CELEX: 32002D0657
Language: hr
Date: 2002-08-12 00:00:00
Title: 2002/657/EZ: Odluka Komisije od 12. kolovoza 2002. o primjeni Direktive Vijeća 96/23/EZ o provođenju analitičkih metoda i tumačenju rezultata (priopćena pod brojem dokumenta C(2002) 3044)  Tekst značajan za EGP

03/Sv. 032
            
            
               HR
            
            
               Službeni list Europske unije
            
            
               109
            
         32002D0657
   
               L 221/8
            
            
               SLUŽBENI LIST EUROPSKE UNIJE
            
            
               12.08.2002.
            
         
      ODLUKA KOMISIJE
   
   od 12. kolovoza 2002.
   o primjeni Direktive Vijeća 96/23/EZ o provođenju analitičkih metoda i tumačenju rezultata
   (priopćena pod brojem dokumenta C(2002) 3044)
   (Tekst značajan za EGP)
   (2002/657/EZ)
   KOMISIJA EUROPSKIH ZAJEDNICA,
   uzimajući u obzir Ugovor o osnivanju Europske zajednice,
   uzimajući u obzir Direktivu Vijeća 96/23/EZ od 29. travnja 1996. o mjerama za praćenje određenih tvari i njihovih rezidua u živim životinjama i proizvodima životinjskog podrijetla i o stavljanju izvan snage direktiva 85/358/EEZ i 86/469/EEZ te odluka 89/187/EEZ i 91/664/EEZ (1), a posebno članak 15, stavak 2, podstavak 1,
   budući da:
   
               (1)
            
            
               Prisutnost rezidua u proizvodima životinjskog podrijetla predstavlja pitanje od važnosti za javno zdravlje.
            
         
               (2)
            
            
               Odluka Komisije 98/179/EZ od 23. veljače 1998. o utvrđivanju detaljnih pravila službenog uzorkovanja u svrhu praćenja određenih tvari i njihovih ostataka u živim životinjama i životinjskim proizvodima (2) predviđa da analizu uzoraka provode isključivo laboratoriji koje je nadležno državno tijelo ovlastilo za službenu kontrolu rezidua.
            
         
               (3)
            
            
               Nužno je osigurati kakvoću i usporedivost analitičkih rezultata dobivenih u laboratorijima koji su odobreni za službenu kontrolu rezidua. To bi se trebalo postići uporabom sustava osiguranja kakvoće i, posebno, primjenom metoda koje su validirane u skladu sa zajedničkim postupcima i kriterijima učinkovitosti te osiguranjem sljedivosti do zajedničkih standarda, odnosno standarda o kojima je postignut zajednički dogovor.
            
         
               (4)
            
            
               Direktiva Vijeća 93/99/EEZ od 29. listopada 1993. o dodatnim mjerama službene kontrole hrane i Odluka 98/179/EZ (3) zahtijevaju da od siječnja 2002. laboratoriji za službenu kontrolu moraju biti ovlašteni u skladu s ISO normom 17025 (1). Prema Odluci 98/179/EZ, odobreni laboratoriji moraju sudjelovati u međunarodno priznatim programima vanjskog ocjenjivanja kontrole kakvoće i sustavu ovlašćivanja. Osim toga, odobreni laboratoriji moraju dokazivati svoju stručnost redovnim i uspješnim sudjelovanjem u odgovarajućim programima provjere kvalitete rada laboratorija koje priznaju ili organiziraju nacionalni referentni laboratoriji ili referentni laboratoriji Zajednice.
            
         
               (5)
            
            
               S ciljem poboljšanja koordinacije, u skladu s Direktivom 96/23/EZ uspostavljena je mreža referentnih laboratorija Zajednice, nacionalnih referentnih laboratorija i nacionalnih kontrolnih laboratorija.
            
         
               (6)
            
            
               S obzirom da je od donošenja Direktive 96/23/EZ došlo do napredaka u analitičkoj kemiji, pojam rutinskih metoda i referentnih metoda zamijenjen je pristupom u kojem se uspostavljaju kriteriji učinkovitosti i postupci za validaciju orijentacijskih i potvrdnih metoda.
            
         
               (7)
            
            
               Nužno je odrediti zajedničke kriterije za tumačenje rezultata testiranja u službenim kontrolnim laboratorijima kako bi se osigurala usklađena provedba Direktive 96/23/EZ.
            
         
               (8)
            
            
               Kako bi se osigurala usklađena provedba Direktive 96/23/EZ, nužno je predvidjeti postupno utvrđivanje najmanju zahtijevanu granicu učinkovitosti (MRPL) analitičkih metoda za one tvari za koje nisu utvrđene dozvoljene granice, a osobito za one tvari čija uporaba nije dozvoljena ili je izričito zabranjena unutar Zajednice,
            
         
               (9)
            
            
               Odluka Komisije 90/515/EEZ od 26. rujna 1990. o utvrđivanju referentnih metoda za detekciju rezidua teških metala i arsena (4), Odluka Komisije 93/256/EEZ od 14. svibnja 1993. o utvrđivanju metoda za detekciju rezidua tvari koje imaju hormonski ili tireostatski učinak (5) i Odluka Komisije 93/257/EEZ od 15. travnja 1993. o utvrđivanju referentne metode i popisa nacionalnih referentnih laboratorija za detekciju rezidua (6) kako je zadnje izmijenjena Odlukom 98/536/EZ (7), preispitane su kako bi se uzela u obzir nova znanstvena i tehnička saznanja i došlo se do zaključka da su zastarjele u pogledu područja primjene i odredaba te da bi se, prema tomu, trebale staviti izvan snage ovom Odlukom.
            
         
               (10)
            
            
               Kako bi se omogućilo da se metode za analizu službenih uzoraka prilagode odredbama ove Odluke, trebalo bi se utvrditi prijelazno razdoblje.
            
         
               (11)
            
            
               Mjere koje se predviđaju ovom Odlukom u skladu su s mišljenjem Stalnog odbora za prehrambeni lanac i zdravlje životinja,
            
         DONIJELA JE OVU ODLUKU:
   Članak 1.
   Predmet i područje primjene
   Ovom se Odlukom utvrđuju pravila za analitičke metode koje se koriste pri testiranju službenih uzoraka koji su uzeti u skladu s drugom rečenicom članka 15. stavka 1. Direktive 96/23/EZ i određuju se zajednički kriteriji za tumačenje analitičkih rezultata koji su za te uzroke dobiveni u službenim kontrolnim laboratorijima.
   Ova se Odluka ne primjenjuje na tvari za koje su utvrđena posebna pravila u ostalom zakonodavstvu Zajednice.
   Članak 2.
   Definicije
   U svrhu ove Odluke primjenjuju se definicije navedene u Direktivi 96/23/EZ i u Prilogu ovoj Odluci.
   Članak 3.
   Analitičke metode
   Države članice moraju osigurati da su službeni uzorci koji se uzimaju u skladu s Direktivom 96/23/EZ analizirani metodama koje:
   
               (a)
            
            
               su dokumentirane u uputama za testiranje, po mogućnosti u skladu s normom ISO 78-2 (6);
            
         
               (b)
            
            
               su u skladu s 2. dijelom Priloga ovoj Odluci;
            
         
               (c)
            
            
               su validirane u skladu s postupcima opisanima u 3. dijelu Priloga;
            
         
               (d)
            
            
               su u skladu s najmanjim zahtijevanim granicama učinkovitosti metode (MRPL) koji će se utvrditi u skladu s člankom 4.
            
         Članak 4.
   Najmanje zahtijevane granice učinkovitosti metode
   Ova će se Odluka revidirati kako bi se postupno utvrdile najmanje zahtijevane granice učinkovitosti (MRPL) analitičkih metoda koje se primjenjuju za tvari za koje nisu utvrđene dozvoljene granice.
   Članak 5.
   Kontrola kakvoće
   Države članice osiguravaju kakvoću rezultata analize uzoraka uzetih u skladu s Direktivom 96/23/EZ, posebno praćenjem ispitivanja i/ili rezultata kalibracije u skladu s poglavlju 5.9. norme ISO 17025 (1).
   Članak 6.
   Tumačenje rezultata
   1.   Rezultat analize smatra se pozitivnim ako je veći od granice odlučivanja po potvrdnoj metodi.
   2.   Ako je za neku tvar utvrđena dozvoljena granica, granica odlučivanja je koncentracija iznad koje se, sa statističkom sigurnošću od 1 – α, može odlučiti da je dozvoljena granica uistinu premašena.
   3.   Ako za neku tvar nije utvrđena dozvoljena granica, granica odlučivanja je najniža razina koncentracije na kojoj metoda se metodom može utvrditi, sa statističkom sigurnošću od 1 – α, da je određeni analit prisutan.
   4.   Za tvari koje su navedene u grupi A u Prilogu Direktivi 96/23/EZ pogreška α je jednaka ili manja od 1 %. Za sve ostale tvari pogreška α je jednaka ili manja od 5 %.
   Članak 7.
   Stavljanje izvan snage
   Odluke 90/515/EEZ, 93/256/EEZ i 93/257/EEZ stavljene su izvan snage.
   Članak 8.
   Prijelazne odredbe
   Metode za analizu službenih uzoraka tvari navedene u grupi A u Prilogu I. Direktivi 96/23/EZ koje zadovoljavaju kriterije navedene u odlukama 90/515/EEZ, 93/256/EEZ i 93/257/EEZ, mogu se primjenjivati najviše dvije godine nakon što ova Odluka stupi na snagu. Metode koje se trenutačno primjenjuju za tvari navedene u grupi B Priloga I. Direktivi 96/23/EZ moraju se uskladiti s ovom Odlukom najkasnije pet godina od dana od kojeg se primjenjuje ova Odluka.
   Članak 9.
   Datum početka primjene
   Ova se Odluka primjenjuje od 1. rujna 2002.
   Članak 10.
   Adresati
   Ova je Odluka upućena državama članicama.
   
      Sastavljeno u Bruxellesu 12. kolovoza 2002.
      
         
            Za Komisiju
         
         David BYRNE
         
         
            Član Komisije
         
      
   
   
      (1)  SL L 125, 23.5.1996., str. 10.
   
      (2)  SL L 65, 5.3.1998., str. 31.
   
      (3)  SL L 290, 24.2.1993., str. 14.
   
      (4)  SL L 286, 18.10.1990., str. 33.
   
      (5)  SL L 118, 14.5.1993., str. 64.
   
      (6)  SL L 118, 14.5.1993., str. 75.
   
      (7)  SL L 251, 11.9.1998., str. 39.
   PRILOG
   KRITERIJI UČINKOVITOSTI, DRUGI ZAHTJEVI I POSTUPCI ZA ANALITIČKE METODE
   1.   DEFINICIJE
   
