CELEX: 32014R0260
Language: et
Date: 2014-01-24 00:00:00
Title: Komisjoni määrus (EL) nr 260/2014, 24. jaanuar 2014 , millega muudetakse tehnika arenguga kohandamise eesmärgil määrust (EÜ) nr 440/2008, millega kehtestatakse katsemeetodid vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrusele (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH)  EMPs kohaldatav tekst

19.3.2014   
            
            
               ET
            
            
               Euroopa Liidu Teataja
            
            
               L 81/1
            
         
      KOMISJONI MÄÄRUS (EL) nr 260/2014,
   24. jaanuar 2014,
   millega muudetakse tehnika arenguga kohandamise eesmärgil määrust (EÜ) nr 440/2008, millega kehtestatakse katsemeetodid vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrusele (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH)
   (EMPs kohaldatav tekst)
   EUROOPA KOMISJON,
   võttes arvesse Euroopa Liidu toimimise lepingut,
   võttes arvesse Euroopa Parlamendi ja nõukogu 18. detsembri 2006. aasta määrust (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) ning millega asutatakse Euroopa Kemikaaliamet, muudetakse direktiivi 1999/45/EÜ ja tunnistatakse kehtetuks nõukogu määrus (EMÜ) nr 793/93 ja komisjoni määrus (EÜ) nr 1488/94 ning samuti nõukogu direktiiv 76/769/EMÜ ja komisjoni direktiivid 91/155/EMÜ, 93/67/EMÜ, 93/105/EÜ ja 2000/21/EÜ, (1) eriti selle artikli 13 lõiget 3,
   ning arvestades järgmist:
   
               (1)
            
            
               Komisjoni määruses (EÜ) nr 440/2008 (2) on esitatud katsemeetodid ainete füüsikalis-keemiliste omaduste, toksilisuse ja ökotoksilisuse määramiseks, mida kasutatakse määruse (EÜ) nr 1907/2006 kohaldamisel.
            
         
               (2)
            
            
               Määrust (EÜ) nr 440/2008 on vaja ajakohastada, et lisada prioriteetsena uued ja ajakohastatud alternatiivsed katsemeetodid, mis on OECD poolt hiljuti heaks kiidetud, et vähendada katsetes kasutatavate loomade arvu vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu 22. septembri 2010. aasta direktiivile 2010/63/EL teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitse kohta (3) ning nõukogu 24. novembri 1986. aasta direktiivile 86/609/EMÜ katseteks ja muudel teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitsega seotud liikmesriikide õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta (4).
            
         
               (3)
            
            
               Käesolevas kohandamismääruses on esitatud kaks meetodit füüsikalis-keemiliste omaduste määramiseks, sealhulgas vees lahustuvuse määramise ajakohastatud meetod ja uus jaotuskoefitsiendi määramise meetod, mis on asjakohane püsivate, bioakumuleeruvate ja toksiliste (PBT) ainete hindamisel; neli uut meetodit ja üks ajakohastatud meetod ökotoksilisuse ning keskkonnas muundumise ja käitumise määramiseks; üheksa meetodit mürgisuse ja muude tervisemõjude määramiseks, sealhulgas neli meetodit sissehingamisel avalduva mürgisuse määramiseks, millest kolm on varasema meetodi ajakohastatud versioonid ja üks on uus meetod, mille eesmärk on vähendada kasutatavate katseloomade arvu ja täiustada mõjude hindamist, korduvannuse toksilisuse 28-päevase katse ajakohastatud versioon, millega hinnatakse ka sisenõristusnäärmetele avalduva mõju näitajaid, toksikokineetika katsemeetodi ajakohastatud versioon, mis on oluline toksikoloogiauuringute kavandamise ja mõistmise jaoks, ning kroonilise mürgisuse, kantserogeensuse ja kombineeritud kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse katsemeetodi ajakohastatud versioon.
            
         
               (4)
            
            
               Määrust (EÜ) nr 440/2008 tuleks seepärast vastavalt muuta.
            
         
               (5)
            
            
               Käesoleva määrusega ette nähtud meetmed on kooskõlas määruse (EÜ) nr 1907/2006 artikli 133 kohaselt asutatud komitee arvamusega,
            
         ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA MÄÄRUSE:
   Artikkel 1
   Määruse (EÜ) nr 440/2008 lisa muudetakse vastavalt käesoleva määruse lisale.
   Artikkel 2
   Käesolev määrus jõustub kolmandal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.
   
      Käesolev määrus on tervikuna siduv ja vahetult kohaldatav kõikides liikmesriikides.
      Brüssel, 24. jaanuar 2014
      
         
            Komisjoni nimel
         
         
            president
         
         José Manuel BARROSO
         
      
   
   
      (1)  ELT L 396, 30.12.2006, lk 1.
   
      (2)  ELT L 142, 31.5.2008, lk 1.
   
      (3)  ELT L 276, 20.10.2010, lk 33.
   
      (4)  EÜT L 358, 18.12.1986, lk 1.
   
      LISA
      Määruse (EÜ) nr 440/2008 lisa muudetakse järgmiselt.
      
                  1)
               
               
                  Peatükk A.6 asendatakse järgmisega:
                  „A.6.   LAHUSTUVUS VEES
                  
                  SISSEJUHATUS
                  
                              1.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga (Test Guideline, TG) 105 (1995). Käesolev katsemeetod on 1981. aastal vastu võetud esialgse meetodi TG 105 läbivaadatud versioon. Käesoleva versiooni ja 1981. aasta versiooni vahel ei ole sisulist erinevust, muudetud on peamiselt vormi. Läbivaadatud versioon põhineb ELi katsemeetodil „Lahustuvus vees” (1).
                           
                        LÄHTEKAALUTLUSED
                  
                              2.
                           
                           
                              Uuritava aine lahustuvus vees võib lisandite mõjul oluliselt muutuda. Käesolevas katsemeetodis kirjeldatakse, kuidas määrata sellise aine lahustuvust vees, mis on praktiliselt puhas, vees püsiv ja ei lendu. Enne vees lahustuvuse määramist on kasulik omada uuritava aine kohta mõningast eelteavet, nagu struktuurvalem, aururõhk, dissotsiatsioonikonstant ja hüdrolüüs sõltuvalt pH väärtusest.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Käesolevas katsemeetodis on kirjeldatud kahte meetodit: kolonn-elueerimismeetod ja kolvimeetod, millega on kaetud lahustuvuse vahemikud vastavalt kuni 10–2 g/l ja alates kontsentratsioonist 10–2 g/l. Kirjeldatud on ka lihtsat eeluuringut. Eeluuringuga saab määrata uuritava proovi ligikaudse sobiva koguse, mida tuleb kasutada lõplikus katses, samuti küllastumise saavutamiseks vajaliku aja.
                           
                        MÕISTED JA ÜHIKUD
                  
                              4.
                           
                           
                              Aine lahustuvus vees on selle küllastav massikontsentratsioon vees antud temperatuuril.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Lahustuvust vees väljendatakse lahustunud aine massina lahuse ruumala kohta. Lahustuvuse SI-ühik on kg/m3; võib kasutada ka ühikut g/l.
                           
                        VÕRDLUSKEMIKAALID
                  
                              6.
                           
                           
                              Uuritava aine lahustuvuse määramisel ei ole vaja kasutada võrdluskemikaale.
                           
                        MEETODITE KIRJELDUS
                  
                     Katsetingimused
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Eelistatav katsetemperatuur on 20 ± 0,5 °C. Valitud temperatuur tuleks seadme kõigis olulistes osades hoida konstantsena.
                           
                        
                     Eeluuring
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Astmelise meetodi kasutamisel lisatakse toatemperatuuril 10-milliliitrises klaaskorgiga mõõtesilindris üha suuremaid veekoguseid umbes 0,1 grammile uuritavale ainele (tahke uuritav aine peab olema peenestatud). Pärast iga veekoguse lisamist loksutatakse segu kümme minutit ja kontrollitakse visuaalselt lahustumata proovijääkide olemasolu. Kui proov või osa sellest jääb pärast 10 ml vee lisamist lahustumata, jätkatakse katset 100 ml mõõtesilindris. Ligikaudne lahustuvus on esitatud tabelis 1 lisatud vee mahulise koguse all, mille juures proov täielikult lahustub. Kui lahustuvus on väike, võib uuritava aine lahustamiseks kuluda palju aega ja katseks tuleb ette näha vähemalt 24 tundi. Kui 24 tunni möödumisel on osa uuritavast ainest ikka veel lahustumata, tuleb lahustamiseks näha ette rohkem aega (kuni 96 tundi) või kasutada suuremat lahjendust, et teha kindlaks, kas tuleb kasutada kolonn-elueerimis- või kolvimeetodit.
                              
                                 Tabel 1
                              
                              
                                          Vee milliliitreid 0,1 g soluudi kohta
                                       
                                       
                                          0,1
                                       
                                       
                                          0,5
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          2
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                       
                                          100
                                       
                                       
                                          > 100
                                       
                                    
                                          Ligikaudne lahustuvus (g/l)
                                       
                                       
                                          > 1 000
                                       
                                       
                                          1 000 – 200
                                       
                                       
                                          200–100
                                       
                                       
                                          100–50
                                       
                                       
                                          50–10
                                       
                                       
                                          10–1
                                       
                                       
                                          < 1
                                       
                                    
                        
                     Kolonn-elueerimismeetod
                  
                  
                     Põhimõte
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Meetodi aluseks on uuritava aine veega elueerimine mikrokolonnist, mis on täidetud inertse tugimaterjaliga, mis on eelnevalt kaetud uuritava aine liiaga (2). Lahustuvus vees leitakse eluaadi massikontsentratsioonist, kui eluaadi kontsentratsioon jõuab teatava aja järel platoole.
                           
                        
                     Seadmed
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Seadmestik koosneb mikrokolonnist (joonis 1), mida hoitakse konstantse temperatuuri juures. Mikrokolonn on ühendatud kas tsirkulatsioonpumbaga (joonis 2) või ühtlustava anumaga (joonis 3). Mikrokolonn sisaldab inertset kandjat, mida hoiab paigal väike klaasvatikork, mis toimib ühtlasi ka osakeste filtrina. Võimalikud inertse kandjana kasutatavad materjalid on klaashelmed, diatomiit või muud inertsed materjalid.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Joonisel 1 kujutatud mikrokolonn sobib töötamiseks koos tsirkulatsioonpumbaga. Kolonnil on tühi ülaosa, mille maht on viis statsionaarse faasi mahtu (mis visatakse ära eksperimendi alguses) ja viis proovi ruumala (mis võetakse analüüsimiseks katse käigus). Seda vaba ruumi võib ka vähendada, kui lisandite kõrvaldamiseks kasutatava viie statsionaarse faasi mahu eluaadi asemele saab katse ajal lisada süsteemi vett. Kolonn on inertsest materjalist toru abil ühendatud tsirkulatsioonpumbaga, mille pumpamiskiirus on ligikaudu 25 ml/h. Tsirkulatsioonpump võib olla näiteks peristaltiline või membraanpump. Tuleb jälgida, et toru materjal ei põhjustaks saastumist ega adsorptsiooni.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Joonisel 3 on skemaatiliselt kujutatud tüüpiline ühtlustava anumaga süsteem. Selles süsteemis on mikrokolonn varustatud ühekäigukraaniga. Ühendamiseks ühtlustava anumaga on kasutatud klaaslihvühendust ja inertsest materjalist valmistatud voolikut. Lahuse ühtlustavast anumast välja voolamise kiirus peaks olema ligikaudu 25 ml/h.
                              
                                 Joonis 1
                              
                              
                                 
                              Mõõtmed millimeetrites
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          Lihvmuhv lihvühenduse jaoks
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          Vaba ruum kolonni peas
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          Sisediameeter 5 mm
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          Välisdiameeter 19 mm
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          Klaasvatist kork
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          Kraan
                                       
                                    
                                 Joonis 2
                              
                              
                                 
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          Tasakaalustamine atmosfäärirõhuga
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          Voolumõõtur
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          Mikrokolonn
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          Termostateeritud tsirkulatsioonpump
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          Tsirkulatsioonpump
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          Kahekäigukraan proovide võtmiseks
                                       
                                    
                                 Joonis 3
                              
                              
                                 
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          Ühtlustav anum (nt 2,5 l kolb)
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          Kolonn
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          Fraktsioonikoguja
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          Termostaat
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          Teflonvoolik
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          Klaaslihvühendus
                                       
                                    
                                          G.
                                       
                                       
                                          Veevoolik termostaadi ja kolonni vahel (sisediameeter ligikaudu 8 mm)
                                       
                                    
                        
                              13.
                           
                           
                              Ligikaudu 600 mg tugimaterjali kantakse 50 ml ümarkolbi. Sobiv kogus uuritavat ainet lahustatakse kergesti lenduvas analüüsireaktiivi puhtusklassiga lahustis ja sobiv kogus seda lahust lisatakse tugimaterjalile. Selleks et vältida jaotumist tugiaine pinnal ja saavutada elueerimisetapil tugiaine küllastumine veega, eemaldatakse lahusti täielikult, näiteks pöördaurusti kasutamisega. Kaetud tugimaterjali lastakse kaks tundi seista ligikaudu 5 ml vees ja seejärel viiakse suspensioon mikrokolonni. Teise võimalusena võib kuiva kaetud tugimaterjali kallata veega täidetud mikrokolonni ja lasta sel kaks tundi tasakaalustuda.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Tugimaterjali katmine uuritava ainega võib tekitada probleeme, mille tõttu saadakse valed tulemused, näiteks kui uuritav aine sadestub tugiainele õlina. Selliseid probleeme tuleks uurida ja katseprotokollis tuleks esitada üksikasjad.
                           
                        
                     Mõõtmine tsirkulatsioonpumba kasutamisega
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Kolonni hakatakse voolutama. Soovitatav on kasutada ligikaudset voolukiirust 25 ml/h, mis kirjeldatud kolonni puhul tähendab kümmet kolonni statsionaarse faasi mahtu tunnis. Vähemalt esimesed viis statsionaarse faasi mahtu visatakse ära, et eemaldada voolutamisega vees lahustuvad lisandid. Seejärel lastakse tsirkulatsioonpumbal töötada tasakaalu saabumiseni, st senikaua, kuni viie järjestikuse proovi kontsentratsioonide erinevused on juhuslikud ega ületa ±30 %. Nende proovide vahelised ajavahemikud peaksid vastama ajale, mis kulub vähemalt kümne statsionaarse faasi mahu eluendi voolamiseks läbi kolonni. Analüüsimeetodist olenevalt võib olla parem koostada graafik kontsentratsiooni sõltuvuse kohta ajast, millelt on näha tasakaalu saabumist.
                           
                        
                     Määramine ühtlustava anuma kasutamisega
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Tuleks koguda järjestikuseid eluaadifraktsioone ja analüüsida neid valitud meetodi abil. Aine lahustuvus vees määratakse eluaadi keskjooksust nende fraktsioonide põhjal, mille kontsentratsioonid jäävad vähemalt viie järjestikuse proovi kestel konstantseks ((±30 %).
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Eelistatud voolutuskeskkond on bidestilleeritud vesi. Kasutada võib ka deioniseeritud vett, mille takistus on üle 10 megaoomi/cm ja orgaanilise süsiniku sisaldus alla 0,01 %.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Kummagi meetodi puhul tehakse teine voolutamine poole väiksema voolukiirusega kui esimene. Kui kahe voolutamise tulemused on kooskõlas, on katse tehtud rahuldavalt. Kui väiksema voolukiiruse juures on mõõdetud lahustuvus suurem, tuleb voolukiiruse poole võrra vähendamist jätkata seni, kui kahe järjestikuse voolutamisega saadakse ühesugune lahustuvus.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Mõlema meetodi puhul tuleb Tyndalli efekti kasutamisega kontrollida, et fraktsioonid ei sisaldaks kolloidset ainet. Kolloidosakeste olemasolu korral katse tulemusi ei arvestata ja katset korratakse kolonniga, mille filtrivad omadused on paremad.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Tuleb mõõta iga proovi pH, eelistatult spetsiaalse indikaatorpabeririba abil.
                           
                        
                     Kolvimeetod
                  
                  
                     Põhimõte
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Aine (tahke aine peab olema peenestatud) lahustatakse vees katsetemperatuurist mõnevõrra kõrgemal temperatuuril. Küllastumise saavutamisel segu jahutatakse ja hoitakse katsetemperatuuril. Mõõtmist võib alustada ka kohe katsetemperatuuril, kui sobivate proovide võtmisega on näidatud, et küllastustasakaal on saavutatud. Seejärel määratakse sobiva analüüsimeetodi (3) abil aine massikontsentratsioon vesilahuses, mis ei tohi sisaldada lahustumata osakesi.
                           
                        
                     Seadmed
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Vaja on järgmisi materjale:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          tavalised labori klaasnõud ja seadmed;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          seade lahuse segamiseks konstantsel termostaaditemperatuuril;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          emulsiooni korral võib vaja minna tsentrifuugi (eelistatult termostateeritud), ning
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analüüsiseadmed.
                                       
                                    
                        
                     Katse läbiviimise kord
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Soovitud ruumala vee küllastamiseks vajalik uuritava aine kogus hinnatakse eeluuringu abil. Võetakse kolm klaaskorgiga klaasnõu (nt tsentrifuugiklaasid või kolvid) ja kaalutakse igaühte umbes viiekordne eespool osutatud ainekogus. Igasse nõusse lisatakse teatav kogus vett; veekogus valitakse vastavalt analüüsimeetodile ja lahustuvuse vahemikule. Nõud suletakse tihedalt korgiga ja seejärel segatakse temperatuuril 30 °C. Kasutada tuleks konstantsel temperatuuril töötavat loksutit või segajat, nt magnetsegajat termostateeritud veevanniga. Ühe päeva pärast võetakse üks nõu ja tasakaalustatakse seda 24 h katsetemperatuuril aeg-ajalt loksutades. Nõu sisu tsentrifuugitakse seejärel katsetemperatuuril ja määratakse siis sobiva analüüsimeetodi abil uuritava aine kontsentratsioon selges veefaasis. Sama korratakse ülejäänud kahe nõuga vastavalt kahe- ja kolmepäevase 30 °C juures eelneva tasakaalustamise järel. Kui vähemalt kahes viimases nõus määratud kontsentratsioonid ei erine rohkem kui 15 %, on katse tehtud rahuldavalt. Kui esimese, teise ja kolmanda nõu mõõtmisel saadud tulemustes ilmneb kasvutendents, tuleb katset korrata pikemate tasakaalustamisaegadega.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Katse võib teha ka ilma eelneva inkubeerimiseta 30 °C juures. Küllastumistasakaalu saavutamise kiiruse hindamiseks võetakse proove senikaua, kuni mõõdetav kontsentratsioon enam ei sõltu segamise ajast.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Tuleb mõõta iga proovi pH, eelistatult spetsiaalse indikaatorpabeririba abil.
                           
                        
                     Analüütilised määramised
                  
                  
                              26.
                           
                           
                              Määramisel eelistatakse spetsiifilisi uuritava aine määramise meetodeid, kuna juba väike lisandikogus võib mõõdetud lahustuvuse väärtuses põhjustada suure vea. Sellised meetodid on näiteks gaas- või vedelikkromatograafia, tiitrimine, fotomeetria, voltameetria.
                           
                        ANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE
                  
                     Andmed
                  
                  
                     Kolonn-elueerimismeetod
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Iga katse puhul tuleks välja arvutada vähemalt viie järjestikuse küllastusplatool võetud proovi keskmine väärtus ja standardhälve. Eri voolukiiruste juures tehtud kahe katse keskmised väärtused ei tohiks erineda rohkem kui 30 %.
                           
                        
                     Kolvimeetod
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Kolme kolvi määramisel saadud üksiktulemused, mis ei tohiks erineda üle 15 %, keskmistatakse.
                           
                        
                     Katseprotokoll
                  
                  
                     Kolonn-elueerimismeetod
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Katseprotokollis esitatakse järgmine teave:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          eeluuringu tulemused;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          aine keemiline määratlus ja lisandid (eelnevad puhastamisetapid, kui ainet puhastati);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          iga proovi kontsentratsioon, voolukiirus ja pH;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          iga katse kohta vähemalt viie küllastusplatool võetud proovi keskväärtus ja standardhälve;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          vähemalt kahe järjestikuse katse keskmine väärtus;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          vee temperatuur küllastamise ajal;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analüüsimeetod;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kasutatud tugimaterjal;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          tugimaterjali katmisega seotud andmed;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kasutatud lahusti;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          andmed aine mis tahes keemilise ebastabiilsuse kohta katse tingimustes;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kogu muu asjakohane teave, eriti lisandite ja aine füüsikalise oleku kohta, mis võib mõjutada tulemuste tõlgendamist.
                                       
                                    
                        
                     Kolvimeetod
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Katseprotokollis esitatakse järgmine teave:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          eeluuringu tulemused;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          aine keemiline määratlus ja lisandid (eelnevad puhastamisetapid, kui ainet puhastati);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          iga üksiku analüüsi tulemus ja tulemuste keskmine, kui ühe kolvi kohta tehti mitu mõõtmist;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          iga proovi pH väärtus;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          eri kolbidega saadud kooskõlaliste tulemuste keskväärtused;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          katsetemperatuur;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analüüsimeetod;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          andmed aine mis tahes keemilise ebastabiilsuse kohta katse tingimustes;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kogu muu asjakohane teave, eriti lisandite ja aine füüsikalise oleku kohta, mis võib mõjutada tulemuste tõlgendamist.
                                       
                                    
                        
                     KIRJANDUS
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              Komisjoni direktiiv 92/69/EMÜ, 31. juuli 1992, millega seitsmeteistkümnendat korda kohandatakse tehnika arenguga nõukogu direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta (EÜT L 383, 29.12.1992, lk 113).
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.”
                           
                        
            
                  2)
               
               
                  Lisatakse peatükk A.23:
                  „A.23   JAOTUSKOEFITSIENT (SÜSTEEMIS 1-OKTANOOL-VESI): AEGLASE SEGAMISE MEETOD
                  
                  SISSEJUHATUS
                  
                              1.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga (Test Guideline, TG) 123 (2006). Aeglase segamise meetodiga saab täpselt määrata jaotuskoefitsiente süsteemis 1-oktanool-vesi (POW) kuni log POW väärtuseni 8,2 (1). Sellepärast sobib see meetod väga hüdrofoobsete ainete POW otseseks katseliseks määramiseks.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Muud meetodid jaotuskoefitsientide määramiseks süsteemis 1-oktanool-vesi (POW) on loksutatava kolvi meetod (2) ja POW määramine pööratud faasi kõrgefektiivse vedelikkromatograafia retentsiooniaja andmetest (3). Loksutatava kolvi meetod võib anda aga vale tulemuse, kuna veefaasi kanduvad üle mikroskoopilised oktanooli piisakesed. Mida suurem on POW väärtus, seda rohkem kiputakse veefaasis olevate oktanooli mikropiiskade tõttu ülehindama uuritava aine kontsentratsiooni vees. Sellepärast võib loksutatava kolvi meetodit kasutada ainult ainete puhul, mille log POW < 4. Teine meetod põhineb otse määratud usaldusväärsetel POW väärtustel, mida kasutatakse kõrgefektiivse vedelikkromatograafia retentsiooniaja ja mõõdetud POW väärtuste vahelise seose kaliibrimiseks. Mõnda aega oli kättesaadav OECD katsejuhendi kavand (4) ioniseeruvate ainete jaotuskoefitsientide määramiseks süsteemis 1-oktanool-vesi, kuid seda meetodit enam ei kasutata.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod on välja töötatud Madalmaades. Siin kirjeldatud meetodite täpsust on kontrollitud ja optimeeritud laboritevaheliste võrdluskatsete uuringuga, milles osales 15 laborit (5).
                           
                        LÄHTEKAALUTLUSED
                  
                     Olulisus ja kasutamine
                  
                  
                              4.
                           
                           
                              On kindlaks tehtud, et inertsete orgaaniliste ainete bioakumulatsioon kalades korreleerub väga tugevasti nende ainete jaotuskoefitsiendiga süsteemis 1-oktanool-vesi (POW). Lisaks on näidatud, et POW korreleerub kemikaalide toksilise mõjuga kaladele ning seostumisega tahkete ainetega, nagu pinnas ja setted. Ulatuslik ülevaade nendest seostest on esitatud publikatsioonis 6.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              On kindlaks tehtud, et aine 1-oktanool-vee-süsteemi jaotuskoefitsiendi ja muude omaduste vahel on palju keskkonnatoksikoloogia ja -keemia seisukohast olulisi seoseid. Sellepärast on jaotuskoefitsient süsteemis 1-oktanool-vesi saanud tähtsaks parameetriks, mille abil hinnatakse kemikaalide keskkonnaohtlikkust ja ennustatakse nende käitumist keskkonnas.
                           
                        
                     Kasutusala
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Aeglane segamine peaks vähendama 1-oktanooli mikropiisakeste moodustumist veefaasis olevatest 1-oktanooli tilkadest. Sellega välditakse aine kontsentratsiooni ülehindamist veefaasis mikropiiskades leiduvate uuritava aine molekulide tõttu. Seepärast on aeglase segamise meetod eriti sobiv POW määramiseks ainetel, mille eeldatav log POW väärtus on 5 või suurem ja mille puhul loksutatava kolvi meetod (2) võib anda vale tulemuse.
                           
                        MÕISTED JA ÜHIKUD
                  
                              7.
                           
                           
                              Aine jaotuskoefitsient vee ja lipofiilse lahusti (1-oktanool) vahel iseloomustab kemikaali tasakaalulist jaotumist kahe faasi vahel. Aine jaotuskoefitsient vee ja lipofiilse lahusti (1-oktanool) vahel (POW) on suhe, mis saadakse veega küllastunud 1-oktanooli faasis oleva uuritava aine tasakaalulise kontsentratsiooni (CO) jagamisel 1-oktanooliga küllastunud veefaasis oleva uuritava aine tasakaalulise kontsentratsiooniga (CW).
                              
                                 
                              Kuna jaotustegur on kontsentratsioonide suhe, on see mõõtühikuta suurus. Enamasti väljendatakse seda kümnendlogaritmi kujul (log POW). POW sõltub temperatuurist, sellepärast tuleb andmete esitamisel märkida ka mõõtmistemperatuur.
                           
                        MEETODI PÕHIMÕTE
                  
                              8.
                           
                           
                              Jaotuskoefitsiendi määramiseks tasakaalustatakse püsival temperatuuril omavahel vesi, 1-oktanool ja uuritav aine. Seejärel määratakse uuritava aine kontsentratsioon mõlemas faasis.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Siin kirjeldatavas aeglase segamise katses on võimalik vähendada eksperimentaalseid raskusi, mida loksutatava kolvi katses põhjustab mikropiiskade tekkimine. Aeglase segamise katses tasakaalustatakse vesi, 1-oktanool ja uuritav aine termostateeritavas ja segajaga varustatud katsenõus. Aine jaotumist faaside vahel kiirendab segamine. Segamine tekitab piiratud turbulentsi, mis kiirendab jaotumist 1-oktanooli ja vee vahel, kuid seejuures ei teki mikropiisku (1).
                           
                        KATSE RAKENDATAVUS
                  
                              10.
                           
                           
                              Kuna lisandid võivad mõjutada uuritava aine aktiivsuskoefitsienti, määratakse jaotuskoefitsient ainult puhta aine jaoks. 1-oktanooli ja vee vahel jaotumise uurimisel tuleb kasutada müügilolevaid kõrgeima puhtusastmega kemikaale.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Käesolev meetod on rakendatav puhta aine korral, mis ei dissotsieeru, assotsieeru ega ole märkimisväärselt pindaktiivne. Meetodit võib kasutada selliste ainete ja nende segude 1-oktanooli ja vee vahel jaotumise suhte määramiseks. Kui meetodit kasutatakse segu puhul, on määratav 1-oktanooli ja vee vahel jaotumise suhe tinglik ja oleneb uuritava segu ning veefaasina kasutatava elektrolüüdi keemilisest koostisest. Täiendavate abinõude rakendamisel võib seda meetodit kasutada ka dissotsieeruvate või assotsieeruvate ühendite puhul (vt punkt 12).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Kuna dissotsieeruvate ainete, nagu orgaanilised happed, fenoolid, orgaanilised alused ja metallorgaanilised ühendid, jaotumisel 1-oktanooli ja vee vahel kujuneb vees ja 1-oktanoolis mitmeastmeline tasakaal, on jaotuskoefitsient süsteemis 1-oktanool-vesi tinglik konstant, mis sõltub tugevasti elektrolüüdi koostisest (7, 8). Seega eeldab jaotuskoefitsiendi määramine süsteemis 1-oktanool-vesi, et katse jooksul kontrollitakse pH väärtust ja elektrolüüdi koostist ning esitatakse need andmed. Nende jaotuskoefitsientide hinnangulise väärtuse saamiseks kasutatakse eksperdihindamist. Dissotsiatsioonikonstandi (-konstantide) alusel valitakse sobivad pH väärtused, et määrata iga ionisatsiooniastme jaotuskoefitsient. Metallorgaaniliste ühendite jaotumise uurimisel kasutatakse puhvreid, mis ei moodusta komplekse (8). Arvestades vesilahuste keemia andmeid (komplekside moodustumise tasakaalukonstandid, dissotsiatsioonikonstandid), valitakse katsetingimused nii, et oleks võimalik hinnata, millises vormis on uuritav aine veefaasis. Kõikide katsete puhul luuakse taustelektrolüüdi abil ühesugune ioonne jõud.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Vees vähe lahustuvate või suure POW väärtusega ainete jaotuskoefitsiendi määramist võib raskendada see, et aine väikest kontsentratsiooni vees on raske täpselt määrata. Käesolevas metoodikas antakse juhendeid, kuidas seda probleemi lahendada.
                           
                        ANDMED UURITAVA AINE KOHTA
                  
                              14.
                           
                           
                              Keemilised reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad või veelgi kõrgema puhtusastmega. Uuritava ainena soovitatakse kasutada teadaoleva keemilise koostisega vähemalt 99-protsendilise puhtusastmega radioaktiivse märgiseta aineid või teadaoleva keemilise koostise ja radiokeemilise puhtusastmega radioaktiivselt märgistatud aineid. Kui märgise poolestusaeg on lühike, tehakse isotoobi lagunemist arvestav parand. Radioaktiivse märgisega uuritava aine puhul tuleb ainespetsiifilise analüüsimeetodiga tõendada, et mõõdetav radioaktiivsus on otse seotud uuritava ainega.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              log POW hinnangu saamiseks võib kasutada müügilolevat log POW hindamiseks ette nähtud tarkvara või kasutada kummaski lahustis lahustuvuste suhet.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Enne aeglase segamise katse korraldamist POW määramiseks peaks uuritava aine kohta teadma järgmist:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          struktuurivalem,
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          analüüsimeetodid, mis sobivad uuritava aine kontsentratsiooni määramiseks vees ja 1-oktanoolis,
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          ioniseeruva aine dissotsiatsioonikonstandid (OECD juhis 112 (9)),
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          lahustuvus vees (10),
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          abiootiline hüdrolüüs (11),
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          kiire biolagunduvus (12),
                                       
                                    
                                          g)
                                       
                                       
                                          aururõhk (13).
                                       
                                    
                        MEETODI KIRJELDUS
                  
                     Seadmed ja aparatuur
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Vaja on harilikku laborivarustust, eeskätt järgmisi vahendeid:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          magnetsegajad ja tefloniga kaetud segamispulgad, mida kasutatakse veefaasi segamiseks;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analüüsiseadmed, mis võimaldavad määrata uuritava aine eeldatavaid kontsentratsiooni väärtusi;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          katsenõu, mille põhja juures on kraan. Olenevalt log POW hinnangulisest väärtusest ja uuritava aine avastamise lävest tuleb vajaduse korral kasutada suuremat kui üheliitrise mahuga, kuid samasuguse kujuga katsenõu, et saaks võtta piisava koguse vett uuritava aine keemiliseks eraldamiseks ja määramiseks. Nii saadakse aine veest eraldamisel suurema sisaldusega kontsentraat ja usaldusväärsem analüüsi tulemus. 1. liite tabelis on esitatud vajaliku minimaalse mahu hinnangud, uuritava aine avastamise läved, hinnangulised log POW väärtused ja lahustuvused vees. Tabel põhineb Pinsuwani jt (14) esitatud seosel ühelt poolt log POW ning teiselt poolt oktanoolis ja vees lahustuvuse (S) suhte vahel:
                                          
                                             
                                          kus
                                          
                                              (väljendatud molaarsustes),
                                          ning Lymani (15) esitatud valemil, mis võimaldab ennustada vesilahustuvust. 1. liites esitatud valemi abil arvutatud vesilahustuvust tuleb käsitada esialgse hinnanguna. Tuleb märkida, et käesoleva meetodi kasutaja võib hinnata vesilahustuvust ka mis tahes muu valemi abil, kui ta arvab, et see kajastab hüdrofoobsuse ja lahustuvuse seost paremini. Näiteks tahkete ühendite puhul on soovitatav lahustuvuse hindamisel arvestada ka sulamistemperatuuri. Kui kasutatakse modifitseeritud valemit, tuleb kontrollida, kas valem lahustuvuse arvutamiseks oktanoolis ikkagi kehtib. 2. liites on skemaatiliselt kujutatud klaasist veesärgiga katsenõu mahuga umbes üks liiter. 2. liites kujutatud nõu proportsioonid on osutunud sobivaks ja muu mahuga nõu peaks olema samasuguse kujuga;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          oluline on sellise seadme olemasolu, mis hoiab aeglase segamise katse jooksul püsivat temperatuuri.
                                       
                                    
                        
                              18.
                           
                           
                              Nõud peavad olema valmistatud inertsest materjalist, et adsorptsioon nõu pinnale oleks tähtsusetu.
                           
                        
                     Katselahuste valmistamine
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              POW määramiseks kasutatakse müügilolevat suurima puhtusastmega (vähemalt üle 99 %) 1-oktanooli. 1-oktanool soovitatakse puhastada happe, aluse ja veega ekstraheerimise abil ning seejärel kuivatada. Lisaks sellele võib 1-oktanooli puhastada destilleerimisega. Puhastatud 1-oktanooli kasutatakse uuritava aine standardlahuste valmistamiseks. POW määramiseks kasutatav vesi peab olema destilleeritud klaas- või kvartsklaasist seadme abil, saadud puhastussüsteemist või olema kõrgefektiivse vedelikkromatograafia puhul nõutava puhtusega. Destilleeritud vesi filtritakse läbi filtri, mille poori suurus on 0,22 μm, ja tehakse pimekatsed, millega kontrollitakse, et kontsentreeritud ekstraktis ei oleks uuritava aine käitumist mõjutavaid lisandeid. Klaaskiudfiltri kasutamisel puhastatakse see eelnevalt kuumutamisega vähemalt kolme tunni jooksul 400 °C juures.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Enne katset küllastatakse mõlemad lahustid vastastikku, tasakaalustades neid piisavalt suures nõus. Selleks segatakse kahefaasilist süsteemi aeglaselt kahe ööpäeva jooksul.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Valitakse vajalik uuritava aine kontsentratsioon ja aine lahustatakse veega küllastunud 1-oktanoolis. Jaotuskoefitsient süsteemis 1-oktanool-vesi tuleb määrata lahja 1-oktanool- ja vesilahuse jaoks. Sellepärast ei tohi uuritava aine kontsentratsioon ületada 70 % selle lahustuvusest kummaski faasis ega olla suurem kui 0,1 (1). Katses kasutatavas 1-oktanooli lahuses ei tohi olla uuritava aine hõljuvaid tahkeid osakesi.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Vajalik kogus uuritavat ainet lahustatakse veega küllastunud 1-oktanoolis. Kui võib arvata, et log POW väärtus on suurem kui viis, tuleb hoolikalt jälgida, et katses kasutatavad 1-oktanooli lahused ei sisaldaks uuritava aine hõljuvaid tahkeid osakesi. Nende ainete puhul, mille log POW > 5, toimitakse seepärast järgmisel viisil:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          uuritav aine lahustatakse veega küllastunud 1-oktanoolis;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          lahusel lastakse piisavalt kaua seista, et hõljuv aine sadestuks. Sadestumise ajal jälgitakse uuritava aine kontsentratsiooni;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kui 1-oktanooli lahuses mõõdetav kontsentratsioon on saavutanud püsiva väärtuse, lahjendatakse põhilahus vajaliku mahu 1-oktanooli lisamisega;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          mõõdetakse lahjendatud põhilahuse kontsentratsioon. Lahjendatud põhilahust võib aeglase segamise katses kasutada, kui mõõdetud kontsentratsiooni väärtus vastab lahjendusele.
                                       
                                    
                        
                     Proovide ekstraheerimine ja analüüsimine
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Uuritava aine määramiseks kasutatakse valideeritud analüüsimeetodit. Uurija peab esitama tõendid, et katses kasutatavad uuritava aine kontsentratsioonid veega küllastunud 1-oktanoolis ja 1-oktanooliga küllastunud vees on suuremad kui kasutatava analüüsimeetodi mõõtmislävi. Kui on vaja kasutada ekstraheerimismeetodit, tuleb enne katset kindlaks teha vee faasis ja 1-oktanooli faasis oleva uuritava aine analüütilise määramise saagis. Analüüsiks kasutatava signaali tugevus peab olema parandatud pimekatses saadud signaali arvestamiseks; hoolikalt jälgitakse, et analüüsitavat ainet ei kantaks üle ühest proovist teise.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Kuna hüdrofoobse uuritava aine kontsentratsioon vee faasis on väike, on vee faasi enne analüüsi tõenäoliselt vaja ekstraheerida orgaanilise lahustiga ja ekstrakti kontsentreerida. Samal põhjusel on vaja kontsentreerida võimalikke pimekatseid. Selleks tuleb kasutada kõrgpuhtaid lahusteid, eelistatavalt selliseid, mis sobivad kasutamiseks jääkide analüüsis. Töötamine hoolikalt puhastatud (lahustiga pestud või kõrgel temperatuuril kuumutatud) klaasnõudega aitab vältida ühe proovi saastamist teise prooviga.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              log POW hinnangulise väärtuse saamiseks võib kasutada hindamisprogrammi või eksperdihindamist. Kui hinnangu järgi on väärtus suurem kui kuus, tuleb pimekatse parandite arvestamisel ja analüüsitava aine võimaliku ülekande vältimisel olla eriti hoolikas. Kui hinnanguline log POW on suurem kui kuus, tuleb määramise saagist arvestava parandi saamiseks kasutada asendavat standardainet, nii et oleks võimalik saavutada suurt eelkontsentreerimistegurit. Müügil on mitu POW hindamiseks ette nähtud tarkvaraprogrammi, (1) nt Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) ja ACD log P (19). Hindamisviise on kirjeldatud publikatsioonides 20–22.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Tunnustatud meetodite abil tehakse kindlaks uuritava aine mõõtmisläve väärtused 1-oktanoolis ja vees. Rusikareeglina võib meetodi mõõtmisläve määratleda kui uuritava aine sellist kontsentratsiooni vees või 1-oktanoolis, mille puhul signaali ja müra taseme suhe on kümme. Valitakse sobiv ekstraheerimise ja eelkontsentreerimise meetod ning leitakse analüütilise määramise saagis. Analüütiliseks määramiseks vajaliku tugevusega signaali saamiseks valitakse sobiv eelkontsentreerimistegur.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Analüüsimeetodi parameetrite ja oodatavate kontsentratsioonide alusel määratakse kindlaks ligikaudne proovi maht, mis on vajalik uuritava aine täpseks määramiseks. Tuleb vältida liiga väikeste veeproovide kasutamist, mis ei anna piisavalt tugevat analüütilist signaali. Tuleb hoiduda ka ülemäära suurte veeproovide võtmisest, kuna sel juhul võib vett mitte jätkuda nõutava minimaalse arvu (n = 5) analüüside tegemiseks. 1. liites on esitatud proovi väikseima mahu sõltuvus nõu mahust, uuritava aine avastamise lävest ja lahustuvusest.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Uuritava aine sisaldus mõõdetakse selle aine kaliibrimiskõveraga võrdlemise teel. Standardproovide kontsentratsioonivahemik peab ulatuma uuritava proovi kontsentratsioonist mõlemale poole.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Kui uuritava aine hinnanguline log POW väärtus on suurem kui kuus, tuleb enne ekstraheerimist lisada veeproovile asendavat standardainet, et osata arvesse võtta kadusid veeproovi ekstraheerimisel ja eelkontsentreerimisel. Määramise saagist arvestava parandi õige väärtuse saamiseks peavad asendava standardaine omadused olema uuritava aine omadustega väga sarnased või identsed. Selleks kasutatakse eelistatavalt (stabiilsete) isotoopidega (nt deuteerium või 13C) märgistatud uuritava aine analooge. Kui stabiilsete isotoopidega (nt deuteerium või 13C) märgistatud analooge kasutada ei saa, tuleb usaldusväärsete kirjandusandmete põhjal näidata, et asendava standardaine füüsikalis-keemilised omadused on väga sarnased uuritava aine omadustega. Vee faasi ekstraheerimisel lahustiga võib moodustuda emulsioon. Emulsiooni vähendamiseks võib lisada soola ja lasta faasidel eralduda järgmise päevani. Ekstraheerimiseks ja proovide eelkontsentreerimiseks kasutatud meetodid märgitakse katseprotokolli.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Vajaduse korral võib enne analüüsi 1-oktanooli faasist võetud proovi lahjendada sobiva lahustiga. Asendava standardaine lisamine saagist arvestava parandi saamiseks on soovitatav ka siis, kui uuritava aine saagisekatsete tulemused on väga varieeruvad (suhteline standardhälve > 10 %).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Analüüsimeetodi üksikasjad märgitakse katseprotokolli. Nende hulka kuuluvad ekstraheerimismeetod, eelkontsentreerimis- ja lahjendustegur, analüüsiseadme parameetrid, kaliibrimismeetod, kaliibrimise kontsentratsioonivahemik, vee faasis oleva uuritava aine määramise saagis, asendava standardaine lisamine saagist arvestava parandi saamiseks, fooni tase, avastamislävi ja mõõtmislävi.
                           
                        
                     Katse läbiviimine
                  
                  
                     Optimaalne 1-oktanooli ja vee mahu suhe
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Vee ja 1-oktanooli mahtude valimisel tuleb arvestada mõõtmisläve väärtust 1-oktanoolis ja vees, veeproovide puhul kasutatavaid eelkontsentreerimistegureid, 1-oktanooli ja vee prooviks võetavaid koguseid ja eeldatavaid kontsentratsioone. Tehnilistel põhjustel valitakse 1-oktanooli maht aeglaselt segatavas süsteemis selliselt, et 1-oktanooli kiht oleks küllalt paks (üle 0,5 cm), nii et 1-oktanooli faasist saaks võtta proovi seda faasi häirimata.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Ühendite puhul, mille log POW on 4,5 või suurem, kasutatakse tavaliselt järgmist faaside suhet: üheliitrisse nõusse pannakse 950–980 ml vett ja 20–50 ml 1-oktanooli.
                           
                        
                     Katsetingimused
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Katse ajal termostateeritakse katsenõu nii, et temperatuurikõikumised on väiksemad kui 1 °C. Katse tuleb teha 25 °C juures.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Katsesüsteemi kaitsmiseks päevavalguse eest tehakse katse pimedas ruumis või kaetakse katsenõu alumiiniumfooliumiga.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Katse tehakse võimalikult tolmuvabas keskkonnas.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              1-oktanooli ja vee süsteemi segatakse tasakaalu saabumiseni. Tasakaalustamisaja hindamiseks tehakse eeluuring, mille jooksul süsteemi segatakse aeglaselt ning võetakse perioodiliselt 1-oktanoolist ja veest proove. Proove võetakse mitte sagedamini kui viie tunni tagant.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Iga POW määramiseks tehakse vähemalt kolm sõltumatut aeglase segamise katset.
                           
                        
                     Tasakaalustamisaja määramine
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Eeldatakse, et tasakaal on saabunud, kui 1-oktanooli faasi ja veefaasi kontsentratsioonide suhte ja aja regressioonisirge tõus nelja järjestikuse proovivõtu ulatuses ei erine oluliselt nullist usaldusnivool 0,05. Enne proovivõtu alustamist tasakaalustatakse süsteemi vähemalt üks ööpäev. Kogemused näitavad, et kui aine hinnanguline log POW väärtus on alla viie, saab proovid võtta teisel ja kolmandal päeval. Hüdrofoobsemate ühendite puhul võib tasakaalustamine kesta kauem. Ühendi puhul, mille log POW väärtus on 8,23 (dekaklorobifenüül), oli piisav tasakaalustamisaeg 144 tundi. Tasakaalu hindamiseks võetakse korduvalt proove ühest nõust.
                           
                        
                     Katse alustamine
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Katse alguses täidetakse katsenõu veega, mis on küllastunud 1-oktanooliga. Püsiva temperatuuri saavutamiseks termostateeritakse katsenõu piisava aja jooksul.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Katsenõusse lisatakse ettevaatlikult vajalik kogus uuritavat ainet, mis on eelnevalt lahustatud sobivas mahus veega küllastunud 1-oktanoolis. See etapp on väga oluline, kuna siin tuleb vältida kahe faasi turbulentset segunemist. Selleks võib 1-oktanooli faasi lisada aeglaselt pipetiga, hoides pipetti vastu katsenõu seina veefaasi pinna läheduses. 1-oktanooli faas voolab mööda klaasseina, moodustades veefaasi peale kihi. Mingil juhul ei tohi 1-oktanooli kallata otse katsenõusse; 1-oktanooli tilgad ei tohi kukkuda otse vette.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Pärast segamise alustamist tõstetakse segamise kiirust aeglaselt. Kui segaja mootorit ei saa vajalikul määral reguleerida, tuleb kasutada trafot. Segamise kiirus reguleeritakse selliseks, et vee ja 1-oktanooli piirpinnal tekiks 0,5–2,5 cm sügavune keeris. Kui keerise sügavus ületab 2,5 cm, tuleb segamise kiirust vähendada; vastasel korral võivad 1-oktanooli tilkadest veefaasis tekkida mikropiisakesed, mille tagajärjel uuritava aine kontsentratsiooni vees hinnatakse tegelikust suuremaks. Maksimaalselt 2,5 cm sügavusele keerisele vastavat segamiskiirust soovitatakse laboritevaheliste võrdluskatsete tulemuste alusel (5). See on kompromiss, mis võimaldab 1-oktanooli mikropiiskade tekke piiramisega samal ajal süsteemi kiiresti tasakaalustada.
                           
                        
                     Proovi võtmine ja ettevalmistamine
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Enne proovi võtmist peatatakse segaja ja oodatakse, kuni vedelike liikumine lakkab. Kui proovid on võetud, pannakse segaja uuesti aeglaselt tööle, nagu eespool kirjeldatud, ja seejärel suurendatakse järk-järgult segamise kiirust.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Vee proove võetakse katsenõu alumises osas oleva kraani kaudu. Kraani sees olev tasakaalustamata veekogus visatakse alati ära (2. liites kujutatud nõu puhul on selle maht umbes 5 ml). Kraani sees olev vesi ei segune ülejäänud faasiga ega ole sellepärast tasakaalus. Registreeritakse veeproovide mahud ja jälgitakse, et massibilansi koostamisel võetaks arvesse ka äravisatud vees leiduv uuritava aine kogus. Aurumiskao vähendamiseks lastakse veel rahulikult voolata jaotuslehtrisse, nii et vee- ja 1-oktanoolikihi olekut ei häiritaks.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              1-oktanooli proove võetakse 1-oktanooli kihist väikeste alikvootide (umbes 100 μl) kaupa 100-mikroliitrise tervenisti klaasist ja metallist süstla abil. Seejuures jälgitakse, et ei häiritaks faasidevahelist piirpinda. Registreeritakse proovide mahud. Väiksest alikvoodist piisab, kuna 1-oktanooli proovi lahjendatakse.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Tuleb vältida asjatuid proovi ülekandmisi. Seepärast määratakse proovi maht gravimeetriliselt. Veeproovi puhul saab seda teha nii, et proov võetakse jaotuslehtrisse, millesse on enne pandud vajalik kogus lahustit.
                           
                        KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE
                  
                              47.
                           
                           
                              Käesoleva katsemetoodika kohaselt tehakse POW määramiseks uuritava ainega ühesugustes tingimustes kolm aeglase segamise katset (kolm paralleelkatset). Tasakaalu saavutamist näitav regressioonikõver peab põhinema CO/CW määramisel vähemalt neljas järjestikuses eri aegadel võetud proovis. See võimaldab arvutada dispersiooni, mis iseloomustab paralleelkatsetest leitud keskväärtuse määramatust.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              POW väärtust võib iseloomustada igast paralleelkatsest saadud andmete dispersiooni abil. Neid andmeid kasutatakse kaalutud keskmise POW väärtuse arvutamiseks üksikute paralleelkatsete tulemuste alusel. Selleks kasutatakse statistilise kaaluna paralleelkatsete tulemuste dispersiooni pöördväärtust. Suure hajuvusega (suure dispersiooniga) ja seega vähem usaldatavad andmed mõjutavad kaalutud keskmist tulemust vähem kui väiksema dispersiooniga andmed.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Samal viisil arvutatakse ka kaalutud standardhälve. See iseloomustab POW määramise korratavust. Kaalutud standardhälbe väike väärtus näitab, et POW määramise tulemus on ühes ja samas laboratooriumis hästi korratav. Järgnevalt on kirjeldatud katseandmete formaalstatistilist analüüsi.
                           
                        
                     Tulemuste töötlemine
                  
                  
                     Tasakaalu saavutamise näitamine
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Iga proovivõtuhetke jaoks arvutatakse 1-oktanoolis ja vees määratud uuritava aine kontsentratsioonide suhte logaritm (log CO/CW). Tasakaalu saavutamise näitamiseks ehitatakse graafik, mis kajastab selle suhte sõltuvust ajast. Kui vähemalt nelja proovi tulemused moodustavad graafikul platoo, tähendab see, et tasakaal on saavutatud ja uuritav aine on 1-oktanoolis tõesti lahustunud. Kui kõnesolevat platood ei ole, jätkatakse katset, kuni nelja järjestikuse proovi tulemused annavad tõusu, mis ei erine oluliselt 0-st usaldusnivool 0,05, näidates, et log CO/CW ei sõltu ajast.
                           
                        
                     Log POW arvutamine
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Iga paralleelkatse log POW saamiseks arvutatakse kaalutud keskmine log CO/CW väärtus kõvera log CO/CW
                                 vs. aeg tasakaaluolekule vastaval osal. Kaalutud keskmise arvutamisel kaalutakse katseandmeid dispersiooni pöördväärtusega; selle tulemusena on katseandmete mõju lõpptulemusele pöördvõrdeline nende määramatusega.
                           
                        
                     Keskmine log POW
                     
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              log POW keskväärtuse arvutamiseks eri paralleelkatsete keskväärtustest leitakse vastavate dispersioonidega kaalutud paralleelkatsete tulemuste keskmine.
                              Arvutused tehakse järgmiselt:
                              
                                 
                              kus
                              
                                          log POW,i
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          on paralleelkatses i leitud log POW väärtus,
                                       
                                    
                                          log POW,Av
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          on üksikutes paralleelkatsetes määratud log POW väärtuste kaalutud keskmine,
                                       
                                    
                                          wi
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          on paralleelkatses i log POW väärtusele omistatud statistiline kaal.
                                       
                                    Statistilise kaaluna wi kasutatakse log POW,i dispersiooni pöördväärtust ().
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              log POW keskväärtuse viga hinnatakse tasakaaluolekus üksikutes paralleelkatsetes määratud log CO/CW väärtuste korratavuse järgi. See väljendatakse log POW,Av kaalutud standardhälbena (σlog Pow,Av), mis omakorda on log POW,Av väärtusega seotud vea mõõt. Kaalutud standardhälbe võib arvutada kaalutud dispersioonist (varlog Pow,Av) järgmisel viisil:
                              
                                 
                              
                                 
                              n on paralleelkatsete arvu tähis.
                           
                        
                     Katseprotokoll
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uuritav aine:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tavanimetus, keemiline nimetus, CASi number, struktuurivalem (mis näitab märgistuse asukohta, kui kasutatakse radioaktiivselt märgistatud ainet) ja olulised füüsikalis-keemilised omadused (vt punkt 17);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uuritava aine puhtusaste (lisandid);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      märgistatud kemikaali märgise puhtus ja molaarne aktiivsus (vajaduse korral);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      log POW esialgne hinnanguline väärtus ja selle tuletusviis.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katsetingimused:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uuringu kuupäevad;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      katsetemperatuur;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      1-oktanooli ja vee maht katse alguses;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      võetud 1-oktanooli ja vee proovide maht;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pärast proovide võtmist katsenõusse jäänud 1-oktanooli ja vee maht;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      katsenõu ja segamistingimuste kirjeldus (segamispulga ja katsenõu ehitus, keerise sügavus millimeetrites ja segamiskiirus, kui see on teada);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uuritava aine määramiseks kasutatud analüüsimeetod ja selle meetodi mõõtmislävi;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      proovivõtuajad;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vee faasi ja kasutatud puhvrite pH (kui ioniseeruvate molekulide tõttu reguleeriti pH väärtust);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      paralleelkatsete arv.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemused:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kasutatud analüüsimeetodi korratavus ja tundlikkus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      1-oktanoolis ja vees määratud uuritava aine kontsentratsioonide sõltuvus ajast;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      massibilansi kontroll;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      katsetemperatuur ja selle standardhälve või katsetemperatuuri vahemik;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kontsentratsioonide suhte ja aja seost kajastav regressioonikõver;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      keskväärtus log POW,Av ja selle standardhälve;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tulemuste arutelu ja tõlgendus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      representatiivse analüüsi originaalarvandmete näidis (hea laboritava kohaselt säilitatakse kõik originaalandmed), kaasa arvatud asendavate standardainete saagised, kaliibrimisel kasutatud kontsentratsioonide arv (koos kaliibrimiskõvera korrelatsioonikordaja kriteeriumidega) ning kvaliteedi tagamise ja/või kontrolli tulemused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kui on olemas, siis: mõõtmismeetodi valideerimisaruanne (esitatakse kirjandusviitena).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     KIRJANDUS
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the ’slow-stirring’ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499–512.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk A.8. Jaotuskoefitsient.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk A.8. Jaotuskoefitsient.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596–2602.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paris.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk A.6. Lahustuvus vees.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk C.7. Lagunemine – abiootiline lagunemine hüdrolüüsi teel sõltuvalt pH-st.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk C.4, II–VII osa (meetodid A–F). Kiire biolagunevuse määramine.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk A.4. Aururõhk.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623–626.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2–1 to 2–52.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA.
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.
                           
                        
                              19)
                           
                           
                              ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001.
                           
                        
                              20)
                           
                           
                              Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C.
                           
                        
                              21)
                           
                           
                              Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479–488.
                           
                        
                              22)
                           
                           
                              Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386–390.
                           
                        
                     1. liide
                     
                        Eri log POW väärtusega uuritavate ainete veefaasis määramiseks vajalike vee miinimumkoguste arvutamise tabel
                     
                     Eeldused
                     
                                 —
                              
                              
                                 Ühe alikvoodi maksimaalne maht on 10 % üldmahust, 5 alikvooti on 50 % üldmahust.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Uuritava aine kontsentratsioon on 70 % lahustuvusest kummaski faasis. Väiksema kontsentratsiooni puhul on vaja kasutada veel suuremat mahtu.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Avastamisläve juures määramiseks vajalik maht on 100 ml.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Uuritavatel ainetel on mõistlikud log Pow
                                    vs. log Sw ja log Pow
                                    vs. SR (Soct/Sw) sõltuvused.
                              
                           
                        Sw hindamine
                     
                     
                                 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Võrrand
                              
                              
                                 log Sw
                                 
                              
                              
                                 Sw (mg/l)
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 0,496
                              
                              
                                 3,133E+00
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 0,035
                              
                              
                                 1,084E+00
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –0,426
                              
                              
                                 3,750E–01
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –0,887
                              
                              
                                 1,297E–01
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –1,348
                              
                              
                                 4,487E–02
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –1,809
                              
                              
                                 1,552E–02
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –2,270
                              
                              
                                 5,370E–03
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –2,731
                              
                              
                                 1,858E–03
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –3,192
                              
                              
                                 6,427E–04
                              
                           
                        Soct hindamine
                     
                     
                                 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Võrrand
                              
                              
                                 Soct (mg/l)
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 3,763E+04
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 4,816E+04
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 6,165E+04
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 7,890E+04
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,010E+05
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,293E+05
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,654E+05
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 2,117E+05
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 2,710E+05
                              
                           
                        
                     
                                 Uuritava aine üldmass
                                 (mg)
                              
                              
                                 Massoct/MassH2O
                                 
                              
                              
                                 MassH2O
                                 
                                 (mg)
                              
                              
                                 KontsH2O
                                 
                                 (mg/l)
                              
                              
                                 Massoct
                                 
                                 (mg)
                              
                              
                                 Kontsoct
                                 
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 1 319
                              
                              
                                 526
                              
                              
                                 2,5017
                              
                              
                                 2,6333
                              
                              
                                 1 317
                              
                              
                                 26 333
                              
                           
                                 1 686
                              
                              
                                 1 664
                              
                              
                                 1,0127
                              
                              
                                 1,0660
                              
                              
                                 1 685
                              
                              
                                 33 709
                              
                           
                                 2 158
                              
                              
                                 5 263
                              
                              
                                 0,4099
                              
                              
                                 0,4315
                              
                              
                                 2 157
                              
                              
                                 43 149
                              
                           
                                 2 762
                              
                              
                                 16 644
                              
                              
                                 0,1659
                              
                              
                                 0,1747
                              
                              
                                 2 762
                              
                              
                                 55 230
                              
                           
                                 3 535
                              
                              
                                 52 632
                              
                              
                                 0,0672
                              
                              
                                 0,0707
                              
                              
                                 3 535
                              
                              
                                 70 691
                              
                           
                                 4 524
                              
                              
                                 1664 36
                              
                              
                                 0,0272
                              
                              
                                 0,0286
                              
                              
                                 4 524
                              
                              
                                 90 480
                              
                           
                                 5 790
                              
                              
                                 5263 16
                              
                              
                                 0,0110
                              
                              
                                 0,0116
                              
                              
                                 5 790
                              
                              
                                 115 807
                              
                           
                                 7 411
                              
                              
                                 1 664 357
                              
                              
                                 0,0045
                              
                              
                                 0,0047
                              
                              
                                 7 411
                              
                              
                                 148 223
                              
                           
                                 9 486
                              
                              
                                 5 263 158
                              
                              
                                 0,0018
                              
                              
                                 0,0019
                              
                              
                                 9 486
                              
                              
                                 189 713
                              
                           
                        Mahtude arvutamine
                     
                     
                        Veefaasi väikseim vajalik maht avastamisläve eri väärtuste korral
                     
                     
                                 log Kow
                                 
                              
                              
                                 Avastamislävi (mikrogramm/l)
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,00
                              
                              
                                 10
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,04
                              
                              
                                 0,38
                              
                              
                                 3,80
                              
                              
                                 38
                              
                              
                                 380
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,09
                              
                              
                                 0,94
                              
                              
                                 9,38
                              
                              
                                 94
                              
                              
                                 938
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,23
                              
                              
                                 2,32
                              
                              
                                 23,18
                              
                              
                                 232
                              
                              
                                 2 318
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,57
                              
                              
                                 5,73
                              
                              
                                 57,26
                              
                              
                                 573
                              
                              
                                 5 726
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,41
                              
                              
                                 14,15
                              
                              
                                 141
                              
                              
                                 1 415
                              
                              
                                 14 146
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 3,50
                              
                              
                                 34,95
                              
                              
                                 350
                              
                              
                                 3 495
                              
                              
                                 34 950
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 8,64
                              
                              
                                 86,35
                              
                              
                                 864
                              
                              
                                 8 635
                              
                              
                                 86 351
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 21,33
                              
                              
                                 213
                              
                              
                                 2 133
                              
                              
                                 21 335
                              
                              
                                 213 346
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 52,71
                              
                              
                                 527
                              
                              
                                 5 271
                              
                              
                                 52 711
                              
                              
                                 527 111
                              
                           
                                 Avastamisläve juures määramiseks vajalik maht (l)
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                        Selgitused arvutuste kohta
                     
                     Vastab vähem kui 10 protsendile veefaasi üldmahust, 1-liitrine katsenõu tasakaalustamiseks.
                     Vastab vähem kui 10 protsendile veefaasi üldmahust, 2-liitrine katsenõu tasakaalustamiseks.
                     Vastab vähem kui 10 protsendile veefaasi üldmahust, 5-liitrine katsenõu tasakaalustamiseks.
                     Vastab vähem kui 10 protsendile veefaasi üldmahust, 10-liitrine katsenõu tasakaalustamiseks.
                     Ületab 10 % isegi 10-liitrise katsenõu mahust.
                     
                        Vajaliku mahu sõltuvus lahustuvusest vees ja log POW väärtusest
                     
                     Veefaasi väikseim vajalik maht avastamisläve eri väärtuste korral (ml)
                     
                                 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Sw (mg/l)
                              
                              
                                 Avastamislävi (mikrogramm/l) →
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,00
                              
                              
                                 10
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,12
                              
                              
                                 1,19
                              
                              
                                 11,90
                              
                              
                                 118,99
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,02
                              
                              
                                 0,24
                              
                              
                                 2,38
                              
                              
                                 23,80
                              
                              
                                 237,97
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 3
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,04
                              
                              
                                 0,40
                              
                              
                                 3,97
                              
                              
                                 39,66
                              
                              
                                 396,62
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,12
                              
                              
                                 1,19
                              
                              
                                 11,90
                              
                              
                                 118,99
                              
                              
                                 1 189,86
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,02
                              
                              
                                 0,20
                              
                              
                                 2,03
                              
                              
                                 20,34
                              
                              
                                 203,37
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                 0,51
                              
                              
                                 5,08
                              
                              
                                 50,84
                              
                              
                                 508,42
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,02
                              
                              
                                 10,17
                              
                              
                                 101,68
                              
                              
                                 1 016,83
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,20
                              
                              
                                 2,03
                              
                              
                                 20,34
                              
                              
                                 203,37
                              
                              
                                 2 033,67
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,09
                              
                              
                                 0,87
                              
                              
                                 8,69
                              
                              
                                 86,90
                              
                              
                                 869,01
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,17
                              
                              
                                 1,74
                              
                              
                                 17,38
                              
                              
                                 173,80
                              
                              
                                 1 738,02
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,375
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,23
                              
                              
                                 2,32
                              
                              
                                 23,18
                              
                              
                                 231,75
                              
                              
                                 2 317,53
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,43
                              
                              
                                 4,35
                              
                              
                                 43,45
                              
                              
                                 434,51
                              
                              
                                 4 345,05
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 0,4
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,19
                              
                              
                                 1,86
                              
                              
                                 18,57
                              
                              
                                 185,68
                              
                              
                                 1 856,79
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,37
                              
                              
                                 3,71
                              
                              
                                 37,14
                              
                              
                                 371,36
                              
                              
                                 3 713,59
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,74
                              
                              
                                 7,43
                              
                              
                                 74,27
                              
                              
                                 742,72
                              
                              
                                 7 427,17
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,49
                              
                              
                                 14,85
                              
                              
                                 148,54
                              
                              
                                 1 485,43
                              
                              
                                 14 854,35
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,63
                              
                              
                                 6,35
                              
                              
                                 63,48
                              
                              
                                 634,80
                              
                              
                                 6 347,95
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,27
                              
                              
                                 12,70
                              
                              
                                 126,96
                              
                              
                                 1 269,59
                              
                              
                                 12 695,91
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 2,54
                              
                              
                                 25,39
                              
                              
                                 253,92
                              
                              
                                 2 539,18
                              
                              
                                 25 391,82
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 5,08
                              
                              
                                 50,78
                              
                              
                                 507,84
                              
                              
                                 5 078,36
                              
                              
                                 50 783,64
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 0,025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 2,17
                              
                              
                                 21,70
                              
                              
                                 217,02
                              
                              
                                 2 170,25
                              
                              
                                 21 702,46
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 4,34
                              
                              
                                 43,40
                              
                              
                                 434,05
                              
                              
                                 4 340,49
                              
                              
                                 43 404,93
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,006
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 9,04
                              
                              
                                 90,43
                              
                              
                                 904,27
                              
                              
                                 9 042,69
                              
                              
                                 90 426,93
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,003
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 18,09
                              
                              
                                 180,85
                              
                              
                                 1 808,54
                              
                              
                                 18 085,39
                              
                              
                                 180 853,86
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 0,006
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 7,73
                              
                              
                                 77,29
                              
                              
                                 772,89
                              
                              
                                 7 728,85
                              
                              
                                 77 288,50
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,003
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 15,46
                              
                              
                                 154,58
                              
                              
                                 1 545,77
                              
                              
                                 15 457,70
                              
                              
                                 154 577,01
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0015
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 23,19
                              
                              
                                 231,87
                              
                              
                                 2 318,66
                              
                              
                                 23 186,55
                              
                              
                                 231 865,51
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 46,37
                              
                              
                                 463,73
                              
                              
                                 4 637,31
                              
                              
                                 46 373,10
                              
                              
                                 463 731,03
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 0,002
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 19,82
                              
                              
                                 198,18
                              
                              
                                 1 981,77
                              
                              
                                 19 817,73
                              
                              
                                 198 177,33
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 39,64
                              
                              
                                 396,35
                              
                              
                                 3 963,55
                              
                              
                                 39 635,47
                              
                              
                                 396 354,66
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0005
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 79,27
                              
                              
                                 792,71
                              
                              
                                 7 927,09
                              
                              
                                 79 270,93
                              
                              
                                 792 709,32
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,00025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 158,54
                              
                              
                                 1 585,42
                              
                              
                                 15 854,19
                              
                              
                                 158 541,86
                              
                              
                                 1 585 418,63
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 33,88
                              
                              
                                 338,77
                              
                              
                                 3 387,68
                              
                              
                                 33 876,77
                              
                              
                                 338 767,72
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0005
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 67,75
                              
                              
                                 677,54
                              
                              
                                 6 775,35
                              
                              
                                 67 753,54
                              
                              
                                 677 535,44
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,00025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 135,51
                              
                              
                                 1 355,07
                              
                              
                                 13 550,71
                              
                              
                                 135 507,09
                              
                              
                                 1 355 070,89
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,000125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 271,01
                              
                              
                                 2 710,14
                              
                              
                                 27 101,42
                              
                              
                                 271 014,18
                              
                              
                                 2 710 141,77
                              
                           
                                 Avastamisläve juures määramiseks vajalik maht (l) on
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                  
                     2. liide
                     
                        Klaasist veesärgiga katsenõu POW määramiseks aeglase segamise katse abil
                     
                     
                        
                  ”
            
                  3)
               
               
                  Peatükk B.2 asendatakse järgmisega:
                  „B.2.   ÄGE MÜRGISUS SISSEHINGAMISEL
                  
                  SISSEJUHATUS
                  
                              1.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 403 (2009) (1). Esialgne sissehingamisel avalduvat ägedat mürgisust käsitlev katsejuhend nr 403 võeti vastu 1981. aastal. Käesolev läbivaadatud katsemeetod B.2 (mis on samaväärne katsejuhendi nr 403 läbivaadatud versiooniga) on koostatud suurema paindlikkuse tagamiseks, loomade kasutamise vähendamiseks ja regulatiivsete vajaduste täitmiseks. Läbivaadatud katsemeetod hõlmab kahte järgmist uuringu tüüpi: tavaline LC50 määramise eeskiri ja C × t (kontsentratsioon × aeg) määramise eeskiri. Käesoleva katsemeetodi peamised omadused on järgmised: meetod võimaldab määrata mõju sõltuvust kontsentratsioonist alates mitteletaalsest kuni letaalse mõjuni, et leida letaalne mediaankontsentratsioon (LC50), mitteletaalse kontsentratsiooni läviväärtus (näiteks LC01) ja kõvera tõus, ning määrata kindlaks mõju võimalik sõltuvus soost. C × t määramise eeskirja tuleks kasutada konkreetse regulatiivse või teadusliku vajaduse puhul, kui on vaja teha mitmesuguse kestusega loomkatsed, näiteks hädaolukorrale reageerimise kavandamiseks (nt akuutse kokkupuute näidistasemete (Acute Exposure Guideline Levels, AEGL) leidmine, hädaolukorras toimimise juhendite (Emergency Response Planning Guidelines, ERPG) kavandamine või akuutse kokkupuute läviväärtuste (Acute Exposure Threshold Levels, AETL) leidmine) või maakasutuse planeerimiseks.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Käesoleva katsemeetodi kohase katse tegemise ja tõlgendamise juhendid on esitatud sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse katse juhenddokumendis (juhenddokument nr 39) (2).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Käesoleva katsemeetodi kontekstis kasutatud mõisted on esitatud selle peatüki lõpus ja juhenddokumendis nr 39 (2).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod võimaldab iseloomustada uuritavat kemikaali, hinnata kvantitatiivselt riski ning määruse (EÜ) nr 1272/2008 (3) kohaselt järjestada ja klassifitseerida uuritavat kemikaali. Juhenddokumendis nr 39 (2) on esitatud juhendid ägeda mürgisuse uurimiseks sobiva katsemeetodi valimiseks. Kui soovitakse saada ainult klassifitseerimiseks ja märgistamiseks vajalikku teavet, soovitatakse üldiselt kasutada käesoleva lisa peatükis B.52 esitatud meetodit (4) (vt juhenddokument nr 39 (2)). Käesolev katsemeetod B.2 ei ole spetsiaalselt ette nähtud erimaterjalide, nagu vähe lahustuvad isomeetrilised või kiudmaterjalid või toodetud nanomaterjalid, uurimiseks.
                           
                        LÄHTEKAALUTLUSED
                  
                              5.
                           
                           
                              Enne käesoleva katsemeetodi kohase katse tegemist peaks uurimislabor läbi vaatama kogu olemasoleva teabe uuritava kemikaali kohta, sh tehtud uuringud (näiteks käesoleva lisa peatükk B.52 (4)), mille andmete abil oleks võimalik täiendava katse tegemisest loobuda, et minimeerida loomade kasutust. Teave, mis võib aidata valida katseks kõige sobivama liigi, liini, soo, kokkupuuteviisi ja sobivad uuritavad kontsentratsioonid, hõlmab järgmist: uuritava kemikaali keemiline nimetus, struktuur ja füüsikalis-keemilised omadused; mis tahes in vitro või in vivo mürgisuse katsete tulemused; eeldatavad kasutusvaldkonnad ja inimestega kokkupuute võimalused; olemasolevad (kvantitatiivsete) struktuuri-aktiivsuse sõltuvuste ((Q)SAR) andmed ja toksikoloogilised andmed samalaadse struktuuriga ainete kohta (vt juhenddokument nr 39 (2)).
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Võimaluste piires tuleks vältida söövitava ja/või ärritava kemikaali katsetamist kontsentratsioonil, mis eeldatavasti põhjustab suurt valu ja/või kannatusi. Söövitava/ärritava mõju võimalust tuleks hinnata eksperdihindamise abil, kasutades selliseid tõendeid nagu inimeste kogemused ja varasemad loomkatsete andmed (näiteks korduvdoosi uuringutest, mis on tehtud mittesöövitava/-ärritava kontsentratsiooniga), olemasolevad in vitro andmed (näiteks käesoleva lisa peatükid B.40 (5) ja B.40a (6) või OECD katsejuhend nr 435 (7)), pH-väärtused, teave samalaadsete ainete kohta või iga muu asjakohane teave, et hinnata, kas täiendavast katsetamisest on võimalik loobuda. Konkreetse regulatiivse vajaduse jaoks (näiteks hädaolukorras tegutsemise kava koostamiseks) võidakse käesolevat katsemeetodit kasutada, et viia loomad kokkupuutesse kõnealuste materjalidega, kuna sellega saab uuringu juht või peamine uurija kontrollida sihtkontsentratsioonide valimise õigsust. Sihtkontsentratsioon ei tohiks siiski põhjustada tugevat ärritavat/söövitavat mõju, kuid peaks olema piisav, et pikendada kontsentratsiooni-mõju kõver tasemeni, millega saavutatakse katse regulatiivne ja teaduslik eesmärk. Kõnealused kontsentratsioonid tuleks valida juhtumipõhiselt ja seda valikut tuleks põhjendada (vt juhenddokument nr 39 (2)).
                           
                        KATSE PÕHIMÕTE
                  
                              7.
                           
                           
                              Käesolev läbivaadatud katsemeetod B.2 on koostatud selleks, et saada piisavalt teavet uuritava kemikaali ägeda mürgisuse kohta, et kemikaal klassifitseerida ja saada letaalsuse andmed (näiteks LC50, LC01 ja kõvera tõus) ühe või mõlema soo kohta, mida vajatakse riski kvantitatiivseks hindamiseks. Käesolev katsemeetod hõlmab kahte meetodit. Esimene meetod on tavaline määramiseeskiri, mille puhul loomade rühmad viiakse kokkupuutesse piirkontsentratsiooniga (piirsisalduskatse) või astmeliselt mitme eri kontsentratsiooniga eelnevalt kindlaks määratud aja jooksul, mis tavaliselt on neli tundi. Konkreetse regulatiivse eesmärgi jaoks võib kasutada muid kokkupuute ajavahemikke. Teine meetod on C × t määramise eeskiri, mille puhul loomade rühmad viiakse kokkupuutesse ühe (piir)kontsentratsiooniga või mitme eri kontsentratsiooniga mitme ajavahemiku jooksul.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Suremas loomad või loomad, kes ilmselgelt kannatavad valu või kellel ilmnevad raskete ja kestvate kannatuste tunnused, tuleks humaansel viisil surmata; selliseid loomi võetakse katsetulemuste tõlgendamisel arvesse samamoodi kui katse käigus surnud loomi. Kriteeriumid, mille põhjal tehakse suremas oleva või raskelt kannatava looma surmamise otsus, ja juhised prognoositava või läheneva surma kindlakstegemiseks on esitatud humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas OECD juhenddokumendis nr 19 (8).
                           
                        MEETODI KIRJELDUS
                  
                     Loomaliigi valimine
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Tuleks kasutada katseloomade enim kasutatavate laboriliinide noori terveid täiskasvanud isendeid. Eelistatav loomaliik on rott; muude liikide kasutamise korral tuleks seda põhjendada.
                           
                        
                     Loomade ettevalmistamine
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Emasloomad ei tohiks olla poeginud ega tiined. Kokkupuute päeval peaksid loomad olema 8 kuni 12 nädala vanused noored täiskasvanud, kelle kehamass ei tohiks erineda rohkem kui ±20 % selliste samas vanuses ja samast soost loomade keskmisest kehamassist, keda kasutati varasemates kemikaaliga kokkupuute katsetes. Loomad valitakse juhuslikult ja märgistatakse individuaalselt. Loomi hoitakse oma puuris vähemalt viis päeva enne katse algust, et võimaldada neil laboritingimustega kohaneda. Loomad peaksid olema enne katset ka katseseadmetega lühikese aja vältel kohanenud, kuna sel viisil vähendatakse uude keskkonda viimisest põhjustatud stressi.
                           
                        
                     Pidamistingimused
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Katseloomade pidamise ruumi temperatuur peaks olema 22 ± 3 °C. Suhtelist õhuniiskust tuleks eelistatult hoida vahemikus 30–70 %, kuigi see ei pruugi olla võimalik, kui kandeainena kasutatakse vett. Enne ja pärast kokkupuudet tuleks loomad tavaliselt paigutada soo ja kontsentratsiooni alusel rühmitatuna puuridesse, kuid loomade arv puuris ei tohiks segada iga looma täpset jälgimist ning peaks minimeerima loomade suremist kannibalismi ja võitlemise tõttu. Kui loomade kokkupuude toimub ainult nina kaudu, siis võib olla vajalik lasta neil hoiutorudega kohaneda. Hoiutorud ei tohiks põhjustada loomadele ülearuseid füüsilisi, soojusest või piiratud liikumisvõimest tingitud ebamugavusi. Loomade liikumise piiramine võib mõjutada füsioloogilisi näitajaid, näiteks kehatemperatuuri (hüpertermia) ja/või hingamise minutimahtu. Kui kättesaadavad on üldandmed, mille kohaselt kõnealuseid muutusi märkimisväärses ulatuses ei teki, siis ei ole eelnev hoiutoruga kohanemine vajalik. Kogu keha kaudu aerosooliga kokku puutuvaid loomi tuleks kokkupuute ajal eraldi hoida, et vältida loomadepoolset uuritava aerosooli filtrimist läbi oma puurikaaslaste karvkatte. Võib kasutada tavalisi ja sertifitseeritud laborisöötasid, v.a kokkupuute ajal, ning anda piiramatus koguses kraanivett. Valgustus peaks olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust.
                           
                        
                     Inhalatsioonikambrid
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Inhalatsioonikambri valimisel tuleks arvesse võtta uuritava kemikaali laadi ja katse eesmärki. Eelistatav kokkupuuteviis on ainult nina kaudu (mis hõlmab ainult pea, nina või koonu kaudu kokkupuudet). Ainult nina kaudu toimuvat kokkupuudet eelistatakse üldiselt vedelik- või pulberaerosooli ja aerosooliks kondenseeruda võiva auruga tehtavate uuringute puhul. Uuringu erieesmärgi saavutamiseks võib parem olla kokkupuude kogu keha kaudu, kuid seda tuleks katseprotokollis põhjendada. Kogukehakambri kasutamise korral keskkonna stabiilsuse tagamiseks ei tohiks katseloomade kogumaht ületada 5 % kambri mahust. Ainult nina ja kogu keha kaudu kokkupuute tehnilisi põhimõtteid ning konkreetseid eeliseid ja puudujääke on kirjeldatud juhenddokumendis nr 39 (2).
                           
                        KOKKUPUUTETINGIMUSED
                  
                     Kontsentratsioonide manustamine
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Kokkupuude ainult nina kaudu võib rottidel kesta kuni kuus tundi. Kui hiirtel kasutatakse ainult nina kaudu kokkupuudet, siis ei tohiks kokkupuude tavaliselt ületada nelja tundi. Kui vajatakse pikema kestusega uuringuid, siis tuleks seda põhjendada (vt juhenddokument nr 39 (2)). Kogukehakambris aerosoolidega kokku puutuvad loomad tuleks eraldi paigutada, et vältida puurikaaslaste karvkatte korrastamise tõttu uuritava kemikaali suukaudset manustamist. Kokkupuute ajal ei tohiks loomi sööta. Loomadele võib kogu keha kaudu toimuva kokkupuute ajal vett anda.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Loomad viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga, mis on gaas, aur, aerosool või nende segu. Katses kasutatav füüsikaline olek sõltub uuritava kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest, valitud kontsentratsioonist ja/või uuritava kemikaali kõige tõenäolisemast füüsikalisest vormist käsitsemise ja kasutamise ajal. Hügroskoopseid ja väga reaktsioonivõimelisi uuritavaid kemikaale tuleks katsetada kuiva õhu tingimustes. Tuleks olla ettevaatlik, et vältida plahvatusohtliku kontsentratsiooni tekkimist.
                           
                        
                     Osakeste jaotus suuruse järgi
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Osakeste suurusjaotus tuleks määrata kõigi aerosoolide puhul ja samuti aurude puhul, mis võivad kondenseeruda ja moodustada aerosooli. Hingamisteede kõigi asjakohaste piirkondadega kokkupuute võimaldamiseks soovitatakse kasutada aerosoole, mille osakeste massikeskmine aerodünaamiline diameeter (MMAD) on vahemikus 1–4 μm ning geomeetriline standardhälve (σg) on 1,5–3,0 (2, 9, 10). Kõnealuse standardi järgimiseks tuleks teha mõistlikud jõupingutused; kui standardit ei ole võimalik järgida, tuleks esitada eksperdihinnang. Näiteks metallisuitsu osakesed võivad olla kõnealusest normväärtusest väiksemad ning laenguga osakesed, kiud ja hügroskoopsed materjalid (mille suurus hingamisteede niiskes keskkonnas suureneb) võivad olla suuremad.
                           
                        
                     Uuritava kemikaali preparaat kandeaines
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Selleks et tagada uuritava kemikaali vajalik kontsentratsioon õhus ja osakeste suurus, võib olla vaja kasutada kandeainet. Eelistatult tuleks kasutada vett. Aineosakesi võib töödelda mehaaniliselt, et saavutada osakeste soovitud suurusjaotus, kuid tuleks olla hoolikas, et uuritavat kemikaali mitte lagundada ega muuta. Kui mehaaniline töötlus (näiteks tugeval jahvatamisel hõõrdumisest tekkinud kõrge temperatuur) võib olla uuritava kemikaali koostist muutnud, siis tuleks uuritava kemikaali koostist analüüsiga kontrollida. Tuleks olla hoolikas, et vältida uuritava kemikaali saastamist. Ei ole vaja katsetada raskesti peenestuvat teralist materjali, mis on sihipäraselt valmistatud nii, et seda ei saa sisse hingata. Materjali hõõrumisega tuleks tõendada, et teralise materjali käsitsemisel ei teki sissehingatavaid osakesi. Kui hõõrumiskatsel tekib sissehingatavaid osakesi, tuleks teha sissehingamisel mürgisust näitav katse.
                           
                        
                     Loomade kontrollrühm
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Samaaegne negatiivne (puhtas õhus peetavate) loomade kontrollrühm ei ole vajalik. Kui katsekeskkonna loomiseks kasutatakse muud kandeainet kui vesi, siis tuleks kandeaine kontrollrühma kasutada ainult juhul, kui varasemad sissehingamisel avalduva mürgisuse andmed ei ole kättesaadavad. Kui kandeaines sisalduva uuritava kemikaali mürgisuse uuringuga mürgisust ei leita, siis võib järeldada, et kandeaine ei ole katsetatud kontsentratsioonil mürgine, seega ei ole kandeaine kontrollrühm vajalik.
                           
                        KOKKUPUUTETINGIMUSTE SEIRE
                  
                     Kambri õhuvarustus
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Igas kokkupuutekatses tuleks kambri õhuvarustust hoolikalt kontrollida, pidevalt seirata ning andmed vähemalt kord tunnis registreerida. Keskkonnas oleva uuritava kemikaali kontsentratsiooni (või selle stabiilsuse) seire on kõigi dünaamiliste parameetrite mõõtmisel tingimata vajalik ja kujutab endast kaudset vahendit keskkonna tekitamise kõigi asjakohaste dünaamiliste parameetrite kontrollimiseks. Eraldi tuleks jälgida, et ainult nina kaudu kokkupuute uurimise kambris ei hingataks väljahingatud õhku uuesti sisse, kuna kokkupuutesüsteemi õhuvarustus ei ole piisav uuritavat kemikaali sisaldava õhu dünaamilise voo tagamiseks. On olemas metoodika, mille abil saab tõendada, et valitud katsetingimustes ei hingata väljahingatud õhku uuesti sisse (2, 11). Hapnikusisaldus peaks olema vähemalt 19 % ja süsinikdioksiidisisaldus ei tohiks ületada 1 %. Kui on alust arvata, et kõnealuseid nõudeid ei ole võimalik täita, siis tuleks hapniku- ja süsinikdioksiidisisaldust mõõta.
                           
                        
                     Kambri temperatuur ja suhteline õhuniiskus
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Kambri temperatuuri tuleks hoida 22 ± 3 °C juures. Loomade hingamistsooni suhtelist õhuniiskust tuleks nii ainult nina kui ka kogu keha kaudu kokkupuute katsetes seirata ja registreerida vähemalt kolm korda kuni neljatunnise katse jooksul ning iga tund lühema katse puhul. Suhtelist õhuniiskust tuleks eelistatult hoida vahemikus 30–70 %, kuid uuritava kemikaali mõju tõttu (näiteks veepõhise segu uurimisel) ei pruugi see olla saavutatav või mõõdetav.
                           
                        
                     Uuritav kemikaal: nimikontsentratsioon
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Kui see on võimalik, siis tuleks kokkupuutekambri nimikontsentratsioon alati arvutada ja registreerida. Nimikontsentratsioon on katsekeskkonda lisatud uuritava kemikaali mass, mis on jagatud läbi kambrisüsteemi suunatud õhu kogumahuga. Nimikontsentratsiooni ei kasutata loomade kokkupuute iseloomustamiseks, kuid nimikontsentratsiooni võrdlus tegeliku kontsentratsiooniga näitab katsesüsteemi kemikaali lisamise tõhusust ning seega saab seda kasutada kemikaali lisamisel esinevate probleemide avastamiseks.
                           
                        
                     Uuritav kemikaal: tegelik kontsentratsioon
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Tegelik kontsentratsioon on inhalatsioonikambris loomade hingamistsoonist võetud proovist määratud uuritava kemikaali kontsentratsioon. Tegelikke kontsentratsioone on võimalik määrata spetsiifiliste meetodite abil (näiteks otsene proovivõtt, adsorptsiooni- või keemilise reaktsiooni meetodid ning järgnev analüüsimine) või mittespetsiifiliste meetodite abil, näiteks filtrite gravimeetriline analüüs. Gravimeetrilise analüüsi kasutamine on lubatud ainult ühest koostisainest koosneva pulberaerosooli või vähelenduva vedeliku aerosooli korral ja see peaks olema enne katse tegemist kinnitatud konkreetse kemikaali määramisega. Mitmest koostisainest koosneva pulberaerosooli kontsentratsiooni kindlaksmääramiseks võib samuti kasutada gravimeetrilist analüüsi. Sel juhul tuleb analüüsiga tõendada, et õhus oleva materjali koostis sarnaneb lähtematerjali koostisega. Kui selline teave ei ole kättesaadav, võib osutuda vajalikuks teha uuringu vältel uuritava kemikaali (eelistatult lenduvas olekus) kordusanalüüse korrapäraste ajavahemike järel. Aerosoolainete puhul, mis võivad aurustuda või sublimeeruda, tuleks näidata, et valitud meetodiga koguti kõiki faase. Katseprotokollis tuleks esitada siht-, nimi- ja tegelikud kontsentratsioonid, kuid letaalse kontsentratsiooni arvutamiseks kasutatakse statistilises analüüsis ainult tegelikke kontsentratsioone.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Võimaluse korral tuleks kasutada uuritava kemikaali ühte partiid ning uuritavat proovi tuleks säilitada tingimustes, milles säilib selle puhtus, homogeensus ja stabiilsus. Enne uuringu alustamist tuleks uuritavat kemikaali, sh selle puhtust, iseloomustada; kui see on tehniliselt võimalik, tuleb keemiliselt määratleda ka kindlakstehtud saasteained ja lisandid ning määrata nende kogused. Seda on võimalik tõendada muu hulgas järgmiste andmete alusel: retentsiooniaeg ja suhteline piigipindala, molekulmass massispektroskoopia või gaaskromatograafia analüüsidest või muud hinnangud. Kuigi uurimislabor ei vastuta uuritava kemikaali proovi keemilise määratlemise eest, võib uurimislaboril olla mõttekas kinnitada tellija iseloomustust vähemalt piiratud ulatuses (näiteks värv, füüsikalised omadused jne).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Kokkupuutekeskkonda hoitakse võimaluste piires muutumatuna ja seiratakse pidevalt ja/või pisteliselt, olenevalt analüüsimeetodist. Kui kasutatakse pistelist proovivõttu, tuleks neljatunnise uuringu vältel võtta kambrikeskkonnast proove vähemalt kaks korda. Kui see ei ole piiratud õhuvarustuse või väikeste kontsentratsioonide tõttu võimalik, võib kogu kokkupuuteperioodi kohta võtta ühe proovi. Kui proovide analüüsimisel saadakse oluliselt erinevad tulemused, tuleks järgmiste uuritavate kontsentratsioonide puhul võtta kokkupuute kohta neli proovi. Kambrist võetud proovide üksikud kontsentratsioonid ei tohiks keskmisest kontsentratsioonist erineda rohkem kui ±10 % gaaside ja aurude puhul või ±20 % vedelik- või pulberaerosoolide korral. Tuleks arvutada kambri tasakaaluoleku saavutamise aeg (t95) ja see registreerida. Kokkupuute kestus on aeg, mille vältel lisatakse uuritavat kemikaali ja seejuures arvestatakse t95 saavutamiseks vajalikku ajavahemikku. Juhendid t95 hindamise kohta on esitatud juhenddokumendis nr 39 (2).
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Väga keeruka segu puhul, mis koosneb gaasidest/aurudest ja aerosoolidest (näiteks põlemiskeskkonnad ja uuritavad kemikaalid, mida paiskab välja mõni eriotstarbeline lõppkasutustoode või -seade), võib iga faas käituda inhalatsioonikambris erinevalt, nii et tuleks valida vähemalt üks uuritav aine (mida analüüsiga määratakse), tavaliselt sellise segu peamine toimeaine, iga faasi (gaas/aur ja aerosool) kohta. Kui uuritav kemikaal on segu, siis tuleks kirja panna segu analüütiline kontsentratsioon ja mitte ainult toimeaine või komponendi (analüüsiga määratava aine) kontsentratsioon. Lisateave tegelike kontsentratsioonide kohta on juhenddokumendis nr 39 (2).
                           
                        
                     Uuritav kemikaal: osakeste suurusjaotus
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Aerosooliosakeste suurusjaotus tuleks kindlaks määrata vähemalt kaks korda iga neljatunnise kokkupuute ajal, kasutades kaskaadimpaktorit või alternatiivset seadet, näiteks aerodünaamilist osakeste suuruse määrajat. Kui on võimalik tõendada kaskaadimpaktori ja alternatiivse seadme abil saadud tulemuste võrdväärsust, võib kogu uuringu tegemiseks kasutada alternatiivset seadet. Paralleelselt peamise seadmega tuleks kasutada teist seadet, näiteks gravimeetrilist filtrit või minitsüklonit või gaasipesukolbi, et veenduda peamise seadme kogumistõhususes. Osakeste suuruse analüüsi kaudu saadud massikontsentratsioon peaks mõistlikes piirides kokku langema filtrianalüüsi abil saadud massikontsentratsiooniga (vt juhenddokument nr 39 (2)). Kui uuringu varajases etapis on võimalik tõendada võrdväärsust, siis võib loobuda täiendavatest kinnitavatest mõõtmistest. Loomade heaolu silmas pidades tuleks võtta meetmeid, et mitte saada katsest ebaselgeid andmeid, mille tõttu võib olla vajalik kokkupuudet korrata. Aurudega tuleks teha osakeste suurusjaotuse määramine sel juhul, kui on võimalik, et auru kondensatsiooni tõttu võib tekkida aerosool või kui auru keskkonnas tuvastatakse osakesi, mille puhul võib tegemist olla faaside seguga (vt punkt 15).
                           
                        KATSE KÄIK
                  
                              26.
                           
                           
                              Allpool on kirjeldatud kahte järgmist uuringutüüpi: tavaline määramiseeskiri ja C × t määramise eeskiri. Mõlemad eeskirjad võivad hõlmata eeluuringut, põhiuuringut ja/või piirsisalduskatset (tavaline määramiseeskiri) või katsetamist piirkontsentratsiooni juures (C × t). Kui mõju on teadaolevalt suurem ühele soole, võib uuringu juht otsustada, et uuringus kasutatakse ainult tundlikuma soo isendeid. Kui ainult nina kaudu toimuvat kokkupuudet kasutatakse muu näriliseliigi kui roti korral, võib suurimat kokkupuute kestust kohandada, et minimeerida konkreetse kasutatava liigi isendite kannatusi. Enne alustamist tuleks loomade kasutamise minimeerimiseks võtta arvesse kõik kättesaadavad andmed. Näiteks käesoleva lisa peatüki B.52 (4) kohaselt saadud andmed võivad muuta eeluuringu tarbetuks ja näidata, kas mõju sõltub looma soost (vt juhenddokument nr 39 (2)).
                           
                        TAVALINE MÄÄRAMISEESKIRI
                  
                     Üldised põhimõtted: tavaline määramiseeskiri
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Tavalise uuringu puhul viiakse loomarühmad kokkupuutesse uuritava kemikaaliga kindla ajavahemiku jooksul (tavaliselt neli tundi) kas ainult nina kaudu kokkupuudet võimaldavas või kogukehakambris. Loomad viiakse kokkupuutesse kas piirkontsentratsiooniga (piirsisalduskatse) või vähemalt kolme kontsentratsiooniga astmelises protseduuris (põhiuuring). Põhiuuringule võib eelneda eeluuring, v.a juhul, kui uuritava kemikaali kohta on mingil määral teavet juba olemas, näiteks eelnevalt tehtud uuring B.52 (vt juhenddokument nr 39 (2)).
                           
                        
                     Eeluuring: tavaline määramiseeskiri
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Eeluuringut kasutatakse uuritava kemikaali mõju prognoosimiseks, mõju sooliste erinevuste kindlaksmääramiseks ning põhiuuringu või piirsisalduskatse jaoks kokkupuute kontsentratsioonide valimisel abistamiseks. Eeluuringu kontsentratsioonide valimisel tuleks kasutada kogu kättesaadavat teavet, sh olemasolevaid (kvantitatiivse) struktuuri-aktiivsuse sõltuvuse ((Q)SAR) andmeid ja andmeid samalaadsete kemikaalide kohta. Iga kontsentratsiooniga ei tohiks puutuda kokku rohkem kui kolm isast ja kolm emast isendit (soolise erinevuse kindlaksmääramiseks võidakse vajada kolme looma kummagi soo kohta). Eeluuringus võib kasutada ühte kontsentratsiooni, aga vajaduse korral võib kasutada ka rohkem kui ühte kontsentratsiooni. Eeluuringus ei tuleks katsetada nii palju loomi ja kontsentratsioone, et see sarnaneks juba põhiuuringuga. Eeluuringu asemel võib kasutada varem tehtud uuringut B.52 (4) (vt juhenddokument nr 39 (2)).
                           
                        
                     Piirsisalduskatse: tavaline määramiseeskiri
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Piirsisalduskatset kasutatakse, kui uuritav kemikaal ei ole teadaolevalt või eeldatavalt mürgine, s.o mürgistus tekib ainult regulatiivse piirkontsentratsiooni ületamise puhul. Piirsisalduskatses viiakse uuritava kemikaaliga piirkontsentratsiooni juures kokkupuutesse üks kolmest isasest ja kolmest emasest koosnev loomarühm. Teavet uuritava kemikaali mürgisuse kohta võib saada varem katsetatud samalaadseid kemikaale käsitlevatest andmetest, võttes arvesse toksikoloogiliselt oluliste koostisainete keemilist laadi ja sisaldust. Kui teavet mürgisuse kohta on vähe või ei ole üldse või kui uuritav kemikaal on eeldatavasti mürgine, tuleks sooritada põhikatse.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Piirkontsentratsiooni valimine sõltub tavaliselt regulatiivsetest nõuetest. Kui kohaldatakse määrust (EÜ) nr 1272/2008, on gaasi, auru ja aerosooli piirkontsentratsioon vastavalt 20 000 ppm, 20 mg/l ja 5 mg/l (või suurim saavutatav kontsentratsioon) (3). Mõne uuritava kemikaali, eelkõige auru või aerosooli piirkontsentratsiooni saavutamine võib olla tehniliselt keeruline. Aerosooli katsetamisel peaks olema peamine eesmärk saavutada sissehingamiseks sobiv osakeste suurus (MMAD 1–4 μm). See on enamiku uuritavate kemikaalide puhul võimalik kontsentratsioonil 2 mg/l. Aerosooli katsetamist rohkem kui 2 mg/l juures tuleks proovida ainult juhul, kui on võimalik saavutada sissehingamiseks sobiv osakeste suurus (vt juhenddokument nr 39 (2)). Määruses (EÜ) nr 1272/2008 ei soovitata loomade heaolu kaalutlustel kasutada katses piirkontsentratsiooni ületavat kontsentratsiooni (3). Piirkontsentratsiooni kasutamist tuleks kaaluda ainult siis, kui on suur tõenäosus, et kõnealuse katse tulemustest võib otseselt sõltuda inimeste tervise kaitse (3), ja seda tuleks katseprotokollis põhjendada. Plahvatusohtliku uuritava kemikaali puhul tuleks olla hoolikas, et vältida plahvatust võimaldavaid tingimusi. Loomade tarbetu kasutamise vältimiseks tuleks enne piirsisalduskatset teha proovikatse ilma loomadeta, et tagada piirsisalduskatse jaoks vajalike kambritingimuste saavutamine.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Kui piirkontsentratsiooni juures täheldatakse, et loomad surevad või on suremas, siis võib piirsisalduskatse tulemusi kasutada eeluuringuna muudel kontsentratsioonidel edasiseks katsetamiseks (vt põhiuuring). Kui uuritava kemikaali füüsikalised või keemilised omadused muudavad piirkontsentratsiooni saavutamise võimatuks, siis tuleks katsetada suurimat saavutatavat kontsentratsiooni. Kui suurim saavutatav kontsentratsioon põhjustab alla 50 % suremuse, siis ei ole edasine katsetamine vajalik. Kui piirkontsentratsiooni ei ole võimalik saavutada, siis tuleks katseprotokollis esitada selgitus ja täiendavad andmed. Kui auruga saavutatav suurim kontsentratsioon ei ole mürgine, siis võib olla vajalik lisada uuritavat kemikaali vedelikaerosoolina.
                           
                        
                     Põhiuuring: tavaline määramiseeskiri
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Põhiuuring tehakse tavaliselt vähemalt kolme kontsentratsiooniga, kasutades viit isas- ja viit emaslooma (või kui on teada, kummast soost isendid on tundlikumad, siis viit sellest soost looma) igal kontsentratsioonil. Usaldusväärse statistilise analüüsi tagamiseks tuleks kasutada piisavalt suuri kontsentratsioone. Ajavahemik katserühmade kokkupuutekatsete vahel määratakse kindlaks mürgistusnähtude alguse, kestuse ja raskuse järgi. Loomade kokkupuude järgmise kontsentratsiooniga tuleks edasi lükata seni, kuni eelmises katses kasutatud loomade ellujäämises võib olla mõistlikkuse piires veendunud. See võimaldab uuringu juhil kohandada järgmise kokkupuuterühma sihtkontsentratsiooni. Kuna katses kasutatakse keerukat tehnoloogiat, ei pruugi see inhalatsiooniuuringute puhul alati olla praktiline. Sellisel juhul peaks loomade kokkupuude järgmise kontsentratsiooniga põhinema varasemal kogemusel ja teaduslikul hinnangul. Segu katsetamisel tuleks tugineda juhenddokumendile nr 39 (2).
                           
                        C × T (KONTSENTRATSIOON × AEG) MÄÄRAMISE EESKIRI
                  
                     Üldised põhimõtted: C × t määramise eeskiri
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              Sissehingamisel avalduva mürgisuse hindamisel võidakse tavalise määramiseeskirja alternatiivina kaaluda astmelist C × t määramise eeskirja (12, 13, 14). Selle lähenemisviisi puhul võivad loomad puutuda uuritava kemikaaliga kokku mitmel kontsentratsioonil ja mitme ajavahemiku vältel. Kõik katsed tehakse ainult nina kaudu kokkupuudet võimaldavas kambris (kogukehakambrid ei ole selle määramiseeskirja jaoks praktilised). Seda eeskirja on kirjeldatud 1. liite toimimisskeemiga. Simulatsioonianalüüsiga on näidatud, et tavaline määramiseeskiri ja C × t määramise eeskiri võivad mõlemad anda kindlaid LC50 väärtusi, kuid C × t määramise eeskiri annab tavaliselt kindlamaid LC01 ja LC10 väärtusi (15).
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Simulatsioonianalüüs on näidanud, et C × t intervalli kohta kahe looma kasutamine (üks loom kummastki soost mõlema soo kasutamise korral või kaks looma sellest soost, kummale on suurem mõju) võib tavaliselt olla piisav põhiuuringus nelja kontsentratsiooni ja viie kokkupuute ajavahemiku katsetamise korral. Mõnel juhul võib uuringu juht otsustada kasutada kummagi soo puhul kahte rotti C × t intervalli kohta (15). Kummastki soost kahe looma kasutamine kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta võib vähendada andmete kallutatust ja hinnangute hajumist, suurendada ennustuste täpsust ja hälvete kirjeldatavust usaldusvahemikuga. Kui andmete kooskõla ei ole hindamiseks piisav (kui kasutatakse ühte looma kummastki soost või kahte looma soost, millele on suurem mõju), siis võib piisata viienda kokkupuutekontsentratsiooni kasutamisest. Täiendavad juhendid C × t uuringus kasutatavate loomade arvu ja kontsentratsioonide kohta on juhenddokumendis nr 39 (2).
                           
                        
                     Eeluuring: C × t määramise eeskiri
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Uuritava kemikaali mõju hindamiseks ja põhiuuringu kokkupuutekontsentratsioonide valimiseks kasutatakse eeluuringut. Vajalik võib olla eeluuring, milles kasutatakse kuni kolme looma soo ja kontsentratsiooni kohta (vt lähemalt juhenddokumendi nr 39 (2) III liide), et valida põhiuuringu jaoks sobiv algkontsentratsioon ja minimeerida kasutatavate loomade arvu. Soolise erinevuse kindlaksmääramiseks võib olla vajalik kasutada kolme looma soo kohta. Need loomad peaksid puutuma ainega kokku katse ühe ajavahemiku jooksul, tavaliselt 240 minutit. Asjakohaste katsekeskkondade loomise võimalikkust tuleks hinnata ilma loomadeta tehtavate tehniliste proovikatsete ajal. Eeluuringu tegemine ei ole tavaliselt vajalik, kui suremuse andmed on kättesaadavad B.52 kohasest uuringust (4). B.2 kohase uuringu lähtesihtkontsentratsiooni valides peaks uuringu juht arvesse võtma kõiki olemasolevaid B.52 kohastes uuringutes (4) mõlema soo ja kõigi katsetatud kontsentratsioonide kohta saadud suremuse andmeid (vt juhenddokument nr 39 (2)).
                           
                        
                     Lähtekontsentratsioon: C × t määramise eeskiri
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Lähtekontsentratsioon (I kokkupuude) (1. liide) on kas piirkontsentratsioon või uuringu juhi poolt eeluuringu alusel valitud kontsentratsioon. Kahest loomast (üks kummagi soo kohta) koosnevad rühmad viiakse kokkupuutesse kõnealuse kontsentratsiooniga mitme ajavahemiku vältel (näiteks 15, 30, 60, 120 või 240 minutit), mis teeb kokku kümme looma (I kokkupuude) (1. liide).
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Piirkontsentratsiooni valimine sõltub tavaliselt regulatiivsetest nõuetest. Kui kohaldatakse määrust (EÜ) nr 1272/2008, on gaaside, aurude ja aerosoolide piirkontsentratsioonid vastavalt 20 000 ppm, 20 mg/l ja 5 mg/l (või suurim saavutatav kontsentratsioon) (3). Mõne uuritava kemikaali, eelkõige auru või aerosooli piirkontsentratsiooni tekitamine võib olla tehniliselt keeruline. Aerosooli katsetamisel peaks eesmärk olema saavutada sissehingamiseks sobiv osakeste suurus (st MMAD 1–4 μm) piirkontsentratsioonil 2 mg/l. See on enamiku uuritavate kemikaalide puhul võimalik. Aerosooli katsetamist rohkem kui 2 mg/l juures tuleks proovida ainult juhul, kui sissehingamiseks sobiv osakeste suurus on võimalik saavutada (vt juhenddokument nr 39 (2)). Määruses (EÜ) nr 1272/2008 ei soovitata loomade heaolu kaalutlustel piirkontsentratsiooni ületava kontsentratsiooniga katsetamist (3). Piirkontsentratsiooni ületava kontsentratsiooni katsetamist tuleks kaaluda ainult juhul, kui on suur tõenäosus, et kõnealuse katse tulemustel on otsene mõju inimeste tervise kaitsele (3), ja katseprotokollis tuleks seda põhjendada. Plahvatusohtliku uuritava kemikaali puhul tuleks olla hoolikas, et vältida plahvatust võimaldavaid tingimusi. Loomade ebavajaliku kasutamise vältimiseks tuleks enne katset lähtekontsentratsiooniga teha proovikatse ilma loomadeta, et tagada kõnealuse kontsentratsiooni jaoks vajalike kambritingimuste saavutatavus.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Kui lähtekontsentratsiooni juures täheldatakse, et loomad surevad või on suremas, võib kõnealuse kontsentratsiooniga saadud tulemusi kasutada lähtepunktina edasiseks katsetamiseks muude kontsentratsioonidega (vt põhiuuring). Kui uuritava kemikaali füüsikalised või keemilised omadused muudavad piirkontsentratsiooni saavutamise võimatuks, tuleks katsetada suurimat saavutatavat kontsentratsiooni. Kui suurim saavutatav kontsentratsioon põhjustab alla 50 % suremuse, ei ole edasine katsetamine vajalik. Kui piirkontsentratsiooni ei ole võimalik saavutada, tuleks katseprotokollis esitada selgitus ja seda toetavad andmed. Kui auru suurim saavutatav kontsentratsioon ei ole mürgine, siis võib olla vajalik lisada uuritavat kemikaali vedelikaerosoolina.
                           
                        
                     Põhiuuring: C × t määramise eeskiri
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Põhiuuringus katsetatav lähtekontsentratsioon (I kokkupuude) (1. liide) on kas piirkontsentratsioon või uuringu juhi poolt eeluuringu alusel valitud kontsentratsioon. Kui I kokkupuute ajal või selle järel täheldatakse loomade suremist, võetakse suremist põhjustav minimaalne kokkupuude (C × t) aluseks II kokkupuute kontsentratsiooni ja ajavahemike kindlaksmääramisel. Iga edasine kokkupuude oleneb eelnevast kokkupuutest (vt 1. liide).
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Paljude uuritavate kemikaalide puhul on lähtekontsentratsiooniga saadud tulemused koos kolme lühema täiendava kokkupuutega (kokkupuute ajavahemikud moodustavad geomeetrilise progressiooni, mille järjestikuste ajavahemike erinevust näitab progressiooni kordaja, tavaliselt √2) piisav C × t suremuse suhte kindlaksmääramiseks (15), kuid otstarbekas võib olla viienda kokkupuutekontsentratsiooni kasutamine (vt 1. liide ja juhenddokument nr 39 (2)). C × t protokolli tulemuste matemaatiline käsitlus on esitatud 1. liites.
                           
                        VAATLUSED
                  
                              41.
                           
                           
                              Loomi tuleks kokkupuute ajal sageli kliiniliselt jälgida. Pärast kokkupuudet tuleks kliinilised vaatlused korraldada vähemalt kaks korda kokkupuutepäeva jooksul või, kui loomade reageerimine kokkupuutele seda nõuab, ka sagedamini, ja seejärel vähemalt kord päevas kokku 14 päeva jooksul. Vaatlemise ajavahemiku kestus ei ole kindlaks määratud; see tuleks määrata kliiniliste nähtude laadi, tekkimisaja ja taastumisperioodi pikkuse alusel. Mürgistusnähtude ilmumise ja kadumise aeg on oluline eelkõige juhul, kui mürgistusnähtudel on kalduvus avalduda viitmõjuna. Kõik vaatlused registreeritakse süstemaatiliselt, säilitades iga looma kohta eraldi andmed. Suremas olevad loomad ja loomad, kellel esinevad tugeva valu ja/või püsivad suurte kannatuste tunnused, tuleks loomade heaolu kaalutlustel humaansel viisil surmata. Mürgistuse kliiniliste nähtude vaatluste tegemisel tuleks olla hoolikas, et mitte pidada kokkupuutekatsest põhjustatud esialgset kehva välimust ja ajutisi hingamismuutusi uuritava kemikaaliga seotud mürgistuseks, mis nõuaks loomade enneaegset surmamist. Tuleks võtta arvesse humaansete lõpetamiskriteeriumide juhenddokumendis (nr 19) esitatud põhimõtteid ja kriteeriume (7). Kui loomad surmatakse humaansetel kaalutlustel või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg võimalikult täpselt registreerida.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Puuri juures tehtavad vaatlused peaksid hõlmama naha ja karvkatte, silmade ja limaskestade, hingamise, vereringe- ning autonoomse ja tsentraalse närvisüsteemi muutusi, somatomotoorset aktiivsust ja käitumismustrit. Võimaluse korral tuleks eristada lokaalset ja süsteemset mõju ja need registreerida. Tuleb pöörata tähelepanu värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, letargia, une ja kooma esinemisele. Pärakutemperatuuri mõõtmine võib anda lisaandmeid refleksipõhise hingamise aeglustumise või hüpo-/hüpertermia kohta, mis on seotud kokkupuute või vangistusega.
                           
                        
                     Kehamass
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Iga looma kehamass tuleks registreerida üks kord kohanemise perioodi vältel, kokkupuute päeval enne kokkupuudet (päev 0) ning vähemalt päevadel 1, 3 ja 7 (ning seejärel iga nädal) ja surma või eutanaasia korral, kui see toimub pärast päeva 1. Kehamass on teatavasti mürgistuse oluline näitaja ja seega tuleks täpselt jälgida loomi, kelle kehamass väheneb püsivalt ≥ 20 % võrreldes uuringueelsete näitajatega. Ellujäänud loomad kaalutakse ja surmatakse humaansel viisil kokkupuutejärgsel ajavahemikul.
                           
                        
                     Patoloogia
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Kõik katseloomad (kaasa arvatud need, kes surid katse käigus või kes surmati eutanaasiaga või kõrvaldatakse uuringust loomade heaolu tagamiseks) lahatakse täielikult. Kui lahkamine vahetult pärast surnud looma leidmist ei ole võimalik, tuleks loom jahutada (mitte külmutada) autolüüsi minimeerimiseks piisavalt madala temperatuurini. Lahata tuleks võimalikult kiiresti, tavaliselt ühe või kahe päeva jooksul. Iga looma kõik üldpatoloogilised muutused tuleks registreerida, pöörates eritähelepanu hingamisteede mis tahes muutustele.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Uuringu tõlgendusväärtuse laiendamiseks võidakse kaaluda kavandis eelnevalt ette nähtud täiendavaid uuringuid, näiteks ellujäänud rottide kopsude massi mõõtmine ja/või hingamisteede ärrituse tõendamine hingamisteede mikroskoobiga vaatlemise alusel. Uurida võib ka organeid, milles 24 tundi või kauem elanud loomadel esineb patoloogilisi muutusi, samuti organeid, mis teadaolevalt või eeldatavasti võivad olla kahjustatud. Kogu hingamistee mikroskoobiuuring võib anda kasulikku teavet veega reageeriva uuritava kemikaali, näiteks happe või hügroskoopse kemikaali kohta.
                           
                        ANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE
                  
                     Andmed
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Tuleks esitada andmed iga üksiku looma kehamassi ja lahkamistulemuste kohta. Kliiniliste vaatluste andmed tuleks esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates iga katserühma puhul ära osalenud loomade arvu, konkreetsete mürgistusnähtudega loomade arvu, katse käigus surnuna leitud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahanguleiud.
                           
                        
                     Katseprotokoll
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Katseprotokoll peaks sisaldama võimaluse korral järgmist teavet.
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katseloomad ja pidamistingimused
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Puuritingimuste kirjeldus, sh: loomade arv (või arvu muutus) puuri kohta, allapanu, õhu temperatuur ja suhteline niiskus, valgustusperiood ja sööt.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kasutatud liik/liin ja muu liigi kui roti kasutamise põhjendus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Loomade arv, vanus ja sugu.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Randomiseerimismeetod.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad (sh sööda tüüp/päritolu, vee päritolu).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kõigi eelnenud ettevalmistamismeetmete kirjeldus, sh söötmine, karantiin ja haiguste ravi.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uuritav kemikaal
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused (kaasa arvatud isomeerne koostis).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Identifitseerimisandmed, Chemical Abstract Services Registry ehk CASi nr, kui see on teada.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Kandeaine
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kandeaine kasutamise põhjendus ja valiku põhjendus (kui kandeainena ei kasutata vett).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Varasemad või rööpandmed, millega tõendatakse, et kandeaine ei mõjuta uuringu tulemusi.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhalatsioonikamber
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Inhalatsioonikambri, sh selle mõõtmete ja mahu kirjeldus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Loomade kokkupuute jaoks kasutatavate seadmete päritolu ja kirjeldus ning samuti keskkonna tekitamise kirjeldus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Temperatuuri, niiskuse, osakeste suuruse ja tegeliku kontsentratsiooni mõõtmise seadmed.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Õhuallikas ja kambrisse suunatud / kambrist välja lastud õhu töötlemine ning konditsioneerimiseks kasutatav süsteem.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Homogeense katsekeskkonna tagamise seadmete kaliibrimisel kasutatud meetodid.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Rõhuerinevus (positiivne või negatiivne).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kokkupuuteportide arv kambri kohta (ainult nina kaudu toimuv kokkupuude); loomade paiknemine süsteemis (kogu keha kaudu toimuv kokkupuude).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Katsekeskkonna ajaline homogeensus/stabiilsus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Temperatuuri- ja niiskusandurite paigutus ning katsekeskkonnast proovide võtmine kambris.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Õhuvoolu kiirused, õhuvoolu kiirus kokkupuutepordi kohta (ainult nina kaudu toimuv kokkupuude) või loomade hulk kambri kohta (kogu keha kaudu toimuv kokkupuude).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Teave hapniku ja süsinikdioksiidi sisalduse mõõtmiseks kasutatud seadmete kohta, vajaduse korral.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Inhalatsioonikambri tasakaaluseisundini jõudmiseks vajalik aeg (t95).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kogu kambris oleva õhu vahetuste arv tunnis.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Mõõteseadmed (vajaduse korral).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Andmed kokkupuute kohta
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Põhiuuringu sihtkontsentratsiooni valimise põhjendus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Nimikontsentratsioonid (inhalatsioonikambrisse suunatud uuritava kemikaali kogumass, mis on jagatud läbi kambri juhitud õhu kogusega).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Uuritava kemikaali tegelikud kontsentratsioonid loomade hingamistsoonist kogutud proovides; heterogeensel füüsilisel kujul esineva segu (gaas, aur, aerosool) puhul võidakse iga faasi eraldi analüüsida.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kõik õhukontsentratsioonid tuleks teatada massiühikutes (näiteks mg/l, mg/m3 jne); sulgudes võib lisada ka ruumalaühikud (näiteks ppm, ppb jne).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Osakeste suurusjaotus, massikeskmine aerodünaamiline diameeter (MMAD) ja geomeetriline standardhälve (σg) ning nende arvutamise meetodid. Tuleks teatada üksikosakeste suuruse analüüsid.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katsetingimused
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Üksikasjalikud andmed uuritava kemikaali ettevalmistamise kohta, sh andmed mis tahes meetmete kohta, mida kasutati tahke aine osakeste suuruse vähendamiseks või uuritava kemikaali lahuste valmistamiseks. Kui mehaanilised protsessid võivad olla muutnud uuritava kemikaali koostist, tuleb lisada nende analüüside tulemused, mille abil kontrolliti uuritava kemikaali koostist.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Katsekeskkonna tekitamiseks ja loomade kokkupuuteks katsekeskkonnaga kasutatud seadmete kirjeldus (eelistatult koos joonisega).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Andmed kasutatud keemilise analüüsi meetodi kohta ja meetodi valideerimise kohta (sh uuritava kemikaali analüütiline saagis proovivõtukeskkonna analüüsil).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Katsekontsentratsioonide valiku põhjendus.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemused
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid katsekambri temperatuuri, niiskuse ja õhuvoolu kohta.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid kambri nimi- ja tegeliku kontsentratsiooni andmete kohta.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid osakeste suurusjaotuse kohta, sh analüüsiproovide võtmise andmed, osakeste suurusjaotus ning MMAD ja σg arvutamine.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid iga looma reageerimise ja kontsentratsioonide kohta (st mürgistusnähtudega loomad, kaasa arvatud surnud loomad, mõjude laad, raskus, ilmumise aeg ja mõju kestus).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Uuringul registreeritud konkreetse looma kehamass; surmakuupäev ja -aeg, kui loom sureb enne plaanijärgset eutanaasiat, mürgistusnähtude tekke aeg ja pöörduvus konkreetse looma puhul.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on olemas.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Suremuse hinnangud (näiteks LC50, LD01), sh 95 % usalduspiirid ja kõvera tõus (kui see hindamismeetodi alusel esitatakse).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Statistiline seos, sh eksponendi n hinnang (C × t määramise eeskiri). Tuleks esitada kasutatud statistikatarkvara nimetus.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemuste arutelu ja tõlgendamine
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Eritähelepanu tuleks pöörata nende meetodite kirjeldamisele, mida kasutati käesoleva katsemeetodi kriteeriumide täitmiseks, näiteks piirkontsentratsioon või osakeste suurus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Üldtulemuste alusel tuleks käsitleda osakeste sissehingamiseks sobivat suurust, eelkõige siis, kui osakeste suuruse kriteeriume ei olnud võimalik täita.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kui OECD humaansete lõpetamiskriteeriumide juhenddokumendis (8) sätestatud kriteeriumide alusel tekkis vajadus humaansel viisil surmata valu kannatavaid või tõsiste ja püsivate kannatuste tunnustega loomi, siis tuleks esitada selgitus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kui katsetamine käesoleva lisa peatüki B.52 (4) alusel katkestati käesoleva katsemeetodi B.2 rakendamiseks, siis tuleks seda põhjendada.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Uuringu üldhinnangus tuleks käsitleda nimi- ja tegelike kontsentratsioonide kindlaksmääramiseks kasutatud meetodite kooskõlalisust ning tegeliku ja nimikontsentratsiooni vahelist seost.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tuleks käsitleda tõenäolist surma põhjust ja uuritava kemikaali peamist toimeviisi (süsteemne või lokaalne).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     KIRJANDUS
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1272/2008, 16. detsember 2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353, 31.12.2008, lk 1).
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.52 „Äge mürgisus sissehingamisel – ägeda mürgisuse klassi määramise meetod”.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.40 „Nahasöövituskatse in vitro: transkutaanse elektritakistuse (TER) mõõtmine”.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.40a „Nahasöövituskatse in vitro: katse inimnaha mudeliga”.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321–327.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160–167.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278–290.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105–117.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65–71.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, London/New York.
                           
                        MÕISTE
                  Uuritav kemikaal: iga aine või segu, mida uuritakse/uuriti käesoleva katsemeetodi abil.
                  
