CELEX: 31976L0372
Language: da
Date: 1976-03-01 00:00:00
Title: Kommissionens syvende direktiv 76/372/EØF af 1. marts 1976 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer

Avis juridique important

|

31976L0372

Kommissionens syvende direktiv 76/372/EØF af 1. marts 1976 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer  

EF-Tidende nr. L 102 af 15/04/1976 s. 0008 - 0018 den finske specialudgave: kapitel 3 bind 7 s. 0048  den græske specialudgave: Kapitel 03 bind 15 s. 0031  den svenske specialudgave: kapitel 3 bind 7 s. 0048  den spanske specialudgave: Kapitel 03 bind 10 s. 0044  den portugisiske specialudgave: Kapitel 03 bind 10 s. 0044 

++++  KOMMISSIONENS SYVENDE DIREKTIV  af 1 . marts 1976  om fastsaettelse af faellesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer   ( 76/372/EOEF )  KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -  under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europaeiske oekonomiske Faellesskab ,  under henvisning til Raadets direktiv af 20 . juli 1970 om indfoerelse af faellesskabsproeveudtagningsmaader og -analysemetoder for saa vidt angaar den officielle kontrol med foderstoffer ( 1 ) , senest aendret ved tiltraedelsesakten ( 2 ) , saerlig artikel 2 , og  ud fra foelgende betragtninger :  Ved ovennaevnte direktiv er det fastsat , at den officielle kontrol med foderstoffer til konstatering af , om de betingelser , der er fastsat paa grundlag af administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser om foderstoffernes beskaffenhed og sammensaetning , er opfyldt , skal foretages efter faellesskabsproeveudtagningsmaader og -analysemetoder ;  der er allerede ved Kommissionens direktiver 71/250/EOEF af 15 . juni 1971 ( 3 ) , 71/393/EOEF af 18 . november 1971 ( 4 ) , 72/199/EOEF af 27 . april 1972 ( 5 ) , 73/46/EOEF af 5 . december 1972 ( 6 ) , 74/203/EOEF af 25 . marts 1974 ( 7 ) og 75/84/EOEF af 20 . december 1974 ( 8 ) fastsat en raekke faellesskabsanalysemetoder ; i betragtning af den hastighed , hvormed arbejdet siden da er skredet frem , boer der fastsaettes en syvende serie af metoder ;  de i dette direktiv fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den staaende Foderstofkomité -  UDSTEDT FOELGENDE DIREKTIV :  Artikel 1  Medlemsstaterne foreskriver , at analyserne i forbindelse med den officielle kontrol af foderstoffer for saa vidt angaar deres indhold af Aflatoxin B1 skal foretages efter de metoder , der er beskrevet i bilaget til dette direktiv .  De almindelige bestemmelser i foerste del ( indledning ) af bilaget til Kommissionens foerste direktiv 71/250/EOEF af 15 . juni 1971 , finder med undtagelse af den del , der vedroerer tilberedelsen af analyseproeven , anvendelse paa de metoder , der er beskrevet i bilaget til dette direktiv .  Artikel 2  Medlemsstaterne saetter senest den 1 . oktober 1976 de noedvendige administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser i kraft for at efterkomme bestemmelserne i dette direktiv . De underretter omgaaende Kommissionen herom .  Artikel 3  Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne .  Udfaerdiget i Bruxelles , den 1 . marts 1976 .  Paa Kommissionens vegne  P . J . LARDINOIS  Medlem af Kommissionen  ( 1 ) EFT nr . L 170 af 3 . 8 . 1970 , s . 2 .  ( 2 ) EFT nr . L 73 af 27 . 