüdroksiidi, mis on küllaldane kogu testaine täielikul lagunemisel tekkiva süsinikdioksiidi absorbeerimiseks. Isegi vahetult enne kasutamist valmistatud naatriumhüdroksiidi lahus sisaldab väikestes kogustes karbonaate, vastav viga korrigeeritakse nullproovi karbonaadikoguse lahutamisega.
      IV.2.5.   Kolbide arv tüüpilises katses
      Kolvid 1 ja 2: katsesuspensioon.
      Kolvid 3 ja 4: inokulaadi nullproov.
      Kolb 5: protseduuri kontrollproov.
      Eelistatavalt ja vajaduse korral:
      kolb 6: abiootiline steriilne kontrollproov,
      kolb 7: mürgisuse kontrollproov,
      kolb 8: mürgisuse kontrollproov.
      Vt ka punkti I.6.7.
      IV.2.6.   Katse tegemine
      Katset alustatakse CO2-vaba õhu juhtimisega läbi suspensioonide kiirusega 30–100 ml/min. Süsinikdioksiidi absorbendist võetakse CO2 sisalduse määramiseks regulaarselt proove. Esimese kümne päeva jooksul on soovitatav teha analüüse iga kahe või kolme päeva tagant, seejärel iga viie päeva tagant kuni 28. päevani, nii et saab määrata kümnepäevase aknaperioodi.
      28. päeval võetakse proovid DOC ja spetsiifilise analüüsi jaoks (kui neid tehakse), mõõdetakse suspensioonide pH ja lisatakse igasse kolbi 1 ml kontsentreeritud vesinikkloriidhapet; kolbe aereeritakse üleöö, et kõrvaldada suspensioonides olev süsinikdioksiid. 29. päeval tehakse viimane eralduva süsinikdioksiidi analüüs.
      CO2 mõõtmise päevadel eemaldatakse kõige kolvipoolsem baariumhüdroksiidiga pesupudel ja tiitritakse hüdroksiidilahust 0,05 M HCl-ga, kasutades indikaatorina fenoolftaleiini. Ülejäänud pesupudelid nihutatakse ühe koha võrra kolvile lähemale ja paigutatakse kaugemasse otsa uus pesupudel 100 ml värske 0,0125 M baariumhüdroksiidiga. Tiitrimisi tehakse kas vastavalt vajadusele, näiteks siis, kui esimeses püüduris täheldatakse märgatavat sadet ja enne sademe teket teises pudelis või vähemalt kord nädalas. NaOH kasutamisel absorbendina võetakse süstlaga väike proov (mille suurus sõltub kasutatavast süsinikuanalüsaatorist) kolvipoolses pesupudelis olevast naatriumhüdroksiidilahusest. Proov süstitakse eraldunud süsinikdioksiidi otseseks määramiseks süsinikuanalüsaatori anorgaanilise süsiniku määrajasse.
      Teise püüduri sisu analüüsitakse alles katse lõpus, et vajaduse korral lisada arvutustesse läbikandunud süsinikdioksiidi arvestav parandus.
      IV.3.   ANDMED JA ARUANDLUS
      IV.3.1.   Tulemuste käsitlemine
      Püüdurisse kogutud CO2 kogus leitakse tiitrimisel järgmise valemi järgi:
      mgCO2 = (100 × CB – 0,5 × v × CA) × 44
      kus:
      
                  V
               
               
                  =
               
               
                  100 ml absorbeerimislahuse tiirimiseks kulunud HCl maht (ml),
               
            
                  CB
                  
               
               
                  =
               
               
                  baariumhüdroksiidilahuse kontsentratsioon (M),
               
            
                  CA
                  
               
               
                  =
               
               
                  vesinikkloriidhappelahuse kontsentratsioon (M),
               
            kui CB on 0,0125 M ja CA on 0,05 M, kulub 100 ml baariumhüdroksiidi tiitrimiseks 50 ml lahust ja CO2 mass leitakse järgmisest valemist:
      
         
      Seega on teisendustegur tekkinud CO2 massi (mg) arvutamisel tiitrimisel kulunud HCl mahust (ml) 1,1.
      Vastavate tiitrimisandmete põhjal arvutatakse ainult inokulaadist tekkiva CO2 ning inokulaadi ja testaine segust tekkiva CO2 massid, nende vahe ongi ainult testainest tekkiva CO2 mass.
      Näiteks kui inokulaadiga kulub tiitrimisele 48 ml ning inokulaadi ja testaine seguga 45 ml,
      CO2 inokulaadist = 1,1 × (50–48) = 2,2 mg
      CO2 inokulaadi ja testaine segust = 1,1 × (50–45) = 5,5 mg
      on testainest tekkiva CO2 mass 3,3 mg.
      Biolagundumise protsent arvutatakse järgmise valemi järgi:
      
         
      
         
      kus 3,67 on teisendustegur (44/12) üleminekul süsiniku massilt süsinikdioksiidi massile.
      Lagunemisprotsent mis tahes ajavahemiku järel leitakse kõigi mõõtmispäevale eelnevate päevade kohta arvutatud protsentuaalsete ThCO2 väärtuste liitmisel.
      Naatriumhüdroksiidiga absorbeerimisel arvutatakse tekkinud süsinikdioksiidi kogus, väljendatuna anorgaanilise süsinikuna (IC) milligrammides, korrutades IC kontsentratsiooni absorbendis absorbendi mahuga.
      Lagunemisprotsent arvutatakse järgmise valemi järgi:
      
         
      DOC kõrvaldamise võib arvutada vastavalt punktile I.7. Need ja kõik ülejäänud tulemused registreeritakse etteantud andmetabelis.
      IV.3.2.   Tulemuste kehtivus
      Katseaine – mineraalse toitelahuse suspensiooni anorgaanilise süsiniku sisaldus katse algul peab olema vähem kui 5 % süsiniku üldsisaldusest (TC) ja eraldunud CO2 summaarne kogus inokulaadiga nullproovi puhul ei tohiks katse lõpul üldjuhul ületada 40 mg/l lahuse kohta. Kui saadavad väärtused on suuremad kui 70 mg CO2/l, tuleks andmed ja katsetehnika kriitiliselt üle vaadata.
      Vt ka punkti I.5.2.
      IV.3.3.   Aruandlus
      Vt punkti I.8.
      IV.4.   ANDMETABEL
      Järgneb andmetabeli näide.
      SÜSINIKDIOKSIIDI ERALDUMISE KATSE
      
                  1.
               
               
                  LABOR
               
            
                  2.
               
               
                  KATSE ALGUSKUUPÄEV
               
            3.   TESTAINE
      Nimi:
      Põhilahuse kontsentratsioon: ... (kemikaali sisaldus, mg/l)
      Algkonts. toitelahuses: ... (kemikaali sisaldus, mg/l)
      Kolbi lisatud süsiniku koguhulk: ...mg C
      ThCO2:...mg CO2
      
      4.   INOKULAAT
      Allikas:
      Töötlus:
      Kohandamine, kui seda tehti:
      Hõljumi kontsentratsioon segus: ... mg/l
      
                  5.
               
               
                  SÜSINIKDIOKSIIDI ERALDUMINE JA LAGUNDUVUS
               
            Meetod: Ba(OH)2/NaOH/muu
      
                  Aeg
                  (päevades)
               
               
                  Tekkinud CO2
                  
                  Katselahus (mg)
               
               
                  Tekkinud CO2
                  
                  nullproov (mg)
               
               
                  Tekkinud CO2 kumulatiivne (mg)
                  (ja nullproovi vahe keskmine)
               
               
                  ThCO2
                  
                  kumulatiiv ne 
               
            
                  1
                  2
               
               
                  keskmine
               
               
                  3
                  4
               
               
                  keskmine
               
               
                  1
               
               
                  2
               
               
                  1
               
               
                  2
               
               
                  keskmine
               
            
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  n1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  n2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  n3
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  28
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
         Märkus.: Võrdlusaine ja mürgisuse kontrollproovide jaoks võib kasutada analoogseid tabeleid.
      5.   SÜSINIKU ANALÜÜS (pole kohustuslik)
      
      Süsinikuanalüsaator:
      
                  Aeg (päevades)
               
               
                  Nullproov (mg/l)
               
               
                  Testaine (mg/l)
               
            
                  0
               
               
                  Cb(o)
                  
               
               
                  Co
                  
               
            
                  28 (5)
                  
               
               
                  Cb(t)
                  
               
               
                  Ct
                  
               
            
         
      7.   ABIOOTILISE LAGUNEMISE KATSE (pole kohustuslik)
      
      
         
      V. OSA   MANOMEETRILISE RESPIROMEETRIA KATSE (meetod C.4-D)
      
      V.1.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Kindlat kogust inokuleeritud mineraalset toitelahust kindla testaine kontsentratsiooniga (100 mg/l testainet, ThOD-ga vähemalt 50–100 mg/l), mis on ainus nominaalne orgaanilise süsiniku allikas, segatakse kuni 28 päeva kinnises kolvis konstantsel temperatuuril (kõikumisega ± 1 oC või alla selle). Hapniku tarbimine määratakse kas konstantse gaasiruumala hoidmiseks vajaliku (elektrolüüsil saadud) hapniku koguse mõõtmisel või ruumala või rõhu (või mõlema) muutuse järgi seadmes. Tekkiv süsinikdioksiid absorbeeritakse kaaliumhüdroksiidi või muu sobiva absorbendi lahuses. Testaine hapnikutarve (mida on parandatud paralleelse inokulaadiga nullproovi vastava väärtuse võrra) väljendatakse protsendina ThOD-st või KHT-st. Lisaks võib inkubeerimise algul ja lõpul tehtud täiendava keemilise analüüsi põhjal arvutada ka esmase biolagundumise määra ja DOC analüüsi põhjal lõpliku biolagundumise määra.
      V.2.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      V.2.1.   Seadmed
      
                  a)
               
               
                  sobiv respiromeeter;
               
            
                  b)
               
               
                  termostaat täpsusega ± 1 oC või täpsem;
               
            
                  c)
               
               
                  membraanfiltratsiooni seade (pole kohustuslik);
               
            
                  d)
               
               
                  süsinikuanalüsaator (pole kohustuslik).
               
            V.2.2.   Mineraalse toitelahuse valmistamine
      Põhilahuste valmistamist vt I.6.2.
      10 ml lahust a segatakse 800 ml lahjendusveega, lisatakse 1 ml lahuseid b kuni d ja täiendatakse veega 1 liitrini.
      V.2.3.   Inokulaadi valmistamine ja kohandamine
      Inokulaadi saamisel võib kasutada mitmeid lähtematerjale: aktiivmuda, reovett, pinnavett ja mulda või nende segu.
      Vt punkte I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ja I.6.5.
      V.2.4.   Kolbide ettevalmistamine
      Põhilahustest valmistatakse eraldi test- ja võrdlusainete lahused mineraalses toitelahuses, üldjuhul kontsentratsiooniga 100 mg kemikaali/liitris (ThOD-ga vähemalt 50–100 mg/l).
      ThOD arvutatakse ammooniumisoolade moodustumise põhjal, välja arvatud juhul, kui eeldatakse nitrifikatsiooni toimumist, sel juhul eeldatakse arvutustes nitraadi moodustumist (vt II liidet punkti 2).
      Kontrollitakse pH väärtusi ja viiakse need vajaduse korral 7,4±0,2ni.
      Vähelahustuvad ained tuleks lisada hilisemas faasis (vt allpool).
      Testaine mürgisuse kontrollimisel valmistatakse ette veel üks lahus, mis sisaldab üksikute lahustega võrdses kontsentratsioonis nii test- kui ka võrdlusainet.
      Kui on vaja määrata füüsikalis-keemiline hapnikutarve, valmistatakse testaine lahus ThOD-ga üldjuhul 100 mg/l, mis steriliseeritakse sobiva mürkaine lisamisega (vt I.6.6).
      Vähemalt kahtedesse paralleelkolbidesse lisatakse vajalikud kogused test- ja võrdlusainete lahuseid. Täiendavad kolvid valmistatakse ette ainult mineraalse toitelahusega (inokulaadi kontrollproovid) ning vajaduse korral test- ja võrdlusaine seguga ja steriilse lahusega.
      Vähelahustuvad testained lisatakse selles faasis massi või mahu järgi otse kolbi või neid käsitsetakse 3. liites kirjeldatud moel. CO2-püüduri kambritesse lisatakse kaaliumhüdroksiidi, naatronlubja graanuleid või muud absorbenti.
      V.2.5.   Kolbide arv tüüpilises katses
      Kolvid 1 ja 2: katsesuspensioon.
      Kolvid 3 ja 4: inokulaadi nullproov.
      Kolb 5: protseduuri kontrollproov.
      Eelistatavalt ja vajaduse korral:
      kolb 6: steriilne kontrollproov,
      kolb 7: mürgisuse kontrollproov.
      Vt ka punkti I.6.7.
      V.2.6.   Katse tegemine
      Kolbidel lastakse jõuda soovitud temperatuurini ning asjaomased kolvid inokuleeritakse ettevalmistatud aktiivmuda või muud päritolu inokulaadiga lõpliku hõljumi kontsentratsiooniga kuni 30 mg/l. Katseaparatuur pannakse kokku, käivitatakse segaja ning kontrollitakse seadme hermeetilisust ja alustatakse hapnikutarbe mõõtmist. Üldjuhul ei ole vaja katseaparatuuri rohkem jälgida, välja arvatud vajalike tulemuste registreerimine ja igapäevase temperatuuri- ja segamisrežiimi kontrollimine.
      Hapnikutarve arvutatakse regulaarselt ja sageli loetavate näitude põhjal, seadme tootja ette nähtud meetodite abil. Inkubatsiooniperioodi lõpus, tavaliselt 28 päeva pärast, mõõdetakse kolbide pH, eriti kui hapnikutarve on madal või kõrgem kui ThODNH4 (lämmastikku sisaldavate ühendite puhul).
      Vajaduse korral võetakse respiromeetri kolbidest katse alguses ja lõpus proove DOC analüüsiks või spetsiifilise aine analüüsiks (vt II.4 liidet). Pärast proovi võtmist katse alguses peab teada olema kolbi jääva katsesuspensiooni maht. Kui hapniku tarbimine on tingitud lämmastikku sisaldavast testainest, mõõdetakse nitriti ja nitraadi kontsentratsiooni tõus 28 päeva jooksul ja arvutatakse välja nitrifikatsiooni hapnikutarvet arvestav parandus (V liide).
      V.3.   ANDMED JA ARUANDLUS
      V.3.1.   Tulemuste käsitlemine
      Testaine hapnikutarve (mg) kindlaksmääratud aja möödumisel (millest on lahutatud inokulaadiga nullproovi vastav näitaja sama aja kohta) jagatakse kasutatud testaine massiga. Nii saadakse BHT väärtus, mis on väljendatud hapniku massina (mg) testaine massi (mg) suhtes, st
      
         
      = hapnikutarve (mg) testaine massiühiku (mg) kohta.
      Biolagundumise protsent arvutatakse kas valemist:
      
         
      või valemist
      
         
      Tuleb märkida, et kui need kaks meetodit ei anna alati samasugust tulemust, on eelistatav kasutada esimest meetodit.
      Lämmastikku sisaldavate testainete puhul tuleb kasutada asjakohast ThOD-d (NH4 või NO3) vastavalt nitrifikatsiooni teadaolevale või eeldatavale toimumisele. Kui nitrifikatsioon toimub, kuid ei ole täielik, arvutatakse nitrifikatsiooni hapnikutarvet arvestav parandus välja nitriti ja nitraadi kontsentratsiooni muutustest (V liide).
      Valikulistel orgaanilise süsiniku ja/või spetsiifilise aine määramistel arvutatakse lagunemisprotsent punktis I.7 kirjeldatud moel.
      Kõik tulemused registreeritakse etteantud andmetabelis.
      V.3.2.   Tulemuste kehtivus
      Inokulaadiga nullproovi hapnikutarve 28 päeva jooksul on üldjuhul 20–30 mg O2/l ega tohiks ületada 60 mg/l. Kui saadavad väärtused on suuremad kui 60 mg/l, tuleks andmed ja katsetehnika kriitiliselt üle vaadata. Kui pH jääb väljapoole vahemikku 6–8,5 ja testaine hapnikutarve on alla 60 %, tuleks katset testaine madalama kontsentratsiooniga korrata.
      Vt ka punkti I.5.2.
      V.3.3.   Aruandlus
      Vt punkti I.8.
      V.4.   ANDMETABEL
      
      Järgneb andmetabeli näide.
      MANOMEETRILISE RESPIROMEETRIA KATSE
      
                  1.
               
               
                  LABOR
               
            
                  2.
               
               
                  KATSE ALGUSKUUPÄEV
               
            3.   TESTAINE
      Nimi:
      Põhilahuse kontsentratsioon: ... mg/l
      Algkontsentratsioon toitelahuses, CO: ... mg/l
      Lahuse maht katsekolvis (V): ... ml
      ThOD või KHT: ... O2 (mg)/testaine (mg) (NH4 või NO3)
      4.   INOKULAAT
      Allikas:
      Töötlus:
      Kohandamine, kui seda tehti:
      Hõljumi kontsentratsioon segus: ... mg/l
      5.   HAPNIKUTARVE: BIOLAGUNDUVUS
      
                   
               
               
                  Aeg (päevades)
               
            
                  0
               
               
                   
               
               
                  7
               
               
                   
               
               
                  14
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  21
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  28
               
               
                   
               
            
                  Hapnikutarve (mg) testaine
               
               
                  1
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a, keskmine
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Hapnikutarve (mg) nullproov
               
               
                  3
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  4
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  b, keskmine
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Parandatud BHT (mg)
               
               
                  (a1–bm)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  (a2–bm)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  BHT mg testaine kohta
               
               
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Lagunemisprotsent
                  
                     
               
               
                  D1 (a1)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  D2 (a2)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Keskmine (6)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  V = lahuse maht katsekolvis
               
            NB: Võrdlusaine ja mürgisuse kontrollproovide jaoks võib kasutada analoogseid tabeleid.
      6.   NITRIFIKATSIOONI ARVESTAV PARANDUS (vt V liidet)
      
      
                  Päev
               
               
                  0
               
               
                  28
               
               
                  Erinevus
               
            
                  
                              i)
                           
                           
                              Nitraadi kontsentratsioon (mg N/liitris),
                           
                        
               
                   
               
               
                   
               
               
                  (N)
               
            
                  
                              ii)
                           
                           
                              Hapnikuekvivalent (4,57 × N × V) (mg)
                           
                        
               
                  —
               
               
                  —
               
               
                   
               
            
                  
                              iii)
                           
                           
                              Nitriti kontsentratsioon (mg N/liitris)
                           
                        
               
                   
               
               
                   
               
               
                  (N)
               
            
                  
                              iv)
                           
                           
                              Hapnikuekvivalent (3,43 × N × V) (mg)
                           
                        
               
                  —
               
               
                  —
               
               
                   
               
            
                  
                              ii + iv)
                           
                           
                              Summaarne hapnikuekvivalent
                           
                        
               
                  —
               
               
                  —
               
               
                   
               
            7.   SÜSINIKU ANALÜÜS (pole kohustuslik)
      
      Süsinikuanalüsaator:
      
                  Aeg (päevades)
               
               
                  Nullproov (mg/l)
               
               
                  Testaine mg/l
               
            
                  0
               
               
                  (Cblo)
               
               
                  (Co)
               
            
                  28 (7)
                  
               
               
                  (Cblt)
               
               
                  (Ct)
               
            
         
      8.   SPETSIIFILINE AINE (pole kohustuslik)
      
      
                  Sb
                  
               
               
                  =
               
               
                  kontsentratsioon füüsikalis-keemilises (steriilses) kontrollproovis 28 päeva möödumisel.
               
            
                  Sa
                  
               
               
                  =
               
               
                  kontsentratsioon inokuleeritud kolvis 28 päeva möödumisel.
               
            
         
      9.   ABIOOTILISE LAGUNEMISE KATSE (pole kohustuslik)
      
      
                  a
               
               
                  =
               
               
                  hapnikutarve steriilsetes kolbides 28 päeva möödumisel (mg)
               
            
         
      (vt jaotiseid 1 ja 3)
      
         
      VI OSA   KINNISE PUDELI KATSE (meetod C.4-E)
      
      VI.1.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Testaine lahus mineraalses toitelahuses, üldjuhul kontsentratsiooniga 2–5 mg/l, inokuleeritakse suhteliselt väikese arvu segapopulatsiooni mikroorganismidega ja seda hoitakse täiesti täis suletud pudelites konstantsel temperatuuril. Lagunemisprotsessi jälgitakse 28 päeva jooksul lahustunud hapniku analüüsimisega. Testaine hapnikutarve (mida on parandatud paralleelse inokulaadiga nullproovi vastava väärtuse võrra) väljendatakse protsendina ThOD-st või KHT-st.
      VI.2.   MEETODI KIRJELDUS
      VI.2.1.   Seadmed
      
                  a)
               
               
                  Klaaskorkidega BHT pudelid mahuga näiteks 250–300 ml.
               
            
                  b)
               
               
                  Vesivann või inkubaator pudelite termostateerimiseks konstantsel temperatuuril (± 1 oC või täpsem) pimedas.
               
            
                  c)
               
               
                  Suured klaaspudelid (2–5 l) lahuste valmistamiseks ja BHT pudelite täitmiseks.
               
            
                  d)
               
               
                  Hapnikuelektrood ja -mõõtur või seadmed ja reaktiivid Winkleri tiitrimiseks.
               
            VI.2.2.   Mineraalse toitelahuse valmistamine
      Põhilahuste valmistamist vt I.6.2.
      1 (üks) ml lahuseid a kuni d segatakse kokku ja täiendatakse lahjendusveega 1 liitrini.
      VI.2.3.   Inokulaadi valmistamine
      Inokulaat valmistatakse üldjuhul valdavalt olmereovett töötlevast puhastusjaamast või laborimõõdus seadmest väljuvast töödeldud reoveest. Veel üks võimalik inokulaadi allikas on pinnavesi. Üldjuhul lisatakse liitri lahuse kohta üks tilk (0,05 ml) kuni 5 ml filtraati; antud reoveele vastava optimaalse koguse määramiseks võib vaja olla eelkatseid (vt I.6.4.2 ja I.6.5).
      VI.2.4.   Kolbide ettevalmistamine
      Mineraalset toitelahust aereeritakse tugevalt vähemalt 20 minutit. Igas katseseerias tuleb kasutada ainult samast partiist pärinevat mineraalset toitelahust. Üldjuhul on lahus kasutusvalmis pärast 20tunnist katsetemperatuuril seismist. Kontrollimiseks määratakse lahustunud hapniku kontsentratsioon, mis peaks 20 oC juures olema umbes 9 mg/l. Kõik ülekande- ja täitmisoperatsioonid õhuga küllastatud toitelahusega tuleb teha mullivabalt, näiteks sifooni abil.
      Test- ja võrdlusainete uurimiseks üheaegsetes katseseeriates valmistatakse ette paralleelsed BHT pudelite rühmad. Katses kasutatakse küllaldast arvu BHT pudeleid, sealhulgas inokulaadiga nullproove, nii et soovitatavate ajavahemike, näiteks 0, 7, 14, 21 ja 28 päeva järel, saab hapnikutarvet mõõta vähemalt kahes paralleelis. Kümnepäevase akna määramiseks võib vaja olla täiendavaid pudeleid.
      Suured pudelid täidetakse põhjalikult aereeritud mineraalse toitelahusega umbes ühe kolmandiku ulatuses. Seejärel lisatakse eraldi suurtesse pudelitesse küllaldased kogused test- ja võrdlusainete põhilahuseid nii, et kemikaalide lõplik kontsentratsioon ei ületa üldjuhul 10 mg/l. Täiendavas suures pudelis olevale kemikaalivabale kontrolltoitelahusele kemikaale ei lisata.
      Et mitte piirata inokulaadi aktiivsust, ei tohi lahustunud hapniku kontsentratsioon BHT pudelites langeda alla 0,5 mg/l. Seega on testaine kontsentratsioon piiratud umbes 2 mg/l. Raskestilagunevate ja madala ThOD-ga ühendite puhul võib siiski kasutada kontsentratsiooni 5–10 mg/l. Mõningatel juhtudel võib soovitada teha paralleelseid katseseeriaid kahe erineva testaine kontsentratsiooniga, näiteks 2 ja 5 mg/l. ThOD arvutatakse üldjuhul ammooniumisoolade moodustumise põhjal, kuid kui eeldatakse nitrifikatsiooni toimumist või selle toimumine on teada, arvutatakse see nitraadi moodustumise põhjal (ThODNO3: vt II liite punkti 2). Kui nitrifikatsioon toimub, kuid ei ole täielik, parandatakse tulemust, arvestades analüütiliselt leitud nitriti ja nitraadi kontsentratsiooni muutusi (vt V liidet).
      Testaine mürgisuse uurimisel (näiteks madala biolagunduvuse tulemuse puhul) on vaja veel üht pudeliseeriat.
      Valmistatakse ette veel üks suur pudel, mis sisaldab aereeritud mineraalset toitelahust (umbes 1/3 pudeli mahust) ja ülejäänud suurte pudelitega võrdses kontsentratsioonis nii test- kui ka võrdlusainet.
      Lahused suurtes pudelites inokuleeritakse töödeldud reoveega (1 tilk ehk umbes 0,05 ml kuni 5 ml/l) või muu inokulaadi, nagu jõeveega (vt I.6.4.2). Seejärel täiendatakse lahused aereeritud mineraalse toitelahusega vajaliku mahuni, kasutades piisava segunemise saavutamiseks pudeli põhjani ulatuvat voolikut.
      VI.2.5.   Kolbide arv tüüpilises katses
      Tüüpilises katses kasutatakse järgmisi pudeleid:
      
                  —
               
               
                  vähemalt 10 pudelit testaine ja inokulaadiga (katsesuspensioon);
               
            
                  —
               
               
                  vähemalt 10 pudelit ainult inokulaadiga (inokulaadiga nullproov);
               
            
                  —
               
               
                  vähemalt 10 pudelit võrdlusaine ja inokulaadiga (protseduuri kontrollproov),
               
            
                  —
               
               
                  ning vajaduse korral 6 pudelit nii testaine, võrdlusaine kui ka inokulaadiga (mürgisuse kontrollproov). Kümnepäevase akna määramiseks võib aga vaja olla umbes kahekordset arvu pudeleid.
               
            VI.2.6.   Katse tegemine
      
      Kõik valmis lahused viiakse kohe vastavasse BHT pudelite rühma, kasutades voolikut, mille ots on BHT pudelite täielikuks täitmiseks vastava suure pudeli alumises veerandis (mitte põhjas). Õrnalt koputades eemaldatakse õhumullid. Nullhetkel määratakse kõigis pudelites Winkleri meetodi või hapnikuelektroodi abil kohe lahustunud hapnik. Proovid võib mangaan(II)sulfaadi ja naatriumhüdroksiidi (esimese Winkleri reaktiivi) abil konserveerida hilisemaks analüüsiks, kasutades Winkleri meetodit. Hoolikalt suletud pudeleid, milles hapnik on fikseeritud pruuni mangaan(III)oksiidi hüdraadina, hoitakse enne Winkleri meetodi järgmiste etappidega jätkamist pimedas 10–20 oC juures kõige rohkem 24 tundi. Ülejäänud paralleelpudelid suletakse õhumullide pudelitesse jäämise vältimiseks korgiga ja inkubeeritakse 20 oC juures pimedas. Iga katseseeriaga peab kaasnema täielik paralleelseeria inokuleeritud, testaineta toitelahuse uurimiseks. Igast seeriast võetakse 28 päeva jooksul kindlate ajavahemike järel (vähemalt kord nädalas) korraga vähemalt kaks pudelit lahustunud hapniku määramiseks.
      Nädalaste vahedega võetud proovid võimaldavad määrata kõrvaldamisprotsendi 14päevases aknas, 3–4päevaste vahedega võetud proovid võimaldavad määrata kümnepäevase akna, selleks on vaja umbes kaks korda rohkem pudeleid.
      Lämmastikku sisaldavate testainete puhul tuleb tulemustesse teha nitrifikatsiooni hapnikutarvet arvestav parandus. Selleks määratakse hapnikuelektroodi abil lahustunud hapniku kontsentratsioon ja võetakse BHT pudelist nitriti ja nitraadi analüüsiks proov. Nitriti ja nitraadi kontsentratsiooni tõusu järgi arvutatakse välja vastav hapnikutarve (vt V liidet).
      VI.3.   ANDMED JA ARUANDLUS
      VI.3.1.   Tulemuste käsitlemine
      Kõigepealt arvutatakse iga ajavahemiku BHT, lahutades testaine hapnikutarbest inokulaadiga nullproovi hapnikutarbe (mg/l). Suhtelise BHT (hapniku ja testaine masside (mg) suhte) saamiseks jagatakse parandatud hapnikutarve testaine kontsentratsiooniga (mg/l). Protsentuaalne biolagunduvus arvutatakse suhtelise BHT jagamisel suhtelise (II liite punktis 2 kirjeldatud viisil arvutatud) ThOD-ga või KHT-ga (mis on määratud analüütiliselt, vt II.3 liidet), seega:
      
         
      = hapnikutarve (mg) testaine massiühiku (mg) kohta
      
         
      või
      
         
      Tuleb märkida, et kui need kaks meetodit ei anna alati samasugust tulemust, on eelistatav kasutada viimast meetodit.
      Lämmastikku sisaldavate testainete puhul tuleb kasutada asjakohast ThOD-d (NH4 või NO3) vastavalt nitrifikatsiooni teadaolevale või eeldatavale toimumisele (II liite punkt 2). Kui nitrifikatsioon toimub, kuid ei ole täielik, arvutatakse nitrifikatsiooni hapnikutarvet arvestav parandus välja nitriti ja nitraadi kontsentratsiooni muutustest (V liide).
      VI.3.2.   Tulemuste kehtivus
      Inokulaadiga nullproovi hapnikutarve 28 päeva jooksul ei tohiks olla suurem kui 1,5 mg/l. Kui saadavad väärtused on suuremad, tuleks katsetehnika üle vaadata. Lahustunud hapniku kontsentratsioon katsepudelites ei tohiks millalgi langeda alla 0,5 mg/l. Sellised madalad hapnikusisaldused saab kehtivaks lugeda ainult juhul, kui kasutatav lahustunud hapniku määramise meetod võimaldab selliseid sisaldusi täpselt määrata.
      Vt ka punkti I.5.2.
      VI.3.3.   Aruandlus
      Vt punkti I.8.
      VI.4.   ANDMETABEL
      Järgneb andmetabeli näide.
      KINNISE PUDELI KATSE
      
                  1.
               
               
                  LABOR
               
            
                  2.
               
               
                  KATSE ALGUSKUUPÄEV
               
            3.   TESTAINE
      Nimi:
      Põhilahuse kontsentratsioon: ... mg/l
      Algkontsentratsioon pudelis: ... mg/l
      ThOD või KHT: ... O2 (mg)/testaine (mg)
      4.   INOKULAAT
      Allikas:
      Töötlus:
      Kohandamine, kui seda tehti:
      Kontsentratsioon katsesegus: ... mg/l
      5.   LAHUSTUNUD HAPNIKU MÄÄRAMINE
      Meetod: Winkler/elektrood
      
         Kolbide analüüsitulemused
      
      
                  Inkubatsiooniaeg (d)
               
               
                  Lahustunud hapnik (mg/l)
               
            
                  0
               
               
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                   
               
            
                  Nullproov (kemikaalita)
               
               
                  1
               
               
                  C1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                  C2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Keskmine
               
               
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Testaine
               
               
                  1
               
               
                  a1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                   
               
               
                  2
               
               
                  a2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Keskmine
               
               
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            Märkus. Võrdlusaine ja mürgisuse kontrollproovide jaoks võib kasutada analoogseid tabeleid.
      6.   NITRIFIKATSIOONI ARVESTAV PARANDUS (vt V liidet)
      
                  Inkubatsiooniaeg (d)
               
               
                  0
               
               
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                  n3
                  
               
            
                  
                              i)
                           
                           
                              Nitraadi kontsentratsioon (mg N/liitris)
                           
                        
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              ii)
                           
                           
                              Nitraadi kontsentratsiooni muutus (mg N/liitris)
                           
                        
               
                  —
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              iii)
                           
                           
                              Hapnikuekvivalent (mg/l)
                           
                        
               
                  —
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              iv)
                           
                           
                              Nitriti kontsentratsioon (mg N/liitris)
                           
                        
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              v)
                           
                           
                              Nitriti kontsentratsiooni muutus (mg N/liitris)
                           
                        
               
                  —
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              vi)
                           
                           
                              Hapnikuekvivalent (mg/l)
                           
                        
               
                  —
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              iii + vi)
                           
                           
                              Summaarne hapnikuekvivalent (mg/l)
                           
                        
               
                  —
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            7.   LAHUSTUNUD HAPNIKU TARBIMINE: LAGUNEMISPROTSENT
      
                   
               
               
                  Tarbimine n päeva pärast (mg/l)
               
            
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                  n3
                  
               
               
                   
               
            
                  1. KOLB: (mto – mtx) – (mbo – mbx)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2. KOLB: (mto – mtx) – (mbo – mbx)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  1. KOLB:
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2. KOLB:
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            keskmine %D (8) = 
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  mto
                  
               
               
                  =
               
               
                  väärtus katsekolvis ajahetkel 0
               
            
                  mtx
                  
               
               
                  =
               
               
                  väärtus katsekolvis ajahetkel x
               
            
                  mb0
                  
               
               
                  =
               
               
                  nullproovi keskmine väärtus ajahetkel 0
               
            
                  mbx
                  
               
               
                  =
               
               
                  nullproovi keskmine väärtus ajahetkel x
               
            Teha tuleb ka nitrifikatsiooni arvestav parandus jaotise 6 punktist iii + vi.
      8.   LAHUSTUNUD HAPNIKU TARBIMINE NULLPROOVIDES
      Nullproovi hapnikutarve: (mb0 – mb28) mg/l. Nullproovi hapnikutarve on oluline katse kehtivuse seisukohalt. See peaks olema alla 1,5 mg/l.
      VII OSA   MITI KATSE (meetod C.4-F)
      
      VII.1.   PÕHIMÕTE
      28 päeva kestel mõõdetakse automaatselt pimedas, suletud respiromeetris 25 ± 1 oC juures oleva, pidevalt segatava, testainest ja mineraalsest toitelahusest koosneva, spetsiaalselt kasvatatud, adapteerimata mikroorganismidega inokuleeritud lahuse või suspensiooni hapnikutarvet. Tekkinud süsinikdioksiid absorbeeritakse naatronlubjaga. Biolagunduvust väljendatakse nullproovi hapnikutarbe võrra parandatud hapnikutarbe protsendina teoreetilisest hapnikutarbest (ThOD). Lisaks arvutatakse inkubeerimise algul ja lõpul tehtava täiendava keemilise analüüsi ja soovi korral ka DOC analüüsi põhjal esmase biolagundumise määr.
      VII.2.   MEETODI KIRJELDUS
      VII.2.1.   Seadmed
      
                  a)
               
               
                  Automaatne elektrolüütiline BHT mõõtur või respiromeeter, tavaliselt kuue 300 ml pudeliga ja topsidega CO2 absorbendi jaoks.
               
            
                  b)
               
               
                  Püsiva temperatuuriga ruum ja/või veevann temperatuuriga 25 oC, lubatava kõikumisega ± 1 oC või alla selle.
               
            
                  c)
               
               
                  Membraanfiltratsiooni seade (pole kohustuslik).
               
            
                  d)
               
               
                  Süsinikuanalüsaator (pole kohustuslik).
               
            VII.2.2.   Mineraalse toitelahuse valmistamine
      Analüüsipuhastest reaktiividest ja veest (1.6.1) valmistatakse järgmised põhilahused:
      
                  a)
               
               
                  Kaaliumdivesinikfosfaat, KH2PO4
                  
               
               
                  8,50 g
               
            
                  Dikaaliumvesinikfosfaat, K2HPO4
                  
               
               
                  21,75 g
               
            
                  Dinaatriumvesinikfosfaatdodekahüdraat, Na2HPO4 · 12H2O
               
               
                  44,60 g
               
            
                  Ammooniumkloriid, NH4Cl
               
               
                  1,70 g
               
            
                  Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini
               
               
                   
               
            
                  Lahuse pH peaks olema 7,2
               
               
                   
               
            
                  b)
               
               
                  Magneesiumsulfaatheptahüdraat, MgSO4 · 7H2O
               
               
                  22,50 g
               
            
                  Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini
               
               
                   
               
            
                  c)
               
               
                  Veevaba kaltsiumkloriid, CaCl2
                  
               
               
                  27,50 g
               
            
                  Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini
               
               
                   
               
            
                  d)
               
               
                  Raud(III)kloriidheksahüdraat, FeCl3 · 6 H2O
               
               
                  0,25 g
               
            
                  Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini
               
               
                   
               
            3 ml igast lahusest a kuni d segatakse kokku ja täiendatakse 1 liitrini.
      VII.2.3.   Inokulaadi valmistamine
      Võetakse värsked proovid vähemalt kümnest kohast, peamiselt piirkondadest, kus kasutatakse ja kuhu suunatakse mitmesuguseid kemikaale. Üheliitrised muda, pindmise mullakihi, vee- jms proovid võetakse näiteks olme- ja tööstusliku heitvee puhastitest, jõgedest, järvedest ja meredest ning segatakse need hoolikalt kokku. Pärast hõljumi kõrvaldamist ja mõningast seismist viiakse supernatandi pH naatriumhüdroksiidi või fosforhappe abil väärtuseni 7 ± 1.
      Sobiva koguse filtritud supernatandiga täidetakse edaspidi regulaarselt täidetav ja osaliselt tühjendatav aktiivmuda anum ja vedelikku aereeritakse umbes 23,5 tundi. 30 minutit pärast aereerimise lõppu kõrvaldatakse umbes kolmandik supernatandist ja lisatakse settinud materjalile samas mahus lahust (pH 7), mis sisaldab 0,1 % glükoosi, 0,1 % peptooni ja kaaliumdivesinikfosfaati, ning jätkatakse aereerimist. Protseduuri korratakse iga päev. Mudareservuaari tuleb käidelda hea tava kohaselt: väljavool peab olema selge, temperatuur peaks olema 25 ± 2 oC, pH peaks olema 7 ± 1, muda peaks hästi settima, aeratsioon peaks segu pideva aeroobsuse tagamiseks olema küllaldane, segu peaks sisaldama algloomi ning muda aktiivsust võrdlusaine suhtes tuleks kontrollida vähemalt iga kolme kuu tagant. Muda võib inokulaadina kasutada pärast vähemalt ühekuulist töötlemist, aga hiljemalt nelja kuu pärast. Seejärel võetakse regulaarsete vaheaegade järel vähemalt kord kolme kuu jooksul jälle vähemalt kümnest paigast eespool kirjeldatud proovid.
      Et tagada värske ja vana muda ühesugune aktiivsus, segatakse kasutuses oleva aktiivmuda filtritud supernatant võrdsetes kogustes vahetult enne kogutud kümne allika segu filtritud supernatandiga ja kultiveeritakse saadud segu eespool kirjeldatud moel. Inokulaadiks võetakse muda 18–24 t pärast selle söötmist.
      VII.2.4.   Kolbide ettevalmistamine
      Valmistatakse ette järgmised kuus kolbi:
      nr 1: testaine lahjendusvees, kontsentratsioonis 100 mg/l;
      nr 2, 3 ja 4: testaine mineraalses toitelahuses, kontsentratsioonis 100 mg/1;
      nr 5: võrdlusaine (nt aniliin) mineraalses toitelahuses, kontsentratsioonis 100 mg/l;
      nr 6: ainult mineraalne toitelahus.
      Vähelahustuvad testained lisatakse massi või mahu järgi otse katsesegusse või käsitsetakse neid 3. liites kirjeldatud moel, kuid lahusteid ega emulgaatoreid kasutada ei tohiks. Kõikidele kolbidele lisatakse vastavasse topsi CO2 absorbent. pH kolbides nr 2, 3 ja 4 viiakse väärtuseni 7,0.
      VII.2.5.   Katse tegemine
      Kolvid nr 2, 3 ja 4 (katsesuspensioonid), nr 5 (inokulaadi aktiivsuse kontrollproov) ja nr 6 (inokulaadiga nullproov) inokuleeritakse sellise väikese koguse inokulaadiga, et hõljumi kontsentratsioon segus oleks 30 mg/l. Abiootilist kontrollproovi kolvis nr 1 ei inokuleerita. Katseaparatuur pannakse kokku, kontrollitakse seadme hermeetilisust, käivitatakse segajad ja alustatakse pimeduses hapnikutarbe mõõtmist. Iga päev kontrollitakse temperatuuri, segajaid ja kulonomeetrilist hapnikutarbe meerikut ning märgitakse üles kõik kolbide sisu värvuse muutused. Sobival moel, näiteks kuue kanaliga meeriku abil jälgitakse vahetult kõigi kolbide BHT-d. Inkubatsiooniperioodi lõpus, tavaliselt 28 päeva möödumisel, mõõdetakse kolbide pH ja määratakse testaine jääkkontsentratsioon, kõigi vaheühendite kontsentratsioonid ja vees lahustuva ühendi puhul DOC kontsentratsioon (II.4 liide). Lenduvate kemikaalide puhul tuleb olla eriti hoolikas. Kui eeldatakse nitrifikatsiooni toimumist, mõõdetakse võimaluse korral nitriti ja nitraadi kontsentratsioon.
      VII.3.   ANDMED JA ARUANDLUS
      VII.3.1.   Tulemuste käsitlemine
      Testaine hapnikutarve (mg) kindla aja möödumisel (millest on lahutatud inokulaadiga nullproovi vastav näitaja sama aja kohta) jagatakse kasutatud testaine massiga. Nii saadakse BHT väärtus, mis on väljendatud hapniku massina (mg) testaine massi (mg) suhtes, st:
      
         
      = hapnikutarve (mg)/testaine (mg).
      Biolagundumise protsent arvutatakse seejärel valemist:
      
         
      Segude puhul arvutatakse ThOD elementanalüüsi tulemuste põhjal, käsitledes segu ühendina. Kasutada tuleb asjakohast ThOD-d (ThODNH4 või ThODNO3) vastavalt nitrifikatsiooni toimumisele või mittetoimumisele (II liite punkt 2). Kui nitrifikatsioon toimub, kuid ei ole täielik, tehakse nitrifikatsiooni hapnikutarvet arvestav parandus, mis arvutatakse välja nitriti ja nitraadi kontsentratsiooni muutustest (V liide).
      Spetsiifilise (lähte-)aine kao järgi arvutatakse esmase biolagundumise protsent (vt I.7.2).
      
         
      Kui testaine sisaldus füüsikalis-keemilist kadu mõõtvas kolvis nr 1 on vähenenud, registreeritakse see ja selles kolvis (Sb) oleva testaine kontsentratsiooni kasutatakse 28 päeva möödumisel biolagundumise protsendi arvutamisel.
      DOC analüüside (pole kohustuslik) tegemisel arvutatakse biolagundumise protsent valemist:
      
         
      vastavalt kirjeldusele punktis I.7.1. Kui DOC sisaldus füüsikalis-keemilist kadu mõõtvas kolvis nr 1 on vähenenud, kasutatakse DOC kontsentratsiooni selles kolvis biolagundumise protsendi arvutamisel.
      Kõik tulemused registreeritakse etteantud andmetabelis.
      VII.3.2.   Tulemuste kehtivus
      Inokulaadiga nullproovi hapnikutarve 28 päeva jooksul on üldjuhul 20–30 mg O2/l ega tohiks ületada 60 mg/l. Kui saadavad väärtused on suuremad kui 60 mg/l, tuleks andmed ja katsetehnika kriitiliselt üle vaadata. Kui pH jääb väljapoole vahemikku 6–8,5 ja testaine hapnikutarve on alla 60 %, tuleks katset testaine madalama kontsentratsiooniga korrata.
      Vt ka punkti I.5.2.
      Kui hapnikutarbe põhjal arvutatud aniliini lagunemisprotsent ei ole 7 päeva jooksul suurem kui 40 % ja 14 päeva jooksul suurem kui 65 %, loetakse katse tühiseks.
      VII.3.3.   Aruandlus
      Vt punkti I.8.
      VII.4.   ANDMETABEL
      Järgneb andmetabeli näide.
      MITI (I) KATSE
      
                  1.
               
               
                  LABOR
               
            
                  2.
               
               
                  KATSE ALGUSKUUPÄEV
               
            3.   TESTAINE
      Nimi:
      Põhilahuse kontsentratsioon: ... (kemikaali sisaldus, mg/l)
      Algkontsentratsioon toitelahuses, C0: ... (kemikaali sisaldus, mg/l
      Katsesegu maht, V: … ml
      ThOD: ... mg O2/l
      4.   INOKULAAT
      Mudavõtukohad:
      
                  
                              1)
                           
                           
                              …
                           
                        
               
                  
                              6)
                           
                           
                              …
                           
                        
            
                  
                              2)
                           
                           
                              …
                           
                        
               
                  
                              7)
                           
                           
                              …
                           
                        
            
                  
                              3)
                           
                           
                              …
                           
                        
               
                  
                              8)
                           
                           
                              …
                           
                        
            
                  
                              4)
                           
                           
                              …
                           
                        
               
                  
                              9)
                           
                           
                              …
                           
                        
            
                  
                              5)
                           
                           
                              …
                           
                        
               
                  
                              10)
                           
                           
                              …
                           
                        
            Hõljumi kontsentratsioon aktiivmudas pärast sünteetilise reoveega aklimatiseerimist = ... mg/l
      Aktiivmuda maht liitri lõpliku lahuse kohta = ... ml
      Muda kontsentratsioon lõplikus lahuses = ... mg/l
      5.   HAPNIKUTARVE: BIOLAGUNDUVUS
      Kasutatava respiromeetri tüüp:
      
                   
               
               
                  Aeg (päevades)
               
            
                  0
               
               
                  7
               
               
                  14
               
               
                  21
               
               
                  28
               
            
                  Hapnikutarve (mg), testaine
               
               
                  a1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a3
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Hapnikutarve (mg), nullproov
               
               
                  b
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Parandatud hapnikutarve (mg)
               
               
                  (a1 – b1)
                  (a1 – b1)
                  (a1 – b1)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  BHT mg testaine kohta
               
               
                  
                     
               
               
                  1. kolb
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2. kolb
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  3. kolb
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Lagunemisprotsent
                  BOD/ThOD × 100
                  
                     
               
               
                   
               
               
                  1
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  3
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Keskmine (9)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            NB: Võrdlusaine jaoks võib kasutada analoogseid tabeleid.
      6.   SÜSINIKU ANALÜÜS (pole kohustuslik)
      
      Süsinikuanalüsaator:
      
                  Kolb
               
               
                  DOC
               
               
                  DOC kõrvaldamisprotsent
               
               
                  Keskmine
               
            
                  Mõõdetud
               
               
                  Parandatud
               
            
                  Vesi + testaine
               
               
                  a
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  —
               
               
                  —
               
            
                  Muda + testaine
               
               
                  b1
                  
               
               
                   
               
               
                  b1–c
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Muda + testaine
               
               
                  b2
                  
               
               
                   
               
               
                  b2–c
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Muda + testaine
               
               
                  b3
                  
               
               
                   
               
               
                  b3–c
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Testaineta kontrollproov
               
               
                  c
               
               
                   
               
               
                  —
               
               
                   
               
               
                  —
               
               
                  —
               
            
         
      7.   SPETSIIFILISE KEEMILISE ANALÜÜSI ANDMED
      
                   
               
               
                  Testaine jääk katse lõpus
               
               
                  Lagunemisprotsent
               
            
                  Nullproov veega
               
               
                  Sb
                  
               
               
                   
               
            
                  Inokuleeritud toitelahus
               
               
                  Sa1
                  
               
               
                   
               
            
                  Sa2
                  
               
               
                   
               
            
                  Sa3
                  
               
               
                   
               
            
         
      Lagunemisprotsent arvutatakse kolbide a, a2 ja a3 puhul.
      8.   MÄRKUSED
      Lisada tuleks BHT kõver ajas, kui see koostati.
      
         I liide
         LÜHENDID JA MÕISTED
         
                     DO
                  
                  
                     :
                  
                  
                     lahustunud hapnik (mg/l) on vesikeskkonnaga proovis lahustunud hapniku kontsentratsioon.
                  
               
                     BHT
                  
                  
                     :
                  
                  
                     bioloogiline hapnikutarve (g) on mikroorganismide poolt testaine metaboliseerimisel tarvitatud hapniku kogus, väljendatakse ka hapnikutarbe (g) ja katseühendi massi (g) suhtena (vt meetodit C.5).
                  
               
                     KHT
                  
                  
                     :
                  
                  
                     keemiline hapnikutarve (g) on testaine oksüdeerimisel kuuma happelise dikromaadiga tarvitatud hapniku kogus, näitab oksüdeeritava materjali sisaldust; väljendatakse ka hapnikutarbe (g) ja katseühendi massi (g) suhtena (vt meetodit C.6).
                  
               
                     DOC
                  
                  
                     :
                  
                  
                     lahustunud orgaaniline süsinik on lahuses olev süsinik, mis läbib 0,45 μm filtri või jääb supernatanti 15minutilisel tsentrifuugimisel 40 000 m/s–2 (±4 000 g) juures.
                  
               
                     ThOD
                  
                  
                     :
                  
                  
                     teoreetiline hapnikutarve (mg) on aine täielikuks oksüdeerimiseks vajalik hapnikukogus; arvutatakse brutovalemi järgi (vt II liite punkti 2) ning väljendatakse ka hapnikutarbe (g) ja katseühendi massi (g) suhtena.
                  
               
                     ThCO2
                     
                  
                  
                     :
                  
                  
                     teoreetiline süsinikdioksiid (mg) on arvutuslik süsinikdioksiidi kogus, mis tekib katseühendi teadaolevast või määratud süsinikusisaldusest katseühendi täielikul mineraliseerumisel; väljendatakse ka mg katseühendi kohta eraldunud süsinikdioksiidi kogusena (mg).
                  
               
                     TOC
                  
                  
                     :
                  
                  
                     proovi kogu orgaaniline süsinik on lahuses ja suspensioonis oleva orgaanilise süsiniku sisalduse summa.
                  
               
                     IC
                  
                  
                     :
                  
                  
                     anorgaaniline süsinik.
                  
               
                     TC
                  
                  
                     :
                  
                  
                     üldsüsinik on proovis oleva orgaanilise ja anorgaanilise süsiniku summa.
                  
               Esmane biolagundumine:
         bioloogilisest toimest tingitud muutus aine keemilises struktuuris, mille tulemusel see aine kaotab mingi spetsiifilise omaduse.
         Lõplik biolagundumine (aeroobne):
         lagunemise määr, mille puhul mikroorganismid on katseühendi täielikult ära tarvitanud ja muutnud selle süsinikdioksiidiks, veeks, mineraalsooladeks ja uute mikroobsete rakkude osaks (biomassiks).
         Bioloogiliselt kergesti lagunduv.
         teatavad kindlaksmääratud lõpliku biolagunduvuse sõelkatsed läbinud kemikaalide rangelt määratlemata klassifikatsioon; need katsed on nii ranged, et võib eeldada, et veekeskkonnas aeroobsetes tingimustes biolagunduvad need ühendid kiiresti ja täielikult.
         Potentsiaalselt biolagunduv:
         klassifikatsioon kemikaalide puhul, mille (esmase või lõpliku) biolagunduvuse kohta mis tahes tunnustatud biolagunduvuse katses on kindlaid tõendeid.
         Biotöödeldavus:
         ühendite kõrvaldatavus biopuhastusjaamades, rikkumata puhastusprotsesside normaalset käiku. Üldjuhul on bioloogiliselt kergesti lagunduvad ühendid biotöödeldavad, samal ajal kui kõik potentsiaalselt biolagunduvad ühendid ei ole biotöödeldavad. Toimida võivad ka abiootilised protsessid.
         Ooteaeg:
         kõrvaldamiskatses ajavahemik inokulatsioonist kuni hetkeni, kus lagunemine on jõudnud vähemalt 10 %ni. Ooteaja pikkus võib olla väga erinev ja halvasti reprodutseeritav.
         Lagunemisaeg:
         aeg ooteaja lõpust hetkeni, mil on saavutatud 90 % maksimaalsest lagunemisest.
         Kümnepäevane aken
         on 10 % lagunemise saavutamisele vahetult järgnevad kümme päeva.
      
      
         2. liide
         SOBIVATE SUMMAARSETE PARAMEETRITE ARVUTAMINE JA MÄÄRAMINE
         Olenevalt valitud meetodist on vajalikud teatavad summaarsed parameetrid. Järgmine jaotis kirjeldab nende väärtuste leidmist. Nende parameetrite kasutamist on kirjeldatud üksikute meetodite juures.
         1.   Süsinikusisaldus
         Süsinikusisaldus arvutatakse testaine teadaoleva elemendilise koostise põhjal või määratakse elementanalüüsil.
         2.   Teoreetiline hapnikutarve (ThOD)
         Teoreetilise hapnikutarbe (ThOD) saab arvutada siis, kui elemendiline koostis on teada või määratakse elementanalüüsil. Järgmise ühendi puhul:
         CcHhClclNnNanaOoPpSs
         
         on see nitrifikatsiooni mitteesinemisel
         
            mg/mg
         ja nitrifikatsiooni esinemisel
         
             mg/mg
         3.   Keemiline hapnikutarve (KHT)
         Keemiline hapnikutarve (KHT) määratakse meetodi C.6 kohaselt.
         4.   Lahustunud orgaaniline süsinik (DOC)
         Lahustunud orgaaniline süsinik (DOC) on määratletud kui mis tahes vees oleva, 0,45 μm filtrit läbiva aine või segu koostises olev orgaaniline süsinik.
         Katseanumatest võetakse proovid ja filtritakse kohe sobiva membraanfiltriga filtrimisseadmes. Esimesed 20 ml filtraati (väikeste filtrite kasutamisel võib kogust vähendada) jäetakse kõrvale. 10–20 ml või süstimisel väiksemad kogused (maht sõltub süsinikuanalüsaatori jaoks vajalikust kogusest) jäetakse süsiniku analüüsimiseks alles. DOC kontsentratsioon määratakse orgaanilise süsiniku analüsaatori abil, mis suudab täpselt mõõta süsiniku kontsentratsiooni, mis on 10 % DOC kontsentratsioonist katse alguses või sellest madalam.
         Filtritud proove, mida ei saa analüüsida samal tööpäeval, võib säilitada külmikus 2–4 °C juures kuni neli tundi või pikaajalisemal säilitamisel alla –18 °C juures.
         Märkused:
         Membraanfiltrid on sageli hüdrofiilsuse suurendamiseks immutatud pindaktiivsete ainetega. Seega võib filter sisaldada mitu mg lahustuvat orgaanilist süsinikku, mis segaks biolagunduvuse määramist. Pindaktiivsed ained ja muud lahustuvad orgaanilised ühendid kõrvaldatakse filtritest kolme tunniajase keetmisega deioniseeritud vees. Filtreid võib seejärel nädal aega vees hoida. Ühekordse filterpadruni kasutamisel tuleb iga partii puhul kontrollida, et see ei eralda lahustuvat orgaanilist süsinikku.
         Olenevalt membraanfiltri tüübist võib testaine sellel adsorbeeruda. Seetõttu on soovitatav veenduda, et testainet filtrisse ei jää.
         DOC eristamisel TOCst võib filtrimise asemel kasutada 15minutilist tsentrifuugimist 40 000 m/s–2 (4 000 g) juures. Kui DOC algkontsentratsioon on alla 10 mg/l, ei ole see meetod usaldusväärne, kuna kõiki baktereid ei kõrvaldata või lahustatakse osa süsinikust bakteriplasmas.
         KIRJANDUS
         
                     —
                  
                  
                     Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, P 65.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Wagner, R., Von Wasser, 1976, vol. 46, 139.
                  
               
                     —
                  
                  
                     DIN-Entwurf 388 409 Teil 41 – Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammunter-chlammunter-suchung, Summarische Wirkungs- and Stoffkenngr6Ben (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuβormenausschuβ Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut fürür Normung e.V.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984,984, vol 133 (1), 169.
                  
               
      
         3. liide
         VÄHELAHUSTUVATE AINETE BIOLAGUNDUVUSE HINDAMINE
         Biolagunduvuse katsetes vähelahustuvate ainetega tuleks erilist tähelepanu pöörata järgmistele asjaoludele.
         Sellal kui homogeensed vedelikud tekitavad proovi võtmisel harva probleeme, on soovitatav tahked ained sobival moel homogeniseerida, et vältida mittehomogeensusest tingitud vigu. Eriti hoolikas tuleb olla siis, kui on vaja mõnemilligrammiseid proove suure lisandite sisaldusega segudest või ainetest.
         Katsete käigus võib kasutada mitmesuguseid loksutamisviise. Loksutada tuleks ainult aine dispergeerituna hoidmiseks vajalikul määral, vältides hoolikalt ülekuumutamist, liigset vahutamist ja liigseid nihkejõude.
         Kasutada võib emulgaatorit, mille abil saadakse ainest stabiilne dispersioon. Emulgaator ei tohiks olla bakteritele mürgine ega olla katse tingimustel biolagunduv või vahtu tekitav.
         Lahustitele kehtivad samad nõuded nagu emulgaatoritele.
         Tahkete testainete puhul ei ole tahkeid kandjaid soovitatav kasutada, küll aga võivad need olla sobivad õlitaoliste ainete puhul.
         Abiainete, nagu emulgaatorite, lahustite ja kandjate kasutamisel tuleks teha nullproov abiainega.
         Vähelahustuvate ühendite biolagunduvuse uurimiseks sobivad respiromeetrilistest katsetest nii CO2, BHT kui ka MITI katse.
         KIRJANDUS
         
                     —
                  
                  
                     de Morsier, A. et al., Biodegradation tests for poorly soluble compounds. Chemosphere, 1987, vol. 16, 833.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Gerike, P., The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.
                  
               
      
         IV liide
         INOKULAADI SUHTES OLETATAVALT MÜRGISTE AINETE BIOLAGUNDUVUSE HINDAMINE
         Kui aine osutub kohese biolagunduvuse katses näiliselt mittelagunevaks, on inhibeerivuse ja inertsuse eristamise vajaduse korral soovitatav kasutada järgmist meetodit (Reynolds jt, 1987).
         Mürgisuse ja biolagunduvuse katsetes tuleks kasutada samasuguseid või identseid inokulaate.
         Kohese biolagunduvuse katsetes uuritud ainete mürgisuse hindamiseks peaks sobima muda hapnikutarbe inhibeerimise (aktiivmuda hapnikutarbe inhibeerimiskatse – direktiiv 88/302/EMÜ), BHT ja/või kasvu pidurdumise meetodid või nende kombinatsioon.
         Kui mürgisusest tulenevat inhibeerumist soovitakse vältida, on kohese biolagunduvuse katsetes soovitatav kasutada testaine kontsentratsioone, mis on väiksemad kui 1/10 mürgisuse katsetes leitud EC50 väärtustest (ehk väiksemad kui EC20 väärtused). Ühendite puhul, mille EC50 on kõrgem kui 300 mg/l, kohese biolagunduvuse katsetes tõenäoliselt mürgist mõju ei ilmne.
         EC50 väärtused alla 20 mg/l tekitavad järgnevates katsetes eeldatavalt tõsiseid probleeme. Kasutada tuleks madalaid katsekontsentratsioone, mistõttu tuleb kasutada ranget ja tundlikku kinnise pudeli katset või 14C-märgistatud materjali. Aklimatiseerunud inokulaat võib võimaldada kasutada testaine kõrgemaid kontsentratsioone. Viimasel juhul ei ole aga täidetud kohese biolagunduvuse katse konkreetne kriteerium.
         KIRJANDUS
         Reynolds, L. et al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere, 1987, vol. 16, 2259.
      
      
         V Liide
         NITRIFIKATSIOONI HAPNIKUTARVET ARVESTAV PARANDUS
         Lämmastikku mittesisaldavate testainete puhul on nitrifikatsiooni arvestamatajätmisest tingitud viga testainete biolagundumise hapnikutarbe hindamisel tühine (ei ületa 5 %), isegi kui toitelahuse ammoniakaalse lämmastiku oksüdatsioon toimub ebaühtlaselt, näiteks erinevustega testainega pudelite ja nullproovidega anumate vahel. Lämmastikku sisaldavate testainete puhul võivad aga ilmneda tõsised vead.
         Kui nitrifikatsioon on toimunud, kuid ei ole täielik, võib nitriti ja nitraadi kontsentratsiooni muutuste määramisel parandada segu mõõdetud hapnikutarvet järgmiste valemite põhjal ammooniumiooni nitritiks ja nitraadiks oksüdeerimisel kuluva hapnikukoguse võrra:
         
                     2 NH4Cl + 3 O2 = 2 HNO2 + 2 HCI + 2 H2O
                  
                  
                     (1)
                  
               
                     2 HNO2 + O2 = 2 HNO3
                     
                  
                  
                     (2)
                  
               
                     Summaarselt:
                  
                  
                      
                  
               
                     2 HN4Cl + 4 O2 = 2 HNO3 + 2 HCl + 2 H2O
                  
                  
                     (3)
                  
               Valemi 1 põhjal kulub ammooniumkloriidi (NH4Cl) koosseisus oleva 28 g lämmastiku oksüdeerimisel nitritiks 96 g hapnikku, st vastav teisendustegur on 3,43 (96/28). Samamoodi kulub valemi 3 põhjal 28 g lämmastiku oksüdeerimisel nitraadiks 128 g hapnikku, st vastav teisendustegur on 4,57 (128/28).
         Kuna need reaktsioonid on järjestikused ja neid viivad läbi erinevad bakteriliigid, võib nitriti kontsentratsioon nii väheneda kui ka suureneda; viimasel juhul tekib vastav kogus nitraati. Seega on nitraadi tekkel kuluv hapnikukogus 4,57kordne nitraadi kontsentratsiooni tõusuga võrreldes, sellal kui nitriti tekkel kuluv hapnikukogus on 3,43kordne nitriti kontsentratsiooni tõusuga võrreldes ning nitriti kontsentratsiooni vähenemisega seotud hapnikukadu –3,43kordne nitriti kontsentratsiooni vähenemisega võrreldes.
         Seega:
         
                     O2 kulu nitraadi tekkel = 4,57 x nitraadi kontsentratsiooni tõus
                  
                  
                     (4)
                  
               
                     ja
                  
                  
                      
                  
               
                     O2 kulu nitriti tekkel = 3,43 x nitriti kontsentratsiooni tõus
                  
                  
                     (5)
                  
               
                     ja
                  
                  
                      
                  
               
                     O2 kadu nitriti kadumisel = –3,43 x nitriti kontsentratsiooni vähenemine
                  
                  
                     (6)
                  
               
                     Seega
                  
                  
                      
                  
               
                     O2 kulu nitrifikatsioonil = ±3,43 x nitriti kontsentratsiooni muutus +4,57 x nitraadi kontsentratsiooni tõus
                  
                  
                     (7)
                  
               
                     ja seega
                  
                  
                      
                  
               
                     O2 kulu süsiniku oksüdeerimisel = vaadeldud kogutarve – nitrifikatsioonist tingitud tarve
                  
                  
                     (8)
                  
               Ainult summaarse oksüdeeritud lämmastiku hulga määramisel võib nitrifikatsioonist tingitud hapnikutarbe lugeda esimeses lähenduses oksüdeeritud lämmastiku hulgaga võrreldes 4,57kordseks.
         Süsiniku oksüdeerimise hapnikutarbe parandatud väärtust võrreldakse seejärel 2. liite kohaselt arvutatud ThODNH3 väärtusega.
      
      C.5.   LAGUNEMINE – BIOKEEMILINE HAPNIKUTARVE
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesoleva meetodi abil mõõdetakse tahkete või vedelate orgaaniliste ainete bioloogilist hapnikutarvet (BHT).
      Katses leitud andmed kehtivad vees lahustuvate ühendite puhul; siiski võib vähemalt põhimõtteliselt uurida ka lenduvaid ja vees vähelahustuvaid ühendeid.
      Meetod on kohaldatav ainult sellistele uuritavatele orgaanilistele katsematerjalidele, mis ei mõju katses kasutatavatel kontsentratsioonidel bakteritele inhibeerivalt. Kui uuritav materjal katsekontsentratsioonil ei lahustu, võib selle hea dispergeerituse saavutamiseks vaja olla erimeetmeid, näiteks ultrahelidispergeerimist.
      Madalate biolagunduvuse väärtuste tõlgendamisel ja sobivate katsekontsentratsioonide valikul võivad kasulikud olla andmed uuritava kemikaali mürgisuse kohta.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      BHT määratletakse kindla koguse aine lahuse ettenähtud tingimustel biokeemiliseks oksüdeerimiseks vajaliku lahustunud hapniku massina.
      Tulemused väljendatakse grammides grammi testaine kohta.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Soovitatav on kontrollida inokulaadi aktiivsust sobiva võrdlusaine abil.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Kindel kogus sobivas hästi aereeritud lahuses lahustatud või dispergeeritud ainet inokuleeritakse mikroorganismidega ja inkubeeritakse pimedas kindlaksmääratud konstantse temperatuuriga ruumis.
      BHT määratakse lahustunud hapniku sisalduse vahe järgi katse algul ja lõpul. Katse kestus peab olema vähemalt viis ja mitte rohkem kui 28 päeva.
      Paralleelselt tuleb teha testaineta nullproov.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      BHT määramist ei saa lugeda aine usaldusväärseks biolagunduvuse määramise meetodiks. Meetod sobib kasutamiseks ainult sõelkatsena.
      1.6.   MEETODI KIRJELDUS
      Ainest valmistatakse lähtelahus või dispersioon, mille BHT sobiks kasutatava meetodiga. Seejärel määratakse mis tahes siseriikliku või rahvusvahelise standardmeetodi abil BHT.
      2.   ANDMED JA HINDAMINE
      Lähtelahuse BHT arvutatakse vastavalt valitud standarditud meetodile ja väljendatakse grammides grammi testaine kohta.
      3.   ARUANDLUS
      Ära tuleb märkida kasutatud meetod.
      Bioloogilise hapnikutarbena esitatakse vähemalt kolme nõuetekohase mõõtmise keskmine tulemus.
      Registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti aine lisandeid, füüsikalist olekut, mürgisust ja koostist käsitlevad andmed ja märkused.
      Kui bioloogilise nitrifikatsiooni pidurdamiseks kasutatakse lisaainet, tuleb see ära märkida.
      4.   VIITED
      
      Näitlike standardmeetodite nimekiri:
      
                   
               
               
                  NF T 90 – 103: Determination of the biochemical oxygen demand.
               
            
                   
               
               
                  NBN 407: Biochemical oxygen demand.
               
            
                   
               
               
                  NEN 32355.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik (BZV).
               
            
                   
               
               
                  The determination of biochemical oxygen demand, Methods for the examination of water and associated materials, HMSO, London.
               
            
                   
               
               
                  ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n days.
               
            C.6.   LAGUNEMINE – KEEMILINE HAPNIKUTARVE
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesoleva meetodi abil mõõdetakse valitud standarditud, kindlaksmääratud laboritingimustel tahkete või vedelate orgaaniliste ainete keemilist hapnikutarvet (KHT).
      Katse tegemisel ja saadud tulemuste tõlgendamisel on kasulik teada aine struktuuri (nt orgaaniline halogeniidsool, orgaaniline Fe++ sool, kloororgaaniline ühend).
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Keemiline hapnikutarve iseloomustab aine oksüdeeritavust ja seda väljendatakse kindlaksmääratud laboritingimustel aine oksüdeerimiseks kulunud oksüdeerija kogusele vastava hapniku kogusena.
      Tulemused väljendatakse grammides grammi testaine kohta.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks kasutada peamiselt meetodi kaliibrimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Kindlaksmääratud kogust vees lahustatud või dispergeeritud ainet oksüdeeritakse kahe tunni jooksul tagasijooksuga kuumutamisel kaaliumdikromaadiga kontsentreeritud väävelhappes, hõbesulfaatkatalüsaatori juuresolekul. Dikromaadi jääk määratakse raud(II)ammooniumsulfaadi standardlahusega tiitrimisel.
      Kloori sisaldavate ühendite puhul lisatakse kloori segava mõju vähendamiseks elavhõbesulfaati (10).
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Rangelt määratlemata määramismeetodi tõttu on KHT „oksüdeeritavuse näitaja” ja on sellisena praktiline meetod orgaanilise aine sisalduse määramiseks.
      Katset võib segada kloorisisaldus; KHT määramist võivad segada ka anorgaanilised redutseerijad ja oksüdeerijad.
      Mõned tsüklilised ühendid ja paljud lenduvad ained (nt madalamad rasvhapped) ei oksüdeeru selles katses täielikult.
      1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      Ainest valmistatakse lähtelahus või -dispersioon, mille KHT jääb vahemikku 250–600 mg/l.
      
         Märkused
      
      Vähelahustuvate või mittedispergeeruvate ainete puhul võib kaaluda 5 mg KHT-le vastava koguse peenestatud ainet või vedelikku ja viia selle koos veega katseseadmesse.
      Sageli ja eriti vähelahustuvate ainete puhul määratakse KHT meetodi ühe variatsiooni kohaselt, st suletud rõhuühtlustajaga süsteemis (H. Kelkenberg, 1975). Selle modifitseeritud meetodi abil saab edukalt uurida ka tavameetodi abil raskesti uuritavaid aineid, nt äädikhapet. Püridiiniga see meetod aga ei toimi. Kui kaaliumdikromaadi kontsentratsioon viiakse viite 1 kohaselt väärtuseni 0,0416 M (0,25 N), võimaldab see 5–10 mg ainet otse sisse kaaluda, mis on vees vähelahustuvate ainete KHT määramisel väga oluline (viide 2).
      Muul juhul määratakse KHT seejärel mis tahes siseriikliku või rahvusvahelise standarditud meetodi abil.
      2.   ANDMED JA HINDAMINE
      Kolvi sisu KHT arvutatakse valitud standarditud meetodi abil ja väljendatakse grammides grammi testaine kohta.
      3.   ARUANDLUS
      Ära tuleks märkida kasutatud standardmeetod.
      Keemilise hapnikutarbena esitatakse vähemalt kolme mõõtmise keskmine tulemus. Registreerida tuleb kõik teadaolevad tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti tulemusi aine lisandeid, füüsikalist olekut ja omadusi käsitlevad andmed ja märkused.
      Ära tuleb märkida elavhõbesulfaadi lisamine kloori segava mõju vähendamiseks.
      4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  Kelkenberg, H., Z. Von Wasser und Abwasserforschung, 1975, vol. 8, 146.
               
            
                  2)
               
               
                  Gerike, P The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, 984, vol. 13, 169.
                  Standardmeetodite näidisloend:
                  
                               
                           
                           
                              NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen demand.
                           
                        
                               
                           
                           
                              ISBN O 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate value) of polluted and waste waters.
                           
                        
                               
                           
                           
                              NF T 90-101 Determination of the chemical oxygen demand.
                           
                        
                               
                           
                           
                              DS 217 = water analysis Determination of the chemical oxygen demand.
                           
                        
                               
                           
                           
                              DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen demand (COD) within the range above 15 mg per litre.
                           
                        
                               
                           
                           
                              NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.
                           
                        
                               
                           
                           
                              ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichromate methods.
                           
                        
            C.7.   LAGUNEMINE – ABIOOTILINE LAGUNEMINE: HÜDROLÜÜSI SÕLTUVUS pHst
      1.   MEETOD
      Käesolev katsemeetod vastab suunisele OECD TG 111 (2004).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Kemikaalid võivad sattuda pinnavette otsese kasutamise, pritsmete edasikandumise, äravoolu, drenaaži, jäätmete kõrvaldamise, tööstus-, olme- või põllumajandusheitvee ja atmosfäärisademetega ning võivad pinnavees muunduda keemiliste (nt hüdrolüüs, oksüdatsioon), fotokeemiliste ja/või mikrobioloogiliste protsesside teel. Käesolevas suunises kirjeldatakse laboratoorset katsemeetodit kemikaalide abiootilise hüdrolüütilise muundumise hindamiseks veesüsteemides pH väärtuste juures, mis esinevad tavaliselt keskkonnas (pH 4–9); meetod põhineb olemasolevatel suunistel (1–7).
      Katsetega määratakse kindlaks i) uuritava aine hüdrolüüsi kiirus pH funktsioonina ja ii) hüdrolüüsisaaduste, millega organismid võivad kokku puutuda, koostis või laad ning tekkimis- ja lagunemiskiirus. Selliseid uuringuid võib olla vaja kemikaalide puhul, mida juhitakse otse vette või mis võivad sattuda keskkonda muudel eespool kirjeldatud viisidel.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Vt 2. liidet.
      1.3.   KATSEMEETODI KASUTUSALA
      Meetod on üldiselt kasutatav (märgiseta või märgisega) keemiliste ainete puhul, mille jaoks on olemas piisava täpsuse ja tundlikkusega määramismeetod. Seda saab kasutada vähelenduva või lendumatu ühendi puhul, mis lahustub piisavalt hästi vees. Käesoleva meetodiga ei tuleks uurida kemikaali, mis lendub vesilahusest väga kergesti (nt fumigant, orgaaniline lahusti) ja mida seetõttu ei saa hoida lahuses käesoleva katse tingimustes. Katset võib olla raske teha vees väga vähe lahustuva ainega (8).
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritav aine viiakse pH eri väärtusega (pH 4, 7 ja 9) steriilsetesse vesipuhverlahustesse ja neid inkubeeritakse kontrollitud laboritingimustes pimedas (püsival temperatuuril). Pärast ettenähtud ajavahemike möödumist määratakse puhverlahuses uuritava aine ja hüdrolüüsisaaduste sisaldus. Märgisega (nt 14C) aine puhul on kergem koostada massibilanssi.
      Käesolevas katsemeetodis kasutatakse astmelist lähenemisviisi, mida on näidatud ja selgitatud 1. liites. Iga järgmine aste sõltub eelmise tulemustest.
      1.5.   ANDMED UURITAVA AINE KOHTA
      Hüdrolüüsi kiiruse mõõtmiseks saab kasutada märgiseta või märgisega ainet. Märgisega ainet tuleb hüdrolüüsitee uurimisel ja massibilansi koostamisel üldiselt eelistada; siiski ei pruugi märgisega aine kasutamine olla erijuhtudel tingimata vajalik. Soovitatakse kasutada 14C-märgist, kuid teiste isotoopide, näiteks 13C, 15N, 3H tarvitamine võib samuti kasulik olla.Märgisega aatom peaks võimaluse korral paiknema molekuli kõige stabiilsema(te)s osa(de)s. Kui uuritav aine sisaldab näiteks ühte tsüklit, peaks märgis olema selles tsüklis; kui uuritav aine sisaldab kaht või enamat tsüklit, võib olla vaja eraldi uuringuid, et hinnata iga märgisega tsükli muundumisi ja saada vajalikku teavet hüdrolüüsisaaduste moodustumise kohta. Uuritava aine puhtus peab olema vähemalt 95 %.
      Enne hüdrolüüsikatse tegemist peab olemas olema järgmine teave uuritava aine kohta:
      
                  a)
               
               
                  lahustuvus vees (katsemeetod A.6);
               
            
                  b)
               
               
                  lahustuvus orgaanilistes lahustites;
               
            
                  c)
               
               
                  aururõhk (katsemeetod A.4) ja/või Henry konstant;
               
            
                  d)
               
               
                  jaotuskoefitsient süsteemis n-oktanool/vesi (katsemeetod A.8);
               
            
                  e)
               
               
                  dissotsiatsioonikonstant (pKa) (OECD suunis 112) (viide 9);
               
            
                  f)
               
               
                  otsese ja kaudse fototransformatsiooni kiirus vees (vajaduse korral).
               
            On vaja määramismeetodeid uuritava aine kvantitatiivseks määramiseks ning vajaduse korral hüdrolüüsisaaduste identifitseerimiseks ja kvantitatiivseks määramiseks vesilahuses (vt ka punkt 1.7.2).
      1.6.   VÕRDLUSAINED
      Hüdrolüüsisaaduste kindlakstegemiseks ja kvantitatiivseks määramiseks spektroskoopiliste ja kromatograafiliste meetodite või muude piisavalt tundlike meetodite abil tuleks võimaluse korral kasutada võrdlusaineid.
      1.7.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      1.7.1.   Saagis
      Uuritava aine määramine puhverlahustest või nende ekstraktidest vähemalt kahes paralleelkatses kohe pärast uuritava aine lisamist annab esimese ettekujutuse määramismeetodi ja uuritava aine lisamise korratavusest. Hilisemate katsestaadiumide puhul saab määramissaagised leida vastavate massibilansside alusel (kui kasutatakse märgisega ainet). Määramissaagis peaks nii märgisega kui ka märgiseta kemikaali puhul olema vahemikus 90–110 % (7). Kui tehniliselt on sellist vahemikku raske saavutada, on 70 %line saagis märgiseta kemikaali puhul lubatav, kuid seda tuleb põhjendada.
      1.7.2.   Määramismeetodi korratavus ja tundlikkus
      Uuritava aine ja hüdrolüüsisaaduste kvantitatiivsel määramisel hiljem kasutatava(te) meetodi(te) korratavust saab kontrollida samade puhverlahuste (või nende ekstraktide) paralleelmääramistega siis, kui määramiseks on tekkinud piisav kogus hüdrolüüsisaadusi.
      Määramismeetod peab olema piisavalt tundlik, et määrata katseaine kontsentratsioone 10 % või vähem algsest kontsentratsioonist. Vajaduse korral peavad analüüsimeetodid olema ka piisavalt tundlikud, et määrata hüdrolüüsisaaduste kogust, mis moodustab 10 % või enam (ükskõik millisel uuringu hetkel) lisatud kogusest või 25 % või vähem selle saaduse maksimaalsest kontsentratsioonist.
      1.7.3.   Hüdrolüüsi kineetiliste andmete usaldusvahemikud
      Kõigi regressioonikoefitsientide, kiiruskonstantide, poolestusaegade ja muude (nt DT50) kineetiliste parameetrite väärtuste jaoks tuleks arvutada ja esitada usaldusvahemikud.
      1.8.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.8.1   Laborivarustus ja seadmed
      Uuring tuleb teha klaasnõudes (nt katseklaasid, väikesed kolvid), vajaduse korral pimedas ja steriilsetes tingimustes, välja arvatud juhul, kui eelnev teave (nagu jaotuskoefitsient n-oktanooli/vee süsteemis) viitab sellele, et uuritav aine võib adsorbeeruda klaasile. Sellistel juhtudel tuleb võib-olla kaaluda muude materjalide (näiteks Teflon®) kasutamist. Klaasile adsorbeerumise mõju saab vähendada ka järgmiste meetoditega:
      
                  —
               
               
                  katseanuma külge sorbeerunud uuritava aine ja hüdrolüüsisaaduste massi määramine;
               
            
                  —
               
               
                  ultrahelivanni kasutamine;
               
            
                  —
               
               
                  kõigi klaasnõude pesemine lahustiga iga katseintervalli ajal;
               
            
                  —
               
               
                  kaubanduslikku segu jäljendavate toodete kasutamine;
               
            
                  —
               
               
                  suurema koguse kaaslahusti kasutamine uuritava aine lisamiseks süsteemile; kui kasutatakse kaaslahustit, peab see olema selline, mis ei hüdrolüüsi uuritavat ainet.
               
            Tavaliselt on vajalikud kontrollitava temperatuuriga vesivann-loksutid või termostateeritavad inkubaatorid eri katselahuste inkubeerimiseks.
      Vaja läheb standardset laborivarustust, eriti järgmisi seadmeid:
      
                  —
               
               
                  pH-meeter;
               
            
                  —
               
               
                  analüüsiseadmed, nagu GC-, HPLC-, TLC-seadmed, kaasa arvatud vajalikud seadmed radioaktiivse märgisega ja märgiseta ainete määramiseks või isotooplahjenduse pöördmeetodi kasutamiseks;
               
            
                  —
               
               
                  seadmed identifitseerimise jaoks (nt MS, GC-MS, HPLC-MS, TMR jne);
               
            
                  —
               
               
                  vedelik-stsintillatsiooniloendaja;
               
            
                  —
               
               
                  jaotuslehtrid vedelik-vedelik-ekstraktsiooni jaoks;
               
            
                  —
               
               
                  seadmed lahuste ja ekstraktide kontsentreerimiseks (nt rotaatoraurusti);
               
            
                  —
               
               
                  temperatuuri kontrollimise vahend (nt veevann).
               
            Keemiareagentidest läheb vaja näiteks järgmisi:
      
                  —
               
               
                  analüüsipuhtad orgaanilised lahustid, nagu heksaan, diklorometaan jne;
               
            
                  —
               
               
                  stsintillatsioonivedelik;
               
            
                  —
               
               
                  puhverlahused (lähemalt vt punktist 1.8.3).
               
            Kõik hüdrolüüsikatsetes kasutatavad klaasnõud, analüütilise puhtusega vesi ja puhverlahused peavad olema steriliseeritud.
      1.8.2.   Uuritava aine lisamine
      Uuritav aine tuleb lisada vesilahusena erinevatesse puhverlahustesse (vt 3. liidet). Lahustumise parandamiseks on lubatud kasutada väikest kogust veega segunevat lahustit (nagu atsetonitriil, atsetoon, etanool), kuid lahusti kontsentratsioon ei tohi tavaliselt ületada 1 mahuprotsenti. Kõrgemat lahusti kontsentratsiooni võib kasutada (nt halvasti lahustuva uuritava aine puhul) ainult siis, kui saab näidata, et lahusti ei mõjuta uuritava aine hüdrolüüsi.
      Kaubanduslikku segu jäljendava toote kasutamist üldiselt ei soovitata, kuna ei saa välistada, et segu koostisosad mõjutavad hüdrolüüsi. Siiski võib kaubanduslikku segu jäljendava materjali kasutamine olla sobiv lahendus vees halvasti lahustuva või klaasile adsorbeeruva uuritava aine puhul (vt punkti 1.8.1).
      Tuleks kasutada ühte uuritava aine kontsentratsiooni; see ei tohiks ületada 0,01 M või poolt küllastuskontsentratsiooni (vt 1. liidet).
      1.8.3.   Puhverlahused
      Hüdrolüüsikatse tuleks sooritada pH väärtuste 4, 7 ja 9 juures. Selleks tuleb puhverlahuste valmistamisel kasutada analüüsipuhtaid kemikaale ja vett. Mõned sobivad puhversüsteemid on esitatud 3. liites. Tuleb märkida, et kasutatav puhversüsteem võib mõjutada hüdrolüüsi kiirust ja sellistel juhtudel tuleb kasutada alternatiivset puhversüsteemi (11).
      Iga puhverlahuse pH väärtust tuleb kontrollida kalibreeritud pH-meetriga, mille täpsus on vähemalt 0,1 nõutava temperatuuri juures.
      1.8.4.   Katsetingimused
      1.8.4.1.   Katsetemperatuur
      Hüdrolüüsikatsed tuleb teha konstantse temperatuuri juures. Ekstrapoleerimise eesmärgil on oluline hoida temperatuuri vahemikus vähemalt ±0,5 oC.
      Kui uuritava aine hüdrolüüsi kohta ei ole midagi teada, tuleks teha eelkatse temperatuuril 50 oC (1. aste). Edasiste astmete kineetilised katsed tuleb teha vähemalt kolmel temperatuuril (kaasa arvatud katse 50 oC juures), välja arvatud juhul, kui 1. astme katses selgub, et uuritav aine on hüdrolüüsi suhtes stabiilne. Soovitatav temperatuurivahemik on 10–70 oC (eelistatavalt tuleks kasutada vähemalt ühte temperatuuri alla 25 oC); see hõlmab standardtemperatuuri 25 oC ja enamikku välitingimustes esinevaid temperatuure.
      1.8.4.2.   Valgus ja hapnik
      Kõik hüdrolüüsikatsed tuleb teha, kasutades sobivaid meetodeid fotolüüsi vältimiseks. Tuleb võtta kõik sobivad meetmed hapniku toime vältimiseks (nt barboteerimine heeliumi, lämmastiku või argooniga viie minuti jooksul enne lahuse valmistamist).
      1.8.4.3.   Katse kestus
      Eelkatse kestab viis päeva, samal ajal kui kõrgemate astmete katsed tehakse kuni 90 %lise hüdrolüüsini või kestavad 30 päeva, sõltuvalt sellest, kumb aeg on lühem.
      1.8.5.   Katse käik
      1.8.5.1.   Eelkatse (1. aste)
      Eelkatse tehakse temperatuuril 50 ±0,5 oC pH väärtuste 4,0, 7,0 ja 9,0 juures. Kui viie päeva pärast täheldatakse alla 10 %list hüdrolüüsi (t0,5 25 oC juures > 1 aasta), peetakse uuritavat ainet hüdrolüüsi suhtes stabiilseks ja tavaliselt ei ole täiendavaid katseid vaja. Kui katseaine on teadaolevalt ebastabiilne keskkonna mõistes oluliste temperatuuride juures, (12) ei ole eelkatset vaja teha. Analüüsimeetod peab olema piisavalt täpne ja tundlik, et avastada esialgse kontsentratsiooni 10 %list vähenemist.
      1.8.5.2.   Ebastabiilse aine hüdrolüüs (2. aste)
      Kõrgema astme katse sooritatakse pH väärtustel, mille juures uuritav aine leiti olevat ebastabiilne vastavalt eespool toodud eelkatse määratlusele. Katseaine puhverdatud lahused termostateeritakse valitud temperatuuridel. Et kontrollida, kas tegemist on 1. järgu reaktsiooniga, tuleb iga reaktsioonilahust analüüsida ajavahemike järel, millega saadakse vähemalt kuus eraldi paiknevat andmepunkti uuritava aine 10–90 %lise hüdrolüüsi vahel. Võetakse individuaalsed paralleelsed proovid (vähemalt kaks proovi eraldi reaktsiooninõudest) vähemalt kuuel proovivõtuajal ja nende sisu analüüsitakse (et saada vähemalt kaksteist paralleeliga andmepunkti). Ühe koondproovi kasutamist, millest igal proovivõtuajal võetakse uuritava aine lahuse individuaalsed alikvoodid, peetakse ebapiisavaks, kuna see ei võimalda analüüsida andmete varieeruvust ja võivad tekkida raskused uuritava aine lahuse saastumise tõttu. Kõrgema astme katse lõpus (st 90 %lise hüdrolüüsi juures või 30 päeva möödudes) tuleb näidata, et lahuse steriilsus on säilinud. Kui lagunemist (st muundumist) ei täheldata, ei peeta steriilsuse katseid siiski vajalikuks.
      1.8.5.3.   Hüdrolüüsisaaduste kindlakstegemine (3. aste)
      Sobivate määramismeetoditega tuleb kindlaks teha kõik peamised hüdrolüüsisaadused, vähemalt sellised, mis moodustavad üle 10 % kasutatud kogusest.
      1.8.5.4.   Mittekohustuslikud katsed
      Kergesti hüdrolüüsuva uuritava aine puhul võivad olla vajalikud lisakatsed muudel pH väärtustel kui 4, 7 ja 9. Näiteks võib füsioloogiaga seotud eesmärkidel olla vajalik teha katse happelisemates tingimustes (nt pH 1,2) füsioloogiliselt olulise temperatuuri (37 oC) juures.
      2.   ANDMED
      Uuritava aine ja hüdrolüüsisaaduste (kui neid on vaja uurida) kogused iga proovivõtuintervalli ning iga pH ja katsetemperatuuri puhul esitatakse, kui see on asjakohane, protsendina esialgsest kasutatud kontsentratsioonist ning vajaduse korral ühikutes mg/l. Kui kasutati märgisega ainet, tuleb lisaks esitada massibilanss protsendina esialgsest kasutatud kontsentratsioonist.
      Tuleb koostada graafik uuritava aine kontsentratsiooni logaritmi sõltuvuse kohta ajast. Kõik peamised hüdrolüüsisaadused, vähemalt need, mis moodustavad ≥ 10 % kasutatud kogusest, tuleb kindlaks teha ja esitada nende kontsentratsiooni logaritmid samal viisil graafikul nagu nende lähteainete puhul, et näidata nende tekkimise ja lagunemise kiirusi.
      2.1.   ANDMETE TÖÖTLEMINE
      Täpsema poolestusaja või DT50 väärtuse arvutamiseks tuleb kasutada sobivaid kineetilisi arvutusmudeleid. Poolestusaja ja/või DT50 väärtused (koos usalduspiiridega) tuleb arvutada iga pH ja temperatuuri jaoks, näidates ära ka mudeli, mida kasutati reaktsiooni kineetika järgu ja determinatsioonikordaja (r2) määramisel. Võimaluse korral tuleb need arvutused teha ka hüdrolüüsisaaduste jaoks.
      Erinevatel temperatuuridel tehtud kiiruse mõõtmiste puhul tuleb pseudoesimest järku hüdrolüüsi kiiruskonstante (k0bS) kirjeldada temperatuuri funktsioonina. Arvutus peaks põhinema nii kobs eraldamisel happekatalüütilise, neutraalse ja alusekatalüütilise hüdrolüüsi kiiruskonstantideks (kH, kneutral, kOH) kui ka Arrheniuse võrrandil:
      
         
      kus Ai ja Bi on regressioonikonstandid, mis leitakse sirge algordinaadist ja tõusust, mis on lineaarse regressiooniga pandud läbi ln ki väärtuse ja kelvinites väljendatud absoluutse temperatuuri (T) pöördväärtusega määratud punktide. Kasutades neid Arrheniuse suhteid happekatalüütilise, neutraalse ja alusekatalüütilise hüdrolüüsi jaoks, saab pseudoesimest järku kiiruskonstandid ja seega poolestusajad välja arvutada teiste temperatuuride jaoks, mille puhul otsene eksperimentaalne kiiruskonstandi määramine pole teostatav (10).
      2.2.   TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE
      Enamik hüdrolüüsireaktsioone toimub pseudoesimest järku reaktsioonina ja seetõttu on poolestusajad sõltumatud kontsentratsioonist (vt 2. liites võrrandit 4). See võimaldab tavaliselt 10–2 kuni 10–3 M juures määratud laboratoorseid tulemusi üle kanda keskkonnatingimustele (≤ 10–6 M) (10). Mabey ja Mill (11) on esitanud rea näiteid selle kohta, et puhtas vees ja looduslikus vees mõõdetud hüdrolüüsi kiirused on eri kemikaalide puhul olnud heas kooskõlas, kui nii pH kui ka temperatuur olid mõõdetud.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuandes tuleks esitada vähemalt järgmine teave.
      Uuritav aine:
      
                  —
               
               
                  tavanimetus, keemiline nimetus, CASi number, struktuurivalem (milles on näidatud märgise asukoht, kui kasutatakse radioaktiivse märgisega materjali) ja olulised füüsikalis-keemilised omadused (vt punkti 1.5);
               
            
                  —
               
               
                  uuritava aine puhtus (lisandid);
               
            
                  —
               
               
                  märgise puhtus märgisega kemikaali puhul ja molaarne aktiivsus (vajaduse korral).
               
            
                  —
               
               
                  Puhverlahused:
               
            
                  —
               
               
                  valmistamise kuupäevad ja üksikasjad;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud puhvrid ja vesi;
               
            
                  —
               
               
                  puhverlahuste molaarsus ja pH.
               
            Katsetingimused:
      
                  —
               
               
                  uuringute tegemise kuupäevad;
               
            
                  —
               
               
                  uuritava aine kasutatud kogus;
               
            
                  —
               
               
                  uuritava aine lisamiseks kasutatud meetod ja lahustid (liik ja kogus);
               
            
                  —
               
               
                  inkubeeritud uuritava aine puhverdatud lahuste mahud;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud inkubatsioonisüsteemi kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  pH ja temperatuur uuringu jooksul;
               
            
                  —
               
               
                  proovivõtuajad;
               
            
                  —
               
               
                  ekstraktsioonimeetod(id);
               
            
                  —
               
               
                  uuritava aine ja selle hüdrolüüsisaaduste puhverlahuses kindlakstegemise ja nende koguse määramise meetodid;
               
            
                  —
               
               
                  paralleelproovide arv.
               
            Tulemused:
      
                  —
               
               
                  kasutatud määramismeetodite korratavus ja tundlikkus;
               
            
                  —
               
               
                  määramissaagised (väärtused (%) õigesti tehtud uuringu jaoks on esitatud punktis 1.7.1);
               
            
                  —
               
               
                  paralleelproovide andmed ja keskmised tabelina;
               
            
                  —
               
               
                  massibilanss kogu katse ajal ja lõpus (kui kasutatakse märgisega ainet);
               
            
                  —
               
               
                  eelkatse tulemused;
               
            
                  —
               
               
                  tulemuste arutelu ja tõlgendamine;
               
            
                  —
               
               
                  kõik originaalandmed ja -näidud.
               
            Järgmine teave on vajalik ainult siis, kui määratakse hüdrolüüsi kiirust:
      
                  —
               
               
                  uuritava aine ja vajaduse korral hüdrolüüsisaaduste kontsentratsiooni graafikud sõltuvusena ajast iga pH väärtuse ja temperatuuri juures;
               
            
                  —
               
               
                  Arrheniuse võrrandi tulemuste tabelid temperatuuri 20 oC/25 oC jaoks koos pH, kiiruskonstandi [h-1 või päev-1], poolestusaja või DT50 ja temperatuuridega [ oC], koos usalduspiiride ja korrelatsioonikordaja (r2) vms andmetega;
               
            
                  —
               
               
                  hüpotees hüdrolüüsitee kohta.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  OECD (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guideline for Testing of Chemicals Nr. 111, adopted 12 May 1981.
               
            
                  2)
               
               
                  US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25 oC. Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
               
            
                  3)
               
               
                  Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate Guidelines for registration of pesticides in Canada.
               
            
                  4)
               
               
                  Euroopa Liit (EL) (1995). Komisjoni direktiiv 95/36/EÜ, millega muudetakse nõukogu direktiivi 91/414/EMÜ taimekaitsevahendite turuleviimise kohta; V liide. Säilimine ja toime keskkonnas.
               
            
                  5)
               
               
                  Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
               
            
                  6)
               
               
                  BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (October 1980).
               