                     1. liide
                     
                        C × t määramise eeskiri
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Sissehingamisel avalduva mürgisuse hindamisel võib tavalise määramiseeskirja alternatiivina kaaluda astmelist C × t (kontsentratsioon × aeg) määramise eeskirja (12, 13, 14). Seda tuleks kasutada eelistatavalt juhul, kui konkreetne regulatiivne või teaduslik vajadus nõuab loomade katsetamist mitme ajavahemiku vältel, näiteks hädaolukorrale reageerimise või maakasutuse kavandamiseks. Sel juhul alustatakse tavaliselt piirkontsentratsioonil katsetamisest (I kokkupuude), mille puhul loomad viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga viie ajavahemiku jooksul (näiteks 15, 30, 60, 120 ja 240 min), nii et ühe kokkupuute ajal püütakse saada andmed mitme ajavahemiku kohta (vt joonis 1). Kui kohaldatakse määrust (EÜ) nr 1272/2008, on gaasi, auru ja aerosooli piirkontsentratsioon vastavalt 20 000 ppm, 20 mg/l ja 5 mg/l. Neid tasemeid võib ületada ainult juhul, kui kõnealustel tasemetel katsetamiseks on regulatiivne või teaduslik vajadus (vt B.2 põhiteksti punkt 37).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Kui uuritava kemikaali mürgisuse kohta on vähe teavet või seda ei ole üldse, tuleks teha eeluuring, mille vältel loomarühmad, milles on kuni kolm looma kummastki soost, viiakse tavaliselt 240 minuti vältel kokkupuutesse uuringu juhi valitud sihtkontsentratsiooniga.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Kui I kokkupuute ajal katsetatakse piirkontsentratsiooni ja täheldatakse suremust alla 50 %, ei ole täiendav katsetamine vajalik. Kui on regulatiivne või teaduslik vajadus määrata kontsentratsiooni/aja/mõju vaheline seos piirkontsentratsioonist suuremal kontsentratsioonil, tuleks järgmine kokkupuude teha kõrgema tasemega, näiteks piirkontsentratsioonist kaks korda suurema kontsentratsiooniga (s.o 2L joonisel 1).
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Kui piirkontsentratsiooni juures täheldatakse mürgisust, on vaja teha täiendav uuring (põhiuuring). Kõnealused täiendavad kokkupuuted tehakse kas väiksema kontsentratsiooniga (joonisel 1: II, III või IV’ kokkupuude) või suurema kontsentratsiooniga, kasutades lühemaid ajavahemikke (joonisel 1: IV kokkupuude), mis on kohandatud ja mille vahed ei ole nii suured.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Katse (esialgne kontsentratsioon ja täiendavad kontsentratsioonid) tehakse, kasutades iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta kas ühte looma kummastki soost või kahte looma sellest soost, kumb on tundlikum. Mõnel juhul võib uuringu juht otsustada, et iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta kasutatakse kahte rotti kummastki soost (või nelja looma tundlikumast soost) (15). Kui kirjeldatud määramiseeskirja puhul kasutatakse iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta kahte looma kummastki soost, väheneb tavaliselt andmete kallutatus ja hinnangute muutlikkus, suureneb hinnangute täpsus ja paraneb hälvete kirjeldatavus usaldusvahemikuga. Täpsemad üksikasjad on esitatud juhenddokumendis nr 39 (2).
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Ideaaljuhul tehakse iga kokkupuude ühel päeval. See võimaldab viivitada järgmise kokkupuutega, kuni võib olla mõistlikult kindel, et loomad jäävad ellu, ja see võimaldab uuringu juhil kohandada järgmise kokkupuute jaoks sihtkontsentratsiooni ja ajavahemikku. Iga kokkupuudet soovitatakse alustada rühmaga, kelle kokkupuute kestus on kõige pikem, näiteks 240-minutilise kokkupuutega rühm, seejärel 120-minutilise kokkupuutega rühm jne. Kui näiteks loomad 240 minuti rühmas 90 minuti möödudes surevad või neil täheldatakse raske mürgistuse nähte (näiteks hingamisrütmi äärmuslikud muutused, nagu raske hingamine), ei ole mõistlik rühmale 120 minuti pikkust kokkupuudet korraldada, kuna suremus oleks tõenäoliselt 100 %. Seega peaks uuringu juht valima kõnealuse kontsentratsiooni jaoks lühemad kokkupuute ajavahemikud (näiteks 90, 65, 45, 33 ja 25 minutit).
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Kambrikontsentratsiooni tuleks mõõta sageli, et määrata kindlaks ajaga kaalutud keskmine kontsentratsioon kokkupuute iga ajavahemiku kohta. Alati kui on võimalik, tuleks statistilise analüüsi jaoks kasutada iga looma surmaaega (kokkupuute kestuse asemel).
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 Esimese nelja kokkupuute tulemusi tuleks uurida, et määrata kindlaks kontsentratsiooni ja aja kõvera andmelüngad (vt joonis 1). Kui kooskõla ei ole piisav, võib korraldada täiendava kokkupuute (5. kontsentratsioon). 5. kokkupuutekontsentratsioon ja ajavahemikud tuleks valida nii, et kõrvaldatakse kõnealune andmelünk.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Kõiki kokkupuuteid (sh esimest kokkupuudet) kasutatakse statistilise analüüsi alusel kontsentratsiooni, aja ja mõju vahelise seose arvutamiseks (16). Kui see on iga C × t intervalli puhul võimalik, siis tuleks kasutada ajaga kaalutud keskmist kontsentratsiooni ja kokkupuute kestust surmani (kui loom sureb kokkupuute ajal).
                                 
                                    Joonis 1
                                 
                                 
                                    Hüpoteetiline joonis kontsentratsiooni, aja ja suremuse vahelise seose kohta rottidel
                                 
                                 
                                    
                                 Valged sümbolid = ellujäänud; mustad sümbolid = surnud loomad
                                 Kolmnurgad = emased; ringid = isased
                                 Katkematu joon = LC50 väärtused (vahemik 7,5–240 min) kõigi n = 1 isaste puhul
                                 Katkendjoon = LC50 väärtused (vahemik 7,5–240 min) kõigi n = 1 emaste puhul
                                 Punktiirjooned = hüpoteetilised LC50 väärtused isaste ja emaste puhul, kui n oleks olnud 2 (12).
                                 Mõisted
                                 kontsentratsioon
                                 kokkupuute aeg
                                 piir
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Allpool on esitatud astmelise toimimiskäigu näide.
                                 
                                    I kokkupuude.   Katse piirkontsentratsioonil (vt joonis 1)
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Kummastki soost üks loom iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta; kokku 10 looma (2)
                                             
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Sihtkontsentratsioon (3) = piirkontsentratsioon.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Viis loomarühma viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga kõnealusel sihtkontsentratsioonil vastavalt 15, 30, 60, 120 ja 240 minutiks.
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    II kokkupuude
                                     (4)
                                    .   Põhiuuring
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Kummastki soost üks loom iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta; kokku 10 looma.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Viis loomarühma viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga väiksemal kontsentratsioonil (5) (1/2L) mõnevõrra pikemateks kokkupuute ajavahemikeks (ajavahemikud moodustavad geomeetrilise progressiooni, mille tegur on √2; vt joonis 1).
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    III kokkupuude.   Põhiuuring
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Kummastki soost üks loom iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta; kokku 10 looma.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Viis loomarühma viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga väiksemal kontsentratsioonil (5) (1/4L) mõnevõrra pikemateks kokkupuute ajavahemikeks (ajavahemikud moodustavad geomeetrilise progressiooni, mille tegur on √2; vt joonis 1).
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    IV’ kokkupuude.   Põhiuuring
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Kummastki soost üks loom iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta; kokku 10 looma.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Viis loomarühma viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga väiksemal kontsentratsioonil (5) (1/8L) mõnevõrra pikemateks kokkupuute ajavahemikeks (ajavahemikud moodustavad geomeetrilise progressiooni, mille tegur on √2; vt joonis 1).
                                          
                                       
                                    ↓ või
                                 
                                 
                                    IV kokkupuude.   Põhiuuring
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Kummastki soost üks loom iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta; kokku 10 looma.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Viis loomarühma viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga suuremal kontsentratsioonil (6) (2L) mõnevõrra lühemateks kokkupuute ajavahemikeks (ajavahemikud moodustavad geomeetrilise progressiooni, mille tegur on √2; vt joonis 1).
                                          
                                       
                           
                        C × t määramise eeskirja tulemuste matemaatiline tõlgendamine
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Nelja või viie kokkupuutekontsentratsiooniga ja viie ajavahemikuga C × t määramise eeskiri annab tulemuseks vastavalt 20 või 25 andmepunkti. Kõnealuste andmepunktide põhjal on võimalik arvutada C × t seos statistilise analüüsi abil (16).
                                 
                                    Võrrand 1:
                                 
                                 
                                    
                                 kus C = kontsentratsioon; t = kokkupuute kestus, või
                                 
                                    võrrand 2:
                                 
                                 
                                    
                                 kus 
                                 Võrrandi 1 abil on võimalik arvutada LC50 väärtus konkreetse ajavahemiku jaoks (näiteks 4 tundi, 1 tund, 30 minutit või muu ajavahemik katsetatud ajavahemike piires), kasutades väärtust P = 5 (50 % vastus). Pange tähele, et Haberi seadus on kohaldatav ainult juhul, kui n = 1. LC01 saab arvutada P = 2,67 alusel.
                              
                           ”
            
                  4)
               
               
                  Peatükid B.7 ja B.8 asendatakse järgmisega:
                  „B.7.   SUUKAUDSE KORDUSDOOSI TOKSILISUSE 28-PÄEVANE UURING NÄRILISTEL
                  
                  SISSEJUHATUS
                  
                              1.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga (Test Guideline, TG) 407 (2008). Esialgne TG 407 võeti vastu 1981. aastal. 1995. aastal võeti vastu läbivaadatud versioon, et saada uuringus kasutatud katseloomalt lisateavet, eelkõige neurotoksilisuse ja immuuntoksilisuse kohta.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              OECD algatas 1998. aastal prioriteetse tegevussuunana olemasolevate katsejuhendite läbivaatamise ja uute väljatöötamise, et sõeluuringutega selgitada välja võimalikud sisesekretsioonisüsteemi kahjustajad ja katsetada neid (8). Selle tegevuse üks osa on olemasoleva OECD juhendi „Suukaudse kordusdoosi toksilisuse 28-päevane uuring närilistel” (TG 407) ajakohastamine selliste näitajate lisamiseks, millega saab määrata uuritavate kemikaalide sisesekretsioonisüsteemi kahjustavat toimet. Ajakohastamiseks viidi ellu laialdane rahvusvaheline programm, et katsetada täiendavate näitajate asjakohasust ja kasutatavust, osutatud näitajate sobivust kemikaalide puhul, millel on (anti)östrogeenne, (anti)androgeenne ja (anti)türoidne toime, laborisisest ja laboritevahelist korratavust ning uute näitajate ja varasema TG 407 kohaselt nõutud näitajate vastastikust mõju. Niimoodi saadud suur hulk andmeid on kokku võetud põhjalikus OECD aruandes (9), milles andmeid on ka üksikasjalikult hinnatud. Käesolev ajakohastatud katsejuhend B.7 (mis on samaväärne katsejuhendiga TG 407) on välja töötatud rahvusvahelise uurimisprogrammi käigus saadud tulemuste ja kogemuste alusel. Käesolev katsemeetod võimaldab seada teatavad endokriinsüsteemi kaudu põhjustatavad toimed muude toksikoloogiliste mõjude konteksti.
                           
                        LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD
                  
                              3.
                           
                           
                              Kemikaali toksiliste omaduste kindlaksmääramisel ja hindamisel võib teha suukaudse mürgisuse katseid kordusdoosidega pärast seda, kui on saadud esialgne teave mürgisuse kohta ägeda mürgisuse katsetest. Käesoleva katsemeetodi eesmärk on uurida mürgisust, mille põhjuseks on väga mitmesugustele võimalikele mürgisuse sihtsüsteemidele avaldatav toime. Sellega saadakse teavet võimalike terviseohtude kohta, mis võivad tekkida korduval kokkupuutel suhteliselt piiratud ajavahemiku jooksul ja mis hõlmavad mõju närvisüsteemile, immuunsüsteemile ja sisesekretsioonisüsteemile. Seoses nende konkreetsete eesmärkidega peaks käesoleva meetodiga olema võimalik kindlaks teha võimalikke neurotoksilisi kemikaale, mida tuleb sellest aspektist edaspidi veel süvendatult uurida, ja kemikaale, mis mõjutavad kilpnäärme talitlust. Meetodiga võib saada andmeid ka kemikaalide kohta, mis mõjutavad mees- ja/või naissuguelundeid noortel täiskasvanud loomadel, samuti nende kemikaalide immunoloogilise toime kohta.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Käesoleva katsemeetodiga B.7 saadud tulemusi tuleks kasutada ohtude kindlakstegemiseks ja riskide hindamiseks. Sisesekretsioonisüsteemi iseloomustavate näitajate kaudu saadud tulemuste käsitlemisel tuleks arvestada „OECD kontseptuaalset raamistikku sisesekretsioonisüsteemi kahjustavate kemikaalide katsetamiseks ja hindamiseks” (11). Meetod kujutab endast põhilist kordusdoosi toksilisuse uurimise meetodit, mida võib kasutada kemikaalide korral, mille puhul 90-päevane uuring ei ole põhjendatud (näiteks kui tootmismaht ei ületa teatavat piiri), või pikaajalist katset ettevalmistava uuringuna. Kokkupuute ajavahemik peaks olema 28 päeva.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Nagu näitas rahvusvaheline programm, mis viidi ellu selliste parameetrite valideerimiseks, mis kõlbaksid uuritava kemikaali võimaliku sisesekretsioonisüsteemi häiriva mõju kindlakstegemiseks, sõltub käesoleva katsemeetodi B.7 tulemuste kvaliteet tugevasti sellest, kui kogenud on uurimislabor. See kehtib eriti emaslooma suguorganite tsükliliste muutuste histopatoloogilise määramise kohta ning selliste väikeste hormoonsõltuvate organite massi määramise kohta, mida on lahkamisel raske eraldada. On välja töötatud histopatoloogiaalane juhend (19). Juhend on kättesaadav OECD katsejuhendeid käsitleva avaliku veebisaidi kaudu. Juhendi eesmärk on aidata patoloogidel teha vaatlusi ja aidata suurendada katse tundlikkust. Sisesekretsioonisüsteemiga seotud toksilisuse kohta saab andmeid mitmesuguste näitajate kaudu, mida määratakse käesoleva katsemeetodiga. Näitajaid, mille kasulikkuse tõendamiseks ei olnud piisavalt andmeid või mille kohta valideerimisel selgus, et nende võime leida sisesekretsioonisüsteemi kahjustavaid kemikaale on vähe tõendatud, pakutakse vabal valikul kasutatavate näitajatena (vt 2. liide).
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Valideerimise käigus saadud andmete põhjal tuleb rõhutada, et käesoleva katse tundlikkus ei ole piisav selleks, et teha kindlaks kõik ained, millel on (anti)östrogeenne või (anti)androgeenne toime (9). Käesolevat meetodit ei kasutata eluetapil, mis on sisesekretsioonisüsteemi mõjutamise suhtes kõige tundlikum. Valideerimisel võimaldas käesolev meetod siiski kindlaks teha aineid, mis nõrgalt või tugevasti mõjutavad kilpnäärme funktsiooni, ning tugeva ja mõõduka endokriinse toimega aineid, mis toimivad östrogeeni või androgeeni retseptorite kaudu, kuid enamikul juhtudest ei võimaldanud meetod kindlaks teha selliseid endokriinse aktiivsusega aineid, mis mõjutavad östrogeeni või androgeeni retseptoreid nõrgalt. Seepärast ei saa seda meetodit pidada endokriinse aktiivsuse leidmise sõeluuringu meetodiks.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Järelikult ei saa sellise toimeviisiga seotud mõju puudumist pidada tõendiks, et aine ei mõjuta sisesekretsioonisüsteemi. Sisesekretsioonisüsteemi kaudu avalduva mõju puhul ei tohiks aine iseloomustamisel toetuda üksnes käesolevale meetodile, vaid seda meetodit tuleks kasutada tõendite kaalumise lähenemisviisi raames ja aine võimaliku endokriinse aktiivsuse iseloomustamiseks võtta arvesse kõik kemikaali kohta olemas olevad andmed. Seepärast peaks õigusloomealaste otsuste tegemine endokriinse toime kohta (aine iseloomustamine) olema põhjendatud laiaulatuslikul alusel, mitte üksnes käesoleva katsemeetodi abil saadud andmetega.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Meetodi kasutamisel arvestatakse, et kõik katsed loomadega peavad vastama loomade hooldamise kohalikele normidele; siin esitatud hoolduse ja kohtlemise kirjeldused on katse tegemise miinimumnõuded ning kui kohalikud eeskirjad on rangemad, tuleb lähtuda kohalikest eeskirjadest. OECD on esitanud loomade humaanse kohtlemise täiendavad juhendid (14).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.
                           
                        KATSE PÕHIMÕTE
                  
                              10.
                           
                           
                              Uuritav kemikaal manustatakse katseloomade eri rühmadele suu kaudu kord päevas astmeliselt suurenevate doosidena selliselt, et üks rühm saaks 28 päeva jooksul ainult ühte doosi. Manustamisperioodi jooksul jälgitakse loomi iga päev hoolikalt toksilisuse märkide tuvastamiseks. Katse ajal surnud või humaansel viisil surmatud loomad lahatakse ning katse lõppemisel surmatakse humaansel viisil ja lahatakse ka ellujäänud loomad. 28-päevane katse annab teavet korduva suukaudse kokkupuute mõjude kohta ja katsest võib selguda, et on vaja korraldada pikemaid uuringuid. Samuti võib katse anda teavet pikemas uuringus kasutatavate kontsentratsioonide valimise kohta. Käesoleva katsemeetodiga saadud andmed peaksid võimaldama kirjeldada uuritava kemikaali mürgisust, koostada mõju doosist sõltuvuse ja määrata katseloomadele täheldatava kahjuliku toimeta kontsentratsiooni (No-Observed Adverse Effect Level, NOAEL).
                           
                        MEETODI KIRJELDUS
                  
                     Loomaliigi valimine
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Närilistest eelistatakse rotte, kuigi kasutada võib ka muid närilisi. Kui käesolevas katsemeetodis B.7 kirjeldatud näitajaid uuritakse mõne muu näriliseliigiga, tuleb seda üksikasjalikult põhjendada. Kuigi bioloogiliselt on võimalik, et muu liik peaks mürgisele kemikaalile reageerima sarnaselt rotiga, võib väiksemate loomade kasutamisel suureneda tulemuste hajuvus, kuna väikseid organeid on tehniliselt keerukam eraldada. Sisesekretsioonisüsteemi häirivate kemikaalide kindlakstegemise rahvusvahelises valideerimisprogrammis kasutati ainsa liigina rotte. Kasutatakse enim kasutatavate laboriliinide noori terveid täiskasvanud loomi. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Doseerimisega tuleks alustada võimalikult kohe pärast võõrutamist ja igal juhul enne loomade üheksanädalaseks saamist. Uuringu alguses peaks loomade kehamassi erinevus olema minimaalne ega tohiks ületada ±20 % kummastki soost loomade keskmisest kehamassist. Kui suukaudse kordusdoosi uuringule järgneb pikaajaline uuring, tuleks mõlemas uuringus kasutada eelistatult samast aretusliinist ja sama päritoluga loomi.
                           
                        
                     Pidamis- ja söötmistingimused
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Kogu katse teostus peaks vastama laboriloomade hooldamise kohalikele normidele. Temperatuur katseloomade ruumis peab olema 22 °C (±3 °C). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitatavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi puhastamise ajal, on eesmärk hoida see vahemikus 50–60 %. Valgustus peab olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmisel võib kasutada tavalist labori söödavalikut; joogivee kogust ei piirata. Söödavalikut võib mõjutada vajadus kindlustada sobiva lisasegu lisamine, kui uuritavat kemikaali manustatakse sellisel viisil. Loomi tuleks pidada puurides väikeste samast soost isendite rühmadena; kui see on teaduslikult põhjendatud, võib loomi pidada ka üksikpuurides. Rühmaviisilisel pidamisel ei tohiks puuris olla rohkem kui viis looma.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Sööta tuleb korrapäraselt analüüsida saasteainete suhtes. Sööda proov tuleb alles hoida kuni katseprotokolli lõpliku valmimiseni.
                           
                        
                     Loomade ettevalmistamine
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Terved noored täiskasvanud loomad määratakse juhuvaliku alusel kontroll- ja katserühma. Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Loomad märgistatakse individuaalseks eristamiseks ning enne katse alustamist hoitakse neid vähemalt viis päeva puurides, et nad jõuaksid laboritingimustega kohaneda.
                           
                        
                     Dooside ettevalmistamine
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Uuritav kemikaal manustatakse sundsöötmisega või koos sööda või joogiveega. Suukaudse manustamise meetod sõltub uuringu eesmärgist ja uuritava kemikaali füüsikalis-keemilistest ja toksiko-kineetilistest omadustest.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav kemikaal sobivas kandeaines. On soovitav, et võimaluse korral kaalutakse esmalt vesilahuse/-suspensiooni kasutamist, seejärel õlilahuse/-suspensiooni (nt maisiõlis) kasutamist ja siis lahustamist mõnes muus võimalikus kandeaines. Kui kandeainena kasutatakse muud ainet peale vee, tuleb teada kandeaine toksilisusega seotud omadusi. Kindlaks tuleks määrata uuritava kemikaali stabiilsus kandeaines.
                           
                        KATSE KÄIK
                  
                     Loomade arv ja sugu
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Igal doositasemel tuleks kasutada vähemalt kümmet looma (viis emas- ja viis isaslooma). Kui plaanitakse vahepealset loomade surmamist, tuleb isendite arvu suurendada vastavalt selle arvu võrra, kui palju loomi kavatsetakse surmata enne uuringu täielikku lõpetamist. Tuleb kaaluda täiendava kümnest loomast (viis kummastki soost) koosneva lisarühma (edaspidi: „satelliitrühm”) kasutamist kontrollina ja suurima doosi rühmas, et jälgida mürgise toime pöörduvust, püsivust või mürgisuse avaldumist hilinemisega vähemalt 14 päeva jooksul pärast doseerimise lõppu.
                           
                        
                     Doseerimine
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Üldiselt tuleks kasutada vähemalt kolme doosi- ja kontrollrühma, kuid kui muude andmete hindamise põhjal ei eeldata ühtegi mõju korduva doosiga 1 000 mg kg kehamassi kohta päevas, võib teha piirsisalduskatse. Kui sobivaid andmeid ei ole, võib kasutatavate dooside kindlaksmääramise hõlbustamiseks teha doosipiirkonna määramise katse (kasutades sama liini ja päritoluga loomi). Kontrollrühma loomi tuleks kohelda samamoodi kui katserühma loomi, välja arvatud uuritava kemikaali manustamine. Kui uuritava kemikaali manustamisel kasutatakse kandeainet, tuleb võrdlusrühmale manustada kandeainet suurimas kasutatud mahus.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Doositaseme valimisel tuleks arvesse võtta kõiki uuritava kemikaali või sellelaadsete kemikaalide toksilisust käsitlevaid ja (toksiko-)kineetilisi andmeid. Kõrgeim doositase tuleks valida nii, et see kutsuks esile toksilise toime, kuid ei põhjustaks surma ega tõsiseid kannatusi. Seejärel tuleks valida aste-astmelt vähenevad doositasemed, et näidata doosi ja toime vahelist seost ning kahjuliku toime puudumist madalaimal doositasemel ehk täheldatava kahjuliku toimeta doositasemel (NOAEL). Alanevate kontsentratsioonide valimisel on sageli parim viis kasutada kahe- kuni neljakordseid vahemikke ja väga suurte kontsentratsioonivahemike (nt üle kümnekordne tegur) kasutamise asemel on parem lisada neljas katserühm.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Täheldatava üldise toksilisuse puhul (nt kehamassi vähenemine, mõju maksale, südamele, kopsudele või neerudele jne) või muude muutuste puhul, mille põhjuseks ei tarvitse olla toksiline toime (näiteks isu halvenemine, maksa suurenemine), tuleks jälgitavaid mõjusid immuunsüsteemi, närvisüsteemi või sisesekretsioonisüsteemi näitajatele tõlgendada suure ettevaatusega.
                           
                        
                     Piirsisalduskatse
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Kui käesolevas uuringus kirjeldatud meetodiga ei tuvastata katses päevadoosil vähemalt 1 000 mg kehamassi kg kohta või uuritava kemikaali protsentuaalselt sama suurel määral (määratud kehamassi alusel) sööda või joogivee kaudu manustamisel märkimisväärset toksilist mõju ja kui toksilisus ei ole samalaadse struktuuriga kemikaalide kohta saadud andmete põhjal ootuspärane, ei loeta täielikku kolme doositasemega uuringut vajalikuks. Võib teha piirsisalduskatse, välja arvatud juhul, kui inimese kokkupuude viitab vajadusele kasutada suuremat doositaset.
                           
                        
                     Dooside manustamine
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Loomadele doseeritakse uuritavat kemikaali seitsmel päeval nädalas 28 päeva jooksul. Kui uuritavat kemikaali manustatakse loomadele sundsöötmisega, tuleks seda teha ühe doosi kaupa, kasutades maosondi või sobivat intubatsioonikanüüli. Suurim vedelikukogus, mida saab ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Maht ei tohiks ületada 1 ml 100 g kehamassi kohta, välja arvatud vesilahuste puhul, kus võib kasutada mahtu 2 ml 100 g kehamassi kohta. Katsekoguse varieeruvust tuleks vähendada ja reguleerida kontsentratsioone nii, et doosi kogumaht oleks kõikide dooside korral sama; seda ei saa teha ärritavate või söövitavate kemikaalide puhul, mille mõju suurema kontsentratsiooni korral tavaliselt tugevneb.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Kemikaalide puhul, mida manustatakse sööda või joogiveega, on oluline tagada, et sisseantavad uuritava kemikaali kogused ei muudaks tavalist toitumise või joogivee tarbimise tasakaalu. Kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga, võib kasutada kas püsivat kontsentratsiooni söödas (ppm) või püsiva suurusega doosi vastavalt looma kehamassile; tuleb täpsustada, millist võimalust kasutatakse. Kui kemikaali manustatakse sundsöötmisega, tuleks doos anda igal päeval samal ajal ning seda tuleks vajaduse korral kohandada, et säiliks püsiv doositase looma kehamassi suhtes. Kui pärast kordusdoosi uuringut tehakse pikaajaline uuring, tuleks mõlema uuringu puhul kasutada samasugust sööta.
                           
                        
                     Vaatlused
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Jälgimise ajavahemik peaks olema 28 päeva. Satelliitrühma kuuluvaid loomi, keda vaadeldakse pikema aja jooksul, et teha kindlaks uuritava kemikaali toksilise toime hilinenud ilmnemist, toime püsimist või toimest toibumist, tuleks pidada veel vähemalt 14 päeva ilma uuritavat kemikaali manustamata.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Üldisi kliinilisi vaatlusi tuleks teha vähemalt kord päevas, soovitatavalt iga kord samal ajal ning võttes arvesse kõige tõenäolisemat aega pärast doseerimist, mille jooksul oodatud mõju peaks olema kõige tugevam. Üles tuleks märkida loomade tervislik seisund. Vähemalt kaks korda päevas tuleks kontrollida, kas loomad on haigestunud või surnud.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Kõikide loomade puhul tuleks üksikasjalik kliiniline vaatlus teha enne seda, kui loomale esimest korda uuritavat kemikaali manustatakse (selleks, et loomi oleks võimalik omavahel võrrelda), ning seejärel vähemalt kord nädalas. Need vaatlused tuleks teha väljaspool puuri, selleks ette nähtud kohas ja eelistatavalt iga kord samal kellaajal. Tulemused tuleks hoolikalt üles märkida, kasutades selleks võimaluse korral uurimislabori selgelt kindlaks määratud hindamissüsteeme. Tuleks püüda tagada, et katsetingimused varieeruksid võimalikult vähe ja eelistatult ei tohiks vaatlejad olla teadlikud uuritava kemikaali manustamisest. Üles tuleks märkida vähemalt järgmised tunnused: muutused nahal, karvastikus, silmades, limaskestal, eritiste esinemine ning autonoomsed muutused (nt pisaravool, turris karv, pupillide suurus, muutunud hingamine). Samuti tuleks üles märkida muutused kõnnakus, kehaasendis ja selles, kuidas loomad endaga ümberkäimisele reageerivad, kloonilised või toonilised liigutused, stereotüübid (nt ülemäärane karvastiku hooldamine, ringiratast keerlemine) või kummaline käitumine (nt enese vigastamine, tagurpidi liikumine) (2).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Neljandal kokkupuutenädalal tuleks hinnata sensoorseid reaktsioone eri liiki ärritajatele (2) (nt kuulmis-, nägemis- ja propriotseptiivsetele ärritajatele) (3, 4, 5), samuti haardetugevust (6) ja motoorset tegevust (7). Võimalike meetodite täpsemad üksikasjad on esitatud vastavates viidatud dokumentides. Siiski võib kasutada ka muid meetodeid kui need, millele viidatakse.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Neljanda kokkupuutenädala funktsionaalsed vaatlused võib ära jätta juhul, kui uuring tehakse subkroonilise toksilisuse 90-päevase uuringu eeluuringuna. Sellisel juhul tuleks funktsionaalsed vaatlused teha kõnealuse järeluuringu käigus. Teiselt poolt võivad kordusdoosi uuringu käigus tehtud funktsionaalsete vaatluste andmed hõlbustada järgneva subkroonilise uuringu jaoks doositasemete valimist.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Erandkorras võib funktsionaalsed vaatlused ära jätta ka rühmade puhul, kellel esineb toksilisuse märke niisugusel määral, et see oluliselt takistab funktsionaalsete katsete tegemist.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Lahkamisel võiks tupeäiete abil määrata kõikide emasloomade innatsükli (valikuline). Sellistest andmetest saadakse teavet innatsükli järgu kohta looma surmamise ajal ja see aitab histoloogiliselt hinnata östrogeenitundlikke kudesid (vt histopatoloogia juhendid (19)).
                           
                        
                     Kehamass ja sööda/vee tarbimine
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Kõiki loomi tuleks kaaluda vähemalt kord nädalas. Sööda tarbimist tuleks mõõta vähemalt kord nädalas. Kui uuritavat kemikaali manustatakse joogiveega, tuleb vee tarbimist samuti mõõta vähemalt kord nädalas.
                           
                        
                     Hematoloogia
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Katseperioodi lõpus tuleks teha järgmised hematoloogilised uuringud: hematokrit, hemoglobiini kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, retikulotsüütide arv, leukotsüütide üldarv ja eri leukotsüüdipopulatsioonide arvud, vereliistakute arv ja vere hüübimisaja/hüübimisvõime mõõtmine. Kui uuritav kemikaal või selle oletatavad metaboliidid on või võivad olla oksüdeerivate omadustega, tuleks teha veel muid määramisi, sealhulgas määrata methemoglobiini kontsentratsioon ja Heinzi kehakesed.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Vereproovid tuleks võtta kindlaksmääratud kohast vahetult enne loomade surmamist või selle ajal ja neid tuleks säilitada sobivates tingimustes. Enne surmamist tuleks loomi hoida üks öö söömata (7).
                           
                        
                     Kliiniline biokeemia
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Kliinilised biokeemilised analüüsid peamiste toksiliste mõjude uurimiseks kudedes ja eelkõige toime uurimisel neerudele ja maksale tuleks teha vereproovidega, mis on võetud loomadelt vahetult enne surmamist või selle ajal (välja arvatud loomad, kes leiti suremas ja/või surmati katse ajal). Plasma- või seerumiuuringud peavad hõlmama naatriumi, kaaliumi, glükoosi, üldkolesterooli, karbamiidi, kreatiniini, üldvalgu ja albumiini, vähemalt kahe hepatotsellulaarsele toimele osutava ensüümi (näiteks alaniinaminotransferaas, aspartaataminotransferaas, leeliseline fosfataas, γ-glutamüültranspeptidaas, ja glutamaatdehüdrogenaas) ja sapphapete määramist. Muude ensüümide (maksa- või muud ensüümid) ja bilirubiini mõõtmised võivad teatavatel tingimustel anda kasulikku teavet.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Uuringu viimasel nädalal on loomadelt teatava aja jooksul teatava mahuga uriiniproovide kogumise teel võimalik teha järgmisi uriinianalüüse: välimus, ruumala, osmolaalsus või suhteline tihedus, pH, valk, glükoos ja veri/vererakud.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Lisaks sellele tuleks kaaluda üldistele koekahjustustele osutavate plasma- või seerumimarkerite uurimist. Muud määramised, mis tuleks teha juhul, kui uuritava kemikaali teadaolevad omadused võivad mõjutada või mõjutavad eeldatavasti sellega seotud metaboliseerimise profiili, hõlmavad kaltsiumi, fosfaadi, triglütseriidide, teatavate hormoonide ja koliinesteraasi määramist. Need on vaja määrata teatud klassi kuuluvate kemikaalide puhul või iga juhtumi puhul eraldi.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Kuigi sisesekretsioonisüsteemi näitajate rahvusvahelise evalueerimisega ei õnnestunud näidata kilpnäärmehormoonide (T3, T4) ja TSH määramise selgeid eeliseid, võib siiski olla kasulik hoida alles plasma- ja seerumiproovid, et määrata T3, T4 ja (soovi korral) TSH, kui on andmeid, et võib esineda mõju ajuripatsi-kilpnäärme süsteemile. Neid proove võib säilitada külmutatult –20 °C juures. Hormoonide määramisel võivad hajuvust ja absoluutseid kontsentratsioone mõjutada järgmised tegurid:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          surmamise aeg, kuna hormoonide kontsentratsioonil on ööpäevane muutumise rütm;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          surmamisviis – tuleb vältida loomade tarbetut stressi, mis võib mõjutada hormoonide kontsentratsioone;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          hormoonide määramise testikomplektid, mille standardkõverad võivad olla erinevad.
                                       
                                    Usaldusväärsemalt kui hormoonide taseme määramisega saab kilpnääret mõjutavaid kemikaale teha kindlaks histopatoloogilise analüüsiga.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Hormoonide määramiseks ette nähtud plasmaproovid tuleb saada enam-vähem ühel kellaajal. T3, T4 ja TSH määramist soovitatakse kaaluda siis, kui kilpnäärmes leitakse histopatoloogilise uuringuga muutusi. Müügilolevate eri testikomplektidega saadakse erinevad hormoonikontsentratsioonide arvväärtused. Järelikult ei tarvitse olla võimalik esitada kvaliteedinõudeid, mis põhineksid ühesugustel varasematel andmetel. Teise võimalusena peaksid laborid püüdma hoida hajuvuskoefitsiendid T3 ja T4 puhul allpool 25 ning TSH puhul allpool 35. Kõik kontsentratsioonid esitatakse ühikutes ng/ml.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Kui varasemad andmed ei ole piisavad, tuleks kaaluda hematoloogiliste ja kliinilise biokeemia näitajate määramist enne doseerimise algust või määrata need loomadel, keda ei kasutata katserühmades.
                           
                        PATOLOOGIA
                  
                     Täielik lahkamine
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Kõik uuringus kasutatud loomad läbivad täieliku, põhjaliku lahkamise, milles uuritakse põhjalikult keha välispinda, kõiki avasid, kolju-, rinna- ja kõhuõõnt ja nende sisaldist. Kõikide loomade (välja arvatud need, kes leitakse surevana ja/või surmatakse uuringu ajal) maks, neerud, neerupealised, munandid, munandimanused, eesnääre ja seemnepõiekesed koos koagulatsiooninäärmetega tervikuna, harknääre, põrn, aju ja süda tuleb vajaduse korral puhastada muudest kudedest ja nende märgmass määratakse kuivamise vältimiseks võimalikult kiiresti pärast väljalõikamist. Eesnäärmekompleksi puhastamisel naaberkudedest tuleb hoolikalt vältida vedelikuga täidetud seemnepõiekeste vigastamist. Teise võimalusena võib seemnepõiekesed ja eesnäärme eraldada ja kaaluda pärast fikseerimist.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Lisaks tuleks vajaduse korral ja kuivamise vältimiseks võimalikult kiiresti pärast väljalõikamist kaaluda veel kaks kude: munasarjade paar (märgmass) ja emakas, kaasa arvatud emakakael (juhendid emakakudede eemaldamiseks ja kaalumiseks ettevalmistamiseks on esitatud dokumendis OECD TG 440 (18)).
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Kilpnäärme massi võib (soovi korral) määrata pärast fikseerimist. Ka siin tuleks väljalõikamine teha väga hoolikalt ja alles pärast fikseerimist, et vältida koe kahjustamist. Koe kahjustamine võib histopatoloogilise analüüsi nurjata.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Järgmisi kudesid tuleks hoida koetüübi ja kavandatava histopatoloogilise uuringu (vt punkt 47) seisukohast kõige sobivamas fikseerimiskeskkonnas: kõik silmaga täheldatavad vigastused, aju (olulised piirkonnad, sealhulgas suuraju, väikeaju, ajusild), seljaaju, silm, magu, peensool ja jämesool (sealhulgas Peyeri naastud), maks, neerud, neerupealised, põrn, süda, harknääre, kilpnääre, hingetoru ja kopsud (kopsud pumbatakse fiksaatorit täis ja pannakse fiksaatorisse), sugunäärmed (munandid ja munasarjad), suguelundid (emakas ja emakakael, munandimanused, eesnääre ja seemnepõiekesed koos koagulatsiooninäärmetega), tupp, kusepõis, lümfisõlmed (peale manustamiskohale kõige lähedasema lümfisõlme tuleks võtta teine lümfisõlm vastavalt labori oskustele (15)), perifeerne närv (istmiku- või sääreluu närv), mis on eelistatult lihase lähedal, skeletilihas ning luu koos luuüdiga (saadud lõikamisega või alternatiivselt värskelt imetud luuüdi). Munandid soovitatakse fikseerida sukeldamisega Bouini või muudetud Davidsoni fikseerimislahusesse (16, 17). Tunica albuginea tuleb elundi mõlemast otsast ettevaatlikult ja mitte sügavalt nõelaga läbi torgata, et fikseerimislahus saaks kiiresti sisse tungida. Kliinilised ja muud leiud võivad osutada vajadusele uurida ka muid kudesid. Säilitada tuleks ka muud organid, mis uuritava kemikaali teadaolevatest omadustest tulenevalt võivad tõenäoliselt olla sihtorganid.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Sisesekretsiooniga seotud mõjude kohta võib väärtuslikke osundusi saada järgmiste kudede uurimisega: sugunäärmed (munasarjad ja munandid), suguelundid (emakas koos emakakaelaga, munandimanused, seemnepõiekesed koos koagulatsiooninäärmetega, eesnäärme dorsolateraalne ja ventraalne osa), tupp, ajuripats, isaslooma rinnanääre, harknääre ja neerupealised. Muutusi isaslooma rinnanäärmetes ei ole piisavalt dokumenteeritud, kuid see näitaja võib olla väga tundlik östrogeense toimega kemikaalide suhtes. Soovi korral võib uurida ka organeid või kudesid, mida ei ole punktis 43 loetletud (vt 2. liide).
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Histopatoloogia juhendis (19) on üksikasjaliselt esitatud lisateavet lahkamise, fikseerimise, väljalõikamise ja sisesekretsioonikudede histopatoloogia kohta.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Rahvusvahelise katsetusprogrammiga saadi mõningaid tõendeid, et suguhormoonide homeostaasi vähe mõjutavate kemikaalide nõrka endokriinset toimet võib kindlaks teha pigem mitmesuguste kudede ja östruse tsükli vahelise sünkronisatsiooni häirumise kaudu, mitte aga emassuguelundite selgete histopatoloogiliste muutuste kaudu. Kuigi sellise mõju kohta selgeid tõendeid ei saadud, soovitatakse tõendeid östruse tsükli võimaliku asünkroonsuse kohta võtta arvesse munasarjade (folliikulrakkude, teekarakkude ja granuloosrakkude), emaka, emakakaela ja tupe histopatoloogiliste muutuste tõlgendamisel. Kui tupeäietega määratakse ka tsükli faasi, võiks saadud tulemust selles võrdluses samuti arvestada.
                           
                        
                     Histopatoloogia
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Kõikide võrdlusrühma ja suure doosiga rühmade loomade säilitatud organeid ja kudesid tuleks histopatoloogiliselt põhjalikult uurida. Histopatoloogilised uuringud tuleks teha ka muude doosirühmade loomade puhul, kui suure doosi rühmas leitakse manustamisega seotud muudatusi.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Uurida tuleks kõiki silmaga täheldatavaid kahjustusi.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Kui kasutatakse satelliitrühma, tuleks teha selliste kudede ja organite histopatoloogiline uuring, milles katserühma loomadel tehti kindlaks mõju.
                           
                        KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE
                  
                     Andmed
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Tulemused esitatakse iga üksiku looma kohta. Lisaks sellele tuleks kõik andmed koondada tabelisse, milles iga katserühma kohta märgitakse loomade arv katse alguses, katse ajal surnud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arv, iga surma või surmamise aeg, mürgistusnähtudega loomade arv, täheldatud mürgistusnähtude kirjeldus, sealhulgas mürgistusnähtude ilmnemise aeg, kestus, raskusaste, kahjustustega loomade arv, kahjustuste liik, raskusaste ja iga liiki kahjustuse kohta nende loomade protsent, kellel neid esines.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Võimaluse korral tuleks numbrilisi tulemusi hinnata asjakohase ja üldiselt tunnustatud statistilise meetodiga. Mõju võrdlemisel manustatud doosidega tuleks vältida mitme t-testi kasutamist. Statistilised meetodid tuleks valida uuringu kavandamise etapis.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Kvaliteedikontrolliks soovitatakse koguda varasemaid kontrollkatsete andmeid ja arvutada arvandmete hajuvuskoefitsiendid, eriti näitajate puhul, mis on seotud sisesekretsioonisüsteemi häirivate kemikaalide kindlakstegemisega. Neid andmeid võib kasutada võrdlemiseks, kui hinnatakse parajasti tehtavaid uuringuid.
                           
                        
                     Katseprotokoll
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uuritav kemikaal:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      füüsikaline olemus, puhtus ja füüsikalis-keemilised omadused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tunnusandmed.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Kandeaine (vajaduse korral):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kandeaine valimise põhjendus, kui kandeaine on muu kui vesi.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katseloomad:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kasutatud liik/liin;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      loomade arv, vanus ja sugu;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      päritolu, pidamistingimused, söötmine jne;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      iga looma kehamass katse alguses;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kui kasutatakse muud katselooma kui rott, siis liigi valimise põhjendus.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katsetingimused:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      doositaseme valimise põhjendus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      üksikasjad uuritava kemikaali koostise / söödavalmistise kohta, valmistises saavutatud kontsentratsiooni, stabiilsuse ja homogeensuse kohta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uuritava kemikaali manustamise üksikasjad;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vajaduse korral söödas/joogivees oleva uuritava kemikaali määra (ppm) teisendus tegelikuks päevadoosiks (mg kehamassi kg kohta);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uuritud valikulised näitajad:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uuritud valikuliste näitajate loetelu.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemused:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kehamass/kehamassi muutused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sööda tarbimine ja vajaduse korral vee tarbimine;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toksilise mõju andmed vastavalt looma soole ja doositasemele, sealhulgas mürgistusnähud;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kliiniliste ilmingute laad, raskus ja kestus (sõltuvalt sellest, kas nähud on pöörduvad või mitte);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sensoorse aktiivsuse, haardetugevuse ja motoorse tegevuse hindamine;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematoloogilised näitajad ja vastavad normaalväärtused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kliinilise biokeemia näitajad ja vastavad normaalväärtused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kehamass surmamise ajal ja organite mass;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      lahkamise tulemused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kõikide histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      võimaluse korral andmed imendumise kohta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vajaduse korral tulemuste statistiline töötlus.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemuste arutelu.
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Järeldused.
                                          
                                       
                                    
                        
                     1. liide
                     MÕISTED
                     Androgeensus– kemikaali võime mõjutada imetaja organismi samamoodi kui looduslik meessuguhormoon (st testosteroon).
                     Antiandrogeensus– kemikaali võime alla suruda loodusliku meessuguhormooni (st testosterooni) mõju imetaja organismile.
                     Antiöstrogeensus– kemikaali võime alla suruda loodusliku östrogeense hormooni (st östradiool 17ß) mõju imetaja organismile.
                     Antitüroidne aktiivsus– kemikaali võime alla suruda loodusliku kilpnäärmehormooni (st hormoon T3) mõju imetaja organismile.
                     Doseerimine– üldmõiste, mis hõlmab doosi, doseerimise sagedust ja kestust.
                     Doos– manustatav uuritava kemikaali kogus. Doos väljendatakse uuritava kemikaali massina katselooma kehamassi ühiku kohta päevas (näiteks mg / kehamassi kg / päev) või söödas oleva püsiva kontsentratsioonina.
                     Ilmne toksilisus– üldmõiste, mis osutab selgetele mürgistusnähtudele pärast uuritava kemikaali manustamist. Kõnealused nähud peaksid olema piisavad ohu hindamiseks ja peaksid olema sellised, et manustatava doosi suurendamise tõenäoliseks tulemuseks on tugev toksilisus ning tõenäoliselt ka surm.
                     NOAEL– lühend, millega tähistatakse doositaset, mis ei põhjusta ilmseid mürgistusnähte. See on kõrgeim doositase, kus doseerimine ei põhjusta manustamisega seotud leide.
                     Östrogeensus– kemikaali võime mõjutada imetaja organismi samamoodi kui looduslik östrogeenne hormoon (st östradiool 17ß).
                     Uuritav kemikaal– iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                     Türoidne aktiivsus– kemikaali võime mõjutada imetaja organismi samamoodi kui looduslik kilpnäärmehormoon (st hormoon T3).
                     Valideerimine– teaduslik menetlus, mille eesmärk on iseloomustada katsemeetodi läbiviimise nõudeid ning tõendada meetodi usaldusväärsust ja asjakohasust konkreetse eesmärgi saavutamiseks.
                  
                  
                     2. liide
                     
                        Käesolevas katsemeetodis B.7 sisesekretsioonisüsteemi häirivate kemikaalide kindlakstegemiseks soovitatavad näitajad
                     
                     
                                 Kohustuslikud näitajad
                              
                              
                                 Vabalt valitavad näitajad
                              
                           
                                 Mass
                              
                           
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             munandid
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             munandimanused
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             neerupealised
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             eesnääre ja seemnepõiekesed koos koagulatsiooninäärmetega
                                          
                                       
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             munasarjad
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             emakas koos emakakaelaga
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kilpnääre
                                          
                                       
                           
                                 Histopatoloogia
                              
                           
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             sugunäärmed:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         munandid ja
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         munasarjad
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             suguelundid:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         munandimanused
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         eesnääre ja seemnepõiekesed koos koagulatsiooninäärmetega
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         emakas koos emakakaelaga
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             neerupealised
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kilpnääre
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tupp
                                          
                                       
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             tupeäiged
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             isaslooma rinnanäärmed
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ajuripats
                                          
                                       
                           
                                 Hormoonide määramine
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             T3 ja T4 tase vereringes
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             TSH tase vereringes
                                          
                                       
                           
                  
                     KIRJANDUS
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691–704.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11 March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              OECD (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              OECD (2012). Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404–407.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52–85.
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM (2002). Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524–533.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties.
                           
                        
                              19)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.
                           
                        B.8.   SUBAKUUTNE MÜRGISUS SISSEHINGAMISEL: 28-PÄEVANE UURING
                  
                  KOKKUVÕTE
                  Käesolev läbivaadatud katsemeetod B.8 on koostatud uuritava kemikaali sissehingamisega toimuval korduval kokkupuutel piiratud ajavahemiku jooksul (28 päeva) avalduva mürgisuse täielikuks iseloomustamiseks ning sissehingamise riski kvantitatiivse hindamise andmete saamiseks. Vähemalt viiest isas- ja viiest emasloomast koosnevad närilisterühmad viiakse 28 päeva jooksul kuus tundi päevas kokkupuutesse a) uuritava kemikaaliga kolmel või enamal kontsentratsioonil, b) filtritud õhuga (negatiivne kontrollgrupp) ja/või c) kandeainega (kandeaine kontrollrühm). Loomade kokkupuude toimub üldjuhul viiel päeval nädalas, aga lubatud on ka kokkupuude seitsmel päeval nädalas. Alati katsetatakse nii isas- kui ka emasloomi, aga neid võidakse viia kokkupuutesse erinevate kontsentratsioonidega, kui on teada, et üks sugu on konkreetse uuritava kemikaali suhtes tundlikum. See meetod võimaldab uuringu juhile paindlikkust kaasata satelliitrühmad (pöörduvuse rühmad), teha bronhoalveolaarset lavaaži (BAL), neuroloogiakatseid ning täiendavaid kliinilise patoloogia ja histopatoloogia alaseid hindamisi, et uuritava kemikaali mürgisust paremini iseloomustada.
                  SISSEJUHATUS
                  
                              1.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga (Test Guideline, TG) 412 (2009). Algne sissehingamisel avalduvat subakuutset mürgisust käsitlev katsejuhend (katsejuhend nr 412) võeti vastu 1981. aastal (1). Käesolev katsemeetod B.8 (mis on samaväärne katsejuhendi nr 412 läbivaadatud versiooniga) on ajakohastatud, et võtta arvesse teaduse taset ja rahuldada praegusi ja tulevasi regulatiivseid vajadusi.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Käesolev meetod võimaldab iseloomustada uuritava kemikaali sissehingamisega toimuval korduval igapäevasel kokkupuutel 28 päeva jooksul avaldatavat kahjulikku mõju. Sissehingamisel avalduva subakuutse mürgisuse 28-päevastest uuringutest saadud andmeid on võimalik kasutada kvantitatiivseteks riskihindamisteks (kui neile ei järgne sissehingamisel avalduva subkroonilise mürgisuse 90-päevane uuring (käesoleva lisa peatükk B.29)). Andmetest saab samuti teavet pikema ajavahemiku uuringu jaoks (näiteks sissehingamise subkroonilise mürgisuse 90-päevase uuringu jaoks) kontsentratsioonide valimiseks. Käesolev katsemeetod ei ole spetsiaalselt ette nähtud nanomaterjalide katsetamiseks. Käesoleva katsemeetodi kontekstis kasutatud mõisted on esitatud selle peatüki lõpus ja juhenddokumendis nr 39 (2).
                           
                        LÄHTEKAALUTLUSED
                  
                              3.
                           
                           
                              Enne käesoleva katsemeetodi kohase katse tegemist peaks uurimislabor läbi vaatama kogu olemasoleva teabe uuritava kemikaali kohta, et parandada uuringu kvaliteeti ja minimeerida loomade kasutamist. Teave, mis aitab valida katseks sobivad uuritavad kontsentratsioonid, hõlmab järgmist: uuritava kemikaali keemiline nimetus, struktuur ja füüsikalis-keemilised omadused; mis tahes in vitro või in vivo mürgisuse katsete tulemused; eeldatavad kasutusvaldkonnad ja inimestega kokkupuute võimalused; olemasolevad (kvantitatiivsete) struktuuri-aktiivsuse sõltuvuste ((Q)SAR) andmed ja toksikoloogilised andmed samalaadse struktuuriga ainete kohta ning sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse katsete andmed. Kui uuringu puhul eeldatakse neurotoksilisust või täheldatakse uuringus selle olemasolu, võib uuringu juht otsustada teha sellekohased hindamised, näiteks funktsionaalsed vaatluskatsed (functional observational battery, FOB) ja motoorse aktiivsuse mõõtmise. Kuigi konkreetsete hindamiste jaoks kokkupuute korraldamise ajastus võib olla kriitilise tähtsusega, ei tohiks kõnealused täiendavad uuringud põhiuuringu kava elluviimist segada.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Söövitava või ärritava uuritava kemikaali lahjendatud lahuseid võib katsetada kontsentratsioonil, mis annab soovitud mürgisuse määra (vt juhenddokument nr 39 (2)). Loomade kokkupuutesse viimisel kõnealuste materjalidega peaks sihtkontsentratsioon olema piisavalt väike, et see ei põhjustaks märkimisväärset valu ega kannatusi, kuid piisav, et pikendada kontsentratsiooni-mõju kõver tasemeni, millega saavutatakse katse regulatiivne ja teaduslik eesmärk. Kõnealused kontsentratsioonid tuleks valida juhtumipõhiselt, eelistatavalt asjakohaselt koostatud doosipiirkonna määramise katse alusel, millega saadakse teavet kõige olulisema näitaja, ärrituse ilmnemise läviväärtuse ja aja kohta (vt punktid 11–13). Tuleks esitada kontsentratsiooni valimise põhjendus.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Suremas olevad loomad ja loomad, kes ilmselgelt kannatavad valu või kellel ilmnevad tõsiste või kestvate kannatuste tunnused, tuleks humaansel viisil surmata. Suremas olevaid loomi võetakse katsetulemuste tõlgendamisel arvesse samamoodi kui katse käigus surnud loomi. Kriteeriumid, mille põhjal tehakse suremas oleva või raskelt kannatava looma surmamise otsus, ja juhised prognoositava või läheneva surma kindlakstegemiseks on esitatud humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas OECD juhenddokumendis (3).
                           
                        MEETODI KIRJELDUS
                  
                     Loomaliigi valimine
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Kasutatakse enim kasutatavate laboriliinide noori terveid täiskasvanud loomi. Eelistatud liigiks on rott. Muu liigi kasutamise korral tuleks seda põhjendada.
                           
                        
                     Loomade ettevalmistamine
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Emasloomad ei tohiks olla poeginud ega tiined. Randomiseerimise päeval peaksid loomad olema seitsme kuni üheksa nädala vanused noored täiskasvanud. Kehamass ei tohiks erineda rohkem kui ± 20 % samast soost loomade keskmisest kehamassist. Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identifitseerimise võimaldamiseks ning hoitakse oma puuris vähemalt viis päeva enne katse algust, et võimaldada neil laboritingimustega kohaneda.
                           
                        
                     Pidamistingimused
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Loomad peaksid olema individuaalselt märgistatud, võimaluse korral nahaaluse transponderiga, et hõlbustada vaatlusi ja vältida segiajamist. Katseloomade pidamise ruumi temperatuur peaks olema 22 ± 3 °C. Suhtelist õhuniiskust tuleks eelistatult hoida vahemikus 30–70 %, kuigi see ei pruugi olla võimalik, kui kandeainena kasutatakse vett. Enne ja pärast kokkupuudet tuleks loomad tavaliselt paigutada soo ja kontsentratsiooni alusel rühmitatuna puuridesse, kuid loomade arv puuris ei tohiks segada iga looma täpset jälgimist ning peaks minimeerima loomade suremist kannibalismi ja võitlemise tõttu. Kui loomade kokkupuude toimub ainult nina kaudu, siis võib olla vajalik lasta neil hoiutorudega kohaneda. Hoiutorud ei tohiks põhjustada loomadele ülearuseid füüsilisi, soojusest või piiratud liikumisvõimest tingitud ebamugavusi. Loomade liikumise piiramine võib mõjutada füsioloogilisi näitajaid, näiteks kehatemperatuuri (hüpertermia) ja/või hingamise minutimahtu. Kui on kättesaadavad üldandmed, mille kohaselt kõnealuseid muutusi märkimisväärses ulatuses ei teki, ei ole eelnev hoiutoruga kohanemine vajalik. Kogu keha kaudu aerosooliga kokku puutuvaid loomi tuleks kokkupuute ajal eraldi hoida, et vältida loomadepoolset uuritava aerosooli filtrimist läbi oma puurikaaslaste karvkatte. Võib kasutada tavalisi ja sertifitseeritud laborisöötasid, v.a kokkupuute ajal, ning anda piiramatus koguses kraanivett. Valgustus peaks olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust.
                           
                        
                     Inhalatsioonikambrid
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Inhalatsioonikambri valimisel tuleks arvesse võtta uuritava kemikaali laadi ja katse eesmärki. Eelistatav kokkupuuteviis on ainult nina kaudu (mis hõlmab ainult pea, nina või koonu kaudu kokkupuudet). Ainult nina kaudu toimuvat kokkupuudet eelistatakse üldiselt vedelik- või pulberaerosooli ja aerosooliks kondenseeruda võiva auruga tehtavate uuringute puhul. Uuringu erieesmärgi saavutamiseks võib parem olla kokkupuude kogu keha kaudu, kuid seda tuleks katseprotokollis põhjendada. Kogukehakambri kasutamise korral keskkonna stabiilsuse tagamiseks ei tohiks katseloomade kogumaht kambris ületada 5 % kambri mahust. Ainult nina ja kogu keha kaudu kokkupuute tehnilisi põhimõtteid ning konkreetseid eeliseid ja puudujääke on kirjeldatud juhenddokumendis nr 39 (2).
                           
                        TOKSILISUSE UURINGUD
                  
                     Piirkontsentratsioonid
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Erinevalt ägeda mürgisuse uuringutest ei ole sissehingamisel avalduva subakuutse mürgisuse 28-päevastel uuringutel kindlaksmääratud piirkontsentratsioone. Maksimaalse katsetatava kontsentratsiooni valimisel tuleks arvesse võtta järgmist: 1) maksimaalne saavutatav kontsentratsioon, 2) millise kemikaalikontsentratsiooniga võib inimene kokku puutuda halvimal juhul, 3) vajadus säilitada piisav varustatus hapnikuga ja/või 4) loomade heaolu kaalutlused. Kui andmetel põhinevad piirangud puuduvad, võib kasutada määruse (EÜ) nr 1272/2008 (13) ägeda mürgisuse piirmäärasid (st kuni kontsentratsioonini 5 mg/l aerosooli puhul, 20 mg/l auru puhul ja 20 000 ppm gaasi puhul); vt juhenddokument nr 39 (2). Kui kõnealune piirmäär tuleb gaasi või väga lenduva uuritava kemikaali (näiteks külmutusagens) katsetamisel ületada, tuleks seda põhjendada. Piirkontsentratsioonil peaks ilmnema üheselt mõistetav mürgisus, kuid see ei tohiks põhjustada loomadele liigset stressi ega lühendada nende elu (3).
                           
                        
                     Doosipiirkonna määramise katse
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Enne põhiuuringu alustamist võib olla vaja teha doosipiirkonna määramise katse. Doosipiirkonna määramise katse on eeluuringust põhjalikum, kuna selles ei piirduta kontsentratsiooni valimisega. Doosipiirkonna määramise katsest saadud teadmistest võib sõltuda põhiuuringu edukus. Doosipiirkonna määramise katses võidakse näiteks saada tehnilist teavet analüüsimeetodite ja osakeste suuruse määramise kohta, teha kindlaks toksilisusmehhanisme, saada kliinilise patoloogia ja histopatoloogia andmeid ning hinnata, milline võib põhiuuringus olla täheldatava kahjuliku toimeta kontsentratsioon (NOAEL) ja minimaalne mürgine kontsentratsioon (MTC). Uuringu juht võib otsustada kasutada doosipiirkonna määramise katset, et määrata kindlaks hingamisteede ärrituse läviväärtus (näiteks hingamisteede histopatoloogia, kopsutalitluse katsete või bronhoalveolaarse lavaaži abil), maksimaalne kontsentratsioon, mille juures loomadele ei tekitata liigset stressi, ja uuritava kemikaali mürgisust kõige paremini iseloomustavad parameetrid.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Doosipiirkonna määramise katse võib hõlmata ühte või enamat kontsentratsiooni. Iga kontsentratsiooniga peaks kokku puutuma kuni kolm isas- ja kolm emaslooma. Doosipiirkonna määramise katse peaks kestma vähemalt viis päeva ja üldjuhul mitte kauem kui 14 päeva. Põhiuuringu kontsentratsioonide valimise põhjendused tuleks esitada uuringuprotokollis. Põhiuuringu eesmärk on näidata mõju sõltuvust kontsentratsioonist eelduste kohaselt kõige tundlikuma näitaja alusel. Väike kontsentratsioon peaks ideaaljuhul olema täheldatava kahjuliku toimeta kontsentratsioon ja suur kontsentratsioon peaks näitama üheselt mõistetavat mürgistust, kuid see ei tohiks põhjustada loomadele liigset stressi ega lühendada nende elu (3).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Doosipiirkonna määramise katse jaoks kontsentratsioonide valimisel tuleks arvesse võtta kogu saadaolevat teavet, sh struktuuri-aktiivsuse sõltuvusi ja samalaadseid kemikaale käsitlevaid andmeid (vt punkt 3). Doosipiirkonna määramise katse võib kinnitada mehhanistlike kriteeriumide alusel kõige tundlikumaks peetavaid näitajaid, nagu organofosfaatide põhjustatud koliinesteraasi inhibeerimine, erütrotsütotoksiliste ainete põhjustatud methemoglobiini teke, türoidhormoonid (T3, T4) türotoksikantide puhul, valk, laktaatdehüdrogenaas (LDH) või neutrofiilid bronhoalveolaarses lavaažis ohutute vähe lahustuvate osakeste või kopse ärritavate aerosoolide puhul, või need ümber lükata.
                           
                        
                     Põhiuuring
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Subakuutse mürgisuse põhiuuring hõlmab üldjuhul kolme kontsentratsiooni ning vajaduse korral samuti samaaegseid negatiivseid (õhu) ja/või kandeaine kontrollrühmi (vt punkt 17). Asjakohaste kokkupuutetasemete valimisel tuleks kasutada kõiki kättesaadavaid andmeid, sh süsteemse mürgisuse uuringute, metaboliseerimise ja kineetika uuringute tulemusi (eriti tuleks tähelepanu pöörata suure kontsentratsiooni vältimisele, mille puhul kineetilised protsessid küllastatakse). Iga katserühm koosneb vähemalt kümnest närilisest (viis isas- ja viis emaslooma), kes viiakse uuritava kemikaaliga kokkupuutesse kuueks tunniks päevas viiel päeval nädalas nelja nädala vältel (uuringu kogukestus on 28 päeva). Loomad võib viia kokkupuutesse ka seitsmel päeval nädalas (näiteks sissehingatavate ravimite katsetamisel). Kui üks sugu on teatava uuritava kemikaali suhtes teadaolevalt tundlikum, võib eri sugude puhul kasutada kokkupuutel erinevaid kontsentratsioone, et optimeerida mõju kontsentratsioonist sõltuvust, nagu on kirjeldatud punktis 15. Kui ainult nina kaudu toimuvat kokkupuudet kasutatakse muu näriliseliigi kui roti korral, võib suurimat kokkupuute kestust kohandada, et minimeerida konkreetse kasutatava liigi isendite kannatusi. Päevas vähem kui kuuetunnise kokkupuute kasutamisel või kui on vajalik korraldada pika kestusega (näiteks 22 tundi päevas) kogu keha kaudu kokkupuute uuring, tuleb seda põhjendada (vt juhenddokument nr 39 (2)). Loomi ei tohiks kokkupuute ajal sööta, v.a juhul, kui kokkupuuteperiood ületab kuut tundi. Kogu keha kaudu toimuva kokkupuute ajal võib loomadele anda vett.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Valitud sihtkontsentratsioonid peaksid võimaldama kindlaks teha sihtorgani(d) ja saada mõju selge sõltuvus kontsentratsioonist.
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Suur kontsentratsioon peaks põhjustama mürgist mõju, kuid ei tohiks põhjustada püsivaid nähte ega surma, mis takistaks usaldusväärset hindamist.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Keskmine (keskmised) kontsentratsioon(id) peaks(id) olema eraldatud, et esile kutsuda eri tugevusega mürgist mõju väikese ja suure kontsentratsiooni vahemikus.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Väike kontsentratsioon peaks põhjustama vähe mürgistusnähtusid või olema mõjuta.
                                       
                                    
                        
                     Satelliituuring (pöörduvuse uuring)
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Mürgistuse pöörduvuse, püsivuse või viivitusega avaldumise jälgimiseks võidakse korraldada satelliituuring (pöörduvuse uuring) töötlusjärgsel asjakohase pikkusega ajavahemikul, mis ei tohi olla lühem kui 14 päeva. Satelliitrühmades (pöörduvuse rühmades) on viis isas- ja viis emaslooma, kellele korraldatakse kokkupuude põhiuuringu katseloomadega samal ajal. Satelliituuringu (pöörduvuse uuringu) rühmad peaksid uuritava kemikaaliga kokku puutuma suurimal kontsentratsioonil ning vajaduse korral tuleks kasutada samaaegseid õhu ja/või kandeaine kontrollrühmi (vt punkt 17).
                           
                        
                     Loomade kontrollrühm
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Samaaegse negatiivse (õhu) kontrollrühma loomi tuleks kohelda katserühma loomadega samalaadsel viisil selle erinevusega, et nad viiakse uuritava kemikaali asemel kokkupuutesse filtritud õhuga. Kui katsekeskkonna loomisel kasutatakse vett või muud ainet, tuleks uuringus kasutada negatiivse (õhu) kontrollrühma asemel kandeaine kontrollrühma. Võimaluse korral tuleks kandeainena alati kasutada vett. Kui kandeainena kasutatakse vett, peaks loomade kontrollrühm puutuma kokku sama suhtelise õhuniiskusega õhuga kui katse käigus kokku puutuvad rühmad. Sobiva kandeaine valimine peaks põhinema asjakohasel eeluuringul või varasematel andmetel. Kui kandeaine mürgisus ei ole hästi teada, võib uuringu juht otsustada kasutada nii negatiivset (õhu) kontrollrühma kui ka kandeaine kontrollrühma, kuid see ei ole soovitatav. Kui varasematest andmetest nähtub, et kandeaine ei ole mürgine, ei ole negatiivset (õhu) kontrollrühma vaja ja tuleks kasutada ainult kandeaine kontrollrühma. Kui kandeaines oleva uuritava kemikaali eeluuringust mürgisust ei nähtu, siis võib järeldada, et kandeaine ei ole katsetataval kontsentratsioonil mürgine ja tuleks kasutada selle kandeaine kontrollrühma.
                           
                        KOKKUPUUTETINGIMUSED
                  
                     Kontsentratsioonide manustamine
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Loomad viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga, mis on gaas, aur, aerosool või nende segu. Katses kasutatav füüsikaline olek sõltub uuritava kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest, valitud kontsentratsioonist ja/või uuritava kemikaali kõige tõenäolisemast füüsikalisest vormist käsitsemise ja kasutamise ajal. Hügroskoopseid ja väga reaktsioonivõimelisi uuritavaid kemikaale tuleks katsetada kuiva õhu tingimustes. Tuleks olla ettevaatlik, et vältida plahvatusohtliku kontsentratsiooni tekkimist. Aineosakesi võib osakeste suuruse vähendamiseks mehaaniliselt töödelda. Täpsemad juhendid on esitatud juhenddokumendis nr 39 (2).
                           
                        
                     Osakeste suurusjaotus
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Osakeste suurusjaotus tuleks määrata kõigi aerosoolide puhul ja samuti aurude puhul, mis võivad kondenseeruda ja moodustada aerosooli. Hingamisteede kõigi asjakohaste piirkondadega kokkupuute võimaldamiseks soovitatakse kasutada aerosoole, mille osakeste massikeskmine aerodünaamiline diameeter (MMAD) on vahemikus 1–3 μm ning geomeetriline standardhälve (σg) on 1,5–3,0 (4). Kõnealuse standardi järgimiseks tuleks teha mõistlikud jõupingutused; kui standardit ei ole võimalik järgida, tuleks esitada eksperdihinnang. Näiteks metallisuitsu osakesed võivad olla kõnealusest normväärtusest väiksemad ning laenguga osakesed ja kiud võivad sätestatud näitajaid ületada.
                           
                        
                     Uuritava kemikaali preparaat kandeaines
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Ideaaljuhul tuleks uuritavat kemikaali katsetada ilma kandeaineta. Kui kandeaine kasutamine on vajalik sobiva uuritava kemikaali kontsentratsiooni ja osakeste suuruse tekitamiseks, tuleks eelistatavalt kasutada vett. Alati, kui uuritav kemikaal lahustatakse kandeaines, tuleks tõendada uuritava kemikaali stabiilsust.
                           
                        KOKKUPUUTETINGIMUSTE SEIRE
                  
                     Kambri õhuvarustus
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Kokkupuutekambri õhuvarustust tuleks hoolikalt kontrollida, pidevalt seirata ning andmed iga kokkupuute korral vähemalt kord tunnis registreerida. Katsekeskkonna kontsentratsiooni (või ajalise stabiilsuse) reaalajas seire on kõigi dünaamiliste parameetrite mõõtmisel tingimata vajalik ja kujutab endast kaudset vahendit sissehingamise kõigi asjakohaste dünaamiliste parameetrite kontrollimiseks. Kui kontsentratsiooni jälgitakse reaalajas, võib õhuvoogude mõõtmise sageduse vähendada ühele mõõtmisele kokkupuute kohta päevas. Ainult nina kaudu kokkupuudet võimaldava kambri puhul tuleks eritähelepanu pöörata väljahingatud õhu uuesti sissehingamise vältimisele. Hapnikusisaldus peaks olema vähemalt 19 % ja süsinikdioksiidisisaldus ei tohiks ületada 1 %. Kui on alust arvata, et kõnealuseid norme ei ole võimalik täita, tuleks hapniku- ja süsinikdioksiidisisaldust mõõta. Kui kokkupuute esimese päeva mõõtmistest nähtub, et kõnealuste gaaside sisaldus on nõuetekohasel tasemel, ei peaks edasine mõõtmine olema vajalik.
                           
                        
                     Kambri temperatuur ja suhteline õhuniiskus
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Kambri temperatuur tuleks hoida 22 ± 3 °C juures. Loomade hingamistsooni suhtelist õhuniiskust nii ainult nina kui ka kogu keha kaudu toimuva kokkupuute korral tuleks pidevalt seirata ja see tuleks registreerida võimaluse korral üks kord tunnis iga kokkupuute ajal. Suhtelist õhuniiskust tuleks eelistatavalt hoida vahemikus 30–70 %, kuid uuritava kemikaali mõju tõttu ei pruugi see olla saavutatav (näiteks veepõhise segu uurimisel) või mõõdetav.
                           
                        
                     Uuritav kemikaal: nimikontsentratsioon
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Kui see on võimalik, tuleks kokkupuutekambri nimikontsentratsioon alati arvutada ja registreerida. Nimikontsentratsioon on katsekeskkonda lisatud uuritava kemikaali mass, mis on jagatud läbi kambrisüsteemi suunatud õhu kogumahuga. Nimikontsentratsiooni ei kasutata loomade kokkupuute iseloomustamiseks, kuid nimikontsentratsiooni võrdlus tegeliku kontsentratsiooniga näitab katsesüsteemi kemikaali lisamise tõhusust ning seega saab seda kasutada kemikaali lisamisel esinevate probleemide avastamiseks.
                           
                        
                     Uuritav kemikaal: tegelik kontsentratsioon
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Tegelik kontsentratsioon on inhalatsioonikambris loomade hingamistsoonist võetud proovist määratud uuritava kemikaali kontsentratsioon. Tegelikke kontsentratsioone on võimalik saada kas spetsiifiliste meetodite abil (näiteks otsene proovivõtt, adsorptsiooni või keemilise reaktsiooni meetodid ning järgnev analüüsimine) või mittespetsiifiliste meetodite abil, näiteks filtrite gravimeetriline analüüs. Gravimeetrilise analüüsi kasutamine on lubatud ainult ühest koostisainest koosneva pulberaerosooli või vähelenduva vedeliku aerosooli korral ja see peaks olema enne katse tegemist kinnitatud konkreetse kemikaali määramisega. Mitmest koostisainest koosneva pulberaerosooli kontsentratsiooni kindlaksmääramiseks võib samuti kasutada gravimeetrilist analüüsi. Sel juhul tuleb analüüsiga tõendada, et õhus oleva materjali koostis sarnaneb lähtematerjali koostisega. Kui selline teave ei ole kättesaadav, võib osutuda vajalikuks teha uuringu vältel uuritava kemikaali (eelistatult lenduvas olekus) kordusanalüüse korrapäraste ajavahemike järel. Aerosoolainete puhul, mis võivad aurustuda või sublimeeruda, tuleks näidata, et valitud meetodiga koguti kõiki faase.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Võimaluse korral tuleks kogu katse jooksul kasutada uuritava kemikaali ühte partiid ning uuritavat proovi tuleks säilitada tingimustes, milles säilib selle puhtus, homogeensus ja stabiilsus. Enne uuringu alustamist tuleks uuritavat kemikaali, sh selle puhtust, iseloomustada; kui see on tehniliselt võimalik, tuleb keemiliselt määratleda ka kindlakstehtud saasteained ja lisandid ning määrata nende kogused. Seda on võimalik tõendada muu hulgas järgmiste andmete alusel: retentsiooniaeg ja suhteline piigipindala, molekulmass massispektroskoopia või gaaskromatograafia analüüsidest või muud hinnangud. Kuigi uurimislabor ei vastuta uuritava kemikaali proovi keemilise määratlemise eest, võib uurimislaboril olla mõttekas kinnitada tellija iseloomustust vähemalt piiratud ulatuses (näiteks värv, füüsikalised omadused jne).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Kokkupuutekeskkonda hoitakse võimaluste piires muutumatuna. Kokkupuutetingimuste stabiilsuse tõendamiseks võib kasutada reaalajas seire seadet, näiteks aerosooli fotomeetrit aerosoolide puhul või süsivesinike kogusisalduse analüsaatorit aurude puhul. Tegelikku kambrikontsentratsiooni tuleks mõõta vähemalt kolm korda iga kokkupuutepäeva jooksul iga kokkupuutekontsentratsiooni kohta. Kui see piiratud õhuvarustuse või väikeste kontsentratsioonide tõttu ei ole võimalik, võib kogu kokkupuuteperioodi kohta võtta ühe proovi. Ideaaljuhul tuleks kõnealune proov võtta kogu kokkupuuteaja jooksul. Kambrist võetud proovide kontsentratsioon ei tohiks keskmisest kontsentratsioonist erineda rohkem kui ±10 % gaaside ja aurude puhul või ±20 % vedelik- või pulberaerosoolide korral. Tuleks arvutada kambri tasakaaluoleku saavutamise aeg (t95) ja see registreerida. Kokkupuute ajavahemik kestab selle aja, kui uuritavat kemikaali lisatakse. Selles võetakse arvesse aega, mis on vajalik kambri tasakaaluseisundi saavutamiseks (t95) ja kontsentratsiooni vähenemiseks. Juhendid t95 hindamise kohta on esitatud juhenddokumendis nr 39 (2).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Väga keeruka segu puhul, mis koosneb gaasidest/aurudest ja aerosoolidest (näiteks põlemiskeskkonnad ja uuritavad kemikaalid, mida paiskab välja mõni eriotstarbeline lõppkasutustoode või -seade), võib iga faas käituda inhalatsioonikambris erinevalt. Seepärast tuleks valida vähemalt üks uuritav aine (mida analüüsiga määratakse), tavaliselt sellise segu peamine toimeaine, iga faasi (gaas/aur ja aerosool) kohta. Kui uuritav kemikaal on segu, tuleks kirja panna kogu segu analüütiline kontsentratsioon ja mitte ainult toimeaine või komponendi (analüüsiga määratava aine) kontsentratsioon. Lisateave tegelike kontsentratsioonide kohta on juhenddokumendis nr 39 (2).
                           
                        
                     Uuritav kemikaal: osakeste suurusjaotus
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Aerosooliosakeste suurusjaotus tuleks kindlaks määrata vähemalt iga nädal iga kontsentratsiooni kohta, kasutades kaskaadimpaktorit või alternatiivset seadet, näiteks aerodünaamilist osakeste suuruse määrajat. Kui on võimalik tõendada kaskaadimpaktori ja alternatiivse seadme abil saadud tulemuste võrdväärsust, võib kogu uuringu tegemiseks kasutada alternatiivset seadet.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Paralleelselt peamise seadmega tuleks kasutada muud seadet, näiteks gravimeetrilist filtrit või minitsüklonit või gaasipesukolbi, et veenduda peamise seadme kogumistõhususes. Osakeste suuruse analüüsi kaudu saadud massikontsentratsioon peaks mõistlikes piirides kokku langema filtrianalüüsi abil saadud massikontsentratsiooniga (vt juhenddokument nr 39 (2)). Kui uuringu varajases etapis on kõikidel uuritavatel kontsentratsioonidel võimalik tõendada võrdväärsust, võib täiendavatest kinnitavatest mõõtmistest loobuda. Loomade heaolu silmas pidades tuleks võtta meetmeid, et mitte saada katsest ebaselgeid andmeid, mille tõttu võib olla vajalik uuringut korrata.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Aurudega tuleks teha osakeste suurusjaotuse määramine sel juhul, kui on võimalik, et auru kondensatsiooni tõttu võib tekkida aerosool või kui auru keskkonnas tuvastatakse osakesi, mille puhul võib tegemist olla faaside seguga.
                           
                        VAATLUSED
                  
                              31.
                           
                           
                              Loomi tuleks enne kokkupuuteperioodi, selle vältel ja pärast seda kliiniliselt jälgida. Olenevalt loomade reageerimisest kokkupuutele võidakse ette näha sagedasem jälgimine. Kui loomade jälgimist takistab looma hoiutoru, halvasti valgustatud kogukehakamber või läbipaistmatu keskkond, tuleks loomi hoolikalt jälgida pärast kokkupuudet. Enne järgmise päeva kokkupuudet toimuva jälgimise abil on võimalik hinnata mürgise mõju pöörduvust või süvenemist.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Kõik vaatlusandmed registreeritakse iga looma kohta eraldi. Kui loomad surmatakse humaansetel kaalutlustel või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg võimalikult täpselt registreerida.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Puuri juures tehtavad vaatlused peaksid hõlmama naha ja karvkatte, silmade, limaskestade, hingamis-, vereringe- ja närvisüsteemi muutusi, samuti somatomotoorse aktiivsuse ja käitumismustri muutusi. Tähelepanu peaks olema suunatud värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, letargia, une ja kooma kindlakstegemisele. Pärakutemperatuuri mõõtmine võib anda lisaandmeid refleksipõhise hingamise aeglustumise või hüpo-/hüpertermia kohta, mis on seotud kokkupuute või vangistusega. Uuringusse võib lisada täiendavaid hindamisi, nagu kineetika, bioseire, kopsutalitlus, kopsukudedesse kogunevate vähe lahustuvate materjalide püsivus ja käitumismuutused.
                           
                        KEHAMASS
                  
                              34.
                           
                           
                              Iga looma kehamass tuleks registreerida natuke enne esimest kokkupuudet (päev 0) ja seejärel kaks korda nädalas (näiteks reedeti ja esmaspäeviti, et tõendada taastumist ilma kokkupuuteta nädalavahetuse jooksul, või pärast ajavahemikku, mis võimaldab süsteemse mürgisuse hindamist) ning surma või eutanaasia ajal. Kui esimese kahe nädala jooksul nähtusid ei ilmne, võib ülejäänud uuringu vältel mõõta kehamassi kord nädalas. Satelliitrühma (pöörduvuse rühma) loomade (kui neid kasutatakse) kaalumist tuleks jätkata iga nädal kogu taastumisperioodi vältel. Uuringu lõpetamisel tuleks iga looma veidi enne surmamist kaaluda, et võimaldada organite ja kehamassi suhte täpset arvutamist.
                           
                        SÖÖDA JA VEE TARBIMINE
                  
                              35.
                           
                           
                              Sööda tarbimist tuleks mõõta iga nädal. Samuti võib mõõta vee tarbimist.
                           
                        KLIINILINE PATOLOOGIA
                  
                              36.
                           
                           
                              Kliinilise patoloogia hindamised tuleks teha igale loomale, sh kontrollrühma ja satelliitrühma (pöörduvuse rühma) loomadele, kui nad surmatakse. Kokkupuute lõpetamise ja vereproovide võtmise vaheline ajavahemik tuleks registreerida, eriti kui kõnealuse näitaja taastumine on kiire. Plasmast kiiresti kaduvate indikaatorainete (näiteks COHb, CHE ja MetHb) määramiseks tuleb proov võtta kohe pärast kokkupuute lõppu.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Tabelis 1 on loetletud kliinilised patoloogilised parameetrid, mida nõutakse üldjuhul kõigi toksikoloogiliste uuringute puhul. Uriinianalüüs ei ole alati vajalik; selle võib teha, kui seda oodatava või ilmnenud toksilisuse tõttu peetakse kasulikuks. Uuringu juht võib uuritava kemikaali mürgisuse paremaks iseloomustamiseks otsustada hinnata täiendavaid parameetreid (näiteks koliinesteraas, lipiidid, hormoonid, happe-aluse tasakaal, methemoglobiin või Heinzi kehakesed, kreatiinkinaas, müeloidi/erütroidi suhe, troponiinid, arteriaalse vere gaasid, laktaatdehüdrogenaas, sorbitooldehüdrogenaas, glutamaatdehüdrogenaas ja γ-glutamüül-transpeptidaas).
                              
                                 Tabel 1
                              
                              
                                 Standardsed kliinilise patoloogia parameetrid
                              
                              
                                          Hematoloogia
                                       
                                    
                                          Erütrotsüütide arv
                                          Hematokrit
                                          Hemoglobiini kontsentratsioon
                                          Hemoglobiini keskmine kogus erütrotsüüdis (MCH)
                                          Keskmine erütrotsüüdi maht (MCV)
                                          Hemoglobiini keskmine kontsentratsioon erütrotsüüdis
                                          Retikulotsüüdid
                                       
                                       
                                          Leukotsüütide koguarv
                                          Diferentseeritud leukotsüütide arv
                                          Trombotsüütide arv
                                          Hüübimisvõime (valige üks):
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      protrombiini aeg
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hüübimisaeg
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      osalise tromboplastiini aeg
                                                   
                                                
                                    
                                          Kliiniline keemia
                                       
                                    
                                          Glükoos (8)
                                          
                                          Üldkolesterool
                                          Triglütseriidid
                                          Vere karbamiidlämmastik
                                          Üldbilirubiin
                                          Kreatiniin
                                          Üldvalk
                                          Albumiin
                                          Globuliin
                                       
                                       
                                          Alaniinaminotransferaas
                                          Aspartaataminotransferas
                                          Leeliseline fosfataas
                                          Kaalium
                                          Naatrium
                                          Kaltsium
                                          Fosfor
                                          Kloriid
                                       
                                    
                                          Uriinianalüüs (valikuline)
                                       
                                    
                                          Välimus (värvus ja hägusus)
                                          Kogus
                                          Suhteline tihedus või osmolaalsus
                                          pH
                                       
                                       
                                          Üldvalk
                                          Glükoos
                                          Veri/vererakud
                                       
                                    
                        
                              38.
                           
                           
                              Kui on tõendeid, et peamine kogunemise ja säilitamise piirkond on madalamad hingamisteed (s.o alveoolid), võib oletatava doosi-toime seose parameetrite kvantitatiivseks hindamiseks kasutada bronho-alveolaarset lavaaži, keskendudes alveoliidile, kopsukoe põletikule ja fosfolipidoosile. See võimaldab asjakohaselt kontrollida alveolaarse kahjustuse puhul esinevat doosi-toime seost ning toime sõltuvust ajast. Bronhoalveolaarse lavaaži vedelikku võib analüüsida leukotsüütide üldarvu ja diferentseeritud leukotsüüdiarvude, üldvalgu ja laktaatdehüdrogenaasi määramiseks. Veel võib kaaluda lüsosoomide kahjustust, fosfolipidoosi, fibroosi ning ärritus- või allergilist põletikku tõendavate näitajate määramist, selleks võib määrata ka põletikuaineid tsütokiine/kemokiine. Bronhoalveolaarse lavaaži mõõtmised üldiselt täiendavad histopatoloogiliste uuringute tulemusi, kuid ei saa neid asendada. Kopsude lavaaži tegemise juhendid on esitatud juhenddokumendis nr 39 (2).
                           
                        MAKROPATOLOOGIA JA ORGANITE MASS
                  
                              39.
                           
                           
                              Kõik katseloomad (kaasa arvatud katse käigus surnud, humaansel viisil surmatud või uuringust looma heaolu tagamiseks kõrvaldatud loomad) tuleks (võimaluse korral) täielikult veretustada ja täielikult lahata. Iga looma viimase kokkupuute lõpu ja surmamise vaheline ajavahemik tuleks registreerida. Kui lahkamine vahetult pärast surnud looma leidmist ei ole võimalik, tuleks loom jahutada (mitte külmutada) autolüüsi minimeerimiseks piisavalt madala temperatuurini. Lahata tuleks võimalikult kiiresti, tavaliselt ühe või kahe päeva jooksul. Iga looma kõik üldpatoloogilised muutused tuleks registreerida, pöörates eritähelepanu hingamisteede mis tahes muutustele.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Tabelis 2 on loetletud organid ja koed, mis täieliku lahkamise ajal tuleks sobivas keskkonnas säilitada histopatoloogilise uuringu jaoks. [Nurksulgudes esitatud] organite ja kudede ning muude organite ja kudede säilitamise otsustab uuringu juht. Paksus kirjas esitatud organid tuleb välja puhastada ja kaaluda nii kiiresti kui võimalik, et vältida kuivamist. Kilpnääret ja munandimanuseid tuleks kaaluda ainult vajaduse korral, kuna nende väljapuhastamisel tekkivad moonutused võivad takistada histopatoloogilist hindamist. Koed ja organid tuleks paigutada 10 % puhverdatud formaliini või muusse sobivasse fikseerivasse ainesse vahetult pärast lahkamist ja mitte vähem kui 24–48 tundi enne väljapuhastamist, olenevalt kasutatavast fikseerivast ainest.
                              
                                 Tabel 2
                              
                              
                                 Täieliku lahkamise juures säilitatavad organid ja koed
                              
                              
                                 Neerupealised
                              
                              Luuüdi (ja/või värske aspiraat)
                              
                                 Aju (sh suuraju osad, väikeaju ning piklikaju/ajusild)
                              [Silmad (võrkkest, nägemisnärv) ja silmalaud]
                              
                                 Süda
                              
                              
                                 Neerud
                              
                              Kõri (3 taset, üks tase hõlmab kõripealise põhja)
                              
                                 Maks
                              
                              
                                 Kopsud (kõik ühe tasandi sagarad, sh peamised bronhid)
                              Lümfisõlmed kopsu kopsuvärati piirkonnast eelkõige vähe lahustuvatest osakestest koosneva uuritava kemikaali korral. Põhjalikuma immunoloogiavaatluse või -uuringu jaoks võib kaaluda täiendavate lümfisõlmede, näiteks keskseinandi, kaela/submandibulaarse ja/või kõrva piirkonna lümfisõlmede säilitamist.
                              Nasofarüngeaalsed koed (vähemalt neljal tasandil; üks tasand peab hõlmama nasofarüngeaalset kanalit ja ninaga seotud lümfikude (NALT)).
                              Söögitoru
                              [Haistmissibul]
                              Munasarjad
                              Seemnepõiekesed
                              Seljaaju (kaela-, rinna- ja nimmepiirkond)
                              
                                 Põrn
                              
                              Magu
                              
                                 Munandid
                              
                              
                                 Harknääre
                              
                              Kilpnääre
                              Hingetoru (vähemalt 2 tasandit, sh 1 pikisuunaline lõige läbi hingetoruharja ja 1 ristlõige)
                              [Kusepõis]
                              Emakas
                              Kõik silmaga nähtavad kahjustused
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Kopsud tuleks tervena eemaldada, kaaluda ja paigutada sobivasse fikseerivasse ainesse rõhul 20–30 cm veesammast, et tagada kopsude struktuuri säilimine (5). Tuleks koguda ühel tasandil tehtud lõiked kõikidest sagaratest, sh peamistest bronhidest, kuid kui tehakse kopsude lavaaž, tuleks sellest sagarast, millele lavaaži ei tehtud, teha lõiked kolmel tasandil (mitte seeriaviisilised lõiked).
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Tuleks uurida vähemalt nelja nasofarüngeaalsete kudede tasandit, millest üks peaks hõlmama nasofarüngeaalset kanalit (5, 6, 7, 8, 9), et võimaldada asjakohaselt uurida skvamoosrakulist, ülemineku- (hingamisteede clara-rakud), hingamisteede (ripsepiteel) ja olfaktoorset epiteeli ning neid dreenivat lümfikude (NALT; 10, 11). Tuleks uurida kõri kolme tasandit ja üks neist tasanditest peaks hõlmama kõripealise põhja (12). Tuleks uurida vähemalt kahte hingetoru tasandit, sh ühte pikisuunalist lõiget läbi peabronhide bifurkatsiooni harja ja ühte ristlõiget.
                           
                        HISTOPATOLOOGIA
                  
                              43.
                           
                           
                              Kontrollrühma ja suure kontsentratsiooni rühma ning kõigi loomade puhul, kes uuringu jooksul surevad või surmatakse, tuleks teha kõigi tabelis 2 loetletud organite ja kudede histopatoloogiline hindamine. Eritähelepanu tuleks pöörata hingamisteedele, sihtorganitele ja nähtavatele kahjustustele. Organeid ja kudesid, milles suure kontsentratsiooni rühma isenditel leiti kahjustusi, tuleks uurida kõigi rühmade isenditel. Uuringu juht võib otsustada teha histopatoloogilised hindamised täiendavate rühmade puhul, et tõendada selget sõltuvust kontsentratsioonist. Kui kasutatakse satelliitrühma (pöörduvuse rühma), tuleks teha kõigi selliste kudede ja organite histopatoloogiline hindamine, milles katserühmade indiviididel leiti muutusi. Kui suure kokkupuute rühmas sureb liiga palju loomi varajases etapis või tekib muid probleeme, mis muudavad andmete tähenduse ähmaseks, tuleks histopatoloogiliselt uurida järgmise väiksema kontsentratsiooni rühma. Tuleks püüda omavahel seostada üldisi tähelepanekuid ja mikroskoopilisi leide.
                           
                        KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE
                  
                     Andmed
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Iga looma kohta tuleks esitada kehamassi, sööda tarbimise, kliinilise patoloogia, üldpatoloogia, organite massi ja histopatoloogia andmed. Kliiniliste vaatluste andmed tuleks esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates iga katserühma puhul ära osalenud loomade arvu, konkreetsete mürgistusnähtudega loomade arvu, katse käigus surnuna leitud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahanguleiud. Kõiki tulemusi, nii kvantitatiivseid andmeid kui ka üksiktähelepanekuid, tuleks sobiva statistilise meetodi abil hinnata. Võib kasutada kõiki üldtunnustatud statistilisi meetodeid; statistilised meetodid tuleks valida juba uuringu kavandamisel.
                           
                        
                     Katseprotokoll
                  
                  
                              45.
                           
                           
                              Katseprotokoll peaks sisaldama võimaluse korral järgmist teavet.
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katseloomad ja pidamistingimused
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Puuritingimuste kirjeldus, sh: loomade arv (või arvu muutus) puuri kohta, allapanu, õhu temperatuur ja suhteline õhuniiskus, valgustusperiood ja sööt.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kasutatud liik/liin ja muu liigi kui roti kasutamise põhjendus. Võib esitada lähteandmed ja varasemad andmed, kui need on saadud loomade kohta, kes viidi kemikaaliga kokkupuutesse samasugustes kokkupuute-, pidamis- ja nälgimistingimustes.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Loomade arv, vanus ja sugu.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Randomiseerimismeetod.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kõigi eelnenud ettevalmistamismeetmete kirjeldus, sh söötmine, karantiin ja haiguste ravi.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uuritav kemikaal
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused (kaasa arvatud isomeerne koostis).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Identifitseerimisandmed, Chemical Abstract Services Registry ehk CASi nr, kui see on teada.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Kandeaine
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kandeaine kasutamise põhjendus ja kandeaine valiku põhjendus (kui kandeainena ei kasutata vett).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Varasemad või rööpandmed, millega tõendatakse, et kandeaine ei mõjuta uuringu tulemusi.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhalatsioonikamber
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Inhalatsioonikambri üksikasjalik kirjeldus, sh selle mahu andmed ja joonis.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Loomade kokkupuute jaoks kasutatavate seadmete päritolu ja kirjeldus ning samuti keskkonna tekitamise kirjeldus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Temperatuuri, niiskuse, osakeste suuruse ja tegeliku kontsentratsiooni mõõtmise seadmed.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Õhuallikas ja õhu konditsioneerimiseks kasutatav süsteem.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Homogeense katsekeskkonna tagamise seadmete kaliibrimisel kasutatud meetodid.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Rõhuvahe (positiivne või negatiivne).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kokkupuuteportide arv kambri kohta (ainult nina kaudu toimuv kokkupuude); loomade paiknemine kambris (kogu keha kaudu toimuv kokkupuude).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Katsekeskkonna (atmosfääri) stabiilsus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Temperatuuri- ja niiskusandurite paigutus ning katsekeskkonnast proovide võtmine kambris.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Sissejuhitud ja väljatõmmatud õhu töötlemine.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Õhuvoolu kiirused, õhuvoolu kiirus kokkupuutepordi kohta (ainult nina kaudu toimuv kokkupuude) või loomade hulk kambri kohta (kogu keha kaudu toimuv kokkupuude).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Inhalatsioonikambri tasakaaluseisundini jõudmiseks vajalik aeg (t95).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kogu kambris oleva õhu vahetuste arv tunnis.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Mõõteseadmed (vajaduse korral).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Andmed kokkupuute kohta
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Põhiuuringu sihtkontsentratsiooni valimise põhjendus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Nimikontsentratsioonid (inhalatsioonikambrisse suunatud uuritava kemikaali kogumass, mis on jagatud läbi kambri juhitud õhu kogusega).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Uuritava kemikaali tegelikud kontsentratsioonid loomade hingamistsoonist kogutud proovides; heterogeensel füüsilisel kujul esineva segu (gaas, aur, aerosool) puhul võidakse iga faasi eraldi analüüsida.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kõik õhukontsentratsioonid tuleks teatada massiühikutena (mg/l, mg/m3 jne), mitte mahuühikutena (ppm, ppb jne).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Osakeste suurusjaotus, massikeskmine aerodünaamiline diameeter (MMAD) ja geomeetriline standardhälve (σg) ning nende arvutamise meetodid. Tuleks teatada üksikosakeste suuruse analüüsid.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katsetingimused
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Üksikasjalikud andmed uuritava kemikaali ettevalmistamise kohta, sh andmed meetmete kohta, mida kasutati tahke aine osakeste suuruse vähendamiseks või uuritava kemikaali lahuste valmistamiseks.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Katsekeskkonna tekitamiseks ja loomade kokkupuuteks katsekeskkonnaga kasutatud seadmete kirjeldus (eelistatult koos joonisega).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kambri temperatuuri, niiskuse ja õhuvoo jälgimiseks kasutatud seadmete üksikasjad (st kalibreerimiskõvera koostamine).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kambrikontsentratsiooni ja osakeste suurusjaotuse määramise proovide kogumise seadmete andmed.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kasutatud keemilise analüüsi meetodi ja selle valideerimise üksikasjad (sh uuritava kemikaali analüütiline saagis proovivõtukeskkonna analüüsimisel).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Loomade katse- ja kontrollrühma määramiseks kasutatud randomiseerimismeetod.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Üksikandmed sööda ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Katsekontsentratsioonide valiku põhjendus.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemused
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid katsekambri temperatuuri, niiskuse ja õhuvoolu kohta.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid kambri nimi- ja tegeliku kontsentratsiooni andmete kohta.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid osakeste suurusjaotuse kohta, sh analüüsiproovide võtmise andmed, osakeste suurusjaotus ning MMAD ja σg arvutamine.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid iga looma reageerimise ja kontsentratsioonide kohta (st mürgistusnähtudega loomad, kaasa arvatud surnud loomad, mõjude laad, raskus, ilmumise aeg ja kestus).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid iga katselooma kehamassi kohta.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid sööda tarbimise kohta.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid kliinilise patoloogia andmete kohta.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on olemas.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid kõigi muude mõõdetud näitajate kohta.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemuste arutelu ja tõlgendamine
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Eritähelepanu tuleks pöörata selliste meetodite kirjeldamisele, mida kasutati käesoleva katsemeetodi kriteeriumide täitmiseks, näiteks piirkontsentratsioon või osakeste suurus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Üldtulemuste alusel tuleks käsitleda küsimust, kas osakeste suurus oli sobiv sissehingamiseks, eelkõige siis, kui osakeste suuruse kriteeriume ei olnud võimalik täita.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Uuringu üldhinnangus tuleks käsitleda nimi- ja tegelike kontsentratsioonide kindlaksmääramiseks kasutatud meetodite kooskõlalisust ning tegeliku ja nimikontsentratsiooni vahelist seost.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tuleks käsitleda tõenäolist surma põhjust ja uuritava kemikaali peamist toimeviisi (süsteemne või lokaalne).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kui OECD humaansete lõpetamiskriteeriumide juhenddokumendis (3) sätestatud kriteeriumide alusel tekkis vajadus humaansel viisil surmata valu kannatavaid või tõsiste ja püsivate kannatuste tunnustega loomi, siis tuleks esitada selgitus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tuleks kindlaks teha sihtorgan(id).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tuleks määrata kindlaks täheldatava kahjuliku toimeta kontsentratsioon (NOAEL) ja väikseim täheldatavat kahjulikku toimet avaldav kontsentratsioon (LOAEL).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     KIRJANDUS
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 412, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229–258.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231–238.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215–263.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419–428.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1272/2008, 16. detsember 2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353, 31.12.2008, lk 1).
                           
                        
                     1. liide
                     MÕISTE
                     Uuritav kemikaal– iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                  ”
            
                  5)
               
               
                  Peatükid B.29 ja B.30 asendatakse järgmisega:
                  „B.29.   SUBKROONILINE MÜRGISUS SISSEHINGAMISEL: 90-PÄEVANE UURING
                  
                  KOKKUVÕTE
                  Käesolev läbivaadatud katsemeetod B.29 on koostatud uuritava kemikaali mürgisuse täielikuks iseloomustamiseks sissehingamisel subkroonilise ajavahemiku vältel (90 päeva) ning usaldusväärsete andmete saamiseks, et kvantitatiivselt hinnata sissehingamise riski. Kümnest isas- ja kümnest emasloomast koosnevad närilisterühmad viiakse 90 päeva (13 nädala) jooksul kuus tundi päevas kokkupuutesse a) uuritava kemikaaliga kolmel või enamal kontsentratsioonil, b) filtritud õhuga (negatiivne kontrollgrupp) ja/või c) kandeainega (kandeaine kontrollrühm). Loomade kokkupuude toimub üldjuhul viiel päeval nädalas, aga lubatud on ka kokkupuude seitsmel päeval nädalas. Alati katsetatakse nii isas- kui ka emasloomi, aga neid võidakse viia kokkupuutesse erinevate kontsentratsioonidega, kui on teada, et üks sugu on konkreetse uuritava kemikaali suhtes tundlikum. See meetod võimaldab uuringu juhile paindlikkust kaasata satelliitrühmad (pöörduvuse rühmad), surmata vahepeal loomi, teha bronhoalveolaarset lavaaži (BAL), neuroloogiakatseid ning täiendavaid kliinilise patoloogia ja histopatoloogia alaseid hindamisi, et uuritava kemikaali mürgisust paremini iseloomustada.
                  SISSEJUHATUS
                  
                              1.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga (Test Guideline, TG) 413 (2009). Algne sissehingamisel avalduvat subkroonilist mürgisust käsitlev katsejuhend (katsejuhend nr 413) võeti vastu 1981. aastal (1). Käesolev katsemeetod B.29 (mis on samaväärne katsejuhendi nr 413 läbivaadatud versiooniga (2009)) on ajakohastatud, et võtta arvesse teaduse taset ning rahuldada praegusi ja tulevasi regulatiivseid vajadusi.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Sissehingamisel subkroonilise mürgisuse uuringuid kasutatakse peamiselt töökeskkonnas töötajate jaoks tekkiva riski hindamiseks, et õigusaktidega kehtestada lubatud kontsentratsioone. Neid kasutatakse samuti inimeste elamute ja transpordiga seotud riskide ja keskkonnariski hindamiseks. Käesolev meetod võimaldab iseloomustada uuritava kemikaali sissehingamisega toimuval korduval igapäevasel kokkupuutel 90 päeva jooksul (ligikaudu 10 % roti elueast) avaldatavat kahjulikku mõju. Sissehingamisel subkroonilise mürgisuse uuringute andmeid saab kasutada kvantitatiivseks riski hindamiseks ja kroonilise mõju uuringute jaoks kontsentratsioonide valimiseks. Käesolev katsemeetod ei ole spetsiaalselt ette nähtud nanomaterjalide katsetamiseks. Käesoleva katsemeetodi kontekstis kasutatud mõisted on esitatud selle peatüki lõpus ja juhenddokumendis nr 39 (2).
                           
                        LÄHTEKAALUTLUSED
                  
                              3.
                           
                           
                              Enne käesoleva katsemeetodi kohase katse tegemist peaks uurimislabor läbi vaatama kogu olemasoleva teabe uuritava kemikaali kohta, et parandada uuringu kvaliteeti ja minimeerida loomade kasutamist. Teave, mis aitab valida katseks sobivad uuritavad kontsentratsioonid, hõlmab järgmist: uuritava kemikaali keemiline nimetus, struktuur ja füüsikalis-keemilised omadused; mis tahes in vitro või in vivo mürgisuse katsete tulemused; eeldatavad kasutusvaldkonnad ja inimestega kokkupuute võimalused; olemasolevad (kvantitatiivsete) struktuuri-aktiivsuse sõltuvuste ((Q)SAR) andmed ja toksikoloogilised andmed samalaadse struktuuriga ainete kohta ning muude korduva kokkupuute uuringutega saadud andmed. Kui uuringu puhul eeldatakse neurotoksilisust või täheldatakse uuringus selle olemasolu, võib uuringu juht otsustada teha sellekohased hindamised, näiteks funktsionaalsed vaatluskatsed (functional observational battery, FOB) ja motoorse aktiivsuse mõõtmise. Kuigi konkreetsete hindamiste jaoks kokkupuute korraldamise ajastus võib olla kriitilise tähtsusega, ei tohiks kõnealused täiendavad uuringud põhiuuringu kava elluviimist segada.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Söövitava või ärritava uuritava kemikaali lahjendatud lahuseid võib katsetada kontsentratsioonil, mis annab soovitud mürgisuse määra. Lisateave on avaldatud juhenddokumendis nr 39 (2). Loomade kokkupuutesse viimisel kõnealuste materjalidega peaks sihtkontsentratsioon olema piisavalt väike, et see ei põhjustaks märkimisväärset valu ega kannatusi, kuid piisav, et pikendada kontsentratsiooni-mõju kõver tasemeni, millega saavutatakse katse regulatiivne ja teaduslik eesmärk. Kõnealused kontsentratsioonid tuleks valida juhtumipõhiselt, eelistatavalt asjakohaselt koostatud doosipiirkonna määramise katse alusel, millega saadakse teavet kõige olulisema näitaja, ärrituse ilmnemise läviväärtuse ja aja kohta (vt punktid 11–13). Tuleks esitada kontsentratsiooni valimise põhjendus.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Suremas olevad loomad ja loomad, kes ilmselgelt kannatavad valu või kellel ilmnevad tõsiste või kestvate kannatuste tunnused, tuleks humaansel viisil surmata. Suremas olevaid loomi võetakse katsetulemuste tõlgendamisel arvesse samamoodi kui katse käigus surnud loomi. Kriteeriumid, mille põhjal tehakse suremas oleva või raskelt kannatava looma surmamise otsus, ja juhised prognoositava või läheneva surma kindlakstegemiseks on esitatud humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas OECD juhenddokumendis (3).
                           
                        MEETODI KIRJELDUS
                  
                     Loomaliigi valimine
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Kasutatakse enim kasutatavate laboriliinide noori terveid täiskasvanud loomi. Eelistatud liigiks on rott. Muu liigi kasutamise korral tuleks seda põhjendada.
                           
                        
                     Loomade ettevalmistamine
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Emasloomad ei tohiks olla poeginud ega tiined. Randomiseerimise päeval peaksid loomad olema seitsme kuni üheksa nädala vanused noored täiskasvanud. Kehamass ei tohiks erineda rohkem kui ±20 % samast soost loomade keskmisest kehamassist. Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identifitseerimise võimaldamiseks ning hoitakse oma puuris vähemalt viis päeva enne katse algust, et võimaldada neil laboritingimustega kohaneda.
                           
                        
                     Pidamistingimused
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Loomad peaksid olema individuaalselt märgistatud, eelistatult nahaaluse transponderiga, et hõlbustada vaatlusi ja vältida segiajamist. Katseloomade pidamise ruumi temperatuur peaks olema 22 ± 3 °C. Suhtelist õhuniiskust tuleks eelistatult hoida vahemikus 30–70 %, kuigi see ei pruugi olla võimalik, kui kandeainena kasutatakse vett. Enne ja pärast kokkupuudet tuleks loomad tavaliselt paigutada soo ja kontsentratsiooni alusel rühmitatuna puuridesse, kuid loomade arv puuris ei tohiks segada iga looma täpset jälgimist ning peaks minimeerima loomade suremist kannibalismi ja võitlemise tõttu. Kui loomade kokkupuude toimub ainult nina kaudu, siis võib olla vajalik lasta neil hoiutorudega kohaneda. Hoiutorud ei tohiks põhjustada loomadele ülearuseid füüsilisi, soojusest või piiratud liikumisvõimest tingitud ebamugavusi. Loomade liikumise piiramine võib mõjutada füsioloogilisi näitajaid, näiteks kehatemperatuuri (hüpertermia) ja/või hingamise minutimahtu. Kui on kättesaadavad üldandmed, mille kohaselt kõnealuseid muutusi märkimisväärses ulatuses ei teki, ei ole eelnev hoiutoruga kohanemine vajalik. Kogu keha kaudu aerosooliga kokkupuutuvaid loomi tuleks kokkupuute ajal eraldi hoida, et vältida loomadepoolset uuritava aerosooli filtrimist läbi oma puurikaaslaste karvkatte. Võib kasutada tavalisi ja sertifitseeritud laborisöötasid, v.a kokkupuute ajal, ning anda piiramatus koguses kraanivett. Valgustus peaks olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust.
                           
                        
                     Inhalatsioonikambrid
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Inhalatsioonikambri valimisel tuleks arvesse võtta uuritava kemikaali laadi ja katse eesmärki. Eelistatav kokkupuuteviis on ainult nina kaudu (mis hõlmab ainult pea, nina või koonu kaudu kokkupuudet). Ainult nina kaudu toimuvat kokkupuudet eelistatakse üldiselt vedelik- või pulberaerosooli ja aerosooliks kondenseeruda võiva auruga tehtavate uuringute puhul. Uuringu erieesmärgi saavutamiseks võib parem olla kokkupuude kogu keha kaudu, kuid seda tuleks katseprotokollis põhjendada. Kogukehakambri kasutamise korral keskkonna stabiilsuse tagamiseks ei tohiks katseloomade kogumaht ületada 5 % kambri mahust. Ainult nina ja kogu keha kaudu kokkupuute tehnilisi põhimõtteid ning konkreetseid eeliseid ja puudujääke on kirjeldatud juhenddokumendis nr 39 (2).
                           
                        TOKSILISUSE UURINGUD
                  
                     Piirkontsentratsioonid
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Erinevalt ägeda mürgisuse uuringutest ei ole sissehingamisel avalduva subkroonilise mürgisuse uuringutel kindlaksmääratud piirkontsentratsioone. Maksimaalse katsetatava kontsentratsiooni valimisel tuleks arvesse võtta järgmist: 1) maksimaalne saavutatav kontsentratsioon, 2) millise kemikaalikontsentratsiooniga võib inimene kokku puutuda halvimal juhul, 3) vajadus säilitada piisav varustatus hapnikuga ja/või 4) loomade heaolu kaalutlused. Kui andmetel põhinevad piirangud puuduvad, võib kasutada määruse (EÜ) nr 1272/2008 (13) ägeda mürgisuse piirmäärasid (st kuni kontsentratsioonini 5 mg/l aerosooli puhul, 20 mg/l auru puhul ja 20 000 ppm gaasi puhul), vt juhenddokument nr 39 (2). Kui kõnealune piirmäär tuleb gaasi või väga lenduva uuritava kemikaali (näiteks külmutusagens) katsetamisel ületada, tuleks seda põhjendada. Piirkontsentratsioonil peaks ilmnema üheselt mõistetav mürgisus, kuid see ei tohiks põhjustada loomadele liigset stressi ega lühendada nende elu (3).
                           
                        
                     Doosipiirkonna määramise katse
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Enne põhiuuringu alustamist on tavaliselt vaja teha doosipiirkonna määramise katse. Doosipiirkonna määramise katse on eeluuringust põhjalikum, kuna selles ei piirduta kontsentratsiooni valimisega. Doosipiirkonna määramise katsest saadud teadmistest võib sõltuda põhiuuringu edukus. Doosipiirkonna määramise katses võidakse näiteks saada tehnilist teavet analüüsimeetodite ja osakeste suuruse määramise kohta, teha kindlaks toksilisusmehhanisme, saada kliinilise patoloogia ja histopatoloogia andmeid ning hinnata, milline võib põhiuuringus olla täheldatava kahjuliku toimeta kontsentratsioon (NOAEL) ja minimaalne mürgine kontsentratsioon (MTC). Uuringu juht võib otsustada kasutada doosipiirkonna määramise katset, et määrata kindlaks hingamisteede ärrituse läviväärtus (näiteks hingamisteede histopatoloogia, kopsutalitluse katsete või bronhoalveolaarse lavaaži abil), maksimaalne kontsentratsioon, mille juures loomadele ei tekitata liigset stressi, ja uuritava kemikaali mürgisust kõige paremini iseloomustavad parameetrid.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Doosipiirkonna määramise katse võib hõlmata ühte või enamat kontsentratsiooni. Olenevalt valitud näitajatest tuleks kokkupuude iga kontsentratsiooniga korraldada kolmele kuni kuuele isasloomale ja kolmele kuni kuuele emasloomale. Doosipiirkonna määramise katse peaks kestma vähemalt viis päeva ja üldjuhul mitte kauem kui 28 päeva. Põhiuuringu kontsentratsioonide valimise põhjendused tuleks esitada uuringuprotokollis. Põhiuuringu eesmärk on näidata mõju sõltuvust kontsentratsioonist eelduste kohaselt kõige tundlikuma näitaja alusel. Väike kontsentratsioon peaks ideaaljuhul olema täheldatava kahjuliku toimeta kontsentratsioon ja suur kontsentratsioon peaks näitama üheselt mõistetavat mürgistust, kuid see ei tohiks põhjustada loomadele liigset stressi või lühendada nende elu (3).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Doosipiirkonna määramise katse jaoks kontsentratsioonide valimisel tuleks arvesse võtta kogu saadaolevat teavet, sh struktuuri-aktiivsuse sõltuvusi ja samalaadseid kemikaale käsitlevaid andmeid (vt punkt 3). Doosipiirkonna määramise katse võib kinnitada mehhanistlike kriteeriumide alusel kõige tundlikumaks peetavaid näitajaid, nagu organofosfaatide põhjustatud koliinesteraasi inhibeerimine, erütrotsütotoksiliste ainete põhjustatud methemoglobiini teke, türoidhormoonid (T3, T4) türotoksikantide puhul, valk, laktaatdehüdrogenaas (LDH) või neutrofiilid bronhoalveolaarses lavaažis ohutute vähe lahustuvate osakeste või kopse ärritavate aerosoolide puhul, või need ümber lükata.
                           
                        
                     Põhiuuring
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Subkroonilise mürgisuse põhiuuring hõlmab üldjuhul kolme kontsentratsiooni ning vajaduse korral samuti samaaegseid negatiivseid (õhu) ja/või kandeaine kontrollrühmi (vt punkt 18). Asjakohaste kokkupuutetasemete valimisel tuleks kasutada kõiki kättesaadavaid andmeid, sh süsteemse mürgisuse uuringute, metaboliseerimise ja kineetika uuringute tulemusi (eriti tuleks tähelepanu pöörata suure kontsentratsiooni vältimisele, mille puhul kineetilised protsessid küllastatakse). Iga katserühm koosneb kümnest isas- ja kümnest emasloomast (närilised), kes viiakse uuritava kemikaaliga kokkupuutesse kuueks tunniks päevas viiel päeval nädalas 13 nädala vältel (uuringu kogukestus on vähemalt 90 päeva). Loomad võib viia kokkupuutesse ka seitsmel päeval nädalas (näiteks sissehingatavate ravimite katsetamisel). Kui üks sugu on teatava uuritava kemikaali suhtes teadaolevalt tundlikum, võib eri sugude puhul kasutada kokkupuutel erinevaid kontsentratsioone, et optimeerida mõju kontsentratsioonist sõltuvust, nagu on kirjeldatud punktis 15. Kui ainult nina kaudu toimuvat kokkupuudet kasutatakse muu näriliseliigi kui roti korral, võib suurimat kokkupuute kestust kohandada, et minimeerida konkreetse kasutatava liigi isendite kannatusi. Päevas vähem kui kuuetunnise kokkupuute kasutamisel või kui on vajalik korraldada pika kestusega (näiteks 22 tundi päevas) kogu keha kaudu kokkupuute uuring, tuleb seda põhjendada (vt juhenddokument nr 39 (2)). Loomi ei tohiks kokkupuute ajal sööta, v.a juhul, kui kokkupuuteperiood ületab kuut tundi. Kogu keha kaudu toimuva kokkupuute ajal võib loomadele anda vett.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Valitud sihtkontsentratsioonid peaksid võimaldama kindlaks teha sihtorgani(d) ja saada mõju selge sõltuvus kontsentratsioonist.
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Suur kontsentratsioon peaks põhjustama mürgist mõju, kuid ei tohiks põhjustada püsivaid nähte ega surma, mis takistaks usaldusväärset hindamist.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Keskmine (keskmised) kontsentratsioon(id) peaks(id) olema eraldatud, et esile kutsuda eri tugevusega mürgist mõju väikese ja suure kontsentratsiooni vahemikus.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Väike kontsentratsioon peaks põhjustama vähe mürgistusnähtusid või olema mõjuta.
                                       
                                    
                        
                     Vahepealsed surmamised
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Kui osa loomi kavandatakse surmata uuringu vältel, tuleks iga kokkupuutetaseme loomade arvu suurendada enne uuringu lõppu surmata plaanitud loomade arvu võrra. Tuleks esitada vahepealsete surmamiste kasutamise põhjendus ja statistilistes analüüsides tuleks neid asjakohaselt arvesse võtta.
                           
                        
                     Satelliituuring (pöörduvuse uuring)
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Mürgistuse pöörduvuse, püsivuse või viivitusega avaldumise jälgimiseks võidakse korraldada satelliituuring (pöörduvuse uuring) töötlusjärgsel asjakohase pikkusega ajavahemikul, mis ei tohi olla lühem kui 14 päeva. Satelliitrühmades (pöörduvuse rühmades) on kümme isas- ja kümme emaslooma, kellele korraldatakse kokkupuude põhiuuringu katseloomadega samal ajal. Satelliituuringu (pöörduvuse uuringu) rühmad peaksid uuritava kemikaaliga kokku puutuma suurimal kontsentratsioonil ning vajaduse korral tuleks kasutada samaaegseid õhu ja/või kandeaine kontrollrühmi (vt punkt 18).
                           
                        
                     Loomade kontrollrühm
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Samaaegse negatiivse (õhu) kontrollrühma loomi tuleks kohelda katserühma loomadega samalaadsel viisil selle erinevusega, et nad viiakse uuritava kemikaali asemel kokkupuutesse filtritud õhuga. Kui katsekeskkonna loomisel kasutatakse vett või muud ainet, tuleks uuringus kasutada negatiivse (õhu) kontrollrühma asemel kandeaine kontrollrühma. Võimaluse korral tuleks kandeainena alati kasutada vett. Kui kandeainena kasutatakse vett, peaks loomade kontrollrühm puutuma kokku sama suhtelise õhuniiskusega õhuga kui katse käigus kokku puutuvad rühmad. Sobiva kandeaine valimine peaks põhinema asjakohasel eeluuringul või varasematel andmetel. Kui kandeaine mürgisus ei ole hästi teada, võib uuringu juht otsustada kasutada nii negatiivset (õhu) kontrollrühma kui ka kandeaine kontrollrühma, kuid see ei ole soovitatav. Kui varasematest andmetest nähtub, et kandeaine ei ole mürgine, ei ole negatiivset (õhu) kontrollrühma vaja ja tuleks kasutada ainult kandeaine kontrollrühma. Kui kandeaines oleva uuritava kemikaali eeluuringust mürgisust ei nähtu, siis võib järeldada, et kandeaine ei ole katsetataval kontsentratsioonil mürgine ja tuleks kasutada selle kandeaine kontrollrühma.
                           
                        KOKKUPUUTETINGIMUSED
                  
                     Kontsentratsioonide manustamine
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Loomad viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga, mis on gaas, aur, aerosool või nende segu. Katses kasutatav füüsikaline olek sõltub uuritava kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest, valitud kontsentratsioonist ja/või uuritava kemikaali kõige tõenäolisemast füüsikalisest vormist käsitsemise ja kasutamise ajal. Hügroskoopseid ja väga reaktsioonivõimelisi uuritavaid kemikaale tuleks katsetada kuiva õhu tingimustes. Tuleks olla ettevaatlik, et vältida plahvatusohtliku kontsentratsiooni tekkimist. Aineosakesi võib osakeste suuruse vähendamiseks mehaaniliselt töödelda. Täpsemad juhendid on esitatud juhenddokumendis nr 39 (2).
                           
                        
                     Osakeste suurusjaotus
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Osakeste suurusjaotus tuleks määrata kõigi aerosoolide puhul ja samuti aurude puhul, mis võivad kondenseeruda ja moodustada aerosooli. Hingamisteede kõigi asjakohaste piirkondadega kokkupuute võimaldamiseks soovitatakse kasutada aerosoole, mille osakeste massikeskmine aerodünaamiline diameeter (MMAD) on vahemikus 1–3 μm ning geomeetriline standardhälve (σg) on 1,5–3,0 (4). Kõnealuse standardi järgimiseks tuleks teha mõistlikud jõupingutused; kui standardit ei ole võimalik järgida, tuleks esitada eksperdihinnang. Näiteks metallisuitsu osakesed on kõnealusest normväärtusest väiksemad ning laenguga osakesed ja kiud võivad sätestatud näitajaid ületada.
                           
                        
                     Uuritava kemikaali preparaat kandeaines
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Ideaaljuhul tuleks uuritavat kemikaali katsetada ilma kandeaineta. Kui kandeaine kasutamine on vajalik sobiva uuritava kemikaali kontsentratsiooni ja osakeste suuruse tekitamiseks, tuleks eelistatavalt kasutada vett. Alati, kui uuritav kemikaal lahustatakse kandeaines, tuleks tõendada uuritava kemikaali stabiilsust.
                           
                        KOKKUPUUTETINGIMUSTE SEIRE
                  
                     Kambri õhuvarustus
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Kokkupuutekambri õhuvarustust tuleks hoolikalt kontrollida, pidevalt seirata ning andmed iga kokkupuute korral vähemalt kord tunnis registreerida. Katsekeskkonna kontsentratsiooni (või ajalise stabiilsuse) reaalajas seire on kõigi dünaamiliste parameetrite mõõtmisel tingimata vajalik ja kujutab endast kaudset vahendit sissehingamise kõigi asjakohaste dünaamiliste parameetrite kontrollimiseks. Kui kontsentratsiooni jälgitakse reaalajas, võib õhuvoogude mõõtmise sageduse vähendada ühele mõõtmisele kokkupuute kohta päevas. Ainult nina kaudu kokkupuudet võimaldava kambri puhul tuleks eritähelepanu pöörata väljahingatud õhu uuesti sissehingamise vältimisele. Hapnikusisaldus peaks olema vähemalt 19 % ja süsinikdioksiidisisaldus ei tohiks ületada 1 %. Kui on alust arvata, et kõnealuseid norme ei ole võimalik täita, tuleks hapniku- ja süsinikdioksiidisisaldust mõõta. Kui kokkupuute esimese päeva mõõtmistest nähtub, et kõnealuste gaaside sisaldus on nõuetekohasel tasemel, ei peaks edasine mõõtmine olema vajalik.
                           
                        
                     Kambri temperatuur ja suhteline õhuniiskus
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Kambri temperatuur tuleks hoida 22 ± 3 °C juures. Loomade hingamistsooni suhtelist õhuniiskust nii ainult nina kui ka kogu keha kaudu toimuva kokkupuute korral tuleks pidevalt seirata ja see tuleks registreerida võimaluse korral üks kord tunnis iga kokkupuute ajal. Suhtelist õhuniiskust tuleks eelistatavalt hoida vahemikus 30–70 %, kuid uuritava kemikaali mõju tõttu ei pruugi see olla saavutatav (näiteks veepõhise segu uurimisel) või mõõdetav.
                           
                        
                     Uuritav kemikaal: nimikontsentratsioon
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Kui see on võimalik, tuleks kokkupuutekambri nimikontsentratsioon alati arvutada ja registreerida. Nimikontsentratsioon on katsekeskkonda lisatud uuritava kemikaali mass, mis on jagatud läbi kambrisüsteemi suunatud õhu kogumahuga. Nimikontsentratsiooni ei kasutata loomade kokkupuute iseloomustamiseks, kuid nimikontsentratsiooni võrdlus tegeliku kontsentratsiooniga näitab katsesüsteemi kemikaali lisamise tõhusust ning seega saab seda kasutada kemikaali lisamisel esinevate probleemide avastamiseks.
                           