3 . 1972 , s . 14 .  ( 3 ) EFT nr . L 155 af 12 . 7 . 1971 , s . 13 .  ( 4 ) EFT nr . L 279 af 20 . 12 . 1971 , s . 7 .  ( 5 ) EFT nr . L 123 af 29 . 5 . 1972 , s . 6 .  ( 6 ) EFT nr . L 83 af 30 . 3 . 1973 , s . 21 .  ( 7 ) EFT nr . L 108 af 22 . 4 . 1974 , s . 7 .  ( 8 ) EFT nr . L 32 af 5 . 2 . 1975 , s . 26 .  BILAG  BESTEMMELSE AF AFLATOXIN B1  A . FREMGANGSMAADE VED ENDIMENSIONAL TYNDTLAGSKROMATOGRAFI  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden goer det muligt at bestemme indholdet af aflatoxin B1 i foelgende foderstoffer : jordnoedkage/skraa , kokoskage/skraa , hoerfroekage/skraa , sesamkage , babass * kage og majskimkage , korn og kornprodukter , formalede aerter , kartoffelpulp og -stivelse , tapiokamel og toerret sukkerroeaffald . Den mindste maengde der kan bestemmes , er 0,01 mg/kg ( 10 ppm ) .  Ved tilstedevaerelse af interfererende stoffer , som forstyrrer bestemmelserne , maa analysen udfoeres efter fremgangsmaaden under B ( ved todimensional tyndtlagskromatografi ) .  2 . Princip  Proeven ekstraheres med chloroform . Ekstrakten filtreres og en alikvot del af ekstrakten renses ved soejlekromatografi paa kiselgel . Eluatet inddampes , og inddampningsresten oploeses i en bestemt maengde chloroform eller i en blanding af benzen og acetonitril . En alikvot del af denne oploesning tyndtlagskromatograferes . Maengden af aflatoxin B1 bestemmes under UV bestraaling af kromatogrammet , enten visuelt eller ved fluorodensitometri , ved sammenligning med kendte maengder af aflatoxin B1 standard , Identiteten af det ekstraherede aflatoxin B1 i foderstoffet skal bekraeftes ved hjaelp af de anfoerte fremgangsmaader .  3 . Reagenser  NB . : Alle reagenserne skal vaere af " analyse " kvalitet , medmindre andet er angivet .  3.1 . Acetone .  3.2 . Chloroform , stabiliseret med 0,5 til 1,0 % 96 % ethanol ( v/v ) .  3.3 . n-Hexan .  3.4 . Methanol .  3.5 . Vandfri diethylether , peroxidfrit .  3.6 . Blanding af benzen og acetonitril : 98/2 ( v/v ) .  3.7 . Blanding af chloroform ( 3.2 ) og methanol  ( 3.4 ) : 97/3 ( v/v ) .  3.8 . Kiselgel til soejlekromatografi kornstoerrelse : 0,05 til 0,20 mm .  3.9 . Hygroskopisk bomuld , forinden affedtet med chloroform , eller glasuld .  3.10 . Natriumsulfat , vandfrit , granuleret .  3.11 . Inaktiv luftart , f.eks . kvaelstof .  3.12 . 1 N saltsyre .  3.13 . 50 % ( v/v ) svovlsyre .  3.14 . Diatoméjord ( Hyflosupercel ) , vasket i syre .  3.15 . Kiselgel G-HR eller tilsvarende til tyndtlagskromatografi .  3.16 . Standardoploesning af ca . 0,1 mg aflatoxin B1 pr . ml . i chloroform ( 3.2 ) eller i benzen acetonitril-blandingen ( 3.6 ) , tilberedt og kontrolleret som angivet under punkt 7 .  3.17 . Kvalitativ standardoploesning af ca . 0,1 mg aflatoxin B1 og B2 pr . ml i chloroform  ( 3.2 ) eller i benzen/acetonitril-blandingen  ( 3.6 ) . Disse koncentrationer er kun vejledende . De skal afpasses , saa der opnaas den samme fluorescensintensitet for begge aflatoxinerne .  3.18 . Udviklingsvaesker :  3.18.1 . Chloroform ( 3.2 ) /acetone ( 3.1 ) : 9/1 ( v/v ) , umaettet kar ;  3.18.2 . Diethylether ( 3.5 ) /methanol ( 3.4 ) /vand : 96/3/1 ( v/v ) , umaettet kar ,  3.18.3 . Diethylether ( 3.5 ) /methanol ( 3.4 ) /vand : 94/4,5/1,5 ( v/v ) , maettet kar ;  3.18.4 . Chloroform ( 3.2 ) /methanol ( 3.4 ) : 94/6 ( v/v ) , maettet kar ;  3.18.5 . Chloroform ( 3.2 ) /methanol ( 3.4 ) : 97/3 ( v/v ) , maettet kar .  