            
                  7)
               
               
                  SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.
               
            
                  8)
               
               
                  OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures, OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment Nr.23.
               
            
                  9)
               
               
                  OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994 – 2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.
               
            
                  10)
               
               
                  Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997) Recommended changes in pesticide fate study guidelines for improving input to computer models. (Text version of oral presentation at the 14th Annual Meeting of the Society of Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, November 1993).
               
            
                  11)
               
               
                  Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis of organic compounds in water under environmental conditions. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383–415.
               
            
         1. liide
         Hüdrolüüsi uuringu astmeline skeem
         
            
      
      
         2. liide
         Mõisted ja mõõtühikud
         Kõigil juhtudel tuleb kasutada rahvusvahelise süsteemi (SI) standardseid mõõtühikuid.
         
         
            Uuritav aine – mis tahes aine, kas lähteühend või asjaomased muundumissaadused.
         
            Muundumissaadused – kõik ained, mis tekivad uuritava aine biootiliste või abiootiliste muundumisreaktsioonide tulemusel.
         
            Hüdrolüüsisaadused – kõik ained, mis tekivad uuritava aine hüdrolüütiliste muundumisreaktsioonide tulemusel.
         
            Hüdrolüüs – uuritava aine RX reaktsioon veega, mille tulemusena X-rühm reaktsioonitsentris asendub OH-rühmaga:
         
                     RX + HOH → ROH + HX
                  
                  
                     [1]
                  
               Aine RX kontsentratsiooni vähenemise kiirust selles lihtsustatud protsessis kirjeldab järgmine võrrand:
         
                     kiirus = k [H2O] [RX]
                  
                  
                     teist järku reaktsioon
                  
               
                     või
                  
               
                     kiirus = k [RX]
                  
                  
                     esimest järku reaktsioon,
                  
               sõltuvalt kiirust määravast staadiumist. Kuna vett on uuritava ainega võrreldes väga palju, kirjeldab seda tüüpi reaktsiooni tavaliselt pseudoesimest järku reaktsiooni võrrand, milles mõõdetav kiiruskonstant on määratud seosega
         
                     kobs = k [H2O]
                  
                  
                     [2]
                  
               ja selle saab määrata valemist (13)
         
         
                     
                         ln 
                        
                  
                  
                     [3]
                  
               kus
         t= on aeg
         ja C0, Ct= on RX kontsentratsioonid ajahetkedel 0 ja t.
         Selle konstandi ühik on (aeg)–1 ja reaktsiooni poolestusaeg (aeg, mis kulub 50 % RX-i reageerimiseks) on määratud seosega
         
                     
                        
                  
                  
                     [4]
                  
               
            Poolestusaeg – (t0,5) on aeg, mis kulub 50 % uuritava aine hüdrolüüsiks, kui reaktsiooni saab kirjeldada esimest järku kineetikaga; see ei sõltu kontsentratsioonist.
         
            DT
            
               50
            
            (50 % kadumisaeg) – aeg, mille jooksul uuritava aine kontsentratsioon väheneb 50 % võrra; see on erinev poolestusajast t0,5, kui reaktsioon ei järgi esimest järku kineetikat.
         
            k hindamine eri temperatuuridel
         
         Kui on teada kiiruskonstandid kahe temperatuuri juures, saab kiiruskonstandid teiste temperatuuride juures arvutada Arrheniuse valemiga:
         
             või 
         Graafik, mis kujutab ln k sõltuvust 1/T-st, annab sirgjoone tõusuga –E/R,
         kus:
         
                     k
                  
                  
                     =
                  
                  
                     erinevatel temperatuuridel mõõdetud kiiruskonstant
                  
               
                     E
                  
                  
                     =
                  
                  
                     aktivatsioonienergia [kJ/mol]
                  
               
                     T
                  
                  
                     =
                  
                  
                     absoluutne temperatuur [K]
                  
               
                     R
                  
                  
                     =
                  
                  
                     gaasikonstant [8,314 J/mol.K]
                  
               Aktivatsioonienergia arvutatakse regressioonanalüüsi teel järgmisest võrrandist:
         
            
         kus T2 > T1.
      
      
         3. liide
         Puhversüsteemid
         A.   CLARK ja LUBS
         CLARKI ja LUBSI puhversegud
                (14)
            
         
         
                     Koostis
                  
                  
                     pH
                  
               
                     
                        0,2 N HCl ja 0,2 N KCl 20 oC JUURES
                     
                  
               
                     47,5 ml HCl + 25 ml KCl, lahjendatud kuni 100 ml
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     32,25 ml HCl + 25 ml KCl, lahjendatud kuni 100 ml
                  
                  
                     1,2
                  
               
                     20,75 ml HCl + 25 ml KCl, lahjendatud kuni 100 ml
                  
                  
                     1,4
                  
               
                     13,15 ml HCl + 25 ml KCl, lahjendatud kuni 100 ml
                  
                  
                     1,6
                  
               
                     8,3 ml HCl + 25 ml KCl, lahjendatud kuni 100 ml
                  
                  
                     1,8
                  
               
                     5,3 ml HCl + 25 ml KCl, lahjendatud kuni 100 ml
                  
                  
                     2,0
                  
               
                     3,35 ml HCl + 25 ml KCl, lahjendatud kuni 100 ml
                  
                  
                     2,2
                  
               
                     
                        0,1 M kaaliumbiftalaat + 0,1 N HCl 20 oC juures
                     
                  
               
                     46,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     2,2
                  
               
                     39,60 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     2,4
                  
               
                     32,95 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     2,6
                  
               
                     26,42 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     2,8
                  
               
                     20,32 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     3,0
                  
               
                     14,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     3,2
                  
               
                     9,90 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     3,4
                  
               
                     5,97 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     3,6
                  
               
                     2,63 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     3,8
                  
               
                     
                        0,1 M kaaliumbiftalaat + 0,1 N NaOH 20 oC juures
                     
                  
               
                     0,40 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     4,0
                  
               
                     3,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     4,2
                  
               
                     7,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     4,4
                  
               
                     12,15 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     4,6
                  
               
                     17,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     4,8
                  
               
                     23,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     5,0
                  
               
                     29,95 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     5,2
                  
               
                     35,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     5,4
                  
               
                     39,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     5,6
                  
               
                     43,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     5,8
                  
               
                     45,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml
                  
                  
                     6,0
                  
               CLARKI ja LUBSI puhversegud (järg)
         
                     
                        0,1 M monokaaliumfosfaat + 0,1 N NaOH 20 oC juures
                     
                  
               
                     5,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml
                  
                  
                     6,0
                  
               
                     8,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml
                  
                  
                     6,2
                  
               
                     12,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml
                  
                  
                     6,4
                  
               
                     17,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml
                  
                  
                     6,6
                  
               
                     23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml
                  
                  
                     6,8
                  
               
                     29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml
                  
                  
                     7,0
                  
               
                     35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml
                  
                  
                     7,2
                  
               
                     39,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml
                  
                  
                     7,4
                  
               
                     42,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml
                  
                  
                     7,6
                  
               
                     45,20 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml
                  
                  
                     7,8
                  
               
                     46,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml
                  
                  
                     8,0
                  
               
                     
                        0,1 M H3BO30,1 M KCl-s + 0,1 N NaOH 20 oC juures
                     
                  
               
                     2,61 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml
                  
                  
                     7,8
                  
               
                     3,97 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml
                  
                  
                     8,0
                  
               
                     5,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml
                  
                  
                     8,2
                  
               
                     8,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml
                  
                  
                     8,4
                  
               
                     12,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml
                  
                  
                     8,6
                  
               
                     16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml
                  
                  
                     8,8
                  
               
                     21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml
                  
                  
                     9,0
                  
               
                     26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml
                  
                  
                     9,2
                  
               
                     32,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml
                  
                  
                     9,4
                  
               
                     36,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml
                  
                  
                     9,6
                  
               
                     40,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml
                  
                  
                     9,8
                  
               
                     43,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml
                  
                  
                     10,0
                  
               B.   KOLTHOFF ja VLEESCHHOUWER
         KOLTHOFFI ja VLEESCHHOUWERI tsitraatpuhvrid
         
                     Koostis
                  
                  
                     pH
                  
               
                     
                        0,1 M monokaaliumtsitraat ja 0,1 N HCl 18 oC juures
                         (15)
                     
                  
               
                     49,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     2,2
                  
               
                     43,4 ml 0,1 N HCl + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     2,4
                  
               
                     36,8 ml 0,1 N HCl + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     2,6
                  
               
                     30,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     2,8
                  
               
                     23,6 ml 0,1 N HCl + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     3,0
                  
               
                     17,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     3,2
                  
               
                     10,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     3,4
                  
               
                     4,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     3,6
                  
               
                     
                        0,1 M monokaaliumtsitraat ja 0,1 N NaOH 18 oC juures
                         (15)
                     
                  
               
                     2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     3,8
                  
               
                     9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     4,0
                  
               
                     16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     4,2
                  
               
                     23,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     4,4
                  
               
                     31,5 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     4,6
                  
               
                     39,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     4,8
                  
               
                     46,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     5,0
                  
               
                     54,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     5,2
                  
               
                     61,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     5,4
                  
               
                     68,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     5,6
                  
               
                     74,4 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     5,8
                  
               
                     81,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml
                  
                  
                     6,0
                  
               C.   SÖRENSEN
         SÖRENSENI boraadisegud
         
                     Koostis
                  
                  
                     Sörensen
                     18 oC
                  
                  
                     Walbum, pH temperatuuril:
                  
               
                     ml booraksit
                  
                  
                     ml HCl/NaOH
                  
                  
                     10 oC
                  
                  
                     40 oC
                  
                  
                     70 oC
                  
               
                     
                        0,05 M booraks + 0,1 N HCl
                     
                  
               
                     5,25
                  
                  
                     4,75
                  
                  
                     7,62
                  
                  
                     7,64
                  
                  
                     7,55
                  
                  
                     7,47
                  
               
                     5,50
                  
                  
                     4,50
                  
                  
                     7,94
                  
                  
                     7,98
                  
                  
                     7,86
                  
                  
                     7,76
                  
               
                     5,75
                  
                  
                     4,25
                  
                  
                     8,14
                  
                  
                     8,17
                  
                  
                     8,06
                  
                  
                     7,95
                  
               
                     6,00
                  
                  
                     4,00
                  
                  
                     8,29
                  
                  
                     8,32
                  
                  
                     8,19
                  
                  
                     8,08
                  
               
                     6,50
                  
                  
                     3,50
                  
                  
                     8,51
                  
                  
                     8,54
                  
                  
                     8,40
                  
                  
                     8,28
                  
               
                     7,00
                  
                  
                     3,00
                  
                  
                     8,08
                  
                  
                     8,72
                  
                  
                     8,56
                  
                  
                     8,40
                  
               
                     7,50
                  
                  
                     2,50
                  
                  
                     8,80
                  
                  
                     8,84
                  
                  
                     8,67
                  
                  
                     8,50
                  
               
                     8,00
                  
                  
                     2,00
                  
                  
                     8,91
                  
                  
                     8,96
                  
                  
                     8,77
                  
                  
                     8,59
                  
               
                     8,50
                  
                  
                     1,50
                  
                  
                     9,01
                  
                  
                     9,06
                  
                  
                     8,86
                  
                  
                     8,67
                  
               
                     9,00
                  
                  
                     1,00
                  
                  
                     9,09
                  
                  
                     9,14
                  
                  
                     8,94
                  
                  
                     8,74
                  
               
                     9,50
                  
                  
                     0,50
                  
                  
                     9,17
                  
                  
                     9,22
                  
                  
                     9,01
                  
                  
                     8,80
                  
               
                     10,00
                  
                  
                     0,00
                  
                  
                     9,24
                  
                  
                     9,30
                  
                  
                     9,08
                  
                  
                     8,86
                  
               
                     
                        0,05 M booraks + 0,1 N NaOH
                     
                  
               
                     10,0
                  
                  
                     0,0
                  
                  
                     9,24
                  
                  
                     9,30
                  
                  
                     9,08
                  
                  
                     8,86
                  
               
                     9,0
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     9,36
                  
                  
                     9,42
                  
                  
                     9,18
                  
                  
                     8,94
                  
               
                     8,0
                  
                  
                     2,0
                  
                  
                     9,50
                  
                  
                     9,57
                  
                  
                     9,30
                  
                  
                     9,02
                  
               
                     7,0
                  
                  
                     3,0
                  
                  
                     9,68
                  
                  
                     9,76
                  
                  
                     9,44
                  
                  
                     9,12
                  
               
                     6,0
                  
                  
                     4,0
                  
                  
                     9,97
                  
                  
                     10,06
                  
                  
                     9,67
                  
                  
                     9,28
                  
               SÖRENSENI fosfaadisegud
         
                     Koostis
                  
                  
                     pH
                  
               
                     
                        0,0667 M monokaaliumfosfaat + 0,0667 M dinaatriumfosfaat 20 oC juures
                  
               
                     99,2 ml KH2PO4 + 0,8 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     5,0
                  
               
                     98,4 ml KH2PO4 + 1,6 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     5,2
                  
               
                     97,3 ml KH2PO4 + 2,7 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     5,4
                  
               
                     95,5 ml KH2PO4 + 4,5 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     5,6
                  
               
                     92,8 ml KH2PO4 + 7,2 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     5,8
                  
               
                     88,9 ml KH2PO4 + 11,1 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     6,0
                  
               
                     83,0 ml KH2PO4 + 17,0 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     6,2
                  
               
                     75,4 ml KH2PO4 + 24,6 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     6,4
                  
               
                     65,3 ml KH2PO4 + 34,7 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     6,6
                  
               
                     53,4 ml KH2PO4 + 46,6 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     6,8
                  
               
                     41,3 ml KH2PO4 + 58,7 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     7,0
                  
               
                     29,6 ml KH2PO4 + 70,4 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     7,2
                  
               
                     19,7 ml KH2PO4 + 80,3 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     7,4
                  
               
                     12,8 ml KH2PO4 + 87,2 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     7,6
                  
               
                     7,4 ml KH2PO4 + 92,6 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     7,8
                  
               
                     3,7 ml KH2PO4 + 96,3 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     8,0
                  
               
      C.8.   TOKSILISUS VIHMAUSSIDELE
      TEHISMULLA KATSE
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Selles laboratoorses katses lisatakse uuritav aine tehismullale, milles 14 päeva jooksul usse hoitakse. Pärast seda perioodi (ja valikuliselt seitsme päeva pärast) uuritakse katseaine letaalset mõju vihmaussidele. Katse annab suhteliselt kiire meetodi naha ja seedekulgla kaudu omastatavate kemikaalide mõju skriinimiseks vihmaussidel.
      1.2.   DEFINITSIOON JA ÜHIK
      LC50 – aine kontsentratsioon, mis arvestuslikult tapab uuringuperioodil 50 % katseloomadest.
      1.3.   VÕRDLUSAINE
      Võrdlusainet kasutatakse perioodiliselt kui vahendit, mis näitab, et katse süsteemi tundlikkus pole oluliselt muutunud.
      Võrdlusainena soovitatakse kasutada analüütilise klassi kloroatsetamiidi.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Muld on varieeruv keskkond, seepärast kasutatakse selles katses hoolikalt määratletud tehislikku liivsavi mulda. Täiskasvanud vihmausse liigist Eisenia foetida (vt märkust liites) hoitakse kindlas tehismullas, mida on töödeldud uuritava aine erinevate kontsentratsioonidega. Konteinerite sisu puistatakse kandikule laiali 14 päeva (ja valikuliselt seitse päeva) pärast katse algust ning loendatakse iga kontsentratsiooni juures ellujäänud vihmaussid.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Katse on planeeritud katsesubstraadi ja organismi osas võimalikult hästi korratavana (reprodutseeritavana). Suremus kontrollis ei tohi katse lõpuks olla kõrgem kui 10 %, vastasel juhul on katse kehtetu.
      1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Materjalid
      
      1.6.1.1.   Katsesubstraat
      
      Katse põhisubstraadina kasutatakse kindla koostisega tehismulda.
      
                  a)
               
               
                  Põhisubstraat (protsendid on antud kuivkaalu kohta)
                  
                              —
                           
                           
                              10 % Sphagnu
                                 m’i turvast (pH võimalikult lähedal vahemikule 5,5–6,0 ning ilma nähtavate taimejäänusteta, ühtlaselt peenestunud);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              20 % kaoliniitsavi, milles võiks olla üle 50 % kaoliniiti;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              umbes 69 % tööstuslikku kvartsiliiva (ülekaalus oleva peene liiva osakestest üle 50 % on suurusega 0,05 kuni 0,2 mm). Kui aine vees piisavalt ei dispergeeru, tuleb jätta 10 g iga katseanuma jaoks saadavale, et see hiljem katseainega segada;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lisatakse umbes 1 % keemiliselt puhast peenestatud kaltsiumkarbonaati (CaCO3), et pH oleks 6,0 ±0,5.
                           
                        
            
                  b)
               
               
                  Katsesubstraat
                  Katsesubstraat sisaldab põhisubstraati, katseainet ja deioniseeritud vett.
                  Veesisaldus on 25–42 % põhisubstraadi kuivkaalust. Substraadi veesisaldus määratakse kindlaks proovi kuivatamisel 105 oC juures konstantse kaaluni. Võtmekriteerium on, et tehismuld tuleb niisutada punktini, kus pole seisvat vett. Segamisel tuleb hoolega jälgida, et substraat ja uuritav aine seguneksid ühtlaselt. Ära tuleb näidata uuritava aine substraati viimise viis.
               
            
                  c)
               
               
                  Kontrollsubstraat
                  Kontrollsubstraat koosneb põhisubstraadist ja veest. Kui kasutatakse mõnda lisaainet, peab täiendav kontroll sisaldama sama koguse seda lisaainet.
               
            1.6.1.2.   Katseanumad
      
      Umbes üheliitrise mahuga klaasanumad (kaetud plastkaante, katete või plastkilega, milles on ventileerimiseks augud), mis on täidetud 500 g kuivale substraadile vastava koguse märja katse- või kontrollsubstraadiga.
      1.6.2.   Katsetingimused
      
      Konteinereid tuleb hoida kliimakambris temperatuuri 20 ± 2 oC pidevas valguses. Valgusintensiivsus peaks olema 400 kuni 800 luksi.
      Uuringuperiood on 14 päeva, kuid suremust võib hinnata valikuliselt seitse päeva pärast katse algust.
      1.6.3.   Katse käik
      
      
         Katse kontsentratsioonid
      
      Uuritava aine kontsentratsioonid väljendatakse aine massina põhisubstraadi kuivkaalu kohta (mg/kg).
      
         Vahemiku leidmise katse
      
      Kontsentratsioonide vahemikku, mis põhjustab 0–100 %lise surevuse, võib määrata vahemiku leidmise katsega. Nii saadakse informatsiooni kontsentratsioonide vahemiku kohta, mida tuleb kasutada lõplikus katses.
      Ainet tuleks uurida järgnevate kontsentratsioonide juures: 1 000; 100; 10; 1; 0,1 mg ainet/kg uuritava substraati (kuivkaalus) kohta.
      Kui tehakse täielik lõplik katse, piisab vahemiku leidmiseks ühest uuringuseeriast iga kontsentratsiooni kohta ja ühest uuringuseeriast töötlemata kontrolli kohta, igas seerias kümme vihmaussi.
      
         Lõplik katse
      
      Vahemiku leidmiseks tehtud uuringu tulemusi kasutatakse vähemalt viie geomeetrilises reas oleva kontsentratsiooni valimiseks, mis katavad surevuse vahemiku 0–100 % ja erinevad konstantse faktori poolest, mis ei ole suurem kui 1,8.
      Uuringud, mis kasutavad neid kontsentratsiooni seeriaid, peaks võimaldama LC50 väärtust ja selle usaldatavuse piire hinnata nii täpselt kui võimalik.
      Lõpliku katse puhul kasutatakse vähemalt nelja uuringukomplekti iga kontsentratsiooni kohta ja nelja töötlemata kontrolli, igas kümme ussi. Nende korduskomplektide tulemused esitatakse keskmise ja standardhälbe kujul.
      Kui kaks järjestikust kontsentratsiooni suhtega 1,8 annavad ainult 0 % ja 100 % surevuse, siis need kaks väärtust on piisavad näitamaks vahemikku, kuhu LC50 langeb.
      
         Katse põhisubstraadi ja uuritava aine segu
      
      Kui vähegi võimalik, tuleks katsesubstraat valmistada ilma igasuguse lisaaineta, v.a vesi. Vahetult enne uuringu algust segatakse uuritavast ainest deioniseeritud vette või muusse lahustisse tehtud emulsioon või dispersioon uuringu põhisubstraadiga või pritsitakse ühtlaselt selle peale peene kromatograafilise või samalaadse pihustiga.
      Vees lahustumatu katseaine võib lahustada võimalikult väikeses sobiva orgaanilise lahusti koguses (näiteks heksaan, atsetoon või kloroform).
      Uuritava aine lahustamiseks, dispergeerimiseks või emulgeerimiseks võib kasutada ainult kergesti lagunevaid aineid. Uuritavat substraati tuleb enne kasutamist aereerida. Aurustunud vesi tuleb samas koguses asendada. Kontroll peab sisaldama sama koguse iga lisaainet.
      Kui uuritav aine pole orgaanilises lahustis lahustatav, dispergeeritav või emulgeeritav, segatakse 10 g peeneteralise kvartsliiva ja 500 g kuivkaalus tehismulla töötlemiseks vajaliku katseaine segu 490 g kuiva katsesubstraadiga.
      Iga katsekomplekti jaoks pannakse igasse klaasanumasse 500 g kuivkaalus substraadiga ekvivalentne kogus niisket substraati ning uuritava substraadi pinnale 10 vihmaussi, keda on eelnevalt 24 tunni jooksul hoitud samasuguses niiskes põhisubstraadis, siis kiirelt pestud ja enne kasutamist filterpaberil üleliigsest veest kuivatatud.
      Konteinerid kaetakse perforeeritud plastkaante, katete või kilega, vältimaks substraadi kuivamist, ning hoitakse 14 päeva katsetingimustes.
      Hindamised tuleb teha 14 päeva (valikuliselt seitse päeva) pärast katse üles seadmist. Substraat laotatakse klaasist või roostevabast terasest tehtud alusele. Vihmaussid vaadatakse üle ja loetakse kokku ellujäänud vihmaussid. Vihmaussid tunnistatakse surnuks, kui nad ei vasta keha eesosa õrnale mehhaanilisele stimuleerimisele.
      Kui ülevaatus tehakse seitsmendal päeval, täidetakse konteiner uuesti substraadiga ja ellujäänud vihmaussid pannakse sama katsesubstraadi pinnale tagasi.
      1.6.4.   Katseorganismid
      
      Katseorganismideks peavad olema täiskasvanud Eisenia foetida eksemplarid (vt märkust liites) (vähemalt kahe kuu vanused, klitellumiga) kaaluga 300 kuni 600 mg (kasvatamise meetodeid vt liitest).
      2.   ANDMED
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE JA HINDAMINE
      Uuritud aine kontsentratsioonid esitatakse vastavate surnud vihmausside protsentide suhtes.
      Kui andmed on küllaldased, määratakse LC50 väärtus ja usalduspiirid (p = 0,05) standardmeetodite abil (Litchfield ja Wilcoxon, 1949, ekvivalentne meetod). LC50 esitatakse kui testaine (mg) uuritava substraadi (kg) kohta (kuivkaalus).
      Neil juhtudel, kui kontsentratsioonikõvera tõus on liiga järsk LC50 arvutamise võimaldamiseks, piisab selle väärtuse graafilisest hindamisest.
      Kui kaks järjestikust kontsentratsiooni vahega 1,8 annavad ainult 0 % ja 100 % surevuse, piisab neist kahest väärtusest selle vahemiku näitamiseks, kuhu LC50 jääb.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmist teavet:
      
                  —
               
               
                  kinnitus, et katse on tehtud vastavalt ülalmainitud kvaliteedikriteeriumidele;
               
            
                  —
               
               
                  tehtud katse (vahemiku leidmise uuring ja/või lõplik katse);
               
            
                  —
               
               
                  katsetingimuste täpne kirjeldus või kinnitus, et katse on tehtud kooskõlas meetodiga; kõik kõrvalekalded tuleb loetleda;
               
            
                  —
               
               
                  täpne uuritava aine ja põhisubstraadi segamise kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  katseorganisme puudutav informatsioon (liik, vanus, keskmine kaal ja kaalude vahemik, hoidmise ja paljundamise tingimused, tarnija);
               
            
                  —
               
               
                  LC50 määramiseks kasutatud meetod;
               
            
                  —
               
               
                  katse tulemused koos kõigi kasutatud andmetega;
               
            
                  —
               
               
                  katseorganismidel täheldatud sümptomite või käitumise muutuste kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  surevus kontrollides;
               
            
                  —
               
               
                  LC50 või kõrgeim katsetatud ilma surevuseta kontsentratsioon ja madalaim 100 %lise surevusega katsetatud kontsentratsioon 14 päeva (ja valikuliselt seitse päeva) pärast katse alustamist;
               
            
                  —
               
               
                  kontsentratsiooni/vastusreaktsiooni kõvera joonistamine;
               
            
                  —
               
               
                  võrdlusaine abil saadud tulemused, kas seoses käesoleva katsega või varasematest kvaliteedikontrollidest.
               
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 207, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2)
               
               
                  Edwards, C. A. and Lofty, J. R., 1977, Biology of Earthworms, Chapman and Hall, London, p. 331.
               
            
                  3)
               
               
                  Bouche, M. B., 1972, Lombriciens de France, Ecologie et Systematique, Institut National de la Recherche Agronomique, 671 pp.
               
            
                  4)
               
               
                  Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method of evaluation dose effect experiments./. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, p. 99.
               
            
                  5)
               
               
                  Commission of the European Communities, Development of a standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.
               
            
                  6)
               
               
                  Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorsch-lag „Toxizitätstest am Regenwurm Eisenia foetida in künstlichem Boden”, in: Rudolph/Boje, Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.
               
            
         Liide
         Vihmausside kasvatamine ja hoidmine enne uurimist
         Loomade paljundamiseks pannakse 30 kuni 50 täiskasvanud ussi värske substraadiga kasvatamise karpi, kust nad võetakse välja 14 päeva pärast. Neid loomi võib kasutada edaspidiste paljundamiste jaoks. Kookonitest koorunud vihmausse kasutatakse uuringuks, kui nad on täiskasvanud (ettenähtud tingimustes kahe või kolme kuu pärast).
         Hoidmise ja paljundamise tingimused
         
                     Kliimakamber
                  
                  
                     :
                  
                  
                     temperatuur 20 ± 2 oC, eelistatavalt pidevas valguses (intensiivsus 400 kuni 800 luksi).
                  
               
                     Kasvatamise karbid
                  
                  
                     :
                  
                  
                     sobivad 10 kuni 20 1 mahuga madalad anumad.
                  
               
                     Substraat
                  
                  
                     :
                  
                  
                     
                        Eisenia foetida’t võib kasvatada erinevate loomade ekskrementides. Kasvukeskkonnana soovitatakse 50 % turba ja 50 % lehma- või hobusesõnniku segu. Segu pH peaks olema 6 kuni 7 (reguleerida kaltsiumkarbonaadiga) ja ioonjuhtivus madal (väiksem kui 6 mmhos või 0,5 % soola kontsentratsioon).
                     Substraat peab olema niiske, kuid mitte liiga märg.
                     Lisaks ülaltoodud meetodile võib kasutada ka teisi tulemuslikke metoodikaid.
                  
               
            Märkus. Olemas on mitu Eisenia foetida rassi, mida mõned taksonomistid on eristanud liikidena (Bouche, 1972). Need on morfoloogiliselt sarnased, välja arvatud Eisenia foetida foetida, mille segmendid on tüüpiliselt põikitriipude või –ribadega, ja Eisenia foetida andrei, millel need puuduvad ja punane värvus on varieerunud. Võib kasutada teisi liike, kui vajalik metoodika on olemas.
      
      C.9.   BIODEGRADATSIOON ZAHNI-WELLENSI KATSE
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesolev meetod on mõeldud vesilahustuvate mittelenduvate orgaaniliste ainete täieliku biodegradatsiooni hindamiseks staatilises katses, eksponeerituna suhteliselt suurele mikroorganismide kontsentratsioonile.
      Võimalik on füüsikalis-keemiline adsorptsioon suspendeeritud kuivainele, mida tuleks arvestada tulemuste interpreteerimisel (vt 3.2).
      Uuritavaid aineid kasutatakse kontsentratsioonides, mis vastavad LOS-väärtustele vahemikus 50 kuni 400 mg/l või KHT-väärtustele vahemikus 100 kuni 1 000 mg/l (LOS = lahustunud orgaaniline süsinik, KHT = keemiline hapnikutarve). Nende suhteliselt suurte kontsentratsioonide eeliseks on analüütiline usaldusväärsus. Toksilise toimega ühendid võivad lagunemisprotsessi aeglustada või inhibeerida.
      Selle meetodi puhul kasutatakse uuritava aine täieliku bioloogilise lagunemise hindamiseks lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarve mõõtmist.
      Samaaegne spetsiifilise analüüsimeetodi rakendamine võib anda võimaluse määrata aine primaarset biolagunemist (eelühendi keemilise struktuuri kadumine).
      Meetod on kasutatav ainult nende uuritavate orgaaniliste ainete puhul, mis katses kasutatud kontsentratsiooni juures
      
                  —
               
               
                  on katsetingimustel veeslahustuvad;
               
            
                  —
               
               
                  omavad katsetingimustel ebaolulist aururõhku;
               
            
                  —
               
               
                  ei ole bakterite suhtes pärssiva toimega;
               
            
                  —
               
               
                  imenduvad katsesüsteemi vaid piiratud ulatuses;
               
            
                  —
               
               
                  ei kao katselahusest vahu tekke tulemusena.
               
            Katsetulemuste tõlgendamisel on kasulik teada uuritava materjali põhikomponentide kohta käivat teavet. Seda eelkõige juhtudel, kui tulemused on väga väikesed või alammääralised.
      Teave uuritava aine toksilisusest mikroorganismidele on vajalik väikeste tulemuste tõlgendamisel ja sobivate kontsentratsioonide valimisel.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Katse lõpuks saavutatud biolagunemise määr on Zahni-Wellensi testis tuntud kui „biolagunemine”:
      
         
      kus:
      
                  DT
               
               
                  =
               
               
                  biodegradatsioon (%) ajahetkel T,
               
            
                  CA
                  
               
               
                  =
               
               
                  LOS- (või KHT-) väärtused katsesegus kolm tundi pärast katse algust (mg/l) (LOS = lahustunud orgaaniline süsinik, KHT = keemiline hapnikutarve),
               
            
                  CT
                  
               
               
                  =
               
               
                  LOS- või KHT-väärtused katsesegus proovi võtmise ajal (mg/l),
               
            
                  CB
                  
               
               
                  =
               
               
                  LOS- või KHT-väärtused „tühja” proovi võtmise ajal (mg/l),
               
            
                  CBA
                  
               
               
                  =
               
               
                  tühja proovi LOS- või KHT-väärtused, mõõdetuna kolm tundi pärast testi algust (mg/l).
               
            Lagunemise ulatus ümardatakse lähima täisarvulise protsendini.
      Lagunemise protsent esitatakse kui LOSi (või KHT) eraldamine testitavast ainest.
      Erinevus kolme tunni järel mõõdetud väärtuse ja arvutatud või eelistatult mõõdetud algväärtuse vahel võib anda kasulikku informatsiooni aine eliminatsiooni kohta (vt 3.2 „Tulemuste tõlgendamine”).
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Mõnel juhul, kui uuritakse uusi aineid, võivad võrdlusained olla kasulikud, siiski ei saa veel soovitada spetsiifilisi võrdlusaineid.
      1.4.   UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE
      Aktiivmuda, mineraalsed toitained ja uuritav materjal (ainuke süsiniku allikas vesilahuses) segatakse kokku ühe-kuni neljaliitrises klaasanumas, mis on varustatud segisti ja aeraatoriga. Segu segatakse ja aereeritakse 20 kuni 25 oC juures üldvalgustatud või pimedas ruumis kuni 28 päeva. Lagunemisprotsessi jälgitakse LOS- (või KHT-) väärtuste määramisel filtreeritud lahuses, mida tehakse iga päev või muude sobivate ajavahemike järel. Kõikide ajavahemike järel mõõdetud elimineeritud LOS- (või KHT-) väärtuste suhet kolme tunni möödumisel saadud näitajaga väljendatakse protsentides biodegradatsioonina. Saadud tulemus näitab degradatsiooni ulatust antud ajavahemikus.
      Kui kasutatakse spetsiifilist analüüsimeetodit, saab mõõta biodegradatsioonist tingitud eellasmolekuli kontsentratsiooni muutusi (primaarne biodegradatsioon).
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Käesoleva katse korduvteostatavus on ringtesti järgi piisav.
      Käesoleva meetodi tundlikkuse määrab suures osas põhilahuse varieeruvus ning vähesemal määral lahustunud orgaanilise süsiniku määramise täpsus ja uuritava ühendi sisaldus vedelikus iga tsükli alguses.
      1.6.   KATSEPROTSEDUURI KIRJELDUS
      1.6.1.   Ettevalmistused
      
      1.6.1.1.   Reagendid
      
      Uuritav vesi: joogivesi, mille orgaanilise süsiniku sisaldus on < 5 mg/l. Kaltsium- ja magneesiumioonide kontsentratsioon ei tohi koos ületada näitajat 2,7 mmol/l; vastasel juhul on vaja piisav lahjendus deioniseeritud või destilleeritud veega.
      
                  Väävelhape, analüüsi reagent (A.R.):
               
               
                  50 g/l
               
            
                  Naatriumihüdroksiidi lahus A.R.:
               
               
                  40 g/l
               
            
                  Mineraalainetega toitelahus: lahustada ühes liitris deioniseeritud vees:
               
               
                   
               
            
                  ammooniumkloriid, NH4Cl, A.R.:
               
               
                  38,5 g
               
            
                  naatriumdivesinikfosfaat, NaH2PO4.2H2O, A.R.:
               
               
                  33,4 g
               
            
                  kaaliumdivesinikfosfaat, KH2PO4, A.R.:
               
               
                  8,5 g
               
            
                  dikaaliumvesinikfosfaat, K2HPO4, A.R.:
               
               
                  21,75 g
               
            Segu on nii toitelahuseks kui ka puhversüsteemiks.
      1.6.1.2.   Seadmed
      
      Klaasnõud mahuga üks kuni neli liitrit (näiteks silindrilised anumad).
      Segisti klaasist või metallist segajaosaga sobiva varre küljes (segaja peaks pöörlema ligikaudu 5 kuni 10 cm kõrgemalt anuma põhjast). Kasutada võib ka 7 kuni 10 cm pikkuse pulgaga magnetsegajat.
      2 kuni 4 mm siseläbimõõduga klaastoru õhu sissejuhtimiseks. Toru avaus peaks olema ligikaudu 1 cm kõrgusel anuma põhjast.
      Tsentrifuug (ligikaudu 3 550 g).
      pH-meeter.
      Lahustunud hapniku mõõtmise seade.
      Paberfiltrid.
      Aparatuur membraanfiltreerimiseks.
      Membraanfiltrid poori läbimõõduga 0,45 μn. Membraanfiltrid on sobivad, kui on kindel, et nad ei lase läbi süsinikku ega absorbeeri aineid filtratsiooni etapis.
      Analüüsivarustus orgaanilise süsiniku sisalduse ja hapnikutarve määramiseks.
      1.6.1.3.   Inokulaadi valmistamine
      
      Reoveepuhastist pärit aktiivmuda pestakse (korduvalt) tsentrifuugimisel või katsevees setitamisel (vt ülalt).
      Aktiivmuda peab olema sobivate omadustega. Sellist muda saadakse õigesti töötavatest reoveepuhastitest. Võimalikult paljude erinevate bakteriliikide ja -tüvede saamiseks võib olla sobivaim meetod erinevatest allikatest pärit inokulaatide kokku segamine (näiteks erinevad reoveepuhastid, mullaekstraktid, jõevesi jne). Segu tuleb töödelda, nagu allpool kirjeldatud.
      Aktiivmuda aktiivsuse kontrollimiseks vt allpool „Funktsionaalne kontroll”.
      1.6.1.4.   Katselahuste valmistamine
      
      Valada anumasse 500 ml katsevett, 2,5 ml/l mineraalainetega toitelahust ja aktiivmuda koguses, mis annab lõpliku segu kuivaine sisalduseks 0,2 kuni 1,0 g/l. Lisada piisavalt uuritava aine põhilahust, et lõpliku segu LOS-kontsentratsioon oleks 50 kuni 400 mg/l. Vastavad KHT-väärtused on 100 kuni 1 000 mg/l. Lisage katsevett kuni üldkoguseks on üks kuni neli liitrit. Valitav lõppkogus oleneb KHT- ja LOS-määramiseks võetud proovide arvust ja analüüsiprotseduurideks vajalikust kogusest.
      Normaalsel juhul on piisavaks koguseks kaks liitrit. Paralleelselt iga katseseeriaga hakatakse kasutama vähemalt ühte kontrollnõud (tühi); see sisaldab ainult aktiivmuda ja mineraalainetega toitelahust, mis lahustatakse katseveega teiste anumates olevate lahustega sama koguseni.
      1.6.2.   Katse käik
      
      Katsenõudes olevat lahust segatakse magnetsegajaga või kruvipropelleriga üldvalgustatud või pimedas ruumis temperatuuril 20 kuni 25 oC. Aeratsiooni tehakse suruõhuga, mida puhastatakse vajaduse korral läbi puuvillast filtri või veega täidetud pesupudeli. Muda ei tohi settida ja hapniku kontsentratsioon ei tohi langeda alla 2 mg/l.
      pH-väärtust tuleb kontrollida regulaarsete ajavahemike järel (näiteks üks kord päevas) ja kohandada vajaduse korral väärtusele pH 7 kuni 8.
      Aurustumisest tingitud kaod taastatakse vahetult enne proovi võtmist deioniseeritud või destilleeritud veega vastavalt vajalikule kogusele. Soovitatav on enne testi alustamist märkida ära vedelikunivoo kõrgus anumas. Uued märked tehakse pärast iga proovi võtmist (aereerimise ja segamiseta). Esimesed proovid võetakse alati kolm tundi pärast katse alustamist, et kindlaks teha uuritava materjali adsorptsiooni aktiivmuda poolt.
      Uuritava aine eliminatsiooni jälgitakse LOS- ja KHT-määramistega iga päev või muude ajavahemike järel. Katse- ja kontrollnõust võetud proovid filtreeritakse läbi hoolikalt pestud paberfiltri. Esimesed 5 ml uuritavat lahusefiltraati visatakse ära. Raskesti filtreeritavad mudaosad eemaldatakse eelnevalt lOminutilise tsentrifuugimise teel. LOS- ja KHT-määramisi tehakse vähemalt kaks korda ühest proovist. Katse kestuseks on kuni 28 päeva.
      
         Märkus. Häguseks jäänud proovid filtreeritakse läbi membraanfiltrite. Membraanfiltrid ei tohi vabastada ega adsorbeerida ühtegi orgaanilist ainet.
      
         Aktiivmuda funktsionaalne kontroll
      
      Paralleelselt katseanumatega kasutatakse teatud kindlat lahust sisaldavat anumat, et kontrollida aktiivmuda funktsionaalsust. Dietüleenglükool on sellisel juhul osutunud kasulikuks kontroll-lahuseks.
      
         Adaptatsioon
      
      Kui analüüse tehakse suhteliselt lühikeste ajavahemike järel (näiteks kord päevas), on võimalik adaptatsiooni selgelt jälgida degradatsiooni kõveralt (vt joonis 2). Seetõttu ei tohiks katset alustada vahetult enne nädalavahetust.
      Kui adaptatsioon tekib perioodi lõpus, võib katset pikendada kuni degradatsiooni lõppemiseni.
      
         Märkus. Kui vajatakse täpsemat teavet adapteerunud muda käitumise kohta, võib sama aktiivmuda veel kord panna kokku sama uuritava materjaliga vastavalt järgnevalt kirjeldatud protseduurile:
      Lülitada segaja ja aeraator välja ja lasta aktiivmudal settida. Visata ära supernatant, täita anum katseveega kuni kahe liitrini, segada 15 minutit ja lasta jälle settida. Kui supernatant on jälle ära visatud, kasutage järelejäänud muda katse kordamiseks vastavalt eespool olevatele punktidele 1.6.1.4 ja 1.6.2. Aktiivmuda võib setitamise asemel eraldada ka tsentrifuugimise teel.
      Adapteerunud muda võib segada värske mudaga kontsentratsioonini 0,2 kuni 1 g kuivainet/l.
      
         Analüüsi käik
      
      Tavalisel juhul filtreeritakse proovid läbi hoolikalt pestud paberfiltri (pesemiseks kasutada ioniseeritud vett).
      Häguseks jäänud proovid filtreeritakse läbi membraanfiltrite (0,45 μm).
      LOS-kontsentratsiooni määratakse ühest proovi filtraadist kaks korda (esimesed 5 ml tuleb ära visata) TOC järgi. Kui infiltraati ei ole võimalik analüüsida samal päeval, tuleb seda kuni järgmise päevani säilitada külmkapis. Pikemaajaline säilitamine ei ole soovitatav.
      KHT-kontsentratsiooni määratakse proovi filtraatidest KHT-analüüsi meetodil, mida on kirjeldatud näitlikult allpool (2).
      2.   ANDMED JA HINDAMINE
      LOS- ja/või KHT-kontsentratsioone määratakse ühest proovist vähemalt kaks korda vastavalt eespool olevale punktile 1.6.2. Degradatsiooni ajahetkel T arvutatakse vastavalt valemile (definitsioonidega) mis on toodud eespool punktis 1.2.
      Degradatsiooni ulatus ümardatakse lähima täisarvulise protsendini. Katse lõpus kindlaks tehtud degradatsiooni näitajat esitatakse kui „Biolagundatavus Zahni-Wellensi testi järgi”.
      
         Märkus. Kui täielik degradatsioon saavutatakse enne katseaja lõppemist ja seda tulemust kinnitatakse järgneval päeval, võib katse lõpetada.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Võimaluse korral peaks katsearuanne sisaldama järgmist teavet:
      
                  —
               
               
                  uuritava aine algkontsentratsioon;
               
            
                  —
               
               
                  kogu ülejäänud teave ja kõik katsetulemused, mis puudutavad uuritavat ainet, võrdlusainet (kui kasutati) ja tühja proovi;
               
            
                  —
               
               
                  kontsentratsioon kolme tunni pärast;
               
            
                  —
               
               
                  biodegradatsiooni kõver koos selgitustega;
               
            
                  —
               
               
                  kuupäev ja koht, kust võeti uuritavate organismide proov, adapteerumise kirjeldus, kasutatud kontsentratsioon jne;
               
            
                  —
               
               
                  uuringuprotseduuri muutuste teaduslik põhjendus.
               
            3.2.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE
      LOS (KHT) vähenemine, mis leiab aset järk-järgult päevade ja nädalate jooksul, viitab uuritava aine biodegradeerumisele.
      Mõnikord võib olulist rolli mängida füüsikalis-keemiline adsorptsioon. See on näidatud juhul, kui esineb täielik või osaline lisatud LOS-eliminatsioon alguses (esimese kolme tunni jooksul) ning erinevused kontrolli ja katse supernatandi vahel jäävad oodatust väiksemateks.
      Kui biodegradatsiooni (või osalise biodegradatsiooni) ja adsorptsiooni tuleb eristada, on vajalikud täiendavad katsed.
      Seda saab teha mitmel erineval viisil, kuid kõige usaldusväärsem on supernatantvedeliku või muda kasutamine inokulaadina baasuuringu raames (eelistatult respiromeetriline uuring).
      Selles uuringus tuleks kõrgeid, adsorptsiooni teel mitte eemaldatavaid LOS (KHT) tulemusi pidada potentsiaalselt biolagundatavateks. Osaline adsorptsiooni teel mitteeemaldamine viitab sellele, et kemikaal allub vähemalt osalisele biodegradatsioonile. LOS-eemaldamise madalate või null-näitajate põhjuseks võib olla mikroorganismide pärssimine uuritava aine poolt ja selle võib vallandada ka muda lõhustamine või kadu, mis tekitab häguse supernatandi. Testi tuleks korrata, kasutades uuritava aine madalamaid kontsentratsioone.
      Spetsiifilise analüütilise meetodi või 14C-märgistatud uuritava aine kasutamine võib anda suurema tundlikkuse. 14C testi ühendi kasutamisel 14CO2 sedastamine kinnitab biodegradatsiooni teket.
      Kui tulemusi antakse ka primaarse biodegradatsiooni kohta, tuleks võimaluse korral anda selgitus keemilise struktuuri muutustele, mis viib uuritava eellasühendi vastusreaktsiooni kadumisele.
      Analüütilise meetodi kinnitus tuleb edastada koos vastusega, mis saadi puhta katsekeskkonna kohta.
      4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2)
               
               
                  Annex V C.9 Degradation: Chemical Oxygen Demand, Commission Directive 84/449/EEC (OJ L 251, 19.9.1984, p. 1).
               
            
         Liide
         HINDAMISE NÄIDE
         
                     Orgaaniline ühend:
                  
                  
                     4-etoksübensoehape
                  
               
                     Teoreetiline katsekontsentratsioon:
                  
                  
                     600 mg/1
                  
               
                     Teoreetiline LOS:
                  
                  
                     390 mg/1
                  
               
                     Inokulaat
                  
                  
                     reoveepuhasti
                  
               
                     Kontsentratsioon:
                  
                  
                     1 g kuivainet/l
                  
               
                     Adaptatsiooni tase:
                  
                  
                     Pole kohandatud
                  
               
                     Analüüs:
                  
                  
                     LOS-määramine
                  
               
                     Proovi kogus:
                  
                  
                     3 ml
                  
               
                     Kontrollaine:
                  
                  
                     Dietüleenglükool
                  
               
                     Ühendi toksilisus:
                  
                  
                     Toksilised toimed puuduvad kontsentratsioonil alla 1 000 mg/1
                     Kasutatud test: ensümaatiline test
                  
               
            
         
                     Katseaeg
                  
                  
                     Kontrollaine
                  
                  
                     Katseaine
                  
               
                     Tühi
                     LOS (16)
                     
                     mg/l
                  
                  
                     LOS (16)
                     
                     mg/l
                  
                  
                     LOS, puhas
                     mg/1
                  
                  
                     Degradatsioon
                     %
                  
                  
                     LOS (16)
                     
                     mg/1
                  
                  
                     LOS, puhas
                     mg/1
                  
                  
                     Degradatsioon
                     %
                  
               
                     0
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
                  
                     300,0
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
                  
                     390,0
                  
                  
                     —
                  
               
                     3 tundi
                  
                  
                     4,0
                  
                  
                     298,0
                  
                  
                     294,0
                  
                  
                     2
                  
                  
                     371,6
                  
                  
                     367,6
                  
                  
                     6
                  
               
                     1 päev
                  
                  
                     6,1
                  
                  
                     288,3
                  
                  
                     282,2
                  
                  
                     6
                  
                  
                     373,3
                  
                  
                     367,2
                  
                  
                     6
                  
               
                     2 päeva
                  
                  
                     5,0
                  
                  
                     281,2
                  
                  
                     276,2
                  
                  
                     8
                  
                  
                     360,0
                  
                  
                     355,0
                  
                  
                     9
                  
               
                     5 päeva
                  
                  
                     6,3
                  
                  
                     270,5
                  
                  
                     264,2
                  
                  
                     12
                  
                  
                     193,8
                  
                  
                     187,5
                  
                  
                     52
                  
               
                     6 päeva
                  
                  
                     7,4
                  
                  
                     253,3
                  
                  
                     245,9
                  
                  
                     18
                  
                  
                     143,9
                  
                  
                     136,5
                  
                  
                     65
                  
               
                     7 päeva
                  
                  
                     11,3
                  
                  
                     212,5
                  
                  
                     201,2
                  
                  
                     33
                  
                  
                     104,5
                  
                  
                     93,2
                  
                  
                     76
                  
               
                     8 päeva
                  
                  
                     7,8
                  
                  
                     142,5
                  
                  
                     134,7
                  
                  
                     55
                  
                  
                     58,9
                  
                  
                     51,1
                  
                  
                     87
                  
               
                     9 päeva
                  
                  
                     7,0
                  
                  
                     35,0
                  
                  
                     28,0
                  
                  
                     91
                  
                  
                     18,1
                  
                  
                     11,1
                  
                  
                     97
                  
               
                     10 päeva
                  
                  
                     18,0
                  
                  
                     37,0
                  
                  
                     19,0
                  
                  
                     94
                  
                  
                     20,0
                  
                  
                     2,0
                  
                  
                     99
                  
               Joonis 1
         Biodegradatsioonikõverate näited
         
            
         Joonis 2
         Aktiivmuda adaptatsiooni näited
         
            
      
      C.10.   BIODEGRADATSIOON AKTIIVMUDA SIMULATSIOONIKATSED
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      1.1.1.   Üldmärkused
      
      Meetod sobib ainult nende orgaaniliste ainete puhul, mis katses kastutatava kontsentratsiooni juures:
      
                  —
               
               
                  on veeslahustuvad katselahuste valmistamiseks vajalikus ulatuses;
               
            
                  —
               
               
                  omavad katsetingimustel tühist küllastatud aururõhku;
               
            
                  —
               
               
                  ei ole katsetingimustes bakterite suhtes pärssiva toimega.
               
            Katsetulemuste tõlgendamisel on kasulik teada uuritava materjali põhikomponentide kohta käivat informatsiooni. Seda eelkõige juhtudel, kui tulemused on väga väikesed või alammääralised.
      Informatsioon aine toksilisuse kohta mikroorganismide suhtes võib olla kasulik väikeste tulemuste interpreteerimisel ja katseks sobiva kontsentratsiooni valimisel.
      1.1.2.   Lõpliku biolagundatavuse määramine (LOS-/KHT-analüüs)
      
      Käesolev meetod on mõeldud lõpliku biolagundatavuse hindamiseks, määrates reoveepuhasti aktiivmudast uuritava aine või metaboliitide eliminatsiooni > 12 mg LOS/l (või ligikaudu 40 mg KHS/l); 20 mg LOS/1 tundub olevat optimaalne. (LOS = lahustunud orgaaniline süsinik, KHT = keemiline hapnikutarve.)
      Määrata tuleb uuritavast materjalist orgaanilise süsiniku sisaldus (või keemiline hapnikutarve).
      1.1.3.   Primaarse biolagundatavuse määramine (erianalüüs)
      
      Meetodi eesmärk on reoveepuhasti aktiivmudas oleva uuritava aine primaarse biolagundatavuse määramine kontsentratsioonil ligikaudu 20 mg/l, kasutades spetsiifilist analüüsimeetodit (kasutada võib väiksemaid või suuremaid kontsentratsioone, kui analüüsimeetod ja toksilisuse näitajad seda võimaldavad). Nii on võimalik määrata uuritava aine primaarset biolagundatavust (eelühendi keemilise struktuuri kadumine).
      Käesoleva meetodi eesmärgiks ei ole uuritava aine mineralisatsiooni määramine.
      Vajalik on uuritava aine määramiseks sobiva analüüsimeetodi kasutamise võimalus.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      1.2.1.   LOS-/KHT-analüüs
      
      Aine eliminatsiooni aste on antud järgmiselt:
      
                  
                     
               
               
                  [1(a)]
               
            kus:
      
                  DR
               
               
                  =
               
               
                  LOS- (või KHT-) eliminatsiooni aste protsentides uuritavale ainele vastavalt etteantud viibeaja juures,
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  uuritava aine kontsentratsioon sissevoolus mg-des LOS/l (või m-des KHT/l),
               
            
                  E
               
               
                  =
               
               
                  LOS- (või KHT-) kontsentratsioon katseseadmes mg-des LOS/l (või mg-des KHT/1),
               
            
                  E0
                  
               
               
                  =
               
               
                  LOS- (või KHT-) kontsentratsioon kontrollseadmes mg-des LOS/l (või mg-des KHT D/l).
               
            Degradatsiooni väljendatakse LOSi (või KHT) protsentuaalse eliminatsioonina uuritavale ainele vastavalt etteantud viibeaja juures.
      1.2.2.   Erianalüüs
      
      Veefaasis (Rw) uuritava aine eliminatsioon protsentides on etteantud viibeaja juures esitatud järgmiselt:
      
                  
                     
               
               
                  [1(b)]
               
            kus:
      
                  C1
                  
               
               
                  =
               
               
                  uuritava aine kontsentratsioon katseseadme sissevoolus (mg ainet/l, määratuna erianalüüsiga),
               
            
                  Co
                  
               
               
                  =
               
               
                  uuritava aine kontsentratsioon katseseadme väljavoolus (mg ainet/l, määratuna erianalüüsiga).
               
            1.3.   VÕRDLUSAINED
      Osadel juhtudel võib uue aine uurimisel olla kasu võrdlusainete kasutamisest. Siinjuures ei tooda aga ära spetsiifilisi võrdlusaineid.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTTED
      Maksimaalse biolagundatavuse määramiseks kasutatakse paralleelselt kahte aktiivmuda katseseadet (OECD tõendav uuring või „poorne pott”). Ühe seadme sissevoolu (kunstlik või olmereovesi) lisatakse uuritavat ainet, teise seadmesse lastakse ainult reovett. Primaarse biolagundatavuse määramiseks erianalüüsidega, mis tehakse sissevoolust ja väljavoolust, kasutatakse ainult ühte seadet.
      Väljavoolus mõõdetakse LOS- või KHT-kontsentratsiooni või määratakse aine kontsentratsioonid erianalüüside abil.
      Uuritavast ainest tingitud LOS-i ei mõõdeta, vaid lihtsalt konstateeritakse selle olemasolu.
      LOS- või KHT-mõõtmiste tegemisel eeldatakse, et katse- ja kontrollväljavoolude keskmiste kontsentratsioonide erinevused tulenevad lagundamata uuritavast materjalist.
      Erianalüüside tegemisel võib mõõta eellasmolekuli kontsentratsioonierinevusi (primaarne biolagundamine).
      Transinokulatsiooni protseduuri kasutades võib seadmeid lasta töötada „ühendatud seadmete” meetodil.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Aine algkontsentratsioon sõltub tehtava analüüsi tüübist ja selle piirangutest.
      1.6.   UURINGUMEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Ettevalmistused
      
      1.6.1.1.   Seadmed
      
      Vaja on ühetüübiliste seadmete paari, välja arvatud juhul, kui tehakse erianalüüse. Kasutada võib kahte tüüpi seadmeid.
      OECD tõendav uuring
      Seadmestik (1. liide) koosneb kunstliku reovee säilitusnõust (A), doseerimispumbast (B), aeratsiooninõust (C), separaatorist (D), õhupumbast (E) aktiivmuda retsükleerimiseks ja töödeldud väljavoolu kogumisnõust (F).
      Anumad (A) ja (F) peavad olema klaasist või sobivast plastikust ning mahutama vähemalt 24 liitrit vedelikku. Pump (B) peab tagama kunstliku reovee pideva voolu aeratsiooninõusse; kasutada võib mis tahes sobivat süsteemi, mis kindlustab kunstliku reovee püsiva kontsentratsiooni ja sissevoolamise aeratsiooninõusse. Seadme normaalse töötamise käigus on separaatori (D) kõrgus fikseeritud niimoodi, et aeratsiooninõus sisalduva vedeliku maht on kolm liitrit. Aeraator (G) riputatakse nõusse (C) koonuse tipu juurde. Aeraatorit läbiva õhu hulka võib mõõta õhuvoolumõõtjaga.
      Õhupump (E) on paigutatud nii, et aktiivmuda retsükleeritakse pidevalt ja korrapäraselt separaatorist aeratsiooninõusse (C).
      „Poorne pott”
      Poorne pott on konstrueeritud poorse polüetüleeni lehtedest (lehe paksus 2 mm, poori maksimaalne suurus 95 μm), millest on tehtud 14 cm läbimõõduga silindrid, mille põhjaks silindri suhtes 45o nurga all paiknev koonus (2. liites joonised 1 ja 2). Poorne pott on mahutatud sobivast plastikust mitteläbilaskvasse anumasse läbimõõduga 15 cm ning selle äravooluava paikneb anuma silindrilise osa 17,2 cm kõrgusel. See määrab poti mahu – 3 liitrit. Sisemise anuma ülaosa ümber on sobivast plastikust jäik tugiring, nii et sisemise ja välimise anuma vahele jääb 0,5 cm väljavooluvee ruum.
      Poorse poti võib paigaldada termostaatiliselt kontrollitava vesivanni põhja. Sisemise anuma põhjas on õhu ligipääsuava, millele paigaldatakse sobivad pihustid.
      Anumad A ja E peavad olema klaasist või sobivast plastikust ning mahutama vähemalt 24 liitrit. Pump B peab tagama kunstliku reovee pideva voolu aeratsiooninõusse; kasutada võib mis tahes sobivat süsteemi, mis kindlustab kunstliku reovee püsiva kontsentratsiooni ja sissevoolamise aeratsiooninõusse.
      Tagavaraks on vaja poorse poti sisemisi anumaid, asendamaks töö käigus ummistunud potte. Ummistunud potte puhastatakse sukeldades nad 24 tunniks hüpokloriti lahusesse ja pestes neid seejärel hoolikalt kraanivee all.
      1.6.1.2.   Filtreerimine
      
      Filtreerimisseade ja membraanfiltrid, mille poori suurus on 0,45 μm. Membraanfiltrid sobivad juhul, kui on kindel, et neist ei eraldu süsinikku ning neile ei adsorbeeru filtreerimise käigus ainet.
      1.6.1.3.   Reovesi
      
      Kasutada võib nii kunstlikku reovett kui ka olmereovett.
      Kunstliku reovee näiteid
      Lahustada 1 liitris kraanivees:
      
                  peptoon:
               
               
                  160 mg,
               
            
                  lihaekstrakt:
               
               
                  110 mg,
               
            
                  uurea:
               
               
                  30 mg,
               
            
                  NaCl:
               
               
                  7 mg,
               
            
                  CaCl2.2H2O:
               
               
                  4 mg,
               
            
                  MgSO4.7H2O:
               
               
                  2 mg,
               
            
                  K2HPO4
                  
               
               
                  28 mg.
               
            Olmereovesi
      Olmereovett tuleks koguda iga päev uuesti põhiliselt olmereovett töötleva biopuhasti eelsetitustanki ülevoolust.
      1.6.1.4.   Põhilahus uuritava ainega
      
      Katseseadmesse lisamiseks valmistatakse uuritava aine lahus, nt 1 %line. Aine kontsentratsioon peab olema määratud selline, et vajaliku reoveele lisatava või (teise pumba abil) vahetult seadmesse lisatava vedeliku ruumala on teada.
      1.6.1.5.   Inokulaat
      
      
         Märkus. Olmereovee kasutamisel pole mõtet kasutada madala bakterite kontsentratsiooniga inokulaati, kuid võib kasutada aktiivmuda.
      Kasutada võib mitmeid erinevaid inokulaate.
      Toodud on kolm sobiva inokulaadi näidet.
      
                  a)
               
               
                  Inokulaat sekundaarsest väljavoolust
                  See inokulaat varutakse kvaliteetsest sekundaarsest väljavoolust, mis on kogutud põhiliselt olmereovett töötlevast biopuhastist. Kogumise ja kasutamise vahel peab väljavooluvett hoidma aeroobsetes tingimustes. Inokulaadi valmistamiseks filtreeritakse kogutud materjal läbi jämeda filtri, esimesed 200 ml eemaldatakse. Filtraati hoitakse kasutamiseni aeroobsetes tingimustes. Inokulaati peab kasutama kogumise päeval. Inokuleerimiseks kasutatakse vähemalt 3 ml.
               
            
                  b)
               
               
                  Segainokulaat
                  Inokulaat sekundaarsest väljavoolust:
                  vt kirjeldust ülal.
                  Inokulaat mullast:
                  100 g aiamulda (fertiilset, mitte steriilset) suspendeeritakse 1 000 ml kloorivabas joogivees. (Väga suurt savi-, liiva- või huumusefraktsiooni sisaldavad mullad ei sobi.) Pärast läbisegamist lastakse suspensioonil 30 minutit settida. Supernatant filtreeritakse läbi jämeda filterpaberi. Esimesed 200 ml eemaldatakse. Filtraati hakatakse kohe aereerima ning seda tehakse kasutamiseni. Inokulaati peab kasutama samal päeval, mil see koguti.
                  Inokulaat pinnaveest:
                  inokulaadi järgmine osa võetakse mesosaproobsest pinnaveest. Materjal filtreeritakse läbi jämeda filtri, esimesed 200 ml eemaldatakse. Filtraati hoitakse aeroobsetes tingimustes kuni kasutamiseni. Inokulaati peab kasutama kogumise päeval.
                  Kolm osa inokulaati segatakse kokku võrdsetes ruumalades, segatakse hästi läbi, ning lõplik inokulaat võetakse sellest segust. Inokulaadiks kasutatakse vähemalt 3 ml.
               
            
                  c)
               
               
                  Inokulaat aktiivmudast
                  Inokulaadina võib kasutada peamiselt olmereovett töötleva biopuhasti aeratsioonimahutist teatud mahus (mitte üle 3 l) võetud aktiivmuda (suspendeerunud tahke aine sisaldusega kuni 2,5 g/l).
               
            1.6.2.   Protseduur
      
      Uuring tehakse toatemperatuuril, mida hoitakse 18 ja 25 oC vahemikus.
      Sobival juhul võib uuringut teha madalamal temperatuuril (mitte alla 10 oC); juhul kui uuritav aine lagundub, pole edasine tegevus vajalik. Kui aine siiski ei lagune, tuleb katset teha püsival temperatuuril 18 ja 25 oC vahel.
      1.6.2.1.   Sissetöötamise periood: muda teke/seadmete stabiliseerumine
      
      Aktiivmuda kasvu/stabiliseerumise perioodil jõuab aktiivmuda tahke faasi kontsentratsioon ja seadmete töö rakendatud töötingimuste juures püsivasse olekusse.
      Sissetöötamisperiood kestab uuritava aine lisamisest ajani, mil selle bioärastamise kiirus jõuab platooni (suhteliselt püsiva suuruseni). See ajavahemik ei tohi ületada kuut nädalat.
      Hindamisperiood on kolmenädalane ajavahemik alates ajast, mil uuritava aine bioärastamine jõuab suhteliselt püsiva ja tavaliselt kõrge väärtuseni. Ainete puhul, mida esimese kuue nädala jooksul lagundatakse vähe või üldse mitte, loetakse hindamisperioodiks järgnevad kolm nädalat.
      Esiteks täidetakse ühe testi jaoks vajalik seade (vajalikud seadmed) sissevooluga, millesse on segatud inokulaat.
      Siis pannakse tööle aeraator (OECD tõendava testi seadmete puhul ka õhupump (E)) ja doseerimisseade (B).
      Sissevool ilma uuritava aineta peab läbima aeratsiooninõu (C) kiirusel üks liiter tunnis või pool liitrit tunnis, mis annab keskmiseks retentsiooniajaks kas kolm või kuus tundi.
      Aeratsioonikiirust reguleeritakse selliselt, et anumas (C) sisalduva suspensiooni hapnikusisaldus on püsivalt vähemalt 2 mg/l.
      Vahutamist peab sobivate vahenditega ära hoidma. Ei tohi kasutada aktiivmuda inhibeerivaid vahutamisvastaseid aineid.
      Aeratsiooninõu (C) ülemise osa ümber (ning OECD tõendava testi seadmete kasutamise korral setitusnõu (D) põhja ja tsirkulatsiooniringi) kogunenud aktiivmuda peab viima tagasi vedelikku vähemalt kord päevas, harjamise või muu sobiva vahendi abil.
      Kui muda ei setti, võib selle tihedust suurendada 5 % raudkloriidi lahuse lisamisega 2 ml annuste kaupa, vajaduse korral tuleb teha seda korduvalt.
      Väljavoolu kogutakse nõusse (E või F) 20 kuni 24 tunni kestel, proov võetakse pärast põhjalikku segamist. Nõu (E või F) peab olema hoolikalt puhastatud.
      Protsessi efektiivsuse jälgimiseks ja kontrollimiseks mõõdetakse (vähemalt kaks korda nädalas) kogunenud väljavoolu filtraadi keemiline hapnikutarve (KHT) või lahustunud orgaaniline süsinik (LOS). Sama näitaja määratakse filtreeritud sissevoolus (kasutades 0,45 μm poori suurusega membraanfiltrit, filtraadi esimesed (ligikaudu) 20 ml eemaldatakse).
      KHT või LOS-i vähenemine peaks ühtlustuma, kui enam-vähem korrapärane päevane biolagundatavus on saavutatud.
      Aeratsioonimahutis oleva aktiivmuda kuivainesisaldust määratakse kaks korda nädalas (grammides liitri kohta). Seadmed võivad töötada kahel viisil: 1) aktiivmuda kuivainesisaldust mõõdetakse kaks korda nädalas ning kui see ületab 2,5 g/l, peab liigmuda eemaldama, või 2) eemaldatakse iga päev igast potist 500 ml vedelikku, et keskmiseks aktiivmuda viibeajaks kujuneks kuus päeva.
      Kui mõõdetud ja hinnatud parameetrid (protsessi efektiivsus (KHT- või LOS-ärastamisena), muda kontsentratsioon, muda settivus, väljavoolu hägusus jne) on piisavalt püsivad, võib ühe seadme sissevoolu lisada uuritavat ainet, järgides punkti 1.6.2.2.
      Teise võimalusena võib uuritava aine lisada muda kasvuperioodi alguses (1.6.2.1), eriti siis, kui muda kasutatakse inokulaadina.
      1.6.2.2.   Uuringuprotseduur
      
      Säilitatakse sissetöötamisperioodi töötingimusi ning lisatakse piisavas koguses uuritava materjali põhilahust (ligikaudu 1 %) katseseadme sissevoolu, nii et reovees saavutatakse testitava materjali soovitud kontsentratsioon (ligikaudu 10 kuni 20 mg LOS-i liitris või 40 mg KHT-d liitris). Selleks võib reoveele iga päev põhilahust juurde segada või kasutada eraldi pumpamissüsteemi. Soovitud kontsentratsioonini võib jõuda seda pidevalt kasvatades. Juhul kui uuritaval ainel ei ole aktiivmudale toksilist mõju, võib katsetada ka kõrgemaid kontsentratsioone.
      Teise seade toiteks kasutatakse ainult sissevoolu, millesse muid aineid pole lisatud. Analüüside jaoks võetakse sobivas ruumalas väljavoolu ning filtreeritakse see läbi membraanfiltrite (0,45 μm), esimesed (ligikaudu) 20 ml filtraati eemaldatakse.
      Filtreeritud proove peab analüüsima samal päeval, vastasel juhul peab neid säilitama mingil sobival meetodil, nt kasutades 0,05 ml 1 % elavhõbedakloriidi (HgCl2) lahust filtraadi iga 10 ml kohta, või säilitades proove 2 kuni 4 oC juures kuni 24 tundi, või alla –18 oC juures pikemate ajavahemike vältel.
      Sissetöötamisaeg koos uuritava aine lisamisega ei tohiks ületada kuut nädalat ning hindamisperiood ei tohiks olla lühem kui kolm nädalat, st lõpliku tulemuse arvestamiseks peaks kasutama umbes 14 kuni 20 määratud proovi.
      Ühendatud seadmete meetod
      Seadmete seostamine saavutatakse, kui vahetatakse kord päevas 1,5 liitrit vedelikusegu (sh aktiivmuda) kahe seadme aktiivmuda aeratsiooninõude vahel. Tugevalt absorbeerivate testmaterjalide puhul võetakse setitusnõu pinnalt 1,5 1 supernatanti ning valatakse see teise seadme aktiivmudanõusse.
      1.6.2.3.   Analüüs
      
      Jälgides uuritava aine käitumist, võib teha kahte tüüpi analüüse.
      LOS ja KHT
      LOS-kontsentratsioonide analüüse tehakse kahekordselt süsinikuanalüsaatoriga ja/või analüüsitakse KHT-d vastavalt viitele 2.
      Erianalüüsid
      Uuritava aine kontsentratsioone mõõdetakse sobiva analüüsimeetodiga. Võimaluse korral tuleb kindlaks teha mudale absorbeerunud ained.
      2.   ANDMED JA HINDAMINE
      2.1.   ÜHENDATUD SEADMETE MEETOD
      Ühendatud seadmete meetodi kasutamisel arvutatakse päevane aine bioärastamise hulk (ABH) ühes päevas vastavalt punktile 1.2.1.
      Päevased aine bioärastamise hulgad ABH teisendatakse ABHc-ks transinokulatsiooniprotseduurist tingitud materjali ülekandmise jaoks, kolmetunnise keskmise retentsiooniaja puhul vastavalt võrrandile (2), kuuetunnise keskmise retentsiooniaja puhul vastavalt võrrandile (3).
      
                  
                     
               
               
                  [2]
               
            
                  
                     
               
               
                  Arvutatakse ABHc väärtuste seeriate keskväärtus ning lisaks standardhälve vastavalt valemile (3).
               
            Arvutatakse ABHc väärtuste seeriate keskväärtus ning lisaks standardhälve vastavalt valemile (4).
      
                  
                     
               
               
                  [4]
               
            kus:
      
                  SABHc
                  
               
               
                  =
               
               
                  ABHc väärtuste seeria standardhälve,
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  ABHc väärtuse keskväärtus,
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  mõõtmiste arv.
               
            ABHc seeriate need väärtused, mis teistest tugevasti erinevad, jäetakse arvutustest välja mõne sobiva statistilise protseduuri abil, nt Nalimov (6), ning arvutatakse ABHc andmetest uuesti keskmine ja standardhälve 95 % usaldusnivool.
      Lõplik tulemus arvutatakse vastavalt valemile (5)
      
                  
                     
               
               
                  [5]
               
            kus:
      
                  tn–1;α
               
               
                  =
               
               
                  tabelist leitud t-statistiku väärtus n-i E ja Eo väärtuste paaride juures, 95 % tõenäosusega P = 95 % (P = 1–α, kus a on olulisuse nivoo).
               
            Tulemus esitatakse keskmisena koos 95 % tolerantsipiiridega, vastava standardhälbega ja ABHc andmestikus, kust tugevasti erinevad andmed on välja jäetud, sisalduvate andmete arvuga ning nende väljajäetute arvuga, nt
      
                  ABHc
               
               
                  =
               
               
                  98,6 ±2,3 % LOS-bioärastamisest,
               
            
                  s
               
               
                  =
               
               
                  4,65 % LOS-bioärastamisest,
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  18,
               
            
                  x
               
               
                  =
               
               
                  välja jäetud tugevasti erinevate mõõtmiste arv.
               
            2.2.   SEOSTAMATA SEADMETE MEETOD
      Seadmete töötamist võib kontrollida järgmiselt:
      
         
      Päevased bioärastamishulgad võib esitada graafiliselt näitamaks võimalikke muutumissuundasid, nt kohandumises.
      2.2.1.   KHT-/LOS-määramiste kasutamine
      
      ABH päevane bioärastamishulk arvutatakse vastavalt punktile 1.2.1.
      Arvutatakse ABH väärtuste seeriate keskväärtus, lisaks arvutatakse standardhälve järgnevalt:
      
                  
                     
               
               
                  [6]
               
            kus:
      
                  SABH
                  
               
               
                  =
               
               
                  ABHi väärtuste seeriate standardhälve,
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  ABHi väärtuste seeriate keskväärtus,
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  määramiste arv.
               
            ABH seeriate need väärtused, mis teistest tugevasti erinevad, jäetakse arvutustest välja mõne sobiva statistilise protseduuri abil, nt Nalimovi järgi (6), ning arvutatakse ABH andmetest uuesti keskmine ja standardhälve 95 % usaldusnivool.
      Lõplik tulemus arvutatakse vastavalt valemile (7):
      
                  
                     
               
               
                  [7]
               
            kus:
      
                  tn–1;α
               
               
                  =
               
               
                  tabelist leitud t-statistiku väärtus n-i E ja Eo väärtuste paaride juures, 95 % tõenäosusega P = 95 % (P = 1–α, kus a on olulisuse nivoo).
               
            Tulemus esitatakse keskväärtusena koos 95 % tolerantsipiiridega, vastava standardhälbega ja ABH andmestikus, kust tugevasti erinevad andmed on välja jäetud, sisalduvate andmete arvuga ning väljajäetute arvuga, näiteks
      
                  ABH
               
               
                  =
               
               
                  (98,6 ±2,3) % LOS-bioärastamisest,
               
            
                  s
               
               
                  =
               
               
                  4,65 % LOS-bioärastamisest,
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  18,
               
            
                  x
               
               
                  =
               
               
                  väljajäetud tugevasti erinevate mõõtmiste arv.
               
            2.2.2.   Spetsiifiliste analüüside kasutamine
      
      Uuritava aine elimineerumine protsentides vesifaasist (Rw) arvutatakse vastavalt punktile 1.2.2.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Uuringuraport võiks võimaluse korral sisaldada järgmist teavet:
      
                  —
               
               
                  3. liites antud ankeedivormi, mis näitab uuringu töötingimusi;
               
            
                  —
               
               
                  millist aparatuuri kasutati (kas OECD tõendava testi või poorse poti aparatuuri);
               
            
                  —
               
               
                  milline töömeetod valiti: ühendatud seadmete meetod või mitte;
               
            
                  —
               
               
                  millist reovett kasutati: kunstlikku või olmereovett, viimasel juhul märkida ära proovi võtmise koht ja kuupäev;
               
            
                  —
               
               
                  millist inokulaati kasutati, proovi tegemise koht ja kuupäev;
               
            
                  —
               
               
                  juhul kui tehti spetsiifilisi analüüse, lisada analüüsimeetodi kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  joonis, millel on KHT- või LOS-bioärastamine ajas, sealhulgas sissetöötamisperiood ja hindamisperiood;
               
            
                  —
               
               
                  analüütiline uuritava aine regeneratsioon põhilahuse KHT või LOSina;
               
            
                  —
               
               
                  spetsiifiliste analüüside tegemise korral teha joonis, millel on protsentides näidatud uuritava aine bioärastamine vesifaasist ajas (sissetöötamis- ja hindamiseperioodil);
               
            
                  —
               
               
                  hindamisperioodi tulemuste põhjal arvutatakse uuritava aine LOS- või KHT-bioärastamise keskväärtus ja standardhälve, seda siis kui esineb püsiv uuritava aine ärastamine või püsiv töötlemisperiood;
               
            
                  —
               
               
                  graafikuna aktiivmuda kontsentratsiooni muutus ajas;
               
            
                  —
               
               
                  märkusi aktiivmuda kohta (liigmuda eemaldamise, suurte koguste esinemine, FeCl3 jne;
               
            
                  —
               
               
                  uuringus kasutatud aine kontsentratsioon;
               
            
                  —
               
               
                  mis tahes tulemused, mis on saadud muda analüüsimisel;
               
            
                  —
               
               
                  kogu uuritava aine (ning ka võrdlusaine, kui seda kasutati) kohta saadud teave ja katsetulemused;
               
            
                  —
               
               
                  teaduslik põhjendus mis tahes muudatustele, mis protseduuris tehtud.
               
            3.2.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE
      Uuritava aine vähene bioärastamine vesifaasist võib tuleneda uuritava aine inhibeerivast toimest mikroorganismidele. See mõju võib avalduda ka muda lüüsumise ja kaona, mille tulemusena tekib hägune supernatant, ning ka katsepuhasti KHT- (või LOS-) bioärastamise efektiivsuse langusena.
      Füüsikalis-keemiline adsorptsioon võib samuti mõnikord oluline olla. Erinevusi molekulidele avalduva bioloogilise toime ja füüsikalis-keemilise adsorptsiooni vahel saab näidata muda analüüsil pärast piisavat desorptsiooni.
      Juhul kui on vaja eristada biolagundatavust (või osalist biolagundatavust) ja adsorptsiooni, on vajalik teha edasisi uuringuid.
      Neid võib teha mitmel eri viisil, kuid kõige kindlama tulemuse saab kasutades inokulaadina supernatanti baastestis (eelistatult respiromeetrilist testi).
      Juhul kui täheldatakse kõrgeid KHT- või LOS-ärastamise väärtusi, tuleneb see biolagunemisest, samas madalate KHT- või LOS-ärastamise väärtuste puhul on biolagundamine eristamatu eliminatsioonist. Näiteks kui lahustuval ühendil on kõrge adsorptsioonikonstant 98 % ja ülearuse jääkmuda tekkimise kiirus on 10 % päevas, on võimalik kuni 40 % elimineerumine; ning kui ülearuse jääkmuda tekkimise kiirus on 30 %, võib adsorptsioonist ja koos ülearuse jääkmudaga eemaldumisest tulenev elimineerumine ulatuda 65 %ni (4).
      Spetsiifiliste analüüside kasutamisel tuleb pöörata tähelepanu aine struktuuri ja kasutatava analüüsi vahekorrale. Sel juhul ei ole võimalik jälgitud nähtust tõlgendada aine mineraliseerumisena.
      4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 303 A, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2)
               
               
                  Annex V C9 Degradation Test – Chemical Oxygen Demand, Commission Directive 84/449/EEC, 
                        Official Journal of the European Communities, No L 251, 19.9.1984.
               
            
                  3)
               
               
                  Painter, H. A., King, E. F., WRC Porous-Pot method for assessing biodegradability, Technical Report TR70, June 1978, Water Research Centre, United Kingdom.
               
            
                  4)
               
               
                  Wierich, P., Gerike, P., The fate of soluble, recalcitrant, and adsorbing compounds in sludge plants, Ecotoxicology and Environmental Safety, vol. 5, No 2, June 1981, pp. 161 to 171.
               
            
                  5)
               
               
                  Council Directives 82/242/EEC and 82/243/EEC (OJ L 109, 22.4.1982, p.1), amending Council Directives 73/404/EEC and 73/405/EEC on biodegradability of detergents (OJ L 347, 17.12.1973, p. 51).
               
            
                  6)
               
               
                  Streuli, H., Fehlerhafte Interpretation und Anwendung von Ausreiβertests, insbesondere bei Ringversuchen zur Überprüfung analytisch-chemischer Untersuchungsmethoden, Fresenius-Zeitschrift für Analytische Chemie, 303 (1980), pp. 406 to 408.
               
            
         1. liide
         Joonis 1
         
            
         Joonis 2
         
            
      
      
         2. liide
         Joonis 1
         Seadmestik biolagundatavuse hindamiseks
         
            
         Joonis 2
         Kolmeliitrise „poorse poti” aeratsiooninõu osad
         
            
      
      
         3. liide
         Aktiivmuda simulatsioonikatse töötingimused
         Kontrollida kõigi rühmade puhul
         Seadmed
         
                     OECD kinnitatud
                  
                  
                      
                  
               
                     Poorne pott
                  
                  
                      
                  
               Tööviis
         
                     Ühe seadmega
                  
                  
                      
                  
               
                     Ühendatud seadmetega
                  
                  
                      
                  
               
                     Ühendamata seadmetega
                  
                  
                      
                  
               Transinokulatsioon
         
                     Puudub
                  
                  
                      
                  
               
                     Aktiivmuda
                  
                  
                      
                  
               
                     Supernatant
                  
                  
                      
                  
               Viibeaeg
         
                     Kolm tundi
                  
                  
                      
                  
               
                     Kuus tundi
                  
                  
                      
                  
               Põhilahus
         
                     Olmereovesi
                  
                  
                      
                  
               
                     Kunstlik reovesi
                  
                  
                      
                  
               Inokulaat
         
                     Sekundaarsest väljavoolust
                  
                  
                      
                  
               
                     Segainokulaat
                  
                  
                      
                  
               
                     Aktiivmuda
                  
                  
                      
                  
               Katsematerjali lisamine
         
                     Algusest peale
                  
                  
                      
                  
               
                     Järk-järgult lisades
                  
                  
                      
                  
               
                     Pärast muda moodustumist
                  
                  
                      
                  
               Analüüs
         
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     KHT
                  
                  
                      
                  
               
                     LOS
                  
                  
                      
                  
               
      C.11.   BIODEGRADATSIOON
      AKTIIVMUDA RESPIRATSIOONI PÄRSSIMISE KATSE
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Kirjeldatud meetodiga määratakse uuritava aine mõju mikroorganismidele, mõõtes respiratsiooni intensiivsust uuritava aine erinevate kontsentratsioonide juures.
      Selle meetodi eesmärk on saada kiire skriiningumeetod, millega kindlaks teha aineid, mis võivad kahjustavalt mõjuda aeroobsetele reoveepuhastitele, ja määrata sobivaid mitte-inhibeeriva toimega uuritava aine kontsentratsioone, mida saaks biodegradatsiooni testides kasutada.
      Lõplikule testile eelneb sobiva vahemiku leidmise test. Selle tulemusena saab teavet kontsentratsioonivahemike kohta, mida põhikatses kasutada.
      Uuringusse kaasatakse kaks kontrolli ilma uuritava aine sisalduseta, üks lisatakse katseseeria alguses ja teine lõpus. Samuti tuleb võrdlusainega kontrollida kõiki aktiivmuda partiisid.
      See meetod on sobivaim ainete puhul, mis seoses oma veeslahustuvuse ja väikese lenduvusega jäävad tõenäoliselt vette.
      Uuritavas keskkonnas vähese lahustuvusega ainete puhul ei ole võimalik EC50 määrata.
      Hapniku omastamisel põhinevad tulemused võivad anda ekslikke tulemusi, kui uuritava aine puhul esineb kalduvus vabastavale oksüdatiivsele fosforülatsioonile.
      Enne uuringu tegemist on kasulik teada järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  vees lahustuvus;
               
            
                  —
               
               
                  küllastunud aururõhk;
               
            
                  —
               
               
                  struktuurvalem;
               
            
                  —
               
               
                  uuritava aine puhtusaste.
               
            Soovitused
      Aktiivmuda võib sisaldada potentsiaalselt patogeenseid organisme, mistõttu tuleb seda käsitseda ettevaatlikult.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Respiratsiooni intensiivsus on hapniku tarbimine aeroobses mudas olevate reovee mikroorganismide poolt, mida väljendatakse tavaliselt O2/mg muda kohta ühes tunnis.
      Uuritava aine kindla kontsentratsiooni inhibeeriva toime arvutamiseks väljendatakse respiratsiooni intensiivsust kahe respiratsiooni intensiivsuse keskmise kontrollnäitaja protsendina:
      
         
      kus:
      
                  RS
                  
               
               
                  =
               
               
                  hapniku tarbimine katseaine uuritava kontsentratsiooni juures,
               
            
                  Rc1
                  
               
               
                  =
               
               
                  hapniku tarbimine, kontroll 1,
               
            
                  Rc2
                  
               
               
                  =
               
               
                  hapniku tarbimine, kontroll 2.
               
            EC50 on käesoleva meetodi puhul uuritava aine kontsentratsioon, mille juures on respiratsiooni intensiivsus 50 % kontrolli puhul saavutatust kirjeldatud tingimuste juures.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Võrdlusainena soovitatakse kasutada tuntud respiratsiooni inhibeerivat ainet 3,5-dikloorfenooli ja seda määrata EC50 iga aktiivmuda partii puhul, et kontrollida, kas muda tundlikkus on normaalne.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Kunstliku muda standardsisaldusega aktiivmudas mõõdetakse respiratsiooni intensiivsust 30minutilise või kolmetunnise kokkupuuteaja järel (või mõlema järel). Samuti mõõdetakse sama aktiivmuda respiratsiooni intensiivsus erinevas kontsentratsioonis uuritava aine juuresolekul muidu samasuguste tingimuste juures. Uuritava aine pärssivat toimet kindla kontsentratsiooni juures väljendatakse protsendina kahe kontrolli keskmisest respiratsiooni intensiivsuse näitajast. EC50 näitaja arvutatakse erinevate kontsentratsioonide juures saadud näitajate põhjal.
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Uuringu tulemused kehtivad, kui
      
                  —
               
               
                  erinevus kahe hingamise intensiivsuse kontrollnäitaja vahel on kuni 15 %;
               
            
                  —
               
               
                  3,5-dikloorfenooli EC50 (30 minutit ja/või kolm tundi) on ettenähtud vahemikus 5–30 mg/l.
               
            1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Reagendid
      
      1.6.1.1.   Uuritava ainega lahused
      
      Uuritavat ainet sisaldavad lahused valmistatakse vahetult uuringu alguses põhilahusega. Kui järgitakse allpool kirjeldatud protseduuri, on põhilahuse sobivaks kontsentratsiooniks 0,5 g/l.
      1.6.1.2.   Kontrollaine lahus
      
      5,5-dikloorfenooli lahuse saab näiteks valmistada 0,5 g 3,5-dikloorfenool lahustamisel 10 ml 1 M NaOH lahuses, saadud lahus lahjendatakse ligikaudu 30 ml destilleeritud veega, lisades samaaegsel segamisel 0,5 M H2SO4 kuni sademe tekke alguseni – vajalik võib olla ligikaudu 8 ml 0,5 M H2SO4 lahuse lisamine – ja lõpuks lahjendatakse segu destilleeritud veega kuni ühe liitrini. Saadud lahuse pH peaks olema vahemikus 7 kuni 8.
      1.6.1.3.   Kunstlik reovesi
      
      Kunstlikul reoveel põhinev sööde valmistatakse järgnevas koguses ainete lahustamisel ühes liitris vees:
      
                  —
               
               
                  16 g peptooni;
               
            
                  —
               
               
                  11 g lihaekstrakti;
               
            
                  —
               
               
                  3 g uureat;
               
            
                  —
               
               
                  0,7 g NaCl;
               
            
                  —
               
               
                  0,4 g CaCl2.2H2O;
               
            
                  —
               
               
                  0,2 g MgSO4.7H2O;
               
            
                  —
               
               
                  2,8 g K2HPO4.
               
            
         Märkus 1. Ära toodud kunstlik reovesi on 100 korda kontsentreeritum, kui kirjeldatud OECD tehnilise raporti peatükis „Soovitatud meetodid sünteetilistes detergentides kasutatavate surfaktantide biodegradeeruvuse kindlaks tegemiseks” (11. juuni 1976), lisatud on kaaliumdivesinikfosfaati.
      
         Märkus 2. Kui valmistatud lahust ei kasutata kohe, tuleb seda säilitada pimedas ruumis temperatuuril 0–4 oC mitte kauem kui üks nädal tingimustes, mis ei põhjusta muutusi aine koostises. Samuti võib lahust enne säilitamist steriliseerida või lisada peptoon ja lihaekstrakt vahetult enne katse tegemist. Enne kasutamist tuleks lahust põhjalikult segada ja selle pH kohandada vastavalt nõuetele.
      1.6.2.   Aparatuur
      
      Mõõteaparatuur: täpselt samasugune ülesehitus ei ole vajalik. Siiski peaks aparaadil olema pealispind ja sond peaks tihedalt sobituma mõõtekolbi kaelaossa.
      Vajalik on tavaline laborivarustus ja eelkõige järgmised seadmed:
      
                  —
               
               
                  mõõteaparatuur;
               
            
                  —
               
               
                  aeratsiooniseade;
               
            
                  —
               
               
                  pH-elektrood ja mõõtmisvarustus;
               
            
                  —
               
               
                  O2-elektrood.
               
            1.6.3.   Inokulaadi valmistamine
      
      Testi bakteriaalse inokulaadina kasutatakse aktiveeritud reovett, mis on pärit peamiselt olmereovett töötlevatest puhastussüsteemidest.
      Vajaduse korral võib suuri osakesi eemaldada sadestamise teel, kui jätta lahus lühiajaliselt (näiteks 15 minutiks) seisma ja dekanteerida ülemine väiksemate osakestega kiht kasutamiseks. Teise võimalusena võib reovett segada blenderiga mõne sekundi jooksul.
      Kui kahtlustatakse inhibeeriva toimega lisandite juuresolekut, tuleks muda loputada kraanivee või isotoonilise lahusega. Pärast tsentrifuugimist supernatant eemaldatakse (seda protseduuri korratakse kolm korda).
      Väike kogus muda kaalutakse välja ja kuivatatakse. Saadud tulemusest võib arvutada märja muda koguse, mida tuleb segada veega, et vedelikusegus suspendeeritud tahke aine kontsentratsioon oleks vahemikus 2–4 g/l. Sellisel juhul saavutatakse eksperimentaaltingimustes kontsentratsioonivahemik 0,8–1,6 g/l, tingimusel et järgitakse allpool soovitatud protseduuri.
      Kui muda ei saa kasutada selle kogumise päeval, lisatakse 50 ml sünteetilist muda igale aktiivmuda kogusele, mis on valmistatud nagu eespool kirjeldatud; seda aereeritakse seejärel öö läbi 20 ± 2 oC ning aereerimist jätkatakse kogu päeva. Enne kasutamist tuleb kontrollida pH-d ja vajaduse korral kohandada väärtuseni 6 kuni 8. Aktiivmuda kuivaine sisaldus tuleks kindlaks määrata, nagu eelmises lõigus kirjeldatud.
      Kui järjestikustel päevadel (maksimaalselt neli päeva) on vaja kasutada sama muda partiid, lisatakse iga tööpäeva lõpus veel 50 ml kunstlikku reovett ühe liitri muda kohta.
      1.6.4.   Katse käik
      
      
                  Kestus/kokkupuuteaeg:
               
               
                  30 minutit ja/või kolm tundi, kogu aja vältel rakendatakse aereerimist
               
            
                  Vesi:
               
               
                  joogivesi (vajaduse korral deklooritud)
               
            
                  Õhu lisamine:
               
               
                  puhas, õlivaba õhk. Õhuvool 0,5–1 l/minutis
               
            
                  Mõõteaparatuur:
               
               
                  lamedapõhjaline konteiner, näiteks BOD-konteiner
               
            
                  Hapnikumõõtur:
               
               
                  sobiv hapnikuelektrood koos registreerijaga
               
            
                  Toitelahus:
               
               
                  sünteetiline reovesi (vt eestpoolt)
               
            
                  Uuritav aine:
               
               
                  uuritav lahus valmistatakse värskena, vahetult enne testi alustamist
               
            
                  Võrdlusaine:
               
               
                  näiteks 3,5-dikloorfenool (vähemalt kolme erinevat kontsentratsiooni)
               
            
                  Kontrollid:
               
               
                  inokuleeritud proov, mis ei sisalda uuritavat ainet
               
            
                  Temperatuur:
               
               
                  20 ± 2 oC.
               
            Järgnevalt on kirjeldatud soovitatavaid katseprotseduure, mida võib järgida nii uuritava kui ka võrdlusaine puhul kolmetunnise kokkupuuteperioodi vältel.
      Kasutatakse mitmeid anumaid (näiteks üheliitriseid mõõteanumaid).
      Kasutada tuleks vähemalt viit kontsentratsiooni, mis erineksid mitte rohkem kui 3,2 korda.
      Ajahetkel 0 lahustatakse 16 ml kunstliku reovee toitelahust veega kuni 300 ml-ni. Lisatakse 200 ml mikrobiaalset inokulaati ja saadud segu (500 ml) valatakse esimesse anumasse (esimene kontroll C1).
      Katsenõusid tuleb pidevalt aereerida, et lahustunud O2 väärtus ei langeks alla 2,5 mg/l ja et vahetult enne hingamissageduse mõõtmist oleks O2 kontsentratsioon ligikaudu 6,5 mg/l.
      Ajahetkel „15 minutit” (15 minutit on suvaline, kuid usaldusväärne ajavahemik) korratakse eespool kirjeldatut. Erinevuseks on 100 ml uuritavat ainet sisaldava põhilahuse lisamine 16 ml kunstlikku reovette enne vee lisamist (lahjendamiseks 300 ml-ni) ja mikrobiaalsesse inokulaati, et saada lõppkoguseks 500 ml. Saadud segu valatakse teise anumasse ja aereeritakse, nagu eespool kirjeldatud. Seda protsessi korratakse 15minutiliste intervallide järel erinevate uuritavat ainet sisaldava põhilahuse kogustega, et saada anumad uuritava aine erinevate kontsentratsioonidega. Lõpuks valmistatakse teine kontroll (C2).
      Kolme tunni pärast registreeritakse pH, esimese anuma sisust võetud korralikult segatud proov valatakse mõõteaparaati ja respiratsiooni intensiivsust mõõdetakse kuni 10 minuti vältel.
      Sama mõõtmist korratakse iga nõu sisuga 15minutiliste intervallide järel, sellisel juhul on iga anuma puhul kokkupuuteaeg kolm tundi.
      Võrdlusainet analüüsitakse iga partii bakteriaalse inokulaadiga samal viisil.
      Kui mõõtmisi tuleb teha 30 minutit pärast kokkupuudet, vajalik võib olla teistsugune režiim.
      Kui on vaja mõõta hapnikutarvet, valmistatakse ette uued anumad, mis sisaldavad uuritavat ainet, kunstlikku reovett ja vett, kuid mitte aktiivmuda. Hapniku tarbimist mõõdetakse ja registreeritakse pärast 30minutilist ja/või kolmetunnilist aereerimist (kokkupuuteaeg).
      2.   ANDMED JA HINDAMINE
      Respiratsiooni intensiivsust arvutatakse registreerija näidu vahemikus ligikaudu 6,5 mg O2/l kuni 2,5 mg O2/l või 10minutilises perioodis, kui respiratsiooni intensiivsus on väike. Respiratsiooni kõvera osa, mille ajal respiratsiooni intensiivsust mõõdetakse, peab olema lineaarne.
      Kui kahe kontrolli respiratsiooni intensiivsuse näitajate omavahelised erinevused ei ole 15 % sees või ei ole võrdlusaine EC50 (30 minutit ja/või kolm tundi) aktsepteeritud vahemikus (5–30 mg/l 3,5-dikloorfenooli), on katse kehtetu ja seda tuleb korrata.
      Iga uuringulahuse kontsentratsiooni kohta arvutatakse protsentuaalne inhibeerumine (vt 1.2). Graafiku teljestikule kantakse protsentuaalne inhibeerumine suhtes kontsentratsiooniga ning saadud EC50 väärtus.
      Standardprotseduuride kasutamisel saab EC50 väärtuste kohta määrata 95 % usalduspiirid.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgnevat teavet:
      
                  —
               
               
                  uuritav aine: keemilised omadused;
               
            
                  —
               
               
                  uuringu süsteem: päritolu, kontsentratsioon ja võimalikud aktiivmuda eeltöötlused;
               
            
                  —
               
               
                  katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              reaktsioonisegu pH enne hingamise mõõtmist;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katsetemperatuur;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katse kestus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              võrdlusaine ja selle mõõdetud EC50;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              abiootiline hapniku omastamine (kui esineb);
                           
                        
            
                  —
               
               
                  tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              kõik mõõdetud andmed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inhibeerumise kõver ja EC50 arvutusmeetod;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              EC50 ja võimaluse korral 95 % usalduspiirid, EC20 ja EC80;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kõik jälgimised ja võimalikud hälbed, mis võiksid tulemusi mõjutada.
                           