                        
                     Uuritav kemikaal: tegelik kontsentratsioon
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Tegelik kontsentratsioon on inhalatsioonikambris loomade hingamistsoonist võetud proovist määratud uuritava kemikaali kontsentratsioon. Tegelikke kontsentratsioone on võimalik saada kas spetsiifiliste meetodite abil (näiteks otsene proovivõtt, adsorptsiooni või keemilise reaktsiooni meetodid ning järgnev analüüsimine) või mittespetsiifiliste meetodite abil, näiteks filtrite gravimeetriline analüüs. Gravimeetrilise analüüsi kasutamine on lubatud ainult ühest koostisainest koosneva pulberaerosooli või vähelenduva vedeliku aerosooli korral ja see peaks olema enne katse tegemist kinnitatud konkreetse kemikaali määramisega. Mitmest koostisainest koosneva pulberaerosooli kontsentratsiooni kindlaksmääramiseks võib samuti kasutada gravimeetrilist analüüsi. Sel juhul tuleb analüüsiga tõendada, et õhus oleva materjali koostis sarnaneb lähtematerjali koostisega. Kui selline teave ei ole kättesaadav, võib osutuda vajalikuks teha uuringu vältel uuritava kemikaali (eelistatult lenduvas olekus) kordusanalüüse korrapäraste ajavahemike järel. Aerosoolainete puhul, mis võivad aurustuda või sublimeeruda, tuleks näidata, et valitud meetodiga koguti kõiki faase.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Võimaluse korral tuleks kogu katse jooksul kasutada uuritava kemikaali ühte partiid ning uuritavat proovi tuleks säilitada tingimustes, milles säilib selle puhtus, homogeensus ja stabiilsus. Enne uuringu alustamist tuleks uuritavat kemikaali, sh selle puhtust, iseloomustada; kui see on tehniliselt võimalik, tuleb keemiliselt määratleda ka kindlakstehtud saasteained ja lisandid ning määrata nende kogused. Seda on võimalik tõendada muu hulgas järgmiste andmete alusel: retentsiooniaeg ja suhteline piigipindala, molekulmass massispektroskoopia või gaaskromatograafia analüüsidest või muud hinnangud. Kuigi uurimislabor ei vastuta uuritava kemikaali proovi keemilise määratlemise eest, võib uurimislaboril olla mõttekas kinnitada tellija iseloomustust vähemalt piiratud ulatuses (näiteks värv, füüsikalised omadused jne).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Kokkupuutekeskkonda hoitakse võimaluste piires muutumatuna. Kokkupuutetingimuste stabiilsuse tõendamiseks võib kasutada reaalajas seire seadet, näiteks aerosooli fotomeetrit aerosoolide puhul või süsivesinike kogusisalduse analüsaatorit aurude puhul. Tegelikku kambrikontsentratsiooni tuleks mõõta vähemalt kolm korda iga kokkupuutepäeva jooksul iga kokkupuutekontsentratsiooni kohta. Kui see piiratud õhuvarustuse või väikeste kontsentratsioonide tõttu ei ole võimalik, võib kogu kokkupuuteperioodi kohta võtta ühe proovi. Ideaaljuhul tuleks kõnealune proov võtta kogu kokkupuuteaja jooksul. Kambrist võetud proovide kontsentratsioon ei tohiks keskmisest kontsentratsioonist erineda rohkem kui ±10 % gaaside ja aurude puhul või ±20 % vedelik- või pulberaerosoolide korral. Tuleks arvutada kambri tasakaaluoleku saavutamise aeg (t95) ja see registreerida. Kokkupuute ajavahemik kestab selle aja, kui uuritavat kemikaali lisatakse. Selles võetakse arvesse aega, mis on vajalik kambri tasakaaluseisundi saavutamiseks (t95) ja kontsentratsiooni langemiseks. Juhendid t95 hindamise kohta on esitatud juhenddokumendis nr 39 (2).
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Väga keeruka segu puhul, mis koosneb gaasidest/aurudest ja aerosoolidest (näiteks põlemiskeskkonnad ja uuritavad kemikaalid, mida paiskab välja mõni eriotstarbeline lõppkasutustoode või -seade), võib iga faas käituda inhalatsioonikambris erinevalt. Seepärast tuleks valida vähemalt üks indikaatoraine (mida analüüsiga määratakse), tavaliselt sellise segu peamine toimeaine, iga faasi (gaas/aur ja aerosool) kohta. Kui uuritav kemikaal on segu, tuleks kirja panna kogu segu analüütiline kontsentratsioon ja mitte ainult toimeaine või komponendi (analüüsiga määratava aine) kontsentratsioon. Lisateave tegelike kontsentratsioonide kohta on juhenddokumendis nr 39 (2).
                           
                        
                     Uuritav kemikaal: osakeste suurusjaotus
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Aerosooliosakeste suurusjaotus tuleks kindlaks määrata vähemalt iga nädal iga kontsentratsiooni kohta, kasutades kaskaadimpaktorit või alternatiivset seadet, näiteks aerodünaamilist osakeste suuruse määrajat. Kui on võimalik tõendada kaskaadimpaktori ja alternatiivse seadme abil saadud tulemuste võrdväärsust, võib kogu uuringu tegemiseks kasutada alternatiivset seadet.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Paralleelselt peamise seadmega tuleks kasutada muud seadet, näiteks gravimeetrilist filtrit või minitsüklonit või gaasipesukolbi, et veenduda peamise seadme kogumistõhususes. Osakeste suuruse analüüsi kaudu saadud massikontsentratsioon peaks mõistlikes piirides kokku langema filtrianalüüsi abil saadud massikontsentratsiooniga (vt juhenddokument nr 39 (2)). Kui uuringu varajases etapis on kõikidel uuritavatel kontsentratsioonidel võimalik tõendada võrdväärsust, võib täiendavatest kinnitavatest mõõtmistest loobuda. Loomade heaolu silmas pidades tuleks võtta meetmeid, et mitte saada katsest ebaselgeid andmeid, mille tõttu võib olla vajalik uuringut korrata.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Aurudega tuleks teha osakeste suurusjaotuse määramine sel juhul, kui on võimalik, et auru kondensatsiooni tõttu võib tekkida aerosool või kui auru keskkonnas tuvastatakse osakesi, mille puhul võib tegemist olla faaside seguga.
                           
                        VAATLUSED
                  
                              32.
                           
                           
                              Loomi tuleks enne kokkupuuteperioodi, selle vältel ja pärast seda kliiniliselt jälgida. Olenevalt loomade reageerimisest kokkupuutele võidakse ette näha sagedasem jälgimine. Kui loomade jälgimist takistab looma hoiutoru, halvasti valgustatud kogukehakamber või läbipaistmatu keskkond, tuleks loomi hoolikalt jälgida pärast kokkupuudet. Enne järgmise päeva kokkupuudet toimuva jälgimise abil on võimalik hinnata mürgise mõju pöörduvust või süvenemist.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Kõik vaatlusandmed registreeritakse iga looma kohta eraldi. Kui loomad surmatakse humaansetel kaalutlustel või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg võimalikult täpselt registreerida.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Puuri juures tehtavad vaatlused peaksid hõlmama naha ja karvkatte, silmade, limaskestade, hingamis-, vereringe- ja närvisüsteemi muutusi, samuti somatomotoorse aktiivsuse ja käitumismustri muutusi. Tähelepanu peaks olema suunatud värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, letargia, une ja kooma kindlakstegemisele. Pärakutemperatuuri mõõtmine võib anda lisaandmeid refleksipõhise hingamise aeglustumise või hüpo-/hüpertermia kohta, mis on seotud kokkupuute või vangistusega. Uuringusse võib lisada täiendavaid hindamisi, nagu kineetika, bioseire, kopsutalitlus, kopsukudedesse kogunevate vähe lahustuvate materjalide püsivus ja käitumismuutused.
                           
                        KEHAMASS
                  
                              35.
                           
                           
                              Iga looma kehamass tuleks registreerida natuke enne esimest kokkupuudet (päev 0) ja seejärel kaks korda nädalas (näiteks reedeti ja esmaspäeviti, et tõendada taastumist ilma kokkupuuteta nädalavahetuse jooksul, või pärast ajavahemikku, mis võimaldab süsteemse mürgisuse hindamist) ning pärast surma või eutanaasiat. Kui esimese nelja nädala jooksul nähtusid ei ilmne, võib ülejäänud uuringu vältel mõõta kehamassi kord nädalas. Satelliitrühma (pöörduvuse rühma) loomade (kui neid kasutatakse) kaalumist tuleks jätkata iga nädal kogu taastumisperioodi vältel. Uuringu lõpetamisel tuleks iga looma veidi enne surmamist kaaluda, et võimaldada organite ja kehamassi suhte täpset arvutamist.
                           
                        SÖÖDA JA VEE TARBIMINE
                  
                              36.
                           
                           
                              Sööda tarbimist tuleks mõõta iga nädal. Samuti võib mõõta vee tarbimist.
                           
                        KLIINILINE PATOLOOGIA
                  
                              37.
                           
                           
                              Kliinilise patoloogia hindamised tuleks teha igale loomale, sh kontrollrühma ja satelliitrühma (pöörduvuse rühma) loomadele, kui nad surmatakse. Kokkupuute lõpetamise ja vereproovide võtmise vaheline ajavahemik tuleks registreerida, eriti kui kõnealuse näitaja taastumine on kiire. Plasmast kiiresti kaduvate indikaatorainete (näiteks COHb, CHE ja MetHb) määramiseks tuleb proov võtta kohe pärast kokkupuute lõppu.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Tabelis 1 on loetletud kliinilised patoloogilised parameetrid, mida nõutakse üldjuhul kõigi toksikoloogiliste uuringute puhul. Uriinianalüüs ei ole alati vajalik; selle võib teha, kui seda oodatava või ilmnenud toksilisuse tõttu peetakse kasulikuks. Uuringu juht võib uuritava kemikaali mürgisuse paremaks iseloomustamiseks otsustada hinnata täiendavaid parameetreid (näiteks koliinesteraas, lipiidid, hormoonid, happe-aluse tasakaal, methemoglobiin või Heinzi kehakesed, kreatiinkinaas, müeloidi/erütroidi suhe, troponiinid, arteriaalse vere gaasid, laktaatdehüdrogenaas, sorbitooldehüdrogenaas, glutamaatdehüdrogenaas ja γ-glutamüül-transpeptidaas).
                              
                                 Tabel 1
                              
                              
                                 Standardsed kliinilise patoloogia parameetrid
                              
                              
                                          Hematoloogia
                                       
                                    
                                          Erütrotsüütide arv
                                          Hematokrit
                                          Hemoglobiini kontsentratsioon
                                          Hemoglobiini keskmine kogus erütrotsüüdis (MCH)
                                          Keskmine erütrotsüüdi maht (MCV)
                                          Hemoglobiini keskmine kontsentratsioon erütrotsüüdis
                                          Retikulotsüüdid
                                       
                                       
                                          Leukotsüütide koguarv
                                          Diferentseeritud leukotsüütide arv
                                          Trombotsüütide arv
                                          Hüübimisvõime (valige üks):
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      protrombiini aeg
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hüübimisaeg
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      osalise tromboplastiini aeg
                                                   
                                                
                                    
                                          Kliiniline keemia
                                       
                                    
                                          Glükoos (9)
                                          
                                          Üldkolesterool
                                          Triglütseriidid
                                          Vere karbamiidlämmastik
                                          Üldbilirubiin
                                          Kreatiniin
                                          Üldvalk
                                          Albumiin
                                          Globuliin
                                       
                                       
                                          Alaniinaminotransferaas
                                          Aspartaataminotransferaas
                                          Leeliseline fosfataas
                                          Kaalium
                                          Naatrium
                                          Kaltsium
                                          Fosfor
                                          Kloriid
                                       
                                    
                                          Uriinianalüüs (valikuline)
                                       
                                    
                                          Välimus (värvus ja hägusus)
                                          Kogus
                                          Suhteline tihedus või osmolaalsus
                                          pH
                                       
                                       
                                          Üldvalk
                                          Glükoos
                                          Veri/vererakud
                                       
                                    
                        
                              39.
                           
                           
                              Kui on tõendeid, et peamine kogunemise ja säilitamise piirkond on madalamad hingamisteed (s.o alveoolid), võib oletatava annuse-mõju seose parameetrite kvantitatiivseks hindamiseks kasutada bronho-alveolaarset lavaaži, keskendudes alveoliidile, kopsukoe põletikule ja fosfolipidoosile. See võimaldab asjakohaselt kontrollida alveolaarse kahjustuse puhul esinevat doosi-toime seost ning toime sõltuvust ajast. Bronhoalveolaarse lavaaži vedelikku võib analüüsida leukotsüütide üldarvu ja diferentseeritud leukotsüüdiarvude, üldvalgu ja laktaatdehüdrogenaasi määramiseks. Veel võib kaaluda lüsosoomide kahjustust, fosfolipidoosi, fibroosi ning ärritus- või allergilist põletikku tõendavate näitajate määramist, selleks võib määrata ka põletikuaineid tsütokiine/kemokiine. Bronhoalveolaarse lavaaži mõõtmised üldiselt täiendavad histopatoloogiliste uuringute tulemusi, kuid ei saa neid asendada. Kopsude lavaaži tegemise juhendid on esitatud juhenddokumendis nr 39 (2).
                           
                        OFTALMOLOOGILINE LÄBIVAATUS
                  
                              40.
                           
                           
                              Enne uuritava kemikaali manustamist tuleks kõikide loomade ning katse lõpetamisel kõikide suure kontsentratsiooni ja kontrollrühmade loomade puhul teha oftalmoskoobi või samaväärse seadme abil silmapõhja, valgust murdvate keskkondade, iirise ja sidekestade oftalmoloogilised uuringud. Kui silmas tuvastatakse muutusi, tuleks uurida kõiki muude rühmade (sh satelliitrühma (pöörduvuse rühma)) loomi.
                           
                        MAKROPATOLOOGIA JA ORGANITE MASS
                  
                              41.
                           
                           
                              Kõik katseloomad (kaasa arvatud katse käigus surnud, humaansel viisil surmatud või uuringust looma heaolu tagamiseks kõrvaldatud loomad) tuleks (võimaluse korral) täielikult veretustada ja täielikult lahata. Iga looma viimase kokkupuute lõpu ja surmamise vaheline ajavahemik tuleks registreerida. Kui lahkamine vahetult pärast surnud looma leidmist ei ole võimalik, tuleks loom jahutada (mitte külmutada) autolüüsi minimeerimiseks piisavalt madala temperatuurini. Lahata tuleks võimalikult kiiresti, tavaliselt ühe või kahe päeva jooksul. Iga looma kõik üldpatoloogilised muutused tuleks registreerida, pöörates eritähelepanu hingamisteede mis tahes muutustele.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Tabelis 2 on loetletud organid ja koed, mis täieliku lahkamise ajal tuleks sobivas keskkonnas säilitada histopatoloogia uuringu jaoks. [Nurksulgudes esitatud] organite ja kudede ning muude organite ja kudede säilitamise otsustab uuringu juht. Paksus kirjas esitatud organid tuleb välja puhastada ja kaaluda nii kiiresti kui võimalik, et vältida kuivamist. Kilpnääret ja munandimanuseid tuleks kaaluda ainult vajaduse korral, kuna nende väljapuhastamisel tekkivad moonutused võivad takistada histopatoloogilist hindamist. Koed ja organid tuleks paigutada 10 % puhverdatud formaliini või muusse sobivasse fikseerivasse ainesse vahetult pärast lahkamist ja mitte vähem kui 24–48 tundi enne väljapuhastamist, olenevalt kasutatavast fikseerivast ainest.
                              
                                 Tabel 2
                              
                              
                                 Täieliku lahkamise juures säilitatavad organid ja koed
                              
                              
                                 Neerupealised
                              
                              Aort
                              Luuüdi (ja/või värske aspiraat)
                              
                                 Aju (sh suuraju osad, väikeaju ning piklikaju/ajusild)
                              Umbsool
                              Käärsool
                              Kaksteistsõrmiksool
                              [Munandimanused]
                              [Silmad (võrkkest, nägemisnärv) ja silmalaud]
                              Reieluu ja põlveliiges
                              Sapipõis (kui see on olemas)
                              [Harderi näärmed]
                              
                                 Süda
                              
                              Niudesool
                              Tühisool
                              
                                 Neerud
                              
                              [Pisaranäärmed (eksorbitaalsed)]
                              Kõri (kolm taset, kaasa arvatud kõripealise põhi)
                              
                                 Maks
                              
                              
                                 Kopsud (kõik ühe tasandi sagarad, sh peamised bronhid)
                              Lümfisõlmed kopsu kopsuvärati piirkonnast, eelkõige vähe lahustuvatest osakestest koosneva uuritava kemikaali puhul. Põhjalikuma immunoloogilise suunitlusega vaatluse ja/või uuringu puhul võib kaaluda täiendavate lümfisõlmede säilitamist, näiteks keskseinandi, kaela/submandibulaarsest ja/või kõrva piirkonnast.
                              Lümfisõlmed (distaalsed sisenemisavast)
                              Piimanääre (emasloomadel)
                              Lihas (reielihas)
                              Nasofarüngeaalsed koed (vähemalt neljal tasandil; üks tasand peab hõlmama nasofarüngeaalset kanalit ja ninaga seotud lümfikude (NALT)).
                              Söögitoru
                              [Haistmissibul]
                              
                                 Munasarjad
                              
                              Kõhunääre
                              Kõrvalkilpnäärmed
                              Perifeerne närv (istmiku- või sääreluu närv, eelistatavalt lihase lähedal)
                              Ajuripats
                              Eesnääre
                              Pärasool
                              Süljenäärmed
                              Seemnepõiekesed
                              Nahk
                              Seljaaju (kaela-, rinna- ja nimmepiirkond)
                              
                                 Põrn
                              
                              Rinnak
                              Magu
                              Hambad
                              
                                 Munandid
                              
                              
                                 Harknääre
                              
                              
                                 Kilpnääre
                              
                              [Keel]
                              Hingetoru (vähemalt kaks tasandit, sh üks pikisuunaline lõige läbi hingetoruharja ja üks ristlõige)
                              [Kusejuha]
                              [Kusiti]
                              Kusepõis
                              
                                 Emakas
                              
                              Sihtorganid
                              Kõik nähtavad kahjustused ja massid
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Kopsud tuleks tervena eemaldada, kaaluda ja paigutada sobivasse fikseerivasse ainesse rõhul 20–30 cm veesammast, et tagada kopsude struktuuri säilimine (5). Tuleks koguda ühel tasandil tehtud lõiked kõikidest sagaratest, sh peamistest bronhidest, kuid kui tehakse kopsude lavaaž, tuleks sellest sagarast, millele lavaaži ei tehtud, teha lõiked kolmel tasandil (mitte seeriaviisilised lõiked).
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Tuleks uurida vähemalt nelja nasofarüngeaalsete kudede tasandit, millest üks peaks hõlmama nasofarüngeaalset kanalit (5, 6, 7, 8, 9), et võimaldada asjakohaselt uurida skvamoosrakulist, ülemineku- (hingamisteede clara-rakud), hingamisteede (ripsepiteel) ja olfaktoorset epiteeli ning neid dreenivat lümfikude (NALT) (10, 11). Tuleks uurida kõri kolme tasandit ja üks neist tasanditest peaks hõlmama kõripealise põhja (12). Tuleks uurida vähemalt kahte hingetoru tasandit, sh ühte pikisuunalist lõiget läbi peabronhide bifurkatsiooni harja ja ühte ristlõiget.
                           
                        HISTOPATOLOOGIA
                  
                              45.
                           
                           
                              Kontrollrühma ja suure kontsentratsiooni rühma ning kõigi loomade puhul, kes uuringu jooksul surevad või surmatakse, tuleks teha kõigi tabelis 2 loetletud organite ja kudede histopatoloogiline hindamine. Eritähelepanu tuleks pöörata hingamisteedele, sihtorganitele ja nähtavatele kahjustustele. Organeid ja kudesid, milles suure kontsentratsiooni rühma isenditel leiti kahjustusi, tuleks uurida kõigi rühmade isenditel. Uuringu juht võib otsustada teha histopatoloogilised hindamised täiendavate rühmade puhul, et tõendada selget sõltuvust kontsentratsioonist. Kui kasutatakse satelliitrühma (pöörduvuse rühma), tuleks teha kõigi selliste kudede ja organite histopatoloogiline hindamine, milles katserühmade indiviididel leiti muutusi. Kui suure kokkupuute rühmas sureb liiga palju loomi varajases etapis või tekib muid probleeme, mis muudavad andmete tähenduse ähmaseks, tuleks histopatoloogiliselt uurida järgmise väiksema kontsentratsiooni rühma. Tuleks püüda omavahel seostada üldisi tähelepanekuid ja mikroskoopilisi leide.
                           
                        KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE
                  
                     Andmed
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Iga looma kohta tuleks esitada kehamassi, sööda tarbimise, kliinilise patoloogia, üldpatoloogia, organite massi ja histopatoloogia andmed. Kliiniliste vaatluste andmed tuleks esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates iga katserühma puhul ära osalenud loomade arvu, konkreetsete mürgistusnähtudega loomade arvu, katse käigus surnuna leitud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahanguleiud. Kõiki tulemusi, nii kvantitatiivseid andmeid kui ka üksiktähelepanekuid, tuleks sobiva statistilise meetodi abil hinnata. Võib kasutada kõiki üldtunnustatud statistilisi meetodeid; statistilised meetodid tuleks valida juba uuringu kavandamisel.
                           
                        
                     Katseprotokoll
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Katseprotokoll peaks sisaldama võimaluse korral järgmist teavet.
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katseloomad ja pidamistingimused
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Puuritingimuste kirjeldus, sh: loomade arv (või arvu muutus) puuri kohta, allapanu, õhu temperatuur ja suhteline õhuniiskus, valgustusperiood ja sööt.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kasutatud liik/liin ja muu liigi kui roti kasutamise põhjendus. Võib esitada lähteandmed ja varasemad andmed, kui need on saadud loomade kohta, kes viidi kemikaaliga kokkupuutesse samasugustes kokkupuute-, pidamis- ja nälgimistingimustes.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Loomade arv, vanus ja sugu.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Randomiseerimismeetod.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kõigi eelnenud ettevalmistamismeetmete kirjeldus, sh söötmine, karantiin ja haiguste ravi.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uuritav kemikaal
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused (kaasa arvatud isomeerne koostis).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Identifitseerimisandmed, Chemical Abstract Services Registry ehk CASi nr, kui see on teada.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Kandeaine
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kandeaine kasutamise põhjendus ja kandeaine valiku põhjendus (kui kandeainena ei kasutata vett).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Varasemad või rööpandmed, millega tõendatakse, et kandeaine ei mõjuta uuringu tulemusi.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhalatsioonikamber
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Inhalatsioonikambri üksikasjalik kirjeldus, sh selle mahu andmed ja joonis.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Loomade kokkupuute jaoks kasutatavate seadmete päritolu ja kirjeldus ning samuti keskkonna tekitamise kirjeldus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Temperatuuri, niiskuse, osakeste suuruse ja tegeliku kontsentratsiooni mõõtmise seadmed.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Õhuallikas ja õhu konditsioneerimiseks kasutatav süsteem.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Homogeense katsekeskkonna tagamise seadmete kaliibrimisel kasutatud meetodid.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Rõhuvahe (positiivne või negatiivne).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kokkupuuteportide arv kambri kohta (ainult nina kaudu toimuv kokkupuude); loomade paiknemine kambris (kogu keha kaudu toimuv kokkupuude).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Katsekeskkonna (atmosfääri) stabiilsus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Temperatuuri- ja niiskusandurite paigutus ning katsekeskkonnast proovide võtmine kambris.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Sissejuhitud ja väljatõmmatud õhu töötlemine.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Õhuvoolu kiirused, õhuvoolu kiirus kokkupuutepordi kohta (ainult nina kaudu toimuv kokkupuude) või loomade hulk kambri kohta (kogu keha kaudu toimuv kokkupuude).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Inhalatsioonikambri tasakaaluseisundini jõudmiseks vajalik aeg (t95).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kogu kambris oleva õhu vahetuste arv tunnis.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Mõõteseadmed (vajaduse korral).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Andmed kokkupuute kohta
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Põhiuuringu sihtkontsentratsiooni valimise põhjendus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Nimikontsentratsioonid (inhalatsioonikambrisse suunatud uuritava kemikaali kogumass, mis on jagatud läbi kambri juhitud õhu kogusega).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Uuritava kemikaali tegelikud kontsentratsioonid loomade hingamistsoonist kogutud proovides; heterogeensel füüsilisel kujul esineva segu (gaas, aur, aerosool) puhul võidakse iga faasi eraldi analüüsida.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kõik õhukontsentratsioonid tuleks teatada massiühikutena (mg/l, mg/m3 jne), mitte mahuühikutena (ppm, ppb jne).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Osakeste suurusjaotus, massikeskmine aerodünaamiline diameeter (MMAD) ja geomeetriline standardhälve (σg) ning nende arvutamise meetodid. Tuleks teatada üksikosakeste suuruse analüüsid.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katsetingimused
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Üksikasjalikud andmed uuritava kemikaali ettevalmistamise kohta, sh andmed mis tahes meetmete kohta, mida kasutati tahke aine osakeste suuruse vähendamiseks või uuritava kemikaali lahuste valmistamiseks.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Katsekeskkonna tekitamiseks ja loomade kokkupuuteks katsekeskkonnaga kasutatud seadmete kirjeldus (eelistatult koos joonisega).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kambri temperatuuri, niiskuse ja õhuvoo jälgimiseks kasutatud seadmete üksikasjad (st kalibreerimiskõvera koostamine).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kambrikontsentratsiooni ja osakeste suurusjaotuse määramise proovide kogumise seadmete andmed.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kasutatud keemilise analüüsi meetodi ja selle valideerimise üksikasjad (sh uuritava kemikaali analüütiline saagis proovivõtukeskkonna analüüsimisel).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Loomade katse- ja kontrollrühma määramiseks kasutatud randomiseerimismeetod.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Üksikandmed sööda ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Katsekontsentratsioonide valiku põhjendus.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemused
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid katsekambri temperatuuri, niiskuse ja õhuvoolu kohta.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid kambri nimi- ja tegeliku kontsentratsiooni andmete kohta.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid osakeste suurusjaotuse andmete kohta, sh analüüsiproovide võtmise andmed, osakeste suurusjaotus ning MMAD ja σg arvutamine.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid iga looma reageerimise ja kontsentratsioonide andmete kohta (st mürgistusnähtudega loomad, kaasa arvatud surnud loomad, mõjude laad, raskus, ilmumise aeg ja kestus).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabel iga katselooma kehamassi kohta.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid sööda tarbimise kohta.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid kliinilise patoloogia andmete kohta.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on olemas.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemuste arutelu ja tõlgendamine
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Eritähelepanu tuleks pöörata selliste meetodite kirjeldamisele, mida kasutati käesoleva katsemeetodi kriteeriumide täitmiseks, näiteks piirkontsentratsioon või osakeste suurus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Üldtulemuste alusel tuleks käsitleda küsimust, kas osakeste suurus oli sobiv sissehingamiseks, eelkõige siis, kui osakeste suuruse kriteeriume ei olnud võimalik täita.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Uuringu üldhinnangus tuleks käsitleda nimi- ja tegelike kontsentratsioonide kindlaksmääramiseks kasutatud meetodite kooskõlalisust ning tegeliku ja nimikontsentratsiooni vahelist seost.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tuleks käsitleda tõenäolist surma põhjust ja uuritava kemikaali peamist toimeviisi (süsteemne või lokaalne).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kui OECD humaansete lõpetamiskriteeriumide juhenddokumendis (3) sätestatud kriteeriumide alusel tekkis vajadus humaansel viisil surmata valu kannatavaid või tõsiste ja püsivate kannatuste tunnustega loomi, siis tuleks esitada selgitus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tuleks kindlaks teha sihtorgan(id).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tuleks määrata kindlaks täheldatava kahjuliku toimeta kontsentratsioon (NOAEL) ja väikseim täheldatavat kahjulikku toimet avaldav kontsentratsioon (LOAEL).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     KIRJANDUS
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 413, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Whalan E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229–258.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231–238.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215–263.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419–428.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1272/2008, 16. detsember 2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353, 31.12.2008, lk 1).
                           
                        
                     1. liide
                     MÕISTE
                     Uuritav kemikaal: iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                  
                  B.30.   KROONILISE MÜRGISUSE UURINGUD
                  
                  SISSEJUHATUS
                  
                              1.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga (Test Guideline, TG) 452 (2009). Esialgne katsejuhend TG 452 võeti vastu 1981. aastal. Käesoleva läbivaadatud katsemeetodi B.30 koostamist peeti vajalikuks, et võtta arvesse hiljutist arengut loomade heaolu ja regulatiivsete nõuete valdkonnas (1, 2, 3, 4). Katsemeetodit B.30 on ajakohastatud paralleelselt käesoleva lisa peatüki B.32 („Kantserogeensuse uuringud”) ja peatüki B.33 („Kombineeritud kroonilise mürgisuse/kantserogeensuse uuringud”) läbivaatamisega selleks, et saada uuringus kasutatavate loomade abil lisateavet ning esitada täpsemaid andmeid dooside valiku kohta. Käesolev katsemeetod on koostatud selleks, et kasutada seda mitmesuguste kemikaalide, sh pestitsiidide ja tööstuslike kemikaalide katsetamiseks.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Enamik kroonilise mürgisuse uuringuid tehakse näriliseliikidega ja käesolev katsemeetod on seega kavandatud peamiselt kasutamiseks nende liikidega tehtavate uuringute puhul. Kui selliseid uuringuid on vaja teha mittenärilistega, võib samuti rakendada käesolevas katsemeetodis kirjeldatud põhimõtteid ja menetlusi koos põhimõtete ja menetlustega, mida on kirjeldatud käesoleva lisa peatükis B.27 („Korduvdoosi suukaudse mürgisuse 90-päevane uuring mittenäriliste puhul”) (5) koos asjakohaste muudatustega, nagu on sätestatud OECD juhenddokumendis nr 116, mis käsitleb kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringute kavandamist ja teostamist (6).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Kroonilise mürgisuse uuringutes kasutatavad kolm peamist manustamisteed on suukaudne, nahakaudne ja sissehingamise teel manustamine. Manustamisviisi valik sõltub uuritava kemikaali füüsikalistest ja keemilistest omadustest ning inimeste peamisest võimalikust ainega kokkupuutumise viisist. Lisateave kokkupuutetee valimise kohta on esitatud OECD juhenddokumendis nr 116 (6).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Käesolevas katsemeetodis on keskendutud suukaudsele manustamisele, mis on kroonilise mürgisuse uuringutes enim kasutatav manustamistee. Kuigi inimeste tervist ohustavate riskide hindamiseks võivad vajalikud olla ka pikaajalised kroonilise mürgisuse uuringud, mis hõlmavad nahakaudset või sissehingamise teel toimuvat kokkupuudet, ja/või neid võidakse nõuda teatavate eeskirjadega, on mõlema nimetatud kokkupuutetee puhul katsete korraldamine tehniliselt keeruline. Kõnealused uuringud tuleb kavandada juhtumipõhiselt, kuigi siin suukaudse manustamise kroonilise mürgisuse hindamiseks kirjeldatud katsemeetodi võib võtta aluseks sissehingamise teel ja/või nahakaudse manustamise uuringu katse-eeskirja koostamisel ja arvestades manustamise ajavahemikke, kliinilisi ja patoloogilisi parameetreid jne käsitlevaid soovitusi. On olemas OECD juhenddokumendid uuritava kemikaali sissehingamise teel (6, 7) ja nahakaudselt (6) manustamise kohta. Kui kavandatakse sissehingamise teel toimuvat kokkupuudet hõlmavaid pikaajalisi uuringuid, tuleks eelkõige vaadata käesoleva lisa peatükke B.8 (8) ja B.29 (9) koos sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse uurimist käsitleva OECD juhenddokumendiga (7). Nahakaudse manustamise katsete tegemisel tuleks vaadata käesoleva lisa peatükki B.9 (10).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Kroonilise mürgisuse uuring annab teavet võimalike terviseriskide kohta, mis võivad tõenäoliselt tekkida korduva kokkupuute korral kasutatava liigi eluea märkimisväärse osa jooksul. Uuringuga saadakse teavet uuritava kemikaali mürgiste mõjude kohta, tehakse kindlaks sihtorganid ja kemikaali akumulatsiooni võimalikkus. Uuringuga võib ka hinnata täheldatava kahjuliku toimeta kontsentratsiooni, mida võib kasutada inimeste kokkupuute jaoks ohutuskriteeriumide kehtestamiseks. Samuti rõhutatakse vajadust teha loomade hoolikas kliiniline läbivaatus, et hankida võimalikult palju teavet.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Käesoleva katsemeetodi kohaste uuringute eesmärgid on järgmised:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          uuritava kemikaali kroonilise mürgisuse kindlaksmääramine;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          sihtorganite tuvastamine;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          mõju doosist sõltuvuse kirjeldamine;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          täheldatava kahjuliku toimeta doositaseme (no-observed-adverse-effect level, NOAEL) või võrdlusdoosi (Benchmark Dose, BMD) kindlakstegemiseks lähtepunkti määramine;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kroonilise mürgise mõju prognoosimine inimeste kokkupuutetasemetel;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          andmete saamine toimeviisi käsitlevate hüpoteeside kontrollimiseks (6).
                                       
                                    
                        LÄHTEKAALUTLUSED
                  
                              7.
                           
                           
                              Uuritava kemikaali toksikoloogiliste omaduste hindamisel peaks uurimislabor enne uuringu tegemist võtma arvesse kogu olemasoleva teabe uuritava kemikaali kohta, et uuringu kavandamisel keskenduda kroonilise toksilisuse võimaluse kõige tõhusamale katsetamisele ja minimeerida loomade kasutamine. Uuringu kavandamist hõlbustav teave hõlmab järgmist: uuritava kemikaali keemiline nimetus, struktuur ja füüsikalis-keemilised omadused; mis tahes teave toimeviisi kohta; in vitro või in vivo mürgisuse katsete tulemused; eeldatav/eeldatavad kasutusvaldkond/-valdkonnad ja inimestega kokkupuute võimalused; samalaadse struktuuriga ainete kohta olemasolevad (kvantitatiivsete) struktuuri-aktiivsuse sõltuvuste ((Q)SAR) andmed ja toksikoloogilised andmed; olemasolevad toksiko-kineetilised andmed (võimaluse korral ühekordse doosi ja korduvdoosi kineetika) ning muude korduva kokkupuute uuringute käigus saadud andmed. Kroonilist mürgisust tuleks uurida alles pärast esialgse mürgisust käsitleva teabe saamist korduvdoosi 28-päevasest ja/või 90-päevasest mürgisuse katsest. Konkreetse uuritava kemikaali võimalike kahjulike tervisemõjude üldhindamisel tuleks kaaluda kroonilise mürgisuse järkjärgulise uurimise lähenemisviisi (11, 12, 13, 14).
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Enne uuringu alustamist tuleks uuringu kava ja eesmärkide alusel kindlaks määrata kõige sobivamad tulemuste analüüsi statistilised meetodid. Tuleb kaaluda ka seda, kas statistikas tuleks arvestada ellujäämise parandust ja analüüsi tegemist sel juhul, kui üks või mitu rühma tuleb enneaegselt surmata. Suunised asjakohaste statistiliste analüüside tegemiseks ja peamised viited rahvusvaheliselt tunnustatud statistilistele meetoditele on esitatud juhenddokumentides nr 116 (6) ning nr 35, milles käsitletakse kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringute analüüsi ja hindamist (15).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Kroonilise mürgisuse uuringu tegemisel tuleks alati järgida suunispõhimõtteid ja kaalutlusi, mis on sätestatud OECD juhenddokumendis nr 19 kliiniliste nähtude tuvastamise, hindamise ja kasutamise kohta ohutuse hindamisel kasutatavate katseloomade humaansete lõpetamiskriteeriumidena (16) ja eelkõige selle punktis 62. Kõnealuses punktis on sätestatud, et „[k]ui uuringutes, milles kasutatakse korduvat annustamist, tekivad loomal kliinilised progresseeruvad nähud, mis põhjustavad tema seisundi halvenemise, tuleb teha andmetel põhinev otsus, kas loom tuleks humaansel viisil surmata. Otsuse tegemisel tuleks kaaluda kõnealuse uuringus osaleva looma jätkuvast elushoidmisest saadava teabe väärtust võrreldes looma üldise seisundiga. Kui tehakse otsus kõnealune loom katsesse jätta, siis tuleks vajaduse korral suurendada vaatluste sagedust. Ilma katse eesmärki kahjulikult mõjutamata võib samuti olla võimalik annustamise ajutine peatamine, kui see vähendab looma valu või kannatusi, või katsedoosi vähendamine.”
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Üksikasjalikke suuniseid ja arutelu kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringute doosi valimise põhimõtete kohta on võimalik leida juhenddokumendist nr 116 (6) ning samuti kahest rahvusvahelise bioteaduste instituudi väljaandest (17, 18). Doosi valimise strateegia sõltub põhiliselt uuringu peamisest eesmärgist või peamistest eesmärkidest (punkt 6). Sobivate doositasemete valimisel tuleks saavutada tasakaal ühelt poolt ohu sõeluuringute ja teiselt poolt väikese doosi mõju iseloomustamise ning doosi ja mõju vahelise seose kindlakstegemise vahel. See on eriti oluline juhul, kui tehakse kombineeritud kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuring (käesoleva lisa peatükk B.33; punkt 11).
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Tuleks kaaluda eraldi kroonilise mürgisuse uuringu (käesolev katsemeetod B.30) ja kantserogeensuse uuringu (käesoleva lisa peatükk B.32) tegemise asemel kombineeritud kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringu (käesoleva lisa peatükk B.33) tegemist. Kombineeritud katse võimaldab kokku hoida aega ja kulusid, võrreldes kahe eraldi uuringu tegemisega, kuid annab samasuguse kvaliteediga andmed nii kroonilise mürgisuse kui ka kantserogeensuse kohta. Kombineeritud kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringu (käesoleva lisa peatükk B.33) tegemisel tuleks siiski hoolikalt kaaluda doosi valimise põhimõtteid (punktid 9 ja 20–25) ning tuleb ka arvestada, et mõnikord nõutakse eraldi uuringute tegemist eeskirjadega.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Käesoleva katsemeetodi kontekstis kasutatud mõisted on esitatud selle peatüki lõpus ja juhenddokumendis nr 116 (6).
                           
                        KATSE PÕHIMÕTE
                  
                              13.
                           
                           
                              Uuritavat kemikaali manustatakse iga päev astmeliselt suurenevate doosidena mitmele katseloomade rühmale üldjuhul 12 kuu vältel, kuigi regulatiivsetest nõuetest olenevalt võib katse kestus olla ka pikem või lühem (vt punkt 33). Katse selline kestus tagab, et see on piisavalt pikk kumulatiivse mürgisuse mõjude avaldumiseks, kuid tulemusi ei hakka veel segama geriaatrilised muutused. Kõrvalekaldeid 12-kuulisest kokkupuute kestusest tuleks põhjendada, eelkõige lühema kestuse puhul. Uuritavat kemikaali manustatakse tavaliselt suu kaudu, kuigi ka sissehingamise või nahakaudse kokkupuute uurimine võib olla sobiv. Uuringu kavaga võib ette näha ühe või mitu vahepealset surmamist, näiteks kolme ja kuue kuu möödudes, ja selle võimaldamiseks võib kasutada täiendavaid loomarühmi (vt punkt 19). Manustamisperioodi jooksul vaadeldakse loomi põhjalikult toksilisuse märkide tuvastamiseks. Katse ajal surnud või tapetud loomad lahatakse ning katse lõppemisel tapetakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad.
                           
                        MEETODI KIRJELDUS
                  
                     Loomaliigi valimine
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              See katsemeetod hõlmab kroonilise mürgisuse hindamist peamiselt näriliste puhul (vt punkt 2), kuigi tuleb arvestada, et mõnikord võidakse eeskirjadega nõuda samalaadsete katsete tegemist muude loomadega kui närilised. Liigi valikut tuleks põhjendada. Kui nõutakse kroonilise mürgisuse uuringut muu liigiga kui närilised, peaks selle kavandamine ja tegemine toetuma põhimõtetele, mis on esitatud käesolevas katsemeetodis ja käesoleva lisa peatükis B.27 („Korduvdoosi suukaudse mürgisuse 90-päevane uuring mittenäriliste puhul”) (5). Lisateave liigi ja aretusliini valimise kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (6).
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Käesoleva katsemeetodi puhul on eelistatud näriliseliik rott, kuigi kasutada võib ka muid närilisi, nt hiiri. Rotid ja hiired on olnud eelistatud katsemudelid tänu nende suhteliselt lühikesele elueale, laialdasele kasutamisele farmakoloogia- ja toksikoloogiauuringutes, võimalusele kutsuda neil kergesti esile kasvajaid ja tänu piisavalt iseloomustatud liinide kättesaadavusele. Nende omaduste tulemusena on olemas palju teavet nende füsioloogia ja patoloogia kohta. Kasutatakse enim kasutatavate laboriliinide noori terveid täiskasvanud loomi. Kroonilise mürgisuse uuring tuleks teha loomadega, kes on samast liinist ja sama päritoluga kui loomad, keda kasutati lühema kestusega esialgses mürgisuse kindlakstegemise uuringus. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined.
                           
                        
                     Pidamis- ja söötmistingimused
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Loomi võib hoida eraldi või väikestes samast soost loomade rühmades; eraldi pidamist tuleks kaaluda ainult juhul, kui see on teaduslikult põhjendatud (19, 20, 21). Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 °C (±3 °C). Kuigi suhteline niiskus peab olema vähemalt 30 % ja eelistatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal, peaks eesmärgiks olema 50–60 %. Valgustus peab olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmisel võib kasutada tavapärast labori söödavalikut; joogivee kogust ei piirata. Sööt peaks vastama kõigile uuritava liigi toitumisvajadustele ja sööda saasteainesisaldus, sh pestitsiidijäägid, püsivad orgaanilised saasteained, fütoöstrogeenid, raskmetallid ja mükotoksiinid, mis võivad mõjutada katse tulemusi, peaks olema võimalikult väike. Regulaarselt tuleks analüüsida sööda toitainete ja saasteainete sisaldust; vähemalt tuleks seda teha uuringu alguses ja siis, kui hakatakse kasutama uut söödapartiid, ning analüüside tulemused tuleks esitada lõpparuandes. Samuti tuleks esitada uuringus kasutatud joogivee analüüsi andmed. Sööda valikut võib mõjutada vajadus tagada uuritava kemikaali jaoks sobiv segu ja rahuldada loomade toitumisvajadused, kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga.
                           
                        
                     Loomade ettevalmistamine
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Kasutada tuleks terveid loomi, kes on labororitingimustega vähemalt seitsme päeva jooksul kohanenud ning keda ei ole varem uuringutes kasutatud. Näriliste korral tuleks loomadele uuritava kemikaali annustamist alustada võimalikult varakult pärast võõrutamist ja kohanemist ning eelistatavalt enne, kui loomad on kaheksa nädala vanused. Katseloomi tuleks kirjeldada ja teatada liik, liin, päritolu, sugu, kehamass ja vanus. Uuringu alguses peaks kummagi soo loomade kehamassi erinevus olema minimaalne ja kõrvalekalle ei tohiks ületada 20 % uuringus kasutatavate loomade keskmisest kehamassist, mis leitakse eraldi kummagi soo loomade jaoks. Loomad tuleks kontroll- ja katserühmadesse jaotada juhuslikkuse alusel. Pärast juhuslikkuse alusel jaotamist ei tohiks rühmades kummagi soo keskmised kehamassid oluliselt erineda. Kui erinevused on statistiliselt olulised, tuleks juhuslikkuse alusel jaotamise etappi võimaluse korral korrata. Igale loomale tuleks määrata ainuline tunnusnumber ja loom tuleks kõnealuse numbriga püsivalt märgistada tätoveerimise, mikrokiibi paigaldamise või muu sobiva meetodi abil.
                           
                        KATSE KÄIK
                  
                     Loomade arv ja sugu
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Tuleks kasutada mõlemat sugu. Tuleks kasutada piisavalt palju loomi, et uuringu lõpus oleks igas rühmas küllalt loomi põhjalikuks bioloogiliseks ja statistiliseks hindamiseks. Näriliste puhul tuleks tavaliselt igas doositaseme rühmas kasutada vähemalt 20 looma kummastki soost ning mittenäriliste puhul on rühmas soovitatav kasutada vähemalt nelja looma kummastki soost. Hiirtega tehtavates uuringutes võib olla vajalik kasutada igas doositaseme rühmas rohkem loomi, et teha kõik nõutavad hematoloogilised analüüsid.
                           
                        
                     Loomade vahepealne surmamine, satelliitrühmad ja kontroll-loomad
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Kui see on teaduslikult põhjendatud, võib uuringus ette näha vahepealsed surmamised (vähemalt kümme looma kummagi soo ja iga doosirühma kohta), näiteks kuue kuu möödumisel, et saada teavet toksikoloogiliste muutuste arengu kohta ja toimemehhanismi kohta. Kui selline teave on uuritava kemikaaliga tehtud varasematest korduvdoosi mürgisuse uuringutest juba olemas, ei pruugi vahepealsed surmamised olla teaduslikult põhjendatud. Samuti võib kaasata satelliitrühmi, et jälgida uuritava kemikaali põhjustatud toksikoloogiliste muutuste pöörduvust; nende puhul kasutatakse üldjuhul uuringu kõrgeimat doseerimistaset ja kontrollrühma. Vajaduse korral võib uuringu vältel lisada haigusseisundi seireks ka täiendava kontroll-loomade rühma (üldjuhul viis looma kummastki soost) (22). Kui kavandatakse vahepealseid surmamisi või satelliit- või kontroll-loomade rühmade kasutamist, tuleks uuringuprojekti kaasatud loomade arvu suurendada nende loomade arvu võrra, kes kavatsetakse enne uuringu lõppu surmata. Selliste loomade puhul tuleks üldjuhul teha samad vaatlused, sh kehamassi ja sööda/vee tarbimise mõõtmised, hematoloogilised ja kliinilise biokeemia mõõtmised ning patoloogiauuringud, kui põhiuuringu kroonilise mürgisuse etapi loomade puhul, kuigi võib ka otsustada, et vahepealse surmamise rühmade puhul piirdutakse konkreetsete peamiste näitajate, näiteks neurotoksilisuse või immunotoksilisuse mõõtmisega.
                           
                        
                     Doosirühmad ja doseerimine
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Juhendid kõigi doosi valiku ja doositaseme intervallidega seotud asjaolude kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (6). Uuringus tuleb kasutada vähemalt kolme doositaset ja uuringuga samal ajal peab tegema ka kontrolli, välja arvatud siis, kui tehakse piirsisalduskatse (vt punkt 27). Doositasemed põhinevad üldjuhul lühema ajavahemiku korduvdoosi või doosipiirkonna määramise katse tulemustel ja nende puhul tuleks arvesse võtta uuritava kemikaali või samalaadsete kemikaalide kohta olemasolevat toksikoloogia- ja toksikokineetikaalast teavet.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Kui uuritava kemikaali füüsikalis-keemilised omadused või bioloogiline mõju seda ei piira, peaks kõrgeim doositase olema üldiselt valitud nii, et saaks määrata kindlaks peamised sihtorganid ja toksilise toime, põhjustamata siiski kannatusi, ägedat mürgisust, haigestumist või surma. Punktis 22 allpool loetletud asjaolusid arvesse võttes tuleks valida kõrgeim doositase, et saada tõendusmaterjali mürgisuse kohta, näiteks kehamassi tõusu vähenemise kaudu (ligikaudu 10 %).
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Sellest hoolimata võidakse uuringu eesmärkidest olenevalt (vt punkt 6) valida suurim doos, mis jääb allapoole mürgisust tõendavat doosi, näiteks kui doos avaldab teatavat kahjulikku mõju, kuid siiski ei mõjuta eluiga ega kehamassi. Suurim doos ei tohiks ületada 1 000 mg kehamassi kg kohta päevas (piirdoos, vt punkt 27).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Doositaseme ja doositasemete intervalli võib valida nii, et määrata kindlaks mõju sõltuvus doosist, täheldatava kahjuliku toimeta kontsentratsioon (NOAEL) või muu soovitud uuringutulemus, näiteks võrdlusdoos (BMD) (vt punkt 25) madalaimal doositasemel. Asjaolud, mida tuleks väiksemate dooside valimisel arvesse võtta, on toime doosist sõltuvuse eeldatav suurenemine, doosid, mis võivad põhjustada olulisi metaboliseerimise muutusi või toksilisuse toimemehhanismi muutumist, kui eeldatakse läviväärtuse olemasolu, või mille puhul eeldatakse väikeste dooside ekstrapoleerimise lähtepunkti olemasolu.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Doositasemete vahemik sõltub uuritava kemikaali omadustest ja seda ei saa käesoleva katsemeetodiga ette kirjutada, aga kahe- kuni neljakordne vahemik annab sageli häid katsetulemusi, kui seda kasutatakse alanevate doositasemete määramiseks, ning dooside vahel väga suure (näiteks rohkem kui kuue- kuni kümnekordse) vahemiku kasutamise asemel on sageli parem lisada neljas katserühm. Üldiselt tuleks vältida kümnest suurema kordaja kasutamist ja kui seda tehakse, tuleks seda põhjendada.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Nagu juhenddokumendis nr 116 (6) on täpsemalt kirjeldatud, tuleb doosi valimisel arvesse võtta järgmist:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          doosi-toime sõltuvuse teadaolev või oletatav mittelineaarsus või murdepunkt;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toksikokineetika ja doosipiirkonnad, mille puhul esineb metaboolne induktsioon, küllastumine või väliste ja sisemiste dooside vaheline mittelineaarsus või neid ei esine;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          esmaskahjustused, toimemarkerid või märgid sellest, et tuleb arvesse võtta peamiste bioloogiliste alusprotsesside toimumist;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          peamised (või oletatavad) toimeviisi asjaolud, näiteks annused, mille juures hakkab suurenema tsütotoksilisus, mõjutatakse hormoonitasemeid, homeostaasi säilitamise mehhanismid saavad üle koormatud jne;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          mõju doosist sõltuvuse kõvera piirkonnad, kus on vaja eriti usaldusväärset hinnangut, näiteks eeldatava võrdlusdoosi (BMD) vahemikus või oletatava läviväärtuse juures;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          inimeste kokkupuute eeldatava tasemega seotud kaalutlused.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              Kontrollrühm on rühm, kellega katseid ei tehta, või kandeaine kontrollrühm, kui uuritava kemikaali manustamisel kasutatakse kandeainet. Kontrollrühma loomi tuleks kohelda samamoodi kui katserühma loomi, välja arvatud uuritava kemikaali manustamine. Kui kasutatakse kandeainet, saab kontrollrühm kandeainet kõige suuremas koguses, mida kasutatakse doosirühmades. Kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga ja katseloomad söövad seda sööda halvema maitse tõttu oluliselt vähem, võib asjakohasema kontrollrühma tagamiseks olla sobiv täiendav kontrollrühm, kes saab samapalju sööta, kui doosirühmas ära süüakse.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Kui eeluuringust saadud teabe alusel võib oletada, et katse ühel doositasemel, mis on võrdväärne päevas vähemalt 1 000 mg-ga kehamassi kg kohta ja mille puhul kasutatakse käesoleva uuringu jaoks kirjeldatud meetodeid, ei põhjusta tõenäoliselt kahjulikku mõju ja kui samalaadse struktuuriga ainete andmete alusel mürgisust ei eeldata, siis ei tarvitse kolme doositaseme kasutamisega täismahus uuring olla vajalik. Võib kasutada piirdoosi 1 000 mg kehamassi kg kohta päevas, välja arvatud juhul, kui inimese võimalikku kokkupuudet arvestades on vaja kasutada suuremat doositaset.
                           
                        
                     Dooside ettevalmistamine ja uuritava kemikaali manustamine
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Uuritavat kemikaali manustatakse tavaliselt suu kaudu koos sööda või joogiveega või sundsöötmisega. Lisateave manustamisteede ja -meetodite kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (6). Manustamistee ja -meetod sõltub uuringu eesmärgist, uuritava kemikaali füüsikalistest/keemilistest omadustest, biosaadavusest ja inimese uuritava kemikaaliga kokkupuutumise peamisest teest ja viisist. Manustamistee ja -meetodi valikut tuleks põhjendada. Loomade heaolu huvides tuleks suukaudne manustamine sundsöötmisega üldiselt valida ainult selliste ainetega, mille puhul see manustamistee ja -meetod on põhjendatult sarnane inimese võimaliku kokkupuutega kemikaaliga (näiteks ravimid). Toidu- või keskkonnakemikaalide puhul, sh pestitsiidide puhul toimub manustamine tavaliselt sööda või joogivee kaudu. Mõne stsenaariumi puhul, näiteks kokkupuude töökohal, võib olla asjakohasem manustada kemikaali muul viisil.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav kemikaal sobivas kandeaines. Vastavalt vajadusele tuleks arvesse võtta järgmisi kandeaine ja muude lisandite omadusi: mõju uuritava aine imendumisele, jaotumisele, metaboliseerimisele või retentsioonile; mõju uuritava kemikaali keemilistele omadustele, mis võivad muuta selle toksilisi omadusi, ning mõjud sööda või vee tarbimisele või loomade toitumusele. On soovitatav, et võimaluse korral kaalutakse esmalt vesilahuse/-suspensiooni kasutamist, seejärel õlilahuse/-emulsiooni (nt maisiõli) kasutamist ja siis võimalikku lahust muus kandeaines. Muu kandeaine kui vee puhul tuleks teada kandeaine mürgiseid omadusi. Tuleks teada uuritava kemikaali stabiilsust ning doseerimislahuste või sööda (nagu on asjakohane) homogeensust manustamise tingimustes (näiteks söödaga).
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Nende kemikaalide puhul, mida manustatakse sööda või joogiveega, on oluline tagada, et sisseantavad uuritava kemikaali kogused ei muudaks tavalist toitumise või joogivee tarbimise tasakaalu. Pikas mürgisuse uuringus, kus kemikaali manustatakse sööda kaudu, ei tohiks uuritava kemikaali kontsentratsioon söödas üldiselt olla suurem kui 5 % sööda üldkogusest, et vältida tasakaalustamata toitumist. Kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga, võib kasutada kas püsivat kontsentratsiooni söödas (mg sööda kg kohta või ppm) või püsivat doositaset looma kehamassi alusel (mg kehamassi kg kohta), mis arvutatakse iga nädal. Tuleks täpsustada, millist võimalust kasutatakse.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Suukaudse manustamise korral saavad loomad uuritavat kemikaali iga päev (seitse päeva nädalas) üldjuhul 12 kuu vältel (vt ka punkt 33), kuigi regulatiivsetest nõuetest olenevalt võib vaja minna ka pikemat katset. Iga muud doseerimiskava, nt viis päeva nädalas, tuleb põhjendada. Nahakaudse manustamise puhul töödeldakse loomi üldjuhul uuritava kemikaaliga 12 kuu vältel vähemalt kuus tundi päevas seitse päeva nädalas, nagu on sätestatud käesoleva lisa peatükis B.9 (10). Sissehingamise teel toimuv kokkupuude toimub kuus tundi päevas ja seitse päeva nädalas; võib kasutada ka kokkupuudet viiel päeval nädalas, kui see on põhjendatud. Kokkupuuteperiood on üldjuhul 12 kuud. Kui ainult nina kaudu toimuvat kokkupuudet kasutatakse muu näriliseliigi kui roti korral, võib suurimat kokkupuute kestust kohandada, et minimeerida konkreetse kasutatava liigi isendite kannatusi. Kui päevas kasutatakse alla kuuetunnist kokkupuute kestust, tuleks seda põhjendada. Vt ka käesoleva lisa peatükk B.8 (8).
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Kui loomadele manustatakse uuritavat kemikaali sundsöötmisega, tuleks seda teha iga päev umbes samal kellaajal maosondi või sobiva intubatsioonikanüüli abil. Üldiselt manustatakse üks annus üks kord päevas; kui aga kemikaal on näiteks lokaalne ärritaja, võib igapäevase doosimäära säilitada, manustades jaotatud annust (kaks korda päevas). Suurim vedelikukogus, mida saab ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Kogus peaks olema nii väike kui praktiliselt võimalik ega tohiks üldjuhul näriliste puhul ületada 1 ml kehamassi 100 g kohta (22). Katses kasutatava mahu erinevusi tuleks vähendada miinimumini; püsiva mahu tagamiseks tuleks kõikidel doositasemetel kasutada erinevaid kontsentratsioone. Erandiks on võimaliku söövitava või ärritava mõjuga kemikaalid, mida tuleb tugeva paikse mõju vältimiseks lahjendada. Tuleks vältida katseid kontsentratsioonidel, mis tõenäoliselt võivad seedetrakti söövitada või ärritada.
                           
                        
                     Uuringu kestus
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              Kuigi käesolev katsemeetod on peamiselt kavandatud kroonilise mürgisuse 12-kuulise uuringuna, võimaldab uuringu kava ka lühema (näiteks kuus või üheksa kuud) või pikema (näiteks 18 või 24 kuud) kestusega uuringuid, olenevalt konkreetsetest eeskirjadest või teatavatest toimemehhanismiga seotud eesmärkidest. Kõrvalekaldeid 12-kuulisest kokkupuute kestusest tuleks põhjendada, eelkõige lühema kestuse puhul. Uuritava kemikaali põhjustatud toksikoloogiliste muutuste pöörduvuse jälgimiseks kasutatavaid satelliitrühmi tuleks pärast kokkupuute lõpetamist hoida ilma annustamiseta vähemalt neli nädalat ja mitte rohkem kui kolmandiku uuringu kogukestusest. Täpsemad juhendid, sh uuringus ellujäämise arvestamise kohta, on esitatud juhenddokumendis nr 116 (6).
                           
                        VAATLUSED
                  
                              34.
                           
                           
                              Kõiki loomi tuleks haigestumise või suremise suhtes kontrollida, tavaliselt iga päeva alguses ja lõpus, sh nädalavahetustel ja pühadel. Vähemalt üks kord päevas tuleks teha üldine kliiniline läbivaatus, eelistatavalt igal päeval samal ajal / samadel aegadel, arvestades sundsöötmisega manustamise puhul eeldatava mõju kõrgperioodi pärast doseerimist.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Kõik loomad tuleks üksikasjalikult kliiniliselt läbi vaadata vähemalt kord enne esimest kokkupuudet (et võimaldada iga katselooma seisundi muutumise võrdlusi), uuringu esimese nädala lõpus ja seejärel iga kuu. Vaatlused tuleks korraldada nii, et üksikute vaatlejate vahelised erinevused oleksid minimeeritud ega sõltuks katserühmast. Need vaatlused tuleks teha väljaspool puuri, eelistatavalt selleks ette nähtud kohas ja iga kord samal ajal. Tulemused tuleks hoolikalt üles märkida, kasutades selleks võimaluse korral katselabori selgelt kindlaks määratud hindamissüsteeme. Tuleks püüda tagada, et vaatlustingimuste varieeruvus oleks minimaalne. Üles tuleks märkida vähemalt järgmised tunnused: muutused nahal, karvastikus, silmades, limaskestal, eritiste esinemine ning autonoomsed muutused (nt pisaravool, turris karv, pupillide suurus ja muutunud hingamine). Samuti tuleks üles märkida muutused kõnnakus, kehaasendis ja selles, kuidas loomad endaga ümberkäimisele reageerivad, kloonilised või toonilised liigutused, stereotüübid (nt ülemäärane karvastiku hooldamine, ringiratast keerlemine) või kummaline käitumine (nt enese vigastamine, tagurpidi liikumine) (24).
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Enne uuritava kemikaali esmakordset manustamist tuleks oftalmoskoobi või muu sobiva seadme abil teha kõikide loomade oftalmoloogiline kontroll. Pärast uuringu lõppu tuleks kõnealune kontroll teha eelistatavalt kõikidele loomadele, kuid vähemalt suure doosi rühma ja kontrollrühma loomadele. Kui silmades avastatakse muutusi, tuleb läbi vaadata kõik loomad. Kui struktuurianalüüs või muu teave viitab mürgisusele silmade suhtes, tuleks silmi kontrollida sagedamini.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Kui kemikaali varasem korduvannuse 28-päevane ja/või 90-päevane mürgisuse uuring näitas võimalikku neurotoksilist mõju, võib soovi korral enne uuringu algust ja kolmekuuliste ajavahemike järel pärast uuringu algust kuni 12 kuuni (kaasa arvatud) ning samuti uuringu lõpus (kui uuring kestab kauem kui 12 kuud) uurida erinevat tüüpi stiimulitele (24) (näiteks helilised, visuaalsed ja propriotseptiivsed stiimulid) sensoorset reageerimist (25, 26, 27), hinnata haardetugevust (28) ja motoorset tegevust (29). Võimalike meetodite täpsemad üksikasjad on esitatud vastavates viidetes. Siiski võib kasutada ka muid meetodeid kui need, millele viidatakse.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Sellise kemikaali puhul, mille varasem korduvannuse 28-päevane ja/või 90-päevane mürgisuse uuring näitas immunotoksilise mõju võimalikkust, võib soovi korral teha uuringu lõpul kõnealuse näitaja täiendavaid uuringuid.
                           
                        
                     Kehamass, sööda ja vee tarbimine ning söödakasutuse tõhusus
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Kõik loomad tuleks kaaluda kemikaali manustamise alguses, vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala vältel ja seejärel vähemalt kord kuus. Sööda tarbimist ja söödakasutuse tõhusust tuleks mõõta vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala vältel ning seejärel vähemalt kord kuus. Kui kemikaali manustatakse joogiveega, siis tuleks vee tarbimist mõõta vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala vältel ja seejärel vähemalt kord kuus. Joogivee tarbimise mõõtmisi tuleks kaaluda ka uuringute puhul, milles muutub loomade joomiskäitumine.
                           
                        
                     Hematoloogia ja kliiniline biokeemia
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Näriliste uuringutes tuleks hematoloogilised uuringud teha vähemalt kümne isas- ja kümne emasloomaga rühma kohta kolme, kuue ja 12 kuu möödumisel ning samuti uuringu lõpus (kui uuring kestab kauem kui 12 kuud); kõik uuringud tehakse alati samadel loomadel. Hiirte puhul võib kõikide nõutavate hematoloogiliste näitajate määramiseks minna vaja satelliitloomi (vt punkt 18). Muude loomade kui näriliste uurimisel võetakse proovid väiksemalt arvult loomadelt (koerte uurimisel näiteks neljalt loomalt kummagi soo ja iga rühma kohta) vahepealsetel proovivõtu aegadel ja uuringu lõpus, nagu on kirjeldatud näriliste puhul. Kui võrreldavate doositasemetega tehtud varasema 90-päevase uuringu vältel ei tuvastatud mõju hematoloogilistele parameetritele, ei ole kolme kuu möödumisel vaja mõõtmisi teha ei näriliste ega muude loomade puhul. Vereproovid tuleks võtta määratud kohast, näiteks otse südamest või retroorbitaalsest siinusest, kasutades tuimestust.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Tuleks uurida järgmisi parameetreid (30): leukotsüütide üldarv ja diferentseeritud leukotsüüdiarvud, erütrotsüütide arv, vereliistakute arv, hemoglobiini kontsentratsioon, hematokrit (rakkude protsent vere üldmahus), erütrotsüütide keskmine maht (MCV), hemoglobiini keskmine kogus erütrotsüüdis (MCH), hemoglobiini keskmine kontsentratsioon erütrotsüüdis (MCHC), protrombiini aeg ja aktiveeritud osalise tromboplastiini aeg. Vajaduse korral võib mõõta muid hematoloogiaparameetreid, näiteks Heinzi kehakesi või muid atüüpilisi erütrotsüüdivorme või methemoglobiini, olenevalt uuritava kemikaali mürgisusest. Üldiselt tuleks kasutada paindlikku lähenemisviisi sõltuvalt konkreetse uuritava kemikaali puhul täheldatud ja/või eeldatavast mõjust. Kui uuritav kemikaal mõjutab vereloomesüsteemi, võib olla vajalik uurida samuti retikulotsüütide arvu ja luuüdi tsütoloogiat, kuigi need uuringud ei ole alati vajalikud.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Olulise kudesid kahjustava toksilise mõju ning eelkõige neerusid ja maksa kahjustava mõju uurimiseks tehakse kliinilise biokeemia analüüsid vereproovidega, mis on võetud vähemalt kümnelt isas- ja kümnelt emasloomalt rühma kohta samade ajavahemike järel, mis on ette nähtud hematoloogiliste uuringute puhul; proovid võetakse alati samadelt loomadelt. Hiirte puhul võib kõikide nõutavate kliinilise biokeemia näitajate määramiseks minna vaja satelliitloomi. Muude loomade kui näriliste uurimisel võetakse proovid väiksemalt arvult loomadelt (koerte uurimisel näiteks neljalt loomalt kummagi soo ja iga rühma kohta) vahepealsetel proovivõtu aegadel ja uuringu lõpus, nagu on kirjeldatud näriliste puhul. Kui võrreldavate doositasemetega tehtud varasema 90-päevase uuringu vältel ei tuvastatud mõju kliinilise biokeemia parameetritele, ei ole kolme kuu möödumisel vaja mõõtmisi teha ei näriliste ega muude loomade puhul. Enne vereproovi võtmist on soovitatav loomi (v.a hiired) öö jooksul näljutada. Tuleks uurida järgmisi parameetreid (30): glükoos, karbamiid (karbamiidlämmastik), kreatiniin, üldvalk, albumiin, kaltsium, naatrium, kaalium, üldkolesterool, vähemalt kaks sobivat hepatotsellulaarse hindamise katset (alaniinaminotransferaas, aspartaataminotransferaas, glutamaatdehüdrogenaas, sapphapete kogusisaldus) (31) ja vähemalt kaks sobivat hepatobiliaarse hindamise katset (aluseline fosfataas, γ-glutamüültransferaas, 5’-nukleotidaas, üldbilirubiini, sapphapete kogusisaldus) (31). Muid kliinilisi keemilisi parameetreid, näiteks triglütseriide paastutingimustes, teatavaid hormoone ja koliinesteraasi võib mõõta vastavalt vajadusele, olenevalt uuritava kemikaali mürgisusest. Üldiselt on vaja paindlikku lähenemisviisi sõltuvalt uuritava kemikaali täheldatud ja/või oletatavast mõjust.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Uriinianalüüsi näitajad tuleks määrata vähemalt kümnel isas- ja kümnel emasloomal rühma kohta proovidest, mis on kogutud samade vahemikega kui hematoloogia- ja kliinilise keemia proovid. Kui võrreldavate doositasemetega tehtud varasema 90-päevase uuringu ajal ei leitud uriinianalüüsil mingit mõju, ei ole kolme kuu möödumisel vaja mõõtmisi teha. Kliinilise patoloogia uuringute eksperdi soovituse (30) kohaselt tuleks määrata järgmised parameetrid: välimus, ruumala, osmolaalsus või suhteline tihedus, pH, üldvalk ja glükoos. Lisaks võib määrata ketoone, urobilinogeeni, bilirubiini ja peitverd. Kui täheldatud mõju on vaja laialdasemalt uurida, võib vajaduse korral määrata täiendavaid näitajaid.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Üldiselt arvatakse, et hematoloogiliste ja kliinilise biokeemia näitajate lähteväärtused on vaja enne kemikaali manustamist määrata koertega tehtavate uuringute puhul, kuid närilistega tehtavate uuringute puhul neid määrata vaja ei ole (30). Kui varem määratud lähteväärtused (vt punkt 50) ei ole õiged, tuleks kaaluda selliste väärtuste määramist.
                           
                        
                     Patoloogia
                  
                  
                     Täielik lahkamine
                  
                  
                              45.
                           
                           
                              Kõik uuringus kasutatud loomad läbivad täieliku, põhjaliku lahkamise, milles uuritakse põhjalikult keha välispinda, kõiki avasid, kolju-, rinna- ja kõhuõõnt ja nende sisaldist. Siiski võib ka ette näha, et mõõtmised piirduvad (vahepeal surmatud või satelliitrühma loomade puhul) kõige olulisemate, näiteks neurotoksilisuse või immunotoksilisuse näitajate määramisega (vt punkt 19). Selliseid loomi ei ole vaja lahata ja nendega teha järgmistes punktides kirjeldatud protseduure. Kontroll-loomade puhul võib uuringu juht konkreetsel juhul otsustada, kas lahkamine on vajalik.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Kõikide loomade puhul, v.a loomad, kellele on tehtud erand punkti 45 viimase osa järgi, tuleks määrata organite mass. Kõigi loomade (välja arvatud loomad, kes leitakse suremas ja/või surmatakse uuringu kestel) neerupealised, aju, munandimanused, süda, neerud, maks, munasarjad, põrn, munandid, kilpnääre (mis kaalutakse pärast fikseerimist koos kõrvalkilpnäärmetega) ja emakas tuleks puhastada kõigist nende küljes olevatest kudedest, nagu on asjakohane, ja kaaluda märjalt võimalikult kiiresti pärast lahkamist, et vältida organite kuivamist. Uuringus, kus kasutatakse hiiri, ei ole neerupealiste kaalumine kohustuslik.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Järgmisi kudesid tuleks hoida koetüübi ja kavandatava histopatoloogilise uuringu (vt punkt 32) seisukohast kõige sobivamas fikseerimiskeskkonnas (kandilistes sulgudes esitatud organite uuring ei ole kohustuslik):
                              
                                          Kõik silmaga nähtavad kahjustused
                                       
                                       
                                          Süda
                                       
                                       
                                          Kõhunääre
                                       
                                       
                                          Magu (eesmagu, mao näärmeline osa)
                                       
                                    
                                          Neerupealised
                                       
                                       
                                          Niudesool
                                       
                                       
                                          Kõrvalkilpnääre
                                       
                                       
                                          [Hambad]
                                       
                                    
                                          Aort
                                       
                                       
                                          Tühisool
                                       
                                       
                                          Perifeerne närv
                                       
                                       
                                          Munandid
                                       
                                    
                                          Aju (sh suuraju osad, väikeaju ning piklikaju/ajusild)
                                       
                                       
                                          Neerud
                                       
                                       
                                          Ajuripats
                                       
                                       
                                          Harknääre
                                       
                                    
                                          Umbsool
                                       
                                       
                                          Pisaranääre (eksorbitaalne)
                                       
                                       
                                          Eesnääre
                                       
                                       
                                          Kilpnääre
                                       
                                    
                                          Emakakael
                                       
                                       
                                          Maks
                                       
                                       
                                          Pärasool
                                       
                                       
                                          [Keel]
                                       
                                    
                                          Koagulatsiooninääre
                                       
                                       
                                          Kops
                                       
                                       
                                          Süljenääre
                                       
                                       
                                          Hingetoru
                                       
                                    
                                          Käärsool
                                       
                                       
                                          Lümfisõlmed (nii pealispinnalt kui ka sügavalt)
                                       
                                       
                                          Seemnepõiekesed
                                       
                                       
                                          Kusepõis
                                       
                                    
                                          Kaksteistsõrmiksool
                                       
                                       
                                          Piimanäärmed (kohustuslikud emaste puhul ja kui need on nähtavalt lõigatavad, siis ka isaste puhul)
                                       
                                       
                                          Skeletilihas
                                       
                                       
                                          Emakas (sh emakakael)
                                       
                                    
                                          Munandimanus
                                       
                                       
                                          [Ülemised hingamisteed, sh nina, ninakarbikud ja ninakõrvalkoopad]
                                       
                                       
                                          Nahk
                                       
                                       
                                          [Kusejuha]
                                       
                                    
                                          Silm (sh võrkkest)
                                       
                                       
                                          Söögitoru
                                       
                                       
                                          Seljaaju (kolmel tasandil: kaela-, rinna- ja nimmepiirkond)
                                       
                                       
                                          [Kusiti]
                                       
                                    
                                          [Reieluu koos liigesega]
                                       
                                       
                                          [Haistmissibul]
                                       
                                       
                                          Põrn
                                       
                                       
                                          Tupp
                                       
                                    
                                          Sapipõis (muud liigid kui rott)
                                       
                                       
                                          Munasarjad
                                       
                                       
                                          [Rinnak]
                                       
                                       
                                          Luuüdi lõige ja/või värske luuüdi aspiraat
                                       
                                    
                                          Harderi nääre
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    Paarisorganite puhul (näiteks neerud, neerupealised) tuleks säilitada mõlemad organid. Kliinilised ja muud leiud võivad osutada vajadusele uurida ka muid kudesid. Säilitada tuleks ka muud organid, mis uuritava kemikaali teadaolevatest omadustest tulenevalt võivad tõenäoliselt olla sihtorganid. Nahakaudse manustamise uuringute puhul tuleks säilitada need organid, mis on ette nähtud suukaudse manustamise puhul, ja ülioluline on manustamiskohast nahaproovide võtmine ja säilitamine. Inhalatsiooniuuringute korral tuleks hingamisteedest säilitatavate ja uuritavate kudede puhul järgida käesoleva lisa peatükkide B.8 (8) ja B.29 (9) soovitusi. Muude organite/kudede puhul (ja lisaks hingamisteedest pärit konkreetselt säilitatavatele kudedele) tuleks järgida suukaudse manustamise puhul esitatud organite nimekirja.
                           
                        
                     Histopatoloogia
                  
                  
                              48.
                           
                           
                              On avaldatud juhendid toksikoloogilise patoloogia uuringute tegemise parimate tavade kohta (32). Tuleb teha vähemalt järgmised histopatoloogilised uuringud:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          suure annuse ja kontrollrühmade loomade kõik koed;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          uuringu vältel surnud või surmatud loomade kõik koed;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kõik koed, milles täheldatakse makroskoopilisi anomaaliaid;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          sihtkoed või koed, mille puhul suure annuse rühmas on näha kokkupuutest tingitud muutusi, kõikidelt suure annuse rühmade loomadelt;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          paarisorganite puhul (näiteks neerud, neerupealised) tuleks uurida mõlemat organit.
                                       
                                    
                        KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE
                  
                     Andmed
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Kõigi hinnatavate parameetrite kohta tuleks esitada iga looma andmed. Lisaks sellele tuleks kõik andmed koondada tabelisse, milles oleks iga katserühma kohta märgitud loomade arv katse alguses, katse ajal surnud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arv, mürgistusnähtudega loomade arv, täheldatud mürgistusnähtude kirjeldus, sealhulgas mürgise toime ilmnemine, kestus, raskusaste, kahjustustega loomade arv, kahjustuste liik ja iga liiki kahjustuse kohta nende loomade protsent, kellel seda esines. Kokkuvõtlikes tabelites tuleks esitada (pidevalt mõõdetud katseandmete puhul) nende loomade keskmised ja standardhälbed, kellel täheldati mürgisuse mõju või kahjustusi, lisaks kahjustuse raskusastme määramisele.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Varasemad kontrolli andmed võivad aidata uuringu tulemusi tõlgendada, näiteks kui samaaegse kontrolli andmed erinevad oluliselt sama katsekorralduse juures kontrollrühma loomadelt saadud hiljutistest andmetest. Hindamiseks võetud varasemad kontrolli andmed peaksid pärinema samast laborist, olema saadud sama vanuserühma ja sama liini loomadega ning olema kogutud kõnealusele uuringule eelneva viie aasta jooksul.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Võimaluse korral tuleks numbrilisi tulemusi hinnata asjakohase ja üldiselt tunnustatud statistilise meetodiga. Statistilised meetodid ja analüüsitavad andmed tuleks valida uuringu kavandamise etapis (punkt 8). Sellisel valimisel tuleks vajaduse korral ette näha, et tulemusi tuleb kohandada ellujäämise määra arvestamiseks.
                           
                        
                     Katseprotokoll
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uuritav kemikaal:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      füüsikaline olemus, puhtus ja füüsikalis-keemilised omadused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tunnusandmed;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kemikaali päritolu;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      partii number;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      keemilise analüüsi sertifikaat.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Kandeaine (vajaduse korral):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kandeaine valimise põhjendus (kui kandeaine on muu kui vesi).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katseloomad:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kasutatud liik/liin ja selle valimise põhjendus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      loomade arv, vanus ja sugu katse alguses;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      päritolu, pidamistingimused, söötmine jne;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      iga looma kehamass katse alguses.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katsetingimused:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      manustamistee ja doosi valiku põhjendus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kui see on kohaldatav, siis andmete analüüsimiseks valitud statistilised meetodid;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      andmed uuritava kemikaali preparaadi/sööda valmistamise kohta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analüüsiandmed preparaadis saavutatud kontsentratsiooni, preparaadi stabiilsuse ja homogeensuse kohta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      manustamistee ja uuritava kemikaali manustamise üksikasjad;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inhalatsiooniuuringute puhul: kas manustamine toimub ainult nina või kogu keha kaudu;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tegelik doos (mg kehamassi kg kohta päevas) ja vajaduse korral ümberarvestustegur söödas või joogivees oleva uuritava kemikaali kontsentratsiooni (mg/kg või ppm) ja tegeliku doosi vahel;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemused (tuleks esitada kokkuvõtlikud tabelandmed ja andmed eraldi iga looma kohta):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ellujäämuse andmed;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kehamass / kehamassi muutused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sööda tarbimine, söödakasutuse tõhususe arvutused (kui need tehti) ja vee tarbimine (kui on kohaldatav);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toksilise mõju andmed vastavalt looma soole ja doositasemele, sealhulgas mürgistusnähud;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kliiniliste ilmingute laad, esinemissagedus (ja kui määrati, siis raskusaste) ning kestus (sõltuvalt sellest, kas nähud on mööduvad või püsivad);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oftalmoloogiline läbivaatus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematoloogilised analüüsid;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kliinilise biokeemia analüüsid;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uriinianalüüsid;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      neurotoksilisuse või immunotoksilisuse uuringute tulemused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kehamass surmamisel;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      organite mass (ja kui võimalik, siis organi massi / kehamassi suhe);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      lahkamise leiud;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kõigi kemikaaliga kokkupuutest tingitud histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      võimaluse korral andmed imendumise kohta.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Vajaduse korral tulemuste statistiline töötlus.
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemuste arutelu:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      mõju sõltuvus doosist;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      võimalikku toimeviisi käsitleva teabe analüüsimine;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      võimaliku modelleerimislähenemisviisi arutelu;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      võrdlusdoosi (BMD), täheldatava kahjuliku toimeta doosi (NOAEL) või vähima täheldatava kahjuliku toimega doosi (LOAEL) kindlaksmääramine;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      varasemad kontrolli andmed;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      asjakohasus inimeste puhul.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Järeldused
                                          
                                       
                                    
                        
                     KIRJANDUS
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145–191.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.27 „Subkroonilise suukaudse toksilisuse katse – suukaudse kordusdoosi toksilisuse 90-päevane uuring mittenärilistel”.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.8 „Subakuutne mürgisus sissehingamisel: 28-päevane uuring”.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.29 „Subkrooniline mürgisus sissehingamisel: 90-päevane uuring”.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.9 „Kordusdoosi mürgisus (28 päeva, nahakaudne)”.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1–7.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37–68.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69–98.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              19)
                           
                           
                              Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiiv 2010/63/EL, 22. september 2010, teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitse kohta (ELT L 276, 20.10.2010, lk 33).
                           
                        
                              20)
                           
                           
                              National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86–23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              21)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
                           
                        
                              22)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              23)
                           
                           
                              Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15–23.
                           
                        
                              24)
                           
                           
                              IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
                           
                        
                              25)
                           
                           
                              Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.
                           
                        
                              26)
                           
                           
                              Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691–704.
                           
                        
                              27)
                           
                           
                              Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.
                           
                        
                              28)
                           
                           
                              Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.
                           
                        
                              29)
                           
                           
                              Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609.
                           
                        
                              30)
                           
                           
                              Weingand K, Brown G, Hall R et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198–201.
                           
                        
                              31)
                           
                           
                              EMEA (draft) document „Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity’ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).
                           
                        
                              32)
                           
                           
                              Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131.
                           
                        
                     1. liide
                     MÕISTE
                     Uuritav kemikaal– iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                  ”
            
                  6)
               
               
                  Peatükid B.32 ja B.33 asendatakse järgmisega:
                  „B.32.   KANTSEROGEENSUSE UURINGUD
                  
                  SISSEJUHATUS
                  
                              1.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga (Test Guideline, TG) 451 (2009). Esialgne kantserogeensuse uuringuid käsitlev katsejuhend TG 451 võeti vastu 1981. aastal. Käesoleva läbivaadatud katsemeetodi B.32 koostamist peeti vajalikuks, et võtta arvesse hiljutist arengut loomade heaolu ja regulatiivsete nõuete valdkonnas (2, 3, 4, 5, 6). Käesolevat katsemeetodit B.32 on ajakohastatud paralleelselt käesoleva lisa peatüki B.30 („Kroonilise mürgisuse uuringud”) ja peatüki B.33 („Kombineeritud kroonilise mürgisuse/kantserogeensuse uuringud”) läbivaatamisega selleks, et saada uuringus kasutatavate loomade abil lisateavet ning esitada täpsemaid andmeid dooside valiku kohta. Käesolev katsemeetod B.32 on koostatud selleks, et kasutada seda mitmesuguste kemikaalide, sh pestitsiidide ja tööstuslike kemikaalide katsetamiseks. Siiski tuleks märkida, et mõned üksikasjad ja nõuded võivad ravimite puhul olla erinevad (vt rahvusvahelise ühtlustamiskonverentsi suunis S1B, mis käsitleb ravimite kantserogeensuse katsetamist).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Enamik kantserogeensuse uuringuid tehakse näriliseliikidega ja käesolev katsemeetod on seega kavandatud peamiselt kasutamiseks nende liikidega tehtavate uuringute puhul. Kui kõnealuseid uuringuid on vaja teha muu loomaliigi kui närilistega, tuleks käesoleva katsemeetodi põhimõtteid ja toimimiskäiku kasutada koos nendega, mis on esitatud käesoleva lisa peatükis B.27 „Subkroonilise suukaudse toksilisuse katse – suukaudse kordusdoosi toksilisuse 90-päevane uuring mittenärilistel” (6) ja teha asjakohased muudatused. Täiendavad suunised on esitatud OECD juhenddokumendis nr 116, mis käsitleb kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringute kavandamist ja tegemist (7).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Kantserogeensuse uuringutes kasutatavad kolm peamist manustamisteed on suukaudne, nahakaudne ja sissehingamise teel manustamine. Manustamisviisi valik sõltub uuritava kemikaali füüsikalistest ja keemilistest omadustest ning inimeste peamisest võimalikust kokkupuuteviisist ainega. Lisateave kokkupuutetee valimise kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Käesolevas katsemeetodis on keskendutud suukaudsele manustamisele, mis on kantserogeensuse uuringutes enim kasutatav manustamistee. Kuigi inimeste tervist ohustavate riskide hindamiseks võivad vajalikud olla ka kantserogeensuse uuringud, mis hõlmavad nahakaudset või sissehingamise teel toimuvat kokkupuudet, ja/või neid võidakse nõuda teatavate eeskirjadega, on mõlema nimetatud kokkupuutetee puhul katsete korraldamine tehniliselt keeruline. Kõnealused uuringud tuleb kavandada juhtumipõhiselt, kuigi siin suukaudse manustamise kantserogeensuse hindamiseks kirjeldatud katsemeetodi võib võtta aluseks sissehingamise teel ja/või nahakaudse manustamise uuringu katse-eeskirja koostamisel, arvestades soovitusi manustamise ajavahemike, kliiniliste parameetrite ja patoloogianäitajate jne kohta. Uuritavate kemikaalide nahakaudse (7) ja sissehingamise teel (7, 8) manustamise kohta on avaldatud OECD juhenddokumendid. Kui kavandatakse sissehingamise kaudu toimuvat kokkupuudet hõlmavaid pikaajalisi uuringuid, tuleks eelkõige vaadata käesoleva lisa peatükke B.8 (9) ja B.29 (10) koos sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse uurimist käsitleva OECD juhenddokumendiga (8). Nahakaudse manustamise katsete tegemise kohta tuleks vaadata käesoleva lisa peatükki B.9 (11).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Kantserogeensuse uuring annab teavet võimalike terviseriskide kohta, mis võivad tõenäoliselt tekkida korduva kokkupuute korral kasutatava liigi kogu eluea jooksul. Uuringuga saadakse teavet uuritava kemikaali mürgiste mõjude, sealhulgas võimaliku kantserogeensuse kohta, võidakse teha kindlaks sihtorganid ja kemikaali akumulatsiooni võimalikkus. Sellega võidakse hinnata täheldatava kahjuliku toimeta doosi taset toksilise mõju puhul ning mittegenotoksiliste kantserogeenide puhul kasvajate teket; saadud andmeid saab kasutada inimeste kokkupuute jaoks ohutuskriteeriumide kehtestamiseks. Samuti rõhutatakse vajadust teha loomade hoolikas kliiniline läbivaatus, et hankida võimalikult palju teavet.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Käesoleva katsemeetodi kohaste kantserogeensuse uuringute eesmärgid on järgmised:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          uuritava kemikaali selliste kantserogeensete omaduste kindlakstegemine, mis põhjustavad uudismoodustiste arvu suurenemist, pahaloomuliste uudismoodustiste osakaalu suurenemist või uudismoodustiste tekkeni kuluva aja lühenemist, võrreldes samaaegsete kontrollrühmadega;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kantserogeense toime sihtorgani(te) tuvastamine;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          uudismoodustiste tekkimiseni kuluva aja kindlakstegemine;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kasvajaid tekitava mõju doosist sõltuvuse kirjeldamine;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          täheldatava kahjuliku toimeta doositaseme (no-observed-adverse-effect level, NOAEL) või võrdlusdoosi (Benchmark Dose, BMD) kindlakstegemiseks lähtepunkti määramine;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kantserogeense toime ekstrapoleerimine inimeste madala doositasemega kokkupuutele;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          andmete saamine toimeviisi käsitlevate hüpoteeside kontrollimiseks (2, 7, 12, 13, 14, 15).
                                       
                                    
                        LÄHTEKAALUTLUSED
                  
                              7.
                           
                           
                              Uuritava kemikaali võimalike kantserogeensete omaduste hindamisel peaks uurimislabor enne uuringu tegemist võtma arvesse kogu olemasoleva teabe uuritava kemikaali kohta, et uuringu kavandamisel keskenduda kantserogeense toime võimaluse kõige tõhusamale katsetamisele ja minimeerida loomade kasutamine. Teave eeldatava kantserogeeni toimeviisi kohta ja selle arvessevõtmine (2, 7, 12, 13, 14, 15) on eriti tähtis, kuna katse optimaalseks kavandamiseks võib olla vaja teada, kas uuritav kemikaal on teadaolev või eeldatav genotoksiline kantserogeen. Täpsemad juhendid toimeviisi arvestamise kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7).
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Uuringu kavandamist hõlbustav teave hõlmab järgmist: uuritava kemikaali keemiline nimetus, struktuur ja füüsikalis-keemilised omadused; mis tahes in vitro või in vivo mürgisuse, sealhulgas genotoksilisuse katsete tulemused; eeldatavad kasutusvaldkonnad ja inimestega kokkupuute võimalused; olemasolevad (kvantitatiivsete) struktuuri-aktiivsuse sõltuvuste ((Q)SAR) andmed, mutageensus/genotoksilisus, kantserogeensus ja muud toksikoloogilised andmed samalaadse struktuuriga ainete kohta; olemasolevad toksiko-kineetilised andmed (võimaluse korral ühekordse doosi ja korduvdoosi kineetika) ning muud korduva kokkupuute uuringutega saadud andmed. Kantserogeensust tuleks uurida alles pärast esialgse mürgisust käsitleva teabe saamist korduvdoosi 28-päevasest ja/või 90-päevasest mürgisuse katsest. Kasulikku teavet võivad anda ka lühiajalised vähi tekke ja arenemise katsed. Konkreetse uuritava kemikaali võimalike kahjulike tervisemõjude üldhindamisel tuleks kaaluda kantserogeensuse järkjärgulise uurimise lähenemisviisi (16, 17, 18, 19).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Enne uuringu alustamist tuleks uuringu kava ja eesmärkide alusel kindlaks määrata kõige sobivamad tulemuste analüüsi statistilised meetodid. Kaaluda tuleb seda, kas statistika peaks hõlmama ellujäämuse arvessevõtmist, katses ellujäämise kestusega seotud kasvajatekke kumulatiivse riski analüüsi, kasvaja tekkimiseni kuluva aja analüüsi ning analüüsi tegemist ühe või mitme rühma kavandatust varasema surmamise korral. Suunised asjakohaste statistiliste analüüside tegemiseks ja peamised viited rahvusvaheliselt tunnustatud statistilistele meetoditele on esitatud juhenddokumentides nr 116 (7) ning nr 35, milles käsitletakse kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringute analüüsi ja hindamist (20).
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Kantserogeensuse uuringu tegemisel tuleks alati järgida suunispõhimõtteid ja kaalutlusi, mis on sätestatud OECD juhenddokumendis nr 19 kliiniliste nähtude tuvastamise, hindamise ja kasutamise kohta ohutuse hindamisel kasutatavate katseloomade humaansete lõpetamiskriteeriumidena (21) ja eelkõige selle punktis 62. Kõnealuses punktis on sätestatud, et „[k]ui uuringutes, milles kasutatakse korduvat annustamist, tekivad loomal kliinilised progresseeruvad nähud, mis põhjustavad tema seisundi halvenemise, tuleb teha andmetel põhinev otsus, kas loom tuleks humaansel viisil surmata. Otsuse tegemisel tuleks kaaluda kõnealuse uuringus osaleva looma jätkuvast elushoidmisest saadava teabe väärtust võrreldes looma üldise seisundiga. Kui tehakse otsus kõnealune loom katsesse jätta, tuleks vajaduse korral suurendada vaatluste sagedust. Ilma katse eesmärki kahjulikult mõjutamata võib samuti olla võimalik annustamise ajutine peatamine, kui see vähendab looma valu või kannatusi, või katsedoosi vähendamine.”
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Üksikasjalikke suuniseid ja arutelu kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringute doosi valimise põhimõtete kohta on võimalik leida juhenddokumendist nr 116 (7) ning samuti kahest rahvusvahelise bioteaduste instituudi väljaandest (22, 23). Doosi valimise strateegia sõltub põhiliselt uuringu peamisest eesmärgist või peamistest eesmärkidest (punkt 6). Sobivate doositasemete valimisel tuleks saavutada tasakaal ühelt poolt ohu sõeluuringute ja teiselt poolt väikese doosi mõju iseloomustamise ning doosi ja mõju vahelise seose kindlakstegemise vahel. See on eriti oluline juhul, kui tehakse kombineeritud kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuring (käesoleva lisa peatükk B.33; punkt 12).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Tuleks kaaluda eraldi kroonilise mürgisuse uuringu (käesoleva lisa peatükk B.30) ja kantserogeensuse uuringu (käesolev katsemeetod B.32) tegemise asemel kombineeritud kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringu (käesoleva lisa peatükk B.33) tegemist. Kombineeritud katse võimaldab kokku hoida aega ja kulusid, võrreldes kahe eraldi uuringu tegemisega, kuid annab samasuguse kvaliteediga andmed nii kroonilise mürgisuse kui ka kantserogeensuse kohta. Kombineeritud kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringu (käesoleva lisa peatükk B.33) tegemisel tuleks siiski hoolikalt kaaluda doosi valimise põhimõtteid (punktid 11 ja 22–25) ning tuleb ka tunnistada, et mõnikord nõutakse eraldi uuringute tegemist eeskirjadega.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Käesoleva katsemeetodi kontekstis kasutatud mõisted on esitatud selle peatüki lõpus ja juhenddokumendis nr 116 (7).
                           
                        KATSE PÕHIMÕTE
                  
                              14.
                           
                           
                              Uuritavat kemikaali manustatakse iga päev astmeliselt suurenevate doosidena mitmele katseloomade rühmale enamiku nende eluea kestel, tavaliselt suukaudselt. Sissehingamise teel või nahakaudne manustamine võib samuti olla sobiv. Katseloomi vaadeldakse hoolikalt mürgistusnähtude ja uudismoodustistest põhjustatud kahjustuste arengu jälgimiseks. Katse ajal surnud või tapetud loomad lahatakse ning katse lõpus tapetakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad.
                           
                        MEETODI KIRJELDUS
                  
                     Loomaliigi valimine
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Käesoleva katsemeetodiga hinnatakse peamiselt kantserogeensust näriliste jaoks (punkt 2). Muu loomaliigi kui näriliste kasutamist võib kaaluda siis, kui olemasolevad andmed osutavad, et selline liik sobib paremini inimesele avalduva tervisemõju prognoosimiseks. Liigi valikut tuleks põhjendada. Närilistest eelistatakse rotte, kuigi kasutada võib ka teisi närilisi, nt hiiri. Kuigi hiire kasutamine kantserogeensuse katsetel võib anda piiratud väärtusega tulemusi (24, 25, 26), nõutakse mõne praegu kehtiva regulatiivse kava alusel kantserogeensuse katsetamist hiirtel, kui ei ole kindlaks tehtud, et kõnealune uuring ei ole teaduslikult vajalik. Rotid ja hiired on olnud eelistatud katsemudelid tänu nende suhteliselt lühikesele elueale, laialdasele kasutamisele farmakoloogia- ja toksikoloogiauuringutes, võimalusele kutsuda neil kergesti esile kasvajaid ja tänu piisavalt iseloomustatud liinide kättesaadavusele. Nende omaduste tulemusena on olemas palju teavet nende füsioloogia ja patoloogia kohta. Lisateave liigi ja aretusliini valimise kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7).
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Kasutatakse enim kasutatavate laboriliinide noori terveid täiskasvanud loomi. Kantserogeensuse uuring tuleks eelistatavalt teha samast liinist ja sama päritoluga loomadega, keda kasutati lühema kestusega mürgisuse eeluuringu(te)s. Kui kõnealusest liinist ja kõnealuse päritoluga loomad võivad teadaolevalt põhjustada probleeme pikaajaliste uuringute üldtunnustatud ellujäämiskriteeriumide (vt juhenddokument nr 116 (7)) saavutamisel, tuleks kaaluda sellise loomaliini kasutamist, kelle ellujäämise määr on pikaajalise uuringu jaoks vastuvõetav. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined.
                           
                        
                     Pidamis- ja söötmistingimused
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Loomi võib hoida eraldi või väikestes samast soost loomade rühmades; eraldi pidamist tuleks kaaluda ainult juhul, kui see on teaduslikult põhjendatud (27, 28, 29). Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 °C (±3 °C). Kuigi suhteline niiskus peab olema vähemalt 30 % ja eelistatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal, peaks eesmärgiks olema 50–60 %. Valgustus peab olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmisel võib kasutada tavapärast labori söödavalikut; joogivee kogust ei piirata. Sööt peaks vastama kõigile uuritava liigi toitumisvajadustele ja sööda saasteainesisaldus, sh pestitsiidijäägid, püsivad orgaanilised saasteained, fütoöstrogeenid, raskmetallid ja mükotoksiinid, mis võivad mõjutada katse tulemusi, peaks olema võimalikult väike. Regulaarselt tuleks analüüsida sööda toitainete ja saasteainete sisaldust; vähemalt tuleks seda teha uuringu alguses ja siis, kui hakatakse kasutama uut söödapartiid, ning analüüside tulemused tuleks esitada lõpparuandes. Samuti tuleks esitada uuringus kasutatud joogivee analüüsi andmed. Sööda valikut võib mõjutada vajadus tagada uuritava kemikaali jaoks sobiv segu ja rahuldada loomade toitumisvajadused, kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga.
                           
                        
                     Loomade ettevalmistamine
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Kasutada tuleks terveid loomi, kes on labororitingimustega vähemalt seitsme päeva jooksul kohanenud ning keda ei ole varem uuringutes kasutatud. Näriliste korral tuleks loomadele uuritava kemikaali annustamist alustada võimalikult varakult pärast võõrutamist ja kohanemist ning eelistatavalt enne, kui loomad on kaheksa nädala vanused. Katseloomi tuleks kirjeldada ja teatada liik, liin, päritolu, sugu, kehamass ja vanus. Uuringu alguses peaks kummagi soo loomade kehamassi erinevus olema minimaalne ja kõrvalekalle ei tohiks ületada 20 % uuringus kasutatavate loomade keskmisest kehamassist, mis leitakse eraldi kummagi soo loomade jaoks. Loomad tuleks kontroll- ja katserühmadesse jaotada juhuslikkuse alusel. Pärast juhuslikkuse alusel jaotamist ei tohiks rühmades kummagi soo keskmised kehamassid oluliselt erineda. Kui erinevused on statistiliselt olulised, tuleks juhuslikkuse alusel jaotamise etappi võimaluse korral korrata. Igale loomale tuleks määrata ainuline tunnusnumber ja loom tuleks kõnealuse numbriga püsivalt märgistada tätoveerimise, mikrokiibi paigaldamise või muu sobiva meetodi abil.
                           
                        KATSE KÄIK
                  
                     Loomade arv ja sugu
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Tuleks kasutada mõlemat sugu. Tuleks kasutada piisavat arvu loomi, et oleks võimalik põhjalik bioloogiline ja statistiline hindamine. Iga doosirühm ja samaaegne kontrollrühm peaks seega koosnema vähemalt 50 loomast kummagi soo kohta. Olenevalt uuringu eesmärgist võib suurendada peamiste näitajate statistilist tähtsust, kui jaotada loomad doosirühmadesse diferentseeritult (mitte võrdselt), nii et väikese doosi rühmades on rohkem kui 50 looma, näiteks väikeste dooside võimaliku kantserogeense mõju prognoosimiseks. Siiski tuleb tunnistada, et rühma mõningane suurendamine lisab uuringule suhteliselt vähe statistilist kaalu. Lisateave uuringu statistilise kavandamise ja doositasemete valiku kohta statistilise olulisuse maksimeerimiseks on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7).
                           
                        
                     Loomade vahepealne surmamine ja satelliitrühmad (kontrollrühmad)
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Kui see on teaduslikult põhjendatud, võib uuringus ette näha vahepealsed surmamised, näiteks 12 kuu möödumisel, et saada teavet uudismoodustiste arengu ja toimemehhanismi kohta. Kui selline teave on uuritava kemikaaliga tehtud varasematest korduvdoosi mürgisuse uuringutest juba olemas, ei pruugi vahepealsed surmamised olla teaduslikult põhjendatud. Kui uuringu kavas on vahepealseid surmamisi, on igas vahepealseks surmamiseks ette nähtud doosirühmas tavaliselt kümme looma kummagi soo kohta, ja uuringus kasutatavate loomade koguarvu tuleks suurendada nende loomade arvu võrra, keda on kavas surmata enne uuringu lõppu. Vajaduse korral võib uuringu vältel lisada haigusseisundi seireks täiendava kontroll-loomade rühma (tavaliselt viis looma kummastki soost) (30). Täpsemad juhendid on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7).
                           
                        
                     Doosirühmad ja doseerimine
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Juhendid kõigi doosi valiku ja doositaseme intervallidega seotud asjaolude kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7). Tuleks kasutada vähemalt kolme doosimäära ja samaaegset kontrollrühma. Doositasemed põhinevad üldjuhul lühema ajavahemiku korduvdoosi või doosipiirkonna määramise katse tulemustel ja nende puhul tuleks arvesse võtta uuritava kemikaali või samalaadsete kemikaalide kohta olemasolevat toksikoloogia- ja toksikokineetikaalast teavet.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Kui uuritava kemikaali füüsikalis-keemilised omadused või bioloogiline mõju seda ei piira, peaks kõrgeim doositase olema valitud nii, et saaks määrata kindlaks peamised sihtorganid ja toksilise toime, põhjustamata siiski kannatusi, ägedat mürgisust, haigestumist või surma. Punktis 23 allpool loetletud asjaolusid arvesse võttes tuleks tavaliselt valida kõrgeim doositase, et saada tõendusmaterjali mürgisuse kohta, näiteks kehakaalu tõusu vähenemise kaudu (ligikaudu 10 %). Sellest hoolimata võidakse uuringu eesmärkidest olenevalt (vt punkt 6) valida suurim doos, mis jääb allapoole mürgisust tõendavat doosi, näiteks kui doos avaldab teatavat kahjulikku mõju, kuid siiski ei mõjuta eluiga ega kehakaalu.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Doositaseme ja doositasemete intervalli võib valida nii, et määrata kindlaks mõju sõltuvus doosist, ning, olenevalt uuritava kemikaali toimeviisist, täheldatava kahjuliku toimeta kontsentratsioon (NOAEL) või muu soovitud uuringutulemus, näiteks võrdlusdoos (BMD) (vt punkt 25) madalaimal doositasemel. Asjaolud, mida tuleks väiksemate dooside valimisel arvesse võtta, on toime doosist sõltuvuse eeldatav tõus, doosid, mis võivad põhjustada olulisi metaboliseerimise muutusi või toksilisuse toimemehhanismi muutumist, kui eeldatakse läviväärtuse olemasolu, või mille puhul eeldatakse väikeste dooside ekstrapoleerimise lähtepunkti olemasolu.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Doositasemete vahemik sõltub uuritava kemikaali omadustest ja seda ei saa käesoleva katsemeetodiga ette kirjutada, aga kahe- kuni neljakordne vahemik alanevate doositasemete määramisel annab sageli häid katsetulemusi ning dooside vahel väga suure (näiteks rohkem kui kuue- kuni kümnekordse) vahemiku kasutamise asemel on sageli parem lisada neljas katserühm. Üldiselt tuleks vältida kümnest suurema kordaja kasutamist ja kui seda tehakse, tuleks seda põhjendada.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Nagu juhenddokumendis nr 116 (7) on selgitatud, tuleb doosi valimisel arvesse võtta järgmist:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          doosi-toime sõltuvuse teadaolev või oletatav mittelineaarsus või murdepunkt;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toksikokineetika ja doosipiirkonnad, mille puhul esineb metaboolne induktsioon, küllastumine või väliste ja sisemiste dooside vaheline mittelineaarsus või seda ei esine;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          esmaskahjustused, toimemarkerid või märgid sellest, et tuleb arvesse võtta peamiste bioloogiliste alusprotsesside toimumist;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          peamised (või oletatavad) toimeviisi asjaolud, näiteks annused, mille juures hakkab suurenema tsütotoksilisus, mõjutatakse hormoonitasemeid, homeostaasi säilitamise mehhanismid saavad üle koormatud jne;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          mõju doosist sõltuvuse kõvera piirkonnad, kus on vaja eriti usaldusväärset hinnangut, näiteks eeldatava võrdlusdoosi (BMD) vahemikus või oletatava läviväärtuse juures;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          inimeste kokkupuute eeldatava tasemega seotud kaalutlused.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              Kontrollrühm on rühm, kellega katseid ei tehta, või kandeaine kontrollrühm, kui uuritava kemikaali manustamisel kasutatakse kandeainet. Kontrollrühma loomi tuleks kohelda samamoodi kui katserühma loomi, välja arvatud uuritava kemikaali manustamine. Kui kasutatakse kandeainet, saab kontrollrühm kandeainet kõige suuremas koguses, mida kasutatakse doosirühmades. Kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga ja katseloomad söövad seda sööda halvema maitse tõttu oluliselt vähem, võib asjakohasema kontrollrühma tagamiseks olla sobiv täiendav kontrollrühm, kes saab samapalju sööta, kui doosirühmas ära süüakse.
                           
                        
                     Dooside ettevalmistamine ja uuritava kemikaali manustamine
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Uuritavat kemikaali manustatakse tavaliselt suu kaudu koos sööda või joogiveega või sundsöötmisega. Lisateave manustamisteede ja -meetodite kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7). Manustamistee ja -meetod sõltub uuringu eesmärgist, uuritava kemikaali füüsikalistest/keemilistest omadustest, biosaadavusest ning inimese uuritava kemikaaliga kokkupuutumise peamisest teest ja viisist. Manustamistee ja -meetodi valikut tuleks põhjendada. Loomade heaolu arvestades tuleks suukaudne manustamine sundsöötmisega üldiselt valida ainult selliste ainetega, mille puhul kui see manustamistee ja -meetod on põhjendatult sarnane inimese võimaliku kokkupuutega kemikaaliga (näiteks ravimid). Toidu- või keskkonnakemikaalide puhul, sh pestitsiidide puhul toimub manustamine tavaliselt sööda või joogivee kaudu. Mõne stsenaariumi puhul, näiteks kokkupuude töökohal, võib olla asjakohasem manustada kemikaali muul viisil.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav kemikaal sobivas kandeaines. Vastavalt vajadusele tuleks arvesse võtta järgmisi kandeaine ja muude lisandite omadusi: mõju uuritava aine imendumisele, jaotumisele, metaboliseerimisele või retentsioonile; mõju uuritava kemikaali keemilistele omadustele, mis võivad muuta selle toksilisi omadusi, ning mõjud sööda või vee tarbimisele või loomade toitumusele. On soovitatav, et võimaluse korral kaalutakse esmalt vesilahuse/-suspensiooni kasutamist, seejärel õlilahuse/-emulsiooni (nt maisiõli) kasutamist ja siis võimalikku lahust muus kandeaines. Muu kandeaine kui vee puhul tuleks teada kandeaine mürgiseid omadusi. Tuleks teada uuritava kemikaali stabiilsust ning doseerimislahuste või sööda (nagu on asjakohane) homogeensust manustamise tingimustes (näiteks söödaga).
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Nende kemikaalide puhul, mida manustatakse sööda või joogiveega, on oluline tagada, et sisseantavad uuritava kemikaali kogused ei muudaks tavalist toitumise või joogivee tarbimise tasakaalu. Pikas mürgisuse uuringus, kus kemikaali manustatakse sööda kaudu, ei tohiks uuritava kemikaali kontsentratsioon söödas üldiselt olla suurem kui 5 % sööda üldkogusest, et vältida tasakaalustamata toitumist. Kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga, võib kasutada kas püsivat kontsentratsiooni söödas (mg sööda kg kohta või ppm) või püsivat doositaset looma kehamassi alusel (mg kehakaalu kg kohta), mis arvutatakse iga nädal. Tuleks täpsustada, millist võimalust kasutatakse.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Suukaudse manustamise korral manustatakse loomadele uuritavat kemikaali iga päev (seitse päeva nädalas), näriliste puhul üldjuhul 24 kuu vältel (vt ka punkt 32). Iga muu doseerimismeetodi (nt viis päeva nädalas) kasutamist tuleb põhjendada. Nahakaudse manustamise puhul töödeldakse loomi üldjuhul uuritava kemikaaliga 24 kuu vältel vähemalt kuus tundi päevas seitse päeva nädalas, nagu on sätestatud käesoleva lisa peatükis B.9 (11). Sissehingamise teel toimuv kokkupuude toimub kuus tundi päevas ja seitse päeva nädalas; võib kasutada ka kokkupuudet viiel päeval nädalas, kui see on põhjendatud. Kokkupuuteperiood on tavaliselt 24 kuud. Kui ainult nina kaudu toimuvat kokkupuudet kasutatakse muu näriliseliigi kui roti korral, võib suurimat kokkupuute kestust kohandada, et minimeerida konkreetse kasutatava liigi isendite kannatusi. Kui päevas kasutatakse alla kuuetunnist kokkupuute kestust, tuleks seda põhjendada. Vt ka käesoleva lisa peatükk B.8 (9).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Kui loomadele manustatakse uuritavat kemikaali sundsöötmisega, tuleks seda teha iga päev umbes samal kellaajal maosondi või sobiva intubatsioonikanüüli abil. Tavaliselt manustatakse üks annus üks kord päevas, kui aga kemikaal on näiteks lokaalne ärritaja, võib igapäevase doosimäära säilitada, manustades jaotatud annust (kaks korda päevas). Suurim vedelikukogus, mida saab ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Kogus peaks olema nii väike kui praktiliselt võimalik ega tohiks üldjuhul näriliste puhul ületada 1 ml kehakaalu 100 g kohta (31). Katses kasutatava mahu erinevusi tuleks vähendada miinimumini; püsiva mahu tagamiseks tuleks kõikidel doositasemetel kasutada erinevaid kontsentratsioone. Erandiks on võimaliku söövitava või ärritava mõjuga kemikaalid, mida tuleb tugeva paikse mõju vältimiseks lahjendada. Tuleks vältida katseid kontsentratsioonidel, mis tõenäoliselt võivad seedetrakti söövitada või ärritada.
                           
                        
                     Uuringu kestus
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Uuringu kestus on näriliste puhul tavaliselt 24 kuud, mis moodustab suurema osa kasutatavate loomade tavalisest elueast. Võib kasutada lühemat või pikemat uuringu kestust, olenevalt uuringus kasutatava loomaliigi liini elueast, aga seda tuleks põhjendada. Konkreetsete hiireliinide puhul, näiteks liin AKR/J, C3H/J või C57BL/6J, võib asjakohasem olla 18kuuline kestus. Allpool on esitatud suunised uuringu kestuse ja lõpetamise ning ellujäämuse kohta; täpsemad suunised, sh uuringus ellujäämusega võrreldes negatiivse kantserogeensuse lubatavuse kaalumine, on esitatud OECD juhenddokumendis nr 116, mis käsitleb kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringute koostamist ja elluviimist (7).
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Kui väiksema doosi rühmade või kontrollrühma ellujäänute arv langeb alla 25 %, tuleks kaaluda uuringu lõpetamist.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Kui mürgistuse tõttu sureb enneaegselt ainult suure doosi rühm, ei tohiks selle pärast uuringut lõpetada.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Kummagi soo ellujäämust tuleks arvesse võtta eraldi.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Uuringut ei tohiks pikendada selle ajavahemikuni, kus uuringust saadavad andmed ei ole enam piisavad statistiliselt kehtivate hinnangute andmiseks.
                                       
                                    
                        VAATLUSED
                  
                              33.
                           
                           
                              Kõiki loomi tuleks haigestumise või suremise suhtes kontrollida, tavaliselt iga päeva alguses ja lõpus, sh nädalavahetustel ja pühadel. Loomi tuleks täiendavalt kontrollida kord päevas konkreetsete mürgistusnähtude suhtes, võttes sundsöötmisega manustamise puhul arvesse eeldatava mõju kõrgperioodi pärast doseerimist. Erilist tähelepanu tuleks pöörata kasvajate tekkimisele; iga nähtava või palpeeritava tuumori kohta tuleb märkida ilmumise aeg, paiknemine, mõõtmed, välimus ja areng.
                           
                        
                     Kehamass, sööda ja vee tarbimine ning söödakasutuse tõhusus
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Kõiki loomi tuleks kaaluda kemikaali manustamise alguses, vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala vältel ja seejärel vähemalt kord kuus. Sööda tarbimist ja söödakasutuse tõhusust tuleks mõõta vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala vältel ning seejärel vähemalt kord kuus. Kui uuritavat kemikaali manustatakse joogiveega, siis tuleks vee tarbimist mõõta vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala vältel ja seejärel vähemalt kord kuus. Joogivee tarbimise mõõtmisi tuleks kaaluda ka uuringute puhul, milles muutub loomade joomiskäitumine.
                           
                        
                     Hematoloogilised, kliinilise biokeemia ja muud mõõtmised
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Uuringust saadava teabe, eelkõige toimeviisiga seotud teabe maksimeerimiseks tuleks uuringu juhi äranägemise järgi võtta hematoloogiliste ja kliinilise biokeemia analüüside jaoks vereproove. Samuti võib olla asjakohane uriinianalüüsi tegemine. Täpsemad juhendid kantserogeensuse uuringu raames kõnealuste proovide võtmise väärtuse kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7). Kui peetakse vajalikuks, võib hematoloogiliste ja kliinilise keemia näitajate kindlaksmääramiseks võtta vereproovid ja teha uriinianalüüs vahepealse surmamise osana (punkt 20) ning uuringu lõpus vähemalt kümne loomaga kummagi soo ja iga rühma kohta. Vereproovid tuleks võtta kindlaksmääratud kohast, näiteks otse südamest või retroorbitaalsest siinusest, kasutades tuimestust, ning kui proov on võetud, tuleks seda hoida vajalikes tingimustes. Uurimiseks võib samuti valmistada vere äigepreparaadid, eelkõige juhul, kui luuüdi näib olevat sihtorgan, kuigi kõnealuse uuringu väärtus kantserogeense/onkogeense mõju hindamiseks on küsitav (32).
                           
                        PATOLOOGIA
                  
                     Täielik lahkamine
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Kõik uuringus kasutatud loomad, v.a kontroll-loomad (vt punkt 20) ja muud satelliitrühma loomad, läbivad täieliku, põhjaliku lahkamise, milles uuritakse põhjalikult keha välispinda, kõiki avasid, kolju-, rinna- ja kõhuõõnt ja nende sisaldist. Kontroll-loomade ja muude satelliitrühma loomade puhul võib uuringu juht konkreetsel juhul otsustada, kas lahkamine on vajalik. Organite massi kantserogeensuse uuringutes tavaliselt ei määrata, kuna geriaatrilised muutused ja hilisematel etappidel kasvajate areng piirab organite massi andmete kasulikkust. Kõnealused andmed võivad siiski olla üliolulised tõendusmaterjali kaalukuse hindamisel ja eelkõige toimeviisi hindamisel. Kui satelliituuringus seda määratakse, tuleks kõnealused andmed koguda hiljemalt aasta möödumisel uuringu algusest.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Järgmisi kudesid tuleks hoida koetüübi ja kavandatava histopatoloogilise uuringu (vt punkt 33) seisukohast kõige sobivamas fikseerimiskeskkonnas (kandilistes sulgudes esitatud organite uuring ei ole kohustuslik):
                              
                                          Kõik silmaga nähtavad kahjustused
                                       
                                       
                                          Süda
                                       
                                       
                                          Kõhunääre
                                       
                                       
                                          Magu (eesmagu, mao näärmeline osa)
                                       
                                    
                                          Neerupealis
                                       
                                       
                                          Niudesool
                                       
                                       
                                          Kõrvalkilpnääre
                                       
                                       
                                          [Hambad]
                                       
                                    
                                          Aort
                                       
                                       
                                          Tühisool
                                       
                                       
                                          Perifeerne närv
                                       
                                       
                                          Munandid
                                       
                                    
                                          Aju (sh suuraju osad, väikeaju ning piklikaju/sild)
                                       
                                       
                                          Neerud
                                       
                                       
                                          Ajuripats
                                       
                                       
                                          Harknääre
                                       
                                    
                                          Umbsool
                                       
                                       
                                          Pisaranääre (eksorbitaalne)
                                       
                                       
                                          Eesnääre
                                       
                                       
                                          Kilpnääre
                                       
                                    
                                          Emakakael
                                       
                                       
                                          Maks
                                       
                                       
                                          Pärasool
                                       
                                       
                                          [Keel]
                                       
                                    
                                          Koagulatsiooninääre
                                       
                                       
                                          Kops
                                       
                                       
                                          Süljenääre
                                       
                                       
                                          Hingetoru
                                       
                                    
                                          Käärsool
                                       
                                       
                                          Lümfisõlmed (nii pealispinnalt kui ka sügavalt)
                                       
                                       
                                          Seemnepõiekesed
                                       
                                       
                                          Kusepõis
                                       
                                    
                                          Kaksteistsõrmiksool
                                       
                                       
                                          Piimanääre (kohustuslik emaste puhul ja kui see on nähtavalt lõigatav, siis isaste puhul)
                                       
                                       
                                          Skeletilihas
                                       
                                       
                                          Emakas (sh emakakael)
                                       
                                    
                                          Munandimanus
                                       
                                       
                                          [Ülemised hingamisteed, sh nina, ninakarbikud ja nina kõrvalkoopad]
                                       
                                       
                                          Nahk
                                       
                                       
                                          [Kusejuha]
                                       
                                    
                                          Silm (sh võrkkest)
                                       
                                       
                                          Söögitoru
                                       
                                       
                                          Seljaaju (kolmel tasandil: kaela-, rinna- ja nimmepiirkond)
                                       
                                       
                                          [Kusiti]
                                       
                                    
                                          [Reieluu koos liigesega]
                                       
                                       
                                          [Haistmissibul]
                                       
                                       
                                          Põrn
                                       
                                       
                                          Tupp
                                       
                                    
                                          Sapipõis (muud liigid kui rott)
                                       
                                       
                                          Munasarjad
                                       
                                       
                                          [Rinnak]
                                       
                                       
                                          Luuüdi lõige ja/või värske luuüdi aspiraat
                                       
                                    
                                          Harderi nääre
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    Paarisorganite puhul (näiteks neerud, neerupealised) tuleks säilitada mõlemad organid. Kliinilised ja muud leiud võivad osutada vajadusele uurida ka muid kudesid. Säilitada tuleks ka muud organid, mis uuritava kemikaali teadaolevatest omadustest tulenevalt võivad tõenäoliselt olla sihtorganid. Nahakaudse manustamise uuringute puhul tuleks säilitada need organid, mis on ette nähtud suukaudse manustamise puhul, ning ülioluline on manustamiskohast nahaproovide võtmine ja säilitamine. Inhalatsiooniuuringute korral tuleks hingamisteedest säilitatavate ja uuritavate kudede puhul järgida käesoleva lisa peatükkide B.8 ja B.29 soovitusi. Muude organite/kudede puhul (ja lisaks hingamisteedest pärit konkreetselt säilitatavatele kudedele) tuleks järgida suukaudse manustamise puhul esitatud organite nimekirja.
                           
                        
                     Histopatoloogia
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              On avaldatud juhendid toksikoloogilise patoloogia uuringute tegemise parimate tavade kohta (33). Tuleb teha vähemalt järgmised histopatoloogilised uuringud:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          suure annuse ja kontrollrühma loomade kõik koed;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          uuringu vältel surnud või surmatud loomade kõik koed;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kõik koed, milles täheldatakse makroskoopilisi anomaaliaid, kaasa arvatud kasvajad;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kui suure doosi rühmas täheldatakse uuritava kemikaaliga kokkupuutest tingitud histopatoloogilisi muutusi, kontrollitakse kõikide muude doosirühmade loomadel samu kudesid;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          paarisorganite puhul (näiteks neerud, neerupealised) tuleks uurida mõlemat organit.
                                       
                                    
                        KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE
                  
                     Andmed
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Kõigi hinnatavate parameetrite kohta tuleks esitada iga looma andmed. Lisaks sellele tuleks kõik andmed koondada tabelisse, milles oleks iga katserühma kohta märgitud loomade arv katse alguses, katse ajal surnud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arv, mürgistusnähtudega loomade arv, täheldatud mürgistusnähtude kirjeldus, sealhulgas mürgise toime ilmnemine, kestus, raskusaste, kahjustustega loomade arv, kahjustuste liik ja iga liiki kahjustuse kohta nende loomade protsent, kellel seda esines. Kokkuvõtlikes tabelites tuleks esitada (pidevalt mõõdetud katseandmete puhul) nende loomade keskmised ja standardhälbed, kellel täheldati mürgisuse mõju või kahjustusi, lisaks kahjustuse raskusastme määramisele.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Varasemad kontrolli andmed võivad aidata uuringu tulemusi tõlgendada, näiteks kui samaaegse kontrolli andmed erinevad oluliselt sama katsekorralduse juures kontrollrühma loomadelt saadud hiljutistest andmetest. Hindamiseks võetud varasemad kontrolli andmed peaksid pärinema samast laborist, olema saadud sama vanuserühma ja sama liini loomadega ning olema kogutud kõnealusele uuringule eelneva viie aasta jooksul.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Võimaluse korral tuleks numbrilisi tulemusi hinnata asjakohase ja üldiselt tunnustatud statistilise meetodiga. Statistilised meetodid ja analüüsitavad andmed tuleks valida uuringu kavandamise etapis (punkt 9). Sellisel valimisel tuleks vajaduse korral ette näha, et tulemusi tuleb kohandada ellujäämise määra arvestamiseks.
                           