4 . Apparatur  4.1 . Kvaern .  4.2 . Rysteapparat eller magnetomroerer .  4.3 . Foldefiltre , Schleicher og Schuell nr . 588 eller tilsvarende , diameter : 24 cm .  4.4 . Kromatografisoejle af glas ( indvendig diameter : 22 mm , laengde : 300 mm ) , med teflonhane og 250 ml beholder .  4.5 . Rotationsfordamper med 500 ml rundbundet kolbe .  4.6 . 500 ml koniske kolber med slib og glasprop .  4.7 . Tyndtlagskromatografiudstyr .  4.8 . Glasplader til tyndtlagskromatografi , 200 gange 200 mm , behandlet som beskrevet nedenfor ( de angivne maengder er passende til at daekke fem plader ) : 30 g G-HR kiselgel ( 3.15 ) haeldes i en konisk kolbe ; der tilsaettes 60 ml destilleret vand , saettes prop i og rystes i et minut . Suspensionen stryges ud paa pladerne , saa der fremkommer et ensartet lag paa 0,25 mm's tykkelse . Pladerne toerres i luften og opbevares dernaest i en ekssikkator , forsynet med kiselgel . Pladerne aktiveres paa anvendelsestidspunktet ved anbringelse i et varmeskab ved 110 * C i en time . Fabriksfremstillede faerdigplader er egnede i det omfang de giver lignende resultater som de plader , der er behandlet paa den ovenfor beskrevne maade .  4.9 . Lang-boelget UV-lampe ( 360 nm ) . Fluorecensintensiteten skal goere det muligt helt klart at skelne en plet paa 1,0 ng aflatoxin B1 paa en plade til tyndtlagskromatografi i en afstand af 10 cm fra lampen .  4.10 . 10 ml maaleglas med polyethylenpropper .  4.11 . UV-spektrofotometer .  4.12 . Fluorodensitometer ( eventuelt ) .  5 . Fremgangsmaade  5.1 . Tilberedning af proeven ( se bemaerkninger , afsnit C , punkt 1 ) .  Proeven findeles saaledes , at den kan passere igennem en sigte med en maskevidde paa 1 mm ( som anbefalet af ISO E 565 ) .  5.2 . Ekstraktion  50,0 g af den findelte og homogeniserede proeve overfoeres til en 500 ml konisk kolbe  ( 4.6 ) . 25 g diatoméjord ( 3.14 ) , 25 ml vand og 250 ml chloroform ( 3.2 ) tilsaettes .  Kolben tilproppes og rystes eller omroeres i 30 minutter ved hjaelp af apparaturet ( 4.2 ) og indholdet filtreres gennem et foldefilter ( 4.3 ) . De foerste 10 ml af filtratet kasseres , dernaest opsamles 50 ml .  5.3 . Oprensning paa soejle  Bunden af et kromatografiroer ( 4.4 ) forsynes med en prop af vat eller glasuld ( 3.9 ) , roeret fyldes to tredjedele op med chloroform ( 3.2 ) , og der tilsaettes 5 g natriumsulfat ( 3.10 ) .  Soerg for , at natriumsulfatlagets oevre overflade er plan , tilsaet dernaest 10 g kiselgel  ( 3.8 ) i smaa portioner . Efter hver tilsaetning roeres omhyggeligt for at fjerne luftblaerer . Efter henstand i 15 minutter , tilsaettes forsigtigt 15 g natriumsulfat ( 3.10 ) . Lad det ovenstaaende chloroform loebe ud saaledes at overfladen staar umiddelbart over natriumsulfatlaget .  De 50 ml ekstrakt , som blev opsamlet under 5.2 , blandes med 100 ml n-Hexan ( 3.3 ) , og blandingen overfoeres kvantitativt til soejlen . Lad vaesken synke , indtil vaeskeniveauet naar natriumsulfatlagets overflade og fjern den gennemloebne vaeske . Dernaest tilsaettes 100 ml diethylether ( 3.5 ) , der elueres indtil vaeskeniveauet atter naar natriumsulfatlagets overflade . Under disse operationer skal gennemloebshastigheden holdes paa 8 til 12 ml i minuttet , og soejlen maa ikke loebe toer . Den gennemloebne vaeske kasseres . Derefter elueres med 150 ml af chloroform/methanol-blandingen ( 3.7 ) , og hele eluatet opsamles .  