                        
            3.2.   ANDMETE TÕLGENDAMINE
      EC50 väärtust tuleks pidada vaid viiteks võimalikule uuritava aine toksilisusele kas reoveepuhastist saadud aktiivmudas või reovees sisalduvatesse mikroorganismidesse, kuna keskkonnas asetleidvaid keerukaid koosmõjusid ei saa laboritingimustes täpselt jäljendada. Lisaks võivad ka uuritavad ained põhjustada ebatüüpilisi inhibeerumise kõveraid, kuna võivad pärssivalt mõjuda ammoniaagi oksüdatsioonile. Eeltoodust lähtuvalt tuleks selliseid kõveraid tõlgendada ettevaatusega.
      4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  International Standard ISO 8192-1986.
               
            
                  2)
               
               
                  Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, p. 165.
               
            
                  3)
               
               
                  Brown, D., Hitz, H. R, Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, p. 245.
               
            
                  4)
               
               
                  ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs Manufacturing Industries), Recommendec Method No 103, also described by:
               
            
                  5)
               
               
                  Robra, B., Wasser/Abwasser 117, 1976, p. 80.
               
            
                  6)
               
               
                  Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, p. 247.
               
            
                  7)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 209, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            C.12.   BIODEGRADATSIOON
      MODIFITSEERITUD SCAS TEST
      1.   MEETOD
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Meetodi eesmärk on hinnata veeslahustuvate, mittelenduvate orgaaniliste ainete võimalikku lõpp-biodegra-deerumist kokkupuutel suhteliselt suurte mikroorganismide kontsentratsioonidega pika aja jooksul. Mikroorganismide elusolek säilitatakse selles perioodis, toites aktiivmuda iga päev setitatud reovee lisamisega. (Nädalavahetuse vajaduste katmiseks võib reovett säilitada temperatuuril 4 oC. Teise võimalusena võib kasutada OECD kunstlikku reovett.)
      Võimalik on füüsikalis-keemiline adsorptsioon suspendeeritud kuivainele, mida tuleks tulemuste interpreteerimisel arvestada (vt 3.2).
      Seoses vedela faasi pika viibeaja perioodiga (36 tundi) ja vahepealse toitainete lisamisega ei jäljenda test neid tingimusi, mis tekivad reoveepuhastis. Erinevate uuritavate ainetega saadud tulemused viitavad sellele, et testi biodegradatsioonivõime on suur.
      Testis tekitatud tingimused on äärmiselt soodsad uuritavat ühendit degradeerivate mikroorganismide valikuks ja/või adaptatsiooniks. (Protseduuri võib samuti kasutada aklimatiseeritud inokulaadi tekitamiseks, mida kasutada teistes testides.)
      Selle meetodi puhul kasutatakse uuritava aine lõpliku biodegradatsiooni hindamiseks lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsiooni määramist. LOS-määramine pärast hapestamist ja puhastamist on eelistatum meetod kui lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsioonide erinevuse (Cüld – Canorgaaniline) arvutamine.
      Samaaegne spetsiifilise analüüsimeetodi kasutamine võib anda võimaluse aine esmase degradatsiooni hindamiseks (lähteühendi keemilise struktuuri kadumine).
      Meetod on kasutatav ainult nende uuritavate orgaaniliste ainete puhul, mis testis kasutatud kontsentratsiooni juures
      
                  —
               
               
                  on veeslahustuvad (vähemalt 20 mg lahustunud orgaanilist süsinikku/l);
               
            
                  —
               
               
                  omavad tühist küllastatud aururõhu väärtust;
               
            
                  —
               
               
                  ei ole bakterite suhtes pärssiva toimega;
               
            
                  —
               
               
                  ei adsorbeeru oluliselt testisüsteemi;
               
            
                  —
               
               
                  ei kao katselahusest vahu tekke tulemusena.
               
            Määrata tuleb orgaanilise süsiniku sisaldus uuritavas materjalis.
      Uuringutulemuste tõlgendamisel on kasulik teada uuritava materjali põhikomponentide kohta käivat teavet. Seda eelkõige juhtudel, kui tulemused on väga väikesed või alammääralised.
      Informatsioon aine toksilisuse kohta mikroorganismidesse võib olla kasulik väikeste tulemuste interpreteerimisel ja katseks sobiva kontsentratsiooni valimisel.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      
                  CT
                  
               
               
                  =
               
               
                  uuritava ühendi kontsentratsioon orgaanilise süsiniku juuresolekul või setitatud reoveele lisamisel aeratsiooniperioodi alguses (mg/l),
               
            
                  Ct
                  
               
               
                  =
               
               
                  lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsioon, mis on sedastatud uuringu supernatantvedelikus aeratsiooniperioodi lõpus (mg/l),
               
            
                  Cc
                  
               
               
                  =
               
               
                  lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsioon, mis on sedastatud kontrolli supernatantvedelikus aeratsiooniperioodi lõpus (mg/l).
               
            Selle meetodi puhul defineeritakse biodegradatsiooni orgaanilise süsiniku kadumisena. Biodegradatsiooni saab väljendada järgmiselt.
      
                  1.
               
               
                  Iga päev lisatud ainekogusest eemaldatud Dda protsent:
                  
                              
                                 
                           
                           
                              [1]
                           
                        kus
                  
                              Dda
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              degradatsioon/päevas lisamine.
                           
                        
            
                  2.
               
               
                  Tiga päeva alguses olemasolevast ainekogusest eemaldatud Dssd protsent:
                  
                              
                                 
                           
                           
                              [2 (a)]
                           
                        
                              
                                 
                           
                           
                              [2 (b)]
                           
                        kus
                  
                              Dssd
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              degradatsioon/aine päeva alguses;
                           
                        indeksid i ja (i+1) viitavad mõõtmispäevale.
                  Valem 2a on soovitatav, kui väljavoolu LOS erineb päevast päeva, mille juures aga valemit 2b võib kasutada, kui väljavoolu LOS püsib päevast päeva suhteliselt konstantsena.
               
            1.3.   VÕRDLUSAINED
      Osadel juhtudel võib uue aine uurimisel olla kasu võrdlusainete kasutamisest. Siinjuures ei tooda aga ära spetsiifilisi võrdlusaineid.
      Andmed ringtestides hinnatud ühendite kohta on äratoodud (vt liide 1) peamiselt nii, et meetodi kalibreerimist võib teha pidevalt ja teistsuguse meetodi kasutamisel on võimalik tulemusi omavahel võrrelda.
      1.4.   UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE
      Reoveepuhastist pärit aktiivmuda asetatakse (SCAS) seadmeosasse. Lisatakse uuritav ühend ja setitatud olmereovesi ning segu aereeritakse 23 tundi. Seejärel aereerimine peatatakse, lastakse mudal settida ja vedelik valatakse ära.
      Aeratsioonikambrisse jäänud muda segatakse järgmise uuritava ühendi alikvoodi ja reoveega ning tsüklit korratakse.
      Biodegradatsioon tehakse kindlaks lahustunud orgaanilise süsiniku sisalduse põhjal supernatantvedelikus. Saadud tulemust võrreldakse näitajaga, mis on saadud ainult setitatud reoveest võetud kontrollist.
      Kui kasutatakse spetsiifilist analüüsimeetodit, saab mõõta biodegradatsioonist tingitud eellasmolekuli kontsentratsiooni muutusi (primaarne biodegradatsioon).
      1.5.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      Selle lahustunud orgaanilise süsiniku eemaldamisel põhineva meetodi korduvteostatavust ei ole veel kinnitatud. (Kui kaalutakse primaarset biodegradatsiooni, saadakse väga täpsed andmed materjalide kohta, mida ulatuslikult degradeeritakse.)
      Käesoleva meetodi tundlikkuse määrab suures osas põhilahuse varieeruvus ning vähesemal määral lahustunud orgaanilise süsiniku määramise täpsus ja uuritava ühendi sisaldus vedelikus iga tsükli alguses.
      1.6.   KATSEPROTSEDUURI KIRJELDUS
      1.6.1.   Ettevalmistused
      
      Iga uuritava aine ja kontrolli jaoks ühendatakse piisav arv puhtaid aeratsiooniseadmeid (alternatiivina võib kasutada originaalset 1,5 l SCAS testi seadmeosa) ja õhu sisselaske torusid (joonis 1). Katseseadmetesse suunatud suruõhk (puhastatud läbi puuvillase filtri) ei tohiks sisaldada orgaanilist süsinikku ja peaks olema eelnevalt küllastatud veega, et vähendada kadusid auramise tõttu.
      Vedelikusegu proov, mis sisaldab 1–4 g suspendeeritud tahkeid osakesi/l saadakse peamiselt olmereovee puhastist pärit aktiivmudast. Iga aeratsiooniseadme kohta vajatakse ligikaudu 150 ml vedelikusegu.
      Uuritava aine põhilahused valmistatakse destilleeritud vees; tavalisel juhul vajalik kontsentratsioon on 400 mg/l, kuna iga aeratsioonitsükli alguses annab orgaaniline süsinik uuritava ühendi kontsentratsiooniks 20 mg/l süsinikku, kui biodegradatsiooni ei teki.
      Suuremad kontsentratsioonid on lubatud, kui toksilisus mikroorganismidele seda võimaldab.
      Määratakse põhilahuste orgaanilise süsiniku sisaldus.
      1.6.2.   Katsetingimused
      
      Katse tuleks teha temperatuuril 20–25 oC.
      Kasutatakse suuri aeroobsete mikroorganismide kontsentratsioone (1–4 g/l suspendeeritud kuivainet) ja efektiivne viibeaja periood on 36 tundi. Süsinikku sisaldavat materjali reovee söötmes oksüdeeritakse ulatuslikult, tavaliselt kaheksa tundi alates iga aeratsioonitsükli algusest. Seejärel muda respireerib endogeenselt ülejäänud aeratsiooniperioodi, mille käigus ainuke olemasolev substraat on uuritav ühend, kui see ei ole juba täielikult metaboliseeritud. Need omadused kombineerituna igapäevase testi reinokuleerimisega (kui keskkonnana kasutatakse olmereovett), tagavad äärmiselt soodsad tingimused nii aklimatsiooniks kui ka ulatuslikuks biodegradatsiooniks.
      1.6.3.   Katse käik
      
      Peamiselt olmereoveest pärit aktiivmudaga puhastist või laboriseadmest võetakse vedelikusegu proov ja seda hoitakse aeroobsetes tingimustes kuni laboris kasutamiseni. Iga aeratsiooniseade ja samuti kontrollseade täidetakse 150 ml vedelikuseguga (kui kasutatakse SCAS originaaltesti ühikut, tuleb kogus kümnekordistada) ja alustatakse aereerimist. 23 tunni pärast aeratsioon peatatakse ja mudal lastakse settida 45 minutit. Järjekorras avatakse kõik torude kraanid ja 100 ml supernatantvedeliku osad eemaldatakse. Setitatud olmereovee proov võetakse vahetult enne kasutamist ja 100 ml lisatakse igasse aeratsiooniühikusse jäänud muda kogusele. Alustatakse uuesti aereerimist. Selles staadiumis enam uuritavat materjali juurde ei lisata ja seadmeosadesse lisatakse toitelahusena üks kord päevas olemreovett kuni saadakse seismisel läbipaistev supernatandi vedelik. Tavaliselt läheb kuni kaks nädalat, et lahustunud orgaanilise süsiniku sisaldus supernatantvedelikus läheneks iga aeratsioonitsükli lõpus püsiväärtusele.
      Selle perioodi lõpuks üksikud setitatud mudakogused segatakse kokku ja igasse seadmeossa lisatakse 50 ml saadud mudasegu.
      Kontrollanumatesse lisatakse 95 ml setitatud reovett ja 5 ml vett ning katseanumatesse lisatakse 95 ml setitatud reovett koos 5 ml sobivat uuritavat ühendit sisaldava põhilahusega (400 mg/l). Aeratsiooni alustatakse uuesti ja jätkatakse 23 tundi. Mudal lastakse seejärel settida 45 minutit, vedelik valatakse pealt ära ja analüüsitakse sellest lahustunud orgaanilise süsiniku sisaldust.
      Eespool kirjeldatud „täida-eemalda” -protseduuri korratakse iga päev kogu katse vältel.
      Enne sadestamist võib olla vajalik anumate seinte puhastamine, et hoida ära tahkete osakeste kuhjumist üle vedelikunivoo. Ristkontaminatsiooni vältimiseks kasutatakse iga seadme jaoks eraldi kaabitsat või harja.
      Ideaaljuhul tuleks lahustunud orgaanilise süsiniku sisaldust supernatantvedelikus määrata iga päev, kuigi lubatud on ka harvemad analüüsid. Enne analüüsimist filtreeritakse vedelikud läbi pestud 0,45 μn membraanfiltrite või tsentrifuugitakse. Membraanifiltrid on sobivad, kui on tagatud, et nad ei lase läbi süsinikku ega absorbeeri ainet filtratsiooni etapis. Tsentrifuugis asuva proovi temperatuur ei tohi ületada 40 oC.
      Vähese või mittemääratava biodegradatsiooniga ühenditega tehtava katse pikkus on kindlaks määramata, kuid kogemuse põhjal peaks see üldiselt olema vähemalt 12 nädalat, kuid mitte kauem kui 26 nädalat.
      2.   ANDMED JA HINDAMINE
      Lahustunud orgaanilise süsiniku väärtused katse- ja kontrollanumate supernatantvedelikus kujutatakse graafikul võrdluses ajaga.
      Biodegradatsiooni saavutamisel läheneb uuritava aine osas sedastatud tase kontrolli puhul kindlaks tehtud näitajale. Kui kahe taseme vahel leitud erinevus püsib kolme järjestikuse mõõtmise puhul, tehakse veel selline arv edasisi mõõtmisi, et võimaldada andmete statistilist töötlust, ja arvutatakse uuritava ühendi protsentuaalne biodegradatsioon (Dda või Dssd, vt 1.2).
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmist teavet:
      
                  —
               
               
                  kogu teave, mis puudutab kasutatud reovett, seadmetüüpi, uuritava ainega seotud katsetulemusi, võrdlusainet, kui kasutati, ja põhilahust;
               
            
                  —
               
               
                  temperatuur;
               
            
                  —
               
               
                  eemaldamiskõver koos kirjeldusega, arvutamisviis (vt 1.2);
               
            
                  —
               
               
                  kuupäev ja koht, kust võeti aktiivmuda ja reovee proovid, adaptatsiooni seisund, kontsentratsioon jne;
               
            
                  —
               
               
                  kõikide uuringuprotseduuride muutuste teaduslik põhjendus;
               
            
                  —
               
               
                  allkiri ja kuupäev.
               
            3.2.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE
      Kuna sellisel meetodil uuritud aine ei ole täielikult biolagundatav, eemaldub LOS ainult biodegradatsiooni tõttu normaalsel juhul järk-järgult päevi ja nädalaid, v.a juhtudel, kui aklimatsioon on toimunud äkki (näidatud äkki kadumisena mõne nädala möödumisel).
      Mõnikord võib olulist rolli mängida füüsikalis-keemiline adsorptsioon. See on näidatud juhul, kui esineb täielik või osaline lisatud LOS-eemaldamine alguses. Edasine käik sõltub sellistest faktoritest nagu adsorptsiooni ulatus ja suspendeeritud kuivaine sisaldus väljavoolu vees. Tavaliselt suureneb erinevus LOS-kontsentratsioonide vahel kontrollis ja proovi supernatantvedelikus järk-järgult algselt madalalt tasemelt ja see erinevus jääb seejärel uuele tasemele ülejäänud eksperimendiks, v.a aklimatisatsiooni korral.
      Kui biodegradatsiooni (või osalise biodegradatsiooni) ja adsorptsiooni tuleb eristada, on vajalikud täiendavad katsed. Seda saab teha mitmel erineval viisil, kuid kõige usaldusväärsem on supernatantvedeliku või muda kasutamine inokulaadina baasuuringu raames (eelistatult respiromeetriline uuring).
      Selles uuringus tuleks kõrgeid, adsorptsiooni teel mitteeemaldatavaid LOS-tulemusi pidada potentsiaalselt biolagundatavateks. Osaline adsorptsiooni teel mitteeemaldamine viitab sellele, et kemikaal allub vähemalt osalisele biodegradatsioonile.
      LOS-eemaldamise madalate või null-näitajate põhjuseks võib olla mikroorganismide pärssimine uuritava aine poolt ja selle võib vallandada ka muda lõhustamine või kadu, mis tekitab häguse supernatandi. Testi tuleks korrata, kasutades uuritava aine madalamaid kontsentratsioone.
      Spetsiifilise analüütilise meetodi või 14C-märgistatud uuritava aine kasutamine võib anda suurema tundlikkuse. 14C testi ühendi kasutamisel 14CO2 sedastamine kinnitab biodegradatsiooni teket.
      Kui tulemusi antakse ka primaarse biodegradatsiooni kohta, tuleks võimaluse korral anda selgitus keemilise struktuuri muutustele, mis viib uuritava eellasühendi vastusreaktsiooni kadumisele.
      Analüütilise meetodi kinnitus tuleb edastada koos vastusega, mis saadi puhta katsekeskkonna kohta.
      4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 A, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
         1. liide
         SCAS test: tulemuste näidised
         
                     Aine
                  
                  
                     CT
                     
                     (mg/l))
                  
                  
                     Ct–Cc
                     
                     (mg/l)
                  
                  
                     Protsentuaalne biodegradatsioon
                     Dda
                     
                  
                  
                     Katse kestus
                     (päevades)
                  
               
                     4-atsetüülaminobenseensulfonaat
                  
                  
                     17,2
                  
                  
                     2,0
                  
                  
                     85
                  
                  
                     40
                  
               
                     Tetrapropüleenbenseensulfonaat
                  
                  
                     17,3
                  
                  
                     8,4
                  
                  
                     51,4
                  
                  
                     40
                  
               
                     4-nitrofenool
                  
                  
                     16,9
                  
                  
                     0,8
                  
                  
                     95,3
                  
                  
                     40
                  
               
                     Dietüleenglükool
                  
                  
                     16,5
                  
                  
                     0,2
                  
                  
                     98,8
                  
                  
                     40
                  
               
                     Aniliin
                  
                  
                     16,9
                  
                  
                     1,7
                  
                  
                     95,9
                  
                  
                     40
                  
               
                     Tsüklopentaantetrakarboksülaat
                  
                  
                     17,9
                  
                  
                     3,2
                  
                  
                     81,1
                  
                  
                     120
                  
               
      
         2. liide
         Uuringuseadme näidis
         
            
      
      C.13.   BIOKONTSENTRATSIOON: KALADEGA LÄBIVOOLUKATSE
      1.   MEETOD
      Käesolev biokontsentratsiooni meetod on OECD katsejuhendi nr 305 (1996) koopia.
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesolev meetod kirjeldab ainete biokontsentratsiooni potentsiaali hindamist kalades läbivoolava vee tingimustes. Kuigi kindlalt tuleb eelistada läbivoolutingimustega katseid, on katsetes lubatav kasutada ka poolseisva vee tingimusi eeldusel, et valideerimisnõuded on täidetud.
      Meetodi kirjeldus on piisavalt üksikasjalik katse tegemiseks, võimaldades samas küllaldast vabadust katse kohandamiseks vastavalt konkreetsetele laboritingimustele ja uuritavate ainete omadustele. Meetod sobib kõige paremini stabiilsete orgaaniliste ainete hindamiseks, mille log Pow väärtus on 1,5 kuni 6,0 (1), kuid seda saab kasutada ka superlipofiilsete ainete jaoks, mille log Pow > 6,0. Biokontsentratsiooni teguri (BCF) eelhinnang, mida tähistatakse ka kui KB, on selliste superlipofiilsete ainete jaoks eeldatavasti kõrgem kui laborikatsetest saadud püsioleku biokontsentratsiooni tegur (BCFSS). Biokontsentratsiooni teguri eelhinnanguid orgaaniliste kemikaalide jaoks, mille log Pow väärtused on kuni 9,0, saadakse Bintein et al (2) võrranditest. Biokontsentratsiooni potentsiaali iseloomustavad parameetrid on seondumise kiiruskonstant (k1) puhastumise kiiruskonstant (k2) ja BCFSS.
      Radiomärgistatud katseained lihtsustavad vee- ja kalaproovide analüüsimist ning neid võib kasutada otsustamisel, kas on vaja teha laguproduktide identifitseerimist ja kvantitatiivset analüüsi. Kogu radioaktiivse jäägi mõõtmisel (näiteks põletamisel või kudede lahustamisel) saadud BCF põhineb lähteainel, mis tahes säilinud metaboliitidel ja samuti assimileerunud süsinikul. Seetõttu ei ole kogu radioaktiivse jäägi mõõtmisel põhinev BCF otseselt võrreldav BCFiga, mis on saadud ainult lähteaine analüüsil teatud keemiliste meetoditega.
      Radiomärgistamisega uuringutes võib lähteainel põhineva BCF määramisel kasutada puhastamismenetlust ja vajaduse korral iseloomustada peamiseid metaboliite. Lisaks on võimalik kombineerida kalade metabolismi uuringut biokontsentratsiooni uuringuga, analüüsides ja identifitseerides kudedes jääke.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      Biokontsentratsioon/bioakumulatsioon on uuritava aine kontsentratsiooni kasv organismis või selle pinnal (teatud kudedes) võrreldes uuritava aine kontsentratsiooniga ümbritsevas keskkonnas.
      Biokontsentratsiooni tegur (BCF või KB) akumulatsioonikatse seondumisfaasi mis tahes ajahetkel on uuritava aine kontsentratsioon kalades (kala pinnal) või teatud kudedes (Cf, ühik μg/g (ppm)) jagatuna uuritava aine kontsentratsiooniga ümbritsevas keskkonnas (Cw, ühik μg/ml (ppm)).
      Püsioleku biokontsentratsiooni tegur (BCFSS või KB) ei muutu märkimisväärselt pikemaajalise ajavahemiku vältel, kui uuritava aine kontsentratsioon ümbritsevas keskkonnas on selle ajavahemiku vältel konstantne.
      Platoo või püsiolek saavutatakse kalades sisalduva uuritava aine kontsentratsiooni (Cf) ja aja funktsiooni esitaval kõveral siis, kui see saab paralleelseks ajateljega ja vähemalt kahepäevaste intervallidega võetud proovide kolm järjestikust Cf analüüsi tulemust on üksteise suhtes ± 20 % ja kolme proovivõtmisperioodi vahel ei ole märkimisväärseid erinevusi. Ühendatud (puulitud) proovide analüüsimisel on nõutavad vähemalt neli järjestikust analüüsi. Aeglaselt seonduvate ainete jaoks on sobivamaks intervalliks seitse päeva.
      Kineetilistest kiiruskonstantidest (k1/k2) otse arvutatud biokontsentratsiooni tegurit nimetatakse kineetiliseks biokontsentratsiooni teguriks BCFk.
      Jaotuskoefitsient oktanool/vesi (Pow) on aine lahustuvuse suhe n-oktanoolis ja vees tasakaalutingimustel (meetod A.8), seda tähistakse ka Kow. Pow logaritmi kasutatakse kemikaali biokontsentratsiooni potentsiaali tähistamiseks veeorganismides.
      Ekspositsiooni- või seondumisfaas on aeg, mille jooksul kala puutub kokku uuritava ainega.
      Seondumise kiiruskonstant (k1) on numbriline väärtus, mis iseloomustab uuritava aine kontsentratsiooni kasvu kiirust kalas või kala pinnal (või teatud kudedes), kui kala puutub kokku selle ainega (k1 ühik on päev–1).
      Ekspositsioonijärgne või puhastumise (kao) faas on aeg, mis järgneb kala viimisele uuritavat ainet sisaldavast keskkonnast ilma selle aineta keskkonda, mille kestel uuritakse selle aine puhastumist (või summaarset kadu) kalast (või teatud kudedest).
      Puhastumise (kao) kiiruskonstant (k2) on numbriline väärtus, mis iseloomustab uuritava aine kontsentratsiooni vähenemise kiirust kalas (või teatud kudedes) pärast kala viimist uuritavat ainet sisaldavast keskkonnast seda ainet mittesisaldavasse keskkonda (k2 ühik on päev-1).
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Katse koosneb kahest faasist: ekspositsiooni (seondumise) faas ja ekspositsioonijärgne (puhastumise) faas. Seondumisfaasi ajal viiakse sama liiki kalade erinevad rühmad kokku uuritava aine vähemalt kahe kontsentratsiooniga. Seejärel viiakse kalad puhastumisfaasi jaoks uuritava aine vabasse keskkonda. Puhastumisfaas on alati vajalik, välja arvatud juhul, kui aine seondumine seondumisfaasis oli tähtsusetu (näiteks BCF < 10). Uuritava aine kontsentratsiooni kalas või kala pinnal (või teatud kudedes) jälgitakse katse mõlema faasi kestel. Lisaks kahele katses kasutatud kontsentratsioonile hoitakse kontrollrühma kalu samalaadsetes tingimustes ilma uuritava aineta, et võrrelda biokontsentratsiooni katse vältel täheldatud võimalikke ebasoodsaid mõjusid vastava kontrollrühmaga ja teha kindlaks uuritava aine foonilist (mõju mitte avaldavat) kontsentratsiooni.
      Seondumisfaas kestab 28 päeva või vähem, kui on võimalik tõestada, et tasakaal püstitus varem. Seondumisfaasi pikkust ja püsioleku saavutamiseks kuluvat aega saab hinnata 3. liites toodud võrrandi abil. Puhastumisperiood algab kala üleviimisega puhtasse nõusse, milles on sama keskkond, kuid mis ei sisalda uuritavat ainet. Võimaluse korral arvutatakse biokontsentratsiooni tegur nii kalas (Cf) ja vees (Cw) sisalduva uuritava aine kontsentratsiooni suhtena näivas püsiolekus (BCFSS) kui ka kineetilise biokontsentratsiooni tegurina (BCFk) seondumise kiiruskonstandi (k1) ja puhastumise kiiruskonstandi (k2) suhtest eeldades, et protsessid on esimest järku kineetikaga. Kui ilmselgelt ei ole tegemist esimest järku kineetikaga, siis peab kasutama keerulisemaid mudeleid (5. liide).
      Kui püsiolekut ei saavutata 28 päeva jooksul, siis peab seondumisfaasi pikendama kuni püsioleku saavutamiseni või 60 päeva pikkuseni, sõltuvalt kumb neist esimesena saavutatakse, misjärel alustatakse puhastumisfaasi.
      Seondumise kiiruskonstant, puhastumise (kao) kiiruskonstant (või konstandid keerulisemate mudelite korral), biokontsentratsiooni tegur ja kus võimalik, iga nimetatud parameetri usalduspiirid arvutatakse mudelist, mis kirjeldab kõige paremini uuritava aine mõõdetud kontsentratsioone kalades ja vees.
      BCF esitatakse kalade märgkaalu funktsioonina. Siiski võib erieesmärgil kasutada teatud kudesid või organeid (näiteks lihased, maks), kui kala on piisavalt suur või kui kala võib jagada söödavaks (filee) ja mittesöödavaks (sisikond) osaks. Kuna paljude orgaaniliste ainete potentsiaalse biokontsentratsiooni ja lipofiil-ipofiilsuse vahel on selge seos, siis on ka uuritava kala rasvasisalduse ja nende ainete vaadeldava biokontsentratsiooni vahel vastav seos. Seetõttu peaks kõrge lipofiilsusega ainete (näiteks log Pow > 3) biokontsentratsiooni väljendama lisaks kogukaalule ka rasvasisalduse suhtes, et vähendada katsetulemuste varieeruvust.
      Võimaluse korral peaks rasvasisaldust määrama samast bioloogilisest materjalist, millest määrati uuritava aine kontsentratsioon.
      1.4.   UURITAVA AINE ANDMED
      Enne biokontsentratsiooni katse tegemist peab uuritava aine kohta teadma järgmisi andmeid:
      
                  —
               
               
                  lahustuvus vees;
               
            
                  —
               
               
                  jaotuskoefitsient oktanool/vesi Pow (tähistatakse ka kui Kow ja määratakse HPLC meetodiga vastavalt punktile A.8);
               
            
                  —
               
               
                  hüdrolüüs;
               
            
                  —
               
               
                  fototransformatsioon vees, määratakse päikesekiirguse või simuleeritud päikesekiirguse abil biokontsentratsiooni katse kiiritustingimustel (3);
               
            
                  —
               
               
                  pindpinevus (ainete jaoks, mille log Pow väärtust ei saa määrata);
               
            
                  —
               
               
                  aururõhk;
               
            
                  —
               
               
                  kohene biolagunduvus (vajaduse korral),
               
            Muu nõutav teave on uuritava aine toksilisus katses kasutatava kalaliigi suhtes, eelistatult asümptootiline LC50 (st ajast sõltumatu). Teadaoleva mõõtetäpsusega, kordustäpsusega ja tundlikkusega sobilik meetod uuritava aine kvantitatiivse sisalduse määramiseks katselahustes ja bioloogilises materjalis peab olema kättesaadav koos üksikasjaliku kirjeldusega proovi ettevalmistamise ja säilitamise kohta. Samuti peab teadma testainete analüütilist määramispiiri vees ja kala kudedes. 14C-märgistatud uuritava aine kasutamisel on vaja teada ka lisanditest tingitud radioaktiivsuse protsenti.
      1.5.   KATSE KEHTIVUS
      Katse kehtivuseks peavad olema täidetud alljärgnevad tingimused:
      
                  —
               
               
                  temperatuuride erinevus alla ± 2 oC;
               
            
                  —
               
               
                  lahustunud hapniku sisaldus ei tohi langeda alla 60 % küllastuskontsentratsioonist;
               
            
                  —
               
               
                  seondumisfaasis hoitakse uuritava aine kontsentratsiooni kambris ± 20 % piires mõõdetud väärtuste keskmisest;
               
            
                  —
               
               
                  suremus või muud ebasoodsad mõjud ja haigused kontroll- ja katserühma kaladel on katse lõpus alla 10 %; kui katse kestab mitmeid nädalaid või kuid, siis surm või muud ebasoodsad mõjud peavad mõlemas kalade rühmas olema vähem kui 5 % kuu kohta ja mitte ületama kokku 30 %.
               
            1.6.   VÕRDLUSAINED
      Vajaduse korral on katsemenetluse kontrollimiseks hea kasutada teadaoleva biokontsentratsiooni potentsiaaliga võrdlusaineid. Siiski ei saa veel soovitada konkreetseid aineid.
      1.7.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.7.1.   Seadmed
      
      Katseseadme kõikide osade korral peab vältima materjalide kasutamist, mis võivad lahustuda, sorbeeruda või leostuda ning millel on kaladele ebasoodne mõju. Kasutada võib keemiliselt inertsetest materjalidest valmistatud standardseid nelinurkseid või silindrilisi mahuteid, mille mahutavus on kooskõlas voolukiirusega. Vältima peaks pehmest plastmassist torude kasutamist. Eelistatult kasutatakse Teflon®ist (R), roostevabast terasest ja/või klaasist torustikku. Kogemustest on teada, et vaja võib minna kõrge absorptsioonikoefitsiendiga aineid, nagu sünteetilised püretroidid, silaniseeritud klaas. Sellistel juhtudel peab seadmed pärast kasutamist ära viskama.
      1.7.2.   Vesi
      
      Tavaliselt kasutatakse katses looduslikku vett, mida peaks saama saastumata ja ühtlase kvaliteediga allikast. Lahjendusvesi peab olema sellise kvaliteediga, mis tagab valitud kalaliikide ellujäämise aklimatsiooni- ja katseperioodide vältel, ilma et tekiks mis tahes ebanormaalse välimuse või käitumise ilminguid. Ideaaljuhul peaks saama näidata, et uuritavad liigid jäävad ellu, kasvavad ja paljunevad lahjendusvees (näiteks laborikultuur või elutsükli toksilisuse test). Kasutatavas vees peaks eelnevalt määrama vähemalt pH, üldkareduse, tahke jäägi, kogu orgaanilise süsiniku, eelistatult ka ammooniumi, nitriti sisalduse ja mereliikide korral ka soolsuse. Kalade optimaalseks kasvuks vajaminevad parameetrid on hästi teada, kuid liites 1 on toodud mitmete parameetrite soovituslikud maksimumkontsentratsioonid mageda ja soolase vee katsetele.
      Katseperioodi kestel peaks vesi olema konstantse kvaliteediga. Vee pH väärtus peaks olema vahemikus 6,0 kuni 8,5, kuid konkreetse katse ajal ei tohiks muutus olla suurem kui ±0,5 pH ühikut. Selleks, et lahjendusvesi ei mõjutaks liialt katsetulemusi (näiteks moodustades uuritava ainega kompleksühendeid) või kalade seisundit, peab teatud ajavahemike järel analüüsima veeproove. Seal kus lahjendusvesi on teadaolevalt suhteliselt püsiva kvaliteediga peaks raskemetallide (näiteks Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), peamiste anioonide ja katioonide (näiteks Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pestitsiidide (näiteks kõik fosfororgaanilised ja kõik kloororgaanilised pestitsiidid), üldise orgaanilise süsiniku ja suspendeerunud tahkete ainete sisaldust määrama näiteks iga kolme kuu järel. Kui vee kvaliteet on püsiv vähemalt ühe aasta vältel, siis võib erinevaid parameetreid analüüsida harvemini ja proovi võtmise ajavahemikke suurendada (näiteks iga kuue kuu järel).
      Lahjendusvee loodusliku hõljuvaine (tahkete osakeste) sisaldus ja üldine orgaaniline süsinik (TOC) peaks olema võimalikult madalad, et vältida uuritava aine adsorptsiooni orgaanilisele hõljuvainele, mis võib vähendada selle biosaadavust (4). Tahkete osakeste maksimaalne vastuvõetav sisaldus on 5 mg/l (kuivaine, mis ei läbi 0,45 μm filtrit) ja üldise orgaanilise süsiniku sisaldus 2 mg/l (vt 1. liidet). Vajaduse korral peaks vett enne kasutamist filtrima. Kalade (väljaheidete) ja toidujääkide panus orgaanilise süsiniku sisaldusele peaks olema võimalikult madal. Kogu katse kestel ei tohiks orgaanilise süsiniku sisaldus katseanumas ületada uuritavast ainest ja solubiseerijast (kui seda kasutatakse) pärineva orgaanilise süsiniku kontsentratsiooni mitte rohkem kui 10 mg/l (±20 %) võrra.
      1.7.3.   Katselahused
      
      Uuritava aine põhilahus valmistatakse sobiva kontsentratsiooniga. Põhilahus valmistatakse eelistatult uuritava aine segamisel või loksutamisel lahjendusvees. Lahustite või dispergeerijate (solubiliseerijate) kasutamine ei ole soovitatav, siiski võib see olla mõningatel juhtudel vajalik piisavalt kontsentreeritud põhilahuse valmistamisel. Sobivad lahustid on etanool, metanool, etüleenglükoolmonometüüleeter, etüleenglükooldimetüüleeter, dimetüülformamiid ja trietüleenglükool. Sobivad dispergaatorid on Cremophor RH40, Tween 80, metüültselluloos 0,01 % ja HCO-40. Kergesti biolagunevate ühendite kasutamisega tuleb olla ettevaatlik, kuna need võivad läbivoolu katsetes põhjustada probleeme bakterite kasvuga. Uuritav aine võib olla radiomärgistatud ja ta peaks olema kõrgeima puhtusastmega (näiteks eelistatult > 98 %).
      Läbivoolukatsete jaoks on nõutav süsteem (näiteks mõõtepump, proportsionaalne lahjendaja, küllastamissüsteem), mis jaotab ja lahjendab pidevalt uuritava aine põhilahust katsekambritesse. Katsekambris peaks vesi eelistatult vahetuma vähemalt viis kambri mahtu ööpäevas. Eelistatud on läbivoolurežiim, kuid kui see pole võimalik (näiteks mõjutab see katseorganisme kahjulikult), võib kasutada poolseisva veega katset eeldusel, et valideerimisnõuded on täidetud. Põhilahuse ja lahjendusvee voolukiiruseid peab kontrollima 48 tundi enne katset ja seejärel vähemalt iga päev katse vältel. Voolukiiruse kontroll peab hõlmama igat katsekambrit ja sellega tagatakse, et voolukiirus ei varieeru rohkem kui 20 % ühe katsekambri piires või katsekambrite vahel.
      1.7.4.   Liikide valik
      
      Liikide valikukriteeriumiteks on kättesaadavus, sobiv suurus ja võimalus kalu laboritingimustes rahuldavalt pidada. Muud kalaliikide valikukriteeriumid hõlmavad harrastuslikku, kaubanduslikku ja ökoloogilist väärtust, aga ka samaväärset tundlikkust, varasemat edukat kasutamist jms.
      Soovitatavad katseloomade liigid on toodud 2. liites. Kasutada võib ka muid liike, kuid see võib eeldada katsemenetluse kohandamist sobivate katsetingimuste loomiseks. Sellisel juhul tuleb esitada liikide ja katsemeetodi valiku põhjendused.
      1.7.5.   Kalade pidamine
      
      Kalavarude populatsioon peab aklimatiseeruma vähemalt kaks nädalat katse temperatuuril oleva veega ja saama piisavalt sööta, mis on sama tüüpi katses kasutatava söödaga.
      Pärast 48tunnist sisseelamisperioodi märgitakse kalade suremus ja rakendatakse järgmisi kriteeriume:
      
                  —
               
               
                  suremus on suurem kui 10 % populatsioonist seitsme päeva jooksul: terve partii loetakse sobimatuks;
               
            
                  —
               
               
                  suremus on 5 % kuni 10 % populatsioonist seitsme päeva jooksul: kalu jälgitakse veel seitse päeva;
               
            
                  —
               
               
                  suremus on vähem kui 5 % populatsioonist seitsme päeva jooksul: kalad loetakse sobivaks, kuid kui järgmise seitsme päeva jooksul ületab suremus 5 %, siis loetakse terve partii sobimatuks.
               
            Eelnevalt peab veenduma, et katsetes kasutatavatel kaladel ei ole märgatavaid haigusi ja väärarenguid. Kõik haigestunud kalad tuleb jätta kõrvale. Kalu ei tohi ravida kaks nädalat enne katset või katse ajal.
      1.8.   KATSE KÄIK
      1.8.1.   Eelkatse
      
      Eelkatse on vajalik selleks, et optimiseerida lõpliku katse tingimusi, näiteks uuritava aine kontsentratsioonid, seondumis- ja puhastumisfaaside kestus.
      1.8.2.   Ekspositsioonitingimused
      
      1.8.2.1.   Seondumisfaasi kestus
      
      Seondumisfaasi kestust saab ennustada praktilisele kogemusele tuginedes (näiteks eelnevast uuringust või sarnase kemikaali akumulatsiooni andmetest) või teatud empiiriliste seoste põhjal, milles kasutatakse uuritava aine lahustuvust vees või jaotuskoefitsienti oktanool/vesi (vt 3. liidet).
      Seondumisfaas kestab 28 päeva või kuni tasakaalu püstitumiseni. Kui püsiolekut ei saavutata 28 päeva jooksul, siis peab seondumisfaasi pikendama ja sooritama lisamõõtmisi, kuni püsioleku saavutamiseni või 60 päeva, olenevalt sellest, kumb neist esimesena saavutatakse.
      1.8.2.2.   Puhastumisfaasi kestus
      
      Ajavahemik, mis võrdub poolega seondumisfaasi kestusest, on tavaliselt piisav aine sobivaks vähenemiseks (näiteks 95 %) kehakaalu kohta (vt 3. liide, hinnangute selgitused). Kui 95 % kao saavutamiseks vajalik ajavahemik on ebapraktiliselt pikk, ületades näiteks kaks korda seondumisfaasi normaalset kestust (st üle 56 päeva), siis võib kasutada lühemat perioodi (st kuni testaine kontsentratsioon on alla 10 % püsioleku kontsentratsioonist). Ainete korral, mille seondumine ja puhastumine on palju keerulisema skeemiga kui esimest järku kineetikaga ühekambriline kaladega mudel, on aine kadumise kiiruskonstantide määramiseks vajalik pikem puhastumisfaas. Nimetatud perioodi pikkus võib olla piiratud ajavahemikuga, mille kestel uuritava aine kontsentratsioon kalas jääb veel ülespoole analüütilisest määramispiirist.
      1.8.2.3.   Kalade arv
      
      Kalade arv uuritava kontsentratsiooni kohta valitakse nii, et minimaalselt neli kala on proovi kohta iga proovivõtu korra jaoks. Suurema statistilise usaldusväärsuse tagamiseks on vaja proovi kohta suuremat kalade arvu.
      Täiskasvanud kalade kasutamisel tuleb üles märkida katses kasutatud kalade sugu. Kui katses kasutatakse mõlemast soost kalu, siis peab enne ekspositsiooni algust dokumentaalselt näitama, et sugudevahelised rasvasisaldused ei erine märkimisväärselt; kusjuures vajalik võib olla kõikide isaste ja emaste kalade puulimine.
      Iga üksiku katse jaoks peab valima sarnase kaaluga kalu, nii et kõige väiksemad kalad moodustaksid vähemalt kaks kolmandikku kõige suuremate kalade kaalust. Kõik kalad peaksid olema ühevanused ja pärinema ühest allikast. Kuna kalade kaal ja vanus mõjutavad mõnikord märkimisväärselt BCF väärtust (1), siis peab sellised üksikasjad täpselt kirja panema. Soovitatavalt võetakse enne katse algust kalavarudest väiksem valim, et hinnata kalade keskmist kaalu.
      1.8.2.4.   Sisselaskmine
      
      Katse alguses kalade lisamisest põhjustatud Cw vähenemise minimiseerimiseks ja lahustunud hapniku kontsentratsiooni alanemise vältimiseks kasutatakse suurt vee ja kalade suhet. Sisselaskmiskiirus peab sobima katses kasutatavatele liikidele. Kõikidel juhtudel soovitatakse normaalselt sisselaskmiskiirust 0,1 kuni 1,0 g kala (märgkaal) liitri vee kohta päevas. Kui uuritava aine nõutavat kontsentratsiooni saab hoida ± 20 % piirides ja lahustunud hapniku kontsentratsioon ei lange alla 60 % küllastumiskontsentratsioonist, siis võib kasutada ka suuremaid kiiruseid.
      Sobivate sisselaskmisrežiimide valikul arvestatakse liigi normaalset looduslikku elukohta. Näiteks veekogu põhjas elavad kalad vajavad suuremat akvaariumi põhja pindala sama vee mahu korral võrreldes avamere liikidega.
      1.8.2.5.   Toitmine
      
      Aklimatsiooni ja katseperioodi vältel toidetakse kalu sobiva toiduga, mille rasva- ja valgusisaldus on teada ning mille kogus on piisav, et hoida neid tervetena ja säilitada kehakaalu. Kalu söödetakse iga päev kogu aklimatsiooniperioodi ja katse vältel sellises koguses, mis on umbkaudu 1–2 % kehakaalust; see hoiab katse ajal enamiku kalaliikide rasvasisalduse suhteliselt püsival tasemel. Toidu kogust peab ümber arvutama näiteks korra nädalas, et säilitada ühtlast kehakaalu ja rasvasisaldust. Selle arvutuse jaoks võib kalade kaalu igas katsekambris hinnata viimati võetud kalaproovi kaalu põhjal. Kambrisse jäävaid kalu ei tohi kaaluda.
      Söömata toit ja väljaheited imetakse sifooniga katsekambrist välja iga päev kohe pärast toitmist (30 minutit kuni tund). Katse ajal hoitakse kambreid nii puhtana kui võimalik, et orgaanilise aine kontsentratsioon oleks võimalikult madal, kuna orgaanilise süsiniku sisaldus võib piirata uuritava aine biosaadavust (1).
      Kuna paljud toidusegud valmistatakse kalalihast, siis peab neis eelnevalt analüüsima uuritava aine sisaldust. Lisaks on soovitatav analüüsida toidus pestitsiide ja raskemetalle.
      1.8.2.6.   Valgus ja temperatuur
      
      Valgustusperiood on tavaliselt 12 kuni 16 tundi ja temperatuur (± 2 oC) peaks olema sobilik katses kasutatavatele liikidele (vt 2. liidet). Valgustuse tüüp ja omadused peavad olema teada. Ettevaatlik peab olema uuritava aine võimaliku fototransformatsiooni suhtes katses kasutatavatel valgustustingimustel. Vältimaks kalade kokkupuudet mittelooduspärase valguskiirgusega, peab kasutama sobivat valgustusallikat. Osadel juhtudel võib kasutada filtrit, mis neelab ultraviolettkiirgust lainepikkusega alla 290 nm.
      1.8.2.7.   Uuritavad kontsentratsioonid
      
      Kalu eksponeeritakse läbivoolu tingimustel vähemalt kahele uuritava aine kontsentratsioonile vees. Tavaliselt valitakse uuritava aine kõrge (või kõrgeim) kontsentratsioon, mis oleks umbes 1 % selle akuutsest asümptootilisest LC50 väärtusest ja see peaks olema vähemalt 10 korda kõrgem kui selle aine määramispiir vees kasutatava analüütilise meetodiga.
      Kõrgeima katses kasutatava kontsentratsiooni määramiseks võib akuutse 96 tunni LC50 väärtuse jagada sobiva akuutse ja kroonilise väärtuse suhtega (sobivad suhted võivad mõnede kemikaalide jaoks olla 3 kuni 100). Võimaluse korral tuleb kontsentratsioonid valida nii, et nad erineksid ülaltoodust 100 korda. Kui see ei ole võimalik 1 % LC50 kriteeriumi ja analüütilise määramispiiri tõttu, siis peab kasutama väiksemat kordajat kui 100 või kaaluma 14C-märgistatud uuritava aine kasutamist. Kasutatav kontsentratsioon ei tohi olla suurem kui uuritava aine lahustuvus.
      Solubiliseerija kasutamisel ei tohi selle kontsentratsioon olla suurem kui 0,1 ml/l ja see peab olema ühesugune kõigis katseanumates. Solubiliseerija ja testaine osakaalu üldise orgaanilise süsiniku sisaldusest katses kasutatavas vees peab teadma. Siiski tuleb võimaluse korral vältida selliste ainete kasutamist.
      1.8.2.8.   Kontrollkatsed
      
      Lisaks katseseeriatele tuleb teha üks lahjendusvee kontrollkatse või üks kontrollkatse solubiliseerijaga eeldusel, et kasutatav ühend ei mõjuta kalu. Kui ühendi mõju pole kindel, siis peab tegema mõlemad kontrollkatsed.
      1.8.3.   Vee kvaliteedi mõõtmise sagedus
      
      Katse ajal peaks kõikides kambrites mõõtma lahustunud hapniku, TOC, pH ja temperatuuri väärtusi. Vajaduse korral peaks mõõtma lisaks üldkaredust ja soolsust kontrollkatsetes ja ühes kõrge (või kõrgeima) kontsentratsiooniga kambris. Minimaalselt peaks lahustunud hapnikku ja soolsust mõõtma kolm korda – seondumisperioodi alguses, keskel ja lõpus ning puhastumisperioodi ajal korra nädalas. TOC peaks mõõtma katse alguses (24 tundi ja 48 tundi enne seondumisfaasi algust), enne kalade lisamist ja korra nädalas nii seondumis- kui ka puhastumisfaaside ajal. Temperatuuri peaks mõõtma iga päev, pH-d iga perioodi alguses ja lõpus ning karedust üks kord iga katse ajal. Eelistatult peaks temperatuuri jälgima pidevalt vähemalt ühes katseanumas.
      1.8.4.   Kalade ja vee proovide võtmine ning analüüs
      
      1.8.4.1.   Kalade ja vee proovivõtmise ajakava
      
      Katsekambritest võetakse veeproove uuritava aine kontsentratsiooni määramiseks enne kalade sisselaskmist ning seondumis- ja puhastumisfaaside ajal. Minimaalselt võetakse veeproove samal ajal kalaproovidega ning enne toitmist. Seondumisfaasi ajal määratakse uuritava aine kontsentratsiooni selleks, et kontrollida vastavust valideerimisnõuetele.
      Kalaproove võetakse vähemalt viiel korral seondumisfaasi ajal ja vähemalt neljal korral puhastumisfaasi ajal. Kuna osadel juhtudel on keeruline arvutada rahuldava täpsusega BCF väärtuse hinnangut sellise arvu proovide põhjal, eriti kui tegemist ei ole esimest järku puhastumiskineetikaga, siis on soovitatav sagedasem proovivõtmine mõlema perioodi ajal (vt 4. liidet). Lisaproove säilitatakse ja analüüsitakse vaid siis, kui esimese ringi analüüsitulemused ei ole piisavad BCF arvutamiseks soovitud täpsusega.
      Vastuvõetava proovivõtu ajakava näide on toodud 4. liites. Muid ajakavasid saab hõlpsasti arvutada, kasutades Pow oletatavaid väärtusi, et arvutada 95 % seondumiseks vajaminevat ekspositsiooniaega.
      Proovivõtmist jätkatakse seondumisfaasi ajal kuni püsioleku saavutamiseni või 28 päeva möödumiseni, vastavalt kumb on lühem ajavahemik. Kui püsiolekut ei saavutata 28 päeva jooksul, siis peab seondumisfaasi pikendama kuni püsioleku saavutamiseni või 60 päeva möödumiseni, sõltuvalt kumb neist esimesena saavutatakse. Enne puhastumisfaasi viiakse kalad puhastesse mahutitesse.
      1.8.4.2.   Proovivõtt ja proovi ettevalmistus
      
      Analüüsimiseks imetakse veeproov sifooniga läbi inertse torustiku katsekambri keskosast. Kuna filtrimine või tsentrifuugimine ei lahuta alati uuritava aine mitte-biosaadavat fraktsiooni biosaadavast osast (eriti superlipofiilsed kemikaalid, näiteks mille log Pow > 5) (1) (5), siis alati ei tohi neid meetodeid kasutada.
      Selle asemel peab kasutama meetmeid mahutite hoidmiseks võimalikult puhtana ja orgaanilise süsiniku sisaldust peaks jälgima nii seondumis- kui ka puhastumisfaaside ajal.
      Iga proovivõtuga eemaldatakse katsekambritest sobiv arv kalu (tavaliselt minimaalselt neli). Proovivõtu käigus püütud kalu loputatakse kiiresti veega, kuivatatakse, tapetakse kohe kõige sobivamal ja humaansemal viisil ning seejärel kaalutakse.
      Eelistatult analüüsitakse kalu ja vett kohe pärast proovivõtmist, et vältida lagunemist või muid kadusid, ja katse jätkudes arvutatakse umbkaudsed seondumis- ja puhastumiskiirused. Kohene analüüs hoiab ära ka viivituse platoo saavutamise kindlaksmääramisel.
      Kui kohene analüüs ei ole võimalik, siis säilitatakse proove sobival meetodil. Enne uuringu algust tehakse kindlaks sobiv meetod uuritava aine säilitamiseks, näiteks sügavkülmutamine, 4 oC juures hoidmine, säilitamise kestus, ekstraktsioon jms.
      1.8.4.3.   Analüüsimeetodi kvaliteet
      
      Kuna kogu protseduuri täpsuse määrab peamiselt ära uuritava aine määramiseks kasutatava analüüsimeetodi mõõtetäpsus, kordustäpsus ja tundlikkus, siis peab eksperimentaalselt kontrollima, kas keemilise analüüsi täpsus ja korratavus ning uuritava aine eraldamine veest ja kaladest rahuldab selle meetodi tingimusi. Lisaks peab kontrollima, et lahjendusvees ei oleks uuritavat ainet määramispiiri ületavas koguses.
      Vajaduse korral parandatakse katsest saadud Cw ja Cf väärtusi kontrollkatsetest saadud saagise ja foonilise kontsentratsiooni väärtustega. Kala ja vee proove käsitletakse nii, et saastumine ja kaod (näiteks adsorptsioon proovivõtuseadmesse) oleks võimalikult väikesed.
      1.8.4.4.   Kalaproovide analüüs
      
      Kui katses kasutatakse radiomärgistatud aineid, siis on võimalik analüüsida kogu radioaktiivsust (st lähteainete ja metaboliitide) või puhastada proovi nii, et lähteainet saaks eraldi analüüsida. Peamisi metaboliite võib määrata püsiolekus või seondumisfaasi lõpus, sõltuvalt kumb neist saabub varem. Kui BCF on üldiste radiomärgistatud jääkide osas ≥ 1 000 %, siis võib olla mõistlik (osade kemikaalide kategooriate, nagu pestitsiidide jaoks tungivalt soovitatav) nende laguproduktide identifitseerimine ja kvantitatiivne analüüs, mis moodustavad püsiolekus ≥ 10 % kogu jääkidest kala kudedes. Laguproduktide, mis moodustavad ≥ 10 % kõikidest radiomärgistatud jääkidest kala kudedes, identifitseerimisel ja kvantitatiivsel analüüsil on soovitatav identifitseerida ja määrata nende kogus ka katsevees.
      Igas kaalutud kalas peab määrama uuritava aine kontsentratsiooni. Kui see ei ole võimalik, siis võib iga proovivõtmise proovid liita (puulida), kuid selline liitmine piirab andmetega tehtavaid statistilisi arvutusi. Kui teatud statistilisi arvutusi ja suurt andmehulka peetakse tähtsaks, siis peab katses kasutama piisaval arvul kalu, et rahuldada soovitud liitmisprotseduuri ja andmehulga nõudeid (6, 7).
      BCF esitatakse kogu märgkaalu funktsioonina ja kõrge lipofiilsusega ainete jaoks rasvasisalduse funktsioonina. Kalade rasvasisaldus määratakse võimaluse korral iga proovivõtu käigus. Rasvasisalduse määramiseks kasutatakse sobivaid meetodeid (3. liites viiteid 8 ja 2). Standardmeetodina võib soovitada kloroformi/metanooli ekstraktsioonitehnikat (9). Kuna erinevad meetodid ei anna samaseid tulemusi (10), siis on tähtis viidata kasutatavale meetodile. Võimaluse korral peaks rasvasisaldust analüüsima samas ekstraktis, mida kasutatakse uuritava aine analüüsiks, kuna lipiidid eemaldatakse sageli ekstraktist enne kromatograafilist analüüsi. Kala rasvasisaldus (mg/kg, märgkaal) ei tohiks katse lõpus erineda katse alguse väärtusest mitte rohkem kui ± 25 %. Kudede tahke jäägi sisalduse peab samuti ära märkima, et rasva kontsentratsiooni märgkaalus oleks võimalik ümber arvutada kala kuivkaalu kohta.
      2.   ANDMED
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE
      Uuritava aine seondumiskõver saadakse seondumisfaasi kontsentratsiooni kalas või kala pinnal (või kindlaksmääratud kudedes) ja aja funktsioonina aritmeetilises skaalas. Kui kõver saavutab platoo ehk muutub ligikaudu asümptootiliseks ajateljega, siis arvutatakse püsioleku BCFSS järgmisest valemist:
      
         
      Kui püsiolekut ei saavutata, siis on võimalik ohtlikkuse hindamiseks arvutada BCFSS piisava täpsusega „püsiolekust”, mis on 80 % tasakaaluolekust (1,6/k2) või 95 % tasakaaluolekust (3,0/k2).
      Lisaks saab määrata biokontsentratsiooni teguri (BCFk) kahe esimest järku kineetiliste konstantide k1/k2 suhtena. Puhastumise kiiruskonstant (k2) määratakse tavaliselt puhastumiskõveralt (st testaine kontsentratsiooni vähenemine kalades aja jooksul). Seondumise kiiruskonstant (k1) arvutatakse k2 ja Cf väärtuse järgi, mis leitakse seondumiskõveralt (vt 5. liidet). Eelistatud meetod BCFk ja kiiruskonstantide k1
          ja k2 määramiseks on mittelineaarne parameetrite hindamine arvutusprogrammiga (11). k1
          ja k2 arvutamiseks võib kasutada ka graafilisi meetodeid. Kui puhastumiskõver ei ole ilmselgelt esimest järku, siis peab kasutama keerulisemaid mudeleid (vt 3. liites viiteid) ja biostatistika spetsialistide abi.
      2.2.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE
      Tulemuste tõlgendamisel peab olema ettevaatlik, kui uuritava lahuse mõõdetud kontsentratsioonitasemed on analüüsimeetodi määramispiiri ligidal.
      Selgelt määratletud seondumis- ja puhastumiskõverad viitavad hea kvaliteediga biokontsentratsiooni andmetele. Seondumis- ja puhastumiskonstantide varieerumine kahe uuritava kontsentratsiooni vahel ei tohiks ületada 20 %. Täheldatud märkimisväärsed erinevused kahe kontsentratsiooni seondumis- ja puhastumiskiiruste vahel peab üles märkima ja andma võimalikud seletused. Üldiselt läheneb BCF usalduspiir hästi kavandatud uuringutes ± 20 %.
      3.   ARUANDLUS
      Katsetulemused peavad sisaldama järgmist teavet.
      3.1.   UURITAV AINE:
      
                  —
               
               
                  füüsikaline olek ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused;
               
            
                  —
               
               
                  keemilised identifitseerimisandmed (sealhulgas vajaduse korral orgaanilise süsiniku sisaldus);
               
            
                  —
               
               
                  radiomärgistatud ühendite puhul märgistatud aatomite täpne asukoht ja lisanditega seotud radioaktiivsuse protsent.
               
            3.2.   KATSES KASUTATAVAD LIIGID:
      
                  —
               
               
                  teaduslik nimetus, liin, allikas, olemasolul eeltöötlused, aklimatiseerumine, suuruste vahemik jms.
               
            3.3.   KATSETINGIMUSED:
      
                  —
               
               
                  kasutatav katsemenetlus (läbivoolava või poolseisva veega);
               
            
                  —
               
               
                  kasutatava valgustuse tüüp ja omadused ning valgustuse kestus(ed);
               
            
                  —
               
               
                  katse ülesehitus (näiteks katsekambrite arv ja suurus, vee vahetumise kiirus, paralleelkatsete arv, kalade arv paralleelkatsetes, uuritud kontsentratsioonide arv, seondumis- ja puhastumisfaaside pikkus, vee ja kala proovide võtmise sagedus);
               
            
                  —
               
               
                  põhilahuste valmistamismeetod ja uuendamise sagedus (solubiliseerija kasutamisel peab tooma selle kontsentratsiooni ja mõju orgaanilise süsiniku sisaldusele katsevees);
               
            
                  —
               
               
                  nominaalsed uuritud kontsentratsioonid, mõõdetud väärtuste keskmised ja nende standardhälbed katsenõudes ning nende saamismeetod;
               
            
                  —
               
               
                  lahjendusvee allikas, eeltöötluse kirjeldus, tõendid selle kohta, et kalad suudavad selles vees elada, ja vee omadused: pH, karedus, temperatuur, lahustunud hapniku kontsentratsioon, kloori jääksisaldus (kui mõõdeti), üldine orgaaniline süsinik, hõljuvained, katsekeskkonna soolsus (kui on asjakohane) ja muud sooritatud mõõtmised;
               
            
                  —
               
               
                  vee kvaliteet katseanumates, pH, karedus, TOC, temperatuur ja lahustunud hapniku kontsentratsioon;
               
            
                  —
               
               
                  üksikasjalik informatsioon kalade toitmise kohta (toidu tüüp, allikas, koostis (kui võimalik, siis vähemalt rasva- ja valgusisaldus), toidu kogus ja toitmise sagedus);
               
            
                  —
               
               
                  andmed kala ja vee proovide töötlemise kohta, sealhulgas valmistamise üksikasjad, säilitamine, ekstraktsioon ning testaine ja rasvasisalduse (kui mõõdeti) analüütilised protseduurid (ja täpsus).
               
            3.4.   TULEMUSED:
      
                  —
               
               
                  eeluuringute tulemused (kui tehti);
               
            
                  —
               
               
                  kontrollkatse ja iga katsekambri kalade suremus ning mis tahes täheldatud ebanormaalne käitumine;
               
            
                  —
               
               
                  kalade rasvasisaldus (kui määratakse katses);
               
            
                  —
               
               
                  kõverad (sealhulgas mõõdetud andmed), mis näitavad uuritava aine seondumist ja puhastumist kalades, aeg püsioleku saavutamiseks;
               
            
                  —
               
               
                  Cf ja Cw väärtused (kui on asjakohane, siis ka standardhälve ja määramispiirkond) kõikide proovivõtmisaegade jaoks (Cf ühik on μg/g märgkaal (ppm) terve keha või teatud kudede jaoks, nagu rasvad, ja Cw ühik on μg/ml (ppm)), lisaks peab esitama kontrollkatsete Cw väärtused (samuti peab esitama fooni määramise katse andmed);
               
            
                  —
               
               
                  püsioleku biokontsentratsiooni tegur (BCFSS) ja/või kineetiline biokontsentratsiooni tegur (BCFk) ja sobivuse korral seondumise ja puhastumise (kao) kiiruskonstantide 95 % usalduspiirid (kõiki väljendatakse terve kala suhtes ja kui mõõdeti, siis looma või teatud kudede kogu rasvasisaldus), võimaluse korral usalduspiirid ja standardhälve ning uuritava aine iga kontsentratsiooni jaoks kasutatud arvutusmeetod ja andmetöötlus;
               
            
                  —
               
               
                  radiomärgistatud ühendite kasutamisel võib vajaduse korral esitada andmed mis tahes määratud metaboliitide akumuleerumise kohta;
               
            
                  —
               
               
                  kõik ebatavaline katse kohta, mis tahes kõrvalekaldumine protseduuridest ja muu asjakohane informatsioon.
               
            Tulemusi stiilis „ei määratud määramispiiri läheduses” peab vältima eelkatse meetodi arendamise ja eksperimentaalse ülesehitusega, kuna selliseid tulemusi ei saa kasutada kiiruskonstandi arvutamisel.
      4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117–156 17-156.
               
            
                  2)
               
               
                  Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fishf fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29-390.
               
            
                  3)
               
               
                  OECD, Paris (1996).1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.
               
            
                  4)
               
               
                  Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.
               
            
                  5)
               
               
                  US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.
               
            
                  6)
               
               
                  US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.
               
            
                  7)
               
               
                  US EPA (1974). Section 5, A(l). Analysis of Human or animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Evironmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.
               
            
                  8)
               
               
                  Compaan H. (19 8 0) in „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation”, Ch. 2.3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands.
               
            
                  9)
               
               
                  Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099–1105.
               
            
                  10)
               
               
                  Randall R. C, Lee H., Ozretich R. J., Lake J. L. and Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp 1431–1436.
               
            
                  11)
               
               
                  CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method- Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm.
               
            
                  12)
               
               
                  ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.
               
            
         1. liide
         Kasutuskõlbliku lahjendusvee keemilised omadused
         
                      
                  
                  
                     Aine
                  
                  
                     Piirkontsentratsioon
                  
               
                     1
                  
                  
                     Osakesed
                  
                  
                     5 mg/l
                  
               
                     2
                  
                  
                     Üldine orgaaniline süsinik
                  
                  
                     2 mg/l
                  
               
                     3
                  
                  
                     Ioniseerumata ammoniaak
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     4
                  
                  
                     Kloori jäägid
                  
                  
                     10 μg/l
                  
               
                     5
                  
                  
                     Fosfororgaanilised pestitsiidid, üldsisaldus
                  
                  
                     50 ng/l
                  
               
                     6
                  
                  
                     Kloororgaanilised pestitsiidid ja polükloreeritud bifenüülid, üldsisaldus
                  
                  
                     50 ng/l
                  
               
                     7
                  
                  
                     Orgaanilise kloori üldsisaldus
                  
                  
                     25 ng/l
                  
               
                     8
                  
                  
                     Alumiinium
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     9
                  
                  
                     Arseen
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     10
                  
                  
                     Kroom
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     11
                  
                  
                     Koobalt
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     12
                  
                  
                     Vask
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     13
                  
                  
                     Raud
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     14
                  
                  
                     Plii
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     15
                  
                  
                     Nikkel
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     16
                  
                  
                     Tsink
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     17
                  
                  
                     Kaadmium
                  
                  
                     100 ng/l
                  
               
                     18
                  
                  
                     Elavhõbe
                  
                  
                     100 ng/l
                  
               
                     19
                  
                  
                     Hõbe
                  
                  
                     100 ng/l
                  
               
      
         2. liide
         Katsetamiseks soovitatavad kalaliigid
         
                      
                  
                  
                     Soovitatav liik
                  
                  
                     Soovitatav katsetemperatuuride vahemik ( oC)
                  
                  
                     Soovitatav katseisendi täispikkus (cm)
                  
               
                     1
                  
                  
                     
                        Danio rerio
                         (17) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan), sebrakala
                  
                  
                     20–25
                  
                  
                     3,0±0,5
                  
               
                     2
                  
                  
                     
                        Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque), pakspea lepamaim
                  
                  
                     20–25
                  
                  
                     5,0±2,0
                  
               
                     3
                  
                  
                     
                        Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus), karpkala
                  
                  
                     20–25
                  
                  
                     5,0±3,0
                  
               
                     4
                  
                  
                     
                        Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck ja Schlegel), riisikala
                  
                  
                     20–25
                  
                  
                     4,0±1,0
                  
               
                     5
                  
                  
                     
                        Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters), gupi
                  
                  
                     20–25
                  
                  
                     3,0±1,0
                  
               
                     6
                  
                  
                     
                        Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque), suur päikeseahven
                  
                  
                     20–25
                  
                  
                     5,0±2,0
                  
               
                     7
                  
                  
                     
                        Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum), vikerforell
                  
                  
                     13–17
                  
                  
                     8,0±4,0
                  
               
                     8
                  
                  
                     
                        Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) (Linnaeus), harilik ogalik
                  
                  
                     18–20
                  
                  
                     3,0±1,0
                  
               Erinevates riikides on kasutatud mitmesuguseid suudmeala ja merelisi liike, näiteks:
         
                     Kotkaskalalane
                  
                  
                     
                        Leiostomus xanthurus
                     
                  
               
                     
                        Sheepshead minnow
                     
                  
                  
                     
                        Cyprinodon variegatus
                     
                  
               
                     Hõbekülg
                  
                  
                     
                        Menidia beryllina
                     
                  
               
                     Punnkõht (kirevahvenlane)
                  
                  
                     
                        Cymatogaster aggregata
                     
                  
               
                     Inglise merikeel
                  
                  
                     
                        Parophrys vertulus
                     
                  
               
                     Sarvikvõldas
                  
                  
                     
                        Leptocottus armatus
                     
                  
               
                     Harilik ogalik
                  
                  
                     
                        Gasterosteus aculeatus
                     
                  
               
                     Meriahven
                  
                  
                     
                        Dicentracus labrax
                     
                  
               
                     Harilik viidikas
                  
                  
                     
                        Alburnus alburnus
                     
                  
               Kogumine
         Tabelis toodud mageveekalasid on lihtne kasvatada ja/või nad on laialt kättesaadavad aasta läbi, kuna aga mereliste ja suudmealade liikide kättesaadavus on piiratud vastavate riikidega. Neid saab kasvatada ja kultiveerida kalafarmides või laboratooriumis, haiguste ja parasiitide suhtes kontrollitud tingimustel nii, et katseloomad on terved ja teadaolevat päritolu. Need kalad on kättesaadavad paljudes maailma piirkondades.
      
      
         3. liide
         Seondumis- ja puhastumisfaaside kestuse hindamine
         1.   Seondumisfaasi kestuse hindamine
         Enne katse tegemist saab k2 ja seeläbi aega, mis on vajalik püsioleku saavutamiseks, hinnata empiirilisest seo k2 ja jaotuskoefitsiendi n-oktanool/vesi (Pow) või k2 ja vees lahustuvuse (s) vahel.
         k2 (päev-1) võib hinnata näiteks järgmisest empiirilisest seosest (1):
         
                     log10 k2 =-0,414 log10(Pow) + 1,47(r2 = 0,95)
                  
                  
                     (võrrand 1)
                  
               Muude seoste kohta vaata viidet 2.
         Kui jaotuskoefitsient (Pow) ei ole teada, siis võib hinnang põhineda (3) kasutatava aine vesilahustuvusel (s):
         
                     log10 (Pow) = 0,862 log10(s) + 0,710 (r2 = 0,994)
                  
                  
                     (võrrand 2)
                  
               kus s = lahustuvus (mol/l): (n = 36).
         Need seosed kehtivad vaid kemikaalidele, mille log Pow väärtused on vahemikus 2–6,5 (4).
         Aega, mis kulub püsioleku mingi protsendi saavutamiseks, võib leida seondumist ja puhastumist kirjeldavast üldisest kineetilisest võrrandist (esimest järku kineetika) saadud k2-hinnangu rakendamisel:
         
            
         või kui Cw on konstant:
         
                     
                        
                  
                  
                     (võrrand 3)
                  
               Püsioleku saavutamisel (t → ∞) võib võrrandit 3 taandada (5, 6):
         
             või Cf/Cw = k1/k2
             = BCF
         Siis läheneb k1/k2 · Cw kontsentratsioonini „püsiolekus” (Cf, s).
         Võrrandit 3 võib esitada järgmiselt:
         
                     
                         or 
                        
                  
                  
                     (võrrand 4)
                  
               Võrrandi 4 rakendamisel võib püsioleku mingi protsendi saavutamise aega hinnata siis, kui k2 väärtust on eelnevalt hinnatud võrrandi 1 või 2 põhjal.
         Seondumisfaasi statistiliselt optimaalne kestus statistiliselt vastuvõetavate andmete (BCFk) saamiseks on selline ajavahemik, mis on vajalik, et uuritava aine kontsentratsiooni logaritmi ja lineaarse aja funktsiooni kujutav kõver saavutab keskpunkti või 1,6/k2 või 80 % püsiolekust, kuid mitte rohkem kui 3,0/k2 või 95 % püsiolekust (7).
         Aeg, mis kulub püsioleku 80 % saavutamiseks (võrrand 4):
         
                     
                         või 
                        
                  
                  
                     (võrrand 5)
                  
               Samamoodi on 95 % püsiolekust:
         
                     
                        
                  
                  
                     (võrrand 6)
                  
               Näiteks seondumisfaasi (up) kestus testaine jaoks, mille log Pow = 4, oleks (kasutades võrrandeid 1, 5 ja 6):
         
                     log10k2 = -0,414 · (4) + 1,47
                  
                  
                     k2 = 0,652 päeva–1
                     
                  
               up (80 %) = 1,6/0,652, s.o 2,45 päeva (59 tundi)
         või up (95 %) = 3,0/0,652, s.o 4,60 päeva (110 tundi)
         Seondumisfaasi (up) kestus testaine jaoks, mille s = 10–5 mol/l (log(s) = -5,0), oleks (kasutades võrrandeid 1, 2, 5 ja 6):
         log10 (Pow) = -0,862 (-5,0) + 0,710 = 5,02
         log10k2 = -0,414 (5,02) + 1,47
         k2 = 0,246 päeva–1
         
         up (80 %) = 1,6/0,246, s.o 6,5 päeva (156 tundi)
         või up (95 %) = 3,0/0,246, s.o 12,2 päeva (293 tundi)
         Alternatiivselt võib võrrandit:
         teq = 6,54 x 10-3 Pow + 55,31 (tundi)
         kasutada efektiivse püsioleku saavutamiseks vajamineva aja arvutamiseks (4).
         2.   Puhastumisfaasi kestuse hindamine
         Aega, mis kulub testaine vähenemiseks kalas mõne protsendi võrra esialgsest kontsentratsioonist, saab hinnata üldvõrrandiga, mis kirjeldab seondumist ja puhastumist (esimest järku kineetika) (1, 8).
         Puhastumisfaasi jaoks eeldatakse, et Cw on null. Võrrandit võib taandada:
         
             või 
         kus Cf, o on kontsentratsioon puhastumisperioodi alguses. Siis 50 % puhastumine saavutatakse ajaga (t50):
         
             või 
         Samamoodi saavutatakse 95 % puhastumine ajaga:
         
            
         Kui esimese perioodi jaoks kasutatakse 80 % seondumist (1,6/k2) ja 95 % kadu puhastumisfaasis (3,0/k2), siis puhastumisfaas on umbkaudu kaks korda pikem kui seondumisfaas.
         Tähtis on märkida, et hinnangud põhinevad eeldusel, et seondumise ja puhastumise skeemid järgivad esimest järku kineetikat. Kui see aga ei vasta ilmselgelt esimest järku kineetikale, siis peab kasutama keerulisemaid mudeleid (näiteks viide 1).
         
            Viited (3. liide)
         
                     1)
                  
                  
                     Spacie A. and Hamelink J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, pp. 309–320.
                  
               
                     2)
                  
                  
                     Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.
                  
               
                     3)
                  
                  
                     Chiou C. T. and Schmedding D. W. (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp. 4–10.
                  
               
                     4)
                  
                  
                     Hawker D. W. and Connell D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp. 701–707.
                  
               
                     5)
                  
                  
                     Branson D. R., Blau G. E., Alexander H. C. and Neely W. B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104(4), pp. 785–792.
                  
               
                     6)
                  
                  
                     Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P. H. Part 4.4, pp. 243 — 255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd N.Y.
                  
               
                     7)
                  
                  
                     Reilly P. M., Bajramovic R., Blau G. E., Branson D. R. and Sauerhoff M. W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kenetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp. 614–622.
                  
               
                     8)
                  
                  
                     Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chloro-benzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp. 3–19.
                  
               
      
         4. liide
         Ainete, mille log Pow = 4, biokontsentratsioonikatsete proovivõtu ajakava teoreetiline näide
         
                     Kala proovivõtmine
                  
                  
                     Proovivõtu ajakava
                  
                  
                     Veeproovide arv
                  
                  
                     Kalade arv proovi kohta
                  
               
                     Minimaalne nõutav sagedus (päevades)
                  
                  
                     Lisa proovivõtmine
                  
               
                     Seondumisfaas
                  
                  
                     –1
                     0
                  
                  
                      
                  
                  
                     2 (18)
                     
                     2
                  
                  
                     Lisada 45–80 kala
                  
               
                     1.
                  
                  
                     0,3
                  
                  
                     0,4
                  
                  
                     2
                     (2)
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     2.
                  
                  
                     0,6
                  
                  
                     0,9
                  
                  
                     2
                     (2)
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     3.
                  
                  
                     1,2
                  
                  
                     1,7
                  
                  
                     2
                     (2)
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     4.
                  
                  
                     2,4
                  
                  
                     3,3
                  
                  
                     2
                     (2)
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     5.
                  
                  
                     4,7
                  
                  
                      
                  
                  
                     2
                  
                  
                     6
                  
               
                     Puhastumisfaas
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     Viia kalad uuritavast ainest vabasse vette
                  
               
                     6.
                  
                  
                     5,0
                  
                  
                     5,3
                  
                  
                      
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     7.
                  
                  
                     5,9
                  
                  
                     7,0
                  
                  
                      
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     8.
                  
                  
                     9,3
                  
                  
                     11,2
                  
                  
                      
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     9.
                  
                  
                     14,0
                  
                  
                     17,5
                  
                  
                      
                  
                  
                     6
                     (4)
                  
               
                     Sulgudes esitatud väärtused on lisaproovivõtmise korral võetav proovide (vesi, kalad) arv.
                     
                                 
                                    NB
                                 
                              
                              
                                 !
                              
                              
                                 Katse-eelne k2 väärtuse hindamise tulemus log Pow = 4,0 jaoks on 0,652 päeva-1. Eksperimendi kogupikkus on 3 × up = 3 × 4,6 päeva, s.o 14 päeva. Seondumisfaasi (up) hindamise kohta vaata 3. liidet.
                              
                           
               
      
         5. liide
         Mudeli valimine
         Enamikku biokontsentratsiooni andmeid saab eeldatavalt kirjeldada „piisavalt” hästi lihtsa kahekambrilise/kaheparameetrilise mudeliga, mida esitab sirgjoon, mis läheneb kalas puhastumisfaasi ajal määratud kontsentratsiooni punktideni, kui need kantakse poollogaritmilisele graafikule. (Kui neid punkte ei saa kanda sirgjoonele, peab kasutama keerulisemaid mudeleid, vt näiteks Spacie ja Hamelink, viide 1 liites 3).
         Puhastumise (kao) kiiruskonstandi k2 graafiline määramismeetod
         Igas kalaproovis määratud uuritava aine kontsentratsioon esitatakse aja funktsioonina poollogaritmilisel graafikul. Saadud joone tõus on k2.
         
            
         
            
         Peab mainima, et kõrvalekalded sirgjoonest võivad viidata keerulisemale puhastumise skeemile kui esimest järku kineetika. Puhastumise kõrvalekaldumisel esimest järku kineetikast võib kasutada graafilist meetodit, et kindlaks teha selle kõrvalekaldumise tüüpe.
         Seondumise kiiruskonstandi k1 graafiline määramismeetod
         Antud k2 korral arvutatakse k1 järgmiselt: x
         
                     
                        
                  
                  
                     (võrrand 1)
                  
               Cf väärtus saadakse tasase seondumiskõvera keskpunktist, mis saadi kontsentratsiooni logaritmi ja aja funktsiooni graafilisel kujutamisel (aritmeetilisel skaalal).
         Seondumise ja puhastumise (kao) kiiruskonstantide määramine arvutiprogrammiga
         Eelistatud meetodid biokontsentratsiooni teguri ja kiiruskonstantide k1 ja k2 määramiseks on mittelineaarne parameetrite hindamismeetod arvutiprogrammiga. Need programmid leiavad k1 ja k2 jaoks väärtusi järjestikuse aja ja kontsentratsiooni andmete ja mudeli põhjal.
         
                     
                         0 < t < tc
                  
                  
                     (võrrand 2)
                  
               
                     
                         t < tc
                  
                  
                     (võrrand 3)
                  
               kus tc = aeg seondumisfaasi lõpus.
         See meetod annab k1 ja k2 standardhälvete hinnangu.
         Kuna k2 saab enamikul juhtudel hinnata puhastumiskõveralt suhteliselt kõrge täpsusega ja kuna kahe parameetri k1 ja k2 vahel on tugev korrelatsioon, siis samaaegsel määramisel on soovitatav esmalt arvutada k2 puhastumisandmetest ja seejärel arvutada k1 seondumisandmetest, kasutades mittelineaarset regressiooni.
      
      C.14.   NOORKALADE KASVUKATSE
      1.   MEETOD
      Käesolev kasvu toksilisuse katsemeetod lähtub juhendist OECD TG 215 (2000).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesoleva katse eesmärk on hinnata kemikaalidega pikaajalise kokkupuute mõju noorkalade kasvule. See põhineb meetodil, mis töötati välja ja mida on võrreldud laboritevaheliselt (1, 2) Euroopa Liidu piires, et hinnata kemikaalide mõju noorte vikerforellide (Oncorynchus mykiss) kasvule läbivoolutingimustes. Võib kasutada ka teisi hästi dokumenteeritud liike. Näiteks on saadud kogemusi sebrakala (Danio rerio) (3, 4) ja jaapani riisikalaga (Oryzias latipes) (5, 6, 7) tehtud kasvukatsetest.
      Vt ka üldise sissejuhatuse C osa.
      1.2.   MÕISTED
      
         LOEC (Lowest Observed Effect Concentration, vähim toimet avaldav kontsentratsioon) – madalaim uuritud uuritava aine kontsentratsioon, mille puhul täheldatakse võrreldes kontrolliga aine märgatavat mõju (p < 0,05). Siiski peavad kõik uuritavad kontsentratsioonid, mis on suuremad kui LOEC, omama kahjulikku mõju, mis on võrdne või suurem kui LOEC korral täheldatud mõju.
      
         NOEC (No Observed Effect Concentration – katsealustele organismidele täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon) – uuritav kontsentratsioon, mille väärtus jääb vahetult alla LOEC väärtuse.
      
         EC
         
            x
          – käesolevas katsemeetodis uuritava aine kontsentratsioon, mis põhjustab x % muutuse kala kasvukiiruses võrreldes kontrollkatsetega.
      
         Laadimisnorm – kalade märgmass vee ruumala kohta.
      
         Loomkoormus – kalade arv vee ruumala kohta.
      
         Üksikute kalade kasvu erikiirus – väljendab ühe üksiku kala kasvukiirust selle esialgse kaalu alusel.
      
         Kasvu keskmistatud erikiirus mahutis – väljendab mahutis oleva populatsiooni keskmist kasvukiirust ühe kontsentratsiooni piires.
      
         Kasvu pseudoerikiirus – väljendab individuaalset kasvukiirust võrrelduna mahutis oleva populatsiooni keskmise esialgse kaaluga.
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Eksponentsiaalses kasvufaasis olevad noorkalad kaalutakse ja asetatakse katsekambritesse, kus nad eelistatult läbivoolutingimustes või, kui see ei ole võimalik, siis sobivates poolstaatilistes (staatiline – uuendamine) tingimustes puutuvad kokku vees lahustatud uuritava aine paljude subletaalsete kontsentratsioonidega. Katse kestab 28 päeva. Kalu toidetakse iga päev. Toiduratsioon põhineb kalade esialgsel kaalul ja selle võib ümber arvutada pärast 14. päeva. Katse lõppedes kaalutakse kalad uuesti. Mõju kasvukiirusele analüüsitakse regressioonimudeli abil eesmärgiga määrata kindlaks kontsentratsioon, mis põhjustaks kasvukiiruses x % muutuse, st ECX (nt EC10, EC20 või EC30). Alternatiivina võib neid andmeid võrrelda ka kontrollväärtustega, et määrata kindlaks vähim toimet avaldav kontsentratsioon (LOEC) ja seega ka täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC).
      1.4.   TEAVE UURITAVA AINE KOHTA
      Akuutse toksilisuse katse tulemused (vt katsemeetod C.1), eelistatavalt samade liikide kohta, kes on valitud kõnealuse katse jaoks, peaksid olema kättesaadavad. See tähendab, et on teada uuritava aine lahustuvus vees ja aururõhk ja olemas on usaldusväärne analüütiline meetod aine kvantifitseerimiseks uuritavates lahustes teadaoleva ja dokumenteeritud täpsusega ja olemas on avastamispiir.
      Kasulik teave on sealhulgas struktuurivalem, aine puhtus, püsivus vees ja valguse käes, pKa, Pow ja kiire biolagunduvuse katse tulemused (vt katsemeetod C.4).
      1.5.   KATSE VALIIDSUS
      Katse valiidsuse kohta kehtivad järgmised tingimused:
      
                  —
               
               
                  kontroll-looma(de) suremus ei tohi katse lõpus ületada 10 %;
               
            
                  —
               
               
                  kalade keskmine kaal kontrollrühma(de)s peab olema piisavalt suurenenud, et võimaldada avastada kasvukiiruse juures oluliseks peetav minimaalne muutus. Laboritevaheline võrdlus (2) on näidanud, et vikerforelli puhul peab kalade keskmine kaal kontrollrühmades suurenema 28 päeva jooksul vähemalt poole võrra (st 50 %) nende esialgsest kaalust; nt esialgne kaal: 1 g/kala (= 100 %), lõplik pärast 28. päeva: ≥ 1,5 g/kala (≥ 150 %);
               
            
                  —
               
               
                  lahustunud hapniku kontsentratsioon peab olema vähemalt 60 % õhuga küllastamisel saadud väärtusest (ASV) kogu katse jooksul;
               
            
                  —
               
               
                  vee temperatuur ei tohi mis tahes ajal katse jooksul katsekambrites erineda rohkem kui ± 1 oC ja see tuleks säilitada 2 oC piires katsealusele liigile ettenähtud temperatuurivahemikus (1. liide).
               
            1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Seadmed
      Tavalised laboratooriumiseadmed, eeskätt järgmised:
      
                  —
               
               
                  hapniku- ja pH-mõõturid;
               
            
                  —
               
               
                  seadmed vee kareduse ja leelisuse kindlaksmääramiseks;
               
            
                  —
               
               
                  asjakohased temperatuuri reguleerimise ja eelistatavalt pideva monitooringu seadmed;
               
            
                  —
               
               
                  keemiliselt inertsest materjalist soovitatud laadimisnormi ja loomkoormuse jaoks piisava suurusega mahutid (vt punkti 1.8.5 ja 1. liidet);
               
            
                  —
               
               
                  sobiva täpsusega kaalud (st täpsus kuni ±0,5 %).
               
            1.6.2.   Vesi
      Uuringus võib kasutada mis tahes sellist vett, milles katsealune liik kasvab ja milles tal on piisavalt pikk eluiga. Vesi peab olema katseperioodi jooksul püsiva kvaliteediga. Vee pH peaks olema vahemikus 6,5–8,5, siiski ei tohiks see katse jooksul muutuda rohkem kui ±0,5 pH-ühikut. Soovitatav vee karedus on üle 140 mg/l (väljendatuna CaCO3-na). Et lahjendamiseks kasutatav vesi ei mõjutaks liigselt katsetulemusi (nt moodustades uuritava aine kompleksi), tuleb vaheaegade järel võtta analüüsimiseks proove. Raskmetallid (nt Cu, Pb, Zn, Hg, Cd ja Ni), enamik anioone ja katioone (nt Ca, Mg, Na, K, Cl ja SO4), pestitsiidid (nt fosfororgaaniliste ja kloororgaaniliste pestitsiitide kogusisaldus), kogu orgaanilise süsiniku ja heljuva tahke aine sisaldus tuleks määrata näiteks iga kolme kuu järel, kui lahjendamiseks kasutatav vesi teatakse olevat suhteliselt püsiva kvaliteediga. Kui vähemalt ühe aasta jooksul on tõestatud püsiv vee kvaliteet, võib neid määramisi teha harvemini ja intervalle pikendada (nt iga kuue kuu järel). 2. liites on esitatud mõned lahjendamiseks kasutatava vee nõuetekohased keemilised omadused.
      1.6.3.   Uuritavad lahused
      Valitud kontsentratsiooniga uuritavad lahused valmistatakse ette põhilahust lahjendades.
      Põhilahus tuleks eelistatavalt valmistada lihtsalt uuritava aine segamise või loksutamisega lahjendamiseks kasutatavas vees, kasutades selleks mehaanilisi vahendeid (nt segamist või ultraheli). Sobiva kontsentratsiooniga põhilahuse saamiseks võib kasutada küllastuskolonne (lahustuvuskolonne).
      Lahustite või dispergantide (solubiliseerivate ainete) kasutamine võib sobiva kontsentratsiooniga põhilahuse valmistamiseks olla teatud juhtudel nõutav. Sobivad lahustid on näiteks atsetoon, etanool, metanool, dimetüülsulfoksiid, dimetüülformamiid ja trietüleenglükool. Sobivad dispergandid on näiteks Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % metüültselluloos ja HCO-40. Kergesti biolagunduvate ainete (nt atsetoon) ja/või väga lenduvate ainete kasutamisel tuleb olla ettevaatlik, sest need võivad põhjustada probleeme bakterite kasvu tõttu läbivooluga katsetes. Solubiliseeriva aine kasutamisel ei tohi sellel olla märkimisväärset mõju kalade kasvule ega märgatavat negatiivset mõju noorkaladele, mida saab täheldada ainult lahustiga tehtava kontrollkatse abil.
      Läbivooluga katsete puhul tuleb kasutada süsteemi, mis pidevalt jaotab ja lahjendab uuritava aine põhilahust (nt dosaatorpump, proportsionaallahjendusseade, küllastus seadmega süsteem), et viia katsekambritesse sisse erinevad kontsentratsioonid. Põhilahuste ja lahjendamiseks kasutatava vee voolukiirust tuleb kontrollida katse jooksul kindlate ajavahemike järel, eelistatavalt iga päev, ja need ei tohiks varieeruda rohkem kui 10 % kogu uuringu jooksul. Laboritevaheline võrdlus (2) on näidanud, et vikerforelli puhul on aktsepteeritav vee eemaldumiskiirus katse jooksul 6 liitrit grammi kala kohta päevas (vt punkti 1.8.2.2).
      Poolstaatiliste (uuendamis)katsete puhul sõltub keskkonna uuendamine uuritava aine püsivusest, kuid vett soovitatakse uuendada iga päev. Kui esialgsetes püsivuskatsetes (vt punkti 1.4) ei ole uuritava aine kontsentratsioon uuendamise perioodil stabiilne (st on väljaspool 80–120 % nimiväärtuse ulatust või langeb alla 80 % esialgselt määratud kontsentratsioonist), tuleks kaaluda läbivoolukatse kasutamist.
      1.6.4.   Liigi valimine
      Käesoleva katse puhul soovitatakse kasutada vikerforelli (Oncorhynchus mykiss), kuna enamik kogemusi on saadud selle liigi laboritevahelise võrdluse kaudu (1, 2). Siiski võib kasutada ka teisi hästi dokumenteeritud liike, kuid katsemenetlust võib olla tarvis kohandada, et oleks tagatud sobivad katsetingimused. Näiteks on olemas kogemused ka sebrakala (Danio rerio) (3, 4) ja jaapani riisikalaga (Oryzias latipes) (5, 6, 7). Sellisel juhul tuleb liigi ja katsemeetodi valikut põhjendada.
      1.6.5.   Kalade pidamine
      Katsealused kalad tuleb valida ühest populatsioonist, eelistatavalt samast pesakonnast, mida on hoitud vähemalt kaks nädalat enne katset sellistes veekvaliteedi ja valgustustingimustes, mis sarnanevad katses kasutatavatele. Kalade päevane toiduratsioon peaks moodustama vähemalt 2 % kehakaalust ja eelistatavalt 4 % kehakaalust päevas kogu pidamisperioodi ja katse jooksul.
      Pärast 48tunnise kohanemisperioodi lõppu registreeritakse suremus ja kohaldatakse järgmisi kriteeriume:
      
                  —
               
               
                  kui suremus on suurem kui 10 % populatsioonist seitsme päeva jooksul: lükatakse kogu partii kõrvale;
               
            
                  —
               
               
                  kui suremus on populatsioonist 5–10 %: lastakse kaladel aklimatiseeruda veel seitse päeva; kui nende järgmise seitsme päeva jooksul on suremus suurem kui 5 %, lükatakse kogu partii kõrvale;
               
            
                  —
               
               
                  kui suremus on seitsme päeva jooksul väiksem kui 5 % populatsioonist: võetakse partii vastu.
               
            Kalad ei tohiks saada haiguste ravi kaks nädalat enne katset ega katse ajal.
      1.7.   KATSE KAVANDAMINE
      „Katse kavandamine” on seotud uuritavate kontsentratsioonide arvu ja vahemike, iga kontsentratsioonitaseme jaoks mahutite arvu valiku ja kalade arvu valikuga mahuti kohta. Ideaaljuhul tuleks katse kavandada vastavalt
      
                  —
               
               
                  uuringu eesmärkidele;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatava statistilise analüüsi meetodile;
               
            
                  —
               
               
                  katsevahendite olemasolule ja maksumusele.
               
            Eesmärkide aruanne peaks võimaluse korral määratlema statistilise võimsuse, millega antud erinevus (nt kasvukiiruses) tuleb tuvastada, või alternatiivina täpsus, millega tuleb määrata ECX (nt x = 10, 20 või 30 ja eelistatavalt mitte alla 10). Ilma selleta ei ole võimalik uuringu suurust kindlalt määratleda.
      Tähtis on mõista, et plaan, mis on optimaalne (võimaldab ressursse kõige paremini ära kasutada) ühte statistilise analüüsi meetodit kasutades, ei ole ilmtingimata optimaalne teise jaoks. Seega ei ole soovitatav plaan LOEC/NOEC kindlaksmääramiseks sama, mida soovitatakse regressioonanalüüsi korral.
      Enamikul juhtudel eelistatakse regressioonanalüüsi dispersioonanalüüsile põhjustel, mida on käsitlenud Stephan ja Rogers (8). Siiski, kui ei ole leitud sobilikku regressioonimudelit (r2 < 0,9), tuleks kasutada NOEC/LOEC.
      1.7.1.   Regressioonanalüüsi kavandamine
      Regressioonalalüüsi kasutava katse kavandamisel tuleb silmas pidada järgmisi tähtsaid asjaolusid:
      
                  —
               
               
                  toimiv kontsentratsioon (nt EC10, 20, 30) ja see kontsentratsioonivahemik, mis pakub uuritava aine toime seisukohalt huvi, peaksid kindlasti olema kaetud katses kasutatavate kontsentratsioonidega. Täpsus, millega saab hinnata toimivaid kontsentratsioone, on suurim siis, kui toimiv kontsentratsioon paikneb kasutatud kontsentratsioonivahemiku keskel. Katse esialgse vahemiku leidmiseks võib olla kasulik katses kasutatavate sobivate kontsentratsioonide valimisel;
               
            
                  —
               
               
                  selleks, et võimaldada rahuldavat statistilist modelleerimist, peaks katses kasutama vähemalt ühte kontrollmahutit ja viit erinevate kontsentratsioonidega lisamahutit. Solubiliseeriva aine kasutamisel tuleks lisaks katseseeriale kasutada ka ühte kontrollkatset, kus kasutatakse solubiliseerivat ainet kõige suuremas uuritud kontsentratsioonis (vt punkte 1.8.3 ja 1.8.4);
               
            
                  —
               
               
                  kasutada võib sobilikku geomeetrilist või logaritmilist jada (9) (vt 3. liidet). Eelistada tuleb uuritavate kontsentratsioonide logaritmilist jaotust;
               
            
                  —
               
               
                  kui kasutatakse rohkem kui kuut mahutit, tuleks lisamahuteid kasutada kas selleks, et võimaldada dubleerimist või jaotada need ära kontsentratsioonivahemike vahel, et võimaldada lähedasem vahemik tasemete vahel. Need mõlemad meetmed on võrdselt soovitatavad.
               