                        
                     Katseprotokoll
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uuritav kemikaal:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      füüsikaline olemus, puhtus ja füüsikalis-keemilised omadused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tunnusandmed;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kemikaali päritolu;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      partii number;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      keemilise analüüsi sertifikaat.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Kandeaine (vajaduse korral):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kandeaine valimise põhjendus (kui kandeaine on muu kui vesi).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katseloomad:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kasutatud liik/liin ja selle valimise põhjendus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      loomade arv, vanus ja sugu katse alguses;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      päritolu, pidamistingimused, söötmine jne;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      iga looma kehamass katse alguses.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katsetingimused:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      manustamistee ja annuse valiku põhjendus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kui see on kohaldatav, siis andmete analüüsimiseks valitud statistilised meetodid;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      andmed uuritava kemikaali preparaadi/sööda valmistamise kohta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analüüsiandmed preparaadis saavutatud kontsentratsiooni, preparaadi stabiilsuse ja homogeensuse kohta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      manustamistee ja uuritava kemikaali manustamise üksikasjad;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inhalatsiooniuuringute puhul: kas manustamine toimub ainult nina või kogu keha kaudu;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tegelik doos (mg kehakaalu kg kohta päevas) ja vajaduse korral ümberarvestustegur söödas või joogivees oleva uuritava kemikaali kontsentratsiooni (mg/kg või ppm) ja tegeliku doosi vahel;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemused (tuleks esitada kokkuvõtlikud tabelandmed ja andmed eraldi iga looma kohta)
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Üldosa:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ellujäämuse andmed;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kehamass / kehamassi muutused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sööda tarbimine, söödakasutuse tõhususe arvutused (kui need tehti) ja vee tarbimine, kui see on kohaldatav;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      võimaluse korral toksiko-kineetilised andmed;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oftalmoskoopia võimaluse korral;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematoloogia andmed võimaluse korral;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kliinilise keemia andmed võimaluse korral.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Kliinilised leiud:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toksilisuse tunnused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      iga anomaalia esinemissagedus (ja kui määrati, siis raskusaste);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kliiniliste ilmingute laad, raskus ja kestus (sõltuvalt sellest, kas ilmingud on ajutised või püsivad).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Lahkamise andmed:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kehamass surmamisel;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      organite mass (ja kui võimalik, siis organi massi / kehamassi suhe);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      lahkamise leiud; anomaaliate esinemissagedus ja raskusaste.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Histopatoloogia:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uudismoodustistega mitteseotud histopatoloogilised leiud;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uudismoodustistega seotud histopatoloogilised leiud;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      korrelatsioon makroskoopiliste ja mikroskoopiliste tulemuste vahel;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kõigi kemikaaliga kokkupuutest tingitud histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus koos raskusastme hindamisega;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aruanne mikroskoobipreparaatide võimalike vastastikuste hindamiste kohta.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Vajaduse korral tulemuste statistiline töötlus.
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemuste arutelu:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      võimalike modelleerimispõhiste lähenemisviiside arutelu;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toime sõltuvus doosist;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      varasemad kontrolli andmed;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      võimalikku toimeviisi käsitleva teabe analüüsimine;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      võrdlusdoosi (BMD), täheldatava kahjuliku toimeta doosi (NOAEL) või vähima täheldatava kahjuliku toimega doosi (LOAEL) kindlaksmääramine;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      asjakohasus inimeste puhul.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Järeldused
                                          
                                       
                                    
                        
                     KIRJANDUS
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145–191.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.27 „Subkroonilise suukaudse toksilisuse katse – suukaudse kordusdoosi toksilisuse 90-päevane uuring mittenärilistel”.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.8 „Subakuutne mürgisus sissehingamisel: 28-päevane uuring”.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.29 „Subkrooniline mürgisus sissehingamisel: 90-päevane uuring”.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.9 „Kordusdoosi mürgisus (28 päeva, nahakaudne)”.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793–801.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581–589.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51–56.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591–653.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1–7.
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37–68.
                           
                        
                              19)
                           
                           
                              Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69–98.
                           
                        
                              20)
                           
                           
                              OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
                           
                        
                              21)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              22)
                           
                           
                              Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West, W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837.
                           
                        
                              23)
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              24)
                           
                           
                              Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1):214.
                           
                        
                              25)
                           
                           
                              Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279–284.
                           
                        
                              26)
                           
                           
                              Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196–1203.
                           
                        
                              27)
                           
                           
                              Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiiv 2010/63/EL, 22. september 2010, teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitse kohta (ELT L 276, 20.10.2010, lk 33).
                           
                        
                              28)
                           
                           
                              National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86–23. Washington, D.C., US Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              29)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
                           
                        
                              30)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              31)
                           
                           
                              Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15–23.
                           
                        
                              32)
                           
                           
                              Weingand K, et al. (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198–201.
                           
                        
                              33)
                           
                           
                              Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P, et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131.
                           
                        
                     1. liide
                     MÕISTE
                     Uuritav kemikaal– iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                  
                  B.33.   KOMBINEERITUD KROONILISE TOKSILISUSE – KANTSEROGEENSUSE UURING
                  
                  SISSEJUHATUS
                  
                              1.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga (Test Guideline, TG) 453 (2009). Esialgne katsejuhend TG 453 võeti vastu 1981. aastal. Käesoleva ajakohastatud katsemeetodi B.33 koostamist peeti vajalikuks, et võtta arvesse hiljutist arengut loomade heaolu ja regulatiivsete nõuete valdkonnas (1, 2, 3, 4, 5). Käesolevat katsemeetodit B.33 on ajakohastatud paralleelselt käesoleva lisa peatüki B.32 („Kantserogeensuse uuringud”) ja peatüki B.30 („Kroonilise mürgisuse uuringud”) läbivaatamisega selleks, et saada uuringus kasutatavate loomade abil lisateavet ning esitada täpsemaid andmeid dooside valiku kohta. Käesolev katsemeetod on koostatud selleks, et kasutada seda mitmesuguste kemikaalide, sh pestitsiidide ja tööstuslike kemikaalide katsetamiseks. Siiski tuleks märkida, et mõned üksikasjad ja nõuded võivad ravimite puhul olla erinevad (vt rahvusvahelise ühtlustamiskonverentsi suunis S1B, mis käsitleb ravimite kantserogeensuse katsetamist).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Enamik kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringuid tehakse näriliseliikidega ja käesolev katsemeetod on seega kavandatud peamiselt kasutamiseks nende liikidega tehtavate uuringute puhul. Kui selliseid uuringuid on vaja teha mittenärilistega, võib samuti rakendada käesolevas katsemeetodis kirjeldatud põhimõtteid ja toimimiskäiku koos põhimõtete ja toimimiskäiguga, mida on kirjeldatud käesoleva lisa peatükis B.27 („Korduvdoosi suukaudse mürgisuse 90-päevane uuring mittenäriliste puhul”) (6) koos asjakohaste muudatustega, nagu on sätestatud OECD juhenddokumendis nr 116, mis käsitleb kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringute kavandamist ja tegemist (7).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Kroonilise mürgisuse – kantserogeensuse uuringutes kasutatavad kolm peamist manustamisteed on suukaudne, nahakaudne ja sissehingamise teel manustamine. Manustamisviisi valik sõltub uuritava kemikaali füüsikalistest ja keemilistest omadustest ning inimeste peamisest võimalikust ainega kokkupuutumise viisist. Lisateave kokkupuutetee valimise kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Käesolevas katsemeetodis on keskendutud suukaudsele manustamisele, mis on kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringutes enim kasutatav manustamistee. Kuigi inimeste tervist ohustavate riskide hindamiseks võivad vajalikud olla ka pikaajalised uuringud, mis hõlmavad nahakaudset või sissehingamise teel toimuvat kokkupuudet, ja/või neid võidakse nõuda teatavate eeskirjadega, on mõlema nimetatud kokkupuutetee puhul katsete korraldamine tehniliselt keeruline. Kõnealused uuringud tuleb kavandada juhtumipõhiselt, kuigi siin suukaudse manustamise kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse hindamiseks kirjeldatud katsemeetodi võib võtta aluseks sissehingamise teel ja/või nahakaudse manustamise uuringu katse-eeskirja koostamisel ja arvestades manustamise ajavahemikke, kliinilisi ja patoloogilisi parameetreid jne käsitlevaid soovitusi. On olemas OECD juhenddokumendid uuritava kemikaali sissehingamise teel (7, 8) ja nahakaudselt (7) manustamise kohta. Kui kavandatakse sissehingamise kaudu toimuvat kokkupuudet hõlmavaid pikaajalisi uuringuid, tuleks eelkõige vaadata käesoleva lisa peatükke B.8 (9) ja B.29 (10) koos sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse uurimist käsitleva OECD juhenddokumendiga (8). Nahakaudse manustamise katsete tegemisel tuleks vaadata käesoleva lisa peatükki B.9 (11).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Kombineeritud kroonilisuse mürgisuse – kantserogeensuse uuring annab teavet võimalike terviseriskide kohta, mis võivad tõenäoliselt tekkida korduva kokkupuute korral kasutatava liigi kogu eluea jooksul. Uuringuga saadakse teavet uuritava kemikaali mürgiste mõjude, sealhulgas võimaliku kantserogeensuse kohta, võidakse teha kindlaks sihtorganid ja kemikaali akumulatsiooni võimalikkus. Sellega võidakse hinnata täheldatava kahjuliku toimeta doosi taset toksilise mõju puhul ning mittegenotoksiliste kantserogeenide puhul kasvajate teket; saadud andmeid saab kasutada inimeste kokkupuute jaoks ohutuskriteeriumide kehtestamiseks. Samuti rõhutatakse vajadust teha loomade hoolikas kliiniline läbivaatus, et hankida võimalikult palju teavet.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Käesoleva katsemeetodi kohaste kroonilise mürgisuse – kantserogeensuse uuringute eesmärgid on järgmised:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          uuritava kemikaali selliste kantserogeensete omaduste kindlakstegemine, mis põhjustavad uudismoodustiste arvu suurenemist, pahaloomuliste uudismoodustiste osakaalu suurenemist või uudismoodustiste tekkeni kuluva aja lühenemist, võrreldes samal ajal kasutatavate kontrollrühmadega;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          uudismoodustiste tekkimiseni kuluva aja kindlakstegemine;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          uuritava kemikaali kroonilise mürgisuse kindlaksmääramine;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kroonilise mürgisuse ja kantserogeense toime sihtorgani(te) tuvastamine;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          mõju doosist sõltuvuse kirjeldamine;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          täheldatava kahjuliku toimeta doositaseme (no-observed-adverse-effect level, NOAEL) või võrdlusdoosi (Benchmark Dose, BMD) kindlakstegemiseks lähtepunkti määramine;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kantserogeense toime ekstrapoleerimine inimeste madala doositasemega kokkupuutele;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kroonilise mürgise mõju prognoosimine inimeste kokkupuutetasemetel;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          andmete saamine toimeviisi käsitlevate hüpoteeside kontrollimiseks (2, 7, 12, 13, 14, 15).
                                       
                                    
                        LÄHTEKAALUTLUSED
                  
                              7.
                           
                           
                              Uuritava kemikaali võimalike kantserogeensete ja kroonilise mürgisuse omaduste hindamisel peaks uurimislabor enne uuringu tegemist võtma arvesse kogu olemasoleva teabe uuritava kemikaali kohta, et uuringu kavandamisel keskenduda toksikoloogilise toime võimaluse kõige tõhusamale katsetamisele ja minimeerida loomade kasutamine. Teave eeldatava kantserogeeni toimeviisi kohta ja selle arvessevõtmine (2, 7, 12, 13, 14, 15) on eriti tähtis, kuna katse optimaalseks kavandamiseks võib olla vaja teada, kas uuritav kemikaal on teadaolev või eeldatav genotoksiline kantserogeen. Täpsemad juhendid toimeviisi arvestamise kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7).
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Uuringu kavandamist hõlbustav teave hõlmab järgmist: uuritava kemikaali keemiline nimetus, struktuur ja füüsikalis-keemilised omadused; teave võimaliku toimeviisi kohta; mis tahes in vitro või in vivo mürgisuse, sealhulgas genotoksilisuse katsete tulemused; eeldatavad kasutusvaldkonnad ja inimestega kokkupuute võimalused; olemasolevad (kvantitatiivsete) struktuuri-aktiivsuse sõltuvuste ((Q)SAR) andmed, mutageensus/genotoksilisus, kantserogeensus ja muud toksikoloogilised andmed samalaadse struktuuriga ainete kohta; olemasolevad toksiko-kineetilised andmed (võimaluse korral ühekordse doosi ja korduvdoosi kineetika) ning muud korduva kokkupuute uuringutega saadud andmed. Kroonilist mürgisust ja kantserogeensust tuleks uurida alles pärast esialgse mürgisust käsitleva teabe saamist korduvdoosi 28-päevasest ja/või 90-päevasest mürgisuse katsest. Kasulikku teavet võivad anda ka lühiajalised vähi tekke ja arenemise katsed. Konkreetse uuritava kemikaali võimalike kahjulike tervisemõjude üldhindamisel tuleks kaaluda kantserogeensuse järkjärgulise uurimise lähenemisviisi (16, 17, 18, 19).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Enne uuringu alustamist tuleks uuringu kava ja eesmärkide alusel kindlaks määrata kõige sobivamad tulemuste analüüsi statistilised meetodid. Kaaluda tuleb seda, kas statistika peaks hõlmama ellujäämuse arvessevõtmist, katses ellujäämise kestusega seotud kasvajatekke kumulatiivse riski analüüsi, kasvaja tekkimiseni kuluva aja analüüsi ning analüüsi tegemist ühe või mitme rühma kavandatust varasema surmamise korral. Suunised asjakohaste statistiliste analüüside tegemiseks ja peamised viited rahvusvaheliselt tunnustatud statistilistele meetoditele on esitatud juhenddokumentides nr 116 (7) ning nr 35, milles käsitletakse kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringute analüüsi ja hindamist (20).
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Kantserogeensuse uuringu tegemisel tuleks alati järgida suunispõhimõtteid ja kaalutlusi, mis on sätestatud OECD juhenddokumendis nr 19 kliiniliste nähtude tuvastamise, hindamise ja kasutamise kohta ohutuse hindamisel kasutatavate katseloomade humaansete lõpetamiskriteeriumidena (21) ja eelkõige selle punktis 62. Kõnealuses punktis on sätestatud, et „[k]ui uuringutes, milles kasutatakse korduvat annustamist, tekivad loomal kliinilised progresseeruvad nähud, mis põhjustavad tema seisundi halvenemise, tuleb teha andmetel põhinev otsus, kas loom tuleks humaansel viisil surmata. Otsuse tegemisel tuleks kaaluda kõnealuse uuringus osaleva looma jätkuvast elushoidmisest saadava teabe väärtust võrreldes looma üldise seisundiga. Kui tehakse otsus kõnealune loom katsesse jätta, tuleks vajaduse korral suurendada vaatluste sagedust. Ilma katse eesmärki kahjulikult mõjutamata võib samuti olla võimalik annustamise ajutine peatamine, kui see vähendab looma valu või kannatusi, või katsedoosi vähendamine.”
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Üksikasjalikke suuniseid ja arutelu kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringute doosi valimise põhimõtete kohta on võimalik leida juhenddokumendist nr 116 (7) ning samuti kahest rahvusvahelise bioteaduste instituudi väljaandest (22, 23). Doosi valimise strateegia sõltub põhiliselt uuringu peamisest eesmärgist või peamistest eesmärkidest (punkt 6). Sobivate doositasemete valimisel tuleks saavutada tasakaal ühelt poolt ohu sõeluuringute ja teiselt poolt väikese doosi mõju iseloomustamise ning doosi ja mõju vahelise seose kindlakstegemise vahel. See on eriti asjakohane käesoleva kombineeritud kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringu puhul.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Tuleks kaaluda eraldi kroonilise mürgisuse uuringu (käesoleva lisa peatükk B.30) ja kantserogeensuse uuringu (käesoleva lisa peatükk B.32) tegemise asemel käesoleva kombineeritud kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringu tegemist. Kombineeritud katse võimaldab kokku hoida aega ja kulusid ning mõnevõrra vähendada ka katseloomade kasutamist, võrreldes kahe eraldi uuringu tegemisega, kuid annab samasuguse kvaliteediga andmed nii kroonilise mürgisuse kui ka kantserogeensuse kohta. Kombineeritud kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringu tegemisel tuleks siiski hoolikalt kaaluda doosi valimise põhimõtteid (punktid 11 ja 22–26) ning tuleb ka tunnistada, et mõnikord nõutakse eraldi uuringute tegemist eeskirjadega. Täpsemad juhendid kombineeritud kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringu kavandamise kohta, et kasutada võimalikult vähe katseloomi ning teha uuring võimalikult lihtsalt ja tõhusalt, on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Käesoleva katsemeetodi kontekstis kasutatud mõisted on esitatud selle peatüki lõpus ja juhenddokumendis nr 116 (7).
                           
                        KATSE PÕHIMÕTE
                  
                              14.
                           
                           
                              Uuringu kava koosneb kahest paralleelsest etapist: kroonilisuse etapp ja kantserogeensuse etapp (kestused on esitatud vastavalt punktides 34 ja 35). Uuritavat kemikaali manustatakse tavaliselt suu kaudu, kuigi ka sissehingamise või nahakaudse kokkupuute uurimine võib olla sobiv. Kroonilisuse etapi puhul manustatakse uuritavat kemikaali iga päev astmeliste doosidena mitmele katseloomade rühmale, igale katseloomade rühmale ühel doosiastmel, tavaliselt 12 kuu vältel, kuigi regulatiivsetest nõuetest olenevalt võib katse kestus olla ka pikem või lühem (vt punkt 34). Katse selline kestus tagab, et see on piisavalt pikk kumulatiivse mürgisuse mõjude avaldumiseks, kuid tulemusi ei hakka veel segama geriaatrilised muutused. Uuringu kavaga võib ette näha ühe või mitu vahepealset surmamist, näiteks kolme ja kuue kuu möödudes, ja selle võimaldamiseks võib kasutada täiendavaid loomarühmi (vt punkt 20). Kantserogeensuse etapi puhul manustatakse uuritavat kemikaali iga päev mitmele katseloomade rühmale nende elueast suure osa vältel. Mõlemal etapil vaadeldakse katseloomi hoolikalt mürgistusnähtude ja uudismoodustistest põhjustatud kahjustuste arengu jälgimiseks. Katse ajal surnud või tapetud loomad lahatakse ning katse lõpus tapetakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad.
                           
                        MEETODI KIRJELDUS
                  
                     Loomaliigi valimine
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Käesoleva katsemeetodiga hinnatakse peamiselt kroonilist mürgisust ja kantserogeensust näriliste jaoks (punkt 2). Muu loomaliigi kui näriliste kasutamist võib kaaluda siis, kui olemasolevad andmed osutavad, et selline liik sobib paremini inimesele avalduva tervisemõju prognoosimiseks. Liigi valikut tuleks põhjendada. Närilistest eelistatakse rotte, kuigi kasutada võib ka teisi närilisi, nt hiiri. Kuigi hiire kasutamine kantserogeensuse katsetel võib anda piiratud väärtusega tulemusi (24, 25, 26), nõutakse mõne praegu kehtiva regulatiivse kava alusel kantserogeensuse katsetamist hiirtel, kui ei ole kindlaks tehtud, et kõnealune uuring ei ole teaduslikult vajalik. Rotid ja hiired on olnud eelistatud katsemudelid tänu nende suhteliselt lühikesele elueale, laialdasele kasutamisele farmakoloogia- ja toksikoloogiauuringutes, võimalusele kutsuda neil kergesti esile kasvajaid ja tänu piisavalt iseloomustatud liinide kättesaadavusele. Nende omaduste tulemusena on olemas palju teavet nende füsioloogia ja patoloogia kohta. Kui nõutakse kroonilise mürgisuse – kantserogeensuse uuringut muu liigiga kui närilised, peaks selle kavandamine ja tegemine toetuma põhimõtetele, mis on esitatud käesolevas katsemeetodis ja käesoleva lisa peatükis B.27 („Korduvdoosi suukaudse mürgisuse 90-päevane uuring mittenäriliste puhul”) (6). Lisateave liigi ja aretusliini valimise kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7).
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Kasutatakse enim kasutatavate laboriliinide noori terveid täiskasvanud loomi. Kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse kombineeritud uuring tuleks eelistatavalt teha samast liinist ja sama päritoluga loomadega, keda kasutati lühema kestusega mürgisuse eeluuringu(te)s. Kui kõnealusest liinist ja kõnealuse päritoluga loomad võivad teadaolevalt põhjustada probleeme pikaajaliste uuringute üldtunnustatud ellujäämiskriteeriumide (vt juhenddokument nr 116 (7)) saavutamisel, tuleks kaaluda sellise loomaliini kasutamist, kelle ellujäämise määr on pikaajalise uuringu jaoks vastuvõetav. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined.
                           
                        
                     Pidamis- ja söötmistingimused
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Loomi võib hoida eraldi või väikestes samast soost loomade rühmades; eraldi pidamist tuleks kaaluda ainult juhul, kui see on teaduslikult põhjendatud (27, 28, 29). Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 °C (±3 °C). Kuigi suhteline niiskus peab olema vähemalt 30 % ja eelistatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal, peaks eesmärgiks olema 50–60 %. Valgustus peab olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmisel võib kasutada tavapärast labori söödavalikut; joogivee kogust ei piirata. Sööt peaks vastama kõigile uuritava liigi toitumisvajadustele ja sööda saasteainesisaldus, sh pestitsiidijäägid, püsivad orgaanilised saasteained, fütoöstrogeenid, raskmetallid ja mükotoksiinid, mis võivad mõjutada katse tulemusi, peaks olema võimalikult väike. Regulaarselt tuleks analüüsida sööda toitainete ja saasteainete sisaldust; vähemalt tuleks seda teha uuringu alguses ja siis, kui hakatakse kasutama uut söödapartiid, ning analüüside tulemused tuleks esitada lõpparuandes. Samuti tuleks esitada uuringus kasutatud joogivee analüüsi andmed. Sööda valikut võib mõjutada vajadus tagada uuritava kemikaali jaoks sobiv segu ja rahuldada loomade toitumisvajadused, kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga.
                           
                        
                     Loomade ettevalmistamine
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Kasutada tuleks terveid loomi, kes on labororitingimustega vähemalt seitsme päeva jooksul kohanenud ning keda ei ole varem uuringutes kasutatud. Näriliste korral tuleks loomadele uuritava kemikaali annustamist alustada võimalikult varakult pärast võõrutamist ja kohanemist ning eelistatavalt enne, kui loomad on kaheksa nädala vanused. Katseloomi tuleks kirjeldada ja teatada liik, liin, päritolu, sugu, kehamass ja vanus. Uuringu alguses peaks kummagi soo loomade kehamassi erinevus olema minimaalne ja kõrvalekalle ei tohiks ületada 20 % uuringus kasutatavate loomade keskmisest kehamassist, mis leitakse eraldi kummagi soo loomade jaoks. Loomad tuleks kontroll- ja katserühmadesse jaotada juhuslikkuse alusel. Pärast juhuslikkuse alusel jaotamist ei tohiks rühmades kummagi soo keskmised kehamassid oluliselt erineda. Kui erinevused on statistiliselt olulised, tuleks juhuslikkuse alusel jaotamise etappi võimaluse korral korrata. Igale loomale tuleks määrata ainuline tunnusnumber ja loom tuleks kõnealuse numbriga püsivalt märgistada tätoveerimise, mikrokiibi paigaldamise või muu sobiva meetodi abil.
                           
                        KATSE KÄIK
                  
                     Loomade arv ja sugu
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Tuleks kasutada mõlemat sugu. Tuleks kasutada piisavat arvu loomi, et oleks võimalik põhjalik bioloogiline ja statistiline hindamine. Näriliste puhul peaks kantserogeensuse etapil igas doosirühmas (nagu on näidatud punktis 22) ja samaaegses kontrollrühmas seega olema vähemalt 50 looma kummastki soost. Olenevalt uuringu eesmärgist võib suurendada peamiste näitajate statistilist tähtsust, kui jaotada loomad doosirühmadesse diferentseeritult (mitte võrdselt), nii et väikese doosi rühmades on rohkem kui 50 looma, näiteks väikeste dooside võimaliku kantserogeense mõju prognoosimiseks. Siiski tuleb tunnistada, et rühma mõningane suurendamine lisab uuringule suhteliselt vähe statistilist kaalu. Kroonilise mürgisuse etapil peaks igas doosirühmas (nagu on näidatud punktis 22) ja samaaegses kontrollrühmas seega olema vähemalt kümme looma kummastki soost, kui kasutatakse närilisi. Tuleb märkida, et see arv on väiksem kui kroonilise mürgisuse uuringu puhul (käesoleva lisa peatükk B.30). Väiksema loomade arvuga rühma andmete tõlgendamine kõnealuse kombineeritud uuringu kroonilise mürgisuse etapil toetub aga uuringu kantserogeensuse etapi suurema arvu loomade põhjal saadud andmetele. Hiirtega tehtavates uuringutes võib olla vajalik kasutada kroonilise mürgisuse etapil igas doositaseme rühmas rohkem loomi, et teha kõik nõutavad hematoloogilised analüüsid. Lisateave uuringu statistilise kavandamise ja doositasemete valiku kohta statistilise olulisuse maksimeerimiseks on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7).
                           
                        
                     Loomade vahepealne surmamine, satelliitrühm ja kontroll-loomad
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Kui see on teaduslikult põhjendatud, võib uuringus ette näha vahepealsed surmamised, näiteks kroonilise mürgisuse etapil kuue kuu möödumisel, et saada teavet muude kui uudismoodustistega seotud muutuste arengu ja toimemehhanismi kohta. Kui selline teave on uuritava kemikaaliga tehtud varasematest korduvdoosi mürgisuse uuringutest juba olemas, ei pruugi vahepealsed surmamised olla teaduslikult põhjendatud. Uuringu tavaliselt 12 kuud kestva (punkt 34) kroonilise mürgisuse etapil kasutatavatest loomadest saadakse vahepealse surmamise andmed uuringu kantserogeensuse etapi jaoks, millega vähendatakse kasutatavate loomade üldarvu. Uuringu kroonilise mürgisuse etapil võidakse samuti kasutada satelliitrühmi, et jälgida uuritava kemikaali põhjustatud mis tahes toksikoloogiliste muutuste pöörduvust. Nende puhul võidakse piirduda uuringu suurima doositasemega ja kontrollrühmaga. Vajaduse korral võib uuringu vältel lisada haigusseisundi seireks täiendava kontroll-loomade rühma (tavaliselt viis looma kummastki soost) (30). Täpsemad suunised uuringu kavandamise kohta, et hõlmata vahepealsed surmamised, satelliitrühmade ja kontroll-loomade kasutamine, minimeerides samal ajal kasutatud loomade üldarvu, on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7).
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Kui uuringu kavas on satelliitloomi ja/või vahepealseid surmamisi, on igas vahepealseks surmamiseks ette nähtud doosirühmas tavaliselt kümme looma kummagi soo kohta, ja uuringus kasutatavate loomade üldarvu tuleks suurendada nende loomade arvu võrra, keda on kavas surmata enne uuringu lõppu. Vahepeal surmatavate ja satelliitloomade puhul tuleks üldiselt teha samad vaatlused, sh kehamassi ja sööda/vee tarbimise mõõtmised, hematoloogilised ja kliinilise biokeemia mõõtmised ning patoloogiauuringud, kui põhiuuringu kroonilise mürgisuse etapi loomade puhul, kuigi võib ka otsustada, et vahepealse surmamise rühmade puhul piirdutakse konkreetsete peamiste näitajate, näiteks neurotoksilisuse või immunotoksilisuse mõõtmisega.
                           
                        
                     Doosirühmad ja doseerimine
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Juhendid kõigi doosi valiku ja doositaseme intervallidega seotud asjaolude kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7). Tuleks kasutada vähemalt kolme doosimäära ja samaaegset kontrollrühma nii kroonilise mürgisuse kui ka kantserogeensuse etapil. Doositasemed põhinevad üldjuhul lühema ajavahemiku korduvdoosi või doosipiirkonna määramise katse tulemustel ja nende puhul tuleks arvesse võtta uuritava kemikaali või samalaadsete kemikaalide kohta olemasolevat toksikoloogia- ja toksikokineetikaalast teavet.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Uuringu kroonilise mürgisuse etapi puhul ei pruugita vajalikuks pidada kolme doositaset hõlmavat täielikku uuringut, kui võib eeldada, et katse tegemine ühel doositasemel, mis on võrdne vähemalt 1 000 mg kehakaalu kg kohta päevas, ei põhjusta tõenäoliselt kahjulikke mõjusid. See peaks põhinema eeluuringutest saadud teabel ja kaalutlusel, et mürgisust samalaadse struktuuriga ainete andmete alusel ei eeldata. Võib kasutada piirdoosi 1 000 mg kehakaalu kg kohta päevas, välja arvatud juhul, kui inimese võimalikku kokkupuudet arvestades on vaja kasutada suuremat doositaset.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Kui uuritava kemikaali füüsikalis-keemilised omadused või bioloogiline mõju seda ei piira, peaks suurim doositase olema valitud nii, et saaks määrata kindlaks peamised sihtorganid ja toksilise toime, põhjustamata siiski kannatusi, ägedat mürgisust, haigestumist või surma. Kõrgeim doositase tuleks üldjuhul valida mürgistusnähtude tekitamiseks, mis võib seisneda näiteks kehakaalu kasvu vähenemises (ligikaudu 10 %). Sellest hoolimata võidakse uuringu eesmärkidest olenevalt (vt punkt 6) valida suurim doos, mis jääb allapoole mürgisust tõendavat doosi, näiteks kui doos avaldab teatavat kahjulikku mõju, kuid siiski ei mõjuta eluiga ega kehakaalu.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Doositaseme ja doositasemete intervalli võib valida nii, et määrata kindlaks mõju sõltuvus doosist, ning, olenevalt uuritava kemikaali toimeviisist, täheldatava kahjuliku toimeta kontsentratsioon (NOAEL) või muu soovitud uuringutulemus, näiteks võrdlusdoos (BMD) (vt punkt 27). Asjaolud, mida tuleks väiksemate dooside valimisel arvesse võtta, on toime doosist sõltuvuse eeldatav tõus, doosid, mis võivad põhjustada olulisi metaboliseerimise muutusi või toksilisuse toimemehhanismi muutumist, kui eeldatakse läviväärtuse olemasolu, või mille puhul eeldatakse väikeste dooside ekstrapoleerimise lähtepunkti olemasolu. Kombineeritud kantserogeensuse – kroonilise mürgisuse uuringu tegemisel on peamine eesmärk saada teavet kantserogeensuse riski hindamise jaoks ja teave kroonilise mürgisuse kohta on üldjuhul lisaeesmärk. Seda tuleks uuringu jaoks doositasemete ja doositasemete intervalli valimisel silmas pidada.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Doositasemete vahemik sõltub uuringu eesmärkidest ja uuritava kemikaali omadustest ning seda ei saa käesoleva katsemeetodiga üksikasjalikult ette kirjutada, aga kahe- kuni neljakordne vahemik annab sageli häid katsetulemusi, kui seda kasutatakse alanevate doositasemete määramiseks, ning dooside vahel väga suure (näiteks rohkem kui kuue- kuni kümnekordse) vahemiku kasutamise asemel on sageli parem lisada neljas katserühm. Üldiselt tuleks vältida kümnest suurema kordaja kasutamist ja kui seda tehakse, tuleks seda põhjendada.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Nagu juhenddokumendis nr 116 (7) on selgitatud, tuleb doosi valimisel arvesse võtta järgmist:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          doosi-toime sõltuvuse teadaolev või oletatav mittelineaarsus või murdepunkt;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toksikokineetika ja doosipiirkonnad, mille puhul esineb metaboolne induktsioon, küllastumine või väliste ja sisemiste dooside vaheline mittelineaarsus või seda ei esine;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          eellasaine põhjustatud kahjustused, toimemarkerid või märgid sellest, et tuleb arvesse võtta peamiste bioloogiliste alusprotsesside toimumist;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          peamised (või oletatavad) toimeviisi asjaolud, näiteks annused, mille juures hakkab suurenema tsütotoksilisus, mõjutatakse hormoonitasemeid, homeostaasi säilitamise mehhanismid saavad üle koormatud jne;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          mõju doosist sõltuvuse kõvera piirkonnad, kus on vaja eriti usaldusväärset hinnangut, näiteks eeldatava võrdlusdoosi (BMD) vahemikus või oletatava läviväärtuse juures;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          inimeste kokkupuute eeldatava tasemega seotud kaalutlused, eriti keskmiste ja väiksemate dooside valimisel.
                                       
                                    
                        
                              28.
                           
                           
                              Kontrollrühm on rühm, kellega katseid ei tehta, või kandeaine kontrollrühm, kui uuritava kemikaali manustamisel kasutatakse kandeainet. Kontrollrühma loomi tuleks kohelda samamoodi kui katserühma loomi, välja arvatud uuritava kemikaali manustamine. Kui kasutatakse kandeainet, saab kontrollrühm kandeainet kõige suuremas koguses, mida kasutatakse doosirühmades. Kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga ja katseloomad söövad seda sööda halvema maitse tõttu oluliselt vähem, võib asjakohasema kontrollrühma tagamiseks olla sobiv täiendav kontrollrühm, kes saab samapalju sööta, kui doosirühmas ära süüakse.
                           
                        
                     Dooside ettevalmistamine ja uuritava kemikaali manustamine
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Uuritavat kemikaali manustatakse tavaliselt suu kaudu koos sööda või joogiveega või kurgusondiga. Lisateave manustamisteede ja -meetodite kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7). Manustamistee ja -meetod sõltub uuringu eesmärgist, uuritava kemikaali füüsikalistest ja keemilistest omadustest, biosaadavusest ning inimese uuritava kemikaaliga kokkupuutumise peamisest teest ja viisist. Manustamistee ja -meetodi valikut tuleks põhjendada. Loomade heaolu huvides tuleks suukaudne manustamine kurgusondiga üldiselt valida ainult selliste ainetega, mille puhul see manustamistee ja -meetod on põhjendatult sarnane inimese võimaliku kokkupuutega kemikaaliga (näiteks ravimid). Toidu- või keskkonnakemikaalide puhul, sh pestitsiidide puhul toimub manustamine tavaliselt sööda või joogivee kaudu. Mõne stsenaariumi puhul, näiteks kokkupuude töökohal, võib olla asjakohasem manustada kemikaali muul viisil.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav kemikaal sobivas kandeaines. Vastavalt vajadusele tuleks arvesse võtta järgmisi kandeaine ja muude lisandite omadusi: mõju uuritava aine imendumisele, jaotumisele, metaboliseerimisele või retentsioonile; mõju uuritava kemikaali keemilistele omadustele, mis võivad muuta selle toksilisi omadusi, ning mõjud sööda või vee tarbimisele või loomade toitumusele. Soovitatakse, et võimaluse korral tuleks kõigepealt kasutada vesilahust/-suspensiooni, seejärel õlilahust/-emulsiooni (nt maisiõli) ja siis lahustamist muudes kandeainetes. Muu kandeaine kui vee puhul tuleks teada kandeaine mürgiseid omadusi. Tuleks teada uuritava kemikaali stabiilsust ning doseerimislahuste või sööda (nagu on asjakohane) homogeensust manustamise tingimustes (näiteks söödaga).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Nende kemikaalide puhul, mida manustatakse sööda või joogiveega, on oluline tagada, et sisseantavad uuritava kemikaali kogused ei muudaks tavalist toitumise või joogivee tarbimise tasakaalu. Pikas mürgisuse uuringus, kus kemikaali manustatakse sööda kaudu, ei tohiks uuritava kemikaali kontsentratsioon söödas üldiselt olla suurem kui 5 % sööda üldkogusest, et vältida tasakaalustamata toitumist. Kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga, võib kasutada kas püsivat kontsentratsiooni söödas (mg sööda kg kohta või ppm) või püsivat doositaset looma kehamassi alusel (mg kehakaalu kg kohta), mis arvutatakse iga nädal. Tuleks täpsustada, millist võimalust kasutatakse.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Suukaudse manustamise korral manustatakse loomadele uuritavat kemikaali iga päev (seitse päeva nädalas) 12 kuu jooksul (kroonilise mürgisuse etapp) või 24 kuu jooksul (kantserogeensuse etapp), vt ka punktid 33 ja 34. Iga muu doseerimismeetodi, nt viis päeva nädalas, kasutamist tuleb põhjendada. Nahakaudse manustamise puhul töödeldakse loomi uuritava kemikaaliga tavaliselt 12 kuu jooksul (kroonilise mürgisuse etapp) vähemalt kuus tundi päevas seitse päeva nädalas, nagu on täpsustatud käesoleva lisa peatükis B.9 (11), või 24 kuu jooksul (kantserogeensuse etapp). Sissehingamise teel toimuv kokkupuude toimub kuus tundi päevas ja seitse päeva nädalas; võib kasutada ka kokkupuudet viiel päeval nädalas, kui see on põhjendatud. Kokkupuuteperiood on tavaliselt 12 kuud (kroonilise mürgisuse etapp) või 24 kuud (kantserogeensuse etapp). Kui ainult nina kaudu toimuvat kokkupuudet kasutatakse muu näriliseliigi kui roti korral, võib suurimat kokkupuute kestust kohandada, et minimeerida konkreetse kasutatava liigi isendite kannatusi. Kui päevas kasutatakse alla kuuetunnist kokkupuute kestust, tuleks seda põhjendada. Vt ka käesoleva lisa peatükk B.8 (9).
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Kui loomadele manustatakse uuritavat kemikaali sundsöötmisega, tuleks seda teha iga päev umbes samal kellaajal maosondi või sobiva intubatsioonikanüüli abil. Üldiselt manustatakse üks annus üks kord päevas; kui aga kemikaal on näiteks lokaalne ärritaja, võib igapäevase doosimäära säilitada, manustades jaotatud annust (kaks korda päevas). Suurim vedelikukogus, mida saab ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Kogus peaks olema nii väike kui praktiliselt võimalik ega tohiks üldjuhul näriliste puhul ületada 1 ml kehamassi 100 g kohta (31). Katses kasutatava mahu erinevusi tuleks vähendada miinimumini; püsiva mahu tagamiseks tuleks kõikidel doositasemetel kasutada erinevaid kontsentratsioone. Erandiks on võimaliku söövitava või ärritava mõjuga kemikaalid, mida tuleb tugeva paikse mõju vältimiseks lahjendada. Tuleks vältida katseid kontsentratsioonidel, mis tõenäoliselt võivad seedetrakti söövitada või ärritada.
                           
                        
                     Uuringu kestus
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Käesoleva uuringu kroonilise mürgisuse etapi annustamise ajavahemik ja kestus on tavaliselt 12 kuud, kuigi uuringu kava võimaldab teha ka lühemaid (näiteks kuus või üheksa kuud) või pikemaid (näiteks 18 või 24 kuud) uuringuid, olenevalt konkreetsetest eeskirjadest või teatavatest toimemehhanismiga seotud eesmärkidest. Kõrvalekaldeid 12-kuulisest kokkupuute kestusest tuleks põhjendada, eelkõige lühema kestuse puhul. Kõik kõnealusele etapile määratud doosirühmad surmatakse määratud ajal kroonilise mürgisuse ja uudismoodustistega mitteseotud patoloogia hindamiseks. Uuritava kemikaali põhjustatud toksikoloogiliste muutuste pöörduvuse jälgimiseks kasutatavaid satelliitrühmi tuleks pärast kokkupuute lõpetamist hoida ilma annustamiseta vähemalt neli nädalat ja mitte rohkem kui kolmandiku uuringu kogukestusest.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Kantserogeensuse uuringu kestus on näriliste puhul tavaliselt 24 kuud, mis moodustab suurema osa kasutatavate loomade tavalisest elueast. Võib kasutada lühemat või pikemat uuringu kestust, olenevalt uuringus kasutatava loomaliigi liini elueast, aga seda tuleks põhjendada. Konkreetsete hiireliinide puhul, näiteks liin AKR/J, C3H/J või C57BL/6J, võib asjakohasem olla 18kuuline kestus. Allpool on esitatud suunised uuringu kestuse ja lõpetamise ning ellujäämuse kohta; täpsemad suunised, sh uuringus ellujäämusega võrreldes negatiivse kantserogeensuse lubatavuse kaalumine, on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7).
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Kui väiksema doosi rühmade või kontrollrühma ellujäänute arv langeb alla 25 %, tuleks kaaluda uuringu lõpetamist.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Kui mürgistuse tõttu sureb enneaegselt ainult suure doosi rühm, ei tohiks selle pärast uuringut lõpetada.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Kummagi soo ellujäämust tuleks arvesse võtta eraldi.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Uuringut ei tohiks pikendada selle ajavahemikuni, kus uuringust saadavad andmed ei ole enam piisavad statistiliselt kehtivate hinnangute andmiseks.
                                       
                                    
                        VAATLUSED (KROONILISE MÜRGISUSE ETAPP)
                  
                              36.
                           
                           
                              Kõiki loomi tuleks haigestumise või suremise suhtes kontrollida, tavaliselt iga päeva alguses ja lõpus, sh nädalavahetustel ja pühadel. Vähemalt üks kord päevas tuleks teha üldine kliiniline läbivaatus, eelistatavalt igal päeval samal ajal / samadel aegadel, arvestades kunstliku manustamise puhul eeldatava mõju kõrgperioodi pärast doseerimist.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Kõik loomad tuleks üksikasjalikult kliiniliselt läbi vaadata vähemalt kord enne esimest kokkupuudet (et võimaldada iga katselooma seisundi muutumise võrdlusi), uuringu esimese nädala lõpus ja seejärel iga kuu. Vaatlused tuleks korraldada nii, et üksikute vaatlejate vahelised erinevused oleksid minimeeritud ega sõltuks katserühmast. Need vaatlused tuleks teha väljaspool puuri, eelistatavalt selleks ette nähtud kohas ja iga kord samal ajal. Tulemused tuleks hoolikalt üles märkida, kasutades selleks võimaluse korral katselabori selgelt kindlaks määratud hindamissüsteeme. Tuleks püüda tagada, et vaatlustingimuste varieeruvus oleks minimaalne. Üles tuleks märkida vähemalt järgmised tunnused: muutused nahal, karvastikus, silmades, limaskestal, eritiste esinemine ning autonoomsed muutused (nt pisaravool, turris karv, pupillide suurus, muutunud hingamine). Samuti tuleks üles märkida muutused kõnnakus, kehaasendis ja selles, kuidas loomad endaga ümberkäimisele reageerivad, kloonilised või toonilised liigutused, stereotüübid (nt ülemäärane karvastiku hooldamine, ringiratast keerlemine) või kummaline käitumine (nt enese vigastamine, tagurpidi liikumine) (32).
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Enne uuritava kemikaali esmakordset manustamist tuleks oftalmoskoobi või muu sobiva seadme abil teha kõikide loomade oftalmoloogiline kontroll. Pärast uuringu lõppu tuleks kõnealune kontroll teha eelistatavalt kõikidele loomadele, kuid vähemalt suure doosi rühma ja kontrollrühma loomadele. Kui silmades avastatakse muutusi, tuleb läbi vaadata kõik loomad. Kui struktuurianalüüs või muu teave viitab mürgisusele silmade suhtes, tuleks silmi kontrollida sagedamini.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Kui kemikaali varasem korduvannuse 28-päevane ja/või 90-päevane mürgisuse uuring näitas võimalikku neurotoksilist mõju, võib soovi korral enne uuringu algust ja kolmekuuliste ajavahemike järel pärast uuringu algust kuni 12 kuuni (kaasa arvatud) ning samuti uuringu lõpus (kui uuring kestab kauem kui 12 kuud) uurida sensoorset reageerimist erinevat tüüpi stiimulitele (32) (näiteks helilised, visuaalsed ja propriotseptiivsed stiimulid) (33, 34, 35), hinnata haardetugevust (36) ja motoorset tegevust (37). Võimalike meetodite täpsemad üksikasjad on esitatud vastavates viidetes. Siiski võib kasutada ka muid meetodeid kui need, millele viidatakse.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Sellise kemikaali puhul, mille varasem korduvannuse 28-päevane ja/või 90-päevane mürgisuse uuring näitas immunotoksilise mõju võimalikkust, võib soovi korral teha uuringu lõpul kõnealuse näitaja täiendavaid uuringuid.
                           
                        
                     Kehamass, sööda ja vee tarbimine ning söödakasutuse tõhusus
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Kõiki loomi tuleks kaaluda kemikaali manustamise alguses, vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala vältel ja seejärel vähemalt kord kuus. Sööda tarbimist ja söödakasutuse tõhusust tuleks mõõta vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala vältel ning seejärel vähemalt kord kuus. Kui uuritavat kemikaali manustatakse joogiveega, tuleks vee tarbimist mõõta vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala vältel ja seejärel vähemalt kord kuus. Joogivee tarbimise mõõtmisi tuleks kaaluda ka uuringute puhul, milles muutub loomade joomiskäitumine.
                           
                        
                     Hematoloogia ja kliiniline biokeemia
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Näriliste uuringutes tuleks hematoloogilised uuringud teha kõikidele katseloomadele (kümme isas- ja kümme emaslooma rühma kohta) kolme, kuue ja 12 kuu möödumisel ning samuti uuringu lõpus (kui uuring kestab kauem kui 12 kuud). Hiirte puhul võib kõikide nõutavate hematoloogiliste näitajate määramiseks minna vaja satelliitloomi (vt punkt 19). Muude loomade kui näriliste uurimisel võetakse proovid väiksemalt arvult loomadelt (koerte uurimisel näiteks neljalt loomalt kummagi soo ja iga rühma kohta) vahepealsetel proovivõtu aegadel ja uuringu lõpus, nagu on kirjeldatud näriliste puhul. Kui võrreldavate doositasemetega tehtud varasema 90-päevase uuringu vältel ei tuvastatud mõju hematoloogilistele parameetritele, ei ole kolme kuu möödumisel vaja mõõtmisi teha ei näriliste ega muude loomade puhul. Vereproovid tuleks võtta määratud kohast, näiteks otse südamest või retroorbitaalsest siinusest, kasutades tuimestust.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Tuleks uurida järgmisi parameetreid (38): leukotsüütide üldarv ja diferentseeritud leukotsüüdiarvud, erütrotsüütide arv, vereliistakute arv, hemoglobiini kontsentratsioon, hematokrit (rakkude protsent vere üldmahus), erütrotsüütide keskmine maht (MCV), hemoglobiini keskmine kogus erütrotsüüdis (MCH), hemoglobiini keskmine kontsentratsioon erütrotsüüdis (MCHC), protrombiiniaeg ja aktiveeritud osalise tromboplastiini aeg. Vajaduse korral võib mõõta muid hematoloogiaparameetreid, näiteks Heinzi kehakesi või muid atüüpilisi erütrotsüüdivorme või methemoglobiini, olenevalt uuritava kemikaali mürgisusest. Üldiselt tuleks kasutada paindlikku lähenemisviisi sõltuvalt konkreetse uuritava kemikaali puhul täheldatud ja/või eeldatavast mõjust. Kui uuritav kemikaal mõjutab vereloomesüsteemi, võib olla vajalik uurida samuti retikulotsüütide arvu ja luuüdi tsütoloogiat, kuigi need uuringud ei ole alati vajalikud.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Olulise kudesid kahjustava toksilise mõju ning eelkõige neerusid ja maksa kahjustava mõju uurimiseks tehakse kliinilise biokeemia analüüsid vereproovidega, mis on võetud kõikidelt katseloomadelt (kümnelt isas- ja kümnelt emasloomalt rühma kohta) samade ajavahemike järel, mis on ette nähtud hematoloogiliste uuringute puhul. Hiirte puhul võib kõikide nõutavate kliinilise biokeemia näitajate määramiseks minna vaja satelliitloomi. Muude loomade kui näriliste uurimisel võetakse proovid väiksemalt arvult loomadelt (koerte uurimisel näiteks neljalt loomalt kummagi soo ja iga rühma kohta) vahepealsetel proovivõtu aegadel ja uuringu lõpus, nagu on kirjeldatud näriliste puhul. Kui võrreldavate doositasemetega tehtud varasema 90-päevase uuringu vältel ei tuvastatud mõju kliinilise biokeemia parameetritele, ei ole kolme kuu möödumisel vaja mõõtmisi teha ei näriliste ega muude loomade puhul. Enne vereproovi võtmist on soovitatav loomi (v.a hiired) öö jooksul näljutada (10). Tuleks uurida järgmisi parameetreid (38): glükoos, karbamiid (karbamiidlämmastik), kreatiniin, üldvalk, albumiin, kaltsium, naatrium, kaalium, üldkolesterool, vähemalt kaks asjakohast hepatotsellulaarse hindamise katset (alaniinaminotransferaas, aspartaataminotransferaas, glutamaatdehüdrogenaas, sapphapete kogusisaldus) (39) ja vähemalt kaks asjakohast hepatobiliaarse hindamise katset (aluseline fosfataas, γ-glutamüültransferaas, 5’-nukleotidaas, üldbilirubiini, sapphapete kogusisaldus) (39). Muid kliinilisi keemilisi parameetreid, näiteks triglütseriide paastutingimustes, teatavaid hormoone ja koliinesteraasi võib mõõta vastavalt vajadusele, olenevalt uuritava kemikaali mürgisusest. Üldiselt on vaja paindlikku lähenemisviisi sõltuvalt uuritava kemikaali täheldatud ja/või oletatavast mõjust.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Uriinianalüüsi näitajad tuleks määrata kõikidel katseloomadel (kümnel isas- ja kümnel emasloomal rühma kohta) proovidest, mis on kogutud samade vahemikega kui hematoloogia- ja kliinilise keemia proovid. Kui võrreldavate doositasemetega tehtud varasema 90-päevase uuringu ajal ei leitud uriinianalüüsil mingit mõju, ei ole kolme kuu möödumisel vaja mõõtmisi teha. Kliinilise patoloogia uuringute eksperdi soovituse (38) kohaselt tuleks määrata järgmised parameetrid: välimus, ruumala, osmolaalsus või suhteline tihedus, pH, üldvalk ja glükoos. Lisaks võib määrata ketoone, urobilinogeeni, bilirubiini ja peitverd. Kui täheldatud mõju on vaja laialdasemalt uurida, võib vajaduse korral määrata täiendavaid näitajaid.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Üldiselt arvatakse, et hematoloogiliste ja kliinilise biokeemia näitajate lähteväärtused on vaja enne kemikaali manustamist määrata koertega tehtavate uuringute puhul, kuid närilistega tehtavate uuringute puhul neid määrata vaja ei ole (38). Kui varem määratud lähteväärtused (vt punkt 58) ei ole õiged, tuleks kaaluda selliste väärtuste määramist.
                           
                        PATOLOOGIA
                  
                     Täielik lahkamine
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Kõik uuringus kasutatud loomad läbivad tavaliselt täieliku, põhjaliku lahkamise, milles uuritakse põhjalikult keha välispinda, kõiki avasid, kolju-, rinna- ja kõhuõõnt ja nende sisaldist. Siiski võib ka ette näha, et mõõtmised piirduvad (vahepeal surmatud või satelliitrühma loomade puhul) kõige olulisemate, näiteks neurotoksilisuse või immunotoksilisuse näitajate määramisega (vt punkt 21). Selliseid loomi ei ole vaja lahata ja nendega teha järgmistes punktides kirjeldatud protseduure. Kontroll-loomade puhul võib uuringu juht konkreetsel juhul otsustada, kas lahkamine on vajalik.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Kõikide loomade puhul, v.a loomad, kellele on tehtud erand punkti 47 viimases osas, tuleks määrata organite mass. Kõigi loomade (välja arvatud loomad, kes leitakse suremas ja/või surmatakse uuringu kestel) neerupealised, aju, munandimanused, süda, neerud, maks, munasarjad, põrn, munandid, kilpnääre (mis kaalutakse pärast fikseerimist koos kõrvalkilpnäärmetega) ja emakas tuleks puhastada kõigist nende küljes olevatest kudedest, nagu on asjakohane, ja kaaluda märjalt võimalikult kiiresti pärast lahkamist, et vältida organite kuivamist.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Järgmisi kudesid tuleks hoida koetüübi ja kavandatava histopatoloogilise uuringu (vt punkt 40) seisukohast kõige sobivamas fikseerimiskeskkonnas (kandilistes sulgudes esitatud organite uuring ei ole kohustuslik):
                              
                                          Kõik silmaga nähtavad kahjustused
                                       
                                       
                                          Süda
                                       
                                       
                                          Kõhunääre
                                       
                                       
                                          Magu (eesmagu, mao näärmeline osa)
                                       
                                    
                                          Neerupealis
                                       
                                       
                                          Niudesool
                                       
                                       
                                          Kõrvalkilpnääre
                                       
                                       
                                          [Hambad]
                                       
                                    
                                          Aort
                                       
                                       
                                          Tühisool
                                       
                                       
                                          Perifeerne närv
                                       
                                       
                                          Munandid
                                       
                                    
                                          Aju (sh suuraju osad, väikeaju ning piklikaju/sild)
                                       
                                       
                                          Neerud
                                       
                                       
                                          Ajuripats
                                       
                                       
                                          Harknääre
                                       
                                    
                                          Umbsool
                                       
                                       
                                          Pisaranääre (eksorbitaalne)
                                       
                                       
                                          Eesnääre
                                       
                                       
                                          Kilpnääre
                                       
                                    
                                          Emakakael
                                       
                                       
                                          Maks
                                       
                                       
                                          Pärasool
                                       
                                       
                                          [Keel]
                                       
                                    
                                          Koagulatsiooninääre
                                       
                                       
                                          Kops
                                       
                                       
                                          Süljenääre
                                       
                                       
                                          Hingetoru
                                       
                                    
                                          Käärsool
                                       
                                       
                                          Lümfisõlmed (nii pealispinnalt kui ka sügavalt)
                                       
                                       
                                          Seemnepõiekesed
                                       
                                       
                                          Kusepõis
                                       
                                    
                                          Kaksteistsõrmiksool
                                       
                                       
                                          Piimanääre (kohustuslik emaste puhul ja kui see on nähtavalt lõigatav, siis isaste puhul)
                                       
                                       
                                          Skeletilihas
                                       
                                       
                                          Emakas (sh emakakael)
                                       
                                    
                                          Munandimanus
                                       
                                       
                                          [Ülemised hingamisteed, sh nina, ninakarbikud ja nina kõrvalkoopad]
                                       
                                       
                                          Nahk
                                       
                                       
                                          [Kusejuha]
                                       
                                    
                                          Silm (sh võrkkest)
                                       
                                       
                                          Söögitoru
                                       
                                       
                                          Seljaaju (kolmel tasandil: kaela-, rinna- ja nimmepiirkond)
                                       
                                       
                                          [Kusiti]
                                       
                                    
                                          [Reieluu koos liigesega]
                                       
                                       
                                          [Haistmissibul]
                                       
                                       
                                          Põrn
                                       
                                       
                                          Tupp
                                       
                                    
                                          Sapipõis (muud liigid kui rott)
                                       
                                       
                                          Munasarjad
                                       
                                       
                                          [Rinnak]
                                       
                                       
                                          Luuüdi lõige ja/või värske luuüdi aspiraat
                                       
                                    
                                          Harderi nääre
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    Paarisorganite puhul (näiteks neerud, neerupealised) tuleks säilitada mõlemad organid. Kliinilised ja muud leiud võivad osutada vajadusele uurida ka muid kudesid. Säilitada tuleks ka muud organid, mis uuritava kemikaali teadaolevatest omadustest tulenevalt võivad tõenäoliselt olla sihtorganid. Nahakaudse manustamise uuringute puhul tuleks uurida neid organeid, mis on ette nähtud suukaudse manustamise puhul, ning väga vajalik on manustamiskohast nahaproovide võtmine ja säilitamine. Inhalatsiooniuuringute korral tuleks hingamisteedest säilitatavate ja uuritavate kudede puhul järgida käesoleva lisa peatükkide B.8 (9) ja B.29 (10) soovitusi. Muude organite/kudede puhul (ja lisaks hingamisteedest pärit konkreetselt säilitatavatele kudedele) tuleks järgida suukaudse manustamise puhul esitatud organite nimekirja.
                           
                        
                     Histopatoloogia
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              On avaldatud juhendid toksikoloogilise patoloogia uuringute tegemise parimate tavade kohta (40). Tuleb teha vähemalt järgmised histopatoloogilised uuringud:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          suure annuse ja kontrollrühmade loomade kõik koed;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          uuringu vältel surnud või surmatud loomade kõik koed;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kõik koed, milles täheldatakse makroskoopilisi anomaaliaid;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          sihtkoed või koed, mille puhul suure annuse rühmas on näha kokkupuutest tingitud muutusi, kõikidelt suure annuse rühmade loomadelt;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          paarisorganite puhul (näiteks neerud, neerupealised) tuleks uurida mõlemat organit.
                                       
                                    
                        VAATLUSED (KANTSEROGEENSUSE FAAS)
                  
                              51.
                           
                           
                              Kõiki loomi tuleks haigestumise või suremise suhtes kontrollida, tavaliselt iga päeva alguses ja lõpus, sh nädalavahetustel ja pühadel. Loomi tuleks samuti kord päevas kontrollida toksikoloogiliselt oluliste nähtude suhtes. Sundtoitmisega uuringute puhul tuleks loomi kontrollida vahetult doosi manustamisele järgneval ajavahemikul. Erilist tähelepanu tuleks pöörata kasvajate tekkimisele; iga nähtava või palpeeritava tuumori kohta tuleb märkida ilmumise aeg, paiknemine, mõõtmed, välimus ja areng.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Kõiki loomi tuleks kaaluda kemikaali manustamise alguses, vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala vältel ja seejärel vähemalt kord kuus. Sööda tarbimist ja söödakasutuse tõhusust tuleks mõõta vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala vältel ning seejärel vähemalt kord kuus. Kui uuritavat kemikaali manustatakse joogiveega, tuleks vee tarbimist mõõta vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala vältel ja seejärel vähemalt kord kuus. Joogivee tarbimise mõõtmisi tuleks kaaluda ka uuringute puhul, milles muutub loomade joomiskäitumine.
                           
                        
                     Hematoloogilised, kliinilise biokeemia ja muud mõõtmised
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Uuringust saadava teabe, eelkõige toimeviisiga seotud teabe maksimeerimiseks tuleks uuringu juhi äranägemise järgi võtta hematoloogiliste ja kliinilise biokeemia analüüside jaoks vereproove. Samuti võib olla asjakohane uriinianalüüsi tegemine. Kõnealuste parameetrite kohta saab teavet kroonilise mürgisuse etapis, mille kestus on tavaliselt 12 kuud (punkt 34), kasutatud loomade andmetest. Täpsemad juhendid kantserogeensuse uuringu käigus kõnealuste proovide võtmise väärtuse kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7). Kui vereproovid võetakse, tuleb seda teha katseperioodi lõpus vahetult enne loomade tapmist või selle käigus. Vereproovid tuleks võtta määratud kohast, näiteks otse südamest või retroorbitaalsest siinusest, kasutades tuimestust. Uurimiseks võib samuti valmistada vere äigepreparaadid, eelkõige juhul, kui luuüdi näib olevat sihtorgan, kuigi kantserogeensuse etapil vere äigepreparaatide uurimise väärtus kantserogeense/onkogeense mõju hindamiseks on küsitav (38).
                           
                        PATOLOOGIA
                  
                     Täielik lahkamine
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              Kõik uuringus kasutatud loomad, v.a kontroll-loomad (vt punkt 20) ja muud satelliitrühma loomad, läbivad täieliku, põhjaliku lahkamise, milles uuritakse põhjalikult keha välispinda, kõiki avasid, kolju-, rinna- ja kõhuõõnt ja nende sisaldist. Kontroll-loomade ja muude satelliitrühma loomade puhul võib uuringu juht konkreetsel juhul otsustada, kas lahkamine on vajalik. Organite massi kantserogeensuse uuringutes tavaliselt ei määrata, kuna geriaatrilised muutused ja hilisematel etappidel kasvajate areng piirab organite massi andmete kasulikkust. Kõnealused andmed võivad siiski olla üliolulised tõendusmaterjali kaalukuse hindamisel ja eelkõige toimeviisi hindamisel. Kui satelliituuringus seda määratakse, tuleks kõnealused andmed koguda hiljemalt aasta möödumisel uuringu algusest.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Järgmisi kudesid tuleks hoida koetüübi ja kavandatava histopatoloogilise uuringu (vt punkt 40) seisukohast kõige sobivamas fikseerimiskeskkonnas (kandilistes sulgudes esitatud organite uuring ei ole kohustuslik):
                              
                                          Kõik silmaga nähtavad kahjustused
                                       
                                       
                                          Süda
                                       
                                       
                                          Kõhunääre
                                       
                                       
                                          Magu (eesmagu, mao näärmeline osa)
                                       
                                    
                                          Neerupealis
                                       
                                       
                                          Niudesool
                                       
                                       
                                          Kõrvalkilpnääre
                                       
                                       
                                          [Hambad]
                                       
                                    
                                          Aort
                                       
                                       
                                          Tühisool
                                       
                                       
                                          Perifeerne närv
                                       
                                       
                                          Munandid
                                       
                                    
                                          Aju (sh suuraju osad, väikeaju ning piklikaju/sild)
                                       
                                       
                                          Neerud
                                       
                                       
                                          Ajuripats
                                       
                                       
                                          Harknääre
                                       
                                    
                                          Umbsool
                                       
                                       
                                          Pisaranääre (eksorbitaalne)
                                       
                                       
                                          Eesnääre
                                       
                                       
                                          Kilpnääre
                                       
                                    
                                          Emakakael
                                       
                                       
                                          Maks
                                       
                                       
                                          Pärasool
                                       
                                       
                                          [Keel]
                                       
                                    
                                          Koagulatsiooninääre
                                       
                                       
                                          Kops
                                       
                                       
                                          Süljenääre
                                       
                                       
                                          Hingetoru
                                       
                                    
                                          Käärsool
                                       
                                       
                                          Lümfisõlmed (nii pealispinnalt kui ka sügavalt)
                                       
                                       
                                          Seemnepõiekesed
                                       
                                       
                                          Kusepõis
                                       
                                    
                                          Kaksteistsõrmiksool
                                       
                                       
                                          Piimanääre (kohustuslik emaste puhul ja kui see on nähtavalt lõigatav, siis isaste puhul)
                                       
                                       
                                          Skeletilihas
                                       
                                       
                                          Emakas (sh emakakael)
                                       
                                    
                                          Munandimanus
                                       
                                       
                                          [Ülemised hingamisteed, sh nina, ninakarbikud ja nina kõrvalkoopad]
                                       
                                       
                                          Nahk
                                       
                                       
                                          [Kusejuha]
                                       
                                    
                                          Silm (sh võrkkest)
                                       
                                       
                                          Söögitoru
                                       
                                       
                                          Seljaaju (kolmel tasandil: kaela-, rinna- ja nimmepiirkond)
                                       
                                       
                                          [Kusiti]
                                       
                                    
                                          [Reieluu koos liigesega]
                                       
                                       
                                          [Haistmissibul]
                                       
                                       
                                          Põrn
                                       
                                       
                                          Tupp
                                       
                                    
                                          Sapipõis (muud liigid kui rott)
                                       
                                       
                                          Munasarjad
                                       
                                       
                                          [Rinnak]
                                       
                                       
                                          Luuüdi lõige ja/või värske luuüdi aspiraat
                                       
                                    
                                          Harderi nääre
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    Paarisorganite puhul (näiteks neerud, neerupealised) tuleks säilitada mõlemad organid. Kliinilised ja muud leiud võivad osutada vajadusele uurida ka muid kudesid. Säilitada tuleks ka muud organid, mis uuritava kemikaali teadaolevatest omadustest tulenevalt võivad tõenäoliselt olla sihtorganid. Nahakaudse manustamise uuringute puhul tuleks uurida neid organeid, mis on ette nähtud suukaudse manustamise puhul, ning väga vajalik on manustamiskohast nahaproovide võtmine ja säilitamine. Inhalatsiooniuuringute korral tuleks hingamisteedest säilitatavate ja uuritavate kudede puhul järgida käesoleva lisa peatükkide B.8 (8) ja B.29 (9) soovitusi. Muude organite/kudede puhul (ja lisaks hingamisteedest pärit konkreetselt säilitatavatele kudedele) tuleks järgida suukaudse manustamise puhul esitatud organite nimekirja.
                           
                        
                     Histopatoloogia
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              On avaldatud juhendid toksikoloogilise patoloogia uuringute tegemise parimate tavade kohta (40). Tuleb teha vähemalt järgmised histopatoloogilised uuringud:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          suure annuse ja kontrollrühma loomade kõik koed;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          uuringu vältel surnud või surmatud loomade kõik koed;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kõik koed, milles täheldatakse makroskoopilisi anomaaliaid, kaasa arvatud kasvajad;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kui suure doosi rühmas täheldatakse uuritava kemikaaliga kokkupuutest tingitud histopatoloogilisi muutusi, kontrollitakse kõikide muude doosirühmade loomadel samu kudesid;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          paarisorganite puhul (näiteks neerud, neerupealised) tuleks uurida mõlemat organit.
                                       
                                    
                        ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE (KANTSEROGEENSUS JA KROONILINE MÜRGISUS)
                  
                     Andmed
                  
                  
                              57.
                           
                           
                              Kõigi hinnatavate parameetrite kohta tuleks esitada iga looma andmed. Lisaks sellele tuleks kõik andmed koondada tabelisse, milles oleks iga katserühma kohta märgitud loomade arv katse alguses, katse ajal surnud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arv, mürgistusnähtudega loomade arv, täheldatud mürgistusnähtude kirjeldus, sealhulgas mürgise toime ilmnemine, kestus, raskusaste, kahjustustega loomade arv, kahjustuste liik ja iga liiki kahjustuse kohta nende loomade protsent, kellel seda esines. Kokkuvõtlikes tabelites tuleks esitada (pidevalt mõõdetud katseandmete puhul) nende loomade keskmised ja standardhälbed, kellel täheldati mürgisuse mõju või kahjustusi, lisaks kahjustuse raskusastme määramisele.
                           
                        
                              58.
                           
                           
                              Varasemad kontrolli andmed võivad aidata uuringu tulemusi tõlgendada, näiteks kui samaaegse kontrolli andmed erinevad oluliselt sama katsekorralduse juures kontrollrühma loomadelt saadud hiljutistest andmetest. Hindamiseks võetud varasemad kontrolli andmed peaksid pärinema samast laborist, olema saadud sama vanuserühma ja sama liini loomadega ning olema kogutud kõnealusele uuringule eelneva viie aasta jooksul.
                           
                        
                              59.
                           
                           
                              Võimaluse korral tuleks numbrilisi tulemusi hinnata asjakohase ja üldiselt tunnustatud statistilise meetodiga. Statistilised meetodid ja analüüsitavad andmed tuleks valida uuringu kavandamise etapis (punkt 9). Sellisel valimisel tuleks vajaduse korral ette näha, et tulemusi tuleb kohandada ellujäämise määra arvestamiseks.
                           
                        
                              60.
                           
                           
                              Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uuritav kemikaal:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      füüsikaline olemus, puhtus ja füüsikalis-keemilised omadused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tunnusandmed;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kemikaali päritolu;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      partii number;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      keemilise analüüsi sertifikaat.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Kandeaine (vajaduse korral):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kandeaine valimise põhjendus (kui kandeaine on muu kui vesi).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katseloomad:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kasutatud liik/liin ja selle valimise põhjendus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      loomade arv, vanus ja sugu katse alguses;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      päritolu, pidamistingimused, söötmine jne;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      iga looma kaal katse alguses.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katsetingimused:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      manustamistee ja annuse valiku põhjendus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kui see on kohaldatav, siis andmete analüüsimiseks valitud statistilised meetodid;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      andmed uuritava kemikaali preparaadi/sööda valmistamise kohta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analüüsiandmed preparaadis saavutatud kontsentratsiooni, preparaadi stabiilsuse ja homogeensuse kohta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      manustamistee ja uuritava kemikaali manustamise üksikasjad;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inhalatsiooniuuringute puhul: kas manustamine toimub ainult nina või kogu keha kaudu;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tegelik doos (mg kehakaalu kg kohta päevas) ja vajaduse korral ümberarvestustegur söödas või joogivees oleva uuritava kemikaali kontsentratsiooni (mg/kg või ppm) ja tegeliku doosi vahel;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemused (tuleks esitada kokkuvõtlikud tabelandmed ja andmed eraldi iga looma kohta)
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Üldosa:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ellujäämuse andmed;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kehamass / kehamassi muutused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sööda tarbimine, söödakasutuse tõhususe arvutused (kui need tehti) ja vee tarbimine (kui on kohaldatav);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toksiko-kineetilised andmed võimaluse korral;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oftalmoskoopia võimaluse korral;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematoloogia andmed võimaluse korral;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kliinilise keemia andmed võimaluse korral.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Kliinilised leiud:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toksilisuse tunnused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      iga anomaalia esinemissagedus (ja kui määrati, siis raskusaste);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kliiniliste ilmingute laad, raskus ja kestus (sõltuvalt sellest, kas ilmingud on ajutised või püsivad).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Lahanguandmed:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kehamass surmamisel;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      organite mass (ja kui võimalik, siis organi massi / kehamassi suhe);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      lahkamise leiud; anomaaliate esinemissagedus ja raskusaste.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Histopatoloogia:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uudismoodustistega mitteseotud histopatoloogilised leiud;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uudismoodustistega seotud histopatoloogilised leiud;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      korrelatsioon makroskoopiliste ja mikroskoopiliste leidude vahel;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kõigi kemikaaliga kokkupuutest tingitud histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus koos raskusastme hindamisega;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aruanne mikroskoobipreparaatide võimalike vastastikuste hindamiste kohta.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Vajaduse korral tulemuste statistiline töötlus.
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemuste arutelu:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      võimaliku modelleerimislähenemisviisi arutelu;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toime sõltuvus doosist;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      varasemad kontrolli andmed;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      võimalikku toimeviisi käsitleva teabe analüüsimine;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      võrdlusdoosi (BMD), täheldatava kahjuliku toimeta doosi (NOAEL) või vähima täheldatava kahjuliku toimega doosi (LOAEL) kindlaksmääramine;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      asjakohasus inimeste puhul.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Järeldused
                                          
                                       
                                    
                        
                     KIRJANDUS
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145–191.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.27 „Korduvdoosi suukaudse mürgisuse 90-päevane uuring mittenäriliste puhul”.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.8 „Subakuutne mürgisus sissehingamisel: 28-päevane uuring”.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.29 „Subkrooniline mürgisus sissehingamisel: 90-päevane uuring”.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.9 „Kordusdoosi mürgisus (28 päeva, nahakaudne)”.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793–801.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581–589.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51–56.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591–653.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1–7.
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Crit. Rev. Toxicol. 36: 9–35.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 37–68.
                           
                        
                              19)
                           
                           
                              Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69–98.
                           
                        
                              20)
                           
                           
                              OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
                           
                        
                              21)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              22)
                           
                           
                              Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837.
                           
                        
                              23)
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              24)
                           
                           
                              Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1):214.
                           
                        
                              25)
                           
                           
                              Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279–284.
                           
                        
                              26)
                           
                           
                              Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect 105:1196–1203.
                           
                        
                              27)
                           
                           
                              Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiiv 2010/63/EL, 22. september 2010, teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitse kohta (ELT L 276, 20.10.2010, lk 33).
                           
                        
                              28)
                           
                           
                              National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86–23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              29)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-06-9.
                           
                        
                              30)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              31)
                           
                           
                              Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology, 21:15–23.
                           
                        
                              32)
                           
                           
                              IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
                           
                        
                              33)
                           
                           
                              Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.
                           
                        
                              34)
                           
                           
                              Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691–704.
                           
                        
                              35)
                           
                           
                              Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.
                           
                        
                              36)
                           
                           
                              Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.
                           
                        
                              37)
                           
                           
                              Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609.
                           
                        
                              38)
                           
                           
                              Weingand K, Brown G, Hall R et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198–201.
                           
                        
                              39)
                           
                           
                              EMEA (draft) document „Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity’ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).
                           
                        
                              40)
                           
                           
                              Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131.
                           
                        
                     1. liide
                     MÕISTE
                     Uuritav kemikaal– iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                  ”
            
                  7)
               
               
                  Peatükk B.36 asendatakse järgmisega:
                  „B.36.   TOKSIKOKINEETIKA
                  
                  SISSEJUHATUS
                  
                              1.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 417 (2010). Uuritava kemikaali toksikokineetika uuringud tehakse selleks, et saada tõest teavet kemikaali imendumise, jaotumise, biotransformatsiooni (metaboliseerimise) ja väljutamise kohta, et aidata kaasa kontsentratsiooni või doosi seostamisele täheldatud mürgisusega ning aidata mõista selle mürgisuse mehhanismi. Toksikokineetika võib aidata mõista toksikoloogiauuringuid, kuna sel viisil näidatakse, et katseloomad puutuvad uuritava kemikaaliga kokku süsteemselt, ning selgitatakse välja, millised struktuuriühikud (lähtekemikaal/metaboliidid) ringlevad katselooma organismis. Kõnealustest uuringutest saadavad toksikokineetika põhiparameetrid annavad teavet ka uuritava kemikaali võimaliku akumulatsiooni kohta kudedesse ja/või organitesse ning uuritava kemikaaliga kokkupuute tõttu võimaliku biotransformatsiooni põhjustamise kohta.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Toksikokineetika andmed võivad aidata hinnata, kuivõrd adekvaatne ja asjakohane on ekstrapoleerida loomadel avalduva mürgisuse andmeid inimestega seotud ohtude ja/või riskide hindamisele. Lisaks sellele võivad toksiko-kineetilised uuringud anda kasulikku teavet mürgisuse uuringute doositasemete (lineaarne vs. mittelineaarne kineetika), manustamistee mõju ja biokättesaadavuse kindlakstegemiseks ning uuringu kavandamise küsimuste lahendamiseks. Teatavat tüüpi toksikokineetika andmeid on võimalik kasutada füsioloogial põhineva toksikokineetika (PBTK) mudeli arendamiseks.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Metaboliitide/toksikokineetika andmetel on tähtsaid kasutusvaldkondi, näiteks aitavad need ennustada kemikaalide võimalikku mürgisust ja toimeviisi ning mõista mürgisuse ja toimeviisi seoseid doositaseme ja kokkupuutumisteega. Lisaks sellele võib kemikaalide metaboliseerumise andmetest saada teavet, mis aitab hinnata uuritava kemikaali eksogeenselt tekkinud/valmistatud metaboliitidega kokkupuute toksikoloogilist tähtsust.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Head toksiko-kineetilised andmed aitavad teha järeldusi, kuivõrd usaldusväärsed ja kasutatavad on kemikaalide ohutuse hindamisel kvantitatiivsed struktuuri-aktiivsuse sõltuvused, analoogmeetod ja grupeerimismeetod. Kineetika andmeid võib kasutada ka muude uuringute (näiteks in vivo / in vitro) toksikoloogilise asjakohasuse hindamiseks.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Kui ei ole nimetatud muud manustamisteed (vt eelkõige punktid 74–78), kasutatakse käesolevat katsemeetodit uuritava kemikaali suukaudse manustamise puhul.
                           
                        LÄHTEKAALUTLUSED
                  
                              6.
                           
                           
                              Õigussüsteemides on eri kemikaaliklasside (näiteks pestitsiidid, biotsiidid, tööstuskemikaalid) toksikokineetika näitajate ja parameetrite mõõtmisega seoses sätestatud erinevad nõuded ja vajadused. Erinevalt enamikust katsemeetoditest kirjeldatakse käesolevas katsemeetodis toksikokineetika katseid, mis hõlmavad mitmeid mõõtmisi ja näitajaid. Tulevikus töötatakse arvatavasti välja mitu uut katsemeetodit ja/või juhenddokumenti, et kirjeldada eraldi ja täpsemalt iga näitajat. Käesoleva katsemeetodi puhul määratakse tehtavad katsed või hindamised kindlaks iga õigussüsteemi nõuete ja/või vajadustega.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Regulatiivseks otstarbeks võib uuritava kemikaali toksiko-kineetilist käitumist hinnata paljude uuringutega. Kõik kõnealused võimalikud uuringud ei pruugi uuritava kemikaali hindamiseks olla siiski vajalikud, kõik oleneb konkreetsetest regulatiivsetest vajadustest või olukorrast. Toksiko-kineetiliste uuringute kavandamiseks on vaja paindlikkust ja uuritava kemikaali omaduste arvestamist. Mõnikord tuleb uurida ainult teatavaid küsimusi, et teha kindlaks uuritava kemikaaliga seotud ohud ja riskid. Mõnikord võib toksiko-kineetilisi andmeid koguda muus toksikoloogiauuringus kemikaali hindamise osana. Muus olukorras võivad olla vajalikud ulatuslikud täiendavad toksiko-kineetilised uuringud, kui selleks on regulatiivne vajadus või tekib uuritava kemikaali hindamisel uusi küsimusi.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Enne käesoleva katsemeetodi kohase katse tegemist peaks uurimislabor läbi vaatama kogu olemasoleva teabe uuritava kemikaali ja asjakohaste metaboliitide ning analoogide kohta, et parandada uuringu kvaliteeti ja vältida loomade tarbetut kasutamist. See võib hõlmata muude asjakohaste katsemeetodite andmete kasutamist (in vivo uuringud, in vitro uuringud ja/või in silico hindamised). Füüsikalis-keemilised omadused, näiteks kemikaali jaotustegur süsteemis oktanool-vesi (log POW), pKa, lahustuvus vees, aururõhk ja molekulmass võivad olla kasulikud uuringu planeerimisel ning tulemuste tõlgendamisel. Need on võimalik kindlaks määrata sobivate meetodite abil, nagu on kirjeldatud asjakohastes katsemeetodites.
                           
                        PIIRANGUD
                  
                              9.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod ei ole ette nähtud tegelemiseks eriolukordadega (näiteks tiined või poegi imetavad loomad ja noorloomad) või võimalike jääkide hindamiseks kemikaalidega kokku puutunud loomades, keda inimene tarbib toiduks. Katsemeetodi B.36 kohase uuringu andmed võivad siiski anda taustteavet, mis aitab kavandada eriuuringuid selliste küsimuste lahendamiseks. Käesolev katsemeetod ei ole ette nähtud nanomaterjalide katsetamiseks. OECD katsejuhendite esialgse läbivaatamise aruandes, milles käsitletakse nende kohaldatavust nanomaterjalide uurimisele, on märgitud, et katsejuhend nr 417 (mis on samaväärne käesoleva katsemeetodiga B.36) ei pruugi olla kohaldatav nanomaterjalide uurimisele (1).
                           
                        MÕISTED
                  
                              10.
                           
                           
                              Käesolevas katsemeetodis kasutatud mõisted on esitatud liites.
                           
                        LOOMADE HEAOLU KAALUTLUSED
                  
                              11.
                           
                           
                              Suunised loomade humaanse kohtlemise kohta on esitatud OECD juhenddokumendis nr 19 (2). OECD juhenddokumenti nr 19 soovitatakse kasutada kõigi käesolevas katsemeetodis kirjeldatud in vivo ja in vitro uuringute puhul.
                           
                        MEETODITE KIRJELDUS
                  
                     Prooviuuringud
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Soovitatakse kasutada prooviuuringuid, et valida toksiko-kineetilistel uuringutel jälgitavad parameetrid (näiteks kemikaali metaboliseerimine, massibilanss, analüüside tegemine, dooside valimine, CO2 väljahingamine jne). Mõnda kõnealustest parameetritest saab määrata ka ilma radiomärgistatud kemikaali kasutamata.
                           
                        
                     Loomade valimine
                  
                  
                     Liik
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Toksikokineetika katsetes kasutatav loomaliik (ja liin) peaks eelistatavalt olema sama kui asjakohase uuritava kemikaaliga tehtud muudes toksikoloogilistes uuringutes. Üldiselt tuleks kasutada rotti, kuna seda liiki on toksikoloogilistes uuringutes palju kasutatud. Muu või täiendava liigi kasutamine võib olla põhjendatud, kui asjakohased toksikoloogilised uuringud näitavad märkimisväärset mürgisust kõnealuse liigi suhtes või kui mürgisus kõnealuse liigi suhtes või liigi isenditel avalduv toksikokineetika on näidatud olevat inimeste jaoks asjakohasem. Loomaliigi ja liini valikut tuleks põhjendada.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Kui ei ole öeldud teisiti, viidatakse käesolevas katsemeetodis katseliigina rotile. Muu katseliigi kasutamise korral võib meetodi teatavaid aspekte muuta.
                           
                        
                     Vanus ja liin
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Tuleks kasutada noori terveid täiskasvanud loomi, kes on annustamise ajal tavaliselt 6–12 nädala vanused (vt ka punktid 13 ja 14). Muude kui noorte täiskasvanud loomade kasutamise korral tuleks seda põhjendada. Kõik loomad peaksid uuringu alguses olema sarnases vanuses. Üksiku looma kehamass ei tohiks erineda rohkem kui ±20% katserühma keskmisest kehamassist. Kõige parem oleks kasutada sama liini, mida kasutati uuritava kemikaali toksikoloogilise andmebaasi koostamisel.
                           
                        
                     Loomade arv ja sugu
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Iga uuritava doosi korral tuleks kasutada vähemalt nelja samast soost looma. Kasutatud loomade soo valikut tuleks põhjendada. Kui on tõendeid, et kummagi soo puhul avaldub mürgisus erinevalt, tuleks kaaluda mõlema soo kasutamist (neli isas- ja neli emaslooma).
                           
                        
                     Pidamis- ja söötmistingimused
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Loomi tuleks katse ajal üldjuhul eraldi pidada. Eriolukorras võib olla põhjendatud rühmas pidamine. Valgustus peaks olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Katseloomade pidamise ruumi temperatuur peaks olema 22 °C (±3 °C) ja suhteline õhuniiskus 30–70 %. Söötmisel võib kasutada tavapärast labori söödavalikut; joogivee kogust ei piirata.
                           
                        
                     Uuritav kemikaal
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Uuringu kõigi massibilansi ja metaboliitide tuvastamise andmete saamiseks tuleks kasutada 14C abil radiomärgistatud uuritavat kemikaali. Kui on aga võimalik tõendada, et
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          massibilanssi ja metaboliite on võimalik õigesti hinnata märgistamata uuritava kemikaaliga,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          mitteradioaktiivse uuritava kemikaaliga kasutatud meetodi analüütiline täpsus ja tundlikkus on radiomärgistatud uuritava kemikaali kasutamisega võrreldes samaväärne või suurem,
                                       
                                    ei ole radiomärgistatud uuritavat kemikaali vaja kasutada. Samuti võib kasutada muid radioaktiivseid ja stabiilseid isotoope, eelkõige juhul, kui kõnealune element põhjustab uuritava kemikaali mürgisuse või on selle osa. Kui võimalik, peaks radiomärgis asuma molekuli metaboliseerimise suhtes stabiilses põhiosas (osa, mis ei ole vahetatav, mida ei eemaldata metaboliseerimisel CO2-na ja mis organismis ei lähe ühe süsinikuaatomiga ühendite puuli). Uuritava kemikaali metaboliseerimise käigu väljaselgitamiseks võib olla vajalik märgistada molekulis mitu aatomit või konkreetset piirkonda.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Radiomärgisega ja radiomärgiseta uuritavat kemikaali tuleks asjakohaste meetodite abil analüüsida, et veenduda kemikaali puhtuses ja vastavuses keemilisele määratlusele. Radioaktiivse uuritava kemikaali radioloogiline puhtus peaks olema nii suur, kui konkreetse uuritava kemikaali puhul on võimalik saavutada (ideaaljuhul üle 95 %), ning tuleks teha mõistlikud jõupingutused, et tuvastada kõik lisandid, mida on 2 % või rohkem. Tuleb esitada andmed uuritava kemikaali puhtuse kohta ja kõikide kindlakstehtud lisandite keemilise määratluse ja osakaalu kohta. Igas regulatiivses kavas võidakse otsustada anda täiendavaid suuniseid, kuidas määratleda ja kirjeldada uuritavat kemikaali, mis kujutab endast segu, ning milliseid meetodeid tuleb kasutada selle puhtuse määramiseks.
                           
                        
                     Doosi valik
                  
                  
                     Prooviuuring
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Üldjuhul on prooviuuringuks piisav üks suukaudne doos. Doos ei tohiks olla mürgine, kuid peaks olema piisavalt suur, et võimaldada metaboliitide tuvastamist väljaheidetes ja väljahingatud õhus (ja plasmas, kui see on asjakohane) ning saavutada prooviuuringu nimetatud eesmärk, mis on märgitud käesoleva katsemeetodi punktis 12.
                           
                        
                     Põhiuuring
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Põhiuuringu puhul eelistatakse vähemalt kahe doosi kasutamist, kuna vähemalt kahest doosirühmast kogutud teave võib aidata määrata doosi muudes mürgisuse uuringutes ja hinnata juba olemasolevate mürgisuse katsete mõju sõltuvust doosist.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Kui manustatakse kahte doosi, peaksid mõlemad doosid olema piisavalt suured selleks, et võimaldada metaboliitide tuvastamist väljaheidetes (ja plasmas, kui see on asjakohane). Doosi valimisel tuleks arvesse võtta olemasolevatest toksilisuse andmetest saadud teavet. Kui teavet (näiteks ägeda suukaudse mürgisuse või korduvdoosi mürgisuse uuringute teavet kliiniliste mürgistusnähtude kohta) ei ole, võib kaaluda suuremat annust, mis on allpool LD50 (suukaudsel ja nahakaudsel manustamisel) või LC50 (sissehingamise kaudu manustamisel) hinnangulist väärtust või allpool ägeda mürgisuse hinnangulise vahemiku alumist väärtust. Väiksem annus peaks olema suurema doosi mingi murdosa.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Ainult ühe doositaseme uurimise korral peaks doos ideaaljuhul olema piisavalt suur, et võimaldada metaboliitide tuvastamist väljaheidetes (ja plasmas, kui see on asjakohane), põhjustamata ilmset mürgistust. Teise doositaseme lisamata jätmist tuleks põhjendada.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Kui on vaja määrata doosi mõju kineetilistele protsessidele, ei pruugi kahest doosist piisata ja vähemalt üks neist peaks olema piisavalt suur, et saavutada kõnealuses protsessis küllastumist. Kui plasmas oleva kontsentratsiooni ajast sõltuvuse kõvera alune pindala (AUC) ei ole põhiuuringus kasutatud kahe doositaseme vahel lineaarne, on see oluline tõend, et ühe või enama kineetilise protsessi küllastumine toimub kusagil kahe doositaseme vahel.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Vähese mürgisusega uuritavate kemikaalide puhul tuleks (suu- ja nahakaudse manustamise korral) kasutada maksimumdoosi 1 000 mg kehakaalu kg kohta (sissehingamise teel manustamise puhul vt suunised, käesoleva lisa peatükk B.2; üldjuhul ei ületa see doos 2 mg/l). Kemikaalist olenevalt võib regulatiivsete nõuete täitmiseks osutuda vajalikuks suurema doosi kasutamine. Doosi valik peaks olema alati põhjendatud.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Ühe doosi toksiko-kineetilised ja kudedes jaotumise andmed võivad olla piisavad bioakumuleerumise ja/või püsivuse võimalikkuse kindlaksmääramiseks. Mõnel juhul võib siiski olla vajalik korduvdoosi manustamine, i) et käsitleda täpsemalt bioakumuleerumise ja/või püsivuse võimalikkust või muutusi toksikokineetikas (s.o näiteks ensüümide induktsioon ja inhibeerimine), või ii) kui seda nõuab kohaldatav õigussüsteem. Kuigi üldjuhul piisab väikese doosi korduvast manustamisest, võib korduvdoosiuuringute puhul olla mõnedel tingimustel vajalik ka suure doosi korduv manustamine (vt punkt 57).
                           
                        
                     Uuritava kemikaali manustamine
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Uuritav kemikaal tuleks lahustada või tekitada selle ühtlane suspensioon samas kandeaines, mida on kasutatud muude suukaudse mürgisuse sundsöötmisega manustamisega uuringutes, kui kõnealune teave kandeaine kohta on olemas. Kandeaine valikut tuleks põhjendada. Kandeaine ja doseerimiskoguse valimist tuleks käsitleda juba uuringu koostamisel. Tavaline manustamismeetod on sundsöötmisega; manustamine želatiinkapslis või söödasegu osana võib siiski olla konkreetses olukorras kasulikum (mõlemal juhul tuleks valitud meetodit põhjendada). Igale loomale tegelikult manustatud doosi tuleks kontrollida.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Suukaudsel sundsöötmisel korraga manustatava vedeliku maksimaalne kogus oleneb katselooma suurusest, doosi kandeaine tüübist ja sellest, kas loomi enne uuritava kemikaali manustamist näljutatakse või mitte. Enne manustamist sööda andmist või mitteandmist tuleks põhjendada. Üldiselt peaks manustatav maht nii veepõhiste kui ka muude kandeainete puhul olema nii väike, kui praktiliselt võimalik. Doosi kogus näriliste puhul ei tohiks üldiselt ületada 10 ml kehakaalu kg kohta. Lipofiilsema uuritava kemikaali puhul kasutatav kandeaine kogus võiks alata 4 ml-st kehakaalu kg kohta. Korduvdoosiuuringutes, kus igapäevane näljutamine on vastunäidustatud, tuleks kaaluda väiksema doosikoguse (näiteks 2–4 ml kehakaalu kg kohta) kasutamist. Kui võimalik, tuleks püüda kasutada sellist doosikogust, mis on kooskõlas uuritava kemikaaliga tehtud muude suukaudse sundsöötmise uuringutega.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Uuritava kemikaali intravenoosset manustamist ning uuritava kemikaali mõõtmist veres ja/või väljaheidetes võib kasutada biosaadavuse või suhtelise suukaudse imendumise määramiseks. Intravenoosse manustamise uuringu puhul manustatakse asjakohase kandeaine abil üks doos uuritavat kemikaali (mis on üldiselt võrdväärne väikese suukaudse doosiga, aga ei tohi seda ületada, vt doosi valimine). Seda materjali tuleks manustada sobiv kogus (näiteks 1 ml kehakaalu kg kohta) valitud manustamiskohas vähemalt neljale asjakohasest soost loomale (kui see on põhjendatud, siis võib kasutada mõlemat sugu, vt punkt 16). Intravenoosseks manustamiseks tuleb ette valmistada uuritava kemikaali täielikult lahustatud või suspendeeritud doos. Intravenoosse manustamise kandeaine ei tohiks mõjutada vere koostist ega voolamist. Kui uuritav kemikaal kanti üle infusioonipumbaga, tuleks katseprotokollis teatada ülekandmise kiirus, mis peaks kõigi loomade puhul olema standardne. Kanüüli viimisel jugulaarveeni (uuritava kemikaali manustamiseks ja/või vere kogumiseks) või reiearterisse (uuritava kemikaali manustamiseks) tuleks kasutada tuimestust. Tuimestuse tüüpi tuleks hoolega kaaluda, kuna see võib toksikokineetikat mõjutada. Loomad peaksid saama enne uuritava kemikaali ja kandeaine manustamist piisavalt toibuda.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Teatava uuritava kemikaali puhul võib olla asjakohane muu manustamistee, näiteks nahakaudne või sissehingamise teel manustamine (vt punktid 74–78), olenevalt kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest ja eeldatavast kasutamisest inimeste poolt või inimestega kokkupuute teest.
                           
                        
                     Mõõtmised
                  
                  
                     Massibilanss
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Massibilansi määramiseks liidetakse manustatud (radioaktiivse) doosi kogused (protsent esialgsest doosist), mis leitakse uriinis, väljaheites ja väljahingatud õhus ning tehakse kindlaks kudedes, korjusejääkides ja puuripesuvedelikus (vt punkt 46). Üldiselt peetakse piisavaks, kui manustatud uuritavast kemikaalist (radioaktiivsusest) suudetakse liitmisega koguda > 90 %.
                           
                        
                     Imendumine
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Esialgne imendumise hinnang saadakse sel teel, et massibilansi arvutusest lahutatakse seedetraktis ja/või väljaheites oleva doosi osakaal. Imendumise protsendi arvutus on esitatud punktis 33. Väljahingatava õhu, väljaheite ja uriini uurimise kohta vt punktid 44–49. Kui pärast suukaudset manustamist ei ole imendumise täpset ulatust võimalik massibilansi abil kindlaks määrata (näiteks kui üle 20 % manustatud doosist leitakse väljaheitest), võib vajalik olla täpsem uuring. Kõnealune uuring võib seisneda kas 1) uuritava kemikaali suukaudses manustamises ja määramises, kui palju uuritavat kemikaali leidub sapis, või 2) uuritava kemikaali suukaudses ja intravenoosses manustamises ning uriinis leiduva uuritava kemikaali netosisalduse mõõtmises, millele liidetakse väljahingatud õhus ja korjuses leiduv uuritava kemikaali sisaldus kummagi manustamistee puhul. Mõlemas uuringuprojektis mõõdetakse radioaktiivsust uuritava kemikaali ja metaboliitide keemilise analüüsi asendusmeetodina.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Sapi kaudu eritamise uuringu tegemisel kasutatakse üldiselt suukaudset manustamist. Kõnealuses uuringus viiakse vähemalt nelja asjakohasest soost (vajaduse korral kummastki soost) looma sapijuhasse kanüül ja manustatakse üks doos uuritavat kemikaali. Pärast uuritava kemikaali manustamist tuleks jälgida radioaktiivsuse / uuritava kemikaali eritumist sapiga nii kaua, kui on vaja sapi kaudu erituva manustatud doosi protsendi hindamiseks, mida saab otseselt kasutada suukaudse imendumise ulatuse arvutamiseks järgmiselt:
                              
                                 
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Mõne uuritavate kemikaalide klassi puhul võib imendunud doos sekreteeruda otse läbi soolestiku membraanide. Sellisel juhul loetakse, et sapijuhasse sisestatud kanüüliga rotile suukaudselt manustatud doosi väljaheites sisalduva protsendi mõõtmine ei näita imendumata doosi protsenti. Kui oletatakse sekretsiooni otse soolestikku, soovitatakse imendunud doosi protsendi arvutamisel toetuda imendumisele, mis arvutatakse suukaudse manustamise puhul väljutamise ja intravenoosse manustamise puhul väljutamise (intaktne rott või rott, kelle sapijuhasse on viidud kanüül) võrdluse alusel (vt punkt 35). Samuti soovitatakse, et kui peetakse vajalikuks soolestiku sekretsiooni arvulist määramist, tuleks mõõta doosi väljutamist pärast doosi intravenoosset manustamist rotile, kelle sapijuhasse on viidud kanüül.
                           
                        
                     Biosaadavus
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Biosaadavust on võimalik kindlaks määrata suukaudse ja intravenoosse manustamise rühmade plasma/vere kineetika alusel, nagu on kirjeldatud punktides 50–52, tuginedes uuritava kemikaali ja/või asjakohase metaboliidi (asjakohaste metaboliitide) keemilisele määramisele; sel juhul ei ole vaja kasutada radiomärgistatud uuritavat kemikaali. Uuritava kemikaali või asjakohase metaboliidi (asjakohaste metaboliitide) biosaadavuse (F) võib siis arvutada järgmiselt:
                              
                                 
                           
                        kus AUC on plasmas sisalduva kontsentratsiooni ajast sõltuvuse kõvera alune pindala, IV on intravenoosne ja exp on eksperimentaalne manustamistee (suukaudne, nahakaudne või sissehingamise teel).
                  
                              36.
                           
                           
                              Süsteemsete mõjude riski hindamisel eelistatakse üldjuhul kasutada toksilise osa biosaadavust imendumise protsendi asemel, kui võrreldakse loomade uuringute süsteemseid kontsentratsioone analoogsete bioseire andmetega, mis saadakse töötajate kokkupuute uuringutest. Olukord võib olla keerukam, kui doosid on mittelineaarses vahemikus, seepärast on tähtis, et toksiko-kineetilise sõelumise raames määratakse kindlaks lineaarse vahemiku doosid.
                           
                        
                     Jaotumine kudedes
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Teadmised uuritava kemikaali ja/või selle metaboliitide kudedes jaotumise kohta on olulised sihtkudede määramiseks ning mürgisuse aluseks olevate mehhanismide mõistmiseks, samuti teabe saamiseks uuritava kemikaali ja metaboliitide bioakumulatsiooni ja püsivuse võimalikkuse kohta. Summaarse (radioaktiivse) doosi protsenti kudedes ning samuti korjusejääkides tuleks mõõta vähemalt väljutamiskatse lõpus (näiteks üldjuhul seitse päeva pärast doosi või vähem, olenevalt uuritava kemikaali konkreetsest käitumisest). Kui uuringu lõpus uuritavat kemikaali kudedes ei tuvastata (näiteks kuna uuritav kemikaal võib olla enne uuringu lõppu lühikese poolestusaja tõttu juba kadunud), siis tuleks olla hoolikas, et vältida andmete väärtõlgendamist. Sellises olukorras tuleks uurida uuritava kemikaali (ja/või metaboliidi) jaotumist kudedes sel ajal, kui selle kontsentratsioon plasmas/veres on maksimaalne (Tmax) või kui selle väljutamine uriini kaudu on kõige kiirem, nagu on asjakohane (vt punkt 38). Lisaks sellele võib olla vajalik kudede kogumine täiendavatel ajahetkedel, et hinnata uuritava kemikaali ja/või selle metaboliitide kudedes jaotumise sõltuvust ajast (kui see on asjakohane), et hõlbustada massibilansi määramist ja/või täita pädeva ametiasutuse esitatud nõudeid. Kogutavate kudede hulka kuuluvad maks, rasvkude, magu ja soolestik, neerud, põrn, täisveri, korjusejäägid, sihtorgani koed, samuti tuleks koguda uuritava kemikaali toksikoloogilise hindamise jaoks võimalikku tähtsust omavaid muid kudesid (näiteks kilpnääre, erütrotsüüdid, suguelundid, nahk, silm (eelkõige pigmenteerunud loomade puhul)). Tuleks kaaluda täiendavate kudede analüüsi samadel ajahetkedel, et kasutada loomi maksimaalselt, samuti juhul, kui subkroonilise või kroonilise mürgisuse uuringutes täheldatakse mürgisust sihtorgani suhtes. Samuti tuleks teatada (radioaktiivsete) jääkide kontsentratsioon ning kudede ja plasma (vere) radioaktiivsuse suhtarvud.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Kudedes jaotumise hindamine täiendavatel ajahetkedel, näiteks siis, kui kontsentratsioon plasmas/veres on maksimaalne (näiteks Tmax) või kui väljutamine uriini kaudu toimub suurima kiirusega, mis on kindlaks tehtud vastavate plasma/vere kineetika või väljutamise katsetega, võib samuti olla vajalik või seda võib nõuda pädev asutus. See teave võib olla vajalik mürgisuse mõistmiseks ning uuritava kemikaali ja metaboliidi bioakumulatsiooni ja püsivuse võimalikkuse hindamiseks. Tuleks esitada proovide valiku põhjendused; analüüsiproovid peaksid üldjuhul olema samad kui eespool nimetatud (vt punkt 37).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Kudedes jaotumise uuringutes võidakse radioaktiivsuse arvuline määramine teha vedelik-stsintillatsiooniloenduri (VSL) abil pärast seda, kui organid on välja lõigatud, homogeenitud, põletatud ja/või solubiliseeritud ning nende jäägid on kogutud ja viidud loendurisse. Praegu arendatakse mitut tehnilist meetodit, nagu kvantitatiivne kogu keha autoradiograafia ja retseptori mikroskoop-autoradiograafia, mis võivad osutuda kasulikuks uuritava kemikaali organites ja/või kudedes jaotumise määramisel (3, 4).
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Muu kui suukaudse kokkupuute puhul tuleks koguda ja analüüsida konkreetseid kudesid, näiteks inhalatsiooniuuringute puhul kopse ja nahakaudsete uuringute puhul nahka. Vt punktid 74–78.
                           
                        
                     Metaboliseerimine
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Väljaheited (ja plasma, kui see on asjakohane) tuleks koguda muutumata uuritava kemikaali ja metaboliitide tuvastamiseks ja arvuliseks määramiseks, nagu on kirjeldatud punktides 44–49. Metaboliitide tuvastamise lihtsustamiseks on lubatav koondada ühe doosirühma väljaheited. Soovitatav on iga ajahetke jaoks määrata metaboliidiprofiil. Kui proovide ja/või radioaktiivsuse puudumine seda ei võimalda, siis on lubatud koondada mitme ajahetke uriin ja fekaalid, kuid sugude- ja doosidevaheline koondamine ei ole lubatud. Uuritava kemikaaliga töödeldud loomade uriini, fekaalide, väljahingatud radioaktiivsuse ja sapi (kui see on asjakohane) analüüsimiseks tuleks kasutada sobivaid kvalitatiivseid ja kvantitatiivseid meetodeid.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Tuleks teha mõistlikud jõupingutused, et määrata kindlaks kõik metaboliidid, mille kogus on vähemalt 5 % manustatud doosist, ning esitada uuritava kemikaali metaboliseerimise skeem. Tuleks kindlaks teha uuritavad kemikaalid, mida on väljaheidetes vähemalt 5 % manustatud doosist. Tuvastamine tähendab siin koostisainete täpse struktuuri määramist. Üldiselt toimub keemilise struktuuri määramine nii, et metaboliiti ja teadaolevaid võrdlusaineid kromatografeeritakse kahes erinevas süsteemis, või kasutatakse meetodeid, mille abil on võimalik otse määrata keemilist struktuuri, näiteks massispektromeetria, tuumamagnetresonants jne. Kromatograafia puhul ei peeta metaboliidi struktuuri kahe meetodi abil tõendamisel piisavaks seda, kui kromatograafiat tehakse kahe erineva lahustisüsteemiga, kuid sama statsionaarse faasiga, kuna need meetodid ei ole sõltumatud. Kromatograafiline tuvastamine peaks toimuma kahe sõltumatu analüüsisüsteemiga, näiteks tavaline ja pöördfaasi õhukese kihi kromatograafia ning kõrgefektiivne vedelikkromatograafia (HPLC). Kui kromatograafiline eraldamine on piisava kvaliteediga, ei ole täiendav spektroskoopiline kinnitamine vajalik. Alternatiivselt võib ühese tuvastamise saavutada struktuuriteavet andvate meetoditega, näiteks vedelikkromatograafia pluss massispektromeetria (LC-MS) või vedelikkromatograafiaga tandemisse ühendatud massispektromeetria (LC-MS/MS), gaaskromatograafia pluss massispektromeetria (GC-MS) ning tuumamagnetresonantsspektromeetria.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Kui ei ole võimalik tuvastada metaboliite, mida on vähemalt 5 % manustatud doosist, tuleks lõpparuandes seda põhjendada või selgitada. Võib olla asjakohane tuvastada sellised metaboliidid, mille kogus on vähem kui 5 % manustatud doosist, et ohu ja/või riski hindamiseks mõista paremini uuritava kemikaali metaboliseerimisteed. Võimaluse korral tuleks esitada struktuuri kinnitus. See võib hõlmata plasmas, veres või muudes kudedes tekkivate metaboliidiprofiilide esitamist.
                           
                        
                     Eritumine
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Tuleks kindlaks teha manustatud doosi eritumise kiirus ja ulatus; selleks mõõdetakse uriinis, fekaalides ja väljahingatud õhus leitud (radioaktiivse) doosi protsent. Neid andmeid saab kasutada ka massibilansi määramiseks. Uriini, fekaalide ja väljahingatud õhuga organismist väljunud uuritava kemikaali (radioaktiivsuse) kogused tuleks kindlaks määrata sobivate ajavahemike järel (vt punktid 47–49). Korduvdoosi katsed tuleks asjakohaselt kavandada, et eritumise andmete kogumisel oleks võimalik järgida punktis 26 sätestatud eesmärke. See võimaldab võrdlemist ühe doosi katsetega.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Kui prooviuuringust selgub, et uuritavat kemikaali (radioaktiivsust) (punkti 49 kohaselt) ei ole väljahingatud õhuga märkimisväärses koguses väljutatud, ei ole lõpliku uuringu ajal vaja väljahingatud õhku koguda.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Iga loom tuleb paigutada eraldi metaboolsesse üksusesse väljaheidete (uriini, fekaalide) ja väljahingatud õhu kogumiseks. Iga kogumisajavahemiku lõpus (vt punktid 47–49) tuleks metaboolsed üksused asjakohase lahustiga loputada (seda nimetatakse puuri loputamiseks), et tagada uuritava kemikaali (radioaktiivsuse) maksimaalne kogumine. Väljaheidete ja väljahingatud õhu kogumine tuleks lõpetada seitsme päeva möödudes või kui vähemalt 90 % manustatud doosist on kogutud, olenevalt sellest, kumb kriteerium enne täidetakse.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Uuritava kemikaali (radioaktiivsuse) summaarsed kogused uriinis määratakse kindlaks vähemalt kahel ajahetkel kogumise 1. päeva kohta, millest üks peaks olema 24 tundi pärast doseerimist, ja seejärel üks kord päevas kuni uuringu lõpuni. Soovitatav on 1. päeval kasutada rohkem kui kahte proovi kogumise ajahetke (näiteks 6, 12 ja 24 tundi pärast doseerimist) valimist. Prooviuuringute tulemusi tuleks analüüsida, et saada teavet proovi kogumise alternatiivsete või täiendavate ajavahemike kohta. Kogumise ajakava tuleks põhjendada.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Uuritava kemikaali (radioaktiivsuse) summaarsed kogused fekaalides tuleks kindlaks määrata iga päev pärast 24 tunni möödumist manustamisest kuni uuringu lõpuni, v.a juhul, kui prooviuuringutest tuleneb, et kogumiseks tuleb kasutada muid või täiendavaid ajavahemikke. Kogumise alternatiivset ajakava tuleks põhjendada.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Väljahingatud CO2 ja muude lenduvate materjalide kogumise võib konkreetses uuringus peatada, kui väljahingatud õhus leitakse pärast 24-tunnist kogumist vähem kui 1 % manustatud doosist.
                           
                        
                     Mõju ajast sõltuvuse uuringud
                  
                  
                     Plasma/vere kineetika
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Kõnealuste uuringute eesmärk on hinnata uuritava kemikaali peamised toksiko-kineetilised parameetrid (näiteks Cmax, Tmax, poolestusaeg (t1/2), plasmas oleva kontsentratsiooni ajast sõltuvuse kõvera alune pindala (AUC)). Kõnealused uuringud võib teha ühe doosiga või tõenäolisemalt kahe või enama doosiga. Doosid tuleks valida eksperimendi laadi ja/või uuritava probleemküsimuse alusel. Kineetilised andmed võivad olla vajalikud, et lahendada selliseid küsimusi nagu uuritava kemikaali biosaadavus ja/või selgitada, kuidas kehast väljutamine sõltub doosist (näiteks selgitada, kas väljutamisel esineb küllastumine alates mingist doosist).
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Kõnealuste uuringute puhul tuleks kasutada doosirühmas vähemalt nelja ühest soost looma. Kasutatud loomade soo valikut tuleks põhjendada. Tuleks kaaluda mõlema soo kasutamist (neli isas- ja neli emaslooma), kui on tõendeid, et mürgisus oleneb oluliselt soost.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Pärast (radiomärgistatud) uuritava kemikaali manustamist tuleks igalt loomalt võtta sobival ajal vereproovid, kasutades asjakohast proovivõtu metoodikat. Loomalt võetavate vereproovide kogus ja arv võib olla piiratud korduva proovivõtu võimaliku mõjuga looma tervisele/füsioloogiale ja/või analüüsimeetodi tundlikkusega. Iga looma proove tuleks analüüsida eraldi. Mõnikord (näiteks metaboliidi iseloomustamine) võib olla vajalik rohkem kui ühe looma proovide koondamine. Koondatud proovid tuleks selgelt märgistada ja esitada koondamise selgitus. Kui kasutatakse radiomärgistatud uuritavat kemikaali, siis võib olla vajalik esineva koguradioaktiivsuse analüüs. Kui see on nii, tuleks radioaktiivsust analüüsida täisveres ja plasmas või plasmas ja punastes verelibledes, et oleks võimalik arvutada vere ja plasma omavahelist suhet. Muudel juhtudel võivad olla vajalikud täpsemad uuringud, mille puhul on vaja määrata lähteühendit ja/või metaboliite või hinnata nende seostumist valkudega.
                           
                        
                     Muude kudede kineetika
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Kõnealuste uuringute eesmärk on hankida teavet mõju ajast sõltuvuse kohta, et saada vastused sellistele küsimustele nagu mürgisuse mehhanism, bioakumulatsioon ja biopüsivus, milleks määratakse kindlaks uuritava kemikaali sisaldus eri kudedes. Kudede ja hindamisajavahemike valik oleneb käsitletavast küsimusest ning uuritava kemikaali toksikoloogilisest andmebaasist. Kõnealuse täiendavate kudede kineetikauuringu kavandamisel tuleks võtta arvesse kogutud teavet, nagu on kirjeldatud punktides 37–40. Kõnealused uuringud võivad hõlmata ühe või mitme doosi manustamist. Kasutatavat lähenemisviisi tuleks üksikasjalikult põhjendada.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Muude kudede kineetiliste uuringute tegemise võimalikud põhjused on järgmised:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          tõendid pikendatud poolestusaja kohta veres, mis viitab uuritava kemikaali võimalikule kogunemisele mitmesugustes kudedes, või
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          vajadus kindlaks teha, kas konkreetses koes on saavutatud statsionaarne olek (näiteks korduvdoosi uuringutes; kuigi veres võib uuritava kemikaali kontsentratsiooniga olla saavutatud statsionaarne olek, võib pakkuda huvi küsimus, kas statsionaarne olek on saavutatud ka sihtkudedes).
                                       
                                    
                        
                              55.
                           
                           
                              Seda tüüpi mõju ajast sõltuvuse uuringutes tuleks asjakohane uuritava kemikaali doos manustada suukaudselt vähemalt neljale loomale iga doosi ja iga määratud ajahetke kohta ning tuleks jälgida valitud kudedes jaotumise ajalist kulgu. Võib kasutada ainult ühte sugu, v.a juhul, kui on täheldatud mürgisuse sõltuvust soost. See, kas analüüsitakse summaarset radioaktiivsust või lähtekemikaali ja/või metaboliite, oleneb ka probleemküsimusest, millega tegeldakse. Kudedes jaotumist tuleks hinnata asjakohaste meetodite abil.
                           
                        
                     Ensüümide induktsioon või inhibeerimine
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Ensüümide induktsiooni (sünteesi esilekutsumise) või inhibeerimise võimaliku mõju uurimine või uuritava kemikaali biotransformatsiooni uurimine võib olla vajalik järgmistel juhtudel:
                              
                                          1)
                                       
                                       
                                          olemasolevad tõendid osutavad, et uuritava kemikaali mürgisust suurendab biotransformatsioon;
                                       
                                    
                                          2)
                                       
                                       
                                          olemasolevad tõendid osutavad, et metaboliseerimine ei sõltu doosist lineaarselt;
                                       
                                    
                                          3)
                                       
                                       
                                          metaboliitide määramise uuring näitab võimaliku mürgise metaboliidi olemasolu, mis võib olla tekkinud uuritava kemikaali poolt indutseeritud ensümaatilise raja kaudu;
                                       
                                    
                                          4)
                                       
                                       
                                          on vaja kontrollida hüpoteesi, et uuritava kemikaali mõju on seotud ensüümi induktsiooni nähtustega;
                                       
                                    
                                          5)
                                       
                                       
                                          kui uuritava kemikaali metaboliseerimise profiilis täheldatakse kas märkimisväärseid toksikoloogilisi muutusi in vitro või in vivo katsetes muude liikidega või muudes tingimustes, võib olla vajalik asjakohas(t)e ensüümi(de) iseloomustamine (näiteks I faasi ensüümid, nagu tsütokroom P450-sõltuva monooksügenaasi süsteemi isoensüümid, II faasi ensüümid, nagu sulfotransferaasi isoensüümid või uridiindifosfaat-glükuronosüül-transferaasi isoensüümid või muud asjakohased ensüümid). Seda teavet võib kasutada, et hinnata mehhanismide liigilt liigile ülekandmise lubatavust.
                                       
                                    
                        
                              57.
                           
                           
                              Uuritava kemikaaliga seotud toksiko-kineetiliste muutuste hindamiseks tuleks kasutada sobilikke nõuetekohaselt valideeritud ja põhjendatud katse-eeskirju. Näidisuuringuprojekt hõlmab märgistamata uuritava kemikaaliga korduvdoosi manustamist, millele järgneb ühekordne radiomärgistatud doos 14. päeval või radiomärgistatud uuritava kemikaaliga korduvdoos ning proovide võtmine 1., 7. ja 14. päeval metaboliidiprofiilide kindlaksmääramiseks. Radiomärgistatud uuritava kemikaali dooside korduv manustamine võib anda teavet ka bioakumulatsiooni kohta (vt punkt 26).
                           
                        TÄIENDAVAD LÄHENEMISVIISID
                  
                              58.
                           
                           
                              Muud lähenemisviisid, mis täiendavad käesolevas katsemeetodis kirjeldatud in vivo katseid, võivad teatavate liikide puhul anda kasulikku teavet uuritava kemikaali imendumise, jaotumise, metaboliseerimise või organismist kõrvaldamise kohta.
                           
                        
                     
                        In vitro teabe kasutamine
                  
                  
                              59.
                           
                           
                              Mitmeid uuritava kemikaali metaboliseerimise küsimusi on võimalik käsitleda in vitro uuringutes, kasutades asjakohaseid katsesüsteeme. Võimalike metaboliitide uurimiseks võib kasutada maksa subtsellulaarse tasandi osakesi (näiteks mikrosoome ja tsütosooli või S9-fraktsiooni) ja värskelt eraldatud või kultuuris kasvatatud hepatotsüüte. Riskihindamisel võib huvi pakkuda lokaalne metaboliseerimine sihtorganis, näiteks kopsus. Selleks otstarbeks võib olla kasulik sihtkoe mikrosoomide fraktsioon. Mikrosoomiuuringud võivad olla kasulikud võimalike sooliste ja vanuseliste erinevuste selgitamiseks ning aidata leida ensüümiparameetreid (Km ja Vmax), mis võivad aidata hinnata metaboliseerimise sõltuvust doosist, arvestades kokkupuutetasemeid. Lisaks võivad mikrosoomiuuringud aidata määrata konkreetseid mikrosoomiensüüme, mis osalevad uuritava kemikaali metaboliseerimises ja mille mõju võib vahest oletada ka muude liikide puhul (vt ka punkt 56). Biotransformatsiooni induktsiooni võimalust võib samuti uurida, kasutades selliste loomade maksa subtsellulaarseid fraktsioone (näiteks mikrosoome ja tsütosooli), keda on eelnevalt töödeldud asjakohase uuritava kemikaaliga, tehes hepatotsüütide induktsiooni in vitro uuringuid või kasutades teatavaid rakuliine, milles sünteesitakse asjaomaseid ensüüme. Teatavatel asjaoludel ja sobivates tingimustes võib kaaluda inimkudedest pärinevate subtsellulaarsete fraktsioonide kasutamist biotransformatsiooni võimalike liigierinevuste kindlakstegemiseks. In vitro uuringud võivad olla kasulikud ka füsioloogial põhinevate toksikokineetika mudelite koostamiseks (5).
                           
                        
                              60.
                           
                           
                              Nahakaudse imendumise in vitro uuringutest võib saada lisateavet imendumise iseloomustamiseks (6).
                           
                        
                              61.
                           
                           
                              Samasuguste küsimuste lahendamiseks, milleks kasutatakse maksa mikrosoome, võib kasutada ka maksa primaarsete rakkude kultuure ja värske koe lõikeid. Mõnikord võib konkreetsele küsimusele vastuse leidmiseks kasutada rakuliini, mille puhul asjakohase ensüümi ekspressioon on tõendatud, või insenergeneetilist rakuliini. Mõnel juhul võib olla kasulik uurida in vitro konkreetsete tsütokroomi P450 isosüümide (näiteks CYP1A1, 2E1, 1A2 ja muud) ja/või II faasi ensüümide induktsiooni ja inhibeerimist lähteühendi poolt. Saadud teave võib olla kasulik samalaadse struktuuriga ühendite puhul.
                           
                        
                     Mürgisusuuringute toksiko-kineetiliste andmete kasutamine lisateabena
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Muude mürgisuse uuringute käigus saadud vere, kudede ja/või väljaheidete proovide analüüsist võib saada andmeid biosaadavuse, plasma kontsentratsiooni ajast sõltuvuse (plasmas oleva kontsentratsiooni ajast sõltuvuse kõvera alune pindala (AUC), Cmax), bioakumulatsiooni võimalikkuse, kliirensi kiiruse ning metaboliseerimise ja kineetika sooliste erinevuste või vanuseliste muutuste kohta.
                           
                        
                              63.
                           
                           
                              Uuringu projekti kavandamist võib kasutada vastuste leidmiseks küsimustele, mis on seotud järgmisega: imendumise küllastumine, biotransformatsioon või väljutamise teed suuremate dooside korral; uute metaboliseerimisradade sisselülitumine suurematel doosidel ning mürgiste metaboliitide esinemine vaid suurematel doosidel.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Muud ohu hindamisega seotud küsimused võivad olla näiteks järgmised:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          tundlikkuse sõltuvus vanusest seoses hematoentsefaalse barjääri, neerude ja/või detoksifitseerimisvõime ealiste muutustega;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          erinev tundlikkus alampopulatsioonides biotransformatsioonivõime või muude toksiko-kineetiliste erinevuste tõttu;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kokkupuute ulatus loote puhul, kuna kemikaal suudab läbida platsentat, või vastsündinu puhul, kuna kemikaal läheb rinnapiima sisse.
                                       
                                    
                        
                     Toksiko-kineetilise modelleerimise kasutamine
                  
                  
                              65.
                           
                           
                              Toksiko-kineetilised mudelid võivad olla kasulikud ohu ja riski hindamise erinevate tahkude jaoks, näiteks süsteemse kokkupuute ning koesisese doosi ennustamine. Lisaks sellele võidakse käsitleda toimeviisiga seotud konkreetseid küsimusi ja need mudelid võivad olla aluseks andmete ekstrapoleerimisel muudele liikidele, kokkupuuteteedele ja doseerimismustritele ning aidata hinnata inimest ohustavat riski. Uuritava kemikaali füsioloogial põhineva toksiko-kineetilise mudeli koostamiseks kasulikud andmed on iga liigi puhul järgmised: 1) jaotuskoefitsiendid, 2) biokeemilised konstandid ja füsioloogilised parameetrid, 3) manustamisteest sõltuvad imendumise parameetrid ning 4) in vivo kineetilised andmed mudeli hindamiseks (näiteks asjakohaste (> 10 %) väljutamisteede kaudu organismist väljaviimise (kliirensi) parameetrid, metaboliseerimise Km ja Vmax). Mudeli koostamisel kasutatavad katseandmed tuleks saada teaduslikult põhjendatud meetodeid kasutades ning mudeli tulemused tuleks valideerida. Sageli määratakse uuritava kemikaali ja liigipõhised parameetrid, näiteks imendumise kiirused, veres ja kudedes jaotumise ning metaboliseerimise kiiruse konstandid, et lihtsustada mittekompartmentaalsete või füsioloogial põhinevate mudelite koostamist (7).
                           
                        KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE
                  
                              66.
                           
                           
                              Uuringu protokoll soovitatakse varustada sisukorraga.
                           
                        
                     Protokolli tekstiosa
                  
                  
                              67.
                           
                           
                              Protokolli tekstiosa peaks sisaldama kõnealuse katsemeetodiga hõlmatud teavet, mis on jaotatud osadesse ja lõikudesse järgmiselt.
                           
                        
                     Kokkuvõte
                  
                  
                              68.
                           
                           
                              See uuringuprotokolli osa peaks sisaldama uuringuprojekti ülevaadet ja kasutatud meetodite kirjeldust. Selles tuleks samuti tuua esile peamised tulemused, mis on seotud massibilansi, metaboliitide laadi ja olulisuse, kudedes olevate jääkide, kliirensi kiirusega, bioakumulatsiooni võimalikkuse, sooliste erinevustega jne. Ülevaade tuleks esitada piisavalt üksikasjalikult, et uuringu tulemusi oleks võimalik hinnata.
                           
                        
                     Sissejuhatus
                  
                  
                              69.
                           