   1.1.   Točnost: stupanj podudarnosti između rezultata ispitivanja i prihvaćene referentne vrijednosti (2). Utvrđuje se utvrđivanjem istinitosti i preciznosti.
   1.2.   Alfa (α) pogreška: vjerojatnost da je ispitani uzorak negativan, iako su dobiveni pozitivni mjerni rezultati (lažno pozitivan rezultat).
   1.3.   Analit: tvar koju treba otkriti, identificirati i/ili kvantificirati kao i njezini derivati koji se jave tijekom analize.
   1.4.   Beta (β) pogreška: vjerojatnost da je ispitani uzorak stvarno pozitivan, iako su dobiveni negativni mjerni rezultati (lažno negativan rezultat).
   1.5.   Mjerno odstupanje: razlika između očekivanog rezultata ispitivanja i prihvaćene referentne vrijednosti (2).
   1.6.   Kalibracijski standard: mjerno sredstvo koje predstavlja količinu testirane tvari tako da povezuje njenu vrijednost s referentnom bazom.
   1.7.   Potvrđeni referentni materijal (CRM): materijal kojemu je utvrđen određeni udio analita.
   1.8.   Ko-kromatografija: postupak u kojemu se ekstrakt, prije kromatografije, dijeli na dva dijela. Jedan se dio podvrgava kromatografiji kao takav. Drugi dio se miješa sa standardnim analitom koji se ispituje. Potom se ta mješavina također podvrgava kromatografiji. Količina dodanog standardnog analita mora biti slična procijenjenoj količini analita u ekstraktu. Cilj je metode poboljšati identifikaciju analita pri uporabi kromatografske metode, posebno kad se ne može koristiti odgovarajući unutarnji standard.
   1.9.   Poredbeno ispitivanje: analiziranje istog uzorka istom metodom kako bi se utvrdila učinkovitost metode. Ispitivanje obuhvaća slučajnu mjernu pogrešku i mjerno odstupanje laboratorija.
   1.10.   Potvrdna metoda: metoda koja daje potpune ili dodatne podatke na temelju kojih je određenu tvar moguće nesumnjivo identificirati, i prema potrebi kvantificirati, na razini značajnosti.
   1.11.   Granica odlučivanja (CCα) granica na kojoj i iznad koje se može zaključiti, uz vjerojatnost pogreške α, da je uzorak pozitivan.
   1.12.   Sposobnost detekcije (CCβ) najmanji udio tvari koji je moguće detektirati, identificirati i/ili kvantificirati u uzorku, uz vjerojatnost pogreške β. U slučaju tvari za koje nije utvrđena dozvoljena granica, sposobnost detekcije je najniža koncentracija na kojoj se metodom može, sa statističkom sigurnošću od 1 – β, detektirati stvarno kontaminirane uzorke. U slučaju tvari za koje je utvrđena dozvoljena granica, sposobnost detekcije je koncentracija na kojoj se metodom mogu, sa statističkom sigurnošću od 1 – β, detektirati koncentracije na dozvoljenoj granici.
   1.13.   Obogaćeni uzorak je uzorak obogaćen poznatom količinom analita koji se treba detektirati.
   1.14.   Međulaboratorijsko ispitivanje (usporedba): organiziranje, provedba i ocjena testiranja istog uzorka u dvama laboratorijima ili više njih prema unaprijed određenim uvjetima, kako bi se odredila učinkovitost testiranja. Ovisno o svrsi, ispitivanje se može kategorizirati kao poredbeno ispitivanje ili provjera kvalitete rada laboratorija.
   1.15.   Unutarnji standard (IS): tvar koja nije sadržana u uzroku, čije su fizikalno-kemijska svojstva što sličnija značajkama analita koji se treba identificirati i koji se dodaje svakom uzorku i svakom kalibracijskom standardu.
   1.16.   Laboratorijski uzorak: uzorak koji je pripremljen za slanje u laboratorij u svrhu pregleda i testiranja.
   1.17.   Razina značajnosti: koncentracija tvari ili analita u uzorku koja je značajna za određivanje njihova pridržavanja zakona.
   1.18.   Najmanja zahtijevana granica učinkovitosti metode (MRPL): minimalni udio analita u uzorku, koji treba detektirati i potvrditi. Služi da bi se uskladila analitička učinkovitost metoda za one tvari za koje nije utvrđena dozvoljena granica.
   1.19.   Učinkovitost: funkcionalna kvaliteta koja se može pripisati analitičkoj metodi. To, primjerice, mogu biti specifičnost, točnost, istinitost, preciznost, ponovljivost, obnovljivost, iskorištenje, sposobnost detekcije i robusnost.
   1.20.   Kriteriji učinkovitosti: zahtjevi u pogledu učinkovitosti prema kojima se može ocijeniti da je analitička metoda primjerena svrsi i da daje pouzdane rezultate.
   1.21.   Dozvoljena granica: najveća granica rezidua, najveća razina ili druga najveća tolerancija za tvari utvrđena u ostalom zakonodavstvu Zajednice.
   1.22.   Preciznost: stupanj podudarnost između rezultata nezavisnih ispitivanja dobivenih pod propisanim (unaprijed određenim) uvjetima. Preciznost se obično izražava kao nepreciznost i računa se kao standardna devijacija rezultata ispitivanja. Što je manja preciznost, veća je standardna devijacija (2).
   1.23.   Ispitivanje kvalitete rada laboratorija: analiziranje istog uzorka, pri čemu laboratoriji mogu primijeniti metode po vlastitom izboru, uz uvjet da se te metode primijene pod rutinskim uvjetima. Ispitivanje se mora provesti u skladu s ISO uputama 43-1 (3) i 43-2 (4) i može služiti za ocjenu obnovljivosti metoda.
   1.24.   Kvalitativna metoda: analitička metoda kojom se tvar identificira na temelju njenih kemijskih, bioloških i fizikalnih značajki.
   1.25.   Kvantitativna metoda: analitička metoda kojom se određuje količina ili maseni udio neke tvari tako da se može iskazati kao brojčana vrijednost u odgovarajućim jedinicama.
   1.26.   Slijepa proba s reagensom: primjena cijelog analitičkog postupka, ali bez poduzorka za analizu ili uporabom jednake količine odgovarajuće otopine umjesto poduzorka za analizu.
   1.27.   Iskorištenje: postotak stvarne koncentracije tvari izdvojene tijekom analitičkog postupka. Ako potvrđeni referentni materijal ne postoji, određuje se tijekom validacije.
   1.28.   Referentni materijal: materijal čije su jedna ili više značajki potvrđene validiranom metodom, tako da se može koristiti za kalibriranje instrumenta ili potvrdu mjerne metode.
   1.29.   Ponovljivost: preciznost u uvjetima ponovljivosti (2).
   1.30.   Uvjeti ponovljivosti: uvjeti u kojima isti analitičar koristeći se istom opremom u istom laboratoriju, dobije nezavisne rezultate ispitivanja primjenjujući istu metodu na istovjetnim ispitivanim jedinicama (2).
   1.31.   Obnovljivost (reproducibilnost): preciznost u uvjetima obnovljivosti (2)(4).
   1.32.   Uvjeti obnovljivosti: uvjeti u kojima različiti analitičari koristeći se različitom opremom, u različitim laboratorijima dobiju rezultate ispitivanja primjenjujući istu metodu na istovjetnim uzorcima. (2)(4).
   1.33.   Robusnost: osjetljivost metode analize na promjene uvjeta ispitivanja, što se može izraziti kao popis uzoraka, analita, uvjeta pohrane, uvjeta okoliša i/ili uvjeta pripreme uzoraka pod kojima se metoda može primjenjivati onakva kakva jest ili uz određene manje izmjene. Za sve uvjete ispitivanja koji bi u praksi mogli biti podložni promjenama (npr. stabilnost reagensa, sastav uzorka, pH, temperatura) trebalo bi ukazati na sve promjene koje bi mogle utjecati na rezultat analize.
   1.34.   Slijepa proba s uzorkom: primjena cijelog analitičkog postupka na poduzorak za analizu koji je uzet iz uzroka u kojemu nije sadržan analit.
   1.35.   Orijentacijska metoda: metode koje se primjenjuju kako bi se otkrila prisutnost neke tvari ili vrste tvari na razini značajnosti. Ove metode odlikuje sposobnost obrade velikog broja uzoraka i koriste se za pregledavanje velikog broja uzoraka s ciljem otkrivanja potencijalnih pozitivnih rezultata. Posebno su osmišljene tako da se izbjegnu lažno negativni rezultati.
   1.36.   Ispitivanje unutar jednog laboratorija (unutarnja validacija): analitičko ispitivanje u kojemu jedan laboratorij, u različitim uvjetima i u opravdano dugim vremenskim intervalima, primjenjuje jednu metodu za analiziranje istih ili različitih materijala za testiranje.
   1.37.   Specifičnost: sposobnost metode da razlikuje analit koji se mjeri od drugih tvari. Ova značajka ovisi prije svega o opisanoj tehnici mjerenja, ali može varirati ovisno o vrsti spoja ili matriksu.
   1.38.   Standardno dodavanje: postupak pri kojemu se uzorak za ispitivanje dijeli na dva (ili više) poduzoraka za analizu. Jedan se poduzorak analizira kao takav, a drugom se prije analize dodaje poznata količina standardnog analita. Količina standardnog analita koja se dodaje mora biti od dva do pet puta veća od procijenjene količine analita u uzorku. Cilj postupka je odrediti udio analita u uzroku, uzimajući u obzir iskorištenje analitičkog postupka.
   1.39.   Standardni analit: analit poznatog i potvrđenog sadržaja i čistoće koji se koristi kao referentni materijal u analizi.
   1.40.   Tvar: tvar posebnog ili određenog kemijskog sastava i njezini metaboliti.
   1.41.   Poduzorak za analizu: količina materijala uzetog iz uzorka za ispitivanje na kojemu se izvodi pokus ili koji se promatra.
   1.42.   Uzorak za ispitivanje: uzorak koji je pripremljen iz laboratorijskog uzorka i iz kojega će se uzimati poduzorci za analizu.
   1.43.   Istinitost: stupanj podudarnosti između srednje vrijednosti dobivene iz velikog niza rezultata ispitivanja i prihvaćene referentne vrijednosti. Istinitost se obično izražava kao mjerno odstupanje. (2).
   1.44.   Jedinice: jedinice opisane u ISO 31 (20) i Direktivi 71/354/EZ (19).
   1.45.   Validacija: potvrđivanje, pomoću ispitivanja i pribavljanja stvarnih dokaza, da su ispunjeni posebni zahtjevi u pogledu specifične predviđene primjene(1).
   1.46.   Obnovljivost unutar laboratorija: preciznost dobivena u istom laboratoriju pod propisanim (unaprijed određenim) uvjetima (u vezi s, primjerice, metodom, materijalom koji se ispituje, analitičarima, okolišem) u opravdano dugim vremenskim razmacima.
   2.   KRITERIJI UČINKOVITOSTI I DRUGI ZAHTJEVI ZA METODE ANALIZE
   
   Analitičke metode ili kombinacije metoda koje su drukčije od dolje opisanih mogu se koristiti kao orijentacijske ili potvrdne ako se može dokazati da ispunjavaju odgovarajuće zahtjeve koji su utvrđeni ovom Odlukom.
   2.1.   OPĆI ZAHTJEVI
   2.1.1.   Rukovanje uzorcima
   
   Uzorci se uzimaju, s njima se postupa i obrađuju se na način koji pruža maksimalnu mogućnost detekcije tvari. Postupci rukovanja s uzrocima moraju spriječiti mogućnost slučajne kontaminacije ili gubitka analita.
   2.1.2.   Izvođenje testova
   
   2.1.2.1.   Iskorištenje
   
   Ako se koristi fiksni faktor korekcije iskorištenja, iskorištenje se tijekom analize uzoraka određuje za svaku seriju uzoraka. Ako je iskorištenje unutar granica, tada se može koristiti fiksni faktor korekcije. U protivnome se koristi faktor iskorištenja dobiven za određenu seriju uzoraka, osim ako se ne primjenjuje specifični faktor iskorištenja analita u uzorku, pri čemu se za kvantitativno određivanje analita u uzorku primjenjuje postupak standardnog dodavanja (vidjeti 3.5) ili unutarnji standard.
   2.1.2.2.   Specifičnost
   
   Metodom se, u eksperimentalnim uvjetima, analit mora moći razlikovati od drugih tvari. Mora se navesti procjena te mogućnosti. Moraju se primijeniti strategije za izbjegavanje svih predviđenih interferencija s tvarima pri primjeni opisane mjerne tehnike, npr. homolozima, analozima, metabolitima rezidua koji se testira. Od najveće je važnosti ispitati interferenciju koju bi mogle uzrokovati sastojci matriksa.
   2.2.   ORIJENTACIJSKE METODE
   U skladu s Direktivom 96/23/EZ, u svrhu orijentacije koriste se samo one analitičke tehnike za koje se na dokumentirani sljedivi način može pokazati da su validirane i da im je, na razini značajnosti, postotak lažno negativnih manji od 5 % (β pogreška). U slučaju sumnje na pozitivni rezultat, takav se rezultat mora potvrditi potvrdnom metodom.
   2.3.   POTVRDNE METODE ZA ORGANSKE REZIDUE I KONTAMINANTE
   Potvrdne metode za organske rezidue i kontaminante daju informacije o kemijskoj strukturi analita. Dakle, metode koje se temelje isključivo na kromatografskoj analizi bez primjene spektrometrijske detekcije, nisu same po sebi prikladne za primjenu kao potvrdne metode. Međutim, ako jednom postupku nedostaje specifičnost, željena se specifičnost postiže analitičkim postupcima koji se sastoje od odgovarajućih kombinacija postupaka pročišćavanja, kromatografske separacije ili separacija i spektrometrijske detekcije.
   Sljedeće metode, odnosno kombinacije metoda, smatraju se prikladnima za identifikaciju organskih rezidua ili kontaminanta za navedene skupine tvari:
   
      Tablica 1.
   
   
      Prikladne potvrdne metode za organske rezidue i kontaminante
   
   
               Mjerni postupak
            
            
               Tvari: Dodatak I Direktivi 96/23/EZ
            
            
               Ograničenja
            
         
               LC ili GC uz detekciju masenom spektrometrijom
            
            
               Skupine A i B
            
            
               Jedino ako slijede nakon vezane ili odvojene kromatografske separacije
               Jedino ako se primjenjuju postupci snimanja cjelokupnog spektra (full scan) ili se koriste barem 3 (skupina B) ili 4 (skupina A) identifikacijske točke za postupke koji ne bilježe cijeli maseni spektar
            
         
               LC ili GC uz detekciju spektrometrijom infracrvenog zračenja
            
            
               Skupine A i B
            
            
               Moraju biti zadovoljeni posebni zahtjevi za spektrometriju apsorpcije infracrvenog zračenja
            
         
               LC-full-scan DAD
            
            
               Skupina B
            
            
               Moraju biti zadovoljeni posebni zahtjevi za spektrometriju apsorpcije UV zračenja
            
         
               LC- fluorescencijska
            
            
               Skupina B
            
            
               Jedino za molekule koje pokazuju prirodnu fluorescenciju i molekule koje pokazuju fluorescencijske značajke nakon transformacije ili derivatizacije.
            
         
               2-D TLC – full scan UV/VIS
            
            
               Skupina B
            
            
               Dvodimenzionalna HPTLC i ko-kromatografija su obvezni.
            
         
               GC-detekcija elektronskog zahvata
            
            
               Skupina B
            
            
               Jedino ako se primjenjuju dvije kolone različitog polariteta
            
         
               LC-imunogram
            
            
               Skupina B
            
            
               Jedino ako se primjenjuju najmanje dva različita kromatografska sustava ili druga, nezavisna metoda detekcije.
            
         
               LC-UV/VIS (jednovalna dužina)
            
            
               Skupina B
            
            
               Jedino ako se primjenjuju najmanje dva različita kromatografska sustava ili druga, nezavisna metoda detekcije.
            
