CELEX: 31992R0690
Language: it
Date: 1992-03-19 00:00:00
Title: Regolamento (CEE) n. 690/92 della Commissione, del 19 marzo 1992, che definisce un metodo di riferimento per individuare la caseina di latte vaccino nei formaggi prodotti con latte di pecora

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31992R0690

Regolamento (CEE) n. 690/92 della Commissione, del 19 marzo 1992, che definisce un metodo di riferimento per individuare la caseina di latte vaccino nei formaggi prodotti con latte di pecora  

Gazzetta ufficiale n. L 074 del 20/03/1992 pag. 0023 - 0032 edizione speciale finlandese: capitolo 3 tomo 41 pag. 0123  edizione speciale svedese/ capitolo 3 tomo 41 pag. 0123 

REGOLAMENTO (CEE) N. 690/92 DELLA COMMISSIONE  del 19 marzo 1992  che definisce un metodo di riferimento per individuare la caseina di latte vaccino nei formaggi prodotti con latte di pecoraLA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,  visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea,  visto il trattato d'adesione della Spagna e del Portogallo, in particolare l'articolo 67, paragrafi 1 e 2, l'articolo 98, l'articolo 234, paragrafo 2 e l'articolo 310,  visto il regolamento (CEE) n. 1677/85 del Consiglio, dell'11 giugno 1985, relativo agli importi compensativi monetari nel settore agricolo (1), modificato da ultimo dal regolamento (CEE) n. 2205/90 (2), in particolare l'articolo 1, paragrafo 1,  visto il regolamento (CEE) n. 804/69 del Consiglio, del 27 giugno 1968, relativo all'organizzazione comune dei mercati nel settore del latte e dei prodotti lattiero-caseari (3), come dall'ultima modifica del regolamento (CEE) n. 374/92 (4), in  particolare l'articolo 9, paragrafo 3, l'articolo 14, paragrafo 7 e l'articolo 17, paragrafo 4,  visto il regolamento (CEE) n. 876/68 del Consiglio, del 28 giugno 1968, che stabilisce, nel settore del latte e dei prodotti lattiero-caseari, le norme generali relative alla concessione delle restituzioni all'esportazione e ai criteri per la fissazione  del loro ammontare (5), modificato da ultimo dal regolamento (CEE) n. 1344/86 (6), in particolare l'articolo 6, paragrafo 3,  considerando che i formaggi prodotti esclusivamente da latte di pecora sono soggetti a talune norme specifiche nel quadro dei regolamenti comunitari nel settore agricolo; che, prima dell'applicazione di queste norme, è necessario verificare che il  prodotto in questione non contenga latte vaccino;  considerando che è possibile concedere un aiuto all'ammasso privato di formaggi a base di latte di pecora ai sensi del regolamento (CEE) n. 508/71 del Consiglio, dell'8 marzo 1971, che stabilisce le norme generali per la concessione di aiuti all'ammasso  privato di formaggi a lunga stagionatura (7); che, a norma del regolamento (CEE) n. 876/68, può essere prevista una speciale restituzione per questi stessi prodotti; che, a norma del regolamento (CEE) n. 1677/85 del Consiglio, nessun importo  compensativo monetario viene imposto agli scambi di prodotti a base di latte di pecora; che l'imposizione di importi compensativi adesione è esclusa dagli scambi di formaggi a base di latte di pecora da e verso la Spagna ai sensi del regolamento (CEE)  n. 466/86 del Consiglio, del 25 febbraio 1986, che stabilisce le norme generali del regime degli importi compensativi adesione nel settore del latte e dei prodotti lattiero-caseari a seguito dell'adesione della Spagna (8), dal regolamento (CEE) n.  3640/90 del Consiglio, dell'11 dicembre 1990, che stabilisce le norme generali del regime degli importi compensativi adesione nel settore del latte e dei prodotti lattiero-caseari durante la seconda tappa dell'adesione del Portogallo (9);  considerando che attualmente la Commissione ha effettivamente adottato le disposizioni di cui sopra per quanto si riferisce ai formaggi a base di latte di