                           
                              See uuringuprotokolli osa peaks sisaldama uuringu eesmärke, põhjendust ja kava ning asjakohaseid viiteid ja taustteavet.
                           
                        
                     Materjalid ja meetodid
                  
                  
                              70.
                           
                           
                              Selles uuringuprotokolli osas tuleks esitada kogu asjakohase teabe üksikasjalik kirjeldus, mis hõlmab järgmist.
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          Uuritav kemikaal
                                          Selles jaotises tuleks esitada uuritava kemikaali tunnusandmed: keemiline nimetus, molekuli struktuur, keemilise koostise kvalitatiivne ja kvantitatiivne määramine, keemiline puhtus ja võimaluse korral lisandite tüüp ja kogused. Samuti esitatakse teave füüsikaliste ja keemiliste omaduste kohta, sh füüsikaline olek, värvus, lahustuvus ja/või jaotuskoefitsient, stabiilsus ja vajaduse korral söövitav toime. Kui see on kohaldatav, tuleks esitada isomeere käsitlev teave. Radiomärgistatud uuritava kemikaali kohta tuleks selles jaotises esitada järgmine teave: radionukliidi tüüp, märgise asukoht, eriaktiivsus ja radiokeemiline puhtus.
                                          Tuleks esitada kandeaine, lahjendusvedeliku, suspendeerimisvahendi ja emulgaatori või muude uuritava kemikaali manustamisel kasutatavate materjalide tüüp või kirjeldus.
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          Katseloomad
                                          Selles jaotises peaks olema teave katseloomade, sh nende valimise kohta; tuleks põhjendada, miks valiti konkreetne liik, liin ja loomade vanus uuringu alguses, sugu, ning esitada andmed kehakaalu, tervisliku seisundi ja loomade pidamise tingimuste kohta.
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          Meetodid
                                          See jaotis peaks sisaldama andmeid uuringu kava ja kasutatud meetodi kohta. Tuleks kirjeldada järgmist:
                                          
                                                      1)
                                                   
                                                   
                                                      kokkupuutetee ja -tingimuste kõigi muudatuste põhjendus, kui see on kohaldatav;
                                                   
                                                
                                                      2)
                                                   
                                                   
                                                      doositasemete valiku põhjendus;
                                                   
                                                
                                                      3)
                                                   
                                                   
                                                      põhiuuringu eksperimentaalse osa kavandamiseks tehtud prooviuuringute kirjeldus, kui see on kohaldatav. Tuleks esitada prooviuuringu alusandmed;
                                                   
                                                
                                                      4)
                                                   
                                                   
                                                      kuidas valmistati doseerimislahus ning lahusti või kandeaine tüüp, kui seda kasutati;
                                                   
                                                
                                                      5)
                                                   
                                                   
                                                      katserühmade arv ja loomade arv rühmas;
                                                   
                                                
                                                      6)
                                                   
                                                   
                                                      doositasemed ja kogus (ning doosi eriaktiivsus, kui kasutati radioaktiivset märgist);
                                                   
                                                
                                                      7)
                                                   
                                                   
                                                      manustamistee(d) ja -meetodid;
                                                   
                                                
                                                      8)
                                                   
                                                   
                                                      manustamise sagedus;
                                                   
                                                
                                                      9)
                                                   
                                                   
                                                      näljutamise ajavahemik (kui loomi näljutati);
                                                   
                                                
                                                      10)
                                                   
                                                   
                                                      summaarne radioaktiivsus looma kohta;
                                                   
                                                
                                                      11)
                                                   
                                                   
                                                      loomade kohtlemine;
                                                   
                                                
                                                      12)
                                                   
                                                   
                                                      proovide kogumine ja ettevalmistamine;
                                                   
                                                
                                                      13)
                                                   
                                                   
                                                      metaboliitide eraldamiseks, koguse määramiseks ja kindlakstegemiseks kasutatud analüüsimeetodid;
                                                   
                                                
                                                      14)
                                                   
                                                   
                                                      kasutatud meetoditega tuvastamise piir;
                                                   
                                                
                                                      15)
                                                   
                                                   
                                                      muud kasutatud eksperimentaalsed mõõtmised ja protseduurid (sh metaboliitide analüüsi meetodite valideerimine).
                                                   
                                                
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          Statistiline analüüs
                                          Kui uuringutulemuste analüüsimiseks kasutati statistilist analüüsi, tuleks lisada piisav teave kasutatud analüüsimeetodi ja arvutiprogrammi kohta, et sõltumatu hindaja või statistik saaks analüüsi uuesti hinnata ja rekonstrueerida.
                                          Kui tehakse süsteemi modelleerimise uuringuid, nagu füsioloogial põhineva toksikokineetika mudeli uuring, tuleks mudel esitada koos täieliku kirjeldusega, et mudelit saaks sõltumatult rekonstrueerida ja valideerida (vt punkt 65 ja liide „Mõisted”)
                                       
                                    
                        
                     Tulemused
                  
                  
                              71.
                           
                           
                              Kõik andmed tuleks esitada tabelites koos asjakohase statistilise töötlusega, andmete kokkuvõte tuleks esitada kõnealuse jaotise tekstiosas. Uuringu jaoks asjakohasel viisil tuleks esitada radioaktiivsuse loendusandmete kokkuvõte; üldiselt esitatakse andmed mikro- või milligrammekvivalentidena proovi massiühiku kohta, kuid võib kasutada ka muid ühikuid. Selles jaotises tuleks tulemused esitada graafiliselt, lisada tüüpilised kromatograafia ja spektromeetria graafilised andmed, metaboliitide tuvastamise ja kvantitatiivse määramise graafikud, oletatavad metaboliseerimisteed, sh metaboliitide molekulaarne struktuur. Kõnealuses jaotises esitatakse veel järgmine teave, kui see on kohaldatav:
                              
                                          1)
                                       
                                       
                                          radioaktiivsuse kogus ja taasleitud radioaktiivsuse protsent uriinis, fekaalides, väljahingatud õhus ning uriini ja fekaale sisaldavas puuriloputusvedelikus.
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Nahakaudse uuringu puhul tuleks samuti lisada andmed manustamiskoha nahast ja nahaloputusest uuritava kemikaali taasleidmise kohta ning jääkradioaktiivsuse kohta nahka katnud seadmetes ja metaboliseerimise uurimise üksuses ning samuti nahaloputusuuringu tulemused. Üksikasjalikuma käsitluse kohta vt punktid 74–77.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Inhalatsiooniuuringute puhul lisage samuti andmed uuritava kemikaali taasleidmise kohta kopsudes ja nina kudedes (8). Üksikasjalikuma käsitluse kohta vt punkt 78;
                                                   
                                                
                                    
                                          2)
                                       
                                       
                                          jaotus kudedes protsendina manustatud doosist ja kontsentratsioonina (mikrogramm-ekvivalente koe grammi kohta) ning koes ja veres leiduva kemikaali või koes ja plasmas leiduva kemikaali suhtena;
                                       
                                    
                                          3)
                                       
                                       
                                          materjalibilanss, mis on arvutatud igast uuringust, mis hõlmab kehakudede ja väljaheidete analüüsimist;
                                       
                                    
                                          4)
                                       
                                       
                                          plasmakontsentratsioonid ja toksiko-kineetilised parameetrid (biosaadavus, plasmas oleva kontsentratsiooni ajast sõltuvuse kõvera alune pindala (AUC), Cmax, Tmax, kliirens, poolestusaeg) pärast asjakohas(t)e kokkupuutetee(de) kaudu manustamist;
                                       
                                    
                                          5)
                                       
                                       
                                          uuritava kemikaali imendumise kiirus ja ulatus pärast asjakohas(t)e kokkupuutetee(de) kaudu manustamist;
                                       
                                    
                                          6)
                                       
                                       
                                          väljaheidetest kogutud uuritava kemikaali ja metaboliitide kogused (väljendatuna manustatud doosi protsendina);
                                       
                                    
                                          7)
                                       
                                       
                                          viide liite andmetele, mis sisaldavad kõiki mõõdetud näitajate andmeid iga üksiku looma kohta (näiteks doosi manustamine, taasleitud koguse protsent, kontsentratsioonid, toksiko-kineetilised parameetrid jne);
                                       
                                    
                                          8)
                                       
                                       
                                          väljapakutud metaboliseerimisteede joonis ning metaboliidimolekulide struktuurid.
                                       
                                    
                        
                     Arutelu ja järeldused
                  
                  
                              72.
                           
                           
                              Selles jaotises peaks(id) autor(id)
                              
                                          1)
                                       
                                       
                                          esitama uuritava kemikaali metaboliseerimistee, toetudes metaboliseerimise ja organismist kõrvaldamise tulemustele;
                                       
                                    
                                          2)
                                       
                                       
                                          käsitlema uuritava kemikaali organismist kõrvaldamise ja/või biotransformatsiooni kõiki võimalikke liikide- ja sugudevahelisi erinevusi;
                                       
                                    
                                          3)
                                       
                                       
                                          esitama tabelina andmed metaboliitide tuvastamise ja koguste, kliirensi ja bioakumulatsiooni võimalikkuse kohta, lähteaine ja/või metaboliidi/metaboliitide jääkide taseme kohta kudedes ning toksikokineetika parameetrite võimaliku doosist sõltuva muutumise kohta, nagu on asjakohane, ja arutama kõike nimetatut;
                                       
                                    
                                          4)
                                       
                                       
                                          lisama kõnealusesse jaotisesse kõik asjakohased mürgisuse uuringutest saadud toksiko-kineetilised andmed;
                                       
                                    
                                          5)
                                       
                                       
                                          esitama lühikese järelduse, mida toetavad kõnealuse uuringu tulemused;
                                       
                                    
                                          6)
                                       
                                       
                                          lisama jaotisi (kui see on vajalik või asjakohane).
                                       
                                    
                        
                              73.
                           
                           
                              Kirjanduse andmete, tabelite, jooniste, liidete jne lisamiseks tuleks kasutada täiendavaid jaotisi.
                           
                        ALTERNATIIVSED KOKKUPUUTETEED
                  
                     Nahakaudne
                  
                  
                     Nahakaudne töötlemine
                  
                  
                              74.
                           
                           
                              Selles jaotises esitatakse üksikasjalik teave uuritava kemikaali toksikokineetika uurimise kohta nahakaudse kokkupuute korral. Nahakaudse imendumise kohta tuleks vaadata käesoleva lisa peatükki B.44 („Nahakaudne imendumine: in vivo meetod” (9)). Muude näitajate puhul, näiteks jaotumine ja metaboliseerimine, võib kasutada käesolevat katsemeetodit B.36. Nahakaudsel töötlemisel tuleks kasutada uuritava kemikaali ühte või enamat doositaset. Uuritav kemikaal (st puhas, lahjendatud või segu koostisse viidud materjal, mis sisaldab nahale kantavat uuritavat kemikaali) peaks olema sama, millega inimene või muu loomaliigi esindaja võib kokku puutuda (või selle lähedane aseaine). Doositase(med) tuleks valida kooskõlas käesoleva katsemeetodi punktidega 20–26. Asjaolud, mida võiks nahakaudse doosi valimisel arvesse võtta, on eeldatav inimeste kokkupuude ja/või doosid, mille juures muudes nahakaudsete mürgisuse uuringutes täheldati mürgisust. Nahakaudne (nahakaudsed) doos(id) tuleks vajaduse korral lahustada sobivas kandeaines ning peale kanda mahus, mis on piisav doosi manustamiseks. Vahetult enne katset eemaldatakse pügamise teel katselooma keha seljaosalt karvkate. Võib kasutada raseerimist, kuid seda tuleb teha umbes 24 tundi enne uuringu algust. Karvkatte pügamisel või raseerimisel tuleks vältida naha marrastamist, kuna see võib mõjutada naha läbilaskvust. Uuritava kemikaali manustamiseks tuleks paljastada ligikaudu 10 % keha pinnast. Väga toksilise aine puhul võib kasutada väiksemat nahapinda kui ligikaudu 10 %, kuid võimalikult suur osa alast tuleks katta õhukese ja ühtlase kihiga. Kõigi nahakaudse kokkupuute katserühmade puhul tuleks kasutada sama töötlemise pindala. Doosiga kaetud alasid tuleb kaitsta sobiva kattega, mis kinnitatakse paigale. Loomi tuleks pidada eraldi.
                           
                        
                              75.
                           
                           
                              Tuleks teha naha pesemise uuring, et hinnata pealekantud uuritava kemikaali kogust, mida on võimalik töödeldud nahalt pehmetoimelise seebi ja veega pesemise teel eemaldada. Uuritava kemikaali nahakaudse manustamise korral võib kõnealune uuring aidata koostada ka massibilanssi. Kõnealuse naha pesemise uuringu jaoks tuleks kahele loomale kanda peale üks doos uuritavat kemikaali. Doositase valitakse vastavalt käesoleva katsemeetodi punktile 23 (vt ka nahaga kokkupuute aja käsitlus, punkt 76). Pesemisel maha tulevad uuritava kemikaali kogused tuleks määrata, et hinnata, kui tõhus on uuritava kemikaali eemaldamine pesemise teel.
                           
                        
                              76.
                           
                           
                              Uuritav kemikaal tuleks kanda nahale ja hoida seda nahal vähemalt kuus tundi, kui seda ei välista kemikaali söövitav toime. Pärast katte eemaldamist tuleks töödeldud pinda pesta, järgides naha pesemise uuringu jaoks kirjeldatud korda (vt punkt 75). Nii katet kui ka pesuvedelikku tuleks analüüsida uuritava kemikaali jääkide kindlakstegemiseks. Uuringu lõpus tuleks iga loom kooskõlas punktiga 2 humaansel viisil surmata ja töödeldud nahk tuleks eemaldada. Töödeldud naha asjakohast osa tuleks analüüsida, et määrata kindlaks uuritava kemikaali jäägid (radioaktiivsus).
                           
                        
                              77.
                           
                           
                              Ravimite toksiko-kineetiliseks hindamiseks võivad vajalikud olla erinevad protseduurid kooskõlas asjakohase õigusraamistikuga.
                           
                        
                     Hingamisteede kaudu
                  
                  
                              78.
                           
                           
                              Tuleks kasutada uuritava kemikaali ühte kontsentratsiooni (või vajaduse korral mitut kontsentratsiooni). Kontsentratsioon(id) tuleks valida kooskõlas käesoleva katsemeetodi punktidega 20–26. Sissehingamise teel manustamine tehakse nn ninakoonuse või ainult peaseadme abil, et vältida imendumist muude kokkupuuteteede kaudu (8). Kui kasutatakse muid sissehingamise teel toimuva kokkupuute tingimusi, tuleks tingimuste muutmine dokumenteerida. Sissehingamise teel toimuva kokkupuute kestus tuleks kindlaks määrata; tavaline kokkupuuteaeg on 4–6 tundi.
                           
                        
                     KIRJANDUS
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73–81.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor microscopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25–40.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400–411.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.45 „Nahakaudne imendumine: in vitro meetod”.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              IPCS (2010). Characterization and application of Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organization, International Programme on Chemical Safety.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.44 „Nahakaudne imendumine: in vivo meetod”.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Barton HA, et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel Dekker, Inc., New York.
                           
                        
                     Liide
                     MÕISTED
                     
                        ADME– lühend sõnadest Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (imendumine, jaotumine, metaboliseerimine ja väljutamine).
                     
                        Akumulatsioon (bioakumulatsioon)– uuritava kemikaali koguse suurenemine aja jooksul kudedes (tavaliselt rasvkoes, korduva kokkupuute korral); kui uuritava kemikaali kehasse sisenemise kiirus on suurem kui kehast väljaviimise kiirus, siis organism akumuleerib uuritavat kemikaali ja võib tekkida uuritava kemikaali toksiline kontsentratsioon.
                     
                        Analoogmeetod– ühe või enama kemikaali näitajaid käsitleva teabe kasutamine sihtkemikaali näitajate prognoosimiseks.
                     
                        AUC (plasmas oleva kontsentratsiooni ajast sõltuvuse kõvera alune pindala)– plasmas oleva uuritava aine kontsentratsiooni ajast sõltuvuse kõvera alune pindala. See vastab eelnevalt kindlaks määratud aja jooksul kehasse imendunud uuritava kemikaali üldkogusele. Lineaarsetes tingimustes on AUC (aja nullpunktist lõpmatuseni) võrdelises sõltuvuses kehasse imendunud uuritava kemikaali summaarsest kogusest, olenemata imendumise kiirusest.
                     
                        Autoradiograafia (kogu keha autoradiograafia)– seda kasutatakse koes radioaktiivse uuritava kemikaali asukoha kvalitatiivseks ja/või kvantitatiivseks kindlaksmääramiseks; selle meetodi puhul kasutatakse röntgenfilmi või viimasel ajal digitaalseid fosforkujutisi, et visualiseerida radioaktiivselt märgistatud molekule või molekuliosi, salvestades uuritava objekti kiiratud radioaktiivsuse. Kvantitatiivsel kogu keha autoradiograafial võivad uuritava kemikaali jaotumise hindamisel ning kudedes radioaktiivse aine taasleitud üldkoguse ja lahutusvõime hindamisel olla mõned eelised võrreldes organite lahkamisega. Üks oluline eelis näiteks on võimalus kasutada seda pigmenteeritud loomamudeli puhul, et hinnata uuritava kemikaali võimalikku sidumist melaniiniga, mis võib teatavaid molekule siduda. Kuigi see meetod võib suure mahu ja vähese afiinsusega sidumiskohtadest kogu kehas ülevaate saamiseks olla kasulik, võib meetod olla piiratud konkreetsete sihtobjektide tuvastamisega, näiteks retseptorsidumiskohtade tuvastamisega, mille puhul tuvastamiseks on vaja suhteliselt suurt eraldusvõimet ja tundlikkust. Kui kasutatakse autoradiograafiat, tuleks manustatud ühendi massibilansi määramiseks kavandatud katsed teha eraldi rühmas või eraldi uuringuna kudedes jaotumise katsest, kus kõik väljaheited (mis võivad samuti hõlmata väljahingatud õhku) ja terved korjused homogeenitakse ja neid analüüsitakse vedelik-stsintillatsiooniloenduri abil.
                     
                        Bioakumulatsioon– vaata „akumulatsioon”.
                     
                        Biopüsivus– vt „püsivus”.
                     
                        Biosaadavus– manustatud doosi osa, mis jõuab süsteemsesse ringlusse või mis on füsioloogilise aktiivsuse kohas kättesaadav. Tavaliselt viitab uuritava kemikaali biosaadavus lähteühendile, kuid see võib viidata ka lähteühendi metaboliidile. Tegemist on ainult ühe keemilise vormiga. Tähelepanu! Biosaadavus ei ole sama, mis imendumine. Erinevus näiteks suukaudse imendumise (s.o olemasolu soolestiku seintes ja portaalringes) ja biosaadavuse (s.o olemasolu üldises vereringes ja kudedes) vahel võib muude tegurite hulgas (10) tekkida sellest, et soolte seinad metaboliseerivad (lagundavad) kemikaali, et kemikaal liigub väljavoolutranspordiga tagasi soolevalendikku või et kemikaal metaboliseeritakse maksas enne üldisse vereringesse sattumist. Mürgise komponendi (lähteühend või metaboliit) biosaadavus on inimest ohustava riski hindamisel ülioluline näitaja (suurelt väikesele doosile ekstrapoleerimine, ühelt kokkupuuteviisilt teisele ekstrapoleerimine), mida kasutatakse välise täheldatava kahjuliku toimeta doosi või võrdlusdoosi (kasutatud doos) alusel sisemise väärtuse tuletamiseks. Maksa mõju uurimiseks suukaudsel manustamisel piisab suukaudsest imendumisest. Kõigi muude mõjude puhul peale sisenemistee mõju on biosaadavus üldiselt usaldusväärsem näitaja edasises riskihindamises kasutamiseks kui imendumine.
                     
                        Biotransformatsioon– asjakohase uuritava kemikaali (tavaliselt ensüümide toimel) keemiline muundamine kehas teiseks kemikaaliks. Sünonüümne metaboliseerimisega.
                     
                        Cmax
                        – kas maksimaalne (tipp)kontsentratsioon veres (plasma/seerum) pärast manustamist või maksimaalne (tipp)kontsentratsioon väljutamisel (uriinis või fekaalides) pärast manustamist.
                     
                        Detoksifitseerimise teed– etapid, mis viivad mürgiste kemikaalide kehast kõrvaldamisele kas metaboliseerimise või väljutamise teel.
                     
                        Eksogeenselt– manustatud väljastpoolt organismi või süsteemi, tekkinud väljaspool organismi või süsteemi.
                     
                        Ekstrapoleerimine– ühe või enama tundmatu väärtuse tuletamine selle alusel, mis on juba teada või mida on täheldatud.
                     
                        Ensüümide parameetrid– Km: Michaelise konstant ning Vmax: maksimumkiirus.
                     
                        Ensüümid/isosüümid– valgud, mis toimivad keemiliste reaktsioonide katalüsaatoritena. Isosüümid on ensüümid, mis katalüüsivad samalaadseid keemilisi reaktsioone, kuid mille aminohapete järjestus on erinev.
                     
                        Imendumine– protsess(id), mille kaudu kemikaal tungib kudedesse või läbi kudede. Imendumisel peetakse silmas lähteühendit ja selle kõiki metaboliite. Seda ei tohiks segi ajada biosaadavusega.
                     
                        Induktsioon / ensüümi induktsioon– ensüümi süntees keskkonnastiimuli või esilekutsuva molekuli tõttu.
                     
                        Jaotumine– uuritava kemikaali ja selle derivaatide hajumine organismis.
                     
                        Jaotumine kudedes– uuritava kemikaali pöörduv liikumine ühest asukohast kehas teise. Jaotumist kudedes on võimalik uurida organite lahkamise, homogeenimise, põletamise ja vedelik-stsintillatsiooniloenduri abil või kvalitatiivse ja/või kvantitatiivse kogu keha autoradiograafia abil. Esimene nimetatud meetod võimaldab leida kudedes ja sama looma korjusejääkides kontsentratsiooni ning sealt taasleidmise protsendi, kuid selle eraldusvõime ei pruugi olla piisav kõigi kudede jaoks ning summaarse taasleidmise jaoks (< 90 %) ei pruugi see parim lahendus olla. Vt summaarse taasleidmise selgitus eespool.
                     
                        Jaotuskoefitsient– see näitaja iseloomustab kemikaali erinevat lahustuvust kahes lahustis.
                     
                        Kliirens– selle kiiruse kvantitatiivne näitaja, millega uuritav kemikaal verest, plasmast või teatavast koest ajaühiku kohta kõrvaldatakse.
                     
                        Kompartment– keha, koe või raku struktuurne või biokeemiline osa (või üksus), mis asub ülejäänust eraldi.
                     
                        Küllastatus– seisund, milles üks või mitu kineetilist protsessi (näiteks imendumine, metaboliseerimine või kliirens) on maksimumis („küllastatud”).
                     
                        Lineaarsus / lineaarne kineetika– protsessi kineetika on lineaarne, kui kõik kompartmentidevahelise ülekande kiirused on võrdelised olemasoleva koguse või kontsentratsiooniga, s.o esimest järku. Sel juhul on uuritava kemikaali kliirensi ja jaotunud kogused, samuti poolestusajad, konstantsed. Saavutatud kontsentratsioonid on võrdelised annustamise määraga (kokkupuutega) ja akumulatsioon on kergemini ennustatav. Lineaarsust/mittelineaarsust on võimalik hinnata, kui võrreldakse omavahel asjakohaseid parameetreid, näiteks uuritava aine kontsentratsiooni plasmas ja plasmas oleva kontsentratsiooni ajast sõltuvuse kõvera alust pindala (AUC) pärast erinevaid doose või pärast ühekordset ja korduvat kokkupuudet. Doosist sõltuvuse puudumine võib viidata ühendi metaboliseerimises osalevate ensüümide küllastatusele; plasmas oleva kontsentratsiooni ajast sõltuvuse kõvera aluse pindala (AUC) suurenemine pärast korduvat kokkupuudet, võrreldes ühekordse kokkupuutega, võib viidata metaboliseerimise inhibeerimisele ning plasmas oleva kontsentratsiooni ajast sõltuvuse kõvera aluse pindala (AUC) vähenemine võib viidata metaboliseerimise induktsioonile (vt ka punkt 11).
                     
                        Manustamistee (suukaudne, intravenoosne, nahakaudne, sissehingamine jne)– viitab viisile, kuidas kemikaali kehasse manustatakse (näiteks suukaudselt sundsöötmisega, suukaudselt söödaga, nahakaudselt, sissehingamise teel, intravenoosselt jne).
                     
                        Massibilanss– uuritava kemikaali süsteemi sisenemise ja sealt väljumise arvestus.
                     
                        Materjalibilanss– vt „massibilanss”.
                     
                        Metaboliidid– metaboliseerimise või metaboliseerimisprotsesside saadused.
                     
                        Metaboliseerimine– sünonüümne „biotransformatsiooniga”.
                     
                        Mudelite valideerimine– protsess, millega hinnatakse mudeli sobivust olemasolevate toksiko-koneetiliste andmete järjepidevaks kirjeldamiseks. Mudeleid võib hinnata sel viisil, et mudeli prognoose võrreldakse statistiliselt ja visuaalselt katses saadud väärtustega ühise sõltumatu näitaja (näiteks aja) eri väärtuste juures. Hindamise ulatust tuleks mudeli kavandatava kasutusvaldkonna alusel põhjendada.
                     
                        Mürgisuse (toimeviis) mehhanism / toimemehhanism (toimeviis)– toimemehhanism viitab konkreetsetele biokeemilistele mõjudele, mille kaudu tekib uuritava kemikaali mõju. Toimeviis viitab üldisematele teedele, mis põhjustavad uuritava kemikaali mürgisuse.
                     
                        Poolestusaeg (t1/2)– aeg, mille jooksul uuritava kemikaali kontsentratsioon väheneb kompartmendis poole võrra. Tavaliselt peetakse silmas uuritava kemikaali kontsentratsiooni plasmas või kogust kogu kehas.
                     
                        Püsivus (biopüsivus)– kemikaali pikaajaline olemasolu (bioloogilises süsteemis) lagunemisele/kõrvaldamisele vastupidavuse tõttu.
                     
                        Retseptori mikroskoopne autoradiograafia (või retseptori mikroautoradiograafia)– seda meetodit võib kasutada selleks, et uurida ksenobiootikumide sidumist konkreetsete koeelementide või rakupopulatsioonide poolt näiteks retseptorite sidumise või konkreetse toimeviisi uuringutes, mis võivad nõuda suurt eraldusvõimet ja suurt tundlikkust, mis ei pruugi olla saavutatavad muu meetodi, näiteks kogu keha autoradiograafia puhul.
                     
                        Sapieritus– eritumine sapijuhade kaudu.
                     
                        Sihtkude– kude, milles avaldub mürgise aine peamine kahjulik mõju.
                     
                        Suukaudne imendumine– manustatud uuritava kemikaali doosi manustamise kohast (näiteks seedetraktist) imendumise protsent. Seda üliolulist parameetrit saab kasutada selleks, et määrata manustatud uuritava kemikaali osa, mis jõuab portaalveeni ja seejärel maksa.
                     
                        Süsteemide modelleerimine (füsioloogial põhinev toksikokineetika, farmakokineetikal põhinev, füsioloogial põhinev farmakokineetika, bioloogial põhinev jne)– abstraktne mudel, milles süsteemi käitumist kirjeldatakse matemaatiliselt.
                     
                        Tmax
                        – Cmax-i saavutamiseks vajalik aeg.
                     
                        Toksikokineetika (farmakokineetika)– kemikaalide imendumise, jaotumise, metaboliseerimise ja väljutamise ajast sõltuvuse uurimine.
                     
                        Tundlikkus– meetodi või mõõtevahendi suutlikkus eristada mõõdetavaid signaale, mis vastavad huvipakkuva muutuja erinevale sisaldusele.
                     
                        Uuritav kemikaal– iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                     
                        Vere (plasma/seerumi) maksimaalsed tasemed– maksimaalne (tipp)kontsentratsioon veres (plasmas/seerumis) pärast manustamist (vt ka „Cmax”).
                     
                        Veres (plasmas) oleva kontsentratsiooni statsionaarne olek– avatud süsteemi mittetasakaaluline olek, mille puhul kõik süsteemile avalduvad mõjud on täpselt tasakaalustatud vastupidiste mõjude poolt selliselt, et kõigi selle komponentide kontsentratsioon on püsiv, kuigi ained voolavad läbi süsteemi.
                     
                        Väljutamine– protsess(id), millega manustatud uuritav kemikaal ja/või selle metaboliidid kehast kõrvaldatakse.
                  ”
            
                  8)
               
               
                  Lisatakse peatükk B.52:
                  „B.52.   ÄGE MÜRGISUS SISSEHINGAMISEL – ÄGEDA MÜRGISUSE KLASSI MÄÄRAMISE MEETOD
                  
                  SISSEJUHATUS
                  
                              1.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga (Test Guideline, TG) 436 (2009). Esimene sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse katsejuhend nr 403 võeti vastu 1981. aastal ja see on hiljem läbi vaadatud (vt käesoleva lisa peatükk B.2 (1)). Sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse klassi (Acute Toxic Class, ATC) määramise meetodi koostamist (2, 3, 4) peeti asjakohaseks pärast läbivaadatud ägeda suukaudse mürgisusastme meetodi vastuvõtmist (käesoleva lisa peatükk B.1b) (5). Sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse klassi määramise meetodi tulemuslikkuse tagantjärele hindamine näitas, et kõnealune meetod on sobiv kasutamiseks klassifitseerimise ja märgistamise eesmärgil (6). Sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse klassi määramise meetod võimaldab kasutada kindlaksmääratud sihtkontsentratsioonide mitut etappi, et määrata uuritava kemikaali mürgisuse klass. Peamise näitajana kasutatakse letaalsust, kuid suurtes valudes, kannatustes, piinlevad või suremas olevad loomad tuleks kannatuste minimeerimiseks humaansel viisil surmata. Humaansete lõpetamiskriteeriumide suunised on esitatud OECD juhenddokumendis nr 19 (7).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Käesoleva katsemeetodi kasutamise ja tõlgendamise suunised on esitatud sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse katset käsitlevas juhenddokumendis nr 39 (8).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Käesoleva katsemeetodi kontekstis kasutatud mõisted on esitatud 1. liites ja juhenddokumendis nr 39 (8).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Katsemeetod annab teavet ohtlike omaduste kohta ning võimaldab reastada ja klassifitseerida uuritava kemikaali vastavalt ägedat mürgisust põhjustavate kemikaalide klassifitseerimist käsitlevale määrusele (EÜ) nr 1272/2008 (9). Kui on vajalikud LC50 punktväärtuste hinnangud või mõju kontsentratsioonist sõltuvuse analüüsid, on asjakohane kasutada käesoleva lisa peatükis B.2 (1) esitatud meetodit. Täpsemad suunised katsemeetodi valiku kohta on esitatud juhenddokumendis nr 39 (8). Käesolev katsemeetod ei ole spetsiaalselt ette nähtud erimaterjalide, nagu vähe lahustuvad isomeetrilised või kiudmaterjalid või toodetud nanomaterjalid, uurimiseks.
                           
                        LÄHTEKAALUTLUSED
                  
                              5.
                           
                           
                              Enne käesoleva katsemeetodi kohase katse tegemist peaks uurimislabor läbi vaatama kogu olemasoleva teabe uuritava kemikaali kohta, sh tehtud uuringud, mille andmete abil oleks võimalik täiendava katse tegemisest loobuda, et minimeerida loomade kasutust. Teave, mis võib aidata valida katseks kõige sobivama liigi, liini, soo, kokkupuuteviisi ja sobivad uuritavad kontsentratsioonid, hõlmab järgmist: uuritava kemikaali keemiline nimetus, struktuur ja füüsikalis-keemilised omadused; mis tahes in vitro või in vivo mürgisuse katsete tulemused; eeldatavad kasutusvaldkonnad ja inimestega kokkupuute võimalused; olemasolevad (kvantitatiivsete) struktuuri-aktiivsuse sõltuvuste ((Q)SAR) andmed ja toksikoloogilised andmed samalaadse struktuuriga ainete kohta. Kontsentratsioone, mis eeldatavasti tekitavad söövitava (11) või tugevasti ärritava toime tõttu tugevat valu ja kannatusi, ei tohiks käesoleva katsemeetodiga katsetada (vt juhenddokument nr 39 (8)).
                           
                        KATSE PÕHIMÕTE
                  
                              6.
                           
                           
                              Katse seisneb selles, et astmelise meetodiga kogutakse neljatunnise kokkupuute jooksul uuritava kemikaali sissehingamisel tekkiva ägeda mürgisuse kohta piisavalt teavet aine klassifitseerimiseks. Konkreetse regulatiivse eesmärgi jaoks võib kasutada muid kokkupuute ajavahemikke. Igal ettenähtud kontsentratsiooni etapil tehakse katse kolme loomaga kummastki soost. Olenevalt loomade suremisest ja/või sellest, kas loomad on suremas, võib uuritava kemikaali ägeda mürgisuse hindamiseks piisata kahest etapist. Kui esitatakse tõendid, et üks sugu on tundlikum kui teine, võib katset jätkata ainult sellest soost loomadega, kumb on tundlikum. Järgmine etapp määratakse kindlaks eelmise etapi tulemusega, nii et
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          lisakatseid ei ole vaja teha;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          katse tehakse kolme loomaga kummagi soo kohta või
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          kuue sellest soost loomaga, kumb on tundlikum, s.o mürgisusklassi alampiiri hinnangud peaksid põhinema kuuel loomal uuritava kontsentratsiooni rühma kohta nende soost olenemata.
                                       
                                    
                        
                              7.
                           
                           
                              Suremas loomad või loomad, kes ilmselgelt kannatavad valu või kellel ilmnevad raskete ja kestvate kannatuste tunnused, tuleks humaansel viisil surmata; selliseid loomi võetakse katsetulemuste tõlgendamisel arvesse samamoodi kui katse käigus surnud loomi. Kriteeriumid, mille põhjal tehakse suremas oleva või raskelt kannatava looma surmamise otsus, ja juhised prognoositava või läheneva surma kindlakstegemiseks on esitatud humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhenddokumendis nr 19 (7).
                           
                        MEETODI KIRJELDUS
                  
                     Loomaliigi valimine
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Tuleks kasutada katseloomade enim kasutatavate laboriliinide noori terveid täiskasvanud isendeid. Eelistatav loomaliik on rott; muude liikide kasutamise korral tuleks seda põhjendada.
                           
                        
                     Loomade ettevalmistamine
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Emasloomad ei tohiks olla poeginud ega tiined. Kokkupuute päeval peaksid loomad olema 8 kuni 12 nädala vanused noored täiskasvanud, kelle kehamass ei tohiks erineda rohkem kui ±20 % selliste samas vanuses ja samast soost loomade keskmisest kehamassist, keda kasutati varasemates kemikaaliga kokkupuute katsetes. Loomad valitakse juhuslikult ja märgistatakse individuaalselt. Loomi hoitakse oma puuris vähemalt viis päeva enne katse algust, et võimaldada neil laboritingimustega kohaneda. Loomad peaksid olema enne katset ka katseseadmetega lühikese aja vältel kohanenud, kuna sel viisil vähendatakse uude keskkonda viimisest põhjustatud stressi.
                           
                        
                     Pidamistingimused
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Katseloomade pidamise ruumi temperatuur peaks olema 22 ± 3 °C. Suhtelist õhuniiskust tuleks eelistatult hoida vahemikus 30–70 %, kuigi see ei pruugi olla võimalik, kui kandeainena kasutatakse vett. Enne ja pärast kokkupuudet tuleks loomad tavaliselt paigutada soo ja kontsentratsiooni alusel rühmitatuna puuridesse, kuid loomade arv puuris ei tohiks segada iga looma täpset jälgimist ning peaks minimeerima loomade suremist kannibalismi ja võitlemise tõttu. Kui loomade kokkupuude toimub ainult nina kaudu, siis võib olla vajalik lasta neil hoiutorudega kohaneda. Hoiutorud ei tohiks põhjustada loomadele ülearuseid füüsilisi, soojusest või piiratud liikumisvõimest tingitud ebamugavusi. Loomade liikumise piiramine võib mõjutada füsioloogilisi näitajaid, näiteks kehatemperatuuri (hüpertermia) ja/või hingamise minutimahtu. Kui on kättesaadavad üldandmed, mille kohaselt kõnealuseid muutusi märkimisväärses ulatuses ei teki, ei ole eelnev hoiutoruga kohanemine vajalik. Kogu keha kaudu aerosooliga kokku puutuvaid loomi tuleks kokkupuute ajal eraldi hoida, et vältida loomadepoolset uuritava aerosooli filtrimist läbi oma puurikaaslaste karvkatte. Võib kasutada tavalisi ja sertifitseeritud laborisöötasid, v.a kokkupuute ajal, ning anda piiramatus koguses kraanivett. Valgustus peaks olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust.
                           
                        
                     Inhalatsioonikambrid
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Inhalatsioonikambri valimisel tuleks arvesse võtta uuritava kemikaali laadi ja katse eesmärki. Eelistatav kokkupuuteviis on ainult nina kaudu (mis hõlmab ainult pea, nina või koonu kaudu kokkupuudet). Ainult nina kaudu toimuvat kokkupuudet eelistatakse üldiselt vedelik- või pulberaerosooli ja aerosooliks kondenseeruda võiva auruga tehtavate uuringute puhul. Uuringu erieesmärgi saavutamiseks võib parem olla kokkupuude kogu keha kaudu, kuid seda tuleks katseprotokollis põhjendada. Kogukehakambri kasutamise korral keskkonna stabiilsuse tagamiseks ei tohiks katseloomade kogumaht ületada 5 % kambri mahust. Ainult nina ja kogu keha kaudu kokkupuute tehnilisi põhimõtteid ning konkreetseid eeliseid ja puudujääke on kirjeldatud juhenddokumendis nr 39 (8).
                           
                        KOKKUPUUTETINGIMUSED
                  
                     Kontsentratsioonide manustamine
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Soovitatakse kasutada fikseeritud neljatunnist kokkupuuteaega, arvestamata tasakaalustamisaega. Muu kestus võib olla vajalik erinõuete täitmiseks, kuid selle kasutamist tuleks uuringuprotokollis põhjendada (vt juhenddokument nr 39 (8)). Kogukehakambris uuritava kemikaaliga kokku puutuvad loomad tuleks eraldi paigutada, et vältida puurikaaslaste karvkatte korrastamise tõttu selle suukaudset manustamist. Kokkupuute ajal ei tohiks loomi sööta. Kogu keha kaudu toimuva kokkupuute ajal võib loomadele anda vett.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Loomad viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga, mis on gaas, aur, aerosool või nende segu. Katses kasutatav füüsikaline olek sõltub uuritava kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest, valitud kontsentratsioonist ja/või uuritava kemikaali kõige tõenäolisemast füüsikalisest vormist käsitsemise ja kasutamise ajal. Hügroskoopseid ja väga reaktsioonivõimelisi uuritavaid kemikaale tuleks katsetada kuiva õhu tingimustes. Tuleks olla ettevaatlik, et vältida plahvatusohtliku kontsentratsiooni tekkimist.
                           
                        
                     Osakeste suurusjaotus
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Osakeste suurusjaotus tuleks määrata kõigi aerosoolide puhul ja samuti aurude puhul, mis võivad kondenseeruda ja moodustada aerosooli. Hingamisteede kõigi asjakohaste piirkondadega kokkupuute võimaldamiseks soovitatakse kasutada aerosoole, mille osakeste massikeskmine aerodünaamiline diameeter (MMAD) on vahemikus 1–4 μm ning geomeetriline standardhälve (σg) on 1,5–3,0 (8, 13, 14). Kõnealuse standardi järgimiseks tuleks teha mõistlikud jõupingutused; kui standardit ei ole võimalik järgida, tuleks esitada eksperdihinnang. Näiteks metallisuitsu osakesed võivad olla kõnealusest normväärtusest väiksemad ning laenguga osakesed, kiud ja hügroskoopsed materjalid (mille suurus hingamisteede niiskes keskkonnas suureneb) võivad olla suuremad.
                           
                        
                     Uuritava kemikaali preparaat kandeaines
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Selleks et tagada uuritava kemikaali vajalik kontsentratsioon õhus ja osakeste suurus, võib olla vaja kasutada kandeainet. Eelistatult tuleks kasutada vett. Aineosakesi võib töödelda mehaaniliselt, et saavutada osakeste soovitud suurusjaotus, kuid tuleks olla hoolikas, et uuritavat kemikaali mitte lagundada ega muuta. Kui mehaaniline töötlus (näiteks tugeval jahvatamisel hõõrdumisest tekkinud kõrge temperatuur) võib olla uuritava kemikaali koostist muutnud, tuleks uuritava kemikaali koostist analüüsiga kontrollida. Tuleks olla hoolikas, et vältida uuritava kemikaali saastamist. Ei ole vaja katsetada raskesti peenestuvat teralist materjali, mis on sihipäraselt valmistatud nii, et seda ei saaks sisse hingata. Materjali hõõrumisega tuleks tõendada, et teralise materjali käsitlemisel ei teki sissehingatavaid osakesi. Kui hõõrumiskatsel tekib sissehingatavaid osakesi, tuleks teha sissehingamisel mürgisust näitav katse.
                           
                        
                     Loomade kontrollrühm
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Samaaegne negatiivne (puhtas õhus peetavate) loomade kontrollrühm ei ole vajalik. Kui katsekeskkonna loomiseks kasutatakse muud kandeainet kui vesi, tuleks kandeaine kontrollrühma kasutada ainult juhul, kui varasemad sissehingamisel avalduva mürgisuse andmed ei ole kättesaadavad. Kui kandeaines sisalduva uuritava kemikaali mürgisuse uuringus mürgisust ei leita, siis võib järeldada, et kandeaine ei ole katsetatud kontsentratsioonil mürgine, seega ei ole kandeaine kontrollrühm vajalik.
                           
                        KOKKUPUUTETINGIMUSTE SEIRE
                  
                     Kambri õhuvarustus
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Igas kokkupuutekatses tuleks kambri õhuvarustust hoolikalt kontrollida, pidevalt seirata ning andmed vähemalt kord tunnis registreerida. Keskkonnas oleva uuritava kemikaali kontsentratsiooni (või selle stabiilsuse) seire on kõigi dünaamiliste parameetrite mõõtmisel tingimata vajalik ja kujutab endast kaudset vahendit keskkonna tekitamise kõigi asjakohaste dünaamiliste parameetrite kontrollimiseks. Eraldi tuleks jälgida, et ainult nina kaudu kokkupuute uurimise kambris ei hingataks väljahingatud õhku uuesti sisse, kuna kokkupuutesüsteemi õhuvarustus ei ole piisav uuritavat kemikaali sisaldava õhu dünaamilise voo tagamiseks. On olemas metoodika, mille abil saab tõendada, et valitud katsetingimustes ei hingata väljahingatud õhku uuesti sisse (8, 15). Hapnikusisaldus peaks olema vähemalt 19 % ja süsinikdioksiidisisaldus ei tohiks ületada 1 %. Kui on alust arvata, et kõnealuseid nõudeid ei ole võimalik täita, tuleks hapniku- ja süsinikdioksiidisisaldust mõõta.
                           
                        
                     Kambri temperatuur ja suhteline õhuniiskus
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Kambri temperatuur tuleks hoida 22 ± 3 °C juures. Loomade hingamistsooni suhtelist õhuniiskust tuleks nii ainult nina kui ka kogu keha kaudu kokkupuute katsetes seirata ja registreerida vähemalt kolm korda kuni neljatunnise katse jooksul ning iga tund lühema katse puhul. Suhtelist õhuniiskust tuleks eelistatult hoida vahemikus 30–70 %, kuid uuritava kemikaali mõju tõttu (näiteks veepõhise segu uurimisel) ei pruugi see olla saavutatav või mõõdetav.
                           
                        
                     Uuritav kemikaal – nimikontsentratsioon
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Kui see on võimalik, tuleks kokkupuutekambri nimikontsentratsioon alati arvutada ja registreerida. Nimikontsentratsioon on katsekeskkonda lisatud uuritava kemikaali mass, mis on jagatud läbi kambrisüsteemi suunatud õhu kogumahuga. Nimikontsentratsiooni ei kasutata loomade kokkupuute iseloomustamiseks, kuid nimikontsentratsiooni võrdlus tegeliku kontsentratsiooniga näitab katsesüsteemi kemikaali lisamise tõhusust ning seega saab seda kasutada kemikaali lisamisel esinevate probleemide avastamiseks.
                           
                        
                     Uuritav kemikaal – tegelik kontsentratsioon
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Tegelik kontsentratsioon on proovist määratud uuritava kemikaali kontsentratsioon loomade hingamistsoonis inhalatsioonikambris. Tegelikke kontsentratsioone on võimalik saada kas spetsiifiliste meetodite abil (näiteks otsene proovivõtt, adsorptsiooni või keemilise reaktsiooni meetodid ning järgnev analüüsimine) või mittespetsiifiliste meetodite abil, näiteks filtrite gravimeetriline analüüs. Gravimeetrilise analüüsi kasutamine on lubatud ainult ühest koostisainest koosneva pulberaerosooli või vähelenduva vedeliku aerosooli korral ja see peaks olema enne katse tegemist kinnitatud konkreetse kemikaali määramisega. Mitmest koostisainest koosneva pulberaerosooli kontsentratsiooni kindlaksmääramiseks võib samuti kasutada gravimeetrilist analüüsi. Sel juhul tuleb analüüsiga tõendada, et õhus oleva materjali koostis sarnaneb lähtematerjali koostisega. Kui selline teave ei ole kättesaadav, võib osutuda vajalikuks teha uuringu vältel uuritava kemikaali (eelistatult lenduvas olekus) kordusanalüüse korrapäraste ajavahemike järel. Aerosoolainete puhul, mis võivad aurustuda või sublimeeruda, tuleks näidata, et valitud meetodiga koguti kõiki faase. Katseprotokollis tuleks esitada siht-, nimi- ja tegelikud kontsentratsioonid, kuid letaalse kontsentratsiooni arvutamiseks kasutatakse statistilises analüüsis ainult tegelikke kontsentratsioone.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Võimaluse korral tuleks kasutada uuritava kemikaali ühte partiid ning uuritavat proovi tuleks säilitada tingimustes, milles säilib selle puhtus, homogeensus ja stabiilsus. Enne uuringu alustamist tuleks uuritavat kemikaali, sh selle puhtust, iseloomustada; kui see on tehniliselt võimalik, tuleb keemiliselt määratleda ka kindlakstehtud saasteained ja lisandid ning määrata nende kogused. Seda on võimalik tõendada muu hulgas järgmiste andmete alusel: retentsiooniaeg ja suhteline piigipindala, molekulmass massispektroskoopia või gaaskromatograafia analüüsidest või muud hinnangud. Kuigi uurimislabor ei vastuta uuritava kemikaali proovi keemilise määratlemise eest, võib uurimislaboril olla mõttekas kinnitada tellija iseloomustust vähemalt piiratud ulatuses (näiteks värv, füüsikalised omadused jne).
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Kokkupuutekeskkonda hoitakse võimaluste piires muutumatuna ja seiratakse pidevalt ja/või pisteliselt, olenevalt analüüsimeetodist. Kui kasutatakse pistelist proovivõttu, tuleks neljatunnise uuringu vältel võtta kambrikeskkonnast proove vähemalt kaks korda. Kui see ei ole piiratud õhuvarustuse või väikeste kontsentratsioonide tõttu võimalik, võib kogu kokkupuuteperioodi kohta võtta ühe proovi. Kui proovide analüüsimisel saadakse oluliselt erinevad tulemused, tuleks järgmiste uuritavate kontsentratsioonide puhul võtta kokkupuute kohta neli proovi. Kambrist võetud proovide kontsentratsioon ei tohiks keskmisest kontsentratsioonist erineda rohkem kui ±10 % gaaside ja aurude puhul või ±20 % vedelik- või pulberaerosoolide korral. Tuleks arvutada kambri tasakaaluoleku saavutamise aeg (t95) ja see registreerida. Kokkupuute kestus on aeg, mille vältel lisatakse uuritavat kemikaali ja seejuures arvestatakse t95 saavutamiseks vajalikku ajavahemikku. Juhendid t95 hindamise kohta on esitatud juhenddokumendis nr 39 (8).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Väga keeruka segu puhul, mis koosneb gaasidest/aurudest ja aerosoolidest (näiteks põlemiskeskkonnad ja uuritavad kemikaalid, mida paiskab välja mõni eriotstarbeline lõppkasutustoode või -seade), võib iga faas käituda inhalatsioonikambris erinevalt, nii et tuleks valida vähemalt üks uuritav aine (mida analüüsiga määratakse), tavaliselt sellise segu peamine toimeaine, iga faasi (gaas/aur ja aerosool) kohta. Kui uuritav kemikaal on segu, siis tuleks kirja panna kogu segu analüütiline kontsentratsioon ja mitte ainult toimeaine või komponendi (analüüsiga määratava aine) kontsentratsioon. Lisateave tegelike kontsentratsioonide kohta on juhenddokumendis nr 39 (8).
                           
                        
                     Uuritav kemikaal – osakeste suurusjaotus
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Aerosooliosakeste suurusjaotus tuleks kindlaks määrata vähemalt kaks korda iga neljatunnise kokkupuute ajal, kasutades kaskaadimpaktorit või alternatiivset seadet, näiteks aerodünaamilist osakeste suuruse määrajat. Kui on võimalik tõendada kaskaadimpaktori ja alternatiivse seadme abil saadud tulemuste võrdväärsust, võib kogu uuringu tegemiseks kasutada alternatiivset seadet. Paralleelselt peamise seadmega tuleks kasutada muud seadet, näiteks gravimeetrilist filtrit või minitsüklonit või gaasipesukolbi, et veenduda peamise seadme kogumistõhususes. Osakeste suuruse analüüsi kaudu saadud massikontsentratsioon peaks mõistlikes piirides kokku langema filtrianalüüsi abil saadud massikontsentratsiooniga (vt juhenddokument nr 39 (8)). Kui uuringu varajases etapis on võimalik tõendada võrdväärsust, siis võib loobuda täiendavatest kinnitavatest mõõtmistest. Loomade heaolu silmas pidades tuleks võtta meetmeid, et mitte saada katsest ebaselgeid andmeid, mille tõttu võib olla vajalik kokkupuudet korrata. Aurudega tuleks teha osakeste suurusjaotuse määramine sel juhul, kui on võimalik, et auru kondensatsiooni tõttu võib tekkida aerosool, või kui auru keskkonnas tuvastatakse osakesi, mille puhul võib tegemist olla faaside seguga (vt punkt 14).
                           
                        KATSE KÄIK
                  
                     Põhikatse
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Igal etapil kasutatakse kolme looma kummagi soo kohta või kuut looma sellest soost, mis on tundlikum. Kui ainult nina kaudu toimuvat kokkupuudet kasutatakse muu näriliseliigi kui roti korral, võib suurimat kokkupuute kestust kohandada, et minimeerida konkreetse kasutatava liigi isendite kannatusi. Lähtedoosina kasutatavaks kontsentratsiooniks valitakse üks nelja kindlaksmääratud taseme hulgast ning lähtekontsentratsioon peaks olema selline, mis tekitab kõige tõenäolisemalt mürgistuse mõnele loomadest, kellele doos manustatakse. Gaaside, aurude ja aerosoolide katseskeemid (mis on lisatud 2.–4. liites) seisnevad katsetamises CLP-määruse ((EÜ) nr 1272/2008) 1.–4. kategooria piirväärtustega (9) gaaside puhul (100, 500, 2 500, 20 000 ppm nelja tunni jooksul) (2. liide), aurude puhul (0,5, 2, 10, 20 mg / l nelja tunni jooksul) (3. liide) ja aerosoolide puhul (0,05, 0,5, 1,5 mg / l nelja tunni jooksul (4. liide). 5. kategooria, mida ei ole määruses (EÜ) nr 1272/2008 (9) rakendatud, on seotud vastavaid piirkontsentratsioone ületavate kontsentratsioonidega. Iga lähtekontsentratsiooni puhul kohaldatakse vastavat katsetamise skeemi. Humaanselt surmatud või surnud loomade arvust sõltuvalt toimitakse katseprotseduuris vastavalt nooltega näidatud suunale, kuni on võimalik määrata kategooria.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Ajavahemik katserühmade kokkupuutekatsete vahel määratakse kindlaks mürgistusnähtude alguse, kestuse ja raskuse järgi. Loomade kokkupuude järgmise kontsentratsiooniga tuleks edasi lükata seni, kuni eelmises katses kasutatud loomade ellujäämises võib olla mõistlikkuse piires veendunud. Enne iga järgmise kontsentratsiooniga kokkupuudet soovitatakse oodata kolm või neli päeva, et oleks võimalik jälgida hiljem avalduvat mürgisust. Ajavahemikku võib vajaduse korral korrigeerida, nt ebaselge vastuse puhul.
                           
                        
                     Piirsisalduskatse
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Piirsisalduskatset kasutatakse, kui uuritav kemikaal ei ole teadaolevalt või eeldatavalt mürgine, s.o mürgistus tekib ainult regulatiivse piirkontsentratsiooni ületamise puhul. Teavet uuritava kemikaali mürgisuse kohta võib saada varem katsetatud samalaadseid aineid või samalaadseid segusid käsitlevatest andmetest, võttes arvesse toksikoloogiliselt oluliste koostisainete keemilist laadi ja sisaldust. Kui teavet mürgisuse kohta on vähe või ei ole üldse või kui uuritav kemikaal on eeldatavasti mürgine, tuleks sooritada põhikatse (täpsemad suunised on esitatud juhenddokumendis nr 39 (8)).
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Tavalise meetodi kasutamisel viiakse kolm looma kummagi soo kohta või kuus looma sellest soost, kumb on tundlikum, kokkupuutesse vastavalt kontsentratsiooniga 20 000 ppm gaaside puhul, 20 mg/l aurude korral ja 5 mg/l tolmu/udu puhul (kui see on saavutatav), mis on käesoleva katsemeetodi piirsisalduskatse. Aerosooli katsetamisel peaks olema peamine eesmärk saavutada sissehingamiseks sobiv osakese suurus (st osakeste massikeskmine aerodünaamiline diameeter (MMAD) on 1–4 μm). See on enamiku uuritavate kemikaalide puhul võimalik kontsentratsioonil 2 mg/l. Aerosooli katsetamist rohkem kui 2 mg/l juures tuleks proovida ainult juhul, kui sissehingamiseks sobiv osakeste suurus on võimalik saavutada (vt juhenddokument nr 39 (8)). Ühtse ülemaailmse kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemi (GHS) (16) kohaselt ei ole katsetamine suuremal kui piirkontsentratsioonil loomade heaolu kaalutlustel soovitatav. GHSi 5. kategooria (16) kohast katsetamist, mida ei ole määruses (EÜ) nr 1272/2008 (9) rakendatud, tuleks kaaluda ainult juhul, kui on suur tõenäosus, et kõnealuse katse tulemused on otseselt seotud inimeste tervise kaitsega, ning seda tuleks sel juhul uuringuprotokollis põhjendada. Plahvatusohtliku uuritava kemikaali puhul tuleks olla hoolikas, et vältida plahvatust võimaldavaid tingimusi. Loomade tarbetu kasutamise vältimiseks tuleks enne piirsisalduskatset teha proovikatse ilma loomadeta, et tagada piirsisalduskatse jaoks vajalike kambritingimuste saavutamine.
                           
                        VAATLUSED
                  
                              29.
                           
                           
                              Loomi tuleks kokkupuute ajal sageli kliiniliselt jälgida. Pärast kokkupuudet tuleks kliinilised vaatlused korraldada vähemalt kaks korda kokkupuutepäeva jooksul või, kui loomade reageerimine kokkupuutele seda nõuab, ka sagedamini, ja seejärel vähemalt kord päevas kokku 14 päeva jooksul. Vaatlemise ajavahemiku kestus ei ole kindlaks määratud; see tuleks määrata kliiniliste nähtude laadi, tekkimisaja ja taastumisperioodi pikkuse alusel. Mürgistusnähtude ilmumise ja kadumise aeg on oluline eelkõige juhul, kui mürgistusnähtudel on kalduvus avalduda viitmõjuna. Kõik vaatlused registreeritakse süstemaatiliselt, säilitades iga looma kohta eraldi andmed. Suremas olevad loomad ja loomad, kellel esinevad tugeva valu ja/või püsivad suurte kannatuste tunnused, tuleks loomade heaolu kaalutlustel humaansel viisil surmata. Uuringute tegemisel tuleks olla hoolikas, et mürgistuse kliinilisi tunnuseid kindlaks tehes vältida kokkupuutest põhjustatud esialgse halva välimuse ja hingamise ajutiste muutuste pidamist töötlemisega seotud mõjudeks. Arvesse tuleks võtta humaansete lõpetamiskriteeriumide juhisdokumendis esitatud põhimõtteid ja kriteeriume (7). Kui loomad surmatakse humaansetel kaalutlustel või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg võimalikult täpselt registreerida.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Puuri juures tehtavad vaatlused peaksid hõlmama naha ja karvkatte, silmade ja limaskestade, hingamise, vereringe- ning autonoomse ja tsentraalse närvisüsteemi muutusi, somatomotoorset aktiivsust ja käitumismustrit. Võimaluse korral tuleks eristada lokaalset ja süsteemset mõju ja need registreerida. Tuleb pöörata tähelepanu värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, letargia, une ja kooma esinemisele. Pärakutemperatuuri mõõtmine võib anda lisaandmeid refleksipõhise hingamise aeglustumise või hüpo-/hüpertermia kohta, mis on seotud kokkupuute või vangistusega.
                           
                        
                     Kehamassid
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Iga looma kehamass tuleks registreerida üks kord kohanemise perioodi vältel, kokkupuute päeval enne kokkupuudet (päev 0) ning vähemalt päevadel 1, 3 ja 7 (ning seejärel iga nädal) ja surma või eutanaasia korral, kui see toimub pärast päeva 1. Kehamass on teatavasti mürgistuse oluline näitaja ja seega tuleks täpselt jälgida loomi, kelle kehamass väheneb püsivalt > 20 % võrreldes uuringueelsete näitajatega. Ellujäänud loomad kaalutakse ja surmatakse humaansel viisil kokkupuutejärgsel ajavahemikul.
                           
                        
                     Patoloogia
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Kõik katseloomad (kaasa arvatud need, kes surid katse käigus või kes surmati eutanaasiaga või kõrvaldatakse uuringust loomade heaolu tagamiseks) lahatakse täielikult. Kui lahkamine vahetult pärast surnud looma leidmist ei ole võimalik, tuleks loom jahutada (mitte külmutada) autolüüsi minimeerimiseks piisavalt madala temperatuurini. Lahata tuleks võimalikult kiiresti, tavaliselt ühe või kahe päeva jooksul. Iga looma kõik üldpatoloogilised muutused tuleks registreerida, pöörates eritähelepanu hingamisteede mis tahes muutustele.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Uuringu tõlgendusväärtuse laiendamiseks võib kaaluda uuringu kavasse eelnevalt ettenähtud täiendavate uuringute lisamist, nagu ellujäänud rottide kopsude kaalu mõõtmine ja/või hingamisteede ärrituse tõendamine hingamisteede mikroskoobiga vaatlemise teel. Uurida võib ka organeid, milles 24 tundi või kauem elanud loomadel esineb patoloogilisi muutusi, samuti organeid, mis teadaolevalt või eeldatavasti võivad olla kahjustatud. Kogu hingamistee mikroskoobiuuring võib anda kasulikku teavet veega reageeriva uuritava kemikaali, näiteks happe või hügroskoopse kemikaali kohta.
                           
                        KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE
                  
                     Andmed
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Tuleks esitada andmed iga üksiku looma kehamassi ja lahkamistulemuste kohta. Kliiniliste vaatluste andmed tuleks esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates iga katserühma puhul ära osalenud loomade arvu, konkreetsete mürgistusnähtudega loomade arvu, katse käigus surnuna leitud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahanguleiud.
                           
                        
                     Katseprotokoll
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Katseprotokoll peaks sisaldama võimaluse korral järgmist teavet.
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katseloomad ja pidamistingimused
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Puuritingimuste kirjeldus, sh: loomade arv (või arvu muutus) puuri kohta, allapanu, õhu temperatuur ja suhteline niiskus, valgustusperiood ja sööt.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kasutatud liik/liin ja muu liigi kui roti kasutamise põhjendus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Loomade arv, vanus ja sugu.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Randomiseerimismeetod.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Üksikandmed sööda ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kõigi eelnenud ettevalmistamismeetmete kirjeldus, sh söötmine, karantiin ja haiguste ravi.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uuritav kemikaal
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused (kaasa arvatud isomeerne koostis).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Identifitseerimisandmed, Chemical Abstract Services Registry ehk CASi nr, kui see on teada.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Kandeaine
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kandeaine kasutamise põhjendus ja valiku põhjendus (kui kandeainena ei kasutata vett).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Varasemad või rööpandmed, millega tõendatakse, et kandeaine ei mõjuta uuringu tulemusi.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhalatsioonikamber
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Inhalatsioonikambri kirjeldus, sh selle mõõtmed ja maht.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Loomade kokkupuute jaoks kasutatavate seadmete päritolu ja kirjeldus ning samuti keskkonna tekitamise kirjeldus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Temperatuuri, niiskuse, osakeste suuruse ja tegeliku kontsentratsiooni mõõtmise seadmed.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Õhuallikas ja kambrisse suunatud / kambrist välja lastud õhu töötlemiseks ning konditsioneerimiseks kasutatav süsteem.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Homogeense katsekeskkonna tagamise seadmete kaliibrimisel kasutatud meetodid.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Rõhuerinevus (positiivne või negatiivne).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kokkupuuteportide arv kambri kohta (ainult nina kaudu toimuv kokkupuude); loomade paiknemine süsteemis (kogu keha kaudu toimuv kokkupuude).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Katsekeskkonna ajaline homogeensus/stabiilsus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Temperatuuri- ja niiskusandurite paigutus ning katsekeskkonna proovide võtmine kambris.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Õhuvoolu kiirused, õhuvoolu kiirus kokkupuutepordi kohta (ainult nina kaudu toimuv kokkupuude) või loomade hulk kambri kohta (kogu keha kaudu toimuv kokkupuude).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Teave hapniku ja süsinikdioksiidi sisalduse mõõtmiseks kasutatud seadmete kohta, vajaduse korral.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Inhalatsioonikambri tasakaaluseisundini jõudmiseks vajalik aeg (t95).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kogu kambris oleva õhu vahetuste arv tunnis.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Mõõteseadmed (vajaduse korral).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Andmed kokkupuute kohta
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Põhiuuringu sihtkontsentratsiooni valimise põhjendus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Nimikontsentratsioonid (inhalatsioonikambrisse suunatud uuritava kemikaali kogumass, mis on jagatud läbi kambri juhitud õhu kogusega).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Uuritava kemikaali tegelikud kontsentratsioonid loomade hingamistsoonist kogutud proovides; heterogeensel füüsilisel kujul esineva segu (gaas, aur, aerosool) puhul võidakse analüüsida iga faasi eraldi.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kõik õhukontsentratsioonid tuleks teatada massiühikutes (mg/l, mg/m3 jne), kontsentratsioonid mahuühikutes (ppm, ppb jne) võib teatada sulgudes.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Osakeste suurusjaotus, massikeskmine aerodünaamiline diameeter (MMAD) ja geomeetriline standardhälve (σg) ning nende arvutusmeetodid. Tuleks teatada üksikosakeste suuruse analüüsid.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katsetingimused
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Üksikasjalikud andmed uuritava kemikaali ettevalmistamise kohta, sh andmed mis tahes meetmete kohta, mida kasutati tahke aine osakeste suuruse vähendamiseks või uuritava kemikaali lahuste valmistamiseks. Kui mehaanilised protsessid võivad olla muutnud uuritava kemikaali koostist, tuleb lisada nende analüüside tulemused, mille abil kontrolliti uuritava kemikaali koostist.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Katsekeskkonna tekitamiseks ja loomade kokkupuuteks katsekeskkonnaga kasutatud seadmete kirjeldus (eelistatult koos joonisega).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kasutatud keemilise analüüsi meetodi ja selle valideerimise üksikasjad (sh uuritava kemikaali analüütiline saagis proovivõtukeskkonna analüüsimisel).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Katsekontsentratsioonide valiku põhjendus.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemused
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelitena andmed katsekambri temperatuuri, niiskuse ja õhuvoolu kohta.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelitena andmed kambri nimi- ja tegeliku kontsentratsiooni kohta.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid osakeste suurusjaotuse andmete kohta, sh analüüsiproovide võtmise andmed, osakeste suurusjaotus ning MMAD ja σg arvutamine.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tabelid iga looma reageerimise andmete (st mürgistustunnustega loomad, kaasa arvatud suremus, mõjude laad, raskus ja kestus) ja annusemäärade kohta.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Uuringupäevadel registreeritud iga looma kehamass; surmakuupäev ja -aeg, kui loom sureb enne plaanijärgset eutanaasiat, mürgistusnähtude tekke aeg ja pöörduvus iga looma puhul.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on olemas.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      CLP-määruse kohane kategooria klassifikatsioon ja LC50 piirväärtus.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemuste arutelu ja tõlgendamine
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Eritähelepanu tuleks pöörata nende meetodite kirjeldamisele, mida kasutati käesoleva katsemeetodi kriteeriumide täitmiseks, näiteks piirkontsentratsioon või osakeste suurus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Üldtulemuste alusel tuleks käsitleda küsimust, kas osakeste suurus oli sobiv sissehingamiseks, eelkõige siis, kui osakeste suuruse kriteeriume ei olnud võimalik täita.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Uuringu üldhinnangus tuleks käsitleda nimi- ja tegelike kontsentratsioonide kindlaksmääramiseks kasutatud meetodite kooskõlalisust ning tegeliku ja nimikontsentratsiooni vahelist seost.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tuleks käsitleda tõenäolist surma põhjust ja uuritava kemikaali peamist toimeviisi (süsteemne või lokaalne).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kui OECD humaansete lõpetamiskriteeriumide juhenddokumendis (7) sätestatud kriteeriumide alusel tekkis vajadus humaansel viisil surmata valu kannatavaid või tõsiste ja püsivate kannatuste tunnustega loomi, siis tuleks esitada selgitus.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     KIRJANDUS
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.2 „Äge mürgisus (sissehingamisel)”.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System. Arch. Toxicol. 77: 243–254.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic-Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations. Arch. Toxicol. 71: 537–549.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives to LD/LC50 Tests. ALTEX 1: 129–134.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.1b „Äge suukaudne mürgisus – ägeda mürgisuse klassi määramise meetod”.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 105, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1272/2008, 16. detsember 2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353, 31.12.2008, lk 1).
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.40 „Nahasöövituskatse in vitro: transkutaanse elektritakistuse (TER) mõõtmine”.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk B.40a „Nahasöövituskatse in vitro: katse inimnaha mudeliga”.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321–327.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160–167.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and Geneva. Available: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_welcome_e.html]
                           
                        
                     1. liide
                     MÕISTE
                     Uuritav kemikaal– iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                  
                  
                     2. liide
                     
                        Toimimine gaasi iga lähtekontsentratsiooni juures (ppm nelja tunni kohta)
                     
                     Üldised märkused (12)
                     
                     Selles liites esitatud vastavad katseskeemid selgitavad, kuidas tuleb toimida iga lähtekontsentratsiooni juures.
                     2.a liide: lähtekontsentratsioon on 100 ppm.
                     2.b liide: lähtekontsentratsioon on 500 ppm.
                     2.c liide: lähtekontsentratsioon on 2 500 ppm.
                     2.d liide: lähtekontsentratsioon on 20 000 ppm.
                     Humaansel viisil surmatud või surnud loomade arvust sõltuvalt toimitakse katseskeemis vastavalt nooltega näidatud suunale.
                  
                  
                     2.a liide
                     
                        Äge mürgisus sissehingamisel
                     
                     
                        Toimimine gaaside puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 100 ppm 4 tunni jooksul
                     
                     
                        
                  
                  
                     2.b liide
                     
                        Äge mürgisus sissehingamisel
                     
                     
                        Toimimine gaaside puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 500 ppm 4 tunni jooksul
                     
                     
                        
                  
                  
                     2.c liide
                     
                        Äge mürgisus sissehingamisel
                     
                     
                        Toimimine gaaside puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 2 500 ppm 4 tunni jooksul
                     
                     
                        
                  
                  
                     2.d liide
                     
                        Äge mürgisus sissehingamisel
                     
                     
                        Toimimine gaaside puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 20 000 ppm 4 tunni jooksul
                     
                     
                        
                  
                  
                     3. liide
                     
                        Toimimine auru iga lähtekontsentratsiooni juures (mg/l nelja tunni kohta)
                     
                     Üldised märkused (13)
                     
                     Selles liites esitatud vastavad katseskeemid selgitavad, kuidas tuleb toimida iga lähtekontsentratsiooni juures.
                     3.a liide: lähtekontsentratsioon on 0,5 mg/l.
                     3.b liide: lähtekontsentratsioon on 2,0 mg/l.
                     3.c liide: lähtekontsentratsioon on 10 mg/l.
                     3.d liide: lähtekontsentratsioon on 20 mg/l.
                     Humaansel viisil surmatud või surnud loomade arvust sõltuvalt toimitakse katseskeemis vastavalt nooltega näidatud suunale.
                  
                  
                     3.a liide
                     
                        Äge mürgisus sissehingamisel
                     
                     
                        Toimimine aurude puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 0,5 mg/l 4 tunni jooksul
                     
                     
                        
                  
                  
                     3.b liide
                     
                        Äge mürgisus sissehingamisel
                     
                     
                        Toimimine gaaside puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 2 mg/l 4 tunni jooksul
                     
                     
                        
                  
                  
                     3.c liide
                     
                        Äge mürgisus sissehingamisel
                     
                     
                        Toimimine aurude puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 10 mg/l 4 tunni jooksul
                     
                     
                        
                  
                  
                     3.d liide
                     
                        Äge mürgisus sissehingamisel
                     
                     
                        Toimimine aurude puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 20 mg/l 4 tunni jooksul
                     
                     
                        
                  
                  
                     4. liide
                     
                        Toimimine aerosooli iga lähtekontsentratsiooni juures (mg/l nelja tunni kohta)
                     
                     Üldised märkused (14)
                     
                     Selles liites esitatud vastavad katseskeemid selgitavad, kuidas tuleb toimida iga lähtekontsentratsiooni juures.
                     4.a liide: lähtekontsentratsioon on 0,05 mg/l.
                     4.b liide: lähtekontsentratsioon on 0,5 mg/l.
                     4.c liide: lähtekontsentratsioon on 1 mg/l.
                     4.d liide: lähtekontsentratsioon on 5 mg/l.
                     Humaansel viisil surmatud või surnud loomade arvust sõltuvalt toimitakse katseskeemis vastavalt nooltega näidatud suunale.
                  
                  
                     4.a liide
                     
                        Äge mürgisus sissehingamisel
                     
                     
                        Toimimine aurude puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 0,05 mg/l 4 tunni jooksul
                     
                     
                        
                  
                  
                     4.b liide
                     
                        Äge mürgisus sissehingamisel
                     
                     
                        Toimimine aerosoolide puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 0,5 mg/l 4 tunni jooksul
                     
                     
                        
                  
                  
                     4.c liide
                     
                        Äge mürgisus sissehingamisel
                     
                     
                        Toimimine aerosoolide puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 1 mg/l 4 tunni jooksul
                     
                     
                        
                  
                  
                     4.d liide
                     
                        Äge mürgisus sissehingamisel
                     
                     
                        Toimimine aerosoolide puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 5 mg/l 4tunni jooksul
                     
                     
                        
                  ”
            
                  9)
               
               
                  Peatükk C.10 asendatakse järgmisega:
                  „C.10.   REOVEE AEROOBSE TÖÖTLEMISE SIMULATSIOONIKATSE: C.10-A: AKTIIVMUDA – C.10-B: BIOKILED
                  
                  
                     C.10-A:   aktiivmuda
                  
                  SISSEJUHATUS
                  
                              1.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 303 (2001). 1950. aastatel jõuti järeldusele, et hiljuti kasutusele võetud pindaktiivsed ained põhjustasid reoveepuhastites ja jõgedes liigset vahutamist. Neid ei kõrvaldatud täielikult aeroobse töötlemise käigus ja mõnel juhul need takistasid muude orgaaniliste ainete kõrvaldamist. Seepärast alustati mitmeid uuringuid selle kohta, kuidas pindaktiivseid aineid reoveest kõrvaldada ja kas tööstuses toodetud uusi kemikaale on üldse võimalik reoveest puhastada. Selleks kasutati mudelseadmeid, mis esindasid aeroobse bioloogilise reovee puhastamise kahte peamist tüüpi (aktiivmuda ja nõrgfiltri kasutamine). Iga uue kemikaali jaotamine puhastusjaamadesse ja suuremahuliste puhastusjaamade jälgimine ei oleks olnud isegi kohalikul tasandil praktiline ning oleks olnud väga kulukas.
                           
                        ESIALGSED KAALUTLUSED
                  
                     Aktiivmuda
                  
                  
                              2.
                           
                           
                              Aktiivmuda mudelühiku suurus on vahemikus 300 ml kuni ligikaudu 2 000 ml. Mõned neist imiteerisid lähedaselt täiemahulisi puhastusjaamu; neil olid mudasettepaagid, milles settinud muda pumbati tagasi aeratsioonibasseini, teistel ei olnud settimisnõusid, näiteks Swisher (1). Seadme suuruse valimisel on tehtud kompromiss; ühelt poolt peab see olema piisavalt suur, et seda oleks võimalik tulemuslikult mehaaniliselt käitada ja tagada piisav proovide kogus ilma käitamist mõjutamata, kuid teiselt poolt ei tohiks see olla nii suur, et selle rajamiseks oleks vaja liiga palju ruumi ja materjale.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Kaks laialdaselt ja rahuldavalt kasutatud seadmete vormi on Husmanni seadmed (2) ja poorse poti seadmed (3, 4), mida kasutati esmakordselt pindaktiivsete ainete uurimisel. Kõnealuseid seadmeid on kirjeldatud käesolevas katsemeetodis. Rahuldavalt on kasutatud ka muid seadmeid, vt näiteks Eckenfelder (5). Kõnealuse simulatsioonikatse tegemise jaoks vajalike suhteliselt suurte kulude ja jõupingutuste tõttu tehti sellega paralleelselt lihtsamad ja odavamad sõelkatsed, mis on nüüd esitatud käesoleva lisa peatüki C.4 meetodites C4.-A kuni C.4-F (6). Kogemused paljude pindaktiivsete ainete ja muude kemikaalidega on näidanud, et sõelkatses kergesti biolagunevaks osutunud ained lagundati ka simulatsioonikatses. Mõned sõelkatse järgi mittelagundatavaks klassifitseeritud ainetest olid loomuliku biolagundatavuse katsetes lagundatavad (käesoleva lisa peatükid C.12 (7) ja C.19 (8)), kuid ainult mõnda ainet viimati nimetatud rühmast lagundati simulatsioonikatses ning loomuliku biolagundatavuse katsetes mittelagunevaks klassifitseeritud kemikaalid ei lagunenud simulatsioonikatsetes (9, 10, 11).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Mõne eesmärgi saavutamiseks piisab ühe käitamistingimuste kogumiga tehtud simulatsioonikatsetest; katsete tulemused väljendatakse lahustunud orgaanilise süsiniku (DOC) või uuritava kemikaali kõrvaldamise protsendiga. Käesolevas katsemeetodis on esitatud sellise katse kirjeldus. Erinevalt käesoleva peatüki varasemast versioonist, kus kirjeldati ainult ühte tüüpi seadet sünteetilise reovee töötlemiseks, mis töötas ühendatud seadmete režiimis ja milles kasutati suhteliselt algelist muda kõrvaldamise meetodit, on käesolevas tekstis esitatud mitmesuguseid variante. On kirjeldatud seadme tüübi, käitamisrežiimi, reovee ja muda kõrvaldamise alternatiive. Käesolev tekst vastab üsna täpselt standardis ISO 11733 (12) kirjeldatule, mida kontrolliti koostamise ajal hoolikalt, kuigi meetodi jaoks ei ole veel laboritevahelist võrdluskatset korraldatud.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Muude eesmärkide saavutamiseks peab uuritava kemikaali kontsentratsioon väljavoolus olema täpsemalt teada ja selleks vajatakse ulatuslikumat meetodit. Näiteks muda kõrvaldamise kiirust tuleb iga päev ja kogu katse ajal täpsemalt kontrollida ning seadmeid tuleb käitada mitmel erineval kõrvaldamise kiirusel. Täiemahulise meetodi jaoks tuleks katsed korraldada ka kahel või kolmel erineval temperatuuril: sellist meetodit on kirjeldanud Birch (13, 14) ja selle kokkuvõte on esitatud 6. liites. Praegused teadmised ei ole siiski piisavad, et otsustada, milline kineetilistest mudelitest on kemikaalide biolagunemisele reovee puhastamisel ja veekeskkonnas üldisemalt kohaldatav. Monod’ kineetika kohaldamine, mis on näitena esitatud 6. liites, on piiratud kemikaalidega, mille sisaldus on vähemalt 1 mg/l, kuid mõne arvates on isegi see veel põhjendamata. Reoveele iseloomulikke kontsentratsioone täpsemalt peegeldavad katsed on esitatud 7. liites, kuid kõnealused katsed (ja 6. liites esitatud katsed) on esitatud liidetes ning neid ei ole avaldatud eraldi katsemeetoditena.
                           
                        
                     Filtrid
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Palju vähem tähelepanu on pööratud nõrgfiltrimudelitele. See võib olla põhjustatud asjaolust, et need on kogukamad ja vähem kompaktsed kui aktiivmudapuhasti mudelid. Gerike et al. töötasid välja nõrgfiltrimisseadmed ja käitasid neid ühendatud režiimis (15). Kõnealused filtrid olid suhteliselt suured (kõrgus 2 m; maht 60 l) ja iga filtri jaoks oli vaja 2 l/h reovett. Baumann et al. (16) simuleerisid nõrgfiltreid, sisestades 1 m torudesse (mille siseläbimõõt oli 14 mm) nn polüestervillaribad, mida oli 30 minuti vältel immutatud kontsentreeritud aktiivmudaga. Uuritav kemikaal, mis oli ainus süsinikuallikas mineraalsoolade lahuses, sisestati püstsuunalisse torusse ja biolagundamist hinnati lahustunud orgaanilise süsiniku määramisega väljavoolus ning CO2 mõõtmisega eralduvas gaasis.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Biofiltreid simuleeriti teise meetodi abil (15); horisontaalsuuna suhtes väikse nurga all olevate pöörlevate torude sisepindadele viidi reovett (ligikaudu 250 ml/h) koos uuritava kemikaaliga või ilma selleta ning kogutud väljavoolu analüüsiti lahustunud orgaanilise süsiniku ja/või konkreetse uuritava kemikaali määramiseks.
                           
                        KATSE PÕHIMÕTE
                  
                              8.
                           
                           
                              Käesolev meetod on kavandatud selleks, et määrata vees lahustuvate orgaaniliste kemikaalide kõrvaldamist ning esmast ja/või täielikku biolagundamist aeroobsete mikroorganismide poolt pidevalt käitatavas katsesüsteemis, millega simuleeritakse aktiivmuda protsessi. Lihtsasti biolagundatav orgaaniline kasvukeskkond ja orgaaniline uuritav kemikaal on mikroorganismidele energia- ja süsinikuallikateks.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Kaks pidevalt käitatavat katseseadet (aktiivmudapuhastid või poorsed potid) töötavad paralleelselt ühesugustel tingimustel, mis valitakse katse eesmärgi kohaselt. Keskmine hüdrauliline retentsiooniaeg on tavaliselt kuus tundi ja keskmine muda kasutamise aeg (muda retentsiooniaeg) on kuus kuni kümme päeva. Muda kõrvaldatakse ühega kahest meetodist. Uuritavat kemikaali lisatakse ainult ühte seadmetest sissevoolu (orgaaniline kasvukeskkond) kaudu tavaliselt kontsentratsiooniga vahemikus 10–20 mg/l lahustunud orgaanilist süsinikku. Teist seadet kasutatakse kontrollseadmena, et määrata orgaanilise kasvukeskkonna biolagunemist.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Väljavooludest võetakse sageli proove ja määratakse nendes (eelistatult) lahustunud orgaaniline süsinik või siis keemiline hapnikutarve; selle seadme väljavoolust, kuhu lisatakse uuritavat kemikaali, määratakse spetsiifilise analüüsimeetodiga uuritava kemikaali kontsentratsioon (kui see on nõutav). Katse- ja kontrollseadme väljavoolus määratud lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsiooni või keemilise hapnikutarbe erinevus on eeldatavasti põhjustatud uuritavast kemikaalist või selle orgaanilistest metaboliitidest. Seda erinevust võrreldakse lisatud uuritavast kemikaalist põhjustatud lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsiooniga või keemilise hapnikutarbega sissevoolus, et määrata uuritava kemikaali kõrvaldamise määr.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Biolagunemist võib tavaliselt eristada bioadsorptsioonist nii, et graafikul uuritakse hoolikalt, kuidas kõrvaldamismäär sõltub ajast, ning seda võib tavaliselt kinnitada kiire biolagundatavuse katsega, kasutades selle seadme aklimatiseeritud inokulumi, kuhu lisatakse uuritavat kemikaali.
                           
                        ANDMED UURITAVA KEMIKAALI KOHTA
                  
                              12.
                           
                           
                              Tulemuste õigesti tõlgendamiseks on vaja teada uuritava kemikaali puhtust, vees lahustuvust, lenduvus- ja adsorptsiooniomadusi. Tavaliselt ei ole lenduvaid ja lahustumatuid kemikaale võimalik katsetada ilma erimeetmeid võtmata (vt 5. liide). Samuti on vaja teada keemilist struktuuri või vähemalt empiirilist valemit, et arvutada teoreetilisi väärtusi ja/või kontrollida parameetrite mõõdetud väärtusi, näiteks teoreetilist hapnikutarvet (ThOD), lahustunud orgaanilist süsinikku (DOC) ja keemilist hapnikutarvet (COD).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Sobivate katsekontsentratsioonide valimiseks võivad vajalikud olla andmed uuritava kemikaali mürgisuse kohta mikroorganismidele (vt 4. liide) ning vähese biolagundatavuse väärtuste õigeks tõlgendamiseks on sellised andmed hädavajalikud.
                           
                        KÜNNISVÄÄRTUSED
                  
                              14.
                           
                           
                              Käesoleva pindaktiivsete ainete esmase biolagundamise simulatsioonikatse (kinnitava katse) esimese rakendamise järel nõutakse konkreetse kemikaali kõrvaldamist rohkem kui 80 % ulatuses, et pindaktiivset ainet võiks lubada turule. Kui 80 % künniseni ei jõuta, võib rakendada kõnealust simulatsioonikatset (kinnitavat katset) ja pindaktiivset ainet võib turustada ainult juhul, kui sellega kõrvaldatakse rohkem kui 90 % konkreetsest kemikaalist. Kemikaalide puhul üldiselt ei teki lubamise/mittelubamise küsimust ja saavutatud kõrvaldamise protsentväärtust võib kasutada tõenäolise keskkonnakontsentratsiooni ligikaudsetes arvutustes, mida kasutatakse kemikaalide põhjustatud ohu hindamiseks. Tulemused järgivad üldjuhul põhimõtet „kõik või mitte midagi”. Puhaste kemikaalide mitmes uuringus leiti, et olulises ulatuses biolagunevatest kemikaalidest rohkem kui kolme neljandiku puhul on lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamise määr > 90 % ning sellistest kemikaalidest rohkem 90 % puhul on see > 80 %.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Kõnealuses katses kasutatud kontsentratsioonidel (ligikaudu 10 mg C/l) esineb reovees suhteliselt väheseid kemikaale (näiteks pindaktiivseid aineid). Mõned kemikaalid võivad sellisel kontsentratsioonil inhibeerida ja mõne muu kemikaali kõrvaldamise kineetika võib väikesel kontsentratsioonil olla erisugune. Lagundamist oleks võimalik täpsemalt hinnata, kui kasutada muudetud meetodeid ja uuritava kemikaali realistlikult väikest kontsentratsiooni ning selliselt kogutud andmeid saaks kasutada kineetiliste konstantide arvutamiseks. Vajalikke katsemeetodeid ei ole siiski veel täielikult valideeritud ja biolagundamisreaktsioone kirjeldavad kineetilised mudelid ei ole veel kindlaks tehtud (vt 7. liide).
                           
                        VÕRDLUSKEMIKAALID
                  
                              16.
                           
                           
                              Katse korraliku tegemise tagamiseks on kasulik kemikaalide uurimise ajal aeg-ajalt katsetada kemikaale, mille käitumine on teada. Sellised kemikaalid on näiteks adipiinhape, 2-fenüülfenool, 1-naftool, difeenhape, 1-naftoehape jne (9, 10, 11).
                           
                        KATSETULEMUSTE REPRODUTSEERITAVUS
                  
                              17.
                           
                           
                              Simulatsioonikatsete uuringute kohta on olnud märksa vähem teateid kui kiire biolagundatavuse katsete kohta. 80 % või rohkem lagundatavate uuritavate kemikaalide puhul on (samaaegsete) paralleelproovide reprodutseeritavus hea (10–15 % piires), kuid vähem lagundatavate kemikaalide puhul on hajuvus suurem. Üheksanädalases lagundamiskatses on eri juhtudel registreeritud ka mõne piiripealse kemikaaliga väga erinevaid tulemusi (näiteks 10 %, 90 %).
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Kahte tüüpi seadmetega saadud tulemustes on leitud vähe erinevusi, kuid mõne kemikaali puhul toimub olmereovee kasutamisel ulatuslikum ja järjepidevam lagunemine kui (OECD) sünteetilise reovee puhul.
                           
                        KATSEMEETODI KIRJELDUS
                  
                     Seadmed
                  
                  
                     Katsesüsteem
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Ühe uuritava kemikaali katsetamise süsteem koosneb katseseadmest ja kontrollseadmest, kuid vaid spetsiifiliste analüüside tegemisel (esmane biolagundamine) on vaja ainult katseseadet. Mitme katseseadme kohta, milles uuritakse kas üht ja sama kemikaali või erinevaid kemikaale, võib kasutada ainult ühte kontrollseadet. Ühendatud seadmete korral (3. liide) peab igal katseseadmel olema oma kontrollseade. Katsesüsteem võib olla kas aktiivmudapuhasti mudel, Husmanni seade (1. liite joonis 1) või poorne pott (1. liite joonis 2). Mõlemal juhul on sissevoolu ja väljavoolu jaoks vaja piisava suurusega säilitusnõusid ning pumpasid, et doseerida sissevoolu, kas eraldi või segatult uuritava kemikaali lahusega.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Iga aktiivmudapuhasti seade koosneb aeratsiooninõust, mille maht on teada, ligikaudu 3 liitrit aktiivmuda, ja separaatorist (teisesest selitist), mille maht on ligikaudu 1,5 liitrit. Mahte võib teatavas ulatuses separaatori kõrguse kohandamisega muuta. Eri suurusega nõude kasutamine on lubatud, kui neid käitatakse võrreldava hüdraulilise koormusega. Kui katseruumi temperatuuri hoidmine soovitud vahemikus ei ole võimalik, soovitatakse kasutada veesärgiga nõusid, mille vee temperatuur on reguleeritav. Aktiivmuda tagasiviimiseks separaatorist aeratsiooninõusse kasutatakse suruõhupumpa või doseerimispumpa, mis töötab kas pidevalt või korrapäraste ajavahemike järel.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Poorse poti süsteem koosneb sisemisest poorsest silindrist, mille koonuseline alaosa asub mõnevõrra suuremas sama kujuga nõus, mis on valmistatud vett mitte läbi laskvast plastikmaterjalist. Poorse nõu jaoks on sobiv materjal poorne polüetüleen, mille pooride maksimaalne suurus on 90 μm ja paksus 2 mm. Muda eraldamine töödeldud orgaanilisest kasvukeskkonnast toimub poorse seina diferentseeritud läbimise teel. Väljavool koguneb ringikujulisse alasse, kust see kandub ülevoolamise teel kogumisnõusse. Settimist ei toimu ja muda seega tagasi ei suunata. Kogu süsteemi võib paigutada termostaadiga reguleeritavasse vesivanni. Poorsed potid ummistuvad algetappides ja võivad üle voolata. Sel juhul asendage poorne vooderdis puhtaga: kandke kõigepealt muda potist sifooniga puhtasse ämbrisse ning kõrvaldage ummistunud vooderdis. Pärast mitteläbilaskva välissilindri puhtakspühkimist pange sisse puhas vooderdis ja kandke muda tagasi potti. Ummistunud vooderdise külge jäänud muda tuleb samuti hoolikalt maha kraapida ja tagasi potti kanda. Puhastage ummistunud pott kõigepealt peene veejoaga, et eemaldada külgejäänud muda, ning leotage potti siis lahjas naatriumhüpokloriti lahuses ja seejärel vees ning loputage siis põhjalikult veega.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Muda aereerimiseks mõlema süsteemi aeratsiooninõus tuleb kasutada sobivat meetodit, näiteks klaasfilteraeraatoreid (aeratsioonielement) ja suruõhku. Õhku puhastatakse vajaduse korral, suunates selle läbi sobiva filtri ja kasutades vesipuhastust. Läbi süsteemi tuleb suunata piisavas koguses õhku, et säilitada aeroobseid tingimusi ja hoida mudahelbed katse vältel kogu aeg hõljuvas olekus.
                           
                        
                     Filtrimisseade või tsentrifuug
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Seade proovide filtrimiseks, milles on sobiva poorisuurusega (ava nominaalläbimõõt 0,45 μm) membraanfiltrid, mis adsorbeerivad lahustuvad orgaanilised kemikaalid ja millest vabaneb võimalikult vähe orgaanilist süsinikku. Kui kasutatakse filtreid, millest vabaneb orgaanilist süsinikku, tuleb filtreid hoolikalt pesta kuuma veega, et eemaldada väljauhutav orgaaniline süsinik. Selle asemel võib kasutada tsentrifuugi, mis tagab 40 000 m/s2.
                           
                        
                     Analüüsiseadmed
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Seadmed, mis on vajalikud järgmise kindlaksmääramiseks:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          lahustunud orgaaniline süsinik, orgaanilise süsiniku kogusisaldus või keemiline hapnikutarve;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          konkreetne kemikaal, kui nõutakse selle määramist;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          hõljuvaine, pH, hapniku kontsentratsioon vees;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          temperatuur, happelisus ja leeliselisus;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          ammoonium, nitrit ja nitraat, kui katse tehakse nitrifikatsiooni tingimustes.
                                       
                                    
                        
                     Vesi
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Kraanivesi, mis sisaldab vähem kui 3 mg/l lahustunud orgaanilist süsinikku. Määrake leeliselisus, kui see ei ole teada.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Deioniseeritud vesi, mis sisaldab vähem kui 2 mg/l lahustunud orgaanilist süsinikku.
                           
                        
                     Orgaaniline kasvukeskkond
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Orgaanilise kasvukeskkonnana võib kasutada sünteetilist reovett, olmereovett või nende segu. On tõendatud (11, 14), et ainult olmereovee kasutamise puhul saadakse sageli suurem lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamise protsent ning sellest saab kõrvaldada ja biolagundada mõnda kemikaali, mis ei ole OECD sünteetilise reovee kasutamisel biolagundatavad. Ka pidev või korrapärane olmereovee lisamine stabiliseerib sageli aktiivmuda, sh võimaldab üliolulise omadusena head settimist. Seega on soovitatav kasutada olmereovett. Igas uues orgaanilise kasvukeskkonna partiis tuleb mõõta lahustuva orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe kontsentratsioon. Orgaanilise kasvukeskkonna happelisus või leeliselisus peaks olema teada. Kui orgaanilise kasvukeskkonna happelisus või leeliselisus on vähene, võib see vajada sobiva puhvri lisamist (naatriumvesinikkarbonaat või kaaliumdivesinikfosfaat), et säilitada katse ajal aeratsiooninõus pH ligikaudu 7,5 ± 0,5. Lisatava puhvri kogus ja selle lisamise aeg tuleb igal eraldi juhul kindlaks määrata. Kui segusid kasutatakse kas pidevalt või aeg-ajalt, tuleb segu lahustunud orgaaniline süsinik (või keemiline hapnikutarve) hoida ligikaudu püsivana, näiteks veega lahjendamise teel.
                           
                        
                     Sünteetiline reovesi
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Ühes liitris kraanivees lahustatakse: 160 mg peptooni, 110 mg lihaekstrakti, 30 mg karbamiidi, 28 mg veevaba dikaaliumvesinikfosfaati (K2HPO4), 7 mg naatriumkloriidi (NaCl), 4 mg kaltsiumkloriiddihüdraati (CaCl2·2H2O), 2 mg magneesiumsulfaatheptahüdraati (Mg2SO4·7H2O). See OECD sünteetiline reovesi on näidis ja selle keskmine lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsioon sissevoolus on ligikaudu 100 mg/l. Alternatiivselt võib kasutada muid koostisi, millel on ligikaudu sama lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsioon ja mis on pärisreoveega sarnasemad. Kui on vajalik väiksema kontsentratsiooniga sissevool, lahjendage sünteetilist reovett näiteks 1 : 1 kraaniveega, et saada kontsentratsioon ligikaudu 50 mg/l. Kõnealune väiksema kontsentratsiooniga sissevool võimaldab nitrifitseerivatel organismidel paremini kasvada ja seda muutust tuleks kasutada juhul, kui on vajalik uurida nitrifitseerivate reoveepuhastite simuleerimist. Kõnealuse sünteetilise reovee kontsentraadi võib valmistada destilleeritud veega ja säilitada kuni ühe nädala temperatuuril 1 °C. Enne kasutamist lahjendatakse seda kraaniveega. (See kasvukeskkond ei ole rahuldav, näiteks lämmastiku kontsentratsioon on väga suur ja süsinikusisaldus on suhteliselt väike, kuid kasvukeskkonna parandamiseks on soovitatud üksnes lisada puhvrina suuremas koguses fosfaati ja rohkem peptooni).
                           
                        
                     Olmereovesi
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Kasutage värskelt settinud reovett, mida kogutakse iga päev peamiselt olmereovett töötlevast veepuhastuskäitisest. Seda tuleks koguda enne esmast settimist esmase settimise paagi ülevoolu kanalist või aktiivmudapuhasti sissevoolust ja see peaks üldiselt olema ilma suurte osakesteta. Seda reovett saab enne kasutamist hoida mitu päeva temperatuuril ligikaudu 4 °C (kuid üldiselt ei tohiks seda hoida üle seitsme päeva), kui tõendatakse, et lahustunud orgaanilise süsiniku sisaldus (või keemiline hapnikutarve) ei ole hoidmise ajal oluliselt vähenenud (s.o vähem kui 20 %). Süsteemi häirimise vähendamiseks tuleks igas uues partiis viia lahustunud orgaaniline süsinik (või keemiline hapnikutarve) enne kasutamist sobivale konstantsele väärtusele näiteks kraaniveega lahjendamise teel.
                           
                        
                     Aktiivmuda
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Koguge inokulatsiooniks aktiivmuda hästi käitatud reoveepuhasti või peamiselt olmereovee puhastamiseks kasutatava laborisuuruses aktiivmudaseadme aeratsiooninõust.
                           
                        
                     Uuritava kemikaali põhilahused
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Kui kemikaal on piisavalt lahustuv, valmistage sobiva kontsentratsiooniga (näiteks 1–5 g/l) põhilahus deioniseeritud vees või sünteetilise reovee mineraalses osas (lahustumatute ja lenduvate kemikaalide korral vt 5. liide). Määrake kindlaks põhilahuse lahustunud orgaaniline süsinik ja orgaanilise süsiniku kogusisaldus ning korrake mõõtmisi iga uue partii puhul. Kui lahustunud orgaanilise süsiniku ja orgaanilise süsiniku kogusisalduse erinevus on suurem kui 20 %, kontrollige uuritava kemikaali lahustuvust vees. Määrake põhilahuses lahustunud orgaanilise süsiniku või mõõdetud uuritava kemikaali kontsentratsioon spetsiifilise analüüsi abil ja võrrelge nimiväärtusega, et näha, kas määramise saagis on piisavalt hea (tavaliselt võib eeldada > 90 %). Veenduge (eelkõige dispersiooni korral), kas lahustunud orgaanilist süsinikku saab kasutada analüüsiparameetrina või tuleb kasutada ainult spetsiifilist analüüsimeetodit, millega saab määrata uuritavat kemikaali. Dispersiooni puhul on vaja proovid tsentrifuugida. Iga uue partii puhul määrake lahustunud orgaaniline süsinik, keemiline hapnikutarve või uuritav kemikaal spetsiifilise analüüsimeetodiga.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Määrake põhilahuse pH. Äärmuslikud väärtused osutavad, et kemikaali lisamine võib mõjutada aktiivmuda pH-d katsesüsteemis. Sel juhul neutraliseerige põhilahus väikse koguse anorgaanilise happe või aluse lisamisega, et pH oleks 7 ± 0,5, kuid vältige uuritava kemikaali sadestamist.
                           
                        KATSE KÄIK
                  
                              33.
                           
                           
                              Siin on kirjeldatud aktiivmudapuhasti katset; poorse poti süsteemi puhul tuleb seda mõnevõrra kohandada.
                           
                        
                     Inokulumi valmistamine
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Inokuleerige katsesüsteem katse alguses kas aktiivmuda või väikesekontsentratsioonilise mikroorganismide inokulumiga. Hoidke inokulumi toatemperatuuril aereerituna kuni selle kasutamiseni ja kasutage ee ära 24 tunni jooksul. Aktiivmuda kasutamise korral võtke aktiivmuda proov tõhusalt käitatava bioloogilise reoveepuhasti aeratsiooninõust või labori puhastist, milles käideldakse peamiselt olmereovett. Kui simuleeritakse nitrifitseerivaid tingimusi, võtke muda nitrifitseerivast reoveepuhastist. Määrake kindlaks hõljuvaine kontsentratsioon ja vajaduse korral suurendage muda setitamise teel selle kontsentratsiooni, et katsesüsteemi lisatav maht oleks minimaalne. Kuivaine lähtekontsentratsioon peab olema ligikaudu 2,5 g/l.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Teisel juhul kasutage inokulumina väljavoolu bioloogilisest olmereovee puhastist koguses 2 ml/l kuni 10 ml/l. Võimalikult paljude eri bakteriliikide saamiseks võib olla kasulik eri allikatest, näiteks pinnaveest, saadud inokulumide lisamine. Sel juhul hakkab aktiivmuda katsesüsteemis arenema ja paljunema.
                           
                        
                     Orgaanilise kasvukeskkonna doseerimine
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Hoolitsege, et sisse- ja väljavoolunõud ning sissevoolunõust väljuvad ja väljavoolunõusse sisenevad torud on korralikult puhastatud, et seal katse alguses ja kogu katse vältel ei kasvaks mikroobe. Seadke katsesüsteem üles ruumis, mille temperatuuri saab reguleerida (üldiselt vahemikus 20–25 °C) või kasutage veesärgiga katseseadmeid. Valmistage piisav kogus vajaminevat orgaanilist kasvukeskkonda (punktid 27–29). Täitke kõigepealt aeratsiooninõu ja separaator orgaanilise kasvukeskkonnaga ning lisage inokulum (punktid 34 ja 35). Alustage aereerimist nii, et muda jääks hõljuvasse ja aeroobsesse olekusse, ning alustage sissevooluvee doseerimist ja settinud muda ringlussevõttu. Doseerige hoiunõust orgaanilist kasvukeskkonda katse- ja kontrollseadmete aeratsiooninõudesse (punktid 20, 21) ning koguge vastavad väljavoolud samalaadsetesse kogumisnõudesse. Tavapärase kuuetunnise hüdraulilise retentsiooniaja saavutamiseks pumbatakse orgaanilist kasvukeskkonda juurde kiirusega 0,5 l/h. Selle kiiruse kontrollimiseks mõõtke iga päev doseeritud orgaanilise kasvukeskkonna kogus, märkides üles kasvukeskkonna koguse vähenemise hoiunõudes. Kemikaalide vahelduva vabanemise ja koormuse järsu suurenemise mõju uurimiseks on vaja kasutada muid doseerimisrežiime.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Kui orgaaniline kasvukeskkond valmistatakse kasutamiseks rohkem kui ühe päeva jooksul, on vaja see jahutada temperatuurini umbes 4 °C või rakendada muid asjakohaseid säilitusmeetodeid, et vältida mikroobide kasvu ja biolagunemist väljaspool katseseadet (punkt 29). Kui kasutatakse sünteetilist reovett, võib valmistada kontsentreeritud põhilahuse (näiteks tavapärasest kontsentratsioonist kümme korda suurema kontsentratsiooniga, punkt 28) ja seda säilitada ligikaudu 4 °C juures. Selle põhilahuse võib enne kasutamist hoolikalt segada vajaliku koguse kraaniveega; teise võimalusena võib seda ka otse katsenõusse pumbata, pumbates eraldi juurde vajaliku koguse kraanivett.
                           
                        
                     Uuritava kemikaali doseerimine
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Lisage vajalikus koguses uuritava kemikaali põhilahust (punkt 31) sissevoolu vee nõusse või doseerige seda eraldi pumba abil otse aeratsiooninõusse. Sissevoolu tavaline keskmine kontsentratsioon peaks olema 10–20 mg/l lahustunud orgaanilist süsinikku ja ülempiir ei tohiks olla rohkem kui 50 mg/l. Kui uuritav kemikaal vees hästi ei lahustu või võib avalduda toksilisus, vähendage katsekontsentratsiooni väärtusele 5 mg/l lahustunud orgaanilist süsinikku või veel väiksemale kontsentratsioonile, aga seda ainult juhul, kui on olemas asjakohane spetsiifiline analüüsimeetod ja seda kasutatakse (vees halvasti lahustuvat dispersiooni moodustavat uuritavat kemikaali võib lisada doseerimise erimeetodite abil, vt 5. liide).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Alustage uuritava kemikaali lisamist pärast ajavahemikku, mille jooksul süsteem on stabiliseerunud ja kõrvaldab tõhusalt orgaanilise kasvukeskkonna lahustunud orgaanilist süsinikku (ligikaudu 80 %). Enne uuritava kemikaali lisamist on tähtis kontrollida, et kõik seadmed töötaksid ühevõrra tõhusalt; kui need ei tööta ühevõrra tõhusalt, on üldiselt kasulik eri mudad kokku segada ja lisada eri seadmetesse uuesti võrdsed kogused muda. Kui kasutatakse aktiivmuda inokulumi (ligikaudu) 2,5 g/l (kuivkaal), võib uuritava kemikaali lisada katse alguses, kuna algusest peale üha suuremate koguste otse lisamine võimaldab aktiivmudal uuritava kemikaaliga paremini kohaneda. Olenemata uuritava kemikaali lisamise viisist, soovitatakse korrapäraste ajavahemike järel mõõta voolukiirust ja/või lahuste mahtu hoiunõu(de)s.
                           
                        
                     Aktiivmuda käsitlemine
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Aktiivmuda tahkete osakeste kontsentratsioon stabiliseerub üldiselt katse jooksul vahemikus 1–3 g/l (kuivkaal), olenemata kasutatud inokulumist, kuid sõltuvalt orgaanilise kasvukeskkonna kvaliteedist ja kontsentratsioonist, käitamistingimustest, mudas olevate mikroorganismide laadist ning uuritava kemikaali mõjust.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Määrake aeratsiooninõudes hõljuvaine sisaldus vähemalt iga nädal ja kõrvaldage liigne muda, et hoida kontsentratsioon vahemikus 1 g/l kuni 3 g/l (kuivkaal) või hoidke püsivana muda keskmist kasutusaega, üldiselt vahemikus 6–10 päeva. Kui muda retentsiooniajaks valitakse näiteks kaheksa päeva, siis eemaldage iga päev 1/8 aeratsiooninõu aktiivmuda kogusest ja kõrvaldage see. Tehke seda iga päev või eelistatavalt automaatselt vahelduvalt sisselülituva pumba abil. Hõljuvaine kontsentratsiooni püsivana või kitsastes piirides hoidmisega ei säilitata püsivat muda retentsiooniaega, mis on käitamisnäitaja, mis määrab uuritava kemikaali kontsentratsioon väljavoolus.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Eemaldage kogu katse vältel vähemalt kord päevas aeratsiooninõu ja separaatori seinte külge jäänud muda, et viia see tagasi suspensiooni. Kontrollige korrapäraselt kõiki torusid ja torustikku ning puhastage neid, et vältida biokile teket. Võtke separaatorist settinud muda aeratsiooninõus ringlusse, eelistatavalt vahelduva pumpamise teel. Poorse poti süsteemis ringlussevõttu ei toimu, kuid veenduge, et olete enne nõus mahu märkimisväärset suurenemist pannud sisse puhtad sisemised potid (punkt 21).
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Husmanni puhasti seadmetes võib muda halvasti settida ja võivad tekkida mudakaod. Seda on võimalik vältida, kui teha katse- ja kontrolliseadmetes paralleelselt järgmist:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          korrapäraste ajavahemike järel, näiteks iga nädal, võib lisada värsket muda või flokulanti (näiteks igasse nõusse 2 ml FeCl3 lahust kontsentratsiooniga 50 g/l), kuid tuleb veenduda, et FeCl3 ei põhjusta uuritava kemikaali reaktsiooni või sadestumist;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          suruõhupumba võib asendada peristaltilise pumbaga, mis võimaldab kasutada sissevooluga ligikaudu võrdväärset muda ringlussevõtu voolu ja võimaldab luua settinud mudas anaeroobse ala (suruõhupumba geomeetria tõttu on tagasisuunatud muda minimaalne voolukiirus ligikaudu 12 korda suurem kui sissevoolu kiirus);
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      muda võib pumbata separaatorist aeratsiooninõusse vahelduvalt sisselülituva pumbaga (näiteks 5 minutit iga 2,5 tunni tagant, et võtta muda ringlusse kiirusega 1–1,5 l/h);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vahutamiskadude vältimiseks võib kasutada minimaalsel kontsentratsioonil mittemürgist vahutamisvastast ainet (näiteks silikoonõli);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      õhku võib separaatoris juhtida läbi muda lühikeste järskude pursetena (näiteks 10 sekundit kord tunnis);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aeratsiooninõusse võib teatava ajavahemiku järel doseerida orgaanilist kasvukeskkonda (näiteks 3–10 minutit iga tund).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     Proovide võtmine ja analüüsimine
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Korrapäraste ajavahemike järel tuleb aeratsiooninõudes mõõta aktiivmuda lahustunud hapniku kontsentratsiooni, temperatuuri ja pH-d. Tuleb veenduda, et alati on saadaval piisavalt hapnikku (> 2 mg/l) ja et temperatuuri hoitakse nõutavas vahemikus (üldiselt 20–25 °C). Hoidke pH-d vahemikus 7,5 ± 0,5, doseerides aeratsiooninõusse või sissevoolu väikses koguses anorgaanilist alust või hapet või suurendades orgaanilise kasvukeskkonna puhverdusvõimet (vt punkt 27). Nitrifitseerimise käigus tekib hapet, 1 mg N oksüdeerumisel tekib kogus, mis on ligikaudu võrdväärne kogusega 7 mg CO3
                                 –. Mõõtmiste sagedus oleneb mõõdetavast parameetrist ja süsteemi stabiilsusest ning võib varieeruda ühest korrast päevas kuni ühe korrani nädalas.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Kontroll- ja katsenõude sissevoolus tuleb mõõta lahustunud orgaanilist süsinikku või keemilist hapnikutarvet. Katse sissevooluvees tuleb spetsiifilise analüüsiga mõõta uuritava kemikaali kontsentratsiooni või seda tuleb hinnata põhilahuse kontsentratsiooni (punkt 31), kasutatud mahu ja katseseadmesse doseeritud reovee koguse põhjal. Uuritava kemikaali kontsentratsiooni on soovitatav arvutada, et vähendada kontsentratsiooniandmete varieerumist.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Võtke kogutud väljavoolust vajalikud proovid (näiteks 24 tunni koondproovid) ja filtrige need läbi membraani, mille poori suurus on 0,45 μm, või tsentrifuugige need 40 000 m/s2 juures 15 minutit. Kui filtrida on raske, tuleb kasutada tsentrifuugimist. Määrake lahustunud orgaaniline süsinik või keemiline hapnikutarve vähemalt kaks korda, et mõõta täielikku biolagunemist ja (kui seda nõutakse) uuritava kemikaali spetsiifilise analüüsiga esmast biolagunemist.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Keemilise hapnikutarbe kasutamine võib põhjustada analüüsiprobleeme väikestel kontsentratsioonidel ja seega soovitatakse seda ainult juhul, kui kasutatakse piisavalt suurt katsekontsentratsiooni (ligikaudu 30 mg/l). Tugevasti adsorbeeruva kemikaali puhul soovitatakse samuti mõõta mudas adsorbeeritud kemikaali, kasutades spetsiifilist uuritava kemikaali analüüsi meetodit.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Proovivõtu sagedus oleneb katse eeldatavast kestusest. Soovitatav sagedus on kolm korda nädalas. Kui seadmed töötavad tõhusalt, laske süsteemil pärast uuritava kemikaali lisamist 1–6 nädalat kohaneda, et saavutada kohanemise statsionaarne olek. Platoofaasis (punkt 59), mis kestab tavaliselt kolm nädalat, mõõtke katsetulemuse hindamiseks, eelistatavalt vähemalt 15 kehtivat väärtust. Katse võib lõpetada, kui on jõutud piisava kõrvaldamise määrani (näiteks > 90 %) ja saadud kõnealused 15 väärtust, mis väljendavad kolme nädala jooksul igal tööpäeval tehtud analüüse. Katse ei tohiks pärast uuritava kemikaali lisamist üldiselt kesta üle 12 nädala.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Kui muda nitrifitseerib ja kui uuritakse kemikaali mõjusid nitrifitseerimisele, tuleb katse- ja kontrollseadmete väljavoolu proovides mõõta vähemalt kord nädalas ammooniumi- ja/või nitriti- ja nitraadisisaldust.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Kõik analüüsid ja eelkõige lämmastikusisalduse määramine tuleks teha võimalikult kiiresti. Kui analüüsid tuleb edasi lükata, säilitage proove tihedalt suletud pudelis pimedas ja temperatuuril ligikaudu 4 oC. Kui proove tuleb säilitada kauem kui 48 tundi, siis kasutage säilitamiseks sügavkülmutamist, hapestamist (näiteks 1 liitri kohta 10 ml väävelhappelahuse (400 g/l) lisamisega) või asjakohase mürgise aine lisamist (näiteks 1 liitri kohta 20 ml elavhõbe(II)kloriidi lahuse (10 g/l) lisamisega). Kontrollige, et säilitamise meetod ei mõjutaks analüüsi tulemusi.
                           
                        
                     Katseseadmete ühendamine
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Kui kasutatakse ühendamist (3. liide), siis vahetage iga päev sama kogus aktiivmuda (150 ml kuni 1 500 ml 3 liitrit lahust sisaldavate aeratsiooninõude puhul) katseseadme ja selle kontrollseadme aeratsiooninõude vahel. Kui uuritav kemikaal adsorbeerub tugevasti muda külge, siis vahetage ainult separaatorite supernatanti. Mõlemal juhul kasutage katsetulemuste arvutamiseks parandustegurit (punkt 55).
                           
                        ANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE
                  
                     Tulemuste töötlemine
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Arvutage uuritava kemikaali lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe kõrvaldamise protsent igal mõõtmise ajal järgmise võrrandi abil:
                              
                                 
                              kus
                              
                                          Dt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe kõrvaldamise protsent ajal t
                                       
                                    
                                          Cs
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          uuritava kemikaali põhjustatud lahustunud orgaaniline süsinik või keemiline hapnikutarve sissevoolu vees, eelistatavalt hinnatud põhilahuse järgi (mg/l)
                                       
                                    
                                          E
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          katse väljavoolus ajal t mõõdetud lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe näitaja (mg/l)
                                       
                                    
                                          Eo
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          kontrollseadme väljavoolus ajal t mõõdetud lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe näitaja (mg/l)
                                       
                                    
                        
                              53.
                           
                           
                              Kontrollseadme orgaanilise kasvukeskkonna lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe kõrvaldamise määr on kasulik teave katse ajal aktiivmuda biolagundava aktiivsuse hindamiseks. Arvutage kõrvaldamise protsent järgmise võrrandi alusel:
                              
                                 
                              kus
                              
                                          DB
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          kontrollseadme orgaanilises kasvukeskkonnas lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe kõrvaldamise protsent ajal t
                                       
                                    
                                          CM
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          orgaanilise kasvukeskkonna lahustunud orgaaniline süsinik või keemiline hapnikutarve kontrollseadme sissevoolu vees (mg/l)
                                       
                                    Soovi korral võite arvutada orgaanilise kasvukeskkonna ja katseseadmes uuritavast kemikaalist tingitud lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe kõrvaldamise protsendi järgmise võrrandi abil:
                              
                                 
                              kus
                              
                                          DT
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          katse kogu sissevooluvee lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe kõrvaldamise protsent
                                       
                                    
                                          CT
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          katse kogu sissevooluvee või põhilahuse alusel arvutatud lahustunud orgaaniline süsinik või keemiline hapnikutarve (mg/l)
                                       
                                    
                        
                              54.
                           
                           
                              Kui mõõdetakse uuritava kemikaali kõrvaldamist, arvutage see igal hindamisajal spetsiifilise analüüsi meetodiga järgmise võrrandi abil:
                              
                                 
                              kus
                              
                                          DST
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          uuritava kemikaali esmase kõrvaldamise protsent ajal t
                                       
                                    
                                          Si
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          uuritava kemikaali mõõdetud või hinnatud kontsentratsioon katse sissevooluvees (mg/l)
                                       
                                    
                                          Se
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          uuritava kemikaali mõõdetud kontsentratsioon katse väljavooluvees ajal t (mg/l)
                                       
                                    
                        
                              55.
                           
                           
                              Kui kasutatakse ühendatud režiimi, siis kompenseerige uuritava kemikaali lahjenemine aeratsiooninõus muda vahetuse tõttu parandusteguri abil (vt 3. liide). Kui kasutati keskmist hüdraulilist retentsiooniaega kuus tundi ja aeratsiooninõus poole aktiivmuda mahu vahetamist, tuleb igapäevaseid määratud kõrvaldamise näitajaid (Dt, punkt 52) parandada, et leida tegelik uuritava kemikaali kõrvaldamise määr Dtc järgmise võrrandiga:
                              
                                 
                           
                        
                     Katsetulemuste esitamine
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Koostage kõrvaldamisprotsendi Dt (või Dtc) ja Dst (kui see on leitud) ajast sõltuvuse graafik (vt 2. liide). Uuritava kemikaali (kui niisuguse või lahustunud orgaanilise süsinikuna) kõrvaldamise kõvera kuju alusel võib teha järeldusi kõrvaldamisprotsessi kohta.
                           
                        
                     Adsorptsioon
                  
                  
                              57.
                           
                           
                              Kui uuritavast kemikaalist tingitud lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamise määr on suur kohe katse algusest peale, siis kõrvaldatakse uuritavat kemikaali tõenäoliselt aktiivmuda tahketesse osakestesse adsorbeerimise teel. Seda on võimalik tõendada adsorbeerunud uuritava kemikaali määramisega spetsiifilise analüüsi abil. Tavaliselt ei jää adsorbeeritavast kemikaalist tingitud lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamine suureks kogu katse vältel; üldiselt toimub alguses suures koguses kõrvaldamine, mis langeb järk-järgult tasakaaluväärtusele. Kui adsorbeeritav uuritav kemikaal suudab siiski mingil viisil põhjustada mikroobipopulatsiooni aklimatiseerumise, siis suureneb seejärel uuritavast kemikaalist tingitud lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamise määr ja jõuab kõrge platooväärtuseni.
                           
                        
                     Ootefaas
                  
                  
                              58.
                           
                           
                              Nagu ka staatilistes sõelumiskatsetes, nii vajavad uuritavad kemikaalid enne täieliku biolagundamise toimumist sageli ootefaasi. Ootefaasis toimub lagundavate bakterite aklimatiseerumine või kohanemine ja uuritavat kemikaali peaaegu ei kõrvaldata; seejärel toimub kõnealuste bakterite esialgne kasv. See faas lõpeb ja lagundamisfaasi alguseks peetakse hetke, kui ligikaudu 10 % uuritava kemikaali esialgsest kogusest on kõrvaldatud (võttes arvesse adsorptsiooni, kui see toimub). Ootefaasi pikkus võib olla väga erinev ja halvasti reprodutseeritav.
                           
                        
                     Platoofaas
                  
                  
                              59.
                           
                           
                              Pidevas katses kõrvaldamist näitava kõvera platoofaas on määratletud kui faas, milles lagundamine on maksimaalne. Platoofaas peaks kestma vähemalt kolm nädalat ja selle käigus tuleks mõõta ligikaudu 15 kehtivat näitajat.
                           
                        
                     Uuritava kemikaali keskmine kõrvaldamise määr
                  
                  
                              60.
                           
                           
                              Arvutage uuritava kemikaali kõrvaldamise näitaja (Dt) väärtustest platoofaasis keskväärtus. See on uuritava kemikaali kõrvaldamise määr ümardatuna lähima täisarvuni (1 %). Samuti soovitatakse arvutada keskväärtuse 95 % usaldusvahemik.
                           
                        
                     Orgaanilise kasvukeskkonna kõrvaldamine
                  
                  
                              61.
                           
                           
                              Koostage kontrollseadme orgaanilise kasvukeskkonna lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe kõrvaldamisprotsendi ajast sõltuvuse graafik (DB). Märkige keskmine kõrvaldamise määr samal viisil kui uuritava kemikaali puhul (punkt 60).
                           
                        
                     Biolagundamise tunnused
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Kui uuritav kemikaal ei adsorbeeru märkimisväärselt aktiivmudasse ja kõrvaldamist näitaval kõveral on ootefaasiga, lagundamis- ja platoofaasiga biolagundamist näitava kõvera tavapärane kuju (punktid 58, 59), siis võib kindel olla, et mõõdetud kõrvaldamise on põhjustanud biolagundamine. Kui on toimunud suures koguses esialgne kõrvaldamine, siis ei suuda simulatsioonikatse eristada bioloogilise ja abiootilise kõrvaldamise protsesse. Sellistel juhtudel ja muudel juhtudel, kui biolagundamise suhtes tekivad kahtlused (näiteks kui toimub väljapuhumine (stripping)), tuleb analüüsida adsorbeerunud uuritavaid kemikaale või teha täiendavad staatilised biolagundamise katsed täpselt bioloogilisi protsesse näitavate parameetrite alusel. Kõnealused katsed on hapniku sidumise meetodid (käesoleva lisa peatüki C.4 meetodid C.4-D, C.4-E ja C.4-F (6)) või katse, milles mõõdetakse süsinikdioksiidi tekkimist (käesoleva lisa peatüki C.4 meetod C.4-C (6)) või ISO Headspace-meetod (18), kasutades simulatsioonikatsest eelnevalt kokku puutunud inokulumi. Kui mõõdetud on nii lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamist kui ka konkreetse kemikaali kõrvaldamist, siis näitab kõrvaldamisprotsentide oluline erinevus (kui esimene on viimati nimetatust väiksem) orgaaniliste vahesaaduste olemasolu väljavoolus; selliseid vahesaadusi võib olla keerulisem lagundada kui lähtekemikaali.
                           
                        
                     Katsetulemuste kehtivus
                  
                  
                              63.
                           
                           
                              Inokulumi tavapärase biolagundamise käitumise kohta on saadud teavet, kui on määratud orgaanilise kasvukeskkonna kõrvaldamise määr (punkt 53) kontrollseadmes. Katset võib pidada kehtivaks, kui lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe kõrvaldamise määr kontrollseadme(te)s on kahe nädala möödudes > 80 % ja ei ole täheldatud ebatavalisi asjaolusid.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Kui on kasutatud kiirelt biolagundatavat (võrdlus)kemikaali, peaks biolagunemise määr (Dt, punkt 52) olema > 90 %.
                           