         2.3.1.   Zajednički kriteriji učinkovitosti i zahtjevi
   
   Potvrde metode daju podatke o kemijskoj strukturi analita. Ako više spojeva daje isti rezultat, metodom se ne mogu razlikovati ti spojevi. Metode koje se temelje jedino na kromatografskoj analizi bez primjene spektrometrijske detekcije, nisu same po sebi prikladne za primjenu kao potvrdne metode.
   Ako se u metodi primjenjuje odgovarajući unutarnji standard, on se dodaje poduzorku za analizu na početku postupka ekstrakcije. Ovisno o raspoloživosti, rabe se bilo stabilni oblici analita obilježeni izotopom, koji su posebno prikladni za detekciju masenom spektrometrijom, bilo spojevi koji su po svojoj strukturi slični analitu.
   Ako se ne može upotrijebiti odgovarajući unutarnji standard, identifikacija analita potvrđuje se ko-kromatografijom. U tom slučaju, dobiva se samo jedan pik (vrh), pri čemu je povećana visina (ili područje) pika jednaka količini dodanog analita. Za plinsku kromatografiju (GC) ili tekućinsku kromatografiju (LC), širina pika na polovici maksimalne visine mora biti između 90 – 110 % raspona izvorne širine, a vremena zadržavanja moraju biti jednaka uz toleranciju od 5 %. Za metode tankoslojne kromatografije (TLC) povećava se samo mrlja za koju se pretpostavlja da je analit; ne smije se pojaviti nova mrlja i izgled se ne smije promijeniti.
   Referentne ili obogaćene materijale koji sadrže poznate količine analita na dozvoljenoj granici ili granici odlučivanja (pozitivni kontrolni uzorak), ili u njihovoj blizini, kao i negativne kontrolne materijale i slijepe probe s reagensom, trebalo bi podvrgnuti cijelom postupku istodobno sa svakom serijom analiziranih uzoraka za ispitivanje. Redoslijed injektiranja ekstrakta u analitički instrument je sljedeći: slijepa proba s reagensom, negativni kontrolni uzorak, uzorak ili uzorci koji se potvrđuju, negativni kontrolni uzorak i na koncu pozitivni kontrolni uzorak. Svaka se izmjena ovog redoslijeda mora opravdati.
   2.3.2.   Dodatni kriteriji učinkovitosti i drugi zahtjevi za kvantitativne metode analize
   
   2.3.2.1.   Istinitost kvantitativnih metoda
   
   U slučaju ponovljenih analiza potvrđenog referentnog materijala, odstupanje prosječnog masenog udjela, koja je eksperimentalno određena i korigirana iskorištenjem, od potvrđene vrijednosti mora biti unutar sljedećih granica:
   
      Tablica 2.
   
   
      Minimalna istinitost kvantitativne metode
   
   
               Maseni udio
            
            
               Granice
            
         
               ≤ 1 μg/kg
            
            
               – 50 % do + 20 %
            
         
               > 1 μg/kg do 10 μg/kg
            
            
               – 30 % do + 10 %
            
         
               ≥ 10 μg/kg
            
            
               – 20 % do + 10 %
            
         Ako ne postoje takvi potvrđeni referentni materijali (CRM), istinitost mjerenja može se ocijeniti iskorištenjem dodataka poznate količine analita na slijepi matriks. Podaci korigirani srednjom vrijednošću iskorištenjem prihvatljivi su jedino ako su u granicama koje su navedene u tablici 2.
   2.3.2.2.   Preciznost kvantitativne metode
   
   Međulaboratorijski koeficijent varijacije (CV) za ponovljene analize referentnog ili obogaćenog materijala, u uvjetima obnovljivosti, ne smije biti veći od razine izračunate Horwitzovom jednadžbom. Jednadžba glasi:
   
      
   gdje je C maseni udio izražen kao potencija (eksponent) s bazom 10 (npr. 1 mg/g = 10-3). Primjeri su prikazani u tablici 3.
   
      Tablica 3.
   
   
      Primjeri koeficijenata varijacije (CV) obnovljivosti za kvantitativne metode kod određenih masenih udjela analita
   
   
               Maseni udio
            
            
               CV obnovljivosti (%)
            
         
               1 μ/kg
            
            
               
                   (1)
               
            
         
               10 μ/kg
            
            
               
                   (1)
               
            
         
               100 μ/kg
            
            
               23
            
         
               1 000 μ/kg
            
            
               16
            
         Za analize izvedene pod uvjetima ponovljivosti, unutarlaboratorijski CV (koeficijent varijacije) obično bi trebao iznositi između jedne polovine i dvije trećine gornjih vrijednosti. Za analize izvedene pod unutarlaboratorijskim uvjetima obnovljivosti unutarlaboratorijski CV ne smije biti veći od CV obnovljivosti.
   Kod tvari za koje je utvrđena dozvoljena granica, metoda mora postići unutarlaboratorijsku obnovljivost koja nije veća od odgovarajućeg CV obnovljivosti kod koncentracije od 0,5 × dozvoljena granica.
   2.3.3.   Kriteriji učinkovitosti i drugi zahtjevi za detekciju masenom spektrometrijom
   
   Metode masene spektrometrije mogu se uzeti u obzir kao potvrdne metode jedino ako slijede nakon što je provedena vezana (on-line) ili odvojena (off-line) kromatografska separacija.
   2.3.3.1.   Kromatografska separacija
   
   Za GC-MS postupke, separacija plinskom kromatografijom izvodi se primjenom kapilarnih kolona. Za LC-MS postupke, kromatografska separacija izvodi se primjenom odgovarajućih LC kolona. U svakom slučaju, najmanje prihvatljivo vrijeme zadržavanja analita koji se ispituje mora biti jednako dvostrukom vremenu zadržavanja koje vrijedi za prazni volumen kolone. Vrijeme zadržavanja (relativno vrijeme zadržavanja) analita u poduzorku za analizu mora odgovarati vremenu zadržavanja kalibracijskog standarda unutar određenog intervala vremena zadržavanja. Interval vremena zadržavanja mora biti razmjeran sposobnosti razlučivanja kromatografskog sustava. Omjer između kromatografskog vremena zadržavanja analita i vremena zadržavanja unutarnjeg standarda, tj. relativno vrijeme zadržavanja analita, mora odgovarati vremenu zadržavanja kalibracijske otopine uz toleranciju od ± 0,5 % za GC i ± 2,5 % za LC.
   2.3.3.2.   Detekcija masenom spektrometrijom
   
   Detekcija masenom spektrometrijom mora se provoditi uporabom MS tehnika, kao što su snimanje cjelokupnih masenih spektara (full scan) ili praćenje odabranih iona (SIM), kao i uporabom MS-MSn tehnika, kao što je praćenje odabranih reakcija (SRM) ili drugih prikladnih MS ili MS-MSn tehnika u kombinaciji s odgovarajućim načinima ionizacije. Kod masene spektrometrije s visokom razlučivošću (HRMS), razlučivost mora općenito biti veća od 10 000 za cijeli raspon mase s ulegnućem od 10 %
   
      Snimanje cjelokupnih spektara (full scan): Kad se određivanje masenom spektrometrijom provodi snimanjem cjelokupnih spektara, moraju obavezno biti prisutni svi izmjereni dijagnostički ioni (molekularni ion, karakteristični adukti molekularnog iona, karakteristični ioni fragmenata i izotopni ioni) s relativnim intenzitetom većim od 10 % u referentnom spektru kalibracijskog standarda.
   
      Praćenje odabranih iona (SIM): Kad se određivanje masenom spektrometrijom provodi fragmentografijom, molekularni bi ion trebao biti jedan od odabranih dijagnostičkih iona (molekularni ion, karakteristični adukti molekularnog iona, karakteristični ioni fragmenata i svi njihovi izotopni ioni). Odabrani dijagnostički ioni ne bi trebali potjecati isključivo iz istog dijela molekule. Omjer signal-šum za svaki dijagnostički ion mora biti ≥ 3:1.
   
      Snimanje cjelokupnih spektara (full scan) i praćenje odabranih iona (SIM): Relativni intenziteti detektiranih iona, izraženi kao postotak intenziteta najintenzivnijeg iona ili najintenzivnijeg prijelaza, moraju odgovarati intenzitetima kalibracijskog standarda, bilo iz otopina kalibracijskog standarda ili obogaćenih uzoraka, na usporedivim koncentracijama, mjerenim pod istim uvjetima, uz sljedeće tolerancije:
   
      Tablica 4.
   
   
      Najviše dozvoljene tolerancije za relativne intenzitete iona kod raznih tehnika masene spektrometrije
   
   
               Relativni intenzitet
               (% baznog pika)
            
            
               EI-GC-MS
               (relativni)
            
            
               CI-GC-MS, GC-MSn
               
               LC-MS, LC-MSn
               
               (relativni)
            
         
               > 50 %
            
            
               ± 10 %
            
            
               ± 20 %
            
         
               > 20 % do 50 %
            
            
               ± 15 %
            
            
               ± 25 %
            
         
               > 10 % do 20 %
            
            
               ± 20 %
            
            
               ± 30 %
            
         
               ≤ 10 %
            
            
               ± 50 %
            
            
               ± 50 %
            
         
      Tumačenje podataka dobivenih masenom spektrometrijom: Relativni intenziteti dijagnostičkih iona i/ili ionskih parova prekursor/produkt moraju se identificirati uspoređivanjem spektara ili integriranjem signala pojedinačnih masenih tragova. Kad god se primjenjuje pozadinska (background) korekcija, ona se mora primijeniti podjednako na cijelu seriju (vidjeti 2.3.1., stavak 4.) i mora biti jasno naznačena.
   
      Snimanje cjelokupnih spektara (full scan): Ako se snimanje cjelokupnih spektara bilježi u jednoj masenoj spektrometriji, moraju biti prisutna najmanje četiri iona relativnog intenziteta od ≥ 10 % baznog pika. Molekularni ion se uključuje ako je prisutan u referentnom spektru s intenzitetom od ≥ 10 %. Najmanje četiri iona moraju biti unutar najviših dozvoljenih tolerancija za relativne intenzitete iona (Tablica 5.) Mogu se, uz pomoć računala, pretraživati baze podataka. U tom slučaju, usporedba podataka o masenom spektru u uzorku za ispitivanje s onima kalibracijske otopine mora biti veća od kritičnog faktora podudarnosti. Taj se faktor određuje tijekom postupka validacije za svaki analit na temelju spektara za koje su ispunjeni dolje opisani uvjeti. Mora se provjeriti varijabilnost spektara uzrokovana matriksom i funkcioniranje detektora.
   
      Praćenje odabranih iona (SIM): Ako se maseni fragmenti mjere drugim tehnikama osim snimanja cjelokupnih spektara (full scan), za tumačenje podataka primjenjuje se sustav identifikacijskih točaka. Za potvrdu tvari koje su navedene u grupi A u Prilogu I. Direktivi 96/23/EZ, potrebne su najmanje 4 identifikacijske točke. Za potvrdu tvari koje su navedene u grupi B u Prilogu I. Direktivi 96/23/EZ, potrebne su najmanje 3 identifikacijske točke. Donja tablica pokazuje broj identifikacijskih točaka koje može zaraditi svaka temeljna tehnika masene spektrometrije. Međutim, da bi se mogla zaraditi identifikacijska točka potrebna za potvrdu i da bi se mogao izračunati ukupni broj identifikacijskih točaka:
   
               (a)
            
            
               mora se izmjeriti omjer najmanje jednog iona; i
            
         
               (b)
            
            
               svi relevantni izmjereni omjeri iona moraju zadovoljavati gore navedene kriterije; i
            
         
               (c)
            
            
               mogu se kombinirati najviše tri posebne tehnike kako bi se postigao minimalni broj identifikacijskih točaka.
            
         
      Tablica 5.
   
   
      Odnos između različitih vrsta masenih fragmenata i zarađenih identifikacijskih točaka
   
   
               Tehnika masene spektrometrije
            
            
               Identifikacijske točke zarađene po ionu
            
         
               Masena spektrometrija niske razlučivosti
            
            
               1,0
            
         
               MR-MSn prekursor ion
            
            
               1,0
            
         
               LR- MSn tranzicijski produkti
            
            
               1,5
            
         
               HRMS
            
            
               2,0
            
         
               HR- MSn prekursor ion
            
            
               2,0
            
         
               HR- MSn tranzicijski produkti
            
            
               2,5
            
         
               
                           (1)
                        
                        
                           Svaki se ion može brojiti samo jednom.
                        
                     
                           (2)
                        
                        
                           GC-MS s elektronskom ionizacijom smatra se drugačijom tehnikom od GC-MS s kemijskom ionizacijom.
                        
                     
                           (3)
                        
                        
                           Da bi se povećao broj identifikacijskih točaka, mogu se rabiti različiti analiti jedino ako u derivatima dolazi do različitih kemijskih reakcija.
                        
                     
                           (4)
                        
                        
                           Za tvari iz grupe A Priloga I. Direktivi 96/23/EZ, ako se tijekom analitičkog postupka primjenjuje jedna od ovih tehnika: HPLC u kombinaciji sa spektrometrijom pomoću niza dioda (diode array detection) uz snimanje cjelokupnog spektra; HPLC u kombinaciji s fluorsecencijskom detekcijom; HPLC u kombinaciji s imunogramom; dvodimenzionalna tankoslojna kromatografija (TLC) u kombinaciji sa spektrometrijskom detekcijom; ove tehnike mogu doprinijeti najviše s jednom identifikacijskom točkom, uz uvjet da su ispunjeni svi kriteriji koji se primjenjuju za te tehnike.
                        
                     
                           (5)
                        
                        
                           Produkti nastali tijekom prijelaza uključuju potomke prve generacije i potomke druge generacije.
                        
                     
         
      
   
      Tablica 6.
   