Eluatet inddampes til naesten toerhed ved gennemblaesning af inaktiv luft ( 3.11 ) og ved en temperatur paa under 50 * C ved hjaelp af rotationsfordamperen ( 4.5 ) . Inddampningsresten overfoeres kvantitativt med chloroform ( 3.2 ) eller benzen/acetonitril-blandingen til et 10 ml maaleglas ( 4.10 ) . Oploesningen inddampes ved gennemblaesning af inaktiv luft ( 3.11 ) og rumfanget justeres til 2,0 ml med chloroform ( 3.2 ) eller benzen/acetonitril-blandingen ( 3.6 ) .  5.4 . Tyndtlagskromatografi  De nedenfor angivne rumfang af standardoploesningen og af ekstrakten paasaettes som pletter paa en plade til tyndtlagskromatografi ( 4.8 ) , 2 cm fra den underste kant med en indbyrdes afstand paa 2 cm :   - 10 , 15 , 20 , 30 og 40 ml af aflatoxin B1 standardoploesning ( 3.16 ) ;   - 10 ml af ekstrakten fra punkt 5.3 og , ovenidette , 20 ml af standardoploesning ( 3.16 ) ;   - 10 og 20 ml af ekstrakten fra punkt 5.3 .  Kromatogrammet udvikles i daempet belysning ved hjaelp af en af vaeskerne ( 3.18 ) . Valget af udviklingsvaeske skal finde sted forinden ved at anbringe 25 ml af den kvalitative standardoploesning  ( 3.17 ) paa pladen og ved at sikre sig , at aflatoxinerne B1 og B2 adskilles fuldstaendigt under kromatograferingen .  Oploesningsmidlerne afdampes i daempet belysning , og der bestraales med UV-lys , idet pladen anbringes 10 cm fra lampen ( 4.9 ) . Aflatoxin B1-pletterne fluorescerer blaat .  5.5 . Kvantitative bestemmelser  Bestemmelserne foretages enten visuelt eller ved hjaelp af fluorodensitometri , som angivet nedenfor .  5.5.1 . Visuel maaling  Maengden af aflatoxin B1 i ekstrakten bestemmes ved at sammenligne fluorescensintensiteten fra pietterne fra ekstrakten med intensiteten fra pletterne fra standardoploesningen . Der interpoleres om noedvendigt . Den fluorescens , som fremkommer ved at anbringe ekstrakten oven i standardoploesningen , skal vaere kraftigere end den , som udsendes fra de 10 ml ekstrakt , og der maa kun kunne opfattes en plet . Hvis fluorescens-intensiteten fra de 10 ml ekstrakt er kraftigere end den , som de 40 ml standardoploesning giver , fortyndes ekstrakten 10 eller 100 gange med chloroform ( 3.2 ) eller med benzen/acetonitril-blandingen ( 3.6 ) , inden den igen tyndtlagskromatograferes .  5.5.2 . Maalinger ved hjaelp af fluorodensitometri  Fluorescensintensiteten fra aflatoxin B1-pletterne maales med et fluorodensitometer ( 4.12 ) , idet der benyttes en excitationsboelgelaengde paa 365 nm og en emissionsboelgelaengde paa 443 nm . Maengden af aflatoxin B1 i de afsatte ekstrakter bestemmes ved at sammenligne ekstraktpletternes fluorescensintensitet med standardoploesningens .  5.6 . Verificering af identiteten af aflatoxin B1  Identiteten af det aflatoxin B1 , som findes i ekstrakten , verificeres ved de nedenfor angivne fremgangsmaader .  5.6.1 Behandling med svovlsyre  Paasproejt forstoevet svovlsyre ( 3.13 ) paa kromatogrammet fra punkt 5.4 . Under UV-bestraaling skal fluorescensen fra aflatoxin B1-pletterne efter paasproejtningen skifte fra blaat til gult .  