pecora, per cui è necesssario verificare mediante controlli adeguati che nei prodotti in questione  non è stato aggiunto latte vaccino; che è necessario definire un metodo di riferimento comunitario atto a individuare la presenza di latte vaccino, salvo restando l'impiego dei metodi correnti, se conformi a certi criteri;  considerando che il comitato di gestione per il latte e i prodotti lattiero-caseari non ha emesso alcun parere nel termine fissato dal suo presidente,  HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:  Articolo 1  Per verificare che il formaggio da produrre obbligatoriamente con solo latte di pecora non contenga caseina di latte vaccino deve essere applicato il metodo d'analisi di riferimento che figura nell'allegato.  Si considera che la caseina di latte vaccino è presente se il tenore apparente di caseina di latte vaccino nel campione da analizzare è pari o superiore al tenore del campione di riferimento descritto nell'allegato.  Articolo 2  I metodi correnti per individuare la caseina di latte vaccino nei formaggi a base di latte di pecora possono essere usati nelle seguenti condizioni:  - il limite di rivelazione non deve essere superiore a 0,5 %;  - non si devono avere risultati falso-positivi. Se ciò avviene, qualsiasi campione che dia un risultato dovrà essere analizzato col metodo di riferimento;  - la caseina di latte vaccino deve essere individuabile con la precisione necessaria persino dopo i lunghi periodi di maturazione consueti in commercio. Se detto requisito non viene rispettato per un certo tipo di formaggio a base di latte di pecora,  quest'ultimo dovrà essere analizzato col metodo di riferimento.  Articolo 3  Il presente regolamento entra in vigore, il terzo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee.  Esso si applica a decorrere dal 16 settembre 1992. Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri.  Fatto a Bruxelles, il 19 marzo 1992. Per la Commissione  Ray MAC SHARRY  Membro della Commissione   (1) GU n. L 164 del 24. 6. 1985, pag. 6. (2) GU n. L 201 del 31. 7. 1990, pag. 9. (3) GU n. L 148 del 28. 6. 1968, pag. 13. (4) GU n. L 41 del 18. 2. 1992, pag. 9. (5) GU n. L 155 del 3. 7. 1968, pag. 1. (6) GU n. L 119 dell'8. 5. 1986, pag.  36. (7) GU n. L 58 dell'11. 3. 1971, pag. 1. (8) GU n. L 53 dell'1. 3. 1986, pag. 23. (9) GU n. L 362 del 27. 12. 1990, pag. 3.    g ALLEGATO  METODO DI RIFERIMENTO PER INDIVIDUARE LA CASEINA DI LATTE BOVINO IN FORMAGGI PRODOTTI CON LATTE DI PECORA   1.  Oggetto   Ricerca della caseina di latte bovino in formaggi prodotti con latte di pecora mediante focalizzazione isoelettrica delle g-caseine, previa plasminolisi.  2.  Campo d'applicazione   Il metodo serve a individuare in modo sensibile e  specifico la caseina di latte vaccino in formaggi freschi e stagionati prodotti con latte di pecora.  3.  Principio del metodo  3.1.  Isolamento della caseina dal formaggio.  3.2.  Solubilizzazione della caseina isolata ed azione plasminica sulla stessa  (EC 3.4.21.7).  3.3.  Focalizzazione isoelettrica della caseina trattata con plasmina in presenza di urea e colorazione delle proteine con Coomassie Brilliant Blue G-250.  3.4.  Determinazione dei profili della g2-caseina (prova della presenza di latte  bovino) confrontando il profilo del campione con quelli ottenuti sullo stesso gel a partire da standard contenenti lo 0 % e l'1 % di latte bovino.  4.  Reattivi   Se non è indicato altrimenti, devono essere usate reattivi chimici con grado di purezza  analitica. L'acqua deve essere bidistillata o di purezza equivalente.   Nota: I particolari che seguono si riferiscono a gel di poliacrilamide contenenti urea, aventi dimensioni 265 × 125 × 0,25 mm, prodotti in laboratorio. Se si usano gel di dimensioni  e tipi diversi, le condizioni di separazione devono essere modificate.   Focalizzazione isoelettrica  4.1.  