            1.7.2.   Dispersioonanalüüsi (ANOVA) kasutamine NOEC/LOEC määramise kavandamisel
      Eelistatavalt peaksid olema dubleerivad mahutid iga kontsentratsiooni jaoks ja statistiline analüüs tuleks teha mahuti tasandil (10). Ilma dubleerivate mahutiteta ei tohi lubada mahutite vahel mingit varieerivust peale selle, mis on põhjustatud üksikutest kaladest. Siiski, kogemus on näidanud (10), et mahutitevaheline varieerivus oli võrreldes mahutisisese (st kaladevahelise) varieerivusega uuritud juhtumi korral väga väike. Seetõttu on statistilise analüüsi tegemine üksikute kalade põhjal suhteliselt aktsepteeritavaks alternatiiviks.
      Tavapäraselt kasutatakse katses vähemalt viit kontsentratsiooni geomeetrilises jadas, mille tegur eelistatavalt ei ületa 3,2.
      Üldiselt, kui katsete tegemisel kasutatakse dubleerivaid mahuteid, peaks dubleerivate kontrollmahutite arv ja seega ka kalade arv olema kaks korda suurem iga uuritava kontsentratsiooni korral olevast arvust (12, 13, 14). Vastupidi, kui dubleerivaid mahuteid ei kasutata, peaks kontrollrühmas olevate kalade arv olema sama, mis iga uuritava kontsentratsiooni korral.
      Kui ANOVA analüüs peab põhinema pigem mahutite kui üksikute kalade kohta käivatel andmetel (mis eeldaks kas iga kala märgistamist või kasvu pseudoerikiiruse kasutamist (vt punkti 2.1.2)), peab dubleerivaid mahuteid olema piisavalt, et oleks võimalik kindlaks määrata sama uuritava kontsentratsiooniga mahutite korral saadud tulemuste standardhälvet. See tähendab, et vigasid puudutav vabadusastme arv dispersioonanalüüsis peaks olema vähemalt 5 (10). Kui dubleeritakse ainult kontrollkatseid, on oht, et vea varieeruvus moondub, sest see võib suureneda koos kõnealuse kasvukiiruse keskväärtusega. Kuna kasvukiirus kontsentratsiooni suurenedes tõenäoliselt aeglustub, toob see endaga kaasa varieerivuse liiga suureks hindamise.
      1.8.   KATSE KÄIK
      1.8.1.   Katsealuste kalade valik ja kaalumine
      Tähtis on minimeerida kalade kaalu varieerumine katse alguses. 1. liites esitatakse erinevate liikide sobivad suuruste vahemikud, mida soovitatakse käesolevas katses kasutada. Katses kasutatava terve kalapartii üksikute kalade kaal katse alguses peaks ideaaljuhul olema vahemikus ± 10 % aritmeetilisest keskmisest kaalust ja igal juhul ei tohiks see ületada 25 %. Soovitatav on varem kaaluda kalade näidispartii, et arvutada välja keskmine kaal.
      Põhipopulatsiooni ei tohiks toita 24 tundi enne katse algust. Seejärel tuleks kalad valida välja juhuslikult. Kasutades üldanesteetikumi (nt 100 mg/l trikaiinmetaansulfonaati (MS 222) sisaldavat vesilahust, mis on neutraliseeritud kahe osa naatriumvesinikkarbonaadi lisamisega ühe osa MS 222 kohta), kaalutakse kalad üksikult märjalt (kuivaks pühituna) 1. liites toodud täpsusega. Kalad, kelle kaal on ettenähtud piirides, tuleks katsesse võtta ja jagada ära juhuslikult katseanumate vahel. Kalade kogu märgmass igas katsemahutis tuleks protokollida. Nii anesteetikumide kasutamine kui ka kalade käitlemine (sealhulgas kuivatamine ja kaalumine) võib põhjustada stressi ja vigastusi noorkaladele, eriti väiksema suurusega liikidele. Seetõttu tuleks noorkalu käidelda äärmise ettevaatlikkusega, et vältida katseloomadele stressi tekitamist ja nende vigastamist.
      Kalad kaalutakse uuesti katse 28. päeval (vt punkti 1.8.6). Siiski, kui peetakse vajalikuks toiduratsioon ümber arvutada, võib kalu uuesti kaaluda ka katse 14. päeval (vt punkti 1.8.2.3). Kalade suuruse muutuste määramiseks võib kasutada ka teist meetodit, näiteks fotografeerimist, mille põhjal saab kohandada toiduratsioone.
      1.8.2.   Kokkupuutetingimused
      1.8.2.1.   Kestus
      Katse kestus on ≥ 28 päeva.
      1.8.2.2.   Laadimisnormid ja loomkoormused
      On oluline, et laadimisnorm ja loomkoormus sobiksid kasutatavale katseliigile (vt 1. liidet). Kui loomkoormus on liiga suur, põhjustab ülekoormus stressi, mis omakorda aeglustab kasvamise kiirust ja võib põhjustada haigestumist. Kui see on liiga väike, võib see põhjustada territoriaalset käitumist, mis omakorda võib mõjutada kasvu. Igal juhul peaks laadimisnorm olema piisavalt väike, et õhustamiseta säilitada lahustunud hapniku kontsentratsioon, mis moodustab vähemalt 60 % õhuga küllastamisel saadavast väärtusest. Laboritevaheline võrdlus (2) on näidanud, et vikerforelli puhul on aktsepteeritav laadimisnorm 16 forelli (kaaluga 3–5 g) 40 liitris. Soovitatav vee eemaldumiskiirus katse jooksul on 6 liitrit grammi kala kohta päevas.
      1.8.2.3.   Söötmine
      Kalu tuleks sööta sobiva toiduga (1. liide) piisaval määral, et esile kutsuda aktsepteeritavat kasvukiirust. Hoolt tuleb kanda mikroobide kasvu vältimise ja vee hägustumise eest. Vikerforelli puhul vastab 4 %ne päevane kaaluiive tõenäoliselt nendele tingimustele (2, 15, 16, 17). Päevase ratsiooni võib jagada kaheks võrdseks portsjoniks ja anda kaladele kaks korda päevas, vähemalt viietunnise vahega. Ratsioon põhineb kalade esialgsel kogukaalul iga katseanuma kohta. Kui kalad kaalutakse uuesti 14. päeval, arvutatakse ratsioon ümber. Kalu ei tohiks toita 24 tundi enne kaalumist.
      Söömata toit ja väljaheited tuleks eemaldada katseanumast iga päev, puhastades hoolikalt iga mahuti põhja imedes.
      1.8.2.4.   Valgus ja temperatuur
      Fotoperiood ja veetemperatuur peaksid olema sobivad katseliigile (1. liide).
      1.8.3.   Uuritavad kontsentratsioonid
      Tavaliselt nõutakse uuritava aine viit kontsentratsiooni hoolimata uuringu kavast (vt punkti 1.7.2). Eelnevad teadmised uuritava aine toksilisuse kohta (nt akuutsest katsest ja/või vahemiku määramise uuringutest) peaks aitama välja valida sobivad uuritavad kontsentratsioonid. Kui kasutatakse vähem kui viit kontsentratsiooni, tuleb seda põhjendada. Kõige kõrgem uuritav kontsentratsioon ei tohiks ületada aine lahustuvuspiiri vees.
      Kui põhilahuse valmistamisel kasutatakse solubiliseerivat ainet, ei tohiks selle lõplik kontsentratsioon olla suurem kui 0,1 ml/l ja see peaks eelistatavalt olema sama kõikides katseanumates (vt punkti 1.6.3). Siiski tuleks tarvitusele võtta kõik meetmed, et vältida selliste kemikaalide kasutamist.
      1.8.4.   Kontrollimised
      Lahjendamiseks kasutatava vee kontrollimiste arv sõltub uuringu kavast (vt punkte 1.7–1.7.2). Kui kasutatakse solubiliseerivat ainet, tuleks seda kontrollida sama arv kordi kui vett.
      1.8.5.   Analüütiliste määramiste ja mõõtmiste sagedus
      Katse jooksul määratakse uuritava aine kontsentratsioonid korrapäraste ajavahemike tagant (vt allpool).
      Läbivoolukatsetes tuleb kontrollida lahusti ja mürkaine põhilahuse voolukiiruseid kindlate ajavahemike järel, eelistatavalt iga päev, ja need ei tohiks varieeruda rohkem kui 10 % kogu katse jooksul. Kui eeldatakse, et uuritava aine kontsentratsioonid on ± 20 % nimiväärtusest (st vahemikus 80–120 %; vt punkte 1.6.2 ja 1.6.3), soovitatakse analüüsida vähemalt kõige kõrgemaid ja madalamaid uuritavaid kontsentratsioone katse alguses ja seejärel nädalaste vaheaegadega. Katse puhul, milles ei eeldata, et uuritava aine kontsentratsioon jääb vahemikku ± 20 % nimiväärtusest (uuritava aine püsivusandmete põhjal), on vajalik analüüsida kõiki uuritavaid kontsentratsioone, kuid järgides sama režiimi.
      Poolstaatilistes (uuendamis)katsetes, kus eeldatakse, et uuritava aine kontsentratsioon jääb vahemikku ± 20 % nimiväärtusest, soovitatakse analüüsida vähemalt kõige kõrgemaid ja madalamaid kontsentratsioone kohe pärast valmistamist ja vahetult enne uuendamist uuringu alguses ja seejärel iga nädal. Katsete puhul, milles ei eeldata, et uuritava aine kontsentratsioon jääb vahemikku ± 20 % nimiväärtusest, tuleb analüüsida kõiki uuritavaid kontsentratsioone, järgides sama režiimi, mida kasutatakse püsivamate ainete puhul.
      On soovitatav, et tulemused põhineksid mõõdetud kontsentratsioonidel. Siiski, kui on tõendeid selle kohta, et uuritava aine kontsentratsiooni lahuses on suudetud säilitada rahuldavalt vahemikus ± 20 % nimiväärtusest või esialgsest mõõdetud kontsentratsioonist kogu katse jooksul, võivad tulemused põhineda nimi- või mõõdetud väärtustel.
      Proove võib olla vaja filtreerida (nt kasutades 0,45 μm suuruseid poore) või tsentrifuugimist. Tsentrifuugimine on soovitatav menetlus. Siiski, kui uuritav aine ei adsorbeeru filtritel, on ka filtreerimine aktsepteeritud.
      Katse jooksul tuleks mõõta lahustunud hapniku kontsentratsiooni, pH-d ja temperatuuri kõikides katseanumates. Kontrollkatsetes ja suurima kontsentratsiooniga anumas mõõdetakse vee kogukaredust, leelisust ja soolsust (kui see on oluline). Lahustunud hapniku kontsentratsiooni ja soolsust (kui see on oluline) tuleb mõõta minimaalselt kolm korda (katse alguses, keskel ja lõpus). Poolstaatiliste katsete puhul soovitatakse lahustunud hapniku kontsentratsiooni mõõta sagedamini, eelistatavalt enne ja pärast iga vee uuendamist või vähemalt kord nädalas. pH tuleks määrata staatilistes uuendamise katsetes iga vee uuendamise alguses ja lõpus ning vähemalt kord nädalas läbivooluga katsetes. Karedust ja leelisust tuleks mõõta üks kord iga katse ajal. Temperatuuri tuleks eelistatavalt jälgida pidevalt vähemalt ühes katseanumas.
      1.8.6.   Vaatlused
      Kaal: katse lõpus tuleb ära kaaluda kõik ellujäänud kalad märgmassi (kuivaks pühituna) saamiseks kas rühmana katseanuma kaupa või üksikult. Üksikute loomade kaalumisele, mis eeldab, et kõik kalad oleksid märgistatud, eelistatakse kaalumist katseanuma kaupa. Individuaalkaalu mõõtmise korral üksikute kalade kasvu erikiiruse kindlaksmääramiseks peaks olema valitud selline märgistamismeetod, mis väldiks loomadele stressi tekitamist (sobida võivad külmmärgistamise alternatiivid, nt peene värvilise õngenööri kasutamine).
      Kalad tuleks katseperioodi jooksul üle vaadata iga päev ja mis tahes välised anomaaliad (nagu verejooks, värvimuutus) ja ebanormaalne käitumine kirja panna. Suremus tuleks registreerida ja surnud kalad eemaldada võimalikult kiiresti. Surnud kalu ei asendata, sest laadimisnorm ja loomkoormus on piisavad, et vältida mahutis olevate kalade arvu muutuse mõju kasvule. Siiski tuleb kohandada söödaratsiooni.
      2.   ANDMED JA ARUANDLUS
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE
      Katse kavandamisel ja analüüsimisel soovitatakse kaasata statistikut, kuna käesolev katsemeetod võimaldab märkimisväärset varieerumist eksperimentaalses plaanis, näiteks katsekambrite arvus, uuritavate kontsentratsioonide arvus, kalade arvus jne. Pidades silmas uuringu kavandamises olevaid võimalusi, ei ole siin antud konkreetseid juhiseid statistiliste menetluste kohta.
      Kasvukiirusi ei tuleks arvutada välja nende katseanumate kohta, milles suremus ületab 10 %. Siiski tuleks suremuse määr registreerida kõikide uuritavate kontsentratsioonide kohta.
      Mis meetodit ka ei kasutata andemete analüüsimisel, keskseks kontseptsiooniks on kasvu erikiirus r aegade t1 ja t2 vahel. Seda võib väljendada erinevalt, sõltuvalt sellest, kas kõik kalad on märgistatud või mitte, või kas on tarvis keskmist väärtust mahuti kohta.
      
         
      
         
      
         
      kus
      
                  r1
                  
               
               
                  =
               
               
                  üksikute kalade kasvu erikiirus
               
            
                  r2
                  
               
               
                  =
               
               
                  keskmine kasvu erikiirus mahutis
               
            
                  r3
                  
               
               
                  =
               
               
                  kasvu pseudoerikiirus
               
            
                  w1, w2
                  
               
               
                  =
               
               
                  ühe konkreetse kala kaal vastavalt ajahetkedel t1 ja t2
                  
               
            
                  loge w1
                  
               
               
                  =
               
               
                  logaritm üksiku kala kaalust uuringuperioodi alguses
               
            
                  loge w2
                  
               
               
                  =
               
               
                  logaritm üksiku kala kaalust uuringuperioodi lõpus
               
            
                  loge W1
                  
               
               
                  =
               
               
                  w1 väärtuste logaritmide keskmine kalade kohta mahutis uuringuperioodi alguses
               
            
                  loge W2
                  
               
               
                  =
               
               
                  w2 väärtuste logaritmide keskmine kalade kohta mahutis uuringuperioodi lõpus
               
            
                  t1, t2
                  
               
               
                  =
               
               
                  aeg (päevades) uuringuperioodi alguses ja lõpus
               
            r1, r2, r3 võib välja arvutada perioodi 0–28 päeva kohta ja vajaduse korral (st kui on tehtud mõõtmised 14. päeval) ka perioodide 0–14 ja 14–28 päeva kohta.
      2.1.1.   Regressioonanalüüsi tulemused (kontsentratsioon – vastuse modelleerimine)
      Käesolev analüüsimeetod sobib esitama sobivat matemaatilist sõltuvust kasvu erikiiruse ja kontsentratsiooni vahel ja seega võimaldab kindlaks määrata ECX, st mis tahes nõutava EC väärtuse. Käesoleva meetodi kasutamisel ei ole r arvutamine üksiku kala jaoks (r1) vajalik ja selle asemel võib analüüs põhineda keskmisel r väärtusel (r2) mahuti kohta. Eelistatud on viimane meetod. See on samuti sobivam väiksemate liikide kasutamise korral.
      Mahuti keskmised spetsiifilised kasvu kiirused (r2) tuleks j joonestada graafiliselt kontsentratsiooniga suhestatuna, selleks et jälgida kontsentratsiooni-reaktsiooni suhet.
      r2 ja kontsentratsiooni vahelise sõltuvuse väljendamiseks tuleks valida sobiv mudel ja selle valikut tuleb toetada sobiva põhjendusega.
      Kui ellujäänud kalade arv on erinevates mahutites erinev, peab mudeli sobitamisel kasutama kas lihtsaid või mittelineaarseid kaalutud mudeleid, mis võimaldavad kasutada erineva suurusega rühmasid.
      Mudeli sobitamise meetod peab võimaldama hinnangu andmist näiteks EC20-le ja selle dispersioonile (kas standardviga või usaldusvahemik). Graafik sobitatud mudeli kohta tuleks andmete suhtes esitada nii, et mudeli sobivus oleks ilmne (8, 18, 19, 20).
      2.1.2.   Tulemuste analüüs LOEC kindlaksmääramiseks
      Kui katse sisaldab endas mahutite dubleerimist kõikidel kontsentratsioonitasanditel, peaks LOEC kindlaksmääramine põhinema mahutit iseloomustava keskmise kasvu erikiiruse (vt punkti 2.1) dispersioonanalüüsil (ANOVA), millele järgneb sobiv meetod (nt Dunnetti või Williamsi katse (12, 13, 14, 21) iga kontsentratsiooni keskmise r-väärtuse võrdlemiseks kontrollkatsete keskmise r-väärtusega eesmärgiga kindlaks määrata madalaim kontsentratsioon, mille jaoks see erinevus on oluline 0,05 tõenäosuse tasemel. Kui parameetriliste meetodite eeldatavad nõuded ei ole täidetud –normaaljaotusest erinev jaotus (nt Shapiro-Wilki katse) või heterogeenne dispersioon (Barletti katse) –, tuleks kaaluda andmete teisendamist homogeenseteks dispersioonideks enne ANOVA analüüsi või kaalutud ANOVA tegemist.
      Kui katses ei dubleerita mahuteid igal kontsentratsioonitasemel, on mahutitel põhinev ANOVA vähetundlik või ei ole seda võimalik teha. Sellisel juhul oleks vastuvõetavaks kompromissiks võtta ANOVA aluseks üksikute kalade kasvu pseudoerikiirused r3.
      Iga uuritava kontsentratsiooni r3 keskväärtust võib seejärel võrrelda kontrollkatsete r3 keskväärtusega. Seejärel võib kindlaks määrata LOEC nii nagu varem. Tuleb tunnistada, et kõnealune meetod ei võimalda mingil moel võtta arvesse suuremat mahutitevahelist varieeruvust kui see, mis on põhjustatud üksikute kalade vahelisest varieeruvusest, ega taga kaitset selle eest. Siiski on kogemus näidanud (8), et mahutitevaheline varieerivus oli väga väike võrreldes mahutisisese (st kaladevahelise) varieerivusega. Kui analüüs ei hõlma üksikuid kalu, tuleb esitada võõrväärtuste identifitseerimise meetod ja õigustus selle kasutamiseks.
      2.2.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE
      Tulemuste tõlgendamisel tuleks olla ettevaatlik, kui uuritavates lahustes mõõdetud mürkaine kontsentratsioonid on analüütilise meetodi avastamispiiri lähedal või kui poolstaatilistes katsetes on uuritava aine kontsentratsioon enne uuendamist väiksem kui värskelt valmistatud lahuses.
      2.3.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      2.3.1.   Uuritav aine:
      
                  —
               
               
                  füüsikaline loomus ning olulised füüsikalis-keemilised omadused;
               
            
                  —
               
               
                  keemilised identifitseerimisandmed, sealhulgas puhtus ja uuritava aine kvantifitseerimiseks kasutatav analüütiline meetod (vajaduse korral).
               
            2.3.2.   Katsealused liigid:
      
                  —
               
               
                  võimaluse korral teaduslik nimi;
               
            
                  —
               
               
                  liin, suurus, tarnija, mis tahes eelnev ravi jms
               
            2.3.3.   Katsetingimused:
      
                  —
               
               
                  kasutatav katsemenetlus (nt poolstaatiline/uuendav, läbivool, laadimine, loomkoormus jne);
               
            
                  —
               
               
                  uuringu kava (nt katseanumate arv, uuritavad kontsentratsioonid ja dubleerivad anumad, kalade arv anuma kohta);
               
            
                  —
               
               
                  põhilahuse valmistamise meetod ja uuendamise sagedus (kui kasutatakse solubiliseerivat ainet, tuleb esitada ka selle kontsentratsioon);
               
            
                  —
               
               
                  uuritavate kontsentratsioonide nimiväärtused, uuritavas anumas mõõdetud keskväärtused ja nende standardhälbed ja nende saamismeetod ning tõendid selle kohta, et need mõõtmised vastavad uuritava aine kontsentratsioonidele tegelikus lahuses;
               
            
                  —
               
               
                  lahjendamiseks kasutatava vee omadused: pH, karedus, leelisus, temperatuur, lahustunud hapniku kontsentratsioon, kloori jääktasemed (kui mõõdetakse), kogu orgaaniline süsinik, suspendeeritud tahked ained, katsekeskkonna soolsus (kui mõõdetakse) ja mis tahes muud tehtud mõõtmised;
               
            
                  —
               
               
                  vee kvaliteet katseanumas: pH, karedus, temperatuur ja lahustunud hapniku kontsentratsioon;
               
            
                  —
               
               
                  üksikasjalik teave söötmise kohta (nt toidu (toitude) liik, päritolu, antav kogus ja sagedus).
               
            2.3.4.   Tulemused:
      
                  —
               
               
                  tõendid selle kohta, et kontrollkatsete korral kehtis valiidsuskriteerium, ning andmed mis tahes kontsentratsiooni korral esineva suremuse kohta;
               
            
                  —
               
               
                  kasutatud statistilise analüüsi meetodid, dubleerimisel või kaladel põhinev statistika, andmete töötlemine ja kasutatud meetodite õigustus;
               
            
                  —
               
               
                  andmetabelid üksikute ja keskmiste kalakaalude kohta 0-, 14. (kui mõõdeti) ja 28. päeval, keskmise kasvu erikiiruse kohta mahutis või kasvu pseudoerikiiruse väärtused (vastavalt olukorrale) perioodide 0–28 päeva või võimaluse korral 0–14 ja 14–28 kohta;
               
            
                  —
               
               
                  statistilise analüüsi tulemused (st regressioonanalüüs või ANOVA) eelistatavalt tabelite ja graafikute kujul ning LOEC (p = 0,05) ja NOEC või ECx võimaluse korral koos vastavate standardvigadega;
               
            
                  —
               
               
                  kalade ebatavalised reaktsioonid ja nähtavad mõjud, mida on põhjustanud uuritav aine.
               
            3.   VIITED
      
      
                  1)
               
               
                  Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals (CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. WRc Report No PRD 1388-M/2.
               
            
                  2)
               
               
                  Ashley S., Mallett M. J. and Grandy N. J. (1990). EEC Ring Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.
               
            
                  3)
               
               
                  Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, pp. 1855–1870.
               
            
                  4)
               
               
                  Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., Munk R., Scholz N. and Höfte B. B. (1991). Effect of 3,4-dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brachydanio rerio): results of a comparative laboratory study. Ecotox. Environ. Safety, 21, pp. 157–164.
               
            
                  5)
               
               
                  Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan.
               
            
                  6)
               
               
                  Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., Leonard, E. N. and Johnson, R. D. (1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes). Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28, pp. 287–297.
               
            
                  7)
               
               
                  Benoit, D. A., Holcombe, G. W. and Spehar, R. L. (1991). Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA-600/3-91-063. US Environmental Protection Agency, Duluth, Minnesota.
               
            
                  8)
               
               
                  Stephan C. E. and Rogers J. W. (1985). Advantages of using regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium, ASTM STP 891, R. C. Bahner and D. J. Hansen, eds., American Society for Testing and Materials, Philadelphia, pp. 328–338.
               
            
                  9)
               
               
                  Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Report EPS 1/RM/28, 81 pp.
               
            
                  10)
               
               
                  Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.
               
            
                  11)
               
               
                  Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10-12 December 1991.
               
            
                  12)
               
               
                  Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp. 1096–1121.
               
            
                  13)
               
               
                  Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, pp. 482-491.
               
            
                  14)
               
               
                  Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, pp. 103–117.
               
            
                  15)
               
               
                  Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994). A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, Oncorhynchus mykiss: effect of feeding level. Aquaculture 120, pp. 123-133.
               
            
                  16)
               
               
                  Quinton, J. C. and Blake, R. W. (1990). The effect of feed cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology, 37, pp. 33–41.
               
            
                  17)
               
               
                  Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 pp.
               
            
                  18)
               
               
                  Bruce, R. D. and Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11, pp. 1485–1494.
               
            
                  19)
               
               
                  DeGraeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, J. H., Dean, Marcus, M. D. and McIntyre, D. O. (1989). Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. Report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Research Institute, Palo Alto, CA.
               
            
                  20)
               
               
                  Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. 12 pp.
               
            
                  21)
               
               
                  Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, pp. 510–531.
               
            
         1. liide
         KATSETEKS SOOVITATAVAD KALALIIGID JA SOBIVAD KATSETINGIMUSED
         
                     Liik
                  
                  
                     Soovitatav katsetemperatuuri vahemik
                     ( oC)
                  
                  
                     Fotoperiood
                     (tundides)
                  
                  
                     Soovitatav vahemik kala algkaalu jaoks
                     (g)
                  
                  
                     Nõutav mõõtmistäpsus
                  
                  
                     Laadimisnorm
                     (g/l)
                  
                  
                     Loomkoormus
                     (liitri kohta)
                  
                  
                     Sööt
                  
                  
                     Katse kestus
                     (päevades)
                  
               
                     
                        Soovitatavad liigid:
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     
                        Oncorhynchus mykiss
                     
                     Vikerforell
                  
                  
                     12,5–16,0
                  
                  
                     12–16
                  
                  
                     1–5
                  
                  
                     lähima 100 mg-ni
                  
                  
                     1,2–2,0
                  
                  
                     4
                  
                  
                     Kaubanduslik lõhelaste kalamaimude kuivtoit
                  
                  
                     ≥ 28
                  
               
                     
                        Teised hästi dokumenteeritud liigid:
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     
                        Danio rerio
                     
                     Sebrakala
                  
                  
                     21–25
                  
                  
                     12–16
                  
                  
                     0,050–0,100
                  
                  
                     lähima 1 mg-ni
                  
                  
                     0,2–1,0
                  
                  
                     5–10
                  
                  
                     Elustoit (Brachionus Artemia)
                  
                  
                     ≥ 28
                  
               
                     
                        Oryzias latipes
                     
                     Jaapani riisikala
                  
                  
                     21–25
                  
                  
                     12–16
                  
                  
                     0,050–0,100
                  
                  
                     lähima 1 mg-ni
                  
                  
                     0,2–1,0
                  
                  
                     5–20
                  
                  
                     Elustoit (Brachionus Artemia)
                  
                  
                     ≥ 28
                  
               
      
         2. liide
         MÕNED AKTSEPTEERITAVA LAHJENDAMISEKS KASUTATAVA VEE KEEMILISEDOMADUSED
         
                     Aine
                  
                  
                     Kontsentratsioonid
                  
               
                     Tahked ained (mikroosakestena)
                  
                  
                     < 20 mg/l
                  
               
                     Kogu orgaaniline süsinik
                  
                  
                     < 2 mg/1
                  
               
                     Ammoniaak (ioniseerimata)
                  
                  
                     < 1 μg/l
                  
               
                     Jääkkloor
                  
                  
                     < 10 μg/l
                  
               
                     Fosfororgaaniliste pestitsiidide kogusisaldus
                  
                  
                     < 50 ng/l
                  
               
                     Kloororgaaniliste pestitsiidide ja poluklooritud bifenüülide kogusisaldus
                  
                  
                     < 50 ng/1
                  
               
                     Orgaanilistes ühendites oleva kloori kogusisaldus
                  
                  
                     < 25 ng/1
                  
               
      
         3. liide
         Toksilisuse uuringuks sobivate kontsentratsioonide logaritmilised jadad (9)
         
                     Veerg (kontsentratsioonide arv 100 ja 10 või 10 ja 1 vahel) (19)
                     
                  
               
                     1
                  
                  
                     2
                  
                  
                     3
                  
                  
                     4
                  
                  
                     5
                  
                  
                     6
                  
                  
                     7
                  
               
                     100
                  
                  
                     100
                  
                  
                     100
                  
                  
                     100
                  
                  
                     100
                  
                  
                     100
                  
                  
                     100
                  
               
                     32
                  
                  
                     46
                  
                  
                     56
                  
                  
                     63
                  
                  
                     68
                  
                  
                     72
                  
                  
                     75
                  
               
                     10
                  
                  
                     22
                  
                  
                     32
                  
                  
                     40
                  
                  
                     46
                  
                  
                     52
                  
                  
                     56
                  
               
                     3,2
                  
                  
                     10
                  
                  
                     18
                  
                  
                     25
                  
                  
                     32
                  
                  
                     37
                  
                  
                     42
                  
               
                     1,0
                  
                  
                     4,6
                  
                  
                     10
                  
                  
                     16
                  
                  
                     22
                  
                  
                     27
                  
                  
                     32
                  
               
                      
                  
                  
                     2,2
                  
                  
                     5,6
                  
                  
                     10
                  
                  
                     15
                  
                  
                     19
                  
                  
                     24
                  
               
                      
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     3,2
                  
                  
                     6,3
                  
                  
                     10
                  
                  
                     14
                  
                  
                     18
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,8
                  
                  
                     4,0
                  
                  
                     6,8
                  
                  
                     10
                  
                  
                     13
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     2,5
                  
                  
                     4,6
                  
                  
                     7,2
                  
                  
                     10
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,6
                  
                  
                     3,2
                  
                  
                     5,2
                  
                  
                     7,5
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     2,2
                  
                  
                     3,7
                  
                  
                     5,6
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,5
                  
                  
                     2,7
                  
                  
                     4,2
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,9
                  
                  
                     3,2
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,4
                  
                  
                     2,4
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,8
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,3
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,0
                  
               
      C.15.   KALA EMBRÜO JA REBUKOTIGA VASTSETEGA TEHTAV LÜHIAJALINE TOKSILISUSE KATSE
      1.   MEETOD
      Käesolev lühiajaline toksilisuse katsemeetod lähtub juhendist OECD TG 212 (1998).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesolev lühiajaline toksilisuse katse kalaembrüote ja rebukotiga vastsetega on lühiajaline uuring, milles uuritava ainega kokkupuudet uuritakse alates värskelt viljastatud marjaterade arenguetapist kuni rebukotist väljatulekuetapi lõpuni. Embrüote ja rebukotiga vastsete katses ei toimu söötmist ja seega tuleks katse lõpetada ajal, kui rebukotiga vastsed toituvad veel rebukotist.
      Katse eesmärk on kindlaks määrata kemikaalide letaalsed ja teatud ulatuses ka subletaalsed mõjud katses kasutatavate liikide konkreetsetes arenguetappides. Käesolevast katsest saadav teave oleks kasulik, kuna a) selle katse abil oleks võimalik ühendada letaalsed ja subletaalsed uuringud, b) seda võiks kasutada sõelkatsena kas täieliku varajaste eluetappide või kroonilise toksilisuse katsete jaoks ja c) sellega võiks uurida liike, mille kasvatamismeetodid ei ole piisavalt arenenud endogeensest toitumisest eksogeensele toitumisele ülemineku perioodi jaoks.
      Tuleks pidada meeles, et kemikaalide kroonilist pikaajalist toksilist toimet kaladele saab tavaliselt täpselt hinnata ainult katsete alusel, mis hõlmavad kala kõiki elutsükleid, ja et mis tahes vähendatud ulatuses kokkupuude ainult teatud eluetappidel võib vähendada tundlikkust ja seega võib tuua kaasa kroonilise toksilisuse alahindamise. Seetõttu eeldatakse, et embrüote ja rebukotiga vastsete katse on vähem tundlik kui täiemahuline varajaste eluetappide katse, eriti mis puutub kõrge lipofiilsusega kemikaalidesse (log Pow > 4) ja kemikaalidesse, millel on spetsiifiline toksiline toime. Siiski eeldatakse väiksemaid erinevusi tundlikkuses nende kahe katse vahel selliste kemikaalide puhul, millel on mittespetsiifiline narkootiline toime (1).
      Enne käesoleva katse avalikustamist saadi enamik embrüote ja rebukotiga vastsete katse kogemusi magevees elava kalaga Danio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae – üldnimetus sebrakala). Üksikasjalikumad juhised katse tegemiseks kõnealuse liigiga on seetõttu esitatud 1. liites. Siiski ei välista see ka teiste liikide kasutamist, mille kohta on olemas kogemusi (tabelid 1A ja 1B).
      1.2.   MÕISTED
      
         LOEC (Lowest Observed Effect Concentration – vähim toimet avaldav kontsentratsioon) – kõige madalam testitud uuritava aine kontsentratsioon, mille puhul täheldatakse aine märgatavat mõju (p < 0,05) võrreldes kontrolliga. Siiski peab kõikidel uuritavatel kontsentratsioonidel, mis on kõrgemad kui LOEC, olema kahjulik mõju, mis on võrdne või suurem kui LOECga täheldatud mõju.
      
         NOEC (No Observed Effect Concentration – täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon) – uuritav kontsentratsioon, mis on vahetult alla LOEC väärtust.
      1.3.   KATSE PÕHIMÕTE
      Embrüod ja rebukotiga vastsed viiakse kokku vees lahustatud uuritava aine erinevate kontsentratsioonidega. Uuringu võib vastavalt protokollile viia läbi kas poolstaatilisena või läbivoolu-uuringuna. Selle valik sõltub uuritava aine iseloomust. Katse algab viljastatud marjaterade asetamisega katsekambritesse ja lõpetatakse vahetult enne seda, kui mis tahes vastsete rebukott ükskõik millises katsekambris on täielikult imendunud või enne nälga suremise algust kontrollkatsetes. Letaalset ja subletaalset mõju hinnatakse ja võrreldakse kontrollväärtustega, et kindlaks määrata vähim toimet avaldav kontsentratsioon ja seega ka kontsentratsioon, mille puhul toimet ei täheldata. Alternatiivina võib neid analüüsida regressioonimudeli abil, et kindlaks määrata kontsentratsioon, mis põhjustaks teatud protsentuaalse toime (nt LC/ECx, kus x on määratletud protsentuaalne toime).
      1.4.   TEAVE UURITAVA AINE KOHTA
      Akuutse toksilisuse katse tulemused (vt meetodit C.1), eelistatavalt samade liikide kohta, kes on valitud kõnealuse katse jaoks, peaksid olema kättesaadavad. Tulemustest võib olla kasu uuritavate kontsentratsioonide sobiva vahemiku valimisel varajaste eluetappide katse jaoks. Teada peaksid olema uuritava aine lahustuvus vees (sealhulgas lahustuvus katses kasutatavas vees) ning aururõhk. Kättesaadavad peaksid olema usaldusväärne teadaoleva ja dokumenteeritud täpsusega analüütiline meetod uuritava aine kvantifitseerimiseks uuritavates lahustes ning avastamispiir.
      Uuritavat ainet puudutav teave, mis on kasulik katsetingimuste loomiseks, on muu hulgas struktuurivalem, aine puhtus, püsivus valguse käes, püsivus katsetingimustes, pKa, Pow ja kiire biolagunduvuse katse tulemused (vt meetodit C.4).
      1.5.   KATSE VALIIDSUS
      Katse valiidsuse kohta kehtivad järgmised tingimused:
      
                  —
               
               
                  viljastatud marjaterade üldine ellujäämine kontrollkatsetes ja, kus see on oluline, ka ainult lahustit sisaldavates anumates, peab olema suurem kui 2. ja 3. liites määratletud piirid või nende piiridega võrdne;
               
            
                  —
               
               
                  lahustunud hapniku kontsentratsioon peab olema vahemikus 60–100 % õhuga küllastumisel saadud väärtusest (ASV) kogu katse jooksul;
               
            
                  —
               
               
                  vee temperatuur ei tohi katsekambrites erineda rohkem kui ±1,5 oC või järjestikuste päevade lõikes mis tahes ajal katse jooksul ja see tuleks hoida katsealusele liigile ettenähtud temperatuurivahemikus (2. ja 3. liidet).
               
            1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Katsekambrid
      Kasutada võib igasuguseid klaasist või muust keemiliselt inertsest materjalist valmistatud anumaid. Anumate mõõtmed peaksid olema piisavalt suured, et võimaldada vastavust laadimisnormile (vt punkti 1.7.1.2). Katsekambrid soovitatakse paigutada uuringupiirkonnas juhuslikult. Kui laboratooriumis on süstemaatilisi mõjusid, mida on võimalik kontrollida väljajätmise abil, eelistatakse täielikult randomiseeritud süsteemile randomiseeritud plokksüsteemi, milles iga menetlus on esindatud igas plokis. Kui kasutatakse väljajätmist, tuleb seda võtta arvesse järgnevas andmete analüüsis. Katsekambrid tuleks varjestada soovimatute häirete eest.
      1.6.2.   Kalaliigi valik
      Soovitatavad kalaliigid on toodud tabelis 1A. Siiski ei välista see ka teiste liikide kasutamist (näited on toodud tabelis 1B), kuid katsemenetlust võib olla tarvis kohandada sobivate katsetingimuste tagamiseks. Sellisel juhul tuleb liigi ja katsemeetodi valikut põhjendada.
      1.6.3.   Sugukalade pidamine
      Sugukalade karja rahuldavatel tingimustel pidamise üksikasjad võib leida OECD juhendist TG 210 (20) 1 ja viidetes 2, 3, 4, 5, 6).
      1.6.4.   Embrüote ja vastsete käitlemine
      Embrüod ja vastsed võivad uuritava ainega puutuda kokku suures anumas olevates võrgust külgedega või otstega väiksemates anumates, mis võimaldavad uuritaval lahusel läbi anuma voolata. Keeristeta voolu läbi nende väikeste anumate võib tekitada nii, et anumad on riputatud kangi külge, mis liigutab neid üles ja alla, kuid hoiab organismid kogu aeg lahuses; kasutada võib ka sifooniga läbivoolutussüsteemi. Lõheliste viljastatud marjaterad võib asetada raamistikule või võrkudele, mille avad on piisavalt suured, et võimaldada vastsetel pärast koorumist sealt läbi kukkuda. Poolstaatilistes katsetes, milles kogu vedelik vahetatakse iga päev, võib kasutada Pasteuri pipette embrüote ja vastsete eemaldamiseks (vt punkti 1.6.6).
      Kui peamises katseanumas on marjaterade hoidmiseks kasutatud marjaterade konteinereid, reste ja võrke, tuleb need piirangud eemaldada pärast vastsete koorumist, (21) välja arvatud see, et võrgud tuleks säilitada kalade põgenemise vältimiseks. Kui on vajadus vastsed ümber paigutada, ei tohi nad kokku puutuda õhuga ning võrke ei tohi kasutada kalade vabastamiseks marjaterade konteineritest (mõnede vähem õrnade liikide nagu karpkala puhul ei ole selline ettevaatusabinõu vajalik). Selle ümberpaigutamise ajastamine erineb liigiti ja ümberpaigutamine ei pea alati olema vajalik. Poolstaatilise meetodi korral võib kasutada mõõteklaase või madalaid anumaid ja vajaduse korral võib asetada võrksõela mõõteklaasi põhjast natuke kõrgemale. Kui nende konteinerite ruumala on piisav, et vastata laadimisnõuetele (vt 1.7.1.2), ei ole embrüote või vastsete ümberpaigutamine vajalik.
      1.6.5.   Vesi
      Katses kasutatavaks veeks sobib vesi, mis vastab 4. liites esitatud aktsepteeritava lahjendamiseks kasutatava vee keemilisi omadusi puudutavatele nõuetele ja milles katsealune liik püsib elusana vähemalt sama kaua kui 2. ja 3. liites kirjeldatud vees. See peab olema katseperioodi jooksul püsiva kvaliteediga. pH peab jääma konstantseks vahemikus ±0,5 pH-ühikut. Selle tagamiseks, et lahjendamiseks kasutatav vesi ei mõjutaks liigselt katse tulemusi (näiteks moodustades uuritava ainega kompleksi) ega mõjutaks negatiivselt sugukarja võimet, tuleb vaheaegade järel võtta analüüsimiseks proove. Raskmetallid (nt Cu, Pb, Zn, Hg, Cd ja Ni), enamik anioone ja katioone (nt Ca, Mg, Na, K, Cl ja SO4), pestitsiidid (nt fosfororgaaniliste ja kloororgaaniliste pestitsiidide kogusisaldus), kogu orgaanilise süsiniku ja heljuva tahke aine sisaldus tuleks määrata näiteks iga kolme kuu järel, kui lahjendamiseks kasutatav vesi teatakse olevat suhteliselt püsiva kvaliteediga. Kui vähemalt ühe aasta jooksul on tõestatud püsiv vee kvaliteet, võib neid määramisi teha harvemini ja pikendada intervalle (nt iga kuue kuu järel).
      1.6.6.   Uuritavad lahused
      Valitud kontsentratsiooniga uuritavad lahused valmistatakse ette põhilahust lahjendades.
      Põhilahus tuleks eelistatavalt valmistada lihtsalt uuritava aine segamise või loksutamisega lahjendamiseks kasutatavas vees, kasutades selleks mehaanilisi vahendeid (nt segamist või ultraheli). Sobiva kontsentratsiooniga põhilahuse saamiseks võib kasutada küllastuskolonne (lahustuvuskolonne). Lahustite või dispergantide (solubiliseerivate ainete) kasutamist tuleks vältida nii palju kui võimalik; siiski võib teatud juhtudel neid ühendeid olla tarvis sobiva kontsentratsiooniga põhilahuse valmistamiseks. Sobivad lahustid on näiteks atsetoon, etanool, metanool, dimetüülformamiid ja trietüleenglükool. Sobivad dispergandid on näiteks Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % metüültselluloos ja HCO-40. Kergesti biolagunduvate ainete (nt atsetoon) ja/või väga lenduvate ainete kasutamisel tuleb olla ettevaatlik, sest need võivad põhjustada probleeme bakterite kasvu tõttu läbivooluga katsetes. Solubiliseeriva aine kasutamisel ei tohi sellel olla märkimisväärset mõju kalade ellujäämisele ega märgatavat negatiivset mõju varajastele eluetappidele, mida saab täheldada ainult lahustiga läbiviidava kontrollkatse abil. Siiski tuleks tarvitusele võtta kõik meetmed, et vältida selliste kemikaalide kasutamist.
      Poolstaatilise meetodi korral võib järgida kahte erinevat uuendamise menetlust; kas i) uued uuritavad lahused valmistatakse puhastes anumates ja ellujäänud embrüod ja vastsed paigutatakse ettevaatlikult ümber uutesse anumatesse koos väikese koguse vana lahusega, vältides kokkupuudet õhuga, või ii) katsealused organismid hoitakse anumas, sellal kui osa (vähemalt kolmveerand) katses kasutatavast veest vahetatakse välja. Keskkonna uuendamine sõltub uuritava aine püsivusest, kuid vett soovitatakse uuendada iga päev. Kui esialgsetes püsivuse katsetes (vt punkti 1.4) ei ole uuritava aine kontsentratsioon püsiv (st on väljaspool 80–120 % nimiväärtust või langeb alla 80 % mõõdetud esialgsest kontsentratsioonist) uuendamise perioodil, tuleks kaaluda läbivoolukatse kasutamist. Igal juhul tuleks vältida vastsetele stressi tekitamist vee uuendamise käigus.
      Läbivooluga katsete puhul tuleb kasutada süsteemi, mis pidevalt jaotab ja lahjendab uuritava aine põhilahust (nt dosaatorpump, proportsionaallahjendusseade, küllastus seadmega süsteem), et viia katsekambritesse sisse erinevad kontsentratsioonid. Põhilahuste ja lahjendamiseks kasutatava vee voolukiirust tuleb kontrollida katse jooksul kindlate ajavahemike järel, eelistatavalt iga päev ja need ei tohiks varieeruda rohkem kui 10 % kogu uuringu jooksul. Sobivaks peetakse voolukiirust, mis vastab vähemalt katsekambri viiekordsele ruumalale 24 tunni jooksul (2).
      1.7.   KATSE KÄIK
      Kasulik teave kalaembrüote ja rebukotiga vastsetega tehtud toksilisuse katsete kohta on kättesaadav kirjandusest, millest mõned näited on esitatud käesoleva teksti kirjanduse jaos (7, 8, 9).
      1.7.1.   Kokkupuutetingimused
      1.7.1.1.   Kestus
      Katse peaks algama eelistatavalt 30 minuti jooksul pärast marjaterade viljastamist. Embrüod viiakse uuritavasse lahusesse enne või võimalikult kohe pärast looteketta jagunemise faasi algust ja kindlasti enne gastrulafaasi algust. Nende embrüote puhul, mis saadakse kaubandusliku tarnija käest, ei pruugi olla võimalik alustada katset kohe pärast viljastamist. Kuna katse tundlikkust võib uuringu alguse edasilükkamine tõsiselt mõjutada, tuleks uuringut alustada kaheksa tunni jooksul pärast viljastamist. Kuna vastseid ei söödeta kokkupuuteperioodi kestel, tuleks katse lõpetada vahetult enne seda, kui mis tahes vastsete rebukott ükskõik millises katsekambris on täielikult imendunud, või enne nälga suremise algust kontrollikatsetes. Kestus sõltub kasutatavast liigist. Mõned soovitatavad kestused on toodud 2. ja 3. liites.
      1.7.1.2.   Laadimine
      Viljastatud marjaterade arv katse alguses peaks olema piisav, et vastata statistilistele nõuetele. Marjaterad tuleks jagada juhuvaliku alusel põhimõttel erinevate käitlusrühmade vahel ja ühe kontsentratsiooni kohta tuleks kasutada vähemalt 30 viljastatud marjatera, võrdselt jagatuna (või võimalikult võrdselt, kuna teatud liikide korral on raske saada võrdseid partiisid) vähemalt kolme dubleeriva katsekambri vahel. Laadimisnorm (biomass uuritava lahuse ruumala kohta) peaks olema piisavalt väike, et õhustamiseta säilitada lahustunud hapniku kontsentratsioon, mis moodustab vähemalt 60 % õhuga küllastamisel saadavast väärtusest. Läbivooluga katsetes soovitatakse laadimisnormi, mis ei ületa 0,5 g/l 24 tunni kohta ega 5 g/l lahust mis tahes ajal (2).
      1.7.1.3.   Valgus ja temperatuur
      Fotoperiood ja katses kasutatava vee temperatuur peaksid olema sobivad katseliigile (2. ja 3. liide). Temperatuuri monitooringuks võib olla vajalik kasutada täiendavat katseanumat.
      1.7.2.   Uuritavad kontsentratsioonid
      Tavaliselt vajatakse uuritava aine viit kontsentratsiooni, mis erinevad konstantse kordaja võrra, mis ei ole suurem kui 3,2. Uuritavate kontsentratsioonide vahemiku valikul tuleks arvesse võtta LC50 ja kokkupuuteperioodi vahelist sõltuvust akuutsuse uuringu käigus. Teatud juhtudel võib olla sobiv kasutada vähem kui viit kontsentratsiooni, näiteks piirsisalduskatsete korral, või kasutada kitsamat kontsentratsioonivahemikku. Kui kasutatakse vähem kui viit kontsentratsiooni, tuleb seda põhjendada. Aine kontsentratsioone, mis on suuremad kui 96 tunnile vastav LC50 või 100 mg/l, ükskõik kumb neist on madalam, ei ole tarvis uurida. Aineid ei peaks uuringus kasutama kogustes, mis ületavad nende lahustuvuspiiri katses kasutatavas vees.
      Kui uuritava lahuse valmistamisel kasutatakse solubiliseerivat ainet (vt punkti 1.6.6), ei tohiks selle lõplik kontsentratsioon katseanumas olla suurem kui 0,1 ml/l ja see peaks olema sama kõikides katseanumates.
      1.7.3.   Kontrollimised
      Lisaks katseseeriale tuleks kasutada ka ühte lahuse vee kontrollkatset (vajaduse korral dubleerituna) ning vajaduse korral ka ühte kontrollkatset, kus kasutatakse solubiliseerivat ainet (vajaduse korral dubleerituna).
      1.7.4.   Analüütiliste määramiste ja mõõtmiste sagedus
      Katse jooksul määratakse uuritava aine kontsentratsioonid korrapäraste ajavahemike tagant.
      Poolstaatilistes katsetes, kus eeldatakse, et uuritava aine kontsentratsioon säilib vahemikus ± 20 % nimiväärtusest (st vahemikus 80–120 %; vt punkte 1.4 ja 1.6.6), soovitatakse analüüsida vähemalt kõige suuremaid ja madalamaid uuritavaid kontsentratsioone, nii värskelt valmistatuna kui ka vahetult enne uuendamist vähemalt kolmel korral võrdsete vahedega katse jooksul (st analüüsid tuleks teha samast lahusest saadud proovi põhjal – kui see on värskelt valmistatud ja uuendamisel).
      Katsete puhul, milles ei eeldata, et uuritava aine kontsentratsioon jääb vahemikku ± 20 % nimiväärtusest (uuritava aine püsivusandmete põhjal), on vajalik analüüsida kõik uuritavad kontsentratsioonid nii värskelt valmistatuna kui ka uuendamisel, kuid järgides sama režiimi (st vähemalt kolmel korral võrdsete vahedega katse jooksul). Uuritava aine kontsentratsiooni määramine enne uuendamist tuleks teha ainult ühes dubleerivas anumas iga uuritava kontsentratsiooni korral. Määramiste vahe võib olla kõige rohkem seitse ööpäeva. On soovitatav, et tulemused põhineksid mõõdetud kontsentratsioonidel. Siiski, kui on tõendeid selle kohta, et uuritava aine kontsentratsiooni lahuses on suudetud säilitada rahuldavalt vahemikus ± 20 % nimiväärtusest või esialgsest mõõdetud kontsentratsioonist kogu katse jooksul, võivad tulemused põhineda nimi- või mõõdetud algväärtustel.
      Läbivooluga katsete puhul sobib kasutada samasugust proovivõturežiimi, mida kirjeldati poolstaatiliste katsete puhul (kuid sellisel juhul ei mõõdeta „vanu” lahuseid). Siiski, kui katse kestus ületab seitset päeva, võib olla soovitav suurendada nädalasi proovivõtmise kordasid (nt kolm mõõtmisseeriat), et kindlustada uuritavate kontsentratsioonide püsivus.
      Proovid võivad eeldada tsentrifuugimist või filtreerimist (nt kasutades poore suurusega 0,45 μm). Siiski, kuna tsentrifuugimine ega filtreerimine ei tundu alati eraldavat uuritava aine biosaadavat osa mittebiosaadavast, ei tule proovidele ilmtingimata neid toiminguid teha.
      Katse jooksul tuleks mõõta lahustunud hapniku kontsentratsiooni, pH-d ja temperatuuri kõikides katseanumates. Kontrollkatsetes ja kõige suuremat kontsentratsiooni sisaldavas anumas mõõdetakse vee kogukaredus ja soolsus (kui see on oluline). Lahustunud hapniku kontsentratsiooni ja soolsust (kui see on oluline) tuleb mõõta minimaalselt kolm korda (katse alguses, keskel ja lõpus). Poolstaatiliste katsete puhul soovitatakse lahustunud hapniku kontsentratsiooni mõõta sagedamini, eelistatavalt enne ja pärast iga vee uuendamist või vähemalt kord nädalas. pH tuleks määrata poolstaatilistes uuendamiskatsetes iga vee uuendamise alguses ja lõpus ning vähemalt kord nädalas läbivooluga katsetes. Karedust tuleks mõõta üks kord iga katse vältel. Temperatuuri tuleks mõõta kord ööpäevas ja seda tuleks eelistatavalt jälgida pidevalt vähemalt ühes katseanumas.
      1.7.5.   Vaatlused
      1.7.5.1.   Embrüonaalse arengu staadium
      Embrüonaalne staadium (st gastrulafaas) uuritava ainega kokkupuute alguses tuleks võimalikult täpselt tõendada. Seda võib teha, kasutades sobivalt säilitatud ja puhastatud esinduslikku marjaterade proovi. Embrüonaalse staadiumi kirjeldamiseks ja illustreerimiseks võib tutvuda ka kirjandusega (2, 5, 10, 11).
      1.7.5.2.   Koorumine ja ellujäämine
      Koorumise ja ellujäämise vaatlust tuleks teha vähemalt kord päevas ja vastavad arvud tuleks protokollida. Katse alguses võib olla soovitatav teha sagedasemaid vaatlusi (nt esimese kolme tunni jooksul iga 30 minuti järel), kuna teatud juhtudel võib eluspüsimise aeg olla olulisem kui ainult surmajuhtude arv (nt kui on tegemist akuutse toksilisuse mõjuga). Surnud embrüod ja vastsed tuleks eemaldada kohe, kui neid märgatakse, kuna need võivad kiiresti laguneda. Eriti hoolikas tuleks olla surnud isendite eemaldamisel, et mitte häirida või füüsiliselt kahjustada kõrvalolevaid marjaterasid/vastseid, kuna need on äärmiselt õrnad ja tundlikud. Kriteeriumid surma kohta varieeruvad vastavalt eluetapile:
      
                  —
               
               
                  
                     marjaterade puhul: eriti varastes etappides, märkimisväärne läbipaistvuse kadumine ja värvuse muutus, mis on põhjustatud valkainete koagulatsioonist ja/või sadestamisest, millele järgneb valge läbipaistmatu välimus;
               
            
                  —
               
               
                  
                     embrüote puhul: kehaliigutuste puudumine ja/või südamelöökide puudumine ja/või värvuse muutumine läbipaistmatuks sellisel liigil, mille embrüod on normaalselt läbipaistvad;
               
            
                  —
               
               
                  
                     vastsete puhul: liikumatus ja/või hingamise puudumine ja/või südamelöökide puudumine ja/või kesknärvisüsteemi värvumine valgeks ja läbipaistmatuks ja/või reaktsiooni puudumine mehaanilisele ärritajale.
               
            1.7.5.3.   Kõrvalekalded välimuses
      Vastsete arv, kelle kehakujus täheldatakse kõrvalekaldeid ja/või pigmentatsiooni, ja rebukoti imendumise etapp tuleks dokumenteerida võrdsete vaheaegade järel sõltuvalt katse kestusest ja kirjeldatud kõrvalekallete iseloomust. Tuleks märkida, et embrüote ja vastsete kõrvalekalded esinevad loomuliku arengu käigus ja nende osakaal võib teatud liikidel olla mitmeid protsente kontrollkatse(te) suhtes. Kõrvalekaldega loomad tuleb lihtsalt eemaldada katseanumast, kui need surevad.
      1.7.5.4.   Kõrvalekalded käitumises
      Kõrvalekalded käitumises, nt hingeldamine, koordineerimata ujumine ja ebatüüpiline liikumatus tuleks registreerida piisavate vaheaegade järel sõltuvalt katse kestusest. Need mõjud, kuigi neid on raske kvantifitseerida, võivad jälgimise korral aidata tõlgendada suremuse andmeid, st nendest võib saada teavet aine toksilisuse toimimisviisi kohta.
      1.7.5.5.   Pikkus
      Katse lõpus on soovitatav mõõta individuaalsed pikkused; kasutada võib standardpikkust, pikkust ninamiku tipust kuni sabauime keskmiste kiirte alguseni või kogupikkust. Kui siiski esineb sabapoolset uimemädanikku või uimede erosiooni, tuleks kasutada standardpikkusi. Üldiselt peaks hästi läbiviidud katses pikkuse variatsioonikoefitsient dubleerivates kontrollkatsetes olema ≤ 20 %.
      1.7.5.6.   Kaal
      Katse lõpus võib mõõta individuaalsed kaalud; kuivmasse (24 tundi, 60 oC) eelistatakse märgmassidele (kuivaks pühituna). Üldiselt peaks hästi tehtud katses massi variatsioonikoefitsient dubleerivates kontrollkatsetes olema ≤ 20 %.
      Nendest vaatlustest saadakse andmeid järgneva statistilise analüüsi jaoks:
      
                  —
               
               
                  kumulatiivne suremus;
               
            
                  —
               
               
                  tervete vastsete arv katse lõpus;
               
            
                  —
               
               
                  koorumise alguse ja lõppemise aeg (st 90 % koorumine igas dubleerivas proovis);
               
            
                  —
               
               
                  igal päeval kooruvate vastsete arv;
               
            
                  —
               
               
                  ellujäänud loomade pikkus (ja kaal) katse lõpus;
               
            
                  —
               
               
                  deformeerunud või ebatavalise välimusega vastsete arv;
               
            
                  —
               
               
                  ebatavaliselt käituvate vastsete arv.
               
            2.   ANDMED JA ARUANDLUS
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE
      Katse kavandamisel ja analüüsimisel soovitatakse kaasata statistikut, kuna käesolev meetod võimaldab märkimisväärset varieerumist eksperimentaalses plaanis, näiteks katsekambrite arvus, uuritavate kontsentratsioonide arvus, viljastatud marjaterade algses arvus ja mõõdetavates parameetrites. Pidades silmas katse kavandamises olevaid võimalusi, ei ole siin antud konkreetseid juhiseid statistiliste menetluste kohta.
      Kui tuleb määrata LOEC/NOEC, tuleb variatsioone analüüsida igas dubleerivas rühmas, kasutades dispersioonanalüüsi (ANOVA) või kooslustabeli menetlusi. Selleks, et teha mitmekordseid võrdlusi üksikute kontsentratsioonide ja kontrollkatsete kontsentratsioonide korral saadud tulemuste vahel, võiks olla kasu Dunnetti meetodist (12, 13). Olemas on teisi kasulikke näiteid (14, 15). ANOVAt või teisi menetlusi kasutades saadud mõju suurus (st katse jõud) tuleks välja arvutada ja avaldada. Tuleb märkida, et kõik punktis 1.7.5.6 toodud vaatlused ei sobi statistiliseks analüüsiks ANOVA abil. Kumulatiivse suremuse ja katse lõpus tervete vastsete arvu analüüsimiseks võiks kasutada probitmeetodeid.
      Kui tuleb kindlaks määrata LC/ECX, tuleks sobiv(ad) kõver(ad), näiteks logistiline kõver, sobitada huvipakkuvate andmetega selliste statistilise meetodi abil nagu näiteks vähimruutude meetod või mittelineaarne vähimruutude meetod. Kõvera(te)s tuleks kasutada selliseid muutujaid, et oleks võimalik otseselt hinnata ära soovitud LC/ECX ja selle standardviga. See kergendab suuresti LC/ECX jaoks usalduspiiri väljaarvutamist. Kui ei ole head põhjust eelistada erinevaid usaldusnivoosid, tuleks määrata kahepoolne 95 % usaldusnivoo. Kõverate sobitamise menetlus peaks eelistatavalt andma aluse sobitamise olulisuse või selle puudumise hindamiseks. Kõverate sobitamiseks võib kasutada graafilist meetodit. Regressioonanalüüs sobib kõikide punktis 1.7.5.6 esitatud vaatlusandmete kohta.
      2.2.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE
      Tulemuste tõlgendamisel tuleks olla ettevaatlik, kui uuritavates lahustes mõõdetud mürkaine kontsentratsioonid on analüütilise meetodi avastamispiiri lähedal. Tulemuste tõlgendamisel selliste kontsentratsioonide korral, mis on suuremad aine lahustuvusest vees, tuleks samuti olla ettevaatlik.
      2.3.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      2.3.1.   Uuritav aine:
      
                  —
               
               
                  füüsikaline loomus ning olulised füüsikalis-keemilised omadused;
               
            
                  —
               
               
                  keemilised identifitseerimisandmed, sealhulgas puhtus ja uuritava aine kvantifitseerimiseks kasutatav analüütiline meetod (vajaduse korral).
               
            2.3.2.   Katsealused liigid:
      
                  —
               
               
                  teaduslik nimi, liin, eellasteks olnud kalade arv (st kui mitut emaskala kasutati katses vajaliku arvu marjaterade saamiseks), päritolu ja viljastatud marjaterade kogumise meetod ning edaspidine käitlemine.
               
            2.3.3.   Katsetingimused:
      
                  —
               
               
                  kasutatav katsemenetlus (nt poolstaatiline või läbivooluga, aeg viljastamisest uuringu alguseni, laadimine jne);
               
            
                  —
               
               
                  fotoperiood(id);
               
            
                  —
               
               
                  katse kavandamine (nt katse- ja dubleerivate anumate arv, embrüote arv dubleerivas katses);
               
            
                  —
               
               
                  põhilahuse valmistamise meetod ja uuendamise sagedus (kui kasutatakse solubiliseerivat ainet, tuleb esitada ka selle kontsentratsioon);
               
            
                  —
               
               
                  uuritavate kontsentratsioonide nimiväärtused, mõõdetud väärtused, nende saamise vahendid ja standardhälbed katseanumas ja meetod, mille alusel need on saadud, ning kui uuritava aine lahustuvus vees on uuritud kontsentratsioonidest väiksem, siis tuleks esitada tõendid selle kohta, et need mõõtmised vastavad uuritava aine kontsentratsioonidele lahuses;
               
            
                  —
               
               
                  lahjendamiseks kasutatava vee omadused: pH, karedus, temperatuur, lahustunud hapniku kontsentratsioon, kloori jääktasemed (kui mõõdetakse), kogu orgaaniline süsinik, suspendeeritud tahked ained, katsekeskkonna soolsus (kui mõõdetakse) ja mis tahes muud tehtud mõõtmised;
               
            
                  —
               
               
                  vee kvaliteet katseanumas: pH, karedus, temperatuur ja lahustunud hapniku kontsentratsioon.
               
            2.3.4.   Tulemused:
      
                  —
               
               
                  uuritava aine püsivuse esialgsete uuringute tulemused;
               
            
                  —
               
               
                  tõendid selle kohta, et kontrollkatsed vastasid katsealuste liikide korral üldisele aktsepteeritavale ellujäämise normile (2. ja 3. liide);
               
            
                  —
               
               
                  andmed suremuse/ellujäämise kohta embrüo ja vastse staadiumites ning üldine suremus/ellujäämine;
               
            
                  —
               
               
                  koorumiseks kulunud päevad ja koorunud isendite arv;
               
            
                  —
               
               
                  andmed pikkuse (ja kaalu) kohta;
               
            
                  —
               
               
                  võimalike morfoloogiliste kõrvalekallete esinemine ja kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  võimalike käitumises ilmnenud mõjude esinemine ja kirjeldus;
               
            
                  —
               
               
                  statistiline analüüs ja andmete töötlemine;
               
            
                  —
               
               
                  katsete puhul, milles kasutatakse ANOVA analüüsi: vähim toimet avaldava kontsentratsiooni (LOEC) p = 0,05 korral täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC) iga hinnatud vastuse kohta, kaasa arvatud kasutatud statistiliste menetluste kirjeldus ja viide selle kohta, milline oli avastatud mõju suurus;
               
            
                  —
               
               
                  katsete puhul, milles kasutatakse regressioonitehnikat: LC/ECX ja usaldusvahemikud ning selle arvutamiseks kasutatud sobitatud mudeli graafik;
               
            
                  —
               
               
                  käesolevast katsemeetodist mis tahes kõrvalekallete selgitamine.
               
            3.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  Kristensen P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, 60 pp. June 1990.
               
            
                  2)
               
               
                  ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. 26 pp.
               
            
                  3)
               
               
                  Brauhn J. L. and Schoettger R. A. (1975). Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.
               
            
                  4)
               
               
                  Brungs W. A. and Jones B. R. (1977). Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures. p. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.
               
            
                  5)
               
               
                  Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Biol. 10, pp. 121–173.
               
            
                  6)
               
               
                  Legault R. (1958). A Technique for Controlling the Time of Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, pp. 328–330.
               
            
                  7)
               
               
                  Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander B. and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish (Brachydanio rerio) Using Chromium and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chemistry, 6, pp. 61–71.
               
            
                  8)
               
               
                  Birge J. W., Black J. A. and Westerman A. G. (1985). Short-term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, pp. 807–821.
               
            
                  9)
               
               
                  Van Leeuwen C. J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986). Aquatic Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. UI. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, pp. 129–145.
               
            
                  10)
               
               
                  Kirchen R. V. and W. R. West (1969). Teleostean Development. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply Company.
               
            
                  11)
               
               
                  Kirchen R. V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina. 36 pp.
               
            
                  12)
               
               
                  Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp. 1096–1121.
               
            
                  13)
               
               
                  Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, pp. 482–491.
               
            
                  14)
               
               
                  Mc Clave J. T., Sullivan J. H. and Pearson J.G. (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.
               
            
                  15)
               
               
                  Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M. and Hermes J. (1990). Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, pp. 321–334.
               
            
                  16)
               
               
                  Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 1/RM/28, December 1992, 81 pp.
               
            
                  17)
               
               
                  Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydanio rerio. Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 21, pp. 126–134.
               
            
                  18)
               
               
                  Meyer A., Bierman C. H. and Orti G. (1993). The phylogenetic position of the Zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology – an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: pp. 231–236.
               
            
                  19)
               
               
                  Ghillebaert F., Chaillou C, Deschamps F. and Roubaud P. (1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and Environmental Safety 32, pp. 19–28.
               
            
                  20)
               
               
                  US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese Medaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, EPA, Duluth.
               
            
                  21)
               
               
                  US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPA report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.
               
            
                  22)
               
               
                  De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic T. L., Reichenbach N. G., Dean J. H. and Marcus M. D. (1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow (Pimephales promelas) larval survival and growth test: an intra- and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, pp. 1189–1203.
               
            
                  23)
               
               
                  Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine and Marine fish.
               
            
                  24)
               
               
                  Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New developmental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., Dordrecht, 280 pp.
               
            
                  25)
               
               
                  Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, in: W. S. Hoar and D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academic press, pp. 1–58.
               
            Tabel 1a
      Katseks soovitatavad kalaliigid
      
                  MAGEVEEKALAD
               
            
                  
                     Oncorhynchus mykiss
                  
                  Vikerforell (9, 16)
               
            
                  
                     Danio rerio
                  
                  Sebrakala (7, 17, 18)
               
            
                  
                     Cyprinus caprio
                  
                  Karpkala (8, 19)
               
            
                  
                     Oryzias latipes
                  
                  Jaapani riisikala (20, 21)
               
            
                  
                     Pimephales promelas
                  
                  Pakspea lepamaim (8, 22)
               
            
         
      Tabel 1b
      Näiteid teistest hästi dokumenteeritud liikidest, mida on samuti kasutatud
      
                  MAGEVEEKALAD
               
               
                  MEREKALAD
               
            
                  
                     Carassius auratus
                  
                  Hõbekoger (8)
               
               
                  
                     Menidia peninsulae
                  
                  Tidewater silverside (23, 24, 25)
               
            
                  
                     Lepomis macrochirus
                  
                  Bluegill (8)
               
               
                  
                     Clupea harengus
                  
                  Harilik heeringas (24, 25)
               
            
                  
                     Gadus morhua
                  
                  Tursk (24, 25)
               
            
                  
                     Cyprinodon variegatus
                  
                  Sheepshead minnow (23, 24, 25)
               
            
         1.liide
         JUHEND TOKSILISUSE KATSE TEGEMISEKS VÖÖDILISE PISIDAANIO (BRACHYDANIO RERIO) EMBRÜOTE JA REBUKOTIGA VASTSETEGA
         SISSEJUHATUS
         Vöödiline pisidaanio on pärit India Coromandeli rannikualalt, kus ta elutseb kiirevoolulistes jõgedes. Vöödiline pisidaanio on levinud akvaariumikala karpkalalaste sugukonnast ja teavet tema hoolitsemise ja tema kasvatamise kohta võib leida tavalistes troopilisi kalu käsitlevates raamatutes. Ülevaate vöödilise pisidaanio bioloogiast ja kasutamisest kalandusalastes uuringutes on koostanud Laale (1).
         Kala kasvab harva pikemaks kui 45 mm. Keha on silindrikujuline 7–9 tumesinise horisontaalse hõbedase triibuga. Need triibud ulatuvad sabapoolsete ja anaalsete uimedeni. Selg on oliivrohelist värvi. Isaskalad on emaskaladest saledamad. Emaskalad on hõbedasemad ja nende alakeha on laienenud, eriti enne kudemist.
         Täiskasvanud kalad on võimelised taluma suuri temperatuuri-, pH- ja vee kareduse kõikumisi. Siiski tuleb selliste tervete kalade saamiseks, kellelt saaks kvaliteetseid marjaterasid, tagada optimaalsed tingimused.
         Kudemise ajal ajab isaskala emaskala taga ja puksib teda ning kui emaskala väljutab marjaterad, siis need ka viljastatakse. Läbipaistvad ja mittekleepuvad marjaterad vajuvad põhja, kus täiskasvanud kalad võivad need ära süüa. Kudemist mõjutab valgus. Kui valgustingimused on hommikul piisavad, koeb vöödiline pisidaanio tavaliselt varajastel hommikutundidel pärast päikesetõusu.
         Emaskala võib anda nädalaste vahedega mitmesajalisi marjaterade partiisid.
         EELLASTEKS OLNUD KALADE, PALJUNEMISE JA VARAJASTE ELUSTAADIUMITE TINGIMUSED
         Välja tuleks valida sobiv arv terveid kalasid ja hoida need sobivas vees (nt 4. liide) vähemalt kaks nädalat enne planeeritud kudemist. Kalade rühmal tuleks võimaldada vähemalt ühe korra sigida enne katses kasutatava marjaterade partiide saamist. Kalade tihedus selle perioodi jooksul ei tohiks olla suurem kui 1 gramm kalu liitri kohta. Regulaarne veevahetus või puhastussüsteemi kasutamine võib võimaldada suuremat tihedust. Temperatuur hoiuanumates tuleks hoida 25 + 2 oC. Kaladele tuleks anda vahelduvat toitu, mis võiks sisaldada näiteks sobivat kaubanduslikku kuivtoitu, elavaid just koorunuid soolavähikesi (Arthemia), surusääski, kiivrikke (Daphnia) ja valgeliimuklasi (Enchytraeidae).
         Allpool on visandatud kaks menetlust, mida kasutades on saadud katseks vajalikul määral terveid, viljastatud marjaterasid.
         
                     i)
                  
                  
                     Kaheksa emaskala ja 16 isaskala pannakse anumasse, mis sisaldab 50 liitrit lahjendamiseks kasutatavat vett ja mis on varjatud otsese valguse eest ja mida häiritakse nii vähe kui võimalik vähemalt järgneva 48 tunni jooksul. Kudemiskandik asetatakse akvaariumi põhja katse algusele eelneva päeva pärastlõunal. Kudemiskandik koosneb (pleksiklaasist või muust sobivast materjalist) raamist kõrgusega 5–7 cm, millel on 2–5 mm silmadega jämedakoeline võrk üleval ja 10–30 μm tihe võrk põhjas. Raami jämedakoelise võrgu külge kinnitatakse mitmeid lahti keeratud nailonnöörist tehtud „kudemispuid”. Kui kalad on olnud pimedas 12 tundi, süüdatakse nõrk lamp, mis algatab kudemise. Kaks kuni neli tundi pärast kudemist eemaldatakse kudemiskandik ja marjaterad kogutakse kokku. Kudemiskandik takistab kaladel marjaterasid süüa ning samal ajal võimaldab see kergesti marjaterad kokku koguda. Kalade rühm peaks olema kudenud vähemalt ühe korra enne katses kasutatava marjaterade partii kudemist.
                  
               
                     ii)
                  
                  
                     Viis kuni kümme isast ja emast kala hoitakse eraldi vähemalt kaks nädalat enne planeeritavat kudemist. 5–10 päeva pärast laienevad emaskalade alakehad ja nende genitaalide papillid muutuvad nähtavaks. Isakaladel nimetatud papillid puuduvad. Kudemine toimub kudemisanumates, mis on varustatud võrgust tehtud väärpõhjaga (nagu eelpool). Anum täidetakse lahjendamiseks kasutatava veega nii, et vee sügavus võrgu kohal on 5–10 cm. Päev enne planeeritavat kudemist asetatakse mahutisse üks emaskala ja kaks isaskala. Vee temperatuuri tõstetakse, kuni see on ühe kraadi võrra kõrgem aklimatsioonitemperatuurist. Valgus kustutatakse ja anumat häiritakse nii vähe kui võimalik. Hommikul süüdatakse nõrk lamp, mis algatab kudemise. 2–4 tunni pärast eemaldatakse kalad ja marjaterad korjatakse kokku. Kui vajatakse suuremaid marjaterade partiisid kui need, mida saab ühelt emaskalalt, võib üles seada piisaval hulgal paralleelseid kudemisanumaid. Kui registreeritakse iga emaskala paljunemise edukust enne katset (partii suurus ja kvaliteet), võib sigimiseks välja valida suurima reproduktiivsusega emaskalad.
                  
               Marjaterad tuleks viia katseanumasse klaastorude abil (sisediameeter vähemalt 4 mm), millel on elastne imiotsak. Marjaterade ümberpaigutamisel kaasamineva vee hulk peaks olema võimalikult minimaalne. Marjaterad on veest raskemad ja vajuvad torust välja. Hoolitseda tuleks selle eest, et marjaterad (ja vastsed) ei puutuks kokku õhuga. Tuleks teha partii(de) proovi(de) mikroskoopiline uuring, et kindlustada esimestes arengustaadiumides anomaaliate puudumine. Marjaterade desinfitseerimine ei ole lubatud.
         Marjaterade suremuse määr on kõrgem esimese 24 tunni jooksul pärast viljastamist. Selle perioodi jooksul on suremus sageli 5–40 %. Ebaõnnestunud viljastamise või arengukahjustuste tulemusel marjaterad degenereeruvad. Marjaterade partii kvaliteet tundub sõltuvat emaskalast, kuna mõned emaskalad annavad pidevalt kvaliteetseid marjaterasid ja teised ei tee seda mitte kunagi. Samuti on erinevatel partiidel erinev arenemis- ja koorumiskiirus. Edukalt viljastatud marjaterade ja rebukotivastsete ellujäämus on hea, tavaliselt üle 90 %. 25 oC juures kooruvad marjaterad 3.–5. päeval pärast viljastamist ning rebukott imendub ligikaudu 13. päeval pärast viljastamist.
         Embrüonaalset arengut on hästi kirjeldanud Hisaoka ja Battle (2). Tänu marjaterade ja koorumisjärgsete vastsete läbipaistvusele on võimalik jälgida kalade arengut ja vaadelda väärarenguid. Ligikaudu neli tundi pärast kudemist on võimalik eristada viljastamata marjaterasid viljastatud marjateradest (3). Selle kindlakstegemiseks asetatakse marjaterad ja vastsed väikese ruumalaga katseanumatesse ja neid uuritakse mikroskoobi all.
         Katsetingimused, mida rakendatakse varajastel elustaadiumitel, on esitatud 2. liites. Optimaalne lahjendamiseks kasutatava vee pH ja karedus on vastavalt 7,8 ja 250 mg CaCO3/l.
         ARVUTUSED JA STATISTIKA
         Pakutakse välja kaheetapiline lähenemine. Kõigepealt analüüsitakse statistiliselt suremuse, väärarengu ja koorumise aega puudutavaid andmeid. Seejärel hinnatakse statistiliselt keha pikkust nende kontsentratsioonide korral, mille puhul ei täheldatud nimetatud parameetritele negatiivset mõju. Selline lähenemine on soovitatav, kuna mürkaine võib valikuliselt surmata väiksemad kalad, aeglustada koorumiseks vajalikku aega ja põhjustada suuri väärarenguid, mis toob endaga kaasa nihkega pikkuse mõõtmised. Lisaks on sellisel viisil võimalik mõõta ligikaudu sama arvu kalu iga menetluse korral, mis kindlustab katsestatistika valiidsuse.
         LC50 JA EC50 MÄÄRAMINE
         Arvutatakse ellujäänud marjaterade ja vastsete arv ning seda korrigeeritakse vastavalt Abbotti valemile (4) suremusega kontrollkatsetes:
         
            
         kus
         
                     P
                  
                  
                     =
                  
                  
                     korrigeeritud ellujäämise protsent
                  
               
                     P'
                  
                  
                     =
                  
                  
                     uuritava kontsentratsiooni korral täheldatud ellujäämise protsent
                  
               
                     C
                  
                  
                     =
                  
                  
                     ellujäämine kontrollkatses
                  
               Kui võimalik, määratakse katse lõpus sobivat meetodit kasutades LC50.
         Kui EC50 statistikasse soovitakse lisada morfoloogiliste kõrvalekallete esinemist, võib vastavad juhised leida viitest Stephan (5).
         LOEC JA NOEC HINDAMINE
         Marjateradega ja rebukotiga vastsete uuringu eesmärk on võrrelda nullist erineva kontsentratsiooniga lahuseid kontrollkatsega, st kindlaks määrata LOEC. Seetõttu tuleks kasutada korduvaid võrdlusmenetlusi (6, 7, 8, 9, 10).
         VIITED
         
                     1)
                  
                  
                     Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, pp. 121–173.
                  
               
                     2)
                  
                  
                     Hisaoka K. K. and Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 311 pp.
                  
               
                     3)
                  
                  
                     Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 2, pp. 173–181.
                  
               
                     4)
                  
                  
                     Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, Great Britain, pp. 1–333.
                  
               
                     5)
                  
                  
                     Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, pp. 69–81.
                  
               
                     6)
                  
                  
                     Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp. 1096–1121.
                  
               
                     7)
                  
                  
                     Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, pp. 482–491.
                  
               
                     8)
                  
                  
                     Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Biometrics, 27, pp. 103–117.
                  
               
                     9)
                  
                  
                     Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a Zero Dose Control. Biometrics 28, pp. 519–531.
                  
               
                     10)
                  
                  
                     Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of Statistics in Biological Research, W. H. Freeman and Co., San Francisco.
                  
               
      
         2. liide
         KATSETINGIMUSED, KESTUS JA ELLUJÄÄMISKRITEERIUMID SOOVITATAVATE LIIKIDE JAOKS
         
                     Liik
                  
                  
                     Temperatuur
                     ( oC)
                  
                  
                     Soolsus
                     (0/00)
                  
                  
                     Fotoperiood
                     (tundides)
                  
                  
                     Etappide kestus
                     (päevades)
                  
                  
                     Tüüpiline katse kestus
                  
                  
                     Ellujäämus kontrollkatses
                     (minimaalne %)
                  
               
                     Embrüo
                  
                  
                     Rebukotiga vastne
                  
                  
                     Koorumisprotsent
                  
                  
                     Pärast koorumist
                  
               
                     MAGEVEEKALAD
                  
               
                     
                        Brachydanio rerio
                     
                     Vöödiline pisidaanio
                  
                  
                     25 ± 1
                  
                  
                     —
                  
                  
                     12–16
                  
                  
                     3–5
                  
                  
                     8–10
                  
                  
                     Võimalikult kohe pärast viljastamist (varane gastrulafaas) kuni 5 päeva pärast koorumist (8–10 päeva)
                  
                  
                     80
                  
                  
                     90
                  
               
                     
                        Oncorhynchus mykiss
                     
                     Vikerforell
                  
                  
                     10 ± 1 (22)
                     
                     12 ± 1 (23)
                     
                  
                  
                     —
                  
                  
                     0 (24)
                     
                  
                  
                     30–35
                  
                  
                     25–30
                  
                  
                     Võimalikult kohe pärast viljastamist (varane gastrulafaas) kuni 20 päeva pärast koorumist (50–55 päeva)
                  
                  
                     66
                  
                  
                     70
                  
               
                     
                        Cyprinus carpio
                     
                     Harilik karpkala
                  
                  
                     21–25
                  
                  
                     —
                  
                  
                     12–16
                  
                  
                     5
                  
                  
                     > 4
                  
                  
                     Võimalikult kohe pärast viljastamist (varane gastrulafaas) kuni 4 päeva pärast koorumist (8–9 päeva)
                  
                  
                     80
                  
                  
                     75
                  
               
                     
                        Oryzias latipes
                     
                     Jaapani riisikala
                  
                  
                     24 ± 1 (22)
                     
                     23 ± 1 (23)
                     
                  
                  
                     —
                  
                  
                     12–16
                  
                  
                     8–11
                  
                  
                     4–8
                  
                  
                     Võimalikult kohe pärast viljastamist (varane gastrulafaas) kuni 5 päeva pärast koorumist (13–16 päeva)
                  
                  
                     80
                  
                  
                     80
                  
               
                     
                        Pimephales promelas
                     
                     Pakspea lepamaim
                  
                  
                     25 ± 2
                  
                  
                     —
                  
                  
                     16
                  
                  
                     4–5
                  
                  
                     5
                  
                  
                     Võimalikult kohe pärast viljastamist (varane gastrulafaas) kuni 4 päeva pärast koorumist (8–9 päeva)
                  
                  
                     60
                  
                  
                     70
                  
               
      
         3. liide
         Katsetingimused, kestus ja ellujäämiskriteeriumid teiste hästi dokumenteeritud liikide korral
         
                     Liik
                  
                  
                     Temperatuur ( oC)
                  
                  
                     Soolsus (0/00)
                  
                  
                     Fotoperiood (Tundides)
                  
                  
                     Etappide kestus (Päevades)
                  
                  
                     Tüüpiline embrüote ja rebukotiga vastsete katse kestus
                  
                  
                     Ellujäämus kontrollkatses (minimaalne %)
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     Embrüo
                  
                  
                     Rebukotiga vastne
                  
                  
                     Koorumisprotsent
                  
                  
                     Pärast koorumist
                  
               
                     MAGEVEEKALAD
                  
               
                     
                        Carassius auratus
                     
                     Kuldkala
                  
                  
                     24 ± 1
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
                  
                     3–4
                  
                  
                     > 4
                  
                  
                     Võimalikult kohe pärast viljastamist (varane gastrulafaas) kuni 4 päeva pärast koorumist (7 päeva)
                  
                  
                     —
                  
                  
                     80
                  
               
                     
                        Leopomis macrochirus
                     
                     Bluegill kuukala
                  
                  
                     21 ± 1
                  
                  
                     —
                  
                  
                     16
                  
                  
                     3
                  
                  
                     > 4
                  
                  
                     Võimalikult kohe pärast viljastamist (varane gastrulafaas) kuni 4 päeva pärast koorumist (7 päeva)
                  
                  
                     —
                  
                  
                     75
                  
               
                     MEREKALAD
                  
               
                     
                        Menidia peninsulae
                     
                     Tidewater silverside
                  
                  
                     22–25
                  
                  
                     15–22
                  
                  
                     12
                  
                  
                     1,5
                  
                  
                     10
                  
                  
                     Võimalikult kohe pärast viljastamist (varane gastrulafaas) kuni 5 päeva pärast koorumist (6–7 päeva)
                  
                  
                     80
                  
                  
                     60
                  
               
                     
                        Clupea harengus
                     
                     Heeringas
                  
                  
                     10 ± 1
                  
                  
                     8–15
                  
                  
                     12
                  
                  
                     20–25
                  
                  
                     3–5
                  
                  
                     Võimalikult kohe pärast viljastamist (varane gastrulafaas) kuni 3 päeva pärast koorumist (23–27 päeva)
                  
                  
                     60
                  
                  
                     80
                  
               
                     
                        Gadus morhua
                     
                     Tursk
                  
                  
                     5 ± 1
                  
                  
                     5–30
                  
                  
                     12
                  
                  
                     14–16
                  
                  
                     3–5
                  
                  
                     Võimalikult kohe pärast viljastamist (varane gastrulafaas) kuni 3 päeva pärast koorumist (18 päeva)
                  
                  
                     60
                  
                  
                     80
                  
               
                     
                        Cyprinodon variegatus
                     
                     Sheepshead minnow
                  
                  
                     25 ± 1
                  
                  
                     15–30
                  
                  
                     12
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
                  
                     Võimalikult kohe pärast viljastamist (varane gastrulafaas) kuni 4/7 päeva pärast koorumist (28 päeva)
                  
                  
                     > 75
                  
                  
                     80
                  
               
      
         4. LIIDE
         MÕNED AKTSEPTEERITAVA LAHJENDAMISEKS KASUTATAVA VEE KEEMILISED OMADUSED
         
                     Aine
                  
                  
                     Kontsentratsioonid
                  
               
                     Tahked ained osakestena
                  
                  
                     < 20 mg/l
                  
               
                     Kogu orgaaniline süsinik
                  
                  
                     < 2 mg/l
                  
               
                     Ammoniaak (ioniseerimata)
                  
                  
                     < 1μg/l
                  
               
                     Jääkkloor
                  
                  
                     < 10 μg/l
                  
               
                     Fosfororgaaniliste pestitsiidide kogusisaldus
                  
                  
                     < 50 ng/l
                  
               
                     Kloororgaaniliste pestitsiidide ja polüklooritud bifenüülide kogusisaldus
                  
                  
                     < 50 ng/l
                  
               
                     Kloori kogusisaldus orgaanilistes ühendites
                  
                  
                     < 25 ng/l
                  
               
      C.16.   MESILASED – AKUUTSE SUUKAUDSE TOKSILISUSE KATSE
      1.   MEETOD
      Käesolev akuutse toksilisuse katsemeetod lähtub juhendist OECD TG 213 (1998).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesolev toksilisuse katse on laboratoorne meetod, mis on kavandatud taimekaitsetoodete ja teiste kemikaalide suukaudse akuutse toksilisuse hindamiseks täiskasvanud töömesilaste abil.
      Ainete toksiliste omaduste hindamisel võib nõuda akuutse suukaudse toksilisuse kindlaksmääramist mesilaste puhul, st siis, kui mesilaste kokkupuutumine antud kemikaaliga on tõenäoline. Akuutse suukaudse toksilisuse uuring tehakse selleks, et määrata kindlaks pestitsiidide ja teiste kemikaalide toksilisus mesilatele. Käesoleva katse tulemusi tuleks kasutada edasise hindamise vajaduse määramiseks. Täpsemalt võib seda meetodit kasutada programmides, milles pestitsiidide poolt mesilastele tekitatud ohte hinnatakse astmeliselt, ja mis põhinevad järjestikusel üleminekul toksilisuse laboratoorsete katsete juurest poolväli-ja välikatseteni (1). Pestitsiide võib uurida nii toimeainetena kui ka valmististena.
      Mesilaste tundlikkuse ja katsemenetluse täpsuse kindlakstegemiseks tuleks kasutada toksilisuse standardit.
      1.2.   MÕISTED
      
         Akuutne suukaudne toksilisus – negatiivne mõju, mis ilmneb hiljemalt 96 tunni jooksul pärast uuritava aine ühe doosi suukaudset manustamist.
      
         Doos – tarbitud uuritava aine kogus. Doosi väljendatakse uuritava aine massina (μg) katselooma kohta (μg/mesilane). Tegelikku doosi iga mesilase kohta ei saa välja arvutada, kuna mesilasi söödetakse kollektiivselt, kuid kindlaks on võimalik teha keskmine doos (kogu tarbitud uuritava aine/mesilaste arv ühes puuris).
      
         LD
         
            50
         
         (letaalse doosi mediaan), suukaudne – statistiliselt saadud aine ühekordne doos, mis võib suukaudsel manustamisel põhjustada surma 50 %-l isenditest. LD50 väärtus avaldatakse uuritava aine mikrogrammides (μg) mesilase kohta. Pestitsiidide korral võib uuritav aine olla kas toimeaine või valmistis, milles on üks või mitu toimeainet.
      
         Suremus – isend loetakse surnuks, kui see on täielikult liikumatu.
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Täiskasvanud töömesilased (Apis mellifera) viiakse kokku sahharoosilahuses dispergeeritud uuritava aine erinevate doosidega. Seejärel söödetakse mesilastele sama toitu ilma uuritava aineta. Suremus registreeritakse iga päev vähemalt 48 tunni jooksul ja võrreldakse kontrollkatses saadud väärtustega. Kui suremuse määr suureneb 24 h ja 48 h vahel ning kui suremus kontrollrühmas jääb aktsepteeritavale tasemele, st < 10 %, on katse kestust sobiv maksimaalselt 96 tunnini pikendada. Tulemusi analüüsitakse, et arvutada välja LD50 väärtused 24. ja 48. tunni jaoks ja juhul, kui uuringut pikendatakse, siis ka 72. ja 96. tunni jaoks.
      1.4.   KATSE VALIIDSUS
      Katse valiidsuse kohta kehtivad järgmised tingimused:
      
                  —
               
               
                  keskmine suremus kõikides kontrollkatsetes kokku ei tohi katse lõpul ületada 10 %;
               
            
                  —
               
               
                  toksilisuse standard LD50 vastab kõnealusele vahemikule.
               
            1.5.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.5.1.   Mesilaste kogumine
      Kasutada tuleks sama tõugu noori töömesilasi, st mesilased peaksid olema samas vanuses, samamoodi toidetud jne. Mesilased peaksid olema pärit piisavalt toidetud, tervetest ja võimalikult haigusvabamatest mesilasemaga kolooniatest, millel on tuntud ajalugu ja füsioloogiline staatus. Mesilased tuleks kokku koguda kasutamispäeva hommikul või katsele eelneval õhtul ja hoida uuringu tingimustes järgmise päevani. Sobivad on need mesilased, mis on kogutud raamidelt, millel ei ole pesakondi. Tuleks vältida kogumist varakevadel või hilissügisel, kuna mesilaste füsioloogia on sellel ajal muutunud. Kui katse tuleb teha varakevadel või hilissügisel, võib mesilastel lasta kooruda inkubaatoris ja neid võib kasvatada ühe nädala jooksul „mesilasleival” (kärjest kogutud õietolm) ja sahharoosilahusega. Toksilisuse katses ei tohiks kasutada mesilasi, keda on ravitud keemiliste ainetega, näiteks antibiootikumid, varroatoosivastased tooted jms nelja nädala jooksul alates viimase ravimenetluse lõpust.
      1.5.2.   Pidamis- ja söötmistingimused
      Kasutatakse kergesti puhastatavaid ja hästiventileeritud puure. Kasutada võib mis tahes materjalist, nt roostevabast terasest, traatvõrgust, plastmassist puure või ühekordselt kasutatavad puupuure jms. Eelistatav mesilaste arv on kümme mesilast puuri kohta. Katsepuuri suurus peaks olema sobiv mesilaste arvuga, st tagama piisava ruumi.
      Mesilased tuleks hoida katseruumis pimedas temperatuuril 25 ± 2 oC. Kogu katse jooksul tuleks registreerida suhteline õhuniiskus, mis normaalselt on ligikaudu 50–70 %. Käitlemisemenetlusi, sealhulgas ainega töötlemist ja vaatlusi, võib teha (päeva)valguses. Toiduks kasutatakse sahharoosi vesilahust, mille lõppkontsentratsioon on 500 g/l (50 massi-/mahuprotsenti). Pärast nimetatud uuritava doosi andmist tuleks toitu anda ad libitum. Toitmissüsteem peaks võimaldama registreerida toidu manustamise iga puuri kohta (vt punkti 1.6.3.1). Kasutada võib klaastoru (ligikaudu 50 mm pikk ja 10 mm läbimõõduga, mille avatud ots kitseneb kuni ligikaudu 2 millimeetrini).
      1.5.3.   Mesilaste ettevalmistamine
      Kogutud mesilased jagatakse juhuvaliku alusel katsepuuridesse, mille paigutus katseruumis on juhuslik.
      Mesilastele võib toitu mitte anda kuni 2 tundi enne katse algust. Mesilastele soovitatakse enne aine mõjule allutamist toitu mitte anda, et kõik mesilased oleksid katse alguses seedekulgla sisu mõttes võrdses olukorras. Surevaid mesilasi ei tuleks kasutada ja need asendatakse enne katse algust tervete mesilastega.
      1.5.4.   Dooside ettevalmistamine
      Kui uuritav aine on veega segunev ühend, võib selle dispergeerida kohe 50 % sahharoosilahuses. Tehniliste valmististe ja madala veeslahustuvusega ainete korral võib kasutada kandeaineid, näiteks orgaanilised lahustid, mesilastele vähemürgised emulgaatorid või dispergandid (nt atsetoon, dimetüülformamiid, dimetüülsulfoksiid). Kandeaine kontsentratsioon sõltub uuritava aine lahustuvusest ja see peaks olema sama kõikide uuritavate kontsentratsioonide korral. Siiski on üldiselt sobiv kandeainekontsentratsioon 1 % ja seda ei tohiks ületada.
      Tuleks valmistada sobivad kontroll-lahused, st kui uuritava aine lahustamiseks kasutatakse lahustit või disperganti, tuleks kasutada kahte iseseisvat kontrollrühma: vesilahust ja sahharoosilahust, milles lahusti/kandeaine kontsentratsioon on sama mis doseerimislahustes.
      1.6.   KATSE KÄIK
      1.6.1.   Katse- ja kontrollrühmad
      Uuritavate dooside ja duplikaatide arv peaks vastama statistilistele nõuetele LD50 kindlaksmääramiseks 95 % usalduspiiriga. Tavaliselt nõutakse katse jaoks viit doosi geomeetrilises jadas, mille tegur ei ületa 2.2 ja mis katavad LD50 jaoks vajaliku vahemiku. Siiski tuleb lahjendusaste ja doseeritavate kontsentratsioonide arv kindlaks määrata vastavalt toksilisuskõvera (doos vs suremus) tõusule ja tulemuste analüüsimiseks valitud statistilisele meetodile. Vahemiku kindlaksmääramise katse võimaldab valida välja doseerimiseks sobivad kontsentratsioonid.
      Iga uuritava kontsentratsiooniga lahust tuleks doseerida vähemalt kolmele dubleerivale katserühmale, milles igas on 10 mesilast. Lisaks katseseeriale tuleks kasutada vähemalt kolme kontrollpartiid, milles igaühes on 10 mesilast. Kontrollpartiid peaksid olema ka kasutatavate lahustite/kandeainete jaoks (vt punkti 1.5.4).
      1.6.2.   Toksilisuse standard
      Katseseerias peaks olema ka toksilisuse standard. Eeldatava LD50 väärtuse katmiseks tuleks valida vähemalt kolm doosi. Iga uuritavat doosi tuleks kasutada vähemalt kolme dubleeriva puuri korral, milles igaühes on 10 mesilast. Eelistatav toksilisuse standard on dimetoaat, mille peroraalse LD50 dokumenteeritud väärtus 24 tunni jaoks on vahemikus 0,10–0,35 μg toimeainet mesilase kohta (2). Siiski võib kasutada ka teisi toksilisuse standardeid juhul, kui on võimalik hankida piisavalt andmeid, et tõestada eeldatud reaktsiooni doosile (nt paratioon).
      1.6.3.   Kokkupuude
      1.6.3.1.   Doseerimine
      Igale mesilaste katserühmale tuleb anda 100–200 μl 50 % sahharoosi vesilahust, mis sisaldab sobivas kontsentratsioonis uuritavat ainet. Suuremat ruumala on vaja vähelahustuvate, madala toksilisusega või valmistises madala kontsentratsiooniga toodete korral, sest siis tuleb sahharoosilahuses kasutada suuremaid koguseid. Rühma kohta manustatud töödeldud toidu hulka tuleb jälgida. Pärast tarbimist (tavaliselt 3–4 tunni jooksul) tuleb toiteseade eemaldada puurist ja asendada teisega, mis sisaldab ainult sahharoosilahust. Sahharoosilahuseid antakse seejärel ad libitum. Mõningate ühendite puhul võib suure kontsentratsiooniga uuritavatest doosidest keeldumine põhjustada selle, et toitu tarbitakse vähe või üldse mitte. Töödeldud toit, mida ei ole tarbitud maksimaalselt 6 tunni jooksul, tuleks asendada ainult sahharoosilahusega. Tarbitud töödeldud toidu hulka tuleks hinnata (nt järelejäänud töödeldud toidu ruumala/massi mõõtmine).
      1.6.3.2.   Kestus
      Katse kestus on eelistatavalt 48 tundi alates uuritava lahuse asendamisest ainult sahharoosi sisaldava lahusega. Kui suremus tõuseb jätkuvalt rohkem kui 10 % pärast esimest 24 tundi, tuleks katse kestust pikendada maksimaalselt 96 tunnini, eeldusel, et suremus kontrollrühmas ei ületa 10 %.
      1.6.4.   Vaatlused
      Suremus registreeritakse 4. tunnil pärast katse algust ja seejärel 24. ja 48. tunnil (st pärast doseerimist). Kui osutub vajalikuks pikendatud vaatlusperiood, tuleks edasisi hindamisi teha 24tunniste vahedega kuni 96. tunnini, eeldusel et suremus kontrollkatses ei ületa 10 %.
      Rühma kohta manustatud toidu hulk tuleb kindlaks määrata. Töödeldud ja töötlemata toidu tarbimismäärade võrdlemine antud 6 tunni jooksul võib anda teavet töödeldud toidu maitsvuse kohta.
      Kõik katseperioodi jooksul tuvastatud kõrvalekalded käitumises tuleks registreerida.
      1.6.5.   Piirsisalduskatse
      Teatud juhtudel (nt kui eeldatakse, et uuritav aine on madala toksilisusega) tuleks teha piirsisalduskatse, kasutades 100 μg toimeainet mesilase kohta, eesmärgiga näidata, et LD50 on sellest väärtusest suurem. Tuleks kasutada sama menetlust, st seal peaks olema kolm dubleerivat katserühma uuritava doosi kohta, asjaomased kontrollkatsed, tarbitud töödeldud toidu koguse hindamine ning toksilisuse standardi kasutamine. Kui esineb suremust, tuleks teha täielik uuring. Kui täheldatakse subletaalseid mõjusid (vt punkti 1.6.4), tuleks need registreerida.
      2.   ANDMED JA ARUANDLUS
      2.1.   ANDMED
      Andmed tuleks kokku võtta tabelina, näidates ära iga menetlusrühma, kontrollrühma ja toksilisuse standardi rühma kohta kasutatud mesilaste arvu, suremuse iga vaatlusaja kohta ja ebatavalise käitumisega mesilaste arvu. Suremuse andmeid tuleks analüüsida sobiva statistilise meetodiga (nt probitanalüüs, libisev keskväärtus, binomiaalne tõenäosus) (3, 4). Doosi-reaktsiooni sõltuvused koostatakse iga soovitatava vaatlusaja kohta ja arvutatakse kõverate tõusud ning letaalse doosi mediaanid (LD50) 95 % usalduspiiri jaoks. Kontrollrühma suremust võib korrigeerida, kasutades Abbotti korrigeerimist (4, 5). Kui töödeldud toit ei ole täielikult tarbitud, tuleks kindlaks määrata tarbitud uuritava aine doos rühma lõikes. LD50 tuleks avaldada uuritava aine μg-des mesilase kohta.
      2.2.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      2.2.1.   Uuritav aine:
      
                  —
               
               
                  füüsikaline loomus ning olulised füüsikalis-keemilised omadused (nt püsivus vees, aururõhk);
               
            
                  —
               
               
                  keemilised identifitseerimisandmed, sealhulgas struktuurivalem, puhtus (st pestitsiidide korral toimeaine(te) loomus ja kontsentratsioon).
               