                        
                              65.
                           
                           
                              Kui katse tehakse nitrifitseerivates tingimustes, peaks väljavoolude keskmine kontsentratsioon olema < 1 mg/l ammoniaaklämmastikku ja < 2 mg/l nitritlämmastikku.
                           
                        
                              66.
                           
                           
                              Kui need kriteeriumid (punktid 63–65) ei ole täidetud, siis korrake katset muust allikast pärit inokulumiga, katsetage võrdluskemikaali ja vaadake läbi kõigi katsete tegemise käik.
                           
                        
                     Katseprotokoll
                  
                  
                              67.
                           
                           
                              Katseprotokollis esitatakse alljärgnev teave.
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uuritav kemikaal:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tunnusandmed;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      füüsikaline olek ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katsetingimused:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      katsesüsteemi tüüp, mis tahes muudatused lahustumatu või lenduva kemikaali katsetamiseks;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      orgaanilise kasvukeskkonna tüüp;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tööstusliku reovee osakaal reovees ja selle laad, kui see on teada;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inokulum, laad ja proovivõtukoht (-kohad), kontsentratsioon ja kõik eeltöötlused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uuritava kemikaali põhilahus: lahustunud orgaanilise süsiniku sisaldus ja orgaanilise süsiniku kogusisaldus; suspensiooni korral selle valmistamise viis; kasutatud katsekontsentratsioon; kui see on väljaspool vahemikku 10–20 mg/l lahustunud orgaanilist süsinikku, siis selle põhjendus; lisamise meetod; esmakordse lisamise kuupäev; kõik muudatused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      keskmine muda kasutamise aeg ja keskmine hüdrauliline retentsiooniaeg; muda kõrvaldamise meetod; muda pundumise, kao jne vältimise meetodid;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kasutatud analüüsimeetodid;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      katsetemperatuur;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      muda pundumisomadused, muda mahuindeks (sludge volume index, SVI), muda kontsentratsioon aktiivmudas (mixed liquor suspended solids, MLSS);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kõik kõrvalekalded tavalisest katse käigust ja kõik asjaolud, mis võivad olla mõjutanud tulemusi.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katsetulemused:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kõik mõõdetud andmed (lahustunud orgaaniline süsinik, keemiline hapnikutarve, uuritava kemikaali määramine spetsiifilise analüüsimeetodiga, pH, temperatuur, hapniku kontsentratsioon, hõljuvaine, N-kemikaalid (kui see on asjakohane));
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kõik Dt (või Dtc), DB, DSt arvutatud väärtused tabelite kujul ja kõrvaldamist näitavad kõverad;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      teave ootefaasi ja platoofaasi, katse kestuse, uuritava kemikaali ja kontrollseadme orgaanilise kasvukeskkonna kõrvaldamise määra kohta koos statistilise teabe ja kinnitustega biolagundatavuse ja katse kehtivuse kohta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tulemuste arutelu.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     KIRJANDUS
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              Swisher RD (1987). „Surfactant Biodegradation”, 2nd Edn. Marcel Dekker Inc. New York, 1085 pp.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              German Government (1962). Ordinance of the degradability of detergents in washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No.49: 698–706.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Painter HA and King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing biodegradability. Technical Report No.70, Water Research Centre, Medmenham, UK.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Painter HA and King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. Res. 12: 909–915.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Eckenfelder, W.W (19) US EPA.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk C.4 „Kohese biolagunduvuse määramine”.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk C.12 „Biodegradatsioon – modifitseeritud SCAS test”.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk C.19 „Adsorptsiooniteguri (K
                                    OC
                                 ) kindlaksmääramine mullas ja reoveesettes kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) abil”.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Gerike P and Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3:157–173.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and conclusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45–55.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Painter HA and Bealing D (1989). Experience and data from the OECD activated sludge simulation test. pp 113–138, In: Laboratory tests for simulation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              ISO 11733 (1995; revised 2004). Evaluation of the elimination and biodegradability of organic substances in an aqueous medium - activated sludge simulation test.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol. Deterg.: 33–48.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 (2): 340–343.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Gerike P, Fischer WK and Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753–758.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214–220.
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. Methods for the examination of waters and associated materials. pp. 91–98, ISBN 011 751661 9.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              ISO 14593 (1998). Water Quality - Evaluation in an aqueous medium of the ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the analysis of inorganic carbon in sealed vessels.
                           
                        
                     1. liide
                     
                        Joonis 1
                     
                     
                        Seade biolagundatavuse hindamiseks
                     
                     Husmanni seade
                     
                        
                     
                                 A.
                              
                              
                                 Hoiunõu
                              
                           
                                 B.
                              
                              
                                 Doseerimispump
                              
                           
                                 C.
                              
                              
                                 Aeratsioonikamber (maht 3 l)
                              
                           
                                 D.
                              
                              
                                 Settimisnõu
                              
                           
                                 E.
                              
                              
                                 Suruõhupump
                              
                           
                                 F.
                              
                              
                                 Kogumisnõu
                              
                           
                                 G.
                              
                              
                                 Aeraator
                              
                           
                                 H.
                              
                              
                                 Õhuvoolumõõtur
                              
                           
                        Joonis 2
                     
                     
                        Seade biolagundatavuse hindamiseks
                     
                     Poorne pott
                     
                        
                     
                                 A.
                              
                              
                                 Hoiunõu
                              
                           
                                 B.
                              
                              
                                 Doseerimispump
                              
                           
                                 C.
                              
                              
                                 Poorne aeratsiooninõu
                              
                           
                                 D.
                              
                              
                                 Mitteläbilaskev välimine nõu
                              
                           
                                 E.
                              
                              
                                 Kogumisnõu
                              
                           
                                 F.
                              
                              
                                 Difusiooninõu
                              
                           
                                 G.
                              
                              
                                 Õhuvoolumõõtur
                              
                           
                        Joonis 3
                     
                     
                        Kolmeliitrise poorse poti aeratsiooninõu andmed
                     
                     
                        
                  
                  
                     2. liide
                     
                        Kõrvaldamiskõvera näide
                     
                     
                        
                  
                  
                     3. liide
                     [TEADMISEKS]
                     KATSESEADMETE ÜHENDAMINE
                     Et proovida võrdsustada reovett ja katsekemikaali käitleva katseseadme ning ainult reovett käitleva kontrollseadme mudade mikroobipopulatsioone, võeti kasutusele mudade igapäevane vahetamine teineteisega (1). See tegevus nimetati ühendamiseks ja selle meetodi kohta kasutatakse nimetust ühendatud seadmed. Ühendamist kasutati esialgu Husmanni aktiivmuda seadmetes, kuid seda on tehtud ka poorse poti seadmetega (2, 3). Ühendamata ja ühendatud seadmete vahel ei leitud Husmanni seadmete ega ka poorse poti seadmete kasutamisel tulemustes märkimisväärseid erinevusi, seega ei anna seadmete ühendamiseks kulutatud aeg ja energia eeliseid.
                     Mudavahetused võivad jätta olulise kõrvaldamise mulje, kuna osa katsekemikaalist kantakse üle ning katsekemikaali kontsentratsioonid katse- ja kontrollseadmete väljavooludes muutuvad peaaegu võrdseks. Seega tuleb kasutada parandustegureid, mis olenevad vahetatud osa suurusest ja keskmisest hüdraulilisest retentsiooniajast. Arvutuste täpsemad kirjeldused on avaldatud (1).
                     Lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe kõrvaldamise määra parandatud väärtused saab arvutada järgmise üldvalemi alusel:
                     
                        
                     kus
                     
                                 Dtc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe kõrvaldamise parandatud protsent
                              
                           
                                 Dt
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe kõrvaldamise määratud protsent
                              
                           
                                 a
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 aktiivmuda seadmete mahust vahetatud osa
                              
                           
                                 r
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 keskmine hüdrauliline retentsiooniaeg (h)
                              
                           Kui vahetatakse näiteks pool aeratsiooninõu mahust (a = 0,5) ja keskmine hüdrauliline retentsiooniaeg on kuus tundi, on parandusteguri võrrand järgmine:
                     
                        
                     
                        KIRJANDUS
                     
                     
                                 1)
                              
                              
                                 Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131–1135.
                              
                           
                                 2)
                              
                              
                                 Painter HA, Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD Activated Sludge Simulation Test. pp. 113–138. In: Laboratory Tests for Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
                              
                           
                                 3)
                              
                              
                                 Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK.
                              
                           
                  
                     4. liide
                     AKTIIVMUDA INHIBITSIOONI HINDAMINE
                     
                        Protsessi inhibeerimine uuritava kemikaali poolt
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Kemikaali (või reovett) ei pruugita simulatsioonikatse käigus lagundada või kõrvaldada ning see võib isegi inhibeerida muda mikroorganisme. Muid kemikaale biolagundatakse väikesel kontsentratsioonil, kuid neil on suuremal kontsentratsioonil inhibeeriv mõju (hormees). Inhibeeriv mõju võib olla leitud juba varasemal etapil või selle võib kindlaks teha mürgisuse katsega, kasutades simulatsioonikatses kasutatavaga samalaadset või identset inokulumi (1). Kõnealused meetodid on hapniku tarbimise inhibitsioon (käesoleva lisa peatükk C.11 (2) ja ISO 8192 (3)) või muda organismide kasvu inhibitsioon (ISO 15522 (4)).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Simulatsioonikatses ilmneb inhibitsioon katsenõust ja kontrollnõust saadud väljavoolus lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe erinevusena, mis on suurem kui uuritava kemikaalina lisatud lahustunud orgaaniline süsinik. Teisiti öelduna väheneb töötlemise käigus orgaanilise kasvukeskkonna lahustunud orgaanilise süsiniku (ja biokeemilise hapnikutarbe, keemilise hapnikutarbe ja/või NH+
                                    4) kõrvaldamise protsent uuritava kemikaali olemasolu tõttu. Sellisel juhul tuleks katset korrata, vähendades uuritava kemikaali kontsentratsiooni, kuni jõutakse tasemeni, mille juures inhibitsiooni ei teki, ja kui võib-olla vähendada kontsentratsiooni veel, hakatakse uuritavat kemikaali biolagundama. Kui uuritaval kemikaalil (või reoveel) on siiski protsessile kõigil katsetatud kontsentratsioonidel kahjulik mõju, näitab see seda, et kõnealust kemikaali on keeruline kui mitte võimatu bioloogiliselt töödelda, kuid otstarbekas võib olla korrata katset muust allikast pärit aktiivmudaga ja/või lastes mudal järkjärgulisemalt aklimatiseeruda.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Vastupidisel juhul, kui uuritav kemikaal simulatsioonikatses esimesel katsel biokõrvaldatakse, tuleks selle kontsentratsiooni suurendada, kui on vaja teada, kas kemikaalil võiks olla inhibeeriv mõju.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Inhibitsiooni astmete määramisel tuleks meeles pidada, et aktiivmuda populatsioon võib muutuda ja seega võivad mikroorganismid aja jooksul hakata inhibeerivat kemikaali taluma.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Inhibitsiooni määra arvutamine:
                                 katse- ja kontrollseadmete biokeemilise hapnikutarbe, lahustunud orgaanilise süsiniku, keemilise hapnikutarbe jne üldist kõrvaldamise protsenti Ro saab arvutada järgmise võrrandi alusel:
                                 
                                    
                                 kus:
                                 
                                             I
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             katse- ja kontrollnõu biokeemilise hapnikutarbe, lahustunud orgaanilise süsiniku, keemilise hapnikutarbe jne kontsentratsioon (mg/l) sissevoolus,
                                          
                                       
                                             E
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             vastavad kontsentratsioonid (mg/l) väljavoolus.
                                          
                                       I ja E tuleb katseseadmetes uuritava kemikaalina lisatud lahustunud orgaanilise süsiniku arvestamiseks parandada, muidu annavad inhibitsiooniprotsendi arvutused vale tulemuse.
                                 Uuritavast kemikaalist tingitud inhibitsiooni määra saab arvutada järgmise võrrandi alusel:
                                 
                                    
                                 kus:
                                 
                                             Rc
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             kontrollnõudes kõrvaldamise protsent
                                          
                                       
                                             Rt
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             katsenõudes kõrvaldamise protsent
                                          
                                       
                           
                        KIRJANDUS
                     
                     
                                 1)
                              
                              
                                 Reynolds L et al. (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259.
                              
                           
                                 2)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.11 „Biodegradatsioon – aktiivmuda respiratsiooni pärssimise katse”.
                              
                           
                                 3)
                              
                              
                                 ISO 8192 (2007) Water quality - Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation.
                              
                           
                                 4)
                              
                              
                                 ISO 15522 (1999) Water Quality - Determination of the inhibitory effect of water constituents on activated sludge microorganisms.
                              
                           
                  
                     5. liide
                     
                        Vees halvasti lahustuvad uuritavad kemikaalid – lenduvad kemikaalid
                     
                     
                        Vees halvasti lahustuvad kemikaalid
                     
                     Vees halvasti lahustuvate ja mittelahustuvate kemikaalide kasutamise kohta reovee puhastamist simuleerivates katsetes näib olevat avaldatud vähe töid (1, 2, 3).
                     Ei ole ühtegi uuritava kemikaali hajutamise meetodit, mis oleks kohaldatav kõigile mittelahustuvatele kemikaalidele. Näib, et kaks neljast standardis ISO 10634 (4) kirjeldatud meetodist on sobivad simulatsioonikatsetes uuritavate kemikaalide hajutamise proovimiseks; need on emulgaatorite ja/või ultrahelienergia kasutamine. Tuleks määrata niiviisi saadava dispersiooni püsivus vähemalt 24 tunni jooksul. Asjakohaselt stabiliseeritud dispersioone, mida hoitakse pidevalt segatavas mahutis (punkt 38), tuleks seejärel doseerida aeratsiooninõusse eraldi olmereoveest (või sünteetilisest reoveest).
                     Kui dispersioon on stabiilne, siis tuleb uurida, kuidas uuritavat kemikaali saab hajutatud kujul määrata. Lahustunud orgaaniline süsinik tõenäoliselt selleks ei sobi, seega tuleks uuritava kemikaali jaoks leida spetsiifiline analüüsimeetod, mida võiks kasutada väljavoolude, väljavoolu tahkete osakeste ja aktiivmuda puhul. Aktiivmuda protsessi simuleerimisel uuritava kemikaaliga toimuvad reaktsioonid tuleks seejärel määrata vedel- ja tahkes faasis. Seega määrataks massibilanss, et otsustada, kas uuritav kemikaal on biolagundatud. See näitaks siiski ainult esmast biolagunemist. Täieliku biolagunemise tõendamist tuleks proovida, kohaldades kiirele biolagundatavusele respiromeetrilist katset (käesoleva lisa peatüki C.4 (5) meetodid C.4-C, C.4-F või C.4-D), kasutades inokulumina simulatsioonikatses uuritava kemikaaliga kokku puutunud muda.
                     
                        Lenduvad kemikaalid
                     
                     Reovee puhastamise simulatsioonide kohaldamine lenduvatele kemikaalide on nii vaieldav kui ka problemaatiline. Nagu ka vees halvasti lahustuvate uuritavate kemikaalide puhul, näib olevat avaldatud vähe artikleid, milles kirjeldatakse lenduvate kemikaalide simulatsioonikatseid. Kasutatakse tavalist tüüpi täieliku segamise seadet ja tihendatud aeratsiooni- ja settenõusid, mõõdetakse ja kontrollitakse voolumõõdikute abil õhuvoolu ning juhitakse väljuv gaas läbi separaatorite, et koguda lenduvat orgaanilist ainet. Mõnikord kasutatakse vaakumpumpa, et juhtida väljuv gaas läbi külmseparaatori või läbipuhumisseparaatori, mis sisaldab gaaskromatograafiliste analüüside jaoks Tenaxit ja silikageeli. Separaatoris leiduva uuritava kemikaali saab määrata analüütiliselt.
                     Katse tehakse kahes osas. Seadmeid käitatakse kõigepealt ilma mudata, aga sünteetilise reoveega ja uuritava kemikaaliga, mida pumbatakse aeratsiooninõusse. Kogutakse sissevoolu, väljavoolu ja väljutatud gaasi proovid ning paari päeva jooksul analüüsitakse uuritava kemikaali olemasolu neis. Kogutud andmete alusel on võimalik arvutada süsteemist väljapuhutud uuritava kemikaali protsent (Rvs).
                     Seejärel tehakse (mudaga) tavaline bioloogiline katse väljapuhumise uuringuga identsetes tingimustes. Samuti tehakse lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe mõõtmised, et kontrollida seadmete tõhusat toimimist. Katse esimese osa jooksul tehakse aeg-ajalt analüüse, et määrata uuritav kemikaal sissevoolus, väljavoolus ja väljuvas gaasis; pärast aklimatiseerumist tehakse analüüse sagedamini. Statsionaarse oleku andmete põhjal võib arvutada uuritava kemikaali kõigi protsesside (füüsikaline ja bioloogiline) käigus vedelfaasist kõrvaldamise protsendi (RT) ning samuti süsteemist väljapuhutud osa (RV).
                     Arvutus
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Mittebioloogilises katses võib arvutada süsteemist väljapuhutud uuritava materjali protsendi (RVP) järgmise võrrandi alusel:
                                 kus
                                 
                                             RVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali kõrvaldamine lendumise teel (%);
                                          
                                       
                                             SVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             separaatorisse kogutud uuritav kemikaal, väljendatuna vedelfaasi võrdväärse kontsentratsioonina (mg/l);
                                          
                                       
                                             SIP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali kontsentratsioon sissevoolus (mg/l).
                                          
                                       
                           
                                 b)
                              
                              
                                 Bioloogilises katses võib arvutada süsteemist väljapuhutud uuritava materjali protsendi (RV) järgmise võrrandi alusel:
                                 kus
                                 
                                             RV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali kõrvaldamine lendumise teel bioloogilises katses (%);
                                          
                                       
                                             SV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             separaatorisse kogutud uuritav kemikaal bioloogilises katses, väljendatuna sissevooluvedeliku võrdväärse kontsentratsioonina (mg/l);
                                          
                                       
                                             SI
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali kontsentratsioon sissevoolus (mg/l).
                                          
                                       
                           
                                 c)
                              
                              
                                 Bioloogilises katses võib kõikides protsessides kõrvaldatud uuritava kemikaali protsendi (RT) leida järgmise võrrandi alusel:
                                 kus
                                 SE= uuritava kemikaali kontsentratsioon (vedelas) väljavoolus (mg/l).
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 Seega on võimalik arvutada biolagundamise ja adsorptsiooni teel kõrvaldatud protsenti (RBA) järgmisest võrrandist:
                                 Tuleks teha eraldi katsed, et teha kindlaks, kas uuritavat kemikaali adsorbeeritakse; kui see on nii, siis võib teha täiendava paranduse.
                              
                           
                                 e)
                              
                              
                                 Bioloogilisest (Rv) ja mittebioloogilisest (Rvp) katsesüsteemist väljapuhutud uuritava kemikaali osakaalu võrdlemine näitab üldist mõju, mis bioloogilisel töötlemisel on uuritava kemikaali heitele atmosfääri.
                                 
                                             
                                                Näide:
                                             
                                          
                                          
                                             benseen
                                          
                                       Muda retentsiooniaeg = neli päeva
                                 Sünteetilise reovee retentsiooniaeg = kaheksa tundi
                                 
                                             SIP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             SI = 150 mg/l
                                          
                                       
                                             SVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             150 mg/l (SEP = 0)
                                          
                                       
                                             SV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             22,5 mg/l
                                          
                                       
                                             SE
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             50 μg/l
                                          
                                       Seetõttu
                                 
                                             RVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             100 %, RV = 15 %
                                          
                                       
                                             RT
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             100 % ja RBA = 85 %.
                                          
                                       Eeldati, et benseen ei adsorbeerunud mudale.
                              
                           
                        KIRJANDUS
                     
                     
                                 1)
                              
                              
                                 Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939–854.
                              
                           
                                 2)
                              
                              
                                 Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.
                              
                           
                                 3)
                              
                              
                                 Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control Fed. 55: 97.
                              
                           
                                 4)
                              
                              
                                 ISO 10634 (1995) Water Quality - Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
                              
                           
                                 5)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.4 „Kohese biolagunduvuse määramine”.
                              
                           
                  
                     6. liide
                     
                        Muda retentsiooniaja mõju kemikaalide töödeldavusele
                     
                     SISSEJUHATUS
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Peamises tekstiosas kirjeldatud meetod kavandati selleks, et teha kindlaks, kas uuritavaid kemikaale (üldjuhul neid, mis on teadaolevalt iseeneslikult, aga mitte kohe biolagundatavad) on võimalik biolagundada reoveepuhastite piiratud tingimustes. Tulemused väljendatakse kõrvaldamise protsendina ja biolagundamise protsendina. Aktiivmuda seadmete käitamise tingimused ja sissevoolu valik võimaldavad uuritava kemikaali kontsentratsiooni puhul väljavoolus üpris suuri erinevusi. Katsed tehakse ainult ühel muda tahkete osakeste nominaalsel kontsentratsioonil või ühe nominaalse muda retentsiooniajaga ning kirjeldatud muda kõrvaldamise režiimid võivad põhjustada muda retentsiooniaja väärtuse märkimisväärset erinemist katse vältel nii eri päevadel kui ka ühe päeva jooksul.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Selle variandi (1, 2) puhul kontrollitakse muda retentsiooniaega palju kitsamates piirides iga 24-tunnise ajavahemiku vältel (täpselt nagu suure ulatuse puhul), mille tulemusel saadakse püsivam kontsentratsioon väljavooludes. Soovitatakse kasutada olmereovett, kuna see annab kõrvaldamise püsivama ja suurema osakaalu. Samuti uuritakse mitme muda retentsiooniaja väärtuse mõju ning üksikasjalikumas uuringus võidakse määrata väljavoolu kontsentratsiooni sõltuvus temperatuurist.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Seni ei ole ühist arusaama selle kohta, millised kineetilised mudelid kirjeldavad kemikaali lagunemist reovee puhastamisel teatavatel tingimustel. Kogutud andmete kirjeldamiseks valiti bakterite kasvu ja substraadi kasutamise Monod’ mudel (1, 2), kuna meetodit oli kavas kasutada ainult suurtes kogustes toodetavate kemikaalide puhul, mille kontsentratsioon reovees on üle 1 mg/l. Lihtsustatud mudeli ja tehtud eelduste õigsust kontrolliti erineva esmase biolagundatavusega alkoholetoksülaatide seeria abil (2, 3).
                                 
                                             
                                                Märkus.
                                             
                                          
                                          
                                             Selles meetodi variandis on lähedaselt järgitud suurt osa käesoleva katsemeetodi C.10-A tekstist ning allpool on esitatud ainud need üksikasjad, mis on erinevad.
                                          
                                       
                           KATSE PÕHIMÕTE
                     
                                 4.
                              
                              
                                 Aktiivmuda poorse poti seadmeid, mis on projekteeritud selleks, et võimaldada (peaaegu) pidevat vedela segu kõrvaldamist ja muda retentsiooniaja (SRT või θs) väga täpset reguleerimist, kasutatakse ühendamata režiimis mitme muda retentsiooniajaga ning soovi korral mitmel temperatuuril. Retentsiooniaeg on tavaliselt vahemikus 2–10 päeva ja temperatuur on 5–20 °C. Reovett (eelistatavalt olmereovett) ja uuritava kemikaali lahust doseeritakse seadmetesse eraldi sellise kiirusega, et saavutada nõutav reovee retentsiooniaeg (3–6 tundi) ja uuritava kemikaali nõutav kontsentratsioon sissevoolus. Kontrollseadmeid, kuhu uuritavat kemikaali ei lisata, käitatakse samal ajal võrdlusandmete saamiseks.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Võib kasutada muud tüüpi seadmeid, kuid tuleks olla väga hoolikas, et tagada muda retentsiooniaja hea reguleerimine. Näiteks settenõuga puhasti kasutamisel võib olla vaja võtta arvesse puhasti väljavoolu kaudu toimuvat tahkete osakeste kadu. Lisaks tuleks võtta erilisi ettevaatusabinõusid, et vältida vigu, mida põhjustab muda koguse varieerumine settenõus.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Seadmeid käitatakse iga valitud tingimuste komplektiga ja pärast tasakaaluoleku saavutamist määratakse uuritava kemikaali väljavoolude keskmised statsionaarse oleku kontsentratsioonid ning soovi korral lahustunud orgaanilise süsiniku näitajad ligikaudu kolmenädalase ajavahemiku vältel. Lisaks uuritava kemikaali ja, soovi korral, lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamise protsendi hindamisele tuleb graafiliselt esitada väljavoolu kontsentratsiooni sõltuvus puhasti kasutustingimustest. Selle alusel saab arvutada esialgsed kineetilised konstandid ja ennustada tingimusi, milles võib töödelda uuritavat kemikaali.
                              
                           ANDMED UURITAVA KEMIKAALI KOHTA
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 12 ja 13.
                              
                           KÜNNISVÄÄRTUSED
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 14 ja 15.
                              
                           VÕRDLUSALUSENA KASUTATAV UURITAV KEMIKAAL
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Kohaldatakse peatüki C.10-A punkti 16.
                              
                           KATSETULEMUSTE REPRODUTSEERITAVUS
                     
                                 10.
                              
                              
                                 Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 17 ja 18.
                              
                           MEETODI KIRJELDUS
                     
                        Seadmed
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Sobiv seade on muudetud poorse poti süsteem (liide 6.1). See koosneb sisemisest nõust (või vooderdisest), mis on valmistatud poorsest polüpropüleenist; vooderdise paksus on 3,2 mm ja poori suurus ligikaudu 90 μm. Nende omavaheline ühendus põkk-keevitatakse. (Nii saadakse töökindlam seade kui käesoleva peatüki C.10-A punktis 21 kirjeldatud seade). Vooderdis on paigutatud vett mitte läbi laskvasse polüetüleenist välisnõusse, mis koosneb kahest osast: ringikujuline alus, millesse on puuritud augud, et paigaldada kaks õhuvoolikut ja muda kõrvaldamise voolik, ning ülemine silinder, mis kruvitakse põhja külge ja millele on paigaldatud väljund, et tagada poorse poti teadaolev maht (3 liitrit). Üks õhuvoolikutest on varustatud õhuvoolu hajutava otsikuga (difuusorkiviga); teine on avatud otsaga ja asetatud potis kivi suhtes täisnurga all. Kõnealune süsteem tekitab keerise, mis on vajalik selleks, et poti sisu oleks täielikult segatud, ning tagab samuti lahustunud hapniku kontsentratsiooni üle 2 mg/l.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Vajalik arv seadmeid hoitakse reguleeritud temperatuuril vahemikus 5–20 °C (±1 °C) kas veevannis või püsiva temperatuuriga ruumis. Pumbad on vajalikud, et doseerida aeratsiooninõudesse uuritava kemikaali lahust ja settinud reovett nõutava kiirusega (vastavalt 0–1,0 ml/min ja 0–25 ml/min) ning kolmas pump on vajalik selleks, et kõrvaldada reomuda aeratsiooninõudest. Vajalik väga väike reomuda voolukiirus saavutatakse pumbaga, mis on seatud suuremale kiirusele ja mis lülitatakse aeg-ajalt sisse taimeriga lüliti abil, näiteks lülitatakse sisse 10 sekundiks minutis, pumpamiskiirus on 3 ml/min, mis annab kõrvaldamise kiiruse 0,5 ml/min.
                              
                           
                        Filtrimisseade või tsentrifuug
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Kohaldatakse peatüki C10-A punkti 23.
                              
                           
                        Analüüsiseadmed
                     
                     
                                 14.
                              
                              
                                 Kohaldatakse peatüki C.10-A punkti 24.
                              
                           
                        Vesi
                     
                     
                                 15.
                              
                              
                                 Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 25 ja 26.
                              
                           
                        Orgaaniline kasvukeskkond
                     
                     
                                 16.
                              
                              
                                 Kohaldatakse peatüki C.10-A punkti 27.
                              
                           
                        Sünteetiline reovesi
                     
                     
                                 17.
                              
                              
                                 Kohaldatakse peatüki C.10-A punkti 28.
                              
                           
                        Olmereovesi
                     
                     
                                 18.
                              
                              
                                 Kohaldatakse peatüki C.10-A punkti 29.
                              
                           
                        Aktiivmuda
                     
                     
                                 19.
                              
                              
                                 Kohaldatakse peatüki C10-A punkti 30.
                              
                           
                        Uuritava kemikaali põhilahus
                     
                     
                                 20.
                              
                              
                                 Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 31 ja 32.
                              
                           KATSE KÄIK
                     
                        Inokulumi valmistamine
                     
                     
                                 21.
                              
                              
                                 Kohaldatakse ainult peatüki C.10-A punkti 34; kasutage aktiivmuda (ligikaudu 2,5 g/l).
                              
                           
                        Katseseadmete arv
                     
                     
                                 22.
                              
                              
                                 Lihtsa katse jaoks, s.o kõrvaldamise protsendi mõõtmiseks, on vajalik ainult üks muda retentsiooniaeg, kuid ligikaudsete kineetiliste konstantide arvutamiseks vajalike andmete saamiseks on vaja 4 või 5 muda retentsiooniaja väärtust. Tavaliselt valitakse väärtused vahemikus 2–10 päeva. Praktilistel kaalutlustel on kasulik teha katse samal ajal 4 või 5 muda retentsiooniajaga ühel temperatuuril; pikendatud uuringute puhul kasutatakse muudel temperatuuridel vahemikus 5–20 °C samu muda retentsiooniaja väärtusi või erinevat väärtuste vahemikku. Esmase biolagunemise (peamine kasutus) korral on ühe tingimuste komplekti jaoks vaja tavaliselt ainult ühte seadet. Täieliku biolagunemise korral on siiski iga tingimuste komplekti jaoks vaja kontrollseadet, millesse lisatakse reovett, kuid mitte uuritavat kemikaali. Kui arvatakse, et uuritavat kemikaali esineb kasutatavas reovees, oleks vaja kasutada esmase biolagunemise hindamisel kontrollseadmeid ja teha arvutustes vajalikud parandused.
                              
                           
                        Orgaanilise kasvukeskkonna ja uuritava kemikaali doseerimine
                     
                     
                                 23.
                              
                              
                                 Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 36–39, kuid pange tähele, et uuritava kemikaali lahust doseeritakse eraldi ja kasutatakse erinevaid muda kõrvaldamise määrasid. Samuti tuleb sagedasti jälgida (näiteks kaks korda päevas) sissevoolu, väljavoolu ja muda kõrvaldamise voolukiiruseid ning vajaduse korral neid kohandada, et erinevus soovitust oleks ±10 % piires. Kui olmereovee kasutamisel tekivad analüüsimeetoditega seotud probleemid, siis tehke katse sünteetilise reoveega, aga tuleb tagada, et erinevad kasvukeskkonnad annavad võrreldavaid kineetilisi andmeid.
                              
                           
                        Aktiivmuda seadmete käsitsemine
                     
                     
                                 24.
                              
                              
                                 Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 40–43, kuid reguleerige muda retentsiooniaega ainult muda „pideva” kõrvaldamise abil.
                              
                           
                        Proovide võtmine ja analüüsimine
                     
                     
                                 25.
                              
                              
                                 Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 44–50, selle erinevusega, et tuleb määrata uuritava kemikaali kontsentratsioon ja soovi korral lahustunud orgaaniline süsinik; keemilist hapnikutarvet ei tohiks kasutada.
                              
                           ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE
                     
                        Tulemuste töötlemine
                     
                     
                                 26.
                              
                              
                                 Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 52–54.
                              
                           
                        Katsetulemuste esitamine
                     
                     
                                 27.
                              
                              
                                 Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 56–62.
                              
                           
                        Kineetiliste konstantide arvutamine
                     
                     
                                 28.
                              
                              
                                 Esmase biolagundamise protsendi esitamise asemel on realistlikum esitada uuritava kemikaali keskmine statsionaarse oleku kontsentratsioon väljavoolus ja kirjeldada, kuidas see sõltub puhasti erinevatest käitamise tingimustest. Seda on võimalik teha liites 6.2 esitatud võrrandi 6 abil, millest võib leida KS, μm ja θSC väärtused (muda kriitiline retentsiooniaeg).
                                 (Selle asemel võib leida KS ja μm ligikaudsed väärtused, kasutades lihtsat arvutiprogrammi, millega võrrandi 2 (liide 6.2) järgi arvutatud teoreetilist kõverat sobitatakse saadud eksperimentaalsete väärtustega. Kuigi ühtki lahendust ei saa pidada ainsaks õigeks lahenduseks, on võimalik saada KS ja μm mõistlikud ligikaudsed väärtused.)
                              
                           
                        Tulemuste hajuvus
                     
                     
                                 29.
                              
                              
                                 On teada, et iga üksiku kemikaali jaoks saadud kineetiliste parameetrite väärtused hajuvad. Arvatakse, et muda kasvatamise tingimused ning samuti katses valdavalt esinenud tingimused (nagu punktis 5 ja muudes katsetes) mõjutavad saadud väärtusi oluliselt. Ühte sellise muutlikkuse tahku on arutanud Grady et al. (4), kes on soovitanud kasutada kineetilise eksperimendi käigus kultuuri saavutatava võimaliku füsioloogilise oleku kahe äärmusliku seisundi jaoks mõisteid „tegelikult esinev” (extant) ja „olemuslik” (intrinsic). Kui oleku muutumist katse jooksul ei lubata, väljendavad kineetilise parameetri väärtused selle keskkonna tingimusi, kust mikroorganismid hangiti; neid väärtusi nimetatakse tegelikult või parajasti esinevaks. Teise äärmuse korral, kui katsetingimused võimaldavad valgusünteesisüsteemi täielikku väljaarenemist ja seega maksimaalset võimalikku kasvukiirust, nimetatakse saadud kineetilisi parameetreid olemuslikuks ning need olenevad ainult substraadi laadist ja kultuuris sisalduvate bakterite tüüpidest. Juhinduda võib sellest, et tegelikult esinevad väärtused saadakse siis, kui substraadi kontsentratsiooni ja kompetentsete mikroorganismide suhe (So / Xo) hoitakse madal, näiteks 0,025, ning olemuslikud näitajad esinevad siis, kui suhe on kõrge, näiteks vähemalt 20. Mõlemal juhul peaks So olema asjakohase poolküllastatuse konstandiga Ks võrdne või seda ületama.
                              
                           
                                 30.
                              
                              
                                 Tulemuste hajuvust ja muid biolagundamise kineetika tahke arutati hiljutises keskkonnatoksikoloogia ja -keemia ühingu õpikojas (5). Neist avaldatud ja kavandatavatest uuringutest peaks saama selgema arusaama reoveepuhastites toimivast kineetikast, mis lubab olemasolevaid andmeid paremini tõlgendada ning tulevasi katsemeetodeid paremini kavandada.
                              
                           
                        KIRJANDUS
                     
                     
                                 1)
                              
                              
                                 Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol Deterg.: 33–48.
                              
                           
                                 2)
                              
                              
                                 Birch RR (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 340–343.
                              
                           
                                 3)
                              
                              
                                 Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411–422.
                              
                           
                                 4)
                              
                              
                                 Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic parameter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. Wat. Res., 30 (3): 742–748.
                              
                           
                                 5)
                              
                              
                                 Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4-6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
                              
                           
                  
                     Liide 6.1
                     
                        Muda retentsiooniaja reguleerimisega poorne pott
                     
                     
                        
                  
                  
                     Liide 6.2
                     
                        Kineetiliste konstantide arvutamine
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Kui eeldada Monod’ kineetika kehtivust ning võtta arvesse aktiivsete tahkete osakeste ja substraadi massibilanssi aktiivmuda süsteemis (1), on võimalik leida järgmised statsionaarse oleku näitajad:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [1]
                                          
                                       või
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [2],
                                          
                                       kus
                                 
                                             S1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             substraadi kontsentratsioon väljavoolus (mg/l)
                                          
                                       
                                             KS
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             poolküllastatuse konstant, kontsentratsioon, mille juures μ = μm/2 (mg/l)
                                          
                                       
                                             μ
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             kasvu erikiirus (d–1)
                                          
                                       
                                             μm
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             μm (d–1) maksimumväärtus
                                          
                                       
                                             Kd
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             aktiivsete tahkete osakeste kadumise erikiirus (d–1)
                                          
                                       
                                             θS
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             muda keskmine retentsiooniaeg, SRT (d)
                                          
                                       Selle võrrandi uurimisel võib teha järgmised järeldused:
                                 
                                             i)
                                          
                                          
                                             väljavoolu kontsentratsioon ei sõltu sissevoolu kontsentratsioonist (S0); seega muutub biolagundamise protsent sissevoolu kontsentratsiooni S0 muutumisel;
                                          
                                       
                                             ii)
                                          
                                          
                                             ainus juhitav puhasti parameeter, mis mõjutab S1 väärtust, on muda retentsiooniaeg θS;
                                          
                                       
                                             iii)
                                          
                                          
                                             sissevoolu kindla kontsentratsiooni S0 puhul on olemas kriitiline muda retentsiooniaeg, mis vastab järgmistele tingimustele:
                                             
                                                         
                                                            
                                                      
                                                      
                                                         [3],
                                                      
                                                   kus
                                             θSC= kriitiline muda retentsiooniaeg, millest väiksema väärtuse puhul uhutakse kompetentsed mikroorganismid puhastist välja;
                                          
                                       
                                             iv)
                                          
                                          
                                             kuna võrrandi 2 muud parameetrid on seotud kasvu kineetikaga, mõjutab temperatuur tõenäoliselt substraadi sisaldust väljavoolus ja muda kriitilist vanust, s.o teatava töötlemismäära saavutamiseks vajalik muda retentsiooniaeg suureneb temperatuuri vähendamisega.
                                          
                                       
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Poorse poti süsteemi tahkete ainete massibilansi alusel ja eeldades, et tahkete osakeste kontsentratsioon puhasti väljavoolus X2 on väike aeratsiooninõu kontsentratsiooniga X1 võrreldes, on muda retentsiooniaeg
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [4]
                                          
                                       ja,
                                 
                                    
                                 kus
                                 
                                             V
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             aeratsiooninõu maht (l)
                                          
                                       
                                             X1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             tahkete osakeste kontsentratsioon aeratsiooninõus (mg/l)
                                          
                                       
                                             X2
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             tahkete osakeste kontsentratsioon väljavoolus (mg/l)
                                          
                                       
                                             Q0
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             sissevoolu voolukiirus (l/d)
                                          
                                       
                                             Q1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             reomuda voolukiirus (l/d)
                                          
                                       Seega on muda retentsiooniaega võimalik reguleerida mis tahes eelnevalt valitud väärtusele reomuda voolukiiruse Q1 reguleerimisega.
                                 Järeldused
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Katse peamine eesmärk on seega võimaldada prognoosida kontsentratsiooni väljavoolus ja sellest tulenevalt uuritava kemikaali taset suublates.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Kui koostada väljavoolukontsentratsiooni S1 retentsiooniajast θS sõltuvuse graafik, on mõnikord võimalik hinnata muda kriitilist retentsiooniaega θSC, vt kõver 3 joonisel 1. Kui see ei ole võimalik, võib arvutada θSC koos μm ja KS ligikaudsete väärtustega, kui koostada S1 sõltuvus S1•θS-st.
                                 Võrrandi 1 teisendamisega saame:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [5]
                                          
                                       Kui Kd on väike, siis 1 + θs • Kd ~ 1 ja võrrandist 5 saame:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [6]
                                          
                                       Seega peaks graafik olema sirge joon (vt joonis 2) tõusuga 1/μm ja alglõiguga KS/μm; sellest tuleneb ka, et θS ~1/μm.
                                 
                                    Joonis 1
                                 
                                 
                                    Kolm temperatuuri; viis muda retentsiooniaega
                                 
                                 
                                    
                                 
                                    Joonis 2
                                 
                                 
                                    Muda retentsiooniaja regressioonijoon S1
                                       vs. S1 T = 5 °C juures
                                 
                                 
                                    
                                 
                                    Terminid:
                                 
                                 kontsentratsioon väljavoolus
                                 kõver
                              
                           
                  
                     7. liide
                     KATSE VÄIKESE KONTSENTRATSIOONI (μg/l) VAHEMIKUS
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Paljud kemikaalid esinevad veekeskkonnas (isegi reovees) tavaliselt väga väheses kontsentratsioonis (μg/l). Sellises kontsentratsioonis ei ole need tõenäoliselt peamised kasvu põhjustavad substraadid; on tõenäoline, et neid lagundatakse kasvu mittepõhjustavate teiseste substraatidena koos mitmesuguste looduslike orgaaniliste ainetega. Seega ei vasta selliste kemikaalide lagunemine 6. liites esitatud mudelile. Võib kasutada mitmeid mudeleid ja reoveepuhastites peamiselt esinevates tingimustes võib samal ajal olla kasutatav rohkem kui üks mudel. Selle asjaolu täpsustamiseks tuleb teha palju rohkem uurimistööd.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Seni võib järgida põhitekstis (peatükk C.10-A) kirjeldatud meetodit, aga ainult esmase biolagundatavuse puhul, kasutades sobivalt väikseid kontsentratsioone (< 100 μg/l) ja valideeritud analüüsimeetodit. Kui võetakse arvesse ka abiootilisi protsesse (adsorptsioon, lendumine jne), võib arvutada biolagundatavuse protsendi (vt käesoleva katsemeetodi punkt 54). Näitena võib kasutada Nyholmi ja tema kolleegide uuringut (1, 2), milles uuritavat kemikaali lisati neljatunnise tsükliga täitmise ja tühjendamise süsteemi (fill and draw system). Nad teatasid pseudo-esimese järgu kineetilised konstandid viie kemikaali jaoks, mis lisati sünteetilisse reovette kontsentratsioonil 5–100 μg/l. (Täieliku biolagundatavuse jaoks võib kasutada 14C märgistusega uuritavaid kemikaale.) Selle kirjeldamine jääb käesolevast katsemeetodist välja, kuna seni puuduvad kinnitatud meetodid, kuigi ISO 14592 (3) jaoks välja pakutud meetod sisaldab suuniseid 14C märgistusega kemikaalide kasutamise kohta.
                              
                           
                        Poolpidev aktiivmudatest
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Hiljem pakuti välja lihtsam kahest etapist koosnev katse (4, 5, 6); poolpideva aktiivmudatesti (SCAS testi) meetodile järgnevad lühiajalised kineetilised katsed poolpideva aktiivmudatesti seadmetest võetud proovidega. Poolpideva aktiivmudatesti süsteemi käitatakse muda kõrvaldamise teadaoleva määraga (erinevalt algsest katsemeetodist C.12) ja sinna lisatakse muudetud OECD sünteetilist reovett või olmereovett. Sünteetilist reovett muudeti (pH muutumise ja muda halva settivuse tõttu) ning lisati puhverdamiseks fosfaati, pärmiekstrakti, raud(III)kloriidi ja mikroelementide soolasid; selle keemiline hapnikutarve suurendati ligikaudu väärtuseni 750 mg/l peptooni ja lihaekstrakti kontsentratsiooni suurendamisega. Seadmeid käitati 24-tunnise tsükliga: aeratsioon 23 tunni vältel, muda kõrvaldamine, settimine, supernatandi (väljavoolu) kõrvaldamine, millele järgnes sünteetilise reovee lisamine ja uuritava kemikaali lisamine kuni kontsentratsioonini 100 μg/l (s.o ligikaudu samal kontsentratsioonil, mida kasutati kiirkatses). Kord nädalas vahetati 10 % mudakogusest värske muda vastu, et säilitada tasakaalustatud mikroobipopulatsiooni.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Uuritava kemikaali kontsentratsiooni mõõdetakse alguses ja aeratsiooni lõpus ning katset jätkatakse, kuni saavutatakse uuritava kemikaali konstantse kiirusega kõrvaldamine; selleks võib kuluda üks nädal kuni mitu kuud.
                              
                           
                        Kiirkatse
                     
                     
                                 5.
                              
                              
                                 Uuritava kemikaali lagunemise pseudo-esimest järku kiiruskonstandi määramiseks teadaoleva, kuid erineva päritolu ja varasema kasutusega aktiivmudas kasutatakse kiirkatset (näiteks kaheksa tundi). Aklimatiseerumiskatse ajal (punktid 3 ja 4) võetakse poolpideva aktiivmudatesti reaktoritest muda proovid (aeratsiooni ajavahemiku lõpus, kui orgaanilise substraadi kontsentratsioon on väike). Võrdluseks võib võtta ka muda paralleelsest poolpideva aktiivmudatesti seadmest, mis ei ole uuritava kemikaaliga kokku puutunud. Muda segusid lisatud uuritava kemikaaliga (kaks või enam kontsentratsiooni vahemikus 1–50 μg/l) aereeritakse ilma sünteetilist reovett või muud orgaanilist substraati lisamata. Lahusesse alles jäänud uuritav kemikaal määratakse korrapäraste ajavahemike järel, näiteks iga tund, olenevalt kemikaali lagundatavusest, kuni 24 tunni jooksul. Enne sobiva analüüsimeetodi kasutamist proovid tsentrifuugitakse.
                              
                           
                        Arvutused
                     
                     
                                 6.
                              
                              
                                 Poolpideva aktiivmudatesti seadmetega saadud andmeid kasutatakse uuritava kemikaali kõrvaldamise protsendi arvutamiseks (punkt 54). Samuti saab arvutada keskmise kiiruskonstandi K1 (mis on hõljuvaine kontsentratsiooni järgi normaliseeritud) järgmisest võrrandist:
                                 
                                    
                                 kus
                                 
                                             t
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             aeratsiooniaeg (23 h)
                                          
                                       
                                             Ce
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             kontsentratsioon aeratsiooniaja lõpus (μg/l)
                                          
                                       
                                             Ci
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             kontsentratsioon aeratsiooni alguses (μg/l)
                                          
                                       
                                             SS
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             aktiivmuda tahkete osakeste kontsentratsioon (g/l)
                                          
                                       
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Kiirkatses koostatakse uuritava kemikaali allesoleva kontsentratsiooni log% ajast sõltuvuse graafik ning graafiku alguse (10–50 % lagunemist) tõus on võrdväärne pseudo-esimest järku kiiruskonstandiga K1. Konstant normeeritakse muda tahkete osakeste kontsentratsiooniga: tõus jagatakse läbi muda tahkete osakeste kontsentratsiooniga. Teatatud tulemus peab samuti sisaldama andmeid uuritava kemikaali ja hõljuvaine lähtekontsentratsioonide, muda retentsiooniaja, muda koguse ja päritolu kohta ning uuritava kemikaaliga eelneva kokkupuute kohta (kui see on toimunud).
                              
                           
                        Tulemuste hajuvus
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Tulemuste hajuvust ja muid biolagundamise kineetika tahke arutati hiljutises keskkonnatoksikoloogia ja -keemia ühingu õpikojas (7). Neist avaldatud ja kavandatavatest uuringutest peaks saama selgema arusaama reoveepuhastites toimivast kineetikast, mis lubab olemasolevaid andmeid paremini tõlgendada ning tulevasi katsemeetodeid paremini kavandada.
                              
                           
                        KIRJANDUS
                     
                     
                                 1)
                              
                              
                                 Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and Schultz B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339–353.
                              
                           
                                 2)
                              
                              
                                 Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993). Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505–1510.
                              
                           
                                 3)
                              
                              
                                 ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Water Quality - Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations in water.
                              
                           
                                 4)
                              
                              
                                 Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996). Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851–864.
                              
                           
                                 5)
                              
                              
                                 Berg UT and Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in semi-continuous activated sludge reactors with low (μg/l range) and standard (ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711–735.
                              
                           
                                 6)
                              
                              
                                 Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegradability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen.
                              
                           
                                 7)
                              
                              
                                 Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, SG. Feitjel, T. King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4–6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
                              
                           
                  
                     C.10-B:   biokiled
                  
                  SISSEJUHATUS
                  
                              1.
                           
                           
                              Simulatsioonikatseid kasutatakse enamasti selliste kemikaalide puhul, mis kiire biolagundatavuse sõelumiskatse (käesoleva lisa peatüki C.4 meetodid C.4-A kuni C.4-F (9)) kohaselt ei ole kiiresti biolagundatavad, kuid mis on siiski iseeneslikult biolagunevad. Erandkorras kasutatakse simulatsioonikatset ka iga kemikaali puhul, mille kohta on vaja rohkem teavet, eelkõige masstootmises olevate kemikaalide puhul, ja tavaliselt kasutatakse aktiivmuda katset (C.10-A). Mõnel juhul vajatakse siiski konkreetset teavet kemikaali käitumise kohta biokiledega seotud reovee puhastamise meetodite puhul, eelkõige nõrgfiltrite, pöörlevate bioloogiliste kontaktseadmete ja keevkihttehnoloogiate puhul. Selle vajaduse täitmiseks on välja töötatud mitmesugused vahendid.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Gerike et al. (1) kasutasid suuri pooltööstuslikke nõrgfiltreid ühendatud režiimis. Need filtrid võtsid palju ruumi ja vajasid suhteliselt palju reovett või sünteetilist reovett. Truesdale et al. (2) kirjeldasid väiksemaid filtreid (läbimõõduga 6 jalga × 6 tolli), millesse lisati pindaktiivseid aineid mitte sisaldavat naturaalset reovett, kuid nende jaoks oli siiski vaja suhteliselt suuri reoveekoguseid. Valmis (küpse) biokile loomiseks kulus 14 nädalat ning pärast pindaktiivse uuritava aine esmakordset lisamist kulus veel 4–8 nädalat, enne kui biokile oli aklimatiseerunud.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Baumann et al. (3) töötasid välja palju väiksema filtri, milles biokilet toetava inertse kasvukeskkonnana kasutati eelnevalt aktiivmudas immutatud nn polüesterfliisi. Uuritavat kemikaali kasutati ainsa süsinikuallikana ja biolagundatavust hinnati sissevoolus ja väljavoolus lahustunud orgaanilise süsiniku mõõtmise teel ning väljunud gaasis CO2 koguse hindamise alusel.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Hoopis erinevat lähenemisviisi kasutasid Gloyna et al. (4), kes leiutasid pöörleva torureaktori. Pöörleva toru sisepinnal kasvatati teadaoleval pindalal biokile, lastes läbi horisontaalsuuna suhtes väikese nurga all oleva toru ülemise osa kaudu lisatavat sissevoolu. Reaktorit on kasutatud pindaktiivsete ainete biolagundatavuse uurimiseks (5) ning samuti biokile optimaalse paksuse ja läbi kile difusiooni uurimiseks (6). Viimati nimetatud autorid arendasid reaktorit edasi, muu hulgas täiustades seda väljuvas gaasis CO2 määramise võimaldamiseks.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Pöörleva torureaktori kinnitas analüütikute alaline komitee (Ühendkuningriik) kui standardmeetodi, millega hinnatakse kemikaalide biolagundatavust (7) ning reovete puhastatavust ja mürgisust (8). Siin kirjeldatud meetodi eelised on lihtsus, kompaktsus, korratavus ja orgaanilise kasvukeskkonna suhteliselt väikse koguse kasutamine.
                           
                        KATSE PÕHIMÕTE
                  
                              6.
                           
                           
                              Kaldu oleva aeglaselt pöörleva toru sisepinnale lisatakse sünteetilist või olmereovett ja uuritavat kemikaali kas seguna või eraldi. Sisepinnale tekib mikroorganismide kiht, mis on samalaadne biofiltrites esinevaga. Reaktori kasutamise tingimused valitakse sellised, et tagada orgaanilise aine piisav kõrvaldamine ja vajaduse korral ammooniumi oksüdeerumine.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Väljavool torust kogutakse ja kas setitatakse ja/või filtritakse enne lahustunud orgaanilise süsiniku ja/või uuritava kemikaali analüüsimist spetsiifilise meetodi abil. Samal ajal ja samadel tingimustel käitatakse võrdluseks kontrollkatse seadmeid, kuhu uuritavat kemikaali ei lisata. Katse- ja kontrollseadmete väljavoolus ilmnev lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsiooni erinevus on eeldatavasti põhjustatud uuritavast kemikaalist ja selle orgaanilistest metaboliitidest. Seda erinevust võrreldakse lisatud uuritava kemikaali kontsentratsiooniga (väljendatud lahustunud orgaanilise süsinikuna), et arvutada uuritava kemikaali kõrvaldamine.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Biolagunemist on bioadsorptsioonist üldiselt võimalik eristada nii, et uuritakse hoolikalt kõrvaldamismäära ajast sõltuvuse graafikut. Tavaliselt saab seda kinnitada kiire biolagundatavuse katsega (hapniku sidumine või süsinikdioksiidi tekkimine), kasutades aklimatiseeritud inokulumi, mis on võetud katse lõpus nendest reaktoritest, kuhu on lisatud uuritavat kemikaali.
                           
                        ANDMED UURITAVA KEMIKAALI KOHTA
                  
                              9.
                           
                           
                              Tulemuste õigeks tõlgendamiseks peaksid olema teada uuritava kemikaali puhtus, vees lahustuvus ning lenduvuse ja adsorptsiooniga seotud omadused.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Lenduvaid ja halvasti lahustuvaid kemikaale ei ole tavaliselt võimalik katsetada ilma erimeetmeid võtmata (vt peatüki C.10-A 5. liide). Samuti peaks olema teada keemiline struktuur või vähemalt empiiriline valem, et arvutada teoreetilised väärtused ja/või kontrollida parameetrite mõõdetud väärtusi, nagu teoreetiline hapnikutarve, lahustunud orgaaniline süsinik.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Sobiva katsekontsentratsiooni valimisel võivad abiks olla andmed uuritava kemikaali mürgisuse kohta mikroorganismidele (vt peatüki C.10-A 4. liide); väikeste biolagundamise väärtuste õigeks tõlgendamiseks on need hädavajalikud.
                           
                        KÜNNISVÄÄRTUSED
                  
                              12.
                           
                           
                              Algul nõuti pindaktiivse kemikaali turule lubamiseks vähemalt 80 % esmast biolagundatavust. Kui 80 % künniseni ei jõuta, võib kohaldada kõnealust simulatsiooni (kinnitavat) katset ja pindaktiivset ainet võib turustada ainult juhul, kui rohkem kui 90 % konkreetsest kemikaalist kõrvaldatakse. Kemikaalide puhul üldiselt ei teki vastuvõetavuse/vastuvõetamatuse taseme küsimust ja saavutatud kõrvaldamise protsentväärtust võib kasutada tõenäolise keskkonnakontsentratsiooni ligikaudsetes arvutustes, mida kasutatakse kemikaalist põhjustatud ohu hindamiseks. Puhaste kemikaalide mitmes uuringus leiti, et olulises ulatuses biolagunevatest kemikaalidest rohkem kui kolme neljandiku puhul on lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamise määr > 90 % ning sellistest kemikaalidest rohkem kui 90 % puhul on see > 80 %.
                           
                        VÕRDLUSKEMIKAALID
                  
                              13.
                           
                           
                              Katse nõuetekohaseks tegemiseks on kasulik teha aeg-ajalt katseid võrdluskemikaalidega, mille käitumine on teada. Kõnealused kemikaalid on näiteks adipiinhape, 2-fenüülfenool, 1-naftool, difeenhape ja 1-naftoehape.
                           
                        KATSETULEMUSTE REPRODUTSEERITAVUS
                  
                              14.
                           
                           
                              Ühendkuningriigi labor leidis, et katsete suhteline standardhälve ühes laboris oli 3,5 % ja katsete vahel 5 % (7).
                           
                        MEETODI KIRJELDUS
                  
                     Seadmed
                  
                  
                     Pöörlevad torureaktorid
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Seade (vt 8. liite joonised 1 ja 2) koosneb akrüültorude komplektist, milles iga toru pikkus on 30,5 cm ja siseläbimõõt 5 cm; torud asuvad kummiümbrisega ratastel, mis paiknevad metallist tugiraamis. Igal torul on ligikaudu 0,5 cm võrra välja ulatuv äärik, et toru püsiks ratastel. Sisepind on muudetud jämeda traatvillaga karedamaks ning ülemises (sissevoolu) otsas 0,5 cm võrra välja ulatuv sisemine äärik, mis hoiab vedelikku torus. Torud on rõhtasendi suhtes ligikaudu ühekraadise nurga all, et saavutada uuritava keskkonna läbi puhta toru suunamisel vajalik kokkupuuteaeg. Kummiümbrisega rattaid pööratakse aeglase reguleeritava kiirusega mootori abil. Torude temperatuuri reguleeritakse sellega, et seade asub püsiva temperatuuriga ruumis.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Kui iga torureaktor pannakse mõnevõrra suuremasse korgiga torusse ja tagatakse ühenduste õhutihedus, on võimalik koguda väljuv gaasiline CO2 hilisemaks määramiseks leeliselahusesse (6).
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Iga toru jaoks hoitakse 20 l nõus (A) (vt joonis 2) 24-tunnist orgaanilise kasvukeskkonna varu, vajaduse korral koos lisatud uuritava kemikaaliga. Vajaduse korral võib eraldi doseerida uuritava kemikaali lahust. Iga sellise nõu põhja lähedal on väljalase, mis on sobiva (näiteks silikoonkummist) toru ja peristaltilise pumba (B) kaudu ühendatud klaasist või akrüülist pealevoolutoruga, mis ulatub 2–4 cm võrra kalduoleva toru ülemise (pealevoolu-)otsa (C) sisse. Väljavoolul lastakse kallutatud toru alumisest otsast tilkuda, et koguda see teise nõusse (D). Väljavool setitatakse või filtritakse enne analüüsi tegemist.
                           
                        
                     Filtrimisseade-tsentrifuug
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Proovide filtrimiseks mõeldud seade, milles on sobiva poorisuurusega (ava nominaalläbimõõt 0,45 μm) membraanfiltrid, mis adsorbeerivad orgaanilised kemikaalid ja millest vabaneb võimalikult vähe orgaanilist süsinikku. Kui kasutatakse filtreid, millest vabaneb orgaanilist süsinikku, tuleb filtreid hoolikalt pesta kuuma veega, et eemaldada väljauhutav orgaaniline süsinik. Selle asemel võib kasutada tsentrifuugi, mis tagab 40 000 m/s2.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Seadmed, mis on vajalikud järgmise kindlaksmääramiseks:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          lahustunud orgaaniline süsinik, orgaanilise süsiniku kogusisaldus või keemiline hapnikutarve;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          konkreetne kemikaal, kui nõutakse selle määramist (kõrgefektiivne vedelikkromatograafia, gaaskromatograafia jne);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pH, temperatuur, happelisus ja leeliselisus;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          ammoonium, nitrit ja nitraat, kui katse tehakse nitrifikatsiooni tingimustes.
                                       
                                    
                        
                     Vesi
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Kraanivesi, mis sisaldab vähem kui 3 mg/l lahustunud orgaanilist süsinikku.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Destilleeritud või deioniseeritud vesi, mis sisaldab vähem kui 2 mg/l lahustunud orgaanilist süsinikku.
                           
                        
                     Orgaaniline kasvukeskkond
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Orgaanilise kasvukeskkonnana võib kasutada sünteetilist reovett, olmereovett või nende segu. On tõendatud, et ainult olmereovee kasutamisel saadakse sageli suurem lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamise protsent (aktiivmuda seadmetes) ning sellest saab biolagundada isegi mõnd sellist kemikaali, mis ei ole OECD sünteetilise reovee kasutamisel biolagundatav. Seega on soovitatav kasutada olmereovett. Lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsiooni (või keemilist hapnikutarvet) tuleb mõõta igas uues orgaanilise kasvukeskkonna partiis. On vaja teada orgaanilise kasvukeskkonna happelisust või leeliselisust. Kui kasvukeskkonna happelisus või leeliselisus on väike, võib see vajada sobiva puhvri lisamist (naatriumvesinikkarbonaat või kaaliumvesinikfosfaat), et hoida katse ajal reaktoris pH väärtus ligikaudu 7,5 ± 0,5. Lisatava puhvri kogus ja lisamise aeg tuleb otsustada igal juhul eraldi.
                           
                        
                     Sünteetiline reovesi
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Ühes liitris kraanivees lahustatakse 160 mg peptooni, 110 mg lihaekstrakti; 30 mg karbamiidi, 28 mg veevaba dikaaliumvesinikfosfaati (K2HPO4), 7 mg naatriumkloriidi (NaCl), 4 mg kaltsiumkloriiddihüdraati (CaCl2·2H2O), 2 mg magneesiumsulfaatheptahüdraati (Mg2SO4·7H2O). See OECD sünteetiline reovesi on näidis ja selle keskmine lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsioon sissevoolus on ligikaudu 100 mg/l. Alternatiivselt võib kasutada muid koostisi, millel on ligikaudu sama lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsioon ja mis on pärisreoveega sarnasemad. Kõnealuse sünteetilise reovee kontsentraadi võib valmistada destilleeritud veega ja hoida kuni ühe nädala temperatuuril 1 °C. Vajaduse korral lahjendatakse seda kraaniveega. (See kasvukeskkond ei ole rahuldav, näiteks lämmastiku kontsentratsioon on väga suur ja süsinikusisaldus on suhteliselt väike, kuid midagi paremat pole soovitatud, kuid kasvukeskkonna parandamiseks on soovitatud üksnes lisada puhvrina suuremas koguses fosfaati ja rohkem peptooni).
                           
                        
                     Olmereovesi
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Kasutage värskelt settinud reovett, mida kogutakse iga päev peamiselt olmereovett töötlevast veepuhastuskäitisest. Seda tuleks koguda esmase settimise paagi ülevoolu kanalist või aktiivmudapuhasti sissevoolust ja see peaks üldiselt olema ilma suurte osakesteta. Seda reovett saab enne kasutamist hoida mitu päeva temperatuuril ligikaudu 4 °C, kui tõendatakse, et lahustunud orgaanilise süsiniku sisaldus (või keemiline hapnikutarve) ei ole hoidmise ajal olulisel vähenenud (s.o vähem kui 20 %). Süsteemi häirimise vähendamiseks tuleks igas uues partiis viia lahustunud orgaaniline süsinik (või keemiline hapnikutarve) enne kasutamist sobivale konstantsele väärtusele näiteks kraaniveega lahjendamise teel.
                           
                        
                     Määrdeaine
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Peristaltilise pumba rullikute määrimiseks võib kasutada glütserooli või oliiviõli: mõlemad on sobivad silikoonkummist torudega kasutamiseks.
                           
                        
                     Uuritava kemikaali põhilahused
                  
                  
                              26.
                           
                           
                              Kui kemikaal on piisavalt lahustuv, valmistage sobiva kontsentratsiooniga põhilahus (näiteks 1–5 g/l) deioniseeritud vees või sünteetilise reovee mineraalses osas. Lahustumatu kemikaali kohta vt peatüki C.10-A 5. liide. Seda meetodit ei saa torureaktoreid muutmata (punkt 16) kasutada lenduva kemikaali puhul. Määrake põhilahuses lahustunud orgaaniline süsinik ja orgaanilise süsiniku kogusisaldus ning korrake mõõtmisi iga uue partii korral. Kui lahustunud orgaanilise süsiniku ja orgaanilise süsiniku kogusisalduse erinevus on suurem kui 20 %, siis kontrollige uuritava kemikaali lahustuvust vees. Võrrelge lahustunud orgaanilist süsinikku või uuritava kemikaali kontsentratsiooni, mis on mõõdetud põhilahuses spetsiifilise analüüsimeetodi abil, nimiväärtusega, et näha, kas määramise saagis on piisavalt hea (tavaliselt võib eeldada > 90 %). Veenduge (eelkõige dispersiooni korral), kas lahustunud orgaanilist süsinikku saab kasutada analüüsiparameetrina või tuleb kasutada ainult spetsiifilist analüüsimeetodit, millega saab määrata uuritavat kemikaali. Dispersiooni puhul tuleb proovid tsentrifuugida. Iga uue partii puhul määrake lahustunud orgaaniline süsinik, keemiline hapnikutarve või uuritav kemikaal spetsiifilise analüüsimeetodi abil.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Määrake põhilahuse pH. Äärmuslikud väärtused osutavad, et kemikaali lisamine võib mõjutada aktiivmuda pH-d katsesüsteemis. Sel juhul neutraliseerige põhilahust väikse koguse anorgaanilise happe või alusega, et pH oleks 7 ± 0,5, kuid vältige uuritava kemikaali sadestamist.
                           
                        KATSE KÄIK
                  
                     Orgaanilise kasvukeskkonna doseerimine
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Hoolitsege, et kõik sissevoolu- ja väljavoolunõud ning sissevoolunõust väljuv ja väljavoolunõusse sisenev toru on korralikult puhastatud, et seal katse alguses ja kogu katse vältel ei kasvaks mikroobe.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Valmistage värske sünteetiline reovesi (punkt 23) iga päev kas tahketest lähteainetest või kontsentreeritud põhilahusest, lahjendades seda vajaliku koguse kraaniveega. Mõõtke nõutav kogus silindriga välja ja viige see puhtasse sissevoolunõusse. Vajaduse korral lisage sünteetilisse reovette enne lahjendamist ka vajalik kogus uuritava kemikaali või võrdluskemikaali põhilahust. Kui nii on mugavam või saab sellega vältida uuritava kemikaali kadusid, siis valmistage eraldi mahutis uuritava kemikaali lahjendatud lahus ja sisestage see eraldi teise doseerimispumba abil kaldega torusse.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Teise võimalusena (ja eelistatavalt) kasutage settinud olmereovett (punkt 24), mis kogutakse võimaluse korral iga päev uuesti.
                           
                        
                     Pöörlevate torureaktorite käitamine
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Ühe uuritava kemikaali hindamiseks vajatakse kahte identset torureaktorit ja need seatakse üles püsiva temperatuuriga ruumis, tavaliselt 22 ± 2 °C.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Reguleerige peristaltilisi pumpasid, et need pumpaksid orgaanilist kasvukeskkonda (ilma uuritava kemikaalita; 250 ± 25 ml/h) kaldega torudesse, mida pööratakse kiirusel 18 ± 2 pööret minutis. Lisage pumba torudele katse alguses ja katse vältel regulaarselt määrdeainet (punkt 25), et tagada korralik toimimine ja pikendada torude kasutusiga.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Reguleerige torude kalle rõhtasendi suhtes nii, et sissevoolulahus viibiks puhtas torus 125 ± 12,5 s. Hinnake viibimisaeg sissevoolu mittebioloogilise markeri (näiteks NaCl, inertse värvaine) lisamise teel: keskmiseks viibimisajaks arvestatakse väljavoolus tippkontsentratsioonini jõudmiseks vajalikku aega (kui on tekkinud maksimaalne kile, võib viibeaeg suureneda kuni ligikaudu 30 minutini).
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Selliste määrade, kiiruste ja aegade juures on täheldatud piisavat lahustunud orgaanilise süsiniku (või keemilise hapnikutarbe) kõrvaldamist (> 80 %) ning nitrifitseeritud väljavoolu tekkimist. Kui kõrvaldamine ei ole piisav või kui tuleb simuleerida konkreetse puhasti tulemusi, tuleks voolukiirust muuta. Viimati nimetatud juhul reguleerige orgaanilise kasvukeskkonna doseerimise kiirust, kuni reaktori töö tulemuslikkus vastab puhasti töö tulemuslikkusele.
                           
                        
                     Inokulatsioon
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Kui kasutatakse sünteetilist reovett, võib mikroorganismide kasvu algatamiseks piisata õhukaudsest inokulatsioonist, vastasel juhul aga lisage sisestusse kolme päeva jooksul 1 ml/l settinud reovett.
                           
                        
                     Mõõtmised
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Kontrollige korrapäraste ajavahemike järel, et doosimäärad ja pöörlemiskiirused oleksid vajalikes piirides. Samuti mõõtke väljavoolu pH-d, eelkõige siis, kui eeldatakse nitrifitseerimist.
                           
                        
                     Proovide võtmine ja analüüsimine
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Proovide võtmise meetod, skeem ja sagedus valitakse katse eesmärgi järgi. Näiteks võib sissevoolust ja väljavoolust võtta hetkeproove (snap/grab) või koguda proov pikema aja, näiteks kolme kuni kuue tunni vältel. Esimesel ajavahemikul, mil uuritavat kemikaali veel sees ei ole, võtke proove kaks korda nädalas. Filtrige proovid läbi membraanide või tsentrifuugige neid kiirusel ligikaudu 40 000 m/s2 umbes 15 minutit (punkt 18). Enne läbi membraanide filtrimist võib olla vajalik lasta proovidel settida ja/või neid jämefiltriga filtrida. Määrake lahustunud orgaaniline süsinik (või keemiline hapnikutarve) vähemalt kaks korda ning vajaduse korral ka biokeemiline hapnikutarve, ammoonium ja nitrit/nitraat.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Kõik analüüsid tuleks teha pärast proovide kogumist ja ettevalmistamist võimalikult kiiresti. Kui analüüsid tuleb edasi lükata, säilitage proove tihedalt suletud pudelis pimedas ja temperatuuril ligikaudu 4 °C. Kui proove tuleb säilitada kauem kui 48 tundi, kasutage säilitamiseks sügavkülmutamist, hapestamist või sobiva mürgise kemikaali lisamist (näiteks 1 liitri kohta 20 ml elavhõbe(II)kloriidi lahuse (10 g/l) lisamisega). Kontrollige, et säilitamismeetod ei mõjutaks analüüsi tulemusi.
                           
                        
                     Sissetöötamisperiood
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Sellel ajavahemikul kasvab pinna biokile optimaalse paksuseni, milleks kulub tavaliselt ligikaudu kaks nädalat ja milleks ei tohiks kuluda üle kuue nädala. Lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamine (punkt 44) (või keemiline hapnikutarve) suureneb ja jõuab tasakaaluoleku väärtuseni. Kui torudes on jõutud sarnaste platooväärtusteni, valitakse üks toru ülejäänud katse vältel kontrollseadmena kasutamiseks ning sel ajal peaks torude tõhusus püsivaks jääma.
                           
                        
                     Uuritava kemikaali lisamine
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Sellel etapil lisage vajaliku kontsentratsiooniga (tavaliselt 10–20 mg C/l) uuritavat kemikaali teise reaktorisse. Kontrollseadmesse lisatakse jätkuvalt ainult orgaanilist kasvukeskkonda.
                           
                        
                     Aklimatiseerumise ajavahemik
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Jätkake lahustunud orgaanilise süsiniku (või keemilise hapnikutarbe) analüüside tegemist kaks korda nädalas ja esmase biolagundatavuse hindamiseks mõõtke ka uuritava kemikaali kontsentratsiooni spetsiifilise analüüsimeetodi abil. Laske süsteemil pärast uuritava kemikaali esmakordset lisamist üks kuni kuus nädalat (või eritingimustes pikemalt) aklimatiseeruda. Kui kõrvaldamise protsent (punktid 43–45) jõuab maksimumväärtuseni, mõõtke keskmise kõrvaldamisprotsendi hindamiseks platoofaasist ligikaudu kolme nädala vältel 12–15 kehtivat väärtust. Katse loetakse lõpetatuks, kui jõutakse piisavalt suure kõrvaldamise määrani. Pärast uuritava kemikaali esmakordset lisamist ei peaks katse kestus tavaliselt ületama 12 nädalat.
                           
                        
                     Kile irdumine
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Torust liigse kile suures koguses äkiline irdumine (sloughing) toimub suhteliselt korrapärase ajavahemiku järel. Selleks et kile irdumine ei mõjutaks tulemuste võrreldavust, peaks katse kestma vähemalt kaks täielikku kasvamise ja irdumise tsüklit.
                           
                        ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE
                  
                     Tulemuste töötlemine
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Arvutage uuritava kemikaali lahustunud orgaanilise süsiniku (või keemilise hapnikutarbe) kõrvaldamise protsent igal etteantud ajal järgmise võrrandi abil:
                              
                                 
                              kus
                              
                                          Dt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          lahustunud orgaanilise süsiniku (või keemilise hapnikutarbe) kõrvaldamise protsent ajal t;
                                       
                                    
                                          Cs
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          uuritavast kemikaalist tingitud lahustunud orgaanilise süsiniku (või keemilise hapnikutarbe) kontsentratsioon sissevoolus, mida hinnatakse eelistatavalt põhilahuse kontsentratsiooni ja selle lisatud koguse alusel (mg/l);
                                       
                                    
                                          E
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          katse väljavoolus ajal t mõõdetud lahustunud orgaanilise süsiniku (või keemilise hapnikutarbe) väärtus (mg/l);
                                       
                                    
                                          Eo
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          kontrollseadme väljavoolus ajal t mõõdetud lahustunud orgaanilise süsiniku (või keemilise hapnikutarbe) väärtus (mg/l).
                                       
                                    Kui katsetatakse ka võrdluskemikaali, tehakse sama arvutus ka võrdluskemikaaliga.
                           
                        
                     Kontrollreaktori tõhusus
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Kontrollreaktori poolt orgaanilise kasvukeskkonna lahustunud orgaanilise süsiniku (või keemilise hapnikutarbe) kõrvaldamise määr (DB) on kasulik teave, mis aitab hinnata katse ajal biokile biolagundamise aktiivsust. Arvutage kõrvaldamise protsent järgmise võrrandi alusel:
                              
                                 
                              kus
                              Cm= lahustunud orgaaniline süsinik (või keemiline hapnikutarve) kontrollseadme sissevoolu orgaanilises kasvukeskkonnas (mg/l).
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Arvutage spetsiifilise analüüsimeetodiga uuritava kemikaali kõrvaldamine (DST) (kui seda mõõdetakse) igal hindamisajal järgmise võrrandi abil:
                              
                                 
                              kus
                              
                                          Si
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          uuritava kemikaali mõõdetud või, eelistatavalt, hinnatud kontsentratsioon katse sissevoolus (mg/l);
                                       
                                    
                                          Se
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          uuritava kemikaali mõõdetud kontsentratsioon katse väljavoolus ajal t (mg/l).
                                       
                                    Kui analüüsimeetod annab muutmata reovees positiivse näitaja (S
                                    c
                                 , mg/l), siis arvutage kõrvaldamise protsent (DSC) järgmise võrrandi alusel:
                              
                                 
                           
                        
                     Katsetulemuste esitamine
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Koostage kõrvaldamise protsendi Dt ja DST (või DSC) (kui see on leitud) graafiline sõltuvus ajast (vt peatüki C.10-A 2. liide). Võtke platoofaasis määratud 12–15 DT (ja DST, kui see on määratud) väärtustest uuritava kemikaali kõrvaldamise protsendi keskmine (väljendatud lähima täisarvuna) ja leidke standardhälve. Kõrvaldamise kõvera kujust saab teha järeldusi kõrvaldamises osalevate protsesside kohta.
                           
                        
                     Adsorptsioon
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Kui uuritavast kemikaalist tingitud lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamise määr on suur kohe katse alguses, kõrvaldatakse uuritavat kemikaali tõenäoliselt biokilele adsorbeerimise teel. Seda võib olla võimalik tõendada irdunud kilest tahketele osakestele adsorbeerunud uuritava kemikaali määramisega. Tavaliselt ei jää adsorbeeritavast kemikaalist tingitud lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamine suuremahuliseks kogu katse vältel; üldiselt toimub alguses suur kõrvaldamine, mis langeb järk-järgult tasakaaluväärtusele. Kui adsorbeeritud uuritav kemikaal suudab aga põhjustada mikroobide populatsiooni aklimatiseerumise, siis suureneb seejärel uuritava kemikaali lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamine ja jõuab kõrge platooväärtuseni.
                           
                        
                     Ootefaas
                  
                  
                              48.
                           
                           
                              Nagu ka staatiliste sõelumiskatsete korral, nii vajavad mitmed uuritavad kemikaalid enne täieliku biolagunemise toimumist ootefaasi. Ootefaasis toimub kompetentsete bakterite aklimatiseerumine (või kohanemine) ja uuritavat kemikaali peaaegu ei kõrvaldata; seejärel toimub kõnealuste bakterite esialgne kasv. See faas lõpeb ja lagundamisfaasi alguseks loetakse hetke, kui ligikaudu 10 % uuritava kemikaali esialgsest kogusest on kõrvaldatud (võttes arvesse adsorptsiooni, kui see toimub). Ootefaasi pikkus võib olla väga erinev ja halvasti reprodutseeritav.
                           
                        
                     Platoofaas
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Pidevas katses kõrvaldamist näitava kõvera platoofaas on määratletud kui faas, milles lagundamine on maksimaalne. See faas peaks kestma vähemalt kolm nädalat ja selle käigus tuleks mõõta ligikaudu 12–15 kehtivat näitajat.
                           
                        
                     Uuritava kemikaali keskmine kõrvaldamise määr
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Arvutage uuritava kemikaali kõrvaldamise näitaja Dt (ja Dst, kui see on leitud) väärtuste alusel keskväärtus platoofaasis. See on uuritava kemikaali kõrvaldamise määr ümardatuna lähima täisarvuni (1 %). Samuti soovitatakse arvutada keskväärtuse 95 % usaldusvahemik. Arvutage samal viisil orgaanilise kasvukeskkonna keskmine kõrvaldamise määr (DB) kontrollnõus.
                           
                        
                     Biolagundamise tunnused
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Kui uuritav kemikaal biokile külge märkimisväärselt ei adsorbeeru ja kõrvaldamise kõveral on ootefaasi, lagundamis- ja platoofaasiga biolagundamise kõvera tavapärane kuju (punktid 48, 49), võib olla kindel, et mõõdetud kõrvaldamine on põhjustatud biolagundamisest. Kui on toimunud suuremahuline esialgne kõrvaldamine, siis ei suuda simulatsioonikatse eristada bioloogilise ja abiootilise kõrvaldamise protsesse. Sellistel juhtudel ja muudel juhtudel, kui biolagundamise suhtes tekivad kahtlused (näiteks kui toimub väljapuhumine (stripping)), tuleb analüüsida adsorbeerunud uuritavat kemikaali kile proovidel või teha täiendavad biolagundamise staatilised (sõelumis)katsed selgelt bioloogilisi protsesse näitavate parameetrite alusel. Kõnealused katsed on hapniku sidumise meetodid (käesoleva lisa peatüki C.4 meetodid C.4-D, C.4-E ja C.4-F) (9) või katse, millega mõõdetakse CO2 tekkimist (käesoleva lisa peatüki C.4 meetod C.4-C või Headspace-meetod) (10), kasutades inokulumina asjaomase reaktori eelnevalt kokkupuutunud biokilet.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Kui mõõdetud on nii lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamist kui ka konkreetse kemikaali kõrvaldamist, siis näitab kõrvaldamisprotsentide oluline erinevus (kui esimene nimetatutest on viimati nimetatust väiksem) orgaaniliste vahesaaduste olemasolu väljavoolus; selliseid vahesaadusi võib olla keerulisem lagundada ja neid tuleks uurida.
                           
                        
                     Katsetulemuste kehtivus
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Katset võib pidada kehtivaks, kui lahustunud orgaanilise süsiniku (või keemilise hapnikutarbe) kõrvaldamise määr (DB) kontrollseadmetes on kahe nädala möödumisel > 80 % ja ei ole täheldatud ebatavalisi asjaolusid.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Kui on katsetatud kiirelt biolagundatavat (võrdlus)kemikaali, peaks biolagunemise määr olema > 90 % ja paralleelide erinevus ei tohiks olla suurem kui 5 %. Kui need kaks kriteeriumi ei ole täidetud, tuleb katse käik läbi vaadata ja/või hankida olmereovesi muust allikast.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Samuti ei tohiks uuritavat kemikaali töötlevate paralleelseadmete (kui neid kasutatakse) biolagundamise näitajate erinevus olla suurem kui 5 %. Kui see kriteerium ei ole täidetud, aga kõrvaldamise määr on suur, siis jätkake analüüsi veel kolme nädala vältel. Kui kõrvaldamise määr on väike, kontrollige uuritava kemikaali inhibeerivat mõju, kui see ei ole teada, ja korrake katset uuritava kemikaali väiksemal kontsentratsioonil, kui see on teostatav.
                           
                        
                     Katseprotokoll
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Katseprotokollis esitatakse alljärgnev teave.
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uuritav kemikaal:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tunnusandmed;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      füüsikaline olek ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katsetingimused:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      katsesüsteemi mis tahes muudatused, eelkõige lahustumatute või lenduvate ainetega katsete tegemisel;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      orgaanilise kasvukeskkonna tüüp;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tööstuslike jäätmete osakaal reovees ja nende laad, kui neid kasutatakse ja need on teada;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inokulatsioonimeetod;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uuritava kemikaali põhilahus – lahustunud orgaanilise süsiniku sisaldus ja orgaanilise süsiniku kogusisaldus; suspensiooni korral selle valmistamisviis; kasutatav(ad) katsekontsentratsioon(id), kui lahustunud orgaaniline süsinik jääb vahemikust 10–20 mg/l väljapoole, siis selle põhjendus; lisamise meetod; esmakordse lisamise kuupäev; mis tahes muutused kontsentratsioonis;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      keskmine hüdrauliline retentsiooniaeg (ilma kasvuta); toru pöörlemiskiirus; ligikaudne kaldenurk, kui võimalik;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      andmed kile irdumise kohta; aeg ja intensiivsus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      katsetemperatuur ja -vahemik;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kasutatud analüüsimeetodid.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katsetulemused:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kõik mõõdetud andmed (lahustunud orgaaniline süsinik, keemiline hapnikutarve, uuritava kemikaali määramine spetsiifilise analüüsimeetodiga, pH, temperatuur, N-kemikaalid (kui see on asjakohane);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kõik arvutatud Dt (või Dtc), DB, Ds näitajad tabelite kujul ja kõrvaldamise kõverad;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      teave ootefaasi ja platoofaasi, katse kestuse, uuritava kemikaali, võrdluskemikaali (kui seda katses kasutati) ja orgaanilise kasvukeskkonna (kontrollseadmes) kõrvaldamise kohta koos statistilise teabe ja kinnitustega biolagundatavuse ja katse kehtivuse kohta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tulemuste arutelu.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     KIRJANDUS
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. Res. 14: 753–758.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441–444.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214–220.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355-1357.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional trickling filter. JAOCS 43: 92–94.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865–881.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, London.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk C.4 „Kohese biolagunduvuse määramine”, meetodid C.4-A kuni C.4-F.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              ISO 14593 (1998). Water Quality-Evaluation in an aqueous medium of the ultimate biodegradability of organic substances. Method by analysis of released inorganic carbon in sealed vessels.
                           
                        
                     8. liide
                     
                        Joonis 1
                     
                     
                        Pöörlevad torud
                     
                     
                        
                     
                        Sõnastik
                     
                     Pealtvaade
                     Vaade A/B
                     Veorattad
                     Tühikäigurattad
                     Ajami mootor
                     Aeglustusülekanne (reduktor)
                     Sisemine äärik
                     Kallutusmehhanism
                     Keskreduktor
                     
                        Joonis 2
                     
                     
                        Vooskeem
                     
                     
                        
                     A. Söötenõu
                     B. Peristaltiline pump
                     C. Pöörlev toru
                     D. Väljavoolu kogumise nõu
                     
                        MÕISTED
                     
                     Uuritav kemikaal: iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                     Kemikaalid: „tuleb silmas pidada, et mõistet „kemikaal” kasutatakse ÜRO keskkonna- ja arengukonverentsi lepingutes ja edasistes dokumentides laia mõistena, mis hõlmab aineid, tooteid, segusid, valmistisi või mis tahes muid mõisteid, mida võib olemasolevates süsteemides hõlmatuse märkimiseks kasutada”.
                  ”
            
                  10)
               
               
                  Lisatakse peatükid C.27, C.28, C.29 ja C.30:
                  „C.27.   SETTE-VEE MÜRGISUSKATSE SURUSÄÄSKLASTEL RIKASTATUD SETTE KASUTAMISEGA
                  
                  SISSEJUHATUS
                  
                              1.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 218 (2004). Käesolev katsemeetod on kavandatud selleks, et hinnata pikaajalise kemikaalidega kokkupuute mõju setetes elavatele magevee kahetiivaliste (Chironomus sp.) vastsetele. See põhineb Chironomus riparius’e ja Chironomus tentans’i kohta olemas olevatel mürgisuse määramise katse eeskirjadel, mis on koostatud Euroopas (1, 2, 3) ja Põhja-Ameerikas (4, 5, 6, 7, 8) ning mille puhul on tehtud laboritevahelised võrdluskatsed (1, 6, 9). Võib kasutada ka muid hästi dokumenteeritud surusääsklaste liike, näiteks Chironomus yoshimatsui’d (10, 11).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Käesolevas katsemeetodis kasutatav kokkupuutestsenaarium on sette rikastamine uuritava kemikaaliga. Sobiva kokkupuutestsenaariumi valimine oleneb katse kavandatud eesmärgist. Sette kemikaaliga rikastamise stsenaarium on kavandatud settes püsivate kemikaalide akumuleerunud tasemete simuleerimiseks. Käesolevas kokkupuutesüsteemis rikastatakse sette-vee katsesüsteemis setet kemikaaliga.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Ained, mille kohta on vaja teha katsed settes elavate organismidega, jäävad tavaliselt sellesse keskkonda pikaks ajaks püsima. Settes elavad organismid võivad kemikaaliga mitmel viisil kokku puutuda. Iga kokkupuutetee suhteline tähtsus ja aeg, mis on iga kokkupuutetee puhul vajalik üldisse mürgisusse panuse andmiseks, sõltub asjaomase kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest. Tugevasti adsorbeeruvate ainete (näiteks log Kow > 5) või settega kovalentseid sidemeid moodustavate ainete puhul võib tähtis kokkupuutetee olla manustamine saastunud toiduga. Väga lipofiilsete ainete mürgisuse alahindamise vältimiseks võib kaaluda settele sööda lisamist enne uuritava aine kasutamist. Kõigi võimalike kokkupuuteteede arvessevõtmiseks on käesolevas katsemeetodis keskendutud pikaajalisele kokkupuutele. C. riparius’e ja C. yoshimatsui puhul kestab katse 20–28 päeva ning C. tentans’i puhul 28–65 päeva. Kui konkreetsel põhjusel vajatakse andmeid lühema aja kohta, näiteks ebastabiilse kemikaali mõju uurimiseks, võib kümnepäevase ajavahemiku järel võtta täiendavad paralleelproovid.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Mõõdetavad näitajad on vastsetest arenenud valmikute koguarv ja nende arenemiseks vajalik aeg. Vastsete elulemust ja kasvu soovitatakse mõõta alles pärast kümnepäevase ajavahemiku möödumist; kui lisaks vajatakse andmeid lühema aja kohta, kasutatakse vajaduse korral täiendavaid paralleelkatseid.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Soovitatakse kasutada spetsiaalselt koostatud setet. Spetsiaalselt koostatud settel on loodusliku sette ees mitmeid eeliseid:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          väheneb katsete hajuvus, kuna nii saadakse reprodutseeritav standardiseeritud maatriks ning kõrvaldatakse vajadus saastumata ja puhaste setteallikate leidmiseks;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          katseid võib alustada ükskõik millal, ei tule arvestada katse setete hooajalist muutlikkust ja setet ei ole vaja eeltöödelda kohaliku fauna kõrvaldamiseks; spetsiaalselt koostatud sette kasutamine vähendab samuti korrapäraseks katsetamiseks kohapeal piisavas koguses sette kogumisega seotud kulusid;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          spetsiaalselt koostatud sette kasutamine võimaldab mürgisust võrrelda ja selle põhjal aineid järjestada.
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.
                           
                        KATSE PÕHIMÕTE
                  
                              7.
                           
                           
                              Kõigepealt puutuvad surusääsklaste esimese kasvujärgu vastsed kokku sette-vee süsteemis teatavas kontsentratsioonivahemikus oleva uuritava kemikaaliga. Uuritavat ainet lisatakse settesse ja esimese kasvujärgu vastsed lisatakse seejärel katsenõudesse, milles kontsentratsioonid settes ja vees on tasakaalustunud. Katse lõpus mõõdetakse surusääsklaste väljaarenemise määra ja arengu kiirust. Vastsete elulemust ja massi võidakse vajaduse korral mõõta ka kümne päeva möödumisel (kasutades vajaduse korral täiendavaid paralleelkatseid). Neid andmeid analüüsitakse kas regressioonimudeli abil, et hinnata kontsentratsioon, mis põhjustab valmikute väljaarenemise või vastsete elulemuse või kasvu x % vähenemise (näiteks EC15, EC50 jne), või kasutades täheldatava toimeta kontsentratsiooni / vähima täheldatava toimega kontsentratsiooni määramiseks statistilise hüpoteesi testimise meetodit. Viimati nimetatud juhul tuleb täheldatud mõju väärtusi võrrelda statistiliste testide abil kontrollkatses määratud väärtustega.
                           
                        ANDMED UURITAVA AINE KOHTA
                  
                              8.
                           
                           
                              Teada peaks olema uuritava aine lahustuvus vees, aururõhk, mõõdetud või arvutatud jaotumine settesse ning stabiilsus vees ja settes. Kättesaadav peaks olema usaldusväärne analüüsimeetod uuritava aine kvantitatiivseks määramiseks katvas veekihis, poorivees ja settes; meetodi täpsus ja määramispiir peaksid olema teada. Kasulik on teada uuritava aine struktuurivalemit ja puhtust. Samuti on kasulik teada uuritava aine keemilist käitumist (näiteks hajumine, abiootiline ja biootiline lagunemine jne). Täiendavad juhised selliste ainete mõju uurimiseks, mille füüsikalis-keemilised omadused raskendavad selle katse tegemist, on esitatud väljaandes (12).
                           
                        VÕRDLUSKEMIKAALID
                  
                              9.
                           
                           
                              Katse-eeskirjade ja -tingimuste täitmise usaldusväärsuse tagamiseks võib korrapäraselt katsetada võrdluskemikaale. Laboritevahelistes võrdlustes ja valideerimisuuringutes edukalt kasutatud võrdlustoksikandid on näiteks lindaan, trifluraliin, pentaklorofenool, kaadmiumkloriid ja kaaliumkloriid (1, 2, 5, 6, 13).
                           
                        KATSE KEHTIVUS
                  
                              10.
                           
                           
                              Katse kehtivuse tõendamisel arvestatakse järgmist:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          kontrollnõus peab katse lõpuks välja arenema vähemalt 70 % putukaid (1, 6);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          
                                             C. riparius’e ja C. yoshimatsui valmikud peaksid kontrollnõudes välja arenema 12–23 päeva jooksul pärast nende viimist nõudesse; C. tentans’i puhul on vajalik ajavahemik 20–65 päeva;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          katse lõpus tuleks igas nõus mõõta pH ja lahustunud hapniku kontsentratsioon. Hapnikukontsentratsioon peaks olema vähemalt 60 % õhuga küllastamisel saadud väärtusest kasutataval temperatuuril ja katva veekihi pH peaks kõigis katsenõudes olema vahemikus 6–9;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          vee temperatuur ei tohiks erineda rohkem kui ±1,0 °C võrra. Vee temperatuuri on võimalik kontrollida isotermilise ruumi abil ja sel juhul peaks ruumi temperatuur olema sobivate ajavahemike järel kinnitatud.
                                       
                                    
                        MEETODI KIRJELDUS
                  
                     Katsenõud
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Uuring tehakse 600 ml klaasist katsenõudega, mille läbimõõt on 8 cm. Muud nõud on sobivad, kuid need peaksid tagama katva veekihi ja sette vajaliku paksuse. Sette pind peaks olema piisav, et tagada vastse kohta 2–3 cm2. Settekihi paksuse ja katva veekihi paksuse suhe peaks olema 1 : 4. Katsenõud ja muud seadmed, mis katsesüsteemiga kokku puutuvad, peaksid olema valmistatud täies ulatuses klaasist või muust keemiliselt inertsest materjalist (näiteks teflonist).
                           
                        
                     Liigi valimine
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Katses kasutatav liik on eelistatavalt Chironomus riparius. Chironomus tentans on samuti sobiv, aga selle käsitlemine on keerukam ja see nõuab pikemat katseperioodi. Chironomus yohimatsui kasutamine on samuti võimalik. 2. liites on esitatud andmed Chironomus riparius’e kultuuri kasvatamise meetodite kohta. Ka muude liikide, nagu Chironomus tentans’i (4) ja Chironomus yoshimatsui (11) kultuuri kasvatamise tingimused on avaldatud. Enne katset tuleb kinnitada liigi määramist, aga seda ei nõuta enne iga katset, kui organismid pärinevad asutusesisesest kultuurist.
                           
                        
                     Sete
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Eelistatavalt tuleks kasutada spetsiaalselt koostatud setet (mida nimetatakse ka taastatud, tehislikuks või sünteetiliseks setteks). Loodusliku sette kasutamise korral tuleks seda iseloomustada (vähemalt pH, orgaanilise süsiniku sisaldus, samuti on soovitatav määrata muud parameetrid, nagu süsiniku-lämmastiku suhe ja granulomeetria) ning selles ei tohiks olla mingeid saasteaineid ega muid organisme, kes võiksid surusääsklastega konkureerida või neid süüa. Enne loodusliku sette kasutamist surusääsklastel avalduva mürgisuse katses on soovitatav seda seitsme päeva jooksul konditsioneerida samades tingimustes, mis valdavalt esinevad edasise katse käigus. Käesolevas katses soovitatakse kasutada järgmist spetsiaalselt koostatud setet, mis põhineb katsemeetodis C.8 (14) kasutataval tehismullal (1, 15, 16):
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          4–5 % (kuivmass) turvast: pH väärtus võimalikult lähedal vahemikule 5,5–6,0; tähtis on kasutada peeneks jahvatatud (osakese suurus ≤ 1 mm) pulbrilist turvast, mida on kuivatatud ainult õhu käes;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          20 % (kuivmass) kaoliinsavi (kaoliniidisisaldus eelistatavalt üle 30 %);
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          75–76 % (kuivmass) kvartsliiva (see peaks peamiselt koosnema peenest liivast ja rohkem kui 50 % osakestest peaksid olema vahemikus 50–200 μm);
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          lõplikus segus niiskusesisalduse 30–50 % saamiseks lisatakse deioniseeritud vett;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          sette lõpliku segu reguleerimiseks pH vahemikku 7,0 ± 0,5 lisatakse keemiliselt puhast kaltsiumkarbonaati (CaCO3). Lõpliku segu orgaanilise süsiniku sisaldus peaks olema 2 % (±0,5 %) ja see tuleks õigeks seada sobivas koguses turba ja liiva kasutamisega kooskõlas alapunktidega a ja c.
                                       
                                    
                        
                              14.
                           
                           
                              Turba, kaoliinsavi ja liiva päritolu peaks olema teada. Sette koostisosi tuleks kontrollida, et tõendada keemilise saaste puudumine (näiteks raskmetallid, kloororgaanilised ühendid, fosfororgaanilised ühendid jne). Spetsiaalselt koostatud sette valmistamise näidis on esitatud 3. liites. Kuivade koostisosade segamine on samuti lubatav, kui tõendatakse, et pärast katva veekihi lisamist ei toimu sette koostisosade eraldumist (näiteks turbaosakeste hõljumist) ja et turvas või sete on piisavalt konditsioneerunud.
                           
                        
                     Vesi
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Katseveeks sobib vesi, mis vastab 2. ja 4. liites esitatud lahjendamiseks kasutatava vee nõutavatele keemilistele omadustele. Kasvuveena ja katseveena lubatakse kasutada iga sobivat vett, looduslikku vett (pinna- või põhjavesi), taastatud vett (vt 2. liide) või deklooritud kraanivett, kui surusääsklased jäävad selles kasvatamise ja katsetamise ajal ellu ega ilmuta stressi tunnuseid. Katse alguses peaks katsevee pH olema vahemikus 6–9 ja vee summaarne karedus ei tohiks olla suurem kui 400 mg/l CaCO3-na. Kui oletatakse karedust tekitavate ioonide ja uuritava aine omavahelist mõju, tuleks kasutada siiski väiksema karedusega vett (ja seega ei tohiks sel juhul kasutada Elendti kasvukeskkonda M4). Kogu uuringu vältel tuleks kasutada sama tüüpi vett. 4. liites loetletud vee kvaliteedi omadusi tuleks mõõta vähemalt kaks korda aastas või siis, kui kahtlustatakse, et kõnealused omadused võivad olla oluliselt muutunud.
                           
                        
                     Põhilahused – rikastatud setted
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Tavaliselt valmistatakse valitud kontsentratsiooniga rikastatud setted uuritava aine lahuse otse settesse lisamise teel. Deioniseeritud vees lahustatud uuritava aine põhilahus segatakse spetsiaalselt koostatud settega rullimisseadme või söödasegaja abil või käsitsi. Vees halvasti lahustuva uuritava aine võib lahustada võimalikult väikses sobiva orgaanilise lahusti (näiteks heksaan, atsetoon või kloroform) koguses. See lahus segatakse ühes katsenõus seejärel 10 g peene kvartsliivaga. Lahustil lastakse auruda ja see tuleb liivast täielikult kõrvaldada; seejärel segatakse liiv katsenõu jaoks sobivas koguses settega. Uuritava aine solubiliseerimiseks, dispergeerimiseks või emulgeerimiseks võib kasutada ainult kergesti lenduvaid aineid. Tuleks meeles pidada, et sette valmistamisel tuleb arvesse võtta uuritava aine ja liiva segust pärit liiva (s.o sete tuleks siis valmistada väiksema liivakogusega). Tuleks hoolitseda, et settele lisatud uuritav aine oleks settes põhjalikult ja ühtlaselt jaotatud. Vajaduse korral võib homogeensuse taseme määramiseks analüüsida alamproove.
                           
                        KATSE KAVANDAMINE
                  
                              17.
                           
                           
                              Katse kavandamine hõlmab katse kontsentratsioonide arvu ja vahemike valimist, iga kontsentratsioonitaseme jaoks nõude arvu ning igas nõus olevate vastsete arvu valimist. Kirjeldatud on, kuidas hinnata EC-punktide väärtusi ja täheldatava toimeta kontsentratsiooni ning teha piirsisalduskatset.
                           
                        
                     Regressioonanalüüsi kavandamine
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Katses kasutatavad kontsentratsioonid peaksid hõlmama toimet avaldavat kontsentratsiooni (nt EC15, EC50) ja uuritava aine puhul huvi pakkuvat kontsentratsioonivahemikku. Tavaliselt paraneb toimet avaldavate kontsentratsioonide (ECx) hinnangute täpsus ja eelkõige kehtivus, kui toimet avaldav kontsentratsioon on uuritud kontsentratsioonide vahemikus. Tuleks vältida suurt ekstrapoleerimist allapoole väikseimat positiivset kontsentratsiooni või ülespoole suuremat kontsentratsiooni. Eelnev annusevahemiku leidmise katse aitab valida kasutatavat kontsentratsioonivahemikku (vt punkt 27).
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Kui tuleb hinnata ECx, tuleks katse teha vähemalt viie kontsentratsiooniga ja iga kontsentratsiooni kohta tuleks kasutada kolme paralleelkatset. Igal juhul on mudeli korraliku hindamise jaoks soovitatav kasutada piisavaid uuritavaid kontsentratsioone. Kontsentratsioonidevaheline kordaja ei tohiks olla suurem kui 2 (erandi võib teha juhul, kui doosi mõju graafiku tõus on madal). Iga doosi paralleelkatsete arvu võib vähendada, kui suurendatakse eri mõjuga uuritavate kontsentratsioonide arvu. Paralleelkatsete arvu suurendamine või uuritavate kontsentratsioonide vahemiku vähendamine enamasti vähendab usaldusvahemikku. Kui on vaja hinnata vastsete elulemust ja kasvu kümne päeva järel, on vaja võtta täiendavaid paralleelproove.
                           
                        
                     Täheldatava toimeta kontsentratsiooni / vähima täheldatava toimega kontsentratsiooni hindamise kavandamine
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Kui hinnatakse täheldatava toimeta kontsentratsiooni või vähimat täheldatava toimega kontsentratsiooni, tuleks kasutada viit uuritavat kontsentratsiooni vähemalt nelja paralleelkatsega ja kõnealuseid kontsentratsioone eraldav kordaja ei tohiks olla suurem kui 2. Paralleelkatsete arv peaks olema piisav, et tagada piisav statistiline võimsus, et tuvastada katse- ja kontrollseadme tulemuste 20 % erinevus 5 % statistilise olulisusega (p = 0,05). Arengu kiiruse puhul on üldiselt asjakohane variatsioonanalüüs (ANOVA), näiteks Dunnetti test ja Williamsi test (17, 18, 19, 20). Väljaarenemise suhte puhul võib kasutada Cochrani-Armitage’i testi, Fisheri täpset testi (Bonferroni parandusega) või Manteli-Haenszeli testi.
                           
                        
                     Piirsisalduskatse
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Kui esialgsetes annusevahemiku leidmise katsetes tulemusi ei saadud, võib teha piirsisalduskatse (üks katsekontsentratsioon ja kontroll). Piirsisalduskatse eesmärk on teha katse kontsentratsioonil, mis on piisavalt suur, et otsustajad võiksid uuritava aine mürgisuse välistada, ning piirsisalduseks võetakse kontsentratsioon, mida eeldatavasti üheski olukorras ei teki. Soovitatakse kasutada 1 000 mg/kg (kuivmass). Enamasti tuleb nii töötlus- kui ka kontrollseadmetega teha vähemalt kuus paralleelkatset. Tuleks tõendada piisava statistilise võimsuse olemasolu, et tuvastada katse- ja kontrollseadme tulemuste 20 % erinevus 5 % statistilise olulisusega (p = 0,05). Mõõdetavate suuruste (arengu kiirus ja kaal) puhul, kui andmed vastavad käesoleva katse nõuetele (normaalsus, ühtlane hajumine), on asjakohane statistiline meetod t-kriteerium. Kui need nõuded ei ole täidetud, võib kasutada mittevõrdse hajumise t-kriteeriumi või mitteparameetrilist testi, näiteks Wilcoxoni-Manni-Whithey testi. Valmikute väljaarenemise suhte puhul on asjakohane kasutada Fisheri täpset testi.
                           
                        KATSE KÄIK
                  
                     Kokkupuutetingimused
                  
                  
                     Rikastatud sette-vee süsteemi valmistamine
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Uuritavate ainete lisamiseks soovitatakse kasutada rikastamismeetodit, mida on kirjeldatud katsemeetodis C.8 „Toksilisus vihmaussidele” (14). Rikastatud setted asetatakse nõudesse ja neile lisatakse kattev veekiht, et saada sette-vee ruumala suhe 1 : 4 (vt punktid 11 ja 15). Settekihi paksus peaks olema 1,5–3 cm. Sette osade eraldumise ja veesambas katsevee lisamisel peene materjali uue suspensiooni tekkimise vältimiseks võib sette katta vee valamise ajal plastikkettaga, mis pärast vee valamist kohe eemaldatakse. Võib kasutada ka muid võtteid.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Katsenõud peaksid olema kaetud (näiteks klaasplaadiga). Vajaduse korral lisatakse vee aurumise kompenseerimiseks ja uuringu algse veetaseme saavutamiseks vett. Soolade kogunemise vältimiseks tuleks lisada destilleeritud või deioniseeritud vett.
                           
                        
                     Püsikindluse tagamine
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Kui rikastatud sete koos katva veekihiga on valmistatud, on soovitatav lasta uuritaval kemikaalil jaotuda vee ja sette vahel (3, 4, 6, 13). Seda tuleks eelistatavalt teha katses kasutatavates temperatuuri- ja õhustustingimustes. Vajalik tasakaalustumisaeg sõltub settest ja kemikaalist ning võib kesta tunde, päevi ja harvadel juhtudel isegi kuni mitu nädalat (4–5 nädalat). Kuna paljud kemikaalid võivad sellise aja jooksul laguneda, ei oodata tasakaaluoleku teket, vaid soovitatakse 48-tunnist tasakaalustamise ajavahemikku. Kõnealuse täiendava tasakaalustamise ajavahemiku lõpus tuleks mõõta uuritava aine kontsentratsioon katvas veekihis, poorivees ja settes vähemalt suurimal ja väiksemal kontsentratsioonil (vt punkt 38). Need uuritava aine analüütilised määramised võimaldavad arvutada massitasakaalu ja väljendada tulemusi mõõdetud kontsentratsioonide alusel.
                           
                        
                     Katseorganismide lisamine
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Neli kuni viis päeva enne katseorganismide lisamist katsenõudesse tuleks võtta kultuuridest munamassid ja asetada need väikestesse nõudesse kultuuri kasvukeskkonnas. Võib kasutada varukultuuri vana kasvukeskkonda või värskelt valmistatud kasvukeskkonda. Viimati nimetatu kasutamisel tuleks lisada kultuuri kasvukeskkonnale väikses koguses sööta, näiteks rohevetikaid ja/või paar tilka peeneks jahvatatud helbelise kalasööda suspensiooni filtraadist (vt 2. liide). Tuleks kasutada ainult värskelt munetud munamasse. Tavaliselt hakkavad vastsed kooruma paari päeva möödumisel munade munemisest (2–3 päeva Chironomus riparius’e puhul temperatuuril 20 °C ning 1–4 päeva Chironomus tentans’i puhul temperatuuril 23 °C ja Chironomus yoshimatui puhul temperatuuril 25 °C) ja vastsed kasvavad neljas kasvujärgus, millest iga kasvujärk kestab 4–8 päeva. Katses tuleks kasutada esimese kasvujärgu vastseid (2–3 või 1–4 päeva pärast koorumist). Sääskede kasvujärke on võimalik kontrollida peakapsli laiuse mõõtmisega (6).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Tömbi pipeti abil jaotatakse 20 esimese kasvujärgu vastset juhuslikult igasse katsenõusse, mis sisaldavad rikastatud setet ja vett. Vee aereerimine tuleb vastsete katsenõudesse lisamise ajal peatada ja seda ei jätkata 24 tunni vältel pärast vastsete lisamist (vt punktid 25 ja 32). Kasutatava katsekava kohaselt (vt punktid 19 ja 20) on kasutatud vastsete arv kontsentratsiooni kohta toimet avaldava kontsentratsiooni (EC-punkti) hindamise korral vähemalt 60 ja täheldatava toimeta kontsentratsiooni määramise korral 80.
                           
                        
                     Uuritavad kontsentratsioonid
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Annusevahemiku leidmise katse võib aidata kindlaks teha lõpliku katse kontsentratsioonivahemikke. Selleks kasutatakse uuritava aine laiade vahedega kontsentratsioonide seeriat. Lõplikus katses kasutatavaga sama pindtiheduse tagamiseks iga surusääsklase kohta puutuvad surusääsklased kokku uuritava aine iga kontsentratsiooniga sellise ajavahemiku vältel, mis võimaldab hinnata asjakohaseid katsekontsentratsioone; paralleelproovid ei ole vajalikud.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Lõpliku katse kontsentratsioonid määratakse kindlaks annusevahemiku leidmise katse tulemuse alusel. Tuleks kasutada vähemalt viit kontsentratsiooni ja need tuleks valida nii, nagu on kirjeldatud punktides 18–20.
                           
                        
                     Kontrollkatsed
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Katse peaks hõlmama vajalikku arvu paralleelseid settega kontrollkatsenõusid, milles ei ole uuritavat ainet (vt punktid 19–20). Kui uuritava aine lisamiseks on kasutatud lahustit (vt punkt 16), siis tuleks teha settele lahusti lisamise kontrollkatse.
                           
                        
                     Katsesüsteem
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Kasutatakse staatilisi süsteeme. Erandjuhul võib kasutada poolstaatilisi või läbivooluga süsteeme koos katva veekihi vahelduva või pideva uuendamisega, näiteks kui vee kvaliteet ei ole katseorganismile enam sobiv või mõjutab kemikaali tasakaaluolekut (näiteks lahustunud hapniku tase langeb liiga madalale, väljutatud saaduste kontsentratsioon muutub liiga suureks või settest leostuvad mineraalained, mis mõjutavad pH-d ja/või vee karedust). Tavaliselt on siiski piisavad ja eelistatavad muud katva veekihi kvaliteedi parandamise meetodid, näiteks aereerimine.
                           
                        
                     Sööt
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Vastseid tuleb sööta eelistatavalt iga päev või vähemalt kolm korda nädalas. Kalasööt (suspensioon vees või peeneks jahvatatud sööt, näiteks TetraMin või TetraPhyll; vt andmed, 2. liide) koguses 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg C. yoshimatui puhul) vastse kohta päevas näib olevat esimese kümne päeva jooksul noorte vastsete jaoks piisav. Vanemad vastsed võivad vajada mõnevõrra rohkem sööta: 0,5–1 mg vastse kohta päevas peaks olema piisav ülejäänud katse vältel. Söödakogust tuleks vähendada kõigi töötlemiste korral ja reguleerida, kui täheldatakse seente kasvu või kui kontrollkatses täheldatakse suremust. Kui seente kasvu ei ole võimalik peatada, tuleb katset korrata. Kui katseid tehakse tugevalt adsorbeeruva ainega (näiteks log Kow > 5) või settega kovalentseid sidemeid tekitava ainega, võib enne stabiliseerumise ajavahemikku lisada spetsiaalselt koostatud settele sellise söödakoguse, mis on vajalik organismide elulemuse ja loodusliku kasvu tagamiseks. Selleks tuleb kasutada kalasööda asemel taimset materjali, näiteks võib kasutada 0,5 % (kuivmass) kõrvenõgese (Urtica dioica), mooruspuu (Morus alba), valge ristiku (Trifolium repens), spinati (Spinacia oleracea) peeneks jahvatatud lehti või muud taimset materjali (Cerophyl või alfatselluloos).
                           
                        
                     Inkubeerimistingimused
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Eelistatavalt 24 tundi pärast vastsete lisamist hakatakse katsenõudes katvat veekihti kergelt aereerima, mida jätkatakse kogu katse vältel (tuleb olla hoolikas, et lahustunud hapniku kontsentratsioon ei langeks alla 60 % hapniku küllastuskontsentratsioonist). Aereerimiseks kasutatakse klaasist Pasteuri pipetti, mis on kinnitatud settekihi kohale 2–3 cm kõrgusele (üks või mõni mull sekundis). Lenduva kemikaali katsetamisel võib kaaluda sette-vee süsteemi aereerimisest loobumist.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Katse tehakse püsival temperatuuril 20 °C (±2 °C). C. tentans’i ja C. yoshimatui puhul on soovitatavad temperatuurid vastavalt 23 °C ja 25 °C (±2 °C). Kasutatakse 16-tunnist valgustusperioodi ja valguse intensiivsus peaks olema 500 kuni 1 000 luksi.
                           
                        
                     Kokkupuute kestus
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Kokkupuude algab vastsete lisamisega rikastatud ja kontrollnõudesse. Maksimaalne kokkupuute kestus on 28 päeva C. riparius’e ja C. yoshimatsui puhul ning 65 päeva C. tentans’i puhul. Kui sääsed arenevad välja varem, võib katse lõpetada vähemalt viie päeva möödumisel pärast viimase valmiku väljaarenemist kontrollnõus.
                           
                        
                     Vaatlused
                  
                  
                     Väljaarenemine
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Tehakse kindlaks arengu aeg ning täielikult väljaarenenud isas- ja emassääskede koguarv. Isased on tänu sulgjatele tundlatele kergesti äratuntavad.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Katsenõusid tuleks vaadelda vähemalt kolm korda nädalas, et hinnata visuaalselt iga ebatavalist käitumist (näiteks settest väljumine, ebatavaline ujumine) kontrollnõuga võrreldes. Oodataval valmikute ilmumise ajal loendatakse sääski iga päev. Registreeritakse täielikult väljaarenenud sääskede sugu ja arv. Pärast tuvastamist kõrvaldatakse sääsed nõudest. Enne katse lõpetamist munetud munamassid tuleks registreerida ja seejärel eemaldada, et vältida settesse uute vastsete teket. Samuti registreeritakse nende nähtavate nukkude arv, millest sääsk ei koorunud. Suunised väljaarenemise mõõtmise kohta on esitatud 5. liites.
                           
                        
                     Kasvamine ja elulemus
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Kui on vaja esitada andmeid vastsete elulemuse ja kasvu kohta kümne päeva jooksul, tuleks katset alustada suurema arvu nõudega, et neid oleks võimalik seejärel kasutada. Kõnealuste täiendavate nõude setteid sõelutakse vastsete saamiseks 250 μm sõela abil. Surma tuvastamise kriteeriumid on liikumatus või reageerimatus mehaanilisele stiimulile. Vastsed, keda ei õnnestunud kätte saada, tuleks samuti surnuks lugeda (vastsed, kes surid katse alguses, võivad olla juba mikroobide poolt lagundatud). Tehakse kindlaks ellujäänud vastsete (tuhavaba) kuivmass katsenõu kohta ja arvutatakse keskmine individuaalne kuivmass nõu kohta. Kasulik on määrata, millisesse kasvujärku ellujäänud vastsed kuuluvad; selleks võib mõõta iga isendi peakapsli laiust.
                           
                        
                     Analüütilised mõõtmised
                  
                  
                     Uuritava aine kontsentratsioon
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Uuritava aine kontsentratsiooni analüütiliseks määramiseks settes võetakse sette proovid enne katse algust (s.o vastsete lisamist) vähemalt ühest nõust iga kokkupuutetaseme kohta. Soovitatakse, et katse alguses (vt punkt 24) ja lõpus analüüsitakse suurimal ja väikseimal kontsentratsioonil vähemalt katva veekihi, poorivee ja sette proove. Kõnealused uuritava aine kontsentratsiooni määramised annavad teavet uuritava aine käitumise/jaotumise kohta vee-sette süsteemis.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Kui tehakse vahepealseid mõõtmisi (näiteks seitsmendal päeval) või kui analüüsi jaoks on vaja suurt proovi, mida ei saa katsenõust ilma katsesüsteemi mõjutamata võtta, tuleks analüüs teha samal viisil töödeldud, kuid bioloogilisteks vaatlusteks mitte kasutatavast täiendavast katsenõust (kus on ka katseorganismid) võetud proovist.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Tsentrifuugimine näiteks 10 000 g ja 4 °C juures 30 minuti vältel on soovitatav meetod poorivee eraldamiseks. Kui on tõendatud, et uuritav aine ei adsorbeeru filtritele, võib sobida ka filtrimine. Mõnel juhul ei pruugi liiga väikse proovi suuruse tõttu olla võimalik poorivee kontsentratsiooni määramine.
                           
                        
                     Füüsikalis-keemilised parameetrid
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Katsenõude pH-d ja temperatuuri (vt punkt 10) tuleks mõõta asjakohasel viisil. Katse alguses ja lõpus tuleks kontrollnõudes ja ühes suurima kontsentratsiooniga katsenõus mõõta karedust ja ammoniaaki.
                           
                        KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE
                  
                     Tulemuste töötlemine
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Kõnealuse katse eesmärk on teha kindlaks uuritava aine mõju isas- ja emassääskede arengu kiirusele ning täielikult välja arenenud sääskede koguarvule või kümnepäevase katse korral mõju vastsete elulemusele ja kehamassile. Kui puuduvad andmed sugude statistiliselt erineva tundlikkuse kohta, võib statistilistes analüüsides isaste ja emaste tulemused koondada. Sugude erinevat tundlikkust on võimalik statistiliselt hinnata näiteks χ2-r × 2 tabeli testi abil. Vajaduse korral tuleb kümne päeva möödumisel teha kindlaks vastsete elulemus ja keskmine individuaalne kuivmass nõu kohta.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Toimet avaldavad kontsentratsioonid, mis põhinevad kuivmassil ja väljendatakse kuivmassina, arvutatakse eelistatavalt katse alguses mõõdetud sette kontsentratsioonide alusel (vt punkt 38).
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              EC50 või muu ECx-näitaja arvutamiseks võib tegelike paralleelproovidena kasutada nõude statistikat. Iga ECx usaldusvahemiku arvutamisel tuleks arvesse võtta eri nõude tulemuste hajumist või tuleks näidata, et kõnealune hajumine on nii väike, et seda võib eirata. Kui andmeid töödeldakse mudeli parameetrite leidmiseks vähimruutude meetodiga, tuleks nõu statistikat teisendada, et dispersioon oleks ühtlasem. ECx-väärtused tuleks siiski arvutada pärast tulemuse esialgsele väärtusele tagasiteisendamist.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Kui statistilise analüüsi eesmärk on teha hüpoteesi katsetamise abil kindlaks täheldatava toimeta kontsentratsioon / vähim täheldatava toimega kontsentratsioon, tuleb võtta arvesse nõudevahelist hajuvust, näiteks kasutada hierarhilist dispersioonanalüüsi (nested ANOVA). Olukorras, kus tavapärased dispersioonanalüüsi (ANOVA) eeldused ei ole täidetud, võivad paremini sobida töökindlamad testid (21).
                           
                        
                     Väljaarenemise määr
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Väljaarenemise määrad on kõik-või-mitte-midagi-andmed ja neid on võimalik analüüsida astmeliselt kohaldatava Cochrani-Armitage’i testi abil, kus eeldatakse, et mõju sõltuvus doosist on monotoonne, ja need andmed on selle eeldusega kooskõlas. Vastasel juhul võib kasutada Fisheri täpset testi või Manteli-Haenszeli testi Bonferroni-Holmi kohandatud p-väärtustega. Kui on tõendeid, et ühe kontsentratsiooniga paralleelproovide hajuvus on suurem, kui eeldatakse binoomjaotuse dispersiooni puhul (nn ekstra-binoomjaotuse dispersioon), tuleks kasutada töökindlat Cochrani-Armitage’i või Fisheri täpset testi, nagu on soovitatud (21).
                              Määratakse nõu kohta välja arenenud sääskede arv ne, mis jagatakse lisatud vastsete arvuga na:
                              
                                 
                              kus:
                              
                                          ER
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          väljaarenemise määr
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          nõu kohta välja arenenud sääskede arv
                                       
                                    
                                          na
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          nõu kohta lisatud vastsete arv.
                                       
                                    
                        
                              47.
                           
                           
                              Ekstra-binoomjaotuse dispersiooni korral on suurte valimite puhul kõige asjakohasem alternatiiv käsitleda väljaarenemise määra pideva vastusena ning kasutada selliseid meetodeid nagu Williamsi test, kui võib eeldada, et mõju sõltuvus doosist on monotoonne, kui see on kooskõlas kõnealuste väljaarenemise määra andmetega. Kui monotoonsust ei ole, on asjakohane kasutada Dunnetti testi. Suur valim on siinkohal määratletud kui väljaarenenud sääskede arv ja väljaarenemata jäänud sääskede arv, mis mõlemad on suuremad kui viis paralleelproovi (nõu) kohta.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Dispersioonanalüüsi (ANOVA) meetodite kohaldamiseks tuleks väljaarenemise määra väärtused kõigepealt teisendada arkussiinus-ruutjuure-teisenduse või Freemani-Tukey teisenduse abil, et saada ligikaudne normaaljaotus ja võrdsustada variatsioonid. Cochrani-Armitage’i testi, Fisheri täpse testi (Bonferroni) või Manteli-Haenszeli testi võib kasutada absoluutsete sageduste kasutamisel. Arkussiinus-ruutjuure-teisendust kohaldatakse, arvutades väljaarenemise määra ruutjuure siinuse pöördarvu (sin–1).
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Väljaarenemise määrade puhul arvutatakse ECx-väärtused regressioonanalüüsi (või näiteks probit- (22) või logit-teisenduse, Weibulli meetodi, sobiva müügiloleva tarkvara jne) abil. Kui regressioonanalüüs ebaõnnestub (näiteks kui on vähem kui kaks osalist vastust), kasutatakse muid mitteparameetrilisi meetodeid, näiteks libisev keskmine või lihtne interpolatsioon.
                           