   
      Primjeri broja identifikacijskih točaka koje se dobivaju za različite tehnike i njihove kombinacije (n = cijeli broj)
   
   
               Tehnika/tehnike
            
            
               Broj iona
            
            
               Identifikacijske točke
            
         
               GC-MS (EI ili CI)
            
            
               N
            
            
               n
            
         
               GC-MS (EI i CI)
            
            
               2 (EI) + 2 (CI)
            
            
               4
            
         
               GC-MS (EI ili CI) 2 derivata
            
            
               2 (derivat A) + 2 (derivat B)
            
            
               4
            
         
               LC-MS
            
            
               N
            
            
               n
            
         
               GC-MS-MS
            
            
               1 prekusor i 2 potomka prve generacije
            
            
               4
            
         
               LC-MS-MS
            
            
               1 prekusor i 2 potomka prve generacije
            
            
               4
            
         
               GC-MS-MS
            
            
               2 iona prekursora, svaki s jednim potomkom prve generacije
            
            
               5
            
         
               LC-MS-MS
            
            
               2 iona prekursora, svaki s jednim potomkom prve generacije
            
            
               5
            
         
               Lc-ms-ms-ms
            
            
               1 prekursor, 1 potomak prve generacije i 2 potomka druge generacije
            
            
               5,5
            
         
               HRMS
            
            
               N
            
            
               2 n
            
         
               GC-MS i LC-MS
            
            
               2 + 2
            
            
               4
            
         
               GC-MS i HRMS
            
            
               2 + 1
            
            
               4
            
         2.3.4.   Kriteriji učinkovitosti i drugi zahtjevi za kromatografiju u kombinaciji s infracrvenom detekcijom
   
   Odgovarajući pikovi: odgovarajući pikovi su maksimumi apsorpcije u infracrvenom spektru kalibracijskog standarda koji ispunjavaju sljedeće zahtjeve:
   2.3.4.1.   Infracrvena detekcija
   
   
      Apsorpcijski maksimum: mora biti u rasponu valnog broja 4 000-500 cm-1
   
   
      Intenzitet apsorpcije: ne smije biti manji od
   
               (a)
            
            
               specifične molarne apsorbancije od 40 u odnosu na baznu liniju pika; ili od
            
         
               (b)
            
            
               relativne apsorbancije od 12,5 % od apsorbancije najintenzivnijeg pika u području 4 000-500 cm-1
               
            
         ako se obje mjere u odnosu na nultu apsorbanciju, i 5 % od apsorbancije najintenzivnijeg pika u području 4 000-500 cm-1 ako se obje mjere u odnosu na baznu liniju pika.
   Napomena: Iako bi se s teoretske točke gledišta mogla dati prednost odgovarajućim pikovima određenim prema točki (a), u praksi je lakše odrediti pikove prema točki (b).
   Određuje se broj pikova u infracrvenom spektru analita čije frekvencije odgovaraju odgovarajućem piku u spektru kalibracijskog standarda, uz toleranciju od ± 1 cm-1.
   2.3.4.2.   Tumačenje podataka o infracrvenom spektru
   
   Apsorpcija mora biti prisutna u svim područjima spektra analita koja odgovaraju odgovarajućem piku u referentnom spektru kalibracijskog standarda. Potrebno je najmanje šest odgovarajućih pikova u infracrvenom spektru kalibracijskog standarda. Ako ima manje od šest odgovarajućih pikova (7), dotični spektar se ne može koristiti kao referentni spektar. „Rezultat”, to jest postotak odgovarajućih pikova pronađenih u infracrvenom spektru analita, mora biti najmanje 50. Ako za odgovarajući pik ne postoji točno poklapanje, relevantno područje spektra analita odgovara prisutnosti pika iste razine. Postupak se može primijeniti jedino na pikove apsorpcije u spektru uzorka čiji je intenzitet najmanje trostruk u odnosu na šum između jednog i drugog pika.
   2.3.5.   Kriteriji učinkovitosti i drugi zahtjevi za određivanje analita uporabom plinske kromatografije i drugih tehnika detekcije
   
   2.3.5.1.   Kromatografska separacija
   
   Koristi se unutarnji standard ako je u tu svrhu na raspolaganju odgovarajući materijal. To bi, po mogućnosti, trebao biti srodni standard kojeg je vrijeme zadržavanja blisko vremenu zadržavanja analita. Analit mora eluirati u vremenu zadržavanja koje je tipično za odgovarajući kalibracijski standard pod istim eksperimentalnim uvjetima. Minimalno prihvatljivo vrijeme zadržavanja za analit mora biti jednako dvostrukom vremenu zadržavanja koje odgovara praznom volumenu kolone. Omjer između vremena zadržavanja analita i vremena zadržavanja unutarnjeg standarda, tj. relativno vrijeme zadržavanja analita, mora biti jednako vremenu zadržavanja kalibracijskog standarda u odgovarajućem matriksu, uz toleranciju od ± 2,5 %.
   2.3.5.2.   UV/VIS detekcija uz snimanje cijelog spektra
   
   Moraju biti ispunjeni kriteriji učinkovitosti za metode tekućinske kromatografije.
   Maksimumi apsorpcije u spektru analita moraju biti na istim valnim dužinama kao i oni kalibracijskog standarda, uz toleranciju koja ovisi o razlučivosti sustava detekcije. Za detekciju pomoću niza dioda, tolerancija je obično unutar ± 2 nm. Za one dijelove dvaju spektrova čija je relativna apsorbancija ≥ 10 %, spektar analita iznad 220 nm ne smije se vidljivo razlikovati od spektra kalibracijskog standarda. Ovaj je kriterij zadovoljen kada su, prvo, prisutni isti maksimumi i, drugo, kada razlika između dva spektra ni u jednoj od promatranih točaka nije veća od 10 % od apsorbancije kalibracijskog standarda. U slučaju računalnog pretraživanja baza podataka i uspoređivanja, usporedba podataka o spektru u uzorku za ispitivanje s onima kalibracijske otopine mora biti veća od kritičnog faktora podudarnosti. Taj se faktor za svaki analit određuje tijekom postupka validacije na temelju spektara za koje su ispunjeni gore opisani uvjeti. Mora se provjeriti varijabilnost spektara uzrokovana matriksom i funkcioniranje detektora.
   2.3.5.3.   Kriteriji učinkovitosti za fluorometrijsku detekciju
   
   Moraju biti ispunjeni kriteriji učinkovitosti za metode tekućinske kromatografije.
   Ovo se odnosi na molekule koje pokazuju prirodnu fluorescenciju i molekule koje pokazuju fluorescenciju nakon transformacije ili derivatizacije. Valne dužine podražaja i emisije, u kombinaciji s kromatografskim uvjetima, moraju se odabrati tako da se pojava interferencijskih komponenata u ekstraktima slijepog uzorka svede na najmanju mjeru.
   Najbliži maksimum pika u kromatogramu mora biti odvojen od utvrđenog pika analita za najmanje jednu punu širinu pika izmjerenu na 10 % od maksimalne visine pika analita.
   2.3.5.4.   Kriteriji učinkovitosti za određivanje analita pomoću LC imunograma
   
   LC imunogram se ne može sam po sebi koristiti kao potvrdna metoda.
   Moraju biti ispunjeni odgovarajući kriteriji za metode tekućinske kromatografije.
   Unaprijed utvrđeni paramateri kontrole kakvoće, primjerice nespecifično vezivanje, relativno vezivanje kontrolnih uzoraka, vrijednost apsorbancije slijepog uzorka, moraju biti unutar granica dobivenih tijekom validacije testa.
   Imunogram se mora sastojati od najmanje pet frakcija.
   Svaka frakcija mora biti manja od polovice širine pika.
   Frakcija s najvećim udjelom analita mora biti ista za uzorka koji se ispituje, za pozitivni kontrolni uzorak i standard.
   2.3.5.5.   Određivanje analita tekućinskom kromatografijom (LC) uz UV/VIS detekciju (jedna valna dužina)
   
   Tekućinska kromatografija (LC) uz UV/VIS detekciju (jedna valna dužina) ne može se sama po sebi koristiti kao potvrdna metoda.
   Najbliži maksimum pika u kromatogramu mora biti odvojen od utvrđenog pika analita za najmanje jednu punu širinu pika izmjerenu na 10 % od maksimalne visine pika analita.
   2.3.6.   Kriteriji učinkovitosti i drugi zahtjevi za određivanje analita uporabom 2-D TLC uz spektrometrijsku UV/VIS detekciju sa snimanjem cijelog spektra
   
   Dvodimenzionalna tankoslojna kromatografija visoke djelotvornosti (HPTLC) i ko-kromatografija su obavezni.
   RF vrijednosti analita moraju se podudarati s RF vrijednostima standarda uz toleranciju od ± 5 %.
   Izgled analita ne smije se razlikovati od izgleda standarda.
   Kod mrlja iste boje, središte najbliže mrlje mora biti odvojeno od središta mrlje analita za najmanje polovicu zbroja promjera mrlja.
   Spektar analita ne smije se vizualno razlikovati od spektra standarda, kao što je opisano za UV/VIS detekciju uz snimanje cijelog spektra.
   U slučaju računalnog pretraživanja baza podataka i uspoređivanja, usporedba podataka o spektru u uzorku za ispitivanje s onima kalibracijske otopine mora biti veća od kritičnog faktora podudarnosti. Taj se faktor određuje tijekom postupka validacije za svaki analit na temelju spektara za koje su ispunjeni gore opisani uvjeti. Mora se provjeriti varijabilnost spektara uzrokovana matriksom i funkcioniranje detektora.
   2.3.7.   Kriteriji učinkovitosti i zahtjevi za određivanje analita plinskom kromatografijom uz detekciju elektronskog zahvata (ECD)
   
   Koristi se unutarnji standard ako je u tu svrhu na raspolaganju odgovarajući materijal. To bi, po mogućnosti, trebao biti srodni standard čije je vrijeme zadržavanja blisko vremenu zadržavanja analita. Analit mora eluirati u vremenu zadržavanja koje je tipično za odgovarajući kalibracijski standard pod istim eksperimentalnim uvjetima. Minimalno prihvatljivo vrijeme zadržavanja za analit mora biti jednako dvostrukom vremenu zadržavanja koje odgovara praznom volumenu kolone. Omjer između vremena zadržavanja analita i vremena zadržavanja unutarnjeg standarda, tj. relativno vrijeme zadržavanja analita, mora biti jednak vremenu zadržavanja kalibracijskog standarda u odgovarajućem matriksu, uz toleranciju od ± 2,5 %. Najbliži maksimum pika u kromatogramu mora biti odvojen od utvrđenog pika analita za najmanje jednu punu širinu pika izmjerenu na 10 % od maksimalne visine pika analita. Za dobivanje dodatnih podataka može se primijeniti ko-kromatografija.
   2.4.   POTVRDNE METODE ZA KEMIJSKE ELEMENTE
   Potvrdne analize kemijskih elementa moraju se temeljiti na pojmu nedvosmislene identifikacije i točne i precizne kvantifikacije, uz pomoć fizikalno-kemijskih značajki koje su jedinstvene za dotični element na razini značajnosti (npr. dužine vala emitirane ili apsorbirane radijacije, atomske mase).
   Sljedeće metode ili kombinacije metoda smatraju se prikladnima za identifikaciju kemijskih elemenata.
   
      Tablica 7.
   
   
      Prikladne metode potvrde za kemijske elemente
   
   
               Tehnika
            
            
               Mjereni parametar
            
         
               Diferencijalna pulsna voltamterija s anodnim otapanjem
            
            
               Električni signal
            
         
               Atomska apsorpcijska spektrometrija
            
         
               Plamen
            
            
               Dužina vala apsorpcije
            
         
               Hibridni potomci
            
            
               Dužina vala apsorpcije
            
         
               Hladna para
            
            
               Dužina vala apsorpcije
            
         
               Elektrotoplinska atomizacija (grafitna peć)
            
            
               Dužina vala apsorpcije
            
         
               Atomska emisijska spektrometrija
            
         
               Induktivno spregnuta plazma
            
            
               Dužina vala emisije
            
         
               Masena spektrometrija
            
         
               Induktivno spregnuta plazma
            
            
               Omjer mase i naboja
            
         2.4.1.   Zajednički kriteriji učinkovitosti i drugi zahtjevi za potvrdne metode
   
   Referentni ili obogaćeni materijal koji sadrži poznatu količinu analita na razini ili blizu razine najveće dozvoljene granice (pozitivni kontrolni uzorak), kao i negativni kontrolni materijali i slijepi uzorak s reagensom, trebali bi se, po mogućnosti, analizirati tijekom cijelog postupka istodobno sa svakom serijom uzoraka za ispitivanje. Preporučeni redoslijed injektiranja ekstrakta u analitički instrument je sljedeći: slijepi uzorak s reagensom, negativni kontrolni uzorak, uzorak koji treba potvrditi, negativni kontrolni uzorak i konačno pozitivni kontrolni uzorak. Svaka izmjena ovog redoslijeda mora se opravdati.
   Općenito, kod većine analitičkih tehnika nužno je potpuna razgradnja organskog matriksa kako bi se dobila otopina prije određivanja analita. To se može postići primjenom postupaka mikrovalne mineralizacije koji rizik od gubitka i/ili kontaminacije značajnog analita svode na najmanju mjeru. Mora se rabiti dekontaminirano teflonsko posuđe dobre kakvoće. Ako se primjenjuju druge metode mokre ili suhe razgradnje, moraju postojati dokumentirani dokazi koji isključuju moguću pojavu gubitka ili kontaminacije. Kao alternativa za razgradnju, u određenim okolnostima se mogu primijeniti postupci separacije (npr. ekstrakcija) s ciljem odvajanja analita od komponenata matriksa i/ili s ciljem koncentracije analita kako bi se unijeli u analitičku opremu.
   Što se tiče kalibracije, bilo da je ona vanjska ili temeljena na metodi standardnog dodavanja, mora se paziti da se ne premaši radni raspon koji je utvrđen za analizu. U slučaju vanjske kalibracije, kalibracijski se standardi moraju obavezno pripremiti u otopini koja se što više podudara sa sastavom otopine uzorka. Ako to zahtijevaju specifične analitičke okolnosti, primjenjuje se i pozadinska korekcija.
   2.4.2.   Dodatni kriteriji učinkovitosti i drugi zahtjevi za kvantitativne metode analize
   
   2.4.2.1.   Istinitost kvantitativnih metoda
   
   U slučaju ponovljenih analiza potvrđenog referentnog materijala za kemijske elemente, odstupanje srednje vrijednosti udjela analita, koje je eksperimentalno utvrđeno, ne smije biti izvan granice od ± 10 %. Ako ne postoje takvi potvrđeni referentni materijali, prihvatljivo je da se istinitost mjerenja ocijeni putem izdvajanja dodataka poznate količine elementa u nepoznate uzorke. Skreće se pozornost na činjenicu da, za razliku od analita, dodani element nije kemijski vezan u stvarnom matriksu te da, stoga, rezultati dobiveni ovim putem imaju manju valjanost od rezultata dobivenih uporabom potvrđenog referentnog materijala. Podaci o iskorištenju prihvatljivi su jedino ako je njihova vrijednost unutar ± 10 % ciljne vrijednosti.
   2.4.2.2.   Preciznost kvantitativnih metoda
   
   U slučaju ponovljenih analiza uzorka provedenih pod unutarlaboratorijskim uvjetima obnovljivosti, unutarlaboratorijski koeficijent varijacije (CV) srednje vrijednosti ne smije biti veći od sljedećih vrijednosti:
   
      Tablica 8.
   