            2.2.2.   Katsealused liigid:
      
                  —
               
               
                  teaduslik nimi, tõug, ligikaudne vanus (nädalates), kogumismeetod, kogumise kuupäev;
               
            
                  —
               
               
                  teave katsemesilaste kogumiseks kasutatud kolooniate kohta, sealhulgas nende tervisliku seisundi, täiskasvanud isendite haiguste, eelneva ravi jms kohta.
               
            2.2.3.   Katsetingimused:
      
                  —
               
               
                  katseruumi temperatuur ja suhteline õhuniiskus;
               
            
                  —
               
               
                  pidamistingimused, sealhulgas puuride tüüp, suurus ja materjal;
               
            
                  —
               
               
                  põhi- ja katselahuste valmistamismeetodid (kui kasutatakse lahustit, tuleb esitada ka selle nimetus ja kontsentratsioon);
               
            
                  —
               
               
                  katse kavandamine, nt kasutatavad uuritavad kontsentratsioonid ja nende arv, kontrollkatsete arv; iga uuritava kontsentratsiooni ja kontrollrühma kohta dubleerivate puuride arv ja mesilaste arv puuri kohta;
               
            
                  —
               
               
                  katse kuupäev.
               
            2.2.4.   Tulemused:
      
                  —
               
               
                  kui tehakse esialgse vahemiku leidmise uuring, siis selle tulemused;
               
            
                  —
               
               
                  lähteandmed: suremus iga doosi lõikes igal vaatlushetkel;
               
            
                  —
               
               
                  doosi-reaktsiooni sõltuvuse graafik katse lõpus;
               
            
                  —
               
               
                  LD50 väärtused 95 % usalduspiiriga iga soovitatava vaatlushetke lõikes uuritava aine ja toksilisuse standardi kohta;
               
            
                  —
               
               
                  LD50 kindlaksmääramiseks kasutatud statistilised menetlused;
               
            
                  —
               
               
                  suremus kontrollrühmades;
               
            
                  —
               
               
                  muu täheldatud või mõõdetud bioloogiline mõju, nt kõrvalekalded mesilaste käitumises (kaasaarvatud uuritavast doosist keeldumine), toidu tarbimise määr töödeldud ja töötlemata rühmades;
               
            
                  —
               
               
                  mis tahes kõrvalekalle siinkirjeldatud katsemenetlustest ja muu oluline teave.
               
            3.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO Bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151–165. March 1993.
               
            
                  2)
               
               
                  Gough, H. J., Mclndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.) 1981-1992. Journal of Apicultural Research, 22, pp. 119–125.
               
            
                  3)
               
               
                  Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99–113.
               
            
                  4)
               
               
                  Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.
               
            
                  5)
               
               
                  Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol., 18, pp. 265–267.
               
            C.17.   MESILASED – AKUUTSE KONTAKTTOKSILISUSE KATSE
      1.   MEETOD
      Käesolev akuutse toksilisuse katsemeetod lähtub juhendist OECD TG 214 (1998).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesolev toksilisuse katse on laboratoorne meetod, mis on kavandatud taimekaitsetoodete ja teiste kemikaalide akuutse kontakttoksilisuse hindamiseks täiskasvanud töömesilastele.
      Ainete toksiliste omaduste hindamisel võib nõuda akuutse kontakttoksilisuse kindlaksmääramist mesilaste puhul, st siis, kui on tõenäoline mesilaste kokkupuutumine antud kemikaaliga. Akuutse kontakttoksilisuse katse tehakse selleks, et kindlaks määrata pestitsiidide ja teiste kemikaalide toksilisus mesilastele. Käesoleva katse tulemusi tuleks kasutada edasise hindamise vajaduse määramiseks. Täpsemalt võib seda meetodit kasutada programmides, milles pestitsiidide poolt mesilastele tekitatud ohte hinnatakse astmeliselt ja mis põhinevad järjestikulisel üleminekul toksilisuse laboratoorsete katsete juurest poolväli- ja välikatseteni (1). Pestitsiide võib uurida nii toimeainetena kui ka valmististena.
      Mesilaste tundlikkuse ja katsemenetluse täpsuse kindlakstegemiseks tuleks kasutada toksilisuse standardit.
      1.2.   MÕISTED
      
         Akuutne kontakttoksilisus – negatiivne mõju, mis ilmneb hiljemalt 96 tunni jooksul pärast uuritava aine ühe doosi pealekandmist.
      
         Doos – pealekantava uuritav aine kogus. Doosi väljendatakse uuritav aine massina (μg) katselooma kohta (μg/mesilane).
      
         LD
         
            50
         
         (letaalse doosi mediaan) kontakti korral – statistiliselt saadud aine ühekordne doos, mis võib kontaktmanustamisel põhjustada surma 50 % isenditest. LD50 väärtust väljendatakse uuritava aine mikrogrammides (μg) mesilase kohta. Pestitsiidide korral võib uuritav aine olla kas toimeaine või valmistis, milles on üks või mitu toimeainet.
      
         Suremus – isend loetakse surnuks, kui see on täielikult liikumatu.
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Täiskasvanud töömesilased (Apis mellifera) viiakse kokku sobivas kandeaines lahustatud uuritava aine erinevate doosidega, kandes need otse rindkerele (tilkadena). Katse kestus on 48 tundi. Kui suremuse määr suureneb 24 h ja 48 h vahel ning kui suremus kontrollrühmas jääb aktsepteeritavale tasemele, st < 10 %, on sobiv katse kestust pikendada maksimaalselt 96 tunnini. Suremust registreeritakse iga päev ja võrreldakse kontrollrühmas saadud väärtustega. Tulemused analüüsitakse, et arvutada välja LD50 väärtused 24. ja 48. tunni jaoks ja juhul, kui uuringut pikendatakse, siis ka 72. ja 96. tunni jaoks.
      1.4.   KATSE VALIIDSUS
      Katse valiidsuse kohta kehtivad järgmised tingimused:
      
                  —
               
               
                  keskmine suremus kõikides kontrollkatsetes kokku ei tohi katse lõpul ületada 10 %;
               
            
                  —
               
               
                  toksilisuse standard LD50 vastab kõnealusele vahemikule.
               
            1.5.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.5.1.   Mesilaste kogumine
      Kasutada tuleks sama tõugu noori töömesilasi, st mesilased peaksid olema samas vanuses, samamoodi toidetud, sama tõugu jne. Mesilased peaksid olema pärit piisavalt toidetud, tervetest ja võimalikult haigusvabamatest mesilasemaga kolooniatest, millel on tuntud ajalugu ja füsioloogiline staatus. Mesilased tuleks kokku koguda kasutamispäeva hommikul või katsele eelneval õhtul ja hoida katse tingimustes järgmise päevani. Sobivad on need mesilased, mis on kogutud raamidelt, millel ei ole pesakondi. Tuleks vältida kogumist varakevadel või hilissügisel, kuna mesilaste füsioloogia on sellel ajal muutunud. Kui katse tuleb teha varakevadel või hilissügisel, võib mesilastel lasta kooruda inkubaatoris ja neid võib kasvatada ühe nädala jooksul „mesilasleival” (kärjest kogutud õietolm) ja sahharoosilahusega. Toksilisuse katses ei tohiks kasutada mesilasi, keda on ravitud keemiliste ainetega, näiteks antibiootikumid, varroatoosivastased tooted jms, nelja nädala jooksul alates viimase ravimenetluse lõpust.
      1.5.2.   Pidamis- ja söötmistingimused
      Kasutatakse kergesti puhastatavaid ja hästiventileeritud puure. Kasutada võib mis tahes materjalist, nt roostevabast terasest, traatvõrgust, plastmassist puure või ühekordselt kasutatavaid puupuure jms. Katsepuuride suurus peaks olema vastavauses mesilaste arvuga, st tagama piisava ruumi. Eelistatav mesilaste arv on kümme mesilast puuri kohta.
      Mesilased tuleks hoida katseruumis pimedas temperatuuril 25 + 2 oC. Kogu uuringu jooksul tuleks registreerida suhteline õhuniiskus, mis normaalselt on ligikaudu 50–70 %. Käitlemismenetlusi, sealhulgas ainega töötlemist ja vaatlusi võib teha (päeva)valguses. Toiduks tuleks kasutada sahharoosi vesilahust, mille lõppkontsentratsioon on 500 g/l (50 massi-/mahuprotsenti) ja seda tuleks anda katse jooksul ad libitum, kasutades mesilaste toiteseadet. Selleks võib olla klaastoru (ligikaudu 50 mm pikk ja 10 mm läbimõõduga, mille avatud ots kitseneb kuni ligikaudu 2 millimeetrini).
      1.5.3.   Mesilaste ettevalmistamine
      Pärast kogumist võib mesilased uuritava aine pealepanemiseks tuimestada süsinikdioksiidi või lämmastikuga. Kasutatava tuimasti kogus ja kokkupuuteaeg tuleks hoida minimaalsena. Surevaid mesilasi ei tuleks kasutada ja need asendatakse enne katse algust tervete mesilastega.
      1.5.4.   Dooside ettevalmistamine
      Uuritav aine tuleb peale kanda kandeaines oleva lahusena, st orgaanilises lahustis või vesilahuses, mis sisaldab märgavat ainet. Orgaanilise lahustina eelistatakse atsetooni, kuid kasutada võib ka teisi mesilastele vähemürgiseid orgaanilisi lahusteid (nt dimetüülformamiidi, dimetüülsulfoksiidi). Vees dispergeeritud valmistitse ja orgaanilistes kandelahustites mittelahustuvate väga polaarsete orgaaniliste ainete lahuseid on lihtsam kasutada siis, kui need on valmistatud müügiloleva märgava aine (nt Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween) lahjas lahuses.
      Valmistada tuleks sobivad kontroll-lahused, st kui kasutatakse lahustit või disperganti uuritava aine lahustamiseks, tuleks kasutada kahte iseseisvat kontrollrühma: üks, milles kasutatakse vett ja teine milles kasutatakse lahustit/disperganti.
      1.6.   KATSE KÄIK
      1.6.1.   Katse- ja kontrollrühmad
      Dooside ja uuritud duplikaatide arv peaks vastama statistilistele nõuetele LD50 kindlaksmääramiseks 95 % usalduspiiriga. Tavaliselt nõutakse katse jaoks viit doosi geomeetrilises jadas, mille tegur ei ületa 2.2 ja mis katavad LD50 jaoks vajaliku vahemiku. Siiski tuleb dooside arv kindlaks määrata vastavalt toksilisuskõvera (doos vs suremus) tõusule ja tulemuste analüüsimiseks valitud statistilisele meetodile. Vahemiku kindlaksmääramise katse võimaldab valida välja sobivaid doose.
      Iga uuritava kontsentratsiooniga lahust tuleks doseerida vähemalt kolmele dubleerivale katserühmale, milles igas on 10 mesilast.
      Lisaks katseseeriale tuleks kasutada vähemalt kolme kontrollpartiid, milles igaühes on 10 mesilast. Kui kasutatakse orgaanilist lahustit või märgavat ainet, tuleb kasutada lahusti või märgava aine kohta kolme täiendavat kontrollpartiid, milles igaühes on 10 mesilast.
      1.6.2.   Toksilisuse standard
      Katseseerias peab olema ka toksilisuse standard. Eeldatava LD50 väärtuse katmiseks tuleks valida vähemalt kolm doosi. Iga uuritavat doosi tuleks kasutada vähemalt kolme dubleeriva puuri korral, milles igaühes on 10 mesilast. Eelistatav toksilisuse standard on dimetoaat, mille kontaktse LD50 dokumenteeritud väärtus 24 tunni jaoks on vahemikus 0,10–0,30 μg toimeainet mesilase kohta (2). Siiski võib kasutada ka teisi toksilisuse standardeid juhul, kui on võimalik hankida piisavalt andmeid, et tõestada eeldatud reaktsiooni doosile (nt paratioon).
      1.6.3.   Kokkupuude
      1.6.3.1.   Doseerimine
      Tuimestatud mesilastele kantakse uuritavat ainet peale individuaalselt. Mesilased määratakse juhuvaliku alusel erinevatele uuritavatele doosidele allutatavatesse rühmadesse ja kontrollrühmadesse. Iga mesilase rindkere selgmisele küljele määritakse peale mikroaplikaatoriga 1 μl uuritavat ainet sobivas kontsentratsioonis sisaldavat lahust. Kasutada võib ka muid koguseid, kui see on õigustatud. Pärast pealekandmist jagatakse mesilased katsepuuridesse ja neile antakse sahharoosilahust.
      1.6.3.2.   Kestus
      Katse kestus on eelistatavalt 48 tundi. Kui suremus tõuseb 24 ja 48 tunni vahel rohkem kui 10 %, tuleks katse kestust pikendada maksimaalselt 96 tunnini eeldusel, et suremus kontrollrühmas ei ületa 10 %.
      1.6.4.   Vaatlused
      Suremus registreeritakse 4. tunnil pärast doseerimist ja seejärel 24. ja 48. tunnil. Kui osutub vajalikuks vaatlusperioodi pikendada, tuleks teha edasisi hindamisi 24tunniste vahedega kuni 96. tunnini eeldusel, et suremus kontrollrühmas ei ületa 10 %.
      Kõik katseperioodi jooksul tuvastatud kõrvalekalded käitumises tuleks registreerida.
      1.6.5.   Piirsisalduskatse
      Teatud juhtudel (nt kui eeldatakse, et uuritav aine on madala toksilisusega) tuleks teha piirsisalduskatse, kasutades 100 μg toimeainet mesilase kohta, eesmärgiga näidata, et LD50 on sellest väärtusest suurem. Tuleks kasutada sama menetlust, st seal peaks olema kolm dubleerivat katserühma uuritava doosi kohta, asjaomased kontrollkatsed ning toksilisuse standardi kasutamine. Kui esineb suremust, tuleks teha täielik uuring. Kui täheldatakse subletaalseid mõjusid (vt punkti 1.6.4), tuleks need registreerida.
      2.   ANDMED JA ARUANDLUS
      2.1.   ANDMED
      Andmed tuleks kokku võtta tabelina, näidates ära iga menetlusrühma, kontrollrühma ja toksilisuse standardi rühma kohta kasutatud mesilaste arvu, suremuse iga vaatlusaja kohta ja ebatavalise käitumisega mesilaste arvu. Suremuse andmeid tuleks analüüsida sobiva statistilise meetodiga (nt probitanalüüs, libisev keskväärtus, binomiaalne tõenäosus) (3, 4). Sõltuvuse doos-reaktsioon koostatakse iga soovitatava vaatlusaja (st 24. h, 48. h ja kui kasutatakse, siis ka 72. h ja 96. h) kohta ja arvutatakse kõverate tõusud ning letaalse doosi mediaanid (LD50) 95 % usalduspiiri jaoks. Kontrollrühma suremust võib korrigeerida, kasutades Abbotti korrigeerimist (4, 5). LD50 tuleks avaldada uuritava aine μg-des mesilase kohta.
      2.2.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      2.2.1.   Uuritav aine:
      
                  —
               
               
                  füüsikaline loomus ning füüsikalis-keemilised omadused (nt püsivus vees, aururõhk);
               
            
                  —
               
               
                  keemilised identifitseerimisandmed, sealhulgas struktuurivalem, puhtus (st pestitsiidide korral toimeaine(te) loomus ja kontsentratsioon).
               
            2.2.2.   Katsealused liigid:
      
                  —
               
               
                  teaduslik nimi, tõug, ligikaudne vanus (nädalates), kogumismeetod, kogumise kuupäev;
               
            
                  —
               
               
                  teave katsemesilaste kogumiseks kasutatud kolooniate kohta, sealhulgas nende tervisliku seisundi, täiskasvanud isendite haiguste, eelneva ravi jms kohta.
               
            2.2.3.   Katsetingimused:
      
                  —
               
               
                  katseruumi temperatuur ja suhteline õhuniiskus;
               
            
                  —
               
               
                  pidamistingimused, sealhulgas puuride tüüp, suurus ja materjal;
               
            
                  —
               
               
                  uuritava aine manustamise meetodid, nt kasutatud kandelahus, pealekantud uuritava lahuse ruumala, kasutatud tuimasti;
               
            
                  —
               
               
                  katse kavandamine, nt kasutatud uuritavad doosid ja nende arv, kontrollkatsete arv; iga uuritava doosi ja kontrollrühma kohta dubleerivate puuride arv ja mesilaste arv puuri kohta;
               
            
                  —
               
               
                  katse kuupäev.
               
            2.2.4.   Tulemused:
      
                  —
               
               
                  kui tehakse esialgse vahemiku leidmise uuring, siis selle tulemused;
               
            
                  —
               
               
                  lähteandmed: suremus iga uuritud kontsentratsiooni kohta igal vaatlushetkel;
               
            
                  —
               
               
                  doosi-reaktsiooni sõltuvuse graafik katse lõpus;
               
            
                  —
               
               
                  LD50 väärtused 95 % usalduspiiriga iga soovitatava vaatlushetke lõikes uuritava aine ja toksilisuse standardi kohta;
               
            
                  —
               
               
                  LD50 kindlaksmääramiseks kasutatud statistilised menetlused;
               
            
                  —
               
               
                  suremus kontrollrühmades;
               
            
                  —
               
               
                  muu täheldatud või mõõdetud bioloogiline mõju ja mesilaste mis tahes ebatavalised reaktsioonid;
               
            
                  —
               
               
                  mis tahes kõrvalekalded siinkirjeldatud katsemeetodi menetlustest ja muu oluline teave.
               
            3.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151–165. March 1993.
               
            
                  2)
               
               
                  Gough, H. J., Mclndoe, E. C, Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981–1992. Journal of Apicultural Research 22, pp. 119-125.
               
            
                  3)
               
               
                  Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99–113.
               
            
                  4)
               
               
                  Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.
               
            
                  5)
               
               
                  Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, pp. 265–267.
               
            C.18.   ADSORPTSIOON/DESORPTSIOON, KASUTADES PARTII TASAKAALUSTAMISE MEETODIT
      1.   MEETOD
      Käesolev meetod lähtub OECD juhendist TG 106 mulla adsorptsiooni/desorptsiooni määramiseks, kasutades partii tasakaalustamise meetodit (2000).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesolev meetod võtab arvesse nii laboritevahelist võrdlust, adsorptsioonikatse tegemise jaoks mulla valikut puudutavat seminari (1, 2, 3, 4) kui ka riiklikul tasandil olemasolevaid juhiseid (5, 6, 7, 8, 9, 10, 11).
      Adsorptsiooni-/desorptsiooniuuringutest saadakse vajalikku teavet kemikaalide liikuvuse ja jaotumise kohta biosfääri maa-, vee- ja õhukihtides (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21). Seda teavet võib kasutada näiteks selleks, et prognoosida või hinnata kemikaalide lagunemist (22, 23), muundumist või organismide poolt omastamist (24), leostumist läbi mullakihtide (16, 18, 19, 21, 25, 26, 27, 28), lenduvust mullast (21, 29, 30) või uhtumist maapinnalt looduslikku vette (18, 31, 32). Adsorptsiooni puudutavaid andmeid võib kasutada võrdlemiseks ja modelleerimiseks (19, 33, 34, 35).
      Kemikaali jagunemine mulla- ja vesifaasi vahel on keeruline protsess, mis sõltub paljudest erinevatest teguritest: aine keemilisest iseloomust (12, 36, 37, 38, 39, 40), mulla omadustest (4, 12, 13, 14, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49) ja kliimateguritest, nagu näiteks sademed, temperatuur, päikesevalgus ja tuul. Seega ei saa kemikaali mullal toimuva adsorptsiooniprotsessiga seotud paljusid erinevaid nähtusi ja mehhanisme täielikult määratleda lihtsustatud laboratoorse mudeli, näiteks käesoleva meetodi abil. Olenemata sellest, et käesoleva meetodiga ei ole võimalik katta kõiki keskkonnas võimalikke juhtusid, annab see siiski väärtuslikku teavet kemikaali adsorptsiooni olulisuse kohta keskkonnale.
      Vt ka üldist sissejuhatust.
      1.2.   REGULEERIMISALA
      Selle meetodi eesmärk on kindlaks määrata kemikaalide adsorptsioon/desorptsioon mullas. Eesmärk on saada sorptsiooniväärtus, mida saab kasutada jaotumuse prognoosimiseks erinevates keskkonnatingimustes; selleks määratakse kindlaks kemikaali tasakaalulised adsorptsioonitegurid erinevatele muldadele mullaomaduste funktsioonina (nt orgaanilise süsiniku sisaldus, savisisaldus, mullastruktuur ja pH). Võimalikult laia konkreetse aine ja looduslike muldade vastastikuse mõju hõlmamiseks tuleb kasutada erinevaid mullatüüpe.
      Käesolevas meetodis tähendab adsorptsioon kemikaali kinnitumisprotsessi mulla pinnale; selles ei eristata erinevaid adsorptsiooniprotsesse (füüsikaline ja keemiline adsorptsioon) ega selliseid protsesse nagu pindkatalüseeritud lagunemine, koguadsorptsioon või keemiline reaktsioon. Mulla tekitatud kolloidosakestes (läbimõõduga < 0,2 μm) toimunud adsorptsiooni ei võeta arvesse.
      Mullaparameetrid, mida peetakse adsorptsiooni puhul kõige tähtsamateks, on: orgaanilise süsiniku sisaldus (3, 4, 12, 13, 14, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48), savisisaldus ja mullastruktuur (3, 4, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48) ning pH ioniseerivate ühendite jaoks (3, 4, 42). Muud mulla parameetrid, mis võivad mõjutada konkreetse aine adsorptsiooni/desorptsiooni, on efektiivne katioonide neelamismahutavus (ECEC), amorfse raua ja alumiiniumoksiidide sisaldus, eriti vulkaaniliste ja troopiliste muldade puhul (4), ja samuti eripindala (49).
      Katse eesmärk on määrata kemikaali adsorptsioon erinevates mullatüüpides, millel on erinev orgaanilise süsiniku sisaldus, savisisaldus, mullastruktuur ja pH. See koosneb kolmest tasemest:
      
                  
                     1. tase:
               
               
                  eelkatse, et teha kindlaks:
                  
                              —
                           
                           
                              mulla/lahuse suhe:
                           
                        
                              —
                           
                           
                              adsorptsiooni tasakaaluoleku püstitumise aeg ja adsorbeerunud uuritava aine kogus tasakaaluolekus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava aine adsorbeerumine katseanumate pindadel ja uuritava aine püsivus katseperioodi jooksul.
                           
                        
            
                  
                     2. tase:
               
               
                  sõeluuring: adsorptsiooni uuritakse viie erineva mullatüübi puhul, kasutades adsorptsioonikineetikat ühel kontsentratsioonil ja määrates jaotustegurid Kd ja Koc.
               
            
                  
                     3. tase:
               
               
                  Freundlichi adsorptsiooniisotermide määramine, et oleks võimalik määrata kontsentratsiooni mõju mullas toimuva adsorptsiooni ulatusele.
                  Desorptsiooniuuring, kasutades desorptsioonikineetikat/Freundlichi desorptsiooniisoterme (1. liide).
               
            1.3.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      
                  Tähis
               
               
                  Mõiste
               
               
                  Ühikud
               
            
                  
                     
               
               
                  adsorptsiooniprotsent ajahetkel ti
                  
               
               
                  %
               
            
                  Aeq
                  
               
               
                  adsorptsiooniprotsent adsorptsiooni tasakaaluolekus
               
               
                  %
               
            
                  
                     
               
               
                  mullal adsorbeerunud uuritava aine mass ajahetkel ti
                  
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  mullal adsorbeerunud uuritava aine mass ajavahemikus Δti
                  
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  mullal adsorbeerunud uuritava aine mass adsorptsiooni tasakaaluolekus
               
               
                  μg
               
            
                  m0
                  
               
               
                  uuritava aine mass katseklaasis adsorptsioonikatse alguses
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               uuritava aine mass, mõõdetud alikvoodis (
                     ) ajahetkel ti
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  aine mass lahuses adsorptsiooni tasakaaluolekus
               
               
                  μg
               
            
                  msoil
                  
               
               
                  mullafaasi kogus, väljendatud mulla kuivmassina
               
               
                  g
               
            
                  Cst
                  
               
               
                  aine põhilahuse mas sikontsentratsioon
               
               
                  μg cm-3
                  
               
            
                  C0
                  
               
               
                  mullaga kokkupuutuva katselahuse esialgne massikontsentratsioon
               
               
                  μg cm-3
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  aine massikontsentratsioon vesifaasis analüüsi tegemise ajahetkel ti
                  
               
               
                  μg cm-3
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  mullal adsorbeerunud aine sisaldus adsorptsiooni tasakaaluolekus
               
               
                  μg cm-1
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  aine massikontsentratsioon vesifaasis adsorptsiooni tasakaaluolekus
               
               
                  μg cm-3
                  
               
            
                  V0
                  
               
               
                  adsorptsioonikatse jooksul mullaga kokkupuutuva vesifaasi esialgne ruumala
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  alikvoodi ruumala, milles uuritavat ainet mõõdetakse
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  Kd
                  
               
               
                  adsorptsiooni jaotustegur
               
               
                  cm3 g-1
                  
               
            
                  Koc
                  
               
               
                  orgaanilise süsiniku suhtes normaliseeritud adsorptsioonitegur
               
               
                  cm3 g-1
                  
               
            
                  Kom
                  
               
               
                  orgaanilise ainese suhtes normaliseeritud jaotustegur
               
               
                  cm3 g-1
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  Freundlichi adsorptsioonitegur
               
               
                  μg 1-1/n (cm3) 1/n g–1
                  
               
            
                  1/n
               
               
                  Freundlichi eksponent
               
               
                   
               
            
                  
                     
               
               
                  desorptsiooniprotsent ajahetkel ti
                  
               
               
                  %
               
            
                  
                     
               
               
                  desorptsiooniprotsent, mis vastab ajavahemikule Δti
                  
               
               
                  %
               
            
                  Kdes
                  
               
               
                  ilmne desorptsioonitegur
               
               
                  cm3 g–1
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  Freundlichi desorptsioonitegur
               
               
                  μg 1-1/n (cm3) 1/n g–1
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  mullast desorbeerunud uuritava aine mass ajahetkel ti
                  
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  mullast ajavahemikus Δti desorbeerunud uuritava aine mass
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  aine analüütiliselt määratud mass vesifaasis desorptsiooni tasakaaluolekus
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  desorbeerunud uuritava aine kogumass desorptsiooni tasakaaluolekus
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  aine mass, mis jääb mullale adsorbeerununa pärast ajavahemiku Δti möödumist
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  osalisest ruumala asendusest tingitud ülejääva aine mass adsorptsiooni tasakaaluolekus
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  mullale jääv adsorbeerunud uuritava aine sisaldus desorptsiooni tasakaaluolekus
               
               
                  μg g–1
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  uuritava aine massikontsentratsioon vesifaasis desorptsiooni tasakaaluolekus
               
               
                  μg cm–3
                  
               
            
                  VT
                  
               
               
                  desorptsioonikineetika määramisel jadameetodiga mullaga kokku puutuva vesifaasi koguruumala
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  VR
                  
               
               
                  adsorptsiooni tasakaaluoleku püstitumise järel katseklaasist eemaldatud supernatandi ruumala, mis asendatakse sama ruumala 0,01 M CaCl2 lahusega
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  desorptsioonikineetika määramisel jadameetodiga analüütilisel eesmärgil ajahetkel (i) võetud alikvoodi ruumala
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  uuritava aine mõõtmiseks katseklaasist (i) võetud lahuse desorptsioonikineetika ruumala (paralleelmeetod)
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  uuritava aine mõõtmiseks katseklaasist võetud lahuse ruumala desorptsiooni tasakaaluolekus
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  MB
               
               
                  massitasakaal
               
               
                  %
               
            
                  mE
                  
               
               
                  mullast ja katseanuma seintelt kahes etapis ekstraheeritud uuritava aine kogumass
               
               
                  μg
               
            
                  Vrec
                  
               
               
                  adsorptsiooni tasakaaluoleku järel regenereeritud supernatandi ruumala
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  Pow
                  
               
               
                  jaotustegur oktanool/vesi
               
               
                   
               
            
                  pKa
               
               
                  dissotsiatsioonikonstant
               
               
                   
               
            
                  Sw
                  
               
               
                  lahustuvus vees
               
               
                  g l-1
                  
               
            1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Uuritava aine lahuste teadaolevad ruumalad, märgistamata või radiomärgistatud, teadaolevate kontsentratsioonidena 0,01 M CaCl2-s lisatakse teadaoleva kuivmassiga mullaproovidele, mis on eeltasakaalustatud 0,01 M CaCl2-s. Segu segatakse piisava aja jooksul. Seejärel eraldatakse mullasuspensioonid tsentrifuugimise ja soovi korral filtreerimise teel ning analüüsitakse vesifaasi. Mullaproovile adsorbeerunud uuritava aine kogus arvutatakse algselt lahuses esinenud uuritava aine koguse ja katse lõpus järelejäänud uuritava aine koguse vahena (kaudne meetod).
      Alternatiivina võib adsorbeerunud uuritava aine koguse määrata ka otse mullaanalüüsi teel (otsene meetod). Menetlust, mis sisaldab mulla astmelist eraldamist sobiva lahustiga, soovitatakse siis, kui aine kontsentratsiooni vahet lahuses ei ole võimalik täpselt määrata. Sellised juhud on näiteks: uuritava aine adsorptsioon katseanuma pinnale, uuritava aine ebastabiilsus katse tegemise jooksul, nõrk adsorptsioon, mis põhjustab lahuses vaid väikese kontsentratsioonimuutuse; ja tugev adsorptsioon, mis põhjustab madala kontsentratsiooni, mida ei ole võimalik täpselt määrata. Radiomärgistatud aine kasutamisel võib mulla eraldamise ära jätta, kui tehakse mullafaasi analüüs, kasutades põlemist ja vedelikstsintillatsiooniloendust. Vedelikstsintillatsiooniloendus on siiski mittespetsiifiline tehnika, millega ei saa teha vahet lähteainetel ja muundatud toodetel, seepärast tuleks seda kasutada ainult siis, kui uuritav aine on püsiv kogu uuringu jooksul.
      1.5.   TEAVE UURITAVA AINE KOHTA
      Keemilised reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad. Soovitatakse kasutada märgistamata uuritavaid aineid, mille koostis on teada ja mille puhtusaste on eelistatavalt vähemalt 95 %, või radiomärgistatud uuritavaid aineid, mille koostis ja radioaktiivsete isotoopide puhtusaste on teada. Kui märgistusainete poolestusaeg on lühike, tuleks kohaldada lagunemise korrigeerimist.
      Enne adsorptsiooni-desorptsioonikatse tegemist peab uuritava aine kohta olema kättesaadav järgmine teave:
      
                  a)
               
               
                  lahustuvus vees (A.6);
               
            
                  b)
               
               
                  aururõhk (A.4) ja/või Henry konstant;
               
            
                  c)
               
               
                  abiootiline lagunemine: hüdrolüüs pH funktsioonina (C.7);
               
            
                  d)
               
               
                  jaotustegur (A.8);
               
            
                  e)
               
               
                  kiire biolagunduvus (C.4) või aeroobne ja anaeroobne muundumine mullas;
               
            
                  f)
               
               
                  ioniseerivate ainete pKa;
               
            
                  g)
               
               
                  otsene fotolüüs vees (st UV-Vis absorptsioonispekter vees, kvantsaagis) ja fotodegradatsioon mullas.
               
            1.6.   KATSE KASUTATAVUS
      Katset kasutatakse keemiliste ainete puhul, mille kohta on olemas piisava täpsusega analüüsimeetod. Uuritava aine püsivus katse jooksul on tähtis parameeter, mis võib mõjutada tulemuste usaldatavust, eriti kui kasutatakse kaudset meetodit. Seega tuleb aine püsivust kontrollida eeluuringuga; kui katse tegemise jooksul tuvastatakse muundumine, soovitatakse põhiuuringu tegemiseks kasutada nii mulla- kui ka vesifaasi analüüsi.
      Raskused võivad tekkida siis, kui katse tegemisel kasutatakse madala veeslahustuvusega uuritavaid aineid (Sw < 10–4 g l-1) või suure laenguga aineid, kuna kontsentratsiooni vesifaasis ei ole võimalik analüütiliselt mõõta piisava täpsusega. Sellisel juhul tuleb võtta lisameetmeid. Juhised selliste probleemide korral käitumiseks esitatakse käesoleva meetodi asjakohastes jagudes.
      Kui uuritakse lenduvaid aineid, tuleb hoolitseda selle eest, et uuringu jooksul ei tekiks kadusid.
      1.7.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.7.1.   Seadmed ja keemilised reaktiivid
      Harilik laboratooriumivarustus, eelkõige järgmine.
      
                  a)
               
               
                  Katseklaasid või anumad katsete tegemiseks. On oluline, et katseklaasid või anumad:
                  
                              —
                           
                           
                              sobiksid vahetult tsentrifuugi, et minimeerida käitlemisest ja ümberpaigutamisest tuleneda võivaid vigu;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              oleksid tehtud inertsest materjalist, mis muudab uuritava aine adsorbeerumise nende pinnal minimaalseks.
                           
                        
            
                  b)
               
               
                  Raputi: rippraputi või samalaadne seade; raputi peab raputamise ajal hoidma mulda suspensioonis.
               
            
                  c)
               
               
                  Tsentrifuug: eelistatavalt suure kiirusega, nt tsentrifugaaljõuga > 3 000 g, reguleeritava temperatuuriga, võimeline eemaldama vesilahusest osakesi, mille läbimõõt on suurem kui 0,2 μm. Konteinerid peavad raputamise ja tsentrifuugimise jooksul olema suletud, et vältida ainete lenduvust ja veekadu; korkidele tekkiva adsorbeerumise minimeerimiseks tuleb kasutada deaktiveeritud korke, näiteks Teflon®iga kaetud keeratavad korgid.
               
            
                  d)
               
               
                  Pole kohustuslik: filtreerimisseade; poorsusega 0,2 μm, steriilsed ja ühekordselt kasutatavad filtrid. Eriti tähelepanelikult tuleks valida filtri materjal, et vältida uuritava aine kadu sellesse; nõrgalt lahustuvate uuritavate ainete korral ei soovitata kasutada orgaanilist filtrimaterjali.
               
            
                  e)
               
               
                  Analüüsivahendid, mis sobivad uuritava kemikaali kontsentratsiooni mõõtmiseks.
               
            
                  f)
               
               
                  Laboratooriumiahi, mis on suuteline säilitama temperatuuri 103–110 oC.
               
            1.7.2.   Mulla iseloomustamine ja valik
      Mulda tuleks iseloomustada kolme parameetri abil, mida peetakse enamasti vastutavaks adsorptsioonimahtuvuse eest: orgaaniline süsinik, savisisaldus ja mullastruktuur ning pH. Nagu juba nimetatud (vt „Reguleerimisala”), võivad ka muud mulla füüsikalis-keemilised omadused mõjutada konkreetse aine adsorptsiooni/desorptsiooni ja neid tuleks sellisel juhul arvestada.
      Mulla iseloomustamisel on kasutatavad meetodid väga olulised ja need võivad tulemusi märkimisväärselt mõjutada. Seetõttu soovitatakse mulla pH-d mõõta 0,01 M CaCl2 lahuses (st lahuses, mida kasutatakse adsorptsiooni-/desorptsioonikatses) vastava ISO meetodi (ISO-10390-1) kohaselt. Samuti soovitatakse teised olulised mulla omadused määrata vastavalt standardmeetoditele (nt ISO „Handbook of Soil Analysis”); see võimaldab kasutada sorptsiooniandmete analüüsi, tuginedes ülemaailmselt standarditud mullaparameetritele. Mõned olemasolevate mulla analüüsimise ja iseloomustamise standardmeetodite juhised on esitatud viidetes (50–52). Mulla katsemeetodite kaliibrimiseks soovitatakse kasutada võrdlusmulda.
      Juhised muldade valimiseks adsorptsiooni-/desorptsioonikatsete jaoks esitatakse tabelis 1. Seitse väljavalitud mulda hõlmavad erinevaid parasvöötme mullatüüpe. Ioniseeruvate uuritavate ainete jaoks peavad väljavalitud mullad hõlmama laia pH vahemikku, et oleks võimalik hinnata aine adsorptsiooni ioniseeritud ja ioniseerimata vormides. Juhised selle kohta, mitut erinevat mulda katse erinevates etappides kasutada, on esitatud punktis 1.9 „Katse käik”.
      Kui eelistatakse teisi mullatüüpe, tuleks neid iseloomustada samade parameetritega ja neil peaks olema samalaadne omaduste varieeruvus nagu tabelis 1 kirjeldatud tüüpidel, isegi kui need ei vasta täpselt kriteeriumidele.
      Tabel 1
      Juhised mullaproovide valimiseks adsorptsiooni-desorptsiooni jaoks
      
                  Mullatüüp
               
               
                  pH-vahemik (0,01 M CaCl2 lahuses)
               
               
                  Orgaanilise süsiniku sisaldus (%)
               
               
                  Savisisaldus (%)
               
               
                  Mulla struktuur (25)
                  
               
            
                  1
               
               
                  4,5–015,5
               
               
                  1,0–2,0
               
               
                  65–80
               
               
                  savi
               
            
                  2
               
               
                  > 7,5
               
               
                  3,5–5,0
               
               
                  20–40
               
               
                  gleistunud saviliiv
               
            
                  3
               
               
                  5,5–7,0
               
               
                  1,5–3,0
               
               
                  15–25
               
               
                  ladestunud saviliiv
               
            
                  4
               
               
                  4,0–5,5
               
               
                  3,0–4,0
               
               
                  15–30
               
               
                  saviliiv
               
            
                  5
               
               
                  < 4,0–6,0 (26)
                  
               
               
                  < 0,5–1,5 (26), (27)
                  
               
               
                  < 10–15 (26)
                  
               
               
                  saviliivane liiv
               
            
                  6
               
               
                  > 7,0
               
               
                  < 0,5–1,0 (26), (27)
                  
               
               
                  40–65
               
               
                  gleistunud saviliiv/savi
               
            
                  7
               
               
                  < 4,5
               
               
                  > 10
               
               
                  < 10
               
               
                  liiv/saviliivane liiv
               
            1.7.3.   Mullaproovide kogumine ja ladustamine
      1.7.3.1.   Kogumine
      Ei soovitata mingeid konkreetseid proovivõtmise tehnikaid ega vahendeid; proovivõtmise tehnika sõltub uuringu eesmärgist (53, 54, 55, 56, 57, 58).
      Arvestada tuleks järgmist:
      
                  a)
               
               
                  vajalik on üksikasjalik teave väliplatsi ajaloo kohta; see sisaldab asukohta, taimkatet, pestitsiidide ja/või väetiste kasutamist, bioloogilisi lisandeid või juhuslikku reostust. Tuleks järgida ISO standardi soovitusi mullaproovide võtmiseks (ISO 10381-6) vastavalt proovivõtmise ala kirjeldusele;
               
            
                  b)
               
               
                  proovivõtukohta tuleb määratleda vastavalt UTM-ile (Universal Transversal Mercator-Projection/European Horizontal Datum) või geograafilistele koordinaatidele; see võimaldab tulevikus konkreetset mulda uuesti koguda või aidata määratleda mulda erinevates riikides kasutatavate erinevate klassifitseerimissüsteemide alusel. Samuti tuleks koguda ainult A-kihist kuni 20 cm sügavuselt. Eriti mullatüübi nr 7 korral, kui mullas esineb Oh-kiht, tuleks see lisada proovile.
               
            Mullaproovid tuleks transportida konteinerites ja sellistel temperatuuritingimustel, mis tagavad, et mulla esialgsed omadused märkimisväärselt ei muutu.
      1.7.3.2.   Ladustamine
      Eelistatakse mulda, mis on värskelt proovivõtualalt võetud. Ainult siis, kui see ei ole võimalik, võib mulda ladustada toatemperatuuril ja seda tuleks hoida õhukuivana. Ladustamisaega ei piirata, kuid üle kolme aasta ladustatud mulda tuleks enne kasutamist uuesti analüüsida orgaanilise süsiniku sisalduse, pH ja katioonide neelamismahutavuse (CEC) suhtes.
      1.7.3.3.   Mullaproovide käitlemine ja ettevalmistamine uuringuks
      Muld kuivatatakse õhu käes toatemperatuuril (eelistatavalt vahemikus 20–25 oC). Kogused tuleks jaotada võimalikult ettevaatlikult, nii et mulla struktuur muutuks nii vähe kui võimalik. Muld sõelutakse kuni osakeste suuruseni ≤ 2 mm; sõelumisprotsessi puhul tuleks järgida ISO standardi soovitusi mullaproovide võtmiseks (ISO 10381-6). Soovitatakse hoolikat homogeenimist, sest see suurendab tulemuste reprodutseeritavust. Iga mulla niiskusesisaldus määratakse kindlaks kolme alikvoodiga, mida kuumutatakse temperatuuril 105 oC, kuni märgatavat massimuutust enam ei esine (ligikaudu 12 tundi). Kõikide arvutuste puhul tähendab mulla mass ahjukuiva massi, st mulla massi, mis on korrigeeritud niiskusesisaldusega.
      1.7.4.   Uuritava aine mullale lisamiseks ettevalmistamine
      Uuritav aine lahustatakse 0,01 M CaCl2 destilleeritud või deioniseeritud vee lahuses; CaCl2 lahust kasutatakse kui vesilahuse faasi, et parandada tsentrifuugimist ja minimeerida katioonide neelamist. Põhilahuse kontsentratsioon peaks eelistatavalt olema kolm suurusjärku kõrgem kui kasutatava analüüsimeetodi avastamispiir. See lävi kaitseb mõõtmise täpsust vastavalt käesolevas meetodis kasutatavale metoodikale; lisaks sellele peaks põhilahuse kontsentratsioon olema allpool uuritava aine lahustuvuse piiri vees.
      Põhilahus tuleks eelistatavalt ette valmistada vahetult enne selle lisamist mullaproovidele ja seda tuleks hoida suletuna pimedas temperatuuril 4 oC. Hoiuaeg sõltub uuritava aine püsivusest ja selle kontsentratsioonist lahuses.
      Ainult halvasti lahustuvate ainete puhul (Sw < 10–4 g l-1) võib osutuda vajalikuks kasutada sobivat solubiliseerivat ainet, kui uuritavat ainet on raske lahustada. See solubiliseeriv aine: a) peaks segunema veega, nagu näiteks metanool või atsetonitriil; b) selle kontsentratsioon ei tohiks ületada 1 % põhilahuse koguruumalast ja peaks moodustama alla selle määra uuritava aine lahuses, mis puutub kokku mullaga (eelistatavalt alla 0,1 %); ja c) ei tohiks olla pindaktiivne aine ega osaleda solvolüüsis uuritavate kemikaalidega. Solubiliseeriva aine kasutamine tuleks sätestada ja uuringuaruandes ära põhjendada.
      Teine võimalus halvasti lahustuvate ainete jaoks on uuritava aine lisamine uuritavasse süsteemi süstitavate portsjonite kaupa: uuritav aine lahustatakse orgaanilises lahustis, selle alikvoot lisatakse mullast ja 0,01 M CaCl2 lahusest destilleeritud või deioniseeritud veest koosnevasse süsteemi. Orgaanilise lahusti sisaldus vesifaasis tuleks hoida võimalikult madalal, tavaliselt mitte üle 0,1 %. Spaikimine orgaanilisest lahusest võib mõjutada negatiivselt mahu reprodutseeritavust. Seega on võimalik täiendava vea esinemine, kui uuritava aine ja kaaslahusti kontsentratsioonid ei ole samad kõikides katsetes.
      1.8.   ADSORPTSIOONI-/DESORPTSIOONIKATSE TEGEMISE EELDUSED'
      1.8.1.   Analüüsimeetod
      Kõige tähtsamad parameetrid, mis võivad mõjutada sorptsiooni määramise täpsust, on nii lahuse-kui adsorptsioonifaaside analüüsimisel kasutatava analüüsimeetodi täpsus, uuritava aine püsivus ja puhtus, sorptsiooni tasakaaluoleku püstitumine, lahuse kontsentratsioonimuutuse suurus, mulla/lahuse suhe ja muutused mulla struktuuris tasakaaluprotsessi jooksul (35, 59–62). 2. liites esitatakse mõningad näited täpsust puudutavate küsimuste kohta.
      Kasutatud analüüsimeetodi usaldusväärsust tuleb kontrollida sellises kontsentratsioonivahemikus, mis võib tõenäoliselt esineda uuringu käigus. Uuringu läbiviija võib vabalt välja töötada sobiva meetodi koos asjakohase täpsuse, kordustäpsuse, reprodutseeritavuse, avastamispiiride ja regenereeritavusega. Juhised sellise uuringu tegemiseks antakse allpool kirjeldatud katsega.
      Sobiv ruumala 0,01 M CaCl2 lahust, nt 100 cm3, segatakse 4 tunni jooksul mulla kogusega (nt 20 g), mille adsorptsioonivõime on kõrge, st millel on kõrge süsiniku- ja savisisaldus; need kogused ja ruumalad võivad varieeruda sõltuvalt analüüsi tingimustest, kuid alguspunktiks on sobiv mulla/lahuse suhe 1:5. Segu tsentrifuugitakse ja vesifaasi võib filtreerida. Viimasele lisatakse teatav ruumala uuritava aine põhilahust, et saavutada nominaalne kontsentratsioon selles kontsentratsioonivahemikus, mis võib katse käigus tõenäoliselt esineda. See ruumala ei tohiks olla suurem kui 10 % vesifaasi lõplikust ruumalast, et võimalikult vähem muuta tasakaaluolekueelse lahuse omadusi. Lahust analüüsitakse.
      Tuleb teha ka üks pimekatse ainult mulla ja CaCl2 lahusega (ilma uuritava aineta), et oleks võimalik kontrollida analüüsimeetodist tulenevaid artefakte ja pinnasest põhjustatud maatriksefekte.
      Analüüsimeetodid, mida võib kasutada sorptsiooni määramiseks, on gaasikromatograafia (GLC), kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC), spektromeetria (nt GC/massispektromeetria, HPLC/massispektromeetria) ja vedelikstsintillatsiooniloendus (radiomärgistatud ainete puhul). Kasutatavast analüüsimeetodist sõltumata loetakse sobivaks, kui taastumine jääb vahemikku 90–110 % nominaalväärtusest. Selleks, et võimaldada pärast jaotamist tulemust kindlaks määrata ja hinnata, peavad analüüsimeetodi avastamispiirid olema vähemalt kaks suurusjärku allpool nominaalset kontsentratsiooni.
      Adsorptsiooniuuringute tegemisel kasutatava analüüsimeetodi omadustel ja avastamispiiridel on katsetingimuste kindlaksmääramisel oluline roll ja need mõjutavad kogu katse tulemusi. Kõnealuse meetodiga järgitakse üldiseid katsete tegemise reegleid ja sellega antakse soovitused ning juhtnöörid alternatiivsete lahenduste jaoks, kui analüüsimeetod ja laboratoorsed võimalused jäävad kitsaks.
      1.8.2.   Optimaalsete mulla/lahuse suhete valimine
      Sobivate mulla/lahuse suhete valik sorptsiooniuuringute jaoks sõltub jaotustegurist Kd ja soovitavast suhtelisest adsorptsioonimäärast. Aine kontsentratsiooni muutus lahuses määrab ära adsorptsiooni võrrandil põhinevate määramiste statistilise täpsuse ja analüüsimeetodi piiri kemikaali kindlaksmääramisel lahuses. Seetõttu on üldises praktikas kasulik keskenduda mõnele fikseeritud suhtele, mille puhul adsorbeerumise protsent on üle 20 % ja soovitatavalt > 50 % (62), hoolitsedes samal ajal selle eest, et uuritava aine kontsentratsioon vesifaasis oleks selle täpseks määramiseks piisavalt kõrge. See on eriti oluline siis, kui adsorptsiooniprotsent on kõrge.
      Otstarbekas lähenemine sobivate mulla/vee suhete valimiseks põhineb Kd väärtuse hindamisel kas eeluuringute käigus või kindlaksmääratud hindamistehnikate abil (3. liide). Seega võib sobiva suhte valimine põhineda Kd funktsioonina esitatud mulla/lahuse suhte graafiku põhjal fikseeritud adsorptsiooniprotsentidel (joonis 1). Selles graafikus eeldatakse, et adsorptsioonivõrrand on lineaarne. (28) Kasutatav sõltuvus saadakse Kd avaldise (4) teisendamisel võrrandi (1) vormi:
      
                  
                     
               
               
                  (1)
               
            Või selle logaritmilisse vormi eeldades, et R = msoil/V0 ja Aeq %/100 = :
      
                  
                     
               
               
                  (2)
               
            
         
      Joonisel 1 esitatakse vajalikud mulla/lahuse suhted Kd funktsioonina erinevate adsorptsiooniastmete jaoks. Näiteks kui mulla/lahuse suhe on 1:5 ja Kd on 20, esineb ligikaudu 80 %ne adsorptsioon. Selleks, et sama Kd korral saada 50 %st adsorptsiooni, tuleb kasutada suhet 1:25. Käesolev lähenemisviis sobivate mulla/lahuse suhete valimiseks võimaldab uurijal paindlikult eksperimendi vajadustega arvestada.
      Raskemini käsitletavad olukorrad on sellised, kus kemikaali adsorptsioon on väga tugev või nõrk. Madala adsorptsiooni korral on soovitatav kasutada mulla ja lahuse vahekorda 1:1, kuigi mõnede väga orgaanilist tüüpi muldade puhul võib suspensiooni saamiseks osutuda vajalikuks väiksem suhe. Lahuses väikeste kontsentratsioonimuutuste määramiseks kasutatava analüüsimeetodi korral tuleb olla ettevaatlik, vastasel korral võib adsorptsiooni määramine olla ebatäpne. Teisest küljest, kui jaotustegurid Kd on väga kõrged, võib mulla/lahuse suhe tõusta kuni 1:100, et lahusesse jääks märkimisväärne kogus kemikaali. Siiski tuleb hoolitseda korraliku segamise eest ning süsteemile tuleb tasakaalu püstitumiseks anda piisavalt aega. Alternatiivseks lähenemiseks selliste ekstreemsete juhtudega tegelemisel, kui sobiv analüüsimeetod puudub, on prognoosida Kd väärtus, kasutades selliseid hindamistehnikaid, mis põhinevad näiteks Pow väärtustel (3. liide). See võiks olla eriti kasulik nõrgalt adsorbeeruvate/polaarsete kemikaalide korral, mille Pow < 20, ja lipofiilsete/väga sorbeeruvate kemikaalide korral, mille Pow > 104.
      1.9.   KATSE KÄIK
      1.9.1.   Katsetingimused
      Kõik katsed tehakse toatemperatuuril ja võimaluse korral konstantse temperatuuri juures, mis jääb vahemikku 20–25 oC.
      Tsentrifuugimisega peaks olema võimalik eraldada lahusest suuremad kui 0,2 μm suurused osakesed. Selle väärtusega tähistatakse väikseimat tahke osakese suurust ja see on piirväärtuseks tahkete ja kolloidosakeste vahel. Tsentrifuugimise tingimuste kindlaksmääramise juhised esitatakse 4. liites.
      Kui tsentrifuugimisega ei ole võimalik tagada suuremate kui 0,2 μm suuruste osakeste eraldamist, tuleks kasutada tsentrifuugimise ja 0,2 μm suurusega filtreid kasutava filtreerimise kombinatsiooni. Need filtrid peaksid olema tehtud sobivast inertsest materjalist, et vältida uuritava aine kadu nendesse. Igal juhul tuleks tõestada, et filtreerimise jooksul ei esine uuritava aine kadu.
      1.9.2.   1. tase – eeluuring
      Eeluuringu eesmärk on esitatud jaos „Reguleerimisala”. Juhised sellise uuringu ettevalmistamiseks esitatakse allpool kirjeldatud katsega.
      1.9.2.1.   Optimaalsete mulla/lahuse suhete valimine
      Kasutatakse kahte mullatüüpi ja kolme mulla/lahuse suhet (kuus katset). Ühel mullatüübil on kõrge orgaanilise süsiniku sisaldus ja madal savisisaldus ning teisel on madal orgaanilise süsiniku sisaldus ja kõrge savisisaldus. Soovitatakse järgmisi mulla/lahuse suhteid:
      
                  —
               
               
                  50 g mulda ja 50 cm3 uuritava aine vesilahust (suhe 1/1);
               
            
                  —
               
               
                  10 g mulda ja 50 cm3 uuritava aine vesilahust (suhe 1/5);
               
            
                  —
               
               
                  2 g mulda ja 50 cm3 uuritava aine vesilahust (suhe 1/25).
               
            Minimaalne mulla kogus, mida võib katses kasutada, sõltub laboratooriumi võimalustest ja kasutatavate analüüsimeetodite võimelisusest. Siiski soovitatakse kasutada vähemalt 1 g ja eelistatavalt 2 g, et uuringu tulemused oleksid usaldusväärsed.
      Ühte kontrollproovi, milles on ainult uuritav aine 0,01 M CaCl2 lahuses (ilma mullata), käideldakse täpselt samamoodi kui katsesüsteemigi, et kontrollida uuritava aine püsivust CaCl2 lahuses ja selle võimalikku adsorptsiooni katseanumate seintele.
      Ühele pimekatsele sama koguse mullaga ja lahuse koguruumalaga 50 cm30,01 M CaCl2 (ilma uuritava aineta) tehakse sama menetlus. See toimib taustkontrollina analüüside jooksul, et avastada häirivad ained või saastunud mullad.
      Kõiki katseid, sealhulgas kontrollid ja pimekatsed, tuleks teha vähemalt kaks korda. Uuringu jaoks ettevalmistatavate proovide koguarvu võib arvutada vastavalt kasutatavale metoodikale.
      Eeluuringu ja põhiuuringu meetodid on üldiselt samad, erandid on vajaduse korral mainitud.
      Õhu käes kuivatatud mullaproovid tasakaalustatakse, raputades neid koos minimaalselt 45 cm30,01 M CaCl2 lahusega terve öö (12 tundi) enne katse tegemise päeva. Hiljem lisatakse teatav kogus uuritava aine põhilahust, et saada lõplikuks mahuks 50 cm. Lisatava põhilahuse maht a) ei tohiks ületada 10 % vesifaasi lõplikust 50 cm3 suurusest mahust, et tasakaalustamiseelse lahuse omadused muutuksid võimalikult vähe, ja b) peaks olema eelistatavalt selline, et mullaga kokku puutuva uuritava aine esialgne kontsentratsioon (C0) on analüüsimeetodi avastamispiiriga võrreldes vähemalt kaks suurusjärku kõrgem; see lävi võimaldab mõõtmisi täpselt teha isegi tugeva adsorptsiooni esinemise korral (> 90 %) ja hiljem määratleda adsorptsiooniisotermid. Samuti soovitatakse võimaluse korral, et aine esialgne kontsentratsioon (C0) ei oleks suurem kui pool selle lahustuvuse piirist.
      Allpool esitatakse näide põhilahuse kontsentratsiooni (Cst) arvutamise kohta. Eeldatakse, et avastamispiir on 0,01 μg cm–3 ja adsorptsioon 90 %; seega peaks mullaga kokkupuutuva uuritava aine esialgne kontsentratsioon olema eelistatavalt 1 μg cm–3 (kaks suurusjärku kõrgem kui analüüsimeetodi avastamispiir). Eeldades, et lisatakse maksimaalne soovitatud põhilahuse ruumala, st 5–45 cm30,01 M CaCl2 tasakaalulahust (= 10 % põhilahust vesifaasi 50 cm3 kogumahust), millega põhilahuse kontsentratsioon peaks olema 10 μg cm-3; see on kolm suurusjärku kõrgem kui analüüsimeetodi avastamispiir.
      Vesifaasi pH tuleks mõõta enne ja pärast mullaga kokkupuutumist, kuna sellel on tähtis osa kogu adsorptsiooniprotsessis, eriti ioniseeruvate ainete korral.
      Segu raputatakse adsorptsiooni tasakaaluoleku püstitumiseni. Tasakaaluoleku püstitumise aeg muldade lõikes erineb suuresti sõltuvalt kemikaalist ja mullast; tavaliselt piisab 24 tunnist (77). Eeluuringus võib proovid koguda järjest 48tunnise segamisperioodi jooksul (näiteks 4., 8., 24. ja 48. tunnil). Siiski tuleks analüüsiajad määrata paindlikult, et võtta arvesse laboratooriumi töögraafikut.
      Uuritava aine analüüsimiseks vesilahuses on kaks võimalust: a) paralleelmeetod ja b) jadameetod. Tuleks rõhutada, et kuigi paralleelmeetod on eksperimentaalselt töömahukam, on tulemuste matemaatiline töötlemine lihtsam (5. liide). Siiski jäetakse kasutatava meetodi valik katse läbiviijale, kes peab arvestama kasutatava laboratooriumi võimalusi ja ressursse.
      
                  a)
               
               
                  Paralleelmeetod: valmistatakse ette nii palju sama mulla/lahuse suhtega proove, kui mitmes ajavahemikus soovitakse adsorptsioonikineetikat uurida. Pärast tsentrifuugimist ja soovi korral pärast filtreerimist regenereeritakse esimese katseklaasi vesifaas võimalikult täielikult ja mõõdetakse nt 4 tunni pärast, vastav teise katseklaasi oma pärast 8. tundi, kolmanda oma pärast 24. tundi jne.
               
            
                  b)
               
               
                  Jadameetod: iga mulla/lahuse suhte kohta valmistatakse ette ainult üks kordusproov. Kindlaksmääratud ajavahemike vahel tsentrifuugitakse segu faaside eraldamiseks. Vesifaasist võetakse väike alikvoot, milles kohe analüüsitakse uuritavat ainet; seejärel jätkub katse esialgse seguga. Kui pärast tsentrifuugimist kasutatakse filtreerimist, peavad laboratooriumil olema vahendid väikeste vesialikvootide filtreerimiseks. On soovitatav, et võetud alikvootide koguruumala ei ületaks 1 % lahuse koguruumalast, et mulla/lahuse suhe ei muutuks märkimisväärselt ning adsorptsiooniks olemasoleva soluudi mass ei väheneks uuringu kestel.
               
            Adsorptsiooniprotsent  arvutatakse igal ajahetkel (ti) nominaalse esialgse kontsentratsiooni alusel ja proovivõtmise hetkel (ti) mõõdetud kontsentratsiooni korrigeeritakse vastavalt pimekatse  väärtusele. Tasakaaluolekule vastava platoo määramiseks koostatakse graafikud teljestikus aeg (5. liites joonis 1) (29). Samuti arvutatakse välja Kd väärtus tasakaaluolekus. Selle Kd väärtuse põhjal valitakse jooniselt 1 välja sobivad mulla/lahuse suhted nii, et adsorptsiooniprotsent on üle 20 % ja eelistatavalt > 50 % (61). Kõik graafikutes kasutatavad võrrandid ja põhimõtted on esitatud punktis „Andmed ja aruandlus” ning 5. liites.
      1.9.2.2.   Adsorptsiooni tasakaaluoleku püstitumise aja ja tasakaaluolekus adsorbeerunud uuritava aine koguse määramine
      Nii nagu juba mainitud, võimaldavad graafikud teljestikus  or  – aeg hinnata adsorptsiooni tasakaaluoleku püstitumist ja adsorbeerunud uuritava aine kogust selles. 5. liites esitatud joonised 1 ja 2 on selliste graafikute näidisteks. Tasakaaluoleku püstitumise aeg on see aeg, mida süsteem vajab tasakaaluolekule vastava platoo saavutamiseks.
      Kui mõne konkreetse mulla puhul saavutatakse tasakaaluolekule vastava platoo asemel pidev kontsentratsiooni tõus, võib see olla tingitud segavatest teguritest, nagu näiteks biolagundamine või aeglane hajumine. Biolagundamist võib näidata, korrates katset steriliseeritud mullaprooviga. Kui tasakaaluolekule vastavat platood ei saavutata ka selle prooviga, peaks katse läbiviija otsima muid nähtusi, mis võiksid olla seotud antud uuringuga; seda võib teha asjakohaste katsetingimuste muutmisega (temperatuur, raputamise ajad, mulla/lahuse suhted). Jäetakse katse tegija otsustada, kas jätkata uuringut, kuigi tasakaaluolek võib jääda püstitumata.
      1.9.2.3.   Adsorptsioon katseanuma pinnal ja uuritava aine püsivus
      Mõningat teavet uuritava aine adsorptsiooni kohta katseanuma pinnal ning püsivuse kohta on võimalik tuletada kontrollproove analüüsides. Kui tuvastatakse kontsentratsiooni kahanemine, mis ületab analüüsimeetodi standardvea, võib olla tegu abiootilise lagunemise ja/või adsorptsiooniga katseanuma pinnale. Neid kahte nähtust on võimalik eristada nii, et anuma seinad pestakse põhjalikult sobiva lahusti teadaoleva ruumalaga ja pesemislahuses analüüsitakse uuritava aine kogust. Kui adsorptsiooni katseanuma pinnal ei täheldata, tähistab kontsentratsiooni vähenemine abiootilist ebastabiilsust. Kui tuvastatakse adsorptsioon, tuleb katseanuma materjal ära vahetada. Siiski ei või käesoleva katsega katseanuma pinnale adsorbeerumise kohta saadud teavet otse ekstrapoleerida mulla/lahuse katsele. Mulla olemasolu mõjutab seda adsorptsiooni.
      Lisateavet uuritava aine püsivuse kohta on võimalik tuletada, määrates esialgse massitasakaalu aja jooksul. See tähendab, et uuritav aine määratakse vesifaasis, mullaproovides ja katseanuma seintel. Lisatud uuritava kemikaali massi ja vesifaasis oleva uuritava kemikaali masside ja mullast ning katseanuma seintelt saadud ekstraktide summa vaheline erinevus on võrdne alanenud ja/või lendunud ja/või mitteekstraheerunud massiga. Massitasakaalu määramiseks peab adsorptsiooni tasakaaluolek püstituma katse tegemise aja jooksul.
      Massitasakaal määratakse mõlema mulla ning ka iga mulla korral ühe muld/lahus suhte jaoks, mille korral on vaesustumine suurem kui 20 % ning eelistatavalt > 50 % tasakaaluolekuga võrreldes. Kui suhte leidmise katse lõpetatakse koos vesifaasist 48 tunni pärast võetud proovi analüüsimisega, eraldatakse faasid tsentrifuugimisega ja soovi korral filtreerides. Vesifaas regenereeritakse niipalju kui võimalik ja mullale lisatakse sobivat ekstrahanti (ekstraktsiooniteguriga vähemalt 95 %), et uuritavat ainet ekstraheerida. Soovitatakse vähemalt kahte järjestikust ekstraheerimist. Määratakse uuritava aine kogus mullas ja katseanuma ekstraktides ja arvutatakse massitasakaal (võrrand 10, „Andmed ja aruandlus”). Kui see on alla 90 %, käsitatakse uuritavat ainet ebapüsivana uuringuks kuluva aja jooksul. Siiski võib uuringut jätkata, võttes arvesse uuritava aine ebapüsivust; sellisel juhul soovitatakse põhiuuringus analüüsida mõlemat faasi.
      1.9.2.4.   2. tase – adsorptsioonikineetika ühel uuritava aine kontsentratsioonil
      Kasutatakse viit mulda, mis on valitud tabelist 1. Nende viie mulla hulka on soovitav lisada võimaluse korral mõned või kõik eeluuringus kasutatud mullad. Sellisel juhul ei tule 2. taset korrata eeluuringus kasutatud muldade puhul.
      Tasakaalu saavutamise aeg, mulla/lahuse suhe, mullaproovi mass, mullaga kokkupuutuva vesifaasi ruumala ja uuritava aine kontsentratsioon lahuses valitakse vastavalt eeluuringu tulemustele. Analüüs tuleks teha eelistatavalt siis, kui kokkupuutest on möödunud ligikaudu 2, 4, 6, 8 (võimaluse korral ka 10) ja 24 tundi; raputamise aega võib pikendada maksimaalselt 48 tunnini juhul, kui kemikaal tasakaalu saavutamiseks suhte leidmise tulemuste alusel on vaja rohkem aega. Siiski võib analüüsiaegadesse suhtuda paindlikult.
      Iga katse (üks muld ja üks lahus) tehakse vähemalt kask korda, et määrata kindlaks tulemuste varieerumine. Iga katse kohta tehakse üks pimekatse. See koosneb mullast ja 0,01 M CaCl2 lahusest ilma uuritava aineta ning selle mass ja ruumala peavad olema katses kasutatavatega identsed. Kontrollproovile, milles on ainult uuritav aine 0,01 M CaCl2 lahuses (ilma mullata), tehakse sama menetlus, et pakkuda kaitset ootamatuste vastu.
      Adsortpsiooniprotsent arvutatakse igal  ja/või  (vastavalt vajadusele) ja esitatakse graafiliselt ajateljel. Arvutatakse ka jaotustegur Kd tasakaaluolekus ning orgaanilise süsiniku suhtes normaliseeritud adsorptsioonitegur Koc (mittepolaarsete orgaaniliste kemikaalide puhul).
      Adsorptsioonikineetika uuringu tulemused
      Lineaarne Kd väärtus on üldiselt täpne sorptsioonilise käitumise kirjeldamiseks mullas (35, 78) ja väljendab kemikaalide loomulikku liikuvust mullas. Näiteks kemikaale, mille Kd ≤ 1 cm3 g-1, peetakse üldiselt kergesti liikuvateks. Sarnaselt on MacCall et al. (16) välja töötanud Koc väärtustel põhineva liikuvuse klassifikatsiooniskeemi. Lisaks on olemas leostumise klassifikatsiooniskeemid, mis põhinevad Koc ja DT-50 suhtel (30) (32, 79).
      Vastavalt veaanalüüsi uuringutele (61) ei ole samuti võimalik täpselt määrata Kd väärtusi, mis on alla 0,3 cm3 g–1 vesifaasi vähenenud kontsentratsiooni alusel, isegi siis, kui kasutatakse kõige soovitavamat (täpsuse seisukohast) mulla/lahuse suhet, st 1:1. Sellisel juhul soovitatakse analüüsida nii mulla kui ka lahuse faasi.
      Seoses eelnevate märkustega soovitatakse kemikaali adsorptsioonilist käitumist ja selle võimalikku liikuvust mullas käsitlevat uuringut jätkata, määrates nendes süsteemides Freundlichi adsorptsiooniisotermid, mille jaoks on võimalik Kd täpselt määrata, kasutades käesolevas katsemeetodis järgitud katseprotokolli. Täpne määramine on võimalik, kui Kd ja mulla/lahuse suhte korrutis on > 0,3, siis kui määramine põhineb kontsentratsiooni langusele vesifaasil (kaudne meetod), või > 0,1, siis kui analüüsitakse mõlemat faasi (otsene meetod) (61).
      1.9.2.5.   3. tase – adsorptsiooniisotermid ja desorptsioonikineetika/desorptsiooniisotermid
      1.9.2.5.1.   Adsorptsiooniisotermid
      
      Kasutatakse viit uuritava aine kontsentratsiooni, mis hõlmavad soovitavalt kahte suurusjärku; nende kontsentratsioonide valimisel tuleks võtta arvesse lahustuvust vees ja sellest tulenevaid vesilahuse tasakaalukontsentratsioone. Iga mulla kohta tuleks säilitada sama mulla/lahuse suhe kogu uuringu jooksul. Adsorptsioonikatse tehakse vastavalt eespool kirjeldatule, välja arvatud see, et vesifaasi analüüsitakse ainult üks kord ajahetkel, mil on vaja saavutada tasakaal, nagu on määratletud eespool 2. taseme juures. Määratakse lahuse tasakaalukontsentratsioonid ja arvutatakse adsorbeerunud kogus uuritava aine vähenemise alusel lahuses või otsese meetodi abil. Adsorbeerunud mass mulla ühikumassi kohta esitatakse uuritava aine tasakaalukontsentratsiooni funktsioonina (vt „Andmed ja aruandlus”).
      Adsorptsiooniisotermide katse tulemused
      Siiani esitatud matemaatilistest adsorptsioonimudelitest on Freundlichi isoterm üks kõige sagedamini kasutatav adsorptsiooniprotsesside kirjeldamise mudel. Üksikasjalikum teave adsorptsioonimudelite tõlgendamise ja olulisuse kohta on esitatud viidetes (41, 45, 80, 81, 82).
      
         Märkus. Tuleb märkida, et erinevate ainete KF väärtuste (Freundlichi adsorptsioonitegur) võrdlemine on võimalik ainult siis, kui need KF väärtused on väljendatud samades ühikutes (83).
      1.9.2.5.2.   Desorptsioonikineetika
      
      Käesoleva katse eesmärk on uurida, kas kemikaal on mullal adsorbeerunud pöörduvalt või mittepöörduvalt. See teave on oluline, sest desorptsiooniprotsessil on samuti tähtis osa kemikaali käitumises välitingimustes asuvas mullas. Lisaks on desorptsiooniandmed kasulikuks sisendiks leostumist kirjeldava arvutiga modelleerimise puhul ja lahustunud aineid sisaldava äravoolusimulatsiooni korral. Desorptsiooniuuringu puhul soovitatakse allpool kirjeldatud uuring teha iga süsteemi kohta, mille kohta oli eelneva adsorptsioonikineetika katse käigus võimalik määrata täpne Kd.
      Nagu adsorptsioonikineetika katse puhul, on ka desorptsioonikineetika katse tegemiseks kaks võimalust: a) paralleelmeetod ja b) jadameetod. Kasutatava meetodi valik jäetakse katse tegijale, kes peab arvestama kasutatava laboratooriumi võimalusi ja ressursse.
      
                  a)
               
               
                  Paralleelmeetod: iga mulla kohta, mis valitakse desorptsiooniuuringu tegemiseks, valmistatakse ette sama mulla/lahuse suhtega nii palju proove, kui mitmes ajavahemikus soovitakse desorptsioonikineetikat uurida. Eelistatavalt tuleks kasutada samasid ajavahemikke, mida kasutati adsorptsioonikineetika katses; siiski võib kogu aeg vajaduse korral pikeneda, et süsteem jõuaks desorptsiooni tasakaaluoleku püstitamiseni. Iga katse (üks muld, üks lahus) korral tehakse üks pimekatse. See koosneb mullast ja 0,01 M CaCl2 lahusest ilma uuritava aineta ja selle mass ja ruumala peavad olema identsed katses kasutatavatega. Kontrollproovile, milles on uuritav aine 0,01 M CaCl2 lahuses (ilma mullata), tehakse sama menetlus. Kõiki mulla ja lahuse segusid raputatakse kuni adsorptsiooni tasakaaluoleku püstitumiseni (nagu on määratletud eespool 2. taseme juures). Seejärel eraldatakse faasid tsentrifuugimise teel ja vesifaas kõrvaldatakse nii suures ulatuses kui võimalik. Kõrvaldatud lahuse ruumala asendatakse sama ruumala 0,01 M CaCl2 lahusega, milles ei ole uuritavat proovi, ja uusi segusid raputatakse uuesti. Esimese katseklaasi vesifaas regenereeritakse nii täielikult kui võimalik ja mõõdetakse hiljem, nt 2 tunni pärast, vastav teise katseklaasi oma pärast 4. tundi, kolmanda oma pärast 6. tundi jne, kuni desorptsiooni tasakaaluolek on püstitunud.
               
            
                  b)
               
               
                  Jadameetod: pärast adsorptsioonikineetika katset tsentrifuugitakse segu ja vesifaas kõrvaldatakse nii suures ulatuses kui võimalik. Kõrvaldatud lahuse ruumala asendatakse sama ruumala 0,01 M CaCl2 lahusega, milles ei ole uuritavat ainet. Uut segu raputatakse desorptsiooni tasakaaluoleku püstitumiseni. Selle aja jooksul tsentrifuugitakse segu kindlaksmääratud ajavahemike järel faaside eraldamiseks. Vesifaasist võetakse väike alikvoot, milles kohe analüüsitakse uuritavat ainet; seejärel jätkub katse esialgse seguga. Iga individuaalse alikvoodi ruumala peaks olema kogumahust alla 1 %. Segule lisatakse sama ruumala värsket 0,01 M CaCl2 lahust mulla/lahuse suhte säilitamiseks ja raputamine jätkub järgmise ajavahemikuni.
               
            Desortpsiooniprotsent arvutatakse igal ajahetkel () ja/või ajavahemikul () (vastavalt uuringu vajadustele) ja esitatakse graafiliselt ajateljel. Samuti arvutatakse Kdes desorptsioonitegur tasakaaluolekus. Kõik kasutatavad võrrandid on esitatud punktis „Andmed ja aruandlus” ja 5. liites.
      Desorptsioonikineetika katse tulemused
      Teljestikus desorptsiooniprotsent  ja adsorptsiooniprotsendi – aeg koostatud graafikute abil on võimalik hinnata adsorptsiooniprotsessi pööratavust. Isegi kui desorptsiooni tasakaaluoleku püstitumiseks kulub kaks korda rohkem aega kui adsorptsiooni tasakaaluoleku püstitumiseks ja kogu desorptsioon on üle 75 % adsorbeerunud kogusest, loetakse adsorptsiooni pöörduvaks.
      1.9.2.5.3.   Desorptsiooniisotermid
      
      Freundlichi desorptsiooniisotermid määratakse muldades, mida on kasutatud adsorptsiooniisotermide katses. Desorptsioonikatse tehakse punktis „Desorptsioonikineetika” kirjeldatud viisil, välja arvatud see, et vesifaasi analüüsitakse ainult üks kord desorptsiooni tasakaaluolekus. Arvutatakse desorbeerunud uuritava aine kogus. Mullale jääv adsorbeerunud uuritava aine kogus desorptsiooni tasakaaluolekus esitatakse uuritava aine tasakaalukontsentratsiooni funktsioonina lahuses (vt „Andmed ja aruandlus” ja 5. liidet).
      2.   ANDMED JA ARUANDLUS
      Analüüsi andmed esitatakse tabelina (vt 6. liidet). Esitatakse individuaalsed mõõtmised ja arvutatud keskmised. Adsorptsiooniisotermid esitatakse graafiliselt. Arvutused tehakse allpool kirjeldatud viisil.
      Uuringu tegemisel arvestatakse, et 1 cm3 vesilahuse mass on 1 g. Mulla/lahuse suhet võib väljendada nii massiprotsendi (w/w) kui ka mahuprotsendi (w/vol) ühikutes sama arvu abil.
      2.1.   ADSORPTSIOON
      Adsorptsiooni  määratletakse kui mullal adsorbeerunud aine protsenti katse alguses olemasolevast kogusest vastavalt katsetingimustele. Kui uuritav aine on püsiv ega adsorbeeru märkimisväärselt anuma seinal, arvutatakse  igal ajahetkel ti vastavalt järgmisele võrrandile:
      
                  
                     
               
               
                  (3)
               
            kus:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  adsorptsiooniprotsent ajahetkel ti (%);
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  mullal adsorbeerunud uuritava aine mass ajahetkel ti (μg);
               
            
                  m0
                  
               
               
                  =
               
               
                  uuritava aine mass katseklaasis katse alguses (μg).
               
            Üksikasjalik teave adsorptsiooniprotsendi  arvutamise kohta paralleel- ja jadameetodite kasutamise korral on esitatud 5. liites.
      Jaotustegur Kd on mullafaasis oleva aine sisalduse ja vesifaasis oleva aine massikontsentratsiooni vaheline suhe katsetingimustes, kui adsorptsiooni tasakaaluolek on püstitunud.
      
                  
                     (cm3 g-1)
               
                  (4)
               
            kus:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  mullal adsorbeerunud aine sisaldus adsorptsiooni tasakaaluolekus (μg g-1);
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  aine massikontsentratsioon vesifaasis adsorptsiooni tasakaaluolekus (μg cm-3). See kontsentratsioon määratakse analüütiliselt, võttes arvesse pimekatsetega saadud väärtusi;
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  mullal adsorbeerunud aine mass adsorptsiooni tasakaaluolekus (μg);
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  aine mass lahuses adsorptsiooni tasakaaluolekus (μg);
               
            
                  msoil
                  
               
               
                  =
               
               
                  mullafaasi kogus, väljendatud mulla kuivmassina (g);
               
            
                  V0
                  
               
               
                  =
               
               
                  mullaga kokkupuutuva vesifaasi esialgne ruumala (cm3).
               
            Aeq ja Kd vaheline suhe saadakse võrrandist:
      
                  
                     (cm3 g-1)
               
                  (5)
               
            kus:
      
                  Aeq
                  
               
               
                  =
               
               
                  adsorptsiooniprotsent adsorptsiooni tasakaaluolekus, %
               
            Orgaanilise süsiniku suhtes normaliseeritud adsorptsioonitegur Koc seob jaotusteguri Kd mullaproovi orgaanilise süsiniku sisaldusega:
      
                  
                     (cm3 g-1)
               
                  (6)
               
            kus:
      
                  %OC
               
               
                  =
               
               
                  orgaanilise süsiniku protsent mullaproovis (g-1).
               
            Koc-tegur esindab ühtset väärtust, mis iseloomustab peamiselt mittepolaarsete orgaaniliste kemikaalide jaotumist mullas või sademes oleva orgaanilise süsiniku ja vee vahel. Nende kemikaalide adsorptsioon viiakse korrelatsiooni tahke sorbeeriva orgaanilise aine sisaldusega (7); seega sõltuvad Koc väärtused humiinosakeste eriomadustest, mille sorptsioonivõime on sõltuvalt päritolust, tekkest jne märkimisväärselt erinev.
      2.1.1.   Adsorptsiooniisotermid
      Freundlichi adsorptsiooniisotermide võrrand seob adsorbeerunud uuritava aine koguse uuritava aine kogusega lahuses tasakaaluolekus (võrrand 8).
      
                  
                     (μg g-1)
               
                  (7)
               
            Võrrand (8) on Freundlichi adsorptsioonivõrrand:
      
                  
                     (μg g-1)
               
                  (8)
               
            või lineaarsena:
      
                  
                     
               
               
                  (9)
               
            kus:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  dimensiooni cm3 l/m g-1
                  
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  regressioonikonstant; l/n on tavaliselt vahemikus 0,7–1,0, mis näitab, et sorptsiooni puudutavad andmed on sageli natuke mittelineaarsed.
               
            Joonistatakse võrrandid 8 ja 9 ning arvutatakse  ja l/n väärtused regressioonanalüüsi abil, kasutades võrrandit 9. Arvutatakse ka logaritmvõrrandi korrelatsioonikordaja r2. Selliste graafikute näited esitatakse joonisel 2.
      
         
      2.1.2.   Massitasakaal
      Massitasakaalu (MB) määratletakse kui pärast adsorptsiooniuuringut analüütiliselt regenereeritava aineprotsendi suhet aine nominaalsesse kogusesse uuringu alguses.
      Andmete töötlemine erineb, kui lahusti lahustub vees täielikult. Vees lahustuva lahusti korral võib kohaldada punktis „Desorptsioon” kirjeldatud andmete töötlemist, et kindlaks määrata lahusti ekstraheerimise abil regenereeritud aine kogus. Kui lahusti veeslahustuvus on väiksem, tuleb regenereeritav kogus mõõta.
      Massitasakaal MB adsorptsiooni jaoks arvutatakse järgmiselt: eeldatakse, et tegur (mE) vastab mullast ja katseanuma seintelt orgaanilise lahusti abil ekstraheeritud uuritavate kemikaalide masside summale:
      
                  
                     
               
               
                  (10)
               
            kus:
      
                  MB
               
               
                  =
               
               
                  massitasakaal (%)
               
            
                  mE
                  
               
               
                  =
               
               
                  mullast ja katseanuma seintelt kahes etapis väljutatud uuritava aine kogumass (μg)
               
            
                  C0
                  
               
               
                  =
               
               
                  mullaga kokku puutuva katselahuse esialgne massikontsentratsioon (μg cm–3)
               
            
                  Vrec
                  
               
               
                  =
               
               
                  adsorptsiooni tasakaaluoleku järel regenereeritud supernatandi ruumala (cm–3).
               
            2.2.   DESORPTSIOON
      Desorptsiooni (D) määratletakse desorbeerunud uuritava aine protsendina eelnevalt adsorbeerunud aine koguse suhtes katsetingimustes:
      
                  
                     
               
               
                  (11)
               
            kus:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  desorptsiooniprotsent ajahetkel ti (%);
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  mullast desorbeerunud uuritava aine mass ajahetkel ti (μg);
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  mullal adsorbeerunud uuritava aine mass adsorptsiooni tasakaaluolekus (μg).
               
            Üksikasjalik teave, kuidas arvutada desorptsiooniprotsenti  paralleel- ja jadameetodite korral, on esitatud 5. liites.
      Ilmne desorptsioonitegur (Kdes) on katsetingimustes mullafaasi jäänud aine sisalduse ja vesilahuses desorbeerunud aine massikontsentratsiooni vaheline suhe, kui desorptsiooni tasakaaluolek on püstitunud:
      
                  
                     (cm3 g-1)
               
                  (12)
               
            kus:
      
                  Kdes
                  
               
               
                  =
               
               
                  desorptsioonitegur (cm3 g-1);
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  desorbeerunud uuritava aine kogumass desorptsiooni tasakaaluolekus (μg);
               
            
                  VT
                  
               
               
                  =
               
               
                  desorptsioonikineetika uuringu jooksul mullaga kokkupuutuva vesifaasi koguruumala (cm3).
               
            Juhised  arvutamiseks esitatakse 5. liites pealkirja „Desorptsioon” all.
      Märkus
      Kui eelnev adsorptsiooniuuring tehti paralleelmeetodiga, peetakse võrrandis (12) toodud ruumala VT sama suureks kui V0.
      2.2.1.   Desorptsiooniisotermid
      Freundlichi desorptsiooniisotermide võrrand seob mullale jääva adsorbeerunud uuritava aine sisalduse uuritava aine kontsentratsiooniga lahuses desorptsiooni tasakaaluolekus (võrrand 16).
      Iga katseklaasi kohta arvutatakse mullale jääv adsorbeerunud aine sisaldus desorptsiooni tasakaaluolekus järgmiselt:
      
                  
                      (µg g-1)
               
                  (13)
               
            
          määratletakse
      
                  
                     (μg)
               
                  (14)
               
            kus:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  mulda jääv adsorbeerunud uuritava aine sisaldus desorptsiooni tasakaaluolekus (μg g-1);
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  aine analüütiliselt määratud mass vesifaasis desorptsiooni tasakaaluolekus (μg);
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  osalisest ruumala asendusest tingitud ülejääva uuritava aine mass adsorptsiooni tasakaaluolekus (μg)
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  aine mass lahuses adsorptsiooni tasakaaluolekus (μg):
               
            
                  
                     
               
               
                  (15)
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  uuritava aine mõõtmiseks katseklaasist võetud lahuse ruumala desorptsiooni tasakaaluolekus (cm3);
               
            
                  VR
                  
               
               
                  =
               
               
                  adsorptsiooni tasakaaluoleku saavutamise järel katseklaasist eemaldatud supernatandi ruumala, mis asendatakse sama ruumala 0,01 M CaCl2 lahusega (cm3).
               
            Võrrand (16) on Freundlichi desorptsioonivõrrand:
      
                  
                     (μg g-1)
               
                  (16)
               
            või lineaarsena:
      
                  
                     
               
               
                  (17)
               
            Kus:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  Freundlichi desorptsioonitegur;
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  regressioonikonstant;
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  aine massikontsentratsioon vesifaasis desorptsiooni tasakaaluolekus (μg cm–3).
               
            Võib joonestada võrrandid 16 ja 17 ning arvutada  ja 1/n väärtused regressioonanalüüsi abil, kasutades võrrandit 17.
      Märkus
      Kui Freundlichi adsorptsiooni või desorptsiooni eksponent l/n on võrdne ühega, võrduvad siduvad Freundlichi adsorptsiooni ja desorptsiooni konstandid ( ja ) adsorptsiooni või desorptsiooni tasakaalukonstantidega (vastavalt Kd ja Kdes), ning Cs vs Caq graafikud on lineaarsed. Kui eksponendid ei võrdu ühega, on graafikud teljestikus Cs vs Caq mittelineaarsed ning adsorptsiooni ja desorptsioonikonstandid erinevad isotermide erinevates kohtades.
      2.2.2.   Katsearuanne
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet:
      
                  —
               
               
                  kasutatud mullaproovide täielik identifitseerimine, sealhulgas:
               
            
                  —
               
               
                  geograafiline viide asukohale (laiuskraad, pikkuskraad);
               
            
                  —
               
               
                  proovivõtu kuupäev;
               
            
                  —
               
               
                  kasutusviis (nt põllumajandusmaa, mets jne);
               
            
                  —
               
               
                  proovivõtu sügavus;
               
            
                  —
               
               
                  liiva/saviliiva/savi sisaldus;
               
            
                  —
               
               
                  pH väärtused (0,01 M CaCl2 lahuses);
               
            
                  —
               
               
                  orgaanilise süsiniku sisaldus;
               
            
                  —
               
               
                  orgaanilise ainese sisaldus;
               
            
                  —
               
               
                  lämmastiku sisaldus;
               
            
                  —
               
               
                  C/N suhe;
               
            
                  —
               
               
                  katioonide neelamismahutavus (mmol/kg);
               
            
                  —
               
               
                  kogu teave mullaproovide kogumise ja ladustamise kohta;
               
            
                  —
               
               
                  vajaduse korral kogu oluline teave uuritava aine adsorptsiooni/desorptsiooni tõlgendamiseks;
               
            
                  —
               
               
                  viited iga parameetri määratlemisel kasutatud meetoditele;
               
            
                  —
               
               
                  vajaduse korral teave uuritava aine kohta;
               
            
                  —
               
               
                  katsete temperatuur;
               
            
                  —
               
               
                  tsentrifuugimise tingimused;
               
            
                  —
               
               
                  uuritava aine analüüsimisel kasutatud menetlus;
               
            
                  —
               
               
                  uuritava aine põhilahuse ettevalmistamisel solubiliseeriva aine kasutamise põhjendus;
               
            
                  —
               
               
                  vajaduse korral arvutustes tehtud paranduste selgitamine;
               
            
                  —
               
               
                  andmed vastavalt tabeli vormile (6. liide) ja graafilisele esitlemisele;
               
            
                  —
               
               
                  kogu teave ja vaatlused, mis aitavad uuringu tulemusi tõlgendada.
               
            3.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  Kukowski H. and Brümmer G., (1987). Investigations on the Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02045, Part II.
               
            
                  2)
               
               
                  Fränzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987). Selection of Representative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02045, Part I.
               
            
                  3)
               
               
                  Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994.
               
            
                  4)
               
               
                  OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18–20 January 1995 (June 1995).
               
            
                  5)
               
               
                  US Environment Protection Agency: Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.
               
            
                  6)
               
               
                  US Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, OPPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996.
               
            
                  7)
               
               
                  ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Determining a Sorption Constant (Koc) for an Organic Chemical in Soil and Sediments.
               
            
                  8)
               
               
                  Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.
               
            
                  9)
               
               
                  Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Application for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
               
            
                  10)
               
               
                  Danish National Agency of Environmental Protection (October 1988): Criteria for registration of pesticides as especially dangerous to health or especially harmful to the environment.
               
            
                  11)
               
               
                  BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, Biological Research Centre for Agriculture and Forestry, Braunschweig, Germany.
               
            
                  12)
               
               
                  Calvet R., (1989), „Evaluation of adsorption coefficients and the prediction of the mobilities of pesticides in soils”, in Methodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).
               
            
                  13)
               
               
                  Calvet R., (1980), „Adsorption-Desorption Phenomena” in Interactions between herbicides and the soil. (R. J. Hance ed.), Academic Press, London, pp. 83–122.
               
            
                  14)
               
               
                  Hasset J. J., and Banwart W.L., (1989), „The sorption of nonpolar organics by soils and sediments” in Reactions and Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, pp. 31–44.
               
            
                  15)
               
               
                  van Genuchten M. Th., Davidson J. M., and Wierenga P. J., (1974), „An evaluation of kinetic and equilibrium equations for the prediction of pesticide movement through porous media”. Soil Sci. Soc. Am. Proc, Vol. 38(1), pp. 29–35.
               
            
                  16)
               
               
                  McCall P. J., Laskowski D. A., Swann R. L., and Dishburger H. J., (1981), „Measurement of sorption coefficients of organic chemicals and their use, in environmental fate analysis”, in Test Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC.
               
            
                  17)
               
               
                  Lambert S. M., Porter P. E., and Schieferrstein R. H., (1965), „Movement and sorption of chemicals applied to the soil”. Weeds, 13, pp. 185–190.
               
            
                  18)
               
               
                  Rhodes R. C, Belasco I. J., and Pease H. L., (1970) „Determination of mobility and adsorption of agrochemicals in soils”. J.Agric.Food Chem., 18, pp. 524–528.
               
            
                  19)
               
               
                  Russell M. H., (1995), „Recommended approaches to assess pesticide mobility in soil” in Environmental Behavior of Agrochemicals (ed. T. R. Roberts and P. C. Kearney). John Wiley & Sons Ltd.
               
            
                  20)
               
               
                  Esser H. O., Hemingway R. J., Klein W., Sharp D. B., Vonk J. W. and Holland P. T., (1988), „Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides”, IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, pp. 901–932.
               
            
                  21)
               
               
                  Guth J. A., Burkhard N., and D. O. Eberle, (1976), „Experimental models for studying the persistence of pesticides in soils”. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, pp. 137-157, BCPC, Surrey, UK.
               
            
                  22)
               
               
                  Furminge C. G. L., and Osgerby J. M., (1967), „Persistence of herbicides in soil”. J. Sci. Fd Agric, 18, pp. 269–273.
               
            
                  23)
               
               
                  Burkhard N., and Guth J. A., (1981), „Chemical hydrolysis of 2-Chloro-4,6-bis(alkylamino)-1,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption”. Pestic. Sci. 12, pp. 45–52.
               
            
                  24)
               
               
                  Guth J. A., Gerber H. R., and Schlaepfer T., (1977), „Effect of adsorption, movement and persistence on the biological availability of soil-applied pesticides”. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, pp. 961–971.
               