                        
                     Arengu kiirus
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Keskmine arengu aeg on keskmine ajavahemik vastsete lisamise (katse päev 0) ja sääskede katsekohordi tekke vahel. (Tegeliku arenguaja arvutamiseks tuleks arvesse võtta vastsete vanust lisamise ajal.) Arengu kiirus on pöördvõrdeline arengu ajaga (ühik: 1/päev) ja väljendab vastsete arengu seda osa, mis toimub ühe päeva jooksul. Kõnealuste sette mürgisuse hindamise uuringute puhul eelistatakse arengu kiirust, kuna selle dispersioon on väiksem, homogeensem kui arenguaja puhul ja lähedasem normaaljaotusele. Seega võib arengu kiiruse puhul kasutada tugevaid parameetrilisi testimismeetodeid, mida ei saa kasutada arenguaja puhul. Arengu kiiruse kui pideva vastuse jaoks saab ECx-väärtusi hinnata regressioonanalüüsiga (näiteks 23, 24).
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Järgmiste statistiliste testide puhul eeldatakse, et kontrolli päeval x täheldatud sääsed on välja arenenud keskmisel ajavahemikul päeva x ja päeva x – l vahel (l = kontrollimistevahelise ajavahemiku pikkus, tavaliselt üks päev). Keskmine arengu kiirus nõu kohta (x) arvutatakse järgmise võrrandi alusel:
                              
                                 
                              kus:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          –
                                       
                                       
                                          keskmine arengu kiirus nõu i kohta
                                       
                                    
                                          i
                                       
                                       
                                          –
                                       
                                       
                                          kontrollivahemiku indeks
                                       
                                    
                                          m
                                       
                                       
                                          –
                                       
                                       
                                          kontrollivahemike maksimaalne arv
                                       
                                    
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          –
                                       
                                       
                                          kontrollivahemikul i välja arenenud sääskede arv
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          –
                                       
                                       
                                          katse lõpuks välja arenenud sääskede koguarv (=)
                                       
                                    
                                          xi
                                          
                                       
                                       
                                          –
                                       
                                       
                                          ajavahemikul i välja arenenud sääskede arengu kiirus
                                       
                                    
                                 
                              kus:
                              
                                          dayi (päevi)
                                       
                                       
                                          –
                                       
                                       
                                          kontrolli päev (lisamisest möödunud päevade arv)
                                       
                                    
                                          li
                                          
                                       
                                       
                                          –
                                       
                                       
                                          kontrolli vahemiku pikkus i (päevades, tavaliselt üks päev).
                                       
                                    
                        
                     Katseprotokoll
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Katseprotokollis tuleks esitada vähemalt järgmine teave.
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uuritav aine:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      füüsikaline olek ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused (lahustuvus vees, aururõhk, jaotustegur mullas (või settes, kui see on määratud), stabiilsus vees jne);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kemikaali tunnusandmed (üldkasutatav nimetus, keemiline nimetus, struktuurivalem, CASi number jne), sh puhtus ja uuritava aine kvantitatiivse analüüsi meetod.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katseorganismi liik:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kasutatud katseloom: liik, teaduslik nimetus, organismide päritolu ja kasvatustingimused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      teave munamasside ja vastsete käsitlemise kohta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      katseloomade vanus katsenõudesse sisestamise ajal.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katsetingimused:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kasutatud sete, s.o looduslik või spetsiaalselt koostatud sete;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      loodusliku sette puhul setteproovi võtmise koha asukoht ja kirjeldus, sh võimaluse korral saastumise ajalugu; omadused: pH, orgaanilise süsiniku sisaldus, süsiniku-lämmastiku suhe ja granulomeetria (kui see on asjakohane);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      spetsiaalselt koostatud sette valmistamine: koostisosad ja omadused (orgaanilise süsiniku sisaldus, pH, niiskus jne katse alguses);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      katsevee valmistamine (kui kasutatakse taastatud vett) ja omadused (hapnikusisaldus, pH, elektrijuhtivus, karedus jne katse alguses);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      settekihi ja katva veekihi paksus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      katva veekihi ja poorivee maht; märja sette kaal koos pooriveega ja ilma selleta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      katsenõud (materjal ja suurus);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sette rikastamise meetod: kasutatud uuritava kemikaali kontsentratsioonid, paralleelproovide arv ja lahusti kasutamine, kui seda tehti;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rikastatud sette-vee süsteemi stabiliseerimise tasakaaluoleku faas; kestus ja tingimused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inkubatsioonitingimused: temperatuur, valgustusperiood ja valguse intensiivsus, aereerimine (sagedus ja intensiivsus);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      üksikasjalik teave söötmise kohta, sh sööda tüüp, valmistamine, kogus ja söötmise ajakava.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemused:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominaalsed katsekontsentratsioonid, mõõdetud katsekontsentratsioonid ja kõigi nende analüüside tulemused, millega määrati uuritava aine kontsentratsiooni katsenõus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vee kvaliteet katsenõus, s.o pH, temperatuur, lahustunud hapnik, karedus ja ammoniaak;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aurustunud katsevee asendamine, kui seda tehti;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      väljaarenenud isas- ja emassääskede arv iga nõu ja iga päeva kohta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      iga nõu kohta nende vastsete arv, kellest sääski ei arenenud;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vastsete keskmine individuaalne kuivmass iga nõu ja kasvujärgu kohta, kui see on asjakohane;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      valmikute väljaarenemise protsent iga paralleelproovi ja katsekontsentratsiooni kohta (isas- ja emassääsed kokku);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      täielikult välja arenenud sääskede keskmine arengu kiirus iga paralleelproovi ja katsekontsentratsiooni kohta (isas- ja emassääsed kokku);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      mürgisuse näitajate hinnangud, näiteks ECx (ja selle usaldusvahemik), täheldatava toimeta kontsentratsioon ja/või vähim täheldatava toimega kontsentratsioon ning nende määramiseks kasutatud statistilised meetodid;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tulemuste arutelu, kaasa arvatud käesolevast katsemeetodist kõrvalekaldumise võimalik mõju katsetulemustele.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     KIRJANDUS
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Käesoleva lisa katsemeetod C.8 „Toksilisus vihmaussidele”.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303.
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096–1121.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482–491.
                           
                        
                              19)
                           
                           
                              Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103–117.
                           
                        
                              20)
                           
                           
                              Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531.
                           
                        
                              21)
                           
                           
                              Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577–585.
                           
                        
                              22)
                           
                           
                              Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.
                           
                        
                              23)
                           
                           
                              Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494.
                           
                        
                              24)
                           
                           
                              Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312.
                           
                        
                     1. liide
                     MÕISTED
                     Käesolevas katsemeetodis kasutatakse järgmisi mõisteid järgmises tähenduses:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    spetsiaalselt koostatud sete (ehk taastatud, tehislik või sünteetiline sete) – selliste materjalide segu, mida kasutatakse loodusliku sette füüsiliste koostisosade imiteerimiseks;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    kattev veekiht – vesi, mis pannakse katsenõus sette peale;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    poorivesi – sette- või mullaosakeste vahelises ruumis olev vesi;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    rikastatud sete – sete, millele on lisatud uuritavat ainet;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                              
                           
                  
                     2. liide
                     
                        
                           Chironomus riparius’e kasvatamist käsitlevad soovitused
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 
                                    Chironomus’e vastseid võib kasvatada kristallisatsiooninõus või suuremas mahutis. Mahuti põhi kaetakse ligikaudu 5–10 mm paksuse peene kvartsliiva kihiga. Diatomiit (näiteks Merck, Art 8117) on samuti tõendatult sobiv substraat (piisab õhemast kihist, isegi mõnest millimeetrist). Seejärel lisatakse sobivat vett mitme cm paksuse kihina. Vett tuleks vajaduse korral lisada aurumiskadude asendamiseks ja kuivamise vältimiseks. Vee võib vajaduse korral välja vahetada. Tuleks tagada kerge aereerimine. Vastsete kasvatamise nõusid tuleks hoida vastavas puuris, millega takistatakse väljaarenenud täiskasvanud isendite väljapääsu. Puur peaks olema piisavalt suur, et võimaldada väljaarenenud valmikute parvedesse kogunemist, vastasel juhul ei pruugi toimuda paljunemist (miinimumsuurus on ligikaudu 30 × 30 × 30 cm).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Puure tuleks hoida toatemperatuuril või püsiva keskkonnaga ruumis temperatuuril 20 ± 2 °C 16-tunnise valgustusperioodiga (intensiivsus ligikaudu 1 000 luksi) ja kaheksa tunni pimedusega. On teada, et vähem kui 60 %-line suhteline õhuniiskus võib paljunemist takistada.
                              
                           
                        Lahjendusvesi
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Võib kasutada mis tahes looduslikku või sünteetilist vett. Enamasti kasutatakse kaevuvett, deklooritud kraanivett ja tehislikke kasvukeskkondi (näiteks Elendti kasvukeskkond M4 või M7, vt allpool). Vett tuleb enne kasutamist aereerida. Vajaduse korral võib kultuuri kasvuvett uuendada, eemaldades kasutatud vee kultuuri kasvunõudest ettevaatlikult valamise teel või sifooniga, kahjustamata vastsete kestasid.
                              
                           
                        Vastsete söötmine
                     
                     
                                 4.
                              
                              
                                 
                                    Chironomus’e vastseid tuleks sööta helbelise kalasöödaga (TetraMin®, TetraPhyll® või muu samalaadne kaubanduslik kalasööda tootemark) koguses ligikaudu 250 mg nõu kohta päevas. Sööta võib anda kuiva jahvatatud pulbrina või suspensioonina vees: 1,0 g helbelist kalasööta lisatakse 20 ml lahjendusveele ja see segatakse homogeense segu saamiseni. Seda preparaati võib sööta koguses 5 ml nõu kohta päevas (preparaati tuleks enne kasutamist loksutada). Vanemad vastsed võivad vajada rohkem sööta.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Söötmist kohandatakse vee kvaliteediga. Kui kultuuri kasvukeskkond muutub häguseks, tuleks sööda hulka vähendada. Sööda lisamist tuleb hoolikalt jälgida. Liiga vähe sööta põhjustab vastsete rände veesamba suunas ning liiga palju sööta hoogustab mikroobide tegevust ja vähendab vee hapnikusisaldust. Mõlemad tingimused võivad vähendada kasvu kiirust.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Uute kultuuri kasvunõude valmisseadmisel võib lisada ka mõne rohevetika (näiteks Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) rakke.
                              
                           
                        Väljaarenenud valmikute söötmine
                     
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Mõned teadlased on soovitanud väljaarenenud valmikute söötmiseks kasutada küllastunud sahharoosilahuses niisutatud puuvillast lappi.
                              
                           
                        Väljaarenemine
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Ligikaudu 13–15 päeva möödumisel hakkavad temperatuuril 20 ± 2 °C vastsete kasvatamise nõudest väljuma valmikud. Isased on tänu sulgjatele tundlatele kergesti äratuntavad.
                              
                           
                        Munamassid
                     
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Kui valmikud on paljundamispuuris, tuleks kõiki vastsete kasvatamise nõusid kontrollida kolm korda nädalas sinna želatiinjate munamasside lisandumise suhtes. Kui leitakse munamass, tuleks see hoolikalt kõrvaldada. See tuleks üle kanda väiksele tassile, mis sisaldab paljundusvee proovi. Munamasse kasutatakse uue kasvunõu kasutusele võtmiseks (näiteks 2–4 munamassi nõu kohta) või mürgisuse katsetes.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Esimese kasvujärgu vastsed peaksid kooruma 2–3 päeva pärast.
                              
                           
                        Uute kasvunõude ülesseadmine
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Kui kultuurid on loodud, peaks iga nädal (või katsenõuetest olenevalt väiksema sagedusega) olema võimalik vastsete uute kasvunõude ülesseadmine, kõrvaldades vanemad nõud pärast täiskasvanud sääskede väljaarenemist. Seda süsteemi kasutades saadakse minimaalse vaevaga regulaarne valmikute varu.
                              
                           
                        Katselahuste M4 ja M7 valmistamine
                     
                     
                                 12.
                              
                              
                                 Elendt (1990) on kirjeldanud kasvukeskkonda M4. Kasvukeskkond M7 valmistatakse samal viisil kui kasvukeskkond M4, v.a tabelis 1 nimetatud ainete puhul, mille kontsentratsioon kasvukeskkonnas M7 on kasvukeskkonnaga M4 võrreldes neli korda väiksem. Kasvukeskkonda M7 käsitlev artikkel on kirjutamisel (Elendt, isiklik teade). Katselahust ei tohiks koostada Elendti ja Biasi (1990) järgi, kuna põhilahuste valmistamiseks ei ole antud NaSiO3 · 5H2O, NaNO3, K2HPO4 ja K2HPO4 kontsentratsioon sobiv.
                              
                           
                        Kasvukeskkonna M7 valmistamine
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Iga põhilahus (I) valmistatakse eraldi ja kombineeritud põhilahus (II) valmistatakse kõnealustest põhilahustest (I) (vt tabel 1). Kasvukeskkonna M7 valmistamiseks võetakse 50 ml kombineeritud põhilahust (II), lisatakse iga makrotoitaine põhilahuse kogused, mis on esitatud tabelis 2 ja täiendatakse deioniseeritud veega 1 liitrini. Vitamiinide põhilahuse valmistamiseks lisatakse deioniseeritud veele kolme vitamiini, nagu on näidatud tabelis 3, ja lõplikule M7 kasvukeskkonnale lisatakse vahetult enne selle kasutamist 0,1 ml kombineeritud vitamiinide põhilahust. (Vitamiinide põhilahust säilitatakse külmutatult väikeste alikvootidena). Kasvukeskkonda aereeritakse ja see stabiliseeritakse.
                              
                           
                        KIRJANDUS
                     
                     BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.
                     
                        Tabel 1
                     
                     
                        Kasvukeskkondade M4 ja M7 mikroelementide põhilahused
                     
                     
                                 Põhilahus (I)
                              
                              
                                 Kogus (mg), mis täiendatakse deioniseeritud veega 1 liitrini
                              
                              
                                 Kombineeritud põhilahuse (II) valmistamiseks: segage põhilahuste (I) järgmised kogused (ml) ja täiendage need 1 liitrini deioniseeritud veega
                              
                              
                                 Lõppkontsentratsioonid katselahustes (mg/l)
                              
                           
                                 M4
                              
                              
                                 M7
                              
                              
                                 M4
                              
                              
                                 M7
                              
                           
                                 H3BO3
                                     (15)
                                 
                              
                              
                                 57 190
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 2,86
                              
                              
                                 0,715
                              
                           
                                 MnCl2 · 4 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 7 210
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,361
                              
                              
                                 0,090
                              
                           
                                 LiCl (15)
                                 
                              
                              
                                 6 120
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,306
                              
                              
                                 0,077
                              
                           
                                 RbCl (15)
                                 
                              
                              
                                 1 420
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,071
                              
                              
                                 0,018
                              
                           
                                 SrCl2 · 6 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 3 040
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,152
                              
                              
                                 0,038
                              
                           
                                 NaBr (15)
                                 
                              
                              
                                 320
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,016
                              
                              
                                 0,004
                              
                           
                                 Na2MoO4 · 2 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 1 260
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,063
                              
                              
                                 0,016
                              
                           
                                 CuCl2 · 2 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 335
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,017
                              
                              
                                 0,004
                              
                           
                                 ZnCl2
                                 
                              
                              
                                 260
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,013
                              
                              
                                 0,013
                              
                           
                                 CaCl2 · 6 H2O
                              
                              
                                 200
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,010
                              
                              
                                 0,010
                              
                           
                                 KI
                              
                              
                                 65
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,0033
                              
                              
                                 0,0033
                              
                           
                                 Na2SeO3
                                 
                              
                              
                                 43,8
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,0022
                              
                              
                                 0,0022
                              
                           
                                 NH4VO3
                                 
                              
                              
                                 11,5
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,00058
                              
                              
                                 0,00058
                              
                           
                                 Na2EDTA · 2 H2O (15)
                                     (16)
                                 
                              
                              
                                 5 000
                              
                              
                                 20,0
                              
                              
                                 5,0
                              
                              
                                 2,5
                              
                              
                                 0,625
                              
                           
                                 FeSO4 · 7 H2O (15)
                                     (16)
                                 
                              
                              
                                 1 991
                              
                              
                                 20,0
                              
                              
                                 5,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,249
                              
                           
                        
                     
                        Tabel 2
                     
                     
                        Kasvukeskkondade M4 ja M7 makrotoitainete põhilahused
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 Kogus, mis täiendatakse deioniseeritud veega 1 liitrini
                                 (mg)
                              
                              
                                 Kasvukeskkondade M4 ja M7 valmistamiseks lisatav makrotoitainete põhilahuste kogus
                                 (ml/l)
                              
                              
                                 Lõppkontsentratsioonid katselahustes M4 ja M7
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 CaCl2 · 2 H2O
                              
                              
                                 293 800
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 293,8
                              
                           
                                 MgSO4 · 7 H2O
                              
                              
                                 246 600
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                 123,3
                              
                           
                                 KCl
                              
                              
                                 58 000
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 5,8
                              
                           
                                 NaHCO3
                                 
                              
                              
                                 64 800
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 64,8
                              
                           
                                 NaSiO3 · 9 H2O
                              
                              
                                 50 000
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                 10,0
                              
                           
                                 NaNO3
                                 
                              
                              
                                 2 740
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,274
                              
                           
                                 KH2PO4
                                 
                              
                              
                                 1 430
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,143
                              
                           
                                 K2HPO4
                                 
                              
                              
                                 1 840
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,184
                              
                           
                        
                     
                        Tabel 3
                     
                     
                        Kasvukeskkondade M4 ja M7 vitamiinide põhilahus. Vitamiinide ühe põhilahuse valmistamiseks valatakse kokku kõik kolm vitamiinilahus
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 Kogus, mis täiendatakse deioniseeritud veega 1 liitrini
                                 (mg)
                              
                              
                                 Kasvukeskkondade M4 ja M7 valmistamiseks lisatav vitamiinide põhilahuse kogus
                                 (ml/l)
                              
                              
                                 Lõppkontsentratsioonid katselahustes M4 ja M7
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 Tiamiinvesinikkloriid
                              
                              
                                 750
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,075
                              
                           
                                 Tsüanokobalamiin (B12)
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,0010
                              
                           
                                 Biotiin
                              
                              
                                 7,5
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,00075
                              
                           
                        KIRJANDUS
                     
                     Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25–33.
                     Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157–1167.
                  
                  
                     3. liide
                     SPETSIAALSELT KOOSTATUD SETTE VALMISTAMINE
                     
                        Sette koostis
                     
                     Spetsiaalselt koostatud sette koostis peaks olema järgmine:
                     
                                 Koostisosa
                              
                              
                                 Kirjeldus
                              
                              
                                 Sette
                                 kuivmassi protsent
                              
                           
                                 Turvas
                              
                              
                                 Turbasamblaturvas, mille pH on võimalikult lähedal vahemikule 5,5–6,0, nähtavad taimeosad puuduvad, peeneks jahvatatud (osakese suurus ≤ 1 mm) ja õhu käes kuivatatud
                              
                              
                                 4–5
                              
                           
                                 Kvartsliiv
                              
                              
                                 Tera suurus: > 50 % osakestest peaksid olema vahemikus 50–200 μm
                              
                              
                                 75–76
                              
                           
                                 Kaoliinsavi
                              
                              
                                 Kaoliniidisisaldus ≥ 30 %
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                 Orgaaniline süsinik
                              
                              
                                 Reguleeritakse turba ja liiva lisamisega
                              
                              
                                 2 (±0,5)
                              
                           
                                 Kaltsiumkarbonaat
                              
                              
                                 CaCO3, pulbriks jahvatatud, keemiliselt puhas
                              
                              
                                 0,05–0,1
                              
                           
                                 Vesi
                              
                              
                                 Juhtivus ≤ 10 μS/cm
                              
                              
                                 30–50
                              
                           
                        Valmistamine
                     
                     Turvas kuivatatakse õhu käes ja jahvatatakse peeneks pulbriks. Valmistatakse vajaliku turbapulbrikoguse suspensioon deioniseeritud vees, kasutades tõhusat homogenisaatorit. Selle suspensiooni pH reguleeritakse CaCO3 abil vahemikku 5,5 ± 0,5. Suspensiooni konditsioneeritakse vähemalt kaks päeva temperatuuril 20 ± 2 °C kerge segamisega, et stabiliseerida pH ja luua stabiilne mikroobikomponent; pH mõõdetakse uuesti ja see peaks olema 6,0 ± 0,5. Seejärel segatakse turba suspensioon muude koostisosadega (liiv ja kaoliinsavi) ning deioniseeritud veega, et saada homogeenne sete, mille veesisaldus on vahemikus 30–50 % sette kuivmassist. Lõpliku segu pH mõõdetakse uuesti ja see reguleeritakse vajaduse korral CaCO3 abil vahemikku 6,5–7,5. Kuivmassi ja orgaanilise süsiniku sisalduse määramiseks võetakse sette proovid. Enne, kui spetsiaalselt koostatud setet kasutatakse surusääsklastele mürgisuse katses, on soovitatav seda seitsme päeva jooksul konditsioneerida samades tingimustes, mis valdavalt esinevad edasise katse käigus.
                     
                        Säilitamine
                     
                     Tehisliku sette valmistamiseks kasutatavaid kuivi koostisosi võib säilitada kuivas ja jahedas kohas toatemperatuuril. Spetsiaalselt koostatud (märga) setet ei tohiks enne selle katses kasutamist säilitada. Seda tuleks kasutada viivitamata pärast seitsmepäevast kohandamisperioodi, millega selle valmistamine lõpetatakse.
                     
                        KIRJANDUS
                     
                     Käesoleva lisa peatükk C.8 „Toksilisus vihmaussidele”.
                     Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10–20.
                  
                  
                     4. liide
                     
                        Kasutuskõlbliku lahjendusvee keemilised omadused
                     
                     
                                 Aine
                              
                              
                                 Kontsentratsioonid
                              
                           
                                 Tahked osakesed
                              
                              
                                 < 20 mg/l
                              
                           
                                 Orgaanilise süsiniku kogusisaldus
                              
                              
                                 < 2 mg/l
                              
                           
                                 Ioniseerimata ammoniaak
                              
                              
                                 < 1 μg/l
                              
                           
                                 Karedus CaCO3-na
                              
                              
                                 < 400 mg/l (17)
                                 
                              
                           
                                 Jääkkloor
                              
                              
                                 < 10 μg/l
                              
                           
                                 Fosfororgaaniliste pestitsiidide üldsisaldus
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Kloororgaaniliste pestitsiidide ja polüklooritud bifenüülide üldsisaldus
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Orgaanilise kloori üldsisaldus
                              
                              
                                 < 25 ng/l
                              
                           
                  
                     5. liide
                     
                        Suunised surusääsklaste vastsete valmikuteks väljaarenemise seireks
                     
                     Katsenõudele paigaldatakse väljaarenenud valmikute püüdurid. Neid püüdureid vajatakse alates 20. päevast kuni katse lõpuni. Kasutatava püüduri näidis on esitatud allpool.
                     
                        
                     A– nailonvõrk
                     B– tagurpidi pööratud plastiktopsid
                     C– tilata kokkupuutenõu
                     D– sõelaga kaetud veevahetusavad
                     E– vesi
                     F– sete
                  
                  C.28.   SETTE-VEE MÜRGISUSKATSE SURUSÄÄSKLASTEL RIKASTATUD VEE KASUTAMISEGA
                  
                  SISSEJUHATUS
                  
                              1.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 219 (2004). Käesolev katsemeetod on kavandatud selleks, et hinnata pikaajalise kemikaalidega kokkupuute mõju settes elavatele magevee kahetiivaliste (Chironomus sp.) vastsetele. See põhineb peamiselt BBA suunisel, milles kasutatakse sette-vee katsesüsteemi tehisliku mullaga ning veesamba kokkupuute stsenaariumiga (1). Selles võetakse samuti arvesse Chironomus riparius’e ja Chironomus tentans’i kohta olemas olevaid mürgisuse määramise katse-eeskirju, mis on koostatud Euroopas ja Põhja-Ameerikas (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) ning mille puhul on tehtud laboritevahelised võrdluskatsed (1, 6, 9). Võib kasutada ka muid hästi dokumenteeritud surusääsklaste liike, näiteks Chironomus yoshimatsui’d (10, 11).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Käesolevas katsemeetodis kasutatud kokkupuutestsenaarium on vee rikastamine. Sobiva kokkupuutestsenaariumi valimine oleneb katse kavandatud eesmärgist. Vee kokkupuutestsenaarium, mis hõlmab veesamba rikastamist, on kavandatud simuleerima pihustatud pestitsiidide hõljumist ja hõlmab esialgseid maksimaalseid kontsentratsioone poorivees. See on kasulik ka muud tüüpi kokkupuudete puhul (sh keemilised lekked), v.a katseperioodist pikemate kogunemisprotsesside puhul.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Ained, mille kohta on vaja teha katsed settes elavate organismidega, jäävad tavaliselt sellesse keskkonda pikaks ajaks püsima. Settes elavad organismid võivad kemikaaliga mitmel viisil kokku puutuda. Iga kokkupuutetee suhteline tähtsus ja aeg, mis on iga kokkupuutetee puhul vajalik üldisse mürgisusse panuse andmiseks, sõltub asjaomase kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest. Tugevasti adsorbeeruvate ainete (näiteks log Kow > 5) või settega kovalentseid sidemeid moodustavate ainete puhul võib tähtis kokkupuutetee olla manustamine saastunud toiduga. Väga lipofiilsete ainete mürgisuse alahindamise vältimiseks võib kaaluda settele sööda lisamist enne uuritava aine kasutamist. Kõigi võimalike kokkupuuteteede arvessevõtmiseks on käesolevas katsemeetodis keskendutud pikaajalisele kokkupuutele. C. riparius’e ja C. yoshimatsui puhul kestab katse 20–28 päeva ning C. tentans’i puhul 28–65 päeva. Kui konkreetsel põhjusel vajatakse andmeid lühema aja kohta, näiteks ebastabiilse kemikaali mõju uurimiseks, võib kümnepäevase ajavahemiku järel võtta täiendavad paralleelproovid.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Mõõdetavad näitajad on vastsetest arenenud valmikute koguarv ja nende arenemiseks vajalik aeg. Vastsete elulemust ja kasvu soovitatakse mõõta alles pärast kümnepäevase ajavahemiku möödumist; kui lisaks vajatakse andmeid lühema aja kohta, kasutatakse vajaduse korral täiendavaid paralleelkatseid.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Soovitatakse kasutada spetsiaalselt koostatud setet. Spetsiaalselt koostatud settel on loodusliku sette ees mitmeid eeliseid:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          väheneb katsete hajuvus, kuna nii saadakse reprodutseeritav standardiseeritud maatriks ja kõrvaldatakse vajadus saastumata ja puhaste setteallikate leidmiseks;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          katseid võib alustada ükskõik millal, ei tule arvestada katse setete hooajalist muutlikkust ja setet ei ole vaja eeltöödelda kohaliku fauna kõrvaldamiseks; spetsiaalselt koostatud sette kasutamine vähendab samuti korrapäraseks katsetamiseks kohapeal piisavas koguses sette kogumisega seotud kulusid;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          spetsiaalselt koostatud sette kasutamine võimaldab mürgisust võrrelda ja selle põhjal aineid järjestada: mürgisuse andmed looduslike ja tehislike setetega tehtud katsetest olid mitme kemikaali puhul võrreldavad (2).
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.
                           
                        KATSE PÕHIMÕTE
                  
                              7.
                           
                           
                              Kõigepealt puutuvad surusääsklaste esimese kasvujärgu vastsed kokku sette-vee süsteemis teatavas kontsentratsioonivahemikus oleva uuritava ainega. Katse alguses pannakse esimese kasvujärgu vastsed katsenõudesse, mis sisaldavad sette-vee süsteemi, ja seejärel lisatakse uuritav aine vette (vesi „rikastatakse” uuritava ainega). Katse lõpus mõõdetakse surusääsklaste väljaarenemise määra ja arengu kiirust. Vastsete elulemust ja massi võib vajaduse korral mõõta ka kümne päeva möödumisel (kasutades vajaduse korral täiendavaid paralleelkatseid). Neid andmeid analüüsitakse kas regressioonimudeli abil, et hinnata kontsentratsioon, mis põhjustab valmikute väljaarenemise või vastsete elulemuse või kasvu x % vähenemise (näiteks EC15, EC50 jne), või kasutades täheldatava toimeta kontsentratsiooni / vähima täheldatava toimega kontsentratsiooni määramiseks statistilise hüpoteesi testimise meetodit. Viimati nimetatud juhul tuleb täheldatud mõju väärtusi võrrelda statistiliste testide abil kontrollkatses määratud väärtustega.
                           
                        ANDMED UURITAVA AINE KOHTA
                  
                              8.
                           
                           
                              Teada peaks olema uuritava aine lahustuvus vees, aururõhk, mõõdetud või arvutatud jaotumine settesse ning stabiilsus vees ja settes. Kättesaadav peaks olema usaldusväärne analüüsimeetod uuritava aine kvantitatiivseks määramiseks katvas veekihis, poorivees ja settes; meetodi täpsus ja määramispiir peaksid olema teada. Kasulik on teada uuritava aine struktuurivalemit ja puhtust. Samuti on kasulik teada uuritava aine keemilist käitumist (näiteks hajumine, abiootiline ja biootiline lagunemine jne). Täiendavad juhised selliste ainete mõju uurimiseks, mille füüsikalis-keemilised omadused raskendavad selle katse tegemist, on esitatud (12).
                           
                        VÕRDLUSKEMIKAALID
                  
                              9.
                           
                           
                              Võrdluskemikaale võib katsetada regulaarselt, et tagada katse-eeskirjade ja katsetingimuste täitmise usaldusväärsus. Laboritevahelistes võrdlustes ja valideerimisuuringutes edukalt kasutatud võrdlustoksikandid on näiteks: lindaan, trifluraliin, pentaklorofenool, kaadmiumkloriid ja kaaliumkloriid (1, 2, 5, 6, 13).
                           
                        KATSE KEHTIVUS
                  
                              10.
                           
                           
                              Katse kehtivuse tõendamisel arvestatakse järgmist:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          kontrollnõus peab katse lõpuks välja arenema vähemalt 70 % putukaid (1, 6);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          
                                             C. riparius’e ja C. yoshimatsui valmikute väljaarenemine kontrollnõudes peaks toimuma 12–23 päeva jooksul pärast nende viimist nõudesse; C. tentans’i puhul on vajalik ajavahemik 20–65 päeva;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          katse lõpus tuleks igas nõus mõõta pH ja lahustunud hapniku kontsentratsioon. Hapnikukontsentratsioon peaks olema vähemalt 60 % õhuga küllastamisel saadud väärtusest kasutataval temperatuuril ja katva veekihi pH peaks kõigis katsenõudes olema vahemikus 6–9;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          vee temperatuur ei tohiks erineda rohkem kui ±1,0 °C võrra. Vee temperatuuri on võimalik kontrollida isotermilise ruumi abil ja sel juhul peaks ruumi temperatuur olema sobivate ajavahemike järel kinnitatud.
                                       
                                    
                        MEETODI KIRJELDUS
                  
                     Katsenõud
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Uuring tehakse 600 ml klaasist katsenõudega, mille läbimõõt on 8 cm. Muud nõud on sobivad, kuid need peaksid tagama katva veekihi ja sette vajaliku paksuse. Sette pind peaks olema piisav, et tagada vastse kohta 2–3 cm2. Settekihi paksuse ja katva veekihi paksuse suhe peaks olema 1 : 4. Katsenõud ja muud seadmed, mis katsesüsteemiga kokku puutuvad, peaksid olema valmistatud täies ulatuses klaasist või muust keemiliselt inertsest materjalist (näiteks teflonist).
                           
                        
                     Liigi valimine
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Katses kasutatav liik on eelistatavalt Chironomus riparius. Chironomus tentans on samuti sobiv, aga selle käsitlemine on keerukam ja see nõuab pikemat katseperioodi. Chironomus yohimatsui kasutamine on samuti võimalik. 2. liites on esitatud andmed Chironomus riparius’e kultuuri kasvatamise meetodite kohta. Ka muude liikide, nagu Chironomus tentans’i (4) ja Chironomus yoshimatsui (11) kultuuri kasvatamise tingimused on avaldatud. Enne katset tuleb kinnitada liigi määramist, aga seda ei nõuta enne iga katset, kui organismid pärinevad asutusesisesest kultuurist.
                           
                        
                     Sete
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Eelistatavalt tuleks kasutada spetsiaalselt koostatud setet (mida nimetatakse ka taastatud, tehislikuks või sünteetiliseks setteks). Loodusliku sette kasutamise korral tuleks seda iseloomustada (vähemalt pH, orgaanilise süsiniku sisaldus, samuti on soovitatav määrata muud parameetrid, nagu süsiniku-lämmastiku suhe ja granulomeetria) ning selles ei tohiks olla mingeid saasteaineid ega muid organisme, kes võiksid surusääsklastega konkureerida või neid süüa. Enne loodusliku sette kasutamist surusääsklastel avalduva mürgisuse katses on soovitatav seda seitsme päeva jooksul konditsioneerida samades tingimustes, mis valdavalt esinevad edasise katse käigus. Käesolevas katses soovitatakse kasutada järgmist spetsiaalselt koostatud setet, mis põhineb katsemeetodis C.8 (14) kasutataval tehismullal (1, 15, 16):
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          4–5 % (kuivmass) turvast: pH väärtus võimalikult lähedal vahemikule 5,5–6,0; tähtis on kasutada peeneks jahvatatud (osakese suurus ≤ 1 mm) pulbrilist turvast, mida on kuivatatud ainult õhu käes;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          20 % (kuivmass) kaoliinsavi (kaoliniidisisaldus eelistatavalt üle 30 %);
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          75–76 % (kuivmass) kvartsliiva (see peaks peamiselt koosnema peenest liivast ja rohkem kui 50 % osakestest peaksid olema vahemikus 50–200 μm);
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          lõplikus segus niiskusesisalduse 30–50 % saamiseks lisatakse deioniseeritud vett;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          sette lõpliku segu reguleerimiseks pH vahemikku 7,0 ± 0,5 lisatakse keemiliselt puhast kaltsiumkarbonaati (CaCO3);
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          Lõpliku segu orgaanilise süsiniku sisaldus peaks olema 2 % (±0,5 %) ja see tuleks õigeks seada sobivas koguses turba ja liiva kasutamisega kooskõlas alapunktidega a ja c.
                                       
                                    
                        
                              14.
                           
                           
                              Turba, kaoliinsavi ja liiva päritolu peaks olema teada. Sette koostisosi tuleks kontrollida, et tõendada keemilise saaste puudumine (näiteks raskmetallid, kloororgaanilised ühendid, fosfororgaanilised ühendid jne). Spetsiaalselt koostatud sette valmistamise näidis on esitatud 3. liites. Kuivade koostisosade segamine on samuti lubatav, kui tõendatakse, et pärast katva veekihi lisamist ei toimu sette koostisosade eraldumist (näiteks turbaosakeste hõljumist) ja et turvas või sete on piisavalt konditsioneerunud.
                           
                        
                     Vesi
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Katseveeks sobib vesi, mis vastab 2. ja 4. liites esitatud lahjendamiseks kasutatava vee nõutavatele keemilistele omadustele. Kasvuveena ja katseveena lubatakse kasutada iga sobivat vett, looduslikku vett (pinna- või põhjavesi), taastatud vett (vt 2. liide) või deklooritud kraanivett, kui surusääsklased jäävad selles kasvatamise ja katsetamise ajal ellu ega ilmuta stressi tunnuseid. Katse alguses peaks katsevee pH olema vahemikus 6–9 ja vee summaarne karedus ei tohiks olla suurem kui 400 mg/l CaCO3-na. Kui oletatakse karedust tekitavate ioonide ja uuritava aine omavahelist mõju, tuleks kasutada siiski väiksema karedusega vett (ja seega ei tohiks sel juhul kasutada Elendti kasvukeskkonda M4). Kogu uuringu vältel tuleks kasutada sama tüüpi vett. 4. liites loetletud vee kvaliteedi omadusi tuleks mõõta vähemalt kaks korda aastas või siis, kui kahtlustatakse, et kõnealused omadused võivad olla oluliselt muutunud.
                           
                        
                     Põhilahused – rikastatud vesi
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Katsekontsentratsioonid arvutatakse veesambas olevate kontsentratsioonide alusel, s.o setet katva veekihi alusel. Valitud kontsentratsiooniga uuritavad lahused valmistatakse tavaliselt põhilahuse lahjendamise teel. Põhilahuse valmistamiseks on soovitatav lahustada uuritav aine katsekeskkonnas. Mõnel juhul võib sobiva kontsentratsiooniga põhilahuse valmistamiseks olla vajalik lahusti või dispergendi kasutamine. Sobivad lahustid on atsetoon, etanool, metanool, etüleenglükoolmonometüüleeter, etüleenglükooldimetüüleeter, dimetüülformamiid ja trietüleenglükool. Sobivad dispergendid on Cremophor RH40, Tween 80, metüültselluloos (0,01 %) ja HCO-40. Solubiliseeriva aine kontsentratsioon lõplikus katse kasvukeskkonnas peaks olema minimaalne (s.o ≤ 0,1 ml/l) ja see peaks olema sama kõigi töötlemiste puhul. Solubiliseeriva aine kasutamisel ei tohi sellel olla märkimisväärset mõju surusääsklaste vastsete elulemusele ega märgatavat negatiivset mõju surusääsklaste vastsetele, mida saab täheldada üksnes lahustiga tehtava kontrollkatse abil. Siiski tuleks teha kõik, et vältida selliste kemikaalide kasutamist.
                           
                        KATSE KAVANDAMINE
                  
                              17.
                           
                           
                              Katse kavandamine hõlmab katse kontsentratsioonide arvu ja vahemike valimist, iga kontsentratsioonitaseme jaoks nõude arvu ning igas nõus olevate vastsete arvu valimist. Kirjeldatud on, kuidas hinnata EC-punktide väärtusi ja täheldatava toimeta kontsentratsiooni ning teha piirsisalduskatset. Regressioonanalüüs on eelistatav statistilise hüpoteesi kontrollimise lähenemisviisile.
                           
                        
                     Regressioonanalüüsi kavandamine
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Katses kasutatavad kontsentratsioonid peaksid hõlmama toimet avaldavat kontsentratsiooni (nt EC15, EC50) ja uuritava aine puhul huvi pakkuvat kontsentratsioonivahemikku. Tavaliselt paraneb toimet avaldavate kontsentratsioonide (ECx) hinnangute täpsus ja eelkõige kehtivus, kui toimet avaldav kontsentratsioon on uuritud kontsentratsioonide vahemikus. Tuleks vältida suurt ekstrapoleerimist allapoole väikseimat positiivset kontsentratsiooni või ülespoole suurimat kontsentratsiooni. Eelnev annusevahemiku leidmise katse aitab valida kasutatavat kontsentratsioonivahemikku (vt punkt 27).
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Kui tuleb hinnata ECx, tuleks katse teha vähemalt viie kontsentratsiooniga ja iga kontsentratsiooni kohta tuleks kasutada kolme paralleelkatset. Igal juhul on mudeli korraliku hindamise jaoks soovitatav kasutada piisavaid uuritavaid kontsentratsioone. Kontsentratsioonidevaheline kordaja ei tohiks olla suurem kui 2 (erandi võib teha juhul, kui doosi mõju graafiku tõus on madal). Iga doosi paralleelkatsete arvu võib vähendada, kui suurendatakse eri mõjuga uuritavate kontsentratsioonide arvu. Paralleelkatsete arvu suurendamine või uuritavate kontsentratsioonide vahemiku vähendamine enamasti vähendab usaldusvahemikku. Kui on vaja hinnata vastsete elulemust ja kasvu kümne päeva järel, on vaja võtta täiendavaid paralleelproove.
                           
                        
                     Täheldatava toimeta kontsentratsiooni / vähima täheldatava toimega kontsentratsiooni hindamise kavandamine
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Kui hinnatakse täheldatava toimeta kontsentratsiooni või vähimat täheldatava toimega kontsentratsiooni, tuleks kasutada viit uuritavat kontsentratsiooni vähemalt nelja paralleelkatsega ja kõnealuseid kontsentratsioone eraldav kordaja ei tohiks olla suurem kui 2. Paralleelkatsete arv peaks olema piisav, et tagada piisav statistiline võimsus, et tuvastada katse- ja kontrollnõu tulemuste 20 % erinevus 5 % statistilise olulisusega (p = 0,05). Arengu kiiruse puhul on üldiselt asjakohane variatsioonanalüüs (ANOVA), näiteks Dunnetti test ja Williamsi test (17, 18, 19, 20). Väljaarenemise suhte puhul võib kasutada Cochrani-Armitage’i testi, Fisheri täpset testi (Bonferroni parandusega) või Manteli-Haenszeli testi.
                           
                        
                     Piirsisalduskatse
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Kui esialgsetes annusevahemiku leidmise katsetes tulemusi ei saadud, võib teha piirsisalduskatse (üks katsekontsentratsioon ja kontroll). Piirsisalduskatse eesmärk on näidata, et uuritava aine mürgine kontsentratsioon on katsetatud piirkontsentratsioonist suurem. Käesolevas katsemeetodis soovituslikku kontsentratsiooni ei esitata; see jäetakse reguleerivate asutuste otsustada. Enamasti tuleb nii töötlus- kui ka kontrollseadmetega teha vähemalt kuus paralleelkatset. Tuleks tõendada piisava statistilise võimsuse olemasolu, et tuvastada katse- ja kontrollnõu tulemuste 20 % erinevus 5 % statistilise olulisusega (p = 0,05). Mõõdetavate suuruste (arengu kiirus ja kaal) puhul, kui andmed vastavad käesoleva katse nõuetele (normaalsus, ühtlane hajumine), on asjakohane statistiline meetod t-kriteerium. Kui need nõuded ei ole täidetud, võib kasutada mittevõrdse hajumise t-kriteeriumi või mitteparameetrilist testi, näiteks Wilcoxoni-Manni-Whithey testi. Valmikute väljaarenemise suhte puhul on asjakohane kasutada Fisheri täpset testi.
                           
                        KATSE KÄIK
                  
                     Kokkupuutetingimused
                  
                  
                     Rikastatud vee-sette süsteemi valmistamine
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Katsenõudesse lisatakse vähemalt 1,5 cm kihi tekitamiseks vajalik kogus spetsiaalselt koostatud setet (vt punktid 13-14 ja 3. liide). Vett lisatakse 6 cm paksuse kihini (vt punkt 15). Settekihi ja veekihi paksuse suhe ei tohiks ületada 1 : 4 ja settekihi paksus ei tohiks olla suurem kui 3 cm. Sette-vee süsteem tuleks jätta enne katseorganismide lisamist seitsmeks päevaks kerge aeratsiooni tingimustesse (vt punkt 14 ja 3. liide). Sette osade eraldumise ja veesambas katsevee lisamisel peene materjali uue suspensiooni tekkimise vältimiseks võib sette katta vee valamise ajal plastikkettaga, mis pärast vee valamist kohe eemaldatakse. Võib kasutada ka muid võtteid.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Katsenõud peaksid olema kaetud (näiteks klaasplaadiga). Vajaduse korral lisatakse vee aurumise kompenseerimiseks ja uuringu algse veetaseme saavutamiseks vett. Soolade kogunemise vältimiseks tuleks lisada destilleeritud või deioniseeritud vett.
                           
                        
                     Katseorganismide lisamine
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Neli kuni viis päeva enne katseorganismide lisamist katsenõudesse tuleks võtta kultuuridest munamassid ja asetada need väikestesse nõudesse kultuuri kasvukeskkonnas. Võib kasutada varukultuuri vana kasvukeskkonda või värskelt valmistatud kasvukeskkonda. Viimati nimetatu kasutamisel tuleks lisada kultuuri kasvukeskkonnale väikses koguses sööta, näiteks rohevetikaid ja/või paar tilka peeneks jahvatatud helbelise kalasööda suspensiooni filtraadist (vt 2. liide). Tuleks kasutada ainult värskelt munetud munamasse. Tavaliselt hakkavad vastsed kooruma paari päeva möödumisel munade munemisest (2–3 päeva Chironomus riparius’e puhul temperatuuril 20 °C ning 1–4 päeva Chironomus tentans’i puhul temperatuuril 23 °C ja Chironomus yoshimatui puhul temperatuuril 25 °C) ja vastsed kasvavad neljas kasvujärgus, millest iga kasvujärk kestab 4–8 päeva. Katses tuleks kasutada esimese kasvujärgu vastseid (2–3 või 1–4 päeva pärast koorumist). Sääskede kasvujärke on võimalik kontrollida peakapsli laiuse mõõtmisega (6).
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Tömbi pipeti abil jaotatakse 20 esimese kasvujärgu vastset juhuslikult igasse katsenõusse, mis sisaldavad rikastatud setet ja vett. Vee aereerimine tuleb vastsete katsenõudesse lisamise ajal peatada ja seda ei jätkata 24 tunni vältel pärast vastsete lisamist (vt punktid 24 ja 32). Kasutatava katsekava kohaselt (vt punktid 19 ja 20) on kasutatud vastsete arv kontsentratsiooni kohta toimet avaldava kontsentratsiooni (EC-punkti) hindamise korral vähemalt 60 ja täheldatava toimeta kontsentratsiooni määramise korral 80.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              24 tundi pärast vastsete lisamist rikastatakse uuritavat ainet katva veekihi sambasse ja alustatakse uuesti kerget aereerimist. Uuritava aine lahuseid lisatakse pipeti abil väikses koguses veepinna alla. Seejärel tuleks kattev veekiht ilma setet mõjutamata ettevaatlikult segada.
                           
                        
                     Uuritavad kontsentratsioonid
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Annusevahemiku leidmise katse võib aidata kindlaks teha lõpliku katse kontsentratsioonivahemikke. Selleks kasutatakse uuritava aine laiade vahedega kontsentratsioonide seeriat. Lõplikus katses kasutatavaga sama pindtiheduse tagamiseks iga surusääsklase kohta puutuvad surusääsklased kokku uuritava aine iga kontsentratsiooniga sellise ajavahemiku vältel, mis võimaldab hinnata asjakohaseid katsekontsentratsioone; paralleelproovid ei ole vajalikud.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Lõpliku katse kontsentratsioonid määratakse kindlaks annusevahemiku leidmise katse tulemuse alusel. Tuleks kasutada vähemalt viit kontsentratsiooni ja need tuleks valida nii, nagu on kirjeldatud punktides 18–20.
                           
                        
                     Kontrollkatsed
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Katse peaks hõlmama vajalikku arvu paralleelseid settega kontrollkatsenõusid, milles ei ole uuritavat ainet (vt punktid 19-20). Kui uuritava aine lisamiseks on kasutatud lahustit (vt punkt 16), tuleks teha settele lahusti lisamise kontrollkatse.
                           
                        
                     Katsesüsteem
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Kasutatakse staatilisi süsteeme. Erandjuhul võib kasutada poolstaatilisi või läbivooluga süsteeme koos katva veekihi vahelduva või pideva uuendamisega, näiteks kui vee kvaliteet ei ole katseorganismile enam sobiv või mõjutab kemikaali tasakaaluolekut (näiteks lahustunud hapniku tase langeb liiga madalale, väljutatud saaduste kontsentratsioon muutub liiga suureks või settest leostuvad mineraalained, mis mõjutavad pH-d ja/või vee karedust). Tavaliselt on siiski piisavad ja eelistatavad muud katva veekihi kvaliteedi parandamise meetodid, näiteks aereerimine.
                           
                        
                     Sööt
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Vastseid tuleb sööta eelistatavalt iga päev või vähemalt kolm korda nädalas. Kalasööt (suspensioon vees või peeneks jahvatatud sööt, näiteks TetraMin või TetraPhyll; vt andmed, 2. liide) koguses 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg C. yoshimatui puhul) vastse kohta päevas näib olevat esimese kümne päeva jooksul noorte vastsete jaoks piisav. Vanemad vastsed võivad vajada mõnevõrra rohkem sööta: 0,5–1 mg vastse kohta päevas peaks olema piisav ülejäänud katse vältel. Söödakogust tuleks vähendada kõigi kokkupuute- ja kontrollkatsete puhul, kui täheldatakse seente kasvu või kui kontrollkatses täheldatakse suremust. Kui seente kasvu ei ole võimalik peatada, tuleb katset korrata. Kui katseid tehakse tugevalt adsorbeeruva ainega (näiteks log Kow > 5) või settega kovalentseid sidemeid tekitava ainega, võib enne stabiliseerumise ajavahemikku lisada spetsiaalselt koostatud settele sellise söödakoguse, mis on vajalik organismide elulemuse ja loodusliku kasvu tagamiseks. Selleks tuleb kasutada kalasööda asemel taimset materjali, näiteks võib kasutada 0,5 % (kuivmass) kõrvenõgese (Urtica dioica), mooruspuu (Morus alba), valge ristiku (Trifolium repens), spinati (Spinacia oleracea) peeneks jahvatatud lehti või muud taimset materjali (Cerophyl või alfatselluloos).
                           
                        
                     Inkubeerimistingimused
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Eelistatavalt 24 tundi pärast vastsete lisamist hakatakse katsenõudes katvat veekihti kergelt aereerima, mida jätkatakse kogu katse vältel (tuleb olla hoolikas, et lahustunud hapniku kontsentratsioon ei langeks alla 60 % hapniku küllastuskontsentratsioonist). Aereerimiseks kasutatakse klaasist Pasteuri pipetti, mis on kinnitatud settekihi kohale 2–3 cm kõrgusele (üks või mõni mull sekundis). Lenduva kemikaali katsetamisel võib kaaluda sette-vee süsteemi aereerimisest loobumist.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Katse tehakse püsival temperatuuril 20 °C (±2 °C). C. tentans’i ja C. yoshimatui puhul on soovitatavad temperatuurid vastavalt 23 °C ja 25 °C (±2 °C). Kasutatakse 16-tunnist valgustusperioodi ja valguse intensiivsus peaks olema 500 kuni 1 000 luksi.
                           
                        
                     Kokkupuute kestus
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Kokkupuude algab vastsete lisamisega rikastatud ja kontrollnõudesse. Maksimaalne kokkupuute kestus on 28 päeva C. riparius’e ja C. yoshimatsui puhul ning 65 päeva C. tentans’i puhul. Kui sääsed arenevad välja varem, võib katse lõpetada vähemalt viie päeva möödumisel pärast viimase valmiku väljaarenemist kontrollnõus.
                           
                        VAATLUSED
                  
                     Väljaarenemine
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Tehakse kindlaks arengu aeg ja täielikult väljaarenenud isas- ja emassääskede koguarv. Isased on tänu sulgjatele tundlatele kergesti äratuntavad.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Katsenõusid tuleks vaadelda vähemalt kolm korda nädalas, et hinnata visuaalselt iga ebatavalist käitumist (näiteks settest väljumine, ebatavaline ujumine) kontrollnõuga võrreldes. Oodataval valmikute ilmumise ajal loendatakse sääski iga päev. Registreeritakse täielikult välja arenenud sääskede sugu ja arv. Pärast tuvastamist kõrvaldatakse sääsed nõudest. Enne katse lõpetamist munetud munamassid tuleks registreerida ja seejärel eemaldada, et vältida settesse uute vastsete teket. Samuti registreeritakse nende nähtavate nukkude arv, millest sääsk ei koorunud. Suunised väljaarenemise mõõtmise kohta on esitatud 5. liites.
                           
                        
                     Kasvamine ja elulemus
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Kui on vaja esitada andmeid vastsete elulemuse ja kasvu kohta kümne päeva jooksul, tuleks katset alustada suurema arvu nõudega, et neid oleks võimalik seejärel kasutada. Kõnealuste täiendavate nõude setteid sõelutakse vastsete saamiseks 250 μm sõela abil. Surma tuvastamise kriteeriumid on liikumatus või reageerimatus mehaanilisele stiimulile. Vastsed, keda ei õnnestunud kätte saada, tuleks samuti surnuks lugeda (vastsed, kes surid katse alguses, võivad olla juba mikroobide poolt lagundatud). Tehakse kindlaks ellujäänud vastsete (tuhavaba) kuivmass katsenõu kohta ja arvutatakse keskmine individuaalne kuivmass nõu kohta. Kasulik on määrata, millisesse kasvujärku ellujäänud vastsed kuuluvad; selleks võib mõõta iga isendi peakapsli laiust.
                           
                        
                     Analüütilised mõõtmised
                  
                  
                     Uuritava aine kontsentratsioon
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Katse alguses (eelistatavalt tund aega pärast uuritava aine lisamist) ja lõpus tuleb analüüsida suurimal ja väiksemal kontsentratsioonil vähemalt katva veekihi, poorivee ja sette proove. Kõnealused uuritava aine kontsentratsiooni määramised annavad teavet uuritava aine käitumise/jaotumise kohta vee-sette süsteemis. Setteproovi võtmine katse alguses võib katsesüsteemi mõjutada (näiteks katse vastsete eemaldamine), seega tuleks analüütiliste näitajate määramiseks kasutada katse alguses ja katse ajal vajaduse korral täiendavaid katsenõusid (vt punkt 39). Sette mõõtmised ei pruugi olla vajalikud, kui uuritava aine jaotumine vee ja sette vahel on võrreldavates tingimustes (näiteks sette ja vee suhe, lisamise tüüp, sette orgaanilise süsiniku sisaldus) tehtud vee/sette uuringu käigus täpselt määratud.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Kui tehakse vahepealseid mõõtmisi (näiteks seitsmendal päeval) või kui analüüsi jaoks on vaja suurt proovi, mida ei saa katsenõust ilma katsesüsteemi mõjutamata võtta, tuleks analüüs teha samal viisil töödeldud, kuid bioloogilisteks vaatlusteks mitte kasutatavast täiendavast katsenõust (kus on ka katseorganismid) võetud proovist.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Tsentrifuugimine näiteks 10 000 g ja 4 °C juures 30 minuti vältel on soovitatav meetod poorivee eraldamiseks. Kui on tõendatud, et uuritav aine ei adsorbeeru filtritele, võib sobida ka filtrimine. Mõnel juhul ei pruugi liiga väikse proovi suuruse tõttu olla võimalik poorivee kontsentratsiooni määramine.
                           
                        
                     Füüsikalis-keemilised parameetrid
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Katsenõude pH-d, lahustunud hapniku sisaldust katsevees ja temperatuuri tuleks mõõta asjakohasel viisil (vt punkt 10). Katse alguses ja lõpus tuleks kontrollnõudes ja ühes suurima kontsentratsiooniga katsenõus mõõta karedust ja ammoniaaki.
                           
                        KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE
                  
                     Tulemuste töötlemine
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Kõnealuse katse eesmärk on teha kindlaks uuritava aine mõju isas- ja emassääskede arengu kiirusele ja täielikult välja arenenud sääskede koguarvule või kümnepäevase katse korral mõju vastsete elulemusele ja kehamassile. Kui puuduvad andmed sugude statistiliselt erineva tundlikkuse kohta, võib statistilistes analüüsides isaste ja emaste tulemused koondada. Sugude erinevat tundlikkust on võimalik statistiliselt hinnata näiteks χ2-r × 2 tabeli testi abil. Vajaduse korral tuleb kümne päeva möödumisel teha kindlaks vastsete elulemus ja keskmine individuaalne kuivmass nõu kohta.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Toimet avaldavad kontsentratsioonid, mis põhinevad katva veekihi kontsentratsioonidel, arvutatakse eelistatavalt katse alguses mõõdetud kontsentratsioonide alusel (vt punkt 38).
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              EC50 või muu ECx-näitaja arvutamiseks võib tegelike paralleelproovidena kasutada nõude statistikat. Iga ECx usaldusvahemiku arvutamisel tuleks arvesse võtta eri nõude tulemuste hajumist või tuleks näidata, et kõnealune hajumine on nii väike, et seda võib eirata. Kui andmeid töödeldakse mudeli parameetrite leidmiseks vähimruutude meetodiga, tuleks nõu statistikat teisendada, et dispersioon oleks ühtlasem. ECx-väärtused tuleks siiski arvutada pärast tulemuse esialgsele väärtusele tagasiteisendamist.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Kui statistilise analüüsi eesmärk on teha hüpoteesi katsetamise abil kindlaks täheldatava toimeta kontsentratsioon / vähim täheldatava toimega kontsentratsioon, tuleb võtta arvesse nõudevahelist hajuvust, näiteks kasutada hierarhilist dispersioonanalüüsi (nested ANOVA). Olukorras, kus tavapärased dispersioonanalüüsi (ANOVA) eeldused ei ole täidetud, võivad paremini sobida töökindlamad testid (21).
                           
                        
                     Väljaarenemise määr
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Väljaarenemise määrad on kõik-või-mitte-midagi-andmed ja neid on võimalik analüüsida astmeliselt kohaldatava Cochrani-Armitage’i testi abil, kus eeldatakse, et mõju sõltuvus doosist on monotoonne, ja need andmed on selle eeldusega kooskõlas. Vastasel juhul võib kasutada Fisheri täpset testi või Manteli-Haenszeli testi Bonferroni-Holmi kohandatud p-väärtustega. Kui on tõendeid, et ühe kontsentratsiooniga paralleelproovide hajuvus on suurem kui eeldatakse binoomjaotuse dispersiooni puhul (nn ekstra-binoomjaotuse dispersioon), tuleks kasutada töökindlat Cochrani-Armitage’i või Fisheri täpset testi, nagu on soovitatud (21).
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Määratakse nõu kohta välja arenenud sääskede arv ne, mis jagatakse lisatud vastsete arvuga na:
                              
                                 
                              kus:
                              
                                          ER
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          väljaarenemise määr
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          nõu kohta välja arenenud sääskede arv
                                       
                                    
                                          na
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          nõu kohta lisatud vastsete arv.
                                       
                                    
                        
                              48.
                           
                           
                              Ekstra-binoomjaotuse dispersiooni korral on suurte valimite puhul kõige asjakohasem alternatiiv käsitleda väljaarenemise määra pideva vastusena ning kasutada selliseid meetodeid nagu Williamsi test, kui võib eeldada, et mõju sõltuvus doosist on monotoonne, kui see on kooskõlas kõnealuste väljaarenemise määra andmetega. Kui monotoonsust ei ole, on asjakohane kasutada Dunnetti testi. Suur valim on siinkohal määratletud kui väljaarenenud sääskede arv ja väljaarenemata jäänud sääskede arv, mis mõlemad on suuremad kui viis paralleelproovi (nõu) kohta.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Dispersioonanalüüsi (ANOVA) meetodite kohaldamiseks tuleks väljaarenemise määra väärtused kõigepealt teisendada arkussiinus-ruutjuure-teisenduse või Freemani-Tukey teisenduse abil, et saada ligikaudne normaaljaotus ja võrdsustada variatsioonid. Cochrani-Armitage’i testi, Fisheri täpse testi (Bonferroni) või Manteli-Haenszeli testi võib kasutada absoluutsete sageduste kasutamisel. Arkussiinus-ruutjuure-teisendust kohaldatakse, arvutades väljaarenemise määra ruutjuure siinuse pöördarvu (sin–1).
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Väljaarenemise määrade puhul arvutatakse ECx-väärtused regressioonanalüüsi (või näiteks probit- (22) või logit-teisenduse, Weibulli meetodi, sobiva müügiloleva tarkvara jne) abil. Kui regressioonanalüüs ebaõnnestub (näiteks kui on vähem kui kaks osalist vastust), kasutatakse muid mitteparameetrilisi meetodeid, näiteks libisev keskmine või lihtne interpolatsioon.
                           
                        
                     Arengu kiirus
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Keskmine arengu aeg väljendab keskmist ajavahemikku vastsete lisamise (katse päev 0) ja sääskede katsekohordi tekke vahel. (Tegeliku arenguaja arvutamiseks tuleks arvesse võtta vastsete vanust lisamise ajal.) Arengu kiirus on pöördvõrdeline arengu ajaga (ühik: 1/päev) ja väljendab vastsete arengu seda osa, mis toimub ühe päeva jooksul. Kõnealuste sette mürgisuse hindamise uuringute puhul eelistatakse arengu kiirust, kuna selle dispersioon on väiksem, homogeensem kui arenguaja puhul ja lähedasem normaaljaotusele. Seega võib arengu kiiruse puhul kasutada tugevaid parameetrilisi testimismeetodeid, mida ei saa kasutada arenguaja puhul. Arengu kiiruse kui pideva vastuse jaoks saab ECx-väärtusi hinnata regressioonanalüüsiga (näiteks 23, 24).
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Järgmiste statistiliste testide puhul eeldatakse, et kontrolli päeval x täheldatud sääsed on välja arenenud keskmisel ajavahemikul päeva x ja päeva x – l vahel (l = kontrollimiste vahelise ajavahemiku pikkus, tavaliselt üks päev). Keskmine arengu kiirus nõu kohta (x) arvutatakse järgmise võrrandi alusel:
                              
                                 
                              kus:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          –
                                       
                                       
                                          keskmine arengu kiirus nõu i kohta
                                       
                                    
                                          i
                                       
                                       
                                          –
                                       
                                       
                                          kontrollivahemiku indeks
                                       
                                    
                                          m
                                       
                                       
                                          –
                                       
                                       
                                          kontrollivahemike maksimaalne arv
                                       
                                    
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          –
                                       
                                       
                                          kontrollivahemikul i välja arenenud sääskede arv
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          –
                                       
                                       
                                          katse lõpuks välja arenenud sääskede koguarv (= )
                                       
                                    
                                          xi
                                          
                                       
                                       
                                          –
                                       
                                       
                                          ajavahemikul i välja arenenud sääskede arengu kiirus,
                                       
                                    
                                 
                              kus:
                              
                                          dayi (päevi)
                                       
                                       
                                          –
                                       
                                       
                                          kontrolli päev (lisamisest möödunud päevade arv)
                                       
                                    
                                          li
                                          
                                       
                                       
                                          –
                                       
                                       
                                          kontrollivahemiku pikkus i (päevades, tavaliselt üks päev).
                                       
                                    
                        
                     Katseprotokoll
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Katseprotokollis tuleks esitada vähemalt järgmine teave.
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uuritav aine:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      füüsikaline olek ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused (lahustuvus vees, aururõhk, jaotustegur mullas (või settes, kui see on määratud), stabiilsus vees jne);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kemikaali tunnusandmed (üldkasutatav nimetus, keemiline nimetus, struktuurivalem, CASi number jne), sh puhtus ja uuritava aine kvantitatiivse analüüsi meetod.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katseorganismi liik:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kasutatud katseloom: liik, teaduslik nimetus, organismide päritolu ja kasvatustingimused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      teave munamasside ja vastsete käsitlemise kohta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      katseloomade vanus katsenõudesse sisestamise ajal.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katsetingimused:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kasutatud sete, s.o looduslik või spetsiaalselt koostatud sete;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      loodusliku sette puhul setteproovi võtmise koha asukoht ja kirjeldus, sh võimaluse korral saastumise ajalugu; omadused: pH, orgaanilise süsiniku sisaldus, süsiniku-lämmastiku suhe ja granulomeetria (kui see on asjakohane);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      spetsiaalselt koostatud sette valmistamine: koostisosad ja omadused (orgaanilise süsiniku sisaldus, pH, niiskus jne katse alguses);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      katsevee valmistamine (kui kasutatakse taastatud vett) ja omadused (hapnikusisaldus, pH, elektrijuhtivus, karedus jne katse alguses);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      settekihi ja katva veekihi paksus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      katva veekihi ja poorivee maht; märja sette kaal koos pooriveega ja ilma selleta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      katsenõud (materjal ja suurus);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      põhilahuse valmistamise meetod ja uuritud kontsentratsioonide saamine;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uuritava aine manustamine: kasutatud kontsentratsioonid, paralleelproovide arv ja lahusti kasutamine, kui seda tehti;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inkubatsioonitingimused: temperatuur, valgustusperiood ja valguse intensiivsus, aereerimine (sagedus ja intensiivsus);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      üksikasjalik teave söötmise kohta, sh sööda tüüp, valmistamine, kogus ja söötmise ajakava.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemused:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominaalsed katsekontsentratsioonid, mõõdetud katsekontsentratsioonid ja kõigi analüüside tulemused, millega määrati uuritava aine kontsentratsiooni katsenõus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vee kvaliteet katsenõus, s.o pH, temperatuur, lahustunud hapnik, karedus ja ammoniaak;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aurustunud katsevee asendamine, kui seda tehti;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      väljaarenenud isas- ja emassääskede arv iga nõu ja iga päeva kohta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      iga nõu kohta nende vastsete arv, kellest sääski ei arenenud;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vastsete keskmine individuaalne kuivmass iga nõu ja kasvujärgu kohta, kui see on asjakohane;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      valmikute väljaarenemise protsent iga paralleelproovi ja katsekontsentratsiooni kohta (isas- ja emassääsed kokku);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      täielikult väljaarenenud sääskede keskmine arengu kiirus iga paralleelproovi ja katsekontsentratsiooni kohta (isas- ja emassääsed kokku);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      mürgisuse näitajate hinnangud, näiteks ECx (ja selle usaldusvahemik), täheldatava toimeta kontsentratsioon ja/või vähim täheldatava toimega kontsentratsioon ning nende määramiseks kasutatud statistilised meetodid;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tulemuste arutelu, kaasa arvatud käesolevast katsemeetodist kõrvalekaldumise võimalik mõju katsetulemustele.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     KIRJANDUS
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk C.8 „Toksilisus vihmaussidele”.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303.
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096–1121.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491.
                           
                        
                              19)
                           
                           
                              Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117.
                           
                        
                              20)
                           
                           
                              Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510–531.
                           
                        
                              21)
                           
                           
                              Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48:577–585.
                           
                        
                              22)
                           
                           
                              Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.
                           
                        
                              23)
                           
                           
                              Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485–1494.
                           
                        
                              24)
                           
                           
                              Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312.
                           
                        
                     1. liide
                     MÕISTED
                     Käesolevas katsemeetodis kasutatakse järgmisi mõisteid järgmises tähenduses:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    spetsiaalselt koostatud sete (ehk taastatud, tehislik või sünteetiline sete) – selliste materjalide segu, mida kasutatakse loodusliku sette füüsiliste koostisosade imiteerimiseks;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    kattev veekiht – vesi, mis pannakse katsenõus sette peale;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    poorivesi – sette- või mullaosakeste vahelises ruumis olev vesi;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    rikastatud vesi – katsevesi, millele on lisatud uuritavat ainet;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                              
                           
                  
                     2. liide
                     
                        
                           Chironomus riparius’e kasvatamist käsitlevad soovitused
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 
                                    Chironomus’e vastseid võib kasvatada kristallisatsiooninõus või suuremas mahutis. Mahuti põhi kaetakse ligikaudu 5–10 mm paksuse peene kvartsliiva kihiga. Diatomiit (näiteks Merck, Art 8117) on samuti tõendatult sobiv substraat (piisab õhemast kihist, isegi mõnest millimeetrist). Seejärel lisatakse sobivat vett mitme cm paksuse kihina. Vett tuleks vajaduse korral lisada aurumiskadude asendamiseks ja kuivamise vältimiseks. Vee võib vajaduse korral välja vahetada. Tuleks tagada kerge aereerimine. Vastsete kasvatamise nõusid tuleks hoida vastavas puuris, millega takistatakse väljaarenenud täiskasvanud isendite väljapääsu. Puur peaks olema piisavalt suur, et võimaldada väljaarenenud valmikute parvedesse kogunemist, vastasel juhul ei pruugi toimuda paljunemist (miinimumsuurus on ligikaudu 30 × 30 × 30 cm).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Puure tuleks hoida toatemperatuuril või püsiva keskkonnaga ruumis temperatuuril 20 ± 2 °C 16-tunnise valgustusperioodiga (intensiivsus ligikaudu 1 000 luksi) ja kaheksa tunni pimedusega. On teada, et vähem kui 60 %-line suhteline õhuniiskus võib paljunemist takistada.
                              
                           
                        Lahjendusvesi
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Võib kasutada mis tahes looduslikku või sünteetilist vett. Enamasti kasutatakse kaevuvett, deklooritud kraanivett ja tehislikke kasvukeskkondi (näiteks Elendti kasvukeskkond M4 või M7, vt allpool). Vett tuleb enne kasutamist aereerida. Vajaduse korral võib kultuuri kasvuvett uuendada, eemaldades kasutatud vee kultuuri kasvunõudest ettevaatlikult valamise teel või sifooniga, kahjustamata vastsete kestasid.
                              
                           
                        Vastsete söötmine
                     
                     
                                 4.
                              
                              
                                 
                                    Chironomus’e vastseid tuleks sööta helbelise kalasöödaga (TetraMin®, TetraPhyll® või muu samalaadne kaubanduslik kalasööda tootemark) koguses ligikaudu 250 mg nõu kohta päevas. Sööta võib anda kuiva jahvatatud pulbrina või suspensioonina vees: 1,0 g helbelist kalasööta lisatakse 20 ml lahjendusveele ja see segatakse homogeense segu saamiseni. Seda preparaati võib sööta koguses 5 ml nõu kohta päevas (preparaati tuleks enne kasutamist loksutada). Vanemad vastsed võivad vajada rohkem sööta.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Söötmist kohandatakse vee kvaliteediga. Kui kultuuri kasvukeskkond muutub häguseks, tuleks sööda hulka vähendada. Sööda lisamist tuleb hoolikalt jälgida. Liiga vähe sööta põhjustab vastsete rände veesamba suunas ning liiga palju sööta hoogustab mikroobide tegevust ja vähendab vee hapnikusisaldust. Mõlemad tingimused võivad vähendada kasvu kiirust.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Uute kultuuri kasvunõude valmisseadmisel võib lisada ka mõne rohevetika (näiteks Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) rakke.
                              
                           
                        Väljaarenenud valmikute söötmine
                     
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Mõned teadlased on soovitanud väljaarenenud valmikute söötmiseks kasutada küllastunud sahharoosilahuses niisutatud puuvillast lappi.
                              
                           
                        Väljaarenemine
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Ligikaudu 13–15 päeva möödumisel hakkavad temperatuuril 20 ± 2 °C vastsete kasvatamise nõudest väljuma valmikud. Isased on tänu sulgjatele tundlatele kergesti äratuntavad.
                              
                           
                        Munamassid
                     
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Kui valmikud on paljundamispuuris, tuleks kõiki vastsete kasvatamise nõusid kontrollida kolm korda nädalas sinna želatiinjate munamasside lisandumise suhtes. Kui leitakse munamass, tuleks see hoolikalt kõrvaldada. See tuleks üle kanda väiksele tassile, mis sisaldab paljundusvee proovi. Munamasse kasutatakse uue kasvunõu kasutusele võtmiseks (näiteks 2–4 munamassi nõu kohta) või mürgisuse katsetes.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Esimese kasvujärgu vastsed peaksid kooruma 2–3 päeva pärast.
                              
                           
                        Uute kasvunõude ülesseadmine
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Kui kultuurid on loodud, peaks iga nädal (või katsenõuetest olenevalt väiksema sagedusega) olema võimalik vastsete uute kasvunõude ülesseadmine, kõrvaldades vanemad nõud pärast täiskasvanud sääskede väljaarenemist. Seda süsteemi kasutades saadakse minimaalse vaevaga regulaarne valmikute varu.
                              
                           
                        Katselahuste M4 ja M7 valmistamine
                     
                     
                                 12.
                              
                              
                                 Elendt (1990) on kirjeldanud kasvukeskkonda M4. Kasvukeskkond M7 valmistatakse samal viisil kui kasvukeskkond M4, v.a tabelis 1 nimetatud ainete puhul, mille kontsentratsioon kasvukeskkonnas M7 on kasvukeskkonnaga M4 võrreldes neli korda väiksem. Kasvukeskkonda M7 käsitlev artikkel on kirjutamisel (Elendt, isiklik teade). Katselahust ei tohiks koostada Elendti ja Biasi (1990) järgi, kuna põhilahuste valmistamiseks ei ole antud NaSiO3 · 5H2O, NaNO3, KH2PO4 ja K2HPO4 kontsentratsioon sobiv.
                              
                           
                        Kasvukeskkonna M7 valmistamine
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Iga põhilahus (I) valmistatakse eraldi ja kombineeritud põhilahus (II) valmistatakse kõnealustest põhilahustest (I) (vt tabel 1). Kasvukeskkonna M7 valmistamiseks võetakse 50 ml kombineeritud põhilahust (II), lisatakse iga makrotoitaine põhilahuse kogused, mis on esitatud tabelis 2, ja täiendatakse deioniseeritud veega 1 liitrini. Vitamiinide põhilahuse valmistamiseks lisatakse deioniseeritud veele kolme vitamiini, nagu on näidatud tabelis 3, ja lõplikule M7 kasvukeskkonnale lisatakse vahetult enne selle kasutamist 0,1 ml kombineeritud vitamiinide põhilahust. (Vitamiinide põhilahust säilitatakse külmutatult väikeste alikvootidena). Kasvukeskkonda aereeritakse ja see stabiliseeritakse.
                                 
                                    Tabel 1
                                 
                                 
                                    Kasvukeskkondade M4 ja M7 mikroelementide põhilahused
                                 
                                 
                                             Põhilahus (I)
                                          
                                          
                                             Kogus (mg), mis täiendatakse deioniseeritud veega 1 liitrini
                                          
                                          
                                             Kombineeritud põhilahuse (II) valmistamiseks: segage põhilahuste (I) järgmised kogused (ml) ja täiendage need 1 liitrini deioniseeritud veega
                                          
                                          
                                             Lõppkontsentratsioonid katselahustes (mg/l)
                                          
                                       
                                             M4
                                          
                                          
                                             M7
                                          
                                          
                                             M4
                                          
                                          
                                             M7
                                          
                                       
                                             H3BO3
                                                 (18)
                                             
                                          
                                          
                                             57 190
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             2,86
                                          
                                          
                                             0,715
                                          
                                       
                                             MnCl2 · 4 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             7 210
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,361
                                          
                                          
                                             0,090
                                          
                                       
                                             LiCl (18)
                                             
                                          
                                          
                                             6 120
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,306
                                          
                                          
                                             0,077
                                          
                                       
                                             RbCl (18)
                                             
                                          
                                          
                                             1 420
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,071
                                          
                                          
                                             0,018
                                          
                                       
                                             SrCl2 · 6 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             3 040
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,152
                                          
                                          
                                             0,038
                                          
                                       
                                             NaBr (18)
                                             
                                          
                                          
                                             320
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,016
                                          
                                          
                                             0,004
                                          
                                       
                                             Na2MoO4 · 2 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             1 260
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,063
                                          
                                          
                                             0,016
                                          
                                       
                                             CuCl2 · 2 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             335
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,017
                                          
                                          
                                             0,004
                                          
                                       
                                             ZnCl2
                                             
                                          
                                          
                                             260
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,013
                                          
                                          
                                             0,013
                                          
                                       
                                             CaCl2 · 6 H2O
                                          
                                          
                                             200
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,010
                                          
                                          
                                             0,010
                                          
                                       
                                             KI
                                          
                                          
                                             65
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,0033
                                          
                                          
                                             0,0033
                                          
                                       
                                             Na2SeO3
                                             
                                          
                                          
                                             43,8
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,0022
                                          
                                          
                                             0,0022
                                          
                                       
                                             NH4VO3
                                             
                                          
                                          
                                             11,5
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,00058
                                          
                                          
                                             0,00058
                                          
                                       
                                             Na2EDTA · 2 H2O (18)
                                                 (19)
                                             
                                          
                                          
                                             5 000
                                          
                                          
                                             20,0
                                          
                                          
                                             5,0
                                          
                                          
                                             2,5
                                          
                                          
                                             0,625
                                          
                                       
                                             FeSO4 · 7 H2O (18)
                                                 (19)
                                             
                                          
                                          
                                             1 991
                                          
                                          
                                             20,0
                                          
                                          
                                             5,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,249
                                          
                                       
                                    Tabel 2
                                 
                                 
                                    Kasvukeskkondade M4 ja M7 makrotoitainete põhilahused
                                 
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Kogus, mis täiendatakse deioniseeritud veega 1 liitrini
                                             (mg)
                                          
                                          
                                             Kasvukeskkonna M4 ja M7 valmistamiseks lisatav makrotoitainete põhilahuste kogus
                                             (ml/l)
                                          
                                          
                                             Lõppkontsentratsioonid katselahustes M4 ja M7
                                             (mg/l)
                                          
                                       
                                             CaCl2 · 2 H2O
                                          
                                          
                                             293 800
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             293,8
                                          
                                       
                                             MgSO4 · 7 H2O
                                          
                                          
                                             246 600
                                          
                                          
                                             0,5
                                          
                                          
                                             123,3
                                          
                                       
                                             KCl
                                          
                                          
                                             58 000
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             5,8
                                          
                                       
                                             NaHCO3
                                             
                                          
                                          
                                             64 800
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             64,8
                                          
                                       
                                             NaSiO3 · 9 H2O
                                          
                                          
                                             50 000
                                          
                                          
                                             0,2
                                          
                                          
                                             10,0
                                          
                                       
                                             NaNO3
                                             
                                          
                                          
                                             2 740
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,274
                                          
                                       
                                             KH2PO4
                                             
                                          
                                          
                                             1 430
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,143
                                          
                                       
                                             K2HPO4
                                             
                                          
                                          
                                             1 840
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,184
                                          
                                       
                                    Tabel 3
                                 
                                 
                                    Kasvukeskkondade M4 ja M7 vitamiinide põhilahus
                                 
                                 Ühe vitamiinide põhilahuse valmistamiseks valatakse kokku kõik kolm vitamiinilahust.
                                 
                                    
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Kogus, mis täiendatakse deioniseeritud veega 1 liitrini
                                             (mg)
                                          
                                          
                                             Kasvukeskkonna M4 ja M7 valmistamiseks lisatav vitamiinide põhilahuse kogus
                                             (ml/l)
                                          
                                          
                                             Lõppkontsentratsioonid katselahustes M4 ja M7
                                             (mg/l)
                                          
                                       
                                             Tiamiinvesinikkloriid
                                          
                                          
                                             750
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,075
                                          
                                       
                                             Tsüanokobalamiin (B12)
                                          
                                          
                                             10
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,0010
                                          
                                       
                                             Biotiin
                                          
                                          
                                             7,5
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,00075
                                          
                                       
                           
                        KIRJANDUS
                     
                     BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
                     Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25–33.
                     Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157–1167.
                  
                  
                     3. liide
                     SPETSIAALSELT KOOSTATUD SETTE VALMISTAMINE
                     
                        Sette koostis
                     
                     Spetsiaalselt koostatud sette koostis peaks olema järgmine:
                     
                                 Koostisosa
                              
                              
                                 Kirjeldus
                              
                              
                                 Sette
                                 kuivmassi protsent
                              
                           
                                 Turvas
                              
                              
                                 Turbasamblaturvas, mille pH on võimalikult lähedal vahemikule 5,5–6,0, nähtavad taimeosad puuduvad, peeneks jahvatatud (osakese suurus ≤ 1 mm) ja õhu käes kuivatatud
                              
                              
                                 4–5
                              
                           
                                 Kvartsliiv
                              
                              
                                 Tera suurus: > 50 % osakestest peaksid olema vahemikus 50–200 μm
                              
                              
                                 75–76
                              
                           
                                 Kaoliinsavi
                              
                              
                                 Kaoliniidisisaldus ≥ 30 %
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                 Orgaaniline süsinik
                              
                              
                                 Reguleeritakse turba ja liiva lisamisega
                              
                              
                                 2 (±0,5)
                              
                           
                                 Kaltsiumkarbonaat
                              
                              
                                 CaCO3, pulbriks jahvatatud, keemiliselt puhas
                              
                              
                                 0,05–0,1
                              
                           
                                 Vesi
                              
                              
                                 Juhtivus ≤ 10 μS/cm
                              
                              
                                 30–50
                              
                           
                        Valmistamine
                     
                     Turvas kuivatatakse õhu käes ja jahvatatakse peeneks pulbriks. Valmistatakse vajaliku turbapulbrikoguse suspensioon deioniseeritud vees, kasutades tõhusat homogenisaatorit. Selle suspensiooni pH reguleeritakse CaCO3 abil vahemikku 5,5 ± 0,5. Suspensiooni konditsioneeritakse vähemalt kaks päeva temperatuuril 20 ± 2 °C kerge segamisega, et stabiliseerida pH ja luua stabiilne mikroobikomponent; pH mõõdetakse uuesti ja see peaks olema 6,0 ± 0,5. Seejärel segatakse turba suspensioon muude koostisosadega (liiv ja kaoliinsavi) ning deioniseeritud veega, et saada homogeenne sete, mille veesisaldus on vahemikus 30–50 % sette kuivmassist. Lõpliku segu pH mõõdetakse uuesti ja see reguleeritakse vajaduse korral CaCO3 abil vahemikku 6,5–7,5. Kuivmassi ja orgaanilise süsiniku sisalduse määramiseks võetakse sette proovid. Enne, kui spetsiaalselt koostatud setet kasutatakse surusääsklastele mürgisuse katses, on soovitatav seda seitsme päeva jooksul konditsioneerida samades tingimustes, mis valdavalt esinevad edasise katse käigus.
                     
                        Säilitamine
                     
                     Tehisliku sette valmistamiseks kasutatavaid kuivi koostisosi võib säilitada kuivas ja jahedas kohas toatemperatuuril. Spetsiaalselt koostatud (märga) setet ei tohiks enne selle katses kasutamist säilitada. Seda tuleks kasutada viivitamata pärast seitsmepäevast kohandamisperioodi, millega selle valmistamine lõpetatakse.
                     
                        KIRJANDUS:
                     
                     Käesoleva lisa peatükk C.8 „Toksilisus vihmaussidele”.
                     Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10–20.
                  
                  
                     4. liide
                     
                        Kasutuskõlbliku lahjendusvee keemilised omadused
                     
                     
                                 Aine
                              
                              
                                 Kontsentratsioonid
                              
                           
                                 Tahked osakesed
                              
                              
                                 < 20 mg/l
                              
                           
                                 Orgaanilise süsiniku kogusisaldus
                              
                              
                                 < 2 mg/l
                              
                           
                                 Ioniseerimata ammoniaak
                              
                              
                                 < 1 μg/l
                              
                           
                                 Karedus CaCO3-na
                              
                              
                                 < 400 mg/l (20)
                                 
                              
                           
                                 Jääkkloor
                              
                              
                                 < 10 μg/l
                              
                           
                                 Fosfororgaaniliste pestitsiidide üldsisaldus
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Kloororgaaniliste pestitsiidide ja polüklooritud bifenüülide üldsisaldus
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Orgaanilise kloori üldsisaldus
                              
                              
                                 < 25 ng/l
                              
                           
                  
                     5. liide
                     
                        Suunised surusääsklaste vastsete valmikuteks väljaarenemise seireks
                     
                     Katsenõudele paigaldatakse väljaarenenud valmikute püüdurid. Neid püüdureid vajatakse alates 20. päevast kuni katse lõpuni. Kasutatava püüduri näidis on esitatud allpool.
                     
                        
                     
                                 A
                              
                              
                                 –
                              
                              
                                 nailonvõrk
                              
                           
                                 B
                              
                              
                                 –
                              
                              
                                 tagurpidi pööratud plastiktopsid
                              
                           
                                 C
                              
                              
                                 –
                              
                              
                                 tilata kokkupuutenõu
                              
                           
                                 D
                              
                              
                                 –
                              
                              
                                 sõelaga kaetud veevahetusavad
                              
                           
                                 E
                              
                              
                                 –
                              
                              
                                 vesi
                              
                           
                                 F
                              
                              
                                 –
                              
                              
                                 sete
                              
                           
                  C.29.   KIIRE BIOLAGUNDATAVUS – CO2 SULETUD NÕUDES (VABARUUMI KATSE)
                  
                  SISSEJUHATUS
                  
                              1.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 310 (2006). Käesolev katsemeetod on sõelumismeetod kemikaalide kiire biolagundatavuse hindamiseks ning see annab samalaadset teavet kui käesoleva lisa peatüki C.4 meetoditena C.4-A kuni C.4-F kirjeldatud kuus katsemeetodit. Seega võib käesoleva katsemeetodi alusel positiivse tulemuse saanud kemikaali pidada kiiresti biolagundatavaks ning seepärast ka keskkonnas kiiresti lagunevaks.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Halvasti lahustuvate ja tugevasti adsorbeeruvate kemikaalide uurimisel on esimene valik tavaliselt olnud süsinikdioksiidi (CO2) meetod (1), mida kasutatakse juba ammu ja mis põhineb Sturmi algsel katsel (2), millega hinnatakse orgaaniliste kemikaalide biolagundatavust mikroobide toimel moodustunud süsinikdioksiidi mõõtmise teel. Seda on samuti kasutatud lahustuvate (kuid mitte lenduvate) kemikaalide puhul, kuna süsinikdioksiidi teket peavad paljud ainsaks kindlaks tõendiks mikroobide tegevuse kohta. Lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamist võivad põhjustada füüsikalis-keemilised protsessid (adsorbeerumine, lendumine, sadestumine, hüdrolüüs) ning ka mikroobide tegevus ja mõned mittebioloogilised hapniku sidumise reaktsioonid; harva tekib CO2 orgaanilistest kemikaalidest abiootilisel teel. Algses ja muudetud Sturmi katses (1, 2) kõrvaldatakse CO2 vedelfaasist absorbeerimisnõudesse läbipuhumisega (s.o CO2 kõrvaldamiseks töödeldud õhu barboteerimisega läbi vedeliku), aga Larsoni versioonis (3, 4) kantakse CO2 reaktsiooninõust üle absorbeerijasse CO2-vaba õhu suunamisega läbi vabaruumi ja katsenõu pideva raputamisega. Reaktsiooninõud raputatakse ainult Larsoni muudetud versiooni puhul; segamine on standardis ISO 9439 (5) ette nähtud ainult lahustumatute ainete puhul ja algses Ameerika Ühendriikide versioonis (6), mõlemas kasutatakse vabaruumi õhu asendamise asemel läbipuhumist. Teises Ameerika Ühendriikide keskkonnakaitseameti meetodis (7), mis põhineb Gledhilli meetodil (8), on raputatav reaktsiooninõu keskkonnast isoleeritud ja tekkiv CO2 kogutakse otse gaasifaasist sisemisse leelispüüdurisse nagu klassikalistes Warburgi-Barcrofti respiromeetri kolbides.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Mitme kemikaali puhul on näidatud, et standardse muudetud Sturmi katse kasutamisel koguneb anorgaaniline süsinik kasvukeskkonda (9). Aniliini (kontsentratsioon 20 mg C/l) lagundamisel leiti anorgaanilise süsiniku kontsentratsioon olevat lausa 8 mg/l. Seega ei väljenda leelispüüdurisse kogutud CO2 lagunemise ajal mikrobioloogiliselt tekkinud CO2 tegelikku kogust. Järelikult ei ole uuritava kemikaali kiiresti biolagunevaks klassifitseerimise tingimus, et > 60 % maksimaalsest teoreetiliselt tekkida võivast CO2 kogusest tuleb koguda kümnepäevase ajavahemiku vältel (10 % biolagunemise saavutamisele vahetult järgnevad kümme päeva), täidetud mõne kemikaali puhul, mis lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamise alusel klassifitseeritaks kiiresti biolagunevaks.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Kui lagunemise protsent on eeldatavast väiksem, võib anorgaaniline süsinik olla kogunenud katselahusesse. Sel juhul võib lagunemist hinnata muude kiire biolagundatavuse katsete abil.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Muud Sturmi meetodi puudused (keerukas, aeganõudev, suurem katsevea tekke tõenäosus, mitte kasutatav lenduva kemikaali puhul) sundisid varem otsima gaasi läbijuhtimise asemele Gledhilli meetodile alternatiivset suletud nõu meetodit (10, 11). Boatman et al. (12) vaatasid varasemad meetodid läbi ja võtsid kasutusele suletud vabaruumi süsteemi, milles CO2 lasti inkubatsiooni lõpus kasvukeskkonna hapestamise teel vabaruumi. CO2 mõõdeti gaaskromatograafia / anorgaanilise süsiniku analüüsi abil vabaruumist automaatselt võetud proovides, aga vedelfaasis lahustunud anorgaanilist süsinikku ei võetud arvesse. Kasutatud nõud olid väga väiksed (20 ml) ja sisaldasid ainult 10 ml kasvukeskkonda, mis tekitas raskusi; näiteks oli raske lisada lahustumatu uuritava kemikaali vajalikku väga väikest kogust ja/või inokuleeritud kasvukeskkonnas ei pruukinud olla piisavalt või üldse mikroorganisme, kes suudavad uuritavat kemikaali lagundada.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Need probleemid on ületatud Struijsi ja Stoltenkampi (13) ning Birchi ja Fletcheri (14) sõltumatute uuringutega. Viimati nimetatud autoreid inspireerisid nende kogemused seadmega, mida kasutati anaeroobse biolagunemise katses (15). Esimesena nimetatud meetodi (13) kohaselt mõõdeti CO2 vabaruumis pärast hapestamist ja tasakaalustamist ning teise meetodi (14) puhul mõõdeti lahustunud anorgaaniline süsinik nii gaasilises kui ka vedelfaasis ilma töötlemiseta; üle 90 % tekkinud anorgaanilisest süsinikust leiti vedelfaasis. Mõlemal meetodil on eeliseid Sturmi katse ees, kuna nende katsesüsteem on kompaktsem ja lihtsamini kasutatav, saab uurida ka lenduvaid kemikaale ning tekkinud CO2 mõõtmise viivituste võimalus on välditud.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Kaks nimetatud lähenemisviisi on ühendatud ISO vabaruumi CO2 standardmeetodis (16), millega on tehtud laboritevaheline võrdluskatse (17), nimetatud standardmeetod on käesoleva katsemeetodi alus. Samal viisil on Ameerika Ühendriikide keskkonnakaitseameti meetodis (18) kasutatud kahte lähenemisviisi. Soovitatud on CO2 mõõtmise kahte meetodit, nimelt vabaruumi CO2 pärast hapestamist (13) ja anorgaaniline süsinik vedelfaasis pärast leelise liia lisamist. Viimati nimetatud meetodi võttis kasutusele Peterson naftaettevõtjate Euroopa assotsiatsiooni keskkonna ning tööohutuse ja töötervishoiu toetamiseks (CONCAWE) tehtud kõnealuse vabaruumi meetodi (mida on muudetud iseenesliku biolagunemise mõõtmiseks) laboritevahelise võrdluskatse ajal (19). Käesoleva lisa peatükis C.4 esitatud kiire biolagundatavuse meetodite läbivaatamisega seoses 1992. aastal tehtud muudatused (20) on kaasatud käesolevasse katsemeetodisse ja seega on tingimused (kasvukeskkond, kestus jne) muudel puhkudel samad kui läbivaadatud Sturmi katses (20). Birch ja Fletcher (14) on näidanud, et käesoleva vabaruumi katsega väga sarnased tulemused saadi läbivaadatud katsemeetodite OECD laboritevahelises võrdluskatses samade kemikaalidega (21).
                           
                        KATSE PÕHIMÕTE
                  
                              8.
                           
                           
                              Uuritavat kemikaali, tavaliselt 20 mg C/l, kui ainsat süsiniku ja energia allikat inkubeeritakse puhvermineraalsoolade kasvukeskkonnas, millesse on külvatud mikroorganismide segapopulatsioon. Katse tehakse suletud pudelites, milles on vaba ruum õhu jaoks; see tagab hapnikuvaru aeroobseks biolagunemiseks. Uuritava kemikaali täielikust aeroobsest biolagunemisest põhjustatud CO2 teke määratakse sel viisil, et mõõdetakse katsepudelites tekkinud anorgaaniline süsinik ja lahutatakse sellest inokuleerimata kasvukeskkonda sisaldavates kontrollkatse nõudes tekkinud anorgaaniline süsinik. Biolagunemise ulatus väljendatakse protsendina anorgaanilise süsiniku tekkimise maksimaalsest teoreetilisest kogusest, mis arvutatakse algselt lisatud uuritava kemikaali (orgaanilise süsiniku) koguse alusel.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Võimalik on mõõta ka lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamise määra ja/või uuritava kemikaali esmase biolagunemise ulatust (20).
                           
                        ANDMED UURITAVA KEMIKAALI KOHTA
                  
                              10.
                           
                           
                              Lagunemise protsendi arvutamiseks peab uuritava kemikaali orgaanilise süsiniku sisaldus (massiprotsent) olema teada kas selle keemilise struktuuri põhjal või mõõtmise teel. Lenduva uuritava kemikaali puhul aitab mõõdetud või arvutatud Henry seaduse konstant leida sobiva vabaruumi ja vedeliku koguse suhte. Sobiva katsekontsentratsiooni valimiseks ning halba biolagundatavust näitavate tulemuste tõlgendamiseks on kasulik omada teavet uuritava kemikaali mürgisuse kohta mikroorganismidele: kui ei ole teada, kas uuritav kemikaal inhibeerib mikroobide tegevust, soovitatakse kaasata inhibitsiooni kontrollrühm (vt punkt 24).
                           
                        MEETODI KASUTUSALA
                  
                              11.
                           
                           
                              Katset kasutatakse nii vees lahustuvate kui ka mittelahustuvate uuritavate kemikaalide puhul, kuid tuleks tagada uuritava kemikaali hea dispersioon. Soovitatud vabaruumi ja vedeliku koguse suhte 1 : 2 kasutamisel on võimalik uurida lenduvaid kemikaale Henry seaduse konstandiga kuni 50 Pa·m3·mol–1, kuna vabaruumis oleva uuritava kemikaali osakaal ei ületa sel juhul veel 1 % (13). Lenduvama kemikaali uurimisel võib kasutada väiksemat vabaruumi, aga piiravaks teguriks võib olla selle biosaadavus, eriti kui kemikaal on vees halvasti lahustuv. Kasutaja peab siiski tagama, et vabaruumi ja vedeliku koguse suhe ning uuritava kemikaali kontsentratsioon on sellised, et täieliku aeroobse biolagunemise toimumiseks oleks piisavalt hapnikku (vältige näiteks substraadi suure kontsentratsiooni ja väikse vabaruumi mahu kasutamist). Suuniseid selle kohta võib leida väljaannetes (13, 23).
                           
                        VÕRDLUSKEMIKAALID
                  
                              12.
                           
                           
                              Katse korrektse läbiviimise kontrollimiseks tuleks paralleelselt katsetada teadaoleva biolagunevusega võrdluskemikaali. Vees lahustuva uuritava kemikaali katsetamisel võib selleks kasutada aniliini, naatriumbensoaati või etüleenglükooli ja halvasti lahustuva uuritava kemikaali katsetamisel 1-oktanooli (13). Nimetatud kemikaalide biolagunemine peab 14 päeva jooksul jõudma > 60 %-ni maksimaalsest teoreetiliselt võimalikust anorgaanilise süsiniku kogusest.
                           
                        REPRODUTSEERITAVUS
                  
                              13.
                           
                           
                              Meetodi ISO standardi kohases laboritevahelises võrdluskatses (17) saadi soovitatud tingimuste kasutamisel 20 mg C uuritava kemikaaliga liitri kohta järgmised tulemused.
                              
                                          Uuritav kemikaal
                                       
                                       
                                          Keskmine biolagundamise protsent
                                          (28 päeva)
                                       
                                       
                                          Variatsioonikordaja
                                          (%)
                                       
                                       
                                          Laborite arv
                                       
                                    
                                          Aniliin
                                       
                                       
                                          90
                                       
                                       
                                          16
                                       
                                       
                                          17
                                       
                                    
                                          1-oktanool
                                       
                                       
                                          85
                                       
                                       
                                          12
                                       
                                       
                                          14
                                       
                                    Katsesisene variatsioon (korratavus) oli aniliini puhul hea ja variatsioonikordajad ei olnud peaaegu üheski katses suuremad kui 5 %. Kahel juhul, kui korratavus oli halvem, oli suurem variatsioon tõenäoliselt põhjustatud suuremahulisest anorgaanilise süsiniku tekkimisest kontrollkatsetes. Korratavus oli 1-oktanooli puhul halvem, kuid jäi 79 % katsete puhul ikkagi alla 10 %. See katsesisene suurem variatsioon võis olla põhjustatud doseerimisvigadest, kuna suletud katsepudelitesse tuli lisada väike kogus (3–4 μl) 1-oktanooli. Uuritava kemikaali väiksema kontsentratsiooni kasutamisel on tulemuseks suuremad variatsioonikordajad, eelkõige kontsentratsioonil, mis on väiksem kui 10 mg C/l. Seda on võimalik osaliselt vältida, vähendades anorgaanilise süsiniku üldkontsentratsiooni inokulumis.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              ELi laboritevahelises võrdluskatses, milles lisati viit pindaktiivset ainet koguses 10 mg C/l (24), saadi järgmised tulemused.
                              
                                          Uuritav kemikaal
                                       
                                       
                                          Keskmine biolagundamise protsent
                                          (28 päeva)
                                       
                                       
                                          Variatsioonikordaja
                                          (%)
                                       
                                       
                                          Laborite arv
                                       
                                    
                                          Tetrapropüleenbenseensulfonaat
                                       
                                       
                                          17
                                       
                                       
                                          45
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Diisooktüül-sulfosuktsinaat
                                          (anioonne)
                                       
                                       
                                          72
                                       
                                       
                                          22
                                       
                                       
                                          9
                                       
                                    
                                          Heksadetsüültrimetüülammooniumkloriid
                                          (katioonne) (21)
                                          
                                       
                                       
                                          75
                                       
                                       
                                          13
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Isononüülfenool(etoksülaat)9
                                          
                                          (mitteioonne)
                                       
                                       
                                          41
                                       
                                       
                                          32
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Kookosamiid-propüül-dimetüülhüdroksü-sulfobetaiin
                                          (amfoteerne)
                                       
                                       
                                          60
                                       
                                       
                                          23
                                       
                                       
                                          11
                                       
                                    Tulemused näitavad, et enamasti oli variatsioon suurem halvemini lagunenud pindaktiivsete ainete puhul. Katsesisene variatsioon oli väiksem kui 15 % enam kui 90 % juhtudest ja suurim variatsioon jäi vahemikku 30–40 %.
                              
                                          MÄRKUS.
                                       
                                       
                                          Enamik pindaktiivseid aineid ei ole individuaalsed ained, vaid kujutavad endast selliste isomeeride, homoloogide jne segu, mis lagunevad pärast erinevaid iseloomulikke ooteperioode ja erineva kineetilise kiirusega. Seetõttu on kõverad „hägused”, venivad, mistõttu ei pruugita kümnepäevase ajavahemiku jooksul jõuda nõutava 60 % väärtuseni, kuigi iga aine eraldi katsetatuna jõuaks kümne päevaga > 60 % väärtuseni. Seda võib täheldada ka muude keerukate segude puhul.
                                       
                                    
                        MEETODI KIRJELDUS
                  
                     Seadmed
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Tavalised laboriseadmed ja
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          klaasist seerumipudelid, mis on suletud butüülkummist korgi ja pealevaltsitava alumiiniumkapsliga. Soovitatav suurus on nn 125 ml pudel, mille kogumaht on ligikaudu 160 ml (sel juhul peaks iga pudeli maht olema teadaolevalt 160 ± 1 ml). Kui tulemused vastavad punktides 66 ja 67 kirjeldatud tingimustele, võib kasutada väiksemaid nõusid;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          süsiniku analüsaator või muu mõõteseade (näiteks gaaskromatograaf) anorgaanilise süsiniku mõõtmiseks;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          suure täpsusega süstlad gaasi- ja vedelikeproovide võtmiseks;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          orbitaalloksuti reguleeritud temperatuuriga keskkonnas;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          varustatus CO2-vaba õhuga; selle tagamiseks juhitakse õhk läbi kaltsiumhüdroksiidi ja naatrium-/kaaliumhüdroksiidi segu graanulite või kasutatakse (soovi korral) gaaside segu koostisega 80 % N2 ja 20 % O2 (vt punkt 28);
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          membraanfiltrimisseade poori suurusega 0,20–0,45 μm (soovi korral);
                                       
                                    
                                          g)
                                       
                                       
                                          orgaanilise süsiniku analüsaator (soovi korral).
                                       
                                    
                        
                     Reagendid
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Kogu katse vältel tuleb kasutada analüütiliselt puhtaid reagente.
                           
                        
                     Vesi
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Tuleks kasutada destilleeritud või deioniseeritud vett, mille orgaanilise süsiniku kogusisaldus on ≤ 1 mg/l. See moodustab ≤ 5 % algsest orgaanilise süsiniku sisaldusest, mis lisatakse soovitatud doosi uuritava kemikaaliga.
                           
                        
                     Mineraalsooli sisaldava kasvukeskkonna põhilahused
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Põhilahused ja mineraalsooli sisaldav kasvukeskkond on samalaadsed kui standardis ISO 14593 (16) ja meetodi C.4 kiire biolagundatavuse katsetes (20). Suurema ammooniumkloriidi kontsentratsiooni kasutamine (2,0 g/l 0,5 g/l asemel) peaks olema vajalik ainult väga erandlikel juhtudel, näiteks siis, kui uuritava kemikaali kontsentratsioon on > 40 mg C/l. Põhilahuseid tuleks säilitada jahutatult ja need tuleks ära visata kuue kuu möödumisel või varem, kui esineb sadestumise või mikroobide kasvu märke. Valmistatakse järgmised põhilahused:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          kaaliumdivesinikfosfaat (KH2PO4) 8,50 g;
                                          dikaaliumvesinikfosfaat (K2HPO4) 21,75 g;
                                          dinaatriumvesinikfosfaatdihüdraat (Na2HPO4·2H2O) 33,40 g;
                                          ammooniumkloriid (NH4Cl) 0,50 g.
                                          Lahustage vees ja lisage vett 1 liitrini. Lahuse pH peaks olema 7,4 (±0,2). Kui see ei ole nii, tuleks valmistada uus lahus;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          kaltsiumkloriiddihüdraat (CaCl2·2H2O) 36,40 g.
                                          Lahustage vees ja lisage vett 1 liitrini;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          magneesiumsulfaatheptahüdraat (MgSO4·7H2O) 22,50 g.
                                          Lahustage vees ja lisage vett 1 liitrini;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          raud(III)kloriidheksahüdraat (FeCl3·6H20) 0,25 g.
                                          Lahustage vees ja lisage vett 1 liitrini ning lisage üks tilk kontsentreeritud HCl.
                                       
                                    
                        
                     Mineraalse kasvukeskkonna valmistamine
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Segage 10 ml lahust a ligikaudu 800 ml veega (punkt 17), seejärel lisage 1 ml lahuseid b, c ja d ning lisage vett 1 liitrini (punkt 17).
                           
                        
                     Muud reagendid
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Kontsentreeritud ortofosforhape (H3PO4) (> 85 massiprotsenti).
                           
                        
                     Naatriumhüdroksiidi lahus 7M
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Lahustage 280 g naatriumhüdroksiidi (NaOH) 1 liitris vees (punkt 17). Määrake saadud lahuses lahustunud anorgaanilise süsiniku kontsentratsioon ja võtke seda näitajat katsetulemuse arvutamisel arvesse (vt punktid 55 ja 61), pidades eelkõige silmas punktis 66 esitatud kehtivuse kriteeriumi (b). Kui lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsioon on liiga suur, siis valmistage uus lahus.
                           
                        
                     Uuritav kemikaal
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Valmistage vees (punkt 17) või kasvukeskkonnas (punkt 19) vees piisavalt lahustuva uuritava kemikaali põhilahus, mille kontsentratsioon on eelistatavalt 100 korda suurem kui katses kasutatav lõplik kontsentratsioon; vajalik võib olla põhilahuse pH reguleerimine. Põhilahust tuleks lisada mineraalsele kasvukeskkonnale, et saada lõplik orgaanilise süsiniku kontsentratsioon vahemikus 2–40 mg C/l, eelistatavalt 20 mg C/l. Kui kasutatakse sellest väiksemat kontsentratsiooni, võib väheneda katse täpsus. Täpse mõõtesüstla abil võib nõudesse lisada lahustuvat või lahustumatut vedelat kemikaali. Halvasti lahustuva või lahustumatu uuritava kemikaali puhul võib vaja minna erimeetodit (25). Valikud on järgmised:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          teadaoleva kaalutud koguse otse lisamine;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          enne lisamist ultraheliga dispergeerimine;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          dispergeerimine emulgaatoriga; sel juhul tuleb enne lisamist kindlaks teha, kas emulgaator mõjutab (inhibeerib või stimuleerib) mikroobide tegevust;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          vedela uuritava kemikaali või sobiva lenduva lahusti abil saadud lahuse adsorbeerimine inertsele kandjale või tugimaterjalile (näiteks klaaskiudfilter), millele järgneb lahusti (kui seda kasutati) aurustamine ja teadaoleva koguse otse lisamine;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          teadaolev kogus uuritava kemikaali lahust kergesti lenduvas lahustis viiakse tühja katsenõusse ja aurustatakse seejärel lahusti.
                                       
                                    Alapunktide c, d ja e puhul kasutatavaid aineid või lahusteid tuleb katsetada, et teha kindlaks nende võimalik stimuleeriv või inhibeeriv mõju mikroobide tegevusele (vt punkti 42 alapunkt b).
                           
                        
                     Võrdluskemikaal
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Valmistage vees (punkt 17) (lahustuva) võrdluskemikaali põhilahus, mille kontsentratsioon on eelistatavalt 100 korda suurem kui katses kasutatav lõplik kontsentratsioon (20 mg C/l).
                           
                        
                     Inhibeerimise kontroll
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Uuritavad kemikaalid sageli ei lagune kiire biolagunemise hindamiseks kasutatavates tingimustes. Üks võimalikke põhjusi on see, et uuritav kemikaal inhibeerib katses kasutataval kontsentratsioonil inokulumi. Katseprojekti võib lisada inhibeerimise kontrollkatse, et teha (tagantjärele) kindlaks inhibeerimine kui võimalik põhjus või mõjutav tegur. Alternatiivselt võib inhibeerimise kontrollkatsega kõnealuse mõju välistada ja näidata, et lagunemise puudumine või vähene lagunemine on põhjustatud üksnes vastupidavusest mikroobide rünnakule katse tingimustes. Et saada teavet uuritava kemikaali mürgisuse kohta (aeroobsetele) mikroorganismidele, valmistage katse kasvukeskkonnas lahus, mis sisaldab uuritavat kemikaali ja võrdluskemikaali (punkt 19) vastavalt igal lisatud kontsentratsioonil (vt punktid 22 ja 23).
                           
                        
                     Inokulum
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Inokulumi saamiseks võib kasutada mitmeid allikaid: aktiivmuda; reovee väljavool (kloorimata); pinnavesi ja muld või nimetatute segu (20). Võrdluskemikaali abil tuleks kontrollida sellise inokulumi biolagundavat toimet. Olenemata lähtematerjalist ei tohiks kasutada uuritava kemikaaliga varem kokku puutunud mikroorganisme, kui meetodit kasutatakse kiire biolagundatavuse katsena.
                              
                                          
                                             Hoiatus.
                                       
                                       
                                          Aktiivmuda, reovesi ja reovee väljavool sisaldavad haigusetekitajaid ja neid tuleb käsitleda ettevaatusega.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              Kogemuste põhjal on optimaalne inokulumi kogus selline, mis
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          on piisav asjakohase biolagunemise tagamiseks;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          lagundab võrdluskemikaali kindlaksmääratud protsendi võrra (vt punkt 66);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          tagab lõppsegus 102 – 105 kolooniaid moodustava ühiku olemasolu milliliitri kohta;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          tagab aktiivmuda kasutamisel lõppsegus tavaliselt hõljuvaine kontsentratsiooni 4 mg/l, võib kasutada kontsentratsioone kuni 30 mg/l, kuid need võivad märkimisväärselt suurendada CO2 tekkimist kontrollkatsetes (26);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          ei sisalda rohkem kui 10 % uuritava kemikaaliga lisatavast orgaanilise süsiniku lähtekontsentratsioonist;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          võimaldab lisada tavaliselt 1–10 ml inokulumi 1 liitri katselahuse kohta.
                                       
                                    
                        
                     Aktiivmuda
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Aktiivmuda kogutakse värskelt reoveepuhasti või peamiselt olmereovett töötleva laborimõõdus seadme aeratsiooninõust. Vajaduse korral tuleks suured osakesed sõelumisega kõrvaldada (sõelaava näiteks 1 mm2) ja muda tuleks hoida kuni kasutamiseni aeroobsena.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Alternatiivselt võib aktiivmuda pärast suurte osakeste kõrvaldamist lasta settida või tsentrifuugida (näiteks 1 100 × g 10 minuti vältel). Supernatant valatakse ära. Muda võib pesta mineraalse lahusega. Suspendeerige kontsentreeritud hõljuvaine mineraalses toitekeskkonnas, et saada kontsentratsioon 3–5 g tahkeid osakesi liitri kohta. Seejärel aereerige, kuni on vaja.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Muda tuleks võtta tavapärasest töökorras puhastist. Suure koormusega puhastist pärinevat või inhibiitoreid sisaldavat muda tuleks pesta. Pärast põhjalikku segamist resuspendeeritud muda setitatakse või tsentrifuugitakse, kõrvaldatakse supernatant ja suspendeeritakse muda uuesti järgmises koguses mineraalses toitekeskkonnas. Seda korratakse, kuni muda peaks olema vaba liigsest substraadist või inhibiitorist.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Täielikult resuspendeeritud või töötlemata mudast võetakse vahetult enne kasutamist proov hõljuvaine kuivkaalu määramiseks.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Veel üks võimalus on aktiivmuda homogeniseerida (3–5 g hõljuvainet / l). Muda töödeldakse Waringi segistis keskmisel kiirusel 2 min. Segatud muda setitatakse 30 minutit või vajaduse korral kauem ja dekanteeritakse vedelik, mida kasutatakse inokulumina kontsentratsioonil u 10 mg/l mineraalse kasvukeskkonna kohta.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              CO2 teket kontrollkatsetes on võimalik vähendada veel sellega, et muda aereeritakse järgmise päevani õhuga, mis ei sisalda CO2. Sellises katses kasutatakse inokulumi kontsentratsiooni 4 mg aktiivmuda tahkeid osakesi 1 liitri kohta (13).
                           
                        
                     Reovee teisene väljavool
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              Inokulumi võib saada ka valdavalt olmereovett töötleva puhasti või laborimõõdus seadme sekundaarsest väljavoolust. Säilitage proovi aeroobsetes tingimustes ja kasutage seda võtmise päeval või laske sellel vajaduse korral kohaneda. Väljavool tuleks filtrida läbi jämefiltri, et eemaldada suured osakesed, ja seejärel mõõta pH.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Väljavoolu anorgaanilise süsiniku sisalduse vähendamiseks puhutakse filtraadist läbi CO2-vaba õhku (punkti 15 alapunkt e) ühe tunni vältel, hoides ortofosforhappe abil pH väärtust 6,5 (punkt 20). Algne pH taastatakse naatriumhüdroksiidiga (punkt 21) ja pärast ligikaudu üks tund kestnud settimist võetakse inokulatsiooniks vajalik kogus supernatanti. Sellise barboteerimisega vähendatakse inokulumis anorgaanilise süsiniku sisaldust. Kui inokulumina kasutati näiteks filtritud barboteeritud väljavoolu maksimaalset soovituslikku kogust (100 ml/l), jäi kontrollnõudes olev anorgaanilise süsiniku kogus vahemikku 0,4 kuni 1,3 mg/l (14), mis moodustas 2–6,5 % uuritava kemikaaliga lisatud süsinikusisaldusest 20 mg C/l juures ja 4–13 % 10 mg C/l juures.
                           
                        
                     Pinnavesi
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Proov võetakse asjakohasest pinnaveest. Seda tuleks hoida aeroobsetes tingimustes ja kasutada võtmise päeval. Proov peaks vajaduse korral olema kontsentreeritud filtrimise või tsentrifuugimisega. Igas katsenõus kasutatud inokulumi maht peaks vastama punktis 26 esitatud kriteeriumidele.
                           
                        
                     Muld
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Maapinnast kuni 20 cm sügavuselt võetakse asjakohane mullaproov. Kivid, taimejäänused ja selgrootud tuleks mullaproovist eemaldada enne selle sõelumist läbi 2 mm avaga sõela (kui proov on kohe sõelumiseks liiga märg, kuivatage seda sõelumise võimaldamiseks osaliselt õhu käes). Proovi tuleks hoida aeroobsetes tingimustes ja kasutada võtmise päeval (kui proovi transporditakse lõdvalt kinniseotud mustas polüetüleenkotis, siis võib seda kotis säilitada 2–4 °C juures kuni ühe kuu vältel).
                           
                        
                     Inokulumi kohanemine
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Inokulumil võib lasta kohaneda katsetingimustega, kuid mitte uuritava kemikaaliga. Kohanemine võib vähendada CO2 teket kontrollkatsetes. Kohanemine hõlmab aktiivmuda katsetemperatuuril aereerimist niiske CO2-vaba õhuga 5–7 päeva jooksul pärast muda lahjendamist katse kasvukeskkonnas kontsentratsioonini 30 mg/l.
                           
                        KATSE KÄIK
                  
                     Pudelite arv
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Katse jaoks vajalike pudelite arv (punkti 15 alapunkt a) oleneb analüüside sagedusest ja katse kestusest.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              On soovitatav analüüsida piisavate ajavahemike järel kolme pudelit, et oleks võimalik määrata kindlaks kümnepäevane ajavahemik. Katse lõpus analüüsitakse vähemalt viit katsepudelit (punkti 15 alapunkt a) komplektidest a, b ja c (vt punkt 42), et saaks arvutada biolagunemise keskmise protsendilise näitaja 95 % usaldusvahemikku.
                           
                        
                     Inokuleeritud kasvukeskkond
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Inokulumi kasutatakse kontsentratsioonil 4 mg aktiivmuda tahkeid kuivi osakesi ühe liitri kohta. Vahetult enne kasutamist valmistage piisavalt inokuleeritud kasvukeskkond, lisades näiteks 2 ml töödeldud aktiivmuda (punktid 27–32) kontsentratsiooniga 2 000 mg/l 1 liitrile mineraalsooli sisaldavale kasvukeskkonnale (punkt 19). Reovee sekundaarse väljavoolu kasutamise korral lisage kuni 100 ml väljavoolu (punkt 33) 900 ml mineraalsooli sisaldavale kasvukeskkonnale (punkt 19) ja lahjendage kasvukeskkonnaga 1 liitrini.
                           
                        
                     Pudelite ettevalmistamine
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Inokuleeritud kasvukeskkonna alikvoodid sisestatakse paralleelproovide pudelitesse, et saada vabaruumi ja vedeliku suhe 1 : 2 (näiteks 160 ml mahuga pudelitesse lisage 107 ml). Võib kasutada ka muud suhtarvu, kuid seejuures tuleb arvesse võtta punktis 11 esitatud hoiatust. Ükskõik kumba tüüpi inokulumi kasutamise puhul tuleb jälgida, et inokuleeritud kasvukeskkond oleks piisavalt segatud, et selle saaks ühtlaselt jaotada katsepudelitesse.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Valmistatakse ette järgmise sisuga pudelite komplektid (punkti 15 alapunkt a):
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          uuritavat kemikaali sisaldavad katsenõud (tähis FT);
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          ainult katse kasvukeskkonda ja inokulumi sisaldavad kontrollnõud (tähis FB); neisse tuleb lisada ka kõik kemikaalid, lahustid, ained või klaaskiudfiltrid, mida kasutatakse uuritava kemikaali lisamiseks katsenõudesse;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          nõud võrdluskemikaaliga (tähis FC) katse õige läbiviimise kontrollimiseks;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          vajaduse korral uuritava kemikaali võimaliku inhibeeriva mõju kontrollimise nõud (tähis FI), mis sisaldavad nii uuritavat kemikaali kui ka võrdluskemikaali samal kontsentratsioonil kui vastavalt pudelid FT ja FC (punkt 24);
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          nõud (tähis FS) nagu punktis a võimaliku abiootilise lagunemise kontrollimiseks, millesse lisatakse 50 mg/l HgCl2 või mis steriliseeritakse muul viisil (näiteks autoklaavimine).
                                       
                                    
                        
                              43.
                           
                           
                              Vees lahustuvad uuritavad kemikaalid ja võrdluskemikaalid lisatakse põhilahustena vees (punktid 22, 23 ja 24), et saada kontsentratsioon 10–20 mg C/l.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Lahustumatu uuritav kemikaal ja lahustumatu võrdluskemikaal lisatakse pudelitesse sobival viisil (vt punkti 22 alapunktid a–e), olenevalt uuritava kemikaali laadist ja lisamise meetodist kas enne või pärast inokuleeritud kasvukeskkonna lisamist. Kui kasutatakse punkti 22 alapunktides a–e nimetatud meetodit, tuleks kontrollpudeleid FB (punkti 42 alapunkt b) töödelda samal viisil, kuid ilma uuritavat kemikaali või võrdluskemikaali lisamata.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Lenduv uuritav kemikaal tuleks mikrosüstla abil sisestada suletud pudelisse (punkt 47). Doos arvutatakse sisestatava koguse ja uuritava kemikaali tiheduse alusel.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Vajaduse korral tuleks nõudesse lisada vett, et kõigis nõudes oleks ühesugune vedelikukogus. Tuleb tagada, et vabaruumi ja vedeliku suhe (enamasti 1 : 2) ning uuritava kemikaali kontsentratsioon on sellised, et vabaruumis on piisavalt hapnikku täieliku biolagunemise võimaldamiseks.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Kõik pudelid suletakse seejärel näiteks butüülkummist vahekorgi ja alumiiniumkapsliga. Lenduv uuritav kemikaal tuleks lisada selles etapis (punkt 45). Kui katselahuses jälgitakse lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsiooni vähenemist ning kui anorgaanilise süsiniku algkontsentratsiooni (steriilne kontrollkatse, punkti 42 alapunkt e) või muid näitajaid määratakse aja nullpunktis, siis eemaldatakse asjaomane proov katsenõust. Katsenõu ja selle sisu tuleb seejärel kõrvaldada.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Suletud pudelid asetatakse pöördloksutile (punkti 15 alapunkt d), mille loksutuskiirus on piisav pudeli sisu hästi segatuna ja suspensioonis hoidmiseks (näiteks 150 kuni 200 pööret minutis), ja inkubeeritakse pimedas temperatuuril 20 ± 1 °C.
                           
                        
                     Proovide võtmine
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Proovide võtmise kava sõltub ooteperioodist ja uuritava kemikaali biolagunemise kineetilisest kiirusest. Pudelid analüüsitakse proovivõtu päeval; proove võetakse vähemalt iga nädal või sagedamini (näiteks kaks korda nädalas), kui on vaja koostada täielik lagunemiskõver. Loksutist võetakse nõutav arv FT, FB ja FC paralleelproovide pudeleid ning, kui neid kasutatakse, siis ka FI ja FS pudeleid (vt punkt 42). Katse kestus on tavaliselt 28 päeva. Kui biolagunemise kõver näitab, et enne 28 päeva möödumist on jõutud platooni, siis võib katse lõpetada enne 28. päeva. Võtke proovid viiest pudelist, mis on hoitud 28. päeva analüüsi jaoks, ja kasutage tulemusi, et arvutada biolagunemise protsendi usalduspiirid või variatsioonikordaja. Inhibeerimise ja abiootilise lagunemise kontrollkatsete pudeleid ei ole vaja võtta proovideks sama sagedasti kui teisi pudeleid; piisab proovi võtmisest 1. ja 28. päeval.
                           
                        
                     Anorgaanilise süsiniku analüüs
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              CO2 tekkimine pudelites inkubeerimise ajal tehakse kindlaks anorgaanilise süsiniku kontsentratsiooni suurenemise mõõtmisega. Katse jooksul tekkinud anorgaanilise süsiniku koguse mõõtmiseks on kaks soovitatud meetodit, mida on kirjeldatud allpool. Kuna meetodid võivad anda veidi erineva tulemuse, tuleks katse vältel neist kasutada ainult ühte.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Meetodit a soovitatakse juhul, kui kasvukeskkond võib tõenäoliselt sisaldada näiteks klaasfilterpaberi ja/või lahustumatu uuritava kemikaali jääke. Kui süsiniku analüsaatorit ei ole, siis võib selle analüüsi teha gaaskromatograafiga. Vabaruumi gaasi analüüsimise käigus on tähtis, et pudelid oleksid katsetemperatuuril või sellele lähedal. Meetod b võib olla lihtsam laborile, kes kasutab anorgaanilise süsiniku mõõtmiseks süsiniku analüsaatorit. On tähtis, et CO2 karbonaadiks muundamiseks kasutatav naatriumhüdroksiidi lahus (punkt 21) oleks kas värskelt valmistatud või selle anorgaanilise süsiniku sisaldus oleks teada, et seda saaks katsetulemuste arvutamisel arvesse võtta (vt punkti 66 alapunkt b.)
                           