   
      CV za kvantitativne metode kod određenih raspona maseni udio elementa
   
   
               Maseni udio
            
            
               CV (%)
            
         
               ≥ 10 μg/kg do 100 μg/kg
            
            
               20
            
         
               ≥ 100 μg/kg do 1 000 μg/kg
            
            
               15
            
         
               ≥ 1 000 μg/kg
            
            
               10
            
         2.4.3.   Specifični zahtjevi za diferencijalnu pulsnu voltametriju s anodnim otapanjem (DPASV)
   
   Od najveće je važnosti da organske tvari u uzorcima bude potpuno uništene prije nego se počne s DPASV određivanjem. Na voltamogramu se ne smije vidjeti niti jedan široki signal nastao zbog nazočnosti organskih materijala. Anorganske komponente matriksa mogu utjecati na visinu pikova u DPASV-u. Stoga se kvantifikacija mora obaviti metodom standardnog dodavanja. Primjerci tipičnih voltamograma otopine uzorka moraju biti dostavljeni uz metodu.
   2.4.4.   Specifični zahtjevi za atomsku apsorpcijsku spektrometriju (AAS)
   
   Ova se tehnika u osnovi koristi za ispitivanje jednog elementa i stoga zahtijeva da eksperimentalni parametri budu optimalno podešeni za određeni element koji se kvantificira. Kad god se to može, rezultati se moraju provjeriti kvalitativno i kvantitativno uz pomoć alternativnih apsorpcijskih linija (idealno bi bilo da se odaberu dvije različite linije). Kalibracijski standard priprema se u otopini matriksa čiji je sastav što je moguće sličniji sastavu otopine uzorka koja se mjeri (npr. koncentracija kiselina ili sastav modifikatora). Kako bi se vrijednosti slijepog uzorka svele na najmanju moguću mjeru, svi reagensi moraju biti najvećeg mogućeg stupnja čistoće. Ovisno o načinu vaporizacije i/ili atomizacije uzorka, mogu se razlikovati različiti tipovi atomske apsorpcijske spektrometrije.
   2.4.4.1.   Specifični zahtjevi za plamenu atomsku apsorpcijsku spektrometriju
   
   Instrument mora biti optimalno podešen za svaki element. Posebno se mora provjeriti sastav plina i brzina protoka. Kako bi se izbjegle interferencije uzrokovane pozadinskom apsorpcijom, mora se koristiti korektor sa neprekidnim izvorom. U slučaju nepoznatih matriksa, mora se provjeriti da li je potrebna pozadinska korekcija.
   2.4.4.2   Specifični zahtjevi za atomsku apsorpcijsku spektrometriju s grafitnom peći
   
   Kontaminacija u laboratoriju često utječe na točnost pri radu na razinama ultra tragova u grafitnoj peći. Stoga se pri postupanju s uzorkom i standardom moraju upotrebljavati reagensi visoke čistoće, deionizirana voda i materijal od inertne plastike. Instrument se mora optimalno podesiti za svaki element. Moraju se posebno provjeriti uvjeti prethodne obrade i atomizacije (temperatura, vrijeme), kao i modifikacija matriksa.
   Rad pod izotermnim uvjetima atomizacije (npr. poprečna zagrijana grafitna cijev s ugrađenom L’vovom platformom (8)) smanjuje utjecaj matriksa u pogledu atomizacije analita. U kombinaciji s modifikacijom matriksa i Zeemanovom korekcijom pozadine (9), dopušta se kvantifikacija pomoću kalibracijske krivulje koja se temelji na mjerenju vodene otopine standarda.
   2.4.5.   Specifični zahtjevi za atomsku apsorpcijsku spektrometriju s hidridnom generacijom
   
   Organski spojevi koji sadrže elemente kao što su arsen, bizmut, germanij, olovo, antimon, selen, kositar i telurij mogu biti vrlo stabilni i mogu zahtijevati oksidativnu razgradnju, kako bi se dobili točni rezultati o ukupnom udjelu elementa. Stoga se preporučuju mikrovalna razgradnja ili visokotlačno izgaranje pod jakim oksidacijskim uvjetima. Najveća se pažnja mora posvetiti potpunoj i reproducibilnoj konverziji elemenata u odgovarajuće hidride.
   Nastajanje arsen-hidrida u otopini klorovodične kiseline s NaBH4 ovisi o oksidacijskom stanju arsena (As III: brzo nastajanje, As V: dulje razdoblje nastajanja). Kako bi se izbjegao gubitak osjetljivosti u određivanju As V pomoću protočno-injekcijske tehnike, koji nastaje zbog kratkog vremena reakcije u tom sustavu, As V se mora reducirati na As III nakon oksidativne razgradnje. U tu su svrhu prikladni kalijev jodid/askorbinska kiselina ili cistein. Na isti način se mora postupati sa slijepim uzorcima, kalibracijskim otopinama i otopinama uzorka. Rad sa serijama omogućuje, ne dovodeći u pitanje točnost, određivanje obiju vrsta arsena. Zbog duljeg razdoblja nastajanja AS V-hidrida, kalibracija se vrši integracijom područja pikova. Instrument mora biti optimalno podešen. Protok plina, kojim se hidrid prenosi u atomizator, posebno je važan i mora se kontrolirati.
   2.4.6.   Specifični zahtjevi za atomsku apsorpcijsku spektrometriju metodom hladne pare
   
   Hladna se para upotrebljava jedino u slučaju žive. Zbog gubitaka elementarne žive uzrokovanih hlapljenjem i apsorpcijom, potrebna je posebna pozornost tijekom cijele analize. Mora se pozorno izbjegavati kontaminacija reagensom ili okolišem.
   Organski spojevi koji sadrže živu zahtijevaju oksidativnu razgradnju, kako bi se dobili točni podaci o ukupnom udjelu žive. Za razgradnju se koriste zatvoreni sustavi s mikrovalnom razgradnjom ili visokotlačnim izgaranjem. Oprema koja je došla u doticaj sa živom mora se posebno pomno očistiti.
   Uporaba protočno-injekcijske tehnike pruža određene prednosti. Za niže granice odlučivanja preporučuje se apsorpcija elementarne žive na adsorber od zlata/platine i potom toplinska disorpcija. Doticaj adsorbera ili stanice s vlagom narušava mjerenje i mora se izbjegavati.
   2.4.7.   Specifični zahtjevi za atomsku emisijsku spektrometriju s induktivno spregnutom plazmom (ICP-AES)
   
   Atomska emisijska spektrometrija s induktivno spregnutom plazmom (10) metoda je koja omogućuje istodobno mjerenje različitih elemenata. Da bi se primijenila metoda ISP-AES, uzorci se najprije moraju rastvoriti kako bi se razgradile organskog matriksa. U tu se svrhu primjenjuju zatvoreni sustavi mikrovalne razgradnje ili visokotlačnog izgaranja. Da bi ICP-AES analiza bila učinkovita, od ključne su važnosti kalibracija instrumenta i odabir elementa ili valne duljine. Za kalibraciju instrumenta, u slučaju linearnih kalibracijskih krivulja, obično je potrebno izmjeriti kalibracijsku otopinu od samo četiri koncentracije jer su kalibracijske krivulje kod ICP-AES metode uglavnom linearne duž četiriju do šest redova veličina koncentracije. Kalibracija ICP-AES sustava uglavnom se obavlja standardom koji vrijedi za više elemenata a koji se priprema u otopini koja sadrži istu koncentraciju kiseline kao i mjerna otopina. Što se tiče linerane krivulje, moraju se provjeriti koncentracije elemenata.
   Odabir valnih duljina za mjerenje emisije analita mora biti primjeren koncentracijama elemenata koji se određuju. Ako je koncentracija analita izvan djelatnog raspona jedne emisijske linije, mora se primijeniti druga emisijska linija. Najprije se bira najosjetljivija emisijska linija (bez smetnji), potom manje osjetljiva linija. Kod analize na granici detekcije, ili u blizini te granice, obično je najbolje odabrati najosjetljiviju liniju za dotični analit. Spektralne i pozadinske smetnje stvaraju najveće poteškoće kod ICP-AES metode. Moguće su smetnje, primjerice, jednostavni pozadinski pomak, kosi pozadinski pomak, izravno spektralno preklapanje i složeni pozadinski pomak. Svaka ta smetnja ima vlastiti uzrok i lijekove. Interferencije se ispravljaju a radni parametri optimiziraju, ovisno o matriksima. Neke se smetnje mogu izbjeći dilucijom ili adaptacijom matriksa. Sa svakom serijom analiziranih uzoraka za ispitivanje, na isti način kao i uzorci za ispitivanje, moraju se obraditi i referentni i obogaćeni materijal koji sadrži poznate količine jednog ili više analita. Za ispitivanje odstupanja standard se mora provjeravati nakon, primjerice, 10 uzoraka. Svi reagensi i plazmeni plin moraju biti najveće moguće čistoće.
   2.4.8.   Posebni zahtjevi za masenu spektrometriju s induktivno spregnutom plazmom (ICP-MS) (11)
   
   Određivanje elemenata u tragovima prosječne atomske mase, kao što su krom, bakar i nikal, može biti podložno jakim smetnjama od drugih iona izobarnih ili/i višeatomskih iona. To se može spriječiti jedino ako je snaga razlučivosti od najmanje 7 000-8 000. Poteškoće vezane za tehnike masene spektrometrije uključuju odstupanja instrumenta, učinke matriksa i interferencije molekularnih iona (m/z < 80). Da bi se ispravila odstupanja instrumenta i učinci matriksa, potrebno je odrediti više unutarnjih standarda koji pokrivaju isti maseni raspon kao i elementi koji se određuju.
   Prije mjerenja pomoću metode ICP-MS, nužna je potpuna razgradnja organskih tvari u uzorcima. Kao i kod atomske apsorpcijske spektrometrije (AAS), hlapivi elementi, npr. jod, moraju se nakon razgradnje u zatvorenim posudama prenijeti u stabilno oksidacijsko stanje. Najjače smetnje uzrokovane su kombinacijama molekuralnih iona argona (plazmeni plin), vodika, ugljika, dušika i kisika (kiseline za otapanje, nečistoća plazmenog plina i privučenih atmosferskih plinova) te matriksom uzorka. Kako bi se izbjegle interferencije, nužno je potpuna razgradnja, pozadinska mjerenja te odgovarajući odabir analitičkih masa ponekad povezanih s manjom brojnošću (slabija granica detekcije) i kiselina za otapanje, npr. dušične kiseline.
   Da bi se odredili elementi, interferencije se moraju isključiti odgovarajućim odabirom specifičnih analitičkih masa, uključujući potvrdu omjera izotopa. Za svako se mjerenje mora uz pomoć unutarnjeg standarda provjeriti odziv instrumenta u pogledu Fano faktora.
   3.   VALIDACIJA
   
   Validacija pokazuje da analitička metoda ispunjava kriterije koji se odnose na odgovarajuće značajke njene učinkovitosti.
   Različiti ciljevi kontrole zahtijevaju različite kategorije metoda. Sljedeća tablica pokazuje koje se značajke učinkovitosti provjeravaju za svaku vrstu metode.
   
      Tablica 9.
   
   
      Klasifikacija analitičkih metoda prema značajkama učinkovitosti koje se moraju odrediti
   
   
                
            
            
               Granica detekcije CCβ
            
            
               Granica odlučivanja CCα
            
            
               Istinitost/iskorištenje
            
            
               Preciznost
            
            
               Selektivnost/specifičnost
            
            
               Primjenljivost/robusnost/stabilnost
            
         
               Kvalitativne metode
            
            
               S
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               +
            
         
               C
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               +
            
         
               Kvantitativne metode
            
            
               S
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               +
            
         
               C
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               +
            
         
               S = orijentacijske metode; C = potvrdne metode; + = određivanje je obvezno
            
         3.1.   POSTUPCI VALIDACIJE
   U ovom su poglavlju navedeni primjeri i/ili naputci za postupke validacije analitičkih metoda. Mogu se primijeniti i drugi postupci kako bi se pokazalo da analitička metoda ispunjava kriterije učinkovitosti, uz uvjet da pružaju istu razinu i kakvoću informacija.
   Validacija se, također, može obaviti provođenjem međulaboratorijskog ispitivanja kao što to utvrđuje Codex Alimentarius, ISO ili IUPAC (12), ili pomoću alternativnih metoda kao što su ispitivanja u jednom laboratoriju, odnosno unutarnja validacija (13)(14). Ovaj se dio usredotočuje na studije unutar jednog laboratorija (unutarnja validaciju) uz modularni pristup. Taj se postupak sastoji od:
   
               1.
            
            
               skupa zajedničkih značajki učinkovitosti koje su neovisne o primijenjenom modelu validacije; i
            
         
               2.
            
            
               specifičnijih postupaka ovisnih o modelu, kao što je opisano u tablici 10.
            
         
      Tablica 10.
   
   
      Parametri učinkovitosti neovisni i ovisni o modelu
   
   
               Validacija
            
         
               Parametri učinkovitosti neovisni o modelu
            
            
               Parametri učinkovitosti ovisni o modelu
            
         
               Zajedničke značajke učinkovitosti (3.1.1.)
            
            
               Uobičajeni postupak validacije (3.1.2.)
            
            
               Unutarnjipostupak validacije (3.1.3.)
            