5.6.2 . Todimensionelt kromatografi der omfatter dannelse af aflatoxin B1-hemiacetal ( aflatoxin B2a )  NB : De nedenfor beskrevne arbejdsoperationer skal foretages i overensstemmelse med skemaet i fig . 3 .  5.6.2.1 Anbringelse af oploesningerne  Paa en plade ( 4.8 ) traekkes to rette linier parallelt med to hosliggende sider ( i en afstand af 6 cm fra disse sider ) , med det formaal at afgraense oploesningsmidlernes bevaegelse . Ved hjaelp af kapillarpipetter eller mikrosproeiter anbringes de nedenfor angivne oploesninger paa pladen .   - I punkt A : et rumfang renset ekstrakt fra punkt 5.3 indeholdende ca . 2,5 ng aflatoxin B1 ;   - I punkterne B og C : 25 ml af standardoploesning ( 3.16 ) .  5.6.2.2 . Kromatografering  Kromatogrammet udvikles i retning I ved hjaelp af vaesken ( 3.18.1 ) ( 1 cm tykt lag i umaettet kar ) , i daempet belysning , indtil vaeskefronten naar graenselinjen .  Pladen fjernes fra karret og toerres i fem minutter ved stuetemperatur i daempet belysning . Dernaest sproejtes med forstoevet saltsyre ( 3.12 ) paa et 2,5 cm bredt stykke af pladen , som daekker punkterne A og B ( angivet ved det skraverede felt paa fig . 3 ) , indtil moerkfarvning , idet resten af pladen beskyttes med en tynd glasplade . Efter 10 minutters indvirkning i moerke , toerres i en luftstroem ved stuetemperatur .  Derefter udvikles kromatogrammet i retning II ved hjaelp af vaesken ( 3.18.1 ) ( 1 cm tykt lag i umaettet kar ) , i daempet belysning , indtil vaeskefronten naar graenselinjen . Pladen fjernes fra karret og toerres ved stuetemperatur .  5.6.2.3 . Fortolkning af kromatogrammet  Kromatogrammet undersoeges ved UV lys ( 4.9 ) , og de nedenfor angivne iagttagelser kontrolleres :  a ) forekomst af en fluorescerende blaa plet af aflatoxin B1 , som hidroerer fra den i C anbragte standardoploesning ( bevaegelse i retning I ;  b ) forekomst af en fluorescerende blaa plet af aflatoxin B1 ( som ikke har reageret med saltsyren ) og af en mere intens fluorescerende blaa plet af aflatoxin B1-hemiacetal , som hidroerer fra den i B anbragte standardoploesning ( bevaegelse i retning II ) ;  c ) forekomst af pletter , som ligner de under punkt b ) beskrevne , hidroerende fra det i A anbragte ekstrakt . Disse pletters beliggenhed defineres ved B1-aflatoxinets tilbagelagte afstand fra punkt A i retning I  ( samme afstand , som er tilbagelagt i retning II af B1-aflatoxinet ( som ikke har reageret med saltsyren ) og af aflatoxin B1-hemiacetalet ( samme afstand som den , den i B anbragte standardoploesning har tilbagelagt ) ; fluorescensintensiteten fra de hemiacetalpletter , som hidroerer fra ekstrakten og fra den i B anbragte standardoploesning , boer stemme overens .  6 . Beregning af resultater  6.1 . Paa grundlag af visuel maaling  Aflatoxin B1-indholdet i proevematerialet i mg/kg ( ppb ) beregnes efter formlen :  S * Y * V/W * X  hvor :  Y og X er indholdet udtrykt i ml af henholdsvis standardoploesningen af aflatoxin B1 ( 3.16 ) og af ekstrakten , som giver en tilsvarende fluorescensintensitet ;  S = koncentrationen i mg af aflatoxin B1 pr . ml standardoploesning ( 3.16 ) ;  V = ekstraktens slutvolumen i ml , under hensyntagen til eventuelle fortyndinger ;  W = provens vaegt i g svarende til rumfanget af den ekstrakt , som blev oprenset paa soejle .  