                        
                     Meetod a:   hapestamine pH-ni < 3
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Enne iga analüüside partiid kaliibritakse anorgaanilise süsiniku analüsaator asjakohase anorgaanilise süsiniku standardi abil (näiteks 1 massiprotsent CO2 N2-s). Läbi iga proovivõtuks kasutatava pudeli vahekorgi süstitakse kontsentreeritud ortofosforhapet (punkt 20), et viia kasvukeskkonna pH väärtusele < 3 (näiteks 107 ml katse kasvukeskkonnale lisatakse 1 ml). Pudelid pannakse tagasi loksutile. Pärast ühetunnilist loksutamist katsetemperatuuril võetakse pudelid loksutilt, iga pudeli vabaruumist võetakse gaasi alikvoot (näiteks 1 ml) ja süstitakse anorgaanilise süsiniku analüsaatorisse. Anorgaanilise süsiniku mõõdetud kontsentratsioon väljendatakse ühikutes mg C/l.
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Selle meetodi põhimõte seisneb asjaolus, et pärast hapestamist tasemele pH < 3 ja tasakaalustamist 20 °C juures on katsepudelites CO2 vedela ja gaasifaasi vahel jaotumise tasakaalukonstant 1,0, kui seda mõõdetakse kontsentratsioonina (13). Seda tuleks katsesüsteemi puhul vähemalt üks kord järgmiselt tõendada.
                              Valmistage ette pudelid, mis sisaldavad 5 ja 10 mg/l anorgaanilist süsinikku, kasutades veevaba naatriumkarbonaadi (Na2CO3) lahust CO2-vabas vees, mis on valmistatud kontsentreeritud ortofosforhappe abil (punkt 20) vee pH viimisega väärtuseni 6,5, lahuse barboteerimisega järgmise päevani CO2-vaba õhuga ja pH viimisega neutraalseks leelise abil. Kontrollige, et vabaruumi mahu ja vedelikukoguse suhe oleks sama kui katsete puhul (näiteks 1 : 2). Hapestage ja tasakaalustage punktis 52 kirjeldatud viisil ning mõõtke anorgaanilise süsiniku kontsentratsioon nii vabaruumis kui ka vedelfaasis. Kontrollige, et need kaks kontsentratsiooni langeksid katsevea piires kokku. Kui need kokku ei lange, peaks katse tegija meetodid üle vaatama. Seda anorgaanilise süsiniku vedela ja gaasifaasi vahel jaotumise kontrolli ei ole vaja teha iga katse puhul; seda võib eeldatavasti teha kalibreerimise ajal.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Kui mõõdetakse lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamist (ainult vees lahustuvad uuritavad kemikaalid), tuleks proovid võtta eraldi (hapestamata) pudelite vedelfaasist, filtrida membraanfiltriga ja süstida lahustunud orgaanilise süsiniku analüsaatorisse. Neid pudeleid võib vajaduse korral kasutada muudeks analüüsideks, et mõõta esmast biolagunemist.
                           
                        
                     Meetod b:   CO2 muundamine karbonaadiks
                  
                  
                              55.
                           
                           
                              Enne iga analüüside partiid kaliibritakse anorgaanilise süsiniku analüsaator asjakohase standardi abil, näiteks naatriumvesinikkarbonaadi (NaHCO3) lahusega CO2-vabas vees (vt punkt 53) anorgaanilise süsiniku vahemikus 0–20 mg/l. Läbi iga proovivõtuks kasutatava pudeli vahekorgi süstitakse naatriumhüdroksiidi lahust (7M, punkt 21) (näiteks 107 ml kasvukeskkonna kohta lisatakse 1 ml) ja pudeleid loksutatakse tund aega katsetemperatuuril. Kõigisse konkreetsel päeval kasutatavatesse pudelitesse süstitakse sama NaOH lahust; katse eri proovivõtukordadel aga ei ole vaja kasutada sama lahust. Kui kõigil proovivõtukordadel on vaja mõõta anorgaanilise süsiniku absoluutsed väärtused kontrollkatsetes, tuleb iga kasutamise ajal määrata NaOH lahuses anorgaaniline süsinik. Pudelid võetakse loksutilt ja neil lastakse settida. Iga nõu vedelfaasist võetakse süstlaga vajalik kogus (näiteks 50 – 1 000 μl). Proov süstitakse anorgaanilise süsiniku analüsaatorisse ja registreeritakse anorgaanilise süsiniku kontsentratsioon. Kasutatav analüsaator peab olema kohandatud selle meetodiga saadavate leeliseliste proovide mõõtmiseks.
                           
                        
                              56.
                           
                           
                              Selle meetodi põhimõte seisneb selles, et pärast leelise lisamist ja loksutamist on anorgaanilise süsiniku kontsentratsioon vabaruumis ebaoluline. Katsesüsteemis tuleks seda vähemalt üks kord kontrollida anorgaanilise süsiniku standardiga, leelise lisamise, tasakaalustamise ja anorgaanilise süsiniku kontsentratsiooni mõõtmisega nii vabaruumis kui ka vedelfaasis (vt punkt 53). Kontsentratsioon vabaruumis peaks olema nullilähedane. Kõnealust CO2 peaaegu täieliku neeldumise kontrolli ei ole vaja teha iga katse puhul.
                           
                        
                              57.
                           
                           
                              Kui mõõdetakse lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamist (ainult vees lahustuvad uuritavad kemikaalid), tuleks eraldi pudelite vedelfaasist (leelist lisamata) võtta proovid, filtrida membraanfiltriga ja süstida lahustunud orgaanilise süsiniku analüsaatorisse. Neid pudeleid võib vajaduse korral kasutada veel muudeks analüüsideks, et mõõta esmast biolagunemist.
                           
                        ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE
                  
                     Tulemuste arvutamine
                  
                  
                              58.
                           
                           
                              Kui eeldada uuritava kemikaali 100 % mineraliseerumist CO2-ni, on kontrollnõus tekkivale CO2-le lisandunud maksimaalne teoreetiliselt võimalik anorgaanilise süsiniku sisaldus (ThIC) võrdne igasse katsepudelisse katse alguses lisatud orgaanilise süsiniku kogusisaldusega (TOC), s.o:
                              
                                 
                              Anorgaanilise süsiniku kogumass TIC (mg) igas pudelis on:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          võrrand 1,
                                       
                                    kus:
                              
                                          VL
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          vedeliku kogus pudelis (liitrites);
                                       
                                    
                                          CL
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          anorgaanilise süsiniku kontsentratsioon vedelikus (mg/l süsinikuna);
                                       
                                    
                                          VH
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          kogus vabaruumis (liitrites);
                                       
                                    
                                          CH
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          anorgaanilise süsiniku kontsentratsioon vabaruumis (mg/l süsinikuna).
                                       
                                    Anorgaanilise süsiniku kogumassi (TIC) arvutamist käesolevas katses anorgaanilise süsiniku mõõtmiseks kasutatud kahe analüüsimeetodi korral on kirjeldatud allpool punktides 60 ja 61. Biolagunemise protsent (% D) leitakse kummalgi juhul järgmiselt:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          võrrand 2,
                                       
                                    kus:
                              
                                          TICt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          anorgaanilise süsiniku kogumass (mg) katsepudelis ajal t;
                                       
                                    
                                          TICb
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          keskmine anorgaanilise süsiniku kogumass (mg) kontrollpudelis ajal t;
                                       
                                    
                                          TOC
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          katsenõusse algselt lisatud anorgaanilise süsiniku kogumass (mg).
                                       
                                    Biolagunemise protsent % D arvutatakse katse (FT), võrdluskatse (FC) ja (kui seda kasutatakse) inhibeerimise seire kontrollkatse (FI) pudelites kuni iga proovivõtuajani tekkinud anorgaanilise süsiniku kogumassi alusel.
                           
                        
                              59.
                           
                           
                              Kui katse vältel suureneb oluliselt anorgaanilise süsiniku kogumass steriilsetes kontrollnõudes (FS), siis võib järeldada, et uuritav kemikaal laguneb abiootiliselt, ja seda tuleb võrrandis 2 D arvutamisel arvesse võtta.
                           
                        
                     Hapestamine pH väärtusele < 3
                  
                  
                              60.
                           
                           Kuna hapestamisel pH väärtusele < 3 ja tasakaalustamisel muutuvad anorgaanilise süsiniku kogumassi kontsentratsioonid vedelfaasis ja gaasifaasis võrdseks, siis on vaja mõõta ainult gaasifaasi anorgaanilise süsiniku kontsentratsioon. Seega saab võrrandi 1 alusel tuletada 
                                 , kus VB on seerumipudeli maht.
                        
                     CO2 muundamine karbonaadiks
                  
                  
                              61.
                           
                           Selle meetodi puhul tehakse arvutused võrrandi 1 järgi, aga ebaolulist anorgaanilise süsiniku kogust gaasifaasis ei võeta arvesse, s.o 
                                 , ja 
                                 .
                        
                     Tulemuste väljendamine
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Biolagunemise kõvera saamiseks kantakse graafikule biolagunemise protsent D sõltuvalt inkubatsiooniajast ning võimaluse korral näidatakse ootefaas, biolagunemise faas, kümnepäevane ajavahemik ja platoofaas (s.o faas, kus on jõutud maksimaalse lagunemiseni ja biolagunemise kõver muutub horisontaalseks). Kui FT paralleelkatsetes saadakse võrreldavad väärtused (erinevus < 20 %), koostatakse keskmistatud kõver (vt 2. liite joonis 1); kui tulemused ei ole võrreldavad, koostatakse kõver iga nõu kohta. Määratakse platoofaasi biolagunemise protsendi keskväärtus või hinnatakse suurim väärtus (näiteks kui kõver hakkab platoofaasis langema); viimati nimetatud juhul on tähtis kontrollida, et väärtus ei oleks võõrväärtus. Katseprotokollis tuleb see biolagunemise maksimaalne tase märkida kui „uuritava kemikaali biolagunemise määr”. Kui katsenõude arv ei ole piisav platoofaasi kindlakstegemiseks, kasutatakse keskväärtuse arvutamiseks katse viimasel päeval mõõdetud andmeid. Viimane nimetatud väärtus, viie paralleelkatse keskmine, näitab biolagunemise protsendi määramise täpsust. Samuti tuleb registreerida kümnepäevase ajavahemiku lõpus saadud näitaja.
                           
                        
                              63.
                           
                           
                              Samal viisil koostatakse võrdluskemikaali FC biolagunemise kõver ning (kui seda kasutatakse) abiootilise kõrvaldamise kontrolli FS ja inhibeerimise kontrolli FI kõver.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Uuritava kemikaalita kontrollkatsetes (FB) oleva anorgaanilise süsiniku kogumass registreeritakse; samuti toimitakse FS (abiootiline kontroll) nõude puhul, kui katses kasutati kõnealuseid kontrollnõusid.
                           
                        
                              65.
                           
                           
                              FI nõude puhul arvutatakse D teoreetiliselt võimaliku anorgaanilise süsiniku tekkimise alusel, lähtudes ainult segus oleva võrdluskemikaali sisaldusest. Kui 28. päeval [(DFC
                                  (22) – DFI)
                                  (23) / DFC] × 100 > 25 %, siis võib eeldada, et uuritav kemikaal inhibeeris inokulumi tegevust, ja see võib seletada katse tingimustes saadud DFT madalat väärtust. Sel juhul võib katset korrata, kasutades väiksemat uuritava kemikaali kontsentratsiooni ning eelistatavalt vähendades lahustunud anorgaanilise süsiniku sisaldust inokulumis ja uuritava kemikaalita kontrollnõudes tekkinud anorgaanilise süsiniku kogumassi, kuna vastasel juhul vähendab väiksem kontsentratsioon meetodi täpsust. Alternatiivselt võib kasutada muud inokulumi. Kui kolvis FS (abiootiline) täheldatakse anorgaanilise süsiniku kogumassi olulist suurenemist (> 10 %), siis võis esineda abiootilist lagunemist.
                           
                        
                     Tulemuste kehtivus
                  
                  
                              66.
                           
                           
                              Katset peetakse kehtivaks, kui
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          võrdluskemikaali sisaldavates nõudes FC on keskmine lagunemise protsent > 60 % inkubatsiooni 14. päevaks ja
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          kontrollnõudes FB on anorgaanilise süsiniku kogumassi keskmine kogus katse lõpus > 3 mg C/l.
                                       
                                    Kui need piirmäärad ei ole täidetud, tuleks katset korrata muust allikast pärit inokulumiga ja/või kasutatud meetodid tuleks läbi vaadata. Näiteks kui probleem on rohke anorgaanilise süsiniku tekkimine kontrollnõudes, tuleks kasutada punktides 27–32 kirjeldatud meetodit.
                           
                        
                              67.
                           
                           
                              Kui uuritava kemikaali lagundamisel ei saavuta 60 % teoreetiliselt maksimaalsest anorgaanilise süsiniku sisaldusest ja inhibeerivat mõju ei täheldatud (punkt 65), võib katset korrata inokulumi suurema kontsentratsiooniga (kuni 30 mg/l aktiivmuda ja 100 ml väljavoolu / l) või muudest allikatest saadud inokulumiga, eelkõige siis, kui lagunemine jäi vahemikku 20–60 %.
                           
                        
                     Tulemuste tõlgendamine
                  
                  
                              68.
                           
                           
                              Selles katses näitab biolagunemine > 60 % teoreetiliselt maksimaalsest anorgaanilise süsiniku tasemest kümnepäevase ajavahemiku jooksul, et uuritav kemikaal on aeroobsetes tingimustes kiirelt biolagundatav.
                           
                        
                              69.
                           
                           
                              Kui nõutud kriteerium – 60 % teoreetiliselt maksimaalsest anorgaanilise süsiniku kogusest – ei ole täidetud, määratakse pudelites oleva kasvukeskkonna pH (ilma hapestamata või leelistamata); väärtus alla 6,5 võib viidata nitrifikatsiooni toimumisele. Sel juhul tuleb katset korrata puhverlahuse suurema kontsentratsiooniga.
                           
                        
                     Katseprotokoll
                  
                  
                              70.
                           
                           
                              Koostatakse tabel, milles on % D väärtused iga katse (FT), võrdluse (FC) ja (kui seda kasutati) inhibeerimise kontrollnõu (FI) iga proovivõtu päeva kohta. Kui paralleelproovide pudelite kohta saadakse võrreldavad tulemused, siis koostatakse keskmise % D ajast sõltuvuse graafik. Registreeritakse anorgaanilise süsiniku kogumass kontrollnõudes (FB) ja lahustunud orgaaniline süsinik ja/või muud näitajad steriilsetes kontrollnõudes (FS) ning nende kõrvaldamise protsent.
                           
                        
                              71.
                           
                           
                              Määratakse % D keskväärtus platoofaasis või suurim väärtus, kui biolagunemise kõver platoofaasis langeb, ning esitatakse see uuritava kemikaali lagunemise määrana. Tähtis on tagada, et viimati nimetatud juhul ei oleks suurim näitaja võõrväärtus.
                           
                        
                              72.
                           
                           
                              Katseprotokollis esitatakse alljärgnev teave.
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uuritav kemikaal:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tavanimetus, keemiline nimetus, CASi number, struktuurivalem ja asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uuritava kemikaali puhtus (lisandid).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katsetingimused:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      viide käesolevale katsemeetodile;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kasutatud katsesüsteemi kirjeldus (näiteks nõu maht, vabaruumi ja vedeliku suhe, segamise meetod jne);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uuritava kemikaali ja võrdluskemikaali lisamine katsesüsteemi: kasutatud kontsentratsioonid ja igasse katsepudelisse lisatud süsiniku kogus ning lahustite kasutamine;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      andmed kasutatud inokulumi kohta, iga eeltöötlemine ja kohandamine;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inkubatsioonitemperatuur;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      anorgaanilise süsiniku analüüsi põhimõtte valideerimine;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kasutatud anorgaanilise süsiniku analüsaatori (ja muude kasutatud analüüsimeetodite) peamised omadused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      paralleelproovide arv.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemused:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      mõõdetud biolagundatavuse andmed ja arvutatud väärtused tabeli kujul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      katse- ja võrdluskemikaali lagunemise protsendi sõltuvus ajast graafikuna, ootefaas, lagunemisfaas, kümnepäevane ajavahemik ja tõus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kõrvaldamise protsent platoofaasis, katse lõpus ja pärast kümnepäevast ajavahemikku;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      iga katsetulemuste arvestamata jätmise põhjendus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kõik muud andmed, mis on kasutatud katsemeetodi puhul asjakohased;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tulemuste arutelu.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     KIRJANDUS
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk C.4 „Kohese biolagunduvuse määramine – CO2 eraldumise katse (meetod C.4-C)”.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 159–167.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153–1161.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195–1210.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              ISO 9439 (1990; revised 1999). Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium - Carbon dioxide evolution Test (Sturm).
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922–929.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801–812.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181–185.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). Appl. Env. Microbiol. 35: 51–53.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233–243.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204–211.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 23: 507–524.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust H, and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19: 1527–1550.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              ISO 14593, (1999) Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in an aerobic medium-method by analysis of inorganic carbon in sealed vessels (CO2 headspace test).
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              Battersby NS (1997). The ISO headspace C02 biodegradation test, Chemosphere 34: 1813–1822.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance, Washington, DC.
                           
                        
                              19)
                           
                           
                              Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR and Starkey M (1999). An „inherent” biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219–3235.
                           
                        
                              20)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk C.4 „Kohese biolagunduvuse määramine”.
                           
                        
                              21)
                           
                           
                              OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris.
                           
                        
                              22)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk C.11 „Aktiivmuda respiratsiooni pärssimise katse”.
                           
                        
                              23)
                           
                           
                              Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319–327.
                           
                        
                              24)
                           
                           
                              EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO2 method: application to surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.
                           
                        
                              25)
                           
                           
                              ISO 10634 (1996) Water Quality - Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
                           
                        
                     1. liide
                     LÜHENDID JA MÕISTED
                     IC– anorgaaniline süsinik.
                     ThCO2– teoreetiline süsinikdioksiid (mg) on arvutuslik süsinikdioksiidi kogus, mis tekib uuritava kemikaali teadaolevast või mõõdetud süsinikusisaldusest uuritava kemikaali täielikul mineraliseerumisel; seda väljendatakse ka uuritava kemikaali mg kohta tekkinud süsinikdioksiidi mg-dena.
                     DOC– lahustunud orgaaniline süsinik (dissolved organic carbon) on lahuses olev orgaaniline süsinik või süsinik, mis läbib 0,45-mikromeetrise filtri või jääb supernatanti 15-minutilisel tsentrifuugimisel ligikaudu 4 000 g (ligikaudu 40 000 m/s-2) juures.
                     DIC– lahustunud anorgaaniline süsinik (dissolved inorganic carbon).
                     ThIC– teoreetiline anorgaanilise süsiniku sisaldus (theoretical inorganic carbon).
                     TIC– anorgaanilise süsiniku kogusisaldus (total inorganic carbon).
                     Kiiresti biolagundatav– hinnanguline klassifikatsioon sellise kemikaali kohta, mis on läbinud konkreetsed kindlaks määratud lõpliku biolagunemise sõelumiskatsed; kõnealused katsed on nii ranged, et kõnealust kemikaali võib pidada kiiresti ja täielikult biolagundatavaks veekeskkonnas aeroobsetes tingimustes.
                     Kümnepäevane ajavahemik– 10 % biolagunemise saavutamisele vahetult järgnevad kümme päeva.
                     Iseeneslik biolagundatavus– klassifikatsioon kemikaalide kohta, mille (esmase või lõpliku) biolagunemise kohta on mis tahes biolagundatavuse katses saadud kindlad tõendid.
                     Täielik aeroobne biolagunemine– saavutatud lagunemise määr, mille korral mikroorganismid on uuritava kemikaali täielikult ära tarvitanud ja muutnud selle süsinikdioksiidiks, veeks, mineraalsooladeks ja uuteks mikroobirakkudeks (biomassiks).
                     Mineraliseerumine– mineraliseerumine on orgaanilise kemikaali täielik lagunemine CO2-ks ja H2O-ks aeroobsetes tingimustes ning CH4-ks, CO2-ks ja H2O-ks anaeroobsetes tingimustes.
                     Ootefaas– aeg katse algusest kuni ajani, millal lagundava toimega mikroorganismid on aklimatiseerunud ja/või kohanenud ja uuritava kemikaali või orgaanilise aine biolagunemine on jõudnud avastatava tasemeni (näiteks 10 % maksimaalsest teoreetilisest biolagunemisest või vähem, olenevalt mõõtemeetodi täpsusest).
                     Lagunemisfaas– aeg ootefaasi lõpust ajani, mil on saavutatud 90 % maksimaalsest lagunemisest.
                     Platoofaas– platoofaas on faas, kus on jõutud maksimaalse lagunemiseni ja biolagunemise kõver muutub horisontaalseks.
                     Uuritav kemikaal– iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                  
                  
                     2. liide
                     
                        Biolagunemise kõvera näide
                     
                     
                        Joonis 1
                     
                     
                        1-oktanooli biolagunemine CO2 vabaruumi katses
                     
                     
                        
                     Mõisted
                     biolagunemine
                     lagunemisfaas
                     biolagunemise maksimaalne tase
                     platoofaas
                     kümnepäevane ajavahemik
                     katse aeg (päevad)
                  
                  C.30.   BIOAKUMULATSIOON MULLA VÄHEHARJASUSSIDES
                  
                  SISSEJUHATUS
                  
                              1.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 317 (2010). Keskkonnale avalduva mõjuga seotud katsemeetoditest avaldati „Biokontsentratsioon: kaladega läbivoolukatse” (käesoleva lisa peatükk C.13 (49)) ja „Bioakumulatsioon setetes elavates põhjaloomadest väheharjasussides” (53) vastavalt 1996. aastal ja 2008. aastal. Vesikeskkonna bioakumulatsiooni andmete ekstrapoleerimine sellistele mullaorganismidele nagu vihmaussid on keeruline, kui üldse võimalik. Uuritava kemikaali lipofiilsusel põhinevaid mudelarvutusi, vt näiteks kirjanduse loetelust 14 ja 37, kasutatakse praegu mullas toimuva kemikaalide bioakumulatsiooni hindamiseks, näiteks ELi tehnilises juhenddokumendis (19). Keskkonnaosa-põhise katsemeetodi vajadusega on juba tegeldud, vt näiteks 55. Selline meetod on eelkõige tähtis teisese mürgisuse hindamiseks mullas elavate loomade toiduahelates (4). Mitmes riiklikus katsemeetodis käsitletakse bioakumulatsiooni muudes organismides kui kalad, vt näiteks kirjanduse loetelust 2 ja 72. USA Materjalide Katsetamise Ühing (3) on välja töötanud meetodi bioakumulatsiooni mõõtmiseks saastunud mullas elavates vihmaussides (Eisenia fetida, Savigny) ja valgeliimuklastes. Rahvusvaheliselt tunnustatud meetod bioakumulatsiooni määramiseks rikastatud mullas parandab kemikaalide riskihindamist maapealsetes ökosüsteemides (vt näiteks 25, 29).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Mulda söövad selgrootud puutuvad kokku mullas olevate kemikaalidega. Nende loomade hulgas on mulla väheharjasussidel mulla struktuuri ja toime säilitamisel tähtis osa (15, 20). Mulla väheharjasussid elavad mullas ja osaliselt maapinnal (eelkõige metsavarise kihis); nad on biomassi mõistes sageli kõige rikkalikum liik (54). Mulla bioturbatsiooni teel ja olles toiduks teistele loomadele võivad need loomad suurel määral mõjutada kemikaalide biosaadavust muudele organismidele, nagu selgrootud röövloomad (näiteks röövlestad ja -põrnikad (näiteks 64) või selgroogsed röövloomad (näiteks rebased ja kajakad) (18, 62). Mõnd mulla väheharjasusside liiki, keda praegu ökotoksikoloogilistes katsetes kasutatakse, on kirjeldatud 5. liites.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              USA Materjalide Katsetamise Ühingu standardjuhend mulla mürgisuse või bioakumulatsiooni laborikatsete tegemise kohta Lumbricidae sugukonda kuuluva vihmaussiga Eisenia fetida ja Enchytraeidae sugukonda kuuluva valgeliimukaga Enchytraeus albidus (3) annab palju üliolulisi ja kasulikke andmeid käesoleva mullas toimuva bioakumulatsiooni katsemeetodi kasutamise kohta. Käesolevas katsemeetodis viidatud täiendavad dokumendid on käesoleva lisa peatükk C.13 „Biokontsentratsioon: kaladega läbivoolukatse” (49) ja OECD katsejuhend nr 315 „Bioakumulatsioon setetes elavates põhjaloomadest väheharjasussides” (53). Käesoleva katsemeetodi jaoks on tähtsad teabeallikad ka praktilised kogemused mulla bioakumulatsiooni uuringutega ja asjaomased väljaanded (näiteks 1, 5, 11, 12, 28, 40, 43, 45, 57, 59, 76, 78, 79).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Käesolev katsemeetod on peamiselt kasutatav stabiilsete neutraalsete orgaaniliste kemikaalide puhul, mis kalduvad adsorbeeruma mullal. Käesoleva katsemeetodi abil võib olla võimalik uurida mullaga seonduvate stabiilsete metallorgaaniliste ühendite bioakumulatsiooni. Seda saab kasutada ka metallide ja muude mikroelementide puhul.
                           
                        EELTINGIMUSED
                  
                              5.
                           
                           
                              Mulla väheharjasussides kemikaali bioakumulatsiooni mõõtmise katseid on tehtud raskmetallidega (vt näiteks 63) ja püsivate orgaaniliste kemikaalidega, millel on väike log Kow väärtus vahemikus 3,0–6,0, vt näiteks 40. Neid katseid kasutatakse järgmiste ainete puhul:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          kemikaalid, mille log Kow on suurem kui 6,0 (väga hüdrofoobsed kemikaalid);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kemikaalid, mis kuuluvad teadaolevalt elusorganismides bioakumuleeruda võivate orgaaniliste kemikaalide hulka, näiteks pindaktiivsed või väga suure adsorptsioonivõimega kemikaalid;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kemikaalid, mille struktuuri alusel võib oletada bioakumulatsiooni, näiteks teadaolevalt bioakumuleeruvate kemikaalide analoogid;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          metallid.
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              Enne uuringu alustamist tuleks uuritava kemikaali kohta teha kindlaks sellised andmed nagu tavanimetus, keemiline nimetus (eelistatavalt Rahvusvahelise Puhta Keemia ja Rakenduskeemia Liidu (IUPAC) nimetus), struktuurivalem, CASi registreerimisnumber, puhtus, ohutusabinõud, säilitamistingimused ja analüüsimeetodid. Lisaks peaks olema teada järgmine teave:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          lahustuvus vees;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          oktanooli/vee jaotuskoefitsient, Kow;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          mulla/vee jaotuskoefitsient, Koc;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          aururõhk;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          lagunduvus (näiteks mullas, vees);
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          teada olevad metaboliidid.
                                       
                                    
                        
                              7.
                           
                           
                              Võib kasutada radiomärgistatud või radiomärgistamata uuritavat kemikaali. Analüüsi lihtsustamiseks soovitatakse siiski kasutada radiomärgistatud kemikaali. Otsus tehakse tuvastuspiiride alusel või lähtudes sellest, kas on vaja mõõta uuritavat lähtekemikaali ja metaboliite. Kui kasutatakse radiomärgistatud uuritavat kemikaali ja mõõdetakse radioaktiivsete jääkide kogusisaldust, siis on tähtis, et mullas ja katseorganismis leiduvates radiomärgisega jääkides määrataks uuritava lähtekemikaali panus ja muude märgisega kemikaalide panus, näiteks statsionaarses olekus või omastamisfaasi lõpus võetud proovides, et oleks võimalik arvutada uuritava lähtekemikaali ja asjakohaste mulla metaboliitide bioakumulatsioonitegur (vt punkt 50). Siin kirjeldatud meetodit võib olla vaja muuta, näiteks selleks, et tagada piisav biomass radiomärgistamata orgaanilise uuritava kemikaali või metallide mõõtmiseks. Kui mõõdetakse radioaktiivsete jääkide kogusisaldust (vedelik-stsintillatsiooni loenduriga pärast ekstraheerimist, põletamist või koe lahustamist), põhineb bioakumulatsioonitegur uuritaval lähtekemikaalil ja metaboliitidel. Eelistatavalt peaks bioakumulatsiooniteguri arvutamine põhinema uuritava lähtekemikaali kontsentratsioonil organismides ja radioaktiivsete jääkide kogusisaldusel. Seejärel tuleks arvutada bioakumulatsiooniteguri alusel elustiku-mulla akumulatsioonitegur, mis on normeeritud ussi lipiidisisalduse ja mulla orgaanilise süsiniku sisalduse järgi, et erinevate bioakumulatsiooni katsete tulemusi oleks võimalik võrrelda.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Peaks olema teada uuritava kemikaali mürgisus katses kasutatava liigi jaoks, näiteks toimet avaldav kontsentratsioon (ECx) või letaalne kontsentratsioon (LCx) omastamisfaasis (vt näiteks 19). Kasutatava analüüsimeetodi järgi tuleks uuritava kemikaali kontsentratsioon valida nii, et see oleks eelistatavalt ligikaudu 1 % kemikaali ägedast asümptootilisest LC50 väärtusest ja vähemalt kümme korda suurem kui kemikaali tuvastamispiir mullas. Andmete olemasolu korral tuleks eelistada subletaalsete näitajate pikaajaliste uuringutega saadud mürgisusnäitajaid (51, 52). Kui selliseid andmeid ei ole, annab kasulikku teavet ägeda mürgisuse katse (vt näiteks 23).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Kättesaadav peaks olema asjakohane teadaoleva täpsuse ja tundlikkusega analüüsimeetod kemikaali kvantitatiivse sisalduse mõõtmiseks katselahustes, mullas ja bioloogilises materjalis, samuti andmed proovi valmistamise ja säilitamise kohta ning materjali ohutuskaardid. Samuti peaksid teada olema uuritava aine analüütilised tuvastuspiirid mullas ja usside kudedes. Kui kasutatakse 14C-märgisega uuritavat kemikaali, peaks olema teada eriradioaktiivsus (s.o Bq mol–1) ja lisanditega seotud radioaktiivsuse protsent. Uuritava kemikaali eriradioaktiivsus peaks olema piisavalt suur, et võimaldada analüüsi, ja katses kasutatavad kontsentratsioonid ei tohiks olla mürgised.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Katset on võimalik teha tehismullaga või loodusliku mullaga. Enne katse algust tuleks teada kasutatava loodusliku mulla omadusi, näiteks mulla või selle koostisosade päritolu, pH-d, orgaanilise süsiniku sisaldust, osakeste suurusjaotust (liiva, tolmu ja savi protsent) ning veemahutavust (3, 48).
                           
                        KATSE PÕHIMÕTE
                  
                              11.
                           
                           
                              Uuritava kemikaali bioakumulatsiooni iseloomustavate parameetrite hulka kuuluvad bioakumulatsioonitegur, omastamise kiiruskonstant (ks) ja kõrvaldamise kiiruskonstant (ke). Mõisted on esitatud 1. liites.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Katse koosneb kahest faasist: omastamise (kokkupuute) faas ja kõrvaldamise (kokkupuutejärgne) faas. Omastamisfaasi ajal puutuvad paralleelproovide usside rühmad kokku mullaga, mida on rikastatud uuritava kemikaaliga. Lisaks katseloomadele hoitakse identsetes tingimustes, aga ilma uuritava kemikaalita, usside kontrollrühmi. Mõõdetakse katseorganismide kuivkaalu ja lipiidisisaldust. Seda võib teha kontrollrühma ussidega. Kontrollrühma usside ja mullaproovide analüüsimise teel on võimalik leida analüütilised taustanäitajad (kontrollnäitajad). Kõrvaldamisfaasi ajaks kantakse ussid üle uuritava kemikaalita mulda. Kõrvaldamisfaas on alati vajalik, v.a juhul, kui kokkupuutefaasi ajal uuritavat kemikaali oluliselt ei omastatud. Kõrvaldamisfaas annab teavet kiiruse kohta, millega uuritavat kemikaali katseorganismidest väljutatakse (vt näiteks 27). Kui omastamisfaasi ajal statsionaarse olekuni ei jõuta, peaks kineetiliste parameetrite (kineetiline bioakumulatsioonitegur, omastamise ja kõrvaldamise kiiruskonstant/-konstandid) määramine põhinema eelistatavalt omastamisfaasi ja kõrvaldamisfaasi tulemuste samaaegsel sobitamisel kineetilise mudeliga. Uuritava kemikaali kontsentratsiooni ussides/ussidel jälgitakse katse kõigi faaside vältel.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Omastamisfaasi ajal tehakse mõõtmisi proovivõtu aegadel kuni 14 päeva (valgeliimuklased) või 21 päeva (vihmaussid), kuni on jõutud statsionaarse olekuni (11, 12, 67). Statsionaarne olek on saavutatud, kui ussides oleva kontsentratsiooni ajast sõltuvuse graafik jääb ajateljega paralleelseks ja vähemalt kahepäevase vahemikuga võetud kolme järjestikuse proovi kontsentratsioonianalüüsi tulemused ei erine üksteisest statistiliste võrdluste (näiteks variatsioonanalüüs, regressioonanalüüs) alusel rohkem kui ±20 %.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Kõrvaldamisfaas hõlmab katseorganismide ülekandmist nõudesse, mis sisaldavad sama substraati ilma uuritava kemikaalita. Kõrvaldamisfaasi ajal tehakse mõõtmisi proovivõtu aegadel 14 päeva vältel (valgeliimuklased) või 21 päeva vältel (vihmaussid), v.a juhul, kui varasemad analüütilised määramised näitasid uuritava kemikaali jääkide 90 % vähenemist ussides. Uuritava kemikaali kontsentratsioon ussides kõrvaldamisfaasi lõpus teatatakse kõrvaldamata jääkidena. Statsionaarse oleku bioakumulatsioonitegur arvutatakse eelistatavalt ussides oleva kontsentratsiooni (Ca) ja mullas oleva kontsentratsiooni (Cs) suhtena näilise statsionaarse oleku korral ja ka kineetilise bioakumulatsioonitegurina, mis on mullast omastamise kiiruskonstandi (ks) ja kõrvaldamise kiiruskonstandi (ke) (vt mõisted, 1. liide) suhe; seejuures eeldatakse esimest järku reaktsiooni kineetikat (vt arvutused, 2. liide). Kui esimest järku reaktsiooni kineetika ei ole ilmselgelt kohaldatav, tuleks kasutada muid mudeleid.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Omastamise kiiruskonstant, kõrvaldamise kiiruskonstant (või muude mudelitega seotud konstandid), kineetiline bioakumulatsioonitegur ja võimaluse korral iga nimetatud parameetri usalduspiirid arvutatakse teoreetilise mudeli võrranditest (vt juhised, 2. liide). Mudeli sobivust katseandmetega saab hinnata näiteks korrelatsioonikordaja või determinatsioonikordaja järgi (kui kordaja läheneb 1-le, kirjeldab mudel katseandmeid hästi) või hii-ruut-testiga. Mudeli sobivust võib samuti näidata määratava parameetri standardhälbe või usaldusvahemiku suurus.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Väga lipofiilse uuritava kemikaali katsetulemuste varieeruvuse vähendamiseks tuleks bioakumulatsioonitegureid väljendada lipiidisisalduse ja orgaanilise süsiniku sisalduse suhte alusel (kg mulla orgaanilist süsinikku ussi lipiidisisalduse kg kohta). See lähenemisviis põhineb asjaolul, et mõne kemikaaliklassi puhul on bioakumulatsiooni tõenäosus selgelt seotud lipofiilsusega; kalade puhul on see täpselt kindlaks tehtud (47). Kõnealuste kemikaalide bioakumulatsioon sõltub kalade lipiidisisaldusest. Põhjaloomade puhul on leitud samalaadseid korrelatsioone, vt näiteks 30, 44. See korrelatsioon on samuti tõendatud mulla väheharjasusside puhul, vt näiteks 5, 6, 7, 14. Kui usside biomassi on piisavalt, saab katseloomade lipiidisisalduse määrata samast bioloogilisest materjalist, millest määrati uuritava kemikaali kontsentratsiooni. Alternatiivselt võib lipiidisisalduse mõõtmiseks kasutada kontrollrühma loomi.
                           
                        KATSE KEHTIVUS
                  
                              17.
                           
                           
                              Katse kehtivuse tagamiseks peavad nii kontrollrühmade kui ka katserühmade puhul olema täidetud järgmised kriteeriumid:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          katse lõpus ei tohiks kogusuremus omastamisfaasi ja kõrvaldamisfaasi ajal ületada 10 % (vihmaussid) või 20 % (valgeliimuklased) kasutatud usside koguarvust;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          
                                             Eisenia fetida ja Eisenia andrei puhul ei tohiks omastamisfaasi ja kõrvaldamisfaasi lõpus mõõdetud keskmine massi kadu ületada 20 % võrrelduna algse toorkaaluga kummagi faasi alguses.
                                       
                                    
                        MEETODI KIRJELDUS
                  
                     Katses kasutatavad liigid
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Bioakumulatsiooni katsetamisel soovitatakse kasutada mitut mulla väheharjasusside liiki. Enim kasutatavaid liike Eisenia fetida või Eisenia andrei (Lumbricidae) või Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus või Enchytraeus luxuriosus (Enchytraeidae) on kirjeldatud 5. liites.
                           
                        
                     Seadmed
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Tuleks olla tähelepanelik, et vältida seadmete kõigis osades selliste materjalide kasutamist, mis võivad lahustuda, uuritavat kemikaali adsorbeerida või muid kemikaale eraldada ja avaldada katseloomadele kahjulikku mõju. Kooskõlas koormuse määraga, s.o katseusside arvuga, võib kasutada tavapäraseid ristkülikukujulisi või silindrilisi nõusid, mis on valmistatud keemiliselt inertsest materjalist ja on sobiva mahuga. Katse kasvukeskkonnaga kokku puutuvates seadmetes võib kasutada roostevaba terast, plastikut või klaasi. Katsenõud peaksid olema korralikult kaetud, et vältida usside põgenemist, võimaldades samas piisavat õhuvarustust. Suure adsorptsioonikoefitsiendiga kemikaalide korral (näiteks sünteetilised püretroidid) võib olla vaja kasutada silaanitud klaasi. Sellistel juhtudel tuleb seadmed pärast kasutamist ära visata (49). Tuleks takistada radiomärgistatud uuritavate ainete ja lenduvate kemikaalide väljapääsemist. Katsenõudest auruvate jääkide väljapääsemise vältimiseks tuleks kasutada separaatoreid (näiteks klaaspudelid gaasi pesemiseks), mis sisaldavad sobivaid absorbente.
                           
                        
                     Muld
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Katsemuld peaks olema sellise kvaliteediga, mis võimaldab katseorganismidel selles elada ja eelistatavalt paljuneda aklimatiseerumise ja katse ajavahemike vältel, ilma et neil tekiks ebatavalisi muutusi välimuses või ebatavalist käitumist. Ussid peaksid saama mulda kaevuda.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Katsetes soovitatakse substraadina kasutada käesoleva lisa peatükis C.8 (48) kirjeldatud tehismulda. Bioakumulatsiooni katsetes kasutatava tehismulla valmistamine ja soovitused tehismulla säilitamiseks on esitatud 4. liites. Õhu käes kuivatatud tehismulda võib kuni kasutamiseni säilitada toatemperatuuril.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Katsemullana ja/või kultuuri kasvumullana võib siiski kasutada looduslikku mulda saastumata kohtadest. Loodusliku mulla kirjeldamisel tuleks esitada vähemalt järgmised andmed: päritolu (võtmise koht), pH, orgaanilise süsiniku sisaldus, osakeste suurusjaotus (liiva, aleuriidi ja savi protsent), maksimaalne veemahutavus ja veesisalduse protsent (3). Kasulikku teavet peaks andma mulla või selle koostisosade mikrosaasteainete analüüsi tegemine enne kasutamist. Kui kasutatakse põllumulda, siis ei tohiks seda olla töödeldud taimekaitsevahenditega ega väetatud töödeldud loomade sõnnikuga vähemalt üks aasta ning orgaanilise väetisega vähemalt kuus kuud enne proovivõttu (50). Loodusliku mulla käsitlemise meetodeid enne väheharjasussidega tehtavates ökotoksikoloogilistes laborikatsetes kasutamist on kirjeldatud väljaandes 3. Loodusliku mulla puhul tuleks laboris säilitamise aeg hoida võimalikult lühikesena.
                           
                        
                     Uuritava kemikaali kasutamine
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Uuritav kemikaal viiakse mulla sisse. Seejuures tuleks arvesse võtta kemikaali füüsikalis-keemilisi omadusi. Vees lahustuv uuritav kemikaal tuleks enne mullaga segamist vees täielikult lahustada. Halvasti vees lahustuva uuritava kemikaali puhul soovitatakse üks või mitu (tehisliku) mulla koostisosa katta uuritava kemikaaliga. Näiteks kvartsliiva või osa sellest võib immutada sobivas orgaanilises lahustis lahustatud uuritava kemikaaliga; seejärel aurustatakse lahusti aeglaselt kuni kuivamiseni. Kemikaaliga kaetud mullakomponendi saab seejärel segada niiske mulla sisse. Selle meetodi peamine eelis on see, et lahustit mulda ei lisata. Kui kasutatakse looduslikku mulda, võib uuritavat kemikaali lisada mulla õhu käes kuivatatud osa rikastamise teel, nagu on kirjeldatud eespool tehisliku mulla puhul, või uuritava kemikaali ja niiske mulla segamisega, kasutades seejärel aurustamise etappi (kui kasutatakse lahustit). Üldiselt tuleks võimaluste piires vältida niiske mulla kokkupuudet lahustitega. Arvestada tuleks järgmist (3):
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          kui vee asemel kasutatakse muud lahustit, peaks see olema veega segunev ja/või seda peaks olema võimalik kõrvaldada (näiteks aurustada), nii et mulda jääb ainult uuritav kemikaal;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kui kasutatakse lahusti kontrollrühma, ei ole negatiivne kontrollrühm vajalik. Lahusti kontrollkatses tuleks kasutada mullale lisatud lahusti suurimat kontsentratsiooni ja lahusti peaks olema samast partiist, mida kasutati põhilahuse valmistamisel. Sobiva lahusti valimisel peaksid peamised kriteeriumid olema lahusti mürgisus ja lenduvus ning uuritava kemikaali lahustuvus valitud lahustis.
                                       
                                    
                        
                              24.
                           
                           
                              Vees ja orgaanilistes lahustites halvasti lahustuva kemikaali korral võib soovitud katsekontsentratsiooni saamiseks segada uuritava kemikaali kogusega 2,0–2,5 g (näiteks uhmri ja nuia abil) peeneks jahvatatud kvartsliiva katsenõu kohta. See kvartsliiva ja uuritava kemikaali segu lisatakse eelnevalt niisutatud mullale ning segatakse sellega põhjalikult läbi ja lisatakse vajalik kogus deioniseeritud vett, et saada sobiv niiskusesisaldus. Lõplik segu jaotatakse katsenõudesse. Protseduuri korratakse iga katsekontsentratsiooni puhul ja samuti valmistatakse ette sobiv kontrollkatsenõu, kus on 2,0–2,5 g peeneks jahvatatud kvartsliiva katsenõu kohta.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Pärast rikastamist tuleks määrata uuritava kemikaali kontsentratsioon mullas. Enne katseorganismide lisamist tuleks kontrollida, et uuritav kemikaal oleks mullas jaotunud ühtlaselt. Katseprotokollis kirjeldatakse rikastamiseks kasutatud meetodit ja esitatakse konkreetse rikastamismeetodi valimise põhjused (24).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Ideaaljuhul tuleks enne organismide lisamist kindlaks teha, et mulla- ja pooriveefaasi vahel on tekkinud tasakaaluolek; soovituslik on neljapäevane ajavahemik 20 °C juures. Vees halvasti lahustuva orgaanilise kemikaali puhul võib adsorbeerunud ja lahustunud fraktsiooni tegeliku tasakaaluolekuni jõudmiseks kuluda päevi või kuid. Olenevalt uuringu eesmärgist, näiteks keskkonnatingimuste imiteerimisel, võib rikastatud mulda vanandada kauem, näiteks metallide puhul kolm nädalat temperatuuril 20 °C (22).
                           
                        
                     Katseorganismide kultuurid
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Usse tuleks eelistatavalt pidada alalises laborikultuuris. Suunised Eisenia fetida ja Eisenia andrei ning Enchytraeidae sugukonna liikide laborikultuuri meetodite kohta on esitatud 5. liites (vt ka 48, 51, 52).
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Katsetes kasutatavatel ussidel ei tohiks olla nähtavaid haigusi, hälbeid ega parasiite.
                           
                        KATSE KÄIK
                  
                              29.
                           
                           
                              Katseorganismid puutuvad uuritava kemikaaliga kokku omastamisfaasi ajal. Omastamisfaasi kestus peaks olema 14 päeva (valgeliimuklased) või 21 päeva (vihmaussid), v.a juhul, kui tõendatakse statsionaarse olekuni jõudmist.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Kõrvaldamisfaasi ajaks kantakse ussid üle uuritava kemikaalita mulda. Esimene proov tuleks võtta 4–24 tunni möödumisel kõrvaldamisfaasi algusest. 21-päevase omastamisfaasi ja 21-päevase kõrvaldamisfaasi proovivõtu ajakavade näidised on esitatud 3. liites.
                           
                        
                     Katseorganismid
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Mitme mulla valgeliimuklase liigi isendi kaal on väga väike (näiteks märgkaal 5–10 mg isendi kohta Enchytraeus albidus’e puhul ja veel väiksem Enchytraeus crypticus’e või Enchytraeus luxuriosus’e puhul); kaalu mõõtmiseks ja keemiliste analüüside tegemiseks võib olla vaja koondada paralleelproovi katsenõude ussid (s.o ühe koeanalüüsi tulemuse saamiseks kasutatakse kõiki paralleelproovi nõu usse). Igale paralleelproovile lisatakse 20 valgeliimuklase isendit ja kasutada tuleks vähemalt kolme paralleelproovi. Kui uuritava kemikaali analüütiline tuvastuspiir on kõrge, võib osutuda vajalikuks kasutada rohkem usse. Suurema isendi massiga katseliikide (Eisenia fetida ja Eisenia andrei) korral võib kasutada ühte isendit sisaldavaid paralleelproovide nõusid.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Katses kasutatavad vihmaussid peaksid olema sarnase massiga (näiteks Eisenia fetida ja Eisenia andrei isendi mass peaks olema 250–600 mg). Valgeliimuklaste (näiteks Enchytraeus albidus’e) pikkus peaks olema ligikaudu 1 cm. Kõik konkreetses katses kasutatavad ussid peaksid olema sama päritoluga ja tegemist peaks olema clitellum’iga täiskasvanud isenditega (vt 5. liide). Kuna looma mass ja vanus võivad bioakumulatsioonitegurit mõjutada (näiteks erineva lipiidisisalduse ja/või munade olemasolu tõttu), tuleks need parameetrid täpselt registreerida ja neid tuleks tulemuste tõlgendamisel arvesse võtta. Lisaks sellele võivad kokkupuutefaasi vältel lisanduda kookonid, mis mõjutavad samuti bioakumulatsioonitegurit. Keskmiste märg- ja kuivmasside hindamiseks soovitatakse enne katset kaaluda katseusside alamproovi.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Tuleks kasutada suurt mulla ja usside suhtarvu, et uuritava kemikaali kontsentratsiooni vähenemine mullas omastamisfaasi ajal oleks minimaalne. Eisenia fetida ja Eisenia andrei korral on soovituslik vähemalt 50 g mulla kuivmassi ussi kohta ja valgeliimuklaste puhul vähemalt 10–20 g mulla kuivmassi katsenõu kohta. Nõud peaksid sisaldama 2–3 cm (valgeliimuklased) või 4–5 cm (vihmaussid) mullakihti.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Katses kasutatud ussid kõrvaldatakse kultuurist (näiteks valgeliimuklased juveliiripintsettide abil). Täiskasvanud isendid kantakse üle töötlemata katsemulda aklimatiseerumiseks ja neid söödetakse (vt punkt 36). Kui katsetingimused erinevad kultuuri tingimustest, peaks ussidele katsetingimustega kohanemiseks piisama 24–72-tunnisest aklimatiseerumisfaasist. Pärast aklimatiseerumist loputatakse vihmausse, tõstes nad puhta veega klaasnõusse (näiteks Petri tassile), ja seejärel kaalutakse vihmaussid enne katsemulda panemist. Enne kaalumist tuleks liigne vesi ussi küljest kõrvaldada, puudutades ussiga õrnalt tassi serva või kuivatades ettevaatlikult veidi niisutatud paberrätikuga.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Tuleks jälgida katseorganismide kaevumiskäitumist ja see tuleks registreerida. Vihmaussidega tehtavates katsetes kaevuvad loomad (kontrollrühmas ja töötlusrühmas) tavaliselt paari tunniga mulla sisse; seda tuleks kontrollida usside katsenõudesse panemisest hiljemalt 24 tunni möödumisel. Kui vihmaussid mulda ei kaevu (näiteks omastamisfaasist rohkem kui poole möödumisel rohkem kui 10 %), siis see näitab, et kas ei ole katsetingimused sobivad või ei ole katseorganismid terved. Sellisel juhul tuleks katse peatada ja seda tuleks korrata. Valgeliimuklased elavad peamiselt mullaosakestevahelistes poorides ja nende välispind võib ümbritseva substraadiga sageli ainult osaliselt kokku puutuda; kaevunud ja mittekaevunud valgeliimuklaste kokkupuude eeldatakse olevat samaväärne ning eeldatakse, et valgeliimuklaste mittekaevumise puhul ei pruugi katse kordamine vajalik olla.
                           
                        
                     Söötmine
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Vähese orgaanilise süsiniku kogusisaldusega mulla kasutamise korral tuleks ette näha söötmine. Tehismulla kasutamise korral soovitatakse vihmaussidele iga nädal (s.o usse tuleks sööta kord nädalas) sööta 7 mg kuivatatud sõnnikut mulla kuivmassi g kohta ja valgeliimuklaste puhul iga nädal 2–2,5 mg jahvatatud kaerahelbeid mulla kuivmassi g kohta (11). Esimene söödakogus tuleks segada mullaga vahetult enne katseorganismide lisamist. Eelistatavalt tuleks kasutada sama tüüpi sööta, mida kasutatakse kultuuris (vt 5. liide).
                           
                        
                     Valgus ja temperatuur
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Katse tuleks teha kontrollitud valgustustsükliga 16 tundi valgust / 8 tundi pimedust, valgustatus katsenõu piirkonnas eelistatavalt 400–800 luksi (3). Katsetemperatuur peaks olema kogu katse vältel 20 ± 2 °C.
                           
                        
                     Katsekontsentratsioonid
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Kasutatakse ühte kontsentratsiooni. Täiendava(te) kontsentratsiooni(de) kasutamise vajadust tuleks põhjendada. Kui uuritava kemikaali mürgisus (ECx) on ligilähedane analüütilise tuvastuspiiriga, siis on soovitatav kasutada suure eriradioaktiivsusega radiomärgistatud uuritavat kemikaali. Metallide puhul peaks kontsentratsioon ületama koe ja mulla tausttaset.
                           
                        
                     Paralleelproovid
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Kineetiliste mõõtmiste puhul (omastamisfaas ja kõrvaldamisfaas) peaks kemikaaliga töödeldud paralleelproovide arv olema vähemalt kolm iga proovivõtupunkti kohta. Ettevalmistatud paralleelproovide koguarv peaks olema piisav, et hõlmata kõik proovivõtuajad omastamisfaasi ja kõrvaldamisfaasi ajal.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Kui lahustina kasutatakse ainult vett, tuleks bioloogiliste vaatluste ja mõõtmiste jaoks (näiteks kuiv- ja märgmassi suhe, lipiidisisaldus) ning usside ja mulla taustkontsentratsioonide analüüsiks ette näha vähemalt 12 negatiivse kontrollrühma paralleelproovinõu (millest neljast võetakse proov alguses, neljast omastamise lõpus ja neljast kõrvaldamise lõpus). Kui uuritava kemikaali lisamiseks kasutatakse lahustavat ainet, tuleks lisaks kemikaaliga töödeldud paralleelproovidele kasutada ka lahusti kontrollrühma (neljast paralleelproovi nõust tuleks võtta proov alguses, neljast omastamisfaasi lõpus ja neljast kõrvaldamisfaasi lõpus), mis hõlmab kõiki koostisosi peale uuritava aine. Sel juhul võib samuti ette näha negatiivse kontrollrühma neli täiendavat paralleelproovi nõud (ilma lahustita) valikuliseks proovivõtuks omastamisfaasi lõpus. Neid paralleelproove võib võrrelda bioloogiliselt lahusti kontrollrühmaga, et saada teavet lahusti võimaliku mõju kohta katseorganismile. Soovitatakse ette näha piisav kogus täiendavaid paralleelproovi varunõusid (näiteks kaheksa) kemikaaliga töötlemise ja kontrollrühma(de) jaoks.
                           
                        
                     Mulla kvaliteedi mõõtmise sagedus
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Mulla pH-d, niiskusesisaldust ja temperatuuri (pidevalt) katseruumis tuleks mõõta omastamisfaasi ja kõrvaldamisfaasi alguses ja lõpus. Kord nädalas tuleks kontrollida mulla niiskusesisaldust, kaaludes katsenõusid ja võrreldes tegelikku massi katse alguse esialgse massiga. Veekadu tuleks kompenseerida deioniseeritud vee lisamisega.
                           
                        
                     Usside ja mulla proovide võtmine ja analüüsimine
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Vihmausside ja valgeliimuklaste bioakumulatsiooni katsete omastamisfaasi ja kõrvaldamisfaasi ajakava näidis on esitatud 3. liites.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Katsenõudest võetakse mullaproov, et määrata uuritava kemikaali kontsentratsioon enne usside lisamist ning omastamisfaasi ja kõrvaldamisfaasi ajal. Katse ajal määratakse uuritava kemikaali kontsentratsioonid ussides ja mullas. Tavaliselt mõõdetakse mulla kogukontsentratsioone. Soovi korral võib mõõta poorivee kontsentratsioone; sel juhul tuleks enne uuringu alustamist formuleerida põhjendus ja ette näha asjakohased meetodid ning esitada need katseprotokollis.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Ussidest ja mullast võetakse proovid vähemalt kuuel korral omastamisfaasi ja kõrvaldamisfaasi vältel. Kui on tõendatud, et uuritav kemikaal on stabiilne, võib mullaproovide arvu vähendada. Omastamisfaasi alguses ja lõpus soovitatakse analüüsida vähemalt kolme paralleelproovi. Kui omastamisfaasi lõpus mõõdetud kontsentratsioon mullas erineb algsest kontsentratsioonist rohkem kui 30 %, tuleks analüüsida ka muudel kuupäevadel võetud mullaproove.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Kõrvaldage konkreetse paralleelproovi ussid igal proovivõtukorral mullast (näiteks pärast paralleelproovi mulla laotamist madalale alusele ja kasutades usside tõstmiseks pehmeid juveliiripintsette) ja loputage neid kiiresti veega madalas klaasis või terasalusel. Eemaldage liigne vesi (vt punkt 34). Tõstke ussid ettevaatlikult eelnevalt kaalutud nõusse ja kaaluge nad, sh nende soolestiku sisu, viivitamata.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Vihmaussidel (Eisenia sp.) tuleks lasta seejärel oma soolestiku sisu öö jooksul väljutada, näiteks kaetud Petri tassil olevale niiskele filterpaberile (vt punkt 34). Pärast väljutamist tuleks teha kindlaks usside kaal, et hinnata katse vältel võimalikku biomassi vähenemist (vt kehtivuse kriteeriumid punktis 17). Valgeliimuklaste kaalumine ja kudede analüüs viiakse ellu ilma väljutamiseta, kuna see on nende usside väiksuse tõttu tehniliselt keerukas. Pärast lõplikku massi määramist tuleks ussid viivitamata kõige asjakohasema meetodi abil surmata (näiteks vedela lämmastiku abil või külmutamisega temperatuurini alla –18 °C).
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Kõrvaldamisfaasi ajal asendavad ussid saastunud soolestiku sisu puhta mullaga. See tähendab, et vahetult enne kõrvaldamisfaasi võetud väljutamata soolestiku sisuga usside (praegusel juhul valgeliimuklased) proovid sisaldavad saastunud mulda. Veekeskkonna väheharjasusside puhul eeldatakse, et pärast esialgset 4–24-tunnist kõrvaldamisfaasi on enamik saastunud soolestiku sisust asendatud puhta settega, vt näiteks 46. Samalaadsetest tulemustest on teatatud vihmausside puhul radiomärgistatud kaadmiumi ja tsingi akumulatsiooni uuringutes (78). Väljutamata soolestiku sisuga valgeliimuklaste puhul võidakse käsitada kõnealust kõrvaldamisfaasi esimese proovi kontsentratsiooni kui kudede kontsentratsiooni pärast soolestiku tühjendamist. Uuritava aine kontsentratsiooni saastamata mullast tingitud lahjenemise arvessevõtmiseks kõrvaldamisfaasis võib hinnata soolestikusisalduse massi ussi märgmassist / ussi tuha massist või ussi kuivmassi / ussi tuha massi suhetest.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Mulla- ja ussiproove tuleks eelistatavalt analüüsida viivitamata pärast kõrvaldamist (s.o 1–2 päeva jooksul), et vältida lagunemist või muid kadusid, ja katse vältel on soovitatav arvutada ligikaudseid omastamis- ja kõrvaldamismäärasid. Kui analüüs tehakse hiljem, tuleks proove säilitada sobiva meetodi abil, näiteks sügavkülmutamise teel (≤ –18 °C).
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Tuleks kontrollida, et keemilise analüüsi täpsus ja reprodutseeritavus ning uuritava kemikaali saagis mulla- ja ussiproovidest oleks kõnealuse meetodi jaoks rahuldav; tuleks registreerida ekstraktsiooni tõhusus, tuvastuspiir ja määramispiir. Samuti tuleks kontrollida, et kontrollnõudes ei oleks uuritava kemikaali kontsentratsioon suurem tausttasemest. Kui uuritava kemikaali kontsentratsioon katseorganismis Ca on kontrollrühma ussides > 0, tuleks seda arvestada kineetiliste parameetrite arvutamisel (vt 2. liide). Kõiki proove tuleks kogu katse vältel käsitleda nii, et minimeeritaks kaod ja saastumine (näiteks proovivõtuseadmele uuritava kemikaali adsorbeerumise tõttu).
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Radiomärgistatud uuritava kemikaaliga töötamisel on võimalik analüüsida lähteainet ja metaboliite. Uuritava lähtekemikaali ja metaboliitide kvantitatiivne määramine statsionaarses olekus või omastamisfaasi lõpus annab olulist teavet. Proove tuleks seejärel „puhastada”, et oleks võimalik määrata eraldi uuritava lähtekemikaali kogust. Kui mõne metaboliidi radioaktiivsus moodustab üle 10 % analüüsitud proovi(de) koguradioaktiivsusest, on soovitatav kõnealused metaboliidid tuvastada.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Uuritava kemikaali üldsaagis ning ussidest, mullast ja aurunud uuritava kemikaali püüdmiseks kasutatavatest absorbente sisaldavatest püüduritest (kui neid kasutatakse) määratud saagised tuleks registreerida ja esitada katseprotokollis.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Konkreetsest katsenõust võetud isendite proovide koondamine on lubatav vihmaussist väiksemate valgeliimuklaste puhul. Kui koondamine tähendab paralleelproovide arvu vähenemist, piirab see statistilisi meetodeid, millega on võimalik andmeid töödelda. Kui on vaja kasutada teatavat statistilist meetodit ja tagada andmete täpsus, tuleks proovide koondamist arvestades kasutada katses piisavat arvu paralleelproovidega katsenõusid selle tagamiseks.
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              On soovitatav, et bioakumulatsioonitegur oleks väljendatud nii summaarse kuivmassi funktsioonina kui ka vajaduse korral (näiteks väga hüdrofoobse kemikaali puhul) lipiidisisalduse funktsioonina. Lipiidisisalduse määramiseks tuleks kasutada asjakohaseid meetodeid (selleks tuleks kasutada mõnd olemasolevat meetodit, vt näiteks 31, 58). Nende meetodite puhul kasutatakse ekstraheerimist kloroformi/metanooliga. Klooritud lahustite kasutamise vältimiseks tuleks siiski kasutada Blighi ja Dyeri meetodi (9) muudetud versiooni (17). Kuna eri meetodid ei pruugi anda sama tulemust, on tähtis kirjeldada kasutatud meetodit. Kui see on võimalik, s.o kui usside kude on piisavalt, tuleks lipiidide analüüs teha ideaaljuhul sama proovi või ekstraktiga, mida kasutati uuritava kemikaali analüüsiks, kuna lipiidid tuleb ekstraktist sageli kõrvaldada, enne kui ekstrakti on võimalik kromatograafiliselt analüüsida (49). Alternatiivselt võib lipiidisisalduse mõõtmiseks kasutada kontrollrühma loomi; lipiidisisaldust on vaja teada bioakumulatsiooniteguri näitajate normeerimiseks. Viimasel juhul väheneb seadmete saastumine uuritava kemikaaliga.
                           
                        ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE
                  
                     Tulemuste töötlemine
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              Uuritava kemikaali omastamise kõvera saamiseks kantakse aritmeetilises skaalas graafikule kemikaali kontsentratsioon ussides/ussidel omastamisfaasis sõltuvana ajast. Kui kõver on jõudnud platoole või statsionaarsesse olekusse (vt mõisted, 1. liide), arvutatakse statsionaarse oleku bioakumulatsioonitegur järgmise võrrandi alusel:
                              
                                 
                              Ca on uuritava kemikaali kontsentratsioon katseorganismis;
                              Cs on uuritava kemikaali kontsentratsioon mullas.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Kui statsionaarse olekuni ei jõuta, tuleks statsionaarse oleku bioakumulatsiooniteguri asemel määrata kiiruskonstantidel põhinev kineetiline bioakumulatsioonitegur, nagu on kirjeldatud allpool:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          määratakse akumulatsioonitegur (BAFK) suhtena ks/ke;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          omastamise ja kõrvaldamise kiirused arvutatakse eelistatavalt ühel ajal (vt 2. liide, võrrand 11);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kõrvaldamise kiiruskonstant (ke) määratakse tavaliselt kõrvaldamise kõvera alusel (s.o kõrvaldamisfaasis ussides leiduva uuritava aine kontsentratsiooni graafikust). Omastamise kiiruskonstant ks arvutatakse seejärel ke ja Ca väärtuse alusel, mis tuletatakse omastamise kõverast – nende meetodite kirjeldus on esitatud 2. liites. Kineetilise bioakumulatsiooniteguri ja kiiruskonstantide ks ja ke saamiseks eelistatud meetod on kasutada arvutis mittelineaarseid parameetri hindamise meetodeid. Kui kõrvaldamine ei ole ilmselgelt esimest järku, tuleks kasutada keerukamaid mudeleid.
                                       
                                    
                        
                     Katseprotokoll
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Katseprotokollis esitatakse alljärgnev teave.
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uuritav kemikaal:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kogu kättesaadav teave, milles käsitletakse uuritava kemikaali ägedat ja pikaajalist mürgisust (näiteks ECx, LCx, täheldatava toimeta kontsentratsioon) mullas elavatele väheharjasussidele;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      puhtus, füüsikaline olek ja füüsikalis-keemilised omadused, näiteks log Kow, lahustuvus vees;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kemikaali tunnusandmed; uuritava aine päritolu, kasutatud lahusti nimetus ja kontsentratsioon;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kui kasutatakse radiomärgistatud uuritavat kemikaali, siis märgistatud aatomite täpne asukoht, eriradioaktiivsus ja radiokeemiline puhtus.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katseliik:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      teaduslik nimetus, liin, päritolu, kõik eeltöötlused, aklimatiseerumine, vanus, suuruse vahemik jms.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Katsetingimused:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kasutatud katsemeetod;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kasutatud valgustuse tüüp ja omadused ning valgustuse kestus(ed);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      katse kava (näiteks katsenõude arv ja suurus, mulla mass ja mullakihi paksus, paralleelproovide arv, usside arv paralleelproovi kohta, katsekontsentratsioonide arv, omastamisfaasi ja kõrvaldamisfaasi kestus, proovivõtu sagedus);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      katsenõu materjali valiku põhjendus;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uuritava aine valmistamise ja kasutamise meetod ning samuti konkreetse meetodi valimise põhjused;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominaalsed katsekontsentratsioonid, mõõdetud väärtuste keskmised ja nende standardhälbed katsenõudes ning hälvete arvutamise meetod;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tehismulla koostisosade päritolu või looduslike kasvukeskkondade kasutamisel mulla päritolu, eeltöötlemise kirjeldus, kontrollrühmade tulemused (elulemus, biomassi teke, paljunemine), mulla omadused (pH, orgaanilise süsiniku kogusisaldus, osakeste suurusjaotus (liiva, aleuriidi ja savi protsent), maksimaalne veemahutavus, veesisalduse protsent katse alguses ja lõpus ning kõik muud tehtud mõõtmised);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      üksikasjalik teave mulla- ja ussiproovide töötlemise kohta, sh andmed uuritava aine valmistamise, säilitamise, rikastamismeetodite, ussidest ja mullast ekstraheerimise ja analüüsimise meetodite (ning täpsuse) kohta ning lipiidisisalduse kohta (kui mõõdeti) ja uuritava aine analüüsisaagiste kohta.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemused:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kontrollrühma usside ja iga katsenõu usside suremus ning mis tahes täheldatud ebatavaline käitumine (näiteks mulla vältimine, mittepaljunemine valgeliimuklastega tehtavates bioakumulatsiooni katsetes);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      mulla ja katseorganismide kuivmassi ja märgmassi suhe (mis on vajalik normeerimise jaoks);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      usside märgmassid igal proovivõtuajal; vihmausside puhul märgmassid katse alguses ja igal proovivõtukorral enne ja pärast soolestiku tühjendamist;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      katseorganismide lipiidisisaldus (kui määrati);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kõverad, mis näitavad uuritava kemikaali omastamise ja kõrvaldamise kineetikat ussides ja statsionaarse olekuni jõudmiseks vajalikku aega;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Ca ja Cs (standardhälbe ja vahemikuga, kui see on asjakohane) kõigi proovivõtuaegade kohta (Ca väljendatud g-des kogu keha märg- ja kuivmassi kg–1 kohta, Cs väljendatud g-des mulla märg- ja kuivmassi kg–1 kohta). Kui on vaja leida elustiku-mulla akumulatsioonitegur (näiteks eri lipiidisisaldusega loomadega tehtud katsete tulemuste võrdlemiseks), võib Ca olla väljendatud ka g-des organismi lipiidisisalduse kg–1 kohta ja Cs võib olla väljendatud g-des mulla orgaanilise süsiniku kg–1 kohta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      samuti võib esitada järgmised näitajad: bioakumulatsioonitegur (väljendatuna mulla kg alusel ussi kg–1 kohta), mullast omastamise kiiruskonstant ks (väljendatuna mulla g alusel usside kg–1 ja päeva–1 kohta) ning kõrvaldamise kiiruskonstant ke (väljendatuna päeva–1 kohta); elustiku-mulla akumulatsioonitegur (väljendatuna mulla kg-des orgaanilise süsiniku kg–1 kohta ja ussi lipiidisisalduse alusel);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kui neid mõõdetakse, siis lähtekemikaali protsendid, metaboliidid ja seotud jäägid (s.o uuritava kemikaali protsent, mida ei saa tavapäraste ekstraheerimismeetodite abil ekstraheerida), mis on tuvastatud mullas ja katseloomades;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      andmete statistiliste analüüside jaoks kasutatud meetodid.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Tulemuste hindamine:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tulemuste vastavus kehtivuskriteeriumidele, mis on loetletud punktis 17;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ootamatud või ebatavalised tulemused, näiteks uuritava kemikaali mittetäielik kõrvaldamine katseloomadest.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     KIRJANDUS
                  
                  
                              1)
                           
                           
                              Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane (γ-HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra.
                           
                        
                              2)
                           
                           
                              ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1688-00a.
                           
                        
                              3)
                           
                           
                              ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid potworm Enchytraeus albidus. ASTM International, E1676-04: 26 pp.
                           
                        
                              4)
                           
                           
                              Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger G (2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): Bioaccumulation - New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235–276.
                           
                        
                              5)
                           
                           
                              Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93–99.
                           
                        
                              6)
                           
                           
                              Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & Hermens J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 154–165.
                           
                        
                              7)
                           
                           
                              Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel C (1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei). Ecotox. Environ. Safety 31: 185–191.
                           
                        
                              8)
                           
                           
                              Bell AW (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902: 1–13.
                           
                        
                              9)
                           
                           
                              Bligh EG and Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911–917.
                           
                        
                              10)
                           
                           
                              Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, 671 p.
                           
                        
                              11)
                           
                           
                              Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P (2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.
                           
                        
                              12)
                           
                           
                              Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes Enchytraeus luxuriosus and Enchytraeus albidus (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). Hydrobiologia 463: 185–196.
                           
                        
                              13)
                           
                           
                              Conder JM and Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm Eisenia fetida. J. Soils Sediments 3: 13–20.
                           
                        
                              14)
                           
                           
                              Connell DW and Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to Earthworm System. Chemosphere 20: 91–100.
                           
                        
                              15)
                           
                           
                              Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37: 2–29.
                           
                        
                              16)
                           
                           
                              Didden WAM (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd., The Netherlands, pp. 555–576.
                           
                        
                              17)
                           
                           
                              De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing Programme.
                           
                        
                              18)
                           
                           
                              Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, Bachmann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 140–145.
                           
                        
                              19)
                           
                           
                              Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1907/2006, 18. detsember 2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) ning millega asutatakse Euroopa Kemikaaliamet, muudetakse direktiivi 1999/45/EÜ ja tunnistatakse kehtetuks nõukogu määrus (EMÜ) nr 793/93, komisjoni määrus (EÜ) nr 1488/94 ning samuti nõukogu direktiiv 76/769/EMÜ ja komisjoni direktiivid 91/155/EMÜ, 93/67/EMÜ, 93/105/EÜ ja 2000/21/EÜ (ELT L 396, 30.12.2006, lk 1).
                           
                        
                              20)
                           
                           
                              Edwards CA and Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. Third Edition, Chapman & Hall, London, 426 pp.
                           
                        
                              21)
                           
                           
                              OECD (2008). Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochaetes, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
                           
                        
                              22)
                           
                           
                              Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th and Römbke J (2009). Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: 149 pp. Allalaaditav aadressil http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
                           
                        
                              23)
                           
                           
                              Elmegaard N and Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: 57 pp.
                           
                        
                              24)
                           
                           
                              Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.
                           
                        
                              25)
                           
                           
                              EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195–208.
                           
                        
                              26)
                           
                           
                              Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk assessment? Chemosphere 32: 1897–1905.
                           
                        
                              27)
                           
                           
                              Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumulation. Chemosphere 29: 1501–1514.
                           
                        
                              28)
                           
                           
                              Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Dichlorprop) beim Regenwurm Lumbricus rubellus (Oligochaeta, Lumbricidae). Dissertation University Mainz, 156 pp.
                           
                        
                              29)
                           
                           
                              Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF - Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 78–84.
                           
                        
                              30)
                           
                           
                              Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225–1231.
                           
                        
                              31)
                           
                           
                              Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099–1105.
                           
                        
                              32)
                           
                           
                              Hawker DW and Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701–707.
                           
                        
                              33)
                           
                           
                              Hund-Rinke K and Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sediments 1: 15–20.
                           
                        
                              34)
                           
                           
                              Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59–81.
                           
                        
                              35)
                           
                           
                              ISO 11268-2 (1998). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction.
                           
                        
                              36)
                           
                           
                              Jaenike J (1982). „Eisenia foetida” is two biological species. Megadrilogica 4: 6–8.
                           
                        
                              37)
                           
                           
                              Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080–2090.
                           
                        
                              38)
                           
                           
                              Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in Eisenia andrei (Oligochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953–961.
                           
                        
                              39)
                           
                           
                              Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, DeJong A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms (Eisenia andrei, Oligochaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 767–775.
                           
                        
                              40)
                           
                           
                              Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm, Eisenia andrei (Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399–3404.
                           
                        
                              41)
                           
                           
                              Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305–312.
                           
                        
                              42)
                           
                           
                              Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217–232.
                           
                        
                              43)
                           
                           
                              Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von 14C-Hexachlorbenzol und 14C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University München, 137 pp.
                           
                        
                              44)
                           
                           
                              Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23: 588–595.
                           
                        
                              45)
                           
                           
                              Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accumulation in Lumbricus rubellus under laboratory conditions compared with accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17–26.
                           
                        
                              46)
                           
                           
                              Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegates. Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244–1249.
                           
                        
                              47)
                           
                           
                              Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumulation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
                           
                        
                              48)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk C.8 „Toksilisus vihmaussidele”.
                           
                        
                              49)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk C.13 „Biokontsentratsioon: kaladega läbivoolukatse”.
                           
                        
                              50)
                           
                           
                              Käesoleva lisa peatükk C.21 „Mullamikroobid: lämmastiku transformatsiooni katse”.
                           
                        
                              51)
                           
                           
                              OECD (2004a). Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
                           
                        
                              52)
                           
                           
                              OECD (2004b). Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia Andrei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
                           
                        
                              53)
                           
                           
                              OECD (2008). Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochaetes, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
                           
                        
                              54)
                           
                           
                              Petersen H and Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287–388.
                           
                        
                              55)
                           
                           
                              Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology Vol. 1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378–396.
                           
                        
                              56)
                           
                           
                              Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser-Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77–81.
                           
                        
                              57)
                           
                           
                              Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm Eisenia fetida. RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.
                           
                        
                              58)
                           
                           
                              Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ.Toxicol. Chem. 10: 1431–1436.
                           
                        
                              59)
                           
                           
                              Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S.
                           
                        
                              60)
                           
                           
                              Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 pp.
                           
                        
                              61)
                           
                           
                              Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105–129.
                           
                        
                              62)
                           
                           
                              Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107–127.
                           
                        
                              63)
                           
                           
                              Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110–2120.
                           
                        
                              64)
                           
                           
                              Schlosser H-J and Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 413–433.
                           
                        
                              65)
                           
                           
                              Schmelz R and Collado R (1999). Enchytraeus luxuriosus sp. nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 57: 93–100.
                           
                        
                              66)
                           
                           
                              Sims R W and Gerard BM (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.
                           
                        
                              67)
                           
                           
                              Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557–2563.
                           
                        
                              68)
                           
                           
                              Spacie A and Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309–320.
                           
                        
                              69)
                           
                           
                              Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scroggins RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxicology. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac Press, Pensacola, 67–81.
                           
                        
                              70)
                           
                           
                              Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM (2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta. Environ. Toxicol. Chemistry 22: 1167–1171.
                           
                        
                              71)
                           
                           
                              UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation - Bewertungskonzept und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.
                           
                        
                              72)
                           
                           
                              US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, MN, March 2000.
                           
                        
                              73)
                           
                           
                              Van Brummelen TC and Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: 277–285.
                           
                        
                              74)
                           
                           
                              Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the toxicity of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earthworms (Ed. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB).
                           
                        
                              75)
                           
                           
                              Van Gestel CA and Ma W-C (1990). An approach to quantitative structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. Chemosphere 21: 1023–1033.
                           
                        
                              76)
                           
                           
                              Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil invertebrates. Environmental Pollution 136: 409–417.
                           
                        
                              77)
                           
                           
                              Venter JM and Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm Eisenia fetida (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161–165.
                           
                        
                              78)
                           
                           
                              Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm Lumbricus rubellus exposed to contaminated floodplain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843–1851.
                           
                        
                              79)
                           
                           
                              Widianarko B and Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402–406.
                           
                        
                     1. liide
                     MÕISTED
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bioakumulatsioon – uuritava kemikaali kontsentratsiooni suurenemine organismis või organismil, võrreldes uuritava kemikaali kontsentratsiooniga ümbritsevas kasvukeskkonnas. Bioakumulatsioon on biokontsentratsiooni ja biomagnifikatsiooni (vt allpool) tulemus.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Biokontsentratsioon – uuritava kemikaali kontsentratsiooni suurenemine organismis või organismil ainult ümbritsevast kasvukeskkonnast kemikaali omastamise teel (näiteks keha pinna ja allaneelatud mulla kaudu), võrreldes uuritava kemikaali kontsentratsiooniga ümbritsevas kasvukeskkonnas.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Biomagnifikatsioon – uuritava kemikaali kontsentratsiooni suurenemine organismis või organismil peamiselt saastunud toidu või saagi kaudu omastamise teel, võrreldes uuritava kemikaali kontsentratsiooniga toidus või saagis. Biomagnifikatsioon võib viia uuritava aine ülekandumise või kogunemiseni toiduvõrgustikes.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Uuritava kemikaali kõrvaldamine – kemikaali kadumine katseorganismi kudedest aktiivsete või passiivsete protsesside tõttu, mis tekivad, sõltumata uuritava aine olemasolust või selle puudumisest ümbritsevas kasvukeskkonnas.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bioakumulatsioonitegur (BAF) – uuritava kemikaali kontsentratsioon katseorganismis/katseorganismil (Ca, g-des ussi kuivmassi kg kohta) kõnealuse bioakumulatsiooni katse omastamisfaasis igal ajamomendil jagatuna kemikaali kontsentratsiooniga ümbritsevas kasvukeskkonnas (Cs, g-des mulla kuivmassi kg kohta); bioakumulatsiooniteguri ühikud on mulla kg ussi kg kohta.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Statsionaarse oleku bioakumulatsioonitegur (BAFss) – bioakumulatsioonitegur statsionaarse oleku puhul, see ei muutu oluliselt pika ajavahemiku jooksul; uuritava kemikaali kontsentratsioon ümbritsevas kasvukeskkonnas (Cs, g-des mulla kuivmassi kg kohta) jääb selle ajavahemiku vältel püsivaks.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bioakumulatsioonitegurid, mis arvutatakse otse mullast omastamise kiiruskonstandist ja kõrvaldamise kiiruskonstandist (ks ja ke, vt allpool), on kineetilised bioakumulatsioonitegurid (BAFK).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Elustiku-mulla akumulatsioonitegur (BSAF) – lipiidide suhtes normeeritud uuritava kemikaali kontsentratsioon katseorganismis/katseorganismil, jagatuna uuritava kemikaali orgaanilise süsiniku suhtes normeeritud kontsentratsiooniga mullas statsionaarses olekus. Ca on sel juhul väljendatud g-des organismi lipiidide kg kohta ja Cs g-des mulla orgaanilise aine kg kohta; elustiku-mulla akumulatsiooniteguri ühikud on kg orgaanilist süsinikku lipiidi kg kohta.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Platoo või statsionaarne olek – määratletud kui tasakaaluolek omastamise ja kõrvaldamise protsesside vahel, mis toimuvad kokkupuutefaasis ühel ja samal ajal. Statsionaarne olek saavutatakse bioakumulatsiooniteguri ajast sõltuvuse graafikul, kui kõver muutub ajateljega paralleelseks ja vähemalt kahepäevase vahemikuga võetud proovide bioakumulatsiooniteguri kolm järjestikust analüüsi jäävad üksteisest 20 % piiresse ning kolme proovivõtu ajavahemiku vahel ei ole statistiliselt olulisi erinevusi. Uuritavate kemikaalide puhul, mida omastatakse aeglasemalt, oleksid sobivamad seitsmepäevased ajavahemikud (49).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Orgaanilise süsiniku-vee jaotuskoefitsient (Koc) – kemikaali kontsentratsiooni suhe mulla orgaanilise süsiniku fraktsioonis/fraktsioonil ja kemikaali kontsentratsioon vees tasakaaluoleku puhul.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Oktanooli-vee jaotuskoefitsient (Kow) – kemikaali lahustuvuse suhe n-oktanoolis ja vees tasakaaluolekus, mida vahel tähistatakse ka Pow-ga. Kow logaritmi (log Kow) kasutatakse kui kemikaali võimaliku veeorganismidesse kogunemise (bioakumulatsiooni) üht näitajat.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Omastamis- või kokkupuutefaas – aeg, mille vältel katseorganismid puutuvad kokku uuritava kemikaaliga.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Mullast omastamise kiiruskonstant (ks) – numbriline väärtus, millega määratakse uuritava aine kontsentratsiooni suurenemise kiirus katseorganismil/katseorganismis, mille on põhjustanud omastamine mullafaasist; ks mõõdetakse mulla g-des usside kg ja päeva kohta.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kõrvaldamisfaas – aeg, mis järgneb katseorganismide ülekandmisele uuritava ainega rikastatud kasvukeskkonnast uuritava aineta kasvukeskkonda, mille vältel uuritakse kemikaali kõrvaldamist katseorganismidest (või netokadu).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kõrvaldamise kiiruskonstant (ke) – numbriline väärtus, millega määratakse uuritava aine kontsentratsiooni vähenemise kiirus katseorganismil/katseorganismis pärast katseorganismide ülekandmist uuritavat ainet sisaldavast kasvukeskkonnast uuritava aineta kasvukeskkonda; ke ühik on d–1.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                              
                           
                  
                     2. liide
                     
                        Omastamise ja kõrvaldamise parameetrite arvutamine
                     
                     Bioakumulatsiooni katse peamine näitaja on bioakumulatsioonitegur, BAF. Bioakumulatsioonitegurit on võimalik mõõtmistulemustest arvutada, kui statsionaarse oleku kontsentratsioon katseorganismis (Ca) jagatakse kontsentratsiooniga mullas (Cs). Kui omastamisfaasi ajal statsionaarse olekuni ei jõuta, siis arvutatakse kiiruskonstantidest statsionaarse oleku bioakumulatsiooniteguri asemel kineetiline bioakumulatsioonitegur. Siiski tuleks ära märkida, kas bioakumulatsioonitegur põhineb statsionaarse oleku kontsentratsioonidel või mitte.
                     Tavapärane meetod kineetilise bioakumulatsiooniteguri (BAFK), mullast omastamise kiiruskonstandi (ks) ja kõrvaldamise kiiruskonstandi (ke) leidmiseks on kasutada arvutitöötluses mittelineaarseid parameetri hindamise meetodeid, näiteks väljaandes 68 kirjeldatud mudelite alusel. Järjestikuste kontsentratsiooni ajast sõltuvuse andmete komplekti ja mudeli võrrandite puhul
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [võrrand 1]
                              
                           või
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 [võrrand 2],
                              
                           kus
                     
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 kemikaali kontsentratsioon ussides (g märg- või kuivmassi kg–1)
                              
                           
                                 ks
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 omastamise kiiruskonstant koes (mulla g ussi kg–1 d–1)
                              
                           
                                 Cs
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 kemikaali kontsentratsioon mullas (g märg- või kuivmassi kg–1)
                              
                           
                                 ke
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 kõrvaldamise kiiruskonstant (d–1)
                              
                           
                                 tc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 aeg omastamisfaasi lõpus,
                              
                           saab nende arvutiprogrammidega arvutada BAFK, ks ja ke väärtused.
                     Kui kontrollkatse (kemikaaliga mitte kokkupuutuvate) usside taustkontsentratsioon, näiteks päeval 0, erineb märkimisväärselt nullist (see võib nii olla näiteks metallide puhul), tuleks kõnealune taustkontsentratsioon (Ca,0) lisada võrranditesse, muutes neid järgmiselt:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [võrrand 3]
                              
                           ja
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 [võrrand 4]
                              
                           Kui täheldatakse uuritava kemikaali kontsentratsiooni märkimisväärset vähenemist mullas omastamisfaasi vältel, võib kasutada järgmisi mudeleid (67, 79):
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [võrrand 5],
                              
                           kus
                     
                                 Cs
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 kemikaali kontsentratsioon mullas (g märg- või kuivmassi kg–1)
                              
                           
                                 k0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 lagunemise kiiruskonstant mullas (d–1)
                              
                           
                                 C0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 kemikaali esialgne kontsentratsioon mullas (g märg- või kuivmassi kg–1)
                              
                           
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [võrrand 6]
                              
                           
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 [võrrand 7],
                              
                           kus
                     
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 kemikaali kontsentratsioon ussides (g märg- või kuivmassi kg–1)
                              
                           
                                 ks
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 omastamise kiiruskonstant koes (mulla g ussi kg–1 d–1)
                              
                           
                                 k0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 lagunemise kiiruskonstant mullas (d–1)
                              
                           
                                 ke
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 kõrvaldamise kiiruskonstant (d–1)
                              
                           
                                 tc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 aeg omastamisfaasi lõpus.
                              
                           Kui statsionaarse olekuni jõutakse omastamisfaasi vältel (s.o t = ∞), siis võib võrrandi 1
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [võrrand 1]
                              
                           taandada kujule:
                     
                        
                     või
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [võrrand 8]
                              
                           Sel juhul on ks/ke × Cs lähenemine uuritava aine kontsentratsioonile ussi kudedes statsionaarses olekus (Ca,ss).
                     Elustiku-mulla akumulatsioonitegurit (BSAF) saab arvutada järgmiselt:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [võrrand 9],
                              
                           kus foc on mulla orgaanilise süsiniku fraktsioon ja flip on ussi lipiidifraktsioon, mis on mõlemad eelistatavalt määratud katse ajal võetud proovidest ja põhinevad vastavalt kas kuivmassil või märgmassil.
                     Kõrvaldamise kineetikat on võimalik modelleerida, kasutades kõrvaldamisfaasi andmeid ja kohaldades järgmist mudelvõrrandit ning arvutipõhist mittelineaarset parameetri hindamise meetodit. Kui aja järgi graafikule kantud andmepunktid näitavad pidevat eksponentsiaalset uuritava aine kontsentratsiooni vähenemist loomades, siis võib ajast sõltuva kõrvaldamise kirjeldamiseks kasutada ühe-kambri-mudelit (võrrand 9).
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [võrrand 10]
                              
                           Kõrvaldamisprotsessid näivad vahel olevat kahefaasilised, näidates Ca kiiret vähenemist kõrvaldamisfaasi alguses, mis hiljem muutub uuritava aine aeglasemaks kaoks kõrvaldamise hilisemates järkudes, vt näiteks 27, 68. Kahte faasi on võimalik tõlgendada eeldusega, et organismis on kaks eraldi kambrit, millest uuritav aine kaob erineva kiirusega. Neil juhtudel tuleks vaadata asjakohaseid väljaandeid, näiteks 38, 39, 40, 78.
                     Eespool esitatud mudelvõrrandite abil võib kineetilised parameetrid (ks ja ke) arvutada ka korraga, kohaldades esimese järgu kineetika mudelit korraga kõigile omastamisfaasi ja kõrvaldamisfaasi andmetele. Omastamise ja kõrvaldamise kiiruskonstantide sellise kombineeritud arvutamise meetodi kirjeldus on esitatud väljaannetes 40, 72 ja 69.
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [võrrand 11]
                              
                           
                                 
                                    Märkus.
                                 
                              
                              
                                 Kui omastamise ja kõrvaldamise parameetreid hinnatakse korraga omastamise ja kõrvaldamise ühendatud andmetest, võimaldab võrrandis 11 kasutatud näitaja m arvutiprogrammil seostada võrrandi alamliikmeid vastava faasi andmekomplektidega ja võrrandit õigesti rakendada (m = 1 omastamisfaasi korral; m = 2 kõrvaldamisfaasi korral).
                              
                           Sellest hoolimata tuleks mudelvõrrandeid kasutades olla ettevaatlik, eelkõige kui katse ajal võib muutuda uuritava kemikaali biosaadavus või esineb kemikaali (bio)lagunemine (vt näiteks 79).
                  
                  
                     3. liide
                     MULLA BIOAKUMULATSIOONI KATSETE AJAVAKAVADE NÄITED
                     
                        Katse vihmaussidega
                     
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Omastamisfaas kineetika arvutamiseks kasutatava kaheksa proovivõtu kuupäevaga
                                 
                                             Päev
                                          
                                          
                                             Tegevus
                                          
                                       
                                             –6
                                          
                                          
                                             Ettevalmistatud mulla kohandamine 48 tunni vältel.
                                          
                                       
                                             –4
                                          
                                          
                                             Mulla fraktsiooni rikastamine uuritava kemikaali lahusega; lahusti aurustamine; mulla koostisosade segamine; mulla jaotamine katsenõudesse; katsetingimustel tasakaalustamine nelja päeva vältel (kolme nädala vältel metalliga rikastatud mulla korral).
                                          
                                       
                                             –3 kuni –1
                                          
                                          
                                             Katseorganismide eraldamine kultuurist aklimatiseerumiseks; mulla koostisosade ettevalmistamine ja niisutamine.
                                          
                                       
                                             0
                                          
                                          
                                             Temperatuuri ja mulla pH mõõtmine; mullaproovide võtmine töödeldud nõudest ja lahusti kontrollkatse nõudest uuritava kemikaali kontsentratsiooni määramiseks; söödaratsiooni lisamine; usside kaalumine ja randomiseeritud jaotamine katsenõudesse; usside piisavate allproovide säilitamine analüütiliste taustnäitajate, märg- ja kuivmassi ning lipiidisisalduse määramiseks; kõigi katsenõude kaalumine mulla niiskuse kontrollimiseks; õhuvarustuse kontrollimine, kui kasutatakse suletud katsesüsteemi.
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             Õhuvarustuse kontrollimine, usside käitumise ja temperatuuri registreerimine; mulla- ja usside proovide võtmine uuritava aine kontsentratsiooni määramiseks.
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1.
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             Õhuvarustuse, usside käitumise ja temperatuuri kontrollimine.
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1.
                                          
                                       
                                             5–6
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 3.
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1; söödaratsiooni lisamine; mulla niiskuse kontrollimine katsenõude uuesti kaalumise teel ja vee aurustumise kompenseerimine.
                                          
                                       
                                             8–9
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 3.
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1.
                                          
                                       
                                             11–13
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 3.
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1; söödaratsiooni lisamine; mulla niiskuse kontrollimine katsenõude uuesti kaalumise teel ja vee aurustumise kompenseerimine.
                                          
                                       
                                             15–16
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 3.
                                          
                                       
                                             17
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1.
                                          
                                       
                                             18–20
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 3.
                                          
                                       
                                             21
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1; temperatuuri ja mulla pH mõõtmine; mulla niiskuse kontrollimine katsenõude uuesti kaalumise teel; omastamisfaasi lõpp; usside ülekandmine allesolevatest kokkupuute paralleelproovidest kõrvaldamisfaasi jaoks puhast mulda sisaldavatesse nõudesse (ilma soolestiku tühjendamiseta); mulla- ja usside proovide võtmine lahusti kontrollrühmades.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Kokkupuute-eelsed tegevused (tasakaalustamise faas) tuleks ajakavas määrata uuritava kemikaali omadusi arvesse võttes.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Päeva 3 jaoks kirjeldatud tegevusi tuleks korrata igal päeval (vähemalt tööpäeviti).
                                          
                                       
                           
                                 b)
                              
                              
                                 Kõrvaldamisfaas
                                 
                                             Päev
                                          
                                          
                                             Tegevus
                                          
                                       
                                             –6
                                          
                                          
                                             Mulla koostisosade ettevalmistamine ja niisutamine; ettevalmistatud mulla kohandamine 48 tunni vältel.
                                          
                                       
                                             –4
                                          
                                          
                                             Mulla koostisosade segamine; mulla jaotamine katsenõudesse; inkubeerimine katsetingimustes neli päeva.
                                          
                                       
                                             0 (omastamisfaasi lõpp)
                                          
                                          
                                             Temperatuuri ja mulla pH mõõtmine; usside kaalumine ja randomiseeritud jaotamine katsenõudesse; söödaratsiooni lisamine; usside ülekandmine allesolevatest kokkupuute paralleelproovidest puhast mulda sisaldavatesse nõudesse; mulla- ja usside proovide võtmine 4–6 tunni pärast uuritava kemikaali kontsentratsiooni määramiseks.
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             Õhuvarustuse kontrollimine, usside käitumise ja temperatuuri registreerimine; mulla- ja usside proovide võtmine uuritava kemikaali kontsentratsiooni määramiseks.
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1.
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             Õhuvarustuse, usside käitumise ja temperatuuri kontrollimine.
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1.
                                          
                                       
                                             5–6
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 3.
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1; söödaratsiooni lisamine; mulla niiskuse kontrollimine katsenõude uuesti kaalumise teel ja vee aurustumise kompenseerimine.
                                          
                                       
                                             8–9
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 3.
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1.
                                          
                                       
                                             11–13
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 3.
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1; söödaratsiooni lisamine; mulla niiskuse kontrollimine katsenõude uuesti kaalumise teel ja vee aurustumise kompenseerimine.
                                          
                                       
                                             15–16
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 3.
                                          
                                       
                                             17
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1.
                                          
                                       
                                             18–20
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 3.
                                          
                                       
                                             21
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1; temperatuuri ja mulla pH mõõtmine; mulla niiskuse kontrollimine katsenõude uuesti kaalumise teel; mulla- ja usside proovide võtmine lahusti kontrollrühmadest.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Mulla ettevalmistamine enne kõrvaldamisfaasi tuleks teha samal viisil kui enne omastamisfaasi.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Päeva 3 jaoks kirjeldatud tegevusi tuleks korrata igal päeval (vähemalt tööpäeviti).
                                          
                                       
                           
                        Katse valgeliimuklastega
                     
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Omastamisfaas kineetika arvutamiseks kasutatava kaheksa proovivõtu kuupäevaga
                                 
                                             Päev
                                          
                                          
                                             Tegevus
                                          
                                       
                                             –6
                                          
                                          
                                             Ettevalmistatud mulla kohandamine 48 tunni vältel.
                                          
                                       
                                             –4
                                          
                                          
                                             Mulla fraktsiooni rikastamine uuritava kemikaali lahusega; lahusti aurustamine; mulla koostisosade segamine; mulla jaotamine katsenõudesse; katsetingimustel tasakaalustamine nelja päeva vältel (kolme nädala vältel metalliga rikastatud mulla korral).
                                          
                                       
                                             –3 kuni –1
                                          
                                          
                                             Katseorganismide eraldamine kultuurist aklimatiseerumiseks; mulla koostisosade ettevalmistamine ja niisutamine.
                                          
                                       
                                             0
                                          
                                          
                                             Temperatuuri ja mulla pH mõõtmine; mullaproovide võtmine töödeldud nõudest ja lahusti kontrollkatse nõudest uuritava kemikaali kontsentratsiooni määramiseks; söödaratsiooni lisamine mulda; usside kaalumine ja randomiseeritud jaotamine katsenõudesse; usside piisavate allproovide säilitamine analüütiliste taustnäitajate, märg- ja kuivmassi ning lipiidisisalduse määramiseks; kõigi katsenõude kaalumine mulla niiskuse kontrollimiseks; õhuvarustuse kontrollimine, kui kasutatakse suletud katsesüsteemi.
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             Õhuvarustuse kontrollimine, usside käitumise ja temperatuuri registreerimine; mulla- ja usside proovide võtmine uuritava aine kontsentratsiooni määramiseks.
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1.
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             Õhuvarustuse, usside käitumise ja temperatuuri kontrollimine.
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1.
                                          
                                       
                                             5–6
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 3.
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1; söödaratsiooni lisamine mulda; mulla niiskuse kontrollimine katsenõude uuesti kaalumise teel ja vee aurustumise kompenseerimine.
                                          
                                       
                                             9
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1.
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 3.
                                          
                                       
                                             11
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1.
                                          
                                       
                                             12–13
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 3.
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             Sama kui päeval 1; söödaratsiooni lisamine mulda; temperatuuri ja mulla pH mõõtmine; mulla niiskuse kontrollimine katsenõude uuesti kaalumise teel; omastamisfaasi lõpp; usside ülekandmine allesolevatest kemikaaliga kokkupuute paralleelproovidest kõrvaldamisfaasi jaoks puhast mulda sisaldavatesse nõudesse (ilma soolestiku tühjendamiseta); mulla- ja usside proovide võtmine lahusti kontrollkatse rühmades.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Kokkupuute-eelsed tegevused (tasakaalustamise faas) tuleks ajakavas määrata kemikaali omadusi arvesse võttes.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Päeva 3 jaoks kirjeldatud tegevusi tuleks korrata igal päeval (vähemalt tööpäeviti).
                                          
                                       
                           
                  
                     4. liide
                     
                        Tehismuld – soovitused valmistamise ja säilitamise kohta
                     
                     Kuna konkreetsest allikast looduslik muld ei pruugi olla kogu aasta vältel kättesaadav ja katset võivad mõjutada seal elavad organismid ning samuti mikrosaasteained, on soovitatav kasutada katses tehislikku substraati, tehismulda, vastavalt käesoleva lisa peatükile C.8 „Toksilisus vihmaussidele”(48). Selles mullas saavad ellu jääda, kasvada ja paljuneda mitmed katseliigid ning tagatakse katse- ja kultuuritingimuste maksimaalne standardiseeritus ning samuti laborisisene ja laboritevaheline võrreldavus.
                     Mulla koostisosad
                     
                                 Turvas:
                              
                              
                                 10 %
                              
                              
                                 Turbasammal kooskõlas OECD suunisega 207 (48).
                              
                           
                                 Kvartsliiv:
                              
                              
                                 70 %
                              
                              
                                 Tööstuslik kvartsliiv (õhu käes kuivatatud); tera suurus: rohkem kui 50 % osakestest peaksid olema vahemikus 50–200 μm, kuid kõik osakesed peaksid olema ≤ 2 mm.
                              
                           
                                 Kaoliinsavi:
                              
                              
                                 20 %
                              
                              
                                 Kaoliniidisisaldus ≥ 30 %.
                              
                           
                                 Kaltsiumkarbonaat:
                              
                              
                                 ≤ 1 %
                              
                              
                                 CaCO3, pulbriks jahvatatud, keemiliselt puhas.
                              
                           Soovi korral võib tehismulla orgaanilise süsiniku sisaldust vähendada, vähendades näiteks turbasisaldust 4–5 %-le kuivast mullast ja suurendades vastavalt liivasisaldust. Sellise orgaanilise süsiniku sisalduse vähendamise teel võib uuritava kemikaali mullal adsorbeerumise (orgaaniline süsinik) võimalus väheneda ja uuritava kemikaali saadavus ussidele võib suureneda (74). On tõendatud, et Enchytraeus albidus ja Eisenia fetida suudavad täita paljunemist käsitleva kehtivuskriteeriumi, kui neid katsetatakse põllumullas, millel on väiksem orgaanilise süsiniku sisaldus, näiteks 2,7 % (33, 61), ja seniste kogemuste põhjal on seda võimalik saavutada 5 % turbasisaldusega tehismullas.
                     
                        Valmistamine
                     
                     Mulla kuivad koostisosad segatakse põhjalikult (näiteks suuremahulises laborisegistis). Seda tuleks teha enne katse alustamist ligikaudu nädala jooksul. Segatud kuiva mulla koostisosi tuleks niisutada deioniseeritud veega vähemalt 48 tundi enne uuritava aine lisamist, et tasakaalustada/stabiliseerida happesust. pH määramiseks kasutatakse mulla ja 1 M KCl lahust suhtega 1 : 5. Kui pH ei ole nõutud vahemikus (6,0 ± 0,5), lisatakse mullale piisavas koguses CaCO3 või valmistatakse ette uus mullapartii.
                     Tehismulla maksimaalne veemahutavus määratakse kooskõlas standardiga ISO 11268-2 (35). Kuiva tehismulda niisutatakse vähemalt kaks päeva enne katse alustamist, lisades piisavalt deioniseeritud või taastatud vett, et saada ligikaudu pool lõplikust veesisaldusest. Lõplik veesisaldus peaks olema 40–60 % maksimaalsest veemahutavusest. Katse alguses jagatakse eelnevalt niisutatud muld nii mitmeks partiiks, kui on katse vältel kasutatud katsekontsentratsioone ja kontrollrühmi, ning niiskusesisaldus reguleeritakse 40–60 %-le maksimaalsest veemahutavusest, kasutades uuritava aine lahust ja/või lisades deioniseeritud või taastatud vett. Niiskusesisaldus määratakse katse alguses ja lõpus (105 °C juures). See peaks olema optimaalne liikide vajaduste jaoks (niiskusesisaldust võib samuti kontrollida järgmiselt: kui mulda käes kergelt vajutatakse, siis peaksid sõrmede vahele tekkima väiksed veepiisad).
                     
                        Säilitamine
                     
                     Tehismulla kuivi koostisosi võib toatemperatuuril säilitada kuni kasutamiseni. Valmistatud eelnevalt niisutatud mulda võib säilitada jahedas kohas kuni kolm päeva enne rikastamist; tuleks olla hoolikas, et vältida vee aurumist. Uuritava ainega rikastatud mulda tuleks kasutada viivitamata, v.a juhul, kui on andmeid selle kohta, et konkreetset mulda saab säilitada ilma uuritava aine mürgisust ja biosaadavust mõjutamata. Rikastatud mulla proove võidakse seejärel säilitada kuni analüüsini konkreetse uuritava aine jaoks soovitatavates tingimustes.
                  
                  
                     5. liide
                     
                        Mulla väheharjasusside liigid, keda soovitatakse kasutada mullast toimuva bioakumulatsiooni katsete tegemiseks
                     
                     
                        Vihmaussid
                     
                     Soovitatav katseliik on Eisenia fetida (Savigny 1826), kes kuulub Lumbricidae sugukonda. Alates 1972. aastast on see jaotatud kahte alamliiki (Eisenia fetida ja Eisenia andrei (10)). Jaenike (36) kohaselt on need täiesti eraldi liigid. Eisenia fetida on kergesti äratuntav oma heledate segmentidevaheliste kollaste triipude poolest, aga Eisenia andrei värvus on ühtlaselt tumepunane. Need liigid on tõenäoliselt pärit Musta mere piirkonnast ja neid esineb praegu kõikjal maailmas eelkõige inimeste tekitatud elupaikades, nagu kompostihunnikud. Mõlemat liiki saab kasutada ökotoksikoloogilisteks ja bioakumulatsiooni katseteks.
                     
                        Eisenia fetida ja Eisenia andrei on kaubanduslikult saadaval näiteks kalasöödana. Võrreldes muude Lumbricidae sugukonda kuuluvate vihmaussidega on neil lühike elutsükkel ja nad saavad (toatemperatuuril) täiskasvanuks ligikaudu kahe kuni kolme kuu vanusena. Nende optimaalne temperatuur on ligikaudu 20–24 °C. Nad eelistavad suhteliselt niiskeid substraate, mille pH on peaaegu neutraalne ja orgaanilise materjali sisaldus on suur. Kuna neid liike on standarditud ökotoksikoloogilistes katsetes ligikaudu 25 aasta vältel laialdaselt kasutatud, on nende kultuuris kasvatamine hästi dokumenteeritud (48, 77).
                     Mõlemat liiki saab kasvatada mitmesugustes loomsetes jäätmetes. ISO (35) alusel soovitatud kasvatamise keskkond on hobuse- või veisesõnniku ja turba segu 50 : 50. Kasvukeskkonna pH peaks olema ligikaudu 6–7 (reguleeritakse kaltsiumkarbonaadiga), kasvukeskkonnal peaks olema vähene ioonjuhtivus (vähem kui 6 mS/cm või vähem kui 0,5 % soola kontsentratsioon) ja see ei tohiks olla ammoniaagi või loomauriiniga liigselt saastunud. Samuti võib kasutada müügil olevat aiamulda, mis ei sisalda lisandeid, või tehismulda OECD (48) kohaselt või nende mõlema segu 50 : 50. Substraat peaks olema niiske, kuid mitte liiga märg. Sobivad on 10- kuni 50-liitrised kasvatuskastid.
                     Standardse vanuse ja massiga usside saamiseks on parim alustada kultuuri kookonitega. Seepärast lisatakse värsket substraati sisaldavasse kasvatuskasti täiskasvanud ussid kookonite saamiseks. Praktilised kogemused on näidanud, et populatsiooni tihedus ligikaudu 100 täiskasvanud ussi substraadi (märgmassi) kg kohta annab head paljunemismäärad. Pärast 28 päeva möödumist täiskasvanud ussid eemaldatakse. Kookonitest koorunud vihmausse kasutatakse katsetamiseks vähemalt 2 kuu ja mitte kauem kui 12 kuu möödumisel täiskasvanuks saamisest.
                     Eespool kirjeldatud liiki usse saab pidada terveks, kui nad liiguvad kogu substraadis, ei proovi substraadist lahkuda ja paljunevad pidevalt. Väga aeglane liikumine või kollane tagaosa (Eisenia fetida puhul) viitab substraadi kurnatusele. Sel juhul soovitatakse kasutada värsket substraati ja/või väiksemat arvu loomi kasti kohta.
                     
                        Täiendavad valitud viited
                     
                     Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean Soc. London, 6: 1–58.
                     Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1–81.
                     Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
                     Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. Oikos 28: 49–55.
                     Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 180–201.
                     Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. London 31: 1–171.
                     Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm Ecology - from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331–338 pp.
                     
                        Valgeliimuklased
                     
                     Soovitatav katseliik on Enchytraeus albidus, Henle 1837 (valgeliimukas). Enchytraeus albidus on üks suurimaid (kuni 15 mm) rõngusside hõimkonna väheharjasusside klassi Enchytraeidae sugukonna liike ja seda leidub kogu maailmas, vt näiteks 8. Enchytraeus albidus’t leidub merelistes, siseveekogude ja mullastiku elupaikades peamiselt lagunevas orgaanilises aines (vetikad, kompost) ja harvadel juhtudel niitudel (42). Kõnealune lai ökoloogiline taluvus ja mõni morfoloogiline erinevus näitab, et kõnealusel liigil võib olla erinevaid liigisiseseid rühmi.
                     
                        Enchytraeus albidus on kaubanduslikult saadaval, seda müüakse kalasöödana. Tuleks kontrollida, kas kultuur on saastunud muude, enamasti väiksemate liikidega (60). Kui saastumine on toimunud, siis tuleks kõiki usse pesta veega Petri tassis. Seejärel valitakse (stereomikroskoobi abil) uue kultuuri alustamiseks Enchytraeus albiduse suured isendid. Kõik muud ussid visatakse ära. Liigi elutsükkel on lühike ja täiskasvanuks saadakse 33 päevaga (18 °C juures) kuni 74 päevaga (12 °C juures). Katses tuleks kasutada ainult kultuure, mida on ilma probleemideta laboris hoitud vähemalt viis nädalat (üks põlvkond).
                     Muud Enchytraeus’e perekonna liigid on samuti sobivad, eelkõige Enchytraeus luxuriosus. See liik elab tegelikult mullas ja seda on hiljuti kirjeldatud väljaandes (65). Kui kasutatakse muud Enchytraeus’e perekonna liiki, tuleks see selgelt tuvastada ja liigi valimist tuleks põhjendada.
                     
                        Enchytraeus crypticus (Westheide ja Graefe 1992) on liik, mis kuulub samasse rühma kui Enchytraeus luxuriosus. Selle leidumist looduses ei ole veel kindlalt tuvastatud, seda on ainult kirjeldatud vihmausside kultuurides ja kompostihunnikutes (Römbke 2003). Selle algsed ökoloogilised nõuded ei ole seega teada. Hiljutised laboriuuringud erinevate alade muldadega on kinnitanud, et sellel liigil on laialdane taluvus mulla omaduste (nagu pH ja tekstuur) suhtes (Jänsch et al. 2005). Viimastel aastatel on seda liiki sageli kasutatud ökotoksikoloogilistes uuringutes, kuna seda on lihtne kasvatada ja katsetada, näiteks Kuperman et al. 2003. Isendid on siiski väiksed (3–12 mm; keskmiselt 7 mm) (Westheide & Müller 1996), mis muudab käsitlemise Enchytraeus albidus’ega võrreldes keerukamaks. Selle liigi kasutamisel Enchytraeus albidus’e asemel võib katsenõu olla väiksem, aga ei pruugi seda olla. Lisaks sellele tuleks arvesse võtta, et see liik paljuneb väga kiiresti. Selle põlvkond saab 20 ± 2 °C juures küpseks vähem kui 20 päevaga (Achazi et al. 1999) ja kõrgemal temperatuuril isegi kiiremini.
                     
                        Enchytraeidae sugukonda kuuluvad Enchytraeus albidus’e liigi isendeid (ning samuti muude Enchytraeus’e perekonna liikide isendeid) on võimalik kasvatada suurtes plastkastides (näiteks 30 × 60 × 10 cm või 20 × 12 × 8 cm, mis on sobivad väikeste usside kasvukultuuri jaoks), mis on täidetud tehismulla ja müügil oleva ilma lisanditeta saastumata aiamulla seguga. Kompostmaterjali tuleks vältida, kuna see võib sisaldada mürgiseid kemikaale, nagu raskmetalle. Fauna tuleks kasvumullast enne kasutamist kolmekordse sügavkülmutamise teel eemaldada. Võib kasutada ka puhast tehismulda, aga paljunemiskiirus selles võib segatud substraatidega võrreldes olla väiksem. Substraadi pH peaks olema 6,0 ± 0,5. Kultuuri hoitakse ilma valguseta inkubaatoris temperatuuril 15 ± 2 °C. Igal juhul tuleks vältida kõrgema temperatuuri kui 23 °C kasutamist. Tehismuld / looduslik muld peaks olema niiske, aga mitte märg. Kui mulda käega õrnalt vajutatakse, peaksid ilmuma ainult väiksed veepiisad. Igal juhul tuleks vältida hapnikuvaegust (näiteks kaane kasutamisel peaks kaane aukude arv olema piisavalt suur, et tagada piisav õhuvahetus). Kasvumulda tuleks kord nädalas hoolika segamisega aereerida.
                     Usse tuleks vähemalt korra nädalas valitud ajal sööta valtsitud kaeraga, mis asetatakse mulda tehtud auku ja kaetakse mullaga. Kui mahutisse jääb eelmisest söötmise kuupäevast sööta, tuleks antava sööda kogust sellele vastavalt kohandada. Kui allesolevale söödale kasvavad seened, tuleks see asendada valtsitud kaera uue kogusega. Paljunemise stimuleerimiseks võib valtsitud kaera täiendada iga kahe nädala tagant müügil oleva vitamiinidega täiendatud valgupulbriga. Kolme kuu möödumisel kantakse loomad üle värskelt valmistatud kultuuri või kasvusubstraati. Valtsitud kaer, mida tuleb säilitada suletud nõudes, tuleks enne kasutamist aidalestade (näiteks Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) või röövlestadega (näiteks Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina) saastumise vältimiseks autoklaavida või läbi kuumutada. Pärast desinfitseerimist jahvatatakse sööt nii, et seda oleks lihtne mulla pinnale puistata. Muud võimalikud söödaallikad on pagaripärm või kalasööt TetraMin®.
                     Üldjoontes on kasvukultuuri tingimused piisavalt head, kui ussid ei proovi substraadist lahkuda, liiguvad mullas kiiresti, nende välispind on läikiv ilma selle külge jäänud mullaosakesteta, ussid on üldjoontes valkja värvusega ja kui näha on erinevas vanuses usse. Tegelikult saab usse pidada terveks, kui nad pidevalt paljunevad.
                     
                        Täiendavad valitud viited
                     
                     Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117–126.
                     Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51–83.
                     Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651–656.
                     Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. Pedobiologia 47: 607–616.
                     Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479–488.
                     Westheide W and Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263–267.”
                  ”
            
         (1)  See teave on ette nähtud üksnes kasutaja abistamiseks. Võib kasutada ka muid samaväärseid arvutiprogramme, kui saab näidata, et need annavad samad tulemused.
      
         (2)  Kui soost sõltuva tundlikkuse andmeid ei ole, kasutatakse kummastki soost rotte, st üks loom kummastki soost iga kontsentratsiooni kohta. Olemasoleva teabe alusel või kui kõnealuse kokkupuute vältel selgub, et üks sugu on tundlikum, kasutatakse edasistes katsetes iga kontsentratsiooni kohta 10 tundlikumast soost looma (kaks looma iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta).
      
         (3)  Kui kohaldatakse määrust (EÜ) nr 1272/2008, siis on gaasi, auru ja aerosooli piirkontsentratsioon vastavalt 20 000 ppm, 20 mg/l ja 5 mg/l. Kui eeldatakse mürgisust või kui mürgisus on tuvastatud eeluuringuga, tuleks valida väiksem lähtekontsentratsioon. Regulatiivse või teadusliku vajaduse korral võib kasutada suuremat kontsentratsiooni.
      
         (4)  Ideaaljuhul tuleks loomade kokkupuude järgmisel kontsentratsioonil edasi lükata seni, kuni eelnevalt töödeldud loomade ellujäämises on mõistlikkuse piires veendutud. See võimaldab uuringu juhil kohandada järgmise kokkupuute sihtkontsentratsiooni ja ajavahemikke.
      
         (5)  Minimaalne doos (kontsentratsioon × aeg), mis põhjustas esialgsel kontsentratsioonil katsetamise ajal surma (esimene kokkupuude), võetakse aluseks kontsentratsiooni ja kokkupuute ajavahemiku järgmise kombinatsiooni kindlaksmääramisel. Tavaliselt vähendatakse kontsentratsiooni kaks korda (1/2L) ja loomade kokkupuude kemikaalidega toimub uute väiksemate vahedega ajavahemike vältel. Kokkupuute ajavahemikud moodustavad geomeetrilise progressiooni, mille tegur on 1,4 (√2; vt viide 11) ja mille keskel on see aeg, kus esimese kokkupuute raames leiti minimaalne letaalne doos (aeg × kontsentratsioon). Kõnealusel joonisel (joonis 1) täheldati surma I kokkupuute vältel esmakordselt 15 minuti möödumisel; II kokkupuute ajavahemike keskel on seega 30 minutit ja ajavahemikud on 15, 21, 30, 42 ja 60 min. Pärast esimest kahte kokkupuudet on väga soovitatav koostada andmete alusel eespool näidatuga samalaadne joonis ning kontrollida, kas kontsentratsiooni ja aja sõltuvuse tõus on 45 kraadi (n = 1) või on kontsentratsiooni, aja ning mõju vaheline sõltuvus laugem (näiteks n = 2) või järsem (näiteks n = 0,8). Viimasel juhul on väga soovitatav edasiste kokkupuudete kontsentratsioone ja ajavahemikke selle alusel kohandada.
      
         (6)  Mõnikord võib olla vajalik suurendada kontsentratsiooni (2L) ja kasutada uusi veelgi väiksemate vahedega ajavahemikke; ajavahemikud moodustavad geomeetrilise progressiooni, mille tegur on 1,4 (√2) ja mille keskel on see aeg, kus esimese kokkupuute raames leiti minimaalne letaalne kontsentratsioon. Kokkupuute minimaalne kestus peaks eelistatavalt olema pikem kui 5 minutit; kokkupuute kestus ei tohiks ületada 8 tundi.
      
         (7)  Mitmete seerumi ja plasma, eelkõige glükoosi mõõtmiste korral oleks eelistatav loomadele eelneva öö jooksul süüa anda. Selle peamine põhjendus on see, et söötmise korral oleks tulemuste varieeruvus suurem ning see varjaks raskemini tuvastatava toime ning muudaks tõlgendamise raskeks. Teisest küljest võib öö läbi söötmata hoidmine aga häirida loomade tavalist üldist ainevahetust ja eelkõige söödaga manustamise uuringute puhul võib see häirida igapäevast kokkupuudet uuritava kemikaaliga. Kui loomadele ei anta öö jooksul süüa, tuleks uuringu neljandal nädalal tehtud funktsionaalsete vaatluste järel teha kliinilis-biokeemilised määramised.
      
         (8)  Kuna pikaajaline nälgimine võib põhjustada glükoosi mõõtmise tulemuste erinevust katserühma ja kontrollrühma loomade vahel, peaks uuringu juht otsustama, kas loomade söödata jätmine on asjakohane. Kui loomad jäetakse söödata, peaks ajavahemik olema vastav kasutatavale liigile; roti puhul võib see ajavahemik olla 16 tundi (nälgimine öö jooksul). Paastuglükoosi võib määrata pärast öist nälgimist viimasel kokkupuutenädalal või pärast öist nälgimist enne lahkamist (viimasel juhul määratakse paastuglükoos koos kõigi muude kliinilise patoloogia näitajatega).
      
         (9)  Kuna pikaajaline nälgimine võib põhjustada glükoosi mõõtmistulemuste erinevust katserühma ja kontrollrühma loomade vahel, peaks uuringu juht otsustama, kas loomade söögita jätmine on asjakohane. Kui loomad jäetakse söögita, peaks ajavahemik olema vastav kasutatavale liigile; roti puhul võib see ajavahemik olla 16 tundi (nälgimine öö jooksul). Paastuglükoosi võib määrata pärast öist nälgimist viimasel kokkupuutenädalal või pärast öist nälgimist enne lahkamist (viimasel juhul määratakse paastuglükoos koos kõigi muude kliinilise patoloogia näitajatega).
      
         (10)  Mitmete seerumi ja plasma, eelkõige glükoosi mõõtmiste korral oleks eelistatav loomadele eelneva öö jooksul süüa mitte anda. Selle peamine põhjendus on see, et söötmise korral oleks tulemuste varieeruvus suurem ning see varjaks raskemini tuvastatava toime ning muudaks tõlgendamise raskeks. Kuid tuleb märkida, et öö läbi söötmata hoidmine võib häirida loomade tavalist üldist ainevahetust ja eelkõige söödaga manustamise uuringute puhul võib see häirida igapäevast kokkupuudet uuritava kemikaaliga. Kõiki loomi tuleks hinnata samas füsioloogilises seisundis ja seepärast tuleks üksikasjalikud või neuroloogilised hindamised määrata muule päevale kui kliinilise biokeemia proovide võtmise päev.
      
         (11)  Söövitavuse hindamiseks võib kasutada eksperdiarvamust ja järgmisi tõendeid: inimeste ja loomadega saadud kogemused, olemasolevad (in vitro) andmed, näiteks käesoleva lisa peatükk B.40 (10), B.40a (11) või OECD katsejuhend nr 435 (12), pH-väärtused, teave samalaadsete kemikaalide kohta või mis tahes muud asjakohased andmed.
      
         (12)  Järgmistes tabelites viidatakse GHSile (ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteem). ELi vaste on määrus (EÜ) nr 1272/2008. Sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse puhul ei rakendata määruses (EÜ) nr 1272/2008 (9) kategooriat 5.
      
         (13)  Järgmistes tabelites viidatakse GHSile (ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteem). ELi vaste on määrus (EÜ) nr 1272/2008. Sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse puhul ei rakendata määruses (EÜ) nr 1272/2008 (9) kategooriat 5.
      
         (14)  Järgmistes tabelites viidatakse GHSile (ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteem). ELi vaste on määrus (EÜ) nr 1272/2008. Sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse puhul ei rakendata määruses (EÜ) nr 1272/2008 (9) kategooriat 5.
      
         (15)  Need ained on M4 ja M7 puhul erinevad, nagu on eespool viidatud.
      
         (16)  Need lahused valmistatakse eraldi, valatakse seejärel kokku ja autoklaavitakse viivitamata.
      
         (17)  Kui kahtlustatakse karedust tekitavate ioonide ja uuritava aine omavahelist mõju, tuleks kasutada väiksema karedusega vett (ja seega ei tohiks nimetatud olukorras kasutada Elendti kasvukeskkonda M4).
      
         (18)  Need ained on M4 ja M7 puhul erinevad, nagu on eespool viidatud.
      
         (19)  Need lahused valmistatakse eraldi, valatakse seejärel kokku ja autoklaavitakse viivitamata.
      
         (20)  Kui kahtlustatakse karedust tekitavate ioonide ja uuritava aine omavahelist mõju, tuleks kasutada väiksema karedusega vett (ja seega ei tohiks nimetatud olukorras kasutada Elendti kasvukeskkonda M4).
      
         (21)  Mürgisuse neutraliseerimiseks lisati SiO2.
      
         (22)  Lagunemise protsent FC nõudes, mis sisaldavad võrdlusainet.
      
         (23)  Lagunemise protsent FI nõudes.