         
               Specifičnost
            
            
               Iskorištenje
            
            
               Iskorištenje
            
         
               Istinitost
            
            
               Ponovljivost
            
            
               Ponovljivost
            
         
               Robusnost: manje promjene
            
            
               Unutarlaboratorijska obnovljivost
            
            
               Unutarlaboratorijska obnovljivost
            
         
               Stabilnost
            
            
               Obnovljivost
            
            
               Obnovljivost
            
         
               Granica odlučivanja (CCα)
            
            
               Granica odlučivanja (CCα)
            
         
               Sposobnost detekcije (CCβ)
            
            
               Sposobnost detekcije (CCβ)
            
         
               Kalibracijske krivulje
            
            
               Kalibracijska krivulja
            
         
               Robusnost: veće promjene
            
            
               Robusnost
            
         3.1.1.   Značajke učinkovitosti neovisne o modelu
   
   Bez obzira koji se postupak validacije primjenjuje, moraju se utvrditi sljedeće značajke učinkovitosti. Da bi se smanjio opseg posla, može se primijeniti pažljivo osmišljeni i statistički utemeljeni postupak u kojem će se kombinirati pokusi obavljeni s ciljem određivanja različitih parametara.
   3.1.1.1.   Specifičnost
   
   Za analitičke je metode važna sposobnost razlučivanja između analita i njima srodnih tvari (izomera, metabolita, produkta degradacije, endogenih tvari, komponenti matriksa itd.). Nužno je provesti dva postupka kako bi se provjerile interferencije.
   Stoga se odabiru tvari koje bi mogle izazvati interferencije i analiziraju se slijepi uzorci kako bi se otkrilo postojanje mogućih interferencija i procijenio njihov učinak:
   
               —
            
            
               odaberite niz kemijski srodnih spojeva (metabolita, derivata itd.) ili drugih tvari koje bi mogle interferirati sa značajnim spojem koji je možda prisutan u uzorku;
            
         
               —
            
            
               analizirajte odgovarajući broj reprezentativnih slijepih uzoraka (n ≥ 20) i provjerite interferencije (signale, pikove, tragove iona) u značajnom području u kojemu očekujemo eluciju analita;
            
         
               —
            
            
               osim toga, reprezentativni slijepi uzorci obogaćuju se do relevantne koncentracije tvarima koje bi mogle ometati identifikaciju i/ili kvantifikaciju analita;
            
         
               —
            
            
               nakon analize, ispitajte:
               
                           —
                        
                        
                           bi li prisutnost mogla dovesti do pogrešne identifikacije,
                        
                     
                           —
                        
                        
                           otežava li prisutnost jedne ili više interferencija identifikaciju ciljnog analita, ili
                        
                     
                           —
                        
                        
                           postoji li značajni utjecaj na kvantifikaciju.
                        
                     
         3.1.1.2.   Istinitost
   
   U ovom se stavku opisuje određivanje istinitosti (jedne komponente točnosti). Istinitost se može utvrditi jedino pomoću potvrđenog referentnog materijala (CRM). Kad god je na raspolaganju potvrđeni referentni materijal, on se mora upotrijebiti. Postupak je detaljno opisan u ISO 5725-4 (5). U nastavku navodimo primjer:
   
               —
            
            
               analizirajte šest replika potvrđenog referentnog materijala u skladu s uputama za izvođenje pokusa koje vrijede za određenu metodu.
            
         
               —
            
            
               odredite koncentraciju analita koji je prisutan u svakom uzorku replika,
            
         
               —
            
            
               izračunajte srednju vrijednost, standardnu devijaciju i koeficijent varijacije (%) za te koncentracije,
            
         
               —
            
            
               izračunajte istinitost tako što ćete podijeliti detektiranu srednju vrijednosti s potvrđenom vrijednošću (mjerenom kao koncentracija) i pomnožite sa 100, kako biste rezultat izrazili u postotku.
            
         Istinitost (%) = srednja vrijednost detektirane koncentracije korigirana iskorištenjem × 100/potvrđena vrijednost
   Ako ne postoji potvrđeni referentni materijal, umjesto istinitosti može se odrediti iskorištenje, kao što je opisano pod točkom 4.1.2.1.
   3.1.1.3.   Primjenljivost/robusnost (manje promjene)
   
   Ove provjera podrazumijeva namjerno uvođenje manjih razumnih varijacija od strane laboratorija i promatranje njihovih posljedica.
   Prije samog ispitivanja mora se izvršiti odabir faktora koji sudjeluju u prethodnoj obradi, pročišćavanju i analizi uzoraka, a koji bi mogli utjecati na rezultate mjerenja. Ti faktori mogu uključivati analitičara, izvor i starost reagensa, otapala, standarde i ekstrakte uzoraka, brzinu zagrijavanja, temperaturu, pH vrijednost, kao i mnoge druge faktore koji se mogu javiti u laboratoriju. Ove bi faktore trebalo modificirati po redu veličine koji odgovara odstupanjima do kojih obično dolazi između laboratorija.
   
               —
            
            
               Odredite faktore koji bi mogli utjecati na rezultate
            
         
               —
            
            
               Neznatno promijenite svaki faktor
            
         
               —
            
            
               Ispitajte robusnost prema Youdenovoj metodi (15)(16). (U ovoj se fazi mogu primijeniti i druge potvrđene metode. Međutim, Youdenova metoda svodi potrebno vrijeme i napor na minimum). Youdenova metoda je frakcionirani faktorski model. Uzajamna djelovanja među različitim faktorima ne mogu se detektirati.
            
         
               —
            
            
               Ako se otkrije da neki faktor značajno utječe na rezultate mjerenja, provedite daljnje pokuse kako biste odredili granice prihvatljivosti tog faktora.
            
         
               —
            
            
               U protokolu izvođenja metode trebali bi biti jasno navedeni faktori koji značajno utječu a rezultate.
            
         Osnovna ideja nije u tomu da se ispituje jedna po jedna promjena, već da se odjednom uvede nekoliko promjena. Neka, za primjer, A, B, C, D, E, F, G označuju nominalne vrijednosti za sedam različitih faktora koji bi, u slučaju da se njihove nominalne vrijednosti neznatno promijene, mogli utjecati na rezultate. Označimo njihove alternativne vrijednosti odgovarajućim malim slovima a, b, c, d, e, f, g. Time dobivamo 27, odnosno 128 različitih kombinacija.
   Moguće je odabrati podskup od osam kombinacija kod kojih postoji ravnoteža između malih i velikih slova (Tablica 11.). Mora se odabrati osam kombinacija koje će sadržavati odabrane faktore (A-G). Rezultat odabranih kombinacija pokazan je u tablici 11. kao S-Z.
   
      Tablica 11.
   
   
      Plan pokusa za ispitivanja robusnosti (manje promjene)
   
   
               Vrijednost faktora F
            
            
               Kombinacije
            
         
               1
            
            
               2
            
            
               3
            
            
               4
            
            
               5
            
            
               6
            
            
               7
            
            
               8
            
         
               A/a
            
            
               A
            
            
               A
            
            
               A
            
            
               A
            
            
               a
            
            
               a
            
            
               a
            
            
               a
            
         
               B/b
            
            
               B
            
            
               B
            
            
               b
            
            
               b
            
            
               B
            
            
               B
            
            
               b
            
            
               b
            
         
               C/c
            
            
               C
            
            
               c
            
            
               C
            
            
               c
            
            
               C
            
            
               c
            
            
               C
            
            
               c
            
         
               D/D
            
            
               D
            
            
               D
            
            
               d
            
            
               d
            
            
               d
            
            
               d
            
            
               D
            
            
               D
            
         
               E/e
            
            
               E
            
            
               e
            
            
               E
            
            
               e
            
            
               e
            
            
               E
            
            
               e
            
            
               E
            
         
               F/f
            
            
               F
            
            
               f
            
            
               f
            
            
               F
            
            
               F
            
            
               f
            
            
               f
            
            
               F
            
         
               G/g
            
            
               G
            
            
               g
            
            
               g
            
            
               G
            
            
               g
            
            
               G
            
            
               G
            
            
               g
            
         
               Opaženi rezultat R
            
            
               S
            
            
               T
            
            
               U
            
            
               V
            
            
               W
            
            
               X
            
            
               Y
            
            
               Z
            
         
               Za izračunavanje vidjeti primjere ispitivanje robusnosti pod točkom 3.3.
            
         3.1.1.4.   Stabilnost
   
   Primijećeno je da nedovoljna stabilnost analita ili komponenti matriksa u uzroku tijekom pohrane ili analize mogu dovesti do značajnih odstupanja u konačnom rezultatu analize. Osim toga, trebalo bi provjeriti stabilnost kalibracijskog standarda u otopini. Stabilnost analita u različitim uvjetima pohrane obično je dobro poznata. Praćenje uvjeta pohrane sastavni je dio uobičajenog sustava ovlašćivanja laboratorija. Ako stabilnost nije poznata, može se odrediti prema primjerima navedenim dalje u tekstu.
   
      Stabilnost analita u otopini:
   
   
               —
            
            
               Pripremite svježe matične otopine jednog ili više analita i razrijedite ih prema uputama za testiranje, kako biste dobili dovoljno alikvota (npr. 40) svake odabrane koncentracije (otprilike oko najmanje zahtijevane granice učinkovitosti za tvari za koje nije utvrđena dozvoljena granica, odnosno oko dozvoljene granice za ostale tvari. Pripremite otopinu analita koji je upotrijebljen za obogaćivanje kao i onoga koji je upotrijebljen u konačnoj otopini za analizu, te bilo koju drugu značajnu otopinu (npr. derivatizirani standardi).
            
         
               —
            
            
               Izmjerite udio analita u svježe pripremljenoj otopini prema uputama za izvođenje pokusa.
            
         
               —
            
            
               Rasporedite odgovarajuće volumene u prikladne posude, označite i pohranite prema sljedećoj shemi:
               
                  Tablica 12.
               
               
                  Shema za određivanje stabilnosti analita u otopini
               
               
                            
                        
                        
                           – 20 °C
                        
                        
                           + 4 °C
                        
                        
                           + 20 °C
                        
                     
                           Tama
                        
                        
                           10 alikvota
                        
                        
                           10 alikvota
                        
                        
                           10 alikvota
                        
                     
                           Svjetlo
                        
                        
                            
                        
                        
                            
                        
                        
                           10 alikvota
                        
                     
         
               —
            
            
               Vrijeme pohrane može iznositi jedan, dva, tri i četiri tjedna, ili prema potrebi dulje, npr. dok se ne primijete prve pojave degradacije tijekom identifikacije i/ili kvantifikacije. Moraju se zabilježiti maksimalno vrijeme pohrane i optimalni uvjeti pohrane.
            
         
               —
            
            
               Koncentraciju analita u svakoj alikvoti treba izračunati uzimajući kao 100 %-tnu vrijednost otopinu koja je svježe napravljena u trenutku analize.
               
                  
               C1= trenutačna koncentracija
               Csvježa= koncentracija svježe otopine
            
         
      Stabilnost analita u matriksu
   
   
               —
            
            
               Kad god se može, treba upotrijebiti prirodno kontaminirane uzorke. Ako prirodno kontaminirani materijal nije na raspolaganju, treba upotrijebiti matriks obogaćenu analitom.
            
         
               —
            
            
               Ako je na raspolaganju prirodno kontaminirani materijal, koncentraciju u materijalu treba odrediti dok je materijal još svjež. Ostale alikvote materijala mogu se uzeti nakon 1, 2, 4 i 20 tjedana te treba izmjeriti koncentracije. Tkivo bi trebalo pohraniti na temperaturi od najmanje minus 20 °C ili, prema potrebi, nižoj.
            
         
               —
            
            
               Ako prirodno kontaminirani materijal nije na raspolaganju, uzmite materijal koji ne sadrži analit i homogenizirajte ga. Podijelite materijal u pet alikvota. Obogatite svaku alikvotu analitom, koji bi trebao biti pripremljen u maloj količini vodene otopine. Odmah analizirajte jednu alikvotu. Ostale alikvote pohranite na temperaturi od najmanje minus 20 °C ili, prema potrebi, nižoj, te ih analizirajte nakon 1, 2, 4 i 20 tjedana.
            
         3.1.1.5.   Kalibracijska krivulja
   
   Kad se kalibracijske krivulje primjenjuju u svrhu kvantifikacije:
   
               —
            
            
               pri njihovoj izradi treba upotrijebiti najmanje pet razina (uključujući nultu),
            
         
               —
            
            
               treba opisati operativni raspon krivulje,
            
         
               —
            
            
               treba opisati matematičku formulu krivulje i primjerenost podataka krivulji,
            
         
               —
            
            
               treba opisati raspone prihvatljivosti parametara krivulje.
            
         Ako je potrebna serijska kalibracija na temelju standardne otopine, treba naznačiti prihvatljive raspone parametara kalibracijske krivulje, koji mogu varirati od serije do serije.
   3.1.2.   Uobičajeni postupak validacije
   
   Izračunavanje parametara u skladu s uobičajenim metodama zahtjeva izvođenje nekoliko pojedinačnih pokusa. Mora se odrediti svaka značajka učinkovitosti za svaku veću promjenu (vidjeti gore pod točkom „Prihvatljivost/robusnost”). Metodama za ispitivanje više analita moguće je istodobno analizirati nekoliko analita, uz uvjet da su prethodno isključene interferencije koje bi mogle biti značajne. Na isti se način može odrediti nekoliko značajki učinkovitosti. Dakle, da bi se smanjila količina posla, preporučljivo je što više kombinirati pokuse (npr. ponovljivost i unutarlaboratorijsku obnovljivost sa specifičnošću, analizu slijepog uzorka kako bi se odredila granica osjetljivosti i ispitivanje osjetljivosti).
   3.1.2.1.   Iskorištenje
   
   Ako ne postoji potvrđeni referentni materijal, iskorištenje se mora odrediti pokusom, uporabom obogaćenog matriksa, primjenjujući, primjerice, sljedeće postupke:
   
               —
            
            
               odaberite 18 alikvota kontrolnog materijala i podijelite ih u tri grupe po šest alikvota, pa svaku grupu obogatite 1, 1,5 i 2 puta koliko iznosi minimalna potrebna granica učinkovitost, ili 0,5, 1 i 1,5 puta koliko iznosi dozvoljena granica.,
            
         
               —
            
            
               analizirajte uzorke i izračunajte koncentraciju u svakom uzorku,
            
         
               —
            
            
               uz pomoć donje jednadžbe izračunajte iskorištenje za svaki uzorak,
            
         
               —
            
            
               izračunajte srednju vrijednost iskorištenje i CV iz šest rezultata u svakoj grupi,
            
         
               —
            
            
               % iskorištenje i = 100 × izmjereni udio/razina obogaćenja.
            