Reattivi per la produzione di gel di poliacrilamide contenenti urea  4.1.1.  Soluzione madre di gel   Sciogliere:   4,85 g di acrilamide   0,15 g  di N,N-metilen-bis-acrilamide (BIS)   48,05 g di urea   12,22 g di glicerol (all'87 % p/p)   in acqua e portare a 100 ml conservando poi in frigorifero in una bottiglia di vetro scuro.   Nota: È preferibile usare una soluzione pronta di acrilamide/BIS,  disponibile in commercio, invece di pesare le quantità delle singole acrilamidi neurotossiche. Qualora una siffatta soluzione contenga il 30 % p/v di acrilamide e lo 0,8 % p/v di BIS, per la formulazione sarà necessario usare un volume di 16,2 ml invece  del peso prestabilito. La conversabilità massima della soluzione madre è di 10 giorni; se la sua conduttività è superiore a 5 mS, deionizzare mediante agitazione con 2 g di Amberlite MB-3 per 30 minuti, quindi filtrare attraverso una membrana di 0,45  mm.  4.1.2.  Soluzione di gel   Preparare una soluzione di gel mescolando additivi e anfoliti con la soluzione madre di gel (vedi 4.1.1).   9,0 ml di soluzione madre   24 mg di v-alanina   500 ml di anfolita pH 3,5-9,5 (1)   500 ml di anfolita pH 6-7  (1).   Miscelare la soluzione di gel e degassare per 2 o 3 minuti in un bagno ad ultrasuoni o sotto vuoto.   Nota: Preparare la soluzione di gel immediatamente prima di versarla (vedi 6.2).  4.1.3.  Soluzioni dei catalizzatori   Persolfato di ammonio  (PER) al 40 % p/v: sciogliere 800 mg di PER in acqua e portare a 2 ml.   N,N,NN-tetrametilendiamina (TEMED).   Nota: Usare sempre una soluzione di PER preparata di recente.  4.2.  Fluido di contatto   Cherosene oppure paraffina liquida  4.3.  Soluzione  anodica   Portare 5,77 g di acido fosforico (all'85 % p/p) a 100 ml con acqua.  4.4.  Soluzione catodica   Sciogliere 2,00 g di idrossido di sodio in acqua e portare a 100 ml con acqua.   Preparazione del campione  4.5.  Reattivi per l'isolamento delle  proteine   Diclorometano   Acido acetico diluito (25,0 ml di acido acetico glaciale portato a 100 ml con acqua).   Acetone.  4.6.  Tampone per la solubilizzazione delle proteine   Sciogliere:   5,75 g di glicerolo (all'87 % p/p)   24,03 g di urea   250  mg di ditiotreitolo   in acqua distillata e portare a 50 ml.   Nota: Conservare in frigorifero, conservabilità massima 1 settimana.  4.7.  Reattivi per l'attacco della caseina da parte della plasmina  4.7.1.  Tampone di carbonato di ammonio   Titolare  una soluzione di bicarbonato di ammonio 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml di acqua) con una soluzione di carbonato di ammonio 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml di acqua) a pH 8.  4.7.2.  Plasmina bovina (EC. 3.4.21.7), attività minima 5 U/ml.  4.7.3.  Soluzione inibente  l'enzima   Sciogliere 2,624 g di acido e-amminocapronico (acido 6-amino-n-esanoico) in 100 ml di etanolo al 40 % (v/v).  4.8.  Preparazione degli standard di coagulo presamico a partire da latte scremato di pecora contenenti lo 0 % e l'1 % di latte  bovino.   Il latte scremato viene preparato centrifugando latte crudo di massa, ovino o bovino, a 37 °C, a 2 500 g per 20 minuti. Dopo aver rapidamente raffreddato il tubo e il contenuto a 6-8 °C, lo strato di grasso affiorato viene completamente  allontanato. Per la preparazione dello standard all'1 % aggiungere 5,00 ml di latte bovino scremato a 495 ml di latte ovino scremato in un bicchiere da 1 l, portare il pH a 6,4 mediante aggiunta di acido lattico diluito (al 10 % p/v). Regolare la  temperatura a 35 °C ed aggiungere 100 ml di presame di vitello (attività del caglio, 1: 10 000, circa 3 000 U/ml), agitare per 1 minuto e lasciare quindi il bicchiere coperto con un foglio di alluminio a 35 °C per 1 ora, in modo da consentire la  formazione di cagliata. Una volta formatasi quest'ultima, tutto il latte coagulato viene liofilizzato senza che sia necessario omogeneizzare previamente oppure scolare il siero. Dopo la liofilizzazione, esso è finemente macinato in modo da produrre ua  polvere omogenea.   