            
                  25)
               
               
                  Osgerby J. M., (1973), „Process affecting herbicide action in soil”. Pestic. Sci., 4, pp. 247–258.
               
            
                  26)
               
               
                  Guth J. A., (1972), „Adsorptions- und Einwascheverhalten von Pflanzenschutzmitteln in Böden”. Schr. Reihe Ver. Wass. -Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, pp. 143–154.
               
            
                  27)
               
               
                  Hamaker J. W., (1975), „The interpretation of soil leaching experiments”, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V.H. freed), pp. 135-172, Plenum Press, NY.
               
            
                  28)
               
               
                  Helling C. S., (1971), „Pesticide mobility in soils”. Soil Sci. Soc. Amer. Proc, 35, pp. 732–210.
               
            
                  29)
               
               
                  Hamaker J. W., (1972), „Diffusion and volatilization” in Organic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring and J. W. Hamaker eds), Vol. I, pp. 49–143.
               
            
                  30)
               
               
                  Burkhard N. and Guth J. A., (1981), „Rate of volatilisation of pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results with those determined in a laboratory model system”. Pestic. Sci. 12, pp. 37–44.
               
            
                  31)
               
               
                  Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R.F., and Enfield C.G., (1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, pp. 297-325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.
               
            
                  32)
               
               
                  Gustafson D. I., (1989), „Groundwater ubiquity score: a simple method for assessing pesticide leachability”. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), pp. 339–357.
               
            
                  33)
               
               
                  Leistra M., and Dekkers W. A., (1976). „Computed effects of adsorption kinetics on pesticide movement in soils”. J. of Soil Sci., 28, pp. 340–350.
               
            
                  34)
               
               
                  Bromilov R. H., and Leistra M., (1980), „Measured and simulated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils”. Pest. Sci., 11, pp. 389–395.
               
            
                  35)
               
               
                  Green R. E., and Karickoff S. W., (1990), „Sorption estimates for modeling”, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., Book Series no. 2, pp. 80–101,
               
            
                  36)
               
               
                  Lambert S. M., (1967), „Functional relationship between sorption in soil and chemical structure”. J. Agri. Food Chem., 15, pp. 572–576.
               
            
                  37)
               
               
                  Hance R. J., (1969), „An empirical relationship between chemical structure and the sorption of some herbicides by soils”. J. Agri. Food Chem., 17, pp. 667–668.
               
            
                  38)
               
               
                  Briggs G. G. (1969), „Molecular structure of herbicides and their sorption by soils”. Nature, 223, 1288.
               
            
                  39)
               
               
                  Briggs G. G. (1981). „Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor”. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050–1059.
               
            
                  40)
               
               
                  Sabljic A., (1984), „Predictions of the nature and strength of soil sorption of organic polutance by molecular topology”. J. Agric. Food Chem., 32, pp. 243–246.
               
            
                  41)
               
               
                  Bailey G. W., and White J. L., (1970), „Factors influencing the adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil”. Residue Rev., 32, pp. 29–92.
               
            
                  42)
               
               
                  Bailey G. W., J. L. White and Y. Romberg., (1968), „Adsorption of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate”. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 32 pp. 222–234.
               
            
                  43)
               
               
                  Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. Chemosphere 10, pp. 833–846.
               
            
                  44)
               
               
                  Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), „Soil Sorption of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners”. Environ. Toxicol. Safety 21, pp. 1–17.
               
            
                  45)
               
               
                  Hamaker J. W., and Thompson J. M., (1972), „Adsorption in organic chemicals” in Organic Chemicals in the Soil Environment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, pp. 49–143.
               
            
                  46)
               
               
                  Deli J., and Warren G. F., 1971, „Adsorption, desorption and leaching of diphenamid in soils”. Weed Sci. 19: pp. 67–69.
               
            
                  47)
               
               
                  Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J. M. and Santelmann, (1975), „Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils”. Weed Science, Vol. 23, pp. 454–457.
               
            
                  48)
               
               
                  Haues M. H. B., Stacey M., and Thompson J. M., (1968), „Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic preparations” in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p.75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.
               
            
                  49)
               
               
                  Pionke H. B., and Deangelis R. J., (1980), „Methods for distributing pesticide loss in field runoff between the solution and adsorbed phase”, CREAMS, in A Field Scale Model for Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Management Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report.
               
            
                  50)
               
               
                  ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality – General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition (1994).
               
            
                  51)
               
               
                  Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition.
               
            
                  52)
               
               
                  Black, Evans D. D., White J. L., Ensminger L. E., and Clark F. E., eds. „Methods of Soil Analysis”, Vol 1 and 2, American Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.
               
            
                  53)
               
               
                  ISO/DIS 10381-1 Soil Quality – Sampling – Part 1: Guidance on the design of sampling programmes.
               
            
                  54)
               
               
                  ISO/DIS 10381-2 Soil Quality – Sampling – Part 2: Guidance on sampling techniques.
               
            
                  55)
               
               
                  ISO/DIS 10381-3 Soil Quality – Sampling – Part 3: Guidance on safety of sampling.
               
            
                  56)
               
               
                  ISO/DIS 10381-4 Soil Quality – Sampling – Part 4: Guidance on the investigation of natural and cultivated soils.
               
            
                  57)
               
               
                  ISO/DIS 10381-5 Soil Quality – Sampling – Part 5: Guidance on the investigation of soil contamination of urban and industrial sites.
               
            
                  58)
               
               
                  ISO 10381-6, 1993: Soil Quality – Sampling – Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
               
            
                  59)
               
               
                  Green R. E., and Yamane V. K., (1970), „Precision in pesticide adsorption measurements”. Soil Sci. Am. Proc, 34, pp. 353–354.
               
            
                  60)
               
               
                  Grover R., and Hance R. J. (1970), „Effect of ratio of soil to water on adsorption of linuron and atrazine”. Soil Sci., pp. 109–138.
               
            
                  61)
               
               
                  Boesten, J. J. T. I, „Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in pesticide/soil system”. Pest. Sci. 1990, 30, pp. 31–41.
               
            
                  62)
               
               
                  Boesten, J. J. T. I. „Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in relation to OECD guideline 106”. Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26-29 April 1994.
               
            
                  63)
               
               
                  Bastide J., Cantier J. M., et Coste C, (1980), „Comportement de substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure chimique”. Weed Res. 21, pp. 227–231.
               
            
                  64)
               
               
                  Brown D. S., and Flagg E. W., (1981), „Empirical prediction of organic pollutants sorption in natural sediments”. J. Environ.Qual., 10(3), pp. 382–386.
               
            
                  65)
               
               
                  Chiou C. T., Porter P. E., and Schmedding D. W., (1983), „Partition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water”. Environ. Sci. Technol., 17(4), pp. 227–231.
               
            
                  66)
               
               
                  Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), „Sorption of organic substances by soils and sediments”. J. Environm. Sci. Health, B19 (3), pp. 297–312.
               
            
                  67)
               
               
                  Vowles P. D., and Mantoura R. F. C, (1987), „Sediment-water partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons”. Chemosphere, 16(1), pp. 109–116.
               
            
                  68)
               
               
                  Lyman W. J., Reehl W. F.and Rosenblatt D. H. (1990). Handbook of Chemical Property Estimation Methods. Environmental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC.
               
            
                  69)
               
               
                  Keniga E. E., and Goring, C. A. I. (1980). „Relationship between water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and concentration of chemicals in the biota” in Aquatic Toxicology (eds J.G. Eaton, et al), pp.78-115, ASTM STP 707, Philadelphia.
               
            
                  70)
               
               
                  Chiou C. T., Peters L. J., and Freed V. H., (1979), „A physical concept of soil-water equilibria for non-ionic organic compounds”. Science, Vol. 206, pp. 831–832.
               
            
                  71)
               
               
                  Hassett J. J., Banwart W. I., Wood S. G., and Means J. C, (1981), „Sorption of/-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption”. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, pp. 38–42.
               
            
                  72)
               
               
                  Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. Chemosphere, Vol. 10(8), pp. 833–846.
               
            
                  73)
               
               
                  Moreale A., van Bladel R., (1981), „Adsorption de 13 herbicides et insecticides par le sol. Relation solubilite-reactivite”. Revue de l'Agric., 34 (4), pp. 319–322.
               
            
                  74)
               
               
                  Müller M., Kördel W. (1996), „Comparison of screening methods for the determination/estimation of adsorption coefficients on soil”. Chemosphere, 32(12), pp. 2493–2504.
               
            
                  75)
               
               
                  Kördel W., Kotthoff G., Müller M. (1995), „HPLC – screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil – results of a ring test”. Chemosphere 30 (7), pp. 1373–1384.
               
            
                  76)
               
               
                  Kördel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), „HPLC – screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil – comparison of different stationary phases”. Chemosphere 27 (12), pp. 2341–2352.
               
            
                  77)
               
               
                  Hance, R. J., (1967), „The Speed of Attainment of Sorption Equilibria in Some Systems Involving Herbicides”. Weed Research, Vol. 7, pp. 29–36.
               
            
                  78)
               
               
                  Koskinen W. C, and Harper S. S., (1990), „The retention processes: mechanisms” in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.
               
            
                  79)
               
               
                  Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R. F., and Enfield C. G. (1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, pp.297-325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.
               
            
                  80)
               
               
                  Giles C. H., (1970), „Interpretation and use of sorption isotherms” in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37, pp. 14–32.
               
            
                  81)
               
               
                  Giles, C. H.; McEwan J. H.; Nakhwa, S.N. and Smith, D, (1960), „Studies in adsorption: XL A system of classification of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of soils”. J. Chem. Soc, pp. 3973–93.
               
            
                  82)
               
               
                  Calvet R., Terce M., and Arvien J. C, (1980), „Adsorption des pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caracteristiques generates de l'adsorption”. Ann. Agron. 31: pp. 239–251.
               
            
                  83)
               
               
                  Bedbur E., (1996), „Anomalies in the Freundlich equation”, Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environment, 13-15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK.
               
            
                  84)
               
               
                  Guth, J. A., (1985), „Adsorption/desorption”, in Joint International Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment, July 1-3, Canterbury, UK.
               
            
                  85)
               
               
                  Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
               
            
         1. liide
         Katse skeem
         
            
      
      
         2. liide
         ANALÜÜSIMEETODI TÄPSUSE JA KONTSENTRATSIOONIMUUTUSE MÕJU ADSORPTSIOONITULEMUSTE TÄPSUSELE
         
                     Amount of soil
                  
                  
                     msoil
                     
                  
                  
                     = 10 g
                  
               
                     Volume of solution
                  
                  
                     V0
                     
                  
                  
                     = 100 cm3
                     
                  
               
            
         
                      
                  
                  FOR-L_2008142ET.01044401.notes.0182.xml.jpg(μg)
                  
                  FOR-L_2008142ET.01044401.notes.0183.xml.jpg(μg cm-3)
                  
                  
                     R
                  
                  FOR-L_2008142ET.01044401.notes.0184.xml.jpg(μg)
                  
                  FOR-L_2008142ET.01044401.notes.0185.xml.jpg(μg g-1)
                  
                  
                     R‡
                  
                  
                     Kd*
                  
                  
                     R‡
                  
               
                      
                  
                  
                     
                        FOR A = 9 %
                     
                  
               
                     m0 = 110 μg or C0=1,100 μg/cm3
                     
                  
                  
                     100
                  
                  
                     1,000
                  
                  
                     true value
                  
                  
                     10
                  
                  
                     1,00
                  
                  
                     true value
                  
                  
                     1
                  
                  
                      
                  
               
                     101
                  
                  
                     1,010
                  
                  
                     1 %
                  
                  
                     9
                  
                  
                     0,90
                  
                  
                     10 %
                  
                  
                     0,891
                  
                  
                     10,9 %
                  
               
                     105
                  
                  
                     1,050
                  
                  
                     5 %
                  
                  
                     5
                  
                  
                     0,50
                  
                  
                     50 %
                  
                  
                     0,476
                  
                  
                     52,4 %
                  
               
                     109
                  
                  
                     1,090
                  
                  
                     9 %
                  
                  
                     1
                  
                  
                     0,10
                  
                  
                     90 %
                  
                  
                     0,092
                  
                  
                     90,8 %
                  
               
                      
                  
                  
                     
                        FOR A = 55 %
                     
                  
               
                     m0= 110 μg or C0=1,100μg/cm3
                     
                  
                  
                     50,0
                  
                  
                     0,500
                  
                  
                     true value
                  
                  
                     60,0
                  
                  
                     6,00
                  
                  
                     true value
                  
                  
                     12,00
                  
                  
                      
                  
               
                     50,5
                  
                  
                     0,505
                  
                  
                     1 %
                  
                  
                     59,5
                  
                  
                     5,95
                  
                  
                     0,8 %
                  
                  
                     11,78
                  
                  
                     1,8 %
                  
               
                     52,5
                  
                  
                     0,525
                  
                  
                     5 %
                  
                  
                     57,5
                  
                  
                     5,75
                  
                  
                     4,0 %
                  
                  
                     10,95
                  
                  
                     8,8 %
                  
               
                     55,0
                  
                  
                     0,550
                  
                  
                     10 %
                  
                  
                     55,0
                  
                  
                     5,50
                  
                  
                     8,3 %
                  
                  
                     10,00
                  
                  
                     16,7 %
                  
               
                      
                  
                  
                     
                        FOR A = 99 %
                     
                  
               
                     m0 = 110 μg or C0=1,100 μg/cm3
                     
                  
                  
                     1,100
                  
                  
                     0,011
                  
                  
                     true value
                  
                  
                     108,9
                  
                  
                     10,89
                  
                  
                     true value
                  
                  
                     990
                  
                  
                      
                  
               
                     1,111
                  
                  
                     0,01111
                  
                  
                     1 %
                  
                  
                     108,889
                  
                  
                     10,8889
                  
                  
                     0,01 %
                  
                  
                     980
                  
                  
                     1,0 %
                  
               
                     1,155
                  
                  
                     0,01155
                  
                  
                     5 %
                  
                  
                     108,845
                  
                  
                     10,8845
                  
                  
                     0,05 %
                  
                  
                     942
                  
                  
                     4,8 %
                  
               
                     1,21
                  
                  
                     0,0121
                  
                  
                     10 %
                  
                  
                     108,790
                  
                  
                     10,8790
                  
                  
                     0,10 %
                  
                  
                     899
                  
                  
                     9,2 %
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     
                        
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     mass of the test substance in the soil phase at equilibrium, μg;
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     mass of the test substance in the aqueous phase at equilibrium, μg;
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     content of the test substance in the soil phase at equilibrium, μg g-1;
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     mass concentration of the test substance in the aqueous phase at equilibrium, μg cm-3;
                  
               
                     R
                  
                  
                     =
                  
                  
                     analytical error in the determination of the ;
                  
               
                     R‡
                  
                  
                     =
                  
                  
                     calculated error due to the analytical error R.
                  
               
      
         3. Liide
         Kd HINDAMISE TEHNIKAD
         
                     1.
                  
                  
                     Hindamistehnikad võimaldavad ennustada Kd väärtusi, mis põhinevad korrelatsioonil, näiteks Pow väärtustega (12, 39, 63–68), veeslahustuvust puudutavate andmetega (12, 19, 21, 39, 68-73) või polaarsust puudutavate andmetega, mis on saadud pöördfaasilise HPLC kasutamisel (74-76). Tabelites 1 ja 2 esitatud Koc ja Kom väärtused on arvutatud nendest võrranditest ja seega Kd kaudselt võrranditest:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 
                                    
                              
                           
               
                     2.
                  
                  
                     Nende korrelatsioonide kontseptsioon põhineb kahel eeldusel: 1) aine adsorptsiooni mõjutab peamiselt just mullas olev orgaaniline aines; ja 2) kaasatud interaktsioonid on peamiselt mittepolaarsed. Seetõttu 1) ei saa neid korrelatsioone kasutada täielikult või teatud ulatuses polaarsete ainete puhul ja 2) juhtudel, kui mullas esineva orgaanilise ainese sisaldus on väga väike (12). Lisaks, kuigi on avastatud rahuldavad korrelatsioonid Pow ja adsorptsiooni vahel (19), ei saa sama öelda veeslahustuvuse ja adsorptsiooni ulatuse vahelise suhte kohta (19, 21); siiani on sellealased uuringud väga vasturääkivad.
                  
               
                     3.
                  
                  
                     Mõned näited adsorptsiooniteguri ja oktanooli-vee jaotusteguri vahelisest korrelatsioonist ja suhtest vees lahustuvusse on esitatud vastavalt tabelites 1 ja 2.
                     Tabel 1
                     Näited adsorptsiooni jaotusteguri ja oktanooli-vee jaotusteguri vahelisest korrelatsioonist; rohkem näiteid viidetes 12, 68.
                     
                                 Ained
                              
                              
                                 Korrelatsioonid
                              
                              
                                 Autorid
                              
                           
                                 Asendatud karbamiidid
                              
                              
                                 log Kom = 0,69 + 0,52 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Briggs (1981) (39)
                              
                           
                                 Aromaatsed klooritud ained
                              
                              
                                 log Koc = -0,779 + 0,904 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Chiou et al. (1983) (65)
                              
                           
                                 Erinevad pestitsiidid
                              
                              
                                 log Kom = 4,4 + 0,72 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Gerstl ja Mingelgrin (1984) (66)
                              
                           
                                 Aromaatsed süsivesinikud
                              
                              
                                 log Koc = -2,53 + 1,15 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Vowles ja Mantoura (1987) (67)
                              
                           
                        
                     Tabel 2
                     Näited adsorptsiooni jaotusteguri ja vees lahustuvuse vahelisest korrelatsioonist; rohkem näiteid viidetes 68, 69.
                     
                                 Ühendid
                              
                              
                                 Korrelatsioonid
                              
                              
                                 Autorid
                              
                           
                                 Erinevad pestitsiidid
                              
                              
                                 log Kom = 3,8 – 0,561 log Sw
                                 
                              
                              
                                 Gerstl ja Mingelgrin (1984) (66)
                              
                           
                                 Alifaatsed, aromaatsed klooritud ained
                              
                              
                                 log Kom = (4,040 +/– 0,038) – (0,557+/– 0,012) log Sw
                                 
                              
                              
                                 Chiou et al. (1979) (70)
                              
                           
                                 α-naftool
                              
                              
                                 log Koc = 4,273 – 0,686 log Sw
                                 
                              
                              
                                 Hasset et al. (1981) (71)
                              
                           
                                 Tsüklilised, alifaatsed aromaatsed ained
                              
                              
                                 log Koc = -1,405 – 0,921 log Sw-0,00953 (mp-25)
                              
                              
                                 Karickhoff (1981) (72)
                              
                           
                                 Erinevad ühendid
                              
                              
                                 log Kom = 2,75 – 0,45 log Sw
                                 
                              
                              
                                 Moreale van Blade (1982) (73)
                              
                           
               
      
         4. liide
         ARVUTUSED TSENTRIFUUGIMISTINGIMUSTE MÄÄRAMISEKS
         
                     1.
                  
                  
                     Tsentrifuugimisaeg saadakse vastavalt järgmisele valemile, eeldades et osakesed on kerakujulised:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (1)
                              
                           Lihtsustamise eesmärgil kirjeldatakse kõiki parameetreid SI-välistes ühikutes (g, cm).
                     kus:
                     
                                 ω
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 pöörlemissagedus (= 2 π rpm/60), rad s–1;
                              
                           
                                 rpm
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 pööret minutis;
                              
                           
                                 η
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 lahuse viskoossus, g s–1 cm–1;
                              
                           
                                 rp
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 osakese raadius, cm;
                              
                           
                                 ρs
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 mulla tihedus, g cm–3;
                              
                           
                                 ρaq
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 lahuse tihedus, g cm–3;
                              
                           
                                 Rt
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 vahemaa tsentrifuugi rootori keskkohast tsentrifuugitorus oleva lahuse pinnani, cm;
                              
                           
                                 Rb
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 vahemaa tsentrifuugi rootori keskkohast tsentrifuugitoru põhjani, cm;
                              
                           
                                 Rb – Rt
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 mulla/lahuse segu pikkus tsentrifuugitorus, cm.
                              
                           Üldiselt kasutatakse täieliku eraldumise tagamiseks arvutatud aegade kahekordistamist.
                  
               
                     2.
                  
                  
                     Võrrandit 1 on võimalik veel lihtsustada, kui oletada, et lahuse viskoossus (η) ja tihedus (ρaq) on võrdsed vee viskoossuse ja tihedusega temperatuuril 25 oC; seega, η = 8,95 × 10-3 g s-1 cm-1 ja ρaq = 1,0 g, cm-3.
                     Seega saadakse tsentrifuugimisaeg võrrandiga 2:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (2)
                              
                           
               
                     3.
                  
                  
                     Võrrandist 2 ilmneb, et tsentrifuugimistingimuste, st aja (t) ja kiiruse (rpm) määratlemisel on tähtsad kaks parameetrit, et saavutada konkreetse suurusega osakeste jagunemine (meie puhul 0,1 μm raadiusega): 1) mulla tihedus ja 2) segu pikkus tsentrifuugitorus (Rb–Rt), st vahemaa, mille mullaosake läbib lahuse pinnalt toru põhjani; on selge, et fikseeritud ruumala korral sõltub segu pikkus torus toru raadiuse ruudust.
                  
               
                     4.
                  
                  
                     Joonisel 1 on näidatud, kuidas tsentrifuugimise kiiruse (rpm) funktsioonina esitatud tsentrifuugimise aeg (t) varieerub erinevate mulla tiheduste (ρs) (joonis 1a) ja tsentrifuugitorus oleva segu erinevate pikkuste vahel (joonis 1b). Joonisel 1a on selgesti näha mulla tiheduse mõju; näiteks klassikalise 3000 rpm tsentrifuugimisel on tsentrifuugimise aeg ligikaudu 240 minutit, kui mulla tihedus on 1,2 g/cm3, ja vaid 50 minutit, kui tihedus on 2,0 g/cm3. Samamoodi näitab joonis 1b, et klassikalise 3000 rpm tsentrifuugimisel on tsentrifuugimise aeg ligikaudu 50 minutit, kui segu pikkus on 10 cm, ja vaid 7 minutit, kui pikkus on 1 cm. Siiski on tähtis leida optimaalne suhe võimalikult väikest pikkust nõudva tsentrifuugimise ja pärast tsentrifuugimist katse tegija poolt võimalikult lihtsalt faaside eraldamise vahel.
                  
               
                     5.
                  
                  
                     Lisaks, kui määratakse katsetingimused mulla/lahuse faaside eraldamiseks, on tähtis arvestada võimaliku kolmanda „pseudofaasi”, kolloidide olemasolu. Nendel osakestel, mille suurus on alla 0,2 μm, võib olla tähtis mõju kogu aine adsorptsioonimehhanismile mulla suspensioonis. Kui tsentrifuugitakse eespool kirjeldatud viisil, jäävad kolloidid vesifaasi ja neid analüüsitakse koos vesifaasiga. Seega jääb teave nende mõju kohta saamata.
                     Kui uuringut tegeval laboratooriumil on ultratsentrifuugimise või ultrafiltreerimise võimalused, võib aine adsorptsiooni/desorptsiooni mullas uurida põhjalikumalt, kaasa arvatud teave aine adsorptsiooni kohta kolloididele. Sellisel juhul tuleks kasutada ultratsentrifuugimist 60 000 rpm/min või ultrafiltreerimist, kui filtri poorsus on 100 000 daltonit, et eraldada järgmised kolm faasi: muld, kolloidid ja lahus. Katsearuannet tuleks samuti vastavalt muuta, et kõigis kolmes faasis ainet analüüsida.
                  
               Joonis 1a.
         
            
         Joonis 1b.
         
            
      
      
         5. liide
         ADSORPTSIOONI A ( %) JA DESORPTSIOONI D ( %) ARVUTAMINE
         Menetluse ajagraafik on järgmine:
         
            
         Kõikide arvutuste puhul eeldatakse, et uuritav aine on püsiv ega adsorbeeru märkimisväärselt konteineri seintele.
         ADSORPTSIOON A (A %)
         a)   Paralleelmeetod
         Adsorptsiooniprotsent arvutatakse iga katseklaasi (i) kohta igal ajahetkel (tj) vastavalt võrrandile:
         
                     
                         (%)
                  
                     (1)
                  
               Selle võrrandi tegurid võib arvutada järgmiselt:
         
                     m0 = C0 · V0 (μg)
                  
                  
                     (2)
                  
               
                     
                         (μg)
                  
                     (3)
                  
               kus:
         
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     Ati
                     
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     uuritava aine mass mullas ajahetkel ti, kui analüüs tehakse (μg);
                  
               
                     m0
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     uuritava aine mass katseklaasis uuringu alguses (μg);
                  
               
                     C0
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     mullaga kokkupuutuva katselahuse esialgne massikontsentratsioon (μg cm-3);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     aine massikontsentratsioon vesifaasis analüüsi tegemise ajahetkel ti (μg cm-3); see kontsentratsioon määratakse analüütiliselt, võttes arvesse pimekatsetega saadud väärtused;
                  
               
                     V0
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     mullaga kokkupuutuva uuritava lahuse esialgne ruumala (cm3).
                  
               Adsorptsiooniprotsendi väärtused Ati  või  esitatakse aja funktsioonina ja määratakse aeg, mis kulus sorptsioonitasakaaluoleku püstitumiseks. Näited sellistest graafikutest esitatakse vastavalt joonisel 1 ja 2.
         
            
         
            
         b)   Jadameetod
         Järgmistes võrrandites võetakse arvesse, et adsorptsioonimenetluseks mõõdetakse uuritavat ainet väikestes vesifaasi alikvootides määratletud ajavahemikel.
         
                     —
                  
                  
                     Iga ajavahemiku jooksul arvutatakse mullal adsorbeerunud aine kogus järgmiselt:
                     
                                 —
                              
                              
                                 esimese ajavahemiku puhul Δt1 = t1 – t0
                                 
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             4
                                          
                                       
                           
                                 —
                              
                              
                                 teise ajavahemiku puhul Δt2 = t2 – t1
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (5)
                                          
                                       
                           
                                 —
                              
                              
                                 kolmanda ajavahemiku puhul Δt3 = t3 – t2
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (6)
                                          
                                       
                           
                                 —
                              
                              
                                 n-nda ajavahemiku puhul Δtn = tn – tn-1
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (7)
                                          
                                       
                           
               
                     —
                  
                  
                     Adsorptsiooniprotsent igas ajavahemikus, , arvutatakse järgmise võrrandi abil:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (8)
                              
                           samal ajal kui desorptsiooniprotsent  ajahetkel ti saadakse võrrandist:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (9)
                              
                           Adsorptsiooni väärtused  või  (vastavalt uuringu vajadustele) esitatakse aja funktsioonina ja määratakse sorptsiooni tasakaaluoleku püstitumiseks kuluv aeg.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Tasakaaluoleku püstitumise hetkel teq
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 mullal adsorbeerunud uuritava aine mass on:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (10)
                                          
                                       
                           
                                 —
                              
                              
                                 uuritava aine mass lahuses on:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (11)
                                          
                                       
                           
                                 —
                              
                              
                                 ja adsorptsiooniprotsent tasakaaluolekus on:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (12)
                                          
                                       
                           
               Eespool kasutatud parameetrid määratletakse järgmiselt:
         
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     mullal adsorbeerunud aine mass vastavalt ajavahemike Δt1, Δt2, ..., Δtn jooksul (μg);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     vastavalt ajahetkedel t1, t2,... , tn (μg)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     mullal adsorbeerunud aine mass adsorptsiooni tasakaaluolekus (μg);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     aine mass lahuses adsorptsiooni tasakaaluolekus (μg);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     alikvoodi ruumala, milles uuritavat ainet mõõdetakse (cm3);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     adsorptsiooniprotsent, mis vastab ajavahemikule Δti ( %);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     adsorptsiooniprotsent adsorptsiooni tasakaaluolekus ( %).
                  
               DESORPTSIOON D ( %)
         Ajahetke t0, kui desorptsioonikineetika katse algab, peetakse selleks hetkeks, kui uuritava aine maksimaalne eemaldatud ruumala (pärast adsorptsiooni tasakaaluoleku püstitumist) asendatakse sama ruumala 0,01 M CaCl2 lahusega.
         a)   Paralleelmeetod
         Ajahetkel ti mõõdetakse uuritava aine mass katseklaasist i () võetud vesifaasis ja desorbeerunud uuritava aine mass arvutatakse vastavalt võrrandile:
         
                     
                        
                  
                  
                     (13)
                  
               Desorptsiooni tasakaaluolekus ti = teq ja seega  = 
         Ajavahemiku (Δti) jooksul desorbeerunud uuritava aine mass saadakse võrrandist:
         
                     
                        
                  
                  
                     (14)
                  
               Desorptsiooniprotsent arvutatakse:
         ajahetkel ti võrrandist:
         
                     
                        
                  
                  
                     (15)
                  
               ja ajavahemikul (Δti) võrrandist:
         
                     
                        
                  
                  
                     (16)
                  
               kus:
         
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     desorptsiooniprotsent ajahetkel ti ( %);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     desorptsiooniprotsent, mis vastab ajavahemikule Δtj ( %);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     desorbeerunud uuritava aine mass ajahetkel ti (μg);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     ajavahemikul Δtj desorbeerunud uuritava aine mass (μg);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     ajahetkel ti analüütiliselt määratud uuritava aine mass lahuse ruumalas , mis võetakse analüüsi jaoks (μg);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     osalisest ruumala asendusest tingitud ülejääva uuritava aine mass adsorptsiooni tasakaaluolekus (μg);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     (17)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     uuritava aine mass lahuses adsorptsiooni tasakaaluolekus (μg);
                  
               
                     VR
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     adsorptsiooni tasakaaluoleku püstitumise järel katseklaasist eemaldatud supernatandi ruumala, mis asendatakse sama ruumala 0,01 M CaCl2 lahusega (cm3);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     uuritava aine mõõtmiseks katseklaasist (i) võetud lahuse ruumala desorptsioonikineetika katses (cm3).
                  
               Desorptsiooni väärtused  või  (vastavalt uuringu vajadustele) esitatakse aja funktsioonina ja määratakse desorptsiooni tasakaaluoleku püstitumiseks kuluv aeg.
         b)   Jadameetod
         Järgmistes võrrandites võetakse arvesse, et eelnevaks adsorptsioonimenetlus viidi läbi, määrates uuritava aine väikestes vesifaasi alikvootides  (jadameetod punktis 1.9 „Katse käik”). Eeldatakse, et a) pärast adsorptsioonikineetika katset katseklaasist eemaldatud supernatandi ruumala asendati sama ruumala 0,01 M CaCl2 lahusega (vR) ja b) desorptsioonikineetika katse jooksul mullaga kokkupuutuva vesifaasi koguruumala (vT) püsib konstantsena ja esitatakse võrrandiga:
         
                     
                        
                  
                  
                     (18)
                  
               Ajahetkel ti:
         
                     —
                  
                  
                     määratakse uuritava aine mass väikeses alikvoodis  ja arvutatakse desorbeerunud mass vastavalt võrrandile:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (19)
                              
                           
               
                     —
                  
                  
                     desorptsiooni tasakaaluolekus, ti = teq, seega = 
                  
               
                     —
                  
                  
                     desorptsiooniprotsent  arvutatakse järgmisest võrrandist:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (20)
                              
                           
               Ajavahemikus (Δti)
         Iga ajavahemiku jooksul arvutatakse desorbeerunud aine kogus järgmiselt:
         
                     —
                  
                  
                     esimese ajavahemiku puhul Δt1 = t1 – t0 ja
                     
                                 
                                     ja 
                                    
                              
                              
                                 (21)
                              
                           
               
                     —
                  
                  
                     ajavahemiku n puhul Δtn = tn – tn-1
                     
                     
                                 
                                     ja
                                 
                                    
                              
                              
                                 (22)
                              
                           
               
                     —
                  
                  
                     teise ajavahemiku puhul Δt2 = t2 – t1 ja
                     
                                 
                                     ja
                                 
                                    
                              
                              
                                 (23)
                              
                           
               Lõpuks arvutatakse desorptsiooniprotsent igas ajavahemikus, , kasutades järgmist võrrandit:
         
                     
                        
                  
                  
                     (24)
                  
               samal ajal kui desorptsiooniprotsent  ajahetkel ti saadakse võrrandist:
         
                     
                        
                  
                  
                     (25)
                  
               milles eespool kasutatud parameetrid määratletakse järgmiselt:
         
                     
                        , 
                        ,... , 
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     aine mass, mis jääb mullale adsorbeerununa vastavalt pärast ajavahemike Δt1, Δt2, ..., Δtn möödumist (μg);
                  
               
                     
                        , 
                        ,... , 
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     uuritava aine mass, mis on desorbeerunud vastavalt ajavahemike Δt1, Δt2, ..., Δtn jooksul (μg);
                  
               
                     
                        , 
                        ,... , 
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     vastavalt ajahetkedel t1, t2, ..., tn (μg)
                  
               
                     VT
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     desorptsioonikineetika määramisel jadameetodiga mullaga Kokku puutuva vesifaasi koguruumala (cm3);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     osalisest ruumala asendusest tingitud ülejääva uuritava aine mass adsorptsiooni tasakaaluolekus (μg)
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (26)
                              
                           
               
                     VR
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     adsorptsiooni tasakaaluoleku püstitumise järel katseklaasist eemaldatud supernatandi ruumala, mis asendatakse sama ruumala 0,01 M CaCl2 lahusega (cm3);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     desorptsioonikineetika määramisel jadameetodiga analüütilisel eesmärgil katseklaasist (i) võetud alikvoodi ruumala (cm3);
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (27)
                              
                           
               
      
         6. lisa
         ADSORPTSIOON-DESORPTSIOON MULDADES: ANDMETE ESITAMISE LEHED
         Uuritud aine:
         Uuritud muld:
         Kuivaine sisaldus mullas (105 oC, 12h): … %
         Temperatuur: … oC
         Analüüsimeetodi sobivus
         
                     Kaalutud muld
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
               
                     Muld: kuivmass
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
               
                     CaCl2 lahuse ruumala
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     Lõpliku lahuse arvutatud kontsentratsioon
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     Lõpliku lahuse määratud kontsentratsioon
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
               Kasutatud analüüsimeetodi põhimõte:
         Analüüsimeetodi kaliibrimine:
         Uuritud aine:
         Uuritud muld:
         Kuivaine sisaldus mullas (105 oC, 12h): … %
         Temperatuur: … oC
         
                     Kasutatud analüüsimetoodika:
                  
                  
                     Kaudne
                  
                  
                     
                  
                  
                     Paralleelne
                  
                  
                     
                  
                  
                     Jada
                  
                  
                     
                  
               
                      
                  
                  
                     Otsene
                  
                  
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Adsorptsiooni uuring: uuritavad proovid
         
                      
                  
                  
                     Tähis
                  
                  
                     Ühikud
                  
                  
                     Tasakaaluoleku saabumise aeg
                  
                  
                     Tasakaaluoleku saabumise aeg
                  
                  
                     Tasakaaluoleku saabumise aeg
                  
                  
                     Tasakaaluoleku saabumise aeg
                  
               
                     Katseklaas nr
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Kaalutud muld
                  
                  
                     —
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Muld: kuivmass
                  
                  
                     msoil
                     
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Vee ruumala kaalutud mullas (arvutatud)
                  
                  
                     VWS
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Mulla tasakaalustamiseks kasutatud 0,01 M CaCl2 lahuse ruumala
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Põhilahuse ruumala
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Mullaga kokkupuutuva vesifaasi koguruumala
                  
                  
                     V0
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Uuritava lahuse esialgne kontsentratsioon
                  
                  
                     C0
                     
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Uuritava aine mass uuringu alguses
                  
                  
                     m
                           0
                        
                     
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Pärast loksutamist ja tsentrifuugimist
                  
               
                     KAUDNE MEETOD
                  
               
                     Paralleelmeetod
                  
               
                     Uuritava aine kontsentratsioon vesifaasis, sisaldab pimekatsest tulenevat parandust
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Jadameetod
                  
               
                     Uuritava aine mõõdetud mass alikvoodisa
                        A
                     
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     OTSENE MEETOD
                  
               
                     Mullal adsorbeerunud uuritava aine mass
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Adsorptsiooni arvutamine
                  
               
                     Adsorptsioon
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     %
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                      
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     %
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Keskmised
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Adsorptsioonitegur
                  
                  
                     Kd
                     
                  
                  
                     cm3 g-1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Keskmised
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Adsorptsioonitegur
                  
                  
                     Koc
                     
                  
                  
                     cm3 g-1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Keskmised
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Uuritud aine:
         Uuritud muld:
         Kuivaine sisaldus mullas (105 oC, 12h): … %
         Temperatuur: … oC
         Adsorptsiooni uuring: pimekatsed ja kontroll
         
                      
                  
                  
                     Tähis
                  
                  
                     Ühikud
                  
                  
                     Pimekatse
                  
                  
                     Pimekatse
                  
                  
                     Kontroll
                  
               
                     Katseklaas nr
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Kaalutud mullad
                  
                  
                      
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     0
                  
                  
                     0
                  
               
                     Vee kogus kaalutud mullas (arvutatud)
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Lisatud 0,01 M CaCl2 lahuse ruumala
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Lisatud uuritava aine põhilahuse ruumala
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                     0
                  
                  
                     0
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Vesifaasi koguruumala (arvutatud)
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Uuritava aine esialgne kontsentratsioon vesifaasis
                  
                  
                      
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Pärast loksutamist ja tsentrifuugimist
                  
               
                     Kontsentratsioon vesifaasis
                  
                  
                      
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Märkus: Vajaduse korral lisada veerge.
         Uuritud aine:
         Uuritud muld:
         Kuivaine sisaldus mullas (105 oC, 12h): … %
         Temperatuur: … oC
         Massibilanss
         
                      
                  
                  
                     Tähis
                  
                  
                     Ühikud
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Katseklaas nr
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Kaalutud muld
                  
                  
                     —
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Muld: kuivmass
                  
                  
                     msoil
                     
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Vee ruumala kaalutud mullas (arvutatud)
                  
                  
                     VWS
                     
                  
                  
                     ml
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Mulla tasakaalustamiseks kasutatud 0,01 M CaCl2 lahuse ruumala
                  
                  
                      
                  
                  
                     ml
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Põhilahuse ruumala
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Mullaga kokkupuutuva vesifaasi koguruumala
                  
                  
                     V0
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Uuritava lahuse esialgne kontsentratsioon
                  
                  
                     C0
                     
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Tasakaaluoleku saabumise aeg
                  
                  
                     —
                  
                  
                     h
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Pärast loksutamist ja tsentrifuugimist
                  
               
                     Uuritava aine kontsentratsioon vesifaasis tasakaaluolekus, sisaldab pimekatsest tulenevat parandust
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Tasakaaluoleku saabumise aeg
                  
                  
                     teq
                     
                  
                  
                     h
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Esimene lahjendamine lahustiga
                  
               
                     Eemaldatud vesifaasi ruumala
                  
                  
                     Vrec
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Lisatud lahusti ruumala
                  
                  
                     ΔV
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Esimene ekstraheerimine lahustiga
                  
               
                     Lahustis analüüsitud signaal
                  
                  
                     SE1
                     
                  
                  
                     var.
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Uuritava aine kontsentratsioon lahustis
                  
                  
                     CE1
                     
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Mullast ja anuma seintelt ekstraheeritud aine mass
                  
                  
                     mE1
                     
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Teine lahjendamine lahustiga
                  
               
                     Eemaldatud lahusti ruumala
                  
                  
                     ΔVs
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Lisatud lahusti ruumala
                  
                  
                     ΔV'
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Teine ekstraheerimine lahustiga
                  
               
                     Lahustifaasis analüüsitud signaal
                  
                  
                     SE2
                     
                  
                  
                     var.
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Uuritava aine kontsentratsioon lahustis
                  
                  
                     CE2
                     
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Mullast ja anuma seintelt ekstraheeritud aine mass
                  
                  
                     mE2
                     
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Kahes etapis ekstraheeritud uuritava aine kogumass
                  
                  
                     mE
                     
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Massibilanss
                  
                  
                     MB
                  
                  
                     %
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Uuritud aine:
         Uuritud muld:
         Kuivaine sisaldus mullas (105 oC, 12h): … %
         Temperatuur: … oC
         Adsorptsiooniisotermid
         
                      
                  
                  
                     Tähis
                  
                  
                     Ühikud
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Katseklaas nr
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Kaalutud muld
                  
                  
                     —
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Muld: kuivmass
                  
                  
                     E
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Vee ruumala kaalutud mullas (arvutatud)
                  
                  
                     VWS
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Mulla tasakaalustamiseks kasutatud 0,01 M CaCl2 lahuse ruumala
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Lisatud põhilahuse ruumala
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Mullaga kokkupuutuva vesifaasi koguruumala (arvutatud)
                  
                  
                     V0
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Lahuse kontsentratsioon
                  
                  
                     C0
                     
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Tasakaaluoleku saabumise aeg
                  
                  
                     —
                  
                  
                     h
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Pärast loksutamist ja tsentrifuugimist
                  
               
                     Aine kontsentratsioon vesifaasis, sisaldab pimekatsest tulenevat parandust
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Temperatuur
                  
                  
                      
                  
                  
                     
                        oC
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Mullaühiku kohta adsorbeerunud mass
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg g-1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Regressioonanalüüs:
         KF
            ads väärtus:
         l/n väärtus:
         regressioonitegur r2:
         Uuritud aine:
         Uuritud muld:
         Kuivaine sisaldus mullas (105 oC, 12h): … %
         Temperatuur: … oC
         
                     Kasutatud analüüsimetoodika:
                  
                  
                     Kaudne
                  
                  
                     
                  
                  
                     Paralleelne
                  
                  
                     
                  
                  
                     Jada
                  
                  
                     
                  
               Desorptsiooni uuring
         
                      
                  
                  
                     Tähis
                  
                  
                     Ühikud
                  
                  
                     Ajavahemik
                  
                  
                     Ajavahemik
                  
                  
                     Ajavahemik
                  
                  
                     Ajavahemik
                  
               
                     Katseklaasi nr, saadakse adsorptsioonietapist
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Mullal adsorbeerunud aine mass adsorptsiooni tasakaaluolekus
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Eemaldatud vesifaasi ruumala, mis asendati 0,01 M CaCl2-ga
                  
                  
                     VR
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Mullaga kokkupuutuva vesifaasi koguruumala
                  
                  
                     PM
                  
                  
                     V0
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     SM
                  
                  
                     VT
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Osalisest ruumala asendusest tingitud ülejääva uuritava aine mass adsorptsiooni tasakaaluolekus
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Desorptsiooni kineetika
                  
               
                     Mullast desorbeerunud aine mõõdetud mass ajahetkel ti
                     
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Uuritava aine mõõtmiseks katseklaasist (i) võetud lahuse ruumala
                  
                  
                     PM
                  
                  
                     Vf
                        i
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     SM
                  
                  
                     va
                        D
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Mullast desorbeerunud aine mass ajahetkel ti (arvutatud)
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Mullast ajavahemikus Δti desorbeerunud aine mass (arvutatud)
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Desorptsiooni protsent
                  
               
                     Desorptsioon ajahetkel ti
                     
                  
                  
                     Dti
                        
                     
                  
                  
                     %
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Desorptsioon ajavahemikus Δti
                     
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     %
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Näiline desorptsioonitegur
                  
                  
                     Kdes
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               PM: paralleelmeetod
         SM: jadameetod
      
      C.19.   ADSORPTSIOONITEGURI (KOC
         ) KINDLAKSMÄÄRAMINEMULLAS JA REOVEESETTES KÕRGSURVEVEDELIKKROMATOGRAAFIA (HPLC) ABIL
      1.   MEETOD
      Käesolev meetod lähtub OECD juhendist TG 121 (2000).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Ainete sorptsiooni muldadesse ja kanalisatsioonijääkidesse võib kirjeldada parameetrite abil, mida saab katseliselt kindlaks määrata meetodi C.18 abil. Üheks oluliseks parameetriks on adsorptsioonitegur, mida määratletakse kui suhet mullas/reoveesettes oleva aine kontsentratsiooni ja vesifaasis oleva aine kontsentratsiooni adsorptsiooni tasakaalu tingimuste vahel. Mulla orgaanilise süsiniku sisalduse suhtes normaliseeritud adsorptsioonitegur Koc on kasulik näitaja, mis iseloomustab kemikaali seostumisvõimet mulla orgaanilise ainese või reoveesettega ning võimaldab võrrelda erinevaid kemikaale. Seda parameetrit võib hinnata veeslahustuvuse ja n-oktanooli/vee jaotusteguri vaheliste korrelatsioonide abil (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7).
      Käesolevas uuringus kirjeldatud katsemeetodis kasutatakse HPLCd adsorptsiooniteguri Koc määratlemiseks mullas ja reoveesettes (8). Need näitajad on usaldusväärsemad kui QSAR-arvutustega saadud näitajad (9). Kuna tegemist on hinnangulise meetodiga, ei saa see täielikult asendada katsemeetodis C.18 kasutatud partii tasakaalustamise katseid. Siiski võib kindlaksmääratud Koc väärtust kasutada selleks, et valida sobivad katseparameetrid adsorptsiooni/desorptsiooni uuringute jaoks vastavalt katsemeetodile C.18, arvutades Kd (jaotustegur) või Kf (Freundlichi adsorptsioonitegur) vastavalt võrrandile 3 (vt punkti 1.2).
      1.2.   MÕISTED
      
         K
         
            d
          – jaotustegur on lahustunud uuritava aine tasakaalukontsentratsioonide C suhe kahefaasilises süsteemis, mis koosneb sorbendist (muld või reoveesete) ja vesifaasist; see on dimensioonita väärtus, kui kontsentratsioonid mõlemas faasis on väljendatud massiprotsendina. Juhul kui kontsentratsioon vesifaasis esitatakse massi ja ruumala suhtena, on ühikuteks ml g-1. Kd võib muutuda vastavalt sorbendi omadustele ning sõltuda kontsentratsioonist.
      
                  
                     
               
               
                  (1)
               
            kus:
      
                  Csoil
                  
               
               
                  =
               
               
                  uuritava aine tasakaalukontsentratsioon mullas (μg· g-1)
               
            
                  Csludge
                  
               
               
                  =
               
               
                  uuritava aine tasakaalukontsentratsioon jääkides (μg· g-1)
               
            
                  Caq
                  
               
               
                  =
               
               
                  uuritava aine tasakaalukontsentratsioon vesifaasis (μg· g-1, (μg· ml-1).
               
            
         K
         
            f
          – Freundlichi adsorptsioonitegur on uuritava aine kontsentratsioon mullas või reoveesettes (x/m), kui tasakaalukontsentratsioon Caq vesifaasis on üks; ühikud on μg· g-1 sorbenti. Väärtus võib muutuda sõltuvalt sorbendi omadustest.
      
                  
                     
               
               
                  (2)
               
            kus:
      
                  x/m
               
               
                  =
               
               
                  sorbendi kogusesse m (g) adsorbeerunud uuritava aine kogus x (μg) tasakaaluolekus
               
            
                  l/n
               
               
                  =
               
               
                  Freundlichi adsorptsiooniisotermi kõver
               
            
                  Caq
                  
               
               
                  =
               
               
                  uuritava aine tasakaalukontsentratsioon vesifaasis (μg· ml-1)
               
            At
      Koc – sorbendi orgaanilise süsiniku sisalduse (foc) suhtes normaliseeritud aine jaotustegur (Kd) või Freundlichi adsorptsioonitegur (Kf); eriti mitteioniseerumata kemikaalide korral on see ligikaudseks indikaatoriks aine ja sorbendi vahelise adsorptsiooni ulatuse määramisel ning võimaldab võrrelda erinevaid kemikaale. Olenevalt Kd ja Kf mõõtmetest võib Koc olla dimensioonita suurus või omada ühikuid ml· g–1 või μg · g–1 orgaanilist ainest.
      
                  
                     
               
               
                  (3)
               
            Koc ja Kd vaheline suhe ei ole alati lineaarne ja seega võivad Koc väärtused mullati erineda, kuid nende varieerivus on palju väiksem võrreldes Kd või Kf väärtustega.
      Adsorptsioonitegur (Koc) tuletatakse võimsustegurist (k'), kasutades kaliibrimisgraafikut, milles log k' esitatakse log Koc funktsioonina valitud võrdlusühendite kohta.
      
                  
                     
               
               
                  (4)
               
            kus:
      
                  tR
                  
               
               
                  =
               
               
                  uuritava aine ja võrdlusaine HPLC peetumisaeg (minutites)
               
            
                  t0
                  
               
               
                  =
               
               
                  HPLC surnud aeg (minutites) (vt punkti 1.8.2).
               
            Pow – oktanooli/vee jaotustegur on n-oktanooli ja vette lahustunud aine kontsentratsioonide suhe, mis on ilma dimensioonita väärtus
      
                  
                     
               
               
                  (5)
               
            1.3.   VÕRDLUSAINED
      Enne meetodi kasutamist peavad olema teada struktuurivalem, puhtus ja dissotsiatsioonikonstant (vajaduse korral). Kasulik on ka teave vees ja orgaanilistes lahustites lahustuvuse, oktanooli/vee jaotusteguri ja hüdrolüüsi omaduste kohta.
      Selleks, et uuritava aine mõõdetud HPLC-retentsiooniandmeid saaks korrelleerida uuritava aine adsorptsiooniteguri Koc-ga, tuleb joonistada kaliibrimisgraafik, milles log Koc esitatakse log k' funktsioonina. Kasutada tuleks minimaalselt kuut võrdluspunkti, millest vähemalt üks on madalam ja üks kõrgem kui uuritava aine eeldatav väärtus. Meetodi täpsus paraneb märgatavalt, kui kasutatakse võrdlusaineid, mis on struktuurilt uuritava ainega seotud. Kui sellised andmed ei ole kättesaadaval, valib kasutaja ise sobivad kaliibrimisained. Sellisel juhul tuleks valida struktuuriliselt heterogeensed ained. Kasutamiseks sobivad ained ja Koc väärtused on esitatud reoveesette puhul liite tabelis 1 ja mulla puhul tabelis 3. Teiste kaliibrimisainete valikut tuleks põhjendada.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      HPLC tehakse analüütilistes kolonnides, mis on täidetud müügiloleva tsüanopropüüli faasiga, mis sisaldab lipofiilseid ja polaarseid struktuuriühikuid. Kasutatakse mõõdukalt polaarset statsionaarset faasi, mis põhineb ränidioksiidmaatriksil:
      
                  - O - Si
               
               
                  - CH2 - CH2 - CH2
                  
               
               
                  - CN
               
            
                  Ränidioksiid
               
               
                  Mittepolaarne spacer-aine
               
               
                  Polaarne struktuuriühik
               
            Katsemeetodi põhimõte on sarnane meetodiga A.8 (jaotustegur, HPLC-meetod). Kui uuritav aine läbib kolonni koos liikuva faasiga, reageerib see statsionaarse faasiga. Kuna uuritav aine jaguneb liikuva ja statsionaarse faasi vahel, aeglustub selle liikumine. Kuna statsionaarses faasis on nii polaarseid kui mittepolaarseid osasid, võivad molekulide polaarsed ja mittepolaarsed rühmad reageerida samal viisil kui orgaaniline aines mulla- või reoveesette maatriksites. See võimaldab määrata kolonniga seotud peetumisaja ja orgaanilise ainese adsorptsiooniteguri vahelise suhte.
      pH-l on märkimisväärne mõju sorptsioonile, eriti polaarsete ainete puhul. Põllumajandusmaa või reoveepuhastusjaamade mahutite pH on tavaliselt vahemikus pH 5,5–7,5. Ioniseeruvate ainete korral tuleks teha kaks uuringut nii ioniseeritud kui ioniseerimata kujul sobivates puhverlahustes, kuid ainult siis, kui vähemalt 10 % katseühenditest dissotsieerub vahemikus pH 5,5–7,5.
      Kuna määramisel kasutatakse ainult HPLC-kolonniga seotud peetumisaja ja adsorptsiooniteguri vahelist suhet, ei ole kvantitatiivset analüüsimeetodit tarvis ja määrata tuleb ainult peetumisaeg. Kui kasutatakse sobivaid võrdlusaineid ja katse tingimused on standardsed, võimaldab see meetod kiiresti ja efektiivselt määrata adsorptsiooniteguri Koc.
      1.5.   UURINGU KASUTATAVUS
      HPLC-meetod sobib selliste keemiliste ainete jaoks (märgistamata või märgistatud), mille jaoks on saadav sobiv tuvastamissüsteem (nt spektrofotomeeter, radioaktiivsuse detektor) ja mis on katse tegemise jooksul piisavalt püsivad. See võib olla eriti kasulik selliste kemikaalide puhul, mida on raske uurida muude katsesüsteemidega (st lenduvad ained; ained, mis ei lahustu vees kontsentratsioonil, mida on võimalik analüütiliselt mõõta; inkubatsioonisüsteemide pinna suhtes suurt afiinsust omavad ained). Meetodit saab kasutada segude puhul, mille korral ei ole võimalik elueerimisribasid eristada. Sellisel juhul tuleks märkida ära uuritavate ainete segu ühendite log Koc väärtuste ülemine ja alumine piir.
      Lisandid võivad mõnikord põhjustada probleeme HPLC-tulemuste tõlgendamisel, kuid need ei ole väga olulised, kui uuritavat ainet on võimalik analüütiliselt selgelt identifitseerida ja lisanditest eraldada.
      See meetod on valideeritud liite tabelis 1 loetletud ainete jaoks ja seda on kasutatud ka paljude teiste kemikaalide puhul, mis kuuluvad järgmistesse kemikaalide klassidesse:
      
                  —
               
               
                  aromaatsed amiinid (nt trifluraliin, 4-klooraniliin, 3,5-dinitroaniliin, 4-metüülaniliin, N-metüülaniliin, 1-naftüülamiin);
               
            
                  —
               
               
                  aromaatsed karboksüülhappe estrid (nt bensoehappe metüülester, 3,5-dinitrobensoehappe etüülester);
               
            
                  —
               
               
                  aromaatsed süsivesinikud (nt tolueen, ksüleen, etüülbenseen, nitrobenseen);
               
            
                  —
               
               
                  arüüloksüfenoksüpropioonhappe estrid (nt diklofop-metüül, fenoksaprop-etüül, fenoksaprop-P-etüül);
               
            
                  —
               
               
                  bensimidasool- ja imidasoolfungitsiidid (nt karbentasiim, fuberidasool, triasoksiid);
               
            
                  —
               
               
                  karboksüülhappe amiidid (nt 2-klorobensamiid, N,N-dimetüülbensamiid, 3,5-dinitrobensamiid, N-metüülbensamiid, 2-nitrobensamiid, 3-nitrobensamiid);
               
            
                  —
               
               
                  klooritud süsivesinikud (nt endosulfaan, DDT, heksaklorobenseen, kintoseen, 1,2,3-triklorobenseen);
               
            
                  —
               
               
                  orgaanilist fosforit sisaldavad insektitsiidid (nt metüülasiinfoss, disulfotoon, fenamifoss, isofeenfoss, pürasofoss, sulprofoss, triasofoss);
               
            
                  —
               
               
                  fenoolid (nt fenool, 2-nitrofenool, 4-nitrofenool, pentaklorofenool, 2,4,6-triklorofenool, 1-naftool);
               
            
                  —
               
               
                  fenüülkarbamiidi derivaadid (nt isoproturoon, monolinuroon, pentsükuroon);
               
            
                  —
               
               
                  värvained (nt Acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct Red 81);
               
            
                  —
               
               
                  polüaromaatsed süsivesinikud (nt atsenafteen, naftaleen);
               
            
                  —
               
               
                  1,3,5-triasiinherbitsiidid (nt prometrüün, propasiin, simasiin, terbutrüün);
               
            
                  —
               
               
                  triasooli derivaadid (nt tebukonasool, triadimefoon, tradimenool, triapentenool).
               
            Meetodit ei kasutata ainete puhul, mis reageerivad kas eluendi või statsionaarse faasiga. Samuti ei kasutata seda ainete puhul, mis reageerivad spetsiifilisel viisil anorgaaniliste ühenditega (nt moodustavad klasterkomplekse savimineraalidega). Meetod ei pruugi toimida ka pindaktiivsete ainete, anorgaaniliste ühendite ja mõõdukalt tugevate või tugevate orgaaniliste hapete ja aluste korral. Kindlaks võib määrata log Koc väärtused vahemikus 1,5–5,0. Tuleb määrata ioniseeruvad ained, kasutades puhverdatud liikuvat faasi, kuid hoolitseda tuleb selle eest, et puhvri komponendid ega uuritav aine ei sadestuks.
      1.6.   KVALTITEEDIKRITEERIUMID
      1.6.1.   Täpsus
      Tavaliselt saab uuritava aine adsorptsiooniteguri määrata täpsusega ±0,5 logaritmiühikut perioodilise tasakaalu meetodiga määratud väärtusest (vt liites olevat tabelit 1). Suurema täpsuse võib saavutada, kui kasutatakse võrdlusaineid, mis on struktuurilt uuritava ainega seotud.
      1.6.2.   Korratavus
      Määramised tuleks teha vähemalt kaks korda. Individuaalsetest määramistest tuletatud log Koc väärtused peaksid jääma vahemikku 0,25 logaritmiühikut.
      1.6.3.   Reprodutseeritavus
      Meetodi kasutamisest saadud kogemused toetavad selle valiidsust. HPLC-meetodi uurimine, milles kasutati 48 ainet (enamasti pestitsiidid), mille kohta on olemas usaldusväärsed mulla Koc kohta käivad andmed, andis korrelatasioonikordaja R = 0,95 (10, 11).
      Meetodi tõhustamiseks ja valideerimiseks viidi läbi laboratooriumidevaheline võrdlusuuring, milles osales 11 laboratooriumi (12). Tulemused on esitatud liite tabelis 2.
      1.7.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.7.1.   Adsorptsiooniteguri esialgne määramine
      Oktanooli/vee jaotustegurit Pow (= Kow) ja teatud ulatuses ka vees lahustuvust saab kasutada adsorptsiooni ulatuse indikaatoritena, eriti ioniseerimata ainete korral, ja seega kasutada esialgse ulatuse leidmiseks. Paljude kemikaalide rühmade kohta on avaldatud mitmeid kasulikke korrelatsioone (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7).
      1.7.2.   Seadmed
      Vajalik on mittepulseeriva pumba ja sobiva tuvastamisseadmega vedelikkromatograafi olemasolu. Soovitatakse kasutada klapp-pihustit, millel on sisestus silmus. Kasutatakse müügilolevaid ränidioksiidist alusega tsüanopropüülsidemega seotud vaike (nt Hypersil ja Zorbax CN). Sama aine juhtkolonni võib asetada sisestussüsteemi ja analüütilise kolonni vahele. Erinevate tarnijate kolonnid võivad oma eraldamise efektiivsuse suhtes märkimisväärselt varieeruda. Juhisena tuleks üritada saavutada järgmised võimsustegurid k': log k' > 0,0, kui log Koc = 3,0, ja log k' > – 0,4, kui log Koc = 2,0, kasutades metanooli/vee suhet 55/45 % liikuva faasina.
      1.7.3.   Liikuvad faasid
      Uuritud on mitmeid liikuvaid faase ja soovitatakse kahte järgmist:
      
                  —
               
               
                  metanool/vesi (55/45 mahuprotsenti);
               
            
                  —
               
               
                  metanool/0,01 M tsitraatpuhver pH 6,0 (55/45 mahuprotsenti).
               
            Elueerimislahusti valmistamiseks tuleb kasutada HPLC-puhast metanooli ja destilleeritud vett või tsitraatpuhvrit. Enne kasutamist segud degaseeritakse. Kasutada tuleb isokraatilist elueerimist. Kui metanooli/vee segud ei sobi, võib kasutada teisi orgaanilise lahusti ja vee segusid, näiteks etanooli ja vee segu või atsetonitriili ja vee segu. Ioniseeruvate ühendite korral soovitatakse kasutada puhverlahust pH stabiliseerimiseks. Tuleb hoolitseda selle eest, et sool ei ladestuks ja kolonn ei manduks, mida võib mõningate orgaaniliste faaside/puhversegude korral esineda.
      Kasutada ei tohi mingeid lisaaineid, nagu näiteks ioonpaari reaktiive, sest need võivad mõjutada statsionaarse faasi sorptsiooni omadusi. Sellised statsionaarse faasi muutused võivad olla pöördumatud. Seetõttu on kohustuslik lisaaineid kasutavad katsed viia läbi eraldi kolonnides.
      1.7.4.   Soluudid
      Uuritavad ained ja võrdlusained tuleks lahustada liikuvas faasis.
      1.8.   KATSE KÄIK
      1.8.1.   Katsetingimused
      Temperatuur mõõtmiste kestel tuleks dokumenteerida. Väga soovitatav on kasutada reguleeritava temperatuuriga kolonni, et tagada püsivad tingimused kaliibrimise ja hindamise katsete jooksul ning uuritava aine määramisel.
      1.8.2.   Surnud aja t0 määramine
      Surnud aja t0 määramiseks võib kasutada kahte erinevat meetodit (vt ka punkti 1.2).
      1.8.2.1.   Surnud aja t0 määramine, kasutades homoloogilist rida
      See menetlus on andnud usaldusväärseid ja standardiseeritud t0 väärtusi. Üksikasju vt katsemeetodit käsitlevas punktis A.8: jaotustegur (n-oktanool/vesi), HPLC-meetod.
      1.8.2.2.   Surnud aja t0 määramine inertsete ainete abil, mis ei jää kolonni
      See tehnika põhineb formamiidi, karbamiidi või naatriumnitraadi lahuste lisamisel. Määramisi tuleks teha vähemalt kaks korda.
      1.8.3.   Peetumisaegade tR määramine
      Võrdlusained tuleks valida punktis 1.3 kirjeldatud viisil. Need võib sisestada segastandardina peetumisaegade kindlaksmääramiseks, tingimusel, et on tõendatud, et ühegi võrdlus standardi peetumisaega ei mõjuta teiste võrdlusstandardite juuresolek. Kaliibrimine tuleks teha korrapäraste ajavahemike tagant vähemalt kaks korda päevas, et oleks võimalik seletada kolonni tulemuste ootamatuid muutusi. Kaliibrimissisestused soovitatakse teha enne ja pärast uuritava aine sisestamist, et saada kinnitust selle kohta, et peetumisaeg ei ole muutunud. Uuritavad ained sisestatakse eraldi võimalikult väikestes kogustes (et vältida kolonni ülekoormust) ning nende peetumisajad määratakse kindlaks.
      Määramiste usaldusväärsuse suurendamiseks tuleb need teha vähemalt kaks korda. Individuaalsetest mõõtmistest tuletatud log Koc väärtused peaksid jääma vahemikku 0,25 logaritmiühikut.
      1.8.4.   Hindamine
      Võimsustegurid k' arvutatakse valitud võrdlusainete surnud aja t0 ja peetumisaegade tR põhjal vastavalt võrrandile 4 (vt punkti 1.2). Seejärel joonistatakse graafik, milles võrdlusainete log k' andmed esitatakse liite tabelites 1 ja 3 toodud partii tasakaalustamise katsetest saadud vastavate log Koc väärtuste funktsioonina. Selle graafiku abil kasutatakse uuritava aine log k' väärtust selle log Koc väärtuse määramiseks. Kui tegelikud tulemused näitavad, et uuritava aine log Koc on väljaspool kaliibrimisvahemikku, tuleks uuringut korrata, kasutades erinevaid, sobivamaid võrdlusaineid.
      2.   ANDMED JA ARUANDLUS
      Aruanne peab sisaldama järgmist teavet:
      
                  —
               
               
                  uuritavate ainete ja võrdlusainete identsus ja puhtus ning vajaduse korral pKa väärtused;
               
            
                  —
               
               
                  seadmete ja tegevustingimuste kirjeldus, nt analüütilise (ja juht-) kolonni tüüp ja mõõtmed, tuvastamisvahendid, liikuv faas (komponentide suhe ja pH), temperatuuri vahemik määramiste jooksul;
               
            
                  —
               
               
                  surnud aeg ja selle määramiseks kasutatud meetod;
               
            
                  —
               
               
                  kolonni viidud uuritavate ainete ja võrdlusainete kogused;
               
            
                  —
               
               
                  kaliibrimiseks kasutatud võrdlusühendite peetumisajad;
               
            
                  —
               
               
                  joonestatud regressioonigraafiku (log k' vs log Koc) üksikasjalikud andmed ja graafik ise;
               
            
                  —
               
               
                  uuritud ühendi keskmised peetumisandmed ja määratud log Koc väärtus;
               
            
                  —
               
               
                  kromatogrammid.
               
            3.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). (1990). Handbook of chemical property estimation methods, Chap. 4, McGraw-Hill, New York.
               
            
                  2)
               
               
                  J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the adsorption coefficient (Koc) for soils by HPLC Chemosphere, 17, 1 67.
               
            
                  3)
               
               
                  G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050–1059.
               
            
                  4)
               
               
                  C T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, pp. 227–231.
               
            
                  5)
               
               
                  Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, pp. 297–312.
               
            
                  6)
               
               
                  C T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical concept of soil water equilibria for nonionic organic compounds, Science, 106, pp. 831–832.
               
            
                  7)
               
               
                  S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, pp. 833–846.
               
            
                  8)
               
               
                  W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), pp. 121–128.
               
            
                  9)
               
               
                  M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. Chemosphere, 32(12), pp. 2493–2504.
               
            
                  10)
               
               
                  W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 27(12), pp. 2341–2352.
               
            
                  11)
               
               
                  B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, pp. 285–304.
               
            
                  12)
               
               
                  W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), pp. 1373–1384.
               
            
         liide
         Tabel 1
         Muldade ja reoveesette Koc väärtuste ja HPLC-sõelumismeetodi alusel arvutatud väärtuste võrdlus (31)/ (32)
         
         
                     Aine
                  
                  
                     CASi nr
                  
                  
                     log Koc reoveesete
                  
                  
                     log Koc HPLC
                  
                  
                     Δ
                  
                  
                     log Koc mullad
                  
                  
                     log Koc HPLC
                  
                  
                     Δ
                  
               
                     Atrasiin
                  
                  
                     1912-24-9
                  
                  
                     1,66
                  
                  
                     2,14
                  
                  
                     0,48
                  
                  
                     1,81
                  
                  
                     2,20
                  
                  
                     0,39
                  
               
                     Linuroon
                  
                  
                     330-55-2
                  
                  
                     2,43
                  
                  
                     2,96
                  
                  
                     0,53
                  
                  
                     2,59
                  
                  
                     2,89
                  
                  
                     0,30
                  
               
                     Fentioon
                  
                  
                     55-38-9
                  
                  
                     3,75
                  
                  
                     3,58
                  
                  
                     0,17
                  
                  
                     3,31
                  
                  
                     3,40
                  
                  
                     0,09
                  
               
                     Monuroon
                  
                  
                     150-68-5
                  
                  
                     1,46
                  
                  
                     2,21
                  
                  
                     0,75
                  
                  
                     1,99
                  
                  
                     2,26
                  
                  
                     0,27
                  
               
                     Fenantreen
                  
                  
                     85-01-8
                  
                  
                     4,35
                  
                  
                     3,72
                  
                  
                     0,63
                  
                  
                     4,09
                  
                  
                     3,52
                  
                  
                     0,57
                  
               
                     Bensoehappe fenüülester
                  
                  
                     93-99-2
                  
                  
                     3,26
                  
                  
                     3,03
                  
                  
                     0,23
                  
                  
                     2,87
                  
                  
                     2,94
                  
                  
                     0,07
                  
               
                     Bensamiid
                  
                  
                     55-21-0
                  
                  
                     1,60
                  
                  
                     1,00
                  
                  
                     0,60
                  
                  
                     1,26
                  
                  
                     1,25
                  
                  
                     0,01
                  
               
                     4-nitrobensamiid
                  
                  
                     619-80-7
                  
                  
                     1,52
                  
                  
                     1,49
                  
                  
                     0,03
                  
                  
                     1,93
                  
                  
                     1,66
                  
                  
                     0,27
                  
               
                     Atseetaniliid
                  
                  
                     103-84-4
                  
                  
                     1,52
                  
                  
                     1,53
                  
                  
                     0,01
                  
                  
                     1,26
                  
                  
                     1,69
                  
                  
                     0,08
                  
               
                     Aniliin
                  
                  
                     62-53-3
                  
                  
                     1,74
                  
                  
                     1,47
                  
                  
                     0,27
                  
                  
                     2,07
                  
                  
                     1,64
                  
                  
                     0,43
                  
               
                     2,5-dikloroaniliin
                  
                  
                     95-82-9
                  
                  
                     2,45
                  
                  
                     2,59
                  
                  
                     0,14
                  
                  
                     2,55
                  
                  
                     2,58
                  
                  
                     0,03
                  
               
            
         Tabel 2
         HPLC-meetodi tõhustamiseks ja valideerimiseks tehtud laboratooriumidevahelise võrdlusuuringu (11 laboratooriumi osalusel) tulemused (33)
         
         
                     Aine
                  
                  
                     CASi nr
                  
                  
                     log Koc (OECD 106)
                  
                  
                     Koc
                     
                  
                  
                     log Koc
                     
                  
               
                     [HPLC-meetod][
                  
                  
                     [HPLC-meetod]
                  
               
                     Atrasiin
                  
                  
                     1912-24-9
                  
                  
                     1,81
                  
                  
                     78 ± 16
                  
                  
                     1,89
                  
               
                     Monuroon
                  
                  
                     150-68-5
                  
                  
                     1,99
                  
                  
                     100 ± 8
                  
                  
                     2,00
                  
               
                     Triapentenool
                  
                  
                     77608-88-3
                  
                  
                     2,37
                  
                  
                     292 ± 58
                  
                  
                     2,47
                  
               
                     Linuroon
                  
                  
                     330-55-2
                  
                  
                     2,59
                  
                  
                     465 ± 62
                  
                  
                     2,67
                  
               
                     Fentioon
                  
                  
                     55-38-9
                  
                  
                     3,31
                  
                  
                     2062 ± 648
                  
                  
                     3,31
                  
               
            
         Tabel 3
         Mulla adsorptsiooni käsitlevatel andmetel põhineva HPLC-sõelumismeetodi jaoks soovitatavad võrdlusained
         
                     Võrdlusained
                  
                  
                     CASi nr
                  
                  
                     Partii tasakaaluolekust saadud log Koc keskmised väärtused
                  
                  
                     Koc andmete number
                  
                  
                     log S.D.
                  
                  
                     Allikas
                  
               
                     Atseetaniliid
                  
                  
                     103-84-4
                  
                  
                     1,25
                  
                  
                     4
                  
                  
                     0,48
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Fenool
                  
                  
                     108-95-2
                  
                  
                     1,32
                  
                  
                     4
                  
                  
                     0,70
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     2-Nitrobensamiid
                  
                  
                     610-15-1
                  
                  
                     1,45
                  
                  
                     3
                  
                  
                     0,90
                  
                  
                     
                         (35)
                     
                  
               
                     N, N-dimetiiiilbensamiid
                  
                  
                     611-74-5
                  
                  
                     1,52
                  
                  
                     2
                  
                  
                     0,45
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     4-metüülbensamiid
                  
                  
                     619-55-6
                  
                  
                     1,78
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,76
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Metüülbensoaat
                  
                  
                     93-58-3
                  
                  
                     1,80
                  
                  
                     4
                  
                  
                     1,08
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Atrasiin
                  
                  
                     1912-24-9
                  
                  
                     1,81
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,08
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Isoproturoon
                  
                  
                     34123-59-6
                  
                  
                     1,86
                  
                  
                     5
                  
                  
                     1,53
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     3-nitrobensamiid
                  
                  
                     645-09-0
                  
                  
                     1,95
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,31
                  
                  
                     
                         (35)
                     
                  
               
                     Aniliin
                  
                  
                     62-53-3
                  
                  
                     2,07
                  
                  
                     4
                  
                  
                     1,73
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     3,5-dinitrobensamiid
                  
                  
                     121-81-3
                  
                  
                     2,31
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,27
                  
                  
                     
                         (35)
                     
                  
               
                     Karbentasiim
                  
                  
                     10605-21-7
                  
                  
                     2,35
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,37
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Triadimenool
                  
                  
                     55219-65-3
                  
                  
                     2,40
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,85
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Triasoksiid
                  
                  
                     72459-58-6
                  
                  
                     2,44
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,66
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Triasofoss
                  
                  
                     24017-47-8
                  
                  
                     2,55
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,78
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Linuroon
                  
                  
                     330-55-2
                  
                  
                     2,59
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,97
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Naftaleen
                  
                  
                     91-20-3
                  
                  
                     2,75
                  
                  
                     4
                  
                  
                     2,20
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Endosulfaandiool
                  
                  
                     2157-19-9
                  
                  
                     3,02
                  
                  
                     5
                  
                  
                     2,29
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Metiokarb
                  
                  
                     2032-65-7
                  
                  
                     3,10
                  
                  
                     4
                  
                  
                     2,39
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Acid Yellow 219
                  
                  
                     63405-85-6
                  
                  
                     3,16
                  
                  
                     4
                  
                  
                     2,83
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     1,2,3-triklorobenseen
                  
                  
                     87-61-6
                  
                  
                     3,16
                  
                  
                     4
                  
                  
                     1,40
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     y-HCH
                  
                  
                     58-89-9
                  
                  
                     3,23
                  
                  
                     5
                  
                  
                     2,94
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Fentioon
                  
                  
                     55-38-9
                  
                  
                     3,31
                  
                  
                     3
                  
                  
                     2,49
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Direct Red 81
                  
                  
                     2610-11-9
                  
                  
                     3,43
                  
                  
                     4
                  
                  
                     2,68
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Pürasofoss
                  
                  
                     13457-18-6
                  
                  
                     3,65
                  
                  
                     3
                  
                  
                     2,70
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     α-endosulfaan
                  
                  
                     959-98-8
                  
                  
                     4,09
                  
                  
                     5
                  
                  
                     3,74
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Diklofop-metüül
                  
                  
                     51338-27-3
                  
                  
                     4,20
                  
                  
                     3
                  
                  
                     3,77
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Fenantreen
                  
                  
                     85-01-8
                  
                  
                     4,09
                  
                  
                     4
                  
                  
                     3,83
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Basic Blue 41 (segu)
                  
                  
                     26850-47-5
                     12270-13-2
                  
                  
                     4,89
                  
                  
                     4
                  
                  
                     4,46
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     DDT
                  
                  
                     50-29-3
                  
                  
                     5,63
                  
                  
                     1
                  
                  
                     —
                  
                  
                     
                         (35)
                     
                  
               
      C.20.   HIIDKIIVRIKU (DAPHNIA MAGNA) SIGIVUSE KATSE
      1.   MEETOD
      Käesolev sigivust kahjustava toksilisuse katse lähtub OECD juhendist TG 211 (1998).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Katse põhieesmärk on hinnata kemikaalide mõju Daphnia magna sigivusele.
      1.2.   MÕISTED JA ÜHIKUD
      
         Vanemad – katse alguse juures olevad emased kiivrikud, kelle sigivuse uurimine on katse eesmärk.
      
         Järglane – noored kiivrikud, kelle vanemad on katse jooksul ilmale toonud.
      
         Vähim toimet avaldav kontsentratsioon (LOEC) – madalaim uuritud kontsentratsioon, mille puhul on ainel kindlaksmääratud kokkupuuteaja jooksul kontrollrühmaga võrreldes statistiliselt märkimisväärne mõju sigivusele ja vanemate suremusele (p < 0,05). Kõigil LOECst suurematel uuritavatel kontsentratsioonidel on siiski kahjulik mõju, mis on samaväärne või suurem kui LOEC korral täheldatav mõju. Kui neid kaht tingimust ei ole võimalik täita, tuleb esitada selgitus selle kohta, kuidas LOEC (ja sellest tulenevalt ka NOEC) on valitud.
      
         Katsealustele organismidele täheldatavat toimet mitte avaldav kontsentratsioon (NOEC) – LOECst vahetult madalam uuritav kontsentratsioon, millel ei ole kindlaksmääratud kokkupuuteaja jooksul kontrollrühmaga võrreldes statistiliselt märkimisväärset mõju (p < 0,05).
      
         EC
         
            X
          – vees lahustatud uuritava aine kontsentratsioon, mis põhjustab kiivrike sigivuse vähenemist kokkupuuteaja jooksul x %.
      
         Sisemise kasvu määr – populatsiooni kasvu määr, milles ühendatakse sigivus ja easpetsiifiline suremus (20, 21, 22). Stabiilsetes populatsioonides on see null. Kasvavate populatsioonide puhul on see positiivne ja kahanevate populatsioonide puhul negatiivne. Kahanevad populatsioonid ei ole ilmselt jätkusuutlikud ja surevad välja.
      
         Avastamispiir – madalaim kontsentratsioon, mille olemasolu on võimalik avastada, kuid mille kogust ei saa kindlaks määrata.
      
         Määramispiir – madalaim kontsentratsioon, mille koguse saab kindlaks määrata.
      
         Suremus – loom loetakse surnuks, kui ta ei liiguta, st ei suuda ujuda, või kui 15 sekundit pärast katseanuma õrna liigutamist ei ole võimalik täheldada tundlate ja tagakeha liikumist. (Kui kasutatakse teistsugust määratlust, tuleb sellest teatada koos vajalike viidetega.)
      1.3.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Noored emased kiivrikud (vanemad), kes on katse alguses alla 24 tunni vanad, viiakse kokku veele lisatud uuritava ainega erinevates kontsentratsioonides. Katse kestab 21 päeva. Katse lõpus hinnatakse iga katse lõpus elus oleva vanema kohta saadud elus järglaste koguarvu. See tähendab, et saadud noorloomi, kes katse käigus surevad, ei arvestata. Vanemate sigivust saab väljendada ka muul moel (nt looma kohta päevas saadud elusate järglaste arv alates esimesest päevast, mil järglaste olemasolu märgati), kuid need tuleks edastada lisaks katse lõpus elus oleva vanema kohta saadud noorloomade koguarvule. Uuritava ainega kokkupuutunud loomade sigivust võrreldakse kontrollrühma(de) omaga, et teha kindlaks vähim toimet avaldav kontsentratsioon (LOEC) ja selle põhjal ka täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC). Lisaks sellele analüüsitakse andmeid võimaluse korral regressioonimudeli abil, et hinnata kontsentratsiooni, mis põhjustaks sigivuse vähenemise x % (st EC50, EC20 või EC10).
      Andmed tuleb esitada ka vanemate ellujäämise ja esimeste järglaste saamise aja kohta. Uurida võib ka muid ainega seotud mõjusid loomade näitajatele, näiteks kasvule (pikkus), ja võimaluse korral ka sisemise kasvu määra.
      1.4.   TEAVE UURITAVA AINE KOHTA
      Olemas peaksid olema andmed hiidkiivrikuga tehtud ägeda toksilisuse katse kohta (vt meetod C.2, I osa). Tulemused võivad aidata valida sigivust puudutavate katsete jaoks sobivaid uuritavate kontsentratsioonide vahemikke. Teada peaksid olema uuritava aine lahustuvus vees ja aururõhk ning olemas peaks olema usaldusväärne analüütiline meetod, mille abil määrata kindlaks aine kogus uuritavas lahuses ja mille kohta on teada tulemuslikkus ja määramispiir.
      Katsetingimuste kindlaksmääramisel võib olla kasulik järgmine uuritavat ainet puudutav teave: struktuurivalem, aine puhtus, püsivus valguse käes, püsivus katsetingimustes, pKa, Pow ja katse tulemused seoses biolagunduvusega (vt meetod C.4).
      1.5.   KATSE VALIIDUSUS
      Katse valiidsuse kohta kehtivad järgmised tingimused (kontrollrühmades):
      
                  —
               
               
                  vanemate (emaste kiivrike) suremus ei ületa katse lõpus 20 %;
               
            
                  —
               
               
                  katse lõpus elus oleva vanema kohta saadud elusate järglaste keskmine arv on ≥ 60.
               
            1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Seadmed
      Katseanumad ja muud seadmed, mis puutuvad kokku uuritava lahustega, peaksid olema üleni klaasist või muust keemiliselt inertsest materjalist. Katseanumad on tavaliselt klaasist keeduklaasid.
      Lisaks võib vaja minna veel järgmisi vahendeid:
      
                  —
               
               
                  hapnikumõõtja (mikroelektroodi või muu sobiva seadmega, mis võimaldaks mõõta lahustunud hapnikku väikese ruumalaga proovides);
               
            
                  —
               
               
                  temperatuuri reguleerimiseks vajalikud seadmed;
               
            
                  —
               
               
                  pH-meeter;
               
            
                  —
               
               
                  seadmed vee kareduse määramiseks;
               
            
                  —
               
               
                  seadmed vee summaarse orgaanilise süsiniku sisalduse määramiseks või seadmed keemilise hapnikutarbe määramiseks;
               
            
                  —
               
               
                  sobivad seadmed valgusrežiimi kontrollimiseks ja valguse intensiivsuse mõõtmiseks.
               
            1.6.2.   Katsealune organism
      Katses kasutatav liik on Daphnia magna Straus. Muid Daphnia liike võib kasutada tingimusel, et nad vastavad vajalikele valiidsuskriteeriumidele (kontrollrühma sigivusega seotud valiidsuskriteerium peaks olema Daphnia liikidele iseloomulik). Kui kasutatakse muid Daphnia liike, tuleb nad selgelt identifitseerida ja nende kasutamine põhjendada.
      Eelistatavalt tuleks kloon identifitseerida genotüübi määramise teel. Teadusuuringud (1) on näidanud, et klooni A (pärit IRCHAst Prantsusmaalt) (3) sigivuse puhul on keskmine valiidsuskriteerium järjekindlalt ≥ 60 järglast ellujäänud vanema kohta, kui kultiveerimine toimub käesoleva meetodi tingimuste kohaselt. Vastuvõetav on ka muude kloonide kasutamine, kui tõendatakse, et kiivrike kultuur vastab katse valiidsuskriteeriumidele.
      Katse alguses ei tohi loomad olla üle 24 tunni vanad ning nad ei tohi olla esimese haudme järglased. Loomad peaksid olema terved (st neil ei tohi olla selliseid stressi tunnuseid nagu kõrge suremus, isaste ja rüpjade esinemine, esimese haudme saamise viibimine, loomade värvuse muutumine jms). Loomi tuleks säilitada katsetingimustega sarnastes kultiveerimistingimustes (valgus, temperatuur, katsevedelik, söötmine ja loomade arv ühikuruumala kohta). Kui katses kasutatav kiivriku kultiveerimise keskkond erineb keskkonnast, mida kasutatakse kiivriku rutiinse kultiveerimise puhul, on hea tava kasutada vanemate stressi vältimiseks enne katset tavaliselt umbes kolme nädala pikkust (st üks põlvkond) aklimatiseerimisperioodi.
      1.6.3.   Katsekeskkond
      Kõnealuses katses on soovitatav kasutada täielikult määratletud keskkonda. See aitab vältida raskesti iseloomustatavate lisaainete (nt merevetikad, mullaekstraktid jms) kasutamist ja parandab seega laboritevahelise standardimise võimalusi. On leitud, et selleks otstarbeks sobivad keskkonnad on Elendt M4 (4) ja M7 (vt 1. liidet). Eeldusel, et kiivrikukultuur vastab katse valiidsuskriteeriumidele, on vastuvõetavad siiski ka muud keskkonnad (nt 5, 6).
      Kui kasutatakse määratlemata lisaaineid sisaldavat keskkonda, tuleb need lisaained selgelt määratleda ning katsearuandes tuleks esitada teave koostise ja eelkõige süsinikusisalduse kohta, sest see võib toetada toiduvalikut. Soovitav on kindlaks määrata orgaanilise lisaaine põhilahuse summaarne orgaanilise süsiniku sisaldus ja/või keemiline hapnikutarve ja hinnata sellest tulenev panus summaarses orgaanilises süsiniku sisalduses/keemilises hapnikutarbes katsekeskkonnas. Keskkonna summaarse orgaanilise süsiniku sisalduse tase (enne vetikate lisamist) võiks olla madalam kui 2 mg/l (7).
      Kui uuringud tehakse metalle sisaldavate ainetega, on oluline meeles pidada, et katsekeskkonna omadused (nt karedus, kelaatimisvõime) võivad mõjutada uuritava aine toksilisust. Seepärast on soovitav kasutada täpselt määratletud keskkonda. Praegu on ainsad täpselt määratletud keskkonnad, mis teadaolevalt sobivad Daphnia magna pikaajaliseks kultiveerimiseks, Elendt M4 ja M7. Mõlemad keskkonnad sisaldavad kelaativat ainet EDTA. Töö on näidanud (2), et kui sigivust puudutav katse sooritatakse M4 ja M7 keskkonnas, on kaadmiumi „näiline mürgisus” üldiselt madalam katsekeskkonna puhul, milles puudub EDTA. Seepärast ei soovitata M4 ja M7 kasutada uuringute tegemiseks metalle sisaldavate ainetega ning vältida tuleks ka muid keskkondi, mis sisaldavad teadaolevaid kelaativaid aineid. Metalli sisaldavate ainete puhul on soovitatav kasutada alternatiivset keskkonda, näiteks ASTMi taastatud karedat magedat vett (7), mis ei sisalda EDTA-d ja millele on lisatud vetikaekstrakti (8). Kõnealune ASTMi taastatud kareda mageda vee ja vetikaekstrakti kombinatsioon on sobiv ka hiidkiivriku pikaajaliseks kultiveerimiseks ja uuringute tegemiseks (2), kuigi lisatud vetikaekstrakti orgaanilise komponendi tõttu võib sellel olla kergelt kelaativ toime.
      Katse alguses ja selle jooksul peaks lahustunud hapniku sisaldus olema üle 3 mg/l. pH peaks olema vahemikus 6–9 ning tavaliselt ei tohiks see ühe katse jooksul kõikuda rohkem kui 1,5 ühikut. Soovitatav karedus on üle 140 mg/l (väljendatud CaCO3). Kõnealusel tasemel tehtud katsete puhul on sigivus olnud vastavuses valiidsuskriteeriumidega (9, 10).
      1.6.4.   Uuritavad lahused
      Valitud kontsentratsiooniga uuritavad lahused valmistatakse tavaliselt põhilahuse lahjendamise teel. Põhilahuse valmistamiseks on soovitatav lahustada aine katsekeskkonnas.
      Mõningatel juhtudel tuleb piisava kontsentratsiooniga põhilahuse saamiseks kasutada orgaanilisi lahusteid või dispergaatoreid, kuid selliste materjalide kasutamist tuleks igati vältida. Sobivad lahustid on näiteks atsetoon, etanool, metanool, dimetüülformamiid ja trietüleenglükool. Sobivad dispergaatorid on näiteks Cremophor RH 40, 0,01 % metüültselluloos ja HCO-40. Mingil juhul ei tohiks uuritava aine hulk uuritavates lahustes ületada lahustuvuse piiri katsekeskkonnas.
      Lahusteid kasutatakse selleks, et saada põhilahus, mida on võimalik täpselt vette annustada. Kui lahusti kontsentratsioon lõplikus katsekeskkonnas on soovitataval tasemel (st ≤ 0,1 ml/l), ei ole eespool loetletud lahustid toksilised ega suurenda aine lahustuvust vees.
      Dispergaatorid võivad kaasa aidata täpsele annustamisele ja dispergeerimisele. Kui dispergaatori kontsentratsioon lõplikus katsekeskkonnas on soovitataval tasemel (≤ 0,1 ml/l), ei ole eespool loetletud dispergaatorid toksilised ega suurenda aine lahustuvust vees.
      1.7.   KATSE KAVANDAMINE
      Uuritava aine jaotamine katseanumatesse ja katseanumate hilisem käitlemine peaks toimuma korrapäratult. Kui nii ei tehta, võib see põhjustada nihke, mida võib tõlgendada kontsentratsiooni mõjuna. Eelkõige juhul, kui katseühikuid käideldakse jaotamise või kontsentratsiooni järjekorras, võib mõni ajaga seotud tegur, näiteks uuringu läbiviija väsimus või muu viga, põhjustada suurema kontsentratsiooni korral tugevamaid mõjusid. Kui katse tulemusi võivad mõjutada tingimused katse alguses või keskkonnatingimused, näiteks asukoht laboris, tuleks kaaluda katse katkestamist.
      1.8.   KATSE KÄIK
      1.8.1.   Kokkupuutetingimused
      1.8.1.1.   Kestus
      Katse kestab 21 päeva.
      1.8.1.2.   Laadimine
      Vanemad jaotatakse ükshaaval katseanumatesse üks loom anuma kohta, kus on 50–100 ml katsevedelikku.
      Vahel võib uuritava aine kontsentratsiooni määramiseks kasutatava analüütilise menetluse nõuete täitmiseks kasutada suuremaid koguseid, kuid lubatud on ka dubleerivate proovide kogumine keemilise analüüsi jaoks. Kui kasutatava katsevedeliku ruumala on üle 100 ml, võib kiivrikutele antava toidu hulka suurendada, et tagada piisava toidu olemasolu ja vastavus valiidsuskriteeriumidele. Läbivoolukatsete korral võib tehnilistel põhjustel kaaluda teistsugust uuringu kavandamist (nt neli kümnekiivrikulist rühma suuremas katseruumalas), kuid kõigist uuringu plaani muudatustest tuleks teatada.
      1.8.1.3.   Loomade arv
      Poolstaatiliste katsete puhul vähemalt 10 eraldi peetavat looma iga uuritava kontsentratsiooni kohta ja vähemalt 10 eraldi peetavat looma kontrollrühmas.
      Läbivoolukatsete korral on osutunud sobivaks 40 looma kasutamine, kes on jagatud nelja kümneliikmelisse rühma iga uuritava kontsentratsiooni kohta (1). Kasutada võib ka väiksemat katsealuste organismide hulka ning soovitatav on kontsentratsiooni kohta vähemalt 20 looma, kes on jagatud kahe või enama võrdse loomade arvuga dubleeriva proovi vahel (nt neli dubleerivat proovi, igas neist viis kiivrikut). Tuleb märkida, et kui loomi peetakse rühmadena, ei saa sigivust väljendada iga katse lõpus elus oleva vanema kohta saadud elus järglaste koguarvuna, juhul kui vanemad surevad. Sellistel juhtudel tuleks sigivust väljendada katse alguses elus olnud iga vanema kohta saadud elus järglaste koguarvuna.
      1.8.1.4.   Söötmine
      Poolstaatiliste katsete puhul peaks kiivrikke söötma iga päev ning soovitatavalt vähemalt kolm korda nädalas (st vastavalt katsekeskkonna vahetusele). Kõrvalekalletest (nt läbivoolukatsete korral) tuleks teatada.
      Katse jooksul peaksid vanemate söödavaliku moodustama peamiselt ühe või mitme järgmise vetikaliigi elusad rakud: Chlorella sp., Selenastrum capricornutum (nüüd Pseudokirchneriella subcapitata (11)) ja Scenedesmus subspicatus. Söödavaliku aluseks peaks olema igale vanemale pakutava orgaanilise süsiniku (C) kogus. Teadusuuringud (12) on näidanud, et hiidkiivrikute puhul on annus 0,1–0,2 mg süsinikku kiivriku kohta päevas piisav, et saada katse valiidsuskriteeriumide täitmiseks vajalik arv järglasi. Sööta võib anda püsiva kogusena kogu katseperioodi jooksul või soovi korral võib alguses kasutada väiksemat kogust, mida siis katse käigus suurendatakse, et võtta arvesse vanemate kasvamist. Sellisel juhul peaks sööda kogus jääma siiski soovitatava annuse piiresse 0,1–0,2 mg süsinikku kiivriku kohta päevas kogu katse vältel.
      Kui nõutava annuse söötmisel kasutatakse asendusmeetmeid, näiteks vetikarakkude arvu või valguse neeldumist (näiteks lihtsustamise huvides, kuna süsinikusisalduse mõõtmine on aeganõudev), peab iga laboratoorium koostama oma nomogrammi, millelt oleks näha asendusmeetme ja vetikakultuuri süsinikusisalduse seos (nõuandeid nomogrammi koostamise kohta vt 2. liidet). Nomogramme tuleks kontrollida vähemalt kord aastas ja juhul, kui vetikakultuuri tingimused on muutunud, siis tihemini. On leitud, et süsinikusisalduse puhul on parem kasutada valguse neeldumist kui rakkude arvu (13).
      Selleks, et minimeerida vetikakultuuri keskkonna sattumine katseanumatesse, tuleks kiivrikuid sööta kontsentreeritud vetikasuspensiooniga. Vetikaid saab kontsentreerida tsentrifuugimisega, millele järgneb resuspensioon destilleeritud vees, deioniseeritud vees või kiivrikute kasvukeskkonnas..
      1.8.1.5.   Valgus
      16 tundi valgust, mille intensiivsus ei ole suurem kui 15–20 μE· m–2 · s-1.
      1.8.1.6.   Temperatuur
      Katsekeskkonna temperatuur peaks olema vahemikus 18–22 oC. Ühe individuaalse katse puhul ei tohiks temperatuur nimetatud piirides võimaluse korral siiski kõikuda rohkem kui 2 oC (st 18–20, 19–21 või 20–22 oC). Temperatuuri jälgimiseks võib olla otstarbekas kasutada täiendavat katseanumat.
      1.8.1.7.   Õhustus
      Katseanumaid ei tohi katse käigus õhustada.
      1.8.2.   Uuritav kontsentratsioon
      Tavaliselt peaks kasutama vähemalt viit uuritavat kontsentratsiooni geomeetrilises jadas, mille eraldustegur ei tohiks soovitatavalt olla suurem kui 3,2, ning iga uuritava kontsentratsiooni puhul tuleks kasutada sobivat arvu dubleerivaid proove (vt punkti 1.8.1.3). Vähema kui viie kontsentratsiooni kasutamine tuleb põhjendada. Aineid ei tohiks uurida, kui kontsentratsioon katsekeskkonnas on kõrgem kui nende lahustuvuse piir.
      Kontsentratsioonivahemike määratlemisel tuleks meeles pidada järgmist:
      
                  i)
               
               
                  kui eesmärk on määrata kindlaks LOEC/NOEC, peab madalaim uuritav kontsentratsioon olema piisavalt madal, et sigivus sellise kontsentratsiooni juures ei oleks märkimisväärselt madalam kui kontrollrühmas. Vastupidisel juhul tuleb katset korrata väiksema madalaima kontsentratsiooniga;
               
            
                  ii)
               
               
                  kui eesmärk on määrata kindlaks LOEC/NOEC, peab kõrgeim katsekontsentratsioon olema piisavalt kõrge, et sigivus sellise kontsentratsiooni juures oleks märkimisväärselt madalam kui kontrollrühmas. Vastupidisel juhul tuleb katset korrata suurema kõrgeima kontsentratsiooniga;
               
            
                  iii)
               
               
                  kui hinnatakse ECX mõju sigivusele, on soovitatav kasutada kontsentratsioone, mis oleksid piisavad, et määratleda ECX vajalikul usaldusväärsuse tasemel. Kui hinnatakse EC50 mõju sigivusele, on soovitatav, et kõrgeim uuritav kontsentratsioon oleks suurem kui kõnealune EC50. Kuigi vastupidisel juhul on võimalik hinnata EC50, on EC50 usaldusvahemik väga suur ning kasutatud mudeli adekvaatsuse hindamine rahuldaval moel ei pruugi olla võimalik;
               
            
                  iv)
               
               
                  uuritavate kontsentratsioonide vahemik ei tohiks hõlmata kontsentratsioone, millel on statistiliselt märkimisväärne mõju täiskasvanud isendite eluspüsimisele, kuna sellisel juhul ei uurita selle katsega enam mitte ainult sigivust, vaid sigivuse ja suremuse kombinatsiooni, ning see eeldaks palju keerukama statistilise analüüsi kasutamist.
               