6.2 . Paa grundlag af fluorodensitometrisk maaling  Aflatoxin B1-indholdet i mg pr . kg af proeven ( ppb ) beregnes efter formlen :  S * V/W * Y  hvor :  Y = volumen i ml af den paa pladen anbragte ekstrakt ( 10 eller 20 ml ) ;  S = maengden i ng af aflatoxin B1 fra den anbragte ekstrakt ( under hensyntagen til volumen Y ) , udledt af bestemmelserne ;  V = ekstraktens slutvolumen i ml , under hensyntagen til eventuelle fortyndinger ;  W = proevens vaegt i g svarende til rumfanget af den ekstrakt , som blev oprenset paa soejle .  7 . Tilberedning af og kontrol med standardoploesning  ( 3.16 )  7.1 . Bestemmelse af aflatoxin B1 koncentration  Der tilberedes en standardoploesning af aflatoxin B1 i chloroform ( 3.2 ) eller i benzen/acetonitrilblandingen ( 3.6 ) med en koncentration paa 8 til 10 mg pr . ml . Absorptions spekret bestemmes mellem 330 og 370 nm ved hjaelp af spektrofotometret ( 4.11 ) .  Lysabsorptionen ( A ) maales ved 363 nm for chloroformoploesningens vedkommende ; ved 348 nm for benzen/acetonitril-blandingen vedkommende .  Aflatoxin B1-koncentrationen i mg/ml oploesning beregnes ud fra nedenstaaende formler :  312 * A * 1000/20 600 for chloroform-oploesningen  312 * A * 1000/19 800 for oploesningen i benzen/acetonitril-blandingen .  I daempet belysning tilberedes passende fortyndinger til en arbejdsstandardoploesning med en aflatoxin B1 koncentration paa ca 0,1 mg/ml . Ved opbevaring i koeleskab ved 4 * C er denne oploesning holdbar i to uger .  7.2 . Kontrol af den kromatografiske renhed  Paa en plade ( 4.8 ) anbringes 5 ml af standardoploesningen med 8 - 10 mg aflatoxin B1 pr . ml ( jf . 7.1 ) . Kromatogrammet udvikles som beskrevet under punkt 5.4 . Fluorescensen maa ved UV-lys kun give anledning til opfattelse af en enkelt plet , og der maa ikke opfattes nogen fluorescens i den oprindeligt afsatte proeves omraade .  8 . Repeterbarhed  Forskellen mellem resultaterne af to sideloebende bestemmelser udfoert af den samme person paa den samme proeve boer ikke overstige :   - 25 % af det hoejeste resultat for et aflatoxinindhold paa mellem 10 og 20 mg/kg ,   - 5 mg i absolut vaerdi for et indhold paa mellem 20 og 50 mg/kg ,   - 10 % af det hoejeste resultat for et indhold paa over 50 mg/kg .  9 . Reproducerbarhed  Se bemaerkninger , afsnit C , punkt 2 .  B . FREMGANGSMAADE VED TODIMENSIONAL TYNDTLAGSKROMATOGRAFI  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden goer det muligt at bestemme indholdet af aflatoxin B1 i foderstoffer som ikke kan bestemmes under metode A . Den mindste maengde , der kan bestemmes , er 0,01 mg/kg ( 10 ppb ) . Metoden kan ikke anvendes til foderstoffer , der indeholder eitruspulp .  2 . Princip  Proeven ekstraheres med chloroform . Ekstrakten filtreres , en alikvot del af ekstrakten oprenses ved soejlekromatografi paa kiselgel . Eluatet inddampes , og inddampningsresten oploeses i en bestemt maengde chloroform eller i en blanding af benzen og acetonitril . En alikvot del af denne oploesning tyndtlagskromatograferes todimensionalt . Maengden af aflatoxin B1 bestemmes under UV-bestraaling af kromatogrammet enten visuelt eller ved fluorodensitometri , ved sammenligning med kendte maengder aflatoxin B1 standard . Identiteten af det ekstraherede aflatoxin B1 af foderstoffet skal verificeres .  