Per la preparazione dello standard allo 0 %, ripetere lo stesso procedimento usando 500 ml di puro latte ovino scremato.   Nota: È consigliabile verificare la purezza del latte ovino mediante focalizzazione isoelettrica della caseina  trattata con plasmina prima della preparazione degli standard.   Reattivi per la colorazione della proteina  4.9.  Reattivo per la fissazione delle proteine   Sciogliere 150 g di acido tricloroacetico in acqua e portare a 1 000 ml.  4.10.  Soluzione  decolorante   Portare 500 ml di metanolo e 200 ml di acido acetico glaciale a 2 000 ml con acqua distillata.   Nota: Preparare ogni giorno una soluzione decolorante fresca; essa può essere preparata mescolando volumi eguali di soluzioni madre di  metanolo al 50 % (v/v) e di acido acetico glaciale al 20 % (v/v).  4.11.  Soluzioni coloranti  4.11.1.  Soluzione colorante (soluzione madre 1)   Sciogliere 3,0 g di Coomassie Brilliant Blue G 250 (C.L. 42655) in 1 000 ml di metanolo al 90 % (v/v)  usando un agitatore magnetico (circa 45 minuti), filtrare attraverso due filtri pieghettati a velocità di filtrazione media.  4.11.2.  Soluzione colorante (soluzione madre 2)   Sciogliere 5,0 g di solfato di rame pentaidrato in 1 000 ml di acido acetico  al 20 % (v/v).  4.11.3.  Soluzione colorante (soluzione di lavoro)   Mescolare 125 ml di ciascuna delle soluzioni madre (4.11.1, 4.11.2) immediatamente prima della colorazione.   Nota: La soluzione colorante non dovrebbe essere riutilizzata il giorno  successivo a quello della preparazione.  5.  Apparecchiatura  5.1.  Piastre di vetro (265 × 125 × 4 mm); rullo di gomma (larghezza 15 cm); piano di appoggio con livello regolabile.  5.2.  Foglio di supporto del gel (265 × 125 mm).  5.3.  Foglio di  copertura (280 × 125 mm). Attaccare una striscia di nastro adesivo (280 × 6 × 0,25 mm) a ciascuno dei lati lunghi (vedi figura 1).  5.4.  Camera di elettrofocalizzazione con piastra di raffreddamento (ad es. 265 × 125 mm) con una opportuna sorgente di  differenza di potenziale ( 2,5 kV) oppure altro sistema per elettroforesi.  5.5.  Criostato a circolazione, termostaticamente controllato a 12 ± 0,5 °C.  5.6.  Centrifuga regolabile a 3 000 g.  5.7.  Strisce per elettrodi ( 265 mm di lunghezza).  5.8.   Bottiglie di plastica con contagocce per le soluzioni dell'anodo e del catodo.  5.9.  Applicatori del campione (10 × 5 mm, filtro di viscosa o di carta a basso assorbimento di proteine).  5.10.  Forbici, bisturi e pinzette in acciaio inossidabile.   5.11.  Vaschette per la colorazione e la decolorazione in acciaio inossidabile o in vetro (ad esempio, bacinella per strumenti chirurgici di 265 × 150 mm).  5.12.  Omogenizzatore ad asta regolabile (diametro 10 mm), regolabile da 8 000 a 20 000 giri al  minuto.  5.13.  Agitatore magnetico.  5.14.  Bagno ultrasonico.  5.15.  Saldatore di pellicole.  5.16.  Micropipette da 5,25 ml.  5.17.  Concentratore sotto vuoto o liofilizzatore.  5.18.  Bagnomaria termostatico regolabile a 35 e 40 ± 1 °C con  agitatore.  5.19.  Apparecchiatura per densitometria con lettura a l=634 nm.  6.  Procedimento  6.1.  Preparazione del campione  6.1.1.  Isolamento della caseina.   