            Eelnevad teadmised uuritava aine toksilisusest (nt ägeda toksilisuse katse ja/või vahemiku leidmise katsed) peaksid aitama sobivaid uuritavaid kontsentratsioone välja valida.
      Kui uuritava lahuse valmistamiseks kasutatakse lahustit või dispergaatorit (vt punkti 1.6.4), ei tohiks selle lõplik kontsentratsioon katseanumas olla suurem kui 0,1 ml/l ning see kontsentratsioon peaks kõigis katseanumates olema sama.
      1.8.3.   Kontrollkatsed
      Lisaks katseseeriale tuleks teha üks katsekeskkonna kontrollkatsete seeria ja vajaduse korral ka üks lahustit või dispergaatorit sisaldav kontrollkatsete seeria. Lahusti või dispergaatori korral peaks nende kontsentratsioon olema sama mis uuritavat ainet sisaldavates anumates. Kasutada tuleks sobivat hulka dubleerivaid proove (vt punkti 1.8.1.3).
      Tavaliselt peaks korralikult läbiviidud katse puhul olema kontrollrühmas (kontrollrühmades) vanema kohta saadud elus järglaste keskmise arvu variatsioonikordaja ≤ 25 % ning see tuleks ära märkida, kui katses kasutatakse eraldi peetavaid loomi.
      1.8.4.   Katsekeskkonna uuendamine
      Katsekeskkonna uuendamise sagedus sõltub uuritava aine püsivusest, kuid see sagedus peaks olema vähemalt kolm korda nädalas. Kui esialgse püsivuse katse (vt punkti 1.4) käigus ilmneb, et maksimaalse uuendamisperioodi (st kolme päeva) jooksul ei ole uuritava aine kontsentratsioon püsiv (st väljaspool 80–120 % vahemikku või madalam kui 80 % esialgsest mõõdetud kontsentratsioonist), tuleks kaaluda katsekeskkonna sagedasemat uuendamist või kasutada läbivoolukatset.
      Kui katsekeskkonda uuendatakse poolstaatiliste katsete puhul, valmistatakse ette teine seeria katseanumaid ning vanemad teisaldatakse nendesse näiteks sobiva läbimõõduga klaaspipeti abil. Koos kiivrikutega teisaldatava katsevedeliku kogus peaks olema minimaalne.
      1.8.5.   Vaatlused
      Katse jooksul tehtud vaatluste tulemused tuleks panna kirja andmelehtedele (vt näidiseid 3. ja 4. liites). Kui on vaja teha muid määramisi (vt 1.3 ja 1.8.8), võib vajalikuks osutuda täiendavate vaatluste tegemine.
      1.8.6.   Järglased
      Iga vanema järglased tuleks eelistatavalt pärast esimese haudme ilmumist iga päev eemaldada ja üle lugeda, et nad ei saaks ära süüa täiskasvanud isendile mõeldud sööta. Käesoleva meetodi puhul tuleb üle lugeda ainult elusad järglased, kuid kirja tuleks panna ka aborteerunud munad ja surnud järglased.
      1.8.7.   Suremus
      Vanemate suremus tuleks registreerida soovitatavalt kord päevas vähemalt järglaste loendamisega samal ajal.
      1.8.8.   Muud parameetrid
      Kuigi selle meetodi põhieesmärk on hinnata mõjusid sigivusele, on võimalik ka muude mõjude esinemine piisavates kogustes selleks, et neid statistiliselt analüüsida. Väga soovitatav on kasvuandmete kogumine, sest see annaks teavet võimalike subletaalsete mõjude kohta, mis võivad olla kasulikumad kui ainult sigivust käsitlevate mõõtmiste tulemused; katse lõpus on soovitatav mõõta vanemate pikkus (st kehapikkus, v.a koja tagaotsas olev oga). Lisaks sellele võib mõõta või arvutada veel järgmised parameetrid: aeg esimese haudme (ja sellele järgnevate haudmete) saamiseni, haudmete arv ja suurus looma kohta, aborteerunud haudmete arv, isasloomade ja rüpjade esinemine ja populatsiooni kasvu sisemine määr.
      1.8.9.   Analüütiliste määramiste ja mõõtmiste sagedus
      Hapnikusisaldust, temperatuuri, vee karedust ja pH taset tuleks mõõta vähemalt kord nädalas värskes ja vanas katsekeskkonnas, kontrollrühmas (-rühmades) ja kõrgeima uuritava aine kontsentratsiooniga katseanumas.
      Katse käigus määratakse uuritava aine kontsentratsioon kindlaks korrapäraste ajavahemike järel.
      Poolstaatiliste katsete puhul, kui võib eeldada, et uuritava aine kontsentratsioon jääb vahemikku ± 20 % nimiväärtusest (st vahemikku 80–120 %; vt 1.4 ja 1.8.4), on soovitatav analüüsida vähemalt madalaimat ja kõrgeimat uuritavat kontsentratsiooni vahetult pärast valmistamist ja uuendamise ajal üks kord esimese nädala jooksul (st analüüsida tuleks proovi, mis on võetud samast lahusest – kohe pärast valmistamist ja uuendamise ajal). Hiljem tuleks nimetatud määramisi korrata vähemalt iga nädala järel.
      Kui katsete puhul ei eeldata, et uuritava aine kontsentratsioon jääb vahemikku ± 20 % nimiväärtusest, tuleb analüüsida kõiki uuritavaid kontsentratsioone vahetult pärast valmistamist ja uuendamise ajal. Kui aga tegemist on katsega, mille puhul esialgne mõõdetud uuritava aine kontsentratsioon ei jää vahemikku ± 20 % nimiväärtusest, kuid esitatakse piisavalt tõendeid selle kohta, et esialgsed kontsentratsioonid on korratavad ja püsivad (st jäävad vahemikku 80–120 % esialgsest kontsentratsioonist), võib katse teisel ja kolmandal nädalal keemilisi määramisi vähendada ja piirduda vaid kõrgeima ja madalaima uuritava kontsentratsiooni analüüsimisega. Igal juhul tuleb enne uuendamist määrata uuritava aine kontsentratsioon ainult ühel dubleerivat proovi sisaldaval anumal iga uuritava kontsentratsiooni kohta.
      Kui kasutatakse läbivoolukatset, on otstarbekas kasutada samasugust korda nagu poolstaatiliste katsete puhul kirjeldatud (kuid sellisel juhul ei ole võimalik mõõta „vanu” lahuseid). Siiski võib olla soovitatav suurendada proovide võtmise arvu esimesel nädalal (nt kolm mõõtmist), et tagada uuritavate kontsentratsioonide püsivuse säilimine. Seda tüüpi katsete puhul tuleks lahjendusvedeliku ja uuritava aine voolukiirust kontrollida iga päev.
      Kui on tõendeid selle kohta, et uuritava aine kontsentratsioon on kogu katse vältel püsinud rahuldaval moel vahemikus ± 20 % nimiväärtusest või esialgselt mõõdetud kontsentratsioonist, võivad tulemused põhineda nimiväärtusel või esialgselt mõõdetud väärtusel. Kui kõrvalekaldumine nimiväärtusest või esialgselt mõõdetud kontsentratsioonist on suurem kui ± 20 %, tuleks tulemused esitada aja-kaalu keskmistena (vt 5. liidet).
      2.   ANDMED JA ARUANDLUS
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE
      Käesoleva katse eesmärk on määrata kindlaks uuritava aine mõju katse lõpus elus olevate vanemate kohta saadud elus järglaste koguarvule. Vanema kohta saadud järglaste koguarv tuleks arvutada iga katseanuma (st iga dubleeriva proovi) kohta. Kui mõnes dubleerivas proovis kasutatav vanem sureb katse ajal või osutub isasloomaks, jäetakse see dubleeriv proov analüüsist välja. Analüüsi aluseks võetakse sel juhul väiksem arv dubleerivaid proove.
      Kui hinnatakse kemikaali mõju sigivusele ja määratakse LOEC ja seega ka NOEC, tuleb arvutada keskmine sigivus dubleerivate proovide lõikes iga kontsentratsiooni puhul ja summaarse standardhälbe jääk ning seda saab teha dispersioonanalüüsiga (ANOVA). Seejärel tuleb iga kontsentratsiooni keskmist võrrelda kontrollrühma keskmisega, kasutades selleks sobivat mitmese võrdluse meetodit. Dunnetti ja Williamsi katsed võivad olla kasulikud (14, 15, 16, 17). Tuleb kontrollida, kas ANOVA eeldus dispersiooni homogeensuse kohta peab paika. Seda oleks soovitatav teha graafiliselt, mitte formaalse statistilise olulisuse katsega (18); alternatiivse võimalusena võib teha Bartletti katse. Kui see eeldus ei pea paika, tuleks kaaluda andmete teisendamist, et homogeniseerida dispersioon enne ANOVA tegemist, või kaalutud ANOVA tegemist. ANOVA abil täheldatud mõju suurus (st väikseim tähendust omav erinevus) tuleks välja arvutada ja aruandesse kirja panna.
      Sellise kontsentratsiooni hindamiseks, mis põhjustaks paljunemisvõime 50 % vähenemise (st EC50), tuleks andmetega sobitada sobiv kõver, näiteks logistiline kõver, kasutades näiteks sellist statistikameetodit nagu vähimruutude meetod. Kõvera võiks parametriseerida nii, et EC50 ja selle standardviga saaks vahetult hinnata. See hõlbustaks märkimisväärselt EC50 usalduspiiri arvutamist. Kui puuduvad põhjused eelistada teistsuguseid usaldusnivoosid, tuleks kasutada kahepoolset 95 % usalduspiiri. Sobituskord võiks olla selline, et selle põhjal saaks hinnata sobivuse puudumise tähendust. Seda saab teha graafiliselt või jagades ruutude jääksumma sobivuse puudumise ja puhta vea komponentideks ning tehes sobivuse puudumise statistilise olulisuse katse. Selliste menetluste puhul, millega kaasneb sigivuse kõrge tase, on saadud noorloomade arvu dispersioon tõenäoliselt suurem kui menetluse puhul, millega kaasneb sigivuse madal tase, ja seetõttu tuleks kaaluda täheldatud väärtuste kaalumist selliselt, et neis kajastuks erinev dispersioon eri menetlusrühmades (taustainfo kohta vt viidet 18).
      Lõpliku laboritevahelise võrdlusuuringu (2) andmete analüüsimiseks sobitati logistiline kõver järgmise valemi abil, kuid kasutada võib ka muid sobivaid valemeid:
      
         
      kus:
      
                  Y
               
               
                  =
               
               
                  katse lõpus elus oleva vanema kohta saadud noorloomade koguarv (arvutatud iga anuma kohta)
               
            
                  x
               
               
                  =
               
               
                  aine kontsentratsioon
               
            
                  c
               
               
                  =
               
               
                  noorloomade eeldatav arv, kui x = 0
               
            
                  x0
                  
               
               
                  =
               
               
                  populatsiooni EC50
                  
               
            
                  b
               
               
                  =
               
               
                  tõusu iseloomustav parameeter.
               
            Nimetatud valem sobib tõenäoliselt suure hulga olukordade jaoks, kuid on olemas ka katseid, mille jaoks see ei sobi. Valemi valiidsust tuleks kontrollida eespool soovitatud viisil. Mõningatel juhtudel võib otstarbekaks osutuda hormeesivalem, mille puhul madalal kontsentratsioonil on märkimisväärne mõju (19).
      Hinnata võib ka muid mõjuga seotud kontsentratsioone, näiteks EC10 ja EC20, kuigi valemi puhul võiks eelistada teistsugust parametriseerimist kui seda, mille abil hinnati EC50.
      2.2.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      2.2.1.   Uuritav aine:
      
                  —
               
               
                  füüsikaline loomus ja asjaomased füüsikalis-keemilised;
               
            
                  —
               
               
                  omadused, keemilised identifitseerimisandmed, sealhulgas puhtus.
               
            2.2.2.   Katsealused liigid:
      
                  —
               
               
                  kloon (kas genotüüp on määratud), tarnija või päritolu (kui on teada) ja kasutatud kultiveerimistingimused. Kui kasutatakse muud hiidkiivriku liiki, tuleks see ära märkida ja seda põhjendada.
               
            2.2.3.   Katsetingimused:
      
                  —
               
               
                  kasutatud katsemeetod (nt poolstaatiline või läbivoolukatse, ruumala, kiivrikute arv liitri kohta);
               
            
                  —
               
               
                  fotoperiood ja valguse intensiivsus;
               
            
                  —
               
               
                  katse kavandamine (nt dubleerivate proovide arv, vanemate arv dubleeriva proovi kohta),;
               
            
                  —
               
               
                  andmed kasutatud kultiveerimiskeskkonna kohta;
               
            
                  —
               
               
                  vajaduse korral kasutatud orgaanilised lisaained, sh koostis, päritolu, valmistusmeetod, põhilahuse summaarne orgaanilise süsiniku sisaldus/keemiline hapnikutarve, sellest tulenev summaarse orgaanilise süsiniku sisalduse/keemilise hapnikutarbe hindamine katsekeskkonnas;
               
            
                  —
               
               
                  üksikasjalikud andmed söötmise kohta, sealhulgas kogus (mg C kiivriku kohta päevas) ja ajakava (nt sööda (söötade) liik, sh vetikate puhul konkreetne (liigi) nimi ja võimaluse korral ka liin, kultiveerimistingimused);
               
            
                  —
               
               
                  põhilahuse valmistamise meetod ja uuendamissagedus (kui kasutatakse lahustit või dispergaatorit, tuleb esitada selle nimi ja kontsentratsioon).
               
            2.2.4.   Tulemused:
      
                  —
               
               
                  võimalike uuritava aine püsivust käsitlevate eeluuringute tulemused;
               
            
                  —
               
               
                  nominaalsed uuritavad kontsentratsioonid ja kõigi uuritava aine kontsentratsiooni määramiseks katseanumates tehtud analüüside tulemused (vt andmelehtede näidised 4. liites); esitada tuleks ka meetodi tulemuslikkus ja määramispiir;
               
            
                  —
               
               
                  katseanumates oleva vee kvaliteet (st pH, temperatuur ja lahustunud hapniku sisaldus, summaarne orgaanilise süsiniku sisaldus ja/või keemiline hapnikutarve ja vajaduse korral vee karedus) (vt andmelehe näidist 3. liites);
               
            
                  —
               
               
                  täielikud andmed iga vanema saadud elus järglaste kohta (vt andmelehe näidist 3. liites);
               
            
                  —
               
               
                  vanemate surmajuhtude arv ja surmapäev (vt andmelehe näidist 3. liites);
               
            
                  —
               
               
                  kontrollrühma sigivuse variatsioonikordaja (katse lõpus elus oleva vanema kohta saadud elus järglaste koguarvu põhjal);
               
            
                  —
               
               
                  graafik, mis kirjeldab katse lõpus elus oleva vanema (iga dubleeriva proovi puhul) kohta saadud järglaste koguarvu suhet uuritava aine kontsentratsiooniga;
               
            
                  —
               
               
                  vähim sigivusele toimet avaldav kontsentratsioon (LOEC), sh kasutatud statistiliste menetluste kirjeldus ja märge selle kohta, kui suurt mõju täheldati, ning sigivusele täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC); vajaduse korral tuleks esitada LOEC/NOEC ka vanemate suremuse kohta;
               
            
                  —
               
               
                  vajaduse korral sigivuse ECX ja usaldusvahemikud ja selle arvutamiseks kasutatud sobitatud valemi graafik, annuse-reaktsiooni kõvera tõusja selle standardviga;
               
            
                  —
               
               
                  muud täheldatud bioloogilised mõjud või mõõtmised; esitada tuleb andmed kõigi täheldatud või mõõdetud bioloogiliste mõjude kohta (nt vanemate kasv) koos võimalike asjakohaste põhjendustega;
               
            
                  —
               
               
                  selgitused kõigi katsemeetodist kõrvalekaldumiste kohta.
               
            3.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 20-21 March 1993.
               
            
                  2)
               
               
                  OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring Test of the Daphnia magna Reproduction Test Paris. 1997.
               
            
                  3)
               
               
                  Baird D. J., Barber J., Bradley M. C., Soares A. M. V. M. and Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss. Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, pp. 257-265.
               
            
                  4)
               
               
                  Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, pp. 25-33.
               
            
                  5)
               
               
                  EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.
               
            
                  6)
               
               
                  Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 47, pp. 775-782.
               
            
                  7)
               
               
                  ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729-88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia P.A. 20 pp.
               
            
                  8)
               
               
                  Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley M. C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In: Proceedings of the 1stEuropean Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Løkke, H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.), pp. 144-148.
               
            
                  9)
               
               
                  Parkhurst B. R., Forte J. L. and Wright G. P. (1981). Reproducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, pp. 1-8.
               
            
                  10)
               
               
                  Cowgill U. M. and Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), pp. 185-196.
               
            
                  11)
               
               
                  Korshikov (1990). Pseudokirchneriella subcapitata Hindak, F-1990. Biologice Prace, 36, 209.
               
            
                  12)
               
               
                  Sims I. R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a standard Daphnia juvenile production test. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, pp. 2053-2058.
               
            
                  13)
               
               
                  Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, pp. 459-466.
               
            
                  14)
               
               
                  Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, pp. 1096-1121.
               
            
                  15)
               
               
                  Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, pp. 482-491.
               
            
                  16)
               
               
                  Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, pp. 103-117.
               
            
                  17)
               
               
                  Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28, pp. 510-531.
               
            
                  18)
               
               
                  Draper N. R. and Smith H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition, Wiley, N.Y.
               
            
                  19)
               
               
                  Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, pp. 93-96.
               
            
                  20)
               
               
                  Wilson E. O. and Bossert, W. H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.
               
            
                  21)
               
               
                  Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, pp. 532.
               
            
                  22)
               
               
                  Meyer J. S., Ingersoll C. G., McDonald L. L. and Boyce M. S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, pp. 1156-1166.
               
            
         1. liide
         TÄIELIKULT MÄÄRATLETUD ELENDTI KESKKONDADE M7 JA M4
         Valmistamine
         Kohanemine Elendti keskkondadega M7 ja M4
         Mõningates laboratooriumites on olnud raskusi kiivrikute viimisega otse keskkonda m4 (1) ja m7. Mõningast edu on siiski saavutatud järkjärgulise aklimatiseerimisega, st viimine oma keskkonnast 30 % elendti sisaldusega keskkonda, seejärel 60 % ja siis 100 % elendti sisaldusega keskkonda. Kohanemisaeg võib kesta kuni kuu aega.
         Valmistamine
         Mikroelemendid
         Kõigepealt valmistatakse sobiva puhtusastmega vees, nt deioniseeritud, destilleeritud või pöördosmoosi teel puhastatud vees individuaalsete mikroelementide eraldi põhilahused (I). Nendest erinevatest põhilahustest (I) valmistatakse üks põhilahus (II), mis sisaldab kõiki mikroelemente (kombineeritud lahus), st:
         
                     Põhilahused I
                     (üks aine)
                  
                  
                     Vette lisatav hulk
                     (mg/l)
                  
                  
                     Kontsentratsioon (keskkonnas M4)
                     (kordades)
                  
                  
                     Kombineeritud põhilahuse II valmistamiseks lisada veele järgmine kogus põhilahust I
                     (ml/l)
                  
               
                     M4
                  
                  
                     M7
                  
               
                     H3BO3
                     
                  
                  
                     57 190
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     MnCl2 * 4H2O
                  
                  
                     7 210
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     LiCl
                  
                  
                     6 120
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     RbCl
                  
                  
                     1 420
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     SrCl2 * 6H2O
                  
                  
                     3 040
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     NaBr
                  
                  
                     320
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     Na2MoO4 * 2H2O
                  
                  
                     1 260
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     CuCl2 * 2H2O
                  
                  
                     335
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     ZnCl2
                     
                  
                  
                     260
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     CoCl2 * 6H2O
                  
                  
                     200
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     Kl
                  
                  
                     65
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     Na2SeO3
                     
                  
                  
                     43,8
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     NH4VO3
                     
                  
                  
                     11,5
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     Na2EDTA * 2H2O
                  
                  
                     5 000
                  
                  
                     2 000
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     FeSO4 * 7H2O
                  
                  
                     1 991
                  
                  
                     2 000
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Nii Na2EDTA kui ka FeSO4 lahused valmistatakse eraldi, valatakse kokku ja autoklaavitakse kohe. Tulemuseks saadakse:
                  
               
                     21 Fe-EDTA lahus
                  
                  
                      
                  
                  
                     1 000
                  
                  
                     20,0
                  
                  
                     5,0
                  
               Keskkonnad M4 ja M7
         Keskkondade M4 ja M7 valmistamiseks kasutatakse põhilahust II, makroelemente ja vitamiine järgmiselt:
         
                      
                  
                  
                     Vette lisatav hulk
                     (mg/l)
                  
                  
                     Kontsentratsioon (keskkonnas M4)
                     (kordades)
                  
                  
                     Keskkonna valmistamiseks lisatud põhilahuse hulk
                     (ml/l)
                  
               
                     M4
                  
                  
                     M7
                  
               
                     Põhilahus II, kombineeritud mikroelemendid
                  
                  
                      
                  
                  
                     20
                  
                  
                     50
                  
                  
                     50
                  
               
                     Makroelementide põhilahused (üks aine)
                  
               
                     CaCl2 * 2H2O
                  
                  
                     293 800
                  
                  
                     1 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     MgSO4 * 7H2O
                  
                  
                     246 600
                  
                  
                     2 000
                  
                  
                     0,5
                  
                  
                     0,5
                  
               
                     KC1
                  
                  
                     58 000
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     NaHCO3
                     
                  
                  
                     64 800
                  
                  
                     1 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     Na2SiO3 * 9H2O
                  
                  
                     50 000
                  
                  
                     5 000
                  
                  
                     0,2
                  
                  
                     0,2
                  
               
                     NaNO3
                     
                  
                  
                     2 740
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     KH2PO4
                     
                  
                  
                     1 430
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     K2HPO4
                     
                  
                  
                     1 840
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     Kombineeritud vitamiinide lahus
                  
                  
                     —
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     Kombineeritud vitamiinide lahuse valmistamiseks lisatakse 3 vitamiini 1 liitrile veele järgmiselt:
                  
               
                     Tiamiinhüdrokloriid
                  
                  
                     750
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Tsüanokobalamiin (B12)
                  
                  
                     10
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Biotiin
                  
                  
                     7,5
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Kombineeritud vitamiinide lahust säilitatakse külmutatuna väikestes alikvootides. Vitamiinid lisatakse katsekeskkonnale vahetult enne kasutamist.
                     
                                 
                                    Märkused
                                 
                              
                              
                                 Soolade sadestumise vältimiseks valmiskeskkonna valmistamisel lisatakse põhilahuse alikvoodid umbes 500–800 ml deioniseeritud veele ning seejärel lisatakse juurde nii palju vett, et kokku saaks 1 liiter.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 M4 keskkonda käsitleva uuringu esimene väljaanne: Elendt, B.P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, pp. 25-33.
                              
                           
               
      
         2. liide
         SUMMAARSE ORGAANILISE SÜSINIKU SISALDUSE ANALÜÜS JA VETIKATEL PÕHINEVA SÖÖDA JAOKS SUMMAARSE ORGAANILISE SÜSINIKU SISALDUSE NOMOGRAMMI KOOSTAMINE
         On teada, et vetikatel põhineva sööda süsinikusisaldust ei mõõdeta tavaliselt otse, vaid asendusparameetrite mõõtmistest (nt vetikarakkude arv või valguse neelduvus) tulenevate korrelatsioonide (st nomogrammi) põhjal.
         Summaarset orgaanilise süsiniku sisaldust tuleks mõõta pigem kõrgel temperatuuril toimuva oksüdatsiooni kui UV või persulfaatmeetodiga. (Vt: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).
         Nomogrammi koostamiseks tuleks vetikad eraldada kasvukeskkonnast tsentrifuugimisega, mille järgneb resuspendeerimine destilleeritud vees. Asendusparameeter ja summaarne orgaanilise süsiniku sisaldus tuleb mõõta igas proovis kolm korda. Analüüsida tuleks ainult destilleeritud ve sisaldavaid proove ning summaarne orgaanilise süsiniku sisaldus leitakse saadud sisalduse lahutamisel vetikaproovi summaarse orgaanilise süsiniku sisaldusest.
         Nomogramm peaks nõutava süsinikusisalduse vahemikus olema lineaarne. Näited on esitatud allpool.
         Märkus. Neid ei tohiks kasutada teisendamiseks; on oluline, et laboratooriumid koostaksid oma nomogrammid ise.
         
            
         
            
         
            
      
      
         3. liide
         SELLISE ANDMELEHE NÄIDIS, MILLELE MÄRGITAKSE KESKKONNA UUENDAMINE, FÜÜSIKALISE/KEEMILISE JÄLGIMISE ANDMED, SÖÖTMINE, KIIVRIKUTE SIGIVUS JA TÄISKASVANUD ISENDITE SUREMUS
         
                     Katse nr:
                  
                  
                     Algkuupäev:
                  
                  
                     Kloon:
                  
                  
                     Keskkond:
                  
                  
                     Sööda liik:
                  
                  
                     Uuritav aine:
                  
                  
                     Nimikontsentratsioon:
                  
               
                     Päev
                  
                  
                     0
                  
                  
                     1
                  
                  
                     2
                  
                  
                     3
                  
                  
                     4
                  
                  
                     5
                  
                  
                     6
                  
                  
                     7
                  
                  
                     8
                  
                  
                     9
                  
                  
                     10
                  
                  
                     11
                  
                  
                     12
                  
                  
                     13
                  
                  
                     14
                  
                  
                     15
                  
                  
                     16
                  
                  
                     17
                  
                  
                     18
                  
                  
                     19
                  
                  
                     20
                  
                  
                     21
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Keskkonna uuendamine (märkida ristiga)
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     PH (37)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     uus
                  
                  
                      
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     vana
                  
                  
                      
                  
               
                     O2 mg/l (37)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     uus
                  
                  
                      
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     vana
                  
                  
                      
                  
               
                     Temperatuur (o C) (37)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     uus
                  
                  
                      
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     vana
                  
                  
                      
                  
               
                     Söötmine (märkida ristiga)
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Elus järglaste arv† (38)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     Kokku
                  
               
                     Anum 1
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     2
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     3
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     4
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     5
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     6
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     7
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     8
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     9
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     10
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     Kokku
                  
                  
                      
                  
               
                     Kumulatiivne täiskasvanud isendite suremus (39)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
      
         4. liide
         SELLISE ANDMELEHE NÄIDIS, MILLELE MÄRGITAKSE KEEMILISE ANALÜÜSI TULEMUSED
         a)   Mõõdetud kontsentratsioonid
         
                     Nimikontsentratsioon
                  
                  
                     1. nädala proov
                  
                  
                     2. nädala proov
                  
                  
                     3. nädala proov
                  
               
                     Värske
                  
                  
                     Vana
                  
                  
                     Värske
                  
                  
                     Vana
                  
                  
                     Värske
                  
                  
                     Vana
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               b)   Mõõdetud kontsentratsioon nimiväärtuse protsendimäärana
         
                     Nimikontsentratsioon
                  
                  
                     1. nädala proov
                  
                  
                     2. nädala proov
                  
                  
                     3. nädala proov
                  
               
                     Värske
                  
                  
                     Vana
                  
                  
                     Värske
                  
                  
                     Vana
                  
                  
                     Värske
                  
                  
                     Vana
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
      
         5. liide
         AJA-KAALU KESKMISE ARVUTAMINE
         Aja-kaalu keskmine
         Arvestades, et uuritava aine kontsentratsioon võib keskkonna uuendamiste vahel väheneda, tuleb vaagida, milline kontsentratsioon on kiivrikute emasloomade keskkonnas esinenud kontsentratsioonide suhtes esindav. Valiku tegemisel tuleks lähtuda nii bioloogilistest kui ka statistilistest teguritest. Näiteks kui arvatakse, et sigivust mõjutab kõige enam kõrgeim kontsentratsioon, siis tuleks kasutada maksimaalset kontsentratsiooni. Kui aga arvatakse, et olulisem on toksilise aine akumulatiivne või pikaajaline mõju, siis on otstarbekam kasutada keskmist kontsentratsiooni. Sellisel juhul on sobiv keskmisena kasutada aja-kaalu keskmist kontsentratsiooni, kuna selle puhul võetakse arvesse hetkekontsentratsioonide varieerumist aja jooksul.
         Joonis 1.
         Aja-kaalu keskmise näide
         
            
         Joonisel 1 on näide (lihtsustatud) katse kohta, mis kestis seitse päeva ja mille puhul vahetati keskkonda 0-, 2. ja 4. päeval.
         
                      
                  
                  
                     Peenike sakiline joon väljendab kontsentratsiooni igal ajahetkel. Eeldatakse, et kontsentratsiooni langus vastab eksponentsiaalsele lagunemisprotsessile.
                  
               
                      
                  
                  
                     Kuus joonisele märgitud punkti kujutavad iga uuendamisperioodi alguses ja lõpus mõõdetud täheldatud kontsentratsioone.
                  
               
                      
                  
                  
                     Jäme pidevjoon näitab aja-kaalu keskmise asukohta.
                  
               Aja-kaalu keskmine arvutatakse selliselt, et aja-kaalu keskmise joone alla jääv ala on võrdne kontsentratsioonikõvera alla jääva alaga. Eespool toodud näidet käsitlevad arvutused on esitatud tabelis 1.
         Tabel 1
         Aja-kaalu keskmise arvutamine
         
                     Uuendami ne nr
                  
                  
                     Päevad
                  
                  
                     Conc0
                  
                  
                     Conc1
                  
                  
                     Ln(Conc0)
                  
                  
                     Ln(Conc1)
                  
                  
                     Pindala
                  
               
                     1
                  
                  
                     2
                  
                  
                     10,000
                  
                  
                     4,493
                  
                  
                     2,303
                  
                  
                     1,503
                  
                  
                     13,767
                  
               
                     2
                  
                  
                     2
                  
                  
                     11,000
                  
                  
                     6,037
                  
                  
                     2,398
                  
                  
                     1,798
                  
                  
                     16,544
                  
               
                     3
                  
                  
                     3
                  
                  
                     10,000
                  
                  
                     4,066
                  
                  
                     2,303
                  
                  
                     1,403
                  
                  
                     19,781
                  
               
                     Päevad kokku: 7
                  
                  
                     Üldpindala
                  
                  
                     50,091
                  
               
                     Aja-kaalu keskmine
                  
                  
                     7,156
                  
               
                     
                        Päevad tähistab uuendamisperioodi päevade arvu.
                     
                        Conc0 tähistab iga uuendamisperioodi alguses mõõdetud kontsentratsiooni.
                     
                        Conc1 tähistab iga uuendamisperioodi lõpus mõõdetud kontsentratsiooni.
                     
                        Ln(Conc0) tähistab Conc0 naturaallogaritmi.
                     
                        Pindala tähistab iga uuendamisperioodi eksponentsiaalkõvera alla jäävat ala. See arvutatakse järgmise valemi kohaselt:
                     
                        Ln(Concl) tähistab Concl naturaallogaritmi.
                     
                        
                  
               Aja-kaalu keskmine on üldpindala, mis on jagatud päevade summaga.
         Kiivriku sigivuse katse puhul tuleb tabelit loomulikult pikendada selliselt, et see hõlmaks 21 päeva.
         On selge, et kui vaatlusi tehakse ainult iga uuendamisperioodi alguses ja lõpus, ei ole võimalik kinnitada, et lagunemisprotsess on tegelikult eksponentsiaalne. Teistsuguse kõvera puhul oleks pindala arvutamine teistsugune. Eksponentsiaalse lagunemisprotsessi olemasolu ei ole siiski ebatõenäoline ning seega on seda kirjeldava kõvera kasutamine muu teabe puudumise korral kõige otstarbekam.
         Juhul, kui keemilise analüüsiga ei leita uuendamisperioodi lõpus jälgi uuritavast ainest, tuleb siiski olla ettevaatlik. Kui aine kadumise kiirust lahusest ei ole võimalik hinnata, on võimatu saada kõvera alla tõelevastavat pindala ja seega ei ole võimalik saada mõistlikku aja-kaalu keskmist.
      
      C.21.   MULLAMIKROOBID: LÄMMASTIKU TRANSFORMATSIOONI KATSE
      1.   MEETOD
      Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 216 (2000).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesolev katsemeetod kirjeldab laborimeetodit, mis on välja töötatud kemikaalide pikaajaliste mõjude uurimiseks mullamikroobide lämmastiku transformatsiooni suhtes pärast ühekordset kokkupuudet Katse põhineb peamiselt Euroopa ja Vahemeremaade taimekaitseorganisatsiooni soovitustel (1). Samuti võetakse arvesse muid juhised, sh Saksa Biologische Bundesanstalti (2), USA Keskkonnakaitseagentuuri (3), SETACi (4) ja Rahvusvahelise Standardiorganisatsiooni (5) juhiseid. Käesolevas katses kasutatavate mullaproovide arvu ja tüüpide osas lepiti kokku mulla ja sedimentide valikut käsitlevas OECD töörühmas, mis tuli kokku Belgirates Itaalias 1995. aastal (6). Mullaproovide kogumist, käsitlemist ja säilitamist käsitlevad soovitused põhinevad ISO juhisdokumendil (7) ja Belgirate töörühma soovitustel. Katseainete toksiliste omaduste hindamisel võib osutuda vajalikuks määrata kindlaks mõjud mulla mikroobsele aktiivsusele, nt kui vajatakse andmeid põllukultuuride kaitsevahendite võimalike kõrvalmõjude kohta mulla mikrofloora suhtes või kui eeldatakse mullamikroobide kokkupuudet muude kemikaalidega kui põllukultuuride kaitsevahendid. Lämmastiku transformatsiooni katse tehakse selleks, et kindlaks määrata selliste kemikaalide mõju mulla mikrofloorale. Kui uuritakse agrokemikaale (nt põllukultuuride kaitsevahendid, väetised, metsanduskemikaalid), sooritatakse nii lämmastiku transformatsiooni kui ka süsiniku transformatsiooni katse. Kui uuritakse muid kui agrokemikaale, piisab lämmastiku transformatsiooni katsest. Kui selliste kemikaalide lämmastiku transformatsiooni katses saadud EC50-väärtused on kaubanduslike nitrifikatsiooniinhibiitorite (nt nitrapüriin) esindavas vahemikus, saab täiendava teabe kogumiseks teha süsiniku transformatsiooni katse.
      Muld koosneb elusatest ja elututes koostisosadest, mis eksisteerivad keerukates ja heterogeensetes segudes. Mikroobid mängivad tähtsat rolli viljaka mulla orgaanilise aine hajutamisel ja muutmisel, ning mõned liigid mõjutavad mulla viljakuse erinevaid aspekte. Kõik nimetatud biokeemiliste protsesside pikaajalised häired võivad häirida toitaineringlust ja see võib muuta mulla viljakust. Süsiniku ja lämmastiku transformatsioon toimub kõikides viljakates muldades. Kuigi nimetatud protsesse põhjustavad mikroobikogumid on mullati erinev, on transformatsioonirajad oma olemuselt samad.
      Käesolev katsemeetod on välja töötatud selleks, et avastada aine pikaajalisi negatiivseid mõjusid aeroobsete pinnamuldade lämmastikutransformatsiooni protsessile. Katsemeetod võimaldab samuti hinnata ainete mõjusid mulla mikrofloora süsiniku transformatsioonile. Nitraat tekib pärast süsinik-lämmastiksidemete lagunemist. Seetõttu kui nitraadi teke leitakse olevat samal tasemel katse- ja kontrollmuldades, on väga tõenäoline, et peamised süsinikusidemete lagunemisteed on puutumata ja toimivad hästi. Katses kasutatava substraadi (peenestatud lutsernijahu) süsiniku-lämmastiku suhe on soodne (tavaliselt 12/1 ja 16/1). Seetõttu ei vähendata süsiniku puudust katse käigus ja kui mikroobikogumeid kahjustab kemikaal, siis taastuvad need 100 päeva jooksul.
      Käesoleva katsemeetodi aluseks olevad katsed töötati välja peamiselt ainete jaoks, mille pinnasesse jõudvat kogust saab ennustada. Sellised ained on näiteks põllukultuuride kaitsevahendid, mille annustamine põllule on teada. Agrokemikaalide puhul piisab sellest, kui uuritakse kahte annust oletatava annustamissageduse osas. Agrokemikaalide puhul saab uurida toimeaineid (a.i.) või preparaate. Katse ei piirdu siiski vaid agrokemikaalidega. Muutes nii pinnasesse annustavaid katseaine koguseid kui ka seda, kuidas andmeid hinnatakse, saab kasutada katset kemikaalide puhul, mille pinnasesse jõudev kogus ei ole teada. Seega määratakse kindlaks muude kemikaalide kui agrokemikaalid puhul kontsentratsiooni ridade mõjud lämmastiku transformatsioonile. Nimetatud katsetest saadud andmeid kasutatakse annuse-reaktsiooni kõvera koostamiseks ja ECX väärtuste arvutamiseks, milles x on mõju protsendina.
      1.2.   MÕISTED
      
         Lämmastiku transformatsioon – mikroobide tegevuse tulemusena ammonifikatsiooni- ja nitrifikatsiooniprotsessi kaudu toimuv, lämmastikku sisaldava orgaanilise aine lõplik lagunemine vastavaks anorgaaniliseks lõppsaaduseks, nitraadiks.
      
         EC
         
            X
         
         (efektiivkontsentratsioon) – mullas esineva katseaine kontsentratsioon, mis tõkestab lämmastiku transformatsiooni nitraadiks x protsenti.
      
         EC
         
            50
         
         (efektiivkontsentratsiooni mediaan) – mullas esineva katseaine kontsentratsioon, mis tõkestab lämmastiku transformatsiooni nitraadiks 50 protsenti (50 %).
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Sõelutud mulda parandatakse peenestatud taimejahuga ning seda kas töödeldakse seejärel katseainega või jäetakse töötlemata (kontrollproov). Kui uuritakse agrokemikaale, on soovitav kasutada vähemalt kahte katsekontsentratsiooni ja need tuleks valida suurima kontsentratsiooni suhtes, mis eeldatavasti esineb põllul. Pärast inkubeerimise 0-, 7., 14. ja 28. päeva ekstraheeritakse katse- ja kontrollmullaproove sobiva lahustiga ning määratakse kindlaks ekstraktides esinevad nitraadikogused. Nitraaditekke kiirust katseproovides võrreldakse kiirusega kontrollproovides ning arvutatakse katse- ja kontrollproovide protsentuaalne hälve. Kõik katsed kestavad vähemalt 28 päeva. Kui 28. päeval on katse- ja kontrollmullaproovide vahelised erinevused võrdsed või suuremad kui 25 %, jätkatakse mõõtmisi kuni 100 päeva. Kui ei uurita agrokemikaale, lisatakse mullaproovidele katseaine kontsentratsiooni ridu ning katse- ja kontrollproovides tekkinud nitraadikoguseid mõõdetakse pärast 28 inkubeerimispäeva. Mitmekordseid kontsentratsioone käsitlevate katsete tulemusi analüüsitakse regressioonmudelit kasutades, ning arvutatakse väärtused (s.t EC50, EC25 ja/või EC10). Vt mõisteid.
      1.5.   KATSE VALIIDSUS
      Agrokemikaalidega tehtud katsete tulemuste hindamine põhineb suhtelistelt väikestel erinevustel (s.t keskmine väärtus on ± 25 %) kontroll- ja katsemullaproovide nitraadi kontsentratsioonide vahel, et kontrollproovide suured muutused võib viia väärate tulemusteni. Seetõttu peaksid paralleelsete kontrollproovide vahelised muutused olema väiksemad kui ± 15 %.
      1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Seadmed
      Katsetes kasutatakse mahuteid, mis on valmistatud keemiliselt inertsest materjalist. Mahutite mahutavus peaks vastama mullaproovide inkubeerimisprotseduurile, s.t üksikute mullaproovide massina või sarjana inkubeerimine (vt punkti 1.7.1.2). Tuleks tagada, et veekadu oleks katse käigus minimaalne ja gaasivahetus oleks võimalik (nt võib katsemahutid katta perforeeritud polüetüleenkilega). Kui uuritakse lenduvaid aineid, tuleks kasutada mastabeeritavaid ja gaasikindlaid mahuteid. Need peaksid olema sellise suurusega, et ligikaudu üks neljandik nende mahust täidetakse mullaprooviga.
      Katses kasutatakse järgmiseid standardseid laboriseadmeid:
      
                  —
               
               
                  segamisseade: mehaaniline segur või vastav seade;
               
            
                  —
               
               
                  tsentrifuug (3 000 g) või filtreerimisseade (kasutades nitraadivaba filterpaberit);
               
            
                  —
               
               
                  nitraadi analüüsi jaoks piisava tundlikkuse mõõteseade, mille mõõtmistulemus on korduvteostatav.
               
            1.6.2.   Mullaliikide valik ja arv
      Kasutatakse ühte mullaliiki. Soovitavad mullaomadused on järgmised:
      
                  —
               
               
                  liivasisaldus: vähemalt 50 % ja kuni 75 %;
               
            
                  —
               
               
                  pH: 5,5–7,5;
               
            
                  —
               
               
                  orgaanilise süsiniku sisaldus: 0,5–1,5 %;
               
            
                  —
               
               
                  mikroobi biomassi tuleks mõõta (8, 9) ja selle süsinikusisaldus peaks olema vähemalt 1 % mulla orgaanilise süsiniku koguhulgast.
               
            Enamikul juhtudel nimetatud omadustega muld esindab halvimat juhtu, kuna uuritava kemikaali absorbtsioon on minimaalne ja selle kättesaadavus mikrofloorale on suurim. Sellest tulenevalt ei ole katsed muude mullaliikidega üldiselt vajalikud. Teatud juhtudel, nt kui katseainet eeldatavasti kasutatakse peamiselt muldades, nt happelised metsamullad, või kui kemikaalid on elektrostaatiliselt laetud, võib osutuda vajalikuks kasutada ka muud mullaliiki.
      1.6.3.   Mullaproovide kogumine ja säilitamine
      1.6.3.1.   Kogumine
      Üksikasjalik teave proovikogumiskoha ajaloo kohta peaks olema kättesaadav. Üksikasjade hulka kuuluvad täpne asukoht, taimkate, põllukultuuride kaitsevahenditega töötlemise kuupäevad, orgaaniliste ja anorgaaniliste väetistega töötlemine, bioloogiliste materjalide lisamine või juhuslik saastumine. Mullaproovide kogumiseks valitud kohta peaks saama kasutada pikka aega. Sobivad on püsikarjamaad, üheaastaste teraviljakultuuridega (v.a mais) põllud või tihedalt külvatud haljaskesa. Valitud proovivõtukohta ei tohiks töödelda põllukultuuride kaitsevahenditega vähemalt ühe aasta jooksul enne proovide võtmist. Samuti ei tohiks kasutada orgaanilisi väetisi vähemalt kuus kuud. Mineraalväetiste kasutamine on lubatud üksnes siis, kui see vastab põllukultuuride nõuetele ja mullaproove ei tohiks võtta vähemalt kolm kuud pärast väetise kasutamist. Biotsiidi mõjuga (nt kaltsiumtsüaanamiid) väetistega töödeldud mulla kasutamist tuleks vältida.
      Proovide võtmist tuleks vältida pikkade (rohkem kui 30 päeva) põua- või vettimisperioodide ajal või vahetult pärast seda. Küntud muldade puhul tuleks proovid võtta 0–20 cm sügavuselt. Rohumaade (karjamaade) või muude muldade puhul, kui ei ole pikka aega küntud (vähemalt ühe kasvuperioodi vältel), peaks proovivõtu suurim sügavus olema veidi rohkem kui 20 cm (nt kuni 25 cm).
      Mullaproovid tuleks transportida mahutites ja temperatuuridel, mis tagavad, et algseid mullaomadusi ei muudeta oluliselt.
      1.6.3.2.   Säilitamine
      Värskelt põllult kogutud mulla kasutamine on eelistatud. Kui ei säilitamine laboris on vältimatu, võib mullaproovid lahustada pimedas temperatuuril 4 ± 2 oC maksimaalselt kolmeks kuuks. Mullaproovide säilitamise ajal tuleb tagada aeroobsed tingimused. Kui mullaproovid kogutakse piirkondadest, kus maapind on vähemalt kolm kuud aastas külmunud, saab kaaluda nende säilitamist kuueks kuuks miinus 18 oC kuni miinus 22 oC juures. Säilitatud mullaproovide mikroobi biomassi mõõdetakse enne igat katset ja biomassis peaks olema süsinikku vähemalt 1 % mulla orgaanilise süsiniku kogusisaldusest (vt punkti 1.6.2).
      1.6.4   Mullaproovide käsitlemine ja katseks ettevalmistamine
      1.6.4.1.   Eelinkubeerimine
      Kui mullaproovid säilitati (vt punkti 1.6.3.2), on soovitav eelinkubeerida 2–28 päeva. Mulla temperatuur ja niiskusesisaldus eelinkubeerimise ajal peaksid olema samasugused kui need, mida kasutati katses (vt punkte 1.6.4.2 ja 1.7.1.3).
      1.6.4.2.   Füüsikalis-keemilised omadused
      Muld puhastatakse käsitsi suurtest objektidest (nt kivid, taimeosad jne) ning seejärel märgsõelutakse ilma liigselt kuivatamata 2 mm või sellest väiksemateks osakeste suuruseks. Mullaproovi niiskusesisaldust peaks reguleerima destilleeritud või deioniseeritud veega 40–60 % maksimaalse veemahutavuseni.
      1.6.4.3.   Parandamine orgaanilise substraadiga
      Mulda tuleks parandada sobiva orgaanilise substraadiga, nt peenestatud lutserni-rohujahu seguga (põhiline koostisosa on Medicago sativa), mille süsiniku-lämmastiku suhe on 12/1 ja 16/1. Soovitav lutserni-mulla suhe on 5 g lutserni ühe kilogrammi mulla kohta (kuivmass).
      1.6.5.   Katseaine ettevalmistamine mulda annustamiseks
      Katseainet annustatakse tavaliselt kandeaine abil. Kandeaine võib olla vesi (veeslahustuvate ainete puhul) või inertne tahke aine, nt peen kvartsliiv (mille osakeste suurus on 0,1–0,5 mm). Vedelaid, veest erinevaid kandeaineid (nt orgaanilisi lahusteid, nagu atsetoon, kloroform) tuleks vältida, kuna nad võivad kahjustada mikrofloorat. Kui kasutatakse kandeainena liiva, saab selle katta katseainega, mis on sobivas lahustis lahustatud või suspendeeritud. Sellisel juhul tuleks lahusti eemaldada aurustumise teel enne mullaga segamist. Katseaine optimaalseks jaotumiseks mullas on soovitav suhe 10 g liiva ühe kilogrammi mulla kohta (kuivmass). Kontrollproove töödeldakse sarnase veehulgaga ja/või üksnes kvartsliivaga.
      Kui uuritakse lenduvaid kemikaale, tuleks vältida kadusid töötlemise ajal niipalju kui võimalik ja tuleks püüda tagada homogeenne jaotus mullas (nt katseainet tuleks injekteerida mulda mitmes kohas).
      1.6.6.   Uuritavad kontsentratsioonid
      Kui uuritakse agrokemikaale, tuleks kasutada vähemalt kahte kontsentratsiooni. Väiksem kontsentratsioon peaks kajastama vähemalt katseaine kasutamisel mulda jõudvat suurimat eeldatavat kogust ning suurem kontsentratsioon peaks olema väiksema kontsentratsiooni kordne. Mulda lisatavate katseainete kontsentratsioonid arvutatakse eeldusel, et aine imendub ühtlaselt 5 cm sügavusele ja mulla lasuvustihedus on 1,5. Agrokemikaalide puhul, mida annustatakse otse mulda, või kemikaalide puhul, mille mulda jõudvat kogust saab ennustada, on soovitavad katsekontsentratsioonid suurimad arvutuskontsentratsioonid (PEC) ja neist viis korda suuremad kontsentratsioonid. Uurides aineid, mida eeldatavasti annustatakse mulda mitmel korral ühel aastaajal, peaks katsekontsentratsioon olema saadud PEC korrutamisel suurima eeldatava annustamiste arvuga. Kõrgeim uuritav kontsentratsioon ei tohiks siiski olla suurem kui kümnekordne suurim üksikannus. Kui uuritakse muid kui agrokemikaale, tuleks kasutada vähemalt viie kontsentratsiooni geomeetrilist sarja. Uuritavad kontsentratsioonid peaksid hõlmama ECx väärtuste kindlaksmääramiseks vajalikku vahemikku.
      1.7.   KATSE KÄIK
      1.7.1.   Kokkupuute tingimused
      1.7.1.1.   Katse- ja kontrollproovid
      Kui uuritakse agrokemikaale, tuleks mullaproovid jagada kolmeks võrdse massiga osaks. Kaks osa segatakse kandeainega, mis sisaldab katseainet, ning kolmas osa segatakse kandeainega, mis ei sisalda katseainet (kontrollproov). On soovitav kasutada vähemalt kolme paralleelset proovi nii katse- kui kontrollproovide korral. Kui uuritakse muid kui agrokemikaale, tuleks mullaproovid jagada kuueks võrdse massiga osaks. Viis proovi segatakse katseainet sisaldava kandeainega ja kuues proov segatakse kandeainega, mis ei sisalda kemikaali. On soovitav kasutada kolme paralleelset proovi nii katse- kui kontrollproovide korral. Tuleks tagada katseaine ühtlane jaotus katseproovide hulka kuuluvates mullaproovides. Segamise ajal tuleks vältida mulla pallideks vormimist.
      1.7.1.2.   Mullaproovide inkubeerimine
      Mullaproove inkubeeritakse kahel moel: katse- ja kontrollmullaproovide koondproovina või katse ja kontrollmullaproovide üksikute ja võrdse suurusega osaproovide sarjana. Kui uuritakse lenduvaid aineid, tuleks katse sooritada vaid üksikute osaproovide sarjana. Kui mullaproovid inkubeeritakse koondproovina, valmistatakse ette katse- ja kontrollmullaproovide suured kogused ning vastavalt vajadusele analüüsitavad osaproovid katse käigus. Algselt iga katse- või kontrollproovi kohta ettevalmistatud kogus sõltub osaproovide suurusest, kasutatud paralleelsete proovide arvust ja suurimatest eeldatavatest proovide võtmise aegadest. Koondproovina inkubeeritavad mullaproovid tuleks enne osaproovide võtmist hoolega segada. Kui mullaproovid inkubeeritakse üksikute mullaproovide sarjana, jagatakse iga katse- ja kontrollmullaproovide koondproov soovitud arvuks osaproovideks, ning neid kasutatakse vastavalt vajadusele. Katsetest, kus eeldatakse rohkem kui kahte proovide võtmise aega, tuleks ette valmistada piisavalt osaproove kõikide paralleelproovide ja proovivõtuaegade jaoks. Vähemalt kolme uuritava mullaproovi paralleelproovi tuleks inkubeerida aeroobsetes tingimustes (vt punkti 1.7.1.1). Kõikide katsete käigus tuleks kasutada sobivaid mahuteid, milles on piisavalt õhuruumi, et vältida anaeroobsete tingimuste tekkimist. Kui uuritakse lenduvaid aineid, tuleks katse sooritada vaid üksikute osaproovide sarjana.
      1.7.1.3.   Katsetingimused ja katse kestus
      Katset tehakse pimedas toatemperatuuril 20 ± 2 oC. Mullaproovide niiskusesisaldust tuleks säilitada katse käigus 40–60 % mulla suurimast veemahutavusest (vt punkti 1.6.4.2) vahemikus ± 5 %. Vajaduse korral võib lisada destilleeritud, deioniseeritud vett.
      Katsete minimaalne kestus on 28 päeva. Kui uuritakse agrokemikaale, võrreldakse katse- ja kontrollproovides nitraaditekke kiirust. Kui need erinevad 28. päeval rohkem kui 25 %, jätkatakse katset seni, kuni erinevus võrdub või on väiksem kui 25 %, või maksimaalselt 100 päeva, olenevalt sellest, kummaks kulub vähem aega. Muude kui agrokemikaalide puhul lõpetatakse katse pärast 28 päeva. Arvutatakse ECx väärtused.
      1.7.2.   Mullaproovide võtmine ja analüüs
      1.7.2.1.   Mullaproovide võtmise ajakava
      Kui uuritakse agrokemikaale, analüüsitakse mullaproovides nitraati 0-, 7., 14. ja 28. päeval. Kui on vaja katset pikendada, tuleks teha täiendavad mõõtmised 14päevaste intervallide tagant pärast 28. päeva.
      Kui uuritakse muid kui agrokemikaale, kasutatakse vähemalt viit katsekontsentratsiooni ja analüüsitakse mullaproovides nitraati kokkupuute perioodi alguses (0-päev) ja lõpus (28. päev). Võib lisada vajaduse korral vahepealse mõõtmise, nt 7. päeval. 28. päeval saadud teavet kasutatakse kemikaali ECx väärtuse kindlaksmääramiseks. Soovi korral võib kasutada 0-päeval kontrollproovidest saadud andmeid mullas nitraadi algkogusest teatamiseks.
      1.7.2.2.   Mullaproovide analüüs
      Igas katse- ja kontrollproovi paralleelproovis tekkinud nitraadi kogus määratakse kindlaks igal proovivõtuajal. Nitraat ekstraheeritakse mullast proovide raputamise teel sobiva ekstrahendiga, nt kaaliumkloriidilahus (0,1 M). Soovitav suhe on 5 ml KCl lahust mullaproovi ühe kuivmassi grammi kohta. Ekstraheerimise optimeerimiseks ei tohiks mulla ja ekstrahendi mahutid olla rohkem kui pooltäis. Segu raputatakse 150 rpm 60 minutit. Segusid tsentrifuugitakse või filtreeritakse ning analüüsitakse vedelfaasist nitraat. Osakestevabad vedelikuekstraktid võib säilitada enne analüüsi miinus 20 ± 5 oC juures kuni kuus kuud.
      2.   TULEMUSED
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE
      Kui katseid tehakse agrokemikaalidega, tuleks registreerida igas mullaproovi paralleelproovis tekkinud nitraadikogus ja tuleks esitada kõikide paralleelproovide keskmised väärtused tabeli kujul. Lämmastiku transformatsiooni kiirusi tuleks hinnata sobivate ja üldiselt heakskiidetud statistiliste meetodite abil (nt F-katse, 5 % olulisusaste). Tekkinud nitraadi koguseid väljendatakse mg nitraadina mulla kuivmassi kg kohta päevas. Nitraadi tekke kiirusi igas katseproovis võrreldakse kiirustega kontrollproovis ning arvutatakse kontrollproovide protsentuaalne hälve.
      Kui katseid tehakse muude kui agrokemikaalidega, määratakse kindlaks igas paralleelproovis tekkinud nitraadi kogused ning koostatakse annuse-reaktsiooni kõver ECx väärtuste hindamiseks. Nitraadikoguseid (s.t mg nitraati mulla kuivmassi kg kohta) katseproovides pärast 28 päeva võrreldakse kontrollproovis olevate nitraadikogustega. Nimetatud andmete põhjal arvutatakse protsentuaalsed inhibitsiooniväärtused iga katsekontsentratsiooni kohta. Need protsendimäärad registreeritakse kontsentratsioonina ning seejärel kasutatakse statistilisi protseduure ECx väärtuste arvutamiseks. Usalduspiirid (p = 0,95) arvutatud ECx puhul määratakse samuti kindlaks standardprotseduuride abil (10, 11, 12).
      Katseained, mis sisaldavad lämmastiku suuri koguseid võivad mõjutada katse käigus tekkivaid nitraadikoguseid. Kui nimetatud aineid uuritakse suurte kontsentratsioonidena (nt kemikaalid, mida eeldatavasti annustatakse korduvalt), peaks katse sisaldama sobivaid kontrolle (s.t mullaproov ja katseaine ilma taimejahuta). Nimetatud kontrollidest saadud andmeid peab võtma arvesse ECx väärtuste arvutamisel.
      2.2.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE
      Kui hinnatakse agrokemikaalidega tehtud katsete tulemusi ning nitraaditekke kiiruste erinevus madalamate katseaineannuste (mis vastab suurimale eeldatavale kontsentratsioonile) ja kontrollproovide vahel on võrdne või väiksem kui 25 % mis tahes proovivõtuajal pärast 28 päeva möödumist, saab hinnata, et katseainel ei ole pikaajalist toimet lämmastiku tekkele muldades. Kui muude kemikaalide kui agrokemikaalidega tehtud katsete tulemusi hinnatakse, kasutatakse EC50, EC25 ja/või EC10 väärtusi.
      3.   ARUANDLUS
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Kasutatava mulla täielik identifitseerimine, kaasa arvatud:
                  
                              —
                           
                           
                              geograafiline viide kohale (laiuskraad, pikkuskraad);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              teave koha ajaloo kohta (s.t taimkate, põllukultuuride kaitsevahenditega töötlemine, väetistega töötlemine, juhuslik saastamine jne);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kasutusviis (nt põllumaa, mets jne):
                           
                        
                              —
                           
                           
                              proovivõtu sügavus (cm);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              liiva-/aleuriidi-/savisisaldus (protsenti kuivmassist);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pH (vees);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              orgaanilise süsiniku sisaldus (protsenti kuivmassist);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lämmastikusisaldus (protsenti kuivmassist);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              algne lämmastikusisaldus (mg nitraati kg kuivmassi kohta);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katioonvahetusvõime (mmol/kg);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mikroobi biomass protsendina orgaanilise süsiniku koguhulgast;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              viide iga parameetri määramismeetodi kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kogu teave mullaproovide kogumise ja säilitamise kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vajaduse korral üksikandmed mulla eelinkubeerimise kohta.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katseaine:
                  
                              —
                           
                           
                              füüsiline laad ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vajaduse korral keemilised tunnusandmed, sh struktuurivalem, puhtus (s.t põllukultuuride kaitsevahendite toimeaine protsendimäär), lämmastikusisaldus.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Substraat:
                  
                              —
                           
                           
                              substraadi allikas;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              koostis (lutsernijahu, lutserni-rohujahu);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              süsiniku-, lämmastikusisaldus (protsenti kuivmassist);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sõelaava suurus (mm).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              üksikasjalikud andmed mulla parandamise kohta orgaanilise substraadiga;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava kemikaali kontsentratsioonide arv ja vajaduse korral valitud kontsentratsioonide põhjendus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikasjalikud andmed katseaine mulda annustamise kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubatsioonitemperatuur;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mulla niiskusesisaldus katse alguses ja kestel;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kasutatav mulla inkubeerimismeetod (koondproovina või üksikute osaproovide sarjana);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              paralleelsete proovide arv;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              proovivõtuajad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              nitraadi mullast ekstraheerimise meetod.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              analüüsimeetod ja -seade, mida kasutatakse nitraadi analüüsimiseks;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              andmed tabeli kujul, sh nitraadi mõõtmiste üksikud ja keskväärtused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katse- ja kontrollproovide paralleelproovide vaheline muutus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              arvutustega tehtud paranduste selgitused, kui on vaja;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              nitraadi tekke kiiruse protsentuaalne muutus igal proovivõtukorral või vajaduse korral EC50 väärtus 95 % usaldusvahemikus, muud ECx väärtused (s.t EC25 või EC10) usaldusvahemikes ning annuse-reaktsiooni kõver;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tulemuste statistiline töötlemine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kogu teave ja vaatlused, mis aitaksid tõlgendada tulemusi.
                           
                        
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
               
            
                  2)
               
               
                  BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
               
            
                  3)
               
               
                  EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.
               
            
                  4)
               
               
                  SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Bruxelles.
               
            
                  5)
               
               
                  ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality – Determination of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical Committee ISO/TC 190/SC 4: Sou Quality – Biological Methods.
               
            
                  6)
               
               
                  OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italie, 18-20 January 1995.
               
            
                  7)
               
               
                  ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling andstorageof soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
               
            
                  8)
               
               
                  ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method.
               
            
                  9)
               
               
                  ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.
               
            
                  10)
               
               
                  Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol, and Exper. Ther., 96, 99–113.
               
            
                  11)
               
               
                  Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.
               
            
                  12)
               
               
                  Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.
               
            C.22.   MULLAMIKROOBID: SÜSINIKU TRANSFORMATSIOONI KATSE
      1.   MEETOD
      Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 217 (2000).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesolev katsemeetod kirjeldab laborimeetodit, mis on välja töötatud selleks, et uurida põllukultuuride kaitsevahendite ja muude võimalike kemikaalide pikaajalisi mõjusid mullamikroobide süsiniku transformatsioonile ühekordse kokkupuute järel. Katse põhineb peamiselt Euroopa ja Vahemere taimekaitseorganisatsiooni soovitustel (1). Samuti võetakse arvesse muid juhised, sh Saksa Biologische Bundesanstalti (2), USA Keskkonnakaitseagentuuri (3) ja SETACi (4) juhiseid. Käesolevas katses kasutatavate mullaproovide arvu ja tüüpide osas lepiti kokku mulla ja sedimentide valikut käsitlevas OECD töörühmas, mis tuli kokku Belgirates Itaalias 1995. aastal (5). Mullaproovide kogumist, käsitlemist ja säilitamist käsitlevad soovitused põhinevad ISO juhisdokumendil (6) ja Belgirate töörühma soovitustel.
      Katseainete toksiliste omaduste hindamisel võib osutuda vajalikuks määrata kindlaks mõjud mulla mikroobsele aktiivsusele, nt kui vajatakse andmeid põllukultuuride kaitsevahendite võimalike kõrvalmõjude kohta mulla mikrofloora suhtes või kui eeldatakse mullamikroobide kokkupuudet muude kemikaalidega kui põllukultuuride kaitsevahendid. Süsiniku transformatsiooni katse tehakse selleks, et kindlaks määrata selliste kemikaalide mõju mulla mikrofloorale. Kui uuritakse agrokemikaale (nt põllukultuuride kaitsevahendid, väetised, metsanduskemikaalid), sooritatakse nii süsiniku transformatsiooni kui ka lämmastiku transformatsiooni katse. Kui uuritakse muid kui agrokemikaale, piisab lämmastiku transformatsiooni katsest. Kui selliste kemikaalide lämmastiku transformatsiooni katses saadud EC50 väärtused on kaubanduslike nitrifikatsiooniinhibiitorite (nt nitrapüriin) esindavas vahemikus, saab täiendava teabe kogumiseks teha süsiniku transformatsiooni katse.
      Muld koosneb elusatest ja elututest koostisosadest, mis eksisteerivad keerukates ja heterogeensetes segudes. Mikroobid mängivad tähtsat rolli viljaka mulla orgaanilise aine hajutamisel ja muutmisel, ning mõned liigid mõjutavad mulla viljakuse erinevaid aspekte. Kõik nimetatud biokeemiliste protsesside pikaajalised häired võivad häirida toitaineringlust ja see võib muuta mulla viljakust. Süsiniku ja lämmastiku transformatsioon toimub kõikides viljakates muldades. Kuigi nimetatud protsesse põhjustav mikroobikogum on mullati erinev, on transformatsioonirajad oma olemuselt samad.
      Käesolev katsemeetod on välja töötatud selleks, et avastada aine pikaajalisi negatiivseid mõjusid aeroobsete pinnamuldade süsiniku transformatsiooni protsessile. Katse on tundlik süsiniku transformatsioonis osaleva mikroobikogumi suuruse ja tegevuse muutuste suhtes, kuna katses lastakse neil mikroobikogumitel osa saada nii keemilisest stressist kui ka süsinikupuudusest. Kasutatakse liivast mulda, mille orgaanilise aine sisaldus on madal. Seda mulda töödeldakse katseainega ja inkubeeritakse tingimustes, mis võimaldavad kiiret mikroobide ainevahetust. Nimetatud tingimustes on kiirelt vähenenud kergesti kättesaadava süsiniku allikad mullas. See põhjustab süsiniku puudust, mis tapab mikroobirakud ning kutsub esile puhkeperioodi ja/või sporulatsiooni. Kui katset tehakse kauem kui 28 päeva, saab mõõta nimetatud reaktsiooni summat (töötlemata mulla) kontrollproovides metaboolselt aktiivse mikroobi biomassi järkjärgulise vähenemisena (7). Kui süsinikupuuduses vaevlevas mullas olevat biomassi mõjutab katsetingimustes kemikaali esinemine, ei saa see pöörduda tagasi samale tasemele nagu kontrollproovis olev biomass. Seetõttu katseaine põhjustatud häireid mis tahes ajal katse käigus kestavad tihti kuni katse lõpuni.
      Käesoleva katsemeetodi aluseks olevad katsed töötati välja peamiselt ainete jaoks, mille pinnasesse jõudvat kogust saab ennustada. Sellised ained on näiteks põllukultuuride kaitsevahendid, mille annustamine põllule on teada. Agrokemikaalide puhul piisab sellest, kui uuritakse kahte annust oletatava annustamissageduse osas. Agrokemikaalide puhul saab uurida toimeaineid (a.i.) või preparaate. Katse ei piirdu siiski vaid prognoositavaid arvestuskontsentratsioone omavate kemikaalidega. Muutes nii pinnasesse annustatavaid katseaine koguseid kui ka seda, kuidas andmeid hinnatakse, saab kasutada katset kemikaalide puhul, mille pinnasesse jõudev kogus ei ole teada. Seega määratakse kindlaks muude kemikaalide kui agrokemikaalid puhul kontsentratsiooni ridade mõjud süsiniku transformatsioonile. Nimetatud katsetest saadud andmeid kasutatakse annuse-reaktsiooni kõvera koostamiseks ja ECX väärtuste arvutamiseks, milles x on mõju protsendina.
      1.2.   MÕISTED
      
         Süsiniku transformatsioon – orgaanilise aine lagundamine mikroorganismide poolt anorgaaniliseks lõppsaaduseks, süsinikdioksiidiks.
      
         EC
         
            X
         
         (efektiivkontsentratsioon) – mullas esineva katseaine kontsentratsioon, mis tõkestab süsiniku transformatsiooni süsinikdioksiidiks x protsendiga.
      
         EC
         
            50
         
         (efektiivkontsentratsiooni mediaan) – mullas esineva katseaine kontsentratsioon, mis tõkestab süsiniku transformatsiooni süsinikdioksiidiks 50 protsendiga.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Puuduvad.
      1.4.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Sõelutud mulda töödeldakse kas katseainega või jäetakse töötlemata (kontroll). Kui uuritakse agrokemikaale, on soovitav kasutada vähemalt kahte katsekontsentratsiooni ja need tuleks valida suurima kontsentratsiooni suhtes, mis eeldatavasti esineb põllul. Pärast 0-, 7., 14. ja 28. inkubeerimispäeva segatakse katse- ja kontrollmullaproovid glükoosiga ning glükoosi põhjustatud hingamiskiirust mõõdetakse järjestikusel 12 tunnil. Hingamiskiirusi väljendatakse vabanenud süsinikdioksiidina (mg süsinikdioksiidi mulla kuivmassi kg kohta tunnis) või tarbitud hapnikuna (mg hapnikku kg mulla kohta tunnis). Keskmist hingamiskiirust katseproovides võrreldakse sama hingamiskiirusega kontrollproovides ning arvutatakse katseproovi ja kontrollproovi vaheline protsentuaalne hälve. Kõik katsed kestavad vähemalt 28 päeva. Kui 28. päeval on katse- ja kontrollproovide vahelised erinevused võrdsed või suuremad kui 25 %, jätkatakse mõõtmisi 14päevaste intervallidega kuni maksimaalselt 100 päeva. Kui uuritakse muid kemikaale kui agrokemikaalid, lisatakse mullaproovidele katseaine kontsentratsioonide sari ning mõõdetakse glükoosi põhjustatud hingamiskiirusi (s.t tekkinud süsinikdioksiidi või tarbitud hapniku koguste keskmine) pärast 28 päeva möödumist. Kontsentratsioonide sarja käsitlevate katsete tulemusi analüüsitakse regressioonmudelit kasutades, ning arvutatakse ECX väärtused (s.t EC50, EC25 ja/või EC10). Vt mõisteid.
      1.5.   KATSE VALIIDSUS
      Agrokemikaalidega tehtud katsete tulemuste hindamine põhineb suhtelistelt väikestel erinevustel (s.t keskmine väärtus on ± 25 %) kontroll- ja katsemullaproovides vabanenud süsinikdioksiidi või tarbitud hapniku vahel, et kontrollproovide suured muutused võivad viia väärate tulemusteni. Seetõttu peaksid paralleelsete kontrollproovide vahelised muutused olema väiksemad kui ± 15 %.
      1.6.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.6.1.   Seadmed
      Katsetes kasutatakse mahuteid, mis on valmistatud keemiliselt inertsest materjalist. Mahutite mahutavus peaks vastama mullaproovide inkubeerimisprotseduurile, s.t üksikute mullaproovide massina või sarjana inkubeerimine (vt punkti 1.7.1.2). Tuleks tagada, et veekadu oleks katse käigus minimaalne ja gaasivahetus oleks võimalik (nt võib katsemahutid katta perforeeritud polüetüleenkilega). Kui uuritakse lenduvaid aineid, tuleks kasutada mastabeeritavaid ja gaasikindlaid mahuteid. Need peaksid olema sellise suurusega, et ligikaudu üks neljandik nende mahust täidetakse mullaprooviga.
      Glükoosi põhjustatud hingamise kindlaksmääramisel on nõutavad inkubeerimissüsteemid ja süsinikdioksiidi tootmise või hapniku tarbimise mõõtmisseadmed. Selliste süsteemide ja seadmete kohta käivad näiteid võib leida kirjandusviidetest (8, 9, 10, 11).
      1.6.2.   Mullaliikide valik ja arv
      Kasutatakse ühte mullaliiki. Soovitavad mullaomadused on järgmised:
      
                  —
               
               
                  liivasisaldus: vähemalt 50 % ja kuni 75 %,
               
            
                  —
               
               
                  pH: 5,5–7,5;
               
            
                  —
               
               
                  orgaanilise süsiniku sisaldus: 0,5–1,5 %;
               
            
                  —
               
               
                  mikroobi biomassi tuleks mõõta (12, 13) ja selle süsinikusisaldus peaks olema vähemalt 1 % mulla orgaanilise süsiniku koguhulgast.
               
            Enamikul juhtudel nimetatud omadustega muld esindab halvimat juhtu, kuna uuritava kemikaali absorbtsioon on minimaalne ja selle kättesaadavus mikrofloorale on suurim. Sellest tulenevalt ei ole katsed muude mullaliikidega üldiselt vajalikud. Teatud juhtudel, nt kui katseainet eeldatavasti kasutatakse peamiselt muldades, nt happelised metsamullad, või kui kemikaalid on elektrostaatiliselt laetud, võib osutuda vajalikuks kasutada ka muud mullaliiki.
      1.6.3.   Mullaproovide kogumine ja säilitamine
      1.6.3.1.   Kogumine
      Üksikasjalik teave proovikogumiskoha ajaloo kohta peaks olema kättesaadav. Üksikasjade hulka kuuluvad täpne asukoht, taimkate, põllukultuuride kaitsevahenditega töötlemise kuupäevad, orgaaniliste ja anorgaaniliste väetistega töötlemine, bioloogiliste materjalide lisamine või juhuslik saastumine. Mullaproovide kogumiseks valitud kohta peaks saama kasutada pikka aega. Sobivad on püsikarjamaad, üheaastaste teraviljakultuuridega (v.a mais) põllud või tihedalt külvatud haljaskesa. Valitud proovivõtukohta ei tohiks töödelda põllukultuuride kaitsevahenditega vähemalt ühe aasta jooksul enne proovide võtmist. Samuti ei tohiks kasutada orgaanilisi väetisi vähemalt kuus kuud. Mineraalväetiste kasutamine on lubatud üksnes siis, kui see vastab põllukultuuride nõuetele ja mullaproove ei tohiks võtta vähemalt kolm kuud pärast väetise kasutamist. Biotsiidi mõjuga (nt kaltsiumtsüaanamiid) väetistega töödeldud mulla kasutamist tuleks vältida.
      Proovide võtmist tuleks vältida pikkade (rohkem kui 30 päeva) põua- või vettimisperioodide ajal või vahetult pärast seda. Küntud muldade puhul tuleks proovid võtta 0–20 cm sügavuselt. Rohumaade (karjamaade) või muude muldade puhul, kui ei ole pikka aega küntud (vähemalt ühe kasvuperioodi vältel), peaks proovivõtu suurim sügavus olema veidi rohkem kui 20 cm (nt kuni 25 cm). Mullaproovid tuleks transportida mahutites ja temperatuuridel, mis tagavad, et algseid mullaomadusi ei muudeta oluliselt.
      1.6.3.2.   Säilitamine
      Värskelt põllult kogutud mulla kasutamine on eelistatud. Kui ei säilitamine laboris on vältimatu, võib mullaproove säilitada pimedas temperatuuril 4 ± 2 oC maksimaalselt kolm kuud. Mullaproovide säilitamise ajal tuleb tagada aeroobsed tingimused. Kui mullaproovid kogutakse piirkondadest, kus maapind on vähemalt kolm kuud aastas külmunud, saab kaaluda nende säilitamist kuueks kuuks miinus 18 oC juures. Säilitatud mullaproovide mikroobi biomassi mõõdetakse enne igat katset ja biomassis peaks olema süsinikku vähemalt 1 % mulla orgaanilise süsiniku kogusisaldusest (vt punkti 1.6.2).
      1.6.4.   Mullaproovide käsitlemine ja katseks ettevalmistamine
      1.6.4.1.   Eelinkubeerimine
      Kui mullaproove säilitati (vt punkte 1.6.4.2 ja 1.7.1.3), on soovitav eelinkubeerida 2–28 päeva. Mulla temperatuur ja niiskusesisaldus eelinkubeerimise ajal peaksid olema samasugused kui need, mida kasutati katses (vt punktid 1.6.4.2 ja 1.7.1.3).
      1.6.4.2.   Füüsikalis-keemilised omadused
      Muld puhastatakse käsitsi suurtest objektidest (nt kivid, taimeosad jne) ning seejärel märgsõelutakse ilma liigselt kuivatamata 2 mm või sellest väiksemateks osakeste suuruseks. Mullaproovi niiskusesisaldust peaks reguleerima destilleeritud või deioniseeritud veega 40–60 % maksimaalse veemahutavuseni.
      1.6.5.   Katseaine ettevalmistamine mulda annustamiseks
      Katseainet annustatakse tavaliselt kandeaine abil. Kandeaine võib olla vesi (veeslahustuvate ainete puhul) või inertne tahke aine, nt peen kvartsliiv (mille osakeste suurus on 0,1–0,5 mm). Vedelaid, veest erinevaid kandeaineid (nt orgaanilisi lahusteid nagu atsetoon, kloroform) tuleks vältida, kuna nad võivad kahjustada mikrofloorat. Kui kasutatakse kandeainena liiva, saab selle katta katseainega, mis on sobivas lahustis lahustatud või suspendeeritud. Sellisel juhul tuleks lahusti eemaldada aurustumise teel enne mullaga segamist. Katseaine optimaalseks jaotumiseks mullas on soovitav suhe 10 g liiva ühe kilogrammi mulla kohta (kuivmass). Kontrollproove töödeldakse sarnase veehulgaga ja/või üksnes kvartsliivaga.
      Kui uuritakse lenduvaid kemikaale, tuleks vältida kadusid töötlemise ajal niipalju kui võimalik ja tuleks püüda tagada ühtlane jaotus mullas (nt katseainet tuleks injekteerida mulda mitmes kohas).
      1.6.6.   Uuritavad kontsentratsioonid
      Kui uuritakse põllukultuuride kaitsevahendeid või muid prognoositavaid arvestuskontsentratsioone omavaid kemikaale, tuleks kasutada vähemalt kahte kontsentratsiooni. Väiksem kontsentratsioon peaks kajastama vähemalt katseaine kasutamisel mulda jõudvat suurimat eeldatavat kogust ning suurem kontsentratsioon peaks olema väiksema kontsentratsiooni kordne. Mulda lisatavate katseainete kontsentratsioonid arvutatakse eeldusel, et aine imendub ühtlaselt 5 cm sügavusele ja mulla lasuvustihedus on 1,5. Agrokemikaalide puhul, mida annustatakse otse mulda, või kemikaalide puhul, mille mulda jõudvat kogust saab ennustada, on soovitavad katsekontsentratsioonid suurimad arvutuskontsentratsioonid (PEC) ja neist viis korda suuremad kontsentratsioonid. Uurides aineid, mida eeldatavasti annustatakse mulda mitmel korral ühel aastaajal, peaks katsekontsentratsioon olema saadud PEC korrutamisel suurima eeldatava annustamiste arvuga. Kõrgeim uuritav kontsentratsioon ei tohiks siiski olla suurem kui kümnekordne suurim üksikannus.
      Kui uuritakse muid kui agrokemikaale, tuleks kasutada vähemalt viie kontsentratsiooni geomeetrilist sarja. Uuritavad kontsentratsioonid peaksid hõlmama ECX väärtuste kindlaksmääramiseks vajalikku vahemikku.
      1.7.   KATSE KÄIK
      1.7.1.   Kokkupuute tingimused
      1.7.1.1.   Katse- ja kontrollproovid
      Kui uuritakse agrokemikaale, tuleks mullaproovid jagada kolmeks võrdse massiga osaks. Kaks osa segatakse kandeainega, mis sisaldab katseainet, ning kolmas osa segatakse kandeainega, mis ei sisalda katseainet (kontrollproov). On soovitav kasutada vähemalt kolme paralleelset proovi nii katse- kui kontrollproovide puhul. Kui uuritakse muid kui agrokemikaale, tuleks mullaproovid jagada kuueks võrdse massiga osaks. Viis proovi segatakse katseainet sisaldava kandeainega ja kuues proov segatakse kandeainega, mis ei sisalda kemikaali. On soovitav kasutada kolme paralleelset proovi nii katse- kui kontrollproovide korral. Tuleks tagada katseaine ühtlane jaotus katseproovide hulka kuuluvates mullaproovides. Segamise ajal tuleks vältida mulla pallideks vormimist.
      1.7.1.2.   Mullaproovide inkubeerimine
      Mullaproove inkubeeritakse kahel moel: katse- ja kontrollmullaproovide koondproovina või katse ja kontrollmullaproovide üksikute ja võrdse suurusega osaproovide sarjana. Kui uuritakse lenduvaid aineid, tuleks katse sooritada vaid üksikute osaproovide sarjana. Kui mullaproovid inkubeeritakse koondproovina, valmistatakse ette katse- ja kontrollmullaproovide suured kogused ning vastavalt vajadusele analüüsitavad osaproovid katse käigus. Algselt iga katse- või kontrollproovi kohta ettevalmistatud kogus sõltub osaproovide suurusest, kasutatud paralleelsete proovide arvust ja suurimatest eeldatavatest proovide võtmise aegadest. Koondproovina inkubeeritavad mullaproovid tuleks enne osaproovide võtmist hoolega segada. Kui mullaproovid inkubeeritakse üksikute mullaproovide sarjana, jagatakse iga katse- ja kontrollmullaproovide koondproov soovitud arvuks osaproovideks, ning neid kasutatakse vastavalt vajadusele. Katsetest, kus eeldatakse rohkem kui kahte proovide võtmise aega, tuleks ette valmistada piisavalt osaproove kõikide paralleelproovide ja proovivõtuaegade jaoks. Vähemalt kolme uuritava mullaproovi paralleelproovi tuleks inkubeerida aeroobsetes tingimustes (vt punkti 1.7.1.1). Kõikide katsete käigus tuleks kasutada sobivaid mahuteid, milles on piisavalt õhuruumi, et vältida anaeroobsete tingimuste tekkimist. Kui uuritakse lenduvaid aineid, tuleks katse sooritada vaid üksikute osaproovide sarjana.
      1.7.1.3.   Katsetingimused ja katse kestus
      Katset tehakse pimedas toatemperatuuril 20 ± 2 oC. Mullaproovide niiskusesisaldust tuleks säilitada katse käigus 40–60 % mulla suurimast veemahutavusest (vt punkti 1.6.4.2) vahemikus ± 5 %. Vajaduse korral võib lisada destilleeritud, deioniseeritud vett.
      Katsete minimaalne kestus on 28 päeva. Kui uuritakse agrokemikaale, võrreldakse katse- ja kontrollproovides vabanenud süsinikdioksiidi või tarbitud hapniku koguseid. Kui need erinevad 28. päeval rohkem kui 25 %, jätkatakse katset seni, kuni erinevus võrdub või on väiksem kui 25 %, või maksimaalselt 100 päeva, olenevalt sellest, kummaks kulub vähem aega. Muude kui agrokemikaalide puhul lõpetatakse katse pärast 28 päeva. 28. päeval määratakse kindlaks katse- ja kontrollmullaproovides vabanenud süsinikdioksiidi või tarbitud hapniku kogused ja arvutatakse ECx väärtused.
      1.7.2.   Mullaproovide võtmine ja analüüs
      1.7.2.1.   Mullaproovide võtmise ajakava
      Kui uuritakse agrokemikaale, analüüsitakse mullaproovides glükoosi põhjustatud hingamiskiirusi 0., 7., 14. ja 28. päeval. Kui on vaja katset pikendada, tuleks teha täiendavad mõõtmised 14päevaste intervallide tagant pärast 28. päeva.
      Kui uuritakse muid kui agrokemikaale, kasutatakse vähemalt viit katsekontsentratsiooni ja analüüsitakse mullaproovides glükoosi põhjustatud hingamist kokkupuute perioodi alguses (0-päev) ja lõpus (28. päev). Võib lisada vajaduse korral vahepealse mõõtmise, nt 7. päeval. 28. päeval saadud teavet kasutatakse kemikaali ECx väärtuse kindlaksmääramiseks. Soovi korral võib kasutada 0-päeval kontrollproovidest saadud andmeid mullas metaboolselt aktiivse mikroobi biomassi algkogustest teatamiseks (12).
      1.7.2.2.   Glükoosi põhjustatud hingamiskiiruste mõõtmine
      Iga katseproovi ja kontrollproovi paralleelse proovi glükoosi põhjustatud hingamiskiirus määratakse kindlaks igal proovivõtukorral. Mullaproovidesse segatakse selline glükoosihulk, millest piisab vahetu suurima hingamisreaktsiooni põhjustamiseks. Nimetatud mullaproovis suurima hingamisreaktsiooni põhjustamiseks vajaliku glükoosi hulga saab kindlaks määrata eelkatses, kasutades glükoosi kontsentratsioonide sarja (14). Liivaste muldade puhul, mille orgaanilise süsiniku sisaldus on 0,5–1,5 %, piisab tavaliselt 2 000–4 000 mg glükoosist mulla kuivmassi kg kohta. Glükoosi võib jahvatada pulbriks koos puhta kvartsliivaga (10 g liiva mulla kuivmassi kg kohta) ja segada ühtlaselt mullaga.
      Glükoosiga parandatud mullaproove inkubeeritakse sobivas hingamiskiiruste mõõtmisseadmes kas pidevalt, kord tunnis või kord kahe tunni jooksul (vt punkti 1.6.1) 20 ± 2 oC juures. Vabanenud süsinikdioksiidi või tarbitud hapnikku mõõdetakse 12 järjestikusel tunnil ning mõõtmisi tuleks alustada nii ruttu kui võimalik, s.t üks-kaks tundi pärast glükoosiga täiendamist. Mõõdetakse vabanenud süsinikdioksiidi või tarbitud hapniku üldkoguseid 12 tunni jooksul ja määratakse keskmised hingamiskiirused.
      2.   ANDMED
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE
      Kui katseid tehakse agrokemikaalidega, tuleks registreerida igas mullaproovi paralleelproovis vabanenud süsinikdioksiidi või tarbitud hapniku kogus ja tuleks esitada kõikide paralleelproovide keskmised väärtused tabeli kujul. Süsiniku transformatsiooni kiirusi tuleks hinnata sobivate ja üldiselt heakskiidetud statistiliste meetodite abil (nt F-katse, 5 % olulisusaste). Glükoosi põhjustatud hingamiskiirusi väljendatakse mg süsinikdioksiidina mulla kuivmassi kg kohta tunnis või mg hapnikuna mulla kuivmassi kg kohta tunnis. Keskmist süsinikdioksiidi tekkekiirust või keskmist hapniku tarbimiskiirust igas katseproovis võrreldakse samade kiirustega kontrollproovis ning arvutatakse katse- ja kontrollproovi vaheline protsentuaalne hälve.
      Kui katseid tehakse muude kui agrokemikaalidega, määratakse kindlaks igas paralleelproovis vabanenud süsinikdioksiidi või tarbitud hapniku kogused ning koostatakse annuse-reaktsiooni kõver ECx väärtuste hindamiseks. Katseproovi glükoosi põhjustatud hingamiskiirusi (s.t mg süsinikdioksiidi mulla kuivmassi kg kohta tunnis või mg hapnikku mulla kuivmassi kg kohta tunnis) pärast 28 päeva möödumist võrreldakse samade kiirustega kontrollproovis. Nimetatud andmete põhjal arvutatakse protsentuaalsed inhibitsiooniväärtused iga katsekontsentratsiooni kohta. Need protsendimäärad registreeritakse kontsentratsioonina ning seejärel kasutatakse statistilisi protseduure ECx väärtuste arvutamiseks. Usalduspiirid (p = 0,95) arvutatud ECX puhul määratakse samuti kindlaks standardprotseduuride abil (15, 16, 17).
      2.2.   TULEMUSTE TÕLGENDAMINE
      Kui hinnatakse agrokemikaalidega tehtud katsete tulemusi ning hingamiskiiruste erinevus madalamate katseaineannuste (mis vastab suurimale eeldatavale kontsentratsioonile) ja kontrollproovide vahel on võrdne või väiksem kui 25 % mis tahes proovivõtuajal pärast 28 päeva möödumist, saab hinnata, et katseaine ei oma pikaajalist toimet süsinikdioksiidi tekkele muldades. Kui muude kemikaalide kui agrokemikaalidega tehtud katsete tulemusi hinnatakse, kasutatakse EC50, EC25 ja/või EC10 väärtusi.
      3.   ARUANDLUS
      3.1   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Kasutatava mulla täielik identifitseerimine, kaasa arvatud:
                  
                              —
                           
                           
                              geograafiline viide kohale (laiuskraad, pikkuskraad);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              teave koha ajaloo kohta (s.t taimkate, põllukultuuride kaitsevahenditega töötlemine, väetistega töötlemine, juhuslik saastamine jne);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kasutusviis (nt põllumaa, mets jne);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              proovivõtu sügavus (cm);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              liiva-/aleuriidi-/savisisaldus (protsenti kuivmassist);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pH (vees);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              orgaanilise süsiniku sisaldus (protsenti kuivmassist);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lämmastikusisaldus (protsenti kuivmassist);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katioonvahetusvõime (mmol/kg);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              algne mikroobi biomass protsendina orgaanilise süsiniku koguhulgast;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              viide iga parameetri määramismeetodi kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kogu teave mullaproovide kogumise ja säilitamise kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vajaduse korral üksikasjalikud andmed mulla eelinkubeerimise kohta.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katseaine:
                  
                              —
                           
                           
                              füüsiline laad ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vajaduse korral keemilised tunnusandmed, sh struktuurivalem, puhtus (s.t põllukultuuride kaitsevahendite toimeaine protsendimäär), lämmastikusisaldus.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              üksikasjalikud andmed mulla parandamise kohta orgaanilise substraadiga;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              uuritava kemikaali kontsentratsioonide arv ja vajaduse korral valitud kontsentratsioonide põhjendus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              üksikasjalikud andmed katseaine mulda annustamise kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubatsioonitemperatuur;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mulla niiskusesisaldus katse alguses ja kestel;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kasutatav mulla inkubeerimismeetod (koondproovina või üksikute osaproovide sarjana);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              paralleelsete proovide arv;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              proovivõtuajad.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              hingamiskiiruste mõõtmismeetod ja -seade;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              andmed tabeli kujul, sh süsinikdioksiidi või hapniku üksikud ja keskmised väärtused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katse- ja kontrollproovide paralleelproovide vaheline muutus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              arvutustega tehtud paranduste selgitused, kui on vaja;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              glükoosi põhjustatud hingamiskiiruse protsentuaalne muutus igal proovivõtukorral või vajaduse korral EC50 väärtus 95 % usaldusvahemikus, muud ECx väärtused (s.t EC25 või EC10) usaldusvahemikes ning annuse-reaktsiooni kõver;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vajaduse korral tulemuste statistiline töötlemine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kogu teave ja vaatlused, mis aitaksid tõlgendada tulemusi.
                           
                        
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
               
            
                  2)
               
               
                  BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
               
            
                  3)
               
               
                  EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.
               
            
                  4)
               
               
                  SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels.
               
            
                  5)
               
               
                  OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
               
            
                  6)
               
               
                  ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
               
            
                  7)
               
               
                  Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for Pesticide Experiments, in „Pesticide Effects on Soil Microflora”. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60.
               
            
                  8)
               
               
                  Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in „Methods of Soil Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties”. Agronomy Monograph Ns 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Keeney. 41: 831- 871.
               
            
                  9)
               
               
                  ISO 11266-1. (1993). Soil Quality – Guidance on Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.
               
            
                  10)
               
               
                  ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
               
            
                  11)
               
               
                  Heinemeyer, O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81.
               
            
                  12)
               
               
                  ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method.
               
            
                  13)
               
               
                  ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.
               
            
                  14)
               
               
                  Malkomes, H.-P. (1986). EinfluE von Glukosemenge auf die Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenuber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113-120.
               
            
                  15)
               
               
                  Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.
               
            
                  16)
               
               
                  Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.
               
            
                  17)
               
               
                  Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.
               
            C.23.   AEROOBNE JA ANAEROOBNE TRANSFORMATSIOON MULLAS
      1.   MEETOD
      Käesolev katsemeetod lähtub juhendist OECD TG 307 (2002).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Käesolev katsemeetod põhineb olemasolevatel juhenditel (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9). Käesolevas katsemeetodis kirjeldatud meetod töötati välja kemikaalide aeroobse ja anaeroobse transformatsiooni hindamiseks mullas. Katsete abil määratakse i) katseaine transformatsioonikiirus ja ii) selliste transformatsioonisaaduse laad, mida taimed ja mullaorganismid saavad mõjutada, ning nende moodustumis- ja hävimiskiirus. Sellised uuringud tehakse kemikaalidega, mida levitatakse otse maapinda või mis tõenäoliselt jõuavad mullakeskkonda. Selliste laboriuuringute tulemusi võib samuti kasutada vastavates väliuuringutes kasutatud proovivõtu- ja analüüsiprotokollide koostamisel.
      Transformatsiooniteede hindamiseks piisab üldjuhul aeroobsest ja anaeroobsest uuringust ühe pinnasetüübiga (8, 10, 11). Transformatsioonikiirused tuleks kindlaks määrata veel lisaks vähemalt kolmes pinnasetüübis (8, 10).
      Käesolevas katses kasutatavate pinnaste arvu ja tüüpide osas lepiti kokku pinnase ja sedimentide valikut käsitlevas OECD töörühmas, mis tuli kokku Belgirates Itaalias 1995. aastal (10). Uuritavad pinnasetüübid peaksid esindama keskkonnatingimusi, kus katseainet kasutatakse või kus vabastamised toimuvad. Näiteks, kemikaale, mis võidakse vabastada subtroopilises kuni troopilises kliimas, tuleks uurida Ferrasoli või Nitosoliga (FAO-süsteem). Töörühm tegi samuti soovitusi seoses mullaproovide kogumise, käsitlemise ja säilitamisega, vastavalt ISO juhendile (15). Käesolevas meetodis võetakse samuti arvesse riisi kasvatamisel kasutatavaid pinnaseid.
      1.2.   MÕISTED
      
         Katseaine – mis tahes aine, kas lähteühend või vastav transformatsioonisaadus.
      
         Transformatsioonisaadused – kõik katseaine biootilistes või abiootilistes transformatsioonireaktsioonides saadud ained, kaasa arvatud CO2 ja tooted, mis on seotud jääkides.
      
         Seotud jäägid – pinnases, taimedes või loomades olevad ühendid, mis ekstraheerimise järel säilivad matriitsis lähteainena või selle metaboliidi(metaboliitide)/transformatsioonisaadustena. Ekstraheerimismeetod ei tohiks oluliselt muuta ühendit ennast või matriitsi struktuuri. Sideme olemust saab selgitada osaliselt matriitsi muutva ekstraheerimismeetodi ja täiustatud analüüsitehnikate abil. Tänaseni, näiteks, on sel viisil kindlaks tehtud kovalentsed ioonsidemed ja sorptsioonsidemed ning „lõksud”. Üldiselt vähendab seotud jääkide teke oluliselt bioloogilist kättesaadavust ja bioloogilist omastatavust (12) 1984. aasta IUPAC muudatus (13).
      