3 . Reagenser  NB : Alle reagenserne skal vaere af " analyse " kvalitet , medmindre andet er angivet .  3.1 . Acetone .  3.2 . Chloroform , stabiliseret med 0,5 til 1,0 % 96 % ( v/v ) ethanol .  3.3 . n-Hexan .  3.4 . Methanol .  3.5 . Vandfri diethylether , peroxidfrit .  3.6 . Blanding af benzen og acetonitril : 98/2 ( v/v ) .  3.7 . Blanding af chloroform ( 3.2 ) og methanol  ( 3.4 ) : 97/3 ( v/v ) .  3.8 . Kiselgel , til soejlekromatografi , kornstoerrelse : 0,05 til 0,20 mm .  3.9 . Hygroskopisk bomuld , forinden affedtet med chloroform , eller glasuld .  3.10 . Natriumsulfat , vandfrit , granuleret .  3.11 . Inaktiv luftart , f.eks . kvaelstof .  3.12 . 1 N saltsyre .  3.13 . Diatoméjord ( Hyflosupercel ) , vasket i syre .  3.14 . Kiselgel G-HR eller tilsvarende til tyndtlagskromatografi .  3.15 . Udviklingsvaesker .  3.15.1 . Diethylether ( 3.5 ) /methanol  ( 3.4 ) /vand : 94/4,5/1,5 ( v/v ) maettet kar .  3.15.2 . Chloroform ( 3,2 ) /acetone ( 3.1 ) : 9/1 ( v/v ) umaettet kar .  3.16 . Standardoploesning af ca . 0,1 mg aflatoxin B1 pr . ml i chloroform ( 3.2 ) eller i benzen/acetonitril-blanding ( 3.6 ) , tilberedt og kontrolleret som angivet under punkt 7 i metode A .  4 . Apparatur  Se punkt 4 under fremgangsmaade A .  5 . Fremgangsmaade  5.1 . Tilberedning af proeven Se punkterne 5.1 , 5.2 og 5.3 under fremgangsmaade A .  5.2 . Ekstraktion Se punkterne 5.1 , 5.2 og 5.3 under fremgangsmaade A .  5.3 . Oprensning paa sojle Se punkterne 5.1 , 5.2 og 5.3 under fremgangsmaade A .  5.4 . Todimensionel tyndtlagskromatografi  5.4.1 . Anbringelse af oploesningerne ( foelg skemaet paa ( fig . 1 )  Paa en plade ( 4.8 ) traekkes to rette linjer parallelt med to hosliggende sider ( med en afstand paa henholdsvis 5 og 6 cm fra disse sider ) , med det formaal at afgraense oploesningsmidlernes bevaegelse . Ved hjaelp af kapillarpipetter eller mikrosproejter placeres de nedenfor angivne oploesninger paa pladen :   - i punkt A : 20 ml oprenset ekstrakt fra punkt 5.3 ,   - i punkt B : 20 ml af standardoploesning ( 3.16 ) ,   - i punkt C : 10 ml af standardoploesning ( 3.16 ) ,   - i punkt D : 20 ml af standardoploesning ( 3.16 ) ,   - i punkt E : 40 ml af standardoploesning ( 3.16 ) .  Toer pletterne ved hjaelp af en svag luftstroem ( 3.11 ) . De paasatte pletter skal have en diameter paa ca . 5 mm .  5.4.2 . Kromatografering ( skemaet paa fig . 1 foelges )  Kromatogrammet udvikles i retning I ved hjaelp af vaesken ( 3.15.1 ) ( 1 cm tykt lag i maettet kar ) , i daempet belysning , indtil vaeskefronten naar graenselinien . Pladen fjernes fra karret og toerres i mindst 15 minutter ved stuetemperatur og i daempet belysning .  Dernaest udvikles kromatogrammet i retning II ved hjaelp af vaesken ( 3.15.2 ) ( 1 cm tykt lag i umaettet kar ) i daempet belysning indtil vaeskefronten naar graenselinien . Pladen fjernes fra karret og toerres ved stuetemperatur og i daempet belysning .  5.4.3 . Fortolkning af kromatogrammet ( skemaet paa fig . 2 foelges )  Kromatogrammet bestraales med UV-lys , idet pladen anbringes 10 cm fra lampen ( 4.9 ) . Placeringen af de blaa fluorescenspletter fra aflatoxin B1 i B , C , D og E , hidroerende fra standardoploesningen , lokaliseres og der traekkes to imaginaere linjer igennem disse pletter vinkelret paa udviklingsretningerne . Skaeringspunktet P for disse rette linjer er det sted , hvor man skulle vente at finde den aflatoxin B1-plet , som hidroerer fra den i A ( fig . 