Pesare l'equivalente di 5 g di sostanza secca di formaggio o di standard - per il  formaggio a crosta fiorita, se possibile, la parte centrale non matura - in un tubo da centrifuga da 100 ml, aggiungere 60 ml di acqua distillata ed omogeneizzare con un omogenizzatore ad asta (8 000-10 000 giri al minuto). Portare a pH 4,6 con acido  acetico diluito (4,5) e centrifugare (5 minuti, 3 000 g). Eliminare per travaso grasso e siero, omogeneizzare il residuo a 20 000 giri al minuto in 40 ml di acqua distillata [portata a pH 4-5 con acido acetico diluito (4.5)], aggiungere 20 ml di  diclorometano (4.5), omogeneizzare e centrifugare (5 minuti, 3 000 g). Recuperare con una spatola lo strato di caseina compreso tra la fase acquosa e quella organica (figura 2) ed eliminare entrambe le fasi. Riomogeneizzare la caseina in 40 ml di acqua  distillata (vedi sopra) e 20 ml di diclorometano e centrifugare. Ripetere questo procedimento finché entrambe le fasi di estrazione diventano incolori (2-3 volte). Omogeneizzare il residuo proteico con 50 ml di acetone anidro (4.5) e filtrare attraverso  carta da filtro pieghettata a velocità di filtrazione media. Lavare il residuo sul filtro con due aliquote separate di 25 ml di acetone e far essiccare all'aria o in corrente di azoto, quindi triturare finemente in mortaio.    Nota: Gli isolati proteici secchi possono essere conservati indefinitamente a temperatura ambiente. Ai fini di un rapido isolamento delle proteine omogeneizzare l'equivalente di 5 g di sostanza secca di formaggio due volte, ciascuna volta con 100  ml di acetone (4.5) a 20 000 giri al minuto, lasciar riposare 5 minuti e filtrare su un filtro a pieghe. Essiccare il residuo proteico con acetone, come descritto prima, in modo da ottenere finalmente la polvere essiccata con acetone. Il metodo rapido  non può essere applicato a formaggi del tipo Roquefort.  6.1.2.  Idrolisi delle v-caseine con plasmina per intensificare le bande di g-caseine   Sospendere 25 mg di caseina isolata oppure 50 mg degli standard liofilizzati (4.8) o della polvere,  essiccata con acetone, proveniente dall'isolamento delle proteine con il sistema veloce in 0,5 ml di tampone di carbonato ammonico (4.7.1), ed omogeneizzare per 20 minuti ricorrendo, per esempio, al trattamento ultrasonico. Scaldare a 40 °C e aggiungere  10 ml di plasmina (4.7.2), mescolare e incubare per 1 ora a 40 °C agitando continuamente. Per inibire l'enzima aggiungere 20 ml di soluzione di acido e-amminocapronico (4.7.3), aggiungere quindi 200 mg di urea solida e 2 mg di ditiotreitolo.   Nota: Per  ottenere più simmetria nelle bande di caseine focalizzate è consigliabile liofilizzare la soluzione dopo aver aggiunto l'acido e-amminocapronico e aver sciolto i residui in 0,5 ml di tampone urea (4.6).  6.2.  Preparazione del gel di acrilamide  contenenti urea   Aiutandosi con poche gocche d'acqua stendere il foglio di supporto del gel (5.2) su una piastra di vetro (5.1), rimovendo l'acqua in accesso con fazzoletti di carta oppure con del tessuto. Stendere il foglio di copertura (5.3) con dei  distanziatori (0,25 mm) su un'altra piastra di vetro nello stesso modo. Disporre la piastra orizzontalmente su un piano livellabile.   Aggiungere 10 ml di ciascuna delle soluzioni catalizzatrici TEMED e PER (4.1.3) alla soluzione di gel preparata e  disaerata (4.1.2), mescolare rapidamente e versare in modo uniforme sul centro del foglio di copertura. Sistemare un bordo della piastra di supporto del gel (con il lato del foglio verso il basso) sulla piastra del foglio di copertura e abbassarla in  modo che tra i fogli si formi uno strato di gel uniforme e senza bolle (figura 3). Far abbassare la piastra di supporto del gel con cautela e completamente, aiutandosi con una spatola sottile e sistemare su di essa altre tre piastre di vetro che  agiscano da peso. Una volta che la polimerizzazione si è completata (circa 60 minuti dopo) rimuovere il gel polimerizzato sul foglio di supporto assieme al foglio di copertura eliminando le piastre di vetro. Pulire accuratamente la parte posteriore  della piastra di supporto del gel in modo da rimuovere residui di gel e di urea. Saldare il gel posto tra i due fogli in un tubo di pellicola e conservare in un frigorifero (massimo 6 settimane).   