         Aeroobne transformatsioon – reaktsioonid, milles osaleb molekulaarne hapnik (14).
      
         Anaeroobne transformatsioon – reaktsioonid, milles ei osale molekulaarne hapnik (14).
      
         Pinnas – väikeste (peamiselt mikro)organismide poolt orgaaniliseks muudetav segu mineraalsetest ja orgaanilistest keemilistest koostisainetest, mis hiljem sisaldab kõrge süsiniku- ja lämmastikusisaldusega ning suure molekulmassiga ühendeid. Pinnast võib töödelda kahes eri seisundis:
      
                  a)
               
               
                  looduspärane, nagu see on aja jooksul arenenud pinnasetüüpide erinevateks iseloomulikeks kihtideks;
               
            
                  b)
               
               
                  häiritud, nagu see on tavaliselt esineb viljeluspõldudel või käesolevas meetodis kasutamiseks kaevatud proovides (14).
               
            
         Mineralisatsioon – orgaanilise ühendi täielik lagunemine CO2-ks ja H2O-ks aeroobsetes tingimustes ning CH4-ks, CO2-ks ja H2O-ks anaeroobsetes tingimustes. Käesoleva katsemeetodi kontekstis, kui kasutatakse 14C-märgistatud ühendit, tähendab mineralisatsioon ulatuslikku lagundamist, mille käigus märgistatud süsinikuaatom oksüdeerub ning vabaneb sobiv kogus 14CO2 (14).
      
         Poolestusaeg – t0,5 on aeg, mis kulub katseaine 50 %liseks transformatsiooniks, kui transformatsiooni saab kirjeldada esimese astme kineetika abil; poolestusaeg ei sõltu kontsentratsioonist.
      
         DT
         
            50
         
         (hävimisaeg 50) – aeg, mille jooksul katseaine kontsentratsiooni vähendatakse 50 % võrra; see on erinev poolestusajast t0,5, mil transformatsioon ei järgi esimese astme kineetikat.
      
         DT
         
            75
         
         (hävimisaeg 75) – aeg, mille jooksul katseaine kontsentratsiooni vähendatakse 75 % võrra.
      
         DT
         
            90
         
         (hävimisaeg 90) – aeg, mille jooksul katseaine kontsentratsiooni vähendatakse 90 % võrra.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Võrdlusaineid tuleks kasutada transformatsioonisaaduste iseloomustamiseks ja/või identifitseerimiseks spektroskoopiliste ja kromatograafiliste meetodite abil.
      1.4.   KATSE KOHALDAMISALA
      Meetodit kohaldatakse kõikide keemiliste ainete suhtes (märgistamata või radiomärgistatud, mille kohta on olemas piisavalt täpne ja tundlik analüüsimeetod. See on kohaldatav kergelt lenduvate, mittelenduvate, veeslahustuvate või vees mittelahustuvate ühendite suhtes. Katset ei kohaldata kemikaalide suhtes, mis kergesti lenduvad pinnasest (nt fumigandid, orgaanilised lahustid) ja seega ei saa seda hoida pinnases käesolevates katsemeetodites.
      1.5.   TEAVE KATSEAINE KOHTA
      Märgistamata või märgistatud katseainet saab kasutada transformatsioonikiiruse mõõtmiseks. Märgistatud materjal on nõutav transformatsioonitee uurimiseks ja ainetaseme määramiseks. 14C-märgistust soovitatakse, kuid muude isotoopide (näiteks 1
         3C, 1
         5N, 3H, 32P) kasutamine võib olla samuti kasulik. Niipalju kui võimalik tuleks märgistus asetada molekuli kõige stabiilsemale) osa(de) külge (40). Katseaine puhtus peaks olema vähemalt 95 %.
      Enne pinnases aeroobset ja anaeroobset transformatsiooni käsitleva katse tegemist peaks olema katseaine kohta kättesaadaval järgmine teave:
      
                  a)
               
               
                  lahustuvus vees (meetod A.6);
               
            
                  b)
               
               
                  lahustuvus orgaanilistes lahustites;
               
            
                  c)
               
               
                  aururõhk (meetod A.4) ja Henry konstant;
               
            
                  d)
               
               
                  n-oktanooli/vee jaotustegur (meetod A.8);
               
            
                  e)
               
               
                  keemiline stabiilsus pimedas (hüdrolüüs) (meetod C.7);
               
            
                  f)
               
               
                  pKa, kui molekulil on kalduvus protoneerumisele või deprotoneerumisele (OECD juhend 112) (16).
               
            Muu vajalik teave võib sisaldada andmeid katseaine mürgisuse kohta mullamikroobide suhtes (katsemeetodid C.21 ja C.22) (16).
      Katseaine ja selle transformatsioonisaaduste kvantifitseerimise ja identifitseerimise analüüsimeetodid (sh ekstraheerimis- ja puhastamismeetodid) peaksid olema kättesaadavad.
      1.6.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Mullaproove töödeldakse katseainega ja inkubeeritakse pimedas Erlenmeyer kolbides või möödavoolusüsteemides kontrollitud laboritingimustes (konstantse temperatuuri ning pinnaseniiskuse juures). Pärast sobivaid ajavahemikku ekstraheeritakse mullaproovid ja neid analüüsitakse lähteaine ja transformatsioonisaaduste suhtes. Lenduvad saadused kogutakse samuti analüüsiks sobivate absorbtsiooniseadmete abil. Kasutades 14C-märgistusega materjali, saab mõõta katseaine erinevaid mineralisatsioonikiiruseid eraldunud 14CO2 kinni püüdes, ning saab määrata ainetaseme, sh pinnases seotud jäägid.
      1.7.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      1.7.1.   Saagis
      Vähemalt kahe mullaproovi ekstraheerimine ja analüüs kohe katseaine lisamise järel annab esimesi märke analüüsimeetodi korratavuse kohta ning katseaine manustamise ühtsuse kohta Saagised katse hilisematelt etappidelt on saadud vastavatelt ainetasemetelt. Saagised peaksid jääma vahemikku 90–110 % märgistatud kemikaalide puhul (8) ja 70–110 % märgistamata kemikaalide puhul (3).
      1.7.2.   Analüüsimeetodi korratavus ja tundlikkus
      Analüüsimeetodi korratavust (v.a alguses tehtud ektraheerimise tõhusus) katseaine ja transformatsiooni saaduste kvantifitseerimiseks saab kontrollida, korduvanalüüsides samast pinnasest tehtud ekstrakti, mida on inkubeeritud seni, kuni tekivad transformatsioonisaadused.
      Katseaine ja transformatsioonisaaduste puhul on analüüsimeetodi avastamislävi (LOD) peaks olema vähemalt 0,01 mg-kg–1 mullaproovi (katseainena) või 1 % kasutatud annusest, olenevalt sellest, kumb on väiksem. Kvantifikatsioonilävi (LOQ) tuleks samuti määrata.
      1.7.3.   Transformatsioonist saadud andmete täpsus
      Katseaine kontsentratsioonide regressioonanalüüs ajafunktsioonina annab vajalikku teavet transformatsioonikõvera usaldusväärsuse kohta ning võimaldab arvutada poolestusaegade usalduspiire (näilise esimese astme kineetika puhul) või DT50 väärtused ja vajaduse korral DT75 ja DT90 väärtused.
      1.8.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.8.1.   Seadmed ja keemilised reaktiivid
      Inkubatsioonisüsteemid võivad olla staatiliselt suletud süsteemid või sobivad möödavoolusüsteemid (7, 17). Näited mullaproovide inkubatsioonil kasutatava möödavooluseadme ja Erlenmeyeri kolvi kohta on esitatud vastavalt joonistel 1 ja 2. Mõlemat tüüpi inkubatsioonisüsteemidel on eelised ja puudused (7, 17).
      Nõutavad on standardsed laboriseadmed, eriti järgmised:
      
                  —
               
               
                  analüütilised seadmed, näiteks GLC, HPLC, TLC-seadmed, kaasa arvatud radiomärgistatud või märgistamata ainete analüüsimisel kohaldatavad avastamissüsteemid või pööratud isotoopide lahjendusmeetod;
               
            
                  —
               
               
                  identifitseerimisel kasutatavad seadmed (nt MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR jne);
               
            
                  —
               
               
                  vedelikstsintsillaatsioonloendur;
               
            
                  —
               
               
                  oksüdeerija radioaktiivsete ainete põletamiseks;
               
            
                  —
               
               
                  tsentrifuug;
               
            
                  —
               
               
                  ekstraheerimisseade (nt tsentrifuugiküvetid külmekstraheerimiseks ja Soxhlet’ seade pidevekstraheerimiseks püstjahuti all);
               
            
                  —
               
               
                  lahuste ja ekstraktide kontsentreerimise seadmed (nt pöördaurusti);
               
            
                  —
               
               
                  veevann;
               
            
                  —
               
               
                  mehaaniline segamisseade (nt sõtkumismasin, pöörlev segisti).
               
            Kasutatud keemilised reaktiivid, näiteks:
      
                  —
               
               
                  NaOH, analüütiliselt puhas, 2 mol· dm–3, või muu sobiv alus (nt KOH, etanoolamiin);
               
            
                  —
               
               
                  H2SO4, analüütiliselt puhas, 0,05 mol· dm–3;
               
            
                  —
               
               
                  etüleenglükool, analüütiliselt puhas;
               
            
                  —
               
               
                  tahked absorbtsioonimaterjalid, nt naatronlubi ja polüuretaanküünlad;
               
            
                  —
               
               
                  orgaanilised lahustid, analüütiliselt puhtad, nt atsetoon, metanool jt;
               
            
                  —
               
               
                  stsintsillatsioonvedelik.
               
            1.8.2.   Katseaine annustamine
      Mullaproovi lisamiseks või levitamiseks võib katseainet lahustada vees (deioniseeritud või destilleeritud) või vajaduse korral väheses koguses atsetoonis või muudes orgaanilistes lahustites (6), milles katseaine on piisavalt lahustuv ja stabiilne. Valitud lahusti kogusel ei peaks siiski olema olulist mõju mulla mikroobsele aktiivsusele (vt punkte 1.5 ja 1.9.2–1.9.3 Selliste mikrobioloogilist aktiivsust inhibeerivate lahustite nagu kloroform, diklorometaan ja muud halogeenitud lahustid kasutamist tuleks vältida.
      Katseainet võib samuti lisada tahkel kujul, nt segatud kvartsliivaga (6) või mullaproovide väikeste osaproovidena, mida on õhkkuivatatud ja steriliseeritud. Kui katseainet lisatakse lahusti abil, tuleks lasta lahustil aurustuda enne katseainet sisaldava osaproovi lisamist algupärasesse ebasteriilsesse mullaproovi.
      Üldkemikaalide puhul, mis sisenevad mulda üldiselt reoveesetete kaudu või põllumajanduslikul kasutamisel, tuleks katseainet esmalt lisada reovette, mida seejärel annustatakse mullaproovi (vt punkte 1.9.2 ja 1.9.3).
      Preparaatide kasutamist tavaliselt ei soovitata. Nt nõrgalt lahustuva katseaine puhul võib siiski kasutada preparaati sobiva alternatiivina.
      1.8.3.   Pinnased
      1.8.3.1.   Pinnase valik
      Transformatsioonitee kindlaksmääramisel võib kasutada representatiivset pinnast; soovitav pinnasetüüp on saviliiv või liivsavi või savi või savine liiv (vastavalt FAO ja USDA klassifikatsioonile (18)), mille pH on 5,5–8,0, orgaanilise süsiniku sisaldus on of 0,5–2,5 % ja mikroobi biomass on vähemalt 1 % orgaanilise süsiniku koguhulgast (10).
      Transformatsioonitee määramisel tuleks uurida vähemalt kolme representatiivset pinnast. Pinnaste orgaanilise süsiniku sisaldus, pH, savi sisaldus ja mikroobi biomass on erinevad (10).
      Kõiki pinnaseid tuleks iseloomustada vähemalt nende tekstuuri (liiva, aluerüdi, savi (protsentides)) (vastavalt FAO ja USDA klassifikatsioonile (18)), pH, katioonvahetusvõime, orgaanilise süsiniku, lasuvustiheduse, veeläbilaskvusvõime (41) ja mikroobi biomassi poolest (üksnes aeroobsetes uuringutes). Tulemuste tõlgendamisel võib osutuda kasulikuks lisateave pinnaseomaduste kohta. Pinnaseomaduste kindlaksmääramiseks saab kasutada viidetes (19, 20, 21, 22, 23) soovitatud meetodeid. Mikroobi biomass tuleks määrata substraadi indutseeritud hingamise (SIR) meetodi (25, 26) või alternatiivsete meetodite abil (20).
      1.8.3.2.   Mullaproovide kogumine, käsitlemine ja säilitamine
      Üksikasjalik teave proovikogumiskoha ajaloo kohta peaks olema kättesaadav. Üksikasjade hulka kuuluvad täpne asukoht, taimkate, põllukultuuride kaitsevahenditega töötlemise kuupäevad, orgaaniliste ja anorgaaniliste väetistega töötlemine, bioloogiliste materjalide lisamine või juhuslik saastumine. Kui pinnaseid on juba töödeldud katseainega või selle struktuursete analoogidega viimase nelja aasta jooksul, ei tuleks neid kasutada transformatsiooni uuringutel (10, 15).
      Muld peaks olema värskelt kogutud põllult (A-horisondilt või ülemisest 20 cm kihist), ning selle veesisaldus peaks olema selline, et hõlbustaks sõelumist. Muude muldade kui riisipõldude muldade puhul tuleks vältida proovide võtmist pikkade (> 30 päeva) põua-, külmumis- või üleujutusperioodide jooksul või vahetult pärast neid (14). Proove tuleks transportida nii, et muutused mulla veesisalduses oleksid minimaalsed ja neid tuleks hoida pimedas võimalikult vaba õhujuurdepääsuga. Nõrgalt seotud polüetüleenkott on üldiselt selleks piisav.
      Mulda tuleks töödelda nii ruttu kui võimalik pärast proovivõtmist. Taimed, suurem mullafauna ja kivid tuleks eemaldada enne mulla sõelumist läbi 2 mm sõela, mis eemaldab väikesed kivid, fauna ja taimejäätmed. Tuleks vältida mulla ulatuslikku kuivatamiste ja purustamist enne sõelumist (15).
      Kui põllult proovide võtmine on raske talvel (pinnas on külmunud või kaetud lumekihtidega), võib proove võtta mullapartiist, mida säilitatakse kasvuhoones taimkatte all (nt rohu või rohu-ristikheina segu all). Väga on eelistatud uuringud värskelt põllult kogutud muldadega, kuid kui kogutud ja töödeldud mulda tuleb säilitada enne uuringu algust, peavad säilitamistingimused olema piisavad ja üksnes piiratud aja jooksul (4 ± 2 oC maksimaalselt kolm kuud), et säiliks mikroobne aktiivsus (42). Üksikasjalikud juhendid selliste mullaproovide kogumiseks, käsitlemiseks ja säilitamiseks, mida kasutatakse biotransformatsioonikatsetes, on toodud viidetes (8, 10, 15, 26, 27).
      Enne töödeldud pinnase kasutamist katses, tuleks seda eelinkubeerida, et lasta seemnetel idaneda ja saaks need eemaldada ning taastada mikroobide ainevahetuse tasakaal pärast proovivõtu- ja säilitamistingimuste muutumist inkubatsioonitingimusteks. 2–28 päeva vahel toimuv eelinkubeerimine ligikaudu samadel temperatuuri ja niiskuse tingimustel nagu tegelikus katseski on üldiselt piisav (15). Säilitamis- ja eelinkubeerimisperioodid kokku ei tohiks ületada kolme kuud.
      1.9.   KATSE KÄIK
      1.9.1.   Katsetingimused
      1.9.1.1.   Katsetemperatuur
      Kogu katseperioodi jooksul tuleks mullaproovid inkubeerida pimedas konstantsel temperatuuril, mis vastab kliimatingimustele, kus katseainet kasutati või kus toimus vabastamine. Kõikide parasvöötmes pinnasesse jõudvate katseainete puhul on soovitav temperatuur 20 ± 2 oC. Temperatuuri tuleks jälgida.
      Kemikaalide puhul, mida kasutatakse või mis vabanevad külmemas kliimas (nt põhjamaades, sügis/talveperioodil), tuleks inkubeerida lisaproove, kuid madalamal temperatuuril (nt 10 ± 2 oC).
      1.9.1.2.   Niiskusesisaldus
      Aeroobsetes tingimustes transformatsioonikatsete puhul tuleks mulla niiskusesisaldust (43) reguleerida ja säilitada pF vahemikus 2,0–2,5 (3). Mulla niiskusesisaldust väljendatakse veemassina kuiva mulla massi kohta ja seda tuleks korrapäraselt kontrollida (nt kahenädalaste intervallide tagant), kaaludes inkubatsioonikolbe ja veekadusid, mida täiendatakse vee lisamise teel (eelistatavalt steriilne filtreeritud kraanivesi). Tuleks püüda vältida või vähendada katseaine ja/või transformatsioonisaaduste kadu lendumise ja/või fotolagundamise (kui see juhtub) kaudu vedeliku lisamise käigus.
      Anaeroobsetes tingimustes transformatsioonikatsete käigus küllastatakse pinnast veega üleujutamise teel.
      1.9.1.3.   Aeroobsed inkubatsioonitingimused
      Möödavoolusüsteemides säilitatakse aeroobsed tingimused vahelduva loputamise või pidevalt niisutatud õhuga ventileerimise teel. Erlenmeyeri kolbides tagatakse õhuvahetus difusiooni abil.
      1.9.1.4.   Steriilsed aeroobsed tingimused
      Katseaine abiootilise transformatsiooni olulisuse kohta käiva teabe saamiseks võib mullaproovid steriliseerida (steriliseerimismeetodid on viidetes 16 ja 29), töödelda steriilse katseainega (nt lahuse lisamine läbi steriilse filtri) ja tuulutada niisutatud steriilse õhuga, nagu on kirjeldatud punktis 1.9.1.3. Riisipõldude mullaproovide puhul tuleks pinnast ja vett steriliseerida ja inkubeerida tuleks vastavalt punktile 1.9.1.6.
      1.9.1.5.   Aneroobsed inkubatsioonitingimused
      Anaeroobsete tingimuste loomiseks ja säilitamiseks katseainega töödeldud ja aeroobsetes tingimustes 30 päeva või ühe poolestusaja jooksul või DT50 ajal (olenevalt sellest, milleks kulub vähem aega) inkubeeritud pinnast küllastatakse seejärel veega (1–3 cm veekiht) ja inkubatsioonisüsteemi loputatakse inertse gaasiga (nt lämmastik või argoon) (44). (2) Katsesüsteem peab võimaldama järgmiseid mõõtmisi: pH, hapniku kontsentratsiooni ja redokspotentsiaali mõõtmised, ja sisaldama lenduvate saaduste püüdmise seadmeid. Erlenmeyeri kolbidest koosnev süsteem tuleb sulgeda, et vältida õhu sisenemist difusiooni teel.
      1.9.1.6.   Niiske põllu mullaproovide inkubatsioonitingimused
      Riisipõllu mullaproovide transformatsiooni uurimisel ujutataks pinnas üle ligikaudu 1–5 cm veekihiga ja katseainet annustatakse veefaasi (9). Soovitav pinnasesügavus on vähemalt 5 cm. Süsteemi õhutatakse samamoodi nagu aeroobsetel tingimustel. Veekihi pH, hapniku kontsentratsiooni ja redokspotentsiaali tuleks jälgida ja sellest teatada. Vähemalt kahenädalane eelinkubatsiooniperiood on vajalik enne transformatsiooniuuringutega alustamist (vt punkt 1.8.3.2).
      1.9.1.7.   Katse kestus
      Kiirust ja transformatsiooniteed käsitlevad uuringud ei tohiks tavaliselt ületada 120 päeva (45) (3, 6, 8), kuna seejärel eeldatakse, et väheneb mulla mikroobne aktiivsus tehislaborisüsteemis, kus ei täiene looduslikult toitainetagavarad. Kui katseaine vähenemist ja peamiste transformatsioonisaaduste teket ja vähenemist on vaja kirjeldada, tuleks uuringuid jätkata pikema aja jooksul (nt 6 või 12 kuud) (8). Pikemaid inkubatsiooniperioode tuleks põhjendada katseprotokollis ja sellele tuleks lisada biomassi mõõtmised nimetatud perioodide kestel ja lõpus.
      1.9.2.   Katse käik
      Ligikaudu 50–200 g mulda (kuivmassina) asetatakse iga inkubatsioonikolvi põhja (vt 3. liites jooniseid 1 ja 2) ning mulda töödeldakse katseainega ühe punktis 1.8.2 kirjeldatud meetodi abil. Kui orgaanilisi lahusteid kasutatakse katseaine annustamiseks, tuleks need eemaldada mullast aurustamise teel. Seejärel segatakse muld hoolikalt spaatliga ja/või kolvi raputamise teel. Kui uuring tehakse niiskete põldude tingimustes, tuleks mulda ja vett hoolikalt segada pärast katseaine lisamist. Väikeseid töödeldud muldade alikvoote (nt 1 g) tuleks analüüsida katseaine ühtlase jaotuse kontrollimiseks. Alternatiivne meetod on toodud allpool.
      Annustatav kogus peaks vastama põllukultuuride kaitsevahendite kasutusjuhendites soovitatud suurimale annusele ja ühtset levimist sobivasse sügavusse (nt ülemisse 10 cm mullakihti (46). Näiteks, kemikaalide puhul, mis levivad taimede lehtedesse või pinnasesse ilma, et need tungiksid taimedesse, sobiv sügavus selle arvutamiseks, kui palju kemikaali tuleks igasse kolbi lisada, on 2,5 cm. Pinnasesse tunginud kemikaalide puhul on sobiv sügavus kasutusjuhendis täpsustatud tungimissügavus. Üldkemikaalide puhul tuleks hinnata annustamist kõige sobivama pinnasesse tungimise tee põhjal, näiteks, kui peamine pinnasesse tungimise tee on läbi reoveesetete, tuleks kemikaali annustada reovette kontsentratsioonis, mis vastab oodatud reovee kontsentratsioonile, ja pinnasesse lisatud reovee hulk peaks vastama tavalisele põllumajanduses kasutatavate pinnaste reovee määrale. Kui see kontsentratsioon ei ole piisavalt suur peamiste transformatsioonisaaduste identifitseerimiseks, võib olla abiks erinevate suuremaid kontsentratsioone sisaldavate mullaproovide inkubeerimine, kuid tuleks vältida liiga suuri annusmäärasid, mis võivad mõjutada mulla mikroobide funktsioone (vt punkte 1.5 ja 1.8.2).
      Alternatiivselt saab katseainega töödelda suuremat mullakogust (s.t 1–2 kg), seda hoolikalt segades sobiva segamisseadme abil ja seejärel asetades need väikeste, 50–200 g osadena inkubatsioonikolbidesse (nt proovijaoturite abil) Väikeseid töödeldud muldade alikvoote (nt 1 g) tuleks analüüsida katseaine ühtlase jaotuse kontrollimiseks. Sellist protseduuri eelistatakse, kuna see võimaldab ühtlasemalt katseainet pinnasesse jagada.
      Samuti inkubeeritakse töötlemata mullaproove samadel tingimustel (aeroobsed) nagu katseainega töödeldud proove. Nimetatud proove kasutatakse biomassi mõõtmistel uuringu käigus ja lõpus.
      Kui katseainet lisatakse pinnasesse lahjendatuna orgaanilis(t)es lahusti(te)s, inkubeeritakse sama koguse lahusti(te)ga töödeldud mullaproove samadel tingimustel (aeroobsed) kui katseainega töödeldud mullaproove. Nimetatud proove kasutatakse biomassi mõõtmistel uuringute alguses, kestel ja lõpus lahusti(te) mõjude kontrollimiseks mikroobi biomassi suhtes.
      Töödeldud mullaproove sisaldavad kolvid kas kinnitatakse möödavoolusüsteemi, mida on kirjeldatud joonisel 1, või suletakse absorbtsioonikolonni, mis on toodud joonisel 2 (vt 3. liidet).
      1.9.3.   Proovide võtmine ja mõõtmine
      Paralleelsed inkubatsioonikolvid eemaldatakse sobiva ajavahemiku tagant ja mullaproovid ekstraheeritakse erineva polaarsusega lahustitega ning analüüsitakse katseaine ja/või transformatsioonisaaduste osas. Hästi väljatöötatud uuringus on piisavalt kolbe, et igal proovivõtukorral kasutatakse kahte kolbi. Samamoodi eemaldatakse absorbtsioonilahused või tahked absorbtsioonimaterjalid erinevate ajavahemike tagant (seitsmepäevane intervallid esimese kuu jooksul ja pärast ühe kuu möödumist 17päevased intervallid) iga mullaproovi inkubatsiooni kestel ja lõpus ning analüüsitakse lenduvate saaduste osas. Kohe katseaine manustamise järel (0-päeva proov) võetud mullaproovile lisaks tuleks katsetesse lisada vähemalt viis erinevat proovivõtukohta. Ajavahemikud tuleks valida nii, et katseaine vähenemisaegu ning transformatsioonisaaduste tekke- ja vähenemisaegu saaks määrata (nt 0, 1, 3, 7 päeva; 2, 3 nädalat; 1, 2, 3 kuud jne).
      Kasutades 14C-märgistusega katseainet, ekstraheerimata radioaktiivsete ainete määr määratakse põlemise teel ja ainetase arvutatakse iga proovivõtuaja kohta.
      Anaeroobsete ja niiske põllu proovide korral mulla- ja veefaase ning katseaine ja transformatsioonisaaduseid analüüsitakse või eraldatakse filtreerimise või tsentrifuugimise teel enne ekstraheerimist ja analüüsi.
      1.9.4.   Valikkatsed
      Aeroobsetes, mittesteriilsetes uuringutes, milles kasutatakse muid temperatuure ja mullaniiskust, võib hinnata pinnase temperatuuri ja niiskuse mõju katseaine ja/või selle transformatsioonisaaduste transformatsioonikiirust pinnases.
      Ekstraheerimata radioaktiivseid aineid võib lisaks proovida kirjeldada näiteks ülikriitilisel vedeliku ekstraheerimisel.
      2.   ANDMED
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE
      Katseaine, transformatsioonisaaduste, lenduvate ainete (vaid protsendina) ja ekstraheerimata ainete kogused tuleks esitada protsendina lähtekontsentratsioonist ja vajaduse korral mg· kg–1 mullaproove (tahke kuivmass) igas proovivõtuvahemikus. Ainetase tuleks esitada protsendina lisatud lähtekontsentratsioonist igas proovivõtuvahemikus. Katseaine graafiline esitamine aja funktsioonina aitab hinnata transformatsiooni poolestusaega või DT50. Peamised transformatsioonisaadused tuleks identifitseerida ja nende kontsentratsioonid tuleks esitada aja funktsioonina, et näidata nende tekke- ja vähenemiskiirust. Peamised transformatsioonisaadused on mis tahes saadused, mida esineb igal ajahetkel uuringu käigus ≥10 % katseaine annusest.
      Kinnipüütud lenduvad ained annavad märke selle kohta, et katseaine ja selle transformatsioonisaaduste võimest pinnasest lenduda.
      Sobivate kineetilise mudeli kohaste arvutuste põhjal peaks saama täpsemalt määrata poolestusajad või DT50 väärtused ja vajaduse korral DT75 ja DT90 väärtused. Poolestusajad ja DT50 väärtused tuleks teatada koos kasutatava mudeli, kineetika astme ja määramiskoefitsiendi (r2) kirjeldusega. Esimese astme kineetika on soositud, välja arvatud juhul, kui r2 < 0,7. Vajaduse korral tuleks arvutused teha peamiste transformatsioonisaaduste kohta. Sobivate mudelite näiteid kirjeldatakse viidetes 31–35.
      Uurides erinevatel temperatuuridel kiiruseid, tuleks kirjeldada transformatsioonikiirust temperatuuri funktsioonina katsetemperatuuri vahemikus, kasutades Arrheniuse võrrandit kujul:
      
          or ,
      kus In A ja B on kõige sobivama joone lõikepunktist ja tõusust saadavad regressioonkonstandid, mis saadakse ln k ja 1/T lineaarse regressioonanalüüsi tulemusena, k on kiirusekonstant temperatuuril T ja T on temperatuur Kelvini järgi. Kui transformatsiooni reguleerib mikroobide tegevus, tuleks võtta arvesse piiratud temperatuurivahemikku, milles Arrheniuse võrrand kehtib.
      2.2.   TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE
      Kuigi uuringuid tehakse tehislaboritingimustes, saab tulemuste põhjal hinnata katseaine transformatsioonikiirust ja samuti transformatsioonisaaduste tekke- ja vähenemiskiirust välitingimustes (36, 37).
      Katseaine transformatsioonitee uuring annab teavet selle kohta, kuidas lisatud ainet struktuur pinnases muutub keemiliste ja mikroobsete reaktsioonide abil.
      3.   ARUANDLUS
      3.1.   KATSEARUANNE
      Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Katseaine:
                  
                              —
                           
                           
                              üldnimetus, keemiline nimetus, CASi number, struktuurivalem (tuues ära märgi/märkide asukoha, kui kasutatakse radiomärgistatud ainet) ja asjaomased füüsikalis-keemilised omadused (vt punkti 1.5);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katseaine puhtus (lisandid);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              märgistatud kemikaali radiokeemiline puhtus ja spetsiifiline aktiivsus (vajaduse korral).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Võrdlusained:
                  
                              —
                           
                           
                              selliste võrdlusainete keemiline nimetus ja struktuur, mida kasutatakse transformatsioonisaaduste kirjeldamiseks ja/või identifitseerimiseks.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsepinnased:
                  
                              —
                           
                           
                              üksikasjalikud andmed kogumiskoha koha;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mullaproovide võtmise kuupäev ja protseduur;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pinnase omadused, nt pH, orgaanilise süsiniku sisaldus, tekstuur (liiva-, aleuriidi-, saviprotsent), katioonvahetusvõime, lasuvustihedus, veeläbilaskvusvõime ja mikroobi biomass;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mullaproovide säilitamise kestus ja tingimused (kui need säilitatakse).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              uuringute tegemise kuupäevad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lisatud katseaine kogus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kasutatud lahustid ja katseaine lisamise meetod;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              töödeldud mullaproovide lähtemass ja nende mass analüüsi igal proovivõtukorral;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kasutatud inkubatsioonisüsteemi kirjeldus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              õhu voolukiirus (üksnes möödavoolussüsteemides);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katsesüsteemi temperatuur;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mullaproovide niiskusesisaldus inkubatsiooni ajal;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mikroobi biomass aeroobse uuringu alguses, kestel ja lõpus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pH, hapniku kontsentratsioon ja redokspotentsiaal anaeroobsete ja niiske põllumaa uuringute alguses, kestel ja lõpus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ekstraheerimismeetod;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katseaine ja peamiste transformatsioonisaaduste kvantifitseerimis- ja identifitseerimismeetodid mullaproovides ning ja absorbtsioonimaterjalides;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              paralleelproovide arv ja kontrollproovide arv.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              mikroobide tegevuse määramistulemus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kasutatud analüüsimeetodite korratavus ja tundlikkus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              saagisemäärad (valiidse katse protsendimäärad on toodud punktis 1.7.1);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tulemused tabeli kujul, väljendatuna protsendina lähteannusest ja vajaduse korral mg· kg–1 mullaproovi (kuivmass);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ainetase uuringute kestel ja lõpus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pinnase ekstraheerimata (seotud) radioaktiivsuse või jääkide iseloomustamine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vabanenud CO2 ja muude lenduvate ühendite kvantifitseerimine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katseaine ja vajaduse korral transformatsioonisaaduste kontsentratsioonid mullaproovis esitatud aja funktsioonina;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katseaine ja vajaduse korral transformatsioonisaaduste poolestusaeg või DT50, DT75 ja DT90 väärtused usaldusvahemikes;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              hinnang abiootilise lagunemise kiirusele steriilsetes tingimustes;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              hinnang katseaine ja vajaduse korral peamiste transformatsioonisaaduste transformatsioonikineetika kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vajaduse korral eeldatavad transformatsiooniteed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tulemuste arutelu ja tõlgendamine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              töötlemata tulemused (s.t proovide kromatogrammid, transformatsioonikiirust käsitlevad arvutused ja transformatsioonisaaduste identifitseerimiseks kasutatavad vahendid).
                           
                        
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
               
            
                  2)
               
               
                  Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada.
               
            
                  3)
               
               
                  European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC of 14 July 1995 amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. Annex II, Part A and Annex HI, Part A: Fate and Behaviour in the Environment.
               
            
                  4)
               
               
                  Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in sou, water and air.
               
            
                  5)
               
               
                  BBA (1986). Richtlinie fur die amtliche Prufung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden – Abbau, Umwandlung und Metabolismus.
               
            
                  6)
               
               
                  ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality – Guidance on laboratory tests for biodegradation of organic chemicals in soil – Part 1: Aerobic conditions.
               
            
                  7)
               
               
                  ISO 14239 (1997). Soil Quality- Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
               
            
                  8)
               
               
                  SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.
               
            
                  9)
               
               
                  MAFF – Japan 2000 – Draft Guidelines for transformation studies of pesticides in soil – Aerobic metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded).
               
            
                  10)
               
               
                  OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
               
            
                  11)
               
               
                  Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123–157.
               
            
                  12)
               
               
                  DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley – VCH (1998).
               
            
                  13)
               
               
                  T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).
               
            
                  14)
               
               
                  OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).
               
            
                  15)
               
               
                  ISO 10381-6 (199 3). Soil Quality – Sampling – Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
               
            
                  16)
               
               
                  Annex V to Dir. 67/548/EEC.
               
            
                  17)
               
               
                  Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85–114.
               
            
                  18)
               
               
                  Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 3 3, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
               
            
                  19)
               
               
                  Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mineralogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
               
            
                  20)
               
               
                  Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Microbiological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
               
            
                  21)
               
               
                  ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality – General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.
               
            
                  22)
               
               
                  Muckenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.
               
            
                  23)
               
               
                  Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.
               
            
                  24)
               
               
                  Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215–221.
               
            
                  25)
               
               
                  ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: fumigation-extraction method.
               
            
                  26)
               
               
                  Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45–60.
               
            
                  27)
               
               
                  Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation in the environment: Aerobic and bio-transformation of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16 Symposium on Environmental Science of Pesticide, 105–120.
               
            
                  28)
               
               
                  Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59–63 (SETAC-Europe).
               
            
                  29)
               
               
                  Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjodahl-Svensson K., Stenstrom J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68–69 (SETAC-Europe).
               
            
                  30)
               
               
                  Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethylene oxide on soil microbial content and some chemical characteristics. Plant and Soil 102, 197–200.
               
            
                  31)
               
               
                  Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Fesdegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141–146.
               
            
                  32)
               
               
                  Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical modelling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181–199.
               
            
                  33)
               
               
                  Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In „Environmental Dynamics of Pesticides”. R. Haque and V.H. Freed, Eds., 135–172.
               
            
                  34)
               
               
                  Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 39, 188–204.
               
            
                  35)
               
               
                  Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 33, 47–60.
               
            
                  36)
               
               
                  Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, 1032–1041.
               
            
                  37)
               
               
                  Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 83–122.
               
            
         1. liide
         VEEPINEVUS, VÄLIVEEMAHUTAVUS (FC) JA VEEMAHUTAVUS (WHC) (47)
         
         
                     Veesamba kõrgus
                     (cm)
                  
                  
                     pF (48)
                     
                  
                  
                     baar (49)
                     
                  
                  
                     Märkused
                  
               
                     107
                     
                  
                  
                     7
                  
                  
                     104
                     
                  
                  
                     Kuiv pinnas
                  
               
                     1,6 · 104
                     
                  
                  
                     4,2
                  
                  
                     16
                  
                  
                     Närbumispiir
                  
               
                     104
                     
                  
                  
                     4
                  
                  
                     10
                  
                  
                      
                  
               
                     103
                     
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1
                  
                  
                      
                  
               
                     6 · 102
                     
                  
                  
                     2,8
                  
                  
                     0,6
                  
                  
                      
                  
               
                     3,3 · 102
                     
                  
                  
                     2,5
                  
                  
                     0,33 (50)
                     
                  
                  
                     Väliveemahutavuse ala (51)
                     
                  
               
                     102
                     
                  
                  
                     2
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     60
                  
                  
                     1,8
                  
                  
                     0,06
                  
               
                     33
                  
                  
                     1,5
                  
                  
                     0,033
                  
               
                     10
                  
                  
                     1
                  
                  
                     0,01
                  
                  
                     WHC (hinnang)
                  
               
                     1
                  
                  
                     0
                  
                  
                     0,001
                  
                  
                     Veega küllastatud pinnas
                  
               
            Veepinevust mõõdetakse veesamba kõrgusena (cm) või baarides. Imirõhu laia ulatuse tõttu väljendatakse seda üksnes pF väärtusena, mis vastab veesamba logaritmile.
         
            Väliveemahutavus on määratletud veehulgana, mida võib säilitada atmosfäärirõhus looduspinnases 2 päeva pärast pikemat vihmaperioodi või pärast piisavat kastmist. See määratakse looduspärases pinnases in situ põllul. Mõõtmist seega ei kohaldata pinnase häiritud laboriproovides. Häiritud mullaproovides määratud FC väärtused võivad esindada suuri süsteemseid muutusi.
         
            Veemahutavus (WHC) määratakse kindlaks laboris looduspärases või häiritud mullas, küllastades mullasammast veega kapillaartranspordi teel. See on eriti kasulik häiritud mullaproovide teel ja võib olla kuni 30 % suurem kui väliveemahutavus (47). Samuti võib olla seda katseliselt kergem määrata kui usaldusväärseid FC-väärtusi.
         Märkused
      
      
         2. liide
         ERINEVATEST RIIKIDEST ERINEVATEST MULLATÜÜPIDEST VÕETUD MULLAPROOVIDE NIISKUSESISALDUS (g vett 100 g kuiva pinnase kohta)
         
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     Niiskusesisaldus
                  
               
                     Mullatüüp
                  
                  
                     Riik
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     WHC (52)
                     
                  
                  
                     pF = 1,8
                  
                  
                     pF = 2,5
                  
               
                     Liiv
                  
                  
                     Saksamaa
                  
                  
                     28,7
                  
                  
                     8,8
                  
                  
                     3,9
                  
               
                     Mudane liiv
                  
                  
                     Saksamaa
                  
                  
                     50,4
                  
                  
                     17,9
                  
                  
                     12,1
                  
               
                     Mudane liiv
                  
                  
                     Šveits
                  
                  
                     44,0
                  
                  
                     35,3
                  
                  
                     9,2
                  
               
                     Aleuriitne muda
                  
                  
                     Šveits
                  
                  
                     72,8
                  
                  
                     56,6
                  
                  
                     28,4
                  
               
                     Savimuda
                  
                  
                     Brasiilia
                  
                  
                     69,7
                  
                  
                     38,4
                  
                  
                     27,3
                  
               
                     Savimuda
                  
                  
                     Jaapan
                  
                  
                     74,4
                  
                  
                     57,8
                  
                  
                     31,4
                  
               
                     Liivane muda
                  
                  
                     Jaapan
                  
                  
                     82,4
                  
                  
                     59,2
                  
                  
                     36,0
                  
               
                     Aleuriitne muda
                  
                  
                     Ameerika Ühendriigid
                  
                  
                     47,2
                  
                  
                     33,2
                  
                  
                     18,8
                  
               
                     Liivane muda
                  
                  
                     Ameerika Ühendriigid
                  
                  
                     40,4
                  
                  
                     25,2
                  
                  
                     13,3
                  
               
      
         3. liide
         Joonis 1
         Näide möödavooluseadmest, mida kasutatakse kemikaalide transformatsiooni uurimisel pinnases
                (53)
                (54)
            
         
         
            
         Joonis 2
         Näide Erlenmeyeri kolvist, mida kasutatakse kemikaalide transformatsiooni uurimisel pinnases
                (55)
            
         
         
            
      
      C.24.   AEROOBNE JA ANAEROOBNE TRANSFORMATSIOON PÕHJASETTES
      1.   MEETOD
      Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 308 (2002).
      1.1.   SISSEJUHATUS
      Kemikaalid võivad pääseda madalasse või sügavasse pinnavette näiteks otse annustatuna, õhku pihustatuna, äravoolu või kuivendamise kaudu, jäätmete kõrvaldamisel, tööstusliku, kodumajapidamise või põllumajandusliku heitveena ja atmosfäärist väljasadenemisel. Käesolev katsemeetod kirjeldab laborimeetodit, mida kasutatakse orgaaniliste kemikaalide aeroobse ja anaeroobse transformatsiooni hindamiseks põhjasettes. See põhineb olemasolevatel juhenditel (1, 2, 3, 4, 5, 6). Käesolevas katses kasutatavate pinnaste arvu ja tüüpide osas lepiti kokku pinnase ja sedimentide valikut käsitlevas OECD töörühmas, mis tuli kokku Belgirates Itaalias 1995. aastal (7). Töörühm tegi samuti soovitusi seoses mullaproovide kogumise, käsitlemise ja säilitamisega, vastavalt ISO juhendile (8). Sellised uuringud tehakse kemikaalidega, mida levitatakse otse vette või mis tõenäoliselt jõuavad veekeskkonda eespool kirjeldatud viisil.
      Loodusliku põhjasette tingimused on tihti aeroobsed ülemises veefaasis. Sette pinnakiht võib olla kas aeroobne või anaeroobne, kuigi sügavam sete on tavaliselt anaeroobne. Kõikide nende võimaluste hõlmamiseks kirjeldatakse käesolevas dokumendis nii aeroobseid kui ka anaeroobseid katseid. Aeroobne katse simuleerib aeroobset veesammast, mille all on aeroobne settekiht ja mille all omakorda anaeroobne gradient. Anaeroobne katse simuleerib täielikult anaeroobset põhjasetet. Kui asjaolud viitavad sellele, et on vaja oluliselt kõrvale kalduda neist soovitustest, nt kasutades puutumata sette tuuma või setteid, mis võivad olla kokku puutunud katseainetega, on selleks kättesaadavad muud meetodid (9).
      1.2.   MÕISTED
      SI-ühikuid tuleks kasutada igal juhul.
      
         Katseaine – mis tahes aine, kas lähteühend või vastav transformatsioonisaadus.
      
         Transformatsioonisaadused – kõik katseaine biootilistes või abiootilistes transformatsioonireaktsioonides saadud ained, kaasa arvatud CO2 ja tooted, mis on seotud jääkides.
      
         Seotud jäägid – pinnases, taimedes või loomades olevad ühendid, mis ekstraheerimise järel säilivad matriitsis lähteainena või selle metaboliidi(metaboliitide)/transformatsioonisaadustena. Ekstraheerimismeetod ei tohiks oluliselt muuta ühendit ennast või matriitsi struktuuri. Seose olemust saab selgitada osaliselt matriitsi muutva ekstraheerimismeetodi ja täiustatud analüüsitehnikate abil. Tänaseni, näiteks, on sel viisil kindlaks tehtud kovalentsed ioonsidemed ja sorptsioonsidemed ning „lõksud”. Üldiselt vähendab seotud jääkide teke oluliselt bioloogilist kättesaadavust ja bioloogilist omastatavust (10) (1984. aasta IUPACi muudatus (11)).
      
         Aeroobne transformatsioon – (oksüdeeriv): reaktsioonid, milles osaleb molekulaarne hapnik (12).
      
         Anaeroobne transformatsioon – (redutseeriv): reaktsioonid, milles ei osale molekulaarne hapnik (12).
      
         Looduslikud veed – pinnaveed, mis on saadud tiikides, jõgedes, ojadest jm.
      
         Sete – segu mineraalsetest ja orgaanilistest keemilistest koostisainetest, millest viimased sisaldavad kõrge süsiniku- ja lämmastikusisaldusega ning suure molekulmassiga ühendeid. See sadestub looduslikku vette, millega ta moodustab piirkihi.
      
         Mineralisatsioon – orgaanilise ühendi täielik lagunemine CO2-ks ja H2O-ks aeroobsetes tingimustes ning CH4-ks, CO2-ks ja H2O-ks anaeroobsetes tingimustes. Käesoleva katsemeetodi kontekstis, kui kasutatakse radiomärgistatud ühendit, tähendab mineralisatsioon ulatuslikku lagundamist, mille käigus märgistatud süsinikuaatom oksüdeeritakse ning vabaneb sobiv kogus 14CO2 või 14CH4.
      
         Poolestusaeg, t0,5 – aeg, mis kulub katseaine 50 %liseks transformatsiooniks, kui transformatsiooni saab kirjeldada esimese astme kineetika abil; poolestusaeg ei sõltu lähtekontsentratsioonist.
      
         DT
         
            50
         
         (hävimisaeg 50) – aeg, mille jooksul katseaine lähtekontsentratsiooni vähendatakse 50 % võrra.
      
         DT
         
            75
         
         (hävimisaeg 75) – aeg, mille jooksul katseaine lähtekontsentratsiooni vähendatakse 75 % võrra.
      
         DT
         
            90
         
         (hävimisaeg 90) – aeg, mille jooksul katseaine lähtekontsentratsiooni vähendatakse 90 % võrra.
      1.3.   VÕRDLUSAINED
      Võrdlusaineid tuleks kasutada transformatsioonisaaduste identifitseerimiseks ja/või kvantifitseerimiseks spektroskoopiliste ja kromatograafiliste meetodite abil.
      1.4.   TEAVE KATSEAINE KOHTA
      Märgistamata või isotoopmärgistatud katseainet saab kasutada transformatsioonikiiruse mõõtmiseks, kuigi eelistatakse märgistatud materjali. Märgistatud materjal on nõutav transformatsioonitee uurimiseks ja ainetaseme määramiseks. 14C-märgistust soovitatakse, kuid muude isotoopide (näiteks 13C, 15N, 3H, 32P) kasutamine võib olla samuti kasulik. Niipalju kui võimalik tuleks märgistus asetada molekuli kõige stabiilsema(te) osa(de) külge (56). Katseaine keemiline ja/või radiokeemiline puhtus peaks olema vähemalt 95 %.
      Enne katse sooritamist peaks katseaine kohta olemas olema järgmine teave:
      
                  a)
               
               
                  lahustuvus vees (meetod A.6);
               
            
                  b)
               
               
                  lahustuvus orgaanilistes lahustites;
               
            
                  c)
               
               
                  aururõhk (meetod A.4) ja Henry konstant;
               
            
                  d)
               
               
                  n-oktanooli/vee jaotustegur (meetod A.8);
               
            
                  e)
               
               
                  adsorptsioonikoefitsient (Kd, Kf või Koc vajaduse korral) (meetod C.18);
               
            
                  f)
               
               
                  hüdrolüüs (meetod C.7);
               
            
                  g)
               
               
                  dissotsiatsioonikonstant (pKa) (OECD juhend 112) (13);
               
            
                  h)
               
               
                  katseaine keemiline struktuur ja isotoopmärgistus(t)e asukoht, kui need esinevad.
               
            
         Märkus. Tuleks märkida temperatuur, mille juures mõõtmisi tehakse.
      Muu kasuliku teabe hulka võivad kuuluda andmed katseaine mikroorganismidele mõjuva mürgisuse kohta, andmed kiire ja/või inherentse biolagundatavuse kohta ning andmed aeroobse ja anaeroobse transformatsiooni kohta pinnases.
      Katseaine ja selle vees ja settes olevate transformatsioonisaaduste kvantifitseerimise ja identifitseerimise analüüsimeetodid (sh ekstraheerimis- ja puhastamismeetodid) peaksid olema kättesaadavad (vt punkti 1.7.2).
      1.5.   KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
      Käesolevas katses kirjeldatud meetod kasutab aeroobseid ja anaeroobseid põhjasetteid (vt 1. liidet), mis võimaldavad:
      
                  i)
               
               
                  katseaine transformatsioonikiiruse mõõtmist põhjasettes;
               
            
                  ii)
               
               
                  katseaine transformatsioonikiiruse mõõtmist settes;
               
            
                  iii)
               
               
                  katseaine ja/või transformatsioonisaaduste mineralisatsioonikiiruse mõõtmist (kui kasutatakse 14C-märgistusega katseainet);
               
            
                  iv)
               
               
                  transformatsioonisaaduste identifitseerimine ja kvantifitseerimine vee- ja settefaasides, sh ainetase (kui kasutatakse märgistatud katseainet);
               
            
                  v)
               
               
                  katseaine ja selle transformatsioonisaaduste jaotamise mõõtmine kahe faasi vahel inkubatsiooni ajal pimedas (et vältida, näiteks, vetikavohangut) konstantsel temperatuuril. Poolestusajad, DT50, DT75 ja DT90 väärtused määratakse, kui andmed seda lubavad, kuid neid ei tohiks ekstrapoleerida pikalt üle katseperioodi (vt punkti 1.2).
               
            Vähemalt kaks setet ja nendega seotud veed on nõutavad nii aeroobseks kui anaeroobseks katseks (7). Siiski võib esineda olukordi, kui tuleks kasutada rohkem kui kahte põhjasetet, näiteks, kemikaalide puhul, mis võivad esineda magevees ja/või merekeskkonnas.
      1.6.   KATSE KOHALDAMISALA
      Meetodit kohaldatakse kõikide keemiliste ainete suhtes (märgistamata või märgistatud, mille kohta on olemas piisavalt täpne ja tundlik analüüsimeetod. See on kohaldatav kergelt lenduvate, mittelenduvate, veeslahustuvate või vees halvasti lahustuvate ühendite suhtes. Katset ei kohaldata kemikaalide suhtes, mis kergesti lenduvad pinnasest (nt fumigandid, orgaanilised lahustid) ja seega ei saa seda hoida vees ja/või settes käesolevates katsemeetodites.
      Meetodit on kohaldatud nii palju, et uurida kemikaalide transformatsiooni magevees ja setetes, kuid põhimõtteliselt võib seda kohaldada ka suudmealas ja merekeskkonnas. See ei sobi voolava vee (nt jõed) või avamere tingimuste simuleerimiseks.
      1.7.   KVALITEEDIKRITEERIUMID
      1.7.1.   Saagis
      Vähemalt kahe vee- ja setteproovi ekstraheerimine ja analüüs kohe katseaine lisamise järel annab esimesi märke analüüsimeetodi korratavuse kohta ning katseaine manustamise ühtsuse kohta Saagised katse hilisematelt etappidelt on saadud vastavatelt ainetasemetelt (kui kasutatakse märgistatud materjali). Saagised peaksid jääma vahemikku 90–110 % märgistatud kemikaalide puhul (6) ja 70–110 % märgistamata kemikaalide puhul.
      1.7.2.   Analüüsimeetodi korratavus ja tundlikkus
      Analüüsimeetodi korratavust (v.a alguses tehtud ekstraheerimise tõhusus) katseaine ja transformatsiooni saaduste kvantifitseerimiseks saab kontrollida, korduvanalüüsides samast veest või settest tehtud ekstrakti, mida on inkubeeritud seni, kuni tekivad transformatsioonisaadused.
      Katseaine ja transformatsioonisaaduste puhul peaks analüüsimeetodi avastamislävi (LOD) olema vähemalt 0,01 mg· kg–1 vee- või setteproovina (katseainena) või 1 % kasutatud lähteannusest, olenevalt sellest, kumb on väiksem. Kvantifikatsioonilävi (LOQ) tuleks samuti määrata.
      1.7.3.   Transformatsioonist saadud andmete täpsus
      Katseaine kontsentratsioonide regressioonanalüüs ajafunktsioonina annab vajalikku teavet transformatsioonikõvera täpsuse kohta ning võimaldab arvutada poolestusaegade usalduspiire (näilise esimese astme kineetika puhul) või DT50 väärtused ja vajaduse korral DT75 ja DT90 väärtused.
      1.8.   KATSEMEETODI KIRJELDUS
      1.8.1.   Katsesüsteem ja -seadmed
      Katse tuleks teha klaasmahutites (nt pudelid, tsentrifuugiküvetid), välja arvatud juhul, kui esialgne teave (nt (n-oktanooli-vee jaotustegur, sorbtsiooniandmed jne) viitab sellele, et katseaine võib kinnituda klaasile, mistõttu võiks kaaluda alternatiivse materjali kasutamist (nt Teflon®). Kui on teada, et katseaine kinnitub klaasile, võib olla võimalik leevendada seda probleemi, kasutades ühte või mitut järgmistest meetoditest:
      
                  —
               
               
                  määrata klaasile kinnitunud katseaine ja transformatsioonisaaduste mass;
               
            
                  —
               
               
                  pesta kõik klaasnõud lahustiga katse lõpus;
               
            
                  —
               
               
                  kasutada preparaate (vt ka punkti 1.9.2);
               
            
                  —
               
               
                  kasutada katseaine süsteemi lisamisel kaaslahusti suurenenud kogust; kui kasutatakse kaaslahustit, peaks see olema selline, mis ei solvolüüsi katseainet.
               
            Tüüpilise katseseadme näited, s.t gaasimöödavoolu- ja biomeetersüsteemid, on toodud vastavalt 2. ja 3. liites (14). Muid kasulikke inkubatsioonisüsteeme on kirjeldatud viites 15. Katseseadme ülesehitus peaks olema selline, et see võimaldab õhu või lämmastiku vahetust ning lenduvate ainete püüdmist. Seadme mõõdud peaksid vastama katsetingimustele (vt 1.9.1). Ventilatsioon tagatakse kas kerge mullitamise või viies õhu või lämmastiku veepinnale. Viimasel juhul on soovitav segada vett kergelt ülevalpool, et hapnik või lämmastik vees paremini leviks. CO2-vaba õhku ei tohiks kasutada, kuna see võib põhjustada vee pH taseme tõusu. Igal juhul sette häirimine on ebasoovitav ja seda peaks vältima niipalju kui võimalik. Kergelt lenduvaid aineid tuleks uurida biomeetersüsteemis, veepinda kergelt segades. Samuti võib kasutada suletud anumaid, milles on kas atmosfääriõhuga või lämmastikuga õhuruum, ja sisemisi pudeleid lenduvate ainete püüdmiseks (16). Õhuruumi gaasi regulaarne vahetumine on nõutav aeroobses katses, et kompenseerida hapniku tarbimist biomassi poolt.
      Lenduvate transformatsioonisaaduste kogumiseks sobivad lõksud sisaldavad, kuid mitte ainult 1 mol· dm–3 kaaliumhüdroksiidi või naatriumhüdroksiidi lahuseid süsinikdioksiidi puhul (57) ja etüleenglükooli, etanoolamiini või 2 % parafiini ksüleenis orgaaniliste ühendite puhul. Anaeroobsetes tingimustes tekkinud lenduvad ained, näiteks metaan, saab koguda, näiteks, molekulaarsõelade abil. Sellised lenduvad ained saab põletada, näiteks, CO2-ks, viies gaasi CuO-ga täidetud kvartstorusse temperatuuril 900 oC ja püüdes absorberis tekkinud CO2 leelisesse (17).
      Nõutavad on katseainete ja transformatsioonisaaduste keemilise analüüsi laboriseadmed (nt gaasvedelikkromatograafia (GLC), kõrgefektiivne vedelikkromatograafia (HPLC), planaarkromatograafia (TLC), mass-spektroskoopia (MS), gaaskromatograaifa – mass-spektroskoopia (GS-MS), vedelikkromatograafia – mass-spektromeetria (LC-MS), tuumamagnetresonants (NMR) jne), sh vajaduse korral radiomärgistatud või märgistamata kemikaalide avastamissüsteemid. Kui kasutatakse radiomärgistatud materjali, soovitatakse samuti vedelikstsintsillatsioonloendurit ja oksüdeerijat põletamiseks (setteproovide põletamiseks enne radioaktiivsuse analüüsi).
      Muud standardlaboriseadmed füüsikalis-keemiliste ja bioloogiliste määramiste joaks (vt tabelit 1 punktis 1.8.2.2), klaasnõud, kemikaalid ja reaktiivid on nõutavad vastavalt vajadusele.
      1.8.2.   Põhjasetete valik ja arv
      Proovivõtukohad tuleks valida vastavalt katse eesmärgile igas nimetatud olukorras. Proovivõtukohtade valikul tuleks kaaluda valgla ja vee ülesvoolu võimalikke põllumajanduslikke, tööstuslikke või kodumajapidamise sisendeid. Setteid ei tohiks kasutada, kui need on saastatud katseainega või selle struktuurse analoogiga viimase 4 aasta jooksul.
      1.8.2.1.   Sette valik
      Tavaliselt kasutatakse aeroobsetes katsetes kahte setet (7). Need kaks setet peaksid erinema orgaanilise süsiniku sisalduse ja tekstuuri poolest. Ühel settel on kõrge orgaanilise süsiniku sisaldus (2,5–7,5 %) ja peen tekstuur, teisel on madal orgaanilise aine sisaldus (0,5–2,5 %) ja jäme tekstuur. Orgaanilise süsiniku sisaldused peaksid tavaliselt erinema vähemalt 2 %. „Peen tekstuur” tähendab määratluse järgi > 50 % [savi + aleuriidi] (58) sisaldust ja „jäme tekstuur” < 50 % [savi + aleuriidi] sisaldust. Kahe sette [savi + aleuriidi] sisaldus peaks tavaliselt erinema vähemalt 20 %. Juhul, kui kemikaal võib samuti jõuda merevette, peaks vähemalt üks põhjasete olema pärit merest.
      Rangelt anaeroobses katses tuleks valida prooviks kaks setet (sh nendega seotud vesi) pinnaveemassist anaeroobselt alalt (7). Sette- ja veefaase tuleks käsitleda ja transportida ettevaatlikult hapnikuta tingimustes.
      Muud parameetrid võivad olla tähtsad setete valikul ja neid tuleks arvesse võtta iga üksikjuhtumi puhul eraldi. Näiteks, setete pH-vahemik on tähtis selliste kemikaalide uurimisel, mille transformatsioon ja/või sorbtsioon sõltub pH-st. Sorbtsiooni pH-sõltuvust saab peegeldada katseaine pKa väärtuses.
      1.8.2.2.   Põhjasette proovide kirjeldamine
      Nii vee kui sette puhul peamised parameetrid, mida tuleb mõõta ja millest tuleb teatada (viidates katsemeetodile), ning katseetapp, milles need parameetrid määratakse, on esitatud kokkuvõtlikult siin toodud tabelis. Nende parameetrite määramismeetodid on toodud viidetes (18, 19, 20, 21).
      Lisaks sellele võib osutuda vajalikuks mõõta ja teatada ka muudest parameetritest iga juhtumi puhul eraldi (nt magevee puhul: osakesed, aluselisus, kõvadus, elektrijuhtivus, NO3/PO4 (suhe ja üksikud väärtused); setete puhul: katioonvahetusvõime, veemahutavus, karbonaat, kogulämmastik ja -fosfor, ning merede puhul: soolsus). Setete või vee analüüs nitraadi, sulfaadi, biokättesaadava raua ja muude võimalike elektronaktseptorite kohta võib olla kasulik redokstingimuste hindamisel, eriti seoses anaeroobse transformatsiooniga.
      
         Vee-setteproovide iseloomustamiseks kasutatavate parameetrite mõõtmine (7, 22, 23)
      
      
                  Parameeter
               
               
                  Katseprotseduuri etapp
               
            
                  väliproovide võtmine
               
               
                  järelkäsitlemine
               
               
                  kohanemise algus
               
               
                  katse algus
               
               
                  katse käigus
               
               
                  katse lõpp
               
            
                  
                     Vesi
                  
               
            
                  Päritolu/allikas
               
               
                  X
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Temperatuur ( oC)
               
               
                  X
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  pH
               
               
                  X
               
               
                   
               
               
                  X
               
               
                  X
               
               
                  X
               
               
                  X
               
            
                  Kogu orgaaniline süsinik
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  X
               
               
                  X
               
               
                   
               
               
                  X
               
            
                  O2 kontsentratsioon (59)
                  
               
               
                  X
               
               
                   
               
               
                  X
               
               
                  X
               
               
                  X
               
               
                  X
               
            
                  Redokspotentsiaal (59)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  X
               
               
                  X
               
               
                  X
               
               
                  X
               
            
                  
                     Setted
                  
               
            
                  Päritolu/allikas
               
               
                  X
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Kihi sügavus
               
               
                  X
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  pH
               
               
                   
               
               
                  X
               
               
                  X
               
               
                  X
               
               
                  X
               
               
                  X
               
            
                  Osakeste jaotus
               
               
                   
               
               
                  X
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Kogu orgaaniline siisinik
               
               
                   
               
               
                  X
               
               
                  X
               
               
                  X
               
               
                   
               
               
                  X
               
            
                  Mikroobi biomass (59)
                  
               
               
                   
               
               
                  X
               
               
                   
               
               
                  X
               
               
                   
               
               
                  X
               
            
                  Redokspotentsiaal (60)
                  
               
               
                  Vaatlused (värv/lõhn)
               
               
                   
               
               
                  X
               
               
                  X
               
               
                  X
               
               
                  X
               
            1.8.3.   Kogumine, käsitlemine ja säilitamine
      1.8.3.1.   Kogumine
      ISO põhjasetteproovide võtmist käsitleva juhendi (8) eelnõud tuleks kasutada setteproovide võtmisel. Setteproovid tuleks võtta sette 5–10 cm ülemisest kihist. Settega seotud vesi tuleks koguda samast kohast ja samal ajal kui sete. Anaeroobse katse puhul tuleks sette- ja sellega seotud vee proove võtta ja transportida hapnikuta (28) (vt punkti 1.8.2.1). Mõningaid proovivõtuseadmeid on kirjeldatud kirjanduses (8, 23).
      1.8.3.2.   Käsitlemine
      Sete eraldatakse veest filtreerimise teel ja sete märgsõelutakse läbi 2 mm sõelaava, kasutades liigsed proovivõtukohast võetud vett, mis seejärel visatakse minema. Seejärel segatakse soovitud suhtes (vt punkti 1.9.1) sette ja vee teadaolevad kogused inkubatsioonikolbides ja valmistataks ette kohanemiseks (vt punkti 1.8.4). Anaeroobse katse puhul tuleb sooritada kõik käsitlemisetapid hapniku puudumisel (29, 30, 31, 32, 33).
      1.8.3.3.   Säilitamine
      Värskelt võetud sette- ja veeproovide kasutamist soovitatakse väga, kuid kuna säilitamine on vajalik, tuleks sete ja vesi sõeluda selliselt, nagu on kirjeldatud eespool, ja säilitada koos, veega küllastatult (6–10 cm veekiht), pimedas, temperatuuril 4 ± 2 oC (61) maksimaalselt 4 nädalat (7, 8, 23). Aeroobsetes katsetes kasutatud proovid tuleks säilitada vaba õhu juurdepääsuga (nt avatud mahutites), samas anaeroobsete katsete proovid tuleks säilitada ilma hapnikuta. Transportimisel ja säilitamisel ei tohi sette- või veeproove külmutada või setteproove kuivatada.
      1.8.4.   Sette-/veeproovide katseks ettevalmistamine
      Kohanemisperiood peaks aset leidma enne katseaine lisamist, asetades iga sette-/veeproovi inkubatsiooninõusse, mida kasutatakse põhikatses, ja kohanemine toimub täpselt samades tingimustes nagu katseinkubatsioon (vt punkti 1.9.1). Kohanemisperiood on aeg, mis kulub süsteemi mõistliku stabiilsuse saavutamiseks, mida peegeldavad pH, hapniku kontsentratsioon vees, sette- ja veeproovi redokspotentsiaal ning faaside makroskoopiline eraldamine. Kohanemisperiood peaks tavaliselt kestma üks kuni kaks nädalat ja ei tohiks ületada nelja nädalat. Nimetatud perioodil tehtud määramiste tulemused tuleks teha teatavaks.
      1.9.   KATSE KÄIK
      1.9.1.   Katsetingimused
      Katse tehakse inkubatsiooniseadmes (vt punkti 1.8.1), milles vee ja sette mahusuhe on 3:1 ja 4:1 ning settekiht on 2,5 cm (±0,5 cm) (62). Vähemalt 50 g setet (kuivmass) inkubatsioonianuma kohta on soovitav.
      Katse tuleks sooritada pimedas konstantsel temperatuuril vahemikus 10–30 oC. Temperatuur (20 ± 2) oC on sobiv. Vajaduse korral võib kasutada täiendavaid madalamaid temperatuure (nt 10 oC) iga juhtumi puhul eraldi, sõltuvalt katse kohta nõutavast teabest. Inkubatsioonitemperatuuri tuleks jälgida ja sellest teatada.
      1.9.2.   Katseaine töötlemine ja lisamine
      Kasutatakse kemikaali ühte katsekontsentratsiooni (63). Põllukultuuride kemikaalide puhul, mida lisatakse otse veemassi, tuleks tõlgendada suurima annusena märgistusel suurimat lisamiskiirust, mis on arvutatud katseanuma vee pindala põhjal. Kõikidel muudel juhtudel peaks kasutatav kontsentratsioon põhinema keskkonnaemissioonidest tehtud ennustuste põhjal. Tuleks püüda tagada seda, et katseainet lisatakse piisavas kontsentratsioonis selleks, et iseloomustada transformatsiooniteed ning transformatsioonisaaduste teke ja vähenemist. Võib osutuda vajalikuks lisada suuremaid annuseid (nt 10kordsed) olukordades, kus katseaine kontsentratsioonid on lähedal avastamispiiridele katse alguses ja/või kui peamisi transformatsioonisaaduseid ei suudeta kohe avastada, kuna nende kontsentratsioon on 10 % katseaine annusemäärast. Kui kasutatakse suuremaid kontsentratsioone, ei tohiks neil olla olulist negatiivset mõju vee-settesüsteemi mikroobide tegevusele. Katseaine konstantse kontsentratsiooni saamiseks erinevate mõõtmetega anumates võib pidada vajalikuks lisatava aine koguse kohandamist, mis põhineb veesamba sügavusel anumas seoses vee sügavusega uuritavas keskkonnas (mis eeldatavasti on 100 cm, kuid võib kasutada ka muid sügavusi). Vt 4. lisa näidisarvutamise kohta.
      Ideaaljuhul tuleks lisada katseainet vesilahusena katsesüsteemi veefaasi. Kui see on vältimatu, on lubatud kasutada veega segunevate lahustite (nt atsetoon, etanool) väikeseid koguseid katseaine lisamiseks ja jaotamiseks, kuid see ei tohiks ületada 1 % v/v ja sellel ei tohiks olla kahjulikke mõjusid katsesüsteemi mikroobide tegevusele. Katseaine vesilahus tuleks teha hoolikalt – täieliku homogeensuse tagamiseks võib vaja minna generaatorkolonne ja eelsegamist. Katsesüsteemi vesilahuse lisamise järel on soovitav veefaasi õrnalt segada, häirides setet nii vähe kui võimalik.
      Preparaatide kasutamist tavaliselt ei soovitata, kuna preparaatide koostisosad võivad mõjutada katseaine ja/või transformatsioonisaaduste jaotumist vee- ja settefaaside vahel. Nt nõrgalt veeslahustuva katseaine puhul võib siiski kasutada preparaati sobiva alternatiivina.
      Inkubatsioonianumate arv sõltub proovivõtukordade arvust (vt punkti 1.9.3). Katsesüsteeme peaks olema piisavalt, et igal proovivõtukorral võib kasutada kahte süsteemi. Kui iga põhjasettesüsteemi kohta tehakse kontrollproovid, ei tohiks neid töödelda katseainega. Kontrollproove saab kasutada sette mikroobi biomassi ning vee- ja setteproovide orgaanilise süsiniku koguarvu määramiseks katse lõpus. Kahte kontrollproovi (s.t üks kontrollproov iga põhjasette kohta) saab kasutada nõutud parameetrite jälgimiseks settes ja vees kohanemise ajal (vt tabelit punktis 1.8.2.2). Tuleks teha kaks täiendavat kontrollproovi juhul, kui katseainet lisatakse lahusti abil, et mõõta kahjulikke mõjusid katsesüsteemi mikroobide tegevusele.
      1.9.3.   Katse kestus ja proovide võtmine
      Katse ei tohiks tavaliselt kesta kauem kui 100 päeva (6) ning peaks jätkuma seni, kuni lagunemise ja vee/sette jaotamise kohta esitatakse selgitus või kui 90 % katseainest on hävinud transformatsiooni ja/või lendumise tõttu. Proovivõtukordade arv peaks olema vähemalt kuus (sealhulgas proovivõtu 0 kord), ja enne katset võib kasutada valikulist eelkatset (vt punkti 1.9.4), mille käigus määratakse asjaomased proovivõturežiimid ja katse kestus, välja arvatud juhul, kui katseaine kohta on olemas piisavalt andmeid eelnevatest uuringutest. Hüdrofoobsete katseainete puhul võib vaja minna täiendavaid proovivõtuhetki katse algperioodil, et määrata vee- ja settefaaside jaotamise kiirus.
      Asjaomastel proovivõtuaegadel eemaldatakse analüüsis kõik inkubatsioonianumad (paralleelproovides). Setet ja selle peal olevat vett analüüsitakse eraldi (64). Pinnavesi tuleks hoolikalt eemaldada setet minimaalselt häirides. Katseaine ja transformatsioonisaaduste ekstraheerimine ja karakteriseerimine peaksid järgima asjaomaseid analüütilisi protseduure. Tuleks hoolikalt eemaldada aine, mis võib olla adsorbeerunud inkubatsioonianumasse või lenduvate ainete püüdmistorusse.
      1.9.4.   Valikulised eelkatsed
      Kui proovivõtu kestust ja režiimi ei saa hinnata muude, katseainet käsitlevate asjaomaste uuringute põhjal, võib pidada vajalikuks teha valikuline eelkatse, mis tuleks sooritada, kasutades samu katsetingimusi, mis on välja pakutud lõppuuringuks. Asjaomased katsetingimuste ja eelkatse tulemuste kohta, kui see on sooritatud) tuleks esitada lühiprotokoll.
      1.9.5.   Mõõtmised ja analüüs
      Katseaine a transformatsioonisaaduste kontsentratsiooni igal proovivõtu korral vees ja settes tuleks mõõta ja neist teatada (lisatud kontsentratsiooni ja protsendimäärana). Üldiselt tuleks identifitseerida transformatsoonisaadused, mis on avastatud ≥ 10 %na radioaktiivsest ainest vee-sette koguproovis igal proovivõtuajal, kui seda ei ole mõistlikult teisiti põhjendatud. Transformatsioonisaaduseid, mille kontsentratsioonid katse käigus pidevalt kasvavad, tuleks samuti identifitseerimisel arvesse võtta, isegi siis, kui nende kontsentratsioonid ei ületa eespool toodud piirnorme, kuna see võib viidata aine püsivusele. Viimast tuleks arvesse võtta iga juhtumi puhul eraldi, tuues põhjendused protokollis.
      Gaaside/lenduvate ainete püüdmissüsteemide (CO2 ja muud, s.t. lenduvad orgaanilised ühendid) tulemustest tuleks teatada igal proovivõtuajal. Tuleks teatada ka mineralisatsioonikiirus. Ekstraheerimata (seotud) jääkidest settes tuleks teatada igal proovivõtuhetkel.
      2.   TULEMUSED
      2.1.   TULEMUSTE TÖÖTLEMINE
      Lisatud radioaktiivse aine kogu ainetase või saagis (vt punkti 1.7.1) arvutatakse igal proovivõtukorral. Tulemustest tuleks teada anda lisatud radioaktiivse aine protsendimäärana. Radioaktiivse aine jaotamisest vee ja sette vahel tuleks teatada kontsentratsioonide ja protsendimääradena igal proovivõtukorral.
      Katseaine poolestusaeg, DT50 ja vajaduse korral DT75 ja DT90 tuleks arvutada koos usalduspiiridega (vt punkti 1.7.3). Teavet katseaine hävimiskiiruse kohta vees ja settes võib saada sobivate hindamisprotseduuride abil. Nende hulka kuuluvad näiline esimese astme kineetika, graafilisi või numbrilisi lahendeid kasutavad empiirilised kõvera moodustamise tehnika ning keerukamad hindamised, näiteks ühe või mitme lahtriga näidised. Täiendavaid üksikasju võib leida asjaomasest avaldatud kirjandusest (35, 36, 37).
      Kõikidel lähenemistel on oma tugevad ja nõrgad küljed ning need erinevad märkimisväärselt oma keerukuse poolest. Esimese astme kineetika võib lagundamis- ja jaotamisprotsesse liiga lihtsustada, kuid võimaluse korral lisab suuruse (kiirusekonstant või poolestusaeg), mis on hõlpsasti mõistetav ja mis on väärtuslik simulatsioonimudelite koostamisel ja prognoositavate arvutuskontsentratsioonide arvutamisel. Empiiriliste lähenemiste või lineaarsete transformatsioonide käigus võidakse saada andmete jaoks paremini sobivaid kõveraid ja seetõttu hinnata paremini poolestusaegasid, DT50 ja vajaduse korral DT75 ja DT90 väärtusi. Tuletatud konstantide kasutamine on siiski piiratud. Lahternäidiste abil võib luua riski hindamise jaoks kasulikke, väärtuslikke konstante, mis kirjeldavad lagunemiskiirust erinevates sektorites ja kemikaali jaotust. Neid tuleks samuti kasutada kiiruskonstantide hindamiseks peamiste transformatsioonisaaduse tekkel ja lagunemisel. Kõikidel juhtudel tuleb valitud meetodit põhjendada ja eksperimenteerija peaks graafiliselt ja/või statistiliselt esitama sobivuse headuse.
      3.   PROTOKOLL
      3.1.   KATSEPROTOKOLL
      Protokoll peab sisaldama järgmist teavet.
      
                   
               
               
                  Katseaine:
                  
                              —
                           
                           
                              üldnimetus, keemiline nimetus, CASi number, struktuurivalem (tuues ära märgi/märkide asukoha, kui kasutatakse radiomärgistatud ainet) ja asjaomased füüsikalis-keemilised omadused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katseaine puhtus (lisandid);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              märgistatud kemikaali radiokeemiline puhtus ja molaarne aktiivsus (vajaduse korral).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Võrdlusained:
                  
                              —
                           
                           
                              selliste võrdlusainete keemiline nimetus ja struktuur, mida kasutatakse transformatsioonisaaduste kirjeldamiseks ja/või identifitseerimiseks.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Uuritavad setted ja veed:
                  
                              —
                           
                           
                              põhjasettest proovide võtmise koha (kohtade) asukoht ja kirjeldus, sh võimaluse korral saastumise ajalugu;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kogu teave vee-settesüsteemide kogumise, säilitamise (kui säilitatakse) ja kohanemise kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vee-setteproovide tunnused, mis on loetletud punkti 1.8.2.2 tabelis.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Katsetingimused:
                  
                              —
                           
                           
                              kasutatud katsesüsteem (nt möödavool, biomeeter, õhutamisviis, segamismeetod, veemaht, settemass, nii vee- kui ka settekihi paksus, katseanumate mõõdud jne);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katseaine lisamine katsesüsteemi: kasutatud katsekontsentratsioon, paralleelproovide ja kontrollproovide arv, katseaine lisamisviis (nt lahusti abil, kui seda kasutatakse) jne;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubatsioonitemperatuur;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              proovivõtuajad;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ekstraheerimismeetodid ja -tõhusused ning analüüsimeetodid ja avastamispiirid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              transformatsioonisaaduste kirjeldamise/identifitseerimise meetodid;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kõrvalekalded katseprotokollist või katsetingimustest katse käigus.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tulemused:
                  
                              —
                           
                           
                              representatiivsete analüüside töötlemata andmed (kõik töötlemata andmed tuleb säilitada labori arhiivis);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kasutatud analüüsimeetodite korratavus ja tundlikkus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              saagisemäärad (valiidse katse protsendimäärad on toodud punktis 1.7.1);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tulemused tabeli kujul, väljendatuna katseaine ja vajaduse korral transformatsioonisaaduste ning ekstraheerimata radioaktiivsete ainete protsendimäärana lähteannusest ja vajaduse korral mg· kg–1 vees, settes ja kogu süsteemis (vaid protsendina);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ainetase uuringute kestel ja lõpus;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vee- ja settefraktsioonides ning kogu süsteemis toimunud transformatsiooni (sh mineralisatsiooni) graafiline esitamine;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mineralisatsioonikiirused;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              katseaine ja vajaduse korral peamiste transformatsioonisaaduste poolestusaeg, DT50 ja vajaduse korral DT75 ja DT90 väärtused, kaasa arvatud usalduspiirid vees, settes ja kogu süsteemis;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              hinnang katseaine ja vajaduse korral peamiste transformatsioonisaaduste transformatsioonikineetika kohta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vajaduse korral eeldatavad transformatsiooniteed;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tulemuste arutelu.
                           
                        
            4.   VIITED
      
                  1)
               
               
                  BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany.
               
            
                  2)
               
               
                  Commission for registration of pesticides: Application for registration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The Netherlands.
               
            
                  3)
               
               
                  MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United-Kingdom.
               
            
                  4)
               
               
                  Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) – Anaerobic and aerobic. Canada, pp. 35–3 7.
               
            
                  5)
               
               
                  US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, Anaerobic aquatic metabolism.
               
            
                  6)
               
               
                  SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.
               
            
                  7)
               
               
                  OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
               
            
                  8)
               
               
                  ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality – Sampling – Part 12: Guidance on sampling of bottom sediments.
               
            
                  9)
               
               
                  US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 712-C-98-080.
               
            
                  10)
               
               
                  DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).
               
            
                  11)
               
               
                  T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).
               
            
                  12)
               
               
                  OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).
               
            
                  13)
               
               
                  OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.
               
            
                  14)
               
               
                  Scholz, K, Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. BCPC – Pests and Diseases, 3B-4, 149–158.
               
            
                  15)
               
               
                  Guth, JA. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry (D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114. J. Wiley & Sons.
               
            
                  16)
               
               
                  Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inoculation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631–637.
               
            
                  17)
               
               
                  Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with 14C-labelled model surfactants. Water Research 21, 661–667.
               
            
                  18)
               
               
                  Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.
               
            
                  19)
               
               
                  APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (17th edition). American Public Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.
               
            
                  20)
               
               
                  Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. Longman.
               
            
                  21)
               
               
                  Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential measurements. Anal. Chemistry 44, 1038–1039.
               
            
                  22)
               
               
                  SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests', 3-4 July 1991.
               
            
                  23)
               
               
                  SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach.
               
            
                  24)
               
               
                  Vink, J.P.M., van der Zee, S.EA.T.M. (1997). Pesticide biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, 2858–2868.
               
            
                  25)
               
               
                  Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.EA.T.M. (1999). Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329–338.
               
            
                  26)
               
               
                  Anderson, T.H., Domsch, KH. (1985). Maintenance carbon requirements of actively-metabolising microbial populations under in-situ conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197–203.
               
            
                  27)
               
               
                  ISO-14240-2. (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.
               
            
                  28)
               
               
                  Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sediment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13–21.
               
            
                  29)
               
               
                  Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850–857.
               
            
                  30)
               
               
                  Birch, R.R., Biver, C, Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, U, Steber,]., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527–1550.
               
            
                  31)
               
               
                  Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegradation tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499–1509.
               
            
                  32)
               
               
                  Nuck, BA. and Federle, T.W. (1986). A batch test for assessing the mineralisation of 14C-radiolabelled compounds under realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597–3603.
               
            
                  33)
               
               
                  US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 712-C-98-090.
               
            
                  34)
               
               
                  Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sediment characteristics and drying sediment on sorption coefficients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, 961–968.
               
            
                  35)
               
               
                  Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 39, 187–203.
               
            
                  36)
               
               
                  Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 33, 47–60.
               
            
                  37)
               
               
                  Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water systems. Brighton Crop Protection Conference – Pest and Diseases, pp. 1349–1354.
               
            
         1. liide
         JUHEND AEROOBSETE JA ANAEROOBSETE KATSESÜSTEEMIDE KOHTA
         Aeroobne katsesüsteem
         Käesolevas meetodis kirjeldatud aeroobne katsesüsteem sisaldab aeroobset veekihti (tüüpilised hapniku kontsentratsioonid on vahemikus 7–10 mg· l-1) ja settekihti, mis on aeroobne pinnal ja anaeroobne pinna all (tüüpilised keskmised redokspotentsiaalid (Eh) sette anaeroobsel alal on vahemikus – 80 kuni – 190 mV). Igas inkubatsiooniüksuses viiakse niisutatud õhk veepinnale piisava hapniku säilitamiseks õhuruumis.
         Anaeroobne katsesüsteem
         Anaeroobse katsesüsteemi puhul on katseprotseduur oma olemuselt samasugune kui aeroobses süsteemis, erandiks on see, et igas inkubatsiooniüksuses viiakse niisutatud lämmastik veepinnale lämmastiku õhuruumi säilitamiseks. Setet ja vett käsitletakse anaeroobsena, kui redokspotentsiaal (Eh) on madalam kui – 100 mV.
         Anaeroobses katses sisaldab mineralisatsiooni hindamine tekkinud süsinikdioksiidi ja metaani mõõtmisi.
      
      
         2. liide
         GAASI MÖÖDAVOOLUSEADME NÄIDIS
         
            
      
      
         3. liide
         BIOMEETRI NÄIDIS
         
            
      
      
         4. Liide
         NÄIDISARVUTUS KATSEAINE ANNUSTAMISE KOHTA KATSEANUMATESSE
         
                     Silindri siseläbimõõt:
                  
                  
                     = 8 cm
                  
               
                     Veesamba sügavus, v.a sete:
                  
                  
                     = 12 cm
                  
               
                     Pindala: 3,142 × 42
                     
                  
                  
                     = 50,3 cm2
                     
                  
               
                     Annusmäär: 500 g katseainet ha kohta vastab 5 μg/cm2
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     Kokku μg: 5 × 50,3
                  
                  
                     = 251,5 μg
                  
               
                     Kohandada kogust seoses 100 cm sügavusega: 12 × 251,5 ÷ 100
                  
                  
                     = 30,18 μg
                  
               
                     Veesamba maht: 50,3 × 12
                  
                  
                     = 603 ml
                  
               
                     Kontsentratsioon vees: 30,18 ÷ 603
                  
                  
                     = 0,050 μg/ml või 50 μg/l
                  
               
      
         (1)  Kõnealuste laboritevaheliste katsete tulemuste ja standardi ISO 6341 tehnilise paranduse kohaselt asub kaaliumdikromaadi (K2Cr2O7) 24 tunni EC50 vahemikus 0,6 mg/l kuni 1,7 mg/l.
      
         (2)  Sobiva puhtusastmega vesi, st puhastatud ioonvahetuse, destilleerimise või pöördosmoosiga; vee juhtivus ei ületa eelistatavalt 10 μS/cm–1.
      
         (3)  D1 ja D2 ei tohiks olulise erinevuse puhul keskmistada.
      
         (4)  D1 ja D2 ei tohiks olulise erinevuse puhul keskmistada.
      
         (5)  või inkubatsiooniperioodi lõpus.
      
         (6)  D1 ja D2 ei tohiks olulise erinevuse puhul keskmistada.
      
         (7)  või inkubatsioonniperioodi lõpus
      
         (8)  Kordustulemuste olulise erinevuse puhul mitte keskmistada.
      
         (9)  Kordustulemuste olulise erinevuse puhul mitte keskmistada.
      
         (10)  Pärast kasutamist tuleb elavhõbedasooli sisaldavad lahused ümber töödelda, et vältida elavhõbeda sattumist looduskeskkonda.
      
         (11)  Mabey ja Mill soovitavad fosfaatpuhvri asemel kasutada boraat- või atsetaatpuhvreid (11).
      
         (12)  Selline teave võib pärineda muudest allikatest, nagu samalaadse struktuuriga ühendite hüdrolüüsi andmed kirjandusest või muud poolkvantitatiivsed hüdrolüüsi eelkatsed uuritava ainega varasemas väljaarendamisetapis.
      
         (13)  Kui logaritmitud andmete ja aja seose graafik ei ole sirge (mis vastab esimest järku reaktsioonile), siis ei sobi valem (3) katseaine hüdrolüüsi kiiruskonstandi määramiseks.
      
         (14)  Nendes tabelites toodud pH väärtused on arvutatud potentsiaali mõõtmistest, kasutades Sörenseni standardvõrrandeid (1909). Vastavad pH väärtused on 0,04 ühikut suuremad kui tabelis olevad väärtused.
      
         (15)  Lisada väike tümooli- või samalaadse aine kristall hallitusseente kasvu ärahoidmiseks.
      
         (16)  Kolme mõõtmise keskmine näitaja.
      
         (17)  Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B., Vol. 252, p. 231.
      
         (18)  Veeproov võtta pärast seda, kui vesi on vahetunud vähemalt kolme kambri mahu võrra.
      Sulgudes esitatud väärtused on lisaproovivõtmise korral võetav proovide (vesi, kalad) arv.
      
                  
                     NB
                  
               
               
                  !
               
               
                  Katse-eelne k2 väärtuse hindamise tulemus log Pow = 4,0 jaoks on 0,652 päeva-1. Eksperimendi kogupikkus on 3 × up = 3 × 4,6 päeva, s.o 14 päeva. Seondumisfaasi (up) hindamise kohta vaata 3. liidet.
               
            
         (19)  Veerust võib valida viiest (või enamast) järjestikusest kontsentratsioonist koosneva jada. Kontsentratsioonidevahelised keskpunktid veerus (x) leitakse veerus (2x + 1). Loetletud väärtused võivad esindada kontsentratsioone, mida väljendatakse protsendina mahu või massi kohta (mg/l või μg/l). Väärtusi võib vajaduse korral korrutada või jagada 10 mis tahes astmega. 1. veergu võiks kasutada juhul, kui määramatus toksilisuse taseme kohta on suur.
      
         (20)  OECD, Paris, 1992, Test Guideline 210, Fish, Early-life Stage Toxicity Test.
      
         (21)  OECD, Paris, 1992, Test Guideline 210, Fish, Early-life Stage Toxicity Test.
      
         (22)  Embrüote puhul.
      
         (23)  Vastsete puhul.
      
         (24)  Embrüod ja vastsed pimeduses kuni üks nädal pärast koorumist, välja arvatud ülevaatamise ajal. Seejärel vähene valgus kogu katse jooksul.
      
         (25)  Vastavalt FAO ja US süsteemile (85).
      
         (26)  Vastavad muutujad peaksid eelistatavalt jääma esitatud vahemikku. Kui sobivat mullamaterjali on siiski raske leida, aktsepteeritakse ka märgitud miinimumist väiksemaid väärtusi.
      
         (27)  Mullad, mille orgaanilise süsiniku sisaldus on alla 0,3 %, võivad häirida orgaanilise aine sisalduse ja adsorptsiooni vahelist korrelatsiooni. Seetõttu on soovitatav kasutada muldasid, mille minimaalne orgaanilise süsiniku sisaldus on 0,3 %.
      
         (28)  
      
         (29)  Tasakaaluolekule vastava platoo püstitumise hindamiseks võib kasutada ka graafikuid, mis kirjeldavad vesifaasis oleva uuritava aine kontsentratsiooni  ja aja suhet (vt 5. lisa joonist 2).
      
         (30)  DT-50: aeg, mille jooksul 50 % uuritavast ainest on hajunud.
      
         (31)  W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), 121-128.
      
         (32)  W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludges. Chemosphere, 35 (1/2), 107-119.
      
         (33)  W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), 1373-1384.
      
         (34)  W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R&D Report No 106 01044 (1994)
      
         (35)  B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Chemosphere, 22, pp. 285-304.
      
         (36)  Tööstusest saadud andmed.
      
         (37)  Märkida, millist anumat katseks kasutati.
      
         (38)  
      
                  †
               
               
                  Aborteerunud haudmed märkida vajalikku lahtisse lühendiga „AB”.
               
            
         (39)  
      
                  ‡
               
               
                  Täiskasvanud isendite suremus märkida vajalikku lahtrisse lühendiga „M”.
               
            
         (40)  Näiteks, kui katseaine sisaldab ühte rõngast, on nõutav see märgistada; kui katseaine sisaldab kahte või enamat rõngast, võib vaja minna eraldi uuringuid kummagi märgistatud rõnga säilimise hindamiseks ja sobiva teabe saamiseks transformatsioonisaaduste tekke kohta.
      
         (41)  Pinnase veeläbilaskvusvõimet saab mõõta väliveemahutavusena, veemahutavuse või imirõhuna (pF). Selgitused on liites 1. Katseprotokollis tuleks edastada, kas pinnase veeläbilaskvusvõime ja lasuvustihedus määrati kindlaks looduspärastes väliproovides või häiritud (töödeldud) proovides.
      
         (42)  Viimased uurimistulemused viitavad sellele, et parasvöötmes kogutud mullaproove saab samuti säilitada –20 oC juures üle kolme kuu (28, 29) mikroobide aktiivsust oluliselt häirimata.
      
         (43)  Mullaproov ei tohiks kunagi olla liiga märg või liiga kuiv, et säiliks mulla mikrofloora piisav ohutus ja toitumine. Soovituslikud niiskusesisaldused optimaalseks mikroobi kasvuks on 40–60 % veemahutavusest (WHC) ja 0,1–0,33 baari (6). Viimane vahemik on sama, mis 2,0–2,5 pF-vahemik. Erinevatele mullatüüpidele omased niiskusesisaldused on toodud 2. liites.
      
         (44)  Aeroobsed tingimused domineerivad pindmises mullakihis ja isegi aluspõhjas, nagu on näidatud ELi rahastatud uurimisprojektis (K. Takagi et al. (1992). Microbial diversity and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal variation in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internal. Symp. Environm. Aspects Pesticides Microbiol, 270-277, 17-21 August 1992, Sigtuna, Sweden). Anaeroobsed tingimused võivad esineda vaid juhuslikult pinnaste üleujutuste käigus pärast tugevaid sademeid või siis, kui on loodud niiske põllumajanduse tingimused riisipõldudel.
      
         (45)  Aeroobsed uuringud tuleks lõpetada palju varem kui 120 päeva, tingimusel et selgelt on selleks ajaks jõutud lõpliku transformatsiooniteeni ja lõpliku mineralisatsioonini. Katse lõpetamine on võimalik pärast 120 päeva või siis, kui vähemalt 90 % katseainest transformeeritakse, kuid tekkis ainult 5 % CO2.
      
         (46)  Järgmise võrrandi abil arvutatakse lähtekontsentratsioon pindala põhjal:
      
         
      
                  Csoil
                  
               
               
                  =
               
               
                  lähtekontsentratsioon mullaproovis [mg·kg-1]
               
            
                  A
               
               
                  =
               
               
                  annustamine [kg· ha-1]; l = mullakihi paksus uuritavas keskkonnas [m]; d = kuivlasuvustihedus [kg· m-3].
               
            Resikareegel on, et annustamisel 1 kg ha-1 saadakse pinnase kontsentratsiooniks kigikaudu 1 mg kg-1 kihis (oletades, et lasuvustihedus on 1 g· cm-3).
      
         (47)  Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.
      
         (48)  pF = veesamba kõrguse (cm) logaritm.
      
         (49)  1 baari = 105 Pa.
      
         (50)  Vastab ligikaudsele 10 %lisele veesisaldusele liivas, 35 %lisele mudas ja 45 %lisele savis.
      
         (51)  Väliveemahutavus ei ole konstantne, vaid see varieerub vastavalt mulla tüübile pF 1,5 ja 2,5 vahel.
      
         (52)  Veemahutavus.
      
         (53)  Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.
      
         (54)  Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.
      
         (55)  Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.
      
         (56)  Näiteks, kui aine sisaldab ühte rõngast, tuleb see rõngas märgistada. Kui katseaine sisaldab kahte või enamat rõngast, on vaja eraldi katseid teha, et hinnata iga märgistatud rõnga säilimise hindamiseks ning sobiva teabe saamiseks transformatsioonisaaduste tekke kohta.
      
         (57)  Kuna nimetatud leeliselised absorbtsioonilahused absorbeerivad ka õhutamisel süsinikdioksiidi ning aeroobsetes katsetes hingamisel tekkinud süsinikdioksiidi, tuleb neid regulaarselt vahetada, et vältida nende küllastumist ja seega nende absorbtsioonivõime hävimist.
      
         (58)  [Savi + aleuriit] on sette mineraalfraktsioon, mille osakeste suurus on < 50 μm.
      
         (59)  Aeroobsetes uuringutes mikroobide hingamiskiiruse meetod (26), suitsutusmeetod (27) või bakterite arvu määramine (nt bakterid, kiirikbakterid, seened ja kolooniate koguarv), anaeroobsetes uuringutes metanogeneesi kiirus.
      
         (60)  Viimased uurimustulemused on näidanud, et vee hapniku kontsentratsioonide ja redokspotentsiaalide mõõtmistel ei ole mehhanistlikku ega ennustatavat väärtust, kui käsitletakse mikroobipopulatsioonide kasvu ja arengut pinnavetes (24, 25). Biokeemilise hapnikutarbe (BOD – määramine väliproovide võtmisel, katse alguses või lõpus) ja mikro-/makrotoitainete Ca, Mg ja Mn kontsentratsioonide määramine (katse alguses ja lõpus) vees ning kogulämmastiku ja kogukaaliumi mõõtmine setetes (väliproovide võtmise ajal ja katse lõpus) sobivad paremini aeroobse biotransformatsiooni kiiruste ja teede tõlgendamiseks ja hindamiseks.
      
         (61)  Viimased uuringud on näidanud, et säilitamine temperatuuril 4 oC võib põhjustada sette orgaanilise süsiniku sisalduse vähenemist, mille võimalikuks tulemuseks on mikroobide tegevuse vähenemine (34).
      
         (62)  Viimased uuringud on näidanud, et säilitamine temperatuuril 4 oC võib põhjustada sette orgaanilise süsiniku sisalduse vähenemist, mille võimalikuks tulemuseks on mikroobide tegevuse vähenemine (34).
      
         (63)  Katse tegemine teise kontsentratsiooniga võib olla kasulik kemikaalide puhul, mis jõuavad pinnavette erinevaid teid pidi oluliselt erinevate kontsentratsioonide tõttu, kuni saab analüüsida väiksemat kontsentratsiooni piisavalt täpselt.
      
         (64)  Kui võib toimuda kiire anaeroobsete transformatsioonisaaduste reoksüdeerumine, tuleks säilitada anaeroobsed tingimused proovivõtu ja analüüsimise ajal.