1 ) anbragte ekstrakt . Ikke desto mindre kan denne plet befinde sig i et punkt Q , beliggende i skaeringspunktet for to imaginaere rette linjer , som med hinanden danner en vinkel paa ca . 100 * , og som gaar gennem pletterne i henholdsvis B og C . Maengden af aflatoxin B1 i ekstrakten fra proeven bestemmes som givet under punkt 5.5 .  5.4.4 . Supplerende kromatografi  Paa en ny plade ( 4.8 ) traekkes to rette linjer parallelt med to hosliggende sider , som angivet i skemaet paa fig . 1 , og i punkt A ( se fig . 1 ) anbringes 20 ml af den under 5.3 fremkomme rensede ekstrakt fra proeven , og oven i denne anbringes 20 ml af standardoploesning ( 3.16 ) . Kromatogrammet udvikles som angivet under 5.4.2 og bestraales med UV lys ( 4.9 ) , hvorefter det kontrolleres at   - aflatoxin B1-pletterne fra ekstrakten og fra standardoploesningen falder sammen ,   - fluorescensen fra denne plet er mere intens end fluorescensen fra den aflatoxin B1-plet , som blev udviklet i punkt Q paa den foerste plade .  5.5 . Kvantitative bestemmelser  Bestemmelserne foretages enten visuelt eller ved hjaelp af fluorodensitometri , som angivet nedenfor .  5.5.1 . Visuel maaling  Maengden af aflatoxin B1 i ekstrakten bestemmes ved at sammenligne fluorescensintensiteten fra pletten fra ekstrakten med intensiteten fra pletterne C , D og E fra standardoploesningen . Der interpoleres om noedvendigt . Hvis fluorescensintensiteten fra de 20 ml ekstrakt er staerkere end intensiteten fra de 40 ml standardoploesning , fortyndes ekstrakten 10 eller 100 gange med chloroform  ( 3.2 ) eller med benzen/acetonitril-blandingen  ( 3.6 ) , inden den paa ny tyndtlagskromatograferes .  5.5.2 . Maalinger ved hjaelp af fluorodensitometri  Intensiteten af fluorescensen fra aflatoxin B1-pletterne maales ved hjaelp af fluorodensitometri ( 4.12 ) , idet der benyttes en excitationsboelgelaengde paa 365 nm og en emissionsboelgelaengde paa 443 nm . Maengden af aflatoxin B1 i den afsatte ekstrakt bestemmes ved at sammenligne pletternes fluorescensintensitet med pletterne C , D og E fra standardoploesningen .  5.6 . Bekraeftelse af indentiteten af afiatoxin B1  Se metode A under punkt 5.6 .  6 . Beregning  Se punkt 6 under metode A .  7 . Repterbarhed  Se punkt 8 under metode A .  8 . Reproducerbarhed  Se Bemaerkninger , afsnit C , punkt 2 .  C . BEMAERKNINGER VEDROERENDE FREMGANGSMAADE A OG B  1 . Affedtning  Proever , der indeholder mere end 5 % fedt boer affedtes med petroleumsbengin ( kogepunkt 40 - 60 * C ) efter den under 5.1 angivne tilberedning . I saa fald skal analyseresultaterne sammenholdes med vaegten af den ikke-affedtede proeve .  2 . Resultaternes reproducerbarhed  Resultaternes reproducerbarhed , dvs . variationer mellem resultater opnaaet af to eller flere laboratorier paa den samme proeve , er bestemt til at vaere :  mere eller mindre 50 % af gennemsnit for gennemsnitsvaerdier af aflatoxin B1 mellem 10 og 20 mg/kg ;  mere eller mindre 10 mg/kg af gennemsnit for gennemsnitsvaerdier stoerre end 20 og op til 50 mg/kg ;  mere eller mindre 20 % af gennemsnit for gennemsnitsvaerdier over 50 mg/kg .  BILAG : JFR . EFT