Nota: Il foglio di copertura con i distanziatori può  essere riutilizzato. Il gel di poliacrilamide può essere tagliato in porzioni più piccole, il che è auspicabile se si tratta di pochi campioni o se viene usato un dispositivo automatico di elettroforesi (2 gel, dimensione 4,5 × 5 cm).  6.3.   Focalizzazione isoelettrica   Regolare il termostato refrigerante a 12 °C. Pulire il supporto del gel con cherosene, quindi far cadere poche gocce di cherosene (4.2) sul centro del blocco di raffreddamento. Far poi ruotare il gel a sandwich con la  parte del supporto verso il basso, su di esso, avendo cura di evitare bolle d'aria. Eliminare eventuali eccessi di cherosene e rimuovere il foglio di copertura. Immergere le strisce per elettrodi nelle soluzioni elettrodiche (4.3, 4.4), tagliarle nel  senso della lunghezza del gel e sistemarle nelle posizioni previste (distanza tra elettrodi 9,5 cm).   Effettuare la focalizzazione nelle seguenti condizioni.  6.3.1.  Dimensioni del gel 265 × 125 × 0,25 mm         Operazione  Tempo (min)  voltaggio (V)   corrente elettrica (mA)  potenza (W)  volt/ora (Vh)         1. Prefocalizzazione  30  max. 2 500  max. 15  const. 4  c. 300  2. Focalizzazione del campione (*)  60  max. 2 500  max. 15  const. 4  c. 1 000  3. Focalizzazione  60  max. 2 500  max. 5   max. 20  c. 3 000   40  max. 2 500  max. 6  max. 20  c. 3 000   30  max. 2 500  max. 7  max. 25  c. 2 500          (*) Applicazione del campione: dopo la prefocalizzazione (fase 1) pipettare 18 ml di ciascuna delle soluzioni di campione sugli  applicatori del campione (10 × 5 mm), sistemarli sul gel ad intervalli di 1 mm l'uno dall'altro e a 5 mm di distanza in senso longitudinale dall'anodo premendo leggermente. Eseguire la focalizzazione nelle condizioni sopra descritte, rimuovere  accuratamente gli applicatori dei campioni dopo 60 minuti dall'inizio della focalizzazione.      Nota: Se si cambia lo spessore o la larghezza dei gel, i valori relativi alla corrente elettrica e alla potenza devono essere aggiustati (ad esempio, se si  usa un gel di 265 × 125 × 0,5 mm devono essere raddoppiati i valori della corrente elettrica e della potenza).  6.3.2.  Esempio di programma di voltaggio per un dispositivo automatico di elettroforesi (2 gel di 5,0 × 4,5 cm), elettrodi senza strisce  applicati direttamente al gel.         Operazione  Voltaggio  Corrente elettrica  Potenza  Temperature  Volt/ora         1. Prefocalizzazione  1 000 V  10,0 mA  3,5 W  8 °C  85 Vh  2. Focalizzazione del campione (*)  250 V  5,0 mA  2,5 W  8 °C  30 Vh   3. Focalizzazione  1 200 V  10,0 mA  3,5 W  8 °C  80 Vh  4. Focalizzazione  1 500 V  5,0 mA  7,0 W  8 °C  570 Vh          Porre l'applicatore del campione nella fase 2 a 0000 Vh   Rimuovere l'applicatore del campione nella fase 2 a 0030 VH  6.4.   Colorazione delle proteine  6.4.1.  Fissaggio delle proteine   Allontanare le strisce elettrodiche immediatamente dopo aver tolto la corrente e mettere il gel immediatamente in una vaschetta per colorazione/decolorazione contenente 200 ml di soluzione  di fissaggio (4.9); lasciar riposare per 15 minuti, agitando di tanto in tanto.  6.4.2.  Lavaggio e colorazione della piastra di gel   Eliminare accuratamente tutto il liquido di fissaggio e lavare la piastra due volte per 30 secondi, ogni volta con 100  ml della soluzione decolorante (4.10). Eliminare la soluzione decolorante e riempire il dischetto con 250 ml della soluzione colorante (4.11.3); lasciar colorare per 45 minuti agitando delicatamente.  6.4.3.  Decolorazione della piastra   Eliminare la  soluzione colorante, lavare la piastra due volte, usando ogni volta 100 ml di soluzione decolorante, agitare quindi per almento 2 × 15 minuti con 200 ml di soluzione decolorante finché il fondo non diventa chiaro e incolore. Sciacquare quindi la piastra  con acqua distillata (2 × 2 min) ed essiccare all'aria (2-3 ore) oppure con un asciugacapelli (10-15 min).   