         Uobičajena metoda za određivanje iskorištenja inačica je metode standardnog dodavanja koja je opisana pod točkom 3.5, ako:
   
               —
            
            
               se uzorak smatra kontrolnim uzorkom, umjesto uzorkom za analizu,
            
         
               —
            
            
               se smatra se da su konačni maseni udio (2) i iskorištenje (3) slični za oba poduzorka,
            
         
               —
            
            
               uzorci za ispitivanje imaju iste mase, a ekstrakti poduzoraka za analizu iste volumene,
            
         
               —
            
            
               količina kalibracijskog standarda koja je dodana drugom (obogaćenom) poduzorku za anlizu iznosi xADD. (xADD = ρΑ.VA),
            
         
               —
            
            
               x1 je izmjerena vrijednost za slijepi uzorak, a x2 izmjerena vrijednost drugog (obogaćenog) poduzorka,
            
         
               —
            
            
               dakle, Iskorištenje % = 100 (x2 – x1)/xADD.
               
            
         Ako bilo koji od gore navedenih uvjeta nije (ili se pretpostavlja da nije) ispunjen, onda se mora primijeniti cijeli postupak određivanja iskorištenja pomoću standardnog dodavanja, kao što je opisano pod točkom 3.5.
   3.1.2.2.   Ponovljivost
   
   
               —
            
            
               Pripremite određeni broj uzoraka identičnih matriksa, kojima je dodan analit tako da se dobiju koncentracije koje iznose 1, 1,5 i 2 puta, koliko iznosi najmanja zahtijevana granica učinkovitosti metode ili 0,5, 1 i 1,5 puta, koliko iznosi dozvoljena granica
            
         
               —
            
            
               Za svaku razinu koncentracije, analizu treba obaviti s najmanje šest replika.
            
         
               —
            
            
               Analizirajte uzorke.
            
         
               —
            
            
               Izračunajte koncentraciju detektiranu u svakom uzorku.
            
         
               —
            
            
               Pronađite srednju koncentraciju, standardnu devijaciju i koeficijent varijacije (%) obogaćenih uzoraka.
            
         
               —
            
            
               Ponovite ove korake još najmanje dva puta.
            
         
               —
            
            
               Izračunajte ukupne srednje koncentracije i koeficijente varijacije za obogaćene uzorke.
            
         3.1.2.3.   Unutarlaboratorijska obnovljivost (reproducibilnost)
   
   
               —
            
            
               Pripremite određeni broj uzoraka specificiranog ispitnog materijala (identičnih ili različitih matriksa), kojima je dodan analit, ili više analita, tako da se dobiju koncentracije koje iznose 1, 1,5 i 2 puta koliko iznosi najmanja zahtijevana granica učinkovitosti metode ili 0,5, 1 i 1,5 puta koliko iznosi dozvoljena granica.
            
         
               —
            
            
               Za svaku razinu koncentracije, analizu treba obaviti s najmanje šest replika.
            
         
               —
            
            
               Ponovite ove korake još najmanje dva puta, s različitim analitičarima i u različitim uvjetima okoliša, npr. različite serije reagensa, otapala itd., različite sobne temperature, različiti instrumenti itd., ako je moguće.
            
         
               —
            
            
               Analizirajte uzorke.
            
         
               —
            
            
               Izračunajte koncentraciju detektiranu u svakom uzorku.
            
         
               —
            
            
               Izračunajte srednju koncentraciju, standardnu devijaciju i koeficijent varijacije (%) obogaćenih uzoraka.
            
         3.1.2.4.   Obnovljivost (reproducibilnost)
   
   Ako se mora provjeriti obnovljivost (reproducibilnost), laboratoriji bi trebali sudjelovati u međulaboratorijskim poredbenim ispitivanjima prema ISO 5725-2 (5).
   3.1.2.5.   Granica odlučivanja (CCα)
   
   Granicu odlučivanja treba utvrditi prema zahtjevima za identifikaciju ili identifikaciju i kvantifikaciju kako je definirano pod u poglavlju „Kriteriji učinkovitosti i drugi zahtjevi za analitičke metode” (drugi dio).
   U slučaju tvari za koje nije utvrđena dozvoljena granica, CCα se može utvrditi:
   
               —
            
            
               postupkom kalibracijske krivulje prema ISO 11843 (17) (u tekstu: kritična vrijednost neto varijable stanja). U tom se slučaju koristi slijepi uzorak koji se obogaćuje na razinu najmanje zahtijevane granice učinkovitosti ili iznad nje, u jednakim razmacima. Analizirajte uzorke. Nakon identifikacije, grafički prikažite odnos signala i dodane koncentracije. Granica odlučivanja jednaka je pripadajućoj koncentraciji u točki sjecišta s ordinatom y plus 2,33 puta standardna devijacija unutarlaboratorijske obnovljivosti. Ovo je primjenljivo jedino za kvantitativna ispitivanja. (α = 1 %).
            
         
               —
            
            
               ili analizom najmanje 20 slijepih uzoraka po matriksu, kako bi izračunali omjer signal-šum u vremenskom intervalu u kojemu se očekuje analit. Kao granica odlučivanja može se uzeti trostruka vrijednost omjera signal-šum. Ovo je primjenljivo i za kvantitativna i kvalitativna ispitivanja.
            
         U slučaju tvari za koje je utvrđena dozvoljena granica, CCα se može utvrditi:
   
               —
            
            
               postupkom kalibracijske krivulje prema ISO 11843 (17) (u tekstu: kritična vrijednost neto varijable stanja). U tom se slučaju koristi slijepi uzorak koji se obogaćuje oko dozvoljene granice, u jednakim razmacima. Analizirajte uzorke. Nakon identifikacije, grafički prikažite odnos signala i dodane koncentracije. Granica odlučivanja jednaka je koncentraciji na dozvoljenoj granici plus 1,64 puta standardna devijacija unutarlaboratorijske obnovljivosti (α = 5 %).
            
         
               —
            
            
               ili analizom najmanje 20 slijepih uzoraka po matriksu, obogaćenih jednim ili više analita na razinu dozvoljene granice. CCα jednaka je koncentraciji na dozvoljenoj granici plus 1,64 puta odgovarajuća standardna devijacija (α = 5 %).
            
         Vidjeti i članak 5. i točku 3.2.
   3.1.2.6.   Sposobnost detekcije (CCβ)
   
   Sposobnost detekcije treba odrediti prema utvrđenim zahtjevima za orijentaciju, identifikaciju ili identifikaciju i kvantifikaciju (vidjeti drugi dio).
   U slučaju tvari za koje nije utvrđena dozvoljena granica, CCβ se može utvrditi:
   
               —
            
            
               postupkom kalibracijske krivulje prema ISO 11843 (17) (u tekstu: najmanja vrijednost neto varijable stanja koja se može detektirati). U tom slučaju, koristi se reprezentativni slijepi uzorak koji je obogaćen na razinu najmanje zahtijevane granice učinkovitosti, ili ispod nje, u jednakim razmacima. Analizirajte uzorke. Nakon identifikacije, grafički prikažite odnos signala i dodane koncentracije. Sposobnost detekcije jednaka je odgovarajućoj koncentraciji na CCα plus 1,64 puta standardna devijacija unutarlaboratorijske obnovljivosti za srednji udio izmjeren na granici odlučivanja (β = 5 %).
            
         
               —
            
            
               analizom najmanje 20 slijepih uzoraka po matriksu obogaćenih jednim ili više analita na razinu CCα. Analizirajte uzorke i identificirajte analite. Sposobnost detekcije jednaka je vrijednosti CCαplus 1,64 puta standardna devijacija unutarlaboratorijske obnovljivosti za izmjereni udio (β = 5 %).
            
         
               —
            
            
               ako ne postoje kvantitativni rezultati, sposobnost detekcije se može odrediti ispitivanjem slijepog uzorka koji je obogaćen koncentracijom na CCα, ili iznad nje. U tom je slučaju sposobnost detekcije metode jednaka razini koncentracije kod koje ostaje samo ≤ 5 % lažno negativnih rezultata. Stoga je potrebno obaviti najmanje 20 ispitivanja za najmanje jednu razinu koncentracije, kako bi se osigurala pouzdana osnova za ovo određivanje.
            
         U slučaju tvari za koje je utvrđena dozvoljena granica, CCβ se može utvrditi:
   
               —
            
            
               postupkom kalibracijske krivulje prema ISO 11843 (17) (u tekstu: najmanja vrijednost neto varijable stanja koja se može detektirati). U tom slučaju, koristi se reprezentativni slijepi uzorak koji se obogaćuje oko dozvoljene granice, u jednakim razmacima. Analizirajte uzorke i identificirajte analit ili analite. Izračunajte standardnu devijaciju srednjeg udjela izmjerenog na razini CCα. Sposobnost detekcije jednaka je odgovarajućoj koncentraciji na razini CCα plus 1,64 puta standardna devijacija unutarlaboratorijske obnovljivosti (β = 5 %),
            
         
               —
            
            
               ili analizom najmanje 20 slijepih uzoraka po matriksu, obogaćenih jednim ili više analita na razinu CCα. Sposobnost detekcije jednaka je vrijednosti CCα plus 1,64 puta odgovarajuća standardna devijacija (β = 5 %).
            
         Vidjeti, također, odjeljak 3.2.
   3.1.2.7.   Robusnost (značajne promjene)
   
   Analitičku metodu bi trebalo ispitati pod različitim eksperimentalnim uvjetima, koji uključuju, primjerice, različite vrste, različite matrikse ili različite uvjete uzorkovanja. Uvedene promjene moraju biti značajne. Značaj tih promjena može se procijeniti, primjerice, Youdenovom metodom (15)(16). Za sve veće promjene za koje se pokazalo da značajno utječu na učinkovitost ispitivanja, trebalo bi odrediti svaku značajku učinkovitosti.
   3.1.3.   Validacija prema alternativnim modelima
   
   Ako se primjenjuju alternativni postupci validacije, u protokolu izvođenja validacije potrebno je utvrditi temeljni model i strategiju s odgovarajućim preduvjetima, pretpostavkama i formulama, ili barem na njih uputiti. U daljnjem se tekstu navodi primjer alternativne metode. Primjenjuje li se, primjerice, model unutarnje validacije, značajke učinkovitosti se utvrđuju na način koji omogućuje validaciju za značajne promjene unutar istog postupka validacije. To zahtijeva izradu plana testiranja u svrhu validacije.
   3.1.3.1.   Plan testiranja
   
   Plan testiranja mora biti napravljen tako da uzme u obzir broj različitih životinjskih vrsta i različitih čimbenika koji se ispituju. Stoga se kao prvi korak u cijelom postupku validacije razmatraju populacijski uzorci koji će se u budućnosti analizirati u laboratoriju, kako bi se odabrale najvažnije vrste i oni čimbenici koji bi mogli utjecati na rezultate mjerenja. Nakon toga se odabire raspon koncentracije koji je prilagođen svrsi, u skladu s razinom značajnosti.
   
      Primjer:
   
   
               —
            
            
               Pomoću metode koja se validira moguće je istodobno ispitati nekoliko analita,
            
         
               —
            
            
               utvrđene su dvije varijacije vodećeg čimbenika (A i B). Vodeći čimbenici su osnova na kojoj se kombiniraju razine čimbenika. Ti vodeći čimbenici mogu uključivati čimbenike kao što su vrsta ili matriks. U ovom je primjeru vodeći čimbenik promijenjen na dvije razine, tj. razmatrane su dvije različite vrste (A i B). Općenito, moguće je promijeniti vodeće čimbenike na više od dvije razine, čime se samo povećava broj analiza koje treba obaviti.
            
         
               —
            
            
               odabrane čimbenike treba promijeniti na dvije razine (označene kao + ili –).
            
         
      Tablica 13.
   
   
      Primjeri čimbenika koji se smatraju značajnima za postupak validacije
   
   
               Spol životinje
            
            
               (čimbenik 1)
            
         
               Pasmina
            
            
               (čimbenik 2)
            
         
               Uvjeti transporta
            
            
               (čimbenik 3)
            
         
               Uvjeti čuvanja/skladištenja
            
            
               (čimbenik 4)
            
         
               Svježina uzorka
            
            
               (čimbenik 5)
            
         
               Uvjeti tova
            
            
               (čimbenik 6)
            
         
               Različiti operatori s različitim iskustvom
            
            
               (čimbenik 7)
            
         
      
   
      Tablica 14.
   
   
      Mogući plan testiranja za gornji primjer
   
   
               Vrsta
            
            
               Čimbenik 1
            
            
               Čimbenik 2
            
            
               Čimbenik 3
            
            
               Čimbenik 4
            
            
               Čimbenik 5
            
            
               Čimbenik 6
            
            
               Čimbenik 7
            
            
               Uzorak br.
            
         
               A
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               1
            
         
               A
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               2
            
         
               A
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               3
            
         
               A
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               4
            
         
               A
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               5
            
         
               A
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               6
            
         
               A
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               7
            
         
               A
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               8
            
         
               B
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               9
            
         
               B
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               10
            
         
               B
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               11
            
         
               B
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               12
            
         
               B
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               13
            
         
               B
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               14
            
         
               B
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               +
            
            
               15
            
         
               B
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               –
            
            
               +
            
            
               16
            
         S obzirom da se svaki uzorak (svaka kombinacija razine čimbenika) mora obogatiti s četiri različite koncentracije oko razine značajnosti, a za svaku razinu se mora analizirati jedan slijepi uzorak, za cijeli postupak validacije mora se obaviti 5 × 16 = 80 analiza.
   Na temelju ovih 80 mjernih rezultata moguće je izračunati sljedeće (13)(14):
   Iskorištenje
   
               —
            
            
               ponovljivost po razini koncentracije (Sir),
            
         
               —
            
            
               unutarlaboratorijska obnovljivost po razini koncentracije (Sir),
            
         
               —
            
            
               granica odlučivanja (CCα),
            
         
               —
            
            
               sposobnost detekcije (CCβ),
            
         
               —
            
            
               krivulja djelotvornosti (postotak β-pogreške u odnosu na koncentraciju (vidjeti 3.1.3.2.)
            