Nota: Effettuare il fissaggio, il lavaggio, la colorazione e la decolorazione a 20 °C. Non usare temperature elevate.  7.  Determinazione  quantitativa   La determinazione quantitativa viene effettuata confrontando il profilo proteico del campione con quello dei campioni di riferimento posti sullo stesso gel. La presenza di latte bovino nel latte di pecora o nei prodotti derivati da  quest'ultimo viene rilevata attraverso le caseine g2 e g3 la cui intensità sia stata aumentata mediante trattamento con plasmina (vedi 6.1.2), i cui punti isoelettrici variano tra pH di 6,5 e 7,5 (figure 4 e 5). Il limite di rivelazione è al di sotto  dello 0,5 %. Per una valutazione visiva del quantitativo di latte bovino presente è consigliabile uniformare le concentrazione dei campioni e degli standard in modo da ottenere lo stesso livello di intensità delle caseine g2 ovine (vedi « g2S » nelle  figure 4 e 5). Dopo di che il quantitativo di latte bovino (inferiore, pari o superiore all'1 %) nel campione in esame può essere stimato direttamente confrontando l'intensità delle caseine g2 bovine (vedi « g2C » nelle figure 4 e 5). Se possibile,  ricorrere alla densitometria (5.19) per la determinazione del rapporto tra le aree dei picchi della caseina g2 bovina e di quella ovina (vedi figura 5). Confrontare questo valore col rapporto tra caseine g2 presenti nello standard all'1 % analizzato  sullo stesso gel.   Nota: Il metodo funziona in modo soddisfacente se vi è un segnale chiaramente positivo per la caseina g2 bovina nello standard all'1 %, ma non nello standard allo 0 %. In caso negativo, ottimizzare la procedura rispettando  accuratamente i particolari del metodo.  8.  Bibliografia   Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine cheese  by gel isoelectric focusing of g2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).   Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholyte/immobilized pH  gradient - isoelectric focusing of g2-caseins using plasmin as signal amplifier. In: Electrophoresis-Forum '89 (B.J. Radola, ed.), pag. 389-393, Bode-Verlag, Muenchen (1989).   Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und  Ziegenmilch bzw. -Kaese durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).   Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Z. Lebensm. Unters. Forsch. (in preparazione).   Radola B.J.:  Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 mm polyacrylamide gels on silanized glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).  Figura 1 Rappresentazione schematica del foglio di copertura.  Nastro distanziatore  Foglio di poliestere  Figura 2 Strato di caseina all'interfaccia tra fase acquosa e fase organica dopo centrifugazione.  Fase di acqua  Caseina  Fase di CH2Cl2  Figura 3 Tecnica per preparare con stampi gel di poliacrilamide ultrasottili:  a = nastro distanziatore (0,25 mm); b = foglio di copertura (5.3); c, e = piastre di vetro (5.1); d = soluzione di gel (4.2); f = foglio di supporto del gel (5.2)                   Figura 4 Focalizzazione isoelettrica della caseina preparata da campioni di formaggi del tipo Pecorino dopo trattamento con plasmina, contenenti differenti quantitativi di latte bovino: % di CM = percentuale di latte bovino; C = vacca; S = pecora.  Formaggio del tipo Pecorino contenente:  Figura 5 Sovrapposizione di densitogrammi relativi a campioni di formaggio del tipo Pecorino contenenti 0, 1, 2, 3 e 7 % di latte bovino dopo focalizzazione isoelettrica. È stata analizzata a l = 634 nm, la parte del gel nella quale sono presenti le  bande di interesse pratico. STD = standard contenenti lo 0 e l'1 % di latte bovino.   (1) I prodotti Ampholine pH 3,5-9,5 (Pharmacia-LKB) e Servalyt pH 6-7 (Serva) si sono dimostrati particolarmente idonei per ottenere la separazione di -caseine richiesta.