         
               —
            
            
               robusnost u odnosu na značajne promjene; robusnost u odnosu na manje promjene može se odrediti prema stavku 3.1.1.3.,
            
         
               —
            
            
               16 kalibracijskih krivulja vezanih za uzorke,
            
         
               —
            
            
               jedna ukupna kalibracijska krivulja,
            
         
               —
            
            
               interval očekivanja sveobuhvatne kalibracijske krivulje
            
         
               —
            
            
               devijacije uzrokovane matriksom (Smat),
            
         
               —
            
            
               devijacije uzrokovane procesom analize (Srun).
            
         
               —
            
            
               utjecaj pojedinačnih čimbenika na mjerne rezultate.
            
         Ove značajke učinkovitosti omogućuju iscrpnu ocjenu učinkovitosti metode, s obzirom da se ne ispituje utjecaj samo pojedinačnih čimbenika, nego i odgovarajuća kombinacija tih čimbenika. Uz pomoć ovakvog plana testiranja moguće je odrediti hoće li se neki od odabranih čimbenika isključiti iz ukupne kalibracijske krivulje zbog značajnog odstupanja od standardnih devijacija ostalih čimbenika.
   3.1.3.2.   Krivulja djelotvornosti
   
   Krivulja djelotvornosti pruža informacije o sposobnosti detekcije metode unutar odabranog raspona koncentracije. Upućuje na rizik od β-pogreške pri primjeni ispitivane metode. Krivulja djelotvornosti omogućuje izračun sposobnosti detekcije za odgovarajuće kategorije metoda (orijentacijska, potvrdna) ili tipove metoda (kvalitativna ili kvantitativna) za određenu β-pogrešku (npr. 5 %).
   Slika 1.
   Krivulja djelotvornosti
   
      
   3.1.3.3.   Obnovljivost
   
   Utvrđivanje obnovljivosti metode putem unutarlaboratorijskog ispitivanja (unutarnja validacija) zahtjeva opetovana sudjelovanja u provjerama kvalitete rada laboratorija u skladu s ISO uputama 43-1 (3) i 43-2 (4). Laboratoriji mogu primjenjivati metode po vlastitom izboru, uz uvjet da se te metode primjenjuju pod rutinskim uvjetima. Standardna devijacija laboratorija može se upotrijebiti za ocjenu obnovljivosti metode.
   3.2   GRAFIČKI PRIKAZ RAZLIČITIH ANALITIČKIH GRANICA
   Slika 2.
   Tvari za koje nije utvrđena dozvoljena granica
   
      
   Slika 3.
   Tvari za koje je utvrđena dozvoljena granica
   
      
   3.3.   PRIMJER IZRAČUNA KOD ISPITIVANJA ROBUSNOSTI U ODNOSU NA MANJE PROMJENE PREMA YOUDENOVOJ METODI (16)
   
      Usporedba prosjeka (A)
   
   
               AA= Σ(Ai)/4
               AB= Σ(Bi)/4
               AC= Σ(Ci)/4
               AD= Σ(Di)/4
               AE= Σ(Ei)/4
               AF= Σ(Fi)/4
               AG= Σ(Gi)/4
               Aa= Σ(ai)/4
               Ab= Σ(bi)/4
               Ac= Σ(ci)/4
               Ad= Σ(di)/4
               Ae= Σ(ei)/4
               Af= Σ(fi)/4
               Ag= Σ(gi)/4
            
            
               Usporedite prosjeke velikih slova (AA do AG) s prosjecima njima pripadajućih malih slova (Aa do Ag). Ako čimbenik ima neki učinak, razlika će biti značajno veća nego razlika kod drugih čimbenika.
               Razlike/varijacije koje skoro sigurno postoje između laboratorija ne bi smjele utjecati na robusnu metodu.
               Ako nema značajne razlike, sedam razlika su najrealnija mjera slučajne pogreške.
            
         
      
   
               Razlike (Di)
            
            
               Kvadrati razlika (Di
                  2)
            
         
               Da= A – a = Σ(Ai) – Σ(ai)
               Db= B – b = Σ(Bi) – Σ(bi)
               Dc= C – c = Σ(Ci) – Σ(ci)
               Dd= D – d = Σ(Di) – Σ(di)
               De= E – e = Σ(Ei) – Σ(ei)
               Df= F – f = Σ(Fi) – Σ(fi)
               Dg= G – g = Σ(Gi) – Σ(gi)
            
            
               Da
                  2= vrijednost a
               Db
                  2= vrijednost b
               Dc
                  2= vrijednost b
               Dd
                  2= vrijednost b
               De
                  2= vrijednost b
               Df
                  2= vrijednost b
               Dg
                  2= vrijednost b
            
         
      Standardna devijacija razlika Di (SDi)
   
   
      
   Ako je vrijednost SDi značajno veća od standardne devijacije metode izvedene pod unutarlaboratorijskim uvjetima obnovljivosti (vidjeti gore), neizbježan je zaključak da svi čimbenici zajedno utječu na rezultat, čak i ako svaki pojedini čimbenik ne pokazuje značajni utjecaj, te da metoda nije dovoljno robusna u odnosu na odabrane modifikacije.
   3.4.   PRIMJER IZRAČUNA ZA UNUTARNJI POSTUPAK VALIDACIJE
   Primjeri i izračuni za protokol unutarnje validacije kako su opisani u poglavlju o validaciji prema alternativnim modelima (3.1.3.) (13) (14).
   3.5.   PRIMJERI ZA METODU STANDARDNOG DODAVANJA
   Uzorak za ispitivanje s T udjelom analita podijeli se na dva poduzorka 1 i 2, čije su mase m1, odnosno m2. Poduzorku 2 doda se Volumen VA otopine koncentracije analita ρΑ. Postupcima ekstrakcije i pročišćavanja koji su propisani metodom, dobivena se dva ekstrakta poduzoraka, volumena V1 odnosno V2. Pretpostavlja se da je iskorištenje analita rc. Oba se ekstrakta ispituju metodom mjerenja osjetljivosti b i daju analitički odgovor x1, odnosno x2.
   Ako se pretpostavi da su rc i b isti za analit u izvornom uzorku i u obogaćenom uzorku, onda se udio T može izračunati kao:
   
      
   Ovom se metodom može odrediti iskorištenje rc. Potom, osim gore opisanog pokusa, dijelu ekstrakta poduzorka 1 (volumena V3) dodaje se poznata količina ρΒ.VB analita te se testira. Analitička reakcija je x1, a iskorištenje je:
   
      
   Osim toga, može se izračunati osjetljivost b, kao:
   
      
   Opisani su svi uvjeti primjene i detalji (18).
   4.   KRATICE
   
   
               AAS
            
            
               atomska apsorpcijska spektrometrija
            
         
               AES
            
            
               atomska emisijska spektrometrija
            
         
               AOAC-I
            
            
               Međunarodno udruženje službenih analitičkih kemičara
            
         
               B
            
            
               vezana frakcija (imunotest)
            
         
               CI
            
            
               kemijska ionizacija
            
         
               CRM
            
            
               potvrđeni referentni materijal
            
         
               CV
            
            
               koeficijent varijacije
            
         
               2D
            
            
               dvodimenzionalni
            
         
               DAD
            
            
               detekcija nizom dioda
            
         
               DPASV
            
            
               diferencijalna pulsna voltametrija s anodnim otapanjem
            
         
               ECD
            
            
               detekcija elektronskog zahvata
            
         
               EI
            
            
               elektronska ionizacija
            
         
               GC
            
            
               plinska kromatografija
            
         
               HPLC
            
            
               tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti
            
         
               HPTLC
            
            
               tankoslojna kromatografija visoke djelotvornosti
            
         
               HRMS
            
            
               (masena spektrometrija) visoke razlučivosti
            
         
               ICP-AES
            
            
               atomska emisijska spektrometrija s induktivno spregnutom plazmom
            
         
               ICP-MS
            
            
               masena spektrometrija s induktivno spregnutom plazmom
            
         
               IR
            
            
               infracrveni
            
         
               ISO
            
            
               Međunarodna organizacija za norme (Interntional Standard Organisation)
            
         
               LC
            
            
               tekućinska kromatografija
            
         
               LR(MS)
            
            
               (masena spektrometrija) niske razlučivosti
            
         
               MRPL
            
            
               najmanja zahtijevana granica učinkovitosti metode
            
         
               MS
            
            
               masena spektrometrija
            
         
               m/z
            
            
               omjer masa/naboj
            
         
               RF
            
            
               relativna migracija prema fronti otapala (TLC)
            
         
               RSDL
            
            
               relativna standardna devijacija laboratorija
            
         
               SIM
            
            
               praćenje odabranih iona
            
         
               TLC
            
            
               tankoslojna kromatografija
            
         
               UV
            
            
               ultraljubičasto zračenje
            
         
               VIC
            
            
               vidljivo zračenje
            
         5.   LITERATURA
   
   
               (1)
            
            
               ISO 17025: 1999 General requirement for the competence of calibration and testing laboratories.
            
         
               (2)
            
            
               ISO 3534-1: 1993 Statistical Methods for quality control — Vol. 1 vocabulary and symbols.
            
         
               (3)
            
            
               ISO Guide 43-1: 1997 Proficiency testing by interlaboratory comparisons — Part 1: Development and operation of proficiency testing schemes.
            
         
               (4)
            
            
               ISO Guide 43-2: 1997 Proficiency testing by interlaboratory comparisons — Part 2: Selection and use of proficiency testing schemes by laboratory accreditation bodies.
            
         
               (5)
            
            
               ISO 5725: 1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results — Part 1: General principles and definitions; ISO 5725-2 Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method; Part 4: Basic methods for the determination of the trueness of a standard measurement method.
            
         
               (6)
            
            
               ISO 78-2: 1999 Chemistry — Layouts for standards — Part 2: Methods of chemical analysis.
            
         
               (7)
            
            
               W.G. de Ruig, J. M Weseman „A new approach to confirmation by infrared spectrometry”, J. Chemometrics 4 (1990) 61-77.
            
         
               (8)
            
            
               Vezi, de exemplu, May, T.W., Brumbaugh, W.G., 1982, Matrix modifier and L’vov platform for elimination of matrix interferences in the analysis of fish tissues for lead by graphite furnace atomic absorption spectrometry, Analytical Chemistry 54(7): 1032-1037 (90353).
            
         
               (9)
            
            
               Applications of Zeeman Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry in the Chemical Laboratory and in Toxicology, C. Minoia, S. Caroli (ed.), Pergamon Press (Oxford), 1992, p. xxvi + 675.
            
         
               (10)
            
            
               Inductively Coupled Plasmas in Analytical Atomic Spectrometry, A. Montaser, D. W. Golighty (ed.), VCH Publishers, Inc. (New York), 1992.
            
         
               (11)
            
            
               Plasma Source Mass Spectrometry Developments and Applications, G. Holland, S. D. Tanner (ed.), The Royal Society of Chemistry, 1997, p. 329.
            
         
               (12)
            
            
               IUPAC (1995), Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies, Pure & Applied Chem, 67, 331.
            
         
               (13)
            
            
               Jülicher, B., Gowik, P. and Uhlig, S. (1998) Assessment of detection methods in trace analysis by means of a statistically based in-house validation concept. Analyst, 120, 173.
            
         
               (14)
            
            
               Gowik, P., Jülicher, B. and Uhlig, S. (1998) Multi-residue method for non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma using high performance liquid chromatography-photodiode-array detection. Method description and comprehensive in-house validation. J. Chromatogr., 716, 221.
            
         
               (15)
            
            
               OAC-I Peer Verified Methods, Policies and Procedures, 1993, AOAC International, 2200 Wilson Blvd., Suite 400, Arlington, Virginia 22201-3301, USA.
            
         
               (16)
            
            
               W.J. Youden; Steiner, E.H.; „Statistical Manual of the AOAC–Association of Official Analytical Chemists”, AOAC-I, Washington DC: 1975, p. 35 și următoarele.
            
         
               (17)
            
            
               ISO 11843: 1997 Capability of detection — Part 1: Terms and definitions, Part 2: Methodology in the linear calibration case.
            
         
               (18)
            
            
               R.W. Stephany & L.A. van Ginkel:„Yield or recovery: a world of difference”. Proceedings 8th Euro Food Chem, Vienna, Austria September 18-20 (1995) Federation of European Chemical Societies, Event 206. ISBN 3-900554-17X, p. 2-9.
            
         
               (19)
            
            
               Directiva 71/354/CEE din 17 octombrie 1971 de apropiere a legislațiilor statelor membre privind unitățile de măsură (JO L 243, 29.10.1971, p. 29).
            
         
               (20)
            
            
               ISO 31-0: 1992 Quantities and units — Part 0: General principles.
            
         
      (1)  Za masene udjele niže od 100 μ/kg Horwitzova jednadžba daje neprihvatljivo visoke vrijednosti. Stoga CV za koncentracije niže od 100 μ/kg moraju biti što je moguće niži.
   
      (2)  Konačni maseni udio (yield): maseni udio analita iz uzorka prisutan u konačnom ekstraktu.
   
      (3)  Iskorištenje (ovdje): maseni udio analita dodan uzorku, prisutan u konačnom ekstraktu. U ostatku ovog dokumenta pretpostavlja se da su konačni maseni udio i iskorištenje isti, pa se stoga upotrebljava jedino izraz „iskorištenje”.